(57)【要約】本開示は、細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含有する免疫調節性融合タンパク質に関し、標的の結合により、Ｔ細胞などの宿主細胞における調節性シグナルが生じ得る。本開示は、がんまたは感染症などのある特定の疾患を処置するための、そのような免疫調節性融合タンパク質を発現する免疫細胞の使用にも関する。ある特定の態様では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインを含有する細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとする。
2020511136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質と前記標的の特異的な結合によって形成される複合体（融合タンパク質：：標的複合体）の細胞外部分が、（ｉ）最大でおよそ免疫学的シナプスの２つの細胞膜間の距離、（ｉｉ）最大で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と前記ＴＣＲが特異的に結合したＭＨＣ−ペプチド複合体との間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ、（ｉｉｉ）最大で、前記結合ドメインを含む天然分子とその同族結合パートナーとの間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ；（ｉｉｉ）約４０ｎｍ未満もしくは最大で約４０ｎｍ、約２５ｎｍ未満もしくは最大で約２５ｎｍ、約２０ｎｍ未満もしくは最大で約２０ｎｍ、約１５ｎｍ未満もしくは最大で約１５ｎｍ、または約１４ｎｍ未満もしくは最大で約１４ｎｍ；または（ｉｖ）それらの任意の組合せのサイズである、またはその距離にまたがり、
前記細胞外成分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、前記細胞内成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質：：標的複合体が、超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に局在する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質：：標的複合体が、中心領域超分子活性化クラスター（ｃＳＭＡＣ）に局在する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＳＭＡＣが、抗原：：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体と会合したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の幅を有する、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質であって、
前記結合ドメインが、阻害分子結合ドメインであるかまたは阻害分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインであるかまたは共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を含み、
前記阻害分子が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、前記共刺激分子または刺激分子が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む、融合タンパク質。
【請求項６】
抗原に特異的なＴＣＲまたはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞において前記融合タンパク質を発現させることにより、前記Ｔ細胞と実質的に同じであるが前記融合タンパク質を含有しない細胞と比較して、前記抗原との結合に応答して、かつ／もしくは被験体への投与後に、前記Ｔ細胞による、生存、拡大、細胞傷害、サイトカイン分泌、および／もしくは多数回の刺激への応答の少なくとも約１．５倍、２倍、または３倍の増大をもたらし、かつ／または、前記細胞が投与される被験体の生存時間、無病生存期間、もしくは１つもしくは複数の疾患症状の改善の少なくとも約１．５倍、２倍、または３倍の増大をもたらす、請求項１から５までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、Ｔ細胞において発現させると、前記Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲまたはＣＡＲと共局在することができる、請求項１から６までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記細胞外成分が、追加的な細胞外部分をさらに含み、前記追加的な細胞外部分が、必要に応じて、前記結合ドメインの供給源分子とは別個の分子の細胞外部分に由来するもしくはそれと同一性を共有する、または前記結合ドメインを含有しない、請求項１から７までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記細胞外成分が、疎水性成分に由来する追加的な細胞外部分をさらに含む、または前記疎水性成分もしくはその一部を含有する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記追加的な細胞外部分が、マルチマー形成ドメインおよび／またはスペーサーを含む、請求項８または９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記細胞外成分または前記追加的な細胞外部分が、マルチマー形成ドメインを含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記マルチマー形成ドメインが、システイン残基を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記マルチマー形成ドメインが、前記疎水性成分から約２〜約１５アミノ酸内にシステイン残基を含有するように改変された細胞外成分を含む、請求項１１または１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記疎水性成分が、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記細胞外成分が、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記疎水性成分が４−１ＢＢの膜貫通ドメインを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記細胞外成分が、前記ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）膜貫通ドメインから伸長したＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞外部分を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞外部分がシステイン残基を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記疎水性成分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の膜貫通ドメインを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記標的が、ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）であるかまたはＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）を含む、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
（ａ）前記細胞外成分がＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインまたはその機能的断片を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片を含む、請求項１から２２までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインが、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外ドメイン全体を含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）が、ヒトＣＤ９５（Ｆａｓ）である、請求項１から２４までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記細胞内成分が、第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインであるかまたはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４、７７、または１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４、７７、または１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４、７７、または１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７２に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７、７８、または１９８に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７、７８、または１９８に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７６に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７、７８、または１９８に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１または５に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
（ａ）配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項３７】
（ａ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインを含む細胞外成分；（ｂ）配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分；および（ｃ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項３８】
請求項１から３７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４０】
ウイルスベクターである、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
抗原特異的ＴＣＲをさらにコードする、請求項３９から４１までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４３】
前記ＴＣＲが、宿主細胞に対して外因性である、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
前記ＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ制限抗原に特異的である、請求項４２または４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記抗原が、がん特異的抗原である、請求項４２から４４までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４６】
前記がん特異的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
リガンドをさらにコードする、請求項３９から４６までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４８】
前記リガンドが、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらにコードする、請求項３９から４８までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５０】
前記内因性受容体が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、もしくはＣＤ２を含む、または、ＴＣＲもしくはその一部である、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項１から３７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む宿主細胞。
【請求項５２】
請求項３８に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項５３】
請求項３９から５０までのいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
免疫系細胞である、請求項５１から５３までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記免疫系細胞が、Ｔ細胞である、請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
必要に応じて抗原特異的ＴＣＲである抗原受容体をさらに含む、請求項５１から５７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記抗原特異的ＴＣＲが、前記細胞または宿主に対して外因性である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記ＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ制限抗原に特異的である、請求項５８から５９までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記抗原が、がん特異的抗原である、請求項５８から６０までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
前記がん特異的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
前記抗原が、ウイルス抗原である、請求項５８から６０までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
前記抗原受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
被験体における疾患の処置において使用するための、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９から５０までのいずれか一項に記載のベクター、または請求項５１から６４までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
前記被験体が、ヒトである、請求項６５に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項６７】
前記疾患が、血液学的悪性疾患または固形腫瘍である、請求項６５または６６に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項６８】
前記疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項６５または６６に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項６９】
前記疾患が、卵巣がんである、請求項６５または６６に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項７０】
前記疾患が、膵がんである、請求項６５または６６に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項７１】
被験体において疾患を処置する方法であって、治療有効量の請求項１から３７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９から５０までのいずれか一項に記載のベクター、または請求項５１から６４までのいずれか一項に記載の宿主細胞を前記被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項７２】
前記被験体が、ヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患が、血液学的悪性疾患または固形腫瘍である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患が、卵巣がんである、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患が、膵がんである、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７７】
（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質と前記標的の特異的な結合によって形成される複合体（融合タンパク質：：標的複合体）の細胞外部分が、（ｉ）最大でおよそ免疫学的シナプスの２つの細胞膜間の距離、（ｉｉ）最大で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と前記ＴＣＲが特異的に結合したＭＨＣ−ペプチド複合体との間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ、（ｉｉｉ）最大で、前記結合ドメインを含む天然分子とその同族結合パートナーとの間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ；（ｉｉｉ）約４０ｎｍ未満もしくは最大で約４０ｎｍ、約２５ｎｍ未満もしくは最大で約２５ｎｍ、約２０ｎｍ未満もしくは最大で約２０ｎｍ、約１５ｎｍ未満もしくは最大で約１５ｎｍ、または約１４ｎｍ未満もしくは最大で約１４ｎｍ；または（ｉｖ）それらの任意の組合せのサイズである、またはその距離にまたがり、
前記細胞外成分が、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ２００Ｒ外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、前記細胞内成分が、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む、融合タンパク質。
【請求項７８】
前記融合タンパク質：：標的複合体が、超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に局在する、請求項７７に記載の融合タンパク質。
【請求項７９】
前記融合タンパク質：：標的複合体が、中心領域超分子活性化クラスター（ｃＳＭＡＣ）に局在する、請求項７７または７８に記載の融合タンパク質。
【請求項８０】
前記ＳＭＡＣが、抗原：：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体と会合したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の幅を有する、請求項７８または７９に記載の融合タンパク質。
【請求項８１】
（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質であって、
前記結合ドメインが、阻害分子結合ドメインであるかまたは阻害分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインであるかまたは共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を含み、
前記阻害分子が、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ２００Ｒ外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、前記共刺激分子または刺激分子が、ＣＤ２８に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ２８に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む、融合タンパク質。
【請求項８２】
抗原に特異的なＴＣＲまたはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞において前記融合タンパク質を発現させることにより、前記Ｔ細胞と実質的に同じであるが前記融合タンパク質を含有しない細胞と比較して、前記抗原との結合に応答して、かつ／もしくは被験体への投与後に、前記Ｔ細胞による、生存、拡大、細胞傷害、サイトカイン分泌、および／または多数回の刺激への応答の少なくとも約１．５倍、２倍、または３倍の増大をもたらし、かつ／または、前記細胞が投与される被験体の生存時間、無病生存期間、もしくは１つもしくは複数の疾患症状の改善の少なくとも約１．５倍、２倍、または３倍の増大をもたらす、請求項７７から８１までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８３】
前記融合タンパク質が、Ｔ細胞において発現させると、前記Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲまたはＣＡＲと共局在することができる、請求項７７から８２までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８４】
前記細胞外成分が、追加的な細胞外部分をさらに含み、前記追加的な細胞外部分が、必要に応じて、前記結合ドメインの供給源分子とは別個の分子の細胞外部分に由来するもしくはそれと同一性を共有する、または前記結合ドメインを含有しない、請求項７７から８３までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８５】
前記細胞外成分が、疎水性成分に由来する追加的な細胞外部分をさらに含む、または前記疎水性成分もしくはその一部を含有する、請求項７７から８４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８６】
前記追加的な細胞外部分が、マルチマー形成ドメインおよび／またはスペーサーを含む、請求項８４または８５に記載の融合タンパク質。
【請求項８７】
前記細胞外成分または前記追加的な細胞外部分が、マルチマー形成ドメインを含む、請求項７７から８６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８８】
前記マルチマー形成ドメインが、システイン残基を含む、請求項８７に記載の融合タンパク質。
【請求項８９】
前記マルチマー形成ドメインが、前記疎水性成分から約２〜約１５アミノ酸内にシステイン残基を含有するように改変された細胞外成分を含む、請求項８７または８８に記載の融合タンパク質。
【請求項９０】
前記疎水性成分が、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む、請求項７７から８９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９１】
前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項７７から９０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９２】
前記細胞外成分が、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、請求項９１に記載の融合タンパク質。
【請求項９３】
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、請求項９２に記載の融合タンパク質。
【請求項９４】
前記疎水性成分が、ＣＤ２００Ｒの膜貫通ドメインを含む、請求項７７から９３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９５】
前記標的が、ＣＤ２００であるかまたはＣＤ２００を含む、請求項７７から９４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９６】
（ａ）前記細胞外成分がＣＤ２００Ｒ外部ドメインまたはその機能的断片を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片を含む、請求項７７から９５までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９７】
前記ＣＤ２００Ｒ外部ドメインが、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む、請求項７７から９６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９８】
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも２００アミノ酸を含む、請求項７７から９６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９９】
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２２５アミノ酸〜少なくとも約２３５アミノ酸を含む、請求項９８に記載の融合タンパク質。
【請求項１００】
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２２８アミノ酸を含む、請求項９８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０１】
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２３１アミノ酸を含む、請求項９８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０２】
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２３４アミノ酸を含む、請求項９８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０３】
前記ＣＤ２００Ｒが、ヒトＣＤ２００Ｒである、請求項７７から１０２までのいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０４】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０５】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０６】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０７】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０８】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１８１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０９】
前記細胞外成分が、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むマルチマー形成ドメインをさらに含む、請求項１０５から１０８までに記載の融合タンパク質。
【請求項１１０】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１１】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１２】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１３】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１４】
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１８２に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７７または８１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１５】
前記細胞外成分が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むマルチマー形成ドメインをさらに含む、請求項１１１から１１４までに記載の融合タンパク質。
【請求項１１６】
（ａ）配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１１７】
（ａ）配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１１８】
（ａ）配列番号８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１１９】
（ａ）配列番号１１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２０】
（ａ）配列番号１８１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２１】
前記細胞外成分が、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むマルチマー形成ドメインをさらに含む、請求項１１７から１２０までに記載の融合タンパク質。
【請求項１２２】
（ａ）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２３】
（ａ）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２４】
（ａ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２５】
（ａ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２６】
（ａ）配列番号１８２に記載のアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質。
【請求項１２７】
前記細胞外成分が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むマルチマー形成ドメインをさらに含む、請求項１２３から１２６までに記載の融合タンパク質。
【請求項１２８】
請求項７７から１２７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２９】
請求項１２８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３０】
ウイルスベクターである、請求項１２９に記載のベクター。
【請求項１３１】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項１３０に記載のベクター。
【請求項１３２】
抗原特異的ＴＣＲをさらにコードする、請求項１２９から１３１までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３３】
前記ＴＣＲが、宿主細胞に対して外因性である、請求項１３２に記載のベクター。
【請求項１３４】
前記ＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ制限抗原に特異的である、請求項１３２または１３３に記載のベクター。
【請求項１３５】
前記抗原が、がん特異的抗原である、請求項１３２から１３４までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３６】
前記がん特異的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む、請求項１３５に記載のベクター。
【請求項１３７】
リガンドをさらにコードする、請求項１２９から１３６までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３８】
前記リガンドが、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８である、請求項１３７に記載のベクター。
【請求項１３９】
内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらにコードする、請求項１２９から１３８までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４０】
前記内因性受容体が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、もしくはＣＤ２を含む、またはＴＣＲもしくはその一部である、請求項１３９に記載のベクター。
【請求項１４１】
請求項７７から１２７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む宿主細胞。
【請求項１４２】
請求項１２８に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１４３】
請求項１２９から１４０までのいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４４】
免疫系細胞である、請求項１４１から１４３までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１４５】
前記免疫系細胞が、Ｔ細胞である、請求項１４４に記載の宿主細胞。
【請求項１４６】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１４５に記載の宿主細胞。
【請求項１４７】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１４５に記載の宿主細胞。
【請求項１４８】
必要に応じて抗原特異的ＴＣＲである抗原受容体をさらに含む、請求項１４１から１４７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１４９】
前記抗原特異的ＴＣＲが、前記細胞または宿主に対して外因性である、請求項１４８に記載の宿主細胞。
【請求項１５０】
前記ＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ制限抗原に特異的である、請求項１４８から１４９までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５１】
前記抗原が、がん特異的抗原である、請求項１４８から１５０までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５２】
前記がん特異的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む、請求項１５１に記載の宿主細胞。
【請求項１５３】
前記抗原が、ウイルス抗原である、請求項１４８から１５０までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５４】
前記抗原受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項１４８に記載の宿主細胞。
【請求項１５５】
被験体における疾患の処置において使用するための、請求項７７から１２７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２９から１４０までのいずれか一項に記載のベクター、または請求項１４１から１５４までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５６】
前記被験体がヒトである、請求項１５５に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項１５７】
前記疾患が、血液学的悪性疾患または固形腫瘍である、請求項１５５または１５６に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項１５８】
前記疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１５５または１５６に記載の融合タンパク質、ベクター、または宿主細胞。
【請求項１５９】
被験体において疾患を処置する方法であって、治療有効量の請求項７７から１２７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２９から１４０までのいずれか一項に記載のベクター、または請求項１４１から１５４までのいずれか一項に記載の宿主細胞を前記被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項１６０】
前記被験体がヒトである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記疾患が、血液学的悪性疾患または固形腫瘍である、請求項１５９または１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１５９または１６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４４７ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは３２２ＫＢであり、２０１８年に３月１５日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞に基づく免疫療法は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団の中で腫瘍反応性Ｔ細胞が見いだされた時に開発され始めた（Ｃｌａｒｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２９巻：７０５頁、１９６９年）。１つの戦略は、養子Ｔ細胞移入として公知であり、一部の状況では、腫瘍反応性について予め選択した腫瘍浸潤リンパ球を単離すること、ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって誘導される腫瘍反応性Ｔ細胞をクローン拡大させること、ならびに、最終的に、拡大させた細胞集団を、腫瘍を担持する患者に注入し戻すこと（化学療法およびＩＬ−２の反復投与と共に）を伴う（Ｄｕｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻：８５０頁、２００２年）。腫瘍浸潤リンパ球を用いるこの形態の養子Ｔ細胞療法は、技術的に煩わしいことがあり、また、完全寛解は黒色腫を有する患者のほんの一部にしか導かれず、他のがんではめったに有効でない（Ｂｅｓｓｅｒら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻：２６４６頁、２０１０年）。
【０００３】
腫瘍反応性Ｔ細胞クローンの単離は、別の免疫療法的手法、つまり、腫瘍細胞上に発現する主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子として公知）によって提示される腫瘍関連ペプチドなどの所望の標的に対する特異性を付与するために、例えばベクター送達系を使用してＴ細胞に導入することができる、特定の抗原に特異的な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の生成につながる。別の手法では、一般には、例えば抗腫瘍療法の状況では腫瘍に特異的であるまたは関連する抗原に結合することができる抗原結合ドメインと、それと連結した、ＴＣＲシグナル伝達ドメインなどの一次シグナル伝達ドメインまたは一部の状況では共刺激シグナル伝達ドメインなどのエフェクタードメインを含む１つまたは複数の細胞内成分を含有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる合成受容体を導入する。ＴＩＬの投与とは異なり、ＴＣＲまたはＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法を操作するための基本的な手順は、一般に、腫瘍標的化部分をコードする導入遺伝子を用いてヒトＴ細胞を遺伝子改変し、組換えＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大させ、拡大させた組換えＴ細胞を患者に輸注し戻すことである。
【０００４】
組換えＴＣＲを発現するＴ細胞を使用する養子Ｔ細胞療法には、特に、ある特定のＢ細胞がんにおいて有望な臨床的有用性があることが示されている。しかし、有効なＴ細胞活性化は、多くの場合、同時の共刺激シグナルを必要とするまたはそれにより増強される（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。腫瘍微小環境では、共刺激分子は一般に下方制御される。結果として、がん抗原に特異的な組換えＴＣＲを発現するＴ細胞には、ＩＬ−２を介した外因性刺激が一般に必要である。
【０００５】
Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣに提示された特異的なペプチドと会合すると開始される（Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：１〜１２頁、２０１２年）。Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の点は免疫学的シナプス（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅ）になり、これは、中心部のｃＳＭＡＣ、周辺部のｐＳＭＡＣ、および遠位のｄＳＭＡＣを含めた３つの同心性超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）で構成される（Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：１〜１２頁、２０１２年）。ｃＳＭＡＣ内では、共刺激受容体によりシグナル伝達分子が動員されてＴＣＲシグナルが増幅し得る。そのような共刺激受容体はＣＤ２８を含み得、一部の状況では、ＴＣＲと共にマイクロクラスターを形成して活性化の閾値を低下させる（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。Ｔ細胞によって発現される膜貫通タンパク質によるｃＳＭＡＣへの接近は、細胞外ドメインのサイズによって制限される可能性がある。例えば、ＣＤ４５は大きな外部ドメインを有し、一般には免疫学的シナプスから排除され、それにより、ＴＣＲシグナル伝達を阻害するその能力が妨げられる（ＪａｍｅｓおよびＶａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ、４８７巻：６４〜６９頁、２０１２年）。
免疫療法の分野では、がんまたは感染などの様々な疾患を処置するために、宿主細胞に免疫調節性シグナルをもたらす代替組成物および方法が依然として必要とされている。本明細書で開示される実施形態は、これらの必要性に対処し、他の関連する利点をもたらすものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１３年）１３巻：２２７〜２４２頁
【非特許文献２】Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２年）３巻：１〜１２頁
【非特許文献３】ＪａｍｅｓおよびＶａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２年）４８７巻：６４〜６９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある特定の態様では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインを含有する細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとする。
【０００８】
一部の実施形態では、融合タンパク質と標的の間で形成される複合体またはそのような融合タンパク質：：標的複合体の一部（一般に、そのような複合体の細胞外部分）の長さまたは空間距離は、特定の距離であるかまたは特定の距離にまたがり、例えば、一部の実施形態では、ある特定の距離未満またはおよそある特定の距離未満の距離である。一部の態様では、融合タンパク質：：標的複合体（または、一般には、その細胞外部分）の距離は、５０ｎｍ未満もしくは約５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満もしくは約４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満もしくは約３０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満もしくは約２０ｎｍ未満、または１５ｎｍに等しいかもしくはそれ未満、もしくは約１５ｎｍに等しいかもしくはそれ未満である。一部の実施形態では、当該距離は、１０ｎｍもしくは約１０ｎｍ、１１ｎｍもしくは約１１ｎｍ、１２ｎｍもしくは約１２ｎｍ、１３ｎｍもしくは約１３ｎｍ、１４ｎｍもしくは約１４ｎｍ、１５ｎｍもしくは約１５ｎｍ、１６ｎｍもしくは約１６ｎｍ、１７ｎｍもしくは約１７ｎｍ、１８ｎｍもしくは約１８ｎｍ、１９ｎｍもしくは約１９ｎｍ、または２０ｎｍもしくは約２０ｎｍ、例えば、１４ｎｍもしくは約１４ｎｍまたは１５ｎｍもしくは約１５ｎｍなどである。一部の態様では、距離は、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離である、または、ＴＣＲ−ペプチド／ＭＨＣ複合体に関しては、ＴＣＲの細胞外ドメインの膜最近位部分、例えば残基と、ＭＨＣ（例えば、ＭＨＣＩもしくはＭＨＣＩＩなどのＨＬＡ）分子の膜最近位部分、例えば残基の間の距離、または、そのような複合体の細胞外部分がまたがる距離（または、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、およびそれぞれの結合パートナーまたはそのリガンドを含有する複合体などの、シナプス内に含有されることが公知の細胞外部分がまたがる空間距離）と、同じ、ほぼ同じ、もしくは実質的に同じ距離である。一部の実施形態では、複合体の空間距離は、２つの異なる細胞の膜間の距離を指し、第１の細胞と第２の細胞は、それぞれ、それらの表面上に、細胞が互いと近傍になった場合に膜間で複合体を形成し得る結合パートナーを発現する。一部の態様では、距離は、ＴＣＲとＭＨＣ分子との同族相互作用の間で形成される複合体の細胞外部分がまたがる距離と同じ、ほぼ同じ、または実質的に同じ距離である。融合タンパク質が、普通は免疫学的シナプスに進入することまたは抗原受容体と共局在することができる分子に由来する結合ドメインを含む場合などの一部の態様では、距離は、分子（融合タンパク質に使用される結合ドメインを有する）と天然の結合パートナーとの間で形成される複合体がまたがる距離と同様であるかまたは同じである。融合タンパク質が、普通は免疫学的シナプスに進入することができないまたは普通は抗原受容体と共局在することができない分子に由来する結合ドメインを含む場合などの一部の態様では、距離は、分子（融合タンパク質に使用される結合ドメインまたはその機能的部分を有する）とその天然の結合パートナーとの間で形成される複合体がまたがる距離とは異なる、例えば、その距離よりも短いまたは実質的に短い。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞外成分内の結合ドメインは、阻害分子、例えば、免疫阻害受容体または免疫チェックポイント分子などの免疫阻害分子などの阻害シグナルを送達することができる分子の標的結合部分を含有する。一部の態様では、そのような分子は、糖タンパク質、チェックポイントファミリーメンバーである。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、糖タンパク質、チェックポイントファミリーメンバーに由来するか、または、Ｂ７もしくはＢ７結合分子ではないか、または、ＣＤ２８−Ｂ７−スーパーファミリーメンバーではない（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、もしくは他のＢ７ファミリー結合分子ではない）結合ドメインを含む。例示的な糖タンパク質、チェックポイントファミリーメンバーは、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５、またはそのような分子のいずれかの結合性改変体を含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞外成分内の結合ドメインは、前述のもののいずれかの結合パートナー、またはそのような分子のいずれかの結合性改変体を含む。そのような実施形態の一部の態様では、融合タンパク質の細胞内部分は、共刺激シグナルなどの刺激シグナルをＴ細胞などのリンパ球に送達することができるシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳの共刺激領域、または他の共刺激分子などを含む。一部の態様では、細胞外結合部分がチェックポイントまたは免疫阻害分子に由来する場合には、融合タンパク質の細胞内部分は、チェックポイントまたは免疫阻害分子などの阻害分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。一部の態様では、融合タンパク質は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたは一次シグナルをＴ細胞に送達することができる他のドメインなどの一次シグナル伝達ドメインを含まない。
【００１０】
ある特定の態様では、細胞外成分またはその結合部分は、ＣＤ２００Ｒの結合部分またはその改変体などの、ＣＤ２００に特異的に結合することができる、分子の結合ドメインまたは外部ドメインを含有する、またはこのドメインである。一部の実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ４７に特異的に結合することができる、分子または外部ドメインの結合領域、例えば、ＳＩＲＰ外部ドメインまたはそのＣＤ４７結合領域など、例えば、ＳＩＲＰα外部ドメインまたはそのＣＤ４７結合領域などであるまたはそれを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、ＰＤ−Ｌ１分子またはＰＤ−Ｌ２分子またはＬＡＧ３分子に結合することができる。例示的な標的は、本発明で提供される融合タンパク質および組成物を用いて処置または改善される疾患もしくは状態に関連するもしくはそれのある特定の細胞もしくは組織、例えば、腫瘍細胞もしくは腫瘍微小環境などにおいて発現が増大するもしくは上方制御される、または、腫瘍などの患部組織に浸潤しているリンパ球などの免疫細胞上で一般に上方制御される受容体が結合する、１つもしくは複数のタンパク質であり得る。
【００１１】
一部の実施形態では、細胞外成分は、例えば結合ドメインが由来する分子以外の分子または結合ドメインが同一性を共有する分子以外の分子に由来する１つまたは複数の追加的な領域またはドメインをさらに含む。１つまたは複数の追加的な細胞外ドメインは、ヒンジまたはＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインなどの定常領域ドメインの全部または一部を含有し得る、免疫グロブリン分子に由来するもの、または、別の細胞表面分子、例えば共刺激受容体など、例えばＣＤ２８などに由来するものなどの、スペーサー領域を含み得る。追加的な細胞外ドメイン（複数可）は、一部の態様では、マルチマー形成ドメイン、例えば、別の分子とのホモダイマー形成またはヘテロダイマー形成、例えば２つまたはそれ超の融合タンパク質のマルチマー形成などを促進し得るダイマー形成ドメインまたは配列を含み得る。一部の実施形態では、そのようなドメインは、少なくとも膜貫通最近位システインを含むＣＤ２８分子の細胞外ドメインの一部、および一般に、そのようなシステインと膜との間の細胞外部分、またはその改変された改変体を含む。一部の態様では、そのようなドメインは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列もしくはその一部、または、それに対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一性を有するものなどのその改変体を含む。一部の態様では、マルチマー形成を容易にするまたは促進するために、そのようなドメインを含めることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２００結合ドメイン、例えば、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分（またはその一部、例えば、その結合ドメインなど）など、例えば、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するもしくは配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるＣＤ２００Ｒの細胞外部分など、またはそのＣＤ２００結合部分もしくはその改変体もしくはその結合部分を含めた細胞外成分を含有する。そのような実施形態の一部の態様では、融合タンパク質の細胞外部分は、ＣＤ２８の細胞外領域の一部、例えば、最大でその約９〜約１２アミノ酸（例えば、９アミノ酸または１２アミノ酸）などをさらに含み、一部の態様では、ＣＤ２８細胞外領域の膜最近位システイン残基を含む。一部のそのような実施形態では、細胞外領域のＣＤ２００Ｒ部分の長さは、ＣＤ２８由来の部分における追加的な残基の数に対応して、長さが、例えば、約９〜約１２アミノ酸（例えば、９アミノ酸もしくは１２アミノ酸）、または、融合タンパク質とＣＤ２００分子の間の複合体の細胞外部分がまたがる距離が、ヒトＣＤ２００Ｒ、例えば、ＣＤ２００ＲとＣＤ２００との複合体の細胞外部分がまたがる距離；もしくは、同族ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合した、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣＩＩ）と同族相互作用しているＴＣＲの複合体の細胞外部分がまたがる距離；もしくは免疫学的シナプスの距離と同様、実質的に同様、もしくは同じになるのに十分な数のアミノ酸だけ、減少する。一部の態様では、融合タンパク質は、膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ２８膜貫通など、例えば、配列番号４として記載されている配列によりコードされる膜貫通ドメインもしくはその一部など、またはその改変バージョン、例えば、分子間相互作用を容���にするために追加的な荷電領域もしくは残基または親水性残基を含有するように改変された改変体などをさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激ドメインなど、例えば、ライゲーションに応答して１つまたは複数のアダプター分子をＣＤ２８に動員することができるものなどをさらに含む。一部の態様では、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる配列またはその部分もしくは機能的改変体を含む、またはこれらの配列またはその部分もしくは機能的改変体である。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＳＩＲＰαの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＴＩＭ３の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＬＡＧ３の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とし、ここで、融合タンパク質と標的の特異的な結合によって形成される複合体（融合タンパク質：：標的複合体）の細胞外部分は、（ｉ）最大でおよそ免疫学的シナプスの２つの細胞膜間の距離、（ｉｉ）最大で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＴＣＲが特異的に結合したＭＨＣ−ペプチド複合体との間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ、（ｉｉｉ）最大で、結合ドメインを含む天然分子とその同族結合パートナーとの間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ；（ｉｉｉ）約４０ｎｍ未満もしくは最大で約４０ｎｍ、約２５ｎｍ未満もしくは最大で約２５ｎｍ、約２０ｎｍ未満もしくは最大で約２０ｎｍ、約１５ｎｍ未満もしくは最大で約１５ｎｍ、または約１４ｎｍ未満もしくは最大で約１４ｎｍ；または（ｉｖ）それらの任意の組合せのサイズである、またはその距離にまたがり、細胞外成分は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、細胞内成分は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とし、ここで、結合ドメインは、阻害分子結合ドメインであるかまたは阻害分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を有し、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインであるかまたは共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を含み、阻害分子は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、共刺激分子または刺激分子は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質を対象とする。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインを含む細胞外成分；（ｂ）配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分；および（ｃ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質を対象とする。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を対象とする。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを対象とする。
【００２７】
ある特定の他の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸、またはベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【００２８】
ある特定の他の態様では、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、免疫細胞活性の増大を必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２９】
他の態様では、本開示は、免疫応答を増強または延長する方法であって、免疫細胞活性の増強または延長を必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００３０】
さらに他の態様では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、免疫細胞活性の増大を必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３１】
他の態様では、本開示は、免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００３２】
他の態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、がんを有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００３３】
他の態様では、本開示は、がん細胞の免疫抵抗性を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００３４】
さらに他の態様では、本開示は、腫瘍を処置するための方法であって、腫瘍を有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含み、投与される宿主細胞が、免疫抑制性の腫瘍微小環境において増殖することができるものである、方法を提供する。
【００３５】
感染を処置する方法であって、感染を有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法も本開示によって提供される。
【００３６】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および付属図を参照すれば明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】図１Ａおよび１Ｂは、初代マウスＣＤ８＋Ｔ細胞上で高レベルで発現されるＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物を示す図である。（Ａ）例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＣＤ２００Ｒ細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜Ｖ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するためにＣＤ２８の細胞外ドメインから膜貫通近位システインの部分も組み込んでいる。任意の追加の細胞外アミノ酸（例えば１から約５０アミノ酸；本明細書で開示される例示的なマウス構築物は追加の９個の（９）アミノ酸を含有し、本明細書で開示される例示的なヒト構築物は１２個の（１２）アミノ酸を含有するなど）を検討するために、一部の構築物は細胞外または細胞内ドメインの切断された一部を有する（例えばＮ連結グリコシル化部位を保存しているＣＤ２００Ｒ）。例えば構築物ＩＶは、３アミノ酸短縮されたＣＤ２００Ｒの切断された一部を有する。構築物Ｖは、９アミノ酸短縮されたＣＤ２００Ｒの切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「Ｖ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＣＤ２００Ｒ抗体によって検出されたＴＣＲｇａｇＴ細胞上のマウスＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物のトランスジェニック発現。対照ベクターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有している。
【図１−２】同上
【００３８】
【図２−１】図２Ａから２Ｇは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ２００＋腫瘍標的細胞に応答して増殖、蓄積およびエフェクター機能を促進し、免疫学的シナプスにおいて蓄積することを示す図である。ナイーブのＴＣＲｇａｇマウス由来脾細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および組換えヒトＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で刺激され、レトロウイルス上清で２日間形質導入された。細胞は、照射ＦＢＬおよび脾細胞で７日ごとに再刺激され、ｒｈＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）と共に３回刺激まで培養された。Ｔ細胞は、最後の刺激の５〜７日後にアッセイのために使用された。（Ａ）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎによって測定されたＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８およびＧＦＰ対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖。Ｔ細胞は、ＣＤ２００−ＦＢＬ（上パネル）またはＣＤ２００＋ＦＢＬ（下パネル）で３日間刺激された。（Ｂ）照射ＣＤ２００＋ＦＢＬおよび脾細胞での刺激の毎週のサイクルの間、形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞との共培養での形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の優先的拡大／生存。（Ｃ）形質導入Ｔ細胞の濃縮。照射ＣＤ２００＋腫瘍細胞での反復再刺激は、空ＧＦＰ対照ベクターで形質導入された野生型Ｔ細胞と比較してＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入された細胞を濃縮した。（Ｄ）Ｔ細胞：ＦＢＬシナプスでのＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００シグナル強度の増加。脂質ラフトは免疫学的シナプス（Ｉ）で増加している。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は脂質ラフトと共局在していた。これは、融合タンパク質が免疫学的シナプス（ＩＩＩ、ＩＶ）内で濃縮していることを示している。（Ｅ）ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解する能力の増強を示している。標的腫瘍細胞は、示したとおり蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）のさまざまな希釈物で標識された。示したＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質または空ベクター対照で形質導入されたエフェクターＴＣＲｇａｇＴ細胞は、示したエフェクター対標的の比で、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（ＣＦＳＥｈｉ）と非特異的ＥＬ４（ＣＦＳＥｌｏ）対照標的との１：１混合物と５時間インキュベートされた。ＦＢＬと対照腫瘍細胞の合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。（Ｆ）（Ｇ）におけるＣＦＳＥアッセイのための標的腫瘍細胞。標的腫瘍細胞は、蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）またはＣＦＳＥのさまざまな希釈物で標識された。ＥＬ４細胞（ＣＴＶ＋）、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（ＣＦＳＥｈｉ）および非特異的ＥＬ４（ＣＦＳＥｌｏ）対照標的の１：１：１混合物が生成された。（Ｇ）ＣＦＳＥ細胞毒性アッセイ。ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８受容体またはＧＦＰ対照ベクターで形質導入された。エフェクターＴＣＲｇａｇＴ細胞は、示したエフェクター対標的の比で、ＣＤ２００−ＦＢＬまたはＣＤ２００＋ＦＢＬと非特異的ＥＬ４対照標的との１：１混合物と４時間インキュベートされた。ＦＢＬと対照腫瘍細胞との合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。
【図２−２−１】同上
【図２−２−２】同上
【図２−３】同上
【図２−４】同上
【図２−５】同上
【図２−６】同上
【図２−７】同上
【００３９】
【図３−１】図３Ａから３Ｄは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍チャレンジに応答して優先的に蓄積し、シクロホスファミド処置、ＦＢＬ保有マウスへの注射後にエフェクター表現型と一致する表面タンパク質を発現することを示す図である。形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、実施例２に記載のとおり生成された。（Ａ）実験の模式図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（Ｔｈｙ１．１ホモ接合）およびｅＧＦＰ対照（Ｔｈｙ１．１ヘテロ接合）ＴＣＲｇａｇＴ細胞をシクロホスファミド処置ＦＢＬ保有Ｂ６マウスに細胞４×１０６個／マウスで同時注射した。ＩＬ−２は、２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。Ｔ細胞移入８日後にマウスは、安楽死され、脾臓および鼠径部リンパ節は回収された。（Ｂ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＦＢＬに応答して脾臓に蓄積する（ＬＮ＝リンパ節；Ｓｐｌ＝脾臓）。（Ｃ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現するように形質導入されたＴ細胞、空ベクターで形質導入されたＴ細胞および内因性Ｔ細胞について移入３日後での表面タンパク質の比較。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞は対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較して低減したＣＤ６２Ｌを発現していた。これは、エフェクターＴ細胞表現型を示唆している。（Ｄ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞を発現するように形質導入された細胞、空ベクターで形質導入されたＴ細胞および内因性Ｔ細胞について移入１５日後での表面タンパク質の比較。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞は対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較して同様のレベルの細胞表面タンパク質を発現している。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【図３−４】同上
【００４０】
【図４−１】図４Ａから４Ｄは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−形質導入Ｔ細胞での養子免疫療法が播種性白血病（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）を根絶させることができることを示す図である。（Ａ）実験の模式図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはｅＧＦＰ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞がＣｙ処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された。ＩＬ−２は、示したとおりマウスのコホートに２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。（Ｂ）フローサイトメトリーによって決定されたＩＬ−２を注射した日のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ形質導入Ｔ細胞および形質導入されていないＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現の代表例。（Ｃ）ＩＬ−２注射存在下で処置したマウスの生存。（Ｄ）ＩＬ−２注射非存在下で処置したマウスの生存。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞の移入は、ＩＬ−２注射非存在下での生存を有意に改善した（ｐ＜０．０５、ログランクマンテル・コックス検定）。
【図４−２】同上
【図４−３】同上
【図４−４】同上
【００４１】
【図５−１】図５Ａから５Ｃは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現しているＴ細胞が検出可能な自己免疫性肝臓損傷を誘導せず、正常組織に浸潤しないことを示す図である。（Ａ）実験の模式図。シクロホスファミド処置Ａｌｂ／Ｇａｇマウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびｅＧＦＰ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞がシクロホスファミド処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された。ＩＬ−２は、示したとおりマウスのコホートに２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。移行の３および７日後に肝臓損傷は、肝臓酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルの定量によって評価された。（Ｂ）Ｔ細胞を受けていない、ＧＦＰを発現している対照Ｔ細胞またはＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現しているＴ細胞を受けたマウスについて移入３および７日後に測定されたＡＳＴおよびＡＬＴレベルは、処置によって変化しなかった。（Ｃ）正常組織のＴ細胞浸潤の評価。肝臓組織においてＴ細胞の限定的な存在がＴ細胞マーカーＣＤ３（左パネル）に特異的な抗体を使用して観察され、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇまたは対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞（右パネル）のレシピエント間で有意な差異はなかった。
【図５−２】同上
【図５−３】同上
【００４２】
【図６−１】図６Ａから６Ｄは、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインがｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積およびエフェクター機能を促進し、ＣＤ２００＋腫瘍標的細胞に応答して形質導入Ｔ細胞の腫瘍保有レシピエントの生存を促進することを示す図である。（Ａ）ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８（「Ｖ」）、−４−１ＢＢ（「ＶＩ」）および−ＣＤ２８−４−１ＢＢ（「ＶＩＩ」）構築物の模式図。（Ｂ）照射ＣＤ２００＋ＦＢＬおよび脾細胞での毎週の刺激後の、形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較した形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の拡大。ＣＤ２００Ｒ−４−１ＢＢおよびＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４−１ＢＢもｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進する。（Ｃ）標準的ＣＦＳＥベース細胞毒性アッセイを使用して、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−４−１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞を溶解する能力の増強を示した。ＦＢＬと対照腫瘍細胞の合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。（Ｄ）ＣＤ２００Ｒ−４１ＢＢ−形質導入Ｔ細胞も対照と比較して生存を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−４−１ＢＢ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８−４−１ＢＢまたはｅＧＦＰ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞はシクロホスファミド処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図６−４】同上
【００４３】
【図７−１】図７Ａから７Ｄは、ＷＴ１特異的ＴＣＲおよびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８融合タンパク質を発現するように形質導入されたヒト初代Ｔ細胞が、ＣＤ２００を発現する標的細胞の増殖の増強およびＣＤ２００を発現する腫瘍細胞に応答したサイトカイン産生の増加を示すことを示す図である。（Ａ）ＷＴ１１２６特異的ＴＣＲ、Ｃ４およびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の発現。（Ｂ）Ｔ２およびＫ５６２細胞におけるＣＤ２００の発現。Ｔ２細胞は、低レベルの内因性ＣＤ２００発現を示す。（Ｃ）ＣＦＳＥによって示されるＴ細胞の増殖。抗原に応答して増殖する細胞は、ＣＦＳＥ蛍光強度の低減を示す。Ｃ４およびＩＦＰの両方で形質導入されたＴ細胞は、Ｃ４のみで形質導入されたＴ細胞と比較して低レベルのＣＤ２００を発現する標的細胞の増殖の増強を示す。（Ｄ）フローサイトメトリーによって測定されたＣＤ２００ｄｉｍ腫瘍細胞への曝露に応答したサイトカイン産生。ＴＣＲ  Ｃ４のみで形質導入された対照Ｔ細胞と比較して、Ｃ４およびＩＦＰ  ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の両方で形質導入されたＴ細胞はサイトカイン産生の増加を示す。
【図７−２】同上
【図７−３】同上
【図７−４】同上
【００４４】
【図８−１】図８Ａから８Ｅは、ＳＩＲＰα細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含有する融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積および増殖を促進することを示す図である。（Ａ）例示的なＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＳＩＲＰα細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＳＩＲＰαｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＳＩＲＰα−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜ＶＩ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するためにＣＤ２８の細胞外ドメインから膜貫通近位システインの部分も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、一部の構築物は、細胞外または細胞内ドメインの切断された一部（例えば、Ｎ連結グリコシル化部位を保存しているＳＩＲＰα部位）を有する。構築物ＩＶは、Ｎ連結グリコシル化部位を保存するように６アミノ酸短縮されているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。構築物Ｖは、９アミノ酸短縮されているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。構築物ＶＩは、２３アミノ酸短縮されているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「Ｖ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較した、照射ＳＩＲＰα＋ＦＢＬおよび脾細胞での毎週の刺激後の形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の拡大。ＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物は、ＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓが蓄積の増強を示して形質導入Ｔ細胞の蓄積をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する。（Ｃ）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈増殖アッセイにおけるＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物で形質導入されたＴ細胞の増殖。Ｔ細胞−腫瘍細胞距離を維持するように操作されたＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物を発現しているＴ細胞は、形質導入されていないＴ細胞と比較して増殖の増強を示した。（Ｄ）ＣＤ４７＋腫瘍細胞は、ＳＩＲＰαｔｍ−ＣＤ２８またはＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ構築物を発現するように形質導入されたＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞との共培養後に殺滅された。対照的に腫瘍細胞は、空ベクターまたその細胞内ドメインを欠如している切断型ＳＩＲＰαを受けたＴ細胞と培養された場合は根絶されなかった。（Ｅ）ＣＤ４７＋腫瘍細胞の殺滅を定量するために使用されるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイの結果。ＣＤ４７＋ＦＢＬ腫瘍細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入された。赤シグナルの喪失は腫瘍細胞の殺滅を示している。腫瘍細胞の殺滅は、エフェクター：標的比１０：１、２：１および０．４：１で検査された。検査した最も低いエフェクター対標的比においてさえ、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４７＋腫瘍細胞を殺滅した。
【図８−２−１】同上
【図８−２−２】同上
【図８−３】同上
【図８−４】同上
【図８−５】同上
【００４５】
【図９−１】図９Ａおよび９Ｂは、ＰＤ−１細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでサイトカイン産生を促進することを示す図である。（Ａ）例示的なＰＤ−１−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＰＤ−１細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＰＤ−１ｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＰＤ−１の細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＰＤ１−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜ＶＩＩ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶ〜ＶＩＩはＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物ＩＶは、９アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物Ｖは、１２アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物ＶＩは、１５アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物ＶＩＩは、２１アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「Ｖ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）ＰＤ１−ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、内因的にＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現するＦＢＬ細胞でＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａの存在下での５時間の刺激に応答してサイトカイン産生の増加を示した。刺激されたＴ細胞は、フローサイトメトリーによってエフェクターサイトカイン、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの細胞内発現について評価された。
【図９−２】同上
【００４６】
【図１０】図１０は、ＴＣＲ  Ｃ４およびＰＤ−１  ＩＦＰの共発現を示す図である（ＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＰＤ１−２１ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。Ｃ４およびＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞は、両方のタンパク質の高い形質導入効率および発現を示した。
【００４７】
【図１１−１】図１１Ａから１１Ｃは、Ｆａｓ細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質が、照射ＦＢＬ細胞での刺激の際にｉｎ  ｖｉｔｒｏで蓄積することを示す図である。（Ａ）例示的なＦａｓ−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、Ｆａｓ細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（Ｆａｓｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、Ｆａｓの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（Ｆａｓ−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ」および「ＩＶ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶはＦａｓの切断された一部を有し、Ｆａｓ細胞外ドメインは９アミノ酸短縮されている。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「ＩＶ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）Ｆａｓ構築物で形質導入されたＴＣＲｇａｇＴ細胞の照射ＦＢＬ細胞での複数回刺激での蓄積。すべての構築物が対照Ｔ細胞と比較してＴ細胞の蓄積を促進した。（Ｃ）Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数回の刺激においてＴ細胞の生存および拡大を促進したが、全長（ＦＬ）Ｆａｓはしなかった。
【図１１−２】同上
【図１１−３】同上
【００４８】
【図１２−１】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＬＡＧ３細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質の構造および発現を示す図である。（Ａ）例示的なＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＬＡＧ３細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＬＡＧ３ｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＬＡＧ３の細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＬＡＧ３−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ」および「ＩＶ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶはＬＡＧ３の切断された一部を有し、ＬＡＧ３細胞外ドメインは９アミノ酸短縮されている。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「ＩＶ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＬＡＧ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって決定されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞によるＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物の発現。ＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物（ＬＡＧ３ｔｍ−ＣＤ２８；ＬＡＧ３−ＣＤ２８ｔｍ；ＬＡＧ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ；ＬＡＧ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を発現するように形質導入されたＴ細胞は、空ベクターを受けた対照Ｔ細胞とは対照的に構築物の発現を示した。
【図１２−２】同上
【００４９】
【図１３−１】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＴＩＭ３細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質の構造および発現を示す図である。（Ａ）例示的なＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＴＩＭ３細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＴＩＭ３ｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＴＩＭ３の細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＴＩＭ３−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ」および「ＩＶ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶはＴＩＭ３の切断された一部を有し、ＴＩＭ３細胞外ドメインは９アミノ酸短縮されている。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「ＩＶ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＴＩＭ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって決定されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞によるＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物の発現。ＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物（ＴＩＭ３ｔｍ−ＣＤ２８；ＴＩＭ３−ＣＤ２８ｔｍ；ＴＩＭ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ；ＴＩＭ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を発現するように形質導入されたＴ細胞は、典型的に、空ベクターを受けた対照Ｔ細胞とは対照的に構築物の発現を示した。
【図１３−２】同上
【００５０】
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは、初代マウスＣＤ８＋Ｔ細胞上で高レベルで発現されるＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物を示す図である。（Ａ）代表的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＣＤ２００Ｒ細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜Ｖ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するためにＣＤ２８の細胞外ドメインから膜貫通近位システインの部分も組み込んでいる。ＣＤ２８の細胞外ドメインの部分を組み込むことによって引き起こされる任意の追加の細胞外アミノ酸（例えば、１から約５０アミノ酸；本明細書で開示される例示的なマウス構築物は追加の３個（３）または９個の（９）アミノ酸を含有し、本明細書で開示される例示的なヒト構築物は追加の９個（９）または１２個の（１２）アミノ酸を含有するなど）を検討するために、一部の構築物は、細胞外または細胞内ドメインの切断された一部を有する（例えば、Ｎ連結グリコシル化部位を保存しているＣＤ２００Ｒ）。例えば、構築物ＩＶは、３アミノ酸短縮されたＣＤ２００Ｒの切断された一部を有する。構築物Ｖは、９アミノ酸短縮されたＣＤ２００Ｒの切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」、および「Ｖ」は、破線で示されているとおり細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＣＤ２００Ｒ抗体によって検出されたＴＣＲｇａｇＴ細胞上のマウスＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物のトランスジェニック発現。
【図１４−１】同上
【００５１】
【図１５−１】図１５Ａから１５Ｎは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ２００＋腫瘍標的細胞によって刺激されるＴ細胞の増殖、蓄積、およびエフェクター機能を促進し、免疫学的シナプスにおいて蓄積することを示す図である。特に示さない限り、結果はすべて、結果が同様であった少なくとも２回の実験を表す。ナイーブのＴＣＲｇａｇマウス由来脾細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、および組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２、１００Ｕ／ｍｌ）で刺激され、レトロウイルス上清で２日間形質導入された。細胞は、照射ＦＢＬおよび脾細胞で７日ごとに再刺激され、ｒｈＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）と共に３回刺激まで培養された。Ｔ細胞は、最後の刺激の５〜７日後にアッセイのために使用された。（Ａ）刺激されていない細胞（影付き）と比較し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈によって測定されたＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８およびＧＦＰ対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖。Ｔ細胞は、ＣＤ２００−ＦＢＬ（上パネル）またはＣＤ２００＋ＦＢＬ（下パネル）で３日間刺激された。（Ｂ）切断されたＣＤ２００Ｒ（ｔｒＣＤ２００Ｒ）の模式図。（Ｃ）共刺激のためにＣＤ２８シグナル伝達ドメインが必要とされる。抗ＣＤ２００Ｒ抗体によって検出された、ＴＣＲｇａｇＴ細胞上のｔｒＣＤ２００Ｒ構築物のトランスジェニック発現。（Ｄ）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈によって測定されたｔｒＣＤ２００Ｒ（青色の線）およびＧＦＰ対照（赤色の線）ＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖。Ｔ細胞は、ＣＤ２００＋ＦＢＬで３日間刺激された。（Ｅ）ＣＤ２００＋ＦＢＬでの再刺激は、ＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰで形質導入されたＴ細胞を濃縮した。照射ＣＤ２００−（左パネル）またはＣＤ２００＋（右パネル）ＦＢＬ、および脾細胞での再刺激の１サイクルの間、形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞を含む混合集団における形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の濃縮。ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８（上パネル）またはＧＦＰ対照（下パネル）で形質導入された。（Ｆ、Ｇ）照射ＣＤ２００＋ＦＢＬおよび脾細胞での刺激の毎週のサイクルの間、形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞を含む混合集団における形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の濃縮。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ｔ検定）。（Ｈ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解する能力の増強を示している。標的腫瘍細胞は、蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識された。ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓまたは模擬形質導入細胞（黒色の記号）で形質導入された。エフェクターＴＣＲｇａｇＴ細胞は、示したエフェクター対標的の比で、ＣＤ２００＋ＦＢＬと非特異的ＥＬ４対照標的との１：１混合物と４時間インキュベートされた。ＦＢＬと対照腫瘍細胞の合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。（Ｉ）１：１の比でのＦＢＬ刺激に応答したＴＣＲｇａｇＴ細胞におけるサイトカイン産生のパターンを示す円グラフ。円グラフ内の各スライスは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２を含むサイトカイン染色の組合せを表す。（Ｊ）フローサイトメトリーによって測定された、（Ｉ）において示したサイトカイン産生のヒストグラム。影付きのヒストグラムは、ＧＦＰ対照で形質導入された細胞を表す。（Ｋ〜Ｍ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は、脂質ラフトと共局在していた。これは、融合タンパク質がＴ細胞：標的接触の領域で濃縮していることを示し、これは、融合タンパク質のサイズが免疫学的シナプス内で適応し得ることを示唆する。ベクターで形質導入されたＴＣＲｇａｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大エフェクターＴ細胞は、３７℃で２０分間、ＦＢＬと１０：１のＥ：Ｔで組み合わせられた。コンジュゲートは、μ−スライドＶＩ．４チャンバー（Ｉｂｉｄｉ）上にさらに１５分間ローディングされた。固定細胞は、染色され、顕微鏡によって視覚化された。図１５Ｋでは、上パネルは、接触している細胞を示し、下パネルは、接触していない細胞を示す。（Ｎ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（赤色の線）、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（青色の線）、およびＧＦＰ対照（黒い線）で形質導入され、標識のとおり１０分間刺激されたＴＣＲｇａｇＴ細胞のＬＣＫ  Ｙ３９４発現。
【図１５−２】同上
【図１５−３】同上
【図１５−４】同上
【図１５−５】同上
【図１５−６】同上
【図１５−７】同上
【図１５−８】同上
【図１５−９】同上
【図１５−１０】同上
【図１５−１１】同上
【図１５−１２】同上
【図１５−１３】同上
【図１５−１４】同上
【００５２】
【図１６−１】図１６Ａから１６Ｅは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍チャレンジに応答して優先的に蓄積し、播種性白血病の養子免疫療法を増強することを示す図である。形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、実施例１５に記載のとおり生成された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（Ｔｈｙ１．１ホモ接合）およびｅＧＦＰ（Ｔｈｙ１．１ヘテロ接合）ＴＣＲｇａｇＴ細胞をＣｙ処置ＦＢＬ保有Ｂ６マウスに細胞４×１０６個／マウスで同時注射した。ＩＬ−２は、２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。Ｔ細胞移入８日後に、マウスは、安楽死され、脾臓および鼠径リンパ節は回収された。（Ａ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓＴＣＲｇａｇＴ細胞は、空ベクター対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較して、ＦＢＬに応答して脾臓に蓄積する。（Ｂ）ＩＦＰで形質導入されたＴ細胞の表現型は、対照と同様である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激の５日後の、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８で形質導入されたＴＣＲｇａｇＴ細胞上の表面マーカーの発現（赤色の線）または形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞上の表面マーカーの発現（青色の線）。（Ｃ）ＦＢＬに応答した、リンパ節（ＬＮ）および脾臓（Ｓｐｌ）へのＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓおよび空ベクター対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞の蓄積。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞（Ｔｈｙ１．１  ｈｏｍ）の増大倍率は、空ベクター対照（Ｔｈｙ１．１＋Ｔｈｙ１．２＋）ＴＣＲｇａｇＴ細胞の百分率で割ることによって算出された。（Ｄ、Ｅ）８日目（Ｄ）および１５日目（Ｅ）のＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞上の表面マーカーの発現（青色の線）、対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞上の表面マーカーの発現（赤色の線）、および内因性Ｔ細胞上の表面マーカーの発現（影付き）。移入の１５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、空ベクター対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較して同様のレベルの細胞表面タンパク質を発現した。
【図１６−２】同上
【図１６−３】同上
【図１６−４】同上
【図１６−５】同上
【００５３】
【図１７−１】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＩＬ−２注射の存在下で処置したマウスの生存（Ａ）またはＩＬ−２注射の非存在下で処置したマウスの生存（Ｂ）を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、およびｅＧＦＰ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞がＣｙ処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された（矢印で示した）。ＩＬ−２は、マウスのコホートに２日ごとに合計１０日間投与された（２×１０４Ｕ／用量）（Ａ）。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＴＣＲｇａｇＴ細胞の移入は、ＩＬ−２注射の非存在下での生存を有意に改善した（Ｐ＜０．０５、ログランクマンテル・コックス検定）（Ｂ）。（Ａ）では、データは１回の実験からのものである（ｎ＝３〜４マウス／群）。（Ｂ）では、データは３回の独立した実験からプールされた（ｎ＝６〜１０マウス／群）。
【図１７−２】同上
【００５４】
【図１８−１】図１８Ａから１８Ｅは、ＷＴ１特異的ＴＣＲおよびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８融合タンパク質を発現するように形質導入されたヒト初代Ｔ細胞が、ＣＤ２００を発現する標的細胞の増殖の増強およびＣＤ２００を発現する腫瘍細胞に応答したサイトカイン産生の増加を示すことを示す図である。（Ａ）健康なドナー白血球アフェレーシス（上パネル）または白血病芽球（下パネル）由来のＣＤ３４＋細胞上のＣＤ２００の発現。（Ｂ）初代ヒトＴ細胞におけるＷＴ１１２６特異的ＴＣＲ、ＴＣＲＣ４、およびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の発現。図は、ＩＦＰ、ＴＣＲα、およびＴＣＲβ鎖を組み合わせた構築物を示す。（Ｃ、Ｄ）ＣＦＳＥによって示されるＴ細胞の増殖。抗原に応答して増殖する細胞は、ＣＦＳＥ蛍光強度の低減を示す。ＴＣＲＣ４またはＴＣＲＣ４およびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８で形質導入されたＴ細胞は、ＷＴ１１２６パルス化Ｔ２細胞で刺激された。（Ｅ）フローサイトメトリーによって測定されたＴ２細胞への曝露に応答したサイトカイン産生。ＴＣＲＣ４のみで形質導入されたＴ細胞（上パネル）またはＴＣＲＣ４およびＣＤ２００標的化ＩＦＰの両方で形質導入されたＴ細胞（下パネル）は、示すとおりＷＴ１１２６パルス化Ｔ２細胞を用量調整(titration)して刺激された。ＴＣＲＣ４のみで形質導入された対照Ｔ細胞と比較して、ＴＣＲＣ４およびＩＦＰ  ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の両方で形質導入されたＴ細胞は、サイトカイン産生の増加を示した。
【図１８−２】同上
【図１８−３】同上
【図１８−４】同上
【図１８−５】同上
【００５５】
【図１９−１】図１９Ａから１９Ｃは、初代ヒトＴ細胞においてＷＴ１特異的ＴＣＲと同時発現されたＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物を示す図である。（Ａ）代表的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物の模式図。（Ｂ）ＩＦＰ、ＴＣＲα、およびＴＣＲβ鎖を組み合わせた構築物を示す図。（Ｃ）初代ヒトＴ細胞におけるＷＴ１１２６特異的ＴＣＲ、ＴＣＲＣ４、およびＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質の発現。
【図１９−２】同上
【図１９−３】同上
【００５６】
【図２０−１】図２０Ａから２０Ｄは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物を発現するＴ細胞の濃縮についてのアッセイの結果を示す図である。
【図２０−２】同上
【図２０−３】同上
【図２０−４】同上
【００５７】
【図２１−１】図２１Ａから２１Ｋは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物を発現するＴ細胞についてのエフェクター機能アッセイ（サイトカイン産生、細胞傷害）を示す図である。
【図２１−２】同上
【図２１−３】同上
【図２１−４】同上
【図２１−５】同上
【図２１−６】同上
【図２１−７】同上
【図２１−８】同上
【図２１−９】同上
【図２１−１０】同上
【図２１−１１】同上
【００５８】
【図２２−１】図２２Ａから２２Ｄは、Ｆａｓ  ＩＦＰ構築物を発現するＴ細胞での免疫療法に関するｉｎ  ｖｉｖｏ研究の結果を示す図である。（Ａ）研究デザイン。（Ｂ〜Ｃ）腫瘍細胞４×１０６個の腹腔内接種（０日目）後、およびシクロホスファミド処置後、その後に、追加的な処置なしでまたはＧＦＰで形質導入されたまたはＦａｓ−ＣＤ２８で形質導入されたＴＣＲｇａｇトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞１０６個の養子移入（５日目）の示した時点でのＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるホタルルシフェラーゼ＋ＦＢＬ腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージング。図２２Ｃに示した２匹のマウスは、ｎ＝４マウスの代表である。（Ｄ）ＩＶＩＳイメージングによって定量されたＦＢＬ腫瘍細胞の体内分布。腫瘍細胞４×１０６個の腹腔内接種（０日目）後およびシクロホスファミド処置後に、追加的な処置なし（白い丸）またはＧＦＰで形質導入されたＴＣＲｇａｇトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞１０６個の養子移入（黒い丸）またはＦａｓ−ＣＤ２８で形質導入されたＴＣＲｇａｇトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞１０６個の養子移入（赤色の丸）（５日目）を行った後の示した時点でのＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＦＢＬ腫瘍。
【図２２−２】同上
【図２２−３】同上
【図２２−４】同上
【００５９】
【図２３−１】図２３Ａから２３Ｄは、Ｆａｓ細胞外成分および４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質が、腫瘍細胞で刺激されるとｉｎ  ｖｉｔｒｏで蓄積し、増殖し、またＦａｓ誘導細胞死も低減することを示す図である。（Ａ）例示的なＦａｓ−４−１ＢＢ構築物の模式図。構築物は、Ｆａｓ細胞外（「ＥＣ」）ドメインおよび４−１ＢＢ膜貫通（「ＴＭ」）および細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメイン（「Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ」）を含有する。（Ｂ）マウスＴ細胞におけるトランスジェニックＴＣＲおよびＦａｓ−４−１ＢＢ  ＩＦＰ（Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ）の同時発現。レトロウイルス上清は、ＴＣＲｇａｇのみ、またはＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍ（配列番号１８７）のいずれかをコードするＤＮＡ構築物でのＰｌａｔ−Ｅ細胞のトランスフェクションによって生成された。ナイーブのＰ１４  Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激され、次いで、レトロウイルス上清で２日間形質導入された。刺激の５日後、形質導入Ｔ細胞は、ＴＣＲに対する特異的抗体およびＦａｓに対する特異的抗体で染色され、フローサイトメトリーによって解析された。（Ｃ）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈によって測定された、ＴＣＲｇａｇのみでまたはＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍで形質導入されたＴ細胞の増殖。形質導入されたＰ１４  Ｔ細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）増殖色素で染色され、刺激されなかったか（左）またはＦＢＬ腫瘍細胞で、エフェクターの標的に対する比８：１で６日間刺激された（右）。次いで、Ｔ細胞は、回収され、フローサイトメトリーによって解析された。（Ｄ）（ｉ）トランスジェニックＴＣＲｇａｇは発現するがＦａｓ発現を欠くＴ細胞；（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲｇａｇを発現する野生型Ｔ細胞；ならびに（ｉｉｉ）トランスジェニックＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍを発現するＴ細胞における細胞死Ｆａｓシグナル伝達経路活性。Ｐ１４  Ｔ細胞は、刺激され、ＴＣＲｇａｇまたはＴＣＲｇａｇ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ  ＩＦＰで形質導入された。７日後、Ｔ細胞は、Ｆａｓ経路による細胞死の尺度として活性カスパーゼ−８発現についてＦＬＩＣＡ方法体系を使用して染色された。
【図２３−２】同上
【図２３−３】同上
【図２３−４】同上
【００６０】
【図２４−１】図２４Ａから２４Ｂは、Ｆａｓ−４−１ＢＢ  Ｔ細胞が、卵巣がんのＩＤ８モデルにおいて腫瘍成長を制御し、生存を促進することを示す図である。（Ａ）ＩＤ８卵巣腫瘍細胞の殺滅を定量するために使用されたＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイの結果。マウス形質導入Ｔ細胞（抗メソテリンＴＣＲまたは抗メソテリンＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ）は、赤色蛍光ＩＤ８卵巣腫瘍細胞と２日間と共インキュベートされ、ＩＤ８細胞成長は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）解析によって定量された。赤色シグナルの消失は、腫瘍細胞の殺滅を示す。（Ｂ）（ｉ）抗メソテリンＴＣＲ細胞または（ｉｉ）抗メソテリンＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ細胞で処置されたＩＤ８マウスの生存。ＩＤ８マウス卵巣がんモデルにおいて、ＩＤ８腫瘍細胞５×１０６個を植え込み、６週間播種させた。シクロホスファミド処置後、マウスは、Ｔ細胞１０７個およびメソテリンパルス化脾細胞５．０×１０８個を受け、その後、１０日間ＩＬ−２注射された。マウスは、安楽死させるまで２週間ごとに処置された。
【図２４−２】同上
【００６１】
【図２５−１】図２５Ａから２５Ｄは、Ｆａｓ−４−１ＢＢ  Ｔ細胞が、膵がんのＫＰＣマウスモデルにおいてより大きな持続性を示し、生存を促進することを示す図である。（Ａ）正常な膵臓を有する健康なマウス（左）および「登録された」マウス（ＫＰＣ遺伝子操作マウス）における膵腫瘍（右）の超音波画像。（Ｂ）実験模式図。ＫＰＣマウスを、超音波によってスクリーニングしていつ腫瘍が生じるかを決定し、およそ８週齢で、腫瘍が検出された場合、研究に登録された。マウスは、処置群にランダムに割り当てられた；マウスは、シクロホスファミドで処置され、ＴＣＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、シクロホスファミド後、メソテリン特異的Ｔ細胞およびメソテリンペプチドパルス化脾細胞それぞれ１０７個を注射された。登録の１４日後に開始して、Ｔ細胞／ＡＰＣ注入（シクロホスファミドは伴わない）を２週間ごとに繰り返し、合計３回の注入を行い、ＩＬ−２注射は伴わなかった。研究終了時に、マウスは、生存について評価された。（Ｃ）最終的なＴ細胞注入の２８日後に生存していたマウスは、採血され、フローサイトメトリーによって遺伝子導入により標識されたＴ細胞を検出することにより移入Ｔ細胞の持続性が評価された。（Ｄ）（ｉ）抗メソテリンＴＣＲ細胞または（ｉｉ）抗メソテリンＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ細胞で処置されたＫＰＣマウスの生存。
【図２５−２】同上
【図２５−３】同上
【図２５−４】同上
【００６２】
【図２６】図２６は、（ｉ）ＴＣＲｇａｇＴ細胞または（ｉｉ）ＴＣＲｇａｇ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ  Ｔ細胞で処置されたＡＭＬモデル（ＦＢＬが注射された）マウスの生存を示す図である。マウスは、ＦＢＬ細胞を注射された。５日後、マウスは、シクロホスファミドで処置され、Ｔ細胞１０６個の投与を伴ったかまたは伴わなかった。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本開示は、免疫細胞などの宿主細胞におけるシグナル伝達を調節する融合タンパク質を提供する。例えば、本開示の融合タンパク質は、ヒトＴ細胞において活性化または共刺激シグナルをもたらすことができ、Ｔ細胞は、任意選択で、好ましい抗原特異的ＴＣＲを有するように操作することができる。これらの免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）は、遍在的に発現される標的または一般に非正常細胞（例えば、がん細胞）において上方制御または過剰発現される標的と相互作用することができる。そのようなＩＦＰは、細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを有する。操作されたＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）および活性化シグナルを生成する本開示の融合タンパク質を用いてＴ細胞に形質導入することにより、Ｔ細胞のある特定の実施形態は、例えば腫瘍細胞との相互作用の際に外因性共刺激がもはや必要なくなる可能性がある。
【００６４】
ある特定の態様では、本開示は、被験体における疾患（例えば、がん、感染症）の処置を含めた様々な治療への適用のための、ＩＦＰを含む宿主細胞（例えば、例えばＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞）、ＩＦＰをコードするベクター、およびＩＦＰを含むＴ細胞を活性化する方法を提供する。
【００６５】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を示すことは、それを理解するのに有用であり得る。付加的な定義は、本開示を通して説明する。
【００６６】
本説明では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、特に示さない限り、列挙範囲内の任意の整数および、適切な場合、その分数（整数の十分の一および百分の一など）の値を含むと理解すべきである。また、ポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さなどの、任意の物理的特徴に関連して本明細書で列挙する任意の数の範囲は、特に示さない限り、列挙範囲内の任意の整数を含むと理解すべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に示さない限り、表示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「１つまたは複数」の列挙された構成要素を意味することが理解されるものとする。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方またはその任意の組合せを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される場合、「包含する」、「有する」および「含む」という用語は、同義で使用され、それらの用語およびその変形形態は、非限定的と解釈するものとする。
【００６７】
「から本質的になる」という用語は、指定された材料もしくはステップに、または特許請求の範囲に記載されている発明の基本的特性に実質的に影響を及ぼさない材料もしくはステップに特許請求の範囲を限定する。例えば、タンパク質ドメイン、領域、またはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール）もしくはタンパク質（１つまたは複数のドメイン、領域、またはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質のアミノ酸配列が、一緒に、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質の長さの多くて２０％（例えば、多くて１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）またはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質の標的結合親和性）に実質的に影響を及ぼさない（すなわち、活性を４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％以下など、５０％を超えて低下させない）伸長、欠失、変異またはそれらの任意の組合せ（例えば、アミノもしくはカルボキシ末端またはドメイン間におけるアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「異種性」または「非内因性」または「外因性」は、宿主細胞もしくは被験体にとって天然ではない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子、もしくは活性を指す、または、宿主もしくは宿主細胞にとって天然であり、構造、活性もしくはその両方が、天然の分子と変異した分子の間で異なるように変更されたもしくは変異した、任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子、もしくは活性である。ある特定の実施形態では、異種、非内因性または外因性の分子（例えば、受容体、リガンド）は、宿主細胞または被験体に対して内因性ではなくてよいが、その代わりに、そのような分子をコードする核酸が、宿主細胞に、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔などによって付加されていてよく、ここで、付加された核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてもよく、染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製性ベクターとして）存在していてもよい。「相同」または「ホモログ」という用語は、宿主細胞、種、または株において見いだされるまたはそれに由来する分子または活性を指す。例えば、分子をコードする異種または外因性の分子または遺伝子は、それぞれ天然の宿主または宿主細胞分子または当該分子をコードする遺伝子と相同であり得るが、構造、配列、発現レベルまたはこれらの組合せが変更されていてよい。非内因性分子は、同じ種、異なる種、またはこれらの組合せに由来するものであり得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「内因性」または「天然」という用語は、宿主または宿主細胞に通常存在し、操作された変更を有さない遺伝子、タンパク質、化合物、分子、または活性を指す。
【００７０】
「結合ドメイン」（「結合領域」または「結合部分」とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、標的分子（例えば、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＳＭＡ、ＷＴ−１、サイクリン−Ａ１）と特異的かつ非共有結合により会合する、１つに合わさる、または組み合わさる能力を保有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などの分子を指す。結合ドメインは、目的の生体分子または他の標的またはその結合タンパク質の、任意の天然に存在する、合成、半合成または組換えにより生成した結合パートナーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または機能的結合ドメインまたはその抗原結合断片などの抗原結合ドメインである。例示的な結合ドメインは、生体分子に結合する特定の能力について選択された、受容体外部ドメイン（例えば、ＣＤ２００Ｒ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、Ｆａｓのもの）またはその結合部分、リガンド（例えば、ＩＬ３５、ケモカインなどのサイトカイン）またはその結合部分、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）またはその結合部分、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原結合領域、または合成ポリペプチドを含む。
【００７１】
一部の実施形態では、「特異的に結合する」は、１０５Ｍ−１に等しいもしくはより大きい親和性もしくはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合ドメイン、もしくはその融合タンパク質が会合することもしくは１つに合わさること、または試料中の任意の他の分子もしくは成分と有意に会合することも１つに合わさることもなしに、そのような標的分子に結合することを指す。結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）または「低親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）と分類することができる。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、最大で１０７Ｍ−１まで、最大で１０６Ｍ−１まで、最大で１０５Ｍ−１までのＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することができる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、「増強された親和性」を有し得、これは、標的抗原に対して野生型（または親）結合ドメインよりも強力な結合を有する、選択または操作された結合ドメインを指す。例えば、増強された親和性は、標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）が野生型結合ドメインよりも高いことに起因し得る、または標的抗原に対するＫｄ（解離定数）が野生型結合ドメインよりも低いことに起因し得る、または標的抗原に対する解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（Ｋｏｆｆ）が野生型結合ドメインよりも低いことに起因し得る。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析などの、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するためならびに結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための様々なアッセイが公知である（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、５１巻：６６０頁、１９４９年；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等物も参照されたい）。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、単鎖で少なくとも２つの別個のドメインを有し、それらのドメインが天然ではタンパク質において一緒には見いだされない、ポリペプチドを指す。融合タンパク質をコードする核酸分子は、ＰＣＲ、組換え操作などを使用して構築することができる、または、そのような融合タンパク質は、タンパク質合成の方法を使用して作製することができる。融合タンパク質は、タグまたは生物活性分子などの他の成分（例えば、共有結合した）をさらに含有し得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）により発現または産生される融合タンパク質は細胞表面に位置し、そこで、融合タンパク質は細胞膜につなぎ止められ、融合タンパク質の一部（例えば、結合ドメインを含有する）が細胞外に位置し、融合タンパク質の一部（例えば、シグナル伝達ドメインを含有する）が細胞内に位置する。
【００７３】
「疎水性成分」は、本明細書で使用される場合、細胞膜において熱力学的に安定な三次元構造を有する任意のアミノ酸配列を意味し、一般に、約１５アミノ酸から約３０アミノ酸までの長さにわたる。疎水性成分の構造は、アルファヘリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータへリックス、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、疎水性成分は、細胞膜に挿入またはまたがり得る膜貫通タンパク質の部分である、公知の膜貫通タンパク質由来の「膜貫通ドメイン」で構成される。さらなる実施形態では、疎水性成分または膜貫通ドメインは、融合タンパク質の細胞外部分と細胞内部分との間に位置し、それらを連結することができる。さらに、疎水性成分は、分子間相互作用を容易にするために、荷電した領域または親水性残基を含有するように改変することができる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、適切なシグナルを受け取った際に細胞における共刺激、陽性、または活性化生物学的応答または生理応答などの応答を直接または間接的に促進することができる、本開示の融合タンパク質において使用されるものなどの分子の細胞内部分である。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、結合によりシグナルを受け取る、またはそれ自体が標的分子に直接結合して細胞内の他の成分にシグナルを伝達することができる、タンパク質またはタンパク質複合体の一部である。細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、キナーゼドメイン、共刺激ドメインなどの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインまたはモチーフを含有する場合、細胞応答を直接促進し得る。他の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進し、それが今度は細胞応答を直接促進する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはそれらの任意の組合せに由来し得る。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、ＣＤ３ζを含まない。
【００７５】
「マルチマー形成ドメイン」は、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド分子または領域と、直接または間接的に、優先的に相互作用または会合するポリペプチド分子または領域を指し、マルチマー形成ドメインの相互作用は、マルチマー形成（すなわち、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモマルチマー、ヘテロマルチマーなどであり得るダイマー、トリマー、テトラマー、またはより高次のマルチマーの形成）に実質的に寄与するまたはそれを効率的に促進する。例えば、マルチマー形成は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合または架橋）、イオン結合、金属結合、静電相互作用、塩橋、双極子−双極子力、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、またはそれらの任意の組合せを含めた１つまたは複数の型の分子力に起因し得る。マルチマーは、適切な条件下（例えば、生理的条件、組換えもしくは操作されたタンパク質の発現、精製、もしくは保管に適した水溶液中、または非変性もしくは非還元電気泳動の条件下）で安定である。例示的なマルチマー形成ドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合、ジンクフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、へリックス−ターン−へリックス、へリックス−ループ−へリックスなどを含み得る。
【００７６】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、得られるポリペプチド構造が標的分子に対する特異的結合親和性を維持するまたはシグナル伝達活性（例えば、エフェクタードメイン活性）を維持するまたはその両方であるように２つの単鎖融合タンパク質の相互作用または１つもしくは複数の結合ドメインの位置付けを容易にするスペーサー機能をもたらす「リンカー」を含有し得る。例示的なリンカーは、１〜約１０のＧｌｙｘＳｅｒｙの反復を含み、式中、ｘおよびｙは、独立に、１〜５の整数である。
【００７７】
「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」は、結合ドメインと隣接する疎水性成分との間または疎水性成分の一方の末端もしくは両方の末端上などの、融合タンパク質の２つの隣接するモチーフ、領域またはドメインの間の１つまたは複数（例えば、約２〜２０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築デザインに起因し得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中の制限酵素部位の使用に起因するアミノ酸残基）。ある特定の実施形態では、接合部アミノ酸は、１〜約１０のＧｌｙｘＳｅｒｙの反復を有し、式中、ｘおよびｙが、独立に１〜５の整数であるものなどのリンカーを形成する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「免疫系細胞」は、２つの主要な系統である骨髄系前駆細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球および顆粒球などの骨髄系細胞を生じる）およびリンパ系前駆細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ系細胞を生じる）を生じる、骨髄における造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を意味する。例示的な免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、調節Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞を含む。マクロファージおよび樹状細胞は、ペプチドと複合体を形成したＡＰＣの表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面上のＴＣＲと相互作用する時にＴ細胞を活性化し得る特殊化した細胞である、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と呼ぶことができる。
【００７９】
「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する免疫系細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの発現の増大、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の低下）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原経験済みおよび長寿命）およびエフェクター細胞（抗原経験済み、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現の増大、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の低下）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ４５ＲＡの発現の低下、ならびにＣＤ１２７の発現の増大）のサブセットにさらに分けることができる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現の低下を有し、グランザイムおよびパーフォリンについて陽性である抗原経験済みＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。他の例示的なＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）調節Ｔ細胞およびＴｒｅｇ１７細胞などの調節Ｔ細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８−、およびＱａ−１制限Ｔ細胞を含む。
【００８０】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３と会合すると、一般に、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見いだされる分子を指す。大多数のＴ細胞では、ＴＣＲは、高度に可変性のα鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）のジスルフィド連結ヘテロダイマーを有する。Ｔ細胞の小さなサブセットでは、ＴＣＲは、可変性のγ鎖およびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）ヘテロダイマーで構成される。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｎ末端免疫グロブリン可変ドメイン１つ、免疫グロブリン定常ドメイン１つ、膜貫通領域、およびＣ末端における短い細胞質尾部を有する（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ
Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４：３３頁、１９９７年を参照されたい）。本開示において使用されるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、または他の哺乳動物を含めた、様々な動物種に由来し得る。ＴＣＲは、細胞に結合した形態（すなわち、膜貫通領域もしくはドメインを有する）または可溶性形態であり得る。
【００８１】
「主要組織適合性遺伝子複合体分子」（ＭＨＣ分子）は、互換的に使用され、ヒト対応物のヒト白血球抗原（ＨＬＡ分子）も指し、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指すと理解される。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜を貫通するα鎖（３つのαドメインを有する）および非共有結合により会合したβ２ミクログロブリンからなるヘテロダイマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、どちらも膜を貫通する２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβで構成される。各鎖は２つのドメインを有する。ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩ分子は、細胞質ゾルにおいて生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこで、ペプチド：ＭＨＣ（または、ヒトではペプチド：ＨＬＡ）複合体がＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子は、小胞系において生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含めた、様々な動物種に由来し得る。
【００８２】
「核酸分子」またはポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、または、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス鎖）であり得る。コード分子は、当技術分野で公知のコード配列と同一のコード配列を有し得る、または、遺伝暗号の重複性もしくは縮重の結果として、異なるコード配列を有し得る、または、スプライシングにより、同じポリペプチドをコードし得る。
【００８３】
本開示の核酸分子またはポリヌクレオチドの改変体も意図されている。改変体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の定義済みの配列のポリヌクレオチドのうちの１つと少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは９９．９％同一である、または、定義済みの配列のそれらのポリヌクレオチドのうちの１つと、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃、もしくは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、約４２℃のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載の機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持する。
【００８４】
「ストリンジェント」という用語は、当技術分野においてストリンジェントであると一般に理解されている条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についてのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃または０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、約４２℃である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい）。
【００８５】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）を使用することもできるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する例では、追加的な例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドに対して）の洗浄を含む。
【００８６】
「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージであり得る。「発現ベクター」は、適切な環境に存在すると、ベクターに担持されている１つまたは複数の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである。
【００８７】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。例示的なガンマレトロウイルスは、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスを含む。
【００８８】
「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：１型ＨＩＶ、および２型ＨＩＶを含む）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。
【００８９】
「同一の」または「パーセント同一性」という用語は、２つまたはそれ超のポリペプチドまたは核酸分子の配列に関しては、配列比較アルゴリズムなどの当技術分野で公知の方法を使用して、手動のアラインメントにより、または目視検査により測定して、比較ウインドウまたは指定の領域にわたって最大の対応について比較し、アラインメントした場合に、同じであるか、または指定された領域にわたって、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性）２つまたはそれ超の配列または部分配列を意味する。例えば、パーセント配列同一性および配列類似性を決定するための適切な好ましいアルゴリズムは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３頁に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。
【００９０】
「処置する」または「処置」または「改善する」は、被験体（例えば、ヒト、または、霊長類、ウマ、イヌ、マウスもしくはラットなどの非ヒト哺乳動物）の疾患、障害、または状態の医学的管理を指す。一般に、本開示の融合タンパク質を発現する宿主細胞、および任意選択でアジュバントまたは補助的療法を含む適切な用量または処置レジメンを、治療的または予防的利益を引き出すために十分な量で投与する。治療的または予防的／防止的利益は、臨床転帰の改善；疾患に関連する症状の軽減または緩和；症状の出現の減少；生活の質の改善；より長い無病状態；疾患の程度の低下、疾患状態の安定化；疾患の進行の遅延；寛解；生存；生存の持続；またはそれらの任意の組合せを含む。
【００９１】
融合タンパク質または本開示の融合タンパク質（例えば、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−４１ＢＢ、ＳＩＲＰα−４１ＢＢ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４１ＢＢ、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８−４−１ＢＢまたは他のそのような融合タンパク質）を発現する細胞の「治療有効量」または「有効量」は、処置される疾患または状態に関しては、処置される疾患の１つまたは複数の症状の改善を統計的に有意にもたらすために（例えば、感染の減少、腫瘍サイズの縮小、がんの成長の阻害など）十分な融合タンパク質の量または細胞の数を指す。
【００９２】
免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）
ある特定の態様では、本開示は、細胞外成分、疎水性成分、および細胞内成分を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、細胞外成分は、標的に特異的に結合するものなどの結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、普通は、例えば、その天然の状態では、免疫阻害受容体もしくはチェックポイント分子などのその結合パートナーもしくはリガンドもしくは受容体に結合すると負もしくは阻害シグナルを送達することができる分子に由来するか、または、標的は、阻害性受容体もしくはリガンドもしくはチェックポイント分子もしくは他の阻害性リガンドである。一部の実施形態では、細胞内成分は、一般に共刺激または正のシグナルを例えば免疫細胞に送達することができる、分子の共刺激シグナル伝達ドメインまたはシグナル伝達領域などのシグナル伝達ドメインを含む。したがって、一部の態様では、融合タンパク質は、天然の状況では阻害シグナルをもたらす結合事象に応答して、正または共刺激シグナルを送達することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、特定の距離が達成されるようなものである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体（例えば、融合タンパク質と標的の間で特異的な結合により形成される複合体の細胞外部分で構成されるものなど）は、特定の長さのものである、または、最大で免疫学的シナプスにおける膜間の距離、もしくは、例えばＴＣＲによる特異的な認識後のＴＣＲとＭＨＣ分子との間の同族複合体の細胞外部分がまたがる距離、もしくは天然分子との天然の結合パートナーとの間で形成される複合体の細胞外部分がまたがる距離などの、特定の距離にまたがる。一部の実施形態では、距離または長さは、Ｔ細胞などの免疫細胞において発現した際、または免疫学的シナプスに進入した際に、融合タンパク質と抗原受容体または他のシグナル伝達分子の共局在を促進するために十分なものである。
【００９４】
背景として、免疫学的シナプスは、様々な細胞間、例えば免疫細胞間で形成され得る、細胞間の界面である（Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：１〜１２頁、２０１２年；Ｈａｔｈｅｒｌｅｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２１巻：８２０頁、２０１３年）。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触するＴ細胞の場合では、免疫学的シナプスは、ＴＣＲ（Ｔ細胞の表面上に見いだされる）とＨＬＡペプチド（非ヒトについてはＭＨＣ−ペプチド）複合体（例えばＡＰＣの表面上に見いだされる；ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面上に見いだされ得、一方、ＨＬＡクラスＩＩは、全ての細胞型において条件的に発現し得るが、通常ＡＰＣ上に見いだされる）との結合によって形成され得る。さらに、免疫学的シナプスは、超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に組織化し得、それが、リンパ球活性化に影響を及ぼし、リンパ球への抗原−ＨＬＡ（または抗原−ＭＨＣ）複合体提示を導き、細胞間のサイトカインまたは溶解性顆粒分泌を導く可能性がある。ＳＭＡＣは、同心円に配置された３つの構造：多数のＴＣＲならびに共刺激および阻害分子を含有する中心領域（ｃＳＭＡＣ）、ＬＦＡ−１およびタリンがクラスター化している周辺領域（ｐＳＭＡＣ）、およびＣＤ４３およびＣＤ４５分子に富む遠位領域（ｄＳＭＡＣ）で構成され得る。ある特定の実施形態では、免疫学的シナプスは、約１０ｎｍから約１５ｎｍまでにまたがる。例えば、ＴＣＲ：：ＨＬＡペプチド相互作用または融合タンパク質−標的相互作用などの、免疫学的シナプス内で見出されるタンパク質相互作用は、一般に、膜間の約１４ｎｍにまたがる。ある特定の実施形態では、免疫学的シナプスにおけるＳＭＡＣの幅は、１５ｎｍを超えない。
【００９５】
一部の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外スパンは、免疫学的シナプスの特定の区画に局在し得るようなものである。免疫学的シナプスの様々な区画に局在すると考えられる一部の複合体は、それらの細胞外スパンの長さに関してよく特徴付けられている。例えば、ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体は、およそ１０〜１５ｎｍの細胞外スパンを有すると考えられ、より多くのインテグリンに基づく複合体は、およそ４０ｎｍの細胞外スパンを有すると考えられる（Ａｌａｋｏｓｋｅｌａら、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ、１００巻：２８６５頁、２０１１年）。追加的な例示的な複合体は、ＣＤ２−ＣＤ４８複合体を含み、これは、およそ１２．８ｎｍの細胞外スパンを有すると考えられる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８３巻：３４４１４頁、２００８年）。さらに、ｃＳＭＡＣに局在すると考えられる例示的なリガンド結合分子は、ＴＣＲおよびＭＨＣ複合体、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、およびそのリガンドを含み（Ｄｕｓｔｉｎら、ＣＳＨ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２巻：ａ００２３１１頁、２０１０年）、したがって、それらの天然のリガンドと複合体を形成するこれらの分子は、ｃＳＭＡＣに局在するのに適したサイズのものであることが意図されている。
【００９６】
一部の態様では、特定の構築物または融合タンパク質の細胞外部分などの操作されたその細胞外部分、または前述のもののいずれかと、例えばその結合パートナーとの複合体の長さもしくは距離またはおよその長さもしくは距離は、公知の方法によって決定またはモデリングすることができる。一部の例示的なモデルでは、タンパク質の三次構造、結合ドメイン、および他の特性は、インプットアミノ酸配列または核酸配列を使用して概算することができる。タンパク質の三次構造を使用して、タンパク質またはその複合体の細胞外部分のおよその長さを決定するために有用な、細胞外部分のサイズ、柔軟性、および他の特性を概算することができる。一般に、タンパク質の細胞外部分の長さをモデリングまたは概算するための方法は公知である。例えば、ｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌ．ｃａおよびＳｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌは、タンパク質の構造を予測するために有用な多数のツールを含有する（Ｓｃｈｗｅｄｅ，  Ｔ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２１巻：１５３１頁、２０１３年も参照されたい）。
【００９７】
ある特定の実施形態では、標的と複合体を形成する、会合するまたは相互作用する本開示の融合タンパク質は、免疫学的シナプス中に存在することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外部分は、免疫学的シナプスにまたがる。他の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体は、ｃＳＭＡＣなどの超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に局在する。さらなる実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外部分は、ＴＣＲ：：ＨＬＡ−ペプチド相互作用の細胞外部分によって定義される免疫学的シナプスにまたがる。さらに別の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外部分の長さは、約１２ｎｍ〜約１５ｎｍ、または約１４ｎｍである。
【００９８】
免疫学的シナプスにおいて相互作用する細胞の細胞膜間の距離は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、距離は、サブ回折解像度方法（ｓｕｂｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）または電子顕微鏡によって測定することができる（ＪａｍｅｓおよびＶａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ、４８７巻：６４〜６９頁、２０１２年）。
【００９９】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から４０ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から３０ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から２０ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から１５ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、提供される融合タンパク質は、細胞膜間の距離と比較して、シナプスへの進入もしくは抗原受容体との共局在を可能にするまたは天然のタンパク質に存在する距離もしくは長さを模倣する細胞外の長さもしくは空間距離を有するという利点を提供する。融合タンパク質の細胞外部分が、結合ドメインを得たものとは異なる分子に由来する追加的な分子由来のドメイン（複数可）を含む一部の実施形態では、結合ドメインを含有する細胞外成分の長さは、そのような同様の長さまたは距離をもたらすように、天然分子の細胞外領域と比較して、減少、例えば、切断される。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、細胞表面受容体の細胞外ドメインおよび第２のドメイン（例えば、リンカーまたは第２の細胞表面受容体の細胞外ドメイン）を含む細胞外成分を含む。一部のそのような実施形態では、標的分子と複合体を形成した場合に免疫学的シナプス中に存在することまたは免疫学的シナプスにまたがることができる細胞外成分を維持するために、細胞外成分の１つまたは複数のドメインを切断することができる。
【０１０１】
一部の疾患（例えば、がん）では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識によって生じるＴ細胞応答の大きさおよび質は、共刺激シグナルと阻害シグナルとの間の不均衡に起因して調節不全である（例えば、低下する）可能性があり、その結果、免疫抵抗性が生じる可能性がある。本開示のある特定の融合タンパク質の１つの利点は、第１のシグナルを質的に異なる第２のシグナルに転換することができることである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、負または阻害シグナルを正または共刺激シグナルに有効に転換することができ、それにより、がんなどの疾患に関連する免疫抵抗性を軽減するまたは最小限にするようなものである。例えば、一部の実施形態では、天然の結合パートナーが結合した場合には阻害または負のシグナルの送達をもたらす標的に、本発明で提供される融合タンパク質が結合すると、その代わりに、正、例えば共刺激シグナルを、それを発現する細胞、例えばＴ細胞などに送達することができる。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、負のシグナルに関連する細胞外成分および正のシグナルに関連する細胞内成分を含む。Ｔ細胞の表面上に見いだされる例示的な受容体、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４またはＣＤ１５２）は、ＡＰＣ上に見いだされるそのリガンドであるＣＤ８０またはＣＤ８６のうちの１つが結合すると、阻害シグナルを受け取り得る。ＣＴＬＡ４は、初期Ｔ細胞活性化の大きさを、Ｔ細胞共刺激受容体ＣＤ２８を打ち消すことによって調節する（Ｒｕｄｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、２２９巻：１２頁、２００９年を参照されたい）。Ｔ細胞の表面上に見いだされる別の例示的な受容体、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）は、ＡＰＣ上に見いだされるそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）またはＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ７３）のうちの１つが結合すると、阻害シグナルを受け取り得る。ＰＤ−１は、炎症中の末梢組織におけるＴ細胞の活性を制限し、自己免疫を最小限にする（Ｋｅｉｒら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６巻：６７７頁、２００８年を参照されたい）。負のシグナルに関連する細胞外成分（例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）および正のシグナルに関連する細胞内成分（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７）を含む本開示の代表的な融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４  ＣＤ２８融合タンパク質、ＣＴＬＡ４  ＣＤ１３７融合タンパク質、ＣＴＬＡ４  ＣＤ２８−ＣＤ１３７融合タンパク質、ＰＤ１−ＣＤ２８融合タンパク質、ＰＤ１−ＣＤ１３７融合タンパク質、またはＰＤ１−ＣＤ２８−ＣＤ１３７融合タンパク質を含む。
【０１０２】
本開示の融合タンパク質は、免疫細胞から受け取る阻害シグナルを遮断するまたはその数を減少させることができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、阻害シグナルを正のシグナルに転換し、それにより、免疫細胞から受け取る阻害シグナルの総数を減少させる、または普通は負または阻害シグナルであるものを正のシグナルに転換する。他の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、野生型受容体のシグナル伝達を遮断する。例えば、ドミナントネガティブ融合タンパク質が本開示の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、野生型受容体に結合し、野生型受容体とオリゴマーを形成することにより、野生型受容体のシグナル伝達を遮断する。
【０１０３】
本開示のある特定の融合タンパク質のさらに別の利点は、１つ超のそのような融合タンパク質を細胞によって発現させ、それにより、多数の刺激シグナルをもたらすことができることである。多数の共刺激ドメインを有する組換えＴＣＲにより適切な共刺激シグナル伝達が起きない場合があることが観察されている。多数の免疫調節性融合タンパク質、特に免疫学的シナプス中に存在することができる免疫調節性融合タンパク質の同時発現により、Ｔ細胞がアネルギーを回避し、増殖するために必要な共刺激シグナル伝達がもたらされ得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＴＣＲもしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他の抗原受容体に対してトランスに作動する。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、免疫学的シナプスの外部で作動する。
【０１０５】
さらに別の態様では、本開示の融合タンパク質により、選別を必要とせずに、融合タンパク質に結合するリガンドを発現する腫瘍細胞を用いて再刺激することにより、形質導入されたＴ細胞を濃縮することが可能になる。
【０１０６】
例示的な一実施形態では、（ａ）ＣＤ２００Ｒの細胞外部分、（ｂ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、および（ｃ）ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、細胞外部分は、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分をさらに含む。さらなる実施形態では、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２３１アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０１０７】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）ＳＩＲＰαの細胞外部分、（ｂ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、および（ｃ）ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分をさらに含む。さらなる実施形態では、ＳＩＲＰαの細胞外部分は、ＳＩＲＰαのＮ末端から少なくとも約３６１アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０１０８】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分、（ｂ）ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の膜貫通ドメイン、および（ｃ）ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０１０９】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分、（ｂ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、および（ｃ）ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分をさらに含む。
【０１１０】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を提供し、ここで、融合タンパク質と標的の特異的な結合によって形成される複合体（融合タンパク質：：標的複合体）の細胞外部分は、（ｉ）最大でおよそ免疫学的シナプスの２つの細胞膜間の距離、（ｉｉ）最大で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＴＣＲが特異的に結合したＭＨＣ−ペプチド複合体との間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ、（ｉｉｉ）最大で、結合ドメインを含む天然分子とその同族結合パートナーとの間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ；（ｉｉｉ）約４０ｎｍ未満もしくは最大で約４０ｎｍ、約２５ｎｍ未満もしくは最大で約２５ｎｍ、約２０ｎｍ未満もしくは最大で約２０ｎｍ、約１５ｎｍ未満もしくは最大で約１５ｎｍ、または約１４ｎｍ未満もしくは最大で約１４ｎｍ；または（ｉｖ）それらの任意の組合せのサイズである、またはその距離にまたがり、細胞外成分は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、細胞内成分は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む。
【０１１１】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を提供し、ここで、結合ドメインは、阻害分子結合ドメインであるかまたは阻害分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を有し、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインであるかまたは共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインに対して少なくとも９５％の同一性を含み、阻害分子は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片であるかまたはＣＤ９５（Ｆａｓ）外部ドメインもしくはその機能的断片を含み、共刺激分子または刺激分子は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分であるかまたはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその機能的部分を含む。
【０１１２】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞外成分、（ｂ）配列番号１９７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む疎水性成分、および（ｃ）配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質を提供する。
【０１１３】
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインを含む細胞外成分；（ｂ）配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む疎水性成分；および（ｃ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む細胞内成分を含む融合タンパク質を提供する。
【０１１４】
ここで本開示の融合タンパク質の構成部分をさらに詳細に記載する。
細胞外成分
【０１１５】
本明細書に記載の通り、本開示の融合タンパク質は、一般に、標的に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分を含む。融合タンパク質結合ドメインの標的への結合により、例えば、融合タンパク質が発現する細胞において、（１）標的と、別の分子との相互作用が遮断される（例えば、受容体−リガンド相互作用が遮断または干渉される）、（２）標的のある特定の機能（例えば、阻害性シグナルトランスダクション）が干渉される、低下するまたは排除される、（３）標的が結合した際に通常は誘導されないある特定の生物学的経路が誘導される（例えば、阻害または負のシグナルが刺激または正のシグナルに転換される）、またはそれらの任意の組合せをもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、細胞外部分を含み、細胞外部分は、負のシグナルに関連するタンパク質の細胞外部分を含む。
【０１１６】
例示的な本開示の結合ドメインは、細胞表面受容体の外部ドメイン、またはその結合部分、細胞表面リガンドの外部ドメイン、サイトカイン（例えば、ＩＬ３５）、ケモカイン、抗体に基づく結合ドメイン、ＴＣＲに基づく結合ドメイン、従来のものではない結合ドメイン、またはそれらの任意の組合せであり得る。例えば、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５の外部ドメインを含む結合ドメインが本開示の範囲内に入る。本明細書で使用される場合、細胞表面受容体またはリガンドに由来する「外部ドメイン」は、完全な細胞外ドメインまたはその機能的（結合）断片を含む。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、標的に対するアビディティが野生型または参照タンパク質と比較して高い、変異した細胞外ドメインまたはその機能的（結合）断片を含む。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、可変様ドメインまたは可変様ドメインのＣＤＲを含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインまたはそのＣＤ２００結合部分などのＣＤ２００結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。背景として、ＣＤ２００Ｒは、免疫グロブリンスーパーファミリーの１型膜タンパク質であるＣＤ２００に結合する受容体である（Ｔｏｎｋｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１巻：５６６〜５６８頁、２００７年）。ＣＤ２００は、白血病、多発性骨髄腫、および様々な固形腫瘍（例えば、黒色腫、乳房、および扁平上皮細胞癌）を含めた様々な悪性疾患において上方制御されることが報告されている。実際、高レベルのＣＤ２００発現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予後不良に関連付けられており、また、ＣＤ２００Ｒシグナル伝達にはＴ細胞に対する阻害効果があることが示されている（Ｃｏｌｅｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２６巻：２１４８〜２１５１頁、２０１２年）。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインは、ＣＤ２００Ｒタンパク質の全長細胞外部分、ＣＤ２００Ｒタンパク質の全長成熟細胞外部分、ＣＤ２００Ｒタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはＣＤ２００Ｒの膜貫通ドメインの一部と共になったＣＤ２００Ｒタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１１８】
さらなる実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインは、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも２００アミノ酸を含む。一部の他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号１１に記載の核酸分子によりコードされる。さらに他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも１８０アミノ酸、１９０アミノ酸、２００アミノ酸、２１０アミノ酸、２２０アミノ酸、２３０アミノ酸、２３１アミノ酸、２３４アミノ酸、または２４３アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号８に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００Ｒ外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２００Ｒ断片は、ヒトＣＤ２００Ｒである。さらなる実施形態では、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２００Ｒ外部ドメインが提供される。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００Ｒ外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２００Ｒ断片は、ヒトＣＤ２００Ｒである。さらなる実施形態では、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２００Ｒ外部ドメインが提供される。
【０１２０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰα外部ドメインまたはその結合部分などのＣＤ４７結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。背景として、ＣＤ４７は、食作用からの細胞の保護において役割を果たす、広範に発現する膜貫通タンパク質である（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍら、ＰＮＡＳ、１０９巻：６６６２〜６６６７頁、２０１２年）。ＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合することにより、ＳＩＲＰαシグナル伝達が開始され、それによりマクロファージによる食作用が阻害される。したがって、ＳＩＲＰαの下方制御により、マクロファージによる食作用が増大する。ＳＩＲＰαは、ＡＭＬ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺、膀胱、および他の固形腫瘍を含めた多数のヒト腫瘍型において発現する。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインは、ＳＩＲＰαタンパク質の全長細胞外部分、ＳＩＲＰαタンパク質の全長成熟細胞外部分、ＳＩＲＰαタンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＳＩＲＰαの膜貫通ドメインの一部と共になったＳＩＲＰαタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１２１】
さらなる実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインまたはその結合部分は、配列番号１７に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインは、ＳＩＲＰαのＮ末端から少なくとも３００アミノ酸、３１０アミノ酸、３２０アミノ酸、３３０アミノ酸、３４０アミノ酸、３５０アミノ酸、３６０アミノ酸、３６１アミノ酸、３７０アミノ酸、３７３アミノ酸、またはそれ超を含む。一部の他の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号２１に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰα外部ドメイン、または任意のそのＳＩＲＰα断片は、ヒトＳＩＲＰαである。さらなる実施形態では、配列番号１７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＳＩＲＰα外部ドメインが提供される。
【０１２２】
さらなる実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰα外部ドメイン、または任意のそのＳＩＲＰα断片は、ヒトＳＩＲＰαである。さらなる実施形態では、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＳＩＲＰα外部ドメインが提供される。
【０１２３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはその両方に結合する結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ−１外部ドメインまたはそのリガンド結合部分を含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、ＰＤ−１タンパク質の全長細胞外部分、ＰＤ−１タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＰＤ−１タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはＰＤ−１の膜貫通ドメインの一部と共になったＰＤ−１タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、ＰＤ−１のＮ末端から少なくとも８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸、１１０アミノ酸、１２０アミノ酸、１２５アミノ酸、１３０アミノ酸、１３２アミノ酸、１３５アミノ酸、１３７アミノ酸、１４０アミノ酸、１４９アミノ酸、１５０アミノ酸、１５５アミノ酸、１５８アミノ酸、１６０アミノ酸、または１７０アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号９１、９３または９５に記載の核酸分子によりコードされる。さらなる実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号６０に記載のＰＤ−１からの少なくとも約９０アミノ酸〜少なくとも約１３０アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号９０に記載のＰＤ−１外部ドメインのＮ末端から１７０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１は、配列番号８９に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＰＤ−１、ＰＤ−１外部ドメイン、または任意のそのＰＤ−１断片は、ヒトＰＤ−１である。さらなる実施形態では、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１外部ドメインが提供される。さらなる実施形態では、配列番号９０に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１外部ドメインが提供される。なおさらなる実施形態では、配列番号８９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１結合ドメインが提供される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号９２、９４、または９６に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、配列番号９２、９４、または９６に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１外部ドメインが提供される。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＰＤ−１、ＰＤ−１外部ドメイン、または任意のそのＰＤ−１断片は、ヒトＰＤ−１である。
【０１２５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２外部ドメインは、配列番号６１に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の実施形態では、ＣＤ２外部ドメインは、ＣＤ２タンパク質の全長細胞外部分、ＣＤ２タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＣＤ２タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはＣＤ２の膜貫通ドメインの一部と共になったＣＤ２タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２、ＣＤ２外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２断片は、ヒトＣＤ２である。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７６７．３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２外部ドメインが提供される。さらなる実施形態では、配列番号６１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２外部ドメインが提供される。
【０１２６】
一部の実施形態では、ＣＤ２外部ドメインは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２外部ドメインが提供される。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２、ＣＤ２外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２断片は、ヒトＣＤ２である。
【０１２７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＦａｓＬに結合する結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｆａｓ（ＣＤ９５）外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。Ｆａｓは、腫瘍関連脈管構造において発現し、細胞死を誘導することによってＣＤ８細胞浸潤を妨げる。ＦａｓＬは、ＡＭＬ、膵臓がん、卵巣がん、および他のがんにおいて発現される（Kornmannら、Annals of Surgery、２３１巻：３６８〜３７９頁、２０００年；Continiら、Leukemia、２１巻：２５３〜２６０頁、２００７年；Motzら、Nature Medicine、２０巻：６０７〜６１５頁、２０１４年）。さらに、多くの化学療法薬が腫瘍でのＦａｓＬの上方制御を引き起こすことが報告されており、また、ＦａｓＬは、ＣＤ４４会合に応答してＴ細胞でも上方制御され得る。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、Ｆａｓタンパク質の全長細胞外部分、Ｆａｓタンパク質の全長成熟細胞外部分、Ｆａｓタンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＦａｓの膜貫通ドメインの一部と共になったＦａｓタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされる。さらに他の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、ＦａｓのＮ末端から少なくとも１５０アミノ酸、１６０アミノ酸、１６１アミノ酸、１６６アミノ酸、１７０アミノ酸、または１７３アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、Ｆａｓは、配列番号７３に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の他の実施形態では、Ｆａｓは、配列番号７５に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＦａｓ、Ｆａｓ外部ドメイン、または任意のそのＦａｓ断片は、ヒトＦａｓである。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４３．４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＦａｓ外部ドメインが提供される。なおさらなる実施形態では、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＦａｓ外部ドメインが提供される。
【０１２８】
一部の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の他の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＦａｓ、Ｆａｓ外部ドメイン、または任意のそのＦａｓ断片は、ヒトＦａｓである。さらなる実施形態では、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＦａｓ外部ドメインが提供される。
【０１２９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＬＡＧ３外部ドメインは、ＬＡＧ３タンパク質の全長細胞外部分、ＬＡＧ３タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＬＡＧ３タンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＬＡＧ３の膜貫通ドメインの一部と共になったＬＡＧ３の細胞外部分タンパク質の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。例えば、一部の実施形態では、ＬＡＧ３外部ドメインは、ＬＡＧ３のＮ末端から約４２０アミノ酸、４１６アミノ酸、４１５アミノ酸、４１３アミノ酸、または４１０アミノ酸を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＬＡＧ３、ＬＡＧ３外部ドメイン、または任意のそのＬＡＧ３断片は、ヒトＬＡＧ３である。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２８６．５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＬＡＧ３外部ドメインが提供される。
【０１３０】
さらなる実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１５３に記載の核酸分子によってコードされる。ある特定の他の実施形態では、ＬＡＧ３外部ドメインは、ＬＡＧ３のＮ末端から少なくとも４３０アミノ酸、４３５アミノ酸、４３８アミノ酸、４４０アミノ酸、４４５アミノ酸、または４５０アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１６１に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＬＡＧ３、ＬＡＧ３外部ドメイン、または任意のそのＬＡＧ３断片は、ヒトＬＡＧ３である。さらなる実施形態では、配列番号１５３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＬＡＧ３外部ドメインが提供される。
【０１３１】
一部の実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１６２に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＬＡＧ３、ＬＡＧ３外部ドメイン、または任意のそのＬＡＧ３断片は、ヒトＬＡＧ３である。さらなる実施形態では、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＬＡＧ３外部ドメインが提供される。
【０１３２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴＩＭ３外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＴＩＭ３外部ドメインは、ＴＩＭ３タンパク質の全長細胞外部分、ＴＩＭ３タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＴＩＭ３タンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＴＩＭ３の膜貫通ドメインの一部と共になったＴＩＭ３タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＴＩＭ３、ＴＩＭ３外部ドメイン、または任意のそのＴＩＭ３断片は、ヒトＴＩＭ３である。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２７８２．４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＴＩＭ３外部ドメインが提供される。
【０１３３】
さらなる実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１６７に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の他の実施形態では、ＴＩＭ３外部ドメインは、ＴＩＭ３のＮ末端から少なくとも１８０アミノ酸、１８５アミノ酸、１９０アミノ酸、１９５アミノ酸、または２００アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１７７に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＴＩＭ３、ＴＩＭ３外部ドメイン、または任意のそのＴＩＭ３断片は、ヒトＴＩＭ３である。さらなる実施形態では、配列番号１６７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＴＩＭ３外部ドメインが提供される。
【０１３４】
一部の実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１６８に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１７８に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＴＩＭ３、ＴＩＭ３外部ドメイン、または任意のそのＴＩＭ３断片は、ヒトＴＩＭ３である。さらなる実施形態では、配列番号１６８に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＴＩＭ３外部ドメインが提供される。
【０１３５】
結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合する任意のペプチドであり得る。結合ドメインの供給源は、ヒト、齧歯類、トリ、またはヒツジを含めた様々な種に由来する抗体可変領域（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖに基づくグラバボディー（ｇｒａｂａｂｏｄｙ）、または可溶性ＶＨドメインまたはドメイン抗体の形態であり得る）を含む。追加的な結合ドメインの供給源は、ラクダ科の動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、もしくはラマに由来する；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４１４巻：５２１頁、１９９７年；Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８４巻：３２７３頁、２００９年；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、１９９３年およびＮｇｕｙｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁、１９９８年）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁、１９９８年）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．、５４巻：３９頁、２００２年）、またはヤツメウナギ（Ｈｅｒｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５巻：２０４０頁、２００８年およびＡｌｄｅｒら  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：３１９頁、２００８年）などの他の種に由来する抗体の可変領域を含む。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成し得る、すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモダイマーである（「重鎖抗体」と呼ばれる）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６４巻：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１２巻：５８０頁、２００６年；およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８３巻：３６３９頁、２００８年）。
【０１３６】
本開示の従来のものではない結合ドメインの代替供給源は、ランダムなペプチドライブラリーをコードする配列、または、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｌａｋｅら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１巻：７４５頁、１９９９年；Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０６巻：５１頁、２００５年；米国特許第８，３６１，７９４号を参照されたい）、フィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１３８８頁、１９８５年を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、デザインされたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｂｉｎｚら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３３２巻：４８９頁、２００３年およびＢｉｎｚら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：５７５頁、２００４年）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）またはモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ））（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３２６巻：１４７５頁、２００３年；Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌｅｃ．、１８巻：４３５頁、２００５年およびＨａｃｋｅｌら（２００８年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１２３８〜１２５２頁）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａら（１９９５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２巻：６４０４〜６４０８頁；Ｍａｒｔｉｎら（２００２年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１巻：７１頁、２００２年およびＨｕａｎｇら（２００５年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１３巻：７５５頁、２００５年）、テトラトリコペプチド（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）リピートドメイン（Ｍａｉｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１１巻：４９７頁、２００３年およびＣｏｒｔａｊａｒｅｎａら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、３巻：１６１頁、２００８年）、ロイシンリッチリピートドメイン（Ｓｔｕｍｐｐら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３３２巻：４７１頁、２００３年）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６巻：１８９８頁、１９９９年およびＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６巻：８１９８頁、２００９年を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７２巻：６１７９頁、２００５年；Ｂｅａｖｉｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９巻：７５３頁、１９９２年およびＳａｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００巻：７７７９頁、２００３年）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号；同第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）、アルマジロリピートタンパク質（例えば、Ｍａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、２１巻：１０１５頁、２０１２年；ＰＣＴ特許出願公��第ＷＯ２００９／０４０３３８号を参照されたい）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３７２巻：１７２頁、２００７年）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ノッチン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（Ｗｅｉｄｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ．  Ｐｒｏｔｅｏ．、１０巻：１５５頁、２０１３年）などの代替的な非抗体足場のループ領域内の操作された多様なアミノ酸をコードする配列を含む（Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻：６０１頁、１９９５年；Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：７７２頁、１９９７年；Ｎｏｒｄら、Ｅｕｒｏ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６８巻：４２６９頁、２００１年；Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻：１２５７頁、２００５年；ＢｏｅｒｓｍａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：８４９頁、２０１１年）。
【０１３７】
一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｖα／βおよびＣα／β鎖（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）を含むまたは目的の標的（例えば、ペプチド−ＭＨＣ複合体またはペプチド−ＨＬＡ複合体）に特異的なＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ対を含む単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）である。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ＴＣＲ  Ｖα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβのアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含む、またはこの配列であり、各ＣＤＲは、目的の標的に特異的に結合するＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体からゼロの変化または最大で１つ、２つ、または３つの変化を含む。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本開示の結合ドメインＶα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域、またはＣβ領域は、公知のＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβに由来するものまたはそれに基づくものであり得、公知のＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβと比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組合せを含有する。挿入、欠失または置換は、各ＣＤＲがゼロの変化または最大で１つ、２つ、または３つの変化を含み、また、改変されたＶα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域、またはＣβ領域を含有する結合ドメインがなおその標的に野生型と同様の親和性で特異的に結合するのであれば、アミノ末端またはカルボキシ末端またはこれらの領域の両末端を含めた、Ｖα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域、またはＣβ領域内のどこにあってもよい。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に対して、約１０μＭから約５００μＭまでにわたる親和性を有する。さらなる実施形態では、ＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に対して、約１０ｎＭから約２００ｐＭまでにわたる高親和性を有する。
【０１４０】
ある特定の態様では、本開示による融合タンパク質は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分（例えば、リガンドまたは受容体）を有し、細胞外成分は、任意選択で、マルチマー形成ドメイン、リンカー、接合部アミノ酸、またはそれらの任意の組合せなどの、１つまたは複数の他の機能的な小成分またはドメインを含む。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、結合ドメインに加えてまたは結合ドメインが由来する分子に由来する部分に加えて、スペーサーまたはマルチマー形成ドメインなどの追加的な細胞外領域をさらに含む。例えば、一部の態様では、マルチマー形成ドメインは、融合タンパク質の細胞外成分に含有されるまたはその一部である。例えば、マルチマー形成ドメインは、細胞外成分を変化させること（例えば、変異させること）によって作製することができる、またはマルチマー形成ドメインは、細胞外成分に１〜約５０アミノ酸残基を付加することによって作製することができる。マルチマー形成ドメインは、細胞外成分の結合ドメインと本開示の融合タンパク質の疎水性成分との間に位置し得る。ある特定の実施形態では、細胞表面上に発現した融合タンパク質は、細胞外成分内にマルチマー形成ドメインを含み、細胞膜に近位であり、疎水性成分から１〜５０アミノ酸の範囲内にある。例えば、融合タンパク質マルチマー形成ドメインは、融合タンパク質疎水性成分から３０アミノ酸、２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、１アミノ酸または０アミノ酸以内に位置する１つまたは複数のシステイン残基を含み得、１つの融合タンパク質からのそのような１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数の他の融合タンパク質と１つまたは複数のジスルフィド架橋を形成し得る。一部の実施形態では、追加的な細胞外部分は、融合タンパク質の膜貫通または刺激領域が由来するものと同じ分子に由来する。
【０１４２】
さらなる実施形態では、２つまたはそれ超の融合タンパク質のマルチマー形成ドメイン間の相互作用は、融合タンパク質モノマーと比較して、シグナルトランスダクション（例えば、免疫細胞刺激または活性化）に実質的に寄与するまたはそれを効率的に促進する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質のマルチマー形成は、融合タンパク質モノマーと比較して、宿主細胞におけるシグナルトランスダクションを統計的に有意に促進する。さらなる実施形態では、宿主細胞におけるシグナルトランスダクションを促進または増強する融合タンパク質のマルチマー形成は、ジスルフィド架橋を介したものである。
【０１４３】
例示的なマルチマーは、「ダイマー」であり、これは、互いと会合した２つの融合タンパク質などの２つの分子を含有する生物学的実体を指す。そのようなダイマーは、２つの会合した融合タンパク質が実質的に同様または同一のアミノ酸配列を有する場合には、「ホモダイマー」とみなされる。同様に、３つの実質的にまたは完全に同一の融合タンパク質のマルチマー形成は、「ホモトリマー」と呼ばれる。一部の実施形態では、マルチマー形成ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含み、第１の融合タンパク質に由来するマルチマー形成ドメインのシステイン残基は、第２の融合タンパク質に由来するマルチマー形成ドメインのシステイン残基とジスルフィド架橋を形成し得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質ダイマーはジスルフィド架橋を介して形成される。他の実施形態では、融合タンパク質トリマーは、２つまたはそれ超のジスルフィド架橋を介して形成される。あるいは、ダイマー、ホモダイマー、トリマーまたはホモトリマーは、ジンクフィンガーモチーフまたはロイシンジッパーモチーフを介してマルチマー形成し得る。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、複数のマルチマー形成ドメインを含み、これは、細胞外、細胞内またはその両方に位置し得る。
【０１４４】
一部の実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、疎水性成分から伸長した細胞外部分を含む。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、膜貫通ドメインに隣接する約５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、または最大で約２５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、膜貫通ドメインに隣接する９アミノ酸または１２アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む。さらに別の例示的な実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）膜貫通ドメインから伸長したＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞外部分（例えば、１〜５０アミノ酸にわたる）を含む。ある特定の実施形態では、マルチマー形成ドメインおよび疎水性成分は、異なるタンパク質に由来する。例えば、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、ＣＤ１３７膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、または、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ１３７の細胞外部分を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、マルチマー形成ドメインは、グリコシル化部位をさらに含み得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、細胞外成分とマルチマー形成ドメインを連結する、または細胞外成分と疎水性成分を連結する、または疎水性成分と細胞内成分を連結するリンカーまたは接合部アミノ酸を含有し得る。一部の実施形態では、リンカーはＧｌｙｘＳｅｒｙであり、式中、ｘおよびｙは、独立に、１〜５の整数である。
【０１４６】
一部の実施形態では、細胞外成分は、マルチマーを形成する分子またはその一部であるかまたはマルチマーを形成する分子またはその一部を含み、細胞内成分は、同じ数のマルチマーを形成する分子またはその一部であるかまたは同じ数のマルチマーを形成する分子またはその一部を含む。例えば、一部の実施形態では、細胞外成分は、ダイマーを形成する分子またはその一部であるかまたはダイマーを形成する分子またはその一部を含み、細胞内成分は、同じくダイマーを形成する分子またはその一部であるかまたは同じくダイマーを形成する分子またはその一部を含む。一部の実施形態では、細胞外成分は、トリマーを形成する分子またはその一部であるかまたはトリマーを形成する分子またはその一部を含み、細胞内成分は、同じくトリマーを形成する分子またはその一部であるかまたは同じくトリマーを形成する分子またはその一部を含む。
【０１４７】
本開示の融合タンパク質に含有される結合ドメインが特異的に結合する標的分子は、目的の細胞（「標的細胞」）上にまたはそれに付随して見いだされ得る。例示的な標的細胞は、免疫細胞、がん細胞、自己免疫疾患もしくは障害もしくは炎症性疾患もしくは障害に関連する細胞、および感染性生物体もしくは細胞（例えば、細菌、ウイルス、ウイルスに感染した細胞）、またはＭＨＣまたはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と複合体を形成した抗原を提示する任意の細胞を含む。哺乳動物寄生生物などの感染性生物体の細胞も標的細胞として意図されている。一部の実施形態では、標的は、免疫抑制リガンドである。一部の実施形態では、標的は、ＣＤ４７、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）、ＣＤ２００、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、またはＧＡＬ９から選択される。
【０１４８】
細胞内成分
本開示の融合タンパク質に含有される細胞内成分は、機能的シグナルを細胞に伝達することができる活性化ドメインまたは共刺激ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインを有する。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞応答を直接促進する１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進する。細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つまたはそれ超の受容体シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、またはこれらの組合せを含み得る。様々なシグナル伝達分子（例えば、シグナルトランスダクション受容体）のいずれかに由来する活性化ドメイン、共刺激ドメイン、またはその両方を含む任意の細胞内成分を本開示の融合タンパク質に使用することができる。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、細胞表面受容体またはリガンドに由来する「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、完全な細胞内ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインを含む部分、またはその機能的（シグナル伝達）断片を含む。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型または参照細胞内シグナル伝達ドメインと比較してシグナル伝達活性が増大した、変異した細胞内ドメインまたはその機能的（シグナル伝達）断片を含む。
【０１５０】
「共刺激分子」は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞にシグナルを伝達してＴ細胞活性化を正に調節することができる受容体または細胞表面分子を指す（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。背景として、Ｔ細胞活性化および増殖には、Ｔ細胞抗原特異的受容体（ＴＣＲ）と共刺激シグナルの会合、最も典型的にはＣＤ２８とＣＤ８０およびＣＤ８６の結合を通じて媒介される２つのシグナルが必要である（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、７５巻：１５３１頁、１９９０年）。
【０１５１】
本開示の融合タンパク質に有用な細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはそれらの任意の組合せに由来するものであり得る。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、一次シグナルを含まない。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含まない。
【０１５２】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８を含む。ＣＤ２８シグナル伝達は、ＴＣＲを介して刺激されるＴ細胞の増殖を促進する（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２８は、膜貫通ドメインの近位にあるシステイン残基の結果としてジスルフィド連結ホモダイマーを形成する（Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４４巻：１２５〜１２９頁、２００６年）。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８タンパク質の全長細胞内部分、ＣＤ２８タンパク質の全長成熟細胞内部分、ＣＤ２８タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、およびＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはその断片と共になったＣＤ２８タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、融合タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。ＣＤ１３７は共刺激分子であり、ＣＤ１３７とそのリガンド（４−１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌ）の結合はＴ細胞活性化および増殖に関連する（Ｃｈｅｕｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１巻：２１５〜２２６頁、２００４年）。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７タンパク質の全長細胞内部分、ＣＤ１３７タンパク質の全長成熟細胞内部分、ＣＤ１３７タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、およびＣＤ１３７の膜貫通ドメインまたはその断片と共になったＣＤ１３７タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含む、または、１つまたは複数の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含み、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、共刺激因子、またはそれらの任意の組合せである。
【０１５５】
一部の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００に特異的に結合するＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含む細胞外成分、ＣＤ２８の細胞内部分を含む細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を有する融合タンパク質を提供するが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体は、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとする。
【０１５６】
特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内成分は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）またはその両方を含む。例えば、一部の実施形態では、細胞内成分は、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、細胞内成分は、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞内成分は、２つの細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）を含む。一部の実施形態では、細胞内成分は、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号１３に記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
疎水性成分
本開示の単鎖融合タンパク質に含有される疎水性部分により、本開示の融合タンパク質と細胞膜の会合が可能になり、その結果、融合タンパク質の一部が細胞外に位置し、一部が細胞内に位置する（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）。疎水性成分は、一般に、細胞膜リン脂質二重層内に配置される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の接合部アミノ酸が間に位置し、疎水性部分と細胞内シグナル伝達ドメインを連結する。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、疎水性ドメインは、内在性膜タンパク質（例えば、受容体、表面抗原分類（ＣＤ）分子、酵素、輸送体、細胞接着分子など）に由来するものなどの膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、疎水性ドメインは、内在性膜タンパク質において見いだされるまたはそれに由来する膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、１つまたは複数のアミノ酸の付加、除去、または分子間相互作用を容易にする荷電または親水性残基などの少なくとも１つの異なるアミノ酸での置き換え、またはそれらの任意の組合せによって改変されている。したがって、「疎水性ドメイン」という用語は、疎水性を低下させ得る改変を有する膜貫通ドメインを含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、疎水性成分は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＰＡ５、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、疎水性部分は、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する膜貫通ドメインである。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通ドメインを含むかまたはこのＣＤ２８膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＣＤ２８膜貫通ドメインである。なおさらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するＣＤ２８膜貫通ドメインである。なおさらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤ２８膜貫通ドメインである。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）膜貫通ドメインを含む。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１９７のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ１３７膜貫通ドメインを含むかまたはこのＣＤ１３７膜貫通ドメインからなる。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１９７の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１９７の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＣＤ１３７膜貫通ドメインである。
【０１６２】
ある特定の他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメインを含むかまたはこのＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメインである。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１８のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰα膜貫通ドメインを含むかまたはこのＳＩＲＰα膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα膜貫通ドメインである。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６３のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ２膜貫通ドメインを含むかまたはこのＣＤ２膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＣＤ２膜貫通ドメインである。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｆａｓ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号７７のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＦａｓ膜貫通ドメインを含むかまたはこのＦａｓ膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号７７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＦａｓ膜貫通ドメインである。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＩＭ３膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１６９のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＴＩＭ３膜貫通ドメインを含むかまたはこのＴＩＭ３膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１６９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１６９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＴＩＭ３膜貫通ドメインである。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＡＧ３膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５５のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＬＡＧ３膜貫通ドメインを含むかまたはこのＬＡＧ３膜貫通ドメインからなる。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１５５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列からなるＬＡＧ３膜貫通ドメインである。
【０１６８】
核酸および宿主細胞
ある特定の態様では、本開示は、免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）であり得る本明細書に記載の融合タンパク質の任意の１つまたは複数をコードする核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、目的の宿主細胞（例えば、造血前駆細胞、Ｔ細胞）への導入のために、適切なベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドベクター）に挿入することができる。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「組換え」または「非天然」という用語は、少なくとも１つの遺伝学的変更を含む、または外因性核酸分子の導入により改変された生物体、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指し、そのような変更または改変は、遺伝子工学により導入される。遺伝学的変更は、例えば、タンパク質、融合タンパク質または酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊を含む。追加的な改変は、例えば、改変により遺伝子またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域を含む。ある特定の実施形態では、被験体から得たＴ細胞などの細胞を、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を導入し、それによって細胞が融合タンパク質を発現することにより、非天然または組換え細胞（例えば、非天然または組換えＴ細胞）に転換することができる。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、特定の型のＴ細胞などの細胞における発現を増強するまたは最大にするために、コドン最適化することができる（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１９巻：１３５〜１４５頁、２００６年）。
【０１７１】
例示的な一実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８）をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＣＤ２００Ｒ外部ドメインを含み、疎水性成分がＣＤ２００Ｒの膜貫通ドメインを含み、細胞内成分がＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、配列番号１に記載の核酸分子が提供される。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドを含むｈｕＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８を提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１のポリヌクレオチド配列からなるｈｕＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８を提供する。
【０１７２】
別の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ）をコードする核酸分子であって、疎水性成分がＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、本開示は、配列番号６に記載の核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドを含むｈｕＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍを提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号６のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号６のポリヌクレオチド配列からなるｈｕＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍを提供する。さらなる実施形態では、ｈｕＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍタンパク質は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１７３】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＣＤ２００Ｒの切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、ＣＤ２００Ｒ細胞外ドメインは、約９〜約１５アミノ酸短縮されたものであり得る。本開示の例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、９アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号７）、１２アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１０）、または１５アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１８３）を含む。ＣＤ２８の細胞外部分は、一部の実施形態では、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなる。ある特定の他の実施形態では、ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓタンパク質は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的なｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓタンパク質は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる。ある特定の他の実施形態では、ｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓタンパク質は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的なｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓタンパク質は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなる。ある特定の他の実施形態では、ｈｕＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓタンパク質は、配列番号１８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的なｈｕＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓタンパク質は、配列番号１８４に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１８４に記載のアミノ酸配列からなる。
【０１７４】
例示的な一実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓｔｍ−４１ＢＢｉｃまたはｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓｔｍ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、核酸分子は、配列番号１２または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を有する。
【０１７５】
別の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ｔｍ  ｉｃ  ４１ＢＢｉｃまたはｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ｔｍ  ｉｃ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。一実施形態では、例えば、本開示の核酸は、配列番号９または配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する。
【０１７６】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号１６に記載の核酸分子（ｈｕＳＩＲＰαｔｍ−ＣＤ２８）または配列番号１９に記載の核酸分子（ｈｕＳＩＲＰα−ＣＤ２８ｔｍ）を含む。
【０１７７】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＳＩＲＰαの切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、約８アミノ酸〜約１５アミノ酸短縮されたものであり得る。例示的なＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物は、１２アミノ酸短縮されたＣＤ９５（Ｆａｓ）細胞外ドメインを有する（例えば、ｈｕＳＩＲＰα−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号２０）。
【０１７８】
例示的な一実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＳＩＲＰα−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓｔｍ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、本開示の核酸は、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列を有する。
【０１７９】
別の例示的な実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＳＩＲＰα−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ｔｍ  ｉｃ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。一実施形態では、例えば、本開示の核酸は、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列を有する。
【０１８０】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＰＤ−１−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号９７に記載の核酸分子（ｈｕＰＤ１−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。
【０１８１】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＰＤ−１−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＰＤ−１の切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、ＰＤ−１細胞外ドメインは、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸短縮されたものであり得る。例示的なＰＤ−１−ＣＤ２８構築物は、１２アミノ酸（例えば、ｈｕＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号９９）、１５アミノ酸（例えば、ｈｕＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１０１）、または２１アミノ酸（例えば、ｈｕＰＤ１−２１ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１０３）短縮されたＰＤ−１細胞外ドメインを有する。
【０１８２】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号６９に記載の核酸分子（ｈｕＣＤ２−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。
【０１８３】
他の例示的な実施形態では、本開示は、Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号８３に記載の核酸分子（ｈｕＦａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。
【０１８４】
他の例示的な実施形態では、本開示は、Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＦａｓの切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、Ｆａｓ細胞外ドメインは、約７アミノ酸〜約１５アミノ酸短縮されたものであり得る。例示的なＦａｓ−ＣＤ２８構築物は、７アミノ酸（例えば、ｈｕＦａｓ−７ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号８５）または１２アミノ酸（例えば、ｈｕＦａｓ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号８７）短縮されたＣＤ９５（Ｆａｓ）細胞外ドメインを有する。
【０１８５】
別の例示的な実施形態では、本開示は、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外ドメイン全体または切断された細胞外ドメインを含み、細胞内成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。さらなる実施形態では、核酸分子は、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物をコードし、疎水性成分は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の膜貫通部分をさらに含む。例えば、ある特定の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、配列番号１８５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有する核酸分子によりコードされる。一部の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、配列番号１８５のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１８５のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。他の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、配列番号１８７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きな配列同一性を有する核酸分子によりコードされる。一部の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、配列番号１８７のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１８７のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。ある特定の他の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、配列番号１８６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むｈｕＦａｓｔｍ−４１ＢＢタンパク質である。例示的なｈｕＦａｓｔｍ−４１ＢＢタンパク質は、配列番号１８６に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１８６に記載のアミノ酸配列からなる。ある特定の他の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、配列番号１８８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むｈｕＦａｓ−４１ＢＢｔｍタンパク質である。例示的なｈｕＦａｓ−４１ＢＢｔｍタンパク質は、配列番号１８８に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１８８に記載のアミノ酸配列からなる。
【０１８６】
他の例示的な実施形態では、本開示は、Ｆａｓ−ＣＤ２８−４１ＢＢ構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外ドメインを含み、疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞内成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、細胞外成分は、切断されたＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む。例えば、ＣＤ９５（Ｆａｓ）細胞外ドメインは、約７アミノ酸〜約１５アミノ酸短縮されたものであり得る。例示的なＦａｓ−ＣＤ２８−４１ＢＢ構築物は、７アミノ酸、９アミノ酸、１２アミノ酸、または１５アミノ酸短縮されたＣＤ９５（Ｆａｓ）細胞外ドメインを有する。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ９５（Ｆａｓ）細胞外ドメインは、配列番号７３または７５に記載の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ２８の細胞外部分は、マルチマー形成ドメインを含み得る。ＣＤ２８の細胞外部分は、例えば、配列番号９に記載の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。
【０１８７】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号１７３に記載の核酸分子（ｈｕＴＩＭ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。細胞外成分がＴＩＭ３の切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含むＴＩＭ３−ＣＤ２８融合タンパク質も本開示の範囲内に含まれる。例えば、ＴＩＭ３細胞外ドメインは、約８〜約１５アミノ酸短縮されたものであり得る（例えば、ｈｕＴＩＭ３−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１７５は１２アミノ酸の短縮を有する）。
【０１８８】
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号１６３に記載の核酸分子（ｈｕＬＡＧ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。細胞外成分がＬＡＧ３の切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含むＬＡＧ３−ＣＤ２８融合タンパク質も本開示の範囲内に含まれる。例えば、ＬＡＧ３細胞外ドメインは、１２アミノ酸短縮されたものであり得る（例えば、ｈｕＬＡＧ３−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１５９）。
【０１８９】
コアウイルスをコードするベクターは、本明細書では、「ウイルスベクター」と呼ばれる。ヒト遺伝子療法への適用のために同定されたものを含め、本開示の組成物と共に使用するのに適した多数の入手可能なウイルスベクターが存在する（ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、２巻：１７７頁、２００１年を参照されたい）。適切なウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスに基づくベクター、例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターなどを含み、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターを含む。ＨＩＶ−１由来ベクターはこのカテゴリーに属する。他の例は、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディ−ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターを含む。キメラ抗原受容体導入遺伝子を含有するウイルス粒子を用いて哺乳動物宿主細胞に形質導入するための、レトロウイルスウイルスベクターおよびレンチウイルスウイルスベクターならびにパッケージング細胞の使用方法は当技術分野で公知であり、以前に、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻：３２７９３０頁、２０１１年；Ｚｈａｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７４巻：４４１５頁、２００５年；Ｅｎｇｅｌｓら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１４巻：１１５５頁、２００３年；Ｆｒｅｃｈａら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１８巻：１７４８頁、２０１０年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、５０６巻：９７頁、２００９年に記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系はまた、市販もされている。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを使用して、融合タンパク質をコードする非内因性核酸配列または標的に特異的な融合タンパク質をコードする非内因性核酸配列を導入する。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、形質導入についてのマーカーをコードする核酸配列も含み得る。ウイルスベクター用の形質導入マーカーは当技術分野で公知であり、薬物耐性を付与することができる選択マーカー、または、フローサイトメトリーなどの方法によって検出することができる蛍光マーカーまたは細胞表面タンパク質などの検出可能なマーカーを含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む形質導入についての遺伝子マーカー、ヒトＣＤ２の細胞外ドメイン、または切断されたヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ；Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：１２５５頁、２０１１年を参照されたい）をさらに含む。ウイルスベクターゲノムが、別々の転写物として宿主細胞において発現される複数の核酸配列を含む場合、ウイルスベクターは、２つ（またはそれ超）の転写物の間に、バイシストロン性または多シストロン性の発現を可能にする追加的な配列も含み得る。ウイルスベクターに使用するそのような配列の例は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、フューリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１９１】
例えばアデノウイルスに基づくベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターを含めた、ＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶを含めた、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するベクターを含めた他のベクターも、ポリヌクレオチド送達のために使用することができる（Ｋｒｉｓｋｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：１５１７頁、１９９８年）。
【０１９２】
遺伝子療法への使用のために最近開発された他のベクターも本開示の組成物および方法と共に使用することができる。そのようなベクターは、バキュロウイルスおよびα−ウイルスに由来するもの（Ｊｏｌｌｙ，  Ｄ  Ｊ．、１９９９年、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．、２０９〜４０頁、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．編、Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ）、またはプラスミドベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙまたは他のトランスポゾンベクターなど）を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターは、形質導入についての遺伝子マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、ｈｕＥＧＦＲｔ）をさらに含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、１つ超の融合タンパク質をコードし得る。例えば、ベクターは、２つの異なる融合タンパク質（例えば、ＰＤ−１外部ドメインを含む第１の融合タンパク質およびＴＩＭ３外部ドメインを含む第２の融合タンパク質）をコードし得る。
【０１９４】
一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、抗原特異的ＴＣＲをさらに含み得る。一部の実施形態では、抗原特異的ＴＣＲは外因性である。一部の実施形態では、抗原特異的ＴＣＲは、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ制限抗原に特異的である。一部の実施形態では、抗原は、がん特異的抗原である。がん特異的抗原がＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む実施形態も本開示の範囲内に入る。さらに他の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８であり得るリガンドをさらにコードする。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらにコードする。一部の特定の実施形態では、内因性受容体は、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）またはＣＤ２である。
【０１９５】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を細胞表面上に発現することができる宿主細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を細胞表面上に発現することができる宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物に由来する初代細胞または細胞株を含めたＴ細胞である。Ｔ細胞は、哺乳動物から得る場合、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織または体液を含めた多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、濃縮または精製することができる。Ｔ細胞株は当技術分野で周知であり、その一部は、Ｓａｎｄｂｅｒｇら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１巻：２３０頁、２０００年に記載されている。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖の内因性発現を欠くＴ細胞を使用する。そのようなＴ細胞は、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖の内因性発現を天然に欠くものであってもよく、発現が遮断されるように改変されたもの（例えば、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖を発現しないトランスジェニックマウス由来のＴ細胞もしくはＴＣＲ  α鎖およびβ鎖の発現が阻害されるように操作された細胞）またはＴＣＲ  α鎖、ＴＣＲ  β鎖、または両方の遺伝子がノックアウトされるように改変されたものであってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞を、特定の抗原に特異的なＴＣＲを発現するように操作することができる。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルまたはエフェクターメモリーＴ細胞、γδ  Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞などの機能的Ｔ細胞である。さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＴＣＭ細胞、ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組合せに導入する。さらに別の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＴＣＭ細胞、ＣＤ４＋ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組合せに導入する。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＴＣＭ細胞が濃縮されたＴ細胞の集団に導入する。さらに他の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＴＣＭ細胞が濃縮されたＴ細胞の集団に導入する。上述の実施形態のいずれかにおいて、Ｔ細胞は、操作された抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、外因性共刺激分子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸分子をさらに含有する。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主細胞は、機能的なナチュラルキラー細胞である。
【０１９８】
本開示の融合タンパク質を発現するＴ細胞の増殖を促進する１つまたは複数の増殖因子サイトカインを、Ｔ細胞を拡大させるために使用する培養物に添加することができる。サイトカインは、ヒトまたは非ヒトであり得る。Ｔ細胞増殖を促進するために使用することができる例示的な増殖因子サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ１５などを含む。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ制限抗原に特異的な抗原特異的高親和性ＴＣＲも発現するＣＤ４＋Ｔ細胞である（Ｓｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、６２巻：３５９〜３６９頁、２０１３年を参照されたい）。
【０２００】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、がん抗原に特異的な組換えＴＣＲも発現する。一部の実施形態では、がん抗原は、ＷＴ１である。「ＷＴ１」は、Ｃ末端に４つのジンクフィンガーモチーフを含有し、Ｎ末端にプロリン／グルタミンリッチＤＮＡ結合ドメインを含有する転写因子であるウィルムス腫瘍１を指す。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発達において重要な役割を有し、ウィルムス腫瘍の患者の小さなサブセットにおいて変異している。ＷＴ１の高発現は、乳がん、卵巣がん、急性白血病、血管の新生物、黒色腫、結腸がん、肺がん、甲状腺がん、骨および軟部組織肉腫、ならびに食道がんを含めた様々ながんにおいて観察されている。ＷＴ１について選択的スプライシングが認められている。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、メソテリンに特異的な組換えＴＣＲも発現する。「メソテリン」（ＭＳＬＮ）は、２つの生成物、巨核球増強因子およびメソテリンに切断される前駆タンパク質をコードする遺伝子を指す。巨核球増強因子は、骨髄巨核球におけるコロニー形成を刺激することができるサイトカインとして機能する。メソテリンは、細胞接着タンパク質として機能し得るグリコシルホスファチジルイノシトール係留細胞表面タンパク質である。このタンパク質は、上皮中皮腫、卵巣がんにおいて、および特定の扁平上皮細胞癌において過剰発現する。選択的スプライシングにより、多数の転写物改変体が生じる。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、サイクリン−Ａ１に特異的な組換えＴＣＲも発現する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、ＣＡＲも発現する。
【０２０４】
さらに他の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する宿主細胞は、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８であり得るリガンドをさらに含む。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する宿主細胞は、内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらに発現する。一部の特定の実施形態では、内因性受容体は、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、またはＣＤ２である。
【０２０５】
一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する宿主細胞は、１つ超の融合タンパク質を発現し得る。例えば、宿主細胞は、２つの異なる融合タンパク質（例えば、ＰＤ−１外部ドメインを含む第１の融合タンパク質およびＴＩＭ３外部ドメインを含む第２の融合タンパク質）を発現し得る。
【０２０６】
使用
本開示に記載の融合タンパク質を発現する細胞を用いて処置することができる疾患は、がん、感染症（ウイルス感染、細菌感染、原生動物感染）、免疫疾患（例えば、自己免疫性）、または老化関連疾患（例えば、老化）を含む。養子免疫および遺伝子療法は、様々な型のがん（Ｍｏｒｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻：１２６頁、２００６年；Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０巻：１２４０頁、２００９年；Ｊｕｎｅ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻：１４６６頁、２００７年）および感染症（Ｋｉｔｃｈｅｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、４巻：３８２０８頁、２００９年；Ｒｏｓｓｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５巻：１４４４頁、２００７年；Ｚｈａｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．、６巻：ｅ１００１０１８頁、２０１０年；Ｌｕｏら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．、８９巻：９０３頁、２０１１年）に対して有望な処置である。
【０２０７】
固形腫瘍および白血病を含む、様々ながんは、本明細書で開示する組成物および方法に感受性である。処置することができる例示的な種類のがんは、乳房、前立腺、および結腸の腺癌；肺のすべての型の気管支原性癌；骨髄性白血病；黒色腫；肝がん；神経芽腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；ならびに癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン・ピアース、腺管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、エンバク細胞、乳頭状、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞、および移行上皮）を含む。処置することができるさらなる種類のがんは、組織球性障害；悪性組織球症；白血病；ホジキン病；免疫増殖性小細胞（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；絨毛性腫瘍を含む。さらに、以下の種類のがんも処置に感受性であると考えられる：腺腫；胆管腫；コレステリン腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝がん；汗腺腫；膵島細胞腫瘍；ライジッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫（ｌｅｉｍｙｏｍａ）；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫（ｍｙｏｍｍａ）；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節細胞腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫。処置することができる種類のがんは、被角血管腫；好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢胞肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌腫；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症（ｎｅｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）；および子宮頸部異形成をも含む。
【０２０８】
融合タンパク質Ｔ細胞療法に感受性である例示的なさまざまな過剰増殖性障害は、Ｂ細胞リンパ腫（様々な種類のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫など）、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病のＢ細胞芽球化反応（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））ならびに骨髄腫（多発性骨髄腫）などを含む、Ｂ細胞がんである。さらなるＢ細胞がんは、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁層リンパ腫、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫（ｅｘｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ様組織の節外性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔の（胸腺の）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、未確定の悪性度のＢ細胞増殖（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性障害を含む。
【０２０９】
炎症性疾患および自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状ループス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シドナム舞踏病、サイトカインおよびＴ−リンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症およびチャーグ・ストラウス病を含めた肉芽腫症、顆粒球減少症、血管炎（過敏性血管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）／過敏性血管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｇｉｉｔｉｓ）、ＡＮＣＡおよびリウマチ性血管炎を含む）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含めた免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器傷害症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、実質臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多発性内分泌腺症、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティフ・マン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含めた精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（または多腺性内分泌疾患症候群）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる１型糖尿病およびシーハン症候群を含めた自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、非特異的間質性肺炎（��ＳＩＰ）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、寒冷グロブリン血症、肝炎に関連する寒冷グロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群および閉塞性血栓性血管炎を含む。
【０２１０】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて被験体を処置する方法は、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄球性白血病を処置することを含む。
【０２１１】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて被験体を処置する方法は、膵がんを処置することを含む。
【０２１２】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて被験体を処置する方法は、卵巣がんを処置することを含む。
【０２１３】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて疾患を処置する方法であって、疾患が、ＣＤ２００を発現する固形腫瘍またはＣＤ２００＋である骨髄細胞によって浸潤される腫瘍を含み、融合タンパク質が、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含む細胞外成分を有する、方法が提供される。
【０２１４】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて疾患を処置する方法であって、疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含み、融合タンパク質が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、またはＣＤ２の細胞外部分を含む細胞外成分を有する、方法が提供される。
【０２１５】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて疾患を処置する方法であって、疾患が、固形腫瘍を含み、融合タンパク質が、ＴＩＭ３、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、またはＣＤ２の細胞外部分を含む細胞外成分を有する、方法が提供される。
【０２１６】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて疾患を処置する方法であって、疾患が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がん、または多発性骨髄腫を含み、融合タンパク質が、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含む細胞外成分を有する、方法が提供される。一部のそのような実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるポリヌクレオチドによりコードされる。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる。
【０２１７】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて疾患を処置する方法であって、疾患が、卵巣がん、膵がん、またはＡＭＬを含み、融合タンパク質が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分を含む細胞外成分を有する、方法が提供される。一部のそのような実施形態では、Ｆａｓｔｍ−４−１ＢＢ融合タンパク質は、配列番号１８５に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるポリヌクレオチドによりコードされる。ある特定の実施形態では、Ｆａｓｔｍ−４−１ＢＢ融合タンパク質は、配列番号１８５に記載のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１８５に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。他の実施形態では、Ｆａｓｔｍ−４−１ＢＢ融合タンパク質は、配列番号１８６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｆａｓｔｍ−４−１ＢＢ融合タンパク質は、配列番号１８６に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１８６に記載のアミノ酸配列からなる。
【０２１８】
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて疾患を処置する方法であって、疾患が、卵巣がん、膵がん、またはＡＭＬを含み、融合タンパク質が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分を含む細胞外成分を有する、方法が提供される。一部のそのような実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ融合タンパク質は、配列番号１８７に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるポリヌクレオチドによりコードされる。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ融合タンパク質は、配列番号１８７に記載のポリヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１８７に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。他の実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ融合タンパク質は、配列番号１８８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ融合タンパク質は、配列番号１８８に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１８８に記載のアミノ酸配列からなる。
【０２１９】
感染症は、感染因子に関連するものを含み、また、様々な細菌（例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア、および寄生生物（原生生物の任意の公知の寄生生物のメンバーを含む）のいずれかを含む。感染性ウイルスは、例えば、アデノウイルス、ブニヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ）などの真核生物ウイルスを含む。ある特定の実施形態では、その抗原がプロセシングされ、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ分子に提示される細胞質ゾル病原体による感染を、本開示の融合タンパク質を用いて処置する。
【０２２０】
本開示の融合タンパク質は、細胞に結合した形態で被験体に投与することができる（例えば、標的細胞集団（成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）または他のＴ細胞系統の細胞）の遺伝子療法）。特定の実施形態では、被験体に投与される融合タンパク質を発現するＴ細胞系統の細胞は、同系細胞、同種異系細胞、または自己細胞である。
【０２２１】
本開示の融合タンパク質を含む医薬組成物は、医療分野の当業者によって決定される処置（または防止）すべき疾患または状態に適切な方式で投与することができる。組成物の適切な用量、好適な投与の期間および頻度は、患者の状態、サイズ、疾患の種類および重症度、有効成分の特定の形態、ならびに投与方法のような因子により決定される。本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。適切な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなどおよびこれらの組合せを含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、本開示は、免疫細胞の活性を増大させる、免疫応答を増強または延長する、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する、がんまたは腫瘍を処置する、がん細胞の免疫抵抗性を阻害する、または感染を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の融合タンパク質を発現する有効量の宿主細胞を投与することを含む方法を対象とする。さらなる実施形態では、上述の方法のいずれかにおいて使用するための宿主細胞は、操作された抗原特異的ＴＣＲ、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、ＣＡＲ、共刺激分子、またはそれらの任意の組合せをさらに発現する。特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質と組換え抗原特異的ＴＣＲを同時発現させることを含む、白血病を処置する方法が提供される。
【０２２３】
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩ  ＨＬＡ応答を誘導または増強する方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の融合タンパク質を発現する有効量のＣＤ４＋Ｔ細胞を投与することを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩ  ＨＬＡ応答を誘導または増強において使用するための宿主細胞は、操作された抗原特異的ＴＣＲ、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、ＣＡＲ、共刺激分子、またはそれらの任意の組合せをさらに発現する。
【０２２４】
上述の実施形態のいずれかにおいて、方法は、外因性ＩＬ−２の投与の非存在下で有効である。
【０２２５】
一部の実施形態では、被験体の免疫細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）におけるサイトカイン産生を増加させるための方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の本明細書で開示する融合タンパク質、または融合タンパク質をコードするベクターを投与することを含む方法が提供される。
【０２２６】
一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）におけるサイトカイン産生を増加させるための方法であって、免疫細胞を、本明細書で開示する融合タンパク質、または融合タンパク質をコードするベクターと接触させることを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、免疫細胞は、操作された抗原特異的ＴＣＲ、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、ＣＡＲ、共刺激分子、またはそれらの任意の組合せをさらに発現する。一部の実施形態では、増加されるサイトカインは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、またはインターロイキン２（ＩＬ−２）を含む。
【０２２７】
さらに他の実施形態では、上述の方法のいずれかの被験体を、化学療法などの補助的療法を用いてさらに処置する。例示的な化学療法剤は、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフロルニチン；エリプチニウム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫＴＭ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン、カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、補助的療法は、ワクチン、免疫抑制シグナルの阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞傷害性薬剤、化学療法薬、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、免疫抑制シグナルの阻害剤は、抗体またはｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、抗体またはｓｉＲＮＡは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＣＤ２４４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、またはそれらの任意の組合せに対して特異的である。
【実施例】
【０２２９】
（実施例１）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質構築
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、図１Ａの模式図を使用して例示される。例示的な融合タンパク質は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部からなる免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）を含む（図１Ａ、構築物Ｉ〜Ｖ）。疎水性成分は、ＣＤ２００Ｒ（図１Ａ、構築物Ｉ）もしくはＣＤ２８（図１Ａ、構築物ＩＩ〜Ｖ）のいずれかの膜貫通ドメインまたはその部分からなってよい。一部の例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質では疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は、ＣＤ２８の細胞外部分、詳細には疎水性成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば図１Ａ構築物ＩＩＩ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；および構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインのすべてまたは部分を含んでよい。一部の実施形態では細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む（図１Ａ、構築物Ｉ〜ＩＩＩ）。他の例では細胞外成分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端からの最初の２３５アミノ酸（Ｎ連結グリコシル化部位を保存している）（例えば図１Ａ、構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）または最初の２２９アミノ酸（例えば図１Ａ、構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。融合タンパク質構築物を調整することによって操作できる細胞外成分のサイズは、免疫学的シナプスに侵入しｃＳＭＡＣ内のＴＣＲと共局在して強い共刺激シグナルを送達する融合タンパク質の能力に影響を与える場合がある。追加的にＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、ＣＤ２００Ｒのその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正のシグナルに転換する能力を有する。
【０２３０】
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質をコードする例示的な核酸分子は、次のエレメントを含む（５’から３’）：細胞外成分（ＣＤ２００Ｒ）−マルチマー形成ドメイン（ＣＤ２８システイン）−疎水性成分（ＣＤ２８膜貫通）−細胞内成分（ＣＤ２８細胞内）。一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号４７〜５１または１、６、７、１０、１２、１４または１５のいずれか１つとして記載する核酸分子を含む。
【０２３１】
構築物をコードする核酸は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに発注したまたはＰＣＲによって所内で生成し、次いでｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に指向的にＴＯＰＯクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してレトロウイルスベクターｐＭＰ７１−ａｔｔＲに移入した。ある特定の実施形態では本開示のＩＦＰをコードする核酸分子は、ｐＭＰ７１−ａｔｔＲレトロウイルスベクターへのクローニングの前にコドン最適化した。
【０２３２】
（実施例２）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物のトランスジェニック発現
マウスＣ５７ＢＬ／６  Ｆｒｉｅｎｄウイルス誘発赤白血病（ＦＢＬ）およびＴＣＲｇａｇトランスジェニックマウスに基づく播種性白血病についての前臨床マウスモデルを、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８キメラ受容体がＴ細胞機能を改善できるかどうかを決定するために使用した。
【０２３３】
ＴＣＲトランスジェニックマウスをｇａｇエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するために生成した（ＴＣＲｇａｇ）。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＴＣＲｇａｇトランスジェニックマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＦｒｉｅｎｄウイルスｇａｇエピトープに特異的なＴＣＲ導入遺伝子を発現する（Ｏｅｈｌｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６巻：２８６３〜２８７０頁、２００１年）。実施されたすべての動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＃２０１３−０１）で承認された。マウスＢ６  Ｆｒｉｅｎｄウイルス誘発赤白血病（ＦＢＬ）は、ｇａｇエピトープ（ペプチドＣＣＬＣＬＴＶＦＬ）（配列番号２１３）をコードするＦ−ＭｕＬＶを発現する。
【０２３４】
マウス遺伝子に基づくＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８キメラ構築物をｐＭＰ７１レトロウイルスベクターに挿入し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激した初代マウス脾細胞を形質導入するために使用した。構築物は、実施例１に記載のとおり設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに発注したまたはＰＣＲによって所内で生成した。次いで構築物をｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に指向的にＴＯＰＯクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してレトロウイルスベクターｐＭＰ７１−ａｔｔＲに移入した。レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｍｏｒｉｔａら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７巻：１０６３〜１０６６頁、２０００年；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）をｅｆｆｅｃｔｅｎｅ形質導入試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してレトロウイルスベクターで形質導入した。ウイルス上清を２および３日目に回収し、次いでＴＣＲｇａｇＴ細胞を形質導入するために使用した。
【０２３５】
トランスフェクションの１日前に、ＴＣＲｇａｇＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８および１００Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２で刺激した。ＴＣＲｇａｇＴ細胞の形質導入を９０分間、１０００ｇでのスピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）によってＩＬ−２およびポリブレンの存在下で１２ウエルプレートで実施した。ＦＢＬ細胞を、Ｔ細胞形質導入と同様にポリブレンスピンフェクションでＣＤ２００で形質導入し、次に均一な集団を生成するために選別した。
【０２３６】
形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＣＤ２００Ｒ抗体染色およびフローサイトメトリーによって構築物発現について解析した（図１Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクターを対照として使用した。形質導入効率は４〜３６％の範囲であり、形質導入細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は構築物間で同様であった。
【０２３７】
（実施例３）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、形質導入Ｔ細胞の増殖、蓄積およびエフェクター機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する
実施例１および２に記載のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物をＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖、蓄積およびエフェクター機能を促進するそれらの能力について評価した。
【０２３８】
エフェクター細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大
ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで以前記載の通り生成した（Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２０巻：３７２２〜３４頁、２０１０年）。照射抗原提示脾細胞（５×１０６個）、照射ＦＢＬ（３×１０６個）およびＴＣＲｇａｇｔｇ細胞（１０６個）をＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）と共に培養培地（非必須アミノ酸、２μＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳおよび５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐａｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を補充したＩＭＤＭ）１０ｍＬ中で培養した。Ｔ細胞を毎週再刺激し、最後の刺激の５〜７日後にフローサイトメトリーによって評価した。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖アッセイ
ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２に記載のとおり形質導入した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖を評価するために、ＴＣＲｇａｇＴ細胞を製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した。ＣＴＶ−標識Ｔｇ  Ｔ細胞（１０５個）およびＧＦＰ対照Ｔ細胞をＣＤ２００−ＦＢＬまたはＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞の数を用量調整（ｔｉｔｒａｔｅ）して刺激した。３日後、ＴＣＲｇａｇＴ細胞のＣＴＶ希釈物をフローサイトメトリーによって評価した。
【０２４０】
ＣＤ２００−ＦＢＬ細胞（上）またはＣＤ２００＋ＦＢＬ（下）の数を用量調整した刺激後のＴＣＲｇａｇＴ細胞の数を示すフローサイトメトリー結果は図２Ａに示されている。検査した５個のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物の内４個は、ＧＦＰ対照形質導入Ｔ細胞（赤線）と比較して、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（青線）に応答してＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖を劇的に改善した。
【０２４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞蓄積アッセイ
増殖の増強も形質導入細胞の蓄積の増加をもたらすかどうかを決定するために、照射ＣＤ２００＋ＦＢＬでの複数サイクルの刺激による総ＴＣＲｇａｇ集団における形質導入細胞の割合を測定した。
【０２４２】
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを含むいくつかの構築物は、形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進した（図２Ｂ）。これらの構築物の内、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓは複数回の刺激で形質導入Ｔ細胞における最も高い増加を示し、３回の刺激で３倍を超える拡大を生じる。
【０２４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞濃縮アッセイ
形質導入したおよび形質導入していないＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団を、再刺激が形質導入ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰ＋Ｔ細胞の集団を濃縮するかどうかを決定するためにＣＤ２００＋またはＣＤ２００−照射ＦＢＬ細胞で再刺激した。照射ＣＤ２００＋腫瘍細胞での反復刺激は、野生型Ｔ細胞と比較してＩＦＰで形質導入した細胞を濃縮し、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰに対するリガンドを発現している標的の認識が応答を増強することを実証している（図２Ｃ）。
【０２４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共局在アッセイ
Ｔ細胞活性化の際に免疫学的シナプス（ＩＳ）においてＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰが同族リガンドと共局在するかどうかを決定するために形質導入Ｔ細胞を顕微鏡によって画像化した。シナプスで濃縮される細胞膜内の脂質を染色するためにＣＴｘＢを使用した（図２Ｄ、パネルＩ）。ＦＢＬ細胞によって発現されるＣＤ２００（図２Ｄ、パネルＩＩ）またはＴ細胞によって発現されるＣＤ２００Ｒ（図２Ｄ、パネルＩＩＩ）を標的化する標識抗体をＩＳとの関連する分子の位置を視覚化するために使用した。ＣＤ２００リガンドおよびＣＤ２００ＲはＩＳ内に共局在し（図２Ｄ、パネルＩＶ）、構築物が免疫学的シナプスによって受け入れられるように適切なサイズにされていることを実証している。
【０２４５】
ＣＦＳＥに基づく細胞毒性アッセイ
ＣＤ２８シグナル伝達の増加もエフェクター機能を促進する（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｓ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質形質導入Ｔ細胞を標的腫瘍細胞の殺滅の増加について検査した。ＦＢＬおよび対照ＥＬ４腫瘍を１０分間、室温で２．５μＭ（ＣＦＳＥｈｉ）または０．２５μＭ（ＣＦＳＥｌｏ）ＣＦＳＥと共にＰＢＳ中でそれぞれインキュベートした。過剰の色素は腫瘍細胞を血清含有培地中で洗浄することによって除去した。ＥＬ４とＦＢＬ腫瘍細胞との１：１混合物を用量調整した数のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８またはＧＦＰベクターで形質導入したＴＣＲｇａｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大エフェクターＴ細胞と共に４時間、９６ウエル丸底プレート、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。特異的ＦＢＬ溶解をウエルに残存している総ＣＦＳＥ陽性細胞（ＦＢＬ＋ＥＬ４）の％ＣＦＳＥｈｉ（ＦＢＬ）についてのフローサイトメトリー解析によって決定した。
【０２４６】
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物で形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、空ベクターで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較してＦＢＬ腫瘍をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解する能力の増強を示した（図２Ｅ、２Ｇ）。標的腫瘍細胞をＥＬ４細胞（ＣＴＶ＋）、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（ＣＦＳＥｈｉ）および非特異的ＥＬ４（ＣＦＳＥｌｏ）対照標的の１：１：１混合物を生成するために、さまざまな希釈の蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）またはＣＦＳＥで標識した（図２Ｆ）。追加的に対照ＧＦＰ形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞はＣＤ２００−ＦＢＬおよびＣＤ２００＋ＦＢＬを等効率で溶解した（図２Ｇ）。対照的にＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較してＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞の殺滅の増加を示し、検査した最低のＥ：Ｔ比において４０％を超えるＣＤ２００＋ＦＢＬを溶解した（図２Ｇ）。
【０２４７】
まとめるとこれらのデータは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物が腫瘍細胞刺激に応答して形質導入Ｔ細胞の蓄積および溶解活性を増加させるように機能することを示している。
【０２４８】
（実施例４）
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴ細胞は、ＦＢＬの認識に応答してｉｎ  ｖｉｖｏで増強した蓄積を示す
Ｂ６マウスに以前記載（Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２０巻：３７２２〜３４頁、２０１０年）のとおり生ＦＢＬ白血病４×１０６個を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＦＢＬを５日間播種した後、マウスはエフェクターＴ細胞の移入の少なくとも６時間前に１８０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（Ｃｙ、「Ｃｙｔｏｘａｎ」として市販されている）をｉ．ｐ．で受けた。生存研究について、刺激１〜３回をｉｎ  ｖｉｔｒｏで先に受けたＴＣＲｇａｇＴ細胞１０５個を腫瘍保有マウスに移入した。短期間増殖および蓄積を評価するために、融合タンパク質を形質導入した、およびＧＦＰ対照を形質導入したＴ細胞各２×１０６個を腫瘍保有マウスに同時注射し、マウスは解析のために８日後に安楽死させた。マウスは、腫瘍負荷について定期的にモニターし、２４〜４８時間以内の死亡が予測される腫瘍進行のエビデンスが生じた場合は安楽死させた。
【０２４９】
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質形質導入Ｔ細胞がＦＢＬの認識に応答してｉｎ  ｖｉｖｏでさらに大きな増殖および蓄積を示すかどうかを評価するために、融合タンパク質形質導入細胞と対照細胞との混合集団を腫瘍保有マウスに移入し、ｅｘ  ｖｉｖｏ解析による細胞の比を移入８日後に比較した（図３Ａ）。導入遺伝子マーカーの使用により、注射した比と比較して脾臓およびリンパ節の両方において対照細胞の１．２〜１．４倍を超える比で形質導入Ｔ細胞が検出された（図３Ｂ）。形質導入ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ発現の低減を腫瘍保有マウスへの移入３日後に示した。これは、エフェクターＴ細胞表現型を示唆している（図３Ｃ）。１５日目までに形質導入および対照Ｔ細胞は、疲弊マーカーの欠如を含む同様の表現型を示した（図３Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの知見と同様にＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現するＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍刺激に応答して増加した蓄積を示した。さらにそれらは、腫瘍保有マウスへの移入後少なくとも３日間についてエフェクターＴ細胞表現型と一致するタンパク質発現パターンを示した。
【０２５０】
（実施例５）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８＋Ｔ細胞での養子免疫療法は、播種性白血病の治療においてさらに大きな活性を示す
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８で形質導入したＴ細胞での養子免疫療法は、播種性白血病の前臨床マウスモデルにおける治療活性の増加を媒介した。
【０２５１】
マウスにＣＤ２００＋ＦＢＬ白血病の致死用量を注射し、５日後、Ｃｙ処置マウスのコホートはＴ細胞１０５個での追加的治療を受けた（図４Ａ）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物によって媒介される有効性へのＣＤ２８システイン結合の寄与を図１Ａに示すＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＧＦＰ対照構築物で形質導入したＴ細胞を比較することによって評価した。ＩＬ−２をＴ細胞の活性を促進するためにマウスのコホートに１０日間、追加的治療試薬として投与した（Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２０巻：３７２２〜３４頁、２０１０年）。注射前にＴ細胞をフローサイトメトリーによって種々の表面タンパク質について評価した。形質導入および対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、同様の表現型を示した。これは、形質導入が注射前の細胞の表現型を変化させなかったことを示している（図４Ｂ）。
【０２５２】
ＩＬ−２注射を受けたマウスの小コホートにおいてＴ細胞は生存を改善したが、異なる群のＴ細胞を受けたマウスの生存において有意な差異は検出できなかった（図４Ｃ）。しかしＩＬ−２注射を受けなかったマウスのコホートでは、免疫学的シナプス内に適合するように適切なサイズにしたＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物で形質導入したＴ細胞を受けたマウスの生存に顕著な改善があった（図４Ｄ）。Ｔ細胞を受けなかった、ＧＦＰ対照ベクターで形質導入したＴ細胞または最も大きな外部ドメイン（ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰ）で形質導入したＴ細胞を受けたマウスの大部分は、３０日を超えて生存しなかった（図４Ｃおよび４Ｄ、それぞれ黒実線、破線およびオレンジ線）。対照的にＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ＋Ｔ細胞を受けたマウスの７１％およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞を受けたマウスの８３％は治療後１００日間より長く生存した（図４Ｃおよび４Ｄ、それぞれ緑および赤線）。これらのデータは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物でのＴ細胞の形質導入が、外因性ＩＬ−２の注射へのＴ細胞免疫療法の依存を克服する十分な共刺激を提供することを示唆している。さらに、外因性ＩＬ−２の注射を受けなかったマウスにおいて検査したＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物とＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ構築物との間では増殖および蓄積において差異があったが、両方のＩＦＰとも、他の進行性白血病からの臨床転帰を有意に改善するようにＴ細胞免疫療法を有効に増強した。
【０２５３】
（実施例６）
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞は、内因性組織に自己反応性を生じず、ｉｎ  ｖｉｖｏで正常組織の浸潤を示さない
ＴＣＲｇａｇＴ細胞の形質導入が内因性組織との自己反応性を生じるように活性化の閾値を十分に低下させるかどうかを決定するために、自己免疫性毒性をアルブミンプロモーターの調節下で肝細胞において自己抗原としてＦＢＬ  ｇａｇ腫瘍Ａｇを発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて評価した（図５Ａ）。ＴＣＲｇａｇエフェクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し、１０６個を播種性白血病を有するシクロホスファミド処置Ａｌｂ：Ｇａｇマウスに移入した。移入３および７日後に肝臓損傷を肝臓酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルを定量によって評価した。マウスにおける対照またはＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋ＴＣＲｇａｇ細胞での養子療法は、移入３または７日後にＡＳＴまたはＡＬＴの血清レベルに影響を与えなかった。これは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓが検出可能な自己免疫性肝臓損傷をＡｌｂ：Ｇａｇマウスにおいて誘導しないことを示している（図５Ｂ）。
【０２５４】
ＩＦＰで形質導入したＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して正常組織の浸潤の増加を示さない。マウスを移入７日後に安楽死させ、肝臓切片をＴ細胞浸潤を定量するためにＴ細胞マーカーＣＤ３に対する抗体で染色した。肝臓組織におけるＴ細胞の限定的な存在が観察され、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋または対照ＴＣＲｇａｇのレシピエント間で有意な差異はなかった。これは、ＩＦＰ発現の結果としてリンパ球細胞浸潤が増加しなかったことを示している（図５Ｃ）。
【０２５５】
（実施例７）
４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進する
共刺激受容体４−１ＢＢは活性化Ｔ細胞で上方制御され、Ｔ細胞生存およびサイトカイン産生を促進する（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを有するまたは有さない４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞増殖および蓄積の増加を誘導できるかどうかを評価するために、４−１ＢＢ（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−４−１ＢＢ）を使用してまたは４−１ＢＢをＣＤ２８（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ）と組み合わせて、実施例２に記載の方法を使用してＩＦＰを生成した（図６Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した。
【０２５６】
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで観察されたとおり、４−１ＢＢ構築物で形質導入したＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複数ラウンドの刺激で蓄積した（図６Ｂ）。これらのデータは、４−１ＢＢ  ＩＦＰもＴ細胞の増殖および生存を促進することを示している。
【０２５７】
ＣＤ２００Ｒ−４−１ＢＢで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、実施例３に記載のＣＦＳＥベース細胞毒性アッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＢＬ腫瘍を溶解する能力の増強を示した（図６Ｃ）。ＣＤ２００Ｒ−４１ＢＢ−形質導入Ｔ細胞も生存を促進する（図６Ｄ）。
【０２５８】
（実施例８）
ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の共発現は、ＷＴ１特異的ＴＣＲ初代Ｔ細胞において機能を増強する
ヒトＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物（配列番号１）をＩＦＰ発現がヒト初代Ｔ細胞のＴ細胞機能を増強するかどうかを決定するために生成した。構築物を、Ｐ２Ａエレメントを有する遺伝子を連結することによってＨＬＡ−Ａ２制限ＷＴ１１２６特異的ＴＣＲ「Ｃ４」のベータおよびアルファ鎖と組み合わせた（図７Ａ）。第２のＰ２Ａ配列との遺伝子組換えを妨げるために第１のＰ２Ａ配列をコドン最適化した。レンチウイルスを生成するために、２９３Ｔ／１７細胞（細胞３×１０６個／プレート）をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｐＲＲＬＳＩＮならびにパッケージングベクターｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２−ＧおよびｐＲＳＶ−ＲＥＶ中のヒト構築物で形質導入した。培養培地をトランスフェクション後１日目に交換し、ウイルス含有上清を２および３日目に回収し、将来の使用のためにアリコートを凍結した。
【０２５９】
内因性ＴＣＲを欠如しているジャーカットヒトＴ細胞亜系統（ｓｕｂｌｉｎｅ）をＩＦＰおよびＴＣＲの発現を検査するために使用した。これらのジャーカットＴ細胞を２ｍｌのレトロウイルス上清、１０００ｇ、９０分間、３２℃での細胞２×１０６個のスピンフェクションによって形質導入した。ジャーカットヒトＴ細胞株の３種の遺伝子構築物での形質導入は、ＩＦＰの高発現およびＴＣＲのみで形質導入したＴ細胞と同様のＭＦＩでＴＣＲの発現を生じた（図７Ａ）。
【０２６０】
初代ヒトＴ細胞を形質導入するために、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＬＡ−Ａ２＋ドナーから回収した。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓを使用して精製し、ヒトＴ細胞Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２で刺激した。刺激４時間後にＴ細胞をジャーカットＴ細胞について上に記載したのと同様に形質導入した。Ｔ細胞は以前記載（Ｈｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１０巻：４０〜５２頁、２００６年）のとおり急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で１０〜１４日ごとに再刺激した。
【０２６１】
ヒト細胞株Ｔ２をＡＰＣとして使用した。これはＴＡＰが欠損しており、そのため内因性ペプチドを提示できないが、低レベルＭＨＣＩ発現により、外因性に負荷されたペプチドの提示は可能だからである。Ｔ２細胞によるＣＤ２００の発現をフローサイトメトリーによって評価した（図７Ｂ）。Ｔ２細胞は、低レベルの内因性ＣＤ２００発現を示した（図７Ｂ）。
【０２６２】
形質導入Ｔ細胞をＷＴ１１２６−パルス化Ｔ２細胞で刺激した。標的細胞での低レベルのＣＤ２００発現にもかかわらず、ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８−形質導入Ｔ細胞は、Ｃ４  ＴＣＲのみで形質導入したＴ細胞と比較して、増殖の増強を示した（図７Ｃ）。加えて、刺激されたＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８−形質導入Ｔ細胞（すなわち、ＩＦＰ＋Ｔ細胞）は、ＣＤ２００ｄｉｍ腫瘍細胞に曝露した場合に対照Ｔ細胞と比較して増加したレベルのＩＦＮγおよびＩＬ−２を産生した（図７Ｄ）。
【０２６３】
全体としてこれらの結果は、ヒトＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物ならびにＷＴ１１２６特異的ＴＣＲのベータおよびアルファ鎖を発現するように形質導入した初代Ｔ細胞が、ＴＣＲ構築物のみで形質導入したＴ細胞と比較して増殖の増強およびサイトカイン産生の増加を示したことを示している。
【０２６４】
（実施例９）
ＳＩＲＰα−ＣＤ２８融合タンパク質構築物は形質導入Ｔ細胞の蓄積をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図８Ａ）。疎水性成分は、ＳＩＲＰαもしくはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＳＩＲＰα−ＣＤ２８融合タンパク質では疎水性成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には疎水性成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＳＩＲＰα−６ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよい。一部の実施形態では細胞外成分は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン全体を含む。他の例では細胞外成分は、ＳＩＲＰαのＮ末端からの最初の３６７アミノ酸（例えばＳＩＲＰα−６ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）、最初の３６４アミノ酸（例えばＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）または最初の３５０（ＳＩＲＰα−２３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）アミノ酸を含む。細胞外成分のサイズは、免疫学的シナプスに侵入しｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在して強い共刺激シグナルを送達する融合タンパク質の能力に影響を与える場合がある。一部の例では細胞外成分は、細胞外成分のサイズを変更できる切断型ＳＩＲＰαを含む。例えば融合タンパク質の細胞外ドメインの追加的細胞外アミノ酸（例えば追加的９または１２アミノ酸）を検討するために、ＳＩＲＰα−６ａａｓ−ＣＤ２８は天然Ｎ連結グリコシル化部位を保存しているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。別の例ではＳＩＲＰα−２３ａａｓ−ＣＤ２８は、ＳＩＲＰα細胞外ドメインのステム領域全体を欠如しているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。追加的にＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物は、ＳＩＲＰαのその標的への結合によって開始されるシグナルをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
【０２６５】
実施例２に記載の方法を使用して、ＳＩＲＰα細胞外成分を使用するＩＦＰを生成した（図８Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した。ＦＢＬ細胞をＣＤ４７またはｍＣｈｅｒｒｙでポリブレンスピンフェクションを用いて、Ｔ細胞形質導入と同様に形質導入し、次に均一な集団を生成するために選別した。
【０２６６】
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで観察されたとおり、ＳＩＲＰα構築物で形質導入したＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複数ラウンドの刺激で蓄積した（図８Ｂ）。これらのデータは、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８  ＩＦＰもＴ細胞の増殖および生存を促進することを示唆している。
【０２６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖を評価するために、ＣＴＶ希釈増殖アッセイを実施例２に記載のとおり実施した。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで観察されたとおり、Ｔ細胞−腫瘍細胞シナプス距離を維持するように操作されたＳＩＲＰα構築物で形質導入したＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して増殖の増強を示した（図８Ｃ）。加えて、ＣＤ４７＋腫瘍細胞はＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞との共培養の３日後に効率的に殺滅されたが、対照Ｔ細胞または細胞内シグナル伝達ドメインを欠如しているＳＩＲＰα構築物で形質導入したＴ細胞ではされなかった（図８Ｄ）。ＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞の溶解能力をさらに評価するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイをＣＤ４７＋ＦＢＬの殺滅を定量するために使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４７＋ＦＢＬ合計１０５個を２４ウエルプレートでＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物で形質導入したヒトＴ細胞を用量調整して共培養した。プレートを細胞培養インキュベーター内でＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）において７０時間インキュベートした。赤色シグナルの消失によって決定される腫瘍細胞の殺滅をモニターするために画像を１時間ごとに保存した。検査した最も低いエフェクター対標的比においてさえＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４７＋腫瘍細胞を殺滅した（０．４：１、図８Ｅ）。
【０２６８】
（実施例１０）
ＰＤ−１−ＣＤ２８融合タンパク質構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を促進する
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図９Ａ）。膜貫通成分は、ＰＤ−１もしくはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＰＤ１−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は鎖間ダイマー形成を促進するためにＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、ＰＤ１−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＰＤ１−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＰＤ１−２１ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＰＤ−１の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、リガンド結合した受容体の免疫学的シナプスへの接近を促進するために細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（例えばマウス構築物において−９ａａ、ヒト構築物において−１２ａａまたは−１５ａａ；ＰＤ−１のステム領域を欠如している、−２１ａａ）。追加的にＰＤ１−ＣＤ２８構築物は、ＰＤ１のその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
【０２６９】
ＰＤ−１細胞外成分を含むＩＦＰは、実施例２に記載の方法を使用して生成した（図９Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した。
【０２７０】
マウスＰＤ１−ＣＤ２８  ＩＦＰを構築物Ｉ〜ＩＶおよびＶＩＩ（図９Ａ）を使用して生成した。ＰＤ１−ＣＤ２８＋Ｔ細胞を内因的にＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現するＦＢＬ細胞でＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（産生されたサイトカインを保持するため）の存在下で再刺激した。５時間後、細胞を固定し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットで処置し、エフェクターサイトカイン、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを細胞内で染色した。５個のＰＤ１−ＣＤ２８構築物のそれぞれでの形質導入は、対照Ｔ細胞と比較して細胞内サイトカインの産生を増強した（図９Ｂ）。
【０２７１】
ヒトＰＤ１−ＣＤ２８  ＩＦＰを構築物Ｉ〜ＩＩＩおよびＶ〜ＶＩＩを使用して生成した（図９Ａ）。ＰＤ１−ＣＤ２８  ＩＦＰおよびＣ４  ＴＣＲを含有するベクターを上に記載のとおり生成した。ジャーカットＴ細胞を上に記載のとおり形質導入した。ＴＣＲおよびＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴ細胞は、両方のタンパク質の高い形質導入効率および発現を示した（図１０）。
【０２７２】
（実施例１１）
Ｆａｓ−ＣＤ２８融合タンパク質構築物はｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞における蓄積を促進し機能を増強する
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、Ｆａｓの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図１１Ａ）。膜貫通成分は、ＦａｓもしくはＣＤ２８のいずれかのドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＦａｓ−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えばＦａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＦａｓ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、Ｆａｓの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、受容体−リガンド相互作用の際に細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（−９ａａ）。追加的にＦａｓ−ＣＤ２８構築物は、Ｆａｓのその標的への結合によって開始されるシグナルをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
【０２７３】
Ｆａｓ細胞外成分を含むＩＦＰを実施例２に記載の方法を使用して生成した（図１１Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した。
【０２７４】
Ｆａｓ−ＣＤ２８  ＩＦＰの発現が形質導入細胞の蓄積の増加を生じるかどうかを決定するために、総ＴＣＲｇａｇ集団における混合集団からの形質導入細胞の割合を実施例３に記載のとおり照射ＦＢＬでの複数サイクルの刺激にわたって測定した。すべての構築物は、対照Ｔ細胞と比較して形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進した（図１１Ｂ）。付加的にＦａｓ−ＣＤ２８構築物の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数回の刺激でＴ細胞の生存および拡大を促進したが、全長（ＦＬ）Ｆａｓはしなかった（図１１Ｃ）。
【０２７５】
（実施例１２）
ＬＡＧ３−ＣＤ２８融合タンパク質構築物
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＬＡＧ３の細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図１２Ａ）。膜貫通成分は、ＬＡＧ３もしくはＣＤ２８のいずれかのドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＬＡＧ３−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えばＬＡＧ３−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＬＡＧ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＬＡＧ３の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、受容体−リガンド相互作用の際に細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（例えば−９ａａ）。追加的にＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物は、ＬＡＧ３のその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
【０２７６】
ＬＡＧ３細胞外成分を使用するＩＦＰを実施例２に記載の方法を使用して生成した（図１２Ａ）。Ｔ細胞を記載のとおりＬＡＧ３−ｅＧＦＰ構築物で形質導入した。形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＬＡＧ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって構築物発現について解析した（図１２Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみをコードするベクターを対照として使用した。すべての構築物はＬＡＧ３の発現を示した（図１２Ｂ）。
【０２７７】
（実施例１３）
ＴＩＭ３−ＣＤ２８融合タンパク質構築物
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＴＩＭ３の細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図１３Ａ）。膜貫通成分は、ＴＩＭ３もしくはＣＤ２８のいずれかのドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＴＩＭ３−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えばＴＩＭ３−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＴＩＭ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＴＩＭ３の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（例えば−９ａａ）。追加的にＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物は、ＴＩＭ３のその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正のシグナルに転換する能力を有する。
【０２７８】
ＴＩＭ３細胞外成分を使用する新規ＩＦＰを実施例２に記載の方法を使用して生成した（図１３Ａ）。Ｔ細胞を記載のとおりＧＦＰ−ＴＩＭ３構築物で形質導入した。形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＴＩＭ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって構築物発現について解析した（図１３Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみをコードするベクターを対照として使用した。大部分の構築物はＴＩＭ３の同様の発現を示した（図１３Ｂ）。
【０２７９】
（実施例１４）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質構築物は、初代Ｔ細胞によって発現させることができる
さらなる実施例では、本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、図１４Ａの模式図を使用して例示される。代表的な融合タンパク質は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部からなるＩＦＰを含む（図１４Ａ、構築物Ｉ〜Ｖ）。疎水性成分は、ＣＤ２００Ｒ（図１４Ａ、構築物Ｉ）もしくはＣＤ２８（図１４Ａ、構築物ＩＩ〜Ｖ）のいずれかの膜貫通ドメインまたはその部分からなってよい。一部の例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質では、疎水性成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は、ＣＤ２８の細胞外部分、詳細には疎水性成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、図１４Ａ構築物ＩＩＩ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；および構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインのすべてまたは部分を含んでよい。一部の実施形態では、細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む（図１４Ａ、構築物Ｉ〜ＩＩＩ）。他の例では、細胞外成分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端からの最初の２３５アミノ酸（Ｎ結合グリコシル化部位を保存している）（例えば、図１４Ａ、構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）または最初の２２９アミノ酸（例えば、図１４Ａ、構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。本明細書で開示するＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、ＣＤ２００Ｒのその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正のシグナルに転換する能力を有する。
【０２８０】
融合タンパク質構築物を調整することによって操作できる細胞外成分のサイズは、免疫学的シナプスに侵入しｃＳＭＡＣ内のＴＣＲと共局在して強い共刺激シグナルを送達する融合タンパク質の能力に影響を与える場合がある。ＣＤ２８シグナル伝達は免疫学的シナプスにおいて天然に存在し、そこでＣＤ２８が動員されてＴＣＲシグナルを増幅させ、活性化の閾値を低下させる（ChenおよびFlies、Nat.Rev. Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年；Yokosukaら、Immunity、２９巻：５８９〜６０１頁、２００８年）。Ｔ細胞とＡＰＣとの間の空間距離は免疫学的シナプス内で最も短く、大きな外部ドメインを有する分子は排除される。したがって、免疫学的シナプスの細胞間の間隔に最もよく近似する構築物が、免疫学的シナプス内にＴＣＲと共局在し、有効な共刺激シグナルを送達することができる可能性がある。構築物ＩＩＩおよびＩＶは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを細胞外空間内に伸長させて、ＣＤ２８ホモダイマー形成を促進し、天然のＣＤ２８シグナル伝達を増強する膜近位システイン（ＣＤ２８Ｃｙｓ）を組み込む（Lazar-Molnarら、Cell Immunol.、２４４巻：１２５〜１２９頁、２００６年）。細胞外ＣＤ２８ドメインの９アミノ酸によって付加される長さを検討するために、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓのＣＤ２００Ｒ細胞外ドメイン部分は、ＣＤ２８細胞外ドメインによって付加されるものと同等数である９アミノ酸だけ短縮されている。同様に、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓの細胞外ＣＤ２００Ｒは３アミノ酸短縮されている。切断された細胞外ＣＤ２００Ｒは、Ｎ結合グリコシル化部位を保存するためにＣ末端から短縮されている。したがって、マウス構築物ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓは、免疫学的シナプス内にＴＣＲと共局在するために必要なＴ細胞とＡＰＣとの間の短い空間距離を理論的に最もよく維持する。
【０２８１】
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質をコードする例示的な核酸分子は、次のエレメントを含む（５’から３’）：細胞外成分（ＣＤ２００Ｒ）−マルチマー形成ドメイン（ＣＤ２８システイン）−疎水性成分（ＣＤ２８膜貫通）−細胞内成分（ＣＤ２８細胞内）。一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号４７〜５１または１、６、７、１０、１２、１４、１５、または１８３のいずれか１つとして記載する核酸分子を含む。
【０２８２】
構築物をコードする核酸をｐＭＰ７１レトロウイルスベクターに挿入して、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した初代マウス脾細胞に形質導入した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＴＣＲｇａｇトランスジェニックマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてフレンドウイルスｇａｇエピトープに特異的なＴＣＲ導入遺伝子を発現する（Ohlenら、J. Exp. Med.、１９５巻：１４０７〜１４１８頁、２００２年）。Ｂ６  フレンドウイルス誘発赤白血病（ＦＢＬ）は、フレンドウイルスｇａｇエピトープ（ペプチドＣＣＬＣＬＴＶＦＬ（配列番号２１３））を発現する（Teagueら、Nat. Med.、１２巻：３３５〜３４１頁、２００６年）。ＤＮＡ構築物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに発注したまたはＰＣＲによって所内で生成した。ベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ指向的にＴＯＰＯクローニングした構築物を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用してレトロウイルスベクター（ＲＶ）ｐＭＰ７１−ａｔｔＲに移入した。レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｃｅｌｌ−Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）をｅｆｆｅｃｔｅｎｅ形質導入試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＶで形質導入した。ウイルス上清を２および３日目に回収した。トランスフェクションの１日前に、ＴＣＲｇａｇＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８および１００Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２で刺激した。ＴＣＲｇａｇＴ細胞の形質導入を、９０分間、１０００ｇでのスピンフェクションによってＩＬ−２およびポリブレンの存在下で１２ウエルプレートで実施した。形質導入した細胞を刺激の７日後に照射脾細胞（５×１０６）、照射ＦＢＬ（３×１０６）、およびＩＬ−２（ＩＵ／ｍＬ）の存在下で再刺激した。
【０２８３】
形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってＩＦＰ発現について解析した（図１４Ｂ）。蛍光色素とコンジュゲートした抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。形質導入効率は５〜４３％にわたり、形質導入細胞の平均蛍光強度は構築物間で同様であり、これは、ＩＦＰ発現が同様であることを示唆する。
【０２８４】
（実施例１５）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、形質導入Ｔ細胞の増殖、蓄積およびエフェクター機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する
実施例１４に記載のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物をＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖、蓄積、およびエフェクター機能を促進するそれらの能力について評価した。
【０２８５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖アッセイ
ＣＤ２８シグナル伝達は、ＴＣＲを介して刺激されるＴ細胞の増殖および生存を促進する（ChenおよびFlies、Nat. Rev. Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰが増殖を改善するかどうかを決定するために、実施例１４に記載のフレンドマウス白血病ウイルス形質転換ＦＢＬ白血病に由来するエピトープに特異的なナイーブのＣＤ８＋ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞（ＴＣＲｇａｇ細胞）（Stromnesら、J Clin Invest.、１２０巻：３７２２〜３７３４頁、２０１０年）を形質導入し、ＩＬ−２の存在下で抗原を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで２〜３回の刺激サイクルにわたって拡大して、エフェクターＴ細胞を生成し、そしてヒト養子免疫療法プロトコールをモデル化した。エフェクターＴ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、およびＣＴＶ標識されたＴｇ  Ｔ細胞（１０５）を、天然にＣＤ２００を発現しないＦＢＬ（ＣＤ２００−ＦＢＬ）（図１５Ａ、上パネル）、またはＣＤ２００を発現するように形質導入されたＦＢＬ株（ＣＤ２００＋ＦＢＬ）（図１５Ａ、下パネル）のいずれかで３日間刺激し、次いで、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２８６】
２５：１の低いＴ細胞のＦＢＬに対する比で、ＧＦＰ対照形質導入Ｔ細胞（図１５Ａ、青色の線）は、ＣＤ２００−またはＣＤ２００＋ＦＢＬに応答して最小の増殖を示した。対照的に、試験した構築物５種のうち４種（図１５Ａ、赤色の線）がＣＤ２００＋ＦＢＬに応答して増殖を劇的に改善したが、ＣＤ２００−ＦＢＬには応答しなかった。最も大きな外部ドメイン、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞は、増殖を改善しなかった。
【０２８７】
白血病に発現されるＣＤ２００とのＣＤ２００Ｒ相互作用によって送達される増殖の増大が共刺激ではなく接着および／またはデコイ結合の増強を反映するかどうかを試験するために、ＣＤ２００Ｒ細胞外およびＣＤ２８膜貫通ドメインのみを用いて構築物の切断された非シグナル伝達バージョンを生成した（「ｔｒＣＤ２００Ｒ」；図１５Ｂ）。構築物を発現する形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞（図１５Ｃ）はＣＤ２００＋ＦＢＬに対して増殖の増強を示さず（図１５Ｄ）、これは、ＣＤ２８共刺激シグナルについて必要な役割を示す。
【０２８８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞濃縮アッセイ
ＣＤ２００標的化ＩＦＰの発現が、ＣＤ２００＋ＦＢＬでの刺激後にＩＦＰ−Ｔ細胞と比較してＩＦＰ＋Ｔ細胞の濃縮をもたらすことが予測された。照射ＣＤ２００−またはＣＤ２００＋ＦＢＬでの複数のサイクルの刺激後の総ＴＣＲｇａｇ集団における形質導入細胞の割合を評価した。ＣＤ２００−またはＣＤ２００＋ＦＢＬのいずれかでの３サイクルの刺激後の細胞組成の解析により、ＧＦＰ対照を発現するＴＣＲｇａｇＴ細胞の分率に変化がないことが明らかになった（図１５Ｅ）。対照的に、ＩＦＰを発現するＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ２００＋での刺激後に濃縮されたが、ＣＤ２００−ＦＢＬでの刺激後には濃縮されなかった（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、図１５Ｆ）。予測どおり、いくつかの構築物は形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進したが、免疫学的シナプス内に適合するように適切なサイズにし、ダイマー形成システインモチーフを含めた構築物、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓは、最大の相対的増加を生じさせ、３回の別々の実験において、３回の刺激後に平均で＞３倍の濃縮をもたらした（Ｐ＜０．０５）（図１５Ｇ、濃縮倍率を示す、刺激３／刺激１、ｅＧＦＰ、ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８ｃｙｓ、およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞について）。
【０２８９】
ＣＦＳＥに基づく細胞傷害性アッセイ
ＣＤ２８シグナル伝達は、エフェクター機能を促進する（ChenおよびFlies、Nat. Rev. Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現するように形質導入されたＴ細胞を腫瘍標的細胞の殺滅の増加について試験した。
【０２９０】
ＦＢＬおよび対照ＥＬ４腫瘍を１０分間、室温で２．５μＭ（ｈｉ）または０．２５μＭ（ｌｏ）ＣＦＳＥと共にＰＢＳ中でそれぞれインキュベートした。過剰の色素は腫瘍細胞を血清含有培地中で洗浄することによって除去した。非特異的ＥＬ４対照標的およびＣＤ２００＋ＦＢＬ腫瘍細胞の１：１混合物を用量調整した数のＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＧＦＰで形質導入したＴＣＲｇａｇエフェクターＴ細胞（すなわち、ある範囲のエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比）と共に５時間、９６ウエル丸底プレート、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。比ＦＢＬ溶解は、ウエルに残存している総ＣＦＳＥ陽性細胞（ＦＢＬ＋ＥＬ４）の％ＣＦＳＥｈｉ（ＦＢＬ）についてのフローサイトメトリー解析によって決定した。
【０２９１】
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、対照Ｔ細胞よりも良好にＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞を殺滅し、低Ｅ：Ｔ比（０．３：１）でＣＤ２００＋ＦＢＬの＞４０％を溶解させた（図１５Ｈ）。
【０２９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカイン産生アッセイ
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰで形質導入したＴ細胞が、共刺激の他の機能を表す、増大した量および多様性のサイトカインを産生するかどうかを決定するために、多機能性サイトカイン産生をフローサイトメトリーによって評価した。より高い百分率のＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰ＋Ｔ細胞が、ＣＤ２００＋ＦＢＬでの刺激後に対照Ｔ細胞よりもＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαを産生した。より低い百分率のＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰ＋Ｔ細胞がサイトカイン非産生細胞である（２７％対５１％、図１５Ｉ、青色）一方、より高い百分率のＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰ＋Ｔ細胞が３種すべてのサイトカインを産生する多機能性細胞であった（２２％対７％、図１５Ｉ、紫色）。ＣＤ２００＋ＦＢＬで刺激したＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰ＋Ｔ細胞は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、サイトカイン／細胞の増加を有した（図１５Ｊ）。
【０２９３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共局在アッセイ
ＩＦＰ発現でのＴ細胞機能の増強の機構をより綿密に調査するために、Ｔ細胞表面上のＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰの位置を顕微鏡によって視覚化した。天然のＣＤ２８の、ＣＤ８０／８６との結合後の免疫学的シナプスへの局在は、ＴＣＲシグナルを増幅するシグナル伝達分子を動員する（ChenおよびFlies、Nat.Rev. Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。刺激後のＩＦＰの移動を評価するために、ＦＩＴＣとコンジュゲートしたコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴｘＢ）を、免疫学的シナプスにおいて濃縮される細胞膜内の脂質ラフトを染色するために使用し（図１５Ｋ、パネルＩＩＩ）（Stephanら、Nat Med.、１３巻：１４４０〜１４４９頁、２００７年）、免疫学的シナプスアセンブリの部位を画定するために使用した。次いで、ＦＢＬ上のＣＤ２００（図１５Ｋ、パネルＩＩ）またはＴ細胞上のＣＤ２００Ｒ（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、図１５Ｋ、パネルＩ）に結合する抗体を、これらの分子を免疫学的シナプスとの関連で視覚化するために使用した。ＣＤ２００Ｒ  ＩＦＰで形質導入したｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大エフェクターＴＣＲｇａｇ細胞をＦＢＬと１５ｍＬ中、１０：１のＥ：Ｔで混合し、次いで、３７℃で２０分インキュベートし、次いで、μ−スライドＶＩ．４チャンバー（Ｉｂｉｄｉ）に１５分にわたってローディングした。スライドをＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで４分間固定した。次いで、細胞を、洗浄し、染色し、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ  Ｅｌｉｔｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して６０×でイメージングし、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を使用して解析した。
【０２９４】
ＣＤ２００Ｒは、Ｔ細胞：標的接触の領域において脂質ラフト染色の増大を伴って局在し（図１５Ｋから１５Ｍ、パネルＩＶ）、これは、ＩＦＰのサイズを免疫学的シナプスによって適応させることができることを示唆する。
【０２９５】
ＬＣＫリン酸化
チロシンキナーゼ、ＬＣＫは、ＴＣＲシグナル伝達およびＣＤ３複合体内の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）配列のリン酸化をもたらしてＴＣＲシグナル伝達カスケードを開始させるＬＣＫのＴＣＲシグナル伝達複合体への動員にとって重要である（ChenおよびFlies、Nat.Rev. Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＬＣＫは、ＣＤ２８シグナル伝達尾部においてプロリンモチーフを介してＣＤ２８と会合し、ＬＣＫ残基Ｙ３９４のリン酸化の持続のためにはＴ細胞によるＣＤ２８の発現が必要である（Holdorfら、Nat Immunol.、３巻：２５９〜２６４頁、２００２年）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰ発現がＣＤ２８シグナル伝達をもたらすまたは強化するかどうかを決定するために、ＧＦＰ対照、リード構築物（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）、または増殖を促進しなかった効果のない構築物（ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）で形質導入したＴ細胞におけるｐＬＣＫ  Ｙ３９４を評価した（図１５Ａ）。形質導入Ｔ細胞を、刺激しなかったかまたはＰＭＡ／イオノマイシン、ＦＢＬ、もしくはＣＤ２００＋ＦＢＬで１０分間刺激し、固定し、細胞内ｐＬＣＫ  Ｙ３９４について染色し、フローサイトメトリーによって解析した。ホスホ−ＬＣＫ（Ｔｙｒ３９４）に対する抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、および細胞内染色はＢｉｏＬｅｇｅｎｄからの抗マウスＰＥでの二次標識によって検出した。
【０２９６】
Ｔ細胞の３つの集団は、強い刺激（ＰＭＡ／イオノマイシン）およびＣＤ２００−ＦＢＬ刺激に応答して同様のＬＣＫ  Ｙ３９４のリン酸化を達成した（図１５Ｎ）。ＧＦＰ対照またはより大きな外部ドメインを有するＩＦＰ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴ細胞は、ＣＤ２００−ＦＢＬおよびＣＤ２００＋ＦＢＬに応答して同様の低レベルのｐＬＣＫ  Ｙ３９４発現を示した。しかし、ＣＤ２００＋ＦＢＬで刺激した場合、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞は、１０分の時点でＬＣＫ  Ｙ３９４のリン酸化の増加の持続を示し、これは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ｃｙｓの発現がＣＤ２８共刺激の必要な機能をもたらしたことを実証する。
【０２９７】
まとめ
総合すると、これらのデータは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物が、腫瘍細胞による刺激に応答して形質導入Ｔ細胞の蓄積および溶解活性を増大させるように機能することを示す。パネルＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰ構築物の解析から、共刺激はダイマー形成モチーフおよび免疫学的シナプスへの局在を容易にする腫瘍−Ｔ細胞距離を含有するＩＦＰにおいて最も有効に達成されることが明らかになった。そのようなＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰで形質導入したＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ２００＋標的細胞に応答して増殖およびエフェクター機能の増強を示した。
【０２９８】
（実施例１６）
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＢＬの認識に応答して蓄積の増強を示す
悪性疾患の養子Ｔ細胞療法では、腫瘍は、一般に、限られた共刺激シグナルしかもたらさないかまたは共刺激シグナルをもたらさず、それどころか、阻害性受容体のリガンドを発現する。白血病では、ＣＤ２００は一般に発現される阻害性リガンドであり、予後不良に関連付けられている（Tonksら、Leukemia、２１巻：５６６〜５６８頁、２００７年）。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最も有効であると思われる、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰを発現するＴＣＲｇａｇＴ細胞の、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ２００＋ＦＢＬ白血病に遭遇した時に増殖し蓄積する能力を評価した。
【０２９９】
形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例１５に記載のとおり生成した。ヒト養子免疫療法プロトコールと同様に、Ｂ６マウスに生ＣＤ２００＋ＦＢＬ白血病４×１０６個を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、ＦＢＬを５日間播種した後、マウスは、腫瘍負荷を低減し、リンパ球減少を誘導するために、エフェクターＴ細胞の移入の６時間前に１８０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（Ｃｙ）をｉ．ｐ．で受けた。短期間増殖および蓄積を評価するために、ＩＦＰで形質導入されたＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞２×１０６個を、同等数の遺伝子導入により明確なＧＦＰ対照で形質導入されたＴｈｙ１．１＋×Ｔｈｙ１．２＋Ｔ細胞と、腫瘍保有マウスに同時注射し、各マウスが内部標準として機能するようにした（図１６Ａ）。どちらのＴ細胞集団も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し、同一方法による３回の刺激サイクルで拡大し、注射日、第３の刺激の５日後に表現型的に同様であると思われた（図１６Ｂ）。ＩＬ−２を２日ごとに投与した（２×１０４Ｕ／用量）。Ｔ細胞移入８日後に、マウスを安楽死させ、脾臓および鼠径リンパ節を回収した。
【０３００】
一部の研究については、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を使用した負の選択によって単離した。マウスは、腫瘍負荷の増大について定期的にモニターし、２４〜４８時間以内の死亡が予測される腫瘍進行のエビデンスが生じた場合は安楽死させた。
【０３０１】
ＩＦＰ発現Ｔ細胞は脾臓およびリンパ節のどちらにおいても対照細胞と比較して１．２〜１．４倍濃縮された（図１６Ｃ）。移入Ｔ細胞により獲得される可能性のある表現型の差異を評価するために、マウスのコホートを初期（ｄ３）および後期（ｄ１５）時点で安楽死させて、エフェクター、メモリー、および疲弊マーカーを同定した。Ｔ細胞を非接触ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮によって脾臓から単離し、フローサイトメトリーによって評価した。形質導入したＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋ＴＣＲｇａｇおよび対照Ｔ細胞は、移入の３日後に、エフェクターＴ細胞表現型と一致して同様の表面分子を発現した（図１６Ｄ）。１５日目までに、持続ＩＦＰ＋および対照Ｔ細胞は再度表現型的に同様であると思われ、疲弊マーカーであるＰＤ−１またはＬａｇ−３を発現せず（図１６Ｅ）、これは、どちらの細胞型もこの期間中、機能的なままである可能性が高いことを示唆する。
【０３０２】
要約すると、播種性白血病の養子療法のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８で形質導入した白血病特異的Ｔ細胞が、それなしでは致死的な疾患を野生型細胞よりも効率的に根絶させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を持続させるためのＩＬ−２投与の必要を回避した。
【０３０３】
（実施例１７）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８＋Ｔ細胞での養子免疫療法は、播種性白血病の治療においてより大きな活性を示す
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰを発現する細胞にもたらされた共刺激が、白血病根絶を達成するためにはＴ細胞応答が＞２５日続くことが必要とされる、播種性白血病の前臨床マウスモデルにおいて治療的Ｔ細胞活性を増強するかどうかを評価した（Cheeverら、J Immunol.、１２５巻：７１１〜７１４頁、１９８０年）。以前記載のとおり、Ｂ６マウスに致死用量（４×１０６個）のＣＤ２００＋ＦＢＬ白血病細胞をｉ．ｐ．注射した（Stromnesら、J Clin Invest.、１２０巻：３７２２〜３７３４頁、２０１０年）。５日後、マウスのコホートは、１８０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（Ｃｙ）をｉ．ｐ．で受け、６時間後にＴＣＲｇａｇエフェクターＴ細胞１０５個を受けて、薬物を代謝させた（Cheeverら、１９８０年）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、予めｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜３回刺激した。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞を用いた治療の有効性を、ＧＦＰ対照を発現するＴ細胞と比較した（図１７Ａ、１７Ｂ）。この手法は、最初に、Ｔ細胞活性を増強し、持続させるためにＴ細胞移入後にＩＬ−２を１０日間受けたマウスの小さなコホートを用いて試験した（Stromnesら、J Clin Invest.、１２０巻：３７２２〜３７３４頁、２０１０年）（図１７Ａ）。
【０３０４】
ＩＬ−２注射を用いると、対照Ｔ細胞を使用した免疫療法では、マウスの６７％が治癒し、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞ではマウスの１００％が治癒し、統計的有意性は達成されなかった（図１７Ａ）。その後の研究はより大きなコホートで行い、ＩＬ−２注射は省いた。これらの研究では、ＧＦＰ対照ベクターで形質導入したＴ細胞で処置したマウスのわずか４０％が３０日目を超えて生存した（図１７Ｂ、青色の線）。対照的に、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞を受けたマウスの８９％がＦＢＬ移入後、１００日間生存した（図１７Ｂ、赤色の線、Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、共刺激シグナルをもたらすＣＤ２００Ｒを有するＩＦＰが、進行性白血病のＴ細胞免疫療法を増強するだけでなく、ＩＬ−２の投与の必要をほぼ回避することができることを示す。
【０３０５】
（実施例１８）
ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の同時発現は、ＷＴ１特異的ＴＣＲ初代Ｔ細胞における機能を増強する
操作されたＴ細胞を用いた養子療法は、特に、急性リンパ球性白血病において、細胞表面タンパク質ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を用いて、有望な臨床上の利益が示されている（Turtleら、J Clin Invest.、１２６巻：２１２３〜２１３８頁、２０１６年；Kalosら、Sci Transl Med.、３巻：９５ｒａ７３頁、２０１１年）。あるいは、Ｔ細胞は、腫瘍に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように形質導入することができ、これは、多くの場合に腫瘍形成表現型を駆動する転写因子などの細胞内タンパク質を含めることによって標的抗原の幅を著しく拡大する。多くの悪性疾患において過剰発現される転写因子であるＷＴ１に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞（Yangら、Leukemia、２１巻：８６８〜８７６頁、２００７年；Qiら、Sci Rep.、５巻：８９２４頁、２０１５年）は、患者への移入後に抗白血病活性を示し（Chapuisら、Sci Transl Med.、５巻：１７４ｒａ１２７頁、２０１３年）、白血病、肺がん、または中皮腫の患者における、高親和性ＷＴ１特異的ＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた試験が進行中である（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ０１６４０３０１、ＮＣＴ０２４０８０１６）。増殖および生存を伴うＴ細胞活性化には、抗原受容体の誘発と同時の共刺激シグナルが必要である（Chenら、Nat Rev Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。共刺激ドメインをキメラシグナル伝達タンパク質内に含むＣＡＲとは異なり、ＴＣＲが導入された細胞は、共刺激受容体の独立した誘発を必要とする。しかし、腫瘍細胞は、一般に、共刺激受容体のリガンドはあったとしてもほとんど発現しないだけでなく、一般に、共刺激に干渉し、Ｔ細胞活性化を遮断する可能性がある阻害性受容体リガンドを上方制御しさえする（Driessensら、Immunol Rev.、２２９巻：１２６〜１４４頁、２００９年）。したがって、Ｔ細胞抗腫瘍活性を促進するために、阻害シグナル伝達を克服し、共刺激／活性化シグナル伝達を増大させるための戦略が積極的に探求されている（Mellmanら、Nature、４８０巻：４８０〜４８９頁、２０１１年）。
【０３０６】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の５年生存率は現行の治療では２６％である（SocietyAC、Cancer Facts & Figures 2016.、Atlanta: American Cancer Society、２０１６年）。Ｔ細胞はＡＭＬが局在する造血部位に天然に輸送されるので、Ｔ細胞療法には、この疾患の処置に関して有意な潜在性があるが、ＡＭＬ細胞による阻害分子の過剰発現が、成功に対する実質的な関門である（GeigerおよびRubnitz、DiscovMed.、１９巻：２７５〜２８４頁、２０１５年）。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである１型膜タンパク質ＣＤ２００は、Ｔ細胞阻害性受容体ＣＤ２００Ｒに結合し（Hatherleyら、Structure、２１巻：８２０〜８３２頁、２０１３年）、ＡＭＬおよび多発性骨髄腫、卵巣がん、および前立腺がんを含めた他の悪性疾患ではＣＤ２００発現の増大が観察される（Sivaら、Cancer Immunol Immunother.、５７巻：９８７〜９９６頁、２００８年；Stumpfovaら、Cancer Res.、７０巻：２９６２〜２９７２頁、２０１０年；Kawasakiら、Trends Immunol.、２９巻：４６４〜４６８頁、２００８年）。標的化治療に関して重要なことに、ＣＤ２００発現の増大は、高い増殖能力ならびに放射線および化学療法に対する抵抗性を有する疾患を開始し、維持する細胞の小集団であるがん幹細胞（ＣＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）において報告されている（Snauwaertら、Oncoimmunology、２巻：ｅ２２９４３頁、２０１３年；Tonksら、Leukemia、２１巻：５６６〜５６８頁、２００７年；Hoら、58th ASH Annual Meeting、San Diego、CA、２０１６年；Kawasakiら、Biochem Biophys Res Commun.、３６４巻：７７８〜７８２頁、２００７年）。ＣＤ２００Ｒシグナル伝達は、Ｔ細胞機能（Colesら、Leukemia、２６巻：２１４８〜２１５１頁、２０１２年；Kretz-Rommelら、The Journal of Immunology、１７８巻：５５９５〜５６０５頁、２００７年）、ならびに、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む他の免疫細胞（Colesら、Leukemia、２５巻：７９２〜７９９頁、２０１１年）を阻害し、高レベルのＣＤ２００発現はＡＭＬ患者の転帰不良に関連付けられている（Tonksら、Leukemia、２１巻：５６６〜５６８頁、２００７年）。
【０３０７】
合成生物学は、Ｔ細胞を、腫瘍反応性受容体を用いてのみだけでなく、負のシグナルを抑止し、それらを活性化シグナルで置き換える分子も用いて操作する機会をもたらす。ＡＭＬに関連する阻害性ＣＤ２００Ｒシグナル伝達を克服すると同時に欠如した共刺激シグナルをＣＤ８＋Ｔ細胞にもたらすために、細胞内Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインと融合したＣＤ２００Ｒ外部ドメインからなる免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）を設計し、その結果、ＩＦＰは、この阻害性リガンドに結合するが共刺激シグナルを生成することによって、ＣＤ２００を発現する白血病細胞を利用し得る。ＰＤ−１外部ドメインを含む融合タンパク質は、共刺激シグナルをもたらすことができることが示されているが（Prosserら、Mol Immunol.、５１巻：２６３〜２７２頁、２０１２年）、共刺激シグナルを生成するかまたはさらには最適化する分子の設計に関する原理は定義されていいない。
【０３０８】
ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞を用いた治療をＡＭＬ臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｏｒｇにＮＣＴ０１６４０３０１として登録）において調査した。臨床的調査はすべて、Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓに従って行われた。プロトコール２４９８は、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）およびＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）により認可された。ＡＭＬ患者をＴＣＲで形質導入されたＴ細胞で処置した。末梢芽細胞をＴ細胞療法後に進行／再発した患者４名から得た。ＡＭＬ維持亜集団、ＬＳＣが白血病芽球のＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋ＣＤ３８−集団内に存在し（Bachasら、Leukemia、２６巻：１３１３〜１３２０頁、２０１２年；Hoら、58th ASH Annual Meeting、San Diego、CA、２０１６年）、ＣＤ２００発現を、注入用のＴ細胞を生成するために使用された健康なドナー３名から動員された白血球アフェレーシスから得たＣＤ３４＋細胞と比較した。正常なＣＤ３４＋細胞上ではＣＤ２００発現は検出されなかったが、試験された患者それぞれ由来のＡＭＬ芽細胞の大部分ではＣＤ２００が発現され（範囲４２〜９７％＋）（図１８Ａ）、これは以前の報告と一致する（Tonksら、Leukemia、２１巻：５６６〜５６８頁、２００７年；Colesら、Leukemia、２９巻：１９５２〜１９５４頁、２０１５年）。
【０３０９】
以前のマウス実験の結果に基づいて（実施例１４〜１７を参照されたい）、ヒトＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物（配列番号１）を、免疫学的シナプスにおけるヒトＴ細胞と腫瘍細胞との間の空間距離が維持されるように生成した（図１８Ｂ）。このＩＦＰの発現が機能を増強し得るかどうかを決定するために、ヒト初代Ｔ細胞を形質導入した。構築物を、ＨＬＡ−Ａ２制限ＷＴ１１２６特異的ＴＣＲＣ４のベータおよびアルファ鎖を有する単一のレンチウイルスベクター構築物に挿入し（Stromnesら、Immunol Rev.、２５７巻：１４５〜１６４頁、２０１４年）、これを、遺伝子のそれぞれとＰ２Ａエレメントと連結することにより、ＡＭＬの治療に関する臨床試験においてＴ細胞を形質導入するために使用した（図１８Ｂ）。第１のＰ２Ａ配列を、第２のＰ２Ａ配列との遺伝子組換えを防止するためにコドン最適化した。
【０３１０】
レンチウイルスを生成するために、２９３Ｔ／１７細胞（細胞３×１０６個／プレート）を、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｐＲＲＬＳＩＮプラスミドならびにパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２−Ｇ、およびｐＲＳＶ−ＲＥＶ中のヒト構築物で形質導入した。培養培地をトランスフェクション後１日目に交換し、ウイルス含有上清を２および３日目に回収し、将来の使用のためにアリコートを凍結した。インフォームドコンセントを得た後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を正常なＨＬＡ−Ａ２＋ドナーから回収した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズを使用して精製し、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いて刺激した。刺激の４時間後、Ｔ細胞を、３２℃、１０００ｇで９０分間のレンチウイルス上清２ｍＬを用いた細胞５〜１０×１０６個のスピンフェクションによって形質導入した。Ｔ細胞を以前記載（Hoら、J. Immunol. Methods、３１０巻：４０〜５２頁、２００６年を参照されたい）のとおり急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で１０〜１４日ごとに再刺激した。
【０３１１】
ＴＣＲＣ４およびＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質を発現するように形質導入されたヒト初代Ｔ細胞は、ＴＣＲＣ４のみで形質導入されたＴ細胞と比較して高レベルのＣＤ２００Ｒ発現および同等レベルのＴＣＲＣ４発現を示した（図１８Ｂ）。
【０３１２】
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰが、形質導入されたヒトＴ細胞の機能を改善するかどうかを決定するために、細胞を、初代ＡＭＬ（図１８Ａ）およびＣＤ２００−ＣＭＬ細胞株、Ｋ５６２と比較して低レベルの内因性ＣＤ２００を天然に発現するペプチドパルス化Ｔ２リンパ芽球様細胞で刺激した（Colesら、Leukemia、２５巻：７９２〜７９９頁、２０１１年）（図１８Ｃ）。ＷＴ１１２６パルス化Ｔ２細胞に応答して、ＴＣＲＣ４プラスＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰで形質導入したＴ細胞は、特に低Ｅ：Ｔ比で増殖の増強（図１８Ｄ）およびサイトカイン産生の増加を示し（図１８Ｅ）、これは、かすかであってもＣＤ２００発現を発現する腫瘍細胞が共刺激をもたらし得ることを示唆する。
【０３１３】
要約すると、ヒトＩＦＰでのヒト初代Ｔ細胞の形質導入も、ＣＤ２００＋白血病細胞に応答して増殖およびサイトカイン産生を増大させた。この研究では、がん細胞、特にＡＭＬおよびＬＳＣ細胞上で頻繁に上方制御され、Ｔ細胞免疫応答を抑制することが公知の阻害分子であるＣＤ２００を標的化するためにＩＦＰを生成することに焦点を当てた。ＡＭＬに加えて、他のヘム悪性疾患ならびに乳がん、結腸がん、卵巣がん、および前立腺がんなどの固形腫瘍についてもＣＤ２００発現の増大が報告されている。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００  ＩＦＰをヘム悪性疾患ならびに乳がん、結腸がん、卵巣がん、および前立腺がんを含めた固形腫瘍の処置に使用することができる。これらの結果は、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインを含有するＩＦＰを用いた腫瘍特異的Ｔ細胞の遺伝子操作により、効率的に、白血病細胞によって送達される阻害シグナルを共刺激シグナルに細胞内因的に変換し、したがって、内因性自己反応性Ｔ細胞の活性化を促進するリスクを伴ってこの阻害性受容体を全体的に遮断する必要を不要にすることができることを示す。さらに、ＩＦＰは、ＴＣＲを操作せずに感受性を改善するために使用することができる。
【０３１４】
（実施例１９）
ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８またはＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓとＷＴ１特異的ＴＣＲの同時発現は、初代Ｔ細胞における機能を増強する
さらなる実施例では、本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、図１９Ａの模式図を使用して例示される。代表的な融合タンパク質は、ヒトＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインまたはその一部、およびヒトＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部で構成されるＩＦＰを含む（図１９Ａ、構築物ＩＩ〜ＶＩＩ）。疎水性成分は、ヒトＣＤ２００Ｒ（図１９Ａ、構築物Ｉ、ＩＩ、およびＶＩＩＩ）またはヒトＣＤ２８（図１９Ａ、構築物ＩＩＩ〜ＶＩＩ）のいずれかの膜貫通ドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質では、疎水性成分は、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は、ヒトＣＤ２８の細胞外部分、特に疎水性成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、図１９Ａ構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；構築物ＶＩ、ＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；および構築物ＶＩＩ、ＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。構築物ＶＩＩＩは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むが、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない（図１９Ａ）。細胞外成分は、ヒトＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインのすべてまたは部分を含んでよい。一部の実施形態では、細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む（図１９Ａ、構築物ＩＩ〜ＩＶおよびＶＩＩＩ）。一部の他の実施例では、細胞外成分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端からの最初の２３４アミノ酸（例えば、図１９Ａ、構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）、最初の２３１アミノ酸（例えば、図１９Ａ、構築物ＶＩ、ＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）、または最初の２２８アミノ酸（例えば、図１９Ａ、構築物ＶＩＩ、ＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。本明細書で開示するヒトＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、ＣＤ２００Ｒのその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正のシグナルに転換する能力を有する。
【０３１５】
融合タンパク質構築物を調整することによって操作できる細胞外成分のサイズは、免疫学的シナプスに侵入しｃＳＭＡＣ内のＴＣＲと共局在して強い共刺激シグナルを送達する融合タンパク質の能力に影響を与える場合がある。ＣＤ２８シグナル伝達は免疫学的シナプスにおいて天然に存在し、そこでＣＤ２８が動員されてＴＣＲシグナルを増幅させ、活性化の閾値を低下させる（ChenおよびFlies、Nat.Rev. Immunol.、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年；Yokosukaら、Immunity、２９巻：５８９〜６０１頁、２００８年）。Ｔ細胞とＡＰＣとの間の空間距離は免疫学的シナプス内で最も短く、大きな外部ドメインを有する分子は排除される。したがって、免疫学的シナプスの細胞間の間隔に最もよく近似する構築物が、免疫学的シナプス内にＴＣＲと共局在し、有効な共刺激シグナルを送達することができる可能性がある。構築物ＩＶ〜ＶＩＩは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを細胞外空間内に伸長させて、ＣＤ２８ホモダイマー形成を促進し、天然のＣＤ２８シグナル伝達を増強する膜近位システイン（ＣＤ２８Ｃｙｓ）を組み込む（Lazar-Molnarら、Cell Immunol.、２４４巻：１２５〜１２９頁、２００６年）。一部の実施形態では、細胞外ＣＤ２８ドメインの追加的なアミノ酸によって付加される長さを検討するために、ＣＤ２００Ｒ細胞外部分が同等数だけ短縮されている；例えば、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓのＣＤ２００Ｒ細胞外ドメイン部分は、ＣＤ２８細胞外ドメインによって付加されるものと同等数である９アミノ酸だけ短縮されている。同様に、ＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓの細胞外ＣＤ２００Ｒは１２アミノ酸短縮されており、ＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓの細胞外ＣＤ２００Ｒは１５アミノ酸短縮されている。構築物Ｖ〜ＶＩＩでは、切断された細胞外ＣＤ２００Ｒは、Ｎ結合グリコシル化部位を保存するためにＣ末端から短縮されている。図１９Ａに例示されている代表的な融合タンパク質については、ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、およびＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８ｃｙｓが、免疫学的シナプス内にＴＣＲと共局在するために必要なＴ細胞とＡＰＣとの間の短い空間距離を理論的に最もよく維持する。
【０３１６】
臨床的調査はすべて、Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓに従って行われた。プロトコール２４９８は、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）およびＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって認可された。この試験はｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｏｒｇでＮＣＴ０１６４０３０１として登録された。
【０３１７】
レンチウイルスを生成するために、２９３Ｔ／１７細胞（細胞３×１０６個／プレート）を、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｐＲＲＬＳＩＮプラスミドならびにパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２−Ｇ、およびｐＲＳＶ−ＲＥＶ中のヒト構築物（図１９Ｂ）で形質導入した。培養培地をトランスフェクション後１日目に交換し、ウイルス含有上清を２日目および３日目に回収し、将来の使用のためにアリコートを凍結した。
【０３１８】
免疫学的シナプスにおけるＴ細胞と腫瘍細胞との間の空間距離を理論的に維持するヒトＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰ構築物を生成した（図１９Ｂ）。構築物をＨＬＡ−Ａ２制限ＷＴ１１２６特異的ＴＣＲＣ４のベータおよびアルファ鎖を有する単一のレンチウイルスベクター構築物に挿入し（Stromnesら、Immunol Rev.、２５７巻：１４５〜１６４頁、２０１４年）、これは、遺伝子のそれぞれとＰ２Ａエレメントと連結することにより、ＡＭＬの治療に関する臨床試験においてＴ細胞を形質導入するために使用した。第１のＰ２Ａ配列を、第２のＰ２Ａ配列との遺伝子組換えを防止するためにコドン最適化した。
【０３１９】
インフォームドコンセントを得た後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を正常なＨＬＡ−Ａ２＋ドナーから回収した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズを使用して精製し、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いて刺激した。刺激の４時間後、Ｔ細胞を、３２℃、１０００ｇで９０分間の、レンチウイルス上清２ｍＬを用いた細胞５〜１０×１０６個のスピンフェクションによって形質導入した。Ｔ細胞を、以前記載（Hoら、J Immunol Methods、３１０巻：４０〜５２頁、２００６年）のとおり急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で１０〜１４日ごとに再刺激した。
【０３２０】
形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってＩＦＰ発現について解析した（図１９Ｃ）。結果は、ＩＦＰおよびＷＴ１特異的ＴＣＲをコードする構築物で形質導入すると、初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８  ＩＦＰおよびＷＴ１特異的ＴＣＲを同時発現することを示す。
【０３２１】
（実施例２０）
ＣＤ２００標的化ＩＦＰを発現するＴ細胞は、ＣＤ２００＋細胞での刺激後にＩＦＰ−Ｔ細胞と比較して濃縮される
ＣＤ２００標的化ＩＦＰの発現が、ＣＤ２００＋細胞での刺激後にＩＦＰ−Ｔ細胞と比較してＩＦＰ＋Ｔ細胞の濃縮をもたらすかどうかを試験するために、ＣＤ２００＋ＬＣＬ細胞での刺激の前後のＣＤ２００Ｒ＋細胞の相対的な割合を測定した。
【０３２２】
図２０Ａに示されているとおり、ＩＦＰ  ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ（図１９Ａの構築物ＩＩＩ）の発現は、ＣＤ２００で形質導入したＬＣＬでの再刺激後にＩＦＰ−Ｔ細胞（ＣＤ２００Ｒ−）と比較してＩＦＰ＋Ｔ細胞（ＣＤ２００Ｒ＋）の濃縮をもたらした。
【０３２３】
ｔｒＣＤ２００Ｒ（図１９Ａの構築物ＶＩＩＩ）およびＣＤ２００Ｒ−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（図１９Ａの構築物ＶＩＩ）で形質導入したＴ細胞は濃縮されず、これは、共刺激の欠如を示唆する（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。しかし、いくつかの他の構築物を発現するＴ細胞は、ＣＤ２００＋ＬＣＬ  ＲＥＰ後に、特にＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ（図１９Ａの構築物ＩＩＩ）およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（図１９Ａの構築物Ｖ）（図２０Ｃおよび２０Ｄ）の比を増大させた。
【０３２４】
（実施例２１）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍおよびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ  ＩＦＰを発現するヒトＴ細胞はより大きなエフェクター機能を示す
ＣＤ２００標的化ＩＦＰ  ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現するヒトＴ細胞は、ＩＦＰ−細胞と比較してサイトカイン産生の増加を有した。ＴＡＰ欠損腫瘍細胞株であるＴ２は、内因性ＣＤ２００を発現する（図２１Ａ）。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ発現は、ペプチドパルス化Ｔ２細胞（１ｕｇ／ｍＬのＷＴ１−１２６でパルス化）に対して、刺激されていない細胞およびＴＣＲを発現するがＩＦＰは発現しない刺激した細胞と比較して、サイトカイン産生を増強した（図２１Ｂ）。
【０３２５】
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ発現に関連するエフェクター機能の増大が共刺激ではなく接着および／またはデコイ結合の増強を反映するかどうかを試験するために、ＣＤ２００Ｒ細胞外およびＣＤ２８膜貫通ドメインのみを用いて構築物の切断された非シグナル伝達バージョンを生成した（「ｔｒＣＤ２００Ｒ」；図１９Ａ、構築物ＶＩＩＩ；図２１Ｃ）。構築物を発現する形質導入Ｔ細胞は、ＴＣＲＣ４のみを発現する細胞と比較してサイトカイン産生の増強を示さず（図２１Ｄ）、これは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓが共刺激シグナルをもたらすことを示す。
【０３２６】
他のＣＤ２００Ｒ標的化構築物のサイトカイン産生を増大させる能力を図２１Ｅに示す。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ（図２１Ｆおよび２１Ｇ、「Ｂ」と標識されている）およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（図２１Ｆおよび２１Ｇ、「−９」と標識されている）は、サイトカイン産生を顕著に改善した。ＣＤ２００標的化ＩＦＰは、増大した、多機能性のサイトカイン産生を示した（図２１Ｉ）。
【０３２７】
エフェクター機能を、実施例１５に記載のものと同様のフローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイにおいても評価した（図２１Ｊ）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物で形質導入したＴ細胞は、標的を対照Ｔ細胞よりも有効に溶解させた（図２１Ｋ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、「Ｂ」と標識されている、およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、「−９」と標識されている）。
【０３２８】
（実施例２２）
ＦＡＳ  ＩＦＰのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物を実施例１１と同様に設計し、白血病のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおいて試験した（図２２Ａ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍細胞４×１０６個を腹腔内接種し（０日目）、シクロホスファミドで処置し、その後、（１）追加的な処置を行わなかったか、（２）ＧＦＰで形質導入されたＴＣＲｇａｇトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞１０６個を養子移入したか（５日目）、または（３）Ｆａｓ−ＣＤ２８で形質導入されたＴＣＲｇａｇトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞１０６個を養子移入した（５日目）。ホタルルシフェラーゼ＋ＦＢＬ腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングを使用して、様々な時点でマウスにおける白血病を測定した。
【０３２９】
Ｆａｓ  ＩＦＰで形質導入したＴ細胞は、疾患をより迅速に根絶させ（図２２Ｂ）、経時的に保護をもたらす（図２２Ｂ、２２Ｃ）傾向があった。
【０３３０】
（実施例２３）
Ｆａｓ−４−１ＢＢ融合タンパク質構築物
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、Ｆａｓの細胞外ドメインまたはその一部、および４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインで構成されるＩＦＰも含む。細胞外成分は、Ｆａｓの細胞外ドメインのすべてまたは部分を含んでよい。一部の実施形態では、膜貫通成分は、Ｆａｓ、４−１ＢＢ、またはＣＤ２８のドメインまたはその部分からなってよい。一部の例示的なＦａｓ−４−１ＢＢ融合タンパク質では、膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は、ＣＤ２８の細胞外部分、特に膜貫通成分と隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、Ｆａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ−４−１ＢＢｉｃおよびＦａｓ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ−４−１ＢＢｉｃ）。細胞外成分は、Ｆａｓの細胞外ドメインのすべてまたは部分を含んでよい、または、受容体−リガンド相互作用の際の細胞間の短い空間距離を維持するよう保存するために短縮されてよい（−９ａａｓ）。一部の他の例示的なＦａｓ−４−１ＢＢ融合タンパク質では、膜貫通成分は、４−１ＢＢの膜貫通ドメインを含む（例えば、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ；図２３Ａ）。さらに、Ｆａｓ−４−１ＢＢ構築物は、Ｆａｓのその標的への結合によって開始されるシグナルを、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば、共刺激）シグナルに変換する能力を有する。
【０３３１】
Ｆａｓ−４−１ＢＢ  ＩＦＰおよびトランスジェニックＴＣＲは、形質導入されたマウスＴ細胞において同時発現させることができる。Ｆａｓ細胞外成分を含むＩＦＰを、実施例２に記載の一般的な方法を使用して生成した。Ｐ１４  Ｔ細胞を、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ  ＩＦＰおよびトランスジェニックＴＣＲ（ＴＣＲｇａｇ、フレンドマウス白血病ウイルス形質転換ＦＢＬ白血病に由来するエピトープに特異的（Stromnesら、J Clin Invest.、１２０巻：３７２２〜３７３４頁、２０１０年））を同時発現するように形質導入した。レトロウイルス上清を、ＴＣＲｇａｇのみ、またはＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍをコードするＤＮＡ構築物でのＰｌａｔ−Ｅ細胞のトランスフェクションによって生成した。ナイーブのＰ１４  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激し、次いで、レトロウイルス上清で２日間形質導入した。刺激の５日後、形質導入Ｔ細胞を、ＴＣＲに対する特異的抗体およびＦａｓに対する特異的抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。ＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍをコードする構築物で形質導入したＰ１４  Ｔ細胞は、ＴＣＲを同様のレベルで発現し、また、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ  ＩＦＰ構築物も高レベルで発現した（図２３Ｂ）。
【０３３２】
Ｆａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖の増強を示すことが見いだされた。形質導入したＰ１４  Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）増殖色素で染色し、ＦＢＬ腫瘍細胞で６日間、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比８：１で刺激した。Ｔ細胞を回収し、フローサイトメトリーによって解析した。刺激を伴わないと、ＴＣＲｇａｇのみで形質導入したＴ細胞は、ＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍの両方で形質導入したＴ細胞（ＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ）と同様に、増殖の欠如を示した（図２３Ｃ、左）。８：１のＥ：Ｔでは、一部のＴＣＲのみのＴ細胞は増殖を示した；しかし、ＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞はすべてが頑強な増殖を示し、これは、刺激および増殖能力の増大を支持する（図２３Ｃ、右）。
【０３３３】
さらに、Ｆａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞は、細胞死Ｆａｓ経路シグナル伝達の低減を示し、これは、Ｆａｓ細胞内ドメインが４−１ＢＢ細胞内ドメインで置き換えられたＩＦＰについて予測されたとおり、Ｆａｓ細胞外ドメインの結合がＦａｓシグナル伝達経路の活性化をもたらさなかったことを示す。（ｉ）トランスジェニックＴＣＲｇａｇは発現するがＦａｓ発現を欠くＴ細胞；（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲｇａｇを発現する野生型Ｔ細胞；ならびに（ｉｉｉ）トランスジェニックＴＣＲｇａｇおよびＦａｓ−４−１ＢＢｔｍを発現するＴ細胞における細胞死Ｆａｓシグナル伝達経路活性を図２３Ｄに示す。Ｐ１４  Ｔ細胞を、刺激し、ＴＣＲｇａｇまたはＴＣＲｇａｇ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢ  ＩＦＰで形質導入した。７日後に、Ｔ細胞を、Ｆａｓ経路による細胞死の尺度として活性カスパーゼ−８発現について、カスパーゼの蛍光阻害剤（ＦＬＩＣＡ）方法体系を使用して染色した。Ｆａｓ欠損Ｔ細胞（灰色）は、活性カスパーゼ−８発現を示さなかったが、ＴＣＲで形質導入したＴ細胞は、発現の上昇を示した。ＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢ  Ｔ細胞は、ＴＣＲのみのＴ細胞と比較してより少ない活性カスパーゼ−８発現を有し、これは、Ｆａｓ経路による細胞死がより少ないことを示す（図２３Ｄ）。
【０３３４】
全体として、これらのデータは、Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍ融合タンパク質が、Ｆａｓの結合に関連する負の／細胞死シグナル伝達を正の共刺激シグナルに変換できることを示す。
【０３３５】
（実施例２４）
Ｆａｓ−４−１ＢＢ融合タンパク質は、ＩＤ８卵巣がんモデルにおいて腫瘍成長の制御を増強し、生存を改善する
Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍで形質導入したＴ細胞は、卵巣がんのＩＤ８モデルにおいて腫瘍成長を制御し、生存を促進した。
【０３３６】
ＩＤ８モデルは、卵巣がんの移植可能なマウスモデルである（Waltonら、Cancer Res、７６巻：６１１８〜２９頁、２０１６年）。ＩＤ８卵巣腫瘍細胞の殺滅を定量するためにＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイを使用した。マウス形質導入Ｔ細胞（ＴＣＲまたはＴＣＲ＋４−１ＢＢ）を、赤色蛍光ＩＤ８卵巣腫瘍細胞と２日間と共インキュベートし、ＩＤ８細胞成長を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）解析によって定量した。赤色シグナルの消失は、腫瘍細胞の殺滅を示す。ＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢ  Ｔ細胞は、赤色シグナルが少ないことによって示されるとおり、ＴＣＲのみのＴ細胞と比較して、ＩＤ８腫瘍細胞成長の制御の増大を示した（図２４Ａ）。
【０３３７】
さらに、抗メソテリンＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍで形質導入したＴ細胞で処置したマウスは、抗メソテリンＴＣＲのみで形質導入したＴ細胞で処置したマウスと比較して生存が増大した。ＩＤ８マウス卵巣がんモデルにおいて、ＩＤ８腫瘍細胞５×１０６個を植え込み、６週間播種させた。シクロホスファミド処置後、マウスは、Ｔ細胞１０７個およびメソテリンパルス化脾細胞５０×１０７個を受け、その後、ＩＬ−２注射を１０日間受けた。マウスを、ＩＡＣＵＣにより認可されたエンドポイント評価基準に従って安楽死させるまで２週間ごとに処置した。ＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍで形質導入したＴ細胞では、ＴＣＲのみのＴ細胞と比較して生存が改善された（図２４Ｂ）。
【０３３８】
（実施例２５）
Ｆａｓ−４−１ＢＢ融合タンパク質を発現するＴ細胞は、膵がんのＫＰＣマウスモデルにおいてＴ細胞持続性を示し、生存を改善する
メソテリンを標的とするＴＣＲ−Ｔ細胞を用いた免疫療法が、マウス膵臓ＫＰＣ腫瘍モデルにおける生存を有意に延長することが以前示されている。この研究では、ＫＰＣモデルを使用して、Ｆａｓ−４−１ＢＢ融合タンパク質を発現するＴ細胞を用いた免疫療法が生存を改善することができるかどうかを決定した。
【０３３９】
自発性ＫＰＣ膵がんモデルを使用して、ヒト疾患をモデル化した（Leeら、Curr. Protoc. Pharmacol.、７３巻：１４．３９．１〜１４．３９．２０頁、２０１６年）。患者において、膵管腺腫（ＰＤＡ）症例の＞９０％が、ＫＲＡＳの活性化変異を示し、＞７５％がｐ５３の変異を有する。ＫＰＣモデルでは、膵臓特異的Ｃｒｅリコンビナーゼ（「Ｃ」）を使用して、膵臓上皮においてＫｒａｓ（「Ｋ」）およびｐ５３（「Ｐ」）に変異を作製する。ＫＰＣモデルは、（ｉ）頑強な炎症反応およびエフェクターＴ細胞の排除を含めた、ヒトＰＤＡにおいて観察される免疫微小環境の重要な特徴の多くを再現し、（ｉｉ）免疫療法の評価のための、最も広範囲にわたって研究されたＰＤＡの遺伝学的モデルであり、（ｉｉｉ）ＣＤ４０アゴニストおよび抗ＰＤＬ１抗体を含めたいくつかの免疫腫瘍学的薬物で処置されたＰＤＡ患者において見られる臨床的知見を再現してきた。このモデルはまた、患者における治療有効性の予測因子としての薬物のスクリーニングにおいても有用である。
【０３４０】
ＫＰＣマウスを、超音波によってスクリーニングしていつ腫瘍が生じるかを決定し、およそ８週齢で、腫瘍が検出された場合、研究に登録した。図２５Ａは、正常な膵臓を有する健康なマウスおよび「登録された」マウス（ＫＰＣ遺伝子操作マウス）における膵腫瘍の超音波画像を示す。マウスを処置群にランダムに割り当てた。マウスを、シクロホスファミドで処置し、ＴＣＲ−Ｔ細胞を受けたマウスには、メソテリン特異的Ｔ細胞（抗メソテリンＴＣＲ細胞または抗メソテリンＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍを形質導入した）およびメソテリンペプチドパルス化脾細胞のそれぞれ１０７個をシクロホスファミド後に注射した。登録の１４日後に開始して、Ｔ細胞／ＡＰＣ注入（シクロホスファミドは伴わない）を２週間ごとに繰り返し、合計３回の注入を行い、ＩＬ−２注射は伴わなかった。最終的なＴ細胞注入の２８日後に生存していたマウスについて、採血し、フローサイトメトリーを使用して遺伝子導入により標識されたＴ細胞を検出することによって移入Ｔ細胞の持続性を評価した。研究終了時に、マウスを、生存について評価し、ＩＡＣＵＣによって認可されたエンドポイント評価基準に従って安楽死させた。本実施例で使用した実験計画の要約を図２５Ｂに示す。
【０３４１】
Ｆａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞は、第３のＴ細胞注入の２８日後に血液中でのより高い持続性を示した（図２５Ｃ）。Ｆａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞を受けたマウスのすべて（１００％）がＴ細胞持続性を示したが、一方、ＴＣＲのみのＴ細胞は持続しなかった（図２５Ｃ）。メソテリン特異的ＴＣＲおよびＦａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞で処置したマウスの生存は、メソテリン特異的ＴＣＲのみのＴ細胞免疫療法よりも有意に改善された（マンテル・コックス検定、Ｐ＜０．０５；図２５Ｄ）。
【０３４２】
（実施例２６）
Ｆａｓ−４−１ＢＢ発現は、ＡＭＬのマウスモデルにおける養子免疫療法を増強する
実施例２４において固形腫瘍について示されたのと同様に、Ｆａｓ−４−１ＢＢ＋Ｔ細胞での処置は、液性腫瘍においても生存を改善する。マウスＡＭＬモデル（Teagueら、Nature Medicine、１２巻：３３５〜３４１頁、２００６年；Odaら、Blood、１３０巻：２４１０〜２４１９頁、２０１７年）において、ＦＢＬ細胞を注射し、５日間播種させた。５日目に、マウスを、Ｔ細胞１０６個を伴ってまたは伴わずに、シクロホスファミドで処置した。ＴＣＲ＋Ｆａｓ−４−１ＢＢｔｍで形質導入したＴ細胞を用いるとＴＣＲのみのＴ細胞と比較して生存が改善された（図２６）。
【０３４３】
本発明の具体的な実施形態は例示され、記載される一方で、上に記載の種々の実施形態をさらなる実施形態を提供するために組み合わせることができ、種々の変更を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることは容易に理解される。
【０３４４】
米国仮特許出願第６２／１２８，９７９号、同第６２／４７３，２８２号および同第６２／６２９，６６３号ならびにＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１０６４号を含むがそれに限定されない、本明細書で言及され、または出願データシートに示された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物のすべては、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いることが必要である場合、実施形態の態様を修正することができる。
【０３４５】
上記の詳細な説明に照らして実施形態についてこれらおよび他の変更を行うことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではないが、すべての可能な実施形態、加えてそのような特許請求の範囲により権利が与えられる均等物のすべての範囲を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示に限定されない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２−１】
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【図２−２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２−１】
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【図８−２−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１５−１０】
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【図１５−１１】
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【図１５−１２】
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【図１５−１３】
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【図１５−１４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
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【図２１−１０】
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【図２１−１１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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