(57)【要約】  本発明は、ウイルスベクターを使用して標的細胞に導入遺伝子を送達する分野、特に遺伝子治療の分野である。ウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子の経口投与を可能にする組成物を特定した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子を有するウイルス粒子を含む産物の経口投与を含む、患者の標的細胞に導入遺伝子を送達する方法。
【請求項２】
ウイルス粒子がアデノウイルス粒子である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
産物が腸溶コーティングをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
導入遺伝子が治療用タンパク質をコードする、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
治療用タンパク質がインスリン又はブチリルコリンエステラーゼである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
導入遺伝子が1つ以上の抗原をコードする、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
導入遺伝子が1つ以上のジカウイルス抗原をコードする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ジカウイルス抗原がエンベロープタンパク質(E)及び/又はNS1に由来する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
導入遺伝子が1つ以上の単純ヘルペスウイルス(HSV)、任意選択でHSV2、抗原をコードする、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
HSV抗原が糖タンパク質C(gC)、糖タンパク質D(gD)及び/又は糖タンパク質E(gE)に由来する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
導入遺伝子の発現が組織特異的プロモーターによって制御される、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プロモーターがグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
治療用タンパク質がインスリンであり、インスリンの発現がグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターによって制御される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
アデノウイルス粒子が
(a)ウイルス粒子、
(b)任意選択で1つ以上の糖並びに
(c)式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化１】
2020505335.tif 000007
(式中、
R1は、水素若しくはC1-6アルキルを表し、
R4は、水素を表し、又は
R1及びR4は、それらが結合する原子と一緒になってピロリジン環を形成し、
R2は、水素、C1-6アルキル又は-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3を表し、
R3は、C1-6アルキルを表す)
及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化２】
2020505335.tif 000008
(式中、
Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し、
Ra及びRbは、独立してC1-6アルキルを表し、
Rcは、カルボン酸アニオン及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1-6アルキルを表す)
を含む医薬組成物に配合される、請求項1から13の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
水溶液が式(I)の化合物若しくはその生理学的に許容される塩又は式(II)の化合物若しくはその生理学的に許容される塩を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
式(I)の化合物がN,N-ジ(C1-6アルキル)-、N,N,N-トリ(C1-6アルキル)-、若しくはN-C1-6アルキル-グリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
式(I)の化合物が、(a)N,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシン、若しくはN-メチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは(b)N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン、若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はその塩酸塩である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
式(I)の化合物がN,N-ジメチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項14又は15に記載の方法であって、
式(I)の化合物が式(IA)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、
【化３】
2020505335.tif 000009
(式中、R5及びR6は独立してC1-4アルキルを表し、R7はC1-4アルキル又は-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3を表す)
式(I)の化合物が式(IB)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、
【化４】
2020505335.tif 000010
(式中、R8及びR9は、独立してC1-4アルキルを表す)
式(II)の化合物が式(IIA)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、
【化５】
2020505335.tif 000011
(式中、Rc及びRdは、独立してC1-4アルキルを表す)又は
式(II)の化合物が式(IIB)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである、
【化６】
2020505335.tif 000012
(式中、Re及びRfは、独立してC1-4を表し、Rgはカルボン酸アニオン及びアミン部分で置換されたC1-4アルキルを表す)、方法。
【請求項２０】
式(I)又は(II)の化合物がジメチルスルホン、トリメチルグリシン、コカミドプロピルベタイン、プロリンベタイン若しくはS-メチル-L-メチオニン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項14、15又は19の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
(a)水溶液が1つ以上の糖を含み、式(I)若しくは(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.1mM〜2.5Mであり、糖濃度、又は2つ以上の糖が存在する場合、合計糖濃度が少なくとも0.01Mであり、或いは(b)式(I)若しくは(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.1mM〜3Mである、請求項15から20の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
式(I)若しくは(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が(a)0.001M〜2.5M、0.01M〜2.5M若しくは0.1M〜2M、又は(b)7mM〜1.5M若しくは0.07M〜0.7M、又は(c)7mM〜1.5M若しくは0.07M〜1M、又は(d)0.05M〜2M、0.02M〜2M若しくは0.07M〜1Mである、請求項15から20の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
水溶液が式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩及び式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項２４】
水溶液が、請求項13から15の何れか一項で定義される通りの式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩及び式(IIC)のスルホン化合物
【化７】
2020505335.tif 000013
(式中、Ra及びRbは、独立してC1-6アルキルを表す)である、式(II)の化合物を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記水溶液中の式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩の濃度が0.1〜1.5Mである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
式(IIC)のスルホン化合物がメチルスルホニルメタンである、請求項24又は25に記載の方法。
【請求項２７】
前記水溶液中の式(IIC)のスルホン化合物の濃度が0.1〜1.5Mである、請求項24から26の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
(a)糖濃度若しくは合計糖濃度が0.1M〜3M若しくは0.2M〜2Mであり、(b)溶液が少なくとも0.1Mの濃度で若しくは2つ以上の糖が存在する場合、合計糖濃度で1つ以上の糖を含み、又は(c)水溶液の糖濃度が0.05〜1Mである、請求項14から27の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が非還元糖又は糖アルコールを含む、請求項14から28の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
2つ以上の糖を使用し、糖のうちの1つがショ糖である、請求項14から29の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
その他の糖に対するショ糖の濃度の比が1:1〜20:1である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
その他の糖がラフィノースである、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３３】
組成物がマンニトールを含む、請求項14から31の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
マンニトールである1つの糖が存在し、又はショ糖及びラフィノースである2つの糖が存在する、請求項14から29の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
水溶液がショ糖又はマンニトールを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
組成物が0.2MのN,N-ジメチルグリシン、0.2Mのジメチルスルホン及び0.4Mのショ糖を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項３７】
組成物が乾燥粉末である、請求項14から36の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
組成物が錠剤又はカプセルの形態で患者に投与される、請求項14から37の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
錠剤又はカプセルが腸溶コーティングされる、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
導入遺伝子を有するウイルス粒子を含む医薬組成物を含む、患者に経口投与するための錠剤又はカプセル。
【請求項４１】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項40に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４２】
組成物が請求項14又は16から25の何れか一項で定義される通りの式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは請求項14、19から24、26又は27の何れか一項で定義される通りの式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに任意選択で1つ以上の糖、好ましくはショ糖を含む、請求項40又は41に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４３】
糖が請求項28から35の何れか一項で定義される通りである、請求項42に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４４】
組成物が0.2MのN,N-ジメチルグリシン、0.2Mのジメチルスルホン及び0.4Mのショ糖を含む、請求項40又は41に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４５】
導入遺伝子が治療用タンパク質をコードする、請求項40から44の何れか一項に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４６】
治療用タンパク質がインスリン又はブチリルコリンエステラーゼである、請求項45に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４７】
導入遺伝子が1つ以上の抗原をコードする、請求項40から45の何れか一項に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４８】
導入遺伝子が1つ以上のジカウイルス抗原をコードする、請求項47に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項４９】
導入遺伝子が、エンベロープタンパク質(E)及び/又はNS1に由来する1つ以上のジカウイルス抗原をコードする、請求項48に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５０】
導入遺伝子が1つ以上のHSV、任意選択でHSV2、抗原をコードする、請求項47に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５１】
導入遺伝子が、糖タンパク質C(gC)、糖タンパク質D(gD)及び/又は糖タンパク質E(gE)に由来する1つ以上のHSV抗原をコードする、請求項50に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５２】
導入遺伝子の発現が組織特異的プロモーターによって制御される、請求項40から51の何れか一項に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５３】
プロモーターがグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターである、請求項52に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５４】
治療用タンパク質がインスリンであり、インスリンの発現がグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターによって制御される、請求項53に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５５】
組成物を錠剤又はカプセルにパッケージする前に乾燥させる、請求項40から54の何れか一項に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５６】
腸溶コーティングでコーティングされる、請求項40から55の何れか一項に記載の錠剤又はカプセル。
【請求項５７】
患者への経口投与のための導入遺伝子を有するウイルス粒子を調製する方法であって、
(a)導入遺伝子を有するウイルス粒子を培養し、精製すること、
(b)ウイルス粒子を医薬組成物に配合すること、
(c)任意選択で組成物を乾燥させること、及び
(d)組成物を患者への経口投与のために錠剤又はカプセルにパッケージすることを含む方法。
【請求項５８】
ウイルス粒子がアデノウイルス粒子である、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
ウイルス粒子が請求項14から36の何れか一項に記載の組成物に配合される、請求項57又は58に記載の方法。
【請求項６０】
導入遺伝子が治療用タンパク質をコードする、請求項57、58又は59に記載の方法。
【請求項６１】
治療用タンパク質がインスリン又はブチリルコリンエステラーゼである、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
導入遺伝子が1つ以上の抗原をコードする、請求項57から60の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
導入遺伝子が1つ以上のジカウイルス抗原をコードする、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
導入遺伝子が、エンベロープタンパク質(E)及び/又はNS1に由来する1つ以上のジカウイルス抗原をコードする、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
導入遺伝子が1つ以上のHSV、任意選択でHSV2、抗原をコードする、請求項62に記載の方法。
【請求項６６】
導入遺伝子が、糖タンパク質C(gC)、糖タンパク質D(gD)及び/又は糖タンパク質E(gE)に由来する1つ以上のHSV抗原をコードする、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
導入遺伝子の発現が組織特異的プロモーターによって制御される、請求項57から66の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
プロモーターがグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターである、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
治療用タンパク質がインスリンであり、インスリンの発現がグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターによって制御される、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
錠剤又はカプセルが腸溶コーティングでコーティングされる、請求項57から69の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
導入遺伝子を有するウイルス粒子の経口投与を含む、患者の標的細胞に導入遺伝子を送達する方法に使用するためのウイルス粒子を含む産物。
【請求項７２】
ウイルス粒子がアデノウイルス粒子である、請求項71に記載の使用するための産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子、特に遺伝子治療の治療用タンパク質等の導入遺伝子を有するアデノウイルス粒子の経口投与に関する。本発明は、特に、導入遺伝子を有するウイルス粒子を含む産物を経口投与することによって、導入遺伝子を標的細胞に送達する方法に関する。本発明は、ウイルス粒子を含む医薬組成物をパッケージした、患者への経口送達に適したカプセル及び錠剤も提供する。本発明は、さらに、患者への経口投与のためのウイルス粒子を調製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスベクターは、遺伝子治療に、またワクチンとして外来抗原を発現するために広く使用されている。アデノウイルスベクターは他の種類のウイルスベクターを上回るいくつかの利点を有する。例えば、アデノウイルスは、充分研究されており、高力価の安定したストックに増殖することができ、分裂細胞と非分裂細胞の両方を効率的に形質導入することができ、大きいセグメントのDNAを保持することができる。現在、アデノウイルスベクターを使用した多くの遺伝子治療の試験が実施されており、その多くが癌治療に関係している。その他の研究では、アデノウイルスを使用して、遺伝子欠陥を修正するために治療用タンパク質を発現させた。これらの臨床試験のほとんど全てが、アデノウイルスベクターは安全で耐性に優れていることを示した。
【０００３】
多くのアデノウイルスベクターは修飾したバージョンのAd5(血清型5)であり、ベクターは自己複製能のある又は自己複製能のないかの何れかであり得る。自己複製能のないベクターは、概して、必須E1A及びE1B遺伝子を欠失させ、高いプロモーター活性を有する発現カセットによって置き換えられて、外来導入遺伝子の発現を駆動する。多くの自己複製能のないベクターは、また、E3領域及びE4領域を欠損している。別の種類の自己複製能のないアデノウイルスベクターは、ゲノムの多くが欠失しているが、複製起点及びビリオンにパッケージするのに必要とされる約500塩基対を保持する「ヘルパー依存性」ベクターである。これらのベクターは、必要とされる初期及び後期タンパク質を提供する、自己複製能のあるヘルパーアデノウイルスの存在下で構築、増殖する。ヘルパーアデノウイルスは、概して、ゲノムのパッケージングシグナルに隣接するloxP部位を有する。ベクターを産生するために使用される細胞株は、条件的に、ヘルパーアデノウイルスゲノムからloxP隣接パッケージングシグナルを切除するCreリコンビナーゼを発現し、ヘルパー依存性アデノウイルスゲノムの好ましいパッケージングを可能にする(例えば、McConnell及びImperiale (2004) Human Gene Therapy、1022-1033並びにVorburger及びHunt (2002) The Oncologist、7、46-59を参照のこと)。
【０００４】
自己複製能のないアデノウイルスベクターは、例えば、嚢胞性線維症膜貫通制御因子を発現する場合、鼻腔内に、又は気管支内カテーテルによって投与され、血管内皮増殖因子を発現する場合、心筋内又は骨格筋注射によって投与され、シトシンデアミナーゼを発現する場合、腫瘍内注射によって投与されてきた。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、アデノウイルス粒子を経口で投与し得ることを発見した。特に、本発明者らは、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターの制御下で、インスリンを有するアデノウイルス粒子が、糖尿病ラットに経口投与されると、グルコースレベルを減少させることができることを示した。アデノウイルス粒子は腸に上手く送達されただけでなく、驚くべきことに、細胞に進入し、治療用タンパク質を発現することができた。治療用タンパク質は、末梢循環で検出可能であることが分かった。
【０００６】
したがって、本発明は、導入遺伝子を有するウイルス粒子を含む産物の経口投与を含む、患者の標的細胞に導入遺伝子を送達する方法を提供する。
【０００７】
本発明は、また、導入遺伝子を有するウイルス粒子を含む医薬組成物を含む、患者に経口投与するための錠剤又はカプセルを提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、患者への経口投与のための導入遺伝子を有するウイルス粒子を調製する方法を提供し、前記方法は、
(a)導入遺伝子を有するウイルス粒子を培養し、精製すること、
(b)ウイルス粒子を医薬組成物に配合すること、
(c)任意に組成物を乾燥させること、及び
(d)組成物を患者への経口投与のために錠剤又はカプセルにパッケージすることを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プロインスリン発現又はGFP発現の何れかを駆動するグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーターを含むアデノウイルス構築物の経口投与についてin vivo評価した結果を示す。提示した結果は、投与前(-3日)又は投与後(1日目に対応する投与で3、5、8、10及び12日目)の尾静脈の血漿試料のグルコース評価についてである。データは逆変換調整ずみ平均であった(n=5〜6)。統計学的モデルの残差からSEMを計算した。データは、治療を因子として、並びに1日目の体重及びログ(-3日目)血漿グルコースを共変数として、一般線形モデルにより分析し、次にダネット検定を行った。ビヒクルに対する有意差は**p<0.01で提供される。
【図２】Ad5-CMV-BChEベクター感染後に細胞培養物(HEK293)の上清におけるブチリルチオコリン(BTC)ヨウ化物基質のin vitroの陽性ブチリルコリンエステラーゼ酵素活性を検出したことを示し、本質的にnul Ad5-CMV-GFPベクターが不在であった(両方ともカプセル化されていない)。
【図３】尾静脈血液(血漿試料)をサンプリングした(投与日(投与前)、投与後1日及び3日)、Brown Norwayラットに経口投与されたアデノウイルス賦形剤を配合したカプセルのin vivo評価を示し、それぞれのアデノウイルス賦形剤の配合用量レベルは、分光光度的に(OD260nm)測定して、2x10^10vp/カプセルであった。n=8の対象の個別の血漿試料のBCHeレベルは、DetectX(登録商標)ブチリルコリンエステラーゼ蛍光活性キット(K016-F1)によって測定し、酵素活性レベルの上昇(P<0.01)を投与の後3日後に検出した。
【図４】ジカウイルスでチャレンジされたときのIFNαβ-/-マウスの感染後最大3日の体重減少率を示す。ワクチン接種したマウスは、プラセボを投与したマウスより、体重減少の程度が低いことを示した(p=0.0003)。
【図５】ジカウイルスでチャレンジされたIFNαβ-/-マウスの眼圧を示す。ワクチン接種したマウスは、プラセボより保護された(p=0.016)。
【図６】ジカウイルスでチャレンジされた後のマウスのウイルス血症を示す。ワクチン(VAC)を3回投与した後のウイルス血症の減少が観察された。プラセボについての結果は「PLA」として示される。
【図７−１】ワクチンに対する免疫適格性のマウスの反応(抗体産生についての制御)を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】経口カプセルのベクターの2回の投与前に、感染性ジカウイルスチャレンジを受けた後のクロミミマーモセット(Callithrix penicillata)におけるウイルス血症の減少を示す。
【図９】ジカウイルスゲノムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
開示する産物及び方法の異なる適用が当該技術分野の特定の必要性に適合され得ることを理解されたい。本明細書で使用する用語は、本発明の特定の実施形態を記述するためだけにあり、限定することを意図していない。
【００１１】
さらに、本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、他に明白な記述がない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「1つのアミノ酸配列」は、2つ以上のこのような配列等を含む。
【００１２】
本明細書に引用される刊行物、特許、特許出願は全て、上記又は下記のものにかかわらず、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００１３】
導入遺伝子
本発明は、患者に導入遺伝子を送達する方法を提供する。特に、本発明は、導入遺伝子を患者の標的細胞に送達する方法を提供する。方法は、導入遺伝子を有するウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子の経口投与を含む。
【００１４】
導入遺伝子(又は異種遺伝子)は、本明細書で使用する場合、遺伝子操作によって細胞に導入されたポリヌクレオチドを指すことを意図する。導入遺伝子は、細胞によって自然に発現しない遺伝子であり得る。導入遺伝子は、また、細胞によって自然に発現する遺伝子であり得る。例えば、導入遺伝子は、タンパク質の自然発現を補足し得、又はタンパク質の発現の欠陥を修正し得る。
【００１５】
導入遺伝子は、概して、治療用タンパク質をコードする。本発明の方法は、概して、遺伝子治療の方法であり、核酸が患者の細胞に治療的に送達され、次に、疾患を治療するために、治療用タンパク質を発現する。治療用タンパク質は、例えば、ホルモン又は酵素であってもよい。
【００１６】
タンパク質及びペプチドを使用する治療法は、機能及び治療的適用に基づいて分類され得る(例えば、Leader等(2008) Nature Reviews Drug Discovery、7、21-39を参照のこと)。例えば、治療用タンパク質は、酵素活性又は調節作用を有し得る(グループ1)。グループ1の治療薬は、(内分泌又は代謝障害に関与することが多い)異常又は欠陥のあるタンパク質を置き換え、既存の経路を増加し(例えば、血液学的及び内分泌経路並びに免疫反応)、又は新しい機能若しくは活性を提供し得る。このカテゴリーのタンパク質の例として、アルブミン、インスリン、第VIII因子、第IX因子及びアンチトロンビンIII、膵酵素等の酵素、ラクターゼ、β-グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-αラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、ガルスルファーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びエリスロポエチン等のその他のタンパク質、ダルベポエチン-α、G-CSF、GM-CSF、インターロイキン11、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン並びに様々なインターフェロンが挙げられる。既存の経路を増加させる治療薬の例として、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子及びトリプシンが挙げられる。新しい機能又は活性を提供するタンパク質の例として、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン及びストレプトキナーゼが挙げられる。
【００１７】
グループ2の治療用タンパク質/ペプチドは、特異的標的活性を有し、分子若しくは生物を干渉し得、又はその他の化合物若しくはタンパク質を送達し得る。例えば、グループ2のタンパク質は、分子に結合し、その分子の機能を遮断し、破壊するために標的にし得、又はシグナル伝達経路を刺激し得る。例として、抗体ベースの薬剤及びFc融合タンパク質が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法において、治療用タンパク質はグループ1又はグループ2に位置し得る。言い換えれば、本発明において、治療用タンパク質は、異常又は欠陥のあるタンパク質を置き換え、既存の経路を増加し又は新しい機能若しくは活性を提供し得る。治療用タンパク質は、抗体又はFc融合タンパク質等の特異的標的活性も有し得る。
【００１９】
グループ3分子は、有害な外来薬剤に対して保護し、自己免疫疾患を治療し、又は癌を治療する(タンパク質ワクチン)。概して、グループ3分子は、ジカウイルス若しくは単純ヘルペスウイルス(HSV)(好ましくはHSV2)等の微生物又は腫瘍から生じた抗原成分を含む。本発明の方法において、治療用タンパク質はグループ3治療であってもよい。言い換えれば、治療用タンパク質は抗原であってもよい。
【００２０】
いくつかの場合では、導入遺伝子は、また、蛍光タンパク質又は外部走査装置によって検出され得るタンパク質等の診断薬をコードし得る。
【００２１】
ウイルスベクターは、しかし、好ましくは遺伝子治療ベクターである。ウイルスベクターは、抗原を発現するワクチンベクターであってもよい。
【００２２】
治療薬は、例えば、遺伝子治療で使用する場合、概して全長タンパク質である。治療薬は、また、機能的変異体、改変した形態又は全長の対応物の1つ以上の活性(好ましくは全ての活性)を保持する配列変異体であってもよい。
【００２３】
本発明において、治療用タンパク質は、当該治療用タンパク質をコードする核酸を患者に経口投与することで恩恵があり、ホルモン及び酵素を含んでいれば、特に限定されない。このようなタンパク質は、当業者の広く一般的な知識から周知され、例えば、インスリン、グルカゴンアンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド-1、レジスチン、レプチン、Acrp30、コレシストキニン、凝固因子(例えば、第VIII、IX又はX因子)、増殖因子(例えば、成長ホルモン、インスリン様増殖因子1、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、酸性及び塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β等)及び抗体(例えば、ヒト又はヒト化)が挙げられる。
【００２４】
治療用タンパク質をコードする付加的な導入遺伝子として、サイトカイン、インターフェロン(例えば、インターフェロン(INF)、INF-α  2b及び2a、INF-α  N1、INF-β  1b、INF-γ)、インターロイキン(例えば、IL-1〜IL-10)、腫瘍壊死因子(TNF-α、TNF-β)、ケモカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、ポリペプチドホルモン、抗微生物性ポリペプチド(例えば、抗細菌性、抗真菌性、抗ウイルス性及び/又は抗寄生虫ポリペプチド)、酵素(例えば、アデノシンデアミナーゼ)、ゴナドトロピン、ケモタクチン(chemotactin)、脂質結合タンパク質、フィルグラスチム、ヘモグロビン、エリスロポエチン、インスリン分泌性(insulinotropin)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、サルグラモスチム、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、神経突起成長因子(neurite growth factor)(NGF)フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、脳由来神経突起因子(brain-derived neurite factor)(BDNF)、神経突起成長因子(NGF)、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、トロンボポエチン(TPO)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、アデノシンデアミナーゼ、カタラーゼカルシトニン、エンドセリアン(endothelian)、L-アスパラギナーゼペプシン、ウリカーゼトリプシン、キモトリプシンエラスターゼ、カルボキシペプチダーゼラクターゼ(carboxypeptidase lactase)、スクラーゼ内因子(sucrase intrinsic factor)、カルシトニン副甲状腺ホルモン(PTH)様、ホルモン、可溶性CD4、並びにその抗体及び/又は抗原結合断片(例えばFAb)(例えば、orthoclone OKT-e(抗CD3)、GPIIb/IIaモノクローナル抗体)が挙げられる。
【００２５】
前述のように、導入遺伝子は、本発明を限定することを意図していない。当業者は、治療用タンパク質をコードする付加的な導入遺伝子を容易に想定することができる。
【００２６】
標的細胞は概して腸細胞である。腸は身体において最大の内分泌臓器であり、大量のタンパク質を産生することができ、分裂細胞が接近可能な素早く再生する組織を含有する。K細胞及び幹細胞等の標的細胞は、経口製剤のような非侵襲性遺伝子治療技術に容易に利用可能な上側の腸に主に位置する。したがって、K細胞等の腸細胞は、調整可能に、とりわけインスリン等のタンパク質、レプチン、グルカゴンアンタゴニスト、GLP-1、GLP-2、グレリン、コレシストキニン、成長ホルモン、凝固因子、抗体を分泌し、例えば、糖尿病、肥満、成長障害、及び粘膜組織にタンパク質を産生することで治療可能なその他の障害を治療する手段である。
【００２７】
本発明では、治療用タンパク質はインスリンが好ましい。したがって、本発明は、それを必要とする患者にインスリンをコードするアデノウイルス粒子を経口投与することを含む、糖尿病の治療方法を提供する。糖尿病に関連するその他の二次的障害又は病態も治療することができ、例えば、腎臓管石灰化、肝臓の変性、眼の損傷(糖尿病性網膜症)、糖尿病性足病変、潰瘍、過剰出血、創傷治癒の遅延、緩凝固、冠動脈心疾患のリスクの増加、卒中、心血管疾患、脂質異常症、高血圧及び肥満が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法を使用して、疾患又は病態を治療及び/又は予防することができる(言い換えれば、本発明の方法は、治療的又は予防的であり得る)。患者は、既に疾患/病態を有し得、又は疾患/病態を発症するリスクがあり得る。治療により、通常、対象の疾患/病態の重症度又は症状が、軽減又は予防される。治療により、疾患/病態の悪化を防ぎ、又は疾患/病態を逆転し得る。例えば、インスリンの送達により、血中グルコースが低下し、グルコース耐性が改善し、正常なグルコースホメオスタシスを提供し、又は前述のような病理組織学的な変化を予防、改善若しくは逆転し得る。
【００２９】
インスリンの配列は、適切な治療用インスリン配列であり得る。例えば、ヒトの患者である場合、インスリンは治療用ヒトインスリンであり得る。導入遺伝子は、例えば、グルコースを低下する能力を維持し、正常なグルコースホメオスタシスを提供し、又は慢性若しくは急性高血糖に関連する病理組織学的病態を減少させる全長インスリンのサブシーケンス、すなわち、その全長の対応物の1つ以上の活性を有する機能的サブシーケンスをコードする。このような配列は、当該技術分野において周知である。
【００３０】
本発明の方法を使用して投与に適した治療用タンパク質の別の例は、ブチリルコリンエステラーゼである。再度、ブチリルコリンエステラーゼの配列は、患者の(ブチリルコリンエステラーゼ欠陥を治療するための)治療的使用に適していれば限定されない。
【００３１】
本発明は、遺伝子編集ペイロード(CRISPR)等の遺伝子ペイロードの送達に使用することもできる。
【００３２】
前述のように、いくつかの例において、導入遺伝子/治療用タンパク質は、(すなわち、宿主の免疫反応を刺激するように設計された)抗原である。したがって、ウイルスベクターは、抗原を発現し、抗原が生じる(例えば微生物)によるチャレンジから宿主を保護するワクチンベクターであり得る。抗原は限定されないが、概して、ウイルスに由来し得る。免疫反応を刺激することができる抗原は、当該技術分野で公知である。
【００３３】
抗原は、ジカウイルスに由来してもよい。図9に示すように、ジカウイルスゲノムは様々なタンパク質をコードする。本発明のワクチンベクターは、これらのタンパク質を1つ以上発現し得る。概して、ワクチンベクターは、エンベロープタンパク質E及び/又はNS1を発現する。エンベロープタンパク質Eは、ウイルス粒子の直接認識に関与し、NS1は、病因に重要な役割を担うと考えられる。全長抗原配列又は全長配列の抗原領域(例えば、Eタンパク質の抗原領域又は完全Eタンパク質)の何れかを発現するようにベクターを設計してもよい。このような抗原は、容易に決定することができる。実施例で説明するように、このような抗原の発現は、CMVプロモーターの制御下にあり得る。当業者は、抗原の発現について、カセットを容易に設計することができる。
【００３４】
抗原は、また、単純ヘルペスウイルス(HSV)、好ましくはHSV2に由来してもよい。導入遺伝子は、免疫反応を刺激することができる適切なHSV抗原をコードし得る。様々なHSV抗原が当該技術分野で公知である。
【００３５】
例えば、糖タンパク質D(gD)は、ウイルス表面に発現し、抗体活性を中和する役割を担うことが知られている。その他のHSV糖タンパク質として、糖タンパク質C(gC)及び糖タンパク質E(gE)が挙げられる。導入遺伝子は、gD、gC及びgE(又はその組合せ)の何れかに由来する抗原をコードし得る。再度、導入遺伝子は、(当業者によって決定される適切な改変で)全長タンパク質又はタンパク質の抗原領域をコードする(すなわちそれらの発現をもたらす)ことができる。
【００３６】
導入遺伝子は、特に、gD、gC及びgEの全てに由来する抗原をコードすることができる(いくつかの例では、導入遺伝子は、gD、gC及びgEの全てをコードし得る)。例えば、導入遺伝子は、ポリタンパク質を発現し得る。
【００３７】
このようなHSV抗原の発現は、適切なプロモーターの制御下で起こり得、その他の適切な制御配列を含み得る。導入遺伝子によって発現されるポリタンパク質は、切断可能であってもよい(いくつかの例では、ポリタンパク質は、自己切断可能であり得る)。当業者は、このようなHSV抗原の発現について、適切なカセットを容易に設計することができる。
【００３８】
ウイルス粒子
以下でさらに検討するように、本発明は、概して、アデノウイルス粒子を使用して実施する。しかしながら、その他の適切なウイルスはアデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及びHSV等の腫瘍溶解性ウイルス並びにワクシニアウイルスである。治療的適用を有するウイルスは当該技術分野において周知である。
【００３９】
アデノウイルス粒子
本発明の方法は、概して、患者にアデノウイルス粒子を経口投与することを伴う。アデノウイルスは、基礎研究の主題として、並びに遺伝子治療及びワクチンに潜在的に使用するために、感染病原体として広く研究されている。多数のヒトアデノウイルス血清型が識別され、核酸の比較、繊維タンパク質の特徴及び生物特性に基づいて、6つの亜属(AからF)に分類される。例えば、グループAは、血清型12及び31を含み、グループBは血清型3及び7を含み、グループCは血清型2及び5を含み、グループDは、血清型8及び30を含み、グループEは、血清型4を含み、グループFは、血清型40及び41を含む。
【００４０】
一般的な構造において、これまでに調査されたアデノウイルスは全て、無エンベロープであり、直径約80ナノメートルの正二十面体である。アデノウイルスは、コアタンパク質で複合体化され、アデノウイルスカプシドによって取り囲まれる直鎖状の二重鎖DNAを含有する。個別のビリオンは、SDSゲルのサイズの小さい順に、ローマ数字(II〜XII)によって示される約11個の異なるタンパク質を含有する。
【００４１】
カプシドは、II(ヘキソン)、III(ペントン)、IIIa、IV(ファイバー)、VI、VII及びIXという7つの構造タンパク質から構成される。カプシドは252個のカプソメアを含み、そのうち240個がヘキソンカプソメアであり、12個がペントンカプソメアである。ヘキソンカプソメアは、ヘキソンタンパク質の三量体であり、カプシドのタンパク質の約75%を構成する。ペントンカプソメアは、ペントンタンパク質の五量体であり、ビリオンの12個の頂点のそれぞれに位置する。ペントンカプソメアはそれぞれ、6つの隣接するヘキソンカプソメア及びファイバーに結合する。ファイバーは、通常、繊維タンパク質の三量体であり、ペントンカプソメアから突出する。ヘキソンタンパク質及び程度は小さいが繊維タンパク質は、アデノウイルスの主要な抗原決定基を含み、また、血清型特異性を決定する。
【００４２】
研究者は、中和抗体が誘発されるタンパク質の領域を規定するために、異なるアデノウイルス血清型のカプシドタンパク質、特にヘキソンタンパク質の構造を調査し、比較した。中和抗体が向けられるヘキソンタンパク質の優勢な領域は、ループ1及び2に存在するように見え(すなわち、それぞれ、LI又はl1、及びLII又はl2)、ヘキソンカプソメアの塩基から外方向に突出する。異なるアデノウイルスヘキソンタンパク質からのループ1及び2の分析では、ヘキソンタンパク質が血清型間でかなり異なる位置に対応する7つの別個の高頻度可変領域(HVR1〜HVR7)の存在を明らかにした。
【００４３】
アデノウイルスビリオンのコアは、直鎖状の二重鎖DNAゲノム、随伴タンパク質V、VII、X(mu)、IVa2及び末端タンパク質(TP)を含有する。異なるアデノウイルスのゲノム機構は保存され、タイミング機能を有するように計画され、ゲノムの末端が最初に転写される(最初期の遺伝子E1及びE4が、直鎖状ゲノムの反対の末端に位置する)。E1及びE4の初期転写は、ゲノムの中心領域が開かれることを導き、中心領域の転写を可能にする。
【００４４】
アデノウイルスゲノムは、概して、8つのRNAポリメラーゼII転写ユニット:5つの初期ユニットE1A、E1B、E2A-E2B、E3及びE4、2つの遅延型初期ユニットIX及びIVa2、並びにMajor Late転写ユニットを含む。Major Late転写ユニットは、さらに、代替スプライシング部位の使用に基づいて、L1〜L5領域に細分される。転写ユニットは、類似の機能のタンパク質を発現することが多い。例えば、E1Aユニットは、細胞感染時にS期の転写及び誘導を活性化する役割を担う2つのタンパク質をコードし、E1B転写ユニットは、細胞アポトーシスを阻害する2つのタンパク質をコードし、E3転写ユニットは、免疫反応の回避に関与し、Major Late転写ユニットは、カプシドの構築に必要な構造タンパク質をコードする。
【００４５】
遺伝子治療及びワクチン接種のために、組み換えアデノウイルスベクターを、異種遺伝子及び抗原をコードし、発現するように設計した。Ad2及びAd5血清型は、この文脈で最も広く使用されてきた。異種配列を、初期転写ユニット並びにヘキソン、ペントン及びファイバー等の様々な構造タンパク質のコード領域におけるものを含むアデノウイルスゲノムに挿入した。多くの場合、アデノウイルスゲノムの(例えばE1領域における)欠失を使用して、複製欠損アデノウイルスベクターを作製し、このベクターは、概して、ヒト対象に投与するためにより安全であると考えられている。
【００４６】
本発明において、アデノウイルスは導入遺伝子を標的細胞に送達するのに適したアデノウイルスであってもよい。例えば、アデノウイルスは任意の血清型であり得るが、概してAd5である。「アデノウイルスベクター」という用語は、野生型、突然変異体、及び/又は組み換えアデノウイルスゲノム並びにそのようなゲノムを含むアデノウイルスを指す。アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型のゲノムの全て又は部分、並びにその組合せ(すなわち、ハイブリッドゲノム)を含み得る。
【００４７】
本発明に使用されるアデノウイルスベクターは、自己複製能のある又は自己複製能のあるかの何れかであり得る。このようなベクターは周知である。例えば、自己複製能のないベクターにおいて、E1領域は欠失し、異種導入遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーターを有する発現カセットに置き換えることができる。通常、E3領域も欠失する。E3の欠失は、E1領域により大きい挿入を可能にする。このようなベクターは、E1A及びE1Bタンパク質を保持し、発現するHEK293細胞等の適切な細胞株に増殖し得る。後世代のベクターもE4領域を欠損しており、いくつかのベクターはさらにE2領域を欠損している。E2及びE4ベクターは、E1、E4及びE2の欠失を補足する細胞株において増殖するに違いない。
【００４８】
ベクターは、また、ヘルパー依存性ベクターであってもよく、アデノウイルス遺伝子の多く又は全てを欠損しているが、末端逆位反復配列等のシス作用配列並びにゲノムをパッケージし、複製するために必要なパッケージング配列を保持している。これらのベクターは、ヘルパーアデノウイルスの存在下で増殖し、ベクターストックから取り除かれるに違いない。再度、このような系は当該技術分野で周知である。
【００４９】
本発明では、ベクターは、概して自己複製能のないベクターであるが(実施例で使用するE1/E3欠失ベクター等)、ベクターは、また、ヘルパー依存性又は自己複製能があり得る。自己複製能のあるベクターは周知である。当業者は、意図した適用に応じて適切なベクター系を容易に選択することができる。
【００５０】
導入遺伝子の発現は、適切なプロモーターへの操作可能な結合を介して駆動することができる。本発明で使用するベクターは、エンハンサー及び制御因子等のその他の適切な発現制御エレメントを使用してもよい。エンハンサーは、シス作用因子として広く規定され、プロモーター/遺伝子配列に操作可能に結合すると、その遺伝子配列の転写が増加する。エンハンサーは、その他の発現制御エレメント(例えば、プロモーター)より目的の配列からかなり離れた位置から機能することができ、目的の配列に対して何れかの方向に配置される場合、機能し得る。エンハンサーは、アデノウイルスを含むいくつかのウイルス源から同定されている。
【００５１】
アデノウイルスベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40ラージT抗原プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルスMajor Lateプロモーター(MLP)、マウス乳房腫瘍ウイルスLTRプロモーター又はSV40初期プロモーター等の高活性プロモーターを使用してもよい。
【００５２】
ベクターは、また、適切なプロモーターを使用して、例えば、標的細胞において必要な場合、導入遺伝子の発現をスイッチオンすることができる(組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーター)。プロモーターは、発現を設計する標的細胞に適合するように選択してもよい。
【００５３】
組織特異的プロモーターは、概して、その細胞種に特異的である転写アクチベータータンパク質又はその他の転写制御因子によって認識されるため、特定の細胞種で活性である。例えば、本発明では、プロモーターは、腸の内分泌細胞に対して導入遺伝子の発現を標的にすることができる(「腸内分泌細胞特異的プロモーター」)。
【００５４】
プロモーターは、導入遺伝子産物の活性から生じる刺激に反応して、導入遺伝子産物の転写ホメオスタシスを維持し得る。
【００５５】
導入遺伝子の発現は、好ましくは、腸内分泌細胞プロモーターの特定の例であるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドプロモーター(GIP)に操作可能に結合することで制御される。この構築物が内分泌細胞に導入される場合、コードされたタンパク質は、制御されて発現及び分泌される。GIPプロモーターは、消化器官のK細胞においてヒトインスリンの発現及び分泌を標的とすることが以前から示されている。最も好ましくは、インスリンの発現を制御するためにGIPプロモーターを使用する。
【００５６】
本出願の実施例は、Biol. Res. (2011) 44、301-305に記載の1.2kbのラットGIP挿入物を使用する。当業者は、適用に応じて適切なプロモーターを容易に選択することができる。
【００５７】
腸の内分泌細胞に対してタンパク質の発現を標的にするための組織特異的プロモーター及びエンハンサーのその他の例は、グルコキナーゼ、クロモグラニンA及びB、コレシストキニン、プログルカゴン、アデノシンデアミナーゼ、セクレチン、ガストリン、ソマトスタチン、モチリン並びにグレリンである。組織特異的発現制御エレメントは、その他の組織で活性であり得るが、その程度は、標的組織よりもかなり小さい。プロモーターは、栄養物に対する反応又は供給停止において、操作可能に結合された核酸の発現を増加又は減少させることもできる。このような栄養物調整可能エレメントも広く知られている。その他の発現制御エレメントは、構成的に活性であってもよく、又は細胞周期の特定のステージに発現してもよい。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「操作可能な結合」という用語、又はその文法的変化例は、意図したように機能することを可能にすると記載されるように、成分の物理的又は機能的並立を指す。核酸との操作可能な結合における発現制御エレメントの例では、その関係性は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようになっている。
【００５９】
ウイルス粒子を含む製剤
ウイルス粒子は、熱安定性を提供する賦形剤と配合される。
【００６０】
WO2011/121306は、凍結、凍結乾燥及び解凍によって生じる損傷に対して、ウイルス粒子を安定にすることができた製剤を開示している。また、長期安定性試験の間もウイルスの活性が維持された。
【００６１】
本発明では、ウイルス粒子は、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに任意に1、2つ以上の糖を含む組成物に配合され得る。ウイルス粒子は、概して、水溶液で、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに任意選択で1つ以上の糖に接触し、次いで、ウイルス粒子が存在する得られた溶液を乾燥して、ウイルス粒子を組み込んだ組成物を形成する。
【００６２】
したがって、ウイルス粒子は、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに任意選択で1つ以上の糖の水溶液と混合され得る。次いで、得られた溶液を乾燥して、ウイルス粒子を組み込んだ組成物を形成する。乾燥した組成物は、ケーキ又は粉末の形態であってもよい。必要であれば、ケーキは、粉砕して粉末にしてもよい。
【００６３】
ウイルス粒子は、乾燥ステップの前に、水溶液に保持される。このことは、ウイルス活性を過度に喪失することなく、乾燥ステップを実施することができる時間まで、水溶液を調製後も保管することを可能にする。
【００６４】
式(I)及び式(II)の化合物は、その生理学的に許容される塩又はエステルとして存在し得る。
【００６５】
塩は、概して、生理学的に許容される酸を有する塩であり、そのため、塩酸若しくは硫酸等の無機酸又はクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸若しくはメタンスルホン酸等の有機酸と共に形成される塩を含む。塩酸塩が好ましい。
【００６６】
エステルは、概して、C1-6アルキルエステル、好ましくはC1-4アルキルエステルである。エステルは、したがって、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はtert-ブチルエステルであってもよい。エチルエステルが好ましい。
【００６７】
本明細書で使用するように、C1-6アルキル基は好ましくはC1-4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。
【００６８】
疑義の生じるのを避けるために、式(I)及び式(II)の化合物の定義は、また、カルボン酸アニオンがプロトン化されて、-COOHになり、アンモニウム又はスルホニウムカチオンが薬学的に許容されるアニオンと結合する化合物を含む。さらに、疑義の生じるのを避けるために、前記の定義された化合物は、互変異性又は鏡像異性形態で使用されてもよい。
【００６９】
式(I)の化合物
概して、R1は、水素又はC1-6アルキルを表し、R4は水素を表す。概して、R2は、水素又はC1-6アルキルを表す。好ましくは、R1は、水素又はC1-6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2は、水素又はC1-6アルキルを表す。より好ましくは、R1は、水素又はC1-6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2はC1-6アルキルを表す。
【００７０】
好ましくは、式(I)の化合物は、N-C1-6アルキル-、N,N-ジ(C1-6アルキル)-若しくはN,N,N-トリ(C1-6アルキル)-グリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、より好ましくは、N,N-ジ(C1-6アルキル)-若しくはN,N,N-トリ(C1-6アルキル)-グリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。アルキル基は、概してC1-4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。
【００７１】
式(I)の好ましい化合物は、N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。N-メチルグリシンは、サルコシンとも呼ばれる。N,N-ジメチルグリシンは、ジメチルグリシン(DMG)又は2-(ジメチルアミノ)-酢酸とも呼ばれる。N,N,N-トリメチルグリシンは、トリメチルグリシン(TMG)と呼ばれる。式(I)の最も好ましい化合物は、DMGである。
【００７２】
或いは、式(I)の化合物は、概して、式(IA)のグリシン誘導体又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、
【００７３】
【化１】
2020505335.tif 000002
式中、R5及びR6は、独立して、C1-6アルキル、例えば、メチル又はエチル等のC1-4アルキルを表し、R7は、C1-6アルキル、例えば、メチル若しくはエチル等のC1-4アルキル又は-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3を表す。式(IA)の好ましい化合物は、トリメチルグリシン(TMG)及びコカミドプロピルベタイン(CAPB)又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。トリメチルグリシンが好ましい。
【００７４】
或いは、式(I)の化合物は、概して、式(IB)のプロリン誘導体又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、
【００７５】
【化２】
2020505335.tif 000003
式中、R8及びR9は、独立して、C1-6アルキル、例えば、メチル又はエチル等のC1-4アルキルを表す。好ましくは、式(IB)の化合物は、S-プロリン誘導体である。好ましくは、R8及びR9は、両方ともメチルを表し、この化合物は、プロリンベタインとして知られる。S-プロリンベタイン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルが特に好ましい。
【００７６】
【化３】
2020505335.tif 000004
【００７７】
式(IA)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルが好ましい。
【００７８】
好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。最も好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。
【００７９】
式(II)の化合物
概して、カルボン酸（carboxylate）及びRcのアミン置換基は、Rcアルキル部分の同炭素原子に結合する。概して、Rcは、C2-4又はC2-3アルキル部分である。
【００８０】
式(II)の化合物は、概して、式(IIA)のスルホン化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、
【００８１】
【化４】
2020505335.tif 000005
式中、Rc及びRdは、独立してC1-6アルキル、例えば、C1-4アルキルを表す。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。最も好ましいスルホン化合物は、メチルスルホニルメタン(MSM)であり、ジメチルスルホン(DMSO2)としても知られる。
【００８２】
式(II)の化合物は、式(IIB)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり得、
【００８３】
【化５】
2020505335.tif 000006
式中、Re及びRfは、独立して、C1-6アルキル、例えば、メチル又はエチル等のC1-4アルキルを表し、Rgは、カルボン酸アニオン及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1-6アルキル、例えば、メチル又はエチル等のC1-4アルキルを表す。好ましくは、カルボン酸塩及びアミン置換基は、同炭素原子に結合する。式(IIB)の好ましい化合物は、S-メチル-L-メチオニン(SMM)又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。
【００８４】
本発明では、式(I)の化合物は、DMG又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、式(II)の化合物は、MSM又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであることが最も好ましい。
【００８５】
糖
本発明の使用に適した糖として、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトース等の還元糖が挙げられ、好ましくはショ糖及びラフィノース等の非還元糖、より好ましくはショ糖が挙げられる。糖は、単糖、二糖、三糖又はその他のオリゴ糖であってもよい。「糖」という用語は、糖アルコールを含む。したがって、一実施形態において、非還元糖又は糖アルコールの使用が好ましい。
【００８６】
ガラクトース及びマンノース等の単糖、ショ糖、ラクトース及びマルトース等の二糖、ラフィノース等の三糖並びにスタキオース等の四糖が想定される。トレハロース、ウンベリフェロース、ベルバスコース、イソマルトース、セロビオース、マルツロース、ツラノース、メレチトース及びメリビオースも本発明の使用に適する。適切な糖アルコールは、マンニトールである。マンニトールを使用する場合、凍結乾燥で改善された外観のケーキを得ることができる。
【００８７】
糖の存在は、安定性の改善に作用し得る。糖の追加は、また、変化した凍結乾燥ケーキ、及び素早い再構成について改善された可溶性等のその他の利益を提供し得る。概して、凍結乾燥を使用する場合、1つ以上の糖が存在する。1つの糖を使用する場合、糖はショ糖又はマンニトールが好ましい。
【００８８】
2つ以上の糖を保存混合物に使用する場合、ウイルス活性の保存が特に効果的である。2、3又は4つの糖を使用してもよい。好ましくは、水溶液は、ショ糖及びラフィノースの溶液である。ショ糖は、グルコース及びフルクトースの二糖である。ラフィノースは、ガラクトース、フルクトース及びグルコースから構成される三糖である。
【００８９】
本発明では、式(I)の化合物は、好ましくは、DMG又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、式(II)の化合物は、好ましくは、MSM又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。組成物は、好ましくは、ショ糖も含む。
【００９０】
水性組成物のその他の成分
本発明では、ウイルス粒子、任意選択で1つ以上の糖並びに式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む水溶液は、概して乾燥させる。任意の適切な水溶液を使用してもよい。溶液は緩衝されてもよい。溶液は、HEPES、リン酸緩衝液、トリス緩衝液又は純水溶液であってもよい。
【００９１】
溶液は、2〜約12のpHを有してもよく、緩衝されてもよい。溶液は、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、ビシン緩衝液(すなわち、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン緩衝液)又はMOPS緩衝液(すなわち、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝液)で緩衝されてもよい。溶液は、NaClを含有しても、含有していなくてもよい。溶液は、したがって、saline sodium citrate(SSC)緩衝液であってもよい。
【００９２】
概して、ウイルス粒子の調製物は、保存混合物、すなわち、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは、式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに任意に1、2つ以上の糖の水溶液と混合する。保存混合物は、それ自体緩衝されてもよい。それは、HEPES、リン酸緩衝液、トリス緩衝液又は純水溶液であってもよい。
【００９３】
或いは、水溶液は、ウイルス粒子、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに任意選択で1つ以上の糖から概してなり得る、又は本質的になり得る。
【００９４】
式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに任意のそれぞれの糖の濃度は、通常の実験で測定することができる。そのため、最も安定性をもたらす最適化された濃度を選択することができる。式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルは、相乗的に作用して、安定性を改善し得る。
【００９５】
乾燥について水溶液に存在する場合、糖の濃度は、少なくとも0.01M、概して、飽和までである。概して、存在する糖の濃度は、少なくとも0.1M、少なくとも0.2M又は少なくとも0.5Mから飽和まで、例えば、室温での飽和又は3M、2.5M若しくは2Mまでである。したがって、糖の濃度は、例えば、0.1M〜3M又は0.2M〜2Mの範囲であってもよい。好ましくは、糖は存在する。或いは、糖の濃度又は2つ以上の糖が存在する場合の合計糖濃度は、0.08M〜3M、0.15M〜2M、又は0.2M〜1Mの範囲であり得る。適切な範囲は、0.05〜1Mである。
【００９６】
2つ以上の糖が存在する場合、好ましくは、それらの糖のうちの1つはショ糖である。ショ糖は、0.05M、0.1M、0.25M又は0.5Mから飽和まで、例えば、室温での飽和又は3M、2.5M若しくは2Mまでの濃度で存在し得る。
【００９７】
その他の糖のモル濃度に対するショ糖のモル濃度の比は、概して、1:1〜20:1、例えば、5:1〜15:1である。したがって、2つの糖が存在する場合、特にショ糖及びラフィノースが存在する場合、ショ糖のモル濃度の比は、概して、1:1〜20:1、例えば、5:1〜15:1、好ましくは約10:1である。
【００９８】
乾燥について水溶液中の式(I)の各化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、概して0.001M〜2.5M、より特定的には0.01M〜2.5Mの範囲である。例えば、濃度の範囲は、0.1M〜2.5Mであってもよい。
【００９９】
或いは、例えば、式(I)の化合物が、DMG又は塩若しくはエステルである場合、乾燥について水溶液中の式(I)の各化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、概して、0.1mM〜3M、又は1mM〜2Mの範囲である。濃度は、1mM〜1.5M又は5mM〜1M又は0.07M〜0.7Mであってもよい。好ましい濃度は、7mM〜1.5M又は0.07M〜1.2Mである。特に、式(I)の化合物がDMG等のN-アルキル化グリシン誘導体である場合、さらに別の好ましい範囲は0.5〜1.5Mである。
【０１００】
使用される式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの特定の濃度は、保存されるウイルス粒子の種類、使用される特定の化合物、1、2つ以上の糖が存在するかどうか、及び糖の個性並びに乾燥手順及び条件を含むいくつかの要因に依存する。したがって、
-  Xが-S(O)2-を表す式(II)の化合物、若しくはMSM等の式(IIA)の化合物、又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは、0.2mM〜1M、例えば、0.35mM〜1M、3.5mM〜0.5M、0.035M〜0.5M又は0.035M〜0.25Mである。
-  式(I)の化合物、又はTMG等の式(IA)若しくは式(IB)の化合物或いはその生理学的に許容される塩又はエステルの濃度は、好ましくは、0.01M〜2M、例えば、0.07M〜2M、0.2M〜1.5M、0.23M〜1.5M又は0.07M〜0.7Mの濃度で使用される。
-  Xが-S+(Rc)-を表す式(II)の化合物、若しくはS-メチル-L-メチオニン等の式(IIB)の化合物、又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは、0.005M〜2M、例えば、0.007M〜2M、0.02M〜2M、0.023M〜1.5M又は0.07M〜1Mである。
-  N,N-ジメチルグリシン(DMG)等の式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、糖が存在しない場合、5mM〜1.5M、又は70mM〜1.5M、若しくは〜1.2M、又は7mM〜1Mである。より好ましい濃度は、0.023M〜0.7M若しくは1M、又は0.07M〜0.7M若しくは1M、例えば約0.7Mである。
-  N,N-ジメチルグリシン(DMG)等の式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、1つ以上の糖が存在する場合、概して低く、1mM〜1M若しくは1.5M又は5mM〜1Mの範囲である。より好ましい濃度は、0.007M〜0.7M又は1M、例えば約0.007Mである。特に好ましい範囲は、0.5〜1.5Mである。
【０１０１】
式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルが存在する場合、好ましくは、N-アルキル化グリシン誘導体又はその塩若しくはエステル及び式(IIA)又は(IIC)のスルホン化合物が存在する場合、化合物は、相乗作用が生じる量で存在し得る。例えば、
-  乾燥について水溶液中のN-アルキル化グリシン誘導体又はその塩若しくはエステルの濃度は、概して、0.1mM〜3M又は1mM〜2Mの範囲である。濃度は、1mM〜1.5M又は5mM〜1Mであってもよい。好ましい濃度は、0.1M〜1.5M又は0.5M〜1.25Mである。
-  乾燥について水溶液中の式(IIA)又は(IIC)のスルホン化合物の濃度は、概して、0.1mM〜3M、1mM〜2M又は0.2mM〜1Mの範囲である。濃度は、0.1M〜1.5M又は0.5M〜1.25Mであってもよい。
【０１０２】
組成物は、当該技術分野で周知の抗酸化剤、潤滑剤及び結合剤等のその他の保存剤も含み得る。
【０１０３】
錠剤及びカプセル
本明細書に記載の医薬組成物は、水性懸濁液若しくは溶液又はトローチの形態で投与され得るが、概して、錠剤又はカプセルとして投与される。組成物は、また、ゼラチンウエハーとして投与され得る。錠剤はコーティングされていても、コーティングされていなくともよい。好ましくは、組成物は、ゼラチンカプセル等のカプセルに組み込まれる。
【０１０４】
薬学的に適合性のある結合剤、及び/又はアジュバント物質を経口製剤に含むことができる。錠剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分:結晶セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン等の結合剤、スターチ若しくはラクトース等の賦形剤、アルギニン酸、Primogel若しくはコーンスターチ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはSterotes等の潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤、ショ糖若しくはサッカリン等の甘味料、又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはフレーバー等の香味料の何れか、或いは類似する性質の化合物を含有することができる。
【０１０５】
カプセル及び錠剤は、概して腸溶コーティングされる。当業者は、当該技術分野で公知である方法を使用して送達される導入遺伝子に応じて、容易に適切な腸溶コーティングを選択及び適用することができる。例えば、腸溶コーティングは、十二指腸への送達を標的にし得る。このようなコーティング剤の例は、実施例で使用するように、ポリ(メタクリル酸-co-アクリル酸エチル)1:1コポリマーである。腸溶コーティングは、pH5.8〜6.8の閾値を有し得る。
【０１０６】
患者へのウイルス粒子の送達
患者は、概してヒトであるが、家畜動物、コンパニオンアニマル(イヌ又はネコ等)又は畜産動物(ヒツジ、ブタ、ウシ)等の動物でもあり得る。
【０１０７】
ウイルス粒子の投与は、予防目的又は治療目的の何れかでもよい。対象を治療するための用量又は「有効量」は、測定可能又は検出可能な範囲で、病態の症状の1つ、いくつか又は全てを改善するのに充分であることが好ましいが、障害若しくは病態、又は症状の進行又は悪化を予防する又は抑制することが満足のいく転帰になる。用量及び投与頻度は、治療対象の病態及び所望の転帰に依存し、当業者によって容易に確認することができる。適量は、所望される治療効果、及び個別の対象(例えば、対象、性別、年齢等のバイオアベイラビリティ)に依存する。例えば、対象の正常なグルコースホメオスタシスの部分的な回復は、インスリン注射から完全に解放されることにはならないが、インスリン注射の頻度を減少することができる。
【０１０８】
有効量は、関連の生理的影響を測定することによって確認することができる。例えば、糖尿病又はその他の高血糖病態の場合では、血中グルコースの減少又はグルコース耐性試験の改善を使用して、インスリンの量が高血糖病態を治療するのに有効であるかどうかを確認することができる。血友病の場合、有効量は、凝固時間又は対象の出血エピソードの頻度若しくは継続時間を減少させる量である。
【０１０９】
対象を治療する本発明の方法は、治療法の他の形態を補助することもできる。補助療法として、薬剤治療、食事の変化(低糖、低脂肪等)、外科手術的切除、移植、放射線療法等が挙げられる。例えば、高血糖病態を治療する本発明の方法は、対象のインスリンを増加する、又はグルコースを低下させる薬剤又はその他の医薬製剤と組み合わせて使用することができる。糖尿病を治療する薬剤として、例えば、ビグアナイド及びスルホニルウレア(例えば、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド及びグリピジド)が挙げられる。食欲抑制剤も周知であり、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。補助療法は、本発明の治療方法の前、同時、又は後に投与することができる。当業者は、本発明の治療方法と組み合わせてレジメンに使用され得る治療法を容易に確認することができる。
【０１１０】
本発明は、また、本発明のウイルス粒子を使用してジカウイルス感染症を予防及び/又は治療する方法を提供する。特に、ウイルス粒子は、ジカウイルス感染症を予防及び/又は治療するためのワクチンとして使用され得る。前述のように、ここではウイルスベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質E及び/又はNS1に由来するジカウイルス抗原を発現し得る。
【０１１１】
ジカウイルスワクチンの用量及び投与レジメンは、当業者によって容易に決定することができる。例えば、予防的ワクチンは、適切な間隔で、複数回(例えば、2回又は3回)投与してもよい。このような間隔は1週間に1回、又は2週間に1回であってもよい。例えば、予防的ワクチンは、(約14日間の間隔で)2週間に2回又は3回、約1回投与することができる。
【０１１２】
ウイルス粒子の調製方法
本発明はまた、患者への経口投与のためのウイルス粒子を調製する方法を提供する。方法は、概して、ウイルス粒子を培養し、精製すること、粒子を組成物に配合すること、任意に組成物を乾燥させること、及び患者への経口投与のために組成物を錠剤又はカプセルにパッケージすることを含む。
【０１１３】
導入遺伝子を有するウイルス粒子は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製することができる。例えば、標準的な分子生物学技術を使用して、導入遺伝子を発現するための遺伝子構築物を作製することができる。
【０１１４】
ウイルスは、培養した宿主細胞に使用するウイルス株を感染させ、ウイルスが培養細胞において複製するように感染を進行させることによって調製し得、ウイルスの回収及び精製について当該技術分野で公知である標準的な方法によって放出させることができる。適切な細胞として、ヒト胎児性腎臓(HEK)293細胞又はHEK293由来の細胞クローンが挙げられ、これらは、使用するアデノウイルスの種類に適している。細胞は、ウイルス粒子を産生する適切な条件下で培養され得る。
【０１１５】
例えば、本出願の実施例は、HEK293細胞においてウイルスを培養し、次に二重の塩化セシウム密度勾配遠心法により精製し、次に賦形剤製剤に脱塩カラム処理(例えば、PD-10)する。賦形剤製剤は前述している。
【０１１６】
概して、凍結乾燥、真空乾燥、流動層乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥を達成する。凍結乾燥が好ましい。材料中の水を減少させ、材料をバイアルに密封することよって、材料を容易に保管し、輸送し、後に元来の形態に再構成することができる。乾燥条件は、通常の実験によって適切に最適化することができる。
【０１１７】
乾燥時、ウイルス粒子を組み込んだ組成物が形成される。ウイルス粒子を組み込むマトリックスを産生する。組成物は、概して、非晶質固体である。したがって、固体マトリックス、概して非晶質固体マトリックスが、概して形成される。「非晶質」は、構造化されていない、観察可能な規則的又は繰り返しの分子の組織化を有しないことを意味する(すなわち、非結晶性)。
【０１１８】
糖は、存在する場合、乾燥した組成物に非晶質マトリックスを提供する。式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルは、糖マトリックスに分散する。式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルは、したがって、糖マトリックスに組み込まれる。ウイルス粒子も糖マトリックスに組み込まれる。したがって、乾燥手順は、例えば、凍結乾燥によって、実行して、ウイルス粒子が組み込まれる非晶質ケーキを形成することができる。
【０１１９】
水溶液が調製されるとすぐに又はまもなく、概して、乾燥ステップが実施される。或いは、水溶液は、概して、乾燥ステップの前に保管される。水溶液中のウイルス粒子は、保管中、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに任意選択で1つ以上の糖によって保存される。
【０１２０】
水溶液又はバルク中間溶液は、概して、最大5年、例えば、最大4年、3年、2年又は1年間保管される。好ましくは、溶液は、最大6か月間、より好ましくは、最大3か月間又は最大2か月間、例えば、1日〜1か月間又は1日〜1週間保管される。乾燥する前に、溶液は、概して、冷蔵庫又は冷凍庫に保管される。冷蔵庫の温度は、概して、2〜8℃、好ましくは4〜6℃、又は例えば約4℃である。冷凍庫の温度は、概して、-10〜-80℃、好ましくは-10〜-30℃、例えば、約-20℃である。
【０１２１】
溶液は、概して、密封容器、好ましくは、バッグ又はボトル等の密封不活性プラスチック容器に保管される。溶液は、概して無菌である。バルク中間溶液の容量は、0.1〜100l、好ましくは0.5〜100l、例えば、0.5〜50l、1〜20l又は5〜10lである。容器は、概して、0.1〜100l、好ましくは0.5〜100l、例えば、0.5〜50l、1〜20l又は5〜10lの容量を有する。
【０１２２】
保管したバルク中間溶液を凍結乾燥する場合、概して、乾燥ステップの前に、凍結乾燥のトレイに注ぐ。
【０１２３】
凍結乾燥の3つの主要なステージ、すなわち、凍結、一次乾燥及び二次乾燥がある。凍結は、概して、凍結乾燥機を使用して実施される。このステップでは、単純な結晶性産物の場合は、生物材料を共融点(Teu)未満に冷却し、又は、非晶質産物の場合は、ガラス遷移温度(Tg')未満に冷却し、すなわち、材料の固体相及び液相が共存することができる最低温度未満に冷却することが重要である。これは、融解より昇華が以下の一次乾燥ステージで生じることを確実にする。
【０１２４】
一次乾燥の最中、適切なレベルの真空を適用することによって圧力を制御し、水が昇華することができるほど充分な熱を供給する。材料中の水の少なくとも50%、概して60〜70%がこのステージで昇華する。一次乾燥は、熱のかけ過ぎによって生物材料の構造が崩壊又は変化する可能性があるので、ゆっくりと行ってもよい。コールドコンデンサー及び/又はコンデンサープレートは、水蒸気が再固化することによって閉じ込められる表面を提供する。
【０１２５】
二次乾燥工程において、水和の水が熱をさらに加えることによって取り除かれる。概して、圧力も低くして、さらなる乾燥を促す。凍結乾燥工程が終了した後、密封する前に、真空が窒素等の不活性ガスで壊れても、材料が真空下で密封されてもよい。
【０１２６】
特定の実施形態において、約1300Paの真空乾燥を使用して真空乾燥を実施する。しかしながら、真空乾燥は、本発明に必須ではなく、他の実施形態において、ウイルス粒子に接触する保存混合物を回転(すなわち、回転乾燥)させるか、又は凍結乾燥する。有利なことに、本発明の方法は、ウイルス粒子を含有する保存混合物を真空に供することをさらに含む。好都合には、真空は、20,000Pa以下、好ましくは、10,000Pa以下の圧力で適用される。有利なことに、真空は、少なくとも10時間、好ましくは16時間以上適用される。当業者に公知のように、真空の適用時間は、試料のサイズ、使用する機械及びその他のパラメーターに依存する。
【０１２７】
別の実施形態において、本発明の保存混合物と混合したウイルス粒子を噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥によって乾燥を達成する。これらの技術は、当業者に周知であり、気体、例えば、空気、無酸素ガス若しくは窒素、又は噴霧凍結乾燥の場合は液体窒素によって液体供給物を乾燥させる方法を伴う。液体供給物は、液滴の噴霧に微粒子化される。次いで、液滴を、乾燥室のガス又は液体窒素に接触させることによって、乾燥させる。
【０１２８】
さらなる実施形態において、保存混合物と混合したウイルス粒子を流動層乾燥によって乾燥を達成する。この技術は当業者に周知であり、概して、制御された速度条件下で、生成物層に気体(例えば、空気)を通して、流体化状態を作ることを伴う。この技術は、粒状生成物材料を乾燥、冷却、凝集、顆粒化及びコーティングするステージを伴い得る。流体ガス及び/又は流体層に浸漬されたその他の加熱面(例えば、パネル又は管)によって熱を供給してもよい。冷却ガス及び/又は流体層に浸漬された冷却面を使用して冷却を達成することができる。凝集及び顆粒化のステップは当業者に周知であり、達成される生成物の特性に応じて様々な方法で実施することができる。粉末、顆粒又は錠剤等の粒状生成物のコーティングは、制御された条件下で、流動粒子に液体を噴霧することで達成することができる。
【０１２９】
したがって、低残留水分量を有する組成物を得ることができる。冷蔵温度より高い温度、例えば40℃〜56℃の範囲以上、又は冷蔵温度より低い温度、例えば0〜-70℃の範囲以下で長期間保存するあるレベルの残留水分量が達成される。乾燥組成物は、そのため、10重量%以下、5重量%以下、2重量%以下、又は1重量%以下の残留水分量を有し得る。好ましくは、残留水分量は0.5%以上又は1%以上である。概して、乾燥組成物は、0.5〜10重量%、好ましくは、1〜5重量%の残留水分量を有する。
【０１３０】
組成物は、乾燥粉末形態で得ることができる。例えば、凍結乾燥から得られるケーキは、粉末形態に粉砕することができる。本発明に記載の固体組成物は、そのため、フリーフロー性の粒子の形態を取り得る。
【０１３１】
本発明では、粉末は、錠剤形態に圧縮され得る。錠剤は前述している。粉末もカプセルに充填され得る。再度、カプセルは前述している。
【０１３２】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【０１３３】
[実施例1]
2つのアデノウイルス(ヒトアデノウイルス5型(dE1/E3))構築物を標準的な分子生物学的技術によって調製した。第1のアデノウイルスは、INS(プロインスリン)発現を駆動するGIP(グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド)プロモーター(GIP-INSとして示す)を有していた。使用した配列は、Biol Res 44:301-305、2011及びNCBI参照配列(プロインスリン)NM_019129.2/3に記載の1.2kbのラットGIP挿入物であった。第2のアデノウイルスは、「null」eGFP(720bp、Gene. 1996;173(1 Spec No):33-8)構築物(GIP-GFPとして示す)を有し、増強した緑色蛍光タンパク質を発現した。GFPの発現は、インスリンカセットについて、同プロモーター系を使用して制御した。
【０１３４】
高力価のアデノウイルスストックをHEK293細胞のウイルス培養によって調製し、次に二重の塩化セシウム密度勾配遠心法により精製し、次に、以下の賦形剤製剤に脱塩カラム処理(例えば、PD-10)した:
-  N,N-ジメチルグリシン(DMG)(0.2M)、
-  メチルスルホニルメタン(MSM)(0.2M)及び
-  ショ糖(0.4M)。
【０１３５】
アデノウイルスを配合した最終賦形剤（final excipient formulated adenovirus）を凍結乾燥し、得られたケーキをスパチュラで粉末にし、その後、ブタゼラチンカプセルサイズ9(Torpac Inc. NJ、07006)に充填した。最後に、十二指腸に標的送達するために、当業者に公知の腸溶コーティング方法によってカプセルをコーティングした(ポリ(メタクリル酸-co-アクリル酸エチル)1:1コポリマー)。
【０１３６】
(経管栄養による)経口投与を行ったアデノウイルス賦形剤を配合したカプセルのin vivo評価は、STZ(35mg/Kg)誘発性の高脂肪食の糖尿病ラット(Cardiovascular Diabetology 2013 12:136)で実施し、1日目に対応する投与で投与前(-3日)及び投与後(3、5、8、10、12及び15日目)に、尾静脈血液(血漿試料)のグルコースを評価した。結果を図1に提示する。それぞれの経口投与アデノウイルス賦形剤の配合用量は、TCID50、HEK293細胞のCPEアッセイによって滴定して、経口投与の生きているウイルスの用量を定量化した。これらは、9.6E+07 TCID用量では-GIP-INS、1.6+07 TCID用量ではGIP-GFPであった。図1において、投与された全てのラットの糖尿病の状態は、正常レベル(約7mM)の約4倍の投与前(-3日)血中グルコースレベルによって示される。
【０１３７】
データは逆変換調整ずみ平均であった(n=5〜6)。統計学的モデルの残差からSEMを計算した。データは、治療を因子として、並びに1日目の体重及びログ(-3日目)血漿グルコースを共変数として、一般線形モデルにより分析し、次にダネット検定を行った。ビヒクルに対する有意差は**p<0.01で提供される。
【０１３８】
[実施例2]
BChE(ブチリルコリンエステラーゼ)発現を駆動するCMV(サイトメガロウイルス)プロモーターから構成されるアデノウイルス(ヒトアデノウイルス5型(dE1/E3))構築物を標準的な分子生物学的技術によって調製し、Ad5-CMV-BChEとして示した。NCBI参照配列:-ブチリルコリンエステラーゼNM_022942.1、ラット種を使用した。
【０１３９】
次に、高力価のアデノウイルスストックをHEK293細胞のウイルス培養によって調製し、次にアデノウイルスのクロマトグラフ、DMG(0.2M)/MSM(0.2M)/ショ糖(0.4M)賦形剤製剤への最終濃縮で精製した。アデノウイルスを配合した最終賦形剤を凍結乾燥し、得られたケーキを粉末にし、その後、ブタゼラチンカプセルサイズ9(Torpac Inc. NJ、07006)に手で充填した。最後に、十二指腸に標的送達するために、腸溶コーティングによってカプセルをコーティングした(ポリ(メタクリル酸-co-アクリル酸エチル)1:1コポリマー)。
【０１４０】
Ad5-CMV-BChEベクター感染後に細胞培養物(HEK293)の上清におけるブチリルチオコリン(BTC)ヨウ化物基質のin vitroの陽性ブチリルコリンエステラーゼ酵素活性を検出し、本質的にnul Ad5-CMV-GFPベクターが不在であった(両方ともカプセル化されていない)。結果を図2に示す。
【０１４１】
経口投与を行ったアデノウイルス賦形剤を配合したカプセルのin vivo評価は、Brown Norwayラットの尾静脈血液(血漿試料)をサンプリングして行い(投与日(投与前)、投与後1日及び3日)、それぞれのアデノウイルス賦形剤の配合用量レベルは、分光光度的に(OD260nm)測定して、2x10^10vp/カプセルであった。
【０１４２】
n=8の対象の個別の血漿試料のBCHeレベルは、DetectX(登録商標)ブチリルコリンエステラーゼ蛍光活性キット(K016-F1)によって測定し、投与の3日後に酵素活性レベルの上昇(P<0.01)を検出した。結果を図3に提示する。
【０１４３】
[実施例3]
ジカ抗原(E及びNS1)発現を駆動するCMVプロモーターから構成されるアデノウイルス(血清型5)構築物(dE1/E3)を調製し、Ad5_FP(E/NS1)_GWとして示した。高力価のウイルスストックをHEK293細胞のウイルス培養によって調製し、次に、賦形剤(0.4Mのショ糖、0.2MのDMG、0.2のMSM)と配合し、凍結乾燥した。得られたケーキ、粉末をブタゼラチンカプセルに充填し、次に、腸溶コーティングして、より低いGI送達を高めた。
【０１４４】
この生成物の試験を12IFNαβ-/-マウス試験で行った(6匹のマウスをワクチンで処置し、6匹のマウスをプラセボで処置した)。SV129マウスは、また、抗体の産生について免疫適格性対照としても使用した。
【０１４５】
マウスに、0、14及び28日目に経管栄養によって投与し、次にジカウイルスでチャレンジした(HS-2015-BA-01分離株、42日目に、尾静脈に4x105PFUを静脈内投与した)。体重、眼圧及び脳ウイルス血症を測定した。
【０１４６】
図4は、ウイルスチャレンジ後3日間のワクチンを投与したマウス及びプラセボを投与したマウスの体重減少率を示す(IFNαβ-/-マウスは、ジカウイルスのチャレンジで体重が減少したことが分かる)。ワクチンは保護を提供した(p=0.0003)。
【０１４７】
図5は、ワクチン接種したマウス及びプラセボを投与したマウスについて、ウイルスチャレンジの眼圧に及ぼす影響を示す。再度、ワクチン接種は保護を提供した(p=0.016)。
【０１４８】
次いで、図6は、脳、視神経及び精巣ウイルス血症を示す(49日目に記録)。プラセボ対照に関して、ウイルス血症量の減少により、保護効果が観察された。
【０１４９】
[実施例4]
クロミミマーモセットにおいて、経口ジカワクチンの試験を行った(免疫前対照の2匹、プラセボの2匹、ワクチン接種の2匹)。前述のようにワクチン製剤を調製し、腸溶コーティングされたカプセルに充填した(1用量につき2.1x108TCID50のワクチン及び2.5x108TCID50のプラセボ)。カプセルを製造後約1か月間、周囲温度で保管した。カプセルを0日目及び13日目に2回投与した。
【０１５０】
その後、動物にジカウイルスHS-2015-BA-01臨床分離株をチャレンジした(5x105PFU、27日目(ワクチンの最後の投与の14日後)に皮下投与した)。チャレンジ後、1、3、6、9及び12日目に血液を採取し、唾液及び尿を3、6、9及び12日目に採取した。
【０１５１】
図8は、チャレンジ後最大5日の相対ウイルス量を示す。ワクチンは、ジカウイルスの曝露前と同等の免疫を与えた。ワクチン接種群又は免疫前群ではジカウイルスは検出されなかった(LOD=4)。したがって、ワクチンは、周囲温度での保管1か月後でも有効であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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