(57)【要約】  １つまたは複数の目的の抗原の調節された弱毒化および／または調節された発現が可能である組み換え細菌を作製および使用するための組成物および方法が本明細書に記載される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌の組み換え誘導体であって：
ａ．第一の表現型を与える第一の糖によって調節される第一の遺伝子；
ｂ．第二の表現型を与える第二の糖によって調節される第二の遺伝子；および
ｃ．第三の表現型を与える第三の糖によって調節される第三の遺伝子；
を含み、
前記の第一、第二および第三の表現型は：
１．調節された遅延した弱毒化；
２．目的の抗原の調節された遅延した発現；
３．インビボでの調節された遅延した溶解；
４．Ｏ−抗原の調節された合成；
５．Ｏ−抗原側鎖の調節された合成；
６．膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）の調節された生産；
７．宿主ストレス状態に対する調節された上昇した生存；および
８．外膜小胞（ＯＭＶ）の調節された生産、
からなる群より選択される、
病原性細菌の組み換え誘導体。
【請求項２】
請求項１の細菌であって、
前記の第一の糖、第二の糖、および第三の糖は、それぞれ異なる糖である、
細菌。
【請求項３】
請求項２の細菌であって、
前記の第一の糖、第二の糖、または第三の糖の任意の１つは、異なる糖によって調節される遺伝子の調節を妨げない、
細菌。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一の糖は、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、およびマルトースからなる群より選択される、
細菌。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項の細菌であって、
前記の第二の糖は、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、およびマルトースからなる群より選択される、
細菌。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の細菌であって、
前記の第三の糖は、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、およびマルトースからなる群より選択される、
細菌。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一の遺伝子は、第一の糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている、
細菌。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項の細菌であって、
前記の第二の遺伝子は、第二の糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている、
細菌。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項の細菌であって、
前記の第三の遺伝子は、第三の糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている、
細菌。
【請求項１０】
請求項１の細菌であって、
遺伝子は、糖によって調節可能な表現型を与える糖含有分子の可逆的合成を可能にするように改変される、
細菌。
【請求項１１】
請求項１０の細菌であって、
前記の改変された遺伝子は、ｐｍｉである、
細菌。
【請求項１２】
請求項１０の細菌であって、
前記の改変された遺伝子は、ｇａｌＥである、
細菌。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、グラム陰性細菌である、
細菌。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、腸内細菌科ファミリーに属する、
細菌。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記表現型は、調節された遅延した弱毒化であり、前記表現型を与える遺伝子は、ｆｕｒである、
細菌。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記表現型は、目的の抗原の調節された遅延した発現であり、前記表現型を与える遺伝子は、目的の抗原をコードする、
細菌。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記表現型は、インビボでの調節された遅延した溶解であり、前記溶解は、ｓｉｆＡ遺伝子内の突然変異に起因して細胞基質内で生じることが可能である、
細菌。
【請求項１８】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記表現型は、Ｏ−抗原の調節された合成であり、前記表現型を与える遺伝子は、ｗａａＧ、ｒｆａＨ、ｗａａＪ、ｗｂａＰ、ｗｚｙ、ｗａａＰ、ｗａａＯ、ｗａａＦ、ｗａａＰ、ｗａａＣ、ｗａａＡ、ｗａａＬおよびｗｂａＰからなる群より選択される、
細菌。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記表現型は、膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）または外膜小胞の生産であり、前記表現型を与える遺伝子は、ｙｂｇＣ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＲ、ｔｏｌＢ、ｐａＩ、およびｙｂｇＦからなる群より選択される、
細菌。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記表現型は、Ｏ−抗原側鎖の調節された合成であり、前記表現型を与える遺伝子は、ｔｏｌＲである、
細菌。
【請求項２１】
請求項１から１４のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一の表現型は、調節されたＯ−抗原合成であり、前記の第二の表現型は、ＧＭＭＡまたは外膜小胞の生産である、
細菌。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されていない目的の抗原をコードする遺伝子をさらに含む、
細菌。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、内因性Ｏ−抗原合成遺伝子の欠失を含む、
細菌。
【請求項２４】
請求項２３の細菌であって、
前記の内因性Ｏ−抗原合成遺伝子内の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失を含む、
細菌。
【請求項２５】
請求項２３の細菌であって、
前記の内因性Ｏ−抗原合成遺伝子内の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失を含む、
細菌。
【請求項２６】
請求項２３から２５のいずれか一項の細菌であって、
前記Ｏ−抗原合成遺伝子は、ｗａａＬまたはｗｂａＰである、
細菌。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失を含む、
細菌。
【請求項２８】
請求項２７の細菌であって、
前記の内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失を含む、
細菌。
【請求項２９】
請求項２７の細菌であって、
前記の内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失を含む、
細菌。
【請求項３０】
請求項２７から２９のいずれか一項の細菌であって、
前記ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子は、ｐｍｉである、
細菌。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子内の欠失を含む、
細菌。
【請求項３２】
請求項３１の細菌であって、
前記の内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子内の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失を含む、
細菌。
【請求項３３】
請求項３２の細菌であって、
前記の内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子内の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失を含む、
細菌。
【請求項３４】
請求項３１から３３のいずれか一項の細菌であって、
前記内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子は、ｙｂｇＣ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＲ、ｔｏｌＢ、ｐａＩ、およびｙｂｇＦからなる群より選択される、
細菌。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一の遺伝子、第二の遺伝子および／または第三の遺伝子は、前記細菌内のプラスミド上に位置する、
細菌。
【請求項３６】
請求項１から３４のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一の遺伝子、第二の遺伝子および／または第三の遺伝子は、前記細菌内の染色体上に位置する、
細菌。
【請求項３７】
請求項７から９のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一、第二または第三の糖によって調節可能なプロモーターは、ラムノースによって調節可能なプロモーターである、
細菌。
【請求項３８】
請求項３７の細菌であって、
前記のラムノースによって調節可能なプロモーターは、ｒｈａＳＲ  ＰｒｈａＢＡＤである、
細菌。
【請求項３９】
請求項７から９のいずれか一項の細菌であって、
前記の第一、第二または第三の糖によって調節可能なプロモーターは、アラビノースによって調節可能なプロモーターである、
細菌。
【請求項４０】
請求項３９の細菌であって、
前記のアラビノースによって調節可能なプロモーターは、ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤである、
細菌。
【請求項４１】
請求項１から４０のいずれか一項の細菌であって、
内因性ｒｅｌＡ遺伝子内に欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項４２】
請求項４１の細菌であって、
前記の内因性ｒｅｌＡ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失である、
細菌。
【請求項４３】
請求項４１の細菌であって、
前記の内因性ｒｅｌＡ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失である、
細菌。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれか一項の細菌であって、
ＬａｃＩリプレッサーをコードする核酸をさらに含む、
細菌。
【請求項４５】
請求項４４の細菌であって、
前記ＬａｃＩリプレッサーは、ｌａｃＩ遺伝子によってコードされる、
細菌。
【請求項４６】
請求項４４または４５の細菌であって、
前記のＬａｃＩリプレッサーをコードする核酸は、前記細菌内のプラスミド上に位置する、
細菌。
【請求項４７】
請求項４４または４５の細菌であって、
前記のＬａｃＩリプレッサーをコードする核酸は、前記細菌内の染色体上に位置する、
細菌。
【請求項４８】
請求項１から４７のいずれか一項の細菌であって、
内因性Ｐｆｕｒプロモーター内に欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項４９】
請求項１５の細菌であって、
前記ｆｕｒ遺伝子は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている、
細菌。
【請求項５０】
請求項４９の細菌であって、
前記ｆｕｒ遺伝子は、前記細菌内のプラスミド上に位置する、
細菌。
【請求項５１】
請求項４９の細菌であって、
前記ｆｕｒ遺伝子は、前記細菌内の染色体上に位置する、
細菌。
【請求項５２】
請求項１から５１のいずれか一項の細菌であって、
アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子内に欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項５３】
請求項５２の細菌であって、
前記のアスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｓｄ遺伝子を含む、
細菌。
【請求項５４】
請求項５２または５３の細菌であって、
前記のアスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｓｄＡ遺伝子を含む、
細菌。
【請求項５５】
請求項１から５４のいずれか一項の細菌であって、
前記の目的の抗原をコードする遺伝子は、前記細菌内のプラスミド内に位置する、
細菌。
【請求項５６】
請求項５５の細菌であって、
前記プラスミドは、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸をさらに含む、
細菌。
【請求項５７】
請求項５６の細菌であって、
前記アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＡｓｄＡを含む、
細菌。
【請求項５８】
請求項５５から５７のいずれか一項のプラスミドであって、
前記プラスミドは、低コピー数プラスミドである、
プラスミド。
【請求項５９】
請求項５５から５７のいずれか一項のプラスミドであって、
前記プラスミドは、高コピー数プラスミドである、
プラスミド。
【請求項６０】
請求項５５から５９のいずれか一項の細菌であって、
前記プラスミドは、ｐＹＡ４５８９、ｐＹＡ４５９５、ｐＹＡ４７６３、ｐＧ８Ｒ１５、ｐＧ８Ｒ１６、ｐＧ８Ｒ１７、ｐＧ８Ｒ１８、ｐＧＲ１１１、ｐＧ８Ｒ１１２、ｐＧ８Ｒ１１３、およびｐＧ８Ｒ１１４からなる群より選択される、
細菌。
【請求項６１】
請求項１から６０のいずれか一項の細菌であって、
前記の目的の抗原をコードする遺伝子は、細菌内の染色体上に位置する、
細菌。
【請求項６２】
請求項１から６１のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、ｐａｇＬ遺伝子内の欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項６３】
請求項６２の細菌であって、
前記のｐａｇＬ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失である、
細菌。
【請求項６４】
請求項６２の細菌であって、
前記のｐａｇＬ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失である、
細菌。
【請求項６５】
請求項６４の細菌であって、
突然変異ΔｗａａＬ／ΔｐａｇＬ：：ＴＴ  ｒｈａＳＲ  ＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬを含む、
細菌。
【請求項６６】
請求項１から２１のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、リプレッサーによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結された目的の抗原をさらに含む、
細菌。
【請求項６７】
請求項６６の細菌であって、
前記プロモーターは、ラクトースによって調節可能なプロモーターである、
細菌。
【請求項６８】
請求項６７の細菌であって、
前記のラクトースによって調節可能なプロモーターは、ＬａｃＩによって調節可能なプロモーターである、
細菌。
【請求項６９】
請求項６５または６６の細菌であって、
前記のＬａｃＩによって調節可能なプロモーターは、Ｐｔｒｃ、Ｐｌａｃ、ＰＴ７ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ＰｏｍｐＡ  ｌａｃＯ、およびＰｌｐｐ  ｌａｃＯからなる群より選択される、
細菌。
【請求項７０】
請求項１から６９のいずれか一項の細菌であって、
前記の目的の抗原は、感染因子に由来する抗原である、
細菌。
【請求項７１】
請求項７０の細菌であって、
前記の目的の抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、プリオン、真菌、および蠕虫からなる群より選択される感染因子に由来する、
細菌。
【請求項７２】
請求項７１の細菌であって、
前記の目的の抗原は、細菌に由来する、
細菌。
【請求項７３】
請求項７２の細菌であって、
前記の目的の抗原は、サルモネラ抗原である、
細菌。
【請求項７４】
請求項７３の細菌であって、
前記のサルモネラ抗原は、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＣ１８０、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＦ、ＳｓｅＢ、およびＳｓｅＩの群から選択される、
細菌。
【請求項７５】
請求項７１の細菌であって、
前記の目的の抗原は、クロストリジウム細菌由来の抗原である、
細菌。
【請求項７６】
請求項７５の細菌であって、
前記抗原は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ抗原である、
細菌。
【請求項７７】
請求項７６の細菌であって、
前記抗原は、ＮｅｔＢ、ＰｌｃＣ、それらの抗原性フラグメント、前記抗原を含む融合タンパク質、または、抗原の抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を含む、
細菌。
【請求項７８】
請求項７１の細菌であって、
前記の目的の抗原は、ウイルス抗原である、
細菌。
【請求項７９】
請求項７８の細菌であって、
前記の目的の抗原は、インフルエンザ抗原である、
細菌。
【請求項８０】
請求項７９の細菌であって、
前記インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼである、
細菌。
【請求項８１】
請求項１から６９のいずれか一項の細菌であって、
前記の目的の抗原は、癌と関連する抗原である、
細菌。
【請求項８２】
請求項８１の細菌であって、
前記の癌と関連する抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＸＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＬＡＧＥ１、およびサバイビンからなる群より選択される、
細菌。
【請求項８３】
請求項７０から８２のいずれか一項の細菌であって、
前記抗原は、前記細菌における発現に関してコドン最適化された核酸配列によってコードされるタンパク質抗原である、
細菌。
【請求項８４】
請求項１から８３のいずれか一項の細菌であって、
ｓｉｆＡ遺伝子内の欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項８５】
請求項８４の細菌であって、
前記のｓｉｆＡ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失である、
細菌。
【請求項８６】
請求項８４の細菌であって、
前記のｓｉｆＡ遺伝子の欠失は、前記の遺伝子の全長の欠失である、
細菌。
【請求項８７】
請求項１７の細菌であって、
前記ｓｉｆＡ遺伝子は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている、
細菌。
【請求項８８】
請求項１から８７のいずれか一項の細菌であって、
ｒｅｃＦ遺伝子内の欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項８９】
請求項８８の細菌であって、
前記のｒｅｃＦ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失である、
細菌。
【請求項９０】
請求項８８の細菌であって、
前記のｒｅｃＦ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失である、
細菌。
【請求項９１】
請求項１から９０のいずれか一項の細菌であって、
ｒｅｃＪ遺伝子内の欠失をさらに含む、
細菌。
【請求項９２】
請求項９１の細菌であって、
前記のｒｅｃＪ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の部分的欠失である、
細菌。
【請求項９３】
請求項９１の細菌であって、
前記のｒｅｃＪ遺伝子の欠失は、前記遺伝子の全長の欠失である、
細菌。
【請求項９４】
請求項１から９３のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、サルモネラ属である、
細菌。
【請求項９５】
請求項１から９４のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ細菌である、
細菌。
【請求項９６】
請求項１から９５のいずれか一項の細菌であって、
前記細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｄｕｂｌｉｎ、または、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓである、
細菌。
【請求項９７】
請求項１から９６のいずれか一項の組み換え細菌、および薬学的に許容できる担体を含む、
医薬組成物。
【請求項９８】
対象において目的の抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
前記方法は、有効量の請求項９７の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１７年１月２３日に出願された米国仮出願番号６２／４４９，２２８および２０１７年８月４日に出願された米国仮出願番号６２／５４１，２９３に対する優先権を主張するものである。前述の出願のそれぞれの内容全体は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【０００２】
本出願に関する配列リストは、「Ｓｅｑ−Ｌｉｓｔ．ｔｘｔ」とラベルされて、２０１８年１月２３日に作成されたものであり、３１ＫＢである。配列リストの内容全体は、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所により授けられた助成金番号ＡＩ０９３３４８、ＡＩ０５６２８９およびＡＩ１２６７１２の下で政府支援によってなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
【背景技術】
【０００４】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａは、世界中のヒトにおいて非常に苦しめる疾患を引き起こす。Ｓ．ＴｙｐｈｉおよびＰａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、ＢおよびＣは、腸炎熱を引き起こし（１）、主な公衆衛生上の懸念である（２〜４）。Ｓ．Ｔｙｐｈｉは、世界的に毎年、２０６０万よりも多い事例、４３３，０００の死亡（５、６）、および、１２２０万の障害調整生存年（７）を生じさせると見積もられている。これらの血清型に加えて、非チフス性サルモネラ（ＮＴＳ）は、世界的に毎年９３８０万の事例および６８１，３００の死亡（１０、１１）によって、敗血症および髄膜炎のような侵襲性疾患の重要な原因としてますます認識されている（２、８、９）。ＮＴＳはまた、米国において食物由来の疾患からの入院および死の主な原因であり（１２）、１年あたり約１２０万事例の炎症性下痢疾患は、２３，０００の入院および４５０の死亡（１２、１３）をもたらし、若年死亡率、身体的障害、医療および生産コストが原因で、およそ３３１億ドルの経済的損失、および１６，７８２の質調整生存年の年間喪失（１４）を伴う。５才未満の子どものあいだで、ＮＴＳは、トップの細菌性病原体であり、４６７０の入院および３８の死亡をもたらす（１５）。米国におけるＮＴＳ疾患は、３つの血清型Ｂ、ＤおよびＣに属する血清型によって主に説明される（１６）。血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、およびＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇは、米国における最も一般的な大流行である（１７）。患者の大多数は、炎症性下痢によって特徴付けられる自己限定の胃腸炎を発症するが、ＮＴＳは全身性疾患も引き起こし得て、米国において主に免疫不全のヒトにおける、ウイルス、寄生虫または細菌と関連する食物由来の病気による死亡の単一の最も一般的な原因である（１８）。小児およびＨＩＶに感染した個体では、ＮＴＳは、高い死亡率と関連する全身性感染を頻繁に引き起こす（１９）。世界の多くの部分、とりわけサブサハラアフリカにおけるＡＩＤＳの上昇は、ＮＴＳと関係がある全身性感染の頻度における劇的な増大をもたらしている（２０、２１）。菌血症は最も重度の症候であり、病院に来る菌血症の子どもにおける死亡率は、ほぼ２５％であり得る（１８、２１）。腸炎熱およびＮＴＳは、多剤耐性のサルモネラの上昇のために抗生物質による治療がますます困難になり（２２、２３）、増大する数の治療できない事例の危険をもたらす（２４、２５）。
【０００５】
腸炎熱は、いくつかのワクチンによって予防され得る（２６、２７）。血清型ＴｙｐｈｉおよびＰａｒａｔｙｐｈｉの死滅全細胞製剤は、流行地での発生率を減少させるのに効果的であったが（２８）、頻繁な有害反応のために中止された（２９）。化学的突然変異誘発によって生産された、生きた弱毒化Ｓ．Ｔｙｐｈｉ株Ｔｙ２１ａは、血清型Ｔｙｐｈｉに対して３年まで、ほんの中程度のレベルの防御を与えるが、他の関連のある血清型には与えない（２９、３０）。さらなる遺伝子改変サルモネラ株が、いくらかの成功で臨床試験において試験されているが、それらのいずれも承認されていない。血清型Ｔｙｐｈｉの精製されたカプセル炭水化物Ｖｉは、Ｔｙｐｈｉおよび場合によりＰａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃに対して数年にわたって防御免疫を誘導するが、Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＢまたはＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対しては誘導せず、それらは全てこのカプセルがない（３１）。タンパク質抗原とＶｉのコンジュゲートは、腸炎熱に感染しやすい主な集団である幼児において免疫応答を改善する。
【０００６】
重要な血清型Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａをカバーするために、現行の試みは、Ｏ−抗原（リポ多糖（ＬＰＳ）の炭水化物部分）を、タンパク質抗原と結合させることに焦点を置いている（２７）。これらの２つの市販ワクチンは、旅行者ワクチン市場のために主に用いられて、普及のための新しいワクチンは１９９０年代以来、認可されていない（２６）。Ｓ．Ｔｙｐｈｉに対する３つのタイプのワクチンは現在市販されるが、残念ながら、Ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａに対して利用可能な認可されたワクチンは１つも存在せず、利用可能なＳ．Ｔｙｐｈｉワクチンによって提供される交差防御は、仮にあったとしても非常に小さい。家禽およびブタのような家畜において効果的なＮＴＳ血清型ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対するワクチンが存在するが（３２）、ヒトでは利用可能でない（３３）。このことは、既存の予防ストラテジーにおける重大な制限を表わす。したがって、全身性サルモネラ症に関する治療はますます困難になっていて、サルモネラに対する現行のワクチンは、中程度のレベルで、制限された持続時間の防御、および、臨床的に関連のある血清型の制限された適用範囲を提供するだけである。これらの状況は、改善されたサルモネラワクチンに関する緊急の医学的必要性を生じさせる。
【０００７】
ワクチンまたは異種抗原送達システムとしての組み換え弱毒化サルモネラワクチン（ＲＡＳＶ）の使用は、局所および遠位部位における全身性および粘膜免疫応答を刺激するそれらの能力および組み換えワクチン抗原を生産および提示するベクターとしての利点のため研究されている。ＲＡＳＶは、制限されないが、疾患、癌、慢性の呼吸器疾患、および心疾患を引き起こす病原体に対するワクチン接種を含む多数の適用のために用いられ得る。最近、調節された遅延した弱毒化ＲＡＳＶ（ＲＤＡ  ＲＡＳＶ）が、ＲＡＳＶおよび保有される防御抗原に対する免疫応答を高めるために開発されている。ＲＤＡ  ＲＡＳＶは、重要な病原性因子に関する遺伝子が、哺乳類宿主には見られないアラビノースによって誘導される誘導性プロモーターＰａｒａＢＡＤの制御下であるように改変される。ＲＤＡ  ＲＡＳＶは、病原表現型を仲介する遺伝子が発現されてＲＡＳＶが野生型の特性を示して宿主内に侵入するように、アラビノースの存在下で、インビトロで増殖する。病原遺伝子の発現は、インビボでアラビノースの不存在に起因して止まり、遺伝子産物は複製に起因して希釈されて、疾患を引き起こさずに、弱毒化された表現型を生じる。それらは完全な病原性で初めに複製するので、リンパ組織に、より高いレベルまでコロニー形成して、構成的に弱毒化されたＲＡＳＶよりも強力な免疫応答を誘発する。
【０００８】
調節された遅延したタンパク質合成（ＲＤＰＳ）もまた、免疫原性を高めるために開発されている。抗原合成レベルの増大は、同起源Ｔ細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用する機会を増大するのを助け、エフェクター分子の効果的な激増および生産およびＴ細胞激増をインビボでもたらす。しかしながら、高レベルの抗原合成は、株がエフェクターリンパ組織にコロニー形成する能力を損なう代謝要求を負わせる。ＲＡＳＶ細胞はインビボで増殖するので、ＲＤＰＳ系は、ＲＡＳＶがリンパ組織にコロニー形成した後にのみ組み換えワクチン抗原生産をする。このストラテジーは、弱毒化のモードによって影響されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
対象において免疫応答を生産するための生ワクチンとしての組み換えサルモネラの使用は有望であるが、生物は生きていて、時には病原である。したがって、細菌によって発現される抗原の発現を弱毒化および制御するために、細菌内に調節系を導入する必要がある。現在使用される弱毒化手段は、インビボで環境ストレスに感受性の生ワクチン株を作製する。その結果として、より少ない細菌が、望ましいレベルの免疫原性を達成するために宿主細胞にコロニー形成することが可能である。したがって、インビボで環境ストレスにより感受性でなく、より良好なレベルの免疫原性を達成するために宿主細胞にコロニー形成することのできる、生ワクチンとしての使用のために開発され得る組み換え微生物の新たな株に関する必要性が存在する。また、インビボで、生の弱毒化ワクチンの安全性を高めるための、新たな手段に関する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、サルモネラを含む組み換え細菌の株を提供して、それは、多数の病原性遺伝子および目的の抗原の発現を制御することによって、細菌の病原性表現型を、ならびに、調節された遅延した溶解表現型を、調節するために、３つの糖類に依存していて、生物学的抑制および免疫原性特性の増強を可能にする。１つまたは複数の糖類によって調節され得る他の属性は、米国特許出願公開番号２０１４／０３７００５７に記載されるように、酸耐性を含み（例えば経口免疫付与中）、その内容全体は、参照により本明細書中に明示的に援用される。３つの糖類に対する依存は、生物が自然発生環境において３つの糖類全てに出くわすことは有り得ないことを考慮すると、組み換え細菌の安全性を高める。驚くべきことに、本発明は、３つの別個の糖類が、カタボライト抑制による任意の他の糖の、糖による調節可能な活性において、いずれかの一方の糖の交差干渉もせずに、組み換え細菌の属性（例えば、目的の抗原をコードする遺伝子の発現、遅延した溶解表現型および／または病原性遺伝子発現）を調節するために成功的に用いられ得ることを示す。
【００１１】
生物は、効果的な防御免疫応答をマウントするために、対象への抗原性化合物の安全で非常に効率的な送達に関して用いられ得る。そのような組み換え細菌は、防御抗原を合成する細胞表面を操ることができ、多数のサルモネラ血清型に対して防御免疫応答を誘導することができる。組み換え細菌は、胃酸のような宿主防御ストレスに対する細菌の生存を高めるために；調節された遅延した弱毒化を与えるために；調節された遅延した溶解をインビボで与えるため（例えば、目的の抗原またはそれらをコードするＤＮＡワクチンの放出によるａｓｄＡおよびｍｕｒＡ遺伝子発現の制御による）；または、炭水化物および／またはタンパク質に対する炭水化物ポリマーの融合を可能にするために、用いられ得る。
【００１２】
特に、三重の糖によって調節される組み換え弱毒化サルモネラワクチン（ＲＡＳＶ）株が本明細書において開示される。これらの株は、多数の保存された防御サルモネラ表面／分泌抗原をそれらの天然コンフォメーションで送達して、多数の毒性の高いサルモネラ血清型に対する防御免疫を誘導する。例として、ＲＡＳＶは、保存された内側コアを曝露するために、マンノースによって調節されるＯ−抗原側鎖合成と組み合わせてラムノースによって調節されるＯ−抗原合成を、および、保存された外膜タンパク質（ＯＭＰ）の生産を高めるために、膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）または外膜小胞のアラビノースによって調節される生産を、インビボで有してよい。ＲＡＳＶは、２つのサルモネラ血清型、グループＢ  Ｓ．ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびグループＤ  Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓにおいて構築され得て、保存された免疫原遺伝子を発現して、抗サルモネラの体液性、細胞性、および粘膜性の免疫応答を最大化する。開示されるＲＡＳＶは、成功を高める他のＲＡＳＶとは異なる合理的な設計特性を有する。特に、開示されるＲＡＳＶは、安全かつ非常に効果的なサルモネラワクチンを低コストで提供して、ヒト用途のためのＳ．ＴｙｐｈｉまたはＳ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ＲＡＳＶを開発するために用いられ得る。
【００１３】
一態様では、本開示は：ａ．）第一の表現型を与える第一の糖によって調節される第一の遺伝子；ｂ．）第二の表現型を与える第二の糖によって調節される第二の遺伝子；およびｃ．）第三の表現型を与える第三の糖によって調節される第三の遺伝子を含む病原性細菌の組み換え誘導体を提供し；第一、第二および第三の表現型は：１．調節された遅延した弱毒化；２．目的の抗原の調節された遅延した発現；３．インビボでの調節された遅延した溶解；４．Ｏ−抗原の調節された合成；５．Ｏ−抗原側鎖の調節された合成；６．膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）の調節された生産；７．宿主ストレス状態に対する調節された上昇した生存；および８．外膜小胞（ＯＭＶ）の調節された生産からなる群より選択される。
【００１４】
一態様では、本開示は：ａ．）第一の表現型を与える第一の糖によって調節される第一の遺伝子；ｂ．）第二の表現型を与える第二の糖によって調節される第二の遺伝子；およびｃ．）第三の表現型を与える第三の糖によって調節される第三の遺伝子を含む病原性細菌の組み換え誘導体を提供し；第一、第二および第三の表現型は：１．調節された遅延した弱毒化；２．目的の抗原の調節された遅延した発現；３．インビボでの調節された遅延した溶解；４．Ｏ−抗原の調節された合成；５．膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）の調節された生産；６．宿主ストレス状態に対する調節された上昇した生存；および７．外膜小胞（ＯＭＶ）の調節された生産からなる群より選択される。
【００１５】
一実施態様では、第一の糖、第二の糖、および第三の糖は、それぞれ異なる糖である。一実施態様では、第一の糖、第二の糖、または第三の糖は、異なる糖によって調節される遺伝子の調節を妨げない。
【００１６】
一実施態様では、第一の糖は、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、およびマルトースからなる群より選択される。一実施態様では、第二の糖は、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、およびマルトースからなる群より選択される。一実施態様では、第三の糖は、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、およびマルトースからなる群より選択される。
【００１７】
一実施態様では、第一の遺伝子は、第一の糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている。一実施態様では、第二の遺伝子は、第二の糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている。一実施態様では、第三の遺伝子は、第三の糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている。
【００１８】
一実施態様では、遺伝子は、糖によって調節可能な表現型を与える糖含有分子の可逆的合成を可能にするように改変される。一実施態様では、改変された遺伝子は、ｐｍｉである。一実施態様では、改変された遺伝子は、ｇａｌＥである。
【００１９】
一実施態様では、細菌は、グラム陰性細菌である。一実施態様では、細菌は、腸内細菌科ファミリーに属する。
【００２０】
一実施態様では、表現型は、調節された遅延した弱毒化であり、その表現型を与える遺伝子はｆｕｒである。一実施態様では、表現型は、目的の抗原の調節された遅延した発現であり、その表現型を与える遺伝子は、目的の抗原をコードする。一実施態様では、表現型は、インビボでの調節された遅延した溶解であり、その溶解は、ｓｉｆＡ遺伝子内の突然変異に起因して、細胞基質内で生じることが可能である。一実施態様では、表現型は、Ｏ−抗原の調節された合成であり、その表現型を与える遺伝子は、ｗａａＧ、ｒｆａＨ、ｗａａＪ、ｗｂａＰ、ｗｚｙ、ｗａａＰ、ｗａａＯ、ｗａａＦ、ｗａａＰ、ｗａａＣ、ｗａａＡ、ｗａａＬおよびｗｂａＰからなる群より選択される。一実施態様では、表現型は、膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）または外膜小胞の生産であり、その表現型を与える遺伝子は、ｙｂｇＣ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＲ、ｔｏｌＢ、ｐａＩ、およびｙｂｇＦからなる群より選択される。
【００２１】
一実施態様では、表現型は、Ｏ−抗原側鎖の調節された合成であり、その表現型を与える遺伝子は、ｔｏｌＲである。一実施態様では、第一の表現型は、調節されたＯ−抗原合成であり、第二の表現型は、ＧＭＭＡまたは外膜小胞の生産である。
【００２２】
一実施態様では、細菌は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されていない目的の抗原をコードする遺伝子をさらに含む。
【００２３】
一実施態様では、細菌は、内因性Ｏ−抗原合成遺伝子の欠失を含む。一実施態様では、内因性Ｏ−抗原合成遺伝子内の欠失は、遺伝子の部分的欠失を含む。一実施態様では、内因性Ｏ−抗原合成遺伝子内の欠失は、遺伝子の全長の欠失を含む。一実施態様では、Ｏ−抗原合成遺伝子は、ｗａａＬまたはｗｂａＰである。
【００２４】
一実施態様では、細菌は、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失を含む。一実施態様では、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失は、遺伝子の部分的欠失を含む。一実施態様では、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失は、遺伝子の全長の欠失を含む。一実施態様では、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子は、ｐｍｉである。
【００２５】
一実施態様では、細菌は、内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子内の欠失を含む。一実施態様では、内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子内の欠失は、遺伝子の部分的欠失を含む。一実施態様では、内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子内の欠失は、遺伝子の全長の欠失を含む。一実施態様では、内因性ｔｏｌ−ｐａｌ系遺伝子は、ｙｂｇＣ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＲ、ｔｏｌＢ、ｐａＩ、およびｙｂｇＦからなる群より選択される。
【００２６】
一実施態様では、第一の遺伝子、第二の遺伝子および／または第三の遺伝子は、細菌内のプラスミド上に位置する。一実施態様では、第一の遺伝子、第二の遺伝子および／または第三の遺伝子は、細菌内の染色体上に位置する。
【００２７】
一実施態様では、第一、第二または第三の糖によって調節可能なプロモーターは、ラムノースによって調節可能なプロモーターである。一実施態様では、ラムノースによって調節可能なプロモーターは、ｒｈａＳＲ  ＰｒｈａＢＡＤである。
【００２８】
一実施態様では、第一、第二または第三の糖によって調節可能なプロモーターは、アラビノースによって調節可能なプロモーターである。一実施態様では、アラビノースによって調節可能なプロモーターは、ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤである。
【００２９】
一実施態様では、細菌は、内因性ｒｅｌＡ遺伝子内の欠失をさらに含む。一実施態様では、内因性ｒｅｌＡ遺伝子内の欠失は、遺伝子の部分的欠失である。一実施態様では、内因性ｒｅｌＡ遺伝子の欠失は、遺伝子の全長の欠失である。
【００３０】
一実施態様では、細菌は、ＬａｃＩリプレッサーをコードする核酸をさらに含む。一実施態様では、ＬａｃＩリプレッサーは、ｌａｃＩ遺伝子によってコードされる。一実施態様では、ＬａｃＩリプレッサーをコードする核酸は、細菌内のプラスミド上に位置する。一実施態様では、ＬａｃＩリプレッサーをコードする核酸は、細菌内の染色体上に位置する。
【００３１】
一実施態様では、細菌は、内因性Ｐｆｕｒプロモーター内の欠失をさらに含む。
【００３２】
一実施態様では、ｆｕｒ遺伝子は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている。一実施態様では、ｆｕｒ遺伝子は、細菌内のプラスミド上に位置する。一実施態様では、ｆｕｒ遺伝子は、細菌内の染色体上に位置する。
【００３３】
一実施態様では、細菌は、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子内の欠失をさらに含む。一実施態様では、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｓｄ遺伝子を含む。一実施態様では、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｓｄＡ遺伝子を含む。
【００３４】
一実施態様では、目的の抗原をコードする遺伝子は、細菌内のプラスミド内に位置する。一実施態様では、プラスミドは、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸をさらに含む。一実施態様では、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＡｓｄＡを含む。一実施態様では、プラスミドは、低コピー数プラスミドである。一実施態様では、プラスミドは、高コピー数プラスミドである。一実施態様では、プラスミドは、ｐＹＡ４５８９、ｐＹＡ４５９５、ｐＹＡ４７６３、ｐＧ８Ｒ１５、ｐＧ８Ｒ１６、ｐＧ８Ｒ１７、ｐＧ８Ｒ１８、ｐＧＲ１１１、ｐＧ８Ｒ１１２、ｐＧ８Ｒ１１３、およびｐＧ８Ｒ１１４からなる群より選択される。
【００３５】
一実施態様では、目的の抗原をコードする遺伝子は、細菌内の染色体上に位置する。
【００３６】
一実施態様では、細菌は、ｐａｇＬ遺伝子内の欠失をさらに含む。一実施態様では、ｐａｇＬ遺伝子の欠失は、遺伝子の部分的欠失である。一実施態様では、ｐａｇＬ遺伝子の欠失は、遺伝子の全長の欠失である。一実施態様では、突然変異は、ΔｗａａＬ／ΔｐａｇＬ：：ＴＴ  ｒｈａＳＲ  ＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬである。
【００３７】
一実施態様では、細菌は、リプレッサーによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結された目的の抗原をさらに含む。一実施態様では、プロモーターは、ラクトースによって調節可能なプロモーターである。一実施態様では、ラクトースによって調節可能なプロモーターは、ＬａｃＩによって調節可能なプロモーターである。一実施態様では、ＬａｃＩによって調節可能なプロモーターは、Ｐｔｒｃ、Ｐｌａｃ、ＰＴ７ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ＰｏｍｐＡ  ｌａｃＯ、およびＰｌｐｐ  ｌａｃＯからなる群より選択される。
【００３８】
一実施態様では、目的の抗原は、感染因子に由来する抗原である。一実施態様では、目的の抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、プリオン、真菌、および蠕虫からなる群より選択される感染因子に由来する。一実施態様では、目的の抗原は、細菌に由来する。一実施態様では、目的の抗原は、サルモネラ抗原である。一実施態様では、サルモネラ抗原は、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＣ１８０、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＦ、ＳｓｅＢ、およびＳｓｅＩの群から選択される。一実施態様では、目的の抗原は、クロストリジウム細菌由来の抗原である。一実施態様では、抗原は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ抗原である。一実施態様では、抗原は、ＮｅｔＢ、ＰｌｃＣ、それらの抗原性フラグメント、前記抗原を含む融合タンパク質、または、抗原の抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を含む。
【００３９】
一実施態様では、目的の抗原は、ウイルス抗原である。一実施態様では、目的の抗原は、インフルエンザ抗原である。一実施態様では、インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼである。
【００４０】
一実施態様では、目的の抗原は、癌と関連する抗原である。一実施態様では、癌と関連する抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＸＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＬＡＧＥ１、およびサバイビンからなる群より選択される。
【００４１】
一実施態様では、抗原は、前記細菌における発現に関してコドン最適化された核酸配列によってコードされるタンパク質抗原である。
【００４２】
一実施態様では、細菌は、ｓｉｆＡ遺伝子内の欠失をさらに含む。一実施態様では、ｓｉｆＡ遺伝子の欠失は、遺伝子の部分的欠失である。一実施態様では、ｓｉｆＡ遺伝子の欠失は、遺伝子の全長の欠失である。一実施態様では、ｓｉｆＡ遺伝子は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されている。
【００４３】
一実施態様では、細菌は、ｒｅｃＦ遺伝子内の欠失をさらに含む。一実施態様では、ｒｅｃＦ遺伝子の欠失は、遺伝子の部分的欠失である。一実施態様では、ｒｅｃＦ遺伝子の欠失は、遺伝子の全長の欠失である。
【００４４】
一実施態様では、細菌は、ｒｅｃＪ遺伝子内の欠失をさらに含む。一実施態様では、ｒｅｃＪ遺伝子の欠失は、遺伝子の部分的欠失である。一実施態様では、ｒｅｃＪ遺伝子の欠失は、遺伝子の全長の欠失である。
【００４５】
一実施態様では、細菌は、サルモネラ属である。一実施態様では、細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ細菌である。一実施態様では、細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｄｕｂｌｉｎ、または、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓである。
【００４６】
別の態様では、本明細書に開示される組み換え細菌および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が、本明細書において開示される。
【００４７】
別の態様では、対象において目的の抗原に対する免疫応答を誘発する方法が、本明細書において開示されて、その方法は、有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
【００４８】
本発明の他の態様および反復は、以下により十分に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】目的の遺伝子への糖調節カセットの融合を、その目的の遺伝子に関するネイティブのプロモーターの置換のために生産するために、自殺ベクター誘導体の構築を可能にするための、糖によって調節されるカセットａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ、ｒｈａＲＳ−ＰｒｈａＢＡＤおよびｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡを含む３つのベクターを示す。
【図２】ＧＦＰ合成が、３つの異なる糖類によって調節される、３つのプラスミドを示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、ガラクトース非感受性突然変異Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１を示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、および４Ｈは、異なる濃度のガラクトースを含む栄養ブロスにおける、異なるｇａｌＥ突然変異を有するサルモネラ株の増殖曲線を示す。
【図５】ｇａｌＥ突然変異体のコロニー形成を示す。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、６Ｉ、６Ｊ、６Ｋ、６Ｌ、６Ｍ、６Ｎ、６Ｏ、６Ｐ、６Ｑ、および６Ｒは、前述の異なる糖濃度を含む増殖培地における２４時間のサルモネラ株χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）およびχ３７６１の増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残部に照らして、当業者によって理解されるとおりに読まれるべきである。別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明にわたって示される。
【００５１】
本明細書において用いられる用語「組み換え細菌」は、そのネイティブの状態から遺伝子改変されている細菌細胞を指す。例えば、組み換え細菌は、１つまたは複数のヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再配列、およびヌクレオチド改変を含んでよい。これらの遺伝子改変は、細菌の染色体内に導入されてよく、またはあるいは、染色体外核酸（例えばプラスミド）上に存在してよい。本開示の組み換え細菌は、プラスミド上に位置する核酸を含んでよい。あるいは、組み換え細菌は、細菌の染色体内に位置する（例えば、安定してその中に組み込まれる）核酸を含んでよい。一部の実施態様では、組み換え細菌は、弱病原性である。一部の実施態様では、組み換え細菌は、低減された病原性を示す。一部の実施態様では、組み換え細菌は、非病原性である。一部の実施態様では、組み換え細菌は、病原性である。一部の実施態様では、組み換え細菌は、弱毒化される。別の実施態様では、組み換え細菌は、病原性細菌の組み換え誘導体である。
【００５２】
本明細書において用いられる用語「遺伝子」は、タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸フラグメント、または、機能的または構造的ＲＮＡ分子を指し、核酸のコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を任意選択で含んでよい。一部の実施態様では、「遺伝子」は、コード配列の前および後の調節配列を含まない。
【００５３】
一実施態様では、遺伝子は、異種遺伝子である。別の実施態様では、核酸は、異種核酸である。本明細書において用いられる用語「異種遺伝子」または「異種核酸」は、通常、野生型細胞（例えば細菌）において天然に見られない、組み換え細胞（例えば細菌）内に存在する遺伝子または核酸配列を指す。一部の実施態様では、異種遺伝子または異種核酸は、所定の細胞内に外因的に導入される。一部の実施態様では、異種遺伝子は、非ネイティブの宿主細胞内に導入された、遺伝子またはそのフラグメントを含んでよい。一部の実施態様では、用語「異種遺伝子」は、対応するネイティブ遺伝子に加えて宿主細胞内に導入されている、ネイティブの遺伝子の第二のコピー、またはそのフラグメントを含む。異種核酸はまた、一部の実施態様では、所定の細胞内に天然に見られるが天然でない量の核酸および／またはそれがコードするポリペプチドを発現するために、例えば異なるプロモーター配列による調節によって改変されている遺伝子配列；および／または、天然には互いに対して同一の関係で見られない２以上の核酸配列も含んでよい。
【００５４】
本明細書において用いられる用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノム（例えば、細菌の染色体）内のその天然の位置に存在するネイティブの遺伝子を指す。
【００５５】
本明細書において用いられる「プロモーター」は、コード配列または遺伝子の発現を制御することが可能な核酸配列を指す。プロモーターは、発現をさらに高めるため、および／または、核酸の空間的発現および／または時間的発現を変更するための、１つまたは複数の特定の転写調節配列を含んでよい。例えば、プロモーターは、転写アクチベータータンパク質（例えば、エンハンサーエレメント）、転写リプレッサータンパク質、ポリメラーゼなどによって特異的に認識される１つまたは複数の核酸を含んでよい。本明細書において用いられる用語「動作可能に連結される」は、核酸配列の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、核酸配列の５’（上流）に、その制御下で位置してよい。プロモーターと発現される核酸配列との間の距離は、そのプロモーターとそれが制御するネイティブ核酸配列との間の距離とだいたい同じであってよい。当技術分野で知られているように、この距離における変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。本明細書に記載のプロモーターの核酸配列は当技術分野で知られていて、これらのプロモーターを遺伝子（例えば、リプレッサーをコードする遺伝子）に動作可能に連結する方法は当技術分野で知られている。
【００５６】
一部の実施態様では、本明細書に記載の使用のためのプロモーターは、糖によって直接的または間接的に調節され得る。例えば、一部の実施態様では、プロモーターは、アラビノースのレベルに応答性であり、他の方法では本明細書において「アラビノースによって調節可能なプロモーター」と呼ばれる。一般的に言えば、アラビノースは、細菌のインビトロでの増殖中に存在してよく、一方で、典型的に宿主組織は存在しない。一実施態様では、プロモーターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のａｒａＣ−ＰａｒａＢＡＤ系に由来する。ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ系は、厳密に調節された発現系であり、低レベルのアラビノースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして作用することが知られている。ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターは、一方向でａｒａＢＡＤ核酸配列および他の方向でａｒａＣ核酸配列の発現を制御している双方向性のプロモーターである。
【００５７】
便宜のために、ａｒａＢＡＤ核酸配列の発現を仲介して、ａｒａＣ核酸配列産物によって制御される、ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターの部分を、本明細書においてＰａｒａＢＡＤと呼ぶ。本明細書に記載の使用のために、ａｒａＣ核酸配列およびａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターを有するカセットが用いられ得る。このカセットは、本明細書において、ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤと呼ばれる。ＡｒａＣタンパク質は、ＰａｒａＢＡＤのポジティブおよびネガティブの両方のレギュレーターである。アラビノース存在下では、ＡｒａＣタンパク質は、ＰａｒａＢＡＤからの発現を可能にするポジティブの調節エレメントである。アラビノースの不存在下では、ＡｒａＣタンパク質は、ＰａｒａＢＡＤからの発現を抑制する。他の腸溶性細菌は、例えばＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含むＥ．ｃｏｌｉ由来のａｒａＣ−ａｒａＢＡＤ系と相同のアラビノース調節系を含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｒａＣタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰａｒａＢＡＤを活性化するだけであり（アラビノース存在下）、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＰａｒａＢＡＤを活性化しない。したがって、アラビノースによって調節されるプロモーターは、プロモーターおよびオペロンが２つの異なる種の細菌から得られたとしても、２つの間で実質的に干渉せずに、同様のアラビノースオペロンを保有する組み換え細菌において用いられ得る。一般的に言えば、発現を誘導するのに必要なアラビノースの濃度は、典型的に、培養培地中に約２％（ｗ／ｗ）未満である。一部の実施態様では、濃度は、培養培地中に約１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、または０．０５％（ｗ／ｗ）未満である。他の実施態様では、濃度は、０．０５％またはそれ未満、例えば約０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％（ｗ／ｗ）である。例示的な実施態様では、濃度は、培養培地中に約０．０５％（ｗ／ｗ）である。
【００５８】
他の実施態様では、プロモーターは、環境中のマルトースのレベルに対して応答性であってよく、他の方法では本明細書において、「マルトースによって調節可能なプロモーター」と呼ばれる。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、マルトースを含む培地中で培養される。ｍａｌＴ遺伝子は、ＭａｌＴという、４つのマルトース応答性プロモーター（ＰＰＱ、ＰＥＦＧ、ＰＫＢＭ、およびＰＳ）のポジティブのレギュレーターをコードする。ｍａｌＴとｍａｌプロモーターの組み合わせは、マルトースの存在下で誘導される強力なプロモーターとして作用することが知られている厳密に調節された発現系を作製する。ａｒａＣ−ＰａｒａＢＡＤ系とは異なり、ｍａｌＴ発現は、他のｍａｌプロモーターと機能上関係のないプロモーター（すなわち、ＰＴ）によって調節される。ＰＴは、ＭａｌＴによって調節されない。ｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターは、一方向でｍａｌＫＢＭ核酸配列、および、他の方向でｍａｌＥＦＧ核酸配列の、発現を制御する双方向性のプロモーターである。便宜のために、ｍａｌＫＢＭ核酸配列の発現を仲介して、ＭａｌＴによって制御される、ｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターの部分を、本明細書においてＰＫＢＭと呼び、ｍａｌＥＦＧ核酸配列の発現を仲介して、ＭａｌＴによって制御される、ｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターの部分を、本明細書においてＰＥＦＧと呼ぶ。ＰＫＢＭの完全な誘導は、ＰＥＦＧのＭａｌＴ結合部位の存在を必要とする。本明細書に記載のベクターおよび系における使用のために、ＭａｌＴをコードする核酸配列およびｍａｌプロモーターを含む遺伝子カセットが用いられ得る。この遺伝子カセットは、本明細書においてｍａｌＴ−Ｐｍａｌと呼ばれる。マルトース存在下で、ＭａｌＴは、Ｐｍａｌによって仲介される発現を可能にするポジティブの調節エレメントである。一般的に言えば、発現を誘導するのに必要なマルトースの濃度は、典型的に、培養培地中に約１％（ｗ／ｗ）未満である。一部の実施態様では、濃度は、培養培地中に、約１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％０．２％、０．１％、または０．０５％（ｗ／ｗ）未満である。他の実施態様では、濃度は、０．０５％またはそれ未満、例えば約０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％（ｗ／ｗ）である。例示的な実施態様では、濃度は、培養培地中に約０．２％〜約０．４％（ｗ／ｗ）である。
【００５９】
さらに他の実施態様では、本明細書において用いられるプロモーターは、環境中のラムノースのレベルに応答性であり、他の方法では本明細書において、「ラムノースによって調節可能なプロモーター」と呼ばれる。上述のａｒａＣ−ＰａｒａＢＡＤ系と同様に、ｒｈａＲＳ−ＰｒｈａＢアクチベーター−プロモーター系は、ラムノースによって厳密に調節される。ラムノースプロモーター（Ｐｒｈａ）からの発現は、ラムノースの存在下で高レベルに誘導される。一部の実施態様では、細菌は、ラムノースの存在下で培養される。ラムノースは、細菌内に一般に見られるが、ヒト対象内には滅多に見られない。ｒｈａＢＡＤオペロンは、ＰｒｈａＢＡＤプロモーターによって制御される。このプロモーターは、２つのアクチベーター、ＲｈａＳおよびＲｈａＲによって調節されて、対応する核酸配列は、ｒｈａＢＡＤ核酸配列の反対方向で位置する１つの転写ユニットに属する。Ｌ−ラムノースの存在下で、ＲｈａＲはＰｒｈａＲＳプロモーターに結合して、ＲｈａＲおよびＲｈａＳの生産を活性化する。ＲｈａＳはＬ−ラムノースと共に、次々に、ＰｒｈａＢＡＤおよびＰｒｈａＴプロモーターに結合して、構造的な核酸配列の転写を活性化する。本明細書に記載のアラビノース、マルトースおよびラムノース（ｒｈａｍｏｎｓｅ）によって調節されるプロモーターの完全な誘導は、Ｃｒｐ−ｃＡＭＰ複合体の結合を必要として、カタボライト抑制の重要なレギュレーターである。
【００６０】
Ｌ−アラビノースおよびＬ−ラムノースの両方とも、それらの異化作用を仲介するレギュロンの発現の誘導因子として直接的に作用するが、調節メカニズムに関して重要な違いが存在する。Ｌ−アラビノースは、アラビノースレギュロンのポジティブコントロールにおいてアクチベーターＡｒａＣとともに誘導因子として作用する。しかしながら、Ｌ−ラムノースレギュロンは、調節カスケードに供されて、したがって、ａｒａＣ−ＰａｒａＢＡＤ系よりもさらに厳密な制御に供される。Ｌ−ラムノースは、ＲｈａＳの合成のためのアクチベーターＲｈａＲとともに誘導因子として作用して、次々に、ラムノースレギュロンのポジティブコントロールにおいてアクチベーターとして作用する。本開示では、ラムノースは、ＲｈａＲタンパク質と相互作用するために用いられ得て、それから、ＲｈａＳタンパク質は、ＰｒｈａＢＡＤプロモーターに動作可能に連結された核酸配列の転写を活性化し得る。
【００６１】
さらに他の実施態様では、プロモーターは、環境内のキシロースのレベルに応答性であってよく、本明細書において、「キシロースによって調節可能なプロモーター」と呼ばれる。一般に、環境内の０．０００２％〜０．６３％（ｗ／ｗ）のキシロース濃度は、本明細書に記載のキシロース誘導性プロモーターの発現を活性化する（例えば、Ｂｈａｖｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（１）：４０３−１０（３４）を参照）。ｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡ系は、別の十分に確立された、誘導可能なアクチベーター−プロモーター系である。キシロースは、ＸｙｌＲおよびサイクリックＡＭＰ−Ｃｒｐ系によって調節されるキシロース特異的オペロン（例えば、ｘｙｌＥ、ｘｙｌＦＧＨＲ、およびｘｙｌＡＢ）を誘導する。ＸｙｌＲタンパク質は、ｘｙｌ核酸配列プロモーターの２つの別個の領域に結合することによって、ポジティブのレギュレーターとしての役割を果たす。上述のａｒａＣ−ＰａｒａＢＡＤ系と同様に、ｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡＢおよび／またはｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＦＧＨ調節系を用いてもよい。これらの実施態様では、ＸｙｌＲタンパク質と相互作用するキシロースは、２つのＰｘｙｌプロモーターのいずれかに動作可能に連結された核酸配列の転写を活性化する。
【００６２】
本明細書において用いられる用語「外因性」は、そのネイティブ由来以外の細胞内に存在する物質（例えば、核酸またはポリペプチド）を指す。用語「外因性」は、人の手が関与するプロセスによって、それが通常は見られないか、または検出できない量で見られる細胞または生物のような生態系の中に導入されている核酸またはタンパク質を指してよい。物質は、その物質を受け継ぐ細胞または細胞祖先の中に導入されるならば、外因性と考えられてよい。対照的に、用語「内因性」は、生体系または細胞にとってネイティブである物質を指す。
【００６３】
本明細書において用いられる「医薬組成物」は、活性成分（例えば、本明細書に記載の組み換え細菌）を、生理的に適切な担体および／または賦形剤のような他の構成要素とともに含む組成物を指す。
【００６４】
本明細書において用いられる用語「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」は、薬学的に許容できる材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ））、または溶媒封入材料（対象化合物を、一方の臓器、または体の一部から、別の臓器、または体の一部へ運搬または輸送するのに関与する）を指す。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合して、患者にとって有害でないという意味で、「許容でき」なければならない。薬学的に許容できる担体としての役割を果たし得る材料の一部の例は：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖類；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよびセルロースアセテート；（４）粉末化されたトラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような平滑剤；（８）カカオ脂および坐薬ワックスのような賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油のような油類；（１０）プロピレングリコールのようなグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリオール類；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質フリーの水；（１７）等張生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル類、ポリカーボネート類および／またはポリ酸無水物類；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸のような充填剤（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬのような血清成分；（２４）エタノールのようなＣ２−Ｃ１２アルコール類；および（２５）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合する物質を含む。湿潤剤、着色料、放出剤、コーティング剤、崩壊剤、結合剤、甘味料、香料、芳香剤、プロテアーゼ阻害剤、可塑剤、乳化剤、安定化剤、増粘剤、フィルムコーティング剤、可溶化剤、界面活性剤、防腐剤および抗酸化が製剤内に存在してもよい。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容できる賦形剤」などの用語は、本明細書において相互交換可能に用いられる。
【００６５】
「プラスミド」または「ベクター」は、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞間の移行のために設計された核酸構築物を含む。プラスミド内に組み込まれた核酸は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列に作動可能に結合され得る。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣接残基のα−アミノおよびカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに結合された一連のアミノ酸残基を示すために、本明細書において相互交換可能に用いられる。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸アナログを、そのサイズまたは機能にかかわらず含む。本明細書において用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、大ポリペプチドおよび小ペプチドの両方を指す。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびそのフラグメントを指す場合、本明細書において相互交換可能に用いられる。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然起源タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび、前述の他の等価物、変異体、フラグメント、およびアナログを含む。
【００６７】
「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらのアナログのユニットを取り込んでいる、任意の分子、好ましくはポリマー分子であってよい。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの１つの核酸鎖であってよい。あるいはそれは、任意の二本鎖ＤＮＡに由来しない一本鎖核酸であってよい。一態様では、核酸はＤＮＡであってよい。別の態様では、核酸はＲＮＡであってよい。適切な核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の適切な核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含むＲＮＡである。
【００６８】
ネイティブアミノ酸配列の変更は、当該分野における当業者に公知の任意の多くの技術によって達成され得る。突然変異は、ネイティブ配列のフラグメントに対するライゲーションを可能にする制限部位によって隣接された突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、例えば特定の遺伝子座に導入され得る。ライゲーションの後に生じる再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチドに向けられた部位特異的突然変異誘発の手順が、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供するために用いられてよい。そのような変更を作製するための技術は十分に確立されていて、例えば、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（３５）；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（３６）；Ｃｒａｉｋ（３７）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（３８）；および米国特許番号４，５１８，５８４および４，７３７，４６２によって開示されるものを含み、それらの全体で参照により本明細書中に援用される。ポリペプチドの適切な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善および異常な架橋を防ぐために、一般にセリンによって置換されてもよい。反対に、システイン結合（単数または複数）は、その安定性を改善またはオリゴマー化を促進するために、ポリペプチドに加えられてよい。
【００６９】
用語「統計的に有意」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）またはより大きな差を意味する。
【００７０】
本明細書において用いられる用語「宿主細胞」は、例えば免疫応答を誘導するために、組み換え細菌が投与される生物内の細胞を指す。一実施態様では、宿主は、鳥類、ウマ、またはヒトであり、宿主細胞はそれぞれ、鳥類細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞と呼ぶ。
【００７１】
実施例（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｅｘａｍｐｌｅ）以外では、または、別段の指示がされる場合以外では、本明細書において用いられる反応条件または成分の量を表わす全ての量は、用語「約」によって、全ての例において修飾されると理解されるべきである。用語「約」は、パーセンテージに関連して用いられる場合、±１％を意味し得る。
【００７２】
本明細書において用いられる冠詞「ａ」および「ａｎ」は、逆のことが明確に指示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【００７３】
語句「および／または」は、リスト内のエレメントの間で用いられる場合、（１）単一の挙げられたエレメントだけが存在すること、または（２）リストの１つよりも多いエレメントが存在することを意味することが意図される。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣであってよいことを示す。語句「および／または」は、リスト内のエレメントの「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」と相互交換可能に用いられ得る。
【００７４】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の値の全てに関する省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲を含むと理解される。
【００７５】
Ｉ．組み換え細菌
本開示は、一部の実施態様では、目的の抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列の調節された発現が可能な組み換え細菌を提供する。本明細書に記載の組み換え細菌は、強力な免疫応答を誘発するために、対象において、細菌が投与の際に複製してリンパ組織にコロニー形成するのを可能にする多数の組み換え調節系を細菌が含むので、目的の抗原に対して免疫応答（例えば、防御免疫）を誘発するのに特に効果的である。しかしながら、インビボでの多数の複製サイクル後に、細菌は最終的に、弱毒化された表現型を示し、例えばワクチン組成物として、対象への安全な投与を可能にする。本明細書に記載の細菌の組み換え調節系は、インビボで細菌にとって利用できない１つまたは複数の糖類（例えば、アラビノース、ラムノース、マンノース、マルトース、キシロース、およびガラクトース）に応答性である多数の遺伝子調節エレメントに部分的に依存する。したがって、本明細書に記載の組み換え細菌の表現型の使用は、対象への投与の際に変更され得る。一部の実施態様では、対象は、細菌の糖応答性の調節系を活性化および／または抑制するために、本明細書に記載の組み換え細菌の投与の前、後、または同時に、１つまたは複数の糖類が投与される。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、少なくとも３つの調節系を含み、それぞれ異なる糖に依存性であり、対象における宿主細胞の最初の侵襲、遅延された弱毒化、および改善された免疫原性を促進する。
【００７６】
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、遅延された弱毒化に関して調節され得る（インビボ）。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、目的の抗原をコードする核酸の調節された遅延した発現が可能である。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）または外膜小胞の調節された生産を示し（インビボ）、細菌内に存在する保存された外膜タンパク質の生産の増強をもたらし得て、最終的に、免疫原性の改善をもたらし得る。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、少なくとも１つの目的の抗原をコードする少なくとも１つの核酸の調節された発現、および、調節された弱毒化の両方が可能である。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、少なくとも１つの目的の抗原をコードする少なくとも１つの核酸の調節された発現、および、ＧＭＭＡまたは外膜小胞の調節された生産（インビボ）の両方が可能である。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、ＧＭＭＡまたは外膜小胞の調節された生産（インビボ）、および、調節された弱毒化の両方が可能である。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、少なくとも１つの目的の抗原をコードする少なくとも１つの核酸の調節された発現、調節された弱毒化、および、ＧＭＭＡまたは外膜小胞の調節された生産（インビボ）が可能である。一部の実施態様では、これらの特性のそれぞれは、少なくとも１つの糖（例えば、アラビノース、ラムノース、マンノース、キシロース、マルトース、およびガラクトース）の豊富さによって直接的または間接的に調節される。
【００７７】
一部の実施態様では、本明細書に記載の細菌は、グラム陰性細菌である。一部の実施態様では、細菌は病原性細菌である。一部の実施態様では、細菌は弱病原性細菌である。一部の実施態様では、細菌は腸内細菌科に属する。一部の実施態様では、細菌は：Ａｌｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｑｕａｍｏｎａｓ、Ａｒａｎｉｃｏｌａ、Ａｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓ、Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ、Ｂｕｄｖｉｃｉａ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｅｄｅｃｅａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ、Ｈａｆｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｌｅｍｉｎｏｒｅｌｌａ、Ｍｏｅｌｌｅｒｅｌｌａ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ、Ｐｒａｇｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓａｍｓｏｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｏｄａｌｉｓ、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ、Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ、Ｘｅｎｏｒｈｂｄｕｓ、または、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａから選択される属に属する。一部の実施態様では、細菌は、腸内細菌科の病原種である。一部の実施態様では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、ＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａおよびＹｅｒｓｉｎｉａからなる群より選択される。一部の実施態様では、細菌はサルモネラ属である。一部の実施態様では、細菌はエルシニア属である。一部の実施態様では、細菌はエドワージエラ属である。一部の実施態様では、属、種、または株の細菌は、一般に、生または弱毒化ワクチンとして用いられる。
【００７８】
本開示の一部の実施態様は、サルモネラ属（例えば、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａまたはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ）の種または亜種を含む。例えば、組み換え細菌は、例えば、Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｔｙｐｈｉ、およびＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型であってよい。一部の実施態様では、組み換え細菌は、血清型Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ、Ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｉｕｓ、Ｓ．Ａｒｉｚｏｎａｅ、Ｓ．Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｓ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｓ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓ．Ｃｈｏｌｅｒａｓｉｕｉｓ、またはＳ．Ｄｕｂｌｉｎである。
【００７９】
サルモネラに由来する組み換え細菌は、ワクチンとして用いるのに特に適合し得る。例えば、サルモネラ株による宿主の経口感染は、典型的に、消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）またはパイエル板のコロニー形成をもたらし、組み換え細菌に対して一般的な粘膜免疫応答の誘導をもたらす。腸間膜リンパ節、肝臓および脾臓への細菌のさらなる透過性は、細菌に対して向けられる全身性および細胞性免疫応答の誘導を増加させ得る。したがって、経口免疫付与のための組み換えサルモネラの使用は、３ブランチの免疫系の全てを刺激して、それは、粘膜表面上にコロニー形成および／またはそれを通って侵入する感染性疾患の薬剤に対して免疫付与するのに特に重要である。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、家禽において免疫応答を誘導するために用いられる（例えばワクチンとして）。家禽において用いられる場合、組み換え細菌は、噴霧経路（ｃｏｕｒｓｅ  ｓｐｒａｙ）によって投与され得て、それにより、眼の曝露を介して結膜関連リンパ組織（ＣＡＬＴ）、呼吸曝露を介して鼻孔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）および気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、および、経口曝露を介してＧＡＬＴに接種する。一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、卵からかえって間もないヒヨコに投与される。
【００８０】
Ａ．弱毒化
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、病原性遺伝子の発現が、糖応答性の様式で調節され得るように改変される。一部の実施態様では、１つまたは複数の内因性遺伝子、例えば、病原性遺伝子は、細菌染色体から欠失される。一部の実施態様では、欠失は、内因性遺伝子の部分的欠失である。一部の実施態様では、欠失は、内因性遺伝子の全長の欠失である。一部の実施態様では、遺伝子、例えば、病原性遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子の転写および／または翻訳を妨げるように遺伝学的に改変される。一部の実施態様では、内因性遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に改変される。一部の実施態様では、遺伝子、例えば、病原性遺伝子の調節領域は、遺伝子の発現を変更（例えば低減）するように遺伝子改変される。一部の実施態様では、遺伝子、例えば、病原性遺伝子のプロモーターは、１つまたは複数の調節エレメント（例えば糖応答性プロモーター）を含むように改変される。
【００８１】
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、遺伝子を含む核酸を含むように改変される。一部の実施態様では、組み換え細菌は、遺伝子を含む核酸を含むように改変されて、それにより、細菌染色体内の遺伝子の内因性コピーが変更および／または欠失されている。一部の実施態様では、核酸は、欠失および／または変更されている細菌染色体内の内因性遺伝子と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、欠失および／または変更されている細菌染色体内の内因性遺伝子と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同の遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種とは異なる細菌種、亜種、血清型、または株由来の遺伝子を含む。
【００８２】
一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種と同一の細菌種、亜種、血清型、または株由来の遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結された遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、ラムノースによって調節可能なプロモーター、キシロースによって調節可能なプロモーター、ガラクトースによって調節可能なプロモーター、アラビノースによって調節可能なプロモーター、マンノースによって調節可能なプロモーター、または、マルトースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結された遺伝子を含む。一部の実施態様では、遺伝子を含む核酸は、細菌内のプラスミド内に位置する。一部の実施態様では、遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内に位置する。一部の実施態様では、遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内の欠失または変更されている内因性遺伝子の遺伝子座に対応する染色体座に位置する。一部の実施態様では、核酸は、コドン最適化される（例えば、組み換え細菌内の核酸の発現を改善するため）。
【００８３】
１．Ｏ−抗原合成遺伝子
一部の実施態様では、組み換え細菌は、内因性Ｏ−抗原合成遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、組み換え細菌は、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、欠失は、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子の部分的欠失である。一部の実施態様では、欠失は、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子の全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に変更される。一部の実施態様では、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子の調節領域は、遺伝子の発現を変更（例えば低減）するように遺伝子改変される。一部の実施態様では、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子のプロモーターは、１つまたは複数の調節エレメント（例えば、糖応答性プロモーター）を含むように変更される。一部の実施態様では、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子のプロモーターは、遺伝子の開始コドンとシャイン・ダルガノ配列の間の間隔を増大するように変更される。一部の実施態様では、内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子のプロモーターは、遺伝子の開始コドンとシャイン・ダルガノ配列の間の間隔を低減するように改変される。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列、開始コドン、第二コドンおよび／または第三コドンは、遺伝子の翻訳効率を高めるために、アデニン核酸塩基の頻度を増大するように改変される。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列、開始コドン、第二コドンおよび／または第三コドンは、遺伝子の翻訳効率を低減するために、アデニン核酸塩基の頻度を減少するように改変される。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子は、ｗａａＬである（ｒｆａＬとしても知られる）。Ｏ−抗原リガーゼＷａａＬは、多糖類をリピドＡ−ＬＰＳコア部分にライゲーションするのに必要である。ｗａａＬの欠失は、Ｏ−抗原またはそれに付着した個々の糖類がない、無傷のリピドＡ−ＬＰＳコアをもたらす。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子は、ｗａａＧ（ｒｆａＧとしても知られる）、ｗａａＩ（ｒｆａＩとしても知られる）、ｒｆａＨ、ｗａａＪ（ｒｆａＪとしても知られる）、ｗｂａＰ（ｒｆｂＰとしても知られる）、ｗｚｙ（ｒｆｃとしても知られる）、ｗａａＰ、ｗａａＱ、ｗａａＦ、ｗａａＰ、ｗａａＣ、およびｗａａＡからなる群より選択される。
【００８４】
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子を含む核酸を含むように改変される。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子を含む核酸は、細菌内のプラスミド上に位置する。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子を含む核酸は、細菌の染色体上に位置する。一部の実施態様では、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内の欠失または変更されている内因性Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子の遺伝子座に対応する染色体座に位置する。一部の実施態様では、組み換え細菌は、Ｏ−抗原リガーゼ遺伝子を含む核酸を含むように改変されて、それにより、細菌染色体内の遺伝子の内因性コピーは、変更および／または欠失されている。一部の実施態様では、核酸は、サルモネラＯ−抗原リガーゼ遺伝子を含む。
【００８５】
例示的なサルモネラｗａａＬ遺伝子の核酸配列は、以下に提供される：
ａｔｇｃｔａａｃｃａｃａｔｃａｔｔａａｃｇｔｔａａａｔａａａｇａｇａａａｔｇｇａａｇｃｃｇａｔｃｔｇｇａａｔａａａｇｃｇｃｔｇｇｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｔｇｃｃａｃｇｔａｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｇｇｔａｔｔａｃｇｃｇｔｔａｔａａａｃａｔｔｔｇａｔａａｔｃａｔａｃｔｔａｔｇｇｔｔａｔｃａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｃａｇｇｔｃｔｃａｃｇｃｔｃａｃｃｇａａａａｇｔｔｔｃｃｃｃｃｃｔｃｔｔｔｔｃａａａａａｔａｇｃｇｔａｔｔｔｔａｔａｇｃｇｔａｇｃａｇｔａｔｔａｔｃａｔｔａａｔｃｃｔｔｇｔｔｔａｔｔｃｃａｔａｃｔｃａｔａｔｃｇｃｃａｇａｔａｔｇａａａｇａａａｇｔｔｔｃａａｇｇａａｔｔｔｇａａａａｔａｃｇｇｔａｃｔｇｇａｇｇｇｃｔｔｃｔｔａｔｔａｔａｔａｃｔｔｔａｔｔａａｔｔｃｃｃｇｔａｃｔａｔｔａａａａｇａｔｇａａａｃａａａａｇａａａｃｇｇｔｔｇｃｇａａａａｔａｇｔａｃｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔｔｔｔａａｃａａｇｔｔｔａｇｇａｃｔｔｃｇｃｔｇｃｃｔｔｇｃａｇａｇａｇｔａｔｔｃｔｇｔａｔａｔｃｇａｇｇａｃｔａｔａａｔａａａｇｇｇａｔｔａｔｇｃｃａｔｔｃａｔａａｇｃｔａｔｇｃｇｃａｔｃｇａｃａｔａｔｇｔｃｃｇａｔｔｃｃａｔｇｇｔｔｔｔｃｔｔａｔｔｔｃｃａｇｃａｔｔａｔｔｇａａｔａｔｔｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｇａａａａａａｔｇｃａａｔｔａａｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇｇｔｇｃｔｔａｇｃｇｃｃａｔｃｔａｃｃｔｔｔｔｃｔｔｔａｔｃｃｔｇｇｇａａｃｃｃｔａｔｃｇｃｇａｇｇｇｇｃａｔｇｇｔｔｇｇｃｇｇｔｇｃｔｔａｔａｇｔａｇｇｔｇｔｔｃｔｇｔｇｇｇｃａａｔａｃｔｇａａｃｃｇｃｃａａｔｇｇａａｇｔｔａａｔａｇｇａｇｔｔｇｇｔｇｃｃａｔｔｔｔａｔｔａｇｃｃａｔｔａｔｃｇｇｃｇｃｔｔｔｇｇｔｔａｔｃａｃｔｃａａｃａｔａａｔａａｃａａａｃｃａｇａｃｃｃａｇａａｃａｔｔｔａｃｔｇｔａｔａａａｔｔａｃａｇｃａｇａｃａｇａｔａｇｃｔｃａｔａｔｃｇｔｔａｔａｃｔａａｃｇｇａａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｃｇｃｇｔｇｇａｔａｃｔｇａｔｔｃａｇｇａａａａｃｃｃｇａｔｃａａｇｇｇｃｔａｃｇｇｃｔａｔｇｇｔａａｔｇａｔｇｔｇｔａｔｇａｔｇｇｔｇｔｔｔａｔａａｔａａａｃｇｃｇｔｔｇｔｃｇａｔｔａｔｃｃａａｃｇｔｇｇａｃｃｔｔｔａａａｇａａｔｃｔａｔｃｇｇｔｃｃｇｃａｔａａｔａｃｃａｔｔｃｔｇｔａｃａｔｃｔｇｇｔｔｔａｇｔｇｃａｇｇｃａｔａｔｔｇｇｇｔｃｔｇｇｃｇａｇｃｃｔｇｇｔｃｔａｔｔｔａｔａｔｇｇｃｇｃｔａｔｃａｔｃａｇｇｇａａａｃａｇｃｃａｇｃｔｃｔａｃｃｃｔｃａｇｇａａａｇｔａｇａｇａｔａａｇｃｃｃｃｔａｃａａｔｇｃｔｃａｔｃｔｃｔｔｇｃｔａｔｔｔｔｔａｔｃｔｔｔｃｇｔｃｇｇｔｔｔｔｔａｔａｔｃｇｔｔｃｇｔｇｇｃａａｔｔｔｔｇａａｃａｇｇｔｃｇａｔａｔｔｇｃｔｃａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｔｔａｃｃｇｇｔｔｔｔｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｔａａｇａａａｔａｇａｔａａ（配列番号１）。
【００８６】
配列番号１の核酸によってコードされるＷａａＬタンパク質のアミノ酸配列は、以下に提供される：
ＭＬＴＴＳＬＴＬＮＫＥＫＷＫＰＩＷＮＫＡＬＶＦＬＦＶＡＴＹＦＬＤＧＩＴＲＹＫＨＬＩＩＩＬＭＶＩＴＡＩＹＱＶＳＲＳＰＫＳＦＰＰＬＦＫＮＳＶＦＹＳＶＡＶＬＳＬＩＬＶＹＳＩＬＩＳＰＤＭＫＥＳＦＫＥＦＥＮＴＶＬＥＧＦＬＬＹＴＬＬＩＰＶＬＬＫＤＥＴＫＥＴＶＡＫＩＶＬＦＳＦＬＴＳＬＧＬＲＣＬＡＥＳＩＬＹＩＥＤＹＮＫＧＩＭＰＦＩＳＹＡＨＲＨＭＳＤＳＭＶＦＬＦＰＡＬＬＮＩＷＬＦＲＫＮＡＩＫＬＶＦＬＶＬＳＡＩＹＬＦＦＩＬＧＴＬＳＲＧＡＷＬＡＶＬＩＶＧＶＬＷＡＩＬＮＲＱＷＫＬＩＧＶＧＡＩＬＬＡＩＩＧＡＬＶＩＴＱＨＮＮＫＰＤＰＥＨＬＬＹＫＬＱＱＴＤＳＳＹＲＹＴＮＧＴＱＧＴＡＷＩＬＩＱＥＮＰＩＫＧＹＧＹＧＮＤＶＹＤＧＶＹＮＫＲＶＶＤＹＰＴＷＴＦＫＥＳＩＧＰＨＮＴＩＬＹＩＷＦＳＡＧＩＬＧＬＡＳＬＶＹＬＹＧＡＩＩＲＥＴＡＳＳＴＬＲＫＶＥＩＳＰＹＮＡＨＬＬＬＦＬＳＦＶＧＦＹＩＶＲＧＮＦＥＱＶＤＩＡＱＩＧＩＩＴＧＦＬＬＡＬＲＮＲ（配列番号２）。
【００８７】
一部の実施態様では、核酸は、サルモネラｗａａＬ遺伝子（配列番号１として提供される）を含む。一部の実施態様では、核酸は、ｗａａＬ遺伝子を含み、ここでｗａａＬ遺伝子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸は、ｗａａＬ遺伝子を含み、ここでｗａａＬ遺伝子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同の核酸配列を含む。
【００８８】
一部の実施態様では、核酸は、Ｏ−抗原リガーゼをコードする核酸配列を含み、ここで前記Ｏ−抗原リガーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸は、Ｏ−抗原リガーゼをコードする核酸配列を含み、ここで前記Ｏ−抗原リガーゼは、配列番号２の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種とは異なる細菌種、亜種、血清型、または株由来のＯ−抗原リガーゼ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種と同一の細菌種、亜種、血清型、または株由来のＯ−抗原リガーゼ遺伝子を含む。
【００９０】
一部の実施態様では、核酸は、調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたＯ−抗原リガーゼ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたＯ−抗原リガーゼ遺伝子（例えば、ｗａａＬ）を含む。有利に、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたＯ−抗原リガーゼ遺伝子（例えば、ｗａａＬ）を含む核酸を含む組み換え細菌株は、インビトロでは糖（例えば、ラムノース）の存在下で正常なＬＰＳを合成するが、プロモーターを活性化する糖、したがってＯ−抗原リガーゼの発現の不存在のため、インビボでは粗いＬＰＳを形成する。任意の特定の理論によって拘束されることを望まずに、このストラテジーを用いて、細菌は、保存されたＬＰＳコアオリゴ糖を曝露して、保存された外膜タンパク質（ＯＭＰ；例えば、ポーリン）の生産を高めて、免疫原性の改善をもたらし得て、細菌においてインビボで合成された目的の抗原に対する交差防御免疫応答の生産に役立ち得る。一部の実施態様では、糖によって調節可能なプロモーターは、特定の糖の存在下で増大した活性（例えば増大した転写）および糖の不存在下で低減した活性を示す。一部の実施態様では、核酸は、ラムノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたＯ−抗原リガーゼ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、アラビノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたＯ−抗原リガーゼ遺伝子を含む。一部の実施態様では、ラムノースによって調節可能なプロモーター（例えば、ｒｈａＳＲ  ＰｒｈａＢＡＤ）の使用は、ラムノースによって調節可能なプロモーターと比較して相対的により高い濃度がアラビノースによって調節可能なプロモーターを活性化するのに必要とされるので、アラビノースによって調節可能なプロモーターよりも好ましくあり得る（例えば、Ｇｉａｃａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４０（３）：３５５−３６６（３９）を参照し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される）。一部の実施態様では、組み換え細菌は、突然変異ΔｗａａＬ／ΔｐａｇＬ：：ＴＴ  ｒｈａＳＲ  ＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬを含む。
【００９１】
２．リピドＡデアシラーゼ遺伝子
一部の実施態様では、組み換え細菌は、内因性リピドＡデアシラーゼ遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、欠失は、内因性リピドＡデアシラーゼ遺伝子の部分的欠失である。一部の実施態様では、欠失は、内因性リピドＡデアシラーゼ遺伝子の全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性リピドＡデアシラーゼ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を導入するように遺伝学的に変更される。一部の実施態様では、内因性リピドＡデアシラーゼ遺伝子の調節領域は、遺伝子の発現を変更する（例えば低減する）ように遺伝子改変される。一部の実施態様では、内因性リピドＡデアシラーゼ遺伝子のプロモーターは、１つまたは複数の調節エレメント（例えば、糖応答性プロモーター）を含むように改変される。一部の実施態様では、リピドＡデアシラーゼ遺伝子は、ｐａｇＬである。リピドＡデアシラーゼ遺伝子ｐａｇＬの欠失を含む細菌は、増大した量の外膜小胞を生産することが見いだされている（例えば、Ｅｌｈｅｎａｗｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ｍＢｉｏ７（４）：ｅ００９４０−１６（４０）を参照）。サルモネラのｐａｇＬ遺伝子の欠失は、細菌病原性を損なわない（例えば、Ｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１：７４０３−８（４１）を参照）。任意の特定の理論によって拘束されることを望まずに、一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、小胞形成の増大（すなわち、小胞生産の増大）をもたらす１つまたは複数の遺伝子改変を含み、細菌によって発現される目的の抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するのに特に有用であり得る。
【００９２】
３．ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子
一部の実施態様では、組み換え細菌は、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子内の欠失を含む。ホスホマンノースイソメラーゼは、マンノース−６リン酸イソメラーゼしても知られ、マンノース６−リン酸へのフルクトース６−リン酸の可逆的な相互転換を触媒する。マンノース６−リン酸はそれからＧＤＰ−マンノースに転換されて、Ｏ−抗原側鎖の合成に用いられる。ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子ｐｍｉの欠失を有する細菌は、マンノース感受性でなく、部分的に弱毒化される（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９（３）：１０７９−８５（４２）を参照）。これらのｐｍｉ突然変異体は、マンノースを含む培地内で増殖された場合、野生型レベルのＬＰＳ  Ｏ−抗原側鎖を合成して、弱毒化されているが非常に免疫原性である（例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．」Ｉｎ：Ｂｒｏｇｄｅｎ  ＫＡ，Ｍｉｎｉｏｎ  ＦＣ，Ｃｏｒｎｉｃｋ  Ｎ，Ｓｔａｎｔｏｎ  ＴＢ，Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｎｏｌａｎ  ＬＫ，Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ  ＭＪ，ｅｄ．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（４３）を参照）。一部の実施態様では、内因性ホスホイソメラーゼ遺伝子の欠失は、部分的欠失である。一部の実施態様では、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の欠失は、全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に変更される。一部の実施態様では、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の調節領域は、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の発現を変更する（例えば低減する）ように遺伝子改変される。一部の実施態様では、内因性ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子のプロモーターは、１つまたは複数の調節エレメント（例えば、糖応答性プロモーター）を含むように変更される。一部の実施態様では、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子は、ｐｍｉである。
【００９３】
一部の実施態様では、細菌は、ｐｍｉ遺伝子の欠失を含む。一部の実施態様では、細菌は、Δｐｍｉ−２４２６突然変異を含む。Δｐｍｉ−２４２６突然変異を含む、マンノース存在下で増殖された細菌は、完全なＬＰＳ  Ｏ−抗原を合成することが可能である。細菌の取り込みに必要な形態である非リン酸化マンノースは、インビボで利用できない。それ故に、Δｐｍｉ−２４２６突然変異を含む細菌は、インビボでＬＰＳ  Ｏ−抗原血清型特異的な側鎖を合成する能力を失い、ＬＰＳコアに付着したＯ−抗原側鎖の数は、インビボでそれぞれの細胞分裂後に約半分低減する。合成されたＬＰＳは、Ｓ．Ａｒｉｚｏｎａを除く全てのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型にわたって実質的に似ているコア構造を含む。これは、細菌ベクターの血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘導せずに少なくとも２つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発することが可能な細菌をもたらす。一部の実施態様では、細菌は、細菌ベクターの血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘発せずに全てのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発することが可能である。
【００９４】
ｐｍｉ突然変異内に欠失を含む本明細書に記載の組み換え細菌は、インビトロの増殖中に細菌が利用できるマンノースがＬＰＳ  Ｏ−抗原合成のために用いられるのを確実にする他の突然変異を含んでもよい。例えば、細菌は、Δ（ｇｍｄ−ｆｃｌ）−２６突然変異を含んでよい。この突然変異は、ＧＤＰ−フコースへのＧＤＰ−マンノースの転換のための酵素をコードする２つの核酸配列を欠失させて、インビトロでの増殖中に細菌が利用可能なマンノースが、コラン酸生産ではなくＬＰＳ  Ｏ−抗原合成のために用いられるのを確実にする。同様に、細菌は、Δ（ｗｃａＭ−ｗｚａ）−８突然変異を含んでよく、コラン酸生産に必要な２０の核酸配列全てを欠失させて、およびＧＤＰ−フコースへのＧＤＰ−マンノースの転換も防ぐ。
【００９５】
４．ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ遺伝子
ＵＤＰ−Ｇａｌは、ＬＰＳ  Ｏ−抗原側鎖、ＬＰＳ外核（コラン酸のため）、および、成分としてガラクトースを有する他の多糖類ポリマーのアセンブリのための前駆体である（４４）。ＵＤＰ−Ｇａｌは、ｇａｌＵ遺伝子によってコードされる酵素グルコース−１−ＰウリジルトランスフェラーゼによるＵＤＰ−Ｇｌｕへのグルコース−１−Ｐの転換によって合成されて、ｇａｌＥ遺伝子によってコードされる酵素ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼによってＵＤＰ−ＧｌｕはＵＤＰ−Ｇａｌに転換される（４５、４６）。ガラクトースの存在下で増殖された株は、取り込み後のガラクトースがｇａｌＫ遺伝子によってコードされるガラクトースキナーゼによってガラクトース−１−Ｐに転換されて次々にｇａｌＴ遺伝子によってコードされる酵素ＵＤＰ−ＧａｌトランスフェラーゼによってＵＤＰ−Ｇａｌへ転換される、異なる経路によってＵＤＰ−Ｇａｌを合成することができる（４５）。ｇａｌＥ突然変異を有する株は、ガラクトースが増殖培地内に供給されない限り、ＬＰＳ外核およびＬＰＳ  Ｏ−抗原を合成することができない（４７）。これらの事実および特性のため、ｇａｌＥ突然変異を有するサルモネラ株は、ガラクトースを用いて増殖された場合にＬＰＳを合成することができて、リンパ（ｌｙｐｈｏｉｄ）組織をコロニー形成するために侵襲性であるが、インビボではフリーのガラクトースが利用できないことに起因してこの能力を失うので、感染または免疫化された動物宿主内で複製するとＬＰＳ構成要素を次第に失う。ｐｍｉ突然変異体とまさに同じように、補体仲介性の細胞毒性に対する感受性の増大および貪食の増強に起因して次第に弱毒化してきて、ｍｙマクロファージを死滅させる。しかしながら、そのようなｇａｌＥ突然変異体にガラクトースを供給することは、Ｇａｌ−１−ＰおよびＵＤＰ−Ｇａｌの蓄積が毒性であるので、溶解によって細胞死をもたらし得る（３０、４８、４９）。このため、ガラクトース存在下でのｇａｌＥ突然変異体の増殖は、毒性産物が合成されないように、ガラクトース取り込みのための遺伝子またはｇａｌＫおよびｇａｌＴ遺伝子内の突然変異に関して選択する。残念ながら、そのようなガラクトース耐性突然変異体は、もはやＬＰＳを作製することが出来ず、全体的に弱毒化されて、非侵襲性かつ非免疫原性である（３０、５０）。サルモネラワクチン株におけるｇａｌＥ突然変異の使用を可能にするためにこれらの問題を回避すべく、我々は、ＬＰＳ合成のためのＵＤＰ−Ｇａｌを合成することができない突然変異体の選択を伴わずに、ガラクトースにして耐性である、ガラクトースの存在または不存在に依存してＬＰＳの可逆的な合成に関して潜在性を有する、ｇａｌＥ突然変異体を作製するための手段を発明した。
【００９６】
５．鉄獲得調節遺伝子
一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｆｕｒ遺伝子の発現を調節する内因性プロモーターＰｆｕｒ内の欠失を含む。Ｆｕｒは、フリーの鉄の存在下で鉄獲得に関与する遺伝子の転写を抑制する。鉄濃度が細菌内で低くなると、Ｆｕｒは合成されなくなり、鉄獲得タンパク質（例えば、鉄によって調節される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）をコードする遺伝子の構成的発現をもたらす。一部の実施態様では、欠失は、内因性Ｐｆｕｒプロモーターの部分的欠失である。一部の実施態様では、欠失は、内因性Ｐｆｕｒプロモーターの全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性Ｐｆｕｒプロモーターは、ｆｕｒ遺伝子の発現を変更する（例えば低減する）ように遺伝子改変される。一部の実施態様では、内因性Ｐｆｕｒプロモーターは、転写終結因子を含むように遺伝学的に変更される。
【００９７】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｆｕｒ遺伝子（例えば、組み換え細菌と同一の細菌種由来のｆｕｒ遺伝子）を含む核酸を含む。
【００９８】
一部の実施態様では、ｆｕｒ遺伝子を含む核酸は、細菌内のプラスミド上に位置する。一部の実施態様では、ｆｕｒ遺伝子を含む核酸は、細菌の染色体上に位置する。一部の実施態様では、ｆｕｒ遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内の欠失または変更されている内因性ｆｕｒ遺伝子の遺伝子座に対応する染色体座に位置する。一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｆｕｒ遺伝子を含む核酸を含むように改変されて、それにより、細菌染色体内のｆｕｒ遺伝子の内因性コピーは、変更および／または欠失している。
【００９９】
例示的なサルモネラｆｕｒ遺伝子の核酸配列が以下に提供される：
ａｔｇａｃｔｇａｃａａｃａａｔａｃｃｇｃａｔｔａａａｇａａｇｇｃｔｇｇｃｃｔｇａａａｇｔａａｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｔｔａａａａａｔｔｃｔｇｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｇｇａａｃｃａｇａｔａａｃｃａｔｃａｃｇｔｃａｇｔｇｃｇｇａａｇａｔｔｔａｔａｃａａａｃｇｃｃｔｇａｔｃｇａｃａｔｇｇｇｔｇａａｇａａａｔｃｇｇｔｃｔｇｇｃａａｃｃｇｔａｔａｃｃｇｔｇｔｇｃｔｇａａｃｃａｇｔｔｔｇａｃｇａｔｇｃｃｇｇｔａｔｃｇｔｇａｃｃｃｇｃｃａｔａａｔｔｔｔｇａａｇｇｃｇｇｔａａａｔｃｃｇｔｔｔｔｔｇａａｃｔｇａｃｇｃａａｃａｇｃａｔｃａｔｃａｃｇａｃｃａｔｃｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｔｇａｔｔｇｃｇｇａａａａｇｔｇａｔｔｇａａｔｔｔａｇｔｇａｔｇａｃｔｃｔａｔｔｇａａｇｃｇｃｇｃｃａｇｃｇｔｇａａａｔｔｇｃｇｇｃｇａａａｃａｃｇｇｔａｔｔｃｇｔｔｔａａｃｔａａｔｃａｃａｇｃｃｔｃｔａｔｃｔｔｔａｃｇｇｃｃａｃｔｇｃｇｃｔｇａａｇｇｃｇａｃｔｇｃｃｇｃｇａａｇａｃｇａｇｃａｃｇｃｇｃａｃｇａｔｇａｃｇｃｇａｃｔａａａｔａａ（配列番号３）。
【０１００】
配列番号３の核酸によってコードされるＦｕｒタンパク質のアミノ酸配列が以下に提供される：
ＭＴＤＮＮＴＡＬＫＫＡＧＬＫＶＴＬＰＲＬＫＩＬＥＶＬＱＥＰＤＮＨＨＶＳＡＥＤＬＹＫＲＬＩＤＭＧＥＥＩＧＬＡＴＶＹＲＶＬＮＱＦＤＤＡＧＩＶＴＲＨＮＦＥＧＧＫＳＶＦＥＬＴＱＱＨＨＨＤＨＬＩＣＬＤＣＧＫＶＩＥＦＳＤＤＳＩＥＡＲＱＲＥＩＡＡＫＨＧＩＲＬＴＮＨＳＬＹＬＹＧＨＣＡＥＧＤＣＲＥＤＥＨＡＨＤＤＡＴＫ（配列番号４）。
【０１０１】
一部の実施態様では、核酸は、サルモネラｆｕｒ遺伝子を含む（配列番号３として提供される）。一部の実施態様では、核酸はｆｕｒ遺伝子を含み、ここでｆｕｒ遺伝子は、配列番号３の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸はｆｕｒ遺伝子を含み、ここでｆｕｒ遺伝子は、配列番号３の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同の核酸配列を含む。
【０１０２】
一部の実施態様では、核酸は、Ｆｕｒタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記Ｆｕｒタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸は、Ｆｕｒタンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで前記Ｆｕｒタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同のアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種と同一の細菌種、亜種、血清型、または株由来のｆｕｒ遺伝子を含む。
【０１０４】
一部の実施態様では、核酸は、調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｆｕｒ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｆｕｒ遺伝子を含む。一部の実施態様では、糖によって調節可能なプロモーターは、特定の糖の存在下で増大した活性（例えば増大した転写）および糖の不存在下で低減した活性を示す。一部の実施態様では、核酸は、ラムノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｆｕｒ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、アラビノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｆｕｒ遺伝子を含む。一部の実施態様では、アラビノースによって調節可能なプロモーターは、ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤである。一部の実施態様では、組み換え細菌は、突然変異ΔＰｆｕｒ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｆｕｒを含む。
【０１０５】
６．コリシン取り込み遺伝子
サルモネラは、膜抗原に関する一般化されたモジュール（ＧＭＭＡ）または外膜小胞とよばれる外側の細胞壁の膜の５０〜９０ｎｍ水疱様粒子を自然発生的に放出して、それらのネイティブの立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）および正しい方位を維持する外膜関連抗原の富化源を構成する。サルモネラは、より多くのＧＭＭＡまたは外膜小胞を生産するように遺伝子改変されてよく（例えば、ｔｏｌＲ遺伝子の欠失による）、容易に精製され得る（例えば、洗浄剤の不存在で遠心分離および濾過によって）。ＧＭＭＡまたは外膜小胞は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを含む多数の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）を含み、免疫応答を誘発すると自己アジュバントとして作用し得る。ｔｏｌＲを発現しない組み換え細菌は、より多くのＧＭＭＡまたは外膜小胞を生産して、保存されたタンパク質の提示を増大するのに特に有利であり得て、例えば、他のサルモネラ血清型のＯＭＰと交差反応性の抗体を誘導するのに役立つ。加えて、任意の特定の理論によって拘束されることを望まずに、増大した生産およびＧＭＭＡまたは外膜小胞の放出は、本明細書に記載の組み換え細菌によって発現される目的の抗原の提示の改善ももたらす。一部の実施態様では、目的の抗原は、分泌された抗原である。
【０１０６】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、コリシン取り込みタンパク質をコードする内因性遺伝子内の欠失を含む。２つのタイプのコリシンが説明されている。グループＡのコリシンはＴｏｌ依存性コリシンであり、グループＢのコリシンはＴｏｎＢ依存性コリシンである（例えば、Ｃａｓｃａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７１（１）：１５８−２２９（５１）を参照し、その内容は全体で参照により本明細書中に援用される）。一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｔｏｌＲ遺伝子の発現を調節する内因性プロモーターＰｔｏｌＲ内の欠失を含む。この欠失は、内因性ｔｏｌＲ遺伝子が、その欠失を含む組み換え細菌によって発現されないようにさせる。一部の実施態様では、内因性ＰｔｏｌＲプロモーターは、ｔｏｌＲ遺伝子の発現を変更する（例えば低減する）ように遺伝子改変される。一部の実施態様では、内因性ＰｔｏｌＲプロモーターは、転写終結因子を含むように遺伝学的に変更される。
【０１０７】
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、ｔｏｌＲ遺伝子を含む核酸を含むように改変される。一部の実施態様では、ｔｏｌＲ遺伝子を含む核酸は、細菌内のプラスミド上に位置する。一部の実施態様では、ｔｏｌＲ遺伝子を含む核酸は、細菌の染色体上に位置する。一部の実施態様では、ｔｏｌＲ遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内の欠失または変更されている内因性ｔｏｌＲの遺伝子座に対応する染色体座に位置する。一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｔｏｌＲ遺伝子を含む核酸を含むように改変されて、それにより、細菌染色体内のｔｏｌＲ遺伝子の内因性コピーは変更および／または欠失されている。
【０１０８】
例示的なサルモネラｔｏｌＲ遺伝子の核酸配列が以下に提供される：
ａｔｇａｃｔｇａｃａａｃａａｔａｃｃｇｃａｔｔａａａｇａａｇｇｃｔｇｇｃｃｔｇａａａｇｔａａｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｔｔａａａａａｔｔｃｔｇｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｇｇａａｃｃａｇａｔａａｃｃａｔｃａｃｇｔｃａｇｔｇｃｇｇａａｇａｔｔｔａｔａｃａａａｃｇｃｃｔｇａｔｃｇａｃａｔｇｇｇｔｇａａｇａａａｔｃｇｇｔｃｔｇｇｃａａｃｃｇｔａｔａｃｃｇｔｇｔｇｃｔｇａａｃｃａｇｔｔｔｇａｃｇａｔｇｃｃｇｇｔａｔｃｇｔｇａｃｃｃｇｃｃａｔａａｔｔｔｔｇａａｇｇｃｇｇｔａａａｔｃｃｇｔｔｔｔｔｇａａｃｔｇａｃｇｃａａｃａｇｃａｔｃａｔｃａｃｇａｃｃａｔｃｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｔｇａｔｔｇｃｇｇａａａａｇｔｇａｔｔｇａａｔｔｔａｇｔｇａｔｇａｃｔｃｔａｔｔｇａａｇｃｇｃｇｃｃａｇｃｇｔｇａａａｔｔｇｃｇｇｃｇａａａｃａｃｇｇｔａｔｔｃｇｔｔｔａａｃｔａａｔｃａｃａｇｃｃｔｃｔａｔｃｔｔｔａｃｇｇｃｃａｃｔｇｃｇｃｔｇａａｇｇｃｇａｃｔｇｃｃｇｃｇａａｇａｃｇａｇｃａｃｇｃｇｃａｃｇａｔｇａｃｇｃｇａｃｔａａａｔａａ（配列番号５）。
【０１０９】
配列番号５の核酸によってコードされるＴｏｌＲタンパク質のアミノ酸配列が以下に提供される：
ＭＴＤＮＮＴＡＬＫＫＡＧＬＫＶＴＬＰＲＬＫＩＬＥＶＬＱＥＰＤＮＨＨＶＳＡＥＤＬＹＫＲＬＩＤＭＧＥＥＩＧＬＡＴＶＹＲＶＬＮＱＦＤＤＡＧＩＶＴＲＨＮＦＥＧＧＫＳＶＦＥＬＴＱＱＨＨＨＤＨＬＩＣＬＤＣＧＫＶＩＥＦＳＤＤＳＩＥＡＲＱＲＥＩＡＡＫＨＧＩＲＬＴＮＨＳＬＹＬＹＧＨＣＡＥＧＤＣＲＥＤＥＨＡＨＤＤＡＴＫ（配列番号６）。
【０１１０】
一部の実施態様では、核酸は、サルモネラｔｏｌＲ遺伝子を含む（配列番号５として提供される）。一部の実施態様では、核酸はｔｏｌＲ遺伝子を含み、ここでｔｏｌＲ遺伝子は、配列番号５の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸はｔｏｌＲ遺伝子を含み、ここでｔｏｌＲ遺伝子は、配列番号５の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同の核酸配列を含む。
【０１１１】
一部の実施態様では、核酸は、ＴｏｌＲタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＴｏｌＲタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸は、ＴｏｌＲタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＴｏｌＲタンパク質は、配列番号６の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同のアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種とは異なる細菌種、亜種、血清型、または株由来のｔｏｌＲ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種と同一の細菌種、亜種、血清型、または株由来のｔｏｌＲ遺伝子を含む。
【０１１３】
一部の実施態様では、核酸は、調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｔｏｌＲ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｔｏｌＲ遺伝子を含む。一部の実施態様では、糖によって調節可能なプロモーターは、特定の糖の存在下で増大した活性（例えば増大した転写）および糖の不存在下で低減した活性を示す。一部の実施態様では、核酸は、ラムノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｔｏｌＲ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｔｏｌＲ遺伝子を含む。一部の実施態様では、アラビノースによって調節可能なプロモーターはＰＢＡＤである。一部の実施態様では、組み換え細菌は、突然変異ΔＰｔｏｌＲ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｔｏｌＲを含む。
【０１１４】
７．エンドソームエスケープ遺伝子
一部の実施態様では、組み換え細菌は、細菌が宿主細胞のエンドソーム区画をエスケープすることが可能であるように遺伝学的に変更されている。組み換え細菌は、宿主細胞の侵襲後、エンドソームをエスケープするのに時間的遅延を示し得る。宿主細胞のエンドソーム区画からのエスケープを検出する方法は、当技術分野でよく知られていて、例えば、顕微鏡的分析を含む。
【０１１５】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、内因性ｓｉｆＡ遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、組み換え細菌は、ＳｉｆＡの機能を変更する突然変異を含む。ＳｉｆＡは、サルモネラによって誘導されるフィラメントの形成および細菌を取り囲んでいる液胞膜の維持に必要なエフェクタータンパク質である。ｓｉｆＡの欠失を含む細菌は、細胞侵襲後に、宿主細胞エンドソーム（サルモネラが含有する小胞、またはＳＣＶとも呼ばれる）をエスケープすることが可能である。一部の実施態様では、内因性ｓｉｆＡ遺伝子の欠失は、部分的欠失である。一部の実施態様では、内因性ｓｉｆＡ遺伝子の欠失は、全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性ｓｉｆＡ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に変更される。一部の実施態様では、内因性ｓｉｆＡ遺伝子の調節領域は、ｓｉｆＡ遺伝子の発現を変更する（例えば低減する）ように遺伝子改変される。一部の実施態様では、内因性ｓｉｆＡ遺伝子のプロモーターは、１つまたは複数の調節エレメント（例えば、糖応答性プロモーター）を含むように変更される。
【０１１６】
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、ｓｉｆＡ遺伝子を含む核酸を含むように改変される。一部の実施態様では、ｓｉｆＡ遺伝子を含む核酸は、細菌内のプラスミド上に位置する。一部の実施態様では、ｓｉｆＡ遺伝子を含む核酸は、細菌の染色体上に位置する。一部の実施態様では、ｓｉｆＡ遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内の欠失または変更されている内因性ｓｉｆＡの遺伝子座に対応する染色体座に位置する。一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｓｉｆＡ遺伝子を含む核酸を含むように改変されて、それにより、細菌染色体内のｓｉｆＡ遺伝子の内因性コピーは、変更および／または欠失されている。
【０１１７】
例示的なサルモネラｓｉｆＡ遺伝子の核酸配列が以下に提供される：
ａｔｇｃｃｇａｔｔａｃｔａｔａｇｇｇａａｔｇｇｔｔｔｔｔｔａａａａａｇｔｇａａａｔｃｃｔｔａｃｃａａｃｔｃｃｃｃａａｇｇａａｔａｃｇａａａｇａａｇｃａｔｇｇｔｇｇａａａｇｔｔｔｔａｔｇｇｇａａａａａａｔｔａａａｇａｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔａｃｔｇｇｃａａａｇｃａａａａｇｃｇｇａｃｃｇｔｔｇｔｃｔａｃａｔｇａｇａｔｇｔｔｇｔｔｔｇｃｃｇａａｃｇｃｇｃｃｃｃｃａｃａｃｇａｇａｇｃｇｇｃｔｔａｃａｇａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｇｔｔｇａａａｇａｇｔｔａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｃｇｃａａａｇａｇａｔａｇａｔｔｔｃａｇｇｔｔｃａｔａａｔｃｃｔｃａｔｇａａａａｔｇａｔｇｃｃａｃｃａｔｔａｔｔｃｔｔｃｇｃａｔｃａｔｇｇａｔｃａａａａｃｇａａｇａｇａａｃｇａａｔｔｇｔｔａｃｇｔａｔｃａｃｔｃａａａａｔａｃｃｇａｔａｃｃｔｔｔａｇｃｔｇｔｇａａｇｔｃａｔｇｇｇｇａａｔｃｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔｇａａａｇａｔｃｇｃｃｃｇｇａｔａｔｔｔｔａａａａｔｃｇｃａｔｃｃａｃａａａｔｇａｃｇｇｃｃａｔｇａｔｔａａｇａｇａａｇａｔａｔａｇｃｇａａａｔｃｇｔａｇａｃｔａｃｃｃｃｃｔｃｃｃｔｔｃｇａｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃａａｔｃｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｃｇａｔａｔｔａｔｃｇｇｔｔｃｃａｔｔａｇａｃａａｃａｔａｇａｇｇｇｇｔａｔｔｔａｔａｔａｃｔｇａａｔｔｇａｇａａａａｇｇａｃａｔｔｔａｇａｔｇｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｃａａｇａａａａｇｇｃａａｃｃｔａｃｃｔｇｇｃａｇｃｇａａａａｔｔｃａｇｔｃｔｇｇｇａｔｔｇａａａａｇａｃａａｃｇｃｇｃａｔｔｔｔａｃａｃｃａｔｇｃｇａａｔａｔａｔｃｃｇａａａｇｔａｃｔｃａｇｃａａａａｃｇｃａｔｔｔｔｔａｇａａａｃａａｔｇｇｃｇａｔｇｔｇｔｇｇａｔｔａａａａｃａｇｃｔｔｇａａａｔａｃｃａｃｃａｃｃｇｃａｔａｃｃｃａｃａｔａｃｃｔａｔｔｇａａａａａａｔｇｇｔａａａａｇａｇｇｔｔｔｔａｃｔａｇｃｇｇａｔａａｇａｃｇｔｔｔｃａｇｇｃｇｔｔｃｃｔｃｇｔａａｃｇｇａｔｃｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａａａｇｔａｔｇｔｔａｇｃｔｇａｇａｔａｇｔｃｇａａｇｃｃａｔｃｔｃｔｇａｔｃａｇｇｔｔｔｔｔｃａｃｇｃｃａｔｔｔｔｔａｇａａｔａｇａｃｃｃｃｃａｇｇｃｔａｔａｃａａａａａａｔｇｇｃｇｇａａｇａａｃａｇｔｔａａｃｃａｃｇｃｔａｃａｃｇｔｔｃｇｃｔｃａｇａａｃａａｃａａａｇｃｇｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｔｔｇｔｔｔｔｔｔａｔａａ（配列番号７）。
【０１１８】
配列番号７の核酸によってコードされるＳｉｆＡタンパク質のアミノ酸配列が以下に提供される：
ＭＰＩＴＩＧＮＧＦＬＫＳＥＩＬＴＮＳＰＲＮＴＫＥＡＷＷＫＶＬＷＥＫＩＫＤＦＦＦＳＴＧＫＡＫＡＤＲＣＬＨＥＭＬＦＡＥＲＡＰＴＲＥＲＬＴＥＩＦＦＥＬＫＥＬＡＣＡＳＱＲＤＲＦＱＶＨＮＰＨＥＮＤＡＴＩＩＬＲＩＭＤＱＮＥＥＮＥＬＬＲＩＴＱＮＴＤＴＦＳＣＥＶＭＧＮＬＹＦＬＭＫＤＲＰＤＩＬＫＳＨＰＱＭＴＡＭＩＫＲＲＹＳＥＩＶＤＹＰＬＰＳＴＬＣＬＮＰＡＧＡＰＩＬＳＶＰＬＤＮＩＥＧＹＬＹＴＥＬＲＫＧＨＬＤＧＷＫＡＱＥＫＡＴＹＬＡＡＫＩＱＳＧＩＥＫＴＴＲＩＬＨＨＡＮＩＳＥＳＴＱＱＮＡＦＬＥＴＭＡＭＣＧＬＫＱＬＥＩＰＰＰＨＴＨＩＰＩＥＫＭＶＫＥＶＬＬＡＤＫＴＦＱＡＦＬＶＴＤＰＳＴＳＱＳＭＬＡＥＩＶＥＡＩＳＤＱＶＦＨＡＩＦＲＩＤＰＱＡＩＱＫＭＡＥＥＱＬＴＴＬＨＶＲＳＥＱＱＳＧＣＬＣＣＦＬ（配列番号８）。
【０１１９】
一部の実施態様では、核酸は、サルモネラｓｉｆＡ遺伝子を含む（配列番号７として提供される）。一部の実施態様では、核酸はｓｉｆＡ遺伝子を含み、ここでｓｉｆＡ遺伝子は、配列番号７の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸はｓｉｆＡ遺伝子を含み、ここでｓｉｆＡ遺伝子は、配列番号７の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同の核酸配列を含む。
【０１２０】
一部の実施態様では、核酸は、ＳｉｆＡタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＳｉｆＡタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸は、ＳｉｆＡタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＳｉｆＡタンパク質は、配列番号８の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種とは異なる細菌種、亜種、血清型、または株由来のｓｉｆＡ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、組み換え細菌の細菌種と同一の細菌種、亜種、血清型、または株由来のｓｉｆＡ遺伝子を含む。
【０１２２】
一部の実施態様では、核酸は、調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｓｉｆＡ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｓｉｆＡ遺伝子を含む。一部の実施態様では、糖によって調節可能なプロモーターは、特定の糖の存在下で増大した活性（例えば増大した転写）および糖の不存在下で低減した活性を示す。一部の実施態様では、核酸は、ラムノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｓｉｆＡ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｓｉｆＡ遺伝子を含む。一部の実施態様では、アラビノースによって調節可能なプロモーターはＰＢＡＤである。一部の実施態様では、組み換え細菌は、突然変異ΔｓｉｆＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｓｉｆＡを含む。一部の実施態様では、組み換え細菌は、突然変異ΔＰｓｉｆＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｓｉｆＡを含む。ｓｉｆＡ遺伝子を含む核酸の発現が、アラビノースによって調節されるプロモーターの制御下である場合、宿主エンドソームからの細菌のエスケープは遅延され得る。アラビノースは宿主細胞内に存在しないため、アラビノースがｓｉｆＡ遺伝子の発現を誘導することができない。したがって、対象への投与の前に組み換え細菌がアラビノース存在下で培養されるならば、ｓｉｆＡの発現は、細菌の細胞分裂のそれぞれの回によって次第に低減されて、それにより、最初の細胞分裂周期中に宿主細胞エンドソームから細菌がエスケープするのを可能にする。同様の遅延されたエスケープの突然変異体が、他の調節可能なプロモーターを用いて、例えば、キシロースによって調節可能またはラムノースによって調節可能なプロモーター系によって、構築され得る。
【０１２３】
８．ＧＴＰピロリン酸キナーゼ遺伝子
一部の実施態様では、組み換え細菌は、ＧＴＰピロリン酸キナーゼＲｅｌＡをコードする内因性ｒｅｌＡ遺伝子内の欠失を含む。組み換え細菌においてｒｅｌＡ欠失を含むことは、増殖依存性の溶解の発生を、連続したタンパク質合成の必要性へ切り離す。一部の実施態様では、内因性ｒｅｌＡ遺伝子の欠失は部分的欠失である。一部の実施態様では、内因性ｒｅｌＡ遺伝子の欠失は全長の欠失である。
【０１２４】
９．他の弱毒化方法
弱毒化の他の方法は当技術分野で知られている。例えば、弱毒化は、野生型細菌内で見られるネイティブの核酸配列を変更する（例えば欠失させる）ことによって達成され得る。例えば、細菌がサルモネラである場合、弱毒化のために用いられ得る核酸配列の非限定的な例は：ｐａｂ核酸配列、ｐｕｒ核酸配列、ａｒｏ核酸配列、ａｓｄ、ｄａｐ核酸配列、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｄａｍ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ、ｇａｌＵ、ｍｖｉＡ、ｓｏｄＣ、ｒｅｃＡ、ｓｓｒＡ、ｓｉｒＡ、ｉｎｖ、ｈｉｌＡ、ｒｐｏＥ、ｆｌｇＭ、ｔｏｎＢ、ｓｌｙＡ、およびそれらの任意の組み合わせを含む。例示的な弱毒化突然変異は、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｏｍｐＲ、ｇａｌＥ、およびｈｔｒＡであってよい。
【０１２５】
特定の実施態様では、上記の核酸配列は、糖によって調節されるプロモーターの制御下に置かれていてよく、糖は、組み換え細菌のインビトロ増殖中は存在するが、動物またはヒト宿主内には実質的に存在しない。上記に挙げた核酸配列の転写の休止は、その結果、弱毒化をもたらして、組み換え細菌が疾患症候を誘導できなくさせる。
【０１２６】
Ｂ．さらなる突然変異
一部の実施態様では、組み換え細菌は、ＤＮＡ複製および修復タンパク質ＲｅｃＦをコードする内因性ｒｅｃＦ遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、内因性ｒｅｃＦ遺伝子の欠失は部分的欠失である。一部の実施態様では、内因性ｒｅｃＦ遺伝子の欠失は全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性ｒｅｃＦ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に変更される。
【０１２７】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、エキソヌクレアーゼＲｅｃＪをコードする内因性ｒｅｃＪ遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、内因性ｒｅｃＪ遺伝子の欠失は部分的欠失である。一部の実施態様では、内因性ｒｅｃＪ遺伝子の欠失は、全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性ｒｅｃＪ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に変更される。
【０１２８】
細菌はまた、平衡致死宿主−ベクター系を作製するように改変されてもよいが、他のタイプの系を用いてもよい（例えば、相補ヘテロ接合体を作製する）。平衡致死宿主−ベクター系のために、細菌は、その細胞壁の硬いペプチドグリカン層の合成に必要な様々な必須成分を合成するその能力を操ることによって改変され得る。一例では、成分は、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）である。様々な酵素は、ＤＡＰの結局の合成に関与する。
【０１２９】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、内因性ａｓｄ遺伝子内の欠失を含む。一部の実施態様では、内因性ａｓｄ遺伝子の欠失は部分的欠失である。一部の実施態様では、内因性ａｓｄ遺伝子の欠失は全長の欠失である。一部の実施態様では、内因性ａｓｄ遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に転写終結因子を挿入するように遺伝学的に変更される。一部の実施態様では、内因性ａｓｄ遺伝子のプロモーターは、１つまたは複数の調節エレメント（例えば、糖応答性プロモーター）を含むように変更される。一例では、細菌は、ＤＡＰの合成に必須な酵素であるβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを細菌が生産する能力を除去するために、ΔａｓｄＡ突然変異を用いることによって改変される。ＤＡＰの合成の廃止をもたらす他の突然変異は、限定されないが、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＣ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、およびａｓｄを含む（例えば、米国特許番号６，８７２，５４７を参照し、参照により本明細書中に援用される）。用いられ得る他の改変は、Ｄ−アラニンを合成またはＤ−グルタミン酸を合成する細菌の能力に対する改変を含み（例えば、ΔｍｕｒＩ突然変異）、両方とも、細菌の細胞壁のペプチドグリカン層の独特な成分である。
【０１３０】
同様に、様々な実施態様は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ核酸配列内に挿入されたａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｃ２遺伝子カセットを含んでよい。ａｒａＣ核酸配列は、隣接核酸配列の発現における干渉をもたらし得てワクチン株の能力に悪影響を及ぼす方向で転写されるので、転写終結（ＴＴ）配列は、一般に、ａｒａＣ核酸配列に対して３’に挿入される。染色体ａｓｄ核酸配列は、平衡致死宿主−ベクター系内の野生型ａｓｄ核酸配列をコードするプラスミドベクターの使用を可能にするために典型的に不活化される。このことは、生きた細菌ワクチンでは許容されない任意の薬物耐性の属性の不存在において、インビボでプラスミドの安定した維持を可能にする。一部のこれらの実施態様では、野生型ａｓｄ核酸配列は、本明細書に記載のベクターによってコードされ得る。ベクターは、抑制可能プロモーターを通して抗原コード配列の調節された発現を可能にする。
【０１３１】
Ｃ．リプレッサー調節系
一部の実施態様では、組み換え細菌は、リプレッサーによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結された核酸（例えば遺伝子）を含み、遺伝子の調節された発現を促進する。したがって、一部の実施態様では、組み換え細菌は、リプレッサーをコードする遺伝子を含む核酸を含む。一部の実施態様では、リプレッサーをコードする遺伝子は、調節可能なプロモーターに動作可能に連結される。調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたリプレッサーをコードする核酸配列を染色体に組み込む方法は当技術分野で知られていて、実施例で詳述される。一部の実施態様では、リプレッサーをコードする核酸配列は、宿主細胞にコロニー形成する細菌の能力が破壊されるように染色体座内に組み込まれない。一部の実施態様では、組み換え細菌は、細菌染色体のｒｅｌＡ座内に組み込まれたリプレッサーをコードする核酸を含む。一部の実施態様では、組み換え細菌は、細菌染色体内のｅｎｄＡ座内に組み込まれたリプレッサーをコードする核酸を含む。一部の実施態様では、組み換え細菌は、リプレッサーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。一部の実施態様では、組み換え細菌は、リプレッサーをコードする少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６またはそれよりも多くの核酸を含む。一部の実施態様では、リプレッサーをコードする核酸は、細菌内のプラスミド上に存在する。一部の実施態様では、リプレッサーをコードする核酸は、細菌染色体内に位置する。リプレッサーをコードする１よりも多い核酸配列が存在するならば、リプレッサーをコードするそれぞれの核酸配列は、それぞれのプロモーターが同一の化合物または条件によって調節されるように、調節可能なプロモーターに動作可能に連結されてよい。あるいは、リプレッサーをコードするそれぞれの核酸配列は、調節可能なプロモーターに動作可能に連結されてよく、それぞれが異なる化合物または条件によって調節される。
【０１３２】
本明細書において用いられる「リプレッサー」は、プロモーターの転写活性を抑制する生体分子を指す。一部の実施態様では、リプレッサーは、リプレッサーによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結された核酸の転写が抑制されるように、インビトロ培養中に十分高い量で組み換え細菌によって合成される。このことは、例えば、前記核酸によってコードされる産物の発現が、細菌のインビトロ増殖、および／または、細菌が対象に感染および／またはコロニー形成する能力を妨げるならば、特に有利であり得る。一部の実施態様では、リプレッサーによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結された核酸は、目的の抗原を発現する。一部の実施態様では、細胞内のリプレッサーの濃度は、リプレッサーをコードする遺伝子の転写後にそれぞれの細胞分裂周期が低減または止まるにつれて次第に低減する（例えば、インビボ）。本明細書に記載の特定のリプレッサーの使用は、用いられる組み換え細菌の種、亜種、株または血清型に部分的に依存し得る。一部の実施態様では、リプレッサーは、リプレッサーによって調節可能なプロモーターが由来する同一種（例えば、同一細菌種または同一ファージ）に由来する。一部の実施態様では、リプレッサーは、リプレッサーが発現される細菌種と同一の細菌種に由来しない。例えば、一部の実施態様では、リプレッサーは、組み換え細菌がサルモネラ属であるならば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する。他の適切なリプレッサーは、バクテリオファージに由来するリプレッサーを含む。
【０１３３】
上記に詳述されるリプレッサーおよび調節可能なプロモーターをコードする核酸配列は、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように改変され得る。リプレッサーをコードする核酸配列の発現の最適レベルは、実験によって見積もられ得て、または決定され得る。そのような決定は、リプレッサーが、単量体、二量体、三量体、四量体、またはより高い多数として作用するかどうかを考慮すべきであり、目的の抗原をコードするベクターのコピー数も考慮すべきである。例示的な実施態様では、発現のレベルは、リプレッサーが、目的の抗原をコードする核酸の発現を実質的に阻害するレベルで許容的環境において合成されて（すなわち、インビトロ増殖）、非許容的環境において実質的に合成されないように最適化されて、それにより、目的の抗原をコードする核酸の発現を可能にする。
【０１３４】
一部の実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードするｌａｃＩ遺伝子を含む核酸を含むように改変される。本明細書に記載の組み換え細菌内のｌａｃＩによってコードされるリプレッサーの発現は、細菌によって発現される目的の抗原をコードする遺伝子の発現を調節するために用いられ得る。例えば、一部の実施態様では、ｌａｃＩ遺伝子の発現は、糖によって調節可能なプロモーター（例えば、アラビノースによって調節可能なプロモーター）によって調節される。アラビノースの存在下で培養された場合、組み換え細菌はＬａｃＩリプレッサータンパク質を合成して、次々に、ＬａｃＩ応答性プロモーター（例えば、Ｐｔｒｃ、Ｐｌａｃ、ＰＴ７ｌａｃおよびＰｔａｃ）に動作可能に連結された目的の抗原をコードする遺伝子の発現を抑制する。対象への投与の際およびアラビノース源の不存在において、ＬａｃＩリプレッサーの合成は止まり、ＬａｃＩ応答性プロモーターの抑制解除および続いて生じる目的の抗原の発現をもたらす。細胞内のＬａｃＩの濃度は、インビボでそれぞれの細胞分裂において約半分低減して、次第に低減されるレベルの抑制および次第に増大される目的の抗原の合成をもたらす。
【０１３５】
一部の実施態様では、ｌａｃＩ遺伝子を含む核酸は、細菌内のプラスミド上に位置する。一部の実施態様では、ｌａｃＩ遺伝子を含む核酸は、細菌の染色体上に位置する。一部の実施態様では、ｌａｃＩ遺伝子を含む核酸は、細菌染色体内の欠失または変更されている内因性ｒｅｌＡ遺伝子の遺伝子座に対応する染色体座に位置する。一部の実施態様では、組み換え細菌は、ｌａｃＩ遺伝子を含む核酸を含むように改変されて、それにより、細菌染色体内のｌａｃＩ遺伝子の内因性コピーは変更および／または欠失されている。
【０１３６】
一部の実施態様では、核酸は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌａｃＩ遺伝子を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＩ遺伝子の核酸配列が以下に提供される：
ｇｔｇａａａｃｃａｇｔａａｃｇｔｔａｔａｃｇａｔｇｔｃｇｃａｇａｇｔａｔｇｃｃｇｇｔｇｔｃｔｃｔｔａｔｃａｇａｃｃｇｔｔｔｃｃｃｇｃｇｔｇｇｔｇａａｃｃａｇｇｃｃａｇｃｃａｃｇｔｔｔｃｔｇｃｇａａａａｃｇｃｇｇｇａａａａａｇｔｇｇａａｇｃｇｇｃｇａｔｇｇｃｇｇａｇｃｔｇａａｔｔａｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｇｃｇｔｇｇｃａｃａａｃａａｃｔｇｇｃｇｇｇｃａａａｃａｇｔｃｇｔｔｇｃｔｇａｔｔｇｇｃｇｔｔｇｃｃａｃｃｔｃｃａｇｔｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｃｇｃｇｃｃｇｔｃｇｃａａａｔｔｇｔｃｇｃｇｇｃｇａｔｔａａａｔｃｔｃｇｃｇｃｃｇａｔｃａａｃｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｇａｔｇｇｔａｇａａｃｇａａｇｃｇｇｃｇｔｃｇａａｇｃｃｔｇｔａａａｇｃｇｇｃｇｇｔｇｃａｃａａｔｃｔｔｃｔｃｇｃｇｃａａｃｇｃｇｔｃａｇｔｇｇｇｃｔｇａｔｃａｔｔａａｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａｔｇａｃｃａｇｇａｔｇｃｃａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａａｇｃｔｇｃｃｔｇｃａｃｔａａｔｇｔｔｃｃｇｇｃｇｔｔａｔｔｔｃｔｔｇａｔｇｔｃｔｃｔｇａｃｃａｇａｃａｃｃｃａｔｃａａｃａｇｔａｔｔａｔｔｔｔｃｔｃｃｃａｔｇａａｇａｃｇｇｔａｃｇｃｇａｃｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｇｃａｔｃｔｇｇｔｃｇｃａｔｔｇｇｇｔｃａｃｃａｇｃａａａｔｃｇｃｇｃｔｇｔｔａｇｃｇｇｇｃｃｃａｔｔａａｇｔｔｃｔｇｔｃｔｃｇｇｃｇｃｇｔｃｔｇｃｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｃｔｇｇｃａｔａａａｔａｔｃｔｃａｃｔｃｇｃａａｔｃａａａｔｔｃａｇｃｃｇａｔａｇｃｇｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃｇａｃｔｇｇａｇｔｇｃｃａｔｇｔｃｃｇｇｔｔｔｔｃａａｃａａａｃｃａｔｇｃａａａｔｇｃｔｇａａｔｇａｇｇｇｃａｔｃｇｔｔｃｃｃａｃｔｇｃｇａｔｇｃｔｇｇｔｔｇｃｃａａｃｇａｔｃａｇａｔｇｇｃｇｃｔｇｇｇｃｇｃａａｔｇｃｇｃｇｃｃａｔｔａｃｃｇａｇｔｃｃｇｇｇｃｔｇｃｇｃｇｔｔｇｇｔｇｃｇｇａｔａｔｃｔｃｇｇｔａｇｔｇｇｇａｔａｃｇａｃｇａｔａｃｃｇａａｇａｃａｇｃｔｃａｔｇｔｔａｔａｔｃｃｃｇｃｃｇｔｔａａｃｃａｃｃａｔｃａａａｃａｇｇａｔｔｔｔｃｇｃｃｔｇｃｔｇｇｇｇｃａａａｃｃａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｃｔｔｇｃｔｇｃａａｃｔｃｔｃｔｃａｇｇｇｃｃａｇｇｃｇｇｔｇａａｇｇｇｃａａｔｃａｇｃｔｇｔｔｇｃｃｃｇｔｃｔｃａｃｔｇｇｔｇａａａａｇａａａａａｃｃａｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃａａｔａｃｇｃａａａｃｃｇｃｃｔｃｔｃｃｃｃｇｃｇｃｇｔｔｇｇｃｃｇａｔｔｃａｔｔａａｔｇｃａｇｃｔｇｇｃａｃｇａｃａｇｇｔｔｔｃｃｃｇａｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｇｃａｇｔｇａ（配列番号９）。
【０１３７】
配列番号９の核酸によってコードされるＥ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＩタンパク質のアミノ酸配列が以下に提供される：
ＭＫＰＶＴＬＹＤＶＡＥＹＡＧＶＳＹＱＴＶＳＲＶＶＮＱＡＳＨＶＳＡＫＴＲＥＫＶＥＡＡＭＡＥＬＮＹＩＰＮＲＶＡＱＱＬＡＧＫＱＳＬＬＩＧＶＡＴＳＳＬＡＬＨＡＰＳＱＩＶＡＡＩＫＳＲＡＤＱＬＧＡＳＶＶＶＳＭＶＥＲＳＧＶＥＡＣＫＡＡＶＨＮＬＬＡＱＲＶＳＧＬＩＩＮＹＰＬＤＤＱＤＡＩＡＶＥＡＡＣＴＮＶＰＡＬＦＬＤＶＳＤＱＴＰＩＮＳＩＩＦＳＨＥＤＧＴＲＬＧＶＥＨＬＶＡＬＧＨＱＱＩＡＬＬＡＧＰＬＳＳＶＳＡＲＬＲＬＡＧＷＨＫＹＬＴＲＮＱＩＱＰＩＡＥＲＥＧＤＷＳＡＭＳＧＦＱＱＴＭＱＭＬＮＥＧＩＶＰＴＡＭＬＶＡＮＤＱＭＡＬＧＡＭＲＡＩＴＥＳＧＬＲＶＧＡＤＩＳＶＶＧＹＤＤＴＥＤＳＳＣＹＩＰＰＬＴＴＩＫＱＤＦＲＬＬＧＱＴＳＶＤＲＬＬＱＬＳＱＧＱＡＶＫＧＮＱＬＬＰＶＳＬＶＫＲＫＴＴＬＡＰＮＴＱＴＡＳＰＲＡＬＡＤＳＬＭＱＬＡＲＱＶＳＲＬＥＳＧＱ（配列番号１０）。
【０１３８】
一部の実施態様では、核酸はｌａｃＩ遺伝子を含み、ここでｌａｃＩ遺伝子は、配列番号９の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸はｌａｃＩ遺伝子を含み、ここでｌａｃＩ遺伝子は、配列番号９の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同の核酸配列を含む。
【０１３９】
一部の実施態様では、核酸は、ＬａｃＩタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＬａｃＩタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、核酸は、ＬａｃＩタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＬａｃＩタンパク質は、配列番号１０の核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同のアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
一部の実施態様では、核酸は、調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｌａｃＩ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、糖によって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｌａｃＩ遺伝子を含む。一部の実施態様では、糖によって調節可能なプロモーターは、特定の糖の存在下で増大した活性（例えば増大した転写）および糖の不存在下で低減した活性を示す。一部の実施態様では、核酸は、ラムノースによって調節可能なプロモーター（例えば、糖によって調節可能なプロモーター）に動作可能に連結されたｌａｃＩ遺伝子を含む。一部の実施態様では、核酸は、アラビノースによって調節可能なプロモーターに動作可能に連結されたｌａｃＩ遺伝子を含む。一部の実施態様では、アラビノースによって調節可能なプロモーターはＰａｒａＢＡＤである。一部の実施態様では、組み換え細菌は、突然変異ΔｒｅｌＡ：：ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｌａｃＩＴＴを含む。
【０１４１】
Ｄ．抗原
一部の実施態様では、組み換え細菌は、目的の抗原をコードする核酸を含む。本明細書において用いられる「抗原」は、宿主において免疫応答を誘発することが可能な生体分子を指す。一部の実施態様では、抗原は、タンパク質、またはタンパク質のフラグメントであってよい。一部の実施態様では、組み換え細菌は、目的の抗原をコードする核酸（例えばプラスミド）を含み、ここで核酸は、宿主細胞によって発現される（例えばＤＮＡワクチン）。例示的な実施態様では、抗原は、対象において防御免疫応答を誘発する。
【０１４２】
本明細書において用いられる「防御」は、免疫応答が、病原体による宿主の感染と関連する任意の症候を減らすのに貢献することを意味し、抗原は、応答を誘発するように得られ、または設計された。例えば、サルモネラのような病原体由来の防御抗原は、サルモネラ感染と関連する症候を寛解させる、または、病原体による感染と関連する罹患率および死亡率を減少させるのを助ける免疫応答を誘導し得て、または、サルモネラが宿主に感染およびコロニー形成する能力を減少させ得る。本開示における用語「防御」の使用は、宿主が病原体の効果から完全に防御されることを必ずしも必要としない。
【０１４３】
一部の実施態様では、目的の抗原は、感染因子に由来する抗原である。一部の実施態様では、目的の抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、プリオン、真菌、および蠕虫からなる群から選択される感染因子に由来する。一部の実施態様では、目的の抗原は、細菌に由来する。一部の実施態様では、目的の抗原はサルモネラ抗原である。一部の実施態様では、サルモネラ抗原は、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＣ１８０、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＦ、ＳｓｅＢ、およびＳｓｅＩの群から選択される。一部の実施態様では、目的の抗原はウイルス抗原である。一部の実施態様では、目的の抗原はインフルエンザ抗原である。一部の実施態様では、インフルエンザ抗原は、ＤＮＡワクチンによって送達されるならば、ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼである。一部の実施態様では、目的の抗原は癌と関連する抗原である。一部の実施態様では、癌と関連する抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＸＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１ＢおよびＬＡＧＥ２としても知られる）、ＬＡＧＥ１（ＣＴＡＧ２としても知られる）およびサバイビンからなる群より選択される。
【０１４４】
あるいは、抗原は、それらが配偶子特異的であるという条件で配偶子に由来してよく、受精をブロックするように設計され得る。別の代替では、抗原は腫瘍抗原であってよく、腫瘍増殖を低減するように設計され得る。新たに同定、または、疾患または病原状態と新たに関連付けられた生物、または、動物またはヒトの新規または新興の病原体由来の抗原（現在知られまたは将来同定されるものを含む）は、本明細書において詳述される細菌によって発現され得ることが明確に検討される。さらに、抗原は、病原生物由来のものに制限されない。
【０１４５】
細菌の免疫原性は、サイトカイン、アジュバント、および他の免疫調節剤に関する配列も発現する株を構築することによって、増強および／または調節され得る。
【０１４６】
抗原に関する由来として有用な微生物の一部の例が以下に挙げられる。これらは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓおよび他のエルシニア種、例えば、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａに起因する疫病の制御のため、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａに起因する淋病の制御のため、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍに起因する梅毒の制御のため、および、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに起因する性病ならびに眼感染の制御のための、微生物を含んでよい。グループＡおよびグループＢの両方由来のストレプトコッカス種、例えば、咽喉痛または心疾患を引き起こす種、ウマにおいて窒息死を引き起こすＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、虫歯を引き起こすＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、および、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび他のマイコプラズマ種、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、他のボルデテラ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、シゲラ種、ボレリア種、バルトネラ種、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、カンピロバクター種、シュードモナス種、モラクセラ種、ブルセラ種、フランシセラ種、アエロモナス種、アクチノバチルス種、クロストリジウム種（例えば、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、リケッチア種、バチルス種、コクシエラ種、エーリキア種、リステリア種、およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａは、抗原核酸配列を得ることのできる本開示の範囲内の細菌のさらなる例である。
【０１４７】
ウイルス抗原を用いてもよい。ウイルス抗原は、例えば、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、ミクソウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルスまたはレトロウイルスのクラス由来の、ウイルス、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスに対して向けられる、抗原送達微生物において用いられ得る。抗原はまた、病原性の菌類、原虫および寄生虫に由来してもよい。しかしながら、抗原送達の手段または抗原をコードする配列は、抗原および／またはウイルスのタイプに依存する。
【０１４８】
特定の実施態様では、抗原は、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含んでよい。あるいは、免疫応答が望まれる抗原は、強力な無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｔ細胞エピトープを含む、および／または、アジュバントとしての働きをする、および／または、抗原の提示を高めるのを促進する、担体タンパク質への融合として発現されてよい（全ての場合において、抗原またはその構成要素部分に対する免疫応答）。これは、当技術分野で知られている方法によって達成され得る。テタヌス毒素（ｔｅｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ）フラグメントＣ、ＣＴ−Ｂ、ＬＴ−Ｂおよび肝炎ウイルスＢコアに対する融合は、これらの目的に特に有用であるが、他のエピトープ提示系が当技術分野でよく知られている。
【０１４９】
さらなる実施態様では、抗原をコードする核酸配列は、分泌シグナルを含んでよい。
【０１５０】
上述のように、目的の抗原の合成レベルは、リプレッサーおよび／またはプロモーターをコードする核酸配列を改変することによって最適化される。本明細書において用いられる「改変」は、リプレッサーをコードする核酸配列の転写レベルの変化をもたらす、または、リプレッサーの合成レベルの変化をもたらす、リプレッサーおよび／またはプロモーターの核酸配列の変更を指す。例えば、一実施態様では、改変は、リプレッサーをコードする核酸配列の開始コドンを変更することを指してよい。一般的に言えば、ＧＴＧまたはＴＴＧ開始コドンは、ＡＴＧ開始コドンとは違い、翻訳効率を１０倍低減させ得る。別の実施態様では、改変は、リプレッサーをコードする核酸配列のシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列を変更することを指してよい。ＳＤ配列は、一般に開始コドンの６〜７ヌクレオチド上流に位置するリボソーム結合部位である。ＳＤコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧであり、コンセンサス配列の変動は翻訳効率を変更し得る。さらに別の実施態様では、改変は、ＳＤ配列と開始コドンとの間の距離を変更することを指してよい。さらに別の実施態様では、改変は、ＲＮＡポリメラーゼ認識に関する−３５配列を変更することを指してよい。同様の実施態様では、改変は、ＲＮＡポリメラーゼ結合に関する−１０配列を変更することを指してよい。さらなる実施態様では、改変は、−３５〜−１０配列の間のヌクレオチドの数を変更することを指してよい。代替の実施態様では、改変は、リプレッサーをコードするｍＲＮＡの翻訳レベルを変更するために、リプレッサーをコードする核酸配列のコドンを最適化することを指してよい。例えば、リプレッサーをコードする核酸配列の開始コドンの後の最初の非Ａリッチコドンは、リプレッサーをコードするｍＲＮＡの翻訳を最大化しなくてよい。同様に、本明細書に記載の任意のタンパク質をコードする核酸配列のコドンは、コドン最適化され得て、すなわち、特定の生物の高度に合成されたタンパク質由来のコドンを模倣するように変更され得る。さらなる実施態様では、改変は、リプレッサーをコードするｍＲＮＡの翻訳レベルを変更するために、リプレッサーをコードする核酸配列のＧＣ含有量を変更することを指してよい。核酸配列を改変する方法は、当技術分野で知られている。
【０１５１】
一部の実施態様では、１よりも多い改変または改変タイプは、本明細書に記載の核酸（例えば、リプレッサーまたは目的の抗原をコードする核酸）の発現レベルを最適化するために行なわれてよい。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９の改変、または改変タイプが、本明細書に記載の核酸の発現レベルを最適化するために行なわれてよい。非限定的な例として、リプレッサーがＬａｃＩである場合、その結果、ＬａｃＩおよびプロモーターの核酸配列は、ＬａｃＩ合成のレベルを増大するように変更されてよい。一実施態様では、ＬａｃＩリプレッサーの開始コドンは、ＧＴＧからＡＴＧに変更されてよい。別の実施態様では、ＳＤ配列は、ＡＧＧＧからＡＧＧＡに変更されてよい。さらに別の実施態様では、ｌａｃＩのコドンは、サルモネラの高度に合成されたタンパク質に関するコドン使用頻度に従って最適化されてよい。さらなる実施態様では、ｌａｃＩの開始コドンは変更されてよく、ＳＤ配列は変更されてよく、ｌａｃＩのコドンは最適化されてよい。
【０１５２】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、プラスミドまたはベクター内に位置する核酸を含む。本明細書において用いられる「ベクター」は、自律複製核酸単位を指す。本開示は、ウイルス、コスミド、ファスミド、およびプラスミドベクターを含む任意の公知のタイプのベクターを用いて実施され得る。最も好ましいタイプのベクターは、プラスミドベクターである。一部の実施態様では、プラスミドまたはベクターは、高コピープラスミドである。一部の実施態様では、プラスミドまたはベクターは、低コピープラスミドまたはベクターである。
【０１５３】
当技術分野でよく知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、幅広いプロモーター、多数のクローニング配列、転写終結因子などを保有してよく、ベクターは、ベクターの相対的コピー数を制御することによって抗原をコードする核酸配列の発現レベルを制御するように選択され得る。ベクターが、抗原として表面に局在した付着因子またはＴ細胞免疫を刺激することが可能な抗原をコードし得る一部の場合において、細菌細胞あたり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーのような低コピー数でベクターを使用することが好ましくあり得る。低コピー数ベクターの非限定的な例は、ｐＳＣ１０１  ｏｒｉを含むベクターであり得る。
【０１５４】
一部の実施態様では、プラスミドは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、ａｓｄＡ）をコードする核酸配列を含む。これらのプラスミドは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異（例えば、ａｓｄＡ）を含む細菌を相補するために有利に用いられ得る。一部の実施態様では、プラスミドは、ｐＹＡ３３４２、ｐＹＡ３３３７、およびｐＹＡ３３３２からなる群より選択される。
【０１５５】
他の場合では、中間コピー数ベクターが、所望の免疫応答を誘導するのに適切であり得る。例えば、中間コピー数ベクターは、細菌細胞あたり少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０コピーを有してよい。中間コピー数ベクターの非限定的な例は、ｐ１５Ａ  ｏｒｉを含むベクターであってよい。
【０１５６】
さらに他の場合では、高コピー数ベクターは、最大の抗体応答の誘導に最適であり得る。高コピー数ベクターは、細菌細胞あたり少なくとも３１、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００コピーを有してよい。一部の実施態様では、高コピー数ベクターは、細菌細胞あたり少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、または４００コピーを有してよい。高コピー数ベクターの非限定的な例は、ｐＢＲ  ｏｒｉまたはｐＵＣ  ｏｒｉを含むベクターを含んでよい。
【０１５７】
加えて、ベクターコピー数は、プラスミドコピー数を増大させる突然変異に関して選択することによって増大され得る。これらの突然変異は、細菌染色体内で生じ得るが、プラスミドベクターにおいて生じる可能性がより高い。
【０１５８】
好ましくは、本明細書において用いられるベクターは、ベクターの維持について選択するための抗生物質耐性マーカーを含まない。
【０１５９】
本明細書に記載の実施態様での使用のためのプロモーターは、当技術分野で知られている。当業者は、リプレッサーの選択は、本明細書に記載の核酸の発現を調節するために用いられるプロモーターの選択を部分的に指示すると認識している。例えば、リプレッサーがＬａｃＩであるならば、その結果、プロモーターは、ＬａｃＩ応答性プロモーター、例えば、Ｐｔｒｃ、Ｐｌａｃ、ＰＴ７ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ＰｏｍｐＡ  ｌａｃＯ、およびＰｌｐｐ  ｌａｃＯからなる群より選択され得る。リプレッサーがＣ２ならば、その結果、プロモーターは、Ｃ２応答性プロモーター、例えば、Ｐ２２プロモーターＰＬおよびＰＲからなる群より選択され得る。リプレッサーがＣ１ならば、その結果、プロモーターは、Ｃ１応答性プロモーター、例えば、λプロモーターＰＬおよびＰＲからなる群より選択され得る。
【０１６０】
本明細書におけるそれぞれの実施態様において、プロモーターは、核酸配列の発現を調節する。一部の実施態様では、プロモーターは、リプレッサーが合成された場合（例えば細菌のインビトロ増殖中）には、核酸配列の発現が抑制されるが、リプレッサーが合成されない場合（例えば、インビボ）では、抗原をコードする核酸配列の発現が高いように、リプレッサーによって制御される調節配列を含む。一般的に言えば、リプレッサーの濃度は、リプレッサーをコードする遺伝子の発現が止まった後、全ての細胞分裂で低減する。一部の実施態様では、リプレッサーの濃度は、調節されている核酸配列の高レベルの発現が、細菌の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２分裂後に達成されるように、低減する。例示的な実施態様では、リプレッサーの濃度は、インビボで細胞の約５分裂後に、抗原をコードする核酸配列の高レベル発現を可能にするのに十分に低減する。
【０１６１】
特定の実施態様では、プロモーターは、他の調節エレメントを含んでよい。例えば、プロモーターは、リプレッサーがＬａｃＩならば、ｌａｃＯを含んでよい。これは、ＬａｃＩによって調節されるリポタンパク質プロモーターＰｌｐｐ  ｌａｃＯでの場合である（ＬａｃＩ結合ドメインｌａｃＯを保有するので）。一実施態様では、リプレッサーはＬａｃＩリプレッサーであり、プロモーターはＰｔｒｃである。
【０１６２】
一部の実施態様では、リプレッサーによって調節される核酸配列の発現は、インビボで抑制される。発現は、抑制されていない条件下での発現の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、または実に１％未満である場合、「抑制」または「部分的に抑制」され得る。したがって、「完全な抑制」の条件下での発現レベルは過度に低くてよいが、抑制は決して絶対的ではあり得ないので、非常に感度の高い方法を用いて検出できる可能性がある。
【０１６３】
反対に、抗原をコードする核酸配列の発現は、リプレッサーの発現が抑制される場合、高いはずである。例えば、リプレッサーが宿主における組み換え細菌の増殖中に合成されないならば、リプレッサーの制御下の核酸の発現は高い。本明細書において用いられる「高レベル」発現は、抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分に強い発現を指す。その結果として、高レベル発現と関連するコピー数は、所望の免疫応答のタイプおよび抗原に応じて変化してよく、および、変化する。例えば、抗体レベルまたは抗原依存性Ｔ細胞集団または抗原依存性サイトカインレベルを測定することによって、抗原が免疫応答を誘発するかどうか判定する方法は、当技術分野で知られていて、転写されるｍＲＮＡのレベルを測定することによって、または、タンパク質の発現レベルを定量化することによって、抗原をコードする配列の発現のレベルを測定する方法も、当技術分野で知られている。
【０１６４】
上記の実施態様のそれぞれにおいて、調節された発現が可能な組み換え細菌は、弱毒化されてもよい。「弱毒化される」は、物理的操作または組み換えの一部の形態によって、細菌がその野生型の適合性から弱められている細菌の状態を指す。これは、細菌の遺伝子型を、疾患を引き起こすその能力を減少させるように変更することを含む。しかしながら、消化管（サルモネラの場合）にコロニー形成して免疫応答を誘導する細菌の能力は、好ましくは、実質的に損なわれない。
【０１６５】
例示的な実施態様では、組み換え細菌は、上述のように弱毒化されてよい。その場合、抗原をコードする配列の調節された発現および調節された弱毒化の両方とも、糖によって調節可能な系に依存してよい。その結果として、抗原コード配列の調節された最適な発現に必要な糖（例えば、アラビノース）の濃度は、弱毒化の最適な発現に関する濃度と同一でなくてよい。例示的な実施態様では、抗原をコードする配列の調節された発現および調節された弱毒化の両方の最適化に関するアラビノースの濃度は、実質的に同一である。
【０１６６】
したがって、プロモーターおよび／または弱毒化タンパク質をコードする核酸配列は、系を最適化するように改変され得る。改変の方法は上記に詳述されている。手短に言うと、例えば、所定の濃度のアラビノースを用いて株を増殖させた場合に、ＦｕｒおよびＰｈｏＰＱの生産レベルが、調節された弱毒化表現型および調節された発現の両方に最適であるように、核酸配列ｆｕｒおよびｐｈｏＰＱに関して、ＳＤリボソーム結合配列が変更されてよく、および／または、開始コドンがＡＴＧからＧＴＧに変更されてよい。当業者は、ｆｕｒおよびｐｈｏＰＱに加えて他の核酸配列もまた、他のよく知られたプロトコルと組み合わせて、本明細書に記載のように変更され得ることを理解している。加えて、これらの弱毒化核酸配列は、当業者に公知の十分に確立されたプロトコルを用いて他の系によって調節され得る。例えば、アラビノースよりむしろ、マルトース、ラムノース、またはキシロースの付加に依存性のプロモーターによって調節され得る。
【０１６７】
ＩＩ．医薬組成物
組み換え細菌は、医薬組成物として宿主に投与されてよい。一部の実施態様では、医薬組成物は、組み換え細菌に対して免疫応答を誘発するためのワクチンとして用いられてよく、細菌によって合成および送達され得る任意の抗原を含む。例示的な実施態様では、免疫応答は防御である。抗原に対する免疫応答は非常に研究されていて、広く報告されている。
【０１６８】
医薬組成物は、免疫応答をマウントすることが可能な任意の宿主に投与されてよい。そのような宿主は全ての脊椎動物、例えば、家畜、農業動物、実験動物、およびヒトを含む哺乳類、および、飼われている鳥類および農業的重要性の鳥類を含む様々な鳥類の種類を含んでよい。好ましくは、宿主は温血動物である。一実施態様では、宿主はウシである。一部の実施態様では、宿主はウマである。別の実施態様では、宿主は鳥類である。別の実施態様では、宿主はヒトである。医薬組成物は、予防として、または治療目的のために、対象に投与されてよい。
【０１６９】
一部の実施態様では、組み換え細菌は、本明細書に記載の医薬組成物において、宿主に投与される場合、生きている。適切なワクチン組成物処方および投与方法は、以下に詳述される。
【０１７０】
組み換え細菌を含む医薬組成物は、１つまたは複数のあり得る添加剤、例えば、担体、防腐剤、安定剤、アジュバント、および他の物質を、任意選択で含んでよい。
【０１７１】
一実施態様では、医薬組成物は、アジュバントを含む。アジュバントは、ワクチンが免疫応答をトリガーする、高める、または延長する能力を増大するために、任意選択で添加されてよい。例示的な実施態様では、生きた弱毒化組み換え細菌の使用は、天然のアジュバントとして作用し得る。一部の実施態様では、組み換え細菌は、免疫モジュレーターを合成および分泌する。さらなる材料、例えば、サイトカイン、ケモカイン、および、細菌内に天然に見られる細菌の核酸配列（ＣｐＧなど）もまた、潜在的なワクチンアジュバントである。
【０１７２】
一部の実施態様では、医薬組成物は、緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を含む。
【０１７３】
一部の実施態様では、医薬組成物は、食品製品を含む。
【０１７４】
別の実施態様では、製剤は、製剤担体（または賦形剤）を含んでよい。そのような担体は、接種される宿主に非毒性であって組み換え細菌と適合するカプセル化のための任意の溶媒または固形物であってよい。担体は、形状または密度を与えてよく、または、希釈剤として作用してよい。適切な製剤担体は、液体担体、例えば、通常の生理食塩水および生理学的濃度またはその付近の他の非毒性塩、および、ヒトに用いられない固形担体、例えば、タルクまたはスクロース、または動物飼料を含んでよい。担体は、安定化剤、湿潤および乳化剤、異なるモル浸透圧濃度に関する塩、カプセル化剤、バッファー、および皮膚透過性増強剤を含んでもよい。担体および賦形剤ならびに非経口および非腸管外（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物輸送のための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に示される。気管支チューブを介した投与に用いられる場合、医薬組成物は、好ましくはエアロゾルの形態で存在する。
【０１７５】
一部の実施態様では、医薬組成物は、家畜（例えば、家禽）に送達される。一部の実施態様では、医薬組成物は、噴霧経路として送達される（例えば、家禽への送達のための孵化場における使用のため）。一部の実施態様では、医薬組成物は、飲料水において送達される。
【０１７６】
生きた組み換え細菌が死滅しないように、添加剤を用いる場合に注意すべきであり、さもなければ、ＧＡＬＴ、ＮＡＬＴおよびＢＡＬＴのようなリンパ組織に効率的にコロニー形成するその能力が添加剤の使用によって損なわれる。安定剤、例えば、ラクトースまたはグルタミン酸モノナトリウム（ＭＳＧ）は、温度変動または凍結乾燥工程のような様々な条件に対して医薬組成物を安定化させるために添加されてよい。組み換え細菌はまた、本明細書に記載のグルタメートおよび／またはアルギニンとともに共投与されてもよい。
【０１７７】
医薬組成物の用量は、当業者によって理解されるように、組み換え細菌、調節される抗原、および意図される宿主に応じて変化してよく、および変化する。一般的に言えば、用量は、宿主の大部分において防御免疫応答を誘発するのに十分であることのみ要する。ルーチン実験によって、必要とされる用量が容易に確立され得る。経口投与のためのワクチンの典型的な最初の用量は、免疫化される宿主の年齢に応じて約１×１０７〜１×１０１０ＣＦＵであってよい。所望のレベルの防御免疫を提供するために、多数回用量の投与が必要に応じて用いられてもよい。
【０１７８】
ＧＡＬＴ、ＮＡＬＴまたはＢＡＬＴ細胞の好ましい応答を刺激するために、消化管、鼻咽頭、または気管支へ直接的に、例えば、経口投与、鼻腔内投与、胃挿管によって、またはエアロゾルの形態で、医薬組成物を投与することが好ましいが、組み換え細菌を投与する他の方法、例えば、静脈内、筋肉内、皮下注入または乳腺内、陰茎内、直腸内、膣投与、または他の非経口経路が、例えば抗癌適用のために可能である。
【０１７９】
一部の実施態様では、これらの組成物は、注入（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、皮内、筋肉内など）による投与のために製剤化される。
【０１８０】
別の実施態様では、本開示は、宿主における抗原に対する免疫応答を誘発するための方法を提供する。当該方法は、本明細書に記載の組み換え細菌を含む有効量の医薬組成物を宿主に投与するステップを含む。
【０１８１】
さらに別の実施態様では、組み換え細菌は、それを必要とする個体における病原体に対する免疫応答を誘発するための方法において用いられ得る。当該方法は、本明細書に記載の組み換え細菌を含む有効量の医薬組成物を宿主に投与するステップを含む。さらなる実施態様では、本明細書に記載の組み換え細菌は、それを必要とする宿主における感染性疾患の１つまたは複数の症候を寛解させるための方法において用いられ得る。当該方法は、本明細書に記載の組み換え細菌を含む有効量の医薬組成物を投与するステップを含む。
【実施例】
【０１８２】
本発明は、いかなる方法においても限定と解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに説明される。本出願全体を通じて挙げられる、参考文献、発行された特許、および、公開された特許出願を含む全ての引用文献の内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。本明細書に添付された全ての図および表の内容もまた参照により本明細書中に明示的に援用されることがさらに理解されるべきである。
【０１８３】
実施例１：背景
サルモネラに対する防御免疫は、特定の抗体の組み合わせた作用、Ｂ細胞およびＴ細胞獲得免疫応答に依存する（５２〜５６）。一次感染の効果的なクリアランスは、菌血症を制限する抗体の助けとともに、Ｔｈ１応答を必要とする（５５、５７）。抗体応答は、マウス（６１）およびヒト（６２〜６４）においてＳ．Ｔｙｐｈｉに対する防御に関して見られるように、サルモネラ感染に対する防御を達成するのに重要である（５８〜６０）。ＲＡＳＶは、免疫系の３つのブランチ全てを誘導する（すなわち、粘膜抗体および細胞性応答、および全身性抗体および細胞性応答）。免疫系の３つのブランチは全て、サルモネラ、および、粘膜表面上にコロニー形成するまたはそれを通って侵襲する全ての病原体に対して、防御免疫を与えるのに重要である。
【０１８４】
サルモネラは、多くの免疫学的に関連した交差反応性抗原を保有する。これらは、Ｓ．Ａｒｉｚｏｎａｅを除いて（６７、６８）、全てではないとしても大部分のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型（６５、６６）において同一のＬＰＳコア多糖類を含む。加えて、ＯＭＰは、微小不均一性を保有するが、それにもかかわらず、抗原性決定因子（６９）、ならびに、鉄によって調節される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）（７０）（感染された動物における病原体の成功に必須の重要な機能である鉄獲得に必要である（７０））を共有する。
【０１８５】
サルモネラワクチンは、インビトロで、および、感染の最初の段階中に、経口で免疫化された宿主における粘膜表面を通して、野生型表面抗原性決定因子を提示するために用いられ得て、それから、Δｐｍｉ突然変異（７１〜７４）によってＬＰＳ  Ｏ−抗原側鎖を合成するのをやめて、ΔＰｆｕｒ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｆｕｒ（ΔＰｆｕｒ）欠失−挿入突然変異（７７）によって、内臓（７５、７６）においてＩＲＯＭＰを構成的に合成するのをやめる。Δｐｍｉ突然変異を有するＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株は、完全に弱毒化されないが、高い免疫原性、交差防御ＯＭＰ、ＩＲＯＭＰ（７６）および保存されたＬＰＳコア（７８、７９）に対する高い抗体力価の誘導を高める有効性を有する。しかしながら、ＬＰＳコアに付着したさらに２つの糖類が存在するため、ＬＰＳコアは完全に露出されない。Δｐｍｉ突然変異を有する株もまた、高い防御免疫のための組み換え防御抗原を送達することのできる外膜小胞（ＯＭＶ）の生産を高める（８０）。ΔＰｆｕｒ突然変異は、ｆｕｒ遺伝子の発現を、アラビノースの存在にのみ依存性にさせて（７５、８１、８２）、鉄の濃度に対して盲目であり、免疫学的に交差反応性のＩＲＯＭＰを含む鉄獲得のための全ての構成要素の高い構成的合成レベルをインビボで達成する。非常に免疫原性のＩＲＯＭＰに対する免疫応答は、腸病原体による敗血症感染を予防するのに効果的である（８３）。１つの細菌血清型由来のＩＲＯＭＰに対して誘導される抗体は、他の血清型によって合成されたＩＲＯＭＰを認識することができる（８４）。ＩＲＯＭＰ過剰生産に基づく２つの不活化ワクチンは、家禽におけるサルモネラ症に対して防御することが認可されている（８５、８６）。
【０１８６】
免疫系に対して表面多糖類およびＯＭＰの両方を送達する生きたサルモネラは、複合糖質ワクチンよりも免疫原性である。サルモネラは、外側の細胞壁の膜の５０〜９０ｎｍの水疱様粒子を自然発生的に放出する（８７〜８９）。これらの水疱は、ＧＭＭＡ（膜抗原に関する一般化されたモジュール）または外膜小胞と呼ばれ、それらのネイティブの立体構造および正しい方位で外膜関連抗原の富化源を構成する。ＧＭＭＡまたは外膜小胞は、それらが誘発する免疫応答において自己アジュバントとして作用する潜在性を有する、ＴＬＲリガンドを含む多数の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含むので（９０〜９５）、組み換えタンパク質よりも重大な利点を提供する。ＧＭＭＡまたは外膜小胞はまた、多くの外膜構成要素（例えばリポタンパク質）を失ったことにより減少した免疫原性をもたらす洗浄抽出されたＯＭＰとは異なる。ＧＭＭＡまたは外膜小胞は、髄膜炎菌（９６、９７）、赤痢菌（８７）およびサルモネラ（２７）に関するワクチンとして現在のところ探求されている。候補ＧＭＭＡまたは外膜小胞ワクチンを用いた前臨床試験は、様々な株に対する広範な交差防御免疫および良好な免疫原性を示す（９８）。プロトタイプ髄膜炎菌性ＧＭＭＡまたは外膜小胞は、１つのフェーズ１臨床試験において副作用なく試験されていて（９９）、プロトタイプ赤痢菌ＧＭＭＡまたは外膜小胞がフェーズ２試験に計画されている。ＧＭＭＡまたは外膜小胞の生産は、サルモネラおよび赤痢菌のｔｏｌＲ突然変異体に見られるように（８７、１０２）、ｔｏｌＲ遺伝子の欠失によって高められ得る（８７、１００、１０１）。リピドＡ改変に関するｈｔｒＢ（８８）およびｍｓｂＢ（１０３）のような遺伝子の欠失は、反応源性を減少させることができる。新規のＧＭＭＡまたは外膜小胞ワクチンは、適切なワクチン細菌性シード株によって自然発生的に放出されるので精製ステップの回数が減少されるが、ＧＭＭＡまたは外膜小胞精製のための複雑な接線流濾過のような下流手順が、なおも必要とされる（８７、１０４、１０５）。対照的に、本開示は、効率を損なうことなく下流の精製手順を省略するための、インビボでのＧＭＭＡまたは外膜小胞生産系を提供する。
【０１８７】
サルモネラ内の表面が露出したまたは分泌された保護抗原のうち、６つの抗原、ＦｌｉＣ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＦ、ＳｓｅＢ、およびＳｓｅＩが用いられ得る（１０６〜１１３）。これらの抗原は、サルモネラの中で最も大量のタンパク質ではない（１０６）。ＦｌｉＣ合成は、全身性部位で調節解除さえもされる（１１４〜１１６）。マウスでの前臨床試験は、これらの上記の抗原による免疫付与は、サルモネラチャレンジに対して防御し得ることを示している（５７、１１１、１１７〜１２０）。ＯｍｐＣおよびＦは、マウスにおいて長期にわたる抗体応答を誘導して（１２１）、ヒトでのフェーズ１試験において試験された場合に安全かつ免疫原性であることが見いだされている（１２２）。ＯｍｐＤは、Ｔ細胞とは独立に、防御Ｂ１ｂ細胞抗体応答に関する重要な標的であり（５７、１１１）、血清型Ｔｙｐｈｉを除くサルモネラの全ての血清型において保存されている（１２３、１２４）。ＳＰＩ−２トランスロコンサブユニットＳｓｅＢは、細胞におけるサルモネラの複製およびＴ３ＳＳエフェクターの分泌に関する決定的な機能を果たす（１２５）。それは、サルモネラ菌血症を有する子どもにおける適応免疫の血清優勢標的であり（１２０）、ヒト志願者におけるＣＤ４Ｔ細胞免疫に関する多数のエピトープを保有する（１０８、１２０、１２６）。別のＳＰＩ−２エフェクター、ＳｓｅＩは、感染された細胞の遊走を調整する役割を果たし、長期の全身性感染に必要とされる（１２７〜１３１）。そのような抗原の正しい立体構造を保存することは、組み換えサルモネラポーリンがマウスを防御できなかったことによって明らかにされるように重大である（１３２）。サルモネラ特有のＴ細胞およびＢ細胞免疫を誘導するためのＴＬＲリガンドおよび他のＰＡＭＰを通して先天性のシグナルを送達するサルモネラの自己アジュバント特性と組み合わせて、ＲＡＳＶは、高レベルの生産で、それらの正しい立体構造および方位でこれらの抗原の送達を可能にする。
【０１８８】
インビボで防御サルモネラ抗原を過剰生産するための革新的なＲＡＳＶプラットフォームが本明細書において開示される。この系は、独特の三重糖（ｔｒｉｐｌｅ  ｓｕｇａｒ）、ラムノースおよびマンノースによるＯ−抗原合成の二重遮断およびアラビノースによるＧＭＭＡまたは外膜小胞の過剰生産によって調節される系である。また、ＲＤＡおよびＲＤＰＳ系も取り込む。これらの系は、抗原遺伝子のほとんどはインビボで高く発現されないので（１０６）、（これらの自己抗原の導入により）病原性を増大させない。抗原遺伝子の過剰発現はまた、フラジェリン遺伝子の過剰発現によって示されるように（１３３、１３５）、株を弱毒化させる（１３３、１３４）。これらの抗原遺伝子に関する染色体突然変異を有するまたは有さない株の病原性は、抗原遺伝子発現プラスミドを保有する場合、以下にさらに述べられるように評価されてもよい。発現プラスミドが、疾患を引き起こすのに十分に高く病原性を増大させる場合、株またはプラスミドは、弱毒化属性を保証するように改変され得る。遺伝子発現のレベルは、糖によって調節されるプロモーターをスイッチすることによって、プロモーターおよびシャイン・ダルガノヌクレオチド配列、および、これらのエレメントと調節される遺伝子の開始コドンとの間の間隔を変更することによって、必要に応じて、上方または下方に調節され得る。
【０１８９】
実施例２：材料および方法
細菌株、培地および細菌増殖：株構築は、病原性Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株χ３７６１（７５）およびＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  χ３５５０（１３６）において行なわれる。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  χ３７６１（Ｂ）、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  χ３５５０（Ｄ）、Ｓ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  χ３７４９（Ｂ）（１３７）、Ｓ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ  χ３２４６（Ｃ１）（１３８）、Ｓ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ  χ３２１３（Ｃ１）（１３９）、Ｓ．Ｎｅｗｐｏｒｔ  χ３２４０（Ｃ２）（１３９）、Ｓ．Ｄｕｂｌｉｎ  χ１２３２３（Ｄ）（１４０）を含む異なる病原性野生型サルモネラ血清型が、チャレンジに用いられる。これらの株の大部分のＬＤ５０は、Ｓ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｓ．ＩｎｆａｎｔｉｓおよびＳ．Ｎｅｗｐｏｒｔがマウスまたはニワトリのいずれにおいても、致死疾患をしばしば引き起こさないことを除き、マウスおよびニワトリにおいて１０３〜１０５である。必要な場合に適切な補充を含むＬＢ培地またはプレートが、サルモネラの増殖のために用いられる（１４１、１４２）。
【０１９０】
分子および遺伝学的手順。ＤＮＡ操作およびＰＣＲのための方法は標準的である（１４３）。ＤＮＡ配列分析はＵＦＬ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで行なわれて、一方で、オリゴヌクレオチドおよび／または遺伝子セグメントの合成は商業的に得られる。サルモネラにおける欠失または欠失／挿入の構築は、自殺ベクターまたはＰ２２形質導入を用いて行なわれる（１４４〜１４６）。
【０１９１】
株の特性化。ワクチン株は、それらの構築におけるそれぞれのステップにおいて、および、免疫付与試験前に、全ての表現型および遺伝子型の存在に関して十分に特徴付けられる。遺伝学的属性は、適切なプローブを用いたＰＣＲおよび／または表現型分析によって確認される。蛍光色素流入方法を用いて突然変異体の膜透過性が評価される。株は、５０世代の期間にわたってアラビノースまたは他の糖類および／またはＤＡＰの存在下で株が増殖された場合の抗原合成およびプラスミド維持の安定性に関して、ベクターコントロール株と比較される（１４７）。ＬＰＳは、銀染色によって調べられる（１４８）。増殖曲線は、それぞれの株に関して決定される。他の実験は、ＯＭＰ（１４７）およびＩＲＯＭＰプロファイル（１４９）、ＯＭＶ（８０）およびＧＭＭＡ特性（８７、１５０、１５１）、血清（１５２）、胆汁および微生物ペプチド耐性（１３６）、および、上皮ＩＮＴ−４０７細胞への付着／侵襲（１５３、１５４）の決定を含む。抗原を特定するプラスミドを有するそれぞれの株は、ウエスタンブロットによって異種抗原の合成に関して評価される。
【０１９２】
抗原の調製。Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する、防御抗原、ＦｌｉＣ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＦ、ＳｓｅＢ、およびＳｓｅＩは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０またはＢＬ２１における合成のためにｐＢＡＤ−ＨｉｓまたはｐＥＴベクター内にクローニングされて、ニッケルクロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａ）によって単離される。精製されたタンパク質は、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびニュージーランド雌ウサギにおける抗血清の調製のために用いられる。サルモネラＬＰＳ  Ｏ−抗原は、商業的に得られる。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ外膜タンパク質（ＳＯＭＰ）は、鞭毛、全てのインビトロで発現される線毛抗原、ＬＰＳ  Ｏ−抗原およびいくつかのカプセルを生産することができないように改変されている株χ９４２４から精製される。他のサルモネラＯＭＰは、対応するＯ−抗原突然変異体から精製される（１４７）。
【０１９３】
統計：ＳＡＳプログラムが、動物の数を評価するための統計検定および電力解析を行なうために用いられる。
【０１９４】
実施例３：糖を代謝することができない株が、その株内の遺伝子または遺伝子配列の調節を可能にするためにその糖を取り込むことができるかどうかの判定を可能にするための、糖によって調節されるＧＦＰの合成を有するプラスミドの構築。
図１は、ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ、ｒｈａＲＳ−ＰｒｈａＢおよびｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡカセットを、これらのカセットをコードするＤＮＡの由来としてそれぞれ保有する、３つのプラスミドｐＹＡ３７００、ｐＹＡ５３５１およびｐＧ８Ｒ７４を図解して、その遺伝子に関するプロモーターの代わりに、選択の遺伝子に対する選択された調節カセットの融合により、自殺ベクターの生産を可能にする。これらの操作は実施例１に記載されて、糖によって調節される遺伝子発現を有する、生じた欠失−挿入突然変異を有する株は、以下の実施例に記載される。
【０１９５】
ｐＹＡ５３５１内のｒｈａＲＳ−ＰｒｈａＢカセットのヌクレオチド配列は以下である：
ＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＡＣＧＡＣＣＡＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＴＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＴＣＧＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＴＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＧＴＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＡＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＧＴＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＣＡＴＡＣＣＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＧＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＡＧＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＣＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＧＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＧＴＣＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＴＴＧＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＡＧＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＡＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＣＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡＣＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＣＴＴＡＧＧＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＴＧＣＣＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＴＡＧＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＣＴＡＧＧＡＴＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号１１）。
【０１９６】
ｐＧ８Ｒ７４内のｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡカセットのヌクレオチド配列は以下である：
ＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＴＧＣＣＧＣＧＧＧＴＧＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＡＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＡＧＡＴＡＡＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＴＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＧＣｔｔｔｔｇａｔａａａａａｔｔｔｔｃｔｃａａａｇｃｃｇｇｔｔａｃｇｔａｔｔａｃｃｇｇｔｔｔｔｇａｇｔｔｔｔｔｇｃａｔｇａｔｔｃａｇｃａｇｇａａａａｇａａｃｃａｔｇｔｔｔａｃｔａａａｃｇｔｃａｃｃｇｃａｔｃａｃａｔｔａｃｔｇｔｔｃａａｔｇｃｃａａｔａａａｇｃｃｔａｔｇａｃｃｇｇｃａｇｇｔａｇｔａｇａａｇｇｃｇｔａｇｇｇｇａａｔａｔｔｔａｃａｇｇｃｇｔｃａｃａａｔｃｇｇａａｔｇｇｇａｔａｔｔｔｔｃａｔｔｇａａｇａａｇａｔｔｔｃｃｇｃｇｃｃｃｇｃａｔｔｇａｔａａａａｔｃａａｇｇａｃｔｇｇｔｔａｇｇａｇａｔｇｇｃｇｔｃａｔｔｇｃｃｇａｃｔｔｃｇａｃｇａｃａａａｃａｇａｔｃｇａｇｃａａｇｃｇｃｔｇｇｃｔｇａｔｇｔｃｇａｃｇｔｃｃｃｃａｔｔｇｔｔｇｇｇｇｔｔｇｇｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｃａｃｃｔｔｇｃａｇａａａｇｔｔａｃｃｃａｃｃｃｇｔｔｃａｔｔａｃａｔｔｇｃｃａｃｃｇａｔａａｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｇｔｔｇａａａｇｃｇｃａｔｔｔｔｔｇｃａｔｔｔａａａａｇａｇａａａｇｇｃｇｔｔａａｃｃｇｃｔｔｔｇｃｔｔｔｔｔａｔｇｇｔｃｔｔｃｃｇｇａａｔｃａａｇｃｇｇｃａａａｃｇｔｔｇｇｇｃｃａｃｔｇａｇｃｇｃｇａａｔａｔｇｃａｔｔｔｃｇｔｃａｇｃｔｔｇｔｃｇｃｃｇａａｇａａａａｇｔａｔｃｇｃｇｇａｇｔｇｇｔｔｔａｔｃａｇｇｇｇｔｔａｇａａａｃｃｇｃｇｃｃａｇａｇａａｃｔｇｇｃａａｃａｃｇｃｇｃａａａａｔｃｇｇｃｔｇｇｃａｇａｃｔｇｇｃｔａｃａａａｃｇｃｔａｃｃａｃｃｇｃａａａｃｃｇｇｇａｔｔａｔｔｇｃｃｇｔｔａｃｔｇａｃｇｃｃｃｇａｇｃｇｃｇｇｃａｔａｔｔｃｔｇｃａａｇｔａｔｇｔｇａａｃａｔｃｔａｃａｔａｔｔｃｃｃｇｔａｃｃｇｇａａａａａｔｔａｔｇｃｇｔｇａｔｔｇｇｃａｔｃｇａｔａａｃｇａａｇａａｃｔｇａｃｃｃｇｃｔａｔｃｔｇｔｃｇｃｇｔｇｔｃｇｃｃｃｔｔｔｃｔｔｃｇｇｔｃｇｃｔｃａｇｇｇｃｇｃｇｃｇｇｃａａａｔｇｇｇｃｔａｔｃａｇｇｃｇｇｃａａａａｃｔｇｔｔｇｃａｔｃｇａｔｔａｔｔａｇａｔａａａｇａａｇａａａｔｇｃｃｇｃｔａｃａｇｃｇａａｔｔｔｔｇｇｔｃｃｃａｃｃａｇｔｔｃｇｃｇｔｃａｔｔｇａａｃｇｇｃｇｃｔｃａａｃａｇａｔｔａｔｃｇｃｔｃｇｃｔｇａｃｃｇａｔｃｃｃｇｃｃｇｔｔａｔｔｃａｇｇｃｃａｔｇｃａｔｔａｃａｔｔｃｇｔａａｔｃａｃｇｃｃｔｇｔａａａｇｇｇａｔｔａａａｇｔｇｇａｔｃａｇｇｔａｃｔｇｇａｔｇｃｇｇｔｃｇｇｇａｔｃｔｃｇｃｇｃｔｃｃａａｔｃｔｔｇａｇａａｇｃｇｔｔｔｔａａａｇａａｇａｇｇｔｇｇｇｔｇａａａｃｃａｔｃｃａｔｇｃｃａｔｇａｔｔｃａｔｇｃｃｇａｇａａｇｃｔｇｇａｇａａａｇｃｇｃｇｃａｇｔｃｔｇｃｔｇａｔｔｔｃａａｃｃａｃｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａａｔｇａｇａｔａｔｃｇｃａａａｔｇｔｇｃｇｇｔｔａｔｃｃａｔｃｇｃｔｇｃａａｔａｔｔｔｃｔａｃｔｃｔｇｔｔｔｔｔａａａａａａｇｃａｔａｔｇａｃａｃｇａｃｇｃｃａａａａｇａｇｔａｔｃｇｃｇａｔｇｔａａａｔａｇｃｇａｇｇｔｃａｔｇｔｔｇｔａａｔＴＣＴＡＧＡｔａａａｔａａａａｇｃａｇｔｔｔａｃａａｃｔｃｃｔａｇａａｔｔｇｔｇａａｔａｔａｔｔａｔｃａｃａａｔｔｃｔａｇｇａｔａｇａａｔａａｔａａａａｇａｔｃｔｃｔｇｃａｇＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号１２）。
【０１９７】
図２は、ＧＦＰの合成をアラビノース、ラムノースまたはキシロースの存在にそれぞれ依存させる、プラスミドｐＧ８Ｒ１１５、ｐＧ８Ｒ１１６およびｐＧ８Ｒ１９２を示す。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性に関する選択によって多数の細菌種の任意の株内にエレクトロポレーションされてよく、それから、目的の糖の存在下でのＧＦＰの合成および糖の不存在下でのＧＦＰ合成の中止に関してスクリーニングされる。ＧＦＰ合成が観察されるならば、その結果、目的の遺伝子に関するプロモーターが欠失されて遺伝子発現が今度はアラビノースまたはラムノースまたはキシロースの存在にそれぞれ依存性であるようにａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ、ｒｈａＲＳ−ＰｒｈａＢまたはｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡカセットによって置換されている突然変異株を構築することが可能である。この可能性は、目的の細菌株または種が、アラビノース、ラムノースまたはキシロースを代謝またはその上で増殖できず、これらの糖類が細菌細胞内に移行され得るかどうか未知であり、その細菌株または種における遺伝子の発現のためにその糖の存在を使用することが必要な場合に、非常に有用であることに注目すべきである。
【０１９８】
実施例４：フリーのガラクトースの存在に依存してＬＰＳの機能的に可逆的な合成を可能にするための、ｇａｌＥ突然変異を有する株の単離および特性化。ＬＰＳ  Ｏ−抗原側鎖およびＬＰＳ外核の合成に必要なＵＤＰ−Ｇａｌの調節された合成を可能にするため、および、免疫原性を減少させるためにガラクトース耐性変異の毒性および潜在的選択を伴わずにガラクトースの存在下での増殖を可能にするための、ｇａｌＥ突然変異を有するワクチンベクター株の構築。
遺伝子ｇａｌＥは、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−グルコースを相互転換するＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼをコードする。ガラクトース異化作用の一部として、ｇａｌＥは、ガラクトース合成および分解の両方に関係した。サルモネラ種の全ての表面リポ多糖（ｌｉｐｏｓｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ）は、ＬＰＳコアおよびＬＰＳ  Ｏ−抗原側鎖内にガラクトース単位を含む。ＵＤＰ−ガラクトースはＬＰＳ内のガラクトース単位の前駆体であるので、ｇａｌＥ突然変異体は、外因性ガラクトースが提供されない限り、コア欠損または「荒い」ＬＰＳを合成する（４７）。Ｓ．ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｇａｌＥ突然変異体は弱病原性であり、マウスにおいて病原性Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍチャレンジに対する防御を提供する（４７、５０、１５５）。Ｓ．ＣｈｏｌｅｒａｅｓｉｕｓのｇａｌＥ突然変異体の一部もまた、弱病原性である（１５６、１５７）。ヒト用途に承認された、唯一の認可された、生きている弱毒化細菌ワクチンは、ｇａｌＥ突然変異ならびに他の突然変異を有するＳ．Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２ｌａである（３０、１５８、１５９）。Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａは、部分的にのみ弱毒化されたものであり、ヒト分野試験における腸チフスに対して中程度の防御免疫を与える（３０、４７、１６０〜１６３）。
【０１９９】
しかしながら、Ｓ．ＣｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓのｇａｌＥ突然変異体でも観察されるように（１６５）、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ内の単一のｇａｌＥ突然変異でさえもヒトに関する病原性を可能にして、腸チフスに対して中程度の防御を提供するだけである（３０、４７、１６１、１６３、１６４）。他に、サルモネラｇａｌＥ突然変異体はガラクトースに感受性であり、インビトロで溶解を誘導する（４８、１６６、１６７）。Ｓ．ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるｇａｌＥの定義された欠失でさえ、ガラクトースによって誘導される溶解に対する感受性を与え、それはワクチンにとって望ましくない属性である。認可された株Ｔｙ２１ａも、この好ましくない属性を有する。ｇａｌＥ突然変異体は、酵素ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼを欠くが、ガラクトーストランスポーターを通して外因性の由来からガラクトースを取り込む能力を維持する（１６８、１６９）。ガラクトース存在下で増殖された場合、遺伝子ｇａｌＫおよびｇａｌＴによってそれぞれコードされるガラクトキナーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼは、ガラクトース−１−リン酸を介してガラクトースからＵＤＰ−ガラクトースを合成することができて、細胞増殖の阻止および溶解さえも導く。正確な溶解メカニズムは知られていないが、死滅は、増殖およびガラクトース代謝物の細胞内蓄積、特にガラクトキナーゼ活性に起因するガラクトース１−リン酸およびＵＤＰ−ガラクトースの蓄積に相関する（３０、４８）。ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトースの蓄積は、ＣＴＰおよびＵＴＰの低い利用率に起因して増殖の阻止を導き、ＲＮＡ合成の減少をもたらす（４９）。ｇａｌＥ突然変異体の増殖は不十分であり、それらの生存能力は凍結乾燥によって著しく減少される（５０）。ｇａｌＥ突然変異体の弱病原性は、ほとんど、不完全な細胞壁リポ多糖およびガラクトースによって誘導される細菌細胞溶解に起因する（３０）。それは、ガラクトース耐性およびＧａｌ＋表現型に関して選択する（１７０）。溶解は、０．００２％のような低いガラクトース濃度で起こり得る（１６６）。ガラクトースによって誘導される溶解は、株Ｔｙ２１ａにおいてインビトロで≧６ｍＭガラクトースで生じて（３０、４７）、一方で、定義されたｇａｌＥ突然変異を有するＴｙ２は≧０．０６ｍＭガラクトースに対してさらにより感受性である（５０、１６３）。ガラクトース存在下でのｇａｌＥ突然変異体の増殖もまた、ガラクトースの供給に依存して可逆的なラフからスムースへの変動を示す能力がないガラクトース耐性株に関して選択する（１７０）。グルコースは、溶解レベルのガラクトース中間体が蓄積し得ない程度に、カタボライト抑制によって溶解からガラクトース感受性ｇａｌＥ株を保護し得る（１６７、１７１）。ガラクトキナーゼ活性の低下は、ガラクトースに対する株の耐性も与え得る（４８、１６６、１６７）。したがって、この問題を克服して、ワクチンに関する調節された遅延した弱毒化のための手段としての役割を果たす可逆的なラフ−スムース変動を与えるｇａｌＥ突然変異の使用を拡張するために、我々は、ガラクトースに対する耐性が増大して、なおかつ、インビボで利用できない添加されたガラクトースの存在に依存性の調節された弱毒化を示している、新規のｇａｌＥ突然変異を有する株を構築した。我々はそれから、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍワクチン株におけるこの突然変異の包含を評価した。
【０２００】
異なるｇａｌＥ突然変異を有する３つの株が生産された。株χ４０９４は、ほとんどのｇａｌＥ突然変異体で見られるようにガラクトース感受性ｇａｌＥ４９６突然変異を有する。株χ４７００は、特性化されていない欠失突然変異Δ（ｇａｌＥ−ｕｖｒＢ）−１００５を有し、それは株をガラクトースに対して非感受性にさせる。株χ９７９２は、ガラクトース非感受性Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１突然変異を有し、それは、ｇａｌＥからｙｂｈＣまで１１の遺伝子配列が欠失している（図３Ａ）。株は、栄養ブロスまたはＬＢブロスにおいて、複雑なＬＰＳ  Ｏ−抗原（図３Ｂ）を形成するために、増殖培地中に０．００１％ガラクトースを必要とする。
【０２０１】
ガラクトースの添加が、異なるｇａｌＥ突然変異を有するサルモネラ株の増殖に影響するかどうか判定するために、増殖実験を行なった。最初の実験は、ＬＢブロスまたはＮＢブロス中の異なるガラクトース濃度での一晩培養の最終的なＯＤを評価した。ＮＢブロスは全ての糖類を欠いているので、微量のガラクトースに起因した結果における干渉は存在し得ないことに注意すべきである。ＬＢ培地では、χ４０９４の一晩培養のＯＤは、０．００１％ガラクトースで１．０８８であるが、０．０１％ガラクトースでは０．１５９まで落ちる。χ４７００およびχ９７９２のＯＤは、異なる濃度のガラクトースによって有意に影響を受けなかった。同様の傾向が、異なるガラクトース濃度でのＮＢブロス中でｇａｌＥ突然変異体を増殖させた場合に観察された（図３Ｃ）。データ全体は、χ９７９２（Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１））が、χ４０９４ほどはガラクトースに感受性でないことを確認する。
【０２０２】
２番目の実験は、異なるガラクトース濃度での増殖培地中の７時間の期間中の株の増殖を評価した（図４Ａ〜４Ｈ）。それぞれの株の一晩培養を、ガラクトースを含まないＮＢブロス中で増殖させた。継代培養を、異なる濃度（％）のガラクトース（０、０．００１、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５）を含む事前に加温された３ｍｌ  ＮＢブロス中に１：１００で希釈によって作製した。培養を、振とうしながら３７℃でインキュベートした。光学濃度を測定して、１時間ごとに記録した。ガラクトースがないと、全ての株は同様に増殖する。株χ４０９４は、ガラクトース感受性ｇａｌＥ４９６突然変異を有する。株χ４７００は、ガラクトース非感受性Δ（ｇａｌＥ−ｕｖｒＢ）−１００５突然変異を有する。株χ９７９２は、ガラクトース非感受性Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１突然変異を有する。株χ１１０１５は、ガラクトース非感受性Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１  ΔｇａｌＰ２１１突然変異を有する。株χ１１１４１は、ガラクトース非感受性Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１  ΔｇａｌＰ２１１  ΔｍｇｌＢＡＣ突然変異を有する。図４Ａ〜４Ｈは、突然変異ΔｇａｌＰ２１１およびΔｍｇｌＢＡＣが、より高いＯＤに株が到達するのを助けることを示した。
【０２０３】
図４Ｂに示されるように、株χ４０９４は２時間増殖して、それから、０．００１％ガラクトースでさえ溶解し始める。ガラクトース濃度が増大するにつれて、溶解の開始時間は減少した。株χ４７００およびχ９７９２の両方とも、増殖を損なわずに０．５％ものガラクトースに堪え得る（図４Ａ〜４Ｈを参照）。これらの結果は、高濃度のガラクトースが、Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）突然変異を有する株の増殖およびコロニー形成を阻害しないことを示す。改善されたガラクトース耐性は、株が、マウスの経口接種後６日目に感受性ｇａｌＥ４９６突然変異を有する株よりも高い組織コロニー形成を示すのを可能にする（図５）。データは、Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１突然変異が、増殖培地中のガラクトースの存在に依存性の可逆的なラフ−スムース表現型を可能にするためにワクチン株において用いられ得ること、および、フリーの非リン酸化ガラクトースは動物組織内に存在しないので、インビボでの調節された遅延した弱毒化のさらなる手段を与えることを、確認する。
【０２０４】
実施例５：ラムノースによって調節される遅延したＯ−抗原合成、マンノースによって調節されるＯ−抗原側鎖合成およびアラビノースによって調節されるＧＭＭＡまたは外膜小胞の生産を有する（防御抗原をインビボで合成する）、グループＢ  ＲＡＳＶ  Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株の構築および評価。
Ｏ−抗原リガーゼＷａａＬは、多糖類をリピドＡコア部分にライゲーションするために必要である。ｗａａＬの突然変異は、Ｏ−抗原が付着していない無傷のコアをもたらす（１７２、１７３）。我々は、オペロン内のｗａａＬを欠失させて、ｐａｇＬ突然変異はサルモネラ病原性を損なわないので（１７４）、ｐａｇＬ遺伝子内にラムノースによって調節されるｗａａＬ（ΔＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬ）を置いた。相対的に高濃度のラムノースがこのプロモーターを活性化するために必要なので（１７５）、インビボでＯ−抗原合成の下方調節を達成するためにラムノースがアラビノースに取って代わる。ラムノースによって調節されるｗａａＬを有するＲＡＳＶ株は、インビトロでラムノースの存在下で正常なＬＰＳを合成するが、インビボでは、Ｏ−抗原リガーゼの不存在に起因して粗いＬＰＳを形成する。このストラテジーは、保存されたＬＰＳコアオリゴ糖を曝露して、ポーリンを含む保存されたＯＭＰの生産を高めて（１７６、１７７）、免疫原性を高めるために宿主免疫系に対する保存されたＯＭＰのより効果的な提示をもたらし、異種細菌に対する交差防御免疫応答の生産に役立つ（１７３）．
【０２０５】
突然変異株は、１０９ＣＦＵまで弱毒化されて、１０９ＣＦＵでＳ．ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓチャレンジの両方に対して防御を提供する（表１）。しかしながら、この突然変異は、１０９でもまだ死滅を引き起こすので、完全には弱毒化されない。したがって、Δｐｍｉ突然変異はまた、株χ１２３３９においてＯ−抗原合成の二重遮断として含められる。ΔＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬおよびΔｐｍｉ突然変異を有するＲＡＳＶは、完全なＯ−抗原を形成するためにラムノースおよびマンノースの両方を必要とする。防御をさらに増大させるために、株χ１２３６２においてなされたように、ΔＰｆｕｒ突然変異が、腸溶性病原体に対する交差防御免疫の誘導を高めるためにインビボでＩＲＯＭＰを上方調節するように含められる。
2020505036.tif 000002
【０２０６】
全ての突然変異は、交差防御免疫の誘導を助けて、調節された遅延した弱毒化を達成するために、保存されたタンパク質の提示を増大させるように働く（ａｒｅ  ｄｅｄｉｃａｔｅｄ  ｔｏ）。ｔｏｌＲ突然変異は、ＧＭＭＡまたは外膜小胞生産を増大させることができるので（１００、１０１）、候補ＲＡＳＶは、アラビノースによって調節されるｔｏｌＲ突然変異（ΔＰｔｏｌＲ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｔｏｌＲ、以降、ΔＰｔｏｌＲと省略）の導入によってさらに改変されていて、他のサルモネラ血清型のＯＭＰに対する抗体交差反応性を最大限に誘導するように、インビボでＧＭＭＡまたは外膜小胞をさらに上方調節する。さらに、防御抗原をコードするプラスミドは、防御免疫を評価するためにワクチン株内に導入される。候補抗原遺伝子は、インビボでは抑制または低レベルで発現されるので（１０６）、これらの抗原の過剰生産は、それらの提示を促進する（１０６、１０８）。
【０２０７】
最終的な株は、野生型として振る舞うためにアラビノース、マンノースおよびラムノースを必要として、インビボで次第に弱毒化を達成する（表２）。ラムノースによって調節される遺伝子およびマンノースによって調節される遺伝子は、最初にそれらの機能を失い、表面抗原を暴露して、それから、アラビノースによって調節される遺伝子の遮断は、ＧＭＭＡまたは外膜小胞を増大させる。
2020505036.tif 000003
2020505036.tif 000004
2020505036.tif 000005
【０２０８】
株の構築。株χ１２４７０は、株χ１２３３７を用いて、続いて、突然変異Δｐｍｉ、ΔＰｆｕｒおよびΔＰｔｏｌＲを連続して加えることによって生産される（表２）。ＲＤＰＳに関する突然変異ΔｒｅｌＡ：：ａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤ  ｌａｃＩ  ＴＴ（ΔｒｅｌＡ）（１８０）、平衡致死系に関するΔａｓｄＡ、および、エキソポリサッカライドの合成を除去するためのΔ（ｗｚａ−ｗｃａＭ）（表２）を導入して、株χ１２４６５を生じさせて、ベクターとしてのその使用を促進する。ΔＰｔｏｌＲ突然変異を加えて株χ１２４７３を生産する。表現型およびＰＣＲ分析によって最終的な株の確認をした後に、個々の抗原遺伝子を保有しているＡｓｄ＋プラスミドを株の中に導入する。対応する抗原遺伝子は、プラスミドおよび染色体上の遺伝子間の潜在的な組み換えを防ぐために、染色体から自殺ベクター（１４４、１８１）を用いて欠失される。膜完全性、ＯＭＶ生産（１０１）、株の全ての表現型特性の存在および安定性は、十分に研究されている。糖によって調節されるプロモーターまたはＳＤまたは開始コドンは、インビトロでのＯ−抗原リガーゼ、Ｆｕｒ、ＴｏｌＲの生産を調節するためにスイッチされ得て、免疫原性および弱毒化のバランスを取る（７５）。
【０２０９】
プラスミドの構築。全ての抗原は表面に露出または分泌されるので、天然の遺伝子配列は、平衡致死Ａｓｄ＋ベクターｐＹＡ３３４２（Ｐｔｒｃ、ｐＢＲ  ｏｒｉ）を用いて発現される（１４７）。ＲＤＰＳの存在は、アラビノースによって、インビトロでの抗原遺伝子発現を抑制するが、インビボで上方調節する（１８０）。過剰生産が、著しくより遅い増殖によって示されるように代謝負荷をもたらすならば、低コピープラスミドｐＹＡ３３３７（Ｐｔｒｃ、ｐＳＣ１０１  ｏｒｉ）（１８２）またはｐＹＡ３３３２（Ｐｔｒｃ、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）（１８３）へのシフトが行なわれる。
【０２１０】
ｆｌｉＣを除く全ての遺伝子は、それらの天然の配列に従って用いられる。トランケートされたＦｌｉＣ１８０は、抗原性に可変の、フラジェリン抗原の血清型特異的な高頻度可変性ドメインをコードする１８０アミノ酸を欠失していて、血清型特異的な抗原に対する抗体力価の誘導を減少させるため、および、フラジェリンの保存されたドメインに対する交差防御を増大させるために、用いられる。ＦｌｉＣ１８０タンパク質は、ＴＬＲ５と相互作用して先天性の免疫応答（１８４、１８５）およびＣＤ４−依存性Ｔ細胞エピトープ（１８６）を動員／刺激する、保存されたＮ−およびＣ−末端領域を維持する。個々の抗原が最初に試験されて、その後に、オペロンとしていくつかの抗原をコードする（１８３、１８７、１８８）または独立に調節される多数の遺伝子を含む（１８９〜１９３）プラスミドを用いて、多数の抗原の試験が続けられる。ｒｅｃＦ突然変異は、プラスミド上の抗原間の組み換えを減少させるように組み込まれる（１９４）。
【０２１１】
防御抗原遺伝子を発現しているＲＡＳＶのインビトロ評価。ＲＡＳＶ株が防御抗原を合成および分泌する能力を、細胞分画試験を行なうことによって分析して、ウエスタンブロットによって、細胞質、ペリプラズムおよび上清画分内に存在する抗原の量を決定する。株は、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）内中で３７℃にてＯＤ６００＝０．８まで増殖されて、遠心分離される。上清流体を、分泌されたタンパク質の解析のために保存する。ペリプラズムおよび細胞質画分を、リゾチーム浸透性ショック方法（１４７、１９５、１９６）によって調製する。等量のペリプラズム、細胞質および上清画分および合計溶解サンプルを、対応する抗体を用いてプローブされるウエスタンブロットを介して分析する。組織培養実験を行なって、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光によって、マウスマクロファージ様細胞株、Ｊ７７４．Ａおよび／またはＰ３８８Ｄ１への抗原転座を評価する（１９７〜１９９）。
【０２１２】
動物実験。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスが用いられて、フィルターボンネットによって覆われたケージを有するＢＳＬ２格納容器内に収容される。典型的な実験は、チャレンジのための１５匹のマウスの群を含む（１回繰り返す）（２００）。コロニー形成を決定するため、および、免疫学的分析のために脾臓を採取するために、さらなるマウスが用いられる。コロニー形成および免疫原性は、サルモネラで保存された防御抗原を合成する全ての構築に関して評価される。
【０２１３】
マウスは、約１０９  ＣＦＵのＲＡＳＶの投与量で０日目に経口で免疫化されて、同一の投与量で１週後にブーストされて、そして、標準的なプロトコルに従って１００×ＬＤ５０病原性サルモネラ株によって４週目に経口でチャレンジされる（２００）。野生基準株のＬＤ５０は、公知であり、または評価される。罹患率および死亡率は、毎日記録される。最初に、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓチャレンジに対するＰＢＳコントロールと、それぞれの個々の抗原を保有している株が比較される。この試験において防御が観察されるならば、後に続く試験を行なって、他のサルモネラ血清型に対する交差防御を決定する。組織内のサルモネラ計数（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）に関して、チャレンジされたマウスから血液、ＰＰ、肝臓および脾臓を採取して、チャレンジ後の時間の関数として生存可能なサルモネラの除去の動態を決定して、チャレンジ後の免疫応答を監視する。
【０２１４】
防御抗原を合成しているＲＡＳＶによって確認される、免疫応答の測定。免疫化されたマウスにおける膣洗浄からの血清ＩｇＧおよび粘膜ＳＩｇＡ応答を、２および４週に、異なる血清型由来の防御抗原、ＯＭＰ、ＩＲＯＭＰおよびＬＰＳを用いて、ＥＬＩＳＡによって評価する（Ｔｈ１およびＴｈ２応答の間を区別するためのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価も同様に）。免疫付与後４週に、精製されたサルモネラ抗原またはサルモネラによる刺激に対する脾細胞応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによるＴ細胞免疫の測定に関して決定して、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７を産生するＣＤ４  Ｔ細胞プロファイルを決定する（２０１）。膣洗浄において得られる分泌ＩｇＡの量は、消化管における粘膜応答を正確に反映し得ないので、腸の粘膜固有層内に存在するＩｇＡ分泌細胞の数は、抗原特異的なＩｇＡ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定される。血清は、製造元の説明書に従ってＢｉｏ−ｐｌｅｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて（２０２）、チャレンジ後２４、４８および７２時間に、多重アッセイを用いたサイトカインアッセイのために回収される。サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３は、サルモネラ抗原とＴリンパ球の共培養の結果として測定されて、Ｂｉｏｐｌｅｘアッセイを用いて（２０２〜２０４）、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７／Ｔｆｈ間のＴ細胞分化パスウェイを決定する。特に、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８が、肝臓および脾臓内の細菌繁殖に関して監視されて（４１、２０５、２０６）、ＬＰＳによって誘導されるサイトカインに関してＴＮＦ−αおよびＩＬ−６が監視される（２０７、２０８）。フローサイトメトリーを用いて、マウスＰＢＭＣおよび組織内のメモリＢおよびＴ細胞の分配（２０９、２１０）およびＴ細胞激増をＣＦＳＥ染色によって決定する（２１１〜２１８）。
【０２１５】
実施例６：ラムノースによって調節される遅延したＯ−抗原合成、マンノースによって調節されるＯ−抗原側鎖合成およびアラビノースによって調節されるＧＭＭＡまたは外膜小胞の生産を有する（防御抗原をインビボで合成する）、グループＤ  ＲＡＳＶ  Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株の構築および評価。
防御抗原を合成するＲＡＳＶ−Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍと同一の特性を有するＲＡＳＶ−Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株を構築して、相補戦略としてＲＡＳＶ−Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍと並行して評価した。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに関して用いられた自殺ベクターは、２つの血清型の間の高い相同性に起因してＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに関して用いられ得る。Ｓ．Ｔｙｐｈｉに関する動物モデルは存在しないので、この研究はまた、それらは両方ともグループＤサルモネラであるので、Ｓ．ｔｙｐｈｉに対する結果の翻訳も促進する。それは、二価ワクチンとして、またはＮＴＳ感染の大部分に対するプライム−ブースト免疫付与のために、使用するのも助け得る（２１９）。
【０２１６】
ＲＡＳＶ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓワクチン株の構築
同様のストラテジーを用いて、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  χ３５５０に由来する、突然変異、ΔｗａａＬ、ΔＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬ、Δｐｍｉ、ΔＰｆｕｒおよびΔＰｔｏｌＲを有するＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ株を構築して、ワクチン株Ｂ１を生産する。ΔＰｔｏｌＲ突然変異は、突然変異ΔｗａａＬ、ΔＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬ、ΔｐｍｉおよびΔＰｆｕｒを有する株χ３５５０に由来する株χ１２４５７に加えられて、ワクチン株Ｂ１を生産する。生じた株の病原性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価される。株がなお病原性を有するならば、リピドＡ毒性を減少させる突然変異が導入される（２２０、２２１）。株が期待通りに弱毒化されたならば、免疫化されたマウスは、１００×ＬＤ５０の野生型Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株χ３７６１によって経口チャレンジされる。防御が観察されたならば、その後の試験は、他のサルモネラ血清型に対して交差防御を判定する。株が十分に弱毒化されて、何らかの防御を提供することを考えると、ΔｒｅｌＡおよびΔａｓｄＡが導入されて株Ｂ２を生産して、ベクターとしてのその使用を促進する。
【０２１７】
ＲＡＳＶ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ抗原送達ベクターのインビトロ評価。
実施例３からの最も良いベクターを株Ｂ２内に導入する。生じた組み換え株を、実施例３に本質的に記載のように、抗原合成、プラスミド安定性および他の特性についてインビトロおよびインビボで評価する。
【０２１８】
動物実験および防御抗原を合成するＲＡＳＶ−Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓによって与えられる免疫応答の測定。
同様の手順および試験を、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが最初にチャレンジされて、それから、他の血清型がチャレンジされることを除き、実施例３のとおりに行なう。
【０２１９】
実施例７．２対３の糖によって調節可能な特性に依存して、調節された遅延した溶解のインビボ表現型および他の弱毒化および防御抗原合成属性を示す株を有するブロイラー鶏におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって誘導される蜂巣炎性腸炎に対するＲＡＳＶの改善された性能
２つの糖によって調節可能な属性系に対する、３つの糖によって調節可能な属性系を含む組み換え細菌株またはＲＡＳＶの防御効果を判定するために、以下の実験を行なった。
【０２２０】
Ｉ．χ１１８０２対χ１２３４１の、比較による免疫原性および防御免疫
ブロイラー鶏を、以下のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ株の１つによって経口免疫化した：
【０２２１】
χ１１８０２  ΔＰｍｕｒＡ２５：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ  ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２  Δｐｍｉ−２４２６  Δ（ｗｚａ−ｗｃａＭ）−８  ΔｒｅｌＡ１９８：：ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｌａｃＩ  ＴＴ  ΔｒｅｃＦ１２６（アラビノース−およびマンノース−調節可能な表現型）は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ防御抗原としてＰｌｃＣおよびＮｅｔＢ融合の合成に関するオペロンをコードするｐＹＡ５１１２（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５９：４７５−８５（１８８）に記載されて、その内容は全体で参照により本明細書中に援用される）を含む。
【０２２２】
χ１２３４１  ΔＰｍｕｒＡ２５：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ  ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２  Δｐｍｉ−２４２６  ΔｗａａＬ４６  ΔｐａｇＬ６４：：ＴＴ  ｒｈａＲＳ  ＰｒｈａＢＡＤ  ｗａａＬ  Δ（ｗｚａ−ｗｃａＭ）−８  ΔｒｅｌＡ１９７：：ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｌａｃＩ  ＴＴ  ΔｒｅｃＦ１２６  ΔｓｉｆＡ２６（アラビノース−、マンノース−およびラムノース−調節可能な表現型）は、空ベクターコントロールとしてｐＹＡ３６８１またはＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ防御抗原としてＰｌｃＣおよびＮｅｔＢ融合の合成に関するオペロンをコードするｐＹＡ５１１２を含む。
【０２２３】
試験は、３８４匹のヒヨコでスタートして４８ケージで構成された。処置は、それぞれ８ケージの６個のブロックで複製された。試験は、鳥が置かれたとき（孵化の日）（ＤＯＴ０）に始まり、そのときに、それらは実験的ケージに割り当てられた。試験の経過中に取り替えられた鳥はいなかった。
2020505036.tif 000006
【０２２４】
実験的配給
米国で一般に用いられる家畜飼料で調合された薬品処置なしのニワトリのスターターを処方した。飲食物は、代表的な地元市販の処方であり、計算された分析は、ＮＲＣブロイラーのスターターの要求に一致し、またはそれを超えた。飲食物の処方は、由来データに含まれた。実験的処置飼料は、この基礎的なスターター飼料から調製された。処置バッチを準備するために用いた全ての基礎飼料および試験品目の量を記録した。処置飼料は、それぞれの試験品目の均一な分配を確実にするように混合された。交差汚染を防ぐために、ミキサーを洗い流した。飼料をビルディング＃２へ移行されて、同一処置のケージ間に分配した。置いたときに、鳥に処置飼料が与えられた。この配給（マッシュ形態で）を、試験中に与えた。飼料はＤＯＴ０に計量されて、残った飼料は、ＤＯＴ１４、２１、および２８に計量された。
【０２２５】
飼料サンプル
処置飲食物のそれぞれのバッチの初め、中間、終わりから１つずつを集めて、混合して混成サンプルを形成した。それぞれの処置に関して混成から１サンプルを取り、潜在的な飼料分析のために、試験完了後、六（６）ヶ月の期間維持した。
【０２２６】
動物
孵化した日の雄ブロイラーヒヨコを、Ｃｏｂｂ−Ｖａｎｔｒｅｓｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＧＡから得た。株はＣｏｂｂ  ５００であった。ブリーダー群れの情報を記録した。孵化場にて、鳥を交尾させて、日常的なワクチン接種を受けさせた。健康そうに見えるヒヨコのみを試験で用いた。それぞれのケージは、８匹のヒヨコで開始した（ＤＯＴ０）。全ての鳥をＤＯＴ０、１４、２１、および２８に計量した。
【０２２７】
株投与
細菌株を、０．１ｍＬの容量で、訳５×１０８ＣＦＵ／ヒヨコによる経口強制飼養を介して、処置群３、４、および５において、それぞれのヒヨコに、ＤＯＴ０に投与した。
【０２２８】
疾患誘導
ＤＯＴ１４に、全ての鳥は、約５，０００オーシストのＥ．ｍａｘｉｍａを用いて経口で接種された。
【０２２９】
ＤＯＴ１９に開始して、全ての鳥（処置１を除く）は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのブロス培養を約１０８ＣＦＵ／ｍｌ与えられた。この試験において除去された飼料はなかった。鳥は、新鮮なブロス培養の経口強制飼養を毎日１回、３日間（ＤＯＴ１９、２０、および２１に）、０．１ｍｌ投与された。
【０２３０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓチャレンジの増殖
用いられたチャレンジ株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＃６（Ｈｏｆａｃｒｅ，ｅｔ  ａｌ．、１９９８）（２２２）であった。それを５％牛肉エキスで補充された一（１）リットルのチオグリコレートブロス中に接種して、３７℃で１５時間インキュベートした。
【０２３１】
蜂巣炎性腸炎の腸病変スコア
蜂巣炎性腸炎の腸病変スコアを、Ｈｏｆａｃｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８（２２２）に記載のとおりに行なった。ＤＯＴ２１に、３回目のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓチャレンジの四（４）時間後に、それぞれのケージから３匹の鳥を選択して、屠殺して、計量して、蜂巣炎性腸炎病変の存在の程度に関して調べた。スコアは、０〜３スコアに基づき、０は正常であり、３は最も重症であった。
【０２３２】
データ分析
ケージの重量増加、飼料消費、飼料転換、病変スコア、およびＮＥ死亡率の統計分析を計算した。実験の結果を以下の表４に示す。
2020505036.tif 000007
2020505036.tif 000008
【０２３３】
表４に示されるように、χ１２３４１（ｐＹＡ５１１２）は、飼料転換効率および重量増加が、χ１１８０２（ｐＹＡ５１１２）（およびベクターおよび未免疫コントロール）よりも優れていて、より低い病変スコアおよび死亡率を有した。
【０２３４】
ＩＩ．ＲＡＳＶ  χ１２３４１（ｐＹＡ５１１２）の投与の効果。
ＲＡＳＶ  χ１２３４１（ｐＹＡ５１１２）の投与の効果を評価するために、以下の実験を、ＲＡＳＶ  χ１２３４１（ｐＹＡ５１１２）細菌株の低力価（５×１０７ＣＦＵ）；中間力価（１．５×１０８ＣＦＵ）またはオリジナル力価（上述のとおり；５×１０８ＣＦＵ）を用いて行なった。
【０２３５】
材料および方法
Ａ．実験的配給
米国で一般に用いられる家畜飼料で調合された薬品処置なしのニワトリのスターターを処方した。飲食物は、代表的な地元市販の処方であり、計算された分析は、ＮＲＣブロイラーのスターターの要求に一致し、またはそれを超えた。実験的処置飼料は、この基礎的なスターター飼料から調製された。処置バッチを準備するために用いた全ての基礎飼料および試験品目の量を記録した。処置飼料は、それぞれの試験品目の均一な分配を確実にするように混合された。交差汚染を防ぐために、ミキサーを洗い流した。飼料を同一処置のケージ間に分配した。この配給（マッシュ形態で）を、試験中に与えた。
【０２３６】
Ｂ．動物
孵化した日の雄ブロイラーヒヨコを、Ｃｏｂｂ−Ｖａｎｔｒｅｓｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＧＡから得た。株はＣｏｂｂ５００であった。ブリーダー群れの情報を記録した。孵化場にて、鳥を交尾させて、日常的なワクチン接種を受けさせた。健康そうに見えるヒヨコのみを試験で用いた。割り当てに用いられなかった全ての鳥の処分（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を記録した。全てのヒヨコの箱の底からのペーパーまたはスワッブを、サルモネラの存在に関して培養した。
【０２３７】
手順
ａ．鳥の割り当ておよびケージの無作為化
試験は、鳥が置かれたとき（孵化の日）（ＤＯＴ０）に始まり、そのときに、それらは実験的ケージに割り当てられた。試験の経過中に取り替えられた鳥はいなかった。
【０２３８】
ｂ．ワクチン投与
細菌株は、０．１ｍＬの容量で、約５×１０８ＣＦＵ／ヒヨコによって経口強制飼養を介して、処置群３、４、５および６において、それぞれのヒヨコに対してＤＯＴ０に投与された。
【０２３９】
ｃ．ケージ重量
全ての鳥は、ＤＯＴ０、１４、２１、および２８に計量された。飼料をＤＯＴ０に計量して、残った飼料は、ＤＯＴ１４、２１、および２８に計量した。
【０２４０】
ｄ．疾患導入
ＤＯＴ１４に、全ての鳥は、約５，０００オーシストのＥ．ｍａｘｉｍａによって経口で接種された。ＤＯＴ１９に開始して、全ての鳥（処置１を除く）は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのブロス培養を約１０８ＣＦＵ／ｍｌ与えられた。この試験で除去された飼料はなかった。鳥は、新鮮なブロス培養の経口強制飼養を毎日１回、３日間（ＤＯＴ１９、２０、および２１に）、０．１ｍｌ投与された。
【０２４１】
ｅ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓチャレンジの増殖
用いられたチャレンジ株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＃６（Ｈｏｆａｃｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８（２２２）に記載）であった。それを５％牛肉エキスで補充された一（１）リットルのチオグリコレートブロス中に接種して、３７℃で１５時間インキュベートした。
【０２４２】
ｆ．蜂巣炎性腸炎の腸病変スコア
ＤＯＴ２１に、３回目のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓチャレンジの四（４）時間後、それぞれのケージから３匹の鳥を選択して、屠殺して、計量して、蜂巣炎性腸炎病変の存在の程度に関して調べた。スコアは、０〜３スコアに基づき、０は正常であり、３は最も重症であった。全ての３つの病変スコアの鳥は、血清保存のために出血させた。
【０２４３】
ｇ．データ分析および結果
ケージの重量増加、飼料消費、飼料転換、病変スコア、および死亡率の統計分析を計算した。実験の結果を以下の表５に示す。表５に示されるように、オリジナルおよび中程度のＲＡＳＶ投与量は、低投与量またはコントロールに勝っていた。
【０２４４】
ＩＩＩ．免疫付与経路の効果
ＲＡＳＶ  χ１２３４１（ｐＹＡ５１１２）の投与経路の効果を決定するために、経口強制飼養、スプレー、または経口（飲料水中）のいずれかによって、高用量（５×１０８ＣＦＵ）または中用量（１×１０８ＣＦＵ）のχ１２３４１（ｐＹＡ５１１２）細菌株を用いてヒヨコを免疫化した。手短に言うと、ＤＯＴ０に、それぞれのヒヨコは、０．１ｍｌの細菌株、約５×１０８ＣＦＵ／ヒヨコによって経口強制飼養されて；ＤＯＴ１４に、全ての鳥は、約５，０００オーシストのＥ．ｍａｘｉｍａによって経口で接種された。ＤＯＴ１９に開始して、全ての鳥（処置１を除く）は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＰ）のブロス培養（約１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を、毎日１回、３日間（ＤＯＴ１９、２０、および２１に）与えられた。ＤＯＴ２１に、３回目のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓチャレンジの四（４）時間後、それぞれのケージから３匹の鳥を、蜂巣炎性腸炎病変の存在の程度に関して調べた。スコアは、０〜３スコアに基づき、０は正常であり、３は最も重症であった。
【０２４５】
表６に示されるように、全ての免疫付与経路は、コントロールのワクチン接種されていない群よりも優れていた。さらに、スプレーの免疫付与群は、経口強制飼養の群と比較して、満足な能力をもたらした。孵化場におけるスプレー免疫付与は、好ましくて最も経済的な家禽のための免疫付与の手段であるので、このことは商業的に重要である。
2020505036.tif 000009
【０２４６】
実施例８．高濃度の１つの糖は、低濃度の２つの他の糖が、調節された遅延した溶解のインビボでの表現型を有するＲＡＳＶ株の生存に必要な遺伝子を調節する能力を、妨げることができない
χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）は、染色体およびｐＹＡ４７６３プラスミドの両方にａｒａＣ  ＰａｒａＢＡＤによって調節されるｍｕｒＡ遺伝子を有するので、生存するためにアラビノースに関する絶対的な要求を有する。ｍｕｒＡ遺伝子によってコードされる酵素の産物はリン酸化されて、そして、サルモネラはリン酸化された糖類を取り込むことができないので、χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）株は、アラビノース依存性の致死構築物を構築する。したがって、アラビノースが、χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）によって取り込まれるまたはＰａｒａＢＡＤプロモーターの活性化によってｍｕｒＡ遺伝子の転写を引き起こす能力をブロックする任意の外因性の糖は、χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）細胞の致死をもたらす。χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）によって用いられる高濃度（すなわち、１．０％）の３つの糖類いずれかの添加が、調節された表現型の提示または生存を可能にするための、より低い濃度（すなわち、０．１％以下）の他の２つの糖類の活性を妨げるどうかを決定するために、以下の実験を行なった。増殖実験は、緩衝されたパープルブロスを用いて行なった（糖利用に相応な任意のｐＨ変化を避けるため）。
【０２４７】
手短に言うと、サルモネラ株χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）およびχ３７６１の増殖を、異なる糖濃度の増殖培地中で、２４時間、評価した。手短に言うと、それぞれの株の一晩培養を、緩衝されたパープルブロス＋０．０５％アラビノース＋０．１％ラムノース＋０．１％マンノース中で増殖させた。異なる濃度のアラビノース、ラムノース、およびマンノースを含む、事前に加温した緩衝されたパープルブロス中に、１：１００（図６Ａ、６Ｂ、６Ｇ、６Ｈ、６Ｍ、および６Ｎ）、１：１，０００（図６Ｃ、６Ｄ、６Ｉ、６Ｊ、６Ｏ、および１６Ｐ）、または１：１０，０００（図６Ｅ、６Ｆ、６Ｋ、６Ｌ、６Ｑ、および６Ｒ）で希釈することによって、継代培養を作製した。２００μＬのそれぞれの培養を、それぞれの株および糖条件に関してデュプリケートで、１００ウェルプレート内の個々のウェルに添加した。プレートを、３７℃に設定されたＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍセットに挿入して、振とうしながら２４時間、インキュベートしたままにさせた。光学濃度を３０分ごとに測定して、ブランクと比較して、純度を確認した。図は、３つの糖類のうちの１つを１％有する条件と比較して（図６Ｇ〜６Ｌ）、および、様々な濃度のアラビノースと比較して（図６Ｍ〜６Ｒ）、全ての条件でのデータを示す（図６Ａ〜６Ｆ）。
【０２４８】
図６Ａ〜６Ｒに示されるように、χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）細菌株は、１．０％濃度での任意の１つの糖および０．１％以下の濃度での他の２つの糖類の存在とは独立に、野生型Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＵＫ−１株と同様に増殖する。パープルブロスは、全ての糖類を欠いているので、微量のアラビノース、マンノースまたはラムノースに起因した結果における干渉は存在し得ないことに注意すべきである。細胞死が観察されなかったので、これらの結果は、高濃度のラムノースまたはマンノースは、低濃度のアラビノースがｍｕｒＡ遺伝子の発現を引き起こす能力を阻害しないことを示す。
【０２４９】
ウエスタンブロット分析を行なって、χ１２３４１（ｐＹＡ４７６３）株における糖によって調節可能なプロモーターの１つによって調節される産物をコードする遺伝子の発現を分析することができる。
【０２５０】
参考文献
2020505036.tif 000010
2020505036.tif 000011
2020505036.tif 000012
2020505036.tif 000013
2020505036.tif 000014
2020505036.tif 000015
2020505036.tif 000016
2020505036.tif 000017
2020505036.tif 000018
2020505036.tif 000019
2020505036.tif 000020
2020505036.tif 000021
2020505036.tif 000022
2020505036.tif 000023
2020505036.tif 000024
2020505036.tif 000025
2020505036.tif 000026
2020505036.tif 000027
2020505036.tif 000028
2020505036.tif 000029
2020505036.tif 000030
2020505036.tif 000031
【図１】
2020505036.tif 000032
【図２】
2020505036.tif 000033
【図３Ａ】
2020505036.tif 000034
【図３Ｂ】
2020505036.tif 000035
【図３Ｃ】
2020505036.tif 000036
【図４Ａ−４Ｈ】
2020505036.tif 000037
【図５】
2020505036.tif 000038
【図６Ａ】
2020505036.tif 000039
【図６Ｂ】
2020505036.tif 000040
【図６Ｃ】
2020505036.tif 000041
【図６Ｄ】
2020505036.tif 000042
【図６Ｅ】
2020505036.tif 000043
【図６Ｆ】
2020505036.tif 000044
【図６Ｇ】
2020505036.tif 000045
【図６Ｈ】
2020505036.tif 000046
【図６Ｉ】
2020505036.tif 000047
【図６Ｊ】
2020505036.tif 000048
【図６Ｋ】
2020505036.tif 000049
【図６Ｌ】
2020505036.tif 000050
【図６Ｍ】
2020505036.tif 000051
【図６Ｎ】
2020505036.tif 000052
【図６Ｏ】
2020505036.tif 000053
【図６Ｐ】
2020505036.tif 000054
【図６Ｑ】
2020505036.tif 000055
【図６Ｒ】
2020505036.tif 000056
【配列表】
2020505036000001.app
【国際調査報告】
2020505036.tif 000057
2020505036.tif 000058
2020505036.tif 000059