(57)【要約】  本開示は、特に肝実質細胞でのＨＭＧＢ１発現を低減するのに有用なオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法に関する。ＨＭＧＢ１発現を低減するための本開示のオリゴヌクレオチドは、二本鎖であってよく又は一本鎖であってもよく、ヌクレアーゼに対するより強力な耐性及びより低い免疫原性等の特徴向上のために修飾されていてもよい。また、ＨＭＧＢ１発現を低減するための本開示オリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞等の特定の細胞又は臓器を標的とするための標的指向性リガンドを含むように設計されていてよく、肝線維症及び関連状態を治療するために使用することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３７４〜３８１、配列番号１９３〜２７２、及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１５個連続ヌクレオチドに相補的であるＨＭＧＢ１に対する相補性の領域を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖は、長さが１９〜２７個ヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７個ヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記相補性の領域は、配列番号１９３〜２７２及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１５個連続ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖を更に含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記センス鎖は、長さが１９〜５０個ヌクレオチドである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記二重鎖領域は、長さが少なくとも１９個ヌクレオチドである、請求項５又は６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域は、配列番号３７４〜３８１に示されている配列の少なくとも１９個連続ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域は、配列番号１９３〜２７２及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１９個連続ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記センス鎖は、配列番号１９３〜２７２又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記センス鎖は、配列番号２０４、２１１、３６４、又は３６５に示されている配列を含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記アンチセンス鎖は、配列番号２７３〜３６２又は配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６、３６７、３６９、又は３７０のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記センス鎖は、その３’末端に、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ1は、Ｓ2に相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に長さが３〜５個ヌクレオチドのループを形成する、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７個ヌクレオチドであり、ＨＭＧＢ１との相補性の領域を有し、
前記センス鎖は、その３’末端に、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ1は、Ｓ2に相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に長さが３〜５個ヌクレオチドのループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、長さが少なくとも１９個ヌクレオチドの二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていない、オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記相補性の領域は、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの少なくとも１９個連続ヌクレオチドに相補的である、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
Ｌは、テトラループである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
Ｌは、長さが４個ヌクレオチドである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記アンチセンス鎖は、長さが２７個ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、長さが２５個ヌクレオチドである、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、長さが２５個ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記アンチセンス鎖に、長さが２個ヌクレオチドの３’突出配列を更に含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
各々長さが２１〜２３個ヌクレオチドの範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
長さが１９〜２１個ヌクレオチドの範囲である二重鎖構造を含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
長さが１個又は複数個ヌクレオチドの３’突出配列を含み、前記３’突出配列は、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖に存在する、請求項２３又は２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは全て修飾されている、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結は、ホスホロチオアート連結である、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む、請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ステム−ループのＬの最大４個のヌクレオチドは各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記標的指向性リガンドは、アプタマーを含む、請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物。
【請求項４１】
対象にオリゴヌクレオチドを送達するための方法であって、請求項４０に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記対象は、肝線維症を有するか又は有するリスクがある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象に前記オリゴヌクレオチドを投与することにより、ＨＭＧＢ１タンパク質の発現が低減される、請求項４１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象は、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝臓疾患を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
肝線維症を有するか又は有するリスクのある対象を治療するための方法であって、前記対象に、ＨＭＧＢ１の発現を低減するオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項４６】
前記対象は、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝臓疾患を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチドは、前記対象が肝毒性剤に曝される前に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドは、前記対象が肝毒性剤に曝された後で投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記オリゴヌクレオチドは、前記対象が肝毒性剤に曝されると同時に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有するか又は有するリスクのある対象を治療するための方法であって、前記対象におけるＨＭＧＢ１の発現を低減するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項５２】
前記投与は、肝臓ＨＭＧＢ１レベルの低減をもたらす、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与は、血清ＨＭＧＢ１レベルの低減をもたらす、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖は、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２から選択される相補的配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
前記センス鎖は、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列からなる、請求項５４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
前記アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２から選択される相補的配列からなる、請求項５４又は５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖は、配列番号１９３〜２７２又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２７３〜３６２又は配列番号３６６〜３７０から選択される相補的配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
前記センス鎖は、配列番号１９３〜２７２又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列からなる、請求項５７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
前記アンチセンス鎖は、配列番号２７３〜３６２又は配列番号３６６〜３７０から選択される相補的配列からなる、請求項５７又は５８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖は、配列番号２０４、２１１、３６４、３６５のいずれか１つに示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６、３６７、３６９、３７０から選択される相補的配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
前記センス鎖は、配列番号２０４に示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６に示されている配列を含む、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
前記センス鎖は、配列番号２１１に示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３６７に示されている配列を含む、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
前記センス鎖は、配列番号３６４に示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３６９に示されている配列を含む、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
前記センス鎖は、配列番号３６５に示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３７０に示されている配列を含む、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
前記センス鎖は、配列番号２０４に示されている配列からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６に示されている配列からなる、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
前記センス鎖は、配列番号２１１に示されている配列からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号３６７に示されている配列からなる、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
前記センス鎖は、配列番号３６４に示されている配列からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号３６９に示されている配列からなる、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
前記センス鎖は、配列番号３６５に示されている配列からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号３７０に示されている配列からなる、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、表７の行から選択される１対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項７０】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項５４〜６９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７１】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む、請求項７０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７２】
前記２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項７１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは全て修飾されている、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７４】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結を含む、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７５】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結は、ホスホロチオアート連結である、請求項７４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７６】
前記アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む、請求項５４〜７５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７７】
前記ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項７６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７８】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている、請求項５４から７７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７９】
各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む、請求項７８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８０】
各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項７９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８１】
前記ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項８０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８２】
前記ステム−ループのＬの最大４個のヌクレオチドは各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項８０又は請求項８１に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／５２６，９７１号、発明の名称「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧ  ＨＭＧＢ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」の米国特許法第１１９条に基づく出願日の利益を主張するものである。この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、オリゴヌクレオチドおよびそれらの使用、特に線維症を含む状態の治療の関連する使用に関する。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、ファイル名がＤ０８００．７０００２ＷＯ００−ＳＥＱ．ｔｘｔであり、２０１８年６月２８日に作成され、サイズが８５キロバイトであるファイルとして提供されている。配列表の電子形式での情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
組織線維症は、瘢痕化をもたらし、慢性臓器傷害を促進する、細胞外マトリックスおよび炎症因子の異常蓄積により特徴付けられる状態である。肝臓では、線維症は、肝硬変及び肝実質細胞がんに結び付く場合がある肝傷害に対する多細胞応答である。この応答は、アルコール乱用、ウイルス性肝炎、代謝疾患、胆汁うっ滞性肝疾患等の肝臓疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の状態に伴う肝臓傷害が引き金となって起きることが多い。研究により、高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質は、肝線維症における線維症促進的役割を有することが示唆されている。（例えば、Ｌｉ  Ｌ−Ｃら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＨＭＧＢ１  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１８巻、１２号、２０１４年、２３３１〜２３３９頁を参照）ＨＭＧＢ１は、傷害細胞から放出される核タンパクであり、炎症促進性メディエーターとして機能し、肝星細胞及び肝臓内皮細胞を肝臓傷害部位へと動員することが示されている。（Ｓｅｏ，ＹＳら、ＨＭＧＢ１  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｊｕｒｙ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、３０５巻：Ｇ８３８〜Ｇ８４８頁、２０１３年。）肝星細胞は、肝臓において線維形成活性を促進する増殖性筋線維芽細胞に転換することにより、肝線維症の進行に中心的な役割を果たすと考えられている。（Ｋａｏ  ＹＨら、Ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．、２００８年；４０巻：２７０４〜５頁を参照）
【発明の概要】
【０００５】
本開示の態様は、対象の線維症（例えば、肝線維症）を治療するための組成物及び方法に関する。一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１発現を選択的に阻害するための強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発された。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、特に肝実質細胞においてＨＭＧＢ１発現を低減し、それにより線維症を減少又は予防するのに有用である（例えば、実施例２〜４、図１４Ａ〜Ｃ、図１７Ａ〜Ｄ、図１９、及び図２２〜２７を参照）。一部の実施形態では、ニック化テトラループ（nicked tetraloop）構造が組み込まれているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ＨＭＧＢ１発現を阻害して肝線維症を治療するために、肝臓肝実質細胞への送達を容易にするように（主に肝実質細胞表面に発現されるアシアロ糖タンパク質受容体との相互作用により）ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされている。一部の実施形態では、本明細書には、例えば、胆汁うっ滞性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の状態を有するか又は有する疑いのある対象を治療するためにＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用することを含む方法が提供される。更なる実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドに基づく手法を使用して、特に標的とし易いＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの重要領域（ホットスポットと呼ばれる）を特定することに基づく。したがって、一部の実施形態では、そうしたｍＲＮＡホットスポットを標的としてＨＭＧＢ１発現を阻害し、線維症を治療するオリゴヌクレオチドを開発した。
【０００６】
本開示の１つの態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、及び配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、及び配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２７３〜３６２及び配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２８６、３６７、３６９、又は３７０のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含むセンス鎖を更に含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１９３〜２７２及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号２０４、２１１、３６４、又は３６５のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。
【０００７】
本開示の１つの態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号３７４〜３８１のいずれか１つに示されている、ＨＭＧＢ１の標的配列に対する相補性の領域を有する。一部の実施形態では、相補性の領域は、長さが、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、又は少なくとも２２個連続ヌクレオチドである。一部の実施形態では、相補性の領域は、ＨＭＧＢ１の標的配列に対して完全に相補的である。一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域は、長さが少なくとも１９個連続ヌクレオチドである。
【０００８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１９〜２７個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜４０個ヌクレオチドのセンス鎖を更に含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する。一部の実施形態では、センス鎖は、長さが１９〜４０個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２７個ヌクレオチドであり、センス鎖は、長さが２５個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、二重鎖領域は、長さが、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、又は少なくとも２１個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、長さが２５個ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する。
【０００９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々長さが２１〜２３個ヌクレオチドの範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々長さが１９〜２１個ヌクレオチドの範囲である二重鎖構造を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１個又は複数個のヌクレオチドの３’突出(overhang)配列を含み、３’突出配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖に、長さが２個ヌクレオチドの３’突出配列を更に含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２個ヌクレオチドの３’突出配列を含み、３’突出配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖は、長さが２１個ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが２３個ヌクレオチドであり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが２１個ヌクレオチドの二重鎖を形成する。
【００１０】
一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、及び配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、及び配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列からなる。
【００１１】
一部の実施形態では、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループ構造を含み、式中Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３〜５個ヌクレオチドのループを形成する。
【００１２】
本開示の別の態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は長さが２１〜２７個ヌクレオチドであり、ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域を有し、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループ構造を含み、式中Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３〜５個ヌクレオチドのループを形成し、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、長さが少なくとも１９個ヌクレオチドの二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていないオリゴヌクレオチドを提供する（例えば、図２を参照）。一部の実施形態では、相補性の領域は、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、又は少なくとも２１個連続ヌクレオチドに対して完全に相補的である。一部の実施形態では、Ｌは、テトラループである。一部の実施形態では、Ｌは、長さが４個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む。一部の実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは全て修飾されている。
【００１４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内(internucleotide)連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結は、ホスホロチオアート連結である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。
【００１５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性(targeting)リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。一部の実施形態では、ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である。一部の実施形態では、ステム−ループのＬの最大で４個ヌクレオチドが各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドはアプタマーを含む。
【００１６】
本開示の別の態様は、本開示のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物を提供する。本開示の別の態様は、本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、肝線維症のレベル減少又は予防をもたらす。一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１タンパク質の発現は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを対象に投与することにより低減される。一部の実施形態では、対象は、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝臓疾患を有する。
【００１７】
本開示の別の態様は、肝線維症を有するか又は有するリスクのある対象を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝臓疾患を有する。一部の実施形態では、対象は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有する。一部の実施形態では、対象に投与されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対象が肝毒性剤に曝される前に投与される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対象が肝毒性剤に曝された後に投与される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対象が肝毒性剤に曝されると同時に投与される。
【００１９】
本開示の別の態様は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有するか又は有するリスクのある対象を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象におけるＨＭＧＢ１の発現を低減するオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの投与は、肝臓ＨＭＧＢ１レベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの投与は、血清ＨＭＧＢ１レベルの低減をもたらす。
【００２１】
本開示の別の態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２から選択される相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号９７〜１９２から選択される相補的配列からなる。
【００２２】
本開示の別の態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は、配列番号１９３〜２７２又は３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２７３〜３６２又は３６６〜３７０から選択される相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１９３〜２７２又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２７３〜３６２又は配列番号３６６〜３７０から選択される相補的配列からなる。
【００２３】
本開示の別の態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜５０個ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが１５〜３０個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は、配列番号２０４、２１１、３６４、３６５のいずれか１つに示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２８６、３６７、３６９、３７０から選択される相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号２０４に示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２８６に示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号２１１に示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号３６７に示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号３６４に示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号３６９に示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号３６５に示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号３７０に示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号２０４に示されている配列からなり、アンチセンス鎖は、配列番号２８６に示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号２１１に示されている配列からなり、アンチセンス鎖は、配列番号３６７に示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号３６４に示されている配列からなり、アンチセンス鎖は、配列番号３６９に示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号３６５に示されている配列からなり、アンチセンス鎖は、配列番号３７０に示されている配列からなる。
【００２４】
本開示の別の態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、表７の行から選択される１対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む。一部の実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは全て修飾されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結は、ホスホロチオアート連結である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。一部の実施形態では、ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である。一部の実施形態では、ステム−ループのＬの最大で４個ヌクレオチドが各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成しており、ある実施形態を例示し、記載されている説明と共に、本明細書で開示される組成物及び方法のある態様の非限定的な例を提供する役目を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】細胞及び動物モデルで試験するための化合物を選択し、ＨＭＧＢ１の発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドを開発するために使用される実験設計を示すフローチャートであるＳＡＲ：構造−活性相関性。
【図２】４つのＧａｌＮＡｃ部分（分子の右側にある菱形）にコンジュゲートされているニック化テトラループ構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの非限定的な例を示す模式図である。
【図３Ａ】Ｈｅｐａ１−６細胞における９６個のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの第１相スクリーニング後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセントを示す一連のグラフである。「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  ５３３〜６４６」は、５’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示し、「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  １５４１〜１６７５」は、マウスｍＲＮＡの３’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示す。
【図３Ｂ】Ｈｅｐａ１−６細胞における９６個のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの第１相スクリーニング後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセントを示す一連のグラフである。「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  ５３３〜６４６」は、５’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示し、「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  １５４１〜１６７５」は、マウスｍＲＮＡの３’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示す。
【図３Ｃ】Ｈｅｐａ１−６細胞における９６個のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの第１相スクリーニング後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセントを示す一連のグラフである。「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  ５３３〜６４６」は、５’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示し、「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  １５４１〜１６７５」は、マウスｍＲＮＡの３’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示す。
【図３Ｄ】Ｈｅｐａ１−６細胞における９６個のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの第１相スクリーニング後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセントを示す一連のグラフである。「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  ５３３〜６４６」は、５’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示し、「Ｍｍ  ＨＭＢＧ１  １５４１〜１６７５」は、マウスｍＲＮＡの３’ＲＴ−ＰＣＲ部位の位置を示す。
【図４】Ｈｅｐａ１−６細胞（３’アッセイ）における、３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）の９６個のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド第２相スクリーニング後に残留していたｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。
【図５】ニック化テトラループ構造の塩基配列が異なる、異なる修飾パターンに構成されたＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド及び未修飾対照を使用してＨｅｐａ１−６細胞にてスクリーニングした結果を示すグラフである。
【図６】Ｈｅｐａ１−６細胞での用量反応曲線スクリーニングから選択された６つのＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのＩＣ50結果を示すグラフである。
【図７】１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドをＣ５７ＢＬ／６に皮下投与した７２時間後に肝臓に残留していた、ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡ量に対するＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量を示すグラフである。
【図８】ニック化テトラループ構造の３つのＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＬＮＰ製剤化オリゴヌクレオチドを、３つの異なる投薬量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇ）でマウスに静脈内投与した。データは、ＰＢＳ対照処置に対して正規化した、投与２４時間に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量を示す。
【図９】ニック化テトラループ構造のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。２つの異なるオリゴヌクレオチド配列を、４つの異なるオリゴヌクレオチド修飾パターンで試験した（Ｍ４９、Ｍ５４、Ｍ５５、Ｍ５６と表記されており、異なる構成の２’−フルオロ及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオアート（phophorothiate）連結を含み、それらのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに位置するホスフェート類似体を含んでいた）。その後、オリゴヌクレオチドを、２つの異なる投薬量（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）でマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照処置に対して正規化した、投与２４時間後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量を示す。
【図１０】ニック化テトラループ構造のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。異なるオリゴヌクレオチド配列を、４つの異なるオリゴヌクレオチド修飾パターンで試験した（Ｍ４９、Ｍ５１、Ｍ５３、Ｍ５７として表記されている）。その後、オリゴヌクレオチドを、３ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照処置に対して正規化した、投与７２時間後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量を示す。
【図１１】ニック化テトラループ構造のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。２つの異なるオリゴヌクレオチド配列を、異なる修飾パターン（Ｍ２９、Ｍ４９、及びＭ５０として表記されている）で試験した。ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、ヒト、アカゲザル、及びマウス配列の、アルゴリズムにより特定された保存配列（「三重共通」配列）に結合するように設計した。データは、１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後の５日目に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量（ＰＢＳ対照処置に対して正規化）を示す。
【図１２】Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１１週）によるＡＰＡＰ誘導性肝臓傷害の実験モデルのフローチャートを示す模式図である。このモデルでは、マウスは、１２時間の絶食期間後に、３５０又は２５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰの腹腔内注射を受けた。６、２４、及び４８時間時に、血液及び/又は組織試料を収集した。
【図１３Ａ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスに残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージ（Ｈｐｒｔ１  ｍＲＮＡに対して正規化）を示す一組のグラフである。図１３Ａは肝臓ＨＭＧＢ１発現を示し、図１６Ｂは血清ＨＭＧＢ１発現を示す。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１３Ａ〜１３Ｂで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図１３Ｂ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスに残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージ（Ｈｐｒｔ１  ｍＲＮＡに対して正規化）を示す一組のグラフである。図１３Ａは肝臓ＨＭＧＢ１発現を示し、図１６Ｂは血清ＨＭＧＢ１発現を示す。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１３Ａ〜１３Ｂで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図１４Ａ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスにおける、ＨＭＧＢ１処置後のＡＳＴ発現、ＡＬＴ発現、及び血清ｍｉＲ１２２発現を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１４Ａ〜１４Ｃで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図１４Ｂ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスにおける、ＨＭＧＢ１処置後のＡＳＴ発現、ＡＬＴ発現、及び血清ｍｉＲ１２２発現を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１４Ａ〜１４Ｃで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図１４Ｃ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスにおける、ＨＭＧＢ１処置後のＡＳＴ発現、ＡＬＴ発現、及び血清ｍｉＲ１２２発現を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１４Ａ〜１４Ｃで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図１５】ＡＰＡＰ誘導性肝臓傷害の実験モデルのフローチャートを示す模式図である。このモデルでは、動物を、５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの５用量、又は１．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの２用量のいずれかで処置した。２週間のオリゴヌクレオチド投与及び１２時間の絶食期間後、マウスは、０．９％ＮａＣｌ中３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰの腹腔内（intraperotineal）（Ｉ．Ｐ．）注射を受けた。ＡＰＡＰ注射投与の１日（２４時間）後、組織及び／又は血液試料を回収した。
【図１６Ａ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスの肝臓又は血清に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。図１６Ａは肝臓ＨＭＧＢ１発現を示し、図１６Ｂは血清ＨＭＧＢ１発現を示す。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。  図１６Ａ〜１６Ｂで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【図１６Ｂ】３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰを注射し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後のマウスの肝臓又は血清に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。図１６Ａは肝臓ＨＭＧＢ１発現を示し、図１６Ｂは血清ＨＭＧＢ１発現を示す。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。  図１６Ａ〜１６Ｂで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【図１７Ａ】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後の、３５０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰＡＰ処置動物におけるＡＬＴ発現（図１７Ａ）、ＡＳＴ発現（図２０Ｂ）、ＬＤＨ発現（図２０Ｃ）、及びｍｉＲ１２２発現（図１７Ｄ）を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１７Ａ〜１７Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【図１７Ｂ】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後の、３５０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰＡＰ処置動物におけるＡＬＴ発現（図１７Ａ）、ＡＳＴ発現（図２０Ｂ）、ＬＤＨ発現（図２０Ｃ）、及びｍｉＲ１２２発現（図１７Ｄ）を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１７Ａ〜１７Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【図１７Ｃ】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後の、３５０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰＡＰ処置動物におけるＡＬＴ発現（図１７Ａ）、ＡＳＴ発現（図２０Ｂ）、ＬＤＨ発現（図２０Ｃ）、及びｍｉＲ１２２発現（図１７Ｄ）を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１７Ａ〜１７Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【図１７Ｄ】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド、又はＰＢＳ対照で処置した後の、３５０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰＡＰ処置動物におけるＡＬＴ発現（図１７Ａ）、ＡＳＴ発現（図２０Ｂ）、ＬＤＨ発現（図２０Ｃ）、及びｍｉＲ１２２発現（図１７Ｄ）を示す一連のグラフである。生理食塩水注射動物を、対照として使用した。図１７Ａ〜１７Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【図１８】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド投薬レジメンによる、抗線維活性の四塩化炭素（ＣＣｌ4）モデルのフローチャートを示す模式図である。
【図１９】皮下５ｍｇ／ｋｇ用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドで５又は７週毎に又はＰＢＳ対照で処置した後の、抗線維活性のＣＣｌ4モデルにおけるシリウスレッド相対平均強度レベルのグラフである。図１９で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図２０】皮下５ｍｇ／ｋｇ用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドで５又は７週毎に又はＰＢＳ対照で処置した後の、抗線維活性のＣＣｌ4モデルにおけるアルファ平滑筋アクチン相対平均強度レベルのグラフである。図２０で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図２１】皮下５ｍｇ／ｋｇ用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドで５又は７週毎に又はＰＢＳ対照で処置した後の、抗線維活性のＣＣｌ4モデルにおける肝臓質量対体重比のグラフである。図２１で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図２２】皮下５ｍｇ／ｋｇ用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドで５又は７週毎に又はＰＢＳ対照で処置した後の、抗線維活性のＣＣｌ4モデルにおけるＦ４／８０＋面積のグラフである。図２２で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図２３】５ｍｇ／ｋｇ皮下用量のテトラループ構造のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド又は２．５ｍｇ／ｋｇ静脈内用量のテトラループ構造のＬＮＰ製剤化オリゴヌクレオチドで処置した４３日後の、抗線維活性のＣＣｌ4モデルにおけるシリウスレッド相対平均強度レベルのグラフである。ＰＢＳ処置動物及びＣＣｌ4未処置動物を対照として使用した。図２３で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図２４】マウスのコンカナバリンＡ（Concavalin A）誘導性肝炎モデルのフローチャートを、実験設計の基本概要を示すチャートと共に示す模式図である。
【図２５】マウスのコンカナバリンＡ誘導性肝炎モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置の結果を示す一連の図である。ＰＢＳ対照で処置したマウスのデータは左側に示されている。１０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの皮下投与で処置したマウスのデータは、右側に示されている。図２５で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【図２６Ａ】コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）又は対照高脂肪餌（ＨＦＤ）を与えたマウスにおける、ＨＭＧＢ１（図２６Ａ及び２６Ｂ）、Ｃｏｌ１ａ１（図２６Ｃ）、及びビメンチン（図２６Ｄ）ｍＲＮＡレベルに対する皮下ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置の結果を、ＰＢＳ対照処置と比較して示す一連のグラフである。図２６Ａ〜２６Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ１９４−ＡＳ２７４−Ｍ３０である。
【図２６Ｂ】コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）又は対照高脂肪餌（ＨＦＤ）を与えたマウスにおける、ＨＭＧＢ１（図２６Ａ及び２６Ｂ）、Ｃｏｌ１ａ１（図２６Ｃ）、及びビメンチン（図２６Ｄ）ｍＲＮＡレベルに対する皮下ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置の結果を、ＰＢＳ対照処置と比較して示す一連のグラフである。図２６Ａ〜２６Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ１９４−ＡＳ２７４−Ｍ３０である。
【図２６Ｃ】コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）又は対照高脂肪餌（ＨＦＤ）を与えたマウスにおける、ＨＭＧＢ１（図２６Ａ及び２６Ｂ）、Ｃｏｌ１ａ１（図２６Ｃ）、及びビメンチン（図２６Ｄ）ｍＲＮＡレベルに対する皮下ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置の結果を、ＰＢＳ対照処置と比較して示す一連のグラフである。図２６Ａ〜２６Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ１９４−ＡＳ２７４−Ｍ３０である。
【図２６Ｄ】コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）又は対照高脂肪餌（ＨＦＤ）を与えたマウスにおける、ＨＭＧＢ１（図２６Ａ及び２６Ｂ）、Ｃｏｌ１ａ１（図２６Ｃ）、及びビメンチン（図２６Ｄ）ｍＲＮＡレベルに対する皮下ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置の結果を、ＰＢＳ対照処置と比較して示す一連のグラフである。図２６Ａ〜２６Ｄで使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ１９４−ＡＳ２７４−Ｍ３０である。
【図２７】コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）又は対照高脂肪餌（ＨＦＤ）を与えたマウスにおける、ＡＬＴレベル及びＡＳＴレベルに対する皮下ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置の結果を、ＰＢＳ対照処置と比較して示す一連のグラフである。図２７で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ１９４−ＡＳ２７４−Ｍ３０である。
【図２８】１ｍｇ／ｋｇ皮下投与後の５日目での、３つの異なる修飾パターンを有する８つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与５日後の肝臓における残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージが示されている。結果は、異なる化学的修飾パターンを有する試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは全て、マウス肝実質細胞でのＨＭＧＢ１ノックダウンに効能があることを示す。
【図２９Ａ】３つの異なる投薬量（１、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）の８つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与５日後の肝臓における残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、５’ｑＰＣＲ反応（図２９Ａ）又は３’ｑＰＣＲ反応（図２９Ｂ）のいずれかで評価した。結果は、試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド全ての効力が、用量依存的であることを示す。
【図２９Ｂ】３つの異なる投薬量（１、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）の８つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与５日後の肝臓における残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、５’ｑＰＣＲ反応（図２９Ａ）又は３’ｑＰＣＲ反応（図２９Ｂ）のいずれかで評価した。結果は、試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド全ての効力が、用量依存的であることを示す。
【図３０Ａ】４つの異なる時点における、３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。データは、オリゴヌクレオチド投与後の７日目、１４日目、２１日目、又は２８日目に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量（ＰＢＳで処置したマウスに残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化）を示す。図３０Ａ及び３０Ｂは、５’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。図３０Ｃ及び３０Ｄは、３’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドが全て、注射の３週間後、ＨＭＧＢ１ノックダウンに効能があったことを示した。
【図３０Ｂ】４つの異なる時点における、３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。データは、オリゴヌクレオチド投与後の７日目、１４日目、２１日目、又は２８日目に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量（ＰＢＳで処置したマウスに残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化）を示す。図３０Ａ及び３０Ｂは、５’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。図３０Ｃ及び３０Ｄは、３’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドが全て、注射の３週間後、ＨＭＧＢ１ノックダウンに効能があったことを示した。
【図３０Ｃ】４つの異なる時点における、３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。データは、オリゴヌクレオチド投与後の７日目、１４日目、２１日目、又は２８日目に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量（ＰＢＳで処置したマウスに残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化）を示す。図３０Ａ及び３０Ｂは、５’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。図３０Ｃ及び３０Ｄは、３’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドが全て、注射の３週間後、ＨＭＧＢ１ノックダウンに効能があったことを示した。
【図３０Ｄ】４つの異なる時点における、３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。データは、オリゴヌクレオチド投与後の７日目、１４日目、２１日目、又は２８日目に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量（ＰＢＳで処置したマウスに残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化）を示す。図３０Ａ及び３０Ｂは、５’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。図３０Ｃ及び３０Ｄは、３’ｑＰＣＲ反応の結果を示す。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドが全て、注射の３週間後、ＨＭＧＢ１ノックダウンに効能があったことを示した。
【図３１Ａ】３つの異なる投薬量（１、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）の４つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与５日後の肝臓における残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、５’ｑＰＣＲ反応（図３１Ａ）又は３’ｑＰＣＲ反応（図３１Ｂ）のいずれかで評価した。試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤は全て、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇのＥＤ50（薬物を受容したレシピエントの５０％に有効な用量）を示した。
【図３１Ｂ】３つの異なる投薬量（１、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）の４つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与５日後の肝臓における残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、５’ｑＰＣＲ反応（図３１Ａ）又は３’ｑＰＣＲ反応（図３１Ｂ）のいずれかで評価した。試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤は全て、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇのＥＤ50（薬物を受容したレシピエントの５０％に有効な用量）を示した。
【図３２Ａ】皮下投与２１日後の、４つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与２１日後の肝臓の残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、５’ｑＰＣＲ反応（図３２Ａ）又は３’ｑＰＣＲ反応（図３２Ｂ）のいずれかで評価した。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドが全て、注射の３週間後にＨＭＧＢ１ノックダウンの効力を保持していたことを示した。
【図３２Ｂ】皮下投与２１日後の、４つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。ＰＢＳで処置したマウスの残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した、オリゴヌクレオチド投与２１日後の肝臓の残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、５’ｑＰＣＲ反応（図３２Ａ）又は３’ｑＰＣＲ反応（図３２Ｂ）のいずれかで評価した。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドが全て、注射の３週間後にＨＭＧＢ１ノックダウンの効力を保持していたことを示した。
【図３３Ａ−Ｃ】初代サル肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ＲｈＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３３Ａ〜３３Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３３Ｄ〜３３Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３３Ｃ、３３Ｆ、及び３３Ｇ）。残留ＲｈＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイでのＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３３Ｇ）。
【図３３Ｄ−Ｆ】初代サル肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ＲｈＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３３Ａ〜３３Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３３Ｄ〜３３Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３３Ｃ、３３Ｆ、及び３３Ｇ）。残留ＲｈＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイでのＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３３Ｇ）。
【図３３Ｇ】初代サル肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ＲｈＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３３Ａ〜３３Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３３Ｄ〜３３Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３３Ｃ、３３Ｆ、及び３３Ｇ）。残留ＲｈＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイでのＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３３Ｇ）。
【図３４Ａ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【図３４Ｂ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【図３４Ｃ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【図３４Ｄ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【図３４Ｅ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【図３４Ｆ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【図３４Ｇ】初代ヒト肝実質細胞における２つのＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの取り込み及び活性を示すＩＣ５０曲線である。ＩＣ５０曲線は、偽処置に対して正規化した。ｈｓＨＭＧＢ１  ５’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ａ〜３４Ｃに示されており、３’ｑＰＣＲ反応の結果は、図３４Ｄ〜３４Ｆに示されている。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを、アッセイ対照として使用した（図３４Ｃ、３４Ｆ、及び３４Ｇ）。残留ＨｓＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲアッセイにおいてＬＤＨＡ特異的プライマーにより測定した（図３４Ｇ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（００６０）  一部の態様によると、本開示は、肝線維症を治療するための、細胞、特に肝臓細胞（例えば、肝実質細胞）におけるＨＭＧＢ１発現の低減に効果的な、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。したがって、関連する態様では、本開示は、肝臓でのＨＭＧＢ１遺伝子発現を選択的に低減することを含む、線維症を治療するための方法を提供した。ある実施形態では、本明細書で提供されるＨＭＧＢ１標的化オリゴヌクレオチドは、標的組織の選択された細胞（例えば、肝臓肝実質細胞）に送達されて、そうした組織の線維症を治療するように設計されている。
【００２７】
（００６１）  用語の定義に関する説明を含む、本開示の更なる態様が、下記に提供されている。
【００２８】
（００６２）  Ｉ．定義
およそ：本明細書で使用される場合、用語「およそ」又は「約」は、１つ又は複数の目的の値に適用される場合、記載されている参照値と同様の値を指す。ある実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別様の記述がない限り又は状況からそうでないことが明白でない限り（そのような数値が、考え得る値の１００％を超えることになる場合を除き）、記載されている参照値のいずれかの方向の（それよりも大きいか又はそれ未満）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれより低い値内に入る値の範囲を指す。
【００２９】
（００６３）  投与する：本明細書で使用される場合、用語「投与する」又は「投与」は、薬理学的に有用な（例えば、対象の状態を治療するために）様式で、物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を対象に提供することを意味する。
【００３０】
（００６４）  アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用される場合、用語、「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」は、主要４８ｋＤａ（ＡＳＧＰＲ−１）及び非主要４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−２）により形成される二分性Ｃ型レクチンを指す。ＡＳＧＰＲは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）との結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を果たす。
【００３１】
（００６５）  減弱する：本明細書で使用される場合、用語「減弱する」は、低減させること又は効果的に停止させることを意味する。非限定的な例として、本明細書で提供される治療の１つ又は複数は、対象の肝線維症又は肝臓炎症の発症又は進行を低減又は効果的に停止させることができる。この減弱は、例えば、肝線維症又は肝臓炎症の１つ又は複数の側面（例えば、症状、組織特徴、及び細胞の炎症活性又は免疫活性等）の減少、そうではないと予想することができる場合に、対象の肝線維症又は肝臓炎症の１つ又は複数の側面の進行（悪化）が検出不能であることにより例示される。
【００３２】
（００６６）  相補的：本明細書で使用される場合、用語「相補的」は、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする２つのヌクレオチド間の（例えば、２つの反対側の核酸の、又は単一核酸鎖の反対側の領域での）構造的関係性を指す。例えば、反対側の核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的な一方の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより一緒になって塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、相補的ヌクレオチドは、ワトソンクリック型の様式で、又は安定二重鎖の形成を可能にする他の様式で塩基対合することができる。一部の実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載のように、相補性の領域を形成するように互いに相補的な複数のヌクレオチドの領域を有していてもよい。
【００３３】
（００６７）  デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位に、ヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、ホスフェート基、若しくは塩基に又は糖、ホスフェート基、若しくは塩基の修飾又は置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
【００３４】
（００６８）  二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に個別の核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合で連結されている核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、互いに塩基対合するヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供するようにフォールディングされている（例えば、ヘアピンにより）単一核酸鎖で形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖である２つの共有結合的に個別の核酸鎖を含む。しかしながら、一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖である、例えば、一方の又は両方の末端に突出を有する２つの共有結合的に個別の核酸鎖を含む。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であり、したがって、内部ミスマッチ又は末端ミスマッチを含んでいてもよい１つ又は複数のミスマッチを有していてもよいヌクレオチドの逆平行配列を含む。
【００３５】
（００６９）  二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する用語「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。
【００３６】
（００７０）  賦形剤：本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の稠度又は安定効果を提供又は寄与するように組成物に含まれていてもよい非治療剤を指す。
【００３７】
（００７１）  肝実質細胞：本明細書で使用される場合、用語「肝実質細胞」又は「肝実質細胞（複数）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。こうした細胞は、肝臓質量のおよそ７０〜８５％を占め、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及びプロトロンビン群の凝固因子（第３因子及び第４因子を除く）を製造する。肝実質細胞系細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンテターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝実質細胞核内因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝実質細胞核内因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を挙げることができる。成熟肝実質細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２−２Ｆ８を挙げることができる。例えば、Ｈｕｃｈら、（２０１３年）、Ｎａｔｕｒｅ、４９４巻（７４３６号）：２４７〜２５０頁を参照されたい。この文献の内容は、肝実質細胞マーカーに関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
（００７２）  肝毒性剤：本明細書で使用される場合、「肝毒性剤」は、肝臓に対してそれ自体が毒性であるか、又はプロセシングされて、肝臓に対して毒性である代謝物質を形成し得る化学化合物、ウイルス、又は他の物質である。肝毒性剤としては、これらに限定されないが、四塩化炭素（ＣＣｌ4）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、塩化ビニル、ヒ素、クロロホルム、非ステロイド系抗炎症薬（アスピリン及びフェニルブタゾン等）を挙げることができる。
【００３９】
（００７３）  肝臓炎症：本明細書で使用される場合、用語「肝臓炎症」又は「肝炎」は、肝臓が、特に、傷害又は感染の結果として、肝毒性剤への曝露により引き起こされ得るように、腫大し、機能障害を起こし、及び／又は苦痛を起こす身体状態を指す。症状としては、黄疸（皮膚又は目が黄色になること）、疲労、虚弱、悪心、嘔吐、食欲減退、及び体重減少を挙げることができる。肝臓炎症は、治療せずにおくと、線維症、肝硬変、肝不全、又は肝臓がんへと進行する場合がある。
【００４０】
（００７４）  肝線維症：本明細書で使用される場合、用語「肝線維症」又は「肝臓の線維症」は、炎症及び肝臓細胞死に起因するコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＩＶ）、フィブロネクチン、ウンズリン（undulin）、エラスチン、ラミニン、ヒアルロナン、及びプロテオグリカンを含んでいてもよい細胞外マトリックスタンパク質の肝臓における過剰蓄積を指す。肝線維症は、治療せずにおくと、肝硬変、肝不全、又は肝臓がんへと進行する場合がある。
【００４１】
（００７５）  ループ：本明細書で使用される場合、用語「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中で、細胞中で）、非対合領域をフランキングする２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成するように、互いに十分に相補的である核酸の２つの逆平行領域によりフランキングされている核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非対合領域を指す。
【００４２】
（００７６）  修飾ヌクレオチド内連結：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド内連結」は、ホスホジエステル結合を含む基準ヌクレオチド内連結と比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチド内連結を指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、非天然連結である。典型的には、修飾ヌクレオチド内連結は、修飾ヌクレオチド内連結が存在する核酸に１つ又は複数の所望の特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。
【００４３】
（００７７）  修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、以下のものから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチドを指す：アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチド。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はホスフェート基に１つ又は複数の化学的修飾を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ又は複数の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ又は複数の所望の特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低減等を向上させることができる。
【００４４】
（００７８）  ニック化テトラループ構造：「ニック化テトラループ構造」は、個別のセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖の存在により特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であり、センス鎖は、アンチセンス鎖と相補的な領域を有し、鎖の少なくとも一方では、センス鎖は、一般に、少なくとも一方の鎖内に形成される隣接ステム領域を安定させるように構成されているテトラループを有する。
【００４５】
（００７９）  オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが、例えば１００個ヌクレオチド未満の短鎖核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよく又は有していなくともよい。一組の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（dicer substrate interfering RNA）（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
【００４６】
（００８０）  突出：本明細書で使用される場合、用語「突出」は、一方の鎖又は領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて、その一方の鎖又は領域が伸長することに起因する末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から伸長する１つ又は複数の非対合ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖の３’又は５’突出である。
【００４７】
（００８１）  ホスフェート類似体：本明細書で使用される場合、用語「ホスフェート類似体」は、ホスフェート基の静電気的及び／又は立体的特性を模倣する化学部分を指す。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、５’−ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに位置しており、酵素的に除去し易いことが多い。一部の実施形態では、５’ホスフェート類似体は、ホスファターゼ耐性連結を含む。ホスフェート類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’−ＭＰ）及び５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）等の５’ホスホネートが挙げられる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドの糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。４’−ホスフェート類似体の一例は、オキシメチル基の酸素原子が、糖部分（例えば、その４’−炭素）に結合されているオキシメチルホスホネート又はその類似体である。例えば、２０１６年９月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書及び２０１６年９月１２日に出願された第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これら文献の各々の内容は、ホスフェート類似体に関して、参照により本明細書に組み込まれる。他の修飾が、オリゴヌクレオチドの５’末端に関して開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号パンフレット、米国特許第８，９２７，５１３号明細書、及びＰｒａｋａｓｈら（２０１５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照されたい。これら文献の各々の内容は、ホスフェート類似体に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
（００８２）  発現の低減：本明細書で使用される場合、遺伝子の「発現の低減」という用語は、適切な参照細胞又は対象と比較して、細胞又は対象において、遺伝子によりコードされているＲＮＡ転写物又はタンパク質の量が減少すること、及び／又は遺伝子の活性の量が減少することを指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ配列に相補的アンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処置する行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処置されていない細胞と比較して、ＲＮＡ転写物、タンパク質、及び／又は活性（例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子によりコードされている）の量の減少をもたらすことができる。同様に、本明細書で使用される場合、「発現を低減する」は、遺伝子（例えば、ＨＭＧＢ１）の発現の低減をもたらす行為を指す。
【００４９】
（００８３）  相補性の領域：本明細書で使用される場合、用語「相補性（complementary）の領域」は、例えば、ヌクレオチドの逆平行配列が、適切なハイブリダイゼーション条件下で、例えば、リン酸緩衝液中で、細胞中等で、ヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションすることを可能にするのに十分に相補的である核酸（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）のヌクレオチドの配列を指す。
【００５０】
（００８４）  リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオチド」は、そのペントース糖としてリボースを有し、その２’位にヒドロキシル基を含むヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、ホスフェート基、若しくは塩基に又はリボース、ホスフェート基、若しくは塩基の修飾又は置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドである。
【００５１】
（００８５）  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部が、アルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより、標的ｍＲＮＡの切断に使用される二本鎖オリゴヌクレオチド、又は（ｂ）単一アンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖（又はそのアンチセンス鎖の一部）が、Ａｇｏ２エンドヌクレアーゼにより、標的ｍＲＮＡの切断に使用される一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
【００５２】
（００８６）  鎖：本明細書で使用される場合、用語「鎖」は、ヌクレオチド内連結（例えば、ホスホジエステル連結、ホスホロチオアート連結）により共に連結されているヌクレオチドの単一連続配列を指す。一部の実施形態では、鎖は、２つの遊離末端、例えば、５’末端及び３’末端を有する。
【００５３】
（００８７）  対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は、「対象」と同義的に使用される場合がある。
【００５４】
（００８８）  合成：本明細書で使用される場合、用語「合成」は、人為的に合成された（例えば、機械（例えば、固相核酸合成機を使用して））、又はそうでなければ、通常はその分子を産生する天然源（例えば、細胞又は生物）に由来しない核酸又は他の分子を指す。
【００５５】
（００８９）  標的指向性リガンド：本明細書で使用される場合、用語「標的指向性リガンド」は、目的の組織又は細胞の同種分子（cognate molecule）（例えば、受容体）に選択的に結合し、別の物質を目的の組織又は細胞に対して標的化するためにその別の物質にコンジュゲートすることができる分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質）を指す。例えば、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織又は細胞に標的化するためにそのオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、細胞表面受容体に選択的に結合する。したがって、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている場合、細胞の表面に発現されている受容体に選択的に結合し、オリゴヌクレオチド、標的指向性リガンド、及び受容体を含む複合体が細胞によりエンドソーム内部移行されることにより、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にする。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドが、細胞内で標的指向性リガンドから放出されるように、細胞内部移行後に又は細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
【００５６】
（００９０）  テトラループ：本明細書で使用される場合、用語「テトラループ」は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの一組のループから平均的に予想される隣接ステム二重鎖のＴｍよりも高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度を、長さが少なくとも２個塩基対の二重鎖を含むヘアピンに付与することができる。一部の実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用により、隣接ステム二重鎖の塩基対を安定させることができる。加えて、テトラループのヌクレオチド間の相互作用としては、限定ではないが、非ワトソン−クリック型塩基対、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられる（Ｃｈｅｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９０年８月１６日；３４６巻（６２８５号）：６８０〜２頁；Ｈｅｕｓ及びＰａｒｄｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１年７月１２日；２５３巻（５０１６号）：１９１〜４頁）。一部の実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドを含むか又はからなり、典型的には、４〜５個のヌクレオチドである。ある実施形態では、テトラループは、３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含むか又はからなり、修飾されていてもよく、又は修飾されていなくともよい（例えば、標的指向性部分にコンジュゲートされていてもよく、又はコンジュゲートされていなくともよい）。一実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドからなる。任意のヌクレオチドをテトラループに使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３巻：３０２１〜３０３０頁に記載のような、そのようなヌクレオチドの標準ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ記号を使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、その位置には任意の塩基が存在してもよいことを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）が、その位置に存在してもよいことを示すために使用することができ、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）が、その位置に存在してよいことを示すために使用することができる。テトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる。（Ｗｏｅｓｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０年１１月；８７巻（２１号）：８４６７〜７１頁；Ａｎｔａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１年１１月１１日；１９巻（２１号）：５９０１〜５頁）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリ���、及びテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻（４８号）、１４２８１〜１４２９２頁、２００２年。ＳＨＩＮＪＩら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ７８巻、２号；７３１頁（２０００年）を参照されたい。これら文献は、それらの関連開示について、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、テトラループは、ニック化テトラループ構造内に含まれている。
【００５７】
（００９１）  治療する：本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、例えば、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康及び／又は福祉を向上させるために、又は状態が発生する可能性を予防又は減少させるために、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）を対象に投与することにより、それを必要とする対象にケアを提供する行為を指す。一部の実施形態では、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、又は寄与要因の頻度又は重症度を低減することを含む。
【００５８】
（００９２）  ＩＩ．オリゴヌクレオチドに基づくＨＭＧＢ１発現阻害剤
ｉ．ＨＭＧＢ１ホットスポット
一部の実施形態では、本明細書には、治療利益を達成するために使用することができるオリゴヌクレオチドに基づくＨＭＧＢ１発現阻害剤が提供される。複数の異なる種（ヒト、アカゲザル、及びマウス）のｍＲＮＡを含むＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの検査（例えば、実施例１を参照）、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験により、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのある領域は、他のものよりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害の影響を受け易いため、標的化のホットスポットであることが発見された。一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１のホットスポット領域は、配列番号３７４〜３８１のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのこうした領域は、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ発現を阻害するために本明細書で考察されているオリゴヌクレオチドを使用して、標的とすることができる。
【００５９】
（００９３）  したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞内のｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害するために、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡに相補的な領域を（例えば、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのホットスポット内に）有するように設計されている。相補性の領域は、一般に、その発現を阻害するために、オリゴヌクレオチド（又はその鎖）のＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡに対するアニーリング（annealling）を可能にするのに好適な長さ及び塩基構成である。一部の実施形態では、相補性の領域は、長さが、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、又は少なくとも２０個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、長さが１２〜３０個（例えば、１２〜３０、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７、又は１５〜３０個）ヌクレオチドの範囲である、ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個ヌクレオチドである、ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域を有する。
【００６０】
（００９４）  一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列に対して少なくとも部分的に相補的な相補性の領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の）を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列に対して完全に相補的な相補性の領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の）を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性の領域は（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の）、長さが１０〜２５個ヌクレオチド（例えば、１０〜２５、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２５、１９〜２５、又は１５〜３０個ヌクレオチド）の範囲である、配列番号１〜９６，１９３〜２７２、及び３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列のヌクレオチドの連続配列に相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性の領域は（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の）、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個連続ヌクレオチドである、配列番号１〜９６，１９３〜２７２、及び３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列のヌクレオチドの連続配列に相補的である。
【００６１】
（００９５）  一部の実施形態では、配列番号１〜９６，１９３〜２７２、及び３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの相補性の領域は、アンチセンス鎖の全長に及ぶ。一部の実施形態では、配列番号１〜９６，１９３〜２７２、及び３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの相補性の領域は、アンチセンス鎖の全長の部分に及ぶ。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１９３〜２７２、１９３〜２７２、及び３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列のヌクレオチド１〜１９に及ぶヌクレオチドの連続伸長に対して少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的な相補性の領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の）を含む。
【００６２】
（００９６）  一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１に対する相補性の領域は、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチを有していてもよい。オリゴヌクレオチドの相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を保持する限り、最大で１つ、最大で２つ、最大で３つ、最大で４つ、最大で５つ等のミスマッチを有していてもよい。或いは、オリゴヌクレオチドにある相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を保持する限り、１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、又は５つ以下のミスマッチを有していてもよい。一部の実施形態では、相補性の領域に１つよりも多くのミスマッチがある場合、それらは、オリゴヌクレオチドが、適切なハイブリダイゼーション条件下でＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を保持する限り、連続的に（例えば、連続して、２つ、３つ、４つ、又はそれよりも多く）位置していてもよく、又は相補性の領域の全体にわたって点在していてもよい。
【００６３】
（００９７）  ｉｉ．オリゴヌクレオチドのタイプ
ＲＮＡｉ、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ等を含む、本開示の方法においてＨＭＧＢ１を標的とするのに有用な構造のオリゴヌクレオチドは、様々なものが存在する。本明細書又は他所に記載の構造はいずれも、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号３７４〜３８１に例示されているもの等の、ＨＭＢＧ１のホットポット配列（hotpot sequence））を組み込むか又は標的とするためのフレームワークとして使用することができる。
【００６４】
（００９８）  一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１発現の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ダイサー介入の上流又は下流のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する。例えば、各鎖が、１〜５個ヌクレオチドの少なくとも１つの３’突出を有し、１９〜２５個ヌクレオチドのサイズを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号明細書を参照）。ダイサーによりプロセシングされて、活性ＲＮＡｉ産物を生成するより長鎖のオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号明細書を参照）。更なる研究により、鎖の一方が熱力学的に安定的なテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の末端が二重鎖標的指向性領域を越えて伸長する伸長二本鎖オリゴヌクレオチドがもたらされた（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号明細書及び第８，９２７，７０５号明細書並びに国際公開第２０１００３３２２５号パンフレットを参照。これら文献は、そうしたオリゴヌクレオチドの開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような構造は、一本鎖伸長（分子の一方の側又は両側の）並びに二本鎖伸長を含んでいてもよい。
【００６５】
（００９９）  一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、ダイサーの介入（例えば、ダイサー切断）の下流のＲＮＡ干渉経路に関与するように設計されている。そのようなオリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端に突出（例えば、長さが１、２、又は３個ヌクレオチドの）を有していてもよい。そのようなオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡ及び相補的パッセンジャー鎖に対してアンチセンスであり、両鎖がアニーリングして、１９ｂｐ二重鎖を形成し、いずれかの又は両方の３’末端に２個ヌクレオチドの突出を形成する２１個ヌクレオチドのガイド鎖を含んでいてもよい。分子の右側（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）に平滑末端が存在し、分子の左側（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）に２個ヌクレオチドの３’ガイド鎖突出が存在する、２３個ヌクレオチドのガイド鎖及び２１個ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有するオリゴヌクレオチドを含むより長鎖のオリゴヌクレオチド設計も利用可能である。そのような分子では、２１個塩基対の二重鎖領域が存在する。例えば、米国特許第９０１２１３８号明細書、米国特許第９０１２６２１号明細書、及び米国特許第９１９３７５３号明細書を参照されたい。これら文献の各々は、それらの関連開示について、本明細書に組み込まれる。
【００６６】
（０１００）  一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、両方とも長さが１７〜２６個（例えば、１７〜２６、２０〜２５、又は２１〜２３個）ヌクレオチドの範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、両方とも長さが１９〜２１個ヌクレオチドの範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は長さが等しい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に３’突出が存在する。一部の実施形態では、両方とも長さが２１〜２３個ヌクレオチドの範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドの場合、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方にある３’突出は、長さが１個又は２個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、分子の右側（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）に平滑末端が存在し、分子の左側（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）に２個ヌクレオチドの３’ガイド鎖突出が存在する、２３個ヌクレオチドのガイド鎖及び２１個ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有する。そのような分子には、２１個塩基対の二重鎖領域が存在する。
本明細書で開示される組成物及び方法で使用される他のオリゴヌクレオチド設計としては、以下のものが挙げられる：１６量体ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（編）、Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年を参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ又はより短いステムを有するもの。例えば、Ｍｏｏｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０年；６２９巻：１４１〜１５８頁を参照）、平滑末端ｓｉＲＮＡ（例えば、長さが１９ｂｐのもの。例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ及びＢａｋｅｒ、ＲＮＡ、１２巻、１６３〜１７６頁（２００６年）を参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ。例えば、Ｓｕｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６巻、１３７９〜１３８２頁（２００８年）を参照）、非対称短鎖二重鎖ｓｉＲＮＡ、（例えば、Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９年４月；１７巻（４号）：７２５〜３２頁を参照）、フォーク型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５５７巻、１〜３号；２００４年１月、１９３〜１９８頁を参照）、一本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０巻、１０６３頁（２０１２年））、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９巻：１５１０８〜１５１０９頁（２００７年）を参照）、及び低分子内部セグメント干渉ＲＮＡ（small internally segmented interfering RNA）（ｓｉｓｉＲＮＡ。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７年９月；３５巻（１７号）：５８８６〜５８９７頁を参照）。先述の参考文献の各々は、その中の関連開示について、その全体が参照により組み込まれる。一部の実施形態で使用して、ＨＭＧＢ１の発現を低減又は阻害することができるオリゴヌクレオチド構造の更なる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡである（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，２００２年、２１巻（１７号）：４６７１〜４６７９頁を参照；また、米国特許出願第２００９００９９１１５号明細書を参照）。
【００６７】
（０１０１）  更に、一部の実施形態では、本明細書に記載されているＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、これに限定されないが、一本鎖ＲＮＡｉ分子が挙げられる。最近の努力により、一本鎖ＲＮＡｉ分子の活性が示されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉら（２０１６年５月）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２４巻（５号）、９４６〜９５５頁を参照）。しかしながら、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載して、特定の核酸の標的セグメントの逆相補体を含み、細胞でのその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介性切断を誘導するように（例えば、ギャップマー（gapmer）として）、又は細胞での標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように（例えば、ミックスマー（mixmer）として）適切に修飾されているヌクレオチド配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本開示で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示について参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５６７，５８７号明細書に示されているものを含む（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、及び核酸塩基のヘテロ環部分の変更を含む）、当技術分野で公知の任意の好適な様式で修飾されていてもよい。更に、アンチセンス分子は、特定の標的遺伝子の発現を低減するために数十年間にわたって使用されている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５７巻：８１〜１０５頁を参照）。
【００６８】
（０１０２）  ｉｉｉ．二本鎖オリゴヌクレオチド
ＨＭＧＢ１発現を標的とするための（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）二本鎖オリゴヌクレオチドは、概して、互いに二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されていない。しかしながら、一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されている。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが、少なくとも１５個（例えば、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、又は少なくとも２１個）ヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが１５〜３０個ヌクレオチドの範囲である（例えば、長さが１５〜３０、１５〜２７、１５〜２２、１８〜２２、１８〜２５、１８〜２７、１８〜３０、又は２１〜３０個ヌクレオチド）。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の全長に及んでいない。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。ある実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
【００６９】
（０１０３）  一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、表７に配置されているように、配列番号１〜９６のいずれか１つに示されている配列を有するセンス鎖、及び配列番号９７〜１９２から選択される相補的配列を含むアンチセンス鎖を含む（例えば、配列番号１に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号９７に示されている配列を含むアンチセンス鎖）。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、表７に配置されているように、配列番号１９３〜２７２及び配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号２７３〜３６２及び配列番号３６６〜３７０から選択される相補的配列を含むアンチセンス鎖を含む（例えば、配列番号１９３に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号２７３に示されている配列を含むアンチセンス鎖）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を記述する際に、配列表に提示されている配列を参照することができることが認識されるべきである。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、指定の配列と本質的に同じか又は類似した相補的特性を保持する限り、指定の配列と比較して、１つ若しくは複数の代替的ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ相当物又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相当物）及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド内連結及び／又は１つ若しくは複数の他の修飾を有していてもよい。
【００７０】
（０１０４）  一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２５個ヌクレオチドのセンス鎖、及びダイサー酵素が作用すると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖をもたらす２７個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２７個ヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個ヌクレオチド）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２５個ヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、又は３０個ヌクレオチド）。
センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖の長さは、長さが１２〜３０個ヌクレオチドである（例えば、１２〜３０、１２〜２７、１５〜２５、１８〜３０、又は１９〜３０個ヌクレオチド）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖の長さは、少なくとも１２個ヌクレオチドの長さである（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、又は少なくとも２５個ヌクレオチドの長さ）。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖の長さは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個ヌクレオチドである。
【００７１】
（０１０５）  一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、一方の５’末端が、他方の５’末端と比較して熱力学的に安定性がより低い。一部の実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端に突出を含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’突出は、長さが１〜８個ヌクレオチドである（例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７、又は８個ヌクレオチドである）。典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２個ヌクレオチドの突出を有する。しかしながら、他の突出も可能である。一部の実施形態では、突出は、１〜６個ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６個ヌクレオチドの長さを含む３’突出である。しかしながら、一部の実施形態では、突出は、１〜６個ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６個ヌクレオチドの長さを含む５’突出である。
【００７２】
（０１０６）  一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、修飾されている。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、標的と相補的ではない。一部の実施形態では、ニック化テトラループ構造中のオリゴヌクレオチドの各３’末端の２つの末端ヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、オリゴヌクレオチドの各３’末端の２つの末端ＧＧヌクレオチドの一方又は両方は、標的と相補的ではない。
【００７３】
（０１０７）  一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間には、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの）ミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、連続して位置していてもよく（例えば、２つ、３つ、又はそれよりも多くが連続して）、又は相補性の領域の全体にわたって点在していてもよい。一部の実施形態では、センス鎖の３’末端は、１つ又は複数のミスマッチを含む。一実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化は、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉの合成二重鎖の効力を向上させた。
【００７４】
（０１０８）  ａ．アンチセンス鎖。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる場合がある。例えば、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に係合し、アルゴノートタンパク質に結合して、又は１つ若しくは複数の同様の因子に係合若しくは結合して、標的遺伝子のサイレンシングを導くことができる場合、ガイド鎖と呼ぶことができる。一部の実施形態では、ガイド鎖と相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる場合がある。
【００７５】
（０１０９）  一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、長さが最大で５０個ヌクレオチド（例えば、長さが最大で３０個、最大で２７個、最大で２５個、最大で２１個、又は最大で１９個ヌクレオチド）であるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも１２個ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１９個、少なくとも２１個、少なくとも２５個、又は少なくとも２７個のヌクレオチド）であるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、長さが１２〜５０個又は１２〜３０個（例えば、１２〜３０、１１〜２７、１１〜２５、１５〜２１、１５〜２７、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、又は１９〜３０個）ヌクレオチドの範囲である。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つのアンチセンス鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個ヌクレオチドである。
【００７６】
（０１１０）  一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、又は配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、又は配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列の、少なくとも１２個（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、又は少なくとも２３個）連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、又は配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列のいずれかの、長さが１２〜３０個ヌクレオチド（例えば、１２〜２７、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７、又は１５〜２７個ヌクレオチド）の範囲である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個連続ヌクレオチドである、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、又は配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号９７〜１９２、配列番号２７３〜３６２、又は配列番号３６６〜３７０のいずれか１つに示されている配列からなるアンチセンス鎖を含む。
【００７７】
（０１１１）  ｂ．センス鎖
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが最大で４０個（例えば、長さが最大で４０個、最大で３５個、最大で３０個、最大で２７個、最大で２５個、最大で２１個、最大で１９個、最大で１７個、又は最大で１２個）ヌクレオチドのセンス鎖を有していてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも１２個ヌクレオチド（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１９個、少なくとも２１個、少なくとも２５個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、又は少なくとも３８個ヌクレオチド）のセンス鎖を有していてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２〜５０個（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０個）ヌクレオチドの範囲のセンス鎖を有していてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個ヌクレオチドのセンス鎖を有していてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２７個ヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個ヌクレオチド）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２５個ヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、又は３０個ヌクレオチド）。
【００７８】
（０１１２）  一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されているセンス鎖配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の、少なくとも１２個（例えば、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、又は少なくとも２３個）連続ヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列のいずれかの、長さが７〜３６個ヌクレオチド（例えば、１２〜３０、１２〜２７、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７、２０〜３６、又は１５〜３６個ヌクレオチド）の範囲である連続ヌクレオチド配列を含むセンス鎖を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個ヌクレオチドである、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチド配列を含むセンス鎖を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９６、配列番号１９３〜２７２、又は配列番号３６３〜３６５のいずれか１つに示されている配列からなるセンス鎖を有する。
【００７９】
（０１１３）  一部の実施形態では、センス鎖は、その３’末端にステム−ループを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、その５’末端にステム−ループを含む。一部の実施形態では、ステム−ループを含む鎖は、２〜６６個ヌクレオチドの長さ（例えば、２〜６６、１０〜５２、１４〜４０、２〜３０、４〜２６、８〜２２、１２〜１８、１０〜２２、１４〜２６、又は１４〜３０個ヌクレオチドの長さ）の範囲である。一部の実施形態では、ステム−ループを含む鎖は、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ステムは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個ヌクレオチドの二重鎖を含む。一部の実施形態では、ステム−ループは、分解（例えば、酵素分解）に対するより良好な保護を分子に提供し、標的細胞に送達するための標的化特徴を促進する。例えば、一部の実施形態では、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に影響を及ぼさずに修飾をなすことができる追加のヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、センス鎖が、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループであって、式中Ｓ1は、Ｓ2に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に長さが最大で１０個ヌクレオチド（例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個ヌクレオチド）のループを形成するステム−ループを含む（例えば、その３’末端に）オリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。
【００８０】
（０１１４）  一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）は、テトラループである（例えば、ニック化テトラループ構造内の）。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せを含んでいてもよい。典型的には、テトラループは、４〜５個のヌクレオチドを有する。しかしながら、一部の実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドに含むか又はからなり、典型的には、４〜５個のヌクレオチドからなる。ある実施形態では、テトラループは、３、４、５、又は６個ヌクレオチドを含むか又はからなる。
【００８１】
（０１１５）  ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
【００８２】
（０１１６）  オリゴヌクレオチドは、特異性、安定性、送達性、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布、及び細胞取り込み、及び治療使用又は研究使用に関連する他の特徴を向上又は制御するような種々の様式で修飾されていてもよい。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁；Ｂｒａｍｓｅｎ及びＫｊｅｍｓ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３巻（２０１２年）：１〜２２頁）を参照されたい。したがって、一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の好適な修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はホスフェート基に修飾を有する。
【００８３】
（０１１７）  オリゴヌクレオチドの修飾の数、及びそうしたヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を及ぼす場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は類似の担体にコンジュゲート又は内包することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体により保護されていない場合、そのヌクレオチドの少なくとも一部が修飾されていることが有利であり得る。したがって、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれかのある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾されている。ある実施形態では、半分を超えるヌクレオチドが修飾されている。ある実施形態では、半分未満のヌクレオチドが修飾されている。典型的には、ネイキッド送達の場合、全ての糖が２’位で修飾されている。そうした修飾は、可逆的であってもよく、又は不可逆的であってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素分解からの保護、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性）を引き起こすのに十分な数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
【００８４】
（０１１８）  ａ．糖修飾
一部の実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）は、例えば、１つ又は複数の修飾が、糖の２’、３’、４’、及び／又は５’炭素位置に生じる修飾デオキシリボース又はリボース部分を含む。また、一部の実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら（１９９８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４巻、３６０７〜３６３０頁を参照）、アンロックド核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄら（２０１３年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２巻、ｅ１０３頁を参照）、及びブリッジ核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａ（２００２年）、Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１６５３〜１６５９頁を参照）に提示されているもの等の非天然代替炭素構造を含んでいてもよい。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、並びにＩｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａは、糖修飾に関するそれらの開示について参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
（０１１９）  一部の実施形態では、糖のヌクレオチド修飾は、２’−修飾を含む。２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸であってもよい。典型的には、修飾は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチルである。一部の実施形態では、糖の修飾は、糖環の１つ又は複数の炭素の修飾を含んでいてもよい糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の１’−炭素又は４’−炭素に連結されている糖の２’−酸素、又はエチレン若しくはメチレン架橋を介して１’−炭素若しくは４’−炭素に連結されている２’−酸素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−炭素から３’−炭素の結合を欠如する非環式糖を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
【００８６】
（０１２０）  一部の実施形態では、ホスフェート基又は他の基を有する末端３’末端基（例えば、３’−ヒドロキシル）を使用して、例えば、リンカー、アダプター、又は標識を付着させることができるか、又はオリゴヌクレオチドを別の核酸に直接ライゲーションすることができる。
【００８７】
（０１２１）  ｂ．５’末端ホスフェート
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’−末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を増強する。しかしながら、５’−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素による分解に感受性である場合があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの生物学的利用能が制限される場合がある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性である５’ホスフェートの類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’−ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分（「ホスフェート模倣体」）に付着されている（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら（２０１５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１５年３月３１日；４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照。この文献の内容は、ホスフェート類似体に関して、参照により本明細書に組み込まれる）。５’末端に付着することができるホスフェート模倣体は多数が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号明細書を参照。この文献の内容は、ホスフェート類似体に関して、参照により本明細書に組み込まれる）。他の修飾が、オリゴヌクレオチドの５’末端に関して開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号パンフレットを参照。この文献の内容は、ホスフェート類似体に関して、参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着されている。
【００８８】
（０１２２）  一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。例えば、２０１６年９月２日に出願された、発明の名称が「４’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」の米国仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された、発明の名称が「４’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」の第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これら文献の各々の内容は、ホスフェート類似体に関して、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’−ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチル基の酸素原子が、糖部分に（例えば、その４’−炭素に）結合されているオキシメチルホスホネート又はその類似体である。他の実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子が、糖部分の４’−炭素に結合されているチオメチルホスホネート若しくはアミノメチルホスホネート又はそれらの類似体である。ある実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネートである。一部の実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＨ）2又は−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ）2により表わされ、式中、Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基、ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）3、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、又は保護基から選択される。ある実施形態では、アルキル基は、ＣＨ2ＣＨ3である。より典型的には、Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ3、又はＣＨ2ＣＨ3から選択される。
【００８９】
（０１２３）  ｃ．修飾ヌクレオシド内(intranucleoside)連結
一部の実施形態では、ホスフェート修飾又は置換は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つ）の修飾ヌクレオチド内連結を含むオリゴヌクレオチドをもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１〜１０個（例えば、１〜１０、２〜８、４〜６、３〜１０、５〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２個）の修飾ヌクレオチド内連結を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾ヌクレオチド内連結を含む。
【００９０】
（０１２４）  修飾ヌクレオチド内連結は、ホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート連結、ホスホトリエステル連結、チオノアルキルホスホネート（thionoalkylphosphonate）連結、チオンアルキルホスホトリエステル（thionalkylphosphotriester）連結、ホスホラミダイト連結、ホスホネート連結、又はボラノホスフェート（boranophosphate）連結であってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド内連結は、ホスホロチオアート連結である。
【００９１】
（０１２５）  ｄ．塩基修飾
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。一部の実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に連結されている。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含んでいない（脱塩基）。
【００９２】
（０１２６）  一部の実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位に、又は二重鎖に存在する場合は、二重鎖の構造を実質的に変更することなく１つよりも多くのタイプの塩基の反対側に位置していてもよいヌクレオチド糖部分の等価位置に位置するヘテロ環部分である。一部の実施形態では、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、標的核酸と完全に相補的な参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、相補的核酸とで形成される二重鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸との二重鎖を形成する。しかしながら、一部の実施形態では、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ユニバーサル塩基が単一のミスマッチを生成する塩基と置換されている参照一本鎖核酸と比較して、ミスマッチ塩基を含む核酸とで形成される二重鎖よりも高いＴｍを有する標的核酸との二重鎖を形成する。
【００９３】
（０１２７）  ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらの米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号明細書；Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔら、Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年１１月１１日；２３巻（２１号）：４３６３〜７０頁；Ｌｏａｋｅｓら、３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年７月１１日；２３巻（１３号）：２３６１〜６頁；Ｌｏａｋｅｓ及びＢｒｏｗｎ、５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４年１０月１１日；２２巻（２０号）：４０３９〜４３頁。先述の文献の各々は、塩基修飾に関するそれらの開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９４】
（０１２８）  ｅ．可逆的修飾
標的細胞に到達する前のｉｎ  ｖｉｖｏ環境からオリゴヌクレオチドを保護するために、ある修飾をなすことできるが、そうした修飾は、標的細胞のサイトゾルに到達すると、オリゴヌクレオチドの効力又は活性を低減する場合がある。分子が細胞の外部で所望の特性を保持するような可逆的修飾であって、その後細胞のサイトゾル環境に進入すると除去される可逆的修飾をなすことができる。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内部の化学的条件（例えば、細胞内グルタチオンによる還元）により除去することができる。
【００９５】
（０１２９）  一部の実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート連結により生成される負電荷を遮蔽し、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を向上させるように、環式ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。Ｔｒａｖｅｒｓａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社に帰属する米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号明細書（「Ｔｒａｖｅｒｓａ」）、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｔｄ．社の国際公開第２０１５／１８８１９７号パンフレット（「Ｓｏｌｓｔｉｃｅ」）、Ｍｅａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、３２巻：１２５６〜１２６３頁（“Ｍｅａｄｅ”）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ社の国際公開第２０１４／０８８９２０号パンフレットを参照されたい。これら文献の各々は、そのような修飾のそれらの開示について、参照により組み込まれる。ヌクレオチド間ジホスフェート連結のこの可逆的修飾は、サイトゾルの還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計されている。より初期の例としては、細胞内部で切断可能であることが報告されていた中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００３年、１２５巻：９４０〜９５０頁）。
【００９６】
（０１３０）  一部の実施形態では、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ及び他の過酷な環境要因（例えば、ｐＨ）に曝されることになるｉｎ  ｖｉｖｏ投与中（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソーム区画の通過中）の保護を可能にする。グルタチオンのレベルが細胞外空間と比較してより高い細胞のサイトゾルへと放出されると、修飾が元に戻り、結果としてオリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部分を使用すると、不可逆な化学的修飾を使用して利用可能な選択肢と比較して、立体的により大きな化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、そうしたより大きな化学基がサイトゾルで除去されることになり、したがって、細胞のサイトゾル内部でオリゴヌクレオチドの生物学的活性に干渉するはずがないからである。結果として、そうしたより大きな化学基を操作して、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性低減等の種々の利点を、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに付与することができる。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造を操作して、その放出の動力学を修飾することができる。
【００９７】
（０１３１）  一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドである場合、糖の５’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオチドである場合、糖の３’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、２０１６年８月２３日に出願された、発明の名称が「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」である米国特許仮出願第６２／３７８，６３５号明細書を参照されたい。この文献の内容は、その関連開示について、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
（０１３２）  ｖ．標的指向性リガンド
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを、１つ若しくは複数の細胞又は１つ若しくは複数の臓器に対して標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器における望ましくない効果の回避を支援することができ、又はオリゴヌクレオチドが有益ではないと考えられる細胞、組織、又は臓器に対するオリゴヌクレオチドの過度の喪失を回避することができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、又は臓器の標的化を容易にするように、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされているヌクレオチドを含む。
【００９９】
（０１３３）  標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はタンパク質の一部（例えば、抗体又は抗体断片）、又は脂質を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、アプタマーである。例えば、標的指向性リガンドは、腫瘍脈管構造若しくは神経膠腫細胞を標的とするために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍脈管構造若しくは小孔（stoma）を標的とするためのＣＲＥＫＡペプチド、ＣＮＳ脈管構造上に発現されるトランスフェリン受容体を標的とするためのトランスファリング（transferring）、ラクトフェリン、若しくはアプタマー、又は神経膠腫細胞上のＥＧＦＲ標的とするための抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。ある実施形態では、標的指向性リガンドは、１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ部分である。
【０１００】
（０１３４）  一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数個（例えば、１、２、３、４、５、又は６個）のヌクレオチドが各々、個別の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの２〜４個のヌクレオチドが各々、個別の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、標的指向性リガンドが、歯ブラシのブラシのようであり、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようになるように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、標的指向性リガンドに個々にコンジュゲートされていてもよい。
【０１０１】
（０１３５）  一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１の発現を低減するオリゴヌクレオチドを、対象の肝臓の肝実質細胞に対して標的化することが望ましい。任意の好適な肝実質細胞標的指向性部分を、この目的に使用することができる。
【０１０２】
（０１３６）  ＧａｌＮＡｃは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）との結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を果たすアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する高親和性リガンドである。本開示のオリゴヌクレオチドに対するＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーション（間接的又は直接的）を使用して、そうしたオリゴヌクレオチドを、そうした肝実質細胞上に発現されるＡＳＧＰＲに対して標的化することができる。
【０１０３】
（０１３７）  一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つよりも多くの一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている（つまり、２つ、３つ、又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、典型的に３つ又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている）。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。
【０１０４】
（０１３８）  一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数個（例えば、１、２、３、４、５、又は６個）のヌクレオチドが各々、ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）の２〜４個のヌクレオチドが各々、個別のＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分が、歯ブラシのブラシのようであり、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようになるように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ部分に個々にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされている。例えば、４つのＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよく、その場合、各ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのヌクレオチドにコンジュゲートされている。
【０１０５】
（０１３９）  任意の適切な方法又は化学（例えば、クリック化学）を使用して、標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用して、ヌクレオチドにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、アセタールに基づくリンカーを使用して、標的指向性リガンドを、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドにコンジュゲートする。アセタールに基づくリンカーは、例えば、２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６１００４０１号Ａ１パンフレットに公開されている。この文献の内容は、そのようなリンカーに関して、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、適度に安定的である。
【０１０６】
（０１４０）  一部の実施形態では、二重鎖伸長部（例えば、長さが最大で３、４、５、又は６つの塩基対）が、標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に提供されている。
【０１０７】
（０１４１）  ＩＩＩ．  製剤
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするための種々の製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び/又は取り込みを容易にするか、又は製剤内のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書には、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が提供される。そのような組成物は、対象の標的細胞の近接環境又は全身のいずれかへと投与されると、オリゴヌクレトチドの十分な部分が細胞内に進入して、ＨＭＧＢ１発現を低減するように、好適に製剤化することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書で開示されるＨＭＧＢ１を低減するためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシド等の緩衝溶液で製剤化されている。
【０１０８】
（０１４２）  カチオン性脂質を用いたオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞内へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）等のカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社、ボールダー、コロラド州）又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられる。これらは全て、製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
【０１０９】
（０１４３）  したがって、一部の実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、若しくはナノ粒子を含むか、又はそれを必要とする対象の細胞、組織、臓器、若しくは体内への投与用に別様に製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１３年を参照）。
【０１１０】
（０１４４）  一部の実施形態では、本明細書で開示される製剤は、賦形剤を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、組成物に、安定性の向上、吸収の向上、溶解度の向上、及び/又は活性成分の治療上の増強を付与する。一部の実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、又は水酸化ナトリウム）又は媒体（例えば、緩衝溶液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱油）である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その貯蔵寿命を延長するために凍結乾燥され、その後、使用（例えば、対象への投与）前に溶液化される。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドン）又は崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、フィコール、又はゼラチン）であってもよい。
【０１１１】
（０１４５）  一部の実施形態では、医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化されている。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、径粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。
【０１１２】
（０１４６）  注射使用に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性である）又は無菌注射溶液若しくは分散剤の即時調製用の分散物及び無菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレン（polyetheylene）グリコール等）及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。多くの場合、組成物には、等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール；塩化ナトリウムが含まれていることが好ましいだろう。無菌注射溶液は、必要量のオリゴヌクレオチドを、上記に列挙されている成分の１つ又は組合せを有する選択された溶媒に組み込み、必要に応じて、その後ろ過滅菌することにより調製することができる。
【０１１３】
（０１４７）  一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％又はそれよりも多くの治療剤（例えば、ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド）を含んでいてもよいが、活性成分のパーセンテージは、全組成物の質量又は容積の約１％〜８０％又それよりも多くともよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命等の要因並びに他の薬学的考慮項目が、そのような医薬品製剤調製の当業者により企図されるだろう。したがって、様々な投薬量及び治療レジメンが妥当であり得る。
【０１１４】
（０１４８）  幾つかの実施形態は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達に関するが、他の組織の標的化も企図される。
【０１１５】
（０１４９）  ＩＶ．使用方法
ｉ．細胞におけるＨＭＧＢ１発現の低減
一部の実施形態では、細胞におけるＨＭＧＢ１の発現を低減するための本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、任意の適切な細胞タイプに有用である。一部の実施形態では、細胞は、ＨＭＧＢ１を発現する任意の細胞である（例えば、肝実質細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺がん細胞、脳の細胞、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、胃腸管、膀胱、脂肪及び軟組織、並びに皮膚）。一部の実施形態では、細胞は、対象から得られ、細胞が天然表現型特性を実質的に維持するように継代の回数が限定されていてもよい初代細胞である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏである（つまり、培養中の細胞に、又は細胞が存在する生物に送達することができる）。特定の実施形態では、肝実質細胞のみにおけるＨＭＧＢ１の発現を低減するための本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。
【０１１６】
（０１５０）  一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含む溶液を注射すること、オリゴヌクレオチドで覆われている粒子で衝撃すること、オリゴヌクレオチドを含む溶液に細胞又は生物を接触させること、又はオリゴヌクレオチドの存在下で細胞膜をエレクトロポレーションすることを含む、適切な核酸送達法を使用して導入することができる。脂質媒介性担体輸送、化学媒介性輸送、及びリン酸カルシウム等のカチオン性リポソームトランスフェクション等の、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適切な方法を使用してもよい。
【０１１７】
（０１５１）  阻害の結果は、細胞又は対象の１つ又は複数の特性を評価するための適切なアッセイにより、又はＨＭＧＢ１発現を示す分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を評価する生化学的技法により確認することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドが、ＨＭＧＢ１発現レベルを低減する程度は、発現レベル（例えば、ＨＭＧＢ１のｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）を適切な対照の発現レベル（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていないか又は陰性対照が送達されている細胞又は細胞の集団でのＨＭＧＢ１発現レベル）と比較することにより評価される。一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定しなくともよいように、所定のレベル又は値であってもよい。所定のレベル又は値は、様々な形態をとることができる。一部の実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均等の、単一のカットオフ値であってもよい。
【０１１８】
（０１５２）  一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの投与は、細胞でのＨＭＧＢ１発現レベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、ＨＭＧＢ１発現レベルの低減は、ＨＭＧＢ１の適切な対照レベルと比較して、１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、又は９０％以下への低減であってもよい。適切な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞の集団におけるＨＭＧＢ１発現のレベルであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法によるオリゴヌクレオチドの細胞送達効果は、有限期間後に評価される。例えば、ＨＭＧＢ１のレベルは、オリゴヌクレオチドを細胞内に導入した少なくとも８時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間に、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１４日後に、細胞で分析することができる。
【０１１９】
（０１５３）  一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞中でオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を発現するように操作されている導入遺伝子の形態で送達される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示される任意のオリゴヌクレオチドを発現するように操作されている導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド又は合成ｍＲＮＡ）を使用して送達することができる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接注入することができる。
【０１２０】
（０１５４）  ｉｉ．治療方法
本開示の態様は、対象の肝線維症の発症又は進行を減弱するために、ＨＭＧＢ１発現を低減するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象に、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を投与することを含んでいてもよい。例えば、そのような治療を使用して、任意のタイプの肝線維症を遅延又は停止させることができる。本開示は、肝線維症及び/又は肝臓炎症に伴う疾患又は障害のリスク（又は感受性）のある対象を治療するための予防法及び治療法の両方を提供する。
【０１２１】
（０１５５）  ある態様では、本開示は、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド若しくはベクター又はそれをコードする導入遺伝子）を対象に投与することにより、対象における本明細書に記載の疾患又は障害を予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、例えば肝臓におけるＨＭＧＢ１タンパク質の量の低減から治療上の利益を得ることになる対象である。疾患又は障害のリスクのある対象は、例えば、当技術分野で公知の診断又は予後アッセイの１つ又は組合せにより特定することができる（例えば、肝線維症及び/又は肝臓炎症の特定）。予防剤の投与は、疾患又は障害が予防されるか又はそうでなければその進行が遅延されるように、疾患又は障害に特徴的な症状の検出又は顕在化の前に生じてもよい。
【０１２２】
（０１５６）  本明細書に記載の方法は、典型的には、オリゴヌクレオチドの有効量を、即ち望ましい治療結果をもたらすことが可能な量を対象に投与することを含む。治療上許容される量は、疾患又は障害を治療することが可能な量であってもよい。任意の１つの対象のための適切な投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間及び経路、全体的健康、及び同時に投与されている他の薬物を含む、ある要因に依存するだろう。
【０１２３】
（０１５７）  一部の実施形態では、対象には、本明細書で開示される組成物のいずれか１つが、経腸的に（例えば、経口で、経胃栄養管により、十二指腸栄養管により、胃瘻造設により、又は直腸的に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射又は注入、動脈内注射又は注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、髄腔内）、局所的に（例えば、皮膚上に、吸入で、目薬により、又は粘膜を介して）、又は標的臓器（例えば対象の肝臓）内への直接注射のいずれかで投与される。典型的には、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、静脈内に又は皮下に投与される。
【０１２４】
（０１５８）  非限定的な一組の例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、典型的には、四半期（３か月毎に１回）、隔月（２か月毎に１回）、毎月、又は毎週投与されることになる。例えば、オリゴヌクレオチドは、１、２、又は３週毎に１回に投与してもよい。オリゴヌクレオチドは、毎日投与してもよい。
【０１２５】
（０１５９）  一部の実施形態では、治療しようとする対象は、ヒト又は非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコ等の飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリ等の家畜；並びにマウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の動物が挙げられる。
【０１２６】
（０１６０）  実施例
実施例１：ヒト及びマウス細胞に基づくアッセイを使用したＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの開発
図１は、ヒト及びマウス細胞に基づくアッセイを使用して、ＨＭＧＢ１発現を阻害するための候補ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを開発するワークフローを示す。まず、コンピューターに基づくアルゴリズムを使用して、ＨＭＧＢ１を阻害するための候補オリゴヌクレオチド配列（２５〜２７量体）を生成した。その後、細胞に基づくアッセイ及びＰＣＲアッセイを使用して、ＨＭＢＧ１発現を低減するそれらの能力について候補ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを評価した。
【０１２７】
（０１６１）  コンピューターアルゴリズムは、ヒトＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ（配列番号３７１、表１）に相補的なＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列を提供した。そのうちある配列は、サルＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ（配列番号３７２、表１）及びマウスＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ（配列番号３７３、表１）にも相補的だった。
【０１２８】
【表１】
2020529197.tif 000003
【０１２９】
（０１６２）  アルゴリズムは、数百個のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列をもたらした。そのうち９６個のオリゴヌクレオチドは、細胞に基づくアッセイでの実験評価のための上位候補であることがバイオインフォマティックス的に特定された。このアッセイでは、ＨＭＧＢ１を発現するＨｅｐａ１−６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１８３０（商標））肝実質細胞を、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をある期間にわたって維持し、その後、残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。２つのｑＰＣＲアッセイ、３’アッセイ及び５’アッセイを使用した。９６個のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは全て、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの組合せを含む、Ｍ１５と指定された同じ修飾パターンを使用して評価した。試験したオリゴヌクレオチドの配列は、表２に提供されている。
【０１３０】
【表２】
2020529197.tif 000004
Ｈｓ：ヒト、Ｒｈ：アカゲザル、及びＭｍ：マウス。センス及びアンチセンス配列番号の列は、各オリゴヌクレオチドを製作するためにハイブリダイズされるセンス鎖及び対応するアンチセンス鎖を提供する。例えば、配列番号１を有するセンス鎖は、配列番号９７を有するアンチセンス鎖とハイブリダイズする。試験したオリゴヌクレオチドの各々は、同じ修飾パターンを有していた。
【０１３１】
（０１６３）  ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのホットスポット
９６個の候補ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングのデータは、図３Ａ〜３Ｄに示されている。陰性対照と比較して２５％以下の残留ｍＲＮＡをもたらした、細胞に基づくアッセイにおける上位成績オリゴヌクレオチドを、更なる実験的特徴付けのヒットとして選択した。ＨＭＧＢ１発現を阻害することが見出されなかったオリゴヌクレオチドを、陰性対照として使用した。ハウスキーピング遺伝子ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を、その発現がＨＭＧＢ１発現の阻害により変更されないため、ＨＭＧＢ１発現の正規化遺伝子として使用した。
【０１３２】
（０１６４）  ヒトＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのホットスポットを、こうしたオリゴヌクレオチドの活性及び位置を検査することにより特定した。ホットスポットは、いずれかのアッセイにおいて対照と比較して２５％以下だったｍＲＮＡレベルをもたらした少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと関連するヒトＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ配列の伸長として特定した。したがって、以下のホットスポットがヒトＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ配列内で特定された：９３５〜９６５；１１００〜１１３０；１１６０〜１２１５；１２３０〜１２７０；１４７０〜１５００；１６８０〜１７１０；２１９０〜２２２０；及び２２８０〜２３１０。
【０１３３】
（０１６５）  ホットスポットの配列は、表３に概説されている。
【０１３４】
【表３】
2020529197.tif 000005
【０１３５】
（０１６６）  用量応答分析
２４個の上位成績ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、遺伝子位置及び種間配列保存を考慮する二次スクリーニングでの分析のために選択した。この二次スクリーニンングでは、一次スクリーニングと同じアッセイを使用したが、３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）でＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを試験した（図４）。その後、更に２以上の濃度で活性を示すＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、更なる分析にかけた。
【０１３６】
（０１６７）  二次スクリーニングからの上位候補のこの更なる分析では、配列は、ニック化テトラループ構造形式のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドに組み込まれていた（２２量体ガイド鎖との３６量体パッセンジャー鎖）。ニック化テトラループ構造形式のこうしたＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ発現を低減するそれらの能力について、まず１ｎＭで試験した。図５は、各々が、異なる構成の２’−フルオロ及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド並びにホスホロチオアート及びホスホジエステル連結を、それらのセンス鎖及びアンチセンス鎖に含み、５’末端ヌクレオチドに位置するホスフェート類似体をそれらのアンチセンス鎖に含む、Ｍ２８、Ｍ４７、Ｍ４８、及びＭ５２と指定された４つの異なる修飾パターンに構成されたニック化テトラループ構造を有する異なる塩基配列で作られたＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、及びＭ４６と指定された未修飾対照のデータを示す。各化合物の最大半量阻害濃度（ＩＣ50）を決定するために、上位ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、Ｈｅｐａ１−６細胞での完全用量応答曲線を使用して更に試験した（図６を参照）。
【０１３７】
（０１６８）  ｉｎ  ｖｉｖｏマウス実験
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のデータを評価して、マウス肝実質細胞でのＨＭＧＢ１発現を低減するための活性を維持しつつ、送達特性を向上させることになると考えられるテトラループ及び修飾パターンを特定した。その後、この分析に基づき、選択したオリゴヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした。図２に例示されているように、一価ＧａｌＮＡｃ部分を、センス鎖のテトラループのＧＡＡＡ配列の各ヌクレオチドにコンジュゲートした。コンジュゲーションは、クリックリンカーを使用して実施した。使用したＧａｌＮＡｃは、下記に示されている通りだった。
【０１３８】
【化１】
2020529197.tif 000006
【０１３９】
（０１６９）  異なる修飾パターン及びニック化テトラループ構造を有するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの群を、１０ｍｇ／ｋｇでＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下投与した。ＨＰＲＴ対照ｍＲＮＡと比較したＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、７２時間時に測定した（図７）。
【０１４０】
（０１７０）  ニック化テトラループ構造を含む３つの候補ＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴヌクレオチドを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用してＰＢＳ対照と比較した、オリゴヌクレオチド投与の２４時間後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量について、３つの異なる用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇ）で再度試験した（図８）。
【０１４１】
（０１７１）  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの２つを、３ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで異なる修飾パターンを使用して更に試験するために選択した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用してＰＢＳ対照と比較した、オリゴヌクレオチド投与の７２時間後に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを再度調査した（それぞれ図９及び図１０）。異なる構成の２’−フルオロ及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド並びにホスホロチオアート及びホスホジエステル連結をそれらのセンス鎖及びアンチセンス鎖に含み、５’末端ヌクレオチドに位置するホスフェート類似体をそれらのアンチセンス鎖に含む、Ｍ４９、Ｍ５４、Ｍ５５、Ｍ５６と指定された異なる修飾パターンのオリゴヌクレオチドを試験した。
【０１４２】
（０１７２）  ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ｋｇ皮下用量後の５日目に残留していたＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを（ＰＢＳ対照と比較）、異なる修飾を有する同じ配列のオリゴヌクレオチド（図１１）並びに同じ修飾パターンを保持していた異なる配列のオリゴヌクレオチドについて決定した。
【０１４３】
（０１７３）  また、三重共通配列を、ヒトＨＭＧＢ１遺伝子でのみ特定された配列（「ヒト固有」）と共に、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを流体力学的に注射したマウス（ＨＤＩマウス）での活性について試験した。手短に言えば、マウスに、２ｍＬのヒトＨＭＧＢ１及びＮＥＯＭＹＣＩＮプラスミド含有溶液を尾静脈から７秒間かけて静脈内投与した。１ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、ＨＤＩ注射の４日前に各マウスに皮下注射した。その後、残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのパーセンテージを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して決定した（ＮＥＯ−１６８に対して正規化）。これらの結果は、その前のスクリーニングで選択された三重共通配列に相補的なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ヒト固有配列のみに結合した選択されたオリゴヌクレオチドよりも強力にＨＭＧＢ１発現を下方制御することを示した。
【０１４４】
（０１７４）  実施例２：肝毒性剤モデルでの処置の評価
実施例１で特定された候補ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、ＡＰＡＰ誘導性（アセトアミノフェン誘導性）肝臓傷害のモデルで更に試験した。アセトアミノフェンは、代謝されると、活性代謝物Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）を形成すること知られている。ＮＡＰＱＩは、ミトコンドリアタンパク質に結合して、ＮＡＰＱＩタンパク質付加体を形成して、肝実質細胞壊死に結び付く。
【０１４５】
（０１７５）  モデル１  −  ＡＰＡＰ
１０匹のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１１週齢）の群を、０．９％ＮａＣｌ中２５０又は３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰの腹腔内注射投与前に１２時間断食させた。６、２４、及び４８時間時に、血液及び/又は肝臓組織を収集した。研究のエンドポイント測定は、肝傷害（ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、及びＧＬＤＨ−ＩＤＥＸＸレベル）、プロファイリングバイオマーカー（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及びＲＴ−ｑＰＣＲによる、血清／肝臓ＨＭＧＢ１レベル及びｍｉＲ１２２レベル）、及び肝臓染色（Ｈ＆Ｅ、ＨＭＧＢ１、Ｌｙ６−Ｂ、及びＦ４／８０染色）の定量化だった。図１２の模式図を参照されたい。
【０１４６】
（０１７６）  図１３Ａ及び１３Ｂは、生理食塩水対照注射に対する、３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰで処置した動物の肝臓（Ｈｐｒｔ１に対して正規化）及び血清（ｍｇ／ｍＬ）に残留していたＨＭＧＢ１のパーセンテージを示す。ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。脂質ナノ粒子製剤で提供されたニック化テトラループ構造及びＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ＬＮＰ製剤化ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡを＞８０％下方制御した。しかしながら、血清ＨＭＧＢ１は、ＨＭＧＢ１−ＬＮＰ処置動物でのみ有意に低減された。図１３Ａ〜１３Ｂに示されている実験で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【０１４７】
（０１７７）  また、肝機能試験（ＬＦＴ）を、３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰで処置した動物で実施した。また、こうした実験は、血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びｍｉＲ１２２レベルによると、ニック化テトラループ構造を含むＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの両方で肝毒性が減少し、ＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを使用した場合に、より大きな減少が見られたことを示した（図１４Ａ〜１４Ｃを参照）。図１４Ａ〜１４Ｃに示されている実験で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【０１４８】
（０１７８）  モデル２  −  ＡＰＡＰ
ＡＰＡＰ毒性のモデルに使用した第２の研究では、１０匹のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１１週齢）の群を、０．９％ＮａＣｌ中３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰの腹腔内注射投与前に１２時間絶食させた。ＡＰＡＰ投与前に、ニック化テトラループ構造を含む５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド又は１．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで、動物を複数回処置した。血液及び/又は肝臓組織を、ＡＰＡＰ投与の２４時間後に収集した。研究のエンドポイント測定は、肝傷害（ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、及びＧＬＤＨ−ＩＤＥＸＸレベル）、プロファイリングバイオマーカー（ＥＬＩＳＡ、及びＲＴ−ｑＰＣＲによる、血清／肝臓ＨＭＧＢ１レベル及びｍｉＲ１２２レベル）、及び肝臓染色（Ｈ＆Ｅ及びＨＭＧＢ１免疫組織化学）の定量化だった。図１５の模式図を参照されたい。
【０１４９】
（０１７９）  図１６Ａ〜１６Ｂは、生理食塩水対照注射に対する、３５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＡＰで処置した動物の肝臓（Ｈｐｒｔ１に対して正規化）及び血清（ｍｇ／ｍＬ）に残留していたＨＭＧＢ１のパーセンテージを示す。ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド及びＬＮＰ製剤化ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓におけるＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡを＞８０％下方制御した。ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド及びＬＮＰ製剤化ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの使用は両方とも、血清ＨＭＧＢ１を有意に低減した。図１６Ａ〜１６Ｂに示されている実験で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【０１５０】
（０１８０）  更に、ＡＰＡＰ処置マウスで測定したＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、ＬＤＨレベル、及び血清ｍｉＲ１２２レベルは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド又はＬＮＰ製剤化ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの投与が、肝傷害を阻害したことを示した（図１７Ａ〜１７Ｄを参照）。図１７Ａ〜１７Ｄに示されている実験で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ５６である。
【０１５１】
（０１８１）  まとめると、ＡＰＡＰ毒性モデルを使用した研究は、ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置動物が、対照動物と比較して、ＨＭＧＢ１血清レベル及び肝臓傷害を減少させたことを示した。
【０１５２】
（０１８２）  モデル３  −  四塩化炭素
マウスの群に、オリーブ油と混合した四塩化炭素（１：５容積／容積比のＣＣｌ4：オリーブ油）又はオリーブ油対照溶液を体重１グラム当たり３μｌで、腹腔内注射により週２回６週間にわたって投与した。表４及び図１８に示されているように、動物を、示されている群に無作為化し、未処置のままにしたか、又は研究設計に従って、ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド若しくはＰＢＳで皮下（Ｓ．Ｃ．）若しくは静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射により週１回５若しくは６週間にわたって処置したかのいずれかであった。
【０１５３】
【表４】
2020529197.tif 000007
【０１５４】
（０１８３）  肝臓傷害を示す幾つかのパラメーターを、研究終了時にマウスで検査した。ＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド処置動物の両群において、線維症（シリウスレッド染色を使用）並びにマクロファージ浸潤及び活性化（マウスマクロファージマーカーであるＦ４／８０タンパク質に特異的な抗体による免疫組織化学的分析を使用）に、ＰＢＳ処置動物と比較して有意な低減が見られた。また、図１９〜２２に示されているより長期の投薬レジメンデータを使用したところ、星細胞活性化（α−ＳＭＡ染色により測定）及び肝腫大（肝臓質量対体重比を使用して測定）に有意な低減が見られた。この研究の中で使用したＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９であると特定され、一価ＧａｌＮａｃ部分が、ＧＡＡＡループの４個のヌクレオチド位置の各々にコンジュゲートされている。
【０１５５】
（０１８４）  加えて、上記のように四塩化炭素で処置した動物に由来する肝臓を、注射４３日後にシリウスレッド染色を使用して検査した。こうした実験は、ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの投与が（５ｍｇ／ｋｇ皮下用量又は２．５ｍｇ／ｋｇ静脈内用量のいずれかでの）、肝臓試料の相対的シリウスレッド陽性面積を有意に低減したことを明らかにし、こうした動物の肝線維症が有意に低減されたことが示された（図２３）。図２３に示されている実験で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【０１５６】
（０１８５）  実施例３：自己免疫性肝臓疾患モデルでの処置の評価
５匹Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１１週齢）の２つ群を、ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド１０ｍｇ／ｋｇ又はＰＢＳのいずれかを皮下投与した６日後に、２０ｍｇ／ｋｇの静脈内コンカナバリンＡで処置した。コンカナバリンＡ投与の１日後に、動物を、ＡＬＴ血清レベル及びＡＳＴ血清レベル並びに肝臓のＨ＆Ｅ染色について検査した（実験模式図は図２４に示されている）。図２５には、ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置すると、動物は、ＰＢＳよりも生存可能性が３倍高かったことが示されている。更に、生存ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド処置動物は、肝臓のＨ＆Ｅ染色試料での壊死がＰＢＳ対照よりも少なかった。図２５に示されている実験で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ２１２−ＡＳ２９６−Ｍ４９である。
【０１５７】
（０１８６）  実施例４：コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）モデルでの処置の評価
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、高脂肪餌（ＣＤＨＦＤ）又はコリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）のいずれか及び通常水又は砂糖水を給餌した。ＣＤＡＨＦＤは、ＣＤＨＦＤよりも低いメチオニン含有量を有する。ＣＤＨＦＤは、メチオニン含有量の差の結果として脂肪症をもたらすことが予想されるが、ＣＤＡＨＦＤ餌で見られるＮＡＦＬＤ様肝臓病理をもたらすことは予想されない。表５及び表６に示されているように、動物は、未処置のままだったか、又はマウスに高脂肪餌を与えた６週間後から開始して６週間にわたってＰＢＳ対照を投与したか若しくは５ｍｇ／ｋｇのニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを投与した（皮下投与）。
【０１５８】
【表５】
2020529197.tif 000008
【０１５９】
【表６】
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【０１６０】
（０１８７）  ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡは、ＣＤＨＦＤ対照高脂肪餌と比較して、コリン欠損アミノ酸限定高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ）を摂取したマウスで上昇した（図２６Ａ及び２６Ｂ）。更に、コラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）及びビメンチンｍＲＮＡレベルは、ＣＤＨＦＤのみと比べて、ＣＤＡＨＦＤで＞１００×上昇した（それぞれ図２６Ｃ及び２６Ｄ）。ニック化テトラループ構造を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、６週間の処置後に、こうしたマーカーの著しい減少を示した。
【０１６１】
（０１８８）  ＡＳＴレベル及びＡＬＴレベルも、対照高脂肪餌（ＣＤＨＦＤ）を摂取したマウスに比べて、ＣＤＡＨＦＤを摂取したマウスで上昇した（図２７）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、６週間の処置後に、こうしたマーカーの中程度の減少を示した。図２６Ａ〜２６Ｄ及び図２７で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、Ｓ１９４−ＡＳ２７４−Ｍ３０であり、異なる構成の２’−フルオロ及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド並びにホスホロチオアート及びホスホジエステル連結を、センス鎖及びアンチセンス鎖に含み、５’末端ヌクレオチドに位置するホスフェート類似体を、そのアンチセンス鎖に含む。
【０１６２】
（０１８９）  実施例５．追加ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性の試験
この実施例では、追加のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは全て、アルゴリズムにより特定された、ヒト、サル（両アカゲザル）、及びマウス配列の保存配列（「三重共通」配列）に結合するように設計した。追加のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを、実施例１に記載されているように、テトラループを含み、異なる修飾パターンを構成するように修飾した。異なる修飾パターン（例えば、Ｍ５８、Ｍ５９、Ｍ６０、又はＭ６１と指定されている）は、異なる構成の２’−フルオロ及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド並びにホスホロチオアート及びホスホジエステル連結を、それらのセンス鎖及びアンチセンス鎖に含み、５’末端ヌクレオチドに位置するホスフェート類似体を、それらのアンチセンス鎖に含む。また、オリゴヌクレオチド阻害剤をＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした。３つのＧａｌＮＡｃ部分を、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートした。コンジュゲーションは、実施例１に記載されているクリックリンカーを使用して実施した。その後、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを、マウスで、及び培養肝実質細胞でのｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡ発現を低減するそれらの能力に関して試験した。
【０１６３】
（０１９０）  ３つの異なる修飾パターン（Ｍ５８、Ｍ５９、及びＭ６０と指定されている）を有する異なる８つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ２０４−ＡＳ２８６、Ｓ２０５−ＡＳ２８７、Ｓ２１０−ＡＳ３６６、Ｓ２１１−ＡＳ３６７、Ｓ３６３−ＡＳ３６８、Ｓ３６４−ＡＳ３６９、Ｓ２１２−ＡＳ２９６、及びＳ３６５−ＡＳ３７０）を、それらのＨＭＧＢ１ノックダウン効力について試験した。特定の修飾パターンを有する表示のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの１回の単一用量（１ｍｇ／ｋｇ）をＣＤ−１マウスに皮下注射した。注射５日後にマウスを安楽死させ、肝臓試料を得た。ＲＮＡを肝臓試料から抽出し、ｑＰＣＲによりＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを評価した（ＨＰＲＴ１−Ｆ５７６、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した）。残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド及び修飾パターンは全て、ＨＭＧＢ１ノックダウンに効能があり、修飾パターン（patters）Ｍ５９及びＭ６０がより高い効力を示した（図２８）。
【０１６４】
（０１９１）  また、確認のための用量応答アッセイを、異なる修飾パターン（Ｍ５８、Ｍ５９、又はＭ６０）を有する６つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ２０４−ＡＳ２８６、Ｓ２０５−ＡＳ２８７、Ｓ２１１−ＡＳ３６７、Ｓ３６４−ＡＳ３６９、Ｓ２１２−ＡＳ２９６、及びＳ３６５−ＡＳ３７０）で実施した。表示のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの単一用量（１、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）をＣＤ−１マウスに皮下投与した。マウスを、投与後５日目に安楽死させ、肝臓試料を得た。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによりＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを評価した（ＨＰＲＴ１−Ｆ５７６、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した）。残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。この実験では、ＰＢＳを陰性対照として使用し、Ｓ２０４−ＡＳ２８６−Ｍ６１を陽性対照として使用した。試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤はほとんど全て、用量依存的な効力を示した（図２９Ａ及び２９Ｂ）。試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤の一部は、Ｓ２０４−ＡＳ２８６−Ｍ６１対照と比較して、効力の向上を示した（図２９Ａ及び２９Ｂ）。確認のための用量応答アッセイを、Ｓ２０４−ＡＳ２８６−Ｍ５９、Ｓ２１１−ＡＳ３６７−Ｍ５９、Ｓ３６４−ＡＳ３６９−Ｍ６０、及びＳ３６５−ＡＳ３７０−Ｍ５９について繰り返した。同様の結果を得た。非肝実質細胞でのＨＭＧＢ１発現レベルを発現基線と見なすと、試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤は全て、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇのＥＤ50を示した（図３１Ａ及び３１Ｂ）。
【０１６５】
（０１９２）  異なる修飾パターン（それぞれＭ５９及びＭ６０と表記されている）を有する２つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ２１１−ＡＳ３６７−Ｍ５９、Ｓ３６４−ＡＳ３６９−Ｍ６０）を、継続研究においてｉｎ  ｖｉｖｏで試験して、マウスにおいてＨＭＧＢ１発現を阻害するそれらの活性を評価した。この実験では、ＰＢＳを陰性対照として使用し、Ｓ２０４−ＡＳ２８６−Ｍ５８を陽性対照として使用した。マウスに、表示のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの単一用量（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。注射後の７、１４、２１、及び２８日目にマウスを安楽死させ、肝臓試料を得た。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによりＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを評価した（ＨＰＲＴ１−Ｆ５７６、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した）。ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの異なる領域に特異的な２つの異なるプライマーを使用して、ｑＰＣＲを実施した。他方のプライマーに対して５’末端のプライマーを使用して実施したｑＰＣＲを、「５’ｑＰＣＲ」と指定した。同様に、他方のプライマーに対して３’末端のプライマーを使用して実施したｑＰＣＲを、「３’ｑＰＣＲ」と指定した。データは、試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは全て、７、１４、２１、及び２８日目においてマウス肝臓の残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡの量が低減されていることにより示されるように、注射の３週間後にＨＭＧＢ１をノックダウンする効能があったことを示した（ＰＢＳ対照治療に対して正規化した）（図３０Ａ及び３０Ｂ）。
【０１６６】
（０１９３）  図３１Ａ及び３１Ｂで試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤（Ｓ２０４−ＡＳ２８６−Ｍ５９、Ｓ２１１−ＡＳ３６７−Ｍ５９、Ｓ３６４−ＡＳ３６９−Ｍ６０、及びＳ３６５−ＡＳ３７０−Ｍ５９）を全て選択して、３週間の継続研究で更に試験した。この研究では、表示のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤の単一用量（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＤ−１マウスに皮下注射した。注射２１日後にマウスを安楽死させ、肝臓試料を得た。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによりＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを評価した（ＨＰＲＴ１−Ｆ５７６、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した）。残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。結果は、試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤は全て、注射の３週後にＨＭＧＢ１ノックダウン効力を保持していたことを示した（図３２Ａ及び３２Ｂ）
【０１６７】
（０１９４）  あるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを、各阻害剤の最大半量阻害濃度（ＩＣ50）を決定するために、アカゲザル又はヒト肝実質細胞での完全用量応答曲線を使用して更に試験した。ヒト初代肝実質細胞（ＨＰＣＨ１０＋、ロット＃１４１０２１４、凍結保存、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社）又はサル初代肝実質細胞（Ｐ２０００．Ｈ１５、ロット＃１４１０２８５、凍結保存、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社）を解凍し、１ウェル当たり５００００個の細胞（ヒト）又は１０００００個（サル）で９６ウェル組織培養プレートのＯｐｔｉＰｌａｔｅ肝実質細胞培地（Ｋ８２００）にプレーティングした。プレートした肝実質細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で１〜６時間回復させ、ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ肝実質細胞培地（Ｋ８３００）を使用して引き続き維持した。５倍系列希釈した（７回）ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ２０４−ＡＳ２８６−Ｍ６１及びＳ３６５−ＡＳ３７０−Ｍ５９）を細胞に添加した。サル又はヒト初代肝実質細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みは、ＡＳＧＰＲ受容体により媒介された。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＳＶ９６全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出し、ｑＰＣＲにより残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡレベルを評価した（ＲｈＰＰＩＢ又はＨｓＳＦＲＳ９及びＨｓＰＩＯ８、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した）。残留ＨＭＧＢ１  ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＤＨＡオリゴヌクレオチドをアッセイ対照として使用し（図３３Ｃ、３３Ｆ、３３Ｇ、３４Ｃ、３４Ｆ、３４Ｇ）、残留ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのレベルを、ＲｈＬＤＨＡ−Ｆ８８７  ｑＰＣＲアッセイにより測定した（図３３Ｇ及び３４Ｇ）。
結果は、ｎＭ未満〜ｎＭのＩＣ50値により示されているように、ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド阻害剤は、初代マウス肝実質細胞におけるＨＭＧＢ１のノックダウンに効能があった（ＩＣ50値がｎＭ未満である）ことを示した（図３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｄ、及び３３Ｅ）。ｎＭ未満のＩＣ50値により示されているように、同様のノックダウン効力が、初代ヒト肝実質細胞で観察された（図３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｄ、及び３４Ｅ）。
【０１６８】
（０１９５）  材料及び方法
トランスフェクション
第１のスクリーニングでは、効率的なトランスフェクションのために、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を使用して、オリゴヌクレオチドと複合体化させた。オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉＭＡＸ、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭをプレートに添加し、トランスフェクション前に２０分間室温でインキュベートした。活発に継代する細胞のフラスコから培地を吸引し、細胞を、トリプシンの存在下で３〜５分間３７℃にてインキュベートした。細胞がもはやフラスコに接着しなくなったら、細胞増殖培地（ペニシリン及びストレプトマイシンを欠如する）を添加してトリプシンを中和し、細胞を懸濁した。１０μＬアリコートを取り出し、血球計算器で計数して、１ミリメートル当たりに基づいて細胞を定量化した。ＨｅＬａ細胞の場合、１ウェル当たり２０，０００個の細胞を１００μＬの培地に接種した。懸濁物を、既知細胞濃度に希釈して、トランスフェクトしようとする細胞数に必要な総容積を得た。希釈した細胞懸濁物を、既にＯｐｔｉ−ＭＥＭ中にオリゴヌクレオチドを含んでいた９６ウェルトランスフェクションプレートに添加した。その後、トランスフェクションプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、培地を各ウェルから吸引した。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲＮＡ単離キットの溶解緩衝液を使用して、細胞を溶解した。溶解緩衝液を、各ウェルに添加した。その後、溶解した細胞を、ＲＮＡ単離のためにＣｏｒｂｅｔｔ  ＸｔｒａｃｔｏｒＧＥＮＥ（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ社）に移したか、又は−８０℃で保管した。
【０１６９】
（０１９６）  その後のスクリーニング及び実験、例えば二次スクリーニングでは、リバーストランスフェクションのために、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡｘを使用して、オリゴヌクレオチドと複合体化させた。複合体は、ＲＮＡｉＭＡＸ及びｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１５分間混合することにより製作した。トランスフェクション混合物を、多ウェルプレートに移し、細胞懸濁物をウェルに添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、その後Ｐｒｏｍｅｇａ  ＳＶ９６キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。ＳＶ９６プレートを真空マニホールドで使用して、ＲＮＡを精製した。その後、４マイクロリットルの精製ＲＮＡを、６５℃で５分間加熱し、４℃に冷却した。その後、ＲＮＡを、高容量逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した１０マイクロリットル反応中での逆転写に使用した。その後、ｃＤＮＡを無ヌクレアーゼ水で５０μｌに希釈し、多重化５’−エンドヌクレアーゼアッセイ及びＳＳｏＦａｓｔ  ｑＰＣＲマスターミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）による定量ＰＣＲに使用した。
【０１７０】
（０１９７）  ｃＤＮＡ合成
Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｘ−ｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｅ（商標）（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ社）を使用して、組織培養中の哺乳動物細胞からＲＮＡを単離した。改変ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩプロトコールを使用して、単離ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。単離ＲＮＡ（およそ５ｎｇ／μＬ）を、５分間６５℃に加熱し、ｄＮＰ、ランダム六量体、オリゴｄＴ、及び水と共にインキュベートした。混合物を１５秒間冷却した。水、５×第１鎖緩衝液、ＤＴＴ、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（商標）（ＲＮＡ阻害剤）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅからなる「酵素ミックス」を、混合物に添加した。内容物を、サーモサイクラーを使用して、４２℃に１時間加熱し、その後７０℃に１５分間加熱し、その後４℃に冷却した。その後、得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録商標）に基づくｑＰＣＲにかけた。１反応当たり２つの５’エンドヌクレアーゼアッセイを含むように、ｑＰＣＲ反応を多重化した。
【０１７１】
（０１９８）  ｑＰＣＲアッセイ
まず、ＳＹＢＲ（登録商標）に基づくｑＰＣＲを使用して、プライマーセットをスクリーニングした。アッセイ特異性を、融解曲線並びに「マイナスＲＴ」対照を評価することにより検証した。ＨｅＬａ細胞及びＨｅｐａ１−６細胞に由来するｃＤＮＡ鋳型の希釈（１反応当たり２０ｎｇから０．０２ｎｇへの１０倍系列希釈）を使用して、ヒト（Ｈｓ）及びマウス（Ｍｍ）アッセイをそれぞれ試験した。ｑＰＣＲアッセイを、３８４ウェルプレートにセットアップし、ＭｉｃｒｏＡｍｐフィルムで被覆し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７９００ＨＴで実施した。試薬濃度及びサイクル条件は、以下のもの：２×ＳＹＢＲミックス、１０μＭフォワードプライマー、１０μＭリバースプライマー、ＤＤ  Ｈ2Ｏ、及びｃＤＮＡ鋳型を含み、それらを１０μＬの総容積にした。
【０１７２】
（０１９９）  ある場合には、ｑＰＣＲは、注記されているように、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）基づくｑＰＣＲアッセイを使用して実施した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＨＭＧＢ１）のコード領域内の２つの異なる位置（互いに５’及び３’）を標的とし、概して、分析におけるｍＲＮＡレベルの追加確認を提供するために使用した。
【０１７３】
（０２００）  クローニング
単一の融解曲線を示したＰＣＲアンプリコンを、製造業者の使用説明書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙベクターキットにライゲーションした。製造業者のプロトコールに従って、ＪＭ１０９高効率細胞を、新たにライゲーションしたベクターで形質転換した。その後、アンピシリンを含むＬＢプレートに細胞をプレーティングし、コロニー増殖のために３７℃で一晩インキュベートした。
【０１７４】
（０２０１）  ＰＣＲスクリーニング及びプラスミドミニプレップ
ＰＣＲを使用して、ライゲーションされた目的のアンプリコンを含むベクターで形質転換されたＥ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを特定した。ＰＣＲ反応では、インサートをフランキングするベクター特異的プライマーを使用した。その後、ＰＣＲ産物を全て１％アガロースゲルに流し、染色後にトランスイルミネーターで画像化した。ゲルを定性的に評価して、どのプラスミドが、予想されるサイズ（およそ３００ｂｐ、アンプリコン及び使用したプライマーに特異的なフランキングベクター配列を含む）のライゲーションアンプリコンを含むと見られるかを決定した。
【０１７５】
（０２０２）  その後、ＰＣＲスクリーニングにより形質転換体が確認されたコロニーを、アンピシリンを有する２ｍＬのＬＢ培地からなる培養中で一晩、３７℃で振とうしながらインキュベートした。その後、Ｅ．コリー細胞を溶解し、目的のプラスミドを、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のミニプレップキットを使用して単離した。プラスミド濃度を、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度により決定した。
【０１７６】
（０２０３）  プラスミド配列決定及び定量化
精製したプラスミドを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーター配列決定キットを使用して配列決定した。ベクター特異的プライマーであるＴ７を使用して、インサート全体にわたる長さを読み取った。以下の試薬：水、５×配列決定緩衝液、ＢｉｇＤｙｅターミネーターミックス、Ｔ７プライマー、及びプラスミド（１００ｎｇ／μＬ）を配列決定に使用し、それらを１０μＬの容積にした。混合物を、９６℃で１分間保持し、その後９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で１分１５秒間の１５サイクル；９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で１分３０秒間の５サイクル；並びに９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、及び６０℃で２分間の５サイクルにかけた。その後、色素停止反応物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のキャピラリー電気泳動シーケンサーを使用して配列決定した。
【０１７７】
（０２０４）  その後、配列が検証されたプラスミドを定量化した。単一の切断制限エンドヌクレアーゼを使用してプラスミドを線形化した。線形化は、アガロースゲル電気泳動法を使用して確認した。プラスミドは全て、１ｍＬ緩衝液当たり１００μｇのｔＲＮＡを有するＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈して、ポリプロピレンバイアルに対するプラスミドの非特異的結合を低減した。
【０１７８】
（０２０５）  その後、線形化されたプラスミドを、１μＬ当たり１，０００，０００から０１コピーまで系列希釈し、ｑＰＣＲにかけた。アッセイ効率を算出し、アッセイは、効率が９０〜１１０％の範囲だった場合、許容可能であるとみなした。
【０１７９】
（０２０６）  多重化アッセイ
各標的について、ｍＲＮＡレベルを、２つの５’ヌクレアーゼアッセイにより定量化した。一般に、各標的について幾つかのアッセイをスクリーニングする。選択された２つのアッセイが、良好な効率、低検出限界、及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）の幅広い５’−＞３’網羅範囲の組合せを示した。異なるフルオロフォアをそれぞれのプローブに使用した場合、１つのＧＯＩに対する両アッセイを１つの反応に組み合わせた。したがって、選択されたアッセイが同じｑＰＣＲに組み合わされていたか又は「多重化」されていた場合、アッセイ検証の最終ステップは、選択されたアッセイの効率を決定することだった。
【０１８０】
（０２０７）  １０倍希釈した両アッセイの線形化プラスミドを組み合わせて、ｑＰＣＲを実施した。各アッセイの効率を、上記に記載のように決定した。許容される効率割合は、９０〜１１０％だった。
【０１８１】
（０２０８）  線形化プラスミド標準物質を使用して多重化反応を検証する間に、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、目的の標的のＣq値も評価した。ヒト又はマウス標的には、それぞれ、ＨｅＬａ細胞及びＨｅｐａ１−６  ｃＤＮＡを使用した。この場合、ｃＤＮＡは、未トランスフェクト細胞からＣｏｒｂｅｔｔで単離したＲＮＡ（水中約５ｎｇ／μｌ）に由来していた。このように、この試料ｃＤＮＡで観察されたＣq値は、９６ウェルプレートトランスフェクションから予想されるＣq値を表していた。Ｃq値が３０よりも大きかった場合、目的の遺伝子のより高い発現レベルを示す他の細胞株を探索した。各ヒト及びマウス系統からＣｏｒｂｅｔｔでハイスループット法により単離した全ＲＮＡのライブラリーを生成し、許容可能レベルの標的発現についてスクリーニングするために使用した。
【０１８２】
（０２０９）  オリゴヌクレオチド命名法の説明
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは全て、いずれかのＳＮ1−ＡＳＮ2−ＭＮ3で指定した。以下の指定が当てはまる。
・Ｎ1：センス鎖配列の配列識別番号
・Ｎ2：アンチセンス鎖配列の配列識別番号
・Ｎ3：修飾パターンの参照番号。各番号は、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオチドのパターンを表わす。
例えば、Ｓ２７−ＡＳ１２３−Ｍ１５は、配列番号２７により示されているセンス配列、配列番号１２３により示されているアンチセンス配列を有し、修飾パターン番号１５に構成されているオリゴヌクレオチドを表す。
【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
（０２１０）  本明細書で例示的に記載されている本開示は、本明細書で具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、１つ又は複数の限定の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例では、用語「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」はいずれも、他の２つの用語のいずれとも置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、説明のために使用されており、限定のためではない。そのような用語及び表現の使用では、表示又は記載されている特徴又はそれらの部分のいかなる均等物も除外することは意図されていないが、特許請求されている本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態により具体的に開示されているが、当業者であれば、本明細書で開示される概念の任意選択の特徴、改変、及び変異をなすことができ、そのような改変及び変異は、本明細書及び添付の特許請求の範囲により確定される本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【０１８５】
（０２１１）  加えて、本発明の特徴又は態様が、選択肢のマーカッシュ群又は他のグループ化の点で記載されている場合、当業者であれば、本発明は、それによりマーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又はメンバーの亜群の点でも記載されていることを認識するだろう。
【０１８６】
（０２１２）  本発明を記載する状況での（特に以下の特許請求の範囲の状況での）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに類似の参照対象は、本明細書で別様の指定がない限り又は状況と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数を両方とも包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の記載がない限り、非限定的な用語として解釈されるべきである（つまり、「含むが、限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別様の指示がない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に参照するための簡略的な方法として役目を果たすことが意図されているに過ぎず、各個別の値は、あたかも本明細書に個々に記載されているかの如く、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法は全て、本明細書に別様の指示がない限り又は状況と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示の言語（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良好に説明することが意図されているに過ぎず、別様に特許請求されていない限り、本発明の範囲を限定しない。明細書中の言語は、本発明の実施に不可欠な任意の非特許請求要素を示すものではないと解釈されるべきである。
【０１８７】
（０２１３）  本発明を実施するための本発明者らが知る最良のモードを含む、本発明の実施形態が、本明細書に記載されている。そうした実施形態の変異は、当業者であれば、先述の説明を読むと明白になるだろう。
【０１８８】
（０２１４）  本発明者らは、当業者がそうした変異を必要に応じて使用することを予想する。本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されているものとは別様に実施されることを承知している。したがって、本発明は、準拠法が許容する限り、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての考え得る変異における上述の要素のあらゆる組合せも、本明細書に別様の指定がない限り又はそれでなければ状況と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。当業者であれば、単なる日常的な実験作業を使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識又は確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ−Ｃ】
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【図３３Ｄ−Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020529197.tif 000080
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