(57)【要約】子宮内膜症の予後及び治療におけるＣＤ７１受容体の使用  本発明は、子宮内膜症の予後及び／又は治療における標的としてのＣＤ７１受容体の使用に関し、この受容体を標的とする、子宮内膜症の予後又は治療の監視検査に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症の治療に使用するための、抗ＣＤ７１抗体又はＣＤ７１受容体を標的とする分子。
【請求項２】
子宮内膜症の予後のための、抗ＣＤ７１抗体の使用。
【請求項３】
前記ＣＤ７１受容体を過剰発現する過剰増殖性子宮内膜症の進行の前記予後のための、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
子宮内膜症の治療における成功を予測するための、抗ＣＤ７１抗体の使用。
【請求項５】
前記ＣＤ７１受容体を過剰発現する子宮内膜症治療における成功を予測するための、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抗ＣＤ７１抗体と、子宮内膜症に罹患する被験者の生体サンプルとを接触させることを含む、前記被験者に対する、子宮内膜症の予後、予測又は治療の監視検査。
【請求項７】
抗ＣＤ７１抗体を備える、予後、予測又は治療の監視キット。
【請求項８】
ＫＩ９７マーカー及び／又はＢｃｌ２タンパク質を標的とする抗体を更に備える、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の免疫組織化学キット。
【請求項１０】
抗ＣＤ７１抗体を実施する免疫組織化学によって、健康な被験者と、子宮内膜症に罹患する被験者との間のＣＤ７１の濃度／密度／発現の比較測定による、子宮内膜症の程度／重篤度を生体内で検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
子宮内膜症は、子宮の外で成長し、コロニー化した臓器内で病変、接着、嚢胞を生じる子宮内膜組織に似た組織によって引き起こされる。子宮内膜症の特徴としては強い疼痛が挙げられ、妊娠可能な年齢の女性のうち１０％が罹患する。これは、世界中で１億８０００万人の女性が罹患していることになる（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３、ＡＳＲＭ、２０１２、Ｂｕｌｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｎｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖａ、２００９）。
【０００２】
子宮内膜症は、卵巣、腹膜、腸、直腸に発症し、稀に、臍帯、肺又は皮膚に発症する場合もある。
【０００３】
該当する女性の主な症状は、生理痛、重症の慢性疼痛、痛みを伴う尿排泄、非常に不規則で過剰な月経である。この疾患により、これらの女性は社会生活及び仕事に重大な支障をきたす（ＥＳＨＲＥ、２００７）。子宮内膜症は、不妊症という深刻な結果をももたらす。概算によると、子宮内膜症を有する女性のうち４０％までが不妊であるとされている。逆にいうと、不妊症の症例のほぼ４０％は、子宮内膜症に起因する。
【０００４】
非常に高い発症率と有病率とにもかかわらず、子宮内膜症の診断までには、平均で９年もの歳月を費やす。その間に子宮内膜症は、罹患した他の臓器に甚大な損傷を引き起こしてしまう。
【０００５】
子宮内膜症により生じる１年間の社会的費用は、米国だけで４９６億ドルであると概算されている（Ｓｉｍｏｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）。この費用は、ＩＩ型糖尿病又はクローン病などの他の慢性疾患により生じる費用に匹敵する。
【０００６】
フランスでは、患者一人あたり子宮内膜症にかかる１年間の費用は、Ｓｉｍｏｅｎｓによるイタリアでの概算費用から、２０１２年に１０，０００ユーロに及ぶと推定された（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｎａｔｅ、２０１３年４月）。
【０００７】
子宮内膜症の現在の治療
アメリカ生殖医学会議（American Society for Reproductive Medicine：ＡＳＲＭ）によれば、子宮内膜症は、内科療法を優先し、繰り返される外科手術を避けるために、この疾患を有する患者の生涯にわたる医学的な監視を必要とする慢性疾患であると考えなければならない。ＡＳＲＭの推定によれば、子宮内膜症を患う患者の４０％〜８０％が、手術から２年以内に再発した慢性疼痛に苦しみ、子宮内膜症に関連する疼痛の長期間監視が通常必要である。（ＡＳＲＭ、２０１２。）
現時点で子宮内膜症に対する特効薬は存在しないが、この病気に関連する症状を治療するために、いくつかの手法が活用されている。治療の選択肢には、手術、ホルモン療法、又はこれらの組み合わせがある。
【０００８】
保存手術は、妊娠を望む女性に多く用いられる選択肢である。実際に、子宮内膜症は、不妊症の主な要因の１つである。子宮内膜症の術後再発率が高いため、患者の管理においては、ほとんどの場合、手術の態様と薬物の態様を組み合わせることにより、よりよい結果を目指している（ＲＣＯＧ、２００６）。
【０００９】
内科療法は、一般的に、子宮内膜症に関連する疼痛が患者の生活の質に大きな支障を与えている場合に行われる。
最も一般的に使用される子宮内膜症治療には、以下が挙げられる。
【００１０】
-プロゲステロン剤及び複合経口避妊薬（Combined Oral Contraceptives：ＣＯＣ）。
【００１１】
-ＬＨ−ＲＨアゴニスト。この治療は、１年間を超えて処方することはできない。
【００１２】
-非ステロイド性抗炎症薬。
【００１３】
-ダナゾール。
【００１４】
-腹部内視鏡手術（最も使用される治療）。
【００１５】
-再発リスクを防ぐために、卵巣摘出と適切な全ての病変除去を伴う子宮摘出（多くは「最後の手段」として手術）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
今日まで、子宮内膜症には治療法がない。
【００１７】
安全性、忍容性及び費用面でより好適なゆえに、ＣＯＣは、手術の代替手段として、また術後補助療法として、一貫して一次治療としての選択肢であると考えられている。ＣＯＣは、排卵を妨げ、子宮内膜症の進行を抑制する。ＣＯＣは、一般的に十分な忍容性を有し、副作用が少ない。プロゲステロン剤は、子宮内避妊器具（intrauterine devices：ＩＵＤ）、注射及び丸薬を含め、多くの形態をとる。非ステロイド性抗炎症薬（non-steroidal anti-inflammatory drugs：ＮＳＡＩＤ）は、一般的に疼痛を緩和する一次治療と組み合わせて使用される。ダナゾールは、エチステロンの誘導体であり、子宮内膜症を治療するために米国で最初に承認された薬であった。ダナゾールは、子宮内膜移植の程度を抑制するには効果的であるが、その過剰な副作用（男性化）によって、もはやほとんど使用されていない。
【００１８】
今日、ＧｎＲＨアゴニストは、中程度から重度までの子宮内膜症に関連する疼痛の一次治療薬物であると考えられる。しかし、ＧｎＲＨアゴニストの副作用、特に、骨密度の著しい減少のため、この薬での治療は最大で１２ヶ月までの期間に制限されている。
【００１９】
ホルモン療法に伴う問題は、その定義からして、ホルモン療法の活用により受胎が妨げられることである。実際に、多くの患者は、不妊症の検診中に子宮内膜症の罹患を発見する。しかし、現時点で行われている治療の大部分は、エストロゲン産生経路を標的とするホルモン療法であり、そのため、多くは避妊薬である。
【００２０】
したがって、利用可能な治療が本質的に制限されるゆえに、子宮内膜症患者を治療するためには、ホルモン療法とは独立した新しい作用機序を有する革新的な薬物の必要性が非常に大きい。
【００２１】
子宮内膜症は通常閉経後に減少し消滅するが、特に、閉経時に代替ホルモン療法がなされる場合には、依然として監視する必要がある。
【００２２】
ＣＤ７１受容体
ＣＤ７１は、全てのヒト細胞の表面に存在するトランスフェリン受容体である。トランスフェリンは、生命に必須の元素（鉄）を体内に輸送することが可能なタンパク質である。トランスフェリンは、その受容体ＣＤ７１に結合し、それにより鉄を細胞内に浸透させることができる。
【００２３】
細胞がより多く増殖するほど（例えば、癌細胞又は子宮内膜細胞）、鉄の必要性が増加する。複数の研究によると、高い増殖能を有する腫瘍細胞は、ＣＤ７１受容体を強く発現し、そのため、細胞の必要性に応じて鉄を取り込み得る。したがって、細胞活性（より特定的には、細胞増殖）の鍵となる制御因子であるＣＤ７１は、腫瘍の増殖を妨げ、癌細胞を根絶するのに関連する標的であると思われる。
【００２４】
子宮内膜症の治療における新しいターゲットＣＤ７１受容体
ＣＤ７１は、細胞内への鉄の動員を可能にすることによって、細胞の活性化と増殖を制御する。Ｉｎａｔｈｅｒｙｓによって実施された前臨床試験によると、高い増殖能を有する腫瘍細胞が、ＣＤ７１受容体を強く発現し、細胞の鉄不足を誘発することによって、抗ＣＤ７１抗体によってその生体活性を妨げ、腫瘍細胞の増殖を阻害し、アポトーシスによって細胞死を引き起こす。Ｉｎａｔｈｅｒｙｓは、また、高密度のトランスフェリン受容体を含む細胞上に優先的に結合する抗ＣＤ７１抗体の標的化の特異性を示した。このことは、特に、特許国際公開番号  ２０１７／０１３２３０Ａ１号の目的である。
【００２５】
近年、複数の国際的な刊行物によると、子宮内膜症の発病には鉄代謝が関与しており、鉄が患者の腹腔に高濃度で存在することが記されている（Ｄｅｆｒｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００８−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．７  ｐｐ．３７７−３８５、２００８；Ｌｏｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００９−Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｖｏｌ  ９１、Ｎｏ．５、Ｍａｙ  ２００９；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４−Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．３  ｐｐ．５７７−５８３、２０１４）。
【００２６】
したがって、癌細胞と同様に、鉄の必要性の増加に対処するために、子宮内膜細胞がＣＤ７１受容体をその表面で過剰発現させることを示し、次いで、これら子宮内膜細胞上での抗ＣＤ７１抗体の抗増殖活性を示すことは、子宮内膜症において高い可能性を有する新しい治療戦略である。
【００２７】
抗ＣＤ７１抗体の使用：ＣＤ７１を標的とする革新的な作用機序と、子宮内膜症の有望な治療 
かかる抗体は、本質的に、高い増殖能を有する細胞を標的とし、ＣＤ７１との結合について、トランスフェリンと競合する。生理学的条件下、静止細胞は、トランスフェリン結合を好む表面で、制限された数のＣＤ７１分子を有する。対照的に、急速に成長する癌細胞又は子宮内膜細胞は、鉄の必要性が高くなっており、そのため、その表面に高密度のＣＤ７１受容体を必要とする。この場合、抗ＣＤ７１抗体は、ＣＤ７１に二価で結合し、トランスフェリンがその受容体に結合するのを抑える。抗ＣＤ７１抗体は以下の特徴を有する。
【００２８】
-細胞表面でのＣＤ７１の数を減少させる。このことは、リソソームコンパートメントに向かう受容体の内在化を誘発し、その場で受容体が分解する。これにより、細胞表面に存在するＣＤ７１受容体はその９０％までが急速に減少する。
【００２９】
-腫瘍細胞の鉄を奪う。したがって、抗ＣＤ７１抗体によって標的とされる腫瘍又は子宮内膜細胞が鉄を取り込む量が顕著に減少する。この鉄欠乏は、癌細胞の死に関与する主な機序とみなさる。
【００３０】
-自発的に作用する。大部分の市販のモノクローナル抗体とは対照的に、抗ＣＤ７１抗体は、抗体依存性細胞障害作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity：ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：ＣＤＣ）に対して固有の独立した効果を奏し、そのため、患者の免疫状態に対して固有の独立した効果を奏する。
【００３１】
したがって、本発明の目的は、子宮内膜症の治療に使用するための抗ＣＤ７１抗体、及び子宮内膜症を罹患し、治療を必要としている被験者に対する抗ＣＤ７１抗体の投与を含む治療処置方法である。
【００３２】
表現「抗体」とは、特に、特許国際公開番号ＷＯ  ２０１７／０１３２３０Ａ１号に定義されるようなモノクローナル抗体又はフラグメントを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】抗ＣＤ７１／トランスフェリン受容体ＩＨＣ、抗ＫＩ６７（増殖マーカー）ＩＨＣ、及び、抗Ｂｃｌ２（抗アポトーシスマーカー）ＩＨＣの写真図である。
【図２】ＮＳＧマウスにおける異種移植片の皮下成長の推移を示す顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
子宮内膜症の診断における新しいターゲットＣＤ７１受容体
この治療的革新と並行して、ＣＤ７１受容体を標的とする診断検査の開発によって、この新しい治療に対応し得る患者を特定することが可能になる。子宮内膜の病変レベルでのＣＤ７１受容体密度の評価は、個々の症例に応じて、子宮内膜症に対する治療としての抗ＣＤ７１抗体の使用が実証可能なコンパニオン診断検査による。
【００３５】
この検査は、特にトランスフェリン受容体の発現を検出する抗体として抗ＣＤ７１抗体を含む免疫組織化学（Immunohistochemistry：ＩＨＣ）キットの形態をとっていてもよい。免疫組織化学は、標的とする受容体の存在及び位置に対する情報を得るために半定量的分析を組織に対して直接行うことが可能である、医療分析実験室又は病院の実験室で日常的に活用される技術である。免疫組織化学は生体外において行う際に選択される、確固とした、信頼性の高い、安価であり、迅速に実施することができる技術である。
【００３６】
ハーセプテストにおいて、ハーセプチンを用いた治療の恩恵を受ける乳癌患者を決定するために、Ｈｅｒ２ｎｅｕの過剰発現に従って患者を層別化する際に、ＣＤ７１の過剰発現を評価する診断検査は、子宮内膜症を有する患者を治療に際して極めて著しい変革をもたらす。実際に、その時まで、この種の治療は選択肢ではなかった。その有効性を予測することによって治療を合理的に定めることは、患者の管理において顕著な改善である。
【００３７】
これに加え、この治療に適した患者の選択以外に、このコンパニオン診断は、短時間で以下のことが可能である。
【００３８】
-コンパニオン診断において応答性の高い、対象となる子宮内膜症患者に投与されている臨床開発中の抗ＣＤ７１抗体の応答速度を改善することと、
-効果対リスク比を改善することと、
-統計による検証を犠牲にすることなく、潜在的に応答性の高い患者のみを対象とすることを可能とする患者の層別化により、必要なコホートの規模を減らすことと、
-開発の第２段階及び第３段階におけるより小さなコホートの活用よって、抗ＣＤ７１抗体の開発段階の期間を短縮、関連する費用を削減することである。
【００３９】
本発明の異なる目的を議論する前に、本文に記載される特定の用語を定義する。
【００４０】
診断とは、被験者が子宮内膜症であるか否かに関わらず、検査された被験者の生体サンプルを検出することである。
【００４１】
予後とは、既に子宮内膜症と診断されている被験者について、疾患が急速に進行するか否かのリスクを判断することである。本願発明者らは、ＣＤ７１受容体の発現の程度に応じて、増殖性子宮内膜症、又はほぼ非増殖性の子宮内膜症について議論する。
【００４２】
予測では、子宮内膜症に罹患している被験者の中で、生物学的特徴によって、目標とする治療が有効であるか否かが予測可能な被験者を選択する。
【００４３】
治療の際の監視では、子宮内膜症に罹患しその治療を受ける被験者が、治療に反応するか否かを判定する。
【００４４】
生体サンプルとは、ＣＤ７１受容体を含有する可能性のある任意のサンプルを意味する。生体サンプルは、例えば、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、有機分泌物、唾液、浸出液、糞便、骨髄、及びこれらの液体サンプルから精製された細胞、又は組織標本又は組織、又は単離された細胞など、任意の生体液からの抽出物に由来していてもよい。好ましくは、手術によって除去された、通常は腹腔鏡検査によって除去された子宮内膜病変である。
【００４５】
したがって、本発明の目的は、以下のものである。
【００４６】
-子宮内膜症の検出及び／又は治療における標的としてのＣＤ７１受容体の使用。
【００４７】
-子宮内膜症の検出及び／又は治療監視のための生体サンプルにおいてＣＤ７１受容体を標的とする診断検査。
【００４８】
-ＣＤ７１受容体の過剰発現を評価し得る診断検査。
【００４９】
-ＣＤ７１受容体の特異的抗体を備える診断又は治療監視キット。
【００５０】
特定の試験を実施する際に、診断キットは、さらに、ＫＩ６７マーカー及び／又はＢｃｌ２タンパク質を標的とする抗体を備える。
【００５１】
本発明の別の特定試験の実施において、診断又は治療監視キットは、免疫組織化学キットである。
【００５２】
-子宮内膜症の検出及び／又は治療後の経過観察のための本発明のキットの使用。
【００５３】
-子宮内膜症の検出及び／又は治療に使用するための抗ＣＤ７１抗体、又はＣＤ７１受容体を標的とする分子。
【００５４】
-ＣＤ７１受容体の濃度／密度／発現を測定することによる、子宮内膜症の程度／重篤度を検出する方法。より詳細には、この方法は、生体外において、抗ＣＤ７１抗体を実施する免疫組織化学によって、健康な被験者と、子宮内膜症を罹患した被験者との間のＣＤ７１の濃度／密度／発現の比較測定を行う。
【００５５】
効果的には、本発明は、子宮内膜症の予後のための抗ＣＤ７１抗体の使用、及び子宮内膜症を有する被験者の生体サンプルと抗ＣＤ７１抗体とを接触させることを含む、子宮内膜症の予後の方法に関する。特に、この使用又は方法は、ＣＤ７１受容体を過剰発現する過剰増殖性子宮内膜症が進行する予後のためのものである。
【００５６】
本発明は、子宮内膜症の治療における成功を予測する抗ＣＤ７１抗体の使用、及び子宮内膜症の治療において成功を予測する方法にも関する。特に、この使用又は方法は、ＣＤ７１受容体を過剰発現する子宮内膜症の治療における成功を予測するためのものである。
【００５７】
本発明は、さらに、抗ＣＤ７１抗体と、被験者の生体サンプルとを接触させることを含む、子宮内膜症を有する被験者における子宮内膜症の予後、予測又は治療監視検査に関する。
【００５８】
この検査の観点から、本発明は、抗ＣＤ７１抗体を備える予後、予測又は治療監視キットに関する。効果的には、キットは、さらに、ＫＩ９７マーカー及び／又はＢｃｌ２タンパク質を標的とする抗体を備える。本発明の好ましいキットは、免疫組織化学キットである。
【００５９】
実施例１：子宮内膜症の治療の可能性としての抗ＣＤ７１抗体の使用の概念の証明
1)パラフィンに埋包された既往の子宮内膜病変に対するトランスフェリン受容体の存在の検証
この工程は、Ｅｎｄｏｄｉａｇが通常使用する技術である免疫組織化学（ＩＨＣ）技術により、パラフィンに（ｎ＝４４）埋包された子宮内膜症サンプルで行われた。一連のサンプルのブロックはそれぞれ、この病状のある段階の代表例であった。
【００６０】
子宮内膜症の病変レベルでのＣＤ７１の存在の検証と並行して、増殖マーカーＫＩ６７及び癌遺伝子Ｂｃｌ２を標的とするＩＨＣを実施した。実際に、抗ＣＤ７１抗体は、好ましくは、高速で増殖する細胞を標的とし、鉄の奪取によってそのアポトーシスを誘発する。抗ＣＤ７１抗体によって標的とされる細胞は、ＣＤ７１の発現に加え、増殖因子ＫＩ６７及び抗アポトーシスマーカーＢｃｌ２に陽性である。
【００６１】
図１は、以下を示す。
【００６２】
-（ａ）抗ＣＤ７１／トランスフェリン受容体ＩＨＣ。
【００６３】
-（ｂ）抗ＫＩ６７（増殖マーカー）ＩＨＣ。
【００６４】
-（ｃ）抗Ｂｃｌ２（抗アポトーシスマーカー）ＩＨＣ。
【００６５】
ＩＨＣは、子宮内膜病変の４４の生検で実施された。この結果は、ＣＤ７１染色の強度が、ＫＩ６７の強度と相関関係にあることを示していた。したがって、ＫＩ６７染色強度が強いほど（腺及び／又は間質）、ＣＤ７１染色の強度が強くなる（組織１番）。逆に、ＫＩ６７染色の強度が低い病変では、ＣＤ７１染色の強度は決して高くない（組織３番）。
【００６６】
ＫＩ６７及びＣＤ７１の染色と、Ｂｃｌ２の染色とにも相関関係がある。ＫＩ６７又はＣＤ７１の染色の強度が強いほど、ｂｃｌ２染色の強度が強くなる。このことにより、子宮内膜細胞の増殖状態が確認される（高い増殖、アポトーシスを阻害した）。
【００６７】
大部分の増殖性子宮内膜病変（高ＫＩ６７と関連する）も、ＣＤ７１受容体を過剰発現する。これら２種類のマーカー発現の間には相関関係がある。この一つ目の結果によって、癌細胞と同様に、これらの増殖性病変が、抗ＣＤ７１抗体の標的とされる作用に対して敏感であると推測することができる。
【００６８】
これらの検査によって、子宮内膜症の治療において、抗ＣＤ７１抗体の試験する目的を検証することができる。
【００６９】
実施例２：子宮内膜細胞表面でのＣＤ７１密度と、抗ＣＤ７１抗体の治療有効性との間の相関関係の実証
（ａ）最初の工程は、子宮内膜病変に由来する細胞の一次培養物を用いた生体外での検査中に開始される。この工程では、これらの培養物に対する抗ＣＤ７１抗体の効果を検査すること（増殖、アポトーシス及び侵襲性、用量依存性の試験）と、抗ＣＤ７１抗体の抗増殖効果を調べることと、からなる。抗ＣＤ７１抗体を用いた免疫組織化学は、細胞表面にあるＣＤ７１受容体を定量化するために並行して行われる。フローサイトメトリー実験も、細胞表面にあるＣＤ７１受容体を定量化するために行われる。これらのデータは、生体外において細胞に対して観察された効果と並行して分析され、ＣＤ７１密度と抗ＣＤ７１抗体 の効率との間の相関関係が求められる。
【００７０】
（ｂ）次の工程において、この相関関係は、子宮内膜細胞異種移植片のマウスモデルでの生体内検査中に示される。このモデルで行われる異なる検査によって、子宮内膜細胞での、抗ＣＤ７１抗体の有効性が強調され得る。次いで、これらの結果と、異種移植したマウス内の子宮内膜病変のレベルでのＣＤ７１受容体密度との相関関係を示し、実験終了時にＩＨＣによって分析する。
【００７１】
実施例３：生体内における検査
生体内検査による技術が検証された後、本願発明者らが血液悪性疾患で既に検証したとおり、切除された３０の新鮮な病変に由来する子宮内膜細胞を注射し、このモデルを用いて、１回の腹膜注射において１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇの範囲の複数投薬量の抗ＣＤ７１抗体を使用し、一連の試験を行う。次いで、いくつかの投与態様（腹膜内（intraperitoneal：Ｉ．Ｐ）及び静脈内（intravenous：Ｉ．Ｖ））により、この治療を数回の投薬回数に分けて（週に１回から週に３回まで）検査される。この検査によって、本願発明者らは、子宮内膜症の治療についての抗ＣＤ７１抗体の使用を生体内において検証し、サルにおける最初の毒性試験で使用される理論的な投薬量を決定することができる。抗ＣＤ７１抗体を用いた治療後の細胞増殖の阻害を正確に定量し、腫瘍内の糖代謝（増殖と同義語）を視覚化することが可能なＸｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＲｅｄｉＪｅｃｔ  ２−ＤＧ−７５０プローブを注射し、細胞増殖を生体内で監視する。蛍光は、Ｋｏｄａｋのｉｍａｇｉｎｅ  ＦＸ  ｐｒｏ  生体内検出器を用いて測定し、画像は、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  ＭＩソフトウェアによって分析する（図２）。動物実験は、倫理委員会に照会され、Ｐａｒｉｓ  Ｖ大学規制機関によって検証される。
【００７２】
図２は、顕微鏡画像による、ＮＳＧマウスにおける異種移植片の皮下成長の推移の一例を示す。細胞増殖の差は、治療した動物と対照動物との間の蛍光の差分を求めることにより説明される。
【００７３】
実施例４：キットの説明
キットは、抗ＣＤ７１抗体の使用に基づく免疫組織化学（ＩＨＣ）キットであり、そのため、感度及び選択性を保証する。診断における使用を意図した抗ＣＤ７１抗体と、治療における使用を意図した抗ＣＤ７１抗体との相違は、前者の製造方法はＧＭＰ（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の厳格な枠組みで行われていない点のみである。それにもかかわらず、抗ＣＤ７１を産生するクローンは、同一物である。
【００７４】
抗ＣＤ７１  ＩＨＣキットによって、市販のＩＨＣキット用に一般的に提案されている３０−５０の試験を行い得る。
【００７５】
キットは、検査を行うのに必要な全ての試薬と、陽性及び陰性の対照スライドガラスと、結果の分析に必要な要素を含む完全なプロトコルと、を含む。
【００７６】
実施例５：試験の最適化
試験の最適化は、最適な条件と、キットの使用を制限する条件とを画定することからなる。この段階では、子宮内膜症病変の新鮮な標本を２０使用する必要がある。
【００７７】
この工程は、それぞれ、以下を包含する。
【００７８】
-組織の分析に先立つプロセスの全ての工程を表す分析前工程、すなわち、パラフィン埋包されたブロックの切除が完了するまでの組織サンプリング、輸送、固定化、封入、切断厚さ、スライドガラスの種類などを示す工程。
【００７９】
-分析の実際の工程、すなわち、ＩＨＣプロトコル、染色、スライドガラス取付の全ての工程。
【００８０】
-結果の解釈及び結果の描画を含む分析後工程。
分析前工程中、以下の基準及び変数を定めることができる。
【００８１】
-組織をサンプリングする方法。
【００８２】
-固定化（時間、方法）。
【００８３】
-脱灰（時間、方法）。
【００８４】
これらの工程は重要である。病変サンプリング条件は、執刀医によって顕著に変化し、サンプル分解を引き起こし得るからである。例えば、プライヤーとハサミを使用すると、症例の４０％において、サンプルが分析不可能となってしまう。
【００８５】
これらの工程は、子宮内膜症用バイオプシーガン及び生検の迅速な固定化に必要な全ての要素を含むサンプリングキットの開発により、既に最適化されている（ＷＯ２０１３／０３４５７３号を参照）。
【００８６】
分析段階によって、以下の基準及び変数を定めることができる。
【００８７】
-切断部の厚さ。
【００８８】
-スライドガラスの種類。
【００８９】
-脱ろう方法。
【００９０】
-抗原賦活化方法。
【００９１】
-視覚化システム。
【００９２】
-試薬。
【００９３】
-対照。
【００９４】
-抗体。
【００９５】
-検査を実施する方法（自動、手動）。
【００９６】
-染色方法。
【００９７】
-ラメラ付着の種類。
【００９８】
より詳細には、満足のいく染色、適切に着色し、取り付けられた組織を得て、したがって最適に分析可能になるように、検査を終了するための全ての条件と、検査中に使用される試薬とを検証することが重要である。調節される各パラメータについて、一般的に使用される種々の方法が検討され、最も適切な方法が選択される。
【００９９】
このようにして、以下のデータを評価する。
【０１００】
-結果に対する切断部の厚さの影響。
【０１０１】
-スライドガラスの種類の影響（単純なスライドガラス、ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ＋（登録商標）スライドガラス、ＦＬＥＸ（登録商標）スライドガラス）。
【０１０２】
-脱ろう方法（時間、温度、材料、抗原賦活化との組み合わせの有無）の影響。
【０１０３】
-視覚化システム、ビオチン／ストレプトアビジンに基づくキット、又はポリマーに基づくキット、使用する色原体の種類（ＤＡＢ、ＡＥＣ）、酵素の種類（ＨＲＰ又はＡＰ）などの影響。
【０１０４】
-試薬（バッファーの洗剤含有の有無、内因性ペルオキシダーゼのブロックなど）の影響。
【０１０５】
-適切な対照（陽性及び陰性の内部及び／又は外部対照）。
【０１０６】
-高品質の検出及び染色を得るのに必要な濃度及び最適な抗体染色時間と、最も適切な希釈剤。
【０１０７】
-０ヶ月−６ヶ月間の抗体安定性。
【０１０８】
-他の選択した試薬の安定性。
【０１０９】
-使用した方法、手動であるか、又はＩＨＣオートメーションの活用。
【０１１０】
-対比染色の時間及び方法（Ｍａｙｅｒ、Ｈａｒｒｉｓ製のヘマトキシリン）。
【０１１１】
-カバーガラス取り付けの種類（選択した色原体に従う恒久性、水性）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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