(57)【要約】  本発明は、ＰＤ−Ｌ１抗体医薬組成物およびその使用を提供する。特に、本発明は、コハク酸緩衝液中にＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。さらに、医薬組成物はまた、糖および非イオン性界面活性剤を含有しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび緩衝液を含む医薬組成物を提供し、ここで、緩衝液は、好ましくはコハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であり、より好ましくはコハク酸緩衝液である医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物のｐＨは、約４．５〜６．０、好ましくは約５．０〜６．０、より好ましくは約５．０〜５．５、最も好ましくは５．２である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記緩衝液の濃度は、約５〜５０ｍＭ、好ましくは約１０〜３０ｍＭ、より好ましくは１０〜２０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭである請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体の濃度は、約３０〜約８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０〜６０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約４５〜５５ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは５０ｍｇ／ｍＬである請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
糖をさらに含み、前記糖は好ましくは二糖であり、より好ましくはトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースである請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記糖の濃度は、約３０〜９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０〜８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５５〜６５ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは６０ｍｇ／ｍＬである請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
界面活性剤をさらに含み、前記界面活性剤は、好ましくはポリソルベート、より好ましくはポリソルベート８０またはポリソルベート２０である請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
界面活性剤の濃度は、約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．４〜０．８ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜０．７ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．６ｍｇ／ｍＬである請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
(ａ)３０〜８０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、
(ｂ)５〜５０ｍＭのコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、
(ｃ)３０〜９０ｍｇ／ｍＬの二糖、および、
（ｄ）０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、を含み、
好ましくは、４０〜６０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、ｐＨ５．０〜５．５の１０〜３０ｍＭコハク酸緩衝液、４０〜８０ｍｇ／ｍＬのスクロース、および０．４〜０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、を含み、
より好ましくは、４５〜５５ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．０〜５．５の１０〜２０ｍＭコハク酸緩衝液、５５〜６５ｍｇ／ｍＬのスクロース、および０．５〜０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．４ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物Ａ、
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．６ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物Ｂ、
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．８ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物Ｃ、
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．５の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．６ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物Ｄ、ならびに、
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．８の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．６ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物Ｅ、からなる群から選択される一つである請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合断片は、
抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ配列（配列番号１〜３、配列番号７〜９）、および／または抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ配列（配列番号４〜６、配列番号１０〜１２）、好ましくは、ＨＣＤＲ１はＮＤＹＷＸ１（配列番号１）またはＳＹＷＭＨ（配列番号７）から選択され、ＨＣＤＲ２は、ＹＩＳＹＴＧＳＴＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）またはＲＩＸ４ＰＮＳＧＸ５ＴＳＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号８）から選択され、および／または、
ＨＣＤＲ３は、ＳＧＧＷＬＡＰＦＤＹ（配列番号３）またはＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹ（配列番号９）から選択され、および／または、
ＬＣＤＲ１は、ＫＳＳＱＳＬＦＹＸ２ＳＮＱＫＸ３ＳＬＡ（配列番号４）またはＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨ（配列番号１０）から選択され、
ＬＣＤＲ２は、ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）またはＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１１）から選択され、および／または、
ＬＣＤＲ３は、ＱＱＹＹＧＹＰＹＴ（配列番号６）またはＱＱＳＦＥＤＰＬＴ（配列番号１２）から選択され、
ここで、Ｘ１は、ＮまたはＴから選択され、Ｘ２は、ＲまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＮまたはＨから選択され、Ｘ４は、ＨまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＧまたはＦから選択されるＣＤＲ領域配列またはその変異配列のいずれか一つを含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２もしくはその変異配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＣＤＲ配列、ならびに配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される重鎖可変領域ＣＤＲ配列もしくはその変異配列を含み、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、ならびに配列番号７、配列番号８、および配列番号９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、または、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３もしくはその変異配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＣＤＲ配列、ならびに配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択される軽鎖可変領域ＣＤＲ配列もしくはその変異配列を含み、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号５、および配列番号６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合断片は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選択され、好ましくはヒト化抗体である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域配列は、配列番号１３に示され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域配列は、配列番号１４に示される請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域配列は、配列番号１５に示され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域配列は、配列番号１７に示される請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容される賦形剤と混合することを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項１７】
疾患または状態が、好ましくは癌、より好ましくはＰＤ−Ｌ１発現癌、さらに好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黒色腫または非小細胞肺癌、特に好ましくは非小細胞肺癌、黒色腫、膀胱癌または腎癌であるＰＤ−Ｌ１媒介疾患または状態を治療するための医薬を製造する際の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
治療有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、ここで、疾患は好ましくは癌であり、より好ましくはＰＤ−Ｌ１発現癌であり、さらに好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黒色腫、非小細胞肺癌または膀胱癌であり、特に好ましくは非小細胞肺癌、黒色腫、膀胱癌または腎癌であるＰＤ−Ｌ１媒介性疾患または状態を治療および予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１７年５月１６日に出願された中国特許出願第ＣＮ２０１７１０３４１６８０．７号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は医薬調製物の分野に関し、特に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、および抗癌剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
１９９２年に発見された、Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質受容体であるＰＤ−１（Programmed death-I）は、アポトーシスのプロセスに関与する。ＰＤ−１は二つのリガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ１は、主にＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ）上で発現し、活性化された細胞上での発現はアップレギュレートされうる。ＰＤ−Ｌ２の発現は比較的限定されており、これは主に抗原提示細胞（たとえば、活性化マクロファージおよび樹状細胞）上で発現される。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１およびＢ７−１に結合して免疫系を阻害し、腫瘍微小環境中の多くの腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１を発現する。最近の研究では乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、メラノーマ癌、非小細胞肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌などのヒト腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の高発現が見出され、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルは患者の臨床状態および予後と密接に関連している。ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞増殖を抑制する第二のシグナル経路として機能するため、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１間の結合を阻止することは、がん免疫療法の分野において非常に有望な新たな標的となっている。
【０００５】
他の化学薬品と比較して、抗体医薬は、それらのより大きな分子量、より複雑な構造、および、容易な分解、重合、または望ましくない化学修飾のために不安定になる。投与に適した抗体分子を作製し、保存およびその後の使用の間の安定性を維持し、より良好な効果を発揮するために、抗体医薬の処方に関する研究は特に重要である。
【０００６】
多数の多国籍製薬会社が、現在、たとえば中国特許出願公開第１０５７９３２８８号明細書（特許文献１）、中国特許出願公開第１０３４２９２６４号明細書（特許文献２）、および中国特許出願公開第１０５９６０４１５号明細書（特許文献３）に開示されているようなＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１抗体を含有する医薬組成物を開発している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０５７９３２８８号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０３４２９２６４号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第１０５９６０４１５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968)
【非特許文献２】Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
【非特許文献３】Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor
【非特許文献４】The Immunoglobulin FactsBook, 2001（ISBN 012441351）
【非特許文献５】Watson etal. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、十分に安定であり、投与に適した、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび緩衝液を含む医薬組成物を提供し、ここで、緩衝液は、好ましくはコハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であり、より好ましくはコハク酸緩衝液である。
【００１１】
本開示の実施形態において、緩衝液の濃度は、約５〜５０ｍＭ、好ましくは約１０〜３０ｍＭ、より好ましくは１０〜２０ｍＭであり、緩衝液の濃度の非限定的な実施形態は、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭおよび２０ｍＭを含む。
【００１２】
本開示の実施形態において、医薬組成物のｐＨは、約４．５〜６．０、好ましくは約４．８〜５．７、より好ましくは５．０〜５．５であり、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４または５．５でありうる。
【００１３】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の抗体の濃度は、約３０〜約８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０〜約６０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは４５〜約５５ｍｇ／ｍＬであり、抗体の濃度の非限定的な実施形態には４５ｍｇ／ｍＬ、４６ｍｇ／ｍＬ、４７ｍｇ／ｍＬ、４８ｍｇ／ｍＬ、４９ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５１ｍｇ／ｍＬ、５２ｍｇ／ｍＬ、５３ｍｇ／ｍＬ、５４ｍｇ／ｍＬおよび５５ｍｇ／ｍＬが含まれる。
【００１４】
さらに、本開示の医薬組成物は、糖類も含む。本明細書の「糖」は、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含む従来の組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎおよびその誘導体を含み、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセロール、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メリチトース、メリトリオース、マンノトリオース、マンノトリオース、スタチオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどからなる群から選択されうる。糖類は、好ましくは非還元二糖類であり、より好ましくはトレハロースまたはスクロースである。
【００１５】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の糖類の濃度が約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜約７０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５５〜約６５ｍｇ／ｍＬであり、糖類の濃度の非限定的な実施形態には５５ｍｇ／ｍＬ、５７ｍｇ／ｍＬ、５９ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６１ｍｇ／ｍＬ、６３ｍｇ／ｍＬおよび６５ｍｇ／ｍＬが含まれる。
【００１６】
さらに、本開示の医薬組成物は、界面活性剤も含む。ここで、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム、 ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグルコシド、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウリルアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノラミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミトイルアミドプロピルベタイン、またはイソステアリルアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミトイルアミドプロピルジメチルアミン、イソステアルアミドプロピルジメチルアミン、メチルココイルタウリン酸ナトリウム、またはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールプロピレングリコール共重合体などからなる群から選択される。界面活性剤は、好ましくはポリソルベート８０またはポリソルベート２０、より好ましくはポリソルベート８０である。
【００１７】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の界面活性剤の濃度は、約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２〜０．８ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．４〜０．８ｍｇ／ｍＬであり、界面活性剤の濃度の非限定的な実施形態は０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬおよび０．８ｍｇ／ｍＬを含む。
【００１８】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ配列（配列番号１〜３、配列番号７〜９）および／または抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ配列（配列番号４〜６、配列番号１０〜１２）からなる群より選択されるＣＤＲ領域配列またはその変異配列のいずれか一つを含む。具体的には以下の通りである。
ＨＣＤＲ１は、ＮＤＹＷＸ１（配列番号１）またはＳＹＷＭＨ（配列番号７）から選択され、
ＨＣＤＲ２は、ＹＩＳＹＧＳＴＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）またはＲＩＸ４ＰＮＳＧＸ５ＴＳＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号８）から選択され、および／または、
ＨＣＤＲ３は、ＳＧＧＷＬＡＰＦＤＹ（配列番号３）またはＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹ（配列番号９）から選択され、および／または、
ＬＣＤＲ１は、ＫＳＳＱＳＬＦＹＸ２ＳＮＱＫＸ３ＳＬＡ（配列番号４）またはＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨ（配列番号１０）から選択され、
ＬＣＤＲ２は、ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）またはＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１１）から選択され、および／または、
ＬＣＤＲ３は、ＱＱＹＹＧＹＰＹＴ（配列番号６）またはＱＱＳＦＥＤＰＬＴ（配列番号１２）から選択され、
ここで、Ｘ１は、ＮまたはＴから選択され、Ｘ２は、ＲまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＮまたはＨから選択され、Ｘ４は、ＨまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＧまたはＦから選択される。
【００１９】
本開示の実施形態において、好ましくは、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、またはその変異配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＣＤＲ配列、ならびに、配列番号７、配列番号８、および配列番号９、またはその変異配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＣＤＲ配列を含み、より好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、ならびに配列番号７、配列番号８および配列番号９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、または、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはその変異配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＣＤＲ配列、ならびに、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、またはその変異配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＣＤＲ配列を含み、より好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号５および配列番号６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む。
【００２０】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ配列、ならびに配列番号７、配列番号８および配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域ＣＤＲ配列を含む。
【００２１】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、好ましくはヒト化抗体からなる群から選択されうる。
【００２２】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列、および配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列を含む。
【００２３】
本開示の実施形態において、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列、および配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列を含む。
【００２４】
本開示はさらに、約３０〜約８０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、約５〜約５０ｍＭの濃度を有するｐＨ５．０〜６．０のコハク酸緩衝液、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する二糖類、および約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本開示はさらに、４０〜６０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、１０〜３０ｍＭのコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５）、４０〜８０ｍｇ／ｍＬのスクロース、および０．４〜０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
本開示はさらに、４５〜５５ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．０〜５．５の１０〜２０ｍＭコハク酸緩衝液、５５〜６５ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．５〜０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本開示はさらに、約３０〜約８０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、約５〜約５０ｍＭの濃度を有するｐＨ５．０〜６．０の酢酸緩衝液、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する二糖類、および約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．３の１０ｍＭコハク酸緩衝液、および６０ｍｇ／ｍＬスクロース、を含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸緩衝液、および９０ｍｇ／ｍＬスクロース、を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５の３０ｍＭ酢酸緩衝液、および６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース、を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５の３０ｍＭ酢酸緩衝液、および６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース、を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．６の３０ｍＭ酢酸緩衝液、および９０ｍｇ／ｍＬスクロース、を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．０〜５．５の１０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０、を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の１０ｍＭ−２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０、を含む医薬組成物を提供する。
【００３５】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭ酢酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０、を含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭ酢酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．２〜０．６ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．４〜０．８ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００３９】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．４ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００４０】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．６ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００４１】
本開示はさらに、５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ｐＨ５．２の２０ｍＭコハク酸緩衝液、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．８ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、を含む医薬組成物を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中のコハク酸緩衝液の濃度は、約５〜５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のコハク酸緩衝液の濃度は、約１０〜３０ｍＭである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のコハク酸緩衝液の濃度は、約２０ｍＭである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の酢酸緩衝液の濃度は、約５〜５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の酢酸緩衝液の濃度は、約１０〜３０ｍＭである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の酢酸緩衝液の濃度は、約２０ｍＭである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約５．０〜６．０である。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約５．０〜５．５である。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、５．２または５．５である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体の濃度は、約３０〜約８０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体の濃度は、約４０〜約６０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の二糖類の濃度は、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の二糖類の濃度は、約４０〜約８０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の二糖類の濃度は、約６０ｍｇ／ｍＬである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中のポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のポリソルベートは、ポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．４〜０．８ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．６ｍｇ／ｍＬである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、調製物は、２〜８℃で少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、または少なくとも２４ヶ月間安定である。いくつかの実施形態では、調製物が４０℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、または少なくとも２８日間安定である。
【００４９】
本開示はさらに、本明細書に記載の安定な医薬組成物のいずれかを含有する容器を含む物品またはキットを提供する。いくつかの実施形態では、容器はガラスバイアルであり、ガラスバイアルは注射用の中性ホウケイ酸ガラスバイアルである。
【００５０】
本開示はさらに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容される賦形剤と混合することを含む上記の医薬組成物を調製するための方法を提供する。
【００５１】
本開示はさらに、ＰＤ−Ｌ１媒介疾患または状態を治療するための医薬を製造する際の上記医薬組成物の使用を提供する。ここで、疾患または状態が、好ましくは癌、より好ましくはＰＤ−Ｌ１発現癌、さらに好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黒色腫または非小細胞肺癌、特に好ましくは非小細胞肺癌、黒色腫、膀胱癌または腎癌である。
【００５２】
本開示はさらに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むＰＤ−Ｌ１媒介疾患または状態を治療または予防するための方法を提供する。ここで、疾患は好ましくは癌であり、より好ましくはＰＤ−Ｌ１発現癌であり、さらに好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黒色腫、非小細胞肺癌または膀胱癌であり、特に好ましくは非小細胞肺癌、黒色腫、膀胱癌または腎癌である。
【００５３】
本明細書で説明される様々な実施形態の特徴のうちの一つ、いくつか、またはすべてをさらに組み合わせて、本開示の他の実施形態を得ることができることを理解されたい。本開示の上記の実施形態の組み合わせによって得られる他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒト化クローン構築中のプライマー設計の概略図
【図２】ヒト化クローン構築中のベクター構築の概略図
【図３】Ｔｍ因子（緩衝系、緩衝液の濃度、医薬組成物のｐＨ、糖類の濃度、および糖類の種類を含む）の主な効果プロット
【発明を実施するための形態】
【００５５】
〔用語〕
本開示をより容易に理解するために、特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書で特に別段の定義がない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有するものと解釈されるものとする。
【００５６】
「緩衝液」は、その共役酸−塩基成分のためにｐＨが変化しにくい緩衝液を指す。本開示の緩衝液のｐＨ値は、約４．５〜６．０、好ましくは約５．０〜６．０、より好ましくは約５．０〜５．５、最も好ましくは５．２である。このような範囲のｐＨを制御する緩衝液の例としては、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グリシルグリシンおよび他の有機酸緩衝液が挙げられる。本開示の緩衝液は、好ましくはコハク酸緩衝液または酢酸緩衝液、より好ましくはコハク酸緩衝液である。
【００５７】
「コハク酸緩衝液」は、コハク酸イオンを含む緩衝液を指す。コハク酸緩衝液の例には、コハク酸−コハク酸ナトリウム、コハク酸ヒスチジン、コハク酸−コハク酸カリウム、コハク酸−コハク酸カルシウムなどが含まれる。本開示のコハク酸緩衝液は、好ましくはコハク酸−コハク酸ナトリウムである。
【００５８】
「酢酸緩衝液」は、酢酸イオンを含む緩衝液を指す。酢酸緩衝液としては、たとえば、酢酸−酢酸ナトリウム、酢酸ヒスチジン、酢酸−酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸−酢酸マグネシウム等が挙げられる。本開示の好ましい酢酸緩衝液は、酢酸−酢酸ナトリウムである。
【００５９】
「医薬組成物」は、本明細書に記載の化合物の一つ以上、またはその生理学的／薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグと他の化学成分とを含む混合物を指す。前記他の化学成分はたとえば、生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤である。医薬組成物の目的は活性成分の吸収を促進し、それによって生物学的活性を発揮する、生物への投与を促進することである。
【００６０】
本開示の医薬組成物は、安定な効果を達成することができる。すなわち、医薬組成物に含まれる抗体は、貯蔵後にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を実質的に保持することができ、好ましくは、医薬組成物は、貯蔵後にその物理的安定性、化学的安定性および生物学的活性を実質的に保持する。貯蔵寿命は一般に、医薬組成物の所定の貯蔵寿命に基づいて選択される。現在、選択された温度で選択された期間貯蔵した後の安定性を測定する、タンパク質安定性を測定するための多くの分析技術が存在する。
【００６１】
安定な抗体医薬調製物は、以下の条件において有意な変化が観察されないものである。すなわち、冷蔵温度（２〜８℃）で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、より好ましくは１年間、さらにより好ましくは２年までの貯蔵、の条件である。さらに、安定な液体調製物は、２５℃および４０℃を含む温度で１ヶ月、３ヶ月、および６ヶ月を含む期間貯蔵したときに所望の特性を示す液体調製物を含む。安定性に関する一般的な許容基準は次のとおりである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの評価により、通常約１０％以内、望ましくは抗体モノマーの約５％以内が分解される。医薬液体調製物は目視分析により、無色または透明〜わずかに乳白色である。調製物の濃度、ｐＨおよび浸透圧は、±１０％以下の変化を有する。典型的には、１０％以下、好ましくは５％以下のクリッピングが観察される。典型的には、１０％以下、好ましくは５％以下の凝集が形成される。
【００６２】
抗体は、色および／または透明度の目視検査時に、またはＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定して、凝集、沈殿および／または変性の有意な増加を示さない場合、医薬調製物中で「その物理的安定性を保持する」といえる。タンパク質コンホメーションの変化は、蛍光分光法（タンパク質の三次構造を決定する）およびＦＴＩＲ分光法（タンパク質の二次構造を決定する）によって評価することができる。
【００６３】
抗体は、それが有意な化学的変化を示さない場合、医薬調製物中で「その化学的安定性を保持する」といえる。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変化した形態を検出および定量することによって評価できる。タンパク質の化学構造をしばしば変化させる分解プロセスには、加水分解またはクリッピング（サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法によって評価される）、酸化（質量分析法またはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチドマッピングなどの方法によって評価される）、脱アミド化（イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸測定などの方法によって評価される）、および異性化（イソアスパラギン酸含量、ペプチドマッピングなどを測定することによって評価される）が含まれる。
【００６４】
抗体は、所与の時点での抗体の生物学的活性が医薬調製物が調製された時点で示される生物学的活性の所定の範囲内である場合、医薬調製物中で「その生物学的活性を保持する」といえる。抗体の生物学的活性はたとえば、抗原結合アッセイによって決定されうる。
【００６５】
本明細書中で使用されるアミノ酸残基についての３文字コードおよび１文字コードは、J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968)（非特許文献１）に記載された通りである。
【００６６】
本開示において使用される「抗体」は、二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖との間のジスルフィド結合によって一緒に連結されたテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。重鎖定常領域のアミノ酸組成および順序の違いは、免疫グロブリン抗原性の違いをもたらす。したがって、免疫グロブリンは５つのクラス（または免疫グロブリンアイソタイプ）、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥに分類することができ、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、およびγ鎖、α鎖、およびε鎖である。そのヒンジ領域のアミノ酸組成、ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置に従って、同じアイソタイプのＩｇを異なるサブクラスに分けることができ、たとえば、ＩｇＧをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、定常領域の違いによりκ鎖またはλ鎖に分類される。Ｉｇの５つのクラスの各々は、κ鎖またはλ鎖を有することができる。
【００６７】
本開示において、本開示の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ鎖、λ鎖またはその変異体を含む軽鎖定常領域をさらに含むことができる。
【００６８】
本開示において、本開示の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体を含む重鎖定常領域をさらに含むことができる。
【００６９】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸配列は、可変領域（Ｆｖ領域）として知られる高度に可変であり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が定常領域として知られる比較的安定である。可変領域は、三つの超可変領域（ＨＶＲ）および四つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する三つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、三つのＣＤＲ領域および四つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端への順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、の順序である。軽鎖の三つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指し、重鎖の三つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指す。本明細書中の抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域におけるＣＤＲ領域アミノ酸残基の数および位置は、公知のＫａｂａｔ番号付け基準（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＥ２−３）に従うか、またはｋａｂａｔおよびｃｈｏｔｈｉａ番号付け基準（ＨＣＤＲ１）に従う。
【００７０】
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。
【００７１】
本開示における「マウス抗体」という用語は、当該分野の知識および技術に従って調製されたヒトＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体を指す。調製中、被験体にＰＤ−Ｌ１抗原を注射し、次いで、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離した。本開示の好ましい実施形態において、ネズミＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ネズミκ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含みうるか、またはネズミＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはその変異体の重鎖定常領域をさらに含みうる。
【００７２】
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体を指し、キメラ抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を構築するために、特異的マウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に構築し、可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローニングする。続いて、ヒト抗体の定常領域遺伝子を所望に応じてクローニングし、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子とライゲーションして、ヒトベクターに挿入可能なキメラ遺伝子を形成し、最後に、キメラ抗体分子を真核または原核産業系で発現させる。本開示の好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含む。ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域、またはその変異体をさらに含む。ヒト抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはその変異体から選択することができ、好ましくはアミノ酸変異後にＡＤＣＣ(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）を伴わないヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。
【００７３】
「ヒト化抗体」という用語は、ＣＤＲ移植抗体としても知られており、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植することによって生成される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列から産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される強力な抗体応答の欠点を克服する。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列または公開された参考文献をカバーする公開ＤＮＡデータベースから得ることができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列はヒト生殖系列配列データベース「ＶＢａｓｅ」（www.mrccpe.com.ac.uk/vbase上で入手可能）に見出すことができ、また、Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.（非特許文献２）に見出すことができる。免疫原性の減少の間の活性の減少を回避するために、ヒト抗体の可変領域におけるフレームワーク配列は、活性を維持するために最小限の復帰突然変異または復帰突然変異に供される。本開示のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによってＣＤＲ親和性成熟が行われるヒト化抗体を含む。
【００７４】
本開示における「抗原結合フラグメント」とは、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１に結合するＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントをいい、それは本開示に記載される抗体の一つ以上のＣＤＲ領域（配列番号１〜配列番号１２からなる群より選択される。）を含む。Ｆｖフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、定常領域を含まず、すべての抗原結合部位を有する最小抗体断片である。一般に、Ｆｖ抗体はＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。また、異なるリンカーを使用して二つの抗体の可変領域を連結して、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれるポリペプチド鎖を形成することができる。本開示における「ＰＤ−Ｌ１に結合する」という用語は、ヒトＰＤ−Ｌ１と相互作用できることを意味する。本開示における「抗原結合部位」という用語は、本開示の抗体または抗原結合断片によって認識される抗原上の不連続な三次元部位を指す。
【００７５】
抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は当該分野で周知であり、たとえば、Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor（非特許文献３）第５〜８章および第１５章に見出されうる。たとえば、マウスをヒトＰＤ−Ｌ１またはその断片で免疫化することができ、得られた抗体を復元し、精製し、通常の方法によりアミノ酸配列決定に供することができる。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製されうる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、一つ以上のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を非ヒト由来ＣＤＲ領域に導入するように遺伝子操作される。ヒトＦＲ生殖系列配列はウェブサイト（http://imgt.cines.fr）を介してImMunoGeneTics（IMGT）から、またはThe Immunoglobulin FactsBook, 2001（ISBN 012441351）（非特許文献４）から得ることができる。
【００７６】
本開示の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法によって調製および精製されうる。たとえば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組換えることができる。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトすることができる。当該分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、代表的にはＦｃ領域における高度に保存されたＮ末端において、抗体のグリコシル化を生じる。安定なクローンは、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体の発現によって得ることができる。陽性クローンは、バイオリアクターにおける抗体産生のために無血清培養培地中で増殖させることができる。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術によって精製することができる。たとえば、培地は、調節された緩衝液で平衡化されたプロテインＡまたはＧセファロースＦＦカラムによって都合よく適用されうる。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合した抗体をｐＨ勾配によって溶出し、抗体断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、次いでプールする。抗体は一般的な技術を用いて濾過し、濃縮することができる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除またはイオン交換を含む一般的な技術によって効果的に除去することができる。得られた生成物は直ちに、たとえば−７０℃で凍結保存することができ、または凍結乾燥することができる。
【００７７】
「保存的修飾」または「保存的置換または置換」の各用語は、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく変化を頻繁に行うことができるように、類似の特徴（たとえば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格コンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸でのタンパク質中のアミノ酸の置換を指す。当業者は一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する（たとえば、Watson etal. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)（非特許文献５）を参照のこと）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。
【００７８】
「同一性」の用語は、二つのポリヌクレオチド配列間または二つのポリペプチド間の配列類似性を指す。二つの比較された配列の両方における位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合、たとえば二つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占有される場合、これらの分子は、その位置において同一である。二つの配列間の同一性パーセントは、二つの配列によって共有される一致または一貫した位置の数を、比較された位置の数×１００で割った関数である。たとえば、配列の最適なアラインメントにおいて、二つの配列の１０の位置に６つの一致または一貫性がある場合、二つの配列は６０％の同一性を有する。一般に、比較は、最も高い同一性パーセントを得るために二つの配列が整列される場合に行われる。
【００７９】
「投与」および「治療」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生物学的流体に適用する場合、外因性医薬、治療、診断薬、または組成物を動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生物学的流体と接触させることを指す。「投与」および「治療」は、たとえば、治療、薬物動態、診断、研究、および実験方法を指すことができる。細胞の処理は、試薬を細胞と接触させること、ならびに試薬を流体と接触させることを包含し、ここで流体は細胞と接触している。「投与」および「処置」は、また、たとえば、細胞の、試薬、診断、結合化合物による、または別の細胞による、in vitroおよびex vivo処置を意味する。「処置」とは、ヒト、家畜、または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防的または予防的手段、研究および診断適用をいう。
【００８０】
「処置」は、治療剤が既知の治療活性を有する一つ以上の疾患症状を有する患者に、治療剤（たとえば、本開示の結合化合物のいずれかを含む組成物）を、内用または外用で投与することを意味する。典型的には、薬剤が治療された患者または集団における一つ以上の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与され、そのような症状の退行を誘導するか、または任意の臨床的に測定可能な程度までそのような症状の進行を阻害する。任意の特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢、および体重、ならびに患者において所望の応答を引き出す薬物の能力などの因子に従って変動し得る。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために、医師または他の熟練した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価され得る。本開示の実施形態（たとえば、治療方法または製品）は全ての患者における関心のある疾患症状を軽減するのに有効ではないかもしれないが、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、MannおよびWhitneyによるＵ検定、Kruskal−Wallis検定（Ｈ検定）、Jonckheere−Terpstra検定、およびWilcoxon検定などの当技術分野で公知の任意の統計学的検定によって決定される、統計学的に有意な数の患者における関心のある標的疾患症状を軽減すべきである。
【００８１】
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を包含する。有効量はまた、診断を可能にするかまたは容易にするのに十分な量を意味する。特定の患者または獣医学的被験体についての有効量は、処置される状態、患者の一般的健康、投与の経路および用量、ならびに副作用の重篤度のような因子に依存して変化し得る。有効量は、有意な副作用または毒性効果を回避する最大用量または投薬プロトコールであり得る。
【００８２】
「Ｔｍ値」は、タンパク質の熱変性中点、すなわち、タンパク質の半分が展開され、タンパク質の空間構造が破壊される温度を指す。したがって、Ｔｍ値が高いほど、タンパク質の熱安定性は高くなる。
【００８３】
本開示は、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施形態を用いてさらに説明される。特定の条件を特定しない本開示の実施形態における実験方法は、通常、従来の条件に従って、または原料もしくは商品の製造業者が推奨する条件に従って実施される。特定の供給源を有さない試薬は、市販されている日常的な試薬である。
【００８４】
実施形態では、Agilent-HPLC 1260高圧液体クロマトグラフ(Waters Xbridge（登録商標） BEH 200A SEC 3.5μm 7.8×300mmカラムおよびThermo ProPac （登録商標） WCX-10 BioLC（登録商標）、250×4mmカラム）を用いて、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＩＥＣ−ＨＰＬＣを測定した。Beckman PA800 plusキャピラリー電気泳動装置(SDS-Gel MWAnalysis Kit)を使用して、還元ＣＥ−ＳＤＳおよび非還元ＣＥ−ＳＤＳを測定した。GE MicroCalVP−Capillary DSC示差走査熱量計を使用して、タンパク質の熱変性温度中点（Ｔｍ）を測定した。Malvern Zetasizer Nano ZSナノ粒子サイズ電位差計を使用して、ＤＬＳ(動的光散乱）平均粒子サイズを測定した。
【００８５】
〔実施例１：ＰＤ−Ｌ１抗体の調製〕
(１)検出に用いるＰＤ−Ｌ１抗原およびタンパク質の調製
UniProt Programmed Cell Death１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１) アイソフォーム１（配列番号１９）のヒトＰＤ−Ｌ１全長遺伝子(Sino Biological Inc., HG10084-M）を、本開示のＰＤ−Ｌ１のテンプレートとして使用した。本開示の抗原および検出に使用されるタンパク質をコードする遺伝子配列を得て、任意に抗体の重鎖Ｆｃフラグメント（たとえば、ヒトＩｇＧ１）と組換え、ｐＴＴ５ベクター（Biovector, Cat#: 102762）またはｐＴａｒｇｅＴベクター（promega, A1410）にクローニングし、２９３Ｆ細胞（Invitrogen, R79007）における一過性発現またはＣＨＯ−Ｓ細胞（Invitrogen, k9000-20）の安定な発現に供し、精製して、本開示の抗原および検出タンパク質を得た。ヒトＰＤ−１遺伝子は、ORIGENE, Art. No. SC117011から購入した（NCBI Reference Sequence: NM_005018.1）。
【００８６】
１.ヒトＰＤ−Ｌ１全長アミノ酸配列
2020520939.tif 000002
（配列番号１９）
【００８７】
注：二重下線の部分はシグナルペプチド（１−１８）であり、一重下線の部分はＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（１９−２３８）であり、１９−１２７はＩｇ様Ｖ型ドメイン、１３３−２２５はＩｇ様Ｃ２型ドメイン、点線の下線の部分は膜貫通ドメイン（２３９−２５９）、斜体部分は細胞質ドメイン（２６０−２９０）である。
【００８８】
２.免疫原：ＨｉｓおよびＰＡＤＲＥタグを有するＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−Ｌ１（Extra Cellular Domain, abbr. ECD）−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６
2020520939.tif 000003
（配列番号２０）
【００８９】
注：一重下線の部分はＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインであり、点線の下線の部分はＰＡＤＲＥラベルであり、イタリック体の部分はＨｉｓ６−タグラベルである。
【００９０】
３.ＦＬＡＧおよびＨＩＳタグを伴うＰＤ−Ｌ１を得て、本開示の抗体の性能を試験するためにＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６を用いた。
2020520939.tif 000004
（配列番号２１）
【００９１】
注：一重下線の部分はＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインであり、点線の下線の部分はＦＬＡＧ−タグラベルであり、イタリック体の部分はＨｉｓ６−タグラベルである。
【００９２】
４．ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−ＦｃのＦｃ融合タンパク質を、本開示の免疫学的抗原または検出試薬として使用した。
ＶＫＬ−ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１）
2020520939.tif 000005
（配列番号２２）
【００９３】
注：一重下線の部分はＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインであり、イタリック体の部分はヒトＩｇＧ１  Ｆｃの部分である。
【００９４】
５．ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−ＦｃのＦｃ融合タンパク質を使用して、本開示の抗体の性能を試験した。
2020520939.tif 000006
（配列番号２３）
【００９５】
注：一重下線の部分はＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であり、イタリック体部分はｈＦｃ(ヒトＩｇＧ１）の部分である。
【００９６】
(２)ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１組換えタンパク質、ハイブリドーマ抗体、および組換え抗体の精製
【００９７】
１.「ＨｉｓおよびＰＡＤＲＥタグを有するＰＤ−Ｌ１」：ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６（配列番号２０）組換えタンパク質の精製
細胞発現上清試料を高速で遠心分離して不純物を除去し、緩衝液をＰＢＳで置換した後、イミダゾールを添加して最終濃度を５ｍＭとした。ニッケルカラムを、５ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で平衡化し、２〜５カラム容量で洗浄した。上清サンプルをＮｉカラム（GE, 17−5318−01）にロードした。カラムを、５ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳで、Ａ２８０読取値がベースラインに低下するまで洗浄した。カラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄して、非特異的結合不純タンパク質を除去し、流出液を回収した。標的タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳで溶出し、溶出ピークを収集した。回収した溶出液を濃縮し、移動相としてＰＢＳを用いたゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によりさらに精製した。ポリマーピークを廃棄し、溶出ピークを収集した。得られたタンパク質は、電気泳動の同定、ペプチドマッピング（Agilent,6530 Q-TOF）およびＬＣ-ＭＳ(Agilent, 6530 Q-TOF）により確認され、その後の使用に向けて小分けされた。ＨｉｓおよびＰＡＤＲＥタグを有するＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６（配列番号２）を得て、本開示の抗体の免疫原として使用した。
【００９８】
２．ＨｉｓタグおよびＦｌａｇタグを有するＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６（配列番号２１）組換えタンパク質の精製
試料を高速で遠心分離して不純物を除去し、所望の体積に濃縮した。上記のようにＩＭＡＣカラムから溶出したタンパク質ピークを、０．５×ＰＢＳ平衡フラグアフィニティーカラム（Sigma, A2220）に充填し、２〜５カラム容量で洗浄した。不純物を除去した後、細胞発現上清サンプルをカラムに充填した。Ａ２８０の読取値がベースラインに低下するまで、カラムを０．５×ＰＢＳで洗浄した。０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳでカラムを洗浄し、不純なタンパク質を溶出し、回収した。標的タンパク質を０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．５〜４．０）で溶出し、収集し、続いてｐＨを中性に調整した。回収した溶出液を濃縮し、移動相としてＰＢＳを用いたゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によりさらに精製した。ポリマーピークを廃棄し、溶出ピークを収集した。収集したサンプルを、電気泳動、ペプチドマッピングおよびＬＣ−ＭＳの同定によって確認し、その後の使用のために小分けした。ＨｉｓタグおよびＦｌａｇタグを有するＰＤ−Ｌ１、すなわちＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６（配列番号３）を、本開示の抗体の性能を試験するために得た。
【００９９】
３．ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１とのＦｃ融合タンパク質の精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、所望の体積に濃縮し、プロテインＡカラム（GE, 17-5438-01）に充填した。Ａ２８０読取値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。目的のタンパク質を、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出した。１ＭトリスＨＣｌによって中和したタンパク質を、ＰＢＳ平衡ゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によってさらに精製した。ポリマーピークを廃棄し、溶出ピークを収集し、その後の使用のために小分けした。この方法を用いて、ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−Ｆｃ(配列番号４）およびＰＤ−１（ＥＣＤ）−Ｆｃ(配列番号５）を精製した。ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−Ｆｃは本開示の免疫化抗原または検出試薬として使用することができ、ＰＤ−１（ＥＣＤ）−Ｆｃは、本開示の抗体の性能を試験するために使用することができる。
【０１００】
(３)抗ヒトＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマモノクローナル抗体の調製
【０１０１】
１.免疫化
抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を、マウスを免疫することから産生した。ここで、ＳＪＬ白色マウス、雌、６週齢((Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Beijing) 2012-0001）を使用した。給餌環境:ＳＰＦレベル。マウスを購入した後、マウスを実験室環境（１２／１２時間の明／暗サイクル調整、温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％）下で１週間飼育した。環境に適応したマウスを、二つのスキーム（スキームＡおよびスキームＢ）、一群当たり６〜１０で免疫した。免疫化抗原は、ＨｉｓおよびＰＡＤＲＥタグ：ＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６（配列番号２０）を有するＰＤ−Ｌ１であった。
【０１０２】
スキームＡにおいて、フロイントアジュバント（シグマロット番号:F5881/F5506）を乳化に使用した：完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を一次免疫に使用し、不完全フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）をレストブースト免疫に使用した。アジュバントに対する抗原の比は、１：１、１００μｇ／マウス（一次免疫）、５０μｇ／マウス（追加免疫）であった。乳化した抗原を、０日目に１００μｇ／マウスで腹腔内注射し、一次免疫後２週間毎に１回、合計６〜８週間注射した。
【０１０３】
スキームＢでは、Titermax(シグマロット番号:T2684）およびAlum(Thremoロット番号: 77161）を交差免疫化に使用した。アジュバントに対する抗原の比率（Titermax）は１：１であり、アジュバントに対する抗原の比率（Alum）は３：１、マウスあたり１０〜２０μｇ／μｇ（一次免疫）、およびマウスあたり５μｇ／μｇ（追加免疫）であった。乳化した抗原を０日目に２０／１０μｇ／マウスで腹腔内注射し、一次免疫後週１回注射した。ＴｉｔｅｒｍａｘをＡｌｕｍと交換可能に６〜１１週間使用した。免疫化の４週間後、抗原を、背部塊および腹部腫脹の状態に基づいて、背部または腹腔内注射によって投与した。
【０１０４】
２.細胞融合
プラトーに達する傾向がある高い血清抗体力価を有するマウスを脾細胞融合のために選択した。脾細胞融合の７２時間前に、ショック免疫化を腹腔内注射によって行った。ハイブリドーマ細胞は、脾臓リンパ球を骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８２８７（登録商標））と、最適化されたＰＥＧ媒介融合手法を介して融合させることによって得た。ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ‐１６４０培地）に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（１×１０５／１５０μＬ／ウェル）に分取し、続いて５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃でインキュベートした。融合後５日目に、ＨＡＴ完全培地を５０μＬ／ウェル添加し、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃でインキュベートした。融合後７日目から８日目まで、細胞増殖濃度に応じて、２００μＬ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ、１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）で全培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１０５】
３.ハイブリドーマ細胞スクリーニング
融合１０日目〜１１日目に、細胞増殖密度に応じてＰＤ−Ｌ１結合のＥＬＩＳＡ法を行った。ＥＬＩＳＡで検出された陽性ウェルの細胞は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１結合のＥＬＩＳＡをブロックした。陽性ウェル中の培地を交換し、陽性細胞を細胞密度に従って２４ウェルプレートに増殖させた。２４ウェルプレートに移された細胞は、再試験に供され、次いで、細胞保存および最初のサブクローニングに供された。最初のサブクローニング後にスクリーニングした陽性のものを細胞保存に供し、続いて２回目のサブクローニングに供した。最初のサブクローニング後にスクリーニングした陽性のものを細胞保存に供し、続いてタンパク質発現に供した。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の結合をブロックしたハイブリドーマ細胞を、複数の融合によって得た。
【０１０６】
ハイブリドーマクローン細胞１および２を、ブロッキングアッセイおよび結合アッセイによってスクリーニングした。抗体は腹水法または無血清細胞培養法によってさらに調製され、抗体は試験実施形態で使用するための精製実施形態に従って精製された。
【０１０７】
マウス抗体の可変領域配列は配列決定によって得られ、ここで、ハイブリドーマクローンのＣＤＲ可変領域配列は以下の表１に示された:
【０１０８】
【表１】
2020520939.tif 000007
【０１０９】
ここで、Ｘ１はＮまたはＴから選択され、Ｘ２はＲまたはＨから選択され、Ｘ３はＮまたはＨから選択され、Ｘ４はＨまたはＧから選択され、Ｘ５はＧまたはＦから選択される。
【０１１０】
(４)抗ヒトＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化
重鎖および軽鎖可変領域において高い相同性を有する生殖系列遺伝子を、ＩＭＧＴおよびＭＯＥソフトウェアのヒト抗体重鎖可変領域生殖系列遺伝子データベースとアラインメントさせることによって、テンプレートとして選択した。マウス抗体１および２のＣＤＲを対応するヒト化テンプレートに移植し、親和性成熟させて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の可変領域配列を形成した。
【０１１１】
マウス抗体１のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ４−１＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ４−３０−４＊０１およびｈｊｈ２であり、ヒト化可変領域配列は以下のとおりである。
【０１１２】
＞１  ｈＶＨ  ＣＤＲ移植片
2020520939.tif 000008
（配列番号２４）
【０１１３】
＞１  ｈＶＬ  ＣＤＲ移植片
2020520939.tif 000009
（配列番号２５）
【０１１４】
マウス抗体２のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ７−３＊０１およびｈｊｋ２．１であり、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１−４６＊０１およびｈｊｈ６．１であり、ヒト化可変領域の配列は以下の通りである。
【０１１５】
＞２ｈＶＨ．１
2020520939.tif 000010
（配列番号２６）
【０１１６】
＞２−ｈＶＬ．１
2020520939.tif 000011
（配列番号２７）
【０１１７】
注：順序はＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であり、イタリック体の部分はＦＲ配列であり、下線の部分はＣＤＲ配列である。
【０１１８】
(５)ヒト化クローン構築
各ヒト化抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築するようにプライマーを設計し、次いで発現ベクターｐＨｒ(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）断片を有する）と相同的に組換えて、全長抗体発現ベクターＶＨＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＫ−ＣＬ−ｐＨｒを構築した。
【０１１９】
１.プライマー設計
オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ(ｖ３．２．２）（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、組換えに必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫを合成するための複数のプライマー：５’−３０ｂｐシグナルペプチド＋ＶＨ／ＶＫ＋３０ｂｐＣＨ１／ＣＬ−３’を設計した。プライマー設計原理：標的遺伝子２と標的遺伝子１との間に異なるアミノ酸が存在する場合、図１に示すように、突然変異部位を含む別のプライマーを設計した。
【０１２０】
２.フラグメントスプライシング
ＴａＫａＲａプライマーＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼの操作説明書に従って、組換えに必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫを、上記で設計された複数のプライマーを使用する２段階ＰＣＲ増幅によって得た。
【０１２１】
３.発現ベクターｐＨｒの構築および酵素消化（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを用いる）
発現ベクターｐＨｒ(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）を、認識配列が制限部位とは異なる特別な設計を有するいくつかの特別な制限エンドヌクレアーゼ（たとえば、ＢｓｍＢＩ）を使用することによって構築した。構築の概略図を図２に示し、ベクターをＢｓｍＢＩで消化し、ゲルを抽出して使用した。
【０１２２】
４.発現ベクターＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＫ−ＣＬ−ｐＨｒの組換え構築
組換えに必要なＶＨ／ＶＫを含む遺伝子断片および回収した発現ベクターｐＨｒ(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）断片を含む）を、３：１のモル比でＤＨ５Ｈコンピテント細胞に添加し、０℃の氷浴中で３０分間維持し、４２℃で９０秒間熱ショックに供し、続いて５倍容量のＬＢ培地を添加し、３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＢ−Ａｍｐプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一クローンを選択し、標的クローンを得るために配列決定のために送った。
【０１２３】
(６)抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化抗体の親和性成熟
【０１２４】
１.ヒト化ＰＤ−Ｌ１抗体１および２のファージミドベクターの構築
ヒト化ＰＤ−Ｌ１抗体１および２は野生型配列（すなわち、親和性成熟のためにスクリーニングされた変異配列に対応する元の配列または開始配列）として、それぞれｓｃＦｖモード（ＶＨ−（ＧＧＧＳ）３−ＶＬ）でファージミドベクターに構築された。ＶＨ、（ＧＧＧＳ）３リンカーおよびＶＬをオーバーラップＰＣＲにより集合させ、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限認識部位を介してファージミドベクターに連結した。
【０１２５】
２.ファージディスプレイライブラリーの構築
構築した野生型ｓｃＦｖをテンプレートとして使用し、コドンベースのプライマーを使用した。プライマー合成プロセスにおいて、突然変異領域中の各コドンは５０％の野生型コドンおよび５０％のＮＮＫを有し（リバースプライマーはＭＮＮであった。）、これは突然変異体ライブラリーを構築するために全てのＣＤＲ領域に突然変異を導入した。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ファージミドベクターに連結し、最後に大腸菌ＴＧ１に電気的に形質転換した。独立したライブラリーを、各コドンベースのプライマーによって構築し、ここで、抗体１を７つのライブラリーに分割し、そして抗体２を８つのライブラリーに分割した。
【０１２６】
３.ライブラリパニング
ライブラリーをレスキューし、パニングのためのファージ粒子のためにパッケージングした後、ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１（ＥＣＤ）抗原およびストレプトアビジン磁気ビーズを液相パニングのために使用し、スクリーニングの各ラウンド後の抗原濃度を、前のラウンドと比較して減少させた。３ラウンドのパニングの後、２５０個のクローンを抗体１および抗体２から選択し、それぞれ結合活性を検出するためにファージＥＬＩＳＡに供し、続いて陽性クローンを配列決定した。
【０１２７】
４.親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出
クローンを配列決定した後、冗長配列を除去し、非冗長配列を哺乳動物細胞発現のために全長ＩＧ(γ１、κ）に変換した。アフィニティー精製後の全長ＩＧを、BIAcoreTM X-100(GE Life Sciences)を用いてアフィニティー検出に供した。
【０１２８】
親和性成熟後のヒト化抗体２の可変領域配列を以下に示す。
【０１２９】
重鎖可変領域
2020520939.tif 000012
（配列番号１３）
【０１３０】
ここで、ＣＤＲ２のＸ４はＧであり、Ｘ５はＦである。
【０１３１】
軽鎖可変領域
2020520939.tif 000013
（配列番号１４）
【０１３２】
注：配列中のイタリック体部分はＦＲ配列であり；下線部分はＣＤＲ配列であり；そして二重下線部分は親和性成熟スクリーニング後に得られた部位である。
【０１３３】
親和性成熟後のヒト化抗体１の可変領域配列は以下の通りである。
【０１３４】
重鎖可変領域
2020520939.tif 000014
（配列番号２８）
【０１３５】
ここで、ＣＤＲ１のＸ４はＴである。
【０１３６】
軽鎖可変領域
2020520939.tif 000015
（配列番号２９）
【０１３７】
ここで、ＣＤＲ１のＸ２はＨであり、Ｘ3はＨである。
【０１３８】
親和性成熟によって得られたクローンをＩｇＧ４型に変換し、コアヒンジ領域がＳ２２８Ｐ変異を含むＩｇＧ４を選択して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを含まない抗体を得て、抗体２から得られた抗体をＨＲＰ０００５２と命名した。
【０１３９】
以下の遺伝子配列（配列番号１６および１８）の最後の三つのヌクレオチド「ＴＧＡ」は終止コドンであり、いかなるアミノ酸もコードしない。
【０１４０】
ＨＲＰ０００５２抗体の重鎖配列
2020520939.tif 000016
（配列番号１５）
【０１４１】
ＨＲＰ０００５２抗体の遺伝子配列をコードする重鎖配列
2020520939.tif 000017
（配列番号１６）
【０１４２】
ＨＲＰ０００５２抗体の軽鎖配列
2020520939.tif 000018
（配列番号１７）
【０１４３】
ＨＲＰ０００５２抗体の遺伝子配列をコードする軽鎖配列
2020520939.tif 000019
（配列番号１８）
【０１４４】
注：下線を付した部分は抗体重鎖もしくは軽鎖の可変領域配列、またはそれをコードするヌクレオチド配列であり；非線部分は抗体定常領域配列およびその対応するコードヌクレオチド配列である。
【０１４５】
ＰＤ−Ｌ１抗体ＨＲＰ０００５２を発現するための発現プラスミドを構築した。重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、およびその対応するプロモーター、ならびにそのポリアデニル化シグナル配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。発現ベクターをＣＨＯ細胞系にトランスフェクトした。抗体を発現するクローンを、増殖および産生安定性に基づいて選択し、続いてマスターシードバンクを調製し、これを使用して抗体を調製し、その後マスターセルバンクを作製した。
【０１４６】
マスターセルバンクからの細胞を振とうフラスコ、培養バッグおよびシードバイオリアクター中で増殖させ、得られたシード細胞を用いてバイオリアクターにより抗体産物を産生した。得られた抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー、ならびにウイルスを除去するための低ｐＨウイルス不活化および濾過工程によるさらなる精製に供した。具体的な精製工程は以下の通りであった。細胞発現上清サンプルを、ＰＢＳ緩衝液平衡化プロテインＡカラム（Merck, 175118824）に充填した。カラムを、Ａ２８０読取値がベースラインまで低下するまでＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢ緩衝液で洗浄して、不純なタンパク質を除去した。標的タンパク質を５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出し、溶出したピークを収集した。精製物を１Ｍトリスで中和し、ＰＢ緩衝液で平衡化した陰イオンクロマトグラフィーカラム（GE, 17-5316-10）にロードし、フロースルーピークを収集し、１Ｍクエン酸でｐＨ５．０に調整した。陰イオンクロマトグラフィー後、タンパク質を、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオンクロマトグラフィーカラム（Merck, 1.168882）でさらに精製した。標的タンパク質を、０．１８Ｍ塩化ナトリウムを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出し、溶出したピークを収集し、その後の使用のために等分した。
【０１４７】
〔実施例２〕
実験は、ＰＤ−Ｌ１調製物の緩衝系、緩衝液濃度、ｐＨ値、糖類タイプおよび糖類濃度（１ｍｇ／ｍＬ）に基づいて設計した。試料のＴｍ値をＤＳＣ技術によって測定し、調製物の製剤を最初にスクリーニングした。
【０１４８】
緩衝液系、緩衝液濃度、ｐＨ値、糖類の種類および糖類濃度を因子として用い、Ｔｍ値を応答値として用いて試験を設計し、設計表を作成した。Ｔｍ値は、設計表の実験群に従って決定した。
【０１４９】
表２：Ｔｍ値応答を有するＤＳＣ結果
【表２】
2020520939.tif 000020
【０１５０】
Ｔｍ値を応答値として使用し、モデルを実験結果に従って適合させた。Ｒ２値は０．９９９８７、調整Ｒ２値は０．９９７９１１３、分散解析ではＰ＝０．０３４８＜０．０５であり、モデルが効果的であり、結果が信頼できることが示された。
【０１５１】
注：糖濃度の単位はｇ／１００ｍＬである。
【０１５２】
Ｔｍの値を最大にする原理に従い、Ｔｍ因子の主要な効果図（図３）によって定式化を予備的に選択した。緩衝系については（酢酸ナトリウム）がより良好であり、続いて（コハク酸ナトリウム）であり、緩衝液濃度が２０〜３０ｍＭである場合、Ｔｍ値はより高く、ｐＨ５〜５．６はＴｍ値に対して有意な効果を有さず、最良の糖類濃度は６％である。
【０１５３】
〔実施例３〕
抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＨＲＰ０００５２）を、１０ｍＭコハク酸（ナトリウム）、酢酸（ナトリウム）、６０ｍｇ／ｍＬスクロース、および０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０、をそれぞれｐＨ５．０〜５．５で含有する調製物に製剤化し、タンパク質濃度は５０ｍｇ／ｍＬであった。各調製物を濾過し、ブロモブチルゴム栓で密封した中性ホウケイ酸ガラス注射バイアルに充填し、２〜８℃で長期安定性を観察した。サンプルの安定性は、表３に示される種々の特徴によって例示された。
【０１５４】
試料の色、外観および透明度を、黒色バックグラウンドを有する室温での白色蛍光下での試料の目視検査によって決定した。標本の純度はさらに高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって評価され、モノマーの割合だけでなく高分子量物質（おそらく集合体）の割合と後期溶出ピーク（おそらく分解生成物）を決定した。純度は高速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰ−ＩＥＸ）を用いて酸性または塩基性変異体の存在を明らかにすることによって評価し、結果は、観察された全物質のパーセンテージとして表した。試料をＣＥ−ＳＤＳ技術によって分析し、ここでタンパク質を還元および非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性させ、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いて分離した。タンパク質を、それらの見かけの分子量に基づいて分離した。非還元条件下で、主要なＩｇＧピークを除く全ての物質を不純物として分類した。還元条件下で、ＩｇＧを重鎖と軽鎖に分割し、他の全ての物質を不純物として分類した。
【０１５５】
その結果、コハク酸緩衝液系における抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の安定性は酢酸緩衝液系よりも有意に良好であり、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体はｐＨ５．０〜５．５で非常に安定であった。
【０１５６】
表３：ＰＤ−Ｌ１抗体の長期安定性に及ぼすｐＨおよび緩衝系の影響（２〜８℃）
【表３】
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【０１５７】
〔実施例４〕
抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、それぞれ１０ｍＭおよび２０ｍＭコハク酸（ナトリウム）（ｐＨ５．２）中に６０ｍｇ／ｍＬスクロースおよび０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を含有する調製物に製剤化し、タンパク質濃度は５０ｍｇ／ｍＬであった。各調製物を濾過し、ブロモブチルゴム栓で密封した中性ホウケイ酸ガラス注入バイアルに充填し、続いて４０℃で加速し、２〜８℃で長期安定性を観察した。結果は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が１０〜２０ｍＭコハク酸緩衝系中で非常に安定であることを示した。
【０１５８】
表４：異なる緩衝系濃度を有する調製物の安定性（４０℃）
【表４】
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【０１５９】
表５：異なる緩衝系濃度を有する調製物の安定性（４０℃）
【表５】
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【０１６０】
〔実施例５〕
５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−ＬＩ抗体（ＨＲＰ０００５２）、ｐＨ５．２の２０ｍＭ酢酸（ナトリウム）および６０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ならびに異なるタイプおよび濃度の界面活性剤を含有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体調製物を調製した。各調製物を濾過し、ブロモブチルゴム栓で密封した中性ホウケイ酸ガラス注入バイアルに充填し、２５℃の恒温振とう器上に置き、２００ｒｐｍで振とうした。
【０１６１】
ＤＬＳ（動的光散乱）を用いて平均拡散係数を測定し、これを用いて溶液中のナノサイズ粒子の粒径および粒径分布を特徴づけた。ＰＤＩ（粒子分散指数）分布係数は、粒子サイズの均一性を反映する。ＰＤＩ値が低いほど、粒径分布は狭く、粒径はより均一である。
【０１６２】
安定性は、０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０またはポリソルベート８０が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の凝集および凝集した大きな粒子の形成を効果的に妨げたことを示した。
【０１６３】
表６：ポリソルベートの種類および濃度の異なる振とう試験の結果
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１６４】
〔実施例６〕
５０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−ＬＩ抗体（ＨＲＰ０００５２）、２０ｍＭコハク酸（ナトリウム）（ｐＨ５．２）および６０ｍｇ／ｍＬスクロース、ならびに異なるタイプおよび濃度の界面活性剤を含有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体調製物を調製した。各調製物を濾過し、ブロモブチルゴム栓で密封した中性ホウケイ酸ガラス注入バイアルに充填し、安定性試験のために２〜８℃に置いた。その結果、ポリソルベート８０はポリソルベート２０よりも有意に良好であり、各濃度間に有意差はなかった。
【０１６５】
表７：ポリソルベートの種類と濃度が異なる製剤の安定性の結果（２〜８℃）
【表７−１】
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【表７−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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