(57)【要約】  血栓形成に続く自然生体防御応答の進行におけるメタボロリピドミクスプロファイル及びＳＰＭシグネチャーを提供するための方法が開示される。前記方法は、患者の血液サンプル中における、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに特異性炎症促進性メディエータＳＰＭの１つ以上の測定値を取得する工程を有し、前記サンプルは血栓形成若しくは凝固の時間経過中又は血栓形成若しくは凝固に続いて得られたものである。これらの測定値から、個別メタボロリピドミクスプロファイルを得ることができる。前記測定値を正常又はリファレンス血液から得られた測定値と比較することにより比較プロファイルを展開することができる。その後前記プロファイル比較プロファイルを医学的又は治療上の判断を行うために用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓形成に続く自然生体防御応答の進行におけるメタボロリピドミクスプロファイル及びＳＰＭシグネチャーを提供するための方法であって、
（ａ）患者の血液サンプル中における、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに特異性炎症促進性メディエータ（ＳＰＭ）の１つ以上の測定値を取得する工程を有し、
前記サンプルは血栓形成若しくは凝固の時間経過中又は血栓形成若しくは凝固に続いて得られたものであり、
個別メタボロリピドミクスプロファイルを得る
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
（ｂ）前記測定値を正常又はリファレンス血液から得られた測定値と比較し、これにより比較プロファイルを展開する工程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）請求項１又は２に記載の前記プロファイルを医学的又は治療上の判断を行うために用いる工程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血液サンプルは全血であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血栓形成又は凝固は、前記サンプルを負に帯電した表面に接触させて配置することで開始されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルを、前記血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを放出するために凍結融解することにより透過処理し、
前記透過処理をする工程を、前記測定値の取得前に行う
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、前記測定値の取得前に精製することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、タンパク質を除去するための薬剤を追加することで精製することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、固相抽出により精製することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定値を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法で取得することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記メタボロリピドミクスプロファイルは、血栓形成に続く初期のエイコサノイドＴｘＢ2、ＬＴＢ4及びＰＧＤ2の出現と、後期の特異的ＳＰＭ含有クラスターの出現とを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記特異的ＳＰＭクラスターは、ＲｖＥ１、ＲｖＤ５、ＲｖＤ１、ＭａＲ１及びＬＸＢ4を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体外でアデノシンを除去する工程をさらに有し、前記アデノシンの除去を前記１つ以上の測定値を取得する前に行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記特異的ＳＰＭクラスターは、前記メタボロリピドミクスプロファイルに特有のクラスター中において促進され、第２のＳＰＭクラスターは前記プロファイルの中でアンマスクされるとともに前記プロファイルの中で表現されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アデノシンを、アデノシンデアミナーゼを用いた前記サンプルのインキュベートによって除去することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
アデノシンデアミナーゼを、４ｍｌの全血毎に２００ｍＵの濃度で用いることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アデノシンの除去によりアンマスクされた前記第２のＳＰＭクラスターは、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４及びＲｖＤ６を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記医学的又は治療上の判断は、疾病、病気、障害又は健康上の欠乏のうちの少なくとも１つの診断であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の前記プロファイルを測定するためのキットであって、
ａ．ヒト組換え型アデノシンデアミナーゼを含む負に帯電したチューブと、
ｂ．ｄ８−５−ＨＥＴＥ、ｄ５−ＲｖＤ２、ｄ５−ＬＸＡ4、ｄ４−ＬＴＢ4及びｄ４−ＰＧＥ2を含む内部基準の混合物と、
ｃ．個々の脂質メディエータクラスター（クラスターＡ−Ｆ）に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｄ．レゾルビンＤ１、レゾルビンＤ２、レゾルビンＤ３、レゾルビンＤ４、レゾルビンＤ５及びレゾルビンＤ６に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｅ．リポキシンＡ4、リポキシンＢ4、１５−ｅｐｉ−リポキシンＡ4（アスピリン誘発リポキシンＡ4）及び１５−ｅｐｉ−リポキシンＢ4（アスピリン誘発リポキシンＢ4）に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｆ．プロテクチンＤ１及び１７−ｅｐｉ−プロテクチンＤ１（アスピリン誘発プロテクチンＤ１）に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｇ．マレシン１及びマレシン２に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｈ．レゾルビンＥ１、レゾルビンＥ２及びレゾルビンＥ３に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｉ．炎症、感染及び炎症収束の診断のため並びに脂肪酸栄養及び補給をモニターするための液体クロマトグラフィー分離及び質量分析法による定量化のために脂質メディエータを捕捉及び分離するためのカートリッジ内に入れられた上記（ｃ−ｈ）脂質メディエータに特異的な抗体と、
ｊ．患者の血液由来ＳＰＭの分離及びヒト全血内の貪食及び細菌殺菌の測定によるそれらの機能的生理活性の試験のための（上記ｉで記載されたような）抗体カートリッジと、からなるグループから選択される少なくとも１つの構成要素を備える
ことを特徴とするキット。
【請求項２０】
自然生体防御の進行におけるメタボロリピドミクスプロファイル及びＳＰＭシグネチャーを提供するための方法であって、
（ａ）患者のサンプル中における１つ以上の測定値を取得する工程を有し、
前記サンプルは、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに特異性炎症促進性メディエータ（ＳＰＭ）の組織又は体液又は排泄物であり、
個別メタボロリピドミクスプロファイルを得る
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
（ｂ）前記測定値を正常又はリファレンス組織又は体液又は排泄物血液から得られた測定値と比較し、これにより比較プロファイルを展開する工程をさらに有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｃ）請求項２０又は２１に記載の前記プロファイルを医学的又は治療上の判断を行うために用いる工程をさらに有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは組織サンプルであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルは、細胞外液、母乳、尿、唾液及び糞便のうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルを、前記血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを放出するために凍結融解することにより透過処理し、
前記透過処理する工程を、前記測定値の取得前に行う
ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、前記測定値の取得前に精製することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、タンパク質を除去するための薬剤を追加することで精製することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、固相抽出により精製することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記測定値を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法で取得することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記メタボロリピドミクスプロファイルは、血栓形成に続く初期のエイコサノイドＴｘＢ2、ＬＴＢ4及びＰＧＤ2の出現と、後期の特異的ＳＰＭ含有クラスターの出現とを有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記特異的ＳＰＭクラスターは、ＲｖＥ１、ＲｖＤ５、ＲｖＤ１、ＭａＲ１及びＬＸＢ4を含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
生体外でアデノシンを除去する工程をさらに備え、前記アデノシンの除去が前記１つ以上の測定値を取得する前に行われることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記特異的ＳＰＭクラスターは、前記メタボロリピドミクスプロファイルに特有のクラスター中において促進され、第２のＳＰＭクラスターは前記プロファイルの中でアンマスクされるとともに前記プロファイルの中で表現されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
アデノシンを、アデノシンデアミナーゼを用いた前記サンプルのインキュベートによって除去することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
アデノシンデアミナーゼを、４ｍｌの全血毎に２００ｍＵの濃度で用いることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アデノシンの除去によりアンマスクされた前記第２のＳＰＭクラスターは、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４及びＲｖＤ６を含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記医学的又は治療上の判断は、疾病、病気、障害又は健康上の欠乏のうちの少なくとも１つの診断であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２０〜３７に記載の前記プロファイルを測定するための装置であって、
前記キットは、
ｋ．ヒト組換え型アデノシンデアミナーゼを含む負に帯電したチューブと、
ｌ．ｄ８−５−ＨＥＴＥ、ｄ５−ＲｖＤ２、ｄ５−ＬＸＡ4、ｄ４−ＬＴＢ4及びｄ４−ＰＧＥ2を含む内部基準の混合物と、
ｍ．個々の脂質メディエータクラスター（クラスターＡ−Ｆ）に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｎ．レゾルビンＤ１、レゾルビンＤ２、レゾルビンＤ３、レゾルビンＤ４、レゾルビンＤ５及びレゾルビンＤ６に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｏ．リポキシンＡ4、リポキシンＢ4、１５−ｅｐｉ−リポキシンＡ4（アスピリン誘発リポキシンＡ4）及び１５−ｅｐｉ−リポキシンＢ4（アスピリン誘発リポキシンＢ4）に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｐ．プロテクチンＤ１及び１７−ｅｐｉ−プロテクチンＤ１（アスピリン誘発プロテクチンＤ１）に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｑ．マレシン１及びマレシン２に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｒ．レゾルビンＥ１、レゾルビンＥ２及びレゾルビンＥ３に特異的な抗体検出分析試薬と、
ｓ．炎症、感染及び炎症収束の診断のため並びに脂肪酸栄養及び補給をモニターするための液体クロマトグラフィー分離及び質量分析法による定量化のために脂質メディエータを捕捉及び分離するためのカートリッジ内に入れられた上記（ｃ−ｈ）脂質メディエータに特異的な抗体と、
ｔ．患者の血液由来ＳＰＭの分離及びヒト全血内の貪食及び細菌殺菌の測定によるそれらの機能的生理活性の試験のための（上記ｉで記載されたような）抗体カートリッジと、からなるグループから選択される少なくとも１つの構成要素を備える
ことを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１６年１１月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４２５，３６７号の利益を主張し、当該仮特許出願の内容は全て参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０００２】
＜連邦政府の支援による研究に関する言明＞
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられたＲ０１ＧＭ３８７６５、Ｒ０１ＧＭ３８７６５−２９Ｓ１及びＰ０１ＧＭ０９５４６７による政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、概して医学的又は治療上の判断をするためのシステム及び方法に関する。より具体的には、本開示は、医学的又は治療上の判断をするために患者の血液サンプルの血栓形成又は凝固の時間経過において行われる測定の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
バリアの損傷は、出血、感染並びに止血のプロセス、急性炎症反応及び組織再生によって自然に対処される組織破壊といった形で人間の健康に複数の驚異をもたらす（１−３）。止血（「出血を止めること」）は、外因系又は内因系の開始を介して急速に進行し凝固及び血栓形成に収束する。これらの事象は、止血栓内の血小板、好中球及び単球の活性化の間に炎症を伴う（４，５）。特定のアラキドン酸由来エイコサノイドは止血及び炎症において必要不可欠な役割を果たし、例えば、トロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２；その他の脂質メディエータの略語については表１参照）は有力な血栓形成促進性のメディエータであり、一方でプロスタグランジン及びロイコトリエン（６，７）は共同で血管透過性を高め、損傷部位に好中球を動員し、そしてロイコトリエン生合成から特異的炎症収束性メディエータＳＰＭ生成への脂質メディエータ（ＬＭ）クラススイッチングのために好中球を位置付ける（８）。これにより、炎症から炎症収束への遷移の中枢となるプロセスである特異的炎症収束性メディエータ（ＳＰＭ；図４参照）の生成が可能となる（８−１１）。次に、ＳＰＭは、前炎症性メディエータ（例えば、サイトカイン及びＬＭ）を逆調整し、エフェロサイトーシス（死にゆく及び死滅細胞の貪食作用）及び創傷治癒を加速するとともに、免疫抑制を伴わずに貪食作用を促進することによって抗生物質の必要性を部分的に低減する（８，１２）。したがって、ＳＰＭは、炎症及び感染の治癒のアゴニストであることから免疫抗原であると考えられる（１３）。
【０００５】
したがって、血栓形成中に生成されたＳＰＭと免疫応答との間のこれまで未発見の相互作用を活用する方法を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
一側面において、本開示は、血栓形成に続く自然生体防御応答の進行におけるメタボロリピドミクスプロファイル及びＳＰＭシグネチャーを提供するための方法であって、（ａ）患者の血液サンプル中における、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに特異性炎症促進性メディエータ（ＳＰＭ）の１つ以上の測定値を取得する工程を有し、前記サンプルは血栓形成若しくは凝固の時間経過中又は血栓形成若しくは凝固に続いて得られたものであり、個別メタボロリピドミクスプロファイルを得る方法を提供する。
【０００７】
他の実施形態では、前記方法は（ｂ）前記測定値を正常又はリファレンス血液から得られた測定値と比較し、これにより比較プロファイルを展開し、前記プロファイルを医学的又は治療上の判断を行うために用いる工程をさらに有する。
【０００８】
一部の側面では、前記血栓形成又は凝固は前記サンプルを負に帯電した表面に接触させて配置することで開始され、前記サンプルを、前記血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを放出するために凍結融解（freeze-thaw）することにより透過処理し、この透過処理する工程を前記測定値の取得前に行う。
【０００９】
一部の側面では、請求項６に記載の方法において、前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを、前記測定値の取得前に精製する。
【００１０】
一部の側面では、前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭをタンパク質を除去するための薬剤を追加することで精製し、前記放出された血栓促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに前記ＳＰＭを固相抽出により精製する。
【００１１】
通常、前記メタボロリピドミクスプロファイルは、血栓形成に続く初期のエイコサノイドＴｘＢ2、ＬＴＢ4及びＰＧＤ2の出現と、後期の特異的ＳＰＭ含有クラスターの出現とを有する。通常、前記特異的ＳＰＭクラスターは、ＲｖＥ１、ＲｖＤ５、ＲｖＤ１、ＭａＲ１及びＬＸＢ4を含む。
【００１２】
一側面では、請求項１に記載の方法は、生体外でアデノシンを除去する工程をさらに有し、前記アデノシンの除去は前記１つ以上の測定値を取得する前に行われる。この側面において、前記特異的ＳＰＭクラスターは、前記メタボロリピドミクスプロファイルに特有のクラスター中において促進され、第２のＳＰＭクラスターは前記プロファイルの中でアンマスクされる(unmasked)とともに前記プロファイルの中で表現される。通常、アデノシンの除去によりアンマスクされた前記第２のＳＰＭクラスターは、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４及びＲｖＤ６を含む。
【００１３】
別の側面において、方法は、自然生体防御の進行におけるメタボロリピドミクスプロファイル及びＳＰＭシグネチャーを提供し、（ａ）患者のサンプル中における１つ以上の測定値を取得する工程を有し、前記サンプルは、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに特異性炎症促進性メディエータ（ＳＰＭ）の組織又は体液又は排泄物であり、個別メタボロリピドミクスプロファイルを得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｅはヒト血栓形成がＳＰＭ及びエイコサノイドの内因的一時的生成を開始することを説明する図である。図１Ａ〜図１Ｅについて、新たに採血したヒト末梢血をシリコン被覆チューブ内で３７℃で示された時間インキュベートし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（例１の［材料及び方法］を参照）のためにサンプルを急速凍結することで凝固を停止させた。図１Ａは、血栓形成中の血液サンプルにおける７５０ｎｍでの光透過率の相対的変化の時間的経過を示す。
【図１Ｂ】サンプル中に確認されたＳＰＭ（上）及びエイコサノイド（下）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。ａ＝６−ｔｒａｎｓ−ＬＴＢ4、ｂ＝ ６−ｔｒａｎｓ，１２−ｅｐｉ−ＬＴＢ4及びｃ＝５Ｓ，１２Ｓ−ｄｉＨＥＴＥである。
【図１Ｃ】ＭＳ／ＭＳスペクトルと、示された確認されたメディエータについての診断用イオンである。図１Ａ〜図１Ｃ中のデータは１２人のドナーを代表する。
【図１Ｄ】血液サンプル中のＳＰＭクラスター及びエイコサノイドの示されたメンバーの濃度の時間変化である。データは、１２回の実験の平均±ＳＥＭである。ボンフェローニの多重比較検定を用いた１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１及び****Ｐ＜０．０００１対ゼロ時間時点。
【図１Ｅ】１２人の個々のドナーからのメディエータの一時的なクラスタリングを示す代表ＰＣＡスコアプロット（上）とローディングプロット（下）である。灰色は、静脈穿刺及び抗凝固剤を含まないシリコン被覆チューブ内への血液の配置から０時間後を示し、青色は０．２５時間後、赤色は３時間後、緑色は２４時間後を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｆはヒト血液中のＳＰＭ形成の制御因子を説明する図である。図２Ａ〜図２Ｅにおいて、ヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）を含む新たに採血したヒト末梢血（４ｍｌ）をポリプロピレンチューブ（図２Ａ）内に配置し、一方で抗凝固剤を含まないヒト末梢血をシリコン被覆チューブ（図２Ｂ〜図２Ｅ）内に配置し、３７℃で０から２４時間の時間的経過でインキュベートした（例１の［材料及び方法］を参照）。その後サンプルを抽出及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために急速凍結した。図２Ａは、インキュベート期間中にヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）を用いずに（「凝固」）又は用いて処理したサンプル内のＳＰＭクラスター（図１Ａ〜１Ｅに示す）のメンバーの濃度である。データは、３人の個々のドナーの平均±ＳＥＭである。
【図２Ｂ】左は、αIIｂβ３阻害剤エプチフィバチド（エプチフィバチド；２０μＭ）の存在下又は非存在下における２４時間の凝固後の全ＳＰＭクラスター、プロスタグランジン及びトロンボキサンの総濃度である。真ん中は、示されたサンプルの２４時間の凝固後の血栓体積である。右は、代表血栓画像である。データは、３人の個々のドナーの平均±ＳＥＭである。
【図２Ｃ】２００ｍＵのＡＤＡの存在下又は非存在下における２４時間の凝固後の全ＳＰＭの濃度及び示された個々のＳＰＭの濃度である。データは、３人の個々のドナーの平均±ＳＥＭである。比率ｔ検定による、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。
【図２Ｄ】上は、ＡＤＡの存在下又は非存在下における凝固中の示された時点における全血中のアデノシン濃度のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定である。ゼロ時間時点と比較した場合**Ｐ＜０．０１。下は、ＡＤＡの非存在下（凝固）又は存在下で示された時間凝固を許された全血中のＣＤ１６及びＣＤ４２ｂについてダブルポジティブであるとして定義される好中球−血小板凝集体の割合のフローサイトメトリー分析である。データは、５人の個々のドナーの平均±ＳＥＭである。スチューデントのｔ検定による、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。ドットプロット及びゲーティングについては図７Ｂを参照。
【図２Ｅ】ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションプロファイルと図２Ｃで確認された示されたＳＰＭについての診断用イオンを示す。
【図２Ｆ】左はＰＣＡスコアプロットである。赤色は１時間の＋ＡＤＡ、黄色は１時間の凝固、緑色は２４時間の凝固、青色は２４時間の＋ＡＤＡを示す。右は、３人の個々のドナーからの示されたメディエータの一時的なクラスタリングを示すＰＣＡローディングプロットである。赤色は１時間でＬＭ、青色は２４時間ＡＤＡであったものを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｄは全血の凝固中に生成されたＳＰＭが貪食作用及び殺菌を促進することを説明する図である。図３Ａは、（ＳＰＭパネルからの）ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１を示された濃度で又は対照(vehicle control)を行って用いて３７℃で１５分間インキュベートし、その後大腸菌を追加してさらに３７℃で６０分間インキュベートしたヒト末梢血における細菌生存の分析である。データは、３人の別々のドナーの平均±ＳＥＭである。両側ｔ検定による、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１対対照。
【図３Ｂ】（図３Ａで示すような）ＳＰＭパネルのメンバーの非存在下又は存在下で３７℃で４５分間インキュベートした後のヒト末梢血好中球（ＣＤ６６ｂ＋）及び単球（ＣＤ１４＋）によるＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ標識された大腸菌の貪食を示す。上：示された細胞のＭＦＩをフローサイトメトリー分析により割り出した。代表的なヒストグラムを示す。下：データは４人の個々のドナーの平均±ＳＥＭである。ボンフェローニの多重比較検定を用いた１元配置分散分析による、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１対対照。
【図３Ｃ】対照又は示されたＳＰＭ（各々１ｎＭ）と別々に又は組み合わせて（大腸菌＋ＳＰＭ）３７℃で１５分間インキュベートした後の、ヒトマクロファージ（細胞毎に５０個の細菌の割合でインキュベート）によるＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ標識された大腸菌の貪食のリアルタイム分析である。ＭＦＩとして表される貪食は、条件毎（ウェル毎）に４フィールド（２０×）の平均値として示される。挿入図：３人の別々ドナーからの代表イメージ。スケールバーは５０μｍ。
【図３Ｄ】１８０分での大腸菌の貪食の分析である。データは３人の別々のドナーの平均±ＳＥＭである。ボンフェローニの多重比較検定を用いた１元配置分散分析による、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１対ＳＰＭパネル、##Ｐ＜０．０１、###Ｐ＜０．００１対対照。
【図４】ＳＰＭ及びその生合成経路を説明する図である。
【図５】凝固ヒト末梢血におけるＬＭの確認を示す。示されたＬＭｓのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションプロファイル。結果は図１に示すものと同じ実験からのものであり、各ＬＭについてこれらの追加のＭＳ−ＭＳを有するパネルＣを確認した。
【図６】凝固によってＳＰＭ、プロスタグランジン及びロイコトリエンの生成が大幅に増大することを説明する図である。３７℃で２４時間インキュベートする前に、ヘパリン添加ヒト血液を１５ｍｌポリプロピレンチューブ（ヘパリン１０Ｕ／ｍｌ）に移し、ヘパリンを含まない血液をシリコンコーティングしたチューブ（−帯電表面）に移した。サンプルを急速凍結し、遠心分離した。上澄み及び沈殿物（血栓に関連）に対し、固相抽出及び図１に記載のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＬＭメタボロリピドミクス分析(ｍｅｔａｂｏｌｏｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ)を行った。結果は３人の個々のドナーの平均±ＳＥＭである。比率ｔ検定による、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。
【図７Ａ】図７Ａ及び図７Ｂは、凝固中のアデノシン促進ＳＰＭ生成及び血小板−好中球相互作用の除去を説明する図である。図７Ａ及び図７Ｂは、ヒト末梢血を凝固中に２００ｍＵのＡＤＡを含んで又は含まずに２４時間インキュベートした。その後サンプルについて、示されたＬＭのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った（図７Ａ）又は血小板−好中球凝集体のフローサイトメトリー分析を行った（図７Ｂ）。図７Ａにおいて、ＡＤＡ存在下で生理活性脂質メディエータ及び経路マーカーが増大したことと、これに対し単独で凝固されたサンプルについて、３人の個別のドナーからの平均比（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）として表現されている。
【図７Ｂ】血小板−好中球凝集体（ＣＤ４２ａ+ＣＤ１６+）の定量化についてのゲーティング模式図を示す。データは５人の個別のドナーを代表し、図２Ｄに示すものと同じ実験から得られたものである。
【図８Ａ】図８Ａ及び図８Ｂはリポキシゲナーゼ活性により調整されたヒト血栓内のＳＰＭ形成を説明する図である。図８Ａ及び図８Ｂにおいて、新たに採血されたヒト末梢血（４ｍｌ）がシリコン被覆チューブ内に３７℃で２４時間配置され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の実施前に急速凍結することにより凝固が停止された。図８Ａはインドメタシン１００μＭ（インドメタシン）の存在下又は非存在下における２４時間の凝固後（凝固）の全ＳＰＭ、プロスタグランジン及びトロンボキサンの濃度である（ｎ＝６人の個々のドナー）。データは平均±ＳＥＭである。比率ｔ検定を用いた、＋ＢＡＩ対凝固について*Ｐ＜０．０５；＋インドメタシン対凝固について****Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｂ】セレコキシブ（ＣＬＸ）５００ｎＭ又はＢＡＩ２０μＭの存在下又は非存在下における２４時間の凝固後（凝固）の全ＳＰＭ、プロスタグランジン及びトロンボキサンの濃度である（ｎ＝３人の個々のドナー）。データは平均±ＳＥＭである。比率ｔ検定を用いた、＋ＢＡＩ対凝固について*Ｐ＜０．０５；＋インドメタシン対凝固について****Ｐ＜０．０００１。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｄは、出血性滲出液におけるＳＰＭ生成が凝固により増大したことを説明する図である。図９Ａ〜図９Ｄにおいて、マウスにザイモサン（１ｍｇ／０．５ｍｌ；無菌滲出液）、トロンビン（５Ｕ／０．５ｍｌ；トロンビン滲出液）又はこれらの組み合わせ（出血性滲出液）を４時間投与し、その後腹膜滲出液及びナイーブ洗浄液（naive lavage）を回収した。図９Ａにおいて、ＲＢＣ対白血球の比（青色のバー；左軸）及び好中球数（白色のバー；右軸）をフローサイトメリーを用いて割り出した。データは条件毎に３匹又は４匹のマウスの平均±ＳＥＭである。出血性滲出液対無菌滲出液について#Ｐ＜０．０５、##Ｐ＜０．０１、###Ｐ＜０．００１である。両側ｔ検定による、出血性滲出液対トロンビン滲出液について*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１である。
【図９Ｂ】洗浄液からの白血球及びＲＢＣを、ライトギムザ染色を改良したものであるディフ・クイック染色（登録商標）を用いて染色して光学顕微鏡検査により分析し、矢印で示されている。スケールバーは２０μｍである。データは条件毎に３匹又は４匹のマウスの平均±ＳＥＭである。
【図９Ｃ】ヒト血栓形成クラスターからのＳＰＭの量を割り出した。データは条件毎に３匹又は４匹のマウスの平均±ＳＥＭである。出血性滲出液対無菌滲出液について#Ｐ＜０．０５、##Ｐ＜０．０１、###Ｐ＜０．００１である。両側ｔ検定による、出血性滲出液対トロンビン滲出液について*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１である。
【図９Ｄ】エイコサノイドの量を割り出した。データは条件毎に３匹又は４匹のマウスの平均±ＳＥＭである。出血性滲出液対無菌滲出液について#Ｐ＜０．０５、##Ｐ＜０．０１、###Ｐ＜０．００１である。両側ｔ検定による、出血性滲出液対トロンビン滲出液について*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１である。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、ＳＰＭ形成阻害ＢＡＩが細菌死滅を減少させることを説明する図である。新たに採血したヒト末梢血（４ｍＬ）をシリコン被覆チューブ内に３７℃で２４時間配置し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために急速凍結により停止した、又は上澄みをＬＢ寒天板上に配置して細菌コロニーの数え上げ前に３７℃で一晩インキュベートした。図１０ＡはＬＯＸ阻害剤（ＢＡＩ）２００μＭの存在下又は非存在下において大腸菌（７×１０８ＣＦＵ）を含んで３７℃で２４時間インキュベートしたヒト末梢血（２．０ｍＬ）内の細菌生存を示す（ｎ＝４人の個々のドナー）。データは平均±ＳＥＭである。比率ｔ検定を用いた、＋ＢＡＩ対凝固．について*Ｐ＜０．０５、****Ｐ＜０．０００１である。
【図１０Ｂ】ＬＯＸ阻害剤（ＢＡＩ）２００μＭの存在下又は非存在下において大腸菌（７×１０８ＣＦＵ）を含んで３７℃で２４時間インキュベートしたヒト末梢血（２．０ｍＬ）内のＳＰＭを示す（ｎ＝４人の個々のドナー）。データは平均±ＳＥＭである。比率ｔ検定を用いた、＋ＢＡＩ対凝固．について*Ｐ＜０．０５、****Ｐ＜０．０００１である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＬＭプロファイルが正常ヒト組織及び疾病ヒト組織間ではっきりと異なることを説明する図である。図１１Ａ〜図１１Ｃにおいて、ヒト精巣組織をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってプロファイリングした。患者基本情報は以下のとおりである。正常精巣：７５歳；白人；故人；転移性黒色腫（肺及び骨）の病歴。悪性精巣：セミノーマ；５２歳；白人；生存。図１１Ａは、３つの別個の測定から得たＬＭのクラスタリングを示すＰＣＡスコアプロット（左）及びローディングプロット（右）である。
【図１１Ｂ】示されたサンプル内の全ＳＰＭ、ＬＴＢ４並びに全ＰＧ及びＴｘＢ２の濃度である。データは３つの別個の測定値の平均±ＳＥＭである。独立ｔ検定による、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１である。
【図１１Ｃ】示されたＳＰＭのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［一般論]
本明細書に開示するのは、自然生体防御応答の進行におけるメタボロリピドミクスプロファイル（ｍｅｔａｂｏｌｏｌｉｐｉｄｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）及びＳＰＭシグネチャーを提供する方法である。
【００１６】
「メタボロリピドミクスプロファイル及びＳＰＭシグネチャー」とは、以下に例のなかで記載するような血栓形成促進性及び炎症性メディエータ並びに特異的炎症収束性メディエータ（ＳＰＭ）の表示群の検査及び作表を意味する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、メディエータのリストは表４に挙げられた通りであり、これは脂質メディエータ機能性クラスター及び性合成経路の確認及びプロファイリングのための脂質メディエータ及び経路マーカーの全リストである。他の実施形態では、パネル／シグネチャーにおいてより少ないメディエータの使用が望まれ得る。例えば、表４に挙げられる少なくとも１０、１５又は２０個のメディエータを試験することが望まれ得る。本発明の別の実施形態では、以下に記載の各クラスターの少なくとも１又は２つのメンバーを含むことが望まれ得る。
【００１８】
メディエータの検査は、通常、時間経過における又は互いに対するメディエータの濃度の検査を含む。プロファイル／シグネチャーの重要な要素は、クラスターの互いに対する出現又は出現の欠如である。
【００１９】
脂質メディエータのクラスターのパネルを以下に示す。
【００２０】
クラスターＡ：トロンボキサンＢ2、プロスタグランジンＤ2及びロイコトリエンＢ4
【００２１】
凝固時間経過の初期段階で増大する脂質メディエータの炎症性凝固クラスター（例えば、負に帯電したチューブに血液を追加した後、これらのメディエータは０．５及び１時間時点で増大する。図１Ｄ及び図１Ｅ参照）。
【００２２】
クラスターＢ：レゾルビンＥ１、レゾルビンＤ１、レゾルビンＤ５、マレシン１、リポキシンＢ4
【００２３】
凝固時間経過の後期段階で増大する脂質メディエータのＳＰＭ凝固クラスター（例えば、負に帯電したチューブに血液を追加した後、これらのメディエータは３、６及び２４時間時点で増大する。図１Ｄ及び図１Ｅ参照）。
【００２４】
クラスターＣ：レゾルビンＤ３、レゾルビンＤ４、レゾルビンＤ６、ＡＴ−ＬＸＡ4、ＬＸＡ5、レゾルビンＤ１、レゾルビンＥ１、ＬＸＢ4
【００２５】
このＳＰＭクラスターは、ヒト血液４ミリリットル毎にヒト組換え型アデノシンデアミナーゼを２００ミリ単位追加すると凝固時間経過の後期段階において増大する（図２Ｃ〜図２Ｆ及び図７参照）。
【００２６】
クラスターＤ：トロンボキサンＢ2、プロスタグランジンＥ2、プロスタグランジンＤ2、プロスタグランジンＦ2α及びロイコトリエンＢ4
【００２７】
これは炎症性エイコサノイド脂質メディエータクラスターである。このクラスターは共同して血管透過性及び炎症部位への好中球動員を促進する。このクラスターは炎症の開始中に増大し、患者の炎症状態の程度の評価に用いることができる。
【００２８】
クラスターＥ：ＲｖＤ４、ＲｖＤ５及びＬＴＢ4
【００２９】
健康組織脂質メディエータクラスター。これらのメディエータは疾病組織に比べて健康組織内で増大する。
【００３０】
クラスターＦ：トロンボキサンＢ2、プロスタグランジンＤ2
【００３１】
疾病組織脂質メディエータクラスター。これらのメディエータは健康組織に比べて疾病組織内で増大する。
【００３２】
一実施形態において、方法は患者の血液サンプル中の測定値を得ることを含み、サンプルは、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）並びに特異的炎症収束性メディエータＳＰＭの血栓形成若しくは凝固の時間経過中又は血栓形成若しくは凝固に続いて得られる。あるいは、方法は、患者の組織、体分泌物又は患者の他の体液若しくは一部における測定値を得ることを含むことができる。これらの測定値から、個別メタボロミックプロファイリングを得ることができる。
【００３３】
方法は、測定値を、正常又はリファレンスサンプル、例えば初期プロファイルが血液サンプルから得られたものであるならリファレンス血液サンプル、から得られたものと比較する工程をさらに有し、これにより比較プロファイルを発展させてもよい。方法は、医学的又は治療上の判断をするために上記プロファイルを用いる工程をさらに有してもよい。
【００３４】
方法は、生体外でアデノシンを除去する及び第２のＳＰＭクラスターを観察する工程をさらに有してもよい。アデノシンは、例えばサンプルをアデノシンデアミナーゼとともにインキュベートすることで除去してもよい。アデノシンデアミナーゼは通常全血４ｍｌ毎に２００ｍＵの濃度で用いられる。アデノシンの除去によりアンマスクされた第２のＳＰＭクラスターはＲｖＤ３、ＲｖＤ４及びＲｖＤ６を有してもよい。
【００３５】
別の側面では、本開示は、疾病、病気、障害又は健康上の欠乏を診断する方法を提供する。方法は、正常又は標準サンプルから得られた標準メタボリピドミクスプロファイルを、患者のサンプルから得られたメタボリピドミクスプロファイルと比較することを含む。患者のサンプル組織内の脂質メディエータ及び経路マーカー代謝物を正常又は標準サンプル内の脂質メディエータ及び経路マーカー代謝物と比較したときの定量的又は時間的表現における差異により疾病又は病的サンプルを識別することができる。医学的又は治療上の判断は、代替的な健康の評価となり得る。例えば、プロファイルを、癌の診断を行うため又は患者のオメガ３系脂肪酸レベルが許容範囲内か否かを決定するために用いてもよい。
【００３６】
疾病又は病的サンプルを、外科的事象、感染、血管炎症、全身性炎症、発作及び癌のグループから選択される事象と関連付けてもよい。本明細書で用いる場合、疾病サンプル又は病的サンプルは、健康状態が良好又は正常でない血液、組織、排泄物又は患者の他の体の一部を含んでもよい。
【００３７】
また、薬物療法による代謝性の影響を判定するために本発明のプロファイル／シグネチャーを用いることが望まれ得る。例えば、薬物が有効か否かを判定するために薬物療法の前後で患者サンプルを検査することが望まれ得る。
【００３８】
［患者サンプル］
患者から採取されるサンプルは、血液、組織、排泄物又は患者の他の体の一部又は体液であってもよい。
【００３９】
患者の血液サンプルの測定を行うために用いる場合、血液は全血であってもよい。本明細書で用いる場合、全血とは、血漿又は血小板などの成分が何も除去されていない患者の体から直接採血された血液として定義される。あるいは、測定は、包装された赤血球、血小板濃縮物、クリオプレシピテート、血漿又は他のそのような血液製剤などの血液製剤について行ってもよい。
【００４０】
患者の血液サンプルは測定を行う前に処理してもよい。例えば、血液サンプルは、希釈若しくは濃縮されてもよく又はサンプルに追加された薬剤を有してもよい。血液の所定の成分は、測定を行う前に選択的に除去されてもよい。
【００４１】
血液サンプルを検査する場合、患者のサンプルを凝固プロセス中の異なる時点で検査し、プロファイル／シグネチャーを含む因子の出現を作表することが望まれ得る。血液サンプルの場合、例に記載のヘパリンで覆われたチューブなどの負に帯電した表面にサンプルを接触させて配置することにより、血栓形成又は凝固が開始され得る。測定は血栓形成の時間経過中に行ってもよい。例えば、測定を、血栓形成の開始前及び０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、４８時間経過後又は他の同等の時間フレームで行ってもよい。
【００４２】
測定を行う前に、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）及びＳＰＭを解放するために凍結融解によってサンプルを透過処理してもよい。例において、凍結融解の典型的な方法を開示する。凍結融解が行われた後、炎症性メディエータ（エイコサノイド）及びＳＰＭはさらに精製される。精製において、望ましくないタンパク質を除去するために血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）及びＳＰＭに薬剤を追加してもよい。薬剤はエタノールでもよい。精製は、固相抽出法を用いて達成してもよい。
【００４３】
患者からの組織を測定を行うために用いる場合、患者のいかなる組織を採用してもよい。本明細書で用いる場合、組織は、固有細胞及びその産物からなる動物を形成する別個の種類の物質として定義される。また、尿又は汗などの体液を検査することが望まれ得る。糞便などの老廃物又は排泄物を検査することが望まれ得る。母乳を検査することが望まれ得る。
【００４４】
［測定］
患者のサンプルを血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（エイコサノイド）及びＳＰＭの濃度について検査する必要がある。測定は、特定のエイコサノイド又はＳＰＭの濃度の決定を伴い得る。これらの測定は、液体クロマトグラフィー、質量分析、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法又は他の分析技術を用いて行われてもよい。測定は、特に、固相抽出法及び脂質メディエータ−ＳＰＭ液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法を用いて行われてもよい。
【００４５】
［プロファイルの分析及び臨床的有用性］
凝固中のヒト全血（ＷＢ）のメタボロリピドミクスに基づくプロファイリングを介する凝固と脂質メディエータ（ＬＭ）による炎症及び感染の収束との間の関係を用いて、内因的に生成された血栓形成促進性及び炎症性ＬＭ（エイコサノイド）及び特異的炎症収束性メディエータＳＰＭの一時的なクラスターを確認することができる。エイコサノイドに加えて、具体的なＳＰＭクラスターを確認することができる。クラスターは、レゾルビンＥ１（ＲｖＥ１）、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、リポキシンＢ４及びマレシン１を含んでもよい。
【００４６】
メタボロリピドミクスプロファイル／シグネチャーは、血液サンプル又は組織の凝固時間経過中の様々な時点で得られた代謝物の濃度を含んでもよい。メタボロリピドミクスプロファイル／シグネチャーは、具体的に、血液凝固及び特異的ＳＰＭ含有クラスターの後期出現の後の、エイコサノイドＴｘＢ２、ＬＴＢ４及びＰＧＤ２の初期出現を含んでもよい。特異的ＳＰＭクラスターは、ＲｖＥ１、ＲｖＤ５、ＲｖＤ１、ＭａＲ１及びＬＸＢ４を含んでもよい。
【００４７】
プロファイルを、他の患者からの前の結果から作成された正常又はリファレンス値と比較してもよい。これらの正常又はリファレンス値は、一般的なものでもよく、あるいは年齢、性別、病歴若しくはその他の具体的な医学的決定要因に特異的なものでもよい。リファレンス値及びこれらから作成されたプロファイルを具体的な疾病、病気、障害又は健康上の欠乏に結びつけてもよい。あるいは、リファレンス値は、特定の対象患者の以前に得られた測定値であってもよい。もし測定値が組織サンプルから得られたものであるならば、その患者の体の別の位置から集められたリファレンス組織を用いてもよい。
【００４８】
本発明のプロファイル／シグネチャーを、医学的又は臨床的診断を助けるために用いることが望まれ得る。臨床医がＬＭシグネチャープロファイルを取得し、そして、典型的に液体クロマトグラフィー分離及び質量分析測定により測定されるＳＰＭ及び他の脂質メディエータの量のＰＣＡクラスター分析を併せて用いた場合、我々の予言的な記載に基づく以下のシナリオにおいて予想クラスター変化を予期できるであろう。
【００４９】
ａ．例えばインドメタシンなどのＮＳＡＩＤを服用した患者：ＮＳＡＩＤを服用していない対象に比べてクラスターＡ及びＤは減少し、クラスターＢ及びＣは減少しない（図８Ａ参照）。したがってより高いＳＰＭ対炎症性エイコサノイド比が得られる。これらの変化は、炎症の収束と生体防御（例えば、細菌及び微生物の殺菌及び除去）とを明確に相互に関連付ける炎症収束性メディエータ（ＳＰＭ）対炎症性エイコサノイドについてのクラスター比をもたらし、これは以下の追加のシナリオに適用することもできる。
ｂ．例えばセレコキシブなどのＣＯＸ−２阻害剤を服用した患者：ＣＯＸ−２阻害剤を服用していない対象に比べてクラスターＡ及びＤは減少し、クラスターＢ及びＣは減少しない（図８Ｂ参照）。
ｃ．例えばジロートン又はコルチコステロイドなどのリポキシゲナーゼ阻害剤を服用した患者：これらの阻害剤を服用していない対象と比べてクラスターＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは減少する（図８Ｂ参照）。
ｄ．脂肪酸欠乏がみられる患者：健康な対象と比べてクラスターＢ及びＣは減少する。健康な対象と比べて炎症収束性クラスターは減少する。
ｅ．サプリメント又は栄養摂取によりオメガ−３を摂取した患者：健康な対象及び／又は脂肪酸欠乏がみられる対象と比べてクラスターＢ及びＣは増大する。
ｆ．癌に罹患した患者：クラスターＥは減少し、クラスターＦは増大する（図１１参照）
ｇ．例えば血小板凝集阻害薬エプチフィバチドなどの血液希釈剤を服用した患者：クラスターＢ及びＣは減少する（図２ｂ参照）。
ｈ．例えばヘパリンなどの抗凝固剤を服用した患者：クラスターＡ、Ｂ及びＣは減少する（図２ａ）。
ｉ．免疫不全患者：クラスターＢ及びＣは減少することが見込まれる。
【００５０】
［サンプル調製及びメタボロリピドミクスのための装置、キット及び構成要素］
本明細書に記載の方法は、装置又はキットの一部として用いることができる。そのような装置又はキットは、種々の溶液、組成、分離手段又は患者の血液サンプルの測定の補助に使用できる他のアイテムを含んでもよい。例えば、本発明の通常のキットは、少なくとも１つ、２つ、３つ又は４つの以下の構成要素を有する。
【００５１】
ａ．追加のアデノシンデアミナーゼを含む負に帯電した表面、例えばヒト組換え型アデノシンデアミナーゼを含むシリコン被覆１０ｍＬチューブ（通常２００ミリ単位／チューブ）。ＳＰＭ−脂質メディエータ生成をアンマスクするため及びＳＰＭクラスターの確認のために用いられる。
ｂ．（ｄ８−５−ＨＥＴＥ、ｄ５−ＲｖＤ２、ｄ５−ＬＸＡ4、ｄ４−ＬＴＢ4及びｄ４−ＰＧＥ2；５００ｐｇ／ｕＬメタノール）を含む内部基準の混合物。脂質メディエータの定量化に用いられる。
ｃ．個々の脂質メディエータクラスター（クラスターＡ−Ｆ）に特異的な抗体検出分析試薬。
ｄ．レゾルビンＤ１、レゾルビンＤ２、レゾルビンＤ３、レゾルビンＤ４、レゾルビンＤ５及びレゾルビンＤ６に特異的な抗体検出分析試薬。
ｅ．リポキシンＡ4、リポキシンＢ4、１５−ｅｐｉ−リポキシンＡ4（アスピリン誘発リポキシンＡ4）及び１５−ｅｐｉ−リポキシンＢ4（アスピリン誘発リポキシンＢ4）に特異的な抗体検出分析試薬。
ｆ．プロテクチンＤ１及び１７−ｅｐｉ−プロテクチンＤ１（アスピリン誘発プロテクチンＤ１）に特異的な抗体検出分析試薬。
ｇ．マレシン１及びマレシン２に特異的な抗体検出分析試薬。
ｈ．レゾルビンＥ１、レゾルビンＥ２及びレゾルビンＥ３に特異的な抗体検出分析試薬。
ｉ．炎症、感染及び炎症収束の診断のため並びに脂肪酸栄養及び補給をモニターするための液体クロマトグラフィー分離及び質量分析法による定量化のために脂質メディエータを捕捉及び分離するためのカートリッジ内に入れられた上記（ｃ−ｈ）脂質メディエータに特異的な抗体。
ｊ．患者の血液由来ＳＰＭの分離及びヒト全血内の貪食及び細菌殺菌の測定によるそれらの機能的生理活性の試験のための（（ｉ）で記載された）抗体カートリッジを含む分析キット。例えば、健康な対象と比べてＳＰＭレベルがより低い患者（クラスターＢ及びＣ）は、健康な対象に比べて全血中の白血球細胞による細菌の貪食がより低くなるとともに生存細菌数がより高くなる（即ち殺菌が減少する）。健康な対象から採取された血液において、リポキシゲナーゼ阻害剤を追加することでクラスターｂのレベルが減少し、生存細菌数が増大する（図１０参照）。ＳＰＭを全血に追加することで全血において貪食及び殺菌が増大する（図３参照）。これらの結果は、患者の生体防御応答に欠陥があること、生体防御及び炎症の収束を加速する治療をテストする方法を臨床医に知らせるために用いることができる。
【００５２】
［例］
以下の例は、本発明のいくつかの実施形態及び側面を示すとともにさらに説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
［例１］
結果
ヒト血液凝固のＬＭ−ＳＰＭプロファイリング
血液凝固、自然免疫貪食機能及びＬＭ間の関係を評価するために、Ｄシリーズレゾルビン、Ｅシリーズレゾルビン、プロテクチン、マレシン、リポキシン、プロスタグランジン及びロイコトリエンを重視した７つのＬＭメタボローム並びにヒト血液の凝固時間経過中のこれらの生合成経路マーカーをモニタリングすることで完全なＬＭプロファイルを取得することが必須である。このために、新鮮なヒト全血を内因性経路を介して凝固させ（３）、血栓形成及びその収縮を確認するために経時的に（０から２４時間）モニターした。ＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳメタボロリピドミクスのために細胞を溶解して上澄みから全エイコサノイド及びＳＰＭを抽出するために、各サンプルを素速く急速凍結及び凍結融解した（［材料及び方法］参照）。凝固の発生後８〜１５分の間で血栓が形成され、この後に血栓収縮及び血清形成が起こり、これは収縮した血栓の上に形成された液相を透過した７５０ｎｍ光透過が増大したことに基づくと４〜８時間の間に急激に増大した（図１Ａ）。各種白血球ポピュレーション（好中球、リンパ球及び単球）の割合及びこれらの生存率を、時間経過を通して割り出した（表２及び表３）。
【００５４】
選択的及び高感度標的メタボロリピドミクスによって、異なる時間プロファイルにおいて、血栓形成促進性及び炎症性メディエータ（トロンボキサン（Ｔｘ）、プロスタグランジン（ＰＧ）及びロイコトリエン（ＬＴ））とＳＰＭとの両方について内因性の量が増大したことが確認された（図１Ｂ〜図１Ｄ、表４）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより取得された結果から、各メディエータについて少なくとも６つの診断用イオンが確認され、真のメディエータとＬＣ保持時間も一致した（図１Ｃ及び図５）。最初に現れるクラスターは、エイコサノイドＴｘＢ２（ＴｘＡ２のマーカー）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）及びＰＧＤ２を含む（図１Ｄ及び表４）。ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＭａＲ１及びＬＸＢ４からなる選択ＳＰＭクラスターは、ＰＧＥ２及びＰＧＦ２αとともにこの時間経過中に増大した。血中にＲｖＤ２が存在するものの（図５）、その存在度は凝固中にはっきりと増大はしなかったことに留意されたい。ＲｖＤ２はヒト脂肪細胞（１４）及び他のヒト組織（１５−１７）によって生成され、真皮熱傷における二次的な血栓症及びネクローシスを防止し（１８）、腹部大動脈瘤において保護的な役割をする（１９）。主成分分析（ＰＣＡ）により、ＴＸＢ２、ＰＧＤ２及びＬＴＢ４の生成が初期段階の時点に関連し、一方で特異的ＳＰＭクラスターは凝固の後期の時間に関連することが確認された（図１Ｅ）。したがって、前に文書で解説したように（２０）初期血小板活性化によりトロンボキサンが生成され、そして進行中の血小板−白血球相互作用及び細胞間生合成が凝固中におけるＳＰＭの一時的な生成に寄与した。
【００５５】
ヒトＳＰＭ生成の制御
健康なドナーでは、血中の凝固の２４時間以内に発生したＳＰＭの最高濃度は、ＲｖＤ１（５４９ｐＭ）、ＬＸＢ４（３０３ｐＭ）、ＭａＲ１（２０９ｐＭ）、ＲｖＤ５（１１５ｐＭ）及びＲｖＥ１（５８ｐＭ）である（平均値は表４に（ｐｇ／ｍｌで）示されている）。これらのＳＰＭは個々に濃度が顕著に減少し、抗凝固剤ヘパリンを含む血液において合計９８％減少した（図２Ａ及び図６）。血小板−血小板相互作用の遮断剤である血小板インテグリンαIIｂβ３の阻害剤の追加によって、細胞生存率を低下させることなく、ＳＰＭクラスターの全量がおよそ５０％（〜５０％）（Ｐ＜０．０１）減少し、同時に血栓体積がおよそ２０％（〜２０％）（Ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）増大した（表５）。これらの結果は、血栓形成及び血栓の血小板インテグリン媒介収縮の両方がＳＰＭ形成に必要であることを示唆するとともに、多くのＳＰＭが全血中の内因性細胞基質から生成されたことを示唆する。
【００５６】
さらなるＳＰＭ生成及び具体的なＳＰＭ経路の解明（unmasking）
赤血球は過剰なアデノシンを除去するためにアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を放出することから、我々はこの機能が凝固中においてＳＰＭ生成に影響を及ぼすか否か、もし及ぼすのであれば蓄積されたアデノシンの除去がＳＰＭ生成を変えたのか否か疑問を抱いた。アデノシンは、ＬＴＢ４の生成を含む好中球機能を阻害する（２１）。我々は、ＡＤＡが血中のＳＰＭ生成を統計学的に大幅に増大させたことを見出し（図２Ｃ）、これは２４時間の時点で凝固単独で達成されるものよりも合計で８倍より多かった（図２Ｃ、生理活性ＬＭプロファイル及び経路マーカーの変化については図７Ａ参照）。ＡＤＡによるアデノシンの排除により、凝固クラスターからの特異的ＳＰＭの生成が増大した。これらはＲｖＤ１及びＲｖＤ５並びにリポキシンを含み、即ち、ＥＰＡからＬＸＡ５が生成され、ＡＡから１５  ｅｐｉ−ＬＸＡ４が生成された（図２Ｃ、図２Ｄ、図７Ａ）。ＡＤＡ処理されたサンプルにおいてＲｖＤ３、ＲｖＤ４及びＲｖＤ６も確認され、存在度が増大した（図２Ｃ及び図２Ｅ）。これらのＤシリーズレゾルビンの最高濃度は、ＲｖＤ３（１５０ｐＭ）、ＲｖＤ４（４４７ｐＭ）及びＲｖＤ６（３０４ｐＭ）であった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づくプロトン化アデニンフラグメントのモニタリングによれば、ＡＤＡは凝固中１時間でアデノシンを排除し（Ｐ＜０．０１）、ＭＲＭトランジションは２６８＞１３６であった（図２Ｄ、［材料及び方法］参照）。加えて、ＡＤＡは、凝固の時間経過において血小板−好中球凝集体の数を統計学的に大幅に増大させ（図２Ｄ及び図７Ｂ）、このことは、アデノシンの除去が、血小板１２−ＬＯＸ及び好中球５−ＬＯＸを伴う細胞間生合成（２２）を介してＳＰＭ生成を促進したことを示唆する（２３−２５）。これに関連して、血小板−好中球凝集体及び細胞間生合成がＬＴＡ４を介してリポキシン生成をもたらす（２３，２６）とともに、１４−ＨｐＤＨＡを介してマレシン生成をもたらす（２４，２５）。ＡＴ−ＬＸＡ４及びＬＸＡ５もまた凝固中に存在度が増大した（図２Ｃ及び図７Ａ）。ＰＣＡによって、ＬＴＢ４（強力な化学誘引物質）の量が凝固の１時間の時点で最大であった（ＡＤＡ有り及び無し）ことが示され、アデノシン排除のためにＡＤＡを追加した場合に凝固の２４時間の時点でＳＰＭは最大量で存在した（図２Ｆ）。細胞生存率はＡＤＡによって低下しなかった（表５）。これらの結果は、凝固によってヒト血液中の多くのＳＰＭ経路が炎症収束性メディエータを生成することが可能となり、ＳＰＭ経路は局所的なアデノシン濃度及びＡＤＡにより実質的に制御されることを示唆する。
【００５７】
次に、ＮＳＡＩＤはトロンボキサン及びプロスタグランジンの生合成を遮断するとともに、血中の殺菌を増大させる（２７）ことから、我々は治療シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ−１）及びＣＯＸ−２阻害剤による凝固中におけるＳＰＭ生成への影響を評価した。我々は、２４時間の時点において、全プロスタグランジン及びトロンボキサン生成が、凝固単独のみにおける場合と比べて、インドメタシンによって遮断された（＞９９％阻害）ことを見出した（図８Ａ）。インドメタシンの存在下では、全ＳＰＭ量は、阻害剤の非存在下と比べて大きくは変わらなかった（全時間経過については表６参照）。ＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブの追加は、全血中のＳＰＭ、プロスタグランジン又はトロンボキサンの量を統計学的に大幅に変えず（図８Ｂ）、一方で、リポキシゲナーゼ阻害剤バイカレイン（ＢＡＩ）、これはシクロオキシゲナーゼについてよりもリポキシゲナーゼについてより選択性が高い（２８）、の追加は、ＳＰＭの全量を減少させた（図８Ｂ）。したがって、これらの結果は、凝固中に生成されたＳＰＭは、リポキシゲナーゼ誘発経路を介して生成されＮＳＡＩＤの影響は受けなかったことを示唆する。
【００５８】
過剰な炎症及び血管透過性は、増大した数の赤血球及び微小血栓を含む出血性滲出液の形成を促進し（５）、一方で無菌（２９）及び膿性滲出液（３０）は主に白血球を含む。凝固中の生体内のＳＰＭ生成を評価するために、我々は、確立された無菌ザイモサン誘発マウス腹膜炎モデル（２９）をトロンビンの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与と組み合わせて用い、これにより出血性滲出液中の赤血球及び白血球の数が増大した（図９Ａ及び図９Ｂ）。ヒト血液凝固クラスターからのＳＰＭ、即ちＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１もまた出血性滲出液中に存在し、対照生理食塩水単独と比べて統計学的に大幅に存在度が増大した（図９Ｃ及び図９Ｄ）。これらの結果は、生体外で確認されたものと同じヒトＳＰＭ凝固クラスターが、マウスの出血性滲出液中において生体内でも生成されたことを示す。
【００５９】
ヒト全血中のＳＰＭ生体防御作用及び貪食細胞
ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１が各々、全血中の貪食細胞（単球及び好中球）内において細胞内シグナル伝達を活性化したことから、我々はこれらのＳＰＭの具体的な及び混合性の生体防御作用を調べた。ヒト全血中において、このＳＰＭパネル（各々１〜５０ｎＭでともに用いた）によって、その濃度が１ｎＭと低いときに得られた大腸菌の生存が統計学的に大幅に減少し（図３Ａ参照）、その濃度が１００ｐＭと低いときに好中球（ＣＤ６６ｂ＋細胞）による大腸菌の貪食が促進した（図３Ｂ）。また、ＳＰＭパネルによって、フローサイトメトリーにより測定されたとおり、１ｎＭ（Ｐ＜０．０１）にいて全血中の単球（ＣＤ１４＋細胞）による大腸菌の貪食が促進した。
【００６０】
次に我々は、凝固中に生成された内因性ＳＰＭの殺菌への影響を評価した。ヒト血液をリポキシゲナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で大腸菌とともにインキュベートした。細菌のカウント数は、リポキシゲナーゼ阻害剤の存在下において統計学的に大幅により多く（＞１０倍；Ｐ＜０．０００１）（図１０Ａ）、これは凝固から得られたこのＳＰＭクラスターのメンバーの存在度が＞８０％減少したことと一致する（図１０Ｂ）。したがって、内因性ＳＰＭ生成の阻害によって末梢血貪食による殺菌が弱まった。
【００６１】
血栓形成によって、細菌の組織への侵入を最小化するために全身性細菌が微小血管内において区画化され、これにより細菌とマクロファージとの間の血管内の関連性が一部促進される（３４）。故に我々は、血栓由来ＳＰＭが、血中好中球及び単球による排除に加えてマクロファージによる細菌の貪食を特に促進したのか否か疑問を抱いた。我々は、ヒトマクロファージによる大腸菌の貪食の広がりが、凝固クラスターの個々のＳＰＭ即ちＲｖＤ１、ＲｖＥ１、ＬＸＢ４及びＭａＲ１によって統計学的に大幅に促進されたことを見出した。個別にいうと、ＬＸＢ４及びＲｖＥ１がマクロファージによる貪食を最も大きく増大させた。ＳＰＭパネルのメンバー、ともに用いられる場合は各々１ｎＭである、は、選択されたＳＰＭ単独とともに扱われたマクロファージによる貪食と比べて、マクロファージによる貪食が促進したとの結果をもたらした（図３Ｄ）。これらの結果は、血液凝固中に生成されたＳＰＭが、ヒト血液中において支配的な白血球（即ち好中球及び単球）による殺菌及び封じ込めを強く促進することを示唆する。疾病組織対健康組織を用いてこのアプローチの有用性をさらに示すために、固体組織腫瘍と、健康なヒトにおけるヒト臓器のなかでもＤＨＡ濃縮箇所として知られる精巣と、直接比較するための悪性精巣とを入手した。各組織から明確に区別されるＬＭ−ＳＰＭプロファイルが得られた。例えば、これらの組織は、プロスタグランジンとトロンボキサンの両方を含んでいるが、健康な精巣はＳＰＭの増大した量を示した（図１１）。これらのデータは、我々のアプローチを用いて疾病組織及び健康組織をプロファイルし比較することができることを示唆する。
【００６２】
議論
トロンボキサン及びプロスタグランジンは確立された凝固のモジュレータである（６）が、ヒト全血中で生成されたレゾルビン及び他のＳＰＭなどのリポキシゲナーゼ由来メディエータの役割については不明である。我々の発見は、ＳＰＭの特異的クラスターが凝固中に形成され、これらの作用が、全血中で機能する周辺環境における貪食をターゲットにすることを示唆する。ＲｖＥ１は、リボゾームＳ６を活性化させるＧＰＣＲ仲介経路（即ちＣｈｅｍＲ２３受容体）を介して分離されたマクロファージによる貪食を増大させる（３２）。ＲｖＤ１及びＭａＲ１は各々、ヒト単球中のｐＣＲＥＢの存在度を増大させる（３５）。我々の単細胞分析は、ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１（同じ血栓ＳＰＭクラスターの構成要素）が各々、好中球及び単球中のＣＲＥＢ及びＳ６を活性化させ、これにより血中のこれらの白血球による貪食を促進して病原体に対する防御の最前線を加速させることを示した。我々が確認したヒト全血中の別のＳＰＭ活性化経路は、Ｂ細胞内のＳ６のリン酸化である（図３Ｃ及び図３Ｄ）。これは、ＳＰＭがリンパ器官にも存在し（１５）かつＲｖＤ１、ＲｖＤ２及びＭａＲ１がＴ細胞により仲介された適応免疫応答を制御すると仮定すると、Ｂ細胞応答でも役割を果たし得る（３６）。興味深いのは、オメガ−３脂肪酸を用いた食事の補給が、炎症性サイトカインの生成を弱める（３７）とともに末梢血中のＳＰＭの量を増大させる（１５，３８）ということである。研究によれば、ＳＰＭの前駆体であるオメガ−３必須脂肪酸が、致命的な冠状動脈性心疾患のリスクがより低いことを示すバイオマーカーであることが確認された（３９，４０）。したがって、我々の結果は、自然免疫細胞に影響を及ぼす機能性ｎ−３由来ＳＰＭの内因性生成を凝固によって開始させる生理学的メカニズムの可能性を示す。血液の生理学的凝固は人間において保護的なものであることから、血栓によるＳＰＭ生成は、手術（４１）、感染（１１，２７，４２，４３）、血管炎症（４４，４５）、発作及び癌（４６，４７）における病態生理学事象に直接関連する可能性がある。
【００６３】
レゾルビン及びプロテクチンＤ１は血漿及び血清（１５，３８）中に存在する。特に、ＲｖＤ４を一致する総合的基準とともに確認することができる前に（４８）、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＰＤ１及び１７Ｒ−ＲｖＤ１はヒト血漿中に確認された（３８）。したがって、凝固によってＳＰＭクラスター（ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１）が生成されることを示す本明細書に記載の結果を鑑みると、これがＰＤ１、ＭａＲ２、ＲｖＤ２、ＲｖＥ２又はＲｖＥ３の量の増大を伴うようにはみえない。したがって、血漿ＳＰＭの量及び確認された血栓駆動ＳＰＭクラスターの特定のメンバーの量は、ＳＰＭの血液伝搬性生成、組織から血液循環内へのＳＰＭの放出又はその両方を反映し得る。本明細書で明らかにしたＳＰＭは血流状態下では調べていないものの、ＣＯＸ−２は層せん断応力（４９）及び低酸素症（５０）によって存在度及び活量が増大したことに留意されたい。また、ＣＯＸ−２は、血中白血球及び血管内皮細胞間の細胞間相互作用によってＲｖＥ１を含むＳＰＭの生成にも寄与することができる（８）。
【００６４】
我々のプロファイリングシステムの有用性を説明するとともに示すために、我々は、健康組織と疾病組織との間で脂質メディエータＳＰＭプロファイルにおける差異が、このＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づくメタボロリピドミクスアプローチを用いて区別できるか否かを割り出した。この例として、生殖能力及び精子形成に必須のＤＨＡを豊富に含む（５１）健康ヒト精巣組織並びに悪性精巣組織から、各々区別可能なプロファイルが得られた。セミノーマ組織はプロスタグランジン及びトロンボキサンの両方を含み、正常精巣組織はＳＰＭの量が増大した（図１１）。正常精巣組織は、より統計学的に大幅に多いＳＰＭ及びＬＴＢ４の量を含み（図１１Ｂ）、これは、ヒト全血及び固体組織腫瘍を用いた我々のメタボロリピドミクスアプローチの診断能力の可能性を説明するとともに、この組織におけるＳＰＭの機能を示唆する。
【００６５】
我々のＬＭメタボロリピドミクスの結果は、ヒト血液の凝固を介して開始された脂質メディエータのファミリーの合成における時間的シーケンスを示した。血栓形成促進性ＴｘＡ２及び炎症性エイコサノイド（プロスタグランジン及びロイコトリエン）は、予期されたように血小板によって、そして血小板−白血球凝集体によって急速生成され、炎症の特性炎症収束性メディエータの形成においてピークとなった。これらの収束性メディエータは、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＲｖＥ１、ＬＸＢ４及びＭａＲ１からなる区別可能なＳＰＭクラスターを含み、その各メンバーが、ＥＲＫ１／２、ＣＲＥＢ、ｐ３８ＭＡＰＫ、Ｓ６及びＡＫＴを含む全血マトリックス内の単白血球内の区別可能な細胞内シグナリング経路を活性化させた。血栓形成を介して生成されたこれらのＳＰＭは、ヒト好中球、単球及びマクロファージによる貪食及び大腸菌の殺菌の両方を促進した。
【００６６】
生合成されたＳＰＭの全機能的可能性は、ＳＰＭの生成を阻害した局所的なアデノシンの蓄積により不明瞭であり、故に炎症部位においてＳＰＭ生成を妨害する収束毒物についての追加の証拠を提供する（８）。人為的な赤血球溶血は採血中に時折生じ、これによりアデノシンの量が増大し、血小板−好中球相互作用が減少する（５２）。したがって、アデノシンの排除によって血小板−好中球凝集体及びＲｖＤ３、ＲｖＤ４及びＲｖＤ６の生合成が増大し、Ｄシリーズレゾルビンの全スペクトルの定量化が可能となったが、但しＲｖＤ２（図１Ａから図１Ｅ）は除かれ、ＲｖＤ２は全血凝固中に増大しなかったが、それでも腹部大動脈瘤（１９）及び熱傷における二次的ネクローシス（１８）に対する保護をする。また、ＳＰＭはフィブリン血栓状の血栓を貪食するためにマクロファージを刺激し（５３）、これにより血栓のリモデリング又はその除去を容易にする。本明細書で報告した分離及び精密検査方法は、ヒト組織により生成されたＳＰＭのスペクトル及びこの環境におけるそれらの機能の割り出しを可能とすることができる。これとともに、これらの結果は、血液の凝固とヒト組織内の特異的炎症収束性メディエータにより活性化された自然生体防御メカニズムとの間の、ＳＰＭにより仲介されるこれまで特徴付けられていなかった関連性を示した。ＬＭ及びＳＰＭの基質が重要であり栄養剤を介して生体に取り込まれることを考慮すれば、ヒト組織におけるＳＰＭプロファイリングのためのこのアプローチ及び新規の方法によって個別の及び高精度の薬物療法のための新たな手段が開かれる。
【００６７】
［材料及び方法］
ヒト末梢血分離
細胞損傷の可能性を最小化するために採血用の特定のチューブ及び採血用シリングを有する１９ゲージ翼状針を用いて健康なボランティアから新たなヒト血液をヘパリン（１０単位／ｍｌ）を用いて又は用いずに採血した。各ボランティアに対し、人研究委員会の承認を受けたプロトコル＃１９９９−Ｐ−００１２９７でインフォームドコンセントした。全てのボランティアが提供前２週間以内に非ステロイド性抗炎症薬を摂取したことを否定した。
【００６８】
ヒト血液の凝固
ヒト全血を４ｍｌの一定分量で、抗凝固剤を含まない負に帯電したシリコン被覆１０ｍｌチューブ（ＢＤ）に移した。ヘパリンを用いる実験については、３７℃でのインキュベートの前にヘパリン処置血液を１５ｍｌポリプロピレンチューブ内に配置した。指定時間でのＬＭプロファイリングにおいて、全サンプルに対しすぐに精密検査を行い、これにより全血がドライアイス／イソプロパノール容器内で急速凍結され、４℃で１００，０００ｇで遠心分離にかけられる前に室温に戻された（×３サイクル）。上澄み（及び選択実験についての血栓；図６参照）を回収し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＬＭメタボロリピドミクスを施した。
【００６９】
ＬＭメタボロリピドミクス
エイコサノイド及びＳＰＭの全血液プロファイルを得るために、各サンプルについて、全血を急速凍結しその後室温まで解凍することを含む手順を３回繰り返し、固相抽出（ＳＰＥ）する前に４℃で１００，０００ｇで３０分間遠心分離した。タンパク質沈殿を促進するために、ｄ８−５−ＨＥＴＥ、ｄ５−ＲｖＤ２、ｄ５−ＬＸＡ４、ｄ４−ＬＴＢ４及びｄ４−ＰＧＥ２（各々５００ｐｇ；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を含む内部標準を４体積のメタノールとともに足し合せた。４℃で１０００ｇで５分間遠心分離した後、各サンプル体積を、窒素ガス流を用いてメタノールが≦１０％となるまで減少させ、次におよそｐＨ３．５（〜ｐＨ３．５）まで急速酸性化（＜３０秒）した後に固相抽出（ＳＰＥ）Ｉｓｏｌｕｔｅ（商標）Ｃ１８  ＳＰＥ３ｍＬ、１００ｍｇカートリッジ（バイオタージ社製）上に搭載した。溶出前に、ＳＰＥマトリックスに結合したＬＭをｄｄＨ２Ｏを用いて中和した。ＳＰＥからのギ酸メチルフラクションをゆるやかな窒素流下で乾燥し、メタノール：水が１：１のなかで再懸濁し、その後、島津製作所（日本、東京）製ＬＣ−２０ＡＤ  ＨＰＬＣを備えたＱＴｒａｐ５５０（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）から構成される液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析システム内に注入した。Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０ＥＣ−１８カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ×２．７μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を５０℃に維持したカラムオーブン内に保持し、脂質メディエータ（ＬＭ）を、５５：４５：０．０１（ｖ／ｖ／ｖ）から１００：０：０．０１のメタノール／水／酢酸の勾配で、０．５ｍｌ／分の流量で溶出した。関心のある脂質メディエータの量をモニター及び定量化するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）をＭＳ／ＭＳとともに用いて各分子についてシグネチャーイオンフラグメントをマッチングした（少なくとも６つの診断用イオン；前に記載したように検出限界およそ０．１ｐｇ（〜０．１ｐｇ）（１５））。前に記載した（１５）ようにＰＣＡをバージョン１３．０．３のＳＩＭＣＡソフトウェアを用いて行った。急速凍結血液中の各ターゲットＬＭについて真の（合成でない）基準及びマトリックス抑制からキャリブレーション曲線を毎日取得するとともに、上澄みを決定してリカバリ及び定量化のために用いた。
【００７０】
ヒト血液中のアデノシン定量化
メタボロリピドミクスにおいて用いたようにヒト血液について同じ凍結融解（freeze-thaw）手順を行った。４℃で１０００ｇで５分間遠心分離を行った後、上澄みを４体積のメタノールを用いて元に戻してタンパク質沈殿を促進するために３０分間氷の上に保持した。その後サンプルを４℃で１０００ｇで５分間遠心分離した。上澄みをメタノールが＜１％となるように元に戻し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに持ち込まれ、プロトン化したアデノシンフラグメント（５４）についてＭＲＭ遷移２６８＞１３６を介して≧９９％の純アデノシン（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて一致した保持時間によってアデノシンの識別及び定量化が行われた。
【００７１】
血栓のフローサイトメリー分析
健康な個人から抗凝固剤を用いずにヒト末梢血を採血し、前述のように２４時間凝固させた。血栓をＣａ２＋（０．９ｍＭ）及びＭｇ２＋（０．５ｍＭ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、その後緩やかに均質化させて７０ミクロンフィルタに通した。血栓由来細胞をフローサイトメリー分析のために染色した。細胞はＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡ１％及びアジ化ナトリウム０．１％を含むＰＢＳ）内で染色された。Ｆｃ受容体仲介の非特異性抗体結合がＨｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（登録商標）溶液によって阻害され、その後ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１４（クローン化  ＨＣＤ１４）、ＰｅｒｃＰ−Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ２０（クローン化２Ｈ７）、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ６６ｂ（クローン化Ｇ１０Ｆ５）及びＡＰＣ  Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ３（クローン化  ＨＩＴ３ａ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いてインキュベートした。生存率評価について、製造者のプロトコルに基づきＦＩＴＣ結合アネキシンＶ（ＢＤ社製）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を細胞に追加した。サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＦｌｏｗＪｏ（登録商標）Ｘソフトウェアを用いて分析した。
【００７２】
好中球−血小板相互作用
健康な個人から抗凝固剤を用いずに全血を採血し、ＡＤＡを用いて又は用いずに１，６又は２４時間凝固させた。血栓をＰＢＳを用いて洗浄し、その後緩やかに均質化させて７０ミクロンフィルタに通した。血栓由来好中球−血小板相互作用を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１６抗体（クローン化ｅｂｉｏ  ＣＢ１６）及びＰＥ結合抗ヒトＣＤ４２ｂ（クローン化ＨＩＰ１）を用いてフローサイトメリー分析によって分析した。好中球は、そのＣＤ１６の細胞表面発現並びにハイサイド（high side）及び前方散乱によって識別した。血小板は、対数スケールでのそのローサイド（low side）及び前方散乱並びにそのＣＤ４２ｂの細胞表面発現に基づき識別した。好中球及び血小板凝集体は、ＣＤ１４−、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ１６＋、ＳＳＣｈｉｇｈ、ＦＳＣｈｉｇｈのようにＣＤ４２ｂ及びＣＤ１６についてダブルポジティブであったＣＤ１４−細胞として識別した。
【００７３】
マウス腹膜炎及び出血性滲出液
全ての実験手順はブリガム・アンド・ウィメンズ・ホスピタルの動物に関する常任委員会（プロトコル番号２０１６Ｎ０００１４５）により承認されたものであるとともに、制度上の及びアメリカ国立衛生研究所のガイドラインに従うものである。雄ＦＶＢマウス（生後６〜８週間）にザイモサンＡ（１ｍｇ／０．５ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社製）、トロンビン（５単位／０．５ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）又はその両方を４時間与えた。その後、二価カチオンを用いずに４．０ｍｌの氷冷ＰＢＳを用いて腹膜洗浄を行う前にマウスをイソフルランを用いて安楽死させた。ＰＥ結合抗マウスＬｙ６Ｇ抗体（クローン化１Ａ８）を用いて好中球の数のメタボロリピドミクス分析及びフローサイトメリー分析をするために洗浄液にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。洗浄液からの細胞もまたサイトスピンによってガラススライドに付着させ、ライトギムザ染色（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて赤血球と白血球を互いに差別化して各スライドにつき最低４低倍率視野で数え上げた。細胞はまたディフクイック（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて製造元の使用書に基づき染色され、ＢＺ−ＩＩビュアーソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いてモノクロ／カラー切替カメラを備えたＫｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−９０００（ＢＩＯＲＥＶＯ社製）倒立型蛍光位相コントラスト顕微鏡（倍率４０×）を用いて画像を取得した。
【００７４】
ヒト全血中における殺菌
大腸菌（血清型Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１）をＬＢブロス中でインキュベートして血液に追加する前に無菌食塩水中で洗浄した。ヒト末梢血（４５μｌ）を、０．１，１，１０若しくは５０ｎＭのＳＰＭパネル（ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＲｖＥ１  ＭａＲ１、ＬＸＢ４）の各メンバー又は対照（ＰＢＳ５μｌ、０．１％エタノール）を用いて３７℃で１５分間インキュベートし、その後およそ２×１０7個（〜２×１０7）の大腸菌（５μｌ）を用いて３７℃で６０分間インキュベートした。その後サンプルを氷上にてＰＢＳ中で１：１０5に希釈して一定分量をＬＢ寒天上に置き３７℃のインキュベータ内で一晩インキュベートした。コロニーを目視により数え上げた。
【００７５】
凝固中の全血殺菌
抗凝固剤を含まない新たなヒト血液（２．０ｍｌ）をバイカレイン（ＬＯＸ阻害剤；Ｓｉｇｍａ社製）２００ｍＭの存在下又は非存在下で大腸菌（およそ７×１０8個）とともにインキュベートし、３７℃で２４時間凝固させた。血液からの血清を氷上にてＰＢＳ中で希釈し、一定分量をＬＢ寒天上に置いて３７℃のインキュベータ内で一晩インキュベートした。コロニーを数え上げた。
【００７６】
ヒト末梢血貪食細胞による貪食
新たなヘパリン処置した全血（１００ｍｌ）を健康なドナーから採血してＳＰＭのパネル（ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１；各々０．１〜５０ｎＭの組み合わせ）又は対照（０．１エタノール）を用いて３７℃で１５分間インキュベートした。大腸菌をＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）蛍光Ｇｒｅｅｎ色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて製造元の使用書に従い標識付けした。標識付けされた大腸菌をサンプルに、貪食細胞：細菌比１：５０で追加して３７℃で４５分間貪食を開始させた。その後サンプルをＡＰＣ−Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ６６ｂ抗体（好中球の標識付けのため）及びＡＣＰ−Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ１４抗体（単球の標識付けのため）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて氷上にて１５分間インキュベートした。細胞を２ｍｌの氷冷ＰＢＳを用いて２度洗浄し、その後、３％パラホルムアルデヒド中で赤血球溶解及び固定を行った。その後細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフロー血球計算器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）又はＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ  Ｘイメージングフロー血球計算器（Ａｍｎｉｓ社製）を用いて分析した。次に好中球（ＣＤ６６ｂ＋）及び単球（ＣＤ１４＋）個体群中の蛍光関連貪食細胞をＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョンＸを用いて識別した。
【００７７】
ヒトマクロファージ
ボストンチルドレンズ病院血液バンクからの匿名の健康な人間のボランティアのヒト末梢血単核細胞を密度勾配であるＦｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ分離によって分離し、次に単球精製を行った。次に単球をＲＰＭＩ１６４０内で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を用いて７日間インキュベートし、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）を用いたインキュベートを介してマクロファージに分化させた。
【００７８】
貪食作用のリアルタイム分析
細胞（ＰＢＳ＋＋中５０，０００細胞／ウェル）を８ウェルチャンバースライド上にプレーティングすることによってヒトマクロファージのリアルタイムイメージングを行った。チャンバースライドは、デジタルガスミキサー及び温度レギュレータ内蔵顕微鏡のためのＳｔａｇｅ  Ｔｏｐインキュベーションシステム（ＴＯＫＡＩ  ＨＩＴモデルＩＮＵＦ−Ｋ１４）内に保持された。ＳＰＭのパネル（ＲｖＥ１、ＲｖＤ１、ＲｖＤ５、ＬＸＢ４及びＭａＲ１；各々又は組み合わせで１ｎＭ）を１５分間マクロファージに追加し、次にＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ標識された大腸菌を追加した（大腸菌：貪食細胞比５０：１）。次に、ＢＺ−ＩＩ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いてモノクロ・カラー切替カメラを備えたＫｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−９０００（ＢＩＯＲＥＶＯ社製）倒立型蛍光位相コントラスト顕微鏡（倍率２０×）を用いて３７℃で３時間にわたり１０分毎に画像を取得した。平均蛍光強度をＢＺ−ＩＩ分析器を用いて定量化した。
【００７９】
統計学的分析
グループをスチューデントの両側ｔ検定（２つのグループについて）又はボンフェローニの多重比較検定を用いた１元配置分散分析（３以上のグループについて）により、Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ社製）を用いて比較した。統計学的優位性の判定基準はＰ＜０．０５であった。ＳＩＭＣＡ１３．０．３ソフトウェア（ＭＫＳ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて主成分分析（ＰＣＡ）を行った。
【００８０】
【表１】
2020513546.tif 000003
【００８１】
表２において、白血球及びリンパ球の個体数は凝固中で一定である。５つの別個の実験（ｎ＝５）からの細胞個体数を各々フローサイトメリー分析を用いて分析した（細胞型マーカーについては上記参照）。値は平均±ＳＥＭである。
【００８２】
【表２】
2020513546.tif 000004
【００８３】
表３において、白血球及びリンパ球は凝固中に生存維持した。５つの別個の実験（ｎ＝５）からの細胞生存率を各々フローサイトメリー分析を用いて分析した（アポトーシス及びネクローシスについてのマーカーについては上記参照）。値は平均±ＳＥＭである。白血球及びリンパ球は凝固＋中に生存維持した。
【００８４】
【表３】
2020513546.tif 000005
【００８５】
表４は凝固中のヒト全血中のＬＭ濃度を示す。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳに基づくＬＭメタボロリピドミクス分析を、凝固後０，０．２５，０．５，１，３，６及び２４時間後において回収されたヒト血液を用いて行った。ＬＭ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を１２人のドナーの平均±ＳＥＭとして表す。（−）は濃度が＜０．１ｐｇ／ｍｌであったことを示す。
【００８６】
【表４】
2020513546.tif 000006
2020513546.tif 000007
【００８７】
表５において、白血球及びリンパ球はエプチフィバチド又はＡＤＡの存在下で凝固中生存維持した。細胞生存率ｎ＝３；フローサイトメリー分析を用いて分析した（アポトーシス及びネクローシスについてのマーカーについては方法参照）。値は平均±ＳＥＭである。
【００８８】
【表５】
2020513546.tif 000008
【００８９】
表６はインドメタシンの存在下の凝固中のヒト全血中のＬＭ濃度を示す。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳに基づくＬＭメタボロリピドミクス分析を、インドメタシンの存在下で、凝固後０，０．２５，０．５，１，３，６及び２４時間で回収されたヒト血液を用いて行った。ＬＭ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を６人のドナーの平均±ＳＥＭとして表す。（−）は濃度が＜０．１ｐｇ／ｍｌであったことを示す。
【００９０】
【表６】
2020513546.tif 000009
2020513546.tif 000010
【００９１】
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いかなる文献の引用も本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。
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【００９２】
本発明は、一以上の好ましい実施形態に基づき記載され、明確に記載されたもの以外にも、多くの同等のもの、代替のもの、バリエーション及び修正が可能であるとともに本発明の範囲内であるとこは明らかである。
【図１Ａ】
2020513546.tif 000011
【図１Ｂ】
2020513546.tif 000012
【図１Ｃ】
2020513546.tif 000013
【図１Ｄ】
2020513546.tif 000014
【図１Ｅ】
2020513546.tif 000015
【図２Ａ】
2020513546.tif 000016
【図２Ｂ】
2020513546.tif 000017
【図２Ｃ】
2020513546.tif 000018
【図２Ｄ】
2020513546.tif 000019
【図２Ｅ】
2020513546.tif 000020
【図２Ｆ】
2020513546.tif 000021
【図３Ａ】
2020513546.tif 000022
【図３Ｂ】
2020513546.tif 000023
【図３Ｃ】
2020513546.tif 000024
【図３Ｄ】
2020513546.tif 000025
【図４】
2020513546.tif 000026
【図５】
2020513546.tif 000027
【図６】
2020513546.tif 000028
【図７Ａ】
2020513546.tif 000029
【図７Ｂ】
2020513546.tif 000030
【図８Ａ】
2020513546.tif 000031
【図８Ｂ】
2020513546.tif 000032
【図９Ａ】
2020513546.tif 000033
【図９Ｂ】
2020513546.tif 000034
【図９Ｃ】
2020513546.tif 000035
【図９Ｄ】
2020513546.tif 000036
【図１０Ａ】
2020513546.tif 000037
【図１０Ｂ】
2020513546.tif 000038
【図１１Ａ】
2020513546.tif 000039
【図１１Ｂ】
2020513546.tif 000040
【図１１Ｃ】
2020513546.tif 000041
【国際調査報告】
2020513546.tif 000042
2020513546.tif 000043
2020513546.tif 000044