(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−３５アンタゴニストとその組成物とを用いて癌転移を治療する方法を開示するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌転移を治療する方法であって、必要とする対象にインターロイキン−３５（ＩＬ−３５）アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｈＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、Ｐ３５、ＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、又はＩＬ−１２Ｒβ２の発現を妨げるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＣＳＦ１Ｒからなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象にＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの治療有効量を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストと前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストとが、同時に又は相互に任意の間隔で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、前記投与前に原発性癌の治療を受けた、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記原発性癌の治療が、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、超音波療法、又はそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頚部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆嚢胆管癌、乳癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨軟部組織肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍及び胸膜悪性腫瘍、中皮腫、又はこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
癌転移を治療するための医薬組成物の調製におけるＩＬ−３５アンタゴニストの使用であって、前記医薬組成物が前記ＩＬ−３５アンタゴニストと薬学的に許容可能な担体とを含む、使用。
【請求項１４】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ｓｈＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、Ｐ３５、ＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−２７Ｒα、又はＩＬ−１２Ｒβ２の発現を妨げるものである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＣＳＦ１Ｒからなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬学的に許容可能な担体が、水、ＰＢＳ、塩類溶液類、ゼラチン類、オイル類、アルコール類、又はその組み合わせである、請求項１３に記載の使用。
【請求項２０】
前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頚部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆嚢胆管癌、乳癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨軟部組織肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍及び胸膜悪性腫瘍、中皮腫、又はこれらの組み合わせである、請求項１３に記載の使用。
【請求項２１】
原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するための医薬組成物であって、
ＩＬ−３５アンタゴニストと、
薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２２】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ｓｈＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、Ｐ３５、ＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−２７Ｒα、又はＩＬ−１２Ｒβ２の発現を妨げるものである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＣＳＦ１Ｒからなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記薬学的に許容可能な担体が、水、ＰＢＳ、塩類溶液類、ゼラチン類、オイル類、アルコール類、又はその組み合わせである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頚部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆嚢胆管癌、乳癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨軟部組織肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍及び胸膜悪性腫瘍、中皮腫、又はこれらの組み合わせである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを更に含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記原発性癌の治療が、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、超音波療法、又はそれらの組み合わせである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するためのキットであって、
ＩＬ−３５アンタゴニストを含む第一の容器と、
ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを含む第二の容器と、を含むキット。
【請求項３３】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記ｓｈＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、Ｐ３５、ＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−２７Ｒα、又はＩＬ−１２Ｒβ２の発現を妨げるものである、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３８】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＣＳＦ１Ｒからなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
前記原発性癌の治療が、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、超音波療法、又はそれらの組み合わせである、請求項３２に記載のキット。
【請求項４０】
癌を治療する方法であって、
（ａ）必要とする対象に原発性癌の治療を施すことと、
（ｂ）前記対象にＩＬ−３５アンタゴニストの治療有効量及び／又はＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの治療有効量を投与することと、を含む方法。
【請求項４１】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｓｈＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、Ｐ３５、ＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−２７Ｒα、又はＩＬ−１２Ｒβ２の発現を妨げるものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＣＳＦ１Ｒからなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が、前記ＩＬ−３５アンタゴニスト及び前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの両方を投与され、前記ＩＬ−３５アンタゴニスト及び前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが同時に又は相互に任意の間隔で投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記原発性癌の治療が、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、超音波療法、又はそれらの組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頚部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆嚢胆管癌、乳癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨軟部組織肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍及び胸膜悪性腫瘍、中皮腫、又はこれらの組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療に関し、特に癌転移を抑制、低減、及び／又は予防するための癌治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界中で主な死因となっている。癌の一次治療（外科手術、放射線療法、及び化学療法）は有益であり、無癌生存期間及び全生存期間を増加させるが、継続的な再発率が見られ、かなりの割合の癌患者が再発癌及び／又は転移性癌を発症するようになる。癌で死亡する人のほとんどは原発性腫瘍で死亡するのではなく、転移性疾患で死亡する。患者が外科手術を受ける場合でも、患者の身体の他の場所に別の更に小さな病変があるかどうか外科医にはわからないものである。癌転移及び再発を効果的に抑制する治療剤が、当該技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的の一つは、癌転移を治療することによって癌患者の無癌生存期間及び全生存期間を増加させることである。本発明のもう一つの目的は、癌転移が治療されるように原発性癌の治療を補助する組成物又はキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上述の目的を達成するために、本発明は、癌転移を治療する方法であって、必要とする対象にインターロイキン−３５（ＩＬ−３５）アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０００５】
本発明はまた、癌転移を治療するための医薬組成物の調製におけるＩＬ−３５アンタゴニストの使用であって、該医薬組成物が該ＩＬ−３５アンタゴニストの治療有効量と薬学的に許容可能な担体とを含む、使用を提供する。
【０００６】
本発明は更に、原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するための医薬組成物であって、ＩＬ−３５アンタゴニストの治療有効量と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明はまた、原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するキットであって、ＩＬ−３５アンタゴニストを含む第一の容器と、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを含む第二の容器とを含むキットを提供する。
【０００８】
本発明は更に、癌を治療する方法であって、（ａ）必要とする対象に原発性癌の治療を施すことと、（ｂ）該対象にＩＬ−３５アンタゴニストの治療有効量及び／又はＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
上記を鑑みて、本発明は、癌転移を治療するためのＩＬ−３５アンタゴニストの使用を提供する。したがって、本発明は、ＩＬ−３５アンタゴニストを用いて癌転移を治療する方法、医薬組成物、及びキットを提供する。本発明は、無癌生存期間及び全生存期間を成功裏に増加させ、癌治療レジメンに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１Ａは、４Ｔ１細胞の播種５週間後の原発性腫瘍（ｐＴＡＭ（ｐ））及び転移性肺（ｍＴＡＭ（ｍ））から単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＴＡＭにおけるＭ１マーカー（Ｎｏｓ２、Ｔｎｆ、ＩＬ１５、Ｃｘｃｌ９、及びＣｘｃｌ１０）とＭ２マーカー（Ａｒｇ１、Ｍｒｃ１、Ｉｌ１０、Ｃｈｉｌ３、及びＣｃｌ１７）との発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、健康なマウス由来の骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）に対して正規化されている。ｎ＝３。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．＝有意差なし。図１Ｂは、４Ｔ１細胞の播種５週間後の原発性腫瘍（ｐＴＡＭ（ｐ））及び転移性肺（ｍＴＡＭ（ｍ））由来のＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｍｒｃ１＋細胞におけるＭ２マーカー（Ａｒｇ１、Ｍｒｃ１、Ｉｌ１０、及びＣｈｉｌ３）の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、健康なマウス由来のＢＭＤＭ（ｎ＝３）に対して正規化されている。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１−２】図１Ｃは、原発性ヒト癌（ｎ＝１１）及び転移性ヒト癌（ｎ＝１２）由来のＣＤ１４＋  ＴＡＭにおけるＭ１マーカー（ＴＮＦＡ、ＩＬ６、ＩＬ１Ｂ）及びＭ２マーカー（ＩＬ１０、ＣＤ１６３、ＣＣＬ１８）の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、末梢血単球由来マクロファージ（ＰＭＭ）に対して正規化されている（ｎ＝５）。データは平均±標準誤差を表す。ｐ値はパネルに示している。ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図２−１】図２Ａは、ＰＢＳ下又はリポソームクロドロネート処置下（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び２００μｇ／ｍｌで２４時間）での４Ｔ１細胞の生存率を分析するためのＭＴＴアッセイ結果を示す。ｎ＝２。図２Ｂは、リポソームクロドロネートの気管内注射を用いた４Ｔ１同所性実験における肺マクロファージ除去の概要を示す。
【図２−２】図２Ｃは、気管内にリポソームクロドロネート又はビヒクル対照（ＰＢＳ）を投与されたマウスの肺におけるＦ４／８０＋マクロファージの定量結果を示す。データは、６つの代表的な場におけるＦ４／８０＋個体数の相対倍率変化として表示されている。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。（各群に対してｎ＝５）。図２Ｄは、マクロファージ除去が転移に及ぼす影響を導き出す図である。上段：原発性腫瘍の写真（左）及び気管内にリポソームクロドロネート又は対照ＰＢＳを投与されたマウスの肺の代表的な写真（右）である。赤色の矢印は転移性肺における小結節を示す。下段：これらの結果を定量したものである。スケールバーは１ｃｍを示す。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。（各群に対してｎ＝５）。
【図２−３】図２Ｅは、腫瘍細胞注入２週間後のＬｙ６ｃ−ＴＡＭ同時注入実験（実験２）における転移性肺小結節の定量結果を示す。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１。（各群に対してｎ＝７）。
【図２−４】図２Ｆは、Ｍｒｃ１＋ＴＡＭ同時注入実験（実験２）の結果を示す。上段：Ｍｒｃ１＋ＴＡＭを伴って又は伴わずに４Ｔ１細胞を注入した２週間後のマウス由来の肺の代表的な写真である。下段：転移性肺小結節の定量結果である。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。（各群に対してｎ＝６）。
【図３−１】図３Ａは、本明細書の実験３の手順を示す。（ＭΦ：マクロファージ）図３Ｂは、所定の馴化培地で４８時間処置した４Ｔ１細胞におけるＥ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンのウェスタンブロットの結果を示す。ＢＭＤＭ（骨髄由来マクロファージ）、ｐＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋原発性ＴＡＭ）、ｍＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋転移性ＴＡＭ）。
【図３−２】図３Ｃは、異なるマクロファージ馴化培地で４８時間インキュベートしたＡ５４９細胞及び４Ｔ１細胞の形態を示した位相差像である。スケールバーは５０μｍを示す。図３Ｄは、異なるマクロファージ馴化培地で４８時間インキュベートしたＡ５４９細胞の移動能を分析するためのトランスウェル遊走アッセイの結果を示す。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図３−３】図３Ｅは、ヒトＣＤ１４＋単球由来の極性化マクロファージにおけるＭ１（ＨＬＡ−ＤＲ）マーカー及びＭ２（ＭＲ及びＣＤ１６３）マーカーの表面発現のフローサイトメトリー分析結果を示す。
【図３−４】同上。
【図３−５】図３Ｆは、ヒトＣＤ１４＋単球由来の極性化マクロファージにおけるＭ１（ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、及びＩＦＮＧ）マーカー及びＭ２（ＭＲＣ１、ＣＤ１６３、及びＣＣＬ１８）マーカーの発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示し、極性化の達成を確認している。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３−６】図３Ｇは、内皮細胞管形成アッセイの結果を示す。上段：ＨＵＶＥＣ組織の代表的な画像である。スケールバーは５０μｍを示す。下段：Ｍ０馴化培地、Ｍ１馴化培地、及びＭ２馴化培地で１２時間共培養した場合の枝分かれ部位数を測定することにより管形成を定量した結果である。ｎ＝３。スケールバーは５０μｍを示す。（Ｍ０  ＣＭ：休止マクロファージ馴化培地、Ｍ１  ＣＭ：Ｍ１マクロファージ馴化培地、Ｍ２  ＣＭ：Ｍ２マクロファージ馴化培地）。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図３−７】図３Ｈは、所定の馴化培地で４８時間処置した際のＯＥＣＭ１細胞、４Ｔ１細胞、及びＡ５４９細胞におけるＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、及びγ−カテニンのウェスタンブロットを示す。
【図３−８】図３Ｉは、所定の馴化培地で４８時間処置した際の４Ｔ１細胞、ＯＥＣＭ１細胞、及びＡ５４９細胞におけるＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、及びビメンチンの免疫蛍光染色結果を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図３−９】図３Ｊは、実験３における経内皮遊走アッセイの結果を示す。上段：所定の馴化培地で処置した際のＡ５４９細胞及びＯＥＣＭ１細胞の経内皮遊走アッセイ結果である。スケールバーは１００μｍを示す。下段：癌細胞遊走の定量結果である。ｎ＝３。データは遊走細胞数の相対倍率変化として示されている。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３−１０】図３Ｋは、同所性ＳＡＳ異種移植マウスモデルから採取した腫瘍サンプルのヘマトキシリン・エオジン染色結果を示す。ＳＡＳ細胞は、播種する前に所定の馴化培地で４８時間処置した。スケールバーは２００μｍを示す。（各群に対してｎ＝５）。  図３Ｌは、Ｍ１  ＣＭ又はＭ２  ＣＭで処置したＡ５４９細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ転移性コロニー形成能を示す。上段：Ｍ１  ＣＭ若しくはＭ２  ＣＭ又は対照培地で前処置したＡ５４９細胞の尾静脈注射を受けたマウス由来の肺の代表的な写真である。下段：腫瘍細胞注射８週間後の転移性肺小結節の定量結果である（各群に対してｎ＝６）。
【図４−１】図４Ａは、４Ｔ１細胞播種５週間後のマウス（ｎ＝３）の原発性腫瘍及び転移性肺由来のＬｙ６Ｃ−ＴＡＭにおけるＩｌ１２ａ及びＥｂｉ３の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、健康なマウス（ｎ＝３）由来のＢＭＤＭに対して正規化されている。図４Ｂは、４Ｔ１播種マウスの転移性肺由来のＬｙ６Ｃ−Ｆ４／８０＋細胞及びＬｙ６Ｃ−Ｆ４／８０−細胞におけるＩＬ−３５（緑）及びＦ４／８０（赤）の免疫蛍光染色結果を示す。青は核である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図４−２】図４Ｃは、２４時間培養後の所定のマクロファージから採取した培地におけるＩＬ−３５レベルを測定するためのＥＬＩＳＡ結果を示す。ｎ＝３。データは平均±標準誤差を表す。＊，ｐ＜０．０５。図４Ｄは、転移性ヒト腫瘍（ｎ＝１０）対末梢血単球由来マクロファージ（ＰＭＭ）（ｎ＝１０）に由来するＣＤ１４＋ＴＡＭにおけるＩＬ１２Ａ及びＥＢＩ３の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは平均±標準誤差を表す。＊，ｐ＜０．０５。
【図４−３】図４Ｅは、２４時間培養後の所定のマクロファージから採取した培地における分泌ＩＬ−３５を定量するためのＥＬＩＳＡ結果を示す。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。図４Ｆは、４８時間ＩＬ−３５（１００ｎｇ／ｍｌ）処置した際の所定の癌細胞株の移動能を分析するためのトランスウェル遊走アッセイの結果を示す。ｎ＝３。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図４−４】図４Ｇは、実験４における同所性異種移植実験の結果を示す。実験はマウスの舌にＳＡＳ細胞を播種する処理により行った。ＳＡＳ細胞は、播種４８時間前の間に組換えＩＬ−３５（５０ｎｇ／ｍｌ）又はビヒクル対照で前処置した。リンパ節を可視化するために腫瘍播種１４日後にＩＶＩＳ画像を撮った（各群に対してｎ＝６）。図４Ｈは、ＩＬ−３５中和の転移に及ぼす影響を示す。上段：４Ｔ１同所性腫瘍マウスモデル（体重：１５ｇ〜２０ｇ）における抗体投与の概要を示す。腫瘍移植２週間後に、５０μｇのＩＬ−３５中和抗体（Ｖ１．４Ｃ４．２２、１００μＬのＰＢＳ中）又はＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照を気管内に送達し、抗体を３日毎に総計５回投与した。４週間目の終わりにマウスを屠殺した。原発性腫瘍及び肺を分析のために採取した。中段：原発性腫瘍の写真及びマウスの肺の代表的な写真である。スケールバーは１ｃｍを示す。下段：腫瘍重量及び肺小結節の定量結果である（ｎ＝６）。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊，ｐ＜０．００１。
【図４−５】図４Ｉは、抗体療法の実験の概要を示す。マウスに４Ｔ１細胞を同所的に移植し、移植した腫瘍を３週目の終わりに外科的に除去した。外科手術後、マウス（体重：１５ｇ〜２０ｇ）に１００μｇの抗ＩＬ−３５抗体（Ｖ１．４Ｃ４．２２、２００μＬのＰＢＳ中）、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（２００μＬのＰＢＳ中）、及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、続いて５０μｇの抗体を３日毎に注射し、総計４回投与した。ＩＶＩＳ評価を５週目の終わりに行った。各群に対してｎ＝７。図４Ｊは、外科手術２週間後の所定の抗体で処置した（図４Ｉに示す通り）マウスの生物発光シグナルを示す。
【図４−６】図４Ｋは、抗体投与後の腫瘍除去マウスの全生存率を示す。ｐ値はパネルに示している。
【図５−１】図５Ａは、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＭ１  ＣＭ又は対照培地で２４時間処置したＡ５４９細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２、Ｅ−カドヘリン、及びＮ−カドヘリンのウェスタンブロット結果を示す。
【図５−２】図５Ｂは、２４時間ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）処置した際の異なる癌細胞株におけるＩＬ１２ＲＢ２の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図５Ｃは、１×１０６個のＴＮＦα前処置Ａ５４９細胞と５×１０５個の休止（Ｍ０）マクロファージ又はＭ２マクロファージとを同時注入されたマウスにおける転移性肺小結節の定量結果を示す。尾静脈注射の２カ月後にマウスを屠殺した（各群に対してｎ＝６）。データは平均±標準誤差を表す。＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１。
【図５−３】図５Ｄは、ＩＬ１２ＲＢ２又は対照配列（ｐＬＫＯ）に対するｓｈＲＮＡを投与されたＡ５４９細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２のノックダウン効率を確認するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果（上段）及びウェスタンブロット結果（下段）を示す。番号はｓｈＲＮＡ実験での二つの別個の配列を示している。ＲＴ−ｑＰＣＲに対してｎ＝２である。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図５Ｅは、実験５における同所性腫瘍実験の結果を示す。Ｉｌ１２ｒｂ２（ｓｈＩｌ１２−ｒβ２）又は対照配列（ｐＬＫＯ）に対するｓｈＲＮＡで感染させた４Ｔ１細胞をマウスに播種した。腫瘍と肺とを腫瘍移植の４週間後に採取した。上段：担癌マウスの原発性腫瘍及び肺の写真である。スケールバーは１ｃｍを示す。下段：腫瘍重量及び肺小結節の定量結果である（各群に対してｎ＝６）。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５−４】図５Ｆは、Ｉｌ１２ｒｂ２（＃１、＃２）又は対照配列（ｐＬＫＯ）に対するｓｈＲＮＡを投与された４Ｔ１細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２のノックダウン効率を確認するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果（上段）及びウェスタンブロット結果（下段）を示す。番号はｓｈＲＮＡ実験での二つの別個の配列を示している。ＲＴ−ｑＰＣＲに対してｎ＝３である。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。図５Ｇは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移性コロニー形成実験の結果を示す。Ｉｌ１２ｒｂ２をノックダウンしたＧＦＰ標識４Ｔ１細胞と、Ｌｙ６Ｃ−Ｆ４／８０＋ｍＴＡＭを同時注入し、注入５日後に肺を採取した（各群に対してｎ＝５）。上段：肺の代表的な切片におけるＧＦＰの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色結果である。下段：５つのパラフィン包埋肺切片の平均ＧＦＰ＋コロニーを数えることによりＩＨＣ結果を定量したものである。
【図５−５】図５Ｈは、胃癌及び肺癌におけるＩＬ１２ＲＢ２発現の予後的影響を示すカプラン・マイヤー生存分析の結果を示す。ｐ値をログランク検定により見積もった。データはカプラン・マイヤープロッターから得た（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／）。
【図５−６】同上。
【図５−７】図５Ｉは、頭頚部癌サンプル（ｎ＝９１）におけるＩＬ−１２Ｒβ２のＩＨＣ染色結果を示す。上段：代表的なＩＨＣ画像である。スケールバーは１００μｍを示す。下段：患者におけるＩＬ−１２Ｒβ２発現とそれに続く転移の発生との相関を示すクロス表である（Ｐ：原発性腫瘍、Ｍ：転移性腫瘍）。低Ｈスコア（０〜１２７）、高Ｈスコア（１２８〜３００）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、癌転移におけるＩＬ−３５の医薬品用途に関する。ＩＬ−３５アンタゴニストを用いることにより、癌転移を抑制、低減、及び／又は予防することができる。
【００１２】
本明細書で使用される場合、対象又は患者における「癌」又は「原発性癌」は、制御不能な増殖、不死性、転移能、急速な成長及び増殖速度、並びに特有の形態的特徴といった発癌性細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を表す。一部の状況では、癌細胞は腫瘍の形態となるか、又は癌細胞は動物の内部に局所的に存在していても、独立細胞として血中を循環していてもよい。
【００１３】
「転移」、「転移性」、又は「転移する」という用語は、原発性腫瘍又は原発腫瘍から別の器官又は組織へ癌細胞が拡散又は遊走することを表し、原発性腫瘍又は原発腫瘍の組織型であり、かつ二次的（転移性）腫瘍が位置する器官又は組織の組織型ではない「二次性腫瘍」又は「二次性細胞集団」の存在によって、通例確認することができる。例えば、骨に遊走した前立腺癌は転移前立腺癌であると言われており、骨組織で増殖する癌性前立腺癌細胞を含んでいる。
【００１４】
転移は微小転移を含むと解することができ、この微小転移は、原発癌性腫瘍のある器官とは直接関係がない器官又は身体部位における検出不可能な量の癌細胞の存在となる。転移はまた、癌細胞が原発腫瘍部位又は原発性腫瘍から出発し、身体の他の部位に遊走及び／又は浸潤するといったプロセスの複数のステップとして定義することもできる。一部の態様では、転移は、原発腫瘍を処置した後に続く、原発腫瘍とは異なる場所における癌性腫瘍の増殖又は出現を表す。
【００１５】
「インターロイキン−３５アンタゴニスト」又は「ＩＬ−３５アンタゴニスト」という用語は、ＩＬ−３５の生理学的機能に対して妨げるか又は該機能を阻害する化合物又は物質を表す。あるいは、該ＩＬ−３５アンタゴニストは、抗体型ＩＬ−３５アンタゴニスト、ＲＮＡｉ型ＩＬ−３５アンタゴニスト、又は小分子阻害剤であり得る。他の実施形態では、該抗体型ＩＬ−３５アンタゴニストは、抗体又はその抗原結合断片であり、以下に限定されないが、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ＩＬ−２７Ｒα、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する抗体又は抗原結合断片を含む。別の代替的な実施形態では、該ＲＮＡｉ型ＩＬ−３５アンタゴニストはｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡであり、該ｓｈＲＮＡ、該ｓｉＲＮＡ及び／又は該ｍｉＲＮＡは、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、Ｐ３５、ＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−２７Ｒα、又はＩＬ−１２Ｒβ２の発現を妨げるものである。他の実施形態では、本明細書で使用される「小分子阻害剤」は、ＩＬ−３５の生理学的機能への抑制効果を有する化合物を表す。
【００１６】
他の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストは多特異性抗体又は抗原結合断片であり得る。別の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストは、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ｇｐ１３０、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＣＳＦ１Ｒからなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である。特定の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストは、ＩＬ−３５及びＣＳＦ１Ｒに結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である。
【００１７】
同様に、「コロニー刺激因子１受容体アンタゴニスト」又は「ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト」という用語は、ＣＳＦ１Ｒの生理学的機能に対して妨げるか又は該機能を阻害する化合物又は物質を表す。他の実施形態では、該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、ＣＳＦ１Ｒに結合する抗体若しくはその抗原結合断片であるか、又はＣＳＦ１Ｒの発現を妨げるｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡである。別の代替的な実施形態では、該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは小分子ＣＳＦ１Ｒ阻害剤である。
【００１８】
用語「抗体」は、抗体の種々の形態を包含しており、以下に限定されないが、全抗体、抗体断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｔ細胞エピトープ枯渇抗体、及び本発明の特徴的な特性が保持される限りは、更に遺伝子操作された抗体を含む。「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン又は少なくともその抗原結合部位を含む。
【００１９】
抗体断片の例には、二重特異性抗体と、一本鎖抗体分子と、抗体断片から形成された多特異性抗体とが含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−８８に記載されている。更に、抗体断片には、抗原に結合するＶＨドメインの特性、すなわち、ＶＬドメインと合わさって機能的抗原結合部位になることができる特性を有するか、又は抗原に結合するＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと合わさって機能的抗原結合部位になることができる特性を有し、それにより本発明の特性を提供する、一本鎖ポリペプチドが含まれる。
【００２０】
本発明の抗体は、酵素、蛍光物質、放射性物質、及びタンパク質などの種々の分子と結合することによって修飾され得る。修飾された抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。この修飾方法は、当該技術分野で一般的に用いられている。また、抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とを有するキメラ抗体として得ることができるか、又は非ヒト抗体由来の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）と定常領域とを含むヒト化抗体として得ることができる。こうした抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いることによって調製することができる。
【００２１】
本明細書で使用される「発現を妨げる」という記述は、標的タンパク質又は遺伝子の転写又は翻訳を低減、停止、抑制することを意味する。標的タンパク質又は遺伝子の発現を妨げる一般的に用いられるツールとして、以下に限定されないが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００２２】
「原発性癌の治療」は、本明細書で使用される場合、癌若しくは腫瘍を部分的若しくは全体的に除去、消滅、破壊、切除、サイズ低減、良性化、若しくは増殖阻害するという効果を有することを目的とするか、又は該効果を有する、任意の種類若しくは手段の任意の治療を意味する。例えば、原発性治療として、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、及び超音波療法のうちの一つ以上が挙げられ得る。他の実施形態では、原発性癌の治療は固体腫瘍の外科的切除である。
【００２３】
「投与する」「投与している」又は「投与」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の発明した医薬組成物を挿入、吸収、摂取、注射、吸入、又は他の方法で導入することを表す。
【００２４】
本明細書で使用される「癌転移の治療」という記述は、癌転移を抑制、低減、及び／又は予防することを意味する。他の実施形態では、具体的には、該癌転移を抑制することは、癌転移の進行又は発生を抑制することを意味する。別の実施形態では、該癌転移を低減することは、癌転移の程度、領域、又は量を低減することを意味する。別の実施形態では、該癌転移を予防することは、癌転移の出現又は再発を予防することを意味する。
【００２５】
本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」は、望ましい効果（例えば、癌転移の治療は本発明の望ましい効果である）を、単独で又は一つ若しくは複数の他の活性剤と併用して対象に与えるのに必要な各活性剤の量を表す。当業者であれば認識するように、有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度や、年齢、健康状態、サイズ、性別、及び体重を含めた個別の患者パラメータ、治療の期間、（適用される場合）併用療法の性質、特定の投与経路、並びに医療従事者の知見及び専門知識の範囲内の因子等に応じて変動する。これらの因子は当業者にはよく知られており、日常的な実験だけで対応することができる。個別の成分またはその組み合わせの最大用量、つまり賢明な医学的判断に従った最大安全量を使用することが一般的に好ましい。しかし、患者は、医学的理由、精神的理由、または実質的にその他任意の理由で、より低い用量または耐えられる用量を要求し得ることが、当業者には理解されるであろう。
【００２６】
本発明の第一の態様において、癌転移を治療する方法が提供される。癌転移を治療する本方法は、必要とする対象にＩＬ−３５アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む。
【００２７】
該治療有効量は、前段に記載した通りに定義される。本発明の他の実施形態では、該治療有効量は、動物モデル実験又はヒト臨床試験から算出することができ、例えば、企業向けガイダンス（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）（ＦＤＡ、２００５、７ページ、表１）に教示されるように算出することができる。一部の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストの該治療有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）である。好ましい実施形態では、該治療有効量は以下の数値の間の任意の範囲であってもよい：０．０１、０．０５、０．１、０．３、０．５、１、１．５、２、３、４、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）。
【００２８】
好ましい実施形態では、本方法は更に、該対象にＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの治療有効量を投与することを含む。他の実施形態では、該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの該治療有効量は０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）である。好ましい実施形態では、該治療有効量は以下の数値のうちの任意の二つの間の範囲であってもよい：０．０１、０．０５、０．１、０．３、０．５、１、１．５、２、３、４、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）。
【００２９】
一部の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストと該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、同時に又は相互に任意の間隔で投与され得る。他の実施形態では、該間隔は、１分、３分、５分、１０分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、又は６００分であってもよい。他の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストが最初に投与され、該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストがその後に投与される。別の実施形態では、該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが最初に投与され、該ＩＬ−３５アンタゴニストがその後に投与される。
【００３０】
一部の実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び／又は該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの投与頻度は、一週間に二回、一週間に一回、２週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、若しくは１０週間毎であるか、又は一カ月に一回、２カ月毎、若しくは３カ月毎、又はそれ以上である。本療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。投与レジメン（使用される抗体を含む）は、経時的に変化し得る。
【００３１】
一部の実施形態では、医学分野の当業者に公知である従来の方法を使用して、該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び／又は該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを、治療すべき癌の種類に応じて対象に投与することができる。本組成物はまた、他の従来の経路を介して投与することができ、例えば、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、直腸内に、経鼻的に、頬側に、経膣的に、又は埋め込みリザーバーを介して投与することができる。「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内の注射又は注入手法を含む。更に、本組成物は、注射可能なデポー投与経路を介して、例えば１カ月、３カ月、又は６カ月のデポー注射用又は生分解性の材料及び方法を用いて、対象に投与され得る。
【００３２】
本発明の第二の態様において、癌転移を治療するための医薬組成物の調製におけるＩＬ−３５アンタゴニストの使用が提供される。本発明の第三の態様において、該医薬組成物が提供される。
【００３３】
該医薬組成物は、ＩＬ−３５アンタゴニストと薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書で使用される「薬学的に許容可能」という用語は、当該技術分野で公知の意味を表す。例えば、「薬学的に許容可能」は、対象に対して無毒であり、検討されている医薬組成物の活性成分の有効性を損なうことがないことを意味する。該薬学的に許容可能な担体には、水、ＰＢＳ、塩類溶液類、ゼラチン類、オイル類、アルコール類、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。該賦形剤の例として、以下に限定されないが、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、保存剤、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
該ＩＬ−３５アンタゴニストは、該医薬組成物の適切な割合を占め得る。医薬組成物における活性成分の量は、活性成分の安定性、活性成分の有効性（活性成分の有効量に対応）、医療従事者のレジメン、患者のコンプライアンスといった様々な因子に基づいて決定され得ることが当該技術分野で知られている。他の実施形態では、該医薬組成物は、該医薬組成物の総重量に対して０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの該ＩＬ−３５アンタゴニストを含む。別の代替的な実施形態では、該ＩＬ−３５アンタゴニストの量は以下の数値のうちの任意の二つの間の範囲である：０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ。
【００３５】
好ましい実施形態では、該医薬組成物はＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを更に含む。好ましくは、該医薬組成物は、該医薬組成物の総重量に対して０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを含む。別の代替的な実施形態では、該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの量は以下の数値のうちの任意の二つの間の範囲である：０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ。
【００３６】
本発明の第四の態様において、原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するためのキットが提供される。該キットは、ＩＬ−３５アンタゴニストを含む第一の容器と、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを含む第二の容器とを備える。
【００３７】
「原発性癌の治療を受けた対象」とは、該対象が原発性癌を有していたが、癌治療により治療されたことを意味する。該原発性癌の治療は前段に記載した通りに定義される。
【００３８】
好ましい実施形態では、該第一の容器は、上記に記載した本発明の医薬組成物を含む。他の実施形態では、前述の容器に含まれている該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び／又は該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、保管安定性、投与経路などの要件に従って製剤化されている。例えば、該第一の容器に含まれているＩＬ−３５アンタゴニストは、注射液として製剤化することができ、該第一の容器はアンプルである。該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び／又は該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが注射液として製剤化される実施形態では、該キットはシリンジを更に含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の第五の態様において、癌を治療する方法は、（ａ）必要とする対象に原発性癌の治療を施すことと、（ｂ）該対象にＩＬ−３５アンタゴニストの治療有効量及び／又はＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの治療有効量を投与することを含む。
【００４０】
他の実施形態では、該（ａ）工程と該（ｂ）工程が任意間隔で行われる。例えば、３０分、６０分、５時間、１０時間、２０時間、１日、３日、５日、１週間、３週間、１カ月、３カ月、又は６カ月の間隔である。
【００４１】
好ましい実施形態では、該対象は、該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの両方を該工程（Ｂ）で投与され、該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは同時に又は相互に任意の間隔で投与される。該間隔は、前段に記載した通りに定義される。
【００４２】
本明細書に記載されている本発明を更に十分理解するために、以下の実施例／実験を説明する。これらの実施例は単なる例示を目的とするものであり、本発明を何ら制限するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。
【００４３】
実験１：原発性腫瘍及び転移性腫瘍における腫瘍関連マクロファージの特性
本試験では、原発性腫瘍及び転移性腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（すなわち、ｐＴＡＭ及びｍＴＡＭ）の特有の役割を調べた。マウス同所性乳癌モデルを、同系４Ｔ１乳癌細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに播種することによって作製した。腫瘍細胞を播種した四〜五週間後に肺転移が発生した。更なる分析のためにＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージを原発性腫瘍及び転移性肺組織から単離した。その結果、ｐＴＡＭは主としてＭ１マクロファージ関連マーカーを発現することがわかった。興味深いことに、ｐＴＡＭは、特定のＭ２マクロファージ関連マーカー（例えば、Ａｒｇ１及びＭｒｃ１）も発現した。逆に、ｍＴＡＭでは、Ｍ１ではなくＭ２パターンが支配的であることがわかった（図１Ａ）。更に、Ｆ４／８０＋Ｍｒｃ１＋ＴＡＭを原発性腫瘍及び転移性腫瘍から単離した。この集団においても、ｍＴＡＭはｐＴＡＭよりも高いレベルのＭ２関連マーカーを発現した（図１Ｂ）。採取した原発性腫瘍及び転移性腫瘍におけるＭ１マーカー及びＭ２マーカーの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色結果が、この知見を裏付けた（データは示さず）。
【００４４】
次に、ＣＤ１４＋ＴＡＭをヒト原発性癌及び転移性癌から単離し、免疫マーカーの発現を調べた。一貫性のある結果が見られた：ｐＴＡＭはＭ１特異的マーカー（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ６、及びＩＬ１Ｂ）を発現し、ｍＴＡＭはｐＴＡＭよりも高いレベルのＭ２マーカー（例えば、ＣＤ１６３）を発現する傾向にあった（図１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ｐＴＡＭとｍＴＡＭとが、別個のマーカーを発現し、かつ異なる機能を持つ別個の集団であることを示唆している。
【００４５】
実験２：ｍＴＡＭが転移性腫瘍のコロニー形成を促進する
本試験では、ｍＴＡＭが転移性コロニー形成に関与すると推測し、転移部位でのマクロファージの役割に着目した。マクロファージをリポソームクロドロネートによって除去することができることが知られている（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｐａｌｌａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。したがって、リポソームクロドロネートの気管内注射により肺マクロファージを除去し、転移性コロニー形成への影響を観察した。クロドロネート自体は、４Ｔ１細胞の増殖に有意な影響を及ぼさなかった（図２Ａ）。肺マクロファージの除去により、原発性腫瘍の重量に影響を及ぼすことなく肺転移が有意に減少した（図２Ｂ〜図２Ｄ）。
【００４６】
続いて、ｐＴＡＭ及びｍＴＡＭのコロニー形成促進効果を調べた。４Ｔ１細胞とＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｌｙ６ｃ−ｍＴＡＭとの尾静脈を介した同時注入により、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｌｙ６ｃ−ｐＴＡＭとの同時注入に比べて、肺腫瘍のコロニー形成が増加した（図２Ｅ）。一貫性のある結果が、４Ｔ１細胞とＦ４／８０＋Ｍｒｃ１＋ｐＴＡＭ又はｍＴＡＭの尾静脈を介した同時注入によって示された。Ｆ４／８０＋Ｍｒｃ１＋ｍＴＡＭはまた、ｐＴＡＭよりも肺コロニー形成を促進する能力を有していた（図２Ｆ）。まとめると、これらの結果はｍＴＡＭが転移性コロニー形成を促進するより高い能力を有することを示唆している。
【００４７】
実験３：Ｍ２様マクロファージは、癌細胞の上皮表現型を促進する
次に、ｍＴＡＭが癌細胞のコロニー形成に直接影響を与えることができるかどうかを調べた。蓄積された根拠から、転移性コロニー形成における間葉上皮転換（ＭＥＴ）の役割が示唆されている（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ｍＴＡＭが癌細胞の上皮可塑性を調節するかどうかを調べ、他の免疫細胞の影響を除外するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで実験を行った。
【００４８】
この目的のために、ｐＴＡＭとｍＴＡＭとを４Ｔ１同所性モデルから単離した後に、癌細胞（Ａ５４９細胞及び４Ｔ１細胞）をＴＡＭ由来の馴化培地で処置した（図３Ａ）。ｐＴＡＭの影響と比較すると、ｍＴＡＭ由来の培地で４Ｔ１細胞を処置することにより、Ｅ−カドヘリンの発現が増加し、Ｎ−カドヘリンが下方制御された（図３Ｂ）。ｍＴＡＭ由来の培地はまた、上皮形態を誘導し、癌細胞の遊走を低減させており（図３Ｃ及び図３Ｄ）、これは、間葉表現型が、ｍＴＡＭ由来の馴化培地で処置した際に抑制されたことを示唆している。
【００４９】
ｍＴＡＭはＭ２様表現型（前掲）を優位に示したため、後続実験のために、ヒトＣＤ１４＋単球をＭ１様マクロファージ及びＭ２様マクロファージにｉｎ  ｖｉｔｒｏ極性化した。既報（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｋｚｈｙｓｈｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）に従い、標準の極性化手順を行った。表面マーカー、遺伝子発現プロファイル、及び血管形成能の分析により、マクロファージの極性化の成功を確認した（図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ）。
【００５０】
更にｃＤＮＡマイクロアレイ分析を行い、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージ（Ｍ１−ＣＭ、Ｍ２−ＣＭ）由来の馴化培地で処置した肺癌細胞株Ａ５４９のトランスクリプトームプロファイルを作製した（データは示さず）。ＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Ｍ１−ＣＭ処置癌細胞の遺伝子発現シグネチャーが、コア上皮間葉転換（ＥＭＴ）シグネチャーと有意に相関することを示した。逆に、Ｍ２−ＣＭ処置のシグネチャーとＥＭＴシグネチャーの間には逆相関が見られており（データは示さず）、これは、Ｍ２セクレトームが癌細胞に影響を及ぼして、上皮表現型を獲得し、逆ＥＭＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ＥＭＴ）を受けていることを示唆している。
【００５１】
一貫して、Ｍ１マクロファージ由来の馴化培地と比較して、Ｍ２マクロファージ由来の培地は、種々の癌細胞株においてＭＥＴを誘導しており、これは上皮マーカーの上方制御と間葉マーカーの下方制御により明らかになっている（図３Ｈ）。また、この培地は、Ｅ−カドヘリンの膜性発現による上皮形態を誘導し（図３Ｉ）、内皮を介した浸透力を低減させた（図３Ｊ）。
【００５２】
ＥＭＴの阻害により局所浸潤が低減するが、転移性コロニー形成が促進する（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）ため、二つの実験を行って、癌細胞のＭ２−ＣＭ調節上皮可塑性がｉｎ  ｖｉｖｏで及ぼす影響を検証した。最初に、口腔癌細胞株ＳＡＳをＭ１培地、Ｍ２培地、又は対照培地で処置した後、マウスの舌にＳＡＳ細胞を播種した。その結果、Ｍ１−ＣＭ処置ＳＡＳ細胞では局所浸潤が増加したが、Ｍ２−ＣＭ処置細胞は末梢浸潤なく限局性腫瘍を形成した（図３Ｋ）。
【００５３】
続いて、Ｍ１−ＣＭ処置又はＭ２−ＣＭ処置Ａ５４９細胞を尾静脈を介して注入し、転移性コロニー形成能を調べた。転移性小結節の数が、Ｍ２−ＣＭ処置癌細胞を投与されたマウス群で有意に増加した（図３Ｌ）。合わせると、これらの結果は、Ｍ２様マクロファージはＥＭＴを抑制し、癌細胞の転移性コロニー形成を促進することを示唆している。
【００５４】
実験４：転移性ＴＡＭはＩＬ−３５を分泌して癌細胞のコロニー形成を促進させる
ｍＴＡＭ媒介癌コロニー形成に関与する因子を明らかにするために、４Ｔ１同所性腫瘍モデルから単離したｐＴＡＭ及びｍＴＡＭのマイクロアレイ分析を行った。ＩＬ−３５（Ｅｂｉ３及びＩＬ−１２Ａからなる）が、ｍＴＡＭにおいて上方制御された分泌因子として見いだされた。４Ｔ１マウス腫瘍モデルでは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）と比較した場合、ｍＴＡＭにおいてＥｂｉ３とＩｌ１２ａの発現が有意に増加したが、ｐＴＡＭでは増加しなかった（図４Ａ）。これらのマウスの肺では、Ｆ４／８０＋ＴＡＭにおいてＩＬ−３５の発現が見られたが、Ｆ４／８０−細胞では見られず、転移性腫瘍におけるＩＬ−３５発現の源を確認した（図４Ｂ）。Ｌｙ６Ｃ−ｍＴＡＭは、ｐＴＡＭ及びＢＭＤＭと比較してＩＬ−３５をより高いレベルで分泌する（図４Ｃ）。
【００５５】
ヒト癌サンプルでは、転移性腫瘍由来のＣＤ１４＋ＴＡＭは、末梢血単球由来マクロファージ（ＰＭＭ）と比較して、ＥＢＩ３及びＩＬ１２Ａをより高いレベルで発現した（図４Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ極性化ヒトＭ２マクロファージは、高レベルのＩＬ−３５を発現及び分泌した（図４Ｅ）。更に、ＩＬ−３５前処置により、４Ｔ１細胞、Ａ５４９細胞、ＯＥＣＭ１細胞、及びＳＡＳ細胞の移動能が低下した（図４Ｆ）。ＩＬ−３５前処置したＳＡＳ細胞をヌードマウスの舌に播種すると、腫瘍細胞の転移性コロニー形成が増加した（図４Ｇ）。ＩＬ−３５中和抗体を４Ｔ１担癌マウスに気管内注射すると、一貫して、原発性腫瘍の増殖に影響を及ぼすことなく、肺転移が有意に低減した（図４Ｈ）。抗ＩＬ−３５抗体は、４Ｔ１細胞の増殖に何ら影響を及ぼさなかった（データは示さず）。
【００５６】
転移性コロニー形成におけるＩＬ−３５の役割を明らかにするために、４Ｔ１マウスモデルにおいて、移植３週間後に原発性腫瘍を除去した。外科手術の後、マウスにＩＬ−３５、ＣＳＦ１Ｒ、若しくはその両方、又はＩｇＧアイソタイプ対照に対する抗体を投与した（図４Ｉ）。転移の発生は、外科手術の２週間後にＩＶＩＳ分析によりモニタリングした。抗ＩＬ−３５抗体又は抗ＣＳＦ１Ｒ抗体のいずれかを投与すると、転移の発生は低減し、抗ＩＬ−３５抗体及び抗ＣＳＦ１Ｒ抗体の組み合わせによって、転移の予防に対する最大の改善効果を得た（図４Ｊ）。抗ＩＬ−３５抗体処置又は抗ＣＳＦ１Ｒ抗体処置により、マウスの生存率が増加した。この中で、組み合わせ処置（抗ＩＬ−３５及び抗−ＣＳＦ１Ｒ）を受けたマウスは、生存率の最大の改善を示した（図４Ｋ）。まとめると、これらの結果は、マクロファージ分泌ＩＬ−３５が種々の癌細胞の転移性コロニー形成に重要な役割を果たしていることを示している。更に、ＩＬ−３５の中和により、転移が低減し、マウスの生存率を増加させることができる。
【００５７】
実験５：ＴＮＦαは癌細胞においてＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導して転移性コロニー形成を促進する
ＴＡＭからのシグナルを受ける癌細胞におけるＩＬ−３５受容体の発現を調べた。ＩＬ−３５受容体は、ＩＬ−１２Ｒβ２及びｇｐ１３０を含むヘテロ二量体である（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αは、マクロファージにより産生される炎症性サイトカインであり、ＥＭＴを誘導することができる（データは示さず）。転移性部位でシグナルを受け取るＩＬ−３５受容体を、ＴＮＦα感作癌細胞が有しているかどうかを調べた。
【００５８】
Ｍ１−ＣＭ処置又はＴＮＦα処置は、Ａ５４９細胞において、ＥＭＴマーカー（Ｎ−カドヘリン）と、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現とを誘導した（図５Ａ）。更に、ＴＮＦαは、四つの異なる癌細胞株においてＩＬ１２ＲＢ２のｍＲＮＡのレベルを上方制御した（図５Ｂ）。続いて、ＩＬ−３５媒介シグナルを介した転移性コロニー形成に対するＴＮＦα感作癌細胞の役割を明らかにした。ＴＮＦα前処置Ａ５４９細胞は、より高い肺コロニー形成能を有した。Ｍ２マクロファージとの同時注入により、ＴＮＦα感作癌細胞のコロニー形成が有意に増進した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。４Ｔ１同系腫瘍モデルにおいて、ＩＬ−１２Ｒβ２発現を抑制することにより、原発性腫瘍の増殖に影響を及ぼすことなく転移が低減した（図５Ｅ及び図５Ｆ）。更に、Ｉｌ１２ｒｂ２ノックダウン腫瘍細胞においてｍＴＡＭ誘導転移性コロニー形成を抑止した（図５Ｇ）。
【００５９】
公開データベースを分析することにより、癌サンプルでの高レベルのＩＬ１２Ｒβ２は、肺癌及び胃癌の患者の生存率の低さと関連があることがわかった（図５Ｈ）。９１個の頭頚部癌の原発性腫瘍におけるＩＬ−１２Ｒβ２の発現をＩＨＣで評価した結果、ＩＬ−１２Ｒβ２のレベルが高いことと、続いて転移が発生する確率が高いことには相関があることがわかった（表１）。更に、１０個の対応のある原発性−転移性腫瘍サンプル対におけるＩＬ−１２Ｒβ２の発現を分析したところ、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現が転移性腫瘍においてより高いことが明らかになった（図５Ｉ）。
【００６０】
表１
【表１】
2020505319.tif 000002
まとめると、これらのデータは、炎症誘発性ＥＭＴが、癌細胞においてＩＬ−１２Ｒβ２の発現を上方制御し、これは、癌細胞がｍＴＡＭ由来のＩＬ−３５に応答して転移性コロニーを形成するのに不可欠となることを示している。
【００６１】
材料及び方法
細胞株、プラスミド、及び試薬。ヒト頭頚部癌細胞株ＳＡＳ（ＲＩＤ  ＃  ＣＶＣＬ＿１６７５）、ヒト胚腎臓細胞株２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）、ＢＡＬＢ／ｃマウス乳癌細胞株４Ｔ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ２５３９）、及びＣ５７ＢＬ／６マウス肺癌細胞株ＬＬＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４２）をＡＴＣＣから得た。ヒト頭頚部癌細胞株ＯＥＣＭ１は、Ｄｒ．  Ｋｕｏ−Ｗｅｉ  Ｃｈａｎｇ（台湾国立陽明大学）より提供された。ｐＬＫＯ．１−対照（ＡＳＮ０００００００００４）、ｈＩＬ１２Ｒβ２＃１  ｓｈＲＮＡ（ＴＲＣＮ００００４３６７５０）、ｈＩＬ１２Ｒβ２＃２  ｓｈＲＮＡ（ＴＲＣＮ０００００５８１５８）、ｍＩＬ１２Ｒβ２＃１  ｓｈＲＮＡ（ＴＲＣＮ０００００６７７２０）、及びｍＩＬ１２Ｒβ２＃２  ｓｈＲＮＡ（ＴＲＣＮ０００００６７７２１）を、遺伝子サイレンシング用に台湾の国立ＲＮＡｉコア施設（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡｉ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から入手した。組換えヒトインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（ニュージャージー州ロッキーヒル）から購入した。組換えヒトＴＮＦαをＡｂｂｉｏｔｅｃ（カタログ番号６００１７３、Ａｂｂｉｏｔｅｃ社、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。組換えヒトＩＬ−３５をＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カタログ番号５７８５０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。リポ多糖（ＬＰＳ）及びデキサメタゾンをシグマ  アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００６２】
動物モデル。動物実験は、台北栄民総医院（Ｔａｉｐｅｉ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のＩＡＣＵＣ（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された（ＩＡＣＵＣ  ２０１６−１１５）。三つのモデルを用いて、転移の発生をモニタリングした。マウスの同系及び同所性の腫瘍モデルに対して、１．５×１０５個の４Ｔ１細胞を５週齢〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの脂肪体に播種した。同系モデルに対しては、１．５×１０５個のＬＬＣ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下播種した。同所性異種移植モデルに対しては、１×１０５個のＳＡＳ細胞を６週齢のヌードマウスの舌に移植した。４〜５週間後に、転移性肺小結節を４Ｔ１及びＬＬＣモデルで評価し、異種移植ＳＡＳモデルにおける転移性リンパ節をＸｅｎｏｇｅｎ製ＩＶＩＳスペクトルシステムで評価した。
【００６３】
転移性コロニー形成。転移性コロニー形成能を評価するために、ルシフェラーゼベクターを持つ癌細胞を懸濁し、マウスの尾静脈に注入した。肺転移を、肺表面小結節、肺パラフィン切片のＧＦＰ染色、又はＩＶＩＳシステムを用いたｅｘ  ｖｉｖｏイメージングによって測定した。リポソームクロドロネートを、マクロファージの全身的除去のために腹腔内に注入するか、又は肺マクロファージの除去のために気管内に注入した。また、転移性シグナルを妨害する抗体を腹腔内又は気管内に送達した。微小転移のコロニー形成への影響を調べるために、４Ｔ１同所性モデルの原発性乳房腫瘍を播種３週間後に外科的に除去し、ＩＶＩＳスペクトルイメージングを用いて腫瘍の完全除去を確認した。外科手術後に、マウスを、各図に示すように抗体、阻害剤、又は対照で処置した。再発／転移腫瘍をＩＶＩＳイメージングで可視化し、マウスの生存をカプラン・マイヤー法を用いて調べた。
【００６４】
マウス腫瘍及びヒト腫瘍由来のＴＡＭの単離。ＴＡＭを新鮮な原発性及び転移性の腫瘍サンプルから単離した。簡単に述べると、組織を小片に刻み、１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｎｏ．９００１−１２−１、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、マサチューセッツ州ウォルサム）と１．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｎｏ．Ｈ６２５４、シグマ  アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）とを含むダルベッコ変法イーグル培地で３７℃にて１時間消化した。続いて、細胞を２００μｍの細胞ろ過器でろ過した。次に、細胞を７００ｇで２０分遠心分離し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｎｏ．１７−５４４５−０２、シグマ  アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）を用いて細胞の異なる層を分離した。ヒトＴＡＭをＣＤ１４マイクロビーズ（Ｎｏ．１３０−０５０−２０１、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いた磁気活性細胞選別（ＭＡＣＳ）により単離し、マウスＴＡＭを、図に示した所定のマーカーで、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて選別した。
【００６５】
患者サンプル。本試験は、台北栄民総医院の治験審査委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）により承認された（２０１６−０７−００１ＣＣ）。本試験では３セットの患者サンプルを用いた。第一のセットは、頭頚部癌を有する同一患者由来の１０個の原発性腫瘍及び１０個の転移性腫瘍のパラフィン包埋サンプルから成った。これらのサンプルをＩＬ−１２Ｒβ２のＩＨＣ分析用に用いた。第二のセットは、１１個の新たに単離された原発性腫瘍（６個の結腸癌、４個の頭頚部癌、及び１個の胃癌）と１２個の新たに単離された転移性腫瘍（７個の結腸癌、４個の頭頚部癌、及び１個の胃癌）とから成った。サンプルを、外科手術で採取した直後に１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶと１．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼとを含むダルベッコ変法イーグル培地で消化し、ＭＡＣＳを用いてＣＤ１４＋ＴＡＭを後続の分析用に選別した。ヒト末梢血単球由来マクロファージ（ＰＭＭ）を、本試験の対照として、１０体の健康なドナーから単離した末梢血中単核細胞（ＰＢＭＣ）から極性化した。第三のセットは、頭頚部癌患者由来の９１個の腫瘍から成った。これらのサンプルを、ＩＬ−１２Ｒβ２のＩＨＣ分析用に、またＩＬ−１２Ｒβ２発現レベルと癌転移との間の相関を調べるために用いた。
【００６６】
定量ＲＴ−ＰＣＲ。定量ＰＣＲをＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲに用いられるプライマー配列を下記表のプライマーリストに記載している。
【００６７】
フローサイトメトリー。細胞を採取し、ＰＢＳで二回洗浄した。続いて、細胞を原発性抗体（以下の抗体リスト表を参照）で４℃にて１時間インキュベートした後に、二次抗体で４℃にて３０分インキュベートした。染色した細胞を、ＣｙｔｏｍｉｃｓＴＭ  ＦＣ５００フローサイトメトリー装置（ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア）でＣｙｔｏｍｉｃｓ  ＣＸＰ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア）を用いて分析した。
【００６８】
ウェスタンブロット。手順を上述した通りに実行した（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。結果をＧＥ  ＬＡＳ−４０００（ＧＥヘルスケア社、マサチューセッツ州マルボロ）で測定した。
【００６９】
マクロファージ除去。リポソームクロドロネート及びリン酸緩衝液リポソームをＣｌｏｄｒｏｎａｔｅＬｉｐｏｓｏｍｅｓ．ｏｒｇ（ハールレム、オランダ）から購入した。リポソーム製剤におけるクロドロネートの濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。リポソームクロドロネートの単回用量を、腹腔内（１ｍｇ／マウス）又は気管内（０．５ｍｇ／マウス）注入により所定回数投与した。
【００７０】
内皮細胞毛細管形成アッセイ。馴化培地（ＢＭＤＭ、選別済ＴＡＭ、ＰＭＤＭ、Ｍ１マクロファージ、又はＭ２マクロファージから得られる）を用いて、５×１０４個のＨＵＶＥＣを再懸濁し、続いてマトリゲル上に直接播種した。１２時間後、枝分かれの数を測定することにより、毛細管形成を分析及び定量した。
【００７１】
ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）。経路分析及び全体的機能分析を、前述した通りに（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を用いて行った。簡潔に述べると、遺伝子識別子及び対応する発現値を含むデータセットをアップロードし、各遺伝子をＩＰＫＢ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ）を用いてマッピングした。
【００７２】
公開データセット及びＧＳＥＡの分析。肺癌及び胃癌の患者における遺伝子発現の生存曲線を、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／）から得た。ＧＳＥＡをＪＡＶＡ（登録商標）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ）を用いて行った。コアＥＭＴ遺伝子シグネチャー（Ｔａｕｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いて、Ｍ１−ＣＭ処置及びＭ２−ＣＭ処置のＡ５４９細胞におけるトランスクリプトーム変化をまとめた。
【００７３】
ヒト単球の調製。末梢単核細胞を、健康的なドナーの血液から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いた標準的な密度勾配遠心分離により単離した。続いて、ＣＤ１４＋細胞を末梢単核細胞から抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｎｏ．１３０−０５０−２０１、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）用いた高勾配磁気選別により精製した。Ｍ０マクロファージを極性化するために、ＣＤ１４＋単球を、ｈＭ−ＣＳＦを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ライフテクノロジーズ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）で５日間培養した。三日目に、ｈＭ−ＣＳＦを添加した新鮮な培地（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
【００７４】
マクロファージ極性化及び馴化培地捕集。５％のＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１４６０培地において、１μｇ／ｍｌのＬＰＳと２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、又は２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４と０．１μＭのデキサメタゾンをそれぞれ添加することにより、Ｍ０マクロファージをＭ１マクロファージ又はＭ２マクロファージに極性化した。４８時間後、更なる４８時間の間、極性化したマクロファージの培地を新鮮な培地に変え、これらは異なるＭ１馴化培地及びＭ２馴化培地として作用した。
【００７５】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）馴化培地をＩＬ−３５ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号４４０５０８及び４３９５０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて評価した。選別したＴＡＭ又は極性化したマクロファージを播種し、２４時間培養した。遠心分離後に上清を採取し、ＩＬ−３５をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００７６】
免疫蛍光。細胞をポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたスライドに播種し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過性にした。ＤＡＰＩを核染色に用いた。画像を６０倍の油対物（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＵＰＬＳＡＰＯ  ６０ＸＯ、ＮＡ  １．３５）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０ｉレーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパス社、東京、日本）を用いて撮影した。画像をレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて経時的に収集し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０−ＡＳＷ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを用いて分析した。
【００７７】
免疫組織化学。脱パラフィン、再水和、抗原回復（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）、透過処理、抗体ハイブリダイゼーション、及び可視化を、前述した通りに行った（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。免疫組織化学的等級づけとして、ＩＬ−１２Ｒβ２の強度を０、１＋、２＋、３＋として定義した。免疫スコア（Ｈスコア）を、強度（０〜３＋）に各サンプルに対する発現割合（０〜１００）を乗じたものとして定義した。スライドを二つの個体により独立して点数化した。
【００７８】
細胞生存性及び増殖アッセイ。細胞生存性のアッセイとして、１×１０４個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩インキュベーションした後に、種々の濃度の試薬で処置した。２４時間後、増殖培地を廃棄し、ＭＴＴアッセイ溶液を３７℃で１時間加えた。新規に形成したミトコンドリアＭＴＴ結晶をジメチルスルホキシドで溶解し、吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて読み取った。
【００７９】
細胞遊走アッセイ。細胞遊走を８μｍのフィルタメンブレンを含む上部チャンバを備えたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社）を用いて評価した。１００μｌの０．５％ＦＢＳ培養培地細胞に懸濁された細胞（２×１０５個）を上部チャンバに入れ、６００μｌの１０％ＦＢＳ培地を下部チャンバに加えた。２４時間後、メンブレンを４％ＰＦＡで固定した後に、視覚化のために染色した。
【００８０】
受託番号。馴化培地で処置したＡ５４９細胞のｃＤＮＡマイクロアレイのデータセットは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）に受託番号ＧＳＥ５９６９４３で寄託されていた。４Ｔ１マウスモデル由来のｐＴＡＭ対ｍＴＡＭ（対照としてＢＭＤＭ）のｃＤＮＡマイクロアレイのデータセットは、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）に受託番号ＧＳＥ５９６９４４で寄託されていた。
【００８１】
統計分析。両側独立ステューデントｔ検定を用いて二群間の連続変量を比較した。カイ二乗検定を適用して、非二分変数を比較した。カプラン・マイヤー推定及びログランク検定を用いて、患者群間の生存率を比較した。全ての統計データは独立して取得され、かつ少なくとも二つの独立した実験により分析され、ｐ値が０．０５未満の場合、有意であるとみなした。
【００８２】
本発明で使用される抗体の表：
【表２−１】
2020505319.tif 000003
【表２−２】
2020505319.tif 000004
本発明で使用されるプライマーの表：
【表３−１】
2020505319.tif 000005
【表３−２】
2020505319.tif 000006
【図１−１】
2020505319.tif 000007
【図１−２】
2020505319.tif 000008
【図２−１】
2020505319.tif 000009
【図２−２】
2020505319.tif 000010
【図２−３】
2020505319.tif 000011
【図２−４】
2020505319.tif 000012
【図３−１】
2020505319.tif 000013
【図３−２】
2020505319.tif 000014
【図３−３】
2020505319.tif 000015
【図３−４】
2020505319.tif 000016
【図３−５】
2020505319.tif 000017
【図３−６】
2020505319.tif 000018
【図３−７】
2020505319.tif 000019
【図３−８】
2020505319.tif 000020
【図３−９】
2020505319.tif 000021
【図３−１０】
2020505319.tif 000022
【図４−１】
2020505319.tif 000023
【図４−２】
2020505319.tif 000024
【図４−３】
2020505319.tif 000025
【図４−４】
2020505319.tif 000026
【図４−５】
2020505319.tif 000027
【図４−６】
2020505319.tif 000028
【図５−１】
2020505319.tif 000029
【図５−２】
2020505319.tif 000030
【図５−３】
2020505319.tif 000031
【図５−４】
2020505319.tif 000032
【図５−５】
2020505319.tif 000033
【図５−６】
2020505319.tif 000034
【図５−７】
2020505319.tif 000035
【配列表】
2020505319000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月11日(2019.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌転移を治療するための医薬組成物の調製におけるＩＬ−３５アンタゴニストの使用であって、前記医薬組成物が前記ＩＬ−３５アンタゴニストと薬学的に許容可能な担体とを含み、前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、頭頚部癌、胃癌、卵巣癌又は口腔癌である使用。
【請求項２】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、又は小分子阻害剤である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体からなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記薬学的に許容可能な担体が、水、ＰＢＳ、塩類溶液類、ゼラチン類、オイル類、アルコール類、又はその組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するための医薬組成物であって、
ＩＬ−３５アンタゴニストと、
薬学的に許容可能な担体と、を含み、
前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、頭頚部癌、胃癌、卵巣癌又は口腔癌である医薬組成物。
【請求項８】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、又は小分子阻害剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体からなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記薬学的に許容可能な担体が、水、ＰＢＳ、塩類溶液類、ゼラチン類、オイル類、アルコール類、又はその組み合わせである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを更に含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記原発性癌の治療が、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、超音波療法、又はそれらの組み合わせである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
原発性癌の治療を受けた対象の癌転移を治療するためのキットであって、
ＩＬ−３５アンタゴニストを含む第一の容器と、
ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを含む第二の容器と、を含み、
前記癌が、膵臓癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、大腸癌、肝臓癌、頭頚部癌、胃癌、卵巣癌又は口腔癌であるキット。
【請求項１７】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、又は小分子阻害剤である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩＬ−３５、ＥＢＩ３、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、ＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、又はこれらの組み合わせに結合する、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、抗体若しくはその抗原結合断片、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子阻害剤である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、多特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２１】
前記ＩＬ−３５アンタゴニストが、ＩＬ−３５、エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）、ＩＬ−３５のサブユニットＰ３５、ＥＢＩ３／Ｐ３５ヘテロ二量体、癌細胞のＩＬ−３５受容体、ＩＬ−１２Ｒβ２、ｇｐ１３０／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体、及びＩＬ−２７Ｒα／ＩＬ−１２Ｒβ２ヘテロ二量体からなる群から選択される二つの抗原に結合する二重特異性抗体又は抗原結合断片である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２２】
前記原発性癌の治療が、内分泌療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、遺伝子療法、温熱療法、超音波療法、又はそれらの組み合わせである、請求項１６に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１−１】図１Ａは、４Ｔ１細胞の播種５週間後の原発性腫瘍（ｐＴＡＭ（ｐ））及び転移性肺（ｍＴＡＭ（ｍ））から単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＴＡＭにおけるＭ１マーカー（Ｎｏｓ２、Ｔｎｆ、ＩＬ１５、Ｃｘｃｌ９、及びＣｘｃｌ１０）とＭ２マーカー（Ａｒｇ１、Ｍｒｃ１、Ｉｌ１０、Ｃｈｉｌ３、及びＣｃｌ１７）との発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、健康なマウス由来の骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）に対して正規化されている。ｎ＝３。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．＝有意差なし。図１Ｂは、４Ｔ１細胞の播種５週間後の原発性腫瘍（ｐＴＡＭ（ｐ））及び転移性肺（ｍＴＡＭ（ｍ））由来のＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｍｒｃ１＋細胞におけるＭ２マーカー（Ａｒｇ１、Ｍｒｃ１、Ｉｌ１０、及びＣｈｉｌ３）の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、健康なマウス由来のＢＭＤＭ（ｎ＝３）に対して正規化されている。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１−２】図１Ｃは、原発性ヒト癌（ｎ＝１１）及び転移性ヒト癌（ｎ＝１２）由来のＣＤ１４＋  ＴＡＭにおけるＭ１マーカー（ＴＮＦＡ、ＩＬ６、ＩＬ１Ｂ）及びＭ２マーカー（ＩＬ１０、ＣＤ１６３、ＣＣＬ１８）の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、末梢血単球由来マクロファージ（ＰＭＭ）に対して正規化されている（ｎ＝５）。データは平均±標準誤差を表す。ｐ値はパネルに示している。ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図２−１】図２Ａは、ＰＢＳ下又はリポソームクロドロネート処置下（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び２００μｇ／ｍｌで２４時間）での４Ｔ１細胞の生存率を分析するためのＭＴＴアッセイ結果を示す。ｎ＝２。図２Ｂは、リポソームクロドロネートの気管内注射を用いた４Ｔ１同所性実験における肺マクロファージ除去の概要を示す。
【図２−２】図２Ｃは、気管内にリポソームクロドロネート又はビヒクル対照（ＰＢＳ）を投与されたマウスの肺におけるＦ４／８０＋マクロファージの定量結果を示す。データは、６つの代表的な場におけるＦ４／８０＋個体数の相対倍率変化として表示されている。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。（各群に対してｎ＝５）。図２Ｄは、マクロファージ除去が転移に及ぼす影響を導き出す図である。上段：原発性腫瘍の写真（左）及び気管内にリポソームクロドロネート又は対照ＰＢＳを投与されたマウスの肺の代表的な写真（右）である。赤色の矢印は転移性肺における小結節を示す。下段：これらの結果を定量したものである。スケールバーは１ｃｍを示す。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。（各群に対してｎ＝５）。
【図２−３】図２Ｅは、腫瘍細胞注入２週間後のＬｙ６ｃ−ＴＡＭ同時注入実験（実験２）における転移性肺小結節の定量結果を示す。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１。（各群に対してｎ＝７）。
【図２−４】図２Ｆは、Ｍｒｃ１＋ＴＡＭ同時注入実験（実験２）の結果を示す。上段：Ｍｒｃ１＋ＴＡＭを伴って又は伴わずに４Ｔ１細胞を注入した２週間後のマウス由来の肺の代表的な写真である。下段：転移性肺小結節の定量結果である。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。（各群に対してｎ＝６）。
【図３−１】図３Ａは、本明細書の実験３の手順を示す。（ＭΦ：マクロファージ）図３Ｂは、所定の馴化培地で４８時間処置した４Ｔ１細胞におけるＥ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンのウェスタンブロットの結果を示す。ＢＭＤＭ（骨髄由来マクロファージ）、ｐＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋原発性ＴＡＭ）、ｍＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋転移性ＴＡＭ）。
【図３−２】図３Ｃは、異なるマクロファージ馴化培地で４８時間インキュベートしたＡ５４９細胞及び４Ｔ１細胞の形態を示した位相差像である。スケールバーは５０μｍを示す。図３Ｄは、異なるマクロファージ馴化培地で４８時間インキュベートしたＡ５４９細胞の移動能を分析するためのトランスウェル遊走アッセイの結果を示す。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図３−３】図３Ｅは、ヒトＣＤ１４＋単球由来の極性化マクロファージにおけるＭ１（ＨＬＡ−ＤＲ）マーカー及びＭ２（ＭＲ及びＣＤ１６３）マーカーの表面発現のフローサイトメトリー分析結果を示す。
【図３−４】同上。
【図３−５】図３Ｆは、ヒトＣＤ１４＋単球由来の極性化マクロファージにおけるＭ１（ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、及びＩＦＮＧ）マーカー及びＭ２（ＭＲＣ１、ＣＤ１６３、及びＣＣＬ１８）マーカーの発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示し、極性化の達成を確認している。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３−６】図３Ｇは、内皮細胞管形成アッセイの結果を示す。上段：ＨＵＶＥＣ組織の代表的な画像である。スケールバーは５０μｍを示す。下段：Ｍ０馴化培地、Ｍ１馴化培地、及びＭ２馴化培地で１２時間共培養した場合の枝分かれ部位数を測定することにより管形成を定量した結果である。ｎ＝３。スケールバーは５０μｍを示す。（Ｍ０  ＣＭ：休止マクロファージ馴化培地、Ｍ１  ＣＭ：Ｍ１マクロファージ馴化培地、Ｍ２  ＣＭ：Ｍ２マクロファージ馴化培地）。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図３−７】図３Ｈは、所定の馴化培地で４８時間処置した際のＯＥＣＭ１細胞、４Ｔ１細胞、及びＡ５４９細胞におけるＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、及びγ−カテニンのウェスタンブロットを示す。
【図３−８】図３Ｉは、所定の馴化培地で４８時間処置した際の４Ｔ１細胞、ＯＥＣＭ１細胞、及びＡ５４９細胞におけるＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、及びビメンチンの免疫蛍光染色結果を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図３−９】図３Ｊは、実験３における経内皮遊走アッセイの結果を示す。上段：所定の馴化培地で処置した際のＡ５４９細胞及びＯＥＣＭ１細胞の経内皮遊走アッセイ結果である。スケールバーは１００μｍを示す。下段：癌細胞遊走の定量結果である。ｎ＝３。データは遊走細胞数の相対倍率変化として示されている。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３−１０】図３Ｋは、同所性ＳＡＳ異種移植マウスモデルから採取した腫瘍サンプルのヘマトキシリン・エオジン染色結果を示す。ＳＡＳ細胞は、播種する前に所定の馴化培地で４８時間処置した。スケールバーは２００μｍを示す。（各群に対してｎ＝５）。  図３Ｌは、Ｍ１  ＣＭ又はＭ２  ＣＭで処置したＡ５４９細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ転移性コロニー形成能を示す。上段：Ｍ１  ＣＭ若しくはＭ２  ＣＭ又は対照培地で前処置したＡ５４９細胞の尾静脈注射を受けたマウス由来の肺の代表的な写真である。下段：腫瘍細胞注射８週間後の転移性肺小結節の定量結果である（各群に対してｎ＝６）。
【図４−１】図４Ａは、４Ｔ１細胞播種５週間後のマウス（ｎ＝３）の原発性腫瘍及び転移性肺由来のＬｙ６Ｃ−ＴＡＭにおけるＩｌ１２ａ及びＥｂｉ３の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは、健康なマウス（ｎ＝３）由来のＢＭＤＭに対して正規化されている。図４Ｂは、４Ｔ１播種マウスの転移性肺由来のＬｙ６Ｃ−Ｆ４／８０＋細胞及びＬｙ６Ｃ−Ｆ４／８０−細胞におけるＩＬ−３５（緑）及びＦ４／８０（赤）の免疫蛍光染色結果を示す。青は核である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図４−２】図４Ｃは、２４時間培養後の所定のマクロファージから採取した培地におけるＩＬ−３５レベルを測定するためのＥＬＩＳＡ結果を示す。ｎ＝３。データは平均±標準誤差を表す。＊，ｐ＜０．０５。図４Ｄは、転移性ヒト腫瘍（ｎ＝１０）対末梢血単球由来マクロファージ（ＰＭＭ）（ｎ＝１０）に由来するＣＤ１４＋ＴＡＭにおけるＩＬ１２Ａ及びＥＢＩ３の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。データは平均±標準誤差を表す。＊，ｐ＜０．０５。
【図４−３】図４Ｅは、２４時間培養後の所定のマクロファージから採取した培地における分泌ＩＬ−３５を定量するためのＥＬＩＳＡ結果を示す。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。図４Ｆは、４８時間ＩＬ−３５（１００ｎｇ／ｍｌ）処置した際の所定の癌細胞株の移動能を分析するためのトランスウェル遊走アッセイの結果を示す。ｎ＝３。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図４−４】図４Ｇは、実験４における同所性異種移植実験の結果を示す。実験はマウスの舌にＳＡＳ細胞を播種する処理により行った。ＳＡＳ細胞は、播種４８時間前の間に組換えＩＬ−３５（５０ｎｇ／ｍｌ）又はビヒクル対照で前処置した。リンパ節を可視化するために腫瘍播種１４日後にＩＶＩＳ画像を撮った（各群に対してｎ＝６）。図４Ｈは、ＩＬ−３５中和の転移に及ぼす影響を示す。上段：４Ｔ１同所性腫瘍マウスモデル（体重：１５ｇ〜２０ｇ）における抗体投与の概要を示す。腫瘍移植２週間後に、５０μｇのＩＬ−３５中和抗体（Ｖ１．４Ｃ４．２２、１００μＬのＰＢＳ中）又はＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照を気管内に送達し、抗体を３日毎に総計５回投与した。４週間目の終わりにマウスを屠殺した。原発性腫瘍及び肺を分析のために採取した。中段：原発性腫瘍の写真及びマウスの肺の代表的な写真である。スケールバーは１ｃｍを示す。下段：腫瘍重量及び肺小結節の定量結果である（ｎ＝６）。データは平均±標準誤差を表す。＊＊＊，ｐ＜０．００１。
【図４−５】図４Ｉは、抗体療法の実験の概要を示す。マウスに４Ｔ１細胞を同所的に移植し、移植した腫瘍を３週目の終わりに外科的に除去した。外科手術後、マウス（体重：１５ｇ〜２０ｇ）に１００μｇの抗ＩＬ−３５抗体（Ｖ１．４Ｃ４．２２、２００μＬのＰＢＳ中）、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（２００μＬのＰＢＳ中）、及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、続いて５０μｇの抗体を３日毎に注射し、総計４回投与した。ＩＶＩＳ評価を５週目の終わりに行った。各群に対してｎ＝７。図４Ｊは、外科手術２週間後の所定の抗体で処置した（図４Ｉに示す通り）マウスの生物発光シグナルを示す。
【図４−６】図４Ｋは、抗体投与後の腫瘍除去マウスの全生存率を示す。ｐ値はパネルに示している。
【図５−１】図５Ａは、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＭ１  ＣＭ又は対照培地で２４時間処置したＡ５４９細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２、Ｅ−カドヘリン、及びＮ−カドヘリンのウェスタンブロット結果を示す。
【図５−２】図５Ｂは、２４時間ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）処置した際の異なる癌細胞株におけるＩＬ１２ＲＢ２の発現を分析するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す。ｎ＝２。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図５Ｃは、１×１０６個のＴＮＦα前処置Ａ５４９細胞と５×１０５個の休止（Ｍ０）マクロファージ又はＭ２マクロファージとを同時注入されたマウスにおける転移性肺小結節の定量結果を示す。尾静脈注射の２カ月後にマウスを屠殺した（各群に対してｎ＝６）。データは平均±標準誤差を表す。＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１。
【図５−３】図５Ｄは、ＩＬ１２ＲＢ２又は対照配列（ｐＬＫＯ）に対するｓｈＲＮＡを投与されたＡ５４９細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２のノックダウン効率を確認するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果（上段）及びウェスタンブロット結果（下段）を示す。番号はｓｈＲＮＡ実験での二つの別個の配列を示している。ＲＴ−ｑＰＣＲに対してｎ＝２である。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図５Ｅは、実験５における同所性腫瘍実験の結果を示す。Ｉｌ１２ｒｂ２（ｓｈＩｌ１２−ｒβ２）又は対照配列（ｐＬＫＯ）に対するｓｈＲＮＡで感染させた４Ｔ１細胞をマウスに播種した。腫瘍と肺とを腫瘍移植の４週間後に採取した。上段：担癌マウスの原発性腫瘍及び肺の写真である。スケールバーは１ｃｍを示す。下段：腫瘍重量及び肺小結節の定量結果である（各群に対してｎ＝６）。データは平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５−４】図５Ｆは、Ｉｌ１２ｒｂ２（＃１、＃２）又は対照配列（ｐＬＫＯ）に対するｓｈＲＮＡを投与された４Ｔ１細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２のノックダウン効率を確認するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果（上段）及びウェスタンブロット結果（下段）を示す。番号はｓｈＲＮＡ実験での二つの別個の配列を示している。ＲＴ−ｑＰＣＲに対してｎ＝３である。データは平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。図５Ｇは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移性コロニー形成実験の結果を示す。Ｉｌ１２ｒｂ２をノックダウンしたＧＦＰ標識４Ｔ１細胞と、Ｌｙ６Ｃ−Ｆ４／８０＋ｍＴＡＭを同時注入し、注入５日後に肺を採取した（各群に対してｎ＝５）。上段：肺の代表的な切片におけるＧＦＰの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色結果である。下段：５つのパラフィン包埋肺切片の平均ＧＦＰ＋コロニーを数えることによりＩＨＣ結果を定量したものである。
【図５−５】図５Ｈは、胃癌及び肺癌におけるＩＬ１２ＲＢ２発現の予後的影響を示すカプラン・マイヤー生存分析の結果を示す。ｐ値をログランク検定により見積もった。データはカプラン・マイヤープロッターから得た（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／）。
【図５−６】同上。
【図５−７】図５Ｉは、頭頚部癌サンプル（ｎ＝１０）におけるＩＬ−１２Ｒβ２のＩＨＣ染色結果を示す。右：代表的なＩＨＣ画像である。スケールバーは１００μｍを示す。左：ＩＨＣ染色画像のＨスコア（Ｐ：原発性腫瘍、Ｍ：転移性腫瘍）。*p < 0.05。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
好ましい実施形態では、該対象は、該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの両方を該工程（ｂ）で投与され、該ＩＬ−３５アンタゴニスト及び該ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは同時に又は相互に任意の間隔で投与される。該間隔は、前段に記載した通りに定義される。
【国際調査報告】
2020505319.tif 000036
2020505319.tif 000037
2020505319.tif 000038