(57)【要約】  本明細書の実施形態は、細胞外マトリクス(ECM)を製造するための方法、キット、及び組成物を含む。いくつかの実施形態において、方法は、線維芽細胞を人工多能性幹細胞に分化させる工程と、人工多能性幹細胞を拡大する工程と、人工多能性幹細胞を線維芽細胞に分化させる工程とを含む。線維芽細胞は、成熟ECMを産生することができ、医療品及び/又は化粧品並びに医学的及び/又は美容手技用に単離及び使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリクスを製造する方法であって、前記方法が、
人工多能性幹細胞(iPSC)を産生線維芽細胞に分化させること、
前記産生線維芽細胞を培養し、それにより前記産生線維芽細胞が細胞外マトリクス(ECM)を産生すること、及び
前記産生線維芽細胞から前記ECMを単離し、それによって前記ECMを製造すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記iPSCを前記産生線維芽細胞に分化させることの前に、前駆線維芽細胞を脱分化させて前記iPSCを形成することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記分化させることの前に前記iPSCを拡大することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記分化させることの前に前記iPSCのバンクを構築することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
分化するiPSCが単一のドナーのみに由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記産生線維芽細胞を培養することが、正常酸素中である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記産生線維芽細胞を培養することが、間葉系幹細胞(MSC)を培養することを含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記iPSCが、フットプリントフリーである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞、ES由来MSC、又は非多能性新生児包皮線維芽細胞細胞株のいずれも含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記ECMが、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法であって、前記方法が、
基質で線維芽細胞及び/又は間葉系幹細胞(MSC)を培養することであって、前記基質が少なくとも2つの表面を含み、前記培養することが血清フリー及びゼノフリーであり、前記線維芽細胞及び/又はMSCが前記少なくとも2つの表面で3次元形状を規定し、並びに線維芽細胞及び/又はMSCの少なくとも80%がその細胞周期を停止するまで、培養すること、
その後、前記線維芽細胞及び/又はMSCを血清と少なくとも約2週間接触させ、それにより前記線維芽細胞及び/又はMSCが可溶性成熟ECMを産生し、それによって可溶性成熟ECM及び前記線維芽細胞又はMSCを含む、ゼノフリーである溶液を生産すること、並びに
前記産生線維芽細胞から前記可溶性成熟ECMを単離し、それによって成熟ゼノフリーECMである前記ECMを製造すること
を含む、方法。
【請求項１２】
ヒト多能性細胞培養物を拡大することであって、前記拡大することが血清フリー及びゼノフリーであり、それによってヒト多能性細胞を生産する、拡大すること、及び
前記ヒト多能性細胞を分化因子と接触させることであって、それにより前記ヒト多能性細胞が前記線維芽細胞又はMSCに分化する、接触させること
を更に含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記線維芽細胞及び/又はMSCを血清と接触させることが、少なくとも約8週間である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト多能性細胞が、人工多能性幹細胞(iPSCS)を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記成熟ゼノフリーECMを含む化粧用組成物を製造することを更に含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟ゼノフリーECMが、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性細胞が、単一のドナー由来である、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法であって、前記方法が、
一定の濃度の血清を含む培地で線維芽細胞を提供すること、
前記培地が5%以下の血清濃度を含有するまで、線維芽細胞を含む前記培地中の血清の量を徐々に低減すること、
前記徐々に低減することの後、前記線維芽細胞を少なくとも約2週間培養し、それにより前記線維芽細胞が可溶性ECMを産生し、それによって前記線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を生産すること、並びに
前記可溶性ECMを前記線維芽細胞から単離し、それによって前記ECMを製造することと
を含む、方法。
【請求項１９】
血清の量を徐々に低減することの開始時の前記培地中の線維芽細胞の量が、前記培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の前記培地中の線維芽細胞の量の少なくとも0.7倍である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
血清の量を徐々に低減することが、細胞拡大又は細胞継代培養なしで行われる、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液中の前記線維芽細胞の少なくとも約90%が、G0細胞周期段階にある、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶液中の前記線維芽細胞の1%未満が、アポトーシスを受けている、請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶液が、前記可溶性ECMを含むナノ構造であって、200nm〜10,000nmの最大直径を有する、ナノ構造を含む、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2017年7月28日に出願された「細胞外マトリクスを製造するための方法及び組成物(Methods and Compositions for Manufacturing Extracellular Matrix)」と題する米国国内出願第15/662901号明細書のPCT規則4.10の下の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表、表、又はコンピュータプログラムリストの参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に出願される。配列表は、2018年6月22日に作成され、最終更新された、サイズ247,550バイトの配列BREK001WO.TXTと題するファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
分野
本明細書のいくつかの実施形態は、細胞外マトリクス(ECM)を製造するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、細胞培養のための方法及び組成物が記載される。
【背景技術】
【０００４】
細胞外マトリクス(ECM)は、多くの化粧用途及び治療的用途を有する多目的な生体材料である。結合組織の大部分は、コラーゲン、並びに程度(質量による相対的存在量に基づく)はずっと低いが、ラミニン、フィブロネクチン、及びグリコサミノグリカン(GAG)(ヒアルロン酸、並びに他の硫化GAG、例えばアグリカン及びペルレカン等を含む)等の他の糖タンパク質を含む。しかし、コラーゲンは架橋されており、化粧用途又は治療的用途のために単離し、ヒト用の有用な製品に製造するには酵素的又は化学的分解を必要とする。ペプシン消化又は化学修飾後のウシ及びブタ真皮、ブタ腸粘膜下層、並びに皮膚及び骨等のヒト死体由来組織の使用を含む例は、全て当技術分野で広く公知である。
【０００５】
ブタ及びウシ組織等のECMの動物源は、ウシ及びブタ抗原又はアレルゲン、主にタンパク質に対する既知のアレルギーを含む不必要な免疫反応のリスクを伴うが、動物由来成分(最も多くはウシ血清、ウシアルブミン、又はブタトリプシンを含む)、又はヒト以外の植物由来タンパク質(残留植物タンパク質又はポリペプチドを含有し得る、植物で産生される大豆トリプシンインヒビター又は組換えヒトアルブミンを含む)を使用するヒト細胞は、同じリスクが問題になる。したがって、動物源からのECMの商業的有用性は、安全性への懸念及び/又は商業的使用のための承認に必要なより安全な残留レベルまでの動物成分の除去を立証するための規制上のハードルによって制限されることがある。ヒト免疫系は、極めて少量の抗原に反応するほど感受性が高く、動物及び植物タンパク質は、アナフィラキシーショックを引き起こし得、場合によっては死の原因にすらなり得る命に関わる可能性があるアレルギー反応を含む、不必要な免疫反応を引き起こすことが示されている。動物由来及び植物由来タンパク質成分、並びに動物由来又は植物由来タンパク質成分中で増殖されたヒト細胞は、まとめて「異種」と呼ばれる。一方、これらの動物由来及び植物由来タンパク質成分と接触せずに製造される製品は、「ゼノフリー」として知られている。異種培地でECMを製造する従来のアプローチは、動物由来及び/又は植物由来タンパク質成分の除去を必要とすることがあり、これらの方法の商業的有用性を制限する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第6,378,527号
【特許文献２】米国特許第5,830,708号
【特許文献３】米国特許第7,118,746号
【特許文献４】米国特許第6,372,494号
【特許文献５】米国特許第8,257,947号
【特許文献６】米国特許第8,530,415号
【特許文献７】米国特許第8,535,913号
【特許文献８】米国特許第9,034,312号
【特許文献９】米国特許第8,852,637号
【特許文献１０】米国特許第8,128,924号
【特許文献１１】米国特許第8,138,147号
【特許文献１２】米国特許第8,361,485号
【特許文献１３】米国特許第8,476,231号
【特許文献１４】米国特許第9,458,486号
【特許文献１５】米国特許第9,683,232号
【特許文献１６】米国特許第8,058,065号
【特許文献１７】US 9,447,408
【特許文献１８】米国特許第6,200,806号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Warrenら(2010)、Cell Stem Cell 7: 618-30
【非特許文献２】Moonら、(2011)、Cell、Res、21: 1305-15
【非特許文献３】Houら、(2013)、Science 341: 651-654
【非特許文献４】Yeら、(2016)、Cell Research 26: 34-35
【非特許文献５】Goodpasterら、(2008)、J. Histochem Cyotchem、56: 347-58
【非特許文献６】Xuら、Scientific Reports 5: 8480 DOI: 10.1038/srep08480
【非特許文献７】Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2000
【非特許文献８】Pinney E、(2011) International Journal of Stem Cells 4: 70-75
【非特許文献９】Menenら、(2012) Anticancer Research 32: 1573-1578
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒトECMは、死体からの同種組織に由来することがある。しかし、そのような死体由来ECMは、疾病伝播のリスクをもたらし、また各ドナーは、得られるヒトECMの量が限られるため(例えば、70kgのヒトは、質量20%未満のヒトコラーゲン又は数キログラム以下のECM原料を含有する)、商業的スケーラビリティの制限をもたらす。更に、死体由来組織は、疾病伝播のいくつかのリスクを軽減するための高額な安全性検査を伴い、ウイルス及び細菌を含むいくつかの疾患を引き起こす病原体について死体ドナーごとに広範に検査されなければならない。
【０００９】
更に、ECMは動物飼料に使用されることがある。しかし、実際には、細胞培養又は死体からの収集を使用してECMを生産する従来のアプローチは、商業規模では法外な費用がかかる可能性がある。本明細書のいくつかの実施形態により記載されるのは、疾病伝播及び免疫原性のリスクを最小限に抑えると同時に、商業規模でECMを効率的に生産するための方法、組成物、及びキットである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクスを製造する方法を含む。方法は、人工多能性幹細胞(induced Pluripotent Stem Cells)(iPSC)を産生線維芽細胞(production fibroblast)に分化させる工程を含んでもよい。方法は、産生線維芽細胞を培養する工程を含んでもよく、培養によって、産生線維芽細胞は細胞外マトリクス(ECM)を産生することができる。方法は、産生線維芽細胞からECMを単離し、故にECMを製造する工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、方法は、iPSCを産生線維芽細胞に分化させる前に、前駆線維芽細胞を脱分化させてiPSCを形成する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、分化の前に、iPSCを例えば少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、又は30倍(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)拡大する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、分化の前にiPSCバンクを構築する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、iPSCSのみが単一のドナーから分化する。いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞を培養する工程は正常酸素(normoxia)中である。いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞を培養する工程は、間葉系幹細胞(MSC)を培養する工程を含まない。いくつかの実施形態において、前駆線維芽細胞は、成体皮膚(生検)線維芽細胞を含む。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを精製し、それによって少なくとも約80w/w%ECMである組成物を製造する工程を含む。いくつかの実施形態において、ECMを精製する工程は、酸性緩衝液中でECMを洗浄する工程と、産生線維芽細胞及びECMを含む溶液をデキストラナーゼと接触させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを基質又は固相から分離する工程を含む。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離している(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。いくつかの実施形態において、ECMはコラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、ECMの約90% (w/w)はCOL1であり、並びに約10%はCOL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、前駆線維芽細胞を脱分化因子と接触させ、それによって前駆線維芽細胞をiPSCに脱分化させる工程を更に含む。いくつかの実施形態において、iPSCは、Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Klfファミリーメンバーをコードするウイルス挿入がない。いくつかの実施形態において、iPSCはフットプリントフリー(footprint free)である。いくつかの実施形態において、方法は、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞、ES由来MSC、又は非多能性新生児包皮線維芽細胞細胞株のいずれも含まない。いくつかの実施形態において、ECMは、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む。いくつかの実施形態において、ECMは、三重らせん及び/又は非還元性のガンマ型線維性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、方法は、産生線維芽細胞が成熟コラーゲンを産生するまで産生線維芽細胞を血清と接触させ、次いで���血清濃度の少なくとも95%の低減があるまで血清の量を徐々に低減する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、漸次低減は少なくとも約5日間にわたる。
【００１１】
いくつかの実施形態は、ECMを製造するためのキットを含む。キットは、ヒト線維芽細胞を含む組成物を含んでもよい。キットは、脱分化因子を含んでもよい。キットは、線維芽細胞分化因子を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物の線維芽細胞の全ては単一のドナー由来である。いくつかの実施形態において、キットは、デキストランマイクロキャリア等の基質を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、デキストラナーゼを更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、デキストラナーゼ及びDNAaseを更に含む。
【００１２】
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクスが上記の方法のいずれかに従って製造される、少なくとも80% (w/w)の細胞外マトリクスを含む組成物を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態は、成熟細胞外マトリクスを産生しているiPSC由来線維芽細胞を含む細胞培養物を含む。細胞培養物は、脱分化因子を更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも50%(w/w)はECMを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法を含む。方法は、線維芽細胞及び/又は間葉系幹細胞(MSC)を基質で培養する工程を含んでもよい。基質は、少なくとも2つの表面を含んでもよい。培養は、血清フリー及びゼノフリーであってもよい。培養は、線維芽細胞及び/又はMSCが少なくとも2表面で3次元形状を規定し、並びに線維芽細胞及び/又はMSCの少なくとも80%がその細胞周期を停止するまで行われてもよい。方法は次いで、線維芽細胞及び/又はMSCを血清と少なくとも約2週間接触させ、これを通じて線維芽細胞及び/又はMSCが可溶性成熟ECMを産生する工程を含んでもよい。このようにして、溶液がゼノフリーである、可溶性成熟ECM及び線維芽細胞又はMSCを含む溶液が生産され得る。方法は、産生線維芽細胞から可溶性成熟ECMを単離し、故に成熟ゼノフリーECMであるECMを製造する工程を更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを基質から分離する工程を含む。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離している(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。いくつかの実施形態において、方法は、ヒト多能性細胞培養物を拡大する工程であって、拡大は血清フリー及びゼノフリーであり、それによってヒト多能性細胞を生産する工程と、ヒト多能性細胞を分化因子と接触さる工程であって、これを通じてヒト多能性細胞が線維芽細胞又はMSCに分化する工程とを更に含む。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCと血清との接触は約2週間〜約8週間である。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCと血清との接触は少なくとも約8週間である。いくつかの実施形態において、ヒト多能性細胞は人工多能性幹細胞(iPSCS)を含む。いくつかの実施形態において、iPSCSはフットプリントフリーである。いくつかの実施形態において、iPSCSは単一のドナー由来である。いくつかの実施形態において、方法は、成熟ゼノフリーECMを含む化粧用組成物を製造する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、血清と接触させる少なくと
も2週間の間、線維芽細胞又はMSCをアスコルビン酸と接触させる工程を更に含む。いくつかの実施形態において、少なくとも2表面の線維芽細胞又はMSCが3次元形状を規定し、及び線維芽細胞又はMSCの少なくとも70%がその細胞周期を停止する前に、前記線維芽細胞又はMSCは血清と接触されない。いくつかの実施形態において、血清の量は約0.1%〜10% (v/v)である。いくつかの実施形態において、血清の量は約1〜2% (v/v)である。いくつかの実施形態において、血清は、臨床グレードの仔ウシ血清、プールされたヒト血清、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、動物成分を使用して以前に増殖されている細胞株である。いくつかの実施形態において、成熟ゼノフリーECMは線維性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、成熟ゼノフリーECMは、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む。いくつかの実施形態において、ECMは、三重らせん及び/又は非還元性のガンマ型線維性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、溶液は、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、製造された成熟ゼノフリーECMは、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、多能性細胞は単一のドナー由来である。いくつかの実施形態において、方法は、溶液中の成熟ECMの量を検出する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、一定量の使用済み培養培地を溶液から採取し、可溶性成熟ECMを使用済み培養培地から単離する工程を更に含む。
【００１５】
いくつかの実施形態は、線維芽細胞又はMSC、及び上記のパラグラフの方法のいずれかに従って生産された可溶性成熟ECMを含む溶液を含む。溶液はゼノフリーであってもよく、可溶性成熟ECMは架橋コラーゲンを含んでもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法を含む。方法は、一定の濃度の血清を含む培地で線維芽細胞を提供する工程を含んでもよい。方法は、培地が5%以下の血清濃度を含有するまで、線維芽細胞を含む培地の血清の量を徐々に低減する工程を含んでもよい。方法は、血清の漸次低減後、線維芽細胞を少なくとも約2週間培養し、これを通じて線維芽細胞が可溶性ECMを産生し、それによって線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を生産する工程とを含んでもよい。方法は、可溶性ECMを線維芽細胞から単離し、それによってECMを製造する工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを基質又は固相から分離する工程を含む。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離している(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量は、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも0.7倍である。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量は、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも0.9倍である。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程は、細胞拡大又は細胞継代培養なしで行われる。いくつかの実施形態において、血清は少なくとも約5日間徐々に低減される。いくつかの実施形態において、溶液中の線維芽細胞の少なくとも約90%はG0細胞周期段階である。いくつかの実施形態において、溶液中の線維芽細胞の1%未満はアポトーシスを受けている。いくつかの実施形態において、溶液は、可溶性ECMを含むナノ構造であって、200nm〜10,000nmの最大直径を有するナノ構造を含む。いくつかの実施形態において、ECMを製造する工程は、滅菌濾過することなく行われる(ナノ構造を排除しないように)。いくつかの実施形態において、可溶性ECMを線維芽細胞から単離する工程は、滅菌濾過することなく行われる。
【００１７】
いくつかの実施形態は、線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を含む。溶液中の線維芽細胞の少なくとも約90%は、G0細胞周期段階であってもよい。溶液中の線維芽細胞の1%未満は、アポトーシスを受けていてもよい。溶液は、可溶性ECMを含むナノ構造であって、200nm〜10,000nmの最大直径を有するナノ構造を含んでもよい。いくつかの実施形態において、可溶性ECMは、請求項48〜57のいずれか一項に記載の方法により製造される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書のいくつかの実施形態による、iPSCから分化させた線維芽細胞を使用してECMを製造する方法を例示するフロー図である。
【図２】本明細書のいくつかの実施形態による、線維芽細胞又はMSCを少なくとも2週間培養する工程を含む、ECMを製造する方法を例示するフロー図である。
【図３】本明細書のいくつかの実施形態による血清離脱を含む、ECMを製造する方法を例示するフロー図である。ECMはゼノフリーであってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ECMは、いくつかの化粧品用途及び治療的用途に有用であり得るが、ECMを生産する従来の方法は、スケーラビリティ、使いやすさ、混入(ヒト宿主における免疫原性を含む)、疾病伝播、及び費用効果に関連する課題を抱えかねない。本明細書に記載されるのは、商業規模でのものを含め、効率的にECMを製造するのに有用な方法、組成物、及びキットである。本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによるECMは、比較的高レベルの商業的に有用な成熟コラーゲン(三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方等)を含んでもよく、潜在的に有害な異物物質等の混入物が比較的ない可能性がある。
【００２０】
いくつかの実施形態は、ヒト細胞外マトリクス(ECM)を製造するバイオリアクターとして使用するための非胚性ヒト線維芽細胞を作るための方法、組成物、及びキットを含む。これらの実施形態によれば、成熟線維芽細胞を、人工多能性幹細胞(iPSC)に脱分化させ、拡大し、及び成熟非胚性産生線維芽細胞に再分化させ得る。これらの産生線維芽細胞は、コラーゲンに富むECMを製造するのに使用することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態は、成熟ゼノフリーECMを製造するための方法、組成物、及び/又はキットを含む。これらの実施形態によれば、細胞は長期間(例えば、最大8週間、例えば2〜3週間又はそれ以上にわたる)培養することができ、コラーゲンの架橋の増加及び優れたECM可溶性等の所望の特性を有するECMをもたらすことができる。対照的に、ECMを製造するための多くの従来のアプローチは、はるかに短時間、例えば12〜17日間で細胞培養を行うことができる。驚くべきことに、本明細書のいくつかの実施形態による2〜3週間又はそれ以上の細胞培養物は、より短期間の培養物と比べて架橋及び可溶性が増加したECMを生産する。
【００２２】
いくつかの実施形態は、線維芽細胞が血清から徐々に離脱される、ECMを生産するための線維芽細胞を培養する方法を含む。これらの実施形態によれば、線維芽細胞は最初に血清含有製剤で培養され得、血清の量が、次いで徐々に低減され得る(例えば、血清含量を下げるために培養培地を除去及び交換して、並びに/又は血清含量がより低い異なる培養培地に細胞を移して)。細胞は成熟可溶性ECMを、血清の低減後少なくとも2週間産生することができ、可溶性ECMは細胞から単離することができる。「可溶性の」(例えば可溶性ECMの文脈で)は、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、水性相に溶解される又は溶解され得るECMのタイプ又は画分を含む。そのため、可溶性ECMは水性相で回収され、水性相で維持され得る。いくつかの実施形態において、可溶性ECMは水性相に沈殿しない。いくつかの実施形態において、可溶性ECMは、最小限の沈殿で、例えば、可溶性ECM沈殿物の約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、若しくは1%、又はそれ未満で、同じ条件下、水性相で少なくとも24時間安定に維持することができる。この方法は、化粧品及び医療品に有用であり得る高可溶性ECMを有利にはもたらすことができる。いくつかの実施形態において、ECMは、いかなる細胞拡大又は継代培養もすることなく効率的に生産される。いくつかの実施形態において、可溶性ECMも非可溶性ECMも同じ培養物から回収することができ、有利には両方の相でECMを回収し、相の一方からECMを得るのみの方法より高い収量を得ることができることが留意される。
【００２３】
細胞外マトリクス(ECM)
「細胞外マトリクス」(ECM)は、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、タンパク質及び炭水化物等の細胞によって分泌される、細胞を支持する構造を提供する分子を含む。ECMは、コラーゲン等の線維性タンパク質を含んでもよい。ヒトECMは、例えばCOLl、COL3、COL4、COL5、及びCOL6、並びにこれらのタンパク質の組み合わせを含む、いくつかのコラーゲンタンパク質を含み得る。ホモ・サピエンス(Homo sapiens) COLl、COL3、COL4、COL5、及びCOL6の例示的ポリペプチド配列は、以下のTable 1 (表1)に示される。いくつかの実施形態の方法、組成物、及び/又はキットにおいて、細胞培養物は、細胞培養物から単離することができるECMを生産する。いくつかの実施形態において、ECMは、ヒトECMを含む、から本質的になる、又はからなる。いくつかの実施形態において、ECMを細胞培養物から単離する工程は、ECMを精製する工程を含む。このようにして、単離されたECMを含む、から本質的になる、又はからなるヒトECM製品が、生産され得る。
【００２４】
【表１−１】
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【表１−２】
2020529220.tif 000004
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
2020529220.tif 000009
【表１−８】
2020529220.tif 000010
【表１−９】
2020529220.tif 000011
【表１−１０】
2020529220.tif 000012
【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
2020529220.tif 000018
【００２５】
本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによる一種の成熟ECMである線維性コラーゲン性ECMコラーゲンは、主成分COL1を含んでもよく、またCOL3、COL4、COL5、及び/又はCOL6も含むことができる(例えば、約90%COL1並びに約10%COL3、COL4、COL5、及び/又はCOL6)が、(i) COLl並びに(ii) COL3、COL4、COL5及び/又はCOL6の他の割合が適切である(例えば、それぞれ約97%及び3%、それぞれ約95%及び5%、それぞれ約93%及び7%、それぞれ約85%及び15%、それぞれ約80%及び20%、それぞれ約75%及び25%、又はそれぞれ約70%及び30%)。
【００２６】
ECM、及び特に、本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットにより生産された場合のヒトECM製品は、筋骨格障害、整形外科的機能障害及び関連する疼痛、心血管障害、皮膚疾患、見た目の改善を必要とする加齢に伴う美容的皮膚及び毛髪状態、外科的創傷、外科切除、化学療法及び免疫療法を含む処置を必要とする固形腫瘍を患っている患者の組織を処置するのに有用である。本明細書のいくつかの実施形態による方法、キット、及び組成物によって生産されたヒトECM製品の使用は、例として、骨軟骨欠損修復、骨関節炎、変性椎間板疾患、整形外科の外科的創傷;腫瘍切除腔を伴う外科的創傷、心血管再生装置及び生物製剤、皮膚創傷装置及び生物製剤、皺を処置するための皮膚充填剤、局所化粧品(topical cosmetics)、治療的発毛、並び患者に移入されたときの持続性の増加及び不必要な免疫反応の低減のための細胞送達及び薬物送達ビヒクルを含む、筋骨格適用のための医療装置及び生物製剤を含む。いくつかの実施形態において、本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットにより生産されたECM (例えば、ヒトECM製品)は、医療品、化粧品、薬物、医療装置、処置、又は生物製剤の少なくとも1つに使用される。いくつかの実施形態においてECMは、FDAによって規制された医療品、生物製剤、医療装置、薬物、又は任意の他の製品若しくは組成物の少なくとも1つに使用することができる。いくつかの実施形態においてECMは、医学的又は美容手技の少なくとも1つに使用することができる。
【００２７】
本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによるヒトECMの生産のためのヒト細胞培養物の使用は、動物及び死体由来ECMに優る利点を提供することができる。例えば、いくつかの実施形態において、培養中の細胞は、単一のドナー由来であってもよく、容易に拡大することができ、及び/又はゼノフリーであってもよい。一方、細胞培養でECMを生産するための従来のアプローチは、課題、例えば、商業規模、費用対効果、及びヒト以外の成分の存在に関連する課題を突きつける。例えば、細胞培養からの線維芽細胞由来ヒトECM及び製造方法が記載されている。例えば、Naughtonらによる特許群(「Naughton特許」と呼ばれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,378,527号; 5,830,708号; 7,118,746号; 6,372,494号; 8,257,947号; 8,530,415号; 8,535,913号; 9,034,312号; 8,852,637号; 8,128,924号; 8,138,147号; 8,361,485号; 8,476,231号;及び9,458,486号)は、可溶性及び不溶性ヒトECMの様々な組成物及び生産方法を開示している。例えば、Naughton特許は、細胞拡大及びヒトECMの生産を支持するウシ胎児血清、仔ウシ血清、及びブタトリプシン等の動物タンパク質の使用を開示している。動物成分を使用するこれらのプロセスは、例えば、CosmoDerm(商標)及びCosmoPlast(商標)皮膚充填剤製品の製造において、ECMが生産された後、ブタペプシンもコラーゲンに利用している。例えば、ブタヘパリン等のブタ炭水化物は、ヒトにおいて有害な免疫反応を引き起こすことがある。
【００２８】
Naughton特許はまた、大豆トリプシンインヒビターも開示している。理論に限定されることなく、大豆トリプシンインヒビターは、血清が含まれない場合に使用し、細胞培養における有害なタンパク質分解を低減することができる。しかし、いくつかの植物タンパク質、及び特に大豆トリプシンインヒビターは、ヒトにおいて不必要な免疫反応、更には潜在的にアレルギー又はアナフィラキシーショック又は稀に死を引き起こすことがある。そのため、動物血清に見出される酵素阻害剤を大豆トリプシンインヒビター等の植物成分と交換することにより、不必要な免疫反応を依然として引き起こし得ると考えられる。更に、大豆トリプシンインヒビターは、大豆トリプシンインヒビターを含有する組成物、又は例えば局所若しくは経皮適用時に大豆トリプシンインヒビターが曝露される皮膚組織に影響を与えることがある酵素活性を有し得ると考えられる。大豆トリプシンインヒビターはまた、発毛を阻害することも示されている。可溶性大豆トリプシンインヒビターを除去することは形式上可能であるが、そうすることは、使用済み培養培地で細胞分泌産物の不明確な混合物における広範な及び費用がかかる精製方法を伴うことになり、正確な活性成分がわからない可能性がある製品をもたらすことから、商業的実用性が限られる。そのため、いくつかの実施形態は、動物由来製品、又は大豆トリプシンインヒビターを含まない。いくつかの実施形態は、動物由来製品又は植物由来製品を含まない。
【００２９】
ゼノフリー系及び方法は、動物及び/又は植物由来成分の使用を最初から回避し得ることから、有利には、本明細書のいくつかの実施形態によるECMを製造するゼノフリー方法は、動物(及び/又は植物)由来成分の除去に関する臨床試験の必要性を排除することができる。例えば、本明細書のいくつかの実施形態による方法及び組成物は、美容的使用のための、及び大豆タンパク質等の既知の植物アレルゲンを必ずしも含有しない可溶性ECM組成物を生産することができる。更に、本明細書のいくつかの実施形態により製造される、動物又は植物由来成分を含有しないECM組成物は、動物製品又は大豆タンパク質等の植物製品に対する潜在的アレルギーに関する安全警告を必要としないであろう。
【００３０】
いくつかの実施形態において、細胞ベースのインビトロ培養方法は、バッチあたり一人のヒトより大規模にゼノフリーヒトECMを生産することができる。更に、細胞株は広範に検査され得るため、ゼノフリーECMは疾病伝播のリスクが低下する可能性があり、検査された細胞株が拡大され得るため、検査の各セットは、ヒトECMを使用して製造された製品の多くの商業規模のバッチを支持することができる。
【００３１】
線維芽細胞使用済み培地は可溶性ECMを含んでもよく、故に、いくつかの実施形態において美容目的のために使用することもできる。理論に限定されることなく、胎児性及び胚性ECMは、比較的より低い存在度の成熟及び非還元性架橋を含有することが本明細書で観察されている。しかし、本明細書のいくつかの実施形態により生産される可溶性ヒトECMは、より大量の成熟コラーゲン1型、例えばより大量の成熟三重らせんコラーゲン1型、並びに若干少ない線維性コラーゲン、例えばコラーゲン3、5、及び6型を含むことができる。
【００３２】
いくつかのアプローチが、本明細書の実施形態によるECM中の成熟コラーゲンの存在及び/又はレベルを評価するのに使用され得る。例えば、架橋された成熟コラーゲンの量は、比較のための成体組織由来I型コラーゲンを使用して、還元SDS-PAGEゲルで測定することができる。
【００３３】
多能性細胞
「多能性細胞」は、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、複数の異なる運命に従って分化することができる細胞のクラスを含む。多能性細胞の例には、人工多能性幹細胞(iPSC)及び胚性幹(ES)細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書の方法、組成物、及び/又はキットに適した多能性細胞は、iPSCを含む、からなる、又はから本質的になる。いくつかの実施形態において、本明細書の方法、組成物、及びキットに適した多能性細胞は、iPSC又はES細胞を含む、からなる、又はから本質的になる。いくつかの実施形態において、本明細書の方法、組成物、及びキットに適した多能性細胞は、iPSCを含む、からなる、又はから本質的になるが、ES細胞ではない。いくつかの実施形態において、本明細書の方法、組成物、及び/又はキットに適した多能性細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書の方法、組成物、及び/又はキットに適した多能性細胞は、単一のドナー由来である。
【００３４】
理論に限定されることなく、多能性細胞(起源が人工又は胚性)は、従来、細胞培養では十分な線維性コラーゲン性ECMを産生しなかった。しかし、本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットでは、多能性細胞は、単一のドナー由来の細胞の豊富な供給(ほぼ無限と考えられ得る)を提供することができ、ECMを分泌し、沈殿させる線維芽細胞に多能性細胞を分化させる場合に使用することができる。故に、本明細書のいくつかの実施形態の組成物、方法、及びキットにより、線維芽細胞をiPSCに脱分化し、iPSCを拡大し、次いでiPSCを線維芽細胞に再分化させる工程は、ECMを生産するための商業規模の量の単一のドナー線維芽細胞を生産することができる。細胞は単一のドナーであることから、生産されたECM製品の均一性はより大きく、混入及び/又は疾患伝播のリスクはより低くなり得る。iPSCを線維芽細胞から一般的に生産し、次いでiPSCを線維芽細胞に再び分化させる工程は、相当な労力を伴うことになるが、本明細書で論じられる実用のための本明細書で論じられる実用的な利点により、労力は価値のあるものになることを当業者は理解するであろう。
【００３５】
「人工多能性幹細胞」(iPSC)は、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、ES細胞と似た特性を有する細胞への体細胞の脱分化によって産生される細胞のクラスを含む。iPSCを作るためのいくつかの当技術分野で認識されているアプローチは、本明細書の実施形態の方法、キット、及び組成物に適している。いくつかの実施形態において、iPSCは、体細胞を脱分化因子と接触させて作られる。本明細書で詳細に述べられているように、脱分化因子は、体細胞がiPSCに分化するように誘導する核酸、ポリペプチド、及び/又は小分子を含み得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「脱分化因子」(この基底語の変形を含む)は、体細胞(例えば、線維芽細胞)をiPSCに脱分化させるのに十分な一連の遺伝子産物、及び/又は遺伝子産物をコードする核酸、及び/又は小分子を指す。脱分化因子は、本明細書のいくつかの実施形態の方法により体細胞(例えば線維芽細胞)をiPSCに脱分化させるのに使用することができる。脱分化因子はまた、体細胞(例えば、線維芽細胞)をiPSCに脱分化させるのに有用であり得ることから、本明細書のいくつかの実施形態による組成物及びキットと共に含むこともできる。いくつかの実施形態において、脱分化因子は2個以上の転写因子を含む。いくつかの実施形態において、脱分化因子は、Octファミリーメンバー(例えば、Oct3/4又はPOU5F1)、Soxファミリーメンバー(例えば、Sox1、Sox2、Sox3、Sox4、Sox11、又はSox15)、Klfファミリーメンバー(例えば、Klf1、Klf2、Klf4、又はKlf5)、並びに(i) Mycファミリーメンバー(例えば、c-Myc、L-Myc、又はN-Myc)、(ii) Nanog、(iii) Lin28若しくはLin28B、又は(iv) Glis1の少なくとも1つ、並びに/又は(脱分化線維芽細胞の場合、Octファミリーメンバー(例えば、Oct 4)及びBmi1を含む、から本質的になる、又はからなる。いくつかの実施形態において、脱分化因子は、化学的脱分化因子(例えば、小分子)を含む、から本質的になる、又はからなる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、脱分化因子は、体細胞(例えば、線維芽細胞)をiPSCに脱分化させるのに十分な遺伝子産物をコードする1つ又は複数の核酸として提供される。そのような脱分化因子は、単一のベクター、又は一連の1つを超えるベクターで提供されてもよい。いくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによる適切なベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、脱分化因子をコードする核酸の各々は、プロモーターに作動可能に連結される(2個以上の核酸が、例えば、IRES又は2Aエレメントによって隔てられて、同じプロモーターの制御下にあり得ることも考えられる)。いくつかの実施形態において、脱分化因子は、体細胞を(例えば、線維芽細胞をiPSCに)脱分化させるのに十分な1つ又は複数の遺伝子産物(例えばタンパク質)として提供される。いくつかの実施形態において、脱分化因子は、タンパク質のコレクションとして提供される。いくつかの実施形態において、脱分化因子は、切断されて個々の脱分化因子をもたらすことができる単一のポリペプチドで提供される。ポリペプチドは、標的細胞の適切な部分への移行及び局在化を促進するタグ、例えば核局在化配列を更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、脱分化因子は、本明細書に記載される化学的脱分化因子を含む。「フットプリントフリー」脱分化因子は、多能性を誘導する因子を送達するのに潜在的に有害なウイルスを使用せず、挿入変異誘発のリスクを高めることがある異物を宿主ゲノムに挿入しないため、(例えば、非組み込みベクター、ベクターの除去、mRNA若しくはポリペプチドの直接投与、又は多能性の化学誘導によって送達される)「フットプリントフリー」脱分化因子と関連した追加の利点がある可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、脱分化因子はフットプリントフリーである。Klf4、c-Myc、Oct4、及びSox2をコードするmRNAの体細胞への送達による、体細胞からのiPSCのフットプリントフリーな生成の例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Warrenら(2010)、Cell Stem Cell 7: 618-30に見出すことができ
、いくつかの実施形態において、脱分化因子をコードするそのようなmRNAが、iPSCを作るのに使用される。いくつかの実施形態において、多能性の化学誘導が本明細書に記載されているとおりである。
【００３８】
Octファミリーメンバー(例えば、Oct3、Oct4、/又はPOU5F1)及びSoxファミリーメンバー(例えば、Sox1、Sox2、Sox3、Sox4、Sox11、又はSox15)の組み合わせは、体細胞をiPSCに脱分化させるのに十分であることが報告されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第9,683,232号を参照のこと。そのため、いくつかの実施形態において、脱分化因子は、Octファミリーメンバー、及びSoxファミリーメンバーを含む、から本質的になる、又はからなる。米国特許第9,683,232号を参照のこと。更に、理論に限定されることなく、追加の因子の包含は、脱分化の効率を高め得ると考えられる。例えば、いくつかの実施形態において、脱分化因子は、Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー(例えば、Klf1、Klf2、Klf4、又はKlf5)及びSoxファミリーメンバーを含む、から本質的になる、又はからなる。例えば、Oct3/4、Klf4、c-Myc、及びSox2の組み合わせは、体細胞(及び特に線維芽細胞)をiPSCに脱分化させるのに十分である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,058,065号を参照のこと。したがって、いくつかの実施形態において、脱分化因子は、Oct3/4、Klf4、c-Myc、及びSox2を含む、から本質的になる、又はからなる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、脱分化因子は、Octファミリーメンバー(例えば、Oct3、Oct4、又はPOU5F1)、Klfファミリーメンバー(例えば、Klf1、Klf2、Klf4、又はKlf5)、Mycファミリーメンバー(例えば、c-Myc、L-Myc、又はN-Myc)、及びSoxファミリーメンバー(例えば  Sox1、Sox2、Sox3、Sox4、Sox11、又はSox15)を含む、から本質的になる、又はからなる。更に、Oct3/4、Klf4、Sox2、及び(i) Mycファミリーメンバー、(ii) Nanog、(iii) Lin28若しくはLin28B、又は(iv) Glis1の少なくとも1つの組み合わせも、体細胞、及び特に線維芽細胞をiPSCに脱分化させるのに十分であることが報告されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、US 9,447,408を参照のこと。したがって、いくつかの実施形態において、脱分化因子は、Oct3/4、Klf4、Sox2、及び(i) Mycファミリーメンバー、(ii) Nanog、(iii) Lin28若しくはLin28B、又は(iv) Glis1の少なくとも1つを含む、から本質的になる、又はからなる。
【００４０】
特に線維芽細胞は、因子Oct4及びBmi1の組み合わせを使用して(例えば、Bmi1が、Sox2、Klf4、及び/又はc-Mycの組み合わせの代わりになり得るように)iPSCに初期化され得ることも報告されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Moonら、(2011)、Cell、Res、21: 1305-15。したがって、いくつかの実施形態において、例えば前駆線維芽細胞をiPSCに脱分化させるならば、脱分化因子はOct4及びBmi1を含む、から本質的になる、又はからなる。
【００４１】
小分子、「VC6TF」(V、VPA; C、CHIR99021又はCHIR; 6、616452; T、トラニルシプロミン; F、フォルスコリン)のカクテルは、体細胞から多能性幹細胞を誘導し得ることが示されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Houら、(2013)、Science 341: 651-654。例えば、H3K79ヒストンメチルトランスフェラーゼDOT1Lの阻害剤、EPZ 004777 (EPZ、E)、及びレチノイド酸受容体(retinoid acid receptor)(RAR)アゴニスト、Ch 55のVC6TFへの添加は、体細胞の脱分化を促進することが示されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yeら、(2016)、Cell Research 26: 34-35。したがって、いくつかの実施形態において、脱分化因子は、化学的脱分化因子、例えば、VC6TF、又はEPZ 004777、DOT1L、及びCh 55と一緒にVC6TFを含む、からなる、又はから本質的になる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、iPSCは単一のドナーの体細胞に由来する。理論に限定されることなく、単一のドナー由来のiPSC (又は他の多能性細胞)は、安全性の利点、例えば、ウイルス、微生物、又は他の潜在的病原体の単一のドナーの補体のみに細胞の曝露を限定すること、及び故に、複数のドナー由来の細胞のコレクションと比べて疾病の伝播のリスクを最小限に抑えることを提供することができる。iPSCが、いくつかの実施形態において、2つ以上のドナーの体細胞に由来することも形式上可能である。いくつかの実施形態において、iPSCは成体皮膚線維芽細胞生検に由来する。
【００４３】
胚性幹細胞は、別のタイプの多能性幹細胞である。本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットにおいて胚性幹細胞を多能性細胞として使用することが可能である。ヒト胚性幹細胞を含む胚性幹細胞を単離及び調製する方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,200,806号に記載されている。しかし、iPSCがいくつかの実施形態において、胚性幹細胞に優るいくつかの利点を提供し得ることも認識されている。例えば、ES細胞は、多能性細胞を生成する1つの方法であるヒト胚の破壊をめぐる倫理的及び法的規定を含む制約があり得る。化学的誘導多能性細胞は、好ましい供給源である。
【００４４】
線維芽細胞
「線維芽細胞」は、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、様々な動物組織に構造的骨組み(間質)を提供する細胞のクラスを含む。線維芽細胞はまた、創傷の部位に遊走して創傷治癒を媒介することもでき、及び様々な結合組織の成分になり得る。線維芽細胞は、例えば、線維芽細胞特異的抗体、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Goodpasterら、(2008)、J. Histochem Cyotchem、56: 347-58に記載されている抗体TE-7を使用して同定することができる。
【００４５】
理論に限定されることなく、細胞培養において基質(例えば、プラスチック)に接着し、血清の存在下で増殖し、線維性コラーゲン性ECMコラーゲンを合成及び沈殿させることができる任意の間葉系細胞が、培養中にヒトECMを作るのに使用され得ると考えられる。いくつかの実施形態において、間葉系細胞の一種である線維芽細胞が、ECMを生産するのに使用される。ECMを産生し得る細胞(「ECM産生細胞」と呼ばれることがある)の例示的タイプには、骨髄間葉系幹細胞(MSC)、iPSC由来MSC、ES由来MSC、及び例えば新生児包皮線維芽細胞株(多能性又は非多能性であってもよい)由来、又は皮膚若しくは血液生検由来の線維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。理論に限定されることなく、間葉系細胞タイプ間の違いは、単一のドナー株の任意の細胞又は細胞株(共通の細胞源由来の)間の違い以下であり得ることが更に考えられる。細胞が、結合組織を含有するヒトドナー試料に由来するならば、これらの細胞は、本明細書のいくつかの実施形態による細胞培養でECMを作るのに適切であり得る。
【００４６】
従来、線維芽細胞は新生児包皮から得られた。その理由は、これらが、廃棄された組織から容易に得られるためである。しかし、このアプローチは、生産規模の細胞バンクを生成及びスクリーニングするために、複数のドナー由来の細胞を一般的に必要とする。1つを超えるドナーの使用はまた、外来性の作用物質が伝播するリスクの増加を高める可能性もある。ドナー細胞バンクを開発及びスクリーニングする費用もまた大きく、不利になり得る。外来性の作用物質の検査要件は、複数のドナー由来の細胞をバンキングし、使用するための別の障害となり得る。更に、一次細胞株は、非形質転換体細胞に関してヘイフリックの限界によって理論的に限定され得るが、実際には、一次細胞株は、組織源からの単離後約8〜20継代に適しているにすぎないことがある。継代に関するこれらの限界は、細胞バンク化プロセス、例えば、商業的な量を製造するためのマスター細胞バンク、ワーキング細胞バンク、又は産生細胞バンク(production cell bank)スキームのプロセスに沿った拡大に対する従来の線維芽細胞の適合性を制限することがある。しかし、本明細書のいくつかの実施形態による方法、キット、及び組成物は、線維芽細胞の従来の供給源に優る利点を提供することができる。例えば、本明細書のいくつかの実施形態によるiPSCから分化させた線維芽細胞は、単一のドナー由来のであり得(例えば、iPSCを、線維芽細胞に分化させる前に拡大されるならば)、疾病の伝播のリスクを低減し、検査要件を低減し得る。更に、いくつかの実施形態において、iPSCは一次細胞株より多くの拡大サイクルを受けることができ、iPSCに由来する線維芽細胞又は他のECM産生細胞の商業的スケーラビリティを促進することができる。いくつかの実施形態において、iPSCは血清の非存在下で拡大される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、iPSCを線維芽細胞に分化して得ることができる。理論に限定されることなく、iPSCは、例えば1つ又は複数の増殖因子を含み得る1つ又は複数の線維芽細胞分化因子とiPSCを接触させて、線維芽細胞に分化させ得ると考えられる。本明細書で使用される場合、「線維芽細胞分化因子」(この基底語の変形を含む)は、多能性細胞(例えば、iPSC)細胞を線維芽細胞に分化させるのに十分な一連の遺伝子産物、及び/又は遺伝子産物をコードする核酸を指す。例えば、iPSCは、結合組織増殖因子(CTGF)とiPSCを接触させて線維芽細胞に分化させ得ることが報告されている。iPSCは、3-D足場で増殖され得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Xuら、Scientific Reports 5: 8480 DOI: 10.1038/srep08480。そのため、いくつかの実施形態において、線維芽細胞分化因子は、CTGFを含む、から本質的になる、又はからなる。いくつかの実施形態において、線維芽細胞分化因子は、CTGF及びフィブリノーゲンを含む、から本質的になる、又はからなる。いくつかの実施形態において、iPSCは3次元基質(例えば、デキストリンマイクロキャリア(dextrin microcarrier);例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,378,527号を参照のこと)で培養され、次いで線維芽細胞分化因子と接触される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「産生線維芽細胞」は、本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによるECMの生産に使用されている、又は使用することができる線維芽細胞を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「前駆線維芽細胞」は、多能性細胞の前駆体として使用されている、又は使用することができる線維芽細胞を指す。例えば、いくつかの実施形態の方法及びキットによれば、前駆線維芽細胞は、前駆線維芽細胞をiPSCに脱分化させるために脱分化因子と接触され得る。
【００５０】
細胞培養及び基質
細胞培養の様々なアプローチが、本明細書のいくつかの実施形態の方法、キット、及び組成物により使用され得る。細胞培養のプロトコル及び試薬に関する詳細な手引きは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2000に見出すことができる。一般的に、本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物(compositons)、及びキットによるECMの製造のための線維芽細胞の培養は、培養培地で行うことができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は血清を含む。血清は、最初に細胞培養培地の一部であってもよく、又は培養プロセスにおいて後で添加されてもよい。本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットと共に使用する血清の適切なタイプには、検査された臨床グレードの仔ウシ血清、期限切れ単位血液からのプールされたヒト血清、又はこれらの2つの物質の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、培養培地の血清の量(v/v)は、約0.1%〜約20%、例えば約0.1%〜約15%、約0.1%〜約10%、約0.1%〜約5%、約0.1%〜約3%、約0.1%〜約1%、約1%〜約20%、約1%〜約15%、約1%〜約10%、約1%〜約5%、約1%〜約3%、約3%〜約20%、約3%〜約35%、約3%〜約30%、約3%〜約5%、約5%〜約20%、約5%〜約15%、約5%〜約10%、約10%〜約20%、又は約15%〜約20%、例えば約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20% (列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)である。いくつかの実施形態において、培養培地の血清の量(v/v)は約0.1%〜約10%である。いくつかの実施形態において、培養培地の血清の量は、培養中の細胞によるECMの生物学的産生を増加させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、培養培地の血清の量は、培養中の細胞によって産生されるECMの成熟及び架橋を誘導するのに十分な量である。本明細書で使用される場合、「架橋された」ECMは、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、ポリペプチド(例えば、コラーゲン)が、ペプチド結合以外のイオン結合及び/又は共有結合によってECMの1つ又は複数の他のポリペプチドに直接的又は間接的に結合しているECMを含む。いくつかの実施形態において、架橋されたECMの各ポリペプチドは、架橋されたECMの少なくとも1つの他のポリペプチドに、ペプチド結合ではない結合によって共有結合及び/又はイオン結合している。いくつかの実施形態において、ECMの架橋されたペプチドは、ECMの別のペプチドに直接結合している。いくつかの実施形態において、ECMの架橋されたポリペプチドは、例えば介在小分子、イオン、アミノ酸、及び/又は異なるポリペプチドを介して、ECMの別のポリペプチドに間接的に結合している。いくつかの実施形態において、架橋されたECMは、ポリペプチドの大部分、実質的に全て、又は全て、例えばポリペプチドの約又は少なくとも約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99% (列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)が、非ペプチド結合によってECMの少なくとも1つの他のポリペプチドに結合しているECMを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、多能性細胞(例えば、iPSC)又は線維芽細胞は、基質で又は基質の近くで培養される。いくつかの実施形態において、基質は、デキストラン、例えばデキストランマイクロキャリアを含む、からなる、又はから本質的になる。有利には、デキストラン基質は、その後、本明細書のいくつかの実施形態による細胞培養によって産生されたECMの単離及び精製を促進することができる、本明細書に記載されるデキストラナーゼを使用して消化され得る。いくつかの実施形態において、基質は、炭水化物を含む、からなる、又はから本質的になる。いくつかの実施形態において、基質は、ポリマーを含む、からなる、又はから本質的になる。いくつかの実施形態において、基質は、プラスチックを含む、からなる、又はから本質的になる。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを任意の基質又は固相から分離する工程を含む。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離している(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。理論に限定されることなく、デキストラナーゼは、ECMにプロテアーゼとして作用せず、そのため、本明細書のいくつかの実施形態によるデキストラナーゼを使用してECMを単離する工程は、インタクト(非プロテアーゼ消化ECM)をもたらすと考えられる。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。
【００５３】
デキストランは、多くのグルコース分子でできた大きな分岐炭水化物である。デキストラン鎖は様々な長さであってもよく、例えば、わずか3kDaから2000kDaを超える分子量を有してもよい。デキストランマイクロキャリア等のデキストラン構造は、本明細書のいくつかの実施形態の方法、キット、及び組成物における多能性細胞、又は線維芽細胞等の細胞の培養のための基質として使用され得ると考えられる。有利には、デキストランは非毒性であり得、本明細書でより詳細に記載されるようにデキストラナーゼによって容易に加水分解され得る。
【００５４】
デキストラナーゼは、産業用途で広範に使用される細菌酵素であり(EC 3.2.1.11、デキストラン加水分解酵素(dextran hydrolase)、エンドデキストラナーゼ、デキストラナーゼDL 2、DL 2、エンドデキストラナーゼ、アルファ-D-1,6-グルカン-6-グルカノヒドロラーゼ、1,6-アルファ-D-グルカン  6-グルカノヒドロラーゼ)、組織名6-アルファ-D-グルカン  6-グルカノヒドロラーゼを有する。この酵素は、以下の化学反応、すなわちデキストランの(1->6)-アルファ-D-グルコシド結合の内部加水分解(endohydrolysis)を触媒する。細胞培養においてデキストラナーゼは、様々な用途、例えば、デキストランマイクロキャリアで細胞製品及び細胞由来ウイルス製品若しくは他の生物学的製剤を製造するための(例えば、米国特許第6,378,527号を参照のこと)、又は生物製剤(biological products)生産のための商業規模の細胞培養で使用された大量のビーズの廃棄物処理のための、ヒト軟骨細胞等の拡大された哺乳動物細胞及び哺乳動物細胞株の単離に使用することができる。いくつかの実施形態の方法、キット、及び組成物において、デキストランは、多能性細胞(例えば、iPSC)、又は多能性細胞に由来する線維芽細胞(例えば、線維芽細胞をiPSCに脱分化し、次いでiPSCを線維芽細胞に再分化して産生される線維芽細胞)の基質又は足場として使用することができる。いくつかの実施形態において、デキストランは、軟骨細胞の培養及び/又は拡大に使用されない。いくつかの実施形態において、デキストランは、ヒト以外の細胞、例えばVERO (サル)及び/又はCHO (げっ歯類)細胞の培養に使用されない。
【００５５】
一般的に商業的使用、ヒトECMに適用できない様々な研究グレードの小規模培養におけるデキストラナーゼ酵素の使用は、Pinneyら(Pinney E、(2011) International Journal of Stem Cells 4: 70-75;及びMenenら、(2012) Anticancer Research 32: 1573-1578を参照のこと。各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)によって開示されている。従来のアプローチは、主にデキストランマイクロキャリアの廃棄物処理の文脈で、拡大後の細胞単離にデキストランの使用を必要としたことが留意される。いくつかの実施形態において、デキストランは、ECMを産生する多能性細胞又は線維芽細胞の培養に使用される。いくつかの実施形態において、デキストランは、多能性細胞又は線維芽細胞の培養で使用されるが、廃棄物処理には使用されない。いくつかの実施形態において、培養は、多能性細胞又は線維芽細胞によって産生されるヒトECMを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態の方法、組成物、及び/又はキットにおいて、ECMは、培養中の細胞(例えば、線維芽細胞、及び/又はiPSC)によって製造され、次いでECMは、培養中の細胞から単離される。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを基質又は固相から分離する工程を含む。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離している(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMの可溶性画分を単離する工程を含む。可溶性ECMを含む使用済み培地は、細胞培養物から単離されてもよく、場合により、細胞培養物が産生し続けるように新鮮培地に置き換えられてもよい。いくつかの実施形態においてECMは、デキストラナーゼの酵素活性を促進するpH(例えば、pH6.0〜6.5)での酸性洗浄と、その後のデキストラナーゼ消化によって単離される。デキストラナーゼは、比較的低い濃度(1000U/ml未満、例えば1000U/ml、900U/ml、800U/ml、700U/ml、600U/ml、500U/ml、400U/ml、300U/ml、200U/ml、100U/ml、50U/ml、10U/ml、5U/ml、2U/ml、又は1U/ml未満(これらの値のいずれか2つの間の範囲、例えば1〜1000U/ml; 500〜1000U/ml、1〜500U/ml、100〜300U/ml、又は600〜800U/mlを含む))であってもよい。より低い濃度のデキストラナーゼは、他の非デキストラン炭水化物を非特異的に分解する可能性が低いと考えられ、他の非デキストラン炭水化物のいくつかは、ECMの成分であり得る。ECMは、細胞核酸を除去するためにDNaseに更に接触され得る。いくつかの実施形態におけるECMの製造は、故に、ゼノフリー培養培地を使用して動物又は植物タンパク質なし、及びエクスビボでの細胞拡大を調節するためのPinneyの使用なしであってもよい。
【００５７】
多能性細胞から生成される線維芽細胞を使用したECMの製造
いくつかの実施形態において、細胞外マトリクスを製造する方法が提供される。方法は、多能性細胞(人工多能性幹細胞(iPSC)等)を産生線維芽細胞に分化させる工程を含んでもよい。方法は、産生線維芽細胞がECMを産生するように産生線維芽細胞を培養する工程を含んでもよい。方法は、産生線維芽細胞からECMを単離し、故にECMを製造する工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、方法は、多能性細胞を産生線維芽細胞に分化させる前に、前駆線維芽細胞を脱分化させて多能性細胞を形成する工程を含む。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、線維芽細胞に分化させる前に拡大される。多能性細胞を最初に拡大することによって、多能性細胞を線維芽細胞に再分化させる前に、多能性細胞の大きな集団が少数の始原多能性細胞から生成され得ることが留意される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、少なくとも約10倍、例えば約又は少なくとも約10、15、20、25、又は30倍(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば約10〜30倍、約10〜25倍、約10〜20倍、約15〜30倍、約15〜25倍、約15〜20倍、又は約20〜30倍を含む)拡大される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、少なくとも約15倍拡大される。多数の倍加を起こす多能性細胞の能力は、消耗し老化する前に典型的には約10〜12倍しか倍加を起こさない新生児包皮細胞等の線維芽細胞の従来の供給源に優る利点を提供することができることが留意される。
【００５８】
図1は、本明細書のいくつかの実施形態による、iPSCから分化させた線維芽細胞を使用してECMを製造する方法を例示するフロー図である。方法において、場合により、前駆線維芽細胞は、iPSCを形成するように脱分化させてもよい100。方法において、人工多能性幹細胞(iPSC)は、産生線維芽細胞に分化させてもよい。110。方法において、産生線維芽細胞は培養してもよく、それにより産生線維芽細胞は細胞外マトリクス(ECM)を産生する。120。方法において、産生線維芽細胞は培養してもよく、それにより産生線維芽細胞は、細胞外マトリクス(ECM)を産生する。130。
【００５９】
いくつかの実施形態の方法、キット、及び組成物において、単一のドナー由来の前駆線維芽細胞(又はiPSC)は、ECMを作るのに使用される。有利には、単一のドナー由来のECMを製造する工程は、潜在的混入物(ウイルス混入物等)の数を最小限に抑えることができる。そのため、いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞に分化するiPSCが単一のドナーのみに由来する。ウイルスフリー(例えばレトロウイルスフリー)多能性細胞は、混入又は免疫原性のリスクを更に最小限に抑えることができることも留意される。したがって、いくつかの実施形態において、iPSCは、本明細書に記載されるOctファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、及びKlfファミリーメンバー等の脱分化因子をコードするウイルス挿入がない。いくつかの実施形態において、方法は、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞(MSC)、ES由来MSC、又は非多能性新生児包皮線維芽細胞細胞株のいずれかを使用する工程を含まない。いくつかの実施形態において、方法は、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞(MSC)、ES由来MSC、又は任意の新生児包皮線維芽細胞細胞株のいずれかを使用する工程を含まない。いくつかの実施形態において、iPSCはフットプリントフリーである(例えば、化学的脱分化因子又はmRNA脱分化因子を使用して脱分化させたiPSC)。
【００６０】
多能性細胞は、本明細書に記載される分化因子を使用して産生線維芽細胞に分化させ得ることが留意される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、該細胞を産生線維芽細胞に分化させる前に拡大される。いくつかの実施形態において、分化の前に多能性細胞を拡大する工程は、分化させて単一のドナー由来の大量の産生線維芽細胞をもたらし得る、単一のドナー由来の大量の細胞を提供することができる。いくつかの実施形態において、拡大後、ただし、産生線維芽細胞への分化の前に、多能性細胞はバンク化される。例えば、多能性細胞は、液体窒素中で凍結してバンク化されてもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞は、末端分化細胞(例えば、産生線維芽細胞それ自体)を含む、から本質的になる、又はからなる培地で培養される。いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞は、間葉系幹細胞(MSC)が実質的にない、又はない培地で培養される。理論に限定されることなく、本明細書のいくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによる、線維芽細胞由来iPSCから分化させた線維芽細胞は、成熟ECMの効率的な大規模生産に有効であり得ると考えられる。例えば、いくつかの実施形態による、単一のドナーiPSCを脱分化し、拡大し、線維芽細胞に再分化させる工程は、混入又は疾病伝播のリスクが最小限の、商業規模のECM産生線維芽細胞をもたらすことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、方法は、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞(MSC)、ES由来MSC、非多能性新生児包皮線維芽細胞細胞株、若しくは任意の新生児包皮線維芽細胞株のいずれか、又はこれらの2つ以上がない状態で行われる。いくつかの実施形態において、方法は、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞(MSC)、ES由来MSC、若しくは非多能性新生児包皮線維芽細胞細胞株のいずれか、又はこれらの2つ以上がない状態で行われる。いくつかの実施形態において、方法は、これらのいずれもない状態で行われる。いくつかの実施形態において、方法は、商業規模で行われ、故にECMの商業規模生産を達成する。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも10リットルの産生線維芽細胞培養物、例えば、少なくとも10、20、30、40、50、10、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、又は1000リットルの産生線維芽細胞培養物(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば10〜1000リットル、10〜500リットル、10〜200リットル、50〜1000リットル、50〜500リットル、50〜200リットル、100〜1000リットル、100〜500リットル、又は100〜200リットルを含む)の培養を含む商業規模生産を含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも50gのECM、例えば少なくとも50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、又は5000gのECM (列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)の生産を含む商業規模生産を含む。上述のとおり、商業スケーリング(commercial scaling)の初代細胞、例えば初代骨髄MSC、又は新生児包皮由来細胞は、複数のドナー由来の細胞を必要とすることがあり、混入又は疾病伝播のリスクを高める可能性がある。また、上述のとおり、ES細胞は、疾病伝播のリスクを高めることがあるほか、例えば倫理的規程のために、利用可能性及び使用の制約を受ける可能性がある。更に、骨髄MSC等のMSCは多能性のままであることがあり、故に更なる分化を受ける可能性がある。一方、いくつかの実施形態における方法、組成物、及びキットは、有利には線維芽細胞が更なる分化を受けないように、分化させた線維芽細胞(ただし、MSCではない)を用いて行うことができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、方法は、前駆線維芽細胞を脱分化させてiPSCを形成する工程を含む。前駆線維芽細胞は、脱分化因子と接触され、それによって前駆線維芽細胞をiPSCに脱分化させることができる。いくつかの実施形態において、前駆線維芽細胞は、成体皮膚(生検)線維芽細胞を含む。いくつかの実施形態において、前駆線維芽細胞は単一のドナー由来である。いくつかの実施形態において、iPSCは、Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、又はKlfファミリーメンバーをコードするウイルス挿入がない。いくつかの実施形態において、iPSCはフットプリントフリーである。iPSCは、次いで拡大され、産生線維芽細胞に分化させ得る。
【００６４】
産生線維芽細胞を培養する工程は、酸素の存在下で行われてもよい。酸素は、全て又は本質的に全ての代謝プロセスに関与する炭素源の効率的で最大の変換を促進するため、理論に限定されることなく、正常酸素中での培養は有利であると考えられる。商業規模では、酸素は、数あるタンパク質の中でも特にコラーゲンの合成を支持するATPにグルコース及びグルタミンを変換する反応の反応物である。低酸素では、細胞は、好気呼吸よりむしろ解糖系にはるかに多く依存せざるを得ず、コラーゲン等のタンパク質の効率の低い合成につながる。そのため、いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞を培養する工程は正常酸素で行われる。いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞を培養する工程は低酸素で行われる。低酸素は一般的に、周囲空気の酸素濃度(正常酸素;約15%〜20%酸素)と比べて低い酸素濃度を指す。いくつかの実施形態において、低酸素条件は約10%未満の酸素濃度を含む。いくつかの実施形態において、低酸素条件は、約1%〜10%、1%〜9%、1%〜8%、1%〜7%、1%〜6%、1%〜5%、1%〜4%、1%〜3%、又は1%〜2%の酸素濃度を特徴とする。低酸素条件は、周囲ガス濃度を制御できるようにする培養装置、例えば、嫌気性チャンバーを使用して作られ、維持されてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞は基質の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、基質は、ポリマー、例えばプラスチック表面又はデキストランを含む。いくつかの実施形態において、基質は、デキストランマイクロキャリアを含む。
【００６６】
例えば、産生線維芽細胞がデキストランマイクロキャリアの存在下で培養されるいくつかの実施形態において、ECMを産生線維芽細胞から単離する工程は、酸性緩衝液中でECMを洗浄する工程と、産生線維芽細胞及びECMを含む溶液をデキストラナーゼと接触させる工程とを含む。産生線維芽細胞及びECMを含む溶液はまた、DNaseにも接触され得る。例として、デキストラナーゼは、細菌デキストラナーゼを含んでもよい。いくつかの実施形態において、デキストラナーゼは、1〜1000U/mlの濃度で提供される。デキストラナーゼ及びDNaseは、このようにして、他の物質を除去してECMの精製を促進し得ると考えられる。したがって、ECMを単離する工程は、ECMを基質又は固相から分離する工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離される(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。いくつかの実施形態において、ヒトECMを精製する工程は、pH 6.0〜6.5の酸性緩衝液で洗浄して、残留培養培地成分を除去する工程を含む。酸性洗浄されたECMは、酵素活性がデキストランビーズ及び細胞核酸を除去するのに十分なpH2.0〜7.0、又は好ましくはpH6.0〜6.5の酸性溶液中で、1〜1000U/mlの細菌デキストラナーゼ及び1〜1000U/mlの組換えヒトDNseを含む溶液と接触されてもよい。場合により、精製は、ECMの工程内検査後に行われてもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞から単離すると、ECMはもはや産生線維芽細胞と流体連通しない。例えば、ECMは、産生線維芽細胞とは別個の容器にあり得る。いくつかの実施形態において、ECMを産生線維芽細胞から単離する工程は、少なくとも20% (w/w) ECM、例えば約又は少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99% (列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)のECMである組成物を製造するためにECMを精製する工程を含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約80%のECMを含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約80%〜95%のECMを含む。いくつかの実施形態において、産生線維芽細胞から単離すると、ECMはもはや基質に結合していない(例えば、もはや基質に直接結合していない、及び/或いは直接又は1つ若しくは複数の介在結合分子を介して基質に結合している分子にもはや結合していない)。
【００６８】
ECMは、本明細書に記載される成熟ECM成分を含んでもよい。「成熟ECM」は、当分野におけるその通常の意味に従って本明細書で使用され、架橋されたECMであって、COL1のc末端プロペプチド、三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は2つ以上のこれらの特徴の組み合わせを含むECMを含む。いくつかの実施形態において、成熟ECMは、三重らせん及び/又は非還元性のガンマ型線維性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、成熟ECMはコラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、ECMの約90% (w/w)はCOL1を含み、及び約10%はCOL3、COL4、COL5、COL6、又はこれらのいずれかの組み合わせ若しくはこれらの全てからなる群から選択される。ホモ・サピエンスCOL1、COL3、COL4、COL5、及びCOL6の例示的配列には、本明細書のTable 1(表1)に示された配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、成熟ECMの少なくとも約80%はCOL1を含み、並びに少なくとも約10%はCOL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、成熟ECMの少なくとも約85%はCOL1を含み(例えば、少なくとも約85%、87%、90%、又は95%)、並びに少なくとも約5%(例えば、少なくとも約5%、10%、13%、又は15%)は、COL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、成熟ECMは、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む。いくつかの実施形態において、成熟ECMは、三重らせん及び/又は非還元性のガンマ型線維性コラーゲンを含む。成熟ECMの異なる分子、例えば、本明細書に記載されるコラーゲン分子は、数あるアッセイの中でも特にELISAを使用して容易に検出することができることが留意される。いくつかの実施形態において、成熟ECMの成分の量を確かめるのに、コラーゲンタンパク質(又はCOL1のc末端プロペプチド)に特異的な抗体が定量的ELISAで使用される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、方法は、産生線維芽細胞が成熟コラーゲンを産生するまで産生線維芽細胞を血清と接触させる工程を更に含む。理論に限定されることなく、産生線維芽細胞を血清と接触させる工程は、ECM沈殿を支持し、生物学的産生を増加させ、及び成熟ECM、例えば架橋されたECMの産生を誘導し得ると考えられる。次いで、血清濃度の少なくとも95%の低減があるまで、血清の量は徐々に低減され得る。いくつかの実施形態において、漸次低減は少なくとも約5日間、例えば約又は少なくとも約5、7、10、12、15、20、25、30、35、40、45、又は50日(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)にわたる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞の生産ロットを開始するために、多能性細胞(例えば、線維芽細胞を脱分化因子と接触させて生成されるiPSC)のバイアルが適切な数に拡大され、多能性細胞が次いでMSC又は線維芽細胞等の線維性コラーゲン性ECM産生細胞に脱分化するように誘導され、成熟ECMを産生するためにこれらの細胞が利用される。そのため、いくつかの実施形態において、ECMを製造するための方法は、(a)線維芽細胞皮膚生検又は血液試料を分化させる工程、(b)化学的ポリペプチドを介した多能性、又は核酸ベースのベクターフリー/フットプリントフリー誘導多能性をその後に誘導する工程、(c)クローンを単離し、多能性状態の細胞を拡大する工程、(d)細胞バンクを生成する工程(細胞の特徴付け及び外来性の作用物質検査を場合により含む)、(e) ECMの生産ロットを開始するために多能性細胞を拡大する工程、及び/又は(f)多能性細胞を、培養下で不溶性である十分な成熟線維性コラーゲン性ECMを産生する分化状態に再び脱分化させる工程を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ECMを製造するためのキットが提供される。キットは、ヒト線維芽細胞を含む組成物、脱分化因子、及び線維芽細胞分化因子を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ヒト線維芽細胞を含む組成物は凍結ヒト線維芽細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物の線維芽細胞の全てが単一のドナー由来である。いくつかの実施形態において、キットは、基質、例えばデキストランマイクロキャリアを更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、例えばECMを細胞及び細胞培養物から単離する上で有用であり得る、デキストラナーゼ及びDNAaseを更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、ヒト線維芽細胞の代わりのiPSC等の多能性細胞及び脱分化因子を含む(ただし、多能性細胞を線維芽細胞に分化させるための分化因子を依然として含む)。いくつかの実施形態において、キットはプロテアーゼを含まない。
【００７２】
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクスが上記に記載された方法のいずれか1つに従って製造される、少なくとも約80%(w/w)の細胞外マトリクスを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約又は少なくとも約60%(w/w)のECM、例えば少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)のECMを含む。いくつかの実施形態において、組成物のECMは、本明細書に記載される成熟ECMを含む、から本質的になる、又はからなる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞外マトリクスを産生している複数のiPSC由来線維芽細胞を含む。細胞培養物は、本明細書に記載される脱分化因子を更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも約5%、例えば少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、又は75%(w/w)(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)はECMである。いくつかの実施形態において、ECMの約90%(w/w)はCOL1を含み、並びに少なくとも約10%はCOL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ECMの少なくとも約80%はCOL1を含み、及び少なくとも約10%は、COL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ECMの少なくとも約85%はCOL1を含み(例えば、少なくとも約85%、87%、90%、又は95%)、並びに少なくとも約5%(例えば、少なくとも約5%、10%、13%、又は15%)は、COL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ECMは、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む。いくつかの実施形態において、ECMは、三重らせん及び/又は非還元性のガンマ型線維性コラーゲンを含む。
【００７４】
成熟ゼノフリーECMの生産
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法を含む。方法は、線維芽細胞及び/又は間葉系幹細胞(MSC)を基質で培養する工程を含んでもよい。基質は、少なくとも2つの表面を含んでもよい。培養は、線維芽細胞及び/又はMSCが少なくとも2表面で3次元形状を規定し、並びに線維芽細胞及び/又はMSCの少なくとも80%がその細胞周期を停止するまで(例えば、少なくとも80%、85%、90%、93%、95%、97%、又は99%)、血清フリー及びゼノフリーで行われてもよい。線維芽細胞及び/又はMSCは、次いで約又は少なくとも約2週間(例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、7、又は8週間)血清と接触され得る。血清との接触の結果、線維芽細胞及び/又はMSCは可溶性成熟ECMを産生することができ、このようにして、可溶性成熟ECM並びに線維芽細胞及び/又はMSCを含む溶液を生産することができる。溶液はゼノフリーであってもよい。方法は、可溶性成熟ECMを線維芽細胞及び/又はMSCから単離し、故に成熟ゼノフリーECMであるECMを製造する工程を更に含んでもよい。例えば、可溶性成熟ECMを単離する工程は、使用済み培地を含む溶液の可溶性画分を採取する工程を含んでもよい。また、いくつかの実施形態において、方法は、(後で血清を添加するのではなく)培養の開始時に血清を含有する培地に線維芽細胞及び/又はMSCがあるように行われ得ることも考えられる。線維芽細胞及びECMが上述されているが、方法はまた、本明細書に記載されたECM産生細胞を用いて行われ得ると明確に考えられることも留意される。いくつかの実施形態において、ECMを単離する工程は、ECMを基質又は固相から分離する工程を含む。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離される(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。
【００７５】
図2は、本明細書のいくつかの実施形態による、線維芽細胞又はMSCを少なくとも2週間培養する工程を含む、ECMを製造する方法を例示するフロー図である。方法において、場合により、ヒト多能性細胞培養物は拡大されてもよい。前記拡大は、血清フリー及びゼノフリーであってもよく、それによってヒト多能性細胞を生産してもよい。ヒト多能性細胞は、分化因子と接触されてもよく、それによりヒト多能性細胞が線維芽細胞又はMSCに分化する。200。方法において、線維芽細胞及び/又は間葉系幹細胞(MSC)は、基質で培養されてもよい。基質は、少なくとも2つの表面を含んでもよい。培養は、血清フリー及びゼノフリーであってもよく、線維芽細胞及び/又はMSCが少なくとも2表面で3次元形状を規定し、並びに線維芽細胞及び/又はMSCの少なくとも80%がその細胞周期を停止するまで行われてもよい。210。方法において、線維芽細胞及び/又はMSCは、血清と少なくとも約2週間接触されてもよく、それにより線維芽細胞及び/又はMSCが可溶性成熟ECMを産生し、それによって可溶性成熟ECM及び線維芽細胞又はMSCを含む溶液を生産することができ、前記溶液はゼノフリーである。220。方法において、可溶性成熟ECMは産生線維芽細胞から単離されてもよく、それによって成熟ゼノフリーECMであるECMを製造することができる。230。
【００７６】
いくつかの実施形態において、方法は、ヒト多能性細胞培養物(例えば、本明細書に記載されるフットプリントフリーiPSC等のiPSC)を拡大する工程を更に含む。拡大は、血清フリー及びゼノフリー条件で行われてもよく、拡大量のヒト多能性細胞を生産することができる。方法は、拡大されたヒト多能性細胞を本明細書に記載される分化因子と接触させる工程を更に含んでもよい。分化因子は、ヒト多能性細胞を線維芽細胞又はMSCに分化させるのに適切であり得る。
【００７７】
線維芽細胞及び/又はMSCを血清と少なくとも2週間以上培養することにより、架橋し、及び優れた可溶性を有するコラーゲンを含む成熟ECMの生産が思いがけずもたらされたことが本明細書で観察されている。したがって、いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCと血清との接触は、少なくとも約2週間、例えば、少なくとも約2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、又は12週間(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)行われる。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCと血清との接触は、少なくとも約8週間行われる。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCと血清との接触は、約2週間〜約12週間、例えば約2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、又は12週間(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば約2週間〜約11週間、約2週間〜約10週間、約2週間〜約8週間、約2週間〜約6週間、約2週間〜約4週間、約3週間〜約12週間、約3週間〜約10週間、約3週間〜約8週間、約3週間〜約6週間、約4週間〜約12週間、約4週間〜約10週間、約4週間〜約8週間、約4週間〜約6週間、約6週間〜約12週間、約6週間〜約10週間、又は約6週間〜約8週間を含む)行われる。いくつかの実施形態において接触は、約2週間〜約8週間行われる。いくつかの実施形態において接触は、2週間より長く行われる。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCは、正常酸素条件下で血清と培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCは、低酸素件下で血清と培養される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ヒト多能性細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)を含む。いくつかの実施形態において、iPSCはフットプリントフリーである。いくつかの実施形態において、iPSCは単一のドナー由来である。本明細書で論じられるとおり、iPSCの使用は、いくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットによる線維芽細胞等のECM産生細胞に分化させる前に、多能性細胞を拡大し、場合によりバンク化できるようにすることができる。したがって、iPSCは単一のドナーに由来し、次いで拡大され得ることから、iPSCのそのような使用により、商業規模の量の単一のドナー由来のECM産生細胞が可能になり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、方法は、成熟ゼノフリーECMを含む化粧用組成物を製造する工程を更に含む。いくつかの実施形態において、使用済み培地はまた、いくつかの化粧用組成物の製造にも有用であり得る。
【００８０】
血清が、本明細書に記載された方法、組成物、及びキットによる線維芽細胞等のECM産生細胞の培養物に使用され、又は添加される場合、アスコルビン酸も、例えば、培養中の細胞の健康の維持に有用であり得る。理論に限定されることなく、アスコルビン酸は、成熟三重らせんコラーゲンを安定させるコラーゲンの特定の転写後修飾に必要とされ得ることが留意される。例として、アスコルビン酸は、プロリルヒドロキシラーゼ等のいくつかの酵素の補因子となり得る。したがって、いくつかの実施形態において、方法は、線維芽細胞又はMSCを、細胞が血清と接触される間(例えば、少なくとも2週間)アスコルビン酸と接触させる工程を更に含む。
【００８１】
理論に限定されることなく、線維芽細胞及び/又はMSC等の細胞は、基質(足場又は支持体等の、例えば、本明細書に記載されるデキストランマイクロキャリア)上で十分な密度に達すると、ECM沈殿及び成熟を支持し得ると考えられる。更に、細胞が十分な密度に達し始めるとき、その細胞周期は停止しし得る(すなわち、細胞が細胞周期のG0期に入り得る)。したがって、いくつかの実施形態において、線維芽細胞又はMSCは、ECM沈殿及び成熟を支持する適切な密度に達するまで血清と接触されない。いくつかの実施形態において、線維芽細胞又はMSCは、これらの線維芽細胞又はMSCが、3次元形状を規定する基質の少なくとも2表面に沈殿し、及び線維芽細胞又はMSCの少なくとも約70%がその細胞周期を停止するまで、血清と接触されない。いくつかの実施形態において、線維芽細胞又はMSCは、これらの線維芽細胞又はMSCが、3次元形状を規定する基質の少なくとも2表面に沈殿し、及び線維芽細胞又はMSCの少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)がその細胞周期を停止するまで、血清と接触されない。
【００８２】
いくつかの適切な血清の形態、例えば検査され臨床グレードの仔ウシ血清又は期限切れ単位血液からプールされたヒト血清、又はこれらの組み合わせが、線維芽細胞及び/又はMSCと接触され得る。いくつかの実施形態において、血清を線維芽細胞と接触させる工程は、線維芽細胞及び/又はMSCを含む溶液を血清に添加する工程を含む。「添加(Adding)」は、本明細書で広く使用され、線維芽細胞及び/又はMSCを含有する溶液への血清の添加、並びに線維芽細胞及び/又はMSCを含有する溶液の血清への添加を含む。いくつかの実施形態において、血清は、血清の量(v/v)が約0.1%〜10%、例えば約1〜2%、1〜5%、2〜10%、2〜5%、3〜10%、3〜5%、又は5〜10%となるまで、線維芽細胞及び/又はMSCを含有する溶液に添加される。
【００８３】
有利には、本明細書のいくつかの実施形態によるゼノフリーECMを生産する工程は、ECMを含有する製品の利用者における有害な免疫反応のリスクを低減することができる。そのような製品は、規制当局の審査の簡素化等の利点を更に享受することができる。いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び/又はMSCは、動物成分を使用して以前に増殖された細胞株のヒト多能性細胞(例えばiPSC)に由来する。いくつかの実施形態において、多能性細胞は単一のドナー由来である。多能性細胞は、異種成分を使用することなく拡大することができる。このようにして、大量のゼノフリー細胞が得られ得る。いくつかの実施形態によるゼノフリー多能性細胞は、次いでECM産生細胞、例えば線維芽細胞及び/又はMSCに分化させ得る。分化は、ゼノフリー多能性細胞を本明細書に記載される分化因子と接触させる工程を含んでもよい。
【００８４】
更に、いくつかの実施形態の方法、組成物、及びキットにより製造されたゼノフリーECMは、本明細書に記載される成熟ECMを含むことができる。そのため、成熟ゼノフリーECMは、いくつかの化粧品及び医療品によく適合し得る。いくつかの実施形態において、成熟ゼノフリーECMは線維性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、成熟ゼノフリーECMは、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む。いくつかの実施形態において、成熟ゼノフリーECMは、三重らせん及び/又は非還元性のガンマ型線維性コラーゲンを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、溶液は、基質1cm2あたり少なくとも約100μgのコラーゲン、例えば1cm2あたり少なくとも約100μgのコラーゲン、1cm2あたり150μgのコラーゲン、1cm2あたり200μgのコラーゲン、1cm2あたり250μgのコラーゲン、1cm2あたり300μgのコラーゲン、1cm2あたり350μgのコラーゲン、1cm2あたり400μgのコラーゲン、1cm2あたり450μgのコラーゲン、1cm2あたり500μgのコラーゲン、1cm2あたり600μgのコラーゲン、1cm2あたり700μgのコラーゲン、1cm2あたり800μgのコラーゲン、1cm2あたり900μgのコラーゲン、又は1cm2あたり1000μgのコラーゲン(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)を含む。いくつかの実施形態において、溶液は、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、製造された成熟ゼノフリーECMは、基質1cm2あたり少なくとも約100μgのコラーゲン、例えば1cm2あたり少なくとも約100μgのコラーゲン、1cm2あたり150μgのコラーゲン、1cm2あたり200μgのコラーゲン、1cm2あたり250μgのコラーゲン、1cm2あたり300μgのコラーゲン、1cm2あたり350μgのコラーゲン、1cm2あたり400μgのコラーゲン、1cm2あたり450μgのコラーゲン、1cm2あたり500μgのコラーゲン、1cm2あたり600μgのコラーゲン、1cm2あたり700μgのコラーゲン、1cm2あたり800μgのコラーゲン、1cm2あたり900μgのコラーゲン、又は1cm2あたり1000μgのコラーゲン(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)を含む。いくつかの実施形態において、製造された成熟ゼノフリーECMは、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、方法は、溶液中の成熟ECMの量を検出する工程を含む。いくつかの実施形態において、検出は、本明細書に記載される成熟ECMの1つ又は複数の成分の存在、非存在、及び又はレベルを検出するのにELISAを使用して行われる。
【００８８】
いくつかの実施形態は、上記の方法のいずれか1つに従って生産された線維芽細胞又はMSC及び可溶性成熟ECMを含む溶液を含む。溶液はゼノフリーであってもよく、可溶性成熟ECMは架橋コラーゲンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、溶液は線維芽細胞を含むが、MSCを含まない。いくつかの実施形態において、線維芽細胞又はMSCは溶液中の基質上にあり、溶液は基質1cm2あたり少なくとも約100μgのコラーゲン、例えば1cm2あたり少なくとも約100μgのコラーゲン、1cm2あたり150μgのコラーゲン、1cm2あたり200μgのコラーゲン、1cm2あたり250μgのコラーゲン、1cm2あたり300μgのコラーゲン、1cm2あたり350μgのコラーゲン、1cm2あたり400μgのコラーゲン、1cm2あたり450μgのコラーゲン、1cm2あたり500μgのコラーゲン、1cm2あたり600μgのコラーゲン、1cm2あたり700μgのコラーゲン、1cm2あたり800μgのコラーゲン、1cm2あたり900μgのコラーゲン、又は1cm2あたり1000μgのコラーゲン(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)を含む。いくつかの実施形態において、溶液は、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む。
【００８９】
本明細書のいくつかの実施形態による記載された期間ECMを生産する工程は、従来の方法より多量の成熟ECMを生産することができる。例えば、本明細書のいくつかの実施形態による、可溶性ECMを含む使用済み培地を採取する前に細胞を約8〜12週間培養する工程は、従来の方法より多くのECMを生産することができる。一方、いくつかの従来の方法による低酸素条件下の胚性様ECMの生産は、全体としてより少ない、及び必ずしもいずれの成熟ECMも含まないECMをもたらす可能性がある。特定の方法によって生産されたECMの量は、例えば、対象の細胞培養物によって生産されたECMと成体組織由来I型コラーゲンを比較するSDS-PAGEゲルによって測定することができる。
【００９０】
血清の漸次除去を含むECMの製造
いくつかの実施形態は、細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法を含む。方法は、非ゼロ濃度の血清を含む培地で線維芽細胞を提供する工程を含んでもよい。方法は、培地が5%以下、例えば、5%以下、4%、3%、2%、又は1%の血清濃度を含有するまで、線維芽細胞を含む培地で血清の量を徐々に低減する工程を含んでもよい。血清のこの漸次低減は、本明細書において「血清離脱」と呼ばれることもある。血清の漸次低減後、方法は、線維芽細胞を少なくとも約1週間(例えば少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12週間(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む))培養し、それによって線維芽細胞が可溶性ECMを産生する工程を含んでもよい。故に、方法は、線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を生産することができる。方法は、可溶性ECMを線維芽細胞から単離し、故にECMを製造する工程を更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、方法は、血清離脱が始まったら細胞拡大をほとんど含まない又は含まない。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量は、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも約0.7倍である。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量は、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも約0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍、又は1.2倍(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)である。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量は、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも約0.9倍である。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量は、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の約0.8〜1.2倍である。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程(すなわち、血清離脱)は、細胞拡大又は細胞継代培養なしで行われる。いくつかの実施形態において、血清の量を徐々に低減する工程(すなわち、血清離脱)は、細胞継代培養なしで行われる。いくつかの実施形態におい
て、血清は、血清の漸次低減によって完全に除去される(培養物又はECMにあまり影響を与えない微量を除く)。線維芽細胞が上述されているが、方法は、本明細書に記載されたECM産生細胞を用いて行うこともできると明確に考えられることが留意される。いくつかの実施形態において、ECMを線維芽細胞から単離する工程は、ECMを基質又は固相から分離する工程を含む(例えば、基質若しくは固相は、線維芽細胞に直接的若しくは間接的に結合していてもよく、及び/又はECMは、線維芽細胞によって産生される過程で基質又は固相と結合していていてもよい)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、任意の基質又は固相から分離される(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)。いくつかの実施形態において、単離されたECMは、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである。
【００９１】
図3は、本明細書のいくつかの実施形態による血清離脱を含む、ECMを製造する方法を例示するフロー図である。ECMはゼノフリーであってもよい。方法において、一定の濃度の血清を含む培地で線維芽細胞が提供され得る。300。方法において、線維芽細胞を含む培地の血清の量は、培地が5%以下の血清濃度を含有するまで、徐々に低減され得る。310。方法において、線維芽細胞は少なくとも約2週間(例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、7、又は8週間)培養することができ、これにより線維芽細胞が可溶性ECMを産生し、それによって線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を生産することができる。320。方法において、可溶性ECMは、線維芽細胞から単離され、それによってECMを製造することができる。330。
【００９２】
本明細書で使用される場合、培地の血清の量を徐々に低減する工程は、数日、例えば少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30日(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば約1〜30日、1〜20日、1〜14日、1〜10日、1〜7日、1〜5日、1〜30日、2〜20日、2〜14日、2〜10日、2〜7日、2〜5日、3〜20日、3〜14日、3〜10日、3〜7日、3〜5日、5〜20日、5〜14日、5〜10日、5〜7日、7〜20日、7〜14日、7〜10日、10〜20日、又は10〜14日を含む)間にわたって起こり得る。いくつかの実施形態において、血清は、少なくとも約5日間徐々に低減される。血清の漸次低減は、血清含有培地の除去、及び血清フリー培地との交換を伴い得る。血清含有培地の一部と血清フリー培地との交換を複数回行うことにより、血清は効果的に排除されるまで(すなわち、細胞培養又はECMにあまり影響を与えないわずか微量の血清が残留するように)、徐々に低減され得る。
【００９３】
驚くべきことに、本明細書のいくつかの実施形態により記載されるように、血清が完全に(又はほぼ完全に)除去されるまで血清を徐々に除去することにより、細胞周期を停止する(すなわち、G0期に入る)ようにECM産生細胞の大部分を誘導し、及び実質的にECMを分解することなく又はアポトーシスを誘導することなく可溶性成熟ECMを生産することができる。したがって、いくつかの実施形態において、血清の漸次低減後、可溶性のインタクトで成熟したECMが生産される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、血清の漸次低減後、溶液中の線維芽細胞の少なくとも約70%、例えば少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば70〜99%、70〜95%、70〜90%、80〜99%、80〜95%、80〜90%、85〜99%、85〜95%、又は85〜90%を含む)がG0細胞周期段階である。いくつかの実施形態において、溶液中の線維芽細胞の少なくとも約90%がG0細胞周期段階である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、血清の漸次低減後、溶液中の線維芽細胞の約5%未満がアポトーシスを受けている。本明細書で使用される場合、アポトーシスを「受けている(undergoing)」一定の割合の細胞は、アポトーシスを示す検出可能なマーカーを示す細胞を指し、故に、アポトーシスの過程にある細胞、及びアポトーシスのプログラムを完了したばかりの細胞を含み得る。アポトーシスを受けている一定の割合の細胞は、例えばカスパーゼ切断、又はTUNEL染色の検出によって測定することができる。いくつかの実施形態において、溶液中の線維芽細胞の5%未満、例えば約4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば、0.1%〜5%、0.1%〜3%、0.1%〜1%、0.5%〜5%、0.5%〜3%、0.5%〜1%、1%〜5%、1%〜3%、又は3%〜5%を含む)がアポトーシスを受けている。いくつかの実施形態において、溶液中の線維芽細胞の約1%未満がアポトーシスを受けている。
【００９６】
本明細書のいくつかの実施形態による方法、組成物、及びキットは、大量の成熟ECMを生産し得ることが留意される。いくつかの実施形態において、顕微鏡下で見ることができる程度に大きな、ECMを含む構造が製造される。いくつかの実施形態において、溶液は可溶性ECMを含むナノ構造を含み、ナノ構造は、少なくとも200nm、及び最大10,000nm、例えば少なくとも200nm、300nm、400nm、500nm、1000nm、2000nm、5000nm、又はそれ以上の最大直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ構造は、200nm〜10,000nmの最大直径を有する。これらの大きな直径を考えると、ECMを含む構造はフィルターを容易に詰まらせ、回収されたECMの相当な喪失を引き起こし得ることから、特定のフィルターを通じた濾過はうまくいきそうにないことが留意される。そのため、いくつかの実施形態において、ECMを製造、精製及び/又は単離する工程は、濾過を含まない精製を含む。いくつかの実施形態において、ECMを製造する工程は、滅菌濾過を含まない精製を含む。いくつかの実施形態において、ECMを製造する工程は、0.1μM濾過を含まない精製を含む。いくつかの実施形態において、0.1μΜ濾過等の濾過(又は滅菌濾過)の回避は、回収される成熟ECMの収量を実質的に増加させることができる。いくつかの実施形態において、ECMを線維芽細胞から単離する工程は、ECMを含む滅菌濾過溶液なしで行われる。いくつかの実施形態において、ECMを製造する工程は、滅菌濾過溶液なしで行われる。
【００９７】
いくつかの実施形態は、線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を含み、溶液中の線維芽細胞の少なくとも約90%はG0細胞周期段階であり、溶液中の線維芽細胞の1%未満はアポトーシスを受けている。溶液は、可溶性ECMを含むナノ構造を含み得る。ナノ構造は、200nm〜10,000nmの最大直径を有し得る。いくつかの実施形態において、溶液中の血清の含量(v/v)は、0.1%未満、例えば、0.1%未満、0.05%未満、0.01%未満、0.005%未満、又は0.001%未満(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば、0.1%〜0.001%の血清含量を含む)である。いくつかの実施形態において溶液は、血清がない(本明細書で使用される場合、血清が「ない(free)」溶液は、ECM産生の細胞培養物にあまり影響を与えないわずかな量の血清を場合により含有し得る)。いくつかの実施形態において溶液は、上記の方法のいずれかに従って製造される。
【００９８】
追加の実施形態
いくつかの実施形態はまた、化粧用途及び治療的用途のヒトECM及びECMを含有する製品の製造及び流通のためのシステム及び方法も含む。いくつかの実施形態において、方法及びシステムは、1)マイクロキャリアからの干渉なしにヒトECMを回収し更に処理するのに十分な、デキストランマイクロキャリアの大部分の低コストで効率的な除去、2)ゼノフリー製品のマーケティング及び商業的実施のための所望の特徴(そのような所望の特徴を製造者及び利用者に伝える方法及びシステムを含む)、並びに3)単一の製造ロットからの可溶性及び非可溶性画分の両方から製品を作る効率性(製品を製造するのにこれらの画分の一方を使用するのみより資源効率的であり得る)という製造及び流通の効率性を提供する。そのため、本明細書のいくつかの実施形態による方法及びシステムは、ECM及びECM含有製品の製造において効率性を提供することができる。
【００９９】
追加のオプションは以下に記載される:
1.細胞外マトリクスを製造する方法であって、
人工多能性幹細胞(iPSC)を産生線維芽細胞に分化させる工程と、
産生線維芽細胞を培養し、それにより産生線維芽細胞が細胞外マトリクス(ECM)を産生する工程と、
産生線維芽細胞からECMを単離し、それによってECMを製造する工程と
を含む方法。
2.iPSCを産生線維芽細胞に分化させる前に、前駆線維芽細胞を脱分化させてiPSCを形成する工程を更に含む、オプション1の方法。
3.前記分化の前にiPSCを拡大する工程を更に含む、オプション1〜2のいずれか1つの方法。
4.前記分化の前にiPSCバンクを構築する工程を更に含む、オプション2〜3のいずれか1つの方法。
5.分化させるiPSCが単一のドナーのみに由来する、オプション1の方法。
6.産生線維芽細胞を培養する工程が正常酸素中である、オプション1〜5のいずれか1つの方法。
7.産生線維芽細胞を培養する工程が、間葉系幹細胞(MSC)を培養する工程を含まない、オプション1〜6のいずれか1つの方法。
8.前駆線維芽細胞が成体皮膚(生検)線維芽細胞を含む、オプション1〜7のいずれか1つの方法。
9.ECMを単離する工程が、ECMを精製し、それによって少なくとも約80w/w%ECMである組成物を製造する工程を含む、オプション1〜8のいずれか1つの方法。
10.ECMを精製する工程が、
酸性緩衝液中でECMを洗浄する工程と、
産生線維芽細胞及びECMを含む溶液をデキストラナーゼと接触させる工程と
を含む、オプション9の方法。
11.ECMがコラーゲンを含む、オプション1〜10のいずれか1つの方法。
12.ECMの約90% (w/w/)がCOL1であり、並びに約10%がCOL3、COL4、COL5、COL6、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、オプション11の方法。
13.前駆線維芽細胞を脱分化因子と更に接触させ、それによって前駆線維芽細胞をiPSCに脱分化させる、オプション2〜12のいずれか1つの方法。
14.iPSCが、Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Klfファミリーメンバーをコードするウイルス挿入がない、オプション1〜13のいずれか1つの方法。
15.iPSCがフットプリントフリーである、オプション1〜13のいずれか1つの方法。
16.方法が、胚性幹(ES)細胞、骨髄多能性幹細胞、ES由来MSC、又は非多能性新生児包皮線維芽細胞細胞株のいずれも含まない、オプション1〜15のいずれか1つの方法。
17.ECMが、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む、オプション1〜16のいずれか1つの方法。
18.産生線維芽細胞が成熟コラーゲンを産生するまで産生線維芽細胞を血清と接触させ、次いで、血清濃度の少なくとも95%の低減があるまで血清の量を徐々に低減する工程を更に含む、オプション1〜17のいずれか1つの方法。
19.漸次低減が少なくとも約5日間にわたる、オプション18の方法。
20.ECMを製造するためのキットであって、
ヒト線維芽細胞を含む組成物と、
脱分化因子と、
線維芽細胞分化因子と
を含むキット。
21.組成物の線維芽細胞の全てが単一のドナー由来である、オプション20のキット。
22.デキストランマイクロキャリア等の基質を更に含む、オプション20〜21のいずれか1つのキット。
23.デキストラナーゼ及びDNAaseを更に含む、オプション22のキット。
24.細胞外マトリクスがオプション1〜14のいずれか1つの方法により製造される、少なくとも80% (w/w)の細胞外マトリクスを含む組成物。
25.成熟細胞外マトリクスを産生しているiPSC由来線維芽細胞と、
脱分化因子と
を含み、組成物の少なくとも50%(w/w)がECMを含む細胞培養物。
26.細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法であって、
維芽細胞及び/又はMSCが少なくとも2表面で3次元形状を規定し、並びに線維芽細胞及び/又はMSCの少なくとも80%がその細胞周期を停止するまで、少なくとも2つの表面を含む基質で前記線維芽細胞及び/又は間葉系幹細胞(MSC)を培養する工程であって、前記培養が線血清フリー及びゼノフリーである工程と、
その後、線維芽細胞及び/又はMSCを血清と少なくとも約2週間接触させ、それにより線維芽細胞及び/又はMSCが可溶性成熟ECMを産生し、それによって可溶性成熟ECM及び線維芽細胞又はMSCを含む、ゼノフリーである溶液を生産する工程と、
産生線維芽細胞から可溶性成熟ECMを単離し、それによって、成熟ゼノフリーECMであるECMを製造する工程と
を含む方法。
27.ヒト多能性細胞培養物を拡大し、前記拡大は血清フリー及びゼノフリーであり、それによってヒト多能性細胞を生産する工程と、
ヒト多能性細胞を分化因子と接触させ、それによりヒト多能性細胞が線維芽細胞又はMSCに分化させる工程と
を更に含む、オプション26の方法。
28.線維芽細胞及び/又はMSCと血清との前記接触が約2週間〜約8週間である、オプション26〜27のいずれか1つの方法。
29.線維芽細胞及び/又はMSCと血清との前記接触が少なくとも約8週間である、オプション26〜27のいずれか1つの方法。
30.前記ヒト多能性細胞が人工多能性幹細胞(iPSCS)を含む、オプション27〜29のいずれか1つの方法。
31.前記iPSCSがフットプリントフリーである、オプション30の方法。
32.前記iPSCSが単一のドナー由来である、オプション30〜31のいずれか1つの方法。
33.成熟ゼノフリーECMを含む化粧用組成物を製造する工程を更に含む、オプション26〜32のいずれか1つの方法。
34.血清と接触させる少なくとも2週間の間、線維芽細胞又はMSCをアスコルビン酸と接触させる工程を更に含む、オプション26〜33のいずれか1つの方法。
35.少なくとも2表面の前記線維芽細胞又はMSCが3次元形状を規定し、及び線維芽細胞又はMSCの少なくとも70%がその停細胞周期を停止する前に、前記線維芽細胞又はMSCが血清と接触されない、オプション26〜34のいずれか1つの方法。
36.血清の量が約0.1%〜10% (v/v)である、オプション26〜35のいずれか1つの方法。
37.血清の量が約1〜2% (v/v)である、オプション26〜36のいずれか1つの方法。
38.血清が、臨床グレードの仔ウシ血清、プールされたヒト血清、又はその組み合わせを含む、オプション26〜37のいずれか1つの方法。
39.ヒト多能性細胞が、動物成分を使用して以前に増殖されている細胞株である、オプション26〜38のいずれか1つの方法。
40.成熟ゼノフリーECMが線維性コラーゲンを含む、オプション26〜39のいずれか1つの方法。
41.成熟ゼノフリーECMが、COL1のc末端プロペプチド、又は三重らせん若しくは非還元性のガンマ型線維性コラーゲン、又は両方を含む、オプション40の方法。
42.溶液が、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む、オプション26〜41のいずれか1つの方法。
43.製造された成熟ゼノフリーECMが、基質1cm2あたり少なくとも250μgのコラーゲンを含む、オプション26〜42のいずれか1つの方法。
44.多能性細胞が単一のドナー由来である、オプション27〜43のいずれか1つの方法。
45.溶液中の成熟ECMの量を検出する工程を更に含む、オプション26〜44のいずれか1つの方法。
46.一定量の使用済み培養培地を溶液から採取し、可溶性成熟ECMを使用済み培養培地から単離する工程を更に含む、オプション26〜45のいずれか1つの方法。
47.溶液がゼノフリーであり、及び可溶性成熟ECMが架橋コラーゲンを含む、線維芽細胞又はMSC、及びオプション26〜45のいずれか1つに従って産生された前記可溶性成熟ECMを含む溶液。
48.細胞外マトリクス(ECM)を製造する方法であって、
一定の濃度の血清を含む培地で線維芽細胞を提供する工程と、
培地が5%以下の血清濃度を含有するまで、線維芽細胞を含む培地の血清の量を徐々に低減する工程と、
前記徐々に低減する工程後、線維芽細胞を少なくとも約2週間培養し、これにより線維芽細胞が可溶性ECMを産生し、それによって線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液を生産する工程と、
可溶性ECMを線維芽細胞から単離し、それによってECMを製造する工程と
を含む方法。
49.血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量が、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも0.7倍である、オプション48の方法。
50.血清の量を徐々に低減する工程の開始時の培地中の線維芽細胞の量が、培地が5%以下の血清中濃度を含有する場合の培地中の線維芽細胞の量の少なくとも0.9倍である、オプション49の方法。
51.血清の量を徐々に低減する工程が、細胞拡大又は細胞継代培養なしで行われる、オプション48〜50のいずれか1つの方法。
52.血清が少なくとも約5日間徐々に低減される、オプション48〜51のいずれか1つの方法。
53.溶液中の線維芽細胞の少なくとも約90%がG0細胞周期段階である、オプション48〜52のいずれか1つの方法。
54.溶液中の線維芽細胞の1%未満がアポトーシスを受けている、オプション48〜53のいずれか1つの方法。
55.溶液が、可溶性ECMを含むナノ構造であって、200nm〜10,000nmの最大直径を有するナノ構造を含む、オプション48〜54のいずれか1つの方法。
56.ECMを製造する工程が、滅菌濾過することなく行われる(ナノ構造を排除しないように)、オプション48〜55のいずれか1つの方法。
57.可溶性ECMを線維芽細胞から単離する工程が、滅菌濾過することなく行われる、オプション48〜56のいずれか1つの方法。
58.溶液中の線維芽細胞の少なくとも約90%がG0細胞周期段階であり、溶液中の線維芽細胞の1%未満がアポトーシスを受けており、及び溶液が、可溶性ECMを含むナノ構造であって、200nm〜10,000nmの最大直径を有するナノ構造を含む、線維芽細胞及び可溶性ECMを含む溶液。
59.可溶性ECMが、オプション48〜57のいずれか1つの方法により製造される、オプション58の溶液。
60.ECMを線維芽細胞(産生線維芽細胞等の)から単離する工程が、ECMを基質又は固相から分離する工程を含む、オプション1〜19、26〜47、又は48〜57のいずれか1つの方法。
61.線維芽細胞(産生線維芽細胞等の)からの単離時に、ECMが任意の基質又は固相から分離される(例えば、任意の基質又は固相に結合していない)、オプション1〜19、26〜47、48〜57、又は60のいずれか1つの方法。
62.線維芽細胞(産生線維芽細胞等の)からの単離時に、単離されたECMが、いかなるプロテアーゼによっても消化されておらず、それ故にインタクトである、オプション1〜19、26〜47、48〜57、又は60〜61のいずれか1つの方法。
63.少なくとも10リットルの産生線維芽細胞、例えば、少なくとも10、20、30、40、50、10、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、又は1000リットルの産生線維芽細胞培養物(列挙された値のいずれか2つの間の範囲、例えば10〜1000リットル、10〜500リットル、10〜200リットル、50〜1000リットル、50〜500リットル、50〜200リットル、100〜1000リットル、100〜500リットル、又は100〜200リットルを含む)が培養される、オプション1〜19、26〜47、又は60〜62のいずれか1つの方法。
64.ECMを産生する少なくとも10リットルの線維芽細胞が培養される、オプション48〜57、又は60〜62のいずれか1つの方法。
65.少なくとも50gのECM、例えば少なくとも50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、又は5000gのECM(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)が生産される、オプション1〜19、26〜47、又は60〜64のいずれか1つの方法。
66.少なくとも50gの可溶性ECM、例えば少なくとも50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、又は5000gの可溶性ECM(列挙された値のいずれか2つの間の範囲を含む)が生産される、オプション48〜57、又は60〜64のいずれか1つの方法。
【実施例】
【０１００】
(実施例1)
ヒト線維芽細胞を単一のドナーの皮膚生検から得る。線維芽細胞をフットプリントフリーiPSCに誘導するために、Oct4、Sox2、及びc-Myc mRNAと線維芽細胞を接触させる。フットプリントフリーiPSCを30倍から拡大し、iPSCをバンク化する。商業規模の量のiPSC細胞が線維芽細胞に分化するように誘導するために、結合組織増殖因子(CTGF)と商業規模の量のiPSCを接触させる。線維芽細胞を、デキストランマイクロキャリア基質を含む培地で培養し、次に成熟ECMの生産に移る。ECMは培養下で不溶性である。デキストランマイクロキャリアを、デキストラナーゼを使用して消化する。成熟ECMを含む残りの不溶性画分を回収する。そのため、成熟ECMを含む培養物の不溶性画分を、線維芽細胞及び可溶性成分から単離する。故に、成熟ECMが製造され、成熟ECMは医療品及び化粧品における使用に適している。
【０１０１】
(実施例2)
小分子カクテル「VC6TF」(V、VPA; C、CHIR99021又はCHIR; 6、616452; T、トラニルシプロミン; F、フォルスコリン)を使用して、ヒト線維芽細胞をフットプリントフリーiPSCに化学的に脱分化させる。iPSCを商業的生産規模まで拡大し、液体窒素極低温冷凍でバンク化する。商業的量のiPSCを回収し、CTGFを使用して線維芽細胞に分化させる。線維芽細胞を、デキストランマイクロキャリア基質を含む血清フリー、ゼノフリー培地で培養する。線維芽細胞が基質の2つ以上の表面で十分な密度に達すると、線維芽細胞の約90%は細胞周期のG0期に入る。この時点で、期限切れ血液からプールされたヒト血清を、2%の血清の濃度(v/v)まで線維芽細胞培養物に添加する。アスコルビン酸を血清と一緒に培養物に添加する。細胞を更に8週間血清中で培養し、細胞は成熟ECMを産生する。成熟ECMを細胞培養物から単離し、その後、化粧品を製造するのに使用する。
【０１０２】
(実施例3)
実施例1に記載したように、ヒト線維芽細胞を単一のドナーヒトiPSCから得る。線維芽細胞を2%のウシ胎児血清で培養し、線維芽細胞は成熟ECMを産生する。10日間毎日、血清含有培地の半分を血清フリー培地と交換する。そのため、交換の10日後、2%の血清は210倍に低減しており、その結果、培養物は0.002%未満の血清を含有すると推定される。漸次血清交換の完了後、線維芽細胞を培地(推定値0.002%未満の血清を含有する)で6週間培養する。可溶性ECMを使用済み培地から回収する。更に、ECMを含む大きな構造(直径200nm〜10,000nm)が培地に存在するため、滅菌濾過せずにECMの単離を行う。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、方法、使用、又は組成物は、単一の工程又は特徴として存在する(複数の工程又は特徴とは対照的に)様々な工程又は特徴を含む。例えば、1つの実施形態において、方法はフローモジュレーターの単回投与を含み、又は組成物は単回使用のためのフローモジュレーター(flow modulator)を含む、又はから本質的になる。フローモジュレーターは、流れを増加させる(又は免疫細胞遊走を減少させる)のに有効な単回投与単位で存在し得る。組成物又は使用は、本明細書に記載されるように、流れを増加させる(又は免疫細胞の遊走を阻害する)のに有効なフローモジュレーターの単回投与単位を含み得る。複数の特徴又は成分は、代替の実施形態において提供される。いくつかの実施形態において、方法、組成物、又は使用は、フロー調節のための1つ又は複数の手段を含む。いくつかの実施形態において、手段はフローモジュレーターを含む。
【０１０４】
様々な態様及び実施形態が本明細書で開示されてきたが、他の態様及び実施形態が当業者には明らかであろう。本明細書に開示された様々な態様及び実施形態は例示の目的であり、限定することを意図するものではなく、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。本明細書に記載された各方法に関して、方法において使用するための関連する組成物が明確に考えられ、方法における組成物の使用、及び該当する場合、方法において使用するための医薬品を作る方法も明確に考えられる。例えば、フローモジュレーターを含む流れを増加させる方法に関して、方法による流れを増加させる上でのフローモジュレーターの使用と同じように、流れを増加させる上で使用するフローモジュレーターを含む医薬品を作る方法と同じように、対応する方法において使用するためのフローモジュレーターもまた考えられる。
【０１０５】
当業者は、本明細書に開示されたこの及び他のプロセス及び方法に関して、プロセス及び方法で行われる機能が、異なる順序で実施され得ることを理解するであろう。更に、概説された工程及び操作は例として提供されるのみであり、工程及び操作のいくつかは任意選択であってもよく、開示された実施形態の本質を損なうことなくより少ない工程及び操作にまとめられてもよく、又は追加の工程及び操作に拡大されてもよい。
【０１０６】
本明細書における実質的に任意の複数形及び/又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び/又は用途に適するように複数形から単数形及び/又は単数形から複数形に変換することができる。様々な単数形/複数形の並べ替えが、わかりやすくするために本明細書に明確に記載され得る。
【０１０７】
一般に、本明細書において、及び特に添付の特許請求の範囲(例えば、添付の特許請求の範囲の本体部)で使用される用語は、一般的に「オープン」用語として意図される(例えば、用語「含む(including)」は、「含むが限定されない(including but not limited to)」と解釈されるべきであり、用語「有する(having)」は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む(include)」は、「含むが限定されない(includes but is not limited to)」と解釈されるべきである等)ことが当業者に理解されるであろう。導入される請求項の記載事項の具体的な数が意図されるならば、そのような意図は請求項に明示的に記載され、そのような記載がなければそのような意図は存在しないことが当業者に更に理解されるであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載事項を導入するための導入句「少なくとも1つ」及び「1つ又は複数の」の使用を含有することがある。しかし、そのような句の使用は、同じ請求項が導入句「1つ又は複数の」又は「少なくとも1つ」及び「a」若しくは「an」等の不定冠詞を含むとしても、不定冠詞「a」又は「an」による請求項の記載事項の導入が、そのような導入される請求項の記載事項を含有する任意の特定の請求項を、そのような記載事項を1つしか含有しない実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきでない(例えば、「a」及び/又は「an」は、「少なくとも1つ」又は「1つ又は複数の」を意味すると解釈されるべきである)。同じことが、請求項の記載事項を導入するのに使用される定冠詞の使用にも当てはまる。更に、導入される請求項の記載事項の具体的な数が明示的に記載されているとしても、そのような記載事項は、少なくとも記載されている数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は認識するであろう(例えば、他の修飾語句がない「2つの記載事項」という最小限の記載事項は、少なくとも2つの記載事項、又は2つ以上の記載事項を意味する)。更に、「A、B、及びC等の少なくとも1つ」に類似する伝統的表現法が使用される例では、一般にそのような構文は、当業者が伝統的表現法を理解する意味で意図される(例えば、「A、B、及びCの少なくとも1つを有するシ
ステム」は、Aだけ、Bだけ、Cだけ、A及びBを一緒に、A及びCを一緒に、B及びCを一緒に、並びに/又はA、B、及びCを一緒に、等を有するシステムを含むが、これらに限定されない)。「A、B、又はCの少なくとも1つ等」に類似する伝統的表現法が使用される例では、一般にそのような構文は、当業者が伝統的表現法を理解する意味で意図される(例えば、「A、B、又はCの少なくとも1つを有するシステム」は、Aだけ、Bだけ、Cだけ、A及びBを一緒に、A及びCを一緒に、B及びCを一緒に、並びに/又はA、B、及びCを一緒に、等を有するシステムを含むが、これらに限定されない)。2つ以上の代替用語を表す実質的に任意の選言的な語及び/又は句は、明細書、特許請求の範囲、又は図面中にあろうと、用語、用語のどちらか一方、又は両方の用語の1つを含む可能性を企図すると理解されるべきことが当業者に更に理解されるであろう。例えば、句「A又はB」は、「A」若しくは「B」又は「A及びB」の可能性を含むと理解されるであろう。
【０１０８】
更に、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、本開示はそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーの下位群に関しても記載されることを当業者は認識するであろう。
【０１０９】
当業者に理解されるように、ありとあらゆる目的のために、例えば文字による説明の提供に関して、本明細書に開示された全ての範囲は、ありとあらゆる可能性のある部分範囲及びその部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、少なくとも2等分、3等分、4等分、5等分、6等分等に分割されている同じ範囲を十分に記載し、及び可能にしていると容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下部3分の1、中部3分の1、及び上部3分の1等に容易に分割することができる。また、当業者に理解されるように、「最大」、「少なくとも」等などの全ての言葉は記載された数を含み、上記に論じられている部分範囲にその後分割され得る範囲を指す。例えば、「約5」は、数字の5を含むものとする。最後に、当業者に理解されるように、範囲は1つ1つの数字を含む。故に、例えば、1〜3個の細胞を有する群は、1、2、又は3個の細胞を有する群を指す。同様に、1〜5個の細胞を有する群は、1、2、3、4、又は5個の細胞等を有する群を指す。「約(approximately)」、「約(about)」、及び「実質的に」等の用語が先行する数字は、本明細書で使用される場合、記載された数字を含み(例えば、約10%=10%)、また、依然として所望の機能を果たし、又は所望の結果を達成する述べられた量に近い量も表す。例えば、用語「約(approximately)」、「約(about)」、及び「実質的に」は、述べられた量の10%未満、5%未満、1%未満、0.1%未満、及び0.01%未満である量を指し得る。
【０１１０】
前述のことから、本開示の様々な実施形態が、例示の目的で本明細書に記載されていること、並びに本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、本明細書に開示された様々な実施形態は、限定することを意図するものではなく、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
2020529220.tif 000020
【図３】
2020529220.tif 000021
【配列表】
2020529220000001.app
【国際調査報告】
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2020529220.tif 000023
2020529220.tif 000024
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