(57)【要約】  本発明は、抗ヒト卵胞刺激ホルモン受容体抗体に関する。本発明は、また、癌治療における抗ヒト卵胞刺激ホルモン受容体抗体の使用に関する。本発明は、また、癌細胞の検出方法及び癌診断の方法に関する。本発明は、治療的及び診断的医療技術分野における応用を見つける。
2020513817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−アミノ酸配列ＸａＸｂＸｃＸｄＸｅ（配列番号１６）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１であって、ＸａはＱ、Ｒ又はＫであり、ＸｂはＦ、Ｑ、Ｓ又はＹであり、ＸｃはＹ又はＷであり、ＸｄはＶ、Ｌ、Ｉ又はＴであり、ＸｅはＧ、Ｉ、Ｌ、Ｑ又はＴであり、
−アミノ酸配列ＥＩＸｆＰＸｇＸｈＸｉＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２であって、ＸｆはＦ、Ｌ又はＹであり、ＸｇはＲ又はＱ、Ｘｈ  Ｔ又はＮ及びＸｉ  Ｇ又はＱであり、
−アミノ酸配列ＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３、
−アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、
−アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）２、並びに
−アミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）３、
を含む群の少なくとも１つを含むヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＱＦＹＶＧ（配列番号１）、ＲＱＷＶＩ（配列番号２）、ＫＱＷＬＬ（配列番号３）、ＲＳＷＩＬ（配列番号４）及びＫＹＷＴＱ（配列番号５）から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列がＥＩＦＰＲＴＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６）、ＥＩＬＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号７）、ＥＩＦＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）、ＥＩＹＰＱＮＱＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号９）及びＥＩＹＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１０）から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＱＦＹＶＧ（配列番号１）であり、前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列がＥＩＦＰＲＴＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＲＱＷＶＩ（配列番号２）であり、前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列がＥＩＬＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号７）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＫＱＷＬＬ（配列番号３）であり、前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列がＥＩＦＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＲＳＷＩＬ（配列番号４）であり、前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列がＥＩＹＰＱＮＱＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号９）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＫＹＷＴＱ（配列番号５）であり、前記可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＥＩＹＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１０）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
前記重鎖の配列が
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＱＦＹＶＧＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＴＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１７）、
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＲＱＷＶＩＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１８）、
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＫＱＷＬＬＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１９）、
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＲＳＷＩＬＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＱＮＱＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２０）及び
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＫＹＷＴＱＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２１）を含む群から選択されるペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって生成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む、医薬組成物及び薬学的に許容される担体。
【請求項１２】
医薬品として使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１３】
癌治療における、請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合部分の使用。
【請求項１４】
試料中の癌細胞を検出するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸又は請求項１６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
ＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の宿主細胞を培養し、その細胞培養物から抗体又はその抗原結合部分を回収することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分を生成する方法。
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの診断又は撮像方法に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ヒト卵胞刺激ホルモン受容体抗体に関する。本発明は、また、癌治療における抗ヒト卵胞刺激ホルモン受容体抗体の使用に関する。
【０００２】
本発明は、また、癌細胞の検出方法及び癌診断の方法に関する。
【０００３】
本発明は、治療的及び診断的医療技術分野における応用を見つける。
【０００４】
以下の記述において、四角形のかぎ括弧（［］）で挟まれた参考文献は、テキストの最後に提供する参考文献のリストを指す。
【背景技術】
【０００５】
癌は西側世界で最も多い悪性腫瘍であり、２番目に多い死因であり続けている。癌治療及び癌死亡率の減少を達成するためには早期発見が欠かせない。
【０００６】
癌の分子的理解を改善することで、診断的及び治療的介入における使用のための様々な癌細胞標的の識別につながった。しかしながら、腫瘍の異種性（表現型及び遺伝型）が腫瘍特異的診断、イメージング及び治療に現在取り組む第１の問題である［Ｍａｒｕｓｙｋ等、２０１２［１］；Ｋｅｅｒｅｗｅｅｒ等、２０１４［２］］。
【０００７】
腫瘍の異種性の問題は、腫瘍関連脈管構造を標的にすることによって減少することができる。後者の癌の偏在性成分は、腫瘍増殖及び転移の基本である［Ｆｏｌｋｍａｎ１９９０［３］］。血管形成（新しい腫瘍血管の形成）の抑制及び腫瘍コア血管の選択的排除（血管標的）は、腫瘍増殖を遮断し得る実用的方法の２つとして考えられる［Ｓｉｅｍａｎｎ等２００５［４］；Ｔｈｏｒｐｅ２００４［５］］。しかしながら、有害な腫瘍過程（すなわち間隙流体圧の増加、プロテアーゼ分泌、アシドーシス及び巣状壊死）は、腫瘍コアの血管形態に影響し、結果的に著しく欠陥のある病理学的脈管構造にする［Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｐａｌａｄｅ１９９７［６］］。腫瘍コア血管の脈管正常化及び／又は除圧は細胞傷害性治療法の送達及び有効性を改善するために必要とされる［Ｊａｉｎ２０１３［７］］。
【０００８】
現在の抗血管療法の有効性は、また、薬が腫瘍塊の周辺に位置する腫瘍細胞（ＴＣ）を殺傷することができないことによって、実質的に損なわれ［Ｎｅｒｉ  ａｎｄ  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ２００５［８］］、ＴＣは影響を受けていない腫瘍周囲血管から酸素及び栄養を得る。
【０００９】
これら全ての治療法は、全ての異なる癌を効率的に治療することができず、癌の高い多様性によって様々な有効性を有することができないため、改善しなければならない。
【００１０】
したがって、より多様な癌をより効率的に及び／又は効果的に治療することができる方法及び／又は化合物を見つける真の必要性がある。特に、癌治療の新しい戦略、すなわち新しい標的／経路を見つける真の必要性がある。
【００１１】
腫瘍周囲血管の管腔側に暴露されている特定の内皮細胞タンパク質の存在は、薬のマーカー特異的送達の機会を提供するはずである。例えば、ＦＳＨＲは、検査される全腫瘍グレード及びステージについて分析された全ての腫瘍タイプに発現する［Ｒａｄｕ等２０１０［９］］。ＦＳＨＲは、腫瘍の周辺の腫瘍内皮細胞（ＥＣ）に存在し［Ｒａｄｕ等２０
１０［９］；Ｒｅｎｎｅｒ等２０１３［１０］；Ｓｉｒａｊ等２０１３［１１］；Ｐｌａｎｅｉｘ等２０１５［１２］］、正常な組織には存在しない。マウス腫瘍モデルは、ＦＳＨＲが腫瘍のＥＣの管腔側に存在し、特に循環に送達されるリガンドを内部移行することができることを示した［Ｒａｄｕ等２０１０［９］］。ＦＳＨＲは腫瘍周囲血管の共通のマーカーであるため、原理的に、単一の治療薬が広範囲の腫瘍タイプに適用可能なはずである。
【００１２】
卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）は、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）結合受容体である。健康なヒトでは、ＦＳＨＲは、標的細胞（精巣のセルトリ細胞及び卵巣の顆粒膜細胞）にのみ膜糖タンパク質として発現する。ＦＳＨＲは、受容体のほぼ半分を示す大きなグリコシル化細胞外ドメインを有する。細胞外ドメインは、ホルモン結合に関与し、ＦＳＨＲ遺伝子の最初の９つのエキソンによってコードされる。最後のエキソンであるエキソン１０は、膜貫通及び細胞内領域の両方をコードする［Ｇｒｏｍｏｌｌ等１９９４［１３］。
【００１３】
これらの所見の観点から、ＦＳＨＲに対するマウス、ウサギ及びヤギモノクローナル抗体が発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍細胞を検出する能力について試験をおこなった。ヒトＦＳＨＲに対して生じたいくつかの抗体は市場で入手することができるが、それらの多くは特異性が低い［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、２０１３［１４］。特異的ＦＳＨＲ３２３モノクローナル抗体は、ＦＳＨＲの細胞外ドメインを認識する［Ｖａｎｎｉｅｒ等１９９６［１５］。しかしながら、周知の化合物、例えば、抗体は、低い特異性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍細胞の再生可能で、信頼できる検出を提供しない。特に、非常に高い親和性抗受容体抗体だけが癌のイメージング、診断及び治療に成功することができたことは明白である［Ｙａｎｇ等１９９５［１６］。したがって、前述の化合物は低い特異性を有するため、効果的ではなく、癌細胞に関係する疾患の治療に使用することができない。したがって、治療薬及びイメージング剤を部位特異的に送達することが可能な化合物を見つける必要性が明白にある。確かに、このことは、薬剤活性を最大にし、副作用を最小にするために、医薬業界の進行中の究極的なゴールである。
【００１４】
まとめると、癌治療をより効率的に行い、及び／又はより多様な癌を効果的に治療することができる新しい方法及び／又は化合物が必要である。特に、癌治療の新しい戦略、例えば、新しい標的／経路を見つける真の必要性がある。さらに、効率的に、信頼できる方法で癌細胞を検出することができる方法及び／又は化合物を見つける必要がある。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた抗体を提供することによって、これらの必要性を満たし、前述の先行技術の欠点を克服する。
【００１６】
特に、本発明の抗体は、非常に高い親和性（ｓｕｂ−ｎＭ範囲の）抗ヒトＦＳＨＲを有する。特に、本発明の発明者は、本発明の抗体が周知の抗体より高い親和性及び特異性を有し、特に、本発明の抗体で得られた結果（ＥＣ５０）は、周知の抗体よりも７．５〜１８．２倍高いことを実証した。さらに、パラフィン包埋組織による免疫組織化学的技術について、本発明の抗体の最適濃度は、例えば、ヒトＦＳＨＲに対する周知の抗体よりも５〜２５倍低かった。
【００１７】
さらに、発明者は、免疫標識技術、例えば、免疫蛍光及び／又はイメージング剤として標識された抗体を使用する場合、本発明の抗体は、周知の／市販の抗体の最適濃度よりも例えば、３３倍低い濃度で使用する場合、ＦＳＨＲを検出し、標識することができることを実証した。言い換えれば、本発明の抗体は、周知の抗体より少なくとも３０倍低い濃度で使用することができ、少なくとも同じ結果を得ることができる。さらに、本発明の抗体
は、効率的に、信頼できる方法で、高濃度の抗体を使用せずに癌細胞を検出／標識することができる。さらに、より高濃度で使用する場合、本発明の抗体は、周知の／市販の抗体によって検出することができないＦＳＨＲを標識／検出することができる。
【００１８】
本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、
−アミノ酸配列ＸａＸｂＸｃＸｄＸｅ（配列番号１６）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１であり、ＸａはＱ、Ｒ又はＫであり、ＸｂはＦ、Ｑ、Ｓ又はＹであり、ＸｃはＹ又はＷであり、ＸｄはＶ、Ｌ、Ｉ又はＴであり、ＸｅはＧ、Ｉ、Ｌ、Ｑ又はＴであり、
−アミノ酸配列ＥＩＸｆＰＸｇＸｈＸｉＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２であり、ＸｆはＦ、Ｌ又はＹであり、ＸｇはＲ又はＱ、Ｘｈ  Ｔ又はＮ及びＸｉ  Ｇ又はＱであり、
−アミノ酸配列ＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む群の少なくとも１つを含む。
【００１９】
本発明では、「ＣＤＲ」は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の３つの超可変領域を意味し、パラトープの要素を構成し、抗原のエピトープを有する抗体の相補性を決定することを可能にする。これらの３つの超可変領域は、「フレームワーク」（ＦＲ又はフレームワーク領域）を構成し、可変領域に安定した構造を与える４つの定常領域によってフレーム化される。ＣＤＲのアミノ酸配列は抗原結合部位の形状及びイオン特性を決定するため、ＣＤＲは抗体の特異性を定める。
【００２０】
本発明では、「抗体」は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び望ましい生物活性及び機能を示す限り、抗体断片を意味する。
【００２１】
本発明では、「抗体断片」又は「抗原結合部分」は、全長抗体の部分、例えば、その抗原結合又は可変領域を意味する。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。本発明では、「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個別の抗体は、少量で存在し得る可能性として自然発生の変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定特異性を有する純粋な抗体である。
【００２２】
本発明では、「抗体その抗原結合部分」は、３つのＣＤＲを含む１つの重鎖又は１つの軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含み得る。例えば、タイトな非共有結合において、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域の二量体を含むｓｃＦｖフラグメントであり得る。
【００２３】
本発明は、また、前述のように、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、それは、さらに、
−アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、
−アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）２、並びに
−アミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む群の少なくとも１つを含む。
【００２４】
言い換えれば、本発明は、また、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分に関し、それは、
−アミノ酸配列ＸａＸｂＸｃＸｄＸｅ（配列番号１６）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補
性決定領域（ＣＤＲ）１であり、ＸａはＱ、Ｒ又はＫであり、ＸｂはＦ、Ｑ、Ｓ又はＹであり、ＸｃはＹ又はＷであり、ＸｄはＶ、Ｌ、Ｉ又はＴであり、ＸｅはＧ、Ｉ、Ｌ、Ｑ又はＴであり、
−アミノ酸配列ＥＩＸｆＰＸｇＸｈＸｉＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２であり、ＸｆはＦ、Ｌ又はＹであり、ＸｇはＲ又はＱ、Ｘｈ  Ｔ又はＮ及びＸｉ  Ｇ又はＱであり、
−アミノ酸配列ＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む群の少なくとも１つを含み、
以下の
−アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、
−アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）２、並びに
−アミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）を有する可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む群の少なくとも１つを含む。
【００２５】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列は、ＱＦＹＶＧ（配列番号１）、ＲＱＷＶＩ（配列番号２）、ＫＱＷＬＬ（配列番号３）、ＲＳＷＩＬ（配列番号４）及びＫＹＷＴＱ（配列番号５）を含む群から選択され得る。
【００２６】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列は、ＥＩＦＰＲＴＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６）、ＥＩＬＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号７）、ＥＩＦＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）、ＥＩＹＰＱＮＱＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号９）、及びＥＩＹＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１０）を含む群から選択され得る。
【００２７】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下の表１に定められる可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１及び可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列を含み得る。
【００２８】
【表１】
2020513817.tif 000003
【００２９】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の重鎖の配列は、ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＱＦＹＶＧＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＴＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１７）、ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬ
ＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＲＱＷＶＩＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１８）、ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＫＱＷＬＬＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１９）、ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＲＳＷＩＬＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＱＮＱＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２０）及びＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＫＹＷＴＱＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＮＧＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２１）を含む群から選択されるペプチドを含み得る。
【００３０】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の軽鎖の配列は、配列ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＩＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２２）のペプチドを含み得る。
【００３１】
本発明の抗体は、非常に高い親和性抗ヒトＦＳＨＲ特異性を有し、周知の抗体よりも多く有する。ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分は、より良い癌治療の有効性を提供するはずである。例えば、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分は、アデニル酸シクラーゼのＦＳＨ誘導活性、及び癌細胞の増殖に関係するＦＳＨ／ＦＳＨＲシグナル伝達経路を遮断する［Ｂｅｎ−Ｊｏｓｅｆ等１９９９［１７］；Ｍａｒｉａｎｉ等２００６［１８］］。
【００３２】
本発明では、「腫瘍」は、細胞の異常な増殖から生じる組織の異常な増殖を指す。腫瘍は、良性、前悪性、又は悪性（すなわち癌性）であってもよい。腫瘍は、原発性腫瘍又は転移性病変であってもよい。
【００３３】
本発明では、癌は、当業者に周知の癌であり得る。癌は、例えば、身体の他の部分に侵入し、又は拡散する能力を有する異常な細胞増殖を伴う疾患であり得る。癌は、例えば、ヒト又は動物の臓器又は組織の癌であり得る。癌は、例えば、肺、肝臓、目、心臓、肺、乳房、骨、骨髄、脳、頭及び首、食道、気管、胃、結腸、膵臓、子宮頸部、尿道、膀胱、前立腺、精巣、皮膚、直腸及びリンパ節を含む群から選択される癌であり得る。
【００３４】
本発明の別の対象は、抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物及び薬学的に許容される担体である。
【００３５】
抗体又はその抗原結合部分は前述に定めた通りである。
【００３６】
医薬組成物は、ヒト又は動物に投与することができる形態であり得る。当業者は、本明細書で使用される「形態」という用語が実用的使用のための医薬品の剤形を指すことを明白に理解している。例えば、医薬品は、注射剤形、経口懸濁液、ペレット、粉末、顆粒又は局所剤形（例えば、クリーム、ローション、洗眼剤）を含む群から選択される剤形であり得る。
【００３７】
薬学的に許容可能な担体は、治療対象に依存して、ヒト又は動物に対する抗体又はその抗原結合部分の投与に使用される周知の薬学的担体であり得る。医薬組成物を投与する医薬剤形又は方法は、治療を受けるヒト又は動物対象に関して、選択され得る。例えば、１歳から１７歳の年齢の子ども、又は、例えば、１歳以下の乳児については、シロップ又は注射が好ましい。例えば、重量目盛の付いたピペット、シリンジで投与され得る。例えば、１７歳以上の成人では、注射が好まれ得る。静脈内重量目盛の付いたシリンジで投与され得る。
【００３８】
本発明に従って、医薬組成物は、薬学的に許容され、有効量の抗体又はその抗原結合部分を含み得る。
【００３９】
例えば、癌の場合、治療有効量の抗体又はその抗原結合部分は、癌細胞の数を減少し、腫瘍サイズを減少し、周辺の臓器への癌細胞の浸潤を抑制し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止する）、腫瘍転移を抑制し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止する）、腫瘍増殖をある程度抑制し、及び／又は癌に関連する１つ以上の症状をある程度軽減することができる。
【００４０】
例えば、抗体又はその抗原結合部分の治療有効量は、例えば、５ｍｇ／患者のｋｇ体重未満又は等しい１日量であり得る。
【００４１】
例えば、医薬組成物は、医薬組成物の１０〜４０ｍｇ．ｍｌ−１、例えば、医薬組成物の１５〜３０ｍｇ．ｍｌ−１、例えば、医薬組成物の２０〜２７．５ｍｇ．ｍｌ−１の濃度の抗体又はその抗原結合部分を含み得る。
【００４２】
前述のように、本発明の発明者は、驚くべきことに、また、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた本発明の単離された抗体又はその抗原結合部分が、例えば、ＦＳＨＲが関与する疾患、例えば、癌、例えば、乳癌を治療することができることを実証し、最初に実証した。例えば、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分は、アデニル酸シクラーゼのＦＳＨ誘導活性、及び癌細胞の増殖に関係するＦＳＨ／ＦＳＨＲシグナル伝達経路を遮断することができる［Ｂｅｎ−Ｊｏｓｅｆ等１９９９［１７］；Ｍａｒｉａｎｉ等２００６［１８］］。
【００４３】
したがって、本発明の別の対象は、医薬品として使用するためのヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分である。ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は前述の通りである。
【００４４】
本発明に従って、医薬品はＦＳＨＲ受容体が関与し得る疾患を治療するための医薬品であり得る。例えば、本発明の医薬品は、ＦＳＨＲが関与する良性又は悪性疾患を治療するための医薬品であり得、例えば、子宮内膜症、平滑筋腫、結腸腺腫、前立腺肥大、癌、例えば、固形腫瘍及び肉腫を含む群から選択される疾患であり得る。
【００４５】
医薬品は、ヒト又は動物に投与することができる形態であり得る。医薬品は、例えば、前述の医薬組成物であり得る。
【００４６】
医薬品は、当業者に周知の方法で投与され得る。医薬品は、例えば、直接的に、すなわち純粋若しくは実質的に純粋に、又は抗体又はその抗原結合部分を薬学的に許容される担体及び／又は培地と混合した後に投与され得る。本発明に従って、医薬品は、注入可能な溶液、例えば、液体製剤、多粒子系、口内分散性剤形を含む群から選択される経口投与用の医薬品であり得る。本発明に従って、医薬品は、液体製剤、経口発泡性剤形、経口粉末
、多粒子系、口内分散性剤形を含む群から選択される経口投与用の医薬品であり得る。
【００４７】
ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は、また癌治療に有用な化合物に直接的に、又はリンカーに結合し得る。
【００４８】
本発明では、癌治療に有用な化合物は、抗体又はその抗原結合部分に直接的に、又はリンカーに結合するように適用することができる当業者に周知の化合物であり得る。これらは、例えば、Ｐｅｔｅｒ  Ｊ  Ｈｏｓｋｉｎ、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ−Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７［１９］に開示される放射性同位元素、前立腺癌においてＰＨＢ１の発現を停止させるための６−メルカプトプリン、ｓｉＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ送達系等の細胞微小管を遮断する小分子（Ｘｕ
Ｘ等２０１７［２０］）、毒素、例えば、サポリン、ゲロニン、リシン、志賀毒素等（レビューについてはＡｌｌａｈｙａｒｉ  Ｈ等２０１７［２１］を参照のこと）、組織因子、例えば、膜結合全長組織因子又は可溶性オルタナティブスプライシング型組織因子（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ  Ａ等［２２］）、ペプチド、例えば、Ａｒａｐ等［２３］；Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｌ  ２００５［２４］に開示されるＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２であり得る。
【００４９】
本発明では、リンカーは本発明で使用するために適合された当業者に周知のリンカーであり得る。リンカーは、例えば、Ｎｏｌｔｉｎｇ２０１３［２５］；Ｊａｉｎ等２０１５
［２６］；Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ  ａｎｄ  Ａｎ２０１５［２７］に開示されるリンカ
ーであり得る。
【００５０】
腫瘍血管の表面にＦＳＨＲの選択的発現パターンを実証する本発明の発明者の研究［Ｒａｄｕ等２０１０［９］；Ｓｉｒａｊ等２０１３［１３］；Ｒｅｎｎｅｒ等２０１３［１０］；Ｐｌａｎｅｉｘ等２０１５［１２］］は、癌治療について、ＦＳＨＲを標的にする治療的能力を強調する。本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は、細胞の成分として、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用する細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞）ベースの免疫療法の成分として使用され得る（Ｒｅｚｖａｎｉ  ａｎｄ  Ｒｏｕｃｅ  ２０１５［２８］；Ｆｉｇｕｅｒｏａ等２０１５［２９］）。
【００５１】
有利な点として、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分を、細胞の成分として、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用するＴ細胞若しくはＮＫ細胞ベースの免疫療法の成分として使用する場合、これらの細胞は、周辺の腫瘍血管に発現される血管内皮ＦＳＨＲを標的にする。さらに有利な点として、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達領域に結合するＦＳＨＲ抗原に特異的な本発明の抗体のｓｃＦｖフラグメントを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現によって、腫瘍脈管構造を認識し、攻撃するようにＴ細胞に指示することができ、例えば、癌患者の腫瘍の治療のための免疫療法戦略として、癌治療のための医薬品として使用され得る。
【００５２】
本発明の発明者は、また、驚くべきことに、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分が特に癌細胞の表面で発現するＦＳＨＲを標的にし、ＦＳＨＲを発現する細胞を検出／標的にすることができることを初めて実証した。さらにＦＳＨＲを発現する細胞は、哺乳動物、特に、腫瘍による影響を受けているヒトの循環血細胞に蓄積する。
【００５３】
したがって、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた抗体又はその抗原結合部分は、免疫化学研究、例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学的研究、例えば、共焦点顕微鏡、免疫電子顕微鏡及び／又は
免疫組織化学的研究に使用され得る。
【００５４】
本発明は、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの診断又は撮像方法に使用するためのヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００５５】
本発明では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの診断又は撮像方法は、抗体又はその抗原結合部分を使用することができる当業者に周知の方法であり得る。例えば、ｉｎ
ｖｉｖｏでの診断又は撮像方法は、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）、造影エンハンス超音波診断イメージング、及び、例えば、Ｍａｎｇｒａｄｅｘナノ粒子を使用することによる磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む群から選択され得る。
【００５６】
本発明の別の目的は、癌細胞、例えば、試料において循環ＦＳＨＲ陽性上皮癌細胞、腫瘍内皮細胞及び／又は循環ＦＳＨＲ外部ドメインを検出するためのヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用である。
【００５７】
ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は前述の通りである。
【００５８】
本発明では、試料は、生体試料であり得る。生体試料は、当業者に周知の生体試料であり得る。生体試料は、例えば、液体又は固体試料であり得る。本発明に従って、試料は生体体液であり得、例えば、血液、血漿、血清、尿、組織、例えば、筋肉の試料、又は組織生検の試料であり得る。
【００５９】
本発明では、癌細胞は、当業者に周知の卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）を発現する癌細胞であり得る。癌細胞は、例えば、循環ＦＳＨＲ陽性上皮癌細胞又は腫瘍内皮細胞であり得る。
【００６０】
本発明では、癌細胞を検出する方法は、当業者に周知の検出方法であり得る。癌細胞の検出方法は、フローサイトメトリーに適用される蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）であり得る。
【００６１】
本発明では、ＦＳＨＲ陽性癌細胞及び／又は腫瘍内皮細胞の表面から拡散される循環ＦＳＨＲ細胞外ドメインを検出する方法は、当業者に周知の検出方法であり得る。例えば、当業者に周知の免疫−酵素法であり得る。例えば、ＥＬＩＳＡであり得る［Ｖａｎｎｉｅｒ１９９６［１５］。
【００６２】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ｈＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分を検出、診断又は撮像方法に使用する場合、抗体は標識され、及び／又はタグ付けされ得る。例えば、ｈＦＳＨＲに対する抗体又はその抗原結合部分は、適合され、当業者に周知のタグでタグされ得る。例えば、ビオチン、蛍光色素、例えば、ロドプシン、ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ、ナノゴールド被覆リガンド、カーボンブラック被覆リガンド、ｍａｎｇｒａｄｅｘ又は蛍光リガンドを含む群から選択されるタグであり得る。例えば、ｈＦＳＨＲに対する抗体又はその抗原結合部分は、放射活性分子を含む群、例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、蛍光色素、不可視近赤外線（ＮＩＲ）化合物、例えば、ＮＩＲ蛍光ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００−ＣＷ（Ｔａｎａｋａ等２００８［３０］）、ビオチン等のシンチグラフィー研究のための放射活性原子を含む群から選択される化合物で標識及び／又はタグされ得る。
【００６３】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分がタグされる場合、共役分子で明らかになり得る。
【００６４】
本発明では、共役分子は、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体に対するタグされた抗体又はその抗原結合部分に結合する分子であり得、当業者に周知である。例えば、タグがビオチンである場合、共役分子はストレプトアビジンであり得る。
【００６５】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は、放射同位体及び／又は蛍光色素で標識される場合、イメージング過程において、例えば、原発性腫瘍及び／又は転移を検出／局所化するのに有用となり得る。
【００６６】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は、不可視近赤外線（ＮＩＲ）化合物で標識される場合、画像誘導治療で有用となり得る。
【００６７】
有利な点として、本発明の発明者は、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分が、ＦＳＨＲに対する良好な親和性及び特異性があるために、例えば、試料に受容体が存在するかどうかについて優れた検出／結果を提供することができることを実証した。
【００６８】
言い換えれば、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた抗体又はその抗原結合部分は、より信頼できる結果及び優れた検出効率を提供する。
【００６９】
したがって、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた抗体又はその抗原結合部分は、例えば、方法、及び、例えば、診断予後の感受性を増加させることができる。
【００７０】
本発明の別の目的は、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた抗体又はその抗原結合部分で、例えば、腫瘍サイズを連続イメージングすることによって、抗腫瘍剤の有効性をモニターするために、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用である。
【００７１】
本発明では、抗腫瘍剤は、当業者に周知の抗腫瘍剤、例えば、化学療法薬剤、放射線療法薬剤であり得る。
【００７２】
本発明の別の目的は、以下のステップを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏに抗腫瘍剤及び／又は抗腫瘍治療の有効性をモニターする方法である：
ａ）ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分で腫瘍サイズ（Ｓ１）を画像上で測定し、
ｂ）治療後のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分で腫瘍サイズ（Ｓ２）を画像上で測定し、
ｃ）以下の公式に従って、腫瘍サイズとスコアの計算値（Ｓ）を比較し、
ｄ）Ｓ＝Ｓ２／Ｓ１、
１．０８未満のＳの値は治療の効果があることを示す。
【００７３】
本発明では、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分を使用して、撮像方法から得られた画像上で腫瘍サイズの測定を行うことができる。腫瘍サイズの測定は、例えば、前述の撮像方法から得られた画像であり得る。
【００７４】
本発明では、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその
断片は、ヌクレオチド配列から得ることができる。
【００７５】
本発明の対象は、したがって、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片をコードする単離されたヌクレオチド配列である。
【００７６】
本発明では、ヌクレオチド配列は、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片をコードし得、
−アミノ酸配列ＸａＸｂＸｃＸｄＸｅ（配列番号１６）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１であり、ＸａはＱ、Ｒ又はＫであり、ＸｂはＦ、Ｑ、Ｓ又はＹであり、ＸｃはＹ又はＷであり、ＸｄはＶ、Ｌ、Ｉ又はＴであり、ＸｅはＧ、Ｉ、Ｌ、Ｑ又はＴであり、
−アミノ酸配列ＥＩＸｆＰＸｇＸｈＸｉＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１１）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２であり、ＸｆはＦ、Ｌ又はＹであり、ＸｇはＲ又はＱ、Ｘｈ  Ｔ又はＮ及びＸｉ  Ｇ又はＱであり、
−アミノ酸配列ＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）を有する可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む群の少なくとも１つを含み得る。
【００７７】
技術知識及びアミノ酸配列−核酸翻訳コードを考慮して、当業者は、対応する核酸コード配列を決定することができる。
【００７８】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、ＣＡＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴ（配列番号３９）、ＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡＴＴ（配列番号４０）、ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号４１）、ＣＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧ（配列番号４２）、ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号４３）を含む群から選択され得る。
【００７９】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、ＧＡＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧ（配列番号４４）、ＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧ（配列番号４５）、ＧＡＡＡＴＴＴＴＴＣＣＧＣＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣ（配列番号４６）、ＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＧＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣ（配列番号４７）、ＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧ（配列番号４８）を含む群から選択され得る。
【００８０】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、ＧＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号４９）であり得る。
【００８１】
非限定的な例として、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体に由来するヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体の可変重（ＶＨ）のペプチド配列配列番号１７〜２１をコードするヌクレオチド配列は決定され、対応するペプチド配列が推定され、以下の表２にそれぞれ示される。
【００８２】
【表２】
2020513817.tif 000004
【００８３】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変重（ＶＨ）のペプチド配列配列番号１７〜２１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を含む群から選択され得る。
【００８４】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変軽（ＶＬ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列ＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴＴ  ＡＴＴＴＡＧＡＡ（配列番号２４）のヌクレオチドを含む群又はその変異体から選択され得る。
【００８５】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変軽（ＶＬ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列ＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴ（配列番号２５）のヌクレオチドを含むヌクレオチド又はその変異体であり得る。
【００８６】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）３のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列ＴＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧ（配列番号２６）のヌクレオチドを含む群又はその変異体から選択され得る。
【００８７】
本発明では、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対して向けられた単離された抗体又はその抗原結合部分の可変軽（ＶＬ）鎖の配列配列番号１３〜１５、２２のペプチドを含む群から選択されるペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６を含む群から選択され得る。
【００８８】
本発明の対象は、また、組み換えベクター、特に本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。
【００８９】
非限定的な例として、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体に由来する重鎖の定常領域のヌクレオチド配列が決定され、対応するペプチド配列が推定され、以下の表３−１〜表３−５にそれぞれ示される。
【００９０】
【表３−１】
2020513817.tif 000005
【００９１】
【表３−２】
2020513817.tif 000006
【００９２】
【表３−３】
2020513817.tif 000007
【００９３】
【表３−４】
2020513817.tif 000008
【００９４】
【表３−５】
2020513817.tif 000009
【００９５】
本発明の別の対象は、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片をコードする単離された核酸又はヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００９６】
本発明は、また、単離された核酸又は配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００９７】
本発明では、ベクターは、組み換えタンパク質を生成するための当業者に周知のベクターの１つであってもよい。ベクターは、概して、使用される細胞性宿主の機能として選択される。ベクターは、カタログｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｍａｍｍａｌｉａｎ＿ｅｘｐｒｅｓｓ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍ［３１］又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ／ｑｉａｇｅｎｅｓ．ａｓｐｘ？ｇａｗ＝ＰＲＯＴＱＩＡｇｅｎｅｓ０８０７＆ｇｋｗ＝ｍａｍｍａｌ＋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［３２］、又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ／ｃｈａｐ＿ｅｘｐ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｈｐ？ｔｙｐｅ＝ｐＣｒｕｚＴＭ％２０Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ％２０Ｖｅｃｔｏｒｓ［３３］に列挙されるベクターから選択され得る。例えば、ＷＯ８３／００４２６１［３４］に記載の発現ベクターであり得る。ベクターは、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター、ＦＪＢ  ＩｇＧ発現ベクターを含む群から選択され得る。
【００９８】
本発明の別の対象は、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片をコードする核酸を含む宿主細胞、又はヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【００９９】
核酸又は発現ベクターは前述の通りである。
【０１００】
宿主細胞は、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片を、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその断片をコードする核酸配列を含む前述のベクターから生成するのに適した宿主であり得る。
【０１０１】
本発明の目的について、「宿主細胞」は、原核生物又は真核生物細胞を意味することが理解される。組み換えタンパク質の発現に多く使用される宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｇｅｒ等の真菌細胞、昆虫細胞及び／又は哺乳動物細胞が挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、マウス細胞及びヒト細胞を含む群から選択され得る。哺乳動物細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ−Ｃ６、ＣＨＯ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含む群から選択され得る。本発明では、宿主細胞はＣＨＯ細胞であり得る。
【０１０２】
原核生物及び真核生物の細胞の形質転換は、当業者に周知の方法／技術である。形質転換は、例えば、リポフェクション、電気穿孔、熱ショック又は化学的方法によって実施され得る。形質転換される細胞に応じて、当業者は、選択した宿主細胞の形質転換に必要な方法を容易に決定することができる。したがって、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、選択した宿主細胞に応じて選択される。発現ベクターによって形質転換された宿主細胞は、例えば、組み換え形態において、対応するタンパク質を生成する。当業者は、例えば、組み換え、例えば、免疫沈降を使用し、次にウエスタンブロット法を使用して、宿主細胞がタンパク質を生成することを容易に検証することができる。
【０１０３】
本発明の対象は、また、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分を生成する方法である。
【０１０４】
本発明では、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分を生成する方法は、当業者に周知の方法によって実施されて、抗体又はその抗原結合部分を生成することができる。本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分を生成する方法は、本発明に記載の宿主細胞を培養し、抗体又はその抗原結合部分を細胞培養物から回収することを含み得る。
【０１０５】
宿主細胞は、当業者に周知の方法で培養され、細胞に適合され得る。原核生物及び真核生物の細胞の培養は、当業者に周知の技術である。細胞に応じて、当業者は、選択した宿主細胞の培養に必要とされる必要な手段、培地、時間及び温度条件を容易に決定することができる。
【０１０６】
細胞培養物から抗体又はその抗原結合部分を回収することは当業者に周知の方法によって行われ得る。例えば、電気泳動法、超遠心分離法、示差沈殿、限外濾過、膜又はゲルろ過、親和性クロマトグラフィーといった方法が選択され得る。
【０１０７】
本発明では、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に対する抗体又はその抗原結合部分は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  １９７５［３５］に記載のハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｃｏｔｅ等、１９８３［３６］）、及び／又は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７［３７］号に記載の組み換
えＤＮＡ法によって作製され得る。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等１９９１［３８］及びＭａｒｋｓ等１９９１［３９］に開示される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから生成及び単離することもできる。
【０１０８】
その他の利点は、例示によって与えられる添付の図面によって示される以下の例を読むことによって当業者に明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図1は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（レーンにつき１マイクログラムのタンパク質）において生成されるマウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＦＳＨＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。この図において、Ｍはマーカー、ｒは減少、「１」：配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：配列番号５のＣＤＲ１を有する抗体であり、全てのＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列である。
【図２Ａ】図２は、ＦＡＣＳの結果を示すダイアグラムであり、「１」：配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：配列番号５のＣＤＲ１及び配列番号１０のＣＤＲ２を有する抗体であり、全てのＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列、「６」はマウスＩｇＧ２Ａ抗体（コントロール）及び「７」はヒトＦＳＨＲに対する周知の抗体である。図２Ａは、ＨｕＦＳＨＲ  Ｌ−細胞（ヒトＦＳＨ−受容体を安定的に発現するＬ細胞で得られるダイアグラム）を示し、図２Ｂは、ＷＴ  Ｌ−細胞（野生型Ｌ細胞；ネガティブコントロール）で得られるダイアグラムを示す。
【図２Ｂ】図２は、ＦＡＣＳの結果を示すダイアグラムであり、「１」：配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：配列番号５のＣＤＲ１及び配列番号１０のＣＤＲ２を有する抗体であり、全てのＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列、「６」はマウスＩｇＧ２Ａ抗体（コントロール）及び「７」はヒトＦＳＨＲに対する周知の抗体である。図２Ａは、ＨｕＦＳＨＲ  Ｌ−細胞（ヒトＦＳＨ−受容体を安定的に発現するＬ細胞で得られるダイアグラム）を示し、図２Ｂは、ＷＴ  Ｌ−細胞（野生型Ｌ細胞；ネガティブコントロール）で得られるダイアグラムを示す。
【図３】図３は、ヒトＦＳＨＲ（「Ｐ」）に対する周知の抗体を使用した免疫組織化学検査の後のヒト精巣組織のパラフィン切片の写真又は本発明の抗体の例（「２〜４」）である。免疫組織化学的分析は、抗ＦＳＨ受容体モノクローナル抗体３２３を使用し、次にストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート及び基質としてアミノエチルカルバゾールを使用して可視化した二次的ビオチン化ヤギ抗マウス抗体によって実施した。パラフィン切片をヘマトキシリンで染色した。全ての矢印は、精細管（ＳＴ）のＦＳＨＲ陽性セルトリ細胞、ＦＳＨの生理学的標的細胞を指し示す。
【図４】図４は、乳房（Ａ）及び前立腺（Ｂ）のヒト組織のパラフィン切片の写真である。矢印はＦＳＨＲ陽性血管のバーは５０μｍを示す。
【図５】図５は、免疫蛍光顕微鏡によって得られた画像である。この図では、以下に示す使用した抗体に従って画像に番号をつける：「１」：配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：配列番号５のＣＤＲ１を有する抗体であり、全てのＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列、並びに「６」は周知のＦＳＨＲ３２３抗体で和えられた画像を示す。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：抗体の製造方法
１．遺伝子及びベクター
重鎖のみをランダム化した本発明のマウスＩｇＧ２ａ抗ｈｕＦＳＨＲの生成について、５つの異なる抗ヒトＦＳＨＲのＶＨをコードする遺伝子、及びＦＪＢ  ＩｇＧ発現ベクターにさらにクローニングするためのＢｓｍＢＩ隣接領域で設計された周知のＦＳＨＲ抗体Ｖκ（配列番号２７）のＶκをコードする遺伝子を生成した。５つの異なる抗ヒトＦＳＨＲの重鎖をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列表の配列番号２８〜３２の配列に対応する。
【０１１１】
異なるＶＨドメインをコードする得られた遺伝子は、マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域コード遺伝子を有するフレームにおけるＢｓｍＢＩ  ａ  ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを介して、別々にクローニングした。これらのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２８〜３２の配列に対応する。平行して、配列番号３３を含むＶκをコードする合成核酸は、また、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを介して、マウスＣκコード遺伝子を有するフレームにおけるｐＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。
【０１１２】
得られた発現ベクター構築物の配列決定によって、対応するクローン化領域が哺乳動物シグナルペプチド及びＦＪＢ発現ベクターに存在する定常領域をコードする遺伝子を有するフレームにクローニングしたことを確認した。
【０１１３】
２．手順
抗体発現システム：ＧｉｂｃｏＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ  Ｎｏ  Ａ２９１３３）及びＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ
Ｎｏ  Ａ２９１２７）を使用した。
【０１１４】
親和性クロマトグラフィーシステム：ＡＫＴＡ純粋クロマトグラフィーシステムのタンパク質Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ  Ｎｏ  １７０６１８０１）、カラム平衡緩衝液：１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、溶出緩衝液：１００ｍＭの酢酸及び中和緩衝液：１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．８を使用した。
【０１１５】
マウスＩｇＧ２  ＦＳＨＲ３２３変異体を、製造者の指示に従って、Ｇｉｂｃｏ１９（登録商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して生成した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を重鎖及び軽鎖発現ベクターと同時導入し、５００ｍｌの培地で６〜８日間培養した。その後、上清を回収し、４℃で１５分間、１０，０００ｇで遠心分離をかけた。ＡＫＴＡ純粋クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のタンパク質ＡによってＩｇＧを精製した。結合し
たＩｇＧを１００ｍＭの酢酸（４〜１０倍のカラム量）で溶出し、１／２カラム量の画分を回収し、１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．８（画分量の１／４）で中和し、４℃で保存した。精製されたＩｇＧを含有する画分をプールし、４℃のＩｇＧで、フィルター上の遠心分離によって濃縮し、１×ＰＢＳに対して透析し（２回、４℃でそれぞれ２時間）、０．２２μｍでろ過することによって最終的に滅菌した。得られたＩｇＧの総量及び濃度を表１に示す。生成したＩｇＧの純度を標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した（１２％のアクリルアミド；２μｇの抗体／レーン；１００Ｖ；１２０分の泳動時間）。使用した分子量マーカーは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｃａｔ  Ｎ°２６６１９）（５μｌ／レーン）であった。結果によると、全てのＩｇＧ調製物が９５％を超えて純粋であり、非還元下で１５０ｋＤａの予想分子量であり、還元条件下（すなわち２００ｍＭのＤＴＴ）で重鎖については５０ｋＤａ、軽鎖については２５ｋＤａであった（図１）。
【０１１６】
【表４】
2020513817.tif 000010
【０１１７】
前述の表において、「１」：重鎖の配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：重鎖の配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：重鎖の配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：重鎖の配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：重鎖の配列番号５のＣＤＲ１及び配列番号１０のＣＤＲ２を有する抗体であり、ＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列を意味する。
【０１１８】
実施例２：マウスＩｇＧ２ａ抗ｈｕＦＳＨＲのＥＣ５０測定
ＩｇＧ抗ヒトＦＳＨＲがｈｕＦＳＨＲに特異性を保持しているかどうか、ＩｇＧ抗ヒトＦＳＨＲが周知の抗体より高い親和性でこの受容体に結合しているかどうかを特徴付け、確認するために、異なるＩｇＧ（ＭＡＢ）濃度、ｈｕＦＳＨＲ−Ｌ−細胞及びＷＴ  Ｌ＿細胞を使用して結合ＦＡＣＳ実験を実施した。これらの細胞は、ｈｕＦＳＨＲ発現についてＱＣｅｄであった。
【０１１９】
本発明では、ＨｕＦＳＨＲ  Ｌ−細胞（ヒトＦＳＨ受容体を安定的に発現するＬ細胞）、ＷＴ  Ｌ−細胞（野生型Ｌ細胞、ネガティブコントロール）を使用した。
【０１２０】
前述のように、ＨｕＦＳＨＲ  Ｌ−細胞を調製した［Ｖａｎｎｉｅｒ等１９９６［１５］。端的には、カルシウムリン酸沈殿法を使用して、マウスＬ細胞を、ｈＦＳＨＲ（ｐＳＧ５−ｈＦＳＨＲ）をコードするプラスミド、プラスミドｐＳＶ−Ｎｅｏ、及び抗生物質Ｇ４１８に耐性を示すベクターと同時導入した。ネオマイシン耐性細胞を１０％のウシ胎仔血清及びＧ４１８（ジェネテシン、Ｓｉｇｍａ）（１ｍｇ／ｍＬ）を補充したＤＭＥＭに選択した。抗受容体抗体３２３を使用する免疫細胞化学的試験によって、耐性クローンをｈＦＳＨ受容体についてスクリーニングした。トランスフェクトした細胞は、さらに試
験を行うためにＧ４１８（２００iｇ／ｍＬ）を含有する培地に保持した。試料は、モノ
クローナル抗体及び緩衝液：ＦＡＣＳ緩衝液（０．４ｇ／ｌのヒトアルブミンを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の４倍段階希釈液であった。
【０１２１】
手順
−細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．４ｇ／ｌのヒトアルブミンを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の１Ｅ＋０６細胞／ｍｌの濃度に希釈し、２Ｅ＋０５細胞／ウェルに対応し、９６ウェルＵ底プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ  Ｎｏ  １６８１３６）に分配した。
−細胞をペレットにし、上清を捨て、５０μｌ／ウェルの各抗体希釈液をＷＴ  Ｌ−細胞及びｈｕＦＳＨＲ  Ｌ−細胞に添加した。混合物を４℃で３０分間インキュベートし、穏やかに振盪した。
−細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。
−１００μｌ／ウェルのＡＰＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ−ＡＰＣ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：５００希釈）を細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートし、穏やかに振盪した。
−細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。
−細胞ペレットを１００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
−細胞へのＭＡＢの結合をＦＡＣＳ機器（ＡｃｃｕｒｉＣ６）で測定し、各試料について、合計１０，０００イベントを得た。
【０１２２】
ＡＰＣ結合抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することによって、抗ｈｕＦＳＨＲマウスＩｇＧ２ａのＬ細胞への結合を検出した。
【０１２３】
図２Ａの結果は、本発明の抗体の全てが、周知の抗ヒトＦＳＨＲ抗体と比較して改善された（ｓｕｂ−ｎＭ範囲の）ＥＣ５０値で、ｈｕＦＳＨＲ発現細胞に特異的結合を保持することを示した。さらに、図２Ｂは、本発明の抗体の例がＷＴ  Ｌ−細胞に結合することができなかったことを明白に実証する（図２Ｂ）。さらに、以下の表２に開示される結果は、本発明の抗体の例が周知の抗ヒトＦＳＨＲ抗体と比較して改善された（ｓｕｂ−ｎＭ範囲の）ＥＣ５０値を有することを明白に実証する。言い換えれば、これらの例は、本発明の抗体が周知の抗体よりも７．５〜１８．２倍高いＥＣ５０を有することを明白に実証する。
【０１２４】
【表５】
2020513817.tif 000011
【０１２５】
前述の表２において、「１」：重鎖の配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：重鎖の配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：重鎖の配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：重鎖の配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：重
鎖の配列番号５のＣＤＲ１及び配列番号１０のＣＤＲ２を有する抗体であり、ＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列を意味する。
【０１２６】
実施例３：標準ペルオキシダーゼ免疫組織化学によるＦＳＨＲ検出についてのマウスＩｇＧ２ａ抗ｈｕＦＳＨＲ抗体の最適濃度の決定
免疫組織化学で使用する場合の本発明の抗体の最適濃度を決定するために、以下の材料及び方法を使用した。
【０１２７】
材料及び方法
化学物質：水素化ホウ素ナトリウム、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アジ化ナトリウム、Ｈ２Ｏ２  ３０％、ヤギ血清、及びヘマトキシリンＧｉｌｌ溶液ｎ°３をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅで購入した。Ｓｈａｎｄｏｎ  ＩｍｍｕＭｏｕｎｔ培地をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｓｎｉｅｒｅ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅから入手した。
【０１２８】
免疫組織化学：ヒト精巣組織の連続３μｍ厚の切片（ｎ＝３０切片）を切り分け、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔスライドに付着させ、キシレンで脱パラフィンし、エタノールにおいて徐々に脱水し、水道水で６０分間洗浄した。１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６で９０℃で４０分間、スライドをインキュベートすることによって、抗体の付着についての組織抗原部位への接近が増加した。室温（ＲＴ）で２０分間冷却した後、続く各ステップの後にスライドをＰＢＳで洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、切片を６％の過酸化水素でインキュベートした（室温すなわち２０℃で１５分）。水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ）を使用して、アルデヒド基をクエンチした（室温すなわち２０℃で１５分）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ブロッキングバッファ）中の２％のヤギ血清のスライドを２０℃（ＲＴ）で２時間インキュベートすることによって、抗体の非特異的結合を遮断した。ブロッキングバッファのモノクローナル一次抗体４、２、３（ブロッキングバッファの５μｇ／ｍｌ−１μｇ／ｍｌ−０．２μｇ／ｍｌ−０．０４μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩、段階希釈することでスライドをインキュベートした。周知のＦＳＨＲ３２３抗体（ＩＮＳＥＲＭ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｔ、Ｐａｒｉｓ）を陽性ＩｇＧ２ａコントロールとして使用した。ＳｉｇｍａのマウスＩｇＧ２ａをネガティブコントロールとして使用した。ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（希釈１：２００）を二次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（希釈１：５００）を使用して検出した。ＡＥＣは我々が使用した色素原であった。切片を０．１％のアジ化ナトリウムを含有する希釈水で洗浄し、Ｇｉｌｌヘマトキシリンで１０秒間対比染色し、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ培地に置いた。
【０１２９】
結果：
図３は本発明の抗体４、２、３で得た画像及び周知のＦＳＨＲ３２３抗体（「Ｐ」）の画像を示す。図３は、本発明の抗体が、免疫組織化学で使用する場合、周知のＦＳＨＲ３２３抗体より高い親和性を有することを明白に実証する。言い換えれば、本発明の抗体は、より優れた、正確なｈＦＳＨＲの識別を提供する。
【０１３０】
さらに、図３に示すように、本発明の抗体、特に抗体４、２、３の親和性は、ヒト精巣組織のパラフィン切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＦＳＨＲ発現について試験を行った場合に、周知の抗体ＦＳＨＲ３２３よりも５〜２５倍高かった（例えば、抗体４の最適希釈は、０．２μｇ／ｍｌであり、ＦＳＨＲ３２３の最適希釈は５μｇ／ｍｌであった）（図３）。
【０１３１】
実施例４：ヒト癌組織の試料におけるマウスＩｇＧ２ａ抗ｈｕＦＳＨＲによるＦＳＨＲ発現の検出
この実験では、使用した抗体は、前述の実施例１で得た抗体であり、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列がＲＳＷＩＬ（配列番号４）であり、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）２のアミノ酸配列がＥＩＹＰＱＮＱＮＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号９）であり、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３がアミノ酸配列ＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）を有し、可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１がアミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）を有し、可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）２がアミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）を有し、可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）３がアミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）を有する。
【０１３２】
ヒト乳癌組織（ｔｈｅ  Ｃｕｒｉｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅからのｎ＝３５名の患者）及びヒト前立腺癌（Ｌａｒｉｂｏｉｓｉeｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａ
ｌ、Ｐａｒｉｓ  Ｆｒａｎｃｅからのｎ＝５０名の患者）の保管されたパラフィン切片（３μｍ厚）を切り分け、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔスライドに付着させ、キシレンで脱パラフィンし、エタノールにおいて徐々に脱水し、水道水で６０分間洗浄した。１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６で９０℃で４０分間、スライドをインキュベートすることによって、抗体の付着についての組織抗原部位への接近が増加した。２０℃（室温（ＲＴ））で２０分間冷却した後、続く各ステップの後にスライドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。切片を６％の過酸化水素でインキュベートする（室温で１５分）ことによって、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ）を使用して、アルデヒド基をクエンチした（室温で１５分）。ＰＢＳ（ブロッキングバッファ）中の２％のヤギ血清でスライドを室温で２時間インキュベートすることによって、抗体の非特異的結合を遮断した。ブロッキングバッファのモノクローナル一次抗体（希釈：０．２μｇ／ｍｌのブロッキングバッファ）で、４℃で一晩、スライドをインキュベートした。周知のＦＳＨＲ３２３抗体（ＩＮＳＥＲＭ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｔ、Ｐａｒｉｓ）を陽性ＩｇＧ２ａコントロールとして使用した。ＳｉｇｍａのマウスＩｇＧ２ａをネガティブコントロールとして使用した。ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（希釈１：２００）を二次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（希釈１：５００）を使用して検出した。ＡＥＣは我々が使用した色素原であった。切片を０．１％のアジ化ナトリウムを含有する希釈水で洗浄し、Ｇｉｌｌヘマトキシリンで１０秒間対比染色し、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ培地に置いた。
【０１３３】
結果
図４は、乳癌及び前立腺癌のヒト組織のパラフィン切片上のＦＳＨＲ発現の代表的な写真である。この図に示されるように、本発明の抗体４は、乳癌（Ａ）及び前立腺癌（Ｂ）に関連する血管において、ＦＳＨＲを検出し、識別することができる（矢印はＦＳＨＲ陽性血管を指し示す）。
【０１３４】
実施例５：受容体を発現する細胞におけるマウスＩｇＧ２ａ抗ｈｕＦＳＨＲによるＦＳＨＲ発現の免疫蛍光顕微鏡の検出
免疫蛍光組織化学で使用する場合の本発明の抗体の有用な濃度を決定するために、以下の材料及び方法を使用した。
【０１３５】
材料及び方法
化学物質：塩化アンモニウム、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロ−クロリド（ＤＡＰＩ；＃３２６７０）、及びヤギ血清をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅで購入した。ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ５５５（＃Ａ２１１３７）及びＳｈａｎｄｏｎ  ＩｍｍｕＭｏｕｎｔ培地をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅで購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ダルベッコ（＃Ｌ１８２−１０）は、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｇｍｂ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
【０１３６】
免疫蛍光顕微鏡
ＦＳＨＲ−Ｌ−細胞及び野生型Ｌ−細胞を、５％ＣＯ２の存在下、１０％のウマ血清、１ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸を含有するＤＭＥＭでＬａｂＴｅｃｋ８ウェル（１０，０００細胞／ウェル）に３７℃で培養した。７０％のコンフルエンスに達したとき、細胞をＰＢＳで（３回）洗浄し、ＰＢＳの４％のパラホルムアルデヒドで固定した（室温（ＲＴ）で１５分）。遊離アルデヒド基をＰＢＳの１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌで、室温（すなわち２０℃）で１５分間クエンチした。抗体の非特異的結合を遮断するために、細胞を２％のヤギ血清（ブロッキングバッファ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で室温（すなわち２０℃）で１時間クエンチした。モノクローナル一次抗体１、２、３、４及び５（３μｇ／ｍｌ−１μｇ／ｍｌ−０．３μｇ／ｍｌ−０．１μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、及び０．０１μｇ／ｍｌのブロッキングバッファ）の段階希釈で、細胞を４℃で一晩、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ２１１３７；ブロッキングバッファ中、希釈１：１０００）で、室温で１時間、細胞をインキュベートすることによって、ＦＳＨＲを検出した。Ｒａｄｕ等２０１０［９］の以前に記載のように、周知のＦＳＨＲ３２３抗体（ＩＮＳＥＲＭ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｔ、Ｐａｒｉｓ）を陽性ＩｇＧ２ａコントロール（３μｇ／ｍｌ）として使用した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ＃３２６７０；ＰＢＳ中希釈１：１０００）で細胞を１０分間培養することによって、細胞核を検出した。スライドを１５ｍＭのアジ化ナトリウムを含有するＤａｋｏ蛍光マウント培地に置き、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で調べた。ＦＳＨＲを発現しないネガティブコントロールの野生型Ｌ−細胞を使用した。
【０１３７】
本発明の例において、モノクローナル一次抗体１、２、３、４及び５は、「１」：重鎖の配列番号１のＣＤＲ１及び配列番号６のＣＤＲ２を有する抗体、「２」：重鎖の配列番号２のＣＤＲ１及び配列番号７のＣＤＲ２を有する抗体、「３」：重鎖の配列番号３のＣＤＲ１及び配列番号８のＣＤＲ２を有する抗体、「４」：重鎖の配列番号４のＣＤＲ１及び配列番号９のＣＤＲ２を有する抗体、「５」：重鎖の配列番号５のＣＤＲ１及び配列番号１０のＣＤＲ２を有する抗体であり、ＣＤＲ３配列が重鎖のＧＰＴＡＳＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）であり、ＲＳＳＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３）のＣＤＲ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４）のＣＤＲ２配列及び軽鎖のＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号１５）のＣＤＲ３配列を意味する。
【０１３８】
図５の結果は、本発明の５つ全ての抗体が受容体を安定的に発現する細胞において、ｈｕＦＳＨＲを特異的に検出することができた。特に、この結果は、非常に低い濃度、すなわち、周知のＦＳＨＲ３２３抗体の最適濃度より３３倍低い０．０３μｇ／ｍｌの濃度で抗体を使用したものの、高い解像度の標識化を実証する。この図は、また、本発明の抗体１〜５が周知のＦＳＨＲ３２３抗体が標識しない（図５、画像６）濃度（図５、画像１〜５）でＦＳＨＲを標識することができることを明白に実証する。
【０１３９】
言い換えれば、この例は、本発明の抗体は優れたＦＳＨＲ標識化合物であり、検出及び高解像度の画像の獲得を可能にすることを明白に実証する。さらに、この例は、本発明の抗体が極めて低い濃度、特に、周知の抗体では役に立たない程の特定の濃度で、効率的であることを明白に実証する。
【０１４０】
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【図１】
2020513817.tif 000012
【図２Ａ】
2020513817.tif 000013
【図２Ｂ】
2020513817.tif 000014
【図３】
2020513817.tif 000015
【図４】
2020513817.tif 000016
【図５】
2020513817.tif 000017
【配列表】
2020513817000001.app
【国際調査報告】
2020513817.tif 000018
2020513817.tif 000019