(57)【要約】  本発明は、インターフェロン-ε(IFN-ε)を使用してがんを治療する方法に関し、IFN-εは、組成物中の様々な天然、合成及び組換えIFN-εを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるがん細胞を阻害するための方法であって、前記がん細胞のアポトーシスを間接又は間接的に誘導すること、増殖、運動性及び/又は移動に関して有効な量のインターフェロンイプシロン(IFNε)、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーに前記がん細胞を曝露する工程を含む方法。
【請求項２】
前記IFNεが、治療される前記対象の種と同種の種に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記IFNεが、治療される前記対象の種と異種の種に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、ヒトである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記IFNεが、組換えヒトIFNε又はIfnε発現のインデューサー;組換え非ヒトIFNε又はIfnε発現のインデューサー;及びヒトIFNεと非ヒトIFNεとのハイブリッドからなるリストから選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記IFNεが、ヒトIFNεとマウスIFNεとのハイブリッドである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記がん細胞が、上皮組織、結合組織、腺組織、胚性組織、造血細胞、リンパ組織若しくは骨髄又はそのような細胞が由来する細胞に由来する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、卵巣、子宮、卵管、子宮内膜、胎盤、乳房、精巣、前立腺、脳、胃、肝臓、脾臓、膵臓、胸腺、結腸、肺、腎臓、心臓、甲状腺又は平滑筋からのがん細胞である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、卵巣がん細胞である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記卵巣がん細胞が、低〜高悪性度漿液性癌細胞である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記卵巣がん細胞が、高悪性度漿液性癌細胞である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記IFNε又はバリアント、ハイブリッド若しくはインデューサーが、別の抗がん剤との組合せで使用される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗がん剤が、化学療法剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、ステロイド、性ホルモン又はホルモン様薬物、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ホルモンアゴニスト及び微小管阻害剤からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
IFNε又はバリアント若しくはハイブリッドの前記量が、10IU/用量〜106IU/用量である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象におけるがんの治療での医薬の製造における、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーの使用。
【請求項１６】
対象におけるがんの治療での使用のための、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項１７】
前記IFNεが、治療される前記対象の種と同種の種に由来する、請求項15に記載の使用、又は請求項16に記載のIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項１８】
前記IFNεが、治療される前記対象の種と異種の種に由来する、請求項15に記載の使用、又は請求項16に記載のIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項１９】
前記対象が、ヒトである、請求項16から18のいずれか一項に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２０】
前記IFNεが、組換えヒトIFNε;組換え非ヒトIFNε;及びヒトIFNεと非ヒトIFNεとのハイブリッドからなるリストから選択される、請求項19に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２１】
前記IFNεが、ヒトIFNεとマウスIFNεとのハイブリッドである、請求項20に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２２】
前記がんが、上皮組織、結合組織、腺組織、胚性組織、造血細胞、リンパ組織又は骨髄のがんである、請求項15から21のいずれか一項に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２３】
前記がんが、卵巣、子宮、卵管、子宮内膜、胎盤、乳房、精巣、前立腺、脳、胃、肝臓、脾臓、膵臓、胸腺、結腸、肺、腎臓、心臓、甲状腺又は平滑筋にある、請求項22に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２４】
前記がんが、卵巣がんである、請求項23に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー若しくはIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２５】
前記卵巣がんが、高悪性度漿液性癌である、請求項24に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２６】
その使用が別の抗がん剤のアジュバントである、使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２７】
前記抗がん剤が、化学療法剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、ステロイド、性ホルモン又はホルモン様薬物、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ホルモンアゴニスト及び微小管阻害剤からなる群から選択される、請求項26に記載の使用又はIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー。
【請求項２８】
がんの治療における使用のための、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー、並びに1つ又は複数の担体、アジュバント及び/又は賦形剤を含む製剤。
【請求項２９】
前記がんが、卵巣、子宮、卵管、子宮内膜、胎盤、乳房、精巣、前立腺、脳、胃、肝臓、脾臓、膵臓、胸腺、結腸、肺、腎臓、心臓、甲状腺又は平滑筋のがんである、請求項28に記載の製剤。
【請求項３０】
前記がんが、卵巣がんである、請求項29に記載の製剤。
【請求項３１】
抗がん剤と組合せる、請求項21から30のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
前記抗がん剤が、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、ステロイド、性ホルモン又はホルモン様薬物、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ホルモンアゴニストからなる群から選択される、請求項31に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「A method of treatment」という表題の2017年1月30日出願のオーストラリア仮特許出願第2017900251号と関連付けられ、その優先権を主張するものであり、当該出願の全内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書は、配列リストを参照する。「ST25.txt」ファイルは、ANSI形式である。このファイルは、AU 2017900251からの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、がん治療及びがん治療に有用な製剤の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において著者が参照する刊行物の書誌の詳細は、説明の末尾にアルファベット順で収集されている。
【０００４】
任意の先行刊行物(又はそれに由来する情報)について、又は公知の任意の事柄についての本明細書における参照は、先行刊行物(又はそれに由来する情報)又は公知の事柄が、本明細書が関連する努力の分野における通常の一般的な知識の部分を形成するという承認若しくは許可又は示唆の任意の形態として解釈されず、且つ解釈されるべきではない。
【０００５】
がんは、複雑で多面的な細胞障害である。それは、潜在的に顕著な罹患率及び死亡率を伴う、衰弱をもたらすレベルの疾患を引き起こし得る。個人及び家族の感情的負担は言うまでもなく、がんの治療におけるヘルスケア部門への経済的コストは、相当なものである。がん生物学並びにその発達を遅延させる内因性及び外因性因子を理解することに、多くの努力が費やされてきた。ここ数十年の大きな進歩にもかかわらず、この疾患を完全に理解するためには更なる研究が欠かせない。
【０００６】
例えば、卵巣がんは、卵巣細胞からのみではなく、卵管及び/又は周囲組織の細胞からも生じる、いくつかの分子的に別個の腫瘍を含む複雑な異種性疾患である(Jaysonら(2014)The Lancet 384(9951):1376〜88頁)。多くの女性は、既に進行期の疾患に達して初めて診断され、治療に応答する人のうちの半分よりも多くが再発し、5年以内に死亡する(AIHW.(2010)Cancer series 52 Cat No.CAN48)。
【０００７】
卵巣がんの大多数は、上皮起源(EOC:epithelial origin)のものであり、4番目に高い女性のがんの致死率を有する(Jaysonら(2014)上記)。EOCは、粘液性癌、明細胞癌、子宮内膜癌及び漿液性癌を含む組織学的サブタイプに基づいて分類され、その各々は、別個の形態、変異性プロファイル、起源細胞及び予後と関連付けられる。漿液性癌は、最もよく診断されるEOCであり、EOCは、遠位卵管の分泌上皮裏層に由来することを示唆する証拠が増大している。進行期の疾患を有する多くの女性は、手術候補者ではなく、化学療法抵抗性は、再発率を増大させるので、標準治療選択肢である外科的切除及びプラチナベースの化学療法は多くの場合、効果がない(Jaysonら(2014)上記)。
【０００８】
卵巣がんの広範囲にわたる分子プロファイリングは、BRCA1/2遺伝子における突然変異が、最も一般的且つ致死的なEOCである高悪性度漿液性癌(HGSC:high grade serous carcinoma)のリスクを顕著に増大させることを示した(Bowtellら(2010)Nature Rev Cancer 10(11):803〜8頁)。BRCA1及びBRCA2は、両方とも実証されたインターフェロン(IFN)により調節される遺伝子(IRG)であり、DNAの相同組換え修復経路(Venkitaraman(2014)Science 343(6178):1470〜5頁)、全体的な染色体不安定性に寄与する体細胞及び生殖細胞系突然変異において重要な役割を果たす。また、分子プロファイリングにより、高悪性度漿液性癌(HGSC)は、免疫サブタイプと呼ばれるCD8A、グランザイムB及びCXCL9等の免疫関連遺伝子のより高度な発現を伴うと、最も優れた全生存期間を示すことが特定されており(Tothillら(2008)Clin Cancer Res. 14(16):5198〜208頁)、このがんにおける免疫により駆動される抑制の利益の可能性を強調した。分子プロファイリングは、基底細胞様乳がんと漿液性卵巣がんとの突然変異プロファイルにおける、両方に共通する高頻度のTP53、BRCA1及びBRCA2突然変異、RB1のダウンレギュレーション並びにサイクリンE1の増幅を伴う、類似性を特定した(Koboltら(2012)Nature 490(7418):61〜70頁)。加えて、卵巣がん腫瘍発生におけるホルモンの役割は不明なままであるが、エストロゲン受容体(ER)発現とはかかわりなくプロゲステロン受容体(PR)陰性患者における予後が悪いという証拠があり(Siehら(2013)The Lancet Oncology 14(9):853〜62頁)、これは、三種陰性乳がん(TNBC)又はエストロゲン受容体陽性/プロゲステロン受容体陰性(ER+/PR-)がんのいずれかを有する乳がん患者における予後が悪いという報告と類似性を有する(Thakkar及びMehta(2011)Oncologist 16(3):276〜85頁)。これらの2つのがんにおける共通の駆動因子については、まだあまり知られておらず、両方とも癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子発現、ホルモン感受性並びに免疫細胞関与の共通要素を有する。
【０００９】
卵巣がん及び他のがんタイプの発達の調節及び治療における免疫誘導の効果を更に調査する必要がある。
【００１０】
これは、特に、先天免疫と適応免疫との間の相互作用についての問題である。先天免疫応答は、病原体への既存の、生得の、第1ラインの、迅速に誘導可能な防御、及びホメオスタシス合図への応答を示す(Manganら(2007)Eur J Immunol 37(5):1302〜12頁;Smithら(2007)J Immunol 178(7):4557〜66頁)。これは、常在細胞、例えばマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)及び上皮細胞を通して媒介される。適応免疫応答は、抗原への認識及び応答を包含し、誘発された応答は、漸進的且つ特異的であり、抗体分泌Bリンパ球並びにTヘルパー及びエフェクターリンパ球を通して媒介される。適応応答は、先天系によって形成される。生殖器系においては、免疫系の両方のアームは、本質的に「外来性」タンパク質を含有する同種異系胎児の存在と、有害な病原体、例えばウイルス及び細菌の制御との均衡を保たなければならない。また、それは、粘膜において起こる周期性ホルモン環境及び構造変化のバックグラウンドに対してホメオスタシスを維持しなければならない。
【００１１】
女性生殖器系(FRT)の先天及び適応免疫細胞は、サイトカイン及びケモカインを生成し、それによって、精子遊走、受精、着床、子宮内膜リモデリング及び感染又は他の負荷に対する免疫応答を含む様々な生殖プロセスに影響を及ぼす(Salamonsenら(2007)Semin Reprod Med 25(6):437〜44頁)。
【００１２】
その最も単純な形態において、先天応答は、物理化学的障壁、例えば粘膜分泌、pH及び酸化還元状態を含む。その最も精巧な形態において、それは、数分以内に病原体を感知し、一連の反応を開始し、結果的に抗菌デフェンシン、NOS酵素、ケモカインのような生成物を生成し、これらが、細胞のふるまいを調節する炎症細胞及びサイトカインを動員及び活性化する、先天免疫応答によって表される。多面的な活性を有するインデューサーの1つのファミリーは、I型インターフェロン(IFN)である。
【００１３】
I型IFN、具体的にIFNα及びIFNβを使用する卵巣がんの治療についての臨床試験は、主に、他の固形腫瘍での場合と同様に、進行期の疾患において高用量治療を妨げる用量制限毒性のために、興味深いものではなかった(Berekら(1985)Cancer Res. 45:4447〜53頁;Willemseら(1990)Eur J Cancer Clin Oncol 26(3):353〜8頁;Markmanら(1992)Gynecol Oncol. 45(1):3〜8頁;Frasciら(1994)Eur J Cancer 30(7):946〜50頁;Bruzzoneら(1997)Gynecol Oncol. 65(3):499〜505頁;Mooreら(1995)Gynecol Oncol. 59(2):267〜72頁;Berekら(1999)Gynecol Oncol. 75(1):10〜4頁;Markmanら(2004)Oncology 66(5):343〜6頁)。しかしながら、IFNの腹水に対する有効性の根底にある機構は不明なままであるにもかかわらず、卵巣がんからの悪性腹水の治療において腹腔内IFNαを使用して、一部の成功が報告されている(Berekら(1985)Cancer Res. 45:4447〜53頁)。最も良い直接の治療をするために、疾患病因におけるIFNの役割を理解することが重要である。
【００１４】
IFNイプシロン(IFNε)は、I型IFNである(Fungら(2013)Science 339(123):1088〜1092頁;Pengら(2007)Prot Expr Purif 53(2):356〜362頁)。Ifnε遺伝子は、I型IFN遺伝子座における染色体9pに位置する(Hardyら(2004)Genomics 84(2):331〜45頁)。IFNεは、IFNα及びIFNβと約30%のアミノ酸配列ホモロジーを共有し、in vitro研究により、IFNεは、特徴的なI型IFN受容体IFNAR1及びIFNAR2を通してシグナル伝達することが示されたが、しかしながら、その潜在的な抗腫瘍特性については、今までのところ取り組まれていない。
【００１５】
興味深いことに、病原体により誘導されるまで検出不能なレベルのままである他のI型IFNとは異なり、IFNεは、主にFRTの器官、例えば子宮、子宮頸部、膣及び卵巣において構成的に発現することが分かっている。IFNεは、FRTの管腔及び腺上皮細胞によって生成され、造血細胞の非存在下では変化しない。
【００１６】
加えて、IFNεの調節は、他のI型IFNとは別個である。Ifnα及びIfnβとは異なり、マウスIfnε発現は、病原体刺激に応答して、大きく変化しない。
【００１７】
代わりに、IFNεレベルは、マウス発情周期の段階にわたり顕著に変動し、発現レベルは、発情期中は発情休止期より30倍高く、発現パターンは、月経周期中のヒト組織において反映される。このことは、他のI型IFNとは異なり、IFNεはホルモン調節されることを示す。
【００１８】
がん生物学におけるIFNεの役割を調査する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第5,763,263号
【特許文献２】米国特許第5,753,187号
【特許文献３】米国特許第5,391,377号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Jaysonら(2014)The Lancet 384(9951):1376〜88頁
【非特許文献２】AIHW.(2010)Cancer series 52 Cat No.CAN48
【非特許文献３】Bowtellら(2010)Nature Rev Cancer 10(11):803〜8頁
【非特許文献４】Venkitaraman(2014)Science 343(6178):1470〜5頁
【非特許文献５】Tothillら(2008)Clin Cancer Res. 14(16):5198〜208頁
【非特許文献６】Koboltら(2012)Nature 490(7418):61〜70頁
【非特許文献７】Siehら(2013)The Lancet Oncology 14(9):853〜62頁
【非特許文献８】Thakkar及びMehta(2011)Oncologist 16(3):276〜85頁
【非特許文献９】Manganら(2007)Eur J Immunol 37(5):1302〜12頁
【非特許文献１０】Smithら(2007)J Immunol 178(7):4557〜66頁
【非特許文献１１】Salamonsenら(2007)Semin Reprod Med 25(6):437〜44頁
【非特許文献１２】Berekら(1985)Cancer Res. 45:4447〜53頁
【非特許文献１３】Willemseら(1990)Eur J Cancer Clin Oncol 26(3):353〜8頁
【非特許文献１４】Markmanら(1992)Gynecol Oncol. 45(1):3〜8頁
【非特許文献１５】Frasciら(1994)Eur J Cancer 30(7):946〜50頁
【非特許文献１６】Bruzzoneら(1997)Gynecol Oncol. 65(3):499〜505頁
【非特許文献１７】Mooreら(1995)Gynecol Oncol. 59(2):267〜72頁
【非特許文献１８】Berekら(1999)Gynecol Oncol. 75(1):10〜4頁
【非特許文献１９】Markmanら(2004)Oncology 66(5):343〜6頁
【非特許文献２０】Fungら(2013)Science 339(123):1088〜1092頁
【非特許文献２１】Pengら(2007)Prot Expr Purif 53(2):356〜362頁
【非特許文献２２】Hardyら(2004)Genomics 84(2):331〜45頁
【非特許文献２３】Altschulら(1997)Nucl. Acids. Res. 25:3389頁
【非特許文献２４】Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons Inc. 1994〜1998)
【非特許文献２５】Buninら(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4708〜4712頁
【非特許文献２６】DeWittら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909〜6913頁
【非特許文献２７】Egleton(1997)Peptides 18:1431〜1439頁
【非特許文献２８】Langer(1990)Science 249:1527〜1533頁
【非特許文献２９】Fix(1996)Pharm Res. 13:1760〜1764頁
【非特許文献３０】Samanen(1996)J. Pharm. Pharmacol. 48:119〜135頁
【非特許文献３１】Putney(1998)Nat. Biotechnol. 16:153〜157頁
【非特許文献３２】Patton(1998)Biotechniques 16:141〜143頁
【非特許文献３３】Robyら(2000)Carcinogenesis 21(4):585〜591頁
【非特許文献３４】Domckeら(2013)Nature Communications 4:2126頁
【非特許文献３５】Kurman及びShih(2011)Human pathology 42:918〜931頁
【非特許文献３６】Patchら(2015)Nature 521:489〜494頁
【非特許文献３７】Tanら(2015)Oncotarget 6:43843〜43852頁
【非特許文献３８】Greenawayら(2008)Gynecologic oncology 108:385〜394頁
【非特許文献３９】Gasteigerら(2003)Nucleic Acids Res 31:3784〜3788頁
【非特許文献４０】Stifterら(2014)Protein Expr Purif 94:7〜14頁
【非特許文献４１】de Weerdら(2013)Nat Immunol 14:901〜907頁
【非特許文献４２】Jaksら(2007)J Mol Biol 366:525〜539頁
【非特許文献４３】Darnell(1997)Science 277:1630〜1635頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、配列識別子番号(配列番号)によって参照される。配列番号は、配列識別子<400>1(配列番号1)、<400>2(配列番号2)等に数字的に対応する。配列識別子の概要は、Table 2(表2)に示す。配列リストは、特許請求の範囲の後に提供する。
【００２２】
本発明は、IFNεががん細胞を阻害することにおいて役割を有するという結果に部分的に基づいている。そのような阻害は、アポトーシスプロセスによるものを含むがん細胞死を直接又は間接的に誘導すること、並びにがん細胞の発達、増殖、運動性及び/又は移動の遅延又は阻害を含む抑止することを含む。IFNεは、がん細胞に直接的に作用し得るか、或いはそれは、免疫応答を誘導することができ、免疫応答は、特定の細胞種を介して、若しくはがん細胞に対して細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制効果を誘導するレギュレータ若しくは他の因子の生成を介して、又は腫瘍細胞環境の間質若しくは成分の細胞を介して作用する。本発明は、卵巣がんの調査に従って解明されたが、この発見は、女性生殖器系(FRT)の他のがん、及び任意の哺乳動物、特にヒトにおける女性又は男性対象の身体の別の場所のがんに適用される。
【００２３】
それゆえ、本発明は、ヒトを含む対象におけるがん細胞の生存能、成長、発達及び広がりを阻害するための方法を提供する。これは、がん細胞の発達、増殖、運動性及び移動の遅延又は阻害を含む抑止することを包含する。
【００２４】
したがって、対象におけるがん細胞を阻害するための方法であって、がん細胞のアポトーシスを直接又は間接的に誘導するか、又はがん細胞の増殖、運動性及び/又は移動を阻害するのに有効な量のインターフェロンイプシロン(IFNε)、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーにがん細胞を曝露する工程を含む方法が、本明細書において教示される。これは、がん細胞の限局性成長及び侵襲並びにそれらの身体の他の部分への転移における低減をもたらし得る。がん細胞に関連する「曝露すること」は、がん細胞を、又は他の細胞若しくは成分を介して直接又は間接的に曝露することを意味する。
【００２５】
がんを有する対象を治療するための方法であって、がん細胞のアポトーシスを直接又は間接的に誘導するか、又はがん細胞の増殖、運動性及び/又は移動を阻害するのに十分な時間及び条件下で、有効量のIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーを対象に投与する工程を含む方法が、本明細書において更に可能になる。これは、がん細胞の成長及び発達を抑止することを含む。
【００２６】
本明細書は、対象におけるがんの治療での医薬の製造における、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーの使用について教示する。一実施形態においては、対象におけるがんの治療での使用のための、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーが、本明細書において教示される。医薬は、主要活性成分としてIFNε又はそのバリアント若しくはハイブリッド若しくはインデューサーを含むか、又はそれが別の抗がん剤のためのアジュバントとして作用する、抗がんワクチンを含む。IFNε又はそのバリアント若しくはハイブリッド若しくはインデューサーと共に使用され得る他の抗がん剤の例として、化学療法剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、ステロイド、性ホルモン又はホルモン様薬物、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ホルモンアゴニスト及び微小管阻害剤が挙げられる。また、組換え細胞を操作して、IFNε又はそのバリアント、ハイブリッド若しくはインデューサーを生成してもよく、或いは組換えウイルスを操作して、感染した細胞がIFNε、そのバリアント、ハイブリッド又はインデューサーを生成するように方向付けてもよい。操作したIFNεは、最適化コドン発現及び/又は最適化治療活性によって生成されるIFNεを含む。
【００２７】
がんの治療における使用のための、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサー、並びに1つ又は複数の担体、アジュバント及び/又は賦形剤を含む製剤。また、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態は、抗がん剤又はがん細胞調節分子と共にワクチンアジュバントとしても使用してもよい。
【００２８】
本明細書において使用する略語を、Table 1(表1)に定義する。
【００２９】
【表１】
2020506923.tif 000002
【００３０】
一部の図面は、色表現又は色実体を含有する。カラー写真は、請求に際して特許権者から、又は適切な特許事務所から入手可能である。特許事務所から得る場合、謝礼が課され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】IFNε及びIFNβによる、ID8細胞におけるインターフェロン調節遺伝子(IRG)の誘導を示す、グラフ表示である。グラフは、CXCL10(A)、lfit1(B)及びIsg15(C)の10〜1000IU/ml IFNε(黒色で示される左パネル)及びIFNβ(灰色の右パネル)誘導の3時間用量応答を示す。遺伝子発現をqRT-PCRによって測定し、発現を18sに対して標準化したdCTによって計算し、ここで示す相対的発現は、t0での発現に対して決定する。データは、各々技術上三重で行ったn=3の独立実験の平均値+/-SEMとして示す。有意性は、スチューデントT検定によって決定した。****p<0.0001。
【図２】がん関連生物学的機能に関連する遺伝子の調節を示す、グラフ表示である。グラフは、1000IU/mlのIFNε(中央のバー)又はIFNβ(右のバー)による3時間の刺激に応答したBcl-2(A)、Ccne1(B)、Cdc20(C)、Tap1(D)及びCasp1(E)の発現を示す。データは、各々技術上三重で行ったn=3の独立実験の平均値+/-SEMとして示す。有意性は、スチューデントT検定によって決定した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。
【図３】ID8細胞のインターフェロンによる72時間の処理にわたる30分間隔での、細胞数の相関物である、平均細胞指数測定を示す、グラフ表示であり;IFNε(A)によるID8細胞増殖の阻害を示すが、IFNβ(B)によっては阻害が示されていない。グラフは、100〜1000IU/mlの:a)IFNε;b)IFNβで48時間処理したID8細胞の増殖の阻害を示す。細胞増殖は、xCELLigenceによって測定する。グラフは、各ウェルにわたる平均細胞指数+/-SDを示す。各細胞指数は、血清非含有培地中に細胞を播種した24時間(矢印)後に正規化し、非処理及び緩衝液処理対照と比較する。各々技術上三重で行ったn=3の独立実験の代表値。凡例(a)-非処理(赤色)、対照(緑色)、100IU/ml IFNε(桃色)及び1000IU/ml IFNε(青色);(b)非処理(赤色)、対照(緑色)、100IU/ml IFNβ(青色)及び1000IU/ml IFNβ(桃色)。
【図４】ID8細胞成長のIFN誘導阻害を示す、グラフ表示である。ID8細胞を、細胞インピーダンスを測定するために電極でコーティングした96ウェルEプレート上に播種した。細胞から血清を24時間枯渇させ、その後0〜1000IU/mlの:(A)IFNε;又は(B)IFNβのいずれかにより48時間処理した。細胞指数(インピーダンスの測定であるCI)を処理時間について正規化し、RTCAソフトウェアを使用して処理後48時間にわたる倍加時間を計算した。(C)また、RTCAソフトウェアを使用して正規化CIから処理後48時間までの成長曲線の傾き(増殖速度の表示)を計算した。技術上四重で行ったn=3の独立実験の代表的データ。データは、N=3の独立実験の平均値+SDとして表し、2元配置ANOVAをシダックの多重比較検定と共に使用して分析した。****p<0.0001。
【図５】IFNε処理がID8細胞の細胞移動を阻害することを示す、グラフ表示である。ID8細胞を、1〜100IU/mlのIFNε又は緩衝液対照で処理し、12時間の処理後に移動を測定した。ウシ胎児血清(FCS)を化学誘因物質として使用した。血清非含有培地(SFM)を陰性対照として使用した。データは、技術上三重で行った1回の独立実験の代表値であり、技術的反復の平均値+SDとして表す。有意性は、1元配置ANOVA及びテューキーの多重比較法を使用して決定した。*p<0.05;**p,0.01;***p<0.001;****p<0.0001。
【図６】IFNε処理がID8細胞のアポトーシスを誘導することを示す、グラフ表示である。データは、40〜400IU/mlのIFNεで4時間処理したID8細胞についての、PBS及び緩衝液処理対照と比較した、アネキシンV/PI染色の分析を示す。H2O2を陽性対照として使用する。(A)生存細胞;(B)壊死細胞;(C)アポトーシス初期;(D)アポトーシス後期。データは、技術上二重で行ったN=3の独立実験の代表値であり、技術的反復の平均値+SDとして表す。有意性は、スチューデントT検定を使用して決定した。*p,0.05;**p<0.01。
【図７】良性ヒト上皮及び漿液性癌試料におけるIFNε染色強度のグラフ表示である。Imagescopeソフトウェアにおける陽性画素分析を使用して、ヒト対照上皮低悪性度(low grade: LG)及び高悪性度(high grade: HG)漿液性癌(SC)試料におけるIFNε発現についての免疫組織化学染色を分析して、上皮由来組織成分における染色強度を定量した。データは、技術上二重で染色した各試料についての強度スコアとして表す。データは、対照上皮のn=30の試料並びに低悪性度(n=6)及び高悪性度漿液性癌試料(n=70)からの上皮の点プロットとして示し、平均値はバーにより示す。データを、個々のマンホイットニー検定を使用して分析した。**p<0.01、***p<0.001。
【図８】直交異方性原発腫瘍からの進行した播種性卵巣がん転移のグラフ表示である。嚢内ID8注射後13週目に、WT及びIfnε欠損マウスは、進行した原発腫瘍及び転移性卵巣がんを示す。A〜B)非腫瘍及びID8注射マウスからの左卵巣及び脾臓を計量し;C)腹水液を腹膜から抜き出し;E)赤血球含有量について測定し;D)腹膜壁上の転移沈着物数を記録した。データは、遺伝子型当たりn=3の非腫瘍所有マウス及びn=6のID8注射マウスを示し、独立スチューデントT検定を使用して分析した。*p<0.05。
【図９】組換えIFNεがin vivoで腹膜免疫細胞集団を調節することを示す、グラフ表示である。健康なC57BL/6野生型マウス(6〜8週齢)を、組換えマウスIFNε又はIFNβ(500IU/用量)で腹腔内注射により、毎週3回8週間処置した。腹膜灌流により腹膜浸出細胞をPBS中に収集し、A)CD45+CD8+T細胞;B)CD45+CD4+T細胞;C)CD45+CD11b+Ly6C+炎症性単球;及びD)CD45+CD4+PD1+T細胞を含む免疫細胞集団についてフローサイトメトリーを使用して分析した。データは、1群当たりn=5のマウスの平均値+/-SEMとして表し、独立スチューデントT検定を使用して分析した。*p<0.05、**p<0.01。
【図１０】IFNεが播種性卵巣がんモデルにおいて悪性腹水発達を抑制することを示す、グラフ表示である。A)画像は、PBS、IFNε又はIFNβ(500IU/用量毎週3回)で処置したID8注射後8週間のマウスの腹膜から抜き出した腹水の体積を示し;B)フローサイトメトリーを使用して、腹水液中の上皮(全サイトケラチン陽性)腫瘍細胞数を測定し;C)Sysmex細胞カウンターを使用して、腹水液中の赤血球の濃度を測定した。データは、n=3のPBS対照マウス及び処置群当たりn=5のマウスを示し、独立スチューデントT検定を使用して分析した。*p,0.05、**p,0.01、***p<0.001。
【図１１】IFNε又はIFNβで処置した腫瘍所有マウスにおける炎症性サイトカインレベルの変化を示す、グラフ表示である。画像は、BD cytometric bead array(CBA)によって測定した、PBS、IFNε又はIFNβ(500IU/用量毎週3回)で処置したID8注射後8週間のマウスの腹膜から抜き出した腹水中のMCP-1(A)、IL6(B)及びIL-10(C)の濃度を示す。データ表示は、n=3のPBS対照マウス及び処置群当たりn=5のマウスの平均値+/-SEMとして示し、独立スチューデントT検定を使用して分析した。*p<0.05。
【図１２】播種性卵巣がんモデルにおいて組換えIFNεが腹膜免疫細胞集団を調節することを示す、グラフ表示である。C57BL/6野生型マウス(6〜8週齢)にID8細胞を腹腔内注射し、腹腔内注射により組換えマウスIFNε又はIFNβ(500IU/用量)で毎週3回8週間処置した。腹膜灌流により腹膜浸出細胞をPBS中に収集し、免疫細胞集団についてフローサイトメトリーを使用して分析した。データは、1群当たりn=5のマウスの平均値+/-SEMとして示し、独立スチューデントT検定を使用して分析した。*p<0.05;**p<0.01。
【図１３】組換えインターフェロンで処置した上皮起源(EOC)のマウスがんにおける成長及び腹水発達を示す、グラフ表示である。A)マウスの体重をID8細胞注射後8週間にわたりモニターし、各処置群の体重増加割合を1日目のすべてのマウスの平均と比較して計算し、実験開始時の平均体重からの距離を、各マウスの全体的な増加割合に組み込んだ。B)組換えIFNの毎週3回の処置あり又はなしのID8細胞注射後8週間のマウスの全体重を測定した全体的な成長曲線。C)ID8細胞注射後8週目に腹囲を測定した。D)ID8細胞注射後8週間の各マウスの腹腔から腹水液の全体積を抜き出した。多数の群間の有意性を決定するために、通常の1元ANOVA及びテューキーの多重比較検定を行い(A)、一方で、独立スチューデントT検定を使用して、2つの平均値を比較した(C及びD)。***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。データは、1群当たりn=3〜5のマウスの平均値+/-SEMとして示す。
【図１４】マウスEOCにおける全身性貧血症、腹膜出血及び脾腫に対するIFNの効果の証拠を示す、グラフ表示である。A)ID8細胞注射後8週目のマウスにおける貧血症の臨床徴候は、後足の蒼白を含み、これを0-正常灌流、1-わずかに蒼白、2-極度に蒼白に等級付けた。B)5ml PBSを使用して腹膜灌流を行い、出血について0(出血なし)〜3(広範な出血、暗赤色及び完全に不透明な液)に等級付けた。C)腹膜浸出細胞(PEC)について、赤血球(RBC)カウントを含む細胞カウントを行った。D)ID8細胞注射後8週間のマウスからの脾臓質量。データは、1群当たりn=3〜5のマウスの平均値+/-SEMとして示す。有意性は、独立スチューデントT検定を使用して決定した。****p,0.0001、**p<0.01、*p<0.05。
【図１５】組換えIFNεで処置したマウスEOCにおける腫瘍負荷に対する効果を示す、グラフ表示である。A)腸間膜腫瘍負荷の程度を、0(肉眼で見える疾患なし)〜4(大きな結節性横隔下腫瘍塊及び腸間膜全体にわたる無数の腫瘍沈着物として明らかな広範な腫瘍形成)に等級付けた。B)腹膜壁に結合した肉眼で見える腫瘍沈着物をカウントした。これらは、様々なサイズの腫瘍を含んだ。C)横隔膜に結合した肉眼で見える腫瘍沈着物をカウントした。これらは、様々なサイズの腫瘍を含んだ。D)肝葉に結合した肉眼で見える腫瘍沈着物をカウントした。E)浮動性球状体をカウントした。F)マウス当たりの最も大きな代表的な腫瘍小結節の表面積の測定。データは、1群当たりn=3〜5のマウスの平均値+/-SEMとして示す。有意性は、独立スチューデントT検定を使用して決定した。***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図１６Ａ】最適化発現配列(最適化コドン利用)を含む、ヒト及びマウスIFNεのヌクレオチド及びアミノ酸配列の表示である。
【図１６Ｂ】最適化発現配列(最適化コドン利用)を含む、ヒト及びマウスIFNεのヌクレオチド及びアミノ酸配列の表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書全体を通して、文脈が別のように要求しない限り、「〜を含む(comprise)」という語又は「〜を含む(comprises)」若しくは「〜を含むこと(comprising)」等の変形は、示される要素若しくは整数若しくは方法工程、又は要素若しくは整数若しくは方法工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素若しくは整数若しくは方法工程、又は要素若しくは整数若しくは方法工程の群の除外を意味しないと理解される。
【００３３】
本明細書において使用されるとき、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈が明らかに別のように示さない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「がん細胞(a cancer cell)」についての言及は、単一のがん細胞及び2つ又はそれよりも多いがん細胞を含み;「IFNε(an IFNε)」についての言及は、単一のIFNε分子及び2つ又はそれよりも多いIFNε分子を含み;「開示(the disclosure)」についての言及は、その開示によって教示される単一及び多数の態様を含む;等。本明細書において教示され、可能になる態様は、「発明」という用語によって包含される。本明細書において企図される任意のバリアント及び誘導体は、本発明の「形態」によって包含される。本発明のすべての態様は、特許請求の範囲の幅にわたり可能になる。
【００３４】
本発明は、対象におけるがんの治療でのインターフェロンイプシロン(IFNε)の使用を教示する。これは、IFNεの機能的な天然若しくは合成バリアント又はハイブリッド形態を含む。がんの治療におけるIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーの使用が、本明細書において更に教示される。それゆえ、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態は、がん細胞に直接的に作用し得るか、又はIFNεによって誘導される先天若しくは適応免疫細胞若しくはレギュレータ若しくはプロセスを介して、若しくは腫瘍細胞環境の間質若しくは成分の細胞を介して間接的に作用し得る。
【００３５】
それゆえ、がん細胞を直接又は間接的に阻害するための:
(i)天然精製IFNε;
(ii)最適化発現によって生成したIFNεを含む、組換えIFNε;
(iii)IFNεの機能的な天然バリアント;
(iv)活性について最適化したものを含む、IFNεの機能的な合成バリアント;
(v)異なる種からの2つ若しくはそれよりも多いIFNεのハイブリッド;及び/又は
(vi)Ifnε発現又はIFNε活性のインデューサー
の使用が本明細書において可能になる。本発明は、がんを治療するために、(i)〜(vi)のうちの任意の1つ、すなわち、(i)〜(vi)からなる群から選択される作用剤を使用するか、又は(i)〜(vi)のうちの2つ若しくはそれよりも多くの組合せを使用し得る。Ifnε発現又はIFNε活性のインデューサーについての言及は、プロモーター活性をアップレギュレートし、調節制御を最適化して高レベルのIFNεを提供する作用剤、及びIFNε活性を向上させる作用剤を含む。
【００３６】
がんの治療は、単一又は多数のがん細胞の阻害を含む。これは、がん細胞のアポトーシスを直接又は間接的に誘導すること、細胞傷害剤として直接又は間接的に作用すること、がん細胞の複製、成長、発達、運動性、増殖、生存及び/又は移動を直接又は間接的に阻害すること、並びに/又はがん細胞の細胞分裂停止を直接又は間接的に誘導することのうちの任意の1つ又は複数を含む。治療は、腫瘍細胞環境の間質又は成分の細胞を介して抗がん活性を向上し得る。
【００３７】
加えて、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはインデューサーは、がん細胞の限局性成長若しくは侵襲を直接又は間接的に防ぎ、且つ/又はがん細胞発達の起源病巣から遠い領域を含む対象の身体の別のところへのがん細胞の転移を防ぎ得る。
【００３８】
本発明は、卵巣がんの調査から部分的に生じた。しかしながら、IFNεの抗がん効果は、上皮組織、結合組織、腺組織、胚性組織に由来するがん、血液由来がん、並びに造血細胞、リンパ組織及び骨髄又はそのような細胞が由来する細胞を含むがんを含むある範囲のがんのいずれかに適用可能である。本発明は、がん又はがんによって影響を受けた器官若しくは解剖学的区画若しくは領域の任意の1つのタイプの治療に限定されるべきはない。それゆえ、本発明は、卵巣、子宮、卵管、子宮内膜、胎盤、乳房、精巣、前立腺、脳、胃、肝臓、脾臓、膵臓、胸腺、結腸、肺、腎臓、心臓、甲状腺及び平滑筋のいずれかからのがんの治療に及ぶ。これは、網羅的なリストであるとは意図されないが、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーによって治療され得るがんのタイプの代表物であると意図される。
【００３９】
しかしながら、一実施形態においては、本発明は、女性生殖器系(FRT)に影響を及ぼすがん、限定されないが、例えば卵巣がんに及ぶ。上述の通り、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態は、がん細胞に直接的に作用して、アポトーシス、細胞傷害性、老化、溶解若しくは細胞死の他の形態のうちの任意の1つ若しくは複数を誘導してもよく、又は細胞の成長、増殖、複製、発達、移動若しくは運動性を遅延、阻害若しくは別の方法で阻害してもよい。また、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態は、がん細胞に間接的に作用して、アポトーシス、細胞傷害性、老化、溶解若しくは細胞死の他の形態のうちの任意の1つ若しくは複数を誘導してもよく、又は細胞の成長、増殖、複製、発達、移動若しくは運動性を遅延、阻害若しくは別の方法で抑止してもよい。本発明を任意の理論又は作用様式に限定するものではないが、間接的な活性は、先天及び適応免疫レギュレータ及びプロセスの誘導を含む。また、IFNεは、がん細胞又はがん組織を囲む環境中の間質又は成分の細胞を介して作用し得る。
【００４０】
治療される対象は、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。非ヒト動物は、動物モデルにおいて有用な動物を含む。そのような動物として、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ及びより大きな非ヒト動物が挙げられる。本明細書に包含される他の動物は、ペット動物(例えばイヌ及びネコ)、並びにウマ、プシバルスキーウマ、シマウマ及びロバを含むウマ科動物である。「ウマ」は、純血種、温血種、クォーターホース及びスタンダードブレッドホースを含む。また、捕獲野生動物、例えばタスマニアデビルは、治療の対象であってもよく、本発明に包含される。それゆえ、本発明は、ヒト及び獣医学用医薬において、及び研究ツールとして適用を有する。
【００４１】
ヒト対象についての言及は、任意の性別又は年齢のヒトを含む。一実施形態においては、ヒトは、FRTに影響を及ぼすがん、限定されないが例えば卵巣がんを有する女性である。
【００４２】
本発明の範囲をいずれかのタイプのがんに限定するつもりはないが、がんは、癌腫、肉腫、腺癌、芽腫、白血病、リンパ腫及び骨髄腫に及ぶ。「がん」という用語は、「腫瘍」との区別として解釈されるべきではなく、両方の用語は、同じ細胞種を意味するために本明細書において使用される。がんは、段階分けがどのように分類されるかにかかわらず、任意の悪性度及び任意の段階のがんであり得る。それゆえ、がんは、固形腫瘍であっても、血液又はリンパ液由来であっても、骨髄由来であってもよく、細胞種、位置、腫瘍サイズ、局所、領域又は遠隔転移の程度の点で定義され得る。例えば、卵巣がんに関連して、これは、高悪性度又は低悪性度又は中間の悪性度の漿液性、粘液性、明細胞又は子宮内膜であり得る。
【００４３】
したがって、対象においてがん細胞を阻害するための方法であって、がん細胞のアポトーシスを直接又は間接的に誘導すること、生存、増殖、運動性及び/又は移動に関して有効な量のインターフェロンイプシロン(IFNε)、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーにがん細胞を曝露する工程を含む方法が、本明細書において可能になる。
【００４４】
がんを有する対象を治療するための方法であって、がん細胞のアポトーシスを誘導するか、又はがん細胞の増殖、運動性及び/又は移動を阻害するのに十分な時間及び条件下で、有効量のIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーを対象に投与する工程を含む方法が、本明細書において更に可能になる。
【００４５】
対象におけるがんの治療での医薬の製造における、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーの使用が、本明細書において教示される。
【００４６】
対象におけるがんの治療での使用のための、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーが、本明細書において更に教示される。
【００４７】
また、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態は、抗がん剤、例えば化学療法剤、別のI型インターフェロン、例えばIFNα若しくはIFNβ又は別の生体分子との使用のためのアジュバントとして用いてもよい。この文脈における「アジュバント」は、IFNε又はバリアント若しくはハイブリッドが別の抗がん剤と相乗的に作用することを意味する。
【００４８】
それゆえ、対象においてがん細胞を阻害するための方法であって、別の抗がん剤との組合せで、がん細胞のアポトーシスを直接又は間接的に誘導すること、生存、増殖、運動性及び/又は移動に関して有効な量のインターフェロンイプシロン(IFNε)、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーにがん細胞を曝露する工程を含む方法が、本明細書において可能になる。
【００４９】
がんを有する対象を治療するための方法であって、別の抗がん剤との組合せで、がん細胞のアポトーシスを誘導するか、又はがん細胞の増殖、運動性及び/又は移動を阻害するのに十分な時間及び条件下で、有効量のIFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーを対象に投与する工程を含む方法が、本明細書において更に可能になる。
【００５０】
対象におけるがんの治療での医薬の製造における、別の抗がん剤との組合せの、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド形態、又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーの使用が、本明細書において教示される。医薬は、単一の実体であっても、互いに組合せで使用される薬学的に有効な作用剤の併置であってもよい。
【００５１】
別の抗がん剤についての言及は、化学療法剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、ステロイド、性ホルモン若しくはホルモン様薬物、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア及び/又はホルモンアゴニストを含むが、これらに限定されない。抗がん剤は、微小管免疫細胞又はその生成物を更に含み得る。
【００５２】
化学療法剤の例として、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン及びミトキサントロン又はプラチナベースの作用剤が挙げられる。代謝拮抗薬は、身体の化学プロセス、例えば細胞成長及び再生に必要なタンパク質、DNA及び他の化学物質を創出することを妨害する物質であり;がん治療においては、代謝拮抗薬は、DNA生成を破壊し、これは次に、細胞分裂を防ぐ。例として、アザセリン、D-サイクロセリン、ミコフェノール酸、トリメトプリム、5-フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセート、ゲムシタビン、シタラビン(ara-C)及びフルダラビンが挙げられる。
【００５３】
抗腫瘍抗生物質は、酵素及び有糸分裂を停止させるか、又は細胞を囲む膜を変化させることによってDNAを妨害する。これらの作用剤は、細胞周期のすべての期において働く。したがって、それらは、様々ながんに広く使用される。抗腫瘍抗生物質の例として、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン及びミトキサントロンが挙げられる。
【００５４】
有糸分裂阻害剤は、植物アルカロイド及び天然生成物由来の他の化合物である。それらは、有糸分裂を阻害若しくは停止するか、又は細胞の再生に必要なタンパク質を製造するための酵素を阻害し得る。これらは、細胞周期のM期中に働く。有糸分裂阻害剤の例として、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド(VP-16)、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。
【００５５】
ステロイドは、一部のタイプのがん(リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫)及び他の病気を治療することにおいて有用な、天然及び合成ホルモンである。それらは、がん細胞を殺滅するか、又はそれらの成長を遅延させることができる。例として、プレドニゾン及びデキサメタゾンが挙げられる。
【００５６】
性ホルモン又はホルモン様薬物は、女性又は男性ホルモンの作用又は生成を変更する。それらは、通常体内のホルモンレベルに応答して成長する、乳がん、前立腺がん及び子宮内膜がんの成長を遅延させるために使用される。例として、抗エストロゲン(タモキシフェン、フルベストラント)、アロマターゼ阻害剤(アナストロゾール、レトロゾール)、プロゲスチン(メゲストロール酢酸エステル)、抗アンドロゲン(ビカルタミド、フルタミド)及びLHRHアゴニスト(リュープロリド、ゴセレリン)が挙げられる。
【００５７】
アルキル化剤は、DNAに直接的に働いて、がん細胞が再生することを防ぐ。薬物のクラスとして、これらの作用剤は、相特異的ではない(換言すると、それらは、細胞周期のすべての期において働く)。これらの薬物は、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫並びに肺、乳房及び卵巣のある特定のがんに対して活性である。アルキル化剤の例として、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン(DTIC)、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)及びメルファランが挙げられる。
【００５８】
結晶塩酸塩の形態のナイトロジェンマスタードは、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫及び脳腫瘍の治療において薬物として使用される。ナイトロジェンマスタードは、細胞の遺伝子材料において突然変異を引き起こし、それによって、有糸分裂又は細胞分裂を破壊する。細胞は、ナイトロジェンマスタードへの感受性において変動し、迅速に増殖する腫瘍及びがん細胞は最も感受性であり;赤血球を生成する骨髄もまた感受性であり、赤血球の生成抑制はナイトロジェンマスタード治療で頻繁に起こる副作用である。また、ナイトロジェンマスタードは、免疫応答を抑制する(免疫を参照のこと)。他のタイプとして、芳香族マスタードメルファラン及びクロラムブシル、シクロホスファミド、HN1、ビス-(2-クロロエチル)エチルアミン;HN2、ビス-(2-クロロエチル)メチルアミン及びHN3、トリス-(2-クロロエチル)アミンが挙げられる。
【００５９】
ニトロソウレアは、アルキル化剤と類似した様式で作用する。それらは、DNA修復を補助する酵素を妨害する。これらの作用剤は、脳まで移動することができるので、それらは、脳腫瘍並びに非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫及び悪性黒色腫を治療するために使用される。ニトロソウレアの例として、カルムスチン(BCNU)及びロムスチン(CCNU)が挙げられる。
【００６０】
ホルモンアゴニストとして、前立腺がんのためのリュープロリド(Lupron、Viadur、Eligard)、乳がん及び前立腺がんのためのゴセレリン(Zoladex)及び卵巣がん及び前立腺がんのためのトリプトレリン(Trelstar)並びにナファレリン酢酸塩(Synarel)が挙げられる。
【００６１】
微小管阻害剤として、「ビンカ」アルカロイド、タキソイド及びベンズイミダゾールが挙げられる。
【００６２】
Ifnε発現又はIFNε活性の誘導は、IFNεインデューサー剤の使用を含む。そのような作用剤として、タンパク質性及び非タンパク質性の作用剤が挙げられる。これらの作用剤は、遺伝子の調節領域(IFNεの成熟又は前駆形態を含む)と相互作用するか、又は上流分子の発現を調節する場合があり、上流分子は次にIfnε発現又は発現生成物活性を調節する。したがって、Ifnε発現及び/又はIFNε活性を直接又は間接的に誘導又は改変する作用剤が、本明細書において企図される。
【００６３】
いかなるようにも本発明を限定するものではないが、Ifnε発現は、ホルモン調節されることが知られている。したがって、一実施形態においては、エストロゲン及びエストロゲンミメティックの使用は、IFNεレベルをアップレギュレートする有用な手段を提供する。別の例においては、TGFβを利用することができる。同様に、バイオインフォマティクス分析は、IFNεプロモーター内のグルココルチコイド受容体応答エレメント及びEts因子結合エレメントを特定した。また、BRCA1の推定上の転写因子結合部位が、ヒトIfnεプロモーターにおいて特定されている。したがって、これらの部位、例えばElf3及びElf5を介して転写を活性化する分子は、Ifnε発現をアップレギュレートするために利用することができる。
【００６４】
本発明のこの態様に従って利用されるインデューサー剤は、任意の好適な形態をとり得る。例えば、タンパク質性の作用剤は、様々な程度までグリコシル化若しくは非グリコシル化され、リン酸化若しくは脱リン酸化されてもよく、且つ/又はタンパク質と使用、連結、結合若しくは別の方法で関連付けられる、ある範囲の他の分子、例えばアミノ酸、脂質、炭水化物若しくは他のペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質を含有してもよい。同様に、また、非タンパク質性分子は、任意の好適な形態をとり得る。本明細書において説明するタンパク質性及び非タンパク質性の作用剤の両方は、任意の他のタンパク質性又は非タンパク質性分子と連結、結合、別の方法で関連付けられ得る。例えば、本発明の一実施形態においては、作用剤は、その局在化領域へのターゲティングを可能にする分子と関連付けられる。
【００６５】
「発現」という用語は、核酸分子の転写及び/又は翻訳を指す。「発現生成物」についての言及は、核酸分子の転写及び翻訳から生成した生成物についての言及である。
【００６６】
本明細書において説明する分子の「バリアント」は、天然又は合成で調製した、断片、部分、一部分又は誘導体を含む。非天然源は、例えば、組換え又は合成源を含む。「組換え源」は、IFNεが回収される細胞源が遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えば、その特定の細胞源による生成の速度及び体積を増大又は別の方法で向上させるために、起こり得る。部分又は断片は、例えばIFNεの活性領域を含む。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失又は置換に由来し得る。アミノ酸挿入誘導体は、アミノ及び/又はカルボキシル末端融合並びに単一又は多数のアミノ酸の配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列バリアントは、1つ又は複数のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されたバリアントであるが、ランダム挿入もまた、得られた生成物の好適なスクリーニングにより可能である。欠失バリアントは、配列からの1つ又は複数のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。置換アミノ酸バリアントは、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたバリアントである。アミノ酸配列への付加は、上記に詳述する通り、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合を含む。
【００６７】
また、バリアントは、ペプチド、ポリペプチド又は他のタンパク質性若しくは非タンパク質性分子に融合した、IFNεタンパク質全体の特定のエピトープ又は部分を有する断片を含む。本明細書において企図する分子の類似体として、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質合成中のグリコシル化バリアント、側鎖への修飾、非天然アミノ酸の組込み及び/又はそれらの誘導体、並びに架橋、及びタンパク質性分子又はそれらの類似体にコンフォメーションの制約を課する他の方法の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
IFNεの「バリアント」又は「変異体」は、バリアント又は変異体が由来するIFNεの機能的活性(すなわち、直接又は間接的な抗がん活性)のうちの少なくとも一部を示す分子を意味すると理解されるべきである。変化又は突然変異は、任意の形態をとってもよく、天然であっても、非天然であってもよい。一実施形態においては、核酸をコドン最適化して、発現を向上し、且つ/又はIFNεタンパク質は、活性を最適化するためにアミノ酸変化を含有してもよい。一実施形態においては、バリアントは、2つ又はそれよりも多いIFNε分子のハイブリッドである。例えば、治療される対象の種に由来するIFNεは、別の種からのIFNεの性質を組み込むように改変してもよく、又はその逆でもよい。一例においては、マウスIFNεは、ヒト細胞に対してヒトIFNεより大きな活性を有し得る。それゆえ、非免疫原性にするためにヒトIFNεのエレメントを組み込むハイブリッドマウスIFNε(又はその逆)が産生され得る。
【００６９】
IFNε又はその核酸についての言及は、配列番号28若しくは32に対して少なくとも80%の類似性、又は配列番号27、29若しくは31に対して少なくとも80%の同一性を有するタンパク質配列を含む。少なくとも「80%」についての言及は、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%を含む。IFNεをコードする核酸のバリアントは、低厳格性条件下で配列番号27、29又は31の相補体にハイブリダイズする核酸を含む(図16も参照のこと)。
【００７０】
「類似性」という用語は、本明細書において使用するとき、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルでの、比較される配列間の正確な同一性を含む。ヌクレオチドレベルでの非同一性が存在する場合、「類似性」は、異なるアミノ酸をもたらし、それにもかかわらず、構造的、機能的、生化学的、且つ/又はコンフォメーション的レベルで互いに関連する配列間の相違を含む。アミノ酸レベルでの非同一性が存在する場合、「類似性」は、それにもかかわらず、構造的、機能的、生化学的、且つ/又はコンフォメーション的レベルで互いに関連するアミノ酸を含む。一実施形態においては、ヌクレオチド及び配列比較は、類似性よりむしろ、同一性のレベルで行われる。
【００７１】
2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語として、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性の割合」、「配列同一性の割合」、「実質的に類似」及び「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、少なくとも12であるが、頻繁には15〜18、多くの場合少なくとも25又はそれよりも多く、例えば30モノマーユニットである。2つのポリヌクレオチドは各々、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似する配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)、及び(2)2つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るので、2つ(又はそれよりも多い)ポリヌクレオチド間の配列比較は典型的に、「比較ウィンドウ」にわたり2つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定及び比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は典型的に、参照配列と比較される12の連続残基の概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウは、2つの配列の最適整列について(付加又は欠失を含まない)参照配列と比較して約20%又はそれよりも少ない付加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。比較ウィンドウを整列するための最適配列整列は、コンピュータで処理されるアルゴリズムの実行(GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA(Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージリリース7.0、Genetics Computer Group社、575 Science Drive Madison、WI、USA))によって、又は検査、及び選択される様々な方法のいずれかによって産生される最も良い(すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高いホモロジー割合をもたらす)整列によって行われ得る。また、例えばAltschulら(1997)Nucl. Acids. Res. 25:3389頁によって開示されているように、参照は、BLASTファミリーのプログラムについて行ってもよい。配列分析の詳細な説明は、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons Inc. 1994〜1998)のユニット19.3において見ることができる。
【００７２】
「配列類似性」及び「配列同一性」という用語は、本明細書において使用するとき、配列が、比較ウィンドウにわたりヌクレオチド毎の基礎又はアミノ酸毎の基礎で、同一であるか、又は機能的若しくは構造的に類似する程度を指す。したがって、例えば、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたり2つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基(例えばA、T、C、G、I)又は同一のアミノ酸残基(例えばAla、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及びMet)が両方の配列において起こる位置の数を決定して、適合した位置の数を産出し、比較ウィンドウ中の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で適合した位置の数を割り、結果を100倍して、配列同一性の割合を産出することによって計算される。本発明の目的のために、「配列同一性」は、DNASISコンピュータプログラム(ウィンドウズ（登録商標）用2.5版;Hitachi Software engineering Co., Ltd.社、South San Francisco、California、USAから入手可能)によって、ソフトウェアに付属の参照マニュアル中で使用される標準のデフォルトを使用して計算される「適合割合」を意味すると理解される。配列類似性に関しても、同様の解説が適用される。
【００７３】
本発明は、Ifnε核酸分子のバリアントに及ぶ。一般的に、バリアントは、低厳格性条件下でIfnε配列になおハイブリダイズする。
【００７４】
バリアントは、IFNεの機能活性(すなわち、直接又は間接的抗がん活性)のうちの任意の1つ又は複数を示す分子を含むIFNεの化学的及び機能的均等物を含み、その機能的均等物は、任意の源、例えば、化学合成された源又はスクリーニングプロセス、例えば天然生成物スクリーニングにより特定された源に由来し得る。例えば、化学的又は機能的均等物は、周知の方法、例えばコンビナトリアルケミストリー又は組換えライブラリーのハイスループットスクリーニング又は次の天然生成物スクリーニングを利用して設計及び/又は特定され得る。
【００７５】
例えば、小有機分子を含有するライブラリーをスクリーニングしてもよく、多数の特定の親基の置換を有する有機分子が使用される。一般的な合成スキームは、公開されている方法に従い得る(例えば、Buninら(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4708〜4712頁;DeWittら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909〜6913頁)。簡単に説明すると、各連続合成工程で、複数の異なる選択した置換基のうちの1つをアレイ中の選択した管のサブセットの各々に添加し、管のサブセットの選択は、ライブラリーの生成において用いられる異なる置換基のすべての可能な順列を産生するための選択である。1つの好適な順列計画は、米国特許第5,763,263号において概略されている。別の計画は、断片に基づく薬物設計を含む。
【００７６】
現在、生物学的に活性な化合物を探索するためにランダム有機分子のコンビナトリアルライブラリーを使用することに、興味が広がっている(例えば米国特許第5,763,263号を参照のこと)。この種類のライブラリーをスクリーニングすることによって発見されたリガンドは、天然リガンドを模倣若しくは遮断するか、又は生物学的標的の天然リガンドを妨害することにおいて有用であり得る。本文脈において、例えば、それらは、より強い薬理学的効果等の特性を示すIFNε類似体を開発するための開始点として使用してもよい。IFNε又はその機能的部分は、本発明に従って、様々な固体相又は溶液相合成法によって形成される組合せライブラリーにおいて使用してもよい(例えば米国特許第5,763,263号及びその中で引用される参考文献を参照のこと)。米国特許第5,753,187号で開示される技術等の技術の使用によって、数百万の新しい化学的及び/又は生物学的化合物が、数週間未満のうちにルーチンにスクリーニングされ得る。特定された多数の化合物のうち、適切な生物学的活性を示す化合物のみを更に分析する。
【００７７】
ハイスループットライブラリースクリーニング法について、選択した生物学的剤、例えば生体分子、高分子複合体又は細胞と特異的に相互作用することができるオリゴマー又は小分子ライブラリー化合物を、周知の方法、例えば上述の方法の範囲から当業者により容易に選択されるコンビナトリアルライブラリーデバイスを利用してスクリーニングする。そのような方法においては、ライブラリーの各メンバーを、選択した作用剤と特異的に相互作用する能力についてスクリーニングする。方法の実行においては、生物学的剤を、化合物含有管に引き込み、各管中の個々のライブラリー化合物と相互作用させる。相互作用は、所望の相互作用の存在をモニターするために使用され得る検出可能なシグナルを生成するように設計する。
【００７８】
本明細書において企図されるIFNεの類似体として、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質合成中の側鎖への修飾、非天然アミノ酸の組込み及び/又は誘導体、並びに架橋、及び類似体にコンフォメーションの制約を課する他の方法の使用が挙げられるが、これらに限定されない。そのような修飾がとり得る特定の形態は、対象分子がタンパク質性であるか、非タンパク質性であるかに依存する。特定の修飾の性質及び/又は好適性は、当業者によってルーチンに決定され得る。
【００７９】
上述の通り、本発明は、IFNεがヒトとマウスIFNεとのハイブリッドである製剤に及ぶ。また、単独の、又は本発明の別の抗がん剤との組合せの、IFNε、又はその機能的な天然若しくは合成バリアント若しくはハイブリッド又はIfnε発現又はIFNε活性のインデューサーを含む製剤の投与は、医薬組成物と呼ばれ得る。そのような製剤は、任意の便利な手段によって調製され得る。製剤の成分は、特定の症例に依存する量で投与されたとき、抗がん活性を示すことが企図される。抗がん活性を達成するのに十分なIFNε又はバリアント、ハイブリッド若しくはインデューサーの量は、「治療有効用量」又は「有効量」として定義される。この使用のために有効な投与量スケジュール及び量、すなわち、「投薬レジメン」は、疾患又は状態の段階、疾患又は状態の重症度、患者の全体的な健康状態、患者の身体状態、年齢、医薬製剤及び活性剤(例えばIFNε)の濃度等を含む、様々な因子に依存する。患者のための投与量レジメンの計算においては、投与様式もまた考慮に入れる。また、投与量レジメンは、薬物動態、すなわち、医薬組成物の吸収速度、バイオアベイラビリティ、代謝、クリアランス等を考慮に入れなければならない。例えば、Egleton(1997)Peptides 18:1431〜1439頁;Langer(1990)Science 249:1527〜1533頁を参照されたい。広範囲の用量が適用可能であり得る。投与量レジメンは、最適治療応答を提供するように調節され得る。例えば、いくつかの分割した用量を毎日、毎週、毎月又は他の好適な時間間隔で投与してもよく、或いは用量は状況の危急によって示される通りに比例して低減してもよい。一例においては、10UI/用量〜1,000,000UI/用量の量が、対象当たり1週間に1〜3回投与され得る。投与量レジメンの例として、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100IU/用量、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000IU/用量又は103、104、105、106IU/用量が挙げられる。これは、1週間に1、2、3、4、5、6又は7回であり得る。また、用量は、IU/対象の体重kgに基づいて計算され得る。一実施形態においては、投与量は、任意の便利な手段によって与えられる。
【００８０】
注射用使用のために好適な医薬形態は、滅菌水溶液(水溶性)若しくは分散体、及び滅菌注射用溶液若しくは分散体の即席の調製のための滅菌粉末を含むか、又はクリームの形態若しくは局所適用に好適な他の形態であってもよい。それは、製造及び保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの好適な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えばコーティング、例えばレシチンの使用によって、分散体の場合必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらすことができる。加えて、活性剤は、ポリLリジンにカップリングするか、又はPEG化してもよい。
【００８１】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記に列挙する他の成分のうちの様々なものと共に、必要な量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散体は、様々な滅菌活性成分を、基礎的な分散媒体及び上記に列挙する成分からの必要な他の成分を含有する滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の、前に滅菌濾過した溶液から、その粉末を産出する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【００８２】
製剤は、便利な様式、例えば経口、腹腔内、静脈内、皮下、吸入、坐剤経路又は留置(例えば遅延放出分子を使用して)によって投与してもよい。製剤は、薬学的に許容される非毒性塩、例えば酸添加塩又は例えば亜鉛、鉄若しくはその他を伴う金属複合体(本出願の目的において塩として考えられる)の形態で投与してもよい。そのような酸添加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。活性成分が錠剤形態で投与される場合、錠剤は、結合剤、例えばトラガカント、トウモロコシデンプン又はゼラチン;崩壊剤、例えばアルギン酸;及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含有し得る。
【００８３】
本発明のIFNε又はそのバリアント、ハイブリッド若しくはインデューサーは、薬学的に許容される担体(賦形剤)と混合して、薬理学的組成物を形成し得る。薬学的に許容される担体は、本発明の医薬組成物の吸収又はクリアランス速度を、例えば安定化又は増大若しくは減少させるように作用する生理学的に許容される化合物を含有し得る。生理学的に許容される化合物は、例えば炭水化物、例えばグルコース、スクロース若しくはデキストラン、抗酸化物質、例えばアスコルビン酸若しくはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドのクリアランス若しくは加水分解を低減する組成物、若しくは賦形剤若しくは他の安定化剤及び/又は緩衝液を含み得る。また、リポソーム担体を含む、洗剤は、医薬組成物の吸収を安定化させるため、又は増大若しくは減少させるために使用され得る。ペプチド及びポリペプチドのための薬学的に許容される担体及び製剤は、当業者に公知であり、科学及び特許文献において詳述されている。
【００８４】
上述の通り、また、IFNεは、別の抗がん剤のアジュバントとして添加してもよい。この点においては、「医薬」は、単独の、又は別の抗がん剤との組合せの、IFNε又はそのバリアント若しくはハイブリッドを含む。
【００８５】
固体製剤は、経腸(経口)投与のために使用することができる。それらは、例えばピル、錠剤、粉末又はカプセルとして配合され得る。固体組成物については、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む、従来型非毒性固体担体を使用することができる。経口投与のために、薬学的に許容される非毒性組成物は、前に列挙する担体等の通常用いる賦形剤のいずれかを組み込むことによって形成される。また、非固体製剤は、経腸投与のために使用することができる。担体は、石油、動物、植物又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む、様々な油から選択することができる。好適な医薬賦形剤として、例えばデンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白墨、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、ポリエチレングリコール、水及びエタノールが挙げられる。
【００８６】
本発明の組成物は、経口投与される場合、消化から保護され得る。これは、組成物を、酸加水分解及び酵素加水分解に抵抗性にするための組成物と複合体形成させることによって、又は適切な抵抗性の担体、例えばリポソーム中にこれらの分子をパッケージングすることによって達成することができる。消化から化合物を保護する手段は、本分野で周知であり、例えば、治療剤の経口送達のための脂質組成物を説明している、Fix(1996)Pharm Res. 13:1760〜1764頁;Samanen(1996)J. Pharm. Pharmacol. 48:119〜135頁;米国特許第5,391,377号を参照されたい(リポソーム送達は、下記に更に詳細に説明する)。
【００８７】
また、本発明の組成物は、製剤を内部で送達することができる維持送達又は維持放出機構で投与することができる。例えば、生分解性ミクロスフェア又はカプセル又はペプチドの維持送達が可能な他の生分解性ポリマー構成は、本発明の製剤中に含まれ得る(例えばPutney(1998)Nat. Biotechnol. 16:153〜157頁を参照のこと)。
【００８８】
吸入のために、本発明の組成物は、乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、エアジェット噴霧器、噴射系等を含む、本分野で公知の任意の系を使用して送達することができる。例えばPatton(1998)Biotechniques 16:141〜143頁;例えばDura Pharmaceuticals社(San Diego、CA)、Aradigm社(Hayward、CA)、Aerogen社(Santa Clara、CA)、Inhale Therapeutic Systems社(San Carlos、CA)等による製品及びポリペプチド高分子のための吸入送達系を参照されたい。例えば、IFNε製剤は、エアロゾル又はミストの形態で投与することができる。エアロゾル投与のために、製剤は、界面活性剤及び噴射剤を伴った細かく分割された形態で供給することができる。別の態様においては、製剤を呼吸組織に送達するためのデバイスは、製剤が気化する吸入器である。他の液体送達系は、例えばエアジェット噴霧器を含む。
【００８９】
また、IFNεは、患者への肺又は呼吸送達に好適な薬学的に許容される組成物中に配合することができる。特定の製剤は、噴霧に好適な乾燥粉末、液体溶液又は懸濁液、及び計量吸入器(MDI)における使用に好適な噴射製剤を含む。そのような製剤の調製は、特許、科学及び医学文献において十分に説明されており、以下の説明は単に例であると意図される。
【００９０】
噴霧器系における使用のためのIFNεの液体製剤は、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤、等張調節剤、不活性ガス等を含む、化学的安定性を向上又は維持する成分を含み得る。
【００９１】
計量吸入器における使用のために、本発明のIFNεは、好適なエアロゾル噴射剤、例えばクロロフルオロカーボン(CFC)又はハイドロフルオロカーボン(HFC)中に溶解又は懸濁される。好適なCFCは、トリクロロモノフルオロメタン(噴射剤11)、ジクロロテトラフルオロエタン(噴射剤114)及びジクロロジフルオロメタン(噴射剤12)を含む。好適なHFCは、テトラフルオロエタン(HFC-134a)及びヘプタフルオロプロパン(HFC-227)を含む。
【００９２】
一実施形態においては、エアロゾル噴射剤への組込みのために、本発明のIFNεを、乾燥粉末製剤について以下に説明する呼吸用粒子に加工する。その後、粒子を、典型的にそれらの分散を向上させるために界面活性剤でコーティングして、噴射剤中に懸濁する。好適な界面活性剤として、オレイン酸、ソルビタントリオレート及び様々な長鎖ジグリセリド及びリン脂質が挙げられる。
【００９３】
そのようなエアロゾル噴射製剤は、低級アルコール、例えばエタノール(最大で30質量%)、並びに化学的安定性及び生理学的許容性を維持又は向上するための他の添加剤を更に含み得る。
【００９４】
乾燥粉末製剤は典型的に、乾燥、通常凍結乾燥形態中にIFNεを含み、粒径は、肺の肺胞領域内への沈着に好ましい範囲内である。好ましいサイズ範囲内のIFNεの呼吸用粉末は、様々な従来技術、例えばジェット製粉、噴霧乾燥、溶媒沈殿等によって生成することができる。その後、乾燥粉末は、粉末を分散させるためにデバイスを通る吸気を使用する従来型乾燥粉末吸入器(DPI)において、又は粉末をエアロゾル雲中に分散させるために外部電源を使用するエアアシストデバイスにおいて患者に投与することができる。上記説明において、「IFNε」についての言及は、そのバリアント、ハイブリッド及びインデューサーを含む。
【００９５】
本発明の医薬製剤の調製において、薬物動態及び生体分布を変更するために、様々な改変を使用及び操作することができる。薬物動態及び生体分布を変更するためのいくつかの方法は、当業者に公知である。
【００９６】
一実施形態においては、Ifnεの発現の誘導は、Ifnεの発現に直接的に影響を及ぼすことによって達成される。これは、Ifnεを含む遺伝子を有する構築物の、固形腫瘍中のがん細胞への直接的な導入によって達成することができ、これは、発現又は更には新規の発現に際してIFNε又はその活性バリアントのレベルの誘導を可能にし、それによってそれが方向付けられている生物学的機能に影響を及ぼす。それゆえ、組換え細胞又はウイルス手段を、がん細胞で、又はがん細胞の近辺で、又はがん細胞内で、IFNε又はそのバリアント、ハイブリッド若しくはインデューサーを産生するために用いてもよい。
【００９７】
本発明は、がんの治療における方法の組合せを更に企図する。例えば、IFNε治療、又はIFNεのバリアント若しくはハイブリッド若しくはインデューサーによる治療は、がん又はがんの影響を受けた器官若しくは組織の外科的又は化学的切除と組合せて使用してもよい。
【実施例】
【００９８】
本明細書において開示する態様を、以下の非限定的な実施例によって更に説明する。
【００９９】
方法
細胞株及び細胞培養
卵巣がん系ID8(マウス;Robyら(2000)Carcinogenesis 21(4):585〜591頁)をin vitroアッセイのために使用した。ID8細胞株を、4% v/v熱活性化ウシ胎児血清(FCS;GibcoBRL社)を補充したRPMI 1640(GibcoBRL社、Ontario、Canada)中で培養した。すべての細胞を、5% v/v二酸化炭素(CO2)の雰囲気中で37℃にて培養した。細胞は、MycoAlert(商標)PLUSマイコプラズマ検出キット(比<1;Lonza社、Basel)によりマイコプラズマ陰性であった。
【０１００】
遺伝子発現研究のための細胞刺激
細胞株を12ウェルプレート中に播種し(1.5×105個の細胞/ウェル)、24時間後に、再懸濁緩衝液(以下に説明する)又はPBSを媒体対照として、0〜1000IU/mlの組換えIFNε又はIFNβ(以下に説明する)で刺激した。その後、細胞を37℃で3時間インキュベートし、その後mRNA抽出した。
【０１０１】
mRNA抽出及び精製
QIAGEN RNeasyミニキット(Invitrogen社、USA)を使用して製造業者のプロトコールにより、RNAを抽出した(詳細なプロトコールについては付録Bを参照のこと)。細胞をベータメルカプトエタノール/RLT(1mlのRLT緩衝液当たり10μl-ME)中に回収し、1mLシリンジ及び23ゲージの針を使用して、各試料をシリンジ中に10回出し入れして細胞をホモジナイズした。QIAGEN RNase-free DNaseセット(Invitrogen社、USA)を使用して製造業者の指示書により、RNAをカラム上DNase処理した。その後、NanoDrop(登録商標)ND-1000分光光度計を使用して、RNA収率及び質を評価し(RNA純度について許容される範囲、2.0まで260/280比及び2.0〜2.2まで260/230比)、-80℃で保存した。
【０１０２】
cDNA合成
全部で500ngのRNAを、ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理したMilli-Q H2Oで7μlにした。その後、M-MLV逆転写酵素(Promega社、USA)を使用して製造業者の指示書により、RNAをcDNAに逆転写した。cDNA試料を、使用するまで-20℃で保存した。
【０１０３】
GAPDHポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
逆転写酵素の存在下又は非存在下(+/-RT)でのcDNA合成からの試料について、GAPDH PCRを行った。陰性RT試料についてGAPDH PCRによって産生した産物が存在しないことにより、ゲノムDNA汚染の存在が除外された。1μlのcDNAのアリコートを、5×緑色GoTaq緩衝液、塩化マグネシウム、フォワード及びリバースGAPDHプライマー、10mM dNTP、GoTaq酵素(Promega社、USA)に添加し、DEPC処理H2Oにより全部で25μlの体積にした。
【０１０４】
MyCycler(商標)サーマルサイクラー(BIO-RAD社)において、以下のサイクル反応条件:
【０１０５】
【化１】
2020506923.tif 000003
【０１０６】
を使用して、すべてのPCR反応を行った。
【０１０７】
次に、各PCR産物を、1.5% w/vアガロースゲル上にロードし、100Vで30分間流した。
【０１０８】
定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)
可能な場合、イントロンにかかるようにプライマーを設計した。これにより、cDNAバンドが、サイズに基づいてゲノムDNAから確実に区別され得る。Primer Express(登録商標)v3.0ソフトウェア(Applied Biosystems社、USA)を使用してプライマーを設計した。2μlのcDNA、5μlのSybr Green PCR Master Mix(Applied Biosystems社、USA)、関連するフォワード及びリバースプライマーの0.2μlの各10mMストック並びにDEPC H2Oを含む、全部で10μlにて、各反応を行った。すべての遺伝子増幅を、細胞内で安定に発現する内部対照遺伝子である18Sの発現について正規化した。試料をMicroAmp(商標)光学384ウェル反応プレート上に三重でロードし、MicroAmp(商標)光学接着フィルムにより密閉した。加えて、2つのRT陰性反応、及びDEPC処理H2OをcDNAに置き換えて使用した転写産物なしの対照を使用した。解離曲線の分析及びアガロースゲルの可視化によって、単一のPCR産物の増幅を確認した。プライマー配列のリストを、Table 2(表2)に提供する。
【０１０９】
【表２】
2020506923.tif 000004
【０１１０】
IFNεヌクレオチド及びアミノ酸配列
ヒトヌクレオチド(配列番号27)
ヒトアミノ酸(配列番号28)
マウスヌクレオチド(配列番号29)
マウスヌクレオチド(最適化)[配列番号30]
マウスヌクレオチド(配列番号31)
マウスアミノ酸(配列番号32)
rmIFNεのアミノ酸残基22〜27(配列番号33)
【０１１１】
7900HT Fast Real Time PCR機(Applied Biosystems社、USA)を使用して、以下のサーマルサイクリングプロトコール(50℃で2分間、95℃で10分間、続いて95℃で15秒間及び60℃で1分間を40サイクル)を使用して、すべての反応を処理した。すべてのプローブについてのサイクル閾値(Ct)の値をエクスポートし、2-ΔΔCT法を使用してデータ分析を行った。計算について、遺伝子増幅を、細胞内で安定に発現する内部対照遺伝子である18Sの発現について正規化した。その後、IFN処理後の倍変化の値を、非処理試料の値(1であった)と比較して表した。
【０１１２】
細胞成長アッセイ
リアルタイム細胞分析(RTCA)のためにxCELLigence系(ACEA Biosciences, Inc.社、San Diego、CA、USA)を使用して、細胞増殖を測定した。50マイクロリットルの細胞培養培地を96ウェルEプレート(ACEA Biosciences, Inc.社)中の各ウェルに添加し、インピーダンスバックグラウンド測定を行った。その後、細胞を、血清非含有培養培地中の100μLの体積に添加し(ID8-6×103個の細胞/ウェル、CAOV3及びOVCAR4-1×105個の細胞/ウェル)、一晩接着させた。組換えIFN又は媒体を細胞に添加し、最終体積を通常の培養培地で200μLにした。Eプレートを37℃で5% v/v CO2にてインキュベートし、処理あり又はなしで、RTCA系上で15分の時間間隔にて最長で72時間インピーダンスを測定した。データ分析のために、細胞含有ウェルについてのCIを培養培地のみを含むウェルのCIから引くことによって基線細胞指数(CI)を決定する。結果の統計評価を容易にするために、各ウェルからのインピーダンス測定を、IFNでの刺激時間について正規化し、「正規化細胞指数」と呼んだ。3つの独立実験を技術上四重で行い、RCTAソフトウェアを使用して、増殖速度を示す、成長曲線の倍加時間及び傾き(1/時間)について分析した。データを2元ANOVA及びシダックの多重比較検定を使用して分析した。****p<0.0001、***p<0.001。
【０１１３】
移動アッセイ
シングルセル追跡のために、48ウェルプレート中に2.5×104個の細胞/ウェルで血清非含有培地中にID8細胞を播種し、一晩接着させた。スクラッチアッセイのために、48ウェルプレート中にID8細胞を播種し、コンフルエンスに到達させた。P10フィルター(Axygen Scientific社、California)の先端を使用して被覆されたウェルをスクラッチした。CellTrace(商標)CFSE細胞増殖キット(ThermoFischer Scientific社、Massachusetts)を使用して製造業者の教示により細胞を染色し、その後、PBS中で洗浄し、組換えIFNで処理した。共焦点顕微鏡を使用して30分毎に12時間、蛍光画像を捕え、Imarisソフトウェアを使用して分析した。シングルセル追跡のために、蛍光により個々の細胞を追跡して、各細胞が移動した全距離(長さ追跡)及び各細胞の最初の位置から最後の位置までの直接置換長(置換追跡)を12時間にわたり測定した。有意性は、技術上三重で播種した2.5×104個の細胞が移動した平均距離を比較するスチューデントT検定によって決定した。スクラッチアッセイについては、12時間にわたるスクラッチ(空の空間)の閉鎖の表面積の割合として細胞移動を測定した。有意性は、1元ANOVA及びテューキーの多重比較法によって決定した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。
【０１１４】
アポトーシスアッセイ
12ウェルプレートにおいて2ml中にID8細胞を播種し(3.5×104個の細胞/ウェル)、一晩接着させた。細胞を組換えマウスIfnε又は媒体対照により48時間刺激した。1〜5mMの過酸化水素(H2O2)を、アポトーシス誘導の陽性対照として使用した。刺激後、細胞をトリプシン処理し、PBS中で洗浄した。シングルセル懸濁液を、FITCアネキシンVアポトーシス検出キットII(BD Biosciences社、New Jersey)を使用して製造業者の教示によりFITCコンジュゲートアネキシンV及びヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、FACSCanto(商標)IIフローサイトメーター(BD Biosciences社)及びFlo-Joソフトウェアを使用してフローサイトメトリーにより分析した。アポトーシスの異なる期をi)生存細胞(FITC Annexin V-/PI-)、ii)アポトーシス初期(FITC Annexin V+/PI-)、iii)アポトーシス後期(FITC AnnexinV+/PI+)及びiv)壊死細胞(FITC Annexin V-/PI+)として定義した。
【０１１５】
免疫組織化学
ヒト卵管、マウス器官及び腫瘍試料を、10% v/v中性緩衝ホルマリン中で24時間固定し、その後、70% v/vエタノール中で洗浄し、パラフィン中に包埋した。組織を、4μmの厚さの切片にし、H&E、平滑筋アクチン(SMa)、サイトケラチン18(Ck18)及びIFNεについて染色した。簡単に説明すると、組織学的組織切片を脱パラフィン処理し、再水和した。10mMトリス/1mM EDTA(pH9.0)中で6分間の熱により抗原回復を行った。3% v/v過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害後、組織をCAS-Block[商標](ThermoFisher Scientific社)中で1時間遮断した。その後、組織を抗IFNε(1:200;Novus Biologicals社、Colorado)、抗SMa(1:100;Dako Omnis社、Santa Clara)、抗Ck18(1:50;Dako Omnis社)及びアイソタイプ対照としてのウサギIgG(1:200;Vector Laboratories社、California)又はマウスIgG1(1:37;Vector Laboratories社)と共に4℃で一晩インキュベートした。ビオチニル化抗ウサギ又は抗マウスIgG(両方とも1:250希釈;Vector Laboratories社)を同じ緩衝液中に希釈し、1時間インキュベートした。その後、スライドを0.05% v/v Tween/PBS中で洗浄し、アビジン及びビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ(VECTASTAIN(登録商標)Elite(登録商標)ABCキット、Vector Laboratories社)と共に製造業者の教示によりインキュベートし、再び洗浄した。その後、スライドをジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB;DAB+Substrate Chromogen System、Dako Omnis社)と共に製造業者の教示によりインキュベートした。切片をヘマトキシリンで45秒間対比染色し、その後脱水し、ジブチルフタレートポリスチレンキシレン(DPX;Merck社、Germany)を伴ってカバーガラス下に置いた。Imagescopeソフトウェアにおける陽性画素分析ツールを使用して染色強度を計算し、有意性を、マンホイットニー検定を使用して決定した。**p<0.01、****p<0.0001。
【０１１６】
免疫表現型検査
蛍光色素に直接的にコンジュゲートした1パネルのモノクローナル抗体を使用して表面抗原発現について研究したC57BL/Jマウスの腹膜灌流細胞から、シングルセル懸濁液を得た。非特異的結合を防ぐために、抗マウスCD16/CD32 FcγIII/II受容体遮断抗体(BD PharMingen社、California)により細胞表面受容体を遮断した。表面染色のために、蛍光色素標識抗体の様々な組合せ:パネル1-APCコンジュゲートCD45、APC-Cy7コンジュゲートCD8、FITCコンジュゲートNK-1.1、PEコンジュゲートCD69、Pacific BlueコンジュゲートCD4;パネル2-APCコンジュゲートCD25、APC-Cy7コンジュゲートCD8、FITCコンジュゲートCD45、PEコンジュゲートPan CK、PE-Cy7コンジュゲートCD4及びPacific BlueコンジュゲートFoxP3;パネル3-APCコンジュゲートCD45、APC-Cy7コンジュゲートCD11b、FITCコンジュゲートLy6C、PEコンジュゲートI-Ab、PE-Cy7コンジュゲートCD11c及びPacific Blue Ly6Gにより細胞を染色した。FACSCanto(商標)IIフローサイトメーター(BD Biosciences社)及びFlo-Joソフトウェアを使用して細胞を分析した。
【０１１７】
細胞数測定ビーズアレイ(CBA)
Cytometric bead array(BD CBAマウス炎症キット;BD Pharmingen社)を使用して、ID8細胞を注射したマウス(以下の卵巣がんの腹腔内モデルを参照のこと)からの腹膜浸出細胞の上清中のサイトカインレベルを製造業者の教示により決定した。IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70又はTNF-αについての捕獲ビーズとサンドイッチ複合体を形成するPEコンジュゲート検出抗体を検出するために、フローサイトメトリーを使用した。FACSCanto(商標)IIフローサイトメーター(BD Biosciences社)及びFlo-Joソフトウェアを使用して、各サンドイッチ複合体についてのPE蛍光強度を得た。
【０１１８】
マウス
C57bl/6バックグラウンドのIfnε-/-マウス(Fungら(2013)上記)及び野生型マウス(Monash Animal Research Facility、Monash University、Clayton、Australia)を、標準の特異的病原体非含有(SPF)条件下で飼育した。
【０１１９】
嚢内(直交異方性)卵巣がんモデル
雌(10週齢)のC57BL/6野生型(Ifnε+/+)及びIfnε欠損マウス(Ifnε-/-)を、これらの実験において使用した。マウスを誘導チャンバー内でイソフルラン吸入(酸素中の5%)によって麻酔し、すべての手技中ノーズコーンにより送達する2.5〜3.0%イソフルランで麻酔を維持した。手術前にマウスにカプロフェン(5mg/kg)を皮下注射した。卵巣脂肪パッドの直ぐ上の背側正中位置で小切開を行い、腹膜壁を通して第2の小切開を行った。卵巣脂肪パッドを外に出し、バルクリップで安定化し、解剖顕微鏡を使用して、曝露した卵巣内の卵管を位置付けた。ID8細胞(1×106個)を左卵巣嚢の下に注射した。6/0縫合糸を使用して腹膜壁を縫合閉鎖し、その後、局所的ブピバカインを投与し、切開閉鎖を手術用ステープルで閉鎖した。その後3日間、鎮痛薬(カプロフェン5mg/体重kg)を飲料水中で与えた。体重、BCS1やせ(骨格構造が目立ち、椎体が突出している)、BCS2不十分な状態(脊柱の区分が明らかであるが、突出はしていない)及びBCS3良い状態(触診なしで脊椎は明らかでない)として定義されるボディコンディションスコア(BCS)並びに臨床徴候について、マウスをモニターし、ID8注射後13週目に処分した。死体解剖で、各マウスの全体的な広がり及び腫瘍負荷を考証し(腫瘍小結節の数、小結節沈着物の部位を記録し、写真撮影した)、腹膜から腹水液を抜き出して体積測定及び細胞カウントを行い、組織(脾臓、横隔膜、腹膜壁、腸間膜脂肪、雌生殖器系)を収集して質量測定及び免疫組織化学分析を行った。
【０１２０】
腹腔内(播種性)卵巣がんモデル
雌(6〜8週齢)のC57BL/6野生型(Ifnε+/+)マウスを、これらの実験において使用した。30ゲージの針を使用して、マウスに5×106個のID8細胞を腹腔内注射した。体重、BCS及び臨床徴候についてマウスをモニターし、ID8注射後8週目に処分した。死体解剖で、各マウスの全体的な広がり及び腫瘍負荷を考証し(腫瘍小結節の数、小結節沈着物の部位を記録し、写真撮影した)、腹膜から腹水液を抜き出して体積測定及び細胞カウントを行い、組織(脾臓、横隔膜、腹膜壁、腸間膜脂肪、雌生殖器系)を収集して質量測定及び免疫組織化学分析を行った。
【０１２１】
腹腔内組換えIFN治療
腹腔内ID8細胞注射後3日目にIFN処置を開始した。マウスは、2〜500IU/注射の用量で1週間に3回腹腔内注射した組換えマウスIfnε、又は500IU/注射のIfnβ、又は媒体のいずれかを8週間受容した。死体解剖で、直交異方性「原発」腫瘍を、転移(横隔膜及び腹膜)、脾臓、腹水液(体積及び細胞カウント)及び腹膜灌流と共に収集し、試料を計量し、写真撮影し、免疫組織化学分析のために処理した。
【０１２２】
組換えIFN生成
マウス
muIFNεの生成及び精製
IFNε遺伝子及びバキュロウイルスを含有する組換えバクミドの産生及びPCRスクリーニングを、他で説明する通りに行った。簡単に説明すると、PCR陽性コロニーを拡張し、EndoFree Maxi-Prepキットを使用して製造業者の教示(Qiagen社)により組換えバクミドを単離した。Sf9昆虫細胞への精製バクミドのトランスフェクションによって、組換えバキュロウイルスを産生し、高タイターバキュロウイルスを産生した。IFNεを可溶性タンパク質として発現させ、培養培地に分泌させた。
【０１２３】
説明される通り、昆虫細胞発現上清を遠心分離によって細胞除去し、1mMの最終濃度でフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を補充し、その後、TBS(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8.0)に対して12.5kDaカットオフ透析管(Sigma-Aldrich社)を使用して4℃で一晩透析した。0.8μmシリンジ駆動フィルター(Sartorius社)を通した透析液の濾過によって微粒子を除去した。10mgの抗IFNε抗体を1mlのAminoLink Plus樹脂に製造業者の教示(Thermo Scientific社)によりカップリングすることによって、抗IFNεモノクローナル抗体アフィニティカラムを調製した。このカラムに濾過物を適用し、次に、カラムをカラム体積(CV)の5倍のTBSにより洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去し、0.5倍CV画分中の0.1MグリシンpH3.0によりrIFNεを溶離した。収集した画分を1/10倍CVの1M Tris-HCl pH8.0により即座に中和し、10×TBS(100mM Tris-HCl、1.5M NaCl、pH8.0)の添加により緩衝液交換した。280nmの吸光度によって決定したタンパク質含有画分に、10% v/vグリセロールを更に補充した。次に、精製IFNεを、10% v/vグリセロールを含有するTBS pH8.0を使用して、AKTA PrimePlus(GE Healthcare社)に接続したS75 10/30サイズ排除カラム(GE Healthcare社)上でのゲル濾過によって更に精製した。精製画分を濾過滅菌し、4℃で保存するか、又は-80℃での長期保存のために液体窒素中で急速凍結した。
【０１２４】
ヒト
細菌系を使用したhuIFNεの生成
ヒトIFNε(タグなしネイティブ187残基配列)を、大腸菌(Escherichia coli)BL21(DE3)においてpET-28a発現ベクター(Novagen社)から発現した。新しく形質転換した細胞のシングルコロニーを、50μg/mLのカナマイシンを含有するL-Brothに接種した。培養物を、250rpmで一定振盪しながら37℃にて一晩成長させた。16時間後、細胞培養物を、50μg/mLのカナマイシンを含有する新しいL-Brothで50倍希釈した。混合物を37℃で振盪しながら、光学密度(OD600)が0.6〜0.8に達するまでインキュベートし、そこで細胞を1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。細胞を3時間成長させ、その後5000gで15分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを更なる使用まで-20℃で凍結した。
【０１２５】
マウス及びヒトIFNε生成は、最適化コドン発現によって向上してもよい。例は、配列番号28〜32に示す。また、コドン最適化は、アミノ酸を置換、付加又は欠失するために使用して、IFNε活性及び/又は安定性、例えば血清半減期を向上してもよい。
【０１２６】
封入体の調製
凍結細胞を室温で30分間解凍した。細胞ペレットの各グラムを、10mMジチオスレイトール(DTT)、5mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)及び0.5% w/v complete Miniプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche社)を添加した10mLのBugBuster Master Mix(Merck Millipore社)により再懸濁し、穏やかに攪拌しながら室温で2時間インキュベートした。溶解物を30000gで20分間遠心分離し、上清を捨てた。次に、封入体(IB)を、すべて10mM DTT及び5mM EDTAを含有する異なる緩衝液(IBの各グラムについて70mL):(1)1:10希釈したBugBuster Master Mix(及びMilliQ水)、(2)10mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)緩衝液pH8.0並びに150mM NaCl及び2M尿素、(3)10mMトリス緩衝液pH8.0並びに150mM NaCl及び5% v/v Triton X-100を使用して多数回洗浄した。各洗浄後、30000gで20分間遠心分離して、上清を除去した。その後、IBを、10mMトリスpH8.0及び150mM NaCl(IBの各グラムについて70mL)で2回洗浄して、生成物中のEDTAを除去した。その後、IBを、6Mグアニジン塩酸塩(Gdn-HCl)pH7.4、100mM Na2HPO4及び10mMトリスを含有する緩衝液を使用して、一定攪拌下で低温室にて一晩可溶化した。得られた混合物を30000gで20分間遠心分離し、溶液を0.2μm濾過した。
【０１２７】
huIFNεのリフォールディング
DTTを5mMの濃度で、変性したhuIFNε溶液に添加し、混合物を室温(25℃)で軽度の攪拌下にて2時間インキュベートした。その後、混合物を4℃まで冷却し、その後それを、穏やかに攪拌しながら4℃で50倍体積のリフォールド緩衝液(20mMリン酸緩衝液pH7.4、150mM NaCl、0.8M L-アルギニン(L-Arg)及び10μM CuSO4)に一滴ずつ添加し、リフォールディングを16時間進行させた。
【０１２８】
タンパク質精製
リフォールド混合物にEDTAを5mM濃度で添加し、リフォールド溶液のpHをpH6.0に調節し、その後、Vivaspin 200接線流フィルター(MWCO 10kDa)及びVivaspin 20濃縮器(MWCO 10kDa)の両方を使用して4℃でそれを濃縮した。その後、試料を、ゲル濾過(HiLoad 16/60 Superdex 200)を使用して、1.0mL/分の流速で、150mM NaCl及び0.8M L-Argを含有する20mMリン酸緩衝液pH6.0をランニング緩衝液として精製した。huIFNεを含有する画分を混合し、1mLの陰イオン交換樹脂(Q Sepharose fast flow)をそれに添加した。混合物を4℃で一定攪拌下にて18時間インキュベートした。その後、素通り画分を収集し、Vivaspin 20濃縮器を使用して濃縮した。
【０１２９】
ゲル電気泳動及びウェスタンブロット
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)及びウェスタンブロットを、Bolt Bis-Tris及び4〜12 %勾配ゲル(Life Technologies社)並びにBolt MOPS SDSランニング緩衝液(Life Technologies社)を使用して165Vで50分間行った。SDS-PAGE分析のために、クーマシーブルー溶液(0.25% w/vクーマシーブルーR-250、50% v/vメタノール及び10% v/v酢酸)で2時間ゲルを染色し、その後、40% v/vエタノール及び10% v/v酢酸を含有する溶液で脱色した。ウェスタンブロットのために、タンパク質バンドを、Immobilon-FLフッ化ポリビニリデン(PVDF)膜に、Bolt移行緩衝液(Life Technologies社)を使用して30Vで45分間移行した。膜をOdyssey遮断緩衝液(PBS)[LI-COR Biosciences社]中で室温にて1時間インキュベートした。緩衝液を捨て、1:500希釈のウサギポリクローナル抗huIFNε抗体(Novus Biological社)を膜上に添加し、4℃で16時間インキュベートした。その後、抗体溶液を除去し、膜を、0.1% v/v Tween20を含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4で3回洗浄した。1:1000希釈の抗ウサギIgG(H&L)(ヤギ)抗体IR染料800コンジュゲート(Rockland社)を膜上に添加し、室温で1時間インキュベートした。膜を、前のように0.1% v/v Tween20を含有するPBS pH7.4で洗浄した。ウェスタンブロット分析を、Odyssey赤外線撮像システム(LI-COR Biosciences社)を使用して700及び800チャネルの両方を使用して行った。
【０１３０】
エンドトキシン試験
カブトガニ血球抽出成分(LAL)試験を使用して、試料中のエンドトキシンレベルを試験した。試験系及び試薬をCharles River社から購入した。タンパク質試料を最初にLAL試薬水で1:10に希釈し、その後、エンドトキシン特異的緩衝液で更に1:10に希釈した。その後、試料をLALカートリッジ(生試料について感受性0.05〜5EU/mL)上にロードし、Endosafe-PTSを使用して吸光度を記録した。
【０１３１】
円二色性
ヒトIFNε試料を、500mM NaCl、5mM EDTA及び10% v/vグリセロールを含有する20mMリン酸緩衝液pH6.0中に調製した。円二色性(CD)実験を、Peltier温度制御水サーキュレーターを備えたJasco J-810分光計で25℃にて行った。1mm経路長の石英セル、3回の蓄積ランサイクル、1nmのバンド幅、0.1nmのデータピッチ及び1秒のデータ統合時間を使用して190〜250nmの範囲のスペクトルを測定した。データを、Jasco Spectra Managerを使用して分析した。
【０１３２】
huIFNε試料の生物学的活性(IU/ml)を、既知の活性のhIFNβタンパク質の連続希釈物に対する比較によって決定した。
【０１３３】
この系を使用してリフォールドしたhuIFNεの特異的活性(IU/mg)は、抗ウイルス保護アッセイ(EMCVによる感染からのWISH細胞の保護)から得た結果と一致し:このリフォールドしたタンパク質は生物学的に活性であり;huIFNεの特異的活性は、昆虫細胞発現系において発現したmuIFNεの特異的活性と同様の桁の活性であることを確実にする(Table 3(表3))。
【０１３４】
【表３】
2020506923.tif 000005
【０１３５】
このレポーター細胞株の使用は、huIFNεの生物学的活性の決定のための容易且つ経済的なアッセイを提供し、この活性を中和することができるモノクローナル抗体の特定を単純化するはずである。
【０１３６】
最終IFNε製剤は、in vivo及びiv vitro実験において「媒体対照」として使用した以下の緩衝液:ランニング緩衝液としての150mM NaCl及び0.8M L-Argを含有する20mMリン酸緩衝液pH6.0中に配合した。
【０１３７】
(実施例1)
卵巣がんにおけるIFNεの役割
マウス及びヒト腫瘍由来細胞株の両方を組換えIFNεにより処理した効果を評価し、他の従来型I型IFNによる効果と比較した。
【０１３８】
試験したマウス細胞株は、in vitro抗腫瘍効果とin vivo抗腫瘍効果との比較を可能にするためにin vivo実験(実施例2)に使用される、マウス卵巣上皮細胞株、ID8であった。
【０１３９】
また、様々なヒト卵巣がん細胞株に対するIFNεの効果を試験した。in vitroで卵巣がんを調査するために、OVCAR4及びCAOV3細胞を含むいくつかのヒト細胞株を使用した。これらは、腫瘍試料との系統的ゲノム比較がヒトHGSCに遺伝的に高度に類似することにより、高悪性度漿液性卵巣がん(HGSC)の代表として分類される細胞株である(Domckeら(2013)Nature Communications 4:2126頁)。使用した細胞株の各々は、高画分のゲノム変化、ユニバーサルTP53突然変異、及びタンパク質コード領域における他の体細胞突然変異が、たとえあるとしても、わずかであることを含むHGSCの基礎的な分子特徴を示し、したがって、in vitroでヒト卵巣がんを研究するための最も好適なモデルの一部を代表する。
【０１４０】
(実施例2)
IFNεはマウス卵巣がんID8細胞株に抗腫瘍効果を誘導する
目的は、卵巣がんのマウスモデルにおいてin vivoでのIFNεの抗腫瘍効果を特徴付けるためにID8細胞株を使用することであった。最初に、この細胞が実際にIFNεを含むI型IFNに応答し得ることを確認することが重要であった。ID8細胞を、in vitroで様々な用量の組換えIFNε又はIFNβのいずれかにより3時間刺激し、その後、3つのウェルの定量により、IFNにより調節される遺伝子(IRG)、cxcl10、isg15及びifit1(図1)を特徴付けた。IFNεは、IFNβ(IU/ml)と同様に、すべての3つのIRGの発現を用量依存的様式で有意に誘導し、したがって、これらの細胞がIFNεに応答し得ることが確認された。
【０１４１】
ID8細胞がIFNεに応答し得ることを確認したので、次に調査したことは、IFNεが、腫瘍関連特性、細胞増殖及びアポトーシスにおいて役割を有する、IRGがコードするタンパク質の発現を調節し得るかどうかであった。1000IU/mlのIFNεによるID8細胞の処理は、抗アポトーシス(bcl-2)及び増殖促進性機能(ccne1、cdc20)を有するタンパク質をコードするbcl-2、ccne1及びcdc20の発現を有意にダウンレギュレートすることが分かった(図2)。逆に、IFNεは、アポトーシス促進性タンパク質をコードする遺伝子であるIRG tap1及びcasp1の発現を有意に誘導した。それゆえ、これらのデータは、IFNεにより調節される遺伝子は、細胞周期、増殖及びアポトーシスに関連することを示す。
【０１４２】
次に評価したことは、細胞増殖のリアルタイムの標識なしモニタリングを可能にするXcelligence(登録商標)リアルタイム細胞分析(RTCA)系(Acea Biosciences社)を使用した、ID8細胞の増殖に対するIFNεの効果であった。それゆえ、30分毎のウェル中の細胞のインピーダンス読取りに基づいてIFNεで処理したID8細胞の増殖をモニターすることが可能であった。細胞が増殖するにつれて、インピーダンス読取り(細胞指数)は増大する。図2で明らかである通り、IFNε(図3A)又はIFNβ(図3B)による処理に際して細胞指数における用量依存的差がある。
【０１４３】
このソフトウェアから、この減少は、成長速度を示す2つの異なる測定:(1)細胞の倍加時間;及び(2)細胞の成長曲線の傾きを使用して細胞増殖を定量し得る。IFNε処理は、IFNβについて観察されたことと同様に、用量依存的様式でID8細胞の倍加時間を増大したことが分かった(図4A及び図4B)。また、IFNε又はIFNβによる処理後に、ID8細胞の成長曲線の傾きにおける減少が観察された(図4C)。それゆえ、IFNε処理は、マウス卵巣がん細胞株の増殖を有意に阻害し得る。
【０１４４】
IFNε処理が、ID8細胞株の増殖を減少させ得ることを観察したので、次に分析したことは、IFNεがどのように腫瘍細胞の転移に影響を及ぼし得るかの表示としての、細胞移動に対する効果であった。これを行うために、蛍光細胞染料(CellTrace(商標)CSFE、ThermoFisher Scientific社)を使用して、スクラッチアッセイ中のID8細胞移動を染色及び追跡した。この分析方法を使用して、ID8細胞が12時間の期間にわたりコンフルエントから開放空間へ移動するときの「スクラッチ」の閉鎖に基づいて、ID8細胞の移動割合を計算した。IFNεによる12時間の細胞の処理は、ID8細胞のスクラッチ閉鎖(又は移動)割合を有意に減少させ、それによって、IFNεが、ID8細胞の転移潜在性を示唆し得るID8細胞運動性の腫瘍関連in vitro活性に影響を及ぼすことを示し得ることが分かった(図5)。
【０１４５】
IFNεがID8細胞増殖、運動性及び移動を阻害することが観察されたので、次に評価したことは、IFNεがID8細胞のアポトーシスを誘導し得るかどうかであった。これを行うために、処理した細胞のアネキシン/PI染色をFACS分析で使用して、末期の細胞がアポトーシス初期若しくは後期にあるか、又は壊死しているかを特定した。IFNε処理は、アッセイにおいて生細胞数を約40%減少させることが分かり、更なる分析に際して、アネキシンVのみ並びにアネキシンV及びPIの両方について陽性の細胞染色によってそれぞれ示される通り、これらの細胞はアポトーシス初期及び後期にあることが分かった。重要なことに、評価したどの用量のIFNεでも壊死は観察されなかった。このFACS分析からのデータを、図6に要約する。
【０１４６】
(実施例3)
卵巣がん発達:患者試料におけるIFNεの調節不全
卵巣がん患者試料における免疫組織化学を使用して、卵巣がん患者に対して健康な人におけるIFNε発現をアッセイした。組織切片を組織マイクロアレイ(TMA)にフォーマットして、染色間の実験誤差を最小限にした。得られた健康な卵管対照試料からの切片を染色し、卵巣がん患者と並列して染色する対照組織ブロックを産生することによって、IHC分析を開始した。IFNεは、健康な卵管の上皮において高度に発現していることが分かった。対照として、上皮をサイトケラチン18で、及び下にある間質細胞を平滑筋アクチン(SMA)で染色した。
【０１４７】
健康な対照卵管のこれらの切片を使用して、卵巣がん患者生検TMAと並列した並列同時染色のための、1ブロック当たり最大で8個の試料を含有する対照ブロックを産生した。これらのTMAは、106人の患者からの高悪性度漿液性癌、低悪性度漿液性癌、良性過形成及び境界上皮の生検を含有する。IFNε発現は、対照良性上皮と比較して漿液性癌試料において有意に抑制されていることが分かった(図7)。
【０１４８】
(実施例4)
卵巣がん発達におけるIFNεの役割及び治療利益:マウスモデル
卵巣がんの腫瘍発生における内因性IFNεの役割を調査した。
【０１４９】
C57BL/6野生型及びIfnε欠損マウスの左卵巣嚢に、ID8細胞を注射した。注射後13週目で、これらのマウスは大きな直交異方性腫瘍、並びに腹膜壁、横隔膜、脾臓及び腸間膜上の転移沈着物と関連付けられる腹腔内の特徴的な血性腹水を発達した。重要なことに、この疾患の広がりのモデルは、ヒト後期卵巣がんの進行及び転移の特徴である。13週で、これらのマウスは進行期の疾患を発症し、続いてWTとIfnε-/-マウスとの間でこのときに原発腫瘍サイズの差は見られなかった(図8)。代わりに、脾腫(図8B)、腹水体積(図8C)、転移性腹膜沈着物の数(図8D)及び抜き出した腹水液中の赤血球(図8E)を含む、より進行した播種性疾患に向かう傾向がIfnε欠損マウスにおいて観察された。原発腫瘍及び転移性沈着物を、免疫組織化学分析のために収集した。ヘマトキシリン及びエオシン染色は、散在性線維芽細胞様細胞及び脂肪組織を有する混合型腺形態、並びに横隔膜及び脾臓への侵襲を示した。これを、免疫細胞パネルについての多重化を使用して更に分析する。
【０１５０】
(実施例5)
播種性卵巣がんのモデルにおける組換えIFNε治療からの追加のデータ
IFNεはヒト卵巣がん細胞において抗腫瘍効果を誘導する
IFNεが、マウス卵巣がん細胞株に対して強い抗腫瘍効果を有することが示されたので、次に評価したことは、ヒト卵巣細胞株に対するその効果であった。上述の通り、CaOV3及びOVCAR4細胞はHGSCを代表するので、これらを選択した。
【０１５１】
最初に、これらの細胞株がI型IFN刺激に応答することを確認した。CaOV3及びOVCAR4細胞を、組換えヒトIFNεで処理した。刺激の3時間後にIRG誘導を測定した。両方の細胞株はI型IFN刺激に応答することが分かったが、異なる細胞株間で異なるIRG誘導が観察された。
【０１５２】
xCELLigence RTCA系を使用して、IFNε刺激がヒト卵巣がん細胞株の増殖を変えるかどうかを次に決定した。IFNεで処理したヒト卵巣がん細胞は、全体的に有意に低い細胞指数プロットを有し、倍加時間の増大を有し、それらの成長曲線の傾きは有意に低いことが分かった。この分析は、IFNε処理が、ヒト卵巣がん細胞株の増殖を減少したことを示す。このIFNεの抗増殖効果は、CaOV3及びOVCAR4において示された。
【０１５３】
健康なマウスにおける腹腔内組換えIFNε治療の免疫調節効果
健康なC57BL/6野生型マウス(6〜8週齢)を、組換えマウスIFNε又はIFNβ(500IU/用量)で腹腔内注射により毎週3回8週間、処置した。腹膜灌流により腹膜浸出細胞をPBS中に収集し、免疫細胞集団についてフローサイトメトリーを使用して分析した。IFNε治療は、CD8+T細胞(図9A)、CD4+T細胞の活性化(図9B)、炎症性単球(図9C)及びCD4+T細胞上のPD1発現(図9D)を含む、抗がん免疫において重要であることが知られている免疫細胞集団及びそれらの活性化状態を有意に調節することが分かった。
【０１５４】
播種性卵巣がんのモデルにおける腹腔内組換えIFNε治療の有効性
ヒト卵巣がんの転移性の広がり(横隔膜、腹膜壁及び腸間膜)、悪性腹水発達、脾腫及び貧血を正確に再現する進行した播種性卵巣がんのモデルのために、腹腔内ID8マウスモデルを使用した。C57BL/6野生型マウス(6〜8週齢)に、ID8細胞(1匹のマウス当たり5×106個の細胞)を腹腔内注射した。注射後3日目に、マウスは、腹腔内組換えIFNε又はIFNβ治療(500IU/用量毎週3回)を8週間開始した。IFNεで処置したマウスは、PBS対照マウス又はIFNβで処置したマウスより、腸間膜における腫瘍散在が有意に減少し、腹膜及び横隔膜沈着物がより少ないことが分かった。
【０１５５】
また、IFNεで処置したマウスは腹水発達を有意に低減し(図10A)、検出可能な腹水腫瘍細胞がより少なく(図10B)、赤血球含有量が減少し(図10C)、より進行していない疾患を示すことが分かった。これは、これらのマウスからの腹水液中で検出可能な炎症性サイトカイン、特にこの疾患において血管新生を促進することが知られているMCP-1(単球化学誘因タンパク質1)レベルの抑制と関連付けられた[図11]。図12は、播種性卵巣がんモデルにおけるIFNεによる腹膜領域免疫細胞調節についてのデータを提供する。
【０１５６】
結果は、図13〜図15に示す。
【０１５７】
図13
図13Aは、8週までにこのモデルは十分に進行して、(体重増加によって、及びマウスの処理に際して示される通り)びまん性腫瘍発達及び腹膜液の出血を有したが、しかしながら、この時点は進行した腹水発達直前のマウスであったことを示す。腹水発達をほとんど示さない非腫瘍所有対照と比較して、処置群のいずれも、有意な体重増加の差を示さなかった。しかしながら、高用量のIFNεを除くどの処置群も、それら自体の対照と比較して有意性へと向かう傾向がある。加えて、腫瘍所有処置群間で有意差が見られ、500IU IFNεで処置したマウスにおいて最も少ない量の疾患発症が示される。
【０１５８】
図13B、顕著な急勾配の曲線が、最後の2週間(週6〜週8)で見られる。この時点は、進行した腹水発達直前の疾患の進行を表す。高用量のIFNεで処置したマウスのみは、この期間中にそれらの非腫瘍所有対照よりも急勾配の成長速度を示さない。
【０１５９】
図13C、腫瘍所有マウスのいずれも、処置群間で有意差を示さなかったが、しかしながら、高用量のIFNεで処置したマウスを除いては、処置群のすべては、それらの非腫瘍所有対照と比較して有意により大きな外周を有した。この傾向は、抜き出した腹水体積によっていくらか反映される。
【０１６０】
図13Dは、8週の実験終点で各マウスの腹腔から抜き出した腹水液の体積を示す。高用量のIFNεで処置したマウスは、有意に低減した腹水発達を有する唯一の処置群(個々のマンホイットニー検定)、及びまだ腹水を発達していない腫瘍所有マウスでの唯一の処置群を構成した。すべての他の腫瘍所有マウスは、腹水を発達し始め、低用量のIFNε群から最も大きな体積が記録された(約3.5ml)。8週目に、これらのマウスはまだ、腹水発達の初期にある。
【０１６１】
図14
体重に対する腫瘍及びIFN処置の影響の評価、並びに貧血のいくつかの評価(足蒼白、腹水液中の赤血球カウント及び出血等級)。高用量のIFNεのみが、足蒼白及びRBCカウントに対して有意な効果を有した。
【０１６２】
図15
図15Aは、0〜4(0(疾患なし)、1(明らかな疾患がほとんどなく、探索に際して一部の小腫瘍沈着物)、2(明らかな腫瘍であるが、1つの沈着物に主に局在化する)、3(脾臓近くに発達した大きな腫瘍小結節及び腸間膜全体にわたる一部の沈着物)、4(脾臓近くの大きな腫瘍小結節が腸間膜全体を通して拡張し、数え切れないほど多い))に等級付けられる、腫瘍発達及び腸間膜全体にわたる広がりの程度を示す。高用量のIFNεで処置したマウスは、有意に少ない腸間膜領域に存在する疾患を有する唯一の処置群であった。
【０１６３】
図15B、高用量のIFNεで処置したマウスは、腹膜小結節が最も少なかった。
【０１６４】
図15C、高用量のIFNεで処置したマウスは、横隔膜小結節が最も少なかったが、しかしながら、PBS対照マウスにおける一部の変動性のために、この群の有意性は示されなかった。
【０１６５】
図15D、肝臓小結節は、他の部位(腹膜、横隔膜)ほど検出可能ではなかったが、しかしながら、高用量のIFNεで処置したマウスにおいては更に低減する傾向がある。
【０１６６】
図15Eは、モデルについての、腫瘍が二次部位にうまく接着してコロニー形成する機会がない、初期の時点である。(10週間行って、大規模な腹水発達を有した)第2のモデルにおいて、球状体は検出されなかった。球状体それ自体は、このモデルにおいてより進行していない疾患のマーカーとして働き得る。この現在のモデルにおいて、8週目の(しかしながら、最後のときよりはまだ前の)適度に進行した段階のために、検出されたこれらの小結節は非常に少なく、有意ではないが、高用量のIFNεで処置したマウスは、非結合球状体の最も高い保有率を示している。おそらく、IFNεがどのようにこの疾患の進行を妨げ得るかの別の指標である。
【０１６７】
図15F、腫瘍沈着物のうちの一部の様々なサイズを仮定して、これが腫瘍成長を破壊するIFNεの傾向を更に反映し得るかどうかを確認するために、マウス当たりの最も大きな単一の腫瘍小結節の表面積寸法を測定した。PBS対照におけるいくらかの変動性があったが(高用量のIFNεでp=0.06)、高用量のIFNεは、低用量のIFNεと比較して大きな小結節を有意に低減し、腫瘍成長における用量低減を示した。
【０１６８】
(実施例6)
高悪性度漿液性卵巣がんにおける卵管上皮IFNεの発現の低減は予後が悪いことと相関する
卵巣がんにおけるIFNεの役割の可能性を更に特定するために、多くのHGSCの推定上の起源細胞である(Kurman及びShih(2011)Human pathology 42:918〜931頁)、分泌上皮細胞(SEC)を含有するヒト卵管(FT)上皮におけるその内因性発現を特徴付けた。免疫組織化学を使用して、本発明者らは、SECを含む見かけ上すべての上皮におけるIFNε発現を示した。この発現パターンは、上皮マーカーであるサイトケラチン18の発現パターンと同様であり、非上皮組織を優勢に染色した平滑筋アクチン(SMa)とは対照的であった。この発現を、ヒトFT分泌細胞のトランスクリプトームデータセット及びIFNεの発現についての主要なFT上皮を分析することによって確認し、IFNεがこれらの細胞において高度且つ構成的に発現する唯一のIFNであることを示した。
【０１６９】
このIFNεの構成的発現は、正常FT上皮と比較して、ヒトHGSCにおいて有意に抑制されていた。これは、低悪性度漿液性癌(LGSC)及びHGSCにおいて定性的且つ定量的に発現の抑制を示したIFNεの組織マイクロアレイの染色によって示された。第2に、本発明者らは、93人の患者からのHGSC試料のオーストラリア卵巣がん研究群(Patchら(2015)Nature 521:489〜494頁)において有意に低いIFNε転写産物レベルを発見した。他のI型IFN、例えばIFNβは、正常及び腫瘍上皮において本質的に検出不能であった。第3に、本発明者らは、公的に入手可能な外部群である、卵巣がん及び非腫瘍組織の707個の試料のシンガポールがん科学研究所卵巣がんデータベース(Tanら(2015)Oncotarget 6:43843〜43852頁)からのマイクロアレイデータを分析することによってこれらの発見を確証した。これらの分析は、FT上皮におけるIFNεの発現及びHGSCにおけるその喪失を確認する。
【０１７０】
IFNε発現が、臨床結果に影響を有するかどうかを決定するために、93症例のHGSC AOCS群及び707症例のCSIOVDB群の両方についての臨床生存データを調べた。高IFNε発現HGSCは、両方の群において無増悪生存期間及び全生存期間の増大と相関することが決定された。合わせると、これらは、正常な上皮において構成的に発現する独特なI型IFNであるIFNεは、卵巣がんにおいて抑制され、その低レベルは予後が悪いことと相関することを示す。
【０１７１】
(実施例7)
IFNεは卵巣がんの同系同所性モデルにおいて強い抗腫瘍効果を有する
上記のデータは、IFNεが抗腫瘍特性を有することを意味し、これを示す任意の先行研究が存在しないので、本発明者らは、卵巣がんのin vivo同系同所性モデルにおけるIFNε活性を調査した(実施例4もまた参照のこと)。免疫応答性マウスの卵巣の嚢内空間にマウス卵巣がん細胞、ID8を注射する(Greenawayら(2008)Gynecologic oncology 108:385〜394頁)。このモデルは、嚢内の「原発」同所性腫瘍成長、並びに腹腔内の様々な段階及び位置の転移性の広がり及び成長に対する腫瘍細胞固有及び外的(免疫調節)機構による、IFNεの直接及び間接的抗腫瘍効果の評価を可能にする。
【０１７２】
組換えマウス(rmu)IFNεの腹腔内注射での処置は、用量依存的様式で、腹膜転移の成長を有意に抑制した。これは第1に、ヒト疾患の進行を緊密に模倣するモデルにおける、末期疾患の重要な特徴である、悪性血性腹水の発達において明らかであった。第2に、IFNεは、腸間膜における腫瘍負荷スコア及び腹膜全体にわたる転移の総数として定量した、腹腔全体にわたる転移性腫瘍沈着物を有意に低減した。第3に、また、IFNεは、進行期の疾患の別の徴候である腹腔内の出血を低減した。興味深いことに、腫瘍の広がりの著しい低減にもかかわらず、IFNεは、同所性原発腫瘍成長に対してほとんど効果を有さず、原発腫瘍サイズ又は質量におけるわずかな低減を有するのみであり、これは、有意性を示さなかった。これらの結果は、IFNεが明らかに抗腫瘍作用を有し、これらは卵巣がん転移に対するものであるという最初の実証を構成する。
【０１７３】
従来型I型IFNは、免疫細胞動員及び活性化によりそれらの抗腫瘍作用を発揮し得るので、このモデルにおいてこれらのパラメータのIFNε誘導を調査した。腫瘍所有マウスは、非腫瘍所有マウス(NT)と比較して、全白血球、CD4+、CD8+及びBリンパ球並びにNK細胞の数及び割合を増大した。「原発」及び転移性腫瘍負荷のすべてのパラメータと免疫細胞応答との手動の相関により、この免疫原性腫瘍モデルが、モデルにおける疾患進行と強く相関する高レベルの免疫細胞によって示される、ホスト防御を誘発したことが強調された。重大なことに、全免疫細胞数は、処置群間の差よりもむしろ、疾患の存在をより反映したが、IFNεで処置したマウスは、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞及びB細胞上のCD69及びPD-1の誘導によって示される、有意に高い割合の活性化免疫細胞及びチェックポイント分子の発現を有した。実際に、IFNεによる疾患抑制は、CD4+CD69+PD1+T細胞及びB220+CD69+B細胞を含む、ある特定の細胞種の活性化と相関した。これらの結果は、腫瘍が有意な免疫細胞動員を誘発するが、これらの免疫細胞は、IFNε処置によって活性化されない限り、腫瘍負荷を除去することにおいて有効ではないように見えることを示す。したがって、本発明者らは初めて、新規I型IFNεがin vivoで強い抗腫瘍及び免疫活性化活性を有することを示す。
【０１７４】
より臨床的に関連する設定においてIFNεの抗腫瘍作用を示すために、本発明者らは、確立した腫瘍に対するその活性を調べ、従来型I型IFNであるIFNβに対して活性を比較した。注目すべきことに、(より確立した同所性腫瘍を形成させるための)4週間までのIFN処置の遅延開始は、全体的なIFNε有効性を減じなかった。遅延開始IFNε治療は、腸間膜腫瘍負荷、腹膜出血及び全体的な転移スコアから明らかなように、卵巣がんの腹膜の広がりを抑制したが;同所性「原発」腫瘍発達を抑制することにおいては無効であった。対照的に、遅延開始IFNβ治療を受容したマウスは、原発又は腹膜腫瘍負荷の低減を示さなかった。際立ったことに、また、IFNε処置は、CD4+及びCD8+T細胞並びにB細胞上のCD69及び、又はチェックポイント分子PD1を誘導する、大多数の腹膜免疫集団を活性化することにおいてIFNβより有意に有効であったが、両方のIFNはNK細胞を有意に活性化した。
【０１７５】
したがって、IFNεは、同等のユニットのIFNβよりももっと、発達中及び確立した卵巣がんの両方の腹膜の広がりに対して抗腫瘍活性を示し;更に、IFNεは、CD4及びCD8 T細胞及びNK細胞を含む免疫細胞、並びにチェックポイントマーカーの発現を活性化する。
【０１７６】
(実施例8)
IFNεは進行した卵巣がんのモデルにおいて腹水及び転移を抑制する
HGSCの大多数は、後期転移性疾患として存在するので、ID8細胞を直接的に腹膜に注射することによって、外因性IFNε処置の有効性を、この進行期の疾患を再現するモデルにおいて評価した。マウスは、腹膜全体にわたる広範囲の播種性腫瘍成長を示し、腹膜壁への、腸間膜全体にわたる、及び横隔膜上の、並びに血性悪性腹水等のヒトにおける卵巣がんの特徴的な広がりを模倣する、多数の器官上の腫瘍小結節の接着及び成長を伴った。IFNεでの処置は、このモデルにおいて腹膜腫瘍散在を有意に抑制し、腸間膜において腫瘍成長が低減し、横隔膜及び腹膜壁に接着した腫瘍小結節がより少なかった。加えて、IFNε処置マウスは、悪性腹水発達の低減を示し、それによって腹膜液は体積が低減し、出血は顕著により少なく、より少ない循環上皮腫瘍細胞しか含有しなかった。IFNε処置は、ケモカインMCP1(CCL2)等の、より低レベルの炎症性サイトカインレベルをもたらした。際立ったことに、IFNβの投与は、どの測定によっても腹水腫瘍成長に対して効果を有しなかった。
【０１７７】
本発明者らは、この進行した腫瘍モデルにおいて、全免疫細胞、例えば白血球、CD4+及びCD8+T細胞は、卵巣腫瘍細胞をi/p.注射したマウスにおいて進行期の疾患の存在と相関したが、これらの集団は処置群間で異ならなかったことを発見した。しかしながら、IFNε処置は、CD25又はCD69によって典型的に表されるこれらのマウスの腹膜における活性化CD4+及びCD8+T細胞の割合、並びにCD4 T細胞及びCD8 T細胞上のPD1誘導を有意に増大し、これは全体的な腫瘍負荷及び腹水発達における減少と相関した。
【０１７８】
(実施例9)
内因性及び外因性IFNεはin vivoで免疫細胞を調節する
上記の結果は合わせて、IFNεが卵巣がんの発達中のモデル、確率したモデル及び進行したモデルの腹膜の広がりに対して有効性を維持することを示すが、しかしながら、IFNβとは共有しないIFNεに特異的な作用機構は未知のままであった。従来型I型IFNは、腫瘍細胞に対して直接的に、又は免疫細胞を介して間接的に、抗腫瘍作用を発揮し得るので、本発明者らは、腫瘍の存在とは独立しているが、卵巣がん転移の部位である腹腔における、IFNεの今まで未知の固有のin vivo免疫調節効果を定義することを求めた。IFNε処置は、CD4+T細胞数を調節せず、CD8+CD4-細胞の小さいが有意な増大のみを示したが、PD1、CD69及びCD25のCD4細胞発現を活性化した。また、IFNε処置は、全腹膜白血球、炎症性マクロファージ及び樹状細胞を増大した。
【０１７９】
WT及びIFNε-/-マウスを比較することによって、腹膜において、この部位で腫瘍発達に対して影響を及ぼし得る内因性IFNεが免疫細胞を調節するかどうかを次に決定した。上記のデータと一致して、WTマウスと比較してIFNε-/-において腹膜白血球又は全T細胞の数において有意差はなかったが、NK細胞がより少なかった。更に、IFNεヌルマウスではより低い、NK並びにCD69及び、又はPD1を発現するCD4T細胞を含む活性化細胞のレベルの増大があった。これらの結果は、内因性IFNεが、免疫監視に好適な、ある特定の腹膜免疫細胞のレベル及び活性化状態を維持することを示す。
【０１８０】
(実施例10)
内因性IFNεは卵巣がん転移を抑制する
WT及びIFNε-/-マウスにおける同所性腫瘍発達及び散在を比較することによって、内因性IFNεが、腫瘍発生において役割を果たすかどうかを調査した。ID8留置後13週目までに、IFNε-/-マウスは、腹膜出血及び腹水蓄積、大きな小結節性同所性腫瘍並びに腹腔全体にわたる多数の転移性腫瘍沈着物を発達した。際立ったことに、腫瘍細胞は、すべての3つの測定による腹膜転移の増大によって示される通り、内因性IFNεの非存在下においてより容易に腹膜全体にわたり散在したが、「原発」同所性腫瘍成長は、同様の卵巣質量によって示される通り、WT及びIFNε-/-マウスにおいて同様であった。初期腫瘍発達におけるこの内因性IFNεの効果の理解を深めるため、本発明者らが、ID8留置後6週間のマウスにおける腫瘍負荷を比較すると、このとき、IFNε-/-マウスは、比較的小さい、より結節性でない同所性腫瘍を発達していた。しかしながら、本発明者らは、この初期段階ではWTとIFNε-/-マウスとの間で原発腫瘍質量の有意差がないことを示したが、IFNε-/-マウスにおいて、腹膜壁上の腫瘍転移の増大及び腹腔内に見られる全転移によって測定される通り、腫瘍散在及び転移性増殖の増大が示された。
【０１８１】
腫瘍留置後6週目に、IFNε-/-マウスは、非腫瘍所有(NT)遺伝子型対照と比較して、全白血球、CD4及びCD8白血球の数の増大を有し、この増大は、WTマウスにおいては見られなかった。このデータは、腫瘍の存在と内因性IFNεからの抑制性シグナルの非存在との組合せは、腫瘍成長の増大をもたらしたことを示す。重要なことに、IFNε-/-マウスは、CD69及びPD1を含むCD4及びCD8 T細胞上で発現したマーカーによって示される、WTマウスより有意に低い割合の活性化免疫細胞を有した。これらのデータは、腫瘍細胞留置の部位で内因性IFNεの非存在の有意な効果はなかったが、内因性IFNεシグナル伝達は、免疫細胞の活性化状態に影響を及ぼし、免疫細胞の腫瘍誘発流入を抑制することを示す。内因性IFNεシグナル伝達によって与えられるこれらの差は、腫瘍細胞の、腹膜全体にわたり散在し、腹膜組織上にマクロ転移を確立する能力に有意な影響を有する。
【０１８２】
(実施例11)
腹膜転移に対するIFNεの直接及び間接的抗腫瘍効果の区別
卵巣がんモデルにおける外因性及び内因性IFNεの作用機構を更に精査するために、本発明者らは、免疫細胞がI型IFNに応答し得ないIFNAR1を欠くマウス(Ifnar1-/-マウス)において、腫瘍発達を特徴付けた。ID8注射後8週目に、Ifnar1-/-マウスは、特徴的な腹膜出血、腹水蓄積、並びに腸間膜全体にわたる、及び腹膜壁に接着した小結節性腫瘍沈着物を示した。WTマウスと比較して、腫瘍所有Ifnar1-/-マウスにおいて、より進行した疾患のいくつかの徴候、特に、より多数の上皮腹膜腫瘍細胞、全腹膜白血球、CD4及びCD8細胞があった。加えて、腹水体積及び腹膜出血は増大する傾向があった。
【０１８３】
重大なことに、外因性IFNεは、Ifnar1-/-マウスにおける全体的な腫瘍転移性負荷を有意に抑制した。以前のデータと一致して、活性化細胞、例えばCD69陽性CD4細胞及びB220陽性細胞の割合は影響を受けず、これがIFNεの直接的な効果であることを示した。対照的に、CD4、CD8細胞の数は、Ifnar1-/-マウスにおいてそれでも外因性IFNεによって低減し、この効果は、腫瘍細胞を介して起こる(唯一のIFN応答性細胞が存在する)ことを示し、これは、抗腫瘍免疫細胞のレベルに対する外因性IFNεの間接的な免疫調節の役割を示す上記で産生したデータと一致した。
【０１８４】
全体的なこれらの結果は、第1に、おそらくIFNεによる、IFNAR1を介する内因性IFNシグナル伝達は、腫瘍発達を抑制することを示す。第2に、外因性IFNε処置の抗腫瘍有効性は、Ifnar1ヌルマウスにおいてそれでも明らかであり、腫瘍細胞に対するこのIFNによる直接的な作用を示す。
【０１８５】
(実施例12)
IFNεは卵巣がん細胞に対して固有の抗腫瘍活性を調節する
このモデルにおけるIFNε駆動腫瘍抑制の機構は、直接的な腫瘍固有の機構によることが示唆されているが、これらは、このIFNについて示されていない。それゆえ、本発明者らは、マウス卵巣がん細胞株ID8におけるin vitroでのIFNεの直接的な抗腫瘍効果のレパートリーを定義することを求めた。rmuIFNεによるID8細胞の処理は、免疫応答、PDL1、Tap1;細胞死、Casp1及びBcl-2;細胞周期、Ccne1及びCdc20、並びに走化性、Cxcl10を含む、がん関連生物学的経路に関連する遺伝子の発現を有意に調節した。組換えmuIFNεは、xCELLigenceを使用して測定した成長速度の減少及び倍加時間の延長によって示される通り、用量依存的抗増殖効果を示し、これは更にMTTアッセイを使用して確認された。加えて、muIFNεは、アネキシンV/PI染色の増大によって示される通り、これらの細胞におけるアポトーシスの増大を誘導した。まとめると、これらの結果は、マウス卵巣がん細胞が、がん関連経路に関連するIRGの誘導を含む、古典的なIFNシグナル伝達経路を通して組換えIFNεによる直接的な刺激に応答することを示す。また、そのような経路の調節は、in vitroでIFNεが、抗増殖効果及びアポトーシス促進効果を含む、固有の抗がん特性を有することを示す、機能アッセイと相関し、これは、それゆえ、上述のIfnarヌルマウスからの結果と一致するin vivoでのその作用機構の1つであり得る。
【０１８６】
マウスモデルからのこれらの表れがヒト卵巣がんと関連したことを強固にするために、及び卵巣がんを有する女性におけるIFNεの腫瘍抑制的役割の強固な臨床徴候を仮定して、及びこの比較的新しいサイトカインの抗腫瘍特性についての公開データがないことから、本発明者らは、ヒト卵巣がん細胞株に対するその直接的な抗腫瘍効果を試験した。組換えヒトIFNε(rhIFNε)を、ヒトHGSCの代表であることを以前に示した(Domckeら(2013)上記)、2つのヒト卵巣がん細胞株、CaOV3及びOVCAR4に対して使用した。最初に、本発明者らは、これらの細胞が、rhIFNε刺激に直接的に応答性であり、これは、IFNβと同様に、古典的なIRG、例えばISG15及びIFIT1の用量依存的誘導を誘発することを示した。したがって、これらのデータは、rhIFNεが古典的なI型IFNシグナル伝達を発揮したことを示したので、本発明者らは、機能アッセイを使用して抗腫瘍効果を決定し;結果は、rhIFNεが細胞増殖を調節し、ヒト卵巣がん細胞の増殖を直接的に抑制することを示した。IFNεは、倍加時間によって測定される通り、両方の細胞株に対して有意な用量依存的抗増殖効果を48〜72時間にわたり有した。これらの結果は、IFNεは、前臨床動物モデルにおいて示される通り、腫瘍細胞固有の経路を調節することによってHGSCにおける生存を延長し得ることを示す。
【０１８７】
(実施例13)
実施例1〜12の要約
インターフェロンイプシロン(IFNε)は、I型IFNクラスターにおける遺伝子によってコードされるI型IFNであり、従来型IFNAR受容体を介してシグナル伝達し、独特に調節され、女性生殖器系(FRT)を感染から保護することにおいて重要である。
【０１８８】
卵巣がんの抑制におけるIFNεの役割の前後関係は独特である。それは、危険シグナルによって誘発され、一過的に発現して、過剰な存在又は存在の維持のための毒性の可能性を更に避けるために有効である典型的な急性相タンパク質である従来型I型IFN(卵巣がん治療において不成功に終わったことが証明され、現在の研究において有効でないα、β等)とは異なる。IFNεは、FRT上皮において構成的、且つ一定に発現し、危険シグナルによって調節されないが、ホルモン及び他の「発達性」因子によって調節される。本発明者らは、実施例1〜12において、ヒト及び前臨床動物モデルを組み合わせて、IFNεのがん、及び特に高悪性度漿液性卵巣がん(HGSC)抑制の最初の証拠を示す。
【０１８９】
(1)IFNεは、卵管上皮におけるHGSCの推定上の起源細胞において発現した;
(2)IFNε発現は、HGSCにおいて低減した;
(3)IFNε発現の低減は、予後が悪いことと相関した
を示す、これらのがんにおけるIFNεの関与の証拠が得られる。
【０１９０】
同系同所性マウスモデルを、免疫応答性マウスにおけるIFNε抗腫瘍作用を定義するために使用し、作用機構を特徴付ける遺伝的アプローチを可能にし、マウス及びヒト卵巣がん細胞株における研究によって補完し、
(4)IFNε-/-マウスにおけるIFNεの喪失は、腫瘍発達の増大を引き起こした;
(5)機構的に、IFNAR1欠損マウスを使用して、本発明者らは、IFNεが腫瘍細胞に対して直接的に作用することを示し、in vitro研究は、IFNεが増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、PDL1のような免疫調節性表面分子及びケモカイン発現を誘導することを示した;
(6)IFNεは、腹膜転移(この疾患を有する女性における主要な問題)の抑制において特に有効であった;
(7)発達中のがん、確立したがん及び進行したがんに対する抗腫瘍作用(治療的可能性);
(8)IFNεは、腹膜免疫細胞活性化及びPDL1発現を調節する(したがって、免疫治療との組合せ)
を示した。
【０１９１】
したがって、本発明者らは、この別個のIFNは、卵巣がん進行の抑制において、以前には未知であった役割を有することを示す。その発現レベルの低下は、予後が悪いことと相関し、IFNε治療についての症例を示し、その可能性は、それが発達中の腹膜転移、確立した腹膜転移及び進行した腹膜転移を有するがんを阻害した前臨床モデル研究によって確認される。IFNεの独特な特性のために、FRTがんの内因性サプレッサーとしての目的にそれは適合する。更に、IFNεによる腫瘍細胞上のPDL1の誘導は、チェックポイント阻害による組合せ療法におけるその可能性を示す。
【０１９２】
(実施例14)
組換えマウスヒト(rm)IFNε及びヒト(hu)IFNεの発現及び生理化学的特徴付け
IFNεの生理化学的及び生物学的特性を特徴付けるために、以前に特徴付けられているI型IFNの場合と同様に、このタンパク質のシグナルペプチドがどこで切断されて成熟分泌タンパク質を産生したかを解明することが重要であった。Ifne1遺伝子を、CMVプロモーターの制御下で発現し、HEK293細胞に一過的にトランスフェクトした。これらの細胞からの上清は、SDS PAGE及び抗IFNεモノクローナル抗体による免疫ブロッティングによって検出される約20kDaのタンパク質を含有することが分かった。これらの上清からのIFNεの免疫沈降により、クーマシーで染色したSDS-PAGE上の約20kDaのバンドが可視化され、これはアイソタイプ対照抗体により免疫沈降を行った場合には見られなかった。この20kDaタンパク質のアミノ末端シークエンシングは、rmIFNεタンパク質(受託番号NP_796322)の残基22〜27を示す6つのアミノ酸残基「LEPKRI(配列番号33)」を特定した。この結果は、成熟IFNεポリペプチドは、公開されているrmIFNε(受託番号NP_796322)の配列のロイシン22で開始すること、及びそれゆえ、成熟タンパク質は、20,006Daの理論的分子量を有する(Gasteigerら(2003)Nucleic Acids Res 31:3784〜3788頁)ことを示した。
【０１９３】
物理化学的及び生物学的特徴付けのために、rmIFNεをバキュロウイルス発現系において生成し、抗IFNεモノクローナル抗体(Stifterら(2014)上記)とカップリングした免疫アフィニティクロマトグラフィーカラムを使用して精製した。SDS-PAGE及びウェスタンブロットによる精製タンパク質の分析は、rmIFNε(約20kDa)について予測されるサイズのタンパク質の存在を明らかにし、これは、抗IFNε抗体(クローンH3)により検出された。精製タンパク質を、円二色性(CD)スペクトル分析に供して、全体的なタンパク質フォールドを示した。平均残基楕円率(MRE)は、α-ヘリックスタンパク質、例えばIFNα及びIFNβの特徴的なプロファイルである208及び222nmでの最小値を示した。これらのデータは、昆虫細胞培養物から発現及び精製した約20kDaタンパク質は、他のI型IFNに典型的なα-ヘリックスフォールドを有したことを示す。
【０１９４】
表面プラズモン共鳴(SPR)のために、mIFNAR1-ECD及びrmIFNβを、それぞれ、以前に説明される通り(Stifterら(2014)Protein Expr Purif 94:7〜14頁)、哺乳動物細胞及び昆虫細胞培養物から発現及び精製し;mIFNAR2-ECDC94S及びrmIFNα1を、これもまた以前に説明される通り(de Weerdら(2013)上記)、哺乳動物細胞培養物から発現及び精製し;huIFNεを同様の様式で生成する。すべてのSPR実験を、ProteOn XPR36(Bio-Rad Labs社)上でHisタグ付きタンパク質のためのHTGチップ及びランニング緩衝液としてTBSを使用して行った。mIFNAR1-ECD及びmIFNAR2-ECDC94Sを、TBS中で25μg/mLに希釈した後、Hisタグを介してニッケル活性化チップに固定し、すべてのIFN(rmIFNα1、rmIFNβ及びrmIFNε)をTBS中で40nMから2μMに及ぶ様々な濃度に希釈した。すべてのデータは、製造業者の教示(Bio-Rad社)により参照し、ラングミュア結合モデルを使用して分析した。データは、カイ二乗値(測定値と適合値との間の誤差の測定値)が製造業者の教示(Bio-Rad社)によりRmaxの10%未満である場合にのみ、分析への包含を考慮した。ProteOn ManagerソフトウェアによってKa(1/Ms)、Kd(1/s)及びKD(nM)を計算し、少なくとも三重の実験からの平均値(+SD)として表す。1元ANOVA及びダネットの多重比較検定を使用して有意性を決定した。
【０１９５】
rmIFNεとmIFNAR1及び/又はmIFNAR2の細胞外ドメイン(ECD)の組換え形態との相互作用の速度論を評価するために、SPRを使用し、結果を他のI型IFN:rmIFNα1又はrmIFNβで得た結果と比較した。結果は、rmIFNεが、mIFNAR2-ECDについてrmIFNα1よりも低い結合アフィニティを有することを明らかにした。rmIFNα1-mIFNAR2-ECD相互作用のアフィニティは、以前に公開された研究(Jaitinら(2006)Mol Cell Biol 26:1888〜1897頁)と同様の1.68(+0.91)nM(10回の独立実験の平均値)であったが、mIFNε-mIFNAR2-ECD相互作用は、最大で2μMのrmIFNε濃度で測定可能でなかった。これらの濃度は、rmIFNεが、この受容体についてrmIFNα1よりも1,000倍超低いアフィニティを有することを示す。rmIFNβは、mIFNAR1-ECDについてrmIFNα1よりも大きなアフィニティを有するので(de Weerdら(2013)Nat Immunol 14:901〜907頁、Jaksら(2007)J Mol Biol 366:525〜539頁)、本発明者らは、rmIFNε-mIFNAR1-ECDの結合アフィニティをrmIFNβ-mIFNAR1-ECD相互作用の結合アフィニティと比較した。IFNAR1-ECDについてのrmIFNεのアフィニティを測定すると、556+239nM(n=9の独立実験)であり、2.45+1.41nM(n=10の独立実験)のrmIFNβ-IFNAR1-ECDの相互作用と比較して約200倍低かった。
【０１９６】
結果は、rmIFNεは、他のI型IFNと比較して、IFNAR1及びIFNAR2についてより低いアフィニティを示したことを示す。受容体係合後、IFNシグナル伝達の初期ステップは、シグナル伝達性転写因子(STAT)タンパク質の活性化であり、これは核に入って、インターフェロン調節遺伝子(IRG)のプロモーターにおけるインターフェロンにより刺激される応答エレメント(ISRE)に結合する。それゆえ、本発明者らは、rmIFNεが、STAT1の活性化を誘導し得るかどうか、及びSTAT1がISRE-及びIRGプロモーター駆動シグナル伝達レポーターに結合し得るかどうかを調査した。
【０１９７】
rmIFNεが、他のI型IFNのようにSTAT1を活性化するかどうかを決定することを求めた。3pmol/mlほどの少ないrmIFNεによるRAW264.7細胞の刺激後に、チロシン残基701上のSTAT1リン酸化は明らかであり、rmIFNβがrmIFNεより30倍低い用量である0.1pmol/mlでSTAT1のリン酸化を誘導した用量依存的様式で増大することが分かった。STAT1活性化の速度論がrmIFNεとrmIFNβとの間で異なるか、異ならないかを調査するために、10pmol/mlのいずれかのIFNでの刺激の5、15、30、60及び120分後に試料を採取した。STAT1リン酸化は、rmIFNε刺激の早くも5分後に起こり、刺激後15〜30分でピークに達し、60〜120分後に減少した。同様に、rmIFNβ刺激は、以前に公開される通り(Darnell(1997)Science 277:1630〜1635頁)、処理5分後にSTAT1リン酸化ピークをもたらし、120分後に減少することが分かった。これらの結果は、rmIFNεは、STAT1の迅速な活性化を誘導し得るが、rmIFNβによる刺激によって見られるのと同様のレベルの活性化を達成するためには、より高い用量が必要とされることを示す。
【０１９８】
本明細書において示すデータは、IFNεが、IFNAR2受容体については低いアフィニティを有するが、IFNAR1受容体についてはより高いアフィニティを有することを示す。rhuIFNεを、大腸菌において生成し、リフォールドする。全長hIFNε[1〜190]を、大腸菌BL21(DE3)からの封入体(IB)として発現した。細菌細胞を溶解し、IBを遠心分離によって単離した。その後、IBを、TritonX-100及び尿素を含有する様々な緩衝液を使用して十分に洗浄した。その後、IBを、グアニジン-HClを含有する緩衝液中に可溶化した。変性タンパク質を、金属触媒空気酸化法を使用して可溶化形態にリフォールドした。次に、hIFNεを、ゲル濾過を使用して精製した。また、マイクロスケール熱泳動(MST:microscale thermophoresis)を用いて、大腸菌発現huIFNεを使用してhuIFNAR2についてのIFNεアフィニティを決定した。アフィニティは、0.25+/-0.04nMのhuIFNβと比較して、8.187±839nMであると決定された。これは、高度なhuIFNε活性を示す。低減した量のhuIFNεが、IFNβを使用する毒性を低減するために投与され得るので、これは重要である。
【０１９９】
当業者は、本明細書において説明する開示は、具体的に説明する変形及び改変以外の変形及び改変を受けやすいことを理解する。本開示は、すべてのそのような変形及び改変を企図することが理解されるべきである。また、本開示は、本明細書において言及又は表示するすべての、個々の、又は集合的な工程、特徴、組成物及び化合物、並びに工程若しくは特徴又は組成物若しくは化合物の任意の2つ又はそれよりも多いもののうちの任意の、及びすべての組合せを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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