(57)【要約】  本明細書では、検体検出イムノアッセイを実施するための組成物、キット及び方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記競合物質と標的検体の両方が前記捕捉剤に結合可能である、工程と、
（ｂ）前記標識競合物質由来のシグナルを測定する工程であって、前記標識競合物質由来のシグナルが、（Ａ）前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、（Ｂ）前記試料中の標的検体の量に反比例する、工程と、それに続いて、
（ｃ）前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能である、工程と、
（ｄ）前記標識検出剤由来のシグナルを測定する工程であって、前記標識検出剤由来のシグナルが、（Ａ）前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、（Ｂ）前記試料中の標的検体の量に比例する、工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
イムノアッセイの工程（ａ）〜（ｄ）が、同一の試料において、同一の物理的位置で、同一の標的検体に対して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イムノアッセイが、既知量の標識競合物質及び未知量の標的検体を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｅ）前記標識競合物質由来のシグナル及び／又は前記標識検出剤由来のシグナルを、既知量の標的検体を用いて調整した基準値と比較して、前記試料中の標的検体の量を測定する工程、
を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｅ）前記標識競合物質由来のシグナルと前記標識検出剤由来のシグナルの比率を測定して無次元量を生成する工程、
を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
（ｆ）前記無次元量を、既知量の標的検体を用いて調整した基準比率と比較して、前記試料中の標的検体の量を測定する工程、
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標識競合物質及び前記標識検出剤が、検出可能に異なる標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標識競合物質及び前記標識検出剤が同一の標識を含み、工程（ａ）由来の前記シグナルが工程（ｂ）において実質的に検出されないように、工程（ａ）と工程（ｂ）の間に前記標識の阻害剤を添加する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識競合物質の標識が、検出可能な活性を有する酵素を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤が、前記酵素との基質結合を防止する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤が、前記酵素による基質代謝回転を防止する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的検体が、標的抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉剤が、前記標的抗体用のエピトープを提示する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識競合物質が、前記標的抗体用のエピトープに結合可能なＦ（ａｂ）2フラグメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出剤が、前記標的抗体のＦｃ部分に結合可能であるが前記Ｆ（ａｂ）2フラグメントには結合不能な抗Ｆｃ抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的検体を検出するためのイムノアッセイを実施するための試薬を含むシステムであって、
（ａ）前記標的検体が安定的に結合可能な捕捉剤を提示する表面と、
（ｂ）第１の検出可能標識を含み、前記捕捉剤に結合可能な標識競合物質と、
（ｃ）第２の検出可能標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記競合物質には結合不能な検出剤と、
を含む、システム。
【請求項１７】
前記表面が、スライドガラス、チューブの内側、プレート、又はマイクロウェルの内側である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記標的検体が、標的抗体である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記標的抗体が、治療抗体である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記捕捉剤が、前記標的抗体のエピトープを含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記競合物質が、前記標的抗体用のエピトープに結合可能なＦ（ａｂ）2フラグメントを含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記第１の検出可能標識が、蛍光色素、検出可能な活性を有する酵素、及び蛍光タンパク質から選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記第１の検出可能標識が酵素であり、前記検出可能な活性が発光である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
検出剤が、前記標的抗体のＦｃ部分に結合可能であるが前記Ｆ（ａｂ）2フラグメントには結合不能な抗Ｆｃ抗体を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２５】
前記第２の検出可能標識が、蛍光色素、検出可能な活性を有する酵素、及び蛍光タンパク質から選択される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記第１の検出可能標識が酵素であり、前記検出可能な活性が発光である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
前記第１の標識及び前記第２の標識が、検出可能に異なる標識である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記第１の標識及び前記第２の標識が同一の標識であり、前記システムが前記標識の阻害剤を更に含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記第１の検出可能標識及び前記第２の検出可能標識が、酵素である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記阻害剤が、前記酵素との基質結合を防止する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記阻害剤が、前記酵素による基質代謝回転を防止する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記捕捉剤が、標的抗体用のエピトープを含み、前記競合物質が、Ｆ（ａｂ）2フラグメント及び第１の検出可能標識を含み、前記標的抗体用のエピトープに結合可能である、工程と、
（ｂ）前記第１の検出可能標識由来のシグナルを測定する工程であって、前記第１の検出可能標識由来のシグナルが、（Ａ）前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、（Ｂ）前記試料中における標的検体の量に反比例する、工程と、
（ｃ）前記標識競合物質と前記捕捉剤に結合した前記標的抗体を有する前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、抗Ｆｃ抗体及び第２の検出可能標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能であり、前記第２の検出可能標識のシグナルが、前記第１の検出可能標識のシグナルと識別可能である、工程と、
（ｄ）前記第２の検出可能標識由来のシグナルを測定する工程であって、前記第２の検出可能標識由来のシグナルが、（Ａ）前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、（Ｂ）前記試料中の標的検体の量に比例する、工程と、
を含む、方法。
【請求項３３】
（ａ）標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記捕捉剤が、標的抗体用のエピトープを含み、前記競合物質が、Ｆ（ａｂ）2フラグメント及び第１の検出可能標識を含み、前記標的抗体用のエピトープに結合可能である、工程と、
（ｂ）前記第１の検出可能標識由来のシグナルを測定する工程であって、前記第１の検出可能標識由来のシグナルが、（Ａ）前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、（Ｂ）前記試料中における標的検体の量に反比例する、工程と、
（ｃ）前記第１の検出可能標識の阻害剤を添加する工程であって、前記阻害剤が、前記標識競合物質の前記第１の検出可能標識に結合して、前記標識競合物質の前記第１の検出可能標識に由来するその後のシグナル検出を防止する、工程と、
（ｄ）前記阻害標識競合物質と前記捕捉剤に結合した前記標的抗体を有する前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、抗Ｆｃ抗体及び第２の検出可能標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能である、工程と、
（ｅ）前記第２の検出可能標識由来の第２のシグナルを測定する工程であって、前記第２の検出可能標識由来の第２のシグナルが、（Ａ）前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、（Ｂ）前記試料中における標的検体の量に比例する、工程と、
を含む、方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）と工程（ｄ）の間に、前記試料中の非結合阻害剤を洗浄除去する工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の検出可能標識及び前記第２の検出可能標識が、同一タイプの標識である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月９日出願の米国仮特許出願シリアル番号６２／４５６，９０６の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書では、検体検出イムノアッセイを実施するための組成物、キット及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
リガンド結合アッセイ／イムノアッセイは、研究、診断、医薬品開発、環境モニタリングなどにおける検体検出用に日常的に使用されてはいるが、かなりの制約がある。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、検体検出イムノアッセイを実施するための組成物、キット及び方法を提供する。
【０００５】
一部の実施形態において、本明細書では、（ａ）標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤（immobilized capture agent）を提示する表面を試料に曝露すること（競合物質と標的検体の両方は捕捉剤に結合可能である）、（ｂ）標識競合物質由来のシグナルを測定すること（標識競合物質由来のシグナルは、（Ａ）捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、（Ｂ）試料中における標的検体の量に反比例する）、（ｃ）表面を標識検出剤に曝露すること（標識検出剤は標的検体に結合可能であるが標識競合物質には結合不能である）、及び、（ｄ）標識検出剤由来のシグナルを測定すること（標識検出剤由来のシグナルは、（Ａ）標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、（Ｂ）試料中における標的検体の量に反比例する）、を含む、試料中における標的検体（例えば、抗体）を検出／定量するための方法を提供する。一部の実施形態では、工程（ａ）〜（ｄ）は、同一の試料中における同一の標的検体に対して同一の物理的位置（例えば、同一のウェル、プレート上の同一の場所など）上で実施される。一部の実施形態では、既知量（例えば、濃度）の標識競合物質を使用する。一部の実施形態では、試料は、未知量（例えば、濃度）の標的検体を含む。一部の実施形態では、方法は、標識競合物質由来のシグナル及び／または標識検出剤由来のシグナルを既知量の標的検体（例えば、本明細書に記載のアッセイ中の）を用いて調整した基準値と比較して、試料中における標的検体の量を定量することを更に含む。一部の実施形態では、方法は、標識競合物質由来のシグナルと標識検出剤由来のシグナルの比率を定量することを更に含む。一部の実施形態では、方法は、無次元量を既知量の標的検体を用いて調整した基準比率と比較して、試料中における標的検体の量を定量することを更に含む。一部の実施形態では、標識競合物質及び標識検出剤は検出可能に異なる標識（例えば、レポーター酵素、蛍光体、放射性同位体、ナノ粒子など）を含む。一部の実施形態では、標識競合物質及び標識検出剤は同一の標識を含み、方法は、工程（ｂ）由来のシグナルが工程（ｄ）において実質的に検出されないように、工程（ｂ）と工程（ｃ）の間に標識の阻害剤を添加する工程を更に含む。一部の実施形態では、標識競合物質の標識は検出活性を有する酵素を含む。一部の実施形態では、阻害剤は酵素の検出活性を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は酵素との基質結合（substrate association）を防止する。一部の実施形態では、阻害剤は酵素による基質代謝回転を防止する。一部の実施形態では、標的検体は標的抗体である。一部の実施形態では、捕捉剤は標的抗体用のエピトープを提示する。一部の実施形態では、標識競合物質は、抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）2、ＳｃＦｃ、Ｆａｂなど）または抗体模倣分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アプタマー、ナノボディなど）を含む。一部の実施形態では、標識競合物質はＦｃ領域を欠いている。一部の実施形態では、標識競合物質は、標的抗体用のエピトープに結合可能な抗体フラグメントまたは抗体模倣分子を含む。一部の実施形態では、標識競合物質は生物発光レポーターに融合している。一部の実施形態では、Ｆ（ａｂ）2フラグメントは生物発光レポーターに融合している。一部の実施形態では、生物発光レポーターはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼの変異体である。一部の実施形態では、検出剤は、標的抗体のＦｃ部分に結合可能であるがＦｃ領域を欠く競合物質（例えば、Ｆ（ａｂ）2フラグメント）には結合不能な抗Ｆｃ抗体、抗Ｆｃ抗体フラグメントまたは抗Ｆｃ抗体模倣分子を含む。
【０００６】
一部の実施形態において、本明細書では、（ａ）標的検体が結合可能な捕捉剤を提示する表面、（ｂ）第１の検出可能標識を含み捕捉剤に結合可能な競合物質、（ｃ）第２の検出可能標識を含み標的検体に結合可能であるが競合物質には結合不能な検出剤、を含む、標的検体（例えば、抗体）を検出するためのイムノアッセイを実施するための試薬を含むシステムを提供する。一部の実施形態では、表面はマイクロウェルの内側である。一部の実施形態では、標的検体は標的抗体である。一部の実施形態では、標的抗体は治療抗体である。一部の実施形態では、捕捉剤は標的検体（例えば、抗体）のエピトープを含む。一部の実施形態では、捕捉剤は標的検体（例えば、抗体）の抗原である。一部の実施形態では、捕捉剤は、共有結合により、非共有結合（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン結合、吸着）により、または、表面上に固相化された抗体への結合を介して表面上に固相化されており、標的検体（例えば、抗体）よりも捕捉剤の別のエピトープに結合する。一部の実施形態では、競合物質は、標的検体（例えば、抗体）用のエピトープに結合可能な抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣分子を含む。一部の実施形態では、競合物質は、Ｆｃ領域を欠く抗体フラグメントまたは抗体模倣分子である。一部の実施形態では、競合物質は、標的抗体用のエピトープに結合可能なｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2またはその他のフラグメントを含む。一部の実施形態では、第１の検出可能標識は、蛍光色素、検出活性を有する酵素、及び蛍光タンパク質から選択される。一部の実施形態では、第１の検出可能標識は酵素であり、検出活性は発光である。一部の実施形態では、検出剤は、標的抗体のＦｃ領域に結合可能であるがＦａｂ領域には結合不能（例えば、Ｆｃ領域を欠くＦ（ａｂ）2フラグメントまたはその他のフラグメントもしくは分子には結合不能）な抗Ｆｃ抗体、抗Ｆｃ抗体フラグメントまたは抗Ｆｃ抗体模倣薬を含む。一部の実施形態では、第２の検出可能標識は、蛍光色素、検出活性を有する酵素、及び蛍光タンパク質から選択される。一部の実施形態では、第２の検出可能標識は酵素であり、検出活性は発光である。一部の実施形態では、第１の標識及び第２の標識は検出可能に異なる標識である。一部の実施形態では、第１の標識及び第２の標識は同一の標識であり、システムは標識の阻害剤を更に含む。一部の実施形態では、第１の標識及び第２の標識は酵素である。一部の実施形態では、阻害剤は酵素の活性を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、酵素基質が酵素の活性部位に接近することを防止する。一部の実施形態では、阻害剤は、酵素基質が代謝回転することを防止する。
【０００７】
一部の実施形態において、本明細書では、（ａ）標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露すること（捕捉剤は標的抗体用のエピトープを含み、競合物質はＦｃ領域を欠く抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）2フラグメント）または抗体模倣薬（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アプタマー、ナノボディなど）及び第１の検出可能標識を含み標的抗体用のエピトープに結合可能である）、（ｂ）第１の検出可能標識由来のシグナルを測定すること（第１の検出可能標識由来のシグナルは、（Ａ）捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、（Ｂ）試料中における標的抗体の量に反比例する）、（ｃ）表面を標識検出剤に曝露すること（標識検出剤は抗Ｆｃ抗体、抗Ｆｃ抗体フラグメントまたは抗Ｆｃ抗体模倣薬及び第２の検出可能標識を含み、検出剤は標的抗体に結合可能であるが標識競合物質には結合不能であり、第２の検出可能標識のシグナルは第１の検出可能標識のシグナルとは識別可能である）、及び、（ｄ）第２の検出可能標識由来のシグナルを測定すること（第２の検出可能標識由来のシグナルは、（Ａ）標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、（Ｂ）試料中における標的検体の量に反比例する）、を含む、試料中における標的抗体を検出／定量するための方法を提供する。
【０００８】
一部の実施形態において、本明細書では、（ａ）標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露すること（捕捉剤は標的抗体用のエピトープを含み、競合物質はＦｃ領域を欠く抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメント）または抗体模倣薬及び検出可能標識を含み標的抗体用のエピトープに結合可能である）、（ｂ）第１の検出可能標識由来のシグナルを測定すること（第１の検出可能標識由来のシグナルは、（Ａ）捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、（Ｂ）試料中における標的抗体の量に反比例する）、（ｃ）検出可能標識の阻害剤を添加すること（阻害剤は標識競合物質の検出可能標識に由来するその後のシグナル検出を防止する）、（ｄ）阻害標識競合物質と捕捉剤に結合した標的抗体を有する表面を標識検出剤に曝露すること（標識検出剤は抗Ｆｃ抗体、フラグメントまたは模倣薬及び検出可能標識を含み標的検体に結合可能であるが標識競合物質には結合不能である）、及び、（ｅ）検出可能標識由来の第２のシグナルを測定すること（検出可能標識由来の第２のシグナルは、（Ａ）標的抗体に結合した標識検出剤の量に比例し、（Ｂ）試料中における標的抗体の量に反比例する）、を含む、試料中における標的抗体を検出／定量するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）と工程（ｄ）の間に試料中における非結合阻害剤を洗浄除去する工程を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、セツキシマブを検出するための２レポーターイムノアッセイの結果を示す図である。図１Ａは標識競合物質の検出を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、セツキシマブを検出するための２レポーターイムノアッセイの結果を示す図である。図１Ｂは標識検出試薬の検出を示す。
【図２】２レポーターイムノアッセイにおける標識検出試薬シグナルと標識競合物質シグナルの比率をセツキシマブ濃度の関数として示す図である。
【図３】単一レポーター組み合わせイムノアッセイと２レポーター組み合わせイムノアッセイ用のイムノアッセイで作成した比率の比較を示す図である。
【図４Ａ】２レポーターイムノアッセイの概略図を示す図である。
【図４Ｂ】１レポーターイムノアッセイの概略図を示す図である。
【００１０】
定義
本明細書に記載の方法及び物質と同様または同等のあらゆる方法及び物質を、本明細書に記載する実施形態の実施または試験に使用可能であるが、一部の好ましい方法、組成物、デバイス及び物質について本明細書において説明する。しかしながら、本物質及び方法を説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法またはプロトコルに限定されず、それらは通常の実験及び最適化により様々であり得るということを理解すべきである。本明細書で使用する専門用語は特定の様式または実施形態を説明するためだけのものであり、本明細書に記載する実施形態の範囲を限定することを意図するものではないということも理解されたい。
【００１１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。しかしながら、矛盾が生じた場合には、本明細書（定義を含む）が優先される。それゆえ、本明細書に記載の実施形態に関しては以下の定義を適用する。
【００１２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に定めない限り、複数の指示対象を含む。それゆえ、例えば、「ａｎ  検体」への言及は、１種または複数種の検体及び当業者に周知のその同等物などへの言及である。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語「含む」及びその言語学上の変形形態は、追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法の工程（複数可）などの存在を除外することなく、列挙した特徴（複数可）、要素（複数可）、方法の工程（複数可）などの存在を示す。逆に、用語「からなる」及びその言語学上の変形形態は、列挙した特徴（複数可）、要素（複数可）、方法の工程（複数可）などの存在を示し、通常は付随する不純物を除き、列挙していないあらゆる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法の工程（複数可）などを除外する。語句「から本質的になる」は、列挙した特徴（複数可）、要素（複数可）、方法の工程（複数可）など、及び、本組成物、システムまたは方法の基本的な性質に実質的に影響を及ぼさない任意の追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法の工程（複数可）などを示す。本明細書の多くの実施形態はオープンな「含む」用語を使用して記載される。このような実施形態は、多数のクローズドな「からなる」及び／または「から本質的になる」実施形態を包含し、あるいは、このような用語を使用してクレームまたは記載され得る。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語「試料」は、その最も広い意味において本明細書で使用される。この用語は、試験体、培養液、溶解液、精製検体、精製酵素、緩衝液中の精製検体などを含むことを意味する。この用語は、調製した溶液または混合液、及び、生物学的採取物と環境的採取物の両方を含む。生体試料は、流体または固体の形態をとってもよく、任意の好適な生物源（例えば、ヒト、微生物などを含む動物）から得てもよく、それら生体試料としては、血液（例えば、全血、白血球、末梢血単核球、軟膜、血漿及び血清）、痰、涙液、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、呼気、尿、精液、唾液、腹膜洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過物、滑液、関節吸引液、器官分泌液、細胞、細胞抽出液、及び、脳脊髄液を挙げてもよい。環境試料としては、地表物質、土壌、植物及び水などの環境物質が挙げられる。これらの例が本発明に適用可能な試料のタイプを限定すると解釈されるべきではない。試料としてはまた、上記の全てにおける加工または別の方法で分離された画分が挙げられる。例えば、血液試料を血清、血漿に分画してもよく、または、特定種の血液細胞、例えば、赤血球または白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））などを含有する画分に分画してもよい。一部の実施形態では、試料は、個体由来試料の混合物、例えば、組織試料と液体試料の混合物などであってもよい。用語「試料」としてはまた、例えば、糞便試料、組織試料または組織生検などからホモジナイズした固体物質を含有する物質、及び、組織培養液または細胞培養液に由来する物質を挙げてもよい。入手／提供後、任意の好適な方法（例えば、濾過、希釈、プール、分画、濃縮など）で試料を加工してもよい。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語「検体」とは、適切な方法（例えば、イムノアッセイ）により検出、定量及び／または解析することができる試料（例えば、生体試料、環境試料など）の分子構成要素のことを意味する。検体は天然物質（例えば、生物学的試料または環境試料から入手／提供）または人工物質（例えば、合成）であってもよい。一部の実施形態では、検体は、抗体（例えば、治療抗体）、抗体フラグメント、抗原分子などであってもよい。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「標識検出剤」とは、標的検体（例えば、標的抗体のＦｃ領域）に結合するが標識競合物質（例えば、Ｆｃ領域を欠く）には結合せずに検出可能標識を含む抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣分子のことを意味し、その標識は、酵素、核酸、放射性同位体、蛍光分子、ナノ粒子またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないリストから選択される。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「標識競合物質」とは、捕捉剤（例えば、表面上に固相化された）に結合するが標的検体とは構造上同一ではない抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣分子（例えば、Ｆｃ領域を欠く、抗体模倣薬である、ブロッキング部分を含むなど）のことを意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「イムノアッセイ」とは抗体−抗原結合アッセイのことを意味し、イムノアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、リガンド結合アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、間接イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット検出、ドットブロットアッセイ、ビーズベースイムノアッセイなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、特に明記しない限り、完全な抗体分子またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2などのフラグメント）のことを意味する。「抗体」に言及する実施形態は、「完全な抗体」及びその抗体のフラグメントを含む複数の実施形態を包含し、あるいは、このような用語を使用してクレームまたは記載され得る。
【００２０】
天然抗体は通常、四量体構造を有する。四量体は通常、それぞれのペアが１本の軽鎖（特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）及び１本の重鎖（特定の実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）を有する、２組の同一ペアのポリペプチド鎖を含む。天然抗体において、重鎖は、可変領域、ＶH、ならびに、３つの定常領域、ＣH1、ＣH2及びＣH3を含む。ＶHドメインは重鎖のアミノ末端にあり、ＣH3ドメインはカルボキシ末端にある。天然抗体において、軽鎖は、可変領域、ＶL、及び、定常領域、ＣLを含む。軽鎖の可変領域は軽鎖のアミノ末端にある。天然抗体において、それぞれの軽鎖／重鎖ペアの可変領域は通常、抗原結合部位を形成する。定常領域は通常、エフェクター機能に影響を及ぼす。
【００２１】
天然抗体において、可変領域は通常、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が３つの超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる）によって結合している同一の一般的構造を示す。それぞれのペアの２本の鎖におけるＣＤＲは通常、特定のエピトープに結合可能となり得るようにフレームワーク領域に位置合わせされている。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方は通常、ドメイン、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。重鎖上のＣＤＲがＨ１、Ｈ２及びＨ３と呼ばれる一方、軽鎖上のＣＤＲはＬ１、Ｌ２及びＬ３と呼ばれる。一般的にＣＤＲ３は、抗原結合部位内における最も多様な分子供給源である。例えば、特定の例では、Ｈ３は、２アミノ酸残基ほども短いかまたは２６アミノ酸残基超であり得る。それぞれのドメインへのアミノ酸の割当ては通常、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ｖｏｌｓ．１−３，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；またはＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。本出願における用語「ＣＤＲ」とは、特に明記しない限り、軽鎖または重鎖のいずれかに由来するＣＤＲのことを意味する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「重鎖」とは、単独でまたは軽鎖と組み合わせてのいずれかで抗原特異性を付与するのに十分な重鎖可変領域配列を含むポリペプチドのことを意味する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「軽鎖」とは、単独でまたは重鎖と組み合わせてのいずれかで抗原特異性を付与するのに十分な軽鎖可変領域配列を含むポリペプチドのことを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、抗体またはその他の要素が抗原またはエピトープを「特異的に認識する」またはそれらに「特異的に結合する」場合、抗体またはその他の要素は、タンパク質及び／または巨大分子の複雑な混合物中における抗原を優先的に認識し、抗原またはエピトープを提示しないその他の要素と比較して実質的により高い親和性で抗原またはエピトープに結合する。これに関連して、「実質的により高い親和性」とは、抗原またはエピトープの検出を可能とするのに十分に高い親和性のことを意味し、所望のアッセイまたは測定装置を使用した要素とは区別される。一般的には、少なくとも１０7Ｍ-1（例えば、＞１０7Ｍ-1、＞１０8Ｍ-1、＞１０9Ｍ-1、＞１０10Ｍ-1、＞１０11Ｍ-1、＞１０12Ｍ-1、＞１０13Ｍ-1など）の結合定数（Ｋa）を有する結合親和性のことを意味する。特定のこのような実施形態では、抗体は、異なる抗原がその特定のエピトープを含む限りにおいて異なる抗原に結合可能である。特定の例においては、例えば、異なる種由来の相同タンパク質は同一のエピトープを含んでいてもよい。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「抗体フラグメント」とは、抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部を含む、全長抗体の一部のことを意味する。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ディアボディ、及び、インタクト抗体の可変領域の少なくとも一部を保持するその他の抗体フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照されたい（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ技術または化学的ポリペプチド合成で作製したインタクト抗体の酵素的または化学的な開裂（例えば、抗体のパパイン消化、ペプシン消化及びＩｄｅｓ消化）により抗体フラグメントを作製する。
【００２６】
例えば、「Ｆａｂ」フラグメントは、１本の軽鎖ならびにＣH1及び１本の重鎖の可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ’」フラグメントは、１本の軽鎖、及び、ＣH1ドメインとＣH2ドメインの間に延びる別の定常領域を含む１本の重鎖を含む。Ｆａｂ’フラグメントの２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、「Ｆ（ａｂ’）2」分子を形成してもよい。Ｆ（ａｂ）2はＦｃ領域を欠いている。
【００２７】
「Ｆｖ」フラグメントは重鎖と軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントは、フレキシブルリンカーにより連結して抗原結合領域を有する１本のポリペプチド鎖を形成する、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む。例示的な一本鎖抗体については、ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許番号４，９４６，７７８及び５，２６０，２０３に詳細に記載されている（それら全体は参照により本明細書に組み込まれる）。特定の例においては、単一の可変領域（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）は抗原を認識して結合する能力を有していてもよい。
【００２８】
その他の抗体フラグメントについて当業者は理解する。
【００２９】
「抗Ｆｃ」抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣分子は、抗体または抗体フラグメントのＦｃ部分に結合する。抗Ｆｃ抗体または抗体フラグメントはＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）2抗体フラグメントに結合しない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
イムノアッセイ（例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）など）は、研究、診断、医薬品開発、環境モニタリングなどにおける検体検出用に使用されている。本明細書では、検体検出イムノアッセイを実施するための組成物、キット及び方法を提供する。
【００３１】
一部の実施形態では、イムノアッセイを実施するために、検体を含む試料を試薬に曝露する。一部の実施形態では、同一の試料及び／または検体を全アッセイ（例えば、第１及び第２の検出工程）に使用する。一部の実施形態では、全アッセイ（例えば、標的検体の捕捉、標識競合物質の結合、標識阻害、洗浄工程、検出剤の結合、検出工程など）を同一の物理的位置内／上（例えば、プレートまたはスライドガラス（slide）上の同一の場所、同一のマイクロウェル内の同一の場所など）で実施する。一部の実施形態では、工程間（例えば、第１の検出工程後、標識阻害後、結合工程後など）に洗浄工程を実施する。一部の実施形態では、本アッセイの全てまたは一部を実施するにあたり、複雑な装置、例えば、マイクロ流体（例えば、米国公開番号２０１６／０１６１４７４（その全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）及び／または電極アレイ（例えば、米国公開番号７，８５８，３２１（その全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）などは必要とはならない及び／または利用することはない。一部の実施形態では、単一の検出可能標識または検出可能標識の一種（例えば、蛍光色素、生物発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）など）を本アッセイの全検出工程に使用する。一部の実施形態では、本アッセイの個々の検出工程に異なる蛍光色素を使用することはない（例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．５４：６，９５６−９６３（２００８）（その全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）。その他の実施形態では、本アッセイの個々の検出工程に、検出可能に異なる標識を使用する。一部の実施形態では、本アッセイのそれぞれの検出工程の結果は別々のものであると考えられる（例えば、第１の検出工程由来のシグナルと第２の検出工程由来のシグナルの比較及び／または比率は実施または生成されない）。一部の実施形態では、本アッセイのそれぞれの検出工程の結果を組み合わせる（例えば、比率を取ることにより）。
【００３２】
一部の実施形態では、捕捉剤を表面（例えば、ウェル、プレート、ビーズなど）に結合させてから、その表面を、検体及びその検体の標識競合物質を含む試料に曝露する。通常の反応（例えば、図１Ａを参照のこと）では、標識競合物質が競合により表面から脱落されるため、検体の濃度が上昇するにつれて標識由来のシグナルは低下する。既知量の検体を用いて求めた基準値と比較することにより、試料中に存在する検体の量を定量することが可能となる。
【００３３】
一部の実施形態では、上記検出工程の後、第２の検出工程用に反応用混合液を調製する。一部の実施形態では、上記の検出工程に使用した標識の阻害剤（例えば、反応用混合液中において、標識由来のシグナルを著しく低下させる（例えば、５０％のシグナル低下、６０％のシグナル低下、７０％のシグナル低下、８０％のシグナル低下、９０％のシグナル低下、９５％のシグナル低下、９９％のシグナル低下、９９．９％のシグナル低下、９９．９９％のシグナル低下、もしくはそれ以上のシグナル低下またはそれらの間の範囲のシグナル低下で）薬剤）を試料に加えることにより、第２の検出工程の同一の反応用混合液中における同一の標識の使用が可能となる。一部の実施形態では、標識阻害剤に続き、非結合阻害剤を除去するための洗浄工程を実施する。一部の実施形態では、標識阻害剤が標識に結合し、その後の工程にわたりその標識に結合したままとなるため、第１の検出で残存した標識に由来するシグナルがその後の検出工程にわたり検出されるということが防止される。一部の実施形態では、第１の検出工程と第２の検出工程の間に阻害剤を加えない。一部の実施形態では、阻害剤を加えるかどうかにかかわらず洗浄工程を実施する。
【００３４】
一部の実施形態では、第２の検出工程を実施するために、試料に検出剤を加える。一部の実施形態では、検出剤は検出可能標識を含み検体に特異的に結合するが競合物質には特異的に結合しない。一部の実施形態では、検出剤は抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣分子である。検体が抗体である一部の実施形態では、検出剤は標識抗Ｆｃ抗体、標識抗Ｆｃ抗体フラグメントまたは標識抗Ｆｃ抗体模倣分子である。このような実施形態では、検出剤は検体のＦｃ部分に結合可能であるが、Ｆｃ部分を含まない競合物質（例えば、Ｆｃ領域を欠く抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）2フラグメント）、抗体模倣分子など）には結合不能である。一部の実施形態では、競合物質はＦｃ部分を欠いている。その他の実施形態では、競合物質は、検出剤が競合物質に結合することを防止する、検体上には存在しないブロッキング部分を含む。一部の実施形態（例えば、検出工程間に標識の阻害剤を添加する実施形態）では、検出剤は標識競合物質の標識と同一の標識を含む。一部の実施形態（例えば、検出工程間に標識の阻害剤を添加しない実施形態）では、検出剤は標識競合物質の標識とは異なる標識を含む。
【００３５】
本明細書の実施形態は試料中における検体の検出及び／または定量に有用である。あらゆるタイプの検体を検出／定量／評価するためのアッセイ、デバイス（例えば、蛍光光度計、照度計、表面など）及び試薬（例えば、捕捉剤（複数可）、検体競合物質（複数可）、標識（複数可）、標識阻害剤（複数可）、洗浄液（複数可）、検出剤（複数可）、緩衝液など）を提供する。例示的な検体としては、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、炭水化物、脂質などが挙げられる。一部の実施形態では、目的の検体を含む試料を提供する。一部の実施形態では、目的の検体を含む試料を調製及び／または加工する（例えば、濾過、濃縮、希釈、遠心分離など）。一部の実施形態では、目的の検体を試料に加える。好適な捕捉剤、競合物質及び／または検出剤が利用可能な及び／または設計／調製されるあらゆる検体が、本明細書の実施形態に有用となり得る。
【００３６】
一部の実施形態では、検体は抗体または抗体フラグメントである。このような実施形態では、捕捉剤は通常、抗体または抗体フラグメント用の抗原、または、抗体または抗体フラグメント用のエピトープを提示する別の薬剤である。その他の実施形態では、捕捉剤は、検体（例えば、抗体検体、非抗体検体など）に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【００３７】
一部の実施形態では、捕捉剤は、検体に結合可能でありその検体と安定した結合（例えば、アッセイ条件下で安定）を形成する任意の低分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体、抗体フラグメントなどである。一部の実施形態では、捕捉剤は抗原である（例えば、標的検体が抗体である場合）。一部の実施形態では、捕捉剤を表面上に固相化させることができる（例えば、共有結合、安定した非共有結合の固相化など）。一部の実施形態では、捕捉剤は、例えば、表面への捕捉剤の固相化を促進する固相部分を含む。一部の実施形態では、固相部分は、表面上に提示された部分との共有結合相互作用を促進する反応性官能基である。一部の実施形態では、捕捉剤は、捕捉部分（例えば、抗原認識部分、エピトープ提示部分、検体結合部分など）及び固相部分（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質もしくはリガンド（例えば、米国特許番号７，２３８，８４２；米国特許番号７，４２５，４３６（それら全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）、ビオチンまたはストレプトアビジンなど）を含む。一部の実施形態では、固相部分は、表面上に提示された部分（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）との非共有結合を促進する親和性分子（例えば、ストレプトアビジンまたはビオチン）である。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイを表面上で実施する。捕捉剤を固相化可能な任意の好適な表面は、本明細書の実施形態に有用である。一部の実施形態では、表面は、捕捉剤が結合する任意の固形物質または固定物質である。表面の例としては、顕微鏡用スライドガラス、マイクロアレイ、マイクロタイタープレートのウェル、カバーガラス、ビーズ、粒子（例えば、ナノ粒子、マイクロ粒子、量子ドットなど）、レジン、細胞培養フラスコに加えて、多くのその他の好適な品目が挙げられる。一部の実施形態では、捕捉剤の結合を促進するために表面をコーティング及び／または官能化する。一部の実施形態では、表面は、表面への捕捉剤の固相化を促進するための１種または複数種の部分を提示する（例えば、特定の官能化を用いてまたは用いずに、溶液の吸着作用を介してなど）。例えば、一部の実施形態では、表面は、相補ＨＡＬＯＴＡＧ構成要素を提示する固相部分を含むＨＡＬＯＴＡＧタンパク質またはリガンド及び捕捉剤を提示する。別の例として、一部の実施形態では、表面は、相補ビオチン／ストレプトアビジン構成要素を提示する固相部分を含むビオチン及び／またはストレプトアビジンならびに捕捉剤を提示する。一部の実施形態では、捕捉剤の表面及び／または固相部分は抗体または抗体フラグメントを提示し、その他の表面及び／または固相部分はその抗体または抗体フラグメント用の抗原／エピトープを提示する。表面に捕捉剤を固相化させるための任意の好適な薬剤／部分は、本明細書の実施形態の範囲内である。
【００３９】
一部の実施形態では、表面に捕捉剤を固相化させた後に、残りの露出面をブロッキングして非特異的結合を防止する。一部の実施形態では、ブロッキングは、表面に不活性薬剤を固相化させることを含む。一部の実施形態では、ブロッキングは、表面上の潜在的な反応性部位を中和または不活性化することを含む。
【００４０】
一部の実施形態では、競合物質（検体競合物質）は、検体と同様の親和性または相互作用強度で捕捉剤に結合する薬剤である。一部の実施形態では、競合物質は検出可能標識または検出可能部分を含む。検体が抗体または抗体フラグメントである特定の実施形態では、競合物質は、検体の抗原／エピトープと同一の抗原／エピトープに結合する標識抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣分子である。抗体、抗体フラグメント及び／または抗体模倣分子に多種多様な種類の検出可能標識を標識するための組成物及び方法は当分野において理解されている。捕捉剤が抗体または抗体フラグメントである一部の実施形態では、競合物質は、検体の抗原／エピトープと同一の抗原／エピトープを提示する。その他の実施形態では、例えば、検体が低分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質などである場合、競合物質は、検体への親和性と同様の親和性で捕捉剤に（が）結合可能な競合部分を提示する。一部の実施形態では、捕捉剤用の競合物質の親和性は、検体の濃度と比較して低濃度の競合物質となるように十分であり、捕捉剤の大部分（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％もしくはそれ以上またはそれらの間の範囲）は検体に結合する。しかしながら、検体に対する競合物質の相対濃度が上昇すると、競合物質は競合して捕捉剤から検体を脱落させる（例えば、図２を参照のこと）。一部の実施形態では、競合物質は、捕捉剤に結合可能であるが標的検体とは構造上異なる（例えば、ブロッキング部分を含む、Ｆｃ領域を欠くなど）抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）2、ＳｃＦｃ、Ｆａｂなど）または抗体模倣分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アプタマー、ナノボディなど）である。一部の実施形態では、競合物質は、Ｆｃ領域を欠くが標的抗体用のエピトープに結合可能な抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）2、ＳｃＦｃ、Ｆａｂなど）または抗体模倣分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アプタマー、ナノボディなど）である。
【００４１】
一部の実施形態では、競合物質は検出可能標識を含む。検体と競合物質の間における競合のモニタリングを容易にする任意の標識は、本明細書の実施形態に有用である。一部の実施形態では、標識は、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、放射性標識（例えば、放射性核種）、発色団（例えば、検出可能な色を付与する色素または粒子）、発光部分（例えば、生物発光標識（例えば、発光タンパク質、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ、ホタル、ＮＡＮＯＬＵＣ（例えば、米国特許番号８，８５９，２２０（その全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）など）など）、リン光標識または化学発光標識）、または、蛍光部分（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）など）、蛍光体（例えば、キサンテン誘導体、シアニン誘導体など））である。一部の実施形態では、検出可能部分は、捕捉剤に結合する部分に直接または間接的に（例えば、好適なリンカーを介して）コンジュゲートまたは融合した低分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ）、ナノ粒子（例えば、量子ドット）またはタンパク質である。
【００４２】
一部の実施形態では、競合物質は、競合部分（例えば、捕捉剤に結合する検体を模倣する競合物質の部分）及び検出可能部分（例えば、検出可能標識）を含む。一部の実施形態では、競合部分と検出可能部分は直接または間接的にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、競合部分と検出可能部分は周知の方法でコンジュゲートしている。一部の実施形態では、競合部分と検出可能部分はリンカー部分によりコンジュゲートしている。一部の実施形態では、競合部分と検出可能部分はポリペプチド（例えば、抗体フラグメントとルシフェラーゼ）であり、単一の融合タンパク質（例えば、任意選択的に、競合部分と検出可能部分の間にリンカーペプチドを含む）の一部である。任意の好適なリンカーが本明細書の実施形態に有用となり得る。競合部分及び／または検出可能部分がポリペプチドではない一部の実施形態（例えば、検出可能部分が蛍光色素であり、競合部分が低分子である）では、リンカーは非ペプチドリンカー（例えば、アルキルリンカー、ヘテロアルキルリンカー、カルバメートリンカー、ＰＥＧリンカーなど）であってもよい。
【００４３】
一部の実施形態では、検体は抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆｃの全てまたは一部を含む抗体フラグメント）であり、競合物質はＦｃ領域の全てまたは一部を欠く標識抗体フラグメントである。一部の実施形態では、競合物質は標識Ｆ（ａｂ）2フラグメントである。
【００４４】
本明細書に記載のシステム及び方法の一部の実施形態では、第１の検出工程の完了後から第２の検出工程の前に、検体競合物質上の標識の阻害剤を用いて標識由来のシグナルを低下及び／または除去する。標識が蛍光標識である一部の実施形態では、阻害剤はその蛍光体の消光剤である。特に検出可能標識が酵素である一部の実施形態では、阻害剤は検出可能標識に結合して、基質またはその他の必須要素（例えば、ＡＴＰ）が検出可能標識に結合することを防止する。一部の実施形態では、阻害剤は、シグナル（例えば、光）生成反応に関与不能な修飾基質、または、シグナル（例えば、光）生成反応において酵素が反応生成物へと変換することができない修飾基質である。一部の実施形態では、検出可能標識はルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ）など）であり、阻害剤は、光生成反応において反応生成物へと変換不能な基質アナログ（例えば、ルシフェリンアナログまたはセレンテラジンアナログ）（例えば、オキソルシフェリンまたはセレンテラミド）である。一部の実施形態では、検出可能標識はＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ）の変異体であり、阻害剤は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの変異体の活性を阻害することにより、そのルシフェラーゼ活性を阻害する（例えば、米国特許出願番号１５／１９２，４２０及び６２／４３９，６００（それら全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）。一部の実施形態では、阻害剤は安定的に、共有結合で及び／または不可逆的に検出可能標識に結合する。特に検出可能標識が蛍光体である一部の実施形態では、阻害剤は、標識に由来する検出可能なシグナル（例えば、蛍光）の消光剤である。一部の実施形態では、阻害剤は、標識、例えば、抗体または低分子の酵素活性を阻害する。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイにおける第１の検出工程と第２の検出工程の間に洗浄工程及び洗浄試薬を用いる。一部の実施形態では、洗浄工程では、非結合の検体及び／または競合物質を除去する。一部の実施形態では、洗浄工程では、過剰な阻害剤を除去する。一部の実施形態では、洗浄試薬は水、緩衝液（複数可）、塩、洗剤、界面活性剤などを含む。一部の実施形態では、洗浄試薬は、アッセイ成分を乱すことなく（例えば、捕捉剤を表面から脱固相化させることなく、検体及び／または競合物質を捕捉剤から解離させることなく、阻害剤を競合物質の検出可能標識から解離させることなく、など）、望ましくない汚染物質（例えば、既に使用され続くアッセイ工程に必須／必要ではないアッセイの成分）の除去を促進する任意の成分を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイでは検出剤を利用する。一部の実施形態では、検出剤は、検体（例えば、捕捉剤に結合した検体）に結合するが検体競合物質には結合しない任意の薬剤である。一部の実施形態では、検出剤は標識される。競合物質上の標識と同様に、捕捉検体への検出剤の結合のモニタリングを容易とする任意の標識は本明細書の実施形態に有用である。一部の実施形態では、標識は、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、放射性標識（例えば、放射性核種）、発色団（例えば、検出可能な色を付与する色素または粒子）、発光部分（例えば、生物発光標識（例えば、発光タンパク質、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ、ホタル、ＮＡＮＯＬＵＣ（例えば、米国特許番号８，８５９，２２０（その全体は参照により組み込まれる）を参照のこと）など）など）、リン光標識または化学発光標識）、または、蛍光部分（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）など）、蛍光体（例えば、キサンテン誘導体、シアニン誘導体など））である。一部の実施形態では、検出可能部分は、捕捉剤に結合する部分に直接または間接的に（例えば、好適なリンカーを介して）コンジュゲートまたは融合した低分子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。一部の実施形態では、検出剤標識と競合物質標識は同一である（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ）。このような実施形態では、本アッセイにおける第１の検出工程と第２の検出工程の間に阻害剤を用いる。一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイにおける競合物質及び検出剤に異なる標識を用いる。一部の実施形態では、別々の標識を使用することにより、標識阻害剤を使用することなく２段階のアッセイを実施することが可能となる。
【００４７】
一部の実施形態では、検出剤は、検体結合部分（例えば、検体が捕捉剤に結合する際に検体に結合する検出剤の部分）及び検出可能部分（例えば、検出可能標識）を含む。一部の実施形態では、検体結合部分と検出可能部分は直接または間接的にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、検体結合部分と検出可能部分は周知の方法でコンジュゲートしている。一部の実施形態では、検体結合部分と検出可能部分はリンカー部分によりコンジュゲートしている。一部の実施形態では、検体結合部分と検出可能部分はポリペプチド（例えば、抗体フラグメントとルシフェラーゼ）であり、単一の融合タンパク質（例えば、任意選択的に、検体結合部分と検出可能部分の間にリンカーペプチドを含む）の一部である。任意の好適なリンカーが本明細書の実施形態に有用となり得る。検体結合部分及び／または検出可能部分がポリペプチドではない一部の実施形態（例えば、検出可能部分が蛍光色素であり、検体結合部分が低分子である）では、リンカーは非ペプチドリンカー（例えば、アルキルリンカー、ヘテロアルキルリンカー、カルバメートリンカー、ＰＥＧリンカーなど）であってもよい。
【００４８】
一部の実施形態では、検出剤は、検体上に存在するが競合物質には欠けている部分を認識する標識抗体である。一部の実施形態では、競合物質は、検出剤が競合物質に結合することを防止するブロッキング部分を含む。一部の実施形態では、競合物質上の標識は、検出剤が競合物質に結合することを防止する。一部の実施形態では、検体は、Ｆｃの全てまたは一部を含む抗体または抗体フラグメントであり、競合物質は、Ｆｃの全てまたは一部を欠く抗体フラグメントであり、検出剤は、検体に結合するが競合物質には結合しない抗Ｆｃ抗体または抗体フラグメントである。
【００４９】
一部の実施形態では、標準液、及び／または、既知量の検体を含む試料を使用して本明細書に記載のイムノアッセイを実施することにより、検量線を作成する。一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイでは、広いダイナミックレンジにわたる検量線を作成することができる。一部の実施形態では、これらの検量線を用いて、未知量の検体を含む試料のアッセイ結果を基準検量線（例えば、第１の検出工程と第２の検出工程の検量線）の一方または両方と比較し、試料中に存在する検体の量を定量する。その他の実施形態では、本アッセイ（図４を参照のこと）における第１の検出工程由来のシグナルと第２の検出工程由来のシグナルの比率を取ることにより無次元量を計算し、この無次元量を検体濃度に対してプロットする。得られた単一プロットは、２回の検出工程から得た全ダイナミックレンジをカバーする。２回の検出工程の組み合わせによる標準的なグラフでは、ｘ値の上昇は検体濃度の上昇に相当し、解析をより直観的なものとしている。
【００５０】
本明細書に記載の所定のプロセス及び方法（例えば、データ収集、データ解析、通信など）は、コンピュータ、プロセッサ、ソフトウェア及び／またはその他のデバイスを用いて実施される（あるいは、それらなしでは実施不能である）。本明細書に記載の方法の全てまたは一部はコンピュータで実施する方法であってもよく、方法のうちの１つまたは複数の部分は１つまたは複数のプロセッサによって実施される場合がある。一部の実施形態では、自動化した方法は、ソフトウェア、プロセッサ、周辺装置、及び／または、同様のものを含む装置を用いて実施される。本明細書で使用する場合、ソフトウェアとは、プロセッサによって実行される際に本明細書に記載のコンピュータ操作を実施するコンピュータ可読プログラム命令のことを意味する。一部の実施形態では、基準値は記憶素子（例えば、データベースを含む）に格納され、実験で得たデータと比較するためにプロセッサがその基準値にアクセスする。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法（例えば、検出可能標識由来のシグナルを測定する）を使用してデータを得るため、データを加工する（例えば、データをプロットする、比率を計算する、回帰分析、データの導関数または積分値を計算するなど）ため、データを格納基準値（例えば、閾値、検体の濃度など）と比較するため、などにおいて、プロセッサ、コンピュータ、ソフトウェアなどを用いて計算を行う。
【実施例】
【００５１】
実験
本明細書の実施形態の開発中に実験を行い、本明細書に記載のイムノアッセイの実現性及び有用性を証明した。
【００５２】
実施例１
２レポーターイムノアッセイ
１）２レポーターシステムを使用して抗ＥＧＦＲ治療抗体であるセツキシマブを検出するための組み合わせアッセイを設計し実施した（図４Ａ）。ＩｄｅＳプロテアーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔａｌｏｇ＃  Ｖ７５１１）を使用して、標識競合物質用に、セツキシマブをＦ（ａｂ）2フラグメントとＦｃフラグメントに分割した。磁気プロテインＡビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して抗体のＦｃ部分を除去し、セツキシマブのＦ（ａｂ）2フラグメントを残した。それから、化学的コンジュゲートを用いてセツキシマブＦ（ａｂ）2をＮＡＮＯＬＵＣで標識した（標識競合物質）。一定濃度のＮＡＮＯＬＵＣ標識セツキシマブＦ（ａｂ）2の存在下で、増加量のセツキシマブ含有試料を、表面固相ＥＧＦＲを含有するプレートに加えた。図１Ａは、セツキシマブの濃度が上昇するにつれてシグナルが低下することを示している。このアッセイにおける検出限界（ＬＯＤ）は約０．０１ｕｇ／ｍｌであり、定量上限（ＵＬＯＱ）は約１．０ｕｇ／ｍｌであった。第１の検出工程の後、プレートを洗浄してから、標識検出剤である、ＨＲＰで標識した抗ヒトＦｃ二次抗体を用いてインキュベートした（図１Ｂ）。本アッセイの第２の検出工程では、０．００００１〜０．０１のダイナミックレンジが認められた。２段階のイムノアッセイの個々のグラフ（図１）を使用することにより、少なくとも５対数オーダーにわたるセツキシマブの検出が可能となる。第２の検出由来のシグナル（標識検出剤由来のシグナル）と第１の検出由来のシグナル（標識競合物質由来のシグナル）の比率を取ることにより、単一の無次元量を得る（図２）。これにより、濃度が上昇するにつれてシグナル比率が上昇し＞５対数オーダーのダイナミックレンジを明確に示す、直観的かつ容易に解釈可能な結果がもたらされる（図３）。加えて、比率を使用することによって、大きく異なった絶対シグナルにより生じ得る潜在的な混乱が排除される。
【００５３】
実施例２
単一レポーターイムノアッセイ
単一レポーターシステムを使用して抗ＥＧＦＲ治療抗体であるセツキシマブを検出するための組み合わせアッセイを設計し実施した（図４Ｂ）。ＮＡＮＯＬＵＣで標識したＩｄｅＳ開裂セツキシマブＦ（ａｂ）2を標識競合物質として使用した。上記のとおり、一定濃度のＮＡＮＯＬＵＣ標識セツキシマブＦ（ａｂ）2の存在下で、増加量のセツキシマブを、表面固相ＥＧＦＲを含有するプレートに加えることにより、第１の検出工程を実施した。次に、ＮＡＮＯＬＵＣ阻害剤であるＪＲＷ−０５５２を使用して、ＮＡＮＯＬＵＣ標識セツキシマブＦ（ａｂ）2由来のシグナルを除去した。それからプレートを洗浄し、ＮＡＮＯＬＵＣで標識した抗ヒトＦｃ二次抗体（標識検出試薬）を用いてインキュベートした。図２に示した２レポーターシステムのシグナル比率と共に、本アッセイにおける２回の検出工程（標識競合物質の検出と標識検出試薬の検出）に由来するシグナルの比率をセツキシマブに対してプロットした（図３）。本明細書の実施形態の開発中に行った実験に由来するデータは、組み合わせイムノアッセイの高ダイナミックレンジを示している。
ＪＲＷ−０５５２
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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