(57)【要約】  ライブラリがあらかじめ決定された適用結果、例えば増幅後の制御された表示、および標的配列への結合後の均一な濃縮を可能にするように、ポリヌクレオチドの種に関してあらかじめ選択された化学量論を有するポリヌクレオチドのライブラリに関する組成物、方法、およびシステムが本明細書で提供される。さらに、均一かつ正確な次世代シーケンシングのための、ポリヌクレオチドプローブとその適用が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドライブラリであって、ポリヌクレオチドライブラリは少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含み、ゲノムフラグメントとのハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズされたゲノムフラグメントのシーケンシングに続いて、ポリヌクレオチドライブラリが、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供するような量で、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は存在する、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９８パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項４】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９０パーセントの固有の読み取りを提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項５】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９５パーセントの固有の読み取りを提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項６】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項７】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントを提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項８】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも９０パーセントを提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項９】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも約８０パーセントを提供する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１０】
ゲノムフラグメントの各々は、約１００塩基から約５００塩基の長さである、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１１】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約８０パーセントは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１２】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも３０パーセントは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１３】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約１５パーセントは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１４】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドは、少なくとも１０００の遺伝子をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１７】
少なくとも５，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのエクソン配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１８】
少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは、総体として単一のエクソン配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１９】
少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１５０，０００セットを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドライブラリであって、ポリヌクレオチドライブラリは少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドの各々は約２０〜２００塩基の長さであり、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも１０００のあらかじめ選択された遺伝子に関して各エクソンからの配列をコードし、各ポリヌクレオチドは分子タグを含み、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノムフラグメントとのハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノムフラグメントのシーケンシングに続いて、ポリヌクレオチドライブラリが、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供するような量で存在する、ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、少なくとも９８パーセントのゲノムフラグメントの塩基の少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９０パーセントの固有の読み取りを提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９５パーセントの固有の読み取りを提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントを提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているゲノムフラグメントの９０パーセントより多くを提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２８】
ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているゲノムフラグメントの約８０パーセントより多くを提供する、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２９】
ゲノムフラグメントの各々は、約１００塩基から約５００塩基の長さである、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３０】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くが、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３１】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの３０パーセントより多くが、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３２】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約１５パーセントより多くが、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３３】
ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３４】
ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３５】
少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは、総体として単一のエクソン配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３６】
少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１５０，０００セットを含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドライブラリを生成するための方法であって、該方法は：
ａ．少なくとも５０００のポリヌクレオチドをコードするあらかじめ決定された配列を提供する工程；
ｂ．少なくとも５０００のポリヌクレオチドを合成する工程；および
ｃ．ポリヌクレオチドライブラリを形成するためにポリメラーゼで少なくとも５０００のポリヌクレオチドを増幅する工程であって、ここで、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約２倍以内の量で表示される、工程、
を含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くが、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの３０パーセントより多くが、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約１５パーセントより多くが、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ポリヌクレオチドライブラリは、エラーの補正なしで、あらかじめ決定された配列と比較して、８００塩基において１未満の合計エラー率を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
あらかじめ決定された配列は、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドをコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの合成は、面を有する構造において行われ、面は複数のクラスタを含み、各クラスタは複数の遺伝子座を含み；および少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は、複数の遺伝子座のうちの異なる遺伝子座から伸長する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
複数の遺伝子座はクラスタあたり最大１０００の遺伝子座を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
複数の遺伝子座はクラスタあたり最大２００の遺伝子座を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ポリヌクレオチドライブラリの増幅のための方法であって、該方法は：
ａ．少なくとも５０００のポリヌクレオチドのための増幅分布を得る工程；
ｂ．少なくとも１つの配列特徴に基づいて２つ以上のビンへと増幅分布の少なくとも５０００のポリヌクレオチドをクラスタリングする工程であって、配列特徴はパーセントＧＣ含量、パーセント反復配列含量、またはパーセント二次構造含量である、工程；
ｃ．あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを生成するために少なくとも１つのビン中のポリヌクレオチドの相対度数を適合させる工程；
ｄ．あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを合成する工程；および、
ｅ．あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを増幅する工程、
を含む、方法。
【請求項４７】
少なくとも１つの配列特徴はパーセントＧＣ含量である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つの配列特徴はパーセント二次構造含量である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの配列特徴はパーセント反復配列含量である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
反復配列含量は３つ以上のアデニンを有する配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
反復配列含量は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの末端に反復配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドは、標的配列を結合するために１つ以上のポリヌクレオチド配列の親和性に基づいてビンへとクラスタリングされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
ビンの下３０パーセントにある配列の数は、調整前のビンの下３０パーセントにある配列の数と比較して、調整後の下流での適用に少なくとも５０％より多くの表示を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
ビンの上３０パーセントにある配列の数は、調整前のビンの上３０パーセントにある配列の数と比較して、調整後の下流での適用に少なくとも５０％より多くの表示を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
ゲノムＤＮＡのシーケンシングのための方法であって、該方法は：
（ａ）複数のゲノムのフラグメントに、請求項１−３６のいずれか１つに記載のライブラリを接触させる工程；
（ｂ）少なくとも１つの濃縮された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ライブラリに結合する少なくとも１つのゲノムフラグメントを濃縮する工程；および、
（ｃ）少なくとも１つの濃縮された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項５６】
複数の濃縮された標的ポリヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドは約８０〜約２００の塩基の長さである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ゲノムフラグメントの各々は、約１００塩基から約５００塩基の長さである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
接触させる工程は溶液中で行なわれる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドはゲノムフラグメントに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
単離は（ｉ）個体担体上のポリヌクレオチド／ゲノムフラグメントのハイブリダイゼーション対を捕捉する工程；および（ｉｉ）濃縮された標的ポリヌクレオチドを生成するために複数のゲノムフラグメントを放出する工程、を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度をもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９８パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度をもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９０パーセントの固有の読み取りをもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９５パーセントの固有の読み取りをもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントをもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントをもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも９０パーセントをもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも約８０パーセントをもたらす、請求項５５に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約８０パーセントが、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される、請求項５５に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも３０パーセントが、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約１５パーセントが、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドは、少なくとも１０００の遺伝子をコードする、請求項５５に記載の方法。
【請求項７４】
ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７５】
ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも５，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのエクソン配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７７】
少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは、総体として単一のエクソン配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１５０，０００セットを含む、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１６年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２４，３０２号、２０１７年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５４８，３０７号、および２０１７年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５５８，６６６号の利益を主張し、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜配列表＞
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年１１月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、４４８５４−７３０＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名であり、５，３０４バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
高い忠実性と低コストでの非常に効率的な化学的遺伝子合成は、バイオテクノロジーと医療において、および基礎的な生物学的研究において中心的な役割を有している。デノボの遺伝子合成は、基礎的な生物学的研究およびバイオテクノロジーでの応用にとって強力なツールである。小規模での比較的短いフラグメントの合成のための様々な方法が知られているが、これらの技術にはしばしば、スケーラビリティ、自動化、速度、精度、およびコストの点で問題がある。
【０００４】
＜引用による組み込み＞
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているかのような程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書にはおいてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含み、ゲノムフラグメントとのハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズされたゲノムフラグメントのシーケンシングに続いて、ポリヌクレオチドライブラリがゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供するような量で、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は存在する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９８パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９０パーセントの固有の読み取りを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９５パーセントの固有の読み取りを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも９０パーセントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも約８０パーセントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここでゲノムフラグメントの各々は、約１００塩基から約５００塩基の長さである。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約８０パーセントは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも３０パーセントは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約１５パーセントは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドは少なくとも１０００の遺伝子をコードする。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのエクソン配列を含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは、総体として単一のエクソン配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１５０，０００のセットを含む。
【０００６】
本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドの各々は約２０から２００塩基の長さであり、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも１０００のあらかじめ選択された遺伝子に関して各エクソンからの配列をコードし、各ポリヌクレオチドは分子タグを含み、ゲノムフラグメントとのハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノムフラグメントのシーケンシングに続いて、ポリヌクレオチドライブラリがゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下でゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供するような量で、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は存在する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９８パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度を提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９０パーセントの固有の読み取りを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９５パーセントの固有の読み取りを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有している９０パーセントより多くのゲノムフラグメントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有している約８０パーセントより多くのゲノムフラグメントを提供する。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここでゲノムフラグメントの各々は、約１００塩基から約５００塩基の長さである。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドの３０パーセントより多くは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００のポリヌクレオチドの１５パーセントより多くは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは、総体として単一のエクソン配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを含む。さらに本明細書においてポリヌクレオチドライブラリが提供され、ここで少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１５０，０００のセットを含む。
【０００７】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリを生成するための方法であって、該方法は：少なくとも５０００のポリヌクレオチドをコードするあらかじめ決定された配列を提供する工程；少なくとも５０００のポリヌクレオチドを合成する工程；および、ポリヌクレオチドライブラリを形成するためにポリメラーゼで少なくとも５０００のポリヌクレオチドを増幅する工程を含み、ここで、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約２倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの３０パーセントより多くは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの１５パーセントより多くは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、エラーの補正なしで、あらかじめ決定された配列と比較して、８００塩基において１未満の合計エラー率を有する。さらに本明細書で提供される方法において、あらかじめ決定された配列は少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドをコードする。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの合成は、面を有する構造において行われ、面は複数のクラスタを含む。各クラスタは複数の遺伝子座を含み、および少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々、複数の遺伝子座の異なる遺伝子座から伸長する。さらに本明細書で提供される方法において、複数の遺伝子座はクラスタあたり最大１０００の遺伝子座を含む。さらに本明細書で提供される方法において、複数の遺伝子座はクラスタあたり最大２００の遺伝子座を含む。
【０００８】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリの増幅のための方法であって、該方法は：少なくとも５０００のポリヌクレオチドのための増幅分布を得る工程；少なくとも１つの配列特徴に基づいて２つ以上のビンへと、増幅分布の少なくとも５０００のポリヌクレオチドをクラスタリングする工程であって、配列特徴はパーセントＧＣ含量、パーセント反復配列含量、またはパーセント二次構造含量である、工程；あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを生成するために少なくとも１つのビン中のポリヌクレオチドの相対度数を適合させる工程；あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを合成する工程；および、あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを増幅する工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも１つの配列特徴はパーセントＧＣ含量である。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも１つの配列特徴はパーセント二次構造含量である。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも１つの配列特徴はパーセント反復配列含量である。さらに本明細書で提供される方法において、反復配列含量は３つ以上のアデニンを有する配列を含む。さらに本明細書で提供される方法において、反復配列含量は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの末端に反復配列を含む。さらに本明細書で提供される方法において、前記ポリヌクレオチドは、標的配列を結合するために１つ以上のポリヌクレオチド配列の親和性に基づいてビンへとクラスタリングされる。さらに本明細書で提供される方法において、ビンの下３０パーセントにある配列の数は、調整前のビンの下３０パーセントにある配列の数と比較して、調整後の下流での適用に少なくとも５０％より多くの表示を有する。さらに本明細書で提供される方法において、ビンの上３０パーセントにある配列の数は、調整前のビンの上３０パーセントにある配列の数と比較して、調整後の下流での適用に少なくとも５０％より多くの表示を有する。
【０００９】
本明細書で提供されるのは、ゲノムＤＮＡのシーケンシングのための方法であって、該方法は：複数のゲノムフラグメントに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリのいずれかを接触させる工程；少なくとも１つの濃縮された標的ポリヌクレオチドを生成するためにライブラリに結合する少なくとも１つのゲノムフラグメントを濃縮する工程；および少なくとも１つの濃縮された標的ポリヌクレオチドを配列決定（シーケンシング）する工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、複数の濃縮された標的ポリヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドは約８０〜約２００の塩基の長さである。さらに本明細書で提供される方法において、ゲノムフラグメントの各々は、約１００塩基から約５００塩基の長さである。さらに本明細書で提供される方法において、接触させる工程は溶液中で行なわれる。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドはゲノムフラグメントに対して少なくとも部分的に相補的である。さらに本明細書で提供される方法において、単離は（ｉ）個体担体上のポリヌクレオチド／ゲノムフラグメントのハイブリダイゼーション対を捕捉する工程；および（ｉｉ）濃縮された標的ポリヌクレオチドを生成するために複数のゲノムフラグメントを放出する工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度をもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して最大５５倍の理論上の読み取り深度のための条件下で、ゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９８パーセントの少なくとも３０倍の読み取り深度をもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９０パーセントの固有の読み取りをもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、ゲノムフラグメントの塩基に関して少なくとも９５パーセントの固有の読み取りをもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９０パーセントをもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有するゲノムフラグメントの塩基の少なくとも９５パーセントをもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも９０パーセントをもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、シーケンシングは結果として、平均読み取り深度の約１．５倍以内の読み取り深度を有する、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているゲノムフラグメントの少なくとも約８０パーセントをもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも約８０パーセントは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも３０パーセントは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントのＧＣの割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの少なくとも１５パーセントは、１０パーセントから３０パーセントまたは７０パーセントから９０パーセントの反復配列または二次構造配列の割合を有しているポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドは少なくとも１０００の遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのエクソン配列を含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは、総体として単一のエクソン配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも７００，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１５０，０００のセットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】最初のポリヌクレオチドライブラリの適用、適用出力からのバイアスの測定、第２の制御された化学量論ポリヌクレオチドライブラリの設計と合成、および望ましい表示出力を生成するための第２のポリヌクレオチドライブラリの適用を含む、概略的なワークフローを示す。
【図１Ｂ】標的結合ポリヌクレオチドライブラリで標的ポリヌクレオチドを濃縮するための概要を示す。
【図１Ｃ】核酸サンプルの濃縮とシーケンシングに関する典型的なワークフローを表す。
【図２】クラスタ増幅からのポリヌクレオチドライブラリの生成の概略を表す。
【図３Ａ】標的化と濃縮のための１対のポリヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチドは、相補的な標的結合（挿入）配列、およびプライマー結合部位を含む。
【図３Ｂ】標的化と濃縮のための１対のポリヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチドは、相補的な標的配列結合（挿入）配列、プライマー結合部位、および非標的配列を含む。
【図４Ａ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列はポリヌクレオチド結合領域より短く、およびポリヌクレオチド結合領域（または挿入配列）は標的配列に対してオフセットされ、さらに隣接する配列の一部に結合する。
【図４Ｂ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列の長さは、ポリヌクレオチド結合領域以下であり、およびポリヌクレオチド結合領域は標的配列で中心におかれ、隣接する配列の一部にさらに結合する。
【図４Ｃ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列はポリヌクレオチド結合領域よりわずかに長く、およびポリヌクレオチド結合領域は、各側の緩衝領域で標的配列上の中心におかれる。
【図４Ｄ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列はポリヌクレオチド結合領域より長く、および２つのポリヌクレオチドの結合領域は、標的配列に及ぶようにオーバーラップする。
【図４Ｅ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列はポリヌクレオチド結合領域より長く、および２つのポリヌクレオチドの結合領域は、標的配列に及ぶようにオーバーラップする。
【図４Ｆ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列はポリヌクレオチド結合領域より長く、および２つのポリヌクレオチドの結合領域は、標的配列に及ぶようにオーバーラップせず、隙間（４０５）を残す。
【図４Ｇ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列へのポリヌクレオチド結合の形態を表す。標的配列はポリヌクレオチド結合領域より長く、および３つのポリヌクレオチドの結合領域は、標的配列に及ぶようにオーバーラップする。
【図５】本明細書に開示される遺伝子合成のための典型的な処理ワークフローを明示する工程の図を示す。
【図６】コンピュータシステムを例示する。
【図７】コンピュータシステムのアーキテクチャを例示するブロック図である。
【図８】複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話と個人用携帯情報端末、およびネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを明示する図表である。
【図９】共有の仮想アドレスメモリ容量を使用するマルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図である。
【図１０】２５６のクラスタを有するプレートの画像であり、各クラスタは１２１の遺伝子座を有し、そこからポリヌクレオチドが伸長する。
【図１１Ａ】２４０のクラスタからの２９，０４０の特有のポリヌクレオチドの合成からの、プレートにわたるポリヌクレオチド表示（測定される吸収度等の、ポリヌクレオチド頻度 対 豊富量）のプロットであり、各クラスタは１２１のポリヌクレオチドを有する。
【図１１Ｂ】個々の各クラスタにわたるポリヌクレオチド頻度 対 豊富量の吸収度（測定される吸収度）の測定のプロットであり、対照のクラスタはボックスで識別される。
【図１２】４つの個別のクラスタにわたるポリヌクレオチド頻度 対 豊富量（測定される吸収度）の測定のプロットである。
【図１３Ａ】２４０のクラスタからの２９，０４０の特有のポリヌクレオチドの合成からの、プレートにわたる頻度 対 エラー率のプロットであり、各クラスタは１２１のポリヌクレオチドを有する。
【図１３Ｂ】各個別のクラスタにわたるポリヌクレオチドのエラー率 対 頻度の測定のプロットであり、対照のクラスタはボックスで識別される。
【図１４】４つのクラスタにわたるポリヌクレオチド頻度 対 エラー率の測定のプロットである。
【図１５】ポリヌクレオチドの数 対 １つのポリヌクレオチドあたりのパーセントの測定数としてのＧＣ含量のプロットである。
【図１６】２つの異なるポリメラーゼでのＰＣＲからの結果を提供する。各チャートは、ポリヌクレオチドの数（０〜２，０００）対 観察された頻度（１００，０００あたりの数で計測した「０〜３５」）を表す。
【図１７】記録された増幅後のポリヌクレオチド集団の均一性の定量化でのチャートを提供する。
【図１８】配列ドロップアウトへの過剰増幅の影響を明示するプロットを表す。
【図１９】ポリヌクレオチドの未増幅集団と増幅集団における、ポリヌクレオチド頻度あたりの（１００，０００読み取りあたりの）ＧＣ含量の割合のプロットを表す。
【図２０】クラスタ増幅後の２つの別個の実行に関する、ポリヌクレオチド頻度あたりの（１００，０００読み取りあたりの）ＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２１Ａ】ポリヌクレオチドのＧＣ平衡ライブラリに関する、ポリヌクレオチド頻度あたりのＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２１Ｂ】ポリヌクレオチドの極度に高い、および低いＧＣバイアスライブラリに関する、ポリヌクレオチド頻度あたりのＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２１Ｃ】ポリヌクレオチドのやや高い、および低いＧＣバイアスライブラリに関する、ポリヌクレオチド頻度あたりのＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２１Ｄ】ポリヌクレオチドの低ＧＣバイアスライブラリに関する、ポリヌクレオチド頻度あたりのＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２１Ｅ】ポリヌクレオチドの高ＧＣバイアスライブラリに関する、ポリヌクレオチド頻度あたりのＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２２】１５％〜８５％のＧＣ含量を含む配列を有する理論上１３，０００ｐｌｅｘポリヌクレオチドライブラリに関する、ポリヌクレオチド頻度あたりのＧＣ含量の割合のプロットである。
【図２３】ＧＣの平衡なポリヌクレオチドライブラリに関する、ポリヌクレオチドの数 対 ポリヌクレオチドの頻度（１００，０００読み取りあたり）のプロットである。
【図２４Ａ】単分散ライブラリの理論上の最大値と比較して、ＧＣの平衡なポリヌクレオチドライブラリに関して８０％のシーケンシングカバー率を得るのに必要なサンプリングの量を示すプロットである。
【図２４Ｂ】単分散ライブラリの理論上の最大値と比較して、ＧＣの平衡なポリヌクレオチドライブラリに関して９０％のシーケンシングカバー率を得るのに必要なサンプリングの量を示すプロットである。
【図２５】８０ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含むライブラリに関する、ポリヌクレオチドの数 対 ポリヌクレオチドの頻度（１，０００，０００読み取りあたりの数）のプロットである。
【図２６】１２０ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含むライブラリに関する、ポリヌクレオチドの数 対 ポリヌクレオチドの頻度（１，０００，０００読み取りあたりの数）のプロットである。
【図２７】８０および１２０のヌクレオチド長さのＧＣの平衡なポリヌクレオチドライブラリの両方に関して、（１，０００，０００の読み取りにつき）ポリヌクレオチドの平均頻度を示すプロットである。
【図２８】ポリヌクレオチド配列表示上の、ＰＣＲ増幅サイクル数、ＧＣ含量、およびＤＮＡポリメラーゼの選択の効果を示すプロットを表す。
【図２９】２つの異なる高忠実度のポリメラーゼに関する増幅サイクルの関数としての配列ドロップアウトのプロットである。
【図３０】配列表示に対する、異なるＤＮＡポリメラーゼの効果を示すプロットを表す。同じポリヌクレオチドライブラリは、ＤＮＡポリメラーゼ１またはＤＮＡポリメラーゼ２を用いて１５サイクル、増幅された。
【図３１Ａ】制御された化学量論なしに、エクソームプローブライブラリを使用して、標的配列に関する任意の読み取り深度を達成するのに求められるシーケンシングに係る量を表す。
【図３１Ｂ】制御された化学量論のないエクソームプローブライブラリと比較した、制御された化学量論を有するエクソームプローブライブラリを使用して標的配列に関する所与の読み取り深度を達成するために求められる配列全体に及ぶ減少を示す。
【図３２Ａ】コンパレータエクソームプローブキットＡと制御された化学量論プローブライブラリ１の両方に関する、１ｘ、２０ｘまたは３０ｘシーケンシング読み取り深度（Ｘカバー率）を有する塩基のパーセントのプロットである。
【図３２Ｂ】コンパレータエクソームプローブキットと制御された化学量論プローブライブラリ１のパネルに関する、４．５Ｇｂのシーケンシングで標準化された、１ｘまたは１０ｘシーケンシング読み取り深度（Ｘカバー率）を有する塩基のパーセントのプロットである。
【図３３】ライブラリ内のポリヌクレオチドの数の関数として、異なるスケールのポリヌクレオチドプローブライブラリの合成を表す。
【図３４】コンパレータアレイベースのプローブライブラリの読み取り深度 対 制御された化学量論プローブライブラリ２の関数としてのカバー率（塩基数）の比較を表す。
【図３５Ａ】１０〜３０％、および３０〜５０％のＧＣ含量を有する標的に関する、コンパレータアレイベースのプローブライブラリ 対 制御された化学量論プローブライブラリ２の読み取り深度の関数としてのカバー率間の比較を示す。
【図３５Ｂ】５０〜７０％より大きい、および３０〜５０％より大きいＧＣ含量を有する標的に関する、コンパレータアレイベースのプローブライブラリ 対 制御された化学量論プローブライブラリ２の読み取り深度の関数としてのカバー率間の比較を示す。
【図３６Ａ】コンパレータアレイベースのプローブライブラリの標的比率のパーセント（％）と、制御された化学量論プローブライブラリ３の０．１ｘ、１ｘ、および３ｘの濃度との間の比較を示す
【図３６Ｂ】コンパレータアレイベースのプローブライブラリの読み取り深度と、制御された化学量論プローブライブラリ４の０．１ｘ、１ｘ、および３ｘの濃度との間の比較を示す。
【図３７】コンパレータエクソームキット 対 制御された化学量論プローブライブラリ４の、特有の読み取りの割合と、１Ｘ、２０Ｘ、および３０Ｘの読み取り深度での標的塩基との間の比較を示す。
【図３８】コンパレータエクソームキット 対 制御された化学量論プローブライブラリ４の、カバーされた塩基の割合と、１Ｘ、２０Ｘ、および３０Ｘの読み取り深度での標的塩基との間の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、別記されない限り、当技術分野の技術内である、従来の分子生物学技術を使用する。他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語と科学的用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１２】
本明細書において、大きなポリヌクレオチドライブラリの化学量論を設計し、合成し、制御する方法が提供される。ポリヌクレオチドの第１の集団が、濃縮のための補足プローブとして、例えば増幅のための、予備的な適用工程、および遺伝子合成にかけられる場合、続くポリヌクレオチドの集団の増幅反応は結果として、ポリヌクレオチド配列における変異によるバイアスのかかった表示出力をもたらし得、特定のポリヌクレオチドは他のものよりもより豊富に表示される。図１１Ａ。この予備的な適用出力から観察される、結果としてもたらされるバイアスが測定され、およびあらかじめ選択された化学量論、例えばＧＣ含量、反復配列、後端（トレーリング）アデニン、二次構造、標的配列結合への親和性、または修飾されたヌクレオチド等の任意の数の配列特徴を考慮した、集団におけるポリヌクレオチドの相対頻度を用いて、ポリヌクレオチドの第１の集団を制御するために使用される。ポリヌクレオチドの化学量論を修正した後に、ポリヌクレオチドの第２の集団は、適用工程に関連する望ましくないバイアス効果を修正するためにあらかじめ選択された化学量論で、設計され、かつ合成される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの第２の制御された化学量論集団を、ＰＣＲ増幅等の適用工程にかけることで、結果として、高度に均一な表示を伴う増幅されたポリヌクレオチド集団等の平衡な出力、または表示にあらかじめ選択された転移を有する不均一な表示等がもたらされる。図１Ａの下のチャートを参照されたい。いくつかの例では、本明細書で記載される方法は、ポリヌクレオチド集団が高度に均一な標的配列捕捉頻度を提供するように、ポリヌクレオチドプローブの配列表示を制御する工程を含む（図１Ｂ）。例えば、ポリヌクレオチド（１００）のサンプルは標的ポリヌクレオチド（１０１）を含む。適切な条件（１０２）下での標的結合ポリヌクレオチド（１０３）とのサンプル（１００）の接触は、結果として、ハイブリダイゼーション対（１０４）の形成をもたらし、これはサンプル（１００）において非標的ポリヌクレオチドから分離される。対（１０４）の変性と分離は、シーケンシング等の下流での適用のために濃縮された標的ポリヌクレオチド（１０７）を放出する。さらに本明細書において提供されるのは、シーケンシングプロセスの文脈における例として、ゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションで使用されるデノボ合成ポリヌクレオチドである。典型的なシーケンシングワークフロー（図１Ｃ）の第１の工程において、標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプル（１０８）が、フラグメント（１０９）のライブラリを形成するために、機械的切断または酵素による切断によってフラグメント化される。随意にプライマー配列および／またはバーコードを含むアダプター（１１５）は、アダプター標識ライブラリ（１１０）を形成するために結合される。このライブラリはその後、随意に増幅され、標的結合ポリヌクレオチド（１１７）とアダプター（１１５）のハイブリダイゼーションを防ぐブロッキング（遮断）ポリヌクレオチド（１１６）と共に、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする標的結合ポリヌクレオチド（１１７）とハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチド・標的結合ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション対（１１２）の補足、および標的結合ポリヌクレオチド（１１７）の除去は、標的ポリヌクレオチド（１１３）の単離／濃縮を可能にし、これはその後、随意に増幅され、配列される（１１４）。
【００１３】
定義
【００１４】
本開示の全体にわたって、数的な特徴は範囲のフォーマットで提示される。範囲のフォーマットでの記載が、単に利便性と簡潔性のためのものであることを理解すべきであり、実施形態の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、文脈が他で明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの範囲内の個々の数値と共に、すべての可能性のある部分範囲を具体的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲と共に、例えば１．１、２、２．３、５、および５．９などの、その範囲内の個々の値を具体的に開示していると考えるべきである。これは範囲の幅にかかわらず適用される。これらの介在範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立して含まれてもよく、また、定められた範囲の具体的に除外された限度に従って、本発明内に包含される。定められた範囲が上限および下限の１つまたはその両方を含む場合、これらの含まれた上限および下限のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、文脈が他で明確に指示しない限り、本発明に包含される。
【００１５】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、実施形態を限定するようには意図されない。本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他で明確に指示しない限り、複数形も同様に含むことが意図される。用語「含む」および／または「含んでいる」は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、工程、動作、要素、および／または構成要素の存在を規定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を妨げないことが、さらに理解される。本明細書において使用されるように、用語「および／または」は、表記される関連項目の１つ以上の任意の、および全ての組み合わせを含む。
【００１６】
具体的に規定されない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるように、数または数の範囲に関する用語「約」は、定められた数の＋／−１０％、または範囲に関して表記される値の表記された下限より１０％下、および表記された上限の１０％上を意味すると理解される。
【００１７】
本明細書において使用されるように、用語「あらかじめ選択された配列」、「あらかじめ規定された配列」または「あらかじめ決定された配列」は、区別なく使用される。該用語は、ポリマーの配列が、ポリマーの合成または組立ての前に既知であり、かつ選択されることを意味する。特に、本発明の様々な態様は主として核酸分子の調製に関連して本明細書に記載され、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列は、核酸分子の合成または組立て前に既知であり、かつ選択されている。
【００１８】
用語「核酸」は、単鎖の分子と共に、二重鎖または三重鎖の核酸を包含する。二重鎖または三重鎖の核酸では、核酸の鎖は同一の広がりを持つ必要はない（すなわち、二重らせん構造の核酸は、両方の鎖の全長に沿って二重らせん構造である必要はない）。核酸配列は、別記されない限り、提供される場合には５’から３’の方向に表記される。本明細書に記載される方法は、単離された核酸の生成を提供する。本明細書に記載される方法は、付加的に、単離され精製された核酸の生成を提供する。提供される場合、ポリヌクレオチドの長さは塩基の数で記載され、ｎｔ（ヌクレオチド）、ｂｐ（塩基）、ｋｂ（キロベース）、またはＧｂ（ギガベース）等で略記される。
【００１９】
本明細書において提供されるのは、合成の（すなわち、デノボ合成された、または化学的に合成された）ポリヌクレオチドの生成のための方法と組成物である。オリゴ核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴ、およびポリヌクレオチドの用語は、全体にわたって同意語として規定される。本明細書で記載される合成されたポリヌクレオチドのライブラリは、総体として１つ以上の遺伝子または遺伝子フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリはコード配列または非コード配列を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは複数のｃＤＮＡ配列をコードする。ｃＤＮＡ配列の基盤となる参照遺伝子配列はイントロンを含んでもよく、しかしｃＤＮＡ配列はイントロンを除外する。本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、有機体からの遺伝子または遺伝子フラグメントをコードし得る。典型的な有機体として、限定されないが、原核生物（例えば細菌）と真核生物（例えばマウス、ウサギ、ヒト、およびヒト以外の霊長類）があげられる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは１つ以上のポリヌクレオチドを含み、１つ以上のポリヌクレオチドの各々は多数のエクソンに関する配列をコードする。本明細書に記載されるライブラリ内の各ポリヌクレオチドは、異なる配列、すなわち非同一の配列をコードし得る。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリ内の各ポリヌクレオチドは、ライブラリ内の他のポリヌクレオチドの配列に相補的な少なくとも１つの部分を含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列は、別段の定めのない限り、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または１，０００，０００より多くのポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００の、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、または１，０００，０００以下のポリヌクレオチドを有し得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは、１０〜５００、２０〜１０００、５０〜２０００、１００〜５０００、５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００、１０，０００〜５０，０００、１００，０００〜５００，０００、または５０，０００〜１，０００，０００のポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは約３７０，０００；４００，０００；５００，０００、またはより多くの異なるポリヌクレオチドを含み得る。
【００２０】
本明細書において提供されるのは、合成の（すなわちデノボ合成された）遺伝子のための方法と組成物である。合成遺伝子を含むライブラリは、ＰＣＡ／非ＰＣＡ遺伝子組立て法または階層的遺伝子組立て法等の、本明細書でさらに詳細に別記される様々な方法によって構築されてもよく、より大きなＤＮＡユニット（すなわちシャシー（ｃｈａｓｓｉｓ））を生成するために、２つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを組み合わせる（縫い合わせる）。大きな構築物のライブラリは、少なくとも１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００ｋｂの長さ、またはより長いポリヌクレオチドを含み得る。大きな構築物は、約５０００、１００００、２００００、または５００００塩基対の独立して選択された上限によって、制限することができる。非リボソームのペプチド（ＮＲＰ）をコードする配列、非リボソームのペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）モジュールをコードする配列、および合成変異体を含む、ヌクレオチド配列をコードするポリペプチドセグメント、抗体等の他の調節タンパク質のポリペプチドセグメント、例えばプロモーター、転写因子、エンハンサー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ由来の小核小体ＲＮＡ、または対象となる機能的または構造的ＤＮＡまたはＲＮＡユニット等の、調節配列等の、非コードＤＮＡまたはＲＮＡを含む、他のタンパク質ファミリーからのポリペプチドセグメント、の任意の数の合成。下記はポリヌクレオチドの非限定な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖解析により規定された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、これは、通常はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写、または増幅によって得られるｍＲＮＡのＤＮＡ表示である；合成または増幅によって生成されたＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。本明細書で言及される遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするｃＤＮＡは、対応するゲノム配列に見られる介在イントロン配列なしに、エクソン配列をコードする少なくとも１つの領域を含み得る。代替的に、ｃＤＮＡに対応するゲノム配列は、そもそもイントロン配列を欠いている場合もある。
【００２１】
増幅反応のための小さなポリヌクレオチド集団のデノボ合成
【００２２】
面、例えばプレートからのポリヌクレオチドの合成の方法が、本明細書に記載される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド拡張のための遺伝子座のクラスタ上で合成され、放出され、次に増幅反応、例えばＰＣＲにさらされる。クラスタからのポリヌクレオチドの合成の典型的なワークフローが図２に示される。シリコンプレート（２０１）は多数のクラスタ（２０３）を含む。各クラスタ内には多数の遺伝子座（２２１）がある。ポリヌクレオチドは、クラスタ（２０３）からのプレート（２０１）上でデノボ合成される（２０７）。ポリヌクレオチドは、開裂され（２１１）、プレートから取り除かれて（２１３）、放出されたポリヌクレオチド（２１５）の集団を形成する。放出されたポリヌクレオチド（２１５）の集団はその後、増幅されて（２１７）、増幅されたポリヌクレオチド（２１９）のライブラリを形成する。
【００２３】
本明細書で提供される方法において、クラスタ上で増幅されたポリヌクレオチドの合成は、そのようなクラスタ構造のない構造の全表面にわたるポリヌクレオチドの増幅と比較して、ポリヌクレオチド表示に対する制御の向上を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチド拡張のための遺伝子座のクラスタ構造を有する面から合成されたポリヌクレオチドの増幅は、大きなポリヌクレオチド集団の繰り返しの合成によって、表示に対する負の効果に打ち勝つようにする。大きなポリヌクレオチド集団の繰り返しの合成による表示に対する典型的な負の効果は、限定されないが、高／低ＧＣ含量に起因する増幅バイアス、反復配列、後端アデニン、二次構造、標的配列結合への親和性、またはポリヌクレオチド配列中の修飾ヌクレオチドを含む。
【００２４】
クラスタ構造のないプレート全体にわたるポリヌクレオチドの増幅とは対照的に、クラスタ増幅は、平均値付近のより緊密な分布を結果としてもたらすことができる。例えば、１００，０００の読み取りが無作為にサンプリングされると、１つの配列につき平均８の読み取りが、平均値から約１．５Ｘの分布を有するライブラリを生み出すだろう。場合によっては、単一のクラスタ増幅は、平均値から多くとも約１．５Ｘ、１．６Ｘ、１．７Ｘ、１．８Ｘ、１．９Ｘ、または２．０Ｘに帰結する。場合によっては、単一のクラスタ増幅は、平均値から少なくとも約１．０Ｘ、１．２Ｘ、１．３Ｘ、１．５Ｘ、１．６Ｘ、１．７Ｘ、１．８Ｘ、１．９Ｘ、または２．０Ｘに帰結する。
【００２５】
プレート全体に及ぶ増幅と比較した場合、本明細書に記載されるクラスタ増幅法は、同等の配列表示のためのより少ないシーケンシングを必要とするポリヌクレオチドライブラリをもたらすことができる。いくつかの例では、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％より少ないシーケンシングが必要である。いくつかの例では最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、または最大９５％より少ないシーケンシングが必要である。時には３０％より少ないシーケンシングが、プレート全体に及ぶ増幅と比較して、クラスタ増幅後に必要である。いくつかの例でのポリヌクレオチドのシーケンシングは、次世代シーケンシング等による高性能配列解読装置によって検証される。シーケンシングライブラリのシーケンシングは、限定されないが、単一分子のリアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、結紮によるシーケンシング、可逆的ターミネーターシーケンシング、プロトン検出シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ナノポアシーケンシング、電子シーケンシング、ピロシーケンス、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、連鎖停止反応（例えばサンガー法）シーケンシング、＋Ｓシーケンシング、または合成によるシーケンシングを含む、任意の適切なシーケンシング技術で行なうことができる。単一のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが特定され、または「読み取られる」回数は、シーケンシング深度または読み取り深度として定義される。場合によっては、読み取り深度は、倍単位でのカバー率、例えば５５倍（または５５Ｘ）のカバー率として言及され、随意に塩基の割合を記載する。
【００２６】
いくつかの例では、プレート全体に及び増幅と比較して、クラスタ構造からの増幅は、より少ないドロップアウト、または増幅産物のシーケンシング後に検出されない配列をもたらす。ドロップアウトはＡＴおよび／またはＧＣのものであり得る。いくつかの例では、ドロップアウトの数は、多くともポリヌクレオチド集団の約１％、２％、３％、４％、または５％である。場合によっては、ドロップアウトの数は０である。
【００２７】
本明細書に記載されるクラスタは、ポリヌクレオチド合成のための分離した重複しない遺伝子座の集合を含む。クラスタは、約５０〜１０００、７５〜９００、１００〜８００、１２５〜７００、１５０〜６００、２００〜５００、または３００〜４００の遺伝子座を含むことができる。いくつかの例では、各クラスタは１２１の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスタは、約５０〜５００、５０〜２００、１００〜１５０の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスタは、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはより多くの遺伝子座を含む。いくつかの例では、単一のプレートは、１００、５００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、１００００００、またはより多くの遺伝子座を含む。遺伝子座は、スポット、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストであり得る。いくつかの例では、各クラスタは、少なくとも１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、またはより多くの、同一の配列を有するポリヌクレオチドの拡張を支持する余剰な別個の特徴を有する。
【００２８】
制御された化学量論を有するポリヌクレオチドライブラリの設計
【００２９】
本明細書において、ポリヌクレオチドライブラリの設計と合成のための方法が提供され、各ポリヌクレオチド種（すなわち、ライブラリの他のポリヌクレオチドとは異なる配列を有する）の量（または化学量論）は、望ましい結果が下流での適用に対して制御されるように、あらかじめ決定された量に調節される。そのため、本明細書において提供されるのは、ポリヌクレオチド種化学量論の制御され、あらかじめ決定された修飾のための方法である。例えば、増幅反応後のポリヌクレオチド種分布は、本明細書に記載される方法を使用するために制御され得る。ポリヌクレオチド種分布は、例えば、シーケンシング解析等のためのハイブリダイゼーションベースのアッセイのためのポリヌクレオチドのパネルを使用して、標的配列の高度に均一な捕捉を提供するために、あらかじめ選択される。さらに、本明細書に記載される方法は、典型的には特定の「問題のある」ポリヌクレオチド配列に起因する不均一な増幅産物または捕捉産物をもたらす１つ以上の配列特徴を伴う配列のポリヌクレオチドライブラリを設計する工程を提供し、ここで「問題のある」ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドライブラリの適用におけるバイアスの生成に関係する１つ以上の特性を含む。本明細書に記載される方法を使用する化学量論の制御のための典型的な「問題のある」ポリヌクレオチド配列特性は、限定されないが、高いまたは低いＧＣあるいはＡＴ含量、反復配列、後端アデニン、二次構造、（増幅、濃縮または検出に関する）標的配列結合への親和性、安定性、融解温度、生物学的活性、より大きなフラグメントに組立てるための性能、修飾されるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む配列、または予測データまたは実験データに基づいて配列の第２のポリヌクレオチドライブラリを生成するための他のポリヌクレオチド特性、を含む。いくつかの例では、配列のライブラリは、化学量論の制御のために取得され、１つ以上の配列特徴に基づいて２つ以上のあらかじめ決定されたグループ（ビン）に整理され、またはクラスタリング（ビン入れ）される。いくつかの例では、２つ以上のビンは個々のユニーク配列を表す。いくつかの例では、ビンは、各々が全配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％を含む、１つ以上の規定された配列特徴に基づいて、値の範囲を表示する。いくつかの例では、ビンは、各々が全配列の多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％未満を含む、数値の範囲を表す。一例では、ビンは％ＧＣによって規定されてもよく、多数のビンが５％のインクリメント（例えば２５−２９％、３０−３４％、３５−３９％等）で２５−７５％を表し、あるビンは２５％未満を表し、またあるビンは７５％より多くのＧＣ含量を表す。各ビンにおける全ての配列に対する分子の化学量論を表す、各ビンに関する存在値が割り当てられる。いくつかの例では、存在値は最初に１００に設定され、ビンあたりの配列の等しい表示をもたらす。いくつかの例では、化学量論の制御には、各ビンに対して存在値を増加させる、減少させる、または維持するために、得られた適用バイアスデータを使用することによって行われる。規格に一致するように配列の豊富量を適合させる他の方法も使用される。いくつかの例では、事前に取得された分布は、最初の存在値を判定するために使用される。
【００３０】
いくつかの例では、適用バイアスデータは、予測的アルゴリズムによって得られる。適用バイアスデータは経験的に得られてもよく、または制御されていない、または事前に制御された化学量論ライブラリから得られてもよい。例えば、適用バイアスデータは、ポリヌクレオチドライブラリの増幅から得られる；増幅後のビンあたりのポリヌクレオチドの頻度は、％ＧＣ含量の関数として増幅バイアスを設定するために、％ＧＣビンに対してプロットされる。他の例において、適用バイアスデータは、ポリヌクレオチドプローブライブラリを用いて標的配列の濃縮後に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データから得られる；標的遺伝子あたりの読み取りは、ビンへとプローブ配列を選別するために使用される；標的遺伝子ごとの読み取りは、ポリヌクレオチドプローブ配列の関数としてＮＧＳシーケンシングバイアスを設定するために、ＮＧＳ読み取りビンの数に対してプロットされる。他の例において、適用バイアスデータは、ポリヌクレオチドライブラリを含むベクターでの細胞処理後に、蛍光等の細胞アッセイ出力から得られるだろう；蛍光細胞で識別された配列ごとの読み取りは、ビンへとプローブ配列を選別するために使用される；配列ごとの読み取りは、ポリヌクレオチドプローブ配列の関数としてバイアスを設定するために、読み取りビンの数に対してプロットされる。
【００３１】
化学量論を制御した後に、修飾された配列ライブラリが、ポリヌクレオチドの制御された化学量論ライブラリを生成するために合成される。いくつかの例では、制御された化学量論ライブラリは、下流での適用に使用される。いくつかの例では、制御された化学量論ポリヌクレオチドライブラリを用いた下流での適用からのデータは、ライブラリの化学量論的修飾の追加ラウンドを実施するために使用される。
【００３２】
ＧＣ含量の制御された化学量論を用いたポリヌクレオチドライブラリの生成
【００３３】
本明細書で提供されるのは、ＧＣ含量、反復配列、後端アデニン、二次構造、標的配列結合への親和性、または予測データあるいは実験データに基づいて、ポリヌクレオチドの第２の集団を生成するための修飾されたヌクレオチド等の、規定された特性を有するポリヌクレオチドライブラリを合成するための方法である。例えば、ポリヌクレオチドライブラリが、増幅後に規定されたＧＣ含量に帰結するように合成用に選択される場合、ＧＣ含量に依存する合成工程におけるライブラリ内のポリヌクレオチドに関する種の表示の調整は、増幅後のポリヌクレオチド表示の改善をもたらす。ポリヌクレオチドライブラリのＧＣ含量は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％以上であり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリのＧＣ含量は、多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％未満である。場合によっては、ＧＣ含量は、約５〜９５％、１０〜９０％、３０〜８０％、４０〜７５％、または５０〜７０％の範囲である。
【００３４】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは、それらのＧＣ含量に適合させてもよい。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは高いＧＣ含量を好む。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が約４０％から約９０％の範囲のＧＣ含量を有するライブラリが設計される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは低いＧＣ含量を含む。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が約１０％から約６０％の範囲のＧＣ含量を有するライブラリが設計される。ライブラリは、高いおよび低いＧＣ含量を好むように設計することができる。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が、主として約１０％から約３０％の範囲、および約７０％から約９０％のＧＣ含量を有するライブラリを設計することができる。いくつかの例では、ライブラリは均一のＧＣ含量を好む。例えば、ポリヌクレオチド頻度は、約１０％から約９０％の範囲のＧＣ含量有し、均一である。いくつかの例では、ライブラリは、約１０％から約９５％のＧＣの割合でポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは、１０％から３０％または７０％から９０％のＧＣの割合を有する、３０％より多くの異なるポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは、１０％から３０％または６０％から９０％のＧＣの割合を有する、約１５％未満のポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドを含む。
【００３５】
いくつかの場合において指定されたＧＣ含量を有するポリヌクレオチドライブラリの生成は、異なるＧＣ含量を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドライブラリを組み合わせることによって起こる。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、または１０より多くのポリヌクレオチドライブラリが、指定されたＧＣ含量を有するポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。場合によっては、２、３、４、５、６、７、または１０以下のポリヌクレオチドライブラリが、指定されたＧＣ含量を有する非同一のポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。
【００３６】
いくつかの例では、ＧＣ含量は、クラスタあたりより少数、またはより多くのポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００より多くの非同一のポリヌクレオチドは、単一のクラスタ上で合成される。場合によっては、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００の、７００、８００、９００、１０００以下の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、５０〜５００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、１００〜２００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、約１００、約１２０、約１２５、約１３０、約１５０、約１７５、または約２００の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。
【００３７】
場合によっては、ＧＣ含量は、可変長の非同一のポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、少なくとも、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、２０００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。合成された非同一のポリヌクレオチドの長さは、多くとも、または多くとも約２０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下でもよい。合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、１０〜２０００、１０〜５００、９〜４００、１１〜３００、１２〜２００、１３〜１５０、１４〜１００、１５〜５０、１６〜４５、１７〜４０、１８〜３５、および１９〜２５であり得る。
【００３８】
反復配列含量の制御された化学量論を用いたポリヌクレオチドライブラリの生成
【００３９】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは、指定された反復配列分布で合成され得る。いくつかの例では、反復配列含量に関してポリヌクレオチドライブラリを適合させることで、結果としてポリヌクレオチド表示が改善する。
【００４０】
反復配列は、単一のヌクレオチドの繰り返し、または２つ以上のヌクレオチドのブロックの繰り返しであり得る。いくつかの例では、反復配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０のヌクレオチドである。いくつかの例では、反復配列は、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、または多くとも１０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ヌクレオチドのブロックは、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２５、５０、１００、２００、５００、または少なくとも１０００のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ヌクレオチドのブロックは、多くとも２、３、４、５、１０、１５、２５、５０、１００、２００、５００、または多くとも１０００のヌクレオチドを含む。反復配列は、より大きな合成ポリヌクレオチドの内部または末端位置に位置し得る。末端位置は、ポリヌクレオチドの５’、３’、または５’と３’末端の両方に近い場合もある。いくつかの例では、反復配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０の末端のヌクレオチド以内にある。いくつかの例では、反復配列は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または多くとも１０の末端のヌクレオチド以内にある。いくつかの例では、反復するヌクレオチドはアデニンである。いくつかの例では、反復配列は、ポリヌクレオチド末端、例えばポリアデニン末端に位置する。
【００４１】
ポリヌクレオチドライブラリの反復配列含量は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％以上であり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリの反復配列含量は、多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％以下である。場合によっては、反復配列含量は、約５〜９５％、１０〜９０％、３０〜８０％、４０〜７５％、または５０〜７０％の範囲である。
【００４２】
ポリヌクレオチドライブラリは、それらの反復配列含量に関して適合させることができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは高い反復配列含量を好む。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が約４０％から約９０％の範囲の反復配列含量を有するライブラリが設計される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは低い反復配列含量を含む。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が約１０％から約６０％の範囲の反復配列含量を有するライブラリが設計される。ライブラリは、高いおよび低い反復配列含量を好むように設計することができる。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が、主として約１０％と約３０％の範囲、および約７０％から約９０％の反復配列含量を有するライブラリを設計することができる。いくつかの例では、ライブラリは均一の反復配列含量を好む。例えば、ポリヌクレオチド頻度は、約１０％から約９０％の範囲の反復配列含量を有し、均一である。いくつかの例では、ライブラリは、約１０％から約９５％の反復配列の割合でポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは、１０％から３０％または７０％から９０％の反復配列の割合を有する、３０％より多くの異なるポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは、１０％から３０％または６０％から９０％の反復配列の割合を有する、約１５％未満のポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
いくつかの場合において指定された反復配列含量を有するポリヌクレオチドライブラリの生成は、異なる反復配列含量を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドライブラリを組み合わせることによって起こる。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、または１０より多くのポリヌクレオチドライブラリが、指定された反復配列含量を有するポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。場合によっては、２、３、４、５、６、７、または１０以下のポリヌクレオチドライブラリが、指定された反復配列含量を有する非同一のポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。
【００４４】
いくつかの例では、反復配列含量は、クラスタあたりより少数、またはより多くのポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００より多くの非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。場合によっては、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００の、７００、８００、９００、１０００以下の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、５０〜５００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、１００〜２００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、約１００、約１２０、約１２５、約１３０、約１５０、約１７５、または約２００の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。
【００４５】
場合によっては、反復配列含量は、可変長の非同一のポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、少なくとも、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、２０００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。合成された非同一のポリヌクレオチドの長さは、多くとも、または多くとも約２０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下でもよい。合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、１０〜２０００、１０〜５００、９〜４００、１１〜３００、１２〜２００、１３〜１５０、１４〜１００、１５〜５０、１６〜４５、１７〜４０、１８〜３５、および１９〜２５であり得る。
【００４６】
二次構造含量の制御された化学量論を用いたポリヌクレオチドライブラリの生成
【００４７】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリは、指定された二次構造含量で合成され得る。いくつかの例では、二次構造含量に関してポリヌクレオチドライブラリを適合させることで、結果としてポリヌクレオチド表示が改善する。
【００４８】
二次構造は、ヘリックス（例えばアルファヘリックス）、ベータシート、ステムループ、シュードノット、ホモダイマー、またはヘテロダイマー等の構造を形成する１つ以上のポリヌクレオチド鎖中の３つ以上のヌクレオチドを含むことができる。ステムループはヘアーピンループ、内部ループ、バルジ、またはマルチループであってもよい。二次構造の種類およびそれらの形成能力は、配列データから予測することができる。線形配列の二次構造への折り重ねまたはハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが個体担体に付着している間に、または溶液への分裂後に生じ得る。
【００４９】
ポリヌクレオチドライブラリの二次構造含量は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％以上であり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリの二次構造含量は、多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％以下である。場合によっては、二次構造含量は、約５〜９５％、１０〜９０％、３０〜８０％、４０〜７５％、または５０〜７０％の範囲である。
【００５０】
ポリヌクレオチドライブラリは、それらの二次構造含量に適合させることができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは高い二次構造含量を好む。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が約４０％から約９０％の範囲の二次構造含量を有するライブラリが設計される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは低い二次構造含量を含む。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が約１０％から約６０％の範囲の二次構造含量を有するライブラリが設計される。ライブラリは、高いおよび低い二次構造含量を好むように設計することができる。例えば、増加したポリヌクレオチド頻度が、主として約１０％と約３０％の範囲、および約７０％から約９０％の二次構造含量を有するライブラリを設計することができる。いくつかの例では、ライブラリは均一の二次構造含量を好む。例えば、ポリヌクレオチド頻度は、約１０％から約９０％の範囲の二次構造含量を有し、均一である。いくつかの例では、ライブラリは、約１０％から約９５％の二次構造の割合でポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは、１０％から３０％または７０％から９０％の二次構造の割合を有する、３０％より多くの異なるポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは、１０％から３０％または６０％から９０％の二次構造の割合を有する、約１５％未満のポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドを含む。
【００５１】
いくつかの場合において指定された二次構造含量を有するポリヌクレオチドライブラリの生成は、異なる反復配列含量を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドライブラリを組み合わせることによって起こる。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、または１０より多くのポリヌクレオチドライブラリが、指定された二次構造含量を有するポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。場合によっては、２、３、４、５、６、７、または１０以下のポリヌクレオチドライブラリが、指定された二次構造含量を有する非同一のポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。
【００５２】
いくつかの例では、二次構造含量は、クラスタあたりより少数、またはより多くのポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００以上の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。場合によっては、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００の、７００、８００、９００、１０００以下の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、５０〜５００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、１００〜２００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、約１００、約１２０、約１２５、約１３０、約１５０、約１７５、または約２００の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。
【００５３】
場合によっては、二次構造含量は、可変長の非同一のポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、少なくとも、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、２０００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。合成された非同一のポリヌクレオチドの長さは、多くとも、または多くとも約２０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下でもよい。合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、１０〜２０００、１０〜５００、９〜４００、１１〜３００、１２〜２００、１３〜１５０、１４〜１００、１５〜５０、１６〜４５、１７〜４０、１８〜３５、および１９〜２５であり得る。
【００５４】
配列含量の制御された化学量論を用いたポリヌクレオチドライブラリの生成
【００５５】
いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、望ましいポリヌクレオチド配列の指定された分布で合成される。いくつかの例では、特定の望ましい配列の濃縮のためにポリヌクレオチドライブラリを適合させることは、下流での適用の結果の改善をもたらす。
【００５６】
１つ以上の特異的配列は、下流での適用におけるそれらの評価に基づいて選択することができる。いくつかの例では、評価は、増幅、濃縮、または検出のための標的配列への結合親和性、安定性、融解温度、生物学的活性、より大きなフラグメントへの組立て能力、またはポリヌクレオチドの他の特性である。いくつかの例では、評価は実験による、または先の実験および／またはコンピュータアルゴリズムから予測される。
【００５７】
ポリヌクレオチドライブラリの選択された配列は、配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％以上であり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリの選択された配列は、配列の多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％未満である。場合によっては、選択された配列は、配列の約５〜９５％、１０〜９０％、３０〜８０％、４０〜７５％、または５０〜７０％の範囲である。
【００５８】
ポリヌクレオチドライブラリは、各選択された配列の頻度に適合される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、より多くの選択された配列を好む。例えば、選択された配列の増加したポリヌクレオチド頻度が約４０％から約９０％の範囲であるライブラリが設計される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、低い数の選択された配列を含む。例えば、選択された配列の増加したポリヌクレオチド頻度が約１０％から約６０％の範囲であるライブラリが設計される。ライブラリは、選択された配列のより高い、およびより低い頻度を好むように設計することができる。いくつかの例では、ライブラリは均一の配列表示を好む。例えば、ポリヌクレオチド頻度は、約１０％から約９０％の範囲の選択された配列の頻度に関して均一である。いくつかの例では、ライブラリは、配列の約１０％から約９５％の選択された配列頻度を伴うポリヌクレオチドを含む。
【００５９】
いくつかの場合において指定された選択された配列の頻度を有するポリヌクレオチドライブラリの生成は、異なる選択された配列の頻度を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドライブラリを組み合わせることによって起こる。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、または１０より多くのポリヌクレオチドライブラリが、指定された選択された配列の頻度を有するポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。場合によっては、２、３、４、５、６、７、または１０以下のポリヌクレオチドライブラリが、指定された選択された配列の頻度を有する非同一のポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。
【００６０】
いくつかの例では、選択された配列の頻度は、クラスタあたりより少数、またはより多くのポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００より多くの非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。場合によっては、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００の、７００、８００、９００、１０００以下の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、５０〜５００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、１００〜２００の非同一のポリヌクレオチドが単一のクラスタ上で合成される。いくつかの例では、約１００、約１２０、約１２５、約１３０、約１５０、約１７５、または約２００の非同一のポリヌクレオチドが、単一のクラスタ上で合成される。
【００６１】
場合によっては、選択された配列の頻度は、可変長の非同一のポリヌクレオチドの合成によって適合される。例えば、合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、少なくとも、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、２０００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。合成された非同一のポリヌクレオチドの長さは、多くとも、または多くとも約２０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下でもよい。合成された非同一のポリヌクレオチドの各々の長さは、１０〜２０００、１０〜５００、９〜４００、１１〜３００、１２〜２００、１３〜１５０、１４〜１００、１５〜５０、１６〜４５、１７〜４０、１８〜３５、および１９〜２５であり得る。
【００６２】
ポリヌクレオチドプローブ構造
【００６３】
ポリヌクレオチドプローブライブラリは、サンプルポリヌクレオチドのより大きな集団において特定の標的配列を濃縮するために使用することができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドプローブの各々は、１つ以上の標的配列に相補的な標的結合配列、１つ以上の非標的結合配列、およびユニバーサルプライマー結合部位等の１つ以上のプライマー結合部位を含む。いくつかの例では、相補的あるいは少なくとも部分的に相補的な標的結合配列は、標的配列に結合する（ハイブリダイズする）。ユニバーサルプライマー結合部位等のプライマー結合部位は、プローブライブラリの全ての構成員、または構成員の部分母集団の同時増幅を促進する。いくつかの例では、プローブはさらにバーコードまたはインデックス配列を含む。バーコードは核酸配列であり、バーコードに関連するポリヌクレオチドのいくつかの特徴を識別できるようにする。シーケンシングの後、バーコード領域は、コード領域に関係する特徴またはサンプル源を識別するための指標を提供する。バーコードは、十分な度合の識別を可能にするために、例えば少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、またはそれ以上の塩基の長さの、適切な長さで設計することができる。約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のバーコード等の多数のバーコードは、非バーコード配列によって随意に分離された同じ分子上で使用されてもよい。いくつかの実施形態では、複数のバーコードにある各バーコードは、少なくとも３つの塩基位置、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の位置等において、複数のうちの他のバーコードごとに異なっている。いくつかの例では、対象の標的配列の続く捕捉のためのプローブを形成するために、ポリヌクレオチドは、小分子、ペプチド、抗原、金属またはタンパク質等の１つ以上の分子（または親和性）タグに結合される。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション可能な相補的な標的結合配列を有する２つのプローブが、二本鎖プローブ対を形成する。
【００６４】
本明細書に記載のプローブは、ゲノム内の配列である標的配列に相補的であり得る。本明細書に記載のプローブは、ゲノム内のエクソーム配列である標的配列に相補的であり得る。本明細書に記載のプローブは、ゲノム内のイントロン配列である標的配列に相補的であり得る。いくつかの例では、プローブは、標的配列に相補的な標的結合配列、および標的に相補的ではない少なくとも１つの非標的結合配列を含む。いくつかの例では、プローブの標的結合配列は、約１２０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１４０、１５０、１６０、１７５、２００、３００、４００、５００、５００以上のヌクレオチドの長さである。標的結合配列は、いくつかの例では、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００以下、または５００以下のヌクレオチドの長さである。プローブの標的結合配列は、いくつかの例では、約１２０ヌクレオチドの長さであり、または約１０、１５、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、８５、８７、９０、９５、９７、１００、１０５、１１０、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、または約５００のヌクレオチドの長さである。標的結合配列は、いくつかの例では、約２０〜約４００のヌクレオチドの長さであり、または約３０〜約１７５、約４０〜約１６０、約５０〜約１５０、約７５〜約１３０、約９０〜約１２０、または約１００〜約１４０のヌクレオチドの長さである。プローブの非標的結合配列は、いくつかの例では、少なくとも約２０のヌクレオチドの長さであり、または少なくとも約１、５、１０、１５、１７、２０、２３、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１４０、１５０、１６０、１７５、または約１７５より多いヌクレオチドの長さである。非標的結合配列は、約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５以下、または約２００以下のヌクレオチドの長さである。プローブの非標的結合配列は、約２０のヌクレオチドの長さ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または約２００のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では非標的結合配列は、約１〜約２５０のヌクレオチドの長さであり、または約２０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約３０〜約１００、約５〜約４０、または約１５〜約３５のヌクレオチドの長さである。非標的結合配列はしばしば、標的配列に相補的でない配列を含み、および／またはプライマーを結合するのに使用されない配列を含む。いくつかの例では、非標的結合配列は、単一のヌクレオチド、例えばポリアデニン、ポリチミジンの反復を含む。プローブはしばしば、非標的結合配列を全く含まない、または少なくとも１つ含む。いくつかの例では、プローブは１つまたは２つの非標的結合配列を含む。非標的結合配列は、プローブ内の１つ以上の標的結合配列に隣接し得る。例えば、非標的結合配列は、プローブの５’または３’末端にある。いくつかの例では、非標的結合配列は、分子タグまたはスペーサーに付けられている。
【００６５】
いくつかの例では、非標的結合配列はプライマー結合部位であり得る。プライマー結合部位はしばしば、各々が少なくとも約２０のヌクレオチドの長さであり、または約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または少なくとも約４０のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では各プライマー結合部位は、約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８以下、または約４０以下のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では各プライマー結合部位は、約１０〜約５０のヌクレオチドの長さであり、または約１５〜約４０である、約２０〜約３０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約３０〜約５０、または約２０〜約６０のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、ポリヌクレオチドプローブは少なくとも２つのプライマー結合部位を含む。いくつかの例では、プライマー結合部位はユニバーサルプライマー結合部位である場合もあり、ここで全てのプローブは、これらの位置に同一のプライマー結合配列を含む。いくつかの例では、特定の配列およびその逆の補体（例えばゲノムＤＮＡの領域）を標的とする１対のポリヌクレオチドは、図３Ａに（３００）で表され、第１の標的結合配列（３０１）、第２の標的結合配列（３０２）、第１の非標的結合配列（３０３）、および第２の非標的結合配列（３０４）を含む。例えば、特定の配列（例えばゲノムＤＮＡの領域）に相補的な１対のポリヌクレオチドプローブ。
【００６６】
いくつかの例では、標的結合配列（３０１）は、第１、第２の標的結合配列（３０２）の逆の補体である。いくつかの例では、両方の標的結合配列が、増幅に先立って化学的に合成される。代替的な構成では、特定の配列とその逆の補体（例えばゲノムＤＮＡの領域）を標的とする１対のポリヌクレオチドプローブは、図３Ｂに（３０５）で表され、第１の標的結合配列（３０１）、第２の標的結合配列（３０２）、第１の非標的結合配列（３０３）、第２の非標的結合配列（３０４）、第３の非標的結合配列（３０６）、およびと第４の非標的結合配列（３０７）を含む。いくつかの例では、標的結合配列（３０１）は第１、第２の標的結合配列（３０２）の逆の補体である。いくつかの例では、１つ以上の非標的結合配列は、ポリアデニンまたはポリチミジンを含む。
【００６７】
いくつかの例では、対に含まれる両方のプローブは、少なくとも１つの分子タグで標識される。いくつかの例では、ＰＣＲは、増幅中にプローブ上に（分子タグを含むプライマーを介して）分子タグを導入するために使用される。いくつかの例では、分子タグは、１つ以上のビオチン、葉酸、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン、または規格と一致する他の分子タグを含む。いくつかの例では、プローブは５’末端で標識される。いくつかの例では、プローブは３’末端で標識される。いくつかの例では、５’と３’末端の両方が、分子タグで標識される。いくつかの例では、対にある第１のプローブの５’末端は、少なくとも１つの分子タグで標識され、および対にある第２のプローブの３’末端は、少なくとも１つの分子タグで標識される。いくつかの例では、スペーサーは、プローブの１つ以上の分子タグと核酸の間に存在する。いくつかの例では、スペーサーは、アルキル、ポリオールまたはポリアミノ鎖、ペプチド、またはポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの例では、プローブ標的核酸を捕捉するのに使用される個体担体は、ビーズまたは面である。いくつかの例における個体担体は、ガラス、プラスチック、または分子タグを結合する捕捉部分を含むことができる他の物質を含む。いくつかの例では、ビーズは磁気ビーズである。例えば、ビオチンで標識されたプローブは、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズで捕捉される。標的配列へのプローブの結合を可能にするために、プローブは核酸のライブラリと接触させられる。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸が、標的核酸に付けられた１つ以上のアダプター配列へのプローブの結合を防ぐために加えられる。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸は、１つ以上の核酸アナログを含む。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸は、１つ以上の位置でチミンの代わりにウラシルを有する。
【００６８】
本明細書に記載されるプローブは、１つ以上の標的核酸配列に結合する相補的な標的結合配列を含み得る。いくつかの例では、標的配列は任意のＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列である。いくつかの例では、標的配列はプローブ挿入より長い場合もある。いくつかの例において、標的配列はプローブ挿入より短い場合もある。いくつかの例において、標的配列はプローブ挿入と同じ長さである場合もある。例えば、標的配列の長さは、少なくとも、または少なくとも約２、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５，０００、１２，０００、２０，０００ヌクレオチド、またはそれ以上である。標的配列の長さは、多くとも、または多くとも約２０，０００、１２，０００、５，０００、２，０００、１，０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、２ヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。標的配列の長さは、２〜２０，０００、３〜１２，０００、５〜５、５０００、１０〜２，０００、１０〜１，０００、１０〜５００、９〜４００、１１〜３００、１２〜２００、１３〜１５０、１４〜１００、１５〜５０、１６〜４５、１７〜４０、１８〜３５、および１９〜２５の範囲であり得る。プローブ配列は、特定遺伝子、疾患、調節経路、または規格と一致する他の生物学的機能に関係した標的配列であり得る。
【００６９】
いくつかの例では、単一のプローブ挿入（４０３）は、より大きなポリ核酸において１つ以上の標的配列（４０２）に相補的である（図４Ａ−４Ｇ）。典型的な標的配列はエクソンである。いくつかの例では、１つ以上のプローブが単一の標的配列を標的とする（図４Ａ−４Ｇ）。いくつかの例では、単一のプローブは複数の標的配列を標的とし得る。いくつかの例では、プローブの標的結合配列は、標的配列（４０２）および隣接する配列（４０１）の両方を標的とする（図４Ａと４Ｂ）。いくつかの例では、第１のプローブは、標的配列の第１の領域と第２の領域を標的とし、および第２のプローブは、標的配列の第２の領域と第３の領域を標的とする（図４Ｄと図４Ｅ）。いくつかの例では、複数のプローブが単一の標的配列を標的とし、複数のプローブの標的結合配列は、標的配列の領域への相補性に関してオーバーラップする１つ以上の配列を含む（図４Ｇ）。いくつかの例では、プローブ挿入は、標的配列の領域への相補性に関してオーバーラップしない。いくつかの例では、少なくとも２、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５，０００、１２，０００、２０，０００、または２０，０００より多くのプローブが、単一の標的配列を標的とする。いくつかの例では、単一の標的配列に向けられる４以下のプローブがオーバーラップし、または単一の標的配列を標的とする３、２、１以下、または０のプローブがオーバーラップする。いくつかの例では、１つ以上のプローブは、標的配列の全ての塩基を標的とせず、１つ以上の隙間を残す（図４Ｃと図４Ｆ）。いくつかの例では、隙間は、標的配列（４０５）の真中に近い（図４Ｆ）。いくつかの例では、隙間（４０４）は、標的配列の５’または３’末端にある（図４Ｃ）。いくつかの例では、隙間は６ヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、隙間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０以下、または５０以下のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、隙間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０，４０、または少なくとも５０のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、隙間の長さは、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、３〜５０、３〜２５、３〜１０、または３〜８のヌクレオチドの長さ以内である。いくつかの例では、配列を標的とする１セットのプローブは、相補的配列にハイブリダイズされた時に、セット内のプローブ間の領域をオーバーラップしない。いくつかの例では、配列を標的とする１セットのプローブは、相補的配列にハイブリダイズされた時に、セット内のプローブ間にいかなる隙間も有さない。プローブは、標的配列への均一の結合を最大化するように設計され得る。いくつかの例では、プローブは、高いまたは低いＧＣ含量、二次構造、反復／回文配列、または標的に結合するプローブに干渉する他の配列特徴の標的結合配列を最小化するように設計されている。いくつかの例では、単一のプローブは複数の標的配列を標的にし得る。
【００７０】
本明細書に記載されるプローブライブラリは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または１，０００，０００より多くのプローブを含み得る。プローブライブラリは、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００以下、または１，０００，０００以下のプローブを有し得る。プローブライブラリは、１０〜５００、２０〜１０００、５０〜２０００、１００〜５０００、５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００、１０，０００〜５０，０００、１００，０００〜５００，０００、または５０，０００〜１，０００，０００のプローブを含み得る。プローブライブラリは約３７０，０００；４００，０００；５００，０００、またはより多くの異なるプローブを含み得る。
【００７１】
次世代シーケンシングの応用
【００７２】
ポリヌクレオチドライブラリの下流での適用は次世代シーケンシングを含み得る。例えば、制御された化学量論ポリヌクレオチドプローブライブラリでの標的配列の濃縮は、より効果的なシーケンシングを結果としてもたらす。標的を捕捉する、または標的にハイブリダイズするためのポリヌクレオチドライブラリの性能は、効率、精度、および正確さを記す多くの異なるメトリックによって定義され得る。例えば、Ｐｉｃａｒｄのメトリックは、ＨＳライブラリ（読み取り対から算出される、標的部位に対応するライブラリ内の特有の分子の数）、平均標的カバー率（特定のカバーレベルに達する塩基の割合）、カバー率の深度（任意のヌクレオチドを含む読み取りの数）、Ｆｏｌｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（標的に固有にマッピングする配列読み取り／全サンプルにマッピングする読み取りを、全サンプルの長さ／標的長さに掛ける）、パーセントオフベイト塩基（プローブ／ベイトの塩基に対応しない塩基のパーセント）、標的の利用可能な塩基、ＡＴまたはＧＣのドロップアウト率、「ｆｏｌｄ  ８０  ｂａｓｅ  ｐｅｎａｌｔｙ」（平均カバー率レベルまで０でない標的の８０パーセントを上昇させるために必要なｆｏｌｄ  ｏｖｅｒ−ｃｏｖｅｒａｇｅ）、パーセント０カバー標的、ＰＦ読み取り（質フィルタを通過する読み取りの数）、パーセント選択塩基（合計の並んだ塩基で割った、ベイト上の塩基とベイト付近の塩基の合計）、パーセント複製、または規格と一致する他の変数等を含む変数を含む。
【００７３】
読み取り深度（シーケンシング深度、またはサンプリング）は、第２の核酸フラグメント（「読み取り」）が配列のために取得される合計回数を表す。理論上の読み取り深度は、同じヌクレオチドが読み取られる予測回数として定義され、読み取りが理想化されたゲノム全体にわたって完全に分散していると仮定する。読み取り深度は％カバー率（またはカバー幅）の関数として表わされる。例えば、完全に分散した１００万の塩基ゲノムの１０００万の読み取りは、理論上、配列の１００％の１０Ｘ読み取り深度をもたらす。実験的に、より多くの読み取り（より高度な理論上の読み取り深度、またはオーバーサンプリング）が、標的配列の割合に関する望ましい読み取り深度を得るために必要である場合もある。より少ない合計読み取りが、標的配列の望ましい％を超える読み取りの許容可能な数を伴う実験結果を得るために求められるため、制御された化学量論プローブライブラリでの標的配列の濃縮は、下流のシーケンシングの効率を高める。例えば、いくつかの例では、標的配列の５５ｘの理論上の読み取り深度は、配列の少なくとも９０％の少なくとも３０ｘのカバー率をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５ｘ以下の理論上の読み取り深度は、配列の少なくとも８０％の少なくとも３０ｘの読み取り深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５ｘ以下の理論上の読み取り深度は、配列の少なくとも９５％の少なくとも３０ｘの読み取り深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５ｘ以下の理論上の読み取り深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも３０ｘの読み取り深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５ｘ以下の理論上の読み取り深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも２０ｘの読み取り深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５ｘ以下の理論上の読み取り深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも５ｘの読み取り深度をもたらす。標的とのハイブリダイゼーション中にプローブの濃度を高めることで、読み取り深度の増加をもたらすことができる。いくつかの例では、プローブの濃度は、少なくとも１．５ｘ、２．０ｘ、２．５ｘ、３ｘ、３．５ｘ、４ｘ、５ｘ、または５ｘ以上に増加する。いくつかの例では、プローブ濃度を高めることで、結果として１０００％の増加、または読み取り深度における２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、７５０％、１０００％、または１０００％以上の増加がもたらされる。いくつかの例では、プローブ濃度を３Ｘまで高めることで、読み取り深度における１０００％の増加がもたらされる。
【００７４】
オンターゲット比率は、望ましい標的配列に対応するシーケンシング読み取りの割合を表す。いくつかの例では、制御された化学量論ポリヌクレオチドプローブライブラリは、少なくとも３０％、または少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット比率をもたらす。標的核酸との接触中にポリヌクレオチドプローブの濃度を高めることで、オンターゲット比率の増加がもたらされる。いくつかの例では、プローブの濃度は、少なくとも１．５ｘ、２．０ｘ、２．５ｘ、３ｘ、３．５ｘ、４ｘ、５ｘ、または５ｘ以上に増加する。いくつかの例では、プローブ濃度を高めることで、少なくとも２０％の増加、またはオンターゲット結合における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、または少なくとも５００％の増加がもたらされる。いくつかの例では、プローブ濃度を３Ｘまで高めることで、オンターゲット比率における２０％の増加がもたらされる。
【００７５】
カバー率の均一性は、場合によっては、標的配列の同定（アイデンティティ）の関数としての読み取り深度として算出される。より高いカバー率の均一性は、望ましい読み取り深度を得るために必要とされる、より少数のシーケンシング読み取りをもたらす。例えば、標的配列の特性は、読み取り深度、例えば高いまたは低いＧＣまたはＡＴ含量、反復配列、後端アデニン、二次構造、標的配列結合（増幅、濃縮、または検出）に対する親和性、安定性、融解温度、生物学的活性、より大きなフラグメントへの組立て能力、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む配列、またはポリヌクレオチドの他の特性に、影響し得る。制御された化学量論ポリヌクレオチドプローブライブラリでの標的配列の濃縮は、シーケンシング後に、より高いカバー率の均一性をもたらす。いくつかの例では、配列の９５％は、平均ライブラリ読み取り深度の１ｘ以内、または平均ライブラリ読み取り深度の０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または約２ｘ以内である読み取り深度を有する。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％は、平均値の１ｘ以内である読み取り深度を有する。
【００７６】
ポリヌクレオチドプローブライブラリでの標的核酸の濃縮
【００７７】
本明細書に記載されるプローブライブラリは、サンプルポリヌクレオチドの集団にある標的ポリヌクレオチドを濃縮するために、様々な下流での適用に使用されてもよい。いくつかの例では、サンプルは１つ以上のソースから得られ、およびサンプルポリヌクレオチドの集団は、当技術分野で既知の従来技術を使用して単離される。サンプルは、（非限定な例として）唾液、血液、組織、皮膚、または完全に合成のソース等の生物学的ソースから得られる。サンプルから得られる複数のポリヌクレオチドはフラグメント化され、末端修復され、そしてアデニル化されて、二本鎖のサンプル核酸フラグメントを形成する。いくつかの例では、末端修復は、適切な緩衝液中で、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ酵素、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の１つ以上の酵素を用いた処理によって行われる。アダプターへの連結反応を促進するヌクレオチドオーバーハングが、いくつかの例では３’から５’のＥｘｏ−ＭｉｎｕｓクレノウフラグメントとｄＡＴＰを用いて、付加される。
【００７８】
アダプターは、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成するために、Ｔ４リガーゼ等のリガーゼでサンプルポリヌクレオチドフラグメントの両端に連結されてもよく、アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリは、ユニバーサルプライマー等のプライマーで増幅される。いくつかの例では、アダプターは、１つ以上のプライマー結合部位、１つ以上の接ぎ木領域、および１つ以上のインデックス領域を含むＹ形のアダプターである。いくつかの例では、１つ以上のインデックス領域はアダプターの各々の鎖に存在する。いくつかの例では、接ぎ木領域は、フローセル面に相補的であり、およびサンプルライブラリの次世代シーケンシングを促進する。いくつかの例では、Ｙ形のアダプターは部分的に相補的な配列を含む。いくつかの例では、Ｙ形のアダプターは、二本鎖アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のオーバーハングしたアデニンにハイブリダイズする単一のチミジンオーバーハングを含む。Ｙ形のアダプターは、分裂に抵抗力のある修飾核酸を含んでもよい。例えば、ホスホロチオエート骨格は、アダプターの３’末端にオーバーハングしたチミジンを付けるために使用される。次に、二本鎖サンプル核酸フラグメントのライブラリは、アダプター遮断薬の存在下で変性される。アダプター遮断薬は、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖上に存在するアダプター配列（標的配列の代わり）へのプローブのオフターゲットハイブリダイゼーションを最小化する。変性は、いくつかの例では９６℃で、または約８５、８７、９０、９２、９５、９７、９８、または約９９℃で実行される。ポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）は、いくつかの例では９６℃、８５、８７、９０、９２、９５、９７、９８、または９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液で変性される。プローブが相補的な標的配列とハイブリダイズすることを可能にするために、変性アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリおよびハイブリダイゼーション溶液は、適切な期間と適切な温度でインキュベートされる。いくつかの例では、適切なハイブリダイゼーション温度は、約４５〜８０℃、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０℃である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション温度は７０℃である。いくつかの例では、適切なハイブリダイゼーション時間は１６時間、または少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２時間、またはそれ以上、または約１２〜２０時間である。次に結合緩衝液がハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブに添加され、捕捉部分を含む個体担体が、ハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合するために使用される。溶出緩衝液が、個体担体からの濃縮された標識ポリヌクレオチドフラグメントに添加される前に、未結合のポリヌクレオチドを除去するために、個体担体を緩衝液で洗浄する。いくつかの例では、個体担体は、２回、または１、２、３、４、５、または６回、洗浄される。アダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントの濃縮されたライブラリは増幅され、および濃縮されたライブラリが配列決定される。
【００７９】
複数の核酸（すなわちゲノム配列）は、サンプルから得られてもよく、およびフラグメント化され、随意に末端修復され、アデニル化されてもよい。アダプターは、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成するために、ポリヌクレオチドフラグメントの両端に連結され、およびアダプター標識ポリヌクレオチドライブラリが増幅される。次に、アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリは、アダプター遮断薬の存在下において、高温、好ましくは９６℃で変性される。ポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）は、高温で、好ましくは約９０〜９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性され、約１０〜２４時間、約４５〜８０℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性した標識ポリヌクレオチドライブラリと結合される。次に結合緩衝液がハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブに添加され、捕捉部分を含む個体担体が、ハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合するために使用される。個体担体から濃縮されたアダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントを放出するために溶出緩衝液を添加する前に、個体担体は、未結合のポリヌクレオチドを除去するために、緩衝液で１回以上、好ましくは約２〜５回、洗浄される。アダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントの濃縮されたライブラリが増幅され、その後にライブラリが配列決定される。インキュベーション時間、温度、反応容積／濃度、洗浄回数、または規格と一致する他の変数等の代替的な実験変数もまた、該方法で使用される。
【００８０】
ポリヌクレオチドの集団は、アダプター連結反応に先立って濃縮されてもよい。一例では、複数のポリヌクレオチドはサンプルから得られ、フラグメント化され、随意に末端修復され、高温で、好ましくは９０〜９９℃で変性される。ポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）は、高温で、好ましくは約９０〜９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性され、約１０〜２４時間、約４５〜８０℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性した標識ポリヌクレオチドライブラリと結合される。次に結合緩衝液がハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブに添加され、捕捉部分を含む個体担体が、ハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合するために使用される。個体担体から濃縮されたアダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントを放出するために溶出緩衝液を添加する前に、個体担体は、未結合のポリヌクレオチドを除去するために、緩衝液で１回以上、好ましくは約２〜５回、洗浄される。濃縮されたポリヌクレオチドフラグメントがその後、ポリアデニル化され、アダプターは、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成するために、ポリヌクレオチドフラグメントの両端に連結され、およびアダプター標識ポリヌクレオチドライブラリが増幅される。次に、アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリが配列決定される。
【００８１】
ポリヌクレオチド標的ライブラリはまた、望ましくないフラグメントにハイブリダイズすることにより、望ましくない配列を複数のポリヌクレオチドからフィルタリングするために使用されてもよい。例えば、複数のポリヌクレオチドはサンプルから得られ、フラグメント化され、随意に末端修復され、アデニル化される。アダプターは、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成するために、ポリヌクレオチドフラグメントの両端に連結され、およびアダプター標識ポリヌクレオチドライブラリが増幅される。代替的に、アデニル化とアダプター連結反応の工程は代わりに、サンプルポリヌクレオチドの濃縮の後に行なわれる。次に、アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリは、アダプター遮断薬の存在下において、高温、好ましくは９０〜９９℃で変性される。望ましくない非標的配列を除去するために設計されたポリヌクレオチドフィルタリングライブラリ（プローブライブラリ）は、高温で、好ましくは約９０〜９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性され、約１０〜２４時間、約４５〜８０℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性した標識ポリヌクレオチドライブラリと結合される。次に結合緩衝液がハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブに添加され、捕捉部分を含む個体担体が、ハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合するために使用される。個体担体は、未結合のアダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントを溶出するために、緩衝液で１回以上、好ましくは約１〜５時間、洗浄される。未結合のアダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントの濃縮されたライブラリが増幅され、その後に増幅されたライブラリが配列決定される。
【００８２】
高度に平行なデノボ核酸合成
【００８３】
本明細書には、革新的な合成プラットフォームを作るために、シリコン上のナノウェル内のポリヌクレオチド合成から遺伝子組立てへの末端間プロセスの小型化、並列化、および垂直的統合を利用するプラットフォームアプローチが記載される。本明細書に記載されるデバイスは、９６ウェルプレートと同じフットプリントを提供し、シリコン合成プラットフォームは、従来の合成方法と比較して、１００〜１，０００倍スループットを増加させることができ、単一の高度に並列された実行（ｒｕｎ）で、最大およそ１，０００，０００のポリヌクレオチドを産生することができる。いくつかの例では、本明細書に記載される単一のシリコンプレートは、約６，１００の非同一のポリヌクレオチドの合成を提供する。いくつかの例では、非同一のポリヌクレオチドの各々はクラスタ内にある。クラスタは５０〜５００の非同一のポリヌクレオチドを含み得る。
【００８４】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つのあらかじめ決定された参照核酸配列のあらかじめ決定された変異体を各々がコードするポリヌクレオチドのライブラリの合成を提供する。場合によっては、あらかじめ決定された参照配列は、タンパク質をコードする核酸配列であり、および、合成された核酸によってコードされるその後のタンパク質中の単一残基の複数の異なる変異体が、標準的な翻訳プロセスによって産生されるように、変異体ライブラリは、少なくとも単一のコドンの変異体をコードする配列を含む。核酸配列中の合成された特定の修正は、オーバーラップすることによって、または平滑末端のポリヌクレオチドプライマーにヌクレオチド変化を取り込むことによって導入され得る。代替的に、ポリヌクレオチドの集団は総体として、長い核酸（例えば遺伝子）およびその変異体をコードする。本構成において、ポリヌクレオチドの集団は、長い核酸（例えば遺伝子）およびその変異体を変化形体にするために、ハイブリダイズされ、そして標準的な分子生物学技術にさらされ得る。長い核酸（例えば遺伝子）およびその変異体が細胞に発現すると、変異タンパク質ライブラリが生成される。同様に、ＲＮＡ配列（例えばｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはＤＮＡ配列（例えばエンハンサー、プロモーター、ＵＴＲ、およびターミネーター領域）をコードする変異体ライブラリの合成のための方法が提供される。さらに本明細書において、本明細書に記載の方法を使用して合成されたライブラリから選択された変異体のための下流での適用が提供される。下流での適用は、向上した生物学的に関連する機能、例えば生化学的親和性、酵素活性、細胞活動の変化を伴う変異核酸またはタンパク質配列の識別、および疾患状態の処置または予防のための識別を含む。
【００８５】
基質
【００８６】
本明細書には、複数のクラスタを含む基質が提供され、ここで各クラスタは、ポリヌクレオチドの付着および合成を支持する複数の遺伝子座を含む。本明細書で使用されるような用語「遺伝子座」は、面から伸長する単一のあらかじめ決定された配列をコードするポリヌクレオチドに対する支持を提供する構造上の離散的領域を指す。いくつかの例では、遺伝子座は、二次元面、例えば実質的に平らな面上にある。いくつかの例では、遺伝子座は、面上の離散的な隆起した、または沈降した部位、例えばウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストを指す。いくつかの例では、遺伝子座の面は、ポリヌクレオチド合成のための少なくとも１つのヌクレオチド、または好ましくは、ポリヌクレオチドの集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に付着するために活発に官能化される物質を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、同じ核酸配列をコードするポリヌクレオチドの集団を指す。いくつかの例では、デバイスの面は、基質の１つまたは複数の面を包含する。
【００８７】
本明細書には、共通の個体担体上のアドレス可能位置で異なるあらかじめ決定された配列を有している複数のポリヌクレオチドの合成を支持する面を含み得る構造が提供される。いくつかの事例では、デバイスは、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００、またはより多くの非同一のポリヌクレオチドの合成のための支持を提供する。いくつかの事例では、デバイスは、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００、またはより多くの、別個の配列をコードするポリヌクレオチドの合成のための支持を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、同一の配列を有し、または同一の配列で合成されるように構成される。
【００８８】
本明細書には、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００の塩基の長さのポリヌクレオチドの製造および成長のための方法とデバイスが提供される。いくつかの例では、形成されるポリヌクレオチドの長さは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５の塩基の長さである。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００の塩基の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、１０〜２２５の塩基の長さ、１２〜１００の塩基の長さ、２０〜１５０の塩基の長さ、２０〜１３０の塩基の長さ、または３０〜１００の塩基の長さであり得る。
【００８９】
いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、基質の別個の遺伝子座において合成され、各遺伝子座はポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例では、各遺伝子座は、別の遺伝子座で成長させポリヌクレオチドの集団とは異なる配列を有するポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例では、デバイスの遺伝子座は複数のクラスタ内に位置する。いくつかの例では、デバイスは、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、またはより多くのクラスタを含む。いくつかの例では、デバイスは、２，０００；５，０００；１０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，１００，０００；１，２００，０００；１，３００，０００；１，４００，０００；１，５００，０００；１，６００，０００；１，７００，０００；１，８００，０００；１，９００，０００；２，０００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；または１０，０００，０００、またはより多くの別個の遺伝子座を含むいくつかの例では、デバイスは、約１０，０００の別個の遺伝子座を含む。単一のクラスタ内の遺伝子座の量は、異なる事例では変更される。いくつかの例では、各クラスタは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、またはより多くの遺伝子座を含む．いくつかの例では、各クラスタは、約５０〜５００の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスタは、約１００〜２００の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスタは、約１００〜１５０の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスタは、約１０９、１２１、１３０、または１３７の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスタは、約１９、２０、６１、６４、またはそれ以上の遺伝子座を含む。
【００９０】
デバイス上で合成された別々のポリヌクレオチドの数は、基質における利用可能な別々の遺伝子座の数に左右され得る。いくつかの事例では、デバイスのクラスタ内の遺伝子座の密度は、１ｍｍ２あたり少なくともまたは約１の遺伝子座、１ｍｍ２あたり１０の遺伝子座、１ｍｍ２あたり２５の遺伝子座、１ｍｍ２あたり５０遺伝子座、１ｍｍ２あたり６５の遺伝子座、１ｍｍ２あたり７５の遺伝子座、１ｍｍ２あたり１００の遺伝子座、１ｍｍ２あたり１３０の遺伝子座、１ｍｍ２あたり１５０の遺伝子座、１ｍｍ２あたり１７５の遺伝子座、１ｍｍ２あたり２００の遺伝子座、１ｍｍ２あたり３００の遺伝子座、１ｍｍ２あたり４００の遺伝子座、１ｍｍ２あたり５００の遺伝子座、１ｍｍ２あたり１，０００の遺伝子座、またはそれ以上である。いくつかの例では、デバイスは、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２あたり約１０の遺伝子座、１ｍｍ２から約４００ｍｍ２あたり約２５の遺伝子座、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２あたり約５０の遺伝子座、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２あたり約１００の遺伝子座、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２あたり約１５０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２５０ｍｍ２あたり約１０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２５０ｍｍ２あたり約５０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２００ｍｍ２あたり約１０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２００ｍｍ２あたり約５０の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスタ内の２つの隣接した遺伝子座の中心からの距離は、約１０μｍから約５００μｍ、約１０μｍから約２００μｍ、または約１０μｍから約１００μｍである。いくつかの例では、隣接した遺伝子座の２つの中心からの距離は、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍより長い。いくつかの例では、２つの隣接した遺伝子座の中心からの距離は、約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例では、遺伝子座それぞれの幅は、約０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍである。いくつかの例では、遺伝子座それぞれの幅は、約０．５μｍから１００μｍ、約０．５μｍから５０μｍ、約１０μｍから７５μｍ、または約０．５μｍから５０μｍである。
【００９１】
いくつかの例では、デバイス内のクラスタの密度は、１００ｍｍ２あたり少なくとも又は約１のクラスタ、１０ｍｍ２あたり１のクラスタ、５ｍｍ２あたり１のクラスタ、４ｍｍ２あたり１のクラスタ、３ｍｍ２あたり１のクラスタ、２ｍｍ２あたり１のクラスタ、１ｍｍ２あたり１のクラスタ、１ｍｍ２あたり２のクラスタ、１ｍｍ２あたり３のクラスタ、１ｍｍ２あたり４のクラスタ、１ｍｍ２あたり５のクラスタ、１ｍｍ２あたり１０のクラスタ、１ｍｍ２あたり５０のクラスタ、またはそれ以上である。いくつかの例では、デバイスは、１０ｍｍ２あたり約１のクラスタから１ｍｍ２あたり約１０のクラスタを含む。いくつかの例では、２つの隣接したクラスタの中心からの距離は、約５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、または５０００μｍ未満である。いくつかの例では、２つの隣接したクラスタの中心からの距離は、約５０μｍから約１００μｍ、約５０μｍから約２００μｍから、約５０μｍから約３００μｍ、約５０μｍから約５００μｍ、および約１００μｍから約２０００μｍである。いくつかの例では、２つの隣接したクラスタの中心からの距離は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。いくつかの例では、各クラスタは、約０．５から２ｍｍ、約０．５から１ｍｍ、または約１から２ｍｍの１寸法に沿った直径または幅を有している。いくつかの例では、各クラスタは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍの１寸法に沿った直径または幅を有している。いくつかの例では、各クラスタは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．１５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍの１寸法に沿った内径または幅を有している。
【００９２】
デバイスは、標準的な９６ウェルプレートのおよそのサイズであってもよく、例えば、約１００〜２００ｍｍ×約５０〜１５０ｍｍであってもよい。いくつかの例では、デバイスは、約１０００ｍｍ、５００ｍｍ、４５０ｍｍ、４００ｍｍ、３００ｍｍ、２５０ｎｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１００ｍｍ、または５０ｍｍ未満の直径を有する。いくつかの例では、デバイスの直径は、約２５ｍｍから１０００ｍｍ、約２５ｍｍから約８００ｍｍ、約２５ｍｍから約６００ｍｍ、約２５ｍｍから約５００ｍｍ、約２５ｍｍから約４００ｍｍ、約２５ｍｍから約３００ｍｍ、または約２５ｍｍから約２００である。デバイスサイズの非限定的な例は、約３００ｍｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１３０ｍｍ、１００ｍｍ、７６ｍｍ、５１ｍｍ、および２５ｍｍを含む。いくつかの例では、デバイスは、少なくとも約１００ｍｍ２；２００ｍｍ２；５００ｍｍ２；１，０００ｍｍ２；２，０００ｍｍ２；５，０００ｍｍ２；１０，０００ｍｍ２；１２，０００ｍｍ２；１５，０００ｍｍ２；２０，０００ｍｍ２；３０，０００ｍｍ２；４０，０００ｍｍ２；５０，０００ｍｍ２、またはより大きな平面面積を有している。いくつかの例では、デバイスの厚さは、約５０ｍｍ〜約２０００ｍｍ、約５０ｍｍ〜約１０００ｍｍ、約１００ｍｍ〜約１０００ｍｍ、約２００ｍｍ〜約１０００ｍｍ、または約２５０ｍｍ〜約１０００ｍｍである。デバイスの厚さの非限定的な例として、約２７５ｍｍ、３７５ｍｍ、５２５ｍｍ、６２５ｍｍ、６７５ｍｍ、７２５ｍｍ、７７５ｍｍ、および９２５ｍｍがあげられる。いくつかの例では、デバイスの厚さは、直径によって変わり、および基質の組成物に左右される。例えば、シリコン以外の物質を含むデバイスは、同じ直径のシリコンデバイスとは異なる厚さを有する。デバイスの厚さは、使用される物質の機械強度によって判定され、取り扱い中に割れることなく、それ自体の重量を支えるのに十分でなければならない。いくつかの例では、構造は、本明細書に記載される複数のデバイスを含む。
【００９３】
面材料
【００９４】
本明細書において、面を含むデバイスが提供され、面は、あらかじめ決定された位置でのポリヌクレオチド合成を支持するように修飾され、および結果として生じる低エラー率、低いドロップアウト率、高い収率、および高いオリゴ表示を伴う。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド合成用のデバイスの面は、新たなポリヌクレオチド合成反応を支持するために修飾可能な様々な材料から製造される。いくつかの場合には、デバイスは十分に導電性であり、例えば、デバイスのすべてまたは一部にわたって均一な電場を形成することができる。本明細書に記載されるデバイスは、可撓性材料を含み得る。典型的な可撓性材料として、限定されないが、改質ナイロン、非改質ナイロン、ニトロセルロース、およびポリプロピレンがあげられる。本明細書に記載されるデバイスは、剛性材料を含み得る。典型的な剛性材料として、限定されないが、ガラス、石英ガラス（ｆｕｓｅ  ｓｉｌｉｃａ）、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらの混合物など）、および金属（例えば、金、白金など）があげられる。本明細書に開示されるデバイスは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせを含む材料から作られてもよい。いくつかの場合には、本明細書に開示されるデバイスは、本明細書にリストされる材料または当技術分野において既知の他の適切な材料を組み合わせて製造される。
【００９５】
本明細書に記載される典型的な物質に関する引張強度のリストは、以下に提供される：ナイロン（７０ＭＰａ）、ニトロセルロース（１．５ＭＰａ）、ポリプロピレン（４０ＭＰａ）、シリコン（２６８ＭＰａ）、ポリスチレン（４０ＭＰａ）、アガロース（１−１０ＭＰａ）、ポリアクリルアミド（１−１０ＭＰａ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（３．９−１０．８ＭＰａ）。本明細書に記載される個体担体は、１〜３００、１〜４０、１〜１０、１〜５、または３〜１１ＭＰａの引張強度を有し得る。本明細書に記載される個体担体は、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、２７０、またはより多くのＭＰａの引張強度を有し得る。いくつかの例では、本明細書に記載されるデバイスは、テープまたは軟質シート等の、連続したループまたはリールに保存することができる可撓性材料の形態の、ポリヌクレオチド合成用の個体担体を含む。
【００９６】
ヤング率は、弾性の（復元可能な）荷重変形に対する物質の抵抗を測定する。本明細書に記載される典型的な物質の剛性に関するヤング率のリストは、以下に提供される：ナイロン（３ＧＰａ）、ニトロセルロース（１．５ＧＰａ）、ポリプロピレン（２ＧＰａ）、シリコン（１５０ＧＰａ）、ポリスチレン（３ＧＰａ）、アガロース（１−１０ＧＰａ）、ポリアクリルアミド（１−１０ＧＰａ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（１−１０ＧＰａ）。本明細書に記載される個体担体は、１〜５００、１〜４０、１〜１０、１〜５、または３〜１１ＧＰａのヤング率を有し得る。本明細書に記載される個体担体は、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００ＧＰａ、またはより多くのＧＰａのヤング率を有し得る。可撓性と剛性は真逆の関係にあるため、可撓性材料は低いヤング率を有し、その形状は負荷を受けてかなり変化する。
【００９７】
いくつかの場合には、本明細書に開示されるデバイスは、二酸化ケイ素の基部と酸化シリコンの表層面を含む。代替的に、デバイスは、シリコン酸化物の基部を含んでもよい。本明細書に提供されるデバイスの面は織り込まれてもよく、結果としてポリヌクレオチド合成のための面の総面積を増加させる。本明細書に開示されるデバイスは、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のシリコンを含み得る。本明細書に開示されるデバイスは、ＳＯＩ（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ウェーハから製造されてもよい。
【００９８】
面アーキテクチャ
【００９９】
本明細書には、隆起した、および／または沈降した機構を含むデバイスが提供される。そのような機構を有する１つの利点は、ポリヌクレオチド合成を支持する表面積の増大である。いくつかの例では、隆起した、および／または沈降した機構を有するデバイスは、三次元基質と呼ばれる。いくつかの例では、三次元デバイスは１つ以上のチャネルを含む。いくつかの例では、１つ以上の遺伝子座はチャネルを含む。いくつかの例では、チャネルは、ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの沈着デバイスによる試薬の沈着に利用可能である。いくつかの例では、試薬および／または流体は、１つ以上のチャネルと流体連通してより大きなウェルに集まる。例えば、デバイスは、クラスタを有する複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスタの１つのウェルと流体連通している。いくつかの方法では、ポリヌクレオチドのライブラリは、クラスタの複数の遺伝子座において合成される。
【０１００】
いくつかの例では、構造は、面上のポリヌクレオチド合成に関する流れの制御および物質移動経路の制御を可能にするように構成されている。いくつかの例では、デバイスの構成は、ポリヌクレオチド合成中の物質移動経路、化学暴露時間、および／または洗浄効果の制御およびその分布さえも可能にする。いくつかの例では、デバイスの構成は、例えば、成長しているポリヌクレオチドによる排除体積が、ポリヌクレオチドの成長に利用可能または適した最初の利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％を超えないように、ポリヌクレオチドの成長に対する十分な体積を提供することによって、奏効率の増大を可能にする。いくつかの例では、三次元構造は、化学暴露の急速な交換を可能にするために流体の流れの管理を可能にする。
【０１０１】
本明細書には、１ｆＭ、５ｆＭ、１０ｆＭ、２５ｆＭ、５０ｆＭ、７５ｆＭ、１００ｆＭ、２００ｆＭ、３００ｆＭ、４００ｆＭ、５００ｆＭ、６００ｆＭ、７００ｆＭ、８００ｆＭ、９００ｆＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、２５ｐＭ、５０ｐＭ、７５ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、またはそれ以上の量のＤＮＡを合成する方法が提供される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、遺伝子の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の長さに及び得る。遺伝子は、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％まで変えられ得る。
【０１０２】
非同一のポリヌクレオチドは総体として、遺伝子の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％に対する配列をコードし得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。
【０１０３】
いくつかの例では、物理構造によって隔離が達成される。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成に対する能動領域および受動領域を生成する面の差次的な官能化によって、隔離が達成される。差次的な官能化はまた、デバイス面にわたる疎水性を交互にし、それによって沈着された試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）または湿りを引き起こす水接触角の効果を作り出すことにより達成される。より大きな構造を利用することで、飛び散り（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）および隣接するスポットの試薬による別々のポリヌクレオチド合成位置の相互汚染を減らすことができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの装置は、別々のポリヌクレオチド合成位置に試薬を沈着するために使用される。三次元の機構を有する基質は、低いエラー率（例えば、約１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２，０００、１：３，０００、１：５，０００、または１：１０，０００未満）でポリヌクレオチド（例えば約１０，０００を超える）の合成を可能にする方法で構成される。いくつかの例では、デバイスは、１ｍｍ２あたり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００、またはより多くの特徴の密度で機構を含む。
【０１０４】
デバイスのチャネルは、基質の別のウェルと同じ、または異なる幅、高さ、および／または体積を有し得る。デバイスのチャネルは、基質の別のチャネルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有し得る。いくつかの例では、クラスタの幅は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスタを含むウェルの幅は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、約０．５ｍｍから約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスタの幅は、約５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、または０．０５ｍｍであり、またはこれらの数値未満である。いくつかの例では、クラスタの幅は、約１．０から１．３ｍｍである。いくつかの例では、クラスタの幅は、約１．１５０ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は、約５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、または０．０５ｍｍであり、またはこれらの数値未満である。いくつかの例では、ウェルの幅は、約１．０から１．３ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は、約１．１５０ｍｍである。いくつかの例では、クラスタの幅は約０．０８ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は約０．０８ｍｍである。クラスタの幅は、二次元または三次元の基質内のクラスタを指す場合もある。
【０１０５】
いくつかの例では、ウェルの高さは、約２０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約１０００μｍ、約１００μｍから約１０００μｍ、約２００μｍから約１０００μｍ、約３００μｍから約１０００μｍ、約４００μｍから約１０００μｍ、または約５００μｍから約１０００μｍである。いくつかの例では、ウェルの高さは、約１０００μｍ未満、約９００μｍ未満、約８００μｍ未満、約７００μｍ未満、または約６００μｍ未満である。
【０１０６】
いくつかの例では、デバイスは、クラスタ内の複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、チャネルの高さまたは深さは、約５μｍから約５００μｍ、約５μｍから約４００μｍ、約５μｍから約３００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、または約１０μｍから約５０μｍである。いくつかの例では、チャネルの高さは、１００μｍ未満、８０μｍ未満、６０μｍ未満、４０μｍ未満、または２０μｍ未満である。
【０１０７】
いくつかの例では、チャネル、遺伝子座（例えば、実質的に平面の基質における）またはチャネルと遺伝子座の両方の直径（例えば、遺伝子座がチャネルに対応する三次元構造デバイスにおける）は、約１μｍから約１０００μｍ、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、または約１０μｍから約１００μｍ、例えば、約９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍまたは１０μｍである。いくつかの例では、チャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の両方の直径は、約１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例では、２つの隣接チャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の中心からの距離は、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、または約５μｍから約３０μｍ、例えば、約２０μｍである。
【０１０８】
面修飾
【０１０９】
様々な例では、デバイス面またはデバイス面の選択された部位あるいは領域の１つ以上の化学的および／または物理的な特性を変更するために付加または減算のプロセスによって、面の化学的および／また物理的な変更のために、面修飾が利用される。例えば、面修飾は、限定されないが、（１）面の湿潤性の変更、（２）面の官能化、つまり面官能基の提供、修飾、または置換、（３）面の脱官能化、つまり面官能基の除去、（４）そうでなければ、例えばエッチングによって、面の化学組成を変更すること、（５）面の粗さを増大または減少させること、（６）面へのコーティング、例えば、面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングの提供、および／または（７）面への粒子の沈着、を含む。
【０１１０】
いくつかの例では、面の最上部の化学層（接着促進剤と呼ばれる）の付加は、基質の面上の遺伝子座の構造化されたパターン化を促進する。接着促進の適用のための典型的な面は、限定されないが、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、および窒化ケイ素を含む。いくつかの例では、接着促進剤は、高い表面エネルギーを有する化学物質である。いくつかの例では、基質の面上に第２の化学層が堆積される。いくつかの例では、第２の化学層は、低い表面エネルギーを有している。いくつかの例では、面上にコーティングされた化学層の表面エネルギーは、面への液滴の局在化を支持する。選択されるパターン配置に応じて、遺伝子座の接近および／または遺伝子座での流体接触の領域は変更可能である。
【０１１１】
いくつかの例では、例えばポリヌクレオチド合成のために、核酸または他の部分が堆積されるデバイス面または分解された遺伝子座は、滑らかであり、または実質的に平面であり（例えば、二次元）、あるいは隆起した、または沈降した機構（例えば三次元の機構）などの不規則性を有している。いくつかの例では、デバイス面は、化合物の１つ以上の異なる層で修飾される。対象のそのような修飾層は、限定されないが、金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子等の、無機層および有機層を含む。非限定的なポリマー層は、ペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの模倣物（例えば、ペプチド核酸等）、多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、および本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で既知の他の適切な化合物を含む。いくつかの例では、ポリマーはヘテロポリマーである。いくつかの例では、ポリマーはホモポリマーである。いくつかの例では、ポリマーは官能性部分を含む、またはそれに結合される。
【０１１２】
いくつかの例では、デバイスの分解された遺伝子座は、表面エネルギーを増大および／または減少させる１つ以上の部分で官能化される。いくつかの例では、部分は化学的に不活性である。いくつかの例では、部分は、ポリヌクレオチド合成反応における望ましい化学反応、例えば、１つ以上のプロセスを支持するように構成されている。面の表面エネルギー、すなわち疎水性は、面上へと付着するヌクレオチドの親和性を測定するための因子である。いくつかの例では、デバイスの官能化のための方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む面を有するデバイスを提供する工程；および（ｂ）本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で既知の適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、面をシラン処理する工程を含む。
【０１１３】
いくつかの例では、有機官能性アルコキシシラン分子は、ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン、メチルジクロロ−オクトデシル−シラン、トリクロロ−オクトデシル−シラン、トリメチル−オクトデシル−シラン、トリエチル−オクトデシル−シラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、デバイスの面は、ポリエチレン／ポリプロピレン（ガンマ線照射またはクロム酸酸化、およびヒドロキシアルキル表面への還元によって官能化される）、高度に架橋されたポリスチレン−ジビニルベンゼン（クロロメチル化によって誘導体化され、ベンジルアミン官能面にアミノ化される）、ナイロン（末端のアミノヘキシル基は直接反応性である）で官能化され、または還元ポリテトラフルオロエチレンでエッチングされる。他の方法および官能化剤は、米国特許第５，４７４，７９６号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
いくつかの例では、デバイスの面は、典型的にデバイス面上に存在する反応性の親水性部分を介して、デバイス面にシランをカップリングするのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含む誘導体化組成物との接触によって官能化される。シラン処理は一般に、自己組織化により有機官能性アルコキシシラン分子で表面を覆う。
【０１１５】
当該技術分野において現在知られているように、例えば、表面エネルギーを低下または増大させるための、様々なシロキサン官能化試薬がさらに使用され得る。有機官能性アルコキシシランは、それらの有機官能性に従って分類され得る。
【０１１６】
本明細書には、ヌクレオシドに結合することができる薬剤のパターン化を含み得るデバイスが提供される。いくつかの例では、デバイスは、活性薬剤でコーティングされてもよい。いくつかの例では、デバイスは、受動剤（ｐａｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）でコーティングされてもよい。本明細書に記載されるコーティング材に包含するための典型的な活性因子として、限定されないが、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＨＡＰＳ）、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）、３−ヨード−プロピルトリメトキシシラン、ブチル−アルデヒド−トリメトキシシラン、二量体二次アミノアルキルシロキサン、（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、および（３−アミノプロピル）−トリメトキシシラン、（３−グリシドキシプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、グリシドキシ−トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン、３−４エポキシシクロヘキシル−エチルトリメトキシシラン、および（３−メルカプトプロピル）−メチル−ジメトキシシラン、アリルトリクロロクロロシラン、７−オクタ−１−エニルトリクロロクロロシラン、またはビス（３−トリメトキシシリルプロピル）アミンがあげられる。
【０１１７】
本明細書に記載されるコーティング材に含有するための典型的な受動剤は、限定されないが、ペルフロオロオクチルトリクロロシラン；トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン；１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−フルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＯＳ）；トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフロオロオクチル）シラン；ｔｅｒｔ−ブチル−［５−フルオロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）インドール−１−イル］−ジメチル−シラン；ＣＹＴＯＰ（商標）；フロリナート（商標）；ペルフロオロオクチルトリクロロシラン（ＰＦＯＴＣＳ）；ペルフロオロオクチルジメチルクロロシラン（ＰＦＯＤＣＳ）；ペルフロオロデシルトリエトキシシラン（ＰＦＤＴＥＳ）；ペンタフルオロフェニル−ジメチルプロピルクロロ−シラン（ＰＦＰＴＥＳ）；ペルフロオロオクチルトリエトキシシラン；ペルフロオロオクチルトリメトキシシラン；オクチルクロロシラン；ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン；メチルジクロロ−オクトデシル−シラン；トリクロロ−オクトデシル−シラン；トリメチル−オクトデシル−シラン；トリエチル−オクトデシル−シラン；またはオクタデシルトリクロロシランを含む。
【０１１８】
いくつかの例では、官能化剤は、オクタデシルトリクロロシランなどの炭化水素シランを含む。いくつかの例では、官能化剤は、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピル／トリメトキシシランおよびＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む。
【０１１９】
ポリヌクレオチド合成
【０１２０】
ポリヌクレオチド合成のための本開示の方法は、ホスホラミダイトの化学作用を含むプロセスを含み得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成は、塩基をホスホラミダイトとカップリングする工程を含む。ポリヌクレオチドは、カップリング条件下でホスホラミダイトの堆積によって塩基をカップリングする工程を含んでもよく、ここで同じ塩基が随意に、１回より多く、つまり二重のカップリングでホスホラミダイトと共に堆積される。ポリヌクレオチド合成は、未反応部位のキャッピングを含んでもよい。いくつかの例では、キャッピングは随意である。ポリヌクレオチド合成はまた、酸化または酸化工程を含んでもよい。ポリヌクレオチド合成は、分解、脱トリチル化、および硫化を含んでもよい。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成は、酸化または硫化のいずれかを含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成反応中の１工程または各工程間で、デバイスは、例えばテトラゾールまたはアセトニトリルを使用して洗浄される。ホスホラミダイト合成法における任意の１工程にかかる時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、および１０秒未満であり得る。
【０１２１】
ホスホラミダイト法を使用するポリヌクレオチド合成は、亜リン酸塩トリエステル結合の形成のために成長しているポリヌクレオチド鎖へのホスホラミダイト構築ブロック（例えば、ヌクレオシドホスホラミダイト）の続く付加を含んでもよい。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、３’から５’の方向に進む。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、１合成サイクルにつき成長している核酸鎖への１つのヌクレオチドの制御された付加を可能にする。いくつかの例では、各合成サイクルはカップリング工程を含む。ホスホラミダイト結合は、活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトと、例えばリンカーによって基質に結合されたヌクレオシドとの間の亜リン酸塩トリエステル結合の形成を伴う。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、起動されたデバイスに提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、アクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）でデバイスに提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、基質に結合されたヌクレオシドよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍、またはそれ以上の過剰量で、デバイスに提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの付加は、無水環境において、例えば無水アセトニトリルにおいて行われる。ヌクレオシドホスホラミダイトの付加に続いて、デバイスは随意に洗浄される。いくつかの例では、カップリング工程は、随意に、基質へのヌクレオシドホスホラミダイトの付加の間の洗浄工程と共に、追加で１回以上繰り返される。いくつかの例では、本明細書で使用されるポリヌクレオチド合成法は、１、２、３、またはより多くの連続したカップリング工程を含む。カップリング前に、多くの場合において、デバイスに結合されたヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。
【０１２２】
カップリングに続いて、ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成法は、随意にキャッピング工程を含む。キャッピング工程では、成長しているポリヌクレオチドがキャッピング剤で処理される。キャッピング工程は、カップリング後にさらなる鎖伸長から未反応の基質に結合した５’−ＯＨ基を遮断するのに有用であり、これによって、内部塩基欠失（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｂａｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を伴うポリヌクレオチドの形成を防ぐ。さらに、１Ｈ−テトラゾールで活性化されたホスホラミダイトは、少しの程度、グアノシンのＯ６位置と反応し得る。理論に縛られることなく、Ｉ２／水での酸化に際して、この副産物は、恐らくＯ６−Ｎ７遊走を介して脱プリン化を受けるであろう。脱プリン化部位は、最終的に、ポリヌクレオチドの最終的な脱保護の過程で切断され、したがって全長の生成物の収率が低下する。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水での酸化前にキャッピング試薬による処理によって除去され得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成中のキャッピング工程を含めることで、キャッピングなしでの合成と比較して、エラー率は低下する。一例として、キャッピング工程は、無水酢酸と１−メチルイミダゾールとの混合物で基質に結合したポリヌクレオチドを処理することを含む。キャッピング工程に続いて、デバイスは随意に洗浄される。
【０１２３】
いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの添加に続いて、および随意にキャッピングと１回以上の洗浄工程後に、デバイスに結合した成長している核酸が酸化される。酸化工程は、亜リン酸塩トリエステルが、自然発生のリン酸ジエステルのヌクレオシド間結合の保護された前駆体である、四配位リン酸塩トリエステルへと酸化される工程を含む。いくつかの例では、成長しているポリヌクレオチドの酸化は、随意に弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素および水による処理によって達成される。酸化は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、無水条件下で実行され得る。いくつかの方法では、キャッピング工程は、酸化に続いて行われる。持続し得る酸化からの残留水が続くカップリングを阻害することができるため、第２のキャッピング工程はデバイスの乾燥を認める。酸化の後に、デバイスおよび成長しているポリヌクレオチドは、随意に洗浄される。いくつかの例では、酸化の工程は、ポリヌクレオチドホスホロチオエートを得る硫化工程と置き換えられ、ここでキャッピング工程は硫化後に実行され得る。限定されないが、３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン、ＤＤＴＴ、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、およびＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含む、多くの試薬が、効率的な硫黄移動を可能にする。
【０１２４】
ヌクレオシド取り込みの続くサイクルを、カップリングを介して生じさせるために、デバイスに結合した成長しているポリヌクレオチドの保護された５’末端は除去され、その結果、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホラミダイトと反応する。いくつかの例では、保護基はＤＭＴであり、分解はジクロロメタン中でトリクロロ酢酸により生じる。時間を延長して、または推奨されるよりも強い酸の溶液を用いて脱トリチル化を行うことで、個体担体に結合したポリヌクレオチドの脱プリン化の増大がもたらされる場合もあり、したがって望ましい完全長の生成物の収率は低下する。本明細書に記載される開示の方法および組成物は、望ましくない脱プリン化反応を制限する制御された分解条件を提供する。いくつかの例では、デバイスに結合したポリヌクレオチドは、分解後に洗浄される。いくつかの例では、分解後の効率的な洗浄は、低いエラー率を有する合成ポリヌクレオチドに寄与する。
【０１２５】
ポリヌクレオチド合成のための方法は、典型的に、以下の工程の反復配列を含む：活性化された面、リンカーまたは事前に脱保護されたモノマーのいずれかと連結するための、保護されたモノマーの活発に官能化された面（例えば遺伝子座）への適用；続いて適用される保護されたモノマーと反応性であるようにする、適用されたモノマーの脱保護；および、連結のための別の保護モノマーの適用。１つ以上の中間工程は、酸化または硫化を含む。いくつかの例では、１つ以上の洗浄工程は、工程の１つまたはすべての前または後にある。
【０１２６】
ホスホラミダイトベースのポリヌクレオチド合成のための方法は、一連の化学工程を含む。いくつかの例では、合成方法の一つ以上の工程は、試薬のサイクリングを伴い、方法の１つ以上の工程は、工程に有用な試薬のデバイスへの適用を含む。例えば、試薬は、一連の液体沈着および真空乾燥の工程によって循環される。ウェル、マイクロウェル、チャネル等の三次元機構を含む基質に関して、試薬は、随意にウェルおよび／またはチャネルを介してデバイスの１つ以上の領域に通される。
【０１２７】
本明細書に記載される方法およびシステムは、ポリヌクレオチドの合成のためのポリヌクレオチド合成デバイスに関する。合成は平行して行われてもよい。例えば、少なくとも，または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、７５０００、１０００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドが、平行して合成され得る。平行して合成され得るポリヌクレオチドの総数は、２〜１０００００、３〜５００００、４〜１００００、５〜１０００、６〜９００、７〜８５０、８〜８００、９〜７５０、１０〜７００、１１〜６５０、１２〜６００、１３〜５５０、１４〜５００、１５〜４５０、１６〜４００、１７〜３５０、１８〜３００、１９〜２５０、２０〜２００、２１〜１５０、２２〜１００、２３〜５０、２４〜４５、２５〜４０、３０〜３５であり得る。当業者は、平行して合成されたポリヌクレオチドの総数が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内、例えば２５〜１００にあり得ることを認識する。平行して合成されたポリヌクレオチドの総数は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。デバイス内で合成されたポリヌクレオの総モル質量またはポリヌクレオの各々のモル質量は、少なくとも、または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００の、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル、またはそれ以上であり得る。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはポリヌクレオチドの平均長は、少なくとも、または少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長は、多くとも、または多くとも約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長は、１０〜５００、９〜４００、１１〜３００、１２〜２００、１３〜１５０、１４〜１００、１５〜５０、１６〜４５、１７〜４０、１８〜３５、１９〜２５の間であり得る。当業者は、デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内、例えば１００〜３００にあり得ることを認識する。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。
【０１２８】
本明細書において提供される面上でのポリヌクレオチド合成の方法は、速い速度での合成を可能にする。例えば、少なくとも１時間あたり３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００ヌクレオチド、またはより多くが合成される。ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジン構築ブロック、またはそれらのアナログ／修飾されたバージョンを含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドのライブラリは基質上で平行に合成される。例えば、約、または少なくとも約１００；１，０００；１０，０００；３０，０００；７５，０００；１００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；または５，０００，０００の分解された遺伝子座を含むデバイスは、別個のポリヌクレオチドの少なくとも同じ数の合成を支持することができ、別個の配列をコードするポリヌクレオチドは分解された遺伝子座において合成される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、約３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日、２４時間未満、あるいはより短い期間で、本明細書に記載の低エラー率で、デバイス上で合成される。いくつかの例では、基質と本明細書に記載の方法を使用して低エラー率で合成されたポリヌクレオチドライブラリから組み立てられたより大きな核酸は、約３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日、２４時間未満、あるいはより短い期間で調製される。
【０１２９】
いくつかの例では、本明細書に記載の方法は、複数のコドン部位で異なっている変異ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリの生成を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、１つの部位、２つの部位、３つの部位、４つの部位、５つの部位、６つの部位、７つの部位、８つの部位、９つの部位、１０の部位、１１の部位、１２の部位、１３の部位、１４の部位、１５の部位、１６の部位、１７の部位、１８の部位、１９の部位、２０の部位、３０の部位、４０の部位、５０の部位、またはより多くの変異コドン部位を有し得る。
【０１３０】
いくつかの例では、変異コドン部位の１つ以上の部位は隣接し得る。いくつかの例では、変異コドン部位の１つ以上の部位は隣接しておらず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くのコドンによって分離され得る。
【０１３１】
いくつかの例では、ポリヌクレオチドは変異コドン部位の多数の部位を含んでもよく、すべての変異コドン部位は互いに隣接し、変異コドン部位の広がりを形成する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは変異コドン部位の多数の部位を含んでもよく、変異コドン部位のいずれも互いに隣接していない。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは変異コドン部位の多数の部位を含んでもよく、いくつかの変異コドン部位は互いに隣接し、変異コドン部位の広がりを形成し、および変異コドン部位のいくつかは、互いに隣接していない。
【０１３２】
図５を参照すると、図５は、より短いポリヌクレオチドからの核酸（例えば遺伝子）の合成のための典型的な処理ワークフローを例示する。ワークフローは概して、以下のフェーズに分けられる：（１）一本鎖ポリヌクレオチドライブラリのデノボ合成、（２）より大きなフラグメントを形成するためのポリヌクレオチドの接合、（３）エラー補正、（４）品質管理、および（５）発送。デノボ合成に先立って、意図した核酸配列または一群の核酸配列が、あらかじめ選択される。例えば、一群の遺伝子は生成のためにあらかじめ選択される。
【０１３３】
一旦、生成のための大きなポリヌクレオチドが選択されると、ポリヌクレオチドのあらかじめ決定されたライブラリは、デノボ合成のために設計される。様々な適切な方法が、高密度ポリヌクレオチドアレイの生成に関して知られている。ワークフロー例において、デバイス面レイヤ（５０１）が提供される。例において、面の化学作用は、ポリヌクレオチド合成プロセスを改善するために修正される。低い界面エネルギーの領域は、液体をはね返すように生成され、他方で高い界面エネルギーの領域は、液体を引きつけるように生成される。面自体が平面形状であってもよく、または表面エリアで増加する突部またはマイクロウェル等の、形状の変化を有してもよい。ワークフローの例において、国際公開第ＷＯ／２０１５／０２１０８０号で開示されるように、選択された高い界面エネルギー分子は、ＤＮＡの化学作用を支持する二元機能を果たし、該出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
ポリヌクレオチドアレイのインサイチュ調製は個体担体上で行われ、および平行して多数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド拡張プロセスを利用する。ポリヌクレオチドシンセサイザー等の材料沈着デバイスは、多数のポリヌクレオチドが並行して伸長するように段階的手法で試薬を放出するよう設計されており、あらかじめ決定された核酸配列を有するオリゴマーを生成するために一度に１試薬が放出される（５０２）。いくつかの例では、ポリヌクレオチドはこの段階で面から切断される。切断は、例えばアンモニアまたはメチルアミンを用いたガスによる切断を含む。
【０１３５】
生成されたポリヌクレオチドライブラリは、反応チャンバに配置される。この典型的なワークフローでは、反応チャンバ（「ナノリアクタ」とも呼ばれる）は、シリコンコーティングされたウェルであり、ＰＣＲ試薬を含み、およびポリヌクレオチドライブラリ上に下げられる（５０３）。ポリヌクレオチドの密封（５０４）の前または後に、基質からポリヌクレオチドを放出するために試薬が加えられる。典型的なワークフローでは、ポリヌクレオチドはナノリアクタの密封後に放出される（５０５）。一旦、放出されると、一本鎖ポリヌクレオチドのフラグメントは、ＤＮＡの全長範囲全体に及ぶようにハイブリダイズする。部分的なハイブリダイゼーション（５０５）が可能であり、なぜなら合成ポリヌクレオチドの各々は、集団内の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドをオーバーラップする少しの部分を含むように設計されるからである。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション後に、ＰＣＲ反応が開始される。ポリメラーゼサイクル中に、ポリヌクレオチドは相補的なフラグメントにアニール化され、隙間がポリメラーゼによって満たされる。各サイクルは、ポリヌクレオチドが互いを発見するかどうかに無作為に依存して、様々なフラグメントの長さを増加させる。フラグメント間の相補性は、二本鎖ＤＮＡの完全で大きなスパンを形成することを可能にする（５０６）。
【０１３７】
ＰＣＲが完了した後、ナノリアクタはデバイスから分離され（５０７）、ＰＣＲのためのプライマーを有するデバイスとのインタラクションのために配置される（５０８）。密封の後、ナノリアクタはＰＣＲにさらされ（３０９）、およびより大きな核酸が増幅される。ＰＣＲの後（５１０）、ナノチャンバが開けられ（５１１）、エラー補正試薬が添加され（５１２）、チャンバが密封され（５１３）、そして、二本鎖ＰＣＲ増幅産物からの相補性の乏しいミスマッチ塩基対および／または鎖を削除するためにエラー補正反応が生じる（５１４）。ナノリアクタが開かれ、分割される（５１５）。エラー補正された生成物は次に、ＰＣＲおよび分子バーコーディング等の追加の処理工程にさらされ、そして出荷（５２３）のために包装される（５２２）。
【０１３８】
いくつかの例では、品質管理測定が行われる。エラー補正の後に、品質管理工程は、例えば、エラー補正された生成物の増幅のためのシーケンシングプライマーを有するウェーハとのインタラクション（５１６）、エラー補正された増幅産物を含むチャンバへのウェーハの密封（５１７）、および増幅の追加サイクルを行う工程（５１８）を含む。ナノリアクタが開けられ（５１９）、そして生成物がプールされ（５２０）、配列される（５２１）。合格品質であるという管理決定がなされた後、包装された生成物（５２２）が出荷（５２３）のために承認される。
【０１３９】
いくつかの例では、図５等のワークフローによって生成される核酸は、本明細書に開示の重複するプライマーを使用して、突然変異誘発にさらされる。いくつかの例では、プライマーのライブラリは、個体担体上でのインサイチュ調製によって生成され、平行に多数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド拡張プロセスを利用する。ポリヌクレオチドシンセサイザー等の材料沈着デバイスは、多数のポリヌクレオチドが並行して伸長するように段階的手法で試薬を放出するよう設計されており、あらかじめ決定された核酸配列を有するオリゴマーを生成するために一度に１試薬が放出される（５０２）。
【０１４０】
大きなポリヌクレオチドライブラリは低エラー率を有する。
【０１４１】
提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関する平均エラー率は、１０００分の１未満、１２５０分の１未満、１５００分の１未満、２０００分の１未満で、３０００分の１未満、またはより低い頻度であり得る。いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関する平均エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満、またはより低い。いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関する平均エラー率は、１／１０００未満である。
【０１４２】
いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関する合計エラー率は、あらかじめ決定された配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満、またはより低い。いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関する合計エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満である。いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関する合計エラー率は、１／１０００未満である。
【０１４３】
いくつかの例では、エラー補正酵素が、使用可能な提供される方法とシステムを使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに使用され得る。いくつかの例では、エラー補正によるポリヌクレオチドに関する合計エラー率は、あらかじめ決定された配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満、またはそれ以下であり得る。いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関するエラー補正による合計エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満であり得る。いくつかの例では、提供されるシステムと方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに関するエラー補正での合計エラー率は、１／１０００未満であり得る。
【０１４４】
エラー率は、遺伝子変異体のライブラリの生成のための遺伝子合成の値を制限し得る。１／３００のエラー率では、１５００の塩基対遺伝子におけるクローンの約０．７％が正しくなる。ポリヌクレオチド合成からのエラーのほとんどは、結果としてフレームシフト突然変異をもたらすため、そのようなライブラリにおけるクローンの９９％以上が、全長タンパク質を生成しない。エラー率を７５％低下させることによって、正しいクローンのフラクションは４０倍増加するだろう。本開示の方法および組成物は、超並列および時間効率の良い方法で可能になる合成の質の改善およびエラー補正方法の適用性の両方によって、一般に観察される遺伝子合成方法よりも低いエラー率での大規模なオリゴヌクレオチドと、遺伝子ライブラリの速いデノボ合成を可能にする。したがって、ライブラリは、ライブラリ全体にわたって、またはライブラリの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上にわたって、塩基の挿入、欠失、置換、あるいは１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれ以下である合計のエラー率を伴って、合成され得る。本開示の方法および組成物はさらに、あらかじめ決定された／あらかじめ選択された配列と比較して、エラーのない配列に関連するライブラリの少なくともサブセットにおいて、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上に関連付けられる低いエラー率での大規模な合成ポリヌクレオチドと遺伝子ライブラリに関する。いくつかの例では、ライブラリ内の単離した量でのポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。いくつかの例では、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上の類似性または同一性に関連する、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。いくつかの例では、ポリヌクレオチドまたは遺伝子上の特定の遺伝子座に関連するエラー率は、最適化される。したがって、大規模なライブラリの一部としての１つ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子の複数の選択された遺伝子座の任意の遺伝子座は各々、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれより低いエラー率を有し得る。様々な例では、そのようなエラーを最適化した遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、５００００、７５０００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上の遺伝子座を含み得る。エラーを最適化した遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、７５０００、１０００００、５０００００の、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子に分布され得る。
【０１４５】
エラー率は、エラー補正の有無に関わらず達成され得る。エラー率は、ライブラリ全体にわたって、またはライブラリの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上にわたって達成され得る。
【０１４６】
コンピュータシステム
【０１４７】
本明細書に記載されるシステムのいずれかは、コンピュータに動作可能に接続されてもよく、およびローカルまたは遠隔のいずれかでコンピュータを通じて自動化されてもよい。様々な例において、本開示の方法とシステムはさらに、コンピュータシステムのソフトウエアプログラムとその使用を含む。したがって、材料沈着デバイスの動き、分配動作、および真空発動の組織化と同期等の、分配／真空／再補充機能の同期のためのコンピュータ制御は、本開示の範囲内にある。コンピュータシステムは、ユーザーに特異的な塩基配列と、基質の特定領域に適正な試薬を送達するための材料沈着デバイスの位置をインターフェースで接続するようにプログラムされてもよい。
【０１４８】
図６に例示されるコンピュータシステム（６００）は、固定媒体（６１２）を有するサーバー（６０９）に随意に接続され得る、媒体（６１１）および／またはネットワークポート（６０５）からの命令を読み取ることができる論理装置として理解してもよい。図６に示されるシステム等のシステムは、ＣＰＵ（６０１）、ディスクドライブ（６０３）、キーボード（６１５）および／またはマウス（６１６）等の随意の入力デバイス、および随意のモニタ（６０７）を含むことができる。データ通信は、示された通信媒体を通って、ローカル位置または遠隔位置のサーバーへと到達され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールドワイドウェブを通じた通信を提供することができる。本開示に関連するデータは、図６に例示されるような当事者（６２２）による受信および／または検証のためのそのようなネットワークまたは接続を通じて送信され得ることが想定される。
【０１４９】
図７は、本開示の例としての事例に関連して使用することができるコンピュータシステム（７００）の第１の例であるアーキテクチャを例示するブロック図である。図７で示されるように、例としてのコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（７０２）を含むことができる。プロセッサの非限定的な例として、以下があげられる：Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２−ｂｉｔ  ＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ  ９３０（商標）プロセッサ、または機能的に同等なプロセッサ。実行の多数のスレッドが、並列処理に使用され得る。いくつかの例では、多数のプロセッサ、または多数のコアを備えたプロセッサはまた、単一のコンピュータシステムにおいて、またはクラスタにおいて使用することができ、または複数のコンピュータ、携帯電話、および／またはパーソナルデータアシスタントデバイスを含むネットワークを通じてシステム全体に分配され得る。
【０１５０】
図７に例示されるように、プロセッサ（７０２）によって最近使用された、または頻繁に使用される命令またはデータのための高速メモリを提供するために、高速キャッシュ（７０４）がプロセッサ（７０２）に接続され、または組み込まれ得る。プロセッサ（７０２）は、プロセッサバス（７０８）によってノースブリッジ（７０６）に接続される。ノースブリッジ（７０６）は、メモリバス（７１２）によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（７１０）に接続され、プロセッサ（７０２）によってＲＡＭ（７１０）に対するアクセスを管理する。ノースブリッジ（７０６）はまた、チップセットバス（７１６）によってサウスブリッジ（７１４）に接続される。サウスブリッジ（７１４）は、順に周辺バス（７１８）に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジとサウスブリッジは、しばしばプロセッサチップセットと呼ばれ、プロセッサ、ＲＡＭ、および周辺バス（７１８）にある周辺コンポーネントの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的なアーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりに、プロセッサに組み込むことができる。いくつかの例では、システム（７００）は、周辺バス（７１８）に付けられたアクセラレータカード（７２２）を含むことができる。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または特定の処理を加速するための他のハードウェアを含むことができる。例えば、アクセラレータは、適応データの再構成のために、または拡張された設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。
【０１５１】
ソフトウェアとデータは外部ストレージ（７２４）に保存され、プロセッサによる使用のためにＲＡＭ（７１０）および／またはキャッシュ（７０４）にロードされ得る。システム（７００）は、システム資源を管理するためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的な例として、以下があげられる：Ｌｉｎｕｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に同等なオペレーティングシステムと共に、本開示の例としての事例に係るデータの記憶および最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行されるアプリケーションソフトウェア。この例において、システム（７００）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および分散並列処理に使用可能な他のコンピュータシステム等の、外部ストレージにネットワークインターフェースを提供するための周辺バスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（７２０）と（７２１）を含むことができる。
【０１５２】
図８は、複数のコンピュータシステム（８０２ａ）と（８０２ｂ）、複数の携帯電話とパーソナルデータアシスタント（８０２ｃ）、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（８０４ａ）と（８０４ｂ）を備えるネットワーク（８００）を示す図である。例としての事例において、システム（８０２ａ）、（８０２ｂ）および（８０２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（８０４ａ）および（８０４ｂ）に保存されたデータのためのデータアクセスを最適化することができる。数学的モデルをデータに使用することができ、およびコンピュータシステム（８０２ａ）と（８０２ｂ）、および携帯電話とパーソナルデータアシスタントシステム（８０２ｃ）にわたる分散並列処理を使用して評価することができる。コンピュータシステム（８０２ａ）と（８０２ｂ）、および携帯電話とパーソナルデータアシスタントシステム（８０２ｃ）はまた、ネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）（８０４ａ）と（８０４ｂ）に保存されたデータの適応データ再構成に並列処理を提供することができる。図８は、単に一例を例示するものであり、種々様々な他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムが、本開示の様々な例と共に使用され得る。例えば、並列処理を提供するためにブレードサーバーを使用することができる。並列処理を提供するために、プロセッサブレードをバックプレーンを介して接続することができる。ストレージもまたバックプレーンに接続することができ、または別のネットワークインターフェースを介してネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）として接続することができる。いくつかの例としての事例において、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持することができ、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクタを介してデータを送信することができる。他の例では、プロセッサのいくつかまたはすべては、共有の仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【０１５３】
図９は、例としての事例に係る共有の仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステム（９００）のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（９０４）にアクセス可能な複数のプロセッサ（９０２ａ−ｆ）を含む。システムは、複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（９０６ａ−ｆ）をメモリサブシステム（９０４）に組み込む。各ＭＡＰ（９０６ａ−ｆ）は、メモリ（９０８ａ−ｆ）と、１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（９１０ａ−ｆ）を含むことができる。ＭＡＰは、設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの部分が、それぞれのプロセッサと密に協働した処理のためにＦＰＧＡ（９１０ａ−ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価するために、および例としての事例において適応データ再構成を実行するために、使用することができる。この例において、各ＭＡＰは、これらの目的のためにすべてのプロセッサによって地球規模でアクセス可能である。１つの構成では、各ＭＡＰは、関連するメモリ（９０８ａ−ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、これによって、それぞれのマイクロプロセッサ（９０２ａ−ｆ）から独立して、およびそれらとは非同期的にタスクを実行することができる。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理および並列実行のために別のＭＡＰに結果を直接供給することができる。
【０１５４】
上記のコンピュータアーキテクチャおよびシステムは単なる例であり、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡおよび他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、および他の処理素子と論理素子の任意の組み合わせを使用するシステムを含む、広範な他のコンピュータ、携帯電話、パーソナルデータアシスタントのアーキテクチャおよびシステムが、例としての事例に関連して使用され得る。いくつかの例では、コンピュータシステムのすべてまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアに実装され得る。ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）および他のローカルまたは分散データストレージデバイスとシステムを含む、あらゆる種類のデータストレージメディアが、例としての事例に関連して使用され得る。
【０１５５】
例としての事例において、コンピュータシステムは、上記または他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムのいずれかにおいて実行されるソフトウェアモジュールを使用して実装され得る。他の例において、システムの機能は、ファームウェア、図９で参照されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）等のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理素子および論理素子等において部分的または完全に実装され得る。例えば、セットプロセッサ（Ｓｅｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）およびオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）は、図７に例示されるアクセラレータカード（７２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によって、ハードウェアアクセラレーションで実装され得る。
【０１５６】
追加の方法と組成物
【０１５７】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリを生成するための方法であって、該方法は：少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドをコードするあらかじめ決定された配列を提供する工程；面を有する構造を提供する工程であって、面は複数のクラスタを含む、工程；少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドを合成する工程であって、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの各々は異なる遺伝子座を伸長させる、工程；および、ポリヌクレオチドライブラリを形成するために少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドを増幅する工程を含み、ここで、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約２倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約９０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約２倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約９０パーセントより多くは、ポリヌクレオチドライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、クラスタ化されていない遺伝子座の面を有する構造を使用する方法からの増幅産物と比較して、より少ないドロップアウトを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは変形ライブラリをコードする。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドライブラリは少なくとも１つの遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドライブラリは少なくとも５０の遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは少なくとも１つの遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、抗体、酵素またはペプチドの少なくとも一部をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、エラーを補正せずに、あらかじめ決定された配列と比較して、５００塩基に１未満の合計エラー比率を有する。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、エラーを補正せずに、あらかじめ決定された配列と比較して、１０００塩基に１未満の合計エラー比率を有する。さらに本明細書で提供される方法において、あらかじめ決定された配列は少なくとも７００，０００の非同一のポリヌクレオチドをコードする。さらに本明細書で提供される方法において、各クラスタは、ポリヌクレオチド合成のための５０〜約５００の遺伝子座を含む。さらに本明細書で提供される方法において、各クラスタは、ポリヌクレオチド合成のための最大約５００の遺伝子座を含む。
【０１５８】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリを生成するための方法であって、該方法は：少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドをコードするあらかじめ決定された配列を提供する工程；面を有する構造を提供する工程であって、面は複数のクラスタを含む、工程；少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドを合成する工程であって、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの各々は異なる遺伝子座を伸長させる、工程；および、ポリヌクレオチドライブラリを形成するために少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドを増幅する工程であって、ポリヌクレオチドライブラリは、増幅反応後に７５％より大きい正確な配列比率を有する工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、増幅反応後に８５％より大きい正確な配列比率を有する。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、クラスタ化されていない遺伝子座の面を有する構造を使用する方法からの増幅産物と比較して、より少ないドロップアウトを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは変形ライブラリをコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは少なくとも１つの遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、抗体、酵素またはペプチドの少なくとも一部をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、エラーを補正せずに、あらかじめ決定された配列と比較して、５００塩基に１未満の合計エラー比率を有する。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリは、エラーを補正せずに、あらかじめ決定された配列と比較して、１０００塩基に１未満の合計エラー比率を有する。さらに本明細書で提供される方法において、あらかじめ決定された配列は少なくとも７００，０００の非同一のポリヌクレオチドをコードする。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも１つの遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも５０の遺伝子をコードする。さらに本明細書で提供される方法において、各クラスタは、ポリヌクレオチド合成のための５０〜約５００の遺伝子座を含む。さらに本明細書で提供される方法において、各クラスタは、ポリヌクレオチド合成のための最大約５００の遺伝子座を含む。
【０１５９】
本明細書で提供されるのは、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリであって、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは合成されたポリヌクレオチドの増幅産物であり、および少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約８０％より多くが、核酸ライブラリに関する平均表示の少なくとも約２倍以内の量で表示される。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約８０パーセントより多くは、核酸ライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約９０パーセントより多くは、核酸ライブラリに関する平均表示の少なくとも約２倍以内の量で表示される。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの約９０パーセントより多くは、核酸ライブラリに関する平均表示の少なくとも約１．５倍以内の量で表示される。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、核酸ライブラリは、クラスタ化されていない遺伝子座の面を有する構造を使用する方法からの増幅産物と比較して、より少ないドロップアウトを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは変形ライブラリをコードする。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも１つの遺伝子をコードする。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも５０の遺伝子をコードする。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、抗体、酵素またはペプチドの少なくとも一部をコードする。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、あらかじめ決定された配列は少なくとも７００，０００の非同一のポリヌクレオチドをコードする。
【０１６０】
本明細書において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリが提供され、ここでＧＣ含量が制御され、およびライブラリは、増幅反応後に７５％より大きい正確な配列比率を提供する。さらに本明細書において、増幅反応後に８５％より大きい正確な配列比率を有する核酸ライブラリが提供される。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％のＧＣの割合を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１６１】
本明細書において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリが提供され、ここで反復配列含量が制御され、およびライブラリは、増幅反応後に７５％より大きい正確な配列比率を提供する。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、ポリヌクレオチドライブラリは、増幅反応後に８５％より大きい正確な配列比率を有する。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１６２】
本明細書において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリが提供され、ここで少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドによってコードされる二次構造含量があらかじめ選択され、およびライブラリは、増幅反応後に７５％より大きい正確な配列比率を提供する。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、核酸ライブラリは、増幅反応後に８５％より大きい正確な配列比率を有する。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも約１０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、多くとも９５％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドは、約１０％から約９５％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約３０％より多くが、１０％から３０％または７０％から９０％の二次構造の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも約５０００の非同一のポリヌクレオチドの約１５％未満が、１０％から３０％または６０％から９０％の反復配列の割合を有するポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書において、変形ライブラリをコードする核酸ライブラリが提供される。さらに本明細書において、少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸ライブラリが提供される。さらに本明細書において、抗体、酵素またはペプチドの少なくとも一部をコードする核酸ライブラリが提供される。さらに本明細書において、エラーを補正せずに、あらかじめ決定された配列と比較して、５００塩基に１未満の合計エラー比率を有する核酸ライブラリが提供される。さらに本明細書において、エラーを補正せずに、あらかじめ決定された配列と比較して、１０００塩基に１未満の合計エラー比率を有する核酸ライブラリが提供される。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、あらかじめ決定された配列は少なくとも７００，０００の非同一のポリヌクレオチドをコードする。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも１つの遺伝子をコードする。さらに本明細書において核酸ライブラリが提供され、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドは少なくとも５０の遺伝子をコードする。
【０１６３】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリの増幅のための方法であって、該方法は：少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドのための増幅分布を得る工程；少なくとも１つの配列特徴に基づいて、２つ以上のビンへと、増幅分布の少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドをクラスタリングする工程；および、あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを生成するために、２つ以上のビンの各々において、少なくとも５０００の非同一のポリヌクレオチドの頻度数に基づいて、非同一のポリヌクレオチドの各々の合成のための表示を調整する工程；あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを合成する工程；および、あらかじめ選択された表示を有するポリヌクレオチドライブラリを増幅する工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも１つの配列特徴はパーセントＧＣ含量である。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも１つの配列特徴はパーセント反復配列含量である。さらに本明細書で提供される方法において、少なくとも１つの配列特徴はパーセント二次構造含量である。さらに本明細書で提供される方法において、反復配列は３つ以上のアデニンを含む。さらに本明細書で提供される方法において、反復配列はポリヌクレオチドの片方または両方の末端にある。さらに本明細書で提供される方法において、前記ポリヌクレオチドは、標的配列を結合するために１つ以上のポリヌクレオチド配列の親和性に基づいてビンへとクラスタリングされる。さらに本明細書で提供される方法において、ビンの下３０％にある配列の数は、調整前のビンの下３０％にある配列の数と比較して、調整後の下流での適用に少なくとも５０％多くの表示を有する。さらに本明細書で提供される方法において、ビンの上３０％にある配列の数は、調整前のビンの上３０％にある配列の数と比較して、調整後の下流での適用に少なくとも５０％多くの表示を有する。さらに本明細書で提供される方法において、前記増幅分布は経験的に得られる。さらに本明細書で提供される方法において、前記増幅分布は、予測的アルゴリズムを通じて得られる。いくつかの例における調整は、ライブラリのポリヌクレオチドの化学量論を制御する工程を含む。
【０１６４】
本明細書で提供されるのは、少なくとも１００，０００の非同一のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリであって、各非同一のポリヌクレオチドは少なくとも１つの異なるエクソーム配列をコードし、および少なくとも１００，０００の非同一のポリヌクレオチドの少なくとも約８０％は各々、ライブラリの非同一のポリヌクレオチドの各々に関して平均頻度の２ｘ以内の量でポリヌクレオチドライブラリに存在する。さらに本明細書で提供されるのは、核酸ライブラリであって、核酸ライブラリはアンプリコンライブラリであり、および複数の非同一のポリヌクレオチドの少なくとも約８０％は各々、ライブラリの非同一のポリヌクレオチドの各々に関して平均頻度の２ｘ以内の量でアンプリコンライブラリに存在する。さらに本明細書で核酸ライブラリが提供され、ライブラリを最大５５倍の理論上の読み取り深度で配列決定することで、結果として、少なくとも３０倍の読み取り深度を有する塩基の少なくとも９０％がもたらされる。さらに本明細書で核酸ライブラリが提供され、ライブラリを最大５５倍の理論上の読み取り深度で配列決定することで、結果として、少なくとも１０倍の読み取り深度を有する塩基の少なくとも９８％がもたらされる。
【０１６５】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリの合成のための方法であって、該方法は：（ａ）少なくとも１００，０００の非同一のポリヌクレオチドにあらかじめ決定された配列を提供する工程であって、各非同一のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの１つ以上の部分をコードする、工程；（ｂ）少なくとも１００，０００の非同一のポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｃ）ポリヌクレオチドのライブラリを生成するために、少なくとも１００，０００の非同一のポリヌクレオチドを増幅する工程であって、ライブラリのポリヌクレオチドの少なくとも約７５％は、少なくとも１００，０００の非同一のポリヌクレオチドに関してあらかじめ決定された配列と比較してエラーがない工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、ポリヌクレオチドライブラリはアンプリコンライブラリであり、複数の非同一のポリヌクレオチドの少なくとも約８０％は各々、ライブラリの非同一のポリヌクレオチドに関して平均頻度の２ｘ以内の量でアンプリコンライブラリに存在する。さらに本明細書で提供される方法において、各非同一のポリヌクレオチドは１つ以上のエクソンをコードする。さらに本明細書で提供される方法において、増幅された非同一のポリヌクレオチドの各々は、少なくとも１つの分子タグを含む。
【０１６６】
本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドライブラリの合成のための方法であって、該方法は：（ａ）少なくとも２，０００の非同一のポリヌクレオチドの第１のライブラリを増幅する工程；（ｂ）１つ以上の配列特徴の関数として第１のライブラリ内の配列の分布を特定する工程；および（ｃ）第２のライブラリを生成するために、配列の分布に基づいて第１のライブラリにおいて配列の相対比率を変更する工程であって、それによって第２のライブラリの２．５ｘ以下のサンプリングは少なくとも８０％のカバー率をもたらす工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の配列特徴はパーセントＧＣ含量を含む。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の配列特徴はパーセント反復配列含量を含む。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の配列特徴はパーセント二次構造含量を含む。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の配列特徴はシーケンシングカバー率を含む。さらに本明細書で提供される方法において、１．７ｘ以下のサンプリングは、少なくとも８０％のシーケンシングカバー率をもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、２．５ｘ以下のサンプリングは、少なくとも９０％のシーケンシングカバー率をもたらす。さらに本明細書で提供される方法において、該方法は第２のライブラリを合成する工程をさらに含む。さらに本明細書で提供される方法において、該方法は第２のライブラリを増幅する工程をさらに含む。さらに本明細書で提供される方法において、ライブラリは少なくとも５，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ライブラリは少なくとも１０，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ライブラリは少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含む。
【０１６７】
本明細書で提供されるのは、標的濃縮のための方法であって、該方法は：少なくとも２，０００の非同一の二本鎖ポリヌクレオチドのライブラリを、標的核酸を含むサンプルポリヌクレオチドの集団に接触させる工程であって、少なくとも２，０００の非同一のポリヌクレオチドの各々は、（５’〜３’まで）第１の非標的配列と第２の非標的配列、および１つ以上の標的核酸配列に相補的な挿入配列を含む、工程；個体担体上の少なくとも２，０００の非同一のポリヌクレオチドの１つ以上にハイブリダイズする標的核酸配列を捕捉する工程；および、標的ポリヌクレオチドライブラリを生成するために、捕捉された標的核酸を放出する工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの分子タグをさらに含む。さらに本明細書で提供される方法において、各非同一の配列はプライマー結合部位をさらに含む。さらに本明細書で提供される方法において、第１の非標的配列はポリヌクレオチドの５’末端に位置し、および第２の非標的配列はポリヌクレオチドの３’末端に位置する。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の分子タグはポリヌクレオチドの５’末端に付けられている。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の分子タグはポリヌクレオチドの３’末端に付けられている。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の分子タグとポリヌクレオチドはスペーサーによって結合される。さらに本明細書で提供される方法において、挿入配列は少なくとも１つのエクソンに相補的である。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の分子タグはビオチン、葉酸、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンである。さらに本明細書で提供される方法において、１つ以上の分子タグは２つのビオチン分子である。さらに本明細書で提供される方法において、個体担体は磁気ビーズである。さらに本明細書で提供される方法において、第１の非標的配列と第２の非標的配列は、２０〜４０の塩基の長さである。さらに本明細書で提供される方法において、挿入配列は９０〜２００の塩基の長さである。さらに本明細書で提供される方法において、ライブラリは少なくとも５，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ライブラリは少なくとも１０，０００のポリヌクレオチドを含む。さらに本明細書で提供される方法において、ライブラリは少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含む。
【０１６８】
本明細書において、複数の部分的に相補的な二本鎖ポリヌクレオチドを含むプローブライブラリが提供され、各々は：第１の非標的配列と第２の非標的配列、および１つ以上の標的核酸配列に相補的な第１の挿入配列を含む、第１のポリヌクレオチド：第１の非標的配列と第２の非標的配列、および第１の挿入配列に相補的な第２の挿入配列を含む、第２のポリヌクレオチド：を含み、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドは部分的にハイブリダイズされる。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖は、少なくとも２つの分子タグをさらに含む。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、第１の非標的配列と第２の非標的配列は相補的ではない。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、第１の非標的配列はポリヌクレオチドの５’末端に位置し、および第２の非標的配列はポリヌクレオチドの３’末端に位置する。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、１つ以上の分子タグはポリヌクレオチドの５’末端に付けられている。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、１つ以上の分子タグはポリヌクレオチドの３’末端に付けられている。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、１つ以上の分子タグとポリヌクレオチドはスペーサーによって結合される。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、挿入配列は少なくとも１つのエクソンに相補的である。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、１つ以上の分子タグはビオチン、葉酸、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンである。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、１つ以上の分子タグは２つのビオチン分子である。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、個体担体は磁気ビーズである。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、第１の非標的配列と第２の非標的配列は、２０〜４０の塩基の長さである。さらに本明細書で提供されるライブラリにおいて、挿入配列は９０〜２００の塩基の長さである。
【０１６９】
本明細書で提供されるのは、プローブライブラリを設計するための方法であって、該方法は：標的配列のライブラリを得る工程；および、標的配列に相補的な挿入配列のライブラリを設計する工程を含み、設計する工程は：標的配列が挿入配列より短い長さであれば、標的配列に相補的な挿入配列を生成する工程；標的配列が挿入配列＋Ｘより短い長さであれば、標的配列に少なくとも部分的に相補的な挿入配列を生成する工程；または、標的配列が挿入配列＋Ｘより長ければ、一般的な標的配列に少なくとも部分的に相補的な１セットの挿入配列を生成工程であって、ここでＸは挿入配列によって標的とされない連続塩基の数である、工程；挿入配列のライブラリを生成するためにライブラリにおいて各標的配列に対して工程（ｂ）を繰り返す工程、を含む。さらに本明細書で提供される方法において、Ｘは３０未満のヌクレオチドである。さらに本明細書で提供される方法において、Ｘは１０未満のヌクレオチドである。さらに本明細書で提供される方法において、Ｘは約６のヌクレオチドである。
【０１７０】
本明細書において、次世代シーケンシングのための方法が提供され、該方法は、複数の標的ポリヌクレオチドを含むサンプルに本明細書に記載されるライブラリを接触させる工程；ライブラリに結合する少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを濃縮する工程；および少なくとも１つの濃縮された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程、を含む。
【０１７１】
本明細書で提供されるのは、次世代シーケンシングのための方法であって、該方法は：複数のポリヌクレオチドを含むサンプルに、本明細書に記載のライブラリを接触させる工程；ライブラリに結合しない少なくとも１つのポリヌクレオチドから、ライブラリに結合するサンプル中の少なくとも１つのポリヌクレオチドを分離する工程；および、ライブラリに結合しない少なくとも１つのポリヌクレオチドを配列決定する工程、を含む。
【実施例】
【０１７２】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限するようには意図されていない。実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を現時点で代表するものであり、例示的なものであり、および本発明の範囲を限定するものとしては意図されていない。そこでの変更、および請求項の範囲により定義される本発明の精神内に包含される他の使用が、当業者に想到されるであろう。
【０１７３】
実施例１：基質面の官能化
【０１７４】
ポリヌクレオチドのライブラリのアタッチメントと合成を支持するために、基質を官能化した。基質面をまず、９０％のＨ２ＳＯ４と１０％のＨ２Ｏ２を含むピラニア溶液を使用して２０分間、湿式洗浄（ウェットクリーニング）した。ＤＩ水を用いて基質をいくつかのビーカー内ですすぎ、５分間、ＤＩ水のグースネック型の栓下で保持し、そしてＮ２で乾燥させた。基質をその後に５分間、ＮＨ４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に浸し、ピストルを使用してＤＩ水ですすぎ、ＤＩ水を用いてこれらの３つの連続したビーカーにそれぞれ１分間浸し、次に再びピストルを使用してＤＩ水ですすいだ。次に、基質面をＯ２にさらすことによってデバイスをプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００器具を使用して、下流モードで１分間、２５０ワットでＯ２のプラズマエッチングを行った。
【０１７５】
浄化した基質面を、以下のパラメータで、ＹＥＳ−１２２４Ｐ蒸着オーブンシステムを使用して、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む溶液で能動的に官能化した：０．５〜１トール、６０分間、７０℃、１３５℃の気化器。基質面を、Ｂｒｅｗｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００Ｘスピンコーターを使用してレジスト塗布した。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、４０秒間、２５００ｒｐｍで基質上にスピンコーティングした。Ｂｒｅｗｅｒホットプレート上で３０分間、９０℃で基質をあらかじめ焼いた。基質を、Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ  ＭＡ６マスクアライナー器を使用して、フォトリソグラフィにさらした。基質を２．２秒間、露出させ、ＭＳＦ  ２６Ａで１分間、現像した。残りの現像液をピストルですすぎ、基質を５分間、水に浸した。基質をオーブンで３０分間、１００℃で焼き、続いてＮｉｋｏｎ  Ｌ２００を使用してリソグラフィの欠損を目視検査した。２５０ワットで１分間、Ｏ２プラズマエッチングを行うためのＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００器具を使用して残りのレジストを取り出すためにデスカム処理を使用した。
【０１７６】
基質面を、１０μＬの軽油と混合した１００μｌのペルフルオロオクチルトリクロロシラン溶液を用いて受動的に官能基化した。基質をチャンバに置き、１０分間、ポンプでくみ上げ、その後にバルブでポンプを止め、１０分間立たせたままにした。チャンバを空気に通気させた。最大出力（クレストシステム上で９）の超音波処理を用いて、基質を７０℃で５分間、５００ｍＬのＮＭＰに２回漬けることによって、レジストストリップを行った。次に、最大出力の超音波処理を用いて、基質を室温で５分間、５００ｍＬのイソプロパノールに漬けた。基質を３００ｍＬの２００プルーフエタノールに漬け、Ｎ２で吹き付けて乾かした。官能化された面を、ポリヌクレオチド合成の支持の役割を果たすように活性化させた。
【０１７７】
実施例２：ポリヌクレオチド合成デバイスにおける５０量体配列の合成
【０１７８】
２次元のポリヌクレオチド合成デバイスをフローセルに組み立て、それをフローセル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ３９４  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ））に接続した。２次元のポリヌクレオチド合成デバイスを、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ）で均一に官能化し、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法を使用して５０ｂｐ（「５０量体ポリヌクレオチド」）の典型的なポリヌクレオチドを合成するために使用した。
【０１７９】
５０量体配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１．５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１）として記される通りであり、ここで＃は、チミジン−スクシニルヘキサンアミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓからのＣＬＰ−２２４４）を意味し、これは脱保護中に面からのポリヌクレオチドの放出を可能にする切断リンカーである。
【０１８０】
表１のプロトコルに従い、およびＡＢＩＡＢＩシンセサイザで、標準的なＤＮＡ合成化学（カップリング、キャッピング、酸化および分解）を使用して、合成を行った。
【０１８１】
【表１−１】
2020504709.tif 000003
【０１８２】
【表１−２】
2020504709.tif 000004
【０１８３】
ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルを通る大量の試薬の送達と同様に送達した。環境が試薬でずっと「湿った」ままであるため、乾燥工程は行わなかった。
【０１８４】
より速い流れを可能にするために、流れレストリクタをＡＢＩ  ３９４シンセサイザから取り除いた。流れレストリクタなしで、アミダイト（ＡＣＮ中に０．１Ｍ）、活性剤（ＡＣＮ中に０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈからの３０−３０７０−ｘｘ））、およびＯＸ（２０％のピリジン１０％の水、および７０％のＴＨＦ中に０．０２Ｍ  Ｉ２）に関する流速は、およそ〜１００ｕＬ／秒であり、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）およびキャッピング試薬（１：１のＣａｐＡとＣａｐＢの混合物、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中の１６％の１−メチルイミジゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）である）に関してはおよそ〜２００ｕＬ／秒であり、およびＤｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）に関してはおよそ〜３００ｕＬ／秒であった（流れレストリクタがある場合のすべての試薬の〜５０ｕＬ／秒と比較）。酸化剤が完全に押し出されるまでの時間を観察し、化学物質の流れ時間のタイミングを適宜、調整し、および余分なＡＣＮ洗浄を異なる化学物質間に導入した。ポリヌクレオチド合成後、７５ｐｓｉで一晩、チップをガス状アンモニアで脱保護した。ポリヌクレオチドを回復させるために水を５滴、面に適用した。次に、回復させたポリヌクレオチドを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ小型ＲＮＡチップで分析した（データは示さず）。
【０１８５】
実施例３：ポリヌクレオチド合成デバイスにおける１００量体配列の合成
【０１８６】
５０量体配列の合成に関して実施例２に記載されたのと同じプロセスを使用して、１００量体のオリゴヌクレオチド（“１００−ｍｅｒ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’、＃はチミジン−スクシニルヘキサンアミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓからのＣＬＰ−２２４４）を意味する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）を、２つの異なるシリコンチップ上で合成し、１つ目は、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドで均一に官能化し、２つ目は１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合物で官能化し、そして面から抽出されたポリヌクレオチドをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ器具で分析した（データは示さず）。
【０１８７】
２つのチップからの１０のサンプルはすべて、以下の熱サイクルプログラムを用いて、順方向プライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３）と逆方向プライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４）を使用し、５０ｕＬのＰＣＲ混合物中（２５ｕＬのＮＥＢ  Ｑ５マスターミックス、２．５ｕＬ  １０ｕＭの順方向プライマー、２．５ｕＬ  １０ｕＭの逆方向プライマー、面から抽出された１ｕＬのポリヌクレオチド、および最大５０ｕＬの水）で、さらにＰＣＲ増幅された：
９８Ｃ、３０秒
９８Ｃ、１０秒；６３Ｃ、１０秒；７２Ｃ、１０秒；１２サイクルを繰り返す
７２Ｃ、２分
【０１８８】
ＰＣＲ生成物もまた、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで分析し（データは示さず）、１００量体位置で鋭いピークを実証した。次に、ＰＣＲ増幅サンプルをクローニングし、およびサンガーシーケンシングを行った。表２は、チップ１からのスポット１−５から採取されたサンプル、およびチップ２からのスポット６−１０から採取されたサンプルに関する、サンガーシーケンシングの結果を概説する。
【０１８９】
【表２】
2020504709.tif 000005
【０１９０】
したがって、合成ポリヌクレオチドの高い品質と均一性は、異なる面化学作用を用いて２つのチップ上で繰り返された。全体として、配列された２６２の１００量体のうち２３３に対応する８９％が、エラーのない完全な配列であった。
【０１９１】
最後に表３は、スポット１−１０からのポリヌクレオチドサンプルから得られた配列に関するエラー特性を概説する。
【０１９２】
【表３】
2020504709.tif 000006
【０１９３】
実施例４：２９，０４０の特有のポリヌクレオチドの平行組立て
【０１９４】
図１０に示されるように、平らなシリコンプレート（１００１）上の１２１の遺伝子座を各々含む２５６のクラスタ（１００５）を有する構造を製造した。クラスタの拡大図は、１２１の遺伝子座を伴い（１０１０）で示される。２５６のクラスタのうち２４０個からの遺伝子座は、別個の配列を有するポリヌクレオチドの合成のためのアタッチメントと支持を提供した。ポリヌクレオチド合成は、実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイトの化学作用によって行なわれた。２５６のクラスタのうち１６個からの遺伝子座は、対照クラスタであった。合成された２９，０４０の特有のポリヌクレオチドの全体的な分布（２４０×１２１）は、図１１Ａで示される。ポリヌクレオチドライブラリは高い均一性で合成された。配列の９０％が、平均の４Ｘ以内のシグナルに存在し、１００％の表示を可能にした。図１１Ｂで示されるように、分布はクラスタごとに測定された。４つの代表的なクラスタで合成された特有のポリヌクレオチドの分布は図１２に示される。全体的なレベルに、実行された全てのポリヌクレオチドが存在し、およびポリヌクレオチドの９９％は、合成の均一性を示す平均の２ｘ以内である豊富量を有していた。この同じ所見は、クラスタごとのレベルで一貫していた。
【０１９５】
各ポリヌクレオチドのエラー率を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ遺伝子シーケンサーを使用して判定した。２９，０４０の特有のポリヌクレオチドに関するエラー率分布が図１３Ａに示され、平均は５００分の１塩基あたりであり、８００分の１塩基と同等に低いいくつかのエラー率が存在する。図１３Ｂで示されるように、分布はクラスタごとに測定された。４つの代表的なクラスタにおける特有のポリヌクレオチドのエラー率分布は、図１４に示される。２９，０４０の特有のポリヌクレオチドのライブラリは２０時間以内に合成された。
【０１９６】
ＧＣの割合 対 ２９，０４０の特有のポリヌクレオチドのすべてにわたるポリヌクレオチド表示の分析は、合成がＧＣ含量に関わらず均一であったことを示した。図１５。
【０１９７】
実施例５：合成されたポリヌクレオチドライブラリのＰＣＲ増幅
【０１９８】
９，９９６のポリヌクレオチド、ＧＣ含量の変動する無作為化された配列の各１００塩基の長さ、２０〜８０％のＧＣ含量を設計し、実施例３に記載の類似する構成を有する構造上で合成した。ＧＣ表示に対するＰＣＲ増幅の効果を判定するために、ポリヌクレオチド集団を、高忠実度のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ１）を用いて６または２０のサイクルのいずれかで増幅した。代替的に、ポリメラーゼ選択が増幅後の全体的な配列表示に効果を有するかどうかを判定するために、２つの他の高忠実度のＰＣＲ酵素を使用し、６、８、１０、または１５サイクルの間、ポリヌクレオチド集団を増幅した。ＰＣＲ増幅後、サンプルは、次世代シーケンシングのために準備され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォーム上で配列決定された。１５０のｂｐ  ＳＥの読み取りが、１００Ｘのおよその読み取り深度へと生成された。生のＦＡＳＴＱファイルが分析された。６、１０、または１５サイクルのいずれかのポリメラーゼによるポリヌクレオチド表示は、図１６に表される。ポリヌクレオチド表示の均一性が、様々な疾病に関して評価され、表４に概説される。
【０１９９】
【表４】
2020504709.tif 000007
【０２００】
増幅された各ポリヌクレオチド集団に関するドロップアウトの数を、図１５に示すように定量化し、増幅サイクル 対 集団のフラクションは平均閾値の１０％を下回った。ポリメラーゼ１ドロップアウトが素早く成長したのに対し、ポリメラーゼ２ドロップアウトは比較的一定のままであった。
【０２０１】
ＧＣ分布に対する過剰増幅の影響を評価した。図１８。一般的には、ＧＣ含量３０％〜７０％のポリヌクレオチドは、近似曲線、Ｙ＝Ｘに従い、およびより多くのサイクルで頻度が増加した。７０％より多くのＧＣ含量を有するポリヌクレオチドが、概して２０サイクル後にわずかに頻度が多かったのに対し、３０％未満のＧＣ含量のポリヌクレオチドは、概して、６サイクル後にわずかに頻度が多かった。
【０２０２】
実施例６：全プレート増幅からのポリヌクレオチド表示と、平行なポリヌクレオチドクラスタ増幅との比較
【０２０３】
図１０に示されるように、平らなシリコンプレート上の１２１の遺伝子座を各々含む２５６のクラスタを有する構造上で、ポリヌクレオチドが合成された。ポリヌクレオチド合成は、実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイトの化学作用によって行なわれた。構造上のポリヌクレオチドを切断して組み合わせた。
【０２０４】
プレートにわたってポリヌクレオチドを組み合わせて増幅した。増幅後に、図１９に見られるような線で表される平均値からの顕著なＧＣのバイアスと分散があった。その結果、より多くのシーケンシングが必要であり、およびより多くのドロップアウトがあった。
【０２０５】
クラスタの増幅からのポリヌクレオチドの分布は図２０に見られる。実行１と実行２では、平均値（線）からの度数分布は約８であり、および平均値からの分散は約１．７Ｘであった。ＧＣの割合は１７％から９４％の範囲であった。図２３と図２０は、再現性があることを例証し、およびポリヌクレオチド集団は、ＧＣバイアスの劇的な減少を示す（図２０）。加えて、０のドロップアウトがあり、および３０％少ないシーケンシングが求められた。
【０２０６】
実施例７：種々のＧＣ含量で合成されたポリヌクレオチドライブラリ
【０２０７】
約１５％から約８５％のＧＣ含量を含む１３，０００のポリヌクレオチド配列のライブラリを、合成のためにあらかじめ選択した（図２２）。第１のポリヌクレオチドライブラリは構造上で合成され、および合成は、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって行なわれた。構造上のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのＰＣＲバイアスのかかったライブラリを生成するために、増幅後に切断されて組み合わされた。ライブラリ内のポリヌクレオチド配列は、ＧＣ含量に従ってビンに入れられ、各ビンの化学量論は、ＰＣＲ増幅によって生成された、観察されたＧＣバイアスを考慮して適合された。例えば、より高い、またはより低いＧＣ含量を含むポリヌクレオチドは、増幅後に化学量論の表示を均一にするより高い初期濃度を有する。これは、増幅工程からのＰＣＲ  ＧＣのバイアスを効果的に減らし、または除去する。第２のポリヌクレオチドライブラリは構造上で合成され、および合成は、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって行なわれた。構造上のポリヌクレオチドは、増幅後に均一のＧＣの表示で（図２１Ａ）、ポリヌクレオチドの高度に均一なライブラリを生成するために（図２３）、切断されて組み合わされ、その後に増幅された。ＧＣの平衡なライブラリの１つの利点は、望ましいサンプリングカバー率のためにより少ないサンプリングが求められることである。例えば、ライブラリの８０％と９０％のカバー率のためのサンプリングは、単分散ライブラリのための理論上の最小に近づいた（図２４Ａと図２４Ｂ）。度合の変動する高いおよび低いＧＣ含量の両方を好むポリヌクレオチドライブラリをさらに合成した（それぞれ図２１Ｂと図２１Ｃ）。低いＧＣ含量（図２１Ｄ）または高いＧＣ含量（図２１Ｅ）を好むポリヌクレオチドライブラリをさらに合成した。
【０２０８】
実施例８：８０量体および１２０量体のポリヌクレオチド長さで合成された、ＧＣの平衡なポリヌクレオチドライブラリ
【０２０９】
各々が８０の核酸長さである、およそ２０，０００の特有のポリヌクレオチドを含むライブラリを設計し、実施例７の一般的方法を使用してＧＣを平衡にし、そして構造上で合成した；合成は、実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイトの化学作用によって行なわれた。各々が１２０の核酸の長さであり、ポリヌクレオチドを含む類似のライブラリをさらに合成した（図２６）。両ライブラリは高度に均一な分布を示し、＞９９％のユニーク配列が識別された。ライブラリはまた、ＧＣ含量の分散を通じて均一性を示し、複製を通じて高い一致を有し（図２７）、雑音にさらされる末尾に少数のポリヌクレオチドを有した。
【０２１０】
実施例９：ポリヌクレオチドライブラリの繰り返しの増幅後のＧＣ含量評価
【０２１１】
２０−８０％のＧＣ含量を含む９，９９６の特有のポリヌクレオチドから成るポリヌクレオチドライブラリは、各々１００塩基の長さであり、実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイト化学作用によって構造上で合成された。ライブラリを、２つの異なる高忠実度のＤＮＡポリメラーゼを用いて８または１５ＰＣＲサイクルのいずれかで増幅し、集団におけるポリヌクレオチドの頻度を、これらの２つの条件間で比較した（図２８）。同定線（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｌｉｎｅ）（黒色破線）は、８または１５ＰＣＲサイクルのいずれか後の、集団内の同じ頻度のポリヌクレオチドを示す。８サイクルの増幅と比較して、同定線上の配列は、１５サイクル後の集団での過剰表示であり、線の下の配列は、１５サイクル後の集団での提示不足である。この場合、ポリメラーゼ１は、増加するＰＣＲサイクルと共にＧＣバイアスを示す。８サイクルの増幅と比較して、１５サイクルの増幅後、高ＧＣの配列（７０％を超えるＧＣ、中くらいの灰色）については過剰表示が観察され、低ＧＣの配列（３０％未満のＧＣ、最も暗い灰色）は提示不足であった。加えて、同様のＧＣ割合内での濃縮における大きな変動は、ＧＣ含量以外の因子、ヘアピン形成またはホモポリマー伸張等が、増幅バイアスに影響を及ぼし得ることを示唆する。ポリメラーゼ２は同じ配列表示バイアスを示さなかった。
【０２１２】
実施例１０：ポリヌクレオチドライブラリの繰り返しの増幅後のドロップアウトと表示評価
【０２１３】
種々のＤＮＡポリメラーゼ酵素での増幅によって導入されたバイアスを調査した。実施例９のポリヌクレオチドライブラリを、６、８、１０、または１５サイクル間、ＤＮＡポリメラーゼ１（図２９、暗い線）またはＤＮＡポリメラーゼ２（図２９、明るい線）のいずれかで増幅した。ＰＣＲサイクルの増加は、ポリヌクレオチド配列のドロップアウト頻度と相関していた。ドロップアウト頻度は、平均の１０％未満の豊富量を有する配列として定義される。この効果の範囲は、増幅に使用されたＤＮＡポリメラーゼに依存した。配列のより大きな部分は、ＤＮＡポリメラーゼ２での増幅と比較して、ＤＮＡポリメラーゼ１での増幅後にドロップアウトした（１５サイクルでのドロップアウトのおよそ２０倍多い）。種々のポリメラーゼは、ＧＣ含量、長さ、および配列の複雑性に応じて、異なるライブラリ配列の増幅のために最適である場合もある。
【０２１４】
各ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５ＰＣＲサイクル増幅されたライブラリを、ポリヌクレオチド配列の表示を評価するためにより詳細に研究した（図３０）。
ＤＮＡポリメラーゼ１を用いたポリヌクレオチドライブラリの増幅は、１５ＰＣＲサイクル度に２０倍より多くの配列ドロップアウトをもたらした（図２９）。
ＤＮＡポリメラーゼ１を用いて増幅されたポリヌクレオチドの分布は、ＤＮＡポリメラーゼ２で増幅されたポリヌクレオチドの分布より大きかった。
ＤＮＡポリメラーゼ１で増幅されたライブラリのポリヌクレオチド分布は、平均値の１．５倍以内に存在する配列の６４％を有した。
同じライブラリをＤＮＡポリメラーゼ２で増幅した場合、＞８９％の配列が平均の１．５倍以内に存在し、ＤＮＡポリメラーゼ２で増幅されたライブラリがＤＮＡポリメラーゼ１よりもはるかに低いバイアスを有することを示した。
ＤＮＡポリメラーゼ１を用いて増幅されたライブラリに導入されたバイアスは、ポリヌクレオチドライブラリをカバーするのに必要なスクリーニング成果を高める。
【０２１５】
実施例１１：次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いた、エクソームを標的とするための制御された化学量論ポリヌクレオチドライブラリの使用
【０２１６】
１つ以上の遺伝子エクソンとオーバーラップする最大３７０，０００以上の非同一のポリヌクレオチドを含むライブラリ（プローブライブラリ）を標的とする第１のポリヌクレオチドｃＤＮＡは、実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイト化学作用によって構造上で設計され、合成される。
ポリヌクレオチドは、対象の標的エクソンの続く捕捉のためのプローブを形成するために、ＰＣＲを使用して（または個体フェーズ合成中に直接）、ビオチン等の分子タグに結合される。
プローブをゲノム核酸のライブラリの配列にハイブリダイズし、未結合の配列から分離する。
未結合のプローブを洗い流して、ｃＤＮＡ配列で濃縮された標的ライブラリを残した。
次に、濃縮されたライブラリを、ＮＧＳを使用して配列し、および各予測される遺伝子に関する読み取りを、遺伝子を標的とするのに使用されるｃＤＮＡプローブの関数として測定する。
【０２１７】
いくつかの例では、標的配列の読み取り頻度は、標的配列の豊富量、プローブ結合、二次構造、または濃縮に関わらず標的配列のシーケンシング後に表示を低下させる他の因子によって影響を受ける。ポリヌクレオチドライブラリの化学量論的制御は、第２のポリヌクレオチドｃＤＮＡ標的ライブラリを得るために第１のポリヌクレオチドｃＤＮＡ標的ライブラリの化学量論の修正によって行われ、より少ない読み取りに帰結するポリヌクレオチドプローブ配列に関する化学量論を増加させる。この第２のｃＤＮＡ標的ライブラリは、実施例３からの一般的方法を使用し、ホスホラミダイト化学作用によって構造上で設計されて合成され、そして前記のように標的ゲノムＤＮＡライブラリの配列エクソンを濃縮するために使用される。
【０２１８】
実施例１２：エクソームプローブライブラリを用いた化学量論制御の多数の反復
【０２１９】
エクソームプローブライブラリは、実施例１１の一般的方法を使用して合成され、試験された。化学量論的な修飾を多数、繰り返し、結果として制御された化学量論プローブライブラリ、ライブラリ１を得た。いくつかのコンパレータエクソーム濃縮キットと比較して、これは、標的の望ましいカバー率を得るために、有意に少ないシーケンシング読み取りをもたらす。正確なシーケンシングのために、標的エクソーム塩基の少なくとも９０％の３０ｘの読み取り深度が望ましく、および過剰シーケンシング（理論上の読み取り深度、３０ｘより大きな読み取り深度）がしばしば、均一性の問題を補うために必要とされる。制御された化学量論エクソームプローブライブラリは、５５ｘの理論上の読み取り深度で、標的塩基の９０％の３０ｘの読み取り深度を達成することができ（図３２Ａ）、これは、他のコンパレータエクソーム濃縮キットによって必要とされるよりも有意に少ないシーケンシングカバー率であり、およびより速い配列スループットであった（１実行あたりのサンプル、表５）。４．５Ｇｂのシーケンシングに標準化される場合、制御された化学量論プローブライブラリは１０ｘの読み取り深度の全標的塩基の＞９５％を提供し、これは他のコンパレータエクソームプローブキットより有意に高かった（図３２Ｂ）。
【０２２０】
【表５】
2020504709.tif 000008
【０２２１】
実施例１３：ハイブリダイゼーションパネルの生成
【０２２２】
ポリヌクレオチド標的ライブラリは、特定遺伝子、疾患、パネルの組み合わせ、またはカスタムエクソームを標的とする実施例１１の一般的方法を使用して調製された。反応サイズは１０３のスケールに及び、およびプローブパネルサイズは、約８０〜約９００，０００のプローブに及んだ（図３３）。
【０２２３】
実施例１４：７０，０００のプローブパネルの生成
【０２２４】
７０，０００の非同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）を、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって、およびライブラリ２を生成するために実施例１１の一般的方法を使用して制御されたＧＣによって、構造上で設計して合成した。シーケンシング後の読み取り分布は図３４に示され、およびＧＣビン標的カバー率は、図３５Ａと図３５Ｂに示される。
【０２２５】
実施例１５：２，５４４のプローブパネルの生成
【０２２６】
２，５４４の非同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）を、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって、およびライブラリ３を生成するために実施例１１の一般的方法を使用して制御された化学量論によって、構造上で設計して合成した。正確な比率は図３６Ａに示され、およびカバー率は図３６Ｂに示される。ライブラリ３での標的濃縮は、コンパレータアレイベースのキット＃２よりも高い、正確な比率とカバー率の両方をもたらした。
【０２２７】
実施例１６：ポリヌクレオチド標的ライブラリを用いたサンプルの調製と濃縮
【０２２８】
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をサンプルから得て、切断緩衝液中で酵素によりフラグメント化し、末端修復し、そして３’アデニル化を行う。アダプターは、アダプター標識ｇＤＮＡ鎖のライブラリを生成するためにゲノムＤＮＡフラグメントの両端に連結され、およびアダプター標識ＤＮＡライブラリが高忠実度のポリメラーゼで増幅される。次にｇＤＮＡライブラリを、アダプター遮断薬の存在下において、９６℃で一本鎖に変性させる。ポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）を９６℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、ハイブリダイゼーション溶液中で７０℃で１６時間、変性した標識ｇＤＮＡライブラリと組み合わせる。次に、結合緩衝液をハイブリダイズされた標識ｇＤＮＡプローブに添加し、およびストレプトアビジンを含む磁気ビーズを使用してビオチン化プローブを捕捉する。磁石を使用してビーズを分離し、そしてビーズを緩衝液で３回洗浄して、溶出緩衝液を加える前に未結合のアダプター、ｇＤＮＡ、およびアダプター遮断薬を除去し、ビーズから濃縮された標識ｇＤＮＡフラグメントを放出する。クラスタ生成に十分な産出を得るために、標識ｇＤＮＡフラグメントの濃縮されたライブラリを高忠実度のポリメラーゼで増幅し、次にライブラリを、ＮＧＳ器具を使用して配列決定する。
【０２２９】
実施例１７：ポリヌクレオチド標的ライブラリを用いた一般的なサンプルの調製と濃縮
【０２３０】
複数のポリヌクレオチドをサンプルから得て、フラグメント化し、随意に末端修復し、アデニル化する。アダプターは、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成するために、ポリヌクレオチドフラグメントの両端に連結され、およびアダプター標識ポリヌクレオチドライブラリが増幅される。次に、アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリを、アダプター遮断薬の存在下において、高温、好ましくは９６℃で変性させる。ポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）を高温で、好ましくは約９０〜９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５〜８０℃で、約１０〜２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性した標識ポリヌクレオチドライブラリと結合させる。次に結合緩衝液をハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む個体担体を、ハイブリダイズされたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合するために使用する。個体担体を１回以上、好ましくは約２〜５回、緩衝液で洗浄して、溶出緩衝液を添加する前に未結合のポリヌクレオチドを除去し、個体担体から濃縮されたアダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントを放出する。アダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントの濃縮されたライブラリが増幅され、その後にライブラリが配列される。
【０２３１】
実施例１８：ポリヌクレオチド標的ライブラリを用いた、標識前の一般的な濃縮
【０２３２】
複数のポリヌクレオチドをサンプルから得て、フラグメント化し、随意に末端修復する。次に、フラグメント化ポリヌクレオチドサンプルを、高温、好ましくは９６℃で変性させる。ポリヌクレオチド標的ライブラリ（プローブライブラリ）を高温で、好ましくは約９０〜９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約１０〜２４時間、約４５〜８０℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性した標識ポリヌクレオチドライブラリと結合させる。次に結合緩衝液をハイブリダイズされたポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む個体担体を使用して、ハイブリダイズされたフラグメント化ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合する。個体担体を１回以上、好ましくは約２〜５回、緩衝液で洗浄して、溶出緩衝液を添加する前に未結合のポリヌクレオチドを除去し、個体担体から濃縮されたポリヌクレオチドフラグメントを放出する。濃縮されたポリヌクレオチドをアデニル化し、アダプター標識ポリヌクレオチド鎖の濃縮されたライブラリを生成するためにアダプターをポリヌクレオチドの両端に連結し、およびアダプター標識ポリヌクレオチドライブラリを増幅する。次に、アダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントの濃縮されたライブラリを配列決定する。
【０２３３】
実施例１９：ポリヌクレオチド標的ライブラリを用いた一般的なサンプル調製とフィルタリング
【０２３４】
複数のポリヌクレオチドをサンプルから得て、フラグメント化し、随意に末端修復し、アデニル化する。アダプター標識ポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成するために、アダプターをポリヌクレオチドフラグメントの両端に連結し、およびアダプター標識ポリヌクレオチドライブラリを増幅する。次に、アダプター標識ポリヌクレオチドライブラリを、アダプター遮断薬の存在下において、高温、好ましくは９６℃で変性させる。望ましくない非標的配列を除去するために設計されたポリヌクレオチドフィルタリングライブラリ（プローブライブラリ）を、高温で、好ましくは約９０〜９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約１０〜２４時間、約４５〜８０℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性した標識ポリヌクレオチドライブラリと結合させる。次に結合緩衝液をハイブリダイズさせたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む個体担体を、ハイブリダイズさせたアダプター標識ポリヌクレオチドプローブを選択的に結合するために使用する。個体担体は、標的アダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントを溶出するために、緩衝液で１回以上、好ましくは約１〜５回、洗浄される。標的アダプター標識ポリヌクレオチドフラグメントの濃縮されたライブラリを増幅し、その後にライブラリを配列決定する。
【０２３５】
実施例２０：１６０量体のプローブライブラリの調製
【０２３６】
少なくとも１０００のプローブを含むライブラリを構造上で合成し、および合成は、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって行なう。各プローブは二本鎖であり、プローブの各鎖は、標的に相補的な１２０ヌクレオチドの標的結合配列を含む。各プローブは、２０ヌクレオチドの順方向プライミング部位と、２０ヌクレオチドの逆方向プライミング部位を含む。プローブの各鎖は、２つのビオチン分子で５’位置に標識される。
【０２３７】
実施例２１：非標的結合配列を含む２１０量体のプローブライブラリの調製
【０２３８】
少なくとも１０００のプローブを含むライブラリを構造上で合成し、および合成は、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって行なう。各プローブは二本鎖であり、プローブの各鎖は、標的に相補的な１２０のヌクレオチド標的結合配列を含む。各プローブはさらに、２０ヌクレオチドの順方向プライマー結合部位、２０ヌクレオチドの逆方向プライマー結合部位、２５ヌクレオチドの５’非標的結合配列、およびポリアデニンを含む２５ヌクレオチドの３’非標的結合配列を含む。プローブの各鎖は、２つのビオチン分子で５’位置に標識される。
【０２３９】
実施例２２：ヒトＨＬＡのエクソン１を標的とする２１０量体のプローブ
【０２４０】
少なくとも１０００のプローブを含むライブラリを構造上で合成し、および合成は、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって行なう。各プローブは二本鎖であり、プローブの各鎖は、ヒトＨＬＡのエクソン１の領域に相補的な１２０ヌクレオチドの標的結合配列を含む。各プローブはさらに、２０ヌクレオチドの順方向プライマー結合部位、２０ヌクレオチドの逆方向プライマー結合部位、２５ヌクレオチドの５’非標的結合配列、およびポリアデニンを含む２５ヌクレオチドの３’非標的結合配列を含む。プローブの各鎖は、２つのビオチン分子で５’位置に標識される。
【０２４１】
実施例２２：オーバーラップしないプローブライブラリの設計方法
【０２４２】
少なくとも１００の標的配列が提供され、相補的なプローブ標的結合配列の所望の長さと比較し、長さに基づいて別個のカテゴリーに選別される。例えば、カテゴリーは、限定されないが、（ａ）挿入長さよりも短い標的、（ｂ）挿入長さ＋Ｘよりも短い、または同等の標的、および（ｃ）挿入長さ＋Ｘより長い標的を含み、ここでＸは、プローブによって標的とされない望ましい隙間の長さである。カテゴリー（ａ）の標的配列は、挿入もまた相補的になる非標的領域（反復、高／低ＧＣ、回文配列等）の複雑性に応じて、標的配列の左または右側に集中あるいは整列する標的結合配列で、標的とされる。カテゴリー（ｂ）の標的配列は、カテゴリー（ａ）と同じ様式で標的とされ、ここでＸは、標的結合配列が標的としない望ましい隙間の長さである。カテゴリー（ｃ）の標的に関しては、標的の全長は、標的結合配列の長さで割られ、および最も近い整数値に切り上げられ、標的配列のための挿入セットを生成するために標的配列のすべてを完全に標的とするのに必要とされる標的結合配列の数を表す。随意に、標的結合配列の数は、減数後に減らされてもよく、および標的結合配列間の隙間は望ましい隙間の長さＹ未満である。その後、この全過程を標的配列ごとに繰り返し、挿入ライブラリを形成する。次に、ライブラリ内の標的結合配列を、１つ以上のプライミング配列を含む１つ以上の非標的配列を加えることによって修飾し、ライブラリを構造上で合成し、合成は実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイト化学作用によって行なわれ、そしてプローブを分子タグで標識する。
【０２４３】
実施例２３：オーバーラップするプローブライブラリのための設計方法
【０２４４】
少なくとも１００の標的配列が提供され、相補的なプローブ標的結合配列の所望の長さと比較し、長さに基づいて別個のカテゴリーに選別される。例えば、カテゴリーは、限定されないが、（ａ）挿入長さよりも短い標的、（ｂ）挿入長さ＋Ｘよりも短い、または同等の標的、および（ｃ）挿入長さ＋Ｘより長い標的を含み、ここでＸは、プローブによって標的とされない望ましい隙間の長さである。カテゴリー（ａ）の標的配列は、挿入もまた相補的になる非標的領域（反復、高／低ＧＣ、回文配列等）の複雑性に応じて、標的配列の左または右側に集中あるいは整列する標的結合配列で、標的とされる。カテゴリー（ｂ）の標的配列は、カテゴリー（ａ）と同じ様式で標的とされ、ここでＸは、標的結合配列が標的としない望ましい隙間の長さである。カテゴリー（ｃ）の標的に関して、標的の全長は、標的結合配列の長さで割られ、および最も近い整数値に切り上げられ、標的配列のすべてを完全に標的とするのに必要とされる標的結合配列の数を表す。相補的な標的結合配列は、その後、標的配列にわたって（随意に均一に）一定間隔で配置され、標的配列のための挿入セットを生成するために、オーバーラップを可能にする。その後、この全過程を標的配列ごとに繰り返して、挿入ライブラリを形成する。次に、ライブラリ内の標的結合配列を、１つ以上のプライミング配列を含む１つ以上の非標的配列を加えることによって修飾し、ライブラリを構造上で合成し、合成は実施例３からの一般的方法を使用して、ホスホラミダイト化学作用によって行なわれ、そしてプローブを分子タグで標識する。
【０２４５】
実施例２４：混合されたプローブライブラリのための設計方法
【０２４６】
プローブライブラリは、修飾を伴う実施例２２と２３の一般的方法に従って合成される。オーバーラップしない挿入、オーバーラップする挿入、または混合された（オーバーラップし、かつオーバーラップしない）挿入を含むセットが、各標的配列のために生成される。
【０２４７】
実施例２５：エクソン標的のためのポリヌクレオチドプローブ
【０２４８】
ポリヌクレオチドプローブは、ゲノム内のエクソンを標的とする場合もあり、および遺伝子は複数のエクソンを含み得る。例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子は７つのエクソンを含み、それらの３つが表６に表記される。
【０２４９】
【表６】
2020504709.tif 000009
任意のエクソンに関して、標的結合配列と非標的結合配列の様々な組み合わせを、様々な構成と長さのプローブを設計するために使用してもよい。ＨＬＡエクソン１を標的とする非限定なプローブ設計は、表７に例として示され、および１本鎖のみのプローブの配列が示される。非標的結合配列と標的結合配列のサイズ、および全プローブ長さは、表８に表記される。
【０２５０】
【表７】
2020504709.tif 000010
【０２５１】
【表８】
2020504709.tif 000011
複数のプローブの様々な構成を、任意のエクソン、例えばヒトＨＬＡエクソン２をカバーするために使用してもよい。ＳＥＱ  ＩＤ：９または１０を含むプローブは、１つのセットと標的ヒトＨＬＡエクソン２を含むが、共に標的エクソンに隙間を残し、および重複配列を含まない（図４Ｆ参照）。ＳＥＱ  ＩＤ：１１を含むプローブはＨＬＡエクソン２を標的とし、およびＳＥＱ  ＩＤ：９および１０とオーバーラップする標的結合配列を含む（図４Ｇ参照）。各々がＳＥＱ  ＩＤ：１５または１６を含むプローブは、セット、標的ヒトＨＬＡエクソン５を含み、および標的または非標的領域の重複する領域を標的としない。ＳＥＱ  ＩＤ：８−１６に対応するプローブは構造上で合成され、および合成は、実施例３からの一般的方法を使用し、ホスホラミダイト化学作用によって行なわれ、ビオチン等の少なくとも１つの分子タグで随意に標識される。
【０２５２】
実施例２６：ポリヌクレオチドプローブライブラリを用いたゲノムＤＮＡ捕捉
【０２５３】
ヒトエクソームを標的とする少なくとも５００，０００の非同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド標的ライブラリは、実施例３からの一般的方法を使用してホスホラミダイト化学作用によって、およびライブラリ４を生成するために実施例１１の一般的方法を使用して制御された化学量論によって、構造上で設計され、合成された。次に、ポリヌクレオチドをビオチンで標識し、溶解して、エクソームプローブライブラリ溶液を作った。乾燥させたインデックス付けライブラリプールを、実施例１６の一般的方法を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルから得た。
【０２５４】
エクソームプローブライブラリ溶液、ハイブリダイゼーション溶液、遮断薬混合物Ａ、および遮断薬混合物Ｂを２秒間、パルス渦で混ぜた。ハイブリダイゼーション溶液を１０分間、またはすべての沈殿物が溶解するまで、６５°Ｃで加熱し、その後さらに５分間、ベンチトップ上で室温に戻した。２０μＬのハイブリダイゼーション溶液と４μＬのエクソームプローブライブラリ溶液を、薄壁のＰＣＲ  ０．２ｍＬストリップチューブに加え、ピペットで優しく混ぜ合わせた。混ぜ合わせたハイブリダイゼーション溶液／エクソームプローブ溶液を９５℃で２分間、１０５℃のふたの温度で、サーマルサイクラーにおいて加熱し、そして少なくとも１０分間、氷の上で素早く冷却した。溶液をその後５分間、ベンチトップ上で室温に冷ました。ハイブリダイゼーション溶液／エクソームプローブライブラリ溶液を冷却しながら、各ゲノムＤＮＡサンプルにつき９μｌに水を加え、および５μｌの遮断薬ミックスＡと２μＬの遮断薬ミックスＢを、薄壁のＰＣＲ  ０．２ｍＬのストリップチューブ内の乾燥させたインデックス付けライブラリプールに加えた。溶液をその後、ピペットで優しく混ぜ合わせた。プールしたライブラリ／遮断薬チューブを、１０５℃のふた温度でサーマルサイクラーにおいて９５℃で５分間、加熱し、その後、次の工程に進む前に５分間以下で、ベンチトップ上で室温に戻した。ハイブリダイゼーション混合物／プローブ溶液をピペットで混ぜ合わせ、全２４μＬのプールされたライブラリ／遮断薬チューブに添加した。全捕捉反応ウェルをピペットで優しく混ぜ合わせて、泡が立たないようにした。サンプルチューブが確実にしっかりと密封されるように、チューブをパルススピンした。捕捉／ハイブリダイゼーション反応物を７０℃で１６時間、ＰＣＲサーモサイクラーで加熱し、ふたの温度は８５℃にした。
【０２５５】
結合緩衝液、洗浄緩衝液１、および洗浄緩衝液２を、すべての沈殿物が溶液に溶解するまで４８℃で加熱した。７００μＬの洗浄緩衝液２を、捕捉ごとに等分して、４８°Ｃにあらかじめ加熱した。ストレプトアビジン結合ビーズとＤＮＡ精製ビーズを、少なくとも３０分間、室温で平衡に保った。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ等のポリメラーゼと増幅プライマーを氷の上で解凍した。一旦、試薬を解凍し、パルス渦で２秒間、攪拌した。捕捉反応につき５００μＬの８０パーセントのエタノールを調製した。ストレプトアビジン結合ビーズをあらかじめ室温と等しくし、均質化されるまで攪拌した。１００μＬのストレプトアビジン結合ビーズを加えて、捕捉反応ごとに１．５ｍＬの微量遠心機チューブを浄化した。各チューブに２００μＬの結合緩衝液を加えて、均質化されるまで各チューブをピペットで混ぜ合わせた。チューブを磁気スタンドに置いた。ストレプトアビジン結合ビーズを１分以内にペレットにした。チューブを取り除き、そして透明な上清を捨て、確実にビーズペレットを妨害しないようにした。チューブを磁気スタンドから取り出して、追加で２回の洗浄を繰り返した。第３の洗浄後、チューブを取り除き、そして透明な上清を捨てた。最終２００μＬの結合緩衝液を添加し、およびビーズを均質になるまで攪拌して再懸濁した。
【０２５６】
ハイブリダイゼーション反応を完了した後に、サーマルサイクラーのふたを開き、および捕捉反応の全量を洗浄したストレプトアビジン洗浄ビーズへと素早く移した（３６−４０μＬ）。混合物を室温で３０分間、振とう機、ロッカー、または回転器上で、捕捉反応／ストレプトアビジン結合ビーズ溶液を均質に保つのに十分な速度で混ぜた。捕捉反応／ストレプトアビジン結合ビーズ溶液を混合器から取り出し、パルススピンによって確実にすべての溶液がチューブの底にあるようにした。サンプルを磁気スタンドに置き、ストレプトアビジン結合ビーズをペレット化し、１分以内に透明な上清を残した。透明な上清を除去して捨てた。チューブを磁気スタンドから取り出し、２００μＬの洗浄緩衝液を室温で加え、その後、均質化されるまでピペットで混ぜた。すべての溶液が確実にチューブの底にあるように、チューブをパルススピンした。サーマルサイクラーは以下の疾病でプログラムされた（表９）。
【０２５７】
加熱されたふたの温度は１０５℃に設定された。
【０２５８】
【表９】
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【０２５９】
増幅プライマー（２．５μＬ）と、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２５μＬ）等のポリメラーゼを、水／ストレプトアビジン結合ビーズスラリーを含むチューブに加えて、ピペットでチューブを混ぜた。次にチューブを２つの反応に分けた。チューブをパルススピンしてサーマルサイクラーに移し、そして表９のサイクリングプログラムを開始した。サーマルサイクラープログラムが完了すると、サンプルをブロックから取り出し、直ちに精製にかけた。あらかじめ室温と等しくしたＤＮＡ精製ビーズを、均質化されるまで攪拌した。９０μＬ（１．８ｘ）の均質化したＤＮＡ精製ビーズをチューブに加えて、攪拌してよく混ぜた。チューブを室温で５分間インキュベートし、そして磁気スタンドに置いた。ＤＮＡ精製ビーズをペレット化し、１分内に透明な上清を残した。透明な上清を捨て、およびチューブを磁気スタンド上に残した。ＤＮＡ精製ビーズペレットを２００μＬの新たに準備した８０パーセントのエタノールで洗浄し、１分間インキュベートし、その度に取り除いてエタノールを捨てた。磁気スタンドにチューブを保持しながら、洗浄を１回繰り返し、つまり合計２回の洗浄を行った。残ったすべてのエタノールを１０μＬのピペットで取り除いて捨て、ＤＮＡ精製ビーズペレットを確実に妨害しないようにした。ＤＮＡ精製ビーズペレットを５〜１０分間、またはペレットが乾燥するまで、磁気スタンドで風乾した。チューブを磁気スタンドから取り出し、３２μＬの水を加え、均質化するまでピペットで移し、そして室温で２分間、インキュベートした。チューブを３分間、またはビーズが完全にペレット化するまで、磁気スタンドに置いた。３０μＬの透明な上清を回収して、清潔な薄壁のＰＣＲ  ０．２ｍＬのストリップチューブに移し、ＤＮＡ精製ビーズペレットを確実に妨害しないようにした。平均のフラグメント長さは、分析器具において１５０ｂｐ〜１０００ｂｐに設定した範囲を使用して、約３７５ｂｐ〜約４２５ｂｐであった。理想的には、最終濃度値は少なくとも約１５ｎｇ／μＬである。各捕捉を定量化し、次世代（ＮＧＳ）を使用して検証した。
【０２６０】
コンパレータエクソーム捕捉キット（コンパレータキットＤ）と比較した、ＮＧＳメトリックの概要は表１０、表１１、および図３７に示される。ライブラリ４は、コンパレータキットＤよりも高いエクソン標的率に対応するプローブ（ベイト）を有する。これは、ライブラリ４を使用した標的配列の同等の質とカバー率を得るためのより少ないシーケンシングをもたらす。
【０２６１】
【表１０】
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【０２６２】
【表１１】
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【０２６３】
キットＤとライブラリ４の両方に関する、オーバーラップする標的部位の比較（全読み取りは９６Ｘのカバー率に標準化）は、表１２と図３７に示される。ライブラリ４は、ハイブリダイゼーションにつき８つのサンプルとして処理され、およびキットＤは、ハイブリダイゼーションにつき２つのサンプルで処理された。付加的に、両方のライブラリに関して、オーバーラップ領域からの一塩基多型とインフレーム欠失呼出しが、“Ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ａ  Ｂｏｔｔｌｅ”ＮＡ１２８７８参照データから特定された高信頼度の領域に対して比較された（表１３）。ライブラリ４は、ＳＮＰとインデルを特定する際に、キットＤと同様に、またはより良好に（より高いインデル精度）機能した。
【０２６４】
【表１２】
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【０２６５】
【表１３】
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【０２６６】
精度は、真の呼出し 対 合計の（真または偽の）陽性の呼出しの比率を表す。感度は、真の陽性の呼出 対 合計の真値（真の陽性と偽の陰性）の比率を表す。
【０２６７】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されたが、そのような実施形態が単なる例として提供されていることは、当業者にとって明白だろう。多数の変形、変更、および置き換えが、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到されるだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲内の方法と構造、およびそれらの同等物を包含するように意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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