(57)【要約】  本発明は、動物への第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用される、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエの非複製性免疫原を含む第１ワクチンと、生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含む第２ワクチンとの組合せに関する。本発明はまた、第１ワクチンと第２ワクチンとを含むパーツキット、およびこれらのワクチンを使用してそのような感染に対して動物を防御する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物への第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用される、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエの非複製性免疫原を含む第１ワクチンと、生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含む第２ワクチンとの組合せ。
【請求項２】
組合せ非混合投与を同時に行う、請求項１記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項３】
第２ワクチンを動物の真皮内に投与する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項４】
第１ワクチンがローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の非複製性免疫原を含む、前記請求項のいずれか１項記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項５】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の免疫原をワクチン投与の２４時間前以内に第１ワクチンに添加する、請求項４記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項６】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の免疫原がローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の凍結乾燥死滅全細胞を含む、請求項５記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項７】
第１ワクチンおよび第２ワクチンを単回投与により投与する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項８】
ＰＣＶ２の非複製性免疫原が、ＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子によりコードされる組換え発現タンパク質である、前記請求項のいずれか１項記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項９】
ＰＣＶ２の非複製性免疫原がＰＣＶ２のバキュロウイルス発現タンパク質である、請求項８記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項１０】
マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原が死滅全マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む、前記請求項のいずれか１項記載の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ。
【請求項１１】
動物への第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用される、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含む第１ワクチンと、それとは独立して、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第２ワクチンとを含むキットオブパーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項１２】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含む第１ワクチンと、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第２ワクチンとの動物への組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療する方法。
【請求項１３】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含むワクチンであって、生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含む別のワクチンと該ワクチンとの動物への組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用されるワクチン。
【請求項１４】
生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含むワクチンであって、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含む別のワクチンと該ワクチンとの動物への組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用されるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、ブタの健康の分野に関する。ブタは多数の病原性微生物に感染しやすい。感染の防除は、一般に、養豚場および飼料の管理、抗ウイルス薬および抗生物質のような薬剤での治療、またはワクチンを使用する予防的治療により行われる。特に、本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２またはＰＣＶ−２）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、および所望によりローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対するワクチン、ならびにそのようなワクチンを使用してそのような感染に対して動物を防御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＶ−２は、若いブタで見られる離乳後多重全身性消耗症候群（ｐｏｓｔ−ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＭＷＳ）に関連している。この疾患は１９９１年にカナダで初めて見出された。その臨床徴候および病理は１９９６年に初めて公開され、進行性消耗、呼吸困難、頻呼吸および時には黄疸を含む。Ｎａｙａｒら（Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７）は、ＰＭＷＳの臨床症状を有するブタにおいてブタサーコウイルスを検出し、ＰＫ−１５細胞の天然生息ウイルスとして認識されている公知ＰＣＶ以外のＰＣＶがＰＭＷＳに関連している可能性があると結論づけた。その後の刊行物（Ｈａｍｅｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８；Ｍｅｅｈａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８）はこれらの知見を証明しており、新規病原性ＰＣＶをＰＣＶ−２と命名し、一方、元のＰＫ−１５細胞培養分離体（Ｔｉｓｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２）をＰＣＶ−１と呼ぶべきだと提示された（Ｍｅｅｈａｎら，前掲）。ＰＣＶ−２は、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する小さな（１７ｎｍ〜２２ｎｍ）二十面体非エンベロープウイルスである。ＰＣＶ−２ゲノムの長さは約１７６８ｂｐである。世界の種々の地域に由来するＰＣＶ−２分離体は互いに密接に関連しているらしく、９５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を示す（Ｆｅｎａｕｘら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００）。ＰＣＶのＯＲＦ２は該ウイルスのカプシドタンパク質をコードしている。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は約２３３アミノ酸のタンパク質をコードしている。全てのＰＣＶ−２分離体のＯＲＦ２遺伝子は９１〜１００％のヌクレオチド配列同一性および９０〜１００％の推定アミノ酸配列同一性を共有している。
【０００３】
マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｈｙｏ）は、ブタを冒す高伝染性慢性疾患であるブタ流行性肺炎を引き起こすことが公知の細菌種である。Ｍｈｙｏは小さいサイズ（４００〜１２００ｎｍ）を有し、小さなゲノム（８９３〜９２０キロベースペア（ｋｂ））を有し、細胞壁を欠いている。Ｍｈｙｏはブタの肺における上皮細胞の繊毛に付着する。それらは繊毛の拍動、凝集および繊毛の喪失を引き起こし、最終的に上皮細胞死を招く。これは、ブタ流行性肺炎を有するブタの肺において見出される病変の原因である。この損傷は正常な繊毛クリアランスを妨げ、しばしば、二次感染が生じる。これは動物の体重の増大の有意な低減をもたらす。米国における損害は年間最大１０億ドルであるとこれまでに推定されている。ブタ流行性肺炎は世界中で流行しており、Ｍｈｙｏはほとんど全てのブタ集団において見られる。ブタにおけるＭｈｙｏの存在により誘導される免疫応答は遅く、有効でない。したがって、この疾患の治療が最も重要であるが、抗生物質に限定されている。抗生物質は感染を完全には除去しないため、抗生物質は現在のところ部分的に有効であるに過ぎない。ワクチンは該疾患の重症度を低減することが判明しているが、感染したブタにおける疾患の発生を完全には予防しない。
【０００４】
ＰＲＲＳウイルスは１９８７年に北米および中欧で初めて報告された。ＰＲＲＳウイルスは小さなエンベロープＲＮＡウイルスである。それは、約１５キロベースのサイズを有する一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを含有する。該ゲノムは９個のオープンリーディングフレームを含有する。該ウイルスはニドウイルス目アルテリウイルス科アルテリウイルス属のメンバーである。ＰＲＲＳＶの２つの原型株は北米株ＶＲ−２３３２および欧州株レリスタッドウイルス（ＬＶ）である。該欧州および北米ＰＲＲＳＶ株は類似した臨床症状を引き起こす。最近、北米遺伝子型の高病原性株が中国で出現した。この株ＨＰ−ＰＲＲＳＶは他の全ての株より強毒性であり、アジア諸国で大きな損害を引き起こしている。臨床徴候には、雌ブタにおける生殖障害、例えば流産および死産またはミイラ変性胎児の出産、ならびに耳および外陰部のチアノーゼが含まれる。新生ブタにおいては、該疾患は呼吸困難を引き起こし、グレッセー病のような呼吸器感染症に対する感受性を高める。
【０００５】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）は、回腸炎としても公知の増殖性腸疾患を引き起こし、これは世界中の離乳後のブタの一般的な腸疾患である。特徴的な病変は回腸陰窩における未熟腸細胞の増殖であり、これらの細胞は、通常、それらの頂端細胞質内に原因細菌を含有する。剖検時に、組織学的病変は、特に腸細胞において、１．５〜２．５μｍの長さのビブリオ様形状細菌の可視化により、ローソニア陽性として確認されうるが、腸間膜リンパ節において、および陰窩間の粘膜固有層において位置するマクロファージ内でもしばしば確認されうる。腸細胞からの該細菌の排除は関連増殖性病変の消散をもたらし、このことは陰窩に対する該細菌の直接的な局所効果を示している。これらの病変におけるローソニア・イントラセルラリスの存在は、疾患を発症している動物および無症状感染のみを示している動物の両方において、ＰＣＲを用いて実証されている。臨床症例は通常、成長（ｇｒｏｗｅｒ）−仕上げ（ｆｉｎｉｓｈｅｒ）期間において見られ、幾つかのより高齢の仕上げブタにおいては、急性出血性形態が記録されている。
【０００６】
前記で特定されている病原体に対するワクチンは一般に公知である。ＰＣＶ２による感染に対して動物、特にブタを予防的に治療するための通常のワクチンは（非複製性）免疫原としての全不活化ＰＣＶ−２ウイルスに基づくものでありうる。また、当技術分野においては、ＯＲＦ２にコードされるカプシドタンパク質（例えば、組換え発現された場合）は、適切なワクチンに使用されるブタサーコウイルス２型のサブユニット免疫原として適していることが示されている。このように理解されうるのは、このサブユニットが循環系においてウイルス自体と同じ様態を示し（それはウイルス様粒子を形成する）、ＤＮＡおよび非構造タンパク質がカプシドの内部に存在しないという点でのみ本質的に異なるに過ぎないからである。当技術分野においてはＰＣＶ２に対する幾つかのワクチンが商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）は、３週齢以上のブタにおいて使用される、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。２回投与（２用量）ワクチンとして投与された場合、免疫持続時間（ＤＯＩ）は２２週間であり、ブタの肥育期間をほぼ完全にカバーする。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＣｉｃｒｏＦｌｅｘ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、２週齢以上のブタにおいて使用される、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。それは１回投与（１用量）ワクチンとしてのみ登録されている。Ｃｉｒｃｏｖａｃ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能）は、３週齢以上のブタにおいて使用される、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ（Ｚｏｅｉｔｉｓ，Ｃａｐｅｌｌｅ  ａ／ｄ  ＩＪｓｓｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）は、３週齢以上のブタにおいて使用される、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。他のＰＣＶ２ワクチンは、例えば、ＷＯ２００７／０２８８２３、ＷＯ２００７／０９４８９３およびＷＯ２００８／０７６９１５に記載されている。
【０００７】
マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関しては、多数の市販ワクチンが存在し、これらは商業的養豚業の大部分において日常的に使用されている。一般に、これらのワクチンは、例えば、典型的には非経口注射されるサブユニットタンパク質および／またはバクテリン［すなわち、全細胞、（部分）溶菌体、ホモジネート化体、フレンチプレス化体またはこの組合せとしての死滅細菌を含む組成物、あるいは別の形態の死滅細菌を含む組成物であって、該組成物が死滅細菌培養に由来するもの］のような非複製性免疫原を含む。幾つかの例としては、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（登録商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）Ｍ．ｈｙｏ、およびＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｈｙｏｒｅｓｐ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）、Ｓｔｅｌｌａｍｕｎｅ（登録商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｅｌａｎｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＣＶ  ＭＨ（Ｚｏｅｔｉｓ）ならびにＭ＋Ｐａｃ（登録商標）およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ（共にＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）が挙げられる。
【０００８】
ＰＲＲＳウイルスに関しては、不活化ウイルスワクチンが記載されており、商業的に入手可能であるが、生弱毒化形態の欧州型（Ｉ型）または北米型（ＩＩ型）のいずれかを含む修飾生ワクチン（ＭＬＶ）がその防除のための主要な免疫学的手段である。幾つかのワクチンが当技術分野で商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）は、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスＩ型を含むワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる感染症（ウイルス血症）を軽減するために登録されている。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ（登録商標）ＭＬＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、ＰＲＲＳウイルスにより引き起こされる疾患の軽減を助けるワクチンであり、該ワクチンは種々のタイプの株に対する交差防御をもたらす。Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＲＲＳ（Ｚｏｅｉｔｉｓ，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡから入手可能）もＭＬＶワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスにより引き起こされる呼吸器および生殖器の両方の形態の疾患に対する防御のために登録されている。更にもう１つのＰＲＲＳ  ＭＬＶワクチンは、Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能なＰｒｉｍｅＰａｃ  ＰＲＲＳ（ＩＩ型）である。他のＰＲＲＳワクチンは、例えば、ＷＯ２００６／０７４９８６、ＵＳ  ８７２８４８７およびＷＯ２０１４／０４８９５５に記載されている。
【０００９】
能動的防御を誘導することによりローソニア・イントラセルラリスと闘うためのワクチンは商業的に入手可能であり、当技術分野において記載されている。これらのワクチンは商品名Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ，ＵＳＡ）（これは生弱毒化ワクチンである）およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）（これは、バクテリンの形態のローソニア・イントラセルラリスの非複製性免疫原を含むワクチンである）で入手可能である。
【発明の概要】
【００１０】
発明の目的
ブタの健康管理のための簡便で安全で効果的な手段が絶えず必要とされている。特に、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療に使用されうる簡便で安全で効果的なワクチンが必要とされている。
【００１１】
発明の概括
本発明の目的を達成するために、第１ワクチンがブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含み、第２ワクチンが生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含む、第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せを本発明において案出した。この場合、該組合せは、動物への第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するために使用される。
【００１２】
前記の各病原体に関しては、ワクチンは公知であり、商業的に入手可能である。しかし、要求される有効性をもたらすと同時に動物（特に若い動物）における使用に関して安全である、組合せ非混合投与のために利用可能なワクチンの組合せは存在しない。一般に公知のとおり、想定または示唆される抗原の組合せの全てが、安全かつ有効な組合せワクチンにつながるとは限らない可能性がある。同様に、併用投与とも称されるワクチンの組合せ非混合使用は、安全性の問題またはワクチン中に存在する個々の免疫原に対する応答の低下を招く相互作用を引き起こしうる。生ワクチンの場合、ワクチン株の複製の低減が生じうる。抗原競合のような種々の免疫学的事象から、異なる免疫原間の干渉が生じうる。抗原競合は、特定の免疫原（抗原とも称される）に対する免疫応答が、同じ免疫原が単独で与えられた場合と比較して、他の免疫原の存在下で低減しうる現象を示す。
【００１３】
混合されずに投与された場合でもワクチンの干渉という一般に公知の問題が生じる証拠として、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＭＡ）の獣医用医薬品委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｕｓｅ）（ＣＶＭＰ）により２０１３年７月１８日付けで公開された「混合ワクチンおよび免疫獣医用医薬品（ＩＶＭＰ）の組合せの要件に関するガイドライン」なる題名のガイドライン（ＥＭＡ／ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５９４６１８／２０１０）が挙げられる。第５．１節に以下のとおりに記載されている：「ＩＶＭＰの組合せの基礎は、許容される安全性と、関与するＩＶＭＰ間の重大な干渉が存在しないこととの実証であるべきである。該組合せに関する安全性プロファイルが、個別の製品に関して確立されたものほどは好ましくない場合、該組合せは適切な利益リスク分析により正当化されるべきであり、この場合、該組合せの利益は安全性の低下のリスクを明らかに上回るべきである。そのような状況においては、ＩＶＭＰの組合せ使用による安全性プロファイルが反映されるように、個別の製品のＳＰＣを修正する必要がある。組合された製品の間の何らかのレベルの干渉が有効性の低下につながる場合、ＩＶＭＰの組合せは、場合に応じて、更に正当化される必要がある。また、関連するＩＶＭＰのいずれかの製造または組成に影響を及ぼす変化も組合せの適合性の再評価を要することに留意すべきである」。
【００１４】
更に、特に生ＰＲＲＳウイルスとのいずれかの組合せ投与の場合、むしろ、その他の免疫原に対する有効性への悪影響があると予想される。なぜなら、ＰＲＲＳウイルスは免疫抑制性であることが一般に公知だからである。例えば、Ｃａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｏｃｔ；７６（４）：２５５−６０：Ｚｈｏｕ  Ｙ１，Ｂａｉ  Ｊ，Ｌｉ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｊｉａｎｇ  Ｐによる“Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．”を参照されたい。
【００１５】
全体として、複数の病原体に対する組合せワクチン接種は簡単ではなく、特に組合せワクチン接種が生ＰＲＲＳウイルスを含む場合には、安全性および有効性を決定するための実験を要することが一般に公知である。
【００１６】
本発明はまた、動物への第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用される、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエの非複製性免疫原を含む第１ワクチンと、それとは別の、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第２ワクチンとを含むパーツキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）に関するものであることが注目される。
【００１７】
本発明はまた、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含む第１ワクチンと、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第２ワクチンとの動物への組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療する方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含むワクチンであって、生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含む別のワクチンと該ワクチンとの動物への組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用されるワクチンに関する。同様に、本発明は、生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを含むワクチンであって、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製性免疫原およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原を含む別のワクチンと該ワクチンとの動物への組合せ非混合投与により、ブタサーコウイルス２型による感染、マイコプラズマ・ヒオニューモニエによる感染およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対して動物を予防的に治療するのに使用されるワクチンに関する。「発明の実施形態」の節において後記に記載されている個々の実施形態のそれぞれは、本発明に従う使用のために、これらの２つのワクチンと組合されうる。
【００１９】
ワクチンにおいては、免疫原（抗原とも称される）は、典型的には、医薬上許容される担体と組合されることが注目される。該担体は、生体適合性媒体、すなわち、対象動物において有意な有害反応を投与後に誘発しない媒体であって、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に免疫原を提示しうるもの、例えば、水および／または任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体、あるいは固体担体、例えば、（糖および／またはタンパク質に基づく）凍結乾燥ワクチンを得るために一般に使用される固体担体であり、所望により、動物への投与に際して、野生型微生物による感染に対して動物を治療する（すなわち、そのような感染またはそれから生じる障害を予防、改善または治癒するのを助ける）ために免疫応答を誘導する免疫刺激性物質（アジュバント）を含みうる。所望により、ワクチンの意図される用途または要求される特性に応じて、他の物質、例えば安定剤、粘度調整剤または他の成分が添加される。
【００２０】
定義
ワクチンは、対象動物において病原性微生物に対する防御免疫を誘導しうる、すなわち、後記のとおりの予防的治療を成功裏にもたらしうる、対象動物に安全に投与される医薬組成物である。
【００２１】
病原体の非複製性免疫原は、対応病原体に対して免疫応答を惹起する、（弱毒化形態の野生型における）全体としての生複製性病原体以外の病原体に対応する任意の物質または化合物であり、この場合、この免疫応答の結果として、対応毒性病原体またはその毒性因子の１以上が宿主免疫系により認識され、最終的に少なくとも部分的に中和される。非複製性免疫原の典型例は、死滅全病原体（この語は細胞溶解形態のこれらの病原体を含む）、ならびにこれらの病原体のサブユニット、例えばカプシドタンパク質、表面発現タンパク質（例えば、組換え発現タンパク質またはリポ多糖）および排出分子、例えば毒素である。
【００２２】
生弱毒化病原体は、低減した毒性を有する、病原体の生存可能で複製可能な形態である。弱毒化の方法は、感染性病原体を採取し、典型的には細胞系による病原体の多重継代または病原体の遺伝的修飾により、それが無害または弱毒性になるようにそれを改変するものである。
【００２３】
病原体による感染に対する予防的治療は、その病原体による感染またはその感染から生じる障害（病原性病原体での治療後チャレンジから生じるもの）の予防、改善または治癒を助けること、特に、そのようなチャレンジの後の宿主におけるその負荷を減少させること、そして所望により、病原体による治療後感染から生じる１以上の臨床症状の予防または改善を助けることである。
【００２４】
ワクチンの組合せ非混合投与は併用投与とも称され、これらのワクチンを、免疫学的干渉が生じうる時間枠内、典型的には２４時間以内に、投与前に混合せずに別々に標的動物に投与することである。組合せ非混合使用の例としては、標的動物における別々の適用部位における同時投与、および同じ又は別々の適用部位における、異なる時点での、典型的には１〜６時間間隔の投与が挙げられる。
【００２５】
ワクチンの同時投与は、厳密に同時に、または少なくとも１時間の時間枠内で、好ましくは５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分以内に、もしくは更には１分の時間枠内で投与することを意味する。
【００２６】
予防的治療に使用されるワクチンの単回（単一用量）投与は、防御免疫を得るためには、ワクチン接種が、ワクチンの第２投与で増強される必要がないことを意味する。２回投与レジメンにおいては、初回（プライム）ワクチン接種は、典型的には、初回投与から６週間以内、一般には、初回投与から３週間以内または更には２週間以内に増強（ブースト）され、第２（ブースト）投与の後で初めて、防御免疫、すなわち、前記の成功した予防的治療が達成されうる。
【００２７】
発明の実施形態
本発明の使用のための第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せの実施形態の１つにおいては、組合せ非混合投与を同時に行う。この実施形態は、両方のワクチンを適用するために動物をただ１回だけ取り扱えば済むという利点を有する。
【００２８】
ワクチンのこの組合せのもう１つの実施形態においては、第２ワクチンを動物の真皮内に投与する。少なくともＰＲＲＳワクチンのそのような投与は安全かつ有効であると同時に、筋肉内投与と比較して動物にとって低ストレス性であることが示されている。真皮内投与（皮内投与とも称される）に関しては、そのような投与は、しばしば、無針ワクチン接種装置、例えばＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種器（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）を使用して行われるが、「皮内」投与自体は「無針」投与と同等ではないはずである。世界保健機関は、その２００９年８月２７日付けの論文（題名“Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ；Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｌｏｗ−  ａｎｄ  ｍｉｄｄｌｅ−ｉｎｃｏｍｅ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ”）において、「無針」ワクチン接種は「皮内」ワクチン接種を必ずしも意味しないことを実際に明らかに示している（該総説の第３頁表１を参照されたい）。無針装置が「皮内ワクチン接種のために構成されている」場合にのみ、ワクチンは実際に（少なくとも部分的に）皮内に運搬される。そうでなければ、ワクチンはその全体が皮下または筋肉内に運搬されうる。
【００２９】
第１ワクチンと第２ワクチンとの組合せの更にもう１つの実施形態においては、第１ワクチンはローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の非複製性免疫原を含む。この実施形態においては、ワクチンの該新規組合せは、ただ１つのワクチン接種プロトコルを用いることにより、４つの主要ブタ病原体に対する防御をもたらしうる。１つの実施形態においては、ローソニア・イントラセルラリスの免疫原を、投与の２４時間前以内に、好ましくは、投与の６時間前以内に、ＰＣＶ２およびマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と一緒にする（組合せる）。投与直前にそれらの抗原を一緒にすることは、賦形剤の選択の、より大きな自由度をもたらす。なぜなら、多数の医薬組成物に関して、そして、自体公知であるＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原を含む組合せワクチン（例えば、ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能なＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ）に関してでさえも公知のことであるが、長期安定性の達成は尚も、少なくともありとあらゆる医薬上許容される担体組成物に関して、容易でない可能性があるからである。もう１つの実施形態においては、ローソニア・イントラセルラリスの免疫原を、ローソニア・イントラセルラリスの凍結乾燥死滅全細胞を含む組成物の形態でワクチンに添加する。
【００３０】
第１ワクチンと第２ワクチンとの該新規組合せの更にもう１つの実施形態においては、第１ワクチンおよび第２ワクチンを単回投与により投与する。単回投与（単一用量投与）は全ての病原体に対して有効なワクチン接種をもたらすことが判明した。これは、これらの病原体に対して動物を防御するための非常に簡便かつ経済的な方法をもたらす。
【００３１】
もう１つの実施形態においては、該非複製性免疫原は、ＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子によりコードされる組換え発現タンパク質であり、例えば、当技術分野で公知のとおり、バキュロウイルスにより発現されたものである。この組換えタンパク質は本発明における適用に適していることが判明している。特に、該ＯＲＦ２タンパク質は、例えばＷＯ２００７／０２８８２３、ＷＯ２００７／０９４８９３またはＷＯ２００８／０７６９１５に記載されているようなバキュロウイルス発現系において発現されうる。
【００３２】
更にもう１つの実施形態においては、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非複製性免疫原は死滅全マイコプラズマ・ヒオニューモニエを含む。そのようなＭｈｙｏ抗原は製造が比較的容易であり、日常的な養豚業の実施において、良好な有効性実績を有する。
【００３３】
次に以下の実施例を用いて、本発明を更に詳細に説明することとする。
【００３４】
実施例
研究１：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  ＭＨｙｏと、それにおいて再構成されたローソニア免疫原およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳとの組合せ非混合使用による、ＰＲＲＳｖチャレンジに対する安全性および防御
この研究は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏにおいて再構成（還元）されたローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の凍結乾燥死滅全細胞（「ローソニア凍結乾燥物」とも称される）との組合せ非混合使用におけるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳの安全性および有効性を評価するために行った。この研究は、各群１２頭の子ブタの５つの群に均等に分配された６０頭のＰＲＲＳＶ抗体陰性子ブタを使用して行った。４つの群に３週齢で２ｍＬのＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳを筋肉内に（ＩＭ；群１および３）または０．２ｍＬのＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳを皮内に（ＩＤ；群２および４）ワクチン接種した。群１および２の子ブタは、ＰＲＲＳワクチンの投与後数分以内に、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ（２ｍＬ；ＩＭ）で再構成されたローソニア凍結乾燥物でワクチン接種した。群５の子ブタ（同様に１２頭の子ブタ）はワクチン接種を受けず、非ワクチン接種チャレンジ対照として使用した。ワクチン接種の４週間後、異種病毒性ＰＲＲＳＶ  １型株（分離物２）を使用して、全ての子ブタを鼻腔内（ＩＮ）経路でチャレンジした。
【００３５】
チャレンジ感染後、以下のパラメーターを測定した：臨床徴候、直腸温ならびにＰＲＲＳＶウイルス血症および血清学。ＰＲＲＳＶチャレンジに関連した臨床徴候はそれらの群のいずれにおいても全く観察されなかった。チャレンジの１日前からチャレンジ後の第１０日まで１２日間、直腸温度を測定した。いずれのワクチン接種群間においても有意差は観察されなかった。全てのＰＲＲＳワクチン接種群の直腸温度は、チャレンジ後の幾つかの時点において、対照群と比較して低かった。ＩＭまたはＩＤワクチン接種群間においても、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳのみで治療された又はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏにおいて再構成されたローソニア凍結乾燥物と組合されたＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳで治療された群の間においても、統計的有意差は認められなかった。
【００３６】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳを子ブタにワクチン接種した場合、およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏにおいて再構成されたローソニア凍結乾燥物のワクチン接種と組合せてＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳを子ブタにワクチン接種した場合、非ワクチン接種対照と比較して、ＰＲＲＳＶウイルス血症の有意な低減が示された（図１）。ＩＭまたはＩＤ経路により投与されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳの単独使用と非混合組合せ使用との間に有意差は見出されなかった。
【００３７】
全てのワクチン接種群は、ワクチン接種の４週間後、チャレンジ日に抗ＰＲＲＳＶ抗体価を示したが、対照群はそれを示さなかった。チャレンジの４週間後、全ての群は抗ＰＲＲＳＶ抗体価を示し、ワクチン接種群における抗体価はチャレンジ当日より高い。ＩＭまたはＩＤ経路で投与されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳの単独使用と非混合組合せ使用との間に統計的有意差は見出されなかった。
【００３８】
結論としては、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏにおいて再構成されたローソニア凍結乾燥物の併用投与は、ＩＭまたはＩＤ経路のいずれにおいても、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳワクチン接種に悪影響を及ぼさなかった。ローソニア−ＰＣＶ−Ｍｈｙｏの三成分ワクチンの組合せ使用がＰＲＲＳワクチンの有効性に悪影響を全く及ぼさないことは予想外であった（研究５を参照されたい）。
【００３９】
研究２：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  ＭＨｙｏと、それにおいて再構成されたローソニア免疫原およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳとの組合せ非混合使用のＰＣＶ２有効性研究
低度ないし中等度の母体由来ＰＣＶ２抗体価（＜５．５  ｌｏｇ２）を有し、ＰＣＶ２ウイルス負荷を有さず、ＰＲＲＳＶ抗体価を有さない合計４５頭の子ブタを各群１５頭の子ブタの３つの治療群に割り当てた。それらの子ブタに３週齢で１回ワクチン接種した。群１および２の子ブタに、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ中に溶解されたローソニアＦＤを共に単一用量（筋肉内経路；ＩＭ）としてワクチン接種し、群１の子ブタには、ほぼ同時に、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳもワクチン接種した（筋肉内および皮内の両方の経路で；ＩＭおよびＩＤ）。群３の動物はワクチン未接種のままにした（対照）。
【００４０】
５週齢（ワクチン接種の２週間後）で、鼻腔内適用野生型ＰＣＶ２チャレンジウイルスを使用して、各動物にチャレンジ感染を行った。チャレンジの２１日後、全ての動物の剖検を行い、ＰＣＶ２の検出のために鼡径リンパ節、扁桃および肺からサンプルを採取した。
【００４１】
ワクチン接種時、チャレンジの１日前、チャレンジ後の第２週および第３週に、血清サンプルを採取した。ＰＣＶ２抗体およびウイルス核酸に関してサンプルを検査した。チャレンジの１日前、チャレンジの２週間後および３週間後に採取した糞便および鼻腔スワブをウイルス核酸に関して検査した。
【００４２】
両方のワクチン接種群はチャレンジ時に同等レベル（６  ｌｏｇ２）の抗ＰＣＶ２抗体を生成したが、対照群における抗体は有意に減少していたことを、血清学的検査は示した。チャレンジ後、ワクチン接種群における抗体はチャレンジの３週間後の測定で約１３  ｌｏｇ２に上昇した。対照群においては、その時点でのレベルは５  ｌｏｇ２であった。チャレンジ後、対照動物において、血清、鼻腔および糞便スワブにおいてウイルス核酸を検出することが可能であった。そのレベルは、ワクチン接種動物においては、実質的に、より低かった。糞便サンプルにおいては、両方のワクチンで同時にワクチン接種された動物は検出可能なレベルのウイルス核酸を示さなかった。このことは、この群がＰＣＶ２チャレンジに対して最も良好に防御されたことを示唆している。防御の改善の可能性に関するこの驚くべき知見は、図２（左から右へ、それぞれ、扁桃、肺および鼡径リンパ節において見出されたＰＣＶ２コピーを表す）において認められうるとおり、該組織のｑＰＣＲ測定により確認された。ウイルス負荷の最低値は、両方のワクチンの投与を受けた動物（左柱状グラフ）において一貫して見られ、市販ＰＣＶワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏの投与を受けた動物（中柱状グラフ）の場合より一層低く、その中柱状グラフの動物は対照（右柱状グラフ）よりかなり低かった。
【００４３】
研究３：ローソニアチャレンジに対してブタにおいてＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳと併用されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏにおいて再構成された凍結乾燥ローソニアの有効性
この研究のために、３つの群に分けられた７５頭の３週齢の子ブタを使用した。群１には、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（２ｍｌ  ＩＭ＋０．２ｍｌ  ＩＤ）と同時に（１時間以内に）投与されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ（２ｍｌ  ＩＭ）において再構成された凍結乾燥ローソニア抗原をワクチン接種し、群２には、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ（２ｍｌ  ＩＭ）において再構成された凍結乾燥ローソニア抗原をワクチン接種し、群３はワクチン未接種対照として残した。７週齢（ワクチン接種の４週間後）で、ホモジナイズされたローソニア感染腸粘膜で全てのブタを経口的にチャレンジした。チャレンジ後、ブタを臨床徴候に関して毎日観察した。チャレンジ前後に定期的に、血清（血清学的検査用）および糞便（ｑＰＣＲ用）サンプルを収集した。チャレンジの３週間後、ブタを安楽死させ、死後検査を行った。ローソニア・イントラセルラリス感染に関して腸を肉眼で検査し、ｑＰＣＲおよび（免疫）組織学的スコア化のために回腸サンプルを収集した。
【００４４】
ワクチン接種日に、ほとんどのブタはローソニアに対して血清陰性であったが、他のブタは低度ないし中等度の抗体価を示した。ワクチン接種後、群１および２の抗体価は抗体価において類似した増加を示したが、対照は僅かな減少を示し、低レベルのままであった。ワクチン接種日に、それらのブタは低度ないし中等度の母体由来ＰＣＶ抗体価を示した。ワクチン接種後、群１および２のＰＣＶ抗体価は、類似した増加を示したが、対照は母体抗体の減少を示した。ワクチン接種日に、そららのブタはＭｈｙｏおよびＰＲＲＳｖに関して血清陰性であった。ワクチン接種後、群１および２はＭｈｙｏに対する類似した抗体応答を示したが、対照群３は試験終了まで血清陰性のままであった。群１はＰＲＲＳワクチン接種に応答したが、群２および３はチャレンジまで血清陰性のままであった。
【００４５】
ローソニアチャレンジ後の種々のパラメーターに関する結果を以下の表１に要約する（チャレンジ後第２１日のｌｏｇ１０  ｐｇ  ＤＮＡ／μｌにおけるＰＣＲデータ）。
【表１】
2020513027.tif 000002
【００４６】
その結果から、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳと共に投与されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ中に溶解されたローソニア凍結乾燥抗原（群１）は、ワクチン接種の４週間後、ローソニア感染に対する有意な防御を誘導したと結論づけられうる。これは排出、感染（ｑＰＣＲ回腸粘膜）、肉眼的回腸病変スコアおよび顕微鏡的回腸病変スコアにおける有意な減少により実証された。ローソニアの有効性に対するＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳの悪影響は観察されなかった。それどころか、組合せ混合使用群は、前記パラメーターに関して、より良好である傾向にあった。
【００４７】
研究４：ワクチン接種の４週間後のマイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）チャレンジ感染に対する３週齢のＳＰＦ子ブタにおける、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏと、それにおいて再構成されたローソニア凍結乾燥物と、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳとの組合せ非混合使用の有効性
マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＰＲＲＳウイルスが存在しない３週齢の集団からの１００頭のブタを各群２５頭の群においてこの研究に使用した。１つの群にはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ  ＋  ローソニア凍結乾燥物をＩＭワクチン接種し、そしてそれと共にＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＩＭ＋ＩＤ；前記を参照されたい）をワクチン接種し、１つの群には、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏをワクチン接種し、ほぼ同時に（１時間以内に）Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＩＭ＋ＩＤ）をワクチン接種し、１つの群には、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏをワクチン接種し、第４の群はワクチン接種を受けず、チャレンジ対照として用いた。ワクチン接種の４週間後、全ての動物に病毒性マイコプラズマ・ヒオニューモニエ株を感染させ、３週間後、全ての動物を肺病変に関して死後検査した。
【００４８】
全ての動物は、ワクチン接種時にマイコプラズマ・ヒオニューモニエに対して血清学的に陰性であり、非ワクチン接種動物はチャレンジ感染まで血清学的に陰性のままであった。ワクチン接種群はワクチン接種の４週間後およびチャレンジ感染の３週間後にマイコプラズマ・ヒオニューモニエに対する類似した血清学的応答を示した。
【００４９】
非ワクチン接種動物と比較して、全てのワクチン接種群に関して、病変スコアにおける有意な減少が観察された。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳと共にワクチン接種されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ  ＋  ローソニア凍結乾燥物は９０％の減少を示し、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳと共にワクチン接種されたＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏは９５％の減少を示した。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏはマイコプラズマ・ヒオニューモニエ病変の中央値における１００％の減少を誘発した。ワクチン接種群間の差は有意ではなかった。
【００５０】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏの単独またはそれと凍結乾燥ローソニア抗原と組合されたものとＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳとの組合せ非混合使用はマイコプラズマ・ヒオニューモニエ誘発性肺病変の軽減に有効であると結論づけられうる。
【００５１】
研究５：生ＰＲＲＳワクチンの有効性に対する不活化ＰＣＶワクチンの使用の効果
この実験においては、ブタサーコウイルス２型の非複製性免疫原を含有する第１ワクチン（ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）と、生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスを含む第２ワクチン（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）とを混合する効果を調べた。これら２つのワクチンを混合する場合には、生ＰＲＲＳウイルスの生存が、決定的に重要な主要パラメーターであるため、１、２および４時間のインキュベーションの後のＰＲＲＳウイルスの生存を調べた。第−１日に、ＭＡ１０４細胞を１０５細胞／ｍｌで播き、ウェルあたり２２５μｌでウェルに入れた。これらの細胞を、５％の二酸化炭素含量の空気中で３７℃に維持した。第０日に、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳを５．３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価までＰＢＳ中で予備希釈した。この混合物をＰＢＳ（対照）で希釈し、またはＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（２つの異なるバッチ）で希釈して、５．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの最終力価にした。新たに混合された組合せワクチンを接種した場合の安定状態での実際の状況を模倣するために、最終混合物を室温で１、２および４時間インキュベートした。この後、インキュベートした混合物のそれぞれの２５μｌをＭＡ１０４細胞中、３７℃、５％二酸化炭素において７日間インキュベートして、ＰＲＲＳウイルスを増殖させた。第７日に、ＰＲＲＳウイルスを測定した。データを以下の表２に示す。
【表２】
2020513027.tif 000003
【００５２】
該表から認められうるとおり、ＰＲＲＳウイルスは、ＰＣＶワクチンと共に室温で短時間インキュベートすることにより、生存能を喪失する。ワクチン効力はワクチン力価の低下により悪影響を受ける。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＰＲＲＳＶチャレンジ後におけるウイルス感染価の推移を示す。
【図２】ウイルスチャレンジ後に扁桃、肺および鼡径リンパ節において見出されたＰＣＶ２コピー数を示す。
【図１】
2020513027.tif 000004
【図２】
2020513027.tif 000005
【国際調査報告】
2020513027.tif 000006
2020513027.tif 000007
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2020513027.tif 000009