(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法とインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力を増加させる方法、前記シードストックを用いてインフルエンザワクチンを製造する方法、前記方法を用いて製造されたインフルエンザ予防ワクチンと感染力が増加したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株をインフルエンザワクチン用ウイルスで感染させて培養し、得られたウイルス培養液を同一細胞株で繰返し継代することにより、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造する方法において、
前記継代でウイルス感染に使用した感染希釈倍数の培養液の中から細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、
ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）が４倍以上の差がある場合には、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択して、その後の継代に使用することを含む、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項２】
前記無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株はＭＤＣＫ細胞株であることを特徴とする、請求項１に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項３】
前記ＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ  Ｂ−７０２、ＭＤＣＫ  ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ１０２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１２）、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ１０２３４（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１４）、またはＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１３）であることを特徴とする、請求項２に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項４】
前記培養条件は、３２℃〜３８℃の温度範囲、１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍの攪拌速度、１日〜３日の培養期間であることを特徴とする、請求項１に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項５】
選択された前記培養液を、その後連続して２回以上継代するか、又は−５０℃〜−８０℃の温度範囲で冷凍保管した後に２回以上継代することを含む、請求項１に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項６】
前記選択された培養液の細胞生存度は、５０％以上であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項７】
選択された前記培養液のＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価は、０または約１００以上であることを特徴とする、請求項６に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項８】
前記複数の感染希釈倍数は１／１倍〜１／１０，０００倍であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の製造方法によって製造したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを大量生産し、前記大量生産したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを弱毒化または不活性化させることを含む、インフルエンザ予防ワクチンの製造方法。
【請求項１０】
前記インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックは継代前のインフルエンザワクチン用ウイルスに比べて感染力が増加したことを特徴とする、請求項９に記載のインフルエンザ予防ワクチンの製造方法。
【請求項１１】
無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株をインフルエンザワクチン用ウイルスに感染させて培養し、得られたウイルス培養液を同一細胞株で繰返し継代することによりインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造することを含み、
前記継代でウイルス感染に使用した感染希釈倍数の培養液の中から細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、ＨＡ力価（ただし、０である場合を除く）が４倍以上の差がある場合には、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数を選択してその後の継代に使用することを含む、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力を増加させる方法。
【請求項１２】
前記無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株はＭＤＣＫ細胞株であることを特徴とする、請求項１１に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力を増加させる方法。
【請求項１３】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の製造方法によって製造し、感染力が継代前のインフルエンザワクチン用ウイルスに比べて１０倍以上増加したことを特徴とする、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストック。
【請求項１４】
前記感染力はｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒで測定されたことを特徴とする、請求項１３に記載のインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストック（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｅｄ  Ｓｔｏｃｋ）の製造方法、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力を増加させる方法、前記シードシトクを用いたインフルエンザワクチンの製造方法、前記方法を用いて製造したインフルエンザ予防ワクチンと感染力が増加したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、サイズが８０〜１２０ｎｍでＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科に属し、膜を有するＲＮＡウイルスであり、Ａ、Ｂ、Ｃの３つの形態が存在する。Ａ型の場合、豚、馬、人間、鳥類などにすべて感染性がある一方、その他のＢとＣ型は人にのみ感染する。Ａ型ウイルスは１８種類のヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）と１１種類のノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、ＮＡ）の組み合わせで、より細分化した亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が存在し、Ｂ型とＣ型の亜型は知られていない。
【０００３】
インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであるため、ＤＮＡウイルスに比べて変異が広範囲で頻繁に発生する。したがって、他のワクチンとは異なり、インフルエンザワクチンはＷＨＯが毎年勧告するワクチン株を利用し、毎年新たに製造して接種するようになっている。これらの季節性インフルエンザウイルスは、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａの血清型などで構成される。このほか、変異により抗原性が変化して人間において既存の免疫がない新しいインフルエンザウイルスが出現したら全世界的に大流行する恐れがあり、これらを新型インフルエンザ（Ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルスと言い、このような可能性があるウイルスとしてＷＨＯはＨ５とＨ７の血清型を注目している。
【０００４】
ＷＨＯはワクチンメーカーがワクチンの製造時に使用できるように、季節性と大流行の可能性があるインフルエンザウイルスワクチン株を公告及び分譲し、該当ワクチン株はｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ、ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓなどのさまざまな方法を利用して用意される。各ワクチン製造社は用意されたワクチン株を利用して、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造することになる。このとき、複数のバッチで使用できる十分な量まで増やされ、高い感染力を持つインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法が要求される。
【０００５】
細胞培養を利用してインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造する際には、通常所定範囲内のＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に基づいてウイルスを感染させる。ＭＯＩは感染細胞に対する感染ウイルスの割合であり、インフルエンザウイルスの感染力を測定するプラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）によって決定され、プラークアッセイは通常３〜７日の期間がかかる。血球凝集反応アッセイ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ、以下、「ＨＡ  ａｓｓａｙ」という。）でＨＡ力価の高いものを選択するか、プラークアッセイでＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）力価を比較して最も高いＰＦＵ力価を示すものを選択することになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明で解決しようとする一つの課題は、初期に分譲されたウイルスに比べて感染力を改善したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造する方法を提供することであり、これにより、短期間で効率的にインフルエンザ予防ワクチンを製造する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の課題は、インフルエンザ予防ワクチンの製造において時間と費用を短縮させて製造効率を向上することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態は、無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株をインフルエンザワクチン用ウイルスで感染させて培養し、得られたウイルス培養液を同一細胞株で繰返し継代することにより、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造する方法であり、前記継代におけるウイルス感染時に使用した感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）で４倍以上の差がある場合にはＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択してその後の継代に使用することを含む、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法に関するものである。
【０００９】
本発明の他の実施形態は、無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株をインフルエンザワクチン用のウイルスに感染させて培養し、得られたウイルス培養液を同一細胞株で繰返し継代することにより、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造することを含み、前記継代におけるウイルス感染時に使用した感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）が４倍以上の差がある場合には、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択してその後の継代に使用することを含む、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力を増加させる方法に関するものである。
【００１０】
本発明のさらに他の一実施形態では、前記実施形態によって製造、または前記実施形態により感染力が増加したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを大量生産し、これを弱毒化または不活性化させてインフルエンザ予防ワクチンを製造する方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらに他の一実施形態では、前記方法で製造されて感染力が増加したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストック、又は前記方法により製造されたインフルエンザ予防ワクチンが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の実施形態による製造方法は、インフルエンザウイルスの感染力を測定するためのプラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を省略することにより、短期間で効率的にインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを提供することができる。
【００１３】
本発明の一実施形態による方法は、分譲された最初のインフルエンザウイルスに比べて感染力が増加したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを提供し、インフルエンザワクチンの製造において時間と費用を低減することが可能であり、大量生産において経済的な利点がある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一態様は、無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株をインフルエンザワクチン用のウイルスに感染させ培養し、得られたウイルス培養液を同一細胞株で繰返し継代することによりインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造する方法であり、前記継代培養におけるウイルス感染時に使用した感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）が４倍以上の差がある場合には、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択してその後の継代に使用することを含む、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造方法に関するものである。
【００１５】
本明細書に記載の「無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株」とは、実質的に血清が添加されていない培地に適応し、また、実質的に担体がない状態で浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）に適応した細胞株をいう。前記「実質的に血清が添加されていない」とは、血清を０．５ｖ／ｖ％以下、具体的には０．２ｖ／ｖ％以下、より具体的には０．０１ｖ／ｖ％以下、またはまったく添加されていないことを意味する。前記「実質的に担体がない」とは、担体が０．５ｖ／ｖ％以下、具体的には０．２ｖ／ｖ％以下、より具体的には０．０１ｖ／ｖ％以下、またはまったく存在しないことを意味する。前記「適応した細胞株」とは、無血清培養と浮遊培養で増殖可能な細胞株をいう。
【００１６】
無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株の例としてＭＤＣＫ細胞株があり、具体的に、ＭＤＣＫ  Ｂ−７０２、ＭＤＣＫ  ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２９７、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ１０２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１２）、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ１０２３４（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１４）、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１３）などが挙げられ、より具体的に、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ１０２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１２）、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ１０２３４（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１４）、ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１（ＤＳＭ  ＡＣＣ３１１３）が挙げられる。前記細胞株からウイルスを継代培養し、分譲初期に比べてウイルスの感染力をより増加させることができる。
【００１７】
インフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、または鳥インフルエンザウイルスであり得る。ヒトインフルエンザウイルスの場合、ウイルスＡ、Ｂ、またはＣであり得る。インフルエンザウイルスは、外皮で少なくとも２つの異なる表面糖蛋白質抗原であり、３つのＨＡモノマーからなるヘマグルチニン（ＨＡ）三量体及び四量体で存在するノイラミニダーゼ（ＮＡ）を有する。ＨＡ及びＮＡは両方、感染されやすい細胞内に感染時に、免疫原性が高いため特異的な抗体反応を起こす。ＨＡとＮＡ糖タンパク質の特性に応じて、インフルエンザＡウイルスのサブタイプがある。今まで１８個のＨＡ（Ｈ１からＨ１８）と１１個のＮＡ（Ｎ１からＮ１１まで）が確認された。一例において、インフルエンザウイルスＡのサブタイプは、Ｈ５Ｎ１，Ｈ９Ｎ１，Ｈ７Ｎ７，Ｈ２Ｎ２，Ｈ７Ｎ１、または、Ｈ１Ｎ１，Ｈ１Ｎ２，Ｈ３Ｎ２，Ｈ３Ｎ８，Ｈ４Ｎ８，Ｈ５Ｎ２，Ｈ５Ｎ３，Ｈ５Ｎ８，Ｈ５Ｎ９，Ｈ６Ｎ５，Ｈ７Ｎ１，Ｈ７Ｎ２，Ｈ７Ｎ３，Ｈ７Ｎ４，Ｈ７Ｎ７，Ｈ８Ｎ４，Ｈ９Ｎ２，Ｈ１０Ｎ７，Ｈ１１Ｎ７，Ｈ１１Ｎ６，Ｈ１２Ｎ５，Ｈ１３Ｎ６，Ｈ１４Ｎ５であり得る。
【００１８】
インフルエンザウイルスＢはインフルエンザＡウイルスと明らかに区別され、人間の中でも特に幼い子供が感染される。
【００１９】
インフルエンザウイルスは、具体例において、ＷＨＯなどで季節性と大流行の可能性あると判断して分譲するウイルスであり得る。
【００２０】
分譲されたインフルエンザウイルスを複数の希釈倍数で希釈し、希釈された各サンプルを無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株から２回以上継代培養する。１次継代の時、インフルエンザウイルスを例えば１／１倍ないし１／１０，０００倍、または１／１倍ないし１／１，０００倍、具体的には１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍などのいくつかの倍数で希釈して一定量を無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株に感染させる。その後の培養条件は、３２℃〜３８℃、１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍの攪拌速度で、４日以内、具体的に１日〜３日間、培養する。このとき培地にトリプシンを任意追加することができ、その濃度は１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲である。任意的に、約１％〜約１０％のＣＯ２の存在条件で培養することもできる。前記感染時の細胞株の濃度は、約１．０Ｅ＋４ｃｅｌｌ／ｍｌのないし１．０Ｅ＋８ｃｅｌｌ／ｍｌの範囲、具体的には、約１．０Ｅ＋５ｃｅｌｌ／ｍｌのないし１．０Ｅ＋７ｃｅｌｌ／ｍｌである。
【００２１】
インフルエンザウイルスを取得する適切な時点を確認するため、１ＤＰＩ、２ＤＰＩ（Ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）などで各感染希釈倍数ごとに細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）およびＨＡ力価を測定する。インフルエンザウイルスの取得対象と時点は、前記測定された細胞生存度およびＨＡ力価の両方を考慮して決定する。具体的には、ウイルス感染時に使用した感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）が４倍以上の差がある場合には、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択し、その後の継代に利用することができる。ウイルス培養液を選択するときには、ＨＡ力価が最も高いものを選択するのが一般的である。しかし、本願発明では、感染力の高いウイルスを製造するためには細胞生存度を優先的に考慮する必要があることを見出した。具体的に、細胞生存度は約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、または約９０％以上、または約１００％、または前記数値の内いずれかの範囲が良い。インフルエンザウイルスの適切な取得対象と時点を判断ことにおいて、細胞生存度を考慮することは通常の技術認識から外れている。従来には、ＨＡ力価が最高値である時点だけを考慮し、細胞生存度は考慮対象ではなかった。したがって、ＨＡ力価だけで選択した培養液は細胞生存度が最高点を過ぎた場合が多かった。しかし、本願発明では、細胞生存度が最も高い培養液を選択した場合に感染力の高いウイルスが製造されることを明らかにした。ＨＡ力価は、０、または約１００以上、約２００以上、約３００以上、約４００以上、約５００以上、具体的には、１０００以上、１１００以上、１２００以上、１３００以上、または１４００以上、より具体的には、１５００以上、または前記の数値のうち任意選択された範囲から選ぶことができる。ただし、複数の感染希釈倍数の培養液から、ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）のみを比較する時に４倍以上の差がある場合は、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数を選択するのが良い。ＨＡ力価で４倍以上の差がある場合、感染力が最も高い培養液を選択するためには細胞生存度よりもＨＡ力価を考慮する必要がある。
【００２２】
細胞生存度およびＨＡ力価は、複数の感染希釈倍数の培養液の中から、その値を相対的に比較して最適の結果を選択するのが良い。一例では、複数の感染希釈倍数の培養液中で細胞生存度が最も高い培養液を優先的に選択し、細胞生存度が同一であれば、ＨＡ力価が最も高い培養液を選択する。一例では、複数の感染希釈倍数の培養液中で細胞生存度が最も高い培養液を優先的に選択するが、細胞生存度がより低い培養液がＨＡ力価において細胞生存度が最も高い前記培養液のＨＡ力価に比べて４倍以上高い場合には、前記細胞生存度がより低い培養液を選択することもできる。一例では、複数の感染希釈倍数の培養液中で細胞生存度が最も高く、しかも同じ生存度を示す培養液が２個以上存在する場合は、このうちＨＡ力価が最も高いものを選択する。
【００２３】
選択された前記１次培養液を直ちに続けて連続して２次以上の継代に使用するか、または次の利用時まで−５０℃〜−８０℃の温度範囲、例えば、−５５℃〜−７０℃の温度範囲で冷凍保管し、その後１回以上から数回以上まで継代することができる。
【００２４】
その後、２次継代培養は１次培養液をさらに複数の希釈倍数で希釈し、新しい無血清培養及び浮遊培養で適応した細胞株に感染させる。２次継代の方法は、前記１次継代と同様である。希釈倍数は例えば、１／１〜１／１０，０００倍であり、１次培養時でＨＡ細胞生存度およびＨＡ力価が高かった感染希釈倍数を考慮することができる。その後、前記１次培養時と同じ方法で培養し、さらに、同一方法で細胞生存度およびＨＡ力価を測定し、１次培養液より同等以上でありながら最も高い細胞生存度を示す培養液を選別する。選別した培養液を回収し、これをインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストック（Ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）に設定する。
【００２５】
選択的に、以降の３次またはそれ以上の継代を前記と同じ方法で実行することができる。２回以上継代することにより、継代前の初期インフルエンザウイルス、例えば分譲されたインフルエンザウイルスに比べてｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒが約１０倍以上、具体的には約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上まで増加したウイルスが得られる。
【００２６】
本発明の他の実施形態では、無血清培養及び浮遊培養に適応した細胞株をインフルエンザワクチン用ウイルスに感染させて培養し、得られたウイルス培養液を同一細胞株で繰返し継代することによりインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを製造することを含み、前記継代においてウイルス感染時に使用した複数の感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択するが、ＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）力価（ただし、０である場合を除く）が４倍以上の差がある場合には、ＨＡ力価が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択して、その後の継代に使用することを含む、インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力を増加させる方法に関するものである。前記実施形態は、前述した実施形態の説明を参考して実施することができるので、記載の繰り返しを避けるため前記実施形態の説明は省略する。
【００２７】
本発明のさらに他の実施形態は、前記実施形態で製造されるか、前記実施形態で感染力が増加したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックを大量生産し、これを弱毒化または不活性化させてインフルエンザ予防ワクチンを製造する方法に関するものである。本発明の一実施形態によって製造されるウイルスは感染力が増加し、継代前の初期ウイルス（例えば、分譲ウイルス）に比べて短時間で多量のウイルスを提供することが可能であって、大量生産に適している。弱毒化または不活性化されたウイルスは、不活性化された全ウイルス、精製されたウイルス粒子が脂質外皮を溶解させる溶剤またはその他の試薬で崩壊したサブ−ビリオン（いわゆるスプリットワクチン）、または精製されたＨＡ及びＮＡ（サブユニットワクチン）であり得る。
【００２８】
本発明のさらに他の実施形態では、前記方法により製造されて感染力が増加してインフルエンザワクチン製造用のウイルス、または前記方法によって製造されたインフルエンザ予防ワクチンが提供される。前記感染力の増加は約１０倍以上の感染力の増加、具体的には、ｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒで約１０倍以上、具体的には約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上の増加を示す。
【００２９】
以下、本発明の理解を助けるため、実施例を用いて詳細に説明する。しかし、本発明に係る実施例は様々な形態で変更することが可能であり、本発明の範囲を下記の実施例で限定して解釈してはいけない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完璧に説明するために提供される。
【実施例１】
【００３０】
ワクチン用ウイルス株の培養時において、細胞の生存度とＨＡ力価による感染力の差
【００３１】
無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１）を、撹拌速度が８０ｒｐｍ、培養温度が３４℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。複数回継代培養して細胞が所定水準以上まで育った場合、培地の交換後、４つの１２５ｍｌのスピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ）で細胞濃度が３．０Ｅ＋６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜４．０＋Ｅ６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように入れて、感染のためトリプシンを培養培地に含ませた。本実験に使用されたウイルスは、２００５年〜２００６年、２００９年〜２０１０年と２０１６年〜２０１７年のシーズンでインフルエンザワクチン株であり、ウイルスの培養条件は表１の通りである。
【００３２】
【表１】
2020532283.tif 000002
【００３３】
ウイルス培養の時、インフルエンザウイルスワクチン株を１〜１／１０００倍に希釈して一定量を感染させ、適切な取得時点を判断するために細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）とＨＡ  ｔｉｔｅｒをＤＰＩ（Ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）ごとに確認した。複数の感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度が異なりＨＡ力価が２倍または４倍の差が出る希釈倍数の培養液の結果を下記の表２で示した。
【００３４】
【表２】
2020532283.tif 000003
【００３５】
前記表２において、例えばＮＹＭＣ  Ｘ−２８３Ａ（Ａ／Ｌｉｓｂｏａ／３２／２０１５）のインフルエンザワクチン株の場合、１倍と１０倍の感染希釈倍数の培養液における細胞生存度およびＨＡ力価を比較すると、細胞生存度は１０倍の感染希釈倍数の培養液（９０％）が１倍の感染希釈倍数の培養液（８０％）よりも高く、ＨＡ力価は２倍低かった。プラークアッセイ（Ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）の結果でＨＡ力価が２倍低くても、細胞生存度が高い１０倍の感染希釈倍数の培養液が約２４．５倍高いｔｉｔｅｒを示すことが確認された。
【００３６】
同様にＮＹＭＣ  Ｘ−１５７（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４）とＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４のインフルエンザワクチン株でも、ＨＡ力価は２倍低くても細胞生存度が高い感染希釈倍数の培養液がより高いｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒを示すことが確認された。
【００３７】
一方、ＮＹＭＣ  Ｘ−２７５（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５）インフルエンザワクチン株の場合、１０００倍と１００００倍の感染希釈倍数の培養液における細胞生存度およびＨＡ力価を比較すると、細胞生存度が１００００倍の感染希釈倍数の培養液（９０％）が１０００倍の感染希釈倍数の培養液（８０％）より高く、ＨＡ力価は４倍低かった。プラークアッセイ（Ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）の結果で、細胞生存度が低くてもＨＡ力価が４倍高い１０００倍感染希釈倍数の培養液が約１．７倍高いｔｉｔｅｒを示すことが確認された。
【００３８】
同様に、ＮＹＭＣ  Ｘ−１７５Ｃ（Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７）とＮＹＭＣ  ＢＸ−３５（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）のインフルエンザワクチン株でも、細胞生存度は低くてもＨＡ力価が４倍高い感染希釈倍数の培養液がより高いｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒを示すことが確認された。
【実施例２】
【００３９】
インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造（１２５ｍｌ容量のスピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ））
【００４０】
無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１）を、撹拌速度が８０ｒｐｍ、培養温度が３４℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。複数回継代培養して細胞が所定水準以上まで育った場合、培地の交換後、４つの１２５ｍｌのスピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ）で細胞濃度が３．０Ｅ＋６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜４．０Ｅ＋６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように入れて、感染のためトリプシンを培養培地に含ませた。本実験で使用されたウイルスは、２００４〜２０１０年でインフルエンザワクチン株であり、１次および２次ウイルスの培養条件は、前記表１の通りである。
【００４１】
１次ウイルス培養の時、インフルエンザウイルスワクチン株を１〜１／１０００倍に希釈して一定量感染し、適切な取得時点を判断するため、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）とＨＡ  ｔｉｔｅｒをＤＰＩ（Ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）ごとに確認した。複数の感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択して、その結果を下記表３に示した（ＨＡ力価（ただし、０である場合を除く）において４倍以上の差があることは、本実施例ではなかった）。前記選択された１次培養の２ＤＰＩ培養液を得て３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した後、１ｍｌずつ小分けして−７０℃以下で保管した。このうち一つのバイアルを融解させて１〜１／１０，０００倍に希釈しウイルスの二次継代培養のために感染させ、１次継代培養と同様にＤＰＩごとに細胞の生存度とＨＡ  ｔｉｔｅｒを測定した。複数の感染希釈倍数の培養液の中で、細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が最も高い感染希釈倍数の培養液を選択し、その結果を下記の表３に示した（ＨＡ力価（ただし、０である場合を除く）において４倍以上の差があることは本実施例ではなかった）。表３から２次培養の２ＤＰＩ培養液を最終的に選択と取得し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、１ｍｌずつ小分けして−７０℃以下で保存し、これをインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックに設定した。
【００４２】
【表３】
2020532283.tif 000004
【００４３】
前記表３の１次培養と二次培養の２ＤＰＩで得られた上澄み液を用いて感染力確認のためにプラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を実施し、その結果は表４の通りである。無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１）でインフルエンザワクチン株を連続して２次継代培養することで、インフルエンザワクチン株よりｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒが約１０〜１０００倍まで増加することを確認した。
【００４４】
【表４】
2020532283.tif 000005
【実施例３】
【００４５】
インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの製造（３Ｌ容量のスピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ））
【００４６】
無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１）を、撹拌速度８０〜１００ｒｐｍ、培養温度３４℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。複数回継代培養して細胞が所定水準以上まで育った場合、培地の交換後、１次ウイルスの培養は４つの１２５ｍｌのスピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ）、２次ウイルス培養は４つの３Ｌのスピナーフラスコに細胞濃度が３．０Ｅ＋６〜４．０Ｅ＋６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように入れて、感染のためトリプシンを培養培地に含ませた。本実験に使用されたウイルスは、２０１３〜２０１７年でインフルエンザワクチン株であり、１次および２次ウイルスの培養条件は表５の通りである。
【００４７】
【表５】
2020532283.tif 000006
【００４８】
実施形態２と同様に行って、ウイルス二次培養の１ＤＰＩと２ＤＰＩ培養液を取得し、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した後、１ｍｌずつ小分けして−７０℃以下で保管し、これをインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックに設定した。各インフルエンザワクチン株の１次と２次継代培養時ＤＰＩ（Ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）別の細胞の生存度とＨＡ  ｔｉｔｅｒの結果を表６で示した。
【００４９】
【表６】
2020532283.tif 000007
【００５０】
前記表６で列挙したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックの感染力確認のため、最終の培養液に対してプラークアッセイを実施し、その結果は以下の表７の通りである。実施例２の表４の結果と同様に、無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ  Ｓｋｙ３８５１）で連続して２回継代培養したインフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックのｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｅｒはほとんど１．００Ｅ＋８ｐｆｕ／ｍｌ以上であることを確認した。
【００５１】
【表７】
2020532283.tif 000008
【実施例４】
【００５２】
インフルエンザワクチン製造用のウイルスシードストックのｓｅｑｕｅｎｃｅ確認
【００５３】
無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株でインフルエンザワクチン株を３回継代培養する間に、主要な表面抗原であるＨＡ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）及びＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）の抗原性の変化有無を確認するため、塩基配列の変化有無を確認した。ワクチン株を実施例２で記述した方法と同様に２回継代培養し、１回の繰返し継代培養して、合計３回の培養を行った後、ウイルスからＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した後、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＩ  ＯＮＥ−ＳＴＥＰ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と各ｓｔｒａｉｎ別にウイルスのＨＡ及びＮＡ  ｇｅｎｅに特異的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いたＰＣＲにより、ＨＡ及びＮＡ  ｇｅｎｅのみを増幅した。続いて、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔでＰＣＲ産物から不純物を除去し、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを分析した。ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ分析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０ｘ／Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒで行い、ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａのａｓｓｅｍｂｌｙはＤＮＡ  ＳＴＡＲ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ８．１  ｐｒｏｇｒａｍの中で、ＳｅｑＭａｎ  ＰｒｏとＭｅｇＡｌｉｇｎを使用して行った。
【００５４】
【表８】
2020532283.tif 000009
【００５５】
前記の分析結果から、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ  ｓｕｂｔｙｐｅのすべてのインフルエンザワクチン株は無血清培養及び浮遊培養に適応したＭＤＣＫ細胞株を３回継代培養しても主要表面抗原であるＨＡとＮＡ  ｇｅｎｅの塩基配列に変化がなく、したがって抗原性が変化せずに維持したことを確認した。
【国際調査報告】
2020532283.tif 000010
2020532283.tif 000011
2020532283.tif 000012
2020532283.tif 000013
2020532283.tif 000014
2020532283.tif 000015