(57)【要約】１エーカー当たり２０ｌｂよりも多くの窒素で施肥された農業系で大気窒素を固定する少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株を含む細菌組成物を生成および使用するための方法および系が提供される。本発明の追加の態様は、大気窒素を固定する少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株を含む細菌組成物であって、少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株が、外因的に加えられたＤＮＡを含み、前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも８０％の同一性を共有する、細菌組成物を提供する。
2020506681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法であって、
前記植物に、複数の非属間細菌を適用するステップを含み、前記複数の非属間細菌が、
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する非属間細菌を含み、
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生し、
前記複数の非属間細菌の各メンバーが、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の非属間細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の非属間細菌が、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の非属間細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した導入制御配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の非属間細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の非属間細菌が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の非属間細菌は、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物に適用される前記複数の非属間細菌が、外因性非大気窒素の取込み増加を刺激しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含み、前記窒素含有肥料が、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記外因性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子の１つまたは複数を含む肥料から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の非属間細菌が、非窒素制限条件で大気窒素を植物内で固定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の非属間細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の非属間細菌により産生される前記固定窒素が、植物組織での大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現または活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種調節配列の挿入もしくは（Ｄ）ドメイン欠失を含む、から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の非属間細菌が、組成物に製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の非属間細菌が、農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の非属間細菌が、前記植物の種子が植栽される畝間内に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の非属間細菌が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物に製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の非属間細菌が、前記植物の種子に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化され、前記植物の種子に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化され、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度で前記植物の種子に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物が、穀類作物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物が、トウモロコシである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物が、農業作物植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物が、遺伝子改変生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物が、遺伝子改変生物ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の非属間細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数の非属間細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の非属間細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数の非属間細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数の非属間細菌が、ＰＴＡ−１２２２９３として寄託された細菌、ＰＴＡ−１２２２９４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
（ｉ）前記植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たりの産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
（ｉ）前記植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たりの産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１７年１月１２日に出願された米国仮出願第６２／４４５，５７０号；２０１７年１月１２日に出願された米国仮出願第６２／４４５，５５７号；２０１７年１月１８日に出願された米国仮出願第６２／４４７，８８９号；２０１７年３月３日に出願された米国仮出願第６２／４６７，０３２号；２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６６，１９９号；および２０１７年１０月２５日に出願された米国仮出願第６２／５７７，１４７号（これらの出願は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１月３日に作成され、名称は４７７３６−７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは約５９９ｋｂである。
【０００３】
連邦政府によって支援された研究への陳述
本発明は、米国国立科学財団により与えられたＳＢＩＲ助成金１５２０５４５の下、米国政府の支援によりなされた。政府は、本開示の主題における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
植物は、共通のメタボロームを介してマイクロバイオームに繋がっている。特定の作物の形質と基本的なメタボロームとの多次元的な関係性は、多数の局所最大値を有するランドスケープにより特徴付けられる。メタボロームに対するマイクロバイオームの影響を変更することによって下位の局所最大値からより良好な形質を表す別の局所最大値へと最適化することは、作物最適化のため等の様々な理由で望ましい場合がある。増加し続ける世界人口の必要性を満たすため、経済的に、環境的に、さらに社会的に持続可能な農業および食糧生産の手法が求められている。国連食糧農業機関は、増加し続ける人口の必要性を満たすために、２０５０年までに総食糧生産が７０％増加しなければならないと予測している。この難問は、真水資源の減少、耕地競合の増加、エネルギー価格の上昇、投入コストの増加、および作物が、より乾燥し温暖化したより極端な全地球的気候の圧力に適応する必要がある可能性が高いことなど、多数の要因のためにさらに難しいものになっている。
【０００５】
興味深い１つの分野は、窒素固定の向上である。窒素ガス（Ｎ２）は、地球の大気の主成分である。加えて、窒素元素（Ｎ）は、生命体を形成する多数の化合物の重要な成分である。しかしながら、多くの生物は、成長および生殖等の生理学的なプロセスで使用される化学物質を合成するために、Ｎ２を直接使用することができない。Ｎ２を利用するためには、Ｎ２を水素と化合させなければならない。水素とＮ２の化合は、窒素固定と呼ばれる。窒素固定は、化学的に達成される場合でもまたは生物学的に達成される場合でも、大量のエネルギー投資を必要とする。生物系では、ニトロゲナーゼとして公知の酵素により、窒素固定をもたらす反応が触媒される。窒素固定研究の重要な目標は、この表現型を、非マメ科植物、特に、小麦、米、およびトウモロコシ等の重要な農業学的イネ科植物に拡張することである。根粒菌とマメ科植物との間で発達した窒素固定共生の理解が大きく進歩したにも関わらず、その知識を使用して非マメ科作物に窒素固定根粒を誘導する目処は依然として立っていない。そうするうちにも、例えば肥料に十分な補充的窒素供給源を提供するという課題は、食糧生産増加の必要性が増加すると共に増加し続けると予想される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様は、１エーカー当たり２０ｌｂよりも多くの窒素で施肥された農業系にて大気窒素を固定する少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株を含む細菌組成物を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様は、１エーカー当たり２０ｌｂよりも多くの窒素で施肥された農業系にて大気窒素を固定するように品種改良された少なくとも１つの細菌菌株を含む細菌組成物を提供する。
【０００８】
本発明の追加の態様は、大気窒素を固定する少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株を含む細菌組成物であって、少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株が、外因的に加えられたＤＮＡを含み、前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも８０％の同一性を共有する、細菌組成物を提供する。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、細菌組成物を接種した植物の種子を含む種子組成物を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、細菌組成物を接種した種子組成物を有する複数の種子を使用して作物を栽培するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の追加の態様は、細菌組成物を圃場に適用するための方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、細菌組成物を含む肥料組成物を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、土壌窒素レベルを維持するための方法を提供する。この方法は、圃場の土壌に、大気窒素を固定する遺伝子操作された細菌によって接種された作物を植栽するステップを含む。この方法は、作物を収穫するステップも含み、上記作物の生産に必要な窒素用量の９０％以下が、植栽と収穫との間に上記圃場の上記土壌に投与される。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、作物植物にプロバイオティクス栄養補助剤を送達するための方法を提供する。この方法は、作物種子を、種子コーティング、種子処理剤、または種子粉衣でコーティングするステップを含む。上記種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤は、上記プロバイオティクスの生存標本を含む。さらに、この方法は、圃場の土壌に上記作物種子を適用するステップを含む。
【００１５】
本発明のさらなる態様では、遺伝子操作された細菌菌株は、遺伝子操作されたグラム陽性細菌菌株である。一部の場合には、遺伝子操作されたグラム陽性細菌菌株は、Ｎｉｆクラスターの調節因子の発現レベルの変更を示す。一部の場合には、遺伝子操作されたグラム陽性細菌菌株は、減少量のＮｉｆクラスターの負の調節因子を発現する。一部の場合には、遺伝子操作された細菌菌株は、減少量のＧｌｎＲを発現する。一部の場合には、遺伝子操作された細菌菌株のゲノムは、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の場合には、遺伝子操作された細菌菌株のゲノムは、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の場合には、遺伝子操作された細菌菌株のゲノムは、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の場合には、遺伝子操作された細菌菌株のゲノムは、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００１６】
本発明の別の態様は、非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法を提供する。この方法は、前記植物に、複数の非属間細菌を適用するステップを含み、前記複数の非属間細菌は、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する非属間細菌を含む。さらに、前記複数の非属間細菌は、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。さらに、前記複数の非属間細菌の各メンバーは、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法を提供する。この方法は、前記植物に、複数の非属間細菌を適用するステップを含み、前記複数の非属間細菌は、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ／または（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する非属間細菌を含む。さらに、前記複数の非属間細菌は、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。さらに前記複数の非属間細菌の各メンバーは、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、微生物菌株を品種改良して、農学的に関連する特定の形質を向上させるための方法を提供する。この方法は、所望の作物でコロニー化する能力を有する複数の微生物菌株を提供するステップを含む。この方法は、ゲノム内再編成により上記形質に影響を及ぼす調節ネットワークを向上させるステップも含む。さらに、この方法は、上記複数の微生物菌株内の微生物菌株を評価して、上記形質の尺度を決定するステップを含む。さらに、この方法は、上記所望の作物の存在下で上記形質の向上を生成する、上記複数の微生物菌株の１つまたは複数の微生物菌株を選択するステップを含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、微生物菌株を品種改良して、農学的に関連する特定の形質を向上させるための方法を提供する。この方法は、所望の作物でコロニー化する能力を有する複数の微生物菌株を提供するステップを含む。この方法は、上記複数の微生物菌株に遺伝的多様性を導入するステップも含む。さらに、この方法は、上記複数の微生物菌株内の微生物菌株を評価して、上記形質の尺度を決定するステップを含む。さらに、この方法は、上記所望の作物の存在下で上記形質の向上を生成する、上記複数の微生物菌株の１つまたは複数の微生物菌株を選択するステップを含む。
【００２０】
本発明の別の態様は、非マメ科植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。この方法は、非マメ科植物を、操作された非属間微生物に曝露するステップを含み、上記操作された非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異または窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。この方法は、トウモロコシ植物を、ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＥ、およびａｍｔＢからなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子内に操作された遺伝子変異を含む操作された非属間微生物に曝露するステップを含む。
【００２２】
本発明の別の態様は、トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。この方法は、トウモロコシ植物を、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む操作された非属間微生物に曝露するステップを含み、上記操作された非属間微生物が、１．２％の１５Ｎを含む肥料で処理された圃場で栽培された作物での１５Ｎ希釈により測定して、上記トウモロコシ植物における固定窒素の少なくとも５％を植物内で産生する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法を提供する。この方法は、前記植物に、複数の非属間細菌を適用するステップを含み、前記複数の非属間細菌は、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する非属間細菌を含む。さらに、（ｉ）植物根組織１単位当たりの上記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．５×１０−８ｍｍｏｌ  Ｎである。さらに、前記複数の非属間細菌は、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。さらに、前記複数の非属間細菌の各メンバーは、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法を提供する。この方法は、上記植物に複数の細菌を適用するステップを含み、上記複数の細菌は、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む。さらに、上記複数の細菌は、上記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、非マメ科植物での窒素固定を増加させる能力のある非属間細菌集団であって、複数の非属間細菌であって、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ／または（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、複数の非属間細菌を含む、非属間細菌集団を提供する。さらに、前記複数の非属間細菌は、前記複数の非属間細菌の存在下で成長した植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。さらに、前記複数の非属間細菌の各メンバーは、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、非マメ科植物で窒素固定を増加させることが可能な細菌集団であって、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する
複数の細菌を含む、細菌集団を提供する。さらに、上記複数の細菌は、上記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。
【００２７】
本発明の別の態様では、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌が提供される。
【００２８】
本発明のさらなる態様では、非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む非属間細菌であって、（ｉ）植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、非属間細菌が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、植物での窒素固定を増加させる方法であって、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団、および／または配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む有効量の組成物を上記植物に投与するステップを含み、上記有効量の上記組成物が投与された上記植物が、上記組成物が投与されていない植物と比較して、窒素固定の増加を示す、方法を提供する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列；配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列；および／または配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を含む、単離された細菌を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有するヌクレオチド配列を増幅するステップを含む、非天然ジャンクション配列を検出するための方法を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、非天然ジャンクション配列を検出するための方法であって、配列番号３７２〜４０５に含まれている少なくとも１０連続塩基対断片と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するヌクレオチド配列を増幅するステップを含み、上記連続塩基対断片が、配列番号３０４〜３３７を含む上流配列および配列番号３３８〜３７１を含む下流配列の共通部分のヌクレオチドで構成されている、方法を提供する。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む、非天然ジャンクション配列を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、配列番号３７２〜４０５に含まれている少なくとも１０連続塩基対断片と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を共有するヌクレオチド配列を含み、上記連続塩基対断片が、配列番号３０４〜３３７を含む上流配列および配列番号３３８〜３７１を含む下流配列の共通部分のヌクレオチドで構成されている、非天然ジャンクション配列を提供する。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、大気窒素を固定する少なくとも１つのリモデリングされた細菌菌株を含む細菌組成物であって、上記少なくとも１つのリモデリングされた細菌菌株が、外因的に加えられたＤＮＡを含み、上記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも８０％の同一性を共有する、細菌組成物を提供する。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、土壌窒素レベルを維持するための方法を提供する。この方法は、圃場の土壌に、大気窒素を固定するリモデリングされた細菌によって接種された作物を植栽するステップを含む。この方法は、作物を収穫するステップも含み、上記作物の生産に必要な窒素用量の９０％以下が、植栽と収穫との間に上記圃場の上記土壌に投与される。
【００３７】
本発明の別の態様は、プロバイオティクス栄養補助剤を作物植物に送達するための方法を提供する。この方法は、作物種子を、種子コーティング、種子処理剤（ｓｅｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、または種子粉衣でコーティングするステップを含み、前記種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤は、前記プロバイオティクスの生存標本（ｌｉｖｉｎｇ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）を含む。この方法は、前記作物種子を圃場の土壌に適用するステップも含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、非マメ科植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。この方法は、非マメ科植物を、リモデリングされた非属間微生物に曝露するステップを含み、上記リモデリングされた非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異または窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。この方法は、トウモロコシ植物を、ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＥ、およびａｍｔＢからなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子内にリモデリングされた遺伝子変異を含むリモデリングされた非属間微生物に曝露するステップを含む。
【００４０】
本発明の別の態様は、トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。この方法は、トウモロコシ植物を、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含むリモデリングされた非属間微生物に曝露するステップを含み、上記リモデリングされた非属間微生物が、１．２％の１５Ｎを含む肥料で処理された圃場で栽培した作物での１５Ｎ希釈により測定して、上記トウモロコシ植物における固定窒素の少なくとも５％を植物内で産生する。
【００４１】
本発明の追加の態様は、非マメ科作物での植物内窒素固定のために進化および最適化された微生物の属を提供する。特に、非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法が開示されている。この方法は、植物を複数の細菌に曝露するステップを含んでいてもよい。複数の細菌の各メンバーは、細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、細菌の窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの非コードポリヌクレオチドの１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む。細菌は、属間微小生物ではない。加えて、細菌は、植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、有益な単離された微生物および微生物組成物を提供する。特に、とりわけ作物での窒素固定を増加させることに適用を有する単離された生物学的に純粋な微小生物が提供される。開示される微小生物は、単離された生物学的に純粋な状態で利用することができ、ならびに組成物に製剤化することができる。さらに、本開示は、開示される微小生物の少なくとも２つのメンバーを含む微生物組成物、ならびに前記微生物組成物を利用するための方法を提供する。
【００４３】
参照による組込み
本明細書で述べられる刊行物、特許、および特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により具体的かつ個々に組み込まれることが示唆されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な記載および添付の図面を参照すればより良好に理解されると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、窒素固定細菌の富化および単離を示す。（Ａ）Ｎｆｂ寒天プレートを使用して、窒素固定細菌の単一コロニーを単離した。（Ｂ）半固体Ｎｆｂ寒天をＢａｌｃｈチューブに流した。矢印は、豊化された窒素固定細菌のペリクルを指す。
【００４６】
【図２】図２は、代表的なｎｉｆＨ  ＰＣＲスクリーニングを示す。このスクリーニングでは２つのコロニーで、約３５０ｂｐに陽性バンドが観察された。その下にあるバンドは、プライマー二量体を表す。
【００４７】
【図３】図３は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ−選択突然変異誘発に由来するコロニーのＰＣＲスクリーニングの例を示す。ＣＩ００６コロニーを、ｎｉｆＬ遺伝子座に特異的なプライマーでスクリーニングした。野生型ＰＣＲ産物は、約２．２ｋｂであることが予想されるが、突然変異体は、約１．１ｋｂであることが予想される。スクリーニングした１０個のコロニーのうちの７個が、所望の欠失を明白に示す。
【００４８】
【図４ＡＢ】図４Ａ〜Ｄは、種々の菌株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型を示す。０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖させた菌株ＣＩ０１０の突然変異体（図４Ａ）および菌株ＣＩ００６の突然変異体（図４Ｂ）のアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）活性。図４Ｃには、追加の菌株のＡＲＡ活性が示され、図４Ｄには、２つの菌株の経時的なアンモニウム排出プロファイルが示される。
【図４ＣＤ】図４Ａ〜Ｄは、種々の菌株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型を示す。０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖させた菌株ＣＩ０１０の突然変異体（図４Ａ）および菌株ＣＩ００６の突然変異体（図４Ｂ）のアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）活性。図４Ｃには、追加の菌株のＡＲＡ活性が示され、図４Ｄには、２つの菌株の経時的なアンモニウム排出プロファイルが示される。
【００４９】
【図５】図５は、ジアゾトロフィック（ｄｉａｚａｏｔｒｏｐｈｉｃ）窒素固定に関与する菌株ＣＩ００６の９個の異なる遺伝子の培養発現プロファイルを示す。数値は、各転写物の計数を表す。種々の条件（０、１、１０ｍＭのグルタミン、および０％、１０％、２０％のＮ２中大気空気）が示される。
【００５０】
【図６】図６は、トウモロコシ根のＣＩ００６コロニー化を示す。トウモロコシ実生に、ＲＦＰ発現プラスミドを内包するＣＩ００６を接種した。適切な抗生物質と共に灌水することによる２週間の増殖およびプラスミド維持の後、根を回収し、蛍光顕微鏡で画像化した。根細胞間隙のコロニー化を観察する。
【００５１】
【図７】図７は、ＷＴ（ＣＩ０５０）菌株および最適化（ＣＭ００２）菌株の微生物レベルに由来する窒素を示す。
【００５２】
【図８】図８は、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ果実質量アッセイの実験設定を示す。
【００５３】
【図９】図９は、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物果実質量の増加に関する、１０個の菌株のスクリーニングを示す。６回の反復の結果が示されている。３列目は、ｐ＝０．０７。７列目は、ｐ＝０．０５。
【００５４】
【図１０ＡＢ】図１０Ａ〜Ｃは、０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖した候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性に関する追加の結果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｃは、０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖した候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性に関する追加の結果を示す。
【００５５】
【図１１】図１１は、それが由来した単一の突然変異体よりも高いアンモニア排出を示す二重突然変異体を示す。
【００５６】
【図１２】図１２は、施肥条件下のトウモロコシ植物のＮＤＦＡを測定するための１５Ｎガス取り込み実験から得られたＮＤＦＡを示す（曝露日数を使用して外挿した）。
【００５７】
【図１３】図１３は、施肥条件下のＳｅｔａｒｉａ属植物のＮＤＦＡを測定するための１５Ｎガス取り込み実験から得られたＮＤＦＡ値を示す（曝露日数を使用して外挿した）。
【００５８】
【図１４Ａ】図１４Ａは、１５Ｎガスの取り込み率を示す。進化させた菌株を接種した植物は、未接種の植物と比較して、１５Ｎガス取り込みの増加を示した。
【００５９】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、植栽４週間後には、進化させた菌株を接種した植物における窒素の最大７％が、微生物的に固定された窒素に由来することを示す。
【００６０】
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、葉面積（および他のバイオマス測定、データ非表示）が、未接種または野生型の接種済み植物と比較して、進化させた菌株を接種した植物で増加することを示す。
【００６１】
【図１５Ａ】図１５Ａは、進化させた菌株が、植物内トランスクリプトーム研究により測定すると、根組織において著しくより高いｎｉｆＨ産生を示すことを示す。
【００６２】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、植物組織に見出される固定窒素の割合が、その特定の植物がＨｏＭＥ最適化菌株によりコロニー化されている割合と相関することを示す。
【００６３】
【図１６Ａ】図１６Ａは、コロニー化を試験した種々の圃場土壌の土壌テクスチャマップを示す。少数の微生物のそもそもの発生源である土壌には、星印が示されている。
【００６４】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、４つの異なる土壌タイプ（円）にわたって試験した菌株１および菌株５のコロニー化率を示す。両菌株は、多様な土壌タイプにわたって比較的ロバストなコロニー化プロファイルを示した。
【００６５】
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、成長季節の期間にわたって圃場試験で試験した菌株１のコロニー化を示す。菌株１は、植栽後１２週目までトウモロコシ組織に存在し続け、その期間後、コロニー化の低下を示し始める。
【００６６】
【図１７Ａ】図１７Ａは、実施形態による微生物品種改良の模式図を示す。
【００６７】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、図１７Ａに示されているマイクロバイオーム組成の測定の拡大図を示す。
【００６８】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、実施例７で使用されている根の試料採取を示す。
【００６９】
【図１８】図１８は、菌株ＣＩ００６に由来する改変菌株の系統を示す。
【００７０】
【図１９】図１９は、菌株ＣＩ０１９に由来する改変菌株の系統を示す。
【００７１】
【図２０】図２０は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。より大きな画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。ヒートマップの下方にある表は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。ヒートマップに使用されている微生物は、トウモロコシでのＮ産生についてアッセイされた。ＷＴ菌株ＣＩ００６およびＣＩ０１９の場合、トウモロコシ根コロニー化データは、単一の圃場サイトから得た。残りの菌株の場合、コロニー化は、ＷＴ圃場レベルと同じであると仮定した。Ｎ固定活性は、５ｍＭグルタミンでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。
【００７２】
【図２１】図２１は、菌株ＣＩ００６に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７３】
【図２２】図２２は、菌株ＣＭ０２９に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７４】
【図２３】図２３は、菌株ＣＭ０３８に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７５】
【図２４】図２４は、菌株ＣＩ０１９に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７６】
【図２５】図２５は、菌株ＣＭ０８１に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７７】
【図２６】図２６は、菌株ＣＭ０２９およびＣＭ０８１に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７８】
【図２７】図２７は、集計したブッシェル増加／喪失として植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率（ｗｉｎ  ｒａｔｅ）である。
【００７９】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｅは、高硝酸塩農業土壌に類似する条件下で窒素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで固定および排出する誘導体微生物を示す。図２８Ａは、重要な連結点であるＮｉｆＬ、ＮｉｆＡ、ＧＳ、２ドメインＡＴａｓｅ−ＡＲ酵素として示されているＧｌｎＥ、およびＡｍｔＢを含む、ＰＢＣ６．１において窒素固定および同化を制御する調節ネットワークを示す。図２８Ｂは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ分離株ＰＢＣ６．１のゲノムを示す。ゲノムの周りの３つのトラックは、それぞれＰＢＣ６．１、ＰＢＣ６．３８の転写データ、および菌株間の発現差異を示す。図２８Ｃは、窒素固定遺伝子クラスターを示し、転写データは、詳細をより詳しく示すための拡大されている。図２８Ｄは、様々な濃度の外因性窒素下におけるニトロゲナーゼ活性が、アセチレン還元アッセイで測定されていることを示す。野生型菌株は、グルタミン濃度が増加すると共にニトロゲナーゼ活性の抑制を示すが、誘導体菌株は、様々な度合いの頑強性を示す。エラーバーは、少なくとも３回の生物学的反復の平均の標準誤差を表わす。図２８Ｅは、誘導体菌株によるアンモニアの経時的な排出が、ｍＭ濃度で観察されることを示す。野生型菌株は、固定窒素を排出することが観察されず、培地に蓄積するアンモニアは無視できる程度である。エラーバーは、平均の標準誤差を表わす。
【００８０】
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｃは、温室実験により、トウモロコシ中での微生物窒素固定が実証されていることを示す。図２９Ａは、ＰＢＣ６．１誘導体菌株によってトウモロコシ植物に接種した６週間後の微生物コロニー化を示す。エラーバーは、少なくとも８回の生物学的反復の平均の標準誤差を示す。図２９Ｂは、全ＲＮＡを根から抽出し、その後Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を行うことにより測定したｎｉｆＨの植物内転写を示す。誘導体菌株のみが、根環境にてｎｉｆＨ転写を示す。エラーバーは、少なくとも３回の生物学的反復の平均の標準誤差を示す。図２９Ｃは、植物組織での同位体トレーサーの希釈により測定された微生物窒素固定を示す。誘導体微生物は、植物への固定窒素の実質的な移入を示す。エラーバーは、少なくとも１０回の生物学的反復の平均の標準誤差を示す。
【００８１】
【図３０】図３０は、ＰＢＣ６．１が、根付随微生物叢のほぼ２１％存在量までトウモロコシ根でコロニー化することを示す。存在量データは、ＰＢＣ６．１を接種し、温室条件で栽培したトウモロコシ植物の根圏および内圏（ｅｎｄｏｓｐｈｅｒｅ）の１６Ｓアンプリコン配列決定に基づいている。
【００８２】
【図３１】図３１は、ＰＢＣ６．１の誘導体菌株におけるｎｉｆＡの転写率が、アセチレン還元速度と相関していたことを示す。ＡＲＡアッセイを、「方法」に記載の通りに実施し、その後、培養物を試料採取し、ｑＰＣＲ分析にかけて、ｎｉｆＡ転写物レベルを決定した。エラーバーは、各測定での少なくとも３回の生物学的反復の平均の標準誤差を示す。
【００８３】
【図３２】図３２は、２０１７年夏の圃場試験実験の結果を示す。得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、潜在的な肥料置換物としての役目を果たすことができることを実証する。例えば、本開示の微生物（つまり、６−４０３）の使用は、野生型菌株（ＷＴ）より高い収穫高および未処理対照（ＵＴＣ）よりも高い収穫高をもたらした。「−２５ｌｂ  Ｎ」処理では、その地域の標準的農業実施よりも１エーカー当たり２５ｌｂ少ないＮが使用される。「１００％Ｎ」ＵＴＣ処理は、その地域の標準的農業実施を示すことが意図されており、Ｎの標準的使用の１００％が、農業従事者により配置される。微生物「６−４０３」は、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託され、表Ａに見出すことができる。これは突然変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ（ＣＭ０３７とも呼ばれる）であり、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代突然変異体菌株である。
【００８４】
【図３３】図３３は、２０１７年夏の圃場試験実験の結果を示す。得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、栽培地（ｌｏｃａｔｉｏｎ）全体にわたって一貫して性能を発揮することを実証する。さらに、収穫高の結果は、本開示の微生物が、窒素ストレス環境ならびに十分な窒素供給を有する環境の両方で良好な性能を発揮することを実証する。微生物「６−８８１」（ＣＭ０９４、ＰＢＣ６．９４としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託され、表Ａに見出すことができる。微生物「１３７−１０３４」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託され、表Ａに見出すことができる。微生物「１３７−１０３６」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、表Ａに見出すことができる。微生物「６−４０４」（ＣＭ３８、ＰＢＣ６．３８としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託され、表Ａに見出すことができる。「栄養ストレス」条件は、０％窒素管理体制に相当する。「十分な肥料」条件は、１００％窒素管理体制に相当する。
【００８５】
【図３４】図３４は、菌株ＣＩ００６（「６」、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ  ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
【００８６】
【図３５】図３５は、菌株ＣＩ０１９（「１９」、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ  ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
【００８７】
【図３６】図３６は、菌株ＣＩ１３７（「１３７」、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ  ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
【００８８】
【図３７】図３７は、菌株１０２１（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ  ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
【００８９】
【図３８】図３８は、菌株９１０（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
【００９０】
【図３９】図３９は、菌株６３（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ  ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
【００９１】
【図４０】図４０は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。より大きな画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。実施例１２の表Ｃは、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。図４０のデータは、圃場条件におけるトウモロコシ中のＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の圃場サイトからのトウモロコシ根コロニー化データを使用した、微生物により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。
【００９２】
【図４１】図４１は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。より大きな画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。実施例１２の表Ｄは、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。図４１のデータは、実験室および温室条件におけるトウモロコシ中のＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の菌株により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。白色点は、トウモロコシ根コロニー化データが温室条件で収集された菌株を表わす。黒色点は、トウモロコシ根コロニー化レベルが、野生型親菌株の平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルから導き出されている突然変異体菌株を表わす。斜線付き点は、平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルの野生型親菌株を表わす。全ての場合で、Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイにより決定した。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
［００９２．１］
本発明の種々の実施形態が本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は例示のために提供されているに過ぎないことは、当業者には明白と予想される。当業者であれば、本発明から逸脱せずに多数の改変、変更、および置換を起想すると予想される。本明細書に記載されている本発明の実施形態の種々の代替形態を用いることができることが理解されるべきである。
［００９２．２］
肥料使用の増加は、それと共に環境上の懸念をもたらし、また、多くの経済的苦境にある地球上の地域では可能でない可能性が高い。さらに、微生物分野の多くの産業関係者が、属間微生物の生成に着目している。しかしながら、属間性であると特徴付けられる／分類される操作された微生物には、厳しい規制負担がある。こうした属間微生物は、広範な採用および実施を困難にするより大きな規制負担に直面するだけでなく、厳しい市民の監視の目にも直面する。
［００９２．３］
現在、非属間であり、非マメ科作物での窒素固定を増加させることが可能である市販の操作された微生物は存在しない。そのような微生物のこの欠如は、真に環境に優しく、より持続可能な２１世紀農業系への導きを支援するために欠けている要素である。
［００９２．４］
本開示は、前述の問題を解決し、作物中で窒素を容易に固定するように操作されている非属間微生物を提供する。こうした微生物は、属間微生物であると特徴付け／分類されず、したがってそのような厳格な規制負担に直面しないと予想される。さらに、教示される非属間微生物は、２１世紀の農業従事者が、かつてなく増加する量の外因性窒素肥料の使用に依存しなくなるように支援する役目を果たすと予想される。
［００９２．５］
定義
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、あらゆる３次元構造も有してもよく、公知か未知かに関わらず、あらゆる機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、下記：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析で規定された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等のうちの１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造への改変は、存在する場合、ポリマー構築の前に付与されてもよく、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後にさらに改変されてもよい。
［００９２．６］
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを反応させて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック型塩基対により生じてもよく、フーグスティン結合により生じてもよく、または塩基相補性による任意の他の配列特異的様式で生じてもよい。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖複合体を形成する３本またはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素切断等の、より広範なプロセスのステップを構成してもよい。第１の配列に相補的な第２の配列は、第１の配列の「相補体」と呼ばれる。用語「ハイブリダイズ可能な」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応にて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する能力を指す。
［００９２．７］
「相補性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型のいずれかにより別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の残基のパーセントを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の隣接残基が全て、第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することになることを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の度合いを指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。相補性パーセントを評価する目的のため等の配列同一性は、これらに限定されないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照。任意選択で初期設定を使用してもよい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照。任意選択で初期設定を使用してもよい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒアライナーを参照。任意選択で初期設定を使用してもよい）を含む任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより測定することができる。初期設定パラメータを含む、選択したアルゴリズムの任意の好適なパラメータを使用して、最適なアラインメントを評価することができる。
［００９２．８］
一般的に、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列との相補性を有する核酸が、主に標的配列とハイブリダイズするが、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般的に配列依存性であり、幾つかの要因に応じて様々である。一般的に、配列が長いほど、その配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３年）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。
［００９２．９］
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと等）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称される場合がある。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡスプライシングを含む場合がある。
［００９２．１０］
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では相互交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であってもよくまた分岐していてもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。また、これら用語は、改変されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーション等の任意の他の操作を包含する。用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、グリシンおよびＤまたはＬの両光学異性体を含む天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。
［００９２．１１］
本明細書で使用される場合、用語「約」は、用語「およそ」と同義的に使用される。例示的には、量に関する用語「約」の使用は、数値が、言及されている数値のわずかに外側にあること、例えば、プラスまたはマイナス０．１％〜１０％であることを示す。
［００９２．１２］
用語「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」は、培養物の複製を妨げたり、または通常の細菌学的技法によって検出されたりするほどの量の他の細菌種を含まない、本明細書に記載の細菌種の培養を指す。
［００９２．１３］
「植物生産性」は、一般的に、植物を成長させる根拠となる植物の成長または発達のあらゆる態様を指す。穀物または野菜等の食用作物の場合、「植物生産性」は、特定の作物から収穫される穀物（ｇｒａｉｎ）または果実の収穫高を指す場合がある。本明細書で使用される場合、植物生産性の向上は、穀物、果実、花、または種々の目的で収穫される他の植物部分の収穫高の向上；茎、葉、および根を含む植物部分の成長の向上；植物成長の促進；葉における高葉緑素含有量の維持；果実数または種子数の増加；果実重量または種子重量の増加；窒素肥料使用量の削減によるＮＯ２排出削減；および植物の成長および発達の類似の向上を、幅広く指す。
［００９２．１４］
食用作物内および周囲の微生物は、それら作物の形質に影響を及ぼす場合がある。微生物により影響を受ける場合がある植物形質としては、以下のものが挙げられる：収穫高（例えば、穀物生産、バイオマス生成、果実形成、着花）；栄養（例えば、窒素、リン、カリウム、鉄、微量栄養素の獲得）；非生物ストレス管理（例えば、干ばつ耐性、耐塩性、耐熱性）；および生物ストレス管理（例えば、害虫、雑草、昆虫、真菌、および細菌）。作物形質を変更するための戦略としては、以下のものが挙げられる：重要な代謝物濃度を増加させること；重要な代謝物に対する微生物影響の経時的動態を変更すること；微生物代謝物産生／分解を新しい環境的要因と関連させること；負の代謝物を減少させること；および代謝物またはそれらの根底をなすタンパク質のバランスを向上させること。
［００９２．１５］
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。
［００９２．１６］
本明細書で使用される場合、「植物内」は、植物の中を指し、植物は、植物の部分、組織、葉、根、茎、種子、胚珠、花粉、花、果実等をさらに含む。
［００９２．１７］
一部の実施形態では、本開示の遺伝子の天然または内因性制御配列は、１つまたは複数の属内制御配列と置換されている。
［００９２．１８］
本明細書で使用される場合、「導入」は、天然の導入ではなく、現代的なバイオテクノロジーによる導入を指す。
［００９２．１９］
一部の実施形態では、本開示の細菌は、改変されており、天然の細菌ではない。
［００９２．２０］
一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、または１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも約１０３ｃｆｕ、約１０４ｃｆｕ、約１０５ｃｆｕ、約１０６ｃｆｕ、約１０７ｃｆｕ、約１０８ｃｆｕ、約１０９ｃｆｕ、約１０１０ｃｆｕ、約１０１１ｃｆｕ、または約１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３〜１０９、１０３〜１０７、１０３〜１０５、１０５〜１０９、１０５〜１０７、１０６〜１０１０、１０６〜１０７ｃｆｕの量で植物中に存在する。
［００９２．２１］
本開示の肥料および外来性窒素は、以下の窒素含有分子：アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア、グルタミン等を含んでもよい。本開示の窒素源としては、以下のものを挙げることができる：無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素の形態、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等。
［００９２．２２］
本明細書で使用される場合、「外来性窒素」は、アンモニア、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、尿酸、アンモニウム酸等を含む、非窒素制限条件下で存在する、土壌、圃場、または増殖培地で容易に利用可能な非大気窒素を指す。
［００９２．２３］
本明細書で使用される場合、「非窒素制限条件」は、Ｋａｎｔら、（２０１０年、Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．、６２巻（４号）：１４９９〜１５０９頁）に開示されているような、約４ｍＭ窒素を超える濃度で土壌、圃場、培地で利用可能な非大気窒素を指す。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
［００９２．２４］
本明細書で使用される場合、「属間微生物」は、元々は異なる分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微生物である。「属間突然変異」は、「属間微生物」と相互交換可能に使用される場合がある。例示的な「属間微生物」は、レシピエント微生物とは異なる属の微生物で最初に同定された可動遺伝要素を含有する微生物を含む。さらなる説明は、特に、連邦規則集第４０巻セクション７２５．３に見出すことができる。
［００９２．２５］
態様では、本明細書で教示された微生物は、「非属間」であり、これは、微生物が属間ではないことを意味する。
［００９２．２６］
本明細書で使用される場合、「属内微生物」は、元々は同じ分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微生物である。「属内突然変異」は、「属内微生物」と相互交換可能に使用される場合がある。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「導入された遺伝物質」は、レシピエントのゲノムに付加され、レシピエントのゲノムの成分として残留する遺伝物質を意味する。
【００９５】
一部の実施形態では、窒素固定および同化の遺伝子調節ネットワークは、遺伝子をコードするポリヌクレオチドならびに微生物の窒素固定および／または同化を指示、調整、および／または調節する非コード配列を含み、ｎｉｆクラスター（例えば、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＣ、．．．ｎｉｆＺ）のポリヌクレオチド配列、窒素調節タンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチド、窒素調節タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎクラスター（例えば、ｇｌｎＡおよびｇｌｎＤ）のポリヌクレオチド配列、ｄｒａＴ、およびアンモニア輸送体／パーミアーゼを含んでもよい。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶを含んでいてもよい。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶのサブセットを含んでいてもよい。
【００９６】
一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の窒素を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の窒素を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量で約５％〜５０％、約５％〜７５％、約１０％〜５０％、約１０％〜７５％、約１５％〜５０％、約１５％〜７５％、約２０％〜５０％、約２０％〜７５％、約２５％〜５０％、約２５％〜７５％、約３０％〜５０％、約３０％〜７５％、約３５％〜５０％、約３５％〜７５％、約４０％〜５０％、約４０％〜７５％、約４５％〜５０％、約４５％〜７５％、または約５０％〜７５％の窒素を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、窒素固定の増加および／または植物における窒素の１％またはそれよりも多くの産生は、本開示の細菌に曝露していない対照植物と比較して測定される。細菌の増加または減少は全て、対照細菌と比較して測定される。植物の増加または減少は全て、対照植物と比較して測定される。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下でおよび／またはほとんどの発生段階中で活性なプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクターの構成的プロモーターを使用することには、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベル産生；容易な検出および定量化を可能にするレポータータンパク質またはスコア化可能なマーカーの高レベル発現；転写調節系の一部である転写因子の高レベル産生；生物中で遍在活性が必要とされる化合物の産生；および全ての発生段階中に必要とされる化合物の産生等の幾つかの利点がある。非限定的で例示的な構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、オパインプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター等が挙げられる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「非構成的プロモーター」は、ある特定の条件下で、ある特定のタイプの細胞で、および／またはある特定の発生段階中に活性なプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的、細胞タイプ優先的な誘導性プロモーター、および発生制御下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生制御下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織で優先的に転写を開始させるプロモーターが挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「誘導性」または「抑制可能な」プロモーターは、化学因子または環境因子の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件等が挙げられる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織でのみ転写を開始させるプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的な発現は、幾つかの遺伝子調節レベルの相互作用の結果である。したがって、当技術分野では、時には、同種のまたは緊密に関連する種に由来するプロモーターを使用して、特定の組織における効率的で信頼性の高い導入遺伝子の発現を達成することが好ましい。これは、特定の組織から単離された組織特異的プロモーターが大量に、科学文献および特許文献の両方に見出されることの主な理由の１つである。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により調節されるように、核酸配列を単一の核酸断片上で関連させることを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節することが可能な（つまり、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、そのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センス配向性で調節配列に作動可能に連結してもよく、またはアンチセンス配向性で調節配列に作動可能に連結してもよい。別の例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’に、または標的ｍＲＮＡの３’に、または標的ｍＲＮＡ内に、直接または間接のいずれかで作動可能に連結してもよい。または、第１の相補的領域が５’であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’である。
【０１０５】
態様では、「植物に複数の非属間細菌を適用する」は、植物（種子、根、茎、組織などの植物部分を含む）を、植物の生活環の任意の段階にて前記細菌と接触させる（つまり、曝露する）ための任意の手段を含む。したがって、「植物に複数の非属間細菌を適用する」は、植物を（種子、根、茎、組織などの植物部分を含む）を前記細菌に曝露するための以下の手段をいずれをも含む：植物に噴霧すること、植物に滴下すること、種子被膜として塗布すること、その後種子を植栽することになる圃場に施すこと、種子を既に植栽した圃場に施すこと、成体植物を有する圃場に施すことなど。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「ＭＲＴＮ」は、対窒素最大収益（ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｔｕｒｎ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）の頭字語であり、実施例の実験処理として使用されている。ＭＲＴＮは、アイオワ州立大学により開発された。情報は、ｈｔｔｐ：／／ｃｎｒｃ．ａｇｒｏｎ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／に見出すことができる。ＭＲＴＮは、窒素適用の経済的純収益が最大化される窒素割合である。ＭＲＴＮを算出する手法は、個々の状態のトウモロコシ窒素割合ガイドラインを開発するための地域別手法である。大豆後のトウモロコシ植栽およびトウモロコシ後のトウモロコシ植栽に関して適切な数の研究試験が入手可能であったイリノイ州、アイオワ州、ミシガン州、ミネソタ州、オハイオ州、およびウィスコンシン州の窒素割合試験データが評価された。試験は、噴出施肥、側方施肥、または植栽前／側方分割施肥（ｓｐｌｉｔ  ｐｒｅｐｌａｎｔ／ｓｉｄｅｄｒｅｓｓ）で適用した窒素で実施され、サイトは、ウィスコンシン州の潅漑砂地で必要とされたものを除いて潅漑されなかった。ＭＲＴＮは、トウモロコシ生産に必要とされる示唆された窒素割合を決定するための方法に明白な差異があること、窒素割合ガイドラインに関する誤解、および適用割合に対する懸念があるため、アイオワ州立大学により開発された。ＭＲＴＮの算出により、実施者は、以下のことを決定することができる：（１）窒素適用の経済的純収益が最大化される窒素割合、（２）窒素の最終増分が、追加の窒素の費用をに賄うのに十分大きな収穫高増加を生み出すポイントである経済的に最適な窒素割合、（３）窒素適用に起因するトウモロコシ穀物増加の値、およびより多くの窒素の適用がトウモロコシ収穫高の増加をもたらさない収穫高である最大収穫高。したがって、ＭＲＴＮ計算は、様々な地域でのトウモロコシ作物を最大化しつつ、窒素適用からの金融上の利得を最大化する手段を実施者に提供する。
【０１０７】
用語「ｍｍｏｌ」は、ミリモルの略語であり、本明細書ではｍｏｌと略されるモルの１０００分の１（１０−３）である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「微小生物」または「微生物」という用語は、広義に解釈されるべきである。これらの用語は、相互交換可能に使用され、２つの原核生物ドメインである細菌および古細菌を含むが、それらに限定されない。この用語は、真核生物真菌および原生生物を包含することもできる。
【０１０９】
用語「微生物コンソーシア」または「微生物コンソーシアム」は、個々の微生物種または種の菌株の微生物共同体のサブセットを指し、共通の機能を実施すると説明することができるか、または目的の表現型形質などの認識可能なパラメーターに関与する、もしくは結び付く、もしくは相関すると説明することができる。
【０１１０】
用語「微生物共同体」は、２つまたはそれよりも多くの種または菌株を含む微生物の群を意味する。微生物コンソーシアとは異なり、微生物共同体は、共通の機能を実施している必要はないか、または目的の表現型形質などの認識可能なパラメーターに関与する、もしくは結び付く、もしくは相関する必要はない。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「単離する」、「単離された」、「単離された微生物」、および類似の用語は、１つまたは複数の微小生物が、特定の環境（例えば、土壌、水、植物組織など）に付随している物質の少なくとも１つから分離されていることを意味することが意図されている。したがって、「単離された微生物」は、その天然に存在する環境に存在せず、むしろ、微生物は、本明細書に記載の種々の技法により、その自然設定から取り出されており、天然に存在しない存在状態に置かれている。したがって、単離された菌株または単離された微生物は、例えば、生物学的に純粋な培養物または胞子（または菌株の他の形態）として存在していてもよい。態様では、単離された微生物は、農業的に許容される担体であってもよい許容される担体に付随していてもよい。
【０１１２】
本開示のある特定の態様では、単離された微生物は、「単離された生物学的に純粋な培養物」として存在する。当業者であれば、特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、前記培養物が、他の生存生物を実質的に含まず、問題としている個々の微生物のみを含むことを示すことを理解すると予想される。培養物は、様々な濃度の前記微生物を含むことができる。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物は、「より純粋でないかまたは不純な物質とは必然的に異なる」ことが多いことが留意される。例えば、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍに関して、４２７  Ｆ．２ｄ  １３９４（ＣＣＰＡ１９７０）（精製プロスタグランジンに関する考察）を参照されたい。またＢｅｒｇｙに関して、５９６  Ｆ．２ｄ  ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（精製微生物に関する考察）を参照されたい。またＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ＆Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ＆Ｃｏ．、１８９  Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（精製アドレナリンに関するＬｅａｒｎｅｄ  Ｈａｎｄの考察）、部分的に支持され部分的に破棄されている１９６  Ｆ．４９６（２ｄ  Ｃｉｒ．１９１２）を参照されたい。これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、一部の態様では、本開示は、単離された生物学的に純粋な微生物培養物内に見出されなければならない濃度または純度限定に関するある特定の定量的尺度を提供する。ある特定の実施形態では、こうした純度値の存在は、本開示の微生物を、天然の状態で存在する微生物と区別するさらなる属性である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ  Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、２５３  Ｆ．２ｄ  １５６（４ｔｈ  Ｃｉｒ．１９５８）（微生物により産生されるビタミンＢ１２の純度限定に関する考察）を参照されたい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「個々の単離株」は、１つまたは複数の他の微小生物から分離された後の、微小生物の優位な単一の属、種、または菌株を含む組成物または培養物を意味すると解釈されるべきである。
【０１１４】
本開示の微生物は、胞子および／または栄養細胞を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本開示の微生物は、生存可能であるが培養不能な（ＶＢＮＣ）状態の微生物を含む。本明細書で使用される場合、「胞子」または「胞子（複数）」は、生存および散布に適した、細菌および真菌により生成された構造を指す。胞子は、一般的には、休眠構造と特徴付けられるが、胞子は、発芽プロセスにより分化することが可能である。発芽は、胞子が、代謝活性、成長、および生殖が可能な栄養細胞へと分化することである。単一の胞子の発芽は、単一の真菌または細菌栄養細胞をもたらす。真菌胞子は、無性生殖の単位であり、一部の場合では、真菌生活環に必要な構造である。細菌胞子は、通常は、栄養細胞の生存または成長に貢献しない場合がある生存条件の場合の構造である。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「微生物組成物」は、本開示の１つまたは複数の微生物を含む組成物を指す。一部の実施形態では、微生物組成物は、植物（種々の植物部分を含む）および／または農業圃場に投与される。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「担体」、「許容される担体」、または「農業的に許容される担体」は、微生物を共に投与することができ、微生物に有害な影響を及ぼさない希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【０１１７】
窒素固定の調節
一部の場合では、窒素固定経路は、遺伝子操作および最適化の標的としての役目を果たす場合がある。本明細書に記載の方法による調節の標的となり得る１つの形質は、窒素固定である。窒素肥料は、農場における最も大きな運営上の出費であり、トウモロコシおよび小麦のような条植え作物の収穫高を向上させる最大の誘因である。本明細書には、非マメ科作物に再生可能な形態の窒素を送達することができる微生物製品が記載されている。一部の内部寄生菌は、純粋培養での窒素固定に必要な遺伝的特徴を有するが、根本的な技術的難問は、穀類（ｃｅｒｅａｌ）およびイネ科植物の野生型内部寄生菌は、施肥圃場では窒素固定を中止してしまうことである。化学肥料の施肥および圃場土壌中の残留窒素レベルは、微生物に対して、窒素固定の生化学経路を停止するようにシグナルを送る。
【０１１８】
肥料の存在下でも窒素を固定してトウモロコシへと移行させることが可能な微生物の開発のためには、窒素固定調節ネットワークの構成成分の転写レベルおよび翻訳後レベルを変更することが有益であり得る。そのため、本明細書には、調節ネットワークを的確に進化させ、新規の表現型を誘発させるための宿主微生物進化（ＨｏＭＥ）技術が記載されている。また、本明細書には、トウモロコシから単離された窒素固定内部寄生菌の固有の独自ライブラリーが、窒素ストレスおよび窒素過剰のような異なる環境条件下での微生物および宿主植物の相互作用を取り巻く広範なオーミクスデータと対にして記載されている。一部の実施形態では、この技術により、内部寄生菌の遺伝子調節ネットワークを的確に進化させて、圃場に肥料が存在する場合であっても活発に窒素を固定する微生物を産生することが可能になる。また、本明細書には、トウモロコシ根組織をコロニー化し、施肥されている植物のために窒素を産生する微生物に進化させる技術的可能性のが評価ならびに微生物を現代的窒素管理戦略に統合する実現可能性を決定するために、内部寄生菌と、標準的製剤化慣例および多様な土壌との適合性の評価が記載されている。
【０１１９】
窒素元素（Ｎ）を化学合成に利用するために、生命体は、窒素固定として公知であるプロセスにおいて、大気中で利用可能な窒素ガス（Ｎ２）を水素と化合させる。生物学的窒素固定は性質がエネルギー集約的であるため、ジアゾトロフ（大気窒素ガスを固定する細菌および古細菌）は、環境中の酸素および利用可能な窒素に応答してｎｉｆ遺伝子クラスターを精巧および厳密に調節するように進化している。Ｎｉｆ遺伝子は、窒素固定に関与する酵素（ニトロゲナーゼ複合体等の）および窒素固定を調節するタンパク質をコードする。Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ（２０１３年、Ｇｌｏｂａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８巻（４号）：８４〜９４頁）には、ｎｉｆ遺伝子およびそれらの産物の詳細な記載が開示されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書には、向上された形質を有する植物を産生するための方法であって、第１の植物から細菌を単離するステップ；単離された細菌の遺伝子に遺伝子変異を導入して窒素固定を増加させるステップ；第２の植物を変異細菌に曝露するステップ；第１の植物と比べて向上された形質を有する第２の植物から細菌を単離するステップ；および第２の植物から単離された細菌を用いてステップを繰り返すステップを含む方法が記載されている。
【０１２０】
プロテオバクテリアでは、ｎｉｆクラスターの正の転写制御因子である、σ５４依存性エンハンサー結合タンパク質ＮｉｆＡが、窒素固定の調節に中心的な役割を果たす。活性ＮｉｆＡの細胞内レベルは、２つの主な因子：ｎｉｆＬＡオペロンの転写およびＮｉｆＬとのタンパク質間相互作用によるＮｉｆＡ活性の阻害により制御される。これらプロセスは両方とも、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｕｌｌａｒ）グルタミンレベルに応答性である。このカスケードは、ＧｌｎＤにより媒介され、ＧｌｎＤは、グルタミンを直接的に感知し、結合グルタミンの非存在または存在に応答して、２つのＰＩＩ調節タンパク質ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化または脱ウリジリル化をそれぞれ触媒する。窒素過剰条件下では、未改変ＧｌｎＢが、ｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化シグナルを送る。しかしながら、窒素制限条件下では、ＧｌｎＢは翻訳後修飾を受け、それによりその活性が阻害され、ｎｉｆＬＡオペロンの転写に結び付く。このように、ｎｉｆＬＡ転写は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に制御されている。ＮｉｆＡの翻訳後レベル調節では、ＧｌｎＫは、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルに依存する様式（ｍａｔｔｅｒ）でＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害する。
【０１２１】
ＮｉｆＡは、ｎｉｆＬＡオペロンから転写され、そのプロモーターは、別のσ５４依存性制御因子であるリン酸化ＮｔｒＣにより活性化される。ＮｔｒＣのリン酸化状態は、ヒスチジンキナーゼＮｔｒＢにより媒介され、ＮｔｒＢは、脱ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用するが、ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用しない。窒素過剰条件下では、高い細胞内レベルのグルタミンは、ＧｌｎＢの脱ウリジリル化に結び付き、脱ウリジリル化されたＧｌｎＢは、その後ＮｔｒＢと相互作用して、そのリン酸化活性を不活化し、そのホスファターゼ活性を活性化させて、ＮｔｒＣの脱リン酸化およびｎｉｆＬＡプロモーターの不活化がもたらされる。しかしながら、窒素制限条件下では、低レベルの細胞内グルタミンは、ＧｌｎＢのウリジリル化をもたらし、それにより、ＮｔｒＢとのその相互作用が阻害され、ＮｔｒＣのリン酸化およびｎｉｆＬＡオペロンの転写を可能にする。このように、ｎｉｆＬＡ発現は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に制御される。ｎｉｆＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、およびｇｌｎＢは全て、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。また、こうしたプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答する場合がある。
【０１２２】
また、ＮｉｆＡの活性は、最も典型的にはＮｉｆＡ活性のＮｉｆＬ媒介性阻害により、環境窒素に応答して翻訳後に調節される。一般的に、ＮｉｆＬとＮｉｆＡとの相互作用は、ＧｌｎＫを介したＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより影響を受けるが、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用の性質は、ジアゾトロフ間で著しく異なる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、両形態のＧｌｎＫが、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害し、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用は、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルにより決定される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、アンモニウム輸送体ＡｍｔＢと相互作用し、これは、ＡｍｔＢによるアンモニウム取り込みを阻止すると共に、ＧｌｎＫを膜に隔離し、ＮｉｆＬによるＮｉｆＡの阻害を可能にする役目を果たす。一方、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉでは、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用およびＮｉｆＡ阻害には、脱ウリジリル化ＧｌｎＫとの相互作用が必要であるが、ＧｌｎＫのウリジリル化は、ＮｉｆＬとの相互作用を阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子が欠如したジアゾトロフでは、ＮｉｆＡ活性は、窒素過剰条件下では、ＧｌｎＫおよびＧｌｎＢの両方の脱ウリジリル化形態との相互作用により直接的に阻害されるという証拠が存在する。一部の細菌では、Ｎｉｆクラスターが、ｇｌｎＲにより調節される場合があり、さらに一部の場合では、これは、負の調節を含む場合がある。その機序に関わらず、ほとんどの公知ジアゾトロフでは、ＮｉｆＡの翻訳後阻害は、ｎｉｆクラスターの重要な制御因子である。加えて、ｎｉｆＬ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫおよびｇｌｎＲは、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。
【０１２３】
多くのジアゾトロフは、ｎｉｆ遺伝子クラスターの転写調節に加えて、ニトロゲナーゼ遮断として公知である、ニトロゲナーゼ酵素自体の直接的翻訳後修飾および阻害の機序を進化させている。これは、窒素過剰条件下でのＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）のＡＤＰリボシル化により媒介される。それにより、ＭｏＦｅタンパク質複合体（ＮｉｆＤＫ）との相互作用が妨害され、ニトロゲナーゼ活性が消失する。ＤｒａＴは、Ｆｅタンパク質のＡＤＰリボシル化およびニトロゲナーゼの遮断を触媒し、ＤｒａＧは、ＡＤＰリボースの除去およびニトロゲナーゼの再活性化を触媒する。ｎｉｆＬＡ転写およびＮｉｆＡ阻害の場合と同様に、ニトロゲナーゼ遮断は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードによっても調節される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＢは、ＤｒａＴと相互作用してＤｒａＴを活性化し、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＤｒａＧおよびＡｍｔＢの両方と相互作用して複合体を形成し、ＤｒａＧを膜に隔離する。窒素制限条件下では、ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化形態は、それぞれＤｒａＴおよびＤｒａＧと相互作用せず、ＤｒａＴの不活化およびＤｒａＧのＦｅタンパク質への拡散に結び付き、そこでＡＤＰリボースが除去され、ニトロゲナーゼが活性化される。また、本明細書に記載の方法では、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、およびｄｒａＴ遺伝子に遺伝子変異を導入することが企図される。
【０１２４】
一部の内部寄生菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで窒素を固定する能力を有するが、この遺伝的特徴は、しばしば、圃場では高レベルの外因性化学肥料によりサイレンシングされる。圃場に基づく窒素固定を容易にするために、外来性窒素の感知をニトロゲナーゼ酵素の発現と切り離すことができる。さらに、ニトロゲナーゼ活性の統合を経時的に向上させることは、作物により利用される窒素の産生を増大させる役目を果たす。本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための具体的な標的としては、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子が挙げられる。
【０１２５】
本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための追加の標的は、ＮｉｆＡタンパク質である。ＮｉｆＡタンパク質は、典型的には、窒素固定遺伝子発現の活性化因子である。ＮｉｆＡの産生を増加させることにより（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、天然アンモニア感知経路が回避される。加えて、ＮｉｆＡの公知阻害剤であるＮｉｆＬタンパク質の産生を低減することは、遊離活性ＮｉｆＡレベルの増加にも結び付く。加えて、ｎｉｆＡＬオペロンの転写レベルを増加させることは（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、全体的により高いレベルのＮｉｆＡタンパク質にも結び付く。ｎｉｆＡＬ発現のレベル上昇は、プロモーター自体を変更することにより、またはＮｔｒＢ（元々は高窒素条件中にｎｉｆＡＬオペロンの遮断をもたらすことになるｎｔｒＢおよびｎｔｒＣシグナル伝達カスケードの一部）の発現を低減させることにより達成される。これらまたは本明細書に記載の任意の他の方法により達成される高レベルのＮｉｆＡは、内部寄生菌の窒素固定活性を増加させる。
【０１２６】
本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための別の標的は、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ  ＰＩＩシグナル伝達カスケードである。細胞内グルタミンレベルは、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ  ＰＩＩシグナル伝達カスケードにより感知される。ＧｌｎＤのウリジリル除去活性を消失させるＧｌｎＤの活性部位突然変異は、窒素感知カスケードを妨害する。加えて、ＧｌｎＢ濃度の低減は、グルタミン感知カスケードを短絡させる。こうした突然変異により、細胞を「騙して」窒素制限状態であると認識させ、それにより窒素固定レベル活性を増加させる。また、こうしたプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答する場合がある。
【０１２７】
ａｍｔＢタンパク質も、本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的である。環境からのアンモニア取り込みは、ａｍｔＢタンパク質の発現レベルを減少させることにより低減させることができる。細胞内アンモニアが存在しないと、内部寄生菌は、アンモニアのレベルが高いことを感知することができず、窒素固定遺伝子の下方制御が防止される。細胞内区画への進入を果たしたアンモニアは全てグルタミンに変換される。細胞内グルタミンレベルは、窒素を感知するための主要な媒介物である。細胞内グルタミンレベルを減少させることにより、細胞が、環境中のアンモニウムレベルが高いことを感知することが防止される。この効果は、グルタミンをグルタメートに変換する酵素であるグルタミナーゼの発現レベルを増加させることにより達成できる。加えて、細胞内グルタミンは、グルタミン合成酵素（アンモニアをグルタミンに変換する酵素）を減少させることによっても低減させることができる。ジアゾトロフでは、固定されたアンモニアは、細胞プロセスに使用されることになるグルタミンおよびグルタメートへと迅速に同化される。アンモニア同化の妨害は、固定窒素を転換して、アンモニアとして細胞から搬出されることを可能にする場合がある。固定されたアンモニアは、主にｇｌｎＡによりコードされているグルタミン合成酵素（ＧＳ）によりグルタミンへと、その後はグルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＧＡＴ）によりグルタミンへと同化される。一部の例では、ｇｌｎＳは、グルタミン合成酵素をコードする。ＧＳは、ＧＳアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ）、つまり、それぞれアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインの活性によりＧＳのアデニリル化および脱アデニリル化の両方を触媒する、ｇｌｎＥによりコードされた二機能性酵素により、翻訳後に調節される。窒素制限条件下では、ｇｌｎＡが発現され、ＧｌｎＥのＡＲドメインは、ＧＳを脱アデニリル化し、ＧＳの活性化を可能にする。窒素過剰条件下では、ｇｌｎＡ発現は中止され、ＧｌｎＥのＡＴドメインは、グルタミンによりアロステリック的に活性化され、ＧＳのアデニリル化および非活性化が引き起こされる。
【０１２８】
さらに、ｄｒａＴ遺伝子もまた、本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的であってもよい。細胞により窒素固定酵素が産生されると、ニトロゲナーゼ遮断が、細胞が高窒素条件で固定活性を下方制御する別のレベルを表す。この遮断は、ＤｒａＴの発現レベルを減少させることにより除去することができる可能性がある。
【０１２９】
新しい微生物表現型を付与するための方法は、転写レベル、翻訳レベル、および翻訳後レベルで実施することができる。転写レベルでは、プロモーターを変更すること（プロモーターの全てまたは一部の欠失を含む、転写因子に対するシグマ因子親和性または結合部位の変更等）または転写ターミネーターおよびアテニュエータを変更することが含まれる。翻訳レベルでは、リボソーム結合部位での変更、およびｍＲＮＡ分解シグナルを変更することが含まれる。翻訳後レベルでは、酵素の活性部位を突然変異させること、およびタンパク質間相互作用を変更させることが含まれる。こうした変更は、数多くの方法で達成することができる。発現レベルの低減（または完全な消失）は、天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはプロモーターを、強度／効率がより低いものと交換することにより達成することができる。ＡＴＧ開始部位を、ＧＴＧ、ＴＴＧ、またはＣＴＧ開始コドンと交換してもよい。それにより、コード領域の翻訳活性の低減がもたらされる。発現の完全な消失は、遺伝子のコード領域をノックアウト（欠失）することにより行うことができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をフレームシフトすると、ＯＲＦに中途終止コドンがもたらされ、非機能性の短縮産物が作成されることになる可能性がある。同様に、インフレーム終止コドンの挿入も、非機能性の短縮産物を作成することになる。Ｎ末端またはＣ末端に分解タグを付加することでも、特定の遺伝子の有効濃度を低減することができる。
【０１３０】
反対に、本明細書に記載されている遺伝子の発現レベルは、より強力なプロモーターを使用することにより達成することができる。高窒素レベル条件（または任意の他の条件）中のプロモーター活性を確実に高くするために、高窒素レベル条件における全ゲノムの転写プロファイルを取得し、そのデータセットから、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを選択して、弱いプロモーターを置換してもよい。弱い開始コドンを、より良好な翻訳開始効率のＡＴＧ開始コドンと交換してもよい。また、弱いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を、より高い翻訳開始効率を有する異なるＲＢＳと交換してもよい。また、加えて、部位特異的突然変異を実施して、酵素の活性を変更してもよい。
【０１３１】
植物に生じる窒素固定のレベルを増加させることは、作物生産に必要とされる化学肥料の量の低減に結びつき、温室効果ガス排出（例えば、亜酸化窒素）を削減することができる。
【０１３２】
細菌集団の生成
細菌の単離
本明細書で開示された方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより得ることができる。微生物は、種子を粉砕して微生物を単離することにより得ることができる。微生物は、種子を多様な土壌試料に植栽し、組織から微生物を回収することにより得ることができる。加えて、微生物は、植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に出現するかを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、または塊茎を挙げることができる。
【０１３３】
微生物を得るための方法は、細菌を土壌から分離することによるものであってもよい。細菌は、種々の土壌タイプから収集することができる。一部の例では、土壌は、高肥沃度または低肥沃度、水分のレベル、ミネラルのレベル、および種々の作付け実施などの形質により特徴付けられ得る。例えば、土壌は、異なる作物が、連続した植栽季節で同じ土壌に植栽される輪作に関与する場合がある。同じ土壌での異なる作物の連続栽培は、ある特定のミネラルの不均衡な欠乏を予防することができる。細菌は、選択された土壌で成長する植物から単離することができる。実生植物は、２〜６週間の栽培で収穫することができる。例えば、少なくとも４００個の分離株を、１ラウンドの収穫で収集することができる。土壌および植物タイプは、植物表現型、ならびにある特定の表現型の下流濃縮を可能にする条件を明らかにする。
【０１３４】
微生物を植物組織から単離して、微生物の形質を評価することができる。組織試料を処理するためのパラメーターを変化させて、根圏菌、着生菌（ｅｐｉｐｈｙｔｅ）、または内部寄生菌（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）等の、異なるタイプの付随微生物を単離することができる。分離株を無窒素培地で培養して、窒素固定を実施する細菌を濃縮することができる。あるいは、世界の菌株バンクから微生物を得ることができる。
【０１３５】
植物内分析を実施して、微生物の形質を評価する。一部の実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイスループット処理によりスクリーニングを行うために、植物組織を処理することができる。加えて、非侵襲性測定を使用して、コロニー化などの植物特徴を評価することができる。野生微生物の測定は、植物ごとに得ることができる。また、野生微生物の測定は、圃場でミディアムスループット（ｍｅｄｉｕｍ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）法を使用して得ることができる。測定は、経時的に逐次的に行うことができる。Ｓｅｔａｒｉａを含むが、それに限定されないモデル植物系を使用することができる。
【０１３６】
植物系中の微生物を、植物系での微生物の転写プロファイリングによりスクリーニングすることができる。転写プロファイリングによるスクリーニングの例は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、転写物検出用の分子バーコード、次世代配列決定法、および蛍光マーカーでの微生物のタグ付けの方法を使用することである。マイクロバイオーム、非生物要因、土壌条件、酸素、水分、温度、接種物条件、および根局在化を含むが、それらに限定されない影響要因を測定して、温室でのコロニー化を評価することができる。細菌中での窒素固定は、本明細書に記載のＩＲＭＳまたはＮａｎｏＳＩＭＳを用いて１５Ｎ気体／肥料（希釈）を測定することにより評価することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、高分解能二次イオン質量分析法である。ＮａｎｏＳＩＭＳ技法は、生物学的試料に由来する化学活性を調査するための様式である。微小生物の代謝を駆動する酸化反応を還元する触媒作用を、細胞レベル、亜細胞（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）レベル、分子レベル、および元素レベルで調査することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、０．１μｍよりも大きな高空間分解能を提供することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、１３Ｃ、１５Ｎ、および１８Ｏなどの同位体トレーサーの使用を検出することができる。したがって、ＮａｎｏＳＩＭＳは、細胞の化学的活性窒素に対して使用することができる。
【０１３７】
植物分析には、自動化温室を使用することができる。微生物曝露に応答した植物測定基準としては、これらに限定されないが、バイオマス、葉緑体分析、ＣＣＤカメラ、容積トモグラフィー測定が挙げられる。
【０１３８】
微生物集団を濃縮するための１つの様式は、遺伝子型によるものである。例えば、標的化プライマーまたは特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである。ジアゾトロフは、窒素固定のプロセス中にｎｉｆＨ遺伝子を発現するため、ｎｉｆＨ遺伝子に対して設計されたプライマーを使用して、ジアゾトロフを特定することができる。また、微生物集団は、単一細胞培養非依存的手法および走化性誘導単離手法により濃縮することができる。あるいは、微生物の標的化単離は、微生物を選択培地で培養することにより実施することができる。微生物集団を所望の形質について濃縮するための計画的な手法は、バイオインフォマティクスデータによってガイドされ得、これは本明細書に記載されている。
【０１３９】
バイオインフォマティクスを使用した窒素固定能力を有する微生物の濃縮
バイオインフォマティクスツールを使用して、植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を特定および単離することができる。それらは、窒素固定を実施する能力に基づいて選択される。高い窒素固定能力を有する微生物は、植物の好ましい形質を促進することができる。ＰＧＰＲを特定するためのバイオインフォマティクス分析モードとしては、これらに限定されないが、ゲノミクス、メタゲノミクス、標的化単離、遺伝子配列決定、トランスクリプトーム配列決定、およびモデリングが挙げられる。
【０１４０】
ゲノミクス分析を使用して、ＰＧＰＲを特定し、本明細書に記載の次世代配列決定法および微生物バージョン管理法（ｍｉｃｒｏｂｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）により突然変異の存在を確認することができる。
【０１４１】
コロニー化の予測アルゴリズムを使用してＰＧＰＲを特定および単離するためにメタゲノミクスを使用することができる。また、メタデータを使用して、環境試料および温室試料中の操作された菌株の存在を特定することができる。
【０１４２】
トランスクリプトーム配列決定を使用して、ＰＧＰＲ表現型に結び付く遺伝子型を予測することができる。加えて、トランスクリプトームデータを使用して、遺伝子発現を変更するためのプロモーターを特定する。トランスクリプトームデータを、全ゲノム配列（ＷＧＳ）と併せて分析して、代謝および遺伝子調節ネットワークのモデルを生成することができる。
【０１４３】
微生物の順化
自然界から単離された微生物は、微生物が、遺伝学的に追跡可能および特定可能な形態に変換される順化プロセスを起こす場合がある。微生物を順化させる１つの様式は、抗生物質耐性を用いて微生物を操作することである。抗生物質耐性を操作するプロセスは、野生型微生物菌株の抗生物質感受性を決定することから開始することができる。細菌が抗生物質に感受性である場合、その抗生物質は、抗生物質耐性操作の良好な候補であり得る。その後、組換え法を使用して、抗生物質耐性遺伝子または対抗選択可能な自殺ベクターを、微生物のゲノムに組み込むことができる。対抗選択可能な自殺ベクターは、目的の遺伝子の欠失、選択可能なマーカー、および対抗選択可能なマーカーｓａｃＢで構成されていてもよい。対抗選択を使用して、天然微生物ＤＮＡ配列を抗生物質耐性遺伝子と交換することができる。ミディアムスループット法を使用して、複数の微生物を同時に評価して、並行順化を可能にすることができる。順化の代替方法としては、ホーミングヌクレアーゼを使用して、自殺ベクター配列がループアウトすることまたは介在ベクター配列を得ることを防止することを含む。
【０１４４】
ＤＮＡベクターは、エレクトロポレーションおよび化学的形質転換を含む幾つかの方法により細菌に導入することができる。ベクターの標準的ライブラリーを形質転換に使用することができる。遺伝子編集法の例は、Ｃａｓ９試験を行って微生物でのＣａｓ９の活性を確実にした後のＣＲＩＳＰＲである。
【０１４５】
微生物の非トランスジェニック操作
好ましい形質を有する微生物集団は、定向進化により得ることができる。定向進化は、自然淘汰プロセスを模倣して、タンパク質または核酸をユーザ設定目標に向かって進化させる手法である。定向進化の例は、ランダム突然変異を微生物集団に導入した場合、最も好ましい形質を有する微生物を選択し、選択した微生物の増殖を継続させることである。成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）の最も好ましい形質は、窒素固定であってもよい。定向進化法は、各反復後の選択プロセスに基づき、反復性および適応性であってもよい。
【０１４６】
高い窒素固定能力を有する植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を生成することができる。ＰＧＰＲの進化は、遺伝子変異の導入により実施することができる。遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発、飽和突然変異誘発、断片シャッフリング突然変異誘発（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的突然変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。こうした手法は、ランダム突然変異を微生物集団に導入することができる。例えば、突然変異体は、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発により合成ＤＮＡまたはＲＮＡを使用して生成することができる。突然変異体は、プラスミドに含まれるツールであって、後で治癒される（ｃｕｒｅ）ツールを使用して生成することができる。目的の遺伝子は、これらに限定されないが、ＰＧＰＲ特性の向上、穀類のコロニー化の向上、酸素感受性の増加、窒素固定の増加、およびアンモニア排出の増加を含む、形質の向上を有する他の種に由来するライブラリーを使用して特定することができる。こうしたライブラリーに基づき、ＧｅｎｅｉｏｕｓまたはＰｌａｔｙｐｕｓ設計ソフトウェアなどのソフトウェアを使用して、属内遺伝子を設計することができる。突然変異は、機械学習の支援により設計することができる。突然変異は、代謝モデルの支援により設計することができる。ａ  ｌａ  Ｐｌａｔｙｐｕｓを使用して突然変異の自動設計を実施することができ、Ｃａｓ誘導突然変異誘発のためのＲＮＡが誘導されることになる。
【０１４７】
属内遺伝子を、宿主微生物に移入することができる。加えて、レポーター系も微生物に移入することができる。レポーター系は、プロモーターを特徴付け、形質転換成功を決定し、突然変異体をスクリーニングし、陰性スクリーニングツールとして作用する。
【０１４８】
突然変異を保持する微生物は、連続継代により培養することができる。微生物コロニーは、微生物の単一変異体を含む。微生物コロニーは、自動コロニーピッカーおよび液体ハンドラーの支援によりスクリーニングされる。遺伝子重複およびコピー数増加を有する突然変異体は、所望の形質のより高い遺伝子型を発現する。
【０１４９】
窒素固定に基づく植物成長促進性微生物の選択
微生物コロニーは、種々のアッセイを使用してスクリーニングして、窒素固定を評価することができる。窒素固定を測定するための１つの様式は、窒素排出が測定される単一の発酵アッセイによる。代替方法は、経時的なインライン試料採取によるアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）である。ＡＲＡは、マイクロチューブアレイのハイスループットプレートで実施することができる。ＡＲＡは、生植物および生植物組織で実施することができる。ＡＲＡアッセイでは、培地処方および培地酸素濃度を変化させることができる。微生物変異体をスクリーニングするための別の方法は、バイオセンサーの使用による。ＮａｎｏＳＩＭＳおよびラマン顕微分光法の使用は、微生物の活性を調査するために使用することができる。また、一部の場合では、細菌を、バイオリアクターでの発酵法を使用して培養および増殖させることができる。バイオリアクターは、細菌成長の頑強性を向上させ、細菌の酸素感受性を減少させるように設計されている。中〜高ＴＰプレートに基づくマイクロ発酵槽を使用して、酸素感受性、栄養必要性、窒素固定、および窒素排出を評価する。また、細菌を、競合性のまたは有益な微生物と共培養して、隠れた経路を明らかにすることができる。化学的、比色定量的、または蛍光性の指示薬を使用して、高レベルの窒素を産生する細菌をスクリーニングするために、フローサイトメトリーを使用することができる。細菌を、窒素源の存在下または非存在下で培養してもよい。例えば、細菌を、グルタミン、アンモニア、尿素、または硝酸塩と共に培養してもよい。
【０１５０】
微生物品種改良
微生物品種改良は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に特定および向上させる方法である。この方法は、以下の３つのステップを含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する調節ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）調節ネットワークおよび遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に向上させること、ならびに３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。菌株向上を系統的に評価するために、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを生成する。そうしたモデルを使用して、遺伝子標的品種改良を予測し、農学的に関連するマイクロバイオームコード形質の向上の選択頻度を向上させる。このプロセスの実施形態の図式表示は、図１７Ａを参照されたい。特に、図１７Ａは、実施形態による微生物品種改良の模式図を示す。図１７Ａに示されているように、作物マイクロバイオームの合理的向上を使用して、土壌生物多様性を増加させ、要となる種の影響を調整し、ならびに／または重要な代謝経路のタイミングおよび発現を変更することができる。この目的のため、本発明者らは、作物マイクロバイオーム内の菌株の役割を特定および向上させるための微生物品種改良パイプラインを開発した。この方法は、以下の３つのステップを含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する調節ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）遺伝子調節ネットワークおよび遺伝子クラスターのゲノム内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に向上させること、ならびに３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。菌株の向上を系統的に評価するために、本発明者らは、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを用いる。このプロセスは、農学的に関連するマイクロバイオームコード形質の向上を品種改良および選択するための方法論である。
【０１５１】
植物形質（例えば、窒素固定）を向上させる細菌の産生は、連続継代により達成することができる。この細菌の生産は、１つまたは複数の植物に１つまたは複数の向上された形質を付与することが可能な細菌および／または組成物を同定することに加えて、微生物叢により影響を受ける特定の向上された形質を有する植物を選択することにより行うことができる。植物形質を向上させる細菌を産生するための１つの方法は、（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ；（ｂ）細菌のうちの１つまたは複数に遺伝子変異を導入して、１つまたは複数の変異細菌を産生するステップ；（ｃ）複数の植物を変異細菌に曝露するステップ；（ｄ）複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、細菌を単離した植物が、複数の植物中の他の植物と比べて向上された形質を有する、ステップ；および（ｅ）向上された形質を有する植物から単離された細菌（ステップ（ｄ））を用いて、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すステップを含む。ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、植物の向上された形質が所望のレベルに達するまで、何回でも（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれよりも多く）繰り返すことができる。さらに、複数の植物は、１０〜２０個の植物、または２０個もしくはそれよりも多く、５０個もしくはそれよりも多く、１００個もしくはそれよりも多く、３００個もしくはそれよりも多く、５００個もしくはそれよりも多く、または１０００個もしくはそれよりも多くの植物等の、２個を超える植物であってもよい。
【０１５２】
向上された形質を有する植物を得ることに加えて、１つまたは複数の遺伝子（例えば、窒素固定を調節する遺伝子）に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団が得られる。上述のステップを繰り返すことにより、目的の植物形質と相関する集団の最も適切なメンバーを含む細菌の集団を得ることができる。遺伝子分析および／または表現型分析等により、この集団内の細菌を同定して、それらの有益な特性を決定することができる。ステップ（ａ）にて、単離された細菌の遺伝子分析を行ってもよい。表現型および／または遺伝子型の情報は、以下のものを含む技法を使用して得ることができる：植物由来の化学成分のハイスループットスクリーニング；遺伝物質のハイスループット配列決定を含む配列決定技法；ディファレンシャルディスプレイ技法（ＤＤＲＴ−ＰＣＲおよびＤＤ−ＰＣＲを含む）；核酸マイクロアレイ技法；ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）；およびｑＲＴ−ＰＣＲ（定量リアルタイムＰＣＲ）。得られた情報を使用して、系統発生分析、またはｒＲＮＡオペロンもしくは他の分類学的に有益な遺伝子座の成分をコードする核酸のマイクロアレイに基づくスクリーニング等、存在する細菌の同一性および活性に関する群生プロファイル情報を得ることができる。分類学的に有益な遺伝子座の例としては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子、ｎｉｆＤ遺伝子が挙げられる。集団に存在する分類群を決定するための分類学的プロファイリングの例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４０１５５２８３号に記載されている。細菌の同定は、窒素固定経路に関連する遺伝子等の、１つもしくは複数の遺伝子または１つもしくは複数のシグナル経路の活性を特徴付けることを含んでもよい。また、異なる細菌種間の相乗効果的な相互作用（２つの成分を組み合わせることにより、付加的な量を超えて所望の効果が増加すること）が、細菌集団に存在している場合がある。
【０１５３】
遺伝子変異−ゲノム変更の位置および供給源
遺伝子変異は、以下のものからなる群より選択される遺伝子であってもよい：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のものからなる群より選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異であってもよい：グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼａＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼ。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。遺伝子変異の導入は、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００個、またはそれよりも多くのヌクレオチド等の、標的部位のうちの１つまたは複数のヌクレオチドの挿入および／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示されている方法の１つまたは複数の細菌に導入された遺伝子変異は、ノックアウト突然変異（例えば、プロモーターの欠失、中途終止コドンを生成する挿入または欠失、全遺伝子の欠失）であってもよく、または、タンパク質ドメインの活性の排除または消失（例えば、活性部位に影響を及ぼす点突然変異、またはタンパク質産物の関連部分をコードする遺伝子の部分の欠失）であってもよく、または標的遺伝子の調節配列の変更または消失であってもよい。また、異種調節配列、および遺伝子変異が導入されている細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列を含む、１つまたは複数の調節配列を挿入してもよい。さらに、調節配列は、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択してもよい。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入される所定の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、標的部位内のランダム突然変異であってもよい。遺伝子変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。一部の場合では、形質向上を評価するために細菌を植物に曝露する前に、複数の異なる遺伝子変異（例えば、２、３、４、５、１０個、またはそれよりも多く）が、単離された細菌のうちの１つまたは複数に導入される。複数の遺伝子変異は、上記のタイプのいずれであってもよく、同じタイプであってもよく、または異なるタイプであってもよく、任意の組合せであってもよい。一部の場合では、複数の異なる遺伝子変異は、複数の遺伝子変異が細菌に蓄積され、向上された形質が関連する植物に徐々に付与されるように、連続的に、第１の単離ステップ後に第１の遺伝子変異を導入し、第２の単離ステップ後に第２の遺伝子変異を導入する等で導入される。
【０１５４】
遺伝子変異−ゲノム変更を導入する方法
一般的に、用語「遺伝子変異」は、基準ゲノムもしくはその部分または基準遺伝子もしくはその部分等の基準ポリヌクレオチドと比べた、ポリヌクレオチド配列に導入される任意の変更を指す。遺伝子変異は、「突然変異」と呼ばれる場合もあり、遺伝子変異を含む配列または生物は、「遺伝子変異体」または「突然変異体」と呼ばれる場合がある。遺伝子変異は、遺伝子発現、代謝、および細胞シグナル伝達を含むある生物活性の増加または減少等の、任意の数の効果を示してもよい。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入されてもよく、またはランダムに導入されてもよい。遺伝子変異を導入するための様々な分子ツールおよび方法が利用可能である。例えば、遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発、飽和突然変異誘発、断片シャッフリング突然変異誘発（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、相同組換え、組換え操作（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ媒介性組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的突然変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。遺伝子変異を導入するための化学的方法としては、ＤＮＡを、化学的突然変異原、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノリンＮ−オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ−１７０、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、エチレンオキシド、ジメチルニトロソアミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、およびビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）等に曝露することが挙げられる。放射線突然変異誘導因子としては、紫外線、γ線、Ｘ線、および高速中性子衝撃が挙げられる。また、例えば、トリメチルソラレンを紫外光と共に使用して、核酸に遺伝子変異を導入することができる。可動ＤＮＡ要素、例えば転位因子のランダムな挿入または標的挿入は、遺伝子変異を生成するための別の好適な方法である。遺伝子変異は、例えば、エラープローンＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系での増幅中に核酸に導入してもよい。遺伝子変異は、ＤＮＡシャッフリング技法（例えば、エクソンシャッフリングおよびドメインスワッピング等）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸に導入してもよい。また、遺伝子変異は、細胞のＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入することができる。例えば、ＤＮＡ修復酵素突然変異体をコードする突然変異遺伝子が細胞に存在すると、その細胞のゲノムには、高頻度の突然変異（つまり、約１個の突然変異／１００遺伝子〜１個の突然変異／１０，０００遺伝子）が生成されることが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、これらに限定されないが、Ｍｕｔ  Ｈ、Ｍｕｔ  Ｓ、Ｍｕｔ  Ｌ、およびＭｕｔ  Ｕ、ならびに他の種におけるそれらのホモログ（例えば、ＭＳＨ  １６、ＰＭＳ  １２、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、およびＥＲＣＣ−１等）が挙げられる。遺伝子変異を導入するための種々の方法の例示的な記載は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ、５巻：１〜７頁；Ｃｈｉａｎｇら（１９９３年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ、２巻（３号）：２１０〜２１７頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；ならびに米国特許第６，０３３，８６１号および同第６，７７３，９００号に提供されている。
【０１５５】
微生物に導入される遺伝子変異は、トランスジェニック、シスジェニック、ゲノム内、属内、属間、合成、進化、再構成、またはＳＮＰとして分類することができる。
【０１５６】
遺伝子変異を、微生物内の多数の代謝経路に導入して、上述の形質の向上を誘発することができる。代表的な経路としては、硫黄取込み経路、グリコーゲン生合成、グルタミン調節経路、モリブデン取込み経路、窒素固定経路、アンモニア同化、アンモニア排出または分泌、窒素取込み、グルタミン生合成、アナモックス（ａｎｎａｍｏｘ）、リン酸塩可溶化、有機酸輸送、有機酸産生、凝集素産生、活性酸素ラジカルスカベンジング遺伝子、インドール酢酸生合成、トレハロース生合成、植物細胞壁分解酵素または経路、根付着遺伝子、菌体外多糖分泌、グルタミン酸合成酵素経路、鉄取込み経路、シデロフォア経路、キチナーゼ経路、ＡＣＣデアミナーゼ、グルタチオン生合成、亜リン酸シグナル伝達遺伝子、クオラムクエンチング経路、チトクロム経路、ヘモグロビン経路、細菌ヘモグロビン様経路、スモールＲＮＡ  ｒｓｍＺ、リゾビトキシン（ｒｈｉｚｏｂｉｔｏｘｉｎｅ）生合成、ｌａｐＡ接着タンパク質、ＡＨＬクオラムセンシング経路、フェナジン生合成、環状リポペプチド生合成、および抗生物質産生が挙げられる。
【０１５７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を使用して、所望の変異を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入核酸のサイレンシングをガイドすることにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価体および／もしくは変異体、つまりＣａｓ９様タンパク質）は、このタンパク質と、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）と呼ばれる２つの天然または合成ＲＮＡ分子との結合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然で含有する。一部の場合では、２つの分子は、共有結合で連結され、単一分子（単鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成および単一分子ガイドＲＮＡ構成を両方とも包含する）と結合し、それによりＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、このタンパク質が標的核酸配列にガイドされる。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、その天然酵素機能が維持されている場合、標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断を作成し、それによりゲノム変更（つまり、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換等）をもたらすことができ、それにより遺伝子発現が変更される。Ｃａｓ９の一部の変異体（変異体は、用語Ｃａｓ９様により包含される）は、ＤＮＡ切断活性の減少を示すように変更されている（一部の場合では、標的ＤＮＡの両鎖ではなく１本の鎖を切断し、他の場合には、著しく還元されて、ＤＮＡ切断活性を示さない）。遺伝子変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲ系のさらなる例示的な記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号に見出すことができる。
【０１５８】
サイクル増幅技法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発では、変異原性プライマーを使用して、所望の突然変異を導入する。ＰＣＲは、変性、アニーリング、および伸長のサイクルで実施される。ＰＣＲによる増幅後、突然変異ＤＮＡの選択および親プラスミドＤＮＡの除去は、以下のようにして達成することができる：１）ＰＣＲ中にｄＣＴＰをヒドロキシメチル化ｄＣＴＰで置換し、その後制限酵素で消化して、非ヒドロキシメチル化親ＤＮＡのみを除去する；２）抗生物質耐性遺伝子および研究対象遺伝子を両方とも同時に突然変異誘発させ、プラスミドを異なる抗生物質耐性を有するように変化させ、新たな抗生物質耐性により、その後の所望の突然変異の選択が容易になる；３）所望の突然変異を導入した後、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限酵素Ｄｐｎｌにより親メチル化鋳型ＤＮＡを消化し、それにより突然変異誘発非メチル化鎖を回収する；または４）突然変異ＰＣＲ産物を、追加のライゲーション反応で環状化して、突然変異ＤＮＡの形質転換効率を増加させる。例示的な方法のさらなる記載は、例えば、米国特許第７１３２２６５号、米国特許第６７１３２８５号、米国特許第６６７３６１０号、米国特許第６３９１５４８号、米国特許第５７８９１６６号、米国特許第５７８０２７０号、米国特許第５３５４６７０号、米国特許第５０７１７４３号、および米国特許出願公開第２０１００２６７１４７号に見出すことができる。
【０１５９】
指定部位突然変異誘発と呼ばれるオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発では、典型的には、合成ＤＮＡプライマーが利用される。この合成プライマーは、所望の突然変異を含有し、目的の遺伝子のＤＮＡとハイブリダイズすることができるように、突然変異部位付近が鋳型ＤＮＡと相補的である。突然変異は、単一塩基の変更（点突然変異）、複数塩基の変更、欠失、または挿入、またはこれらの組合せであってもよい。その後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、一本鎖プライマーを伸長させ、それにより遺伝子の残りを複製する。このように複製された遺伝子は、突然変異部位を含有し、その後ベクターとしての宿主細胞に導入し、クローニングしてもよい。最後に、突然変異体をＤＮＡ配列決定により選択して、それらが所望の突然変異を含有することを確認することができる。
【０１６０】
遺伝子変異は、エラープローンＰＣＲを使用して導入してもよい。この技法では、目的の遺伝子は、配列複製のフィデリティーが不十分である条件下でＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。その結果、増幅産物は、少なくとも１つのエラーを配列に含有する。遺伝子を増幅し、得られた反応産物が、鋳型分子と比較して１つまたは複数の変更を配列に含有する場合、得られた産物は、鋳型と比較して突然変異誘発されている。ランダム突然変異を導入する別の手段は、細胞を、ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸等の化学的突然変異原に曝露し（Ｎｅｓｔｍａｎｎ、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、１９７５年６月；２８巻（３号）：３２３〜３０頁）、その後、その遺伝子を含むベクターを宿主から単離することである。
【０１６１】
飽和突然変異誘発は、別の形態のランダム突然変異誘発であり、特異的部位にまたは遺伝子の狭い領域に、全てのまたはほぼ全ての考え得る突然変異を生成しようするものである。一般的な意味では、飽和突然変異誘発は、突然変異誘発させようとする確定ポリヌクレオチド配列（突然変異誘発させようとする配列の長さは、例えば１５〜１００，０００塩基である）に変異原性カセットの完全なセット（各カセットの長さは、例えば１〜５００塩基である）を突然変異誘発させることで構成されている。したがって、一群の突然変異（例えば、１から１００個までの範囲の突然変異）が、突然変異誘発させようとする各カセットに導入される。１つのカセットに導入される突然変異のグループ分けは、飽和突然変異誘発の１ラウンドを施している間に第２のカセットに導入される突然変異の第２のグループ分けと異なっていてもよく、または同じであってもよい。そのようなグループ分けは、欠失、付加、特定のコドンのグループ分け、および特定のヌクレオチドカセットのグループ分けにより例示される。
【０１６２】
ＤＮＡシャッフリングとも呼ばれる断片シャッフリング突然変異誘発は、有益な突然変異を迅速に増幅させる方法である。シャッフリングプロセスの一例では、ＤＮＡｓｅを使用して、１セットの親遺伝子を、例えば長さが約５０〜１００ｂｐの小片に断片化する。その後、プライマーを用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が続き、十分な重複相同性配列を有するＤＮＡ断片が互いにアニーリングすることになり、その後ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。ＤＮＡ分子の幾つかが親遺伝子のサイズに到達した後も、このＰＣＲ伸長を数ラウンド行う。その後、これら遺伝子を、今度は、鎖の末端に相補的になるように設計したプライマーを添加した別のＰＣＲで増幅してもよい。プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要とされる制限酵素認識部位の配列等の追加の配列が、それらの５’末端に付加されてもよい。シャッフリング技法のさらなる例は、米国特許出願公開第２００５０２６６５４１号に提供されている。
【０１６３】
相同組換え突然変異誘発は、外因性ＤＮＡ断片と標的ポリヌクレオチド配列との間の組換えを含む。二本鎖切断が生じた後、切断の５’末端付近のＤＮＡの区画は、切除と呼ばれるプロセスで切り離される。その後のストランド侵入ステップでは、切断されたＤＮＡ分子の突出３’末端が、切断されていない類似のまたは同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法を使用すると、遺伝子を欠失させ、エキソンを除去し、遺伝子を付加し、点突然変異を導入することができる。相同組換え突然変異誘発は、恒久的であってもよく、または暫定的であってもよい。典型的には、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別のベクターの成分であってもよく、別個のベクターに含有されていてもよく、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。一部の実施形態では、組換え鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼによりニックまたは切断される標的配列内または付近等で相同組換えの鋳型としての役目を果たすように設計されている。鋳型ポリヌクレオチドは、長さが約１０個もしくはそれよりも多く、約１５個もしくはそれよりも多く、約２０個もしくはそれよりも多く、約２５個もしくはそれよりも多く、約５０個もしくはそれよりも多く、約７５個もしくはそれよりも多く、約１００個もしくはそれよりも多く、約１５０個もしくはそれよりも多く、約２００個もしくはそれよりも多く、約５００個もしくはそれよりも多く、約１０００個もしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド等、任意の好適な長さであってもよい。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの部分に相補的である。鋳型ポリヌクレオチドは、最適にアランメントされる場合、標的配列のうちの１つまたは複数のヌクレオチドと重複してもよい（例えば、約１個もしくはそれよりも多く、約５個もしくはそれよりも多く、約１０個もしくはそれよりも多く、約１５個もしくはそれよりも多く、約２０個もしくはそれよりも多く、約２５個もしくはそれよりも多く、約３０個もしくはそれよりも多く、約３５個もしくはそれよりも多く、約４０個もしくはそれよりも多く、約４５個もしくはそれよりも多く、約５０個もしくはそれよりも多く、約６０個もしくはそれよりも多く、約７０個もしくはそれよりも多く、約８０個もしくはそれよりも多く、約９０個もしくはそれよりも多く、約１００個もしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）。一部の実施形態では、鋳型配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアランメントされる場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から、約１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個またはそれよりも多くのヌクレオチド内にある。相同組換えの方法に有用な部位指定ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。そのようなヌクレアーゼの使用に関するさらなる記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号および米国特許出願公開第２０１４０３０１９９０号を参照されたい。
【０１６４】
化学的突然変異原または放射線を含む、主として点突然変異、ならびに短い欠失、挿入、転換、および／または転移を作成する突然変異原を使用して、遺伝子変異を作成してもよい。突然変異原としては、これらに限定されないが、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン等）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドが挙げられる。
【０１６５】
遺伝子変異の導入は、不完全なプロセスであってもよく、細菌の処置集団中の一部の細菌は、所望の突然変異を保持するが、他のものは保持していない。一部の場合では、所望の遺伝子変異を保持する細菌が富化されるように、選択圧を加えることが望ましい。伝統的には、遺伝子変異が成功した変異体の選択は、抗生物質耐性遺伝子の挿入または非致死性化合物を致死性代謝物へと変換することが可能な代謝活性の消失の場合等、遺伝子変異により機能が付与または消失されたものを選択することまたはそれらに対して選択することを含んでいた。所望の遺伝子変異のみを導入すればよい（例えば、選択可能なマーカーさえ必要としない）ように、ポリヌクレオチド配列自体に基づく選択圧を加えることも可能である。この場合、選択圧は、遺伝子変異を導入することが求められている基準配列に対して選択が効果的に向けられるように、標的部位に導入される遺伝子変異が欠如したゲノムを切断することを含んでもよい。典型的には、切断は、標的部位の１００個ヌクレオチド内で生じる（例えば、標的部位から７５個、５０個、２５個、１０個、またはそれより少数のヌクレオチド内、標的部位でのまたは標的部位内での切断を含む）。切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼからなる群より選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示されてもよい。そのようなプロセスは、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、標的部位での相同組換えを強化するためのプロセスに類似する。その結果、所望の遺伝子変異が欠如した細菌は、修復されずに細胞死に至る切断を受ける可能性がより高い。その後、選択を生き残った細菌を単離し、植物に曝露して、向上された形質の付与を評価するために使用することができる。
【０１６６】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、標的部位に切断を指示してもよい。突然変異微生物の選択の向上は、Ｃａｓ９を使用して非突然変異細胞を死滅させることにより得ることができる。その後、植物に突然変異微生物を接種して共生を再確認し、進化的圧力を作成して、効率的な共生生物を選択する。その後、微生物を植物組織から再単離してもよい。非変異体に対する選択に用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系は、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、遺伝子変異の導入に関して上述されているものと同様のエレメントを用いることができる。したがって、標的部位に指示された切断は、影響を受ける細胞の死を増強する。
【０１６７】
標的部位での切断を特異的に誘導するための他の選択肢は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、およびメガヌクレアーゼ等が利用可能である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、それにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、固有の標的配列を切断することが可能になる。ＺＦＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するよう迅速に操作することができ、ＴＡＬＥＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大型認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用して、高度に標的化された様式で配列を置換、排除、または改変することができる。タンパク質工学によりそれらの認識配列を改変することにより、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物に関わらず、あらゆるゲノムタイプの改変に使用することができ、通例では、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１）、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。
【０１６８】
遺伝子変異−特定方法
本開示の微生物は、前記微生物へ導入されている１つまたは複数の遺伝子改変または変更により特定することができる。前記遺伝子改変または変更を特定することができる１つの方法は、遺伝子改変または変更を特定するのに十分な微生物のゲノム配列の部分を含む配列番号を参照することによる。
【０１６９】
さらに、遺伝子改変または変更がそれらのゲノムに導入されていない微生物（例えば、野生型、ＷＴ）の場合、本開示では、１６Ｓ核酸配列を使用して、前記微生物を特定することができる。１６Ｓ核酸配列は、「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」の例であり、核酸配列の特徴の差異を視覚化するための方法に使用される指標を指す。他のそのような指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入突然変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、またはアイソザイムマーカー、または特定の遺伝子および染色体位置を規定する本明細書に記載のマーカーの組合せである。マーカーとしては、１６Ｓまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、および互いと比較して関係性または特徴の解明に特に有用であることが証明されている小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子と大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子との間に見出される配列である内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列がさらに挙げられる。さらに、本開示は、本明細書で開示された微生物を特定するために、目的の遺伝子（例えば、ｎｉｆＨ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、ｇｌｎＥ、ａｍｔＢなど）に見出される固有配列を使用する。
【０１７０】
主要ｒＲＮＡサブユニット１６Ｓの一次構造は、異なる速度で進化し、ドメインなどの非常に古代の系統および属などのより現代的な系統の両方の分解能を可能にする保存された領域、可変領域、および超可変領域の特定の組合せを含む。１６Ｓサブユニットの二次構造は、残基の約６７％の塩基対合をもたらすおよそ５０個のヘリックスを含む。こうした高度に保存された二次構造特徴は、機能的に非常に重要であり、複数配列アラインメントおよび系統学的分析における位置的相同性を確保するために使用することができる。これまで数十年間にわたって、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、最も多く配列決定された分類学的マーカーになっており、細菌および古細菌の現在の系統的分類の基盤である（Ｙａｒｚａら、２０１４年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏ．  １２巻：６３５〜４５頁）。
【０１７１】
したがって、ある特定の態様では、本開示は、表Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨにおけるいずれかの配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する配列を提供する。
【０１７２】
したがって、ある特定の態様では、本開示は、配列番号６２〜３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表Ｆ、Ｇ、およびＨに見出され得る。
【０１７３】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する１６Ｓ核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表ＧおよびＨに見出され得る。
【０１７４】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表ＧおよびＨに見出され得る。
【０１７５】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表ＧおよびＨに見出され得る。
【０１７６】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３０４〜４２４と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物、またはプライマー、またはプローブ、または非天然ジャンクション配列を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表Ｅに見出され得る。
【０１７７】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する非天然ジャンクション配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表Ｅに見出され得る。
【０１７８】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号７７、７８、８１、８２、または８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表ＦおよびＨに見出され得る。
【０１７９】
遺伝子変異−検出方法：プライマー、プローブ、およびアッセイ
本開示は、本明細書で教示された微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、およびアッセイを教示する。一部の態様では、本開示は、ＷＴ親菌株を検出するための方法を提供する。他の態様では、本開示は、ＷＴ菌株に由来する非属間の操作された微生物を検出するための方法を提供する。態様では、本開示は、微生物の非属間遺伝子変更を特定するための方法を提供する。
【０１８０】
態様では、本開示のゲノム操作法は、導出された非属間微生物中の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列の生成に結び付く。こうした天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを、本明細書で教示された微生物における特定の遺伝子改変の存在を示す特徴的タイプとして使用することができる。
【０１８１】
本技法は、固有に設計されたプライマーおよびプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法を使用することにより、こうした天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。一部の態様では、本開示のプローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合する。一部の態様では、従来のＰＣＲが使用される。他の態様では、リアルタイムＰＣＲが使用される。一部の態様では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が使用される。
【０１８２】
したがって、本開示は、リアルタイムでＰＣＲ産物を検出するための２つの一般的な方法の使用を包含することができる：（１）任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、および（２）プローブがその相補的配列とハイブリダイゼーションした後でのみ検出が可能になる蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドで構成される配列特異的ＤＮＡプローブ。一部の態様では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーにより増幅されることになり、結果的に、非特異的色素または特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用のいずれかにより検出することができる。他の態様では、本開示のプライマーは、プライマーがジャンクション配列のいずれかの側に隣接するように選択され、したがって、増幅反応が生じると、前記ジャンクション配列が存在する。
【０１８３】
本開示の態様は、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列分子それ自体に加えて、穏やかな〜ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能な他のヌクレオチド分子を含む。一部の態様では、穏やかな〜ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能なヌクレオチド分子は、「ヌクレオチドプローブ」と名付けられる。
【０１８４】
態様では、ゲノムＤＮＡを、試料から抽出し、ｑＰＣＲを使用することにより本開示の微生物の存在を定量化するために使用することができる。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間突然変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）により設計されたプライマーであってもよい。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ／Ｎ１１７６２１００）キットを使用し、フォワードおよびリバース増幅プライマーのみを使用して実施してもよく、あるいは、Ｋａｐａ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆｏｒｃｅキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ＫＫ４３０１）を、増幅プライマー、ならびに５’末端のＦＡＭ色素標識、内部ＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤および蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて使用してもよい。
【０１８５】
ある特定のプライマー、プローブ、および非天然ジャンクション配列は、表Ｅに列挙されている。ｑＰＣＲ反応効率は、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから生成される標準曲線を使用して測定することができる。データは、組織重量および抽出容積を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に正規化することができる。
【０１８６】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、１つまたは複数の核酸配列の増幅を、リアルタイムで定量化するための方法である。ＰＣＲアッセイのリアルタイム定量化は、増幅中の目的の核酸および校正標準としての役目を果たすことができる適切な対照核酸配列を比較することにより、ＰＣＲ増幅ステップにより生成されている核酸の量の決定を可能にする。
【０１８７】
ＴａｑＭａｎプローブは、標的核酸配列を定量化するために特異性を増加させることが必要なｑＰＣＲアッセイで使用されることが多い。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に付着されたフルオロフォア、およびプローブの３’末端に付着されたクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドプローブを含む。ＴａｑＭａｎプローブが、プローブの５’および３’末端が依然として互いに緊密に接触したままである場合、クエンチャーは、フルオロフォアからの蛍光シグナル伝達を防止する。ＴａｑＭａｎプローブは、特異的なプライマーセットにより増幅される核酸領域内にアニーリングするように設計されている。Ｔａｑポリメラーゼが、プライマーを伸長し、新生鎖を合成するときに、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にアニーリングしたプローブが分解される。このプローブ分解によりフルオロフォアが放出されるため、クエンチャーへの緊密な近接が破られ、フルオロフォアの蛍光が可能になる。ｑＰＣＲアッセイで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォアおよび反応中に存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。
【０１８８】
ｑＰＣＲの特徴は、実施者が、従来のＰＣＲアッセイの増幅産物の観察に一般的に必要とされる労働集約的なゲル電気泳動調製の増幅後ステップを排除することを可能にする。従来のＰＣＲに対するｑＰＣＲの利益は大きく、利益としては、速さの増加、使いやすさ、再現性、および定量化能力が挙げられる。
【０１８９】
形質の改善
本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または向上させるために用いることができる。導入または向上される形質の例としては、以下のものが挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、およびプロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、向上された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。
【０１９０】
導入または向上される好ましい形質は、本明細書に記載されているような窒素固定である。一部の場合では、本明細書に記載の方法から生じる植物は、同じ土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。追加の例では、本明細書に記載の方法から生じる植物は、同じ土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。
【０１９１】
向上される形質は、１つまたは複数の生物ストレス因子または非生物ストレス因子を適用することを含む条件下で評価してもよい。ストレス因子の例としては、非生物ストレス（熱ストレス、塩ストレス、干ばつストレス、寒冷ストレス、および低栄養ストレス等）および生物ストレス（線虫ストレス、昆虫草食ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス、およびウイルス病原体ストレス等）が挙げられる。
【０１９２】
本開示の方法および組成物により向上された形質は、以前は窒素固定が可能ではなかった植物におけるものを含む窒素固定であってもよい。一部の場合では、本明細書に記載の方法により単離された細菌は、植物の窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれよりも多く）を産生する。これは、一切の遺伝子変異を導入する前の第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれよりも多く）の窒素固定能力の増加に相当する場合がある。一部の場合では、細菌は、植物の窒素の５％またはそれよりも多くを産生する。窒素固定の所望のレベルは、遺伝子変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、および向上された形質を有する植物から細菌を単離するステップを、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で達成されてもよい。一部の場合では、窒素固定の増強されたレベルは、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で達成される。窒素固定の度合いを評価するための方法は公知であり、それらの例は、本明細書に記載されている。
【０１９３】
微生物品種改良は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に特定および向上させるための方法である。この方法は、以下の３つのステップを含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する調節ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）調節ネットワークおよび遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に向上させること、ならびに３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。菌株の向上を系統的に評価するために、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを生成する。そうしたモデルを使用して、遺伝子標的品種改良を予測し、農学的に関連するマイクロバイオームコード形質の向上の選択頻度を向上させる。
【０１９４】
農業的に関連する圃場状況で送達された窒素の測定
圃場では、送達された窒素の量は、コロニー化×活性の関数により決定することができる。
【数１】
2020506681.tif 000003
【０１９５】
上記の数式は、（１）植物組織１単位当たりの平均コロニー化、および（２）固定された窒素の量または各微生物細胞により排出されるアンモニアの量のいずれかとしての活性を必要とする。１エーカー当たりの窒素のポンドに変換するために、トウモロコシ成長生理学、例えば植物のサイズおよび付随根系を、経時的に成熟段階の全体にわたって追跡する。
【０１９６】
１エーカー−季節当たりの作物に送達された窒素のポンドは、以下の数式により算出することができる。
【数２】
2020506681.tif 000004
【０１９７】
植物組織（ｔ）は、栽培時間（ｔ）にわたるトウモロコシ植物組織の生重量である。合理的に計算を行うための値は、Ｒｏｏｔｓ，  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｕｐｔａｋｅ（Ｍｅｎｇｅｌ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｐｕｂ．＃  ＡＧＲＹ−９５−０８（９５年５月改訂版、１〜８頁））と題する刊行物に詳述されている。
【０１９８】
コロニー化（ｔ）は、栽培季節中の任意の特定の時間ｔにおける、植物組織の生重量１グラム当たりの植物組織内に見出される目的の微生物の量である。単一時点のみが利用可能である場合、単一時点は、季節全体のピークコロニー化速度として正規化され、残りの時点のコロニー化速度は、それに応じて調整される。
【０１９９】
活性（ｔ）は、栽培季節中の任意の特定の時間ｔにおいて、Ｎが、目的の微生物により１単位時間当たりに固定される速度である。本明細書で開示された実施形態では、この活性速度は、５ｍＭグルタミン存在下のＡＲＡ培地でのｉｎ  ｖｉｔｒｏアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）、または５ｍＭアンモニウムイオンの存在下のＡＲＡ培地でのアンモニウム排出アッセイにより近似される。
【０２００】
その後、上記の関数を積分することにより窒素送達量を算出する。上述の変数の値が、設定された時点で個別に測定される場合、それら時点間の値は、線形補間を実施することにより近似される。
【０２０１】
窒素固定
本明細書には、植物における窒素固定を増加させるための方法であって、植物を、窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌に曝露するステップを含み、細菌が、植物における窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、２％、５％、１０％、またはそれよりも多く）を産生し、産生が、細菌の非存在下における植物と比較して、少なくとも２倍の窒素固定能力に相当してもよい方法が記載されている。細菌は、グルタミン、尿素、硝酸塩またはアンモニアで補充された肥料の存在下で窒素を産生することができる。遺伝子変異は、上記で提供されている例を任意の数および任意の組合せで含む、本明細書に記載されている任意の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群より選択される遺伝子に導入されてもよい。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。本明細書に開示されている方法のうちの１つまたは複数の細菌に導入される遺伝子変異は、ノックアウト突然変異であってもよく、または標的遺伝子の調節配列を消失させてもよく、または異種調節配列の挿入、例えば、同じ細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含んでもよい。調節配列は、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。遺伝子変異は、化学的突然変異誘発により生成されてもよい。ステップ（ｃ）にて栽培された植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露してもよい。
【０２０２】
本明細書に記載の植物に生じる窒素固定の量は、幾つかの方法で、例えばアセチレン還元（ＡＲ）アッセイにより測定することができる。アセチレン還元アッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。特定の細菌が植物に固定窒素を提供している証拠としては、以下のものを挙げることができる：１）接種すると、総植物Ｎが著しく増加し、好ましくはそれに伴って植物におけるＮ濃度が増加すること；２）接種すると、窒素欠乏症状がＮ制限条件下で緩和されること（緩和には、乾燥物質の増加が含まれるべきである）；３）Ｎ２固定が、１５Ｎ手法（同位体希釈実験であってもよく、１５Ｎ２還元アッセイであってよく、または１５Ｎ天然存在量アッセイであってもよい）の使用により確認されること；４）固定されたＮが、植物タンパク質または代謝物に組み込まれること；および５）これら効果の全てが、未接種の植物または接種菌株の突然変異体を接種した植物で見られる訳ではないこと。
【０２０３】
野生型の窒素固定調節カスケードは、入力Ｏ２およびＮＨ４＋がＮＯＲゲートを通過し、その出力が、ＡＴＰに加えてＡＮＤゲートに入力されるデジタル論理回路として表すことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、微生物が施肥圃場であっても窒素を産生することができるように、この回路に対するＮＨ４＋の影響を調節カスケードの複数地点で妨害する。しかしながら、本明細書に開示されている方法では、上記回路に対するＡＴＰまたはＯ２の影響を変更すること、または回路を細胞の他の調節カスケードと置換すること、または窒素固定以外の遺伝子回路を変更することも起想される。異種調節系の制御下で機能性産物を生成するように遺伝子クラスターを再操作してもよい。遺伝子クラスターのコード配列の外部および内部の天然調節エレメントを排除することにより、およびそれらを代替調節系と置換することにより、複雑な遺伝子オペロンおよび他の遺伝子クラスターの機能性産物を制御することができ、および／または天然遺伝子が由来していた種以外の異なる種の細胞を含む異種細胞に移動させることができる。合成遺伝子クラスターは、再操作されると、遺伝子回路または他の誘導可能な調節系により制御され、それにより産物の発現を所望のように制御することができる。ロジックゲート、パルス発生器、発振器、スイッチ、またはメモリデバイスとして作用するような発現カセットを設計してもよい。制御性発現カセットは、発現カセットが、酸素、温度、接触、浸透圧ストレス、膜ストレス、または酸化還元センサ等の環境センサとして機能するように、プロモーターに連結されてもよい。
【０２０４】
例として、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＴ、およびｎｉｆＸ遺伝子を、ｎｉｆ遺伝子クラスターから排除してもよい。各アミノ酸配列をコードするＤＮＡをコドンランダム化することにより合成遺伝子を設計してもよい。コドン選択を実施して、コドン使用頻度を天然遺伝子のコドン使用頻度からできるだけ逸脱するよう特定する。提案された配列を、制限酵素認識部位、トランスポゾン認識部位、反復配列、シグマ５４およびシグマ７０プロモーター、潜在性リボソーム結合部位、およびｒｈｏ非依存性ターミネーター等の、あらゆる望ましくない特徴について走査する。合成リボソーム結合部位を、遺伝子の開始コドンを取り囲む１５０ｂｐ（−６０から＋９０まで）が蛍光遺伝子に融合されている蛍光レポータープラスミドを構築すること等により、各々対応する天然リボソーム結合部位の強度と一致するように選択する。このキメラをＰｔａｃプロモーターの制御下で発現させ、フローサイトメトリーにより蛍光を測定することができる。合成リボソーム結合部位を生成するために、合成発現カセットの１５０ｂｐ（−６０〜＋９０）を使用するレポータープラスミドのライブラリーを生成する。手短に言えば、合成発現カセットは、ランダムＤＮＡスペーサー、ＲＢＳライブラリーをコードする縮重配列、および各合成遺伝子のコード配列からなってもよい。複数のクローンをスクリーニングして、天然リボソーム結合部位に最も良好に一致した合成リボソーム結合部位を同定する。このようにして天然オペロンと同じ遺伝子からなる合成オペロンを構築し、機能的な相補性について試験する。合成オペロンのさらなる例示的な記載は、米国特許出願公開第２０１４０３２９３２６号に提供されている。
【０２０５】
細菌種
本明細書で開示された方法および組成物に有用な微生物は、任意の供給源から得ることができる。一部の場合では、微生物は、細菌、古細菌、原生動物、または真菌であってもよい。本開示の微生物は、窒素固定微生物、例えば窒素固定細菌、窒素固定古細菌、窒素固定真菌、窒素固定酵母、または窒素固定原生動物であってもよい。本明細書で開示された方法および組成物に有用な微生物は、胞子形成微生物、例えば胞子形成細菌であってもよい。一部の場合では、本明細書で開示された方法および組成物に有用な細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。一部の場合では、細菌は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門の内生胞子形成細菌であってもよい。一部の場合では、細菌は、ジアゾトロフ（ｄｉａｚａｔｒｏｐｈ）であってもよい。一部の場合では、細菌は、ジアゾトロフでなくともよい。
【０２０６】
本開示の方法および組成物は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓなどの古細菌と共に使用することができる。
【０２０７】
いくつかの場合には、有用であり得る細菌として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｚａｗａｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｂｏｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｉｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓとしても公知）  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ（同義語：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｒｈｙｔｈｍｏｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｄｕｓａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｒｓｔａｋｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｃｏｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓとしても公知）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｒｏｃｃａｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｅｍａｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｒｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｎｉｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（正式にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｂｔｓｕｇａｅ、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ、Ｐ���ｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ（正式にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ（正式にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｕｓｇａｅ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ（正式にはＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ（正式にはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａとして公知）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｒａｄｉｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｓｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓａｒａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ  ＡＱ７１９（ＮＲＲＬアクセッション番号Ｂ−２１６６３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＱ１７５（ＡＴＣＣアクセッション番号５５６０８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＱ１７７（ＡＴＣＣアクセッション番号５５６０９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＱ１７８（ＡＴＣＣアクセッション番号５３５２２）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．菌株ＮＲＲＬアクセッション番号Ｂ−３０１４５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、細菌は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂｃｔｅｒ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉであり得る。
【０２０８】
いくつかの場合には、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの種、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ    ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍであり得る。
【０２０９】
一部の場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される細菌は、シアノバクテリアであってもよい。シアノバクテリア属の例としては、Ａｎａｂａｅｎａ（例えば、Ａｎａｇａｅｎａ  ｓｐ．ＰＣＣ７１２０）、Ｎｏｓｔｏｃ（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）が挙げられる。
【０２１０】
一部の場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される細菌は、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ門、例えばＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍに属していてもよい。
【０２１１】
一部の場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、公知のＮｉｆＨ遺伝子と相同性である遺伝子を含んでいてもよい。公知のＮｉｆＨ遺伝子の配列は、例えば、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）、またはＢｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｓ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｂｕｃｋｌｅｙ／ｎｉｆｈ．ｈｔｍ、ならびにＧａｂｙ、Ｊｏｈｎ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、およびＤａｎｉｅｌ  Ｈ．  Ｂｕｃｋｌｅｙ、「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｌｉｇｎｅｄ  ｎｉｆＨ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：  ａ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．」、Ｄａｔａｂａｓｅ、２０１４巻（２０１４年）：ｂａｕ００１）に見出すことができる。一部の場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。一部の場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（Ｇａｂｙ、Ｊｏｈｎ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、およびＤａｎｉｅｌ  Ｈ．  Ｂｕｃｋｌｅｙ、「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｌｉｇｎｅｄ  ｎｉｆＨ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：  ａ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．」、Ｄａｔａｂａｓｅ、２０１４巻（２０１４年）：ｂａｕ００１）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。
【０２１２】
本明細書に開示されている方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより；種子を粉砕して微生物を単離することにより；多様な土壌試料に種子を植栽し、組織から微生物を回収することにより；または植物に外因性微生物を接種し、微生物が植物組織に出現するか否かを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、または塊茎が挙げられる。一部の場合では、細菌は、種子から単離される。試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌等の、異なるタイプの付随微生物を単離することができる。また、細菌は、第１の植物から初期に分離する代わりに、環境菌株コレクション等のレポジトリを供給源としてもよい。微生物は、単離された微生物のゲノムを配列決定することにより；植物内群生の組成物をプロファイリングすることにより；群生もしくは単離された微生物のトランスクリプトーム機能性を特徴付けることにより；または選択培地もしくは表現型培地（例えば、窒素固定またはリン酸可溶化表現型）を使用して微生物の特徴をスクリーニングすることにより、遺伝子型および表現型を決定することができる。選択する候補菌株または集団は、配列データ；表現型データ；植物データ（例えば、ゲノム、表現型、および／または収穫高データ）；土壌データ（例えば、ｐＨ、Ｎ／Ｐ／Ｋ含有量、および／またはバルク土壌生物群生）；またはこれらの任意の組合せにより得ることができる。
【０２１３】
本明細書に記載の細菌および細菌を産生するための方法は、有害な植物防御反応を誘導せずに、葉表面、根表面、もしくは内部植物組織で効率的に自己増幅することができる細菌、または植物防御応答に耐性である細菌に適用してもよい。本明細書に記載の細菌は、窒素が添加されていない培地で植物組織抽出物または葉表面洗浄液を培養することにより単離してもよい。しかしながら、細菌は、培養可能でない場合があり、すなわち、培養可能かどうか公知でないか、当技術分野で公知の標準的方法の使用では培養が困難である場合がある。本明細書に記載の細菌は、内部寄生菌、または着生菌、または植物根圏に生息する細菌（根圏細菌）であってもよい。遺伝子変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、および向上された形質を有する植物から細菌を単離するステップを、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で得られる細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。内部寄生菌は、疾患症状を引き起こさずに、または共生構造の形成を誘発せずに、植物の内部に進入する生物であり、植物成長を増強し、植物の栄養を向上させる（例えば、窒素固定により）ことができるため農耕学的に興味深い生物である。細菌は、種子伝染性内部寄生菌であってもよい。種子伝染性内部寄生菌としては、成熟し乾燥した無損傷の（例えば、ひび割れ、目に見える真菌性感染、または早期発芽がない）種子に見出される種子伝染性細菌性内部寄生菌等の、イネ化植物または植物の種子に付随するまたは由来する細菌が挙げられる。また、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、種子の表面に付随もしくは由来してもよく、その代わりにまたはそれに加えて、内部種子区画（例えば、表面滅菌種子の）に付随もしくは由来してもよい。一部の場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、植物組織内で、例えば種子の内部で複製することが可能である。また、一部の場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、乾燥を生き抜くことが可能である。
【０２１４】
本開示の方法により単離されるまたは本開示の方法もしくは組成物において使用される細菌は、複数の異なる細菌分類群を組合せで含むことができる。例として、細菌としては、プロテオバクテリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＨａｌｏｍｏｎａｓ等）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）が挙げられる。本開示の方法および組成物で使用される細菌は、２つまたはそれよりも多くの種の窒素固定細菌コンソーシアを含んでいてもよい。一部の場合では、細菌コンソーシアの１つまたは複数の細菌種は、窒素を固定することが可能であってもよい。一部の場合では、細菌コンソーシアの１つまたは複数の種は、窒素を固定する他の細菌の能力を促進または増強することができる。窒素を固定する細菌および窒素固定する他の細菌の能力を増強する細菌は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。一部の例では、細菌菌株は、異なる細菌菌株と組み合わせると、またはある特定の細菌コンソーシアでは、窒素を固定することができる場合があるが、単一培養では窒素を固定することができない場合がある。窒素固定細菌コンソーシアに見出すことができる細菌属の例としては、これらに限定されないが、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、およびＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。
【０２１５】
本明細書に開示されている方法により産生することができる細菌としては、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられる。一部の例では、細菌は、以下のものからなる群より選択されてもよい：Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ。いくつかの場合には、細菌は、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒまたはＲａｈｎｅｌｌａ属であり得る。いくつかの場合には、細菌は、Ｆｒａｎｋｉａ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属であり得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の例として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｉｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、細菌は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｕｒｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．  Ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．  Ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｂｕｌｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａであり得る。
【０２１６】
一部の例では、本開示の方法によって単離された細菌は、以下の分類群：Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｚ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｆｉｐｉａ、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｔｏｐｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ、Ｂｏｓｅａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｈａｌｏｒｅｄｉｖｉｖｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒａｌｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｄｅｓｅｍｚｉａ、Ｄｅｖｏｓｉａ、Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ、Ｄｙｅｌｌａ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ／Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｌｉｍｏｎａｓ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｆｎｉａ、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｌｅｎｔｚｅａ、Ｌｕｔｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ、Ｍａｓｓｉｌｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｃｅａｎｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｏｋｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ、Ｏｒｙｚｉｈｕｍｕｓ、Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｅｏａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｅｒｌｕｃｉｄｉｂａｃａ、Ｐｌａｎｔｉｂａｃｔｅｒ  、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃ��ｕｓ、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｈｉｎｅｌｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、２５  Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、ＷＰＳ−２  ｇｅｎｅｒａ  ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎｅｌｌａのうちの１つまたはそれより多くのメンバーであり得る。
【０２１７】
いくつかの場合には、以下の属：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、およびＲａｈｎｅｌｌａのうちの１つから選択される細菌種が利用される。いくつかの場合には、以下の属：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、およびＲａｈｎｅｌｌａからの細菌種の組合せが利用される。いくつかの場合には、利用される種は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＲａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓのうちの１種またはそれより多くであり得る。
【０２１８】
一部の場合では、グラム陽性微生物は、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＸ、ｈｅｓＡ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＩ１、およびｎｉｆＩ２を含むモリブデン−鉄ニトロゲナーゼ系を有していてもよい。一部の場合では、グラム陽性微生物は、ｖｎｆＤＧ、ｖｎｆＫ、ｖｎｆＥ、ｖｎｆＮ、ｖｕｐＣ、ｖｕｐＢ、ｖｕｐＡ、ｖｎｆＶ、ｖｎｆＲ１、ｖｎｆＨ、ｖｎｆＲ２、ｖｎｆＡ（転写調節因子）を含むバナジウムニトロゲナーゼ系を有していてもよい。一部の場合では、グラム陽性微生物は、ａｎｆＫ、ａｎｆＧ、ａｎｆＤ、ａｎｆＨ、ａｎｆＡ（転写調節因子）を含む鉄のみのニトロゲナーゼ系を有していてもよい。一部の場合では、グラム陽性微生物は、ｇｌｎＢおよびｇｌｎＫ（窒素シグナル伝達タンパク質）を含むニトロゲナーゼ系を有していてもよい。グラム陽性微生物の窒素代謝に関与する酵素の一部の例としては、ｇｌｎＡ（グルタミン合成酵素）、ｇｄｈ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、ｂｄｈ（３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）、グルタミナーゼ、ｇｌｔＡＢ／ｇｌｔＢ／ｇｌｔＳ（グルタミン酸合成酵素）、ａｓｎＡ／ａｓｎＢ（アスパラギン酸−アンモニアリガーゼ／アスパラギン合成酵素）、およびａｎｓＡ／ａｎｓＺ（アスパラギナーゼ）が挙げられる。グラム陽性微生物の窒素輸送に関与するタンパク質の一部の例としては、ａｍｔＢ（アンモニウムトランスポーター）、ｇｌｎＫ（アンモニウム輸送の調節因子）、ｇｌｎＰＨＱ／ｇｌｎＱＨＭＰ（ＡＴＰ依存性グルタミン／グルタミン酸トランスポーター）、ｇｌｎＴ／ａｌｓＴ／ｙｒｂＤ／ｙｆｌＡ（グルタミン様プロトン共輸送トランスポーター）、およびｇｌｔＰ／ｇｌｔＴ／ｙｈｃｌ／ｎｑｔ（グルタミン酸様プロトン共輸送トランスポーター）が挙げられる。
【０２１９】
特に興味深いものであり得るグラム陽性微生物の例としては、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｐｈｉｌｕｍ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｒｅｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｉｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｓｐｏｒａ  ｓｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられる。
【０２２０】
グラム陽性微生物になすことができる遺伝子変更の一部の例としては、ｇｌｎＲを欠失させて、環境窒素の存在下でのＢＮＦの負の調節を除去すること；ｎｉｆクラスターのすぐ上流に異なるプロモーターを挿入して、環境窒素に応答したＧｌｎＲによる調節を除去すること；ｇｌｎＡを突然変異させて、ＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化の速度を低減すること；ａｍｔＢを欠失させて、培地からのアンモニウムの取込みを低減させること；ｇｌｎＡを突然変異させ、それにより構成的にフィードバック阻害（ＦＢＩ−ＧＳ）状態にして、ＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化を低減させることが挙げられる。
【０２２１】
一部の場合では、ｇｌｎＲは、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種におけるＮ代謝および固定の主要な調節因子である。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＲを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＥまたはｇｌｎＤを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含んでいてもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＷＬＹ７８は、ｇｌｎＢの遺伝子、または古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに見出されるそのホモログであるｎｉｆＩ１およびｎｉｆＩ２を含んでいない。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、様々であってもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ  Ｅ６８１は、ｇｌｎＫおよびｇｄｈを欠如し、幾つかの窒素化合物トランスポーターを有するが、ａｍｔＢのみが、ＧｌｎＲにより制御されると考えられる。別の例では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＪＤＲ２は、ｇｌｎＫ、ｇｄｈ、およびほとんどの他の中心的な窒素代謝遺伝子を有し、はるかにより少数の窒素化合物トランスポーターを有するが、ＧｌｎＲにより制御されるｇｌｎＰＨＱを有する。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ  ＳＢＲ５は、標準ｇｌｎＲＡオペロン、ｆｄｘ遺伝子、主要ｎｉｆオペロン、二次ｎｉｆオペロン、およびａｎｆオペロン（鉄のみのニトロゲナーゼをコードする）を含んでいる。推定上のｇｌｎＲ／ｔｎｒＡ部位が、こうしたオペロンの各々の上流に見出された。ＧｌｎＲは、ａｎｆオペロンを除き、上記オペロンの全てを調節することができる。ＧｌｎＲは、二量体として、こうした調節配列の各々に結合することができる。
【０２２２】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｎ固定菌株は、以下の２つの部分群に分類することができる：最小限のｎｉｆ遺伝子クラスターのみを含む部分群Ｉ；ならびに最小限のクラスターに加えて、ｎｉｆＸとｈｅｓＡとの間にある特徴付けられていない遺伝子、および多くの場合はｎｉｆＨ、ｎｉｆＨＤＫ、ｎｉｆＢＥＮなどのｎｉｆ遺伝子の一部が重複している他のクラスター、またはバナジウム（ｖａｎａｄａｉｕｍ）ニトロゲナーゼ（ｖｎｆ）もしくは鉄のみのニトロゲナーゼ（ａｎｆ）遺伝子をコードするクラスターを含む部分群ＩＩ。
【０２２３】
一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ−７０プロモーターから転写される９つの遺伝子を有する最小限のｎｉｆクラスターを含んでいてもよい。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｆクラスターは、窒素または酸素により負に調節されてもよい。一部の場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ−５４を産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＷＬＹ７８は、シグマ−５４の遺伝子を含んでいない。一部の場合では、ｎｉｆクラスターは、ｇｌｎＲおよび／またはＴｎｒＡにより調節されてもよい。一部の場合では、ｎｉｆクラスターの活性は、ｇｌｎＲおよび／またはＴｎｒＡの活性を変更することにより変更されてもよい。
【０２２４】
Ｂａｃｉｌｌｉでは、グルタミン合成酵素（ＧＳ）は、高濃度の細胞内グルタミンによりフィードバック阻害され、確認のシフト（ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を引き起こす（ＦＢＩ−ＧＳと呼ばれる）。Ｎｉｆクラスターは、幾つかのＢａｃｉｌｌｉ種では、調節因子ＧｌｎＲおよびＴｎｒＡに対して個別の結合部位を含む。ＧｌｎＲは、過剰な細胞内グルタミンおよびＡＭＰの存在下で結合し、遺伝子発現を抑制する。ＧｌｎＲの役割は、高窒素利用可能条件下で、グルタミンおよびアンモニウムの流入および細胞内産生を防止することであってもよい。ＴｎｒＡは、限定的な細胞内グルタミンの存在下および／またはＦＢＩ−ＧＳの存在下で結合し、および／または遺伝子発現を活性化する（または抑制する）ことができる。一部の場合では、Ｂａｃｉｌｌｉ  ｎｉｆクラスターの活性は、ＧｌｎＲの活性を変更することにより変更することができる。
【０２２５】
フィードバック阻害されたグルタミン合成酵素（ＦＢＩ−ＧＳ）は、ＧｌｎＲに結合し、認識配列に対するＧｌｎＲの結合を安定化することができる。幾つかの細菌種は、ｎｉｆクラスターの上流にＧｌｎＲ／ＴｎｒＡ結合部位を有する。ＦＢＩ−ＧＳおよびＧｌｎＲの結合を変更することにより、ｎｉｆ経路の活性を変更することができる。
【０２２６】
微生物の供給源
細菌（または本開示に従う任意の微生物）は、その土壌、植物、真菌、動物（無脊椎動物を含む）、ならびに湖および川の堆積物、水、および生物相を含む他の生物相を含む任意の一般的陸生環境；海洋環境、その生物相および堆積物（例えば、海水、海泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば、海綿動物）、海洋脊椎動物（例えば、魚類））；陸生および海洋性地圏（表土および岩石、例えば、粉砕された地中岩石、砂、および粘土）；氷雪圏およびその融雪氷水；大気（例えば、濾過空気粉塵、雲、および雨滴）；都市環境、工業環境、および他の人為的環境（例えば、コンクリート、道路側溝、屋根表面、および道路表面に蓄積された有機物および無機物）から得ることができる。
【０２２７】
細菌（または本開示に従う任意の微生物）が得られる植物は、１つまたは複数の望ましい形質を有する植物、例えば、特定の環境でまたはある特定の目的の条件下で自然に成長する植物であってもよい。例として、ある特定の植物は、砂質土壌および高塩分の砂地で、もしくは極端な温度下で、もしくは水がほとんどなくとも自然に成長することができ、または環境に存在するある特定の害虫または疾患に耐性であってもよく、商品作物は、そのような条件下で成長することが望ましい場合があり、そのような条件が、例えば特定の地理的位置において利用可能な唯一の条件である場合は特にそうである。さらなる例としては、細菌は、そのような環境で栽培された商品作物から、またはより具体的には、任意の特定の環境で栽培された作物のうち目的の形質を最も良好に示す作物植物個体：例えば、塩分制限土壌で栽培された作物のうち最も迅速に成長する植物、深刻な虫害もしくは疾患流行に曝露された作物のうち最も被害が少なかった植物、または繊維含量および油分含量等を含む、ある特定の代謝物および他の化合物の所望の量を有する植物、または望ましい色、味、もしくは匂いを示す植物から収集してもよい。細菌は、以前に参照されているような環境中の真菌および他の動物相および植物相、土壌、水、堆積物、ならびに他の要素を含む、目的の環境に生じる目的の植物または任意の物質から収集してもよい。
【０２２８】
細菌（または本開示に従う任意の微生物）は、植物組織から単離してもよい。この単離は、例えば、根、茎葉、および植物再生組織を含む、植物の任意の適切な組織から行ってもよい。例として、植物から単離するための従来の方法は、典型的には、目的の植物物質（例えば、根長、または茎長、葉）を無菌切除すること、適切な溶液（例えば、２％次亜塩素酸ナトリウム）で表面を滅菌してから、植物物質を、微生物培養用の栄養培地に配置することを含む。あるいは、表面を滅菌した植物物質を滅菌液中（通常は、水）で粉砕し、粉砕した植物物質の小片を含む懸濁液を、選択的であってもよくまたは非選択的であってもよい（例えば、リンの供給源としてフィチン酸のみを含有する）１つまたは複数の好適な固体寒天培地の表面に播種してもよい。この手法は、単離されたコロニーを形成し、個々に摘取して栄養培地のプレートから分離することができ、さらに周知の方法により単一種に精製することができる細菌に特に有用である。あるいは、植物根または葉試料を表面滅菌せず、穏やかな洗浄のみを行って、表面に生息する着生微生物を単離プロセスに含めてもよく、または植物の根、茎、もしくは葉の小片を寒天培地の表面に押しつけてから離し、その後上述のように個々のコロニーを単離することにより、着生微生物を別々に単離してもよい。この手法は、例えば、細菌に特に有用である。あるいは、根に付着している少量の土を洗い流さずに、したがって植物根圏でコロニー化する微生物を含むように、根を処理してもよい。そうでなければ、根に付着している土壌を取り出し、希釈し、好適な選択的および非選択的培地の寒天上に播種して、根圏細菌の個々のコロニーを単離してもよい。
【０２２９】
特許手続きのための微生物寄託の国際承認および規制に関するブダペスト条約（ｂｕｄａｐｅｓｔ  ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  ｐａｔｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）
本開示の微生物寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際承認および規制に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項に基づいてなされた。
【０２３０】
出願人は、米国特許規則第１．８０８条（ａ）（２）に準じて、「寄託された物質の公的な入手可能性に対して寄託者により課された全ての制限は、特許付与時に変更不能に取り除かれることになる」ことを申し立てる。この陳述は、この項の段落（ｂ）（つまり、米国特許規則第１．８０８条（ｂ））に従うものとする。
【０２３１】
Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉの生物学的な純粋培養物を、２０１５年７月１４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；国際寄託機関）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、マナサス、ＶＡ  ２０１１０、米国に寄託し、それぞれＡＴＴＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２２２９３およびＰＴＡ−１２２２９４を割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表Ａに見出される。
【０２３２】
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉは、今では、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉとして分類し直されており、この生物の名称は、本稿全体にわたって相互交換可能に使用される場合がある。
【０２３３】
図１８および図１９に示されているように、本開示の多数の微生物は、２つの野生型菌株に由来する。菌株ＣＩ００６は、以前はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（前述のＫｏｓａｋｏｎｉａへの再分類を参照）に分類されていた細菌種であり、図１９には、ＣＩ００６に由来する突然変異体の系統が特定されている。菌株ＣＩ０１９は、Ｒａｈｎｅｌｌａ属に分類されている細菌種であり、図１９には、ＣＩ０１９に由来する突然変異体の系統が特定されている。なお、図１８および図１９に関して、名称にＣＭを含む菌株は、前記ＣＭ菌株のすぐ左側に示されている菌株の突然変異体である。ＣＩ００６  Ｋｏｓａｋｏｎｉａ野生型（ＷＴ）およびＣＩ０１９  Ｒａｈｎｅｌｌａ  ＷＴの寄託情報は、下記の表Ａに見出される。
【０２３４】
本出願に記載されている一部の微小生物は、２０１７年１月６日または２０１７年８月１１日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ  ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託された。前述のように、寄託は全て、特許手続きのための微生物寄託の国際承認および規制に関するブダペスト条約の条項に基づいてなされた。前述のブダペスト条約寄託に関する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａアクセッション番号および日付は、表Ａに提供されている。
【０２３５】
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ（ＷＴ）、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ  （ＷＴ）、および変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１月６日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ  ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０１００１号、第２０１７０１００３号、および第２０１７０１００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表Ａに見出される。
【０２３６】
変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０８００４号、第２０１７０８００３号、および第２０１７０８００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表Ａに見出される。
【０２３７】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ（ＷＴ）の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、ＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０８００１号が割り当てられた。２つのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ変異体の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１２月２０日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ、Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ、Ｍａｉｎｅ０４５４４、ＵＳＡに位置する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７１２００１号および第２０１７１２００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表Ａに見出される。
【表Ａ】
2020506681.tif 000005
【０２３８】
単離された生物学的に純粋な微小生物
本開示は、ある特定の実施形態では、特に農業に適用を有する単離された生物学的に純粋な微小生物を提供する。開示される微小生物は、単離された生物学的に純粋な状態で使用することができ、ならびに組成物に製剤化することができる（例示的な組成物の説明は、下記のセクションを参照）。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微小生物の少なくとも２つのメンバーを含む微生物組成物、ならびに前記微生物組成物を使用するための方法を提供する。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微生物の使用により植物中の窒素固定をモジュレ−トするための方法を提供する。
【０２３９】
一部の態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表Ａに示されているものである。他の態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表Ａの微小生物から導出される。例えば、表Ａの微小生物の菌株、子孫、突然変異体、または誘導体が、本明細書で提供されている。本開示では、表Ａに列挙されている微生物のあらゆる考え得る組合せが企図され、前記組合せは微生物コンソーシアを形成することがある。表Ａの微生物は、個々にまたは任意の組合せのいずれでもよく、本開示で言及されている任意の植物、活性物質（ａｃｔｉｖｅ）（合成、有機など）、アジュバント、担体、栄養補助剤、または生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と組み合わせることができる。
【０２４０】
組成物
本明細書に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、および／または本明細書に記載のような特徴を有する組成物は、液体、泡沫、または乾燥製品の形態であってもよい。また、本明細書に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、および／または本明細書に記載のような特徴を有する組成物を使用して、植物形質を向上させることができる。一部の例では、細菌集団を含む組成物は、乾燥粉末、粉末および水のスラリー、または流動性種子処理剤の形態であってもよい。細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングしてもよく、液体形態であってもよい。
【０２４１】
組成物は、連続撹拌槽型反応器、回分反応器などのバイオリアクターで、および農場で製造することができる。一部の例では、組成物は、ジャグなどの容器中でまたはミニバルクで保管することができる。一部の例では、組成物は、ボトル、ジャー、アンプル、パッケージ、入れ物、袋、箱、ビン、封筒、紙箱、容器、サイロ、発送容器、トラック荷台、および／またはケースからなる群より選択される物体内で保管することができる。
【０２４２】
また、組成物は、植物形質を向上させるために使用することができる。一部の例では、１つまたは複数の組成物を、種子にコーティングしてもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物を、実生にコーティングしてもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物を、種子の表面にコーティングしてもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物を、種子の表面上方の層としてコーティングしてもよい。一部の例では、種子にコーティングされる組成物は、液体形態であってもよく、乾燥製品形態であってもよく、泡沫形態であってもよく、粉末および水のスラリー形態であってもよく、または流動性種子処理剤であってもよい。一部の例では、１つまたは複数の組成物を種子および／または実生に、噴霧、浸漬、コーティング、封入、および／または散布することにより、１つまたは複数の組成物を種子および／または実生に適用してもよい。一部の例では、細菌組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種より多くの細菌は、以下の属：Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓのうちの１つから選択され得る。
【０２４３】
一部の例では、内部寄生性組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種より多くの細菌および細菌集団は、以下の科：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、およびＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
【０２４４】
一部の例では、内部寄生性組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種より多くの細菌および細菌集団は、以下の科：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
【０２４５】
組成物の例としては、商業的に重要な農業作物、例えば、モロコシ、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、メイズ（ｍａｉｚｅ）、および小麦のための種子コーティングを挙げることができる。また、組成物の例としては、トウモロコシ、大豆、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、米、野菜、穀類、および脂肪種子のための種子コーティングを挙げることができる。本明細書で提供される種子は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよく、非ＧＭＯであってもよく、有機的なものであってもよく、従来のものであってもよい。一部の例では、組成物は、細胞生存、および宿主植物での人為的接種およびコロニー化の能力を維持する好適な様式で脱水してもよい。細菌種は、１０８〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌの間の濃度で組成物中に存在してもよい。一部の例では、組成物は、モリブデンイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらイオンの組合せ等の微量金属イオンで補充されてもよい。本明細書に記載の組成物の例におけるイオンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの間であってもよい。また、組成物の一部の例は、ベータ−グルカン、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、細菌性細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）、糖、畜乳、または他の好適な担体等の担体と共に製剤化されてもよい。一部の例では、泥炭または植栽用物質を担体として使用してもよく、または組成物がバイオポリマーに捕捉されているバイオポリマーを担体として使用してもよい。本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実数または種子数の増加、および果実単位重量または種子単位重量の増加等、植物形質を向上させることができる。
【０２４６】
本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、種子の表面上にコーティングしてもよい。そのため、本明細書に記載のうちの１つまたは複数の細菌でコーティングされた種子を含む組成物も企図される。種子コーティングは、細菌集団を、多孔性の化学的に不活性な粒状担体と混合することにより形成することができる。あるいは、組成物は、種子が植栽される畝間内に直接挿入してもよく、植物葉に噴霧してもよく、または根を組成物の懸濁液に浸漬することにより適用してもよい。有効量の組成物を使用して、植物の根に隣接する土壌下領域に生存可能な細菌増殖を定植させてもよく、または植物の葉に生存可能な細菌増殖を定植させてもよい。一般的に、有効量は、向上された形質（例えば、所望のレベルの窒素固定）を有する植物をもたらすのに十分な量である。
【０２４７】
本明細書に記載の細菌組成物は、農業的に許容される担体を使用して製剤化することができる。こうした実施形態に有用な製剤は、粘着付与剤、微生物安定化剤（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）、殺真菌剤、抗細菌剤、保存剤、安定化剤、界面活性剤、抗錯体剤（ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｇｅｎｔ）、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、肥料、殺鼠剤、乾燥剤、殺菌剤、栄養素、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含んでいてもよい。一部の例では、組成物は、保管安定性であってもよい。例えば、本明細書に記載の組成物はいずれも、農業的に許容される担体（例えば、非天然肥料等の肥料、非天然付着剤等の付着剤、および非天然殺虫剤等の殺虫剤のうちの１つまたは複数）を含んでもよい。非天然付着剤は、例えば、ポリマー、コポリマー、または合成ろうであってもよい。例えば、本明細書に記載されているコーティングされた種子、実生、または植物はいずれも、種子コーティングにそのような農業的に許容される担体を含有することができる。本明細書に記載されている組成物または方法のいずれにおいても、農業的に許容される担体は、非天然化合物（例えば、非天然肥料；ポリマー、コポリマー、もしくは合成ろう等の非天然付着剤；または非天然殺虫剤）であってもよく、または含んでもよい。農業的に許容される担体の非限定的な例は、下記に記載されている。農業的に許容される担体の追加の例は、当技術分野で公知である。
【０２４８】
一部の場合では、細菌は、農業的に許容される担体と混合されてもよい。担体は、固体担体であってもよくまたは液体担体であってもよく、ミクロスフェア、粉末、およびエマルジョン等を含む種々の形態であってもよい。担体は、安定性、湿潤性、または分散性の増加等の様々な特性を付与する幾つかの担体のいずれか１つまたは複数であってもよい。非イオン性界面活性剤であってもよく、またはイオン性界面活性剤であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい天然または合成界面活性剤等の湿潤剤が、組成物中に含まれてもよい。また、単離された細菌を含む組成物を製剤化するために、油中水型エマルジョンを使用してもよい（例えば、米国特許第７，４８５，４５１号を参照）。調製することができる好適な製剤としては、水和性粉末、顆粒、ゲル、寒天片またはペレット、および増粘剤等、およびマイクロカプセル化粒子等、流動性水溶液、水性懸濁液、油中水型エマルジョン等の液体等が挙げられる。製剤は、穀物またはマメ科植物産物、例えば地上穀物または豆、穀物または豆に由来するブロスまたは粉末、デンプン、糖、または油を含んでもよい。
【０２４９】
一部の実施形態では、農業担体は、土壌であってもよく、または植物生育培地であってもよい。使用することができる他の農業担体としては、水、肥料、植物系の油、保湿剤、またはそれらの組合せが挙げられる。あるいは、農業担体は、顆粒、ペレット、または懸濁液を含む、ケイソウ土、ローム、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種嚢、他の植物および動物産物、または組合せ等の固形物であってもよい。これらに限定されないが、ローム、砂、または粘土等の中のペスタ（ｐｅｓｔａ）（粉末およびカオリン粘土）、寒天または粉末に基づくペレット等の、前述の成分のいずれかの混合物も担体として企図される。製剤は、大麦、米、または種子等の他の生物学的材料；植物部分；サトウキビバガス；穀物処理に由来する殻または柄；建築現場廃物に由来する地上植物材料または木材；紙、繊維、または木材の再利用に由来するおがくずまたは繊維片等の、細菌の食料源を含んでもよい。
【０２５０】
例えば、肥料を使用して、成長促進を支援してもよく、種子、実生、または植物への栄養素供給を支援してもよい。肥料の非限定的な例としては、窒素、亜リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、カリウム、カルシウム、硫黄、マグネシウム、ホウ素、塩化物、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、およびセレン（またはそれらの塩）が挙げられる。肥料の追加の例としては、１つまたは複数のアミノ酸、塩、炭水化物、ビタミン、グルコース、ＮａＣｌ、酵母抽出物、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、グリセロール、バリン、Ｌ−ロイシン、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸水素カリウム、キシロース、リキソース、およびレシチンが挙げられる。一実施形態では、製剤は、他の活性剤が物質（例えば、種子の表面）に結合するのを支援するために、粘着付与剤または粘着剤（接着剤と呼ばれる）を含んでもよい。そのような薬剤は、他の化合物（例えば、生物学的ではない制御因子）を含有してもよい担体を細菌と組み合わせて、コーティング組成物を産出するために有用である。そのような組成物は、植物または種子の周囲にコーティングを作成して、微生物および他の薬剤と植物または植物部分との接触の維持を支援する。一実施形態では、接着剤は、以下のものからなる群より選択される：アルギン酸塩、ゴム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチネート、ヘスペリチン、ポリ酢酸ビニル、ケファリン、アラビアゴム、キサンタンガム、鉱油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノ−ガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガッチゴム、およびポリオキシエチレン−ポリオキシブチレンブロックコポリマー。
【０２５１】
一部の実施形態では、接着剤は、例えば、カルナウバろう、みつろう、中国ろう、セラックろう、鯨ろう、カンデリラろう、キャスターろう、オーリクリーろう、および米ぬかろう等のろう、ポリサッカライド（例えばデンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサン）、脂肪、油、タンパク質（例えば、ゼラチンおよびゼイン）、アラビアガム、ならびにシェラックであってもよい。接着剤は、非天然化合物、例えばポリマー、コポリマー、およびろうであってもよい。例えば、接着剤として使用することができるポリマーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アシルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレン。
【０２５２】
一部の例では、付着剤、抗真菌剤、成長調節剤、および殺虫剤（例えば、殺虫剤）のうちの１つまたは複数は、非天然化合物（例えば、任意の組合せの）である。農業的に許容される担体の追加の例としては、分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートＰＶＰＩＶＡ  Ｓ−６３０）、界面活性剤、結合剤、および充填剤が挙げられる。
【０２５３】
また、製剤は、界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤の非限定的な例としては、Ｐｒｅｆｅｒ２８（Ｃｅｎｅｘ）、Ｓｕｒｆ−Ｎ（ＵＳ）、Ｉｎｈａｎｃｅ（Ｂｒａｎｄｔ）、Ｐ−２８（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＰａｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ）等の窒素界面活性剤配合物が挙げられる。エステル化種子油としては、Ｓｕｎ−Ｉｔ  ＩＩ（ＡｍＣｙ）、ＭＳＯ（ＵＡＰ）、Ｓｃｏｉｌ（Ａｇｓｃｏ）、Ｈａｓｔｅｎ（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＭｅｓ−１００（Ｄｒｅｘｅｌ）が挙げられる。有機シリコーン界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（ＵＡＰ）、Ｓｉｌｉｋｉｎ（Ｔｅｒｒａ）、Ｄｙｎｅ−Ａｍｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｓｙｌｇａｒｄ３０９（Ｗｉｌｂｕｒ−Ｅｌｌｉｓ）、およびＣｅｎｔｕｒｙ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が挙げられる。一実施形態では、界面活性剤は、０．０１％ｖ／ｖ〜１０％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は、０．１％ｖ／ｖ〜１％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。
【０２５４】
ある特定の場合では、製剤は、微生物安定化剤を含む。そのような薬剤としては、乾燥剤として分類することができる任意の化合物または化合物の混合物を含む乾燥剤を挙げることができ、化合物は、液体接種物に対して実際に乾燥効果を有するような濃度で使用されるか否かを問わない。そのような乾燥剤は、理想的には、使用される細菌集団と適合性を有し、微生物集団が種子へと適用されても生存し、乾燥しても生存する能力を促進すると予想される。好適な乾燥剤の例としては、トレハロース、スクロース、グリセロール、およびメチレングリコールのうちの１つまたは複数が挙げられる。他の好適な乾燥剤としては、これらに限定されないが、非還元糖および糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）が挙げられる。製剤に導入される乾燥剤の量は、重量／容積で約５％から約５０％まで、例えば、約１０％〜約４０％の間、約１５％〜約３５％の間、または約２０％〜約３０％の間の範囲であってもよい。一部の場合では、製剤は、殺真菌剤、抗細菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、殺菌剤または栄養素等の薬剤を含有することが有利である。一部の場合では、製剤は、殺真菌剤、抗細菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、殺菌剤、または栄養素などの作用剤を含むことが有利である。一部の例では、作用剤は、種子表面伝染性病原体からの保護を提供する保護剤を含んでもよい。一部の例では、保護剤は、ある程度のレベルの土壌伝染性病原体の制御を提供することができる。一部の例では、保護剤は、主に種子表面で有効であり得る。
【０２５５】
一部の例では、殺真菌剤は、化学的かまたは生物学的かに関わらず、真菌の成長を阻害することができるか、または真菌を死滅させることができる化合物または作用剤を含んでいてもよい。一部の例では、殺真菌剤は、静真菌性であってもよくまたは殺真菌性であってもよい化合物を含んでいてもよい。一部の例では、殺真菌剤は、保護剤であってもよく、または主に種子表面で有効であり、種子表面伝染性病原体に対する保護を提供し、ある程度のレベルの土壌伝染性病原体の制御を提供する作用剤であってもよい。保護剤殺真菌剤の非限定的な例としては、カプタン、マネブ、チラム、またはフルジオキソニルが挙げられる。
【０２５６】
一部の例では、殺真菌剤は、出芽中の実生に吸収され、宿主植物組織内部の真菌を阻害または死滅させることができる浸透移行性殺真菌剤であってもよい。種子処理剤に使用される浸透移行性殺真菌剤としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：アゾキシストロビン、カルボキシン、メフェノキサム、メタラキシル、チアベンダゾール、トリフロキシストロビン、ならびにジフェノコナゾール、イプコナゾール、テブコナゾール、およびトリチコナゾールを含む種々のトリアゾール殺真菌剤。メフェノキサムおよびメタラキシルは、主に、水生カビ真菌ＰｙｔｈｉｕｍおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａを標的とするために使用される。病原性真菌種の感受性に微妙な差異があるため、または植物の殺真菌剤分布もしくは感受性に差異があるためのいずれかのため、植物種に応じて、ある殺真菌剤は、他の殺真菌剤よりも好ましい。一部の例では、殺真菌剤は、細菌または真菌などの生物学的制御因子であってもよい。そのような生物は、病原性真菌に寄生性であってもよく、または真菌を死滅させるかもしくはそうでなければ真菌の成長を防止することができる毒素もしくは他の物質を分泌してもよい。任意のタイプの殺真菌剤、特に植物に対して一般に使用されるものを、種子組成物中の制御因子として使用することができる。
【０２５７】
一部の例では、種子コーティング組成物は、抗細菌特性を有する制御因子を含む。一実施形態では、抗細菌特性を有する制御因子は、本明細書の他所に記載されている化合物から選択される。別の実施形態では、化合物は、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、オキソリン酸、またはゲンタマイシンである。種子コーティング組成物の一部分として使用することができる抗細菌化合物の他の例としては、ジクロロフェンおよびベンジルアルコールヘミホルマールに基づくもの（ＩＣＩのＰｒｏｘｅｌ（登録商標）またはＴｈｏｒ  ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＲＳ、およびＲｏｈｍ＆ＨａａｓのＫａｔｈｏｎ（登録商標）ＭＫ２５）、ならびにアルキルイソチアゾリノンおよびベンゾイソチアゾリノンなどのイソチアゾリノン誘導体に基づくもの（Ｔｈｏｒ  ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＭＢＳ）が挙げられる。
【０２５８】
一部の例では、成長調節剤は、アブシジン酸、アミドクロル、アンシミドール、６−ベンジルアミノプリン、ブラシノリド、ブトラリン、クロルメコート（塩化クロルメコート）、塩化コリン、シクラニリド、ダミノジット、ジケグラック、ジメチピン、２，６−ジメチルプリジン、エテホン、フルメトラリン、フルルプリミドール、フルチアセト、ホルクロルフェヌロン、ジベレリン酸、イナベンフィド、インドール−３−酢酸、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピクアト（塩化メピクアト）、ナフタレン酢酸、Ｎ−６−ベンジルアデニン、パクロブトラゾール、プロヘキサジオンホスホロトリチオエート、２，３，５−トリ−ヨード安息香酸、トリネキサパック−エチル（ｔｒｉｎｅｘａｐａｃ−ｅｔｈｙｌ）、およびウニコナゾールからなる群より選択される。成長調節剤の追加の非限定的な例としては、ブラシノステロイド、サイトカイニン（例えば、キネチンおよびゼアチン）、オーキシン（例えば、インドリル酢酸およびアスパラギン酸インドリルアセチル）、フラボノイドおよびイソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｉｄ）（例えば、ホルモノネチンおよびジオスメチン）、フィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｉｘｉｎ）（例えば、グリセオリン）、およびフィトアレキシン誘導性オリゴ糖（例えば、ペクチン、キチン、キトサン、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオリゴガラクツロン酸）、ならびにジベレリン（ｇｉｂｅｌｌｅｒｉｎ）が挙げられる。そのような薬剤は、理想的には、製剤が適用される農業種子または実生と適合性を有する（例えば、植物の成長または健康に有害であるべきではない）。さらに、薬剤は、理想的には、ヒト、動物、または工業使用に関して安全性の懸念を引き起こさないものである（例えば、安全性の問題がないか、または化合物は、十分に不安定であり、植物に由来する商品植物製品に含まれる化合物の量は無視できる程度である）。
【０２５９】
線虫アンタゴニスト生物防除剤の一部の例としては、ＡＲＦ１８；３０  Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｓｐｐ．；Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ  ｓｐｐ．；Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．；Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｓｐｐ．；Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．；ＶＡ菌根菌（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ  ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ  ｆｕｎｇｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．；Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｓｐｐ．，Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．；およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。特に好ましい線虫アンタゴニスト生物防除剤としては、ＡＲＦ１８、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ  ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ  ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｖｉｘｅｎｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔｅｎｓｉｓ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｅｃａｎｉｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ、Ｍｙｒｏｔｅｈｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ、Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｅ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｈａｓｅｏｌｉ、ＶＡ菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｔｈｏｒｎｅｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｎｉｓｈｉｚａｗａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｐａｓｔｒｕｅｉａ  ｕｓａｇｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ菌株Ｇ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。
【０２６０】
栄養素の一部の例は、これらに限定されないが、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、無加圧窒素溶液、アンモニア水、無水アンモニア、チオ硫酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、尿素−ホルムアルデヒド、ＩＢＤＵ、ポリマー被覆尿素、硝酸カルシウム、尿素ホルム（Ｕｒｅａｆｏｒｍ）、およびメチレン尿素を含む窒素肥料；リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、濃縮過リン酸石灰、および重過リン酸石灰などの亜リン酸肥料：ならびに塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硝酸カリウムなどのカリウム肥料からなる群より選択することができる。そのような組成物は、種子被膜組成物内の遊離塩またはイオンとして存在することができる。あるいは、栄養素／肥料は、経時的な持続放出を提供するように錯体化またはキレート化されていてもよい。
【０２６１】
殺鼠剤の一部の例としては、２−イソバレリルインダン−１，３−ジオン、４−（キノキサリン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド、アルファ−クロロヒドリン、リン化アルミニウム、アンツー（ａｎｔｕ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｏｕｓ  ｏｘｉｄｅ）、炭酸バリウム、ビスチオセミ、ブロディファコウム、ブロマジオロン、ブロメタリン、シアン化カルシウム、クロラロース、クロロファシノン、コレカルシフェロール、クマクロル、クマフリル、クマテトラリル、クリミジン、ジフェナコウム、ジフェチアロン、ジファシノン、エルゴカルシフェロール、フロクマフェン、フルオロアセトアミド、フルプロパジン、フルプロパジン塩酸塩、シアン化水素、ヨードメタン、リンデン、リン化マグネシウム、臭化メチル、ノルボルミド、ホサセチン、ホスフィン、リン、ピンドン、亜ヒ酸カリウム、ピリヌロン、シリロシド、亜ヒ酸ナトリウム、シアン化ナトリウム、フルオロ酢酸ナトリウム、ストリキニーネ、硫酸タリウム、ワルファリン、およびリン化亜鉛からなる物質の群から選択されるものを挙げることができる。
【０２６２】
液体形態、例えば、溶液または懸濁液の場合、細菌集団は、水または水溶液に混合または懸濁されてもよい。好適な液体希釈剤または担体としては、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が挙げられる。
【０２６３】
固形組成物は、泥炭、小麦、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、ケイソウ土、フラー土、および低温滅菌土等の適切に分割された固体担体内にまたは固体担体上に細菌集団を分散させることにより調製することができる。そのような製剤が水和性粉末として使用される場合、非イオン性、陰イオン性、両性、または陽イオン性の分散剤および乳化剤等の、生物学的に適合性の分散剤を使用することができる。
【０２６４】
製剤時に使用される固体担体としては、例えば、カオリン粘土、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、ケイソウ土、酸性白土、バーミキュライト、およびパーライト等の鉱物担体；ならびに硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、および炭酸カルシウム等の無機塩が挙げられる。また、小麦粉、小麦ふすま、および米ぬか等の有機微細粉末を使用してもよい。液体担体としては、大豆油および綿実油等の植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【０２６５】
作物に対する細菌集団の適用
本明細書に記載されている細菌または細菌集団の組成物は、畦間で、タルク中でまたは種子処理剤として適用することができる。組成物は、バルク、ミニバルク、袋、またはタルク中の種子パッケージに適用することができる。
【０２６６】
植栽者は、処理された種子を植栽し、従来の様式に従って２条で、または耕うんを必要としない様式で作物を栽培する。種子は、コントロールホッパーまたは個別のホッパーを使用して散布することができる。また、種子は、加圧空気を使用してまたは手作業で散布することができる。種子配置は、可変作業技術（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒａｔｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して実施することができる。加えて、本明細書に記載されている細菌または細菌集団の適用は、可変作業技術を使用して適用することができる。一部の例では、細菌は、トウモロコシ、大豆、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、米、野菜、穀類、擬似穀類（ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｅａｌ）の種子、および脂肪種子に適用することができる。穀類の例としては、大麦、フォニオ、オート麦、パルマーグラス（ｐａｌｍｅｒ’ｓ  ｇｒａｓｓ）、ライ麦、トウジンビエ（Ｐｅａｒｌ  Ｍｉｌｌｅｔ）、モロコシ、スペルトコムギ、テフ、ライ小麦、および小麦を挙げることができる。擬似穀類の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チーア、亜麻、アマランサス子実、ハンザ（ｈａｎｚａ）、キノア、およびゴマを挙げることができる。一部の例では、種子は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよく、非ＧＭＯであってもよく、有機的なものであってもよく、従来のものであってもよい。
【０２６７】
マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、および殺真菌剤などの添加剤を追加で使用して、作物を処理することができる。添加剤の例としては、殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤などの作物保護剤；着色剤、ポリマー、植込錠（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）、下塗剤（ｐｒｉｍｉｎｇ）、および消毒剤などの増強剤；ならびに接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、および微量栄養素などの他の作用剤が挙げられる。ＰＧＲは、根成長、開花、または茎伸長に影響を及ぼす天然または合成の植物ホルモンであってもよい。ＰＧＲとしては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、およびアブシジン酸（ＡＢＡ）を挙げることができる。
【０２６８】
組成物は、液体肥料と組み合わせて畦間で適用することができる。一部の例では、液体肥料は、タンクに保持してもよい。ＮＰＫ肥料は、ナトリウム、亜リン酸、およびカリウムという主要栄養素を含む。
【０２６９】
組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実または種子数の増加、および果実または種子単位重量の増加などの、植物形質を向上させることができる。本開示の方法は、様々な望ましい形質の１つまたは複数を導入または向上させるために用いることができる。導入または向上される形質の例としては、以下のものが挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、低窒素ストレスへの耐性、窒素使用効率、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、代謝物のレベルの調整、プロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、導入および／または向上された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。導入または向上される好ましい形質は、本明細書に記載されているような窒素固定である。一部の例では、植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、類似条件下で栽培された基準農業植物（例えば、導入されたおよび／または向上された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。
【０２７０】
宿主植物の農学的形質としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：油含有量の変更、タンパク質含有量の変更、種子炭水化物組成の変更、種子油組成の変更、および種子タンパク質組成の変更、化学物質耐性、耐寒性、老化遅延、病害耐性、干ばつ耐性、穂重、成長改善、健康増強、耐熱性、除草剤耐性、草食動物耐性、窒素固定の向上、窒素利用の向上、根アーキテクチャーの向上、水使用効率の向上、バイオマスの増加、根長の増加、種子重量の増加、苗条長さの増加、収穫高の増加、水制限条件下での収穫高の増加、穀粒質量、穀粒水分含有量、金属耐性、穂数、１穂当たりの穀粒数、さや数、栄養増強、病原体耐性、害虫耐性、光合成能力の向上、塩分耐性、緑維持（ｓｔａｙ−ｇｒｅｅｎ）、活力向上、成熟種子の乾燥重量の増加、成熟種子の生重量の増加、１植物当たりの成熟種子数の増加、葉緑素含有量の増加、１植物当たりのさや数の増加、１植物当たりのさや長の増加、１植物当たりのしおれた葉の数の減少、１植物当たりの重度にしおれた葉の数の減少、および１植物当たりのしおれていない葉の数の増加、前記種子処理剤製剤を用いずに種子から成長させた同系統植物と比較した、代謝物質レベルの検出可能なモジュレーション、転写物レベルの検出可能なモジュレーション、およびプロテオームの検出可能なモジュレーション。
【０２７１】
一部の場合では、接種される植物の植物要素と同じ種の植物から単離された細菌または細菌集団を植物に接種する。例えば、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）の１つの品種に通常見出される細菌または細菌集団を、その天然の状態では前記細菌および細菌集団を欠如するＺｅａ  ｍａｙｓの別の品種の植物の植物要素に付随させる。一実施形態では、細菌および細菌集団は、接種される植物の植物要素と関連する植物種に属する植物に由来する。例えば、Ｚｅａ  ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ  Ｉｌｔｉｓなど（ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ｔｅｏｓｉｎｔｅ）に通常見出される細菌および細菌集団を、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）に適用するか、またはその逆である。一部の場合では、接種される植物の植物要素とは異種である細菌および細菌集団を植物に接種する。一実施形態では、細菌および細菌集団は、別の種の植物に由来する。例えば、通常は双子葉植物に見出される細菌および細菌集団を、単子葉植物に適用するか（例えば、大豆由来細菌および細菌集団をトウモロコシに接種する）、またはその逆である。他の場合では、植物に接種しようとする細菌および細菌集団は、接種されている植物の関連種に由来する。一実施形態では、細菌および細菌集団は、関連分類群に、例えば関連種に由来する。別の種の植物は、農業植物であってもよい。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、任意の宿主植物要素に接種されるように設計された組成物の一部分である。
【０２７２】
一部の例では、細菌または細菌集団は外因性であり、細菌および細菌集団は、接種される植物とは異なる植物から単離される。例えば、一実施形態では、細菌または細菌集団は、接種される植物と同じ種の異なる植物から単離することができる。一部の場合では、細菌または細菌集団は、接種される植物と関連する種から単離することができる。
【０２７３】
一部の例では、本明細書に記載の細菌および細菌集団は、１つの組織タイプから別のタイプへと移動させることが可能である。例えば、種子の外側にコーティングした後の植物の成熟組織内での細菌および細菌集団の本発明の検出および単離により、種子外側から成熟中の植物の栄養組織内へと移動するそれらの能力が実証される。したがって、一実施形態では、細菌の集団および細菌集団は、種子外側から植物の栄養組織内へと移動することが可能である。一実施形態では、植物の種子にコーティングされた細菌および細菌集団は、種子が植物状態へと発芽すると、植物の異なる組織へと局在化することが可能である。例えば、細菌および細菌集団は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、突起様構造、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、および木部を含む植物の組織のいずれか１つに局在化することが可能であり得る。一実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根および／または根毛に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化される。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することが可能である。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニー化する。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の表面に存在する（つまり、その存在は、植物外側、または植物のエピスフィア（ｅｐｉｓｐｈｅｒｅ）に検出可能に存在する）ように、植物にコロニー化することができる。さらに他の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
【０２７４】
また、組成物の有効性は、作物の相対的成熟度または作物発熱単位（ＣＨＵ、ｃｒｏｐ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を測定することにより評価することができる。例えば、細菌集団をトウモロコシに適用することができ、トウモロコシ成長を、トウモロコシ穀粒の相対的成熟度、またはトウモロコシ穀粒が最大重量になる時間により評価することができる。また、作物発熱単位（ＣＨＵ）を使用して、トウモロコシ作物の成熟度を予測することができる。ＣＨＵは、作物が成長する際の一日の最高温度を測定することにより熱蓄積量を決定する。
【０２７５】
例では、細菌は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、突起様構造、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、および木部を含む植物の組織のいずれか１つに局在化してもよい。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化される。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、または果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニー化する。さらに別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の表面に存在するように、植物にコロニー化することができる。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
【０２７６】
作物に適用される細菌組成物の有効性は、これらに限定されないが、植栽率、播種活力（ｓｅｅｄｉｎｇ  ｖｉｇｏｒ）、根の強度、干ばつ耐性、植物丈、ドライダウン（ｄｒｙ  ｄｏｗｎ）、および検査重量を含む、作物成長の種々の特徴を測定することにより評価することができる。
【０２７７】
植物種
本明細書に記載の方法および細菌は、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、およびＴｒｉｔｉｃｅａｅ属の植物等の、様々な植物のいずれにも好適である。好適な植物の他の非限定的な例としては、コケ類、地衣類、および藻類が挙げられる。一部の場合では、植物は、食用作物、繊維作物、油用作物、森林またはパルプおよび製紙業界の植物、バイオ燃料生産用の原料、および／または観賞植物等の、経済的、社会的、および／または環境的な価値を有する。一部の例では、植物は、穀物；小麦粉；デンプン；シロップ；粗挽き子；油；フィルム；パッケージング；栄養補給製品；パルプ；動物飼料；魚飼料；工業化学物質、シリアル製品、加工ヒト用食品、糖、アルコール、および／またはタンパク質のバルク材料などの、経済的に価値のある製品を生産するために使用することができる。作物植物の非限定的な例としては、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀（ｍｉｌｌｅｔ）、オートムギ、ライ小麦、ソバ、スイートコーン、サトウキビ、玉ねぎ、トマト、イチゴ、およびアスパラガスが挙げられる。
【０２７８】
一部の例では、本明細書で開示された方法および組成物を使用して得ることができるかまたは向上させることができる植物としては、農業、園芸、バイオ燃料分子および他の化学物質を生産するためのバイオマス、ならびに／または林業にとって重要であるかまたは興味深い植物を挙げることができる。それらの植物の一部の例としては、パイナップル、バナナ、ココナッツ、ユリ、グラスピー、およびイネ科植物；ならびに、例えば、エンドウ、アルファルファ、オオブドウホオズキ、メロン、ヒヨコマメ、チコリー、クローバ、ケール、レンズマメ、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイコン、キャベツ、アブラナ、リンゴの木、ブドウ、綿、ヒマワリ、シロイヌナズナ、キャノーラ、柑橘類（オレンジ、マンダリン、キンカン、レモン、ライム、グレープフルーツ、タンジェリン、タンジェロ、シトロン、およびザボンを含む）、コショウ、豆、レタス、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（モロコシ、スーダン（ｓｕｄａｎ））、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐ．（エネルギーケーン（ｅｎｅｒｇｙｃａｎｅ））、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（小麦）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（米）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンヒエ）、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）、Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ  ｓｐｐ．（ｔｒｉｔｉｃｕｍ−２５  小麦×ライ麦）、タケ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アブラヤシ）、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ（ナツメヤシ）、Ａｒｃｈｏｎｔｏｐｈｏｅｎｉｘ  ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｎａ（ユスラヤシ）、Ｓｙａｇｒｕｓ  ｒｏｍａｎｚｏｆｆｉａｎａ（ジョウオウヤシ）、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ（ｃａｓｓａｙａ））、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｌｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ（イチ��）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ（トウガラシおよびアマトウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）、Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ、Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｌｉｖａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ、Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｉｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐｐ．、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｐｐ．、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、Ｈｅｖｅａ  ｓｐｐ．（ゴム）、Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ（ミント）、Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ（ミント）、Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オート麦）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、およびＬｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．（ライ麦）などの双子葉植物を挙げることができる。
【０２７９】
一部の例では、単子葉植物を使用することができる。単子葉植物は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、およびＺｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓの目に属する。Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅの綱に属する植物は、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｇｎｅｔａｌｅｓ、およびＰｉｎａｌｅｓである。一部の例では、単子葉植物は、メイズ、米、小麦、大麦、およびサトウキビからなる群より選択することができる。
【０２８０】
一部の例では、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ａｓｔｅｒａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｍｉｄｄｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂ  ａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｓａｎｔａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、およびＶｉｏｌａｔｅｓの目に属するものを含む双子葉植物を使用することができる。一部の例では、双子葉植物は、綿、大豆、コショウ、およびトマトからなる群より選択することができる。
【０２８１】
一部の場合では、向上される植物は、実験条件に容易に適合しない。例えば、作物植物は、十分に成長するのに時間が長くかかり過ぎるため、向上された形質を複数の繰り返しで連続的に評価することが実際上できない場合がある。したがって、細菌が最初に単離される第１の植物および／または遺伝子操作した細菌を適用する複数の植物は、所望の条件下での評価をより行い易い植物等のモデル植物であってもよい。モデル植物の非限定的な例としては、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属が挙げられる。その後、モデル植物を使用して本開示の方法により単離された細菌の能力を、別のタイプの植物（例えば、作物植物）に適用して、向上された形質の付与を確認することができる。
【０２８２】
本明細書に開示されている方法により向上させることができる形質としては、例えば、成長速度、植物丈、重量、色、味、臭い、植物による１つまたは複数の化合物（例えば、代謝物、タンパク質、薬物、炭水化物、油、および任意の他の化合物を含む）の産生の変化を含む植物の任意の観察可能な特徴が挙げられる。遺伝子型情報に基づいて植物を選択することも起想される（例えば、細菌に応答した植物遺伝子発現のパターンを含むこと、または窒素固定の増加に関連するもの等の遺伝子マーカーの存在を同定すること）。また、植物は、ある特定の特徴または形質（望ましい特徴または形質等）の存在ではなく、ある特定の特徴または形質（望ましくない特徴または形質等）の非存在、抑制、または阻害に基づいて選択してもよい。
【０２８３】
農業組成物の適用の濃度および速度
上述のように、教示される微生物を含む本開示の農業組成物は、数多くの様式で植物に適用することができる。２つの特定の態様では、本開示は、畦間処理剤または種子処理剤を企図する。
【０２８４】
種子処理剤の実施形態の場合、本開示の微生物は、様々な濃度で種子上に存在することができる。例えば、微生物は、１種子当たり１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、またはそれよりも高いｃｆｕ濃度で種子処理剤に見出すことができる。特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０４〜約１×１０８ｃｆｕを含む。他の特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕを含む。他の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０６ｃｆｕを含む。
【０２８５】
アメリカ合衆国では、トウモロコシ作付面積の約１０％は、１エーカー当たり約３６，０００種子を超える種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３３，０００〜３６，０００種子の種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３０，０００〜３３，０００種子の種子密度で植栽され、残りの作付面積は、様々である。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｉｏｎｅｅｒ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ａｇｒｏｎｏｍｙ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｃｏｒｎ−ｓｅｅｄｉｎｇ−ｒａｔｅ−ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ／で入手可能であるＳｔｅｖｅ  Ｂｕｔｚｅｎ著「Ｃｏｒｎ  Ｓｅｅｄｉｎｇ  Ｒａｔｅ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」を参照されたい。
【０２８６】
下記の表Ｂでは、企図されている種子処理剤実施形態における１種子当たりの種々のｃｆｕ濃度（行）および種々の種子作付け植栽密度（第１の欄：１５Ｋ〜４１Ｋ）を使用して、１エーカー当たりのｃｆｕの合計量が算出されている。これが、種々の農業シナリオで使用されることになる（つまり、１種子当たりの種子処理剤濃度×１エーカー当たりの植栽種子密度）。したがって、１種子当たり１×１０６ｃｆｕで種子処理剤を使用し、１エーカー当たり３０，０００種子を植栽する場合、１エーカー当たりの総ｃｆｕ含有量は、３×１０１０（つまり３０Ｋ＊１×１０６）になると予想される。
【表Ｂ】
2020506681.tif 000006
【０２８７】
畦間実施形態の場合、本開示の微生物は、１×１０６、３．２０×１０１０、１．６０×１０１１、３．２０×１０１１、８．０×１０１１、１．６×１０１２、３．２０×１０１２の、またはそれよりも高い１エーカー当たりのｃｆｕ濃度で適用することができる。したがって、態様では、液体畦間組成物は、１エーカー当たり約１×１０６〜約３×１０１２ｃｆｕの濃度で適用することができる。
【０２８８】
一部の態様では、畦間組成物は、液体製剤に含まれる。液体畦間実施形態では、微生物は、１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３の、またはそれよりも高い１ミリリットル当たりのｃｆｕ濃度で存在していてもよい。ある特定の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０６〜約１×１０１１ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体畦間組成物は、１ミリリットル当たり最大約１×１０１３ｃｆｕの濃度の微生物を含む。
【実施例】
【０２８９】
本明細書に提供される実施例には、細菌単離、細菌および植物分析、および植物形質向上の方法が記載される。こうした実施例において、説明は目的であるに過ぎず、いかなる点でも限定として解釈されるべきではない。
【０２９０】
（実施例１）
植物組織からの微生物の単離
カリフォルニア中部の種々の農業地域から表土を得た。重粘土、泥炭粘土ローム、シルト質粘土、および砂質ロームを含む、多様なテクスチャ特徴を有する２０種の土壌を収集した。表１に示されているように、種々の飼料用トウモロコシ、スイートコーン、古代トウモロコシ、およびトマトの種子を、各土壌に植栽した。
【表１】
2020506681.tif 000007
【０２９１】
２〜４週間の栽培後に植物を引き抜き、根表面の過剰な土壌を脱イオン水で除去した。土壌を除去した後、植物を漂白剤で表面滅菌し、滅菌水で入念にすすいだ。洗浄された、１ｃｍ区画の根を植物から切除し、３ｍｍの鋼鉄ビーズを含有するリン酸緩衝生理食塩水に入れた。Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩで溶液を激しく振とうすることにより、スラリーを生成した。
【０２９２】
根および生理食塩水スラリーを希釈し、種々のタイプの増殖培地に接種し、根圏微生物、内部寄生微生物、着生微生物、および他の植物関連微生物を単離した。Ｒ２ＡおよびＮｆｂ寒天培地を使用して、単一コロニーを得て、半固形Ｎｆｂ傾斜培地を使用して、窒素固定細菌の集団を得た。半固形Ｎｆｂ傾斜培地で２〜４週間インキュベーションした後、微生物集団を収集し、Ｒ２Ａ寒天にストリークして、図１Ａ〜Ｂに示されるように単一コロニーを得た。単一コロニーを、Ｒ２Ａとグリセロールの混合物に再懸濁し、ＰＣＲ分析にかけ、後の分析のために−８０℃で凍結した。およそ１，０００個の単一コロニーが得られ、それらを「単離された微生物」と称した。
【０２９３】
その後、ジアゾトロフを同定するために、単離菌をコロニーＰＣＲスクリーニングにかけて、ｎｉｆＨ遺伝子の存在を検出した。スクリーニングで９０％を超えるジアゾトロフが検出されることが示されている、以前に記載のプライマーセットＵｅｄａ  １９Ｆ／３８８Ｒを使用して、各単離菌におけるｎｉｆクラスターの存在を調査した（Ｕｅｄａら、１９９５年；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７巻：１４１４〜１４１７頁）。精製した単離菌の単一コロニーを摘取し、ＰＢＳに再懸濁し、図２に示されているように鋳型としてコロニーＰＣＲに使用した。陽性ＰＣＲのバンドを示した単離菌のコロニーを再びストリークし、コロニーＰＣＲおよび再ストリークプロセスを２回繰り返して、ジアゾトロフの偽陽性同定を防止した。その後、精製された単離菌を、「候補微生物」と称した。
【０２９４】
（実施例２）
単離された微生物の特徴付け
配列決定、分析、および系統学的特徴付け
５１５ｆ−８０６ｒプライマーセットによる１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列決定を使用して、単離された候補微生物の予備的な系統学的同一性を生成した（例えば、Ｖｅｒｎｏｎら、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２年１２月２３日；２巻：３９頁を参照）。微生物は、表２に示されているように、以下のものを含む多様な属を含む：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ。
【表２】
2020506681.tif 000008
【０２９５】
続いて、３９個の候補微生物のゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォームを使用して配列決定した。純粋培養に由来するゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、配列決定用の全ＤＮＡライブラリーを、サードパーティ供給業者（ＳｅｑＭａｔｉｃ、ヘイワード）により調製した。その後、Ａ５パイプラインによりゲノム構築を実施した（Ｔｒｉｔｔら、２０１２年；ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７巻（９号）：ｅ４２３０４頁）。遺伝子を同定し、注釈を付け、窒素固定の調節および発現と関連するものを、突然変異誘発の標的として記録した。
【０２９６】
候補微生物のトランスクリプトームプロファイリング
菌株ＣＩ０１０のトランスクリプトームプロファイリングを実施して、環境窒素の存在下で活性であるプロモーターを同定した。菌株ＣＩ０１０を、１０ｍＭグルタミンで補充された限定無窒素培地で培養した。これら培養から全ＲＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキット）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（ＳｅｑＭａｔｉｃ、フリーモント、ＣＡ）によりＲＮＡｓｅｑ配列決定にかけた。配列決定リードを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを使用してＣＩ０１０ゲノムデータにマッピングし、近位転写プロモーターの制御下で高度に発現された遺伝子を同定した。
【０２９７】
表３Ａ〜３Ｃには、全ＲＮＡのＲＮＡＳｅｑ配列決定により測定された、遺伝子およびそれらの相対的発現レベルが列挙されている。ｎｉｆ経路、窒素利用関連経路、または所望の発現レベルを示す他の遺伝子の突然変異誘発に使用するための近位プロモーターの配列が記録されている。
【表３Ａ】
2020506681.tif 000009
【表３Ｂ】
2020506681.tif 000010
【表３Ｃ−１】
2020506681.tif 000011
【表３Ｃ−２】
2020506681.tif 000012
【表３Ｃ−３】
2020506681.tif 000013
【表３Ｃ−４】
2020506681.tif 000014
【表３Ｃ−５】
2020506681.tif 000015
【表３Ｃ−６】
2020506681.tif 000016
【表３Ｃ−７】
2020506681.tif 000017
【表３Ｃ−８】
2020506681.tif 000018
【表３Ｃ−９】
2020506681.tif 000019
【表３Ｃ−１０】
2020506681.tif 000020
【表３Ｃ−１１】
2020506681.tif 000021
【表３Ｃ−１２】
2020506681.tif 000022
【表３Ｃ−１３】
2020506681.tif 000023
【表３Ｃ−１４】
2020506681.tif 000024
【表３Ｃ−１５】
2020506681.tif 000025
【表３Ｃ−１６】
2020506681.tif 000026
【表３Ｃ−１７】
2020506681.tif 000027
【表Ｉ−１】
2020506681.tif 000028
【表Ｉ−２】
2020506681.tif 000029
【表Ｉ−３】
2020506681.tif 000030
【表Ｉ−４】
2020506681.tif 000031
【表Ｉ−５】
2020506681.tif 000032
【表Ｉ−６】
2020506681.tif 000033
【表Ｉ−７】
2020506681.tif 000034
【表Ｉ−８】
2020506681.tif 000035
【表Ｉ−９】
2020506681.tif 000036
【表Ｊ−１】
2020506681.tif 000037
【表Ｊ−２】
2020506681.tif 000038
【表Ｊ−３】
2020506681.tif 000039
【表Ｊ−４】
2020506681.tif 000040
【表Ｊ−５】
2020506681.tif 000041
【表Ｊ−６】
2020506681.tif 000042
【表Ｊ−７】
2020506681.tif 000043
【表Ｊ−８】
2020506681.tif 000044
【表Ｊ−９】
2020506681.tif 000045
【表Ｊ−１０】
2020506681.tif 000046
【表Ｊ−１１】
2020506681.tif 000047
【表Ｊ−１２】
2020506681.tif 000048
【０２９８】
遺伝子取り扱い易さの評価
候補微生物を、形質転換性および遺伝子取り扱い易さに基づいて特徴付けた。最初に、至適炭素源利用を、少数パネルの関連培地での増殖ならびに無窒素培地および窒素富化培地の両方での増殖曲線により決定した。第２に、各菌株の天然抗生物質耐性を、スポットプレーティング、および突然変異誘発の選択マーカーとして使用される抗生物質のパネルを含有する液体培養での増殖により決定した。第３に、各菌株を、１群のプラスミドのエレクトロポレーションにより、その形質転換性に関して試験した。プラスミド群は、７個の複製開始点、つまりｐ１５ａ、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ、ｃｏｌＡ、ＲＫ２、ｐＢＢＲ１、およびｐＲＯ１６００、ならびに４個の抗生物質耐性マーカー、つまりＣｍＲ、ＫｍＲ、ＳｐｅｃＲ、およびＴｅｔＲのコンビナトリアル展開を含む。開始点および耐性マーカー適合性に関するこの系統的評価を使用して、候補微生物でのプラスミドに基づく突然変異誘発用のベクターを同定した。
【０２９９】
（実施例３）
候補微生物の突然変異誘発
Ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ媒介性ノックアウト
プラスミドｐＫＤ４６またはカナマイシン耐性マーカーを含有する誘導体を使用して、候補微生物の幾つかの突然変異体を生成した（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、２０００年；ＰＮＡＳ、９７巻（１２号）：６６４０〜６６４５頁）。標的遺伝子を端部に有する２５０ｂｐ相同性を有するノックアウトカセットを設計し、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより生成した。候補微生物をｐＫＤ４６で形質転換し、アラビノースの存在下で培養して、Ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ機械的発現を誘導し、エレクトロポレーション用に調製し、ノックアウトカセットで形質転換して、候補突然変異体菌株を産生した。表４に示されているように、４個の候補微生物および１個の実験室菌株Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  Ｍ５Ａ１を使用して、窒素固定調節遺伝子ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、およびａｍｔＢの１３個の候補突然変異体を生成した。
【表４】
2020506681.tif 000049
【０３００】
Ｃａｓ９選択によるオリゴ誘導突然変異誘発
オリゴ誘導突然変異誘発を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ＢのｒｐｏＢ遺伝子をゲノム変化の標的とし、突然変異体をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で選択した。ｒｐｏＢ遺伝子への４ｂｐ突然変異によりリファンピシン耐性を付与するように、変異原性オリゴ（ｓｓ１２８３：「Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊ＡＴＣＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＧＧＡＣＣＴＴＣｃａａｇＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＧＡＣＡＴＡＣＧＣＧＡＣＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＡＣＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣ」（配列番号２）、式中＊は、ホスホロチオエート結合を示す）を設計した。Ｃａｓ９をコードするプラスミドを含有する細胞を誘導してＣａｓ９を発現させ、エレクトロポレーション用に調製し、その後、変異原性オリゴ、およびＷＴ  ｒｐｏＢ配列のＣａｓ９切断を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の構成的発現をコードするプラスミドの両方と共にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を非選択的培地で一晩回復させ、得られた突然変異染色体の十分な分離を可能にした。プレーティングして、ｇＲＮＡをコードするプラスミドを選択した後、スクリーニングした１０個のコロニーのうちの２つが、所望の突然変異を含有することが示され、残りは、ｇＲＮＡプラスミド喪失またはＣａｓ９プラスミド喪失のプロトスペーサー突然変異により生成されたエスケープ突然変異体であることが示された。
【０３０１】
Ｃａｓ９選択によるＬａｍｂｄａ−Ｒｅｄ突然変異誘発
候補微生物ＣＩ００６およびＣＩ０１０の突然変異体を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによる選択を用いてｌａｍｂｄａ−ｒｅｄ突然変異誘発により生成した。ノックアウトカセットは、転写プロファイリングにより同定された内因性プロモーター（実施例２に記載され、表３Ａ〜Ｃに表示されている）および欠失標的を端部に有する約２５０ｂｐ相同性領域を含有した。ＣＩ００６およびＣＩ０１０を、アラビノース誘導性プロモーターの制御下にあるＬａｍｂｄａ−ｒｅｄ組換え系（エキソ、ベータ、ｇａｍ遺伝子）およびＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓ９をコードするプラスミドで形質転換した。得られた形質転換体にてＲｅｄ組換えおよびＣａｓ９系を誘導し、菌株をエレクトロポレーション用に調製した。続いて、ノックアウトカセットおよびプラスミドにコードされた選択ｇＲＮＡを、コンピテント細胞に形質転換した。Ｃａｓ９プラスミドおよびｇＲＮＡプラスミドの両方に選択的な抗生物質にプレーティングした後、図３に示されるように、スクリーニングされた１０個のコロニーのうちの７個が、意図したノックアウト突然変異を示した。
【０３０２】
（実施例４）
候補分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型決定
種々の突然変異体のニトロゲナーゼ生合成および活性に対する外来性窒素の影響を評価した。アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）（Ｔｅｍｍｅら、２０１２年；１０９巻（１８号）：７０８５〜７０９０頁）を使用して、純粋培養条件でのニトロゲナーゼ活性を測定した。菌株を、気密試験チューブ内で増殖させ、アセチレンのエチレンへの還元を、Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０ガスクロマトグラフで定量化した。０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖させた候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性は、図４Ａ〜Ｂおよび図１０Ａ〜Ｃに示されている。
【０３０３】
嫌気培養条件下で、様々なグルタミンおよびアンモニア濃度を試験して、窒素固定活性に対する影響を定量化した。野生型細胞では、活性は、グルタミン濃度が増加すると共に急速に減少した。しかしながら、一連の初期ノックアウト突然変異では、１種類の突然変異が、そうでなければ野生型では活性を遮断することになるグルタミン濃度下で窒素固定遺伝子の発現を可能にすることが確認された。このプロファイルは、図４Ｃで見られるように、４つの異なる種のジアゾトロフで生成された。加えて、同定された遺伝子部分を使用して調節ネットワークを書き換えることにより、窒素固定活動レベルが予想通りに調整された。これは、図４Ｂで見られ、この図には、菌株ＣＭ０２３、ＣＭ０２１、ＣＭ０１５、およびＣＩ００６が例示されている。菌株ＣＭ０２３は、進化菌株ｌｏｗであり、菌株ＣＭ０２１は進化菌株ｈｉｇｈであり、菌株ＣＭ０１５は、進化菌株ｍｉｄであり、菌株ＣＩ００６は、野生型（菌株２）である。培養上清に排出されたアンモニアを、酵素に基づくアッセイ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ）を使用して試験した。このアッセイでは、消費されたＮＡＤＰＨの量を、３４０ｎｍの吸光度で測定した。１Ｅ９  ＣＦＵ／ｍｌの開始密度を有する無窒素嫌気性環境で増殖させた細菌培養物でアッセイを実施した。図４Ｄで見られるように、６つの進化菌株のパネルのうち１つの菌株が、４８時間の期間の経過にわたって、最大１００μＭのアンモニアを排出した。さらに、図１１で見られるように、二重突然変異体は、それが由来した単一突然変異体よりも高いアンモニア排出を示した。これは、その生理学的な必要性よりも過剰なアンモニアを産生する微生物の能力を実証するものである。
【０３０４】
純粋培養の転写プロファイリング
ＣＩ００６の転写活性を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓプラットフォームを使用して測定した。細胞を無窒素培地で増殖させ、４時間インキュベーションした後、１０Ｅ８個の細胞を収集した。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出した。精製したＲＮＡを、図５に示されているように、プローブハイブリダイゼーションおよびデジタルアナライザ分析のために、Ｃｏｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、パロアルト、ＣＡに提出した。
【０３０５】
（実施例５）
候補微生物の植物内表現型決定
候補微生物による植物のコロニー化
候補微生物による所望の宿主植物のコロニー化を、短期間植物成長実験により定量化した。プラスミドまたはＴｎ５組込みＲＦＰ発現カセットのいずれかに由来するＲＦＰを発現する菌株をトウモロコシ植物に接種した。植物を滅菌砂培地および非滅菌泥炭培地の両方で栽培し、発芽３日後に１ｍＬの細胞培養を、出現しつつある植物子葉鞘に直接ピペットすることにより接種を実施した。適切な抗生物質を含有する溶液で植物を灌水することによりプラスミドを維持した。３週間後に、植物根を収集し、滅菌水で３回すすいで目に見える土壌を除去し、２つの試料に分割した。１つの根試料を蛍光顕微鏡で分析して、候補微生物の局在化パターンを同定した。図６に示されているように、顕微鏡検査は、長さが１０ｍｍの最も微細な完全な植物根で実施した。
【０３０６】
コロニー化を評価するための第２の定量化法を開発した。内部寄生菌を接種した植物の根に由来する全ＤＮＡ調製物で定量ＰＣＲアッセイを実施した。トウモロコシ（Ｄｅｋａｌｂ  ＤＫＣ−６６−４０）の種子を、２．５インチ×２．５インチ×１０インチの鉢の事前にオートクレーブした砂で発芽させた。植栽した１日後に、１ｍｌの内部寄生菌一晩培養物（ＳＯＢ培地）で、種子が位置していたまさしくそのスポットを浸した。この一晩培養物の１ｍＬは、約１０＾９ｃｆｕとほぼ等しく、使用されている菌株に応じて互いに３倍以内で変動する。各実生を、２．５ｍＭまたは０．２５ｍＭのいずれかの硝酸アンモニウムで補充した５０ｍＬ改変ホーグランド溶液で週３回施肥した。植栽した４週間後、ＤＮＡを抽出するために根試料を収集した。加圧水噴霧を使用して土壌残屑を洗い流した。その後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒを使用して、これら組織試料をホモジナイズしてから、推奨プロトコールに従ってＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＤＮＡを抽出した。内部寄生菌のゲノムの各々の遺伝子座に特異的であるように設計した（ＮＣＢＩのＰｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴを使用して）プライマーを使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ  ＲＴ−ＰＣＲを使用して、これらＤＮＡ抽出物のｑＰＣＲアッセイを実施した。内部寄生菌のゲノムコピーの存在を定量化した。内部寄生菌の同一性をさらに確認するために、ＰＣＲ増幅産物を配列決定し、正しい配列を有することを確認する。候補微生物に由来する菌株ＣＩ００６およびＣＩ００８のコロニー化プロファイルの要約は、表５に提示されている。菌株ＣＩ００８において、１０＾７×ｃｆｕ／根ｇ  ｆｗと高いコロニー化率が実証された。
【表５】
2020506681.tif 000050
【０３０７】
植物内ＲＮＡプロファイリング
ｎｉｆ遺伝子の転写を測定することにより、植物内でのｎｉｆ経路成分の生合成を推定した。ＣＩ００６接種植物の根植物組織から全ＲＮＡを得た（以前に記載されているような植栽方法）。ＲＮＡ抽出は、推奨プロトコールに従ってＲＮＥａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して実施した。その後、これら植物組織に由来する全ＲＮＡを、菌株ＣＩ００６のゲノムのｎｉｆ遺伝子に特異的なプローブを使用したＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してアッセイした。植物内でのｎｉｆ遺伝子発現のデータは、表６に要約されている。ｎｉｆＨ遺伝子発現は、ＣＭ０１３菌株によって接種された植物では検出されたが、ｎｉｆＨ発現は、ＣＩ００６接種植物では検出されなかった。菌株ＣＭ０１３は、ｎｉｆＬ遺伝子がノックアウトされている菌株ＣＩ００６の誘導体である。
【０３０８】
ＣＭ０１１の高度に発現された遺伝子を、１００万キロ塩基当たりの転写物（ＴＰＭ）で格付けし、施肥条件下の植物内で測定した。これら高度に発現された遺伝子の幾つかの発現を制御するプロモーターを、標的とする窒素固定および同化遺伝子座への相同組換え用の鋳型として使用した。温室栽培したＣＭ０１１接種植物に由来するＲＮＡ試料を抽出し、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏキットを使用してｒＲＮＡを除去し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕｓｅｑプラットフォームを使用して配列決定し、ＣＭ０１１のゲノムに対してマッピングし戻した。ＣＭ０１１に由来する高度に発現された遺伝子は、表７に列挙されている。
【表６】
2020506681.tif 000051
【表７−１】
2020506681.tif 000052
【表７−２】
2020506681.tif 000053
【０３０９】
１５Ｎアッセイ
固定を実証するための主要な方法では、１４Ｎに対して一定の割合で大気中に見出される窒素同位体１５Ｎが使用される。肥料または大気のいずれかを富化レベルの１５Ｎで補充することにより、１５Ｎ２ガスで補充された大気から固定された１５Ｎの高められた量において直接的に固定を観察すること（Ｙｏｓｈｉｄａ、１９８０年）、または植物組織中で大気Ｎ２ガスにより富化肥料が希釈されることにより逆に固定を観察すること（Ｉｎｉｇｕｅｚ、２００４年）のいずれかが可能である。希釈法では、植物成長の経過にわたって累積的な固定窒素を観察することができるが、１５Ｎ２ガス法では、植物を閉鎖大気中で栽培することができる短期間に生じる固定の測定（比率測定）に限定される。したがって、ガス法は、特異性に優れているが（大気中の割合を超える植物におけるあらゆる１５Ｎ２レベル上昇を、一義的に固定に帰属させることができるため）、累積的な活性を示すことができない。
【０３１０】
両タイプのアッセイを実施して、野生型および未接種トウモロコシ植物と比べた改良菌株の固定活性を測定し、改良菌株の幾つかで植物内で固定率の上昇が観察された（図１２、図１４Ａ、および図１４Ｂ）。これらアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された菌株の活性が、ｉｎ  ｖｉｖｏ結果に変換されることを実証する手段となる。さらに、これらアッセイにより、菌株活性に対する肥料の影響を測定することが可能になり、農業設定での好適な機能性が示唆される。Ｓｅｔａｒｉａ属植物に野生型および改良菌株を接種した場合も同様の結果が観察された（図１３）。図１４Ａ〜１４Ｃに示されている植物内固定活性は、トランスクリプトームデータによりさらに支持されている。進化した菌株は、野生型相当物と比べてｎｉｆＨ転写レベルの増加を示す。さらに、植物内の微生物由来窒素レベルは、植物ベースによる植物でのコロニー化レベルとも相関している。これらの結果（図１２、図１３、図１４Ａ〜１４Ｃ、図１５Ａ、および図１５Ｂ）は、微生物が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの調節向上により植物組織で見られた大気由来窒素増加の理由である可能性が高いという仮説を支持している。固定を直接測定することに加えて、植物に改良菌株を接種した影響を、窒素ストレス植物バイオマスアッセイで測定した。植物バイオマスは、植物との多くの考え得る微生物相互作用と関連する場合があり、固定窒素の追加は、窒素が制限されると植物表現型に影響を及ぼすことになると予想されるであろう。接種した植物を、窒素の完全な非存在下で栽培した。未接種対照と比べて、接種した植物の葉面積、苗条の生重量および乾燥重量、ならびに根の生重量および乾燥重量の著しい増加が観察された（図１４Ｃ）。こうした差は、全てを窒素固定だけに帰することはできないが、改良菌株が活発に窒素を植物に供給しているという結論を支持している。トウモロコシおよびＳｅｔａｒｉａ属植物を、上述のように栽培および接種した。１．２％の１５Ｎを含む肥料を、灌水により植物に定期的に供給した。微生物による窒素固定を、植物組織の１５Ｎレベルを測定することにより定量化した。第４の葉組織を、植栽の４週間後に収集および乾燥した。乾燥した葉試料を、ビーズ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ）を使用してホモジナイズし、ＩＲＭＳ用のスズカプセル（ＭＢＬ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｔ  Ｔｈｅ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、ウッズホール、ＭＡ）に分取した。大気由来窒素（ＮＤＦＡ）を算出し、ＣＩ０５０およびＣＭ００２による窒素産生は、図７に示されている。
【０３１１】
植物ホルモン産生アッセイ
ドワーフトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ栽培品種「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」は、果実成熟に対するインドール−３−酢酸の影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて研究するために以前に使用されている（Ｃｏｈｅｎ、１９９６年；Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｏｒｔｉｃ  Ｓｃｉ、１２１巻：５２０〜５２４頁）。候補微生物による植物ホルモン産生および分泌を評価するために、未熟Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ果実を使用した、プレートに基づくスクリーニングアッセイを開発した。図８に示されているように、ウェルを寒天培地で満たして固化させ、１０ｕＬの一晩微生物培養物を寒天表面にスポット播種することにより、１２ウェル組織培養試験プレートを調製した。増加量のジベレリン酸（ＧＡ）を含有する寒天を有するが、細菌培養物を有していないウェルを陽性対照および標準として使用した。成長中のＭｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物から離脱させた開花１日後の花を、細菌スポット培養の地点の寒天に、茎を先にして挿入した。これら花を２〜３週間モニターした後、果実を回収して計量した。図９に示されているように、幾つかの反復にわたって植物果実質量が増加したことは、接種した微生物により植物ホルモンが産生されたことを示している。
【０３１２】
（実施例６）
循環的宿主−微生物進化
トウモロコシ植物にＣＭ０１３を接種し、およそＶ５成長段階へと４週間栽培した。１５Ｎ分析により微生物源に由来する窒素蓄積の向上を実証したものを引き抜き、加圧水を使用して根を洗浄し、バルク土壌を除去した。根の０．２５ｇ区画を切断し、ＰＢＳ溶液ですすいで、微細土壌粒子および非付着微生物を除去した。組織試料を、ＱＩＡＧＥＮ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩで３ｍｍ鋼ビーズを使用してホモジナイズした。ホモジネートを希釈し、ＳＯＢ寒天培地にプレーティングした。単一コロニーを液体培地に再懸濁し、１６ｓ  ｒＤＮＡおよび接種菌株に固有な突然変異のＰＣＲ分析にかけた。微生物単離、突然変異誘発、接種、および再単離のプロセスを反復して繰り返して、微生物形質、植物形質、および微生物のコロニー化能力を向上させることができる。
【０３１３】
（実施例７）
地理学的特徴にわたる適合性
改良微生物が接種した植物でコロニー化する能力は、圃場条件下での植物の成功に重要である。記載されている単離方法は、トウモロコシ等の作物植物と緊密な関係性を有し得る土壌微生物から選択するように設計されているが、多くの菌株は、様々な植物遺伝子型、環境、土壌タイプ、または接種条件にわたって効果的にコロニー化することができない。コロニー化は、微生物菌株と宿主植物との様々な相互作用を必要とする複雑なプロセスであるため、コロニー化可能能力をスクリーニングすることは、さらなる開発のための優先菌株を選択するための中心的な方法になっている。コロニー化を評価するための初期努力では、菌株の蛍光タグ化が使用され、これは有効ではあるが、時間がかかり、菌株ベース毎に測定可能ではなかった。コロニー化活性は、簡単には向上させ難いため、天然コロニー菌である菌株から有望な産物候補を選択することが是非とも必要である。
【０３１４】
ｑＰＣＲと、群生試料で菌株特異的であるように設計されたプライマーとを使用して、任意の所与の宿主植物における野生型菌株のロバストなコロニー化を試験するためのアッセイを設計した。このアッセイは、トウモロコシ組織試料に由来する微生物のコロニー化率を迅速に測定することを目的とする。蛍光顕微鏡法およびプレートに基づく技法を使用してコロニー化の可能性があると評価した菌株を使用した初期試験は、ｑＰＣＲ手法が、定量的かつ測定可能であるだろうということを示した。
【０３１５】
典型的なアッセイを、以下のように実施する：ほとんどがトウモロコシおよび小麦の品種である植物を、１菌株当たり６つの重複試料を用いて、鉢植え用混合泥炭で温室栽培する。植栽した４日後または５日後に、０．６〜１．０のＯＤ５９０（およそ５Ｅ＋０８  ＣＦＵ／ｍＬ）に希釈した細菌の初期定常期培養の１ｍＬ液を、出現しつつある子葉鞘にピペットした。植物を水道水のみで灌水し、４週間栽培してから試料採取した。試料採取時には、植物を引き抜き、根を入念に洗浄して、ほとんどの残留泥炭を除去する。洗浄した根の試料を切除およびホモジナイズして、植物細胞残屑および関連細菌細胞のスラリーを作成する。本発明者らは、植物とｑＰＣＲの鋳型として使用するための細菌ＤＮＡとの混合物を効果的に産生するハイスループットＤＮＡ抽出プロトコールを開発した。細菌細胞スパイクイン実験に基づくこのＤＮＡ抽出プロセスは、根の生重量に対して定量化した細菌ＤＮＡ試料を提供する。各菌株を、Ｐｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴ（Ｙｅ、２０１２年）を使用して設計した菌株特異的プライマーを使用して評価し、未接種植物のバックグラウンド増幅と比較した。一部のプライマーは、未接種植物でオフターゲット増幅を示すため、コロニー化は、バックグラウンドレベルと比較した正しい産物の増幅の存在または増幅上昇のいずれかにより決定した。
【０３１６】
このアッセイを使用して、微生物製品の適合性を様々な土壌地理学的特徴にわたって測定した。圃場土壌特性および圃場条件は、微生物製品の効果に多大な影響を及ぼす場合がある。土壌ｐＨ、保水容積、および競合微生物は、接種菌生存およびコロニー化能力に影響を及ぼし得る土壌要因のほんの少数の例である。コロニー化アッセイは、植物生育培地としてカリフォルニアの農業圃場から試料採取した３つの多様な土壌タイプを使用して実施した（図１６Ａ）。中程度の接種密度を使用して、現実的な農業条件に近似させた。菌株５は、３週間以内に、全ての植物で１Ｅ＋０６〜１Ｅ＋０７  ＣＦＵ／ｇ  ＦＷにてコロニー化した。７週間の植物栽培後、菌株１の進化型は、全ての土壌タイプで高いコロニー化率（１Ｅ＋０６  ＣＦＵ／ｇ  ＦＷ）を示した。（図１６Ｂ）。
【０３１７】
加えて、複雑な圃場条件でのコロニー化を評価するために、２０１５年６月にサンルイスオビスポ市にて１エーカー圃場試験を開始して、飼料用トウモロコシの２つの品種における野生型菌株の７つの影響およびコロニー化を評価した。この試験の農耕学的設計および執行は、圃場研究受託会社であるＰａｃｉｆｉｃ  Ａｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが実施した。接種は、接種法実験で試験したものと同じ泥炭培養種子コーティング技法を用いた。成長季節の期間中に、植物試料を収集して、根および茎内部のコロニー化を評価した。植栽の４週間または８週間後には各処理の３つの重複プロットから、１６週目に収穫する直前には各処理の６つの重複プロット全てから、試料を収集した。１２週目に、菌株１および菌株２で接種した処理の６つ全ての重複プロットならびに未処理対照から、追加の試料を収集した。ｑＰＣＲおよび菌株特異的プライマーを用いた他のコロニー化アッセイと同様に、洗浄した根の１グラム生重量当たりの細胞数を評価した。２つの菌株、菌株１および菌株２は、一貫して広範な根コロニー化を示し、１２週目でピークに達したが、その後急激に低下した（図１６Ｃ）。菌株２の存在数は、菌株１よりも１桁少ないように考えられたが、植物によっては数がより一貫していることが見出された。茎内部で効果的にコロニー化する菌株はなかったと考えられる。ｑＰＣＲコロニー化データを裏付けるものとして、プレーティングおよび１６Ｓ配列決定を使用して両菌株を根試料から再単離して、配列が一致する単離菌の同定に成功した。
【０３１８】
（実施例８）
微生物品種改良
微生物品種改良の例は、図１７Ａの模式図に要約することができる。図１７Ａは、まずマイクロバイオームの組成を測定することができ、目的の種を特定する微生物品種改良を示している。マイクロバイオームの代謝をマッピングし、遺伝的特質に関連付けることができる。その後、コンジュゲーションおよび組換え、化学的突然変異誘発、適応進化、および遺伝子編集を含むが、それらに限定されない方法を使用して、標的化遺伝子変異を導入することができる。誘導体微生物を使用して作物に接種する。一部の例では、最良の表現型を有する作物を選択する。
【０３１９】
図１７Ａに提供されているように、まずマイクロバイオームの組成を測定することができ、目的の種を特定する。図１７Ｂは、マイクロバイオームステップの測定に関する拡大図を示す。マイクロバイオームの代謝をマッピングし、遺伝的特質に関連付けることができる。窒素の代謝には、ＡｍｔＢトランスポーターによる根圏から細菌のサイトゾル内へのアンモニア（ＮＨ４＋）の進入が関与する場合がある。アンモニアおよびＬ−グルタメート（Ｌ−Ｇｌｕ）は、グルタミン合成酵素およびＡＴＰによりグルタミンへと触媒される。グルタミンは、バイオマスの形成（植物成長）に結び付く場合があり、また、ｎｉｆオペロンの発現を阻害することができる。その後、コンジュゲーションおよび組換え、化学的突然変異誘発、適応進化、および遺伝子編集を含むが、それらに限定されない方法を使用して、標的化遺伝子変異を導入することができる。誘導体微生物を使用して作物に接種する。最良の表現型を有する作物を選択する。
【０３２０】
（実施例９）
本開示の微生物による圃場試験−２０１６年夏
様々な窒素管理体制下におけるトウモロコシ成長および生産性に対する本開示の菌株の有効性を評価するため、圃場試験を実施した。
【０３２１】
試験は、（１）６つの菌株＋対照の７つのサブプロット処理で実施した。４つの主プロットは、現地検証された０、１５、８５、および１００％の対窒素最大収益（ＭＲＴＮ）を含んだ。対照（ＵＴＣのみ）は、１０個の１００％ＭＲＴＮ＋５、１０、または１５ポンドで実施した。処理は、４つの重複物を有していた。
【０３２２】
トウモロコシのプロット（最小）は、長さ３０フィートの４条であり、１栽培地当たり１２４プロットであった。観察は全て、プロットの中央２条から得、破壊的試料採取は全て、外側の条から得た。種子試料は、使用前の１．５〜２時間まで冷蔵した。
【０３２３】
現地農業実施：種子は、従来の殺真菌剤および殺虫剤処理をしていない市販トウモロコシであった。種子処理剤は全て、均一性を担保するために１人の種子処理専門家により適用された。植栽日付、播種割合、雑草／昆虫管理などは、現地農業実施に従った。殺真菌剤適用を除いて、標準的管理実施に従った。
【０３２４】
土壌特徴付け：土質（ｓｏｉｌ  ｔｅｘｔｕｒｅ）および土壌肥沃度を評価した。各重複物の土壌試料を予植栽して、５０ｌｂ／Ａｃよりも低い残留硝酸塩レベルを保証した。０ｃｍから３０ｃｍまでの土壌コアを採取した。土壌を、ｐＨ、ＣＥＣ、ＫおよびＰの総量についてさらに特徴付けた。
【０３２５】
評価：初期植物集団を、１４日の植栽後日数（ＤＡＰ）／エーカーで評価し、さらに以下について評価した：（１）活力（１〜１０のスケール、Ｗ／１０＝優秀）１４ＤＡＰおよびＶ１０；（２）プロットに症状が明らかになった際は常に病害ランクを記録する；（３）プロットに倒伏が生じた場合は、倒伏のあらゆる差異を記録する；（４）標準的水分ｐｃｔに調整された収穫高（Ｂｕ／エーカー）；（５）重量を試験する；および（６）穀物水分パーセンテージ。
【０３２６】
試料採取要件：３つの時点（試験開始前、Ｖ１０〜ＶＴ、収穫１週後）で土壌を試料採取した。６つの栽培地全ておよびプロット全てを、１試料当たり１０グラムで試料採取した（１２４プロット×３時点×６栽培地）。
【０３２７】
コロニー化試料採取：コロニー化試料を、５つの栽培地では２つの時点（Ｖ１０およびＶＴ）で、および６つの時点（Ｖ４、Ｖ８、Ｖ１０、ＶＴ、Ｒ５、および収穫後）で収集した。試料は、以下のように収集した：（１）０％〜１００％ＭＲＴＮは、１栽培地当たり６０プロット；（２）外側の条から無作為に選択された１プロット当たり４つの植物；（３）５グラムの根、８インチの茎、および上部３枚の葉。袋詰めし、各々に個別に識別子を割り当て、１プロット当たり１２／袋；（４）５つの栽培地（６０プロット×２時点×１２袋／プロット）；および１つの栽培地（６０プロット×６時点×１２袋／プロット）。コロニー化試料採取を示す図１７Ｃを参照されたい。
【０３２８】
正規化差植生指数（ＮＤＶＩ）決定を、２つの時点（Ｖ４〜Ｖ６およびＶＴ）にて、Ｇｒｅｅｎｓｅｅｋｅｒ機器を使用して行った。６つの栽培地全てで各プロットを評価した（１２４プロット×２時点×６栽培地）。
【０３２９】
最も良好に処理差異を示した１つの栽培地の根分析を、Ｗｉｎ  Ｒｈｉｚｏを用いて実施した。１プロット当たり１０個の植物を、無作為に試料採取し（各外側条の隣接する５個；Ｖ３〜Ｖ４段階の植物が好ましかった）、穏やかに洗浄して、できるだけ合理的に土を除去した。１０個の根をビニール袋に入れ、ラベルを付けた。ＷｉｎＲｈｉｚｏ  Ｒｏｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓで分析した。
【０３３０】
６箇所の栽培地全てにおいてＲ２〜Ｒ５の茎特徴を測定した。１プロット当たり１０個の植物の６インチの高さの茎直径を記録し、６インチマークよりも上方の最初の節間の高さも記録した。１０個の植物をモニターした；２つの内側条の中央から連続５個の植物。６箇所の栽培地を評価した（１２４プロット×２測定×６栽培地）。
【０３３１】
組織硝酸塩を、全てのプロットおよび全ての栽培地で分析した。トウモロコシが黒色層を形成した１〜３週後に、土壌の上方６インチから始まる茎の８インチ区画；葉鞘を取り出した。全ての栽培地およびプロットを評価した（６栽培地×１２４プロット）。
【０３３２】
以下の天候データを、植栽から収穫までの全ての栽培地で記録した：１日の最高および最低温度；播種時の土壌温度；１日の降雨量＋灌水（該当する場合）；ならびに過度の雨、風、低温、または高温などのあらゆる異常な気象事象。
【０３３３】
６箇所の栽培値全てにわたる収穫高データは表８に示されている。窒素割合は、収穫高に有意な影響を示したが、菌株はどの窒素割合でも影響を示さなかった。しかしながら、最低の窒素割合では、菌株ＣＩ００６、ＣＭ０２９、およびＣＩ０１９は、ＵＴＣよりも数的に４〜６ｂｕ／エーカーだけ収穫高が高かった。また、菌株ＣＭ０２９、ＣＩ０１９、およびＣＭ０８１による収穫高は、１５％ＭＲＴＮでは、２〜４ｂｕ／エーカーだけ数的に増加した。
【表８−１】
2020506681.tif 000054
【表８−２】
2020506681.tif 000055
【表８−３】
2020506681.tif 000056
【０３３４】
別の分析手法は、表９に示されている。この表には、窒素に対する応答が最も大きかった４箇所の栽培地が含まれており、窒素に対する応答が最も大きかったことは、利用可能な残留窒素が最も低かったことを示唆する。この手法は、窒素割合は収穫高に有意な影響を及ぼし、菌株は全ての窒素割合にわたって平均すると影響を及ぼさなかったという評価を変更しない。しかしながら、全ての菌株では、Ｎ割合が最も低い場合に数値的収穫高がより顕著に有利であり、特にＣＩ００６、ＣＭ０２９、およびＣＭ０２９／ＣＭ０８１では、収穫高が８から１０ｂｕ／エーカーまで増加した。１５％ＭＲＴＮでは、菌株ＣＭ０８１は、収穫高がＵＴＣよりも５ｂｕだけ多かった。
【表９−１】
2020506681.tif 000057
【表９−２】
2020506681.tif 000058
【表９−３】
2020506681.tif 000059
【０３３５】
また、圃場試験の結果が、図２１〜２７に示されている。結果は、本開示の微生物が、植物収穫高を増加させることができることを示しており、これは、教示される微生物が、重要な農業作物、つまりトウモロコシ中で窒素固定を増加させることができることを指し示している。
【０３３６】
圃場に基づく結果は、選択された微生物菌株のゲノムを非属間的に改変して、前記操作された菌株を作物に適用した場合に圃場設定にて農業的に関連する結果をもたらすための開示される方法が有効であることをさらに確認するものである。
【０３３７】
図１８は、菌株ＣＩ００６（ＷＴ  Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）に由来する改変菌株の系統を示す。圃場データは、ＣＩ００６  ＷＴ菌株の操作された誘導体、つまりＣＭ０２９が、圃場設定にて数的に関連する結果をもたらすことができることを実証している。例えば、表８は、ＣＭ０２９が、０％ＭＲＴＮでは、１４１．２ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４７．０ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（５．８ｂｕ／エーカーの増加）。また、表８は、ＣＭ０２９が、１５％ＭＲＴＮでは、１６５．１ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６７．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（２．２ｂｕ／エーカーの増加）。表９は、これらの結果を支持し、ＣＭ０２９が、０％ＭＲＴＮでは、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４０．７ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（８．８ｂｕ／エーカーの増加）。また、表９は、ＣＭ０２９が、１５％ＭＲＴＮでは、１６１．３ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６４．１ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（２．８ｂｕ／エーカーの増加）。
【０３３８】
図１９は、菌株ＣＩ０１９（ＷＴ  Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）に由来する改変菌株の系統を示す。圃場データは、ＣＩ０１９  ＷＴ菌株の操作された誘導体、つまりＣＭ０８１が、圃場設定にて数的に関連する結果をもたらすことができることを実証している。例えば、表８は、ＣＭ０８１が、１５％ＭＲＴＮでは、１６５．１ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６９．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（４．２ｂｕ／エーカーの増加）。表９は、これらの結果を支持し、ＣＭ０８１が、０％ＭＲＴＮでは、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１３６．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（４．４ｂｕ／エーカーの増加）。また、表９は、ＣＭ０８１が、１５％ＭＲＴＮでは、１６１．３ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６６．８ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（５．５ｂｕ／エーカーの増加）。
【０３３９】
さらに、表９では、ＣＭ０２９／ＣＭ０８１の組合せが、０％ＭＲＴＮにて、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４１．４ｂｕ／エーカーの収穫高であったこと（９．５ｂｕ／エーカーの増加）を理解することができる。
【０３４０】
（実施例１０）
本開示の微生物による圃場試験
多様な窒素固定細菌を、農業土壌を含む自然界に見出すことができる。しかしながら、作物に十分な窒素を提供して肥料使用の減少を可能にする微生物の能力は、施肥土壌ではニトロゲナーゼ遺伝子が抑制されること、ならびに作物根と緊密に付随する存在量が低いことにより制限される場合がある。重要な商品作物と緊密に付随する微生物の特定、単離、および品種改良は、窒素感知および窒素固定を関連付ける調節ネットワークを破壊または向上させ、作物に付随する微生物による著しい窒素寄与を開放する可能性がある。この目的のため、トウモロコシの根系に付随し、コロニー化する窒素固定微生物を特定した。
【０３４１】
農学的に関連する土壌で栽培されたトウモロコシ植物の根試料を収集し、根圏および内圏から微生物集団を抽出した。こうした試料からゲノムＤＮＡを抽出し、その後１６Ｓアンプリコンを配列決定して、共同体組成をプロファイリングした。Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ微生物（菌株ＰＢＣ６．１）を単離し、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび全ゲノム配列決定により分類した。これは、根付随微生物叢のほぼ２１％の存在量までコロニー化することができる特に興味深い窒素固定菌である（図３０）。外因性窒素に対する菌株感受性を評価するため、純粋培養での窒素固定割合を、古典的アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）で、グルタミン添加補充レベルを変えて測定した。この種は、無窒素培地にて高レベルの窒素固定活性を示したが、外因性固定窒素は、ｎｉｆ遺伝子発現およびニトロゲナーゼ活性を抑制した（菌株ＰＢＣ６．１、図２８Ｃおよび２８Ｄ）。加えて、窒素固定条件で増殖したＰＢＣ６．１の上清に放出されたアンモニアを測定したところ、非常に少量の固定窒素放出しか検出することができなかった（図２８Ｅ）。
【０３４２】
本発明者らは、ＰＢＣ６．１が、固定窒素の存在下で最適なニトロゲナーゼ発現およびアンモニア放出を可能にするように窒素代謝を制御する調節ネットワークを書き換えれば、施肥圃場において固定窒素の重要な寄与菌になり得ると仮定した。導入遺伝子または合成調節エレメントを挿入せずに幅広い表現型リモデリングを可能にするためには、十分な遺伝的多様性が、ＰＢＣ６．１ゲノム内に存在しなければならない。単離された菌株は、少なくとも５．４Ｍｂｐのゲノムおよび標準的窒素固定遺伝子クラスターを有する。ＰＢＣ６．１の関連窒素代謝経路は、窒素固定のモデル生物、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  ｍ５ａｌの窒素代謝経路に類似している。
【０３４３】
特に、高い外因性固定窒素濃度において、窒素固定およびその後の宿主植物への移入を増大させることができる幾つかの遺伝子調節ネットワーク連結点を特定した（図２８Ａ）。ｎｉｆＬＡオペロンは、ＮｉｆＡによる転写活性化ならびにＮｉｆＬによるＮｉｆＡの窒素および酸素依存性抑制を介してｎｉｆクラスターの残りを直接的に調節する。ｎｉｆＬの破壊は、酸素および外因性固定窒素の両方の存在下でＮｉｆＡの阻害を消失させ、ｎｉｆ発現を向上させることができる。さらに、窒素非依存性プロモーターの制御下でのｎｉｆＡの発現は、ニトロゲナーゼ生合成を、ＮｔｒＢ／ＮｔｒＣ窒素感知複合体による調節から切り離すことができる。微生物により固定窒素を同化して、グルタミン合成酵素（ＧＳ）によりグルタミンに変換することは、ＧＳのアデニリル化および脱アデニル化を介して２ドメインアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴａｓｅ）酵素ＧｌｎＥにより可逆的に調節され、活性をそれぞれ減弱および回復させる。ＧｌｎＥタンパク質を短縮して、そのアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠失させると、グルタミン合成酵素の構成的アデニリル化に結び付き、微生物によるアンモニア同化を制限し、細胞内および細胞外アンモニアを増加させることができる。最後に、アンモニア取込みに関与するトランスポーターであるＡｍｔＢの発現低減は、より多くの細胞外アンモニアに結び付く場合がある。導入遺伝子を使用せずに合理的に設計された微生物表現型を生成するために、２つの手法を用いた：タンパク質ドメインをコードするゲノム配列または全ゲノムのマーカー無し欠失を生成する手法；およびゲノム内プロモーター再編成により調節ネットワークを書き換える手法。反復突然変異誘発プロセスにより、ＰＢＣ６．１の幾つかの非トランスジェニック誘導体菌株を生成した（表１０）。
【表１０】
2020506681.tif 000060
【０３４４】
幾つかのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、誘導体菌株の特定の表現型を特徴付けた。ＡＲＡを使用して、外因性窒素に対する菌株感受性を評価した。ＰＢＣ６．１は、高グルタミン濃度でニトロゲナーゼ活性の抑制を示した（図２８Ｄ）。対照的に、ほとんどの誘導体菌株は、抑制解除された表現型を示し、高グルタミン濃度で観察されたアセチレン還元のレベルは様々であった。ｑＰＣＲにより分析した試料中のｎｉｆＡ転写速度は、アセチレン還元速度と良好に相関し（図３１）、ｎｉｆＬ破壊およびｎｉｆＡを駆動する窒素非依存性プロモーターの挿入が、ｎｉｆクラスター抑制解除に結び付き得るという仮説が支持された。変更されたＧｌｎＥまたはＡｍｔＢ活性を有する菌株は、野生型またはこうした突然変異を有していない誘導体菌株と比較して、顕著に増加したアンモニウム排出速度を示し（図２８Ｅ）、アンモニア同化および再取込みに対するこれらの遺伝子型の効果が示された。
【０３４５】
２つの実験を実施して、ＰＢＣ６．１誘導体とトウモロコシ植物との相互作用を研究し、植物組織内への固定窒素の組込みを定量化した。まず、微生物窒素固定の割合を、温室研究にて同位体トレーサーを使用して定量化した。手短に言えば、植物を１５Ｎ標識肥料を用いて栽培し、植物組織における１５Ｎの希釈濃度は、微生物からの固定窒素の寄与を示す。トウモロコシ実生に、選択された微生物菌株を接種し、植物をＶ６成長段階まで栽培した。その後、植物を解体して、微生物コロニー化および遺伝子発現の測定、ならびに同位体比質量分析法（ＩＲＭＳ）による植物組織中の１５Ｎ／１４Ｎ比の測定を可能にした。地上部分組織の分析は、植物窒素レベルに対するＰＢＣ６．３８の寄与が少なく有意ではなく、ＰＢＣ６．９４の寄与は有意であった（ｐ＝０．０１１）ことを示した。地上トウモロコシ葉に見出された窒素のおよそ２０％が、ＰＢＣ６．９４により産生され、残りは種子、ポッティングミックス（ｐｏｔｔｉｎｇ  ｍｉｘ）、または他の土壌伝播性微生物による「バックグラウンド」固定に由来していた（図２９Ｃ）。これは、本発明者らの微生物品種改良パイプラインが、窒素肥料の存在下で植物に対して著しい窒素寄与を行うことが可能な菌株を生成することができることを示す。植物組織内での微生物転写を測定し、ｎｉｆ遺伝子クラスターの発現は、誘導体菌株では観察されたが、野生型菌株では観察されず（図２９Ｂ）、ＢＮＦが施肥条件で作物に寄与するためには、ｎｉｆ抑制解除が重要であることが示された。ｑＰＣＲにより測定された根コロニー化は、コロニー化密度が、試験した菌株の各々で異なることを実証した（図２９Ａ）。ＰＢＣ６．３８とＰＢＣ６．９４との間には、コロニー化に５０倍の差があることが観察された。この差異は、ＰＢＣ６．９４が、高レベルの固定および排出の結果として、ＰＢＣ６．３８よりも根圏での適応度が低減されたことを示すものであり得る。
【０３４６】
方法
培地
最少培地は、２５ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ｇのＣａＣＬ２−２Ｈ２Ｏ、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＮａＣｌ、２．９ｍｇのＦｅＣｌ３、０．２５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および２０ｇのスクロースを含む（１リットル当たり）。増殖培地は、１リットル当たり５０ｍｌの２００ｍＭグルタミンで添加補充された最少培地であると規定される。
【０３４７】
ジアゾトロフの単離
トウモロコシ実生を、２２℃（夜間）から２６℃（日中）までに制御された温室環境で種子（ＤＫＣ６６−４０、ＤｅＫａｌｂ、ＩＬ）から２週間成長させ、Ｓａｎ  Ｊｏａｑｕｉｎ  Ｃｏｕｎｔｙ、ＣＡから収集された土壌中で１６時間光サイクルに曝露した。根を収穫し、無菌脱イオン水で洗浄して、バルク土壌を除去した。根組織を、ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ８５３００）で２ｍｍステンレス鋼ビーズを用いて、設定３０で３分間ホモジナイズし、試料を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、組織を根付随細菌から分離した。上清を、２つの画分に分割し、１つを１６Ｓ  ｒＲＮＡアンプリコン配列決定によるマイクロバイオームの特徴付けに使用し、残りの画分を希釈し、１．５％寒天で添加補充された無窒素ブロス（ＮｆＢ）培地にプレーティングした。プレートを、３０℃で５〜７日間にわたってインキュベートした。出現したコロニーを、ｎｉｆＨ遺伝子の存在に関して、プライマーＵｅｄａ１９ｆおよびＵｅｄａ４０６ｒを用いたコロニーＰＣＲにより試験した。ｎｉｆＨコロニーＰＣＲが陽性である菌株からゲノムＤＮＡを単離し（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット、カタログ番号５１３０６、ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、配列決定した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｖ３、ＳｅｑＭａｔｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）。配列を組み立て注釈を付けた後、窒素固定遺伝子クラスターを含む分離株を、下流研究に使用した。
【０３４８】
単離実生のマイクロバイオームプロファイリング
ゲノムＤＮＡを、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡ  Ｉキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐ／Ｎ  Ｄ３０１１）を使用して根付随細菌から単離し、７９９ｆおよび１１１４ｒを標的とするｎｅｘｔｅｒａバーコード付きプライマーを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡアンプリコンを生成した。アンプリコンライブラリーを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｖ３プラットフォーム（ＳｅｑＭａｔｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）で配列決定した。読取りは、Ｋｒａｋｅｎを使用し、ｍｉｎｉｋｒａｋｅｎデータベースを使用して、分類学的に分類した（図３０）。
【０３４９】
アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）
アセチレン還元アッセイの変法を使用して、純粋培養条件におけるニトロゲナーゼ活性を測定した。菌株を、ＳＯＢ（ＲＰＩ、Ｐ／Ｎ  Ｓ２５０４０−１０００）中で２４時間３０℃にて２００ＲＰＭで振盪して単一のコロニーから増殖させ、その後１：２５で増殖培地にて二次培養し、２４時間にわたって好気的に増殖させた（３０℃、２００ＲＰＭ）。その後、１ｍｌの最少培地培養物を、気密性Ｈｕｎｇａｔｅチューブ中の０〜１０ｍＭグルタミンで添加補充された４ｍｌの最少培地に添加し、４時間にわたって嫌気的に増殖させた（３０℃、２００ＲＰＭ）。１０％ヘッドスペースを取り出し、その後注射により等容積のアセチレンと入れ替え、１時間にわたってインキュベーションを継続した。続いて、２ｍｌのヘッドスペースをガス密注射器で取り出し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ６８５０ガスクロマトグラフを使用して、エチレン産生を定量化した。
【０３５０】
アンモニウム排出アッセイ
アンモニア形態の固定窒素の排出を、嫌気性バイオリアクターでのバッチ発酵を使用して測定した。菌株を、９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌプレートの１ｍｌ／ウェルＳＯＢで単一コロニーから増殖させた。プレートを、３０℃にて２４時間２００ＲＰＭで振盪してインキュベートし、その後１ｍｌ／ウェルの増殖培地を含む新たなプレートに１：２５希釈した。細胞を、２４時間（３０℃、２００ＲＰＭ）でインキュベートし、その後、最少培地を含む新たなプレートに１：１０希釈した。プレートを、＞９８．５％窒素、１．２〜１．５％水素、および＜３０ｐｐＭ酸素の混合気体を有する嫌気性チャンバーに移し、室温で６６〜７０時間にわたって１３５０ＲＰＭでインキュベートした。初期培養バイオマスを、５９０ｎｍの光学濃度を測定することにより最終バイオマスと比較した。その後、細胞を遠心分離により分離し、リアクターブロスの上清を、Ｍｅｇａｚｙｍｅアンモニアアッセイキット（Ｐ／Ｎ  Ｋ−ＡＭＩＡＲ）を使用して、遊離アンモニアについてアッセイし、各時点でバイオマスに対して正規化した。
【０３５１】
根付随マイクロバイオームの抽出
根を穏やかに振って、固着していない粒子を除去し、根系を分離し、ＲＮＡ安定化溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ／Ｎ  ＡＭ７０２１）に３０分間浸漬した。その後、根を、無菌脱イオン水で手短にすすいだ。試料を、ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ８５３００）で１／２インチステンレス鋼ボールベアリングを用いたビーズビーティングを使用して２ｍｌの溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ７９２１６）中でホモジナイズした。ＺＲ−９６  Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐ／Ｎ  Ｄ３０１０）を用いてゲノムＤＮＡ抽出を実施し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ７４１０４）を使用してＲＮＡ抽出を実施した。
【０３５２】
根コロニー化アッセイ
植栽４日後に、１ｍｌの細菌一晩培養物（およそ１０９ｃｆｕ）を、植栽した種子の上方の土壌に適用した。実生に、０．５ｍＭ硝酸アンモニウムで添加補充された２５ｍｌの改変Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液を週３回施肥した。植栽４週間後に、根試料を収集し、全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。根コロニー化を、野生型または誘導体菌株ゲノムのいずれかの固有領域を増幅するように設計されたプライマーによるｑＰＣＲを使用して定量化した。ＱＰＣＲ反応効率を、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから生成された標準曲線を使用して測定した。データを、組織重量および抽出容積を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に対して正規化した。各実験で、コロニー化数を未処理対照実生と比較した。
【０３５３】
植物内トランスクリプトミクス
根付随微生物の転写プロファイリングを、成長させた実生で測定し、根コロニー化アッセイに記載されているように処理した。精製ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（ＳｅｑＭａｔｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を使用して配列決定した。読取りを、「−−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｌｏｃａｌ」パラメーターおよび最低アラインメントスコア３０を使用したｂｏｗｔｉｅ２を使用して、接種した菌株のゲノムにマッピングした。ゲノムにわたる網羅範囲を、ｓａｍｔｏｏｌｓを使用して算出した。網羅範囲の差異を、ハウスキーピング遺伝子発現に対して正規化し、Ｃｉｒｃｏｓを使用してゲノムにわたって、およびＤＮＡｐｌｏｔｌｉｂを使用してｎｉｆ遺伝子クラスターにわたって視覚化した。加えて、植物内転写プロファイルを、標的化Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析により定量化した。精製ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｓｐｒｉｎｔ（Ｃｏｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）で処理した。
【０３５４】
１５Ｎ希釈温室研究
１５Ｎ肥料希釈実験を実施して、最適化菌株活性を植物内で評価した。最小限のバックグラウンドＮを含む植栽媒体を、バーミキュライトおよび水洗砂（ＤＩ  Ｈ２Ｏで５回すすいだ）の混合物を使用して調製した。砂混合物を、１２２℃で１時間オートクレーブし、およそ６００ｇを４０立方インチ（６５６ｍＬ）の鉢に量り取り、それを無菌ＤＩ  Ｈ２Ｏで飽和させ、植栽前に２４時間排水させた。トウモロコシ種子（ＤＫＣ６６−４０）を、０．６２５％次亜塩素酸ナトリウム中で１０分間表面滅菌し、その後、滅菌蒸留水で５回すすぎ、１ｃｍの深さに植栽した。植物を、平均して２２℃（夜間）〜２６℃（日中）の室温にて１６時間日長で４週間にわたって蛍光灯下で維持した。
【０３５５】
植栽５日後、１ｍｌの細胞懸濁物を出現しつつある子葉鞘に直接灌水して、実生に接種した。接種物は、ＳＯＢでの５ｍｌ一晩培養物から調製した。一晩培養物を遠沈し、５ｍｌのＰＢＳに２回再懸濁して、残留ＳＯＢを除去してから、最終的に１．０のＯＤに希釈した（およそ１０９ＣＦＵ／ｍｌ）。対照植物を、無菌ＰＢＳで処理し、各処理物（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を１０個の重複植物に適用した。
【０３５６】
植栽の５、９、１４、および１９日後に２％１５Ｎ富化２ｍＭ  ＫＮＯ３を含む２５ｍｌ肥料溶液を植物に施肥し、植栽の７、１２、１６、および１８日後にＫＮＯ３を含まない同じ溶液で施肥した。肥料溶液は、３ｍｍｏｌ  ＣａＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４、１７．９μｍｏｌ  ＦｅＳＯ４、２．８６ｍｇのＨ３ＢＯ３、１．８１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５１μｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および０．１４ｎｍｏｌ  ＮｉＣｌ２を含んでいた（１リットル当たり）。ポットは全て、必要に応じて無菌ＤＩ  Ｈ２Ｏで灌水して、流出のない一貫した土壌水分を維持した。
【０３５７】
４週時に、植物を収穫し、最も低い節で分離して、根ｇＤＮＡおよびＲＮＡ抽出ならびにＩＲＭＳ用地上部分組織の試料とした。地上部分組織を、必要に応じて拭いて砂を除去し、全体を紙袋に入れ、６０℃で少なくとも７２時間乾燥させた。完全に乾燥したら、全地上部分組織をビーズビーティングでホモジナイズし、ＭＢＬ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｔｈｅ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ、ＭＡ）が、５〜７ｍｇの試料を、δ１５Ｎの同位体比質量分析法（ＩＲＭＳ）で分析した。ＮＤＦＡパーセントは下記式を使用して算出した：％ＮＤＦＡ＝（ＵＴＣのδ１５Ｎの平均−試料のδ１５Ｎ）／（ＵＴＣのδ１５Ｎの平均）×１００。
【０３５８】
（実施例１１）
本開示の微生物による圃場試験−２０１７年夏
様々な窒素管理体制下におけるトウモロコシ成長および生産性に対する本開示の菌株の有効性を評価するため、圃場試験を実施した。下記の圃場データは、本開示の非属間微生物が、大気窒素を固定し、前記窒素を植物に送達し、窒素制限環境ならびに非窒素制限環境の両方で収穫高の増加をもたらすことができることを実証している。
【０３５９】
試験は、アメリカ合衆国の７箇所の栽培地で実施し、６箇所は、地理的に多様な米国中西部の栽培地であった。肥料処理には５つの窒素管理体制を使用した：サイト／地域の標準農業実施の１００％、１００％マイナス２５ポンド、１００％マイナス５０ポンド、１００％マイナス７５ポンド、および０％；全て１エーカー当たり。１００％管理体制の１エーカー当たりの窒素のポンド数は、サイト／地域の標準農業実施に依存した。前述の窒素管理体制は、１エーカー当たり約１５３ポンドから１エーカー当たり約１８０ポンドまでの範囲であり、平均で１エーカー当たり約１６４ポンドの窒素であった。
【０３６０】
各肥料管理体制内には、１４個の処理物が存在した。各管理体制は、６つの重複物を有し、分割プロット設計を使用した。１４個の処理物が含まれていた：１２個の異なる微生物、主プロットと同じ肥料割合の１つのＵＴＣ、および１００％の窒素を有する１つのＵＴＣ。１００％窒素管理体制では、第２のＵＴＣは、１００＋２５ポンドである。
【０３６１】
トウモロコシのプロットは、最低で、長さ３０フィートの４条であり（条間は３０インチ）、１栽培地当たり４２０プロットであった。観察は全て、別様の記載がない限り、植物の中央２条から得、破壊的試料採取は全て、外側の条から得た。種子試料は、使用前の１．５〜２時間まで冷蔵した。
【０３６２】
現地農業実施：種子は、市販の種子処理剤が適用された市販のトウモロコシであり、生物学的な同時適用を受けていなかった。播種割合、植栽日時、雑草／昆虫管理、収穫時期、および他の標準的管理実施は、殺真菌剤適用（必要な場合）を除き、その地域の現地農業実施の基準に従った。
【０３６３】
微生物適用：微生物を、通常の化学処理を既に受けた種子への種子処理において、種子に適用した。微生物を含む発酵ブロスで種子をコーディングした。
【０３６４】
土壌特徴付け：土質および土壌肥沃度を評価した。標準的土壌試料採取手順を使用し、試料は、０〜３０ｃｍおよび３０〜６０ｃｍの深さの土壌コアを含んでいた。標準的土壌試料採取は、硝酸性窒素、アンモニウム窒素、総窒素、有機物、およびＣＥＣの決定を含んでいた。標準的土壌試料採取は、ｐＨ、総カリウム量、および総亜リン酸量の決定をさらに含んでいた。窒素肥料レベルを決定するため、０〜１２インチ、可能であれば１２インチから２４インチの土壌領域が硝酸性窒素用に確実に採取されるように、各栽培地の植栽前土壌試料を採取した。
【０３６５】
植栽および施肥前に、２ｍｌの土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１重複物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。（５つの肥料管理体制×６重複物＝３０個の土壌試料）。
【０３６６】
植栽後（Ｖ４〜Ｖ６）、２ｍｌ土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１重複物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。（５つの肥料管理体制×６重複物＝３０個の土壌試料）。
【０３６７】
収穫後（Ｖ４〜Ｖ６）、２ｍｌ土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１重複物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。追加の収穫後土壌試料を、ＵＴＣの０〜１２インチから、および潜在的にＵＴＣの１２〜２４インチから収集した（５つの肥料管理体制×６重複物＝３０個の土壌試料）。
【０３６８】
全ての肥料管理体制で０〜１２インチおよび１２〜２４インチのＶ６〜Ｖ１０土壌試料を各肥料管理体制から得た（１００％および１００％＋２５ｌｂの処理を除く［１００ブロック］）。（５つの肥料管理体制×２つの深さ＝１栽培地当たり１０個の試料）。
【０３６９】
全ての肥料管理体制で０〜１２インチおよび１２〜２４インチの収穫後土壌試料を、各肥料管理体制から得た（１００％および１００％＋２５ｌｂの処理を除く［１００％ブロック］）。（５つの肥料管理体制×２つの深さ＝１栽培地当たり１０個の試料）。
【０３７０】
評価：初期植物集団を、約５０％ＵＴＣで評価し、最終植物集団を、収穫前に評価した。評価は、（１）可能であれば温度（温度プローブ）；（２）Ｖ４およびＶ８〜Ｖ１０での活力（１〜１０のスケール、１０＝優秀）；（３）Ｖ８〜Ｖ１０およびＶ１４での植物丈；（４）標準水分パーセンテージに調整された収穫高（ブッシェル／エーカー）；（５）重量の試験；（６）穀物水分パーセンテージ；（７）黒色層での茎硝酸塩試験（４２０プロット×７栽培地）；（８）Ｖ４〜Ｖ６における０％および１００％肥料のジップロック袋中の１プロット当たり１植物のコロニー化（１植物×１４処理×６重複物×２肥料管理体制＝１６８植物）；（９）Ｖ４〜Ｖ６における０％および１００％肥料のジップロック袋中の１プロット当たり１植物のトランスクリプトミクス（１植物×１４処理×６重複物×２肥料管理体制＝１６８植物）；（１０）Ｇｒｅｅｎｓｅｅｋｅｒ機器を使用して２時点（Ｖ４〜Ｖ６およびＶＴ）で７箇所の栽培地全ての各プロットを評価するための正規化差植生指数（ＮＤＶＩ）または正規化差レッドエッジ（ＮＤＲＥ）の決定（４２０プロット×２時点×７栽培地＝５，８８０データポイント）；（１１）１０植物／プロットの６インチの高さの茎直径を記録し、６インチマークよりも上方の最初の節間の長さを記録し、１０植物（２つの内側条の中央からの連続５つの植物）をモニターすることにより、７箇所の栽培地全てにてＲ２〜Ｒ５で測定した茎特徴（４２０プロット×１０植物×７栽培地＝２９，４００データポイント）を含んでいた。
【０３７１】
モニタリングスケジュール：Ｖ３〜Ｖ４の段階で実施者が全ての試験地を訪れて、処理に対する初期季節応答を評価し、生殖成長段階中に成熟度をモニターした。現地協力者が、継続的に研究試験地を訪れた。
【０３７２】
天候情報：植栽から収穫までにわたって天候データを収集した。天候データは、１日最低および最高温度；播種時の土壌温度；１日の降雨量＋灌水（該当する場合）；ならびに過度の風、雨、低温、高温などの異常な気象事象で構成されていた。
【０３７３】
データ報告：上記に示されているデータを含めて、圃場試験は、土質；条間隔；プロットサイズ；灌水；耕うん；以前の作物；播種割合；植物集団；供給源、割合、タイミング、および配置を含む季節肥料入力；収穫面積寸法、手作業または機械によるなどの収穫方法、ならびに使用される測定ツール（秤、収穫高モニターなど）を含むデータポイントを生成した。
【０３７４】
結果：前述の圃場試験の選択された結果は、図３２および図３３に報告されている。
【０３７５】
図３２では、本開示の微生物（つまり、６−４０３）が、野生型菌株（ＷＴ）よりも高い収穫高をもたらし、未処理対照（ＵＴＣ）よりも高い収穫高をもたらしたことを理解することができる。「−２５ｌｂ  Ｎ」処理では、その地域の標準的農業実施よりも１エーカー当たり２５ｌｂ少ないＮが使用される。「１００％Ｎ」ＵＴＣ処理は、その地域の標準的農業実施を示すことが意図されており、Ｎの標準的使用の１００％が、農業従事者により配置される。微生物「６−４０３」は、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託され、表Ａに見出すことができる。これは、突然変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ（ＣＭ０３７とも呼ばれる）であり、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代突然変異体菌株である。
【０３７６】
図３３では、得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、栽培地全体にわたって一貫して性能を発揮することを実証している。さらに、収穫高の結果は、本開示の微生物が、窒素ストレス環境（つまり、窒素制限環境）ならびに十分な窒素供給を有する環境（つまり、非窒素制限条件）の両方で良好な性能を発揮することを実証している。微生物「６−８８１」（ＣＭ０９４、ＰＢＣ６．９４としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託され、表Ａに見出すことができる。微生物「１３７−１０３４」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託され、表Ａに見出すことができる。微生物「１３７−１０３６」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、表Ａに見出すことができる。微生物「６−４０４」（ＣＭ３８、ＰＢＣ６．３８としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代突然変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託され、表Ａに見出すことができる。
【０３７７】
（実施例１２）
農業系に有益な非属間微生物の属
本開示の微生物を、一季節にわたって１エーカーで産生された窒素の生産について、互いに対して評価および比較した。図２０、図４０、および図４１を参照されたい。
【０３７８】
本発明者らは、操作された非属間微生物の集団が現代的条植え作物農業系に有益であるためには、微生物の集団は、１季節当たり１エーカー当たり少なくとも１ポンドまたはそれよりも多くの窒素を産生する必要があるという仮説を立てる。
【０３７９】
そのため、本発明者らは、驚くべきことに、特に、非マメ科作物の収穫高の増加；および／または外因性窒素適用に対する農業従事者の依存性の低減；および／または非窒素制限環境下でさえも、１季節当たり１エーカー当たり少なくとも１ポンドの窒素を産生する能力に寄与することができる微生物の機能性属を発見した。前記属は、コロニー化能力×１時間当たり１微生物当たりの産生されるＮのｍｍｏｌの積により規定される（つまり、図２０、４０、および４１の分割線）。
【０３８０】
図２０、４０、および４１に関して、本開示の微生物を使用したある特定のデータを、本開示の微生物により１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示すために集計した。そられは、窒素／微生物−時間のｍｍｏｌにより、生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録されている。より大きな画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。
【０３８１】
圃場データおよび野生型コロニー化ヒートマップ：図２０のヒートマップに使用されている微生物を、トウモロコシでのＮ産生についてアッセイした。ＷＴ菌株ＣＩ００６およびＣＩ０１９の場合、トウモロコシ根コロニー化データを、単一の圃場サイトから得た。残りの菌株の場合、コロニー化は、ＷＴ圃場レベルと同じであると仮定した。Ｎ固定活性を、５ｍＭグルタミンでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。図２０のヒートマップの下にある表は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。
【０３８２】
圃場データヒートマップ：図４０のヒートマップに使用されているデータは、圃場条件におけるトウモロコシでのＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の圃場サイトからのトウモロコシ根コロニー化データを使用した、微生物により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。Ｎ固定活性を、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。下記の表Ｃは、図４０のヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。
【０３８３】
温室および実験室データヒートマップ：図４１のヒートマップに使用されているデータは、実験室および温室条件におけるトウモロコシでのＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の菌株により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。白色点は、トウモロコシ根コロニー化データが温室条件で収集された菌株を表わす。黒色点は、トウモロコシ根コロニー化レベルが、野生型親菌株の平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルから導き出されている突然変異体菌株を表わす。斜線付き点は、平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルの野生型親菌株を表わす。全ての場合で、Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイによって決定した。下記の表Ｄは、図４１のヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。
【表Ｃ−１】
2020506681.tif 000061
【表Ｃ−２】
2020506681.tif 000062
【表Ｄ】
2020506681.tif 000063
【０３８４】
結論：図２０、４０、４１ならびに表ＣおよびＤのデータは、記載されている属の１ダースよりも多くの代表的なメンバーを示す（つまり図中の線の右側の微生物）。さらに、これら多数の代表的なメンバーは、多様な一連の分類学的属に由来し、それらは、上記の表ＣおよびＤに見出すことができる。またさらに、本発明者らは、微生物の多くに見出される構造／機能関連性を示す多数の遺伝子属性を発見した。これらの遺伝子関連性は、本発明者らにより導入された遺伝子改変（窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに少なくとも１つの遺伝子変異を導入することが挙げられる）を示す本開示の多数の表に見出すことができる。
【０３８５】
結果的に、新たに発見された属は、（１）ロバストなデータセット、（２）１ダースよりも多くの代表的なメンバー、（３）多様な分類学的属に由来するメンバー、および（４）属メンバーの根本的な遺伝子アーキテクチャーにて構造／機能関連性を規定する遺伝子改変の種類により支持される。
【０３８６】
（実施例１３）
非属間の操作された微生物を検出するための方法およびアッセイ
本開示は、種々の前述の実施例で使用された微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、およびアッセイを教示する。アッセイは、導出／突然変異体非属間微生物の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列を検出することができる。こうした天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを、微生物における特定の遺伝子変更の存在を示す特徴のタイプとして使用することができる。
【０３８７】
本技法は、固有に設計されたプライマーおよびプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法を使用することにより、こうした天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。プローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合し得る。すなわち、プローブがその相補的配列とハイブリダイゼーションした後でのみ検出が可能である蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドで構成される配列特異的ＤＮＡプローブを使用することができる。この定量的な方法では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーにより増幅されることになり、結果的に、非特異的色素または特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用のいずれかにより検出することができることが保証され得る。この方法の別の態様は、プライマーがジャンクション配列のいずれかの側に隣接するようにプライマーを選択することであり、したがって、増幅反応が生じる場合、前記ジャンクション配列が存在する。
【０３８８】
結果的に、ゲノムＤＮＡを試料から抽出し、ｑＰＣＲの使用により本開示の微生物の存在を定量化するために使用することができる。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間突然変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）により設計されたプライマーであってもよい。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ／Ｎ１１７６２１００）キットを使用し、フォワードおよびリバース増幅プライマーのみを使用して実施してもよく、あるいはＫａｐａ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆｏｒｃｅキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ＫＫ４３０１）を、増幅プライマーと、５’末端のＦＡＭ色素標識、内部ＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤および蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを用いて使用してもよい。
【０３８９】
ｑＰＣＲ法で使用することができるある特定のプライマー、プローブ、および非天然ジャンクション配列は、下記の表Ｅに列挙されている。具体的には、非天然ジャンクション配列は、配列番号３７２〜４０５に見出すことができる。
【表Ｅ−１】
2020506681.tif 000064
【表Ｅ−２】
2020506681.tif 000065
【表Ｅ−３】
2020506681.tif 000066
【表Ｅ−４】
2020506681.tif 000067
【表Ｅ−５】
2020506681.tif 000068
【表Ｅ−６】
2020506681.tif 000069
【表Ｅ−７】
2020506681.tif 000070
【表Ｅ−８】
2020506681.tif 000071
【表Ｅ−９】
2020506681.tif 000072
【表Ｅ−１０】
2020506681.tif 000073
【表Ｅ−１１】
2020506681.tif 000074
【表Ｅ−１２】
2020506681.tif 000075
【表Ｅ−１３】
2020506681.tif 000076
【表Ｅ−１４】
2020506681.tif 000077
【表Ｅ−１５】
2020506681.tif 000078
【表Ｅ−１６】
2020506681.tif 000079
【表Ｅ−１７】
2020506681.tif 000080
【表Ｅ−１８】
2020506681.tif 000081
【表Ｅ−１９】
2020506681.tif 000082
【表Ｅ−２０】
2020506681.tif 000083
【表Ｅ−２１】
2020506681.tif 000084
【表Ｅ−２２】
2020506681.tif 000085
【表Ｅ−２３】
2020506681.tif 000086
【表Ｆ】
2020506681.tif 000087
【表Ｇ−１】
2020506681.tif 000088
【表Ｇ−２】
2020506681.tif 000089
【表Ｇ−３】
2020506681.tif 000090
【表Ｇ−４】
2020506681.tif 000091
【表Ｇ−５】
2020506681.tif 000092
【表Ｇ−６】
2020506681.tif 000093
【表Ｇ−７】
2020506681.tif 000094
【表Ｇ−８】
2020506681.tif 000095
【表Ｇ−９】
2020506681.tif 000096
【表Ｇ−１０】
2020506681.tif 000097
【表Ｇ−１１】
2020506681.tif 000098
【表Ｇ−１２】
2020506681.tif 000099
【表Ｇ−１３】
2020506681.tif 000100
【表Ｇ−１４】
2020506681.tif 000101
【表Ｇ−１５】
2020506681.tif 000102
【表Ｇ−１６】
2020506681.tif 000103
【表Ｇ−１７】
2020506681.tif 000104
【表Ｇ−１８】
2020506681.tif 000105
【表Ｇ−１９】
2020506681.tif 000106
【表Ｇ−２０】
2020506681.tif 000107
【表Ｇ−２１】
2020506681.tif 000108
【表Ｇ−２２】
2020506681.tif 000109
【表Ｇ−２３】
2020506681.tif 000110
【表Ｇ−２４】
2020506681.tif 000111
【表Ｇ−２５】
2020506681.tif 000112
【表Ｈ−１】
2020506681.tif 000113
【表Ｈ−２】
2020506681.tif 000114
【表Ｈ−３】
2020506681.tif 000115
【表Ｈ−４】
2020506681.tif 000116
【表Ｈ−５】
2020506681.tif 000117
【表Ｈ−６】
2020506681.tif 000118
【表Ｈ−７】
2020506681.tif 000119
【表Ｈ−８】
2020506681.tif 000120
【表Ｈ−９】
2020506681.tif 000121
【表Ｈ−１０】
2020506681.tif 000122
【表Ｈ−１１】
2020506681.tif 000123
【表Ｈ−１２】
2020506681.tif 000124
【表Ｈ−１３】
2020506681.tif 000125
【表Ｈ−１４】
2020506681.tif 000126
【表Ｈ−１５】
2020506681.tif 000127
【表Ｈ−１６】
2020506681.tif 000128
【表Ｈ−１７】
2020506681.tif 000129
【表Ｈ−１８】
2020506681.tif 000130
【表Ｈ−１９】
2020506681.tif 000131
【表Ｈ−２０】
2020506681.tif 000132
【表Ｈ−２１】
2020506681.tif 000133
【表Ｈ−２２】
2020506681.tif 000134
【表Ｈ−２３】
2020506681.tif 000135
【表Ｈ−２４】
2020506681.tif 000136
【表Ｈ−２５】
2020506681.tif 000137
【表Ｈ−２６】
2020506681.tif 000138
【表Ｈ−２７】
2020506681.tif 000139
【表Ｈ−２８】
2020506681.tif 000140
【表Ｈ−２９】
2020506681.tif 000141
【表Ｈ−３０】
2020506681.tif 000142
【表Ｈ−３１】
2020506681.tif 000143
【表Ｈ−３２】
2020506681.tif 000144
【表Ｈ−３３】
2020506681.tif 000145
【表Ｈ−３４】
2020506681.tif 000146
【表Ｈ−３５】
2020506681.tif 000147
【表Ｈ−３６】
2020506681.tif 000148
【表Ｈ−３７】
2020506681.tif 000149
【表Ｈ−３８】
2020506681.tif 000150
【表Ｈ−３９】
2020506681.tif 000151
【表Ｈ−４０】
2020506681.tif 000152
【表Ｈ−４１】
2020506681.tif 000153
【表Ｈ−４２】
2020506681.tif 000154
【表Ｈ−４３】
2020506681.tif 000155
【表Ｈ−４４】
2020506681.tif 000156
【表Ｈ−４５】
2020506681.tif 000157
【表Ｈ−４６】
2020506681.tif 000158
【表Ｈ−４７】
2020506681.tif 000159
【表Ｈ−４８】
2020506681.tif 000160
【表Ｈ−４９】
2020506681.tif 000161
【表Ｈ−５０】
2020506681.tif 000162
【表Ｈ−５１】
2020506681.tif 000163
【表Ｈ−５２】
2020506681.tif 000164
【表Ｈ−５３】
2020506681.tif 000165
【表Ｈ−５４】
2020506681.tif 000166
【表Ｈ−５５】
2020506681.tif 000167
【表Ｈ−５６】
2020506681.tif 000168
【表Ｈ−５７】
2020506681.tif 000169
【表Ｈ−５８】
2020506681.tif 000170
【表Ｈ−５９】
2020506681.tif 000171
【表Ｈ−６０】
2020506681.tif 000172
【０３９０】
本発明を記載する状況（特に、以下の特許請求の範囲の状況）での用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の参照対象の使用は、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、単数および複数を両方とも包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の指示がない限り、非限定的用語として解釈されるべきである（つまり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、限定されない」ことを意味する）。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書で別様の指示がない限り、各別個の数値がその範囲内に入ることを個々に参照するための簡略的な方法としての役目を果たすことが意図されているに過ぎず、各別個の数値は、それが本明細書にあたかも個々に記載されているが如く、本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されているありとあらゆる例または例示的な文言（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良好に説明するためのものに過ぎず、別様に特許請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書中の文言は、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施にとって不可欠なものであることを示すものとして解釈されるべきでない。
項目
１．非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法であって、
前記植物に、複数の非属間細菌を適用するステップを含み、前記複数の非属間細菌が、
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ／または
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する非属間細菌を含み、
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生し、
前記複数の非属間細菌の各メンバーが、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、方法。
２．前記複数の非属間細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有する細菌を含む、第１項に記載の方法。
３．前記複数の非属間細菌が、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第１項に記載の方法。
４．前記複数の非属間細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第１項に記載の方法。
５．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した導入制御配列を含む、第１項に記載の方法。
６．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む、第１項に記載の方法。
７．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む、第１項に記載の方法。
８．前記複数の非属間細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第１項に記載の方法。
９．前記複数の非属間細菌が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第１項に記載の方法。
１０．前記複数の非属間細菌は、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１項に記載の方法。
１１．前記植物に適用される前記複数の非属間細菌が、外因性非大気窒素の取込み増加を刺激しない、第１項に記載の方法。
１２．前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含む、第１項に記載の方法。
１３．前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含み、前記窒素含有肥料が、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む、第１項に記載の方法。
１４．前記外因性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子の１つまたは複数を含む肥料から選択される、第１項に記載の方法。
１５．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第１項に記載の方法。
１６．  前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第１項に記載の方法。
１７．前記複数の非属間細菌が、非窒素制限条件で大気窒素を植物内で固定する、第１項に記載の方法。
１８．前記複数の非属間細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１項に記載の方法。
１９．前記複数の非属間細菌により産生される前記固定窒素が、植物組織での大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈により測定される、第１項に記載の方法。
２０．窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される、第１項に記載の方法。
２１．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現または活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす突然変異である、第１項に記載の方法。
２２．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種調節配列の挿入もしくは（Ｄ）ドメイン欠失を含む、から選択される、第１項に記載の方法。
２３．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子である、第１項に記載の方法。
２４．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第１項に記載の方法。
２５．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第１項に記載の方法。
２６．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せから選択される、第１項に記載の方法。
２７．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第１項に記載の方法。
２８．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第１項に記載の方法。
２９．前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、第１項に記載の方法。
３０．前記複数の非属間細菌が、組成物に製剤化される、第１項に記載の方法。
３１．前記複数の非属間細菌が、農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化される、第１項に記載の方法。
３２．前記複数の非属間細菌が、前記植物の種子が植栽される畝間内に適用される、第１項に記載の方法。
３３．前記複数の非属間細菌が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物に製剤化される、第１項に記載の方法。
３４．前記複数の非属間細菌が、前記植物の種子に適用される、第１項に記載の方法。
３５．前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化され、前記植物の種子に適用される、第１項に記載の方法。
３６．前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化され、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度で前記植物の種子に適用される、第１項に記載の方法。
３７．前記植物が、穀類作物である、第１項に記載の方法。
３８．前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、第１項に記載の方法。
３９．前記植物が、トウモロコシである、第１項に記載の方法。
４０．前記植物が、農業作物植物である、第１項に記載の方法。
４１．前記植物が、遺伝子改変生物である、第１項に記載の方法。
４２．前記植物が、遺伝子改変生物ではない、第１項に記載の方法。
４３．前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、第１項に記載の方法。
４４．前記複数の非属間細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、第１項に記載の方法。
４５．前記複数の非属間細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、第１項に記載の方法。
４６．前記複数の非属間細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第１項に記載の方法。
４７．前記複数の非属間細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第１項に記載の方法。
４８．前記複数の非属間細菌が、ＰＴＡ−１２２２９３として寄託された細菌、ＰＴＡ−１２２２９４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第１項に記載の方法。
４９．１エーカー当たり２０ｌｂよりも多くの窒素で施肥された農業系で大気窒素を固定する少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株を含む細菌組成物。
５０．１エーカー当たり２０ｌｂよりも多くの窒素で施肥された農業系で大気窒素を固定するように品種改良された少なくとも１つの細菌菌株を含む細菌組成物。
５１．肥料が、無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素ホルム、ＵＡＮ（尿素硝酸アンモニウム）リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、および硝酸ナトリウムからなる群より選択される化学肥料である、第４９項または第５０項に記載の細菌組成物。
５２．大気窒素を固定する少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株を含む細菌組成物であって、前記少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株が、外因的に加えられたＤＮＡを含み、前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも８０％の同一性を共有する細菌組成物。
５３．前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも８５％の同一性を共有する、第５２項に記載の細菌組成物。
５４．前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも９０％の同一性を共有する、第５２項に記載の細菌組成物。
５５．前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも９５％の同一性を共有する、第５２項に記載の細菌組成物。
５６．前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも９９％の同一性を共有する、第５２項に記載の細菌組成物。
５７．前記外因的に加えられたＤＮＡが、前記対応する天然細菌菌株と同じ細菌菌株に由来する、第５２項に記載の細菌組成物。
５８．前記細菌組成物が、施肥組成物である、前記項のいずれかに記載の細菌組成物。
５９．前記少なくとも１つの遺伝子操作された細菌菌株が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群より選択される遺伝子または遺伝子から１０，０００ｂｐ以内の遺伝子間領域に少なくとも１つの変異を含む、前記項のいずれかに記載の細菌組成物。
６０．粘着付与剤、微生物安定化剤、殺真菌剤、抗細菌剤、保存剤、安定化剤、界面活性剤、抗錯体剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、肥料、殺鼠剤、乾燥剤、殺菌剤、および栄養素からなる群より選択される少なくとも１つの追加成分をさらに含む、前記項のいずれかに記載の細菌組成物。
６１．着色剤、プライマー、ペレット、消毒剤、植物成長調節剤、毒性緩和剤（ｓａｆｅｎｅｒ）、および殺線虫剤からなる群より選択される少なくとも１つの追加成分をさらに含む、前記項のいずれかに記載の細菌組成物。
６２．圃場に適用されるように製剤化されている、前記項のいずれかに記載の細菌組成物。
６３．畦間で適用されるように製剤化されている、第６２項に記載の細菌組成物。
６４．種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤として適用されるように製剤化されている、第６２項に記載の細菌組成物。
６５．種子の植栽時に、植栽前に、または植栽後に適用されるように製剤化されている、第６１項または第６２項に記載の細菌組成物。
６６．前記項のいずれかに記載の細菌組成物が接種されている植物の種子を含む種子組成物。
６７．第６６項に記載の種子組成物を有する複数の種子を使用して、作物を栽培するための方法。
６８．前記作物を収穫するステップをさらに含む、第６７項に記載の方法。
６９．前記項のいずれかに記載の細菌組成物を圃場に適用するための方法。
７０．前記細菌組成物が、液体形態、乾燥形態、顆粒、粉末、およびペレットからなる群より選択される形態で前記圃場に適用される、第６９項に記載の方法。
７１．前記細菌組成物が、種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤として前記圃場に適用される、第６９項に記載の方法。
７２．前記細菌組成物が、畦間処理剤として前記圃場に適用される、第６９項に記載の方法。
７３．前記細菌組成物が、前記種子の植栽時に、植栽前に、または植栽後に適用される、第６９項に記載の方法。
７４．前記項のいずれかに記載の細菌組成物を含む肥料組成物。
７５．種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤組成物である、第７４項に記載の肥料組成物。
７６．畦間組成物である、第７４項に記載の肥料組成物。
７７．植栽時に、植栽前に、または植栽後に作物に提供される、第７４項に記載の肥料組成物。
７８．多孔質担体をさらに含む、第７４項に記載の肥料組成物。
７９．前記細菌組成物と組み合わせると、その個々の成分の累積的利益を超えて作物に対する前記肥料組成物の施肥利益を増加させる追加の相乗効果的成分をさらに含む、第７４項に記載の肥料組成物。
８０．土壌窒素レベルを維持するための方法であって、
圃場の土壌に、大気窒素を固定する遺伝子操作された細菌によって接種された作物を植栽するステップ、および
前記作物を収穫するステップを含み、前記作物の生産に必要な窒素用量の９０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、方法。
８１．前記作物の生産に必要な窒素用量の８０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、第８０項に記載の方法。
８２．前記作物の生産に必要な窒素用量の７０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、第８０項に記載の方法。
８３．前記作物の生産に必要な窒素用量の６０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、第８０項に記載の方法。
８４．前記作物の生産に必要な窒素用量の５０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、第８０項に記載の方法。
８５．前記作物の生産に必要な窒素用量の４０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、第８０項に記載の方法。
８６．前記遺伝子操作された細菌が、前記項のいずれかに記載の細菌組成物を含む、第８０項に記載の方法。
８７．前記遺伝子操作された細菌が、前記項のいずれかに記載の細菌組成物からなる、第８０項に記載の方法。
８８．プロバイオティクス栄養補助剤を作物植物に送達するための方法であって、
作物種子を、種子コーティング、種子処理剤、または種子粉衣でコーティングするステップであって、前記種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤が、前記プロバイオティクスの生存標本を含む、ステップおよび
圃場の土壌に前記作物種子を適用するステップを含む、方法。
８９．前記種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤が、単一層で前記作物種子に適用される、第８８項に記載の方法。
９０．前記種子コーティングが、複数層で前記作物種子に適用される、第８８項に記載の方法。
９１．前記種子コーティングが、配合物で前記作物種子に適用される、第８８項に記載の方法。
９２．前記作物種子が、非根粒性である、第８８項に記載の方法。
９３．前記種子コーティングが、前記項のいずれかに記載の細菌組成物を含む、第８８項に記載の方法。
９４．前記遺伝子操作された細菌菌株が、遺伝子操作されたグラム陽性細菌菌株である、前記項のいずれかに記載の方法。
９５．前記遺伝子操作されたグラム陽性細菌菌株が、Ｎｉｆクラスターの調節因子の発現レベルの変更を示す、第９４項に記載の方法。
９６．前記遺伝子操作されたグラム陽性細菌菌株が、減少量のＮｉｆクラスターの負の調節因子を発現する、第９４項に記載の方法。
９７．前記遺伝子操作された細菌菌株が、減少量のＧｌｎＲを発現する、第９４項に記載の方法。
９８．前記遺伝子操作された細菌菌株のゲノムが、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれか一項に記載の方法。
９９．前記遺伝子操作された細菌菌株のゲノムが、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれか一項に記載の方法。
１００．前記遺伝子操作された細菌菌株のゲノムが、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれか一項に記載の方法。
１０１．前記遺伝子操作された細菌菌株のゲノムが、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれか一項に記載の方法。
１０２．微生物菌株を品種改良して、農学的に関連する特定の形質を向上させるための方法であって、
所望の作物でコロニー化する能力を有する複数の微生物菌株を提供するステップ、
ゲノム内再編成により前記形質に影響を及ぼす調節ネットワークを向上させるステップ、
前記複数の微生物菌株内の微生物菌株を評価して、前記形質の尺度を決定するステップ、および
前記所望の作物の存在下で前記形質の向上を生成する、前記複数の微生物菌株の１つまたは複数の微生物菌株を選択するステップを含む、方法。
１０３．向上された前記特定の形質が、前記微生物菌株が窒素を固定する能力である、第１０２項に記載の方法。
１０４．向上された前記特定の形質が、前記微生物菌株が、Ｎ施肥栽培条件の存在下で大気窒素を固定する能力である、第１０３項に記載の方法。
１０５．微生物菌株を品種改良して、農学的に関連する特定の形質を向上させるための方法であって、
所望の作物でコロニー化する能力を有する複数の微生物菌株を提供するステップ、
前記複数の微生物菌株に遺伝的多様性を導入するステップ、
前記複数の微生物菌株内の微生物菌株を評価して、前記形質の尺度を決定するステップ、および
前記所望の作物の存在下で前記形質の向上を生成する、前記複数の微生物菌株の１つまたは複数の微生物菌株を選択するステップを含む、方法。
１０６．向上された前記特定の形質が、前記微生物菌株が窒素を固定する能力である、第１０５項に記載の方法。
１０７．向上された前記特定の形質が、前記微生物菌株が、Ｎ施肥栽培条件の存在下で大気窒素を固定する能力である、第１０６項に記載の方法。
１０８．非マメ科植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、
前記非マメ科植物を、操作された非属間微生物に曝露するステップを含み、前記操作された非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異または窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、方法。
１０９．前記操作された非属間微生物が、前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、第１０８項に記載の方法。
１１０．前記操作された非属間微生物が、前記窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、第１０８項に記載の方法。
１１１．前記操作された非属間微生物が、前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および前記窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、第１０８項に記載の方法。
１１２．前記操作された非属間微生物が、前記非マメ科植物の種子が植栽される畝間内に適用される、第１０８項に記載の方法。
１１３．前記操作された非属間微生物が、前記非マメ科植物の種子にコーティングされる、第１０８項に記載の方法。
１１４．前記非マメ科植物が、モロコシ、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、小麦、ジャガイモ、雑穀、穀類、穀物、およびメイズからなる群より選択される非マメ科農業作物植物である、第１０８項に記載の方法。
１１５．前記操作された非属間微生物が、前記非マメ科植物の少なくとも根でコロニー化し、前記操作された非属間微生物が、組織の生重量１グラム当たり少なくとも１０５コロニー形成単位の量で前記非マメ科植物に存在する、第１０８項に記載の方法。
１１６．前記操作された非属間微生物が、非窒素制限条件で大気窒素を固定することが可能である、第１０８項に記載の方法。
１１７．前記操作された非属間微生物が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１０８項に記載の方法。
１１８．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される遺伝子に導入される、第１０８項に記載の方法。
１１９．前記操作された非属間微生物が、前記非マメ科植物における固定窒素の少なくとも１％を植物内で産生する、第１０８項に記載の方法。
１２０．前記操作された非属間微生物により産生された前記非マメ科植物における前記固定窒素が、１．２％の１５Ｎを含む肥料で処理された圃場で栽培した作物中での１５Ｎ希釈により測定される、第１１９項に記載の方法。
１２１．前記操作された非属間微生物が、前記非マメ科植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第１１９項に記載の方法。
１２２．前記非属間微生物が、定方向突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、および定向進化からなる群より選択される少なくとも１つのタイプの操作を使用して操作される、第１０８項に記載の方法。
１２３．トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、
前記トウモロコシ植物を、ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＥ、およびａｍｔＢからなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子内に操作された遺伝子変異を含む操作された非属間微生物に曝露するステップを含む、方法。
１２４．前記操作された非属間微生物が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１２３項に記載の方法。
１２５．前記操作された非属間微生物が、前記トウモロコシ植物の種子が植栽される畝間内に適用される、第１２３項に記載の方法。
１２６．前記操作された非属間微生物が、前記トウモロコシ植物の種子にコーティングされる、第１２３項に記載の方法。
１２７．トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、
前記トウモロコシ植物を、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む操作された非属間微生物に曝露するステップを含み、前記操作された非属間微生物が、１．２％の１５Ｎを含む肥料で処理された圃場で栽培された作物での１５Ｎ希釈により測定して、前記トウモロコシ植物における固定窒素の少なくとも５％を植物内で産生する、方法。
１２８．非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法であって、
前記植物に、複数の非属間細菌を適用するステップを含み、前記複数の非属間細菌が、
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する非属間細菌を含み、
（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．５×１０−８ｍｍｏｌ  Ｎであり、
前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生し、
前記複数の非属間細菌の各メンバーが、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、方法。
１２９．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した導入制御配列を含む、第１２８項に記載の方法。
１３０．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む、第１２８項に記載の方法。
１３１．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む、第１２８項に記載の方法。
１３２．前記複数の非属間細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第１２８項に記載の方法。
１３３．前記複数の非属間細菌が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第１２８項に記載の方法。
１３４．前記複数の非属間細菌は、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１２８項に記載の方法。
１３５．前記植物に適用される前記複数の非属間細菌が、外因性非大気窒素の取込み増加を刺激しない、第１２８項に記載の方法。
１３６．前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含む、第１２８項に記載の方法。
１３７．前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含み、前記窒素含有肥料が、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む、第１２８項に記載の方法。
１３８．前記外因性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子の１つまたは複数を含む肥料から選択される、第１２８項に記載の方法。
１３９．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第１２８項に記載の方法。
１４０．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第１２８項に記載の方法。
１４１．前記複数の非属間細菌が、非窒素制限条件で大気窒素を植物内で固定する、第１２８項に記載の方法。
１４２．前記複数の非属間細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１２８項に記載の方法。
１４３．前記複数の非属間細菌により産生される前記固定窒素が、植物組織での大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈により測定される、第１２８項に記載の方法。
１４４．窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される、第１２８項に記載の方法。
１４５．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現または活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす突然変異である、第１２８項に記載の方法。
１４６．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種調節配列の挿入もしくは（Ｄ）ドメイン欠失を含む、から選択される、第１２８項に記載の方法。
１４７．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子である、第１２８項に記載の方法。
１４８．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第１２８項に記載の方法。
１４９．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第１２８項に記載の方法。
１５０．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せから選択される、第１２８項に記載の方法。
１５１．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第１２８項に記載の方法。
１５２．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第１２８項に記載の方法。
１５３．前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、第１２８項に記載の方法。
１５４．前記複数の非属間細菌が、組成物に製剤化される、第１２８項に記載の方法。
１５５．前記複数の非属間細菌が、農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化される、第１２８項に記載の方法。
１５６．前記複数の非属間細菌が、前記植物の種子が植栽される畝間内に適用される、第１２８項に記載の方法。
１５７．前記複数の非属間細菌が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物に製剤化される、第１２８項に記載の方法。
１５８．前記複数の非属間細菌が、前記植物の種子に適用される、第１２８項に記載の方法。
１５９．前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化され、前記植物の種子に適用される、第１２８項に記載の方法。
１６０．前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化され、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度で前記植物の種子に適用される、第１２８項に記載の方法。
１６１．前記植物が、穀類作物である、第１２８項に記載の方法。
１６２．前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、第１２８項に記載の方法。
１６３．前記植物が、トウモロコシである、第１２８項に記載の方法。
１６４．前記植物が、農業作物植物である、第１２８項に記載の方法。
１６５．前記植物が、遺伝子改変生物である、第１２８項に記載の方法。
１６６．前記植物が、遺伝子改変生物ではない、第１２８項に記載の方法。
１６７．前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、第１２８項に記載の方法。
１６８．前記複数の非属間細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、第１２８項に記載の方法。
１６９．前記複数の非属間細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、第１２８項に記載の方法。
１７０．前記複数の非属間細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第１２８項に記載の方法。
１７１．前記複数の非属間細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第１２８項に記載の方法。
１７２．前記複数の非属間細菌が、ＰＴＡ−１２２２９３として寄託された細菌、ＰＴＡ−１２２２９４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第１２８項に記載の方法。
１７３．非マメ科植物での窒素固定を増加させる方法であって、
ａ．前記植物に複数の細菌を適用するステップを含み、前記複数の細菌が、
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含み、
前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、方法。
１７４．前記複数の細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有する細菌を含む、第１７３項に記載の方法。
１７５．前記複数の細菌が、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１７３×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第１７３項に記載の方法。
１７６．前記複数の細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第１７３項に記載の方法。
１７７．前記複数の細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含み、（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．５×１０−８ｍｍｏｌ  Ｎである、第１７３項に記載の方法。
１７８．前記複数の細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第１７３項に記載の方法。
１７９．前記植物に適用された前記複数の細菌が、外来性非大気窒素の取込み増加を刺激しない、第１７３項に記載の方法。
１８０．前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、第１７３項に記載の方法。
１８１．前記複数の細菌が、組成物に製剤化される、第１７３項に記載の方法。
１８２．前記複数の細菌が、農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化される、第１７３項に記載の方法。
１８３．前記複数の細菌が、前記植物の種子が植栽される畝間内に適用される、第１７３項に記載の方法。
１８４．前記複数の細菌が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物に製剤化される、第１７３項に記載の方法。
１８５．前記複数の細菌が、前記植物の種子に適用される、第１７３項に記載の方法。
１８６．前記複数の細菌が、種子コーティングに製剤化され、前記植物の種子に適用される、第１７３項に記載の方法。
１８７．前記複数の細菌が、種子コーティングに製剤化され、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度で前記植物の種子に適用される、第１７３項に記載の方法。
１８８．前記植物が、穀類作物である、第１７３項に記載の方法。
１８９．前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、第１７３項に記載の方法。
１９０．前記植物が、トウモロコシである、第１７３項に記載の方法。
１９１．前記植物が、農業作物植物である、第１７３項に記載の方法。
１９２．前記植物が、遺伝子改変生物である、第１７３項に記載の方法。
１９３．前記植物が、遺伝子改変生物ではない、第１７３項に記載の方法。
１９４．前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、第１７３項に記載の方法。
１９５．前記複数の細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、第１７３項に記載の方法。
１９６．前記複数の細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、第１７３項に記載の方法。
１９７．前記複数の細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第１７３項に記載の方法。
１９８．前記複数の細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第１７３項に記載の方法。
１９９．前記複数の細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００１として寄託された細菌、およびＮＣＭＡ２０１７０８００１として寄託された細菌から選択される、第１７３項に記載の方法。
２００．非マメ科植物での窒素固定を増加させる能力のある非属間細菌集団であって、
複数の非属間細菌であって、
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、かつ／または
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、
複数の非属間細菌を含み、
前記複数の非属間細菌が、前記複数の非属間細菌の存在下で成長した植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生し、
前記複数の非属間細菌の各メンバーが、前記非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、非属間細菌集団。
２０１．前記複数の非属間細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有する細菌を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０２．前記複数の非属間細菌が、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０３．前記複数の非属間細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０４．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した導入制御配列を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０５．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０６．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０７．前記複数の非属間細菌が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０８．前記複数の非属間細菌が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２０９．前記複数の非属間細菌は、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１０．前記植物に適用される前記複数の非属間細菌が、外因性非大気窒素の取込み増加を刺激しない、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１１．前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１２．前記植物が、１エーカー当たり少なくとも約５０ｌｂの窒素含有肥料が投与された圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも約５重量％の窒素を含み、前記窒素含有肥料が、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１３．前記外因性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子の１つまたは複数を含む肥料から選択される、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１４．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１５．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１６．前記複数の非属間細菌が、非窒素制限条件で大気窒素を植物内で固定する、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１７．前記複数の非属間細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１８．前記複数の非属間細菌により産生される前記固定窒素が、植物組織での大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈により測定される、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２１９．窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２０．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現または活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす突然変異である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２１．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種調節配列の挿入もしくは（Ｄ）ドメイン欠失を含む、から選択される、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２２．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２３．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２４．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２５．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せから選択される、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２６．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２７．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２８．前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２２９．前記複数の非属間細菌が、組成物に製剤化さている、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３０．前記複数の非属間細菌が、農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化さている、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３１．前記複数の非属間細菌が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物に製剤化されている、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３２．前記複数の非属間細菌が、種子コーティングに製剤化されている、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３３．前記植物が、穀類作物である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３４．前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３５．前記植物が、トウモロコシである、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３６．前記植物が、農業作物植物である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３７．前記植物が、遺伝子改変生物である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３８．前記植物が、遺伝子改変生物ではない、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２３９．前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２４０．前記複数の非属間細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２４１．前記複数の非属間細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２４２．前記複数の非属間細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２４３．前記複数の非属間細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２４４．前記複数の非属間細菌が、ＰＴＡ−１２２２９３として寄託された細菌、ＰＴＡ−１２２２９４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第２００項に記載の非属間細菌集団。
２４５．非マメ科植物で窒素固定を増加させることが可能な細菌集団であって、
ａ．
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する
複数の細菌を含み、
前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、方法。
２４６．前記複数の細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有する細菌を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２４７．前記複数の細菌が、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約２４５×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２４８．前記複数の細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２４９．前記複数の細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌を含み、（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．５×１０−８ｍｍｏｌ  Ｎである、第２４５項に記載の細菌集団。
２５０．前記複数の細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第２４５項に記載の細菌集団。
２５１．前記植物に適用された前記複数の細菌が、外来性非大気窒素の取込み増加を刺激しない、第２４５項に記載の細菌集団。
２５２．前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２５３．前記複数の細菌が、組成物に製剤化される、第２４５項に記載の細菌集団。
２５４．前記複数の細菌が、農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化される、第２４５項に記載の細菌集団。
２５５．前記複数の細菌が、前記植物の種子が植栽される畝間内に適用される、第２４５項に記載の細菌集団。
２５６．前記複数の細菌が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物に製剤化される、第２４５項に記載の細菌集団。
２５７．前記複数の細菌が、前記植物の種子に適用される、第２４５項に記載の細菌集団。
２５８．前記複数の細菌が、種子コーティングに製剤化され、前記植物の種子に適用される、第２４５項に記載の細菌集団。
２５９．前記複数の細菌が、種子コーティングに製剤化され、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度で前記植物の種子に適用される、第２４５項に記載の細菌集団。
２６０．前記植物が、穀類作物である、第２４５項に記載の細菌集団。
２６１．前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、第２４５項に記載の細菌集団。
２６２．前記植物が、トウモロコシである、第２４５項に記載の細菌集団。
２６３．前記植物が、農業作物植物である、第２４５項に記載の細菌集団。
２６４．前記植物が、遺伝子改変生物である、第２４５項に記載の細菌集団。
２６５．前記植物が、遺伝子改変生物ではない、第２４５項に記載の細菌集団。
２６６．前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、第２４５項に記載の細菌集団。
２６７．前記複数の細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２６８．前記複数の細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２６９．前記複数の細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第２４５項に記載の細菌集団。
２７０．前記複数の細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第２４５項に記載の細菌集団。
２７１．前記複数の細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００１として寄託された細菌、およびＮＣＭＡ２０１７０８００１として寄託された細菌から選択される、第２４５項に記載の細菌集団。
２７２．
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する細菌。
２７３．非属間細菌が外因性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む非属間細菌であって、
ｉ．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、および／または
ｉｉ．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、非属間細菌。
２７４．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有する、第２７３項に記載の非属間細菌。
２７５．１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、第２７３項に記載の非属間細菌。
２７６．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、第２７３項に記載の非属間細菌。
２７７．前記細菌が、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の植物根組織１単位当たりの平均コロニー化能力を有し、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生し、（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．５×１０−８ｍｍｏｌ  Ｎである、第２７３項に記載の非属間細菌。
２７８．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した導入制御配列を含む、第２７３項に記載の非属間細菌。
２７９．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８０．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子と作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８１．窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８２．ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８３．窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８４．窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８５．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現または活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす突然変異である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８６．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種調節配列の挿入もしくは（Ｄ）ドメイン欠失を含む、から選択される、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８７．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８８．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２８９．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９０．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せから選択される、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９１．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９２．前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９３．組成物に製剤化されている、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９４．農業的に許容される担体を含む組成物に製剤化されている、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９５．液体畦間組成物に製剤化されている、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９６．種子コーティングに製剤化されている、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９７．Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９８．内部寄生性、着生性、または根圏性である、第２７３項に記載の非属間細菌。
２９９．ＰＴＡ−１２２２９３として寄託された細菌、ＰＴＡ−１２２２９４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびそれらの組合せから選択される、第２７３項に記載の非属間細菌。
３００．植物での窒素固定を増加させる方法であって、
ｉ．配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団、
ｉｉ．配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団、および／または
ｉｉｉ．配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む有効量の組成物を前記植物に投与するステップを含み、
前記有効量の前記組成物が投与された前記植物が、前記組成物が投与されていない植物と比較して、窒素固定の増加を示す、方法。
３０１．前記組成物が、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、および２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０２．前記組成物が、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、および２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０３．前記組成物が、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、および２７７〜２８３から選択される１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０４．前記組成物が、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０５．前記組成物が、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０６．前記組成物が、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０７．前記組成物が、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０８．前記組成物が、配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３０９．前記組成物が、配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１０．前記組成物が、配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１１．前記組成物が、配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１２．前記組成物が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１３．前記組成物が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を有する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、（Ｃ）異種調節配列の挿入、または（Ｄ）ドメイン欠失を含む、第３００項に記載の方法。
３１４．前記組成物が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、もしくはＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす少なくとも１つの突然変異を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１５．前記組成物が、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１６．前記組成物が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１７．前記組成物が、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１８．前記組成物が、以下の遺伝子変更：ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せ、のうちの少なくとも１つを有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３１９．前記組成物が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３２０．前記組成物が、ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子を有する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３２１．前記組成物が、ｎｉｆＬ改変を有する細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３２２．前記組成物が、ｎｉｆＬ改変を有する細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記改変が、破壊、ノックアウト、または短縮である、第３００項に記載の方法。
３２３．前記組成物が、ｎｉｆＬ改変を有する細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記細菌が、ｎｉｆＡ配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、第３００項に記載の方法。
３２４．前記組成物が、ｎｉｆＬ改変を有する細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記細菌が、ｎｉｆＬホモログを欠如する、第３００項に記載の方法。
３２５．前記組成物が、ｇｌｎＥ改変を有する細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含む、第３００項に記載の方法。
３２６．前記組成物が、ｇｌｎＥ改変を有する細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記改変が、破壊、ノックアウト、または短縮である、第３００項に記載の方法。
３２７．前記組成物が、ｇｌｎＥ改変を有する細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記ＧｌｎＥタンパク質の配列が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する、第３００項に記載の方法。
３２８．前記組成物が、ｇｌｎＥ改変を有する細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現する細菌を含む精製細菌集団を含み、前記ＧｌｎＥタンパク質の配列が、アデニリル除去（ＡＲ）活性を欠如する、第３００項に記載の方法。
３２９．前記精製細菌集団が、前記植物に固定窒素の少なくとも１％を植物内で提供する、第３００項に記載の方法。
３３０．前記精製細菌集団が、前記植物に固定窒素の少なくとも５％を植物内で提供する、第３００項に記載の方法。
３３１．前記精製細菌集団が、前記植物に固定窒素の少なくとも１０％を植物内で提供する、第３００項に記載の方法。
３３２．前記精製細菌集団が、非窒素制限条件で大気窒素を固定することが可能である、第３００項に記載の方法。
３３３．前記精製細菌集団が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第３００項に記載の方法。
３３４．前記精製細菌集団が、前記植物に固定窒素の少なくとも１％を植物内で提供し、前記固定窒素が、植物組織での大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈により測定される、第３００項に記載の方法。
３３５．前記精製細菌集団が、前記植物の根でコロニー化し、植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の量で存在する、第３００項に記載の方法。
３３６．前記植物が、種子、茎、花、果実、葉、または根茎を含む、第３００項に記載の方法。
３３７．前記組成物が、農業的に許容される担体を含む、第３００項に記載の方法。
３３８．前記精製細菌集団を含む前記組成物が、前記植物の種子が植栽される畝間内に投与される、第３００項に記載の方法。
３３９．前記精製細菌集団を含む前記組成物が、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物として製剤化される、第３００項に記載の方法。
３４０．前記精製細菌集団を含む前記組成物が、前記植物の種子に投与される、第３００項に記載の方法。
３４１．前記精製細菌集団を含む前記組成物が、種子コーティングとして製剤化され、前記植物の種子に投与される、第３００項に記載の方法。
３４２．前記精製細菌集団を含む前記組成物が、種子コーティングとして製剤化され、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度で前記植物の種子に投与される、第３００項に記載の方法。
３４３．前記植物が、非マメ科である、第３００項に記載の方法。
３４４．前記植物が、穀類作物である、第３００項に記載の方法。
３４５．前記植物が、トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される、第３００項に記載の方法。
３４６．前記植物が、トウモロコシである、第３００項に記載の方法。
３４７．前記植物が、マメ科植物である、第３００項に記載の方法。
３４８．前記植物が、穀物作物である、第３００項に記載の方法。
３４９．前記精製細菌集団が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５０．前記精製細菌集団が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属の細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５１．前記精製細菌集団が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ種の細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５２．前記精製細菌集団が、ＰＴＡ−１２２２９３として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５３．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０１００３として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５４．前記精製細菌集団が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属の細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５５．前記精製細菌集団が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ種の細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５６．前記精製細菌集団が、ＰＴＡ−１２２２９４として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５７．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０１００１として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５８．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０１００２として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３５９．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０８００４として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６０．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０８００３として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６１．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０８００２として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６２．前記精製細菌集団が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６３．前記精製細菌集団が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ種の細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６４．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７０８００１として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６５．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７１２００１として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６６．前記精製細菌集団が、ＮＣＭＡ  ２０１７１２００２として寄託された細菌を含む、第３００項に記載の方法。
３６７．
ｉ．配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列；
ｉｉ．配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列；および／または
ｉｉｉ．配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列
を含む、単離された細菌。
３６８．配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、および２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３６９．配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、および２７７〜２８３から選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である１６Ｓ核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７０．配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、および２７７〜２８３から選択される１６Ｓ核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７１．配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７２．配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一である核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７３．配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７４．配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、および２８４〜２９５から選択される核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７５．配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９０％同一である核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７６．配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一である核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７７．配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７８．配列番号１７７〜２６０および２９６〜３０３から選択される核酸配列を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３７９．ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８０．ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、およびニトロゲナーゼ酵素の生合成に関連する遺伝子からなる群より選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含み、前記遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、（Ｃ）異種調節配列の挿入、または（Ｄ）ドメイン欠失を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８１．ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、もしくはＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少の１つまたは複数をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８２．前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８３．アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８４．前記ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８５．以下の遺伝子変更：ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、ａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子、およびそれらの組合せ、のうちの少なくとも１つを含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８６．ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８７．ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている突然変異ｎｉｆＬ遺伝子、およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす突然変異ｇｌｎＥ遺伝子、およびａｍｔＢ遺伝子の発現の欠如をもたらす突然変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、第３６７項に記載の単離された細菌。
３８８．ｎｉｆＬ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現する、単離された細菌。
３８９．ｎｉｆＬ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現し、前記改変が、破壊、ノックアウト、または短縮である、単離された細菌。
３９０．ｎｉｆＬ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現し、前記細菌が、ｎｉｆＡ配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、単離された細菌。
３９１．ｎｉｆＬ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｎｉｆＬ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＮｉｆＬタンパク質を発現し、前記細菌が、ｎｉｆＬホモログを欠如する、単離された細菌。
３９２．ｇｌｎＥ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現する、単離された細菌。
３９３．ｇｌｎＥ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現し、前記改変が、破壊、ノックアウト、または短縮である、単離された細菌。
３９４．前記組成物が、ｇｌｎＥ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現し、前記ＧｌｎＥタンパク質の配列が、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する、単離された細菌。
３９５．前記組成物が、ｇｌｎＥ改変を含む第３６７項に記載の単離された細菌であって、前記ｇｌｎＥ改変を欠如する細菌の約５０％未満のＧｌｎＥタンパク質を発現し、前記ＧｌｎＥタンパク質の配列が、アデニリル除去（ＡＲ）活性を欠如する、単離された細菌。
３９６．前記細菌が、前記細菌に曝露された植物に固定窒素の少なくとも１％を植物内で提供する、第３６７項に記載の単離された細菌。
３９７．前記細菌が、前記細菌に曝露された植物に固定窒素の少なくとも５％を植物内で提供する、第３６７項に記載の単離された細菌。
３９８．前記細菌が、前記細菌に曝露された植物に固定窒素の少なくとも１０％を植物内で提供する、第３６７項に記載の単離された細菌。
３９９．非窒素制限条件で大気窒素を固定することが可能である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４００．窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０１．前記細菌に曝露された植物に固定窒素の少なくとも１％を植物内で提供し、前記固定窒素が、植物組織での大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈により測定される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０２．植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１．０×１０４細菌細胞の濃度まで前記細菌に曝露された植物の根でコロニー化する、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０３．農業組成物に製剤化されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０４．畦間組成物に製剤化されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０５．１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の細菌を含む液体畦間組成物として製剤化されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０６．種子処理剤または種子コーティングとして製剤化されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０７．１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕの濃度の細菌を含む種子処理剤または種子コーティングとして製剤化されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０８．植物と接触し、前記植物での窒素固定を増加させる、第３６７項に記載の単離された細菌。
４０９．非マメ科植物に配置される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１０．穀類作物に配置される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１１．トウモロコシ、米、小麦、大麦、モロコシ、雑穀、オート麦、ライ麦、およびライ小麦からなる群より選択される植物に配置される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１２．トウモロコシに配置される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１３．マメ科植物に配置される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１４．穀物作物に配置される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１５．Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびそれらの組合せから選択される、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１６．Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１７．Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ種である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１８．ＰＴＡ−１２２２９３として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４１９．ＮＣＭＡ２０１７０１００３として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２０．Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２１．Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ種である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２２．ＰＴＡ−１２２２９４として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２３．ＮＣＭＡ  ２０１７０１００１として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２４．ＮＣＭＡ  ２０１７０１００２として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２５．ＮＣＭＡ  ２０１７０８００４として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２６．ＮＣＭＡ  ２０１７０８００３として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２７．ＮＣＭＡ  ２０１７０８００２として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２８．Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４２９．Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ種である、第３６７項に記載の単離された細菌。
４３０．ＮＣＭＡ  ２０１７０８００１として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４３１．ＮＣＭＡ  ２０１７１２００１として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４３２．ＮＣＭＡ  ２０１７１２００２として寄託されている、第３６７項に記載の単離された細菌。
４３３．第４１５項〜第４３２項に記載のいずれか１つまたは複数の細菌を含む組成物。
４３４．配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有するヌクレオチド配列を増幅するステップを含む、非天然ジャンクション配列を検出するための方法。
４３５．前記増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を実施することによる、第４３４項に記載の方法。
４３６．前記増幅するステップが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することによる、第４３４項に記載の方法。
４３７．非天然ジャンクション配列を検出するための方法であって、配列番号３７２〜４０５に含まれている少なくとも１０連続塩基対断片と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するヌクレオチド配列を増幅するステップを含み、前記連続塩基対断片が、配列番号３０４〜３３７を含む上流配列および配列番号３３８〜３７１を含む下流配列の共通部分のヌクレオチドで構成されている、方法。
４３８．前記増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を実施することによる、第４３７項に記載の方法。
４３９．前記増幅するステップが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施することによる、第４３７項に記載の方法。
４４０．配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む、非天然ジャンクション配列。
４４１．配列番号３７２〜４０５に含まれている少なくとも１０連続塩基対断片と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を共有するヌクレオチド配列を含み、前記連続塩基対断片が、配列番号３０４〜３３７を含む上流配列および配列番号３３８〜３７１を含む下流配列の共通部分のヌクレオチドで構成されている、非天然ジャンクション配列。
４４２．
大気窒素を固定する少なくとも１つのリモデリングされた細菌菌株を含む細菌組成物であって、前記少なくとも１つのリモデリングされた細菌菌株が、外因的に加えられたＤＮＡを含み、前記外因的に加えられたＤＮＡが、対応する天然細菌菌株と少なくとも８０％の同一性を共有する、細菌組成物。
４４３．土壌窒素レベルを維持するための方法であって、
圃場の土壌に、大気窒素を固定するリモデリングされた細菌によって接種された作物を植栽するステップ、および
前記作物を収穫するステップを含み、前記作物の生産に必要な窒素用量の９０％以下が、植栽と収穫との間に前記圃場の前記土壌に投与される、方法。
４４４．作物植物にプロバイオティクス栄養補助剤を送達するための方法であって、
作物種子を、種子コーティング、種子処理剤、または種子粉衣でコーティングするステップであって、前記種子コーティング、種子粉衣、または種子処理剤が、前記プロバイオティクスの生存標本を含む、ステップおよび
圃場の土壌に前記作物種子を適用するステップを含む、方法。
４４５．非マメ科植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、
前記非マメ科植物を、リモデリングされた非属間微生物に曝露するステップを含み、前記リモデリングされた非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異または窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、方法。
４４６．トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、
前記トウモロコシ植物を、ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＥ、およびａｍｔＢからなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子内にリモデリングされた遺伝子変異を含むリモデリングされた非属間微生物に曝露するステップを含む、方法。
４４７．トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、
前記トウモロコシ植物を、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含むリモデリングされた非属間微生物に曝露するステップを含み、前記リモデリングされた非属間微生物が、１．２％の１５Ｎを含む肥料で処理された圃場で栽培した作物での１５Ｎ希釈により測定して、前記トウモロコシ植物における固定窒素の少なくとも５％を植物内で産生する、方法。
４４８．前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４４９．前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、前記項のいずれかに記載の細菌。
４５０．前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４５１．前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４５２．前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
４５３．前記細菌が、外因性窒素が存在する場合、１時間当たり１細菌細胞当たり少なくとも約１×１０−１７ｍｍｏｌ  Ｎの固定Ｎを産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４５４．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４５５．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４５６．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌。
４５７．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４５８．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４５９．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
４６０．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４６１．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４６２．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４６３．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌。
４６４．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４６５．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４６６．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
４６７．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４６８．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４６９．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４７０．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌。
４７１．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４７２．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４７３．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
４７４．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の１５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４７５．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４７６．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
４７７．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌。
４７８．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４７９．前記複数の細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４８０．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
４８１．前記複数の非属間細菌が、前記植物における固定窒素の２０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４８２．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の方法。
４８３．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の細菌。
４８４．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４８５．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４８６．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
４８７．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−７ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４８８．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の方法。
４８９．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の細菌。
４９０．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
４９１．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
４９２．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４９３．（ｉ）植物根組織１単位当たりの前記平均コロニー化能力および（ｉｉ）１時間当たり１細菌細胞当たり産生される固定Ｎの積が、１時間当たり植物根組織の生重量１グラム当たり少なくとも約２．０×１０−６ｍｍｏｌ  Ｎである、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
４９４．前記植物が、効率的な窒素使用のためにリモデリングされているかまたは品種改良されている、前記項のいずれかに記載の方法。
４９５．前記少なくとも１つのリモデリングされた細菌菌株が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群より選択される遺伝子または遺伝子から１０，０００ｂｐ以内の遺伝子間領域に少なくとも１つの変異を含む、前記項のいずれかに記載の細菌組成物。
４９６．前記リモデリングされた細菌が、前記項のいずれかに記載の細菌組成物を含む、前記項のいずれか一項に記載の方法。
４９７．前記リモデリングされた細菌が、前記項のいずれかに記載の細菌組成物からなる、前記項のいずれかに記載の方法。
４９８．前記リモデリングされた細菌菌株が、リモデリングされたグラム陽性細菌菌株である、前記項のいずれかに記載の方法。
４９９．前記リモデリングされたグラム陽性細菌菌株が、Ｎｉｆクラスターの調節因子の発現レベルの変更を示す、前記項のいずれかに記載の方法。
５００．前記リモデリングされたグラム陽性細菌菌株が、減少量のＮｉｆクラスターの負の調節因子を発現する、前記項のいずれかに記載の方法。
５０１．前記リモデリングされた細菌菌株が、減少量のＧｌｎＲを発現する、前記項のいずれかに記載の方法。
５０２．前記リモデリングされた細菌菌株のゲノムが、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれかに記載の方法。
５０３．前記リモデリングされた細菌菌株のゲノムが、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれかに記載の方法。
５０４．前記リモデリングされた細菌菌株のゲノムが、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれかに記載の方法。
５０５．前記リモデリングされた細菌菌株のゲノムが、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベースに由来する配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記項のいずれかに記載の方法。
５０６．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５０７．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５０８．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および前記窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５０９．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記非マメ科植物の種子が植栽される畝間内に適用される、前記項のいずれかに記載の方法。
５１０．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記非マメ科植物の種子にコーティングされる、前記項のいずれかに記載の方法。
５１１．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記非マメ科植物の少なくとも根でコロニー化し、前記リモデリングされた非属間微生物が、組織の生重量１グラム当たり少なくとも１０５コロニー形成単位の量で前記非マメ科植物に存在する、前記項のいずれかに記載の方法。
５１２．前記リモデリングされた非属間微生物が、非窒素制限条件で大気窒素を固定することが可能である、前記項のいずれかに記載の方法。
５１３．前記リモデリングされた非属間微生物が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、前記項のいずれかに記載の方法。
５１４．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記非マメ科植物における固定窒素の少なくとも１％を植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
５１５．前記リモデリングされた非属間微生物により産生される前記非マメ科植物における前記固定窒素が、１．２％の１５Ｎを含む肥料で処理された圃場で栽培した作物での１５Ｎ希釈により測定される、前記項のいずれかに記載の方法。
５１６．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記非マメ科植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、前記項のいずれかに記載の方法。
５１７．前記非属間微生物が、定方向突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、および定向進化からなる群より選択される少なくとも１つのタイプの操作を使用してリモデリングされている、前記項のいずれかに記載の方法。
５１８．前記リモデリングされた非属間微生物が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、前記項のいずれかに記載の方法。
５１９．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記トウモロコシ植物の種子が植栽される畝間内に適用される、前記項のいずれかに記載の方法。
５２０．前記リモデリングされた非属間微生物が、前記トウモロコシ植物の種子にコーティングされる、前記項のいずれかに記載の方法。
５２１．前記リモデリングされた非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５２２．前記非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５２３．前記遺伝子操作された非属間微生物が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５２４．前記リモデリングされた非属間細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５２５．前記非属間細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５２６．前記遺伝子操作された非属間細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
５２７．前記細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の細菌。
５２８．前記細菌集団内の細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の細菌集団。
５２９．前記単離された細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の単離された細菌。
５３０．前記非属間細菌集団内の非属間細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の非属間細菌集団。
５３１．前記非属間細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異および窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、前記項のいずれかに記載の非属間細菌。
５３２．前記項のいずれかに記載のいずれか１つまたは複数の細菌を含む組成物。
【０３９１】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は例示のために提供されているに過ぎないことは、当業者には明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱せずに多数の改変、変更、および置換を起想するであろう。本発明の実施には、本明細書に記載されている本発明の実施形態の種々の代替形態を用いることができることが理解されるべきである。本発明の範囲を規定するのは、以下の特許請求の範囲であり、それら請求項の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの等価物が、それにより包含されることが意図されている。
【図１Ａ】
2020506681.tif 000173
【図１Ｂ】
2020506681.tif 000174
【図２】
2020506681.tif 000175
【図３】
2020506681.tif 000176
【図４Ａ】
2020506681.tif 000177
【図４Ｂ】
2020506681.tif 000178
【図４ＣＤ】
2020506681.tif 000179
【図５】
2020506681.tif 000180
【図６】
2020506681.tif 000181
【図７】
2020506681.tif 000182
【図８】
2020506681.tif 000183
【図９】
2020506681.tif 000184
【図１０ＡＢ】
2020506681.tif 000185
【図１０Ｃ】
2020506681.tif 000186
【図１１】
2020506681.tif 000187
【図１２】
2020506681.tif 000188
【図１３】
2020506681.tif 000189
【図１４Ａ】
2020506681.tif 000190
【図１４Ｂ】
2020506681.tif 000191
【図１４Ｃ】
2020506681.tif 000192
【図１５Ａ】
2020506681.tif 000193
【図１５Ｂ】
2020506681.tif 000194
【図１６Ａ】
2020506681.tif 000195
【図１６Ｂ】
2020506681.tif 000196
【図１６Ｃ】
2020506681.tif 000197
【図１７Ａ】
2020506681.tif 000198
【図１７Ｂ】
2020506681.tif 000199
【図１７Ｃ】
2020506681.tif 000200
【図１８】
2020506681.tif 000201
【図１９】
2020506681.tif 000202
【図２０】
2020506681.tif 000203
【図２１】
2020506681.tif 000204
【図２２】
2020506681.tif 000205
【図２３】
2020506681.tif 000206
【図２４】
2020506681.tif 000207
【図２５】
2020506681.tif 000208
【図２６】
2020506681.tif 000209
【図２７】
2020506681.tif 000210
【図２８】
2020506681.tif 000211
【図２９】
2020506681.tif 000212
【図３０】
2020506681.tif 000213
【図３１】
2020506681.tif 000214
【図３２】
2020506681.tif 000215
【図３３】
2020506681.tif 000216
【図３４】
2020506681.tif 000217
【図３５】
2020506681.tif 000218
【図３６】
2020506681.tif 000219
【図３７】
2020506681.tif 000220
【図３８】
2020506681.tif 000221
【図３９】
2020506681.tif 000222
【図４０】
2020506681.tif 000223
【図４１】
2020506681.tif 000224
【配列表】
2020506681000001.app
【国際調査報告】
2020506681.tif 000225