(57)【要約】  本発明は、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質およびその使用を提供し、具体的に、本発明は、シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７における重要部位に対して改造した後、ＰＰＤ収量およびＰＰＤ／ＤＭ比率を顕著に向上させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質であって、
前記突然変異タンパク質は非天然タンパク質であり、かつ、前記突然変異タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有しており、かつ、前記突然変異タンパク質は野生型のシトクロムＰ４５０の配列番号１に対応し、
９１番目のプロリン（Ｐ）、
８７番目のロイシン（Ｌ）、
２３５番目のリジン（Ｋ）、
３４９番目のリジン（Ｋ）、
３６６番目のバリン（Ｖ）、
２３１番目のアスパラギン（Ｎ）、
２８５番目のセリン（Ｓ）、
１１３番目のグルタミン（Ｑ）、
１８番目のロイシン（Ｌ）、ならびに／あるいは、
１〜４番目における１、２、３、または４個のアミノ酸の欠失
からなる群から選ばれる一つまたは複数の酵素触媒活性に関連するコアアミノ酸で突然変異していることを特徴とする、前記突然変異タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異タンパク質をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含むか、あるいは、そのゲノムに請求項２に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を生成する方法であって、
発現に適切な条件において、請求項４に記載の宿主細胞を培養することによって、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を発現させる工程と、
前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を単離する工程
とを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を含むことを特徴とする、酵素製剤。
【請求項７】
プロトパナキサジオールを製造する方法であって、
（ｉ）請求項１に記載のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を反応基質と接触させ、触媒反応を行うことによって、前記プロトパナキサジオールを得る工程と、
（ｉｉ）任意に、前記プロトパナキサジオールを単離・精製する工程
とを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の突然変異タンパク質の使用であって、ダンマレンジオール（ＤＭ）からプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）への生成、またはダンマレンジオール（ＤＭ）からプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）への生成を触媒する触媒製剤の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項９】
請求項１に記載の突然変異タンパク質または請求項４に記載の宿主細胞の使用であって、プロトパナキサジオール（ＰＰＤ）の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項１０】
遺伝子組み換え植物を生成する方法であって、植物細胞である請求項４に記載の宿主細胞を、植物に再生させる工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術および植物生物学、天然産物薬物の分野に関し、具体的に、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジンセノサイドは、ウコギ科トチバニンジン属の植物（たとえばオタネニンジン、サンシチニンジン、アメリカニンジンなど）おける主要活性物質で、近年、ウリ科植物のアマチャヅルにもジンセノサイドが少し発見された。現在、国内外の科学者は既にオタネニンジン、アマチャヅルなどの植物から１００種類以上のジンセノサイドが単離され、これらのジンセノサイドはオタネニンジンにおける含有量が大きく異なる。中では、一部の治療効果が顕著なトリテルペノイドサポニンは天然の全サポニンにおける含有量が非常に低く（希少サポニンとも呼ばれる）、抽出のコストが高いため、非常に高価である。現在、多くのサポニンが既に臨床に使用され、たとえばジンセノサイドＲｇ３単量体を主要成分とする薬物である参一カプセルは主要患者の気虚症状を改善し、生体の免疫機能を向上させることができる。ジンセノサイドＲｈ２単量体を主要成分とする今幸カプセルは生体の免疫力を向上させ、抗病力を増強するための健康薬品である。
【０００３】
希少ジンセノサイドは、通常、独特な生物活性またはより顕著な治療効果を有するため、従来の希少ジンセノサイドの製造はいずれもオタネニンジンやサンシチニンジンから抽出された大量のサポニンから化学加水分解法、酵素法による加水分解および微生物法による加水分解によって製造する。野生のジンセン資源はほぼなくなり、ジンセン全サポニン資源は現在主にオタネニンジンやサンシチニンジンの人工栽培に依頼するが、その人工栽培の成長周期が長く（一般的に５〜７年以上が必要）、そして地域の制限もあり、また病虫害が多くて大量の農薬の施用が必要であるため、オタネニンジンやサンシチニンジンの人工栽培は深刻な連作障害があり（オタネニンジンやサンシチニンジンの栽培地は連作障害を克服するには５〜１５年以上の休耕が必要である）、よってジンセノサイドの生産量、品質および安全性はいずれもチャレンジに直面している。一方、ジンセン全サポニンを原料として単一成分のサポニンを製造する場合、全サポニンに目的のジンセノサイド単量体（たとえばプロトパナキサトリオール型サポニン）に変換できない成分も大量にあって利用されず、資源の浪費のみならず、さらに抽出・精製のコストも増加する。
【０００４】
合成生物学の発展は植物由来の天然産物の異種合成に新たなチャンスをもたらした。酵素を基盤に、代謝経路の構築と最適化によって、安価の単糖からアルテミシン酸またはジヒドロアルテミシン酸を発酵合成し、続いてさらにワンステップの化学変換の方法によってアルテミシニンを生産することが既に実現され、これは合成生物学は天然産物の薬物合成において大きな可能性があることを示す。酵素基盤細胞を利用して合成生物学の方法によって希少ジンセノサイド単量体を異種合成し、原料は安価の単糖で、製造過程は安全性が制御可能な発酵過程で、あらゆる外来の汚染（たとえば、原料植物の人工栽培時使用される農薬）が避けられるため、合成生物学の技術によって希少ジンセノサイド単量体を製造するのは、コストの優勢のみならず、完成品の品質と安全性も保証できる。合成生物学の技術によって十分な量の様々な高純度の希少ジンセノサイド単量体を製造し、活性測定および臨床実験に使用し、希少ジンセノサイドの新薬の研究・開発を促進する。
【０００５】
合成生物学の方法によって薬用活性を有するジンセノサイドを人工合成するには、まず、プロトパナキサジオールＰＰＤの合成代謝経路を解析・再構築する必要がある。ジンセノサイドはトリテルペン化合物に属し、植物におけるＭＶＡおよびＭＥＰ代謝経路はテルペン系化合物の共通の前駆体であるＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを提供し、トリテルペン化合物の前駆体であるスクアレンおよび２，３−エポキシスクアレンの合成の基礎となるが、現在のシトクロムＰ４５０タンパク質のダンマレンジオールからプロトパナキサジオールへの合成に対する触媒活性が低く、微生物細胞工場でＰＰＤを生産する場合、律速ステップとなり、ＰＰＤの生産量の向上を制限するのみならず、中間産物ＤＭの蓄積にもつながる。
【０００６】
そのため、本分野では、シトクロムＰ４５０をさらに研究・改造することによって、より効率的なシトクロムＰ４５０タンパク質エレメントを得ることで、ジンセノサイドの細胞工場の合成効率を促進することが必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を提供し、前記の突然変異タンパク質を使用することによって、非常に高いＰＰＤ生産量およびＰＰＤ／ＤＭ比が得られる。
【０００８】
本発明の第一の側面では、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質であって、前記の突然変異タンパク質は非天然タンパク質で、かつ前記突然変異タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有し、そして前記突然変異タンパク質は野生型のシトクロムＰ４５０の配列番号１に対応する、からなる群から選ばれる一つまたは複数の酵素触媒活性に関連するコアアミノ酸で突然変異し、
９１番目のプロリン（Ｐ）、
８７番目のロイシン（Ｌ）、
２３５番目のリジン（Ｋ）、
３４９番目のリジン（Ｋ）、
３６６番目のバリン（Ｖ）、
２３１番目のアスパラギン（Ｎ）、
２８５番目のセリン（Ｓ）、
１１３番目のグルタミン（Ｑ）、
１８番目のロイシン（Ｌ）、ならびに／あるいは、
１〜４番目における１、２、３、または４個のアミノ酸が欠失した、
タンパク質を提供する。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記突然変異タンパク質は、以下の群から選ばれる一つまたは複数のアミノ酸が欠失した：
１番目のメチオニン（Ｍ）、
２番目のアラニン（Ａ）、
３番目のアラニン（Ａ）、
４番目のアラニン（Ａ）。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異タンパク質は、配列番号１における１〜４番目が欠失し、かつ１８番目のロイシン（Ｌ）が突然変異した。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異タンパク質は、配列番号１における１〜４番目が欠失し、かつ１８番目のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異した。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記８７番目のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異し、および／または、
２３５番目のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に突然変異し、および／または、
３４９番目のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に突然変異し、および／または、
３６６番目のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異し、および／または、
２３１番目のアスパラギン（Ｎ）がチロシン（Ｙ）に突然変異し、および／または、
２８５番目のセリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）に突然変異し、および／または、
９１番目のプロリン（Ｐ）がヒスチジン（Ｈ）に突然変異し、および／または、
１１３番目のグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）に突然変異し、および／または、
１８番目のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異した。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記の突然変異は、Ｌ８７Ｉ、Ｋ２３５Ｒ、Ｋ３４９ＲおよびＶ３６６Ｉ、Ｎ２３１ＹおよびＳ２８５Ｃ、Ｐ９１Ｈ、Ｑ１１３Ｒからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２〜８で示される。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異タンパク質は、前記突然変異（たとえば８７、２３５、３４９、３６６、２３１、２８５、９１、１１３、１８、および／または１〜４番目のアミノ酸）以外、ほかのアミノ酸配列は配列番号１で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記のほぼ同様とは、多くとも５０個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が相違し、ここで、前記の相違はアミノ酸の置換、欠失または付加を含み、かつ前記の突然変異タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有するままである。
【００１２】
もう一つの好適な例において、配列番号１で示される配列との相同性は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％で、かつ相同性は≦４８５／４８６または９９．７９％である。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質は、ダンマレンジオール（ＤＭ）を反応させてプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）を生成するのを触媒する。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質は、ダンマレンジオール（ＤＭ）のＣ１２部位をヒドロキシ化させ、プロトパナキサジオール（ＰＰＤ）を生成するのを触媒する。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質は、以下のような反応を触媒する。
【化１】
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【００１４】
もう一つの好適な例において、前記方法は、
（ｉ）反応系のｐＨは５．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０、より好ましくは７．４〜７．５であること、
（ｉｉ）反応温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは２６〜３３℃、最も好ましくは３０℃であること、
（ｉｉｉ）反応時間は０．５ｈ〜３６ｈ、好ましくは２ｈ〜１２ｈ、より好ましくは２ｈ〜３ｈであること、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質は、ダンマレンジオール（ＤＭ）からプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）への生成に対する触媒活性が野生型Ｐ４５０（配列番号１）の１２５〜２５０％である。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質は、
（ａ）野生型のシトクロムＰ４５０タンパク質と比べ、触媒で得られるプロトパナキサジオール収量／ダンマレンジオール（ＰＰＤ／ＤＭ）の比は≧２０％、好ましくは２３〜２５０％、より好ましくは２５〜２５０％または３０〜２００％であること、
（ｂ）野生型のシトクロムＰ４５０タンパク質と比べ、触媒で得られるプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）の収量（ｍｇ／Ｌ）は≧３００、好ましくは３０３〜６００、より好ましくは３０５〜５００であること、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の特徴を有する。
【００１６】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは、
（ａ）  配列番号２〜８のいずれかで示されるペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）  配列番号１５〜２１のいずれかで示されるポリヌクレオチド、
（ｃ）  ヌクレオチド配列と配列番号１５〜２１のいずれかで示される配列との相同性が≧９５％（好ましくは≧９８％）で、かつ配列番号１または２〜８のいずれかで示されるペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれる。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質の横に、さらに、シグナルペプチド、分泌ペプチド、タグ配列（たとえば６Ｈｉｓ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる補助エレメントを含有する。
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１８】
本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ベクターは、発現ベクター、シャトルベクター、組込みベクターを含む。
【００１９】
本発明の第三の側面では、本発明の第三の側面に記載のベクターを含むか、あるいはそのゲノムに本発明の第二の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は真核細胞で、たとえば酵母細胞または植物細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞で、たとえば大腸菌である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、オタネニンジン細胞である。
【００２０】
本発明の第五の側面では、本発明の第一の側面に記載のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を生成する方法であって、
発現に適切な条件において、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞を培養することによって、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を発現させる工程と、
前記シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を単離する工程と、
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を含む酵素製剤を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の酵素製剤は、注射剤、および／または凍結乾燥製剤を含む。
【００２２】
本発明の第七の側面では、プロトパナキサジオールを製造する方法であって、
（ｉ）本発明の第一の側面に記載のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質を反応基質と接触させ、触媒反応を行うことによって、前記プロトパナキサジオールを得る工程と、
（ｉｉ）任意に、前記プロトパナキサジオールを単離・精製する工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記反応基質は、ダンマレンジオールである。
もう一つの好適な例において、工程（ｉ）では、前記触媒反応の時間は０．５ｈ〜３６ｈ、好ましくは２ｈ〜１２ｈ、より好ましくは２ｈ〜３ｈである。
もう一つの好適な例において、工程（ｉ）では、前記触媒反応の温度は、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは２６〜３３℃、最も好ましくは３０℃である。
【００２３】
本発明の第八の側面では、ダンマレンジオール（ＤＭ）からプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）への生成、またはダンマレンジオール（ＤＭ）からプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）への生成を触媒する触媒製剤の製造のための本発明の第一の側面に記載の突然変異タンパク質の使用を提供する。
【００２４】
本発明の第九の側面では、本発明の第一の側面に記載の突然変異タンパク質または本発明に記載の宿主細胞の使用であって、プロトパナキサジオール（ＰＰＤ）の製造に使用されることを特徴とする使用を提供する。
【００２５】
本発明の第十の側面では、遺伝子組み換え植物を生成する方法であって、植物細胞である、本発明の第四に記載の宿主細胞を植物に再生させる工程を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明の第十一の側面では、突然変異したプロモーター配列であって、野生型Ｐ４５０プロモーター（配列番号９）と比べ、Ｐ４５０タンパク質の転写活性が少なくとも３０％（たとえば４０〜１００％）向上したものを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のプロモーターの配列は、配列番号１０〜１３のいずれかで示される配列である。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記突然変異プロモーターはプロモーター１Ｄ１で、Ｐ４５０タンパク質の発現量を顕著に向上させることができ、
前記突然変異プロモーターは転写強度に関連する以下のコアヌクレオチドを有し、
２８番目のヌクレオチドＴが欠失し、
４１７番目のヌクレオチドがＧで、
４４５番目のヌクレオチドがＧで、
６５４番目のヌクレオチドがＡで、
６５５番目のヌクレオチドがＡで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号９で示される配列に基づくものである。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記突然変異したプロモーター１Ｄ１は転写強度に関連する以下のコアヌクレオチドを有し、
４１７番目のヌクレオチドがＧで、
４４５番目のヌクレオチドがＧで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号９で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター１Ｄ１は、４１７および４４５番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号９で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター１Ｄ１は配列番号１０で示される配列を有する。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記突然変異したプロモーターはプロモーター９Ｃ１−２で、転写強度に関連する以下のコアヌクレオチドを有し、
２８番目のヌクレオチドＴが欠失し、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号９で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター９Ｃ１−２は、２８番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号９で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター９Ｃ１−２は配列番号１１で示される配列を有する。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記突然変異したプロモーターはプロモーター１１Ｂ５で、転写強度に関連する以下のコアヌクレオチドを有し、
６５４番目のヌクレオチドがＡで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号９で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター１１Ｂ５は、６５４番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号９で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター１１Ｂ５は配列番号１２で示される配列を有する。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記突然変異したプロモーターはプロモーター１５Ｆ１で、転写強度に関連する以下のコアヌクレオチドを有し、
６５５番目のヌクレオチドがＡで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号９で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター１５Ｆ１は、６５５番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号９で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター１５Ｆ１は配列番号１３で示される配列を有する。
【００３２】
本発明の第十二の側面では、本発明の上記のプロモーター、および前記プロモーターの操作性に関連する本発明に記載の本発明のＰ４５０の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する、発現カセットを提供する。
【００３３】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ダンマレンジオールを生産する組換え出芽酵母菌株ＷＰ８を示す構築概略図である。
【図２】図２は、野生型と１Ｇ４、２Ｄ８、３Ｂ９、８Ｇ７、９Ｃ１、１６Ｆ８および２４Ａ１０の突然変異体菌株ＰＰＤ／ＤＭを示す縦棒グラフである。
【図３】図３は、プロトパナキサジオールを生産する組換え出芽酵母菌株のＨＰＬＣ検出を示す図である。
【図４】図４は、プロトパナキサジオールを生産する組換え出芽酵母菌株の収量を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究し、大量の選別によって、意外に、シトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質の触媒活性を顕著に向上できる重要アミノ酸部位を見つけた。本発明者は、シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７における重要部位に対して改造した後、ＰＰＤ収量およびＰＰＤ／ＤＭ比率を顕著に向上させることができることを見出した。また、本発明者は、さらに、野生型のシトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７の１番目〜４番目のアミノ酸が欠失し、同時にその一つの重要部位（たとえば１８番目のアミノ酸）が突然変異すると、その触媒活性が顕著に向上し、具体的に、ＰＰＤ／ＤＭの比率が１２５．６％まで向上すると表れることを見出した。
【００３６】
また、本発明者は、ダンマレンジオールＤＭを合成する出芽酵母基盤細胞ＷＰ８を構築し、そしてStratagene社のGeneMorph II Random Mutagenesis Kitランダム突然変異キットを使用することによって、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ７１６Ａ４７）の突然変異体ライブラリーを得、そして出芽酵母基盤細胞ＷＰ８を形質転換させ、一つの単コピーを酵母ゲノムに挿入してプロトパナキサジオールＰＰＤを合成するＣＹＰ７１６Ａ４７酵母突然変異体ライブラリーを構築した。これに基づき、本発明を完成させた。
【００３７】
用語
本明細書で用いられるように、用語「ＡｘｘＢ」とはｘｘ番目のアミノ酸Ａがアミノ酸Ｂに変わることを表し、たとえば「Ｌ８７Ｉ」とは８７番目のアミノ酸ＬがＩに突然変異することを表し、ほかも同じように表記する。
【００３８】
本発明の突然変異タンパク質およびそのコード核酸
本明細書で用いられるように、用語「突然変異タンパク質」、「本発明の突然変異タンパク質」、「本発明のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質」は入れ替えて使用することができ、いずれも非天然のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質で、かつ前記突然変異タンパク質は配列番号１で示されるタンパク質を人工的に改造したタンパク質で、ここで、前記の突然変異タンパク質は酵素の触媒活性に関連するコアアミノ酸を含有し、かつ前記コアアミノ酸のうち、少なくとも一つが人工的に改造され、そして本発明の突然変異タンパク質はダンマレンジオールＤＭのＣ１２がヒドロキシ化してプロトパナキサジオールＰＰＤになるのを触媒する酵素活性を有する。
【００３９】
用語「コアアミノ酸」とは配列番号１に基づいたもので、かつ配列番号１との相同性が少なくとも８０％、たとえば８４％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％に達する配列において、対応する部位は本明細書に記載の特定のアミノ酸で、たとえば配列番号１で示される配列に基づき、コアアミノ酸は、
９１番目のプロリン（Ｐ）、
８７番目のロイシン（Ｌ）、
２３５番目のリジン（Ｋ）、
３４９番目のリジン（Ｋ）、
３６６番目のバリン（Ｖ）、
２３１番目のアスパラギン（Ｎ）、
２８５番目のセリン（Ｓ）、
１１３番目のグルタミン（Ｑ）、
１８番目のロイシン（Ｌ）、ならびに／あるいは、
１〜４番目における１、２、３、または４個のアミノ酸の欠失であり、かつ上記コアアミノ酸を突然変異させて得た突然変異タンパク質または前記１〜４番目のアミノ酸を欠失させて得た突然変異タンパク質はダンマレンジオールＤＭのＣ１２がヒドロキシ化してプロトパナキサジオールＰＰＤになるのを触媒する酵素活性を有する。
【００４０】
好ましくは、本発明において、本発明の前記コアアミノ酸に対して以下の突然変異をさせた：
８７番目のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異し、および／または、
２３５番目のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に突然変異し、および／または、
３４９番目のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に突然変異し、および／または、
３６６番目のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異し、および／または、
２３１番目のアスパラギン（Ｎ）がチロシン（Ｙ）に突然変異し、および／または、
２８５番目のセリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）に突然変異し、および／または、
９１番目のプロリン（Ｐ）がヒスチジン（Ｈ）に突然変異し、および／または、
１１３番目のグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）に突然変異し、および／または、
１８番目のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に突然変異した。
【００４１】
もちろん、本発明の突然変異タンパク質におけるアミノ酸の番号は配列番号１に基づくもので、ある具体的な突然変異タンパク質と配列番号１で示される配列の相同性が８０％またはそれ以上に達する場合、突然変異タンパク質のアミノ酸の番号は配列番号１のアミノ酸とずれ、たとえばアミノ酸のＮ末端またはＣ末端の方向に１〜５番ずれることがあるが、本分野の通常の配列アライメント技術によって、当業者にはこのようなずれが合理的な範囲内にあることがわかり、かつアミノ酸の番号のずれで、相同性が８０％（たとえば９０％、９５％、９８％）に達する、同様または類似のプロトパナキサジオールＰＰＤを生成する触媒活性を有する突然変異タンパク質が本発明の突然変異の範囲内に入らないことはない。
【００４２】
本発明の突然変異タンパク質は、合成タンパク質または組換えタンパク質で、すなわち、化学合成の産物でもよく、あるいは組換え技術で原核または真核宿主（たとえば、細菌、酵母、植物）から生成するものでもよい。組み換え生産プロセスで用いられる宿主にによって、本発明の突然変異タンパク質は、グリコシル化されたものでもよく、又はグリコシル化されていないものでもよい。また、本発明の突然変異タンパク質は、開始のメチオニン残基を含有してもよく、含有しなくてもよい。
【００４３】
本発明は、さらに、前記突然変異タンパク質の断片、誘導体および類似物を含む。本明細書で用いられるように、用語の「断片」、「誘導体」および「類似物」とは、実質的に前記突然変異タンパク質と同じ生物学的機能または活性を維持するタンパク質である。
本発明の突然変異タンパク質の断片、誘導体や類似物は、（ｉ）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換された突然変異タンパク質でもよく、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、または（ｉｉ）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基がある突然変異タンパク質でもよく、または（ｉｉｉ）成熟の突然変異タンパク質と他の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールような突然変異タンパク質の半減期を延ばす化合物）と融合した突然変異タンパク質でもよく、または（ｉｖ）付加のアミノ酸配列がこの突然変異タンパク質に融合した突然変異タンパク質（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこの突然変異タンパク質を精製するための配列または蛋白質前駆体配列、あるいは抗原ＩｇＧ断片と形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。本発明において、保存的に置き換えたアミノ酸は、表Ｉのようにアミノ酸の置き換えを行って生成することが好ましい。
【００４４】
【表１】
2020513843.tif 000003
【００４５】
本発明の活性突然変異タンパク質は、ダンマレンジオールＤＭのＣ１２がヒドロキシ化してプロトパナキサジオールＰＰＤになるのを触媒する酵素活性を有する。
好ましくは、前記の突然変異タンパク質は配列番号２〜８で示される。もちろん、本発明の突然変異タンパク質は配列番号２〜８で示される配列と比べ、通常、高い相同性を有し、好ましくは、前記の突然変異タンパク質と配列番号２〜８で示される配列との相同性は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％〜９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％で、最も好ましくは≧４８５／４８６（９９．７９％）である。
【００４６】
また、本発明の突然変異タンパク質を修飾してもよい。修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外の突然変異タンパク質の化学的に誘導された形態、たとえばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、たとえば突然変異タンパク質の合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行った突然変異タンパク質も含む。このような修飾は、突然変異タンパク質をグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（たとえばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させた突然変異タンパク質または溶解性を改善した突然変異タンパク質を含む。
【００４７】
用語「突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
本発明は、さらに、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは突然変異タンパク質の断片、類似物および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの代替形態で、１つまたは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入でもよいが、実質的にコードする突然変異タンパク質の機能を変えることはない。
【００４８】
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、たとえば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上のときだけハイブリダイズすることである。
【００４９】
本発明の突然変異タンパク質およびポリヌクレオチドは、好ましくは分離された形態で提供し、より好ましくは均質に精製される。
本発明のポリヌクレオチドの全長配列は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。ＰＣＲ増幅法について、本発明で公開された関連のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、２回または２回以上のＰＣＲ増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。
【００５０】
関連の配列を獲得すれば、組換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
【００５１】
現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドを得るには、ＰＣＲ技術でＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法が好適に使用される。特にライブラリーから全長のｃＤＮＡを得ることが困難な場合、好適にＲＡＣＥ法（ＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ末端快速増幅法）を使用し、ＰＣＲに使用されるプライマーはここで公開された本発明の配列情報によって適切に選択し、かつ通常の方法で合成することができる。通常の方法、たとえばゲル電気泳動によって増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ断片を分離、精製することができる。
【００５３】
野生型シトクロムＰ４５０
本明細書で用いられるように、「野生型シトクロムＰ４５０」とは、天然に存在する、人工的に改造されていないシトクロムＰ４５０で、そのヌクレオチドは遺伝子工学技術、たとえばゲノムシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ、そのアミノ酸配列はヌクレオチド配列から推測することができる。前記野生型シトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は配列番号１で示される。
上記に係る野生タンパク質、本発明の突然変異タンパク質の配列情報は表２（実施例を参照）に示す。
【００５４】
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたは本発明の突然変異タンパク質コード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞、ならびに組み換え技術によって本発明に係るポリペプチドを生成する方法にも関する。
通常の組み換えＤＮＡ技術によって、本発明のポリヌクレオチド配列で組み換えの突然変異タンパク質を発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む。
（１）本発明の本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド（または変異体）を使用し、あるいはこのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
（２）適切な培地において宿主細胞を培養する。
（３）培地または細胞からタンパク質を分離し、精製する。
【００５５】
本発明において、突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクターに挿入してもよい。用語「組換え発現ベクター」とは、本分野でよく知られている細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルスまたはほかのベクターである。宿主体内で安定して複製することができれば、どんなプラスミドおよびベクターでも使用できる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御エレメントを含むことである。
【００５６】
本発明の突然変異タンパク質のコードＤＮＡ配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築に当業者によく知られている方法を使用することができる。これらの方法は、体外組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、体内組換え技術などを含む。前記のＤＮＡ配列は、有効に発現ベクターにおける適切なプロモーターに連結し、ｍＲＮＡ合成を指導することができる。これらのプロモーターの代表的な例として、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、λファージのＰＬプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーターを含む真核プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲｓやほかの既知の制御可能な遺伝子の原核または真核細胞あるいはそのウイルスにおける発現されるプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、さらに、翻訳開始用リボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含む。
【００５７】
また、発現ベクターは、好ましくは１つまたは２つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、たとえば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、あるいは大腸菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供する。
【００５８】
上記の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現するようにすることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、植物細胞（たとえばオタネニンジン細胞）がある。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞において発現される場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入すると転写が強化される。エンハンサーは、ＤＮＡのシスエレメントで、通常、約１０〜３００ｂｐで、プロモーターに作用して遺伝子の転写を強化する。例を挙げると、複製起点の後期側にある１００〜２７０ｂｐのＳＶ４０エンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどを含む。
当業者は、どうやって適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞を選択するか、よくわかる。
【００６０】
ＤＮＡ組換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行っても良い。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。
【００６１】
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
【００６２】
上記の方法における組換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の分離方法で組換えタンパク質を分離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の各種の液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（ｉ）大量の選別と改造を経て、本発明は、初めて、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ７１６Ａ４７）の触媒活性部位およびそのプロモーターの重要部位を見出し、関連部位を改造すると、シトクロムＰ４５０の触媒活性と発現量が顕著に向上し、かつＰＰＤ収量とＰＰＤ／ＤＭ比率が顕著に向上する。
（ｉｉ）本発明は、初めて、野生型のシトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７の１番目〜４番目のアミノ酸が欠失し、同時にその一つの重要部位（たとえば１８番目のアミノ酸）が突然変異すると、その触媒活性が顕著に向上し、具体的に、ＰＰＤ／ＤＭの比率が１２５．６％まで向上すると表れることを見出した。
（ｉｉｉ）本発明は、また、野生型のシトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７のほかの部位、たとえば２３５／３４９／３６６／２３１／２８５／９１／１１３番目などの部位の一つまたは複数のアミノ酸を突然変異させると、その触媒活性が顕著に向上し、具体的に、ＰＰＤ／ＤＭの比率が２６．１〜８０．２％向上すると表れることを見出した。
【００６４】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９）  に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
特に説明しない限り、本発明の実施例における試薬および材料はいずれも市販品である。
【実施例】
【００６５】
実施例１  ダンマレンジオールを生産する組換え出芽酵母菌株の構築
シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７のライブラリーを選別するため、本発明では、まず、プロトパナキサジオールの前駆体化合物であるダンマレンジオールを生産する出芽酵母基盤細胞を１株構築した。
野生型出芽酵母にダンマレンジオール合成酵素遺伝子ＰｇＤＤＳを導入し、出芽酵母自身のメバロン酸経路によって合成された２，３−エポキシスクアレンでダンマレンジオールを合成することができる。合成の律速ステップの最適化、前駆体の供給の最適化などを含む人工的に構築されたダンマレンジオール合成経路に対する最適化によって高収率でダンマレンジオールを生産する出芽酵母菌株ＷＰ８を出芽酵母基盤細胞として得たが、図１に示す。
【００６６】
実施例２  定向進化による効率的なシトクロムＰ４５０の突然変異体タンパク質の獲得
（１）シトクロムＰ４５０遺伝子配列（ｏｐｔＰＰＤＳと名づけ、配列番号１４で、配列番号１をコードするアミノ酸配列）を鋳型とし、プライマーＥＰ−１（５’’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＴ−３’’（配列番号２２））およびＥＰ−２（５’’−ＧＴＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴ−３’’  （配列番号２３）を使用してエラープローンＰＣＲを行った。前記エラープローンＰＣＲはStratagene社のGeneMorph II Random Mutagenesis Kitランダム突然変異キットを使用した。ＰＣＲプログラムは、９５℃  ２ｍｉｎで、９５℃  １０ｓ、５５℃  １５ｓ、７２℃  ２ｍｉｎの計２８サイクルで、７２℃  １０ｍｉｎ後、１０℃に降温させ、鋳型の使用量は５０ｎｇであった。ＰＣＲ産物にアガロースゲル電気泳動を行った後、得られたシトクロムＰ４５０をエラープローンＰＣＲ産物として得た。
（２）出芽酵母ゲノムを鋳型とし、分子クローニングの通常の方法における酢酸リチウム転換方法によって工程（１）におけるエラープローンＰＣＲ産物を実施例１で製造された出芽酵母基盤細胞を導入し、形質転換産物（すんわち形質転換体）を得た。
【００６７】
（３）形質転換産物を均一にＹＰＤ＋２００ｍｇ／Ｌ  Ｇ４１８抗生物質選別プレートに塗布し、３０℃で静置して２〜３日培養した。すべてのクローンを爪楊枝で取って９６ウェルプレートに接種し、３０℃で１日振とう培養し、新しい９６ウェルプレートに移して４日発酵させた。発酵液に等体積のｎ−ブタノール溶媒を入れて１ｈ抽出し、上層の有機相を吸い取ってＨＰＬＣを行って各形質転換体のダンマレンジオールおよびプロトパナキサジオールの収量およびその比率を検出した。
（４）２４枚の９６ウェルプレートに対する選別によって、プロトパナキサジオールの収量／ダンマレンジオールの比率（ＰＰＤ／ＤＭ）が２０％以上向上したクローンを計７つ得たが、番号はそれぞれ１Ｇ４、２Ｄ８、３Ｂ９、８Ｇ７、９Ｃ１、１６Ｆ８および２４Ａ１０である。それぞれ各クローンのゲノムを鋳型とし、プライマーＥＰ−１およびＥＰ−２でＰＣＲを行って各クローンのシトクロムＰ４５０の断片を得、シークエンシングを行うことによって、各突然変異体のヌクレオチド配列およびタンパク質配列を得た。
上記で得られた各野生型および突然変異体のタンパク質配列の情報およびＰＰＤ／ＤＭは図２および表２に示す。
【表２】
2020513843.tif 000004
【００６８】
（５）シトクロムＰ４５０突然変異体ライブラリーに対する選別の過程において、さらに選別して一連の突然変異プロモーター配列を得、これらの突然変異したプロモーター配列はシトクロムＰ４５０の発現量の向上によるプロトパナキサジオールの合成効率および収量の向上に有利である。プロトパナキサジオールの収量／ダンマレンジオールの比率（ＰＰＤ／ＤＭ）が２０％以上向上したクローンを計４つ得たが、番号はそれぞれ１Ｄ１、９Ｃ１−２、１１Ｂ５および１５Ｆ１である。それぞれ１Ｄ１、９Ｃ１−２、１１Ｂ５および１５Ｆ１のクローンのゲノムを鋳型とし、プライマーでＰＣＲを行って各クローンのプロモーター断片を得、シークエンシングを行うことによって、突然変異プロモーターのヌクレオチド配列を得た。
【００６９】
上記で得られた各野生型および突然変異プロモーターのヌクレオチド配列の情報およびＰＰＤ／ＤＭは表３に示す。
【表３】
2020513843.tif 000005
【００７０】
前記結果から、これらの突然変異したプロモーターはさらに野生型Ｐ４５０タンパク質の発現量を向上させることによって、プロトパナキサジオールの収量／ダンマレンジオールの比率を向上させることが示された。また、これらの突然変異したプロモーターは、本発明のＰ４５０の突然変異タンパク質のコード配列と併用することによって、プロトパナキサジオールの収量／ダンマレンジオールの比率をさらに向上させることができる。
【００７１】
実施例３  前記シトクロムＰ４５０の突然変異体タンパク質によるプロトパナキサジオールの効率的な異種合成
（１）出芽酵母ゲノムを鋳型とし、実施例１の方法によって、配列番号１４で出芽酵母菌株ＷＰ８を形質転換させ、プロトパナキサジオールを生産する組換え出芽酵母菌株ＷＰ８−ＷＴを得た。
（２）野生型ｏｐｔＰＰＤＳ遺伝子の代わりに、同じようにそれぞれ突然変異体の遺伝子１Ｇ４、２Ｄ８、３Ｂ９、８Ｇ７、９Ｃ１、１６Ｆ８および２４Ａ１０（ヌクレオチド配列は配列番号１５〜２１で、対応するアミノ酸配列は配列番号２〜８）を鋳型とした。上記ＰＣＲで各ＰＣＲ断片を得、それぞれ出芽酵母菌株ＷＰ８を形質転換させ、各突然変異体タンパク質を含有する、プロトパナキサジオールを生産する組換え出芽酵母菌株ＷＰ８−１Ｇ４、ＷＰ８−２Ｄ８、ＷＰ８−３Ｂ９、ＷＰ８−８Ｇ７、ＷＰ８−９Ｃ１、ＷＰ８−１６Ｆ８およびＷＰ８−２４Ａ１０を得た。
【００７２】
（３）固体培地の調製：培地：１％ Yeast Extract（酵母エキス）、２％ Peptone（ペプトン）、２％ Dextrose（デキストロース）（グルコース）、２％寒天粉を調製した。
液体培地の調製：培地：１％ Yeast Extract（酵母エキス）、２％ Peptone（ペプトン）、２％ Dextrose（デキストロース）（グルコース）を調製した。
固体培地プレートに画線した組換え出芽酵母菌ＷＰ８−１Ｇ４、ＷＰ８−２Ｄ８、ＷＰ８−３Ｂ９、ＷＰ８−８Ｇ７、ＷＰ８−９Ｃ１、ＷＰ８−１６Ｆ８およびＷＰ８−２４Ａ１０を取り、それぞれ５ｍＬ液体培地を含有する試験管に置いて一晩振とう培養し（３０℃、２５０ｒｐｍ、１６ｈ）、遠心で菌体を収集し、１０ｍＬ  液体培地が入った５０ｍＬ三角フラスコに移し、ＯＤ６００が０．０５になるように調整し、３０℃、２５０ｒｐｍで４日振とう培養して発酵産物を得た。本方法は各組換え酵母に対して同時に一つの平行実験を設けた。
【００７３】
ダンマレンジオールおよびプロトパナキサジオールの抽出および検出：１０ｍＬの発酵液から１００μＬの発酵液を吸い取り、Ｆａｓｔｐｒｅｐで振とうして酵母を分解させ、等体積のｎ−ブタノールを入れて抽出した後、真空の条件においてｎ−ブタノールを蒸発させた。１００μＬのメタノールで溶解させた後、ＨＰＬＣによって目的産物であるＰＰＤおよびＤＭの収量を検出した（図３、図４および表４）。
【００７４】
上記で得られた各組換え出芽酵母菌株のプロトパナキサジオールおよびダンマレンジオールの収量は表４に示す。
【表４−１】
2020513843.tif 000006
【表４−２】
2020513843.tif 000007
【００７５】
結果から、野生型のシトクロムＰ４５０と比べ、本発明のシトクロムＰ４５０の突然変異タンパク質は顕著にＰＰＤの収量（最高は４９０ｍｇ／Ｌに達する）およびＰＰＤ／ＤＭの比率（最高は６３％に達する）を向上させることが示された。
【００７６】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
2020513843.tif 000008
【図２】
2020513843.tif 000009
【図３】
2020513843.tif 000010
【図４】
2020513843.tif 000011
【配列表】
2020513843000001.app
【国際調査報告】
2020513843.tif 000012
2020513843.tif 000013
2020513843.tif 000014
2020513843.tif 000015
2020513843.tif 000016
2020513843.tif 000017