(57)【要約】  本明細書で述べる本発明の態様は、導入遺伝子発現用の誘導性プロモーターの作製方法および使用方法に関する。本発明の誘導性プロモーターはNFAT応答配列誘導系に由来するものであり、T細胞の生存および増殖を向上または増強させるために使用される。
2020520922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導性合成プロモーターライブラリーの作製方法であって、
キメラ抗原受容体（CAR）T細胞の活性化により活性化されるプロモーターをスクリーニングして、スクリーニングされたプロモーターを作製する工程；
転写因子応答配列をスクリーニングして、スクリーニングされた転写因子応答配列を作製する工程；
CAR T細胞による転写因子応答配列の活性化により活性化されるプロモーターを含む誘導性合成プロモーターライブラリーを作製する工程；および
スクリーニングされた転写因子応答配列をコードする第１の配列とスクリーニングされたプロモーターをコードする第２の配列を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程
を含む方法。
【請求項２】
誘導性合成プロモーターであって、
転写因子応答配列をコードする第１の配列；および
プロモーター配列をコードする第２の配列を含み、
任意で、配列番号１〜３３の１つ以上を含む、
誘導性合成プロモーター。
【請求項３】
キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である、請求項２に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である、請求項３に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項５】
抗CD3／抗CD28との相互作用によって誘導可能である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項６】
化学物質によって誘導可能である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項７】
前記化学物質がPMAまたはロノマイシンである、請求項６に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項８】
内在性最小IL2プロモーター配列を含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項９】
配列番号１〜３３のいずれか１つで示される配列を含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項１０】
前記転写因子応答配列が、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーター。
【請求項１１】
分子発現用細胞であって、
請求項２〜９のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーター；
分子をコードする遺伝子；および
キメラ抗原受容体をコードする配列
を含むベクターを含む細胞。
【請求項１２】
前記分子が、タンパク質、抗体、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
造血幹細胞である、請求項１１または１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記キメラ抗原受容体がCD19に特異的である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
CD8+またはCD4+である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記分子の発現が誘導性発現である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記キメラ抗原受容体がシグナル伝達ドメインを含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記シグナル伝達ドメインが、第１世代、第２世代または第３世代である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、トランスポゼースを用いたミニサークル、またはナノプラスミドである、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
キメラ抗原受容体（CAR）特異的活性化のためのTCRノックアウト系をさらに含む、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記分子が、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記分子がキメラサイトカイン受容体である、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記キメラサイトカイン受容体が、CCR、PD1キメラおよび／またはmiRNAである、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記CCRが、CD122、CD127またはCD360を含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記PD1キメラが、PD1:CD28、dnSHP1/2またはIL-12を含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記miRNAがmiRNA155を含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法において遺伝子の発現を制御する方法であって、
請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の細胞を提供する工程；および
CAR T細胞療法を必要とする対象に前記細胞を導入する工程
を含む方法。
【請求項２８】
前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子に対する前記対象の反応を監視する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子の発現について前記対象をさらに監視する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記分子が、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、サイトカインまたは抗がん治療薬である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記分子の発現を誘導する工程をさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記誘導が、PMAまたはロノマイシンの投与により行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記誘導工程が、前記対象に前記細胞を投与する前に行われ、前記細胞が投与前に抗CD3／抗CD28ビーズに暴露される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、がんに罹患しているか、またはがんを有するという診断を受けている、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記分子が、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
疾患（たとえば、白血病、乳癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、子宮癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌または甲状腺癌のいずれか１種以上）の緩和、抑制または治療を必要とする対象において、該疾患を緩和、抑制または治療する方法であって、
細胞にベクターを導入することによって、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の誘導性合成プロモーターとキメラ抗原受容体を含む細胞を得る工程；
前記対象に前記細胞を投与する工程；および
分子の発現を誘導する工程
を含む方法。
【請求項３７】
前記細胞が、前記対象から得られたものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子に対する前記対象の反応を監視する工程をさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記分子が、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、サイトカインまたは抗がん治療薬である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記分子の発現を誘導する工程をさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記誘導が、PMAまたはロノマイシンの投与により行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記誘導工程が、前記対象に前記細胞を投与する前に行われ、前記細胞が投与前に抗CD3／抗CD28ビーズに暴露される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が、がんに罹患している、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記分子が、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が、がんの治療法を実施するために選択された対象である、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記がんが、白血病、乳癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、子宮癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌または甲状腺癌である、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年5月17日に出願された米国仮特許出願第62/507,565号に基づく優先権を主張するものである。この出願に開示された内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI.152WO.TXTのファイル名で2018年5月15日に作成された22kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
導入遺伝子発現用の誘導性プロモーターの作製方法および使用方法について述べる。本発明の誘導性プロモーターはNFAT応答配列誘導系に由来するものであり、T細胞の生存および増殖を向上または増強させるために使用される。
【背景技術】
【０００４】
様々な誘導性プロモーターがT細胞療法において使用されている。強いシグナルを示すプロモーターが依然として必要とされており、特に、シグナル／ノイズ比が高く、繰り返し「オン」の状態にすることが可能なプロモーターが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、誘導性合成プロモーターライブラリーの作製方法であって、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞の活性化により活性化されるプロモーターをスクリーニングして、スクリーニングされた一連のプロモーターを作製する工程；転写因子応答配列をスクリーニングして、スクリーニングされた一連の転写因子応答配列を作製する工程；CAR T細胞による転写因子応答配列の活性化により活性化されるプロモーターを含む誘導性合成プロモーターライブラリーを作製する工程；およびスクリーニングされた転写因子応答配列をコードする第１の配列とスクリーニングされたプロモーターをコードする第２の配列を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む方法を提供する。
【０００６】
第２の態様において、誘導性合成プロモーターを提供する。該誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含み、任意で、配列番号１〜３３の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3抗体／抗CD28抗体との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３３のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。
【０００７】
第３の態様において、分子発現用細胞であって、前記実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーター；分子をコードする遺伝子；およびキメラ抗原受容体をコードする配列を含むベクターを含む細胞を提供する。前記誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含んでいてもよく、任意で、配列番号１〜３３の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3抗体／抗CD28抗体との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３３のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体はCD19に特異的である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記分子の発現は誘導性発現である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体（CAR）はシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、第１世代、第２世代または第３世代である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、トランスポゼースを用いたミニサークルまたはナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CAR特異的活性化のためのTCRノックアウト系をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記キメラサイトカイン受容体は、CCR、CASTAT5、PD1キメラおよび／またはmiRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記miRNAはmiRNA155を含む。いくつかの実施形態において、前記CCRは、CD122、CD127またはCD360を含む。いくつかの実施形態において、前記PD1キメラは、PD1:CD28、dnSHP1/2および／またはIL-12を含む。
【０００８】
第４の態様において、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法において遺伝子の発現を制御する方法であって、本発明の実施形態のいずれかに記載の細胞を提供する工程、およびCAR T細胞療法を必要とする対象に前記細胞を導入する工程を含む方法を提供する。前記細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーター；分子をコードする遺伝子；およびキメラ抗原受容体をコードする配列を含むベクターを含む。前記誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含んでいてもよく、任意で、配列番号１〜３３の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3抗体／抗CD28抗体との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３３のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体はCD19に特異的である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記分子の発現は誘導性発現である。いくつかの実施形態において、前記CARはシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、第１世代、第２世代または第３世代である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、トランスポゼースを用いたミニサークルまたはナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CAR特異的活性化のためのTCRノックアウト系をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体（CCR（CD122、CD127およびCD360）など）、CASTAT5、PD1キメラ（PD1:CD28など）、dnSHP1/2、IL-12および／またはmiRNA（miRNA155など）である。いくつかの実施形態において、CAR T細胞療法において遺伝子の発現を制御する前記方法は、前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子に対する前記対象の反応を監視する工程をさらに含む。CAR T細胞療法において遺伝子の発現を制御する前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子の発現について前記対象をさらに監視する。CAR T細胞療法において遺伝子の発現��制御する前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、サイトカインおよび／または抗がん治療薬である。CAR T細胞療法において遺伝子の発現を制御する前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記分子の発現を誘導する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導は、PMAまたはロノマイシンの投与により行われる。いくつかの実施形態において、前記誘導工程は、前記対象に前記細胞を投与する前に行われ、前記細胞は投与前に抗CD3／抗CD28ビーズに暴露される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患しているか、またはがんを有するという診断を受けている。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体（CCR（CD122、CD127およびCD360）など）、CASTAT5、PD1キメラ（PD1:CD28など）、dnSHP1/2、IL-12および／またはmiRNA（miRNA155など）である。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記キメラサイトカイン受容体は、CCR、CASTAT5、PD1キメラおよび／またはmiRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記miRNAはmiRNA155を含む。いくつかの実施形態において、前記CCRは、CD122、CD127またはCD360を含む。いくつかの実施形態において、前記PD1キメラは、PD1:CD28、dnSHP1/2および／またはIL-12を含む。
【０００９】
第５の態様において、疾患、たとえば、がん（たとえば、白血病、乳癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、子宮癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌または甲状腺癌のいずれか１種以上）の緩和、抑制または治療を必要とする対象において、該疾患を緩和、抑制または治療する方法であって、細胞にベクターを導入することによって、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーターとキメラ抗原受容体を含む細胞を得る工程；前記対象に前記細胞を投与する工程；および分子の発現を誘導する工程を含む方法を提供する。前記ベクターは、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーター；分子をコードする遺伝子；およびキメラ抗原受容体をコードする配列を含む。前記誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含んでいてもよく、任意で、配列番号１〜３３の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3抗体／抗CD28抗体との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３３のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体はCD19に特異的である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記分子の発現は誘導性発現である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体（CAR）はシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、第１世代、第２世代または第３世代である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、トランスポゼースを用いたミニサークルまたはナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CAR特異的活性化のためのTCRノックアウト系をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象から得られたものである。疾患の緩和、抑制または治療を必要とする対象において、該疾患を緩和、抑制または治療する前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子に対する前記対象の反応を監視する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体、サイトカインまたは抗がん治療薬である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記分子の発現を誘導する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導は、PMAまたはロノマイシンの投与により行われる。いくつかの実施形態において、前記誘導工程は、前記対象に前記細胞を投与する前に行われ、前記細胞は投与前に、ビーズに結合された抗CD3抗体／抗CD28抗体に暴露される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記分子は、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんの治療法を実施するために選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記がんは、白血病、乳癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、子宮癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌または甲状腺癌である。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記キメラサイトカイン受容体は、CCR、CASTAT5、PD1キメラおよび／またはmiRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記miRNAはmiRNA155を含む。いくつかの実施形態において、前記CCRは、CD122、CD127またはCD360を含む。いくつかの実施形態において、前記PD1キメラは、PD1:CD28、dnSHP1/2および／またはIL-12を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】CAR T細胞療法における遺伝子発現の制御の概要を示す。
【００１１】
【図２】CARの活性化により誘導される遺伝子発現系の概要を示す。
【００１２】
【図３】誘導性合成プロモーター（iSynPro）の機能を例示した略図と、iSynProによるCAR T細胞の活性化を示したグラフを示す。CARのscFvと抗原が結合すると、CARの細胞内ドメインが様々な転写因子を誘導し、これらの転写因子が様々なプロモーター領域に結合して、それぞれのプロモーター領域に対応する遺伝子発現が活性化される。種々の内在性遺伝子が一斉に発現されると、最適な転写因子応答配列（TRE）から構成された合成プロモーターは、活性化された転写因子を利用して下流の転写を開始することができる。合成プロモーターによるこの転写活性化は、CAR T細胞の活性化により複数回誘導することができる。従来のプロモーターの構築方法では、合理的な設計に尽力する必要があった。試験可能なTREの数は限られており、成功率も低かった。図に示すように、合成プロモーターライブラリーは、数百種のユニークな配列から作製されたものであり、CAR T細胞を利用したスクリーニングによって、最も強力な誘導性プロモーターを同定することが可能である。
【００１３】
【図４】CD8+細胞におけるNFATプロモーターの機能性を示すグラフである。図に示すように、CD8+細胞においてNFAT制御下のプロモーターを使用しても弱い誘導しか得られない。
【００１４】
【図５】CAR T細胞の活性化により活性化されるプロモーターをスクリーニングするための合成プロモーターライブラリーの設計方法の概要を示す。
【００１５】
【図６】様々なデータベースを使用した、合成プロモーターライブラリーの構成単位の構築方法の概要を示す。ベン図に示すように、このタンパク質ライブラリーは、E2F1、EGR1、FOS、1IF1A、JUN、JFAT、LEF1、NFKB、SP1、PU.1および／またはSTAT4を含んでいてもよい。
【００１６】
【図７】誘導性iSynProライブラリーを構築する工程および方法の概要である。
【００１７】
【図８】iSynPRoプラスミドライブラリーから得たコロニーのサンガーシーケンシングの概要を示す。シーケンシング結果をマッピングしたものを略図に示す。図に示すように、転写因子応答配列（TRE）が配列にマッピングされている。選択されたクローンのシーケンシング結果を２つの棒グラフにまとめた。左のパネルに、１０個のクローンにおいてTREの頻度を測定した結果を示す。右のパネルは、クローン１個あたりのTREの数を測定した結果を示す。
【００１８】
【図９】NFAT制御下のプロモーターおよびNFkB制御下のプロモーターと比較することにより、iSynProライブラリーを導入したJurkat細胞を評価した一連のFACSアッセイの結果を示す。
【００１９】
【図１０】CD8初代T細胞におけるプロモーターライブラリーのスクリーニングの一例である。図に示すように、まず、GFP発現誘導用のiSynPro-IL2mpプロモーターを有する核酸と、EGFRtマーカータンパク質とCD19を発現する核酸を同時にCD8初代T細胞に形質導入する。次に、抗CD3／抗CD28ビーズで細胞を活性化し、その後ビーズを除去する。次に、細胞からEGFRt+GFP-集団をソーティングする。次に、ソーティングにより単離した細胞をCD19+細胞と共培養して刺激し、１日目、２日目および３日目ならびに再刺激した翌日にGFP陽性細胞をソーティングする。
【００２０】
【図１１】ソーティングした細胞におけるiSynProライブラリーの次世代MiSeqシーケンシングの結果を示した棒グラフである。図に示すように、１日目、２日目、３日目および再刺激した翌日の細胞において、ユニークなコンティグの発現が認められた。
【００２１】
【図１２】２人のドナーから得たCD8 T細胞におけるiSynProの検証プロトコルの概要である。３種の核酸、すなわち、ａ）GFPの発現を誘導するためのiSynProプロモーター-IL2mpを発現する核酸；ｂ）EGFRtマーカーを有するCD19を発現する核酸；およびｃ）薬剤誘導性プロモーターであるDHFRdmプロモーターとEGFRtマーカーを有するCD19+を発現する核酸を示す。核酸ａ）と核酸ｂ）または核酸ｃ）とを細胞に形質導入する。図に示すように、抗CD3／抗CD28ビーズで細胞を刺激し、２４時間後に細胞に形質導入する。ビーズを除去し、MTX（メトトレキサート）により選択する。１３日目に、放射線照射したTm-LCL細胞とともに細胞を共培養する。３０日目および４６日目に、放射線照射したTm-LCL細胞とともに細胞を再度共培養する。
【００２２】
【図１３】図１４に示す方法を使用して、２人の異なるドナーから得たCD8 T細胞においてiSynProを検証した結果を示す。抗CD3／抗CD28ビーズでCD8 T細胞を活性化した後、CD19CARとiSynProライブラリーをCD8 T細胞に同時に形質導入する。ビーズを除去した６日後に、放射線照射したTm-LCL細胞とCD8 T細胞を共培養し、２４時間後および７２時間後にCD8 T細胞の一部を回収してフローサイトメトリー分析を行う。残りの細胞を２週間培養後、Tm-LCL細胞で再刺激し、その後、再度刺激を行う。選択された上位２８種のiSynProを最初にドナーＮｏ．１のCD8＋T細胞において検証する。抗CD3／抗CD28ビーズで刺激すると、内在性TCRを介してGFPシグナルが様々な程度でオンの状態になり、ビーズを除去するとベースラインに戻る。このシグナルの上昇および下降は、放射線照射したTm-LCL細胞にCD19CAR陽性T細胞を接触させることによって、少なくとも３サイクルにわたり繰り返し観察される。全体では、活性化を誘導すると２８種のiSynProのうち２７種は、6×NFATプロモーターよりもGFPの陽性率およびMFIが高くなり、そのうちの半数は、7×NFkBよりもGFPの陽性率が高くなり、１０種は7×NFkBよりもMFIが高くなる。次に、２８種のiSynProのうち９種を使用して、ドナーＮｏ．２から得た細胞において実験を繰り返す。この実験では、薬剤選択マーカーであるDHFRdmをCD19CARコンストラクトに組み込み、さらに純度の高い集団を選択できるようにする。先の実験と非常に類似した結果が得られる。
【００２３】
【図１４】前述の２人のドナーから得た細胞において観察されたiSynProの制御下のGFPの発現を重ね合わせたグラフを示す。GFP（％）の結果およびMFIの結果は、２人のドナーから得た細胞間で非常によく似ており、これは、iSynProの誘導が一貫しており、ロバストであることを意味している。
【００２４】
【図１５】転写因子のプルダウンアッセイを示す。方法：ビオチン標識プライマーを使用して、iSynPro配列およびコントロール配列をPCRで増幅する。PMA／イオノマイシンで処理したJurkat細胞から核抽出物を単離し、ビオチン標識した二本鎖iSynPro DNA（この実験では３種のiSynPro配列を試験した）を加えてインキュベートし、ストレプトアビジン結合磁気ビーズでプルダウンする。プロモーターDNAでプルダウンした転写因子を変性させて、SDS-PAGEゲルに載せ、予測された転写因子を標的とする抗体で免疫ブロットする。ここで試験した３種のiSynPro配列のうちの少なくとも２種において、これらの転写因子に対応するTREが含まれていたことが示されている。
【００２５】
【図１６】CD19CARと様々なCD19+細胞の相互作用を介してiSynProを活性化することができることを示す。左から右に順に、Tm-LCL細胞、K562/CD19細胞、Raji細胞、DHL-4細胞、SupB15細胞、Be2/CD19細胞、K562細胞またはBe2細胞で刺激した後のGFPの発現を示す。
【００２６】
【図１７】T細胞共刺激因子（CD28受容体）であるCD80およびCD86を発現する様々な標的細胞株によって、CD19CAR T細胞中のiSynPro S1-61-GFP:fflucおよび7×NFkB-GFP:fflucを活性化した結果を示す一連の棒グラフである。左から右に順に、K562細胞、K562/OKT3細胞、K562/CD19細胞、K562/CD80/CD86/CD19細胞、K562/CD80/CD86細胞、Raji細胞、Raji/CD19−細胞およびTm-LCL細胞を示す。K562親細胞は、細胞表面にCD19、CD80およびCD86を発現しない。K562/OKT3細胞は、TCRで活性化された傷害活性を示すためのポジティブコントロールとして使用した。K562細胞上に外因性に発現させたCD80/CD86のみでは、iSynProや7×NFkBを活性化することはできなかった。CD80/CD86およびCD19の相乗的活性化効果は7×NFkBを導入した細胞のみで見られ（右のグラフ）、GFPの発現が、K562/CD19細胞よりもK562/CD80/CD86/CD19細胞において増強していたが、このような相乗的活性化効果は、S1-61を導入した細胞では認められなかった（左のグラフ）。Raji細胞およびTm-LCL細胞は、CD19およびCD80/CD86を発現するが、その発現量は異なる。Raji細胞およびTm-LCL細胞は、S-61と7×NFkBを活性化し、7×NFkBの方がより強いシグナルを示した。これは、恐らくCD19とCD80/CD86の相乗効果が関連していると考えられる。CRISPRでCD19遺伝子をノックダウンすると、いずれのプロモーターでもGFPの発現がベースライン値付近まで急激に低下し、この結果は、CD19遺伝子をノックインしたK562細胞において観察された結果を支持するものであった。これまでの実験データから、T細胞共刺激因子はS1-61および7×NFkBを誘導せず、S1-61の活性化は、7×NFkBと比べて、CARと抗原の相互作用に対してより特異的であることが示唆された。S1-61または7×NFkBの誘導がCD19CARの機能と共存すること、S1-61または7×NFkBの誘導がCD19CARの機能と相関すること、およびS1-61または7×NFkBによる効果が変量効果ではないことを示すために、後述の図２０および図２１に示すサイトカイン放出アッセイおよびクロム放出アッセイを同時に実施した。
【００２７】
【図１８】CD80/CD86共刺激因子のみでは、細胞からのサイトカイン放出が誘導されなかったことを示す。左から順に、Mock細胞、CD19CAR細胞、CD19CAR＋S1-61-GFP:ffluc細胞およびCD19CAR＋NFkB-GFP:ffluc細胞を示す。分析したサイトカインはIL-2、IFNγおよびTNFαであった。
【００２８】
【図１９】クロム放出アッセイの結果を示す。CD80/CD86共刺激因子を発現するがCD19は発現しない細胞が、CD19CAR T細胞により殺傷されなかったことを実証している。K562親細胞は、細胞表面にCD19、CD80およびCD86を発現しない。この実験データでは、外因性にCD19を発現させたK562細胞は、CD19CAR T細胞により殺傷されたが、外因性にCD80/CD86を発現させたK562細胞は、CD19CAR T細胞により殺傷されなかったことが示された。方法：CD19CARの標的細胞をCr51で標識し、様々なエフェクター：標的比（３０：１、１０：１、３：１または１：１）となるようにエフェクター細胞（CD19CAR T細胞）を段階希釈し、標的細胞と共培養した。さらに、ポジティブコントロールとして２％SDSを加えて標識標的細胞を培養し、ネガティブコントロールとしてRPMI培地中で標識標的細胞を培養した。４時間のインキュベーション後、上清を回収し、LUMA 96ウェルプレートに移した。プレートを一晩乾燥させ、TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで計測した。
【００２９】
【図２０】Be2/CD19皮下移植モデルを使用したインビボにおけるiSynProのパイロット研究を示す。プロトコルのスケジュールを図に示す。１５匹のNSGマウスを、５匹のマウスからなる３つの群に分けた。Ａ群のマウスには、両方の脇腹に300万個のBe2細胞を皮下移植した。Ｂ群マウスには、左脇腹に300万個のBe2細胞を移植し、右脇腹に300万個のBe2/CD19細胞を移植した。Ｃ群マウスには、両方の脇腹に300万個のBe2/CD19細胞を移植した。腫瘍を移植した５日後に、CD19CAR/S1-61-GFP:fflucを発現するCD8 T細胞250万個を各群のマウスに静脈注射した。CAR T細胞注射の翌日に発光画像を撮影し、数日間にわたって連続して撮影し、移植したT細胞におけるルシフェラーゼの発現を追跡した。
【００３０】
【図２１】前記インビボ実験の結果を示す。CAR T細胞注射の翌日に、Be2細胞とBe2/CD19細胞の両方を移植したＢ群のマウスにおいて、強力なルシフェラーゼシグナルが観察された。Be2/CD19細胞を両方の脇腹に移植したＣ群のマウスでは、さらに強力なシグナルが観察された。Be2細胞のみを移植したＡ群マウスでは、シグナルはほとんど観察されなかった。ルシフェラーゼシグナルはCD19抗原に特異的であることが示唆され、先のインビトロ実験で見られたように、CD19CARの活性化によるものであると推測された。CAR T細胞は脇腹の領域には局在しておらず、全身に拡散し、特に肺に多く見られたことから、CAR T細胞が腫瘍細胞に遭遇した翌日には、CAR T細胞は腫瘍部位に留まっていなかったことが示された。CAR T細胞注射の３日後、Ｂ群に属する１匹のマウスは、腫瘍に局在したルシフェラーゼシグナルを示した（右脇腹のみ）。CAR T細胞注射の約７日後、Ｂ群の別のマウスにおいても同じ現象が見られた。第１のマウスにおいて、局在したルシフェラーゼシグナルは、時間の経過に従って増加し、その後低下し、第２のマウスでも同じ傾向があるようであった。ルシフェラーゼは腫瘍体積と相関すると見られた。Ｂ群に属する５匹のマウスのうち、これら２匹のマウスは、CAR T細胞の局在したルシフェラーゼシグナルが高値に達したときに、最も大きな腫瘍体積を示した（データ示さず）。これは最初のパイロット実験であり、結論を導くにはさらに実験を行う必要がある。
【００３１】
【図２２】CD8/CD19CAR/S1-61-GFP:ffluc EGFRtでソーティングした細胞をマウスに注射した結果を示す。
【００３２】
【図２３】DNAターゲットシーケンシングを行うための試料の処理の概要である。図に示すように、工程１は、PCRにより目的領域を増幅することを含む。工程２は、イルミナ社製のインデックスとシーケンシングアダプターを加えて、２回目のPCRを行うことを含む。工程３は、PCR産物の精製、TapeStationによる解析およびDNA MiSEQを含む。
【００３３】
【図２４】MiSeqの結果として得られたプロモーターの長さの分布を示す２つのグラフを示す。
【００３４】
【図２５】DNAシーケンシングの結果をまとめたものを示す。シーケンシングによって同定されたユニークなコンティグの総数を、グラフの外郭線を引いた領域に示す。
【００３５】
【図２６】iSynProプロモーターの分析を示す。
【００３６】
【図２７】CD8+ CAR T細胞においてSyn-iProを試験するためのスケジュールの一例である。図に示すように、まず、CD8 T細胞をCD3／CD28ビーズで刺激する。２４時間後、ウイルスベクターを細胞に形質導入する。７日目に、ビーズを除去する。次いで、１１日目に、放射線照射したTm-LCL細胞と細胞を共培養する。この手順を２７日目および４１日目に繰り返す。
【００３７】
【図２８】mock細胞、CD19CARを発現する細胞、CD19+CAR（プロモーターなし）を発現する細胞、IL2mpとCD19CAR+を発現する細胞、6×NFAT-IL2mpとCD19CAR+を発現する細胞、および7×NFkB-IL2mpとCD19CAR+を発現する細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示す。すべての細胞においてEGFRtおよびGFPを測定した。図に示すように、6×NFAT-IL2mpプロモーターを発現する細胞では、EGFRtおよびGFPの発現量が少なかった。
【００３８】
【図２９】ユニークな発現パターンはないが、タンパク質の発現を再誘導可能であったことを示す２つのグラフを示す。
【００３９】
【図３０】標的細胞によるCAR T細胞の活性化前および活性化後のGFPのMFIを示す。左側に活性化前の状態を示し、右側に活性化後の状態を示す。
【００４０】
【図３１】一連のFACSアッセイにおいて示されたEGFRt+集団を示す。上の列には刺激前の細胞を示し、下の列には刺激後の細胞を示す（CD19CAR＋6×NFAT-IL2mp、CD19CAR＋7×NFkBおよびCD19CAR＋S1-61-IL2mp）。図に示すように、7×NFkBプロモーターまたはS1-61-IL2mpプロモーターを含む細胞は、刺激後にEGFRtを発現した。
【００４１】
【図３２】CD3／CD28またはLCL細胞で刺激した後の細胞におけるEGFRtおよびGFPの発現を示す。CD19CARのみの細胞、CD19CAR＋プロモーターなしの細胞、CD19CAR＋IL2mpのみの細胞、CD19CAR＋6×NFAT-IL2mp細胞、およびCD19CAR＋S1-61-IL2mp細胞を使用した。図に示すように、刺激後、S1-61-IL2mpを含む細胞は、EGFRtとGFPの発現量が最も多くなった。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書で使用される「条件誘導」または「誘導可能」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、誘導因子の存在下で遺伝子を発現させるが、誘導因子の非存在下では実質的に遺伝子を発現させないプロモーターのような核酸構築物が挙げられるが、これに限定されない。哺乳動物の発現コンストラクト用の誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン、エクジソン、ストレプトグラミン系抗生物質、マクロライド系抗生物質またはドキシサイクリンにより誘導可能なプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。細菌の発現コンストラクト用の誘導性プロモーターとしては、T7プロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、tetAプロモーター、araBADプロモーターおよびrhaPBADプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。昆虫由来のプロモーターとしては、pB2プロモーターおよびポリヘドリンのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態のいくつかにおいて、哺乳動物のタンパク質発現用の誘導性プロモーターを提供する。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導性合成プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターとして、CAR T細胞の活性化により活性化されるプロモーターが選択される。
【００４３】
「プロモーター」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に存在し、構造遺伝子の転写開始部位の近傍に位置する。転写を開始させるプロモーター配列のエレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始させるDNA領域である。プロモーターは、同じDNA鎖内の上流（センス鎖の５’領域方向）の遺伝子転写開始部位の近傍に位置する。プロモーターの長さは、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対もしくは約１０００塩基対、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制可能なプロモーター、誘導可能なプロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導可能なプロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは合成プロモーターである。
【００４４】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られる断片、ライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、エキソヌクレアーゼ作用および合成のいずれかにより得られる断片などの、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNA、RNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合またはホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。核酸は「オリゴヌクレオチド」と呼ぶこともできる。
【００４５】
本明細書で使用される「転写因子応答配列」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、特定の転写因子に結合することができ、遺伝子の転写を制御することが可能な、遺伝子プロモーター領域内の短いDNA配列が挙げられるが、これに限定されない。ストレス条件下では、転写アクチベータータンパク質が転写因子応答配列に結合し、転写を刺激する。転写因子応答配列は、タンパク質（アクチベーター）が結合することができる短いDNA領域（50〜1500bp）であり、アクチベーターが転写因子応答配列に結合することによって特定の遺伝子の転写が起こる可能性やその転写量を高めたり、促進したり、増強させたりすることができる。このようなアクチベータータンパク質は、通常、転写因子と呼ばれる。エンハンサーは、通常、シス作用性であり、標的遺伝子から最大で１Mbp（1,000,000bp）離れて位置し、転写開始部位の上流または下流に存在し、順方向または逆方向である。エンハンサーは、制御対象の遺伝子の上流または下流に位置していてもよい。いくつかの実施形態において、転写量を増加させるために複数のエンハンサー領域を使用してもよく、たとえば、多量体化した活性化結合ドメインを使用して、転写量をさらに増強または増加させることができる。さらに、エンハンサーは、転写開始部位から数十万塩基対離れた上流または下流に位置することが何人かの研究者によって見出されたことから、転写に影響を与えるためにエンハンサーを転写開始部位の近傍に置く必要はない。エンハンサーは、プロモーター領域自体には作用しないが、アクチベータータンパク質と結合する。アクチベータータンパク質は、メディエーター複合体と相互作用し、ポリメラーゼIIおよび基本転写因子を動員し、遺伝子の転写を開始する。エンハンサーはイントロン内に存在していてもよい。エンハンサーの方向は、逆方向であってもよく、逆方向であることによってその機能は影響を受けない。さらに、エンハンサーは、切断されてもよく、染色体の任意の位置に挿入されてもよく、このような処理を行っても遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる。エンハンサー結合領域の一例として、TCRαエンハンサーが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態におけるエンハンサー領域は、TCRαエンハンサーである。
【００４６】
本明細書で使用される「転写アクチベーター領域」または「転写活性化領域」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、転写因子が結合することができる特定のDNA配列であって、転写因子が結合することによって、DNAからメッセンジャーRNAへの遺伝子情報の転写速度を制御することができるDNA配列が挙げられるが、これに限定されない。転写因子の具体例としては、SP1、AP1、C/EBP、熱ショック因子、ATF/CREB、c-Myc、Oct-1および／またはNF-1が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で述べる「キメラ抗原受容体（CAR）」は、キメラT細胞受容体としても知られており、この用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、エフェクター免疫細胞に所望の特異性を移植することができる人工T細胞受容体または遺伝子組換え受容体が挙げられるが、これらに限定されない。CARは、前記疾患または障害に関連する分子と結合する抗体配列やその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含む合成設計された受容体であってもよく、該リガンド結合ドメインは、スペーサードメインを介して、T細胞受容体またはその他の受容体に由来する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）に連結されている。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体を含む細胞（哺乳動物細胞など）が作製される。キメラ抗原受容体を使用して、たとえば、モノクローナル抗体またはその結合部分の特異性をT細胞に移植することができる。本発明の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え細胞は、キメラ抗原受容体をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞上の分子に特異的である。T細胞受容体を発現する遺伝子組換え細胞またはキメラ抗原受容体を使用して、特定の組織を標的化することができる。
【００４８】
本明細書で述べる「リガンド」は、生体分子と複合体を形成することができる物質を指す。リガンドとしては、たとえば、基質、タンパク質、小分子、阻害因子、活性化因子、核酸および神経伝達物質が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドは分子間力によって結合し、たとえばイオン結合、水素結合、およびファンデルワールス相互作用によって結合する。リガンドが受容体タンパク質に結合すると、三次元構造が変化し、それによってリガンドの機能が発揮される。リガンドの結合強度は、結合親和性とも呼ばれ、直接的な相互作用および解離作用によって決まる。リガンドは、「リガンド結合ドメイン」によって結合されてもよい。「リガンド結合ドメイン」は、たとえば、タンパク質上の特定のリガンドまたは特定のエピトープと結合可能な構造に見られる保存配列を指してもよい。リガンド結合ドメインまたはリガンド結合部分は、抗体またはその結合断片もしくはscFv、受容体のリガンドもしくはその変異体、ペプチド、および／またはポリペプチド性親和性分子もしくはポリペプチド性結合パートナーを含んでいてもよい。リガンド結合ドメインは、１つまたは複数のリガンドに特異的な特定のタンパク質ドメインやタンパク質上のエピトープであってもよいが、これらに限定されない。
【００４９】
「PMA」すなわち「ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート」は、ホルボールのジエステルであり、シグナル伝達酵素であるプロテインキナーゼＣ（PKC）を活性化するために生物医学研究においてしばしば使用される強力な発がんプロモーターである。本明細書に記載の実施形態において、PMAは、誘導性合成プロモーターを誘導するために使用される。
【００５０】
「ロノマイシン」は、細菌の一種であるStreptomyces conglobatusから産生されるイオノフォアである。ロノマイシンは、カルシウム（Ｃａ２＋）の細胞内濃度を上昇させるために研究において使用され、生体膜を横切ったＣａ２＋の運搬を理解するための研究ツールとしても使用される。また、ロノマイシンは、サイトカイン（インターフェロン、パーフォリン、IL-2および／またはIL-4）の細胞内産生を刺激するために、通常PMAと併用される。本発明の実施形態において、ロノマイシンは、誘導性合成プロモーターを誘導するために使用される。
【００５１】
「最小プロモーター」は、標的遺伝子の転写量を低く抑えるために使用される。最小プロモーターは、転写開始部位を特定する重要な配列を有するが、RNAポリメラーゼや転写因子を強力に動員しないため、弱い転写活性化しか誘導しない。本発明の実施形態において、最小プロモーター配列は、IL2プロモーター（−７０〜＋４７）のTATAボックス含有断片である最小IL2プロモーター配列である。最小IL-2プロモーターの構築前および使用前に、誘導性遺伝子発現コンストラクト内の市販の最小プロモーターを試験した。この市販の最小プロモーターは、細胞株では機能するが、初代T細胞では機能しないことが示された。
【００５２】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、糖鎖基などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によってなされてもよく、細胞の種類にも左右される。本明細書において、タンパク質は、そのアミノ酸主鎖の構造で定義され、糖鎖基などの置換基は特に規定されないが、このような置換基がタンパク質中に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子をコードする遺伝子を含むベクターを含む細胞を提供する。
【００５３】
本明細書で述べる「抗体」は、形質細胞によって産生されるＹ字型の大きなタンパク質を指し、免疫系において細菌やウイルスなどの異物を特定し、それらを中和する機能を有する。抗体タンパク質は４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により連結された同一の重鎖２本と同一の軽鎖２本を含んでいてもよい。それぞれの重鎖および軽鎖は、免疫グロブリンドメインと呼ばれる構造ドメインから構成される。これらのドメインは約７０〜１１０個のアミノ酸を含むことができ、そのサイズおよび機能により様々なカテゴリーに分類される。
【００５４】
本明細書で述べる「増殖促進分子」は、CCR（CD122）、CCR（CD127）、CCR（CD360）などのキメラサイトカイン受容体；caSTAT5；miRNA155などのmiRNA；dnSHP1；dnSHP2；PD1:MyD88やPD1:CD28などのPD1キメラ；およびCD200:CD28を指す。本発明のいくつかの実施形態において、誘導性合成プロモーターにより増殖促進分子の合成が誘導される。
【００５５】
本明細書で使用される「誘導性合成プロモーターライブラリー」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、CARの活性化により誘導可能なプロモーターライブラリー、T細胞の疲弊により誘導可能なプロモーターライブラリー、腫瘍微小環境により誘導可能なプロモーターライブラリー、および低酸素状態により誘導可能なプロモーターライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される「誘導性合成プロモーター（iSynPro）」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、CARの活性化により誘導可能なプロモーターライブラリー、T細胞の疲弊により誘導可能なプロモーターライブラリー、腫瘍微小環境により誘導可能なプロモーターライブラリー、および低酸素状態により誘導可能なプロモーターライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で述べる「T細胞前駆細胞」は、胸腺へと遊走して、T細胞前駆細胞となることができるリンパ球前駆細胞を指し、T細胞前駆細胞はT細胞受容体を発現しない。あらゆるT細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に定着し、細胞分裂により増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。最も初期の胸腺細胞はCD4もCD8も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（CD4−CD8−）細胞に分類される。これらは発達が進むにつれて、ダブルポジティブ胸腺細胞（CD4＋CD8＋）となり、最終的にシングルポジティブ（CD4＋CD8−またはCD4−CD8＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。
【００５８】
本明細書で使用される「CD19」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、白血球の表面上に存在するタンパク質であり、Ｂリンパ球の抗原受容体と会合して抗原受容体依存性刺激の閾値を低下させることができるタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。CD19は、濾胞樹状細胞およびB細胞に発現される。CD19は、Bリンパ芽球へと発達する過程において最も初期に見られるB系細胞の段階から見られるが、形質細胞に成熟すると失われる。CD19は、CD21およびCD81と一緒になってB細胞補助受容体として主に作用する。CD19は活性化されると、その細胞内尾部がリン酸化され、リン酸化されたCD19にSrcファミリーキナーゼが結合し、PI-3キナーゼが動員される。T細胞の場合と同様に、いくつかのB細胞表面分子が抗原受容体を形成し、Bリンパ球上で複合体を形成する。
【００５９】
CD19の突然変異は、抗体産生の減少を特徴とする重症免疫不全症候群と関連している。たとえば、CD19の発現異常は、急性骨髄性白血病における単球系マーカーである。CD19はB細胞の特徴のひとつであるため、このタンパク質を用いることによって、B細胞から生じるがん、特にB細胞リンパ腫を診断することができる。2011年以来、CD19を標的とした治療法の臨床試験が始められている。現在開発中の実験的抗CD19薬のほとんどは、CD19の存在を利用して治療法をB細胞がんに特異的に指向させることにより作用する。一方、CD19は、MYC腫瘍性タンパク質の濃度を安定化させることによって、B細胞がんの成長の助長に積極的な役割を果たしていることが徐々に分かってきている。したがって、CD19およびその下流のシグナル伝達は、治療標的として有望であると考えられる。
【００６０】
本明細書で述べる「対象」または「患者」は、たとえば、実験、診断、予防および／または治療を目的として、本明細書に記載の実施形態を使用または投与してもよい任意の生物を指す。対象または患者として、たとえば、動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記対象は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類および／またはヒトである。いくつかの実施形態において、前記対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、霊長類またはヒトである。
【００６１】
本明細書で述べる「サイトカイン」は、細胞のシグナル伝達において重要な役割を果たす小さいタンパク質（５〜２５ｋＤａ）を指す。サイトカインは、細胞により放出され、他の細胞の挙動や、時にはサイトカインを放出した細胞自体（たとえばT細胞など）の挙動に影響を及ぼす。サイトカインとしては、たとえば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび／または腫瘍壊死因子が挙げられる。サイトカインは様々な細胞によって産生され、このような細胞としては、たとえば、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球および／またはマスト細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および／または様々な間質細胞が挙げられる。
【００６２】
サイトカインは、受容体を介して作用することができる。サイトカインは、液性免疫応答と細胞性免疫応答の間のバランスを調節することができ、さらに特定の細胞集団の成熟、増殖、および応答性を調節することができるため、免疫系とって重要である。サイトカインの中には、複雑な方法で他のサイトカインの作用を増強または抑制するものもある。サイトカインとしては、たとえば、アシル化刺激タンパク質、アディポカイン、アルブインターフェロン、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、ケモカイン、コロニー刺激因子、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、エリスロポエチン、Gc-MAF、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞増殖因子、IL10サイトカインファミリー、IL17サイトカインファミリー、IL1A、IL1B、インフラマソーム、Interferome、インターフェロン、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂ、インターフェロンγ、Ｉ型インターフェロン、II型インターフェロン、III型インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン１ファミリー、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターロイキン１２βサブユニット、インターロイキン１３、インターロイキン１５、インターロイキン１６、インターロイキン２、インターロイキン２３、インターロイキン２３αサブユニット、インターロイキン３４、インターロイキン３５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン３６、白血病抑制因子、白血球促進因子、リンホカイン、リンホトキシン、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症タンパク質、マクロファージ活性化因子、モノカイン、マイオカイン、マイオネクチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ、オプレルベキン、血小板第４因子、炎症促進性サイトカイン、プロメガポエチン、RANKL、間質細胞由来因子１、タリモジーン・ラハーパレプベック、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子、XCL1、XCL2、GM-CSFおよび／またはXCR1を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書で述べる「インターロイキン」すなわちILは、免疫系を大きく左右するサイトカインである。本発明で使用することができるインターロイキンとしては、たとえば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8/CXCL8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35および／またはIL-36が挙げられる。T細胞をインターロイキンと接触させることによって、T細胞の移植適合性が促進、補助、誘導または向上されるという効果が得られることがある。IL-1は、たとえば、T細胞の成熱および増殖において機能することができる。IL-2は、たとえば、T細胞応答の増殖および分化を刺激することができる。IL-3は、たとえば、骨髄系前駆細胞の分化および増殖を促進することができる。IL-4は、たとえば、増殖および分化を促進することができる。IL-7は、たとえば、B細胞、T細胞およびNK細胞の生存、発達および／またはホメオスタシスに関与するリンパ系前駆細胞の分化および／または増殖を促進することができる。IL-15は、たとえば、ナチュラルキラー細胞の発生を誘導することができる。IL-21は、たとえば、CD8+T細胞の活性化および／もしくは増殖を共刺激し、NK細胞の細胞傷害性を増強し、CD40の誘導によるB細胞の増殖、分化および／もしくはアイソタイプスイッチングを増強し、ならびに／またはTh17細胞の分化を促進する。
【００６４】
「ベクター」、「発現ベクター」または「コンストラクト」は、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であり、様々な制御因子を含むことから、細胞において異種核酸を発現させることができる。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母および／またはウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母またはウイルスゲノムである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、大腸菌などの細菌系におけるタンパク質発現用のベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、大腸菌などの細菌系におけるタンパク質発現用のベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、トランスポゼースを用いたミニサークルまたはナノプラスミドである。
【００６５】
本明細書で述べる「併用療法」は、２種以上の薬剤または治療法を使用して治療を行うことを指す。また、併用療法は、たとえば、単一の疾患を治療するために複数の治療法を使用することも指し、これを目的として複数の医薬製剤が併用されることが多い。さらに、併用療法は、別々の薬剤を処方および投与して２種以上の有効成分を投与することも含む。いくつかの実施形態において、併用療法が提供される。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、CAR発現T細胞を、これを必要とする対象（たとえばヒト）に投与することをさらに含む。
【００６６】
「化学療法薬」は、標準化された化学療法レジメンの一部として投与することが可能な化学物質（たとえば抗がん薬（化学療法剤））などが使用されてもよい抗がん医薬品類である。化学療法薬は、治癒を目的として投与される場合と、生存期間の延長または症状の緩和を目的として投与される場合（緩和的化学療法）とがある。化学療法は、腫瘍内科の主要なカテゴリーの１つであるホルモン療法および標的療法をさらに含んでいてもよい（がん薬物療法）。これらの化学療法は、放射線療法、外科手術、および／または温熱療法などの別のがん療法としばしば併用される。ごくわずかな症例においては、外科手術によってがんが拡散することが知られている。いくつかの実施形態において、外科的処置の前またはその後に、遺伝子組換え免疫細胞を腫瘍部位に投与する。
【００６７】
最近になって新たに開発された抗がん薬（たとえば様々なモノクローナル抗体、そのヒト化抗体および／またはそれらの結合断片）のいくつかは、無差別に細胞傷害性を発揮するわけではなく、がん細胞において異常発現され、がん細胞の増殖にとって必須であるタンパク質を標的としている。このような治療法は、（古典的化学療法と区別して）標的療法と呼ばれることが多く、抗腫瘍プロトコルにおいて従来の化学療法剤と併用されることが多い。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、このような標的抗がん療法（たとえば様々なモノクローナル抗体、そのヒト化抗体および／またはそれらの結合断片）の１種以上を投与することをさらに含んでいてもよい。
【００６８】
化学療法では、化学療法薬が投与されるが、１回の化学療法において１種類の薬剤を使用してもよく（単剤化学療法）、あるいは複数種の薬剤を同時に使用してもよい（併用化学療法または多剤併用化学療法）。放射線療法を併用した化学療法は、化学放射線療法と呼ばれる。光線に曝露させると細胞傷害活性を発揮する物質に変換される薬剤を使用した化学療法は、光化学療法または光線力学療法と呼ばれる。本明細書に記載の細胞を投与することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、がんを有する対象に前記細胞を投与した後に、光化学療法または光線力学療法を該対象に施す工程をさらに含むことができる。
【００６９】
化学療法薬としては、抗体−薬物複合体（たとえば、リンカーにより薬物に結合された抗体またはその結合断片）、ナノ粒子（たとえば、腫瘍選択性を促進し、低溶解性の薬剤の送達を補助する1〜1000nmの粒子であってもよい）、電気化学療法、アルキル化剤、代謝拮抗薬（たとえば、５−フルオロウラシル（5-FU）、６−メルカプトプリン（6-MP）、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ara-C（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標））、ペントスタチンおよび／またはチオグアニン）、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、分裂阻害薬、コルチコステロイド、DNAインターカレーター、ならびにチェックポイント阻害剤（たとえばチェックポイントキナーゼであるCHK1またはCHK2）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え免疫細胞、または前記遺伝子組換え免疫細胞を含む組成物は、前記化合物または治療法の１種以上などの、１種以上の抗がん剤と併用投与される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞と共投与または併用投与される前記１種以上の抗がん剤は、抗体−薬物複合体、ナノ粒子、電気化学療法、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、分裂阻害薬、コルチコステロイド類、DNAインターカレーターまたはチェックポイント阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記代謝拮抗薬は、５−フルオロウラシル（5-FU）、６−メルカプトプリン（6-MP）、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ara-C（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標））、ペントスタチンまたはチオグアニンを含む。
【００７０】
本明細書で述べる「がん」は、体内の他の部位に浸潤または拡散することがある異常細胞の増殖を伴う悪性腫瘍または悪性新生物を指してもよい。いくつかの実施形態において、対象における疾患または感染症を治療、緩和または抑制する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかにより作製された細胞を前記対象に送達する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記対象は、がん療法を実施するために選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記がんは、副腎癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管類癌腫、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭・下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性中皮腫、骨髄異形成症候群、鼻咽腔癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、小腸癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌または子宮肉腫を含む。
【００７１】
公知の最小IL2プロモーター（IL2mp）の上流に構築した複数の転写因子応答配列（TRE）をランダムにライゲーションして合成プロモーターライブラリーを作製し、キメラ抗原受容体（CAR）遺伝子改変T細胞においてCARを活性化させた際のレポーター遺伝子の発現により合成プロモーターをスクリーニングした。このアッセイを行うためのライブラリーの構築方法を図５に例示する。この図では、CAR T細胞の活性化により活性化されるプロモーターのスクリーニング方法が示されている。誘導性合成プロモーター（iSynPro）の作用を図３に示す。ソーティングされた細胞からDNAを抽出し、配列を決定した。次に、得られたプロモーター配列の上位候補を合成し、前述と同じ系において検証した。同定すなわち選択されたプロモーター（本開示においてSyn-i-Proとも呼ぶ）は、CARの活性化により誘導可能であり、CD3／CD28により誘導可能であり、あるいは化学物質（たとえばPMA／ロノマイシン）により誘導可能であることが分かった。たとえば、このプロモーターは、CD3を含むビーズ、CD28を含むビーズまたはCD3とCD28の両方を含むビーズによって誘導可能である（図２７）。このSyn-i-Proの制御下の遺伝子発現は、複数回（少なくとも４回）刺激を繰り返した後でも有意に低下しなかった。このプロモーターはCAR T細胞療法に有用であり、たとえば、構成的発現を使用した場合に見られる副作用を回避すると同時に、CAR T細胞において所望の分子を選択的に発現させる必要がある場合などに有用である。
【００７２】
従来、誘導性NFATプロモーターがT細胞療法に使用されてきたが、本明細書に記載の方法によって作製された誘導性プロモーター（Syn-i-Proプロモーター）は、内在性NFATプロモーターや非修飾NFATプロモーターよりも強力なレポーターシグナルを示した。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって構築した誘導性NFATプロモーターは、内在性NFATプロモーターや非修飾NFATプロモーターよりもシグナル／ノイズ比が大幅に高いことが示され、本明細書に記載の方法を使用して作製されたプロモーターのいくつかは、繰り返しオンの状態にすることができた。図４に示すように、CD8細胞においてNFATプロモーターを使用しても弱い誘導しか得られない。本明細書に記載の方法を使用して構築したSyn-i-Proプロモーターは、構成的に発現されると副作用を起こしうる分子の発現を制御するためのみならず、CAR T細胞が所望の抗原と相互作用する前の分子の発現を制限または阻止するために、CAR T細胞において使用することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して構築したSyn-i-Proプロモーターは、基底レベルの発現が比較的高くてもよい。基底レベルの発現が低いSyn-i-Proプロモーターは、最小プロモーター配列を構築すること、またはレンチウイルスを用いた発現系の代わりにトランスポゼースを用いたミニサークルもしくはナノプラスミドを使用することによって作製することができる。本明細書で述べたSyn-i-Proプロモーターの遺伝子発現をCARにより活性化することの利点の一つとして、CARの活性化を利用しているため薬剤を使用する必要がなく、副作用が起こらないことが挙げられる。使用される方法論およびさらなる実施形態を、以下のさらなる実施形態において述べる。
【００７４】
さらなる実施形態
いくつかの実施形態において、誘導性合成プロモーターライブラリーの作製方法であって、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞の活性化により活性化されるプロモーターをスクリーニングして、スクリーニングされたプロモーターを作製する工程；転写因子応答配列をスクリーニングして、スクリーニングされた転写因子応答配列を作製する工程；CAR T細胞による転写因子応答配列の活性化により活性化されるプロモーターを含む誘導性合成プロモーターライブラリーを作製する工程；およびスクリーニングされた転写因子応答配列をコードする第１の配列とスクリーニングされたプロモーターをコードする第２の配列を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む方法を提供する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、誘導性合成プロモーターであって、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含み、任意で、配列番号１〜３９の１つ以上を含む誘導性合成プロモーターを提供する。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、CD3／CD28との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記CD3／CD28は、ビーズに結合されている。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列と、８０％、８５％、９０％もしくは９０％の配列同一性またはこれらのパーセンテージのいずれか２つの間にある範囲内の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、分子発現用細胞であって、本発明の実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーター；分子をコードする遺伝子；およびキメラ抗原受容体をコードする配列を含むベクターを含む細胞を提供する。前記誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含み、任意で、配列番号１〜３９の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3／抗CD28との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記抗CD3／抗CD28は、ビーズに結合されている。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列と、８０％、８５％、９０％もしくは９０％の配列同一性またはこれらのパーセンテージのいずれか２つの間にある範囲内の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体はCD19に特異的である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記分子の発現は誘導性発現である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体（CAR）はシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記CARはスペーサーを含む。キメラ抗原受容体において、スペーサーは、たとえば、２０種のアミノ酸のうち任意のものを任意の順序で含むことによって、所望の長さのポリペプチド鎖を構成していてもよく、前記２０種のアミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、および／またはトリプトファンが挙げられる。スペーサー配列は、前記キメラ抗原受容体においてscFVと膜貫通ドメインとをつなぐリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、第１世代、第２世代または第３世代である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、トラ��スポゼースを用いたミニサークルまたはナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CAR特異的活性化のためのTCRノックアウト系をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記キメラサイトカイン受容体は、CCR、CASTAT5、PD1キメラおよび／またはmiRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記miRNAはmiRNA155を含む。いくつかの実施形態において、前記CCRは、CD122、CD127またはCD360を含む。いくつかの実施形態において、前記PD1キメラは、PD1:CD28、dnSHP1/2および／またはIL-12を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法において遺伝子の発現を制御する方法であって、本発明の実施形態のいずれかに記載の細胞を提供する工程、およびCAR T細胞療法を必要とする対象に前記細胞を導入する工程を含む方法を提供する。前記細胞は、本発明の実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーター；分子をコードする遺伝子；およびキメラ抗原受容体をコードする配列を含むベクターを含む。前記誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含み、任意で、配列番号１〜３９の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3／抗CD28との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記抗CD3／抗CD28は、ビーズに結合されている。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列と、８０％、８５％、９０％もしくは９０％の配列同一性またはこれらのパーセンテージのいずれか２つの間にある範囲内の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、増殖促進分子または腫瘍を根絶することができる分子である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体はCD19に特異的である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記分子の発現は誘導性発現である。いくつかの実施形態において、前記CARはシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記CARはスペーサーを含む。キメラ抗原受容体において、スペーサーは、たとえば、２０種のアミノ酸のうち任意のものを任意の順序で含むことによって、所望の長さのポリペプチド鎖を構成していてもよく、前記２０種のアミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、および／またはトリプトファンが挙げられる。スペーサー配列は、前記キメラ抗原受容体においてscFVと膜貫通ドメインとをつなぐリンカーであってもよい。いくつ��の実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、第１世代、第２世代または第３世代である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、トランスポゼースを用いたミニサークルまたはナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CAR特異的活性化のためのTCRノックアウト系をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子に対する前記対象の反応を監視する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子の発現について前記対象をさらに監視する。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、サイトカインまたは抗がん治療薬である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記分子の発現を誘導する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導は、PMAまたはロノマイシンの投与により行われる。いくつかの実施形態において、前記誘導工程は、前記対象に前記細胞を投与する前に行われ、前記細胞は投与前に抗CD3／抗CD28ビーズに暴露される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患しているか、またはがんを有するという診断を受けている。いくつかの実施形態において、前記分子は、CCR（CD122）、CASTAT5、PD1:CD28および／またはmiRNAである。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記キメラサイトカイン受容体は、CCR、CASTAT5、PD1キメラおよび／またはmiRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記miRNAはmiRNA155を含む。いくつかの実施形態において、前記CCRは、CD122、CD127またはCD360を含む。いくつかの実施形態において、前記PD1キメラは、PD1:CD28、dnSHP1/2および／またはIL-12を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、疾患（たとえば、白血病、乳癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、子宮癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌または甲状腺癌のいずれか１種以上）の緩和、抑制または治療を必要とする対象において、該疾患を緩和、抑制または治療する方法であって、細胞にベクターを導入することによって、本発明の実施形態のいずれかに記載の誘導性合成プロモーターとキメラ抗原受容体を含む細胞を得る工程；前記対象に前記細胞を投与する工程；および分子の発現を誘導する工程を含む方法を提供する。前記誘導性合成プロモーターは、転写因子応答配列をコードする第１の配列；およびプロモーター配列をコードする第２の配列を含み、任意で、配列番号１〜３９の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、キメラ抗原受容体の活性化によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、前記キメラ抗原受容体がリガンドに結合することによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、抗CD3／抗CD28との相互作用によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記抗CD3／抗CD28は、ビーズに結合されている。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、化学物質によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記化学物質は、PMAまたはロノマイシンである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、内在性最小IL2プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記誘導性合成プロモーターは、配列番号１〜３９のいずれか１つで示される配列と、８０％、８５％、９０％もしくは９０％の配列同一性またはこれらのパーセンテージのいずれか２つの間にある範囲内の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記転写因子応答配列は、E2F1、EGR1、HIF1A、NFAT、LEF1、SP1、PU.1、NFKB、JUN、FOSおよび／またはSTAT4である。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象から得られたものである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記誘導性合成プロモーターの制御下において発現された前記分子に対する前記対象の反応を監視する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、タンパク質、抗体もしくはその結合断片、サイトカインまたは抗がん治療薬である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記分子の発現を誘導する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導は、PMAまたはロノマイシンの投与により行われる。いくつかの実施形態において、前記誘導工程は、前記対象に前記細胞を投与する前に行われ、前記細胞は投与前に抗CD3／抗CD28ビーズに暴露される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体（CCR（CD122、CD127およびCD360）など）、CASTAT5、PD1キメラ（PD1:CD28など）、dnSHP1/2、IL-12および／またはmiRNA（miRNA155など）である。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんの治療法を実施するために選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記がんは、白血病、乳癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、子宮癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌または甲状腺癌である。いくつかの実施形態において、前記対象は、併用療法を実施するために選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記分子は、キメラサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、前記キメラサイトカイン受容体は、CCR、CASTAT5、PD1キメラおよび／またはmiRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記miRNAはmiRNA155を含む。いくつかの実施形態において、前記CCRは、CD122、CD127またはCD360を含む。いくつかの実施形態において、前記PD1キメラは、PD1:CD28、dnSHP1/2および／またはIL-12を含む。
【００７９】
実施形態１．CD8細胞においてNFATプロモーターを使用しても弱い誘導しか得られない
CAR T細胞療法における遺伝子発現の制御に有用なプロモーターを得るために、合成プロモーターの作製を試みた。図１に示すように、薬剤を使用することにより、導入遺伝子の発現（T細胞におけるCARまたはTCRの発現など）のオンとオフを制御してもよく、あるいは活性化をオンにしてもよい。
【００８０】
また、CAR T細胞の活性化により活性化されるプロモーターの単離を目的としたスクリーニングのための合成プロモーターライブラリーを設計する方法も考えられる（図５）。T細胞の活性化によりアップレギュレートされた遺伝子およびアップレギュレートされた転写因子をmRNA解析により同定してもよく、これらを転写応答配列（TRE）として同定してもよい（図６）。
【００８１】
TCRを介して活性化されたCD8 T細胞の網羅的相対遺伝子発現プロファイルは、Blairらによって過去に報告されている（Best, Blairら、2013；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。TREDデータベースおよびTRANSFACデータベースを探索することによって、CD8 T細胞の活性化に関連する遺伝子を制御することが確認された１１種の転写因子を選択した。選択された遺伝子は、E2F1、EGR1、FOS、HIF1a、JUN、NFAT、LEF1、NFkB、SP1、PU.1およびSTAT4であった。これらに対応するTRE配列をJASPARデータベースから入手し、合成した。
【００８２】
各TREをコードする遺伝子をプロモーターとともにベクターにライゲートし、CARまたはTCRの発現を誘導してもよい（図７）。図８に示すように、プロモーターの種類に依存して、TREの頻度に応じ、いくつかのTREが発現されうる。
【００８３】
図６に示すように、TCRを介して活性化されたCD8 T細胞の網羅的相対遺伝子発現プロファイルは、過去に報告されている（Best, Blairら，2013）。CD8 T細胞の活性化により有意にアップレギュレートされた遺伝子を選択した。TREDデータベースおよびTRANSFACデータベースを探索することによって、これらの遺伝子を制御することが確認された１１種の転写因子を選択した。選択された遺伝子は、E2F1、EGR1、FOS、HIF1a、JUN、NFAT、LEF1、NFkB、SP1、PU.1およびSTAT4であった。これらに対応するTRE配列をJASPARデータベースから入手し、合成した。
【００８４】
過去の報告に従って、各TREのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングし、得られた各TREの二本鎖を「構成単位」として使用してランダムにライゲーションすることにより合成プロモーターライブラリーを作製した（Brown A.，2014；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）（図７）。臨床試験において使用されているCARは主に第２世代の4-1BB-CD3ζCARであった。NFkBは4-1BBの下流の転写因子であることが知られており、4-1BBを細胞内シグナル伝達ドメインとして使用したため、比較的多くのNFkBが構成単位として動員された。制限酵素切断部位を含む２つのクローニング単位もライブラリーに導入し、これにより、プラスミドベクターへのクローニングを可能とし、ライゲーション産物のサイズを調節した。したがって、ランダムなライゲーションによる反応物のプールは、２倍の比率の各TRE単位（ただしNFkBのTREは含まない）、６倍の比率のNFkB単位、および１倍の比率のクローニング単位を含んでいた。dsDNAライゲーションライブラリーを制限酵素で消化したところ、予想した通り、アガロースゲル上において約７５ｂｐ〜約５００ｂｐの範囲のスメアが認められたことから、多様なライブラリーであることが示された。
【００８５】
初代T細胞においてライブラリーをスクリーニングするため、消化したライゲーションライブラリーを、GFPとホタルルシフェラーゼの融合レポーター遺伝子（GFP:ffluc）およびIL2の最小プロモーター（IL2mp）を含むHIV7トランスファープラスミドに挿入した。GFP:fflucレポーター遺伝子は、本発明者らの研究室において、インビトロアッセイとインビボアッセイの両方に使用した経験があった。IL2mpは複数の研究室で使用された報告があり（Durand, Shawら，1988、Fiering, Northrop，1990；これらの文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、本発明者らの研究室でも過去に試験を行った経験がある。ネガティブコントロールコンストラクトとして、プロモーターを含まないコンストラクトおよびIL2mpのみを含むコンストラクトを作製し、ポジティブコントロールコンストラクトとして、6×NFAT-IL2mpを含むコンストラクトおよび7×NFkB-IL2mpを含むコンストラクトを作製して、以下のスクリーニングで使用した。ウイルスへのパッケージングおよびスクリーニングを引き続き実施する前に、予想した通りのライブラリーが構成されているのかを確認するためにライブラリーを分析した。形質転換した少量の大腸菌細胞をアガロース平板培地に塗抹し、１０個のコロニーをピックアップしてmini-prepで精製し、サンガーシーケンシングを行った。試験の結果、１０個のクローンのうち９個は、ランダムなライゲーションにより組み込まれたプロモーターと６〜２０個のTREを含んでいたことが示された。各TREが少なくとも１個のクローンにおいて示され、NFkBの頻度が最も高かった。この結果は、ライゲーションプールにおけるTREの混合比率と一致していた（図８）。
【００８６】
Syn-iPro合成プロモーターの制御下でTCRを発現する細胞をFACSで分析して、PMA／ロノマイシンまたは抗CD3／抗CD28と接触させた後のCD69およびGFPの発現を調べた。図に示すように、Syn-iPro合成プロモーターを使用すると、化学物質としてのPMA／ロノマイシンの制御下でCD69およびGFPの発現が誘導される（図９）。
【００８７】
Syn-iPro合成プロモーターのライブラリーをCD8初代T細胞においてスクリーニングした（図１０）。臨床試験において使用される第２世代のCD19CAR-T2A-EGFRtを詳細に研究したところ、有望な結果が示された。これを踏まえ、第２世代のCD19CAR-T2A-EGFRtをiSynProライブラリーと同時に形質導入することによって、iSynProライブラリーの発現を惹起した。ピギーバック効果によって偽陽性配列が選別されないように、ライブラリーを低いMOIで形質導入し、単一の細胞に最大でも１つのiSynPro配列が含まれるようにする必要があった。また、「静止」期すなわち「オフ」期とCAR活性化期すなわち「オン」期を含む細胞系も必要であった。構成的に活発なプロモーターやCARの非存在下においてGFP陽性の細胞を選別しないように、フローサイトメーター／ソーターを使用して、「静止」期（抗CD3／抗CD28ビーズを除去した７日後）にEGFRt陽性GFP陰性の細胞のみを単離した。次に、単離した細胞を、放射線照射したTm-LCL（CD19+）細胞と共培養してCD19CARを活性化した。２４時間後、４８時間後および７２時間後にGFPの発現が中程度の細胞およびGFPを高発現している細胞をゲーティングすることによって、iSynProの活性化によりGFPを発現したGFP陽性細胞を選別した。残りの細胞をさらに１週間にわたり培養を継続した後、再度、Tm-LCL細胞と共培養した。２４時間後にGFP陽性細胞をソーティングした。
【００８８】
図１１に示すように、１日目、２日目および３日目、ならびにPMA／ロノマイシンで再刺激後に細胞をスクリーニングし、発現されたユニークなコンティグの数を調べた。DNAターゲットシーケンシングを行うための試料の処理を図２３に示す。図に示すように、PCRで目的領域を増幅し、精製した。次に、精製したDNA配列にイルミナ社製のインデックスとシーケンシングアダプターを加えて、２回目のPCRを行った。次に、DNA MiSeqシーケンシングを行った（図２４）。次に、配列を分析して、１時点あたりのユニークなコンティグの総数を調べた（図１１）。１日目、２日目、３日目、刺激後および再刺激の翌日におけるユニークなコンティグの総数を左から右に順に示す。各パターンの上位２８番目までにヒットしたコンティグを使用して、クローンにおけるユニークな発現パターンを分析し、特定のCARを有するT細胞による発現の誘導を評価した。
【００８９】
また、GFPを発現させるための最小プロモーター（IL2mp）に連結されたSyn-iPro合成プロモーターを含む第１のベクターをCD8+細胞にトランスフェクトした。さらに、この細胞に、ａ）EGFRtマーカーを有するCD19を発現する核酸を含むベクター；またはｂ）薬剤誘導性プロモーターであるDHFRdmプロモーターとEGFRtマーカーを有するCD19+を発現する核酸を含むベクターを同時にトランスフェクトした（図１２）。Syn-Proの発現の分析は、図２７に概要を示した方法により実施することができる。次に、細胞を回収し、プルダウンアッセイを使用してタンパク質の発現を分析した。
【００９０】
図１６および図１７に示すように、CD19CARと様々なCD19+細胞の相互作用を介してiSynProを活性化してもよい。左から右に順に、Tm-LCL細胞、K562/CD19細胞、Raji細胞、DHL-4細胞、SupB15細胞、Be2/CD19細胞、K562細胞またはBe2細胞との相互作用によって誘導されたGFPの発現を示す。
【００９１】
さらに、サイトカイン（IL-2、IFNγおよびTNFα）の発現について細胞を分析した。図に示すように、CD80/CD86共刺激因子のみでは、細胞からのサイトカイン放出は誘導されなかった。しかしながら、Syn-iProプロモーターをコードする核酸を含む細胞は、CD19+CAR T細胞によって活性化または刺激される（図１８）。図１９に示すように、CD80/CD86共刺激因子を発現する細胞は、CD19CAR T細胞によって殺傷されなかった（右上パネル、左中央パネルおよび左下パネル）。
【００９２】
次に、インビボにおけるiSynProのパイロット研究を、Be2/CD19皮下移植モデルを使用して行った。図２０に示すように、マウスの尾部にBe2細胞を皮下注射した。５日目に、Be2細胞を注射した部位にCD8 T細胞を注射した。６日目、７日目、８日目、９日目および１２日目にマウスの撮影を行った（図２１および図２２）。
【００９３】
ａ）Syn-Pro-IL2mp-GFPベクターおよびｂ）EF1a-CD19scFv-EGFRtベクターを細胞に同時にトランスフェクトすることによって、CD8 CAR T細胞におけるSyn-iProを試験した（図２７）。まず、CD3／CD28ビーズでCD8 T細胞を刺激し、ウイルスをトランスフェクトした。次に、１２日目、１３日目、１５日目、２６日目、２７日目、２８日目、２９日目、４１日目、４２日目および４３日目に、放射線照射したTm-LCL細胞とCD8 CAR T細胞を共培養した。次に、FACSアッセイで細胞を分析した。図２８に示すように、Tm-LCL細胞はCD19CAR発現細胞で刺激された。また、図２８に示すように、CD19 CARのみで刺激した細胞はEGFRtの発現量が最も多かった。Syn iPro合成プロモーターであるS1-61-IL2mpを含む細胞は、刺激後にGFPの発現量が最も高くなった（図３１）。
【００９４】
実施形態２
ソーティングしたGFP+細胞から得たDNAを次世代シーケンシング（NGS）で分析すると、200,000個を超えるユニークなプロモーターリードが得られる。上位の配列（リード数による順位付け）から約３０個のユニークなプロモーターリード配列を選択し、CAR T細胞において試験したところ、これらの大部分は誘導可能なプロモーターであり、6×NFATプロモーターよりも良好に機能した。試験しなかった配列プールには機能性配列がさらに含まれていると予想される。
【００９５】
プロモーターのスクリーニングプロセスの全体を通して、技術的な制限およびバイアスが存在することから、各工程においてライブラリーの多様性が制限される。たとえば、ライブラリーのサンプル数が各工程において減少し、たとえば、ランダムなライゲーションにより得たライブラリーをGFP:ffluc_HIV 7プラスミドにクローニングする際、レンチウイルスにプラスミドをパッケージングする際、およびソーティングした細胞から抽出されたDNAをPCR増幅用に回収する際にサンプル数が減少してしまう。一方、増幅が起こるいくつかの工程において配列に冗長性が生じ、たとえば、GFP:ffluc_HIV7プラスミドによる大腸菌細胞の形質転換、293T細胞におけるレンチウイルスの産生、およびターゲットシーケンシングを目的としたPCRにおいて配列の冗長性が生じる。各工程においてライブラリーをシーケンシングした場合にのみ（ライゲーション、プラスミドおよびウイルスから得た生のデータ）、バイアスを知ることができ、ソーティングした細胞のシーケンシング結果からこのバイアスを取り除くことができる。このようにすれば、ソーティングした細胞の順位付けがより意味のあるものとなる。しかし、残念ながら、すべてのライブラリーのシーケンシングは未だ完了していない。一方、PCRでは短い配列の方が有利であり、長い配列は通常、短い配列ほどには効率的に増幅されないことが知られている。PCR増幅を２回行っていることから、長い配列はリード数による順位が低くなっている可能性がある。したがって、ソーティングした細胞から得たDNAをNGS Miseqで分析した配列のうち、試験していないものの中から、単にPCR増幅に有利ではないという理由に基づいて、特許申請可能な長いプロモーター配列（現時点で最も好ましいプロモーターであるS-61と同程度またはそれ以上の長さ）のみを選択することができる。長い配列のうち、少なくとも３つの時点または４つの時点で認められた配列をさらに選択した。ここで、リード数のカットオフ閾値は１００とする（配列番号３４〜３９）。
【００９６】
いくつかの実施形態において、誘導性合成プロモーターライブラリーの作製方法であって、マーカー遺伝子を含む細胞のDNAの配列を決定する工程；推定上のプロモーターをスクリーニングする工程；転写因子応答配列をスクリーニングして、スクリーニングされた転写因子応答配列を作製する工程；前記推定上のプロモーターを含む誘導性合成プロモーターライブラリーを作製する工程；およびスクリーニングされた転写因子応答配列をコードする第１の配列と前記プロモーターをコードする第２の配列を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、次世代シーケンシングによって行われる。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、CARの結合およびCAR Tのシグナル伝達による活性化を評価するために、CAR T細胞において試験される。いくつかの実施形態において、前記スクリーニングは、マーカー遺伝子の転写または翻訳を評価するためにアッセイを行う工程を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、マーカー遺伝子のアップレギュレーションが確認された後に配列が決定され、リガンドと相互作用したCAR T細胞に応答した活性化が試験される。いくつかの実施形態において、前記CAR T細胞の相互作用によって転写因子応答配列がアップレギュレートされる。
【００９７】
配列
Syn-iProの配列
配列番号、配列名、配列
配列番号1
S1-17
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGAGGAAAAACTCGATGTGACTCATTCGAAGATCAAAGGGTCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGAATGACATCATCTTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAATGAGTCACATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGCGCCAAATCGAGGACGTGATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号2
S1-37
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGGGGCGGGGTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAATGACATCATCTTTCGACCCTTTGATCTTCGAAGGAAGTTCGATCACGTCCTCGATTTGGCGCTCGAGGGGACTTTCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号3
S1-4
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCCAAGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGAGTCACATCGACCCTTTGATCTTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGACCCCGCCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号4
S1-1
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAAGATCAAAGGGTCGAGGGGACTTTCCTCGATTTCTTGGAAATCGAATGACATCATCTTTCGATTTGGCGCTCGAATGACATCATCTTTCGACCCTTTGATCTTCGATGTGACTCATTCGAGGGGACTTTCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAGGGGACTTTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号5
S1-3
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGGCGGGGTCGATTTGGCGCTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAATGAGTCACATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAGGAAAAACTCGATGTGACTCATTCGATTTCCAAGAAATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号6
S1-42
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCCAAGAAATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAATGACATCATCTTTCGAATGACATCATCTTTCGAGGAGGAAAAACTCGACCCCGCCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGCGCCAAATCGAAGGAAGTTCGAATGACATCATCTTTCGAATGAGTCACATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号7
S1-61
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAATGAGTCACATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGGGGCGGGGTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGAGTCACATCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCGGGGTGGAGCAAGCGTGACAAGTCCACGTATGACCCGACCGACGATATCGAAGCCTACGCGCTGAACGCCAGCCCCGATCGACCCCGCCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGAATGACATCATCTTTCGAATGACATCATCTTTCGAGGGGACTTTCCTCGAACTTCCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号8
S1-62
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCCAAGAAATCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGGGGCGGGGTCGAGGGGACTTTCCTCGACCCTTTGATCTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGCGCCAAATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号9
S1-15
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAAGATCAAAGGGTCGATTTCTTGGAAATCGATGTGACTCATTCGATCACGTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAGGAAAGTCCCCTCGAACTTCCTTCGAGGGGGCGGGGTCGAATGAGTCACATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGACTTTCCTCGATTTCTTGGAAATCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATCGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号10
S1-2
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAATGAGTCACATCGAAGATCAAAGGGTCGACCCTTTGATCTTCGATTTGGCGCTCGATGTGACTCATTCGACCCCGCCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGATTTGGCGCTCGAGGACGTGATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号11
S1-27
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCCAAGAAATCGAGTTTTTCCTCCTCGATTTCCAAGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAATGACATCATCTTTCGATGTGACTCATTCGAAGATCAAAGGGTCGAAGGAAGTTCGAATGAGTCACATCGAATGAGTCACATCGACCCTTGATCTTCGAGGAGGAAAAACTCGATTTGGCGCTCGATTTGGCGCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号12
S1-8
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCTTGGAAATCGATTTGGCGCTCGAAGGAAGTTCGAGGGGGCGGGGTCGATTTCCAAGAAATCGAGTTTTTCCTCCTCGAGCGCCAAATCGACCCTTTGATCTTCGATCACGTCCTCGAGCGCCAAATCGAGGACGTGATCGAATGAGTCACATCGAATGAGTCACATCGAATGAGTCACATCGATTTGGCGCTCGATCGGGGGGCGGGGTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGATTTGGCGCTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号13
S1-30
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAATGACATCATCTTTCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGACCCCGCCCCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGGCGGGGTCGAGGACGTGATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号14
S1-33
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAAGATCAAAGGGTCGAGGAGGAAAAACTCGAGGGGACTTTCCTCGACCCTTTGATCTTCGAATGAGTCACATCGATTTCTTGGAAATCGAAGGAAGTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAACTTCCTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAAGGAAGTTCGAAAGATGATGTCATTCGATTTCTTGGAAATCGAAGATCAAAGGGTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGATTTCCAAGAAATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号15
S1-41
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAATGAGTCACATCGAGCGCCAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGGCGGGGTCGAGTTTTTCCTCCTCGATTTCCAAGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号16
S1-59
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAAAGATGATGTCATTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAATGAGTCACATCGACCCTTTGATCTTCGACCCTTTGATCTTCGATTTCCAAGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号17
S1-66
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGATTTGGCGCTCGAGGAGGAAAAACTCGATGTGACTCATTCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGCGCCAAATCGAGGAGGAAAAACTCGAGGGGACTTTCCTCGATTTCTTGGAAATCGAAAGATGATGTCATTCGACCCTTTGATCTTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号18
S1-71
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGAATGACATCATCTTTCGATCACGTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGATTTCCAAGAAATCGATTTCTTGGAAATCGACCCTTTGATCTTCGAGGAGGAAAAACTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号19
S1-56
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATGTGACTCATTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTGGCGCTCGATGTGACTCATTCGATTTGGCGCTCGAGGGGACTTTCCTCGATTTCCAAGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号20
S1-6
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATGTGACTCATTCGAGCGCCAAATCGATTTCCAAGAAATCGAATGAGTCACATCGAATGACATCATCTTTCGATGTGACTCATTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAATGACATCATCTTTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号21
S1-60
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGGGACTTTCCTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAAGGAAGTTCGAACTTCCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAAGGAAGTTCGAGCGCCAAATCGAATGAGTCACATCGATTTCCAAGAAATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGAGGAAAAACTCGAGGGGACTTTCCTCGATTTCCAAGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGATCACGTCCTCGAGGACGTGATCGAATGAGTCACATCGATGTGACTCATTCGACCCTTTGATCTTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号22
S1-86
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCCAAGAAATCGAGGGGGCGGGGTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAACTTCCTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAATGAGTCACATCGATTTGGCGCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGGCGGGGTCGAACTTCCTTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号23
S1-32
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAATGAGTCACATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGATTTGGCGCTCGAGGGGACTTTCCTCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号24
S1-10
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTGGCGCTCGATGTGACTCATTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAAAGATGATGTCATTCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCCGCCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGAATGAGTCACATCGATTTCTTGGAAATCGATGTGACTCATTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号25
S1-18
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGGGACTTTCCTCGATGTGACTCATTCGATTTCTTGGAAATCGATTTCCAAGAAATCGACCCCGCCCCCTCGAGGAGGAAAAACTCGATTTCCAAGAAATCGAATGACATCATCTTTCGAGGGGACTTTCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAAGATCAAAGGGTCGAGGAGGAAAAACTCGATTTCCAAGAAATCGAATGAGTCACATCGAGTTTTTCCTCCTCGATTTCTTGGAAATCGAAGAGGGGGCGGAGATCGATTTGGCGCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号26
S1-14
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAAAGATGATGTCATTCGAATGAGTCACATCGATTTGGCGCTCGAGGGGGCGGGGTCGATTTGGCGCTCGAAAGATGATGTCATTCGAGTTTTTCCTCCTCGACCCTTTGATCTTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAAAGATGATGTCATTCGAATGAGTCACATCGATTTCCAAGAAATCGATTTCCAAGAAATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号27
S1-16
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGAGGAAAAACTCGATTTCTTGGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAAAGATGATGTCATTCGAAGATCAAAGGGTCGATGTGACTCATTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGGCGGGGTCGAATGACATCATCTTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAATGACATCATCTTTCGATTTCTTGGAAATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号28
S1-19
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGTTTTTCCTCCTCGATTTCTTGGAAATCGAAGATCAAAGGGTCGATTTCTTGGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGATTTGGCGCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号29
S1-26
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAAAGATGATGTCATTCGAGTTTTTCCTCCTCGAAGGAAGTTCGAGGACGTGATCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAATGAGTCACATCGAAGGAAGTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号30
S1-65
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGACCCCGCCCCCTCGAGCGCCAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号31
S2-n1
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGGGGCGGGGTCGAATGACATCATCTTTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGACCCTTTGATCTTCGAAGATCAAAGGGTCGATGTGACTCATTCGAAGATCAAAGGGTCGATTTGGCGCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号32
S4-n1
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGATTTCCAAAAAACTCGAATGACATCATCTTTCGAAGATCAAGGGGTCGAAGATCAAAGGGTCGATTTCCAAGAAATCGATTTCTTGGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAAGATCAAAGGGTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号33
S6-n1
CTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATCGATTTCCAAGAAATCGATTTCTTGGAAATCGAATGACATCATCTTTCGAGTTTTTCCTCCTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGAACTTCCTTCGAAGGAAGTTCGAGGAGGAAAAACTCGAGGGGGCGGGGTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGACCCCGCCCCCTCGACCCTTTGATCTTCGATTTCCAAGAAATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCAT
配列番号34
S1-325
TCGAAGATCAAAGGGTCGATTTCCAAGAAATCGATGTGACTCATTCGATTTGGCGCTCGACCCCGCCCCCTCGAAGAGGGGGCGGAGATCGAATGAGTCACATCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGACATCATCTTTCGAATGAGTCACATCGATTTCTTGGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGACCCCGCCCCCTCGAGGTGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGATGTGACTCATTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGACCCTTTGATCTTCGATTTGGCGCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCA
配列番号35
S1-60
TCGAATGAGTCACATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGGGGCGGGGTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGAGTCACATCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCGGGGTGGAGCAAGCGTGACAAGTCCACGTATGACCCGACCGACGATATCGAAGCCTACGCGCTGAACGCCAGCCCCGATCGACCCCGCCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGAATGACATCATCTTTCGAATGACATCATCTTTCGAGGGGACTTTCCTCGAACTTCCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCA
配列番号36
S2-274
TCGAATGAGTCACATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGGGGCGGGGTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGAGTCACATCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCGGGGTGGAGCAAGCGTGACAAGTCCACGTATGACCCGACCGACGATATCGAAGCCTACGCGCTGAACGCCAGCCCCGATCGACCCCGCCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGAATGACATCATCTTTCGAATGACATCATCTTTCGAGGGGACTTTCCTCGAACTTCCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAAAGATGATGTCATTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCA
配列番号37
S2-310
TCGAATGAGTCACATCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGGGGGCGGGGTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGAGTCACATCGACCCTTTGATCTTCGAGGGGACTTTCCGGGGTGGAGCAAGCGTGACAAGTCCACGTATGACCCGACCGACGATATCGAAGCCTACGCGCTGAACGCCAGCCCCGATCGACCCCGCCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGAATGACATCATCTTTCGAATGACATCATCTTTCGAGGGGACTTTCCTCGAACTTCCTTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCA
配列番号38
S1-367
TCGATTTCCAAGAAATCGACCCCGCCCCCTCGAACTTCCTTCGATTTCTTGGAAATCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCTTGGAAATCGATTTCTTGGAAATCGAATGACATCATCTTTCGATTTCTTGGAAATCGACCCTTTGATCTTCGAGGAGGAAAAACTCGAATGACATCATCTTTCGATCACGTCCTCGAAGATCAAAGGGTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATGTGACTCATTCGATTTCTTGGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGAGGGGACTTTCCTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGGAGGAAAAACTCGATTTCCAAGAAATCGAGGGGACTTTCCTCGACCCTTTGATCTTCGAGCGCCAAATCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCA
配列番号39
S1-7
TCGATTTCTTGGAAATCGATTTGGCGCTCGAAGGAAGTTCGAGGGGGCGGGGTCGATTTCCAAGAAATCGAGTTTTTCCTCCTCGAGCGCCAAATCGACCCTTTGATCTTCGATCACGTCCTCGAGCGCCAAATCGAGGACGTGATCGAATGAGTCACATCGAATGAGTCACATCGAATGAGTCACATCGATTTGGCGCTCGATCGGGGGGCGGGGTCGAGGAAAGTCCCCTCGAGGAAAGTCCCCTCGATTTCCAAGAAATCGATTTGGCGCTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGATCTCCGCCCCCTCTTCGAGTTTTTCCTCCTCGAGTAGAGTCTAGACTCTACATTTTGACACCCCCA
【図１】
2020520922.tif 000003
【図２】
2020520922.tif 000004
【図３】
2020520922.tif 000005
【図４】
2020520922.tif 000006
【図５】
2020520922.tif 000007
【図６】
2020520922.tif 000008
【図７】
2020520922.tif 000009
【図８−１】
2020520922.tif 000010
【図８−２】
2020520922.tif 000011
【図９】
2020520922.tif 000012
【図１０】
2020520922.tif 000013
【図１１】
2020520922.tif 000014
【図１２】
2020520922.tif 000015
【図１３】
2020520922.tif 000016
【図１４】
2020520922.tif 000017
【図１５】
2020520922.tif 000018
【図１６】
2020520922.tif 000019
【図１７】
2020520922.tif 000020
【図１８】
2020520922.tif 000021
【図１９−１】
2020520922.tif 000022
【図１９−２】
2020520922.tif 000023
【図２０】
2020520922.tif 000024
【図２１−１】
2020520922.tif 000025
【図２１−２】
2020520922.tif 000026
【図２２】
2020520922.tif 000027
【図２３】
2020520922.tif 000028
【図２４】
2020520922.tif 000029
【図２５】
2020520922.tif 000030
【図２６−１】
2020520922.tif 000031
【図２６−２】
2020520922.tif 000032
【図２６−３】
2020520922.tif 000033
【図２７】
2020520922.tif 000034
【図２８】
2020520922.tif 000035
【図２９】
2020520922.tif 000036
【図３０】
2020520922.tif 000037
【図３１】
2020520922.tif 000038
【図３２−１】
2020520922.tif 000039
【図３２−２】
2020520922.tif 000040
【図３２−３】
2020520922.tif 000041
【配列表】
2020520922000001.app
【国際調査報告】
2020520922.tif 000042
2020520922.tif 000043
2020520922.tif 000044