(57)【要約】ある態様において、対象をアルツハイマー病に罹患していると診断する方法、および対象をアルツハイマー病に進行するリスクがあると予後診断する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料においてｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）の発現レベル、微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）の発現レベル、フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を決定することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、アルツハイマー病に進行するリスクがある対象を予後診断する方法：
基準値と比較して対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、または（ｉｖ）ＡＰＰもしくはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加のうち１つ以上を検出する；
これにより対象をアルツハイマー病に進行するリスクがあるとして予後診断する。
【請求項２】
対象が軽度認知障害を有している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
基準値と比較した対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のリン酸化の減少を検出することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
アルツハイマー病に進行するリスクがあると同定されている対象について、対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
治療介入が食生活改善を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
治療介入が脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
治療介入が対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
以下を含む、対象をアルツハイマー病に罹患していると診断する方法：
対象由来の試料において（ｉ）ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少のうち１つ以上は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【請求項１０】
以下を含む、請求項９記載の方法：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベルを測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【請求項１１】
以下を含む、請求項９記載の方法：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【請求項１２】
定量ＰＣＲによってＲＴＫＮ２およびＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
試料が、血液、血清、血漿または脳脊髄液を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
以下をさらに含む、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法：
対象由来の試料においてＦＯＸＯ１のリン酸化のレベルを測定する；および
対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のリン酸化のレベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のリン酸化の減少は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【請求項１５】
対象をアルツハイマー病に罹患していると同定した後に、対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
治療介入が食生活改善を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
治療介入が脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
治療介入が対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
以下を含む、アルツハイマー病の進行を遅延または改善することによって対象を処置する方法：
対象由来の試料において（ｉ）ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を測定する；
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの減少のうち１つ以上を有することを決定する；および
対象に治療介入を施す；これにより対象を処置する。
【請求項２０】
以下を含む、請求項１９記載の方法：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベルを測定する；および
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少を有することを決定する。
【請求項２１】
以下を含む、請求項１９記載の方法：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定する；および
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少を有することを決定する。
【請求項２２】
治療介入が食生活改善を含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
治療介入が脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
以下を含む、アルツハイマー病の進行を遅延する化合物を同定する方法：
（ａ）１以上の化合物を細胞または細胞集団に接触させる；
（ｂ）１以上の化合物が細胞または細胞集団におけるｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）の発現レベルを基準値と比較して増加させるか否かを決定する；および
（ｃ）細胞または細胞集団においてＲＴＫＮ２の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択する。
【請求項２５】
１以上の化合物が細胞または細胞集団における微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）の発現レベルを基準値と比較して増加させるか否かを決定すること、および細胞または細胞集団においてＭＡＳＴ４の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択することをさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
発現レベルが定量ＰＣＲによって測定される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞または細胞集団を１以上のストレス刺激にさらすこと、および１以上のストレス刺激の存在下において細胞生存を基準値と比較して増加させる１以上の化合物を選択することをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ストレス刺激がオキシステロールまたはパルミチン酸である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
細胞がヒト細胞である、請求項２４〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
細胞がアルツハイマー病に罹患している対象に由来している、請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
選択された１以上の化合物の構造関連類似体を化学合成することをさらに含む、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の化学合成された類似体。
【請求項３３】
請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法によって同定された化合物または請求項３２記載の化学合成された類似体を対象に投与することを含む、対象のアルツハイマー病の進行を遅延させる方法。
【請求項３４】
請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法によって同定された化合物または請求項３２記載の化学合成された類似体を対象に投与することを含む、軽度認知障害を有する対象においてアルツハイマー病への進行を遅延させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，０９１号の優先権を主張し、この出願は参照によってその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、記憶喪失、認知障害、および推論障害または判断障害を特徴とする進行性脳障害である。アルツハイマー病は認知症の最も一般的な形態であり、約５００万人のアメリカ人がこの疾患に罹患してい得ると推定されている。
【０００３】
長年の研究にもかかわらず、アルツハイマー病の病理を引き起こす機構は不明のままである。アミロイドカスケード仮説は、アルツハイマー病が細胞外沈着物中のアミロイドベータペプチド（Ａβ）の蓄積、オリゴマー化および凝集によって引き起こされることを提唱している。Ａβはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解的に生じるため、アルツハイマー病を処置するための治療手段は疾患を改善または停止させるために脳内のＡβの蓄積を防ぐことに集中している。しかしながら、脳内のＡβの負荷を減少させることを目的とした多数の薬物は、アルツハイマー病を処置できない。例えば、Castello et al., BMC Neurology, 2014, 14:169参照。さらに、認知機能が健常な集団のかなりの部分が脳内にＡβの蓄積を示し（例えば、Aizenstein et al., Arch Neurol, 2008, 65:1509-1517参照）、これはＡβが疾患を引き起こすのに必要でも十分でもないことを示している。
【０００４】
したがって、アルツハイマー病を診断する方法ならびにアルツハイマー病を処置する組成物および方法が未だ必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
ある態様において、アルツハイマー病に進行するリスクがある対象を予後診断する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
基準値と比較して対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、または（ｉｖ）ＡＰＰもしくはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加のうち１つ以上を検出する；
これにより対象をアルツハイマー病に進行するリスクがあると予後診断する。
【０００６】
いくつかの実施態様において、対象は軽度認知障害を有する。
【０００７】
いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少（例えば、基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の減少）を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少（例えば、基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の減少）を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加（例えば、基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の増加）を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料におけるＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加（例えば、基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の増加）を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、ならびに（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のうち少なくとも１つ以上を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料における（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のうち２つ以上を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料における（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）をそれぞれ検出することを含む。
【０００８】
いくつかの実施態様において、対象をアルツハイマー病に進行するリスクがあると予後診断する方法は、基準値と比較して対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のリン酸化の減少（例えば、基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の減少）を検出することをさらに含む。いくつかの実施態様において、対象をアルツハイマー病に進行するリスクがあると予後診断する方法は、基準値と比較して対象由来の試料におけるフィリピンのレベルの増加（例えば、基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の増加）を検出することをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病に進行するリスクがあると同定されている対象について、本方法は対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む。いくつかの実施態様において、治療介入は食生活改善を含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む。
【００１０】
別の態様において、対象をアルツハイマー病に罹患していると診断する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少のうち１つ以上は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベルを測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本方法は、定量ＰＣＲによってＲＴＫＮ２および／またはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＰＣＲと組み合わせたクロマチンＩＰによってＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルおよび／またはＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定することを含む。
【００１４】
いくつかの実施態様において、試料は、血液、血清、血漿または脳脊髄液を含む。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本方法は以下をさらに含む：
対象由来の試料においてＦＯＸＯ１のリン酸化のレベルを測定する；および
対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のリン酸化のレベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のリン酸化の減少は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【００１６】
いくつかの実施態様において、本方法は以下をさらに含む：
対象由来の試料においてフィリピンのレベルを測定する；および
対象由来の試料におけるフィリピンのレベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるフィリピンのレベルの増加は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【００１７】
いくつかの実施態様において、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定した後に、本方法は対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む。いくつかの実施態様において、治療介入は食生活改善を含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む。
【００１８】
別の態様において、検出方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象（例えば、アルツハイマー病に罹患しているリスクがある対象、またはアルツハイマー病に罹患していると推測される対象）由来の試料を取得する；および
対象由来の試料において（ｉ）ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を測定する。
【００１９】
いくつかの実施態様において、本方法は、定量ＰＣＲによってＲＴＫＮ２および／またはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、表１に開示される１以上のプライマーを用いて定量ＰＣＲによってＲＴＫＮ２および／またはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＰＣＲと組み合わせたクロマチンＩＰによってＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルおよび／またはＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、表１に開示される１以上のプライマーを用いてＰＣＲと組み合わせたクロマチンＩＰによってＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルおよび／またはＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定することを含む。
【００２０】
いくつかの実施態様において、試料は、血液、血清、血漿または脳脊髄液を含む。
【００２１】
別の態様において、アルツハイマー病の進行を遅延または改善することによって対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上を測定する；
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの減少のうち１つ以上を有することを決定する；および
対象に治療介入を施す；これにより対象を処置する。
【００２２】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベルを測定する；および
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、および（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少を有することを決定する；
【００２３】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定する；および
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少を有することを決定する。
【００２４】
いくつかの実施態様において、治療介入は食生活改善を含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む。
【００２５】
さらに別の態様において、アルツハイマー病の進行を遅延する化合物を同定する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
（ａ）１以上の化合物を細胞または細胞集団に接触させる；
（ｂ）１以上の化合物が細胞または細胞集団におけるｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）の発現レベルを基準値と比較して増加させるか否かを決定する；および
（ｃ）細胞または細胞集団においてＲＴＫＮ２の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択する。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本方法は、１以上の化合物が細胞または細胞集団における微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）の発現レベルを基準値と比較して増加させるか否かを決定すること、および細胞または細胞集団においてＭＡＳＴ４の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択することをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施態様において、発現レベルは定量ＰＣＲによって測定される。
【００２８】
いくつかの実施態様において、本方法は、細胞または細胞集団を１以上のストレス刺激にさらすこと、および１以上のストレス刺激の存在下において細胞生存を基準値と比較して増加させる１以上の化合物を選択することをさらに含む。いくつかの実施態様において、ストレス刺激はオキシステロールまたはパルミチン酸である。
【００２９】
いくつかの実施態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施態様において、細胞はアルツハイマー病に罹患している対象に由来する。
【００３０】
いくつかの実施態様において、本方法は、選択された１以上の化合物の構造関連類似体を化学合成することをさらに含む。
【００３１】
別の態様において、対象のアルツハイマー病の進行を遅延させる方法、または軽度認知障害を有する対象においてアルツハイマー病への進行を遅延させる方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、本明細書に記載の方法によって同定された化合物または化学合成されたその類似体を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を図に示す濃度の２７ＯＨＣで１８時間処理し、ＬＤＨ放出を決定した。２７ＯＨＣは、１０μＭ未満の濃度ではベースライン（溶媒のみ）と比較してＬＤＨの減少をもたらし、より高い濃度では用量依存的な細胞毒性をもたらすという二相応答を誘発した。
【図１Ｂ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を図に示す濃度の２４ＯＨＣで１８時間処理し、ＬＤＨ放出を決定した。種々の用量の２４ＯＨＣに応答したＬＤＨの変化は測定できなかった。
【図１Ｃ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。ＡＰＰを持たないＢ１０３細胞に、ＡＰＰの６９５アミノ酸アイソフォーム（Ｂ１０３−ＡＰＰ６９５）または空の宿主ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｂ１０３−ＥＶ）を安定に遺伝子導入し、図に示す濃度の２７ＯＨＣで１８時間処理し、ＬＤＨ放出を決定した。細胞傷害性はＡＰＰ非存在下において用量依存的であるが、Ｂ１０３−ＡＰＰ６９５細胞において（Ａ）に見られる二相性パターンと同等の二相性パターンに従う。
【図１Ｄ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。Ｂ１０３−ＥＶ細胞およびＢ１０３−ＡＰＰ６９５細胞を図に示すように２７ＯＨＣで処理し、膜の完全性をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイで測定および定量化した。緑色に染色された生細胞および赤色に染色された死細胞を示す、ＡＰＰを持たない細胞（Ｂ１０３−ＥＶ；上段のパネル）またはＡＰＰを発現する細胞（Ｂ１０３−ＡＰＰ６９５；下段のパネル）の代表的な顕微鏡写真。
【図１Ｅ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。Ｂ１０３−ＥＶ細胞およびＢ１０３−ＡＰＰ６９５細胞を図に示すように２７ＯＨＣで処理し、膜の完全性をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイで測定および定量化した。（Ｄ）に示された割合として示されるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを用いた細胞生存率の定量化、これは２７ＯＨＣに対するＡＰＰ依存的な二相応答を確認する。
【図１Ｆ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。ＡｐｐｗｔおよびＡｐｐｋｏ遺伝子型のマウス大脳皮質における網羅的な転写変化を示すボルケーノプロット。各円は１つの遺伝子を表す。
【図１Ｇ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。Ａｐｐｗｔ皮質とＡｐｐｋｏ皮質との間で最も著しく発現が変化した遺伝子の表示。
【図１Ｈ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス応答を誘発する。２７ＯＨＣに対するＡＰＰ依存的なホルミシス応答に関与する遺伝子を同定するための戦略の模式図。
【図１Ｉ】ＡＰＰは、２７ＯＨＣ細胞毒性に対するホルミシス応答を誘発する。ＡＰＰ、ＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＲＴＫＮ２に対する５μＭまたは５０μＭの２７ＯＨＣの効果について図示された仮説。細胞保護用量において、２７ＯＨＣはＡＩＣＤによるＭＡＳＴ４の調節を誘発し、これは次にＲＴＫＮ２のＦＯＸＯ１転写調節を導き得、細胞生存を最適化し得る。
【００３３】
【図２Ａ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。対照またはＡＰＰ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図２Ｂ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。ＡＰＰ６９５またはＡＰＰＧ７００Ａを遺伝子導入したＢ１０３細胞におけるＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図２Ｃ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。ラット皮質ニューロンにおけるＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図２Ｄ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡ。
【図２Ｅ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。ＡＰＰ６９５またはＡＰＰＧ７００Ａを遺伝子導入したＢ１０３細胞におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡ。
【図２Ｆ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。ラット皮質ニューロンにおけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡ。
【図２Ｇ】ＡＩＣＤは、ホルミシス濃度の２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる。ＡＰＰ ｓｉＲＮＡを含む、または含まない２７ＯＨＣに応答した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＭＡＳＴ４タンパク質発現。
【００３４】
【図３Ａ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。０、５、または５０μＭの２７ＯＨＣで処理した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からのＭＡＳＴ４の免疫沈降物におけるＦＯＸＯ１およびｐＳｅｒ−ＦＯＸＯ１の代表的なウエスタンブロット。５０μＭ ２７ＯＨＣに応答して、またはＩｇＧ対照免疫沈降物においてｐＳｅｒ−ＦＯＸＯ１の増加は生じなかった。組換えＦＯＸＯ１の非存在下においてｐＳｅｒ−ＦＯＸＯ１は検出されなかった。
【図３Ｂ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ＭＡＳＴ４ドメイン構造の模式図。推定されるキナーゼヌル変異体は、Ｅ６８２Ａ部位特異的変異誘発によって作成された。
【図３Ｃ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。対照（ＳＣＲ）、ＡＰＰまたはＭＡＳＴ４ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図３Ｄ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ＦＯＸＯ１野生型（ＦＯＸＯ１−ＷＴ）またはＤＮＡ結合欠損変異型（ＦＯＸＯ１−ＤＢＤ）を遺伝子導入した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図３Ｅ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ＡＰＰ６９５またはＡＰＰＧ７００Ａを遺伝子導入したＢ１０３細胞におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図３Ｆ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ラット皮質ニューロンにおけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合についてのＣｈＩＰアッセイ。
【図３Ｇ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。対照（ＳＣＲ）、ＡＰＰ、ＭＡＳＴ４およびＦＯＸＯ１ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ。
【図３Ｈ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ＦＯＸＯ１野生型（ＦＯＸＯ１−ＷＴ）またはＤＮＡ結合欠損変異型（ＦＯＸＯ１−ＤＢＤ）を遺伝子導入した神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ。
【図３Ｉ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ＡＰＰ６９５またはＡＰＰＧ７００Ａを遺伝子導入したＢ１０３細胞におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ。
【図３Ｊ】ＭＡＳＴ４キナーゼは、５μＭの２７ＯＨＣに応答してＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を調節し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させる。ラット皮質ニューロンにおけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ。
【００３５】
【図４Ａ】ＲＴＫＮ２タンパク質は、２７ＯＨＣに対するホルミシス応答を生じるのに必要である。細胞保護用量の２７ＯＨＣ（２．５および５μＭ）は、ＣｈＩＰアッセイによって測定されるように、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の減少をもたらす。
【図４Ｂ】ＲＴＫＮ２タンパク質は、２７ＯＨＣに対するホルミシス応答を生じるのに必要である。細胞保護用量の２７ＯＨＣ（２．５および５μＭ）はＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡの増加をもたらす。
【図４Ｃ】ＲＴＫＮ２タンパク質は、２７ＯＨＣに対するホルミシス応答を生じるのに必要である。細胞保護用量の２７ＯＨＣ（２．５および５μＭ）はタンパク質発現の増加をもたらす。
【図４Ｄ】ＲＴＫＮ２タンパク質は、２７ＯＨＣに対するホルミシス応答を生じるのに必要である。ＲＴＫＮ２ノックダウンは、活性化カスパーゼ３、活性化カスパーゼ７およびＢａｘ／Ｂｃｌ２比の発現プロファイルによって測定されるように、５μＭの２７ＯＨＣに曝露された細胞の細胞保護を改善する。
【００３６】
【図５Ａ】ＡＰＰの除去は、インビボ(in vivo)においてＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達を減少させた。ＡＰＰ＋／＋またはＡＰＰ−／−マウス皮質試料におけるＡＣＩＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合。Ｎ＝３回の独立した実験。
【図５Ｂ】ＡＰＰの除去は、インビボ(in vivo)においてＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達を減少させた。ＡＰＰ＋／＋またはＡＰＰ−／−マウス皮質試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡ存在量。Ｎ＝３回の独立した実験。
【図５Ｃ】ＡＰＰの除去は、インビボ(in vivo)においてＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達を減少させた。ＡＰＰ＋／＋またはＡＰＰ−／−マウス皮質試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合。Ｎ＝３回の独立した実験。
【図５Ｄ】ＡＰＰの除去は、インビボ(in vivo)においてＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達を減少させた。ＡＰＰ＋／＋またはＡＰＰ−／−マウス皮質試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ存在量。Ｎ＝３回の独立した実験。
【図５Ｅ】ＡＰＰの除去は、インビボ(in vivo)においてＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達を減少させた。ＡＰＰ＋／＋またはＡＰＰ−／−マウス皮質試料における定量化（下段のパネル）を伴うＭＡＳＴ４およびＲＴＫＮ２（上段のパネル）のイムノブロッティング。Ｎ＝３回の独立した実験。
【００３７】
【図６Ａ】高脂肪食を与えたマウスでは、ＡＣＩＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路が変化する。ＣｈＩＰは、ＡＣＩＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合が、対照食を与えたマウスと比較して高脂肪食を与えたマウスの脳において減少することを示し（図６Ａ）、これはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図６Ｂ）。
【図６Ｂ】高脂肪食を与えたマウスでは、ＡＣＩＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路が変化する。ＣｈＩＰは、ＡＣＩＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合が、対照食を与えたマウスと比較して高脂肪食を与えたマウスの脳において減少することを示し（図６Ａ）、これはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図６Ｂ）。
【図６Ｃ】高脂肪食を与えたマウスでは、ＡＣＩＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路が変化する。ＣｈＩＰは、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合が、対照食を与えたマウスと比較して高脂肪食を与えたマウスの脳において増加することを示し（図６Ｃ）、これはＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図６Ｄ）。
【図６Ｄ】高脂肪食を与えたマウスでは、ＡＣＩＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路が変化する。ＣｈＩＰは、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合が、対照食を与えたマウスと比較して高脂肪食を与えたマウスの脳において増加することを示し（図６Ｃ）、これはＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図６Ｄ）。
【図６Ｅ】高脂肪食を与えたマウスでは、ＡＣＩＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路が変化する。高脂肪食または対照食を与えたマウスの脳におけるＲＴＫＮ２タンパク質発現のウエスタンブロット。
【図６Ｆ】高脂肪食を与えたマウスでは、ＡＣＩＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路が変化する。高脂肪食または対照食を与えたマウスの脳におけるＲＴＫＮ２タンパク質発現の定量化。
【００３８】
【図７Ａ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＣｈＩＰは、ＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合が、認知機能的対照と比較して遅発性ＡＤ患者の側頭葉において減少することを示し（図７Ａ）、これはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図７Ｂ）。ＣｈＩＰを測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｂ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＣｈＩＰは、ＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合が、認知機能的対照と比較して遅発性ＡＤ患者の側頭葉において減少することを示し（図７Ａ）、これはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図７Ｂ）。ｍＲＮＡ存在量を測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｃ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＣｈＩＰは、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合が、認知機能的対照と比較して遅発性ＡＤ患者の側頭葉において増加することを示し（図７Ｃ）、これはＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図７Ｄ）。ＣｈＩＰを測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｄ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＣｈＩＰは、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合が、認知機能的対照と比較して遅発性ＡＤ患者の側頭葉において増加することを示し（図７Ｃ）、これはＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡの減少と同時に起こる（図７Ｄ）。ｍＲＮＡ存在量を測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｅ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤ患者および認知機能が健常な対照の側頭葉におけるＲＴＫＮ２レベルのウエスタンブロット。
【図７Ｆ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤ患者および認知機能が健常な対照の側頭葉におけるＲＴＫＮ２レベルの定量化。
【図７Ｇ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。キナーゼアッセイは、対照試料と比較した遅発性ＡＤ患者の側頭葉におけるＭＡＳＴ４キナーゼ活性の減少を立証する。
【図７Ｈ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。キナーゼアッセイは、対照試料と比較した遅発性ＡＤ患者の側頭葉におけるＭＡＳＴ４キナーゼ活性の減少を立証する。
【図７Ｉ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤおよびＦＴＤ患者由来の側頭葉におけるＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合。ＣｈＩＰを測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。Ｎ＝５の試料。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｊ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤおよびＦＴＤ患者由来の側頭葉におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡ存在量。ｍＲＮＡ存在量を測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。Ｎ＝５の試料。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｋ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤおよびＦＴＤ患者由来の側頭葉におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合。ＣｈＩＰを測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。Ｎ＝３の正常試料。Ｎ＝１１のＡＤ試料。Ｎ＝９のＦＴＤ試料。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｌ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤおよびＦＴＤ患者由来の側頭葉におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ存在量。ｍＲＮＡ存在量を測定値の倍率変化（ＦＣ）として表す。Ｎ＝３の正常試料。Ｎ＝１１のＡＤ試料。Ｎ＝９のＦＴＤ試料。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｍ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＡＤまたは正常な認知機能を有する患者由来の側頭葉試料からのＲＴＫＮ２のイムノブロッティング（上段のパネル）および定量化（下段のパネル）。パネルＭおよびＮは、各ゲルにロードした同一の３つの正常試料を含む。Ｎ＝３の正常試料。Ｎ＝１１のＡＤ試料。＊正常試料と比較してＰ＜０．０５の有意性である。
【図７Ｎ】ＡＩＣＤ／ＭＡＳＴ４／ＦＯＸＯ１シグナル伝達経路は遅発性ＡＤの側頭葉において変化するが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）において変化しない。ＦＴＤまたは正常な認知機能を有する患者由来の側頭葉試料からのＲＴＫＮ２のイムノブロッティング（上段のパネル）および定量化（下段のパネル）。パネルＭおよびＮは、各ゲルにロードした同一の３つの正常試料を含む。Ｎ＝３の正常試料。Ｎ＝９のＦＴＤ試料。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ｉ．イントロダクション
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、タンパク質分解的に切断された場合にアミロイドベータペプチド（Ａβ）を生成する前駆体分子である。脳内におけるＡＰＰの生物学的機能は未解決のままであり、遅発性アルツハイマー病の病因の理解を妨げる欠点である。アルツハイマー病の原因および処置に関する研究のほとんどはアミロイドカスケード仮説の前提によって推進され、これはアルツハイマー病が細胞外沈着物におけるアミロイドベータペプチド（Ａβ）の蓄積、オリゴマー化および凝集によって引き起こされると提唱している。しかしながら、アミロイドカスケード仮説は、ＡＰＰの役割を単に一次病原性カスケード(primary pathogenic cascade)におけるＡβの前駆体とみなすものであり、利用可能な証拠に適合しない。例えば、Castello et al., BMC Neurol, 2014, 14:169; Castellani et al, J Alzheimers Dis, 2009, 18:447-452;およびHerrup, Nat Neurosci, 2015, 18:794-799参照。
【００４０】
代替の仮説は、アルツハイマー病がどのように発生および発症するかについて提唱されている。この仮説は適応応答仮説と呼ばれ、Ａβが脳内の慢性的なストレス（酸化ストレス、代謝調節異常（例えば、コレステロール恒常性およびインスリン抵抗性）、遺伝的要因および炎症反応など）に応答して調節される保護分子であると仮定する。この仮説において、Ａβの存在は疾患発症のマーカーではなく、進行中のストレス過程の証拠である。Castello et al., BMC Neurol, 2014, 14:169;およびCastello et al., Ageing Research Reviews, 2014, 13:10-12参照。
【００４１】
本明細書に記述されるように、ＡＰＰはアルツハイマー病の脳におけるコレステロール調節異常の初期マーカーに対する適応応答を調節し、コレステロール酸化から脳を保護することが見出されている。特定の理論に拘束されないが、遺伝子ＲＴＫＮ２、ＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＡＰＰは、ストレス刺激に対するホルミシス適応応答において機能する「脳保護物質」として働くと考えられる。アルツハイマー病に罹患している患者において、これらの遺伝子の発現および／または活性は著しく不足している。したがって、ある態様において、これらの遺伝子は対象をアルツハイマー病に罹患していると診断するためのバイオマーカーである。対象由来の血液試料においてアッセイされ得るこれらのバイオマーカーの同定は、少なくともアルツハイマー病を診断する低侵襲の方法を提供するため、および疾患の初期段階で発生する分子の変化を検出できるため有用である。さらに、以下に詳述されるように、治療介入は、これらの「脳保護」遺伝子の発現または活性を増加させ、これによりアルツハイマー病の進行を遅延または改善するように設計され得る。
【００４２】
ＩＩ．定義
本明細書における用語は特定の実施態様を説明することのみを目的とし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定することを意図しない。他に定義されない限り、本明細書におけるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を持つ。本明細書および添付の特許請求の範囲において、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義される多数の用語が参照される。例えば、通常理解される意味を持つ用語は本明細書において明確性のために、および／または容易に参照できるように定義され、このような定義を本明細書に包含することは、当分野で通常理解される用語の定義との実質的な差異を示すものと解釈されるべきではない。
【００４３】
範囲を含むあらゆる数値表示（例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量）は、必要に応じて０．１または１．０の増加量で（＋）または（−）に変動する近似値である。必ずしも明記されているわけではないが、あらゆる数値表示の前に「約」という用語があることが理解されるはずである。
【００４４】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかな他の指示がない限り複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「化合物(a compound)」への言及は複数の化合物を包含する。
【００４５】
用語「含む」は、化合物、組成物および方法が記載されている要素を包含するが、他の要素を排除しないことを意味することが意図される。化合物、組成物および方法を定義するのに使用される場合、「から本質的になる」は、請求項に係る発明の基本的な特徴および新規な特徴に実質的に影響を及ぼす他の要素を排除することを意味する。「からなる」は、請求項に明記されていないあらゆる要素、工程または成分を排除することを意味する。これらの各移行用語(transition term)によって定義される実施態様は、本発明の範囲内である。
【００４６】
本明細書において、「アルツハイマー病」は進行性認知障害を特徴とする疾患を指す。アルツハイマー病の症状は通常、病気が進行するにつれて徐々に悪化し、疾患は通常３つの段階を経て進行する：「軽度」（アルツハイマー病の初期段階形態）、「中程度」（中期段階形態）、および「重度」（後期段階形態）。軽度のアルツハイマー病において、症状には例えば、記憶喪失、物の紛失または置き忘れ、名前の記憶障害または言葉を思い出すことの障害、計画または整理の困難度の上昇、通常の日常作業の完了により長い時間がかかること、および質問の繰り返しが含まれる。中程度のアルツハイマー病（これは通常、多くの患者において疾患の最も長い段階である）では、言語、推論、感覚処理および意識的思考を制御する脳の領域に損傷が生じる。この段階において、症状には例えば、出来事または自分の経歴の健忘、家族および友人を認識することの問題、新たな情報を学ぶことができないこと、多段階の作業の実行困難、衝動的行動、睡眠パターンの変化、幻覚、妄想およびパラノイアが含まれ得る。重度のアルツハイマー病では、記憶力および認知能力が悪化し続け、患者は通常、自分の環境に対応する能力、会話を続ける能力、および／または動作を制御する能力を失い、患者は日常活動およびパーソナルケアについて高度な支援を必要とする。
【００４７】
いくつかの実施態様において、患者は「遅発性」アルツハイマー病に罹患しており、これは患者が約６５歳以降に疾患の臨床症状を示すアルツハイマー病の一種を指す。いくつかの実施態様において、患者は「早発性」アルツハイマー病に罹患しており、これは患者が６５歳より前に疾患の臨床症状の発症を示すアルツハイマー病の一種を指す。いくつかの実施態様において、早発性アルツハイマー病に罹患している患者は、３０代、４０代または５０代で疾患の臨床症状の発症を示す。いくつかの実施態様において、早発性アルツハイマー病は早発性家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）であり、これはＡＰＰプロセシングに影響を与える常染色体優性突然変異によって引き起こされる遺伝型のアルツハイマー病である。
【００４８】
本明細書において、「軽度認知障害」は、個人の年齢および教育レベルから予想されるものよりも大きいが、日常生活の活動を特に妨げない認知能力（記憶力および思考能力など）の低下を特徴とする障害を指す。Gauthier et al., Lancet, 2006, 367-1262-1270参照。
【００４９】
本明細書において、「ＲＴＫＮ２」は「ｒｈｏｔｅｋｉｎ２」を指す。ＲＴＫＮ２遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｒｈｏ結合ドメインおよびプレクストリン相同ドメインの存在によって部分的に特徴付けられるＲｈｏ−ＧＴＰアーゼエフェクターである。Collier et al., Biochem Biophys Res Commun, 2004, 324:1360-1360参照。ヒトＲＴＫＮ２遺伝子およびタンパク質配列（現在知られているあらゆるスプライスバリアントおよびアイソフォームバリアントを含む）は例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５３０７．３、ＮＭ＿００１２８２９４１．１、ＸＲ＿００１７４７０５３．１、ＸＲ＿９４５６１８．２、ＸＭ＿０１７０１５８４４．１、ＸＭ＿０１７０１５８４２．１、ＸＭ＿０１１５３９４５６．２、ＡＡＩ４２７２６．１、ＡＡＩ４１８２２．１、ＡＡＨ２５７６５．１、ＮＰ＿００１２６９８７０．１、ＮＰ＿６６０３５０．２、ＸＰ＿０１６８７１３３３．１、ＸＰ＿０１６８７１３３２．１、ＸＰ＿０１６８７１３３１．１、ＸＰ＿０１１５３７７６２．１、ＸＰ＿０１１５３７７５９．１、ＸＰ＿０１１５３７７５８．１、およびＡＡＮ７１７３８．１に記載されている。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法に従って検出されるＲＴＫＮ２遺伝子またはタンパク質は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５３０７．３、ＮＭ＿００１２８２９４１．１、ＸＲ＿００１７４７０５３．１、ＸＲ＿９４５６１８．２、ＸＭ＿０１７０１５８４４．１、ＸＭ＿０１７０１５８４２．１、ＸＭ＿０１１５３９４５６．２、ＡＡＩ４２７２６．１、ＡＡＩ４１８２２．１、ＡＡＨ２５７６５．１、ＮＰ＿００１２６９８７０．１、ＮＰ＿６６０３５０．２、ＸＰ＿０１６８７１３３３．１、ＸＰ＿０１６８７１３３２．１、ＸＰ＿０１６８７１３３１．１、ＸＰ＿０１１５３７７６２．１、ＸＰ＿０１１５３７７５９．１、ＸＰ＿０１１５３７７５８．１、またはＡＡＮ７１７３８．１のいずれかに記載の天然に存在するＲＴＫＮ２遺伝子またはタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するバリアントである。
【００５０】
本明細書において、「ＭＡＳＴ４」は、「微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４」を指す。ＭＡＳＴ４遺伝子によってコードされるタンパク質は、セリンスレオニンキナーゼドメインおよびＰＤＺドメインの存在によって特徴付けられるキナーゼである。Garland et al., Brain Res, 2008, 1195_12-19参照。ヒトＭＡＳＴ４遺伝子およびタンパク質配列（現在知られているあらゆるスプライスバリアントおよびアイソフォームバリアントを含む）は例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２９７６５１．１、ＮＧ＿０３４０３６．１、ＮＭ＿００１２９０２２７．１、ＮＭ＿００１２９０２２６．１、ＮＭ＿００１１６４６６４．１、ＮＭ＿０１５１８３．２、ＮＭ＿１９８８２８．２、ＸＭ＿０１７００９４５３．１、ＸＭ＿０１７００９４５２．１、ＸＭ＿０１７００９４５１．１、ＸＭ＿００６７１４６１０．２、ＸＭ＿０１１５４３３８６．２、ＸＭ＿０１１５４３３８５．２、ＸＭ＿０１７００９４５０．１、ＸＭ＿０１１５４３３８４．２、ＸＭ＿００６７１４６０６．３、ＸＭ＿０１７００９４４９．１、ＸＭ＿０１７００９４４８．１、ＸＭ＿０１１５４３３８２．２、ＸＭ＿０１７００９４４７．１、ＮＰ＿００１２８４５８０．１、ＮＰ＿００１２７７１５６．１、ＮＰ＿００１２７７１５５．１、ＮＰ＿００１１５８１３６．１、ＮＰ＿０５５９９８．１、ＮＰ＿９４２１２３．１、ＸＰ＿０１６８６４９４２．１、ＸＰ＿０１６８６４９４１．１、ＸＰ＿０１６８６４９４０．１、ＸＰ＿０１６８６４９３９．１、ＸＰ＿０１６８６４９３８．１、ＸＰ＿０１６８６４９３７．１、ＸＰ＿０１６８６４９３６．１、ＸＰ＿０１１５４１６８８．１、ＸＰ＿０１１５４１６８７．１、ＸＰ＿０１１５４１６８６．１、ＸＰ＿０１１５４１６８４．１、ＸＰ＿００６７１４６７３．１、およびＸＰ＿００６７１４６６９．１、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースアクセッション番号Ｏ１５０２１．３に記載されている。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法に従って検出されるＭＡＳＴ４遺伝子またはタンパク質は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２９７６５１．１、ＮＧ＿０３４０３６．１、ＮＭ＿００１２９０２２７．１、ＮＭ＿００１２９０２２６．１、ＮＭ＿００１１６４６６４．１、ＮＭ＿０１５１８３．２、ＮＭ＿１９８８２８．２、ＸＭ＿０１７００９４５３．１、ＸＭ＿０１７００９４５２．１、ＸＭ＿０１７００９４５１．１、ＸＭ＿００６７１４６１０．２、ＸＭ＿０１１５４３３８６．２、ＸＭ＿０１１５４３３８５．２、ＸＭ＿０１７００９４５０．１、ＸＭ＿０１１５４３３８４．２、ＸＭ＿００６７１４６０６．３、ＸＭ＿０１７００９４４９．１、ＸＭ＿０１７００９４４８．１、ＸＭ＿０１１５４３３８２．２、ＸＭ＿０１７００９４４７．１、ＮＰ＿００１２８４５８０．１、ＮＰ＿００１２７７１５６．１、ＮＰ＿００１２７７１５５．１、ＮＰ＿００１１５８１３６．１、ＮＰ＿０５５９９８．１、ＮＰ＿９４２１２３．１、ＸＰ＿０１６８６４９４２．１、ＸＰ＿０１６８６４９４１．１、ＸＰ＿０１６８６４９４０．１、ＸＰ＿０１６８６４９３９．１、ＸＰ＿０１６８６４９３８．１、ＸＰ＿０１６８６４９３７．１、ＸＰ＿０１６８６４９３６．１、ＸＰ＿０１１５４１６８８．１、ＸＰ＿０１１５４１６８７．１、ＸＰ＿０１１５４１６８６．１、ＸＰ＿０１１５４１６８４．１、ＸＰ＿００６７１４６７３．１、もしくはＸＰ＿００６７１４６６９．１またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースアクセッション番号Ｏ１５０２１．３のいずれかに記載の天然に存在するＭＡＳＴ４遺伝子またはタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するバリアントである。
【００５１】
本明細書において、「ＦＯＸＯ１」は「フォークヘッドボックスＯ１」を指す。ＦＯＸＯ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、フォークヘッドドメインの存在によって特徴付けられ、細胞ストレスに応答して多様な細胞内システムを調節する転写因子である。Martins et al., Aging Cell, 2016, 15:196-207参照。ヒトＦＯＸＯ１遺伝子およびタンパク質配列（あらゆるスプライスバリアントおよびアイソフォームバリアントを含む）は例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿０２３２４４．１、ＮＭ＿００２０１５．３、ＮＣ＿００００１３．１１、ＮＣ＿０１８９２４．２、ＸＭ＿０１１５３５０１０．２、ＸＭ＿０１１５３５００８．２、ＢＣ０７００６５．１、ＢＣ０２１９８１．２、ＨＦ５８３６６６．１、ＮＰ＿００２００６．２、ＸＰ＿０１１５３３３１２．１、ＸＰ＿０１１５３３３１０．１、ＡＡＨ７００６５．３、ＡＡＨ２１９８１．１、およびＣＣＱ４３１６３．１に記載されている。いくつかの実施態様において、ＦＯＸＯ１遺伝子またはタンパク質は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿０２３２４４．１、ＮＭ＿００２０１５．３、ＮＣ＿００００１３．１１、ＮＣ＿０１８９２４．２、ＸＭ＿０１１５３５０１０．２、ＸＭ＿０１１５３５００８．２、ＢＣ０７００６５．１、ＢＣ０２１９８１．２、ＨＦ５８３６６６．１、ＮＰ＿００２００６．２、ＸＰ＿０１１５３３３１２．１、ＸＰ＿０１１５３３３１０．１、ＡＡＨ７００６５．３、ＡＡＨ２１９８１．１、またはＣＣＱ４３１６３．１のいずれかに記載の天然に存在するＦＯＸＯ１遺伝子またはタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するバリアント（例えば、多型バリアント、スプライスバリアントまたは切断型タンパク質）である。
【００５２】
本明細書において、「ＡＰＰ」は「アミロイド前駆体タンパク質」を指す。ＡＰＰ遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｅ１ドメインおよびＥ２ドメインを有するＩ型膜タンパク質である。ＡＰＰタンパク質の切断は、アミロイドベータ（Ａβ）フラグメントおよびＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を生成する。Zheng et al., Mol Neurodegener, 2006, 1:5 (doi: 10.1186/1750-1326-1-5)参照。ヒトＡＰＰ遺伝子およびタンパク質配列（あらゆるスプライスバリアントおよびアイソフォームバリアントを含む）は例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５２９５．２、ＮＭ＿０００４８４．３、ＮＭ＿００１１３６１３１．２、ＮＭ＿００１１３６０１６．３、ＮＭ＿００１２０４３０３．１、ＮＭ＿００１２０４３０１．１、ＮＭ＿００１２０４３０２．１、ＮＭ＿２０１４１４．２、ＮＭ＿２０１４１３．２、ＮＭ＿００１１３６１２９．２、ＮＭ＿００１１３６１３０．２、ＢＣ０６５５２９．１、ＢＣ００４３６９．１、ＨＦ５８３４３５．１、Ｘ０６９８９．１、Ｄ８７６７５．１、ＡＡＢ５９５０２．１、ＡＡＢ５９５０１．１、ＮＰ＿０００４７５．１、ＮＰ＿００１１９１２３２．１、ＮＰ＿００１１９１２３０．１、ＮＰ＿００１１９１２３１．１、ＮＰ＿００１１２９６０３．１、ＮＰ＿００１１２９６０２．１、ＮＰ＿００１１２９６０１．１、ＮＰ＿００１１２９４８８．１、ＮＰ＿９５８８１７．１、ＮＰ＿９５８８１６．１、ＥＡＸ０９９６６．１、ＥＡＸ０９９６５．１、ＥＡＸ０９９６４．１、ＥＡＸ０９９６３．１、ＥＡＸ０９９６２．１、ＥＡＸ０９９６１．１、ＥＡＸ０９９６０．１、ＥＡＸ０９９５９．１、ＥＡＸ０９９５８．１、ＥＡＸ０９９５７．１、ＡＡＨ６５５２９．１、ＡＡＷ８２４３５．１、ＣＡＡ３００５０．１、およびＢＡＡ２２２６４．１に記載されている。いくつかの実施態様において、ＡＰＰ遺伝子またはタンパク質は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５２９５．２、ＮＭ＿０００４８４．３、ＮＭ＿００１１３６１３１．２、ＮＭ＿００１１３６０１６．３、ＮＭ＿００１２０４３０３．１、ＮＭ＿００１２０４３０１．１、ＮＭ＿００１２０４３０２．１、ＮＭ＿２０１４１４．２、ＮＭ＿２０１４１３．２、ＮＭ＿００１１３６１２９．２、ＮＭ＿００１１３６１３０．２、ＢＣ０６５５２９．１、ＢＣ００４３６９．１、ＨＦ５８３４３５．１、Ｘ０６９８９．１、Ｄ８７６７５．１、ＡＡＢ５９５０２．１、ＡＡＢ５９５０１．１、ＮＰ＿０００４７５．１、ＮＰ＿００１１９１２３２．１、ＮＰ＿００１１９１２３０．１、ＮＰ＿００１１９１２３１．１、ＮＰ＿００１１２９６０３．１、ＮＰ＿００１１２９６０２．１、ＮＰ＿００１１２９６０１．１、ＮＰ＿００１１２９４８８．１、ＮＰ＿９５８８１７．１、ＮＰ＿９５８８１６．１、ＥＡＸ０９９６６．１、ＥＡＸ０９９６５．１、ＥＡＸ０９９６４．１、ＥＡＸ０９９６３．１、ＥＡＸ０９９６２．１、ＥＡＸ０９９６１．１、ＥＡＸ０９９６０．１、ＥＡＸ０９９５９．１、ＥＡＸ０９９５８．１、ＥＡＸ０９９５７．１、ＡＡＨ６５５２９．１、ＡＡＷ８２４３５．１、ＣＡＡ３００５０．１、またはＢＡＡ２２２６４．１のいずれかに記載の天然に存在���るＡＰＰ遺伝子またはタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するバリアント（例えば、多型バリアント、スプライスバリアントまたは切断型タンパク質）である。いくつかの実施態様において、ＡＰＰタンパク質はＡＰＰ細胞内ドメインを含むフラグメントであり、これはアミノ酸７１２〜７７０（配列ＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧＶＶＥＶＤＡＡＶＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮを有する）に包括的に及ぶγセクレターゼＣ末端フラグメント５９、またはアミノ酸７１４〜７７０（配列ＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧＶＶＥＶＤＡＡＶＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮを有する）に包括的に及ぶγセクレターゼＣ末端フラグメント５７、またはアミノ酸７２１〜７７０（配列ＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧＶＶＥＶＤＡＡＶＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮを有する）に包括的に及ぶγセクレターゼＣ末端フラグメント５０と呼ばれる（全ての数は７７０アミノ酸を含むＡＰＰアイソフォームに対応する）。
【００５３】
２以上のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」または「割合同一性」は、同一の２以上の配列、または特定の領域にわたって同一である特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチド（例えば約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する２以上の配列を指す。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較し、割合同一性を決定する方法は当分野に記述されている。例えば、Roberts et al., BMC Bioinformatics, 7:382, 2006参照、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は本明細書において互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーならびにそれらの相補体を指す。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）である。他の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば縮重コドン置換）、多型バリアント（例えばＳＮＰ）、スプライスバリアント、およびタンパク質の切断型をコードする核酸配列、相補配列ならびに明示された配列を暗黙的に包含する。
【００５５】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書において、この用語はあらゆる長さのアミノ酸鎖（全長タンパク質および切断型タンパク質を含む）を包含する。
【００５６】
本明細書において、「フィリピン」は、ストレプトマイセス・フィリピネンシス(Streptomyces filipinensis)から最初に単離された固有の蛍光を示すポリエンマクロライド化合物を指す。フィリピンは、脂質調節異常の疾患のための診断ツールとして当分野で公知である。例えば、Distl et al., The Journal of Pathology, 2003, 200:104-111参照。フィリピンの構造および蛍光特性は、例えばCastanho et al., Eur. J. Biochem., 1992, 207:125-134およびXu et al., J. Biol. Chem., 2010, 285:16844-16853に記述されている。
【００５７】
本明細書において、用語「化合物」は、天然に存在するか、または合成のあらゆる分子（例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴペプチド（例えば約５〜約２５アミノ酸長、好ましくは約１０〜２０または１２〜１８アミノ酸長、好ましくは１２、１５または１８アミノ酸長）、有機小分子、多糖、ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣物、脂質、脂肪酸、ｓｉＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）を指す。
【００５８】
本明細書において、「類似体」は、１以上の原子または官能基が親化合物と異なっている親化合物の構造誘導体である化合物を指す。いくつかの実施態様において、類似体は、親化合物と比較して同等または優れた安定性、溶解性、有効性および半減期などを有する。
【００５９】
本明細書において、「生物学的試料」は、ヒト対象または非ヒト哺乳類対象から得られる体組織または体液を指す。いくつかの実施態様において、試料には、血液、血液分画もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球および末梢血単核細胞など）、痰もしくは唾液、便、尿、他の体液（例えば、リンパ液、唾液、前立腺液、胃液、腸液、腎液、肺液および脳脊髄液など）、組織（例えば、腎臓、肺、肝臓、心臓、脳、神経組織、甲状腺、眼、骨格筋、軟骨または骨組織）、または培養細胞（例えば、初代培養細胞、外植片、形質転換細胞または幹細胞）が含まれる。いくつかの実施態様において、生物学的試料は血液を含む。いくつかの実施態様において、生物学的試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。
【００６０】
「対象」は哺乳類であり、いくつかの実施態様においてヒトである。また、哺乳類には、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、スポーツ動物(sport animal)、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットが含まれ得るが、これらに限定されない。 
【００６１】
本明細書において、用語「処置」、「処置している」および「処置する」は、あらゆる客観的または主観的パラメータ（軽減；寛解；症状の軽減、または傷害、疾患もしくは状態を対象により許容できるものにすること；悪化または衰退の速度の遅延；悪化の終点をより衰弱していないようにすること；および／または対象の身体的健康または精神的健康の改善など）を含む、傷害、疾患または状態の処置または改善の成功のあらゆる兆候を指す。
【００６２】
用語「医薬組成物」は対象への投与に適した組成物を指す。一般に、医薬組成物は無菌であり、好ましくは対象に望ましくない応答を誘発できる混入物質を含まない。医薬組成物は、それを必要とする対象に多数の異なる投与経路（経口、静脈内、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下および吸入などを含む）を介して投与されるように設計され得る。
【００６３】
ＩＩＩ．診断方法および検出方法
ある態様において、対象をアルツハイマー病に罹患していると診断する方法または対象のアルツハイマー病を検出する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法は遅発性アルツハイマー病を診断または検出することに関する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法は早発性アルツハイマー病を診断または検出することに関する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法は軽度および／または中程度のアルツハイマー病を診断または検出することに関する。別の態様において、アルツハイマー病に関連していることが見出されている一連のバイオマーカーを対象において検出する方法が提供される。
【００６４】
ＲＴＫＮ２、ＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＡＰＰバイオマーカー
本明細書に記載されるように、ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）および微小管結合セリンスレオニンキナーゼ４（ＭＡＳＴ４）の発現ならびにフォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の活性は、アルツハイマー病の対象の脳において異常調節されていることが見出されている。したがって、ある態様において、本開示は、ＦＯＸＯ１およびＡＰＰタンパク質のそれぞれＲＴＫＮ２およびＭＡＳＴ４のプロモーターへの結合によって測定されるように、ＲＴＫＮ２およびＭＡＳＴ４遺伝子の一方または両方の発現レベルの変化、および／またはＦＯＸＯ１およびＡＰＰタンパク質の一方または両方の活性レベルの変化を対象由来の試料において検出することによってアルツハイマー病を診断する方法を提供した。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）を測定する；および
対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）を対照試料（例えば、アルツハイマー病に罹患していないことが知られている健常対象）と比較する；
ここで、対照試料と比較した対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２の発現の減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４の発現の減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少のうち１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）は、対象をアルツハイマー病に罹患していると同定する。
【００６５】
いくつかの実施態様において、対象がＲＴＫＮ２の発現の減少、ＭＡＳＴ４の発現の減少、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加、およびＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少のうち１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）を有すると同定され、アルツハイマー病に罹患していると同定されている場合、本方法は対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む。いくつかの実施態様において、治療介入は以下のＶ節に記述される介入である。
【００６６】
別の態様において、対象由来の試料においてバイオマーカーＲＴＫＮ２およびＭＡＳＴ４の発現レベルならびにバイオマーカーＦＯＸＯ１およびＡＰＰの活性レベルを検出する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料を取得する；および
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）を測定する。
【００６７】
いくつかの実施態様において、対象が閾値レベル（例えば健常対象の集団について決定された基準値）未満のＲＴＫＮ２の発現レベル、閾値レベル（例えば健常対象の集団について決定された基準値）未満のＭＡＳＴ４の発現レベル、閾値レベルより高いＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および閾値レベル（例えば健常対象の集団について決定された基準値）未満のＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルのうち１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）を有すると同定された場合、本方法は対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む。いくつかの実施態様において、治療介入は以下の節Ｖに記載される介入である。
【００６８】
いくつかの実施態様において、本方法はＲＴＫＮ２ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法はＲＴＫＮ２タンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、対象（本明細書において「テスト対象」とも呼ばれる）が基準値（例えば、テスト対象と年齢を適合させた健常対象の集団についてのＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルから決定される基準値）未満のＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを有している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。
【００６９】
いくつかの実施態様において、本方法はＭＡＳＴ４ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法はＭＡＳＴ４タンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、対象（または「テスト対象」）が基準値（例えば、テスト対象と年齢を適合させた健常対象の集団についてのＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルから決定される基準値）未満のＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを有している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。
【００７０】
ポリヌクレオチド発現の測定
いくつかの実施態様において、ＲＴＫＮ２およびＭＡＳＴ４の一方または両方についてポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）発現のレベルが決定される。ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）発現は、日常的な技術（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、半定量ＲＴ−ＰＣＲ、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックス分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、マイクロアレイハイブリダイゼーションまたは配列解析（例えばＲＮＡシーケンシング（「ＲＮＡ−Ｓｅｑ」））など）を用いて分析され得る。ポリヌクレオチド発現を定量化する方法は、例えばFassbinder-Orth, Integrative and Comparative Biology, 2014, 54:396-406; Thellin et al., Biotechnology Advances, 2009, 27:323-333;およびZheng et al., Clinical Chemistry, 2006, 52:7 (doi: 10/1373/clinchem.2005.065078)に記述されている。
【００７１】
いくつかの実施態様において、リアルタイムまたは定量ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは、生物学的試料中のポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のレベルを測定するのに使用される。例えば、Nolan et al., Nat. Protoc, 2006, 1:1559-1582; Wong et al., BioTechniques, 2005, 39:75-75参照。遺伝子発現を測定する定量ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイもまた市販されている（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ、ThermoFisher Scientific）。ｑＰＣＲの例示的なプライマー配列を表１に示す。
【００７２】
いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）発現はシーケンシングによって測定される。配列解析の限定されない例には、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、サーマルサイクルシーケンシング(Sears et al., Biotechniques, 13:626-633 (1992))、固相シーケンシング(Zimmerman  et al., Methods Mol. Cell Biol., 3:39-42 (1992))、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ；Fu et al., Nature Biotech., 16:381-384 (1998)）などの質量分析を用いたシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング(Drmanac et al., Nature Biotech., 16:54-58 (1998))、および「次世代シーケンシング」法（限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、これらはそれぞれIlluminaから入手可能である）、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Life Technologies）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Life Technologies）およびパイロシーケンシング（例えば、４５４（商標）シーケンシング、Roche Diagnostics）を含む）が含まれる。例えば、Liu et al., J. Biomed Biotechnol, 2012, 2012:251364参照、これは参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド発現はＲＮＡ−Ｓｅｑ技術を用いて測定される。例えば、Finotello et al., Briefings in Functional Genomics, 2014, doi:10.1093/bfgp/elu035;およびMortazavi et al., Nat Methods, 2008, 5:621-628参照。
【００７３】
検出可能な成分が、本明細書に記載のアッセイにおいて使用され得る（直接検出または間接検出）。必要とされる感度、プローブとの結合の容易さ、安定性の要求、ならびに利用可能な機器および廃棄規定に応じた標識の選択を伴って、多種多様な検出可能な成分が使用され得る。適切な検出可能な成分には、限定されないが、放射性核種、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート(tetrarhodimine isothiocynate)（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、蛍光マーカー（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリンなど）、腫瘍関連プロテアーゼによって活性化される自己消光(autoquenched)蛍光化合物、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、および金属などが含まれる。
【００７４】
タンパク質発現の測定
いくつかの実施態様において、ＲＴＫＮ２およびＭＡＳＴ４の一方または両方についてタンパク質発現のレベルが決定される。タンパク質発現は、日常的な技術（当業者に公知の免疫測定法、二次元ゲル電気泳動および定量的質量分析など）を用いて生物学的試料において検出および定量化され得る。タンパク質定量化技術は、"Strategies for Protein Quantitation," Principles of Proteomics, 2nd Edition, R. Twyman, ed., Garland Science, 2013に一般的に記述されている。いくつかの実施態様において、タンパク質発現は免疫測定法（限定されないが、競合的酵素免疫測定法（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ）、および微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）などの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）；キャピラリー電気泳動免疫測定法（ＣＥＩＡ）；放射免疫測定法（ＲＩＡ）；免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）；免疫蛍光法（ＩＦ）；蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）；および化学発光アッセイ（ＣＬ）など）によって検出される。必要に応じて、このような免疫測定法は自動化され得る。また、免疫測定法はレーザー誘起蛍光と組み合わせて使用され得る（例えば、Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-80 (1997)参照）。
【００７５】
抗体のタンパク質への特異的な免疫学的結合は、直接的または間接的に検出され得る。直接標識には、抗体に結合している蛍光タグまたは発光タグ、金属、色素、および放射性核種などが含まれる。ヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識された抗体が使用され得る。タンパク質マーカーに特異的な化学発光抗体を用いた化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度な非放射性検出に適している。蛍光色素で標識された抗体もまた適している。蛍光色素の例には、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびリサミンが含まれるが、これらに限定されない。間接標識には当分野で周知の様々な酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼおよびウレアーゼなど）が含まれる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出システムは、例えば発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用され得、これは過酸化水素存在下において４５０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生じる。アルカリホスファターゼ検出システムは、発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸塩と共に使用され得、これは例えば、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生じる。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出システムは、発色基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に使用され得、これは４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生じる。ウレアーゼ検出システムは、尿素−ブロモクレゾールパープル(Sigma Immunochemicals; St. Louis, MO)などの基質と共に使用され得る。
【００７６】
直接標識または間接標識からの信号は、例えば、発色基質由来の色を検出するための分光光度計；放射線を検出するための放射線測定器（１２５Ｉを検出するためのガンマカウンターなど）；または特定の波長の光の存在下において蛍光を検出するための蛍光光度計を用いて分析され得る。酵素結合抗体の検出のために、定量分析が分光光度計（ＥＭＡＸマイクロプレートリーダー(Molecular Devices; Menlo Park, CA)など）を用いて製造者の説明書に従って行われ得る。必要に応じて、アッセイは自動化またはロボット制御で実行され得、複数の試料からの信号が同時に検出され得る。いくつかの実施態様において、信号の量は、自動化されたハイコンテントなイメージングシステムを用いて定量化され得る。ハイコンテントなイメージングシステムは市販されている（例えば、ImageXpress, Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA）。
【００７７】
抗体は様々な固体支持体（磁性またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（例えばマイクロタイターウェル）の表面、および固体基板物質または膜（例えばプラスチック、ナイロン、紙）の一部など）上に固定化され得る。有用な物理フォーマットには、複数の個別のアドレス可能な位置を有する表面（タンパク質マイクロアレイまたは「タンパク質チップ」など）（例えば、Ng et al., J. Cell Mol. Med., 6:329-340 (2002)参照）および特定のキャピラリーデバイス（例えば、米国特許第６，０１９，９４４号参照）が含まれる。これらの実施態様において、個別の各表面位置は、各位置における検出のために１以上のタンパク質マーカーを固定化する抗体を含み得る。あるいは、表面は、表面の個別の位置に固定化された１以上の個別の粒子（例えば微粒子またはナノ粒子）を含み得、微粒子は検出のために１以上のタンパク質マーカーを固定化する抗体を含む。
【００７８】
分析は様々な物理フォーマットで実行され得る。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化は、多数のテスト試料の処理を容易にするために使用され得る。
【００７９】
いくつかの実施態様において、タンパク質発現は定量的質量分析（例えば、限定されないが、スペクトルカウントＭＳ、イオン強度ＭＳ、代謝標識法（例えば、細胞培養液中のアミノ酸による安定同位体標識法（ＳＩＬＡＣ））、酵素標識法、同位体標識法（例えば、同位体コード化(isotope-coded)タンパク質標識法（ＩＣＰＬ）または同位体コード化アフィニティータグ（ＩＣＡＴ））、および同重体(isobaric)ラベル化法（例えば、絶対および相対定量のためのタンデム質量タグ（ＴＭＴ）または同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）））によって検出される。例えば、Bantscheff et al., Anal Bioanal Chem, 2012, 404:949 (doi:10.1007/s00216-012-6203-4);およびNikolov et al., Methods in Molecular Biology, 2012, 893:85-100参照。
【００８０】
プロモーター結合の測定
いくつかの実施態様において、本方法は、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、対象（または「テスト対象」）が基準値（例えば、テスト対象と年齢を適合させた健常対象の集団についてのＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルから決定される基準値）よりも高いＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルを有している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に増加している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上に増加している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。
【００８１】
いくつかの実施態様において、本方法は、ＡＰＰまたはＡＩＣＤを含むＡＰＰフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、対象（または「テスト対象」）が基準値（例えば、テスト対象と年齢を適合させた健常対象の集団についてのＡＰＰまたはＡＩＣＤを含むＡＰＰフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルから決定される基準値）未満のＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを有している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に罹患していると診断される。
【００８２】
タンパク質−ＤＮＡ相互作用を検出する方法は、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合およびＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを検出するのに使用され得る。適切な方法には、限定されないが、ＰＣＲ（例えば定量ＰＣＲまたは定量リアルタイムＰＣＲ）と組み合わせたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡ分解酵素フットプリント法、プルダウンアッセイ、ならびにマイクロプレート捕捉および検出アッセイが含まれる。いくつかの実施態様において、プロモーター結合は、ＰＣＲ（例えばｑＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わせたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって測定される。プロモーター結合を測定する方法は当分野において記述されている。例えば、Lin et al., Genome Res., 2007, 17:818-827参照。ＰＣＲと組み合わせたＣｈＩＰの例示的なプライマー配列を表１に示す。
【００８３】
追加のバイオマーカー
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される診断方法および検出方法は、上述されるＲＴＫＮ２、ＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＡＰＰバイオマーカーに加えて、１以上の追加のバイオマーカーの発現および／または活性のレベルを検出することをさらに含む。
【００８４】
いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料（例えば細胞試料）中のフィリピンの量の増加を検出することをさらに含む。フィリピンは、脂質調節異常の疾患のための診断ツールとして使用される蛍光ポリエンマクロライドである。血液細胞中のフィリピンのレベルが２７ＯＨＣによって引き起こされる細胞損傷と相関することが報告されている。さらに、アルツハイマー病に罹患している対象は、対照患者と比較してより多くのフィリピン陽性Ｂリンパ球およびより高い平均蛍光強度を示すことが見出されている。Castello et al., Advances in Alzheimer's Disease, 2014, 3:137-144参照。したがって、フィリピンは、ＡＩＣＤによるＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＲＴＫＮ２の調節の障害をもたらす２７ＯＨＣによる損傷の増加を検出するマーカーであり、アルツハイマー病を診断し、（例えば軽度認知障害を有する対象について）アルツハイマー病に進行するリスクを予測するためのマーカーとして使用され得る。
【００８５】
試料（血液試料など）中のフィリピンの量を検出および定量化する方法は上記のCastello et al.に記述され、これは参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様において、本方法は試料（例えば血液試料、例えば末梢血単核細胞を含む試料）に対してフローサイトメトリーを実行し、フィリピンの蛍光のレベルを定量化することを含む。いくつかの実施態様において、対象由来の試料における増加した数の細胞が、基準値（例えば健常対象の集団について決定された値）に対して、または対照（例えばアルツハイマー病に罹患していないことが知られている健常対象）由来の試料と比較してフィリピン蛍光を示す場合、患者はアルツハイマー病に罹患していると診断される。いくつかの実施態様において、対象由来の試料中の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％またはそれ以上の細胞がフィリピン蛍光を示す場合、患者はアルツハイマー病に罹患していると診断される。
【００８６】
いくつかの実施態様において、対象をアルツハイマー病に罹患していると診断する方法は、対象由来の試料においてＦＯＸＯ１リン酸化のレベルを測定することをさらに含む。ＦＯＸＯ１リン酸化は、例えばＦＯＸＯ１の１以上のリン酸化残基に特異的なリン酸化部位特異的抗体を用いた免疫測定法（ウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡなど）によって測定され得る。いくつかの実施態様において、ＦＯＸＯ１リン酸化は、フローサイトメトリーを用いたリンタンパク質分析によって測定される。例えば、Krutzik et al., Clin Immunol., 2004, 110:206-221参照。ＦＯＸＯ１に対するリン酸化部位特異的抗体は当分野で公知であり、例えばCell Signaling Technology (Danvers, MA)またはEMD Millipore (Billerica, MA)から市販されている。いくつかの実施態様において、ＦＯＸＯ１リン酸化のレベルが、基準値（例えば健常対象の集団について決定された値）と比較して、または対照試料（例えばアルツハイマー病に罹患していないことが知られている健常対象）におけるＦＯＸＯ１リン酸化のレベルと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上減少している場合、患者はアルツハイマー病に罹患していると診断される。
【００８７】
対象集団および試料
いくつかの実施態様において、テスト対象（すなわち、アルツハイマー病について評価される対象）はヒトである。いくつかの実施態様において、対象は少なくとも３０歳の成人である。いくつかの実施態様において、対象は少なくとも６５歳の成人である。いくつかの実施態様において、対象は軽度認知障害と診断されているヒトまたは軽度認知障害を有すると推測されるヒトである。
【００８８】
いくつかの実施態様において、対象由来の試料には、全血、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液または組織試料（例えば脳組織）が含まれる。いくつかの実施態様において、試料には、血液、血清、血漿または脳脊髄液が含まれる。いくつかの実施態様において、試料は血液試料である。いくつかの実施態様において、試料は末梢血単核細胞を含む血液試料である。
【００８９】
基準値
ある実施態様において、テスト対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２またはＭＡＳＴ４ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質の発現レベル、（例えば、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルまたはＡＰＰもしくはＡＩＣＤを含むフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルによって評価される）ＦＯＸＯ１タンパク質またはＡＰＰタンパク質の活性レベル、ＦＯＸＯ１タンパク質のリン酸化レベル、および／またはフィリピンの発現レベルは、テスト対象がアルツハイマー病に罹患しているか否かを決定するために基準値と比較される。本明細書に記載のバイオマーカーの基準値を決定するために様々な方法が使用され得る。ある実施態様において、特定のバイオマーカー（例えばＲＴＫＮ２の発現レベル）の基準値は、アルツハイマー病に罹患していないことが知られている対象の集団由来の試料における特定のバイオマーカーのレベルを評価することによって決定される。限定されない例として、ある実施態様において、対象の集団（例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００またはそれ以上の対象）は全員アルツハイマー病に罹患していないことが知られており、特定のバイオマーカーのレベル（例えばＲＴＫＮ２の発現レベル）について分析される。別の実施態様において、特定のバイオマーカー（例えばＲＴＫＮ２の発現レベル）の基準値は、軽度認知障害または特定の形態のアルツハイマー病に罹患している対象の集団由来の試料における特定のバイオマーカーのレベルを評価することによって決定される。限定されない例として、ある実施態様において、対象の集団（例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００またはそれ以上の対象）は全員軽度のアルツハイマー病に罹患しており、特定のバイオマーカーのレベル（例えばＲＴＫＮ２の発現レベル）について分析される。いくつかの実施態様において、対象の集団は１以上の患者の特徴（年齢、性別、民族性または他の基準など）によってテスト対象と適合している。いくつかの実施態様において、基準値は、テスト対象においてバイオマーカーのレベルを評価するのに使用される試料と同じ種類の対象の集団由来の試料（例えば、血液または脳脊髄液を含む試料）を用いて確立される。
【００９０】
基準値は日常的な方法を用いて決定され得る（例えば対象から試料を採取し、バイオマーカーの値を決定する）。テスト対象がアルツハイマー病に罹患していると同定するための特定の閾値の決定、適切な範囲、カテゴリーおよびアルツハイマー病の段階などの選択は、本開示によって導かれる当業者の技能の範囲内である。標準的な統計的方法がそのような決定をする際に実行者によって利用され得ることが理解される。例えば、Principles of Biostatistics by Marcello Pagano et al. (Brook Cole; 2000);およびFundamentals of Biostatistics by Bernard Rosner (Duxbury Press, 5th Ed, 1999)参照。
【００９１】
別の実施態様において、テスト対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２またはＭＡＳＴ４ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質の発現レベル、（例えば、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルまたはＡＰＰもしくはＡＩＣＤを含むフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルによって評価される）ＦＯＸＯ１タンパク質またはＡＰＰタンパク質の活性レベル、ＦＯＸＯ１タンパク質のリン酸化レベル、および／またはフィリピンの発現レベルは、テスト対象がアルツハイマー病に罹患しているか否かを決定するために対照試料と比較される。いくつかの実施態様において、対照試料はアルツハイマー病または軽度認知障害のいかなる臨床症状も示さない対象由来の試料である。いくつかの実施態様において、対照試料は、軽度認知障害またはアルツハイマー病（例えば特定の段階のアルツハイマー病、例えば軽度のアルツハイマー病）に罹患していると臨床的に診断されている対象由来の試料である。いくつかの実施態様において、対照試料が取得される対象は、テスト対象と同年齢またはほとんど同年齢である。
【００９２】
ＩＶ．予後診断方法
別の態様において、アルツハイマー病を発症するリスクが高い対象を同定する方法およびアルツハイマー病に進行するリスクがある対象を予後診断する方法が提供される。いくつかの実施態様において、対象は軽度認知障害を有している（例えば、対象は軽度認知障害を有していると臨床診断されている）。いくつかの実施態様において、本方法は、上述の「脳保護」バイオマーカーのうち１つ以上の発現および／または活性のレベルを検出すること（例えば、これらのバイオマーカーのうち１つ、２つ、３つまたはそれ以上（例えば、ＲＴＫＮ２発現のレベル、ＭＡＳＴ４発現のレベル、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合のレベル、およびＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合のレベルのうち、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）の発現および／または活性のレベルを検出すること）を含む。
【００９３】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
基準値と比較して対象由来の試料における（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、または（ｉｖ）ＡＰＰもしくはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加のうち１つ以上を検出する；
これにより対象をアルツハイマー病に進行するリスクがあると予後診断する。
【００９４】
いくつかの実施態様において、本方法は、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のうち２つ、３つまたは４つ全てを検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、対象由来の試料においてＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少を検出することを含み、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、またはＡＰＰもしくはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加のうち１つ以上を検出することをさらに含む。
【００９５】
いくつかの実施態様において、本方法は、軽度認知障害を有する対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、または（ｉｖ）ＡＰＰもしくはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルの増加のうち１つ以上を検出することを含む。
【００９６】
いくつかの実施態様において、試料には、全血、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液または組織試料（例えば脳組織）が含まれる。いくつかの実施態様において、試料には、血液、血清、血漿または脳脊髄液が含まれる。いくつかの実施態様において、試料は血液試料である。いくつかの実施態様において、試料は末梢血単核細胞を含む血液試料である。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料においてＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定する；および
対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２の発現の減少は、対象をアルツハイマー病を発症するリスクが高いと同定し、またはアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定する。
【００９８】
いくつかの実施態様において、本方法は、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＲＴＫＮ２タンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）を発症するリスクが高いと同定される。いくつかの実施態様において、対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）由来の試料におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定される。
【００９９】
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病を発症するリスクが高い対象を同定する方法、またはアルツハイマー病に進行するリスクがある対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）を予後診断する方法は、対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質）の発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料においてＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定する；および
対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４の発現の減少は、対象をアルツハイマー病を発症するリスクが高いと同定し、またはアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定する。
【０１００】
いくつかの実施態様において、本方法は、ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＭＡＳＴ４タンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）を発症するリスクが高いと同定される。いくつかの実施態様において、対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）由来の試料におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定される。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病を発症するリスクが高い対象を同定する方法、またはアルツハイマー病に進行するリスクがある対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）を予後診断する方法は、対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルを検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料においてＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合を測定する；および
対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の増加は、対象をアルツハイマー病を発症するリスクが高いと同定し、またはアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定する。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に増加している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）を発症するリスクが高いと同定される。いくつかの実施態様において、対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）由来の試料におけるＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に増加している場合、対象はアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定される。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病を発症するリスクが高い対象を同定する方法、またはアルツハイマー病に進行するリスクがある対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）を予後診断する方法は、対象由来の試料におけるＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを検出することを含む。いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料においてＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメインを含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合を測定する；および
対象由来の試料におけるＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを基準値と比較する；
ここで、基準値と比較した対象由来の試料におけるＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の減少は、対象をアルツハイマー病を発症するリスクが高いと同定し、またはアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定する。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、対象由来の試料におけるＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）を発症するリスクが高いと同定される。いくつかの実施態様において、対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）由来の試料におけるＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルが基準値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に減少している場合、対象はアルツハイマー病に進行するリスクがあると同定される。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、本方法はＲＴＫＮ２発現のレベルを検出することを含み、（ｉ）ＭＡＳＴ４発現のレベル、（ｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合のレベル、および／または（ｉｉｉ）ＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合のレベルを検出することをさらに含む。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、本方法は、ＲＴＫＮ２発現のレベル、ＭＡＳＴ４発現のレベル、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合のレベル、またはＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合のレベルのうち１つ、２つまたは３つを検出することを含み、対象由来の細胞試料においてフィリピンの量の増加を検出することをさらに含む。いくつかの実施態様において、対象由来の試料における細胞のうち少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％またはそれ以上がフィリピン蛍光を示す場合、患者はアルツハイマー病を発症するリスクが高いと同定される。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、基準値は本明細書に記載されるように（例えば上記ＩＩＩ節に記載されるように）決定される。いくつかの実施態様において、基準値は、アルツハイマー病に罹患していないことが知られている対象または対象の集団由来の試料におけるバイオマーカーのレベル（例えば、ＲＴＫＮ２発現のレベル、ＭＡＳＴ４発現のレベル、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合のレベル、ＡＰＰのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合のレベル、またはフィリピンの量）である。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病に進行するリスクがあると同定されている対象（例えば、軽度認知障害を有する対象）について、治療介入が提供される。したがって、いくつかの実施態様において、アルツハイマー病に進行するリスクがあると同定されている対象について、本方法は対象に１以上の治療介入を施すことをさらに含む。いくつかの実施態様において、治療介入は以下のＶ節に記載されている治療介入である。いくつかの実施態様において、治療介入は食生活改善を含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、１以上の脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む。いくつかの実施態様において、治療介入は認知的働きかけを含む。いくつかの実施態様において、治療介入は、対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む。
【０１０９】
Ｖ．治療方法
別の態様において、アルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病または早発性アルツハイマー病）に罹患していると診断されている対象を処置する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法は軽度または中程度のアルツハイマー病を処置することに関する。いくつかの実施態様において、本方法はアルツハイマー病の進行を遅延または改善することによって対象を処置することを含む。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、本方法は以下を含む：
対象由来の試料において（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベル、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を含むそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合レベルを測定する；
対象由来の試料が、基準値と比較して（ｉ）ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉ）ＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少、（ｉｉｉ）ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合レベルの増加、および（ｉｖ）ＡＰＰまたはそのフラグメントのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合のレベルの減少を有することを決定する；および
対象に１以上の治療介入を施す。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、治療介入は食生活改善を含む。食生活改善の例には、より健康的な脂肪の選択、パルミチン酸の摂取量の減少、オメガ３脂肪酸が豊富な食品の選択、水溶性繊維の増加、飽和脂肪およびトランス脂肪の減少、食事由来のコレステロールの減少、ナトリウムの摂取量の減少、ならびにアルコールの消費量の減少が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、治療介入は、１以上の脂質低下薬またはコレステロール低下薬を投与することを含む。いくつかの実施態様において、脂質低下薬またはコレステロール低下薬は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（スタチン）、ＭＴＰ阻害剤、胆汁酸封鎖剤、スクアレン合成酵素阻害剤、酸化スクアレン環化酵素阻害剤、ＰＰＡＲアゴニスト、フィブリン酸誘導体、ニコチン酸もしくはその誘導体、アポリポタンパク質Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド、２−アゼチジノン(2-azetidione)、抗ＰＣＳＫ９抗体、またはオメガ３脂肪酸である。いくつかの実施態様において、脂質低下薬またはコレステロール低下薬はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（スタチン）である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬には、アトルバスタチン（リピトール）、フルバスタチン（レスコール）、ロバスタチン、ピタバスタチン（リバロ）、プラバスタチン（プラバコール）、ロスバスタチン（クレストール）およびシンバスタチン（ゾコール）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、治療介入は、対象のＲＴＫＮ２発現を増加させる化合物を投与することを含む。いくつかの実施態様において、化合物は、（例えば、本明細書に記載されるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出する方法に従って、対象由来の生物学的試料をテストすることによって測定されるように）対象のＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％増加させる。いくつかの実施態様において、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させる化合物は、ペプチド、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖、ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣物、脂質、脂肪酸、ｓｉＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、治療介入は、以下のＶＩ節に記載されるものとして同定される治療用化合物、その構造関連類似体もしくはその化学的に合成された類似体、またはこの化合物またはその類似体を含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１１５】
本明細書に記載の治療方法の実施において、化合物または医薬組成物は、例えば、静脈内、髄腔内、脊髄内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経口、局所および／または吸入によって投与され得る。
【０１１６】
化合物または医薬組成物は投与剤形に適合する様式で治療上有効である量で投与される。用語「治療有効量」は、処置される疾患、障害または状態をある程度処置する（例えば、疾患（すなわち感染症）の症状のうち１つ以上を軽減する）投与物質（例えば、本明細書に記載の化合物または医薬組成物）の量、および／または処置される対象が罹患しているか、または発症するリスクがある疾患（すなわち感染症）の症状のうち１つ以上をある程度予防する量を指す。いくつかの実施態様において、１日用量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲で使用され得る。しかしながら、投与量は、患者の要求、処置される状態の重症度および用いる化合物に応じて様々であり得る。用量の大きさはまた、特定の患者における特定の化合物の投与に伴うあらゆる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、実行者の技能の範囲内である。多くの場合、処置は化合物の最適な用量よりも少ない用量で開始される。その後、投与量をその状況下で最適な効果に達するまで少しずつ増加させる。便宜上、所望の場合、１日の総投与量は分割され得、一日の間に部分に分けて投与され得る。
【０１１７】
ＶＩ．アルツハイマー病の処置のための治療化合物を同定する方法
別の態様において、アルツハイマー病の処置のための治療化合物を同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、同定される治療化合物はアルツハイマー病の発症を遅延するために使用され得る。いくつかの実施態様において、同定される治療化合物は、アルツハイマー病の進行を遅延または改善するために使用され得る。いくつかの実施態様において、同定される治療化合物は、遅発性アルツハイマー病の処置のために使用され得る。いくつかの実施態様において、同定される治療化合物は、早発性アルツハイマー病の処置のために使用され得る。
【０１１８】
本明細書に記載のアッセイを用いて、アルツハイマー病の発生または進行を遅延させるのに治療上有効な化合物を同定するためのさらなるテストに適したリード化合物が同定され得る。対象の化合物は合成されているか、天然に存在しているかのいずれかであり得る。いくつかの実施態様において、対象の化合物は、血液脳関門を通過する化合物を濃縮するために（例えば、初期スクリーニングとして）スクリーニングされる。
【０１１９】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイは（細胞ベースのアッセイなどを使用することによって）インビトロまたは（動物モデルなどを使用することによって）インビボで実行され得る。スクリーニング方法は、アッセイの工程を自動化し、任意の便利な供給源からアッセイに化合物を提供する（これは通常、並行して（例えば、ロボットのアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマットにおいて）行われる）ことによって、大規模な化合物ライブラリーまたはポリマーライブラリー（例えば、有機小分子、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、オリゴ糖、または抑制性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを含む）をスクリーニングするように設計される。いくつかの実施態様において、スクリーニングアッセイはハイスループットフォーマットを利用する。
【０１２０】
スクリーニングアッセイ
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病の処置のための化合物（例えば、アルツハイマー病の発症または進行を遅延させるために使用され得る化合物）を同定する方法は以下を含む：
（ａ）１以上の化合物を細胞または細胞集団に接触させる；
（ｂ）１以上の化合物が、基準値または１以上の化合物に接触していない対照試料と比較して、細胞または細胞集団におけるｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させるか否かを決定する；および
（ｃ）細胞または細胞集団におけるＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択する。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本方法は、１以上の化合物が、基準値または１以上の化合物に接触していない対照試料と比較して細胞または細胞集団におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させるか否かを決定し、細胞または細胞集団におけるＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択することをさらに含む。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、選択する工程は、細胞または細胞集団において、基準値または対照試料と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させ、かつ／またはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択することを含む。いくつかの実施態様において、選択する工程は、細胞または細胞集団において、基準値または対照試料と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍またはそれ以上、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させ、かつ／またはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させる１以上の化合物を選択することを含む。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性の誘導を測定することは、化合物と接触している細胞または細胞集団におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現または活性のレベルを決定すること、およびそのレベルをベースラインまたは範囲と比較することを含む。通常、ベースラインの値は、化合物に接触していない生物学的試料におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を表す。ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量化する方法は、上記のＩＩＩ節に記述されている。
【０１２４】
ストレス刺激に対する応答の測定
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病の処置のための化合物を同定する方法は、１以上のストレス刺激に対する応答について化合物（例えば、細胞または細胞集団においてＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させ、かつ／またはＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加させると同定された化合物）をスクリーニングする工程をさらに含む。したがって、いくつかの実施態様において、スクリーニング方法はさらに以下を含む：
細胞または細胞集団を１以上のストレス刺激にさらす；および
基準値または１以上の化合物に接触していない対照試料と比較して細胞生存を増加させる１以上の化合物を選択する。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、ストレス刺激はオキシステロールである。いくつかの実施態様において、ストレス刺激はパルミチン酸である。いくつかの実施態様において、ストレス刺激にさらされた場合に生存している細胞の割合が、基準値または化合物の非存在下でストレス刺激にさらされた対照試料と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上に増加している場合、化合物は細胞生存を増加させる化合物として同定される。いくつかの実施態様において、化合物は、ストレス刺激の存在下で細胞生存を増加させるための公知の陽性対照（例えば、２７−ヒドロキシコレステロール）と少なくとも同程度に細胞生存を増加させる化合物である。
【０１２６】
スクリーニングアッセイのための細胞
本明細書に記載のスクリーニングアッセイは、あらゆる多数の細胞型または細胞集団において実施され得る。いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団は哺乳類細胞である。いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団はヒト細胞である。いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団は、脳、神経組織、甲状腺、眼、骨格筋、軟骨、腎臓、肺、肝臓、心臓もしく骨組織、または血液、血清、血漿もしくは脳脊髄液由来である。いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団は、海馬細胞、ニューロン、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞または人工多能性幹細胞を含む。いくつかの実施態様において、細胞は初代細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は形質転換細胞系由来である。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団はアルツハイマー病の動物モデル由来である。アルツハイマー病の動物モデルおよびアルツハイマー病の動物モデルから得られた細胞培養物は当分野で記述されている。例えば、Trinchese et al., J Mol Neurosci, 2004, 24:15-21；およびLaFerla et al., Cold Spring Harb Perspect Med, 2012 Nov. 1, doi: 10.1101/cshperspect.a006320参照；米国特許公開公報第２００５／０１７２３４４号も参照、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様において、（細胞もしくは細胞集団を得るための、またはインビボモデルのための）動物モデルはＳＡＭＰ８マウスモデルであり、これは記憶障害を示す促進老化モデルである。Yagi et al., Brain Res., 1998, 474:86-93; Takeda et al., J. Amer. Geriatr. Soc., 1991, 39:911-919参照。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団はアルツハイマー病に罹患している対象由来である。いくつかの実施態様において、細胞または細胞集団は軽度認知障害を有する対象由来である。
【０１２９】
化学物質および化合物ライブラリー
本質的にあらゆる化学物質が、細胞または細胞集団においてＲＴＫＮ２および／またはＭＡＳＴ４の発現レベルを増加させる能力、および任意でストレス刺激に応答して細胞生存を増加させる能力についてテストされ得る。いくつかの実施態様において、化合物は水溶液または有機溶液に溶解できる化合物である。多くの化学物質の供給業者（Sigma (St. Louis, MO)、Aldrich (St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland)を含む）、ならびにスクリーニングの準備が整っている有機小分子およびペプチドライブラリーの供給者（Chembridge Corp. (San Diego, CA)、Discovery Partners International (San Diego, CA)、Triad Therapeutics (San Diego, CA)、Nanosyn (Menlo Park, CA)、Affymax (Palo Alto, CA)、ComGenex (South San Francisco, CA)、Tripos, Inc. (St. Louis, MO)およびSelleckchem (Houston, TX)を含む）が存在することが理解される。
【０１３０】
代表的なアミノ酸化合物ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；第６，８２８，４２２号；および第６，８４４，１６１号；Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991); Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991);ならびにEichler, Comb Chem High Throughput Screen., 8:135 (2005)参照）、ペプトイド（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／１９７３５）、コード化ペプチド（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９２／０００９１）、ビニル性(vinylogous)ポリペプチド（Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:6568 (1992)）、β−Ｄ−グルコース骨格(glucose scaffolding)を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc.,  114:9217-9218 (1992)）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えば、米国特許第６，６３５，４２４号および第６，５５５，３１０号；ＰＣＴ出願公開ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７；およびVaughn et al., Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996)参照）、およびペプチジルホスホネート（Campbell et al., J. Org. Chem., 59:658 (1994)）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
代表的な核酸化合物ライブラリーには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、抑制性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, eds. 1987-2005, Wiley Interscience;およびSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照。核酸ライブラリーは、例えば米国特許第６，７０６，４７７号；第６，５８２，９１４号；および第６，５７３，０９８号に記述されている。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば米国特許第６，８４６，６５５号；第６，８４１，３４７号；第６，８２８，０９８号；第６，８０８，９０６号；第６，６２３，９６５号；および第６，５０９，１７５号に記述されている。ＲＮＡライブラリー（例えば、リボザイム、ＲＮＡ干渉またはｓｉＲＮＡライブラリー）は例えば、Downward, Cell, 121:813 (2005)およびAkashi et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6:413 (2005)に記述されている。アンチセンスＲＮＡライブラリーは、例えば米国特許第６，５８６，１８０号および第６，５１８，０１７号に記述されている。
【０１３２】
代表的な有機小分子ライブラリーには、ダイバーソマー(diversomer)（ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなど）（Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913 (1993)）；小分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chen et al., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)）；オリゴカルバメート(oligocarbamate)（Cho et al., Science, 261:1303 (1993)）；ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号；およびBaum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993)）；イソプレノイド（例えば、米国特許第５，５６９，５８８号）；チアゾリジノンおよびメタチアザノン(metathiazanone)（例えば、米国特許第５，５４９，９７４号）；ピロリジン（例えば、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号）；モルフォリノ化合物（例えば、米国特許第５，５０６，３３７号）；四環性ベンズイミダゾール(tetracyclic benzimidazole)（例えば、米国特許第６，５１５，１２２号）；ジヒドロベンゾピラン(dihydrobenzpyran)（例えば、米国特許第６，７９０，９６５号）；アミン（例えば、米国特許第６，７５０，３４４号）；フェニル化合物（例えば、米国特許第６，７４０，７１２号）；アゾール（例えば、米国特許第６，６８３，１９１号）；ピリジンカルボキサミドまたはスルホンアミド（例えば、米国特許第６，６７７，４５２号）；２−アミノベンゾオキサゾール（例えば、米国特許第６，６６０，８５８号）；イソインドール、イソオキシインドール(isooxyindole)またはイソオキシキノリン(isooxyquinoline)（例えば、米国特許第６，６６７，４０６号）；オキサゾリジノン（例えば、米国特許第６，５６２，８４４号）；およびヒドロキシルアミン（例えば、米国特許第６，５４１，２７６号）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
コンビナトリアルライブラリーを調製するためのデバイスは市販されている。例えば、Advanced Chem. Tech (Louisville, KY)の357 MPSおよび390 MPS、Rainin Instruments (Woburn, MA)のSymphony、Applied Biosystems (Foster City, CA)の433A、ならびにMillipore (Bedford, MA)の9050 Plus参照。
【０１３４】
化合物の最適化
いくつかの実施態様において、アルツハイマー病の処置のための候補化合物を上述のスクリーニングアッセイによって同定した後、化合物の最適化が行われる。通常、最適化は、化合物の生物学的特性、薬物動態学的特性および薬力学的特性（経口バイオアベイラビリティ、半減期、代謝、毒性、薬物動態プロファイルおよび薬力学的活性など）を評価するためにインビトロおよびインビボにおける（例えば適切な動物モデル（例えば、マウス、ラットまたはサルなどの哺乳類）における）スクリーニングの使用を含む。例えば、Guido et al., Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2011, 14:830-839；およびGhose et al., ACS Chem Neurosci, 2012, 3:50-68参照。いくつかの実施態様において、候補化合物の構造類似体が設計およびスクリーニングされる。構造類似体を設計およびスクリーニングする方法は当分野で記述されている。例えば、Dimova et al., Med. Chem. Commun., 2016, 7:859-863;およびAnalogue-Based Drug Discovery II, J. Fischer and C.R. Ganellin, eds., Wiley-VCH Verlag GmbH & Co., KGaA, Weinheim, Germany, 2010参照。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される化合物またはその構造関連類似体は、アルツハイマー病の処置における使用のための（例えばアルツハイマー病の発症または進行を遅延させる）医薬組成物の調製のために使用される。医薬組成物は通常、化合物（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定された化合物またはその構造関連類似体）および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または薬学的に許容され得る賦形剤を含む。本明細書において、「薬学的に許容され得る担体」または「薬学的に許容され得る賦形剤」は、活性成分と組み合わせた場合にその成分が生物学的活性を保持し、かつ対象の免疫系と反応しないあらゆる物質を含む。例として、あらゆる標準的な医薬担体（リン酸緩衝生理食塩水など）、水、エマルジョン（油／水エマルジョンなど）および様々な種類の湿潤剤が含まれるが、これらに限定されない。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって処方される（例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Allen, Lloyd V., Jr., ed., Pharmaceutical Press, 2013参照）
【実施例】
【０１３６】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、請求項に係る発明を（限定しないが）説明するために提供される。
【０１３７】
実施例１
脳内のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の生物学的機能は未解決のままであり、これは遅発性アルツハイマー病（ＡＤ）の複雑な病因の理解を妨げる重大な欠点である（１〜５）。本発明者らの研究室を含むいくつかの研究室は、ＡＰＰが遅発性ＡＤの真の病原性誘因（酸化ストレス、感染／炎症およびコレステロール調節異常など）に対する適応応答の一部として代わりに機能し得ることを提案している（４、６〜８）。それにもかかわらず、そのような適応応答の役割に一致する記述的な証拠はあるが、それを裏付ける機構的証拠はほとんどない。本研究の目的は、ＡＰＰがコレステロール酸化代謝物２７−ヒドロキシコレステロール（２７ＯＨＣ）（これはインビトロおよびインビボの両方においてＡＤ様病変を引き起こすＡＤの脳内におけるコレステロール調節異常の初期マーカーである）に対するこのような適応応答を調節するか否かを決定し、そのような応答が遅発性ＡＤの病因に機構的に関連し得るか否かを決定することであった。
【０１３８】
本発明者らは、培養細胞において、ＡＰＰが２７ＯＨＣ細胞傷害性に対するホルミシス適応応答を開始するために必要であることを報告する。ＡｐｐｗｔおよびＡｐｐｋｏマウス大脳皮質からの詳細なトランスクリプトーム分析およびクロマチン免疫沈降アッセイにより、この適応応答を駆動する分子カスケードを引き出すことができ、ここでＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）の転写活性は、オキシステロールストレスレスポンダーＲＴＫＮ２のＦＯＸＯ１依存的な上方制御を最終的にもたらし、細胞生存率を最適化する。より高い、非ホルミシス用量の２７ＯＨＣでは、ＡＩＣＤによる経路は関与せず、ＲＴＫＮ２の下方制御およびより高い細胞障害性をもたらす。本発明者らはさらに、この経路が認知障害およびより高いレベルの２７ＯＨＣに関連する脂質異常症のマウスモデルの脳ならびに遅発性ＡＤ患者の脳において損なわれていることを示す。注目すべきことに、この経路は、脂質異常症またはオキシステロール調節異常とは主として関連しない神経変性疾患である前頭側頭型認知症に罹患している患者の脳内では変化しない。本発明者らの発見はＡＰＰの従前未知であった機能を明らかにし、健常な脳および認知症の脳におけるＡＰＰの機能のより深い理解を導き得る新たな概念的枠組みを提供し、これは根拠に基づく新規な治療法を潜在的に導く。
【０１３９】
ＡＰＰは２７ＯＨＣに対するホルミシス応答を仲介する
細胞生存率に対する２７ＯＨＣの効果を決定するために、本発明者らは神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２７ＯＨＣの濃度を増加させながら処理し、細胞生存率の指標として乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のレベルを測定した。図１Ａに示されるように、２７ＯＨＣは、低いレベルが５μＭで観察される最大の保護効果を伴って細胞恒常性を最適化するストレス応答を誘発し、１５、２５および５０μＭの処理において細胞傷害性が増加していくように、本質的にホルミシスであるように見える二相性の用量依存的な細胞応答を誘発した（１１）。オキシステロール対照として用いた２４−ヒドロキシコレステロール（２４ＯＨＣ）は効果がなかった（図１Ｂ）。２７ＯＨＣに対する細胞生存応答に対するＡＰＰの影響を決定するために、本発明者らはＡＰＰを発現しないＣＮＳラット神経細胞系であるＢ１０３細胞（１０）にＡＰＰの６９５アミノ酸アイソフォーム（ＡＰＰ６９５）または対照の空ベクターのいずれかを遺伝子導入し、ＬＤＨレベルによって決定される細胞生存率を測定した。ＡＰＰの非存在下において、２７ＯＨＣは用量依存的な様式でＬＤＨレベルを増加させた。対照的に、ＡＰＰの存在はＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞によって示された応答と同等の二相性応答を導き、５μＭ ２７ＯＨＣはＬＤＨレベルを減少させたが、１０μＭよりも高い用量は用量依存的な細胞障害性であった（図１Ｃ）。ＬＤＨレベルが細胞死の増加のために変化することを確認するため、本発明者らはＡＰＰ存在下または非存在下において５μＭおよび５０μＭ ２７ＯＨＣに応答した生細胞／死細胞存在比を分析した。ＬＤＨのデータと一致して、２７ＯＨＣはＡＰＰ発現細胞において保護的であったが、空ベクターを遺伝子導入した細胞において保護的ではなかった（図１Ｄ〜１Ｅ）。
【０１４０】
本発明者らは次に、２７ＯＨＣに対する細胞生存率応答に対するＡＰＰの効果を仲介する分子機構が、その細胞内ドメインＡＩＣＤの転写活性を介して直接起こり得るか否かを求めた。２７ＯＨＣに応答して調節されるＡＩＣＤ転写標的を探索するために、本発明者らは最初に３週齢のＡｐｐｋｏおよび対照（Ａｐｐｗｔ）マウスの大脳皮質からマイクロアレイトランスクリプトームを作成し、ボルケーノプロットを用いて差示的に発現される遺伝子を同定した（図１Ｆ）。最も高い倍率変化および最も低いｐ値を有するもののうち、ＭＡＳＴ４（微小管結合セリンスレオニンキナーゼファミリーメンバー４）はＡｐｐｋｏ脳において最も著しく下方制御された遺伝子であった（図１Ｇ）。ＭＡＳＴ４は神経ストレスに応答して上方制御され、脳において高度に発現される（１２）ため、ＡＩＣＤによって調節されるストレス応答メディエーターとしてもっともらしい候補である。ＭＡＳＴ４の具体的な機能は報告されていないが、セリンスレオニンキナーゼであることが予測されている（１３）。オキシステロール調節に関連するＭＡＳＴ４の生理学的状況を作成するために、本発明者らは図１Ｈに記載される戦略を選択した。本発明者らは最初に、ＭＡＳＴ４と相互作用するタンパク質の文字列データベースを検索した（ｓｔｒｉｎｇ−ｄｂ．ｏｒｇ）。同定された候補のうち、ＦＯＸＯ１はＭＡＳＴ４に関連することが予測される。ＦＯＸＯ１は細胞ストレスに応答して多様な細胞内システムを調節する転写因子であり（１４、１５）、特に興味深いことに、ＦＯＸＯ１はインスリンのシグナル伝達およびレプチンのシグナル伝達の両方に共通したメディエーターであり、その機能障害はそれに関連する高コレステロール血症、肥満および健康上のリスク（遅発性ＡＤを含む）を導く（１６、１７）。したがって、本発明者らは、ＡＰＰの非存在下において発現が差示的に調節されるＦＯＸＯ１の下流転写標的を検索し、本発明者らのＡｐｐｋｏおよびＡｐｐｗｔ大脳皮質トランスクリプトームデータセットからｐ値＜０．０４５および倍率変化＞２を有する転写物を選択し、転写開始部位から＋／−２０００ｂｐのそれらのプロモーター配列を検索し、ヒト、マウスおよびラットにわたって保存されているＦＯＸＯ１コンセンサス配列を含むプロモーターを同定した。同定されたプロモーターのうち、本発明者らはコレステロール代謝への関与の予測に基づいてそれらをさらにソートした（図１Ｈ）。同定された転写物のうち、ｒｈｏｔｅｋｉｎ２（ＲＴＫＮ２）は、最も高いレベルの有意性を伴って最も大きな差示的発現を示した。重要なことは、ＲＴＫＮ２はオキシステロールの細胞傷害性に対する細胞ストレス応答を誘発するのに必要であり、これは脳内のオキシステロールシグナル伝達における潜在的な役割と一致している（２１〜２３）。これらのデータに基づいて、２７ＯＨＣに対するＡＰＰによるホルミシス応答の作用モデルを作成した。このモデル（これは図１Ｉに示されている）は、高用量ではなく低用量の２７ＯＨＣがＭＡＳＴ４のＡＩＣＤによるトランス活性化を誘発し、これはリン酸化およびＲＴＫＮ２のＦＯＸＯ１転写抑制の阻害をもたらし、細胞生存を最適化することを提唱する。
【０１４１】
ＡＩＣＤは２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４を調節する
２７ＯＨＣに対するＡＰＰによる適応応答におけるＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＲＴＫＮ２の潜在的な関与について検証するために、本発明者らは最初に、神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来のＡＩＣＤのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を２７ＯＨＣの存在下および非存在下において行うことによって、ＭＡＳＴ４が実際にＡＩＣＤ標的であるか否かを決定した。図２Ａは、ＡＩＣＤが細胞保護的な５μＭ ２７ＯＨＣの存在下においてＭＡＳＴ４プロモーターに結合するが、細胞障害性の５０μＭにおいては結合しないことを示す。ＡＰＰ ｓｉＲＮＡノックダウンによって結合は増加しなかった（図２Ａ）。次に、ＡＰＰはコレステロールおよびオキシステロールの両方に結合することが知られているコレステロールセンシングドメインを有しているため（１２）、本発明者らはこのドメインの完全性を破壊することが２７ＯＨＣに対するＡＰＰ適応応答を妨げ得ると考えた。したがって、本発明者らは、野生型６９５アミノ酸形態のＡＰＰ（ＡＰＰ６９５）またはＧ７００Ａ変異を有するＡＰＰ（ＡＰＰＧ７００Ａ）（これはそのコレステロールセンシング機能を抑制することが示されている（１４））を遺伝子導入したＡＰＰヌルＢ１０３細胞においてＣｈＩＰを行った。ＡＰＰＧ７００Ａは予想されるように（１２）、コレステロールが豊富な脂質ラフトに分配されず（図に示さず）、ＡＰＰ代謝において測定可能な差異を示さない。図２Ｂは、５μＭの２７ＯＨＣに応答するが５０μＭには応答しないＡＰＰ６９５を遺伝子導入したＢ１０３細胞におけるＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合の増加を示し、この効果はＡＰＰＧ７００Ａを発現する細胞には見られず、これはＡＰＰのコレステロールセンシングドメインが２７ＯＨＣに応答したＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合に実際に必要であることを示している。最後に、図２Ｃに示されるように、ＡＩＣＤはまた、５μＭ ２７ＯＨＣで処理されたラット一次皮質ニューロンにおいてＭＡＳＴ４プロモーターと相互作用するが、５０μＭの２７ＯＨＣで処理された場合には相互作用しない（図２Ｃ）。次に、本発明者らはＭＡＳＴ４に対するＡＩＣＤの転写効果を評価した。図２Ｄ〜２Ｆは、ＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合が５μＭ ２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡレベルの上昇と同時に起こるが、５０μＭ ２７ＯＨＣには応答せず、これはＡＰＰのコレステロールセンシングドメインに依存しており（図２Ｅ）、ラット一次ニューロンにおいて存在する（図２Ｆ）ことを示す。さらに、ＭＡＳＴ４タンパク質発現は、神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において５μＭ ２７ＯＨＣに応答して増加したが、５０μＭ ２７ＯＨＣまたはＡＰＰノックダウン後には応答しなかった（図２Ｇ）。したがって、ＡＩＣＤはＭＡＳＴ４プロモーターに結合し、細胞保護的な５μＭ ２７ＯＨＣに応答してＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質のより高い発現を導くが、細胞障害性の５０μＭ用量には応答しない。このシグナル伝達イベントはＡＰＰコレステロール結合ドメインの変異によって消失する。
【０１４２】
ＭＡＳＴ４はＦＯＸＯ１を介してＲＴＫＮ２発現を調節する
次に、本発明者らは、ＭＡＳＴ４が関連することが予想されるＦＯＸＯ１の真のキナーゼであるか否かを決定した。本発明者らは、組換えＦＯＸＯ１、および０、５、または５０μＭ ２７ＯＨＣで処理した細胞由来の溶解物から免疫沈降されたＭＡＳＴ４を用いてインビトロキナーゼアッセイを行った。ＦＯＸＯ１リン酸化の増加が、５μＭ ２７ＯＨＣで処理した細胞由来のＭＡＳＴ４免疫沈降物において観察されたが、５０μＭ ２７ＯＨＣで処理した細胞由来のＭＡＳＴ４免疫沈降物においては観察されなかった（図３Ａ）。次に本発明者らは、キナーゼヌルＭＡＳＴ４変異体を作成することによってＦＯＸＯ１リン酸化のＭＡＳＴ４キナーゼ活性に対する依存性を確認した。ＭＡＳＴ４の配列解析は、隣接するアスパラギン酸残基を有するｗａｌｋｅｒ−Ｂモチーフを含むセリン／スレオニンキナーゼドメイン、ＡＴＰ結合に関連する化学的特性およびリン酸化の触媒作用を明らかにする（図３Ｂ）（１５）。キナーゼヌルＭＡＳＴ４変異体を作成するために、本発明者らはＷａｌｋｅｒ−Ｂモチーフに隣接するコドン６８２の野生型グルタミン酸をアラニンに置換し、ＭＡＳＴ４Ｅ６８２Ａを作成した。ＭＡＳＴ４Ｅ６８２Ａの免疫沈降物はＦＯＸＯ１をリン酸化しなかった（示さず）。次に、本発明者らは、ＦＯＸＯ１がＲＴＫＮ２プロモーターに結合するか否か、およびその結合が２７ＯＨＣ曝露に応答して調節され得るか否かを決定した。神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＣｈＩＰは、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合および５μＭ ２７ＯＨＣへの曝露によるその結合の減少を確認したが、５０μＭ ２７ＯＨＣへの曝露またはＡＰＰもしくはＭＡＳＴ４のノックダウン後においてはこの減少は確認されなかった（図３Ｃ）。トランス活性化ドメインを持たないＦＯＸＯ１のドミナントネガティブ型（ＦＯＸＯ１−ＤＢＤ）の発現は結合の増加をもたらした（図３Ｄ）。さらに、ＦＯＸＯ１結合は、ＡＰＰ６９５を発現するＢ１０３において５μＭ ２７ＯＨＣに応答して減少したが、ＡＰＰＧ７００Ａを発現するＢ１０３または５０μＭ ２７ＯＨＣで処理された細胞においては減少しなかった（図３Ｅ）。これらの結果はラット皮質ニューロンにおいて確認された（図３Ｆ）。
【０１４３】
次に、ＲＴＫＮ２の転写に対するＦＯＸＯ１の効果を決定するため、本発明者らは神経分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対照、ＡＰＰ、ＭＡＳＴ４またはＦＯＸＯ１ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入し、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを測定する前に５または５０μＭ ２７ＯＨＣで処理した。図３Ｇに示されるように、５μＭ ２７ＯＨＣはＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡを増加させたが、５０μＭ ２７ＯＨＣは増加させず、ＡＰＰもしくはＭＡＳＴ４をノックアウトした場合にも増加させなかった。また、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡはＦＯＸＯ１ ｓｉＲＮＡ遺伝子導入細胞において増加した（図３Ｇ）。さらに、ＦＯＸＯ１−ＤＢＤのＲＴＫＮ２プロモーターへの結合の欠如に一致して、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡはＦＯＸＯ１−ＤＢＤ発現によって増加した（図３Ｈ）。Ｂ１０３細胞において、ＲＴＫＮ２は５μＭ ２７ＯＨＣで処理された後、ＡＰＰ６９５の存在下において上方制御されたが、ＡＰＰＧ７００Ａの発現によって、または５０μＭ ２７ＯＨＣで処理された細胞において上方制御されなかった（図３Ｉ）。これらの結果はラット皮質ニューロンにおいて確認された（図３Ｊ）。
【０１４４】
次に本発明者らは、ラット皮質ニューロンにおいて、２７ＯＨＣに応答したＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合が、細胞保護的な２．５および５μＭ ２７ＯＨＣ用量において減少し、１５、２５および５０μＭ ２７ＯＨＣにおいて増加するような用量依存的なパターンに従い（図４Ａ）、これはＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡ発現（図４Ｂ）だけでなくＲＴＫＮ２タンパク質発現パターン（図４Ｃ）とも逆相関していた。したがって、２７ＯＨＣの細胞保護用量に応答したＦＯＸＯ１のＭＡＳＴ４を仲介するリン酸化はＦＯＸＯ１を仲介するＲＴＫＮ２転写を制御する。
【０１４５】
次に、ＲＴＫＮ２発現が２７ＯＨＣに応答して見られる細胞保護的な効果に必要であることを示すために、本発明者らは、細胞保護的な５μＭまたは細胞障害性の５０μＭ ２７ＯＨＣで処理した後に、活性型カスパーゼ３および７ならびにＢａｘおよびＢｃｌ−２を測定した。５０μＭ ２７ＯＨＣへの曝露は両方の活性型カスパーゼを増加させ、Ｂｃｌ−２を減少させた（図４Ｄ）。比較によって、５μＭ ２７ＯＨＣへの曝露は、Ｂｃｌ−２およびＲＴＫＮ２のロバストな増加、ならびに両方の活性型カスパーゼの減少をもたらした。重大なことに、ＲＴＫＮ２のノックダウンはこのパターンを逆転させ、これはこのオキシステロールストレスレスポンダーの発現が２７ＯＨＣに対して観察された細胞保護的な応答に必要であることを実証した。まとめると、これらのデータは２７ＯＨＣ用量にホルミシスに応答する提案された分子モデル（図１Ｉ）の重要な要素を確認する。
【０１４６】
ＡＰＰはインビボにおいてＭＡＳＴ４およびＦＯＸＯ１を介したＲＴＫＮ２発現を制御する
本発明者らのこれまでの結果は、培養細胞において、ＡＰＰが２７ＯＨＣに対するホルミシス適応応答を開始することを実証し、この重要な要素は図１Ｉに表されている：より低いレベル（すなわち、本発明者らの細胞モデルにおける５μＭ）において２７ＯＨＣがオキシステロールストレス応答タンパク質ＲＴＫＮ２のＭＡＳＴ４依存的なＦＯＸＯ１調節を含む細胞保護的な応答を開始し、より高いレベルの２７ＯＨＣ（すなわち５０μＭ）がこの適応応答を開始できないように、ＡＩＣＤは２７ＯＨＣに対する適応応答を調節する。ＡＰＰがインビボにおけるＡＩＣＤ−ＭＡＳＴ４−ＦＯＸＯ１−ＲＴＫＮ２経路の基礎的な活性化に重要であるか否かを決定するために、ＡＰＰ＋／＋マウスおよび５μＭ ２７ＯＨＣを模倣した通常の食餌を与えたＡＰＰ−／−同腹仔由来の大脳皮質を使用した。ＡＰＰ−／−脳と比較してＡＰＰ＋／＋において、ＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへのより高い結合およびＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡのより高い存在量が観察された（図５Ａ〜Ｂ）。さらに、ＡＰＰ−／−脳と比較してＡＰＰ＋／＋脳において、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合はより低く、ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡはより高かった（図５Ｃ〜Ｄ）。最終的に、ＭＡＳＴ４およびＲＴＫＮ２ならびにタンパク質存在量はともに、ＡＰＰ−／−脳と比較してＡＰＰ＋／＋脳においてより高かった（図５Ｅ）。これらの発見はＡＩＣＤ−ＭＡＳＴ４−ＦＯＸＯ１−ＲＴＫＮ２シグナル伝達がインビボにおいて損なわれていないことを示す。
【０１４７】
ＡＰＰをコレステロール調節異常に対する適応応答のメディエーターとみなす本発明者らの神経変性のモデルによると（２、８）、適応応答の失敗は、本発明者らがインビトロにおいて細胞障害性の用量で観察したのと同様に脳内の疾患表現型を反映する。そうであるか否かを決定するために、本発明者らは認知障害の肥満を引き起こすマウスモデルを使用した。６週齢のマウスにパルミチン酸に富んだ食事または対照食を１６週間与え、ＡＩＣＤ−ＭＡＳＴ４−ＦＯＸＯ１−ＲＴＫＮ２機能的相互作用の状態を決定した。パルミチン酸は、ＡＤの病理およびこの疾患のより高いリスクに関連する典型的な肥満を引き起こす西洋食において最も大量に存在する脂肪酸である（１６〜２１）。これは二次的な２７ＯＨＣの蓄積を導く（２２、２３）；これはインスリンおよびレプチンに対するＣＮＳ抵抗性を引き起こし（２４、２５）、これに関連する肥満および健康上のリスク（ＡＤを含む）をもたらし（２６、２７）、認知障害および行動障害を引き起こす（２８、２９）。さらに、ＦＯＸＯ１はインスリンとレプチンの両方に共通するメディエーターであり（３０、３１）、２７ＯＨＣはレプチンの発現を減弱する（３２）。したがって、本発明者らは、この認知障害のモデルに関連する疾患表現型が脂質異常症に対するＡＩＣＤによる適応応答の失敗の証拠を伴い得ると考えた。図６に示されるように、ＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合は高脂肪食群において減少し（図６Ａ）、これはより低いレベルのＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡと同時に起こったが（図６Ｃ）、より低いＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル（図６Ｄ〜６Ｆ）と同時に、ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合は増加した（図６Ｂ）。したがって、高レベルの２７ＯＨＣに曝露された細胞において観察されるように（例えば図１〜４に示されるように）、ＡＩＣＤによるＭＡＳＴ４、ＦＯＸＯ１およびＲＴＫＮ２の調節の減少は肥満を引き起こすパルミチン酸に富んだ食事を与えられたマウスの脳においても明らかである。
【０１４８】
ＡＩＣＤによるＲＴＫＮ２の調節は遅発性ＡＤにおいて障害されている
これまでの本発明者らの発見は、細胞障害性レベルの２７ＯＨＣへのインビトロでの曝露、ならびに認知障害および２７ＯＨＣ蓄積に関連するインビボでの脂質異常症が、細胞保護的なＡＩＣＤ−ＭＡＳＴ４−ＦＯＸＯ１−ＲＴＫＮ２経路内の機能的相互作用の障害をもたらし、最終的に細胞ストレスレスポンダーＲＴＫＮ２のより低い発現を導くことを示している。これは本発明者らの遅発性ＡＤの神経変性モデルと一致しており、ＡＰＰの転写活性は脂質異常症（コレステロール調節異常を含む）に応答して適切な脳の恒常性および認知機能を支える適応応答を促進するのに必要である（２、８）。このモデルは正しければ、遅発性ＡＤの脳においてＡＩＣＤ−ＭＡＳＴ４−ＦＯＸＯ１−ＲＴＫＮ２経路の障害が予想される。この考えを検証するために、本発明者らは遅発性ＡＤに罹患している患者、認知機能が健常な個体および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に罹患している患者からの解剖検体由来の側頭葉において、ＡＩＣＤ−ＭＡＳＴ４プロモーターおよびＦＯＸＯ１−ＲＴＫＮ２プロモーター相互作用、ならびにＭＡＳＴ４およびＲＴＫＮ２発現を測定した。本発明者らは、認知機能が健常な個体およびＦＴＤの脳と比較して、遅発性ＡＤ患者の脳においてＡＩＣＤのＭＡＳＴ４プロモーターへの結合が減少していたことを見出し（図７Ａおよび図７Ｉ）、これはＡＤ患者におけるより低いＭＡＳＴ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを伴っていた（図７Ｂおよび７Ｊ）。ＦＯＸＯ１のＲＴＫＮ２プロモーターへの結合は、対照試料およびＦＴＤ試料と比較してＡＤ患者において増加していた（図７Ｃおよび７Ｋ）。ＲＴＫＮ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、対照試料またはＦＴＤ試料と比較してＡＤ患者由来の試料において減少していた（図７Ｄ、７Ｌ、７Ｍおよび７Ｎ）。したがって、遅発性ＡＤ脳におけるＡＩＣＤによる分子経路の状態は、細胞障害性の用量の２７ＯＨＣに曝露された培養細胞において観察される状態、ならびにマウスの認知障害、２７ＯＨＣ調節異常、およびヒトの遅発性ＡＤのより高いリスクに関連する典型的な西洋食を与えられたマウスの脳において観察される状態と同等である。最終的に、本発明者らは、細胞傷害性レベルの２７ＯＨＣに曝露された細胞の場合と同様に、ＭＡＳＴ４キナーゼ活性が遅発性ＡＤ脳において減少するか否かを検証するために、組換えＦＯＸＯ１、および対照、ＦＴＤまたは遅発性ＡＤ側頭葉解剖検体由来の溶解物から免疫沈降されたＭＡＳＴ４を用いてインビトロキナーゼアッセイを行った。図７Ｇおよび７Ｈに示されるように、これは確かに事実であった。これらの結果は、遅発性ＡＤ脳において活性ではない正常およびＦＴＤの脳における新規のＡＰＰによって調節される細胞保護的な経路を明らかにする。
【０１４９】
考察
本発明者らは本明細書において、ＡＰＰの転写活性が遅発性ＡＤ脳におけるコレステロール調節異常の初期マーカーである２７ＯＨＣに対するホルミシス応答を促進するという新規なシグナル伝達経路を報告する（９、１０）。分子機構はＭＡＳＴ４キナーゼおよびＦＯＸＯ１の調節を含み、オキシステロールストレスレスポンダーＲＴＫＮ２の発現を最適化し、２７ＯＨＣの細胞障害性に対抗する。この適応応答は認知機能低下の脂質異常症マウスモデルおよびヒト遅発性ＡＤ患者（これらは共に異常な２７ＯＨＣ調節を示す）の脳には存在しないが、発症が脂質異常症またはオキシステロール調節異常と主として関連しないＦＴＤの脳においては変化しない。さらに、適応応答の成功にはＡＰＰの機能的なコレステロールセンシングドメインが必要であり、これはオキシステロールに結合することも示されている（１４、３３、３４）。
【０１５０】
健常な脳において明白であるが遅発性ＡＤにおいて存在しないＡＰＰによるホルミシス適応応答の存在は概念的に重要である。多種多様なストレス刺激（酸化ストレス、エネルギー欠乏、グルタミン酸、一酸化炭素、ＴＮＦαおよび様々な植物性化学物質を含む）に応答するホルミシスが脳において報告されている（３５、３６）。これはまた、初期の病原性誘因に対する認知症における保護機構として存在し得ることが示唆されており（３７、３８）、本明細書における本発明者らの発見は、遅発性アルツハイマー病に関連する生活習慣のリスク因子に関する神経変性ストレス要因に対するホルミシスの存在についての現在不足している機構的裏付けを提供する。
【０１５１】
さらに、このホルミシス応答のドライバーとしてのＡＰＰの解明は、ＡＰＰを単なる一次病原性カスケード内のアミロイドペプチドＡβの前駆体としての現在受け入れられている役割（これは明白な病態生理学的文脈を持たず、全体的な証拠に合わないと考えられる（２、５、８））を超えて定義するため、病因論においてその機能を理解するための新規な基準の枠組みを提供する。最終的に、２７ＯＨＣに対する適応応答が遅発性ＡＤ脳において欠損しているという発見は、その最適化のための合理的根拠を与え、根拠に基づく治療法の探索に情報を提供する。
【０１５２】
材料と方法
バイオインフォマティクスおよびデータマイニング
Ｅｎｔｒｏｓｏｌｖｅ（Entrosolve.com）を、あらゆる大規模データセットをマイニングし、コンセンサス配列マッピングを実行し、シグナル伝達経路を同定するために採用した。
【０１５３】
細胞単離および培養
ラット皮質ニューロンを、製造者の説明書に従ってパパイン解離キット（Worthington、NJ；カタログ番号ＬＫ００３１５０）を用いて解離した。ニューロンを、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬを含むＢ２７サプリメントを含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で培養した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＢ１０３細胞を、５％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ（Sigma カタログ番号Ｄ６４２９−５００Ｍ）中で培養した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１０μＭレチノイン酸の添加によって、実験前に７日間分化させた。
【０１５４】
遺伝子導入
遺伝子導入をリポフェクタミンＬＴＸ（Thermofisher；カタログ番号Ａ１２６２１）を用いて製造者の説明書に従って行った。
【０１５５】
ヒト脳
死後組織をカリフォルニア大学ロサンゼルス校のイーストンアルツハイマー病研究センターブレインバンクから取得した。承認された臨床的基準および病理組織学的基準を用いて診断を確立した。
【０１５６】
全ての患者および／または彼らの法定後見人は、組織提供の前に研究プロトコルに参加するというインフォームド・コンセントを与えた。すべての方法およびプロトコル（ヒト対象のプライバシーの権利を確保するために必要な方法およびプロトコルを含む）は関連する施設の規則に従って実行され、ロマリンダ大学メディカルセンターの治験審査委員会によって承認された（承認番号５４１７４）。
【０１５７】
動物研究
全ての動物処置は、実験動物の人道的管理および使用に関する米国公衆衛生局の規範に従って実行され、ノースダコタ大学の動物実験委員会によって承認された（プロトコル１５０６−３ｃ）。全ての動物実験は、実験動物の管理および使用に関する国立衛生研究所の指針（NIH Publications No. 8023、1978年改訂）に従う。マウスを、室温（２３〜２５℃）および５０〜７０％の範囲の周囲相対湿度において個別に換気されたケージに収容した。マウスを１２：１２時間の明：暗周期で維持した。雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢）に、正常食またはパルミテートに富んだ食餌を１６週間与えた（１群あたりｎ＝６）。正常食は０．８％のパルミテートおよび２．２％のリノール酸を含む（ＮＩＨ−０７オープンフォーミュラマウス、ＴＤ．８＋５１７２；Herlan Teklad）。パルミテートに富んだ食餌は、３０ｇ／ｋｇのパーム油（３％）をＮＩＨ−０７マウス食餌に添加してパルミチン酸を０．８から２．２重量％に増加させ、リノール酸を２．２から０．８％に低下させることによって処方される（ＴＤ．１１０６１６、Harlan Teklad）。対照食およびパルミテートの食餌は等カロリーであり、重要な相違点はパルミテートレベルにある。
【０１５８】
マイクロアレイ転写プロファイリング
マイクロアレイトランスクリプトームを作成するために本研究で使用されたマウスは詳細に記載されている(Nunes et al., Neurobiol Dis.. 2011, 42:349-59)。試料を液体窒素中で急速凍結し、凍結試料をマイクロアレイ転写プロファイリングのためにGenus Biosystems (Northbrook, IL)に送った。
【０１５９】
ＲＮＡ精製
ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬を用いて製造者の説明書に従って精製した（Thermofisherカタログ番号１０２９６０１０）。
【０１６０】
クロマチン免疫沈降アッセイ
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを、ABcamによって公開されている標準プロトコルに従って行った。処理後、細胞を終濃度０．７５％のホルムアルデヒドと共に１０分間インキュベートし、次いで終濃度１２５ｍＭのグリシンと共にさらに５分間インキュベートした。次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＦＡ溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤）に溶解した。得られた細胞溶解物を超音波処理してＤＮＡを断片化し、遠心沈殿させ、抗体結合プロテインＡセファロースビーズ（ThermoFisher カタログ番号１０１０４１）と共に穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートした。インキュベーション後、ビーズをペレット化し、ＦＡ溶解緩衝液で３回洗浄し、ＤＮＡを溶出緩衝液（１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３）で溶出した。得られたＤＮＡフラグメントをｑＰＣＲ分析の前にＤＮＡ精製キット（Clontech カタログ番号７４０６０９．２５０）を用いてさらに精製した。使用した抗体は抗ＡＰＰ Ｃ末端（Sigma ＃Ａ８７１７）；抗ＦＯＸＯ１（Abcam ＃３９６７０）であった。プライマー配列を表１に記載する。
表１．プライマー配列
【表１】
2020504626.tif 000003
【０１６１】
ｑＰＣＲ
ｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて精製し、逆転写酵素を用いて製造者の説明書に従ってｃＤＮＡに変換し、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Bio-Rad カタログ番号１７２５１２０）を用いて定量化した。結果をデルタデルタサイクル閾値（ｃｔ）法を用いて決定した。プライマー配列を表１に記載する。
【０１６２】
イムノブロッティング
イムノブロッティングを以下の抗体を用いて以前に記述されているように実行した：ＡＰＰ（Sigma ＃Ａ８７１７；Millipore ＃２２Ｃ１１）；ＭＡＳＴ４（GeneTex ＃ＧＴＸ８７８９９）；ＦＯＸＯ１（Cell Signaling Technology ＃２８８０）；ＲＴＫＮ２（Proteintech ＃１７４５８−１−ＡＰ）；カスパーゼ３（Cell Signaling Technology ＃９６６２）；カスパーゼ７（Cell Signaling Technology ＃９４９２）；アクチン（Sigma ＃Ａ５３１６）（７）。
【０１６３】
免疫沈降
免疫沈降を、非変性条件下においてABcamによって概説されるように行った。
【０１６４】
ＭＡＳＴ４インビトロキナーゼアッセイ
キナーゼ活性を、５０μＭ ＡＴＰおよびヒト組換えＦＯＸＯ１（１μｇ；Origene ＃ＴＰ３００４７７）を添加した５０μｌ キナーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）において３７℃で３０分間測定した。キナーゼ反応を４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（Thermofisher）上で行い、副産物を抗ホスホ−セリン／スレオニン抗体（Abcam ab17464）を用いて同定した。
【０１６５】
ＬＤＨアッセイ
ＬＤＨアッセイを、製造者の説明書に従ってＬＤＨアッセイキット（カタログ番号８８９５４）を用いて行った。
【０１６６】
生死細胞アッセイ
生死細胞アッセイを、製造者の説明書に従って生死細胞アッセイキット（Thermofisher＃Ｌ３２２４）を用いて行った。
【０１６７】
脂質ラフト分画
脂質ラフトを界面活性剤を含まない方法を用いて単離した。具体的には、細胞を１０ｃｍディッシュ中において８０％コンフルエンスまで増殖させ、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、２ｍｌの１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．０プラスＨａｌｔＴＭプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Thermofisher カタログ番号７８４４３）を用いて溶解した。細胞懸濁液をダウンス型Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーの８回のストロークでホモジナイズし、次いでＶｉｂｒａ Ｃｅｌｌ(Sonics and Materials, USA)によるパワー設定１（３×２０秒）での連続的な超音波処理を用いて超音波処理した。次に、ホモジネートをＭＢＳ緩衝液中の２ｍｌの９０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液と混合することによって４５％スクロースに調整し、次いで１２ｍｌのベックマンウルトラクリア遠心チューブに加えた。４ｍｌの３５％（ｗ／ｖ）スクロースを慎重に積層し、次いで４ｍｌの５％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を積層した。９０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液をＭＢＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｍｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で調製した。３５％および５％スクロース溶液を共にＭＢＳ緩衝液プラス２５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３で調製した。次に試料を１７５０００ｇ（ベックマン ＳＷ４１ローターを用いて３９０００ｒｐｍ）で４℃で１８時間遠心分離した。１ｍｌの画分をチューブの上部から取得し、そして−２０℃で保存した。
【０１６８】
統計解析
データは少なくとも３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ノンパラメトリックなデータに使用した検定には、テューキーの事後検定を伴うクラスカル−ウォリス検定およびマン−ホイットニーのＵ検定が含まれていた。パラメトリックなデータを、事後ボンフェローニを伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。他の指示がない限り、Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なされる。
【０１６９】
参考文献
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【０１７０】
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＊＊＊
【０１７１】
本明細書において引用されたあらゆる刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されるように、参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連した方法および／または物質を開示および記述するように参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
本発明は、本明細書に広く一般的に記載されている。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属の分類もそれぞれ本発明の一部を形成する。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者はそれによって本発明がマーカッシュグループのあらゆる個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載されていることを認識する。
【０１７３】
本発明は特定の態様、実施態様および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、そのような態様、実施態様および任意選択の特徴の修飾、改良および変形が当業者によって再分類され得ることが理解されるはずであり、そのような修飾、改良および変形は本開示の範囲内であるとみなされることが理解されるはずである。
【図１Ａ】
2020504626.tif 000004
【図１Ｂ】
2020504626.tif 000005
【図１Ｃ】
2020504626.tif 000006
【図１Ｄ】
2020504626.tif 000007
【図１Ｅ】
2020504626.tif 000008
【図１Ｆ】
2020504626.tif 000009
【図１Ｇ】
2020504626.tif 000010
【図１Ｈ】
2020504626.tif 000011
【図１Ｉ】
2020504626.tif 000012
【図２Ａ】
2020504626.tif 000013
【図２Ｂ】
2020504626.tif 000014
【図２Ｃ】
2020504626.tif 000015
【図２Ｄ】
2020504626.tif 000016
【図２Ｅ】
2020504626.tif 000017
【図２Ｆ】
2020504626.tif 000018
【図２Ｇ】
2020504626.tif 000019
【図３Ａ】
2020504626.tif 000020
【図３Ｂ】
2020504626.tif 000021
【図３Ｃ】
2020504626.tif 000022
【図３Ｄ】
2020504626.tif 000023
【図３Ｅ】
2020504626.tif 000024
【図３Ｆ】
2020504626.tif 000025
【図３Ｇ】
2020504626.tif 000026
【図３Ｈ】
2020504626.tif 000027
【図３Ｉ】
2020504626.tif 000028
【図３Ｊ】
2020504626.tif 000029
【図４Ａ】
2020504626.tif 000030
【図４Ｂ】
2020504626.tif 000031
【図４Ｃ】
2020504626.tif 000032
【図４Ｄ】
2020504626.tif 000033
【図５Ａ】
2020504626.tif 000034
【図５Ｂ】
2020504626.tif 000035
【図５Ｃ】
2020504626.tif 000036
【図５Ｄ】
2020504626.tif 000037
【図５Ｅ】
2020504626.tif 000038
【図６Ａ】
2020504626.tif 000039
【図６Ｂ】
2020504626.tif 000040
【図６Ｃ】
2020504626.tif 000041
【図６Ｄ】
2020504626.tif 000042
【図６Ｅ】
2020504626.tif 000043
【図６Ｆ】
2020504626.tif 000044
【図７Ａ】
2020504626.tif 000045
【図７Ｂ】
2020504626.tif 000046
【図７Ｃ】
2020504626.tif 000047
【図７Ｄ】
2020504626.tif 000048
【図７Ｅ】
2020504626.tif 000049
【図７Ｆ】
2020504626.tif 000050
【図７Ｇ】
2020504626.tif 000051
【図７Ｈ】
2020504626.tif 000052
【図７Ｉ】
2020504626.tif 000053
【図７Ｊ】
2020504626.tif 000054
【図７Ｋ】
2020504626.tif 000055
【図７Ｌ】
2020504626.tif 000056
【図７Ｍ】
2020504626.tif 000057
【図７Ｎ】
2020504626.tif 000058
【配列表】
2020504626000001.app
【国際調査報告】
2020504626.tif 000059
2020504626.tif 000060
2020504626.tif 000061
2020504626.tif 000062