(57)【要約】単離されたＣＴＬＡ４モノクローナル抗体を提供する。当該抗体はＣＴＬＡ４に高度に特異的に結合することができ、ＣＬＴＡ４のＢ７への結合を効果的に遮断することができ、ＣＴＬＡ４の活性または発現レベルを低下させ、生体の免疫機能に対するＣＴＬＡ４の阻害を軽減し、Ｔリンパ球を活性化し、腫瘍および免疫系疾患を効果的に処置することができる。また、抗体の医薬組成物および診断用組成物を含むモノクローナル抗体複合体、ならびに腫瘍および免疫系疾患を組み合わせて予防および／または処置するための薬物の調製におけるその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４のヒトＢ７への結合を阻害する単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに／または軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含み、あるいは
前記重鎖可変領域は、配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに／または軽鎖可変領域は、配列番号２２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含み、あるいは
前記重鎖可変領域は、配列番号２５に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７に記載の重鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに／または軽鎖可変領域は、配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む、
単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体が全長抗体である、請求項１に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗原結合フラグメントは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）’２またはｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号９、または配列番号１１に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が配列番号７に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号８に記載の配列を含む、請求項６に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記重鎖可変領域が配列番号９に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号１０に記載の配列を含む、請求項６に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記重鎖可変領域が配列番号１１に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号１２に記載の配列を含む、請求項６に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域が配列番号３９または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６または１０のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含み、前記抗体の前記重鎖定常領域は、マウス抗体の重鎖定常領域もしくはヒト抗体の重鎖定常領域であり、および／または前記抗体の前記軽鎖定常領域は、マウス抗体の軽鎖定常領域もしくはヒト抗体の軽鎖定常領域である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４のヒトＢ７−１および／またはヒトＢ７−２への結合を阻害する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ＣＴＬＡ４のヒトＢ７への結合を阻害する単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合するか、または請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメントとヒトＢ７との結合について競合する、単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
抗体部分および結合部分を含み、前記抗体部分が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記結合部分が治療試薬または診断試薬である、免疫接合体。
【請求項１９】
前記結合部分が、放射性核種、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、フルオレセイン、およびビオチンの１つ以上から選択される、請求項１８記載の免疫接合体。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１５に記載の核酸、または請求項１８もしくは１９に記載の免疫接合体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
ＣＴＬＡ４に特異的に結合するための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１５に記載の核酸、または請求項１８もしくは１９に記載の免疫接合体の使用。
【請求項２２】
ＣＴＬＡに特異的に結合する前記医薬が、ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断し、ＣＴＬＡ４の活性もしくはレベルをダウンレギュレートし、ＣＴＬＡ４の生体への免疫抑制を軽減し、Ｔリンパ球を活性化し、またはＴリンパ球におけるＩＬ−２の発現を改善するために使用される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
ＣＴＬＡに特異的に結合する前記医薬が、癌および免疫系疾患の予防および／または処置および／またはアジュバント処置に使用される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、結腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、神経膠腫または黒色腫から選択される、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
癌および免疫系疾患の予防および／または処置および／またはアジュバント処置の方法であって、それを必要とする対象に請求項２０に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、結腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、神経膠腫または黒色腫から選択される、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍免疫療法および分子免疫学の分野にあり、ＣＴＬＡ４抗体、医薬組成物およびその使用に関する。具体的には、本発明は、ＣＴＬＡ４の種々のモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の免疫系は、最適な免疫応答を達成するために、複数のレベルでの分子および細胞の相互作用を必要とする。特に、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の活性化は、生物の免疫応答系において重要な役割を果たしている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に運ばれるペプチドを介して抗原を提示することによってＴ細胞を活性化することができる。この活性化にはＡＰＣの同時刺激も必要である。Ｔ細胞への非特異的同時刺激シグナルの送達には、ＡＰＣ上に見いだされる少なくとも２つの相同なＢ７ファミリーメンバー、すなわちＢ７−１（Ｂ７、Ｂ７．１、またはＣＤ８０とも呼ばれる）およびＢ７−２（Ｂ７．２またはＣＤ８６とも呼ばれる）が必要であり、これらの両方は、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体に結合するときに同時刺激シグナルを送達することができ、その結果、Ｔ細胞が活性化される。ＣＤ２８は、単一の細胞外可変領域を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのホモ二量体糖タンパク質メンバーであり、大部分の成熟ヒトＴ細胞上に発現される。
【０００３】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４、すなわち短縮してＣＴＬＡ４は、遺伝子構造、染色体マッピング、配列相同性、および遺伝的発現の点でＣＤ２８分子と非常に密接に関連している。ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８は共に、同時刺激分子Ｂ７のレセプターであり、主に活性化Ｔ細胞の表面に発現している。しかし、リンパ球活性化の同時刺激シグナルとして、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８分子の機能は逆である。ＣＴＬＡ４の役割は主にＴ細胞活性化を阻害することであり、これはＣＴＬＡ４欠損マウスで観察される大量のリンパ節（ｍａｓｓｉｖｅ  ｌｙｍｐｈａｄｅｎｉａ）によって示される。
【０００４】
以前の研究は、ＣＴＬＡ４または外因性ＣＴＬＡ４タンパク質に対する中和抗体が、ＣＴＬＡ４の天然リガンドへの結合を遮断することができ、それによってＣＴＬＡ４のＴ細胞への負の調節シグナルを遮断し、種々の抗原に対するＴ細胞の反応性を増強することができることを示している。従って、ＣＴＬＡ４をブロックすることは、癌および感染症のような免疫刺激の増強を必要とする関連するヒト疾患を処置するための新規方法を提供し得る。現在、ＣＴＬＡ４抗体は悪性黒色腫の処置のために承認されており、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、消化器癌、肝癌などの臨床試験に用いられている。
【０００５】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞亜集団を調節するためのＴ細胞によって産生されるサイトカインであり、免疫応答を調節する重要な因子でもある。ＩＬ−２はまた、Ｂ細胞の増殖および分化を促進し、抗体応答、造血および腫瘍学的サーベイランスに関与し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ＣＴＬＡ４抗体が微生物に対するＣＴＬＡ４の免疫抑制を特異的に軽減し、Ｔ細胞を活性化し、ＩＬ−２産生を誘発することができることを示しており、腫瘍および感染症の処置において大きな展望を示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在のところ、ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を阻止するための新たな抗体およびそのヒト化抗体を開発することが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マウスを免疫するための抗原として、哺乳動物細胞発現系によって発現される組換えＣＴＬＡ４タンパク質を使用する。ハイブリドーマ細胞は、マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合によって得られる。試料についてのハイスループットスクリーニングの後、本発明者らは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する特異的モノクローナル抗体を分泌することができるいくつかのハイブリドーマ細胞株を見出し、モノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ４のＢ７−１またはＢ７−２への結合を非常に効果的に遮断することができる（図３、表ＩＩ）。キメラ抗体はさらに分子クローニング等により得られ、特性化と機能研究に関する一連の研究が行われた。得られたキメラ抗体は、ヒトＴ細胞の表面（図４）のＣＴＬＡ４に高親和性（表Ｖ）で、参照抗体と比較して同一または異なるエピトープで結合することができる（図５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能試験により、これらのキメラ抗体がＴ細胞株および初代Ｔ細胞の免疫機能を促進することが明らかになり（図７、８）、動物実験の結果から、これらのキメラ抗体はヒト化ＣＴＬＡ４ノックインマウスにおける腫瘍成長を効果的に阻害できることが示された（図９）。最後に、これらの抗体をヒト化して免疫原性を低下させ、治療用抗体を得た。以下の発明は、それによって提供された。
【０００８】
本発明は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗体を提供し、また、ヒトＣＴＬＡ４の結合がヒトＣＴＬＡ４のヒトＢ７への結合を阻害し得るキメラ抗体およびヒト化抗体を提供する。本発明はまた、ヒトＣＴＬＡ４のヒトＢ７への結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％遮断するヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合するキメラ抗体を提供する。
【０００９】
本発明は、ハイブリドーマ細胞株から産生されたヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗体を提供する。免疫化マウスおよび細胞融合から誘導される本発明によって提供されるハイブリドーマ細胞株は、スクリーニングなどの一連の操作を介して、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０への結合を特異的に遮断するモノクローナル抗体を産生し得る。（実施例１参照）
【００１０】
一態様では、本発明は、組換えＣＴＬＡ４タンパク質に結合するマウスモノクローナル抗体を提供し、ＥＣ５０は０．０２ｎＭおよび０．０６ｎＭの範囲内にあり；提供されるマウスモノクローナル抗体は、細胞表面上の天然ＣＴＬＡ４タンパク質に結合し、ＥＣ５０は１ｎＭおよび４ｎＭの範囲内にある。この場合、ＥＣ５０という言葉は、最大効果の５０％の濃度を指す。（実施例２参照）
【００１１】
本発明の別の態様において、マウスモノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ４のＢ７−１（ＣＤ８０）またはＢ７−２（ＣＤ８６）への結合を遮断するために提供され、ＩＣ５０はそれぞれ、２ｎｇ／ｍＬ〜７０ｎｇ／ｍＬおよび２００ｎｇ／ｍＬ〜１１０００ｎｇ／ｍＬの範囲である。この場合、ＩＣ５０（半最大阻害濃度）とは、測定されるアンタゴニストの半分の阻害濃度を指す。（実施例３参照）
【００１２】
特に明記しない限り、本発明におけるＢ７は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２であり；特定のタンパク質配列は、従来技術において公知の配列であり、これは、既存の文献またはＧｅｎＢａｎｋに開示される配列を指すことができる。例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９４１）；Ｂ７−２（ＣＤ８６、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９４２）。
【００１３】
一態様では、本発明で提供されるマウスモノクローナル抗体は、マウスとのより弱い種間交差反応を示すが、カニクイザルとの種間交差反応を有する。（実施例４参照）
【００１４】
本発明はまた、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合するキメラ抗体を提供し、キメラ抗体の重鎖および軽鎖は、マウスＣＴＬＡ４抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１およびカッパの定常領域に連結することによって構築される。本発明によって提供されるキメラ抗体は、マウス抗体と比較して類似の親和性を有する。（実施例５参照）
【００１５】
一態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４のヒトＢ７への結合を阻害する単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに／または軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含み、あるいは
前記重鎖可変領域は、配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに／または軽鎖可変領域は、配列番号２２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含み、あるいは
前記重鎖可変領域は、配列番号２５に記載の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に記載の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７に記載の重鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに／または軽鎖可変領域は、配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、抗体は全長抗体である。
【００１７】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、抗原結合フラグメントは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）’２またはｓｃＦｖである。
【００１８】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００１９】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号７、配列番号９、または配列番号１１に示される配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２に示される配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号７に示される配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８に示される配列を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号９に示される配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０に示される配列を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１１に示される配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示される配列を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号３９または配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含み；抗体の重鎖定常領域は、マウス抗体の重鎖定常領域もしくはヒト抗体の重鎖定常領域であり、および／または抗体の軽鎖定常領域は、マウス抗体の軽鎖定常領域もしくはヒト抗体の軽鎖定常領域である。
【００２７】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４のヒトＢ７−１および／またはヒトＢ７−２への結合を阻害する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、上記の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメントのいずれかと同じエピトープに結合するか、または上記の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメントのいずれかとヒトＢ７との結合について競合する、ＣＴＬＡ４のヒトＢ７への結合を阻害する、単離された抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、上記の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかをコードする単離された核酸；核酸を含むベクター；および核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３０】
本発明によって提供されるキメラ抗体は、活性化Ｔ細胞に結合することができる。（実施例６参照）
【００３１】
本発明により提供されるキメラ抗体は、速度論的検出において高親和性を示し、平衡会合定数ＫＤは、＜１×１０−１２および８．６８×１０−１１である。一態様では、本発明によって提供される動態パラメータは、生体分子相互作用系Ｏｃｔｅｔ−９６（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓ−０００９５９）を用いて決定される。（実施例７参照）
【００３２】
本発明によって提供されるキメラ抗体の抗原ＣＴＬＡ４−ｈＦｃへの結合エピトープは、既知の正の対照抗体と比較して、正確には同じではない。（実施例８参照）
【００３３】
本発明によって提供されるキメラ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでより高い生物活性を有する。一態様では、本発明の抗体は、細胞活性実験中にＪｕｒｋａｔ細胞検出を用いてＩＬ−２サイトカインの分泌を増強することができ（実施例９参照）、別の態様では、本発明の抗体は、同種混合リンパ球反応中のＩＦＮ−γの分泌を増強することができる（実施例１０参照）。
【００３４】
本発明によって提供されるキメラ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより高い薬理活性を有する。本発明の抗体は、腫瘍増殖を効果的に阻害し、動物の腫瘍モデルにおける腫瘍の体積を減少させることができる。（実施例１１参照）
【００３５】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで以下の用途を有する：ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断する、ＣＴＬＡ４の活性またはレベルを調節する（例えば、ダウンレギュレートする）、ＣＴＬＡ４の生体への免疫抑制を軽減する、Ｔリンパ球を活性化する、またはＴリンパ球におけるＩＬ−２の発現を改善する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、抗体部分および接合部分を含む免疫接合体に関するものであり、抗体部分は、上記の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかであり、接合部分は、治療試薬または診断試薬である。好ましくは、接合部分は、放射性核種、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、フルオレセイン、およびビオチンの１つ以上から選択される。
【００３７】
本発明は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する薬学的に有効な抗体を提供する。具体的には、薬学的に有効なヒト抗体は、Ｔ細胞および他の免疫細胞の表面上のＣＴＬＡ４に結合する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、上記のような抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント、上記のような核酸、または上記のような免疫接合体、および薬学的に許容可能な担体のいずれかを含む、医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、さらに、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントと、別々の分子としての１つ以上の他の生理活性分子との接合体（例えば、本発明の少なくとも１つのキメラ抗体と別の生理活性分子との接合体）を含んでもよく、または１つの分子中の１つ以上の他の生理活性分子の複数の接合体、例えば、二重特異的または多重特異的分子の場合、本発明の２つ以上のキメラ抗体の接合体、または１つ以上の他の生理活性分子との接合体と結合してもよい。
【００３９】
別の態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４を特異的に結合するための医薬の製造における、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメント、核酸または免疫接合体の使用に関する。
【００４０】
いくつかの具体的な実施形態において、ＣＴＬＡに特異的に結合する医薬は、ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断し、ＣＴＬＡ４の活性またはレベルをダウンレギュレートし、ＣＴＬＡ４の生体への免疫抑制を軽減し、Ｔリンパ球を活性化し、またはＴリンパ球におけるＩＬ−２の発現を改善するために使用される。
【００４１】
いくつかの具体的な実施形態において、ＣＴＬＡに特異的に結合する医薬は、癌および感染症の予防および／または処置および／またはアジュバント処置に使用される。
【００４２】
いくつかの具体的な実施形態において、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、結腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、神経膠腫または黒色腫から選択される。
【００４３】
別の態様において、本発明は、癌および免疫系疾患の予防および／または処置および／またはアジュバント処置の方法であって、それを必要とする対象に本発明の有効量の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００４４】
いくつかの具体的な実施形態において、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、結腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、神経膠腫または黒色腫から選択される。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「同一性」とは、既定のパラメータと共に当該技術分野で周知のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴを用いて計算した２つ以上の配列間の同一のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。
【００４６】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」とは、安全に投与することができる固体または液体の希釈剤、充填剤、抗酸化剤、安定剤などを指す。投与経路によれば、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、マルトース、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸塩、リン酸緩衝液、乳化剤、等張性生理食塩水、および／またはパイロジェン非含有水などを含むがこれらに限定されない当該技術分野で周知の種々の異なる担体を投与することができる。
【００４７】
本明細書で使用される用語「有効量」とは、対象において臨床医が望むように生物学的または医学的応答をもたらすのに十分である活性化合物の量を指す。抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントの「治療有効量」は、投与経路、および患者の体重、年齢、疾患などの因子に従って当業者によって決定することができる。例えば、典型的な１日投与量は、体重ｋｇ当たり活性成分０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
【００４８】
本発明により提供される医薬は、粉末、注射等のような臨床的に許容可能な剤形にすることができる。本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路を用いて対象に投与することができ、例えばそれを、経口的に、静脈内注入によって、筋肉内注射によって、皮下注射によって、腹膜下に、直腸内に、舌下に、または吸入によって、経皮的などで投与することができる。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」は、典型的には、限定されるものではないが、包含することを意味する。ある配列を「構成する」ことを言及する場合、それはまた、この配列からなる場合を構成すると考えるべきである。
【００５０】
当業者は、本明細書に記載するものに加えて、本発明の抗体がさらなる用途または組成を有し得ることを理解するであろう。抗体がヒトＣＴＬＡ４抗原に結合する全ての場合において、そのような用途および組成は、本発明の範囲内であると考えられる。当業者は、本発明の抗体の可変領域配列（配列番号７〜配列番号１２）、または本発明の抗体のＣＤＲ（配列番号１３〜配列番号３０）、またはヒト化抗体の配列（配列番号３１〜配列番号４５）に変更を加えてもよいことを理解するであろう。このような変化は本発明の抗体の特性を著しく変化させるものではなく、従って、このような変形は本発明の範囲内にあると考えるべきである。さらに、抗体の可変領域またはＣＤＲ配列内のこのような変化は、そのような変異体の可変領域配列が本発明の配列と有意な相同性を有する限り、本発明の範囲内にあると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＥＬＩＳＡによるマウス抗ＣＴＬＡ４抗体のｈＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質への結合の検出。
【図２】ＦＡＣＳによるマウス抗ＣＴＬＡ４抗体の２９３Ｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞への結合の検出。
【図３】ＥＬＩＳＡによるＣＤ８０またはＣＤ８６のＣＴＬＡ４への結合を遮断するマウス抗ＣＴＬＡ４抗体の検出。
【図４】ＦＡＣＳによる活性化Ｔ細胞へのＣＴＬＡ４キメラ抗体の結合の検出。
【図５】ＥＬＩＳＡによるＣＴＬＡ４キメラ抗体と他の抗体との間のエピトープ競合の検出。
【図６】ＥＬＩＳＡによるＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ−２分泌を用量依存的に増強するＣＴＬＡ４キメラ抗体の検出。
【図７】ＥＬＩＳＡによるＪｕｒｋａｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞におけるＩＬ−２分泌を用量依存的に増強するＣＴＬＡ４キメラ抗体の検出。
【図８】ＥＬＩＳＡによるＭＬＲ実験におけるＩＦＮ−γ分泌を増強するＣＴＬＡ４キメラ抗体の検出。
【図９】ＣＴＬＡ４キメラ抗体によるヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスにおける腫瘍成長阻害。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を参考に詳細に説明する。当業者は、以下の実施例が本発明を説明することを意図するに過ぎないが、本発明の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。特定の技術または条件が示されていない例は、当該技術分野の文献に記載されている技術または条件に従って（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（著者）、Ｈｕａｎｇ  Ｐｅｉｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（翻訳者）、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓを参照して））、または製品仕様に従って実施される。製造業者が表示されていない試薬または器具は、市販されている従来の製品である。
【００５３】
実施例１：動物免疫化およびマウス抗ＣＴＬＡ４抗体のスクリーニング
年齢に適したＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、免疫注射を行った。ｈＣＴＬＡ４−ｍＦｃ融合タンパク質を抗原として使用し、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合し、次いで、対応するＢリンパ球のクローニングを刺激するために、皮下注射によって免疫化マウスに注射した。次いで、免疫化マウスを、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で乳化した１００μｇのＣＴＬＡ４−ｍＦｃを約２〜３週間毎に１：１の比で腹腔内注射することによって追加免疫した。無菌操作によりマウスから採取した脾臓リンパ球を、調製したＳＰ２／０骨髄腫細胞と、ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１８１）を加えて一定の比率（脾臓細胞１×１０８、骨髄腫細胞２×１０７）で混合した。
【００５４】
融合後、融合細胞をウェル当たり０．１ｍＬのＨＡＴ培地で９６ウェルプレートに加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。４日目に、ウェル当たり０．１ｍＬのＨＴ培地を添加した。７日目に、培地をＨＴ培地に完全に置換した。スクリーニングは８〜１２日目に実施した。陽性細胞を限界希釈によりサブクローニングし、下記のようにＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにより増殖および試験した。
【００５５】
ｈＣＴＬＡ４−ｈＦｃの２μｇ／ｍＬを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃９０１８）上にコーティングし、続いて４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳ）で３回洗浄し、５％脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ、カタログ＃ＬＰ００３１Ｂ）で遮断した。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、ハイブリドーマ上清を加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１／５０００希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ第二抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ＃４０５３０６）と共にインキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｉａｎｇｅｎカタログ＃  ＰＡ１０７−０２）を加えて展開した。
【００５６】
２９３Ｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞への抗体の結合はＦＡＣＳにより検出された。ウェル当たり２９３Ｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞の１×１０５を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３７９９）に添加し、ハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を緩衝液（１％ＢＳＡおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を緩衝液で洗浄し、Ａｔｔｕｎｅ  Ｎｘｔフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で分析した。
【００５７】
ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０への結合を遮断することができるので、ハイブリドーマ上清を、リガンド遮断実験を用いることによってさらにスクリーニングした。２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｍ４２８０）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃９０１８）にコーティングし、その後４℃で一晩インキュベートした。プレートを３回洗浄し、５％脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ、カタログ＃ＬＰ００３１Ｂ）で３７℃で２時間遮断した。プレートを３回洗浄し、２０μｇ／ｍＬのｈＣＤ８０−Ｆｃおよび２０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｈＣＴＬＡ４−Ｈｉｓの予備混合物と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＢＤ、カタログ＃５５４０６６）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢを加えて展開した。
【００５８】
実施例２：精製ハイブリドーマ上清抗ＣＴＬＡ４抗体の物理化学的および結合特性
ハイブリドーマのモノクローナル細胞は、３回以上の制限希釈によって得た。ハイブリドーマの安定なモノクローナル細胞を無血清栽培化（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１２０４５−０７６）を８〜９日間行い、Ｔ−１７５培養フラスコ（ＮＵＮＣ、カタログ＃１５９９１０）に拡大した。８〜９日目に、上清を採取し、０．２２μｍフィルター膜を用いて濾過した。上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ＃１７５４９１１２）に通して、カラムに吸着された抗体を単離し、精製した。プロテインＡカラムを１ｍＭ  ＰＢＳで洗浄し、抗体を５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出した。０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で溶出液を中性に調整し、０．２２μｍのフィルター膜を用いて濾過した。抗体の溶液をＵｌｔｒａ−１５遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＡＣＳ５０００２４）で濃縮し、抗体の濃度をナノドロップ分光光度法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００）を用いて検出した。精製抗体の溶液中のエンドトキシンの含有量は、標準含有量が１ＥＵ／ｍＬ未満のＧｅｌ  Ｃｌｏｔ  ＴＡＬキット（Ｘｉａｍｅｎ  Ｂｉｏｅｎｄｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ＃０１０２５０）を用いて検出した。
【００５９】
精製抗体のＣＴＬＡ４−ｈＦｃへの結合を検出するためにＥＬＩＳＡを用いた。ｈＣＴＬＡ４−ｈＦｃを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃９０１８）上にコーティングし、続いて４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳ）で３回洗浄し、５％脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ、カタログ＃ＬＰ００３１Ｂ）で３７℃で２時間遮断した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、検出する抗体と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１／５０００希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃３１４３２）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢを添加して展開した。その結果を図１に示し、結合の有効濃度の中央値を表Ｉに示す。
【００６０】
精製した抗体を、ＦＡＣＳを用いて２９３Ｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞への結合について検出した。２９３Ｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で４×１０６細胞／ｍＬに再懸濁し、５０μＬ／ウェルで９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３７９５）に添加した。検出する精製抗体を一定の濃度（５０μＬ／ウェル）でウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を緩衝液で３回洗浄し、ＰＥ標識蛍光二次抗体と共に４℃で０．５時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２００μＬ／ウェルまで再懸濁した。蛍光シグナルはＡｔｔｕｎｅ  Ｎｘｔフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて検出した。結果を図２に示し、結合の有効濃度の中央値を表Ｉに示す。
【００６１】
表Ｉ
【表１】
2020513819.tif 000002
【００６２】
実施例３：マウスＣＴＬＡ４抗体によるＣＤ８０またはＣＤ８６とＣＴＬＡ４との間の相互作用の遮断
ＥＬＩＳＡを用いて、抗体がＣＤ８０またはＣＤ８６とＣＴＬＡ４との間の結合を遮断するか否かを検出した。ｈＣＴＬＡ４−ｈＦｃタンパク質を、ビオチン標識キット−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ＃ＬＫ０３）を用いてビオチンで標識した。精製した抗体を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃９０１８）にコーティングした後、４℃で一晩インキュベートし、５％脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ、カタログ＃ＬＰ００３１Ｂ）で３７℃で２時間遮断した。プレートを３回洗浄し、ビオチン化ｈＣＴＬＡ４−ｈＦｃおよびｈＣＤ８０−ＦｃまたはｈＣＤ８６−Ｆｃの予備混合物と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＢＤ、カタログ＃５５４０６６）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢを加えて展開した。その結果を図３に示し、その結果を表ＩＩにまとめた。
【００６３】
表ＩＩ
【表２】
2020513819.tif 000003
【００６４】
実施例４：マウスＣＴＬＡ４抗体の種間交差反応
精製抗体の種間交差反応を、ＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。定量した精製抗体を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃９０１８）にコーティングし、続いて４℃で一晩インキュベートし、５％脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ、カタログ＃ＬＰ００３１Ｂ）で３７℃で２時間遮断した。ビオチン標識マウスＣＴＬＡ４−Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ＃５０５０３−Ｍ０８Ｈ）またはサルＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ＃９０２１３−Ｃ０２Ｈ）をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１／１０００希釈ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＢＤ、カタログ＃５５４０６６）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢを加えて展開した。その結果を表ＩＩＩに示す。
【００６５】
表ＩＩＩ
【表３】
2020513819.tif 000004
【００６６】
実施例５：マウス抗体のｃＤＮＡのクローニングおよびキメラ抗体の構築
縮重プライマーＰＣＲに基づく方法を用いて、ハイブリドーマ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の遺伝子配列を得る。ハイブリドーマのモノクローナル細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１５５９６−０１８）を用いて溶解して、全ＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１８０８０−０５１）を用いて鋳型としてＲＮＡを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡバンクを得た。得られたｃＤＮＡバンクを鋳型として用い、縮重プライマー（Ｚｈｏｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌｅＩＣＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：８８８−８８９（１９９４）、Ｃｈａｒｄｅｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５２：３８６−３９４（１９９９））を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により検出した。重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅産物のサイズは、４００塩基対であると予想される。ＰＣＲ産物をｐＣｌｏｎｅ００７ベクター（Ｔｓｉｎｇｋｅ、カタログ＃ＴＳＶ−００７ＢＳ）にクローニングし、大腸菌のコンピテンスであるＴｒａｎｓ  ５α（Ｔｒａｎｓｇｅｎ、カタログ＃  ＣＤ２０１−０２）に形質転換した。３〜６のモノクローナル大腸菌を、遺伝子配列決定のために寒天プレート上で選択した。場合によっては、ＰＣＲ産物を遺伝子配列決定に直接使用することもできる。抗体４Ｈ９−Ｇ５−Ｄ５−Ｂ１、９Ｂ８−Ｈ２−Ｂ６−Ｇ５、および１９Ｃ５−Ｇ１１−Ａ７−Ｇ５の重鎖および軽鎖の可変領域の全長遺伝子配列を、上記の方法を通して最終的に得た。抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域およびフレームワーク領域の遺伝子およびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｉｇ−ＢＬＡＳＴを使用した分析によりさらに得た（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／）（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄ，ｉｎ：ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．）。詳細な情報は、抗体および表ＩＶの配列リストに開示された。
【００６７】
キメラ抗体の軽鎖および重鎖を、マウスＣＴＬＡ４抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１およびカッパ定常領域に連結することによって構築した。ＰＣＲにより重鎖および軽鎖の可変領域に適当な制限部位を導入し、対応するキメラ抗体の発現ベクターにそれぞれクローニングした。キメラ抗体の重鎖および軽鎖のプラスミドを２９３Ｆ細胞にリポフェクションにより導入し、６日間培養した。細胞培養上清中の抗体を、プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ＃１７５４９１１２）で精製した。プロテインＡカラムを１ｍＭのＰＢＳで洗浄し、抗体を５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出した。０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で溶出液を中性に調整し、０．２２μｍのフィルター膜を用いて濾過した。抗体の溶液をＵｌｔｒａ−１５遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＡＣＳ５０００２４）で濃縮し、抗体の濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度法を用いて検出した。精製抗体の溶液中のエンドトキシンの含有量は、標準含有量が１ＥＵ／ｍＬ未満のＧｅｌ  Ｃｌｏｔ  ＴＡＬキット（Ｘｉａｍｅｎ  Ｂｉｏｅｎｄｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ＃０１０２５０）を用いて検出した。トランスフェクトされた２９３Ｆ細胞によって産生されたキメラ抗体の結合活性は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって検出された（具体的なステップについては実施例２を参照のこと）。結果は、キメラ抗体がマウス抗体と同等の親和性でＣＴＬＡ４に結合することを示した。
【００６８】
表ＩＶ
【表４−１】
2020513819.tif 000005
【表４−２】
2020513819.tif 000006
【００６９】
実施例６：活性化ヒトＴ細胞へのヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体の結合
ＣＴＬＡ４キメラ抗体の活性化ヒトＴ細胞への結合をＦＡＣＳにより検出した。密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ＃１７−５４４２−０２）を用いて、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をヒト末梢血液から単離した。Ｔ細胞をさらにＰａｎ  Ｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ＃１３０−０９６−５３５）を用いてＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞を培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃Ｃ２２４００５００ＢＴ）、１０％不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１００９９−１４１）およびペニシリン／ペニシリンダイアボディ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１５１４０−１２２））に再懸濁し、指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１１１３２Ｄ）を用いて活性化した。３日後、活性化Ｔ細胞を、緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中の１０μｇ／ｍＬのキメラ抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ＃４０９３０４）と共に４℃で１時間インキュベートした。Ｔ細胞を緩衝液で３回洗浄し、２００μＬ／ウェル緩衝液に再懸濁した後、Ａｔｔｕｎｅ  Ｎｘｔフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で蛍光シグナルを検出した。その結果を図４に示す。
【００７０】
実施例７：ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体の速度論的検出
生体分子相互作用系Ｏｃｔｅｔ−９６（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓ−０００９５９）を用いて抗体および抗原の結合の速度定数（ｋａｓｓｏｃおよびｋｄｉｓｓｏｃ）を測定し、平衡結合定数ＫＤをさらに計算した。ＣＴＬＡ４−ｍＦｃ抗原タンパク質をＡＭＣセンサー（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＮ１８−５０９９）の表面に結合させ、種々の濃度の抗体を加えて、センサー表面上のＣＴＬＡ４キメラ抗体とＣＴＬＡ４−ｍＦｃタンパク質との間の結合および解離を測定した。具体的には、ＡＭＣセンサーを緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で１０分間予め湿潤させた後、ＣＴＬＡ４−ｍＦｃサンプル緩衝液中で５分間平衡化させて、ＣＴＬＡ４−ｍＦｃタンパク質がセンサーの表面に結合されるようにした。ＣＴＬＡ４−ｍＦｃ結合ＡＭＣセンサーを、まず緩衝液中で２分間平衡化した後、種々の濃度の抗体（３〜２００ｎＭ）を含む緩衝液中で５分間インキュベートし、抗体のＣＴＬＡ４−ｍＦｃタンパク質への結合を測定した。最後に、抗原および抗体結合センサーを試料緩衝液中に再配置し、１０分間待って、ＣＴＬＡ４−ｍＦｃタンパク質からの抗体の解離を測定した。測定データを、１：１モデルを用いて全体的に適合させて、結合および解離の動力学定数を得た。これに基づいて、平衡結合定数ＫＤをさらに得た。実験結果を表Ｖに示す。
【００７１】
表Ｖ
【表５】
2020513819.tif 000007
【００７２】
実施例８：ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体のエピトープ分析
ＥＬＩＳＡを用いて、ＣＴＬＡ４キメラ抗体と基準値抗体との間のエピトープ競合を検出した。イピリムマブ２μｇ／ｍＬを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃９０１８）にコーティングした後、４℃で一晩インキュベートし、５％脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ、カタログ＃ＬＰ００３１Ｂ）で３７℃で２時間遮断し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ビオチン標識ＣＴＬＡ４−ｈＦｃを、室温で３０分間、勾配希釈キメラ抗体と共に予めインキュベートし、９６ウェルプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１／１０００希釈ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＢＤ、カタログ＃５５４０６６）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢを加えて展開した。その結果を図５に示す。イピリムマブのＣＴＬＡ４−ｈＦｃへの結合は、キメラ抗体４Ｈ９−Ｇ５−Ｄ５−Ｂ１によって完全に遮断することができる。対照的に、イピリムマブのＣＴＬＡ４−ｈＦｃへの結合は、キメラ抗体９Ｂ８−Ｈ２−Ｂ６−Ｇ５によって完全には遮断できず、このことは、これらの２つの抗体が抗原ＣＴＬＡ４−ｈＦｃに対して異なる結合エピトープを有することを示す。
【００７３】
実施例９：ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞の免疫機能の増強
Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体の細胞生物学的活性を検出した。１つの実験では、抗原提示細胞としてＲａｊｉ細胞を用いてＪｕｒｋａｔ細胞を刺激したが、これは外因性ＣＴＬＡ４−ｈＦｃタンパク質を加えることによって遮断することができた。上記の系におけるＣＴＬＡ４抗体の添加は、外因性ＣＴＬＡ４−ｈＦｃタンパク質を中和し、Ｊｕｒａｋｔ細胞の機能を回復してＪｕｒｋａｔ細胞を活性化し得る。具体的には、Ｒａｊｉ細胞を２５μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、カタログ＃ＨＹ−１３３１６）で３７℃で１時間処理し、ＰＢＳで４回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ細胞および処理したＲａｊｉ細胞を培地（１０％不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁し、等量の抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｎｇｅｎｄ、カタログ＃３１７３２６）、ＣＴＬＡ４−ｈＦｃ融合タンパク質、およびさまざまな濃度の試験抗体と共に９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３７９９）に添加した。細胞の培養２日後に上清を採取し、上清中のＩＬ−２含有量をＥＬＩＳＡを用いて定量した（抗体はＢＤから購入した）。結果は、ＣＴＬＡ４抗体はＩＬ−２の分泌を増強することができることを示し、図６に示すように用量依存的な効果を示した。
【００７４】
別の実験では、Ｊｕｒｋａｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞株を用いて、抗ＣＴＬＡ４抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を評価した。ｈＣＴＬＡ４プラスミドをエレクトロポレーション（Ｌｏｎｚａ）によりＪｕｒｋａｔ細胞に導入し、次にハイグロマイシンでクローニングし、スクリーニングしてＪｕｒｋａｔ−ｈＣＴＬＡ４安定細胞系を得た。Ｊｕｒｋａｔ−ｈＣＴＬＡ４細胞およびマイトマイシンＣ処理Ｒａｊｉ細胞を、様々な濃度のＣＴＬＡ４抗体と共に９６ウェル丸底プレートに添加した。細胞の培養２日後に上清を採取し、上述のようにＥＬＩＳＡ法を用いてＩＬ−２を定量的に検出した。結果は、ＣＴＬＡ４抗体がＩＬ−２の分泌を増強することができることを示し、図７に示すように用量依存的な効果を示した。
【００７５】
実施例１０：ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体の同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
混合リンパ球反応を用いて、ＣＴＬＡ４抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を検出した。密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ＃１７−５４４２−０２）を用いて、末梢血液単球（ＰＢＭＣｓ）をヒト末梢血液から単離した。ＣＤ１４  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ＃１３０−０５０−２０１）を用いて、ＰＢＭＣから単球をさらに精製した。サイトカイン１０００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｒｏｓｐｅｃ、カタログ＃ＣＹＴ−２２１）および１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−４（Ｐｒｏｓｐｅｃ、カタログ＃ＣＹＴ２１１）を培地に添加して、樹状細胞への単球分化を誘発した。サイトカインを２〜３日毎に補給し、その後の実験のために５〜６日後に未成熟樹状細胞を採取した。
【００７６】
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ＃１３０−０９６−５３５）を用いてＰＢＭＣから単離した。様々な濃度のＣＤ３＋Ｔ細胞、未成熟樹状細胞および種々の濃度のＣＴＬＡ４抗体を、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３７９９）に添加した。細胞培養５〜６日後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてサイトカインの含有量を定量的に検出した。結果は、ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体がＭＬＲにおけるＩＦＮ−γの分泌を増強し得ることを図８に示した。
【００７７】
実施例１１：ヒト−マウスＣＴＬＡ４キメラ抗体の腫瘍成長阻害
本発明の腫瘍動物モデルは、特別な腫瘍動物モデルであり、ＣＴＬＡ４ヒト化トランスジェニックマウス（Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇａｌａｘｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｃｏ，Ｌｔｄにより開発された）にＭＣ３８マウス結腸癌細胞（ＮＣＩ）を接種して、マウスにおけるＣＴＬＡ４抗体のドラッガビリティー（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を試験することにより構築された。
【００７８】
ＣＴＬＡ４ヒト化トランスジェニックマウス（７〜１１週齢）に３×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞を０．１ｍＬ体積で側腹部に皮下注射した。６日後、腫瘍体積が７０ｍｍ３に達した時点で、ＣＴＬＡ４抗体、参照抗体および対照ＰＢＳを１０ｍｇ／ｋｇ（投与体積１０ｍＬ／ｋｇ）の用量で隔週で計６回注射した。皮下腫瘍の体積は、実験期間中、バーニヤキャリパーを用いて隔週で測定した。腫瘍細胞注入後３４日目まで動物を追跡した。図９に示すように、６回の投与後、検出すべき抗体９Ｂ８−Ｈ２−Ｂ６−Ｇ５により腫瘍成長が有意に阻害され、薬物治療後に一部の腫瘍がほぼ消失する。
【００７９】
実施例１２：ヒト−マウスキメラＣＴＬＡ４抗体のヒト化
マウス抗体９Ｂ８−Ｈ２−Ｂ６−Ｇ５をＣＤＲグラフト技術によりヒト化した。文献報告によれば、ヒト抗体における重鎖のサブタイプＩＩＩおよびカッパ軽鎖のサブタイプＩのフレームワーク領域は、抗体のヒト化において広く使用されている（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８９：４２８５−４２８９（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：４５９３−４５９９（１９９７））。マウス抗体９Ｂ８−Ｈ２−Ｂ６−Ｇ５のＣＤＲ領域を上記のヒト抗体のフレームワーク領域に移植し、フレームワーク領域のアミノ酸残基を変異させて抗体の親和性を高めた。得られたヒト化抗体のＣＴＬＡ４−ｍＦｃに対する親和性をＯｃｔｅｔシステムおよびＡＭＣセンサを用いて検出し、最良のものをスクリーニングした。ヒト化されたタンパク質の重鎖および軽鎖（９Ｂ８−ＶＨ４、９Ｂ８−ＶＨ５、９Ｂ８−ＶＨ６、９Ｂ８−ＶＬ４、９Ｂ８−ＶＬ５）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、表ＩＶに示す。
【００８０】
本発明を、特定の実施形態を参照して記載したが、当業者は、全ての開示された教示に従って、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲およびその任意の同等のもの内で種々の変更および置換を行うことができることを認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月7日(2019.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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