(57)【要約】開示される実施形態は、感染を同定するための非侵襲的な方法、および装置、およびシステムに関する。該方法は、参照対象中に存在する抗体の混合物の結合に対して、感染に起因する対象からの試料中に存在する抗体の異なる混合物により示差的に結合される、ペプチドアレイ上に存在する識別ペプチドを同定することに基づいている。
2020511633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する方法であって、
（ａ）該対象からの試料を、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；
（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、該試料中に存在する抗体の該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出すること；および
（ｃ）結合シグナルの該組み合わせを参照結合シグナルの組み合わせの２つ以上の群と比較し、そのことによりＴ．ｃｒｕｚｉに対する該対象の血清学的状態を決定することを含み、ここで、参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陽性であることが知られている複数の参照対象から得られ、そして参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陰性であることが知られている複数の対象から得られるものである、方法。
【請求項２】
（ｉ）差別化参照結合シグナルの組み合わせを同定すること、ここで、該差別化参照結合シグナルは、該感染に対して血清陰性であることが知られている参照対象からの試料から、該感染に対して血清陽性であることが知られている参照対象からの試料を区別するものである；および
（ｉｉ）識別ペプチドの組み合わせを同定することをさらに含み、ここで、差別化参照結合シグナルの該組み合わせは、識別ペプチドの組み合わせに対応するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
差別化参照結合シグナルの該組み合わせのそれぞれが、該複数の参照対象のそれぞれからの試料中に存在する抗体の、請求項１の工程（ａ）における少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出することにより得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該感染を有するかまたは有する疑いのある該対象が、該感染の無症候性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該感染を有するかまたは有する疑いのある該対象が、該感染の症候性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該参照対象が、いかなる感染症についても無症候性である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該識別ペプチドが、図９Ｂおよび図２３Ａ〜図２３Ｃに列挙された１つ以上の配列モチーフで構成され、全てのアレイペプチド間の識別ペプチドと比較して、モチーフを含有する全てのペプチド間の識別ペプチドにおいて１００％を超えて富化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
該差別化ペプチドが、図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に列挙されたペプチドから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）において得られた抗体の結合に対応する結合シグナルが、Ｓ／ＣＯスコアリングシステムを使用する場合、＜１のスコアを有する対象の試料からの抗体の結合から得られる参照結合シグナルよりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性である参照対象の該１つ以上の群が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対して血清陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該識別ペプチドが、図１４Ａに列挙された１つ以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性である参照対象の該１つ以上の群が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して血清陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該識別ペプチドが、１つ以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性である参照対象の該１つ以上の群が、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染に対して血清陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該識別ペプチドが、図１６Ａに列挙された１つ以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルス感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する方法であって、
（ａ）該対象からの試料を、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；
（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、該試料中に存在する抗体の該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出すること；および
（ｃ）結合シグナルの該組み合わせを参照結合シグナルの組み合わせの２つ以上の群と比較し、そのことにより該対象の血清学的状態を決定することを含み、ここで、参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陽性であることが知られている複数の参照対象から得られ、そして参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陰性であることが知られている複数の対象から得られるものである、方法。
【請求項１７】
（ｉ）差別化参照結合シグナルの組み合わせを同定すること、ここで、該差別化結合シグナルは、該感染に対して血清陰性であることが知られている参照対象からの試料から、該感染に対して血清陽性であることが知られている参照対象からの試料を区別するものである；および
（ｉｉ）識別ペプチドの組み合わせを同定することをさらに含み、ここで、差別化参照結合シグナルの該組み合わせは、差別化ペプチドの組み合わせに対応するものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該ウイルス感染がＨＢＶ感染であり、参照対象の該１つ以上の群がＨＢＶに対して血清陰性であり、ＨＣＶに対して血清陽性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該識別ペプチドが、図１７Ａからの１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ウイルス感染がＨＢＶ感染であり、参照対象の該１つ以上の群がＨＢＶに対して血清陰性であり、そしてＷＮＶに対して血清陽性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該識別ペプチドが、図１８Ａからの１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該ウイルス感染がＨＣＶ感染であり、参照対象の該１つ以上の群が、ＨＣＶに対して血清陰性であり、ＷＮＶに対して血清陽性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
該識別ペプチドが、図１９Ａからの１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｔ．ｃｒｕｚｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶから選択される複数の感染の少なくとも１つを有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を決定する方法であって、
（ａ）該感染症の１つを有すると疑われる対象からの試料を、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；
（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、該試料中に存在する抗体の該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出すること；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶからの感染に対応する差別化結合シグナルの少なくとも第１、第２、第３および第４セットを提供すること、ここで差別化結合シグナルの該セットのそれぞれは、該複数の感染の残りの１つに対してそれぞれ血清陽性である対象から得られた試料の混合物から、該感染の１つについて血清陽性である対象の群からの試料を区別するものである；
（ｄ）差別化結合シグナルの該セットを組み合わせて、差別化結合シグナルのマルチクラスセットを得ること、ここで、該マルチクラスセットは、該Ｔ．ｃｒｕｚｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶ感染のそれぞれを互いに差別化することができるものである；および
（ｅ）工程（ｂ）において該対象から得られた結合シグナルの組み合わせを、差別化結合シグナルの該マルチクラスセットと比較し、そのことにより該対象の血清学的状態を同定すること
を含む、方法。
【請求項２５】
差別化結合シグナルの該第１、第２、第３、および少なくとも第４セットのそれぞれについて、識別ペプチドのセットを同定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
識別ペプチドの該第１セットが、それぞれがＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶの１つに対して血清陽性である試料の混合物から、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉに対して血清陽性である試料を区別するシグナルを表示する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該識別ペプチドが、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合に１００％を超えて富化されている、図１０Ａに列挙される１つ以上の配列モチーフを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該識別ペプチドの第２セットが、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ、ＨＣＶ、およびＷＮＶのうちの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物からＨＢＶに対して血清陽性である試料を区別するシグナルを表示する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
該識別ペプチドが、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合に１００％を超えて富化されている、図１１Ａに列挙される１つ以上の配列モチーフを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
識別ペプチドの該第３セットが、ＨＣＶ血清陽性である試料を、ＨＢＶ、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉおよびＷＮＶの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物から区別するシグナルを表示する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
該識別ペプチドが、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合に１００％を超えて富化されている、図１２Ａに列挙される１つ以上の配列モチーフを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該識別ペプチドの少なくとも第４セットが、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＴ．ｃｒｕｚｉｉのうちの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物から、ＷＮＶに対して血清陽性である試料を区別する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
該識別ペプチドが、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合に１００％を超えて富化されている、図１３Ａに列挙される１つ以上の配列モチーフを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該差別化ペプチドが、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合に１００％を超えて富化されている、図２０Ａのリストから選択される１つ以上のモチーフを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
該方法の性能が、０．９３以上の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする、請求項１、１６、および２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
対象における感染症のための少なくとも１個の候補バイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）ペプチドアレイを提供すること、および該対象からの生体試料をペプチドアレイにインキュベートすること；
（ｂ）該対象からの生体試料中の抗体に結合した識別ペプチドのセットを同定すること、ここで、識別ペプチドのセットは、該感染症に対して血清陽性である試料と該感染症に対して血清陰性である試料を差別化することができる結合シグナルを表示するものである；
（ｃ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを使用してプロテオームデータベースを照会すること；
（ｄ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを、該感染症を引き起こす病原体のプロテオームデータベース内の１つ以上のタンパク質に合わせること；および 
（ｅ）プロテオームデータベースから同定されたタンパク質のそれぞれについて関連性スコアおよびランキングを得ることを含み、ここで、該同定されたタンパク質のそれぞれは、該対象における疾患の候補バイオマーカーである、方法。
【請求項３７】
重複スコアを得ることをさらに含み、該スコアがペプチドライブラリーのペプチド組成を補正する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該識別ペプチドが、１０−７未満のｐ値を有するとして同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
識別ペプチドの該セットを同定する工程が、
（ｉ）結合シグナルの第１の組み合わせを得るために、異なるペプチドのアレイに対する該疾患に対して血清陽性である複数の対象からの試料中に存在する抗体の結合を検出すること；
（ｉｉ）結合シグナルの第２の組み合わせを得るために、ペプチドの同じアレイへの抗体の結合を検出すること、ここで、該抗体は、対象の２つ以上の参照群からの試料中に存在し、各群は疾患に対して血清陰性であるものである；
（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組み合わせと該第２の組み合わせを比較すること；および
（ｉｖ）該疾患を有する対象からの試料中の抗体および対象の２つ以上の参照群からの該試料中の抗体により示差的に結合する該アレイ上の該ペプチドを同定し、そのことにより該識別ペプチドを同定すること
を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
識別ペプチドの数が、該アレイ上のペプチドの総数の少なくとも一部に対応する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
該感染症がシャーガス病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
該少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーが、表２に提供されるリストから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該少なくとも１個のタンパク質バイオマーカーが、図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に提供される識別ペプチドの少なくとも一部から同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に提供されるペプチドの少なくとも一部を含む、ペプチドアレイ。
【請求項４５】
対象におけるシャーガス病の少なくとも１個の候補バイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）ペプチドアレイを提供すること、および該対象からの生体試料をペプチドアレイにインキュベートすること；
（ｂ）該対象からの生体試料中の抗体に結合した識別ペプチドのセットを同定すること、ここで、識別ペプチドの該セットは、シャーガス病に対して血清陰性の試料から該感染症に対して血清陽性の試料を差別化することができる結合シグナルを表示するものである；
（ｃ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを使用してプロテオームデータベースを照会すること；
（ｄ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを、シャーガス病を引き起こす病原体のプロテオームデータベース内の１つ以上のタンパク質に合わせること；および
（ｅ）プロテオームデータベースから同定されたタンパク質のそれぞれについて関連性スコアおよびランキングを得ることを含み、ここで該識別されたタンパク質のそれぞれは、該対象におけるシャーガス病の候補バイオマーカーである、方法。
【請求項４６】
オーバーラップスコアを得ることをさらに含み、該スコアがペプチドライブラリーのペプチド組成を補正する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該識別ペプチドが、１０−７未満のｐ値を有するとして同定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
識別ペプチドの該セットを同定する工程が、
（ｉ）結合シグナルの第１の組み合わせを得るために、異なるペプチドのアレイに対する該疾患に対して血清陽性である複数の対象からの試料中に存在する抗体の結合を検出すること；
（ｉｉ）結合シグナルの第２の組み合わせを得るために、ペプチドの同じアレイへの抗体の結合を検出すること、ここで、抗体は対象の２つ以上の参照群からの試料中に存在し、各群は疾患に対して血清陰性である；
（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組み合わせと該第２の組み合わせを比較すること；および
（ｉｖ）シャーガス病を有する対象からの試料中の抗体および対象の２つ以上の参照群からの試料中の抗体により示差的に結合する該アレイ上の該ペプチドを同定し、そのことにより該識別ペプチドを同定すること
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
識別ペプチドの数が、該アレイ上のペプチドの総数の少なくとも一部に対応する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
該少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーが、表６に提供されるリストから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
該少なくとも１個のタンパク質バイオマーカーが、図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に提供される識別ペプチドの少なくとも一部から同定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
該識別用ペプチドが、図２３に列挙された１つ以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
図２３に提供される１つ以上のモチーフを含むペプチドを含む、ペプチドアレイ。
【請求項５４】
該対象がヒトである、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
該試料が血液試料である、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
該血液試料が全血、血漿、または血清から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
該試料が血清試料である、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
該試料が血漿試料である、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
該試料が乾燥血液試料である、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ペプチドのアレイが少なくとも５０，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
該ペプチドアレイが少なくとも１００，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
該ペプチドアレイが少なくとも３００，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
該ペプチドアレイが少なくとも５００，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
該ペプチドアレイが少なくとも１，０００，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
該ペプチドアレイが少なくとも２，０００，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
該ペプチドアレイが少なくとも３，０００，０００個の異なるペプチドを含む、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
該ペプチドアレイ上の異なるペプチドが少なくとも５個のアミノ酸の長さである、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
該ペプチドアレイ上の異なるペプチドが５〜１３個のアミノ酸の長さである、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
該異なるペプチドが２０個未満のアミノ酸から合成される、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
該アレイ上の異なるペプチドが沈着される、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
該アレイ上の異なるペプチドがｉｎ  ｓｉｔｕで合成される、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
該方法の性能が、０．６以上の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする、請求項１、１６、２４、３６、および４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本特許出願は、２０１７年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４６２，３２０号の利益を主張し、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
感染症は、通常、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫などの微生物により引き起こされる障害である。典型的に、感染症の診断は、血液、尿、咽喉スワブ、便試料などの体液の実験室でのテスト、および場合によっては脊椎穿刺を必要とする。イメージングスキャンおよび生検も、感染源を同定するために使用されてもよい。感染を診断するために様々な個々のテストが利用可能であり、免疫アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および病原体の遺伝子テストを含む。現在の方法は、時間がかかり、複雑で、労働集約的であり、異なる程度の専門知識を必要としてもよい。さらに、該利用可能な診断ツールは、しばしば、感染の初期段階を検出するために信頼できず、しばしば、１つ以上の方法が、感染を確実に診断するのに必要とされる。多くの場合、感染者は重度の合併症が起こるまで感染の症状を示さないかもしれない。
【０００３】
一例は、シャーガス病を引き起こすＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）による感染である。シャーガス病は、ラテンアメリカおよびカリブ海における死亡および罹患の主要原因の１つであり[ Perez CJ et al., Lymbery AJ, Thompson RC (2014) Trends Parasitol 30: 176-182]、心血管疾患の世界的な負担のかなりの原因である[Chatelain E (2017) Comput Struct Biotechnol J 15: 98-103]。シャーガス病は、これらの地理的地域において最も無視されている寄生虫病と考えられており、疫学者は米国およびヨーロッパを含む非流行国へのさらなる拡大を追跡している[Bern C (2015) Chagas' Disease. N Engl J Med 373: 1882; Bern C, and Montgomery SP (2009) Clin Infect Dis 49: e52-54; Rassi Jr A et al., (2010) The Lancet 375: 1388-1402]。病原体であるＴ．ｃｒｕｚｉは、主に血液を摂食するトリアトミン昆虫により哺乳動物宿主に伝播する鞭毛原生動物であり、そこで任意の有核細胞内で増殖することができる。普及の他の様式は、輸血または先天性および経口経路を含む[Steverding D (2014) Parasit Vectors 7: 317]。
【０００４】
感染を同定する、好ましくは初期段階で、症状のない状態で感染を検出するための、方法、診断ツールおよびさらなるバイオマーカーが必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
開示される実施形態は、感染を同定するための方法、装置、およびシステムに関する。該方法は、参照対象からの試料の結合と比較して、感染に起因する対象からの生物学的試料により示差的に結合されるペプチドアレイ上に存在する識別ペプチドを同定することに基づく。
【０００６】
一実施形態において、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定するための方法が提供され、該方法は：（ａ）該対象からの該試料を、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、該試料中に存在する抗体の該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出すること；および（ｃ）結合シグナルの該組み合わせを参照結合シグナルの組み合わせの２つ以上の群と比較し、そのことにより該対象の血清学的状態を決定することを含み、ここで、参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陽性であることが知られている複数の参照対象から得られ、そして参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陰性であることが知られている複数の対象から得られるものである。いくつかの実施形態において、アレイ上の異なるペプチドはｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。いくつかの実施形態において、該方法は、さらに：（ｉ）差別化参照結合シグナルの組み合わせを同定すること、ここで、該差別化結合シグナルは、該感染に対して血清陰性であることが知られている参照対象からの試料から、該感染に対して血清陽性であることが知られている参照対象からの試料を区別するものである；および（ｉｉ）識別ペプチドの組み合わせを同定することを含み、ここで、該識別ペプチドは、該差別化参照結合シグナルに対応するシグナルを示すものである。いくつかの実施形態において、差別化参照結合シグナルの該組み合わせのそれぞれは、該複数の該参照対象のそれぞれからの試料中に存在する抗体の、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドの同じアレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出することにより得られる。いくつかの実施形態において、アレイ上の異なるペプチドは、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、該感染に対して無症候性である対象の血清学的状態を同定する。他の実施形態において、提供される方法は、該感染の症状を示す対象の血清学的状態を同定する。さらに他の実施形態において、提供される方法は、感染の症状を示す対象の血清学的状態を同定する。さらに他の実施形態において、識別ペプチドは、全てのアレイペプチド間の識別ペプチドと比較して、モチーフを含有する全てのペプチド間の識別ペプチドにおいて１００％を超えて富化されている、図９Ｂおよび図２３Ａ〜図２３Ｃに列挙された１つ以上の配列モチーフを含む。さらに他の場合において、差別化ペプチドは、図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に列挙されたペプチドから選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、同定され、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染に対して血清陰性の対象から血清陽性の対象を区別する識別ペプチドは、図９Ｂに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、識別ペプチドは、例えば図２１Ａ〜Ｎに列挙されたペプチドから選択される。他の実施形態において、本願明細書に記載の方法の工程（ｂ）における抗体の結合に対応する結合シグナルは、シャーガス病患者を明確に同定するためのＳ／ＣＯ（ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）血清学的スコアリングシステムを使用する場合、＜１のスコアを有する対象の試料からの抗体の結合から得られる参照結合シグナルより、例えば約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、基準より約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、または約２００％以上高い。
【０００９】
他の実施形態において、本願明細書に提供される方法およびシステムは、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉに対して血清陰性であり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対して血清陽性である参照対象の１つ以上の群に対して、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する。ＨＢＶに対して血清陽性である対象からＴ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性である対象を区別する識別ペプチドは、図１４Ａに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む。
【００１０】
他の実施形態において、本願明細書に提供される方法およびシステムは、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性であり、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して血清陽性である参照対象の１つ以上の群に対して、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する。ＨＣＶに対して血清陽性である対象からＴ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性である対象を区別する識別ペプチドは、図１５Ａに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている配列モチーフを含む。
【００１１】
他の実施形態において、本願明細書に提供される方法およびシステムは、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉに対して血清陰性であり、西ナイルウイルスウイルス（ＷＮＶ）に対して血清陽性である１つ以上の参照対象の群に対して、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する。ＷＮＶに対して血清陽性の対象からＴ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性の対象を区別する識別ペプチドは、図１６Ａに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている配列モチーフを含む。
【００１２】
別の実施形態において、ウイルス感染を有するまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定するための方法およびシステムが本願明細書に提供され、該方法は：（ａ）該対象からの該試料を、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、該試料中に存在する抗体の該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出すること；および（ｃ）結合シグナルの該組み合わせを参照結合シグナルの組み合わせの２つ以上の群と比較し、そのことにより該対象の血清学的状態を決定することを含み、ここで、参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、血清陽性であることが知られている複数の参照対象から得られ、そして参照結合シグナルの組み合わせの該群のそれぞれの少なくとも１つは、該感染に対して血清陰性であることが知られている複数の対象から得られるものである。いくつかの実施形態において、アレイ上の異なるペプチドはｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。いくつかの実施形態において、該方法は、さらに：（ｉ）差別化参照結合シグナルの組み合わせを同定すること、ここで、該差別化結合シグナルは、該感染に対して血清陰性であることが知られている参照対象からの試料から、該感染に対して血清陽性であることが知られている参照対象からの試料を区別するものである；および（ｉｉ）識別ペプチドの組み合わせを同定することを含み、ここで、該識別ペプチドは、差別化参照結合シグナルに対応するシグナルを表示するものである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムは、ＨＢＶに対して血清陽性であることが知られている参照対象およびＨＣＶに対して血清陽性である参照対象と比較した場合に、ＨＢＶ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する。ＨＣＶに対して血清陽性の対象からＨＢＶに対して血清陽性の対象を区別する識別ペプチドは、図１７Ａに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本願明細書の方法およびシステムは、ＨＢＶに対して血清陽性であることが知られている参照対象およびＷＮＶに対して血清陽性である参照対象と比較した場合に、ＨＢＶ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する。ＷＮＶに対して血清陽性である対象からＨＢＶに対して血清陽性である対象を区別する識別ペプチドは、図１８Ａの配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている配列モチーフを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本願明細書の方法およびシステムは、ＨＣＶに対して血清陽性であることが知られている参照対象およびＷＮＶに対して血清陽性である参照対象と比較した場合に、ＨＣＶ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を同定する。ＷＮＶに対して血清陽性である対象からＨＣＶに対して血清陽性である対象を区別する識別ペプチドは、図１９Ａの配列モチーフを含む１００％を超えて富化されている配列モチーフを含む。
【００１６】
別の実施形態において、Ｔ．ｃｒｕｚｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶから選択される複数の異なる感染の１つを有するかまたは有する疑いがある対象の血清学的状態を決定するための方法およびシステムが提供され、該方法は：（ａ）該感染の１つを有すると疑われる対象からの試料を、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、該試料中に存在する抗体の該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出すること；（ｃ）該複数の感染のそれぞれについて、第１、第２、第３、および少なくとも第４の差別化結合シグナルのセットを提供すること、ここで差別化結合シグナルの該セットのそれぞれは、該複数の感染の残りの１つに対してそれぞれ血清陽性である対象から得られた試料の混合物から、該感染の１つについて血清陽性である対象の群からの試料を区別するものである；（ｄ）差別化結合シグナルの該セットを組み合わせて、差別化結合シグナルのマルチクラスセットを得ること、ここで該マルチクラスセットは、該複数の異なる感染のそれぞれを互いに差別化するものである；および（ｅ）工程（ｂ）において得られた結合シグナルの該組み合わせを差別化結合シグナルの該マルチクラスセットと比較し、そのことにより該対象の血清学的状態を同定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法はさらに、差別化結合シグナルの該第１、第２、第３、および少なくとも第４セットのそれぞれについて識別ペプチドのセットを同定することを含む。いくつかの実施形態において、Ｔ．ｃｒｕｚｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶから選択される複数の異なる感染を互いに区別する識別ペプチドの第１、第２、第３、および少なくとも第４セットは、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合、１００％を超えて富化されている図２０Ａのリストから選択される配列モチーフを含む差別化ペプチドをさらに含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、識別ペプチドの第１セットは、それぞれがＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶのうちの１つに対して血清陽性である試料の混合物からＴ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性である試料を区別するシグナルを示す。ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶのいずれかに対して血清陽性である試料の混合物から、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉに対して血清陽性である試料を区別する識別ペプチドは、該アレイ内の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合、図１０Ａに列挙された１つ以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている。いくつかの実施形態において、識別ペプチドの第２セットは、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ、ＨＣＶ、およびＷＮＶのうちの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物からＨＢＶに対して血清陽性である試料を区別するシグナルを表示する。Ｔ．ｃｒｕｚｉ、ＨＣＶ、およびＷＮＶの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物からＨＢＶに対して血清陽性である試料を区別する識別ペプチドは、該アレイの少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合、図１１Ａに列挙される配列モチーフを含む１００％を超えて富化されている１つ以上の配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、識別ペプチドの第３セットは、ＨＣＶ血清陽性である試料を、それぞれＨＢＶ、Ｔ．ｃｒｕｚｉおよびＷＮＶの１つに対して血清陽性である試料の混合物から区別するシグナルを表示する。ＨＢＶ、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ、およびＷＮＶの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物から、ＨＣＶに対して血清陽性である試料を区別する識別ペプチドは、該アレイの少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合、図１２Ａに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、識別ペプチドの少なくとも第４セットは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＴ．ｃｒｕｚｉのうちの１つに対してそれぞれ血清陽性である試料の混合物から、ＷＮＶに対して血清陽性である試料を区別する。ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＴ．ｃｒｕｚｉのうちの１つに対して血清陽性の試料の混合物から、ＷＮＶに対して陽性の試料を区別する識別ペプチドは、該アレイ中の少なくとも１０，０００個のペプチドと比較した場合、図１３Ａに列挙された配列モチーフを含む、１００％を超えて富化されている配列モチーフを含む。
【００１８】
提供される方法のいずれかの方法の性能は、０．６以上の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする。他の実施形態において、方法の性能は、０．６０から０．６９、０．７０から０．７９、０．８０から０．８９、または０．９０から１．０の範囲の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする。
【００１９】
別の実施形態において、対象における感染症のための少なくとも１個の候補バイオマーカーを同定する方法が提供される。該方法は：ペプチドアレイを提供すること、および対象からの生物学的試料をペプチドアレイにインキュベートすること；該対象からの生体試料中の抗体に結合した識別ペプチドのセットを同定すること、ここで識別ペプチドのセットは、該感染症に対して血清陽性の試料と該感染症に対して血清陰性の試料を差別化することができる結合シグナルを表示するものである；識別ペプチドのセット内の各ペプチドを使用してプロテオームデータベースを照会すること；識別ペプチドのセット内の各ペプチドを、該感染症を引き起こす病原体のプロテオームデータベース内の１つ以上のタンパク質に合わせること；およびプロテオームデータベースから同定された各タンパク質の関連性スコアおよびランキングを得ることを含み；ここで、同定されたタンパク質のそれぞれは、対象の疾患の候補バイオマーカーである。いくつかの実施形態において、該方法は、オーバーラップスコアを得ることをさらに含み、ここで、該スコアは、ペプチドライブラリーのペプチド組成を修正する。識別ペプチドを同定する方法は、（ｉ）試料中に存在する抗体の異なるペプチドの配列に対する該疾患に対して血清陽性である複数の対象からの結合を検出して、結合シグナルの第１の組み合わせを得ること；（ｉｉ）結合シグナルの第２の組み合わせを得るために、ペプチドの同じアレイへの抗体の結合を検出すること、ここで該抗体は対象の２つ以上の参照群からの試料中に存在し、各群は疾患に対して血清陰性であるものである；（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組み合わせと該第２の組み合わせを比較すること；および（ｉｖ）該疾患を有する対象からの試料中の抗体および対象の２つ以上の参照群からの該試料中の抗体により示差的に結合する該アレイ上の該ペプチドを同定し、そのことにより該識別ペプチドを同定することを含む。いくつかの実施形態において、識別ペプチドの数は、該アレイ上のペプチドの総数の少なくとも一部に対応する。いくつかの実施形態において、識別ペプチドの数は、アレイ上のペプチドの総数の少なくとも０．００００５％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．００１％、少なくとも０．００３％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％に対応する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、シャーガス病のための少なくとも１個の候補バイオマーカーを同定する。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーは、表２および表８に提供されるリストから選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のタンパク質バイオマーカーは、図２１Ａ〜２１Ｎ、表６および表７に提供される識別ペプチドの少なくとも一部から同定される。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のタンパク質バイオマーカーは、図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に提供されている識別ペプチドの、少なくとも０．００００５％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．００１％、少なくとも０．００３％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％から同定される。
【００２１】
対象におけるシャーガス病のための少なくとも１個の候補バイオマーカーを同定するための方法およびシステムが本願明細書に開示され、該方法は：（ａ）ペプチドアレイを提供すること、および生体試料を該対象からペプチドアレイにインキュベートすること；（ｂ）該対象からの生体試料中の抗体に結合した識別ペプチドのセットを同定すること、ここで、識別ペプチドのセットは、シャーガス病に対して血清陰性の試料と該感染症に対して血清陽性の試料を差別化することができる結合シグナルを表示するものである；（ｃ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを使用してプロテオームデータベースを照会すること；（ｄ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを、シャーガス病を引き起こす病原体のプロテオームデータベース内の１つ以上のタンパク質に合わせること；および（ｅ）プロテオームデータベースから同定されたタンパク質のそれぞれの関連性スコアおよびランキングを得ることを含み、ここで同定されたタンパク質のそれぞれは、対象のシャーガス病の候補バイオマーカーである。いくつかの場合において、本願明細書に開示される方法およびシステムは、オーバーラップスコアを得ることをさらに含み、ここで、該スコアはペプチドライブラリーのペプチド組成を補正する。さらに他の実施形態において、本願明細書に開示される識別ペプチドは、１０−７未満のｐ値を有するとして同定される。
【００２２】
さらに他の実施形態において、識別ペプチドの該セットを同定する工程は、（ｉ）結合シグナルの第１の組み合わせを得るために、異なるペプチドのアレイに対する該疾患に対して血清陽性である複数の対象からの試料中に存在する抗体の結合を検出すること；（ｉｉ）結合シグナルの第２の組み合わせを得るために、ペプチドの同じアレイへの抗体の結合を検出することであって、該抗体は対象の２つ以上の参照群からの試料中に存在し、各群は疾患に対して血清陰性である；（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組み合わせと該第２の組み合わせを比較すること；および（ｉｖ）シャーガス病を有する対象の試料中の抗体および対象の２つ以上の参照群の試料中の抗体により示差的に結合する該アレイ上の該ペプチドを同定し、そのことにより該識別ペプチドを同定すること。さらに他の実施形態において、識別ペプチドの数は、該アレイ上のペプチドの総数の少なくとも一部に対応する。いくつかの例において、少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーは表６に提供されるリストから選択される。さらに他の例において、少なくとも１個のタンパク質バイオマーカーは図２１Ａ〜Ｎ、表６および表７に提供される識別ペプチドの少なくとも一部から同定される。さらに他の実施形態において、識別ペプチドは、全ての配列ペプチド間の識別ペプチドと比較して、モチーフを含有する全てのペプチド間の識別ペプチドが、１００％を超えて富化されている、図９Ｂおよび図２３Ａ〜図２３Ｃに列挙された１つ以上の配列モチーフを含む。さらに他の実施形態において、図２３に提供される１つ以上のモチーフを含むペプチドを含むペプチドアレイも本願明細書で開示される。
【００２３】
本願明細書に提供される方法およびシステムは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む対象に適用可能である。いくつかの実施形態において、該方法で使用される試料は、全血、血漿、およびその血清画分を含む血液試料である。いくつかの実施形態において、試料は血清試料である。他の実施形態において、試料は血漿試料である。さらに他の実施形態において、試料は乾燥血液試料である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実施するために利用されるアレイは、少なくとも５，０００個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実行するために利用されるアレイは、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実施するために利用されるアレイは、少なくとも５０，０００個の異なるペプチドを含む。他の実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実施するために利用されるアレイは、少なくとも１００，０００個の異なるペプチドを含む。他の実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実施するために利用されるアレイは、少なくとも３００，０００個の異なるペプチドを含む。他の実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実行するために利用されるアレイは、少なくとも５００，０００個の異なるペプチドを含む。他の実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実施するために利用されるアレイは、少なくとも１，０００，０００個の異なるペプチドを含む。他の実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実行するために利用されるアレイは、少なくとも２，０００，０００個の異なるペプチドを含む。
【００２５】
他の実施形態において、本願明細書に記載の方法およびシステムを実行するために利用されるアレイは、少なくとも３，０００，０００個の異なるペプチドを含む。異なるペプチドは、２０個未満のアミノ酸から合成できる。いくつかの実施形態において、ペプチドアレイ上の異なるペプチドは少なくとも５個のアミノ酸の長さである。他の実施形態において、ペプチドアレイ上の異なるペプチドは、長さが５〜１３個のアミノ酸である。ペプチドはアレイ表面に沈着できる。他の実施形態において、ペプチドはｉｎ  ｓｉｔｕで合成できる。
【００２６】
提供される方法のいずれも、ＡＵＣ＞０．６を特徴とする分類の再現性を有する。一部の実施形態において、ＡＵＣを特徴とする分類の再現性は、０．６０から０．６９、０．７０から０．７９、０．８０から０．８９、または０．９０から１．０の範囲である。
【００２７】
参照による組み込み
本願明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、血中の抗体のペプチドアレイ特徴への結合（図１Ａ）、およびシャーガス病に対して血清陰性の参照対象からの試料中の抗体の結合間の差異を反映する示差蛍光シグナルを示す概略図を示す。１Ｂ）およびシャーガス病に対して血清陽性の対象由来の試料中の抗体の同じペプチドアレイへの結合（図１Ｃ）。
【００２９】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）標準（４Ｃ１（図２Ａ）、ｐ５３Ａｂ１（図２Ｂ）、ｐ５３Ａｂ８（図２Ｃ）およびＬｎｋＢ２（図２Ｄ）のアレイ上の同族エピトープ対照特徴への結合を表す棒グラフを示している。モノクローナル抗体の標準セットを２．０ｎＭで３連でアレイに適用した各モノクローナル抗体について、同族対照特徴の平均ｌｏｇ１０ＲＦＩを使用してＺスコアを計算した。個々のモノクローナル抗体を個々のバーとしてプロットした対照特徴エラーバーは、個々の対照特徴のＺスコアの標準偏差を表す各ｍＡｂの既知のエピトープは、各棒グラフの上に表示される。
【００３０】
【図３】図３は、シャーガス血清陽性対象とシャーガス血清陰性対象との間で有意に異なる抗体結合シグナルを表示するライブラリーペプチドのセットを視覚化するボルケーノプロットを示す。ボルケーノプロットを使用して、ｔ検定ｐ値対シグナル強度平均の対数差（比の対数）の同時分布として該識別を評価する。プロットされた各位置でのペプチドの密度は、ヒートスケールで示される。緑の破線の白（green dashed white)上の３５６個のペプチドは、多重度にボンフェローニ調整を適用した後、９５％の信頼度で免疫標識テクノロジー（ＩＳＴ）により陽性疾患と陰性疾患とを識別する。色付きの円は、Ｐ．＜４ｅ−７（緑）のボンフェローニしきい値または＜１０％（青）の誤検出率のいずれかにより、Ｔ．ｃｒｕｚｉ  ＥＬＩＳＡ由来のシグナルオーバーカットオフ（Ｓ／ＣＯ）値と有意に相関する強度を有する個々のペプチドを示す。Ｓ／ＣＯ相関ペプチドのほとんどは、ＩＳＴボンフェローニの白い破線より上にある。
【００３１】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、シャーガス血清陽性ドナーと血清陰性ドナーの区別における免疫標識アッセイ（ＩＳＴ）の性能を示す。（図４Ａ）２０１５年訓練コホートの受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線。青い曲線は、１００回の４重交差検証試行でアウトオブバッグ（ｏｕｔ−ｏｆ−ｂａｇ）予測の中央値を計算することにより生成された。（図４Ｂ）２０１６年検証コホートのＲＯＣ曲線。青い曲線は、２０１６年試料を予測するために訓練セットから派生したアルゴリズムを適用して生成された。信頼区間（ＣＩ）は灰色で表示され、訓練コホートのドナーのブートストラップリサンプリングにより推定され、検証コホートのＤｅＬｏｎｇ方法（DeLong ER, et al. Biometrics 44:837-845 [1988]）により推定された。
【００３２】
【図５】図５は、シャーガス分類対ドナーＳ／ＣＯ値により表示されるシグナル強度パターンを示す。シャーガス陰性ドナーからシャーガス血清陽性陽性を区別する３７０個のライブラリーペプチドのシグナル強度の範囲を並べたヒートマップ。これらのドナーを各ドナーのＥＬＩＳＡ  Ｓ／ＣＯ値に関連付けた横棒グラフ。
【００３３】
【図６】図６は、全てのシャーガスタンパク質に対する上位３７０個のペプチドのアラインメントスコアのヒストグラムを示す（青いバーで示される）。３７０個のランダムに選択されたライブラリーペプチドの１０個の同等のアラインメントで、マッピングアルゴリズムが繰り返された。それぞれが、虹色のラインプロットとして表示されるヒストグラムを生じた。
【００３４】
【図７】図７は、ペプチドを分類するライブラリーのＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質抗原のファミリーに対する類似性のレベルの表示を示す。ムチンＩＩＧＰＩ付着部位への上位３７０個のペプチドのアラインメントは、標準の１文字コードを使用して、各アラインメント位置でバーがアミノ酸組成に置き換えられた棒グラフとして表される。Ｘ軸は、ムチンＩＩタンパク質のアラインメント位置の保存アミノ酸を示す。ｙ軸は、分類ペプチドによるアミノ酸位置のカバレッジを表す。ある位置での全ての文字の高さは、各位置での絶対数のアラインメントである。単一のアミノ酸が占める各文字バーの割合は、その位置でのアラインメントの割合と等しい。
【００３５】
【図８】図８は、シャーガス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、西ナイルウイルスのクラス割り当ての確率を示す。各試料の平均予測確率は、１００回反復されたマルチクラスＳＶＭ機械クラシファイアーを使用した４重交差検証分析からのアウトオブバッグ予測により計算された。各試料は、０（黒）から１００％（白）の範囲の各疾患クラスの予測クラスメンバーシップを有する。
【００３６】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｆは、シャーガス血清陰性（健康）の対象の試料から、シャーガスに感染した血清陽性の対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているアミノ酸（Ａ）およびモチーフ（Ｂ〜Ｆ）を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｆは、シャーガス血清陰性（健康）の対象の試料から、シャーガスに感染した血清陽性の対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているアミノ酸（Ａ）およびモチーフ（Ｂ〜Ｆ）を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｆは、シャーガス血清陰性（健康）の対象の試料から、シャーガスに感染した血清陽性の対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているアミノ酸（Ａ）およびモチーフ（Ｂ〜Ｆ）を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｆは、シャーガス血清陰性（健康）の対象の試料から、シャーガスに感染した血清陽性の対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているアミノ酸（Ａ）およびモチーフ（Ｂ〜Ｆ）を示す。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｆは、シャーガス血清陰性（健康）の対象の試料から、シャーガスに感染した血清陽性の対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているアミノ酸（Ａ）およびモチーフ（Ｂ〜Ｆ）を示す。
【図９Ｆ】図９Ａ〜９Ｆは、シャーガス血清陰性（健康）の対象の試料から、シャーガスに感染した血清陽性の対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているアミノ酸（Ａ）およびモチーフ（Ｂ〜Ｆ）を示す。
【００３７】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶに感染した対象の群からの試料から、シャーガスに感染した対象の試料を区別する上位識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００３８】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、シャーガス、ＨＣＶ、およびＷＮＶに感染した対象の群からの試料から、ＨＢＶに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００３９】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＨＢＶ、シャーガス、およびＷＮＶに感染した対象の群からの試料から、ＨＣＶに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４０】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびシャーガスに感染した対象の群からの試料から、ＷＮＶに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４１】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＨＢＶに感染した対象の試料から、シャーガスに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４２】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＨＣＶに感染した対象の試料から、シャーガスに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４３】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＷＮＶに感染した対象の試料から、シャーガスに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４４】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＨＣＶに感染した対象の試料から、ＨＢＶに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４５】
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＷＮＶに感染した対象の試料から、ＨＢＶに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４６】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＷＮＶに感染した対象の試料から、ＨＣＶに感染した対象の試料を区別する上部識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４７】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、マルチクラスクラシファイアーにより決定されたシャーガス、ＨＣＶ、ＨＢＶ、およびＷＮＶに感染した対象からの試料を区別する最上位の識別ペプチドが富化されているモチーフ（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）を示す。
【００４８】
【図２１Ａ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｇ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｈ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｉ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｊ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｋ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｌ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｍ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【図２１Ｎ】図２１Ａ〜２１Ｎは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別する識別ペプチドの配列を示す。
【００４９】
【図２２】図２２は、Ｖ１６、Ｖ１３およびＩＥＤＢライブラリー（Ｖ１６アレイ）からのライブラリーペプチドのセットを視覚化するボルケーノプロットを示し、シャーガス血清陽性およびシャーガス血清陰性対象間で有意に異なる抗体結合シグナルを表示する。
【００５０】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｃは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別するＶ１６アレイ中のペプチドが富化されていることが見出された例示的なモチーフを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｃは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別するＶ１６アレイ中のペプチドが富化されていることが見出された例示的なモチーフを示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、血清陰性のシャーガス試料から、血清陽性のシャーガス試料を区別するＶ１６アレイ中のペプチドが富化されていることが見出された例示的なモチーフを示す。
【００５１】
発明の詳細な説明
開示される実施形態は、対象の感染を同定するための方法、装置、およびシステムに関する。さらに、感染の診断、予後、モニタリングおよびスクリーニングに、および／または感染の治療のための治療標的として有用なタンパク質バイオマーカーを含む候補バイオマーカーを同定するために、該方法、装置、およびシステムは提供される。
【００５２】
任意の１つの感染および感染の候補バイオマーカーの同定は、結合シグナルのパターン、すなわち結合シグナルの組み合わせとしてアレイ上のペプチドのライブラリーへの対象からの抗体の結合を示す免疫標識アッセイ（ＩＳＴ）の存在に基づいている。これは対象の免疫状態を反映する。ＩＳＴは、参照試料中に存在する抗体により結合されたペプチドの組み合わせに対して、対象の試料中に存在する抗体に示差的に結合する識別ペプチドの組み合わせである。結合シグナルのパターンは、例えば、感染に起因する症候性の、および／または無症候性の血清陽性または血清陰性の状態を示すことができる結合情報を含む。
【００５３】
本願明細書に記載の方法は、既存の方法に勝るいくつかの利点を提供する。一実施形態において、記載された方法は、症候性および無症候性の両方の対象の感染を検出できる。該方法は、単一のテストイベント、すなわち単一のマイクロアレイ標識が複数の感染のいずれか１個の存在を評価でき、複数の感染の診断を同時に決定できるという点で非常に効率的である。いずれかの感染の同定は、識別ペプチドが同定された異なる感染の数によってのみ制限される。本願明細書に記載の方法、装置、およびシステムは、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、虫、および寄生虫を含む多種多様な病原体により引き起こされる感染を同定するのに適しており、研究、医療および獣医診断、および病原体による突発の広がりの追跡などの健康監視の分野における適用を有する。
【００５４】
本願明細書では、ペプチドアレイに結合する末梢血抗体の異なるパターンを同定する単一の非侵襲的スクリーニング方法を使用して感染の検出および診断を可能にする方法、装置、およびシステムが提供される。患者試料のペプチドアレイへの示差的結合は、特定の結合パターン、すなわち、患者の健康状態、例えば感染を示す免疫標識アッセイ（ＩＳＴ）結果をもたらす。加えて、本願明細書に提供される装置およびシステムは、生物学的試料の抗体に対する抗原または結合パートナーの同定を可能にし、標的化治療介入の候補バイオマーカーとして評価することができる。
【００５５】
典型的に、状態に特徴的な免疫標識は、１つ以上の異なる基準試料のセットから得られる１つ以上の基準免疫標識に対して決定され、各セットは基準対象の１つ以上の群から得られ、各群は異なる条件、例えば異なる感染を有する。例えば、テスト対象から得られた免疫標識は、感染していないおよび／または異なる病原体により誘発された異なる感染の参照対象の免疫標識と比較した場合に、テスト対象の感染を同定する。したがって、テスト対象からの免疫標識と参照対象の免疫標識との比較は、テスト対象の状態、例えば感染を決定することができる。参照群は健康な対象の群であることができ、その状態は本願明細書では健康状態と呼ばれる。健康な対象は、通常、テストされている感染を有しないか、テストされている感染に対して血清陰性であることがわかっている対象である。
【００５６】
提供される方法は、試料、例えば異なる感染に対して血清陽性である症候性または無症候性の対象集団内の異なる個人からの血液中の多くの異なる感染を、高い性能、感度、および特異性で検出することができる。提供される方法に従って検出できる感染は、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、および虫を含む微生物により引き起こされる感染を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
一部の実施形態において、ＩＳＴは、既知のプロテオーム配列を提示するのではなく、２０アミノ酸未満のアミノ酸組み合わせの少なくとも一部の不偏サンプリングを提供するように選択されたペプチドのアレイへの抗体結合の多様であるが再現可能なパターンに基づく。対象からの試料中の抗体により結合されたペプチドは、天然の標的配列ではないかもしれないが、代わりに同族の天然のエピトープの配列または構造を模倣してもよい。例えば、例１に記載されるＩＳＴライブラリーのペプチドは、既知のプロテオームデータベースの９量体配列と一致するものはない。考えられる９量体ペプチド配列の数は、プロテオームデータベース内の連続する９量体配列の数よりも数桁大きいため、これは驚くべきことではない。したがって、天然配列に正確に対応する模倣ペプチドの確率は低い。抗体により選択的に結合される各ＩＳＴペプチド配列は、抗体が生体内で認識したエピトープの機能的代替物であることができる。その結果、抗体結合アレイペプチド配列の一部または全てを含むタンパク質の配列は、治療標的として評価できる候補タンパク質バイオマーカーを同定するのに役立つ。
【００５８】
一実施形態において、少なくとも１つの感染を有するかまたは有すると疑われる対象の血清学的状態を同定するための方法が提供され、該方法は：（ａ）対象からの試料を少なくとも１０，０００の異なるペプチドを含むペプチドのアレイに接触させること；（ｂ）結合シグナルの組み合わせを得るために、試料中に存在する抗体とアレイ上の少なくとも２５個のペプチドとの結合を検出すること；（ｃ）対象からの試料の結合シグナルの組み合わせを参照結合シグナルの組み合わせの１つ以上の群と比較し、そのことにより対象の血清学的状態を決定することを含み、ここで参照結合シグナルの組み合わせの各群の少なくとも１つが、複数の参照から得られる感染に対して血清陽性であることが知られている複数の対象から得られ、そして参照結合シグナルの組み合わせの各群の少なくとも１つが、感染に対して血清陰性であることが知られている複数の対象から得られるものである。いくつかの実施形態において、ある感染に対して血清陰性である参照対象は、異なる感染に対して血清陽性であることができる。アレイペプチドは、固体表面上に沈着されるか、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成することができる。いくつかの実施形態において、方法の性能は、０．６より大きい受信機操作者特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とすることができる。いくつかの実施形態において、ＡＵＣからの分類の再現性は、０．６０から０．６９、０．７０から０．７９、０．８０から０．８９、または０．９０から１．０の範囲である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、該方法はさらに、感染に対して血清陰性であることが知られている参照対象からの試料から、同じ感染に対して血清陽性であることが知られている参照対象からの試料を区別する参照結合シグナルを差別化する組み合わせを同定すること、および差別化結合シグナルの組み合わせを表示するアレイペプチドの組み合わせを同定することを含む。差別化結合シグナルの組み合わせは、参照試料から得られる対応する結合シグナルに対して、増加または減少するシグナル、新たに追加されるシグナル、および／または感染の存在下で失われるシグナルを含むことができる。差別化結合シグナルの組み合わせを表示するアレイペプチドは、識別ペプチドとして知られている。アレイペプチドに関して使用される場合、「区別する」なる語は、本願明細書では「分類する」と互換的に使用される。いくつかの実施形態において、参照結合シグナルを差別化する組み合わせは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、またはそれを超えるアレイ上の識別ペプチドへの結合シグナルの組み合わせを含む。例えば、１０，０００個のペプチドのアレイ上の少なくとも２５個のペプチドが、所与の条件の識別ペプチドとして同定される。いくつかの実施形態において、複数の参照対象のそれぞれからの参照試料中に存在する抗体の、少なくとも１０，０００個の異なるペプチドを含むペプチドの同じアレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの結合を検出することにより、差別化結合シグナルの各組み合わせが得られる。いくつかの実施形態において、ペプチドはｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。いくつかの実施形態において、識別ペプチドは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも４，０００，０００、少なくとも５，０００，０００または少なくとも１００，０００，０００、またはそれを超えるアレイ基板上の異なるペプチドのライブラリーを含むペプチドアレイに示差的に結合する抗体から同定される。いくつかの実施形態において、示差的結合シグナルは
【００６０】
一部の実施形態において、少なくとも０．００００５％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．００１％、少なくとも０．００３％、少なくとも０．００５％、少なくとも．０１％、少なくとも．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、アレイ上のペプチドの総数の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が識別ペプチドである。他の実施形態において、アレイ上のペプチドの全てが識別ペプチドである。
【００６１】
結合アッセイ
【００６２】
対象の免疫標識は、アレイペプチドに結合された抗体の結合パターンとして同定される。試料中の抗体のアレイに固定化されたペプチドへの結合を促進するために、任意の適切な条件下で、該ペプチドアレイは、試料、例えば血液、血漿または血清と接触させることができる。したがって、本発明の方法は、使用される特定の種類の結合条件により制限されない。かかる条件は、使用されているアレイ、基板のタイプ、基板上に配列されたペプチドの密度、結合相互作用の所望のストリンジェンシー、および結合溶液中の競合する材料の性質に応じて変わる。好ましい実施形態において、条件は、アドレス可能なアレイから未結合抗体を除去する工程を含む。かかる工程の必要性、およびかかる工程の適切な条件の決定は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００６３】
本願明細書に記載の方法およびシステムにおいて、任意の適切な検出技術を使用して、試料中の抗体のアレイ上のペプチドへの結合を検出し、感染に起因する免疫プロファイルを生成することができる。一実施形態において、（放射性同位体標識、蛍光標識、発光標識、および電気化学標識（すなわち、異なる電極中点電位を有するリガンド標識、ここで検出は標識の電位を検出することを含む）を含むが、これらに限定されない）任意のタイプの検出可能な標識が、アレイ上の標識ペプチドに使用できる。あるいは、例えば、検出可能に標識された二次抗体を使用して、結合抗体を検出することができる。
【００６４】
検出可能な標識からのシグナルの検出は、十分に当業者のレベル内である。例えば、蛍光アレイリーダーは、基板上の電位を記録する機器と同様に、当技術分野で周知である（電気化学的検出については、例えば、J. Wang (2000) Analytical Electrochemistry, Vol., 2nd ed., Wiley--VCH, New Yorkを参照）。結合相互作用は、ｓＳＰＲおよび質量分析などの他の無標識法を使用して検出することもできる。ＳＰＲは、解離定数と解離速度の尺度を提供できる。例えば、Ａ−１００  Ｂｉｏｃｏｒｅ／ＧＥ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、該タイプの分析に適する。ＦＬＥＸチップは、同じサポート上で最大４００の結合反応に使用できる。
【００６５】
あるいは、試料中の抗体とアレイ上のペプチドとの間の結合相互作用は、競合形式で検出することができる。競合的な結合阻害剤の存在下および非存在下での試料へのアレイの結合プロファイルの違いは、試料の特性評価に役立つ。
【００６６】
分類アルゴリズム
抗体結合シグナルデータ、すなわち免疫標識データ（ＩＳＴ）の分析、およびそこから導き出される診断は、通常、種々のアルゴリズムおよびプログラムを使用して実行される。一次抗体に結合した標識二次抗体により製造される抗体結合パターンは、例えばレーザースキャナーを使用してスキャンされる。スキャナーにより取得された結合シグナルの画像は、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ８ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）などのソフトウェアを使用してインポートおよび処理し、各ペプチドの表形式情報を、例えば連続的な値の範囲で提供できる０〜６５，５３５。表形式のデータをインポートし、例えば、統計コンピューティングのためのＲ言語および環境(R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/)を使用して、統計分析を実行できる。
【００６７】
異なる条件を有する参照対象、例えば感染に起因する血清陽性である対象から得られた試料間で、異なるシグナル伝達パターンを示すペプチド、すなわち識別ペプチドは、スチューデントのＴ検定またはＡＮＯＶＡなどの既知の統計的検定を使用して同定できる。統計分析を適用して、所定のストリンジェンシーレベルで異なる条件を区別する識別ペプチドを選択する。いくつかの実施形態において、最も識別性の高いペプチドのリストは、β値などの統計的手段によりペプチドをランク付けすることにより得ることができる。例えば、識別ペプチドは０〜１のｐ値を有するものとしてランク付けおよび同定できる。ｐ値のカットオフは、いくつかの依存または独立した統計的テストが単一のデータセットで同時に実行されている場合を考慮して、さらに調整できる。例えば、ボンフェローニ調整を使用すると、単一のデータセットに対して複数のペアワイズテストが実行される場合に、誤検出が発生する可能性を減らすことができる。修正は、アレイライブラリーのサイズに依存する。いくつかの実施形態において、識別を決定するためのカットオフｐ値は、１０−２０未満、１０−１９未満、１０−１８未満、１０−１７未満、１０−１６未満、１０−１６未満、１０−１５未満、１０−１４未満、１０−１３未満、１０−１２未満、１０−１１未満、１０−１０未満、１０−９未満、１０−８未満、１０−７未満、１０−６未満、または１０−５未満、または１０−４未満、または１０−３未満、または１０−２未満に調整することができる。調整は、アレイライブラリーのサイズに依存する。あるいは、識別ペプチドはランク付けされず、そして同定された識別ペプチドの全てまで表示される結合シグナル情報は、条件、例えば試料の血清学的状態を分類するために使用される。
【００６８】
続いて、統計分析に従って選択された識別ペプチドの結合シグナル情報を機械学習アルゴリズムにインポートして、統計的または数学的なモデル、すなわち抗体プロファイルデータを正確性、感度および特異性で分類するクラシファイアーを得ることができる。試料の血清学的状態、および本書の他の場所で説明されている他の適用を決定する。分類には、多くの計算アルゴリズムのいずれかを使用できる。
【００６９】
クラシファイアーは、ルールベースであるか、または計算的にインテリジェントであることができる。さらに、計算的にインテリジェントな分類アルゴリズムは、管理ありまたは管理なしであることができる。基本的な分類アルゴリズムである線形識別分析（ＬＤＡ）は、２つ以上の疾患クラスを分類するために生物医学データの分析に使用できる。ＬＤＡは、例えば分類アルゴリズムにすることができる。より複雑な分類方法であるサポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、数学カーネルを使用して元の予測子を高次元空間に投影し、クラスに従って試料を最適に分離する超平面を同定する。一般的なカーネルは、線形、多項式、シグモイド、または放射基底関数を含む。当該技術分野で説明されている一般的なクラシファイアーの比較研究は、（Kukreja et al, BMC Bioinformatics. 2012; 13: 139）に記載される。抗体結合プロファイルのデータに基づくデータ分析および予測モデリングの他のアルゴリズムは、単純ベイズクラシファイアー、ロジスティック回帰、二次識別分析、Ｋ−最近傍（ＫＮＮ）、Ｋスター、属性選択クラシファイアー（ＡＣＳ）クラスタリングによる分類、回帰による分類、ハイパーパイプ（Ｈｙｐｅｒ  Ｐｉｐｅｓ）、投票機能間隔クラシファイアー、決定木、ランダムフォレスト、および深層学習アプローチを含むニューラルネットワークを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
いくつかの実施形態において、抗体結合プロファイルは、ＳＶＭ分析に基づく排除アルゴリズムを適用することにより、ペプチドの最も識別的な組み合わせを同定するために使用される試料の訓練セットから得られる。統計的有意性のレベルによりランク付けされた種々の数の入力ペプチドを使用したアルゴリズムの精度は、交差検証により決定できる。実行可能な数の識別ペプチドの抗体結合プロファイルを生成および評価するために、複数の識別ペプチドを使用して複数のモデルを構築し、最適な性能のモデルを同定できる。該方法は、ペプチドの数を制限することを排除しないが、該方法は、利用可能なペプチド結合情報、例えば結合シグナルの全てまたは実質的に全てを活用することができる。したがって、該方法は、配列を結合目的に利用できるペプチドを先験的に決定しようとするアプローチとは対照的である。いくつかの実施形態において、アレイ上の最大で全てのペプチドが識別ペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００以上の識別ペプチドを使用して、特定の疾患分類モデルを訓練する。いくつかの実施形態において、アレイ上のペプチドの総数の少なくとも０．００００１％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が識別ペプチドであり、対応する結合シグナル情報は、特定の条件分類モデルを訓練するために使用される。いくつかの実施形態において、アレイ上の全てのペプチドについて得られたシグナル情報を使用して、状態特異的モデルを訓練する。
【００７１】
異なる数の識別ペプチドを含む複数のモデルを生成することができ、各モデルの性能は交差検証プロセスにより評価することができる。試料の訓練セットの各試料を複数の交差検証群の１つに割り当てることにより、ＳＶＭクラシファイアーを訓練し、交差検証することができる。例えば、４重交差検証について、各試料は４重交差検証群の１つに割り当てられ、各群はテストと対照、すなわち参照試料を含むようになる；交差検証群の１つ、例えば群１は保留され、群２〜４の試料を使用してＳＶＭクラシファイアーモデルが訓練される。訓練群内のテストケースと参照試料とを識別するペプチドは、例えば統計ｐ値により分析およびランク付けされる。次に、上位ｋ個のペプチドがＳＶＭモデルの予測子として使用される。入力予測子の数とモデルの性能との関係を解明し、過剰適合を防ぐために、ｓｕｂ＝ｌｏｏｐがｋの範囲で、例えば上位２５、５０、１００、２５０、１０００、２００、３０００個以上のペプチドで繰り返される。予測、すなわち群１における試料の分類は、群２〜４を使用して生成されたモデルを使用して行われる。４個の群それぞれのモデルが生成され、性能（ＡＵＣ、感度および／または特異性）は、真の疾患試料からのシグナル結合データを使用して４個のモデルからの全ての予測を使用して計算される。交差検証工程は少なくとも１００回繰り返され、平均性能は、信頼区間、例えば９５％に対して計算される。診断の視覚化は、例えば入力ペプチドの数に対するモデルの性能を使用して生成できる。
【００７２】
識別入力ペプチドのセット（最も識別性の高いペプチドのリスト、ｋ）への抗体結合情報に基づく最適なモデル／クラシファイアーが選択され、テストセットの疾患状態を予測するために使用される。異なるクラシファイアーの性能は、検証セットを使用して、そして試料のテストセットを使用して決定され、精度、感度、特異性、受信者操作特性（ＡＵＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）などの性能特性が、最大の性能を有するモデルから得られる。いくつかの実施形態において、識別ペプチドの異なるセットが同定されて、異なる状態を区別する。したがって、最も識別性の高い入力ペプチドのセットに基づく最適なモデル／クラシファイアーは、異なる対象において同定される健康状態、例えば感染のそれぞれに対して確立される。
【００７３】
条件の分類
いくつかの実施形態において、個々のバイナリクラシファイアーを得て、参照状態の血清学的状態、例えば感染の血清学的状態に対する感染の血清学的状態を同定することができる。単一の異なる感染、およびクラシファイアーにより利用される識別ペプチドの組み合わせが提供される。例えば、実施例３に示されるように、識別ペプチドの組み合わせに基づく最適なクラシファイアーが選択され、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有するかまたは有する疑いのある対象の血清学的状態を予測する。実施例３において、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性である対象群からの参照試料から、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を有する血清陽性である対象からの試料を区別するために、識別ペプチドが決定された（図２１Ａ〜Ｎ）。
【００７４】
識別ペプチドの組み合わせの特徴は、１つ以上のアミノ酸の有病率、および／または同定された識別ペプチド中に存在する特定の配列モチーフの有病率を含む。アミノ酸およびモチーフ含有量の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸およびモチーフ含有量に関連する。いくつかの実施形態において、感染について血清陰性である参照対象から、同じ感染の結果として血清陽性である対象を区別する免疫標識結合パターンの識別ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なるアミノ酸において富化されていることができる。いくつかの実施形態において、識別ペプチドにおけるアミノ酸の富化は、全てのライブラリーペプチド中に存在するアミノ酸のそれぞれの合計含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００７５】
同様に、いくつかの実施形態において、感染の結果として血清陽性である対象を、同じ感染について血清陰性である参照対象から区別する免疫標識結合パターンの識別ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なる配列モチーフにおいて富化されていることができる。配列モチーフの富化は、全てのライブラリーペプチド中に存在するモチーフのそれぞれの総含有量に対して、少なくとも１個のモチーフにおいて、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、感染症はシャーガス病であり、血清陽性対象のシャーガス病をシャーガス病に対して血清陰性の対象であることができる健康な参照対象と区別する識別ペプチドは、アルギニンのうちの１つ以上において富化されている。アスパラギン酸、およびリジン（図９Ａ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０以上％、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、シャーガス病を健康な参照対象と区別する識別ペプチドは、図９Ｂ〜Ｆに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００７７】
好ましい実施形態において、感染症はシャーガス病であり、血清陽性対象のシャーガス病をＨＢＶに対して血清陽性である参照対象と区別する識別ペプチドは、アルギニン、トリプトファン、セリン、アラニン、バリンの１つ以上において富化されている。グルタミン、およびグリシン（図１４Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、シャーガス病をＨＢＶ参照対象から区別する識別ペプチドは、図１４Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００７８】
好ましい実施形態において、感染症はシャーガス病であり、ＨＣＶに対して血清陽性である参照対象から血清陽性対象のシャーガス病を区別する識別ペプチドは、アルギニン、トリプトファン、セリン、バリン、およびグリシンのうちの１つ以上において富化されている。（図１５Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＨＣＶに対して血清陽性である参照対象から、シャーガス病を区別する識別ペプチドは、図１５Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００７９】
好ましい実施形態において、感染症はシャーガス病であり、血清陽性対象のシャーガス病をＷＮＶに対して血清陽性である参照対象と区別する識別ペプチドは、リジン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、およびグリシンのうちの１つ以上において富化されている、（図１６Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、シャーガス病をＷＮＶ参照対象から区別する識別ペプチドは、図１６Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８０】
好ましい実施形態において、感染症はＨＢＶ疾患であり、ＷＮＶに対して血清陽性である参照対象から血清陽性対象のＨＣＶ疾患を区別する識別ペプチドは、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、ロイシン、アラニンおよびヒスチジンのうちの１つ以上において富化されている（図１７Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドに対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ疾患をＨＣＶ参照対象から区別する識別ペプチドは、図１７Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８１】
好ましい実施形態において、感染症はＨＢＶ疾患であり、ＷＮＶに対して血清陽性である参照対象から、血清陽性対象のＷＮＶ疾患を区別する識別ペプチドは、トリプトファン、リジン、フェニルアラニン、ヒスチジン、およびバリンのうちの１つ以上において富化されている（図１８Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＷＮＶ参照対象からＨＢＶ疾患を区別する識別ペプチドは、図１８Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８２】
好ましい実施形態において、感染症はＨＣＶ疾患であり、ＷＮＶに対して血清陽性である参照対象から血清陽性対象のＨＣＶ疾患を区別する識別ペプチドは、リジン、トリプトファン、アルギニン、チロシン、およびプロリンのうちの１つ以上において富化されている（図１９Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ疾患をＷＮＶ参照対象から区別する識別ペプチドは、図１９Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８３】
他の実施形態において、個々のクラシファイアーを得て、２つ以上の異なる感染の組み合わされた群に対する感染を同定することができ、クラシファイアーにより利用される識別ペプチドの組み合わせが提供される。識別ペプチドの組み合わせの特徴は、１つ以上のアミノ酸の有病率、および／または同定された識別ペプチド中に存在する特定の配列モチーフの有病率を含む。例えば、例５に示すように、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはＷＮＶに対してそれぞれ血清陽性である対象の組み合わせである対象の群からＴ．ｃｒｕｚｉｉに対して血清陽性である対象を区別するために、識別ペプチドに基づいて第１のバイナリクラシファイアーが作成された。第２のバイナリクラシファイアーは、ペプチドの識別に基づいて作成され、シャーガス、ＨＣＶ、またはＷＮＶに対して血清陽性の対象の組み合わせである対象の群から、ＨＢＶに対して血清陽性の対象を区別する。ＨＰＶ、シャーガス、またはＷＮＶに対してそれぞれ血清陽性である対象の組み合わせである対象群から、ＨＣＶに対して血清陽性である対象を区別するために、識別ペプチドに基づいて第３のクラシファイアーが作成された。第４のクラシファイアーは、それぞれＨＰＶ、ＨＣＶ、またはシャーガスに対して血清陽性の対象の組み合わせである対象の群から、ＷＶＮに対して血清陽性の対象を区別するために、ペプチドの識別に基づいて作成された。
【００８４】
アミノ酸およびモチーフ含量の富化は、アレイライブラリー中の全てのペプチドの対応する総アミノ酸およびモチーフ含量に関連する。いくつかの実施形態において、方法およびアレイを用いて対象の感染症を診断または検出する際に各対象が２つ以上の異なる感染の１つを有する対象の群から感染症の対象を区別する免疫標識結合パターンの識別ペプチド本願明細書に開示されるアミノ酸は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なるアミノ酸において富化されている。アミノ酸の富化は、感染症の免疫標識を含むペプチドに対する１を超えるアミノ酸において、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８５】
同様に、いくつかの実施形態において、本願明細書に開示される方法およびアレイによる２つ以上の異なる感染のうちの１つをそれぞれ有する対象の群と比較した対象における感染症を診断または検出するための免疫標識結合パターンの識別ペプチドは少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なる配列モチーフにおいて富化されている。配列モチーフの富化は、感染症の免疫標識を含むペプチドに対する１を超えるモチーフにおいて、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、感染症はシャーガスであり、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶのうちの１つに対して血清陽性である参照対象の群から血清陽性対象のシャーガス病を区別する識別ペプチドは、１つ以上に富化されているより多くのアルギニン、チロシン、セリン、バリン（図１０Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチド対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、シャーガス病をＨＢＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶ参照対象から区別する識別ペプチドは、図１０Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、感染症はＨＢＶであり、シャーガス、ＨＣＶおよびＷＮＶのうちの１つに対して血清陽性である参照対象の群から血清陽性対象のＨＢＶ疾患を区別する識別ペプチドは、トリプトファン、フェニルアラニン、リジン、バリン、ロイシン、アルギニン、およびヒスチジンの１種以上の１個以上において富化されている（図１１Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ疾患をＷＮＶ参照対象から区別する識別ペプチドは、図１１Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、感染症はＨＣＶであり、シャーガス、ＨＢＶおよびＷＮＶのうちの１つに対して血清陽性である参照対象の群から血清陽性対象のＨＣＶ疾患を区別する識別ペプチドは、アルギニン、チロシン、アスパラギン酸、グリシンの１種以上の１個以上において富化されている（図１２Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＨＣＶ疾患を参照対象から区別する識別ペプチドは、図１２Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、感染症はＷＮＶであり、シャーガス、ＨＢＶおよびＨＣＶのうちの１つに対して血清陽性である参照対象の群から血清陽性対象のＷＮＶ疾患を区別する識別ペプチドは、リジン、トリプトファン、ヒスチジン、およびプロリンの１種以上の１個以上において富化されている（図１３Ｂ）。１つ以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総アミノ酸含量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、ＷＮＶ疾患を他の参照対象から区別する識別ペプチドは、図１３Ａに提供される１つ以上のモチーフにおいて富化されている。１つ以上のアミノモチーフの富化は、アレイライブラリー内の全てのペプチドの対応する総モチーフ含有量に対して、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。
【００９０】
さらに他の実施形態において、互いに独立した個々のクラシファイアーは、異なる識別ペプチドのセットへの抗体結合に基づいて得られ、分類の効率および精度を高めながら可能な限り最良の分類を潜在的に達成するために多クラシファイアーに組み合わされる。例えば、感染ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶの参照群からＴ．ｃｒｕｚｉｉ感染を区別する識別ペプチドに基づく第１の個々のクラシファイアーは、感染シャーガス、ＨＣＶ、およびＷＮＶの参照群からＨＢＶを区別する識別ペプチドに基づく第２の個々のクラシファイアーと、感染シャーガス、ＨＢＶ、およびＷＮＶの参照群からＨＣＶを区別する識別ペプチドに基づく第３の個々のクラシファイアーと、そして感染シャーガス、ＨＢＶおよびＨＣＶの参照群からＷＮＶを区別する識別ペプチドに基づく第４の個々のクラシファイアーと組み合わせて、多重クラシファイアーを得ることができる。個々のクラシファイアーのそれぞれの識別ペプチドに基づいて、ペプチドの最適な組み合わせが出現し、２つ以上の異なる感染を同時に区別できる多重クラシファイアーを提供できる。実施例６は、個々のクラシファイアーの識別ペプチドの組み合わせが、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ感染、ＨＰＶ感染、ＨＣＶ感染、およびＷＮＶ感染を互いに区別できる識別ペプチドの組み合わせに基づく多重クラシファイアーをもたらすことを示す。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本願明細書に開示される方法およびアレイを用いて対象における２つ以上の感染の同時同定を提供するための免疫標識結合パターンの識別ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の異なるアミノ酸において富化されている。アミノ酸の富化は、感染症に対する免疫標識を含むペプチドの少なくとも１個のアミノ酸において、１００％超、１２５％超、１５０％超、１７５％超、２００％超、２２５％超、２５０％超、２７５％超、３００％超、３５０％超、４００％超、４５０％超、または５００％超であることができる。いくつかの実施形態において、シャーガス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶの間で同時差別化が行われ、識別ペプチドはこれらの感染のそれぞれを互いに同時に区別する。いくつかの実施形態において、シャーガスをＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ感染のそれぞれから同時に区別する識別ペプチドは、アルギニン、チロシン、リジン、トリプトファン、バリンおよびアラニンの１つ以上において富化されている（図２０Ｂ）。いくつかの実施形態において、シャーガス、ＨＣＶ、およびＷＮＶ感染のそれぞれからＨＢＶを同時に区別する識別ペプチドは、（図２０Ａ）に列挙された１つ以上のモチーフにおいて富化されている。
【００９２】
アッセイ性能
００９２いくつかの実施形態において、感染を分類するための結果としての方法の性能は、無線操作者特性曲線（ＲＯＣ）下の面積を特徴とする。分類の特異性、感度、および精度の指標は、ＲＯＣ（ＡＵＣ）の下の領域により決定できる。いくつかの実施形態において、該方法は、健康状態、例えば対象の血清学的状態に対する感染の有無を決定／分類する。健康状態が代替方法により既に知られている複数の患者に適用される場合の方法の性能または精度は、０．９０超の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴としてもよい。他の実施形態において、方法の性能は、０．７０超、０．８０超、０．９０超、０．９５超である受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とし、方法の性能は、０．９７超である受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とし、方法の性能は、０．９９超である受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする。他の実施形態において、方法の性能は、０．６０から０．６９、０．７０から０．７９、０．８０から０．８９、または０．９０から１．０の範囲の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする。さらに他の実施形態において、方法の性能は、感度、特異性、および／または精度に関して表される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも６０％の感度、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感度を有する。
【００９４】
他の実施形態において、方法は、少なくとも６０％の特異性、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の特異性を有する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも６０％の制度、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の精度を有する。
【００９６】
１つ以上の異なる条件、例えば個人の血清学的状態を区別する最適クラシファイアーまたは多重クラシファイアーモデルを確立し、方法は、条件、例えば対象の血清学的状態を決定するために適用される。試料は、診断が必要な対象から得られる。試料をペプチドのアレイに接触させ、対象試料中の抗体がアレイ上の複数のペプチドに結合することから生じる結合シグナルを、例えばスキャナーを使用して検出する。画像はソフトウェアにインポートされ、対象試料の結合抗体から生じる結合シグナルを、最適なクラシファイアーモデル用に以前に同定された識別ペプチドの対応する結合シグナルと定量的に比較する。モデルの識別ペプチドおよび対象の試料の抗体により結合された対応するペプチドの結合シグナルとの間のシグナルの違いを説明する総合スコアが計算され、例えば感染の有無を示す出力が与えられる。他の出力は、感染の状態を示すことができる。例えば、出力は、感染が急性状態か、慢性状態か、不確定状態かを示すことができる。感染の状態は、本願明細書に提供される例示的な感染のいずれか１つ、すなわちＴ．ｃｒｕｚｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＷＮＶ、および本願明細書の他の場所に提供される他の既知の感染について決定することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、該方法は、０．６超、０．６５超、０．７超、０．７５超、０．８０超、０．８５超、０．９．０超、０．９５超、０．９６超、０．９７超、０．９８超、または０．９９超のＡＵＣを特徴とする分類の再現性を有する。いくつかの実施形態において、分類の再現性は、ＡＵＣ＝１を特徴とする。
【００９８】
候補バイオマーカーの同定
次に提供されるように得られた免疫標識は、本願明細書に開示されている方法および装置に従って、感染を分類し、感染の活性をモニターし、そして同定された感染障害に対する個人の治療を開発するための候補治療標的を同定することを含む複数の適用において使用することができる。別の実施形態において、２つ以上の異なる健康状態を有する対象からの試料中の抗体の示差的結合は、例えば、タンパク質データベースにおけるアレイ配列における２つ以上の健康状態を区別して、標的タンパク質の候補を同定する１つ以上の識別ペプチドの配列を比較することにより分析できるアレイ上の識別ペプチドを同定する。いくつかの実施形態において、ペプチドのアレイ上で抗体レパートリーを広げること（免疫標識アッセイ、ＩＳＴ）、および疾患の対象、例えば感染した対象からの試料と、健康な参照対象、例えば感染していないことが知られている対象からの試料とを比較することは、有益な識別ペプチドを同定し、認識された、すなわち抗体により結合されたタンパク質を明らかにすることができる。例えば、ペプチドは情報学の方法で同定できる。
【００９９】
不連続エピトープの場合のように、情報学が推定一致を同定できない場合、情報提供ペプチドは、反応性抗体を精製するための親和性試薬として使用できる。次に、精製された抗体を標準的な免疫学的手法で使用して、標的を同定できる。
【０１００】
状態、すなわち感染を診断した後、適切な参照プロテオームを照会して、試料中の抗体により結合された識別ペプチドの配列を関連付けることができる。全てのプロテオーム間で参照プロテオームが選択され（多数の基準に従って手動およびアルゴリズムで）、生命の樹を広範囲にカバーする。参照プロテオームは、http：//www.uniprot.org/proteomes/？query = reference：yesのUniProtKB内にある分類学的多様性の代表的な断面を構成する。参照プロテオームは、生物医学および生物工学研究のためのよく研究されたモデル生物のプロテオームおよび目的の他のプロテオームを含む。特に重要な種は、特定のエコタイプまたは目的の株の多数の参照プロテオームにより表されてもよい。照会することができるプロテオームの例は、ヒトのプロテオーム、および他の哺乳動物、非哺乳類動物、ウイルス、細菌、真菌、虫、寄生虫および原生動物の寄生虫からのプロテオームを含むが、これらに限定されない。さらに、照会可能なタンパク質のその他の編集は、疾患関連タンパク質のリスト、既知または未知の変異（一塩基多型、挿入、置換および削除を含む）を含有するタンパク質のリスト、既知および未知のスプライスバリアントからなるタンパク質のリスト、またはコンビナトリアルライブラリーのペプチドまたはタンパク質のリスト（天然および非天然アミノ酸を含む）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、同定された識別ペプチドを使用して照会することができるプロテオームは、T.cruziのプロテオーム(Sodre CL et al., Arch Microbiol. [2009] Feb;191(2):177-84. Epub 2008 Nov 11. Proteomic map of Trypanosoma cruzi CL Brener: the reference strain of the genome project)；例えば、http：//www.uniprot.org/proteomes/に見出すことができるHBV、HCV、およびWNVのプロテオームを含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
１つ以上のタンパク質をプロテオームまたはタンパク質リストに合わせるためのソフトウェアは、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ−ＢＬＡＳＴ、ＣＵＤＡＷＳ＋＋、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＦＡＳＴＡ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ（ＧＧまたはＧＬ）、Ｇｅｎｏｏｇｌｅ、ＨＭＭＥＲ、Ｈ−ｓｕｉｔｅ、ＩＤＦ、ＫＬＡＳＴ、ＭＭｓｅｑｓ２、ＵＳＥＡＲＣＨ、ＯＳＷＡＬＤ、Ｐａｒａｓａｉｌ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｅｑｕｉｌａｂ、ＳＡＭ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＳＷＡＰＨＩ、ＳＷＩＭＭ、およびＳＷＩＰＥを含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
あるいは、アレイ上のペプチドライブラリー全体に見られるモチーフに対して識別ペプチドにおいて富化されている配列モチーフをプロテオームに合わせて、状態の治療のための可能な治療標的として検証できる標的タンパク質を同定することができる。タンパク質ドメイン、ファミリー、機能部位を同定するためのオンラインデータベースおよび検索ツール、例えばＥｘＰＡＳｙでのＰｒｏｓｉｔｅ、ＭｏｔｉｆＳｃａｎ（ＭｙＨｉｔｓ、ＳＩＢ、スイス）、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ５、ＭＯＴＩＦ（ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ、日本）、およびＰｆａｍ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）が、利用可能である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、アラインメント方法は、ＢＬＡＳＴ(Altschul, S.F. & Gish, W. [1996] "Local alignment statistics." Meth. Enzymol. 266:460-480)、組成置換およびスコアリングマトリックスの使用、ギャップの有無にかかわらない完全一致、エピトープ予測、抗原性予測、疎水性予測、表面アクセシビリティ予測を含む、より長いタンパク質配列上に照会配列のアミノ酸をマップするための任意の方法であることができる。各アプローチに対し、標準または修正されたスコアリングシステムを使用できる。修正されたスコアリングシステムは、ペプチドライブラリー組成のバイアスを修正するために最適化される。いくつかの実施形態において、アレイのアミノ酸組成を反映するように修正(States et al., Methods 3:66-70 [1991])された、BLOSUM62のスコアリングマトリックス(Henikoff, J.G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919 [1992])とともに、４のギャップペナルティーを有する３個のアミノ酸のシードを必要とする修正されたＢＬＡＳＴアラインメントが使用される。これらの修正により、類似の置換のスコアが増加し、配列にないアミノ酸のペナルティーが削除され、全ての完全一致が等しくスコア付けされる。
【０１０４】
提供される方法に従って候補バイオマーカータンパク質を同定するために使用できる識別ペプチドは、２つ以上の異なる健康状態を区別する能力に従って選択される。本願明細書の他の場所に記載されるように、識別ペプチドは、所定の統計的ストリンジェンシーで、例えば２つ以上の条件を区別する確率に対するｐ値により、２つ以上の条件の間で相対的な結合シグナル強度の変化の違いにより、単一の条件での強度ランクにより、２つ以上の条件、例えばＡＵＣに対して訓練された機械学習モデルの係数により、または１つ以上の研究パラメーター、例えば例えばＲ２乗、スピアマン相関との相関関係により、選択できる。いくつかの実施形態において、１つ以上の候補バイオマーカーを同定するために選択される識別ペプチドは、ｐ＜１Ｅ−０３、ｐ＜１Ｅ−０４、またはｐ＜１Ｅ−０５のｐ値を有するものとして選択される。
【０１０５】
本願明細書の他の個所に記載されるように、感染に対する識別ペプチドのセットを同定したら、識別ペプチドを１つ以上の病原体プロテオームに合わせ、陽性ＢＬＡＳＴスコアを有するペプチドを同定する。識別ペプチドが合わせられる各タンパク質について、合わされたペプチドに対応するマトリックスの各行および、タンパク質を含む連続したアミノ酸の１つに対応する各列とともに、アラインメント中のＢＬＡＳＴ陽性ペプチドのスコアがマトリックス、例えば修正ＢＬＯＳＵＭ６２に組み立てられる。
【０１０６】
マトリックスの各行は合わされたペプチドに対応し、各列はタンパク質上のアミノ酸に対応し、タンパク質へのアラインメントを可能にするためにペプチド行内でギャップおよび削除が許可される。
【０１０７】
上記の修正ＢＬＡＳＴスコアリングマトリックスを使用して、マトリックス内の各位置は、そのカラム内のペプチドおよびタンパク質の対アミノ酸のスコアを受け取る。次に、タンパク質内の各アミノ酸について、対応する列を合計して、識別ペプチドによるタンパク質内の位置でのそのアミノ酸のカバレッジを表すアミノ酸「オーバーラップスコア」を作成する。
【０１０８】
アミノ酸重複スコアは、続いて組成、すなわちアレイライブラリーのアミノ酸含量について修正される。例えば、２０個の天然アミノ酸の１つ以上を除外するライブラリアレイペプチドを考慮して修正が行われる。ライブラリー構成の該スコアを修正するために、全ての配列ペプチドのリストに対して同じ方法でアミノ酸重複スコアが計算される。これは、次の式に従って、各アミノ酸位置での識別ペプチドに基づいたペプチドオーバーラップ差分スコアＳｄの計算を可能にする。
【数１】
2020511633.tif 000003
【０１０９】
ここで、「ａ」は識別ペプチドからの重複スコア、「ｂ」はＩｍｍｕｎｏＳｉｇｎａｔｕｒｅ識別ペプチドの数、「ｃ」はペプチドの完全な配列の重複スコア、「ｄ」はアレイ全体上のライブラリーペプチドの数である。
【０１１０】
次に、識別ペプチドのアラインメントから得られたアミノ酸重複スコアは、タンパク質スコアＳｄに変換される。アミノ酸レベルのスコアＳｄを全タンパク質統計Ｓｄに変換するには、タンパク質内の全ての可能なタイリングｎ量体エピトープのスコアの合計が計算され、そして最終スコアは、各タンパク質のｎ量体の該ローリングウィンドウに沿って得られた最大スコアである（ｎは２０などであることができる）。いくつかの実施形態において、該スコアは、タイリング１０量体エピトープ、１５量体エピトープ、２０量体エピトープ、２５量体エピトープ、３０量体エピトープ、３５量体エピトープ、４０量体エピトープ、４５量体エピトープ、または５０量体エピトープに対して得られることができる。タンパク質スコアＳｄは、ローリングウィンドウに沿って得られた最大スコアである。いくつかの実施形態において、ｎ量体はタンパク質の全長に相関する、すなわち、識別ペプチドはタンパク質の配列全体に合わされる。あるいは、該スコアは、ペプチド配列をタンパク質配列全体に合わせることにより得られることができる。
【０１１１】
同定された候補バイオマーカーのランキングは、ランダムに選択された非識別ペプチドのランキングに関連して引き続いて作成される。したがって、非識別ペプチドのオーバーラップスコア（非識別ランダム「Ｓｒ」スコア）、すなわち、同じプロテオームまたはタンパク質リストの１つ以上のタンパク質のそれぞれにアラインメントするランダムに選択されたペプチドが、差別ペプチドについて説明したように得られる。ランダムペプチドのアミノ酸オーバーラップスコアが計算され、その後ペプチドライブラリーのアミノ酸含有量が補正されて、非識別またはランダムＳｒスコアが提供される。次いで、非識別Ｓｒスコアは、ランダムに選択された複数の非識別ペプチドのそれぞれについて非識別タンパク質「Ｓｒ」スコアに変換される。例えば、非識別ランダムタンパク質「Ｓｒ」スコアは、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、またはそれを超えるランダムに選択された非識別ペプチドについて得ることができる。いくつかの実施形態において、ランダムに選択された非識別ペプチドの最終タンパク質スコア、Ｓｒスコアは、タンパク質スコアＳｄを得るために使用される同等の数の識別ペプチドを使用して計算できる。他の実施形態において、Ｓｄの決定に使用される識別ペプチドの数の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が、非識別タンパク質「Ｓｒ」スコアを決定するために使用される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、候補タンパク質バイオマーカーは、非識別ペプチドのアラインメントにより同定されたタンパク質のＳｒスコアに対するＳｄスコアによりランク付けされる。いくつかの実施形態において、ランキングは、ｐ値に従って決定できる。上位の候補バイオマーカーは、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０−１０未満、１０−１２未満、１０−１５未満、１０−１８未満、１０−２０未満、またはそれ未満のｐ値を有するとして選択できる。一部の実施形態において、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、またはそれを超える候補バイオマーカーが、該方法に従って同定される。
【０１１３】
他の実施形態において、候補バイオマーカーは、前述の段落に記載されるように複数の識別ペプチドをｎ量体エピトープにタイリングすること、および病原体のプロテオームの最大のＳｄスコアを有するタンパク質のパーセントとしての候補バイオマーカーの数を選択することにより得られるＳｄスコアに従って選択される。いくつかの実施形態において、候補バイオマーカーは、最高ランキングＳｄスコアを有し、病原体のプロテオームのタンパク質の総数の少なくとも０．０１％を含むタンパク質である。他の実施形態において、候補バイオマーカーは、最高ランキングＳｄスコアを有し、そして病原体のプロテオームのタンパク質の総数の少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．２％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、少なくとも０．３５％、少なくとも０．４％、少なくとも０．４５％、少なくとも０．５％、少なくとも０．５５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．６５％、少なくとも０．７％、少なくとも０．７５％、少なくとも０．８％、少なくとも０．８５％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、またはそれ以上を含むタンパク質である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、対象における感染の少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーを同定するための方法が提供され、該方法は：（ａ）ペプチドアレイを提供すること、および該対象からペプチドアレイへ生体試料をインキュベートすること；（ｂ）該対象からの生体試料中の抗体に結合した識別ペプチドのセットを同定すること、ここで、ペプチドのセットは、少なくとも１個の異なる状態から感染を差別化することができるものである；（ｃ）該セット内の複数の該識別ペプチドを用いてプロテオームデータベースに照会すること；（ｄ）該セット内の該複数のペプチドを、感染原因病原体のプロテオームの１つ以上のタンパク質に合わせること；および（ｅ）タンパク質のそれぞれの関連性スコアを得ること、およびプロテオームデータベースから同定されたタンパク質のそれぞれをランク付けすることを含み；ここで、同定されたタンパク質のそれぞれは、対象の疾患の候補バイオマーカーである。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の異なる状態は、１つ以上の異なる感染、および／または健康状態を含むことができる。いくつかの実施形態において、該方法は、オーバーラップスコアを得ることをさらに含み、ここで、該スコアは、ペプチドライブラリーのペプチド組成を修正するものである。識別ペプチドは、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０−１０未満、１０−１１未満、１０−１２未満、１０−１３未満、１０−１４未満、または１０−１５未満のｐ値を有するとして、統計的手段、例えばｔ検定により同定できる。いくつかの実施形態において、得られた候補バイオマーカーは、該方法に従うが非識別ペプチドを使用して識別されたタンパク質と比較した場合、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、または１０−６未満のｐ値に従ってランク付けすることができる。
【０１１５】
感染症例えばシャーガス病の候補バイオマーカー
実施例４は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）に感染した対象からの試料から健康な対象の試料の血清学的状態を区別する識別ペプチドを使用して候補タンパク質バイオマーカーを同定する方法を例示する。健康な対象は、以前にＴ．ｃｒｕｚｉに感染して血清陰性に転化した対象、および／またはＴ．ｃｒｕｚｉに一度も感染したことがない対象であることができる。候補タンパク質バイオマーカーのリストを表２に示す。同様に、候補タンパク質バイオマーカーは、他の感染症を有する対象から、健康な対象から、他の感染症を有する対象から、および感染的であるかどうかにかかわらず、擬態疾患を有する対象からの試料の血清学的状態を区別する識別ペプチドを使用して同定できる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、感染症の候補タンパク質バイオマーカーを同定する方法は：（ａ）ペプチドアレイを提供すること、および生体試料を該対象からペプチドアレイにインキュベートすること；（ｂ）対象の生体試料中の抗体に結合した識別ペプチドのセットを同定すること、ここで、識別ペプチドのセットは、同じ感染症の血清陰性の試料と感染症の血清陽性の試料を差別化することができるシグナルを表示するものである；（ｃ）識別ペプチドのセット内の各ペプチドを使用してプロテオームデータベースを照会すること；（ｄ）ペプチドのセット内の各ペプチドをプロテオームデータベース内の１つ以上のタンパク質に合わせて、感染の原因となっている病原体の１つ以上のタンパク質を同定すること；および（ｅ）タンパク質のそれぞれの関連性スコアを得ること、およびプロテオームデータベースから同定されたタンパク質のそれぞれをランク付けすることを含み；ここで、識別されたタンパク質のそれぞれは、対象の感染症の候補バイオマーカーである。いくつかの実施形態において、該方法で使用される識別ペプチドは、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０−１０未満、１０−１１未満、１０−１２未満、１０−１３未満、１０−１４未満、または１０−１５未満のｐ値を有すると識別される。他の実施形態において、該方法で使用される識別ペプチドは、全ての識別ペプチド、すなわち統計的方法に従ってランク付けされていないペプチドである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、該方法は、感染症を健康な状態、例えば血清陰性状態から差別化する識別ペプチドのセットを同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、識別ペプチドは、異なる感染を有する対象からのシャーガスを有する対象と区別する。あるいは、識別ペプチドは、シャーガスを有する対象を、それぞれ異なる感染を有する対象の混合物から区別する。いくつかの実施形態において、任意の１つの感染、例えば、シャーガス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＷＮＶは、感染していない対象と区別できる。いくつかの例において、感染していない対象は、感染したことから逆転した血清陰性の対象である。したがって、候補バイオマーカーは、疾患を診断し、疾患進行の段階を同定するのに役立つことができる。バイオマーカーは、感染症のモニタリングにも使用できる。健康な対象に対してシャーガスを有する対象で同定された候補バイオマーカーの例を表２に列挙する。いくつかの実施形態において、方法に従って同定された候補バイオマーカータンパク質は、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、または１０−６未満より少ないｐ値に従ってランク付けされる。結果の候補のランキングは、状態を識別しないアレイペプチドから同定されたタンパク質に対して決定することができる。
【０１１８】
あるいは、提供される方法に従って同定された識別ペプチドは、２個の異なる条件を区別する最も識別可能なペプチドにおいて富化されている配列モチーフを使用して候補標的タンパク質を同定できる。一実施形態において、ヒト対象における感染症の治療のための候補標的を同定する方法は：（ａ）感染症を１つ以上の異なる感染症から差別化する識別ペプチドのセットを得ること；および（ｂ）該識別ペプチドのモチーフのセットを同定すること；（ｃ）モチーフのセットをヒトのプロテオームに合わせること；（ｄ）セット内の各モチーフと免疫原性タンパク質の領域との間の相同性領域を同定すること；および（ｅ）該感染症を治療するための候補標的としてタンパク質を同定することを含む。該方法は、感染症と健康状態を差別化する識別ペプチドのセットを同定することをさらに含むことができる。中には進行の異なる段階にあるものもある、種々の感染症の治療における開発および使用のための候補標的タンパク質を同定するために使用できる最も識別性の高いペプチドにおいて富化されているモチーフを図９〜２０に示す。進行の異なる段階にある種々の感染症の開発および使用のための候補標的タンパク質を同定するために使用できる最も識別性の高いペプチドにおいて富化されているモチーフを図９〜２０に示す。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、識別ペプチドを同定する工程は：（ｉ）試料中に存在する抗体の異なるペプチドのアレイに対する該感染症を有する複数の対象からの結合を検出して、結合シグナルの第１の組み合わせを得ること；（ｉｉ）ペプチドの同じアレイへの抗体の結合を検出すること、ここで、該抗体は、異なる健康状態を有する各対象の２つ以上の参照群からの試料中に存在するものである；（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組み合わせと該第２の組み合わせを比較すること；および（ｉｖ）該疾患を有する対象からの試料中の抗体および対象の２つ以上の参照群からの該試料中の抗体により示差的に結合する該アレイ上のペプチドを同定し、そのことにより該識別ペプチドを同定することを含むことができる。いくつかの実施形態において、感染症はシャーガス病である。いくつかの実施形態において、シャーガスは健康状態とは区別される。いくつかの実施形態において、シャーガスは、１つ以上の異なる感染症と区別される。上記のように、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＷＮＶ、シャーガスなどの感染は互いに区別できる。
【０１２０】
候補バイオマーカーの適用
他の実施形態において、提供される方法、装置、およびシステムは、疾患活性と相関するおよび／または経時的な疾患活性の変化と相関する識別ペプチドを同定する。例えば、識別ペプチドは疾患活性を決定し、既存のスコアリングシステムの既知のマーカーにより定義された活性と相関させることができる。実施例３は、いくつかの識別ペプチドがシャーガスのＳ／ＣＯ活性スコアと相関することを説明している。これらの識別ペプチドは、提供された方法に従ってタンパク質を同定するために使用される。したがって、これらのタンパク質の一部は、シャーガス病の活性のテストおよびモニタリングに使用できる新しい候補バイオマーカーである可能性がある。
【０１２１】
識別ペプチドはまた、標的タンパク質間相互作用を阻害または活性化する薬の設計の基礎として役立つことができる。別の実施形態において、本発明の方法により同定された新規の識別ペプチドの治療的および診断的使用が提供される。したがって、実施形態および実施形態は、本発明によるペプチドおよびその誘導体を含む製剤、医薬品、および医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、新規の識別ペプチドまたはその誘導体が医学で使用するために提供される。より具体的には、細胞表面受容体などの標的リガンドの機能を拮抗または作動させるのに使用するため。本発明の識別ペプチドは、癌および変性疾患などのヒトまたは動物の身体の種々の疾患および状態の治療に使用することができる。治療は、予防的治療、治療的治療、および疾患または状態の緩和をも含んでもよい。
【０１２２】
したがって、本願明細書で開示される方法、システム、およびアレイ装置は、候補バイオマーカーを同定し、ワクチン標的を同定する役割を果たし、疾患および／または状態の初期段階で疾患および／または状態を治療するための医学的介入に有用である、識別ペプチドを同定することができる。例えば、本願明細書に開示される方法、システムおよびアレイ装置は、従来のバイオマーカーベースのアッセイの数日または数週間前に疾患および／または状態を検出、診断およびモニターすることができる。さらに、炎症状態、自己免疫疾患、癌および病原性感染症を含む、感染性因子により引き起こされる疾患および状態の副スペクトルを検出、診断、およびモニターするために、たった１個のアレイ、すなわち１個の免疫標識アッセイが必要である。候補バイオマーカーは、治療薬の検証およびその後の開発のために同定できる。
【０１２３】
感染症
提供されるアッセイ、方法、および装置は、複数の異なる感染を同定するために利用することができる。いくつかの実施形態において、提供されるアッセイ、方法、および装置を利用して、任意の感染を他の任意の感染と区別する識別ペプチドを同定することができる。他の実施形態において、異なる感染を同定する識別ペプチドを利用して、異なる感染の候補バイオマーカーを同定することができる。本願明細書に記載の方法、装置、および装置は、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、虫、および寄生虫を含む多種多様な病原体により引き起こされる感染を同定するのに適する。いくつかの実施形態において、提供されるアッセイ、方法、および装置を利用して、感染症の診断、他の感染症や感染症により引き起こされた疾患に似た疾患との鑑別診断の提供、感染症とそのことにより引き起こされた疾患の進行の決定、活性のスコアリングなど、異なる感染症の医学的介入の候補バイオマーカーを同定する感染および疾患の治療のための治療薬としての評価の候補標的として機能し、治療に対する予測応答に基づいて臨床試行で患者を層別化する。
【０１２４】
候補バイオマーカーは、あらゆる感染症の医学的介入に利用することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、感染症は、提供される方法に従って候補バイオマーカーを同定することができる病原性ウイルス感染により引き起こされる。提供される方法に従って候補バイオマーカーを同定できる病原性ウイルス感染の非限定的な例は、以下のウイルス科で見られ、例示的な種で説明されるウイルスにより引き起こされる感染を含む：ａ）アデノウイルス種などのアデノウイルス科；ｂ）単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型などのヘルペスウイルス科；ｃ）ヒトパピローマウイルス種などのパピローマウイルス科；ｄ）ＢＫウイルス、ＪＣウイルス種などのポリオマウイルス科；ｅ）天然痘種などのポックスウイルス科；ｆ）Ｂ型肝炎ウイルス種などのヘパドナウイルス科；ｇ）ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９種などのパルボウイルス科；ｈ）ヒトアストロウイルス種などのアストロウイルス科；ｉ）ノーウォークウイルス種などのカリシウイルス科；ｊ）Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス種などのフラビウイルス科；ｋ）風疹ウイルス種などのトガウイルス科；ｌ）Ｅ型肝炎ウイルス種などのヘペウイルス科；ｍ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）種などのレトロウイルス科；ｎ）インフルエンザウイルス種などのオルソミクソウイルス科；ｏ）グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、および／またはサビアウイルス種などのアレナウイルス科；ｐ）クリミア・コンゴ出血熱ウイルス種などのブニヤウイルス科；ｑ）エボラウイルスおよび／またはマールブルグウイルス種などのフィロウイルス科；麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルスおよび／またはニパウイルス種などのパラミクソウイルス科；ｒ）狂犬病ウイルス種などのラブドウイルス科；ｓ）ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルスおよび／またはバンナウイルス種などのレオウイルス科；ｔ）ジカウイルスなどのフラビウイルス科。いくつかの実施形態において、ウイルスは、Ｄ型肝炎などのウイルス科に割り当てられない。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、感染は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｖｉｒｉｄａｎｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ａｕｒｅｕｓ、ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ａｖｉｕｍ）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、  Ｂｏｒｒｅｌｉａ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｄｉａ（Ｅ．ｃｏｌｉ、  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ（ＥＨＥＣ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７を含む）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｌ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅを含む、病原体により引き起こされる細菌性感染である。偏性細胞内寄生虫（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ（Ｅ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ、他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ。細菌性病原体により引き起こされる感染は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉにより引き起こされる軟性下疳、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓにより引き起こされるクラミジア、淋病（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、鼠径肉芽腫または（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミ���ス、梅毒（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、およびウレアプラズマ感染症を含む性感染症をさらに含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、対象は原生動物感染症に罹患しており、これは以前に原生動物界に分類された生物により引き起こされる寄生虫病である。それらは、アメーボゾア、エクスカバータ、およびクロムアルベオラータに分類される生物を含む。例は、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ  ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ；およびＥｎｄｏｌｉｍａｘ；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（一部はマラリアを引き起こす）、およびＧｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａを含む［２］。ツェツェバエにより伝染し、アフリカ睡眠病の原因であるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉは別の例である。原生動物の他の非限定的な例は、以下のファミリーで見出すことができ、例示的な種で説明される：ａ）Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ種；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ種；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ種；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ種；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ種およびＧｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ種。感染症の候補バイオマーカーを同定するために提供される方法の能力は、識別ペプチドが原生動物Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉに感染した対象からの試料中の候補バイオマーカーを同定できることを示す。
【０１２８】
他の実施形態において、感染症は、真菌感染、例えば、一次病原体による、表在性真菌症、皮膚真菌症、皮下真菌症、全身性真菌症を含む真菌症、および、カンジダ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｃｏｃｕｓ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｓｔａｃｈｙｂｉｔｒｙｓ種、およびＥｎｄｏｔｈｅｒｍｙ種を含む病原性真菌による、全身性真菌症である。
【０１２９】
他の実施形態において、感染症は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）であり、これは、ヒトを含む多くの動物の脳（脳症）および神経系に影響を及ぼす進行性疾患の群に属し、プリオンによる感染症により引き起こされる。伝染性の病原体である。最も一般的な仮説によれば、それらはプリオンにより伝播されるが、他のデータはスピロプラズマ感染の関与を示唆する。ヒトのプリオン病は、古典的なクロイツフェルトヤコブ病、新しい変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ、ウシ海綿状脳症に関連するヒト障害）、ゲルストマンストロイスラーシャインカー症候群、致死性家族性不眠症、クールー、および最近発見された様々なプロテアーゼ敏感プリオノパシー（ｐｒｉｏｎｏｐａｔｈｙ）を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、感染は、寄生虫虫症としても知られる寄生虫症であり、これは、寄生蠕虫として知られている体の一部が寄生虫に感染しているヒトおよび他の動物の任意のマクロ寄生虫病である。これらの寄生虫には多数の種があり、サナダムシ、吸虫、回虫に広く分類される。彼らはしばしば彼らの宿主の消化管に住むが、彼らは他の器官に潜り込み、そこで生理学的損傷を引き起こす。既知の全ての寄生蠕虫種のうち、乾燥糞便、糞便スラッジ、廃水、および下水スラッジからのヒトの排泄物の試料における伝達経路、その制御、不活性化、および列挙の理解に関する最も重要な寄生蠕虫は以下である：Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ（世界で最も一般的）、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓおよびＡｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ；Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ；  Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ；Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ；Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ；Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ；Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｔｉ。蠕虫症は以下のように分類される（疾患名は「−ｓｉｓ」で終わり、原因となる虫は括弧内にある）：回虫感染（線虫症）：フィラリア症（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ感染）；オンコセルカ症（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ感染）；土壌伝染性虫症−これは、回虫症（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ感染、鞭虫症（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ感染）、および鉤虫感染（ＮｅｃａｔｏｒｉａｓｉｓおよびＡｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ感染を含む）を含む；毛様線虫症（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｓｐｐ．感染）；メジナ虫症（ギニアワーム感染）；条虫感染（ｃｅｓｔｏｄｉａｓｉｓ）；エキノコックス症（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ感染症）；膜様条虫症（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ感染）；条虫症／嚢虫症（Ｔａｅｎｉａ感染）；共尾虫症（Ｔ．ｍｕｌｔｉｃｅｐｓ、Ｔ．ｓｅｒｉａｌｉｓ、Ｔ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ、およびＴ．ｂｒａｕｎｉ感染）；吸虫感染（吸虫症）；双口吸虫症（ａｍｐｈｉｓｔｏｍｅｓ感染）；肝吸虫症（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ感染）；肝蛭症（Ｆａｓｃｉｏｌａ感染）；肥大吸虫症（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ  ｂｕｓｋｉ感染）；オピストルキス症（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ感染）；肺吸虫症（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ感染）；住血吸虫症／住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ感染）、および鈎頭虫感染：Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ感染。
【０１３１】
他の実施形態において、感染は、アナプラズマ症、バベシア症、エールリヒア症、ライム病（ボレリア・ブルゴフェリ感染症）、ポワッサンウイルス感染症、ロッキーマウンテン紅斑熱（ＲＭＳＦ）およびチフス熱を含む斑点熱リケッチア症を含むダニ媒介感染である。
【０１３２】
感染性生物のタイムラインおよび対応する個人の症状の変化は、疾患ごとに異なってもよい。例えば、シャーガス病において、感染した個人は最初に４〜８週間の急性期を経験し、これは侵入部位で眼窩周囲の腫脹または潰瘍性病変として現れ、血流中を循環する高レベルの寄生虫に関連する。これは無症候性の非決定的段階に移行し、通常は生涯にわたる感染であり、血液寄生虫血症の損失および宿主器官の筋肉および脂肪細胞への原生動物の隔離を特徴とする[ Perez CJ et al., Lymbery AJ, Thompson RC (2014) Trends Parasitol 30: 176-182.]。１０〜３０年後、不確定段階の３人以上の個人が、慢性の症候期に進行し、そして不可逆的な筋肉病変を引き起こし、しばしば慢性期に入ってから２年以内の死亡を引き起こす心臓、胃、または他の臓器関連疾患の重篤な症状を呈するだろう[Viotti R et al., (2006) Ann Intern Med 144: 724-734; Granjon E et al., (2016) PLoS Negl Trop Dis 10: e0004596; Oliveira GBF et al., (2015) Global Heart 10: 189-192]。さらに、シャーガス病の再活性化は、ＨＩＶに共感染した患者や癌または自己免疫疾患の治療中の患者を含む免疫不全患者で報告される[Rassi Jr A et al., (2010); Pinazo MJ et al., (2013) PLoS Negl Trop Dis 7: e1965]。
【０１３３】
ＷＨＯは最近、今後５年間で約２０万人がシャーガス病により死亡すると推定している。これは、同じ期間内に米国で乳癌で死亡すると予測される同数の女性に対応する[Pecoul B et al., (2016) PLoS Negl Trop Dis 10: e0004343]。
【０１３４】
シャーガスに対するワクチンはなく、予防の唯一の方法は、昆虫ベクターの広がりを制御することである。過去４０年間、ベンズニダゾールおよびニフルチモックスの２つの薬のみが治療に利用可能であった[Rassi Jr A et al., (2010),  Clayton J (2010) Nature 465: S4-S5]。それらは、急性期感染症に対して可変的であるが有意な有効性を示したが、慢性症状に苦しむ人々または無症候性から症候性疾患への移行を防止するための治療的価値はほとんどないことが証明されている[Issa VS and Bocchi EA (2010) The Lancet 376: 768.; Morillo CA et al., (2015) New England Journal of Medicine 373: 1295-1306.]。該薬の有効性の予測不能性、利用性の低さ、既知の副作用により、診断されたシャーガス病患者への処方が１％未満になった[Clayton J (2010) ; Viotti R et al., (2009) Expert Rev Anti Infect Ther 7: 157-163]。治療を受ける一部の人は、停止を必要とする有害な合併症を経験する[Viotti R et al., (2006) ]。現在、どの患者が治療により利益を受けるのか、害を受けるのかを同定するツールはない。
【０１３５】
最近、より安全でより有効なＴ．ｃｒｕｚｉ感染に対する新薬を発見することに関心が高まっている[De Rycker M et al., (2016) PLoS Negl Trop Dis 10: e0004584.]。しかしながら、新薬の開発は、無症状期および慢性期での薬効を評価するための信頼できる実用的な方法の欠如により妨げられてきた。感染状態の測定と治療効果の決定には多くの困難が存在する[Gomes YM et al., (2009) Mem Inst Oswaldo Cruz 104 Suppl 1: 115-121]。例えば、寄生虫血症はサブパテントであり、低レベルの組織寄生虫は解剖学的に散在しており、リーシュマニア症およびマラリアなどの他の固有病への抗原類似性の存在、初期または活性疾患の信頼できるマーカーの欠如、および初期感染後数十年までの症状の進行の遅れ[Keating SM et al.,et al. (2015) Int J Cardiol 199: 451-459.]。要するに、シャーガス血清陽性の個人を臨床的に異なる群に層別化する方法が必要である。例えば、急性期を過ぎても感染し続けている個人と、それを解決した人を区別することが重要である。したがって、不確定段階のどの感染した個人が臨床的に無症状から生命を脅かす合併症に進行するかを予測することが望ましいだろう。
【０１３６】
Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ寄生虫の直接検出は、末梢血細胞から抽出された核酸の血液顕微鏡検査、血液培養、異種診断、またはＰＣＲにより行うことができる。しかしながら、これらのアッセイは感度が高くなく、慢性疾患の段階では情報価値がないと見なされる。診療所や血液バンクにおいて、診断は血清学による間接的な検出に依存する。ＥＬＩＳＡテストは、粗寄生虫ライセートに対するＴ．ｃｒｕｚｉ抗体（Ｏｒｔｈｏ  Ｔ．ｃｒｕｚｉ  ＥＬＩＳＡ）、半精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養エピマスチゴート画分、または４個の組換えタンパク質（Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭおよびＥＳＡ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ）の混合物の検出に利用可能である。ＦＤＡは、血漿中の抗原結合レベルを定量化し、抗体価を反映するシャーガス病のカットオフ値（Ｓ／ＣＯ）のシグナルを報告するＯｒｔｈｏおよびＡｂｂｏｔｔテストを承認した。残念ながら、これらのテストプラットフォーム間およびテストプラットフォーム内での決定的で一致しない結果は、交差反応性および誤検出の一般的な発生と同様に、永続的な問題である。その結果、ＦＤＡが承認した、またはシャーガス診断の参照標準と見なされているものはないが、確度を高めるために確認血清学的テストが使用される。放射免疫沈降アッセイ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ  ＲＩＰＡ）は、脱マスチゴート溶解物に対する反応性抗体の定性的でより特異的なテストであり、一部の血液バンクによる確認テストとして日常的に使用される[Tobler LH et al., (2007) Transfusion 47: 90-96.]。その他のアッセイ、例えば、ESA（ELISAストリップアッセイ）[Cheng KY et al., (2007) Clinical and Vaccine Immunology 14: 355-361]、Architect Chagasキット[Praast G et al., (2011) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 69: 74-81.]、およびGranjonら(2016)のアッセイは、Ｔ．ｃｒｕｚｉの組換え抗原を利用する。Ｔ．ｃｒｕｚｉの複雑なプロテオームおよびライフサイクルは、追加の抗原の発見を必要とすることが認識される[De Pablos LM and Osuna A (2012) Infection and Immunity 80: 2258-2264.]。Ｔ．Ｃｒｕｚｉｉに対するヒト免疫応答の多様性感染症[Chatelain E (2017)]は、特に無症候性疾患を有する大規模な使用集団内で陽性を正確に決定するために多くの標的を使用する必要性を証明する。Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染状態の測定および疾患活性のモニタリングのための新しい検証済みマーカーおよび新しいアプローチの必要性が、実証される[Pinazo MJ et al., (2013); Pinazo MJ et al., (2014) Expert Rev Anti Infect Ther 12: 479-496.]。
【０１３７】
所望のテストを確立するための前提条件は、献血者などの多様な無症状の集団においてシャーガスを正確かつ再現可能に検出できる単一の堅牢なプラットフォームを開発することである。加えて、シャーガスおよび他の病原体、例えばＴ．ｃｒｕｚｉと同じ地理的地域に固有の西ナイルウイルス（ＷＮＶ）により引き起こされる感染を含む他の疾患感染症を同時に診断できる単一のテストが望まれる。血液バンクの場合、これは、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）などのウイルスをも含む。
【０１３８】
現在の血液テスト研究所は、感染症のない製品の米国輸血レシピエントを確実にするために、それぞれがシャーガスシリーズとともに全ての血液試料で実行される別個の一連のアッセイを使用する[McCullough J (1993) JAMA 269: 2239-2245]。血清学的スクリーニングに加えて、異なるウイルスシリーズのテストは、プーリングおよびパーティショニングプロトコルに基づく核酸スクリーニングを含む[Busch MP et al., (2008) J Infect Dis 198: 984-993]。
【０１３９】
シャーガス病の場合と同様に、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスに感染した多くの対象は最初の感染中に症状がなく、慢性疾患を発症する多くの患者は無症状のままである。さらに、ウイルス性肝炎の症状は、存在する場合、どの肝炎であっても同様である。長年にわたり、感染症はしばしば肝疾患と肝硬変を引き起こし、それが肝不全および肝癌などの合併症を引き起こすことができる。ＨＢＶおよびＨＣＶ感染の検出のためのアッセイは、ウイルス抗原または宿主により製造される抗体を検出するテストを含む。しかしながら、これらのアッセイの解釈は複雑である。さらに、ＨＢＶおよびＨＣＶのテストは定期的に実行されず、宿主での深刻な合併症の発生およびウイルスの伝播は未確認のままである。
【０１４０】
同様に、西ナイルウイルスにより引き起こされる蚊媒介感染は、ヒトの約８０％で症状を製造しなくてもよい。未治療の場合、西ナイル脳炎、西ナイル髄膜炎、ＷＮ髄膜脳炎、ＷＮポリオ脊髄炎などの神経疾患が発症することができる。多くの種々の疾患が、臨床的ＷＮＶ感染、例えばエンテロウイルス感染症および細菌性髄膜炎により引き起こされる症状と同様の症状を呈してもよい。鑑別診断の説明は、ＷＮＶの確定診断に不可欠であり、症状を引き起こす特定の病原体を同定するには、ＰＣＲやウイルス培養などの診断および血清学的テストが必要である。
【０１４１】
試料
提供される方法に従って利用される試料は、任意の生物学的試料であることができる。例えば、生物学的試料は、抗体を含む生物学的液体試料であることができる。適切な生体液試料は、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、便水、耳液、リンパ液、唾液、脳脊髄液、破壊、骨髄懸濁液、膣液、大腿骨頸部洗浄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、脳液、嚢胞液、胸膜および腹膜液、心膜液、腹水、乳、膵液、呼吸器、腸および泌尿生殖器の分泌物、羊水液体、乳、および白血球除去試料を含むが、これらに限定されない。生体試料は、胚盤腔、臍帯血、または胎児または母体起源の母体循環をも含んでもよい。いくつかの実施形態において、試料は、非侵襲的手順により容易に得ることができる試料、例えば血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、痰、耳の流れ、または唾液である。特定の実施形態において、試料は、末梢血試料、または末梢血試料の血漿または血清画分である。本願明細書で使用される「血液」、「血漿」および「血清」なる語は、その画分または処理された部分を明確に包含する。
【０１４２】
侵襲性が最小限であり、すぐに利用できるため、血液は、日常的な臨床診療で測定される最も好ましく使用されるヒト体液である。さらに、血液は全ての体組織に灌流するため、その組成は個人の全体的な生理機能の指標として重要である。いくつかの実施形態において、免疫特性／抗体結合プロファイルを得るために使用される生体試料は血液試料である。他の実施形態において、生体試料は血漿試料である。さらに他の実施形態において、生体試料は血清試料である。さらに他の実施形態において、生体試料は乾燥血液試料である。生物学的試料は、抗体結合プロファイルの分析を実行していない者、および／またはペプチドアレイへの結合アッセイを実行している者などの第三者を通じて取得することができる。例えば、試料は、試料が由来する対象の臨床医、医師、または他のヘルスケアマネージャーを通じて得られてもよい。あるいは、生体試料は、ペプチドアレイへの試料の結合アッセイを実行している者、および／または抗体結合プロファイル／ＩＳを分析している同じ者により得られてもよい。アッセイされる生物試料は、保存（凍結など）するか、保存条件で保存することができる。
【０１４３】
「患者試料」および「対象試料」なる語は、本願明細書では互換的に使用され、試料、例えば、患者、すなわち医学的注意、ケアまたは治療の受け手から得られた生物学的試料を指す。対象試料は、本願明細書に記載の試料のいずれかであることができる。特定の実施形態において、対象試料は、非侵襲的手順により得られる試料、例えば末梢血試料である。
【０１４４】
試料中の循環抗体の抗体結合プロファイルは、限られた量の試料を使用して提供される方法に従って得ることができる。例えば、アレイ上のペプチドを数ミリリットルの血液と接触させて、対象の健康状態を同定するのに十分な数の有益なペプチド-タンパク質複合体を含む抗体結合プロファイルを得ることができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、抗体結合プロファイルを得るために必要な生体試料の体積は、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、１ｍｌ未満、９００ｕｌ未満、８００ｕｌ未満、７００ｕｌ未満、６００ｕｌ未満、５００ｕｌ未満、４００ｕｌ未満、３００ｕｌ未満、２００ｕｌ未満、１００ｕｌ未満、５０ｕｌ未満、４０ｕｌ未満、３０ｕｌ未満、２０ｕｌ未満、１０ｕｌ未満、未満１ｕｌ、９００ｎｌ未満、８００ｎｌ未満、７００ｎｌ未満、６００ｎｌ未満、５００ｎｌ未満、４００ｎｌ未満、３００ｎｌ未満、２００ｎｌ未満、１００ｎｌ未満、５０ｎｌ未満、４０ｎｌ未満、３０ｎｌ未満、２０ｎｌ未満、１０ｎｌ未満、または１ｎｌ未満である。いくつかの実施形態において、生体液試料を数倍に希釈して、抗体結合プロファイルを得ることができる。例えば、対象から得られた生体試料は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１０，０００倍で希釈できる。抗体は希釈血清試料中に存在し、対象の健康に重要であると考えられる。希釈血清試料にも抗体が残っている場合、患者の血液中に比較的多量に存在しているはずであるためである。
【０１４６】
本願明細書に記載の方法に従って対象の疾患を検出する例は、実施例に記載される。これらの例は、わずか９０マイクロリットルの血清または血漿を使用して、感染の正しい診断が行われたことを示す。
【０１４７】
治療および条件
本発明の方法およびアレイは、感染のスクリーニングに使用することができる識別ペプチドを同定し、感染の候補バイオマーカーを同定するための方法、アッセイおよび装置を提供する。本願明細書に開示される実施形態の方法およびアレイは、例えば、感染のスクリーニングおよび／または対象における感染の１つ以上の候補バイオマーカーの同定に使用することができる。対象は、ヒト、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ウサギ、および種々の他の動物であることができる。対象は、あらゆる年齢のものであることができ、例えば、対象は、幼児、幼児、子供、思春期前、青年、成人、または高齢者であることができる。
【０１４８】
本発明のアレイおよび方法は、ユーザーにより使用できる。複数のユーザーは、本発明の方法を使用して、状態の治療を識別および／または提供することができる。ユーザーは、例えば、自分の健康状態をモニターしたいヒトである。ユーザーは、例えば医療提供者でありうる。医療提供者は、例えば医師であることができる。いくつかの実施形態において、ユーザーは、対象に参加している医療提供者である。本発明のユーザーであることができる医師および医療提供者の非限定的な例は、以下を含む：麻酔専門医、肥満手術専門医、血液バンク輸血医学専門医、心臓電気生理学専門医、心臓外科医、心臓専門医、認定看護助手、臨床心臓電気生理学の専門家、臨床神経生理学の専門家、臨床専門看護師、結腸直腸外科医、救急医療の専門家、救急医療の専門家、歯科衛生士、歯科医、皮膚科医、救急医療技師、緊急事態内科医、胃腸外科医、血液専門医、ホスピスケアおよび緩和医療の専門家、ホメオパシーの専門家、感染症の専門家、内科医、顎顔面外科医、医療助手、医学検査官、遺伝学者、腫瘍内科医、助産師、新生児周産期の専門家、腎臓科医、神経科医、脳神経外科医、核医学の専門家、看護師、ナース・プラクティショナー、産科医、腫瘍医、口腔外科医、歯科矯正医、整形外科の専門家、疼痛管理の専門家、病理学者、小児科医、灌流士、歯周病専門医、形成外科医、足病医、肛門科医、補綴専門医、精神科医、呼吸器専門医、放射線科医、外科医、胸部専門医、移植専門医、血管専門医、血管外科医、および獣医。本発明のアレイおよび方法で同定された診断は、対象の医療記録に組み込むことができる。
【０１４９】
アレイプラットフォーム
いくつかの実施形態において、化学ライブラリー合成の多様性および忠実度の増加を可能にするアレイプラットフォームを提供する方法およびプロセスが、本願明細書に開示される。アレイプラットフォームは、アレイの表面上の複数の個々の特徴を含む。各特徴は、通常、アレイの表面上でｉｎ  ｓｉｔｕで任意に合成される複数の個々の分子を含み、分子は特徴内で同一であるが、分子の配列または同一性は特徴間で異なる。アレイ分子は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む）、ペプチド、ペプチド模倣体、およびそれらの組み合わせなどを含むが、これらに限定されず、ここでアレイ分子は分子内に天然または非天然１量体を含んでもよい。かかるアレイ分子は、大きな合成ペプチドアレイの合成を含む。いくつかの実施形態において、アレイ内の分子はミモトープ、エピトープの構造を模倣する分子であり、エピトープ誘発抗体に結合することができる。いくつかの実施形態において、アレイ内の分子は、抗原のエピトープに結合する抗体（またはＴ細胞受容体）の可変領域内の部位を含むパラトープまたはパラトープ模倣物である。いくつかの実施形態において、本発明のアレイは、ランダム、擬似ランダム、または最大限に多様なペプチド配列を含むペプチドアレイである。
【０１５０】
ペプチドアレイは、十分に特徴付けられたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のエピトープと一致する制御配列を含むことができる。制御配列およびライブラリーペプチドへの結合パターンを測定して、アレイおよび免疫標識アッセイプロセスを修飾できる。既知のエピトープを有するｍＡｂ  ４Ｃ１、ｐ５３Ａｂ１、ｐ５３Ａｂ８およびＬｎＫＢ２は、異なる用量でアッセイできる。さらに、測定の精度は、異なるウェーハからのアレイ上で、試料、例えば血漿試料の複製物をテストすること、および全てのライブラリーペプチドに対する変動係数（ＣＶ）を計算することにより、決定できる。結合シグナルの測定の精度は、同じバッチのウェーハ上（ウェーハバッチ内）で合成されたアレイで行われたアレイ間、スライド間、ウェーハ間および日内変動の集合として決定できる。さらに、異なるバッチのウェーハ上のアレイ（ウェーハバッチ間）の測定精度を決定できる。いくつかの実施形態において、結合シグナルの測定は、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、または３０％未満で変動する精度でウェーハバッチ内および／またはウェーハバッチ間で行うことができる。
【０１５１】
本願明細書に開示される技術は、半導体製造プロセスおよびコンビナトリアル化学合成を組み合わせて、シリコンウェーハ上にアレイベースのライブラリーを製造するフォトリソグラフィーアレイ合成プラットフォームを含む。フォトリソグラフィーにより形成されたパターニングの驚異的な進歩を利用することにより、アレイ合成プラットフォームは非常にスケーラブルであり、８インチウェーハ上に４，０００万個の特徴を備えたコンビナトリアルケミカルライブラリーを製造できる。フォトリソグラフィーアレイ合成は、高い再現性を達成するために、クラス１０，０００クリーンルーム内で半導体ウェーハ製造装置を使用して実行される。ウェーハを標準の顕微鏡スライド寸法にさいの目状に切ると、各スライドは３００万を超える異なる化学物質を含有する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本願明細書に開示されるフォトリソグラフィー技術により製造される化学ライブラリーを有するアレイは、例えば免疫標識アッセイと呼ばれる免疫ベースの診断アッセイに使用される。アレイに結合した一滴の血液から得た患者の抗体レパートリーを使用して、結合したアレイの蛍光結合プロファイル画像は、疾患と健康を分類するのに十分な情報を提供する。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、免疫疾患アッセイは、感染症を診断／モニターし、感染治療に対する応答を評価する臨床応用のために開発されている。免疫標識アッセイの例示的な実施形態は、「Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」と題する米国付与前公開番号２０１２／０１９０５７４および「Ｉｍｍｕｎｏｓｉｇｎａｔｕｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐａｔｈ  ｔｏ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」と題する米国付与前公開番号２０１４／００８７９６３に詳細に記載される。両方ともかかる開示のために参照により本願明細書に組み込まれる。ここで開発されたアレイは、エリプソメトリー、質量分析、蛍光などの直交分析法を使用して、各合成アレイ内に分析測定能力を組み込む。これらの測定により、アレイ合成性能の長期的な定性的および定量的評価が可能になる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、アレイは、スケーラブルな数の組み合わせ配列ペプチドのアレイを得るために再利用可能なマスクおよび自動化を使用して製造された、ウェーハベースのフォトリソグラフィックなｉｎ  ｓｉｔｕペプチドアレイである。いくつかの実施形態において、ペプチドアレイは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも４，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００以上の異なる配列を有するペプチドを含む。異なる配列ペプチドのそれぞれの複数のコピーは、特徴として知られるアドレス可能な場所でウェーハ上に配置することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ペプチドアレイ上の抗体結合の検出は、本願明細書に開示される技術により対処することができるいくつかの課題を提起する。したがって、いくつかの実施形態において、本願明細書に開示されるアレイおよび方法は、免疫標識アッセイを実行するために必要な所望の特性を調整できるアレイの表面上の特定のコーティングおよび官能基密度を利用する。例えば、シリコン表面を適度に親水性の単層ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルデキストラン、およびそれらの組み合わせでコーティングすることにより、ペプチドアレイ上の非特異的抗体結合を最小限に抑えることができる。いくつかの実施形態において、親水性単層は均質である。第二に、合成されたペプチドは、ペプチドを表面から遠ざけるスペーサーを使用してシリコン表面に結合され、該ペプチドは、妨げられていない方向で抗体に提示される。
【０１５６】
ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されたペプチドライブラリーは、疾患にとらわれず、診断しようとする疾患を先験的に認識せずに合成することができる。同一のアレイを使用して、健康状態を決定できる。
【０１５７】
本願明細書で使用される「ペプチド」なる語は、直鎖または環状鎖で一緒に結合された複数のアミノ酸を指す。本発明の目的のために、ペプチドなる語は、特定の数のアミノ酸に限定されない。しかしながら、好ましくは、それらは、最大約４００個のアミノ酸、最大約３００個のアミノ酸、最大約２５０個のアミノ酸、最大約１５０個のアミノ酸、最大約７０個のアミノ酸、最大約５０個のアミノ酸、最大約４０個のアミノ酸、最大３０個のアミノ酸、最大２０個のアミノ酸、最大１５個のアミノ酸、最大１０個のアミノ酸、または最大５個のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態において、アレイのペプチドは、５〜３０個のアミノ酸、５〜２０個のアミノ酸、または５〜１５個のアミノ酸である。ペプチド分子の全部または一部を形成するアミノ酸は、２０個の従来の天然アミノ酸、すなわちアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）のいずれかであってもよい。本発明のアレイを形成するペプチド中のアミノ酸のいずれかは、従来とは異なるアミノ酸で置き換えられてもよい。一般に、保存的な置換が優先される。いくつかの実施形態において、アレイ上のペプチドは、２０個未満のアミノ酸から合成される。いくつかの実施形態において、ペプチドの合成中に、アミノ酸メチオニン、システイン、イソロイシンおよびトレオニンの１つ以上が除外される。
【０１５８】
デジタル処理装置
いくつかの実施形態において、本願明細書に記載されるシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワーク、および方法は、デジタル処理装置、またはその使用を含む。さらなる実施形態において、デジタル処理装置は、１つ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）、すなわち装置の機能を実行するプロセッサを含む。さらなる実施形態において、デジタル処理装置は、実行可能な命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムをさらに備える。いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、所望によりコンピューターネットワークに接続される。さらなる実施形態において、デジタル処理装置は、所望により、ワールドワイドウェブにアクセスするようにインターネットに接続される。さらに別の実施形態において、デジタル処理装置は、所望によりクラウドコンピューティングインフラストラクチャーに接続される。他の実施形態において、デジタル処理装置は、所望によりイントラネットに接続される。他の実施形態において、デジタル処理装置は、所望によりデータ記憶装置に接続される。
【０１５９】
本願明細書の説明によれば、適切なデジタル処理装置は、非限定的な例として、サーバーコンピューター、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、ノートブックコンピューター、サブノートブックコンピューター、ネットブックコンピューター、ネットパッドコンピューター、セットトップコンピューター、ハンドヘルドコンピューター、インターネット機器、モバイルスマートフォン、タブレットコンピューター、携帯情報端末、ビデオゲームコンソール、通信手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含む。当業者は、多くのスマートフォンが本願明細書に記載のシステムでの使用に適していることを認識するだろう。当業者は、オプションのコンピューターネットワーク接続性を備えた選択されたテレビ、ビデオプレーヤー、およびデジタル音楽プレーヤーが、本願明細書に記載されるシステムでの使用に適していることも認識するだろう。適切なタブレットコンピューターは、当業者に知られている小冊子、スレート、およびコンバーチブル構成を備えたものを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、実行可能な命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、例えば、装置のハードウェアを管理し、アプリケーションの実行サービスを提供する、プログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適切なサーバーオペレーティングシステムが、非限定的な例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳ  ＸＳｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、ＷｉｎｄｏｗｓＳｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）を含むことを認識するだろう。当業者は、適切なパーソナルコンピューターオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳＸ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、およびＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸ様オペレーティングシステムを含むことを認識するだろう。いくつかの実施形態において、オペレーティングシステムはクラウドコンピューティングにより提供される。当業者はまた、適切なモバイルスマートフォンオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎ  Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＷｉｎｄｏｗｓＰｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＷｉｎｄｏｗｓＭｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）を含むことも認識するだろう。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、ストレージおよび／またはメモリ装置を含む。ストレージおよび/またはメモリ装置は、データまたはプログラムを一時的または永続的に保存するために使用される１つ以上の物理的装置である。いくつかの実施形態において、装置は揮発性メモリであり、保存された情報を維持するために電力を必要とする。いくつかの実施形態において、装置は不揮発性メモリであり、デジタル処理装置に電力が供給されていないときに保存された情報を保持する。さらなる実施形態において、不揮発性メモリはフラッシュメモリを含む。一部の実施形態において、不揮発性メモリは、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。他の実施形態において、装置は、非限定的な例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースのストレージを含むストレージ装置である。さらなる実施形態において、ストレージおよび／またはメモリ装置は、本願明細書に開示されているような装置の組み合わせである。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、視覚情報をユーザーに送信するディスプレイを含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイは陰極線管（ＣＲＴ）である。いくつかの実施形態において、ディスプレイは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。さらなる実施形態において、ディスプレイは薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）である。いくつかの実施形態において、ディスプレイは有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。種々のさらなる実施形態において、ＯＬＥＤディスプレイ上には、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイがある。いくつかの実施形態において、ディスプレイはプラズマディスプレイである。他の実施形態において、ディスプレイはビデオプロジェクタである。さらに別の実施形態において、ディスプレイは、本願明細書に開示されているような装置の組み合わせである。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、ユーザーから情報を受信するための入力装置を含む。いくつかの実施形態において、入力装置はキーボードである。いくつかの実施形態において、入力装置は、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラー、またはスタイラスを含むポインティング装置である。いくつかの実施形態において、入力装置はタッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の実施形態において、入力装置は、音声または他の音声入力をキャプチャするためのマイクである。他の実施形態において、入力装置は、動きまたは視覚入力をキャプチャするビデオカメラである。さらに別の実施形態において、入力装置は、本願明細書に開示されているような装置の組み合わせである。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置はデジタルカメラを含む。いくつかの実施形態において、デジタルカメラはデジタル画像をキャプチャする。いくつかの実施形態において、デジタルカメラはオートフォーカスカメラである。いくつかの実施形態において、デジタルカメラは電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラである。さらなる実施形態において、デジタルカメラはＣＣＤビデオカメラである。他の実施形態において、デジタルカメラは相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）カメラである。いくつかの実施形態において、デジタルカメラは静止画像をキャプチャする。他の実施形態において、デジタルカメラはビデオ画像をキャプチャする。異なる実施形態において、適切なデジタルカメラは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、およびそれを超えるメガピクセルカメラ（増分を含む）を含む。いくつかの実施形態において、デジタルカメラは標準解像度カメラである。他の実施形態において、デジタルカメラはＨＤビデオカメラである。さらなる実施形態において、ＨＤビデオカメラは、少なくとも約１２８０×約７２０ピクセルまたは少なくとも約１９２０×約１０８０ピクセルの画像をキャプチャする。いくつかの実施形態において、デジタルカメラはカラーデジタル画像をキャプチャする。他の実施形態において、デジタルカメラはグレースケールデジタル画像をキャプチャする。異なる実施形態において、デジタル画像は、任意の適切なデジタル画像形式で保存される。適切なデジタル画像形式は、非限定的な例として、Ｊｏｉｎｔ  Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｅｘｐｅｒｔｓ  Ｇｒｏｕｐ（ＪＰＥＧ）、ＪＰＥＧ  ２０００、Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ  ｉｍａｇｅ  ｆｉｌｅ  ｆｏｒｍａｔ（Ｅｘｉｆ）、Ｔａｇｇｅｄ  Ｉｍａｇｅ  Ｆｉｌｅ  Ｆｏｒｍａｔ（ＴＩＦＦ）、ＲＡＷ、Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ（ＰＮＧ）、グラフィックスインターチェンジ形式（ＧＩＦ）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ビットマップ（ＢＭＰ）、ポータブルピックスマップ（ＰＰＭ）、ポータブルグレーマップ（ＰＧＭ）、ポータブルビットマップファイル形式（ＰＢＭ）、およびＷｅｂＰを含む。異なる実施形態において、デジタル画像は、任意の適切なデジタルビデオ形式で保存される。適切なデジタルビデオ形式は、非限定的な例として、ＡＶＩ、ＭＰＥＧ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ（登録商標）、ＭＰ４、ＡＶＣＨＤ（登録商標）、ＷｉｎｄｏｗｓＭｅｄｉａ（登録商標）、ＤｉｖＸTM、Ｆｌａｓｈ  Ｖｉｄｅｏ、Ｏｇｇ  Ｔｈｅｏｒａ、ＷｅｂＭ、およびＲｅａｌＭｅｄｉａを含む。
【０１６５】
非一時的コンピューター可読記憶媒体
いくつかの実施形態において、本願明細書で開示されるシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワーク、および方法は、任意にネットワーク化されたデジタル処理装置のオペレーティングシステムにより実行可能な命令を含むプログラムでエンコードされた１つ以上の非一時的コンピューター可読記憶媒体を含む。さらなる実施形態において、コンピューター可読記憶媒体は、デジタル処理装置の有形のコンポーネントである。さらに別の実施形態において、コンピューター可読記憶媒体は、所望によりデジタル処理装置から取り外し可能である。いくつかの実施形態において、コンピューター可読記憶媒体は、非限定的な例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどを含む。場合によっては、プログラムおよび命令は、メディア上に永続的、実質的に永続的、半永続的、または非一時的にエンコードされる。
【０１６６】
コンピュータープログラム
いくつかの実施形態において、本願明細書で開示されるシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワーク、および方法は、少なくとも１個のコンピュータープログラムを含む。コンピュータープログラムは、指定されたタスクを実行するように記述された、デジタル処理装置のＣＰＵで実行可能な一連の命令を含む。本願明細書に提供される開示に照らして、当業者は、コンピュータープログラムが種々の言語の種々のバージョンで書かれ得ることを認識するだろう。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは命令の１個のシーケンスを含む。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、命令の複数のシーケンスを含む。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは１個の場所から提供される。他の実施形態において、コンピュータープログラムは複数の場所から提供される。種々の実施形態において、コンピュータープログラムは１つ以上のソフトウェアモジュールを含む。種々の実施形態において、コンピュータープログラムは、部分的または全体的に、１つ以上のウェブアプリケーション、１つ以上のモバイルアプリケーション、１つ以上のスタンドアロンアプリケーション、１つ以上のウェブブラウザプラグイン、拡張、アドイン、またはアドオン、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１６７】
ウェブアプリケーション
いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムはウェブアプリケーションを含む。本願明細書に提供される開示に照らして、当業者は、ウェブアプリケーションが、種々の実施形態において、１つ以上のソフトウェアフレームワークおよび１つ以上のデータベースシステムを利用することを認識するだろう。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）．ＮＥＴまたはＲｕｂｙ  ｏｎ  Ｒａｉｌｓ（ＲｏＲ）などのソフトウェアフレームワーク上に作成される。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、非限定的な例として、リレーショナル、非リレーショナル、オブジェクト指向、連想、およびＸＭＬデータベースシステムを含む１つ以上のデータベースシステムを利用する。さらなる実施形態において、適切なリレーショナルデータベースシステムは、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒ、ｍｙＳＱＬＴＭ、およびＯｒａｃｌｅ（登録商標）を含む。当業者はまた、ウェブアプリケーションが、種々の実施形態において、１つ以上の言語の１つ以上のバージョンで書かれていることを認識するだろう。ウェブアプリケーションは、１つ以上のマークアップ言語、プレゼンテーション定義言語、クライアント側スクリプト言語、サーバー側コーディング言語、データベース照会言語、またはそれらの組み合わせで記述できる。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、ハイパーテキストマークアップ言語（ＨＴＭＬ）、拡張可能なハイパーテキストマークアップ言語（ＸＨＴＭＬ）、または拡張可能なマークアップ言語（ＸＭＬ）などのマークアップ言語である程度記述される。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ｃａｓｃａｄｉｎｇ  Ｓｔｙｌｅ  Ｓｈｅｅｔｓ（ＣＳＳ）などのプレゼンテーション定義言語である程度書かれている。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ  ａｎｄ  ＸＭＬ（ＡＪＡＸ）、Ｆｌａｓｈ（登録商標）Ａｃｔｉｏｎｓｃｒｉｐｔ、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、またはＳｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）などのクライアント側スクリプト言語である程度記述される。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｐａｇｅ（ＡＳＰ）、ＣｏｌｄＦｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａTM、ＪａｖａＳｅｒｖｅｒ  Ｐａｇｅｓ（ＪＳＰ）、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰＨＰ）、ＰｙｔｈｏｎTM、Ｒｕｂｙ、Ｔｃｌ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、ＷｅｂＤＮＡ（登録商標）、またはＧｒｏｏｖｙなどのサーバー側コーディング言語である程度記述される。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｑｕｅｒｙ  Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＳＱＬ）などのデータベース照会言語である程度書かれている。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、ＩＢＭ（登録商標）ＬｏｔｕｓＤｏｍｉｎｏ（登録商標）などのエンタープライズサーバー製品を統合する。いくつかの実施形態において、アーティストが情報およびメディアファイルをアップロードできるようにする���ーティストのためのキャリア開発ネットワークを提供するウェブアプリケーションは、メディアプレーヤー要素を含む。種々のさらなる実施形態において、メディアプレーヤー要素は、非限定的な例として、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（登録商標）、ＨＴＭＬ  ５、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｓｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）、ＪａｖａTM、およびＵｎｉｔｙ（登録商標）を含む、多くの適したマルチメディア技術の１つ以上を利用する。
【０１６８】
モバイルアプリ
いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、モバイルデジタル処理装置に提供されるモバイルアプリケーションを含む。いくつかの実施形態において、モバイルアプリケーションは、製造時にモバイルデジタル処理装置に提供される。他の実施形態において、モバイルアプリケーションは、本願明細書に記載されるコンピューターネットワークを介してモバイルデジタル処理装置に提供される。
【０１６９】
本願明細書に提供される開示に鑑みて、モバイルアプリケーションは、当技術分野で知られているハードウェア、言語、および開発環境を使用して、当業者に知られている技法により作成される。当業者は、モバイルアプリケーションがいくつかの言語で書かれていることを認識するだろう。適切なプログラミング言語は、非限定的な例として、ＣＳＳありまたはなしの、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、ＪａｖａTM、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、Ｐａｓｃａｌ、Ｏｂｊｅｃｔ  Ｐａｓｃａｌ、ＰｙｔｈｏｎTM、Ｒｕｂｙ、ＶＢ．ＮＥＴ、ＷＭＬ、およびＸＨＴＭＬ／ＨＴＭＬ、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１７０】
適切なモバイルアプリケーション開発環境は、いくつかのソースから利用可能である。市販の開発環境は、非限定的な例として、ＡｉｒｐｌａｙＳＤＫ、ａｌｃｈｅＭｏ、Ａｐｐｃｅｌｅｒａｔｏｒ（登録商標）、Ｃｅｌｓｉｕｓ、Ｂｅｄｒｏｃｋ、Ｆｌａｓｈ  Ｌｉｔｅ、．ＮＥＴ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、Ｒｈｏｍｏｂｉｌｅ、ＷｏｒｋＬｉｇｈｔ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを含む。非限定的な例として、  Ｌａｚａｒｕｓ、ＭｏｂｉＦｌｅｘ、ＭｏＳｙｎｃ、Ｐｈｏｎｅｇａｐなどの他の開発環境が無料で利用可能である。また、モバイル装置メーカーは、非限定的な例として、ｉＰｈｏｎｅおよびｉＰａｄ（ｉＯＳ）ＳＤＫ、ＡｎｄｒｏｉｄTMＳＤＫ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ＳＤＫ、ＢＲＥＷ  ＳＤＫ、Ｐａｌｍ（登録商標）ＯＳ  ＳＤＫ、Ｓｙｍｂｉａｎ  ＳＤＫ、ｗｅｂＯＳ  ＳＤＫ、およびＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ  ＳＤＫを含むソフトウェア開発者キットを配布する。
【０１７１】
当業者は、非限定的な例として、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ａｐｐ  Ｓｔｏｒｅ、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）Ｍａｒｋｅｔ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ａｐｐ  Ｗｏｒｌｄ、Ｐａｌｍ装置用Ａｐｐ  Ｓｔｏｒｅ、ｗｅｂＯＳ用アプリカタログ、モバイル用Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ、Ｎｏｋｉａ（登録商標）装置用Ｏｖｉ  Ｓｔｏｒｅ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ａｐｐ、およびＮｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）ＤＳｉ  Ｓｈｏｐを含むモバイルアプリケーションの配布にいくつかの商業フォーラムが利用可能であることを認識するだろう。
【０１７２】
スタンドアロンアプリケーション
いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムはスタンドアロンアプリケーションを含み、これは既存のプロセスへのアドオンではなく、例えばプラグインではなく、独立したコンピュータプロセスとして実行されるプログラムである。当業者は、スタンドアロンアプリケーションがしばしば編集されることを認識するだろう。コンパイラは、プログラミング言語で記述されたソースコードを、アセンブリ言語またはマシンコードなどのバイナリオブジェクトコードに変換するコンピュータープログラムである。適切な編集済みプログラミング言語は、非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、ＣＯＢＯＬ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｅｉｆｆｅｌ、ＪａｖａTM、Ｌｉｓｐ、ＰｙｔｈｏｎTM、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、ＶＢ  ．ＮＥＴ、またはそれらの組み合わせを含む。実行可能なプログラムを作成するために、少なくとも部分的に、編集がしばしば実行される。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、１つ以上の実行可能な編集済みアプリケーションを含む。
【０１７３】
ソフトウェアモジュール
本願明細書に開示されるシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワーク、および方法は、種々の実施形態において、ソフトウェア、サーバー、およびデータベースモジュールを含む。本願明細書に提供される開示を考慮して、ソフトウェアモジュールは、当技術分野で知られている機械、ソフトウェア、および言語を使用して、当業者に知られている技法により作成される。本願明細書で開示されるソフトウェアモジュールは、多数の方法で実装される。種々の実施形態において、ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードのセクション、プログラミングオブジェクト、プログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。さらに種々の実施形態において、ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、複数のコードセクション、複数のプログラミングオブジェクト、複数のプログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。種々の実施形態において、１つ以上のソフトウェアモジュールは、非限定的な例として、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、およびスタンドアロンアプリケーションを含む。いくつかの実施形態において、ソフトウェアモジュールは１個のコンピュータープログラムまたはアプリケーションにある。他の実施形態において、ソフトウェアモジュールは、複数のコンピュータープログラムまたはアプリケーションにある。いくつかの実施形態において、ソフトウェアモジュールは１つのマシンでホストされる。他の実施形態において、ソフトウェアモジュールは複数のマシンでホストされる。さらなる実施形態において、ソフトウェアモジュールはクラウドコンピューティングプラットフォーム上でホストされる。いくつかの実施形態において、ソフトウェアモジュールは、１個の場所の１つ以上のマシンでホストされる。他の実施形態において、ソフトウェアモジュールは、１つ以上の場所にある１つ以上のマシンでホストされる。
【０１７４】
本発明は、特許請求される本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の実施例においてさらに詳細に説明される。添付の図は、本発明の仕様および説明の不可欠な部分と見なされることを意図している。以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、特許請求される発明を限定するものではない。
【０１７５】
実施例
実施例１−感染症の診断のための免疫学的方法
以下に従って、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ感染を検出および差別化するために、免疫標識アッセイを開発した。
【０１７６】
ドナー試料。年齢および性別が一致した健康なドナー血漿とともに血清学的にシャーガス抗体陽性のドナー血漿試料、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）または西ナイルウイルス（ＷＮＶ）（ＷＮＶ）に対して血清陽性であるテストした血漿試料を、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｔｅｍｐｅ,ＡＺ）から得た。１つは２０１５年、第２セットは２０１６年のものである、試料の２個のコホートを得た。受け取り次第、血漿を解凍し、凍結防止剤としてエチレングリコールと１：１で混合し、１回使用量に分注した。使い捨てのアリコートを、必要になるまで−２０℃で保存した。残りの試料量を、−８０℃でそのまま保存した。全ての試料のＩＤを、２Ｄバーコード付きチューブ（Ｍｉｃｒｏｎｉｃ，Ｌｅｙｓｔａｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して追跡した。アッセイの準備として、試料アリコートを氷上で４℃に温め、一次インキュベーションバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）および１％マンニトールを含むリン酸緩衝生理食塩水）で１：１００に希釈した。次いで、アッセイで使用するために、１：１００希釈液を含有するマイクロタイタープレートを、１：６２５に希釈した。ウェーハロット全体のプラットフォーム性能を評価するために選択した試料のサブセットについて、１：１００希釈液を使い捨てマイクロタイタープレートに分注し、−８０°Ｃで保存した。全ての分注および希釈工程を、ＢＲＡＶＯロボットピペッティングステーション（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して実行した。未同定の預けられた試料を使用する全ての手順を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（プロトコル番号２０１５２８１６）により見直した。
【０１７７】
アレイ。９個の残基の中央値長を有し、５から１３個のアミノ酸の範囲の１２６，００９個のペプチドのコンビナトリアルライブラリーを、１６個のアミノ酸の可能な４量体の９９．９％および全ての可能な５量体の４８．３％を含むように設計した（メチオニン、Ｍ；システイン、Ｃ；イソロイシン、Ｉ；およびスレオニン、Ｔを除外した）。これらを、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基ペプチド化学に適合した標準的な半導体フォトリソグラフィーツールを使用して、２００ｍｍの酸化ケイ素ウェーハ上で合成した（Legutki JB et al., Nature Communications. 2014;5:4785）。簡単に言えば、アミノシランで官能化されたウェーハを、ＢＯＣ−グリシンでコーティングした。次に、ＵＶ光により活性化される光酸発生剤を含有するフォトレジストを、スピンコーティングによりウェーハに塗布した。フォトマスクを介してウェーハをＵＶ光（３６５ｎｍ）に露光すると、所定のマスクを使用してウェーハ上のどの特徴を露光するかの固定選択が可能になる。ＵＶ光への暴露後、ウェーハを加熱し、暴露された特徴のＢＯＣ脱保護が可能になった。その後の洗浄、その後の活性化アミノ酸の適用により、サイクルを完了する。各サイクルで、アレイ上の特定の場所にあるペプチドのＮ末端に特定のアミノ酸を追加した。コンビナトリアルペプチドライブラリーを実現するために、これらのサイクルを繰り返し、マスクおよびアミノ酸の結合を変化させた。各ウェーハを、標準的な顕微鏡スライドの寸法を有する１３個の長方形の領域に、さいの目状に切った。完成した各ウェーハを、標準の顕微鏡スライド（２５ｍｍＸ７５ｍｍ）の寸法で、１３個の長方形の領域にさいの目状に切った。これらの各スライドは、８行３列の２４個の配列を含有していた。最後に、標準的なカクテルを使用して、いくつかのアミノ酸の側鎖の保護基を除去した。完成したスライドを、必要になるまで乾燥窒素環境で保存した。多数の品質テストを実行し、各工程での３σ統計限界の使用を含むプロセス仕様内でアレイが製造されていることを確認する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによりウェーハバッチを断続的にサンプリングし、各アミノ酸が正しい工程で結合されたことを同定し、コンビナトリアル合成を構成する個々の工程が正しいことを確認する。ウェーハ製造を、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃで記述され、ＳＱＬバックエンドを備えたアクセスフロントエンドを有する電子カスタムリレーショナルデータベースを介して、最初から最後まで追跡する。フロントエンドのユーザーインターフェイスにより、操作者はデータベースに製造情報を簡単に入力できる。ＳＱＬバックエンドを使用すると、データベースを簡単にバックアップし、必要に応じて他のコンピューターシステムと統合してデータを共有できる。通常、追跡されるデータは、化学物質、レシピ、時間、および技術者がタスクを実行することを含む。ウェーハを製造した後、データを見直し、記録をロックして保存する。最後に、以下で説明するように、各ロットを結合アッセイにおいて評価して性能を確認する。
【０１７８】
血漿アッセイ。製造品質の製造されたマイクロアレイを得、そして使用前に蒸留水に１時間、ＰＢＳに３０分間、一次インキュベーションバッファー（ＰＢＳＴ、１％マンニトール）に１時間浸漬して再水和した。スライドを、ＡｒｒａｙＩｔマイクロアレイカセット（ＡｒｒａｙＩｔ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にロードして、個々のマイクロアレイをマイクロタイタープレートのフットプリントに適合させた。液体ハンドラーを使用して、９０μｌの各試料を、一次インキュベーションバッファー（ＰＢＳＴ、１％マンニトール）で１：６２５に希釈して調製し、カセットに移した。該混合物を、アレイ上で３７℃で１時間インキュベートし、ＴｅｌｅＳｈａｋｅ９５（ＩＮＨＥＣＯ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で混合して、抗体−ペプチド結合を促進した。インキュベーション後、ＢｉｏＴｅｋ  ４０５ＴＳ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、カセットをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に結合した４．０ｎＭヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、またはＤｙＬｉｇｈｔ５５０（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）に結合した４．０ｎＭヤギ抗ヒトＩｇＡを使用して、結合抗体を検出した）ＴｅｌｅＳｈａｋｅ９５プラットフォームミキサーで混合しながら３７℃で１時間、二次インキュベーションバッファー（ＰＢＳＴ中０．５％カゼイン）で二次とのインキュベーション後、スライドを再度ＰＢＳＴで洗浄し、続いて蒸留水で洗浄し、カセットから取り出し、イソプロパノールを噴霧し、遠心乾燥した。各アドレス可能なペプチドの特徴の相対的な蛍光値を決定することにより、定量的なシグナル測定値を得た。別に、ＥＬＩＳＡを行って、抗ＩｇＧおよび抗ＩｇＡ二次抗体産物間の交差反応性を評価した。ＩｇＡモノクローナルに対する抗ＩｇＧ産物について、低レベルの交差反応性を認めた。ＩｇＧモノクローナルに対する抗ＩｇＡ産物の反応性を見出さなかった。
【０１７９】
モノクローナルアッセイ。ドナー血漿でＩＳＴアッセイを実施する前に、各ｍＡｂの確立されたエピトープ配列に対応する、制御ペプチドに対する市販のマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合活性を評価した。ＩＳＴアレイを、一次インキュベーションバッファー（１％マンニトール、ＰＢＳＴ）中の抗体クローン４Ｃ１（Ｇｅｎｗａｙ）、ｐ５３Ａｂ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｐ５３Ａｂ８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびＬｎｋＢ２（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）をそれぞれ２．０ｎＭで３回プローブした。二次インキュベーションおよびシグナルの定量化は、上記と同じであった。
【０１８０】
データ収集。５３２ｎｍレーザーおよび５７２ｎｍ  ＢＰ  ３４フィルター（Ｉｎｎｏｐｓｙｓ，Ｃａｒｂｏｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を取り付けたＩｎｎｏｐｓｙｓ  ９１０ＡＬマイクロアレイスキャナーを使用して、アッセイしたマイクロアレイを画像化した。Ｍａｐｉｘソフトウェアアプリケーション（バージョン７．２．１）は、自動グリッディングアルゴリズムを使用して、各ペプチド特徴に関連付けられた画像の領域を同定した。各ペプチド特徴のピクセル強度の中央値を、タブ区切りのテキストファイルとして保存し、分析のためにデータベースに保存した。
【０１８１】
データ分析。均一な値１００を追加して等分散性を改善した後、中央値の特徴強度をｌｏｇ１０に変換した。各アレイの強度を、そのアレイのコンビナトリアルライブラリー機能の強度の中央値を差し引くことにより正規化した。
【０１８２】
モノクローナルアッセイにおいて、その同族エピトープへの各モノクローナルの選択的結合を、以下のように計算されるＺスコアを使用して評価した：
【数２】
2020511633.tif 000004
ここで、ＩｍＡｂおよびＩ２ｏは、それぞれモノクローナル抗体または二次抗体のみの存在下での形質転換ペプチドの強度である。ｍＡｂの１個のエピトープを含有する各ペプチドへの結合を、４つ全てのｍＡｂで測定した。
【０１８３】
ＩＳＴアッセイにおいて、蛍光シグナルを定量化することにより、各特徴への血漿抗体の結合を測定した。群間で異なるシグナルを示したペプチドの特徴を、不等分散のウェルチ調整を伴う平均ペプチド強度のｔ検定により決定した。２１０５年シャーガスコホートについて、シャーガス血清陽性ドナー（ｎ＝１４６）と血清陰性ドナー（ｎ＝１８９）とを比較し、シグナルが有意に異なるペプチドを同定した。シャーガスを他の感染症と識別できるペプチドの第２セットを、標準血液パネルテストアルゴリズムにより、シャーガス血清陽性ドナー（ｎ＝８８）と、ＨＣＶ（ｎ＝７１）、ＨＢＶ（ｎ＝８８）またはＷＮＶ（ｎ＝８８）陽性のシャーガス血清陰性ドナーとの間の平均強度を比較することにより同定した。多重度（すなわち、ｐ＜４ｅ−７）にボンフェローニ調整を適用した後、偽陽性の５％のしきい値に基づいて、有意な識別を示すペプチドを同定した。さらに、３個のＴ．ｃｒｕｚｉ  ＥＬＩＳＡアッセイからのカットオフ値（Ｓ／ＣＯ）の中央値シグナルに対するシャーガス陽性ドナーの変換ペプチド強度のピアソン相関を計算した。また、Ｓ／ＣＯに相関するペプチドを、２０１５年コホート内で、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Benjamini Y and Hochberg Y [1995] Journal of the Royal Statistical Society, Series B 57: 289-300）による１０％の誤発見率基準を使用して同定した。
【０１８４】
クラシファイアーを構築するために、特徴を、シャーガス陽性ドナーとシャーガス陰性ドナーとを比較するウェルチのｔ検定に関連するｐ値に基づいて、またはマルチ疾患モデルにおける異なる疾患タイプ間で、シャーガス陽性を他の試料から識別する能力について、ランク付けした。選択されたペプチドの数を５から４０００個の特徴の間で段階的に変化させ、選択された各特徴を、線形カーネルおよび０．０１のコストパラメーターを用いてサポートベクターマシン(Cortes C, and Vapnik V. Machine Learning. 1995;20(3):273-97)に入力し、クラシファイアーを訓練する。１００回繰り返される４重または５重交差検証を使用して、モデルの性能を定量化し、受信者操作特性曲線（ＡＵＣ）の誤差として推定し、バイアスを回避するために機能選択およびクラシファイアー開発の両方を組み込んだ。
【０１８５】
最後に、固定ＳＶＭクラシファイアーを、それらのｔ検定ｐ値により選択された交差検証の下での性能に基づく特徴の最適数を使用して２０１５年コホートに適合させた。該モデルを、プラットフォームの精度と再現性の評価に使用し、交差検証分析の独立した検証テストとして２０１６年コホートでも評価した。
【０１８６】
全ての分析を、Ｒバージョン３．２．５ (Team RC. R: 統計コンピューティングのための言語および環境。R Foundation for Statistical Computing Vienna 2016。https://www.R-project.org/から入手可能)を使用して実行した。
【０１８７】
ペプチドアラインメントスコアリング。ライブラリーペプチドを、Ｔ．ｃｒｕｚｉ  ＣＬ  Ｂｅｎｅｒプロテオームに合わせた[Sodre CL et al., (2009) Arch Microbiol 191: 177-184]。アラインメントアルゴリズムを、修正ＢＬＡＳＴ戦略[Altschul SF and Gish W (1996) Methods Enzymol 266: 460-480]を使用し、３個のアミノ酸のシード、４個のアミノ酸のギャップペナルティー、およびＢＬＯＳＵＭ６２のスコアリングマトリックス[Henikoff  and, Henikoff JG (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 10915-10919]アレイのアミノ酸組成を反映するように修正した[States DJ et al., (1991) Methods 3: 66-70]。これらの修正は、類似の置換のスコアを増価させ、配列にないアミノ酸のペナルティーを削除し、そして全ての完全一致を等しくスコア付けする。
【０１８８】
一連の分類ライブラリーペプチド、すなわち識別ペプチドのタンパク質に対するアラインメントスコアを生成するために、正のＢＬＡＳＴスコアを生じるものを、合わされたペプチドに対応する各行、およびタンパク質の配列内のアミノ酸の１つに対応する各列を有するマトリックスに組み立てる。タンパク質とのアラインメントのために、ペプチド列内のギャップおよび削除を許可する。このようにして、マトリックス内の各位置は、ペプチドおよびタンパク質の合わされたアミノ酸に関連付けられたスコアを受け取る。次に、タンパク質のアミノ酸に対応する各列を合計して、オーバーラップスコアを作成する。これは、分類ペプチドによるそのアミノ酸位置のカバレッジを表す。ライブラリー構成の該スコアを修正するために、全ての配列ペプチドのリストに対して同一の方法を使用して、別のオーバーラップスコアを計算する。これは、以下の方程式を介して、各アミノ酸位置でのペプチド重複差スコアｓの計算を可能にする：
【数３】
2020511633.tif 000005
【０１８９】
該方程式において、aは識別ペプチドからの重複スコア、bは識別ペプチドの数、cはペプチドの完全なライブラリーの重複スコア、dはライブラリー内のペプチドの数である。
【０１９０】
（アミノ酸レベルでの）これらのスコアを全タンパク質統計に変換するために、タンパク質内のあらゆる可能なタイリング２０量体エピトープのスコアの合計を計算する。タンパク質エピトープスコアとも呼ばれる最終的なタンパク質スコアＳｄは、各タンパク質の該２０のローリングウィンドウに沿った最大値である。同様のスコアのセットを、識別ペプチドの数に等しい数の、ライブラリーからランダムに選択された１００回の反復ラウンドに対して計算した。各スコアのｐ値Ｓを、ランダムに選択されたペプチド間で該スコアが満たされるか超過される回数に基づいて計算し、反復回数を制御する。
【０１９１】
精度、再現性および性能分析。シャーガス固定クラシファイアーモデルにおいて使用される２００個のペプチドのシグナルを測定することにより、８個の血漿試料のセットに対して、アレイ特徴に結合する抗体の精度を特徴付けた。Ｓ／ＣＯ値の範囲を示す４人のシャーガス血清陽性ドナーおよび３個のシャーガス血清陰性試料を、ドナーの全コホートから選択した。これらを三重にアッセイした。健康なドナーからの十分に特徴付けられた社内血漿試料もスライド設計に含まれ、二重にアッセイされた。陰性対照として、１個のアレイを一次インキュベーション段階で血漿なしでインキュベートしたが、二次検出抗体とともにインキュベートした。これらの２４個の試料を、単一のスライド上のアレイ位置全体に均等に分配した。該スライドレイアウトを、複数のスライドに複製した。
【０１９２】
バッチ内の精度を評価するために、単一の製造ロットからの３個のウェーハを選択した。上記の１スライド精密設計を使用して、各ウェーハからの１３枚のスライドのうち１２枚を評価した。スライドを、３個の異なる日に１日に３個のＡｒｒａｙＩｔカセットで評価した。各ウェーハからのスライドを、各カセットが３個のウェーハの１つからの２個のスライドおよび残りの２個のウェーハからの１個のスライドを含有するように、３日間にわたって均等に割り当てた。
【０１９３】
バッチ間の精度を測定するために、４個の異なる製造ロットのそれぞれから１個のウェーハを選択した。各ウェーハからの１３枚のスライドのうち１２枚を、上記の精密研究試料セットを使用して評価した。これらのスライドを、３日間に渡って１日に４個のカセットにテスト用に分配した。各カセットを、４枚のウェーハのうち２枚からの２枚のスライドを含有するように、各ウェーハからのスライドを３日間にわたって均等に分配した。混合効果モデルを使用して、実験分散の原因を推定した。ドナー試料を、固定効果として扱った。ネストされた因子「ウェーハ」、「スライド」、および「アレイ」を「日」と交差し、これらをランダム効果として扱った。モデルを、ｌｍｅ４パッケージを使用してＲに適合させ、分散係数（ＣＶ）を導き出した。
【０１９４】
多くのウェーハ製造バッチおよびアッセイにわたってＩｍｍｕｎｏＳｉｇｎａｔｕｒｅクラシファイアーの堅牢性を評価するために、単一のスライドでアッセイできる品質管理（ＱＣ）試料セットを選択した。これは、１０個の合成バッチで製造された２２個の異なるウェーハからの単一スライドで分析された１１個のケースおよび１１個の対照の代表的なパネルで構成されていた。テストされた２２枚のウェーハスライドのそれぞれについて、シャーガス試行で開発された固定モデルクラシファイアーを該試料セットに適用して、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を推定した。これらのウェーハの１つを、シャーガス試行、もう１つを混合コホート（シャーガス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＷＮＶ）試行に使用した。
【０１９５】
実施例２−プラットフォーム検証
モノクローナル抗体を使用して実験を行い、リガンド提示および抗体認識に関して最終的なｉｎ  ｓｉｔｕ合成アレイペプチド産物の品質を評価した。
【０１９６】
全ての診断アッセイを、検証済みのマイクロアレイプラットフォームで実施した。
【０１９７】
マスクおよびフォトリソグラフィー技術を使用して、シリコンウェーハ上で並列カップリング反応を直接行うペプチド合成プロトコルを開発した。それぞれ１４μｍｘ１４μｍの特徴で合計１３１，７１２個のペプチド（９個のアミノ酸の中央値長）を表示するアレイを使用して、抗体結合イベントを照会した。アレイレイアウトは、共通のリンカーを介して表面に取り付けられた１２６，００９個のライブラリーペプチド機能および６２０３個の対照ペプチド機能を含んでいた（実施例１を参照）。ライブラリーペプチドを、考えられる全てのアミノ酸の組み合わせを均等にサンプリングするように設計した。対照ペプチドは、それぞれが１００回複製された、５個の異なる特性解析されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の確立されたエピトープに対応する５００個の特徴を含む。別の９３５個の特徴は、５個のエピトープのうちの３個の４個の異なる配列変異体に対応し、それぞれが１００〜２８０回複製されている。追加の５００個の対照特徴を、ライブラリーペプチドのアミノ酸組成と同様であるが、均一に８量体であり、三重に存在するアミノ酸組成で設計した。これら５００個の対照特徴のシグナルの中央値を定量化し、ＩＳＴモデルの開発時にライブラリーの一部として扱った。残りの３，２６８個の対照は、グリッドアラインメントを支援する基準マーカー、分析対照配列、リンカーのみの機能を含む。基準を除いて、全ての機能をアレイ全体に均等に分配する。
【０１９８】
リガンド提示および抗体認識に関して最終的なアレイ合成産物の品質を評価したｍＡｂを使用して実験を行った。４個のマウス抗体クローンのパネル：４Ｃ１、ｐ５３Ａｂ１、ｐ５３Ａｂ８、およびＬｎｋＢ２を、アレイレイアウト内で設計された５個の対照エピトープのうちの４個に対応する認識配列で選択した。４個のアレイで表されるエピトープの配列コンテンツは、ライブラリーの構築に使用されたすべての１６個のアミノ酸を集合的に含む。
【０１９９】
図２は、記載されたように（実施例１を参照）行われた結合アッセイの結果を示し、各抗体を、競合剤を有するアレイに個別に３回適用した。各ｍＡｂについて、対照特徴強度を使用して、そのエピトープに対応するペプチド配列および３個の非同族配列の両方のＺスコアを計算した。同族配列のそれぞれは、高いシグナル強度と結合されたが、非同族はバックグラウンド値を超えるシグナルをほとんどまたはまったく表示しなかった（二次のみ）。
【０２００】
これらのデータは、合成ライブラリー産物の完全性を検証する。データは、マイクロアレイが特定の抗体の認識と結合に適したペプチドを保持していることを示す。ｉｎ  ｓｉｔｕプロセスに対するフォトリソグラフィーおよびマスクの使用は、製造スケーリングおよび効率的なコスト削減の機会を提供する。特に、まったく同じライブラリー配列設計を使用して、種々の異なる条件、例えば、シャーガス病、ＨＰＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶの分類の正確性により例示されるような感染を区別するペプチドを同定できる（表４および５）。
【０２０１】
実施例３−免疫標識アッセイは、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性の対象とＴ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性の対象を差別化する
無症候性ドナーの血漿試料の２個のコホートを血液バンクリポジトリ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｔｅｍｐｅ，ＡＺ）から得て、表１に示す。血液バンクのアルゴリズムを使用する。該テストは、シャーガスの兆候を有する任意のドナーから血液供給への試料の侵入を防ぐことを目的とする。最初に、Ｔ．ｃｒｕｚｉライセート全体（Ｏｒｔｈｏ）に対して血漿をアッセイする３つのＥＬＩＳＡを連続して実施した。これらのいずれかが、カットオフ値へのシグナル（Ｓ／ＣＯ＞１．０）により正のスコアが付けられた場合、確認テストを実行する。これは、血漿を使用して放射標識されたＴ  ｃｒｕｚｉライセートを沈殿させる免疫沈降アッセイ（Ｔ  ｃｒｕｚｉ  ＲＩＰＡ）である。これらの基準により、１８９人のドナーが血清陽性であり、１４６人が血清陰性であった。＞４．０のＳ／ＣＯスコアは、強い陽性とみなされる[Remesar M et al., (2015) Transfusion 55: 2499-2504]。性別、年齢、民族性の分布は、米国の献血者集団で一般的に観察されるものであった。２０１６年コホートは、上記のシリアルＥＬＩＳＡおよびＲＩＰＡテストと同じプロトコルでシャーガスのテストを受けた１１６人のドナーである。その結果、５８人のシャーガス血清陽性および５８人の血清陰性参加者を同定した。シャーガス陽性の個人の高い割合（５８人中３１人（５３％）が、高いＳ／ＣＯ＞４サブ群にスコア付けられた。性別および年齢の分布は似ているが、該第２のドナー集団の民族性はやや偏っていた。
2020511633.tif 000006
【０２０２】
本願明細書に提示した研究試行を、２０１５年コホートをアルゴリズム訓練セットとして使用して実施し、シャーガス血清陽性と血清陰性の個人を区別するクラシファイアーを開発した。該クラシファイアーを修正し、２０１６年コホートドナーの陽性を予測するために適用した。したがって、２０１６年試料は、訓練に依存しない検証セットを表す。
【０２０３】
シャーガス陽性を決定するための免疫標識の性能の評価
実施例１に記載されるように免疫特徴（ＩＳＴ）アッセイを実施し、各特徴でシグナル強度測定値を取得するためにスキャンした。ウェルチのｔ検定の適用は、シャーガス血清陽性対血清陰性として血液バンクスコア付けされたドナー間で平均シグナルにおいて有意差を有する３５６個の個々のペプチドを同定した。図３において白い点線で区切られているように、全てではないがほとんどのペプチドは、シャーガス陰性ドナーと比較して、シャーガス陽性でより高い結合強度を示した。これらのペプチドの多くは、全てのシャーガス陽性ドナーのＴ．ｃｒｕｚｉ  Ｓ／ＣＯ値の中央値（青および緑の円で表示）にも正の相関があるシグナルを有した。これは、いくつかのライブラリーペプチドがＥＬＩＳＡスクリーニングで抗原が結合したものと同じまたは関連する血漿抗体に結合する可能性と一致する。Ｓ／ＣＯと有意に相関する１４個のペプチドがあったが、シャーガス陽性のＩＳＴ識別のボンフェローニしきい値を満たさなかった（白い破線の下の円）。特に、ＩＳＴによる最強の識別を示した３５６個のペプチドの多くは、Ｓ／ＣＯ値と有意に相関しなかった。これは、ＩＳＴ（ｔ検定）により収集された結合データが、ＥＬＩＳＡ（Ｓ／ＣＯ）により収集されたものと一部重複していることを示すが、固有の相互作用も測定されたことを示す。
【０２０４】
シャーガス血清陽性のサポートベクターマシン（ＳＶＭ）クラシファイアーを、２０１５年コホートにおいて開発した。交差検証下で、ウェルチのｔ検定でランク付けされた上位５００個のペプチドをモデルに入力したときに、最高の性能を達成した。該数は、ボンフェローニの有意性カットオフを満たした３５６を超えており、重要性の低い厳密な誤検出率（ＦＤＲ）カットオフを満たすペプチドの一部に追加の情報コンテンツが存在したことを示す。図４Ａは、各訓練試料内の上位５００個のペプチドを使用して、診断しきい値の関数として、５回の交差検証モデルの１００回の反復の平均感度と特異性の関係を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）は、２個の群のそれぞれから無作為に選択されたドナーについて、血清陽性ドナーは、９７％〜９９％の９５％信頼区間（ＣＩ）で、血清陰性ドナーよりもシャーガス陽性の可能性が高いと分類される９８％の確率を有するだろうと推定する。感度が特異性に等しい閾値では、精度は９３％（ＣＩ＝９１％〜９５％）であった。観察された性能（ＡＵＣ９７％；精度９１％）が推定値推定値の９５％ＣＩ以内である２０１６年コホートに上位５００個のペプチドを使用して、単一の固定ＳＶＭクラシファイアーの適用により、推定値推定値を確認した（図４Ｂ）。
【０２０５】
該同じ固定クラシファイアーを使用して、４人のシャーガス血清陽性ドナーおよび３個のシャーガス血清陰性試料を方法セクションに記載のように繰り返しアッセイするプロトコルを使用して、アッセイの結合精度および再現性を評価した。分類精度を繰り返し計算した。これらの正確な測定は、固定クラシファイアーを構成するＩＳＴアッセイ機能の以下の結合シグナルＣＶを示した：アレイ間＝１１％、スライド間＝４％、ウェーハ間＝２．７％、日間＝７．７％、および内部−バッチ＝１４．６％。方法に記載されるように、ＡＵＣ＞０．９８（中央値ＡＵＣ＝１．０）を示す分類の再現性をも決定した。
【０２０６】
図５の結果は、２０１５シャーガスコホート全体の抗体結合の不均一性を調査する。ＥＬＩＳＡのＳ／ＣＯレベルまたは両方の基準との相関により、ｔ検定によるシャーガス陽性の有意な識別を提供した図３に記載される３７０（３５６＋１４）ペプチドの相対シグナル強度が表示される（図２１Ａ〜Ｎ）。
【０２０７】
シャーガス血清陰性試料からシャーガス血清陽性を識別するペプチドは、全ペプチドライブラリーにおける同じモチーフの発生率に対して、図９Ｂ〜Ｆに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されていることを見出した。さらに、血清陽性および血清陰性の試料を識別するペプチドの９９％が、アルギニン、アスパラギン酸、およびリジンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図９Ａ）。
【０２０８】
各ドナー（ｙ軸）の各ペプチド（ｘ軸）を表し、対照として機能する全ての血清陰性ドナーにおける同じペプチドの平均強度と比較したその強度の差に対して陰影を付けている。ヒートマップのカラースキームを、対照の特徴のシグナルからの特徴のシグナルの標準偏差（ｓｄ）によりスケーリングする。凡例を７ｓｄで切り捨て、小さいながらも重要な変動を視覚化する。ドナーを、報告されたＥＬＩＳＡ  Ｓ／ＣＯ測定値の中央値で順序付け、これらのデータをヒートマップと一緒にプロットする。ペプチドを、上部の樹状図で示されるようにクラスター化する。ＥＬＩＳＡ陽性ドナーと陰性ドナーの違いは、いくつかのペプチドのＩＳＴシグナルとＥＬＩＳＡシグナルレベルの相関関係と同様、ヒートマップの視覚化で明らかである。シャーガス陽性試料は、ｉ）対照より均一に低いシグナル、ｉｉ）対照よりわずかに高いシグナル、およびｉｉｉ）Ｓ／ＣＯ値が増加するにつれて増加するシグナルを有するペプチドのサブセットに対して、少なくとも３個の異なる結合プロファイルを示す。シャーガス陰性試料におけるペプチドシグナルの不均一性は比較的わずかである。
【０２０９】
これらのデータは、異なるクラスターが感染の状態と相関する可能性があること、および／または疾患の進行を示すことを示す。
【０２１０】
ＩＳＴペプチドアレイに結合したＩｇＧ抗体を測定することに加えて、蛍光標識抗ＩｇＡ特異的二次試薬で血漿抗体結合事象を単に検出することにより、ＩｇＡ結合活性を決定した。少数のライブラリーペプチド（２２４）が、血清陽性ドナーと陰性ドナー間で有意に異なるシグナルレベルのボンフェローニカットオフを通過し、これらは抗ＩｇＧ二次試薬により検出されたものの５０％と重複した。さらに、Ｓ／ＣＯ値と相関する２３個のＩｇＡ分類ペプチド全てを、Ｓ／ＣＯと相関する２６個のＩｇＧ分類ペプチドのリスト内で見出した（２３／２６＝８８％重複）。ＩｇＡ分類（ＡＵＣ＝０．９４）の性能は、ＩｇＧ分類の性能と同様であった。
【０２１１】
これらの知見は、ＩＳＴ試験結果と疾患特異的免疫活性との間に相関関係が存在することを示す。これらの知見は、Ｔ．ｃｒｕｚｉにより誘発されるシャーガス病の状態をモニターするためのテストとしてイムノシグネチャー法の使用を示唆する。縦断的研究は、血清陽性対象の血清再転換または感染の生命にかかわる合併症の長期的発達をモニターするために必要な情報を提供できる。
【０２１２】
実施例４−シャーガス分類ペプチドをマップするプロテオーム
シャーガス陽性と陰性ドナーとを有意に区別する３５６個のＩＳＴライブラリーペプチドに加えて、Ｓ／ＣＯ値に相関する１４個を、２０量体のスライディングウィンドウを使用する修正ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびスコアリングシステムで、Ｔ．ｃｒｕｚｉプロテオームに合わせた（実施例１）。これは、表２に示す候補タンパク質標的領域のランク付けされたリストを生じさせた。これらの分類ペプチドは、ライブラリーからランダムに選択した１０個の同じサイズ（３７０）のペプチドセットで同じ分析を実行して得られた最大スコアを大幅に超える高頻度のアラインメントスコアを示す（図６）。例えば、ランダムに選択されたペプチドで得られた最大スコアは、２０００未満から２５００までの範囲であった。一方、分類ペプチドは３５００のアラインメントスコアを生成した。したがって、該例において、分類ペプチドは最高スコアのランダムペプチドのタンパク質スコアよりも少なくとも２８％高いタンパク質スコアを提供した。分離度を低くしても、信頼できる結果を得ることができる。
【０２１３】
シャーガス分類ペプチドによりマップされたトップスコアの候補は、表面糖タンパク質のムチンＩＩファミリーのＣ末端であった。ＩＳＴペプチド配列領域は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着部位を含み、シャーガス患者の免疫原性の高いエピトープに対応する[Buscaglia CA et al., (2004) J Biol Chem 279: 15860-15869]。ムチンＩＩアラインメントＩＳＴペプチドで最も頻繁に同定されるアミノ酸は、図７に修正ＷｅｂＬｏｇｏとして要約される[Crooks GE et al., (2004) Genome Res 14: 1188-1190]。対応するＴ．ｃｒｕｚｉムチン配列（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ＝Ｑ４ＤＸＭ４）をｘ軸に沿って表示する。任意の１個の位置でのアミノ酸置換を垂直に示し、マップされたライブラリーペプチド内の比例カバレッジを、１文字のコードの高さで示す。ムチンＩＩタンパク質ファミリーのもう１個のメンバーを、６番目にランク付けされた標的候補として識別し、Ｃ末端にもマップする（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ＝Ｑ４ＤＮ８８）。別のＴ．ｃｒｕｚｉ表面糖タンパク質ファミリーのメンバーである分散遺伝子ファミリータンパク質（ＤＧＦ−１）[Lander N et al., (2010) Infection and Immunity 78: 231-240]、アラインメントアルゴリズム（Ｑ４ＤＱ０５）で８位、そのＣ末端領域にマップし、ファミリーのコンセンサス配列に対応する。残りの上位１０個のスコアリングアラインメント領域は、カルシウムシグナル伝達に関与するタンパク質（カルモジュリン）、小胞輸送（液胞タンパク質選別関連タンパク質、Ｖｐｓ２６）にマップされる[Haft CR et al., (2000) Molecular Biology of the Cell 11: 4105-4116]および特徴づけられていないタンパク質。合わせて、これら１０個の候補プロテオーム標的は、合わされた３７０個のＩＳＴ分類ペプチドのうち２２０個を占めた。主要な候補バイオマーカーも、識別ペプチドの総数の全てにより同定できる。
2020511633.tif 000007
【０２１４】
これらのデータは、寄生性エピトープを模倣するアレイペプチドが、シャーガス血清陽性対象において末梢血抗体により特異的に結合されたことを示す。これらの識別ペプチドを、いくつかの既知の免疫原性Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質、およびいくつかの未知の抗原にマップした。
【０２１５】
実施例５−他の血液感染症（シャーガス病、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、および西ナイルウイルス病）のテストで陽性のドナーからのシャーガス陽性ドナーのＩＳＴ共分類
シャーガス陰性試料からシャーガス陽性試料を識別することに加えて、シャーガス病を他の感染症と識別できるかどうか、および他の感染症を互いに識別できるかどうかを決定するために、イムノシグネチャー法をテストした。
【０２１６】
シャーガス陽性試料と他の感染症試料とをＩＳＴにより識別できるかどうかを決定するために、８８のＨＢＶ、８８ＷＮＶ、および７１のＨＣＶ疾患陽性血漿試料とともに、シャーガス２０１５の全コホートからの８８試料のサブセットを再評価した。ウイルス試料を、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの間接的な血清学的および直接的な核酸テストの両方により陽性に割り当てた。全ての研究試料を、４つの疾患のうち１つだけが陽性であると報告した。人口統計データを表３に示す。性別および民族性の混合、および年齢の範囲を示す。ヒスパニック系ドナーの間で、シャーガス陽性の有病率が高く、これは中南米の疾病有病率と一致する。該高い有病率は、完全なシャーガスコホート内でも見られた（表１）。ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ陽性のドナーの民族性の分布は、一般的な米国の人口に見られる分布と同様であった。
【０２１７】
該研究のための全てのＩＳＴアッセイを同じ日に実施し、すぐにスキャンして各特徴でシグナル強度測定値を取得した。生データを、分析のためにＲにインポートした。
2020511633.tif 000008
【０２１８】
免疫標識アッセイを全ての試料で実施して、Ｔ．ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、および西ナイルに感染した対象の試料中の抗体が特異的に結合したアレイペプチドを同定した。アレイベースのアッセイは、表３に記載の対象からの試料に対して、実施例１に記載のように実施し、各試料中のアレイ結合抗体のシグナル強度を記載のように取得および分析した。
【０２１９】
別の感染からの感染の区別
感染を別の感染と識別するアレイペプチドへの示差的抗体結合は、シャーガス（Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染）をＨＢＶから、シャーガスをＨＣＶから、シャーガスをＷＮＶから、ＨＢＶをＨＣＶから、ＨＣＶをＷＮＶから、およびＷＮＶをＨＢＶから識別するペプチドを同定した。
【０２２０】
シャーガス対象からの試料から得られたシグナル結合データと、ＨＢＶを有する対象の群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、１４Ａ図に列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、群ＨＢＶからシャーガス試料を識別するペプチドを同定した。さらに、シャーガス試料とＨＢＶ試料を識別するペプチドは、アルギニン、チロシン、セリン、アラニン、バリン、グルタミン、およびグリシンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１４Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、０．９８（０．９８〜０．９９）により特徴付けられた。９０％の感度では、アッセイの特異性は９６％（９４〜９７％）、９０％の特異性でのアッセイの感度は９６％（９４〜９７％）、そして感度＝特異性でのアッセイの精度は９４％（９３〜９６％）であった。
【０２２１】
シャーガス対象からの試料から得られたシグナル結合データと、ＨＣＶを有する対象の群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図１５Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、群ＨＣＶからシャーガス試料を識別するペプチドを同定した。さらに、ＨＣＶ試料からシャーガス試料を識別するペプチドは、アルギニン、チロシン、セリン、バリン、およびグリシンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１５Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、０．９９（０．９８〜０．９９）により特徴付けられた。９０％の感度で、アッセイの特異性は９４％（９２〜９８％）、９０％の特異性でのアッセイの感度は９８％（９５〜９９％）で、感度＝特異性でのアッセイの精度は９３％（９２〜９５％）。
【０２２２】
シャーガス対象からの試料から得られたシグナル結合データと、ＷＮＶを有する対象群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、１６Ａ図に列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、群ＷＶＮからシャーガス試料を識別するペプチドを同定した。さらに、シャーガスの試料とＷＶＮの試料を識別するペプチドは、リジン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、グリシンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１６Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、０．９５（０．９４〜０．９７）により特徴付けられた。９０％の感度では、アッセイの特異性は８７％（７６〜９４％）、９０％の特異性でのアッセイの感度は８９％（８５〜９２％）、感度＝特異性でのアッセイの精度は９０％（８６〜９１％）であった。
【０２２３】
ＨＢＶ対象からの試料から得られたシグナル結合データと、ＨＣＶを有する対象群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図１７Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、群ＨＣＶからＨＢＶ試料を識別するペプチドを同定した。さらに、ＨＢＶ試料とＨＣＶ試料を識別するペプチドは、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、ロイシン、アラニン、およびヒスチジンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１７Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、０．９１（０．８８〜０．９４）により特徴付けられた。９０％の感度で、アッセイの特異性は７９％（６９〜８６％）、９０％の特異性でのアッセイの感度は７１％（５３〜８３％）、感度＝特異性でのアッセイの精度は８４％（７８〜８７％）であった。
【０２２４】
ＨＢＶ対象からの試料から得られたシグナル結合データと、ＷＮＶを有する対象群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図１８Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、群ＷＮＶからのＨＢＶ試料を識別するペプチドを同定した。さらに、ＷＮＶ試料からＨＢＶ試料を識別するペプチドは、１つ以上のアミノ酸トリプトファン、リジン、フェニルアラニン、ヒスチジン、およびバリンにおいて１００％を超えて富化されていることを見出した（図１８Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、０．９７（０．９６〜０．９８）により特徴付けられた。９０％の感度で、アッセイの特異性は９６％（９０〜９９％）、９０％の特異性でのアッセイの感度は９４％（９０〜９７％）、感度＝特異性でのアッセイの精度は９３％（９０〜９６％）であった。
【０２２５】
ＨＣＶ対象からの試料から得られたシグナル結合データと、ＷＮＶを有する対象群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率と比較して、１９Ａ図に列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、群ＷＮＶからＨＣＶ試料を識別するペプチドを同定した。さらに、ＨＣＶ試料とＷＮＶ試料を識別するペプチドを、リジン、トリプトファン、アルギニン、チロシン、およびプロリンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１９Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、０．９７（０．９５〜０．９８）により特徴付けられた。９０％の感度では、アッセイの特異性は９２％（８４〜９７％）、９０％の特異性でのアッセイの感度は９３％（８６〜９７％）、感度＝特異性でのアッセイの精度は９２％（８７〜９４％）であった。
【０２２６】
これらのデータは、本願明細書に記載の免疫標識アッセイを使用して個々の感染の比較を行い、多くの異なる感染状態を鑑別診断できることを示す。
【０２２７】
利用可能な感染症のそれぞれを他の感染症の組み合わせから差別化するために、バイナリクラシファイアーを開発した（表４）。各疾患の対比およびそれに対応する９５％ＣＩの性能メトリックを、４重交差検証分析により決定した。モデルは０．９４から０．９７の範囲の同様の強力なＡＵＣを生成し、８７％〜９２％の精度に対応した。名目上、シャーガス病対残りの３つの疾患（その他）を組み合わせたクラスの対比が最もよく機能していた。しかしながら、括弧で示したＣＩは重複していた。名目上、肝炎の対比は最も弱いモデルであった。最適なＳＶＭ入力ペプチドの数は、５０から１６，０００個のペプチドまで大きく変化した。
【０２２８】
アレイペプチドへの示差的抗体結合により、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ（その他）を有する対象からの混合試料の群からシャーガス試料を識別するペプチドを同定した。最も識別性の高いペプチドは、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図１０Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されていることを見出した。さらに、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ試料の群からシャーガス試料を識別するペプチドは、アルギニン、アスパラギン酸、およびリジンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１０Ｂ）。
【０２２９】
識別ペプチドの結合シグナル情報に基づいてバイナリクラシファイアーが開発され、ＡＵＣ＝０．９７により特徴づけられるアッセイ性能により、シャーガス病対象の試料と他の感染症、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶの試料を明確に差別化することが示された。９０％の信頼レベルで、アッセイの特異性は９４％、アッセイの感度は９２％、アッセイの精度は９２％であった（表４）。
【０２３０】
シャーガス病、ＨＣＶ、およびＷＮＶを有する対象の群からの結合データと、ＨＢＶ対象からの試料から得られたシグナル結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図１１Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、シャーガス病、ＨＣＶ、およびＷＮＶの群からＨＢＶ試料を識別するペプチドを同定した。さらに、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ試料の群からＨＢＶ試料を識別するペプチドは、１つ以上のアミノ酸トリプトファン、フェニルアラニン、リジン、バリン、ロイシン、アラニン、およびヒスチジンにおいて１００％を超えて富化されていることを見出した（図１１Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、ＡＵＣ９４％により特徴付けられた。９０％の信頼レベルで、アッセイの特異性は８５％、アッセイの感度は８５％、アッセイの精度は８７％であった（表４）。
【０２３１】
対照の第３セットにおいて、ＨＣＶ対象からの試料から得られたシグナル結合データと、シャーガス病、ＨＢＶ、およびＷＮＶを有する対象の群からの結合データとの比較は、ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図１２Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されている、シャーガス病、ＨＢＶ、およびＷＮＶの群からＨＣＶ試料を識別するペプチドを同定した。さらに、ＨＣＶ試料をＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ試料の群から識別したペプチドは、アルギニン、チロシン、アスパラギン酸、およびグリシンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１２Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、ＡＵＣ＝９６％であった。９０％の信頼レベルで、アッセイの特異性は９１％、アッセイの感度は９０％、アッセイの精度は９０％であった（表４）。
【０２３２】
対比の第４セットにおいて、ＷＮＶ対象からの試料から得られたシグナル結合データと、シャーガス病、ＨＢＶ、およびＨＣＶを有する対象の群からの結合データとの比較が、シャーガス病、ＨＢＶ、およびＨＣＶの群からＷＮＶ試料を識別するペプチドを同定した。これらは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの発生率に対して、図１３Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されていた。さらに、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびシャーガス試料の群からＷＮＶ試料を識別するペプチドは、リジン、トリプトファンヒスチジン、およびプロリンの１つ以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることを見出した（図１３Ｂ）。この対比に関する方法の性能は、ＡＵＣ＝０．９６により特徴付けられた。９０％の信頼レベルで、アッセイの特異性は８８％、アッセイの感度は８７％、アッセイの精度は８９％であった（表４）。
2020511633.tif 000009
【０２３３】
これらのデータは、同定された識別ペプチドに基づく複数の異なる感染のバイナリ分類により、シャーガスに対して血清陽性の対象をシャーガスに対して血清陰性の対象から、そしてＷＮＶ、ＨＰＶ、およびＨＣＶに対して無症状の対象から区別できることを示している。示されているように、全ての事例で、該方法の性能は０．９４を超えている。
【０２３４】
実施例６−４つの異なる感染の同時分類
選択されたペプチドの１個のセットおよび１個のアルゴリズムを用いて、４つの感染症状態全てを同時に分類するために、多重クラシファイアーモデルを開発した。該マルチクラスモデルは、表４に示すバイナリクラシファイアーと同様の性能を示した。すなわち、４重交差検証分析により、シャーガスで０．９８、ＨＢＶで０．９６、ＨＣＶで０．９５、ＷＮＶで０．９７のマルチクラスＡＵＣを生じさせた。表５は、予測される最高の確率に基づいて、クラスへの各試料の割り当ての性能メトリックを示している。該混同マトリックスでは、各バイナリ対比が示されている。推定される全体的なマルチクラス分類の精度は、８７％に達した。
【０２３５】
前述の段落および表５に記載された群対比のクラシファイアーを組み合わせて、４つの感染症：シャーガス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶが互いに同時に識別できるかどうかを決定するための多重クラシファイアーを得た。
【０２３６】
多重クラシファイアー分析においてシャーガス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ試料を互いに区別するペプチドは、全ペプチドライブラリーにおける同じモチーフの発生率に対して、図２０Ａに列挙された１つ以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されていた。さらに、多重分類分析においてシャーガス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＷＮＶ試料を互いに識別するペプチドは、アルギニン、チロシン、リジン、トリプトファン、バリン、およびアラニンの１つ以上のアミノ酸が１００％を超えて富化されていた（図２０Ｂ）。
【０２３７】
図８に示されるヒートマップは、４つの疾患全てを包含する３３５個の試験コホート試料のそれぞれについて、バッグ交差検証モデル予測（表５に示される）のクラスメンバーシップの平均予測確率を視覚化する。該図は、最高の予測確率が試料を感染症クラスに正しく割り当てたことを示している。分類ペプチドのシグナル強度は、３個のウイルス試料全てに対して、シャーガス試料において明らかにより異なる。全てではないがほとんどは、ＨＢＶおよびＷＮＶに対して、いくつかの低いペプチドシグナルについて著しい例外はあるが、シャーガスで高い。対照的に、ＨＢＶおよびＨＣＶ試料に対してアッセイされた同じペプチドのシグナル強度の違いはそれほど極端ではない。
【０２３８】
各試料は、０（黒）から１００％（白）までの範囲の各結果に対する予測クラスメンバーシップを有する。各試料は、図８に示す最高の予測確率に基づいて疾患クラスに割り当てられ、表５に示す混同マトリックスに示されている。分類は、図８に示す予測確率に基づいて割り当てられ、各試料は最も高い確率でクラスに割り当てられた。４個の対比のアッセイ性能は、０．９５〜０．９８の範囲であった。全体の精度は８７％であった。
2020511633.tif 000010
【０２３９】
これらのデータは、免疫標識アッセイが、１つの感染を２つ以上の他の感染から同時に高い精度で区別できることを示している。全ての事例で、ＡＵＣで定義されている方法の性能は０．９５を超えていた。
【０２４０】
実施例７−免疫標識アッセイは、拡張ペプチドアレイを使用して、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性の対象とＴ．ｃｒｕｚｉに対して血清陰性の対象を差別化する
Ｔ．ｃｒｕｚｉに対して血清陽性である試料と血清陰性である試料を差別化することができる追加の配列ペプチドを同定するために、３．２Ｍ固有ペプチドの３．３Ｍ特徴配列（Ｖ１６配列）を結合研究に使用した。Ｖ１６アレイは、システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）を除外することにより、２０個の天然アミノ酸のうち１８個から合成されたペプチドのライブラリーを含む。ペプチドは、中央値長８で、５〜１６個の範囲のアミノ酸長である。Ｖ１６アレイ上のライブラリーは：（Ａ）低バイアスライブラリーであって、５量体、６量体、９量体、８量体、およびその１量体、２量体、３量体、４量体サブ配列を含む、１８個のアミノ酸に基づいて配列スペースを均等にカバーするように設計された固有ペプチドの高配列多様性ライブラリー；（Ｂ）実施例２に記載のアレイライブラリーからの８８，９２７個の完全長ペプチド、および実施例２に記載のアレイライブラリーからの別の３７，０９８個のペプチドの２〜４個の断片からなるＶ１３ライブラリー；および（Ｃ）国際エピトープデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）のエピトープを標的とする２７４，４１７個の固有エピトープ配列ペプチドのＩＥＤＢライブラリーを含む。ＩＥＤＢライブラリーは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ生物のタンパク質のエピトープにマップされた２，９５１個の固有ペプチドを含む。
【０２４１】
血漿試料を、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＣＴＳ；ＵＳＡ）（ｗｗｗ．ｍｙｃｔｓ．ｏｒｇ）から得た。結合アッセイを、Ｓ／ＣＯスコアが少なくとも１．２４５のシャーガスに対して血清陽性であることがわかっている無症候性ドナーからの４９個の試料および、血清陰性ドナーからの４１個の試料を使用して実行した。血清陰性ドナーの１人の６個の追加の複製物も、結合アッセイに含まれた。結合アッセイを実施し、実施例１に記載されるように、試料の抗体とペプチドの結合を、各アドレス可能なペプチドの特徴の相対蛍光値を決定することにより得られた定量シグナル測定値として検出した。
【０２４２】
クラシファイアーを構築するために、シャーガス陽性ドナーとシャーガス陰性ドナーとを比較するウェルチのｔ検定に関連するｐ値に基づいて、血清陰性試料からシャーガス血清陽性を識別する能力について特徴をランク付けした。選択された入力ペプチドの数を２５から１６，０００個の特徴の間で段階的に変化させ、選択された特徴の各セットを、線形カーネルおよび０．０１のコストパラメーターを用いて、サポートベクターマシン（Cortes C, and Vapnik V. Machine Learning. 1995;20(3):273-97）に入力し、クラシファイアーを訓練する。１００回繰り返される５重交差検証を使用してモデルの性能を定量化し、受信者操作特性曲線（ＡＵＣ）下の誤差として推定し、バイアスを回避するために機能選択およびクラシファイアーの開発の両方を組み込んだ。
【０２４３】
全ての分析を、Ｒバージョン３．３．３(Team RC. R: 統計コンピューティングのための言語および環境。R Foundation for Statistical Computing Vienna 2017。https://www.R-project.org/から利用可能)を使用して実行した。
【０２４４】
シャーガス血清陽性およびシャーガス血清陰性対象間で有意に異なる抗体結合シグナルを表示するライブラリーペプチドのセットを視覚化するボルケーノプロットを図２２に示す。ボルケーノプロットを使用して、ｔ検定ｐ値の同時分布として該識別を評価する。シグナル強度の平均値の対数差（比率の対数）をテストする。プロットされた各位置でのペプチドの密度は、ヒートスケールで示される。赤い破線の上の２，７０７個のペプチドは、多重度にボンフェローニ調整を適用した後、９５％の信頼度で免疫標識テクノロジー（ＩＳＴ）により陽性疾患と陰性疾患とを識別する。青い円は、シャーガス病のエピトープを標的とするＩＥＤＢライブラリーのペプチドへの血清陽性および血清陰性の試料の異なる結合を示す。青い線の上の青い円で示された６７個の識別ペプチドは、多重度にボンフェローニ調整を適用した後、９５％の信頼度で陽性疾患と陰性疾患を識別する。緑の円は、Ｖ１３ライブラリーのペプチドに対する試料抗体により結合された４９３個のペプチドを表す。緑の線の上の緑の円で示された５２個のペプチドは、多重度にボンフェローニ調整を適用した後、９５％の信頼度で陽性疾患と陰性疾患を識別する。Ｖ１６、Ｖ１３、およびＩＥＤＢライブラリーのペプチドの３個のサブセットのサイズに合わせて調整された、３個のボンフェローニカットオフ値を使用した。
【０２４５】
Ｖ１６アレイ分析からの識別ペプチドを、以下の表６に列挙する。ペプチドは、シャーガス血清陽性の対象の平均対数変換強度とシャーガス血清陰性の対象の平均対数変換強度の差のｔ検定ｐ値を増加させることにより並べられる。ハッシュタグ記号（＃）は、報告されているシャーガスエピトープ配列にマップするように設計されたＩＥＤＢライブラリーからの識別ペプチドを識別し、アスタリスク記号（＊）は、図２１Ａ〜Ｎに列挙されたＶ１６のＶ１３ライブラリーからのペプチドを識別する。各固有のペプチドの配列の後に、そのペプチドの平均血清陰性強度と平均血清陰性強度の比が続く。
表６−シャーガス血清陰性試料とシャーガス血清陽性試料とを区別するペプチド配列
【表１−１】
2020511633.tif 000011
【表１−２】
2020511633.tif 000012
【表１−３】
2020511633.tif 000013
【表１−４】
2020511633.tif 000014
【表１−５】
2020511633.tif 000015
【表１−６】
2020511633.tif 000016
【表１−７】
2020511633.tif 000017
【表１−８】
2020511633.tif 000018
【表１−９】
2020511633.tif 000019
【表１−１０】
2020511633.tif 000020
【表１−１１】
2020511633.tif 000021
【表１−１２】
2020511633.tif 000022
【表１−１３】
2020511633.tif 000023
【表１−１４】
2020511633.tif 000024
【表１−１５】
2020511633.tif 000025
【表１−１６】
2020511633.tif 000026
【表１−１７】
2020511633.tif 000027
【表１−１８】
2020511633.tif 000028
【０２４６】
加えて、実施例３（上記）からのＶ１３ライブラリーと重複したｔ検定ｐ値＜０．０００１を有するＶ１６アレイ分析からの５２個のＶ１３ライブラリー識別ペプチドを、以下の表７に列挙する。これらのペプチドは、図２２に緑色で強調表示されている。ペプチドは、シャーガス血清陽性の対象の平均対数変換強度とシャーガス血清陰性の対象の平均対数変換強度の差のｔ検定ｐ値の増加順に並べられている。各固有のペプチドの配列の後に、そのペプチドの平均血清陰性強度と平均血清陰性強度の比が続く。
表７−Ｖ１６アレイ分析におけるシャーガス血清陰性試料とシャーガス血清陰性試料の区別を示すＶ１３ライブラリーペプチド配列（Ｖ１６）
【表２】
2020511633.tif 000029
【０２４７】
１，０００個の入力ペプチドを有するＳＶＭモデルについて、交差検証下の最良の平均性能を達成した。１００回の交差検証試行で訓練およびテストされた１０００個の入力ペプチドを含むモデルで生成された受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の平均曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９８（９５％ＣＩ  ０．９７〜０．９９）であった。９０％の特異性について選択された診断閾値での平均感度は、これらのモデルでは９６％（９２％〜９８％）であった。９０％感度について選択された診断閾値での平均特異性は、９８％（９２％〜１００％）であった。
【０２４８】
シャーガス血清陰性試料からシャーガス血清陽性を識別するＶ１６アレイのペプチドは、Ｖ１６ペプチドライブラリー全体における同じモチーフの発生率に対して、図２３Ａ、図２３Ｂおよび図２３Ｃに列挙された１つ以上のモチーフにおいて富化されていることがわかった。
【０２４９】
実施例８−拡張アレイ上で同定されたシャーガス分類ペプチドをマップするプロテオーム
ボンフェローニ基準９５％信頼レベルを満たすシャーガス陽性ドナーから陰性ドナーを有意に区別した２，７０７個のライブラリーペプチドは、２０量体のスライディングウィンドウを使用した修正ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびスコアリングシステムを用いて、Ｔ．ｃｒｕｚｉプロテオームに合わせられた（実施例１）。このことは、表８に示す候補タンパク質標的領域のランク付けされたリストを生じさせた。これらの分類ペプチドは、ライブラリーからランダムに選択された１０個の同じサイズのペプチドセットで同じ分析を実行して得られた最大スコアを大幅に超える高頻度のアラインメントスコアを表示する。例えば、ランダムに選択されたペプチドで得られた最大スコアは８５４３未満から１５９２０の範囲であったが、分類ペプチドは、トップヒットＷｅｅ９０に対して４６９８５のアラインメントスコアを生成した。したがって、この場合、分類ペプチドは、最高スコアのランダムペプチドのタンパク質スコアよりも少なくとも３００％大きいタンパク質スコアを提供した。分離度を低くしても、信頼できる結果を得ることができる。
2020511633.tif 000030
【０２５０】
これらのデータは、寄生性エピトープを模倣するアレイペプチドが、シャーガス血清陽性の対象において末梢血抗体により特異的に結合されたことを示している。これらの識別ペプチドを、いくつかの既知の免疫原性Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質、およびいくつかの未知の抗原にマップした。これらのデータはまた、ペプチドが以前にＶ１３で見られた「ＬＲ」モチーフを含む強力なモチーフを共有し（実施例４）、ＩＥＤＢからの既知のシャーガスエピトープを標的とするペプチドを含むことも示している。
【０２５１】
該研究は、実施例１〜４に提供される知見を支持し、Ｖ１３アレイを使用した研究から以前に得られたリストを拡張する。
【図１】
2020511633.tif 000031
【図２】
2020511633.tif 000032
【図３】
2020511633.tif 000033
【図４】
2020511633.tif 000034
【図５】
2020511633.tif 000035
【図６】
2020511633.tif 000036
【図７】
2020511633.tif 000037
【図８】
2020511633.tif 000038
【図９Ａ】
2020511633.tif 000039
【図９Ｂ】
2020511633.tif 000040
【図９Ｃ】
2020511633.tif 000041
【図９Ｄ】
2020511633.tif 000042
【図９Ｅ】
2020511633.tif 000043
【図９Ｆ】
2020511633.tif 000044
【図１０】
2020511633.tif 000045
【図１１】
2020511633.tif 000046
【図１２】
2020511633.tif 000047
【図１３】
2020511633.tif 000048
【図１４】
2020511633.tif 000049
【図１５】
2020511633.tif 000050
【図１６】
2020511633.tif 000051
【図１７】
2020511633.tif 000052
【図１８】
2020511633.tif 000053
【図１９】
2020511633.tif 000054
【図２０】
2020511633.tif 000055
【図２１Ａ】
2020511633.tif 000056
【図２１Ｂ】
2020511633.tif 000057
【図２１Ｃ】
2020511633.tif 000058
【図２１Ｄ】
2020511633.tif 000059
【図２１Ｅ】
2020511633.tif 000060
【図２１Ｆ】
2020511633.tif 000061
【図２１Ｇ】
2020511633.tif 000062
【図２１Ｈ】
2020511633.tif 000063
【図２１Ｉ】
2020511633.tif 000064
【図２１Ｊ】
2020511633.tif 000065
【図２１Ｋ】
2020511633.tif 000066
【図２１Ｌ】
2020511633.tif 000067
【図２１Ｍ】
2020511633.tif 000068
【図２１Ｎ】
2020511633.tif 000069
【図２２】
2020511633.tif 000070
【図２３Ａ】
2020511633.tif 000071
【図２３Ｂ】
2020511633.tif 000072
【図２３Ｃ】
2020511633.tif 000073
【配列表】
2020511633000001.app
【国際調査報告】
2020511633.tif 000074
2020511633.tif 000075
2020511633.tif 000076
2020511633.tif 000077
2020511633.tif 000078
2020511633.tif 000079