(57)【要約】  本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、新規な二重特異性抗原結合分子、及びこれらの分子を産生する方法及びその使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）とを含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインがＦａｂ断片である、請求項１から２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、請求項１から４のいずれか１項、又は請求項８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｃ）配列番号１８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｄ）配列番号１９３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１９４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１から４のいずれか１項、又は請求項８又は請求項９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、請求項１から４のいずれか１項、又は請求項１１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、請求項１から４いずれか１項、又は請求項１１又は請求項１２のに記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
Ｆｃドメインが、抗原結合分子のＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、特に、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）抗原結合分子のＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ  Ｆｃドメイン
を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ＶＨドメインが２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインが第２の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片
を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）抗原結合分子のＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ  Ｆｃドメイン
を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２２】
二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子を産生する方法。
【請求項２３】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項２４】
がん又は感染性疾患の治療における使用のための、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
医薬としての使用のための、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
がんの治療における使用のための、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療における使用のための、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
がん又は感染性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子の又は請求項２３に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３０】
腫瘍細胞の増殖を阻害するために、請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子の又は請求項２３に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３１】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、がん又は感染性疾患を治療する方法。
【請求項３２】
マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合し、かつ、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項３２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項３２又は請求項３３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、新規な二重特異性抗原結合分子に関する。本発明はさらに、これらの分子を産生する方法及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定されている（Kwon Y.H. and Weissman S.M.(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell L.M. et al.(2011) Immunol. Rev. 244, 197-217 or Zhang X.et al.(2010), J. Immunol. 184, 787-795）、ＮＫ細胞（Lin W. et al.(2008), Blood 112, 699-707）、ＮＫＴ細胞（Kim D.H. et al.(2008), J. Immunol. 180, 2062-2068）、単球（Kienzle G. and von Kempis J.(2000), Int. Immunol. 12, 73-82, or Schwarz H. et al.(1995), Blood 85, 1043-1052）、好中球（Heinisch I.V. et al.(2000), Eur. J. Immunol. 30, 3441-3446）、肥満細胞（Nishimoto H. et al.(2005), Blood 106, 4241-4248）、及び樹状細胞、並びに非造血起源の細胞、例えば内皮細胞及び平滑筋細胞（Broll K. et al.(2001), Am. J. Clin. Pathol. 115, 543-549又はOlofsson P.S. et al.(2008), Circulation 117, 1292-1301）における４−１ＢＢの発現を実証した。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は、主に誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガー、並びに炎症誘発性サイトカインの共刺激分子又は受容体を介して誘導されるシグナル伝達などの様々な刺激シグナルによって駆動される（Diehl L. et al.(2002), J. Immunol. 168, 3755-3762; von Kempis J. et al.(1997), Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406; Zhang X.et al.(2010), J. Immunol. 184, 787-795）。
【０００３】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激するだけでなく（Buechele C. et al.(2012), Eur. J. Immunol. 42, 737-748; Lin W. et al.(2008), Blood 112, 699-707; Melero I. et al.(1998), Cell Immunol. 190, 167-172）、それらの生存の増加及びサイトカインを分泌し、共刺激分子を上方制御する能力によって示されるようにＤＣ活性化を促進することが知られている（Choi B. K. et al.(2009), J. Immunol. 182, 4107-4115; Futagawa T. et al.(2002), Int. Immunol. 14, 275-286; Wilcox R. A. et al.(2002), J. Immunol. 168, 4262-4267）。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセット及びＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell L.M. et al.(2011) Immunol. Rev. 244, 197-217）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞に対する４−１ＢＢ抗体のこれらの共刺激効果に沿って、担腫瘍マウスへのそれらの投与は、多くの実験的腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero I. et al.(1997), Nat. Med. 3, 682-685; Narazaki H. et al.(2010), Blood 115, 1941-1948）。ｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇実験は、４−１ＢＢ特異的抗体の抗腫瘍効果において、ＣＤ８＋Ｔ細胞が最も重要な役割を果たすことを実証した。しかし、腫瘍モデル又は抗４−１ＢＢを含む併用療法に依存して、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋  Ｔ細胞などの他の型の細胞の寄与が報告されている（Melero et al., 2009; Murillo et al., -2436; Narazaki et al., 2011; Stagg et al., 108）。
【０００４】
これは、ＴＮＦＲ−スーパーファミリーの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの４−１ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性は、抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、それにより、そのような試薬の薬理学的活性に必要とされる重要な事象としてのＦｃ受容体結合を示唆していると思われる（Li F. and Ravetch J.V.(2011), Science 333, 1030-1034; Teng M.W. et al.(2009), J. Immunol. 183, 1911-1920）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下で減少するか又は有意に改善される肝臓毒性に関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を誘導する（Dubrot J. et al.(2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233）。
【０００５】
ウレルマブ（ＢＭＳ−６６６５１３、クローン１０Ｃ７）は、４−１ＢＢ細胞外ドメインに結合する完全ヒト型、アゴニスト非リガンド遮断モノクローナルＩｇＧ４抗体である。それは、米国特許第７２８８６３８号において、２０Ｈ４．９−ＩｇＧ４として開示されている。ヒト臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ００３０９０２３）では、３週間に１回１２週間投与されたウレルマブは、メラノーマ、卵巣癌又は腎細胞癌の患者の疾患の安定化を誘導した。しかしながら、抗体がグレード４の肝炎を引き起こし、２つの肝毒性関連の死亡が発生したため、試験は終了した（Simeone E. and Ascierto P.A.(2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247）。臨床的安全性データのその後の詳細な分析は、重度の高トランスアミナーゼ血症の発症が、与えられたウレルマブの用量によって引き起こされることを実証した。グレード２＋の好中球減少症、白血球減少症、及び血小板減少症もまた観察された。臨床的安全性データのその後の詳細な分析は、重度の高トランスアミナーゼ血症の発症が、与えられたウレルマブの用量によって引き起こされることを実証した。しかしながら、２０１２年において、ウレルマブは、３週間ごとに与えられる＜１ｍｇ／ｋｇの用量が使用される条件下で、臨床開発に再び入った。現在の推奨用量は、３週間ごとに与えられる０．１ｍｇ／ｋｇである（N. Segal et al.(2016), Results From an Integrated Safety Analysis of Urelumab, an Agonist Anti-CD137 Monoclonal Antibody, Clin. Cancer Res., published online December 1, 2016）。従って、用量制限毒性の観点から、制御不能な副作用を回避するために、腫瘍特異的部位でのみ作用するはずである４−１ＢＢに特異的な改善された抗原結合分子が必要とされている。本発明の二重特異性抗原結合分子は、腫瘍特異的又は腫瘍関連抗原に優先的に結合することができる抗原結合ドメインと、４−１ＢＢにアゴニスト結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを組み合わせる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、４−１ＢＢを効果的にトリガーするだけでなく、所望の部位で極めて選択的にトリガーすることができ、それによってウレルマブなどの従来の単一特異性抗体で観察された望ましくない副作用を低減することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインであって、特に、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインと、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを組み合わせた二重特異性抗原結合分子に関する。これらの二重特異性抗原結合分子は、それらが、標的細胞抗原に対するそれらの結合能力のために、標的細胞抗原が発現される部位で４−１ＢＢを好ましくは活性化し、身体の他の部位での活性化を減少させ、それにより、４−１ＢＢのみに特異的な抗原結合分子の副作用を回避するであろうゆえに有利である。さらに、本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、特に二重特異性抗原結合分子の薬理学的及び薬物動態学的性質を増強するＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む。
【０００７】
一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを提供し、
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０００８】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）とを含む４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。より具体的には、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０００９】
一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片である。
【００１０】
さらなる態様では、提供されるのは、二重特異性抗原結合分子、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであり、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含み、
ここで、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【００１１】
一態様では、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１２】
特に、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００１３】
さらなる態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００１４】
さらに、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１５】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１７】
特に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００１８】
別の態様では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｃ）配列番号１８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｄ）配列番号１９３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１９４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００１９】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２０】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２１】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２２】
またさらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２４】
特に、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２５】
別の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【００２６】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２７】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
一態様では、二重特異性抗原結合分子はヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。特に、二重特異性抗原結合分子は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。
【００２９】
さらなる態様では、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への抗体の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【００３０】
さらなる態様では、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本発明は、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。より具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００３１】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる各抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【００３２】
一態様では、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３３】
特定の態様では、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）抗原結合分子のＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ  Ｆｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。より具体的には、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、抗原結合分子のＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【００３４】
従って、二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対して二価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３５】
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインが２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインが第２の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
【００３６】
さらなる態様では、提供されるのは、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【００３７】
別の態様では、提供されるのは、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３９】
特定の態様では、ｃｒｏｓｓｆａｂ断片は、ＦＡＰ、ＣＥＡ又はＣＤ１９に特異的に結合することができる。より具体的には、ｃｒｏｓｓｆａｂ断片は、ＣＥＡに特異的に結合することができる。
【００４０】
別の態様では、提供されるのは、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１３のアミノ酸配列を含むさらなる軽鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号２１６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含むさらなる軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【００４１】
別の態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４２】
従って、二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４３】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、かつ、それらの各２つが任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。
【００４４】
一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインがＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨドメインがＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインがＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結されている、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４５】
さらなる態様では、提供されるのは、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【００４６】
別の態様では、提供されるのは、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞とを提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００４８】
別の態様では、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子を産生する方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造された二重特異性抗原結合分子を包含する。
【００４９】
本発明はさらに、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、がん又は感染性疾患の治療における使用のためのものである。特に、薬学的組成物は、がんの治療における使用のためのものである。
【００５０】
また、本発明には、医薬としての使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物が包含される。
【００５１】
一態様では、
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【００５２】
別の態様では、本発明は、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子に関し、
ここで、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【００５３】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）と、配列番号１７８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）とを含む。特に、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。別の特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は１つであり、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合し、かつ、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。特に、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００５４】
特定の態様では、がんの治療における使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の特定の態様では、本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、二重特異性抗原結合分子は、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００５６】
また、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特に、がん又は感染性疾患の治療のための医薬の製造のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の態様では、疾患はがんである。上記の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢへの二価結合）と、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、例えば、それぞれ重鎖のＣ末端に融合した抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ又は抗ＣＤ１９とを含む、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの二重特異性抗原結合分子の例を示す。このフォーマットは、本明細書では２＋１フォーマットとも呼ばれる。黒色の点は、ノブ・イントゥー・ホール変異を象徴する。図１Ａは、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＬドメインが、Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合しており、ホールＶＬと呼ばれる、二重特異性抗原結合分子を示し、図１Ｂは、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨドメインが、Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合しており、ホールＶＨと呼ばれる、二重特異性抗原結合分子を示す。図１Ｃは、１＋１フォーマットとも呼ばれる二重特異性一価抗４−１ＢＢ及び一価抗ＦＡＰ抗原結合分子（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）を示す。抗ＦＡＰはクロスオーバーｆａｂであり、これは、重鎖がＶＬ−ＣＨ１を含むのに対し、軽鎖はＶＨ−ＣＬを含み、抗４−１ＢＢは荷電変異体を有するｆａｂであることを意味する。図１Ｄ及び１Ｅは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢへの二価結合）及び標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ−ｆａｂ、例えば、重鎖のうちの１つのＣ末端に融合している、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ又は抗ＣＤ１９を含む、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの二重特異性抗原結合分子を示す。このフォーマットは、本明細書では２＋１フォーマットとも呼ばれる。図１Ｄは、ＣＨＣＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂを有する変異体を示し、図１Ｅでは、ＶＨＶＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂを有する変異体を示す。図１Ｅにおける三角形は、荷電変異体（１２３位のアミノ酸（ＥＵの番号付け）のアルギニン（Ｒ）への、及び１２４位のアミノ酸（ＥＵの番号付け）のリジン（Ｋ）へのＣＬドメインにおける変異、及び１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）へのＣＨ１ドメインにおける変異）の可能性を象徴する。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ抗原結合分子の同時結合に関する。図２Ａは、アッセイの設定のピクトグラムである。図２Ｂは、二重特異性抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰ抗原結合分子（被分析物１）の固定化ヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰ（被分析物２）への同時結合を示す。
【図３】図３は、二価（ＩｇＧ）抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）抗体及び二価（２＋１）抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子の膜結合型４−１ＢＢへの結合を評価するためのＦＲＥＴに基づく競合アッセイを示す。二重特異性、二価（２＋１）抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子は、ＩｇＧ対応物として競合する。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、４つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢへの四価結合）と、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、例えば、それぞれ重鎖のＣ末端に融合した抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ又は抗ＣＤ１９とを含む、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの二重特異性抗原結合分子の例を示す。このフォーマットは、本明細書では４＋１フォーマットとも呼ばれる。黒色の点は、ノブ・イントゥー・ホール変異を象徴する。抗４−１ＢＢ  ＦａｂドメインのＶＨＣＨ１ドメインの各２つはお互いに、及びＦｃドメインに融合している。図４Ａは、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＬドメインが、Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合しており、ホールＶＬと呼ばれる、二重特異性抗原結合分子を示し、図４Ｂは、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨドメインが、Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合しており、ホールＶＨと呼ばれる、二重特異性抗原結合分子を示す。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、二重特異性４＋１抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰ抗原結合分子の同時結合に関する。図５Ａは、アッセイの設定のピクトグラムである。図５Ｂは、二重特異性抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰ抗原結合分子（被分析物１）の固定化ヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰ（被分析物２）への同時結合を示す。
【図６】図６は、二価（ＩｇＧ）抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）抗体及び四価（４＋１）抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子の膜結合型４−１ＢＢへの結合を評価するためのＦＲＥＴに基づく競合アッセイを示す。二重特異性、四価（４＋１）抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子は、ＩｇＧ対応物よりも良好に競合する。
【図７】図７Ａから７Ｄは、休止及び活性化ヒトＴ細胞への結合を示す。抗４−１ＢＢ抗原結合分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、一次検出抗体なし、二次検出抗体のみ）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。上のパネルには、休止ＣＤ４  Ｔ細胞（図７Ａ）又は活性化ＣＤ４  Ｔ細胞（図７Ｂ）への結合が示されている。下のパネルには、休止ＣＤ８  Ｔ細胞（図７Ｃ）及び活性化ＣＤ８  Ｔ細胞（図７Ｄ）への結合が示されている。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒色の塗りつぶされた菱形）、二重特異性抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１抗原結合分子（黒色の塗りつぶされた三角形、点線）、及び抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１抗原結合分子（灰色の塗りつぶされた四角形）などの４−１ＢＢ結合ドメイン含有抗原結合分子のみが、４−１ＢＢ発現細胞に効率的に結合する。コントロール分子ＤＰ４７（生殖系列コントロール）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（白抜きの黒丸、点線）では、結合は検出できなかった。
【図８】図８Ａ及び８Ｂにおいて、活性化ヒトＴ細胞への結合が示される。このグラフでは、図７Ｃ及び図７Ｄの曲線下面積が表示されている。図８Ａにおいて、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合が示されており、図８Ｂは活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合を示している。抗体４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒）、二重特異性抗原結合分子４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１（チェス）、二重特異性抗原結合分子４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（対角線ストライプ）、及びコントロール分子ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡをそれぞれ示す。
【図９】図９Ａ及び９Ｂにおいて、ヒトＦＡＰ発現細胞への結合が示される。４−１ＢＢ結合分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、一次検出抗体なし、二次検出抗体のみ）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図９Ａにおいて、中等度ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４への結合、及び図９Ｂにおいて、高ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞への結合が示される。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１（黒色の塗りつぶされた三角形と点線）及び４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（塗りつぶされた灰色の四角形）などのＦＡＰ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子のみが、ＦＡＰ発現細胞に効率的に結合する。非ＦＡＰ標的化分子である抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒色の塗りつぶされた三角形）及びコントロール分子であるＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（白抜きの黒丸、点線）では、結合は検出できなかった。
【図１０Ａ−１０Ｃ】図１０Ａから１０Ｃは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃにおけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現を示す。４−１ＢＢ結合分子の濃度が、インキュベーションの６時間後に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図１０Ａにおいて、ＦＡＰ標的非依存性４−１ＢＢ活性化が示され、それにより４−１ＢＢ結合は、レポーター細胞株において、いかなるＦＡＰ媒介架橋もなしにＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する。図１０Ｂにおいて、ＦＡＰ中等度発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４、及び図１０Ｃにおいて、高ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９を、レポーター細胞株に５：１の比率で添加した。ＦＡＰ発現細胞は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢ結合分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株においてＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を誘導するそれらの可能性を増加させる。
【図１０Ｄ−１０Ｅ】図１０Ａから１０Ｅは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃにおけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現活性を示す。ＦＡＰ標的化アゴニスト４−１ＢＢ結合構築物４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）１＋１（黒色の菱形）又はそのコントロールの濃度を、６時間のインキュベーション後に測定された放出された光の単位（ＵＲＬ）に対してブロットする。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図１０Ｄにおいて、ＦＡＰ標的非依存性４−１ＢＢ活性化が示され、それにより４−１ＢＢ結合は、レポーター細胞株において、いかなるＦＡＰ媒介架橋もなしにＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する。図１０Ｅにおいて、ＦＡＰ表面発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４を、レポーター細胞株に５：１の比率で添加した。ＦＡＰ発現ＷＭ−２６６−４細胞は、二重特異性結合４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）１＋１分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株においてＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を誘導するその可能性を増加させた。
【図１１】図１１Ａから１１Ｃはまた、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃにおけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現を示す。このグラフでは、図１０Ａ及び図１０Ｃの曲線下面積が表示されている。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒）、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１（チェス）、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（対角線ストライプ）、及びコントロール分子ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（白）をそれぞれ示す。
【図１２】図１２Ａから１２Ｄにおいて、ヒトＦＡＰ発現線維芽細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）の存在下におけるヒトＰＢＭＣ活性化が示される。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）抗原結合分子（黒色の塗りつぶされた三角形及び点線及び塗りつぶされた灰色の四角形）又は二重特異性抗原結合分子４−１ＢＢ（１２Ｂ３）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（黒色の星、別の抗４−１ＢＢクローンを有する陽性コントロール分子）が存在する場合、ＦＡＰ発現細胞及びＣＤ３刺激の存在下における新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣのインキュベーションは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１２Ａ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１２Ｂ）上のＣＤ２５の上方調節、並びにＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１２Ｃ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１２Ｄ）の増殖の増加をもたらす。ターゲティング比（４＋１対２＋１）に関係なく、４−１ＢＢバインダークローン２０Ｈ４．９を有する両方の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の類似の活性化を誘導することができるが、一方、４−１ＢＢバインダー１２Ｂ３を含む二重特異性抗原結合分子は、より少ない活性化効力をもたらす。非ＦＡＰ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ分子（黒色の塗りつぶされた菱形）は、ある程度までしかＣＤ４  Ｔ細胞の活性化及び増殖を増加させることができない。
【図１３】図１３において、図１２Ａから図１２Ｄに示した４つ全てのパラメータが曲線下面積としてまとめられている。陰性コントロールとして、非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ分子は、ベースライン活性化及び増殖を示すことが示されている。
【図１４Ａ−１４Ｄ】二重特異性マウス４−１ＢＢ／ＦＡＰ抗原結合分子によるマウスＴ細胞活性化の誘導を図１４Ａから１４Ｊに示す。アゴニストマウス−４−１ＢＢ抗体の添加濃度（ｘ軸）を、ｙ軸上の陽性細胞のパーセンテージ（図１４Ａから１４Ｈ）又は蛍光強度の平均（図１４Ｉ及び１４Ｊ）に対してブロットする。左側に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化パラメータ（図１４Ａ、１４Ｃ、１４Ｅ、１４Ｇ及び１４Ｉ）、右側にＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化パラメータ（図１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｆ、１４Ｈ及び１４Ｊ）を示す。示されるのは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ａ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｂ）における４−１ＢＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｃ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｄ）におけるＣＤ２５発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｅ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｆ）におけるグランザイムＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｇ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｈ）の増殖の増加、及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｉ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｊ）における側方散乱値の増加によるサイトゾル構造の増加である。架橋共刺激アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体（シグナル２）と組み合わせた０．５μｇ／ｍＬのアゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアハムスターＩｇＧ（シグナル１）によるマウスＴ細胞の活性化は、４−１ＢＢ、ＣＤ２５及びグランザイムＢの増加した発現によって示されるＴ細胞活性化の増加、並びに側方散乱の平均蛍光強度による増殖及びサイトゾル構造の増加をもたらす。相乗効果は、４−１ＢＢに結合する能力と、同時に架橋される能力に依存する。アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体の架橋結合は、ＦｃγＲ結合によって（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ｗｔ、黒色の菱形）、又は同時にＦＡＰに結合することによって（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ  ２＋１、灰色の星及び点線）もたらすことができる。例えばＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖によって示されるように（図１４Ｈ）、ＦＡＰを介した架橋ははるかに強力である。４−１ＢＢへの結合に不活性の抗体（非標的化ｍｏＩｇＧ１、白抜きの灰色の丸及び点線）又はＦｃγＲ結合に不活性の抗体（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ）は、バックグラウンドを超えてＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞活性化を増加させることはできない。
【図１４Ｅ−１４Ｈ】二重特異性マウス４−１ＢＢ／ＦＡＰ抗原結合分子によるマウスＴ細胞活性化の誘導を図１４Ａから１４Ｊに示す。アゴニストマウス−４−１ＢＢ抗体の添加濃度（ｘ軸）を、ｙ軸上の陽性細胞のパーセンテージ（図１４Ａから１４Ｈ）又は蛍光強度の平均（図１４Ｉ及び１４Ｊ）に対してブロットする。左側に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化パラメータ（図１４Ａ、１４Ｃ、１４Ｅ、１４Ｇ及び１４Ｉ）、右側にＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化パラメータ（図１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｆ、１４Ｈ及び１４Ｊ）を示す。示されるのは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ａ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｂ）における４−１ＢＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｃ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｄ）におけるＣＤ２５発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｅ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｆ）におけるグランザイムＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｇ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｈ）の増殖の増加、及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｉ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｊ）における側方散乱値の増加によるサイトゾル構造の増加である。架橋共刺激アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体（シグナル２）と組み合わせた０．５μｇ／ｍＬのアゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアハムスターＩｇＧ（シグナル１）によるマウスＴ細胞の活性化は、４−１ＢＢ、ＣＤ２５及びグランザイムＢの増加した発現によって示されるＴ細胞活性化の増加、並びに側方散乱の平均蛍光強度による増殖及びサイトゾル構造の増加をもたらす。相乗効果は、４−１ＢＢに結合する能力と、同時に架橋される能力に依存する。アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体の架橋結合は、ＦｃγＲ結合によって（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ｗｔ、黒色の菱形）、又は同時にＦＡＰに結合することによって（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ  ２＋１、灰色の星及び点線）もたらすことができる。例えばＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖によって示されるように（図１４Ｈ）、ＦＡＰを介した架橋ははるかに強力である。４−１ＢＢへの結合に不活性の抗体（非標的化ｍｏＩｇＧ１、白抜きの灰色の丸及び点線）又はＦｃγＲ結合に不活性の抗体（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ）は、バックグラウンドを超えてＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞活性化を増加させることはできない。
【図１４Ｉ−１４Ｊ】二重特異性マウス４−１ＢＢ／ＦＡＰ抗原結合分子によるマウスＴ細胞活性化の誘導を図１４Ａから１４Ｊに示す。アゴニストマウス−４−１ＢＢ抗体の添加濃度（ｘ軸）を、ｙ軸上の陽性細胞のパーセンテージ（図１４Ａから１４Ｈ）又は蛍光強度の平均（図１４Ｉ及び１４Ｊ）に対してブロットする。左側に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化パラメータ（図１４Ａ、１４Ｃ、１４Ｅ、１４Ｇ及び１４Ｉ）、右側にＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化パラメータ（図１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｆ、１４Ｈ及び１４Ｊ）を示す。示されるのは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ａ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｂ）における４−１ＢＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｃ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｄ）におけるＣＤ２５発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｅ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｆ）におけるグランザイムＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｇ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｈ）の増殖の増加、及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｉ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｊ）における側方散乱値の増加によるサイトゾル構造の増加である。架橋共刺激アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体（シグナル２）と組み合わせた０．５μｇ／ｍＬのアゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアハムスターＩｇＧ（シグナル１）によるマウスＴ細胞の活性化は、４−１ＢＢ、ＣＤ２５及びグランザイムＢの増加した発現によって示されるＴ細胞活性化の増加、並びに側方散乱の平均蛍光強度による増殖及びサイトゾル構造の増加をもたらす。相乗効果は、４−１ＢＢに結合する能力と、同時に架橋される能力に依存する。アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体の架橋結合は、ＦｃγＲ結合によって（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ｗｔ、黒色の菱形）、又は同時にＦＡＰに結合することによって（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ  ２＋１、灰色の星及び点線）もたらすことができる。例えばＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖によって示されるように（図１４Ｈ）、ＦＡＰを介した架橋ははるかに強力である。４−１ＢＢへの結合に不活性の抗体（非標的化ｍｏＩｇＧ１、白抜きの灰色の丸及び点線）又はＦｃγＲ結合に不活性の抗体（マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ）は、バックグラウンドを超えてＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞活性化を増加させることはできない。
【図１５】図１５Ａから１５Ｂは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現活性を示す。ＣＥＡ標的化アゴニスト４−１ＢＢ結合構築物４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１の濃度を、６時間のインキュベーション後に測定された放出された光の単位（ＵＲＬ）に対してブロットする。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図１５Ａにおいて、ＣＥＡ標的非依存性４−１ＢＢ活性化が示され、それにより４−１ＢＢ結合は、レポーター細胞株において、いかなるＣＥＡ媒介架橋もなしにＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する。図１５Ｂにおいて、ＣＥＡ表面発現ヒト胃腺癌細胞株ＭＫＮ４５を、レポーター細胞株に５：１の比率で添加した。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞は、二重特異性結合４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ４Ｂ７）２＋１分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株においてＮＦκＢ誘導ルシフェラーゼ活性化を誘導するその可能性を増加させる。ＡＵＣ及びＥＣ５０値は、平均値（ＳＤ）としてブロットに示されている。
【図１６】図１６Ａは、実施例８に記載の二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９抗体（４−１ＢＢ×ＣＤ１９と呼ばれる）の構造的２＋１フォーマットを示す。分子は、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片（４−１ＢＢへの二価結合）と、それぞれ重鎖のＣ末端に融合した、ＣＤ１９に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインとを含む、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの二重特異性抗原結合分子である。黒色の点は、ノブ・イントゥー・ホール変異を象徴する。例は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）又は４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）である。図１６Ｂは、陽性コントロールであって、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）二量体及び４−１ＢＢＬ（７１−２４８）単量体に隣接するＣＨ１及びＣＬドメインに修飾を有する抗原結合分子（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）を含む、一価ＣＤ１９  ４−１ＢＢＬ−三量体を示す。太い黒色の点は、ノブ・イントゥー・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン（いわゆる荷電残基）におけるアミノ酸修飾を表す。分子は、国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載されており、ＣＤ１９バインダークローン２Ｂ１１を含むのでＣＤ１９（２Ｂ１１）×４−１ＢＢＬと命名されている。図１６Ｃは、陰性コントロールであって、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合した４−１ＢＢＬ（７１−２４８）二量体、及びＦｃホール鎖のＣ末端に融合した４−１ＢＢＬ（７１−２４８）単量体を有する非標的化（ＤＰ４７）抗原結合分子（ｈｕＩｇＧ、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）を示す。
【図１７】図１７Ａにおいて、ヒトＦｃに対する二次抗体により検出されるように、４−１ＢＢｘＣＤ１９構築物のＣＤ１９＋ヒトＢ細胞への結合が示される。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）は、ＣＤ１９（２Ｂ１１）ｘ４−１ＢＢＬと比較して低い親和性で用量依存的にヒトＢ細胞に結合するが、一方非標的化ＤＰ４７ｘ４−１ＢＢＬはＢ細胞に結合しなかった。図１７Ｂにおいて、ヒトＦｃに対する二次抗体によって検出された、ＣＤ１９＋  ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株への異なる４−１ＢＢｘＣＤ１９  構築物の結合を示す。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＤ１９（２Ｂ１１）は、初代Ｂ細胞と同様の様式でＣＤ１９＋  ＷＳＵ腫瘍細胞に結合する。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）と比較して同一の結合特性を示す。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１８Ａ）又は活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１８Ｂ）への４−１ＢＢ×ＣＤ１９構築物の結合を示す。特異的結合は、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の純粋な集団に対してゲートされた。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＤ１９（２Ｂ１１）は、用量依存的に４−１ＢＢ発現ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞への優れた結合を示したが、ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬと比較してわずかに低い親和性であった。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（０１８）は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）と比較して同一の結合特性を示す。
【図１９】図１９において、４−１ＢＢｘＣＤ１９構築物によって引き起こされる活性化ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出が示される。全てのヒトＰＢＭＣを、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８マイクロビーズ及び滴定濃度の４−１ＢＢ×ＣＤ１９構築物と共にインキュベートした。２日後、上清を、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γの測定のために収集した。
【図２０】図２０Ａから２０Ｃは、ＣＥＡに対する一価結合を有する２＋１二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体の、特に抗原Ｎ（Ａ２−Ｂ２）Ａのエピトープ領域、及びｈｕ４−１ＢＢへの同時結合を指す。図２０Ａはアッセイの設定を示す。図２０Ｂにおいて、ＣＨＣＬｃｒｏｓｓｆａｂを有する２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ構築物（被分析物１）の、固定化Ｎ（Ａ２−Ｂ２）Ａ及びヒト４−１ＢＢ（被分析物２）への同時結合が示される。図２０Ｃは、ＶＨＶＬｃｒｏｓｓｆａｂを有する２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ構築物（被分析物１）の、固定化Ｎ（Ａ２−Ｂ２）Ａ及びヒト４−１ＢＢ（被分析物２）への同時結合を示す。
【図２１Ａ−２１Ｂ】図２１から２１Ｄにおいて、二重特異性分子のヒト４−１ＢＢ又はヒトＣＥＡ発現細胞への結合がそれぞれ示される。二重特異性ＣＥＡ及び４−１ＢＢ結合分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、一次検出抗体なし、二次検出抗体のみ）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図２１Ａにおいて、ヒト４−１ＢＢ発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃへの結合、及び図２１Ｂにおいて、ヒトＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５への結合が示されている。４−１ＢＢ抗原結合ドメイン又はＣＥＡ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子のみが、それぞれヒト４−１ＢＢ発現Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞又はヒトＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞に効率的に結合する。陰性コントロールとして、非特異的ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を使用してベースラインをもたらした。図２１Ｃにおいて、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃへの結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）、図２１Ｄにおいて、ＭＫＮ４５細胞への結合曲線のＡＵＣを示す。
【図２１Ｃ−２１Ｄ】図２１から２１Ｄにおいて、二重特異性分子のヒト４−１ＢＢ又はヒトＣＥＡ発現細胞への結合がそれぞれ示される。二重特異性ＣＥＡ及び４−１ＢＢ結合分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、一次検出抗体なし、二次検出抗体のみ）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図２１Ａにおいて、ヒト４−１ＢＢ発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃへの結合、及び図２１Ｂにおいて、ヒトＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５への結合が示されている。４−１ＢＢ抗原結合ドメイン又はＣＥＡ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子のみが、それぞれヒト４−１ＢＢ発現Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞又はヒトＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞に効率的に結合する。陰性コントロールとして、非特異的ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を使用してベースラインをもたらした。図２１Ｃにおいて、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃへの結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）、図２１Ｄにおいて、ＭＫＮ４５細胞への結合曲線のＡＵＣを示す。
【図２２Ａ−２２Ｂ】図２２Ａから２２Ｃは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株（Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２）におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現、従って活性を示す。二重特異性ＣＥＡ標的化アゴニスト４−１ＢＢ二重特異性抗体の濃度が、６時間のインキュベーション後に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図２２Ａにおいて、ＣＥＡ標的非依存性４−１ＢＢ活性化が示され、それにより４−１ＢＢ結合は、レポーター細胞株において、いかなるＣＥＡ媒介架橋もなしにＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する。図２２Ｂにおいて、ＣＥＡ表面発現ヒト胃腺癌細胞株ＭＫＮ４５を、レポーター細胞株に５：１の比率で添加した。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞は、二重特異性４−１ＢＢ及びＣＥＡ抗原結合分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株においてＮＦκＢ誘導ルシフェラーゼ活性化を誘導するその可能性を増加させた。ＣＥＡ標的化クローン及び二重特異性フォーマットに応じて、分子は異なる活性化潜在力を示した。クローンＡ５Ｂ７Ｐは３つの異なるフォーマットで使用されており、それによりＡ５Ｂ７ＰクローンのＣ末端ＶＨ／ＶＬ融合（灰色の三角形）は、Ａ５Ｂ７ＰがＣ末端でＣＨ／ＣＬ  ｃｒｏｓｓＦａｂ（黒色の菱形）として融合されている二重特異性フォーマットとしては活性が低いことを示している。最も高い活性化潜在力は、Ａ５Ｂ７ＰがＣ末端でＶＨ／ＶＬ  ｃｒｏｓｓＦａｂ（白抜きの黒四角形）として融合されている場合に見られた。そのため、クローンＡ５Ｂ７Ｐは、異なる活性化潜在力をもたらすフォーマット制限の基礎となる。最も強い活性化は、ＣＥＡバインダークローンＡ５Ｂ７（黒色の下向き三角形）で見られる。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＤＰ４７  ２＋１（白抜きの灰色の丸、点線）又は４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（灰色の塗りつぶされた丸）などの非標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）分子は、ＣＥＡ架橋非依存性ベースライン活性を示す。計算されたＡＵＣは図２２Ｃに要約されている。使用されたＣＥＡ結合クローン及びフォーマットは、Ｘ軸において、及び列の上に絵として示されている。
【図２２Ｃ】図２２Ａから２２Ｃは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株（Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２）におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現、従って活性を示す。二重特異性ＣＥＡ標的化アゴニスト４−１ＢＢ二重特異性抗体の濃度が、６時間のインキュベーション後に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図２２Ａにおいて、ＣＥＡ標的非依存性４−１ＢＢ活性化が示され、それにより４−１ＢＢ結合は、レポーター細胞株において、いかなるＣＥＡ媒介架橋もなしにＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する。図２２Ｂにおいて、ＣＥＡ表面発現ヒト胃腺癌細胞株ＭＫＮ４５を、レポーター細胞株に５：１の比率で添加した。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞は、二重特異性４−１ＢＢ及びＣＥＡ抗原結合分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株においてＮＦκＢ誘導ルシフェラーゼ活性化を誘導するその可能性を増加させた。ＣＥＡ標的化クローン及び二重特異性フォーマットに応じて、分子は異なる活性化潜在力を示した。クローンＡ５Ｂ７Ｐは３つの異なるフォーマットで使用されており、それによりＡ５Ｂ７ＰクローンのＣ末端ＶＨ／ＶＬ融合（灰色の三角形）は、Ａ５Ｂ７ＰがＣ末端でＣＨ／ＣＬ  ｃｒｏｓｓＦａｂ（黒色の菱形）として融合されている二重特異性フォーマットとしては活性が低いことを示している。最も高い活性化潜在力は、Ａ５Ｂ７ＰがＣ末端でＶＨ／ＶＬ  ｃｒｏｓｓＦａｂ（白抜きの黒四角形）として融合されている場合に見られた。そのため、クローンＡ５Ｂ７Ｐは、異なる活性化潜在力をもたらすフォーマット制限の基礎となる。最も強い活性化は、ＣＥＡバインダークローンＡ５Ｂ７（黒色の下向き三角形）で見られる。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＤＰ４７  ２＋１（白抜きの灰色の丸、点線）又は４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（灰色の塗りつぶされた丸）などの非標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）分子は、ＣＥＡ架橋非依存性ベースライン活性を示す。計算されたＡＵＣは図２２Ｃに要約されている。使用されたＣＥＡ結合クローン及びフォーマットは、Ｘ軸において、及び列の上に絵として示されている。
【図２３】図２３Ａから２３Ｄにおいて、ＣＥＡ発現腫瘍細胞（ＭＫＮ４５）の存在下におけるヒトＰＢＭＣ活性化が示される。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞及びＣＤ３刺激の存在下における新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣのインキュベーションは、ＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）抗原結合分子（黒色の塗りつぶされた三角形及び線）が存在する場合、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図２３Ａ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図２３Ｂ）上のＣＤ２５の上方制御、並びに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の増加（図２３Ｃ）及びより少ない程度でＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加（図２３Ｄ）をもたらす。非ＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＤＰ４７  ２＋１（灰色の白抜きの丸、点線）又は４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（塗りつぶされた灰色の丸、塗りつぶし線）分子は、制限されたベースライン活性化のみを与えたが、一方、陰性コントロールとしてのＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、真のベースラインをもたらした。
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａから２４Ｄにおいて、図２３Ａから２３Ｄに示されるような異なるドナーからのヒトＰＢＭＣは、ＣＥＡ発現腫瘍細胞（ＭＫＮ４５）の存在下において活性化された。ＣＥＡ発現細胞及びＣＤ３刺激の存在下における新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣのインキュベーションは、ＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）抗原結合分子が存在した場合、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図２４Ａ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図２４Ｂ）上のＣＤ２５の上方制御、並びに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の増加（図２４Ｃ）及びより少ない程度でＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加（図２４Ｄ）をもたらす。
【図２４Ｃ−２４Ｄ】図２４Ａから２４Ｄにおいて、図２３Ａから２３Ｄに示されるような異なるドナーからのヒトＰＢＭＣは、ＣＥＡ発現腫瘍細胞（ＭＫＮ４５）の存在下において活性化された。ＣＥＡ発現細胞及びＣＤ３刺激の存在下における新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣのインキュベーションは、ＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）抗原結合分子が存在した場合、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図２４Ａ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（図２４Ｂ）上のＣＤ２５の上方制御、並びに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の増加（図２４Ｃ）及びより少ない程度でＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加（図２４Ｄ）をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
発明の詳細な記載
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００５９】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００６０】
本明細書で使用される用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」又は「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが結合する実体（例えば、４−１ＢＢアゴニスト）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に導くことができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインには、本明細書においてさらに定義される抗体及びその断片が含まれる。さらに、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインとしては、本明細書でさらに定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。
【００６１】
抗体又はその断片に関して、用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む分子の部分を指す。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片である。
【００６２】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００６４】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体とは、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００６５】
本出願において使用される用語「価数」は、１つの区別できる抗原決定基に特異的である抗原結合分子中の１つの区別できる抗原決定基に特異的な特定の数の結合部位の存在を示す。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子中に特定の抗原決定基に特異的であるそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。本発明の特定の態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、それらが前記抗原決定基に対してただ１つの結合部位を有することを意味し、又は特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができ、それらが前記抗原決定基に対してそれぞれ２つの結合部位又は４つの結合部位を有することを意味する。
【００６６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００６７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられる。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315(1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134(2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134(2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００６８】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生産する。本明細書で使用される場合、従って、用語「Ｆａｂ」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。本発明によれば、用語「Ｆａｂ断片」は、以下に定義される「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」も含む。
【００６９】
「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を指す。ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。また一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００７０】
「単一鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここで、前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさら安定化され得る。
【００７１】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常  ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。
【００７２】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、約１０個から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、かつ溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆に連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203(1991) 46-96に記載される。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００７３】
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されている（例えばGebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照のこと）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255(2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701(2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように改変されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディー（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７（Ｂ１）号）。エビボディーは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248(1-2), 31-45(2001)を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように改変することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０−１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350(2000)、米国特許第７２５０２９７（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。アフィボディは、抗原に結合するように改変することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのヘリックスの束からなる。ライブラリーは表面残基の無作為化によって生成されている。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及び欧州特許第１６４１８１８（Ａ１）号を参照のこと。アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、Ａドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然変異をシャッフルすることによって生成される。さらなる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561(2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917(June 2007)を参照のこと。トランスフェリンは単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。改変されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）が含まれる。さらなる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073(1999)を参照のこと。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックス及びβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、第１のαヘリックス及び各リピートのβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。それらの結合界面は、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503(2003), PNAS 100(4), 1700-1705(2003)及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028(2007)及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８（Ａ１）号を参照のこと。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように改変することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。β−サンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが、関心のある治療標的を特異的に認識することを可能にするように改変することができる。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444(2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８（Ｂ１）号を参照のこと。ペプチドアプタマーは、定常性の足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797(2005)を参照のこと。ミクロボディーは、３−４個のシステイン架橋を含む長さが２５−５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように改変することができるループを有する。改変されたノッチンドメイン���さらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照のこと。
【００７４】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００７５】
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７６】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、近接した一続きのアミノ酸、又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造の配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００７７】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置における解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００７８】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比率である。従って、等価な親和性は、速度定数の比率が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７９】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ又は複数の改変があり、そのような改変が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
【００８０】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００８１】
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体をも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号９５）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を配列番号９６に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号９７）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号９８は、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号９９は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
【００８２】
特に断りのない限り、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている用語「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号１００）に示されている。ＣＥＡは、腫瘍関連抗原として長い間同定されている（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。もともと胎児組織においてのみ発現されるタンパク質として分類されていたが、ＣＥＡは現在いくつかの正常な成人組織において同定されている。これらの組織は主に上皮起源であり、消化管、呼吸器、及び泌尿生殖器の管の細胞、並びに結腸、子宮頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む（Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992）。上皮起源の腫瘍、並びにそれらの転移は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含む。ＣＥＡの存在自体はがん性細胞への形質転換を示さないが、ＣＥＡの分布は指標となる。正常組織では、ＣＥＡは一般に細胞の頂端膜側に発現しているため（Hammarstroem S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81(1999)）、血流中の抗体に接近できなくしている。正常組織とは対照的に、ＣＥＡはがん性細胞の全表面にわたって発現される傾向がある（Hammarstroem S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81(1999)）。表現パターンのこの変化は、がん性細胞において、ＣＥＡを抗体結合に接近しやすくする。さらに、ＣＥＡ発現は、がん性細胞において増加する。さらに、ＣＥＡ発現の増加は細胞間接着の増加を促進し、それが転移を引き起こし得る（Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般に非常に高い。公表されたデータと一致して、組織試料において行われたそれ自身の分析はその高い有病率を確認し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）では約９５％、膵臓がんでは９０％、胃がんでは８０％、非小細胞肺がん（ＨＳＣ３と共発現するＮＳＣＬＣ）では６０％、乳がんでは４０％であった；低発現は、小細胞肺がん及び神経膠芽腫において見いだされた。
【００８３】
ＣＥＡは細胞表面から容易に切断され、直接又はリンパ管を介して腫瘍から血流に流れ込む。この性質のために、血清ＣＥＡのレベルはがんの診断、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されてきた（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006）。
【００８４】
特に断りのない限り、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている用語「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号１０１）に示されている。特に断りのない限り、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１とも呼ばれる用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号１０２）に示されている。特に断りのない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号１０３）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ２０」は、膜貫通型４ドメインサブファミリーＡメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号１０４）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られる骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号１０５）に示されている。
【００８５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００８６】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基  ２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すためにいずれかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上に引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として下記の表Ａに示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
表Ａ：ＣＤＲの定義１
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１表Ａにおける全てのＣＤＲの定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらによって記載される番号付け規則に従う。（下を参照のこと）。
２表Ａにおいて使用されている小文字の「ｂ」を含む「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウエアによって定義されるＣＤＲを指す。
【００８７】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００８８】
ＶＨ中のＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００８９】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９０】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００９１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される他の型の「ヒト化抗体」は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれからさらに修飾されるか又は変更されているものである。
【００９３】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００９４】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域はＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合される。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端側の一続きの残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照のこと）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る．一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００９５】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように隆起を空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、従って二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15(2001)）。
【００９６】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むように意図されている。例えば、１つ又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対する影響が最小限であるように、当該技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10(1990)を参照のこと）。
【００９７】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９８】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、対応する抗体で被覆された赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49(1991) 511-524を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9(1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4(1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126(1995) 330-341；及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76(1998) 231-248に記載される。
【００９９】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエーターの放出、並びに免疫複合体クリアランス及び抗体産生の調節を含む広範囲のエフェクター機能を誘発する。ヒトでは、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴づけられており、
−  ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は単量体ＩｇＧと高親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球上に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおける、ＩｇＧのＦｃ領域における改変は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された位置２３３−２３６のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を千分の一に減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29(1999) 2613-2624）。
−  ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低い親和性で、複合体化したＩｇＧに結合し、広く発現される。この受容体は、２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、死滅に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、死滅プロセスを活性化するようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球に見られる。Ｂ細胞では、さらなる免疫グロブリン産生、及び例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するように機能するようである。マクロファージでは、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞では、Ｂ型は、ＩｇＥがその別の受容体に結合することによってこれらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４の少なくとも１つに変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見いだされる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
−  ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、及びいくつかの単球及びＴ細胞上に見いだされ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上で高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６の少なくとも１つに変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見いだされる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１００】
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記変異部位、及びＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276(2001) 6591-6604に記載される。
【０１０１】
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における本明細書中に報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力を、ＦｃγＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）などの、Ｆｃγ受容体を発現する細胞に対するそれらの結合を測定することによって調べる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合を測定する。
【０１０２】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照のこと）。
【０１０３】
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は、現在、２７の受容体からなる。これは、細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体の群である。これらの偽リピートは、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成される鎖内ジスルフィドによって定義される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは典型的なＴＮＦアルファに相同である。それらの活性型では、大部分のＴＮＦ受容体は、細胞膜中に三量体複合体を形成する。従って、ほとんどのＴＮＦ受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。これらの受容体のいくつかはまた、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を補充してカスパーゼ活性化の外因性経路を開始させる細胞内デスドメイン（ＤＤ）を含む。デスドメインを欠いている他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化を引き起こし得る細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体はまた、アポトーシスを開始することもできるが、間接的な機構を介してアポトーシスを開始する。アポトーシスを調節することに加えて、いくつかのＴＮＦスーパーファミリー受容体は、Ｂ細胞恒常性及び活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、及びＴ細胞同時刺激などの免疫細胞機能の調節に関与する。いくつかの他のものは、毛包発達及び破骨細胞発達などの細胞型特異的応答を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーには、以下が含まれる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンパ毒素ベータ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ−１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ−１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ−２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、オステオプロテゲリン（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルスエントリメディエーター（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８、ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳ−１、ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。
【０１０４】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、Ｔ細胞応答を維持するための初期Ｔ細胞活性化後に機能する。「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリー受容体」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを指す。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲからなる群から選択され、それらの全てがＴ細胞に対して共刺激効果を有することができる。より具体的には、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは４−１ＢＢである。
【０１０５】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「４−１ＢＢ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型４−１ＢＢを指す。その用語は、「完全長」で未処理の４−１ＢＢ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを含む。その用語はまた、４−１ＢＢの天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号１０６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）に示され、例示的なマウス４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号１０７（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０３３４）に示され、例示的なカニクイザル４−１ＢＢ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来）のアミノ酸配列は配列番号１０８（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示される。
【０１０６】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、４−１ＢＢを標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特に、抗４−１ＢＢ抗体は、米国特許第７２８８６３８号に開示されているように、クローン２０Ｈ４．９である。
【０１０７】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野において公知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１から１０の数、典型的には２から４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドはＧＧＧＧＳ（配列番号１０９）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１２）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１１３）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１１４）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１６）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１１７）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１１８）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１１９）、ＧＧＳＧ（配列番号１２０）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１２１）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１２２）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１２３）も含む。特に興味のあるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１０９），（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０），（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１１４）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１５）である。
【０１０８】
本出願の中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【０１０９】
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂ断片）が、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【０１１０】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
【０１１１】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が熟考される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させることができる。置換変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は表Ｂの「好ましい置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）から（６）を参照して以下でさらに説明される。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
表Ｂ
2020504622.tif 000003
【０１１２】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１１３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換する必要があろう。
【０１１４】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に作成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、改変が抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内に置換、挿入又は欠失が生じてもよい。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいてなされ得る。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells(1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又はさらに、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１１５】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する本発明の二重特異性抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１１６】
特定の実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖は改変され得る。哺乳類細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般的に結合される分枝鎖の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32(1997)を参照のこと。オリゴ糖は、様々な糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。いくつかの実施態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子におけるオリゴ糖の修飾が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。別の態様では、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体もまた提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１１７】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン改変変異体（cysteine engineered variant）、例えば分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作ることが望ましい場合がある。特定の態様では、置換される残基は抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分に結合させ、イムノコンジュゲートを作るために使用することができる。特定の態様では、以下の残基のうちのいずれかの１つ又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１１８】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１１９】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、通常そのポリヌクレオチド分子を含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は染色体外に又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖形式及びマイナス鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節エレメントであり得るか又はそれらを含み得る。
【０１２０】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の１つ又は複数の連続する群において散在して生じ得る。特定の事項として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを使用して常套的に決定することができる。
【０１２１】
用語「発現カセット」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１２２】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１２３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１２４】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１２５】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１２６】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１２７】
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。
【０１２８】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
【０１２９】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記がんの任意の難治性のもの、又は上記がんのうちの１つ又は複数の組み合わせを含む。
【０１３２】
本発明の二重特異性抗体
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、標的化効率、及び低減された毒性などの特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３３】
例示的な二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み、
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１３４】
特定の態様では、これらの二重特異性抗原結合分子は、４−１ＢＢに対する標的化アゴニスト結合によって特徴づけられる。特に、二重特異性抗原結合分子は、腫瘍関連標的細胞抗原に対して標的化されている４−１ＢＢアゴニストである。
【０１３５】
一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記抗原結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）とを含む。特定の態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１３６】
一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインはＦａｂ断片である。
【０１３７】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、本明細書で前に定義される４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。特に、本発明の二重特異性抗原結合分子は、本明細書で前に定義される４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。別の特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、本明細書で前に定義される４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインを含む。
【０１３８】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むことによってさらに特徴づけられる。従って、二重特異性抗原結合分子は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる従来の抗体を超える利点を有し、それらは標的細胞、典型的にはがん細胞において、共刺激Ｔ細胞応答を選択的に誘導する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＣＤ１９から選択される。１つの特定の態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）から選択される。別の特定の態様では、標的細胞抗原はＣＤ１９である。
【０１３９】
標的細胞抗原がＦＡＰである二重特異性抗原結合分子
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２００６号に記載されている。特に興味のあるＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１４１】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４２】
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４３】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１４４】
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１４５】
４−１ＢＢ及びＦＡＰに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４６】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４７】
マウス４−１ＢＢに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子が提供され、
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１４８】
別の態様では、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子が提供され、
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含み、
ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合し、かつ、（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４９】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５０】
特定の態様では、マウス４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１５１】
標的細胞抗原がＣＥＡである二重特異性抗原結合分子
特定の態様では、標的細胞抗原は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。ＣＥＡ結合部分は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ２）号又は国際公開第２００７／０７１４２６号に記載されている。特に興味のあるＣＥＡ結合部分を以下に記載する。
【０１５２】
一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む。
【０１５３】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５４】
別の態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５５】
さらなる態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５６】
さらなる態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５７】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｃ）配列番号１８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｄ）配列番号１９３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１９４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５８】
一態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１５９】
さらなる態様では、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１６０】
４−１ＢＢ及びＣＥＡに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６１】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６２】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６３】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６４】
標的細胞抗原がＣＤ１９である二重特異性抗原結合分子
特定の態様では、標的細胞抗原はＣＤ１９である。ＣＤ１９結合部分は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載されている。特に興味のあるＣＤ１９結合部分を以下に記載する。
【０１６５】
一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む。
【０１６６】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【０１６７】
別の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【０１６８】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む。
【０１６９】
一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又はＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１７０】
４−１ＢＢ及びＣＤ１９に結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７１】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７２】
二重特異性、一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１７３】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み；
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１７４】
一態様では、標的細胞抗原はＦＡＰである。一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、該分子は
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み；
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１７５】
特定の態様では、本発明は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７６】
４−１ＢＢへの結合に対して二価であり、標的細胞抗原への結合に対して一価である二重特異性抗原結合分子（２＋１フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１７７】
従って、二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対して二価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１７８】
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインがそれぞれペプチドリンカーを介して２つの重鎖のＣ末端の一方に連結している、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
【０１７９】
特定の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４、及び配列番号１１５から選択されるアミノ酸配列を含む。より具体的には、ペプチドリンカーは配列番号１１５を含む。
【０１８０】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインが重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインが第２の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
【０１８１】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインがＦｃノブ重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインがＦｃホール重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
【０１８２】
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１８３】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０１８４】
別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１８５】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０１８６】
さらに特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ｅ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｆ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０１８７】
さらなる態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ｇ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｈ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｉ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｊ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０１８８】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１８９】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０１９０】
４−１ＢＢへの結合に対して二価であり、標的細胞抗原への結合に対して一価である二重特異性抗原結合分子（２＋１  ｃｒｏｓｓＦａｂフォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインはｃｒｏｓｓＦａｂ断片であり；かつ
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０１９１】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインはＦａｂ断片であり、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインはｃｒｏｓｓＦａｂ断片である。
【０１９２】
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片
を含む。
【０１９３】
特定の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４、及び配列番号１１５から選択されるアミノ酸配列を含む。より具体的には、ペプチドリンカーは配列番号１１５を含む。
【０１９４】
一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片を含む抗体の２つの重鎖は、ノブ・イントゥー・ホール変異を含み、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、ノブ変異を含む重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している。別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、ホール変異を含む重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している。
【０１９５】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ（ＣＨＣＬ）断片
を含む。
【０１９６】
別の特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）２つの重鎖のうちの一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している、標的細胞抗原に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨＶＬ）断片
を含む。
【０１９７】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに結合する２つのＦａｂ断片のＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、４−１ＢＢに結合する２つのＦａｂ断片のＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）と２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０１９８】
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１９９】
別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２００】
別の態様では、提供されるのは、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１３のアミノ酸配列を含むさらなる軽鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号２１６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含むさらなる軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【０２０１】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓＦａｂ断片、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２０２】
４−１ＢＢへの結合に対して四価であり、標的細胞抗原への結合に対して一価である二重特異性抗原結合分子（４＋１フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０２０３】
従って、二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２０４】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、かつ、それらの各２つが任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。特定の態様では、ペプチドリンカーは配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。より具体的には、抗原結合分子は、それぞれがＶＨＣＨ１−ペプチドリンカー−ＶＨＣＨ１断片を含む２つの重鎖を含む。特定の態様では、ペプチドリンカーは配列番号１１０のアミノ酸配列を有する。
【０２０５】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインはＶＨ及びＶＬドメインを含み、かつ、ＶＨドメインがＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインがＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結されている。
【０２０６】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の４つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインが重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインが第２の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
【０２０７】
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２０８】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０２０９】
別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１０】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０２１１】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ｅ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２０４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｆ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｇ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｈ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０２１２】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１３】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１４８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１５４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
【０２１４】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。
【０２１５】
特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２１６】
Ｆｃドメインは、標的組織中への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比を含む、本発明の二重特異性抗体に望ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりはむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対しての、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。従って、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０２１７】
１つのそのような態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示し、かつ／又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、エフェクター機能の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌のうちの１つ又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％超、具体的には約８０％超、より具体的には約９０％超を示すときに達成される。
【０２１８】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して、低減した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。別の態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。一態様では、改変されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、Ｆｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈し得る。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低減するように改変される。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができ��。
【０２１９】
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276(2001) 6591-6604を参照のこと）。
【０２２０】
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。より特定の態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又は  Ｐ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、及びＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択されるさらなるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させる。前記文献はまた、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法を記載する。そのような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
【０２２１】
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91(2010)参照）。
【０２２２】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117(1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24(1994) 2429-2434）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ又は複数に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322(1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２２３】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び組換え発現によって得ることができるＦｃ受容体を使用して、容易に決定することができる。適切なそのような結合アッセイが本明細書に記載される。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063(1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502(1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361(1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656(1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０２２４】
以下のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、抗体の、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合親和性を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、エフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０２２５】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合された異なる抗原結合部位を含み、従ってＦｃドメインの２つのサブユニットは２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体形成は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するためには、従って、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに導入することが有利であろう。
【０２２６】
従って、本発明の特定の態様は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０２２７】
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。従って、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、該Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、該Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２２８】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０２２９】
従って、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
【０２３０】
さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter(2001), J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２３１】
別の態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０２３２】
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は短縮されたＣ末端のＰＧである。本明細書中に報告された全ての態様のうちの一態様では、本明細書中に特定されるようなＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書中に報告された全ての態様のうちの一実施態様では、本明細書中に特定されるようなＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２３３】
ＣＨ１／ＣＬドメインにおける修飾
正しい対合をさらに改善するために、二重特異性抗原結合分子は異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ＣＬドメインの少なくとも１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＣＨ１ドメインの少なくとも１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２３４】
より具体的には、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４−１ＢＢに結合するＦａｂドメインのＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、４−１ＢＢに結合するＦａｂドメインのＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）と２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２３５】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆａｂ断片の１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換されている二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２３６】
１つの結合アームにおけるドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer、W.et al、PNAS、108(2011)11187-1191に詳細に記載されている。それらは、第１の抗原に対する軽鎖の第２の抗原に対する誤った重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副産物を（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）明らかに減少させる。
【０２３７】
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆａｂ断片の１つにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗原結合分子に関する（ＣＨ−ＣＬ  ｃｒｏｓｓｍａｂ）。別の態様では、Ｆａｂ断片の１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である（ＶＨ−ＶＬ  ｃｒｏｓｓｍａｂ）。より具体的には、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている。
【０２３８】
特定の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。そのような分子は、一価の二重特異性抗原結合分子と呼ばれる。
【０２３９】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、該分子は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片がそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている、２つの追加のＦａｂ断片を含む。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である。
【０２４０】
従って、一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる前記２つの追加のＦａｂ断片はクロスオーバーＦａｂ断片であり、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され、ＶＬ−ＣＨ鎖はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。
【０２４１】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、該分子は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片がペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖の１つのＣ末端に連結されている、１つの追加のＦａｂ断片を含む。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である。別の態様では、追加のＦａｂ断片は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である。
【０２４２】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２４３】
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０２４４】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２４５】
一態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０２４６】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０２４７】
組換え法
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば組換え産生によって得ることができる。組換え生産のために、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが提供される。二重特異性抗原結合分子をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、１つ又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機���の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２４８】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２４９】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断される、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２５０】
後の精製を容易にするため（例えば、ヒスチジンタグ）、又は融合タンパク質を標識するのを補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
【０２５１】
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう改変できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからポリペプチドを単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414(2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215(2006)を参照のこと。
【０２５２】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59(1977）に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)を参照のこと。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当該技術分野で周知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように改変することができる。
【０２５３】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供され、ここで該方法は、本明細書で提供される本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養すること、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
【０２５４】
本明細書で記載のように調製される本発明の二重特異性分子は、当該技術分野で公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された二重特異性抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
【０２５５】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子が、同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられる。
【０２５６】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体断片の、４−１ＢＢ及び標的細胞抗原に対する親和性を、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを使用して、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。二重特異性抗原結合分子の、その標的細胞抗原に対する親和性も、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例１．２で説明される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２５７】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、その対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。一態様では、４−１ＢＢを発現する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（４−１ＢＢを発現する）を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の、その対応する４−１ＢＢ発現細胞への結合を実証した。さらなる態様では、健常なＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのヘパリン処置血液から単離したＰＢＭＣを使用して、対応するカニクイザル４−１ＢＢ発現細胞に対する二重特異性抗原結合分子又は抗体を示した。
【０２５８】
さらなる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰ又はＣＥＡを発現するがん細胞株を使用して、抗原結合分子の標的細胞抗原への結合を実証した。
【０２５９】
別の態様では、競合アッセイを使用して、特異的抗体又は抗原結合分子と、標的又は４−１ＢＢのそれぞれへの結合について競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、特異的抗標的抗体又は特異的抗４−１ＢＢ抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris(1996) 「Epitope Mapping Protocols」に詳細に示されている。
【０２６０】
３．活性のアッセイ
一態様では、特定の標的細胞抗原及び生物学的活性を有する４−１ＢＢに結合する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上の４−１ＢＢを介したアゴニストシグナル伝達を含み得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのような生物学的活性を有するものとして、本アッセイによって同定された二重特異性抗原結合分子も提供される。
【０２６１】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、そのような生物学的活性について試験される。さらに、細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスキネティクスを検出するためのアッセイ（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用する）は、当該技術分野において周知である。加えて、そのような複合体の生物学的活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
【０２６２】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又は抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の他の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの追加的治療剤とを、例えば後述するように含む。
【０２６３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に溶解又は分散された１つ又は複数の二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも１つの本発明による二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加の活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示に照らして当業者には公知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者には周知であるように、任意の及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせを含む。
【０２６４】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの製剤関連薬剤を含むことができる。あるいは、二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）を用いた組成用の粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の抗原結合分子を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその液体媒質から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、十分な生理食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。内毒素汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。適切な薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含まれ得る。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含むことができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２６５】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって作られたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０２６６】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２６７】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０２６８】
前に記載した組成物に加えて、抗原結合分子はデポー製剤としても製剤化することができる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２６９】
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２７０】
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、水性及び他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。
【０２７１】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な１つを超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２７３】
治療的方法及び組成物
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかが、治療方法において使用され得る。
【０２７４】
治療法における使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、投与され得る。これに関連して考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。
【０２７５】
一態様では、医薬としての使用のための本発明の二重特異性抗原結合分子又が提供される。
【０２７６】
さらなる態様では、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激又は増強することに使用のため、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することに使用のため、（ｉｉｉ）感染症の治療における使用のため、（ｉｖ）がんの治療における使用のため、（ｖ）がんの進行を遅延させることに使用のため、又は（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、疾患の治療、特にがんの治療における使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２７７】
特定の態様では、治療方法における使用のための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様では、治療される疾患はがんである。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２７８】
一態様では、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激又は増強する、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持する、（ｉｉｉ）感染症を治療する、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、又は（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長するための方法が提供され、ここで、該方法は、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０２７９】
さらなる態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの例には、限定されないが、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。がんの他の例には、カルシノーマ、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を使用して治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は治癒をもたらし得ないが、恩恵を提供し得ることを容易に認識する。いくつかの態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。従って、いくつかの態様では、生理的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【０２８０】
疾患の予防又は治療のために、本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な用量は（単独で使用されるか、あるいは１つ又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、特定の分子、疾患の重症度及び経過、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が予防目的又は治療目的のために投与されるのかどうか、以前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。いずれの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２８１】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回で、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１μｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ、体重１ｋｇあたり約１０μｇ、体重１ｋｇあたり約５０μｇ、体重１ｋｇあたり約１００μｇ、体重１ｋｇあたり約２００μｇ、体重１ｋｇあたり約３５０μｇ、体重１ｋｇあたり約５００μｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ又はそれ以上、及びそこから導かれるあらゆる範囲を含み得る。本明細書に列挙した数値からの誘導可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇから体重１ｋｇあたり約１ｍｇなどが投与され得る。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）が患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が融合タンパク質の約２から約２０用量、例えば約６用量を受けるように）投与され得る。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は３週間ごとに投与されるであろう。初回の高負荷用量の後、１つ又は複数の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２８２】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくは抗体又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２８３】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
【０２８４】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を使用して推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２８５】
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の血漿レベルを提供するために個々に調整されてもよい。注射による投与のための通常の患者投与量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．１から１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２８６】
局所投与又は選択的取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２８７】
本明細書に記載される本発明の二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養アッセイ及び動物試験を使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照のこと。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２８８】
本発明の二重特異性抗体を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することも分かっているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０２８９】
その他の薬剤及び治療
本発明の二重特異性抗原結合分子は、治療において、単独で、又は１つ若しくは複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、少なくとも１つの追加的治療剤と同時投与され得る。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加的治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加的治療剤は、別の抗がん剤又は化学療法剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、アントラサイクリン、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。特定の態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。
【０２９０】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、化学療法剤、放射線療法、及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される。化学療法剤は、上記で定義されたような抗がん剤である。あるいは、化学療法剤は、ヌクレオチド類似体（例えば、アザシチジン、カペシタビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素又はメトトレキサート）、白金系薬剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン又はオキサリプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン又はタキソテール）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン又はテモゾロミド）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はイダルビシン）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン又はトポテカン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド又はテニポシド）、キナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ又はビスモデギブ）、レチノイド、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びビンカアルカロイドからなる群から選択される。がん免疫療法における使用のための他の薬剤には、例えばＰＤ１抗体（例えばペンブロリズマブ又はニボルマブ）又はＰＤ−Ｌ１抗体（例えばアテゾリズマブ）などのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤が含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２９１】
このような他の薬剤は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
【０２９２】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与が、追加的治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。一態様では、二重特異性抗原結合分子の投与及び追加的治療剤の投与は、互いに、約１か月以内又は約１、２、若しくは３週間以内、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に生じる。
【０２９３】
製造品
本発明の他の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。
【０２９４】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を治療するために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗原結合分子を含有する組成物を中に収容する第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含有する組成物を中に収容する第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の症状を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０２９５】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
表Ｃ（配列）：
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【０２９６】
全てのヌクレオチド配列は、それぞれの終止コドン配列なしで提示される。
【０２９７】
発明の態様
以下の番号付けされた項（パラグラフ）は、本発明の態様を説明する。
１．４−１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、
ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、二重特異性抗原結合分子。
【０２９８】
２．４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）とを含む、項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２９９】
３．４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３００】
４．４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインがＦａｂ断片である、項１から３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０１】
５．標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、項１から４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０２】
６．標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、項１から５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０３】
７．線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、項１から６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０４】
８．線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、項１から７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０５】
９．
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項１から８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０６】
１０．
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項１から８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０７】
１１．標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、項１から５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０８】
１２．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、項１から５、又は１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３０９】
１３．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｃ）配列番号１８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｄ）配列番号１９３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び配列番号１９４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、項１から５、又は１１又は１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１０】
１４．
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項１から５、又は１１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１１】
１５．
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項１から５、又は１１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１２】
１６．標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、項１から５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１３】
１７．ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、項１から５、又は１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１４】
１８．ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号１７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、項１から５、又は１６又は１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１５】
１９．
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項１から５、又は１６から１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１６】
２０．
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項１から５、又は１６から１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１７】
２１．二重特異性抗原結合分子が、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、項１から２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１８】
２２．Ｆｃドメインが、抗原結合分子のＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、項１から２１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３１９】
２３．Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、項１から２２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２０】
２４．Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、項１から２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２１】
２５．Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、項１から２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２２】
２６．４−１ＢＢに特異的に結合することができる各抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つ以上の抗原結合ドメインを含む、項１から２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２３】
２７．
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、項１から２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２４】
２８．二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対して二価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である、項１から２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２５】
２９．
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインが重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインが第２の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む、項１から２６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２６】
３０．  
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、項２７から２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２７】
３１．
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｅ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、項２７から２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２８】
３２．
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、項１から２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３２９】
３３．二重特異性抗原結合分子が、４−１ＢＢに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である、項１から２６、又は３２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３３０】
３４．４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、かつ、それらの各２つが任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している、項１から２６、又は３２又は３３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３３１】
３５．標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＶＨ及びＶＬドメインを含み、かつ、ＶＨドメインがＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、ＶＬドメインがＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結されている、項１から２６、又は３２から３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３３２】
３６．
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、項３２から３５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３３３】
３７．
（ａ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号４６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、項２７から３０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０３３４】
３８．項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【０３３５】
３９．項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【０３３６】
４０．医薬としての使用のための、項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項３９に記載の薬学的組成物。
【０３３７】
４１．
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項３９に記載の薬学的組成物。
【０３３８】
４２．がんの治療における使用のための、項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項３９に記載の薬学的組成物。
【０３３９】
４３．二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療における使用のための、項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項３９に記載の薬学的組成物。
【０３４０】
４４．腫瘍細胞の増殖を阻害するために、項１から３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は項３９に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【実施例】
【０３４１】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０３４２】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０３４３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０３４４】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成されるか、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを，標準的なクローニング／配列決定ベクターにクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にするために適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０３４５】
タンパク質の精製
標準プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質をＰＢＳ又は２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．０中でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を使用して濃縮し（必要に応じて）、−２０℃又は−８０℃で凍結し、保存した。試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
【０３４６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４−１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤泳動用緩衝液添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）泳動用緩衝液を使用した。
【０３４７】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の測定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上の３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５の中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに又はＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステム上の２ｘＰＢＳの中のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄゲルろ過スタンダード１５１−１９０１が標準の役割を果たした。
【０３４８】
質量分析
このセクションでは、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ／ＣＬ交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）の特徴づけについて、それらの正確な組み立てに重点を置いて記載する。期待される一次構造は、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ、及び脱グリコシル化／プラスミン消化ＣｒｏｓｓＭａｂ又は代わりに脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析された。
【０３４９】
ＣｒｏｓｓＭａｂを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３７℃で最大１７時間、リン酸又はトリス緩衝液中でＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン消化又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化は、脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂ１００μｇを用いて、トリス緩衝液ｐＨ８中で室温で１２０時間、３７℃で４０分間、それぞれ行った。質量分析に先立ち、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＰＬＣにより試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ−ＭＳによって全質量を測定した。
【０３５０】
実施例１
４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特徴づけ
１．１  ４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して二価結合及びＦＡＰに対して一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図１Ａ及び１Ｂに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０３５１】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダーのＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合している。ＦＡＰバインダー４Ｂ９の生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されている。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。２つの重鎖の組み合わせにより、ＦＡＰ結合部分及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０３５２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０３５３】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ  抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０３５４】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表１に見いだすことができる。
【０３５５】
表１：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、以下の表３においてホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０３５６】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表２に見いだすことができる。
【０３５７】
表２：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、以下の表３においてホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０３５８】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１を添加した。７日間培養した後、細胞上精を、２１０×ｇで１５分間の遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０３５９】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０にわたって作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０から５００ｍＭ）を使用して溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０３６０】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７の泳動用緩衝液中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した（表３）。
【０３６１】
表３：４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（２＋１  ４−１ＢＢ／ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の生化学的分析
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【０３６２】
抗原及びスクリーニングツールのヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）の調製：
ヒト４−１ＢＢのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（Ｑ０７０１１に従って合成）を、ノブについてのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとフレーム内にサブクローニングした。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、４−１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す。表４は、抗原Ｆｃ融合構築物のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【０３６３】
表４：単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子（１つのＦｃホール鎖と１つの抗原Ｆｃノブ鎖との組み合せによって産生される）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列
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【０３６４】
１．２  ４−１ＢＢ二価及びＦＡＰ一価を標的とする二重特異性抗体（２＋１抗原結合分子）の結合
１．２．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰへ同時に結合する能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、泳動用緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０３６５】
ビオチン化ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大４００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。４−１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、第２の被分析物として、５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通して注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。アッセイの設定を図２Ａに示す。
【０３６６】
全ての二重特異性構築物は、ヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた（図２Ｂ）。
【０３６７】
１．２．２  ヒト４−１ＢＢへの結合−二価抗４−１ＢＢ抗原結合分子の競合アッセイ
我々の２＋１抗４−１ＢＢ抗原結合分子がｈｕ  ４−１ＢＢに結合する能力を確認するために、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイ（ＴａｇＬｉｔｅ）を適用した。従って、ｈｕ４−１ＢＢ−ＳＮＡＰ融合体でトランスフェクトし、ＦＲＥＴドナーテルビウム（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した２５００個のＨｅｋ２９３  ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、ＦＲＥＴアクセプターｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した０．６ｎＭの抗４−１ＢＢ  ２０Ｈ４．９のいずれかと混合した。さらに、非標識ＩｇＧ（２０Ｈ４．９）又は二価（２０Ｈ４．９／４Ｂ９  ２＋１）二重特異性抗体の０．００６−１０００ｎＭの範囲の濃度希釈物を添加して、室温で２−４時間インキュベートした。蛍光シグナルは、蛍光ドナー（Ｔｅｒｂｉｕｍ）については６２０ｎｍで、蛍光アクセプター色素（Ｍ１００  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）については６６５ｎｍで測定した。６６５／６２０＊１０００の比率を計算し、基準（細胞のみ）を差し引いた。ＥＣ５０の決定のために、結果をＧｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。４時間のインキュベーション後に観察された５０値を表５に示す。二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ抗原結合分子（２０Ｈ４．９／４Ｂ９  ２＋１）の競合は、親ＩｇＧについて観察されたものと同じである（図３）。
【０３６８】
表５：二価４−１ＢＢ抗原結合分子の競合的結合に対するＥＣ５０値
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【０３６９】
実施例２
４−１ＢＢへの四価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特徴づけ
２．１  ４−１ＢＢへの四価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して四価結合及びＦＡＰに対して一価結合（４＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図４Ａ及び４Ｂに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０３７０】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合している。ＦＡＰバインダー４Ｂ９の生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されている。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。２つの重鎖の組み合わせにより、ＦＡＰ結合部分及び４つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。
【０３７１】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０３７２】
二重特異性４＋１抗４−１ＢＢ  抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０３７３】
抗原結合分子は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例１．１を参照のこと）。
【０３７４】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表６に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表７に見いだすことができる。
【０３７５】
表６：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０３７６】
表７：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＦＡＰ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０３７７】
表８：４−１ＢＢへの四価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（４＋１  ４−１ＢＢ／ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の生化学的分析
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【０３７８】
２．２  ４−１ＢＢ四価及びＦＡＰ一価を標的とする二重特異性抗体（４＋１抗原結合分子）の結合
２．２．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、泳動用緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０３７９】
ビオチン化ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大４００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。４−１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、第２の被分析物として、５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通して注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。全ての二重特異性構築物は、ヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた（図５Ｂ）。
【０３８０】
２．３  ヒト４−１ＢＢへの結合−二価対四価抗４−１ＢＢ構築物の競合アッセイ
４つ全ての抗４−１ＢＢ  Ｆａｂドメインのｈｕ４−１ＢＢに結合する能力を確認するために、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイ（ＴａｇＬｉｔｅ）を適用した。従って、ｈｕ４−１ＢＢ−ＳＮＡＰ融合体でトランスフェクトし、ＦＲＥＴドナーテルビウム（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した２５００個のＨｅｋ２９３  ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、ＦＲＥＴアクセプターｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した０．６ｎＭの抗４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９  ＩｇＧのいずれかと混合した。さらに、非標識抗４−１−ＢＢ  ＩｇＧ（２０Ｈ４．９）、二価（２０Ｈ４．９／４Ｂ９  ２＋１）又は四価（２０Ｈ４．９／４Ｂ９  ４＋１）二重特異性構築物の０．００６−１０００ｎＭの範囲の濃度希釈物を添加して、室温で２−４時間インキュベートした。蛍光シグナルは、蛍光ドナー（Ｔｅｒｂｉｕｍ）については６２０ｎｍで、蛍光アクセプター色素（Ｍ１００  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）については６６５ｎｍで測定した。６６５／６２０＊１０００の比を計算し、基準（細胞のみ）を差し引いた。ＥＣ５０の決定のために、結果をＧｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。４時間のインキュベーション後に観察された５０値を表９に示す。四価の４＋１  ２０Ｈ４．９抗原結合分子は、ＩｇＧ対応物よりも良好に競合する（図６）。
【０３８１】
表９：二価対四価４−１ＢＢ結合分子の競合的結合に対するＥＣ５０値
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【０３８２】
２．４  細胞への結合
２．４．１  ヒト４−１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ヒト４−１ＢＢの発現は、休止（ナイーブ）ヒトＴ細胞には存在しない（Kienzle G. and von Kempis J(2000), Int. Immunol. 12(1):, 73-82, Wen T. et al.(2002), J. Immunol. 168, 4897-4906）。固定化抗ヒトＣＤ３アゴニスト抗体による活性化後、４−１ＢＢはＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上で上方制御される。４−１ＢＢの発現は、活性化ヒトＮＫ細胞（Baessler T. et. al.(2010) Blood 115(15), 3058-3069）、活性化ヒトＮＫＴ細胞（Cole S.L. et al.(2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907）、活性化ヒトＢ細胞（Zhang et al.(2010) J. Immunol. 184(2), 787-795）、活性化ヒト好酸球（Heinisch et al. 2001）、恒常的にヒト好中球（Heinisch I.V.(2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21-28）、活性化ヒト単球（Langstein J.et al.(1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494, Kwajah M. and Schwarz H.(2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949）、恒常的にヒト制御性Ｔ細胞（Bacher P. et al.(2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928）、ヒト濾胞性樹状細胞（Pauly S. et al.(2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42）、活性化ヒト樹状細胞（Zhang L. et al.(2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76）及び悪性ヒト腫瘍の血管（Broll K. et al.(2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549）についても報告されている。
【０３８３】
本発明者らの抗４−１ＢＢ抗原結合分子の天然に細胞発現されたヒト４−１ＢＢへの結合を試験するために、休止末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＰＨＡ−Ｌ／Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及びＣＤ３／ＣＤ２８再活性化ＰＢＭＣを使用した。チューリッヒ献血センターから得られたバフィコートからのＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を使用したフィコール密度遠心分離によって単離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸＩ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止細胞）、又は６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、ＣＨＣＬＢ−Ｐ−４７６−７００−１０３４０）及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｌ２７６９）を補充したＴ細胞培地中で３から５日間培養し、次いで２日間、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９２８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート中で、３７℃、５％ＣＯ２でＴ細胞培地において培養することによって、Ｔ細胞の細胞表面で４−１ＢＢ発現を誘導するように刺激された。
【０３８４】
ヒトＰＢＭＣによって発現されるヒト４−１ＢＢへの結合を決定するために、０．１−０．２×１０６個の新たに単離された、例えば休止又は活性化ＰＢＭＣを、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳと共に４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を、２００μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、滴定された二重特異性ＦＡＰ標的化抗ヒト４−１ＢＢ抗体を含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液の５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して、結合していない分子を除去した。その後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）、抗ヒトＣＤ４５  ＡＦ４８８（クローンＨＩ３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０１９）、０．６７μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ１κ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４３０）、０．１２５μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４  ｍｏＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）又は０．２３μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ２ｂκ（クローンＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、０．３３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８−ＢＶ５１０（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７３２）及び０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ／Ｃｙ７（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＨＩＢ１９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２１６）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液と共にさらにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁することにより固定した。細胞を、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、同日又は翌日に取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）を使用して、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値（一次抗体を添加せず）を差し引いてデータをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を使用して計算した。
【０３８５】
ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞は、休止状態では４−１ＢＢ発現を欠くが、活性化後に４−１ＢＢを上方制御する。ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、記載された活性化条件下でＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも強い上方制御を示す。生成された抗ヒト４−１ＢＢ特異的抗体は、活性化ヒトＴ細胞によって発現されるヒト４−１ＢＢに結合することができるが（図７Ｃ及びＤ）、一方、休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞では、有意な結合を検出することはできない（図７Ａ及びＢ）。結合は、細胞の４−１ＢＢ発現レベルによって影響を受け、例えば、４−１ＢＢ特異的分子は、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞（図７Ｃ）よりも活性化ＣＤ８  Ｔ細胞（図７Ｄ）に強く結合し、かつ、そのフォーマットによって影響を受け、例えば、二価の４−１ＢＢバインダー（ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ及び２＋１フォーマット）は四価の４−１ＢＢバインダー（４＋１フォーマット）とは異なって結合する。四価の４−１ＢＢ結合は、４−１ＢＢ特異的エピトープに対する内部競合のためにＭＦＩの減少をもたらす。おそらく方法に関連した限られた感度のために、ＥＣ５０（表１０に列挙）に変化は見られない。Ｔａｇｌｉｔｅアッセイ（図６）はより高感度（洗浄工程なし）であり、二価と四価の４−１ＢＢ結合との間のＥＣ５０の差を明らかに示している。
【０３８６】
図８Ａ及び８Ｂにおいて、結合曲線下面積（ＡＵＣ）が示されている。活性化ＣＤ８  Ｔ細胞では、４−１ＢＢ結合の明らかな減少が次の順序で見られる：４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ＞４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１＞４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１。ＦＡＰ結合ドメインのＦｃドメインへの融合は、エピトープをマスキングすることによってポリクローナルＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片の結合を妨げる場合があり、より弱い検出をもたらす。これは、両方の分子が二価の４−１ＢＢ結合側を示すという事実にもかかわらず、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡと４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１との間の結合特性の低下を説明し得る。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１＞４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１の間のＡＵＣの違いは、上記で説明したように、４−１ＢＢ特異的エピトープについての内部競合によって説明され得る。
【０３８７】
表１０：フローサイトメトリーによって決定された、活性化及び４−１ＢＢ発現ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合曲線のＥＣ５０値。
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【０３８８】
２．４．２  ヒトＦＡＰ発現細胞への結合
細胞表面発現ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）への結合については、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞又はヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）を使用した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９は、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を、ＣＭＶプロモーター下でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドでトランスフェクションすることによって生成した。１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ−ｐｒ−５）の存在下で細胞を維持した。２×１０５個のＦＡＰ発現腫瘍細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５  ０８６３  １８）又はＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを４℃で３０時間インキュベートし、２００μＬの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後細胞を、４−１ＢＢ特異的ＦＡＰ標的化抗体及び非標的化抗体の異なる滴定濃度を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて４℃で１時間インキュベートした。２００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液で４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで固定のために１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日又は翌日、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して取得した。
【０３８９】
図９に示されるように、ＦＡＰ標的化分子は（しかしＦＡＰ非標的化ｈｕＩｇＧ１  Ｐ２９３Ｇ  ＬＡＬＡ分子ではなく）、ヒトＦＡＰ発現ＷＭ−２６６−４細胞（図９Ａ）及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（図９Ｂ）に効率的に結合する。従って、ＦＡＰ結合側を含むことは、ヒトＦＡＰ発現細胞に対する効率的な標的化効果を誘導する。結合曲線のＥＣ５０値並びに曲線下の値を表１１に列挙する。
【０３９０】
表１１：ＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９及びＷＭ−２６６−４への結合のＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）の値
2020504622.tif 000048
【０３９１】
２．５  ＮＦκＢの活性化
２．５．１  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）の配列を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０３９２】
４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーにより４−１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して取得した。記載されるように、限定希釈を行って単一クローンを生成した：ヒト４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、細胞懸濁液２００μＬを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一クローンを収集し、増殖させ、上記のように４−１ＢＢ発現について試験した。４−１ＢＢの最も高い発現を有するクローン（クローン５）を、その後のＮＦκＢ−ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢによるトランスフェクションのために選択した。このベクターは、トランスフェクトされた細胞に、ＮＦ−ｋＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下で、ハイグロマイシンＢに対する耐性及びルシフェラーゼを発現する能力の両方を与える。トランスフェクションのために、ヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌０．４ｃｍ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５−２０８１）に添加した。２．５×１０６個のヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を４００μｌの無添加ＤＭＥＭ培地に添加し、プラスミド溶液と注意深く混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５  ２６６０）を使用して以下の設定で細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％のＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸＩを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含む培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一クローンを生成した。
【０３９３】
クローンを、上記のように４−１ＢＢ発現について、及び以下のようにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地中に収集し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ｘｒ  ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を使用して計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋の付いた滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移した。細胞を細胞培養器（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ）中で３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し（４０μｌ）、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、プレートを可能な限り迅速に測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦαを添加せず）より上の５００ｍｓ／ウェル（ＵＲＬ）で放出された光の測定単位をルシフェラーゼ活性とした。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃクローン２６は、最も高いルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４−１ＢＢ発現を示し、さらなる使用のために選択された。
【０３９４】
２．５．２  ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養したＨｅＬａ発現ヒト４−１ＢＢ及びルシフェラーゼレポーター細胞株におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃクローン２６細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定したＦＡＰ標的化抗ヒト４−１ＢＢ構築物又はそれらの親ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を含む培地５０μＬを添加した。ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９又はＷＭ−２６６−４を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。
【０３９５】
ＦＡＰ発現腫瘍細胞の懸濁液（５０μｌ）又は陰性コントロールとしての培地を各ウェルに添加し、プレートを細胞インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
【０３９６】
図１０において、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株を使用した異なるＦＡＰ標的化４−１ＢＢ特異的構築物の活性化特性が示されている。図１０Ａにおいて、ＦＡＰ発現細胞の非存在下での活性化特性が示されている。四価の４−１ＢＢ結合側を含む分子４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（灰色の塗りつぶされた四角形）のみが、強力な活性化を誘導することができる。二価の４−１ＢＢ結合側のみを含む分子はこの強力な活性化を誘導することができず、４−１ＢＢ活性化はエフェクター細胞の表面上の４−１ＢＢ分子の強力な架橋に依存することを示している。次のブロットにおいて、ＦＡＰ発現腫瘍細胞を、中程度レベルのＦＡＰを発現するヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（図１０Ｂ）、又は高レベルのヒトＦＡＰを発現するようにトランスフェクトされたマウス線維腫細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３（図１０Ｃ）の形で添加した。ＦＡＰ標的化分子がこのＦＡＰ発現腫瘍細胞を介して架橋されるとすぐに、４−１ＢＢ結合側は、レポーター細胞株表面上の４−１ＢＢの強力な架橋をもたらし、ＮＫｋＢ媒介ルシフェラーゼ発現の強力な活性化を誘導する。４−１ＢＢ結合側の部分とは無関係に、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１及び４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１の活性化はかなり似ている。２＋１フォーマットと４＋１フォーマットとの間の唯一の明らかな違いは、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の非存在下で見られる。曲線下のフィッティング面積（ＡＵＣ）を図１１に示し、ＥＣ５０値は表１２に列挙される。
【０３９７】
表１２：ＦＡＰ発現細胞の存在下におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化のＥＣ５０値
2020504622.tif 000049
【０３９８】
２．６  ＦＡＰ発現細胞の存在下でのヒトＰＢＭＣの活性化アッセイ
アゴニスト４−１ＢＢバインダー２０Ｈ４．９のＦＡＰ結合媒介架橋については、ＦＡＰ発現接着細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９を使用した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞をＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０３２６）で洗浄し、酵素を含まないＰＢＳベースのＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号１３１５１−０１４）で３７℃で１０分間処理した。細胞を収集し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、米国産、ＰＡＮ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０−２００９、Ｌｏｔ  Ｐ１５０３０７ＧＩ、ガンマ線照射マイコプラズマフリー、５６℃で３５分間の熱不活性化）、１％のＬ−ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％のＭＥＭ−非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、５０μＭのβ−メルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１−０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁し、５０Ｇｙ（Ｘ線照射装置ＲＳ２０００、Ｒａｄ  ｓｏｕｒｃｅ）を照射した。５０μＬのＴ細胞培地中の２×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、丸底組織培養９６ウェルプレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２６９７）の各ウェルに播種した。異なる滴定濃度の４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１又はコントロール分子４−１ＢＢ（１２Ｂ３）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３１９８に記載されている）及びＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを含むＴ細胞培地５０μＬがそれぞれ添加された。ヒトＰＢＭＣを、３７℃で１５分間、４０ｎＭのＣＦＤＡ−ＳＥ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８８−２５ＭＧ−Ｆ）を含む３７℃の温かいＤＰＢＳ中で標識した。ＦＢＳを添加することによってＣＦＳＥ標識を停止し、ＰＢＭＣを２回洗浄し、１．５×１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度までＴ細胞培地に再懸濁した。このＰＢＭＣ細胞溶液５０μＬを各ウェルに播種して、７．５×１０４個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣをウェルに添加した。最後に、２ｍＭのアゴニスト抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を含むＴ細胞培地のストック溶液を調製し、５０μＬ／ウェルを各ウェルに添加して、最終濃度０．５ｍＭの抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を得た。
【０３９９】
プレートを３７℃で４日間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１：１０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで１回洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ１３７マウスＩｇＧ１κ（クローン４Ｂ４−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、０．１μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＰＤ−１マウスＩｇＧ１κ（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８）、０．０３μｇ／ｍＬのＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ２５マウスＩｇＧ１κ（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１０）、０．０６μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８マウスＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３０１０１６）、ＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）を含む、５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給されたＤＰＢＳ）で４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３  Ｐｅｒｍ／Ｆｉｘ緩衝液と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ結合１：２５０希釈抗ヒトグランザイムＢマウスＩｇＧ１κ（クローンＧＢ１１、ロット４２６９８０３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５６１１４２）を供給した５０μＬ／ウェルの新たに調製したＰｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−８３３３）に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、細胞を１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含むＤＰＢＳで１５分間固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０４００】
図１２に示すように、ＦＡＰ標的化アゴニスト４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）２＋１及び４＋１抗原結合分子は、最適以下のＣＤ３刺激の存在下において、ＣＤ２５の上方制御、並びにＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖の改善を誘導することができる。両方の分子は、陽性コントロールとして添加され、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３１９８に以前に記載されている分子４−１ＢＢ（１２Ｂ３）×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１よりも優れた効果を示している。従って、ＦＡＰ発現細胞及び最適以下のＴＣＲ刺激の存在下では、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）アゴニストは、そのフォーマットとは無関係にＴ細胞活性化及び増殖を誘導することができ、例えば、４＋１二重特異性抗原結合分子は、２＋１二重特異性抗原結合分子よりも効率的ではない。
【０４０１】
図１３において、図１２の曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。ベースライン活性化として、コントロール分子（非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）のＡＵＣを示す。フィッティングＥＣ５０値が表１３に列挙される。
【０４０２】
表１３：ヒトＰＢＭＣ活性化曲線のＥＣ５０値
2020504622.tif 000050
【０４０３】
実施例３
４−１ＢＢへの一価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特徴づけ
３．１  ４−１ＢＢへの一価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して一価結合及びＦＡＰに対して一価結合（１＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図１Ｃに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０４０４】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１とそれに続くＦｃノブ。第２の重鎖ＨＣ２は、抗ＦＡＰ（クローン４Ｂ９）のＶＬＣＨ１とそれに続くＦｃホールから構成された。正しい対合を改善するために、以下の変異（荷電変異体）が抗４−１ＢＢ（Ｆｃノブ鎖）のＣＨ−ＣＬに導入されている：ＣＬにおいてＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ＣＨ１においてＫ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。ＦｃノブとＦｃホール鎖との組み合わせは、１つのＦＡＰ結合Ｆａｂ及び１つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にした。
【０４０５】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【０４０６】
１＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡのアミノ酸配列は、表１４に見いだすことができる。
【０４０７】
表１４：二重特異性、一価抗４−１ＢＢ／一価抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列
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【０４０８】
二重特異性１＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０４０９】
トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をｅｖｉＭａｋｅ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）培地中の無血清懸濁液中で培養する。７日後、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中において３７℃にて、培養上清を精製のために遠心分離により収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍフィルター）、４℃に保った。
【０４１０】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０にわたって作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を使用して溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１６／６００  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４１１】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７の泳動用緩衝液中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０４１２】
表１５：４−１ＢＢへの一価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（１＋１  ４−１ＢＢ／ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の生化学的分析
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【０４１３】
３．２  機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴づけ：４−１ＢＢとＦＡＰの同時結合を介したＮＦκＢ活性化を誘導する能力
３．２．１  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）の配列を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０４１４】
４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーにより４−１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して取得した。記載されるように、限定希釈を行って単一クローンを生成した：ヒト４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、細胞懸濁液２００μＬを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一クローンを収集し、増殖させ、上記のように４−１ＢＢ発現について試験した。４−１ＢＢの最も高い発現を有するクローン（クローン５）を、その後のＮＦκＢ−ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢによるトランスフェクションのために選択した。このベクターは、トランスフェクトされた細胞に、ＮＦκＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下で、ハイグロマイシンＢに対する耐性及びルシフェラーゼを発現する能力の両方を与える。トランスフェクションのために、ヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌０．４ｃｍ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５−２０８１）に添加した。２．５×１０６個のヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を４００μｌの無添加ＤＭＥＭ培地に添加し、プラスミド溶液と注意深く混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５２６６０）を使用して以下の設定で細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、無制限の抵抗。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％のＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸＩを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含む培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一クローンを生成した。
【０４１５】
クローンを、上記のように４−１ＢＢ発現について、及び以下のようにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地中に収集し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ｘｒ  ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を使用して計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋の付いた滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移した。細胞を細胞培養器（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ）中で３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し（４０μｌ）、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、プレートを可能な限り迅速に測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦαを添加せず）より上の５００ｍｓ／ウェル（ＵＲＬ）で放出された光の測定単位をルシフェラーゼ活性とした。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃクローン２６は、最も高いルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４−１ＢＢ発現を示し、さらなる使用のために選択された。
【０４１６】
３．２．２  ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養したヒト４−１ＢＢレポーター細胞株を発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定濃度の４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）１＋１、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ４、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ又は非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを含む培地５０μＬが添加された。ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。ＦＡＰ発現ＷＭ−２６６−４細胞の懸濁液（５０μｌ）又は陰性コントロールとしての培地を各ウェルに添加し、プレートを細胞インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
【０４１７】
図１０Ｄ及び１０Ｅにおいて、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株を使用した、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）１＋１（黒色の塗りつぶされた菱形）、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ４（白抜きの黒色六角形、点線）、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（塗りつぶされた灰色の四角形）又は非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（白抜きの灰色の丸、点線）の活性化特性が示されている。図１０Ｄにおいて、ＦＡＰ発現ＷＭ−２６６−４の非存在下での活性化特性、図１０Ｅにおいて、ＷＭ−２６６−４細胞の存在下での活性化特性を試験した。いかなる架橋も存在しない場合、活性化は４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ４（白抜きの黒色六角形）についてのみ見られ、不活性ＦｃγＲ結合Ｆｃ部分を含む４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（塗りつぶされた灰色の四角形）についてはより少ない程度で見られる。ＦＡＰ架橋の存在下において、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＦＡＰ（４Ｂ９）１＋１（黒色の菱形）は、同時に結合するその能力のために最も強い活性化潜在力を示し、従って、レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−Ｌｕｃクローン２６細胞の表面上の４−１ＢＢ受容体のＦＡＰ媒介架橋を示している。ＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を表１６に列挙し、ＡＵＣ値を図１１Ａから１１Ｃにも同様に示す。
【０４１８】
表１６：ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在下におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化のＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）
2020504622.tif 000054
【０４１９】
実施例４
４−１ＢＢへの二価結合及び非標的化ＶＨ及びＶＬ部分を有する二重特異性抗原結合分子（コントロール分子）の調製、精製及び特徴づけ
４．１  ４−１ＢＢへの二価結合及び非標的化ＶＨ及びＶＬ部分を有する二重特異性抗体（ＤＰ４７生殖系列コントロール）の生成
【０４２０】
４−１ＢＢに対して二価の結合を有し、非標的化（ＤＰ４７）ＶＨ及びＶＬ部分を含む二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体を、実施例１の２＋１フォーマットと同様に、図１Ａ及び１Ｂに示すように調製した。
【０４２１】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に非結合クローン（ＤＰ４７）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に非結合クローン（ＤＰ４７）のＶＬ又はＶＨが融合している。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。Ｆｃノブとホール鎖との組み合わせは、非結合部分（ＤＰ４７）及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０４２２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【０４２３】
ノブに融合した、２＋１抗４−１ＢＢ、非標的化（ＤＰ４７）ＶＨ、及びホール鎖に融合したＶＬのアミノ酸配列はそれぞれ表１７に見いだすことができる。ノブに融合した、２＋１抗４−１ＢＢ、非標的化（ＤＰ４７）ＶＬ、及びホール鎖に融合したＶＨのアミノ酸配列はそれぞれ表１８に見いだすことができる。
【０４２４】
表１７：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／非標的化ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したＤＰ４７  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、以下でホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000055
【０４２５】
表１８：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したＤＰ４７  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０４２６】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ  ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。産生は、実施例１に記載されるように行われた。
【０４２７】
実施例５
マウス４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
５．１  マウス４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して二価結合及びＦＡＰに対して一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニストマウス４−１ＢＢ抗体が、図１Ａ及び図１Ｂと同様にして調製された。この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１、それに続いて変異Ｌｙｓ３９２Ａｓｐ及びＬｙｓ４０９Ａｓｐを含むＦｃ（Ｆｃ−ＤＤと呼ばれる）、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１、それに続いて変異Ｇｌｕ３５６Ｌｙｓ及びＡｓｐ３９９Ｌｙｓを含むＦｃ（Ｆｃ−ＫＫと呼ばれる）、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＶＨ又はＶＬが融合している。抗体Ｆｃヘテロ二量体形成を増強するためのＤＤＫＫ変異は、とりわけ、Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010,19637-19646に記載されている。標的化抗ＦＡＰ−ＦｃＤＤと抗４−１ＢＢ−ＦｃＫＫ鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合部分及び２つのネズミ科マウス４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０４２８】
マウスＦｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Baudino et al. J. Immunol.(2008), 181, 6664-6669、又は国際公開第２０１６／０３０３５０（Ａ１）号記載された方法に従って、ＤＡＰＧ変異が重鎖の定常領域に導入された。簡潔には、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ａｓｐ２６５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ変異がＦｃ−ＤＤ及びＦｃ−ＫＫ重鎖の定常領域に導入された（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；すなわちＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
【０４２９】
Ｆｃ−ＫＫに融合したａ−ＦＡＰ（２８Ｈ１）ＶＨ及びＦｃ−ＤＤ鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表１９に見いだすことができる。Ｆｃ−ＫＫに融合したａ−ＦＡＰ（２８Ｈ１）ＶＬ及びＦｃ−ＤＤ鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表２０に見いだすことができる。
【０４３０】
表１９：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）／抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧ抗原結合分子の配列（Ｆｃ−ＤＤ鎖に融合したＦＡＰ  ＶＬ及びＦｃ−ＫＫ鎖に融合したＶＨを有する構築物、以下でＦｃ−ＤＤ−ＶＬと呼ばれる）
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【０４３１】
表２０：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）／一価抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧ抗原結合分子の配列（Ｆｃ−ＤＤ鎖に融合したＦＡＰ  ＶＨ及びＦｃ−ＫＫ鎖に融合したＶＬを有する構築物、Ｆｃ−ＤＤ−ＶＨと呼ばれる）
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【０４３２】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターＦｃ−ＤＤ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターＦｃ−ＫＫ重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０４３３】
トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をｅｖｉＭａｋｅ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）培地中の無血清懸濁液中で培養する。７日後、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中において３７℃にて、培養上清を遠心分離による精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍフィルター）、４℃に保った。
【０４３４】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０にわたって作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を使用して溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１６／６００  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４３５】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７の泳動用緩衝液中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０４３６】
表２１：４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子、（２＋１）抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧの生化学的分析
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【０４３７】
５．２  マウス脾細胞活性化アッセイを使用した機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴づけ
機能的アッセイのために、マウス脾細胞をマウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−マウスＦＡＰクローン３６と共培養する。マウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−マウスＦＡＰクローン３６は、ＣＭＶプロモーター下でマウスＦＡＰをコードする発現プラスミドを用いて、親ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＣＲＬ−１６５８）をトランスフェクトすることにより入手された。細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−マウスＦＡＰクローン３６を、１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、γ線照射、熱不活性化）及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）を供給したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４３０−０８２）中、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ−ｐｒ−５）の存在下で維持する。機能的アッセイのために、マウス脾臓を６−８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから滅菌ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０１３６）の中に単離した。単一細胞脾細胞懸濁液を、７０μｍのＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２３５０）を通して脾臓を分離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、γ線照射、熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを供給した、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１−０４２）中で、３０μｍのプリセパレーションフィルター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０４１−４０７）を通して濾過することによって製造した。ＡＣＫ溶解緩衝液（再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ、ｐＨ７．２）中の０．１５ＭのＮＨ４ＣＬ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中に細胞を再懸濁することによって赤血球を溶解し、室温で１０分間インキュベートした。ＦＢＳで溶解を停止させ、細胞を滅菌ＤＰＢＳで洗浄し、３７℃のＰＢＳ中で１０分間、０．５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素標識（Ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５７）で標識した。標識化はＦＢＳで停止した。０．１５×１０６個のバイオレット細胞増殖染料標識脾細胞を、９６ウェル組織培養丸底プレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２０９７）中で４日間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、γ線照射、熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを供給した、２００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１−０４２）中で、０．０２ｘ１０６個の接着性５０Ｇｙ照射ＮＩＨ／３Ｔ３マウスＦＡＰクローン３６細胞、０．５μｇ／ｍＬ（約３．５７ｎＭ）アゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアハムスターＩｇＧ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ、カタログ番号５５３０５７）及び異なる滴定濃度のアゴニストマウス４−１ＢＢ抗体（クローンＭＵ１３７−１）又はコントロール（ＬＥＡＦ精製マウスＩｇＧ１  ｋアイソタイプコントロールクローンＭＯＰＣ−２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５３）と共培養した。
【０４３８】
４日後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１：５０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎを含む５０μＬ／ウェルの冷ＤＰＢＳ中で４℃で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を、抗マウスＣＤ８ａ  ｒａｔＩｇＧ２ａ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１４、クローン５３−６．７）、抗マウスＣＤ４  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ、κ−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４１２、クローンＧＫ１．５）、抗マウスＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シリアンハムスターＩｇＧ−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０６１０６、クローン１７Ｂ５）及び抗マウスＣＤ２５−ＰＥｒＣＰ−Ｃｙ５．５  ｒａｔＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１９１１２）を含む５０μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄し、新たに調製したＦｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５５２３−００）中で４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を抗マウスグランザイムＢ−ｒａｔＩｇＧ２ｂ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１２８８２２、クローン１６Ｇ６）を含む５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ緩衝液で４℃で１時間染色した。次に細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して取得し、Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  ｖ１０．０．７（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を使用して分析した。
【０４３９】
図１４Ａから１４Ｊに示されるように、架橋アゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体と組み合わせた０．５μｇ／ｍＬのアゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアハムスターＩｇＧ（シグナル１）によるマウスＴ細胞の活性化は、増殖の増加をもたらし、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ａ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｂ）における４−１ＢＢ発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｃ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｄ）におけるＣＤ２５発現の増加、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｅ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｆ）におけるグランザイムＢの発現、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｇ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｈ）における増殖、並びにＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１４Ｉ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１４Ｊ）における側方散乱値の増加によって示されるサイズの増加をもたらす。４−１ＢＢ相乗作用のために、アゴニスト抗マウスクローンＭＵ１３７−１は架橋されなければならない。これは、図１４Ｈにおいてわずかに増加したＣＤ４増殖によって示されるように、ＦｃγＲ架橋（黒色の塗りつぶされた菱形、マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１）によって媒介されるか、又は、図１４Ａから１４Ｆ及び図１４Ｈから１４Ｊに示すように、二重特異性ＦＡＰ結合（灰色の星、点線、マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）×ＦＡＰ（２８Ｈ１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧ  ２＋１）を介したより強力な相乗的様式で媒介される。マウス４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）ｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰ抗体（黒の白抜き菱形、点線）は、ＦｃγＲ結合について不活性であり、従って架橋はバックグラウンドを上回る相乗効果を有する。
【０４４０】
実施例６
４−１ＢＢへの二価結合及びＣＥＡへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
６．１  ４−１ＢＢへの二価結合及びＣＥＡへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して二価結合及びＣＥＡに対して一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図１Ａ及び１Ｂに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０４４１】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に抗ＣＥＡバインダー（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ又はＡ５Ｂ７）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に抗ＣＥＡバインダー（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ又はＡ５Ｂ７）のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合している。ＣＥＡバインダーＴ８４．６６−ＬＣＨＡの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ２）号に記載されている。ＣＥＡクローンＡ５Ｂ７のＶＨ及びＶＬ配列は、国際公開第２００７／０７１４２６号から得られ、マウス抗ＣＥＡクローンＡ５Ｂ７に由来する。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。２つの重鎖の組み合わせにより、ＣＥＡ結合部分及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０４４２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０４４３】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ  抗ＣＥＡ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０４４４】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表２２に見いだすことができる。
【０４４５】
表２２：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０４４６】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表２３に見いだすことができる。
【０４４７】
表２３：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０４４８】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表２４に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＬと呼ばれる。
【０４４９】
表２４：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０４５０】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表２５に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＨと呼ばれる。
【０４５１】
表２５：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０４５２】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表２６に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＬと呼ばれる。
【０４５３】
表２６：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０４５４】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表２７に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＨと呼ばれる。
【０４５５】
表２７：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000078
【０４５６】
さらなる例を、（国際公開第９２／０１０５９号にさらに記載されているように）マウスＣＥＡクローンＡ５Ｂ７Ｐ及び（欧州特許第５０１２１５（Ａ２）号にさらに記載されているように）ＣＥＡクローン４３１／２６を用いて調製した。Ｆｃノブ重鎖に融合した親ａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表２８に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ、ホールＶＬと呼ばれる。
【０４５７】
表２８：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、（Ｇ４Ｓ）４ホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000079
【０４５８】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表２９に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ、（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＨと呼ばれる。
【０４５９】
表２９：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000080
【０４６０】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（４３１／２６）ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表３０に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（４３１／２６）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ、（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＬと呼ばれる。
【０４６１】
表３０：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（４３１／２６）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000081
【０４６２】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（４３１／２６）ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表３１に見いだすことができる。分子は、２＋１  ４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）／ＣＥＡ（４３１／２６）ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ、（Ｇ４Ｓ）４、ホールＶＨと呼ばれる。
【０４６３】
表３１：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（４３１／２６）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000082
【０４６４】
二重特異性抗４−１ＢＢ／抗ＣＥＡ抗原結合分子は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例１．１を参照のこと）。５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１を添加した。７日間培養した後、細胞上精を、２１０×ｇで１５分間の遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０４６５】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０にわたって作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を使用して溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１６／６００  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４６６】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７の泳動用緩衝液中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０４６７】
表３２：２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡの生化学的分析
2020504622.tif 000083
【０４６８】
６．２  機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴づけ：４−１ＢＢ及びＣＥＡへの同時結合を介したＮＦκＢ活性化を誘導する能力
６．２．１  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）の配列を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０４６９】
４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーにより４−１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して取得した。記載されるように、限定希釈を行って単一クローンを生成した：ヒト４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、細胞懸濁液２００μＬを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一クローンを収集し、増殖させ、上記のように４−１ＢＢ発現について試験した。４−１ＢＢの最も高い発現を有するクローン（クローン５）を、その後のＮＦκＢ−ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢによるトランスフェクションのために選択した。このベクターは、トランスフェクトされた細胞に、ＮＦκＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下で、ハイグロマイシンＢに対する耐性及びルシフェラーゼを発現する能力の両方を与える。トランスフェクションのために、ヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌０．４ｃｍ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５−２０８１）に添加した。２．５×１０６個のヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を４００μｌの無添加ＤＭＥＭ培地に添加し、プラスミド溶液と注意深く混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５２６６０）を使用して以下の設定で細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、無制限の抵抗。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％のＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸＩを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含む培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一クローンを生成した。
【０４７０】
クローンを、上記のように４−１ＢＢ発現について、及び以下のようにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地中に収集し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ｘｒ  ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を使用して計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋の付いた滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移した。細胞を細胞培養器（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ）中で３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し（４０μｌ）、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、プレートを可能な限り迅速に測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦαを添加せず）より上の５００ｍｓ／ウェル（ＵＲＬ）で放出された光の測定単位をルシフェラーゼ活性とした。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃクローン２６は、最も高いルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４−１ＢＢ発現を示し、さらなる使用のために選択された。
【０４７１】
６．２．２  ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養したヒト４−１ＢＢレポーター細胞株を発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１を含む培地５０μＬを添加した。ＣＥＡ発現ヒト胃腺癌細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞の懸濁液（５０μｌ）又は陰性コントロールとしての培地を各ウェルに添加し、プレートを細胞インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
【０４７２】
図１５Ａ及び１５Ｂにおいて、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株を使用した４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１（（Ｇ４Ｓ）２、ホールＶＨ）の活性化特性を示す。図１５Ａにおいて、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５の非存在下での活性化特性、図１５ＢにおいてＭＫＮ４５細胞の存在下での活性化特性を試験した。いかなる架橋も存在しない場合、活性化は高濃度で、制限された最大値でのみ見られる。ＭＫＮ４５細胞の存在下において、ＥＣ５０値を減少させることができ、活性化の最大値は増加する。従って、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１のその最大の潜在力は、ＣＥＡ媒介架橋の存在下でのみ見られる。ＥＣ５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を、図１５Ａ及び１５Ｂのグラフに示す。
【０４７３】
６．３  ４−１ＢＢへの二価結合及びＣ末端連結ｃｒｏｓｓｆａｂを含むＣＥＡへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して二価結合及びＣＥＡに対して一価結合（２＋１ｃｒｏｓｓｆａｂとも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図１Ｄ及び１Ｅに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０４７４】
この実施例では、構築物のＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、及び抗ＣＥＡクローン（クローンＡ５Ｂ７Ｐ）の交差ＶＨＣＬ、又はＶＬＣＨ１。ＨＣ２は、抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１とそれに続くＦｃホールから構成された。構築物のＬＣ１は、抗４−１ＢＢ（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１を含んでいた。構築物のＬＣ２は、抗ＣＥＡバインダー（クローンＡ５Ｂ７Ｐ）の交差ＶＬＣＨ１又はＶＨＣＬを含んでいた。
【０４７５】
抗原結合分子の１つにおいて、軽鎖の正しい対合を改善するために、以下の変異が抗４−１ＢＢ  ＦａｂのＣＨ−ＣＬに導入されている：ＣＬドメインにおいてＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ＣＨ１ドメインにおいてＫ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０４７６】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【０４７７】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ＣＨＣＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂを有する２＋１ｃｒｏｓｓｆａｂ抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表３３に見いだすことができる。
【０４７８】
表３３：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃノブ鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＣＨＣＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂを有する構築物、ノブ−ＣＨＣＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂと呼ばれる）
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【０４７９】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ＣＨＣＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂを有する２＋１ｃｒｏｓｓｆａｂ抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表３４に見いだすことができる。
【０４８０】
表３４：荷電変異体を有する、二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃノブ鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨＶＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂを有する構築物、ノブ−ＶＨＶＬ  ｃｒｏｓｓｆａｂと呼ばれる）
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【０４８１】
ｃｒｏｓｓｆａｂを含む二重特異性抗体は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって生成された。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターをＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合し、ＰＥＩを添加し、溶液をボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した。トランスフェクションの１日後に、１２％のＦｅｅｄを添加した。細胞上清を７日後に収集し、標準的方法により精製した。
【０４８２】
標準プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて試料を直ちに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でサイズ排除クロマトグラフィーによって単量体タンパク質から分離した。
【０４８３】
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度を、Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。タンパク質の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩを使用して還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。凝集物含有量の測定は、２５℃で２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、ｐＨ６．７の泳動用緩衝液中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ）を用いるＨＰＬＣクロマトグラフィーにより行った。
【０４８４】
表３５：２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ  ｃｒｏｓｓｆａｂ  ヒトＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子の生化学的分析
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【０４８５】
６．３．１  Ｃ末端結合ＣＥＡｃｒｏｓｓｆａｂを含む２＋１二重特異性４−１ＢＢ抗体の機能的特徴づけ
ＣＥＡ上の特定のエピトープ領域を指す抗原Ｎ（Ａ２−Ｂ２）Ａを使用して、ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＣＥＡを同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、泳動用緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。ヒトＮ（Ａ２−Ｂ２）Ａを、アミンカップリング（ＣＭ５センサーチップ）によってフローセルに直接カップリングさせた。７５０共鳴単位（ＲＵ）の固定化レベルを使用した。
【０４８６】
ＣＥＡ標的化二重特異性抗体を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２の被分析物として注入した（図２０Ａ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０４８７】
図２０Ｂ及び２０Ｃのグラフに見られるように、ＣＥＡに対して一価結合を有する２＋１二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体は、ヒトＮ（Ａ２−Ｂ２）Ａ及びヒト４−１ＢＢに同時に結合することができる。
【０４８８】
６．４．細胞への結合
６．４．１．ヒト４−１ＢＢ発現細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２への結合
細胞発現４−１ＢＢへの結合を決定するために、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９６００４）細胞を使用した。従って、０．２×１０６個のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６３−１８）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳと共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬ／ウェルの冷ＤＰＢＳで１回洗浄した。次に、滴定された二重特異性ＣＥＡ標的化抗ヒト４−１ＢＢ分子を含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液の５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で６０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して、結合していない分子を除去した。その後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液と共にさらにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）に再懸濁することによって固定した。細胞を、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、同日又は翌日に取得した。ゲートを生細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）を使用して、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値（一次抗体を添加せず）を差し引いてデータをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を使用して計算し、同様に曲線下面積（ＡＵＣ）も計算した。
【０４８９】
図２１Ａにおいて、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２への結合が、二重特異性ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニスト分子について示されている。全ての分子は、二価４−１ＢＢ抗原結合クローン２０Ｈ４．９部分を含み、それらのＣＥＡ結合部分（クローン又は融合が異なる）とは無関係に、ヒト４−１ＢＢ発現細胞に対して同様の結合を示す。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１（黒い三角形）のみが、少し低いＥＣ５０値（表３６）と、わずかに増加したＡＵＣ（図２１Ｃ）を示した。含まれた陰性コントロール、例えば、非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（白抜きの黒丸）はベースラインを示した。表３６において、ＥＣ５０値を列挙する。
【０４９０】
表３６：ヒト４−１ＢＢ発現トランスジェニック細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２への結合曲線のＥＣ５０値
2020504622.tif 000089
【０４９１】
６．４．２．ヒトＣＥＡ発現腫瘍細胞株への結合
細胞発現ＣＥＡへの結合を決定するために、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）を使用した。従って、０．２×１０６個のＭＫＮ４５細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６３−１８）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳと共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬ／ウェルの冷ＤＰＢＳで１回洗浄した。次に、滴定された二重特異性ＣＥＡ標的化抗ヒト４−１ＢＢ分子を含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液の５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で６０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して、結合していない分子を除去した。その後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液と共にさらにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）に再懸濁することによって固定した。細胞を、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、同日又は翌日に取得した。ゲートを生細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）を使用して、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値（一次抗体を添加せず）を差し引いてデータをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を使用して計算し、同様に曲線下面積（ＡＵＣ）も計算した。
【０４９２】
図２１Ｂにおいて、ＣＥＡ発現ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５への結合が、二重特異性ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニスト分子について示されている。最強の親和性は、８．９ｎＭの最低ＥＣ５０値及び図２１Ｄに示す最高ＡＵＣ値によって示される分子４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１（黒い三角形）で見られた。他の全ての結合曲線は、試験した濃度においてプラトーに達しなかったので、さらなるＥＣ５０は示されていない。フォーマット及び分子に組み込まれたＣＥＡ結合クローンに応じて、図２１ＤのＡＵＣにも示されているように、二重特異性ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニスト分子は、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞に対して異なる親和性を示す。
【０４９３】
６．５  ＮＦκＢの活性化
６．５．１  ＣＥＡ発現腫瘍細胞と共培養したＨｅＬａ又はＪｕｒｋａｔ発現ヒト４−１ＢＢ及びルシフェラーゼレポーター細胞株におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６（図１５のように、２．５．１に記載の世代）又はＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２（Ｐｒｏｍｅｇａから購入、ＣＳ１９６００４）のいずれかをレポーター細胞株として使用した。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２細胞をレポーター細胞株として使用した場合、細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移した。ＨｅＬａーｈｕ４ー１ＢＢーＮＦκＢーｌｕｃクローンの場合、２６個の細胞プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。アッセイを実施するために、滴定された二重特異性ＣＥＡ標的化抗ヒト４−１ＢＢ分子を含む培地５０μＬを添加した。ＣＥＡ発現ヒト胃腺癌細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）を、ＤＭＥＭ培地（ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６がレポーター細胞株として使用された場合）又は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１を供給したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２がレポーター細胞株として使用された場合）中に、２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞の懸濁液（５０μｌ）又は陰性コントロールとしての培地を各ウェルに添加し、プレートを細胞インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
【０４９４】
図２３Ａ及び２３Ｂにおいて、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔーｈｕ４ー１ＢＢーＮＦＢーｌｕｃ２を使用して、異なるＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）分子の活性化特性を示す。図２３Ａにおいて、ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５の非存在下での活性化特性、図２３ＢにおいてＭＫＮ４５細胞の存在下での活性化特性を試験した。いかなる架橋も存在しない場合、活性化は高濃度で、制限された最大値でのみ見られる。ＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）分子の存在下で、ＭＫＮ４５細胞の存在下で、ＥＣ５０値が減少し、活性化の最大値が増加する。ＡＵＣ値は図２３Ｃに表示されている。活性化特性は、図２１Ｂに示すＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞への結合親和性と正に相関する。ＥＣ５０値を表３７に列挙する。
【０４９５】
表３７：ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞の存在下でのＪｕｒｋａｔーｈｕ４ー１ＢＢーＮＦκＢーｌｕｃ２レポーター細胞株活性化曲線のＥＣ５０値。
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【０４９６】
６．６  ＣＥＡ発現腫瘍細胞の存在下でのヒトＰＢＭＣの活性化アッセイ
ＣＥＡ発現ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５をＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０３２６）で洗浄し、酵素を含まないＰＢＳベースのＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号１３１５１−０１４）で３７℃で１０分間処理した。細胞を収集し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、米国産、ＰＡＮ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０−２００９、Ｌｏｔ  Ｐ１５０３０７ＧＩ、ガンマ線照射マイコプラズマフリー、５６℃で３５分間の熱不活性化）、１％のＬ−ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％のＭＥＭ−非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、５０μＭのβ−メルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１−０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁し、５０Ｇｙ（Ｘ線照射装置ＲＳ２０００、Ｒａｄ  ｓｏｕｒｃｅ）を照射した。５０μＬのＴ細胞培地中の２×１０４個のＭＫＮ４５細胞を、丸底組織培養９６ウェルプレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２６９７）の各ウェルに播種した。異なる滴定濃度のＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニスト分子又はコントロールを含む５０μＬのＴ細胞培地をそれぞれ添加した。ヒトＰＢＭＣを、３７℃で１５分間、４０ｎＭのＣＦＤＡ−ＳＥ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８８−２５ＭＧ−Ｆ）を含む３７℃の温かいＤＰＢＳ中で標識した。ＦＢＳを添加することによってＣＦＳＥ標識を停止し、ＰＢＭＣを２回洗浄し、１．５×１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度までＴ細胞培地に再懸濁した。このＰＢＭＣ細胞溶液５０μＬを各ウェルに播種して、７．５×１０４個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣをウェルに添加した。最後に、２ｍＭのアゴニスト抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を含むＴ細胞培地のストック溶液を調製し、５０μＬ／ウェルを各ウェルに添加して、最終濃度０．５ｍＭの抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を得た。
【０４９７】
プレートを３７℃で４日間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１：１０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで１回洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ１３７マウスＩｇＧ１κ（クローン４Ｂ４−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、０．１μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＰＤ−１マウスＩｇＧ１κ（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８）、０．０３μｇ／ｍＬのＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ２５マウスＩｇＧ１κ（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１０）、０．０６μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８マウスＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３０１０１６）、ＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）を含む、５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給されたＤＰＢＳ）で４℃で３０分間染色した。プレートを２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、細胞を１％ホルムアルデヒドを含むＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０ー９．５Ｌ）で１５分間固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０４９８】
図２３Ａから２３Ｄに示すように、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１（Ｇ４Ｓ）２分子は、最適以下のＣＤ３刺激の存在下において、ＣＤ２５の上方制御、並びにＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖の改善を誘導することができた。非標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＤＰ４７  ２＋１又は４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ分子は、限られたＴ細胞活性化のみを誘導した。従って、ＣＥＡ発現細胞及び最適以下のＴＣＲ刺激の存在下では、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）２＋１（Ｇ４Ｓ）２アゴニストは、非標的化分子よりも強いＴ細胞活性化及び増殖を誘導することができる。表３８において、ＥＣ５０値を列挙する。
【０４９９】
表３８：ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞の存在下でのＰＢＭＣ活性化曲線のＥＣ５０値。
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【０５００】
図２４Ａから２４Ｄに示すように、図２３に示すように別のドナーからのＰＢＭＣの活性化をモニターした。全てのＣＥＡ標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）アゴニスト分子は、最適以下のＣＤ３刺激の存在下において、非標的化４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）分子を超えて、ＣＤ２５の上方制御、並びにＣＤ２５及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖の改善を誘導することができた。表３９において、ＥＣ５０値を列挙する。
【０５０１】
表３９：ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞の存在下でのＰＢＭＣ活性化曲線のＥＣ５０値。
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【０５０２】
実施例７
４−１ＢＢへの四価結合及びＣＥＡへの一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特徴づけ
７．１  ４−１ＢＢへの四価結合及びＣＥＡへの一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して四価結合及びＣＥＡに対して一価結合（４＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図４Ａ及び４Ｂに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０５０３】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に抗ＣＥＡバインダー（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ又はＡ５Ｂ７）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ又はＡ５Ｂ）のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合している。ＣＥＡバインダーＴ８４．６６−ＬＣＨＡの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ２）号に記載されている。ＣＥＡクローンＡ５Ｂ７のＶＨ及びＶＬ配列は、国際公開第２００７／０７１４２６号から得られ、マウス抗ＣＥＡクローンＡ５Ｂ７に由来する。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。２つの重鎖の組み合わせにより、ＣＥＡ結合部分及び４つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。
【０５０４】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０５０５】
二重特異性４＋１抗４−１ＢＢ  抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０５０６】
抗原結合分子は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例１．１を参照のこと）。
【０５０７】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４０に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４１に見いだすことができる。
【０５０８】
表４０：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０５０９】
表４１：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０５１０】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４２に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４３に見いだすことができる。
【０５１１】
表４２：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
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【０５１２】
表４３：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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【０５１３】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４４に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４５に見いだすことができる。
【０５１４】
表４４：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000117
2020504622.tif 000118
【０５１５】
表４５：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（Ａ５Ｂ７Ｐ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000119
2020504622.tif 000120
【０５１６】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（４３１／２６）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４６に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＥＡ（４３１／２６）構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表４７に見いだすことができる。
【０５１７】
表４６：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（４３１／２６）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000121
2020504622.tif 000122
【０５１８】
表４７：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＥＡ（４３１／２６）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＥＡ  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
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2020504622.tif 000124
【０５１９】
実施例８
４−１ＢＢへの二価結合及びＣＤ１９への一価結合を有する二重特異性抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
８．１  ４−１ＢＢへの二価結合及びＣＤ１９への一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して二価結合及びＣＤ１９に対して一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図１Ａ及び１Ｂに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０５２０】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に抗ＣＤ１９バインダー（クローン２Ｂ１１又は８Ｂ８−０１８）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に抗ＣＤ１９バインダー（クローン２Ｂ１１又は８Ｂ８−０１８）のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合している。ＣＤ１９バインダークローン２Ｂ１１又は８Ｂ８−０１８の生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ２）号に記載されている。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。２つの重鎖の組み合わせにより、ＣＤ１９結合部分及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０５２１】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０５２２】
ノブに融合したａ−ＣＤ１９（２Ｂ１１）ＶＨ及びホール鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表４８に見いだすことができる。ノブに融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びホール鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表４９に見いだすことができる。
【０５２３】
表４８：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬとも呼ばれる）
2020504622.tif 000125
【０５２４】
表４９：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000126
【０５２５】
ノブに融合したａ−ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ＶＨ及びホール鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５０に見いだすことができる。ノブに融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びホール鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５１に見いだすことができる。
【０５２６】
表５０：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する構築物、ホール−ＶＬとも呼ばれる）
2020504622.tif 000127
【０５２７】
表５１：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000128
【０５２８】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ  抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡは、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０５２９】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１を添加した。７日間培養した後、細胞上精を、２１０×ｇで１５分間の遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０５３０】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０にわたって作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を使用して溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１６／６００  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０５３１】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７の泳動用緩衝液中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０５３２】
表５２：４−１ＢＢへの二価結合及びＣＤ１９への一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ及び２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の生化学的分析
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【０５３３】
実施例９
４−１ＢＢへの四価結合及びＣＤ１９への一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特徴づけ
９．１  ４−１ＢＢへの四価結合及びＣＤ１９への一価結合を有する二重特異性抗体の生成
４−１ＢＢに対して四価結合及びＣＤ１９に対して一価結合（４＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体が、図４Ａ及び４Ｂに示すように調製された。ヘテロ二量体の生成を可能にするために、ノブ・イントゥー・ホール技術が、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を導入し、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を導入することによって適用された。
【０５３４】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、それに続くＦｃホール、そのＣ末端に抗ＣＤ１９バインダー（クローン２Ｂ１１又は８Ｂ８−０１８）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢバインダー（クローン２０Ｈ４．９）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、それに続くＦｃノブ、そのＣ末端に抗ＣＤ１９バインダー（クローン２Ｂ１１又は８Ｂ８−０１８）のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合している。ＣＤ１９バインダークローン２Ｂ１１又は８Ｂ８−０１８の生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載されている。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。２つの重鎖の組み合わせにより、ＣＤ１９結合部分及び４つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。
【０５３５】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１Ａ１に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０５３６】
二重特異性４＋１抗４−１ＢＢ  抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞を、１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）において対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０５３７】
抗原結合分子は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例８．１を参照のこと）。
【０５３８】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５３に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５４に見いだすことができる。
【０５３９】
表５３：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９  ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する４＋１構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000130
2020504622.tif 000131
【０５４０】
表５４：二重特異性、四価抗１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（２Ｂ１１）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000132
2020504622.tif 000133
【０５４１】
Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＨ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＬを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５５に見いだすことができる。Ｆｃノブ重鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＬ及びＦｃホール重鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５６に見いだすことができる。
【０５４２】
表５５：二重特異性、四価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９  ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ＶＬ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＨを有する４＋１構築物、ホール−ＶＬと呼ばれる）
2020504622.tif 000134
2020504622.tif 000135
【０５４３】
表５６：二重特異性、四価抗１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗原結合分子の配列（Ｆｃホール鎖に融合したａ−ＣＤ１９  ＶＨ及びＦｃノブ鎖に融合したＶＬを有する構築物、ホール−ＶＨと呼ばれる）
2020504622.tif 000136
2020504622.tif 000137
【０５４４】
実施例１０
４−１ＢＢ及びＣＤ１９に結合する二重特異性抗原結合分子の機能的特徴づけ
１０．１  ＣＤ１９への結合
二重特異性、二価抗４−１ＢＢ／一価抗ＣＤ１９抗体（４−１ＢＢｘＣＤ１９と呼ばれる）のＣＤ１９に対する結合特性を、初代ヒトＢ細胞又はＣＤ１９陽性腫瘍細胞株（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ５７５）において測定した。簡潔には、全ＰＢＭＣを健常ドナーからのバフィコートから精製した。ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０３２６）に再懸濁した細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで１回洗浄した。細胞を１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）に再懸濁し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃冷ＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、構築物の４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）２＋１、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）２＋１（両者の構造を図１６Ａに示す）、ＣＤ１９（２Ｂ１１）ｘ４−１ＢＢＬ（図１６Ｂ、国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載）及びＤＰ−４７ｘ４−１ＢＢＬ（図１６Ｃ、国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載）を一連の濃度で含む、５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給されたＤＰＢＳ）に再懸濁し、続いて４℃で１時間インキュベートした。十分に洗浄した後、細胞を、５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９１１６０９８）と、ＡＰＣ−Ｈ７結合ＣＤ２０  Ａｂ（ＢＤ、カタログ番号５６０７３４）、及びＡＰＣ結合抗ＣＤ３  Ａｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１２）、及び／又はＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ）とを含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液を用いて４℃で３０分間さらに染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０５４５】
細胞をＣＤ３−ＣＤ２０＋生存集団にゲートし、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  ＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の幾何平均を、構築物の滴定濃度に対してプロットした。図１７Ａ及び図１７Ｂに示すように、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）は、ＣＤ１９（２Ｂ１１）ｘ４−１ＢＢＬと比較して低い親和性で用量依存的にヒトＢ細胞に結合するが、一方非標的化ＤＰ４７ｘ４−１ＢＢＬはＢ細胞に結合しなかった（図１７Ａ）。同様に、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＤ１９（２Ｂ１１）構築物は、初代Ｂ細胞と同様の様式でＣＤ１９＋  ＷＳＵ腫瘍細胞に結合する。（図１７Ｂ）。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）と比較して同一の結合特性を示す。表５７において、ＣＤ１９＋腫瘍結合曲線のＥＣ５０値を列挙する。
【０５４６】
表５７：ＣＤ１９＋腫瘍細胞への結合曲線のＥＣ５０値
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【０５４７】
１０．２  活性化Ｔ細胞上の４−１ＢＢへの結合
４−１ＢＢｘＣＤ１９の４−１ＢＢ発現Ｔ細胞への結合を調べるために、ヒトＰＢＭＣを、Ｔ細胞上の４−１ＢＢの上方制御のために４８時間のＴＣＲ刺激によって事前に活性化した。精製したＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号７２４００−０５４）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２−０６８）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３５０−０１０）に再懸濁して２．８×１０６個／ｍｌの濃度に希釈した。９０ｕｌの細胞を、丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。次に、さらなる５０ｕｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１３１Ｄ）を、８×１０５ビーズ／ｍｌでウェルに添加した。２日後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、２００１２−０６８）で１回洗浄し、９０μｌの冷ＰＢＳで再懸濁し、４℃で１時間、構築物（４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（０１８）及びＣＤ１９（２Ｂ１１）ｘ４−１ＢＢＬ）を含む１０μｌの溶液と共にインキュベートした。十分に洗浄した後、細胞を、５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９１１６０９８）と、付加的に抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１２）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）及びＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７１０）Ａｂとを含む５０μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液を用いて、４℃で３０分間さらに染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０５４８】
特異的結合は、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の純粋な集団に対してゲートされた。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＤ１９（２Ｂ１１）は、用量依存的に４−１ＢＢ発現ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞への優れた結合を示したが、ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬと比較してわずかに低い親和性であった（図１８Ａ及び１８Ｂ）。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（０１８）は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）と比較して同一の結合特性を示す。表５８において、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞結合曲線のＥＣ５０値を列挙する。
【０５４９】
表５８：ＣＤ４＋又はＣＤ８＋腫瘍細胞への結合曲線のＥＣ５０値
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【０５５０】
１０．３  ４−１ＢＢｘＣＤ１９は生物学的活性を示した
生理学的設定における生物学的活性を測定するために、活性化ヒトＰＢＭＣを使用して、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を共刺激することによるエフェクター機能分子ＩＦＮγの放出を調べた。簡潔には、構築物（４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（０１８）、ＣＤ１９（２Ｂ１１）ｘ４−１ＢＢＬ及びＤＰ−４７ｘ４−１ＢＢＬ）と共培養した精製ＰＢＭＣを一連の濃度で、そして付加的な５０μｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１３１Ｄ）と共に８×１０５ビーズ／ｍｌでウェルに添加した。４８時間のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔヒトＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２８５）によるＩＦＮ−γの測定のために上清を集めた。図１９は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×ＣＤ１９（２Ｂ１１）及びＣＤ１９（２Ｂ１１）×４−１ＢＢＬ構築物の両方がＰＢＭＣを刺激し、用量依存的に同様の量のＩＦＮγを産生したが、一方、非標的化ＤＰ４７ｘ４−１ＢＢＬ（陰性コントロール）は、架橋の欠如のためにＴ細胞又はＮＫ細胞を活性化しなかったことを示している。４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（０１８）は、４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＣＤ１９（２Ｂ１１）と比較して同様の生物学的活性を示した。表５９において、ＩＦＮ−γ産生のＥＣ５０値を列挙する。
【０５５１】
表５９：ＩＦＮ−γ産生のＥＣ５０値
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１０Ｄ−１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｄ】
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【図１４Ｅ−１４Ｈ】
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【図１４Ｉ−１４Ｊ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−２１Ｂ】
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【図２１Ｃ−２１Ｄ】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ−２４Ｂ】
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【図２４Ｃ−２４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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