(57)【要約】  MeCP2ベースの治療本発明は、レット症候群を含むMeCP2活性の低下に関連する障害の治療に有用な合成ポリペプチドに関する。本発明は、i)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すMBDアミノ酸配列と;ii)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すNIDアミノ酸配列とを含み、完全長のMeCP2 e1及びe2配列と比較するとき、少なくとも50アミノ酸の欠失を有する、合成ポリペプチドを提供する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを提供する、核酸構築物、発現ベクター、ビリオン、医薬組成物、及び細胞を更に提供する。本発明は、本発明の合成ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、動物の疾患を治療又は予防する方法を更に提供する。
2020513830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すMBDアミノ酸配列と;
ii)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すNIDアミノ酸配列と
を含み、完全長のMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較するとき、少なくとも50アミノ酸の欠失を有する合成ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号3及び配列番号4に示される、MeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって90%未満の同一性を有する、請求項1に記載の合成ポリペプチド。
【請求項３】
構造:
A-B-C-D-E
を有し、式中、
合成ポリペプチドの部分Bが、前記MBDのアミノ酸配列であり、
合成ポリペプチドの部分Dが、前記NIDのアミノ酸配列であり、
更に、
合成ポリペプチドの部分Aが、40個未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6で示されるアミノ酸配列と80%未満の同一性を有し、
合成ポリペプチドの部分Cが、20個未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号7に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号7で示されるアミノ酸配列と80%未満の同一性を有し、
合成ポリペプチドの部分Eが存在しないか、タンパク質タグであるか、及び/又は配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8で示されるアミノ酸配列と80%未満の同一性を有する、請求項1又は請求項2に記載の合成ポリペプチド。
【請求項４】
前記合成ポリペプチドが、NCoR/SMRT、HDAC3、GPS2、TBL1X、又はTBLR1、好ましくは、TBL1X又はTBLR1等のNCoR/SMRTコリプレッサー複合体の構成要素を、メチル化DNAに動員することができる、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
【請求項５】
前記合成ポリペプチドが、430個未満のアミノ酸、好ましくは400、350、320、270、又は200個未満のアミノ酸、更に好ましくは180個未満のアミノ酸からなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、核局在シグナル(NLS)を含み、好ましくは前記NLSが、MBDとNIDの間のアミノ酸配列内に含まれる、請求項5に記載の合成ポリペプチド。
【請求項７】
MBDとNIDのアミノ酸配列の間のアミノ酸配列が、配列番号7に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号7に示されるアミノ酸配列と75%未満の同一性、好ましくは50%未満、更に好ましくは30%未満の同一性を有する、請求項6に記載の合成ポリペプチド。
【請求項８】
MBDとNIDのアミノ酸配列の間のアミノ酸配列が、50個未満のアミノ酸長、好ましくは30個未満のアミノ酸長、更に好ましくは20個未満のアミノ酸長である、請求項7に記載の合成ポリペプチド。
【請求項９】
MBDとNIDのアミノ酸配列の間のアミノ酸配列が、配列番号4に示される全長ヒト野生型MeCP2ポリペプチド配列(e2アイソフォーム)の207位〜271位のアミノ酸配列と比較して、少なくとも10個の連続的なアミノ酸の置換又は欠失を有する、請求項8に記載の合成ポリペプチド。
【請求項１０】
NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列が、配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に示されるアミノ酸配列と75%未満の同一性、好ましくは50%未満、更に好ましくは30%未満の同一性を有する、請求項9に記載の合成ポリペプチド。
【請求項１１】
NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列が、50個未満のアミノ酸長、好ましくは30個未満のアミノ酸長、又は20個未満のアミノ酸長であり、更に好ましくは、NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列がない、請求項10に記載の合成ポリペプチド。
【請求項１２】
MBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列が、配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列と75%未満の同一性、好ましくは50%未満、更に好ましくは30%未満の同一性を有する、請求項11に記載の合成ポリペプチド。
【請求項１３】
MBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列が、50個未満のアミノ酸長、好ましくは30個未満のアミノ酸長、又は20個未満のアミノ酸長であり、更に好ましくは、10個未満のアミノ酸長である、請求項12に記載の合成ポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが、配列番号3及び配列番号4に示されるMeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって90%未満の同一性を有し、好ましくは80%未満の同一性、70%未満の同一性、又は60%未満の同一性、更に好ましくは40%未満の同一性を有する、請求項13に記載の合成ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項14に記載のポリペプチドをコードする核酸構築物。
【請求項１６】
請求項1から14のいずれか一項に記載の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
神経細胞におけるヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、例えば、Mecp2又はMECP2プロモーター、MECP2又はMecp2の3'UTR由来の1つ以上の下流miR結合部位、及びAUリッチエレメントから選択される、1つ以上の制御エレメントを更に含む、請求項16に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はαウイルスベクター等のウイルスベクターである、請求項16又は請求項17に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項18に記載のベクターを含むビリオン。
【請求項２０】
請求項1から14のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項15に記載の核酸構築物、請求項16から18に記載の発現ベクター、及び/又は請求項19に記載のビリオンを含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項1から14のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するよう適合された合成遺伝的構築物を含む細胞。
【請求項２２】
請求項16から18のいずれか一項に記載のベクターを含む、請求項21に記載の細胞。
【請求項２３】
請求項19に記載のビリオンを産生するための請求項21又は22に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項1から14のいずれか一項に記載の合成ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、動物において疾患を治療又は予防する方法。
【請求項２５】
前記疾患が、MeCP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与する工程が、請求項1から14のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項15に記載の核酸構築物、請求項16から18に記載の発現ベクター、請求項19に記載のビリオンを含む組成物、及び/又は請求項20に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、請求項24又は25に記載の方法。
【請求項２７】
MeCP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項15に記載の核酸構築物、請求項16から18に記載の発現ベクター、請求項19に記載のビリオン、及び/又は請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
MeCP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1から14のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項15に記載の核酸構築物、請求項16から18に記載の発現ベクター、請求項19に記載のビリオン、及び/又は請求項20に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レット症候群を含むMeCP2活性の低下に関連する障害の治療に有用な合成ポリペプチドに関する。本発明はまた、合成ポリペプチドを発現するための核酸構築物、発現ベクター、ビリオン及び細胞に関する。更に、本発明は、本発明の合成ポリペプチドを使用して、レット症候群等の障害を治療する方法、レット症候群を含むMeCP2活性の低下に関連する障害の治療のための医薬の製造における合成ポリペプチド、核酸構築物、発現ベクター、ビリオン及び細胞の使用、並びに本発明の合成ポリペプチド、核酸構築物、発現ベクター、及びビリオンを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)は、メチル化DNAに優先的に結合する能力から命名された核タンパク質である。MECP2遺伝子の変異がレット症候群患者の大多数で特定されたとき、MeCP2への関心が高まった。
【０００３】
レット症候群は、15,000人のうちの約1人の少女に発生する。2000人に1人未満しか罹患していないため、理論上はまれな病気であるが、実際には女性の知的障害の最も一般的な遺伝的原因の1つである。約6ヶ月の年齢からの障害を持つものの発達の減少、停止、及び遅延のために、それはもともと神経発達障害であると考えられていた。しかしながら、主な症状の一部がこの疾患のマウスモデルで可逆的であることがわかったという事実は、現在一般的に神経障害とみなされていることを意味する。
【０００４】
MECP2遺伝子はX染色体上に位置する。76kbにわたり、4つのエクソンで構成されている。MeCP2タンパク質は、タンパク質のN末端が異なる2つのアイソフォーム、MeCP2 e1及びMeCP2 e2を有する。アイソフォームe1は498アミノ酸で構成され、アイソフォームe2は486アミノ酸長である。MECP2(ヒト)及びMecp2(マウス)遺伝子は4つのエクソンで構成され、選択的スプライシングを受けて2つのmRNA種を生成し、e1はエクソン1、3、及び4で構成され、e2は1、2、3、及び4で構成される。翻訳は、アイソフォームe1及びe2において、それぞれエクソン1又は2から始まる。コード配列の大部分はエクソン3及び4にあるため、これら2つのアイソフォームは非常に類似しており、最端のN末端でのみ異なる。MECP2 e1バリアントのmRNAは、MECP2 e2のmRNAよりも脳でより多く発現し、e1タンパク質はマウス及びヒトの脳でより豊富である。MeCP2は、対称メチル化mCpGジヌクレオチド及び非対称メチル化mCpAジヌクレオチドにおける5メチルシトシン残基に選択的に結合する豊富な哺乳類タンパク質である。CpGジヌクレオチドは遺伝子のプロモーター領域に優先的に位置するが、これらはほとんどメチル化されていない。比較すると、高度にメチル化されているのはバルクゲノムのCpGジヌクレオチドであり、MeCP2が結合するのはこれらに対してである。ニューロン内でメチル化されたmCpAの存在は、結合部位の数を更に増加させる。このように、MeCP2は遺伝子配列の本体に結合することにより、遺伝子転写を制御する1。
【０００５】
MeCP2は脊椎動物にわたって高度に保存されており、タンパク質において、高移動度タンパク質様ドメイン、メチル結合ドメイン(MBD)、NCoR/SMRT相互作用ドメイン(NID)を含む転写抑制ドメイン、並びにC末端ドメインα及びβを含む少なくとも6つの生化学的に異なるドメインが特定されている2。機能的に、MeCP2は、転写コリプレッサー4(例えば、NCoR/SMRT5)、転写アクチベーター6、RNA7、クロマチンリモデラー8、9、マイクロRNA処理タンパク質10、及びスプライシング因子11を含む、40を超える結合パートナー3とのその報告された相互作用に基づいて、いくつかの細胞プロセスへの関与が示唆されしている。したがって、MeCP2は、成熟ニューロンに不可欠な多様な機能を統合する多機能ハブであるとみられている12。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO00/67796
【特許文献２】米国特許第5,168,062号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Henikoff S.及びHenikoff J.G.、P.N.A.S. USA 1992年、89:10915〜10919頁
【非特許文献２】Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol.、1970年48:443〜453頁
【非特許文献３】Ben-Bassat等、J. Bacteriol.、169:751〜7頁1987年
【非特許文献４】O'Regan等、Gene、77:237〜51頁、1989年
【非特許文献５】Sahin-Toth等、Protein Sci.、3:240〜7頁、1994年
【非特許文献６】Hochuli等、Bio/Technology、6:1321〜5頁、1988年
【非特許文献７】Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math.、2:482頁、1981年
【非特許文献８】Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol.、48:443頁、1970年
【非特許文献９】Pearson及びLipman、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、85:2444頁、1988年
【非特許文献１０】Higgins及びSharp、Gene、73:23744頁、1988年
【非特許文献１１】Higgins及びSharp、CABIOS、5:151〜3頁、1989年
【非特許文献１２】Corpet等、Nuc. Acids Res.、16:10881〜90頁、1988年
【非特許文献１３】Huang等、Computer Appls. in the Biosciences、8、155〜65頁、1992年
【非特許文献１４】Pearsonら、Meth. Mol. Bio.、24巻:307〜31頁、1994年
【非特許文献１５】Altschul等、J. Mol. Biol.、215:403〜10頁、1990年
【非特許文献１６】Science 1983年、222: 524〜527頁
【非特許文献１７】Nature 1982年、296:39〜42頁
【非特許文献１８】Voellmy等、P.N.A.S. USA 1985年、82:4949〜4953頁
【非特許文献１９】Mettenleiter及びRauh、J. Virol. Methods 1990年、30:55〜66頁
【非特許文献２０】Gorman等、P.N.A.S. USA、1982年、79:6777〜6781頁
【非特許文献２１】Rodriguez, R. L.及びD. T. Denhardt編、「Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses」、Butterworths、1988年
【非特許文献２２】Current protocols in Molecular Biology編: F. M. Ausubel等、Wiley N. Y.、1995年
【非特許文献２３】DNA Cloning、1〜4巻、第2版、1995年編:Glover及びHames、Oxford University Press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、レット症候群に特異的である利用可能な治療法は存在しない。代わりに、治療は一般的に伝統的な薬を使用して疾患の症状を治療することを含み、一方で予防戦略は積極的な栄養管理、胃腸及び整形外科の合併症の予防、リハビリテーション療法を含む。したがって、レット症候群の発症を特異的に治療及び予防する手段に対する差し迫った必要性が残存する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すMBDアミノ酸配列と、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すNIDアミノ酸配列とを含む合成ポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明の合成ポリペプチドは、完全長のMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較して、少なくとも50アミノ酸の欠失又は置換を有し得る。更に、又は代替的に、本発明の合成ポリペプチドは、配列番号3及び/又は配列番号4に示される、MeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって90%未満の同一性を有する。
【００１１】
一般に、本発明の合成ポリペプチドは、MeCP2によるMBD及びNIDドメインを含むが、MeCP2の天然配列の他の部分を欠いている。したがって、合成ポリペプチドにおける任意の欠失又は置換は、MeCP2の天然配列の一部であり得るが、MeCP2のMBD又はNIDの一部ではない。したがって、本発明の合成ポリペプチドは一般に、構造
A-B-C-D-E
を有し得、
式中、合成ポリペプチドの部分Bは、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すMBDアミノ酸配列であり、合成ポリペプチドの部分Dは、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すNIDアミノ酸配列であり、次の3つのうち少なくとも1つが真である:合成ポリペプチドの部分Aが30未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6で示されるアミノ酸配列と90%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Cが20未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号7に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号7に示されるアミノ酸配列と90%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Eは存在しないか、ポリペプチドタグであるか、及び/又は配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に示されるアミノ酸配列と90%未満の同一性を有する。当業者は、この一般構造が、一般に認められる、合成ポリペプチドのN末端からC末端の方向に左から右に開示されることを理解するであろう。
【００１２】
本発明はまた、本発明の合成ポリペプチドをコードする核酸構築物、及び本発明の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。発現ベクターはウイルスベクターであってもよく、したがって、本発明はまた、本発明による発現ベクターを含むビリオンを提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように適合された合成遺伝子構築物を含む細胞、本発明のベクターを含む細胞、及び本発明のビリオンを産生するための細胞を提供する。
【００１３】
本発明はまた、本発明の合成ポリペプチド、核酸構築物、発現ベクター及び/又はビリオンを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明の合成ポリペプチドは、医学において、特にMECP2の不活性化変異等の不活性化に関連する神経障害の治療において有用性を有する。このような障害には、レット症候群が含まれる。したがって、本発明は、本発明の合成ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、動物の疾患を治療又は予防する方法を提供する。前記投与する工程は、本発明の合成ポリペプチド、本発明の発現ベクター、本発明のビリオン及び/又は本発明の医薬組成物を投与することを含み得る。
【００１５】
更に、本発明は、MECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防のための本発明の合成ポリペプチド、本発明の発現ベクター、及び本発明のビリオンを提供する。本発明はまた、MECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防のための医薬の製造における、本発明の合成ポリペプチド、本発明の発現ベクター、及び本発明のビリオンの使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の合成ポリペプチドは、MeCP2の不活性化又は活性低下により引き起こされる障害の治療に使用できる治療用タンパク質を提供する。このような障害には、特にレット症候群が含まれる。本発明の核酸構築物、発現ベクター、ビリオン、及び細胞を使用して、合成ポリペプチドを産生し、必要に応じて送達することができる。本発明はまた、本発明の生成物を使用する治療方法、及びそれらの治療におけるそれらの生成物の使用を提供する。
【００１７】
本発明は、レット症候群の発症に対して重要であるのはMeCP2のMBD及びNIDに関連する生物活性の欠損であり、MeCP2は高度に保存されたタンパク質であるという事実にもかかわらずタンパク質の他の部分が不要であるという本発明者らの驚くべき予期しない発見に基づいている。本発明者らは、レット症候群で重要なMeCP2機能は、クロマチンとNCoR/SMRT複合体の間に架橋を形成するMeCP2によるものであり、MeCP2の他の全てのドメインは不要であるという仮説を立て、検証した。更に、本発明者らは、MBD又はNIDドメイン内で発生するレット症候群の変異がこの機能を直接妨害し、MBD及びNIDの外部で発生するレット症候群の変異が一般的にタンパク質を不安定化するか、又は具体的にクロマチンとNCoR/SMRT複合体との架橋を損なうという仮説を立てた。本発明者らの研究と理解の結果、本発明者らはMBDとNIDがそれゆえ、レット症候群と同様の障害の治療又は予防に必要なMeCP2機能に十分であると結論付けた。これは、例えば、いくつかの実施形態では、天然のMeCP2タンパク質の50〜65%までのかなりの部分を投棄することにより、「ミニMeCP2」タンパク質誘導体を提供できることを意味する。
【００１８】
本明細書の他の場所で議論されているように、本発明者の結論は、全長MeCP2よりもかなり小さい治療用合成ポリペプチドを調製できることを意味する。当然ながら、これは、より簡単に産生し、効果的に患者に届けることができることを意味する。例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター等の一部の送達ビヒクルは、運搬できるペイロードの量が制限されているため、より小さなポリペプチドをコード化することで負荷を軽減する能力が有利である。また、MeCP2ポリペプチドの不必要な部分の除去は、ペプチドタグ、調節タグ、及び/又はシグナル伝達ペプチド等の代替ポリペプチド配列が、いくつかの実施形態では、ポリペプチドを過度に大きくすることなくポリペプチドに挿入できることを意味する。同様に、より小さなタンパク質は、より小さな核酸配列がタンパク質をコードできることを意味し、本発明のいくつかの実施形態では、特定の構築物に含まれ得る核酸配列の量にサイズの制約があるとき、本発明のポリペプチドをコードするそのタイプの構築物は、より小さなポリペプチドの代わりに全長MeCP2タンパク質がコードされている場合にサイズの制約により含めるのが困難である調節エレメント等の追加の配列を含むことができる。更に、MeCP2タンパク質の他の生物学的に活性であるが不要な部分の除去は、治療又は予防治療中のタンパク質のそれらの部分の相互作用による望ましくない副作用の可能性がより少ないことを意味し得る。
【００１９】
したがって、本発明は、レット症候群等のMeCP2活性の低下に関連する障害を治療又は予防する改善された方法、及びそれらの方法で使用するための治療用生成物を提供する。
【００２０】
更に、本発明者らは、MBD及びNIDドメインを連結するMeCP2の部分の欠失がMBD及びNIDドメインを有する合成ポリペプチドの安定性を低下させるようであるが、この安定性の低下は、MeCP2ポリペプチドによる対象への過剰投与に伴う可能性のある毒性を軽減するために、有益な効果を有し得るということを、驚くべきことに予期せず見出した。したがって、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、より安全で毒性副作用に関連する可能性が低い改良された方法、及びMeCP2のMBDとNIDを連結するアミノ酸配列の少なくとも一部を欠く合成ポリペプチドを提供するこれらの方法で使用するための治療用生成物を提供する。
【００２１】
本発明の理解を助けるために、本明細書で使用される特定の用語をここで更に定義し、より一般的に本発明の更なる詳細を以下の段落で示す。
【００２２】
合成ポリペプチド
本発明は、MBDアミノ酸配列及びNIDアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドを提供する。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用することができ、ペプチジル結合により連結された少なくとも2つの共有結合したアルファアミノ酸残基を意味する。ポリペプチドという用語は、組換え又は合成技術を使用して部分的又は全体的に生成され得る精製された天然生成物又は化学生成物を包含する。ポリペプチドという用語は、二量体又は他の多量体、融合タンパク質、タンパク質バリアント、又はそれらの誘導体等、1つを超えるポリペプチドの複合体を指し得る。この用語には、修飾タンパク質、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、ユビキチン化等により修飾されたタンパク質も含まれる。ポリペプチドは、核酸コドンによってコードされていないアミノ酸を含んでもよい。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「合成ポリペプチド」という用語は、ヒトの媒介による方法によって形成されるポリペプチド配列を指す。本発明の合成ポリペプチドは、野生型MeCP2タンパク質に存在するもの等の生物学的に活性なMBD及びNID配列を有するという点でMeCP2に基づくが、天然に存在するMeCP2タンパク質とは区別される。本発明のポリペプチドは、野生型MeCP2配列にアミノ酸欠失、置換、及び/又は挿入等の変異を含み、得られる合成ポリペプチドは当該技術分野では天然ポリペプチドとして知られていないものとなるため、合成のものである。
【００２５】
「天然に存在する」、「天然」、又は「野生型」は、人工的に生成されたものとは異なるものとして自然界で見出し得る対象を記載するために使用される。例えば、生物(ウイルスを含む)に存在するタンパク質又はヌクレオチド配列は、自然界の源から分離でき、実験室のヒトによって意図的に改変されていないため、天然に存在するものである。
【００２６】
MeCP2のメチルCpG結合ドメイン(MBD)には、メチル化されたDNAに結合する能力がある。本明細書では、ヒトMeCP2のMBD配列を配列番号1として提供する。これは、包括的に、ヒトMeCP2タンパク質の72〜173までのアミノ酸で構成されている(番号はe2アイソフォーム、すなわち配列番号4におけるものを指す)。マウスMeCP2のMBD配列は、ヒト配列と同一である。本発明のポリペプチドは、このMeCP2のMBD配列(配列番号1)と少なくとも70%の類似性を有するMBDを含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒトMeCP2のMBD配列(配列番号1)と少なくとも70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の類似性を有するMBDを含む。更に好ましくは、本発明のポリペプチドは、少なくとも90%の類似性を有するMBDを含む。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒトMeCP2のMBD配列(配列番号1)を含む。本発明の合成ポリペプチドのMBD配列は、メチル化DNAに結合する能力を有する。
【００２７】
本発明の合成ポリペプチドに関して特に興味深いMBD配列は、MeCP2 e2アイソフォーム(配列番号4)の78〜162位のアミノ酸の配列である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、MeCP2 e2アイソフォーム(配列番号4)の78〜162位のアミノ酸配列と、少なくとも85%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%。又は99%の類似性を有するMBDを含む。最も好ましくは、本発明のポリペプチドのMBDアミノ酸配列は、MeCP2 e2アイソフォーム(配列番号4)の78〜162位のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
MeCP2のMBD配列には、いくつかのリン酸化部位(Ser80、Ser86、Thr148/9、及びSer164、e2アイソフォームに関する付番)が含まれる。少なくとも、Ser80及びSer164でのリン酸化は、MeCP2の活性に影響を及ぼすことに関連している。したがって、これらのアミノ酸の1つ、複数、又は全てが、本発明の合成ポリペプチドのMBD配列に保持されていることが好ましい。
【００２９】
本発明のMBD配列は、天然に存在するMeCP2 MBD配列、例えば、MeCP2のゼブラフィッシュホモログ中のMBDの配列に対応し得る。
【００３０】
MeCP2のNCoR/SMRT相互作用ドメイン(NID)は、MeCP2がNCoR/SMRTコリプレッサー複合体と相互作用するドメインである。本明細書では、ヒトMeCP2のNID配列を配列番号2として提供する。これは、包括的に、ヒトMeCP2タンパク質の272〜312までのアミノ酸で構成されている(番号はe2アイソフォーム、すなわち配列番号4におけるものを指す)。マウスMeCP2のMBD配列は、マウスではヒスチジンであるがヒトではグルタミンである、配列番号4のアミノ酸297位(すなわち、配列番号2の26位のアミノ酸)を除き、ヒト配列と同一である。本発明のポリペプチドは、このMeCP2のNID配列(配列番号2)と少なくとも70%の類似性を有するNIDアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒトMeCP2のNID配列(配列番号2)と少なくとも75%、80%、85%、88%、90%、92%、94%、95%、95%、97%、98%、又は99%の類似性を有するNIDを含む。更に好ましくは、本発明のポリペプチドは、少なくとも90%の類似性を有するNIDを含む。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒトMeCP2のNID配列(配列番号2)を含む。本発明の合成ポリペプチドのNID配列は、NCoR/SMRTコリプレッサー複合体と相互作用又は結合する能力を有する。
【００３１】
本発明の合成ポリペプチドに関して特に興味深いNID配列は、MeCP2 e2アイソフォーム(配列番号4)の298〜309位のアミノ酸の配列である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、MeCP2 e2アイソフォーム(配列番号4)の298〜309位のアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の類似性を有するMBDを含む。最も好ましくは、本発明のポリペプチドのNIDアミノ酸配列は、MeCP2 e2アイソフォーム(配列番号4)の298〜309位のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
MeCP2のNID配列には、リン酸化部位(Thr308及びSer274、e2アイソフォームに関する付番)が含まれ、前者はNIDの活性に影響を及ぼすことに関連している。したがって、少なくともThr308は、本発明の合成ポリペプチドのNID配列に保持されていることが好ましい。
【００３３】
本発明のNID配列は、天然に存在するMeCP2のNID配列、例えば、MeCP2のゼブラフィッシュホモログ中のNIDの配列に対応し得る。MBD及びNID配列は、それぞれの野生型ヒトMeCP2配列に対して同一量の類似性パーセンテージを有し得るか、又はそれらは、それぞれの野生型ヒトMeCP2配列と異なる量の類似性パーセンテージを有し得る。したがって、MBDとNIDに対する類似性パーセンテージは、上記で開示した類似性パーセンテージの任意の組み合わせからなり得る。したがって、本発明は、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すMBDアミノ酸配列と、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すNIDアミノ酸配列とを含む合成ポリペプチドを提供するが、好ましくは、MBD及びNIDのアミノ酸配列は、ヒトMeCP2ドメイン配列と、少なくとも75%、80%、85%、88%、90%、92%、94%、95%、95%、97%、98%、又は99%の類似性を有し得る。更に好ましくは、少なくとも90%の類似性である。同様に、MBD配列は、ヒトMeCP2のMBD配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、94%、95%、95%、97%、98%、又は99%の類似性を有し得、同一の合成ポリペプチドのNID配列は、ヒトMeCP2のNID配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、94%、95%、95%、97%、98%、又は99%の類似性を有し得る。好ましくは、MBD及びNID配列の一方又は両方は、それらの対応するヒト又はマウスドメイン配列からなるか、又は含むであろう。
【００３４】
「類似性」という用語は、配列のアライメントした位置のアミノ酸の違いを考慮に入れたタンパク質又はポリペプチドの配列間の類似性の程度を指すが、ほぼ同じサイズの観点から、異なるアミノ酸残基の機能的類似性、親油性、酸性度等も考慮される。Henikoff S.及びHenikoff J.G.、P.N.A.S. USA 1992年、89:10915〜10919頁に記載される、Blosum62マトリックス等の類似性スコアマトリックスを使用して、配列の最適なアライメントにより、類似性パーセンテージを計算することができる。Blosum62類似性マトリックスとNeedleman及びWunsch(J. Mol. Biol.、1970年48:443〜453頁)のアルゴリズムを使用した、2つの配列の類似性パーセンテージと最適なアライメントの計算は、プログラムの既定のパラメーターを使用して、Genetics Computer Group社(GCG、Madison, WI, USA)のGAPプログラムを使用して実行できる。
【００３５】
本発明における類似性のアミノ酸比較のための例示的なパラメーターは、GAPプログラムの以下の設定に関連してBlosum62マトリックス(Henikoff及びHenikoff、前出)を使用する:
・ギャップペナルティ:8
・ギャップ長ペナルティ:2
・末端ギャップにペナルティはない。
【００３６】
マウス及びヒトからのMBD及びNIDの機能的多型形態、並びに他の種のMeCP2からのこれらのドメインのホモログは、本発明のポリペプチドに含まれ得る。本発明の一部をも形成するポリペプチドのこれらのドメインのバリアントは、前記配列中の1つ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転、若しくは付加によるか、又はタンパク質に化学的に結合した部分の変化による、アミノ酸配列の変異を含み得る天然又は合成のバリアントである。例えば、タンパク質バリアントは、タンパク質に結合した改変された炭水化物又はPEG構造であってもよい。本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのそのようなタンパク質修飾を含み得る。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドドメイン又はタンパク質の「バリアント」とは、ポリペプチドが1つ以上のアミノ酸によって修飾(例えば、挿入、欠失、若しくは置換)されたときに生じるポリペプチドドメイン若しくはタンパク質、又はタンパク質修飾を含むもの、又は修飾若しくは非天然アミノ酸を含むものを指す。ポリペプチドの置換バリアントは、アミノ酸配列の少なくとも1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。本発明のポリペプチド中のドメインは、ドメインが機能を保持する限り、保存的変化を含むことができ、置換されたアミノ酸は類似の構造的若しくは化学的特性、又はよりまれに非保存的置換、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を有する。バリアントには、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はその両方を持つ配列も含み得る。生物学的又は免疫学的活性を損なわずにどのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失することができるかを決定する際の目安は、当技術分野において周知のコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。
【００３８】
「保存的置換」という用語は、1つ以上のアミノ酸置換の類似の生化学的特性を有するアミノ酸残基への置換に関する。典型的には、保存的置換は、得られるポリペプチド配列の活性にほとんど又はまったく影響を与えない。例えば、結合ドメインにおける保存的置換は、ドメインがその結合パートナーに結合するか、さもなければその通常の生物学的機能を実行する能力に実質的に影響しないアミノ酸置換であり得る。本発明のポリペプチドドメインのバリアントのスクリーニングは、どのアミノ酸残基がアミノ酸置換に耐えることができるかを特定するために使用することができる。一例では、修飾ドメインを有するポリペプチドの関連する生物活性は、1つ以上の保存的アミノ酸置換が行われるとき、25%を超えず、好ましくは20%を超えず、特に10%を超えて変化しない。
【００３９】
本発明のポリペプチドのMBD又はNIDに1つ以上の保存的置換を含めることができる。一例では、10個以下の保存的置換がドメインに含まれる。したがって、本発明のポリペプチドは、MBD及び/又はNIDドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上の保存的置換を含み得る。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入又はPCR等の標準的な手順を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することにより、1つ以上の保存的置換を含むように産生できる。代替的に、例えば当該技術分野で公知のペプチド合成法を使用することにより、1つ以上の保存的置換を含むポリペプチドを生成することができる。
【００４０】
タンパク質の元のアミノ酸を置換することができ、保存的置換とみなされるアミノ酸の例には以下が含まれる:AlaをSerに;ArgをLysに;AsnをGln又はHisに;AspをGluに;GlnをAsnに;GluをAspに;GlyをProに;HisをAsn又はGlnに;IleをLeu又はValに;LeuをIle又はValに;LysをArg又はGlnに;MetをLeu又はIleに;PheをMet、Leu、又はTyrに;SerをThrに;ThrをSerに;TrpをTyrに;TyrをTrp又はPheに;及びValをIle又はLeuに。一実施形態では、置換は、Ala、Val、Leu、及びIleの間で;SerとThrの間で;AspとGluの間で;AsnとGlnの間で;LysとArgの間で;及び/又はPheとTyrの間である。しかしながら、置換は、ポリペプチド配列内のリン酸化部位の除去をもたらす場合、保存的とはみなし得ない。保存的置換についての更なる情報は、他の場所でとりわけ、Ben-Bassat等(J. Bacteriol.、169:751〜7頁、1987年)、O'Regan等(Gene、77:237〜51頁、1989年)、Sahin-Toth等(Protein Sci.、3:240〜7頁、1994年)、Hochuli等(Bio/Technology、6:1321〜5頁、1988年)、WO00/67796(Curd等)並びに遺伝学及び分子生物学の標準的な教科書に見出すことができる。
【００４１】
MBD及びNIDの機能の喪失又は減少を引き起こす置換は、とりわけレット症候群及び他のMeCP2関連障害とのいくつかの関連により、当該技術分野で公知である。このような有害な変化又は変異の例には、MBDのTable 1(表1)及び図2Cに示されているもの、並びにNIDのTable 2(表2)及び図2Dに示されているものが含まれる。したがって、当業者は、これらの有害な変化が本発明のポリペプチドのMBD及びNIDドメインに含まれるべきではないことを理解するであろう。
【００４２】
表1:MBDの有害で良性のアミノ酸の変化。慣例に従って、以下に示す全てのアミノ酸番号は、ヒト及びマウスのe2アイソフォームを指す。*ヘミ接合体オスで見つかったものは太字で、ヘテロ接合型の女性で見つかったものは斜体である;**非哺乳類の脊椎動物で見つかったものは、斜体で提示される。以下に列挙されている「良性の変化」は、MeCP2に関連する障害に関連することは知られていないため、おそらく良性である。
【００４３】
【表１Ａ】
2020513830.tif 000003
【００４４】
【表１Ｂ】
2020513830.tif 000004
【００４５】
Table 1(表1)及びTable 2(表2)はまた、MECP2関連障害との関連が知られていないため、良性と考えられている変化も列挙されている    したがって、当業者は、そのような明らかに良性の変化が本発明の合成ポリペプチドに必要に応じて含まれ得ることを理解するであろう。
【００４６】
表2: NIDの有害で良性のアミノ酸の変化。慣例に従って、以下に示す全てのアミノ酸番号は、ヒト及びマウスのe2アイソフォームを指す。*ヘミ接合体オスで見つかったものは太字で、ヘテロ接合型の女性で見つかったものは斜体である;**マウスで見つかったものは太字で、非哺乳類の脊椎動物で見つかったものは斜体で提示される。
【００４７】
【表２】
2020513830.tif 000005
【００４８】
本発明にとって特に興味深いMBD及びNIDドメインの生物活性は、NCoR/SMRTコリプレッサー複合体のメンバーをメチル化DNAに動員する能力である。したがって、本発明の合成ポリペプチドは、メチル化DNAにNCoR/SMRTコリプレッサー複合体の構成要素を動員できることが好ましい。NCoR/SMRTコリプレッサー複合体構成要素には、NCoR、HDAC3、SIN3A、GPS2、SMRT、TBL1X、及びTBLR1が含まれる。好ましくは、合成ポリペプチドは、TBL1X又はTBLR1をメチル化DNAに動員することができる。
【００４９】
本発明者らは、レット症候群及び関連障害におけるMeCP2の低下した活性を補償するために、治療用MeCP2に必要な活性に重要であるものとしてMBD及びNIDドメインを同定した。したがって、MBD及びNIDドメインは本発明の合成ポリペプチドにおいて生物学的に活性であることが必要であるが、野生型MeCP2タンパク質の他の部分のアミノ酸配列は、例えばアミノ酸の欠失により変更され得る。したがって、本発明の合成ポリペプチドは、完全長のヒトMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較するとき、少なくとも50アミノ酸の欠失を有し得る。少なくとも50個のアミノ酸の前記欠失は、完全長のヒトMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較するとき、少なくとも60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、又は300個のアミノ酸の欠失であり得る。好ましくは、前記欠失は、完全長ヒトMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較するとき、少なくとも200個のアミノ酸のものである。少なくとも50個のアミノ酸のそのような欠失は、目的のアミノ酸配列とヒトMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)とのアライメントを作成することにより評価できる(上記参照)。これにより、MeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)にアライメントされた目的の配列にギャップがあるため、MeCP2配列におけるアミノ酸残基が削除された領域を同定できる。好ましくは、前記少なくとも50個のアミノ酸の欠失が、MeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)内で少なくとも5、10、15、20、30、40、50、又はそれ以上の連続的なアミノ酸の欠失を含むように、欠失したアミノ酸の少なくともいくつかはMeCP2配列内で連続的である。少なくとも50個のアミノ酸の欠失は、e1とe2の配列の両方とのアラインメントから明らかであるため、MeCP2のN末端領域に存在し、e1及びe2配列のいずれかにのみ関連する任意の欠失は、本発明に従って欠失した少なくとも50個の連続したアミノ酸の一部とみなされる欠失と考えるべきではない。しかしながら、MeCP2のN末端領域に存在し、e1とe2配列のアラインメントの両方に存在する欠失は、欠失とみなされ、本発明による少なくとも50個の欠失アミノ酸の一部とみなされるべきである。
【００５０】
野生型MeCP2 e1及びe2配列から欠失したアミノ酸は、いくつかの他の有用なアミノ酸配列で置き換えられてもよい。例えば、完全長のヒトMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較して少なくとも50個のアミノ酸の欠失が発生し得るが、それらの欠失したアミノ酸は、リンカー、タグ、及び/又はシグナル伝達ペプチドを提供するアミノ酸配列によって少なくとも部分的に置き換えられていてもよい。これは、合成ポリペプチドのアミノ酸配列におけるMeCP2配列と一致しない区間によって、合成ポリペプチドとMeCP2 e1及びe2配列とのアラインメントにおいて同定され、その一致しないアミノ酸配列の区間は有用な、又は目的のある異種配列に対応する。したがって、少なくともいくつかの実施形態では、本発明は、MBD及びNID配列に関連するMeCP2活性を有するが、合成ポリペプチドを野生型MeCP2タンパク質より大きくする必要なく、有用な異種配列を含むことができる合成ポリペプチドを提供する。MeCP2配列の大部分は本発明の合成ポリペプチドから除外できるため、合成ポリペプチドの比較的小さな全体サイズを維持しながら異種配列を含めることができる。
【００５１】
上述の少なくとも50個のアミノ酸の欠失の代替として、又はそれに加えて、MBD及びNIDアミノ酸配列を有する本発明の合成ポリペプチドは、ポリペプチドアミノ酸配列に変化があり、それにより、配列番号3及び4に示されるMeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号3及び4に示されるMeCP2のアミノ酸配列と90%未満の同一性を有するようにすることができる。前記90%未満の同一性は、e1とe2配列の両方との比較から明らかであり、したがって、e1及びe2配列の1つにのみ関連するMeCP2のN末端領域の変化だけによるものであるような任意の同一性は、本発明による90%未満の同一性を有する合成ポリペプチドとみなされない。好ましくは、前記同一性は、85%、80%、75%、70%、65%、60%、又は55%未満である。前記同一性は60%未満であることが特に好ましい。
【００５２】
本発明の合成ポリペプチドは一般に構造:
A-B-C-D-E
を有し、式中、合成ポリペプチドの部分Bは、上述のようなMBDアミノ酸配列であり、合成ポリペプチドの部分Dは、上述のような前記NIDアミノ酸配列である。しかしながら、上記で説明したように、MBD及びNIDドメイン以外の合成ポリペプチドの部分、すなわち部分A、C、及びDは、野生型MeCP2配列と比較して変化を有し得る。したがって、合成ポリペプチドは以下の1つ以上に従う変化を含み得る:合成ポリペプチドの部分Aが40未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6で示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Cが20未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号7に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号7に示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Eは存在しないか、タンパク質タグであるか、及び/又は配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有する。
【００５３】
ポリペプチドのN末端部分及びMBDアミノ酸配列がNIDアミノ酸配列のN末端にあるときのMBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接する領域に対応する合成ポリペプチドの部分Aは、40個のアミノ酸未満、好ましくは35、30、25、又は20個のアミノ酸未満であり得る。部分Aが25個のアミノ酸未満であることが特に好ましい。追加的又は代替的に、部分Aは、配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有し得、好ましくは、同一性は、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、又は50%未満である。好ましくは、部分Aは、MeCP2 e1及びe2の天然配列と比較して短縮され、その結果、部分Aは、72個未満のアミノ酸長、好ましくは70、65、50、55、45、30、又は25個未満のアミノ酸である。更に好ましくは、部分Aは、配列番号5及び6が本質的に存在しない程度まで短縮される。例えば、配列番号5及び6は、合成ポリペプチドのアミノ酸配列から欠失され、必要に応じてN末端タグで置換されていてもよい。
【００５４】
したがって、ヒトe1の24個のアミノ酸長(マウスe1の29個のアミノ酸)及びe2の9個のアミノ酸長(ヒト/マウス)であり、MECP2及びMecp2のエクソン1及び2並びにエクソン3の最初の10塩基対によってコードされるe1及びe2に特異的なアミノ酸配列は、本発明の合成ポリペプチドに含まれてもよく、したがって、例えば、合成ポリペプチドの最もN末端のアミノ酸配列を提供し得る。マウスe1特異的N末端アミノ酸配列は、MAAAAATAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK(配列番号9)である。マウスe2特異的N末端アミノ酸配列は、MVAGMLGLREEK(配列番号10)である。ヒトe1特異的N末端アミノ酸配列は、MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK(配列番号11)である。ヒトe2特異的N末端アミノ酸配列は、MVAGMLGLREEK(配列番号12)である。したがって、本発明の合成ポリペプチドは、配列番号9〜12のいずれかに対応するアミノ酸配列を含み得、必要に応じて、前記アミノ酸配列は、本発明の合成ポリペプチドの最もN末端配列であり得る。
【００５５】
しかしながら、好ましくは、野生型e1及びe2 MeCP2に特異的なこれらの最端のN末端配列は、本発明の合成ポリペプチドに含まれないであろう。したがって、好ましくは、本発明の合成ポリペプチドは、配列番号9〜12のいずれかに対応するアミノ酸配列を含まない。
【００５６】
好ましくは、MBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列は、配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列と75%未満の同一性、好ましくは50%未満、更に好ましくは30%未満の同一性を有する。
【００５７】
好ましくは、MBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列は、50個未満のアミノ酸長、好ましくは30個未満のアミノ酸長、又は20個未満のアミノ酸長、更に好ましくは10個未満のアミノ酸長である。MBDとNIDアミノ酸配列の間のアミノ酸配列に対応する合成ポリペプチドの部分Cは、20個のアミノ酸未満、好ましくは15、10、又は5個のアミノ酸未満であり得る。追加的又は代替的に、部分Cは、配列番号7に示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有し得、好ましくは、同一性は、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、50%未満、又は30%未満である。好ましくは、部分Cは、MeCP2の天然配列と比較して短縮され、その結果、部分Cは、98個未満のアミノ酸長、好ましくは90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、又は15個未満のアミノ酸長である。好ましくは、MBDとNIDのアミノ酸配列の間のアミノ酸配列は、50個未満のアミノ酸長、好ましくは30個未満のアミノ酸長、更に好ましくは20個未満のアミノ酸長である。
【００５８】
合成ポリペプチドの部分C、すなわちMBDとNIDの配列の間のアミノ酸配列内の欠失のさらなる利点は、本発明者らが発見した、この部分の欠失が合成ポリペプチドの安定性を低下させるということである。驚くべきことに、本発明者らは、そのような安定性の低下が、合成ポリペプチドの過剰発現の可能性を低下させる可能性があるため、臨床環境における合成ポリペプチドの実用に有益であり得ることを見出した。したがって、いくつかの実施形態では、MBDアミノ酸配列とNIDアミノ酸配列との間のアミノ酸配列、例えば、上述の一般構造の部分Cに顕著な欠失、例えば、少なくとも10、15、20、30、40、又は50個のアミノ酸の欠失があることが特に好ましい。好ましくは、アミノ酸の置換又は顕著な欠失は、配列番号4に示される全長ヒト野生型MeCP2ポリペプチド配列(e2アイソフォーム)の207位〜271位の領域からの置換又は顕著な欠失を含む。
【００５９】
MBDアミノ酸配列がNIDアミノ酸配列のN末端であるとき、ポリペプチドのC末端部分及びNIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接する領域に対応する合成ポリペプチドの部分Eは、存在しない場合があり、NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端が合成ポリペプチドのC末端に対応する。或いは、部分Eは、例えば、部分Eを使用して合成ポリペプチドを単離又はモニター/検出できるようにタンパク質タグを含むことができる。更に、又は代替的に、部分Eは、配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に提供されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有し得、好ましくは、同一性は、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、又は50%未満である。したがって、部分Eは、MeCP2(配列番号4)の313位〜486位のアミノ酸の全て又はかなりの部分の欠失を含み、必要に応じてタグによる欠失配列の置換、更に必要に応じて合成ポリペプチドにタグを結合するリンカーを伴うことができる。
【００６０】
好ましくは、NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列は、配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に示されるアミノ酸配列と75%未満の同一性、好ましくは50%未満、更に好ましくは30%未満の同一性を有する。
【００６１】
好ましくは、NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列は、50個未満のアミノ酸長、好ましくは30個未満のアミノ酸長、又は20個未満のアミノ酸長であり、更に好ましくは、NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列がなく、その結果、NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端が合成ポリペプチドのC末端に対応する。
【００６２】
本発明の合成ポリペプチドの部分Eの一部を形成するタグは、以下で更に説明するように、合成ポリペプチドのモニタリング又は検出のため、又は合成ポリペプチドの翻訳後調節を可能にするためのものであり得る。ポリペプチドの検出又はモニタリングに適したタグの例は当該技術分野で公知であり、ポリヒスチジンタグ、FLAGタグ、Mycタグ、及び強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)等の蛍光タンパク質タグが含まれる。
【００６３】
好ましくは、本発明の合成ポリペプチドは、配列番号3及び配列番号4に示されるMeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって90%未満の同一性を有し、好ましくは80%未満の同一性、70%未満の同一性、又は60%未満の同一性、更に好ましくは40%未満の同一性を有する。
【００６４】
「同一性」という用語は、2つのアミノ酸配列がアライメントの同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。本明細書で使用される同一性パーセンテージは、本明細書に記載の比較配列、例えば本明細書に記載の配列番号3〜8のうちの1つの長さにわたって計算される。したがって、その比較配列内の全ての残基は、目的の配列とアライメントする必要があり、同一性パーセンテージを計算する際に、目的の配列と比較配列の全長とのアライメント中に生じたギャップを考慮する必要があり、そのような「ギャップ」が、アライメントの目的の配列の両端に発生するときを含む。ただし、比較配列の末端を超えてアライメントする、すなわち比較配列とアライメントしないが、代わりに比較配列の末端を突出する目的の配列内の追加の末端配列は、同一性パーセンテージを計算する際に含めるべきではない。したがって、同一性パーセンテージを計算するとき、同一性スコアは、目的の配列との最適なアライメントの結果として比較配列に挿入された任意のギャップを含む比較配列の長さで除算され、次いで100倍される。
【００６５】
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野で公知である。様々なプログラム及びアライメントのアルゴリズムは以下に記載される:Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math.、2:482頁、1981年;Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol.、48:443頁、1970年;Pearson及びLipman、Proc. Nat. Acad Sci. USA、85:2444頁、1988年;Higgins及びSharp、Gene、73:23744頁、1988年;Higgins及びSharp、CABIOS、5:151〜3頁、1989年;Corpet等、Nuc. Acids Res.、16:10881〜90頁、1988年;Huang等、Computer Appls. in the Biosciences、8、155〜65頁、1992年;並びにPearson等、Meth Mol. Bio.、24:307〜31頁、1994年。Altschul等、J. Mol. Biol.、215:403〜10頁、1990年は、配列アライメント法と相同性計算の詳細な検討事項を提示する。GCG社(Genetics Computer Group Inc., Madison, WI, USA)で実行されるGAPプログラム等、配列アライメントの作成と同一性パーセンテージの計算を可能にするプログラムは容易に入手できる。
【００６６】
本発明の合成ポリペプチドの他のバリアントは、例えば、塩、アミド、エステル、具体的にはC末端エステル、及びN-アシル誘導体等の機能的バリアントであり得る。また、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、又はリン酸化によりin vivo又はin vitroで修飾されるペプチドも含まれる。
【００６７】
本発明の利点は、MBD及びNIDの配列を、レット症候群において欠損しているMeCP2の活性に重要なものであると特定することにより、レット症候群等の障害の治療又は予防に使用する合成タンパク質を調製するときにMeCP2タンパク質の他のセクションのかなりの部分を除去できることを特定したことである。したがって、本発明は、MBD及びNIDの配列を含むが、完全長ヒトMeCP2 e1及びe2配列(配列番号3及び4)と比較するとき、MBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列(例えば、部分A中)、MBDとNIDのアミノ酸配列の間(例えば、部分C中)、及びNIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接する部分(例えば部分E中)の1つ以上の部分を欠くMeCP2の短縮型である合成ポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明の合成ポリペプチドは、野生型MeCP2タンパク質よりも少ないアミノ酸を有し、例えば、本発明の合成ポリペプチドは、430個未満のアミノ酸、好ましくは400、350、320、270、又は200個未満のアミノ酸からなり得、更に好ましくは180個未満のアミノ酸からなり得る。
【００６８】
本発明の合成ポリペプチドは、シグナルペプチド、例えば、核局在化シグナルを適切に含むことができる。核局在化シグナルは、核輸送による細胞核へと移入するようポリペプチドを標的化し得る。適切な核局在化シグナルは当該技術分野で公知であり、SV40核局在化シグナル及び天然MeCP2タンパク質のNLS(配列番号4のアミノ酸253〜271)が含まれる。NLSは、ポリペプチドの任意の部分に位置してもよいが、MBDをNIDに連結するアミノ酸配列に位置することが好ましい。
【００６９】
本発明の合成ポリペプチドは、細胞透過性ペプチド(CPP)を適切に含み得る。タンパク質形質導入ドメインとも呼ばれるCPPは、細胞への分子の侵入を促進できる8〜30個のアミノ酸長の短い配列からなる15。CPPは、合成、治療用分子の標的化のために特別に設計されたもの、又は天然に存在するものであり得る。好ましくは、CPPは神経細胞への侵入を促進するであろう。本発明の合成ポリペプチドと共に使用するのに好ましいCPPは、転写タンパク質のトランス活性化因子TatのCPPである。
【００７０】
本発明の合成ポリペプチドは、タグを適切に含み得る。そのようなタグは当該技術分野で公知であり、ポリペプチドの精製、検出/モニタリング、及び/又は翻訳後調節に有用であり得る。ポリペプチドの精製又は検出に有用な適切なタグの例は当該技術分野で公知であり、ポリヒスチジンタグ、FLAGタグ、Mycタグ、及び強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)等の蛍光タンパク質タグが含まれる。
【００７１】
タグは、例えば、ポリペプチドの翻訳後分解を制御する能力を提供することにより、ポリペプチドの翻訳後調節に使用され得る。翻訳後分解のそのような制御を可能にするために本発明の合成ポリペプチドと共に使用され得る適切なタグの例には、SMAShタグ及びFKBP12の不安定化ドメイン(DD)が含まれる。SMAShタグの長さは約300アミノ酸長であり、プロテアーゼ切断部位とそれに続くプロテアーゼ、それに続くデグロンタグを含む。SMAShタグは、目的のタンパク質(POI)において、POIとデグロンタグ間のプロテアーゼ切断部位及びプロテアーゼに融合される。これは、POIのどちらの終端にも存在し得る。通常、プロテアーゼはプロテアーゼ部位を自己切断し、デグロンタグを除去してタンパク質が分解されないようにする。しかしながら、アスナプレビル等の薬で処理すると、プロテアーゼが阻害され、デグロンタグの除去が妨げられるため、結合したPOIが分解される。アスナプレビルの投与はPOI分解に用量依存的な影響を与えるため、アスナプレビルとともにSMAShタグを使用すると、POIの量の翻訳後調節が可能になる。
【００７２】
同様に、DD-FKBP12は約110個のアミノ酸長であり、結合しているPOIを不安定化する。それはPOIのいずれかの末端に融合することができるが、N末端に接着することが、一般的により効果的であるため好ましい。したがって、産生される融合タンパク質は一般に不安定になるが、Shield-1と呼ばれる分子の投与によって保護できる。Shield-1の投与は、POIの分解の防止に用量依存的な効果を有する。
【００７３】
当業者は、特定のタイプのタグ、特にMyc又はEGFP等のポリペプチド合成中の精製又は検出に使用されるものを、対象に送達される最終の治療用ポリペプチドに含めることが、タグが望ましくない方法で免疫原性又は活性であり得るので、望ましくない場合があることを理解するであろう。したがって、本発明の合成ポリペプチドに含まれるタグは、例えば、化学薬剤又はタンパク質分解又はインテインスプライシング等の酵素的手段によって除去可能であってもよく、これにより、合成ポリペプチドの調製中のタグの使用が可能になり、その後、本明細書に開示される治療用途(例えば、タンパク質補充療法)による治療のために動物にポリペプチドが導入される前にタグが除去される。
【００７４】
本発明の合成ポリペプチドは、MeCP2のこれら2つの配列を連結する天然配列の代わりに、或いはタグ、CPP、若しくはNLSを本発明の合成ポリペプチドに結合又は挿入する手段として、例えばMBD配列をNID配列に連結するリンカー配列を含んでもよい。そのようなリンカーの設計及び使用は、当該技術分野で公知である。適切なリンカーは、4〜15個のアミノ酸、好ましくは6〜10個のアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーは、グリシン、セリン、又はグリシンとセリンの組み合わせからなるであろう。
【００７５】
好ましくは、本発明の合成ポリペプチド配列は、ΔNC(配列番号13)、ΔNIC(配列番号14)、ΔNマウス(配列番号15)、ΔNCマウス(配列番号16)、及びΔNICマウス(配列番号17)の配列のうちの1つ以上に対して少なくとも80%の類似性を、好ましくは少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の類似性を示すであろう。必要に応じて、上記で開示したように、本発明の合成ポリペプチド配列は、好ましくは合成ポリペプチドのN末端にe1又はe2特異的配列を含んでもよい。したがって、好ましくは、本発明の合成ポリペプチド配列は、配列:ΔNC(配列番号13);ΔNIC(配列番号14);ΔNマウス(配列番号15);ΔNCマウス(配列番号16);及びΔNICマウス(配列番号17)、並びに配列のN末端におけるe1又はe2特異的配列(配列番号9〜12)のうちの1つ以上からなる配列と少なくとも80%の類似性を、好ましくは少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の類似性を示すであろう。更に好ましくは、本発明の合成ポリペプチド配列は、配列ΔNC(配列番号13)、ΔNIC(配列番号14)、ΔNマウス(配列番号15)、ΔNCマウス(配列番号16)、ΔNICマウス(配列番号17)、又は配列ΔNC(配列番号13)、ΔNIC(配列番号14)、ΔNマウス(配列番号15)、ΔNCマウス(配列番号16)、ΔNICマウス(配列番号17)のうちの1つを、配列のN末端におけるe1又はe2特異的配列(配列番号9〜12)、ΔNC(配列番号13)を含み得るか又はそれからなり得る。ΔNCマウス(配列番号13)、ΔNマウス(配列番号15)及びΔNCマウス(配列番号16)には、野生型MeCP2 NLS配列が含まれる。ΔNIC(配列番号14)及びΔNICマウス(配列番号17)にはSV40のNLS配列が含まれる。
【００７６】
本発明の合成ポリペプチド配列は、ΔNIC(配列番号14)及びΔNIC(配列番号14)のN末端に直接隣接するヒトe1又はe2特異的配列(配列番号11及び12)からなる配列と少なくとも80%の類似性を、好ましくは少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の類似性を示すことが特に好ましい。更に好ましくは、本発明の合成ポリペプチド配列は、ΔNIC(配列番号14)を、必要に応じてΔNIC(配列番号14)のN末端に直接隣接するヒトe1又はe2特異的配列(配列番号11及び12)を含むか、又はそれからなり得る。本発明の合成ポリペプチドは、以下で更に説明するように、MECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防に使用することができる。
【００７７】
核酸構築物、発現ベクター、ビリオン、及び細胞
本発明は、本発明の合成ポリペプチドをコードする核酸構築物、及び本発明の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターはウイルスベクターであってもよく、したがって、本発明はまた、本発明による発現ベクターを含むビリオンを提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように適合された合成遺伝子構築物を含む細胞、本発明のベクターを含む細胞、及び本発明のビリオンを産生するための細胞を提供する。
【００７８】
核酸構築物及び/又は発現ベクターは、合成ポリペプチドの発現を駆動するために、本発明の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも1つの発現制御配列を適切に含む。「発現制御配列」は、コード配列の上流(5'非コード配列)、内部、又は下流(3'非コード配列)にあるヌクレオチド配列であり、関連するコード配列の転写、RNA処理、若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。発現制御配列には、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列が含まれる。それらには、天然配列及び合成配列、並びに合成配列と天然配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。本明細書に記載されているように、「発現制御配列」という用語はプロモーターに限定されない。しかしながら、本発明において有用ないくつかの適切な発現制御配列には、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、調節可能プロモーター、及びウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
そのような発現制御配列は、一般に、プロモーター配列と、転写及び翻訳を調節する並びに/又は発現レベルを増強する追加の配列を含む。適切な発現制御配列は当該技術分野で公知であり、真核生物、原核生物、若しくはウイルスのプロモーター又はポリAシグナルが含まれる。発現制御及び他の配列は、当然に、選択された宿主細胞に応じて変化するか、誘導可能にすることができる。有用なプロモーターの例は、SV-40プロモーター(Science 1983年、222: 524〜527頁)、メタロチオネインプロモーター(Nature 1982年、296:39〜42頁)、熱ショックプロモーター(Voellmy等、P.N.A.S. USA 1985年、82:4949〜4953頁)、PRV gXプロモーター(Mettenleiter及びRauh、J. Virol. Methods 1990年、30:55〜66頁)、ヒトCMV IEプロモーター(米国特許第5,168,062号)、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター(Gorman等、P.N.A.S. USA、1982年、79:6777〜6781頁)、又はヒト伸長因子1アルファ若しくはユビキチンプロモーターである。動物、例えばヒトの発現を駆動するのに適した制御配列は、当該技術分野で公知である。発現制御配列は、遍在的な発現又は組織若しくは細胞特異的な発現を駆動できる。発現制御配列は、例えば、ウイルス又はヒトのプロモーターを含むことができる。適切なプロモーターは、偏在的(例えば、CAGプロモーター)、組織限定、又は組織特異的であり得る。例えば、NESTINプロモーターはCNSでの発現を駆動でき、TAU及びSYNAPSINプロモーターはニューロンでの発現を駆動できる。好ましくは、プロモーターは、神経細胞におけるヌクレオチド配列の発現用であり、例えばMECP2又はMecp2プロモーターである。多くの適切な制御配列が当該技術分野で知られており、使用されている発現系に適切な配列を選択することは当業者にとって日常的であろう。
【００８０】
MECP2の発現は動物で厳しく制御されている。したがって、本発明の核酸構築物及び発現ベクターが、動物における本発明の合成ポリペプチドの発現、例えば遺伝子治療に使用される場合、前記発現は神経細胞、特に脳及びCNSの神経細胞に特異的であることが好ましい。これは、例えば、核酸構築物及び発現ベクターの脳及び/又は神経細胞への特異的な標的化により、AAVビリオン等の送達媒体の使用により、及び/又はCNSへの直接投与によるもの等の特異的な投与経路により達成できる。更に又は代替的に、前記ニューロン特異的発現は、合成ポリペプチドの発現を神経細胞に実質的に制限する核酸構築物及び/又は発現ベクターにおける発現制御配列の使用により達成され得る。好ましくは、それらの発現制御配列は、MECP2遺伝子の自然発現を制御するために使用される発現制御配列から選択されるだろう。
【００８１】
MECP2遺伝子には非常に大きく、高度に保存された3'UTRが含まれており、その中にはエンハンサー、サイレンサー、及び多くのmiRNA結合部位が同定されている。同様に、MECP2遺伝子プロモーター領域も非常に大きく、サイレンサー、調節エレメント、及びプロモーター配列が含まれている。したがって、好ましくは、本発明の発現ベクター及び/又は核酸構築物は、MECP2 3'UTRからの発現制御配列エレメントのうちの1つ以上を含むであろう。例えば、Mecp2遺伝子からの上流コアプロモーターエレメント、並びに下流マイクロRNA(miR)結合部位及びAUリッチエレメントを含む発現カセットを使用した遺伝子治療が本明細書に開示されている。したがって、本発明の発現ベクター及び/又は核酸構築物は、好ましくは、上流MECP2又はMecp2コアプロモーター配列(例えば、包括的に配列番号65のヌクレオチド200〜329を参照されたい);MECP2又はMecp2の3'UTRからの1つ以上の下流miR結合部位;及びMECP2又はMecp2の3'UTRのAUリッチエレメントから選択される1つ以上のエレメントを含む。更に好ましくは、MECP2又はMecp2の3'UTRからの1つ以上の下流miR結合部位は、以下のmiR結合部位の1つ以上、又は全てを含む:mir-22の結合部位(包括的に、配列番号65のヌクレオチド1166〜1195)、mir-19の結合部位(包括的に、配列番号65のヌクレオチド1196〜1224)、mir-132の結合部位(包括的に、配列番号65のヌクレオチド1225〜1252)、及びmir-124の結合部位(包括的に、配列番号65のヌクレオチド1318〜1324)。
【００８２】
好ましくは、本発明の発現ベクター及び/又は核酸構築物は、Mecp2又はMECP2からの上流CNS調節エレメント(例えば、包括的に、配列番号65のヌクレオチド422〜443を参照されたい)及び/又はMecp2又はMECP2からの上流サイレンサー(例えば、包括的に、配列番号65のヌクレオチド142〜203までを参照されたい)を含み得る。
【００８３】
本発明の発現ベクター及び/又は核酸構築物の上流領域が、mMeP426配列(配列番号65のヌクレオチド117〜542;図17B、図17Cを参照されたい)を含むこと、及び/又は本発明の発現ベクター及び/又は核酸構築物の下流領域が、RDH1pA配列(配列番号65のヌクレオチド1166〜1370;図17B、図17Cを参照されたい)を含むことが特に好ましい。
【００８４】
当然に、当業者は、本発明の発現ベクター及び/又は核酸構築物において、翻訳開始シグナル、例えばコザック配列、ポリアデニル化シグナル、及びCstF(切断刺激因子)等のポリアデニル化機構の成分の結合部位等の1つ以上の他の配列エレメントも望ましいか又は必要であることを理解するであろう。当業者は、そのような必要な又は望ましい公知の配列を有する本発明による発現ベクター及び/又は核酸構築物を設計することができるであろう。
【００８５】
ヒト野生型MECP2 e1アイソフォームcDNA配列は、配列番号18として本明細書で提供される。マウス野生型MECP2 e1アイソフォームcDNA配列は、配列番号21として本明細書で提供される。
【００８６】
適切には、本発明の核酸構築物は、ΔNC(配列番号19)、ΔNIC(配列番号20)、ΔNマウス(配列番号22)、ΔNCマウス(配列番号23)、又はΔNICマウス(配列番号24)のcDNA配列をコードするための配列を含み得る。上記で説明したように、必要に応じて、本発明の合成ポリペプチドは、e1又はe2特異的N末端配列を含んでもよい。マウスe1特異的N末端アミノ酸配列は、cDNA配列ATGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAGGAAAAG(配列番号25)によってコードされる。マウスe2特異的N末端アミノ酸配列は、cDNA配列ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAGGAAAAGGGAGGAAAAG(配列番号26)によってコードされる。ヒトe1特異的N末端アミノ酸配列は、cDNA配列ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAG(配列番号27)によってコードされる。ヒトe2特異的N末端アミノ酸配列は、cDNA配列ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAAGAAAAG(配列番号28)によってコードされる。したがって、本発明の核酸構築物は、配列番号25〜28のいずれかによるcDNA配列をコードするための配列を含み得る。
【００８７】
更に好ましくは、本発明の核酸構築物は、ΔNICのcDNA配列(配列番号20)に直接隣接する配列番号28又は29のcDNA配列をコードするための配列を含み得る。
【００８８】
遺伝暗号の縮重により、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、異なる特定のコドンを利用する可能性がある(例えば、同義の塩基置換)。上記で定義された合成ポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドは、本発明の一部とみなされる。
【００８９】
本発明は、本発明の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、上記のような単離又は合成核酸構築物を適切に含む。
【００９０】
本発明によるベクターは、宿主細胞の形質転換に適している。適切なクローニングベクターの例は、pBR322、様々なpUC、pEMBL、及びBluescriptプラスミド等のプラスミドベクター、又はHVT(七面鳥ヘルペスウイルス)、MDV(マレック病ウイルス)、ILT(感染性喉頭気管炎ウイルス)、FAV(鶏アデノウイルス)、FPV(伝染性上皮腫ウイルス)、若しくはNDV(ニューカッスル病ウイルス)等のウイルスベクターである。pcDNA3.1は、動物細胞での発現に特に好ましいベクターである。
【００９１】
ポリヌクレオチドが適切なベクターにクローン化された後、構築物は、エレクトロポレーション、CaCl2トランスフェクション、又はリポフェクチン等の適切な方法によって細胞、細菌、又は酵母に導入され得る。バキュロウイルス発現系が使用されるとき、ポリヌクレオチドを含むトランスファーベクターは、完全なバキュロゲノムとともにトランスフェクトされ得る。
【００９２】
これらの技術は当該技術分野で公知であり、分子生物学的材料の製造業者(Clontech社、Stratagene社、Promega社、及び/又はInvitrogen社等)が適切な試薬とそれらの使用方法に関する使用説明書を提供する。更に、これに関する詳細な情報を提供する、例えば、Rodriguez, R. L.及びD. T. Denhardt編、「Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses」、Butterworths、1988年;Current protocols in Molecular Biology編: F. M. Ausubelet等、Wiley N. Y.、1995年;Molecular Cloning: a laboratory manual、前出;及びDNA Cloning、1〜4巻、第2版、1995年編:Glover及びHames、Oxford University Press)のような、多くの標準参考教科書が存在する。
【００９３】
ベクターを介した発現のための本発明による好ましいタンパク質の詳細は上述されている。
【００９４】
ベクターは、宿主細胞における一過性の発現又は安定した発現を提供するように適合され得る。安定的な発現は、例えば、合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノムに組み込むことにより達成できる。
【００９５】
適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター(レンチウイルスベクターを含む)、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、及びアルファウイルスベクターが含まれる。好ましくは、ウイルスベクターは、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、又はAAV9等のAAVベクターである。好ましくは、AAVベクターは自己相補型(sc)AAVベクターである。
【００９６】
本発明のベクターは、ビリオンに存在してもよい。したがって、本発明は、本発明によるベクターを含むビリオンも提供する。好ましくは、ビリオン及び/又はウイルスベクターは、神経細胞等の中枢神経系(CNS)の細胞での発現用である。したがって、好ましくは、本発明のビリオンは、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、及びAAV9のうちの1つ以上からのカプシド及び/又は末端逆位配列(ITR)を含む。好ましくは、AAVは自己相補型(sc)AAVベクターである。更に好ましくは、ITR及びカプシドタンパク質は異なる血清型に由来し得、例えば、AAV2からのITRをAAV9からのカプシドタンパク質とともに使用して、scAAVビリオンを形成し得る。
【００９７】
本発明によるベクターは、本発明によるタンパク質の発現のための細胞の形質転換に使用することができる。これは、細胞培養で行われて収集のための組換えタンパク質を産生することができ、又はin vivoで行われて本発明によるタンパク質を動物に送達することができる。
【００９８】
したがって、本発明は、細胞が本発明によるタンパク質を発現するように適合された合成遺伝子構築物を含む細胞集団も提供する。前記細胞集団は、細胞増殖を支援するための適切な培地中の細胞培養系に存在し得る。
【００９９】
細胞は真核生物又は原核生物であり得る。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、任意の適切な発現系にクローン化され得る。適切な発現系には、細菌発現系(例えば、大腸菌DH5α)、ウイルス発現系(例えば、バキュロウイルス)、酵母系(例えば、Saccharomyces cerevisiae)、又は真核細胞(例えば、COS-7、CHO、BHK、HeLa、HD11、DT40、CEF、又はHEK-293T細胞)が含まれる。広範囲の適切な発現システムが市販されている。典型的には、ポリヌクレオチドは、適切な構成的又は誘導性プロモーターの制御下の適切なベクターにクローニングされ、次いで、発現のために宿主細胞に導入される。
【０１０１】
適切には、細胞は動物細胞であり、より好ましくは、それらは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。適切には、細胞は上記のベクターを含む。
【０１０２】
好ましくは、細胞は、本発明によるタンパク質の発現が誘導性であるように適合される。
【０１０３】
細胞は、本発明の合成ポリペプチドを発現するための発現ベクターを含むことが特に好ましく、細胞は、本発明の発現ベクターを含むビリオンを産生するのに適している又は適合している。したがって、細胞を使用して、レット症候群及び関連障害の遺伝子治療処置に使用するビリオンを産生することができる。好ましくは、ビリオンは、本発明のポリペプチドを発現するためのAAVベクターを含み、更に好ましくは、AAVベクターはAAV9及び/又はAAV2を含む。
【０１０４】
AAVビリオンを産生するのに適した宿主細胞には、異種DNA分子の受容者として使用できる、又は使用されてきた微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が含まれる。この用語には、トランスフェクトされている元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、一般に、外因性DNA配列をトランスフェクトされている細胞を指す。安定したヒト細胞株293由来の細胞(例えば、受託番号ATCC CRL1573でAmerican Type Culture Collectionを通じて容易に入手可能)は、本発明の実施に使用することができる。特に、ヒト細胞株293は、アデノウイルス5型DNA断片で形質転換されたヒト胎児腎細胞株であり、アデノウイルスEla及びElb遺伝子を発現する。293細胞株は容易にトランスフェクトされ、AAVビリオンを産生する特に便利なプラットフォームを提供する。
【０１０５】
適切には、in vivo送達のために、AAVビリオン等の本発明のビリオンは、医薬組成物に製剤化され得る。適切には、医薬組成物は、本発明の合成ポリペプチドの治療有効量、すなわち、レット症候群等のMeCP2活性の低下に関連する障害の症状を軽減、改善又は予防するのに十分な量を産生するのに十分な遺伝物質を含む。医薬組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような賦形剤には、それ自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品薬剤が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、Tween80、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩等をそこに含めることができる。更に、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質等の補助物質が、そのようなビヒクルに存在してもよい。
【０１０６】
当業者には明らかなように、添加しなければならないウイルスベクターの有効量は経験的に決定することができる。投与は、一つの用量で実現可能であり、その用量は治療過程を通じて連続的又は断続的である。投与の最も効果的な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、及び治療される対象に合わせて変化する。単回及び複数投与は、担当医師により選択された用量レベル及びパターンに合わせて行うことができる。
【０１０７】
医薬組成物、予防及び治療の方法、並びにその使用
本発明の合成ポリペプチドは、レット症候群又は関連障害の影響を受ける細胞の欠陥MeCP2を置換するのに有用である。したがって、本発明は、本発明の合成ポリペプチドを投与する工程を含む、動物の疾患を治療又は予防する方法を提供する。好ましくは、疾患は、MECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群である。好ましくは動物はヒト患者である。
【０１０８】
本発明の方法における投与は、本発明の合成ポリペプチドを含む組成物の投与、本発明の発現ベクターの投与、及び/又は本発明のビリオンの投与を含み得る。
【０１０９】
したがって、本発明はまた、MECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防のための合成ポリペプチド、発現ベクター、及びビリオン、並びにMECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群の治療又は予防のための医薬の製造における、本発明の合成ポリペプチド、本発明の発現ベクター又は本発明のビリオンの使用を提供する。
【０１１０】
本明細書で提供されるように治療又は予防できる障害には、MeCP2の活性の低下又は不活性化を伴う障害が含まれる。したがって、本明細書で使用されるとき、「不活化変異」という語句は、MeCP2活性の低下をもたらす変異、並びにMeCP2活性、特にMeCP2がNCoR/SMRTコリプレッサー複合体のメンバーをメチル化DNAに動員する能力に起因する活性を無効にする変異を包含する。そのような障害は、例えば、障害を有する、又は障害を有するリスクのある対象におけるMeCP2の変異の同定により認識し得る。例えば、男性の再発性(例えばA140V)又は散発的な変異は、X連鎖知的障害の一部の場合に原因となることが判明している。同様に、女性では、この種の「低形質」変異は学習障害と関連しており、発達遅延と診断された子供のエクソーム配列決定もMECP2の変異を明らかにしている。このような変異は、MeCP2がNCoR/SMRTコリプレッサー複合体の構成要素をメチル化DNAに動員する能力に影響を与える可能性があり、及び/又は一般にタンパク質の安定性に影響を与える可能性がある。
【０１１１】
本発明の方法及び医学的使用の文脈において、治療される動物は、治療を必要とするもの、又は関連する障害を発症するリスクがあるとみなされるものであり得る。適切には、動物は哺乳動物、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒト対象であり得る。
【０１１２】
治療される動物は、MeCP2に関連する障害を示唆する症状を呈することがある。代替的に、対象は無症候であるように見えるかもしれないが、MeCP2機能の喪失によって引き起こされるMECP2関連障害を発症するリスクがあるとみなされるため、本発明の合成ポリペプチドによる予防的治療が望ましい。適切には、無症候性の対象は、MeCP2関連障害を有するリスクが高いと考えられている対象であり得る。そのような無症候性の対象は、MeCP2の家族歴を有するもの、又はMECP2遺伝子の変異を示す遺伝子検査を受けたものであり得る。
【０１１３】
本発明は、治療薬、すなわち、本発明の合成ポリペプチド組成物、核酸構築物、発現ベクター、及び/又はビリオンの投与によるMeCP2活性の低下に関連する障害の治療又は予防を企図する。本発明による治療薬の投与は、例えば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療的又は予防的であるかどうか、及び熟練した専門家に知られている他の要因に応じて、連続的又は断続的であり得る。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、又は一連の間隔を空けた用量であり得る。局所投与と全身投与の両方が企図される。
【０１１４】
本発明の治療薬を有する1つ以上の適切な単位剤形は、静脈内及び筋肉内経路を含む非経口を含む様々な経路によって、並びにMeCP2活性の低下に直接関連する組織への直接注射によって投与することができる。例えば、治療薬は脳に直接注入することができる。代替的に、脳及び脊髄の状態のために治療薬を髄腔内に導入してもよい。別の例では、AAV、レンチウイルス、及びアデノウイルス等、筋肉から影響を受けたニューロンに戻ってくるウイルスに関して、治療薬を筋肉内に導入してもよい。製剤は、適切な場合、個別の単位剤形で便利に提供されてもよく、薬学で公知の方法のいずれかによって調製されてもよい。そのような方法は、治療薬を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微粉化固体担体又はそれらの組み合わせと結び付ける工程と、次いで、必要に応じて、所望の送達システムに生成物を導入又は成形する工程を含んでもよい。
【０１１５】
本発明の治療薬が投与のために調製されるとき、それらは好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わされて、医薬製剤又は単位剤形を形成する。そのような製剤中の総活性成分は、製剤の0.1〜99.9重量%を含む。「薬学的に許容される担体」は、製剤の他の成分と適合性があり、その受容者に有害ではない希釈剤、賦形剤、及び/又は塩である。投与のための活性成分は、粉末又は顆粒として、溶液、懸濁液、又は乳剤として存在してもよい。
【０１１６】
本発明の治療薬を含む医薬製剤は、公知の容易に入手可能な成分を使用して、当該技術分野で公知の手順により調製することができる。
【０１１７】
本発明の治療薬は、例えば筋肉内、皮下、又は静脈内経路による非経口投与に適した溶液として製剤化することもできる。
【０１１８】
本発明の治療薬の医薬製剤はまた、水性若しくは無水の溶液若しくは分散液の形態、又は代替的にエマルジョン若しくは懸濁液の形態をとることができる。
【０１１９】
したがって、治療薬は、非経口投与(例えば、注射、例えば、ボーラス注射又は持続注入による)のために製剤化することができ、アンプル、事前充填シリンジ、小容量注入容器の単位投与形態、又は保存剤を添加した複数回投与容器で提供することができる。活性成分は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、又は乳剤のような形態を取り得、懸濁剤、安定剤、及び/又は分散剤のような配合剤を含むことができる。代替的に、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリー水で構成するための、無菌固体の無菌分離又は溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態であってもよい。
【０１２０】
本発明の医薬製剤は、任意の成分として、薬学的に許容される担体、希釈剤、可溶化剤、又は乳化剤、及び当該技術分野で公知のタイプの塩を含んでもよい。本発明の医薬製剤に有用な担体及び/又は希釈剤の特定の非限定的な例には、水、並びにpH7.0〜8.0のリン酸緩衝生理食塩水及び水等の生理学的に許容される緩衝生理食塩水が含まれる。
【０１２１】
ここで、特定の実施形態及び添付の図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】変異分析によって予測された2つの重要な機能的ドメインのみを保持する、MeCP2タンパク質の段階的な欠失を示す。A)メチル-CpG結合ドメイン(MBD)[残基78〜16212]及びNCoR/SMRT相互作用ドメイン(NID)[残基285〜3094]を含むヒトMeCP2タンパク質配列(e1アイソフォーム)の概略図。注釈付き(上):健康なヘミ接合体オスの多型、RTTを引き起こすミスセンス変異、及び(下)チンパンジー(e1)、マウス(e1)、アフリカツメガエル、及びゼブラフィッシュのホモログの配列同一性[アフリカツメガエル及びゼブラフィッシュの挿入部位は長いバーで示される]。B)この研究で提示された3つの新規マウス系統(及びWT-EGFPマウス16)で発現するMeCP2タンパク質(マウスe2アイソフォーム)の一連の欠失の概略図。C)EGFPタグ付短縮タンパク質はHeLa細胞において過剰発現し、GFP-TRAPビーズを使用して免疫沈降した。ウエスタンブロットは、これらのタンパク質(GFP)の発現と精製、及びNCoR/SMRTコリプレッサー複合体の構成要素(NCoR、HDAC3、及びTBL1XR1)の共免疫沈降を示す。WT-EGFP及びR306C-EGFPを対照として使用して、これらのタンパク質への結合の有無をそれぞれ示した。「In」=インプット、「IP」=免疫沈降物。D)EGFPタグ付短縮MeCP2タンパク質は、NIH-3T3細胞で過剰発現し、PFA固定され、DAPIで染色された。WT-EGFP及びR111G-EGFPは、それぞれ局所及び拡散局在化を示すための対照として使用された。E)EGFPタグ付短縮タンパク質は、NIH-3T3細胞でTBL1X-mCherryと共過剰発現し、PFA固定され、DAPIで染色された。WT-EGFP及びR306C-EGFPを対照として使用して、それぞれヘテロクロマチン構造へのTBL1X-mCherryの動員の有無を示した。
【図２】MeCP2欠失の一連の設計を示す。A)エクソン1及び2、並びにエクソン3の最初の10bpにコードされている最端のN末端アミノ酸の保持、N及びC末端の欠失、介在領域のリンカーとSV40のNLSでの置換、C末端EGFPタグの付加を示す野生型及びΔNIC MeCP2のゲノムDNA配列の概略図である。色分け: 5'UTR=白、MBD=中間灰色、NID=暗い灰色、特徴のない領域=灰色、SV40のNLS=リンカーの横にある中間灰色、リンカー=暗い灰色、及びEGFP=C末端の中間灰色。B)3つ全ての短縮タンパク質(e1及びe2アイソフォーム)の配列のN末端は、最端のN末端アミノ酸とMBD(Pro72で始まる)の融合を示す。C)、D)ClustalWSを使用した(C)MBD及び(D)NID領域のタンパク質配列アライメント、BLOSUM62スコアに従って陰影付け。両方の配置には次の注釈を付す。(上)RTTミスセンス変異13及び活性依存性リン酸化部位17、18、19;(下)配列保存、相互作用ドメイン、及び公知20/予測21の構造。相互作用部位:meDNA結合(残基78〜16212)、ATフック1(残基183〜19522)、ATフック2(残基257〜27223)、NCoR/SMRT結合(残基285〜3094)。2つの部分の核局在シグナル(NLS)も示されている(残基253〜256及び266〜271)。残基の番号は、哺乳類のe2アイソフォームの番号に対応する。ΔNICに保持される領域は次のとおりである。MBDは72〜173(Cの灰色の長方形で強調)にあり、NIDは272〜312(Dの灰色の長方形で強調)にある。
【図３】ΔN及びΔNCマウスの生成のための構築物を示す。(上)(A)ΔN及び(B)ΔNCマウス生成の図。内因性のMecp2対立遺伝子は、オスのES細胞で標的とされた。選択カセットは、キメラを削除者(CMV-Cre)マウスと交配させることにより、in vivoで除去された。(下)サザンブロット分析は、ES細胞の正しい標的化とノックインマウスでのカセット削除の成功を示す。
【図４】ΔNIC及びSTOPマウスの生成のための構築物を示す。(上)ΔNICマウス生成の図。内因性のMecp2対立遺伝子は、オスのES細胞で標的とされた。選択カセットは、キメラを削除者(CMV-Cre)マウスと交配させることにより、in vivoで除去され、構成的に発現するΔNICマウスを生成するか、又はSTOPマウスを生成するために保持した。(下)サザンブロット分析は、ES細胞の正しい標的化とΔNICノックインマウスでのカセット削除の成功を示す。
【図５】ΔN及びΔNCタンパク質がノックインマウスの野生型レベル付近で発現していることを示す。A、上)C末端MeCP2抗体を使用して検出された野生型同腹仔(n=3)と比較したΔNマウス(n=3)のタンパク質サイズとレベルを示す粗製脳全体抽出物のウエスタンブロット分析。A、下)GFP抗体を使用して検出されたWT-EGFP対照(n=3)と比較したΔN(n=3)及びΔNC(n=3)マウスのウエスタンブロット分析。ヒストンH3をローディング対照として使用した。* GFP抗体によって検出された非特異的バンドを示す。B)EGFP蛍光を使用して検出された、脳全体(「All」)及びWT-EGFP(n=3)、ΔN(n=3)、及びΔNC(n=3)のマウスの高NeuN亜集団(「Neurons」)から調製した核のタンパク質レベルのフローサイトメトリー分析。グラフは、平均±標準誤差を示し、遺伝子型がt検定によりWT-EGFP対照と比較された。All  ΔN p=0.338、ΔNC ** p=0.003;及びNeurons  ΔN p=0.672、ΔNC * p=0.014。
【図６】N及びC末端の欠失が最小限の表現型結果を有することを示す。A)、B)ヘミ接合体オス(A)ΔNマウス(n=10)及び(B)ΔNCマウス(n=10)の表現型スコア付、それぞれ1年にわたる野生型同腹仔(n=10)と比較した。グラフは平均スコア±標準誤差を示す。Mecp2-nullデータ(n=12)16は比較対象として使用される。C)、D)部分AとBにおいて同一のコホートの生存率を示すカプラン・マイヤープロット。Mecp2-nullデータ(n=24)16が比較対象として使用される。E)、F)、G)20週齢で実施された別々のコホートの行動分析:ΔN(n=10)及びΔNCマウス(n=10〜11)は、それぞれ野生型同腹仔(n=10)と比較した。全てのグラフは、個々の値と中央値、及び遺伝子型を比較する統計分析の結果を示す(下記参照):有意ではない(「n.s.」)p>0.05、*p<0.05。E)Elevated Plus Mazeの閉じられたアームと開放的なアームで費やした時間を15分間の試行中に測定し、KS検定を使用して遺伝子型を比較した。ΔNコホート(左)閉じられたアームp=0.988、及び開放的なアームp=0.759;ΔNCコホート(右)閉じられたアームp=0.956及び開放的なアームp=0.932。F)オープンフィールドテストの中心領域で費やした時間を20分間の試行中に測定し、t検定を使用して遺伝子型を比較した。ΔN p=0.822;ΔNC *p=0.020。G)3日間の実験のそれぞれについて、4つの試験で加速ロータロッドから落ちるまでの平均滞在時間を計算し、KS検定を使用して遺伝子型を比較した。ΔNコホート1日目p=0.759、2日目p=0.401、3日目p=0.055;ΔNCコホート1日目p=0.988、2日目p=0.401、3日目p=0.759。
【図７】ΔNCがバックグラウンドに依存してわずかに増加した体重表現型を有することを示す。A)、B)戻し交配スコア付コホートの成長曲線(図6A〜図6Dを参照されたい)。C)ΔNCマウス(n=7)及び野生型同腹仔(n=9)の非近交系(75% C57BL/6J)コホートの成長曲線。A)、B)、C)グラフは平均値±標準誤差を示す。反復測定ANOVAを使用して遺伝子型を比較した:ΔN p=0.385、ΔNC **** p<0.0001、ΔNC(非近交系) p=0.739。Mecp2-nullデータ(n=20)16は比較対象として使用される。
【図８】ΔN又はΔNCマウスのいずれについても活性表現型が検出されなかったことを示す。A)、B)ΔN(n=10)及びΔNCマウス(n=10)の行動分析、それぞれ20週齢の野生型同腹仔(n = 10)と比較(図6E〜図6Gを参照されたい)。20分間の試行中に、オープンフィールドテストの総走行距離を測定した。グラフは個々の値と中央値を示し、遺伝子型はt検定を使用して比較した。ΔN p=0.691;ΔNC p=0.791。
【図９】介在領域の追加の欠失がタンパク質の不安定性と軽度のRTT様症状をもたらすことを示す。A)GFP抗体を使用して検出されたΔNICマウス(n=3)及びWT-EGFP対照(n=3)のタンパク質サイズとレベルを示す粗製脳全体抽出物のウエスタンブロット分析。ヒストンH3をローディング対照として使用した。* GFP抗体によって検出された非特異的バンドを示す。B)EGFP蛍光を使用して検出された、脳全体(「All」)及びΔNICマウス(n=3)及びWT-EGFP対照(n=3)の高NeuN亜集団(「Neurons」)から調製した核のタンパク質レベルのフローサイトメトリー分析。グラフは、平均±標準誤差を示し、遺伝子型がt検定により比較された。All*** p=0.0002及びNeurons *** p=0.0001。C)ΔNICマウス(n=3)及び野生型同腹仔(n=3)の脳全体から調製したmRNAレベルの定量的PCR分析。Mecp2転写産物レベルはシクロフィリンAに対して標準化された。グラフは平均±標準誤差(野生型と比較)を示し、遺伝子型をt検定で比較した:** p=0.005。D)ΔNICマウス(n=10)の表現型スコア付、1年にわたる野生型同腹仔(n=10)と比較した。グラフは平均スコア±標準誤差を示す。Mecp2-nullデータ(n=12)16は比較対象として使用される。E)パートDの同一のコホートの生存率を示すカプラン・マイヤープロット。1匹のΔNIC動物が43週で死亡し、重症度スコアは2.5を超えなかった。Mecp2-nullデータ(n=24)16は比較対象として使用される。F)、G)、H)20週齢で実施された別々のコホートの行動分析:ΔNIC(n=10)とそれらの野生型同腹仔(n=10)と比較した。全てのグラフは、個々の値と中央値、及び遺伝子型を比較する統計分析の結果を示す(下記参照):有意ではない(「n.s.」)p>0.05、*p<0.05、**p<0.01。F)Elevated Plus Mazeの閉じられたアームと開放的なアーム及び中央領域で費やした時間を15分間の試行中に測定し、KS検定を使用して遺伝子型を比較した:閉じられたアーム** p=0.003、開放的なアームp=0.055及び中心* p=0.015。G)オープンフィールドテストの中心領域で費やした時間を20分間の試行中に測定し、t検定を使用して遺伝子型を比較した:p=0.402。H)3日間の実験のそれぞれについて、4つの試験で加速ロータロッドから落ちるまでの平均滞在時間を計算し、KS検定を使用して遺伝子型を比較した:1日目p=0.164、2日目p=0.055、及び3日目  ** p=0.003。3日間のパフォーマンスの変化(学習/悪化)は、フリードマン検定を使用して決定された:野生型動物p=0.601、ΔNIC動物** p=0.003。
【図１０】非近交系ΔNICマウスの生存率が1年にわたって100%であることを示す。ΔNICマウス(n=10)とその野生型同腹子(n=1)の非近交系(75% C57BL/6J)コホートの生存率を示すカプラン・マイヤープロット。Mecp2-nullデータ(n=24)16は比較対象として使用される。
【図１１】ΔNICマウスの体重が減少したことを示す。戻し交配スコア付コホートの成長曲線(図9D〜図9Eを参照されたい)。グラフは平均±標準誤差を示す。反復測定ANOVAを使用して遺伝子型を比較した:**** p<0.0001。Mecp2-nullデータ(n=20)16は比較対象として使用される。
【図１２】ΔNICマウスについて活性表現型が検出されなかったことを示す。20週齢での野生型同腹子(n=10)と比較したΔNIC(n=10)の行動分析(図9F〜図9Hを参照されたい)。20分間の試行中に、オープンフィールドテストの総走行距離を測定した。グラフは個々の値と中央値を示し、遺伝子型はt検定を使用して比較したp=0.333。
【図１３】ΔNICマウスの表現型が、RTTの最も穏やかなマウスモデルであるR133Cよりも軽度であることを示す。A)、B)、C)比較対象としてEGFPタグ付R133Cマウス(n=10)16を使用した、図9D〜図9E及び図S11に示すΔNICマウス及び野生型同腹仔の表現型分析のコピー。
【図１４】転写が抑制されたΔNICを持つ「STOP」マウスがMecp2nullに類似することを示す。A)GFP抗体を使用して検出されたWT-EGFP(n=3)及びΔNIC対照(n=3)と比較した、STOPマウス(n=3)のタンパク質サイズ及びレベルを示す粗製脳全体抽出物のウエスタンブロット分析。ヒストンH3をローディング対照として使用した。* GFP抗体によって検出された非特異的バンドを示す。B)EGFP蛍光を使用して検出された、脳全体(「All」)及びWT-EGFP(n=3)、ΔNIC(n=3)、及びSTOP(n=3)のマウスの高NeuN亜集団(「Neurons」)から調製した核のタンパク質レベルのフローサイトメトリー分析グラフは、平均±標準誤差を示し、遺伝子型がt検定を使用して比較された。****  はp値<0.0001を示す。C)Mecp2-nullデータ(n=12)16と比較したSTOPマウス(n=22)の表現型スコア付。グラフは平均スコア±標準誤差を示す。D)Mecp2-nullデータ(n=24)16と比較したSTOPマウス(n=14)の生存率を示すカプラン・マイヤープロット。
【図１５】ΔNICの再活性化がMeCP2欠損マウスの神経症状を逆転させることに成功することを示す。A)反転実験のタイムライン(結果はB〜C及び図16に示す)。B)4〜28週間のタモキシフェン注射マウスの表現型スコア付:WTT(n=4)、WT CreERT(n=4)、STOPT(n=9)、及びSTOP CreERT(n=9)。グラフは平均スコア±標準誤差を示す。C)同一のコホートの生存率を示すカプラン・マイヤープロット。矢印はタモキシフェン注射のタイミングを示す。「T」はタモキシフェンを注射した動物を示す。D)AAVを介した救助実験のタイムライン(結果はE〜F及び図17に示す)。E)AAV9を注入したマウスの5〜20週間の表現型スコア付:WT+ビヒクル(n=19)、Null+ビヒクル(n=21)、及びNull+ΔNIC(n=11)。グラフは平均スコア±標準誤差を示す。F)同一の動物の生存率を示すカプラン・マイヤープロット。矢印は、ウイルス注射のタイミングを示す。
【図１６】タモキシフェンを注射したSTOP CreERマウスにおけるΔNICの再活性化の成功を示す。A)タモキシフェン(「+Tmx」)注射STOP CreER動物(n=8)でのCreERによる組換えレベルを決定するためのゲノムDNAのサザンブロット分析。組換えがCreERに依存していることを示す陰性対照として、1匹のタモキシフェンを注射したSTOP動物を含めた。参照のための他の試料が含まれている(図4の制限マップを参照されたい)。B)タモキシフェンを注射したSTOP CreER動物のタンパク質レベルは、ウエスタンブロッティング(上、n=5)及びフローサイトメトリー(下、n=3)を使用して決定した。構成的に発現するΔNICマウス(n=3)を比較対象として使用した。グラフは平均値±標準誤差を示す(ウエスタンブロッティングによる定量化はΔNICに対して標準化して示す)。遺伝子型は、t検定を使用して比較した:ウエスタンブロッティングp=0.434;フローサイトメトリー全ての核p=0.128及びニューロン核* p=0.016。
【図１７Ａ】ΔNICを野生型マウスに導入しても悪影響がないことを示す。A)AAV9を注入したマウスの5〜20週間の表現型スコア付:WT+ビヒクル(n=19)、Null+ビヒクル(n=21)、及びWT+ΔNIC(n=9)。グラフは平均スコア±標準誤差を示す。矢印は、ウイルス注射のタイミングを示す。
【図１７Ｂ】ΔNICを野生型マウスに導入しても悪影響がないことを示す。B)ΔNICのベクター送達に使用される構築物の設計。拡張されたmMeP426プロモーター及び内因性の遠位3'-UTRの推定調節エレメント(RE)を示す。当該技術分野で開示されているマウスMecp2内因性コアプロモーターの短い229bp領域の範囲29、38(mMeP229)は、この構築物で使用されるmMeP426プロモーターと比較して示される。RDH1pA 3'-UTRは、遠位の内因性MECP2ポリアデニル化シグナルとそれに付随する調節エレメントの一部に隣接する「結合パネル」として組み込まれたいくつかの外因性microRNA(miR)結合部位からなる。アスタリスクの付いた参照は、げっ歯類ではなく、ヒトのin vitro試験を示す。
【図１７Ｃ】ΔNICを野生型マウスに導入しても悪影響がないことを示す。C)AAV2 ITRに隣接する、図17Bに示す発現カセットの完全な注釈付配列。この配列は配列番号65としても提示される。
【図１８Ａ】野生型ヒトMECP2 e1アイソフォームのcDNA配列と、本発明によるポリペプチド配列をコードするcDNA配列とのアライメント、及び本明細書で提供される実験結果を示す。「ヒトWT」(配列番号18)は、野生型MeCP2アイソフォーム1のcDNA配列である。「dNIC-Myc」(配列番号62)は、MeCP2のN及びC末端配列、並びにMBDとNIDを連結する配列に欠失を有し、C末端にMycタグを有する本発明による合成ポリペプチドのcDNA配列である。「dNC-Myc」(配列番号63)は、MeCP2のN及びC末端配列に欠失を有し、C末端にMycタグを有する本発明による合成ポリペプチドのcDNA配列である。e1特異的配列、MBD、NID、Mycタグ、SV40のNLS、及びタグとNLSを結合するためのリンカーを提供する、ポリペプチドの最端のN末端に対応するcDNA配列のセクションが全て示されている。
【図１８Ｂ】図１８Ａの続きである。
【図１８Ｃ】図１８Ｂの続きである。
【図１９】本発明によるポリペプチド配列を有する野生型ヒトMeCP2 e1アイソフォームのアミノ酸配列のアライメント及び本明細書で提供される実験結果を示す。「ヒトWT」(配列番号3)は、野生型MeCP2アイソフォーム1のアミノ酸配列である。「dNIC-Myc」(配列番号61)は、MeCP2のN及びC末端配列、並びにMBDとNIDを連結する配列に欠失を有し、C末端にMycタグを有する本発明による合成ポリペプチドのアミノ酸配列である。「dNC-Myc」(配列番号60)は、MeCP2のN及びC末端配列に欠失を有し、C末端にMycタグを有する本発明による合成ポリペプチドのアミノ酸配列である。e1特異的配列、MBD、NID、Mycタグ、SV40のNLS、及びタグとNLSを結合するためのリンカーを有する、ポリペプチドの最端のN末端に対応するアミノ酸配列のセクションが全て示されている。
【図２０Ａ】EGFPタグを有する野生型マウスMECP2 e1アイソフォームのcDNA配列と、本発明によるポリペプチド配列をコードするcDNA配列とのアライメント、及び本明細書で提供される実験結果を示す。「dNIC-EGFP」(配列番号51)は、MeCP2のN及びC末端配列、並びにMBDとNIDを連結する配列に欠失を有し、C末端にEGFPタグを有する本発明による合成ポリペプチドのcDNA配列である。「dNC-EGFP」(配列番号50)は、MeCP2のN及びC末端配列に欠失を有し、C末端にEGFPタグを有する本発明による合成ポリペプチドのcDNA配列である。「WT-EGFP」(配列番号48)は、EGFPタグを有する野生型MeCP2アイソフォーム1のcDNA配列である。「dN-EGFP」(配列番号49)は、MeCP2のN末端配列に欠失を有し、C末端にEGFPタグを有する本発明による合成ポリペプチドのcDNA配列である。e1特異的配列、MBD、NID、EGFPタグ、SV40のNLS、及びタグとNLSを結合するためのリンカーを提供する、ポリペプチドの最端のN末端に対応するcDNA配列のセクションが全て示されている。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２０Ｃ】図２０Ｂの続きである。
【図２０Ｄ】図２０Ｃの続きである。
【図２１Ａ】本発明によるポリペプチド配列を有するEGFPタグを有する野生型ヒトMECP2 e1アイソフォームのアミノ酸配列のアライメント及び本明細書で提供される実験結果を示す。「WT-EGFP/1-748」(配列番号40)は、C末端にEGFPタグを有する野生型MeCP2アイソフォーム1のアミノ酸配列である。「ΔN-EGFP/1-689」(配列番号41)は、MeCP2のN末端配列に欠失を有し、C末端にEGFPタグを有する本発明による合成ポリペプチドのアミノ酸配列である。「ΔNIC-EGFP/1-432」(配列番号43)は、MeCP2のN及びC末端配列、並びにMBDとNIDを連結する配列に欠失を有し、C末端にEGFPタグを有する本発明による合成ポリペプチドのアミノ酸配列である。「ΔNC-EGFP/1-516」(配列番号42)は、MeCP2のN及びC末端配列に欠失を有し、C末端にEGFPタグを有する本発明による合成ポリペプチドのアミノ酸配列である。e1特異的配列、MBD、NID、EGFPタグ、SV40のNLS、及びタグとNLSを結合するためのリンカーを有する、ポリペプチドの最端のN末端に対応するアミノ酸配列のセクションが全て示されている。
【図２１Ｂ】図２１Ａの続きである。
【０１２３】
配列
以下は、本発明に従って使用されるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
【０１２４】
[配列番号1] MeCP2  メチルCpG結合ドメイン(MBD)ポリペプチド配列
PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPP
【０１２５】
[配列番号2] MeCP2 NCoR/SMRT相互作用ドメイン(NID)ポリペプチド配列
PGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETV
【０１２６】
[配列番号3]  全長ヒト野生型MeCP2ポリペプチド配列(e1アイソフォーム)
MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１２７】
[配列番号4]  全長ヒト野生型MeCP2ポリペプチド配列(e2アイソフォーム)
MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１２８】
[配列番号5] MeCP2ポリペプチド配列(e1アイソフォーム)MBDに対してN末端
MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSA
【０１２９】
[配列番号6] MeCP2ポリペプチド配列(e2アイソフォーム)MBDに対してN末端
MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSA
【０１３０】
[配列番号7] MeCP2のMBDとNIDの間に介在するポリペプチド配列
KKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRK
【０１３１】
[配列番号8] MeCP2ポリペプチド配列、NIDに対してC末端
SIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１３２】
[配列番号9]  マウスe1特異的な最端のN末端ポリペプチド配列
MAAAAATAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK
【０１３３】
[配列番号10]  マウスe2特異的な最端のN末端ポリペプチド配列
MVAGMLGLREEK
【０１３４】
[配列番号11]  ヒトe1特異的な最端のN末端ポリペプチド配列
MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK
【０１３５】
[配列番号12]  ヒトe2特異的な最端のN末端ポリペプチド配列
MVAGMLGLREEK
【０１３６】
[配列番号13]  ΔNC:短縮型合成ポリペプチド配列(ヒトMeCP2に由来)
PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETV
【０１３７】
[配列番号14]  ΔNIC:短縮型合成ポリペプチド配列(ヒトMeCP2に由来)
PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPGSSGSSGPKKKRKVPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETV
【０１３８】
[配列番号15]  ΔNマウス:短縮型合成ポリペプチド配列(マウスMeCP2に由来)
PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLVVKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVHETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESTKAPMPLLPSPPPPEPESSEDPISPPEPQDLSSSICKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPMVATTTTVAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１３９】
[配列番号16]  ΔNCマウス:短縮型合成ポリペプチド配列(マウスMeCP2に由来)
PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLVVKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVHETVLPIKKRKTRETV
【０１４０】
[配列番号17]  ΔNICマウス:短縮型合成ポリペプチド配列(マウスMeCP2に由来)
PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPGSSGSSGPKKKRKVPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVHETVLPIKKRKTRETV
【０１４１】
[配列番号18]  全長ヒト野生型MeCP2cDNA配列(e1アイソフォーム)
ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGC
【０１４２】
[配列番号19]  ΔNC:短縮型合成ポリペプチド配列のcDNA配列(ヒトMeCP2に由来)
CCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTC
【０１４３】
[配列番号20]  ΔNIC:短縮型合成ポリペプチド配列のcDNA配列(ヒトMeCP2に由来)
CCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTGGATCCAGTGGCAGCTCTGGGCCCAAGAAAAAGCGGAAGGTGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTC
【０１４４】
[配列番号21]  全長マウス野生型MeCP2cDNA配列(e1アイソフォーム)
ATGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAGGAAAAGTCAGAAGACCAGGATCTCCAGGGCCTCAGAGACAAGCCACTGAAGTTTAAGAAGGCGAAGAAAGACAAGAAGGAGGACAAAGAAGGCAAGCATGAGCCACTACAACCTTCAGCCCACCATTCTGCAGAGCCAGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAAACATCAGAAAGCTCAGGCTCTGCCCCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATCAGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGATGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGCCATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTTGGTGAGAAAAGCGGGAAGGGACTGAAGACCTGCAAGAGCCCTGGGCGTAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGTGCCTCCTCCCCACCTAAGAAGGAGCACCATCATCACCACCATCACTCAGAGTCCACAAAGGCCCCCATGCCACTGCTCCCATCCCCACCCCCACCTGAGCCTGAGAGCTCTGAGGACCCCATCAGCCCCCCTGAGCCTCAGGACTTGAGCAGCAGCATCTGCAAAGAAGAGAAGATGCCCCGAGGAGGCTCACTGGAAAGCGATGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCTATGGTCGCCACCACTACCACAGTTGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCTTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTCT
【０１４５】
[配列番号22]  ΔNマウス:短縮型合成ポリペプチド配列のcDNA(マウスMeCP2に由来)
CCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATCAGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGATGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGCCATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTTGGTGAGAAAAGCGGGAAGGGACTGAAGACCTGCAAGAGCCCTGGGCGTAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGTGCCTCCTCCCCACCTAAGAAGGAGCACCATCATCACCACCATCACTCAGAGTCCACAAAGGCCCCCATGCCACTGCTCCCATCCCCACCCCCACCTGAGCCTGAGAGCTCTGAGGACCCCATCAGCCCCCCTGAGCCTCAGGACTTGAGCAGCAGCATCTGCAAAGAAGAGAAGATGCCCCGAGGAGGCTCACTGGAAAGCGATGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCTATGGTCGCCACCACTACCACAGTTGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCTTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTGT
【０１４６】
[配列番号23]  ΔNCマウス:短縮型合成ポリペプチド配列のcDNA(マウスMeCP2に由来)
CCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATCAGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGATGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGCCATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTC
【０１４７】
[配列番号24]  ΔNICマウス:短縮型合成ポリペプチド配列のcDNA(マウスMeCP2に由来)
CCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTGGATCCAGTGGCAGCTCTGGGCCCAAGAAAAAGCGGAAGGTGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTC
【０１４８】
[配列番号25]  マウスe1特異的な最端のN末端cDNA配列
ATGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAGGAAAAG
【０１４９】
[配列番号26]  マウスe2特異的な最端のN末端cDNA配列
ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAGGAAAAGGGAGGAAAAG
【０１５０】
[配列番号27]  ヒトe1特異的な最端のN末端cDNA配列
ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAG
【０１５１】
[配列番号28]  ヒトe2特異的な最端のN末端cDNA配列
ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAAGAAAAG
【０１５２】
[配列番号29]  全長マウス野生型MeCP2ポリペプチド配列(e1アイソフォーム)
MAAAAATAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLRDKPLKFKKAKKDKKEDKEGKHEPLQPSAHHSAEPAEAGKAETSESSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLVVKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVHETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESTKAPMPLLPSPPPPEPESSEDPISPPEPQDLSSSICKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPMVATTTTVAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１５３】
[配列番号30]  全長マウス野生型MeCP2ポリペプチド配列(e2アイソフォーム)
MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLRDKPLKFKKAKKDKKEDKEGKHEPLQPSAHHSAEPAEAGKAETSESSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLVVKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVHETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESTKAPMPLLPSPPPPEPESSEDPISPPEPQDLSSSICKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPMVATTTTVAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１５４】
[配列番号31]  全長マウス野生型MeCP2cDNA配列(e2アイソフォーム)
ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAGGAAAAGTCAGAAGACCAGGATCTCCAGGGCCTCAGAGACAAGCCACTGAAGTTTAAGAAGGCGAAGAAAGACAAGAAGGAGGACAAAGAAGGCAAGCATGAGCCACTACAACCTTCAGCCCACCATTCTGCAGAGCCAGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAAACATCAGAAAGCTCAGGCTCTGCCCCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATCAGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGATGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGCCATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTTGGTGAGAAAAGCGGGAAGGGACTGAAGACCTGCAAGAGCCCTGGGCGTAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGTGCCTCCTCCCCACCTAAGAAGGAGCACCATCATCACCACCATCACTCAGAGTCCACAAAGGCCCCCATGCCACTGCTCCCATCCCCACCCCCACCTGAGCCTGAGAGCTCTGAGGACCCCATCAGCCCCCCTGAGCCTCAGGACTTGAGCAGCAGCATCTGCAAAGAAGAGAAGATGCCCCGAGGAGGCTCACTGGAAAGCGATGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCTATGGTCGCCACCACTACCACAGTTGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCTTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGC
【実施例】
【０１５５】
実験結果
1. 物質及び方法
命名法
慣例に従って、以下に示す全てのアミノ酸番号は、e2アイソフォームを指す。番号は、ヒトタンパク質に2つのアミノ酸挿入がある残基385までの、ヒト(NCBI受託P51608)及びマウス(NCBI受託Q9Z2D6)の相同アミノ酸を指す。
【０１５６】
変異分析
上述のように、変異データ4が収集された。原因となるRTTを引き起こすミスセンス変異は、RettBASEデータセットから抽出された13。健康なヘミ接合体オスで同定された多型は、Exome Aggregation Consortium(ExAC)データベースから抽出された14。
【０１５７】
短縮MeCP2タンパク質の設計
MBD及びNIDは、それぞれ残基72〜173及び272〜312として定義された。3つ全てのコンストラクトは、エクソン1と2によってコードされた最端のN末端配列を保持し、それぞれアイソフォームe1とe2に存在する。それらにはまた、スプライス受容部位を保持するために、エクソン3の最初の3つのアミノ酸(EEK)も含まれている。介在領域(I)はΔNICで、柔軟なリンカーが前に付いたSV40のNLSに置き換えられた。NLSの配列は、PKKKRKV(配列番号32)(DNA配列:CCCAAGAAAAAGCGGAAGGTG(配列番号33))であり、リンカーのものはGSSGSSG(配列番号34)(DNA配列:GGATCCAGTGGCAGCTCTGGG (配列番号35))である。3つのタンパク質は全て、リンカーで接続されたEGFPでC末端にタグ付けされている。全長MeCP216をタグ付けする以前の研究と一致するように、リンカー配列CKDPPVAT(配列番号36)(DNA配列:TGTAAGGATCCACCGGTCGCCACC(配列番号37))を使用して、ΔNのC末端をEGFPに接続した。ΔNC及びΔNICにおいてNIDをEGFPタグに接続するために、柔軟なGSSGSSG(配列番号38)リンカーを、代わりに使用した(DNA配列:GGGAGCTCCGGCAGTTCTGGA(配列番号39))。WT-EGFP、ΔN-EGFP、ΔNC-EGFP、及びΔNIC-EGFPポリペプチドのe1及びe2アイソフォームのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号40〜47として本明細書で提示される。WT-EGFP、ΔN-EGFP、ΔNC-EGFP、及びΔNIC-EGFPポリペプチドのe1及びe2アイソフォームのcDNA配列は、それぞれ配列番号48〜55として本明細書で提示される。
【０１５８】
培養細胞での発現のために、MeCP2欠失一連のe2アイソフォームをコードするcDNA配列を合成し(GeneArt、Thermo Fisher Scientific社)、XhoI及びNotI制限部位(NEB社)を使用してpEGFPN1ベクター(Clontech社)にクローニングした。QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社)を使用して、点突然変異(R111G及びR306C)をWT-EGFPプラスミドに挿入した。R111Gのプライマー配列:  フォワードTGGACACGAAAGCTTAAACAAGGGAAGTCTGGCC(配列番号56)及びリバースGGCCAGACTTCCCTTGTTTAAGCTTTCGTGTCCA(配列番号57);並びにR306C:フォワードCTCCCGGGTCTTGCACTTCTTGATGGGGA(配列番号58)及びリバースTCCCCATCAAGAAGTGCAAGACCCGGGAG(配列番号59)。ES細胞ターゲティングの場合、EGFPタグ付短縮タンパク質のエクソン3及び4をコードするゲノム配列を合成し(GeneArt、Thermo Fisher Scientific社)、MfeI制限部位(NEB社)を使用して以前に使用された24ターゲティングベクターにクローニングした。このベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子と、その後にイントロン2のLoxP部位が隣接する転写「STOP」カセット(「floxed」)が含まれている。
【０１５９】
短縮MeCP2タンパク質のウイルス送達のために、Mycエピトープタグ付タンパク質を調製した。ヒトΔNC-Myc及びΔNIC-Mycポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号60〜61として本明細書で提示される。ヒトΔNC-Myc及びΔNIC-MycポリペプチドのcDNA配列は、それぞれ配列番号62〜63として本明細書で提示される。
【０１６０】
細胞培養
HeLa及びNIH-3T3細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS;Gibco社)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco社)を添加したDMEM(Gibco社)で増殖させた。ES細胞は、ウシ胎児血清(FBS、Gibco社によりバッチテスト)、1%非必須アミノ酸(Gibco社)、1%ピルビン酸ナトリウム(Gibco社)、0.1%β-メルカプトエタノール(Gibco社)、及びLIF(ESGRO社)を添加したグラスゴーMEM(Gibco社)で増殖させた。
【０１６１】
免疫沈降
HeLa細胞にJetPEI(PolyPlus Transfection社)を使用してpEGFPN1-MeCP2プラスミドをトランスフェクトし、24〜48時間後に回収した。核抽出物はBenzonase(Sigma社E1014-25KU)と150mM NaClを使用して調製し、MeCP2-EGFP複合体はこれまでに記載されたようにGFP-Trap_Aビーズ(Chromotek社)を使用して捕捉した4。タンパク質は、GFP(NEB社#2956)、NCoR(Bethyl社A301-146A)、HDAC3(Sigma社3E11)、及びTBL1XR1(Bethyl社A300-408A)に対する抗体を全て1:1000の希釈率で使用し、1:10,000希釈でのLI-COR社の二次抗体:IRDye(登録商標)800CWロバ抗マウス(926-32212)及びIRDye(登録商標)800CWロバ抗ウサギ(926-32213)又はIRDye(登録商標)680LTロバ抗ウサギ(926-68023)が後に続くウエスタンブロッティングで分析した。
【０１６２】
動員アッセイ
NIH-3T3細胞を6ウェルプレートのカバースリップに播種し(ウェルあたり25,000細胞)、JetPEI(PolyPlus Transfection社)を使用して2μgのプラスミドDNA(pEGFPN1-MeCP2及びpmCherry-TBL1X)をトランスフェクトした。48時間後、細胞を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(Sigma社)で染色し、次いでProLong Diamond(Life Technologies社)を使用してマウントした。固定細胞は、共焦点顕微鏡(Leica社SP5)を使用して撮影した。
【０１６３】
ノックインマウスの生成
エレクトロポレーションによりターゲティングベクターを129/Ola E14 TG2a ES細胞に導入し、Mecp2遺伝子座に正しくターゲティングしたG418耐性クローンをPCR及びサザンブロットスクリーニングにより同定した。CRISPR-Cas9テクノロジーは、ΔN及びΔNIC系統のターゲティング効率を高めるために使用された。ガイドRNA配列(GGTTGTGACCCGCCATGGAT)(配列番号64)がpX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Feng Zhangからの贈り物;Addgene社プラスミド#4223025)にクローニングされ、ターゲティングベクターとともにES細胞に導入された。これにより、野生型遺伝子のイントロン2(ターゲティングベクターのNeoSTOPカセットの部位)に二本鎖切断が導入された。マウスは、これまでに記載されたようにES細胞から生成された26。「floxed」NeoSTOPカセットは、C57BL/6JバックグラウンドでトランスジェニックCMV-Cre削除者系統(JAX Stock#006054)のホモ接合メスとキメラを交配させることにより、in vivoで除去された。CMV-Cre導入遺伝子はその後育種された。この研究で使用された全てのマウスは、標準条件下でエジンバラ大学の動物施設で飼育及び維持され、手順は1986年英国内務省によって認可されたスタッフによって、動物及び科学的手順法に従って行われた。
【０１６４】
ノックインマウスの生化学的特性評価
生化学分析のために、特に明記しない限り、6〜13週齢において、液体窒素で急速凍結することにより脳を採取した。特に明記しない限り、全ての分析にヘミ接合体オスマウスの脳を使用した。サザンブロット分析のために、半脳を50mM Tris Cl pH7.5、100mM NaCl、5mM EDTA中でホモジナイズし、1%SDS中の0.4mg/mlプロテイナーゼKで、55℃で一晩処理した。ゲノムDNAのフェノール:クロロホルム抽出前に、試料を0.1mg/ml RNAseAで、37℃で1〜2時間処理した。ゲノムDNAは、Puregene Core Kit A(Qiagen社)を使用して、培養細胞に関する製造者の取扱説明書に従ってES細胞から精製した。ゲノムDNAを制限酵素(NEB社)で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ZetaProbeメンブレン(BioRad社)に転写した。エクソン4又は3'相同性アームの末端のいずれかに相同なDNAプローブを、Prime-a-Gene Labeling System(Promega社)を使用して[α32]dCTP(Perkin Elmer社)で放射性標識した。Typhoon FLA 7000でスキャンする前に、ブロットを一晩プローブし、洗浄し、Phosphorimagerカセットで露光した。ImageQuantソフトウェアを用いてバンドを定量化した。
【０１６５】
全脳粗製抽出物中のタンパク質レベルは、ウエスタンブロッティングを使用して定量化した。抽出物をこれまでに記載されたように調製し16、ブロットを両方とも1:1,000の希釈のGFP(NEB社#2956)又はMeCP2(Sigma社M6818)に対する抗体でプローブし、LI-COR社の二次抗体(上述)が後に続いた。ヒストンH3(Abcam社ab1791)をローディング対照として使用した(1:10,000希釈)。Image Studio Lite Ver 4.0ソフトウェアを使用してレベルを定量化し、t検定を使用して比較した。WT-EGFPマウス16を対照として使用した。
【０１６６】
フローサイトメトリー分析のために、12週齢の動物から新鮮な脳を採取し、5mlのホモジナイズ緩衝液(320mMスクロース、5mM CaCl2、3mM Mg(Ac)2、10mM Tris HCl pH.7.8、0.1mM EDTA、0.1%NP40、0.1mM PMSF、14.3mMβ-メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤(Roche社))、及び5mlの50%OptiPrep勾配遠心分離媒体(50%Optiprep(Sigma社D1556-250ML)、5mM CaCl2、3mM Mg(Ac)2、10mM Tris HCl pH7.8、0.1M PMSF、14.3mMβ-メルカプトエタノール)をダウンス型ホモジナイザーに添加した。これをUltra clear Beckman Coulter社遠沈管内の10mlの29%OptiPrep溶液(H2O中v/v)の上に重層し、試料を7,500rpmで30分間、4℃で遠心分離した。ペレット化された核は、再懸濁緩衝液(プロテアーゼ阻害剤(Roche社)を含むDPBS中の20%グリセロール)に再懸濁した。フローサイトメトリー分析のために、核を600×gでペレット化し(5分、4℃)、1mlのPBTB(プロテアーゼ阻害剤(Roche社)を含むDPBS中5%(w/v)BSA、0.1%Triton X-100)で洗浄し、その後、250μlのPBTBに再懸濁した。NeuNを染色するために、NeuN-A60抗体(Millipore社MAB377)10μlをAlexa Fluor 647(APEX Antibody Labelling Kit、Invitrogen社A10475)に結合させ、1:125の希釈で添加し、4℃で45分間回転させてインキュベートした。フローサイトメトリー(BD社LSRFortessa SORP)を使用して、全核(試料あたりn=50,000)及び高NeuN(neuronal)亜集団(サンプルあたりn>8,000)の平均EGFP発現を取得し、t検定を使用して遺伝子型を比較した。WT-EGFPマウス16を対照として使用した。
【０１６７】
mRNAレベルを決定するために、半脳からRNAを精製して逆転写した。Mecp2及びシクロフィリンA転写産物は、これまで記載されたようにqPCRで分析した16。ΔNICマウスのmRNAレベルを、t検定を使用して野生型同腹仔と比較した。
【０１６８】
ノックインマウスの表現型の特性評価
これまでの研究16と一致して、マウスは表現型の特性評価を受ける前に、約94%のC57BL/6Jに達するように4世代戻し交配された。それぞれが10の変異動物と10の野生型同腹仔で構成される2つの別個のコホートが、各新規ノックイン系統について作成された。1つのコホートが記録され、これまでに記載されたように生後4〜52週で定期的に体重を測定した24、27。生存率を、カプラン・マイヤープロットを使用してグラフ化した。(7匹のΔNCマウスと9匹の野生型同腹仔の予備的非近交系[75%C57BL/6J]コホートも記録された。)2番目の戻し交配コホートは、20〜21週齢で行動分析を受けた(詳細なプロトコールについては27及び16を参照されたい)。試験は2週間にわたって実施された。1日目の高架式十字迷路、2日目のオープンフィールドテスト、6〜9日目の加速ロータロッドテスト(1日の訓練と続く3日間の試行)。全ての分析は遺伝子型を隠して実施された。
【０１６９】
統計学的分析
反復測定ANOVAを使用して成長曲線を比較した。行動分析では、全てのデータが正規分布(オープンフィールドにおける中心での時間と移動距離)に適合するとき、t検定を使用して遺伝子型を比較した。そうでない場合(高架式十字迷路のアーム内の時間及び加速ロータロッドの落下までの滞在時間)、コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して遺伝子型を比較した。加速ロータロッドテストにおける経時的なパフォーマンスの変化は、フリードマン検定を使用して決定された。
【０１７０】
最小MeCP2(ΔNIC)の遺伝的再活性化
転写が抑制された最小MeCP2(ΔNIC)は、27で使用した手順に従って症候性null様「STOP」マウスで再活性化された。手短に、ΔNICMecp2対立遺伝子は、削除者マウスの代わりに野生型メスとキメラを交配させることにより、イントロン2にNeoSTOPカセットを保持することにより不活性化された。得られたSTOP/+メスは、ヘテロ接合Cre-ERトランスジェニックオス(JAX Stock#004682)と交配され、4つの遺伝子型のオス(87.5% C57BL/6J)を生成した。WT(n=4)、WT CreER(n=4)、STOP(n=9)、STOP CreER(n=9)の4つの遺伝子型全てからなるコホートをスコア付けし、4週齢から毎週計量した。6週間(STOP及びSTOP CreERマウスがRTT様症状を示したとき)から、全ての個体に一連のタモキシフェン注射を投与した:毎週2回、続いて毎日5回、それぞれ100μg/g体重の用量であった。タモキシフェンで処理したSTOP CreER(n=8)、WT(n=1)及びWT CreER(n=1)動物の脳組織を生化学分析のために28週齢で(STOP CreERマウスでの症状反転が成功した後)採取した。タモキシフェンで処理した1匹のSTOPマウスの脳組織も生化学分析に含めた(上述の方法)。
【０１７１】
最小MeCP2(ΔNIC)のベクター送達
最小MeCP2(ΔNIC)AAVベクターは、C57BL/6バックグラウンドで維持されたMecp2-null及びWTマウスで試験された。組換えAAVベクター粒子は、UNC遺伝子治療センターベクターコア施設で生成された。自己相補型AAV(scAAV)粒子(AAV9キャプシドにパッケージ化されたAAV2 ITR隣接ゲノム)は、ヘルパープラスミド(pXX6〜80、pGSK2/9)及びITRに隣接するΔNIC導入遺伝子構築物を含むプラスミドを含むポリエチレンイミン(Polysciences社、Warrington、PA)を使用してトランスフェクトされた懸濁HEK293細胞から生成された。使用した構築物を図17Bに示し、ITRに隣接するΔNIC導入遺伝子構築物の注釈付き配列(配列番号65)を図17Cに示す。翻訳に関連して、ΔNIC発現構築物は、同等のヒトMECP2_e1コード配列を利用し、他の実験で使用されたEGFPタグを置き換える小さなC末端Mycエピトープタグを使用した。導入遺伝子は、追加のプロモーター調節エレメントと推定サイレンサーエレメントを組み込んだ拡張内因性Mecp2プロモーター断片(MeP426)の制御下にあった(図17B、図17C)。構築物は、Mecp239〜41の調節に関与することが知られているmiRNAの結合部位の選択パネルとともに、内因性MECP2 3'UTRの断片からなる新規3'UTRも組み込んだ(図17B、図17C)。これまでに記載されたようにウイルス産生を行い28、5%ソルビトールを補充した高塩濃度PBS(350mM総NaClを含む)の最終製剤でベクターを調製した。マウスへの脳注射では、これまでに記載されたように、ウイルスの直接両側注射(部位あたり3μl;用量=マウスあたり1×1011ウイルスゲノム)を、麻酔していないP1/2オスの神経網に送達した29。対照注射は、ベクターを欠く同一の希釈剤を使用して行われた(「ビヒクル対照」)。注射された胎仔をホームケージに戻し、上記のように毎週評価した。
【０１７２】
2.  結果
MeCP2のアミノ酸配列は脊椎動物種全体で高度に保存されており(図1A)、タンパク質のほとんどが精製選択の対象であることを示唆している。これは、複数の結合パートナーとの相互作用が機能的に重要であるという広く支持されている見解を裏付けている。MeCP2は、適切な神経機能に必要ないくつかの細胞経路への関与が示唆されている11、3。RTTの原因となるミスセンス変異の分布を分析すると、重要なものとしてMBDとNID(タンパク質のごく少数)のみが強調表示される代替的な画像が表れる(図1A)。更に、健康な個人から収集されたエクソーム配列決定データは、タンパク質の他の領域に多数の多型を示し(図1A)、これらの配列が不要であることを示唆している。MBD及びNIDがMeCP2機能に十分であるかどうかを試験するために、内因性遺伝子の段階的な一連の欠失を設計して、N末端からMBD(ΔN)、C末端からNID(ΔC)、及びこれらのドメイン間の介在するアミノ酸(ΔI)の領域を削除した(図1B)。介在領域は、短いリンカーで接続されたSV40ウイルスに由来する核局在化シグナル(NLS)配列に置き換えられた。Mecp2遺伝子には4つのエクソンがあり、転写産物が選択的にスプライシングされて、最端のN末端でのみ異なる2つのアイソフォームが生成される30。ノックインマウスのMecp2遺伝子構造を維持するために、構築物はエクソン1と2、及びエクソン3の最初の10bp(スプライスアクセプター部位)を保持し、結果として、アイソフォームe1及びe2のそれぞれについて、29及び12のN末端アミノ酸が含まれる(図2A〜図2B、図3、図4)。タグ付はマウスのMeCP2機能に影響しないため16、検出と回収を容易にするためにC末端EGFPタグが付加された(図1B)。マップされた結合部位、構造情報、及び進化的保存を考慮して、残基72〜173としてMBDを、残基272〜312としてNIDを包含した(図S1C〜図S1D)。ΔN、ΔNC、及びΔNICに保持される天然MeCP2タンパク質配列の割合は、それぞれ野生型の88%、52%、及び32%である。
【０１７３】
最初に、細胞培養ベースのアッセイを使用して、短縮MeCP2タンパク質がメチル化DNA及びNCoR/SMRTコリプレッサー複合体と相互作用する能力を保持しているかどうかを試験した。3つのタンパク質誘導体は全て、HeLa細胞で過剰発現すると内因性NCoR/SMRT複合体成分を免疫沈降させたが、この相互作用は陰性対照NID変異体R306Cで消失した(図1C)。mCpGの結合をアッセイするために、マウス線維芽細胞でmCpGに富むペリセントリックヘテロクロマチン構造に発現タンパク質が局在するかどうかを調べた。以前の研究では、これらの構造への野生型MeCP2の局在は、DNAメチル化31、32及びMBD機能33の両方に依存していることが確立された。MeCP2の3つの短縮バージョンは全てヘテロクロマチン構造に局在していたが、陰性対照のMBD変異体(R111G)は拡散した核分布を示した(図1D)。短縮タンパク質がクロマチンとNCoR/SMRT複合体に同時に結合できるかどうかを判断するために、MeCP24に直接結合するNCoR/SMRTサブユニットであるTBL1Xをヘテロクロマチンに動員できるかどうかを調べた。過剰発現したTBL1X-mCherryはNLSを欠いているため細胞質に存在するが、過剰発現したMeCP2の存在下ではヘテロクロマチン構造に効率的に動員される4。同様に、短縮MeCP2タンパク質は全て、TBL1Xをヘテロクロマチン構造に動員し、DNAをコレプレッサーと架橋する能力を実証した(図1E)。MeCP2 NID変異対照(R306C)自体は正しく局在したが、これまでに記載されたように4、TBL1Xを細胞質から再配置できなかった(図1E)。これらの3つのアッセイは、全ての短縮タンパク質がメチル化DNAとNCoR/SMRT複合体に結合し、それらの間に架橋を形成する能力を保持していることを確認する。
【０１７４】
ES細胞の内因性Mecp2対立遺伝子を置換した後、胚盤胞注入と生殖系列伝達を行うことで、最初にΔN及びΔNCノックインマウスを生成した(図3)。これらの短縮タンパク質は、ウエスタンブロット及びフローサイトメトリー分析によって判定されたように、脳全体及びニューロンでほぼ野生型レベルで発現した(図5A〜図5B)。これらの短縮の表現型を評価するために、ノックインマウスをC57BL/6Jバックグラウンドと交配し、コホートに毎週表現型スコア付け24、27又は行動分析を実施した。ΔNとΔNCの両方のヘミ接合体オスマウスはいずれも生存能力があり、繁殖力があり、1年間にわたって野生型同腹仔と区別できない表現型スコアを示した(図6A〜図6D)。ΔNマウスには体重表現型がなかったが(図7A)、ΔNCマウスは野生型同腹仔と比較して体重がわずかに増加した(図7B、反復測定ANOVA p<0.0001)。ΔNCマウスのより非近交系(75%C57BL/6J)コホートでは体重差はなく(図7C)、RTTモデルの体重表現型は遺伝的バックグラウンドの影響を受けるというこれまでの観察結果と一致した26。
【０１７５】
20週齢で、RTTモデルで一般的に報告される行動、機能低下、不安の減少、及び運動能力の低下について、別々のコホートを試験した。ΔN又はΔNCマウスのいずれについても、活動表現型(オープンフィールドテストで移動した総距離で分析)は検出されなかった(図8)。いずれの新規マウス系統についても、不安表現型(高架式十字迷路の開放的なアームで費やされる時間の増加によって分析された)は検出されなかった(図6E)。しかしながら、ΔNCマウスは、オープンフィールドアリーナの中央広場で野生型同腹仔よりも有意に多くの時間を過ごし(図6F)、これは、不安がわずかに減少したことを示す。運動協調性は、3日間の加速ロータロッドテストを使用して評価された。RTTのマウスモデルは、3日目に最も顕著なこのテストでのパフォーマンスの低下を示すが34、16、ΔN及びΔNCマウスは、3日間のいずれにおいても野生型同腹仔と有意な差がなかった(図6G)。全体として、結果は、N及びC末端ドメインのMeCP2機能への寄与が最大でも微妙であることを示唆している。この結果は、T308を超える残基を欠く35わずかに重度のC末端短縮を発現するオスマウスのRTT様症状を考えると特に顕著である。表現型の違いは、更に4つのC末端アミノ酸(309〜312)の損失がNCoR/SMRTコリプレッサー複合体に対するこの短縮されたMeCP2分子の親和性を低下させることを以前の証拠が示す4ため、ΔNCマウスにおける完全なNID機能の保持によって説明され得る。
【０１７６】
次に、内因性Mecp2遺伝子を、MBD及びNIDドメインのみを含み、全長タンパク質配列の32%を含む最小の対立遺伝子であるΔNICに置き換えた(図1B、図4)。脳全体のタンパク質レベルは、ウエスタンブロッティングとフローサイトメトリーによって定量化され、どちらも存在量の減少を示した(WT-EGFP対照の約50%;図9A〜図9B)。タンパク質の存在量の同様の減少は、ニューロンの亜集団でも見られた(WT-EGFP対照の約40%;図9B)。mRNAは実際には野生型同腹仔よりもΔNICマウスで豊富であったため(図9C)、低タンパク質レベルは転写の抑制によるものではなく、中間領域の欠失がタンパク質安定性を損なうことを示唆している。タンパク質レベルが低いにもかかわらず、オスのΔNICマウスの寿命は正常であった(図9E、図10)。1年間にわたる表現型スコア付けにより、軽度の神経学的表現型(図9D)、主に歩行異常、及び部分的な後肢の握りしめが検出された。これらの症状はスコア付け期間中ずっと続いたが、それ以上重くなることはなかった。ΔNICマウスの体重も、野生型の同胞よりも約40%少なくなった(図11A;反復測定ANOVA p<0.0001)。この研究で見られるように、体重の増加と減少の両方がMeCP2変異マウスモデルでこれまでに報告されている26、36、23、16。高架式十字迷路の閉じられたアームで過ごす時間が大幅に短縮されたことから明らかなように、20週の別のコホートの行動分析では、オスのΔNICマウスの不安が減少した(図9F、KS検定p=0.003)。この結果は、オープンフィールドテスト(図9G)でも活性表現型を検出せず(図12)、裏付けされなかった。スコア付コホートで検出された歩行障害と一致して、ΔNICマウスは、これは、加速ロータロッドにおける3日間の毎日の試行でパフォーマンスが低下することによって示されるように(図9H、フリードマン検定p=0.003)、運動協調性を低下させた。これにより、野生型同腹仔と比較して、試験3日目にパフォーマンスが有意に低下した(KS検定p=0.003)。全体として、ΔNIC動物は、寿命の中央値は42週間で、症候性スコアが高く、体重減少の表現型がより強力であった16RTT患者で見出された最も軽度の共通変異であるR133Cを有するオスマウスよりもそれほど深刻な影響を受けないことは注目に値する(図13)。この結果は、NCoR/SMRTコリプレッサー複合体のクロマチンへの動員がMeCP2の主要な機能であるという仮説を強く支持し、軽度の表現型は、野生型レベルの50%で完全長のMeCP2を発現する低形質マウスについてこれまでに記載されたように37、タンパク質レベルの低下の結果である可能性が高いことが観察された。
【０１７７】
最小MeCP2の機能を更に試験するために、遺伝子の再活性化によるΔNICの遅い提供が、以前の完全長タンパク質で示されているように24、症候性MeCP2欠損マウスの表現型の欠陥を回復できるかどうかを調べた。イントロン2のfloxed転写STOPカセットをΔNICで発現させないことにより、null様MeCP2欠損マウスを作製した(図4、図14)。これらのマウスは、タモキシフェン処理時の再活性化を可能にするために、CreER導入遺伝子(改変エストロゲン受容体に融合されたCreリコンビナーゼ)を持つマウスと交配された。これはSTOP CreERマウスで症状が発現した後に誘導され(図15A)、高レベルのCre組換え(図16A)とΔNICマウスと同様のタンパク質レベル(図16B)をもたらした。ΔNIC遺伝子の再活性化は、表現型の進行に劇的な影響を及ぼし、神経学的症状を改善し、正常な生存率を回復した(図15B〜図15C)。対照的に、CreER導入遺伝子を持たないSTOPマウスは26週間以上生存できなかった。したがって、長さが根本的に短く、存在量が比較的低いにもかかわらず、ΔNICはMeCP2欠損マウスのRTT様表現型を効果的に逆転させることができた。
【０１７８】
この発見により、Mecp2-nullマウスで試験した遺伝子治療にΔNICを使用できるかどうかを調査することになった。最小のMecp2プロモーターによって駆動されるΔNIC遺伝子は、Mycエピトープでタグ付けされ(はるかに大きいEGFPの代わりに)、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV9)にパッケージされた。新生仔マウス(P1〜2)の頭蓋内にこのウイルス又はAAVビヒクルのみを注射した(図15D)。ΔNIC遺伝子を受け取ったMecp2-null動物は、症状の重症度の大幅な低下と生存率の向上を示した(図15E〜図15F)。脳細胞あたりの感染率を細かく制御することはできないが、野生型動物であっても、過剰発現による有害な影響は観察されなかった(図17)。毒性は、中程度の不安定性及び/又はΔNICタンパク質の活性低下により緩和されると考えられる。この実験は、ΔNICタンパク質が大きなEGFPタグなしで機能することも示す。最小のMeCP2を使用すると、AAVベクターの容量が制限されるため、治療上の利点が得られる。コード配列を短くすると、追加の制御配列の余地ができ、発現レベルの制御を向上することを可能にする。
【０１７９】
3.  議論
全体として、MeCP2は多機能ハブとして機能するという見解に反し、代わりにその主要な機能がクロマチンのメチル化部位にNCoR/SMRTコリプレッサー複合体を動員するという単純なモデルを裏付ける結果が得られた。最小のMeCP2タンパク質(ΔNIC)には、ATフック23、いくつかの活性依存性リン酸化部位17、18、RNA結合モチーフ6、及びマイクロRNAプロセシング9、スプライシング10、クロマチンリモデリング8への関与が示唆されているタンパク質の相互作用部位等、潜在的に重要であると強調されているいくつかのドメインの全て又は一部が欠落していることは注目に値する。重要なことに、これら2つのドメインがMeCP2欠損マウスの神経機能を回復するのに十分であるという発見により、最小タンパク質の治療可能性を示すことができた。
【０１８０】
4.  更なる実験
完全長のMecp2/MECP2がマウスに送達されるとき、運動機能障害、運動失調、及び固有受容性感覚の明らかな消失という形での毒性の出現がこれまでに報告されている49、50。独立した報告書は、最近、より大きな哺乳類種でのAAV9バリアント(AAVhu68)の送達に応答する同一のステレオタイプ運動失調と固有受容性感覚の喪失を示しており、末梢神経後根神経節はAAV9変異体の投与に特に感受性がある可能性があることを示している51。
【０１８１】
全長MECP2とΔNIC MECP2の直接比較を実行した(Table 3(表3))。完全長のMECP2で処理したマウスと比較して、AAV9ΔNIC MECP2で処理した動物では、運動失調と固有受容性感覚の障害の有意な減少が観察された。これらのデータは、同一条件下で、ΔNIC MECP2ミニ遺伝子が完全長のMeCP2と比較して既知の末梢神経毒性に対する感受性を低下させるという事実を裏付けている。
【０１８２】
表3:完全長MECP2とΔNIC MECP2の比較
AAV9-MeP229/MECP2は、内因性Mecp2プロモーターの強い229bp断片と完全長MECP2を持つAAV2/9ベクターを指す。AAV9-MeP426/MECP2は、内因性Mecp2プロモーターの426bp断片と完全長MECP2を持つAAV2/9ベクターを指す。AAV9-MeP426/ΔNIC MECP2は、内因性Mecp2プロモーターの426bp断片とΔNIC MECP2ミニ遺伝子挿入物を有するAAV2/9ベクターを指す。
【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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