(57)【要約】  本発明は、好ましくは初期段階、より好ましくは前駆期でのパーキンソン病（ＰＤ）の診断に関する。本発明は、例えば、ＰＤを診断する方法、ＰＤの進行をモニタリングする方法、治療に対する反応をモニタリングする方法、または臨床研究のために対象を層別化する方法に利用することができる。前記方法で使用するためのキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるパーキンソン病（ＰＤ）を診断またはモニタリングする方法であって、全体的な翻訳レベルの変化について、対象から得られた試料を試験することを含み、全体的な翻訳の減少がＰＤを示す、方法。
【請求項２】
ＳＮＸ２の発現の減少を含む発現シグネチャが、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＬＩＭＡ１の発現の減少をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＲＲＳ１、ＴＦＲＣ、ＲＡＳＡ１、ＮＲＡＳ、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣ、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１Ｌ、およびＲＰＬ２７をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
全体的な翻訳の減少を示す発現シグネチャが、ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＤＢＩ、ＡＤＡ１Ｂ０ＧＶＧ８、ＥＲＬＥＣ１、ＴＸＮＬ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＢＡＧ３、ＲＡＳＡ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡＧＮＬ３、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７ＡおよびＡＳＮＳをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
全体的な翻訳の減少を示す発現シグネチャが、ＳＮＸ２、ＬＩＭＡ１、ＲＲＳ１、ＴＦＲＣ、ＲＡＳＡ１、ＮＲＡＳ、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣ、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１Ｌ、ＲＰＬ２７、ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＤＢＩ、ＡＤＡ１Ｂ０ＧＶＧ８、ＥＲＬＥＣ１、ＴＸＮＬ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＢＡＧ３、ＲＡ−ＳＡ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡＧＮＬ３、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７ＡおよびＡＳＮＳからなる群から選択された遺伝子によりコードされる１種または複数のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＤが孤発性ＰＤである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＦＡＭ１２０ＡおよびＡＤＡＲの発現の減少を含む発現シグネチャが、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮ３１、ＴＭＥＭ２０８およびＣＲＩＰ２をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＤＲＭ１、ＰＥＦ１、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１  ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２、ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、ＥＨＤ１およびＰＡＬＬＤをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＦＡＭ１２０Ａ、ＡＤＡＲ、ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮ３１、ＴＭＥＭ２０８、ＣＲＩＰ２、ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＤＲＭ１、ＰＥＦ１、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１  ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２、ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、ＥＨＤ１およびＰＡＬＬＤからなる群から選択された遺伝子によりコードされる１種または複数のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、Ｇ２０１９Ｓのキャリアであるか、または孤発性ＰＤ患者のサブグループに属する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対照試料と比較した際の翻訳の変化レベルが、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
翻訳レベルが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並行反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ依存型取得（ＤＤＡ）またはデータ非依存型取得（ＤＩＡ）を含む質量分析、代謝標識およびクリックケミストリーからなる群から選択される方法によって評価されるか、または前記薬剤が抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現シグネチャが非比較的または比較的様式で使用される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
質量分析法または抗体によって定量的または定性的に評価された翻訳後修飾の変化が、翻訳の変化を示す、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記翻訳後修飾の構造の変化が、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記モニタリングが、ＰＤの進行をモニタリングすること、治療に対する反応をモニタリングすること、ＰＤの寛解をモニタリングすること、またはＰＤの再発をモニタリングすることを含む、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記診断が、前記対象をＰＤのサブグループに層別化することを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、皮膚生検試料、血液試料、細胞試料、組織試料、または体液である、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドまたはタンパク質の発現レベルの変化について試料を試験するための１種または複数の試薬を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキット。
【請求項２２】
ＰＤを診断、分類診断またはモニタリングするための、またはＰＤ患者を層別化するためのキットの使用であって、前記キットが、ペプチドまたはタンパク質の発現レベルの変化について試料を試験するための１種または複数の試薬を含む、キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは発症前の段階におけるパーキンソン病（ＰＤ）の診断に関する。本発明は、例えば、ＰＤを診断する方法、ＰＤの進行をモニタリングする方法、治療に対する反応をモニタリングする方法、または臨床研究のために対象を層別化する方法に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性疾患であり、ヨーロッパと南北アメリカで最も罹患率が高くなっている。ＰＤに対する治療法は存在しないが、いくつかの有望な介入が臨床試験中であり、長期の対症療法が合併症と関連している。その神経病理学的根拠は完全には理解されていないが、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるドーパミン作動性ニューロンの変性が繰り返し示されており、大脳基底核におけるその後のドーパミン放出の減少は、パーキンソン運動症状をもたらす。
【０００３】
ＰＤは、孤発性の非遺伝性（症例の９５％）および遺伝性（家族性）ＰＤに大別することができる不均一性疾患であり、２８のリスク関連変異が知られている１。病理学の重要な特徴には、運動症状、ドーパミン作動性ニューロン死、神経炎性萎縮、ドーパミン枯渇および行動障害が挙げられる。興味深いことに、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓキャリアは、孤発性症例と症状的に区別が付かず２、共通の根本的なメカニズムがある可能性を示唆している。したがって、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓの研究は、より多くの集団の孤発性症例にも関連する見識を提供することが望まれている。
【０００４】
ＰＤの症状が現れるまでに、最大８０％の脳のドーパミン作動性ニューロンが既に死滅している。これらの死滅したニューロンを交換または再生することは実現可能ではないが、長期前臨床フェーズは、広範囲のニューロン喪失の前に治療的介入の可能性を提供する。新しい推定機構に基づいて治療戦略が提案されているが３、４、ＰＤの確定的なバイオマーカーは認められていない。したがって、治療または予防的処置が行われた際に最大の利益を得ることができるように、発症前の段階でＰＤを診断するためのバイオマーカーを同定する必要性が満たされていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、ＰＤを診断するための手段および方法を提供することである。この目的は、独立請求項に記載されていることを特徴とする方法および装置によって達成される。本発明のいくつかの好ましい実施形態は、従属請求項に開示されている。
【０００６】
本発明により、最小限の侵襲的な様式で（すなわち、皮膚生検または生検そのものからの線維芽細胞の使用、あるいは血液試料由来の末梢血単核細胞からの線維芽細胞あるいは例えば尿または脳脊髄などの他の体液からの線維芽細胞の使用）、様々な組織型における疾患の検出を可能にする。読み出しは、タンパク質合成レベルの変化の形態で、または疾患に固有のユニークなタンパク質またはペプチドシグネチャの発現の変化による形態であり得る。例に示されているように、読み出しは、孤発性の非遺伝性症例の診断ならびに遺伝性症例の診断に関連している。
【０００７】
一態様では、本発明は、対象におけるパーキンソン病（ＰＤ）を診断またはモニタリングする方法を提供し、上記方法は、全体的な翻訳の減少について、対象から得られた試料を試験することを含む。全体的な翻訳の減少は、ＰＤを示しており；一方、翻訳の変化がないことは、ＰＤがないことを示している。
【０００８】
全体的な翻訳の減少は、様々な形で証明することができる。いくつかの実施形態では、全体的な翻訳の減少の存在は、対照試料と比較した場合の翻訳の変化レベルによって示される。全体的な翻訳レベルの減少は、全体的な発現レベルが減少するように、種々のタンパク質についてのタンパク質発現レベルの増加および減少の組み合わせから生じ得る。翻訳レベルは、例えば、代謝標識およびクリックケミストリーからなる群から選択される方法によって評価され得る。
【０００９】
いくつかの他の実施形態では、全体的な翻訳の減少の存在は、ユニークな分子シグネチャの存在によって示される。この方法は、当該シグネチャと、関連する対照のシグネチャとを比較することを含んでも含まなくてもよい。
【００１０】
いくつかのさらなる実施形態では、全体的な翻訳の減少の存在は、定量的または定性的のいずれかで評価され得る、翻訳後修飾の変化によって示される。いくつかのさらなる実施形態では、翻訳後修飾の構造の変化は、全体的な翻訳の減少を示す。
【００１１】
この方法は、様々な目的でＰＤをモニタリングするために使用できる。例えば、この方法は、ＰＤの進行をモニタリングすること、治療に対する反応をモニタリングすること、ＰＤの寛解をモニタリングすること、またはＰＤの再発をモニタリングすることに使用できる。
【００１２】
他の態様では、本発明は、本方法の異なる実施形態において使用するためのキットを提供する。上記キットは、全体的な翻訳の減少について試料を試験するための少なくとも１つ以上の試薬を含む。
【００１３】
ＰＤを診断、分類診断またはモニタリングするための本キットの使用もまた提供され、上記キットは、全体的な翻訳の減少について試料を試験するための少なくとも１つ以上の試薬を含む。
【００１４】
本発明の他の目的、態様、実施形態、詳細および利点は、以下の図面、詳細な説明、および例から明らかになるであろう。
【００１５】
以下では、添付の図面を参照しながら好ましい実施形態を用いて本発明をさらに詳細に説明し、添付の図面には、本発明の基礎および２つのフォーマットでの診断への応用が示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ（家族性および孤発性ＰＤと関連するＬＲＲＫ２の機能獲得型キナーゼ変異体（ＰＡＲＫ８））が、リボソームタンパク質をリン酸化し、一方、ミトコンドリアタンパク質のリン酸化は比較的低いことを示す。ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色（ｌ．ｈ．ｓ．）は、リボソーム画分およびミトコンドリア画分からのタンパク質負荷を示す。オートラジオグラフ（ｒ．ｈ．ｓ．）は、予想外に、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓが優先的にリボソームタンパク質をリン酸化することを示す。ｂ）リボソーム画分からのＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ基質の質量分析による同定。正確なＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓリン酸化部位が示されている。これらのデータは、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓがリボソーム機能を調節することを示している。
【図２】図２は、パーキンソン病（ＰＤ）のロテノンモデルではタンパク質翻訳が損なわれていることを、Ｓ３５−メチオニン標識を用いて示している。示されるように、海馬ニューロンをロテノン有りまたは無しで処理した。ロテノンは、慢性投与の際にげっ歯類における孤発性ＰＤの特徴を再現する殺虫剤である。ヒトでは、ロテノンへの曝露は、ＰＤを発症するリスクの増加と関連している。これらのデータは、ＰＤにおいてタンパク質合成阻害が生じ、そして病理に寄与し得ることを示している。平均値の標準誤差を示す。
【図３】図３は、ロテノンがドーパミン作動性ニューロンおよびＢＨＫ２１細胞において内因性ＬＲＲＫ２を活性化すること、およびこれがＬＲＲＫ２−ＩＮ１を用いて内因性ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の阻害を回復できることを実証する。さらに、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓは、再構成翻訳系におけるタンパク質翻訳を直接損なう。ａ）ＬＲＲＫ２の活性型を認識するリン酸特異的抗体（ＬＲＲＫ２−Ｓ３９５）を用いてＬＲＲＫ２活性を推定する。ｂ）（ａ）に示すように、６回の独立した反復からの定量的データ。ｃ、ｄ）ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の阻害が培養細胞中の正常なタンパク質翻訳を回復できるかどうかを決定するために、表示濃度のＬＲＲＫ２−ＩＮ１の存在下または非存在下で、ＢＨＫ２１細胞をロテノン（１００ｎＭ））の存在下または非存在下処理した。タンパク質翻訳は、ＡＨＡを用いた非標準アミノ酸標識、続いて、アルキン−Ａｌｅｘａ−４８８の銅触媒クリック付加を用いて測定した。代表的な蛍光顕微鏡写真（ｃ）および定量的データ（ｄ）を示す。タンパク質翻訳レベルは、１μＭのＬＲＲＫ２−ＩＮ１を用いてＬＲＲＫ２の阻害時に対照レベルに回復する。ｅ）タンパク質合成に対するＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓの効果を直接試験するために、精製ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓを無細胞翻訳系に添加し、タンパク質翻訳をβ−ガラクトシダーゼの比色産生によって決定した。これらのデータは、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓがタンパク質合成機構を直接損なうこと、および内因性ＬＲＲＫ２活性がロテノン処理に応答してタンパク質合成を抑制することを示している。平均値の標準誤差をプロットする。＃、ｐ＜０．０００１。
【図４】図４は、ＬＲＲＫ２キナーゼ阻害剤による処理が、培養中脳のドーパミン作動性ニューロンを、ロテノン誘導性神経突起萎縮から保護することを示す。ａ）示されるように、中脳培養物を２４時間ロテノン（０〜１００ｎＭ）で処理した。ドーパミン作動性ニューロンを同定するために、チロシンヒドロキシラーゼについて培養物を免疫染色した。無傷の神経突起を有するドーパミン作動性、ＴＨ陽性細胞の割合を示す。ロテノンは神経突起の用量依存的な喪失を誘導した。２回の独立した実験からの平均データ±標準偏差を示す。１条件につき３００を超える細胞を記録した。ｂ）ＴＨ免疫染色（緑色）ドーパミン作動性ニューロンを示す代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。（ｃ、ｄ）３つの構造的に異なるＬＲＲＫ２阻害剤、ＬＲＲＫ２−ＩＮ１（１μＭ）、ＧＳＫ−２５７８２１５Ａ（１μＭ）またはＭＬｉ−２（１０または５０ｎＭ）での処理は、ドーパミン作動性ニューロンにおけるロテノン誘発性神経突起の喪失を防止した。（ｅ）阻害剤単独での処理は、無傷の神経突起を有するドーパミン作動性ニューロンの数を変化させなかった。平均値の標準誤差を示す。＃、ｐ＜０．０００１。
【図５】図５は、クリックケミストリーおよびレポーターとしてＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−４８８−アルキンを使用することによって、その内因性ＬＲＲＫ２が初代培養ニューロンにおけるタンパク質翻訳を抑制することを示す。ａ〜ｆ）示されるように、海馬ニューロンをＬＲＲＫ２阻害剤（ＬＲＲＫ２−ＩＮ１またはＧＳＫ−２５７８２１５Ａ）有りまたは無しで処理した。タンパク質翻訳のレベルは、メチオニン類似体Ｌ−アジド−ホモアラニン（ＡＨＡ）によるニューロンの代謝標識後に測定した。クリック反応を用いて、新生タンパク質をＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−４８８で共有結合的にタグ付けした。デノボタンパク質合成のレベルは、蛍光強度から推測した。２つの構造的に独立したＬＲＲＫ２阻害剤での処理は、海馬ニューロンにおけるタンパク質合成のレベルを増加させた（ａ〜ｆ）。タンパク質合成の阻害剤であるアニソマイシンを陰性対照として添加した。平均値の標準誤差を示す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。同様に、クリックケミストリーを使用して、経口投与可能なＬｒｒｋ２の特異的阻害剤（ＭＬｉ−２）を試験した。ｇ〜ｉ）は、ＬＲＲＫ２の高度に特異的な阻害剤であるＭＬｉ−２を用いた培養海馬ニューロンの処理がデノボタンパク質合成を増加させたことを示す。ｇ）示された量のＭＬｉ−２で処理した海馬ニューロンの代表的な蛍光画像を示す。（ｈ、ｉ）体細胞および樹状突起におけるデノボタンパク質合成のレベルを蛍光強度から推定した。平均値の標準誤差を示す。＃、ｐ＜０．０００１。
【図６】図６は、クリックケミストリーを使用して、新しく合成されたタンパク質をＡＨＡで標識している。この知見は、内因性Ｌｒｒｋ２の阻害が、中脳ニューロンの初代培養におけるタンパク質翻訳を増加させることを示している。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）染色によって可視化される。ａ）漸増濃度のＬｒｒｋ２  ＩＮ２で処理し、ＴＨについて染色した中脳培養物の代表的な画像を示す。ｂ、ｃ）ＴＨ陽性細胞およびＴＨ陰性細胞の体細胞におけるタンパク質翻訳を示す。ｄ）中脳培養デノボタンパク質合成に対する、アニソマイシン（翻訳を阻害するための）の効果を、代表的な画像によって示す。ｅ）ｄからの定量的データを示す。ｐ値は、それらが適用されるデータポイントの上のグラフに表示される。
【図７】図７は、同年齢の健常対照と比較して、臨床的に診断されたＰＤ患者から得られた線維芽細胞において、タンパク質翻訳が有意に減少することを示す。ａ）健常対照（対照）および孤発性ＰＤまたはＧ２０１９Ｓキャリアを有する個人からの線維芽細胞の代表的な蛍光画像。ｂ）患者からの定量的データを示す。平均体細胞強度は、Ａｌｅｘａ−４８８−アルキン蛍光強度を指し、タンパク質翻訳の尺度である。個人の年齢は、ヒストグラムバーの上に表示される。平均値の標準誤差を示す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、ＰＤ患者および健常個人の細胞から測定されたタンパク質合成のレベルを示す。タンパク質合成レベルは、患者集団において有意に減少している。この減少は、ＬＲＲＫ２阻害剤−２（ＩＮ２）またはＭＬｉ−２で処理すると線維芽細胞における正常レベルに逆転する。患者は６７〜７５歳だった。平均値の標準誤差を示す。Ｐ値、＃ｐ＜０．０００１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図９】図９は、フィンランドのトゥルク大学病院からの別々のコホートからの患者および健常集団におけるタンパク質合成レベルを示す。この場合、推定ＰＤ個人からの線維芽細胞は、運動症状を有するが、ＤＡＴ結合によってまだ診断されていない。ａ）対照（健常）および推定ＰＤ患者のタンパク質合成レベルを、平均値および標準偏差で示す。ｂ）個々のデータは、ヒストグラムバーの上に示される年齢、性別および細胞継代数（ｐＸ）で示す。平均値の標準誤差を示す。対照個人（黒色、ヒストグラムバー１〜７）、運動症状を有する個人（灰色、ヒストグラムバー８〜２０）。ほとんどの個人は、タンパク質合成の減少を示している。一人の個人が増加を示している。
【図１０】図１０ａ）患者および健常個人からの線維芽細胞におけるｍＲＮＡ翻訳のレベルについての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。このデータは、２つのコホート：（ＮＩＮＤｓ−Ｃｏｒｉｅｌｌ）およびトゥルク大学病院（Ｔ．Ｕ．Ｈ．）の全試料を組み合わせたものである。曲線下面積（ＡＵＣ）は９３％であり、患者群におけるタンパク質翻訳のレベルが良好な予測力を提供することを示していた。ＡＵＣの有意性（ｐ＝０．０００２）は、スチューデントのｔ検定を用いて決定された。効果の大きさは１．８６であった。ｂ）ピアソンの相関分析を、同じ患者と対照からの翻訳データについて行った。タンパク質翻訳対年齢を、Ｔ．Ｕ．Ｈ．コホートおよびＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ群について示す。全体的な翻訳の減少は、患者集団内の年齢と負の相関があった。ｃ）ＰＤ患者および健常対照に対するピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を示す。健常集団では、翻訳レベルの減少と年齢との間に有意な相関はなく、全体的な翻訳の減少がＰＤの疾患特異的な特徴であることを示している。
【図１１】図１１は、マルチウェルプレートアッセイにおける蛍光検出を用いたタンパク質合成の測定が、個々の細胞イメージングからの知見を再現することを示す。患者の線維芽細胞（ＰＤ１、ＰＤ２）および健常個人（Ｃ２）を、４８ウェルプレート中で、Ｌ−アジド−ホモアラニン（ＡＨＡ）標識に供し、続いてＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−４８８を環状付加に供した。バックグラウンド蛍光（すなわち、２０μＭアニソマイシンの存在下での蛍光）を差し引いた。マルチウェルアッセイは、蛍光顕微鏡および個々の細胞分析を使用して、同じ患者細胞において観察された減少した翻訳レベルを再現した（図９）。平均値の標準誤差を示す。
【図１２】図１２は、患者の線維芽細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のデノボ合成タンパク質のタンパク質強度測定値を示す。患者試料は、米国のＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ研究所、ミラノの欧州バイオバンク、およびフィンランドのトゥルク大学病院（Ｔ．Ｕ．Ｈ．）コホートからのものであった。ａ）ＡＨＡ標識細胞（線維芽細胞およびＰＢＭＣ）由来のＭＳ／ＭＳ同定新生タンパク質の強度値を示すヒートマップ。アルキン−アガロースビーズへの共有結合後に新生タンパク質を単離した。トリプシン消化後、放出されたペプチドを質量分析法により配列決定し、Ｍａｘｑｕａｎｔソフトウェアを用いて同定した。非特異的タンパク質結合を測定するための陰性対照として、細胞をＡＨＡの代わりにメチオニンで標識した。これらの結果は、ＡＨＡ−アルキンビーズ濃縮が、患者細胞由来のデノボ合成タンパク質を単離するために働くことを示している。このアプローチにより、選択反応モニタリングまたは並行反応モニタリングを用いるデータ依存型取得（ＤＤＡ）を使用するか、またはデータ非依存型取得（ＤＩＡ）を使用するか、あるいは他の種類の質量分析法を使用する質量分析計を使用して、迅速に定量できる一連のペプチドが得られる。代替的な方法は、単独または多重化された様式で、新規タンパク質に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡベースの検出を使用することである。ｂ）図の部分は、質量分析法を用いてＡＨＡ基が正確に同定された、Ｌ−アジド−ホモアラニン（ＡＨＡ）−標識ペプチドのパネルを示す。これを、ＡＨＡの代わりにメチオニンで標識された試料と比較する。これは、上記方法がＡＨＡで標識されたデノボ合成タンパク質を首尾よく同定することを示している。ｃ）ＡＨＡ標識ＰＢＭＣおよび線維芽細胞由来の新生タンパク質をビオチン−アルキンへの環状付加により精製し、ストレプトアビジンビーズを用いて精製した。抗ビオチン−ＨＲＰ抗体を用いたイムノブロッティングを用いてタンパク質翻訳レベルを報告した。得られたシグナルが翻訳によるものであること（およびビーズへの非有意な結合ではないこと）を試験するために、翻訳阻害剤アニソマイシンで処理した試料を含めた。アニソマイシンの存在下ではシグナルは存在せず、新たに合成されたタンパク質に対する標識反応の特異性を示している。
【図１３】図１３は、３つの組み合わされたコホート（ＮＩＮＤＳ、Ｔ．Ｕ．Ｈおよび欧州バイオバンク、表１）からの患者および健常個人についての生強度値を示す。それらは、診断に従って孤発性Ｇ２０１９Ｓキャリアと健常に分類される。陰性対照は、ＡＨＡ無しで標識された同じ線維芽細胞由来であり、非特異的バックグラウンドを表す。Ｌｏｇ２強度値が示されている。このデータセットでは、１６５３個のタンパク質グループが同定された。これは、デノボ合成タンパク質の分析によって提供される情報の深さを説明している。すべての患者試料において、タンパク質レベルは、健常個人におけるタンパク質レベルよりも低かった。同等のＭＳ／ＭＳ分析のために、ＨＰＬＣにロードする前にタンパク質レベルを基準化した。これは、これらの試料における全体的な翻訳の減少の過小評価をもたらす。それでも、明らかな減少が見られる。この生強度データからまた明らかなのは、孤発性Ｇ２０１９Ｓと健常個人との間のシグネチャの違いである。
【図１４】図１４は、孤発性ＰＤ患者対健常個人において有意に変化しているデノボ合成タンパク質の比較を示す。試料をコホート（ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ、Ｔ．Ｕ．Ｈ、および欧州バイオバンク）から組み合わせた。タンパク質名をｙ軸に示し、ｌｏｇ２タンパク質強度単位をｘ軸に示す。個々のボックスは、異なる患者を表す（左から右）。スチューデントのｔ検定によって孤発性患者と健常個人との間で有意に異なるタンパク質レベル（ｐ値＜０．０５）のみを示す。
【図１５】図１５は、Ｇ２０１９Ｓの症例を健常個人と比較した場合に、有意に異なったデノボ合成タンパク質の比較を示す。試料をコホート（ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ、Ｔ．Ｕ．Ｈ、および欧州バイオバンク）から組み合わせた。タンパク質名をｙ軸に示し、ｌｏｇ２タンパク質強度単位をｘ軸に示す。個々のボックスは異なる患者を表す（左から右）。スチューデントのｔ検定によってＧ２０１９Ｓ患者と健常個人との間で有意に異なるタンパク質レベル（ｐ値＜０．０５）のみを示す。
【図１６】図１６は、強度が健常個人と比較して孤発性ＰＤにおいて有意に変化している３２個のタンパク質のシグネチャを示す。このシグネチャは、９３％の予測精度で孤発性ＰＤを明確に同定した。患者データを、フィンランド、米国、イタリアの３つの別々の患者群から組み合わせた。対照と比較したＬｏｇ２タンパク質強度の変化を、グレースケールＬＵＴおよび表２および３に示す。
【図１７】図１７は、強度が健常個人と比較して孤発性ＰＤにおいて有意に変化している１４個のタンパク質のシグネチャを示す。このシグネチャは、９９％の予測精度で孤発性ＰＤを明確に同定した。患者データを、フィンランド、米国、イタリアの３つの別々の患者コホートから組み合わせた。対照と比較したＬｏｇ２タンパク質強度の変化を、グレースケールＬＵＴおよび表２および３に示す。
【図１８】図１８は、強度が健常個人と比較して孤発性ＰＤにおいて有意に変化している２個のタンパク質のシグネチャを示す。これら２つのタンパク質ＳＮＸ２およびＬＩＭＡ１は、８８％の予測精度で孤発性ＰＤを明確に同定した。患者データを、フィンランド、米国、イタリアの３つの別々の患者コホートから組み合わせた。対照と比較したＬｏｇ２タンパク質強度の変化を、グレースケールＬＵＴおよび表２および３に示す。
【図１９】図１９は、強度が健常個人と比較してＧ２０１９Ｓ  ＰＤにおいて有意に変化している１３個のタンパク質のシグネチャを示す。このシグネチャは、９８％の予測精度でＰＤを明確に同定した。患者データを、フィンランド、米国、イタリアの３つの別々の患者コホートから組み合わせた。対照と比較したＬｏｇ２タンパク質強度の変化を、グレースケールＬＵＴおよび表２および３に示す。
【図２０】図２０は、強度が健常個人と比較してＧ２０１９Ｓ  ＰＤにおいて有意に変化している２個のタンパク質のシグネチャを示す。これら２つのタンパク質ＡＤＡＲおよびＦＡＭ１２０Ａは、９８％の予測精度でＧ２０１９Ｓ  ＰＤ患者を明確に同定した。患者データを、フィンランド、米国、イタリアの３つの別々の患者コホートから組み合わせた。対照と比較したＬｏｇ２タンパク質強度の変化を、グレースケールＬＵＴおよび表２および３に示す。  表１。この表は、この研究で使用された患者材料をリスト化している。トゥルク大学病院（Ｔ．Ｕ．Ｈ）からローカルに収集されたコホートを使用した。本発明者らはまた、遺伝性疾患に罹患した患者からのＮＩＮＤＳリポジトリからの試料と、細胞株と、ＤＮＡバイオバンクとの共有を確認する５。  表２は、孤発性ＰＤ患者に対するタンパク質強度の変化を示す。示されたタンパク質（遺伝子名によって定義される）は、同じタンパク質に対する健常個人からの強度の％として記載されている。健常対照者との同等の一致は１００％として示される。患者を表１に記載する。  表３は、Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤ患者に対するタンパク質強度の変化を示す。示されたタンパク質（遺伝子名によって定義される）は、そのタンパク質に対する健常個人からの強度の％として記載されている。健常対照者との同等の一致は１００％になる。患者を表１に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、少なくとも部分的には、家族性パーキンソン病（ＰＤ）の一般的な原因であるロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）における機能獲得型変異（Ｇ２０１９Ｓ）の病態メカニズムを詳述することを目的とした研究に基づく。これらの研究は、孤発性非遺伝性ＰＤおよびＧ２０１９Ｓキャリアの両方において、ＰＤが翻訳の減少と関連しているという驚くべき認識をもたらした。したがって、全体的な翻訳の減少の決定または全体的な翻訳の減少から生じるシグネチャの決定は、孤発性および遺伝性ＰＤの両方を診断およびモニタリングする際に使用され得る。
【００１８】
本発明者らは、孤発性ＰＤについてより学ぶことを予想して、ニューロンにおけるＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ機能を同定することに着手した。本発明者らは、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓがリボソームタンパク質をリン酸化することを見出した（図１ａおよびｂ）。本発明者らは、これがＰＤに関連しているのかどうか疑問に思ったので、タンパク質合成がＰＤのロテノンモデルで変化したかどうかを試験した（図２）。実際、本発明者らは、全体的な翻訳が減少したＰＤのこのモデルが、Ｓ３５代謝標識で測定できることを示した。本発明者らは、ニューロンのＰＤのロテノンモデルをさらに調査し、全体的な翻訳の減少のレポーターとして４８８−Ａｌｅｘａ蛍光色素でのアジド−アルキン環化付加を用いた場合、全体的な翻訳の減少がロテノンによって引き起こされることを同定した（図３ａ〜ｄ）。さらに、本発明者らは、ＬＲＲＫ２が阻害された条件下で、ロテノン誘導性翻訳低下が逆転したことを示し、これはＰＤとの機構的関連を示している。また、機能亢進性ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤ変異体タンパク質を使用した翻訳の再構成アッセイでは、全体的な翻訳が減少し（図３ｅ）、ＰＤと翻訳減少との間の関連性がさらに実証された。本発明者らはさらに、ロテノンがドーパミン作動性ニューロンの翻訳を減少させることを示し、その喪失はＰＤにおける運動機能の障害の特徴を引き起こす。また、ドーパミン作動性ニューロン（チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性細胞）は、ロテノン処理後に神経突起萎縮を生じた（図４）。これは、ＬＲＲＫ２の３つの構造的に独立した阻害剤（ＩＮ１、ＧＳＫ２５７８２１５ＡおよびＭＬｉ−１）による処理によって防止された（図４ｃ〜ｅ）。これは、全体的な翻訳の減少をもたらすＬＲＲＫ２活性化が、ＰＤの病理学的特徴であるドーパミン作動性ニューロン神経突起の死滅において因果的役割を果たすことを示した。また、３つの構造的に独立したＬＲＲＫ２阻害剤は、Ａｌｅｘａ−４８８蛍光読み出しと組み合わせたアジド−アルキン付加環化を用いて測定したように、健康なニューロンにおける翻訳を有意に増加させた（図５ａ〜ｉ、図６ａ〜ｅ）。まとめると、これらの結果は、ヒトのＰＤに関連する薬剤であるロテノンでの処理に基づいて、ＰＤの細胞およびニューロンモデルにおけるＬＲＲＫ２活性の上昇と全体的な翻訳の減少との間の関連を確立するものである６。
【００１９】
本発明者らは次に、全体的な翻訳の減少が患者試料から測定できるＰＤの特徴であるかどうかを試験した。本発明者らは、Ｃｏｒｉｅｌｌ研究所（ＮＩＮＤＳ）から入手した、健常個人、孤発性ＰＤ症例およびＧ２０１９Ｓ  ＰＤ症例由来の皮膚線維芽細胞における翻訳を測定した。これは、ＬＲＲＫ２およびＰＤ病理学に機構的に関連している全体的な翻訳の減少が、孤発性非遺伝性ＰＤ患者およびＧ２０１９Ｓ遺伝性ＰＤ患者などの両方からの皮膚生検から得られた末梢細胞からも測定できることを示した（図７）。図８は、患者の皮膚細胞における翻訳の減少がＬＲＲＫ２に依存することを示す。これらのデータは、ＬＲＲＫ２が孤発性ＰＤおよび家族性Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤなどの両方において翻訳を減少させることを示している。
【００２０】
全体的な翻訳の減少が、疾患の初期段階でＰＤ患者からの診断的読み出しを提供し得るかどうかを試験するために、フィンランドのトゥルク大学病院でＰＤ患者を募集した。ＰＤの家族歴がない（孤発性と呼ばれる）１３名のボランティア患者および７名の健常対照（同年齢の配偶者または兄弟姉妹）が皮膚生検を提供した。上述のようにアジド−アルキン環状付加化学を用いて、これらの生検から増殖させた線維芽細胞から全体的な翻訳を測定できることを示した（図３〜８）。これは、健常個人由来の細胞と比較した場合、全体的な翻訳の減少が、初期段階のＰＤ患者細胞における特徴であることを示した（図９）。
【００２１】
本発明者らは次に、患者データの受信者動作特性（Ｒ．Ｏ．Ｃ．）分析を行い、測定した全体的な翻訳の減少の診断的可能性を決定した。このために、ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ患者群から得られたデータをＴ．Ｕ．Ｈ．コホートと組み合わせた（表１）。これは、１．８６のサイズ効果および９３％の曲線下面積（Ａ．Ｕ．Ｃ．）を生じた（図１０ａ）。これは、全体的な翻訳の減少の測定が、例３〜８に記載されるように、シクロ付加化学および蛍光レポーターを用いて、健常対照からＰＤ患者を分離するための優れた識別能力を有することを示す。本発明者らは次に、全体的な翻訳の減少が患者集団における年齢と相関することを示した（図１０ｂ）。したがって、より高齢の患者、またはより長い間症状を有する患者は、全体的な翻訳のより大きい減少を示した。健常個人では年齢と負の相関は見出されなかったことに注意する（図１０ｃ）。これは、全体的な翻訳の減少が通常の老化の特徴ではなく、疾患特異的なＰＤの特徴であることを意味している。これらの結果は、全体的な翻訳の減少の読み出しが、疾患の進行を測定するのに有用である可能性があり、したがって治療中の患者モニタリングの価値を保持すると共に、臨床試験中の新規薬物評価またはドラッグリパーパシングの価値を保持し、ここで薬物はＰＤ症状の緩和または疾患進行の停止に関連する。
【００２２】
次に、分光光度計ベースのマルチウェルアッセイを用いて、全体的な翻訳の減少も測定できることを示した（図１１）。これにより、蛍光顕微鏡を用いた例７〜８で用いた方法と同等の結果が得られた。マルチウェルアッセイは、ＰＤを定義する読み出しとして翻訳の減少を測定するための診断キットの基礎を形成するために、ハイスループットモードで使用することができる代替の分析方法を提供する。
【００２３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、全体的な翻訳の減少に基づいて対象におけるＰＤを診断またはモニタリングする方法を提供し、上記全体的な翻訳の減少はＰＤを示す。本方法は、当技術分野で利用可能な任意の適切な技術を使用することにより実施することができ、これらには、上述した技術が含まれるが、これらに限定されない。そのような方法を実施するためのキットも提供される。
【００２４】
本発明者らは次に、翻訳アウトプットのタンパク質シグネチャを同定し、全体的な翻訳の減少の読み出しとして使用することができることを示した。これらのシグネチャは、ＰＤを健常個人と区別することができる。このために、本発明者らは最初に、アルキンタグアガロースを用いたＡＨＡ標識細胞からのデノボ合成タンパク質の単離が、新たに翻訳されたタンパク質を分離するために使用できることを示した。これにより、質量分析を用いて配列決定することができる、患者細胞から新たに合成されたタンパク質の精製試料が得られ、健常対照の試料と比較した場合の各タンパク質の強度はＰＤにおける全体的な翻訳の減少の詳細なシグネチャを提供した。本発明者らは最初に、この方法が、バックグラウンド干渉の少ないＰＤ患者において新たに翻訳されたタンパク質を正確に同定することを実証した（図１２ａ）。ＡＨＡ基を含むペプチドのみにＭＳ／ＭＳ検索を限定することにより、本発明者らは、本方法が、全体的な翻訳の減少の詳細なフィンガープリントまたはシグネチャを提供するデノボ合成タンパク質を濃縮するために効率的に機能することを示すことができた（図１２ｂ）。最後に、本発明者らは、抗体ベースの方法を用いて、全体的な翻訳の減少も測定できることを示した（図１２ｃ）。
【００２５】
健常対照と比較して孤発性ＰＤおよびＧ２０１９Ｓ症例の群からの全体的な翻訳の減少のＭＳ／ＭＳシグネチャを測定し続けた（図１３〜１５）。これらの患者群は、前のようにＴ．Ｕ．Ｈ．初期段階ＰＤコホートおよびＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌコホートを含んでいたが、それに加えて、欧州バイオバンクからの患者試料の群を含んでいた。すべての患者試料を表１に記載する。本発明者らは、健常対照と比較して孤発性ＰＤにおいて強度が有意に変化した（増加または減少のいずれか）３９個のデノボ翻訳タンパク質を同定した（図１４）。これらのタンパク質の８０％が有意に低下した強度を示した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより獲得された、強度の減少を特徴とする第１群タンパク質は、（遺伝子名により）ＬＩＭＡ１、ＣＣＤＣ５０、ＴＭＳＢ１０、ＭＫＲＮ２、ＤＲＧ２、ＳＮＸ２、ＴＯＭＭ４０、ＭＸ１、ＦＡＢＰ３、ＡＰＯＬ２、ＴＦＲＣ、ＲＲＳ１、ＤＢＩ、ＣＳＥ１Ｌ、ＲＰＬ２７、ＴＭＥＭ１６７、ＰＳＭｃａ、ＨＩＮＴ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＣＥＲＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＪＡＧＮ１、ＴＲＩＭ２５、ＡＳＮＳ、ＴＸＮＬ１ｍ  ＥＲＬＥＣ１、ＡＣＯＸ１、ＧＮＬ３、ＷＤＲ３６、およびＡＤＡＭ１０であった。２０％の有意に増加した強度を有する第２群タンパク質は、（遺伝子名により）Ｑ５６ＵＱ５、ＮＲＡＳ、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、ＰＰＩＣ、ＢＡＧ３およびＹＴＨＤＦ３であった。ここに示されているような質量分析法（図１４）による、または抗体ベースなどの他の方法による第１群（減少）または第２群（増加）のタンパク質の測定は、孤発性ＰＤを診断する読み出しとしての全体的な翻訳の減少を決定するための基礎を提供する。
【００２６】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤを診断およびモニタリングする方法を提供し、上記方法は、ＰＤに罹患している疑いのある対象由来の試料を、ＬＩＭＡ１、ＣＣＤＣ５０、ＴＭＳＢ１０、ＭＫＲＮ２、ＤＲＧ２、ＳＮＸ２、ＴＯＭＭ４０、ＭＸ１、ＦＡＢＰ３、ＡＰＯＬ２、ＴＦＲＣ、ＲＲＳ１、ＤＢＩ、ＣＳＥ１Ｌ、ＲＰＬ２７、ＴＭＥＭ１６７、ＰＳＭｃａ、ＨＩＮＴ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＣＥＲＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＪＡＧＮ１、ＴＲＩＭ２５、ＡＳＮＳ、ＴＸＮＬ１ｍ  ＥＲＬＥＣ１、ＡＣＯＸ１、ＧＮＬ３、ＷＤＲ３６、ＡＤＡＭ１０からなる群から選択された１種または複数の遺伝子の遺伝子発現の変化の存在について試験またはアッセイすることを含む。Ｑ５６ＵＱ５、ＮＲＡＳ、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、ＰＰＩＣ、ＢＡＧ３およびＹＴＨＤＦ３、またはそれらの任意の組み合わせ。より具体的な実施形態では、ＬＩＭＡ１、ＣＣＤＣ５０、ＴＭＳＢ１０、ＭＫＲＮ２、ＤＲＧ２、ＳＮＸ２、ＴＯＭＭ４０、ＭＸ１、ＦＡＢＰ３、ＡＰＯＬ２、ＴＦＲＣ、ＲＲＳ１、ＤＢＩ、ＣＳＥ１Ｌ、ＲＰＬ２７、ＴＭＥＭ１６７、ＰＳＭｃａ、ＨＩＮＴ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＣＥＲＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＪＡＧＮ１、ＴＲＩＭ２５、ＡＳＮＳ、ＴＸＮＬ１ｍ  ＥＲＬＥＣ１、ＡＣＯＸ１、ＧＮＬ３、ＷＤＲ３６、およびＡＤＡＭ１０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現減少、および／またはＱ５６ＵＱ５、ＮＲＡＳ、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、ＰＰＩＣ、ＢＡＧ３およびＹＴＨＤＦ３、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現増加は、ＰＤ、特に孤発性ＰＤを示している。いくつかの好ましい実施形態では、試験またはアッセイされる試料は、線維芽細胞を含む。本方法は、当技術分野で利用可能な任意の適切な技術を使用することにより実施することができ、これらには、上述した技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明者らは次に、健常対照と比較してＧ２０１９Ｓ患者において有意に変化した５６種のデノボ翻訳タンパク質強度を同定した。これらのうち、５６種中５５種のタンパク質は、対照と比較してＧ２０１９Ｓ症例において強度が有意に減少した。これらは（遺伝子名で）ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＣＲＩＰ２、ＡＤＲＭ１、ＦＡＭ１２０Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＰＥＦ１、ＡＤＡＲ、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１および２、ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２；ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、ＥＨＤ１であった。強度が増加した１種のタンパク質は、（遺伝子名で）ＰＡＬＬＤであった。本明細書に示されるような質量分析法による（図１５）、または抗体ベースなどの他の方法による、タンパク質の減少またはＰＡＬＬＤのレベルの上昇の測定は、孤発性ＰＤを診断する読み出しとしての全体的な翻訳の減少を決定するための基礎を提供する。この読み出しは、家族性ＰＤ、特にＧ２０１９Ｓキャリアに関連する。また、孤発性ＰＤ患者のサブグループにおける全体的な翻訳の減少の読み出しを提供することができるが、解明されておらず、この方法では患者の層別化に用いることができる。重要なことに、すべての患者および対照試料を、必要な調製工程として、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳの前にタンパク質濃度の基準化に供した。
【００２８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤを診断およびモニタリングする方法を提供し、上記方法は、ＰＤに罹患している疑いのある対象由来の試料を、ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＣＲＩＰ２、ＡＤＲＭ１、ＦＡＭ１２０Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＰＥＦ１、ＡＤＡＲ、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１および２、ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２；ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、ＥＨＤ１およびＰＡＬＬＤまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の遺伝子発現の変化の存在について試験またはアッセイすることを含む。より具体的な実施形態では、ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＣＲＩＰ２、ＡＤＲＭ１、ＦＡＭ１２０Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＰＥＦ１、ＡＤＡＲ、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１および２、ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２；ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、およびＥＨＤ１、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現減少、および／またはＰＡＬＬＤの発現増加は、ＰＤ、特に家族性ＰＤを示している。いくつかの好ましい実施形態では、試験またはアッセイされる試料は、線維芽細胞を含む。本方法は、当技術分野で利用可能な任意の適切な技術を使用することにより実施することができ、これらには、上述した技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
シグネチャが使用される臨床診断の現場では、より少ない数の機能が、より多くの機能を持つシグネチャよりも有利になる可能性がある。したがって、本発明者らは、孤発性およびＧ２０１９Ｓ  ＰＤのシグネチャにおける疾患定義特徴の数を減らすために、機械学習を適用した。孤発性ＰＤのパネル内の特徴の数を３９から３２に減らすことによって、９３％の予測精度を得た。このシグネチャを図１６に示す。以下のタンパク質（遺伝子名によって記載される）ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＳＮＸ２、ＲＲＳ１、ＤＢＩ、ＡＯＡ１ＢＯＧＶＧ８、ＬＩＭＡ１、ＥＲＬＥＣ１、ＴＳＮＬ１、ＴＦＲＣ、ＪＡＧＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＣＨＭＢＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＣＥＲＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡ、ＧＮＬ３、ＷＤＲ３６、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７Ａ、ＲＰＬ２７、ＴＲＩＭ２５、ＡＳＮＳおよびＣＳＥ１Ｌのレベルの減少は、孤発性ＰＤを診断するための手段として全体的な翻訳の減少を実証するために使用することができ、ＮＲＡＳ、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、ＰＰＩＣまたはＢＡＧ３のレベルの増加は、予測力に寄与する。
【００３０】
したがって、いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、ＰＤを診断およびモニタリングする方法を提供し、上記方法は、ＰＤに罹患している疑いのある対象由来の試料を、ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＳＮＸ２、ＲＲＳ１、ＤＢＩ、ＡＯＡ１ＢＯＧＶＧ８、ＬＩＭＡ１、ＥＲＬＥＣ１、ＴＳＮＬ１、ＴＦＲＣ、ＪＡＧＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＣＨＭＢＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＣＥＲＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡ、ＧＮＬ３、ＷＤＲ３６、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７Ａ、ＲＰＬ２７、ＴＲＩＭ２５、ＡＳＮＳ、ＣＳＥ１Ｌ、ＮＲＡＳ、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、ＰＰＩＣまたはＢＡＧ３、あるいはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の遺伝子発現の変化の存在について試験またはアッセイすることを含む。より具体的な実施形態では、ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＳＮＸ２、ＲＲＳ１、ＤＢＩ、ＡＯＡ１ＢＯＧＶＧ８、ＬＩＭＡ１、ＥＲＬＥＣ１、ＴＳＮＬ１、ＴＦＲＣ、ＪＡＧＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＣＨＭＢＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＣＥＲＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡ、ＧＮＬ３、ＷＤＲ３６、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７Ａ、ＲＰＬ２７、ＴＲＩＭ２５、ＡＳＮＳおよびＣＳＥ１Ｌ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現減少、および／またはＮＲＡＳ、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、ＰＰＩＣおよびＢＡＧ３、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現増加は、ＰＤ、特に孤発性ＰＤを示している。いくつかの好ましい実施形態では、試験またはアッセイされる試料は、線維芽細胞を含む。
【００３１】
次に、２倍の変化（対照と比較して増加または減少）の閾値カットオフを課し、モデルのさらなるトレーニングを行い、特徴の数を１４に減らした。このシグネチャは、孤発性ＰＤにおいて強度が増加したＲＲＳ１、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣおよびＮＲＡＳならびに対照と比較して強度が減少したＳＮＸ２、ＴＦＲＣ、ＬＩＭＡ１、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１ＬおよびＲＰＬ２７を含み、孤発性ＰＤを健常個人と区別するための９８％の予測精度を有する（図１７）。孤発性予測には、タンパク質シグネチャの総当たり一対比較を使用した。得られたペアのシグネチャは、８８％の予測精度でＳＮＸ２とＬＩＭＡ１であった。ＳＮＸ２レベルの減少は、孤発性ＰＤを健常対照と単独で区別することができるタンパク質であった。したがって、図１７および図１８のシグネチャ（強度レベルが対照と２倍を超えて異なる場合）またはＳＮＸ２レベルの減少単独は、孤発性ＰＤの診断方法として全体的な翻訳の減少を定義することができる。
【００３２】
したがって、いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、ＰＤを診断およびモニタリングする方法を提供し、上記方法は、ＰＤに罹患している疑いのある対象由来の試料を、ＲＲＳ１、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣ、ＮＲＡＳ、ＳＮＸ２、ＴＦＲＣ、ＬＩＭＡ１、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１ＬおよびＲＰＬ２７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の遺伝子発現の変化の存在について試験またはアッセイすることを含む。いくつかのより具体的な実施形態では、ＳＮＸ２、ＴＦＲＣ、ＬＩＭＡ１、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１ＬおよびＲＰＬ２７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現減少、および／またはＲＲＳ１、ＲＡＳＡ１、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣおよびＮＲＡＳ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現増加は、ＰＤ、特に孤発性ＰＤを示している。好ましくは、本方法は、ＳＮＸ２およびＬＩＭＡ１レベルの減少、またはさらにＳＮＸ２レベルの減少のみに基づくことができる。いくつかの好ましい実施形態では、試験またはアッセイされる試料は、線維芽細胞を含む。
【００３３】
次に、Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤのシグネチャ読み出しの特徴の数を減らすためにモデルトレーニングを使用した。対照と比較して２倍変化したタンパク質のみを含めた。これにより、１６種の特徴および９８％の予測精度を有するシグネチャが得られた（図１９）。これには、対照と比較して強度が減少したタンパク質ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ１、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＦＡＭ１２０Ａ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＤＡＲ、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮＥ１、ＴＭＥＭ２０８および強度が増加した１種のタンパク質ＣＲＩＰ２が含まれた。本発明者らは、Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤについて疾患を規定するタンパク質の最良の対を見出すために、総当たり一対比較を使用した。これにより、９８％の予測精度を有する最良のペアとしてＦＡＭ１２０ＡおよびＡＤＡＲが同定された。
【００３４】
したがって、いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、ＰＤを診断およびモニタリングする方法を提供し、上記方法は、ＰＤに罹患している疑いのある対象由来の試料を、ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ１、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＦＡＭ１２０Ａ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＤＡＲ、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮＥ１、ＴＭＥＭ２０８およびＣＲＩＰ２、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の遺伝子発現の変化の存在について試験またはアッセイすることを含む。いくつかのより具体的な実施形態では、ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ１、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＦＡＭ１２０Ａ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＤＡＲ、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮＥ１、およびＴＭＥＭ２０８、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１種または複数の遺伝子の発現減少、および／またはＣＲＩＰ２の発現増加は、ＰＤ、特にＧ２０１９Ｓ  ＰＤを示している。好ましくは、本方法は、ＦＡＭ１２０ＡおよびＡＤＡＲレベルの減少に基づくことができる。いくつかの好ましい実施形態では、試験またはアッセイされる試料は、線維芽細胞を含む。
【００３５】
図１４および１５のシグネチャは、孤発性（図１４）およびＧ２０１９Ｓ（図１５）ＰＤにおいて有意に変化した翻訳（上で定義された通り）のタンパク質強度変化を列挙する。図１６、１７および１８のシグネチャは、その強度が孤発性ＰＤを定義するタンパク質を列挙する。図１９および２０のシグネチャは、その強度がＧ２０１９Ｓ  ＰＤを定義するタンパク質を列挙する。将来的には、これらのシグネチャは、新しい対照試料を必要とせずに、患者試料を診断するために同じモデル内で適用することができる。対照レベルは、モデルによって既に設定されている。あるいは、これらのシグネチャは、新しい患者または対照試料が利用可能である際に、予測がさらに改善されるように、さらにトレーニングすることができる。本発明者らは、試料を２つのサブグループに分割することによって、線形回帰モデルを試験し；このサブグループは、確定的に診断されたＰＤ（ＤＡＴ結合不全）症例と健常対照のみからなるトレーニングセットおよびトレーニングされたモデルが試験される群である。結果は、高水準の神経学的診断に準拠していた。これは、現在の状態で、３つの独立したサイト（米国、フィンランドおよびイタリア）からのデータを学習したモデルが、ＰＤ患者の診断を支援するための貴重な試験を提供することを示している。
【００３６】
例１０〜１４に記載のシグネチャを、デノボ翻訳タンパク質の測定に基づいて同定した。しかし、それらの使用は、そのような試料の分析に限定されない。これらのシグネチャは、粗細胞溶解物、組織生検または体液からの測定にも同様に使用できる。明らかに、ＰＤにおいて全体的な翻訳が減少した場合、（上記のように）粗試料からの単純な測定値はまた、翻訳の減少を示す。そのような実施形態では、ＳＲＭ、ＰＲＭ、ＭＲＭ、ＤＤＡまたはＤＩＡなどの質量分析アッセイが適切である。これらの方法または抗体法を用いて、これらのシグネチャを検出することができ、またはこれらのリストからのタンパク質の新たな組み合わせを検出して、新しいシグネチャを生成することができ、またはこれらのリストからの単一タンパク質を使用して、ＰＤの読み出しとしての全体的な翻訳の減少を定義することができる。
【００３７】
本明細書の例（１０〜１４）は、孤発性およびＧ２０１９Ｓ  ＰＤが、新たに翻訳されたタンパク質の別個のシグネチャによって特徴付けられ得ることを実証する。ＰＤは異質性疾患であるため、これはこれら２つの患者群の根本的な病態メカニズムの違いを表すことができる。これらのプロファイルを用いて、孤発性ＰＤをＧ２０１９Ｓ  ＰＤと区別することができる。この方法では、これらのシグネチャを用いて、疾患のモニタリングまたはカスタム治療の定義に関して患者を層別化することができる。これらのシグネチャはまた、ＰＤのサブタイプを定義するのにも役立つ。この例として、階層的クラスタリングは、患者群内のいくつかのさらなる層別化を明らかにする（図１４〜２０）。
【００３８】
ＰＤの指標として全体的な翻訳の減少を測定することは、例１〜８に示すように、疾患過程自体に基本メカニズムを有する診断試験である。これは、「連座の誤謬」の論理に依存するバイオマーカーアッセイとは対照的である。ＰＤベースのバイオマーカーアッセイは、遺伝子スクリーニングに基づいて提案されることが多い。しかし、ＰＤの遺伝型は症例のごくわずかな割合（約５％）しか占めていないため、臨床の現場では、ＰＤの家族歴が知られていない限り、ＰＤの遺伝子検査は診断プロセスの一部ではない４。したがって、例えば、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ変異についてスクリーニングすることによるＰＤの診断は、ＰＤの家族歴を有する症状のある患者における診断を補助するために有用であることのみが示されている７。全体的な翻訳の減少に基づく本発明者らの読み出しは、例により示されるように、患者のこのサブグループに制限されない。それは、孤発性ＰＤ症例とＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ症例の両方の疾患を定義するためにうまく機能する。興味深いことに、この読み出しの徴候、すなわち図１６〜１０のシグネチャは、これらの患者群が分子的に異なる翻訳プロファイルを有することを示している。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ＰＤを示す」という用語は、全体的な翻訳の減少に適用される場合、信頼水準を最小９５％に設定する通常の統計的方法を用いて、検出された翻訳レベルが、ＰＤまたは他の段階のＰＤを有さない対象よりも、ＰＤまたはある段階のＰＤを有する対象おいて有意に頻繁に見出されるように、ＰＤまたはある段階のＰＤの診断である翻訳レベルを意味する。好ましくは、ＰＤを示す翻訳レベルは、疾患を有する対象の少なくとも８０％に見られ、疾患を有さない対象の１０％未満に見られる。より好ましくは、ＰＤを示す翻訳レベルは、疾患を有する対象の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれ以上に見られ、疾患を有さない対象の１０％未満、８％未満、５％未満、２．５％未満、または１％未満に見られる。
【００４０】
したがって、「全体的な翻訳の減少」という用語は、関連する対照試料と比較して、定量的に変化したタンパク質合成を意味することができる。いくつかの実施形態では、上記全体的な翻訳の減少は、翻訳障害を意味する。本明細書中で使用される場合、「翻訳」および「タンパク質合成」という用語は、交換可能である。あるいは、病状に固有の一連のシグネチャタンパク質またはペプチドを、全体的な翻訳の減少の定性分析に使用してもよい。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「翻訳障害」という用語は、関連する対照試料と比較して、試料中の翻訳レベルの減少または低下を意味する。それはまた、新規のタンパク質またはペプチドの産生を含むか、または代替の読み枠の使用を引き起こし得る。上記減少は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて決定され得る。試料中の翻訳レベルが、対照試料中の翻訳レベルよりも、例えば、少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍または３０倍低い場合、翻訳は減少する。いくつかの実施形態では、「翻訳障害」という用語は、関連する対照のレベルと比較して、翻訳レベルの統計的に有意な減少を意味する。好ましい実施形態では、線維芽細胞および血液試料、ならびに尿、唾液および脳脊髄液を含むがこれらに限定されない他の体液を用いて、翻訳障害を測定することができる。
【００４２】
翻訳の定量的評価は、細胞が合成するタンパク質の量の決定、または細胞内の翻訳レベルの決定を意味し、それは、細胞によって合成されるタンパク質の総量、または診断シグネチャとして定義することができるものなどのその任意の適切なサブフラクションに関し得る。「レベル」および「量」という用語は、絶対量または相対量を意味することができる。
【００４３】
生物学的試料中の翻訳レベルは、当業者には容易に明らかであるように、種々の技術によって決定され得る。例えば、代謝標識は、生細胞の内因性合成および修飾機構によって分子をデノボ合成タンパク質に組み込むために使用され得る。これは、典型的には、その放射性崩壊（例えば、Ｓ３５−メチオニン）により直接検出されるか、またはタグへの共有結合により検出され得るアミノ酸の存在下で細胞を培養することにより行われる。そのような目的のための適切な標識の非限定的な例には、顕微鏡法または分光法などの定量的蛍光検出法および他のバイオ共役技術のためのＡｌｅｘａ色素などの蛍光標識（例えば図３、４、６、７、８、９、１０、１１）が含まれる。
【００４４】
あるいは、クリックケミストリーを用いて、細胞内の全体的な翻訳の減少の有無を決定することができる。いくつかの実施形態では、クリックケミストリーは、Ｌ−アジド−ホモアラニン（ＡＨＡ）またはホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）などのアジドまたはアルキレンを有するメチオニン類似体の生合成的取り込みに基づいてもよい。得られたアジド−またはアルキレン−標識タンパク質は、蛍光検出用の試薬を用いた銅−Ｉ−触媒アルキン−アジド環状付加（ＣｕＡＡＣ）（例えば、図３、４、６、７、８、９、１０、１１）によって、またはアルキン−アガロースを用いたアフィニティー精製および質量分析法による同定（例えば、図１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）によって、あるいはアルキン−ビオチン−ニュートラアビジン−セファロース共役の使用および抗ビオチン抗体または質量分析法を用いた検出（例えば図１２）によって検出することができる。組み込まれたＡＨＡの可視化はまた、例えばＦＵＮＣＡＴ（蛍光非古典的アミノ酸標識付け）と呼ばれるアプローチを使用した従来の蛍光顕微鏡検査により行うことができる。
【００４５】
さらに、抗体は、異常に翻訳されたタンパク質を同定するために利用され得るか、あるいは翻訳開始の阻害剤（例えばハリングトニン）またはトランスロケーションの阻害剤（例えばシクロヘキシミド）の使用は、対象の新生タンパク質のＮ末端ペプチドを濃縮するために用いられ得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、全体的な翻訳の減少はまた、代替のオープンリーディングフレームの使用または翻訳後修飾の変化から生じる全体的な翻訳の減少を示すシグネチャ分子、あるいは翻訳ブロックの正確なメカニズムが未知の場合でさえ、全体的な翻訳の減少を示すシグネチャに基づいて定性的に決定することができる。シグネチャを測定するための適切な方法は、疾患に関連する診断または予測情報を提供する翻訳生成物の質量分析選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または並行反応モニタリング（ＰＲＭ）アッセイ（ならびにＤＤＡショットガンまたはＤＩＡアプローチ）を含むことができる。さらに、全体的な翻訳の減少を検出するための抗体ベースの方法、例えばＥＬＩＳＡを使用して、全体的な翻訳の減少から生じ、病状の特徴または予測である「シグネチャ」を指定する単一のタンパク質またはタンパク質群を測定することができる。
【００４７】
翻訳レベルが疾患を示しているかどうかを決定するために、関連する対照における翻訳レベルを決定しなければならない。一旦対照レベルが分かると、決定された翻訳レベルをそれと比較することができ、標準的な統計的方法を用いて差異の有意性を評価することができる。本開示のいくつかの実施形態では、決定された翻訳レベルと対照レベルとの間の統計的有意差は、ＰＤを示す。いくつかのさらなる実施形態では、対照と比較する前に、標準的な方法を用いて翻訳レベルを基準化する。
【００４８】
新規タンパク質アイソフォームの産生の場合、本方法は対照試料を参照せずに使用することができる。想定される検出方法には、質量分析、ＥＬＩＳＡ型抗体認識による検出、または固有の翻訳産物の酵素活性の測定による検出が挙げられる。
【００４９】
同様に、所与の分子シグネチャが疾患を示しているかどうかを決定するためには、関連する対照における対応するシグネチャを決定しなければならない。一旦対照シグネチャが分かると、決定されたシグネチャをそれと比較することができる。上記シグネチャ間の違いは、疾患を示し得る。しかし、固有のシグネチャはまた、非比較的または絶対的な方法で、すなわち、対照シグネチャと比較しなくても、全体的な翻訳の減少の指標として使用され得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「対照」という用語は、見かけ上の健常個人または見かけ上の健常個人のプールから得られた対照試料を意味することができ、あるいはＰＤの有無を示す所定の閾値または分子シグネチャを意味することができる。適切な閾値を決定するための統計的方法は、当業者には容易に明らかであろう。対照または閾値、ならびに対照シグネチャは、必要に応じて、同年齢の対象の試料、人口統計学的特徴、および／または疾患状態などから決定されてもよい。対照または閾値、あるいは対照シグネチャは、ＰＤに罹患していない単一の個人に由来してもよく、またはそのような複数の個人からプールされた値であってもよい。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「見かけ上の健常」という用語は、ＰＤの徴候を示さず、したがってＰＤに罹患していないと考えられるおよび／またはＰＤを発症しないと予測される個人または個人のプールを意味する。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを意味する。問題の実施形態に応じて、上記対象は、診断の有無にかかわらずＰＤに罹患している、ＰＤに罹患していると疑われる、ＰＤのリスクがある、または既にＰＤの治療を受けている可能性がある。本明細書では、「ヒト対象」、「患者」および「個人」という用語は、交換可能である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「試料」という用語は、生物学的試料、典型的には、対象から得た、例えば、皮膚試料などの組織試料、皮膚細胞試料（例えば、皮膚線維芽細胞試料）などの細胞試料、あるいは皮膚穿孔または皮膚剃毛、あるいは尿、血液、血漿または血清などの体液の試料であり得る臨床試料を意味する。一般に、分析される試料を対象から得ることは、本発明の方法の一部ではなく、したがって、インビトロ法と見なすことができる。好ましい試料には、皮膚生検または生検そのものからの線維芽細胞、あるいは血液試料由来の末梢血単核細胞からの線維芽細胞または血液から単離されたエキソソームからの線維芽細胞が挙げられる。結果として、本発明の方法は、最小の侵襲様式で行われ得る。
【００５４】
本発明は様々な方法で行うことができる。第一に、全体的な翻訳の減少をＰＤの診断に使用することができる。本明細書中で使用される場合、「診断」という用語は、対象がＰＤに罹患しているか否かを決定することを目的とするプロセスを意味するが、これらに限定されない。これはまた、ＰＤの存在またはＰＤの段階が最終的に決定されないが、さらなる診断試験が保証される事例を含むことを意味する。そのような実施形態では、本方法は、それ自体では対象におけるＰＤの有無、またはＰＤの段階を決定するものではないが、さらなる診断試験が必要であるかまたは有益であることを示すことができる。したがって、本方法は、対象におけるＰＤの有無、またはＰＤの段階の最終決定のための１種または複数の他の診断方法と組み合わせることができる。そのような他の診断方法は、当業者にはよく知られており、［１２５Ｉ］ＦＰ−ＣＩＴおよび質量分析を用いた陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）スキャンなどの神経学的検査および脳スキャンが挙げられるが、これらに限定されない。質量分析は、タンパク質または一連のタンパク質（または消化によって産生されるそれらのペプチド産物）の絶対的または相対的発現レベルの変化を検出するために使用され得る。これは、タンパク質の選択的スプライシングの変化、それらの翻訳後修飾、または翻訳後修飾自体の構造の変化（例えば、Ｏ−またはＮ−結合型グリコシル化ペプチドのグリカン構造の変化）を含むと解釈されるべきである。
【００５５】
重要なことに、本発明は、好ましくは前駆期に、またはドーパミン作動性ニューロンのいかなる有意な損失の前に、ＰＤの早期検出または診断を可能にする。ＰＤの早期診断は早期治療を可能にし、したがって進行を遅らせる可能性がある。さらに、早期診断により、対象は、進行を遅らせることまたは症状を軽減することを目的とした適切な措置を講じることが可能になる。そのような措置の非限定的な例には、健康的な食事療法および身体運動が含まれる。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「前駆」という用語は、うつ、睡眠障害および便秘（腸管障害）などの症状がある疾患発症の初期段階を意味する。このような症状は、ＰＤを定義するものではない。前駆期の症状は、運動症状、すなわちまだ疾患を定義するものではない古典的なＰＤ症状に先行する。本発明の好ましい実施形態では、ＰＤは、前駆期、または運動症状の発症後であるが古典的なＰＤ診断の前に診断される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＤのサブグループを定義するために、すなわち対象をＰＤサブグループに層別化するために使用され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、生物学的試料は、治療前、治療中、または治療後の様々な時点で対象から取得することができる。次いで、生物学的試料中の翻訳レベルを決定し、異なる時点で同じ対象から得た生物学的試料中の翻訳レベルと比較するか、または例えばＰＤ状態が吉であり、および／または上記治療にさらされていない個人由来の基準試料から得られた対照レベルと比較する。いくつかの実施形態では、見かけ上の健常個人のプールから得られた所定の基準値を、上記比較における対照レベルとして使用することができる。
【００５９】
したがって、本発明は、診断目的だけでなくＰＤのモニタリングにも使用することができる。本明細書中で使用される場合、「モニタリング」という用語は、対象の病状またはＰＤの進行を経時的にモニタリングすること、ならびに疾患の可能性のある寛解または再発、あるいは治療に対する反応をモニタリングすることを含む。上記モニタリングは、翻訳レベルを連続的に評価すること、および／または医学的試験を繰り返し実施することによって行われ得る。本発明のいくつかの実施形態では、対象の病状は、試料を繰り返し取得し、全体的な翻訳の減少について試料をアッセイし、アッセイの結果を互いにおよび基準値と比較することによってモニタリングされ、対象の病状の変化を同定する。本発明のこれらの態様のいずれかは、神経学的検査および脳スキャンを含むがこれらに限定されない他の診断試験と組み合わせて使用することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、現在知られている、または将来の予防および／または治療計画を、本方法によってＰＤと診断された対象に処方および／または施すことができる。したがって、ＰＤを有する対象、またはＰＤの危険性が高い対象を同定し、次いで、上記対象に予防的または治療的計画を処方するための方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態は、対象におけるＰＤのリスクを低減する方法またはＰＤを治療する方法に関し得る。いくつかのさらなる実施形態では、そのような方法は臨床試験の状況で行うことができる。
【００６１】
したがって、本発明はまた、臨床研究のために参加者を層別化するために使用され得る。初期段階の患者の治療に最も効果的なＰｒｏＳａｖｉｎ（ＯＸＢ１０１）と呼ばれるオックスフォード・バイオメディカの遺伝子治療を使用するか、病状が進行した患者を対象としたより高用量の薬物であるＯＸＢ１０２を使用するかを選択できる。
【００６２】
さらに、本発明は、細胞内の正常な翻訳を回復するのに適した薬物を同定するための薬物スクリーニングにおいて利用することができる。例えば、化合物ライブラリーは、当該分野で公知の任意の標準的な技術によって、ＰＤを有する対象から得られた皮膚線維芽細胞の培養物などの全体的な翻訳の減少を示す細胞培養物上に候補化合物を適用し、翻訳レベルにおける変化について化合物を分析することによって、全体的な翻訳の減少のモジュレーターについてスクリーニングすることができる。薬理学的手段による基準化翻訳または全体的な翻訳の減少の軽減は、ＰＤを予防、治癒、改善または軽減すると予想される。
【００６３】
本発明はまた、対象におけるＰＤを診断またはモニタリングするのに使用するためのキットを提供する。上記キットは、本明細書に開示されるように、タンパク質翻訳を評価するために必要な任意の試薬または試験剤を含み得る。当業者は、問題の実施形態の詳細および上記評価を行うための所望の技術に応じて含まれるべき試薬を容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、適切な対照試料または閾値がキットに含まれ得る。キットはまた、本開示の方法のうちのいずれかを行うためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含み得る。
【００６４】
当業者に明らかなように、開示された方法の任意の実施形態、詳細、利点などは、上記方法で使用するためのキットを含む本発明の他の態様に適宜適用され、その逆も同様である。
【００６５】
技術が進歩するにつれて、本発明の概念が様々な方法で実施され得ることは当業者には明らかであろう。本発明およびその実施形態は、上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変更することができる。
【００６６】
実験部分
すべての患者試料は、トゥルク大学およびＮＩＮＤＳリポジトリ（米国）から、倫理的ガイドラインに従って適切な許可およびインフォームドコンセントを得て入手した。
【００６７】
すべての動物実験は、フィンランドの動物実験委員会によって確立された動物の世話および使用における倫理的行動のためのガイドラインに従って適切な許可を得て行われた（Ｅｌａｉｎｋｏｅｌａｕｔａｋｕｎｔａ、許可、決定＃１８９７）。
【００６８】
例１。ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ基質はリボソームが豊富である。
【００６９】
目的。脳内のＬＲＲＫ２の機能はほとんど知られていないままであるが、ＬＲＲＫ２はミトコンドリアや他の小胞構造に局在することが示されている８。本発明者らの予備的知見は、ＬＲＲＫ２がリボソームと共に機能することを示唆した。したがって、本発明者らは、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ基質がミトコンドリアまたはリボソームで濃縮しているかどうかを決定することに着手した。本発明者らは、潜在的な基質の供給源として精製オルガネラ、およびＰＤに関連するＬＲＲＫ２の活性変異体としてＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓを用いてインビトロキナーゼアッセイを行った。
【００７０】
方法。ミトコンドリア画分およびリボソーム画分を、修飾を伴って以前に記載されているように９、１０、ラット脳から単離した。１４日齢のラット脳を、プロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍｌロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニンおよび１００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）を添加した１２ｍｌホモジナイズ緩衝液（３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。溶解物を２０分間氷上に保った。次いで、未破壊細胞および核を、４℃でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ遠心分離機で１０分間、２８００ｘｇａｖｇで遠心分離することにより除去した。ＳＷ４１ＴｉローターおよびＢｅｃｋｍａｎ  Ｌ９０Ｋ超遠心機を使用して、上清１（Ｓ１）を４℃で１０分間、２２，０００ｘｇａｖｇで遠心分離した。これにより、ミトコンドリアペレット２（Ｐ２）を得た。残りの上清２（Ｓ２）を４℃で８時間、１００，０００ｘｇａｖｇで遠心分離して、リボソームおよび上清３（Ｓ３）を含むペレット３（Ｐ３）を得た。
【００７１】
リボソームおよびミトコンドリアにおけるＬＲＲＫ２基質の相対的濃縮度を比較するために、以下のように画分のインビトロリン酸化を行った−Ｐ７ラット脳からのＰ２ミトコンドリア画分およびＰ３リボソーム画分を、等容量（３００〜４００μｌ）のプロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍｌロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニンおよび１００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）およびを１％  ＩＧＥＰＡＬ添加した溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭベンザミジン）に再懸濁した。氷上で５分後、溶解物を２７Ｇシリンジを用いて８ストロークでホモジナイズし、次いで４℃で１６，０００×ｇで遠心分離した。タンパク質から内因性リン酸を除去するために、上清に０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２．５  Ｕの南極ホスファターゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を添加し、３７℃で２時間インキュベートして、共有結合したリン酸を除去した。次いでホスファターゼを６５℃で１０分間不活性化した。溶解物を、バイオ・ラッド社からのマイクロバイオスピンカラム（カタログ番号７３２−６２２３）を用いて脱塩した。ＬＲＲＫ２基質を可視化するために、インビトロキナーゼアッセイを行った。キナーゼ反応は、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）および０．０．９μｇ／１００μｌ（４４．１２ｎＭ）のＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ（インビトロジェン社、カタログ番号ＰＶ４８８１）を添加することによって開始した。５μＣｉのγ−［３２Ｐ］ＡＴＰを反応に含めて、リン酸取り込みの効率をモニターした。ＬＲＫＫ２反応物を３０℃で１時間インキュベートし、そしてＬａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加することにより停止させた。放射標識ＡＴＰとの反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシー染色によって分離し、リン酸取り込みをオートラジオグラフィーによって可視化した（図１上パネル）。放射性ＡＴＰを含まないリン酸化反応を並行して調製した。これらの非放射性試料を、潜在的なＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ基質を同定するためにＴｉＯ２濃縮、続いてＭＳ／ＭＳ検出（下記に記載）に供した。
【００７２】
質量分析を用いたＬＲＲＫ２基質の同定。２００μｇのＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓリン酸化タンパク質（上記）を１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで染色し、脱色し、１０片にスライスした。次いで、試料を還元し、アルキル化し、ＡＣＮで脱水した後、５０ｍＭ  ＡＭＢＩＣ中の１２．５μｇ／ｍｌ  ＭＳグレードトリプシンを添加し、３７℃で一晩消化を行った。ペプチドを溶出し、乾燥させ、０．１％ギ酸に溶解させた。次いで、試料を、８００ｒｐｍでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中で３０分間、ＴｉＯ２ビーズと共にインキュベートした。濃縮したホスホペプチドを溶出し、乾燥させ、０．１％ギ酸中に再懸濁し、そしてＥｋｓｉｇｅｎｔ  ｎａｎｏ−ＬＣ  ２Ｄシステムを用いて分離した。８μｌの試料を、プレカラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  １００、Ｃ１８、３μｍ粒径）に充填し、一定流速の５μｌ／分の溶媒Ａ（水中０．１％ＦＡ）で１５分間洗浄し、１０μｍの融合シリカエミッタ、７５μｍ×１６ｃｍピコティップエミッタ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社で分離し、Ｃ１８レプロシル・ピュールを内部充填し、３００ｎｌ／分での３％〜９０％溶媒Ｂ（８０％ＡＣＮ）の７８分勾配を用いて分離した。ＨＰＬＣシステムを、データ依存型取得モードで動作するＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計に連結した。スプレー電圧を１．９０ｋＶに設定し、加熱されたキャピラリーの温度は２００℃に設定した。Ｏｒｂｉｔｒａｐによって行われたサーベイスキャンからの最も強い１０イオンは、ＬＴＱ（基準化衝突エネルギー３５、親質量選択ウィンドウ０．５Ｄａ、３０ｍｓ活性化時間および１００に設定したＭＳ／ＭＳスキャンセットの最小シグナル閾値）における衝突誘起解離によって断片化された。動的排除リストは、最大保持時間ウィンドウ２分および相対質量ウィンドウ１０ｐｐｍの最大５００質量に制限された。１％のＦＤＲをペプチドレベルで使用し、ホスホ部位を手動およびＭａｓｃｏｔ確率（カットオフ９０％）の両方を使用して確認した。
【００７３】
結果。結果は、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓキナーゼが、リボソーム画分中のタンパク質に対して優先的な活性を示すのに対して、ミトコンドリア画分中のタンパク質は、リン酸化が不十分であることを同定した（両方の画分は総タンパク質量に対して基準化された）。これは、ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓがリボソームタンパク質を直接修飾することを示していた。次いで、ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、本発明者らは、Ｇ２０１９Ｓ−ＬＲＲＫ２によってリン酸化されたタンパク質を同定し、そのうちのいくつかを示す（図１）。これらには、とりわけ、４０Ｓリボソームタンパク質Ｒｐｓ６、ＲｐＳ３およびＲｐＳ２、ならびに真核生物開始因子ｅＩＦ２Ｂ５、Ｅｉｆ４ｇ３およびＥｉＦ３ｂが含まれた。本発明者らは、組換えタンパク質のインビトロリン酸化によってＲｐＳ２をさらに検証し、報告された基質Ｍ２Ｋ７よりも高い比活性でＧ２０１９Ｓ−ＬＲＲＫ２によってリン酸化されていることを見出した（図示せず）。本発明者らは、内因性ＬＲＲＫ２の７０％がＰ３リボソーム画分と共精製されたのに対し、Ｐ２ミトコンドリア画分とは２０％が共精製されたことを見出した（図示せず）。
【００７４】
結論。まとめると、これらの知見は、ＬＲＲＫ２とリボソームとの際立った関連性を強調し、ＰＤの試験としてホスホ抗体またはＳＲＭアッセイを使用して検出され得るＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓに対するいくつかの潜在的基質を同定した。
【００７５】
例２。タンパク質翻訳は、ロテノンへの曝露後のニューロンにおいて損なわれ、ＬＲＲＫ２活性は増加する。
【００７６】
ＰＤの根本的な分子メカニズムを理解するには、疾患の特徴を確実に再現する細胞および動物モデルの使用が必要である。ロテノンはそのようなモデルである。ロテノンは、げっ歯類でＰＤの解剖学的および行動的特徴を引き起こす天然の殺虫剤であるが４、５、ヒトでは、ロテノンはＰＤを発症するリスクの増加に関連する環境因子の１つである６。
【００７７】
方法。様々なＳ３５−メチオニン標識を用いたタンパク質翻訳の測定−インビトロでＰＤをモデル化するために、海馬ニューロンをＳ３５−メチオニンで代謝的に標識した。２４ウェルプレート中の海馬ニューロンを、Ｍｅｔ／Ｃｙｓ不含培地（インビトロジェン社、Ｇｉｂｃｏ）に移した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間処理した。１ウェルあたり５００μｌの標識培地（１００μＣｉＭｅｔ−Ｓ３５／ｍｌ）を添加し、細胞をロテノン（０．０１〜１０μＭ）の存在下または非存在下で３７℃、５％ＣＯ２で２時間増殖させた。細胞を洗浄し、７５μｌのＬａｅｍｍｌｉ溶解緩衝液中で溶解させた。試料をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、ＥＮ３ＨＡＮＣＥ（ＮＥＮ）と共にインキュベートし、ゲルを乾燥させ、増感スクリーンを有するオートラジオグラフィーフィルムに露光して、相対的なデノボタンパク質合成レベルを決定した。
【００７８】
結果。Ｓ３５−メチオニン標識を用いて測定したところ、ロテノンによるニューロンの処理は、用量依存的にデノボタンパク質合成を減少させた（図２）。
【００７９】
結論。ｍＲＮＡの翻訳は、ＰＤにおいて損なわれ、根本的な病状に寄与し得る。
【００８０】
例３。ロテノンはＬＲＲＫ２を活性化する。
【００８１】
目的。本発明者らは、ラットにおいて、黒質−線条体ドーパミン作動性ニューロンの非常に特異的な変性、レビー小体形成およびＬ−ＤＯＰＡ行動障害を誘導する、ＰＤの神経病理学的特徴を再現するロテノンモデルにおいてＬＲＲＫ２が活性化されるかどうかを試験したいと考えた５、７。本発明者らはまた、タンパク質翻訳に対するＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓの効果を決定したいと考えた。
【００８２】
方法。ＬＲＲＫ２活性に対するロテノン処理の効果を調べるために、ＢＨＫ２１細胞を、示された用量のロテノンを用いてまたは用いないで４時間処理した。細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解させ、タンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した。ＬＲＲＫ２活性を、ホスホ−Ｓ９３５−ＬＲＲＫ２を検出する抗体を用いたイムノブロッティングにより決定した。負荷変動性を確立するために、ＬＲＲＫ２を検出する抗体でブロットを再プローブした。ＬＲＲＫ２活性を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲシステム（バイオ・ラッド社）を用いて、捕捉されたゲル曝露の濃度測定によって定量化した。
【００８３】
ＬＲＲＫ２活性の阻害がロテノン処理後のＢＨＫ２１細胞における正常な翻訳を回復させることができるかどうかを決定するために、ＬＲＲＫ２阻害剤（１または１０μＭのＩＮ１）での前処理（３０分）を伴うか、または伴わないＢＨＫ２１細胞を、示すように、ロテノンまたはキャリア（対照）で処理した。翻訳はＡＨＡ標識後に可視化され、免疫蛍光は上述のように定量化された。
【００８４】
ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓがタンパク質翻訳に直接影響を与えたかどうかを決定するために、本発明者らは、タカラバイオ社（日本）からの無細胞タンパク質発現システムを利用した。β−ガラクトシダーゼレポータープラスミド（１５０ｎｇ）を６０ｎＭのＧＳＴ−Ｇ２０１９Ｓ−ＬＲＲＫ２またはＧＳＴ単独と共に、５μｌの反応において３２℃で１．５時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼの量は、９６ウェルフォーマットを用いた二連の試料から比色検出を用いて推定した。２μｌの反応混合物ごとに、１００μｌのオルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）緩衝液（ＯＮＰＧ０．６６ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）を添加した。１５分後に停止溶液（１００ｍＭグリシン、ＮａＯＨ、ｐＨ１２．８）１００μｌ／ウェルを添加することによって反応を停止させた。４２０ｎｍでの吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１ハイブリッドリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ社）を用いて測定した。
【００８５】
結果。ロテノンは、無傷の細胞においてＬＲＲＫ２活性を用量依存的に増加させた（図３）。
【００８６】
例４。Ｌｒｒｋ２阻害は、ロテノン誘導性萎縮からドーパミン作動性ニューロンを保護する。
【００８７】
目的。ロテノンに反応したＬｒｒｋ２活性化がパーキンソン病の特徴である神経突起退縮を誘導するかどうかを確かめるために、本発明者らは、ロテノンに曝露された培養ドーパミン作動性ニューロンにおける神経突起萎縮の程度を測定した。
【００８８】
方法。細胞培養物のロテノン処理−Ｐ０ラットからの中脳ニューロンを、ウェル当たり２００，０００細胞の密度で播種した。インビトロで３日目に、細胞を、示した濃度で、ＩＮ１、ＧＳＫ−２５７８２１５ＡまたはＭＬｉ−２を含む、または含まないＤＭＳＯ中のロテノンで処理した。２４時間後、細胞をＰＢＳ中の４％ＰＦＡで固定し、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を、当業者に明らかな標準的な免疫染色法により検出した。細胞をＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡を用いて画像化した。萎縮を測定するために、無傷の神経突起を有するＴＨ陽性ニューロンの％を記録した。
【００８９】
結果。ロテノンは、ドーパミン作動性ニューロンの萎縮を誘導した。これは、３つすべてのＬｒｒｋ２阻害剤で治療することによって予防された。ロテノンの非存在下でのＬｒｒｋ２単独の阻害は、神経突起長を有意には変化させなかった。
【００９０】
結論。Ｌｒｒｋ２活性は、パーキンソン病の特徴であるドーパミン作動性ニューロン萎縮を促進する。
【００９１】
例５。構造的に独立した分子でＬＲＲＫ２を阻害すると、海馬ニューロンにおいてタンパク質翻訳が増加する。
【００９２】
目的。Ｌｒｒｋ２がニューロンのリボソーム機能を調節するかどうかを試験するために、本発明者らは、非標準アミノ酸標識を使用して、デノボタンパク質合成に対するＬｒｒｋ２の３つの構造的に独立した阻害剤の効果を測定した。以前に記載されたように８、メチオニン類似体であるＬ−アジド−ホモアラニン（ＡＨＡ）を用いてラット海馬ニューロンを標識し、続いてＡｌｅｘａ−４８８とアルキン部分との銅−Ｉ−触媒アルキン−アジド環状付加を行って、新たに合成されたタンパク質を可視化した。使用した阻害剤は、０．０１μＭの生化学的ＩＣ５０でＬｒｒｋ２をブロックするＬＲＲＫ２−ＩＮ１９、非常に特異的かつ強力なＬＲＲＫ２阻害剤であるＧＳＫ−２５７８２１５Ａ１０およびＬＲＲＫ２の選択的経口活性阻害剤である３−（４−ピリミミジル）インダゾール（ＭＬＩ−２）１１であった。
【００９３】
方法。ＦＵＮＣＡＴを用いた海馬ニューロンにおけるタンパク質翻訳の測定。タンパク質翻訳を測定するために、海馬ニューロンを、２４ウェルプレートの円形カバーガラス（直径１．３ｃｍ）上に、ウェルあたり１００，０００細胞の密度で播種した。播種してから２０時間後にタンパク質翻訳を測定した。細胞を１回洗浄し、２ｍＭグルタミンを添加したメチオニン不含ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と共にインキュベートした。次いで、１ｍＭ  Ｌ−アジドホモアラニン（ＡＨＡ）を３０分間添加した。細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＲＲＫ２阻害剤を使用する場合は、メチオニン不含培地に添加し、ＡＨＡ標識化手順全体を通して保持した。細胞をブロック溶液（ＰＢＳ中の０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．２％ＢＳＡ、５％スクロース、１０％ウマ血清）中で透過処理し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ  １ｍｌで５回洗浄した。ＡＨＡでのインサイチュ標識は、サーモフィッシャーライフテクノロジーズ社（カタログ番号Ａ１０２６７）の試薬を用いて、共有結合的にＡｌｅｘａ−４８８に対するｃｌｉｃｋ−ｉｔ反応を用いて達成された。カバーガラスを、２．５％１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンを含むＭｏｗｉｏｌにマウントした。蛍光画像は、ライカＤＭＲＥ顕微鏡および浜松ホトニクスＯＲＣＡ  Ｃ４７４２−９５  ＣＣＤカメラおよびＺｅｎソフトウェア（カールツァイス社）を使用して取得した。平均蛍光強度は、ペリソーム領域内の対象領域から測定した。樹状突起測定は、線強度（体細胞から樹状突起までの１０μｍ線）から行った。
【００９４】
結果。Ｌｒｒｋ２阻害剤（ＧＳＫ−２５７８２１５、ＬＲＲＫ２−ＩＮ１およびＭＬｉ−２）は、それぞれ０．１μＭ（ＧＳＫ−２５７８２１５およびＬＲＲＫ２−ＩＮ１）および０．０１μＭ（ＭＬｉ−２）程度の低い用量で処理した海馬ニューロンの海馬ニューロン神経体細胞（図５Ａａ〜ｂ、５Ｂａ、ｂ）および樹状突起（図５Ａｄ〜ｅ、５Ｂａ、ｃ）において測定したように、タンパク質合成を有意に増加させた。これは、基礎的なＬｒｒｋ２活性が、ニューロンにおけるタンパク質合成に対して抑制的効果を有することを示している。陰性対照として、本発明者らは、ペプチジルトランスフェラーゼのリボトキシン阻害剤であるアニソマイシンでニューロンを処理した。この処理は、このアッセイにおいてデノボタンパク質合成を効果的に阻害した（図５Ｂｃ、ｆ）。
【００９５】
結論。ＬＲＲＫ２は、海馬ニューロンにおいて新生タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を抑制する。
【００９６】
例６。構造的に独立した分子でＬＲＲＫ２を阻害すると、ドーパミン作動性ニューロンにおいてタンパク質翻訳が増加する。
【００９７】
目的。ＬＲＲＫ２阻害が中脳培養物、より具体的にはドーパミン作動性ニューロンにおけるタンパク質翻訳を変化させるかどうかを決定すること。
【００９８】
方法。ドーパミン作動性ニューロンにおけるタンパク質翻訳を測定するために、中脳培養物を、２４ウェルプレートの円形カバーガラス（直径１．３ｃｍ）上に、ウェル当たり５００，０００細胞の密度で播種した。播種後３日目に、ニューロンをＦＵＮＣＡＴに供した（例４参照）。ドーパミン作動性ニューロンを、チロシンヒドロキシラーゼ免疫蛍光により検出した。例４（方法）に記載のように蛍光強度を測定した。
【００９９】
結果。２つの構造的に独立した阻害剤を用いたＬＲＲＫ２の阻害は、ドーパミン作動性ニューロンにおけるタンパク質翻訳を増加させた（図５ｇ〜ｊ、図６ａ〜ｃ）。アニソマイシン（翻訳阻害剤）を陰性対照として添加した。蛍光を用いて決定されるように、翻訳を効果的に減少させた（図５ｋ、ｌ、図６ａ〜ｃ）。
【０１００】
結論。これらの知見は、構成的ＬＲＲＫ２活性が、ドーパミン作動性ニューロンにおけるタンパク質翻訳を抑制し、機能獲得型ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ変異体が、ＰＤの神経病理学に関連し得るという考えと一致することを示している。
【０１０１】
例７。患者の皮膚線維芽細胞における新生タンパク質合成の測定は、ＰＤの機能的読み出しを提供する。
【０１０２】
目的。Ｌｒｒｋ２は広範囲に発現しているタンパク質であるので、本発明者らは、ＰＤ患者からの末梢細胞（皮膚穿孔から得た）が翻訳障害を示すかどうかを試験したいと考えた。対照個人からの線維芽細胞および孤発性またはＧ２０１９Ｓ  ＰＤを有すると臨床的に診断された患者からの線維芽細胞は、国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ）リポジトリから入手した。
【０１０３】
方法。図７について、本発明者らは、例４に概説した非標準的標識アプローチを用いて、以下の変更を加えて、患者の皮膚生検から培養した線維芽細胞におけるｍＲＮＡ翻訳を測定した。線維芽細胞を９５％コンフルエントに達した際に継代し、継代数７〜９でアッセイした。新生タンパク質合成の測定のために、播種後４８時間の線維芽細胞は、メチオニンを枯渇させ、ＡＨＡと共にインキュベートし、続いて例４の方法の項に記載したようにＡｌｅｘａ−４８８のＡＨＡ−クリック共役を行った。平均体細胞蛍光強度を測定した。すべての線維芽細胞株を同時にアッセイすることができなかったので、同等の継代数の１種または複数の対照株と患者株を対にし、同じ日にアッセイした。図８について、本発明者らは、１μＭ  ＬＲＲＫ２阻害剤−１（ＩＮ１）または０．０１μＭ  ＭＬｉ−２で処理すると、患者細胞で観察されたタンパク質合成の減少が逆転し得るかどうかを試験した。
【０１０４】
結果。ＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓキャリアおよび孤発性症例由来の皮膚線維芽細胞では、翻訳は抑制された（図７）。タンパク質合成のこの抑制は、構造的に独立したＬＲＲＫ２阻害剤ＩＮ１またはＭＬｉ−２によるＬＲＲＫ２活性の阻害によって逆転した（図８）。
【０１０５】
結論。これらの結果は、ＬＲＲＫ２がＧ２０１９Ｓキャリアおよび孤発性ＰＤ患者からの末梢細胞におけるタンパク質合成を同様に抑制することを示している。この知見は、ｍＲＮＡ翻訳を負に調節するＰＤ関連ＥＩＦ４Ｇ１変異と一致している１１。これらのデータは、リボソーム機能のＬＲＲＫ２抑制が、家族性および孤発性ＰＤに存在する収束メカニズムを提供することを示している。
【０１０６】
例８。タンパク質合成は、初期段階の可能性が高いＰＤ患者では減少している。
【０１０７】
目的。ＰＤの初期段階で「全体的な翻訳の減少」が観察されるかどうかを試験する。
【０１０８】
方法。本発明者らは、トゥルク大学病院（Ｔ．Ｕ．Ｈ）でパーキンソン病の可能性が高い患者の上腕から皮膚穿孔を採取した。同年齢の対照（配偶者または兄弟姉妹）からの皮膚穿孔も同時に採取した。これらの患者の大部分は、生検時にＤＡＴ結合異常について、［１２３Ｉ］−ＦＰ−ＣＩＴ−ＳＰＥＣＴイメージングで診断されていなかった。皮膚穿孔を最少必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に直接播種し、抽出後１時間以内に分析した。皮下組織層から脂肪組織を除去し、残りの真皮層および表皮層を２ｍｍの小片に細断し、次いで、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＭＥＭ中に、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。線維芽細胞は、播種の数日以内にこれらの外植片から増殖した。
【０１０９】
結果。ＮＩＮＤコホート（例６）と比較して、ＰＤの初期段階の患者（５２〜６９歳）由来の線維芽細胞は、対照個人と比較して有意に減少したタンパク質合成を示した（図９）。以前と同様に、ＡＨＡ標識および蛍光検出を用いてｍＲＮＡ翻訳を測定した（例７）。Ｔ．Ｕ．Ｈ．およびＮＩＮＤＳコホートを組み合わせることにより、１．８６のサイズ効果が得られた。組み合わされたコホートに対する受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析は、９３％の曲線下面積を与え、この測定が良好な予測力を提供することを示している（図１０ａ）。タンパク質合成は患者の年齢と負の相関を示したが（図１０ｂ）、健常個人では相関しなかった（図１０ｃ）。これは、翻訳阻害が、年齢とともに進行する疾患特異的な特徴であり、健常個人における正常な老化に関連していないことを示唆している。結論。新生タンパク質合成の測定により、初期段階で孤発性およびＧ２０１９Ｓ  ＰＤの両方のバイオマーカーの読み出しを提供することができる。
【０１１０】
例９。患者の線維芽細胞からのタンパク質合成は、マルチウェルフォーマットで測定することができる。
【０１１１】
目的。個々の細胞の蛍光測定（図７−９）が、スケールアップに適している分光光度計の読み出し値を使用して、マルチウェルフォーマットで単純化できるかどうかを決定すること（図１１）。
【０１１２】
方法。患者および対照個人からの線維芽細胞を、例７に記載のように単離した。マルチウェルフォーマットでのタンパク質翻訳の測定のために、細胞を、ＤＭＥＭ中の４８ウェルプレートウェル当たり３０，０００の密度で播種した。本質的に例４の方法に記載したように、細胞をメチオニン不含ＤＭＥＭ中で３０分間インキュベートし、１ｍＭ  ＡＨＡを添加した。３０分後、細胞を４％スクロースを含む４％パラホルムアルデヒドで室温で３０分間固定した。細胞をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．２５％ＴＸ１００、０．２％ＢＳＡ、５％スクロース、１０％ウマ血清）中で一晩透過処理した。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（３％）で３回洗浄した。標準的なｃｌｉｃｋ−ｉｔ反応プロトコルはいずれもうまくいくはずであるが、サーモフィッシャーライフテクノロジーズ社（カタログ番号Ａ１０２６７）からのキットを使用して、ｃｌｉｃｋ−ｉｔ反応を例４に記載のように行い、ＡＨＡをＡｌｅｘａ−４８８と連結した。反応は３０分間行った。次いで、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで５回洗浄し、ＰＢＳ中で４℃に維持した。３５０／４６１ｎｍフィルターを使用するＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マルチモードプレートリーダーを使用して蛍光を検出した。バックグラウンド蛍光を、ＡＨＡ標識に供さずに差し引いた細胞を含むウェルから決定した。
【０１１３】
結果。結果は、ＰＤ患者由来の線維芽細胞においてタンパク質翻訳が阻害されることを示している（図１１）。
【０１１４】
結論。この例は、単純なマルチウェル蛍光検出フォーマットで新生タンパク質合成を測定することが可能であり、これにより、ＰＤについての定量的バイオマーカーが得られることを示す。
【０１１５】
例１０。ＡＨＡ標識を用いた患者の線維芽細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における翻訳の測定は、翻訳障害を検出するための質量分析（ＭＳ）に基づく方法を提供する。
【０１１６】
目的。ＭＳベースのタンパク質配列決定が、皮膚および血液由来の患者試料および健常試料のデノボ合成タンパク質を同定するために適用され得るかどうかを試験すること。
【０１１７】
方法。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離。血液（７〜９ｍｌ）を、ヘパリンを含むバキュテイナチューブ（ＢＤ）に回収し、ＰＢＭＣを以下のように患者または志願者からの抽出の１時間以内に単離し：血液を滅菌ＰＢＳで１：１に希釈し、１５ｍｌのファルコンチューブ中の４，５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ溶液（アマシャムバイオサイエンス社、＃１７−１４４０−００２）に、６ｍｌを層にした。チューブを室温で３０分間４００  ＲＣＦで遠心分離した。ＰＢＭＣ細胞層を滅菌ＰＢＳ中に回収し、３０ｍｌの滅菌ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞ペレットをメチオニン不含ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁した。
【０１１８】
ＰＢＭＣのＡＨＡ標識。ＰＢＭＣをＬ−アジド−ヒドロアラニン（ＡＨＡ）で標識するために、細胞を上述のように１ｍｌのメチオニン不含ＲＰＭＩ−１６４０中のディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。培地を、２ｍＭ  ＡＨＡ（Ｂａｓｅｃｌｉｃｋ社）を含むＲＰＭＩと交換して、インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、１００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ｂ−グリセロホスファート、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％ＴＸ１００、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、４０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭベンザマジン）を添加した。プロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍｌロイペプチン、ペプスタチンおよび１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を使用前に新たに添加した。８Ｍ尿素および２５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（ＭＥＲＣＫ＃７０７４６）も添加した。細胞を氷上で１５分間インキュベートし、４℃で５分間、１３，４００  ＲＣＦで遠心分離して、未破壊細胞を除去した。任意のクリックケミストリープロトコルが機能するはずであるが、上清を、インビトロジェンキット（＃Ｃ１０２６９）を使用して、ＡＨＡ標識タンパク質をアルキンアガロースに結合させるための環化付加反応に供した。成分Ａ、ＣおよびＢを、５：５：１の割合で混合した（クリック反応）。アルキンアガロース（試料あたり２５μｌ）をミリＱで洗浄した。５０μｌのクリック反応混合物をビーズに添加し、続いて４００μｇの溶解物を添加した。混合物をボルテックスし、穏やかに回転させながら室温でインキュベートした。次いで、ビーズをミリＱで洗浄し、続いてＳＤＳ洗浄緩衝液で洗浄した。７ｍＭヨードアセトアミドを含む１ｍｌのＳＤＳ洗浄緩衝液、ｐＨ８．５を添加し、試料を暗所で３０分間インキュベートした。アガロースを、５ｍＭ  ＤＴＴを含む１ｍｌのＳＤＳ洗浄緩衝液（ｐＨ８．５）中で洗浄し、トリプシン処理および質量分析のために調製する前に４℃で貯蔵した。樹脂結合タンパク質をトリプシンで一晩消化し、回収したペプチドを、Ｃ１８  ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラムで洗浄し、ＭＳ／ＭＳで分析した。
【０１１９】
線維芽細胞のＡＨＡ標識。患者の線維芽細胞（例７参照）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｇｌｎ、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した５ｍｌ  ＤＭＥＭ中に６ｃｍディッシュ当たり１００ｋで播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＡＨＡ標識の前に、培地をメチオニン不含無血清ＲＰＭＩ−１６４０と交換し、３０分間インキュベートした。次いで、培地を、２ｍＭ  ＡＨＡ（Ｂａｓｅｃｌｉｃｋ社）を含む３ｍｌの無血清／メチオニン不含ＲＰＭＩと交換し、１４時間インキュベートした。細胞を穏やかにこすり、４℃で５分間、４００ＲＣＦで遠心分離することにより回収した。試料あたり１００μｌの溶解緩衝液を用いて、ＰＢＭＣについて上述のように溶解物を調製した。ＡＨＡの代わりにメチオニンで処理した試料を、陰性対照として用いた。ＡＨＡ標識タンパク質のビーズへの結合、トリプシン処理およびＭＳ／ＭＳ分析は、ＰＢＭＣ試料について上述したようにして行った。得られたＲＡＷデータファイルを分析し、０．０５％ＦＤＲ率を用いてＭａｘＱｕａｎｔで定量した。逆配列および閾値スコアに達しなかった配列を除去した後、ペプチドを結合してタンパク質強度を得た。これらは、試料中の特定のタンパク質の量を表す。
【０１２０】
結果。結果は、タンパク質翻訳が、非侵襲的に得られたＰＢＭＣおよび患者の皮膚生検から得られた線維芽細胞において、ＡＨＡ標識タンパク質の濃縮とそれに続くトリプシン処理されたタンパク質の質量分析検出によって測定できることを示す。これにより、患者の状態を定義するために使用することができる、デノボタンパク質合成シグネチャが同定される（図１２ａ）。また、特にＡＨＡ標識試料中の共役ＡＨＡ基の検出は、本方法がＡＨＡ標識タンパク質を濃縮することを実証する（図１２ｂ）。
【０１２１】
結論。これにより、質量分析検出を使用して、タンパク質翻訳ならびにタンパク質および／またはペプチドシグネチャの機能的読み出しを患者の試料から得ることができる方法が提供される。
【０１２２】
例１１。タンパク質合成は、患者細胞におけるＡＨＡ標識、それに続くアルキン−ビオチン−ニュートラアビジン濃縮および抗体（または質量分析）検出を用いて測定することができる。
【０１２３】
目的。抗体検出が、患者細胞の翻訳レベルをモニターするために使用できるかどうかを決定すること。
【０１２４】
方法。ＰＢＭＣを、例１０に記載のように単離した。線維芽細胞を、例７および１０に記載のようにして単離し、培養した。両方の細胞型について、メチオニン飢餓およびＡＨＡ標識を、例１０に記載のように行った。細胞を、１００μｌの低張溶解緩衝液（使用前に新たに添加した、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよびペプスタチンおよび１００μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭβ−グリセロリン酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％ＴＸ１００、１０％グリセロール、４０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭベンズアミジン）に溶解した。成分Ａ（１０μｌ）、成分Ｂ（２μｌ）および成分Ｃ（１０μｌ）を混合した。示されるように、０．２μｌのビオチン−アルキン（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社：Ｃ３７Ｂ０）を添加した。溶解物をビーズと５０：５０で混合し、穏やかに混合しながら室温で２０時間インキュベートした。アルキン−ビオチンとの反応のために、反応チューブを穏やかにボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。過剰の試薬（遊離ビオチンを含む）を、ＰＤ−ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ２５カラム（５ｋＤａカットオフ）（アマシャムファルマシア社）および低張溶解緩衝液を用いた、ゲル濾過によって除去した。室温で３０分間インキュベートすることによって、ビオチン−ＡＨＡタグ付きタンパク質を、２０μｌ（ベッド容量）のニュートラアビジンアフィニティーセファロース樹脂（ピアス社）に固定化した。
【０１２５】
セファロースを１ｍｌ  ＬｉＣｌ緩衝液（５００ｍＭ  ＬｉＣｌ２、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．６、０．１％ＴＸ１００、１ｍＭ  ＤＴＴ）で２回洗浄し、それに続いて１ｍｌ  ＰＢＳで４回洗浄した。次いで、試料をＬａｅｍｍｌｉで溶解し、１０分間煮沸し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した。試料をＭＳ／ＭＳ同定のためにトリプシンでゲル内消化するか（例１）、または抗ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いる定量的免疫ブロット検出のためにニトロセルロースに移した（例９ｂ）。ＡＨＡタグ付きタンパク質の相対量を化学発光検出から可視化し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｇｅｌ−ｄｏｃシステム（Ｂｉｏｒａｄ社）でスキャンした。タンパク質翻訳の阻害剤であるアニソマイシンを陰性対照として添加した。
【０１２６】
結果。患者由来のＰＢＭＣまたは線維芽細胞のＡＨＡ標識は、抗体検出を用いたタンパク質合成の高感度測定を可能にする。患者細胞由来のＰＢＭＣまたは線維芽細胞のＡＨＡ標識は、ゲル消化後のＭＳ／ＭＳ検出のための新生タンパク質の濃縮を容易にする（図１２ｃ）。
【０１２７】
結論。これにより、濃縮およびそれに続く抗体／酵素検出を使用して、タンパク質翻訳の機能的読み出し値を対照および患者の血液または皮膚試料から得ることができる方法が提供される。
【０１２８】
例１２。質量分析は、健常対照と比較して、孤発性およびＧ２０１９Ｓ  ＰＤ症例からの細胞における、損なわれた翻訳レベルを同定する。
【０１２９】
目的。対照とＰＤ患者細胞との翻訳の間の有意差が、質量分析法を用いて検出できるかどうかを決定すること。
【０１３０】
方法。図１３について、試料調製は、本質的に例１０に記載の通りであった。対応する陰性対象を各試料に含めた。これらは、ＡＨＡではなくメチオニンで標識された細胞からなっていた。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ設定は、例１に記載の通りであった。得られたＲＡＷデータファイルを分析し、０．０５％ＦＤＲ率を用いてＭａｘＱｕａｎｔで定量した。ＭａｘＱｕａｎｔからの定量化されたタンパク質の結果を、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェアにインポートし、そこで偽陽性の逆識別が除去された。生強度値をｌｏｇ２変換し、欠損値を１とし、タンパク質をユークリッド距離および平均連結を用いて、ペルセウスの階層的クラスタリングでクラスタ化した。表１に示すように、試料を３つの独立したコホート（ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ、Ｔ．Ｕ．Ｈ、および欧州バイオバンク）から組み合わせた。
【０１３１】
結果。孤発性およびＧ２０１９Ｓ患者群と対照群との間で、単にタンパク質強度のヒートマップを可視化することによって、明らかなタンパク質強度の差が見られた（図１３）。孤発性ＰＤ患者のデノボ合成タンパク質強度を健常対照と比較すると、有意に翻訳障害が見られた。３９種の有意に変化したタンパク質が同定された（図１４）。Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤ患者のデノボ合成タンパク質強度を健常対照と比較すると、有意に翻訳障害が見られた。５０種の有意に変化したタンパク質が同定された（図１５）。
【０１３２】
結論。本発明者らは、健常対照と比較して孤発性およびＧ２０１９Ｓ  ＰＤ患者において有意に変化しているタンパク質の別々のパネルを同定した。
【０１３３】
例１３。患者の状態を予測するシグネチャ：正常な健常対孤発性ＰＤ。
【０１３４】
目的。孤発性ＰＤを正常な（健常な）個人と区別するのに役立つ、翻訳障害から生じる単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーシグネチャを同定すること。
【０１３５】
方法。孤発性ＰＤ対対照において有意に変化したタンパク質強度のリストを、線形回帰モデルに適合させ、どの特徴が疾患状態の最良の予測を与えるかを同定するために、Ｇｌｍｎｅｔパッケージを用いてトレーニングした。すべての予測について、本発明者らは、上述のように３つのコホートからのすべての患者データを使用した（ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＴＵＨ、ＥＢ）。第１の図では、追加の閾値を使用せずに、孤発性対対照健常個人から、有意に変化するタンパク質のリストを使用した。これにより、９３％の予測スコアで、患者の状態（孤発性ＰＤまたは健常）を予測する３２個の特徴のシグネチャが得られた（図１６）。次いで、２倍の変化をカットオフした。対照と比較してレベルが２倍を超えて有意に変化したタンパク質のみを含めた。これにより、Ｇｌｍｎｅｔパラメータα＝０．０１、λ＝０．００５（図１７）を用いて、Ｇｌｍｎｅｔパラメータα＝０．１、λ＝０．００５を用いて、１４個の特徴および９９％の予測スコアを有するシグネチャが得られた。次いで、このシグネチャからどのペアの特徴が最良の予測スコアを与えたかを同定するために、総当たりを使用した。これにより、Ｇｌｍｎｅｔパラメータα＝１、λ＝０．０５６を用いて、８８％の予測スコアを有する二重特徴シグネチャとして、ＳＮＸ２およびＬＩＭＡ１が得られた（図１８）。
【０１３６】
結果。本発明者らは、それぞれ３２、１４または２個の特徴を含む３つのシグネチャを同定し、予測精度は９３％、９９％および８８％であった。
【０１３７】
結論。これらのシグネチャは、ＰＤの非遺伝性形態でＰＤの予測を助けるに使用されるべきである。それらは、患者試料、皮膚線維芽細胞、血液、または脳脊髄液もしくは尿などの他の体液をスクリーニングするために使用することができる。
【０１３８】
例１４。患者の状態を予測するシグネチャ：正常な健常対Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤ。
【０１３９】
目的。Ｇ２０１９Ｓ  ＰＤを正常な（健常な）個人と区別するのに役立つ、翻訳障害から生じる単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーシグネチャを同定すること。
【０１４０】
方法。対照個人と比較してＧ２０１９Ｓ  ＰＤ患者において２倍を超えて有意に変化したタンパク質強度のリストを、例１３のように、線形回帰モデルに適合させ、どの特徴が疾患状態の最良の予測を与えるかを同定するために、Ｇｌｍｎｅｔパッケージを用いてトレーニングした。すべての予測について、本発明者らは、上述のように３つのコホートからのすべての患者データを使用した（ＮＩＮＤＳ−Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＴＵＨ、ＥＢ）。これにより、Ｇｌｍｎｅｔパラメータα＝０．１、λ＝０．００３を用いて、１３個の特徴および９８％の予測精度スコアを有するシグネチャが得られた（図１９）。次いで、このサブグループの患者の予測スコアが最も高い一対のマーカーを同定するために、総当たりを使用した。これにより、一緒に試験した場合に、９８％の予測スコアを与える２つのバイオマーカーとしてＦＡＭ１２０ＡおよびＡＤＡＲが得られた（図２０）。
【０１４１】
結果。本発明者らは、それぞれ１３個または２個の特徴に由来する２つのシグネチャを同定し、予測精度は９８％であった。
【０１４２】
結論。これらのシグネチャは、ＰＤの遺伝性形態でＰＤの予測を助けるに使用されるべきである。それらは、患者試料、皮膚線維芽細胞、血液、または脳脊髄液もしくは尿などの他の体液をスクリーニングするために使用することができる。
【０１４３】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月9日(2019.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるパーキンソン病（ＰＤ）を診断またはモニタリングする方法であって、全体的な翻訳レベルの変化について、対象から得られた試料を試験することを含み、全体的な翻訳の減少がＰＤを示す、対象におけるパーキンソン病（ＰＤ）を診断またはモニタリングする方法。
【請求項２】
ＳＮＸ２の発現の減少を含む発現シグネチャが、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＬＩＭＡ１の発現の減少をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＲＲＳ１、ＴＦＲＣ、ＲＡＳＡ１、ＮＲＡＳ、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣ、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１Ｌ、およびＲＰＬ２７をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
全体的な翻訳の減少を示す発現シグネチャが、ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＤＢＩ、ＡＤＡ１Ｂ０ＧＶＧ８、ＥＲＬＥＣ１、ＴＸＮＬ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＢＡＧ３、ＲＡＳＡ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡＧＮＬ３、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７ＡおよびＡＳＮＳをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
全体的な翻訳の減少を示す発現シグネチャが、ＳＮＸ２、ＬＩＭＡ１、ＲＲＳ１、ＴＦＲＣ、ＲＡＳＡ１、ＮＲＡＳ、ＫＲＴ３６、Ｑ５６ＵＱ５、ＰＰＩＣ、ＴＲＩＭ２５、ＪＡＧＮ１、ＷＤＲ３６、ＣＳＥ１Ｌ、ＲＰＬ２７、ＭＸ１、ＡＰＯＬ２、ＤＢＩ、ＡＤＡ１Ｂ０ＧＶＧ８、ＥＲＬＥＣ１、ＴＸＮＬ１、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＤＣ５０、ＢＡＧ３、ＲＡ−ＳＡ１、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＥＩＦ２Ｓ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＮＡＣＡＧＮＬ３、ＰＳＭＣ１、ＡＣＯＸ１、ＴＭＥＭ１６７ＡおよびＡＳＮＳからなる群から選択された遺伝子によりコードされる１種または複数のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＤが孤発性ＰＤである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＦＡＭ１２０ＡおよびＡＤＡＲの発現の減少を含む発現シグネチャが、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮ３１、ＴＭＥＭ２０８およびＣＲＩＰ２をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＤＲＭ１、ＰＥＦ１、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１  ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２、ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、ＥＨＤ１およびＰＡＬＬＤをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
全体的な翻訳の減少を示す前記発現シグネチャが、ＦＡＭ１２０Ａ、ＡＤＡＲ、ＭＡＰ１Ａ、ＣＯＬ５Ａ、ＢＣＬ９Ｌ、ＵＳＰ７、ＲＥＣＫ、ＣＮＯＴ７、ＮＫＩＲＡＳ１、ＡＲＰＣ５、ＣＰＮ３１、ＴＭＥＭ２０８、ＣＲＩＰ２、ＧＤＩ１、ＵＳＰ９Ｘ、ＡＤＲＭ１、ＰＥＦ１、ＹＩＦ１Ｂ、ＣＡＮＸ、ＧＨＩＴＭ、ＣＡＮＸ、ＴＮＳ１、ＯＧＤＨ、ＴＮＰＯ１  ＰＥＰＤ、ＨＮＲＮＦＡ３、ＭＡＰ４、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＤＤＸ２１、ＤＥＲＬ１、ＴＰＭ２、ＮＰＭ１、ＣＬＩＣ４、ＨＬＡ−Ａ、ＣＤＣ４１、ＳＴＴ３Ａ、ＲＨＯＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＲＡＭ１、ＰＬＳ３、ＳＳＲ３、ＣＴＳＫ、ＮＣＢＰ１、ＰＴＲＨ２、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２Ａ３、ＮＵＣＢ２、ＨＥＬ−Ｓ−１０９、ＳＥＣ６１Ｇ、ＣＬＰＴＭ１、ＲＥＣＫ、ＰＲＭＴ１、ＡＢＣＦ２、ＶＡＭＰ７、ＲＴＣＡ、ＡＥＢＰ１、ＣＰＸＭ２、Ｓ１００Ａ１６、ＲＲＡＧＤ、ＲＲＡＧＣ、ＥＨＤ１およびＰＡＬＬＤからなる群から選択された遺伝子によりコードされる１種または複数のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、Ｇ２０１９Ｓのキャリアであるか、または孤発性ＰＤ患者のサブグループに属する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対照試料と比較した場合、翻訳レベルの変化が、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
翻訳レベルが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並行反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ依存型取得（ＤＤＡ）またはデータ非依存型取得（ＤＩＡ）を含む質量分析、代謝標識およびクリックケミストリーからなる群から選択される方法によって評価されるか、または前記薬剤が抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
発現シグネチャが非比較的または比較的様式で使用される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
質量分析法または抗体によって定量的または定性的に評価された翻訳後修飾の変化が、翻訳の変化を示す、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳後修飾の構造の変化が、全体的な翻訳の減少を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記モニタリングすることが、ＰＤの進行をモニタリングすること、治療に対する反応をモニタリングすること、ＰＤの寛解をモニタリングすること、またはＰＤの再発をモニタリングすることを含む、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記診断することが、前記対象をＰＤのサブグループに層別化することを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、皮膚生検試料、血液試料、細胞試料、組織試料、または体液である、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドまたはタンパク質の発現レベルの変化について試料を試験するための１種または複数の試薬を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキット。
【請求項２２】
ＰＤを診断、分類診断またはモニタリングするための、またはＰＤ患者を層別化するためのキットの使用であって、前記キットが、ペプチドまたはタンパク質の発現レベルの変化について試料を試験するための１種または複数の試薬を含む、キットの使用。
【国際調査報告】
2020504815.tif 000028
2020504815.tif 000029
2020504815.tif 000030