(57)【要約】ナノ粒子(ＮＰ)、例えばＰＥＧ化ナノ粒子などを、例えば、モジュール式及び直交式に、ＮＰ表面上の様々な種類の異なる機能性リガンド(機能基)で機能化するための多用途表面修飾アプローチが記載される。それは、様々な特性（例えば、蛍光検出、特異的細胞標的化、放射性同位体キレート化／標識化、レシオメトリックｐＨ検知、薬物送達）を、単一のＮＰに組み込むＰＥＧ化５機能性ナノ粒子の合成を可能にし、一方、全体のＮＰサイズは例えば、１０ｎｎ未満のままである【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ナノ粒子を形成する方法であって、
２〜１５ｎｍのサイズを有し、ナノ粒子の表面に共有結合した複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基を有するナノ粒子を、少なくとも１つの反応基を有する１つ以上の機能化前駆体と接触させることを含み、
この際、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した少なくとも１つの反応基を有する機能性ナノ粒子が形成される、方法。
【請求項２】
前記接触が、水性媒体中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子を、２つ以上の機能化前駆体と接触させる場合、当該接触が単一の反応混合物中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子を、２つ以上の機能化前駆体と接触させる場合、当該接触が、少なくとも２つの異なる反応混合物中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの追加の機能化前駆体と接触させることを含み、個々の機能化前駆体の少なくとも１つ、少なくとも２つ又はすべての反応基が、他の機能化前駆体の反応基と構造的に異なっており、
ここで、前記少なくとも１つの追加の機能化前駆体の官能基が、前記機能化前駆体の反応基と構造的に異なっており、
前記機能性ナノ粒子を、２つ以上の追加の機能化前駆体と接触させる場合、個々の機能化前駆体の反応基は、他の機能化前駆体の反応基と構造的に異なっており、
機能性ナノ粒子の表面に共有結合した２つ以上の反応基を有する機能性ナノ粒子が形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記機能性ナノ粒子を、１つ以上の機能基を有する１つ以上の機能基前駆体と接触させることを含み、ここで、機能基を有する機能性ナノ粒子が形成され、各機能基が、機能性ナノ粒子の表面に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
各機能基前駆体との接触が、単一の反応混合物中で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個々の機能基前駆体との各接触について、前記接触を別個の反応混合物中で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)で表面機能化されたナノ粒子を、少なくとも１つの第一反応基を有する第一機能化前駆体と接触させ、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した前記少なくとも１つの反応基を有する第一機能性ナノ粒子を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第二反応基を有する第二機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基及び前記第二反応基は構造的に異なるものであり、
機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基及び前記少なくとも１つの第二反応基を有する第二機能性ナノ粒子が形成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、前記第二機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、及び前記第三反応基は、構造的に互いに異なるものであり、
機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、及び前記少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能性ナノ粒子が形成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記第三機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、及び前記第三反応基は、構造的に互いに異なるものであり、
機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、及び前記少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能性ナノ粒子が形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、前記第三機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第四反応基を有する第四機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、前記第三反応基、及び前記第四反応基は、構造的に互いに異なるものであり、
機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、前記少なくとも１つの第三反応基、及び前記少なくとも１つの第四反応基を有する第四機能性ナノ粒子が形成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、前記第四機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第五反応基を有する第五機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、前記第三反応基、前記第四反応基、及び前記第五反応基は、構造的に互いに異なるものであり、
機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、前記少なくとも１つの第三反応基、前記少なくとも１つの第四反応基、及び前記少なくとも１つの第五反応基を有する第五機能性ナノ粒子が形成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記機能性ナノ粒子を、１つ以上の機能基を有する、１つ以上の第一機能基前駆体、第二機能基前駆体、第三機能基前駆体、第四機能基前駆体、第五機能基前駆体、又はそれらの組み合わせと接触させることを含み、
ここで、前記機能基を有する機能性ナノ粒子が形成され、各機能基が、機能性ナノ粒子の表面に共有結合している、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
各機能基前駆体との接触が、単一の反応混合物中で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個々の機能基前駆体との各接触について、前記接触を別個の反応混合物中で行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記機能化前駆体が、アミン基、チオール基、カルボン酸基、カルボキシレート基、エステル基、マレイミド基、アリル基、末端アルキン基、アジド基、チオシアネート基、及びそれらの組み合わせから選択される反応基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能化前駆体が、１つ以上のシラン基及び１つ以上の反応基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記シラン基が以下のものから選択される、請求項１に記載の方法：
【化３】
2020520930.tif 000008
ここで、Ｒはそれぞれ独立して、Ｃ1〜Ｃ4アルキル基であり、Ｒはそれぞれ独立して、Ｈ又はＣ1〜Ｃ4アルキル基である。
【請求項２１】
前記機能化前駆体の１又は複数が以下の構造を有する、請求項１に記載の方法：
【化４】
2020520930.tif 000009
ここで、Ｘは、アミン基、チオール基、カルボン酸基、カルボキシレート基、エステル基、マレイミド基、アリル基、末端アルキン基、アジド基、又はチオシアネート基であり、ｎは１〜８であり、Ｒはそれぞれ独立して、Ｃ1〜Ｃ4アルキル基である。
【請求項２２】
少なくとも１つの機能基又は全ての機能基が、リンカー基を介してナノ粒子の表面に共有結合している、請求項６〜８及び１６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの機能基又は全ての機能基が、リンカー基を介してナノ粒子の表面に共有結合している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
それぞれの個々の場合におけるリンカー基が、アルキル基から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
それぞれの個々の場合におけるリンカー基が、アルキル基から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記機能基が、色素基、検知基、キレート剤基、標的化基、薬物基、１つ以上の放射性標識を有するキレート剤基、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項６〜８及び１６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記機能基が、色素基、検知基、キレート剤基、標的化基、薬物基、１つ以上の放射性標識を有するキレート剤基、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
複数のナノ粒子を含む組成物であって、各ナノ粒子が、ナノ粒子表面に共有結合した複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基と、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した少なくとも１つの機能基を含み、
前記ナノ粒子の少なくとも９５％が、２〜１５ｎｍのサイズを有し、当該組成物が、いかなる粒子サイズ識別処理も受けていない、組成物。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が、１０ｎｍ未満のサイズを有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、コアナノ粒子、コア-シェルナノ粒子、又はそれらの組み合わせである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記コアナノ粒子が、アルミノシリケートコアナノ粒子又はシリカコアナノ粒子である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記コアがシリカコアであるか、又は前記コアシェルナノ粒子のコア及びシェルがシリカシェルである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記コアシェルナノ粒子のコアが、アルミノシリケートコアであり、前記コアシェルナノ粒子のシェルが、シリカシェルである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記機能基が、色素基、検知基、キレート剤基、標的化基、薬物基、１つ以上の放射性標識を有するキレート剤基、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの機能基が、リンカー基を介してナノ粒子の表面に共有結合している、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
それぞれの個々の場合におけるリンカー基が、アルキル基から選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
１〜１００の機能基が、各ナノ粒子の表面に共有結合している、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３８】
ポリエチレン基の少なくとも一部又は全てが、１つ以上の機能基を有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３９】
前記機能基が、色素基、検知基、キレート剤基、標的化基、薬物基、１つ以上の放射性標識を有するキレート剤基、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ナノ粒子が、その中に封入された１つ以上の色素分子をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項４１】
コア当たりの色素分子の数が１〜７である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
組成物が、少なくとも６か月間安定である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項４３】
個体内の領域を画像化するための方法であって、
請求項２８に記載の組成物を個体に投与すること、ここで、ナノ粒子は１つ以上の色素分子及び／又は１つ以上の色素基を含んでいる；
励起電磁放射線を被験体に向け、それによって前記１つ以上の色素分子及び／又は１つ以上の色素基の少なくとも１つを励起すること；
励起電磁放射線を検出すること、ここで検出された電磁放射線は、励起電磁放射線による励起の結果として個体内の色素分子によって放出されたものである；及び
検出された電磁放射線に対応する信号を処理して、被験体内の領域の１つ以上の画像を提供することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１７年５月１９日に出願された米国仮出願６２/５０８，７０３に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本願に包含される。
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号ＣＡ１９９０８１の下、政府支援を受けて完成された。合衆国政府は本発明に所定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、一般に、表面機能化ナノ粒子及びそれを製造する方法、並びに使用する方法に関する。より具体的には、本開示は、一般に、表面機能化シリカ及びアルミノシリケートナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００４】
シリカナノ粒子(ＳＮＰ)は、その大きな表面積、不活性及び高い生体適合性のため、潜在的な治療/診断用途について関心を集めている。しかしながら、たいていのＳＮＰは１０ｎｍを超える大きさである。
【０００５】
１２ｎｍを超える粒子は、インビボで生体から効率的に除去されず、不都合なことに肝臓及び他の器官/組織に分布し、これらの組織を有毒物質にさらす可能性がある(特に、これらの１０ｎｍを超えるＳＮＰは、薬物及び／又は放射能で改変される)。直径約８ｎｍの粒子は約１日間、１０〜１１ｎｍの粒子は約３〜５日間体内に存在し、１２ｎｍより大きい場合は、除去されないか非常にゆっくりと除去される。
【０００６】
現在、極小無機ナノ粒子は、癌セラノスティクス(theranostics)のためのナノ医療として急速に関心を集めている。いくつかの有機系ナノ医療は、多機能性及び多原子価効果に起因して、すでに従来の化学療法薬より競合的である。無機ナノ粒子は、さらに、ナノ医療の構築要素を多様化し、それらの内在的な物性に関連する利点及びより低い製造コストを提供するかもしれない。研究室からクリニックへのナノ粒子の安全な橋渡しには、実質的な科学及び制御に関する多数のハードルを克服することが必要になる。最も重要な判断基準は、好ましい体内分布であり、その経時的進化(薬物動態、ＰＫ)プロファイルである。腎クリアランスのための大きさの閾値は、１０ｎｍ未満である。今日まで、ごく少数の無機ナノ粒子プラットホームが、効率的な腎クリアランスを可能にする１０ｎｍ未満のサイズで合成されてきた。それらの中で、コーネルドット(Cornell dots)又は単にＣドット(C dots)と呼ばれる１０ｎｍ未満サイズのポリエチレングリコール被覆(ＰＥＧ化：ＰＥＧ化)蛍光コア-シェルシリカナノ粒子(ＳＮＰ)のみが、ヒトでの第一臨床試験のための治験薬(ＩＮＤ)として、米国食品医薬品局(ＦＤＡ)によって承認されている。メラノーマ患者での第一臨床試験の結果が後押ししているが、複数の合成の挑戦が、このような１０ｎｍ未満サイズの蛍光性有機-無機ハイブリッドＳＮＰのために続いている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
第一に、従前のＣドット-タイプのＳＮＰ合成の試みはすべて、修正Stober法に従っており、溶媒としてアルコールが使用されていた。しかしながら、生物学的又は臨床応用で使用する物質としては、反応媒体として水が好ましい。それは、合成と精製プロトコルを非常に簡素化し、揮発による無駄をより少なくし、それによって粒子製造を実質的により速くよりコスト効率良くするであろう。さらに、Stober法は直径が数十ｎｍ〜ミクロンのＳＮＰを製造するために広く使用されているが、アルコール中での反応速度論の制限のため、１０ｎｍ以下の粒子サイズが、この合成方法によるサイズ制御の限界である。
【０００８】
第二に、ＰＥＧで共有結合的に覆われたシリカ粒子の表面は、ＰＥＧ化の間の表面電荷の減少が、粒子凝集をもたらすか、又は少なくとも広い粒径分布をもたらし得るため、扱いにくい可能性がある。この影響は、粒子表面エネルギーの増加に起因して、極小粒子でより明白であり、それゆえ、粒子の単分散度とサイズ制御能力を制限する。
【０００９】
第三に、その等電点ｐＨ２〜３より上では、シリカが負の表面電荷を有するため、負に帯電した基を有するシラン-結合有機蛍光色素の、ＳＮＰへの共有結合性の封入効率は低い(シリカとフルオロフォアの間の静電反発力の結果として)。これは特に、生体組織のイメージング用途に最も望ましい近赤外線(ＮＩＰ)発光色素に当てはまる。ＮＩＲ色素は、大きな非局在化π-電子系を有し、水に可溶性である(一般的に、その周辺に複数の負の電荷を有する機能基を必要とする(例えば、硫酸塩))。それらの典型的なコストは、１ｍｇあたり２００〜３００ドルのオーダーであり、典型的に用いられているシラン-色素コンジュゲートの最初の合成後の再使用には問題があるため、低い取り込み効率はこれらの色素にとって問題である。
【００１０】
最後に、１０ｎｍ未満サイズの蛍光ＳＮＰ及びコア-シェルＳＮＰのために報告されている無機元素組成はシリカ以外にはない。特に、剛性の増加が、非放射レートの減少の結果として色素あたりの蛍光収量の増加と直接相関していたため、有機色素環境により高い剛性をもたらす組成は興味深い。ここで、アルミニウムアルコキシドを添加剤として派生するシリカ組成は、アルミニウムアルコキシドがアルコキシシラン由来のシリカにおける既知の硬化成分であり、かつ、アルミナが筋肉内及び皮下注射される高容積ワクチンに添加できる承認されたアジュバントであるため、特に興味深い。
【００１１】
これらの課題はすべて、サイズ制御の改善された１０ｎｍ未満の有機-無機ハイブリッドドットを得るための水ベースのアプローチ、これまで知られていない組成、及び増強したパフォーマンス特性を系統的に開発するために、オリジナルの蛍光性コア-シェルＳＮＰ(Ｃドット)合成を再考することを提起する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、ナノ粒子(例えば、コア又はコア−シェルナノ粒子)を提供する。本開示はまた、ナノ粒子を製造及び使用する方法を提供する。
【００１３】
一態様では、本開示は、機能性ナノ粒子(例えば、超小型機能性ナノ粒子)を作製する方法を提供する。この方法は、挿入によるＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ＝post-PEGylation surface modification by insertion)アプローチ(例えば、本明細書中に記載されるような(ＰＰＳＭＩ)アプローチ)を含み得る。
【００１４】
本方法は、２〜１５ｎｍ(例えば、２〜１０ｎｍ)のナノ粒子(例えば、最長寸法などが、このサイズであるもの)と、少なくとも１つの反応基を有する１つ以上の機能化前駆体(官能化前駆体)との反応に基づき、前記ナノ粒子は、複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基を有する１０ｎｍ未満のサイズ(例えば、２〜９．９９ｎｍサイズ)の超小型ナノ粒子であってもよく、そのいくつか又は全ては、ナノ粒子の表面に共有結合された１つ以上の機能基（あるいは反応して、機能基を形成することができる基）で機能化されていてもよい(これは、ＰＥＧ化ナノ粒子とも呼ばれる)。ナノ粒子の表面に共有結合した１つ以上の反応基を有する得られたナノ粒子は続いて、反応基と反応する機能基前駆体と反応し、ナノ粒子の表面に共有結合した１つ以上の機能基を有するナノ粒子を生じる。
【００１５】
一態様では、本開示は、本開示のナノ粒子を含む組成物を提供する。組成物は１つ以上のタイプ(例えば、異なる平均サイズ及び／又は１つ以上の異なる組成特徴を有する)を含むことができる。前記組成物は、ＮＰ表面上に配置された(例えば、共有結合された)１〜５(例えば、１、２、３、４、又は５)種類の異なる機能性リガンドを有する機能性ナノ粒子を含むことができる。
【００１６】
一態様では、本開示は、本開示のナノ粒子及び組成物の使用を提供する。ナノ粒子によって担持されるリガンド(機能基)は、診断薬及び／又は治療薬(例えば、薬物)を含むことができる。したがって、ナノ粒子又はナノ粒子を含む組成物は、送達(例えば、治療方法)及び／又は画像化方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本開示の本質及び対象をより完全に理解するために、以下の詳細な説明が、添付の図面とともに参照されるべきである。
【００１８】
図１は、挿入によるＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)方法を導入するＣ'ドット合成システムの図を示す。追加の機能性リガンドによるＣ'ドットの表面修飾(表面改質)は、(ｉ)ＰＥＧ化工程中に異なるヘテロ二官能性(二機能性)ＰＥＧ−シランを共凝縮させ、次いでＰＥＧ化後に、前記ヘテロ二官能性ＰＥＧに機能性リガンドを共有結合的に付着させることによって、又は(ii) ＰＥＧ化後工程(１又は複数)において、ＰＥＧ鎖間及びシリカ表面上に官能基(例えばアミン又はチオール)を有するシランを共有結合的に挿入することによって達成される(ＰＰＳＭＩ)。各反応ステップにおける代替経路は、破線を用いて表示される。異なる多機能性Ｃ'ドットに対する反応経路の具体的な選択は、アプリケーション要件に依存する。ＳＨ-薬物-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-ｃ'ドットをＤＦＯ-薬物-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-ｃ'ドットに変換するために使用したチオール-エン反応を、黒の実線の中断を使用して示す(右下)。右上の挿入図は、その合成経路が明るい青色で強調されている５機能性Ｃ'ドットの分子レンダリングを示す。５つの機能には、シリカコア内部のＮＩＲ蛍光Ｃｙ５色素を介する蛍光、特定のｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドを介する癌細胞標的化、ＰＥＧ鎖のいくつかに付着した小分子の治療用ＥＦＶ薬物、特定ＤＦＯキレート剤を介する放射性同位体標識、及び第２のセンサＦＩＴＣ色素の付着を介するｐＨ検知が含まれる(後者の２つはＰＥＧ鎖の間にある)。シリコン、酸素、炭素、窒素、硫黄、塩素及びフッ素原子は、それぞれ、紫、赤、灰色、青、黄、緑及び淡緑に着色されている。水素原子は、より良好な可視化のために表示されない。
【００１９】
図２は、ＮＰあたりのｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドの数を増加させたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットを示す。
（Ａ〜Ｃ）標準的なＣ'ドット合成プロトコルを使用して(Ａ)、又は高ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン濃度で(Ｂ)、又はｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランと水酸化アンモニウムの両方を高濃度にして(Ｃ)製造された、合成ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム(elugram)を示す。
（Ｄ及びＥ）ペプチドあたり平均で５８個のｃ(ＲＧＤｙＣ)を含む精製されたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム(Ｄ)及びＦＣＳ相関曲線(Ｅ)。
（Ｆ）挿入に示すように、ＮＰあたりのｃＲＧＤＹリガンドの数を変えた場合の、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較。
【００２０】
図３は、ＰＥＧ化の間(左)又は後(右)、アミン基で官能化(機能化)されたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットの特性評価を示す。
（Ａ及びＢ）４サイクルのＧＰＣ精製の前(Ａ)及び後(Ｂ)のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-ＮＨ2-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム ＰＥＧ化の間にアミン基で官能化。
（Ｃ）精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-ＮＨ2-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｄ）ＰＥＧ化の間のアミン官能化有り(赤)及び無し(黒)のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視スペクトルの比較。
（Ｅ及びＦ）精製の前(Ｅ)及び後(Ｆ)のＮＨ2-ｃＲＧＤＹ-ＰＥＧ- Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム ＰＥＧ化の後にアミン官能化。
（Ｇ）精製ＮＨ2-ｃＲＧＤＹ-ＰＥＧ- Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｈ）ＰＥＧ化工程後のアミン官能化有り(赤)及び無し(黒)のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視スペクトルの比較。
【００２１】
図４は、放射性同位体キレート剤を用いたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットの、ＰＰＳＭＩによる表面機能化を示す。
（Ａ及びＢ）精製の前(Ａ)及び後(Ｂ)のＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム、このために、ワンポットＮＰ合成の間に、ＰＥＧ化後に派生したアミン官能化ＮＨ2-ｃＲＧＤＹ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットに、さらにＤＦＯ-ＮＣＳを結合させることにより、ＤＦＯリガンドを導入した。
（Ｃ）精製ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｄ）２つの異なるＤＦＯ-ＮＣＳ濃度を使用して合成した精製ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視スペクトルの比較。
（Ｅ及びＦ）精製の前(Ｅ)及び後(Ｆ)のＤＯＴＡ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ- Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム、このために、ワンポットＮＰ合成の間に、ＰＥＧ化後に派生したアミン官能化ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットに、さらにＤＯＴＡ-ＮＣＳを付着させることにより、ＤＯＴＡリガンドを導入した。
（Ｇ）精製ＤＯＴＡ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット
（Ｈ）２つの異なるＤＯＴＡ-ＮＣＳ濃度を使用して合成した精製ＤＯＴＡ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視スペクトルの比較。ＤＦＯ-ＮＣＳ及びＤＯＴＡ-ＮＣＳキレート剤の化学構造が、（Ａ）及び（Ｅ）にそれぞれ挿入図として示される。
【００２２】
図５は、ＮＰ表面に３種類の機能性リガンドを有する４機能性Ｃ'ドットを示す。
（Ａ）挿入部に示すように、段階的に機能性を増加させたＣ'ドットの比較。
（Ｂ及びＣ）精製ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム(Ｂ)及びフィットを伴うＦＣＳ相関曲線(Ｃ)。
（Ｄ及びＥ）それぞれ、５００ｎｍ(Ｄ)及び６５０ｎｍ(Ｅ)の励起波長による精製ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットの発光スペクトル
（Ｆ）ピークセンサー発光強度(５２５ｎｍ)をピーク参照発光強度(６６０ｎｍ)で割ることによって得られたレシオメトリック較正曲線（対ｐＨ）
（Ａ）に示すＵＶ-可視吸光度スペクトルは、ＮＰ当たりのＦＩＴＣ色素数を推定するために、所望のＦＩＴＣシグナルをＰＢＳバッファー溶液中で測定した。
【００２３】
図６は、ＮＰ表面に４種類の機能性リガンドを有する５機能性Ｃ'ドットを示す。
（Ａ〜Ｃ）５機能性ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの、ＧＰＣエルグラム(Ａ)、ＦＣＳ相関曲線(Ｂ)、及びフィットを伴うＵＶ-可視スペクトル。ＥＦＶ薬物の化学構造は（Ａ）に示される。
（Ｄ〜Ｈ）ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ｄ)、ｃ(ＲＧＤｙＣ)(Ｅ)、ＥＦＶ(Ｆ)、ＤＦＯ(Ｇ)、及びＦＩＴＣ(Ｈ)の寄与へのＵＶ-可視スペクトル(Ｃ)のデコンボリューション。デコンボリューションは、個々の成分それぞれの標準スペクトルのセットを使用して、ＵＶ-可視スペクトル(Ｃ)のフィッティングにより得た（図１２Ｂ〜Ｄ、図１５Ｅ及び図１７Ｃ）。
【００２４】
図７は、多機能性Ｃ'ドットの命名法を示す。３機能性ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットが一例として使用され、その粒子構造の図が、左下に挿入される。
【００２５】
図８は、異なるＮＩＲ色素で機能化された癌ターゲティングｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットを示す。
（Ａ及びＢ）Ｃｙ５.５色素を封入したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットの精製前(Ａ)及び後(Ｂ)のＧＰＣエルグラム。
（Ｃ）精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｄ）ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化有り及び無しのＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度の比較。
（Ｅ及びＦ）Ｃｙ５色素を封入したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＮＰ精製の前(Ｅ)及び後(Ｆ) のＧＰＣエルグラム。
（Ｇ）精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｈ）ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化有り及び無しのＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度の比較。
（Ｉ及びＪ）ＣＷ８００を封入したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-ＣＷ８００-Ｃ'ドットのＮＰ精製の前(Ｉ)及び後(Ｊ) のＧＰＣエルグラム。
（Ｋ）精製ｃＲＧＤＹ-ＰＥＧ-ＣＷ８００-Ｃ'ドットのＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｌ）ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化有り及び無しのＰＥＧ-ＣＷ８００-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度の比較。
６５５ｎｍ(Ｄ)、６５７ｎｍ(Ｈ)及び７９５ｎｍ(Ｌ)付近の異なる吸光度ピークは、異なる種類のＮＩＲ色素の封入が成功したことを示す。
【００２６】
図９は、ＮＰのＰＥＧ化の間に、ｍａｌ-ＰＥＧ-シランを導入することによって調製された多機能性ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの特性評価を示す。
（Ａ及びＢ）精製前(Ａ)及び後(Ｂ)のＧＰＣエルグラム。典型的なＣ'ドットの精製は、２サイクルのＧＰＣ実行により行われるが、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットについては、(Ｂ)に示される所望の製品純度を得るために、合計４サイクルのＧＰＣ実行が必要である。
（Ｃ）精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの代表的なＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｄ）異なるｍａｌ-ＰＥＧ-シラン濃度を使用して合成した、精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較。(Ｄ)における挿入は、ｍａｌ-ＰＥＧ-シランの濃度が増加するにつれて増加する、短波長における吸収を示し、これは、マレイミド基のＮＰ積載が増加していることに起因し得る。
【００２７】
図１０は、ＮＰのＰＥＧ化の間に、ＤＦＯ-シラン及びＤＢＣＯ-ＰＥＧ-シランを導入することによって調製された、多機能性ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット及びｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの特性評価を示す。
（Ａ及びＢ）ＰＥＧ化工程の間に、ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-シランと、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランとの共凝縮によって合成されたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの、精製前(Ａ)及び後(Ｂ)のＧＰＣエルグラム。
（Ｃ）精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの代表的なＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｄ）異なるＤＢＣＯ-ＰＥＧ-シラン濃度を使用して合成した、精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較。
（Ｅ及びＦ）ＰＥＧ化工程の間に、ＤＦＯ-シランと、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランとの共凝縮によって合成されたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの、精製前(Ｅ)及び後(Ｆ)のＧＰＣエルグラム。
（Ｇ）精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの代表的なＦＣＳ相関曲線及びフィット。
（Ｈ）異なるＤＦＯ-シラン濃度を使用して合成した、精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較。ＤＢＣＯ-シラン及びＤＦＯ-ＰＥＧ-シランの化学構造が、（Ａ）及び（Ｅ）にそれぞれ挿入図として示される。単分散のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット、及びｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットが、このアプローチで製造できるが、得られるＮＰは、制限されたリガンドアクセス性と、望ましくないリガンド分布に起因していると思われる弱いコンジュゲーション活性を示した。
【００２８】
図１１は、様々な方法を使用してＤＦＯで機能化したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較を示す。ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットをＤＦＯ-シラン・コンジュゲートと混合すると、得られたＮＰの吸光度スペクトルは、機能化していないｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのものと比較して実質的な差を示さず、低い反応効率を示唆する。さらに、ｃＲＧＤＹペプチドは、ＤＦＯ-ＮＣＳと潜在的に反応可能な第一級アミン基を一つ有する。ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットとＤＦＯ-ＮＣＳによる合成の反応生成物の吸光度スペクトルも、２４５ｎｍ付近に、さらなる吸収特性を示さず、このＤＦＯコンジュゲーションの変換収率が無視できるほどであることを示唆した(結果は、ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド上の第一級アミン基とＤＦＯ-ＮＣＳとの限定的な反応性も示唆する)。これらの実験で得られたＣ'ドットあたりのＤＦＯ基の平均数は、０．５未満である。これと比べて、ＤＦＯ-ＮＣＳを、アミノ-シランを用いたＰＥＧ化後表面修飾反応から派生したアミン官能化ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットと混合すると、Ｃ'ドット最終生成物は、３００ｎｍ未満に実質的な吸光度を示し、有意なＤＦＯの付着を示唆する(較正から、Ｃ'ドットあたりのＤＦＯ分子の平均は〜２０に達する)。これらのデータは、ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット上のＤＦＯ基は、ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド上の第一級アミン基ではなく、主に、ＰＥＧ化後に導入されたアミン基を経て付着していることを示唆する。
【００２９】
図１２は、吸光度スペクトルのデコンボリューションによる、表面に２種以上の機能性リガンドを有する多機能性Ｃ'ドットあたりのリガンド数の推定を示す。
（Ａ）機能性を段階的に増加させたＣ'ドットのＣ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較、それに基づいて、ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの各成分の吸光度スペクトルが生成される（Ｂ〜Ｄ）。Ｃ'ドット表面上のｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドの吸光度シグナル(Ｃにおける緑色の曲線)は、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸収シグナル(Ａにおける緑色の曲線)からＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸収シグナル(Ａ/Ｂにおける赤色の曲線)を差し引くことによって得られる。Ｃ'ドット表面上のＤＦＯキレート剤の吸光度(Ｄにおける青色の曲線)は、ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸収シグナル(Ａにおける青色の曲線)からｃＲＧＤＹ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸収シグナル(Ａにおける緑色の曲線)を差し引くことによって得られる。得られたｃ(ＲＧＤｙＣ)及びＤＦＯのスペクトルは、その後、遊離ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド(Ｃにおける上の緑色の曲線)及びＤＦＯ-シラン分子(Ｄにおける上の青色の曲線)の吸光度と、それぞれ比較され(Ｃ及びＤ)、スペクトルの整合性を確認する。コンジュゲート型ＤＦＯ-シランが、ＮＰ上のＤＦＯとの比較のために、ＤＦＯ-ＮＣＳ分子の代わりに使用された理由は、アミン官能化リガンド(例えば、アミン-シラン)へのＤＦＯ-ＮＣＳの結合が、吸光度スペクトルの実質的な変化をもたらすためである(データは示さない)。それゆえ、ＤＦＯ-シランの吸光度は、遊離ＤＦＯ-ＮＣＳよりも、Ｃ'ドット上のＤＦＯ基とより一致する。ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ｂ)、Ｃ'ドット上のｃ(ＲＧＤｙＣ)(Ｃにおける下の緑色の曲線)、及びＣ'ドット上のＤＦＯ(Ｄにおける下の青色の曲線)の得られた標準スペクトルは、正規化され、その後、他のＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットサンプル(Ｅ)の吸光度スペクトルをフィットさせるための標準として使用された。適合方程式は、様々な成分の吸収強度の線形結合、すなわち、Ｆ(Ａ, Ｂ, Ｃ, Ｄ)＝Ａ*ＩPEG-Cy5-C'ドット＋Ｂ*Ｉc(RGDyC)＋Ｃ*ＩDFO＋Ｄであり、これはサンプルのスペクトルをよく説明する(Ｅ)。パラメータＤは、ＵＶ-可視セットアップの考えられるベースラインのドリフトを補正するために、適合方程式に加えられる。フィッティングは、個々の成分の寄与(Ｆ〜Ｈ)に、サンプルスペクトル(Ｅ)をデコンボリュートし、そこから、ＮＰあたりのＣｙ５、ｃ(ＲＧＤｙＣ)、及びＤＦＯ分子の数が、Ｃｙ５遊離色素、遊離ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド及び遊離ＤＦＯ-シラン分子の吸光係数を用いて、それぞれ約１．６、２３及び４と推定された。Ｃｙ５の吸光係数は、製造者が報告したものを使用し、遊離ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド及び遊離ＤＦＯ-シラン分子の吸光係数のそれぞれの較正は、それぞれ(Ｃ)及び(Ｄ)に挿入した結果を用いて行った。
【００３０】
図１３は、他の種類のコンジュゲーション化学を使用したＰＥＧ化後表面修飾の一般化を示す。
（Ａ〜Ｃ）ＮＰのＰＥＧ化後、精製前に、ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの反応混合物に、チオール-シランを導入することによって合成した、精製チオール官能化ＳＨ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム(Ａ)、ＦＣＳ相関曲線及びフィット(Ｂ)、及びＵＶ-可視吸光度スペクトル(Ｃ)。追加のチオール官能化を行わなかったＮＰと比べて、２５０ｎｍ未満にわずかに増加した吸収が観察された(Ｃ)。
（Ｄ〜Ｆ）チオール-シランの添加後、ＮＰ精製前に、チオール-官能化ＳＨ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの反応混合物に、ＦＩＴＣ-ＮＣＳ色素をさらに導入することによって合成した、精製ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム(Ｄ)、ＦＣＳ相関曲線及びフィット(Ｅ)、及びＵＶ-可視吸光度スペクトル(Ｆ)。チオール-官能化無しのＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを使用して同じように合成したものと比較して、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸収シグナルは、４５０ｎｍ付近の波長で実質的に増加する。
（Ｆ）このシグナルは、ＤＩ水におけるＦＩＴＣ色素の吸光度シグナルと対応し、ＦＩＴＣの付着の成功と、ＳＨ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット上のチオール基のアクセス性を確認する。低いＦＩＴＣシグナルが、チオール-官能化無しのサンプルでも観察されたが、これは、Ｃ'ドットへのＦＩＴＣ色素の非特異的吸収か、又はＣｙ５色素シラン-コンジュゲーション工程で使用した過剰のチオール-シランがもたらした、標準的Ｃ'ドット合成で残ったチオール基に起因していると思われる。
【００３１】
図１４は、アミン官能化多機能性Ｃ'ドットの安定性を示す。ＮＰ製造から６か月後の時点の、精製ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ａ)、及びＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ｂ)のＧＰＣエルグラム。両方のケースにおいて、ＮＰは、安定性試験の間４℃で、ＰＢＳバッファー中で保存された。ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ａ)のエルグラムは、より小さいモル質量の生成物と関連する小さな追加のピークを示し、シリカ表面上の第一級アミン基によって引き起こされたと思われるＮＰ分解を示唆した。これに比べて、ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ｂ)は、安定性試験の全期間にわたり安定であった。
【００３２】
図１５は、ＮＰ表面に３種類の機能性リガンドを有する多機能性Ｃ'ドットの吸光度スペクトルのデコンボリューション示す。
（Ａ）ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット、ｃ(ＲＧＤｙＣ)、ＤＦＯ、及びＦＩＴＣからの吸収シグナルの線形結合を使用して十分にフィットされるＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度スペクトル。デコンボリューションは、図１２のＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットについて記載したのと同様であるが、さらに、解析においてＦＩＴＣのＵＶ-可視シグナルを含む。そのフィットに基づいて、スペクトル(Ａ)を、ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ｂ)、ｃ(ＲＧＤｙＣ)(Ｃ)、ＤＦＯ(Ｄ)、及びＦＩＴＣ(Ｅ)からの寄与にデコンボリュートする。フィットにおけるこれらの寄与から、ＮＰあたりのＣｙ５、ｃ(ＲＧＤｙＣ)、ＤＦＯ、及びＦＩＴＣ分子の数が、それぞれ約１．７、２３、１９及び４と推定される。
【００３３】
図１６は、直交表面機能化によって合成した４機能性Ｃ'ドットの特性評価及び吸光度スペクトルのデコンボリューションを示す。
（Ａ〜Ｃ）４機能性ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの、ＧＰＣエルグラム(Ａ)、フィットを伴うＦＣＳ相関曲線(Ｂ)、デコンボリューションからのフィットを伴うＵＶ-可視スペクトル(Ｃ)、ここでＦＩＴＣ及びＤＦＯ基は、段階的に付着されるのではなく、同時に導入された(図１５の結果との比較)。
（Ｄ〜Ｇ）ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット(Ｄ)、ｃ(ＲＧＤｙＣ)(Ｅ)、ＤＦＯ(Ｆ)、及びＦＩＴＣ(Ｇ)からの寄与への、ＵＶ-可視スペクトル(Ｃ)のデコンボリューション。フィットにおけるこれらの寄与から、ＮＰあたりのＣｙ５、ｃ(ＲＧＤｙＣ)、ＤＦＯ、及びＦＩＴＣ分子の数が、それぞれ、約１．９、２２、４及び３と推定される。
【００３４】
図１７は、５機能性Ｃ'ドットを調製するための小分子治療薬の付着を示す。
（Ａ）ＥＦＶ薬物分子をチオール基で官能化するための、ＥＦＶとアジド-ＰＥＧ-チオールとのコンジュゲーション反応。得られたＥＦＶ-ＰＥＧ-チオール分子は、その後、ＮＰのＰＥＧ化後、ＤＦＯとＦＩＴＣを導入する前に、チオール-エン反応によって、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットに付着された。
（Ｂ）ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット、及び、ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視スペクトルの比較。２つのサンプルは、ＥＦＶ-ＰＥＧ-チオールの添加有り、及び無しで、同じ反応バッチから得られた。
（Ｃ）Ｃ'ドット上のＥＦＶの標準吸光度スペクトル、これは、ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度から、ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度を差し引くことによって得られる。得られたスペクトルは、遊離ＥＦＶ薬物のＵＶ-可視スペクトルと一致し、Ｃ'ドットへのＥＦＶの付着が成功したことを示唆する。遊離ＥＦＶ薬物分子の吸光係数の較正を(Ｃ)に挿入する。
【００３５】
図１８は、ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの特性評価を示す。
（Ａ）異なるＤＢＣＯリガンド数を有する、ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのデコンボリューションフィットを伴う、ＵＶ-可視吸光度スペクトルの比較。
（Ｂ〜Ｇ）粒子あたりそれぞれ、３２(Ｂ、Ｄ、Ｆ)及び６４(Ｃ、Ｅ、Ｇ)のＤＢＣＯ基を有するＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＵＶ-可視吸光度デコンボリューション(Ｂ、Ｃ)、フィットを伴うＧＰＣエルグラム(Ｄ、Ｅ)、及びフィットを伴うＦＣＳ相関曲線(Ｆ、Ｇ)。
【００３６】
図１９は、ＤＢＣＯ-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの特性評価を示す。
（Ａ）デコンボリューションフィットを伴うＵＶ-可視吸光度スペクトル。
（Ｂ）ＵＶ-可視吸光度デコンボリューション。
（Ｃ）フィットを伴うＧＰＣエルグラム。
（Ｄ）フィットを伴うＦＣＳ相関曲線。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本開示は、ナノ粒子(例えば、コア又はコア-シェルナノ粒子)を提供する。様々な例において、前記ナノ粒子は、極小ナノ粒子である。本開示は、前記ナノ粒子を製造する方法及び使用する方法も提供する。
【００３８】
本明細書で提示される範囲はすべて、別段の記載がない限り、少数第十位までの範囲内のすべての値を含む。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、特に断らない限り、用語「基」は、化学構造の文脈で使用される場合、他の化学種に共有結合することができる１つ以上の末端を有する化学実体を指す。基の非限定的且つ例示的な例には、以下のものが含まれる:
【化１】
2020520930.tif 000002
基のさらなる非限定的且つ例示的な例には、以下のものが含まれる:
【化２】
2020520930.tif 000003
【００４０】
本明細書中で使用される場合、特に断らない限り、用語「アルキル」は、分岐又は非分岐飽和炭化水素基を指す。アルキル基の例としてはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基、tert−ブチル基などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アルキル基はＣ1〜Ｃ8であってもよく、アルキル基はそれらの間の全ての整数値の炭素、及び炭素数の範囲(例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、及びＣ8)を含む。アルキル基は置換されていなくてもよいし、１個以上の置換基で置換されていてもよい。置換基の例としては、例えば、ハロゲン(−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ)、脂肪族基(例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基)、アリール基、アルコキシド基、アミン基、カルボキシレート基、カルボン酸、エーテル基、アルコール基、アルキン基(例えば、アセチレニル基)など、及びこれらの組合せなどの様々な置換基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書に開示される技術は、粒子サイズ、粒子サイズ分布、蛍光波長、蛍光輝度、組成、粒子ＰＥＧ化、粒子表面機能化、合成収率、生成物純度、及び製造信頼性を含む、複数の側面において改善された制御を有する微小機能性ＰＥＧ化蛍光シリカナノ粒子への水性合成アプローチを提供する。単一の有機−無機ハイブリッドナノ材料合成システムにおけるこれらの側面を網羅する系統的かつ正確な制御は、これまで達成されておらず、有機−無機ハイブリッドナノ材料の実験室から臨床への安全な橋渡しを妨げている。したがって、本明細書に開示される技術は、ナノ医療用途において有意な可能性を示す、明確に定義され、体系的に調節可能なシリカベースのナノ材料へのアクセスを提供する。
【００４２】
本明細書に開示されるのは、例えば、ＮＰ表面上に１〜５(例えば、１、２、３、４、又は５)種類の異なる機能性リガンドを有する、例えば、本開示のナノ粒子(例えば、超小型の１０ｎｍ未満のＰＥＧ化コア又はコアシェルシリカ又はアルミノシリカナノ粒子)であり得る、ナノ粒子(例えば、コーネルプライムドット(Ｃ'ドット))をモジュール式及び直交式に機能化する多用途表面修飾アプローチである。表面修飾アプローチは、ナノ粒子表面上に配置されたＰＥＧ基中のギャップ、及び、例えば、アミン及び／又はチオール官能化シラン分子(種々の機能性リガンドで機能化されうる)を使用して挿入されたアンカー基を活用する。
【００４３】
一例では、修飾アプローチは、様々な特性（例えば、蛍光検出、特異的細胞標的化、放射性同位体キレート化／標識化、レシオメトリックｐＨ検知、薬物送達、又はそれらの組み合わせ）を単一のＮＰに組み込む５機能性ナノ粒子(例えば、Ｃ'ドット)の合成を提供し、一方、全体のＮＰサイズは、例えば１０ｎｍ未満(例えば、８ｎｍ未満又は７ｎｍ未満)のままである。これは、Ｃ'ドットのＰＥＧ層が小分子に浸透可能であるという事実を利用することによって達成される。
【００４４】
例えば、アミノ及び／又はチオール官能化シラン分子は、ＰＥＧ鎖の間、及びナノ粒子(例えば、Ｃ'ドット)のシリカ表面上に挿入可能であり、これに、続いてさらなる機能性リガンドが付着され得る。挿入によるこのＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)アプローチは、高品質ＮＰ生成を減少させることなく、ワンポット型水系合成におけるナノ粒子(例えば、Ｃ'ドット)のＰＥＧ化と精製との間に挟まれた少数の余分な工程のみを必要とする。追加の機能性を有する得られたナノ粒子(例えば、Ｃ'ドット)は、臨床的に転換されたナノ粒子(例えば、Ｃドット)に近い物理化学的特性(例えば、サイズ及びＰＥＧ密度)を示し、それらの臨床用途の多様化へのゲートを開く。ナノ粒子合成(例えば、Ｃ'ドット合成)の改変は、例えば、粒子当たり多数の標的化ペプチドを可能にし、且つ、個々の成分への吸収スペクトルのデコンボリューションによって、異なる表面リガンドの具体的な数を定量的に評価するための容易かつ汎用性のある分光アプローチを可能にする。
【００４５】
一態様では、本開示は、機能性ナノ粒子(例えば、極小機能性ナノ粒子)を作製する方法を提供する。本方法は例えば、本明細書で説明されるＰＰＳＭＩアプローチのようなＰＰＳＭアプローチを含むことができる。この方法は、水性反応媒体(例えば、水)の使用に基づく。一例では、本開示のナノ粒子(単数又は複数)(例えば、ナノ粒子組成物)は、本開示の方法によって作製される。
【００４６】
本方法は、２〜１５ｎｍ(例えば、２〜１０ｎｍ)のナノ粒子(例えば、最長寸法などが、このサイズであるもの)と、少なくとも１つの反応基を有する１つ以上の機能化前駆体(官能化前駆体)との反応に基づき、前記ナノ粒子は、複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基を有する１０ｎｍ未満のサイズ(例えば、２〜９．９９ｎｍサイズ)の超小型ナノ粒子であってもよく、そのいくつか又は全ては、ナノ粒子の表面に共有結合された１つ以上の機能基(あるいは反応して、機能基を形成することができる基)で機能化されていてもよい(これは、ＰＥＧ化ナノ粒子とも呼ばれる)。ナノ粒子の表面に共有結合した１つ以上の反応基を有する得られたナノ粒子は続いて、反応基と反応する機能基前駆体と反応し、ナノ粒子の表面に共有結合した１つ以上の機能基を有するナノ粒子を生じる。
【００４７】
この方法は、「ワンポット」反応であってもよい。この方法はまた、個々の反応を含み得る。個々の反応は、同じ又は異なる反応物(例えば、ナノ粒子、機能化前駆体、機能基前駆体、溶媒など、及びそれらの様々な組み合わせ)との反応混合物を有する可能性がある。ナノ粒子は、任意の個々の反応の間で単離することができる。
【００４８】
一例では、ＰＥＧ化ナノ粒子を、１つ以上の機能化前駆体及び１つ以上の機能基前駆体と反応させる。反応はナノ粒子が最初に少なくとも１つの機能化前駆体と反応する限り、任意の順序で行うことができる。例えば、単一タイプの反応基を有するナノ粒子を、１つ以上の機能基前駆体と反応させる。別の例では２つ以上の構造的及び／又は化学的に異なる反応基(例えば、２、３、４、又は５つの構造的及び／又は化学的に異なる反応基)を有するナノ粒子を、２つ以上の異なる機能基前駆体(例えば、２、３、４、又は５つの構造的及び／又は化学的に異なる機能基前駆体)と反応させ、この際、個々の反応基／機能基前駆体は直交反応性を有する可能性がある。
【００４９】
様々なコンジュゲーション化学／反応を使用して、機能基をナノ粒子の表面に共有結合させることができる。したがって、機能化前駆体は、様々な反応基を有することができる。多数の適切なコンジュゲーション化学及び反応が、当該分野で公知である。種々の例において、反応基は当該分野で公知の特定のコンジュゲーション化学又は反応において反応するものであり、そして機能基前駆体は、当該分野で公知の特定のコンジュゲーション化学／反応の相補的基を有する。
【００５０】
機能化前駆体は１つ以上の反応基と、ナノ粒子の表面と反応して共有結合を形成することができる基(例えば、シラン基)とを含む。反応基は、機能基前駆体と反応して、ナノ粒子の表面に共有結合した機能基を形成することができる。反応基の非限定的な例としては、アミン基、チオール基、カルボン酸基、カルボキシレート基、エステル基(例えば、活性化エステル基)、マレイミド基、アリル基、末端アルキン基、アジド基、チオシアネート基、及びそれらの組合せが挙げられる。機能化前駆体の例は当技術分野で公知であり、市販されているか、又は当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。
【００５１】
様々な例において、機能化前駆体は、１つ以上の−Ｓｉ−ＯＨ基(例えば、１、２、又は３個のＳｉ−ＯＨ基) を含むシラン基及び少なくとも１つの反応基(例えば、１、２、又は３個の反応基)を含む。シラン基及び反応基は、連結基、例えば、アルキル基(例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、又はＣ8アルキル基)を介して共有結合されてもよい。いかなる特定の理論に束縛されることも意図しないが、機能化前駆体のＳｉ−ＯＨ基は、ナノ粒子の表面水酸基(例えば、表面Ｓｉ−ＯＨ基)と反応すると考えられる。
【００５２】
ナノ粒子(単数又は複数)を反応させて、様々な数の反応基及び／又は機能基を形成することができる。例えば、ナノ粒子を反応させて、ナノ粒子の表面に共有結合された１〜１００個の反応基及び／又は機能基(それらの間の全ての整数の反応基及び／又は範囲を含む)を形成する(例えば、複数のナノ粒子を反応させて、ナノ粒子あたり、平均１〜１００個の基及び／又は機能基(それらの間の全ての整数の反応基及び範囲を含む)を形成する)。様々な例において、ナノ粒子(単数又は複数)を反応させて、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、又は５０〜１００個の基及び／又は機能基を形成することができる(例えば、複数のナノ粒子を反応させて、ナノ粒子のそれぞれの表面に共有結合した、平均２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、又は５０〜１００個の基及び／又は機能基を形成することができる)。所望の数の基及び／又は機能基を形成するための反応条件(反応物濃度、反応時間、反応温度など、又はそれらの組合せ)を決定することは、当業者の範囲内である。
【００５３】
機能基前駆体は、ナノ粒子の反応基と反応して、ナノ粒子の表面に共有結合した機能基を形成することができる。機能基前駆体は、機能基(例えば、色素分子、キレート剤分子、標的化分子などに由来し得る、色素基、キレート剤基、標的化基、薬物基、放射性標識／同位体基など)及びナノ粒子の反応基と反応し得る基を有する。反応基と反応する基の非限定的な例としては、アミン基、チオール基、カルボン酸基、カルボキシレート基、エステル基(例えば、活性化エステル基)、マレイミド基、アリル基、末端アルキン基、アジド基、チオシアネート基、及びそれらの組合せが挙げられる。様々な例において、機能基前駆体は、当技術分野で公知の特定のコンジュゲーション化学又は反応において反応する１つ以上の基を有する(例えば、機能基前駆体は、当技術分野で公知のクリックケミストリーなどの特定のコンジュゲーション化学／反応において、例えば末端アルキンなどのナノ粒子の反応基に相補的な１つ以上の基(例えば、アジドなど)を含む)。機能基前駆体の例は当技術分野で公知であり、市販されているか、又は当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。
【００５４】
様々な機能基が当技術分野で知られている。機能基はまた、本明細書中ではリガンドと称され得る。機能基は様々な機能性(例えば、イメージング、センサー機能(例えば、ｐＨ検知、イオン検知、酸素検知、生体分子検知、温度検知など)のために使用され得る、例えば、蛍光及びリン光などの吸収／放出挙動、キレート化能力、標的化能力(例えば、抗体フラグメント、アプタマー、タンパク質／ペプチド(天然、切断型、又は合成)、核酸(例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡなど)、診断能力(例えば、放射性同位体)、治療能力(例えば、薬物、核酸など)、及びこれらの組合せを有する。機能基は、画像化機能及び治療機能の両方を有し得る。機能基は、コンジュゲーション化学及び当技術分野で公知の反応を用いて化合物を誘導体化することによって、機能性を示す化合物から形成することができる。
【００５５】
ナノ粒子によって担持される機能基は、診断剤及び／又は治療剤(例えば、放射性同位体、薬物、核酸など)を含むことができる。ナノ粒子は、異なる機能基の組合せを含んでもよい。
【００５６】
薬物であり得る治療剤の非限定的な例としては、化学療法剤、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、及びそれらの組合せ、ならびにそれらに由来する基が挙げられるが、これらに限定されない。適切な薬物／薬剤の例は、当技術分野で公知である。
【００５７】
ナノ粒子は様々な色素(例えば、様々な色素から形成される機能基)を含むことができる。種々の例において、色素は有機色素である。一例では、色素は金属原子を含まない。色素の非限定的な例としては、蛍光色素(例えば、近赤外(ＮＩＲ)色素)、リン光色素、非蛍光色素(例えば、１％未満の蛍光量子収率を示す非蛍光色素)、蛍光タンパク質(例えば、ＥＢＦＰ２(青色蛍光タンパク質の変異体)、ｍＣＦＰ(シアン蛍光タンパク質)、ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質)、ｍＣｈｅｒｒｙ(赤色蛍光タンパク質の変異体)、ｉＲＦＰ７２０(近赤外蛍光タンパク質))、及びこれらに由来する基が挙げられる。種々の例において、色素は、電磁スペクトルのＵＶ可視部分において吸収を示す。種々の例において、色素は電磁スペクトルの近赤外線部分(例えば、６５０〜９００ｎｍ)において励起及び／又は発光を有する。
【００５８】
有機色素の非限定的な例としては、シアニン色素(例えば、Ｃｙ５(登録商標)、Ｃｙ３(登録商標)、Ｃｙ５.５(登録商標)、Ｃｙ７(登録商標)など)、カルボローダミン色素(例えば、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ(ＡＴＴＯ−ＴＥＣ及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ(登録商標)から入手可能)、ＢＯＤＩＰＹ色素(例えば、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５など)、キサンテン色素(例えば、フルオレセイン色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ローズベンガルなど)、エオシン(例えば、エオシンＹなど)、及びローダミン(例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン(ＴＭＲ)、ＴＲＩＴＣ、ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)６３３、Ａｌｅｘａ ６３３、ＨｉＬｙｔｅ ５９４など)、Ｄｙｏｍｉｃｓ(登録商標)ＤＹ８００、Ｄｙｏｍｉｃｓ(登録商標)ＤＹ７８２及びＩＲＤｙｅ(登録商標)８００ＣＷなど、及びこれらに由来する基が挙げられる。
【００５９】
ナノ粒子は、様々な検知基(センサー基)を有することができる。検知基の非限定的な例には、ｐＨ検知基、イオン検知基、酸素検知基、生体分子検知基、温度検知基などが含まれる。適切な検知化合物／基の例は、当技術分野で知られている。
【００６０】
ナノ粒子は、様々なキレート基を有することができる。キレート基の非限定的な例には、デスフェロキサミン(ＤＦＯ)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(ＤＯＴＡ)、1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリ酢酸(ＮＯＴＡ)、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、ポルフィリンなど、及びそれらから誘導される基が含まれる。キレート基は、放射性同位体を含んでもよい。放射性同位体の例は本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。
【００６１】
放射性同位体は機能基であり得る。放射性同位体は、診断剤及び／又は治療剤であり得る。例えば、124Ｉのような放射性同位体は、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)に使用される。放射性同位体の非限定的な例には、124Ｉ、131Ｉ、225Ａｃ、177Ｌｕなどが含まれる。放射性同位体は、キレート基にキレート化され得る。
【００６２】
標的化基はまた、ナノ粒子(単数又は複数)の標的化送達を可能にするために、ナノ粒子にコンジュゲートされてもよい。標的化基は、標的化分子から形成され得る(派生し得る)。例えば、特定の細胞型に関連する細胞成分(例えば、細胞膜上の又は細胞内コンパートメント中の)に結合することができる標的化基が、ナノ粒子にコンジュゲートされる。標的化基は、腫瘍マーカー又はシグナル伝達経路における分子であり得る。標的化基は、特定の細胞型(例えば、腫瘍細胞など)に対して特異的結合親和性を有し得る。特定の例では、標的化基は、ナノ粒子を特定の領域、例えば、肝臓、脾臓、脳などに誘導するために使用され得る。イメージングは、個体におけるナノ粒子の位置を決定するために使用され得る。標的化基の例としては、線状及び環状ペプチド(例えば、αvβ3インテグリン標的化環状(アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、チロシン−システイン)ペプチド、ｃ(ＲＧＤｙＣ)など)、抗体フラグメント、種々のＤＮＡ及びＲＮＡセグメント(例えば、ｓｉＲＮＡ)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「誘導された(派生した)」は特に明記しない限り、化合物の天然の官能基の反応による基の形成(例えば、化合物のアミンと、カルボン酸との反応による基の形成)、又は化合物(反応して基を形成する)上に新しい化学反応基を導入するための化合物の化学修飾を指す。
【００６４】
本明細書に記載される方法は、生成物の質に実質的な変化を生じることなく、例えば、１０ｍＬの反応から１０００ｍＬ以上へ、直線的にスケールアップされてもよい。この拡張性は、ナノ粒子の大規模製造にとって重要である。
【００６５】
前記方法は、水性反応媒体(例えば、水)中で実施される。例えば、前記水性媒体は水を含む。ある反応物が、極性非プロトン性溶媒(例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ)による溶液として、様々な反応混合物に添加される。様々な例において、前記水性媒体は、極性非プロトン性溶媒以外の有機溶媒（例えば、Ｃ1〜Ｃ6アルコールなどのアルコール）を、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上含まない。ある例では、前記水性媒体は、アルコールを１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は５％以上含まない。ある例では、前記水性媒体は、検出可能なアルコールを含まない。例えば、本明細書に開示される任意の方法の任意の工程の反応媒体は、本質的に水、及び任意で極性非プロトン性溶媒からなる。
【００６６】
前記方法の様々な時点で、ｐＨを所望の値又は所望の範囲内に調節することができる。前記反応混合物のｐＨは、塩基の添加によって高めることができる。適切な塩基の非限定的な例には、水酸化アンモニウムが含まれる。
【００６７】
様々なナノ粒子が使用できる。ナノ粒子の非限定的な例として、シリカナノ粒子及びアルミノシリケートナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子は、コア-シェルナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、ポリエチレングリコール基で表面機能化されていてもよく(例えば、ＰＥＧ化)、そのいくつか又は全ては、共有結合された１つ以上の機能基（あるいは反応して、機能基を形成することができる基）で機能化されていてもよい)。ナノ粒子は、反応して、機能基を形成することができる基を有するＰＥＧ基を含んでもよい。これらのナノ粒子は、１つ以上の機能基で機能化されてもよい。例えば、機能化リガンド(機能基前駆体)は、ＰＥＧ基の反応基と反応する。ナノ粒子合成後のＰＥＧ基の機能化のための適切な反応化学及び条件の例は、当該分野で公知である。適切なナノ粒子及びそのようなナノ粒子の作製方法は、２０１７年１１月２日に出願された米国特許出願第１５/５７１，４２０号に開示されており、そのようなナノ粒子及び方法に関するその開示は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００６８】
例えば、ナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面(ポリエチレングリコール基で表面機能化[すなわち、ＰＥＧ化]されていてもよい)を作製する方法には、
ａ）室温(地域に応じて、例えば１５℃〜２５℃)で、水とＴＭＯＳ(シリカコア形成モノマー)を含む(例えば、１１ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度で)反応混合物を形成すること、ここで、当該反応混合物のｐＨ(例えば、水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して調整できる)は６〜９である(これが、平均径[例えば、最長寸法]が、例えば１ｎｍ〜２ｎｍであるコア前駆物質ナノ粒子の形成をもたらす)；
ｂ）ｉ）前記反応混合物を、ある時間(ｔ1)及び温度(Ｔ1)で保持(例えば、室温〜９５℃[Ｔ1]で０．５日〜７日[ｔ1])することにより、平均径(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍであるナノ粒子(コアナノ粒子)を形成するか、又は
ii）前記反応混合物を、必要に応じて室温まで冷却し、及び、ａ）で得られた反応混合物に、シェル形成モノマー(例えば、オルトケイ酸テトラエチル、ＴＭＯＳ以外の、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳなど)を添加する(前記添加は、シェル形成モノマー濃度が二次核形成の閾値未満となるように行われる)ことによって、平均径(例えば、最長寸法)が２〜５０ｎｍ(例えば、２〜１５ｎｍ)のコア-シェルナノ粒子を形成すること；
ｃ）必要に応じて、ｂ）ｉ）で又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨを、ｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）任意で(コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子をＰＥＧ化する場合)、ｂ）ｉ）の又はｂ）ii）のコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(シラン基に共有結合したＰＥＧ基を有する)(例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度で)(例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中に溶解されたＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を添加し、及び、得られた反応混合物をある時間(ｔ2)及び温度(Ｔ2)で保持(例えば、室温[Ｔ2]で０．５分〜２４時間[ｔ2])すること(これによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部がｂ）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着する)；
ｅ）ｄ）の混合物をある時間 (ｔ3)及び温度(Ｔ3)で加熱する(例えば、４０〜１００℃[Ｔ3]で１時間〜２４時間[ｔ3])ことによって、ポリエチレングリコール基で表面機能化(官能化)されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること、
が含まれる。
【００６９】
前記ナノ粒子は、合成後の処理工程にかけられてもよい。例えば、合成後(例えば上記例のｅ)の後)、溶液を室温まで冷まし、その後透析膜チューブ(例えば、分子量カットオフ[分画分子量]が１０，０００であり、市場で入手可能な(例えば、Ｐｉｅｒｃｅから)透析膜チューブ)に移す。透析チューブに入れた溶液を、ＤＩ-水(水の容積は、反応容積より２００倍以上大きい、例えば、１０ｍＬの反応に対して２０００ｍＬの水)で透析し、水を１〜６日間毎日交換し、残存試薬、例えば水酸化アンモニウムと遊離シラン分子を洗い流す。前記粒子を、その後２００ｎｍのシリンジフィルター(fisher brand)を通してろ過し、凝集物又はダストを除去する。必要であれば、さらに高純度の合成粒子(例えば、未反応試薬又は凝集塊が１％以下)を保証するために、さらなる精製プロセス(ゲル浸透クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含む)を、前記ナノ粒子に適用してもよい。任意の精製プロセス後、もし他の溶媒を更なるプロセスで使用するのであれば、精製されたナノ粒子を脱イオン水に戻してもよい。
【００７０】
前記コアはシリコンコアであってもよい。シリコンコア形成で使用される反応混合物は、唯一のシリコンコア形成モノマーとして、ＴＭＯＳを含んでもよい。
【００７１】
前記コアはアルミノシリケートコアであってもよい。アルミノシリケートコア形成で使用される反応混合物は、唯一のシリコンコア形成モノマーとしてＴＭＯＳを、及び一以上のアルミナコア形成モノマー(例えば、アルミニウムアルコキシド、例えば、アルミニウム-tri-sec-ブトキシド又は複数のアルミニウムアルコキシドの組み合わせなど)を含むことができる。
【００７２】
アルミノシリケートコア合成の場合、反応混合物のｐＨは、アルミナコア形成モノマーを添加する前に、ｐＨ１〜２に調節される。アルミノシリケートコア形成後、溶液のｐＨは、ｐＨ７〜９に調節され、そして任意で、１００〜１，０００ｇ/ｍｏＬの分子量(その間の全ての整数値及び範囲を含む)のＰＥＧを、１０ｍＭ〜７５ｍＭの濃度(その間の全ての整数値及び範囲を含む)で、前記反応混合物のｐＨをｐＨ７〜９に調節する前に前記反応混合物に添加する。
【００７３】
コアナノ粒子を形成するために使用される反応混合物は、色素前駆物質を含んでもよい。この場合、得られたコア又はコア-シェルナノ粒子は、その中に被包された又は取り込まれた一以上の色素分子を有する。例えば、コアナノ粒子は、その中に被包された、１，２，３，４，５，６，又は７つの色素分子を有する。色素前駆物質の混合物を使用してもよい。前記色素前駆物質は、シランにコンジュゲートした色素である。例えば、マレイミド官能基を有する色素が、チオール官能基を有するシランにコンジュゲートされる。別の例では、ＮＨＳエステル官能基を有する色素が、アミン官能基を有するシランにコンジュゲートされる。適切なシランとコンジュゲーション化学の例は、当該分野において既知である。前記色素は、波長４００ｎｍ(青)〜８００ｎｍ(近赤外)の発光(例えば、蛍光)を有してもよい。例えば、前記色素はＮＩＲ色素である。適切な色素の例が本明細書中に記載される。様々な例において、ポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子又はポリエチレングリコール基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子は、その中に被包された一以上の蛍光色素分子を有する。
【００７４】
シリカシェルは、前記コアナノ粒子上に形成されることができる。シリカシェルは、例えばコア形成が完了した後、形成される。シリカシェル形成前駆物質の例には、オルトケイ酸テトラアルキル(例えば、ＴＥＯＳ及びＴＰＯＳなど)が含まれる。シリカシェル形成前駆物質の混合物を使用してもよい。ＴＭＯＳは、シリカシェル形成前駆物質ではない。シリカシェル形成前駆物質は、極性非プロトン性溶媒による溶液として、前記反応混合物に添加されてもよい。適切な極性非プロトン性溶媒の例として、ＤＭＳＯ及びＤＭＦが挙げられる。
【００７５】
シリカシェル形成前駆物質は別々のアリコートで添加することが望ましい。例えば、前記シェル形成モノマー(単数又は複数)を、別個のアリコート(例えば、４０〜５００アリコート)で添加する。前記アリコートは、一以上のシェル形成前駆物質(例えば、ＴＥＯＳ及び／又はＴＰＯＳ)と極性非プロトン性溶媒(例えば、ＤＭＳＯ)を含むことができる。各アリコートは、１〜２０マイクロモルのシェル形成モノマーを有することができる。アリコートを添加する間隔は、１〜６０分(その間の全ての整数の分の値と範囲を含む)とすることができる。反応混合物のｐＨは、シリカシェル形成プロセスの間に変動し得る。ｐＨを７〜８に維持するためにｐＨを調節することが望ましい。
【００７６】
コア又はコア-シェルナノ粒子形成後、前記コア又はコア-シェルナノ粒子を、一以上のＰＥＧ-シラン・コンジュゲートと反応させてもよい。様々なＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを、一緒に又は様々な順番で添加することができる。このプロセスは本明細書においてＰＥＧ化とも称される。ＰＥＧ-シランの変換率は５％と４０％の間であり、ポリエチレングリコールの表面密度は、ｎｍ2あたり１．３〜２．１のポリエチレングリコール分子である。リガンド機能化ＰＥＧ-シランの変換率は４０〜１００％であり、各粒子と反応するリガンド機能化ＰＥＧ-シラン前記物質の数は３〜９０である。
【００７７】
ＰＥＧ化は様々な時間と温度で実施することができる。例えば、シリカコア又はコア-シェルナノ粒子の場合は、ＰＥＧ化は室温で０．５分から２４時間(例えば一晩)ナノ粒子と接触させることによって実施できる。例えば、アルミナ-シリケートナノ粒子(例えば、アルミナ-シリケートコアナノ粒子、又はシリカコア・シリカシェルナノ粒子)の場合、温度は８０℃で一晩である。
【００７８】
ＰＥＧ-シランのＰＥＧ基の鎖長(すなわち、ＰＥＧ基の分子量)は、３〜２４のエチレングリコールモノマー(例えば、３〜６、３〜９、６〜９、８〜１２、又は８〜２４のエチレングリコールモノマー)に調節されてもよい。ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長は、粒子を取り囲むＰＥＧ層の厚みとＰＥＧ化粒子の薬剤動態特性を調節するために選択できる。リガンド-機能化ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長は、粒子のＰＥＧ層の表面上のリガンド基のアクセス性(露出度)(これにより結合性能及び標的指向性能が変化する)を調節するために使用することができる。
【００７９】
ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートは、リガンドを含むことができる。リガンドは、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのＰＥＧ基に共有結合する(例えば、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのヒドロキシ末端を通じて)。前記リガンドは、シラン基にコンジュゲートした末端と反対側のＰＥＧ基の末端にコンジュゲートできる。ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートは、ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物(例えば、マレイミド官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ、ＮＨＳエステル官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ、アミン官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ、チオール官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧなど)を使用して形成することができる。適切なリガンド(機能基)の例が、本明細書中に記載される。
【００８０】
例えば、リガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを、ＰＥＧ-シランに加えて添加する(例えば、上記例のｄ)で)。この場合、リガンドを含むポリエチレングリコール基及びポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基及びリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子、が形成される。リガンド-機能化又は反応基-機能化ＰＥＧ-シランの変換率は４０〜１００％であり、各粒子と反応するリガンド-機能化ＰＥＧ-シラン前駆物質の数は３〜６００である。
【００８１】
例えば、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを添加(例えば、上記例のｄ)で) する前後(例えば、２０秒〜５分前又は後)に、リガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを(例えば、０．０５ｍＭ〜２．５ｍＭの間の濃度で)、室温で、前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物(例えば、上記例のｂ)ｉ)又はｂ)ii)から得られたもの)に添加する。得られた反応混合物を、ある時間(ｔ4)と温度(Ｔ4)で(例えば、室温[Ｔ4]で０．５分から２４時間[ｔ4])保持し、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部を、前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子(例えば、上記例のｂ)から得られたもの)の表面の少なくとも一部に吸着させる。続いて、前記反応混合物を、ある時間(ｔ5)と温度(Ｔ5)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ5]で１時間〜２４時間[ｔ5])加熱し、リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。任意で、その後に、得られた反応混合物(リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を含む反応混合物)に、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(リガンド無しのＰＥＧ-シランの濃度は１０ｍＭ〜７５ｍＭの間)(例えば、極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなど]に溶解したＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を室温で添加し、得られた反応混合物をある時間(ｔ6)と温度(Ｔ6)で(例えば、室温[Ｔ6]で０．５分〜２４時間[ｔ6])保持する(それによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部が、リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子の表面の少なくとも一部、又はリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子の少なくとも一部に吸着される)、及び、得られた混合物をある時間(ｔ7)と温度(Ｔ7)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ7]で１時間〜２４時間[ｔ7])加熱し、それによって、ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。
【００８２】
別の例では、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ基の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン基コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、それにより、反応基を有するポリエチレングリコール基、及び任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。任意で、ポリエチレングリコール基を、第二反応基(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び、任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び任意で、ポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。
【００８３】
別の例では、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ基の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン基コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を任意で有するポリエチレングリコール基、及び任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基、及び任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成した後、第二反応基(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び、任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び任意で、ポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成し、ここで、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部はＰＥＧ基の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン基コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を有するポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又は反応基を有するポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の形成後、前記反応基を、ある反応基で機能化された第二リガンド(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、ポリエチレングリコール基と第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、ポリエチレングリコール基と第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子、リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基と第二リガンドで機能化されたリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。
【００８４】
前記ナノ粒子は、狭い粒度分布を有することができる。様々な例において、前記ナノ粒子の粒度分布(ＰＥＧ化の前又は後)(これは、外来性物質、例えば、未反応試薬、ダスト粒子/凝集物などを含まない)は、平均粒径(例えば、最長寸法)＋/−５，１０，１５，又は２０である。粒径は、当該分野で既知の方法で測定できる。例えば、粒径は、ＴＥＭ、ＧＰＳ、又はＤＬＳで決定される。ＤＬＳは、系統偏差を含み、それゆえ、ＤＬＳ粒度分布は、ＴＥＭ又はＧＰＳによって決定される粒度分布と相関しないかもしれない。
【００８５】
ナノ粒子は、機能基以外の色素分子に由来する１つ以上の基(例えば、ナノ粒子当たり１〜７個の色素)を含んでもよい。例えば、本明細書中に記載されるような色素分子又は色素分子の誘導体は、ナノ粒子のネットワークに(例えば、色素前駆物質の部分であり得るリンカー部分を介して)共有結合される。得られた共有結合色素基は、元の色素分子に由来する。色素分子から誘導される基の例示的な非限定的な例は、本明細書に記載される。一実施例では、ゾル-ゲルシリカ前駆体(例えば、Ｒがアルキル基である-Ｓｉ(ＯＲ)3基)にコンジュゲートされた色素を含む色素前駆物質を使用して、色素がシリカ又はアルミノシリケートネットワークに組み込まれる。
【００８６】
一面では、本開示は、本開示のナノ粒子を含む組成物を提供する。前記組成物は、一以上の種類を含むことができる(例えば、異なる平均径及び／又は一以上の異なる組成的特徴を有する)。該組成物はＮＰ表面上に配置された(例えば、共有結合された)１〜５(例えば、１、２、３、４、又は５)種類の異なる機能性リガンドを有する機能性ナノ粒子を含むことができる。例えば、５機能性ナノ粒子(例えば、Ｃ'ドット)は、様々な特性、すなわち、蛍光検出、特異的細胞標的化、放射性同位体キレート化／標識化、レシオメトリックｐＨ検知、及び薬物送達を単一のＮＰに統合するが、全体のＮＰサイズは７ｎｍ未満のままである)。
【００８７】
例えば、組成物は、複数のコアナノ粒子及び／又はコア-シェルナノ粒子(例えば、シリカコアナノ粒子、シリカコア-シェルナノ粒子、アルミノシリケートコアナノ粒子、アルミノシリケートコア-シェルナノ粒子)を含む。ナノ粒子は、１種以上のポリエチレングリコール基(例えば、ポリエチレングリコール基、機能化[例えば、一以上のリガンド及び／又は反応基で機能化された]ポリエチレングリコール基、又はそれらの組み合わせ)で表面機能化されていてもよい。ナノ粒子は、その中に被包された一つの色素又は複数の色素の組み合わせ(例えば、ＮＩＲ色素)を有していてもよい。色素分子は、ナノ粒子に共有結合される。前記ナノ粒子は、本開示の方法によって作製できる。
【００８８】
組成物中のナノ粒子は、様々な大きさを有することができる。前記ナノ粒子は、２〜１５ｎｍのコアサイズ(その間の全ての０．１ｎｍの値及び範囲を含む)を有することができる。様々な例において、前記ナノ粒子は、２，２．５，３，３．５，４，４．５，５，５.５，６，６．５，７，７．５，８，８．５，９，９．５，１０，１０．５，１１，１１．５，１２，１２．５，１３，１３．５，１４，１４．５又は１５ｎｍのコアサイズを有する。様々な例において、前記ナノ粒子(例えば、コア及び／又はコア-シェルナノ粒子)の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、２〜１５ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有する。前記ナノ粒子は、極小ナノ粒子であってもよい。様々な例において、極小ナノ粒子(例えば、極小コア及び／又はコア-シェルナノ粒子)は、１０ｎｍ以下の大きさを有する(例えば、２〜８ｎｍ又は２〜７ｎｍ)。様々な例において、前記極小粒子(例えば、極小コア及び／又はコア-シェルナノ粒子)の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、１０ｎｍ以下の大きさ(例えば、最長寸法)を有する(例えば、２〜８ｎｍ又は２〜７ｎｍ)。代表的な粒度分布の場合、前記組成物は、粒径判別(粒径選択/除去)プロセス(例えば、ろ過、透析、クロマトグラフィー(例えば、ＧＰＣ)、遠心分離など)にかけられなくてよい。例えば、本開示のナノ粒子は、前記組成物の唯一のナノ粒子である。
【００８９】
前記組成物は、さらなる成分を含んでもよい。例えば、前記組成物は、個体(例えば、哺乳類、例えばヒト)に投与するために適切なバッファーも含むことができる。前記バッファーは、薬学的に許容できるキャリアでもよい。
【００９０】
前記組成物は、合成された際、そして合成後の加工/処理の前に、ナノ粒子、粒子(２〜１５ｎｍ)、ダスト粒子/凝集物(＞２０ｎｍ)、未反応試薬(＜２ｎｍ)を有してもよい。
【００９１】
一面では、本開示は、本開示のナノ粒子及び組成物の使用を提供する。例えば、ナノ粒子又はナノ粒子を含む組成物は、治療(例えば、送達)及び／又は診断(例えば、イメージング)方法で使用される。
【００９２】
ナノ粒子によって運ばれるリガンド(機能基)は、診断及び／又は治療薬(例えば、薬物)を含んでもよい。治療薬の例には、化学療法剤、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。親和性リガンドが前記ナノ粒子にコンジュゲートされ、ナノ粒子の標的化送達を可能にしてもよい。例えば、前記ナノ粒子は、特定の細胞型に関連する細胞成分(例えば、細胞膜上の又は細胞内コンパートメント中の)に結合する能力のあるリガンドにコンジュゲートされる。標的にされる分子は、腫瘍マーカー又はシグナル伝達経路の分子であってもよい。前記リガンドは、ある細胞型(例えば、腫瘍細胞など)に特異的に結合する親和性を有してもよい。ある例では、前記リガンドは、ナノ粒子を特定のエリア、例えば、肝臓、脾臓、脳などに導くために使用されてもよい。個体におけるナノ粒子の位置を決定するためにイメージングが使用できる。
【００９３】
前記ナノ粒子又はナノ粒子を含む組成物は、例えば、薬学的に許容できるキャリア(前記ナノ粒子を体の一つの器官又は部分から、体の別の器官又は部分に輸送するのを促進するもの)内に含まれて、個体に投与されてもよい。個体の例には、ヒト及び非ヒト動物などの動物が含まれる。個体の例には哺乳類も含まれる。
【００９４】
薬学的に許容できるキャリアは、一般的に水性である。薬学的に許容できるキャリアで使用できる物質の例には、糖(例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース)；デンプン(例えば、コーンスターチ及びポテトスターチ)；セルロース、及びその誘導体(例えばカルボキシメチル・セルロース・ナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース)；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤(例えば、ココアバター及び坐剤ワックス)；油(例えば、ピーナツ油、綿実油、サフラワー油、セサミ油、オリーブ油、コーン油、大豆油)；グリコール(例えば、プロピレングリコール)；ポリオール(例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール)；エステル(例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル)；アガー；緩衝剤(例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム)：アルギン酸；発熱物質非含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；及び製薬処方で採用される他の非毒性の適合物質が含まれる(REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975)参照)。例えば、非毒性であるさらなる適切なキャリア又は賦形剤として、バッファー(例えば、酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸)；抗酸化剤(アスコルビン酸及びメチオニンが挙げられる)、保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど)；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン(例えば、メチル又はプロピルパラベンなど)；カテコール；レゾルシノール：シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール；アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなど)；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物(グルコース、マンノース、又はデキストリンが挙げられる)；キレート剤(例えば、ＥＤＴＡなど)；等張化剤(tonicifier；例えば、トレハロース及び塩化ナトリウムなど)；糖類(例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなど)；界面活性剤(例えば、ポリソルベートなど)；塩形成対イオン(例えば、ナトリウムなど)；及び／又は非イオン性界面活性剤(例えば、Tween又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)など)等が挙げられる。医薬組成物は、他の治療剤を含んでもよい。
【００９５】
本ナノ粒子を含む組成物は、任意の適切なルートで、単独で又は他の剤と組み合わせて、個体に投与できる。投与は、任意の手段、例えば、非経口的、粘膜、肺、局所、カテーテルを使用した、又は経口的手段による送達などによって、達成できる。非経口的送達には、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、及び臓器の組織への注射が含まれる。粘膜送達には、例えば、鼻腔内送達が含まれる。肺送達には、薬物の吸入が含まれる。カテーテルを使用する送達には、イオン注入カテーテル系送達による送達が含まれる。経口送達には、腸溶性剤による送達、又は経口での液体の投与が含まれる。経皮送達には、皮膚パッチの使用による送達が含まれる。
【００９６】
本ナノ粒子を含む組成物の投与後、ＮＰの経路、位置、及びクリアランスを、一以上の画像処理技術を使用してモニターできる。適切な画像処理技術の例には、Artemis Fluorescence Camera Systemが含まれる。
【００９７】
本開示は、細胞、細胞外成分又は組織などの生物材料をイメージング(画像処理)する方法を提供し、当該方法は、前記生物材料を、一以上の色素を含むナノ粒子あるいは当該ナノ粒子を含む組成物と接触させること；励起電磁(ｅ/ｍ)放射線(例えば、光)を、組織又は細胞に照射し、それによって、前記色素分子を励起させること；前記励起色素分子によって放射されるｅ/ｍ放射線を検出すること；及び検出されたｅ/ｍ放射線を捕獲し処理して、前記生物材料の一以上のイメージを提供することを含む。これらの工程の一以上を、インビトロ又はインビボで実施できる。例えば、細胞又は組織は個体に存在してもよく、培地中に存在してもよい。ｅ/ｍ放射線への細胞又は組織の暴露は、インビトロで(例えば、培養条件下で)達成されてもよく、又はインビボで達成されてもよい。個体内又は個体の体の一部内にあり、容易に到達できない細胞、細胞外物質、組織、器官などにｅ/ｍ放射線を照射するために、光ファイバー装置が使用できる。
【００９８】
例えば、個体内の領域をイメージングする方法は、（ａ）前記個体に、一以上の色素分子を含む本開示のナノ粒子又は組成物を投与すること；（ｂ）被検者に励起光を照射し、それによって、前記一以上の色素分子の少なくとも一つを励起すること；（ｃ）励起された光を検出すること(検出された光は、励起光による励起の結果として個体中の前記色素分子によって放射されたものである)；及び（ｄ）検出された光に対応するシグナルを処理して前記被検者内の領域のイメージを一つ以上提供すること(例えば、リアルタイムのビデオストリーム)；を含む。
【００９９】
蛍光粒子は、遊離色素より明るいので、蛍光粒子は、組織画像処理のため、及び、転移腫瘍を画像化するために使用できる。加えて、又はその代わりに、リガンド-機能化粒子のリガンド基(例えば、チロシン残基又はキレート剤)に、又は特定のリガンド機能化がないＰＥＧ化粒子のシリカマトリクスに、光誘起電子移動イメージングのために、放射性同位体をさらに付着させることができる。前記放射性同位体が治療のために選択される場合(例えば、225Ａｃ又は177Ｌｕなど)、これは付加的な放射線治療特性を有する粒子をもたらすであろう。
【０１００】
例えば、薬物-リンカー・コンジュゲート(このリンカー基は、薬物放出のために、腫瘍内の酵素又は酸性条件で特異的に切断されることができる)を、薬物送達用の粒子上の機能性リガンドに共有結合的に付着することができる。例えば、薬物-リンカー-チオール・コンジュゲートは、マレイミド-ＰＥＧ-粒子の合成後、チオール-マレイミド・コンジュゲーション反応を通じて、マレイミド-ＰＥＧ-粒子に付着できる。さらに、薬物-リンカー・コンジュゲートと癌を標的とするペプチドの両方を、腫瘍に特異的に薬物送達するために、粒子表面に付着することができる。
【０１０１】
本明細書に開示された様々な実施形態と例において記載する方法の工程は、本開示の方法を実施し、本開示の組成物を製造するのに十分である。このように、一実施形態では、前記方法は本質的に、本明細書に開示の方法の工程の組み合わせからなる。別の実施形態では、前記方法は、そのような工程のみからなる。
【０１０２】
以下の陳述において、本開示の方法及び組成物の種々の例、ならびに組成物を使用する方法が記載される:
陳述１．本開示の機能性ナノ粒子を形成する方法であって、ナノ粒子の表面に共有結合した複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基を有する、例えば、シリカナノ粒子又はアルミノシリケート粒子などの(例えば、２〜１５ｎｍ(例えば、１０ｎｍ以下、例えば、２〜１０ｎｍ又は２〜９．９９ｎｍなど)のサイズ(例えば、最長寸法)を有する)ナノ粒子を、少なくとも１つの反応基を有する１つ以上の機能化前駆体と接触させることを含み、これにより、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した少なくとも１つの反応基を有する機能性ナノ粒子が形成される、方法。
陳述２．前記接触が水性媒体(例えば、水)中で行われる、陳述１に記載の方法。
陳述３．前記ナノ粒子が２つ以上の機能化前駆体(例えば、各々が少なくとも１つの反応基を有する２、３、４、又は５つの機能化前駆体、ここで、個々の機能化前駆体の反応基の少なくとも２つ又は全てが、他の機能化前駆体の反応基と構造的に異なる)と接触する場合、当該接触が単一の反応混合物中で実施される、陳述１又は２に記載の方法。
陳述４．前記ナノ粒子が２つ以上の機能化前駆体(例えば、それぞれが少なくとも１つの反応基を有する２、３、４、又は５つの機能化前駆体、ここで、個々の機能化前駆体の反応基の少なくとも２つ又はすべてが、他の機能化前駆体の反応基と構造的に異なる)と接触する場合、当該接触が、少なくとも２つの異なる反応混合物中で実施される、前記陳述のいずれか１つに記載の方法。
陳述５．さらに、前記機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの追加の機能化前駆体と接触させることを含み、個々の機能化前駆体の少なくとも１つ、少なくとも２つ又はすべての反応基が、他の機能化前駆体の反応基と構造的に異なっており、ここで、前記少なくとも１つの追加の機能化前駆体の官能基が、機能化前駆体の反応基と構造的に異なっており、前記機能性ナノ粒子を２つ以上の追加の機能化前駆体と接触させる場合、個々の機能化前駆体の反応基は、他の機能化前駆体の反応基と構造的に異なっており、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した２つ以上の反応基を有する機能性ナノ粒子が形成される、前記陳述のいずれか１つに記載の方法。
陳述６．さらに、前記機能性ナノ粒子を、１つ以上の機能基を有する１つ以上の機能基前駆体と接触させることを含み、ここで、機能基を有する機能性ナノ粒子が形成され、各機能基が、機能性ナノ粒子の表面に共有結合している、前記陳述のいずれか１つに記載の方法。
陳述７．各機能基前駆体との接触が単一の反応混合物中で行われる、陳述６に記載の方法。
陳述８．個々の機能基前駆体との各接触について、前記接触を別個の反応混合物中で行う、陳述６に記載の方法。
陳述９．ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)で表面機能化されたナノ粒子を、少なくとも１つの第一反応基を有する第一機能化前駆体と接触させ、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した前記少なくとも１つの反応基を有する第一機能性ナノ粒子を形成する、前記陳述のいずれか１つに記載の方法。
陳述１０．さらに、前記機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第二反応基を有する第二機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基及び前記第二反応基は構造的に異なるものであり、前記機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基及び前記少なくとも１つの第二反応基を有する第二機能性ナノ粒子が、形成される、陳述９に記載の方法。
陳述１１．さらに、前記第二機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、及び前記第三反応基は、構造的に互いに異なるものであり、機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、及び前記少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能性ナノ粒子が形成される、陳述１０に記載の方法。
陳述１２．さらに、前記第三機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、及び前記第三反応基は、構造的に互いに異なるものであり、機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、及び前記少なくとも１つの第三反応基を有する第三機能性ナノ粒子が形成される、陳述１１に記載の方法。
陳述１３．さらに、前記第三機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第四反応基を有する第四機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、前記第三反応基、及び前記第四反応基は、構造的に互いに異なるものであり、機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、前記少なくとも１つの第三反応基、及び前記少なくとも１つの第四反応基を有する第四機能性ナノ粒子が形成される、陳述１２に記載の方法。
陳述１４．さらに、第四機能性ナノ粒子を、少なくとも１つの第五反応基を有する第五機能化前駆体と接触させることを含み、ここで、前記第一反応基、前記第二反応基、前記第三反応基、前記第四反応基、及び前記第五反応基は、構造的に互いに異なるものであり、機能性ナノ粒子の表面にそれぞれ共有結合した前記少なくとも１つの第一反応基、前記少なくとも１つの第二反応基、前記少なくとも１つの第三反応基、前記少なくとも１つの第四反応基、及び前記少なくとも１つの第五反応基を有する第五機能性ナノ粒子が形成される、陳述１３に記載の方法。
陳述１５．さらに、前記機能性ナノ粒子を、１つ以上の機能基を有する１つ以上の機能基前駆体(例えば、第一機能基前駆体、第二機能基前駆体、第三機能基前駆体、第四機能基前駆体、第五機能基前駆体、又はそれらの組み合わせ)と接触させることを含み、ここで、機能基を有する機能性ナノ粒子が形成され、各機能基が、機能性ナノ粒子の表面に共有結合している、陳述９〜１４のいずれか１つに記載の方法。
陳述１６．各機能基前駆体との接触が、単一の反応混合物中で行われる、陳述１５に記載の方法。
陳述１７．個々の機能基前駆体との各接触について、前記接触を別個の反応混合物中で行う、陳述１５に記載の方法。
陳述１８．前記機能化前駆体が、アミン基、チオール基、カルボン酸基、カルボキシレート基、エステル基(例えば、活性化エステル基)、マレイミド基、アリル基、末端アルキン基、アジド基、チオシアネート基、及びそれらの組み合わせから選択される反応基を有する、前記陳述のいずれか１つに記載の方法。
陳述１９．前記機能化前駆体が、１つ以上のシラン基及び１つ以上の反応基を有する、前記陳述のいずれか１つに記載の方法。
陳述２０．前記シラン基が以下のものから選択される、前記陳述のいずれか１つに記載の方法：
【化３】
2020520930.tif 000004
ここで、Ｒはそれぞれ独立して、アルキル基(例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3又はＣ4アルキル基)であり、Ｒはそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル基(例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3又はＣ4アルキル基)である。
陳述２１．前記機能化前駆体の１又は複数が以下の構造を有する、前記陳述のいずれか１つに記載の方法：
【化４】
2020520930.tif 000005
ここで、Ｘは本明細書に記載されている反応基(例えば、アミン基、チオール基、カルボン酸基、カルボキシレート基、エステル基(例えば、活性化エステル基)、マレイミド基、アリル基、末端アルキン基、アジド基、又はチオシアネート基)、ｎは例えば、１，２，３，４，５，６，７又は８であり、Ｒはそれぞれ独立して、アルキル基(例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3又はＣ4アルキル基)である。
陳述２２．少なくとも１つの機能基又は全ての機能基が、リンカー基を介してナノ粒子の表面に共有結合している、陳述６〜８及び１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
陳述２３．それぞれの個々の場合におけるリンカー基がアルキル基(例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3又はＣ4アルキル基)から選択される、陳述２２に記載の方法。
陳述２４．前記機能基が、本明細書に記載の機能基及びそれらの組み合わせから選択される、陳述６〜８及び１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
陳述２５．本明細書に記載される複数のナノ粒子(例えば、複数のナノ粒子であって、各ナノ粒子は、ナノ粒子表面に共有結合した複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基と、機能性ナノ粒子の表面に共有結合した少なくとも１つの機能基(例えば、１、２、３、４、又は５つの異なるタイプの機能基)を含んでいる)を含む組成物であって、ナノ粒子の少なくとも９５％(例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％)が、本明細書に記載されるサイズ(例えば、２〜１５ｎｍ(例えば、１０ｎｍ以下、例えば、２〜８又は２〜７ｎｍ)、又は２〜１０ｎｍもしくは２〜９．９９ｎｍ)を有し、当該組成物が粒子サイズ識別処理を受けていない、組成物。
陳述２６．前記ナノ粒子が、コアナノ粒子(例えば、２〜１５ｎｍ(例えば、１０ｎｍ以下、例えば、２〜１０ｎｍ又は２〜９．９９ｎｍなど)のサイズ(例えば、最長寸法)を有するもの)、コア−シェルナノ粒子(例えば、２〜１５ｎｍ(例えば、１０ｎｍ以下、例えば、２〜１０ｎｍ又は２〜９．９９ｎｍなど)のサイズ(例えば、最長寸法)を有するもの)、又はそれらの組合せである、陳述２５に記載の組成物。
陳述２７．前記コアナノ粒子が、アルミノシリケートコアナノ粒子又はシリカコアナノ粒子である、陳述２６に記載の組成物。
陳述２８．前記コアがシリカコアであるか、又は前記コア−シェルナノ粒子のコア及びシェルがシリカシェルである、陳述２６又は２７に記載の組成物。
陳述２９．前記コアシェルナノ粒子のコアが、アルミノシリケートコアであり、前記コアシェルナノ粒子のシェルが、シリカシェルである、陳述２６〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
陳述３０．前記機能基が、本明細書に記載の機能基及びそれらの組み合わせから選択される、陳述２５〜２９のいずれか１つに記載の組成物。
陳述３１．少なくとも１つの機能基又は全ての機能基が、リンカー基を介してナノ粒子の表面に共有結合している、陳述２５〜３０のいずれか１つに記載の方法。
陳述３２．各リンカー基がアルキル基(例えば、Ｃ1からＣ4アルキル基)から選択される、陳述３１に記載の方法。
陳述３３．１〜１００(例えば、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、又は５０〜１００)の機能基(例えば、平均１〜１００の機能基)が、各ナノ粒子の表面に共有結合している、陳述２５〜３２のいずれか１つに記載の組成物。
陳述３４．ポリエチレン基の少なくとも一部又は全てが、１つ以上の機能基を有する、陳述２５〜３３のいずれか１つに記載の組成物。
陳述３５．機能基が、本明細書に記載の機能基及びそれらの組み合わせから選択される、陳述３４に記載の方法。
陳述３６．ナノ粒子が、その中に封入された本明細書に記載の１つ以上の色素分子又はそれらの組み合わせをさらに含む、陳述２５〜３５のいずれか１つに記載の組成物。
陳述３７．コア当たりの色素分子の数が１〜７である、陳述３６に記載の組成物。
陳述３８．組成物が安定である(例えば、凝集及び／又は分解(例えば、機能基の喪失)が観察されない；例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)によって、又は蛍光相関分光法(ＦＣＳ)とＧＰＣとの組合せによって)(例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、又は２４ヶ月間) 、陳述２５〜３７のいずれか１つに記載の組成物。
陳述３９．陳述２５〜３８のいずれかに記載の組成物を使用する、本明細書に開示の診断方法(例えば、画像化方法)(例えば、本明細書に開示の個体内領域画像化方法であって、陳述２５〜３８のいずれか１つに記載の組成物を個体に投与すること、ここで、ナノ粒子は１つ以上の色素分子及び／又は１つ以上の色素基を含んでいる；励起電磁放射線を被験体に向け、それによって前記１つ以上の色素分子及び／又は１つ以上の色素基の少なくとも１つを励起すること；励起電磁放射線による励起の結果として個体内の色素分子によって放出された励起電磁放射線を検出すること；及び検出された電磁放射線に対応する信号を処理して被験体内の領域の１つ以上の画像を提供することを含む、方法)。
陳述４０．薬物を含む機能基又は薬物に由来する機能基を有する１つ以上のナノ粒子を含む陳述２５〜３８のいずれか１つに記載の組成物を使用する、本明細書に開示の治療方法(例えば、薬物を個体に送達する方法)(例えば、薬物を含む機能基又は薬物に由来する機能基を有する１つ以上のナノ粒子を含む陳述２５〜３８のいずれか１つに記載の組成物を個体に投与することを含む、本明細書に開示の個体への薬物送達方法であって、この際、薬物が個体内で放出される、方法)。
陳述４１．本明細書に開示された、個体内領域画像化(例えば、陳述３９に記載の方法)をさらに含む、陳述４０に記載の治療方法。
【０１０３】
以下の実施例は、本開示を説明するために提示される。これらは、いかなる方法による限定も意図していない。
【０１０４】
［実施例１］
この実施例は、本開示の方法及び組成物、並びにその使用の例を示す。
【０１０５】
様々な機能成分を単一のＮＰプラットフォームに組み合わせる多機能性ナノ粒子(ＮＰ)は、ナノバイオテクノロジー及びナノ医療の分野において非常に興味深い。本実施例では、ＮＰ表面上に４種類までの異なる機能性リガンドを有する、コーネルプライムドット(Ｃ'ドット)、１０ｎｍ以下の極小ＰＥＧ化蛍光コアシェルシリカナノ粒子を、モジュール式及び直交式に機能化するための多用途表面修飾アプローチを記載する。それは、様々な特性（すなわち蛍光検出、特異的細胞標的化、放射性同位体キレート化／標識化、レシオメトリックｐＨ検知、及び薬物送達）を単一のＮＰに統合する５機能性Ｃ'ドットの合成を可能にし、一方、全体的なＮＰサイズは７ｎｍ未満のままである。これは、Ｃ'ドットのＰＥＧ層が小分子に浸透可能であるという事実を利用することによって達成される。アミン及び／又はチオール官能化シラン分子は、ＰＥＧ鎖の間及びＣ'ドットのシリカ表面上に挿入可能であり、これに、続いてさらなる機能性リガンドが付着可能である。挿入によるこのＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)アプローチは、高品質のＮＰ生成を減少させることなく、Ｃ'ドットＰＥＧ化とワンポット型水系合成における精製との間に生じる少数の余分な工程のみを必要とする。追加の機能性を有する得られたＣ'ドットは、臨床的に転換されたＣドットに近いそれらのサイズ及びＰＥＧ密度のような物理化学的特性を示し、それらの臨床応用の多様化へのゲートを開く。本発明者らはさらに、粒子当たり多数の標的化ペプチドを可能にするＣ'ドット合成の改変、ならびに個々の成分への吸収スペクトルのデコンボリューションによって、異なる表面リガンドの具体的な数を定量的に評価するための容易かつ汎用性のある分光アプローチを実証する。合成ＰＥＧ化及びＰＥＧ化後表面修飾法のこの研究から得られた知見は、生物医学的用途及び臨床解釈のための他のＰＥＧ化ＮＰプラットフォームの開発に移行可能である。
【０１０６】
この実施例では、この目標を達成する、モジュール式及び直交式の挿入によるＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)法を記載する(図１)。それは、直交官能基、例えばアミン及びチオールを有するシランを、ＮＰのＰＥＧ化と精製との間に生じる合成工程において、ＰＥＧ鎖の間及びＣ'ドットのシリカ表面上に共有結合的に挿入することからなる(図１)。本発明者らは、このようにして、ＰＥＧ化の間にこれらの基が導入される際に観察される粒子凝集を含む、既存の機能化ストラテジーの制限を克服できることを実証する。ＰＰＳＭＩ法は、水性媒体中でのＣ'ドット合成のワンポット性を保存する。さらに、本発明者らは、これらのモジュール及び直交表面改質反応が、サイズ及びＰＥＧ密度を含む粒子の全体的な物理化学的特性にわずかな影響しか及ぼさず、それによって、それらの臨床への橋渡しの機会を最大化することを示す。このアプローチを用いて、種々の多機能性Ｃ'ドットを生成することができる(表１)。特に、ＮＰ表面に結合した全部で４つの機能性リガンドを有する５機能性Ｃ'ドット粒子を合成し、同時蛍光追跡、腫瘍標的化、レシオメトリックｐＨ検知、放射性同位体キレート化及び疾患治療を可能にする(図１)。この表面修飾アプローチは、良好にＰＥＧ化されたＮＰのＰＥＧ層が、依然として他の分子によって浸透可能であるという事実を利用する。このような粒子の化学的複雑性を適切に説明し、異なる多機能性ＮＰ化学を互いに区別するために、本発明者らは、(ｉ)ＮＰプラットフォーム、例えば、Ｃ'ドット対メソポーラスＣドット(ｍＣドット)、(ii)封入蛍光色素、(iii)特異的表面機能性及び粒子に対するその結合性、(iv)特異的付着化学、(ｖ)特異的ＰＥＧ鎖長、及びその他に関する情報を含む命名システムを開発する(例えば、図７)。最後に、個々の成分への吸収スペクトルのデコンボリューションによって、粒子表面に導入された異なるリガンドの具体的な数を定量的に評価するための分光学的アプローチを実証する。本研究で得られた洞察はまた、生物医学的応用のための他のＰＥＧ化ＮＰプラットフォームの開発への道筋を提供すると期待される。
【０１０７】
［表１］
2020520930.tif 000006
【０１０８】
結果と考察
ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットの合成及び精製。以前に報告されたＣ'ドットの合成は、異なるタイプの色素及び癌標的化ペプチドを用いてＣ'ドットの機能化を可能にする多用途アプローチである(図８)。例えば、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットと呼ばれる、ＮＩＲ色素Ｃｙ５.５及びαvβ3インテグリン-ターゲティング環状(アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ-チロシン−システイン)ペプチド(ｃ(ＲＧＤｙＣ))で機能化したＣ'ドットを生成するために、オルトケイ酸テトラメチル(ＴＭＯＳ)及びＣｙ５.５ シランコンジュゲート(Ｃｙ５.５-シラン)を、まず室温でｐＨ８付近の水酸化アンモニウム水溶液に添加した。加水分解されたＴＭＯＳ及びＣｙ５.５-シラン分子は、一緒に縮合して、シリカマトリクス中に共有結合的に封入されたＣｙ５.５色素を有する極小シリカＮＰを形成する。次の工程では、シラン官能化ＰＥＧ(ＰＥＧ-シラン)及びｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド修飾ＰＥＧ-シラン(ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン)を一緒に反応混合物に添加した。添加すると、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランは、表面シラノール基とＰＥＧとの間の水素結合を介してＮＰ表面上に迅速に吸着され、それによってナノ粒子成長を終結させる。反応混合物を室温で一晩放置した後、反応温度を８０℃に上昇させ、そこで一晩維持して、ＮＰ表面へのＰＥＧ-シラン及びｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランの共有結合を増強した。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-Ｃｙ５.５-Ｃドットを、最終的にゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)を用いて精製し、続いて最終用途のために滅菌フィルターを用いて濾過した。
【０１０９】
ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラムは、精製前に３つのピークを示した(図２Ａ及び図８Ａ)。約９分での主ピークは、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットナノ粒子生成物に対応し、約５分及び１６分でのピークはそれぞれ、ＰＥＧ試薬及び未反応Ｃｙ５.５-シランからの不純物に対応した。ナノ粒子生成物に対応する溶出体積を収集し、ＧＰＣカラムに再度流して、可能な限り最高の純度を保証した。ＧＰＣ精製後、最終Ｃ'ドット溶液のエルグラムは、約９分で単一のピークのみを示し、約１００％のＧＰＣ純度を示した(図８Ｂ)。さらに、生成物ピークは、検出可能な歪みのない狭くて非常に対称的な形状を示し、単一成分ガウス分布を用いてフィッティングすることができ、ＮＰ生成物の狭いサイズ分散性を示した。
【０１１０】
次いで、精製したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットを、吸光度及び蛍光相関分光法(ＦＣＳ)特性評価に供した。ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットの吸光度スペクトルは、Ｃｙ５.５色素に対応する約６７５ｎｍにピークを示し、及び、ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化を伴わないＰＥＧ化Ｃｙ５.５-Ｃ'ドット(ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドット)では見られなかった２７５ｎｍ付近の小さなピークを示した(図８Ｄ)。従って、このピークの存在はｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドに特徴的であり、Ｃ'ドット表面へのｃ(ＲＧＤｙＣ)の首尾よい付着を実証する。ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットのＦＣＳ曲線は、ＮＰ生成物の狭いサイズ分散性を確認する単一モードＦＣＳ相関関数を用いて良好にフィッティングされた(図８Ｃ)。ＦＣＳフィットから、流体力学的粒子直径及び粒子濃度を決定することができる。吸光度測定から得られたＣｙ５.５及びｃ(ＲＧＤｙＣ)の濃度を、ＦＣＳから得られた粒子濃度で割ることによって、Ｃドット当たりのＣｙ５.５色素及びｃ(ＲＧＤｙＣ)リガンドの数を推定した。結果はｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットが約６．４ｎｍの平均直径を有し、ＮＰ当たり約１．６個のＣｙ５.５色素及び２４個のｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドが存在することを示した(表１)。最後に、ＦＣＳと吸光度測定の組合せはまた、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットが、ＦＣＳセットアップの励起条件下で、水溶液中の遊離Ｃｙ５.５色素よりも約３倍明るいことを示唆する粒子輝度の推定を可能にする。最終的なｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドット生成物を、さらなる使用の前に４℃で脱イオン(ＤＩ)水中に保存した。
【０１１１】
ＰＥＧ化コンディションの調整によるｃ(ＲＧＤｙＣ)表面リガンド密度の増加。臨床用に変換されたＣ'ドットの以前に報告された合成アプローチにおいて、ｃ(ＲＧＤｙＣ)癌標的化ペプチドは、ＰＥＧ化工程の間にＮＰ表面上へのｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランの両方の縮合を介して導入された。ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランがＰＥＧ-シランよりもはるかに高価であることを考慮して、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランは常に、ＰＥＧ-シランの添加前に反応混合物に添加され、初期のＮＰ表面との反応を可能にし、所望の変換効率を達成する。このアプローチは、ＮＰ当たり最大で約２０〜２５のｃ(ＲＧＤｙＣ)リガンドを有するＣ'ドットを生成するために使用できるが、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランの濃度をさらに増加させても、分散性の狭いＣ'ドットは得られないことが観察された。むしろ、合成混合物は、これらのより高い濃度でｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランを添加すると直ちに濁り、ＮＰ凝集を示唆する。実際、反応生成物のＧＰＣエルグラムは、ＮＰ凝集に起因する５〜１１分の広いピークを示す(図２Ｂ)。ＧＰＣ精製を多数繰り返した後でさえ、ＮＰ生成物のＧＰＣエルグラムは広く分布したままであり、合成の失敗を示唆する。
【０１１２】
ＮＰ凝集を引き起こすことなく合成中に許容されるｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランの量は、水酸化アンモニウム[ＮＨ3ＯＨ]の濃度に非常に敏感であることが分かった。[ＮＨ3ＯＨ]を基準の２ｍＭから６ｍＭに増加させると、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランの濃度は、良好なＮＰ生成物の質を維持しながら、３倍まで増加させることができる。６ｍＭの[ＮＨ3ＯＨ]及び３倍のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン濃度で合成したＣ'ドットのＧＰＣエルグラム(図２Ｃ)は、通常のコンディション(図２Ａ)と同様の特性を示した。結果は、高品質ＮＰ生成物を示唆し、前述のようにＧＰＣを用いて、他の不純物からのＣ'ドットの分離を可能にする。精製後、ＮＰ当たり推定５８個のリガンドを有する狭く分散したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットが首尾よく生成された(図２Ｄ〜Ｆ)。より少ないリガンド数のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５.５-Ｃ'ドットと比較して、予想通り、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルにおける２７５ｎｍでの吸収が増強される(図２Ｆ)。ＦＣＳ特性評価によれば、これらの粒子はまた、より低いリガンド数の(すなわち、２４ｃ(ＲＧＤｙＣ)の)粒子よりも、わずかに増加した流体力学的サイズ、すなわち、６．８ｎｍ対６．４ｎｍ(図２Ｅ及び表１)を有し、これはおそらく、粒子当たりのｃ(ＲＧＤｙＣ)の数の増加(図２Ｄ)に起因している(より大きなシリカコアではなく)。
【０１１３】
ｃ(ＲＧＤｙＣ)表面機能化の成功のための[ＮＨ3ＯＨ]に対する高感受性は、おそらく、裸のシリカ表面へのｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドの迅速な吸着、及びＮＰ間の静電相互作用の変化によって引き起こされる。Ｃ'ドット合成については、ＰＥＧ化工程の間に、ＰＥＧ及びＰＥＧ-ペプチド・コンジュゲートの両方が、おそらく水素結合を介して、裸のシリカＮＰ表面に迅速に吸着されることが実証されている。この迅速なＰＥＧ吸着は、ＮＰ成長を効率的に停止させ、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン添加の変換効率を改善するために、Ｃ'ドット合成において利用されている。しかしながら、各ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドは、反応ｐＨで正電荷を有する複数のアミン基を含有する、すなわち、それらは弱塩基であるので、ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドの吸着は、裸のシリカＮＰの正味の負電荷を効果的に覆い、ＮＰの静電安定性の損失をもたらし、それによってＮＰ凝集をもたらし得る。対照的に、[ＮＨ3ＯＨ]がわずかに増加すると、ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドの平均正味正電荷が減少し、極小シリカＮＰが、ＮＰ安定性を失うことなく、ＰＥＧ化の間により多くのｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランを吸着することが可能になる。このメカニズムについてのこの仮説を裏付けるために、より系統的な研究が必要とされるが、癌標的化ペプチドの表面リガンド密度を２倍以上向上する能力は、Ｃ'ドットの腫瘍標的化効率をさらに増強し得る。
【０１１４】
ＰＥＧ化の間に共縮合リガンド-ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを介してＣ'ドット表面に二次機能基を導入。５８ｃ(ＲＧＤｙＣ)までのリガンドでＣ'ドット表面を機能化するために開発された反応条件はまた、Ｃ'ドット表面に複数のタイプの他の機能性リガンドを導入するために適用された。これは、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランを、ＰＥＧ化工程の間に、異なるリガンド-ＰＥＧ-シラン及び／又はリガンド−シラン・コンジュゲートの組合せに置き換えることによって達成された。しかし、合成された多機能性Ｃ'ドットの品質、すなわちこのアプローチを用いた成功は、機能性リガンドの特性に大きく依存した。
【０１１５】
例えば、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン、マレイミド(ｍａｌ)官能化ＰＥＧ-シラン(ｍａｌ-ＰＥＧ-シラン)及びＰＥＧ-シランの組合せを、ＰＥＧ化工程の間、この順序でＣｙ５系Ｃ'ドットの反応混合物に添加した。得られたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドに加えて、ＰＥＧ化ＮＰ表面上にマレイミド基を有し、Ｃ'ドットが、セラノスティック用途のために、例えばチオール官能化薬物-リンカー-コンジュゲートとさらに反応することを可能にした(図１)。合成されたままのｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラム(すなわち、ＧＰＣ精製前)は、わずかに歪んだＮＰピークを示したが(図９Ａ)、ＧＰＣ精製の４サイクル後に、満足なＦＣＳ特性決定結果と共に対称ＮＰピークが得られ(図９Ｂ及びＣ)、ＮＰ合成生成物の許容可能な品質を示唆した。異なるｍａｌ-ＰＥＧ-シラン濃度から得られた精製ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度スペクトルは、ｃ(ＲＧＤｙＣ)リガンドに帰する２７５ｎｍ付近に強いピークを示すだけでなく、対照ＮＰと比較して２５０ｎｍ未満の吸収を増加させ、これはマレイミド官能基の存在に帰するものであった(図９Ｄ)。ＦＣＳによるｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、約６．８ｎｍの流体力学的サイズを有した(表１)。
【０１１６】
多機能性Ｃ'ドットの合成は、他のタイプのリガンドが使用される場合、等しく成功しないかもしれない。例えば、マレイミド基は、アジド基と反応するジベンゾシクロオクチル(ＤＢＣＯ)基によって置換され、クリックケミストリーを介してＣ'ドットの他のリガンドによる修飾を可能にした。ＧＰＣ、ＵＶ-ｖｉｓ及びＦＣＳ特性評価によれば、このアプローチを用いて単分散ＤＢＣＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットを生成することができたが(図１０Ａ〜Ｄ、表１)、ＤＢＣＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットをアジド官能化基と結合させる試みにおいて、ＤＢＣＯ反応性は観察されなかった。これは、Ｃ'ドット表面上のＤＢＣＯリガンドのアクセス性が低いことを示唆する。これは、マレイミド基と比較して、ＤＢＣＯリガンドの疎水性が高いことに起因し得る。ＤＢＣＯリガンドの水溶性が乏しいと、ＮＰのＰＥＧ化後でさえ、Ｃ'ドットのシリカ表面と会合したままになることがあり、それによって、それらのアクセス性及び反応性が制限される。
【０１１７】
我々の最初の試験では、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃドットを、124Ｉを用いてｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドのチロシン残基上で標識し、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)イメージングの使用を可能にした。Ｃ'ドットを他の放射性同位体、例えば、ジルコニウム(89Ｚｒ)又はルテチウム(177Ｌｕ)で標識するためには、特定のキレート剤リガンドでＣ'ドットを機能化することが非常に望ましい。例えば、デフェロキサミン(ＤＦＯ)は、89Ｚｒによる放射線標識のための最も効率的なキレート剤の１つである。Ｃ'ドットをＤＦＯで機能化するために、イソチオシアネート(ＮＣＳ)官能化ＤＦＯ(ＮＣＳ-ＤＦＯ)を、まずアミノシランとコンジュゲートさせてＤＦＯ-シランを生成し、次いでこれを、ＰＥＧ化中に、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランと共に、反応混合物に添加した。狭く分散したＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットがこのアプローチによって生成されたが(図１０Ｅ〜Ｈ及び表１)、これらのＮＰは、生物学的実験において好ましくない結果を示し、我々はこれを、様々なＣ'ドットにわたるＤＦＯ基の不均一な分布の結果であると仮定した(データは示さず)。
【０１１８】
最後の実施例は、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットのアミン基による官能化であり、Ｃ'ドットをアミン反応性機能性リガンドで修飾することを可能にする。アミノプロピル-トリメトキシシラン(ＡＰＴＭＳ)のようなアミノシランを、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランと一緒に、ＰＥＧ化中に導入した場合、得られたｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＮＨ2-ＰＥＧ-Ｃ'ドットは、ＧＰＣエルグラムにおいて広がった粒子ピークを示した(図３Ａ)。ピークは、４サイクルのＧＰＣ精製後でさえも歪んだままであった(図３Ｂ)。歪んだＧＰＣエルグラムは、ＮＰ凝集を示し、これは、おそらく、結合したアミン基がＳｉ-Ｏ-Ｓｉ結合形成を触媒し、ＮＰ安定性の損失をもたらすことによって引き起こされる。ＦＣＳ特性評価によって示唆されるように、ＧＰＣ精製後、平均粒径は約６．８ｎｍのままであったが(図３Ｃ及び表１)、元の凝集ピークが精製ＮＰでも依然として観察されたので、このＮＰ凝集は最終Ｃ'ドット生成物の収率及び品質の両方に大きく影響した(図３Ｂ)。さらに、この方法を用いて合成したｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＮＨ2-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度は、標準ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットと比較して、４８０ｎｍ付近に追加のピークを示した(図３Ｄ)。この吸光度は、おそらくアミン基とシリカ表面に近いＣｙ５分子との間の相互作用によって引き起こされる、Ｃｙ５色素の分解生成物に起因し得る。Ｃｙ５色素のこの分解は、粒子の蛍光輝度を低下させ、生物医学的用途には非常に望ましくない。
挿入によるＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)を介したＣ'ドット表面への二次機能基の導入。ＰＥＧ化の間に異なるリガンド-シラン・コンジュゲートを共縮合させることによってＣ'ドット表面に二次機能基を導入する試みは、異なる機能基と裸のシリカＮＰ表面との間の劇的に変化する親和性に基づく。生物医学的用途にとって興味深い機能性リガンドの多くは、シリカに対して高い親和性を有するかなりの量のアミン基及び／又はヒドロキシル基を保有する。前節で説明したように、このようなリガンドとシリカとの間の強い会合は潜在的に、それらのアクセス不能性及び不均質な分布につながる可能性がある。
【０１１９】
この課題に対する１つの可能な解決策は、リガンドとシリカとの間の会合の動力学を制御することである。理想的な状況では、反応転化率を高めるために、リガンドと裸のシリカとの間に、ある程度の親和性があることが好ましい。一方、親和性が高すぎると、リガンドアクセス性が妨げられ、リガンド分布が不均一になることがある。会合動力学の制御に依存することは、いくつかの理由から最適ではない。第１に、リガンドとシリカとの間の会合は、リガンド分子構造の詳細に非常に感受性である。全ての異なるリガンドについて別々にＰＥＧ化条件を最適化することは非効率的であろう。第２に、水中の裸のシリカＮＰは静電的に安定化され、それらの安定性は、イオン強度及びｐＨを含む反応条件に非常に敏感であるので、ＰＥＧ化条件を調整することはＮＰ安定性を妨害し、その結果、合成が失敗しうる(上記を参照のこと)。
【０１２０】
これらの問題を克服するために、ＰＥＧ化工程中にＣ'ドットを機能化し続けるのではなく、挿入によるＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)反応を用いて実験した。このＰＰＳＭＩアプローチは、Ｃ'ドットの十分に確立されたＰＥＧ化プロトコルを利用する。粒子ＰＥＧ化は、追加のリガンドとシリカＮＰ表面との間の会合を減速させ、これらのリガンドに、シリカＮＰと反応する前に、反応混合物中に均一に分散するためのより多くの時間を残す。さらに、明確に定義されたＰＥＧ化は、Ｃ'ドットに、より極端な合成条件下であっても、凝集からＣ'ドットを保護する明確な立体安定性を与える。したがって、追加のリガンドによる効率的な表面修飾のために反応パラメータを調整するためのより広いウィンドウを提供する。最も重要なことに、ＰＥＧ化ＮＰのＰＥＧ層は、多くのパラメータ(表面ＰＥＧ密度及びＮＰ表面曲率を含む)に依存して、タンパク質のような生体分子によって依然として透過可能であり得ることが最近報告されている。一方、ＰＥＧ化後でさえ、シリカコアとＰＥＧ化シリカナノ粒子のＰＥＧ層との間の界面には常に残存するシラノール基が存在し、潜在的に、小さなシラン分子とのさらなる縮合を可能にする。
【０１２１】
その目的に向けた最初の試みにおいて、我々はｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの反応混合物中に、すなわちＰＥＧ化工程の後に、ＤＦＯ-シランを添加した。残念ながら、最終生成物は３００ｎｍ未満のレジームにおいて吸光度シグナルの予想される増加を示さず、これはＤＦＯ-シランとの低い反応効率を示唆する(図１１)。これは、いくつかの理由に起因する可能性がある。第１に、ＤＦＯ-シラン・コンジュゲートは、Ｃ'ドットＰＥＧ化に使用されるＰＥＧ-シランよりもさらに大きいモル質量を有するので、ＰＥＧ層を通って効率的に拡散せず、下にあるシリカ表面シラノール基と反応し得ない。これは、我々の以前の研究と一致するＰＥＧ化Ｃ'ドットのかなり密なＰＥＧ層を示唆する。第２に、加水分解されたＤＦＯ-シランの自己縮合は、Ｃ'ドットへのそれらの付着と競合する。自己縮合は、ＰＥＧ層を通るＤＦＯ-シランの浸透が遅いので、反応を引き継ぐことができる。これらの初期の結果及び結論に基づいて、我々はｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットをＤＦＯで機能化するための代替的なアプローチを選択し、ここで、表面修飾は２つの工程に分割された(図１)。第１の工程では、アミノシランを反応混合物に添加した。アミノシランは比較的小さい分子であり、したがって、ＰＥＧ層中により速く拡散し、その下のシリカ表面に付着することが予想される。得られたＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、対応する(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットと比較して、粒子特性に実質的な変化を示さなかった(表１、及び、図３Ｅ〜Ｈと図８Ｅ〜Ｈとの比較)。例えば、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット及びＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度スペクトルは、互いにほぼ完全に重なり合っており、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットへのアミノシランの付着は、これらの粒子の光学特性に影響を及ぼさないことを示唆している(図３Ｈ)。
【０１２２】
その後、追加の表面アミン基を使用して、二次機能性リガンドをＣ'ドットシリカ表面に導入することができる。この考えを試験するために、アミノ-シランの添加に続いて、ＤＦＯ-ＮＣＳを次の工程で添加して、アミン-ＮＣＳ反応により、ＰＥＧ層の下に位置するアミン基と反応させた(図１)。この方法の利点は、比較的高いＤＦＯ濃度を適用してＤＦＯ-ＮＣＳ分子をＰＥＧ層に浸透させることができる一方、余分なＤＦＯは、遠心分離及びＧＰＣによって最終精製工程で容易に除去することができることである。得られたＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＧＰＣエルグラムは、ＮＰ生成物の１つの主ピークのみを有する比較的クリーンなサンプルを示唆した(図４Ａ)。精製後、直径６．４ｎｍの狭く分散したＣ'ドットが得られた(図４Ｂ及びＣ、表１)。精製されたＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットと比較して、２００〜３００ｎｍの間に明確な吸光度特性を有した(図４Ｄ)。この吸光度シグナルは、ＤＦＯ分子による吸光度に対応し、反応に使用されるＤＦＯ-ＮＣＳの濃度が増加するにつれて増加する。ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度を、一組の吸光度標準を用いてスペクトルをフィッティングすることにより、各成分からの個々の寄与にデコンボリューションした(図１２)。次いで、粒子当たりのＣｙ５、ｃ(ＲＧＤｙＣ)及びＤＦＯ分子の数は、約０．２ｍＭのＤＦＯ-ＮＣＳ濃度を用いて合成されたＣ'ドットについて、それぞれ約１．６、２３及び４であると推定された(図１２及び表１)。これらの光学分光法の結果は、ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットへのＤＦＯの付着の成功を実証し、さらなる反応のためのＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット上のアミン基のアクセス性を確認する。ＤＦＯ分子の付着以外に、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット又はＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットに対するさらなるＧＰＣ及びＦＣＳに基づくＣ'ドット特性評価において、実質的な変化は観察されず(表１)、このことは、この室温のＰＥＧ化後修飾が、通常のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの特性に対してわずかな影響しか有さず、それによって、臨床応用への機会を最大にすることを示唆する。
【０１２３】
ＰＰＳＭＩ法の一般化
ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットにＤＦＯを付着させるのと同様のアプローチを使用して、他のタイプの機能性リガンドを導入することもできる。例えば、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-四酢酸(ＤＯＴＡ)は、177Ｌｕのような放射性同位体による放射性標識のための最も効率的なキレート剤の１つである。ＤＦＯ-ＮＣＳをＤＯＴＡ-ＮＣＳに置き換えることにより、狭く分散したＤＯＴＡ機能化ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドット、すなわちＤＯＴＡ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットが生成され、それにより、例えば、177Ｌｕ放射性標識が可能になった(図４Ｅ〜Ｈ)。このアプローチは、他のタイプのコンジュゲーション化学にも適用することができる。例えば、ＰＥＧ化後表面修飾工程においてアミノシランをチオールシランで置換することによって、チオール官能化Ｃ'ドットを生成することができ、追加のチオール基は、チオール-エンクリック反応を介して、例えばマレイミド-官能化リガンドとさらに反応することができる。原理証明として、このアプローチによって、チオール-シランをＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのシリカ表面上に導入し、狭く分散したＳＨ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを生成した(図１３Ａ〜Ｃ、表１)。その後、マレイミド官能化ＦＩＴＣ色素(ｍａｌ-ＦＩＴＣ)を、精製工程の前にＳＨ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの反応混合物に添加して、チオール-マレイミド・コンジュゲーションを介してｐＨ検知ＦＩＴＣ色素でＮＰを機能化した(図１)。得られたＦＩＴＣ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは精製後にクリーンなＧＰＣエルグラムを示し、高品質のＮＰ精製物を示唆した(図１３Ｄ)。ＦＣＳ特性評価は、６．７ｎｍの平均粒径を示した(図１３Ｅ、表１)。精製されたＦＩＴＣ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットと比較して、４５０ｎｍ付近の波長でさらなる吸収特性を示し、これはＦＩＴＣ色素の特徴的な吸収に対応していた(図１３Ｆ)。結果は、チオール-エンクリック反応によるＦＩＴＣ色素の付着の成功と、チオール-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット上のチオール基のアクセス性を実証した。
【０１２４】
上記のアミン-シラン／ＮＣＳ-リガンド及びチオール-シラン／ｍａｌ-リガンド化学に加えて、類似のアプローチ(例えば、アジド-シラン／アルキン-リガンド(下記参照))を用いて、他のタイプのコンジュゲーション化学を適用することもできる。
【０１２５】
ＰＰＳＭＩ合成アプローチは、様々な機能性を有するＣ'ドットのファミリーの生成を可能にし、これにはアミン及びチオール官能化Ｃ'ドットも含まれる。これらの反応性Ｃ'ドットは、目的とする用途に応じて様々なリガンドを使用する、後続の修飾、すなわちＮＰ製造後の修飾を可能にする、有用なプラットフォームとなり得る。しかしながら、特にＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを用いて作業する欠点の１つは、それらが減少した安定性を示すことである。ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-Ｃｙ５-Ｃ'ドットについては、小モル質量種に関連するピークが、ＮＰ製造後６ヶ月でＧＰＣエルグラム中に現れ始めた(図１４Ａ)。これは、例えば、ＮＰ表面から放出されるペプチド基に起因し得る。対照的に、通常のｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットは、ＮＰ特性又はインビボ性能のいずれの変化もなく、少なくとも２年の期間にわたって明確なＮＰ安定性を示す。従って、アミノ化Ｃ'ドットの分解はおそらく、シラン加水分解を促進する第一級アミン基の周りの局所的な高ｐＨ環境によって引き起こされると考えられる。
【０１２６】
対照的に、アミンベースのＰＰＳＭＩアプローチを用いたＮＰ製造の６ヶ月後、ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-Ｃｙ５-Ｃ'ドットについてのＧＰＣエルグラム及びＦＣＳ特性評価において実質的な変化は観察されず、所望のＮＰ安定性を示唆した(図１４Ｂ)。これは、おそらく、ＰＥＧ化後修飾反応の間に、ＤＦＯ-ＮＣＳが第一級アミン基を終結させることに起因しており、それによって活性な第一級アミン基を有するＣ'ドットの寿命が短くなるためである。この理由から、アミン及びチオール官能化Ｃ'ドットは原則として、ＮＰ製造後のさらなる修飾のために別々に製造することができるが、ＮＰ製造中にさらなる機能性ＮＰリガンドの導入を介してこれらの官能基を直接反応させて、これらの反応基を迅速に変換することが、所望のＮＰ安定性及び長い製品保存可能期間のために最も望ましい。
【０１２７】
３種類の機能性表面リガンドを有する４機能性Ｃ'ドット：ＰＰＳＭＩアプローチのモジュラリティ。上記の様々なコンジュゲーション化学は、ＰＥＧ化後の表面修飾反応の間に組み合わされて、全てワンポット合成において、多機能性Ｃ'ドットへのモジュール経路を提供し得る。
【０１２８】
原理証明として、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを、ＰＥＧ化後にまずアミン基で官能化し、ＮＨ2-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを生成した。次いで、ＤＦＯ-ＮＣＳキレート剤を、アミン-ＮＣＳコンジュゲーションを介してこれらのＣ'ドットに付着させ、それによって第一級アミン基を終結させた。その後、得られたＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを、チオール-シランでさらに官能化し、ＳＨ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを生成した。最終的に、ＦＩＴＣ-ｍａｌ・ｐＨ検知色素をＰＥＧ層に挿入し、チオール-エンクリック反応を介してＣ'ドットシリカ表面に付着させ、反応性チオール基を終結させた(図１)。得られた狭く分散したＦＩＴＣ-ＤＦＯ-Ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、吸光度測定によって確認されるように、合計４つの機能基を統合したが(図５Ａ)、ＧＰＣ及びＦＣＳ特性評価の両方によって示唆されるように、６．８ｎｍの粒径は、狭い分布のままであり且つ７ｎｍ未満であった(図５Ｂ及びＣ)。ＮＰ当たりのＣｙ５、ｃ(ＲＧＤｙＣ)、ＤＦＯ及びＦＩＴＣ基の数を、個々の成分についての吸光度標準のセットを使用して、上記のデコンボリューション法に従って推定した(図１５及び表１)。ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドをＣ'ドットＰＥＧ層の外側に付着させて、活性な腫瘍標的化を可能にした。放射性同位体キレート化及びｐＨ検知をそれぞれ可能にするＤＦＯ及びＦＩＴＣリガンドを、ＰＥＧ層に挿入した。この設計は、小さいイオンへのそれらのアクセス性を確実にするが、同時に、Ｃ'ドットのインビボ性能に対する潜在的な負の副作用を減少させる。ＮＰは、４８８ｎｍで励起された場合、５２５ｎｍ付近に、様々なｐＨにより変化する蛍光強度を示した(図５Ｄ)。この蛍光は、ＰＥＧ層に挿入されたｐＨ感受性ＦＩＴＣ色素の発光に割り当てることができる。比較として、ＮＰは、６４５ｎｍで励起された場合、約６７５ｎｍにｐＨ非依存性蛍光を示した(図５Ｅ)。この蛍光は、シリカコア内のＣｙ５色素に対応する。この明るいＮＩＲ蛍光は、例えば、画像誘導手術のためにＣ'ドットを使用する光学的画像化を可能にするだけでなく、レシオメトリックｐＨ検知のための参照シグナルとしても使用され得る。その目的のために、ｐＨの関数として、ピークセンサー発光強度(５２５ｎｍ)を、ピーク参照発光強度(６６０ｎｍ)で割ることによって、レシオメトリック較正曲線を得た(図５Ｆ)。
【０１２９】
ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-Ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのｐＨ応答は、以前に報告されたｐＨ検知ＣドットのｐＨ範囲、すなわち、ｐＨ４．５からｐＨ８(中間ｐＨ約６．５41)と比較して、より広いｐＨ領域、すなわち、ｐＨ４からｐＨ１０(中間ｐＨ約７)をカバーすることは注目に値する(図５Ｅ)。これは、ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＰＥＧ層下の末端第二アミン基が、ＦＩＴＣ色素周辺の局所酸性度に影響を及ぼすことによって起こると考えられる。ＰＥＧ層におけるＦＩＴＣ及びアミン基の共局在化は、他の粒子機能に加えて、Ｃ'ドットに明確なｐＨ感受性を与える。この設計戦略はまた、色素を取り囲む化学環境、すなわちシリカコア及びＰＥＧ層を注意深く調整することによって、Ｃ'ドットの光学特性をさらに調整する概念を提供する。
【０１３０】
ＰＰＳＭＩアプローチの直交性
上述のＰＰＳＭＩアプローチの最も重要な利点の１つは、それが、十分に確立された、モジュール式の、ならびに直交コンジュゲーション化学の豊富なツールボックスによってサポートされるという事実である。例えば、上記のアミン-シラン／ＮＣＳ-リガンド及びチオール-シラン／ｍａｌ-リガンド化学に加えて、類似のアプローチ、例えば、アジド-シラン／アルキン-リガンドを用いて、他のタイプのコンジュゲーション化学を適用することもできる。さらに、異なる化学的性質を用いるこれらのコンジュゲーション反応は、通常、互いに干渉しないので、異なる機能性リガンドをＣ'ドットに同時に付着させることができる。
【０１３１】
原理証明として、アミン-シランの逐次添加の代わりに、ＤＦＯ-ＮＣＳ、チオール-シラン及びＦＩＴＣ-ｍａｌ、アミン-シラン及びチオール-シランを、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドット反応に一緒に添加し、Ｃ'ドットをアミン及びチオール基の両方で同時に官能化した。次いで、ＤＦＯ-ＮＣＳ及びＦＩＴＣ-ｍａｌを一緒に添加して、アミン及びチオール基を機能性リガンドに同時に変換した。得られたＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、精製後、所望のＧＰＣエルグラムを示し、ＦＣＳ特性評価当たり約６．７ｎｍの平均直径を有した(図１６Ａ及びＢ)。精製された粒子のＵＶ-ｖｉｓスペクトル(図１６Ｃ)をフィッティングすることによって、Ｃｙ５、ｃ(ＲＧＤｙＣ)、ＤＦＯ及びＦＩＴＣを含む個々の成分の吸収をデコンボリューションした(図１６Ｄ〜Ｇ)。これは、同時コンジュゲーション反応を用いたＤＦＯ及びＦＩＴＣによる表面修飾の成功を示した。ＰＰＳＭＩを用いたコンジュゲーションの直交性は、表面修飾に必要な反応時間を有意に短縮し、それによって多機能性シリカＮＰの製造をさらに単純化するので、ＰＰＳＭＩアプローチは、ＰＥＧ化シリカＮＰを機能化するための強力な方法である。
【０１３２】
ＰＥＧ化の間及びＰＥＧ化の後の表面修飾の組合せによる４種類の機能性表面リガンドを有する５機能性Ｃ'ドット
我々は、異なるタイプの機能基が、ＰＥＧ化工程の間又はＰＥＧ化後の表面修飾を介して、Ｃ'ドット表面に導入できることを記載した。これらの２つのアプローチの組合せは、水性媒体中でのワンポット合成アプローチにおいて、最も多数の表面機能基を有する多機能性Ｃ'ドットへの、モジュール経路及び直交経路を提供する。その目的のために、原理証明として、ＮＰ表面上に全部で４つの異なる機能性リガンドを有する５機能性Ｃ'ドットを合成し(図１)、同時光学トレーシング、特異的細胞標的化、レシオメトリック検知、放射性金属キレート化、及び潜在的薬物送達を可能にした。
【０１３３】
５機能性Ｃ'ドットを合成するために、ＮＰ表面をまず、ＰＥＧ化工程の間に、特異的細胞標的化基、すなわちｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド、及びマレイミド基で修飾した。これは、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン、ｍａｌ-ＰＥＧ-シラン、及びＰＥＧ-シランを、上記のようにシリカコアの表面上に共縮合させることによって行った。ＰＥＧ化後、チオール修飾小薬物分子を反応混合物に添加して、チオール-エンクリック反応を介してＣ'ドット表面上のマレイミド基に付着させた(それによってマレイミド基を終結させた)。原理証明のために、我々は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療及び予防するために使用される周知の抗レトロウイルス薬である小分子治療薬の例として、エファビレンツ(ＥＦＶ、分子構造については図６Ａを参照のこと)を選択した。ＥＦＶはアルキン基を含み、これは別の工程において、クリックケミストリーによってヘテロ二官能性アジド-ＰＥＧ-チオールと反応し、ＥＦＶをチオール基で修飾する(図１７Ａ)。さらに、ＥＦＶは、５機能性Ｃ'ドット上の他の機能基の吸光度と区別することができる、３００ｎｍ未満の波長範囲における独特の吸光度特性を示す(図１７Ｂ及びＣ)。本明細書では、先に記載した酵素切断可能な薬物-リンカー・コンジュゲートを含む、他の薬物リンカー-コンジュゲーション戦略を使用することができることに留意されたい。チオール修飾ＥＦＶをｃ(ＲＧＤｙＣ)-ｍａｌ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットに付着させた後、アミン-シラン、ＤＦＯ-ＮＣＳ、チオール-シラン及びＦＩＴＣ-ｍａｌを、上記の４機能性Ｃ'ドットのＰＰＳＭＩ合成アプローチに従う順序で反応混合物に添加して、さらにＤＦＯ及びＦＩＴＣ基を、ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットに導入し、放射性金属キレート化及びレシオメトリックｐＨ検知をそれぞれ可能にした。
【０１３４】
得られたＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、精製後に所望のＧＰＣエルグラムを示し、高い粒子純度を示唆した(図６Ａ)。ＦＣＳ自己相関曲線は、狭い粒径分布を示すシングルモード相関関数を用いて良好に適合された(図６Ｂ)。ＦＩＴＣ-ＤＦＯ-ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットの吸光度は、スペクトル全体にわたって複数のピークを示し、これは、一連の吸光度スペクトル標準を用いてスペクトルをフィッティングすることによって、各成分からの個々の寄与にうまくデコンボリューションすることができた(図６Ｄ〜Ｈ)。次いで、Ｃ'ドット上の各機能基についての具体的な平均数を、各成分の濃度を上記と同様にＦＣＳから得られたＮＰの濃度で割ることによって推定した(表１及び図６Ｃ〜Ｈ)。合計４種類の異なる機能基がＣ'ドット表面に付着しているが、平均粒径は６．９ｎｍと７ｎｍ未満のままであり、依然として臨床的に適用されたＣ'ドットのサイズに非常に近かった(表１)。
【０１３５】
この実施例では、蛍光超小型(＜１０ｎｍ直径)ＰＥＧ化シリカベースのナノ粒子(ここではＣ'ドット)の表面上に、複数の(ここでは４つまでの)種類の機能性リガンドをモジュール式及び部分的に直交する方法で導入するワンポット型合成アプローチを記載する。様々なヘテロ二官能性ＰＥＧ-シランをシリカコアの表面上に共縮合させることにより、ＰＥＧ化工程の間に、様々な種類の機能基を導入することができる。しかし、我々はＰＥＧ化工程の間に機能基が導入されるこのアプローチ及び類似のアプローチが限定され、そしてしばしば、粒子凝集のような望ましくない特性をもたらすことを実証した。これらの制限は、挿入によるＰＥＧ化後表面修飾(ＰＰＳＭＩ)反応に移行することによって克服することができる。ＰＥＧ化後、小さい直交反応性リガンド、例えばアミノ-及び／又はチオール-シラン分子をＰＥＧ層に挿入し、シラン縮合を介してシリカ表面に付着させて、粒子追跡及び腫瘍標的化リガンドのための蛍光に勝る機能性を有するモジュールＮＰ修飾を可能にすることができる。最も効率的なキレート剤(例えば、89Ｚｒ及び177Ｌｕ標識のための)であるＤＦＯ及びＤＯＴＡはそれぞれ、アミン又はチオール基との反応を通じて、ＰＥＧ鎖間及びＣ'ドットのシリカ表面に結合することができる。Ｃ'ドット型ＰＥＧ化シリカナノ粒子を機能化するためのＰＰＳＭＩ法は、チオール-エン及びアジド-アルキンクリック反応を含む他の種類の広く使用されているコンジュゲーション化学を採用することによって一般化することができる。さらに、異なるコンジュゲーション化学を使用する挿入によるＰＥＧ化後表面修飾を組み合わせて、多機能性Ｃ'ドットへのモジュール及び直交アクセスを提供することができる。最後に、表面機能性を最大にするために、ＰＥＧ鎖間にリガンドを挿入することによるＰＥＧ化後表面修飾を、ＰＥＧ化工程中のものと組み合わせて、表面結合ＰＥＧ鎖の外側に表面リガンドをもたらすことができる。原理証明として、５機能性ＤＦＯ-ＦＩＴＣ-ＥＦＶ-ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを合成し、単一粒子上で合計５種類のリガンド基／機能性を組み合わせた：光学粒子イメージングを可能にする粒子コア中のＮＩＲ蛍光色素、特異的腫瘍細胞標的化を可能にするペプチドリガンド、定量的レシオメトリック検知を可能にするｐＨ検知色素、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)イメージング及び放射線療法へのアクセスを可能にする放射線金属キレート剤、ならびに粒子をセラノスティックにし、疾患治療能力を可能にするリガンド-薬物コンジュゲート。これは全て、臨床への粒子適用に必要とされる好ましい生体内分布及びＰＫ特性を維持するはずの、７ｎｍ未満の超小粒子サイズ、高いＰＥＧ化密度、良好なコロイド安定性、及び個々のリガンド数／表面密度に対する制御のようなナノ粒子特性を同時に維持しながら達成される。複数の特定のＣ'ドットが、ヒト臨床試験のためにＦＤＡによって既にＩＮＤ承認されているが、この研究はＣ'ドットの臨床適用のさらなる多様化のためのゲートを開く。
【０１３６】
化学物質及び試薬
全ての材料は、受け取ったままで使用した。ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、イソプロパノール、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(ＭＰＴＭＳ)、(３-アミノプロピル)トリエトキシシラン(ＡＰＴＥＳ)、(３-アミノプロピル)トリメトキシシラン(ＡＰＴＭＳ)、オルトケイ酸テトラメチル(ＴＭＯＳ)、エファビレンツ(ＥＦＶ)、及びエタノール中２．０Ｍアンモニアを、Sigma Aldrichから購入した。メトキシ末端ポリ(エチレングリコール)鎖(ＰＥＧ-シラン、モル質量約５００)をGelestから購入した。マレイミド基及びＮＨＳエステル基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ(ｍａｌ-ＰＥＧ-ＮＨＳ、モル質量約８７０)をQuanta BioDesignから購入した。ヘテロ官能性アジド-ＰＥＧ-チオール(約６００のモル質量)は、Nanocs Inc.から購入した。Ｃｙ５及びＣｙ５.５蛍光色素をGEから購入し、ＣＷ８００蛍光色素をLi-corから購入した。Ｓ-２-(４-イソチオシアナトベンジル)-１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸(ＤＯＴＡ-ＮＣＳ)、及び１-(４-イソチオシアナトフェニル)-３-[６,１７-ジヒドロキシ-７,１０,１８,２１-テトラオキソ-２７-(Ｎ-アセチルヒドロキシルアミノ)-６,１１,１７,２２-テトラアザヘプタエイコシン]チオ尿素(ＤＦＯ-ＮＣＳ)を、Macrocyclicsから購入した。環状(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-Ｄチロシン-システイン)ペプチド(ｃ(ＲＧＤｙＣ))は、Peptide Internationalから購入した。Millipore Milli-Ｑシステムを用いて脱イオン水(ＤＩ水)を生成した。
【０１３７】
様々なＣ'ドット化学を記述するための包括的な命名法
本明細書で導入され、異なるＣ'ドット化学を区別するために以下で使用される命名法は、図７に示される(表１も参照)。より詳細には、左側からの第１の語がＮＰ生成物プラットフォーム、例えば、水ベースのＣ'ドット又は単孔メソポーラスシリカナノ粒子(ｍＣドット)。シリカマトリクス中に共有結合的に封入された特定の色素は、ＮＰプラットフォームに続く括弧内で特定される(例えば、図７のＣｙ５)。括弧の右側の内容は、ＮＰ表面に付着した成分を、それらの付着の順序で記述する(ドットは最初に合成されるので、それらは既存の短縮された命名法におけるように、右側ではなく左側に現れる)。粒子表面上の機能基の結合性を強調するために、我々は以下の区別を導入する：ダッシュの右側に現れる成分は、それがそのダッシュの左側の成分に直接付着していることを示す。対照的に、成分がアンダースコアの右側に現れる場合、この成分は、そのアンダースコアの左側の先の成分に付着されるのではなく、シリカＮＰ表面に直接付着される。コンジュゲーション化学に使用される基(例えば、マレイミドとチオール基との間のコンジュゲーションを表すｍａｌ-チオール)とは対照的に、機能を規定する成分(例えば、標的リガンド又は他の蛍光色素)は太字であり、イタリック体である(図７及び表１を参照のこと)。機能基がＰＥＧ鎖を介してシリカＮＰ表面に連結される場合、エチレングリコールモノマー単位の数が示される(例えばＰＥＧ６又はＰＥＧ１２)。序論で概説したように、このようにして、ナノ粒子名は、(ｉ)ＮＰプラットフォーム、(ii)封入された蛍光色素、(iii)特定の表面機能性及び粒子へのその結合性、(iv)特定のコンジュゲーション化学、(ｖ)合成順序、又は(vi)特定のＰＥＧ鎖長に関する正確な情報を有する。
【０１３８】
様々な種類のＮＩＲ色素で機能化したＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６の合成
ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化Ｃ'ドットの詳細な合成は、我々の以前の刊行物に記載されている。様々な種類のＮＩＲ色素を封入するために、シラン官能化色素、すなわち、Ｃｙ５-シラン、Ｃｙ５.５-シラン及びＣＷ８００-シランを、Ｃ'ドット合成の第一工程の間にＴＭＯＳと一緒に、反応混合物に添加した。ＮＰ合成の残りは、ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化Ｃ'ドットについて以前に報告したプロトコルと同じままとした。
【０１３９】
粒子当たりのｃ(ＲＧＤｙＣ)数の増加を伴うＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６の合成
ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シランの濃度を、最初の０．６９ｍＭから(これは、Ｃ'ドット当たりのｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドの数を、典型的には１６〜２５とする)、１．７３ｍＭ(この濃度は、ＮＰ当たりのｃ(ＲＧＤｙＣ)の数をさらに増加させる)に増加させた。ＮＰ凝集を防ぐために、水酸化アンモニウムの反応濃度も２ｍＭから６ｍＭに増加させた。これは、６ｍＭの水酸化アンモニウム濃度でＣ'ドット合成を開始するか、又はＰＥＧ化工程の直前に追加の水酸化アンモニウムを添加して水酸化アンモニウムの濃度を６ｍＭに増加させるかのいずれかによって、達成することができる。これらの２つのわずかに異なるアプローチによって生成された最終的なＣ'ドット生成物には、わずかな差異のみが観察された。したがって、製造工程を簡略化するためには、アンモニウム濃度６ｍＭで合成を開始することが好ましい。
【０１４０】
Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ_ＰＥＧ６、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_ＰＥＧ６、及びＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ４-ＤＢＣＯ_ＰＥＧ６の合成。
Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６に追加の機能性リガンドを導入するために、ＰＥＧ化工程中に、リガンド-シラン・コンジュゲートを、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランと共に、反応混合物に添加した。これらのリガンド-シラン・コンジュゲートには、マレイミド官能化ヘテロ二官能性ＰＥＧ-シラン(ｍａｌ-ＰＥＧ-シラン)、ＤＦＯ機能化シラン(ＤＦＯ-ＮＣＳ-アミン-シラン)及びＤＢＣＯ機能化ヘテロ二官能性(二機能性)ＰＥＧ-シラン(ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-シラン)が含まれた。これらのリガンド-シラン・コンジュゲートの濃度は、表面リガンド密度の要求に応じて、０．０１ｍＭ〜０．３４ｍＭの範囲であった。このアプローチによって産生されたＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ_ＰＥＧ６は、チオール-官能化リガンドとの所望の反応性を示した。しかし、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_ＰＥＧ６及びＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ４-ＤＢＣＯ_ＰＥＧ６は、望ましくない特性プロファイル又は不均一なリガンド分布を示した。
【０１４１】
Ｃ'ドット(色素)-アミン_ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６、及びＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンの合成。
Ｃ'ドットにアミン基を導入するために、アミノシラン、すなわちＡＰＴＭＳを、Ｃ'ドット合成の異なる工程の間に、反応混合物中に導入した。１つの方法では、ＡＰＴＭＳを、ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-シラン及びＰＥＧ-シランを１．７ｍＭの濃度で添加する直前に、激しい撹拌下で反応混合物に添加したが、合成の残りは同じままとした。得られたＣ'ドット(色素)-アミン_ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６は、広がったＮＰサイズ分布を示した。同時に、Ｃｙ５色素の分解が観察された。ＰＥＧ化後アプローチでは、ＡＰＴＭＳをＰＥＧ化工程の後に添加した。これは、ＰＥＧ化工程の最後で、まず反応温度を８０℃から室温に下げ、続いて２．３ｍＭの濃度で激しく撹拌しながらＡＰＴＭＳを添加することによって行った。次いで、反応混合物を、激しく撹拌しながら室温で一晩放置した後、精製した。得られたＣ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンは、ＧＰＣ及びＵＶ-ｖｉｓ特性評価によって示されるように、所望のＮＰサイズ分布及び好ましい吸光度特性を示した。このアプローチでは、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンを、０．３ｍＭ程度の低いＡＰＴＭＳ濃度で首尾よく製造することができた（アミン反応性リガンドとの反応性を失ったＮＰ生成物を生じることなしに）。
【０１４２】
Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ、及び、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＯＴＡの、ＰＰＳＭＩに基づく合成
Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ、及び、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＯＴＡは、アミノ-シラン添加の１日後、激しく撹拌しながら室温にて、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンの反応混合物中に、ＤＦＯ-ＮＣＳ又はＤＯＴＡ-ＮＣＳをそれぞれ添加することによって合成した。反応物を、激しく撹拌しながら室温にて一晩放置し、その後精製した。ＤＦＯ-ＮＣＳ、及びＤＯＴＡ-ＮＣＳの濃度を、大まかに０．０２ｍＭ〜０．４ｍＭの間で変化させ、ＮＰ当たりのＤＦＯ又はＤＢＣＯの数を変化させた。ＡＰＴＭＳ及びＤＦＯの両方の濃度は、ＮＰ当たりのＤＦＯの数を制御するために変えることができた。
【０１４３】
Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオール、及び、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣの、ＰＰＳＭＩに基づく合成
ＰＥＧ-Ｃ'ドットにチオール基を導入して、チオール-官能化Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオールを生成するために、アミン-シランをチオール-シランで置き換えること、及び、ベースＮＰとして、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６の代わりに、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６を使用することによって、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンの合成を修正した。ＮＰの合成の残りは、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンの合成と同じとした。さらに、ＦＩＴＣ色素を、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオールに付着させて、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣを生成するために、ＤＦＯ-ＮＣＳをＦＩＴＣ-ｍａｌで置き換えることによって、及び、ベースＮＰとして、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミンの代わりに、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオールを使用することによって、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯの合成を修正した。ＮＰの合成の残りは、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯの合成と同じとした。
【０１４４】
４機能性のＣ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣのＰＰＳＭＩに基づく合成
Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯのために記載した合成アプローチにより、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６にまずＤＦＯ基を導入することによって、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣを合成した。その後、前記合成アプローチにより、チオール基を、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオールに添加して、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオールを生成した。最後の工程で、前記合成アプローチにより、ＦＩＴＣ色素を、Ｃ'ドット(色素)-ＰＥＧ６_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣに付着させた。得られたＣ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣを、最終的に、ＧＰＣによって精製し、ＦＣＳ及び光学特性評価に供した。同じＣ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣはまた、別のアプローチでも合成され、そのアプローチでは、アミン-シランとチオール-シランを、別々に添加する代わりに、反応混合物中に一緒に添加した。反応物をその後、激しく撹拌しながら室温で４時間放置し、続いて、ＤＦＯ-ＮＣＳ及びＦＩＴＣ-ｍａｌを同時に添加した。反応の残りは同じとした。
【０１４５】
Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ＰＥＧ１０-ＥＶＦ_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣの合成
ＤＭＳＯ中でのアジド-アルキン・クリックケミストリーによって、まずＥＦＶにアジド-ＰＥＧ-チオールをコンジュゲートすることによって、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ＰＥＧ１０-ＥＶＦ_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣを合成した。この際、モル比は４ＥＦＶ：１アジド-ＰＥＧ-チオールとし、ＥＦＶの濃度は約０．０２１Ｍとした。反応混合物を、窒素下で６日間放置し、所望のコンジュゲーション率を達成した。得られたチオール-官能化ＥＦＶを、次いで、ＰＥＧ工程の直後、すなわち、８０℃での熱処理工程後に、１．１５ｍＭの濃度で、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ_ＰＥＧ６の反応混合物中に添加した。反応混合物をその後激しく撹拌しながら、室温でさらに６日間放置し、チオール-官能化ＥＦＶを、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ_ＰＥＧ６上のマレイミド基に付着させて、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ＰＥＧ１０-ＥＶＦ_ＰＥＧ６を生成した。その後、Ｃ'ドット(Ｃｙ５)-ＰＥＧ１２-ｍａｌ-チオール-ｃ(ＲＧＤｙＣ)_ＰＥＧ６_アミン-ＮＣＳ-ＤＦＯ_チオール-ｍａｌ-ＦＩＴＣのために上述したのと同じ手順によって、ＤＦＯ及びＦＩＴＣを導入した。
【０１４６】
ｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃ'ドットのＧＰＣ特性評価及び精製
Ｃ'ドットの詳細なＧＰＣ特性評価及び精製工程は、我々の以前の刊行物に記載されている。
【０１４７】
ＵＶ-ｖｉｓ及びＦＣＳ測定
試料の吸光度スペクトルを、Varian Cary 5000分光光度計で測定した。ＦＣＳ測定は、前述のように家庭用ＦＣＳ／ＦＣＣＳセットアップを使用して行った。６３５ｎｍの固体レーザーを用いてＣｙ５及びＣｙ５.５ドットを励起し、７８５ｎｍの固体レーザーを用いてｃｗ８００ドットを励起した。
【０１４８】
様々なＣ'ドット化学を記述するための包括的な命名法
本明細書で導入され、異なるＣ'ドット化学を区別するために以下で使用される命名法は、図７に示される(表１も参照)。より詳細には、左側からの第１の語がＮＰ生成物プラットフォーム、例えば、水ベースのＣ'ドット又は単孔メソポーラスシリカナノ粒子(ｍＣドット)。シリカマトリクス中に共有結合的に封入された特定の色素は、ＮＰプラットフォームに続く括弧内で特定される(例えば、図７のＣｙ５)。括弧の右側の内容はＮＰ表面に付着した成分を、それらの付着の順序で記述する(ドットは最初に合成されるので、それらは我々の既存の命名法におけるように、右側ではなく左側に現れる)。粒子表面上の機能基の結合性を強調するために、我々は以下の区別を導入する：ダッシュの右側に現れる成分は、それがそのダッシュの左側の成分に直接付着していることを示す。対照的に、成分がアンダースコアの右側に現れる場合、この成分は、そのアンダースコアの左側の先の成分に付着されるのではなく、シリカＮＰ表面に直接付着される。コンジュゲーション化学に使用される基(例えば、マレイミド基とチオール基との間のコンジュゲーションを表すｍａｌ-チオール)とは対照的に、機能を規定する成分(例えば、標的リガンド又は他の蛍光色素)は太字であり、イタリック体である(図７及び表１を参照のこと)。機能基がＰＥＧ鎖を介してシリカＮＰ表面に連結される場合、エチレングリコールモノマー単位の数が示される(例えばＰＥＧ６又はＰＥＧ１２)。序論で概説したように、このようにして、ナノ粒子名は、(ｉ)ＮＰプラットフォーム、(ii)封入された蛍光色素、(iii)特定の表面機能性及び粒子へのその結合性、(iv)特定のコンジュゲーション化学、(ｖ)合成順序、又は(vi)特定のＰＥＧ鎖長に関する正確な情報を有する。
【０１４９】
［実施例２］
この実施例は、本開示の方法及び組成物、並びにその使用の例を提供する。
【０１５０】
ＰＰＳＭＩアプローチによって合成された機能的Ｃ'ドットの例、すなわちＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを記載する(図１８)。ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、Ｃ'ドット表面上のＰＥＧ鎖間にＤＢＣＯ反応基を含有する。ＤＢＣＯ基は、クリックケミストリーを介して、アジド-コンジュゲート化機能性リガンドとさらに反応することができ、Ｃ'ドットに追加の機能基を導入する。ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを生成するために、シラン-コンジュゲート化Ｃｙ５蛍光色素を、まずシリカナノ粒子中に共有結合的に封入した(Ｃ'ドットシリカコアの形成中に)。次いで、ＰＥＧ-シランをシリカナノ粒子の表面に共有結合させて、ＰＥＧ化ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを形成した。ＰＥＧ化工程の後、アミン-シランを反応混合物に添加して、シラン縮合を介して、Ｃ'ドットのＰＥＧ層下の残りのシラノール基に共有結合させ、反応性アミン基を導入した。次いで、ＤＢＣＯ-ＰＥＧ４-ＮＨＳエステルを添加して、アミン-ＮＨＳエステル・コンジュゲーション反応を介して、Ｃ'ドットのＰＥＧ層下のアミン基とさらに反応させた。異なる濃度のＤＢＣＯ-ＰＥＧ４-ＮＨＳエステルを使用して、ＤＢＣＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットのＤＢＣＯリガンド数を変化させた。
【０１５１】
［実施例３］
この実施例は、本開示の方法及び組成物、並びにその使用の例を提供する。
【０１５２】
ＰＰＳＭＩアプローチによって合成された機能性Ｃ'ドットの例、すなわち、ＤＢＣＯ-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを記載する(図１９)。ＤＢＣＯ-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットは、Ｃ'ドット表面上のＰＥＧ鎖間に、ＤＢＣＯ反応性基及びＤＦＯキレート基の両方を含む。ＤＢＣＯ基は、Ｃ'ドットに追加の機能基を導入するために、クリックケミストリーを介して、アジド-コンジュゲート化機能性リガンドとさらに反応することができるが、ＤＦＯ基は放射性金属をキレート化して、Ｃ'ドットを陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)プローブとして使用することを可能にする。ＤＢＣＯ-ＤＦＯ-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを製造するために、シラン-コンジュゲート化Ｃｙ５蛍光色素を、まずシリカナノ粒子中に共有結合的に封入した(Ｃ'ドットシリカコアの形成中に)。次いで、ＰＥＧ-シランをシリカナノ粒子の表面に共有結合させて、ＰＥＧ化ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ'ドットを形成した。ＰＥＧ化工程の後、アミン-シランを反応混合物に添加して、シラン縮合を介して、Ｃ'ドットのＰＥＧ層下の残りのシラノール基に共有結合させ、反応性アミン基を導入した。次に、ＳＣＮ官能化ＤＦＯ(ＤＦＯ-ＳＣＮ)を反応混合物に添加して、アミン-ＳＣＮ・コンジュゲーション反応を介して、Ｃ'ドットのＰＥＧ層下のアミン基と反応させた。
低濃度のＤＦＯ-ＳＣＮを用いて、各Ｃ'ドットに、５個未満と少ないＤＦＯキレート剤を導入した。従って、Ｃ'ドット表面上の残りのアミン基は、上記のようにＤＢＣＯ付着のために使用され得る。ＤＦＯ-ＳＣＮの添加の１日後、次いで、ＤＢＣＯ-ＰＥＧ４-ＮＨＳエステルを反応混合物に添加して、アミン-ＮＨＳエステル・コンジュゲーション反応を介して、Ｃ'ドットのＰＥＧ層下の残りのアミン基とさらに反応させた。その結果、ＤＦＯとＤＢＣＯの両方が、ＰＰＳＭＩ法によりＰＥＧ鎖間のＣ'ドット表面に共有結合した。
【０１５３】
［実施例４］
この実施例は、本開示の反応条件の要約を提供する。
【０１５４】
合成システムは、様々な機能基を、単一のナノ粒子プラットフォーム上で選択的に組み合わせるために、少なくとも９つの直交式及びモジュール式機能化経路に拡張することができる。これらの機能化アプローチが適用可能なナノ粒子プラットフォームには、Ｃ'ドット、ＡｌＣ'ドット、及びｍＣドットが含まれるが、これらに限定されない(表２の1)。
【０１５５】
Ｃｙ５、Ｃｙ５.５及びｃｗ８００に加えて、他の種類の色素をコンジュゲーション化学(チオール-エン、アミン-ＮＨＳエステル、アジド-アルキン化学を含むがこれらに限定されない)によって、シラン基で官能化することができる。次いで、色素-シラン・コンジュゲートを、異なる蛍光特性をナノ粒子に与えるために、コア形成工程の間に添加することができる。異なる種類の色素としては、ＤＡＣＭ、ＤＥＡＣ、ＲＨＧ、ＴＭＲ、ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ６８０及びＤＹ７８２が挙げられるが、これらに限定されない(表２の2)。
【０１５６】
ｃ(ＲＧＤｙＣ)癌標的化ペプチドに加えて、特定の用途機能を果たす他のリガンドを、コンジュゲーション化学(チオール-エン、アミン-ＮＨＳエステル、アジド-アルキン化学を含むがこれらに限定されない)により、ヘテロ二官能性ＰＥＧ-シランに付着させることができる。次いで、得られたリガンド-ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを、ＰＥＧ化工程中に添加して、ナノ粒子に異なる機能を付与することができる。異なる機能性リガンドには、ペプチド、抗体フラグメント、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、蛍光色素、検知分子、薬物分子及びキレート剤分子が含まれるが、これらに限定されない(表２の3)。
【０１５７】
マレイミド官能化ヘテロ二官能性ＰＥＧ-シランに加えて、反応基を含有する他のヘテロ二官能性ＰＥＧ-シランを、ＰＥＧ化工程の間に、ナノ粒子表面に付着させることができ、追加の機能性リガンドでナノ粒子をさらに修飾することができる(ＰＥＧ鎖末端にて)。反応基としては、マレイミド基、ＮＨＳエステル基、アジド基、アミン基、チオール基、アルキン基及びＤＢＣＯ基が挙げられるが、これらに限定されない(表２の4)。
【０１５８】
ＥＦＶ-ＰＥＧ-ＳＨに加えて、ＰＥＧ化後、特定の用途機能を実行する他のリガンドを、コンジュゲーション化学(チオール-エン反応、アミン-ＮＨＳエステル反応、又はアジド-アルキン反応を含むが、これらに限定されない)により、ナノ粒子表面上のＰＥＧ鎖末端に既に存在する反応基に付着させることができる。異なる機能性リガンドには、ペプチド、抗体フラグメント、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、蛍光色素、検知分子、薬物分子、及びキレート剤分子が含まれるが、これらに限定されない(表２の5)。
【０１５９】
チオール-シラン及びアミノ-シランに加えて、反応基を有する他のシランコンジュゲートを、ＰＥＧ化後にＰＥＧ層中に挿入し、下のシリカ表面に付着させることができ、追加の機能性リガンドでナノ粒子をさらに修飾することができる(ＰＥＧ鎖の間で)。反応基としては、マレイミド基、ＮＨＳエステル基、アジド基、アミン基、チオール基、アルキン基及びＤＢＣＯ基が挙げられるが、これらに限定されない(表２の6)。
【０１６０】
ＤＦＯ、ＤＯＴＡ及びＦＩＴＣに加えて、ＰＥＧ化後、特定の用途機能を果たす他のリガンドを、ＰＥＧ層中にすでに挿入されている反応基に付着させることができる。異なる機能性リガンドには、ペプチド、抗体フラグメント、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、蛍光色素、検知分子、及びキレート剤分子が含まれるが、これらに限定されない(表２の7)。
【０１６１】
特定の用途機能を果たす小さいリガンドを含む他のシランコンジュゲートを、ＰＥＧ化後にＰＥＧ層中に挿入し、その下のシリカ表面に付着させることができる。異なる機能性リガンドには、ペプチド、抗体フラグメント、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、蛍光色素、検知分子及びキレート剤分子が含まれるが、これらに限定されない(表２の8)。
【０１６２】
［表２］
2020520930.tif 000007
【図１】
2020520930.tif 000010
【図２Ａ−Ｃ】
2020520930.tif 000011
【図２Ｄ−Ｆ】
2020520930.tif 000012
【図３Ａ−Ｄ】
2020520930.tif 000013
【図３Ｅ−Ｈ】
2020520930.tif 000014
【図４Ａ−Ｄ】
2020520930.tif 000015
【図４Ｅ−Ｈ】
2020520930.tif 000016
【図５Ａ−Ｃ】
2020520930.tif 000017
【図５Ｄ−Ｆ】
2020520930.tif 000018
【図６Ａ−Ｄ】
2020520930.tif 000019
【図６Ｅ−Ｈ】
2020520930.tif 000020
【図７】
2020520930.tif 000021
【図８Ａ−Ｄ】
2020520930.tif 000022
【図８Ｅ−Ｈ】
2020520930.tif 000023
【図８Ｉ−Ｌ】
2020520930.tif 000024
【図９】
2020520930.tif 000025
【図１０Ａ−Ｄ】
2020520930.tif 000026
【図１０Ｅ−Ｈ】
2020520930.tif 000027
【図１１】
2020520930.tif 000028
【図１２Ａ−Ｄ】
2020520930.tif 000029
【図１２Ｅ−Ｈ】
2020520930.tif 000030
【図１３Ａ−Ｃ】
2020520930.tif 000031
【図１３Ｄ−Ｆ】
2020520930.tif 000032
【図１４】
2020520930.tif 000033
【図１５Ａ−Ｃ】
2020520930.tif 000034
【図１５ＤＥ】
2020520930.tif 000035
【図１６Ａ−Ｃ】
2020520930.tif 000036
【図１６Ｄ−Ｇ】
2020520930.tif 000037
【図１７】
2020520930.tif 000038
【図１８Ａ−Ｃ】
2020520930.tif 000039
【図１８Ｄ−Ｇ】
2020520930.tif 000040
【図１９】
2020520930.tif 000041
【国際調査報告】
2020520930.tif 000042
2020520930.tif 000043