(57)【要約】  本発明は、一般に、様々な実施形態において、単一サンプル又は単一細胞中におけるタンパク質などの非核酸分子及び核酸の両方の発現を検出し及び／又は定量化するための方法、結合剤及びキットを提供する。本発明の方法、結合剤及びキットは、所定の非核酸分子（例えばタンパク質）を発現するサンプル中の細胞の数を検出し及び／又は定量化するのに有用である。
2020513826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的非核酸分子及び標的核酸分子を検出する方法であって、次の工程：
（ａ）標的非核酸分子及び標的核酸分子を含むサンプルと結合剤とを前記サンプル中における前記結合剤と前記標的非核酸分子との結合を可能にする条件下で接触させ、ここで、前記結合剤は、結合剤識別タグを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
（ｂ）前記サンプル中における前記結合オリゴヌクレオチドと前記標的核酸分子とを同時に逆転写させ、それによって結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と標的核酸分子逆転写産物とを生成させ；
（ｃ）前記結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と前記標的核酸分子逆転写産物とを同時に増幅させ、それによって結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物とを生成させ；及び
（ｄ）（１）前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的非核酸分子を検出し、及び（２）前記標的核酸分子増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的核酸分子を検出すること
を含む方法。
【請求項２】
前記結合剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合オリゴヌクレオチドがＤＮＡ分子である、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分子が一本鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端が前記結合剤に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの３’末端が前記結合剤に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記結合オリゴヌクレオチドがポリ（Ａ）配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記結合オリゴヌクレオチドが親和性タグをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記結合オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの伸長を阻害するブロッキング基をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ブロッキング基がｄｄＮＴＰ又は逆ｄＴＴＰである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ブロッキング基が、前記結合オリゴヌクレオチドの３’末端にある、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）が、前記結合オリゴヌクレオチドの３’末端を逆転写酵素で伸長させ、それによって二本鎖結合オリゴヌクレオチド逆転写産物を生成することをさらに含む、請求項１〜６、８又は９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｂ）における前記結合オリゴヌクレオチドの逆転写が、細胞識別タグ若しくは固有分子識別子（ＵＭＩ）配列又はそれらの組み合わせを含む伸長プライマーを使用してプライミングされる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記伸長プライマーが、その３’末端にポリ（Ｔ）配列をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記伸長プライマーのポリ（Ｔ）配列が、前記結合オリゴヌクレオチドのポリ（Ａ）配列の長さ以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）が、前記サンプル中の非標的核酸分子を逆転写することをさらに含み、それによって非標的核酸分子逆転写産物を生成する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプル中の前記非標的核酸分子が非標的ｍＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸分子逆転写産物を前記工程（ｃ）において選択的に増幅させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸分子逆転写産物及び前記非標的核酸分子逆転写産物を前記工程（ｃ）で増幅させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び前記標的核酸分子増幅産物を前記工程（ｄ）における検出の前に分離する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び前記標的核酸分子の増幅産物をサイズに基づいて分離する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程（ｃ）で生成された増幅産物に対して、配列決定プライマーのための結合部位を付加することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記配列決定プライマーのための結合部位を、トランスポゾンを使用して付加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記配列決定プライマーのための結合部位を、前記増幅産物の核酸分子を断片化し、そして前記結合部位を前記断片に連結することによって、プライマー伸長反応によって若しくは核酸増幅反応によって又はそれらの組み合わせによって付加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び前記標的核酸増幅産物をサイズに基づいて検出する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び前記標的核酸増幅産物に対して異なる標識を行い、前記工程（ｄ）における検出を、前記増幅産物について前記異なる標識を検出することによって実施する、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記工程（ｄ）において前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び前記標的核酸増幅産物を検出することが、前記増幅産物を配列決定することを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプル中の前記標的非核酸分子、前記標的核酸分子又はその両方の発現を定量化することをさらに含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記標的非核酸分子が標的タンパク質である、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸分子が標的ＲＮＡ分子である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記標的ＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが複数の細胞を含む、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、前記工程（ｂ）の前に複数の細胞を含むサンプルから単一細胞を単離することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが単一の細胞を含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドに共有結合した結合剤であって、前記オリゴヌクレオチドは、結合剤識別タグと、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害するブロッキング基とを含む結合剤。
【請求項３７】
前記結合剤が抗体である、請求項３６の結合剤。
【請求項３８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７記載の結合剤。
【請求項３９】
前記結合オリゴヌクレオチドがＤＮＡ分子である、請求項３６、３７又は３８に記載の結合剤。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ分子が一本鎖である、請求項３９に記載の結合剤。
【請求項４１】
前記結合オリゴヌクレオチドがポリ（Ａ）配列をさらに含む、請求項３６〜４０のいずれかに記載の結合剤。
【請求項４２】
ブロッキング基がｄｄＮＴＰ又は逆ｄＴＴＰである、請求項３６〜４１のいずれかに記載の結合剤。
【請求項４３】
ブロッキング基が、前記結合オリゴヌクレオチドの３’末端にある、請求項３６〜４２のいずれかに記載の結合剤。
【請求項４４】
前記結合剤と前記オリゴヌクレオチドとの間にリンカーをさらに含む、請求項３６〜４３のいずれかに記載の結合剤。
【請求項４５】
サンプル中の標的非核酸分子及び標的核酸分子を検出するためのキットであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドに共有結合した結合剤であって、前記オリゴヌクレオチドが結合剤識別タグを含むものと、
（ｂ）１種以上のＤＮＡ増幅プライマーと
を含むキット。
【請求項４６】
前記結合剤が抗体である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記結合オリゴヌクレオチドがＤＮＡ分子である、請求項４５、４６又は４７のキット。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ分子が一本鎖である、請求項４８記載のキット。
【請求項５０】
前記結合オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害するブロッキング基を含む、請求項４５〜４９のいずれかに記載のキット。
【請求項５１】
前記ブロッキング基がｄｄＮＴＰ又は逆ｄＴＴＰである、請求項５０記載のキット。
【請求項５２】
前記ブロッキング基が、前記結合オリゴヌクレオチドの３’末端にある、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５３】
逆転写反応を実施するための試薬をさらに含む、請求項４５〜５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
前記試薬が、逆転写（ＲＴ）酵素、オリゴｄＴプライマー、逆転写緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）又はそれらの組み合わせを含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
核酸増幅反応を実施するための試薬をさらに含む、請求項４５〜５４のいずれかに記載のキット。
【請求項５６】
前記試薬が、ＤＮＡポリメラーゼ、増幅緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）又はそれらの組み合わせを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
１種以上の配列決定プライマーをさらに含む、請求項４５〜５６のいずれかに記載のキット。
【請求項５８】
サンプル中の標的タンパク質及び標的核酸分子を検出する方法であって、次の工程：
（ａ）標的タンパク質及び標的核酸分子を含むサンプルと結合剤とを前記サンプル中における前記結合剤と前記標的タンパク質との結合を可能にする条件下で接触させ、ここで、前記結合剤は、結合剤識別タグを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
（ｂ）前記サンプル中における前記結合オリゴヌクレオチドと前記標的核酸分子とを同時に逆転写させ、それによって結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と標的核酸分子逆転写産物とを生成させ；
（ｃ）前記結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と前記標的核酸分子逆転写産物とを同時に増幅させ、それによって第１の結合オリゴヌクレオチド増幅産物と第１の標的核酸分子増幅産物とを生成させ；
（ｄ）第１の結合オリゴヌクレオチド増幅産物と第１の標的核酸分子増幅産物とを分離し；
（ｅ）分離した結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物とを別々の反応で増幅させ、それによって第２の結合オリゴヌクレオチド増幅産物と第２の標的核酸分子増幅産物とを生成し；及び
（ｆ）（１）前記第２の結合オリゴヌクレオチド増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的タンパク質を検出し、及び（２）前記第２の標的核酸分子増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的核酸分子を検出すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年３月２４日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１７０２４２３Ｘ号に対する３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条又は第３６５条に基づく優先権を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示を参照により本明細書において援用する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
タンパク質の検出及び定量化は、分子生物学研究及び医療用途の両方のために重要である。免疫ＰＣＲ技術は、様々な異なる形式のＤＮＡラベルを持つタンパク質を検出できる１つの方法を提供する。多くの免疫ＰＣＲ手法では、まず標的アナライトを表面に固定し、その後増幅のためにＤＮＡラベル及びオリゴヌクレオチドタグ（ＩＤ）を有する抗体を使用して検出することを伴う異種アッセイを使用する。この手法はタンパク質検出の顕著な進歩を示しているが、感度が低いことや標的結合速度が緩やかなことなどのいくつかの欠点がある。さらに、この手法には、複合体結合化学が必要となる。
【０００４】
サンプル中の非ＤＮＡ分子を検出するための高感度で迅速な方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、サンプルの要素又は成分を定量化するための方法、結合剤及びキットを提供する。例えば、この方法は、サンプル中に存在するタンパク質、核酸、及び／又は細胞の定量化に適用できる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプルからプロテオミクス情報及び核酸情報を取得するために使用できる方法を提供する。
【０００７】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、サンプル中の標的非核酸分子（例えば標的タンパク質）及び標的核酸分子（例えば標的ｍＲＮＡ）を検出する方法を提供する。この方法は、概して次の工程を含む：
（ａ）標的非核酸分子及び標的核酸分子を含むサンプルと結合剤とを前記サンプル中における前記結合剤と前記標的非核酸分子との結合を可能にする条件下で接触させ、ここで、前記結合剤は、結合剤識別タグを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
（ｂ）前記サンプル中における前記結合オリゴヌクレオチドと前記標的核酸分子とを同時に逆転写させ、それによって結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と標的核酸分子逆転写産物とを生成させ；
（ｃ）前記結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と前記標的核酸分子逆転写産物とを同時に増幅させ、それによって結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物とを生成させ；及び
（ｄ）（１）前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的非核酸分子を検出し、及び（２）前記標的核酸分子増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的核酸分子を検出すること。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害するブロッキング基を含むオリゴヌクレオチドに共有結合する結合剤を提供する。いくつかの実施形態では、結合剤は結合剤識別タグを含む。特定の実施形態では、結合剤は抗体である。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、サンプル中の標的タンパク質及び標的核酸分子を検出するためのキットを提供する。キットは、概して、オリゴヌクレオチドに共有結合した結合剤と、１種以上のＤＮＡ増幅プライマーとを含む。いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは、結合剤識別タグをさらに含む。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明は、サンプル中の標的タンパク質及び標的核酸分子を検出する方法を提供する。本発明の方法は、概して、次の工程：
（ａ）標的タンパク質及び標的核酸分子を含むサンプルと結合剤とを前記サンプル中における前記結合剤と前記標的タンパク質との結合を可能にする条件下で接触させ、ここで、前記結合剤は、結合剤識別タグを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
（ｂ）前記サンプル中における前記結合オリゴヌクレオチドと前記標的核酸分子とを同時に逆転写させ、それによって結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と標的核酸分子逆転写産物とを生成させ；
（ｃ）前記結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と前記標的核酸分子逆転写産物とを同時に増幅させ、それによって第１の結合オリゴヌクレオチド増幅産物と第１の標的核酸分子増幅産物とを生成させ；
（ｄ）第１の結合オリゴヌクレオチド増幅産物と第１の標的核酸分子増幅産物とを分離し；
（ｅ）分離した結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物とを別々の反応で増幅させ、それによって第２の結合オリゴヌクレオチド増幅産物と第２の標的核酸分子増幅産物とを生成し；及び
（ｆ）（１）前記第２の結合オリゴヌクレオチド増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的タンパク質を検出し、及び（２）前記第２の標的核酸分子増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的核酸分子を検出すること。
【００１１】
本明細書に記載の方法、結合剤、及びキットは、プロテオミクス情報及びゲノム情報が同時にかつ同一（又は単一の）サンプルから取得できるため、既存の方法を上回る特定の利点を与える。さらに、この方法、結合剤及びキットにより、タンパク質と核酸の両方を同一サンプルからサンプルを分割することなく測定するためのシンプルなワークフローが可能になる。本明細書に記載されるように、本発明の方法、結合剤及びキットは、所定のサンプル中の多数の異なる標的タンパク質及び核酸に関する情報（例えば発現情報）を提供することができる。
【００１２】
以下に示す図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１：細胞（円）又は細胞群がＤＮＡ結合抗体にさらされている。ここに示されている３つの異なる抗体はそれぞれ異なるＤＮＡタグを有する。サンプルを洗浄して未結合の標的分子を除去し、定量ＰＣＲ又はハイスループットＤＮＡ配列決定分析によりＤＮＡラベルを定量する。
【図２Ａ】図２ＡはＣＤ３陽性細胞の５６．６１％がＣＤ４陽性に染色されたことを示すＦＡＣＳプロットである。
【図２Ｂ】図２ＢはＤＮＡタグ化抗ＣＤ４に基づくＣｔ値のヒストグラムであり、ＤＮＡタグ化法を使用してＣＤ３陽性細胞の５８％がＣＤ４に対して標識されたことを示す。
【図２Ｃ】図２ＣはＣＤ８に対して染色された細胞の分布を示す。
【図２Ｄ】図２ＤはＣＤ８ソーティングからのｑＰＣＲ結果を示す。
【図３】図３：蛍光ＣＤ３、及びＤＮＡバーコードＣＤ４及びＣＤ８によるＰＢＭＣの三重標識。結果は、ＣＤ８を発現するほとんどの細胞がＣＤ４に対して検出できないシグナルを有すること及びその逆を示す。少数のＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞が存在し、ここでは２つが捕捉された（重複領域）。数値はＣｔの逆数に基づく相対的発現である。検出不能なＰＣＲシグナルを４０のＣｔに設定し、このグラフにおいてこれをゼロシグナルとして示している。
【図４】図４：シーケンシング読み取りカウントは、ＣＤ１９（Ｂ細胞）とＣＤ４（Ｔ細胞）の相互に排他的な発現間のバックグラウンドシグナルが低いことを示す。
【図５】図５は増幅プロットである。
【図６】図６は標的ＲＮＡ配列決定（「ＴＣＲ」）方法を含めた、本明細書に記載の方法での使用に適した結合オリゴヌクレオチドの例を示す図である。
【図７】図７は、ポリＡテールを含有する５’結合オリゴヌクレオチド（左上）と、この結合オリゴヌクレオチドのＲＴをプライミングするための細胞識別（セルＩＤ）タグ及び／又はＵＭＩ及びｄＴテール（右上）を含有する伸長プライマーとを含む、本発明の例示方法を示す図である。ＰＣＲプライマー１のみを使用するｃＤＮＡ増幅工程（３’ＲＡＣＥ）の間に、元のコンジュゲート鎖からのアンチセンスプライマー１結合部位を含むＲＴ産物の線形増幅が得られる。
【図８】図８は、ポリＡテール（左上）及び非オリゴ（ｄＴ）を欠失する５’結合オリゴヌクレオチド、又は結合オリゴヌクレオチドのＲＴをプライミングするための細胞識別（細胞ＩＤ）タグ及び／又はＵＭＩ（右上）を含有する鋳型切換伸長プライマーを含む本発明の例示方法を示す図である。並行して、標準又はターゲットｃＤＮＡライブラリーを生成できる。遺伝子特異的プライマーを使用して、標的３’ＲＡＣＥ及び標的５’ＲＡＣＥの両方をｃＤＮＡに対して実施できる。
【図９】図９は、ポリＡテール（左上）及び非オリゴ（ｄＴ）を欠失する３’結合オリゴヌクレオチド、又は結合オリゴヌクレオチドのＲＴをプライミングするための細胞識別（細胞ＩＤ）タグ及び／又はＵＭＩ（右上）を含有する鋳型切換伸長プライマーを含む、本発明の例示方法を示す図である。並行して、標準又はターゲットｃＤＮＡライブラリーを生成できる。遺伝子特異的プライマーを使用して、標的３’ＲＡＣＥ及び標的５’ＲＡＣＥの両方をｃＤＮＡに対して実施できる。
【図１０】図１０は本発明の例示方法の一般的なワークフロー図である。抗体結合体の処理中に、ｃＤＮＡを同一サンプルで、例えばｄＴプライミング及び鋳型切換（５’ＲＡＣＥなど）によって、又はＲＴプライマー（３’末端）上に配置された若しくは５’プライマーを介して後でもたらされる細胞ＩＤを用いた遺伝子特異的プライマーＲＴプライミングによって増幅することもできる。各抗体は固有の抗体バーコード配列を有することができる。ＲＴ工程中に、固有の分子識別（ＵＭＩ）配列を追加して、各ＤＮＡ分子が固有のタグを受け取るようにすることもできる。抗体結合体から得られた配列読取値を、既知の抗体バーコードのリストにマッピングする。その後、測定値はＵＭＩに基づいて崩壊する。同一抗体バーコード及び同一ＵＭＩを持つ配列を１回のみカウントする。データの崩壊後、各抗体バーコードの残りのカウント数は、標的タンパク質の発現レベルを表す。
【図１１Ａ】図１１Ａは１０Ｘゲノミクス３’ＲＮＡシーケンスキットを使用した３’ＲＡＣＥ法のタンパク質発現データである。図８に示す例示方法に従って、ＰＢＭＣをＤＮＡコード抗体で染色し、１０Ｘゲノミクスシングルセル３’試薬キットへの入力として使用した。ライブラリー生成後、抗体結合ＤＮＡの配列を決定し、ＣＤ４及びＣＤ８抗体の読取りカウントをプロットした。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは１０ＸゲノミクスＶＤＪキットを使用した５’ＲＡＣＥ法のタンパク質発現データである。図８に示した例示方法に従って、ＰＢＭＣをＤＮＡコード抗体で染色し、１０ＸゲノミクスシングルセルＶ（Ｄ）Ｊ試薬キットへの入力として使用した。ライブラリー生成後、抗体結合ＤＮＡの配列を決定し、ＣＤ４及びＣＤ８抗体の読取りカウントをプロットした。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、サイトカイン産生（ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＴＮＦ）を誘導するためにＰＭＡの添加のあり又はなしで一晩培養されたヒトＰＢＭＣである。ライブラリーの生成及び配列決定のための１０Ｘゲノミクスシングルセル３’キットへの入力として使用する前に、方法１に従って細胞を混合し、ＤＮＡコード抗体で染色した。Ｔ−ｓｎｅ分析はタンパク質データに基づいてクラスター化された細胞（ドットで表示）に投影された遺伝子発現データ（ＲＮＡ）を示す。暗いスポットは、所定のサイトカインの遺伝子発現に対して陽性の細胞である。明るいドットはそのサイトカインに対して陰性である。細胞を染色／配列決定の前にＰＭＡで１時間処理した。
【図１３】図１３は５’ＲＡＣＥ技術を使用したＴＣＲデータである。これらのＴＣＲは、前の５’ＲＡＣＥタンパク質プロットに示されているのと同一の細胞で見出された。図８に示した例示方法に従って、ＰＢＭＣをＤＮＡコード抗体で染色し、１０ＸゲノミクスシングルセルＶ（Ｄ）Ｊ試薬キットへの入力として使用した。ライブラリー生成後、抗体結合ＤＮＡの配列を決定し、ＣＤ４及びＣＤ８抗体の読取りカウントをプロットした。さらに、ＲＮＡサンプルをキットプロトコルによって進めて、Ｔ細胞受容体配列を得た。ここでは、α及びβサブユニットでのＶＤＪセグメントの使用は、１０Ｘゲノミクスソフトウェアを使用してプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
続いて、例示実施形態を説明する。
【００１５】
別に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。
【００１６】
用語「プロテオミクス」は、サンプル内に存在するタンパク質に関する情報を包含するものとする。例えば、この用語は、サンプル内のタンパク質の数に関連する量のデータを含む場合がある。この用語は、さらに（又は）サンプル中に存在するタンパク質の種類又は同一性に関連する場合がある。当業者であれば、タンパク質が細胞により発現されるタンパク質である場合には、サンプル中の当該細胞に関連するタンパク質の量を決定することによって、細胞の数もカウントできることが分かるであろう（細胞関連タンパク質の数はサンプル中に存在する細胞の数に正比例する）。
【００１７】
本明細書全体を通して、用語「含む」は、本発明の実施形態が言及された特徴を「含む」ことを示し、それ自体が他の特徴を含むこともあることに留意されたい。ただし、本発明の文脈において、用語「含む」は、本発明が関連する特徴から「本質的になる」又は関連する特徴から「なる」実施形態も包含する場合がある。
【００１８】
本発明の文脈において、用語「核酸」は、分析されるサンプルの総核酸含有量に関する。例えば、核酸という用語は、ゲノム核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）及びプラスミド核酸及び／又はミトコンドリア核酸などの他の形態の核酸を包含する。本明細書全体を通して、「ゲノム核酸」という用語を使用する。この用語は、細胞（例えば、哺乳類細胞、植物細胞、細菌細胞又は真菌細胞）を含むサンプルに関連する場合があり、かつ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、組み込まれたウイルス核酸、ミトコンドリア核酸（ＤＮＡ）などの総核酸含有量に関連する。サンプルがウイルス粒子を含む場合には、用語「核酸」は、任意のゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを含めて、ウイルスに関連する任意の種類の核酸に適用される。
【００１９】
用語「ヌクレオチド」とは、天然型リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド単量体、並びにその非天然型誘導体及びアナログをいう。したがって、ヌクレオチドには、例えば、天然型塩基（例えばＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）を含むヌクレオチド及び修飾塩基（例えば、７−デアザグアノシン又はイノシン）を含むヌクレオチドが包含され得る。
【００２０】
核酸に関する用語「配列」又は「ポリヌクレオチド配列」とは、共有結合（例えば、ホスホジエステル結合）によって連結された連続する一連のヌクレオチドをいう。
【００２１】
用語「サンプル」には、全ての種類の細胞を含むサンプルが含まれる。細胞は、生存細胞、生存可能細胞又は死細胞であってもよい。サンプルは、細胞若しくは組織サンプル又は血液サンプルであることができる。また、用語「サンプル」には、細胞溶解物及び細胞抽出物も含まれる。
【００２２】
細胞は固定されていてもよい。
【００２３】
さらに、用語「細胞」には、哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞及び真菌細胞が含まれる。
【００２４】
上記のように、サンプルはウイルス粒子を含んでいてもよい。
【００２５】
サンプルは、複数の細胞又は単一の細胞を含有することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、サンプルは細胞成分を含むが、細胞全体又はそのままの細胞を欠く。例えば、サンプルは、１種類以上の細胞体、例えば、核、エンドソーム、ミトコンドリア、エキソソーム又はそれらの任意の組み合わせなどを含むことができる。特定の実施形態では、サンプルはエキソソームを含む。
【００２７】
サンプルは、無細胞サンプル又は溶液とすることもできる。
【００２８】
サンプルは、ウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）に入れることができ、例えばプレート上やアレイに配置することができる。ウェルは、ビーズに固定化することができるオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）をさらに含むことができる。
【００２９】
サンプルは、例えば、微小流体ベースのプラットフォームを使用した評価のために、微小液滴（例えば、約１ｐＬ〜約１０ｎＬの体積を有する液滴）に入れることができる。
【００３０】
実際に、本発明の方法は、タンパク質及び核酸の供給源を示すほとんど全てのサンプルに適用できる。理想的には、タンパク質及び核酸は単一源から提供される。当業者であれば、サンプルが細胞を含む場合には、各細胞がタンパク質及び核酸の両方の供給源を示すことができることが分かるであろう。
【００３１】
本明細書に記載の方法は、様々な用途に使用することができ、かつ、サンプルの所定の態様を定量化し、分析し、決定し、カウントし、評価し又は測定するために使用できる。
【００３２】
上記のように、サンプルは細胞を含んでいてもよいため、本明細書に記載の方法は、サンプル内の細胞の数若しくは種類及び／又は１種以上の細胞マーカー型の頻度に関する情報と、例えば遺伝子発現データなどを含めた細胞の総核酸含量に関連する情報とを決定するために利用することができる。これらの用途は例示的な用途に過ぎず、当業者であれば、本明細書に開示された方法を任意の数の他の異なる用途や別の用途に容易に適用できることに留意されたい。
【００３３】
本発明に係る方法は共役結合剤を活用する。
【００３４】
様々な実施形態において、本発明は、サンプル中の標的非核酸分子（例えば標的タンパク質）及び標的核酸分子（例えば標的ｍＲＮＡ）を検出する方法を提供する。この方法は、概して、次の工程を含む：
（ａ）標的非核酸分子及び標的核酸分子を含むサンプルと結合剤とを前記サンプル中における前記結合剤と前記標的非核酸分子との結合を可能にする条件下で接触させ、ここで、前記結合剤は、結合剤識別タグを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
（ｂ）前記サンプル中における前記結合オリゴヌクレオチドと前記標的核酸分子とを同時に逆転写させ、それによって結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と標的核酸分子逆転写産物とを生成させ；
（ｃ）前記結合オリゴヌクレオチド逆転写産物と前記標的核酸分子逆転写産物とを同時に増幅させ、それによって結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物とを生成させ；及び
（ｄ）（１）前記結合オリゴヌクレオチド増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的非核酸分子を検出し、及び（２）前記標的核酸分子増幅産物を検出することによって、前記サンプル中の前記標的核酸分子を検出すること。
【００３５】
本発明の方法に使用するのに好適な結合剤は、所定の親和性及び／又は特異性プロファイルを有することができる。特定の「親和性」及び／又は「特異性」プロファイルを有する有用な結合剤は標的に結合する（例えば特異的に結合する）ことができる。
【００３６】
用語「標的」には、例えばエピトープを有する任意の分子が含まれていてよく、当該分子としては、タンパク質（例えば、糖タンパク質、分化クラスター（ＣＤ）マーカー）、炭水化物（例えばタンパク質上の糖部分）、脂質などが挙げられるが、これらに限定されない。標的は、細胞によって発現される任意のタンパク質、例えば、細胞膜結合タンパク質とすることができる。特定の実施形態では、標的非核酸分子はタンパク質である。
【００３７】
本明細書で使用するときに、「標的核酸分子」とは、分析されている（例えば、発現レベル、配列情報又は突然変異の存在について）連続ヌクレオチドの配列を含む核酸分子をいう。標的核酸分子は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ（例えば非コードＲＮＡ又はｍＲＮＡ）とすることができる。特定の実施形態では、標的核酸分子はｍＲＮＡである。
【００３８】
結合剤は抗体とすることができる。本明細書で使用するときに、特に明記しない限り、「抗体」とは、修飾された又は操作されたそのままの抗体又は抗原結合断片を含めて、そのままの抗体又は抗体の抗原結合断片を意味する。修飾又は操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、マルチパラトピック抗体（例えばバイパラトピック抗体）及び多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）である。
【００３９】
結合剤は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とすることができる。結合剤は抗体断片を含むことができ、この断片は、エピトープ結合断片又はその標的に結合する天然（又は完全）抗体の能力を保持する断片である。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ｄＡｂｓ、低分子化抗体及び二特異性抗体が挙げられる。
【００４０】
結合剤は、細胞表面受容体に対するリガンドなどのタンパク質リガンドであってもよい。
【００４１】
結合剤は、炭水化物結合性タンパク質（例えば、レクチン）であってもよい。
【００４２】
結合剤は脂質結合性タンパク質であってもよい。
【００４３】
結合剤は小分子又はアプタマーであってもよい。例えば、結合剤は、標的分子（例えば、タンパク質、糖タンパク質、ＣＤマーカーなど）に対して親和性又は特異性（すなわち結合する能力）を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００４４】
結合剤はオリゴヌクレオチドに結合できる。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖核酸、又は部分二本鎖核酸を含むことができる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００４６】
オリゴヌクレオチドは、約２５〜約１１０ヌクレオチドの範囲の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは約５０〜約８０ヌクレオチド長を有する。
【００４７】
結合剤は、任意の既知の方法によって、例えばオリゴヌクレオチドに結合できる。抗体である結合剤の場合には、結合（コンジュゲーション）には、酵素反応、化学的タグ化及び／又は非天然アミノ酸の取り込みを介して生成できる官能化抗体及び官能化オリゴヌクレオチドの提供が必要な場合がある。例えば、結合剤（例えば抗体）は、ビオチン−ストレプトアビジンを介したカップリング又はチオール−マレイミド化学を使用した共有結合などの共有的戦略又は非共有的戦略を使用して結合できる。結合は直接的（すなわち、リンカーなし）であってもよいし、リンカーオリゴヌクレオチド又は切断可能なリンカーなどの他のリンカー分子といった中間構造を介してもよい。結合は可逆的であっても不可逆的であってもよい。特定の実施形態では、結合剤は、共有結合を介してオリゴヌクレオチドに結合する。
【００４８】
オリゴヌクレオチド結合体はブロックされていてもよい。特に、オリゴヌクレオチドの３’末端がブロックされていてよい。好適なブロッキング基が当該技術分野において知られている。例として、オリゴヌクレオチド結合体は、何らかの形態の修飾ヌクレオチドでブロックされていてもよい。ブロックの目的は、ポリメラーゼが修飾塩基を超えて連鎖反応を延長するのを防ぐことである。一例では、オリゴヌクレオチド結合体は、３’ｄｄＮＴＰ（例えば３’ｄｄＧＴＰ）でブロックできる。３’ブロックを生成する他の方法は、逆ｄＴ（３’エキソヌクレアーゼによる分解及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する３’−３’結合を生成する）又は３’リン酸基の使用を含めてこの分野における当業者に知られている。
【００４９】
オリゴヌクレオチド結合体は、ポリＡテールを含むことができる。後で明らかにするように、ポリアデニル化オリゴヌクレオチド結合体の使用に関連する利点は、オリゴヌクレオチドがＲＮＡ配列決定プロセスに関与できる可能性があることである。ポリＡテールは、典型的には約１４〜約３５個の連続したアデニン塩基、より典型的には約２５〜約３０個の連続したアデニン塩基を含む。
【００５０】
オリゴヌクレオチド結合体は結合剤識別タグを含むことができる。本明細書で使用するときに、「結合剤識別タグ」又は「結合剤バーコード」とは、結合剤に結合し、かつ、伸長産物（例えば逆転写産物、増幅産物）に組み込むことができるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列をいう。結合剤識別タグを配列決定用途で使用して、対応するオリゴヌクレオチドが結合する特定の結合剤を同定することができる。例えば、結合剤識別タグは、特定の抗体を識別することができ、かつ、相関によって、抗体が結合する標的タンパク質を識別することができる。
【００５１】
オリゴヌクレオチド結合体は親和性タグ（例えばビオチン分子）を含むことができる。
【００５２】
したがって、本明細書に開示されるのは、オリゴヌクレオチドに結合した結合剤、ブロック化オリゴヌクレオチドに結合した結合剤、及びポリアデニル化オリゴヌクレオチドに結合した結合剤である。
【００５３】
本明細書に記載の方法は、オリゴヌクレオチド結合体が結合剤から切断されることを必要としない場合がある。
【００５４】
さらに、本明細書に記載の方法は、サンプルと、結合した結合剤との接触及び／又はその後の核酸増幅手順の前に、サンプルを任意の特定の基質に固定することを必要としない場合がある。
【００５５】
本明細書に記載の方法は、開示される結合した結合剤のいずれかを使用し又は活用することができる。
【００５６】
したがって、結合した結合剤（例えば、オリゴヌクレオチドに結合した抗体）を使用して、サンプル中のタンパク質の量を定量することができる。
【００５７】
サンプルは、生物学的サンプル、例えば組織、体液、分泌物、生検又は細胞サンプルを含むことができ、サンプルは定量化されるべきタンパク質を含む。上記のように、サンプルは細胞を含むことができる。サンプルは細胞の混合集団を含むことができる。本発明の方法を行う前に、細胞の混合集団を含むサンプルに対して選別手順を実施して、単一細胞型を含む調製物を得ることができる。単一細胞調製物は、ＦＡＣＳ、液滴カプセル化、又はマイクロ流体ベースの手順によって得ることができる。多細胞型集団から単一細胞を調製する他の手順は、この分野における当業者に知られている。
【００５８】
定量されるタンパク質は、細胞によって発現されるタンパク質とすることができる。タンパク質は、細胞表面で発現するタンパク質であることができ、これは膜結合タンパク質としても知られている。タンパク質は、糖タンパク質、例えば細胞分化クラスター（ＣＤ）マーカーとすることができる。この分野における当業者であればＣＤマーカーに精通しており、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６、及びＣＤ３４が挙げられるが、これらはほんの数例である。細胞は、このような１種以上のＣＤマーカーの有無に基づいて特徴付けることができる。
【００５９】
したがって、ある種の細胞膜結合部分（例えばＣＤマーカーなど）に対して親和性のある結合剤を使用する方法を使用して、特定の細胞又は細胞型がサンプル中に存在するかどうかを決定することができる。さらに、この方法を使用して、サンプル中の細胞の数をカウントし、又はサンプル中に特定のタイプの細胞がいくつあるかを決定することができる。
【００６０】
本明細書に記載の方法は、結合した結合剤とサンプルとを接触させて、結合した結合剤をその標的に結合させることを必要とする。結合剤は、標的結合を可能にするのに十分な時間にわたって、標的結合に資する条件下で接触できる。
【００６１】
例えば、結合剤が特定の細胞ＣＤマーカーに結合する場合には、その結合剤（本発明に従って結合）の結合形態は、結合剤と細胞上に存在するＣＤマーカー標的との結合を可能にする条件下で細胞と接触できる。
【００６２】
次いで、結合した結合剤のうち結合しなかったものを、例えば洗浄により除去できる。
【００６３】
これらの方法は、２種類以上の結合剤を活用できる。
【００６４】
これらの方法は、複数の（２種類以上の異なる）結合剤を活用できる。一実施形態において、一方の結合剤（又は結合剤のコホート）は、一方の標的に対する親和性及び／又は特異性を示し、他方の結合剤（又は結合剤のコホート）は、他方の標的に対する親和性及び／又は特異性を示すことができる。
【００６５】
様々な結合剤は、同一の又は異なる結合体を含むことができる。例えば、共通する又は共有の親和性／特異性を有する結合剤は、同一の（オリゴヌクレオチド）結合体に結合できる。
【００６６】
したがって、複数の異なるタイプの結合した結合剤を使用する方法（上記）を、多重タンパク質検出アッセイで使用することができる。例えば、２種類の結合剤、すなわち一方が一方のタンパク質標的に対する親和性及び／又は特異性を有し、他方が他方のタンパク質標的に対する親和性及び／又は特異性を有するものを使用する方法を用いて、サンプル中の２種以上のタンパク質を定量できる。このタイプの多重方法の適用は、サンプル中の細胞タイプの数をカウントすることであり、その際、特定の細胞マーカーに対して特異性を有する結合した結合剤により、ユーザーはサンプル中に存在する任意のタイプの細胞数を決定することができる。
【００６７】
全ての場合において、サンプル中に存在するタンパク質の定量化は、必要な洗浄ステップ後に存在する各タイプの結合体の量を決定することにより達成できる。存在する結合体の量は、結合した結合剤の量に正比例する。
【００６８】
結合体が核酸、例えばオリゴヌクレオチドである場合には、核酸増幅技術を使用して、存在する結合体の量を定量化することができる。
【００６９】
核酸増幅技術は、ＰＣＲベースの技術とすることができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲベースの技術は、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲベースの技術は５’−ＲＡＣＥを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲベースの技術は３’−ＲＡＣＥを含む。
【００７０】
例えば、（オリゴヌクレオチド）結合結合剤がサンプル中に存在する標的物（タンパク質）の任意の部分に結合したら、必要な洗浄手順の後に、オリゴヌクレオチド結合体を増幅して増幅産物を生成できる。例えば、プライマーを使用して、オリゴヌクレオチド結合体を増幅することができる。本明細書で使用するときに、用語「プライマー」とは、鋳型ポリヌクレオチド配列に相補的であり、かつ、プライマー伸長産物の合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド（例えば一本鎖オリゴヌクレオチド）をいう。プライマーは、ポリヌクレオチド配列のセンス鎖に相補的であり、順方向伸長産物の合成の開始点として作用できる。プライマーは、ポリヌクレオチド配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ、逆方向伸長産物の合成の開始点として作用することができる。プライマーは、精製された制限消化物のように天然型であってもよいし、合成により生成されてもよい。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的に依存するが、通常は約５〜約２００、約５〜約１００、約５〜約７５、約５〜約５０、約１０〜約３５、約１８〜約２２ヌクレオチドの範囲である。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマー伸長が生じるように鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。すなわち、プライマーは、プライマー伸長を許容する条件下でプライマーが鋳型にアニーリングするように鋳型ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的である。
【００７１】
プライマーは、遊離であっても固定化されていてもよい（例えばビーズに結合）。いくつかの実施形態において、プライマーはビーズ（例えばマイクロウェル又はナノウェル内のビーズ）に固定化される。固定化プライマーを含むビーズは、伸長プライマー、１種以上の遺伝子に対する遺伝子特異的プライマー又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【００７２】
その後、生成された増幅産物の量及び／又は増幅の速度と量は、サンプル中に存在する標的物（たとえば標的タンパク質）の量を決定又は定量化するための手段として使用できる。このように、ＰＣＲベースの技術は定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）技術とすることができる。
【００７３】
上記方法が異なるオリゴヌクレオチド結合体を有する結合剤を使用した場合には、得られる増幅物の同一性及び／又は配列をさらなるパラメーターとして使用して、サンプル中の特定のタンパク質又は細胞の量を定量化することができる。
【００７４】
核酸増幅技術は、任意の好適な核酸ポリメラーゼ酵素又は核酸ポリメラーゼ酵素の組み合わせを使用して実施できる。本明細書で使用するときに、用語「核酸ポリメラーゼ酵素」とは、ヌクレオシド三リン酸の鋳型依存性重合を触媒して、鋳型核酸配列の核鎖酸の一方に相補的なプライマー伸長産物を形成する酵素（例えば、天然型、組換え、合成）をいう。多数の核酸ポリメラーゼが当該技術分野で知られており、市販されている。熱安定性のある核酸ポリメラーゼ、例えば、相補的な核酸のアニール鎖を変性させるのに十分な温度にさらされた後に機能を保持する核酸ポリメラーゼが、本発明の方法に特に有用である。
【００７５】
核酸増幅技術を使用して、特定のタグ、配列、又はバーコードを増幅産物に導入することができる。例えば、核酸増幅技術を使用して、結合剤識別タグ、細胞識別タグ、固有分子識別（ＵＭＩ）配列、又はプライマー結合部位（例えば配列決定プライマーの結合のための）などの特定のタグ、配列又はバーコードを増幅産物に導入することができる。
【００７６】
本明細書で使用するときに、「細胞識別タグ」又は「細胞識別バーコード」とは、伸長産物（例えば増幅産物）に組み込まれかつ配列決定用途において特定の細胞（例えば単一の細胞）又は伸長産物が生成された細胞型を特定することができるヌクレオチドの配列をいう。本明細書に記載の方法において、細胞識別タグは、結合剤に結合されたオリゴヌクレオチドに存在していてもよいし、伸長産物（例えば、ＲＴ産物、増幅産物）への導入用のプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマーなどの伸長プライマー又は増幅プライマー）に含まれていてもよい。細胞識別タグは、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ酵素などの好適な核酸ポリメラーゼによって伸長産物に組み込むことができる。
【００７７】
「ランダム分子タグ（ＲＭＴ）」とも呼ばれる「固有分子識別子」又は「ＵＭＩ」は、核酸分子をタグ化するために使用されるヌクレオチドの配列であり（例えば増幅前に）、かつ、二重鎖の同定に役立つ。ＵＭＩは、一般にランダムな配列であり、典型的にはサイズが約４〜約２０ヌクレオチド長の範囲である。ＵＭＩの例は当該技術分野で知られている。このようなＵＭＩは、本発明において有用である。
【００７８】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは逆転写酵素により逆転写され、本明細書では結合オリゴヌクレオチド逆転写産物という逆転写産物又はＲＴ産物を生じる。結合オリゴヌクレオチド逆転写産物は一本鎖とすることができ（例えば、オリゴヌクレオチドがブロッキング基を含む場合及び／又はその３’末端で結合剤に結合する場合）、又は完全若しくは部分二本鎖とすることができる（例えば、オリゴヌクレオチドがブロッキング基を含まずかつその５’末端で結合剤に結合する場合）。特定の実施形態では、結合オリゴヌクレオチドの逆転写は、逆転写酵素で伸長プライマーにアニールした結合オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長し、それによって二本鎖結合オリゴヌクレオチド逆転写産物を生成することを含む。
【００７９】
結合オリゴヌクレオチド及び／又は標的核酸分子（例えば標的ｍＲＮＡ）の逆転写は、結合オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的な伸長オリゴヌクレオチド又は伸長プライマーでプライミングすることができる。ポリ（Ａ）テールを含む結合オリゴヌクレオチドの場合には、伸長プライマーは相補的なポリ（ｄＴ）配列（例えば、３’末端にポリ（Ｔ）テール）を含むことができる。伸長プライマーのポリ（ｄＴ）配列は、結合オリゴヌクレオチドの対応するポリ（Ａ）配列と同一以上の長さとすることができる。ポリ（Ａ）テールを欠失する結合オリゴヌクレオチドの場合には、伸長プライマーは相補的な非ｄＴ配列を含むことができる。
【００８０】
伸長プライマーは、細胞識別タグ、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、ポリ（ｄＴ）配列、及び結合オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的な非ｄＴ配列又は上記のいずれかの組合せから選択される１以上の特徴を含むことができる。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、鋳型切換オリゴヌクレオチドを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチド及び１種以上の標的核酸分子（例えば細胞ｍＲＮＡ分子）の逆転写を同時に実施し、それによって、結合オリゴヌクレオチド逆転写産物及び標的核酸分子逆転写産物を生成させる。例えば、結合オリゴヌクレオチド及び１種以上の標的核酸分子の逆転写は、結合オリゴヌクレオチド及び１種以上の標的核酸分子にハイブリダイズできる単一の伸長プライマー（例えばｏｌｉｇ（ｄＴ）配列を含む伸長プライマー）でプライミングでき、又は２種以上の異なる伸長プライマー（例えば結合オリゴヌクレオチドの非ｄＴ鋳型切換オリゴヌクレオチドプライマー及び細胞ｍＲＮＡのオリゴ（ｄＴ）プライマー）でプライミングできる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的核酸分子（例えば細胞ｍＲＮＡ分子）の逆転写は、ｃＤＮＡライブラリー生成プロセスの一部である。ｃＤＮＡライブラリーは、一般的なｃＤＮＡライブラリー（例えば、細胞からの全ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリー）又は標的化ｃＤＮＡライブラリーとすることができる。
【００８３】
したがって、いくつかの実施形態では、サンプル中の標的核酸分子及び非標的核酸分子の両方を逆転写し、それによって標的核酸分子逆転写産物及び非標的核酸分子逆転写産物を生成させる。標的核酸分子逆転写産物及び非標的核酸分子逆転写産物の両方が生成される場合には、標的核酸分子逆転写産物を選択的に増幅させることができる。あるいは、標的核酸分子の逆転写産物及び非標的核酸分子の逆転写産物は、その後、両方とも同じ反応で増幅できる。
【００８４】
結合オリゴヌクレオチド及び１種以上の標的核酸分子（例えば細胞ｍＲＮＡ分子）の逆転写を同時に（例えば同じ反応で）実施する場合には、得られる結合オリゴヌクレオチド逆転写産物及び標的核酸分子逆転写産物をそれぞれ増幅させて、結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び標的核酸分子増幅産物を生成する。結合オリゴヌクレオチド増幅産物及び標的核酸分子増幅産物は、例えば、２回目の増幅の前及び／又は増幅産物の検出の前に分離できる。結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物との分離は、増幅産物のサイズ又は親和性タグなどのラベルに対する結合に基づくことができる。いくつかの態様では、増幅産物のさらなる増幅及び／又は検出の前に、結合オリゴヌクレオチド増幅産物と標的核酸分子増幅産物との分離は必要とされない。
【００８５】
場合によっては、オリゴヌクレオチド結合体を増幅して、配列決定用のＤＮＡを生成することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチド逆転写産物及び標的核酸分子逆転写産物を増幅して、配列決定のためのＤＮＡを得ることができる。
【００８７】
増幅中に、生成された増幅産物に配列決定プライマーのための結合部位を付加できる。例えば、配列決定プライマーのための結合部位は、当業者に知られている標準的な技術に従ってトランスポゾンを使用して付加できる。その代わりに又はそれに加えて、増幅産物の核酸分子を断片化し、結合部位をそれらの断片に連結することによって配列決定プライマーのための結合部位を付加できる。当業者であれば理解されるように、プライマーを配列決定するための結合部位は、プライマーを使用して、例えばプライマー伸長反応又は核酸増幅反応によって付加することもできる。
【００８８】
上記のように、サンプルが細胞を含み、かつ、結合剤の結合体がオリゴヌクレオチドである場合には、必要な任意の洗浄工程（未結合の結合結合剤を除去するため）が完了したら、サンプルに対して細胞選別手順を行うことができる。細胞は、核酸増幅を可能にする試薬を含む媒体に直接選別できる。これらの試薬は、ＰＣＲ用の試薬とすることができる。ＰＣＲ（又は任意の核酸増幅技術）用の試薬は、ジヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、プローブ又はプライマーを含むことができる。例えば、ＰＣＲ試薬がオリゴヌクレオチド結合体の配列に相補的なプライマーを含む場合には、正確なサイクリング条件下で反応が進行し、ＤＮＡ増幅が生じる。
【００８９】
上記のように、
（ｉ）接触工程の後に、未結合の結合剤を除去することができる。これは、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを含めた任意の好適な技術によって達成できる。ただし、未結合の結合剤は洗浄によって除去でき、細胞は未結合の結合剤を除去するために何度でも洗浄できる。
（ｉｉ）細胞を選別できる。例えば、接触及び／又は洗浄工程の後に、細胞を選別できる。細胞は、例えば、ＦＡＣＳ、液滴カプセル化及び／又は微小流体を含めた任意の好適な細胞選別技術によって選別できる。選別技術を使用して、単一細胞の集団を取得することができる。例えば、サンプルが複数の異なる種類の細胞を含有する場合には、選別技術を使用して、サンプルを、より小さい又はさらに単一の細胞型を含む、さらに小さな集団に分割することができる。細胞は、核酸増幅手順のための試薬を含む媒体に直接選別できる。
【００９０】
したがって、本発明は、オリゴヌクレオチド結合結合剤を使用して、非ＤＮＡ分子（タンパク質など）を定量化する方法を提供する。結合事象（結合剤と非ＤＮＡ標的分子との間）は、本質的には、非ＤＮＡ分子を特定のＤＮＡ分子（すなわち、オリゴヌクレオチド結合体）に変換するのに役立つ。
【００９１】
上記のように、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて又はそれと共に使用する選別手順は、液滴ベースの方法を含むことができる。その代わりに又はそれに加えて、液滴ベースの選別技術を核酸増幅手順と組み合わせることができる。例えば、本発明の方法は、蛍光ＰＣＲベースの液滴選別などの技術を活用できる。この選別技術では、染色細胞（例えば、本明細書で開示される結合した結合剤で染色された細胞）を液滴に選別又は区画化でき、その液滴内で核酸増幅プロセスを行う。これは蛍光ＰＣＲの形をとる。液滴内で、成功した又は完了したＰＣＲ反応により、結合剤のオリゴヌクレオチド結合体から蛍光増幅産物が生成され、このシグナル（又はその欠如）に基づいて液滴を選別できる。さらに、これらの液滴ベースの方法は、液滴内の追加のオリゴヌクレオチド結合体を増幅する他の核酸増幅プロセスを含むことができる。その代わりに又はそれに加えて、増幅産物は配列であることができる。
【００９２】
他のプロセスとしては、配列決定によって測定、決定、又は定量化されるタンパク質含有量を用いたジェノタイピングＰＣＲ法によって液滴カプセル化細胞を選別できる技術が挙げられる。
【００９３】
本明細書に記載の方法のさらなる態様は、オリゴヌクレオチド結合体を増幅するために使用される核酸増幅技術（例えばＰＣＲベースの技術）も（又は同時に）使用して、同一サンプルのいくつかの核酸ベースの態様に関する情報を生成することもできることである。
【００９４】
例えば、この方法を使用して、例えばゲノム配列、遺伝子、ＲＮＡ、遺伝子発現、ミトコンドリア核酸、プラスミド配列、ウイルス配列などに関する情報を含めた細胞核酸に関する情報をさらに生成することができる。
【００９５】
複数の異なるタンパク質源を含むサンプル（例えば、異なる細胞型の集団を含むサンプル）からデータを抽出する場合には、入力量を正規化する必要がある。これは、サンプルからのＤＮＡ又はＲＮＡ入力を試験して、タンパク質源又は細胞数を正規化することによって行うことができる。例えば、本明細書に記載の方法は、サンプルの核酸含有量から取得した情報（例えば、任意の細胞内核酸（ＲＮＡ）又はゲノムＤＮＡ）を使用して、結合した結合剤の結合及びその後のオリゴヌクレオチド結合体の増幅から取得したプロテオミクス情報を正規化できる。
【００９６】
したがって、結合した結合剤のオリゴヌクレオチドは、サンプルに存在する他のいくつかの核酸と共に増幅できる。他の核酸は、細胞内核酸、例えばゲノムの一部、プラスミド核酸、ＲＮＡ及び／又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）とすることができる。
【００９７】
したがって、サンプルが細胞、例えば哺乳類細胞を含む場合には、ＰＣＲベースの技術（例えばＱＰＣＲ）を使用して、結合した結合剤のオリゴヌクレオチド成分（オリゴヌクレオチド結合体用のプローブ又はプライマーを使用）及びミトコンドリア遺伝子（例えばＭｔＮＤ１；ＭｔＮＤ１遺伝子を増幅するために別のプローブ又はプライマーのセットを使用）を増幅することができる。
【００９８】
異なる増幅産物は様々に標識できる。例えば、それぞれの異なる増幅反応用の核酸塩基、プローブ及び／又はプライマーを、異なる（蛍光）色素又はタグで標識できる。例えば、フルオレセイン（ＦＡＭ）及び／又はＶＩＣ型色素を使用することができる。当業者であれば、プローブ及び／又はプライマーの標識に使用できる他の様々な色素が分かるであろう。これらの色素としては、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、及び／又はテキサスレッド型の色素が挙げられる。
【００９９】
この方法の増幅工程が完了したら（この増幅工程は、結合した結合剤のオリゴヌクレオチド結合体と他の（例えば細胞内）核酸の両方を同時増幅する）、各増幅反応の平均閾値サイクル（Ｃｔ）データを得ることができる。
【０１００】
結合した結合剤のオリゴヌクレオチド結合体から進行する増幅反応のＣｔデータは、他の（例えば細胞内（場合によってはｍｔＤＮＡ））核酸から進行する増幅反応のＣｔデータと比較して、反復実験（又はアッセイ）間又は異なるサンプル間の正規化係数を得ることができる。
【０１０１】
正規化係数を使用して、サンプル間の細胞数を正規化し及び／又は実験を繰り返すことができる。
【０１０２】
本明細書に記載の方法は、ＲＮＡからｃＤＮＡを生成するための逆転写酵素（ＲＴ）ベースのプロトコルを含むことができ、又はこれをさらに含むことができる。例えば、これらの方法は、サンプルに対して、サンプル内の任意のＲＮＡ含有量からｃＤＮＡを生成するＲＴプロセスを行うことができる。サンプルは１種以上の細胞を含むことができるため、ＲＴプロセスを使用してｃＤＮＡを得ることができ、このｃＤＮＡ自体を使用して細胞内の遺伝子発現レベル、Ｔ細胞受容体及び／又は抗体発現及び／又は配列データを決定できる。
【０１０３】
ＲＴプロセスを使用することを目的とする場合には、結合剤に結合したオリゴヌクレオチドは、上記ブロック化オリゴヌクレオチドとすることができる。
【０１０４】
ＲＴプロセスは、数サイクル又はそれよりも少ないサイクル数に制限される場合がある。例えば、ＲＴプロセスは、３、６、９、１２、１５、１８、２１又はそれ以上のサイクルに制限される場合がある。
【０１０５】
次いで、生成されたｃＤＮＡ及び結合剤の（ブロック化）オリゴヌクレオチド結合体に対して、さらなる核酸（ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）増幅プロセスを行うことができる。これは、タグ化反応及び／又は標準的なＱＰＣＲプロセスとすることができる。
【０１０６】
したがって、本発明の方法は、サンプル中のタンパク質（例えば細胞膜タンパク質）及びＲＮＡ（又は遺伝子発現）に関する情報を提供するために単一の読み出し（ＤＮＡ配列決定など）を使用できる手段を提供する。
【０１０７】
全ての場合において、当該方法のＤＮＡ増幅部分は、結合剤に結合した核酸、ＲＴプロセスによって生成されたｃＤＮＡ、及び／又はここに記載された他の細胞内核酸の両方が共に同一のプロセスで増幅される同時増幅プロセスの形態をとってもよい。
【０１０８】
したがって、サンプル中の特定のタンパク質を発現する細胞の数を定量化する方法は、次の工程を含むことができる：
細胞を含むサンプルを準備し；
該細胞を本発明の結合した結合剤と接触させ、ここで、該結合剤はタンパク質標的に対して親和性／特異性を示し、該結合剤及びサンプルとを、該結合剤とサンプル中におけるそのタンパク質標的のいずれかとの結合を可能にする条件下で接触させ；
該サンプルに対して逆転写プロセスを行って該細胞からｃＤＮＡを生成させ；
該サンプルに対してＤＮＡ増幅プロセスを行って、該結合剤に結合したオリゴヌクレオチド及び細胞からのｃＤＮＡの両方から増幅産物を生成させ；
該サンプル中のタンパク質標的を発現する細胞の数を定量化するために、増幅された核酸を検出し、配列決定し、又は定量化すること。
【０１０９】
このタイプの方法では、
（ｉ）結合剤をブロック化オリゴヌクレオチドに結合させることができ；
（ｉｉ）ＤＮＡ増幅プロセスはＱＰＣＲ又は多重化ＱＰＣＲプロセスとすることができる。
【０１１０】
ＲＴプロセスは、ｐｏｌｙｄＴプライマー及び／又はランダムプライマーを使用できる。
【０１１１】
同一の（細胞）サンプル中のＲＮＡ及びタンパク質を同じ読み取り値（又は単にシーケンス読み取り値）で測定し、かつ、本発明の範囲内にある特定の方法としては、例えば以下の（非限定的な）例１〜５４に詳述される方法が挙げられる：
【０１１２】
１．細胞を含むサンプルを、ＤＮＡの３’末端がブロックされた（他の箇所で説明）ＤＮＡ結合結合剤（抗体など）と接触（又は染色）させる。
【０１１３】
ＤＮＡ結合結合剤は、結合した結合剤とサンプル中におけるそのタンパク質標的のいずれかとの結合を可能にする条件下で、細胞によって発現されるタンパク質（注：このタンパク質を発現する細胞は、準備した細胞のサンプルに存在してもよいし存在しなくてもよい）に対して親和性及び／又は特異性を示すことができる。任意に、サンプルに対して、結合していない結合剤を除去するための洗浄手順を行ってもよい。
【０１１４】
その後、（洗浄された）サンプルに対して、サンプルの細胞からｃＤＮＡを生成するためのＲＴプロセスを行うことができる。これは、例えばｃｌｏｎｔｅｃｈ製ＳＭＡＲＴｅｒキットを使用して達成できる。
【０１１５】
次に、生成されたｃＤＮＡを選択的に増幅して、ＲＮＡｓｅｑライブラリーを生成させる。イルミナのタグ化技術などの技術を使用できる。
【０１１６】
ＲＮＡｓｅｑライブラリー及び結合剤に結合したＤＮＡの両方を同時増幅できる。このプロセスでは、サンプルバーコードを追加し、配列決定用のライブラリーを調製することができる。このようなプロセスでは、ＲＮＡｓｅｑライブラリーの生成に使用されるプロセス（例えばタグ化反応）との反応が防止されるため、抗体に結合したＤＮＡが一本鎖であることが重要な場合がある。
【０１１７】
２．サンプルバーコードがｃＤＮＡ生成工程で追加される場合に液滴で使用されるものを含めた、他のＲＮＡｓｅｑライブラリー。他の実施形態では、結合した結合剤のオリゴヌクレオチド結合体は、ポリＡテールを含むように修飾された修飾ＤＮＡであってもよい。オリゴ合成技術及び／又はポリＡポリメラーゼを使用してもよい。
【０１１８】
本明細書に記載の他の方法と同様に、細胞を含むサンプルを、結合剤と結合剤のタンパク質標的を発現する任意の細胞との結合を可能にする条件下で、結合した結合剤（例えば抗体）と接触（又は染色）させることができる。なお、上記のように、結合剤のタンパク質標的を発現する細胞は、準備した細胞のサンプルに存在してもしなくてもよい。任意に、サンプルに対して、結合していない結合剤を除去するための洗浄手順を行うことができる。
【０１１９】
その後、（洗浄された）サンプルに対して、サンプルバーコードを含むｏｌｉｇｏ−ｄＴを用いたＲＴプロセスを行うことができる。これによって、一本鎖及び二本鎖ｃＤＮＡが生成される（二本鎖ＤＮＡ結合抗体も作成される）。次いで、ＤＮＡを切断し、配列決定アダプターに連結して、配列決定用のライブラリーを生成することができる。この方法の重要な特徴は、結合剤（抗体）に結合したＤＮＡがＲＮＡと同様に処理されることである。
【０１２０】
３．他の方法は、ｃＤＮＡ内の特定の部位（遺伝子融合接合部、Ｔ細胞受容体部位など）の増幅を伴うことができる。これらは、上記のｇＤＮＡ増幅手順と同様の方法で配列決定できる。
【０１２１】
４．変形方法は、ゲノムＤＮＡ増幅産物に（例えば）イルミナアダプターを付加するＤＮＡベースのＰＣＲ工程を含むことができる。
【０１２２】
５．他の方法は、ゴールデンゲートアッセイ技術、分子反転プローブ又は近接連結（例えば、ｔｅｍｏ−ｏ−ｓｅｑ／連結連鎖反応）を使用したＲＮＡ読み出しを含むことができる。この実施形態では、ＲＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズするプローブは、結合した結合剤（例えば、抗体−オリゴヌクレオチド結合体）又は異なるハンドル配列と同一の（イルミナ）ハンドル配列を有することができる。２回の異なるＰＣＲを実施して、配列決定されるＲＮＡに対するタンパク質シグナルの量を制御できるように、異なるハンドル配列を使用することが好ましい。
【０１２３】
本発明は、単一の（又は同一の）細胞を、本明細書に記載の結合（例えば、ＤＮＡタグ化）結合剤（例えば抗体）及び何らかの形態の核酸（ＤＮＡ）増幅プロセスで分析できる方法を提供する。核酸増幅（ゲノムＤＮＡ増幅を含む）は、タンパク質数、細胞数又は遺伝子型の相対的な正規化を達成する手段として使用できる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ増幅の量又はレベルは制限される。例えば、これらの方法は、制限されたサイクル増幅の使用によって制限又は限定されるゲノムＤＮＡ増幅を活用することができる。制限されたサイクルのゲノムＤＮＡ増幅は、アダプターを配列決定するための「ハンドル」を含むプライマーを活用することができる。その原理は、ゲノム増幅のレベルが、結合した結合剤のオリゴヌクレオチドから進行する増幅プロセスによって圧倒されたりマスクされたりしない程度に十分でなければならないことである。実際には、ゲノムＤＮＡ増幅のレベルと結合オリゴヌクレオチド増幅のレベルとは、どちらの産物も圧倒されたりマスクされたりしないようにバランスが取れていなければならない。
【０１２５】
これを達成するために、
（ａ）制限されたサイクルＰＣＲの使用によって、ゲノムＤＮＡ増幅のレベルを制限することができる。その後、ゲノムＤＮＡ増幅産物と、結合した結合剤のオリゴヌクレオチドとの両方の追加のＰＣＲ用の配列アダプターを使用できる；
（ｂ）ゲノムＤＮＡ増幅のレベルは、制限サイクルＰＣＲの使用と、その後のプライマー消化又はＰＣＲクリーンアップ技術（例えばａｍｐｕｒｅビーズなど）によるプライマー除去によって制限できる。この後、配列決定アダプターを使用した追加のＰＣＲを実行できる；
（ｃ）制限サイクルＰＣＲの使用によって、ゲノムＤＮＡ増幅のレベルが制限され、その後、反応が配列アダプターを含む新たなＰＣＲ反応に希釈され；及び／又は
（ｄ）ゲノムＤＮＡ増幅のレベルは、結合した結合剤のオリゴヌクレオチドのための結合部位とは異なる、第１配列アダプター１のための結合部位を含むプライマーを用いた制限サイクルの使用によって制限される。その後、結合した結合剤のオリゴヌクレオチドに結合する第２配列アダプター用のプライマーを加える。
【０１２６】
本発明は、本明細書に記載の結合した結合剤及び本発明の方法のいずれかで使用するための指示書を含むキットをさらに提供する。例えば、キットは、細胞によって発現されるタンパク質に対して特異性を有する抗体を含むことができ、この抗体はオリゴヌクレオチドに結合している。
【０１２７】
キットは、細胞をカウントし又は定量化するためのものとすることができ、ここで、このキットは、カウントされる細胞により発現されるタンパク質に対する親和性及び／又は特異性を有する結合した結合剤を少なくとも含むことができる。
【０１２８】
上で詳細に説明したように、このタイプのキットを使用して、サンプル内の特定の細胞タイプをカウントし又は定量化できる。
【０１２９】
したがって、キットは、オリゴヌクレオチド結合抗体を含むことができ、結合体の抗体成分は、細胞により発現されるタンパク質に対して特異性又は親和性を示す。
【０１３０】
キットは、核酸増幅プロセス用の試薬をさらに含むことができる。例えば、キットは、（標識された）プライマー、（標識された）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、酵素（例えばポリメラーゼ酵素）などを含めた、ＰＣＲ型反応用試薬を含むことができる。
【０１３１】
キットは、逆転写酵素反応用の試薬を含む又はさらに含むことができる。このような試薬は、例えば逆転写酵素を含むことができる。
【０１３２】
キットは、本発明の方法及びその様々な段階を実施できる容器を含むことができる。
【０１３３】
特定の実施形態において、本発明は、サンプル中の標的タンパク質及び標的核酸分子を検出するためのキットを提供する。キットは、一般に、オリゴヌクレオチドに結合した結合剤、及び１種以上のＤＮＡ増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キット内の結合剤はオリゴヌクレオチドに共有結合している。
【０１３４】
特定の実施形態では、キットは、２種以上の異なる標的（例えば、２種以上の異なる標的タンパク質）に対して親和性及び／又は特異性を有する複数の結合剤を含むことができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは、結合剤識別タグをさらに含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、結合剤はモノクローナル抗体などの抗体である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチドはＤＮＡ分子である。特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は一本鎖である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害するブロッキング基を含む。特定の実施形態では、ブロッキング基はｄｄＮＴＰ又は逆ｄＴＴＰである。特定の実施形態では、ブロッキング基は、結合オリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【０１３９】
キットは、逆転写反応を実施するための試薬（例えば逆転写酵素（ＲＴ）酵素、オリゴｄＴプライマー、逆転写緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）又はそれらの組み合わせなど）及び／又は核酸増幅反応を実施するための試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、増幅緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）又はそれらの組み合わせ）などの１種以上の追加の成分をさらに含むことができる。
【０１４０】
特定の実施形態において、キットは、１種以上の配列決定プライマーを含むこともできる。
【０１４１】
様々な実施形態では、本発明は、ブロック化オリゴヌクレオチドに結合された結合剤に関する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、結合剤は、抗体又はそのエピトープ結合断片を含む。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、結合剤は小分子又はアプタマーを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、結合剤は、タンパク質に対する親和性及び／又は特異性、あるいはタンパク質に結合する能力を有する。特定の実施形態では、タンパク質は細胞により発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は細胞膜結合タンパク質である。特定の実施形態では、タンパク質は分化クラスター（ＣＤ）糖タンパク質である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、結合剤はポリアデニル化オリゴヌクレオチドに結合している。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは３’ブロック化されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの付加によりブロック化されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３’ｄｄＮＴＰ又は逆ｄＴＴＰの付加によりブロック化されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは３’ｄｄＧＴＰの付加によりブロック化されている。
【０１４６】
様々な実施形態において、本発明は、サンプル中のタンパク質及び／又は核酸、あるいは細胞の数（例えば標的タンパク質を発現する細胞の数）を測定し又は定量する方法に関する。特定の実施形態において、この方法は、サンプルと、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに結合した結合剤及び／又は結合した結合剤とを接触させる工程を含む。結合剤はタンパク質標的に対して親和性／特異性を示し、結合剤とサンプル中のタンパク質標的のいずれかとの結合を可能にする条件下で結合剤とサンプルとを接触させる。この方法は、核酸増幅技術を介してオリゴヌクレオチド結合体を増幅し；サンプル中のタンパク質、核酸、又は細胞の数（例えば、標的タンパク質を発現する細胞の数）、あるいはそれらの任意の組み合わせを定量化するために、増幅された核酸を検出し、配列決定し、又は定量化することをさらに含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、この方法は、増幅産物の配列を決定することを含み、ここで、この配列情報を使用して、サンプル中に存在するタンパク質及び／又は核酸を定量化する。
【０１４８】
特定の実施形態において、この方法は、核酸増幅技術の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を介してオリゴヌクレオチド結合体を増幅することによって、オリゴヌクレオチド結合体及びサンプル中に存在する任意の核酸を増幅することをさらに含む。ｑＰＣＲデータを使用して、サンプルに存在するタンパク質及び／又は核酸を定量化できる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、この方法は単一のサンプルに適用され、タンパク質及び核酸は同一サンプル中で定量化される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、結合剤は抗体又はそのエピトープ結合断片である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、結合剤は小分子又はそのエピトープ結合断片である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、結合剤は、細胞によって発現される糖タンパク質又はＣＤマーカーに対して親和性及び／又は特異性を示す。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、サンプルは、単一の細胞型、細胞の集団、又は細胞の混合集団を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、この方法は、サンプルが結合剤と接触した後に、結合していない結合剤を除去（例えば洗浄により）することをさらに含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、接触工程及び／又は任意の非結合結合剤の除去若しくは洗浄工程の後に、細胞を選別する。特定の実施形態では、細胞は、ＦＡＣＳ、液滴カプセル化、又は微小流体ベースのプロセスによって選別される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、核酸増幅技術又はプロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのプロセスである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＣＲ用の１種以上の試薬を含む媒体に直接選別される。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、核酸増幅技術をさらに使用して、サンプル中に存在する核酸を増幅する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、核酸増幅技術はＰＣＲベースの技術である。特定の実施形態では、核酸増幅技術はＱＰＣＲである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、核酸は細胞核酸である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、核酸は、細胞核酸、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌核酸及び／又はウイルス核酸を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、サンプル中に存在する核酸の増幅は、最初に、かつ、結合剤に結合したオリゴヌクレオチドの増幅の前に行う。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、サンプル中に存在する核酸の増幅は制限される。特定の実施形態では、サンプル中に存在する核酸の増幅は、制限サイクルＰＣＲにより制限される。いくつかの実施形態では、制限サイクルＰＣＲの後に、サンプル中に存在する核酸に特異的なプライマーの除去及び／又はその消化、変性若しくは破壊を行う。サンプルの核酸を増幅するための制限サイクルＰＣＲの特定の実施形態では、その核酸に特異的なプライマーはＰＣＲクリーンアッププロセスにより除去される。特定の実施形態では、制限サイクルＰＣＲの後に、ＰＣＲ試薬を、少なくとも結合剤に結合したオリゴヌクレオチドの増幅用の新たな試薬に希釈する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、この方法は逆転写酵素（ＲＴ）プロセスを含む又はさらに含む。特定の実施形態において、ＲＴプロセスは、サンプル中に存在する又はサンプルのＲＮＡからｃＤＮＡを生成するために使用される。特定の実施形態では、ＲＮＡは細胞ＲＮＡとすることができる。いくつかの実施形態では、サンプルは１種以上の細胞を含み、ＲＴプロセスを使用して１種以上の細胞のＲＮＡ含有量からｃＤＮＡを得る。特定の実施形態では、ＲＴプロセスは、制限された、削減された又は限定されたサイクル数を含む。特定の実施形態では、ＲＴプロセスは、３、６、９、１２、１５、１８、２１以上のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、ＲＴプロセスは核酸増幅プロセスの前に実施される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、核酸増幅及び／又はＲＴプロセスから得られた情報を使用して、任意のタンパク質又は細胞定量化データを正規化する。
【０１６６】
様々な実施形態において、本発明は、サンプル中のタンパク質を定量する方法であって、サンプルとオリゴヌクレオチドに結合した結合剤とを接触させ、ここで、該結合剤はタンパク質標的に対して親和性／特異性を示し、該結合剤とサンプルとは、該結合剤と該サンプル中のタンパク質標的のいずれかとの結合を可能にする条件下で接触させ；該サンプルに対して逆転写プロセスを行って、該サンプル中に存在するＲＮＡからｃＤＮＡを生成させ；該サンプルに対してＤＮＡ増幅プロセスを行って、該結合剤に結合したオリゴヌクレオチド及び細胞由来のｃＤＮＡの両方から増幅産物を生成させ；及び増幅された核酸を検出し、配列決定し又は定量化して、該サンプル中のタンパク質標的を発現する細胞の数を定量化することを含む方法に関する。
【０１６７】
様々な実施形態では、本発明は、サンプル中の特定のタンパク質を発現する細胞の数を定量化する方法であって、細胞を含むサンプルを準備し；該細胞と、オリゴヌクレオチドに結合した結合剤及び／又は本明細書に記載の結合した結合剤とを接触させ、ここで、該結合剤はタンパク質標的に対して親和性／特異性を示し、該結合剤と該サンプルとを、該結合剤と該サンプル中におけるそのタンパク質標的のいずれかとの結合を可能にする条件下で接触させ；該サンプルに対して逆転写プロセスを行って、細胞からｃＤＮＡを生成させ；該サンプルに対してＤＮＡ増幅プロセスを行って、該結合剤に結合したオリゴヌクレオチド及び細胞由来のｃＤＮＡの両方から増幅産物を生成させ；及び増幅された核酸を検出し、配列決定し、又は定量化して、該サンプル中のタンパク質標的を発現する細胞の数を定量化することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、結合剤はブロック化オリゴヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ増幅プロセスは、ＰＣＲベースのプロセス及び／又はＱＰＣＲベースのプロセスである。いくつかの実施形態では、核酸増幅プロセスの増幅産物の配列を決定する。特定の実施形態では、この配列情報を使用して又はさらに使用して、サンプル中の細胞の遺伝子型及び／又は１種以上の遺伝子の発現に関する情報を取得する。
【実施例】
【０１６８】
例１
非ＤＮＡ分子の定量
この例では、非ＤＮＡ分子を特定のＤＮＡ分子に変換することによって定量化し、その後、これを増幅し、ハイスループットＤＮＡシーケンスで配列決定する。この例は、本発明の方法を単一細胞ベースのタンパク質測定に適用する方法を示すが、同一又は同様の方法を複数の細胞の測定に適用することもできる。
【０１６９】
抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、最終読み取り値（ｑＰＣＲ又は配列決定）に応じて異なるＤＮＡ配列で標識した。
【０１７０】
ＴＣＥＰの抗体を減少させ、それらをマレアミド標識オリゴ（ＩＤＴ：マレアミドとのＮＨＳエステル形成によりマレアミドに変換された５’アミンオリゴとして生成）と反応させることによって抗体結合を実施した。
【０１７１】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的な方法で精製し、次の方法で染色した：〜１００万個の細胞を丸底９６ウェルプレートのウェルに添加し、１０％ウサギ血清、２％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌのサーモンスパームＤＮＡ、０．２ｍｇ／ｍｌのシステインをＴＢＳ中に含む緩衝液でブロックした。全ての工程を氷上で実施した。１０分間ブロックした後に、細胞を５００ｇで３分間にわたって遠心沈殿させ、上清を除去した。
【０１７２】
ブロッキング溶液に抗体を１ｎｇ／μｌ添加し、３０分間インキュベートした。
【０１７３】
細胞を遠心沈殿させ、上清を除去した後に、ブロッキング緩衝液で１×５分間、ＴＢＳで３×２分間洗浄した。
【０１７４】
細胞をＴＢＳに再懸濁し、Ｓｙ３２００細胞ソーターを使用してＣＤ３陽性細胞又は生細胞のいずれかを選別した（ＤＡＰＩ除外によって）。
【０１７５】
ＤＮＡをさらに処理するためのＰＣＲ試薬２０μｌを含む９６ウェルプレートの各ウェルに１個の細胞を添加した。
【０１７６】
使用されたＤＮＡ配列：
Ｔａｑｍａｎについて：ＩＤＴが提供する配列及びｔａｑｍａｎキットを使用してアッセイを開発した。抗体結合体は次の通りである：抗ＣＤ４を、ｇＴｃａＩＧＣＣＧＴＡＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡ（配列番号１）に結合させ、抗ＣＤ８を、ｇａｔｃｇｔＩＧＣＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＣＴＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号２）に結合させた。
【０１７７】
ＤＮＡを、Ｂ２Ｍ遺伝子（ＣＤ４）又はＨＰＲＴ１遺伝子（ＣＤ８）を標的とする対応するＩＤＴキットを使用したｔａｑｍａｎアッセイで増幅した。
【０１７８】
色素としてＶｉｃ及びＦＡＭを使用して、Ｔｈｅｒｍｏ−ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ  ６で反応を実施した。ＰＣＲは、ＢｉｏＲａｄ  ２Ｘ  ｑＰＣＲプローブマスターミックスを使用して、３分間９５℃、その後、９５℃で１０秒間、６２℃で３０秒間の４０サイクルであった。分析はデフォルト設定を使用して実施した。
【０１７９】
ＤＮＡ配列決定アッセイのために、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ１９を使用し、オリゴに結合させた：ＣＤ４：ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣ（配列番号：３）及びＣＤ１９：ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）。
【０１８０】
１Ｘ  ＮＥＢ  Ｔａｑマスターミックスを次のプライマーと共に使用して、ＤＮＡをＰＣＲ増幅させた：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号５）及び
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧ（配列番号６）、ここで、Ｘは、９６ウェルプレートの各ウェルごとに異なるイルミナインデックス配列である。ＰＣＲは、９５℃で３分間、その後９５℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で１５秒間のサイクルを２５回実施した。
【０１８１】
ＰＣＲ後に、５μｌの反応物を各ウェルから除去し、単一の試験管に混合した。Ａｍｐｕｒｅビーズのクリーンアップは、２：１のビーズ比を使用して、製造元の指示に従って、混合されたサンプルで実施した。
【０１８２】
ＤＮＡ配列決定を、標準プロトコルに従ってイルミナＭｉｓｅｑで実施した。データを次の方法で分析した。
【０１８３】
生ｆａｓｔｑファイルの品質トリミングを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用して実行した。アダプター配列を、Ｂｉｏｐｉｅｃｅｓに基づくカスタムスクリプトを使用して除去した。同一のバーコード及びＵＭＩシーケンスを有する重複配列を潰し、固有ＵＭＩを有する読み取り数を集計した。次に、カスタムｐｅｒｌスクリプトを使用して、潰された読み取り値をＣＤ４及びＣＤ１９ビンにソートし、そこで、各サンプルについて取得された読み取り値の総数によって読み取り値を正規化した。
【０１８４】
概略プロセスを図１に示す。
【０１８５】
結果
単一細胞タンパク質測定
単一細胞の測定には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。これらは、既知のタンパク質の測定を可能にする十分に特徴付けられた細胞型である。最初の研究は、ＣＤ３及びＣＤ４陽性Ｔ細胞に焦点を合わせた。
【０１８６】
市販の蛍光標識抗体を使用して、解凍したＰＢＭＣをＣＤ３とＣＤ４の両方に対して共染色した。図２は、得られたＦＡＣＳプロットを示しており、ＣＤ３陽性細胞の５６．６％が、特定のＰＢＭＣ単離物についてＣＤ４陽性であることが分かった。
【０１８７】
次に、ＰＢＭＣを蛍光抗ＣＤ３抗体及びＤＮＡ標識抗ＣＤ４抗体で染色した。この特定のＤＮＡ標識は、ｔａｑｍａｎベースの定量ＰＣＲアッセイに特異的なものである。
【０１８８】
細胞を、ＰＣＲ試薬を含む３８４ウェルプレートの個々のウェルに分けた。ＰＣＲ後に、細胞を陽性集団及び陰性集団に明確に分けることができた。この場合、ＣＤ４陽性細胞のＣｔ値はより低く（つまり、元の開始ＤＮＡ分子と同じく、ＤＮＡが速く増幅する）、Ｃｔ値が高いほどＣＤ４に対して陰性の細胞を表す。
【０１８９】
図２に示すアッセイでは、測定された細胞の５８％がＣＤ４陽性であり、ＦＡＣＳデータと強い相関を示した。
【０１９０】
細胞ごとに測定されるタンパク質分子の数に注目することができる。定量的ＰＣＲを使用して測定を行い、ＤＮＡ入力の標準曲線を作成して、各単一細胞で検出される開始ＤＮＡ分子の数を定義する。アッセイ全体の緩衝液条件のわずかな変動が所定の役割を果たす可能性があるが、平均して陽性細胞には細胞１個あたり１，０００個以上のＤＮＡタグが含まれると共に、陰性細胞のシグナルはバックグラウンドシグナルの分子が１０未満であることを示す。
【０１９１】
初期データは、１つはＤＮＡを使用し、もう１つは蛍光を使用した２つのタンパク質測定値からなるが、サンプルごとに３種のタンパク質を測定する反復可能なデータが存在する。これらの実験について、蛍光抗ＣＤ３抗体をＣＤ３陽性細胞の選別に使用した。次に、これらの細胞をＤＮＡタグ化抗ＣＤ４及びＣＤ８で共染色した。抗ＣＤ４及びＣＤ８抗体を、各細胞についてｑＰＣＲによって独立して読み取ることができるユニークなＤＮＡタグで標識した。ＣＤ４とＣＤ８は相互に発現が排他的であり、測定された１９２個の細胞にわたって、二重陽性細胞の２つの例しか検出されなかったところ、これは、このような事象の既知の頻度に基づいて予想される。本明細書で説明する方法及び技術は、その系の生物学を極めて低いバックグラウンドシグナルで明確に再現する。一方の抗体に対して陽性の細胞のほとんどが他方からのＰＣＲシグナルがゼロである（図３を参照）。
【０１９２】
ハイスループット配列決定を使用した単一細胞でのタンパク質の多重検出
細胞を、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ４で標識した。これはそれぞれＢ細胞及びＴ細胞を標識した。個々の細胞をウェルに選別し、イルミナＭｉｓｅｑでの配列決定のためにＤＮＡをＰＣＲ増幅した。結果（図４を参照）は、２つの細胞集団間で重複がなく、バックグラウンド信号がほとんどないことを示す。カウントを全配列決定読み取り値により正規化し、ユニークなＤＮＡ分子のみをカウントした。
【０１９３】
ｇＤＮＡを使用して細胞数を正規化する
ＰＢＭＣＳを、蛍光抗ＣＤ３と、ＤＮＡタグ化抗ＣＤ４及びＣＤ８とで上記のように染色した。細胞を、１０個の細胞／ウェル又は５０個の細胞／ウェルのいずれかでウェルに選別した。ＦＡＭで標識され、かつ、ＶＩＣで標識されたミトコンドリア遺伝子ＭｔＮＤ１に対するプローブを用いて同時増幅された上記抗体結合体のためのｔａｑｍａｎプローブを使用してｑＰＣＲを実施した。
【０１９４】
同時増幅後、細胞を、ＶＩＣ及びＦＡＭ  Ｃｔｓについて平均化した。
【０１９５】
細胞ＤＮＡを使用してタンパク質数を正規化することができ、ｍｔＤＮＡを少なくとも１０個の細胞で使用する場合には、サンプル間で使用する正規化係数を作成することが可能である。
【０１９６】
表１は、細胞を蛍光抗ＣＤ３及びＤＮＡ標識抗ＣＤ４で染色した実験の結果を示す。細胞を、ＣＤ３陽性の５０個の細胞／ウェル、ＣＤ３陽性の１００個の細胞／ウェル、又はＣＤ３陽性の５０個細胞／ウェル＋ＣＤ３陰性の５０個の細胞のいずれかに分類した（定義によって、これらはＣＤ４陰性であることもできる）。
【０１９７】
【表１】
2020513826.tif 000003
【０１９８】
抗体結合オリゴの３’ブロック化
抗ＣＤ４抗体を、標準オリゴヌクレオチド又はターミナルトランスフェラーゼにより３’ｄｄＧＴＰでブロックされたオリゴヌクレオチドのいずれかに結合させた。上記のように、ＰＢＭＣをＣＤ４（正常なオリゴヌクレオチドに結合）又はＣＤ４Ｂ（ブロック化オリゴヌクレオチドに結合）で染色した。６００個のＣＤ３陽性細胞を１０μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ  ｖ４超低入力ＲＮＡキットに選別して配列決定した。ｃＤＮＡをメーカーのプロトコルに従って生成し、９サイクルにわたって増幅した。イルミナのプロトコルに従ってＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴを使用して、１５０ｐｇの各ｃＤＮＡをイルミナタグ化のための入力として使用した。
【０１９９】
５μｌの最終タグ化生成物又は同等の質量の非タグ化ｃＤＮＡを、総量２０μｌのタクマン反応（上記）における鋳型として使用した。
【０２００】
図５は、ｑＰＣＲでは、ブロック化オリゴがタグ化反応の影響を受けなかったのに対し、非ブロック化オリゴがそのシグナルの約５０％を失った（シグナルが２倍減少）ことを示す。
サンプル名      ＣＴ
４              ３０．８３８
４ｂ            ３１．７５３
４タグ          ３１．３２８
４ｂタグ        ３１．６２３
【０２０１】
例２
同一細胞内のＲＮＡ及びタンパク質を同一の読み取り値又は単に配列読み取り値で測定するための方法（特にサンプルを分割する必要がない場合には両者とも有用である）
細胞は、抗体−ＤＮＡ結合体により染色される。細胞は固定又は非固定細胞とすることができる。細胞を、単一細胞又は単一細胞集団に選別できる。
【０２０２】
逆転写を、プライミング用のｐｏｌｙｄＴプライマー及び／又はランダムマーを使用して実施する（標準的な方法を使用できる）。ｑＰＣＲについて、目的のｃＤＮＡ及び抗体に結合したＤＮＡの両方について、ｔａｑｍａｎ試薬を使用して多重ＱＰＣＲを実施する。
【０２０３】
同一サンプルにおけるタンパク質及びＲＮＡを測定する場合には、使用できる多数の方法が存在し、それに基づいてＲＮＡ配列決定ライブラリー生成方法を使用する。例としては次のものが挙げられる：
【０２０４】
１．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴｅｒキット（ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１のあり又はなし）。ＤＮＡの３’末端がブロック化されたＤＮＡ結合抗体で細胞を染色し、ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴｅｒキットでｃＤＮＡ反応を実施する。ｃＤＮＡを選択的に増幅し、その後イルミナのタグ化を使用してＲＮＡｓｅｑライブラリーを生成する。ＲＮＡｓｅｑライブラリー及び抗体に結合したＤＮＡの両方を増幅して、サンプルバーコードを付加し、配列決定用のライブラリーを準備する。このプロセスについては、抗体に結合したＤＮＡが、タグ化反応しないように一本鎖であることが重要である。
【０２０５】
２．サンプルバーコードをｃＤＮＡ生成工程で付加する、液滴で使用されるものを含めた他のＲＮＡｓｅｑライブラリー。オリゴ合成又はポリＡポリメラーゼのいずれかによってＤＮＡ抗体結合体にポリＡテールを付加する。ＤＮＡ結合抗体で細胞を染色する。サンプルバーコードを含むｏｌｉｇｏ−ｄＴでＲＴを実施する。一本鎖及び二本鎖ｃＤＮＡを生成する（二本鎖ＤＮＡ結合抗体も生じる）。ＤＮＡを切断し、配列決定アダプターに連結して、配列可能なライブラリーを生成する。重要なことは、抗体に結合したＤＮＡがＲＮＡのように処理されることである。
【０２０６】
３．上記ｇＤＮＡ増幅と同様に、配列決定のためにｃＤＮＡ内の特定の部位（遺伝子融合連結部分又はＴ細胞受容体部位など）を増幅する。
【０２０７】
４．ＤＮＡ＋ＲＮＡ＋タンパク質。基本的に上記と同じであるが、ゲノムＤＮＡ増幅産物にイルミナアダプターを付加するＤＮＡベースのＰＣＲ工程を含む。ＤＮＡ配列部分は増幅産物配列である。
【０２０８】
５．ゴールデンゲートアッセイ、分子反転プローブ、又は近接連結（例えば、ｔｅｍｐ−ｏ−ｓｅｑ／連結連鎖反応）を使用したＲＮＡ読み出し。この場合、ＲＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズするプローブは、抗体−オリゴ結合体と同一の又は異なるイルミナハンドル配列を有することができる。２つの異なるＰＣＲを実行できるため、異なっている方がよく、配列決定されるＲＮＡシグナル対タンパク質シグナルの量について制御可能である。
【０２０９】
例３
材料及び方法
図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ〜１２Ｃ及び１３に記載された実験では、次の材料及び方法を使用した。
【０２１０】
細胞染色：１００万個のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＤＮＡコード抗体のプールで染色した。全ての工程を氷上で実施した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウサギ血清、２％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＳＳのサーモンスパームＤＮＡ、０．２ｍｇ／ｍｌシステインを含むブロック用緩衝液に１０分間再懸濁した。細胞をスピンダウンし、ブロック用緩衝液を、ＤＮＡコード抗体プールを含むブロック用緩衝液に置き換えた。各抗体は経験的に決定された至適濃度であった。抗体を３０分間染色した後にスピンダウンし、抗体を含む緩衝液をＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで置き換えた。ＰＢＳ＋ＢＳＡ緩衝液で３回連続して洗浄した後、細胞を上記１０Ｘゲノミクスクロムアッセイへの入力として使用した。１つの例外を除き、メーカーのプロトコルに従って１０Ｘゲノミクスアッセイを実施した。ｃＤＮＡ増幅工程及びＡｍｐｕｒｅベースのサイズ選択の最初の工程の後に、プロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅ溶液を廃棄する代わりに保持した。ＲＮＡ及び／又はＴＣＲ配列決定用ライブラリーの生成についてはプロトコルの他の順に全て従い、提案された配列決定及び分析方法を使用した。
【０２１１】
抗体結合体について、保存したＡｍｐｕｒｅ溶液を、新たなＡｍｐｕｒｅビーズの元の体積の２．６倍を添加することによってサイズ選択した。サイズ選択のためのＡｍｐｕｒｅプロトコルに従って、精製された抗体結合オリゴ（及びそのコピー）を得た。次に、これらのオリゴを、次のオリゴを使用してＰＣＲ増幅させた：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ＊Ｃ＊Ｔ（配列番号７）及び
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣ（配列番号８）
ここで、ＸＸＸＸＸＸＸＸはイルミナインデックス読み取り配列を表す。増幅を、収集された細胞の数、実施されたアッセイ、及びプールに存在する抗体の数に応じて、異なるサイクル数で実施した。
【０２１２】
結合オリゴは次の配列を有するものであった：３’ＲＮＡアッセイについては、
ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＺＺＺＺＺＺＺＺＮＢＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号９）であり、
ここで、ＺＺＺＺＺＺＺは固有抗体バーコードを表す。
【０２１３】
ＴＣＲアッセイについては、ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＺＺＺＺＺＺＺＺＣＣＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号１０）であり、ここで、ＺＺＺＺＺＺＺＺは固有抗体バーコードを表す。
【０２１４】
データ処理：
抗体バーコード：細胞バーコード、固有分子識別子（ＵＭＩ）、及び抗体バーコードを、カスタムスクリプトを使用して生ｆａｓｔｑファイルから抽出した。抗体バーコードを、編集距離１でクラスター化した。細胞バーコードを編集距離３でクラスター化した。読み取りカウントを潰し、それによって、細胞バーコード、ＵＭＩ、及び抗体バーコードの各組み合わせを１回だけカウントした。ＵＭＩ読み取りの数が少ない細胞を除外した。これにより、細胞抗体ＵＭＩカウント行列が生成され、これを後で下流分析に使用する。これらの行列をさらに処理して、配列深さについて正規化し又は中心変換してカウントをｚスコアに変換する。その後、主成分分析を実行し、変換された値をｔ分布確率的近傍埋め込みに使用した（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ，Ｌ．Ｊ．Ｐ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｔ−ＳＮＥ  ｕｓｉｎｇ  Ｔｒｅｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５，３２２１−３２４５（２０１４）に記載されたｔ−ＳＮＥ分析）。この行列を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してＦＣＳファイル視覚化にも変換した。
【０２１５】
ＲＮＡカウント：ＲＮＡカウントを１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒパイプライン（ｖ２．１．１）によって生成して、遺伝子バーコード行列を生成した。読み取り値をｈｇ３８参照ゲノムにマッピングした。カウントデータを抽出し、ログ変換し、中央配置し、スケーリングした。ＰＣＡが実行し、変換された値をｔ−ＳＮＥ分析の入力として使用する。
【０２１６】
タンパク質及びＲＮＡの組み合わせ分析：抗体とＲＮＡの両方のＵＭＩカウントから同定された細胞バーコードを使用して、タンパク質及びｍＲＮＡの発現を比較した。
【０２１７】
抗体ベースのクラスタリング：抗体数についてｔ−ＳＮＥプロジェクションを実行し、ＲＮＡ発現値を重ね合わせた。
【０２１８】
トランスクリプトームベースのクラスタリング：トランスクリプトームカウントについてｔ−ＳＮＥプロジェクションを実行し、抗体バーコード値に基づくタンパク質発現を重ね合わせた。
【０２１９】
本明細書で使用するときに、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、逆の意味として明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
【０２２０】
本明細書で使用するときに、用語「及び／又は」とは、このように連結される要素、すなわち、いくつかの場合には連言的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「どちらか又は両方」を意味すると理解すべきである。
【０２２１】
また、逆の意味として明確に示されない限り、複数の工程又は行為を含む本明細書に記載の方法において、方法の工程又は行為の順序は、この方法の工程又は行為を記載した順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。
【０２２２】
特に明記しない限り又は文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈がそうではないと明確に示さない限り、様々な実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値又は下位範囲をとることができる。
【０２２３】
本明細書に引用された全ての特許、公開された出願及び参考文献の教示は、その全体が参照により援用される。
【０２２４】
例示的な実施形態を特に示しかつ説明してきたが、当業者であれば、特許請求の範囲に含まれる実施形態の範囲から逸脱することなく、形式的に及び詳細に様々な変更を加えることができることが分かるであろう。
【図１】
2020513826.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020513826.tif 000011
【図６】
2020513826.tif 000012
【図７】
2020513826.tif 000013
【図８】
2020513826.tif 000014
【図９】
2020513826.tif 000015
【図１０】
2020513826.tif 000016
【図１１Ａ】
2020513826.tif 000017
【図１１Ｂ】
2020513826.tif 000018
【図１２Ａ】
2020513826.tif 000019
【図１２Ｂ】
2020513826.tif 000020
【図１２Ｃ】
2020513826.tif 000021
【図１３】
2020513826.tif 000022
【国際調査報告】
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2020513826.tif 000024
2020513826.tif 000025
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