(57)【要約】  【解決手段】  本開示は、神経剤に曝露された対象をダントロレンまたはその薬学的に許容される塩で治療する方法に関する。  【選択図】      なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が神経剤に曝露された後に神経壊死から対象を保護する方法であって、治療有効量のダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前頭頭頂皮質、海馬、および/または視床は神経壊死から保護される、方法。
【請求項３】
神経剤に曝露された対象を治療する方法であって、治療有効量のダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４】
神経剤への曝露に起因する中枢神経系機能の低下から対象を保護する方法であって、ダントロレンまたはその薬学的に許容される塩の治療有効量を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５】
神経剤誘発性発作、特にてんかん重積状態を治療する方法であって、治療有効量のダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項６】
神経剤への曝露から生じる中枢神経系機能障害から対象を保護する方法であって、治療有効量のダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項７】
神経剤への曝露から生じる行動変化を治療する方法であって、ダントロレンまたはその薬学的に許容される塩の治療有効量を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法において、前記神経剤がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤である、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法において、前記神経剤が有機リン酸塩である、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法において、前記神経剤が、Ｏ−ピナコリルメチルホスホノフルオリデート（ソマン）、エチルＮ、Ｎ−ジメチルホスホラミドシアニデート（タブン）、プロパン−２−イルメチルホスホノフルオリデート（サリン）、シクロヘキシルメチルホスホノフルオリデート（シクロサリン）、または２−（ジメチルアミノ）エチル（ＧＶ）である、方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法において、前記神経剤が、Ｏ−シクロペンチルＳ−（２−ジエチルアミノエチル）メチルホスホノチオレート（ＥＡ−３１４８）、（Ｓ）−（エチル｛［２−（ジエチルアミノ）エチル］スルファニル｝（エチル）ホスフィン酸塩）（ＶＥ）、Ｏ、Ｏ−ジエチルＳ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］ホスホロチオエート（ＶＧ）、Ｓ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］Ｏ−エチルメチルホスホノチオエート（ＶＭ）、Ｎ、Ｎ−ジエチル−２−（メチル−（２−メチルプロポキシ）ホスホリル）スルファニルエタンアミン（ＶＲ）、またはエチル（｛２−［ビス（プロパン−２−イル）アミノ］エチル｝スルファニル）（メチル）ホスフィネート（ＶＸ）である、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法において、前記対象が哺乳動物である、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法において、前記対象はヒトである、方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記治療有効量はダントロレン１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法において、前記ダントロレンは対象が神経剤に曝露されてから２４時間以内に対象に投与される、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法において、前記医薬組成物は１回以上の用量で対象に投与される、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法であって、さらに、前記対象にアセチルコリンエステラーゼ反応促進剤、アセチルコリン受容体の逆拮抗薬、抗発作薬、またはそれらの組み合わせを投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記アセチルコリンエステラーゼ反応促進剤が塩化アソキシム（ＨＩ−６）である、方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法において、前記アセチルコリン受容体の逆拮抗薬がアトロピン硝酸メチルである、方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法において、前記抗発作薬がベンゾジアゼピンである、方法。
【請求項２１】
請求項１９記載の方法において、前記ベンゾジアゼピンがミダゾラムである、方法。
【請求項２２】
請求項１７記載の方法において、前記医薬組成物がアセチルコリンエステラーゼ反応促進剤の投与後に投与される、方法。
【請求項２３】
請求項１７記載の方法において、前記医薬組成物が前記アセチルコリンエステラーゼ反応促進剤の投与後、および前記アセチルコリン受容体の逆拮抗薬の投与後に投与される、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記医薬組成物が前記抗発作薬の投与と同時にまたは実質的に同時に投与される、方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、前記医薬組成物が前記抗発作薬の投与後に投与される、方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法において、前記医薬組成物が静脈内、皮下、筋肉内、骨内、または経皮的に投与される、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法において、前記薬組成物がダントロレンまたはその薬学的に許容される塩、マンニトール、ポリソルベート、ポビドン、任意のｐＨ調整剤、および水を含む、方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法において、前記ダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物の投与が、前記ダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を投与されなかった神経剤に曝露された対象と比較して、改善された神経行動性能をもたらす、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年９月５日に出願された米国仮出願第６２／５５４，０４９号および２０１８年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／６７４，４０６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、神経毒性神経剤に曝露された対象をダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩で治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経剤とも呼ばれる神経毒性神経物質は、アセチルコリンエステラーゼを遮断することにより、神経系の神経インパルスの伝達を妨害する有機リン化合物である。これらの薬剤は、気体、エアロゾル、液体のいずれの形態であっても、非常に有毒であり、非常に迅速な効果を有する。神経物質中毒は、片側または両側の縮瞳、頭痛、痙攣、意識喪失、昏睡、および死を含む無数の症状を引き起こす。特に、神経剤中毒は発作を引き起こし、発作はすぐにてんかん重積状態（ＳＥ）に発展し、発作関連の脳損傷につながる。神経剤誘発性の発作は通常、標準的な抗てんかん療法に抵抗性になる。
【０００４】
神経剤中毒を治療するための医療は、神経剤誘発性発作を終わらせるための治療期間を超えて遅れる可能性が高く、発作関連の脳損傷は病理学的カスケードに沿って継続する。したがって、神経薬剤誘発性発作の不応期の間に神経保護を提供するために病理学的カスケードを中断することができる薬物療法の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ある量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物で神経毒性神経剤に曝露された対象を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、経時的なテストグループの平均体重を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、試験１４日目からのスクロース嗜好試験の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験１５日目からのスクロース嗜好試験の結果を示す。
【図３】図３は、強制水泳テストの結果を示す。
【図４】図４は、前頭頭頂皮質からの平均壊死スコアを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、グループＥの動物の前頭頭頂皮質の顕微鏡写真を示す（陽性対照、ＳＥ発症後５０分で水）。矢印は、色あせた、収縮したニューロンを示す。壊死スコアは４である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、グループＤの動物の前頭頭頂皮質の顕微鏡写真を示す（３０ｍｇ／ｋｇＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）、ＳＥ発症後２０分）。矢印は正常なニューロンを示す。壊死スコアは０である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本開示は、本開示の一部を形成する添付の図面および実施例に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解され得る。本開示は、本明細書に記載および／または示される特定の組成物または方法に限定されず、本明細書で使用される用語は、例のみとして特定の実施形態を説明するためのものであり、請求された開示を限定することは意図しないことを理解されたい。また、添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数を含み、特定の数値への言及は、文脈が明確でない限り、少なくともその特定の値を含むそれ以外の場合に指示する。すべての範囲は包括的であり、組み合わせ可能である。
【０００８】
修飾子「約」は、２つのエンドポイントの絶対値によって定義される範囲の開示と見なされるべきである。例えば、表現「約２から約４」は、「２から４」の範囲も開示する。単一の数を変更するために使用される場合、「約」という用語は、示された数のプラスまたはマイナス１０％を指し、示された数を含む。例えば、「約１０％」は９％から１１％の範囲を示し、「約１」は０．９から１．１を意味する。
【０００９】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で本明細書に記載される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されても良いことを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴は、別個にまたは任意のサブコンビネーションで提供されても良い。さらに、範囲に記載されている値への参照には、その範囲内のすべての値が含まれる。
【００１０】
本明細書で使用する「医薬組成物」という用語は、ヒトへの投与に適した組成物を意味し、例えば、限定されないが、安定剤、増量剤、緩衝剤、担体、希釈剤、ビヒクル、可溶化剤、および結合剤を含む。本明細書で使用される医薬組成物には、皮下注射または注入および筋肉内注射の準備ができた液体形態が含まれるが、これらに限定されない。
【００１１】
「治療的有効量」とは、特定の対象または対象集団で治療されている障害または状態の改善、抑制、または改善を引き起こすのに十分な、本明細書に記載の活性医薬品の量を指す。特定の実施形態では、ヒトまたは他の哺乳動物において、治療有効量は、実験室または臨床環境で実験的に決定することができ、または特定の疾患および治療対象の政府ガイドラインによって必要とされる量であり得る。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「改善する」とは、特定の対象または対象集団で治療されている障害または状態の重症度の軽減を指す。
【００１３】
本明細書で使用する「患者」または「対象」は、哺乳動物を意味することを意図している。したがって、本明細書に記載の方法は、ヒトおよび非ヒト被験者に適用可能である。本明細書に記載の方法は、特にヒトに適用可能である。
【００１４】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、薬学的組成物の薬学的に許容されるもの、例えば、容器を含む成分が、薬理活性の許容できない損失または許容できない有害な副作用を引き起こさないことを意味する。製薬上許容される成分の例は、１９９０年にメリーランド州ロックビルで開催された米国薬局方会議で採択された米国薬局方（ＵＳＰ）、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＮＦ）およびＦＤＡ  Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ  １９９０、１９９６米国食品医薬品局（いずれも図面を含め、参照により本明細書に組み込まれる）。ＵＳＰ／ＮＦ以外の必要な制限および／または仕様を満たす他のグレードのソリューションまたはコンポーネントも使用できる。
【００１５】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容され、親化合物の所望の薬理活性を有する本開示の化合物の塩を意味する。特に、そのような塩は非毒性であり、無機または有機酸付加塩および塩基付加塩であり得る。具体的には、そのような塩には、親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、またはアルミニウムイオンで置き換得られた時、またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と調整する時に形成される塩が含まれる。塩には、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム、化合物が塩基性官能基を含む場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシレート、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの無毒の有機または無機酸の塩などが含まれる。
【００１６】
本明細書で使用される「神経毒性神経剤」または「神経剤」とは、神経系における神経インパルスの伝達に影響を与える化合物を指す。神経薬は有機リン化合物であり、つまり、それらは式（Ｒ）３Ｐ（Ｏ）であり、各Ｒ基は同じでも異なっていても良い。「Ｇ」タイプの神経剤には、Ｏ−ピナコリルメチルホスホノフルオリデート（ソマン、ＧＤ）、エチルＮ、Ｎ−ジメチルホスホラミドシアニデート（タブン、ＧＡ）、プロパン−２−イルメチルホスホノフルオリデート（サリン、ＧＢ）、シクロヘキシルメチルホスホノフルオリデート（シクロサリン、ＧＦ）、および２−（ジメチルアミノ）エチル（ＧＶ）である。「Ｖ」タイプの神経剤には、Ｏ−シクロペンチルＳ−（２−ジエチルアミノエチル）メチルホスホノチオレート（ＥＡ−３１４８）、（Ｓ）−（エチル｛［２−（ジエチルアミノ）エチル］スルホニル｝（エチル）ホスホネート）など（Ｓ）−（エチル｛［２−（ジエチルアミノ）エチル］スルファニル｝（エチル）ホスフィン酸塩）（ＶＥ）、Ｏ、Ｏ−ジエチルＳ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］ホスホロチオエート（ＶＧ）、Ｓ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］Ｏ−エチルメチルホスホノチオエート（ＶＭ）、Ｎ、Ｎ−ジエチル−２−（メチル−（２−メチルプロポキシ）ホスホリル）スルファニルエタンアミン（ＶＲ）、およびエチル（｛２−［ビス（プロパン−２−イル）アミノ］エチル｝スルファニル）（メチル）ホスフィン酸塩（ＶＸ）である。本明細書に記載の方法を使用して、１つの神経剤に曝露した対象を治療することができる。本明細書に記載の方法は、２つ以上の神経剤に曝露された対象を治療するためにも使用できる。
【００１７】
本明細書で使用する「神経剤への曝露による」および「神経剤曝露による」という語句は、神経剤への曝露の直接的な結果である効果、および神経剤の二次的な結果である効果、ならびに神経剤曝露の間接的な結果である影響を指す。
【００１８】
とりわけ、本開示は、ある量のダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物で神経剤に曝露された対象を治療する方法に関する。本開示はまた、ある量のダントロレン代謝産物、例えば５−ヒドロキシダントロレンまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物で神経剤に曝露された対象を治療する方法に関する。例えば、いくつかの局面において、記載された方法は、神経剤曝露に続発する神経学的損傷を防ぐ。他の態様において、記載された方法は、神経剤曝露後の神経保護効果を提供する。他の態様において、記載された方法は、神経剤曝露に続発する脳組織損傷を改善する。他の態様では、記載された方法は、神経剤曝露に続発するてんかん重積状態に続発する脳組織損傷を改善する。他の態様において、記載された方法は、神経剤曝露による神経細胞壊死を防ぐ。他の態様において、記載された方法は、神経剤曝露による神経細胞壊死を改善する。他の側面において、記載された方法は、神経剤曝露による細胞内カルシウム過負荷を治療する。他の態様において、記載された方法は、神経剤曝露による細胞内カルシウム過負荷を改善する。他の態様において、記載された方法は、神経剤曝露による細胞内カルシウム過負荷を防ぐ。
【００１９】
本明細書に記載の対象は、吸入を介して神経剤に曝露される可能性がある。他の局面において、対象は、薬剤の経皮的伝達を介して神経剤に曝露される。さらに他の局面において、対象は、神経剤で汚染された液体または食物の消費を介して神経剤に曝露される。他の態様において、対象への薬剤の皮下、静脈内、または筋肉内投与を介して、対象は神経剤にさらされる。
【００２０】
いくつかの態様では、方法は、対象が神経剤に曝露された後、対象を神経壊死から保護する方法を対象とする。これらの実施形態では、ある量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、対象が神経剤に曝露された後に対象に投与される。本明細書で使用される場合、神経壊死からの「保護」は、神経剤の効果の重症度を軽減すること、または神経剤の効果を改善すること、または神経剤曝露に起因する神経損傷を減少させることを包含する。いくつかの態様では、神経壊死からの「保護」は、神経剤にさらされた対象における神経壊死の予防を包含する。すなわち、記載されたダントロレン含有組成物（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物を含む組成物）の投与により神経壊死から「保護された」被験者は、当該組成物を投与されなかった神経作用物質曝露被験者と比較して、神経行動試験においてより良好に機能する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、対象の中枢神経系全体が神経壊死から保護される。いくつかの実施形態では、前頭頭頂皮質、海馬、および／または視床は神経壊死から保護される。他の側面では、前頭頭頂皮質は神経壊死から保護される。他の側面では、海馬は神経壊死から保護される。他の実施形態では、視床は神経壊死から保護される。
【００２２】
神経壊死の存在および程度は、神経行動学的検査、放射線学的検査、および病理学的評価を含む当技術分野で知られる方法を使用して決定され得る。
【００２３】
本開示はまた、神経剤への曝露に起因する中枢神経系機能の低下から対象を保護する方法に関する。これらの方法は、被験者が神経剤に曝露された後に、ある量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む。
【００２４】
本開示は、神経剤への曝露に起因する中枢神経系機能障害から対象を保護する方法にも向けられる。これらの方法は、被験者が神経剤に曝露された後に、ある量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む。
【００２５】
本開示はまた、神経剤への曝露に起因する対象の行動変化を治療する方法に関する。これらの方法は、被験者が神経剤に曝露された後に、ある量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む。
【００２６】
本明細書で使用するとき、中枢神経系機能の低下からの「保護」は、神経剤の中枢神経系効果の重症度の軽減、または神経剤の中枢神経系効果の改善、または神経の中枢神経系効果の減少を包含する。すなわち、当該組成物の投与により中枢神経系機能の低下から「保護された」被験者は、当該組成物を投与されなかった神経剤曝露被験者と比較して、神経行動試験でより良好に機能する。
【００２７】
本開示はまた、神経剤に曝露された対象における神経剤誘発性発作を治療する方法に関する。いくつかの側面では、治療される発作はてんかん重積状態（ＳＥ）である。これらの方法は、ある量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。本明細書で使用されるように、神経剤誘発性発作の治療は、発作の重症度または持続期間の減少をもたらす。他の態様では、治療により発作の重症度と持続時間の両方が減少します。
【００２８】
記載された方法のいずれかに従って対象を治療するのに治療上有効なダントロレンまたはその薬学的に許容される塩の量は、当業者によって決定されるべきである。治療的有効量は、単回投与で対象を治療するのに必要な量であり得る。あるいは、治療有効量は、治療の長期または長期にわたる複数回投与、例えば複数回投与で対象を治療するために必要なダントロレンの累積量であり得る。
【００２９】
対象がヒトである実施形態では、ダントロレンの治療有効量は１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇであり、１回または２回の投与で投与される。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレンの治療有効量は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ヒト対象を治療するためのダントロレンの治療有効量は、１回または２回の投与で投与される３０ｍｇ／ｋｇを超え、例えば３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、ヒト対象を治療するためのダントロレンの治療有効量は約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００３０】
記載された方法のいずれかに従って対象を治療するのに治療上有効なダントロレン代謝産物（５−ヒドロキシダントロレンなど）またはその薬学的に許容される塩の量は、当業者によって決定されるべきである。対象がヒトであるこれらの実施形態では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇであり、１回または２回の投与で投与される。他の局面において、ダントロレン代謝産物の治療有効量は１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の局面において、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の局面において、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の局面において、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。他の局面において、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。他の態様では、ダントロレン代謝産物の治療有効量は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ヒト対象を治療するためのダントロレン代謝産物の治療有効量は、１回または２回の投与で投与される３０ｍｇ／ｋｇ超、例えば３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。一部の態様では、ヒト対象を治療するためのダントロレン代謝産物の治療有効量は、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００３１】
本開示のいくつかの態様では、神経剤への曝露後、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与するタイミングは、影響を及ぼし得る。被験者に与えられた神経壊死保護の量。
【００３２】
本開示のいくつかの態様では、神経剤への曝露後、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を対象に投与するタイミングは、被験者に与えられた中枢神経系機能の減少量に影響し得る。
【００３３】
本開示のいくつかの態様において、神経剤への暴露後の、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物の対象への投与のタイミングは、被験者に与えられる中枢神経系機能の減少量に影響を与える。
【００３４】
ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、２回以上の用量で、すなわち２週間以上、例えば、被験者が神経剤にさらされてから２、３、４、５、６、７、８週間以上にわたって対象に慢性的に投与され得る。ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、１回以上の用量で、すなわち２週間未満の期間にわたって、例えば、数時間または数日間にわたって、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８被験者が神経にさらされた後、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間以上、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３日以上にわたって対象に急性的に投与することが可能である。
【００３５】
ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物のタイミングに関して、いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）を含む医薬組成物、または薬学的に許容されるその塩、少なくとも１回の用量は、対象が神経剤に曝露されてから２４時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから２０時間以内に対象に投与される。いくつかの態様において、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから１６時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから１２時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから８時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから４時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから２時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量は、対象が神経剤に曝露されてから１時間以内に対象に投与される。いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、少なくとも１用量が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または被験者が神経にさらされてから約２４時間以内で対象に投与される。
【００３６】
いくつかの態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、治療有効量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）を１回の投与で神経ガスにさらされた被験者に送達できる。他の態様において、治療有効量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）を神経剤に曝露された対象に送達するために、医薬組成物の２回以上の用量が必要な場合がある。例えば、神経ガスにさらされた被験者に治療有効量のダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝物）を送達するために、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０用量の医薬組成物が必要になる場合がある。これらの追加の投与量は、最初の投与と実質的に同時に投与することが可能である。他の局面において、追加の投与量は、最初の投与から時間的に分離される。３回以上の用量が投与されるこれらの局面において、各用量は、他の用量の投与から時間的に分離され得る。
【００３７】
本開示のいくつかの態様では、神経剤曝露対象へのダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）の投与は、神経剤曝露の補助療法である。神経剤に曝露した被験者には、１つ以上の神経剤解毒剤を投与することも可能である。神経剤暴露の解毒剤の１つのクラスは、アセチルコリンエステラーゼ反応性物質、例えば塩化アソキシム（ＨＩ−６）である。神経剤曝露のための別のクラスの解毒剤は、アセチルコリン受容体の可逆的拮抗薬、例えばアトロピン、例えば硝酸アトロピン硝酸塩である。神経剤に曝露した被験者には、抗発作薬を投与することもできる。抗発作薬の例には、アルデヒド（例、パルアルデヒド）、芳香族アリルアルコール（例、スチリペントール）、ベンゾジアゼピン（例、クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸塩、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム、ニメタゼパム）、メチルフェノバルビタール、バルベキサクロン）、臭化物（例、臭化カリウム）、カルバメート（例、フェルバメート）、カルボキサミド（例、カルバマゼピン、オキシカルバゼピン、酢酸エスリカルバゼピン）、脂肪酸（例、バルプロ酸、バルプロ酸ナトリウム、ジバルプロエックスナトリウム、ビガバトリン、プロガミド、チアガビン）、トピラマート、ＧＡＢＡ類縁体（例、ガバペンチン、プレガバリン）、ヒダントイン（例、エトトイン、フェニトイン、メフェニトイン、フォスフェニトイン）、オキサゾリジンジオン（例、パラメタジオン、トリメタジオン、エタジオン）、プロピオン酸（例、ベクラミド）、ピリミジンジオン（例、プリミドン）、ピロリジン（例、ブリバラセタム、レビチラセタム、セレトラセタム）、スクシンイミド（例、エトスクシミド、フェンスクシミド、メスキシミド）、スルホンアミド（例、アセタゾラミド、スルチアム、メタアゾラミド、ゾニサミド）、トリアジン（例、ラモトリジン）、尿素（例、フェネツリド、フェナセミド）、バルプロイルアミド（例、バルプロミド、バルノクタミド）、ペランパネル、およびそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、抗発作薬はベンゾジアゼピン、例えばミダゾラムである。他の局面において、抗発作薬はバルビツール酸塩である。さらに他の側面では、抗てんかん薬はヒダントインである。いくつかの側面では、抗てんかん薬はパラアルデヒドである。他の側面では、抗てんかん薬は臭化カリウムである。いくつかの側面では、抗てんかん薬は脂肪酸である。他の側面では、抗てんかん薬はトピラメートである。
【００３８】
神経剤に曝露された対象に解毒剤が投与されるこれらの局面において、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）は、解毒剤が投与された後に投与される。例えば、ダントロレンは、アセチルコリンエステラーゼ反応促進剤の投与後および／またはアセチルコリン受容体の逆拮抗薬の投与後に投与することができる。
【００３９】
神経剤に暴露された対象に抗発作薬が投与される態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）は、抗発作薬の投与と同時に投与され得る。ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）は、抗発作薬の投与と同時に、例えば抗発作薬投与の約５分以内に実質的に現在投与され得る。他の実施形態において、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）は、抗発作薬が投与される前に投与される。他の実施形態において、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）は、抗発作薬が投与された後に投与される。
【００４０】
ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、静脈内投与され得る。他の態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物は、経皮投与され得る。他の態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を筋肉内に投与され得る。他の態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、骨内に投与され得る。他の態様では、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物は、皮下投与され得る。
【００４１】
当該方法での使用に好ましい医薬組成物には、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤が含まれる。好ましい医薬組成物は、ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩、マンニトール、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、ポビドン（例えば、ポビドンＫ１２）、任意のｐＨ調整剤（例えば、ＮａＯＨ）を含むまたはＨＣｌ）、および水を含む。
【００４２】
ダントロレン（または５−ヒドロキシダントロレンなどのダントロレン代謝産物）またはその薬学的に許容される塩を含む特に好ましい医薬組成物は、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）（ダントロレンナトリウム、Ｅａｇｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｗｏｏｄｃｌｉｆｆ  Ｌａｋｅ、ＮＪ）である。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）は、滅菌凍結乾燥粉末として提供される注射可能な懸濁液である。２５０ｍｇのダントロレンナトリウム、１２５ｍｇのマンニトール、２５ｍｇのポリソルベート８０、４ｍｇのポビドンＫ１２、およびｐＨ調整に十分な水酸化ナトリウムまたは塩酸を含む２０ｍＬバイアルで提供される。ＵＳＰ注射用滅菌水５ｍＬで再構成すると、懸濁液が得られる。
【００４３】
以下の例は、本開示内で説明される概念のいくつかを説明するために提供される。各例は、開示の特定の個々の実施形態を提供すると考えられるが、本明細書に記載されているより一般的な実施形態を限定するものと考えられるべきではない。以下の例では、使用した数値（量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされるが、いくつかの実験誤差と偏差を考慮する必要がある。
【実施例１】
【００４４】
この研究の目的は、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）がラットの確立されたＧＤ（ソマン）生存モデルで神経保護効果を有するかどうかを判断することだった。ソマン誘発性発作の発症後２０または５０分に、ボーラスＩＶ注射により１０または３０ｍｇ／ｋｇのＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）を単回投与した。皮下（ＳＱ）ソマン注射の３０分前の塩化アソキシム（ＨＩ−６）、ＳＱソマン注射の１分後のアトロピン硝酸メチル、およびラマンスコアに達するソマン誘発性発作の発症から２０分後のミダゾラムによる治療により、生存が促進された対照群には、未治療（ナイーブ）ラットの１つのグループと、ソマン誘発性発作の発症から５０分後に滅菌水を投与する別のグループが含まれた。
【００４５】
一連の神経行動学的試験は、ＧＤの単回投与後約２８日間にわたって実施された。２９日目に、すべてのラットを、失血および心臓内灌流による麻酔下で屠殺した。顕微鏡的神経病理検査のために各ラットから脳を収集し、病理検査のために各ラットから心臓を収集した。
【００４６】
実験対象は、暴露の日に体重３００−５００ｇの８週齢以上の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にカニューレ挿入された頸静脈だった。スクロース嗜好テストおよび強制水泳神経行動テストを使用し、学習および／または感覚運動統合を伴うタスクの潜在的な不足を評価した。
【００４７】
Ｓｏｍａｎ（ＧＤ）−０．９％塩化ナトリウムで希釈。ソマンは、酵素との付加体を形成することによりアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を不活性化する有機リン神経剤である。
化学名：ピナコリルメチルホスホノフルオリデート
・化学式：Ｃ７Ｈ１６ＦＯ２Ｐ
・分子量：１８２．１７
・ＭＲＩＧｌｏｂａｌロット番号：ＧＤ０９０４１５−ＤＯＣ−１
・プライマリ標準ＩＤ：１３９７２−４９−３
・純度：１００％
・保管条件：＜４°Ｃ
【００４８】
ＨＩ−６：化学名：［（Ｅ）−［１−［（４−カルバモイルピリジン−１−イウム−１−イル）メトキシメチル］ピリジン−２−イリデン］メチル］−オキソアザニウム；メタンスルホネート（塩化アソキシム）
構造：
【化１】
2020532555.tif 000003
式：Ｃ１４Ｈ１６Ｃｌ２Ｎ４Ｏ３
分子量：３５９．２０７
【００４９】
アトロピン硝酸メチル：化学名：（（８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）３−ヒドロキシ−２−フェニルプロパノエート；硝酸塩
構造：
【化２】
2020532555.tif 000004
化学式：Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６
分子量：３６６．４１４
【００５０】
ミダゾラム：化学名：８−クロロ−６−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−４Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン
構造：
【化３】
2020532555.tif 000005
化学式：Ｃ１８Ｈ１３ＣｌＦＮ３
分子量：３２５．７７１
【００５１】
ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）は、適切な支援手段と組み合わせた悪性高体温の治療および高リスク患者の悪性高体温の予防のためのＦＤＡ承認薬である。
【００５２】
動物
この研究では、４８匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（プラス５６匹の合計８匹のエキストラ／交換品、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、生後＞８週、ベンダーによって移植された頸静脈血管カテーテルを備えた３００−５００ｇが使用された。ラットは、尾のマーキングまたは一意の英数字の表示を付けたイヤータグによって識別された。（ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５０４「動物およびケージの識別手順」を参照）。
【００５３】
研究に含まれるすべてのラットは健康であり、臨床疾患の兆候はなく、研究開始時の投与に適したパテントカテーテルがあった。出産後、動物の健康状態の徴候を検査し、スペンサーの従来の動物施設で４８時間以上隔離した。獣医が動物の健康状態を検査し、研究のために放た（ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５０１、「動物の気候変動および／または検疫手順」を参照）。ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５００に従って、動物は出産後３日以内に体重測定された。動物の到着の翌日から研究全体にわたって、研究中の順応と一貫性のために、ラットは毎日少なくとも２回スタッフによって取り扱われた。
【００５４】
すべてのラットには、供給元、ロット番号、および分析証明書（自由裁量）として特定されたＬａｂ  Ｄｉｅｔ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄげっ歯類食品が提供された。分析証明書（各ロットについて、ベンダーが提供。ＳＯＰＭＲＩ−１５１０「動物への給餌手順」を参照）で検証されたように、研究の結果に影響を与える可能性のある汚染物質は飼料に存在しなかった。順応期間とスクロース嗜好試験の実施期間を除き、研究全体を通して水ボトル（１つの水ボトル／ケージ）に水道水を提供した（下記参照）。その間、ラットには水道水を含む水ボトル２本、または水道水を含む水ボトル１本、および１％スクロース溶液を含む水ボトル１本を提供した。
【００５５】
動物は、順化／検疫および生存期間中、ワイヤートップ（テクニプラスト、フェニックスビル、ペンシルバニア州）を備えたポリカーボネートテクニプラストケージに収容された。カテーテルの損傷を防ぐために、動物を１匹ずつ収容した。ラットは、環境制御された部屋に収容され、１時間に少なくとも１０回空気を交換した。部屋は、１日あたり１２時間の明暗サイクルで、６８．０°Ｆ〜７９．０°Ｆの温度と５０％±２０％の相対湿度に維持された。室温、湿度、および光のサイクル（１２時間：１２時間逆光／暗）は、ＡｍｅｇａＶｉｅｗモニタリングシステムによって２４時間／日、または研究中にＨｙｇｒｏｔｈｅｒｍｏｇｒａｐｈによって監視された（ＳＯＰ  ＭＲＩ−１１７０、「温度および湿度の監視」を参照）アニマルルーム」）。
【００５６】
投与量
ＨＩ−６、ソマン、硝酸アトロピン、ミダゾラム：ＨＩ−６の単回投与（ＩＰ、１２５ｍｇ／ｋｇ）；ソマン（ＳＣ、１５４μｇ／ｋｇ、１．４ｘＬＤ５０）、アトロピン硝酸メチル（ＩＭ、２ｍｇ／ｋｇ）；ミダゾラム（ＩＭ、２ｍｇ／ｋｇ）は、モデルの以前の経験に基づいて選択された。このレジメンは、少なくとも３のＲａｃｉｎｅスコアと追跡調査のための容認できる数の生存者を達成する痙攣を引き起こすと予想された。
【００５７】
ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）：ラットの単回投与耐容性評価では、頸静脈カニューレ挿入ラットの別々のグループに、１２、４０、および６０ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス用量を投与した。１２ｍｇ／ｋｇの忍容性は良好だった。４０ｍｇ／ｋｇの投与量は投与２日後にわずかな体重減少をもたらし、６０ｍｇ／ｋｇはこの投与量を受けた５匹すべてのラットの投与後約２４時間に瀕死の犠牲をもたらした。この研究では、予想される忍容性に基づいて、１０および３０ｍｇ／ｋｇのＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）の単回ＩＶボーラス投与が選択された。ラットでの１０および３０ｍｇ／ｋｇのＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）用量は、それぞれ約２および６ｍｇ／ｋｇのヒト用量と同等である。
【００５８】
投与計画
表１に示すように、ベンダーによって移植された頸静脈カテーテルを備えた合計４８プラス最大８匹の余分なオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを６グループで使用した。
【表１】
2020532555.tif 000006
【００５９】
投与管理はグループＤで始まり、グループＢ、Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＦがそれぞれ続いた。
【００６０】
投与準備
ＧＤは、ＳＯＰ  ＭＲＩ−５８２１「研究開発および試験評価（ＲＤＴＥ）希釈溶液からの標準およびサンプルの調製」に従って、氷冷０．９％塩化ナトリウムで調製した。
【００６１】
ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）は、５ｍＬの注射用滅菌水を１バイアルの凍結乾燥製品に加えることで調製した。
【００６２】
実験計画
動物の準備
研究１日目（ＧＤ暴露の日）の前またはその日に、ラットを希薄動物実験施設に移した。
【００６３】
投与量
研究１日目に、グループＡ〜Ｅのすべての動物にコリンエステラーゼ反応促進剤を投与し、ＧＤチャレンジの３０分前に腹腔内（ＩＰ）経由でＨＩ−６（１２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。グループＡ−Ｅのすべてのラットは、１回の皮下注射でＧＤ（１５４μｇ／ｋｇまたは〜１．４ｘＬＤ５０）に暴露された。グループＡ−Ｅの約１分後のＧＤ注射、アトロピン硝酸メチル（ＡＭＮ）をＩＭ経路（２．０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。上記の表１に定義されるＧＤ暴露後の発作活動開始の約２０分後、グループＡからＥのすべての動物に、筋肉内に２ｍｇ／ｋｇのミダゾラムを投与した。グループＦは、ＨＩ−６、ＧＤ、ＡＭＮ、ミダゾラム、およびＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）を受け取らなかった。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）は、ハミルトンのマイクロシリンジを介して投与され、その後、カテーテルは、注射用の滅菌水０．２ｍＬでフラッシュされ、静脈への完全な送達を確実にした。
【００６４】
発作活動の開始は、以下で説明するように、ラシーンスケールで「３」のスコアによって定義された。
１  ＝固定化と凝視
２  ＝うなずき、「ぬれた犬が揺れる」
３  ＝前肢クローン
４  ＝両側前肢のクローン
５  ＝両側前肢のクローン、飼育およびバランスの喪失
【００６５】
ラットがＧＤ暴露から約２０分後にこの「３」のスコアを達成しなかった場合、研究で置き換えられた。
【００６６】
表１に示すように、グループＡおよびＣのラットには１０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）ＩＶを投与し、グループＢおよびＤのラットには３０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）ＩＶを発症後５０分または２０分で投与した発作（「３」のラシーンスケール）。グループＥのラットには、発作の開始後５０分で最高用量のＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）に匹敵する量のコントロール（注射用滅菌水）ＩＶを投与した。
【００６７】
グループＡ−ＥのＧＤチャレンジ後約６時間、そしてすべてのＡＭおよびＰＭで、ラットに５ｍＬの乳酸リンゲル液ＳＱをチャレンジ後最初の７日間投与して回復を助けた。動物が自由に食べたり飲んだり、ケージの周りを自由に動き、脱水の兆候が見られない（背中に皮膚の張りがない）ことで示されるように、チャレンジから回復すると、ＳＱ液は止まった。これは、動物の評価に基づいた獣医師の裁量の一部だった。さらに、この同じ時間枠（チャレンジ後最大７日間）でのチャレンジ後、動物はＧＤチャレンジの影響から回復するのを助けるために、ヒドロゲル（ＣｌｅａｒＨ２Ｏ）とｇｒ（ケージの床の廃ｒｏｃｋに湿らせた飼料）を与えられた。
【００６８】
体重
ベンダーからの受領後最初の７２時間以内に、各動物の体重を記録し、その後１、３、５、１０、１７、２４、２８日目に再び記録した。動物は攻撃後も体重が減少し続けていることを認識した。動物の体重が元の体重の１０％以上減少した場合、体重が減少するのではなく、常に増加するまで毎日体重を測定した。すべてのグループの体重を図１に示す。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）で処理したすべてのソマン暴露グループ（グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の体重は、試験２５日までに陰性対照（グループＦ）値に回復した。
【００６９】
臨床所見
一般的な健康状態の観察は、隔離期間と順応期間を通して毎日行われた。動物は、検疫と順応期間を通して、そして生涯を通して毎日２回取り扱われた。試験１日目に、暴露前にラットを観察した。ＧＤ曝露後、発作の初期出現を評価するためにラットを頻繁にモニターした。ミダゾラム、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）および／または滅菌水投与後、動物は最低でも１日２回、安楽死の日に少なくとも１回観察された。かがんだ姿勢、脱水、粗い被毛および食欲不振を含む臨床観察を評価し、記録した。該当する場合、修正されたＲａｃｉｎｅスコアが各観測ポイントで記録された。この時点で、ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５２８「動物の観察手順」に従って、他の異常な臨床観察も研究ノートまたは適切なデータキャプチャフォームに記録された。死亡時刻が記録された。死亡した動物は、発見された時点で記録される。
【００７０】
動物の処分
研究の１日目は、ソマン暴露とＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）治療の日であった。死亡したすべてのラットは死んでいることが判明した（瀕死状態では安楽死されなかった）。プロトコルで指定されたラットの数は８匹の生存者／グループであり、これは高ソマン線量に関連した死亡率のために達成されなかった。全生存率は、ソマンにさらされた４５匹のラットのうち２７匹（６０％）だった。表２を参照。
【表２】
2020532555.tif 000007
2020532555.tif 000008
【００７１】
神経行動学的検査
ソマン暴露により損傷を受けた脳領域には、海馬と嗅内、前頭、および頭頂皮質が含まれていた。これらの領域には、学習、記憶形成、情報処理、その他の認知プロセスのための構造と神経回路が含まれている。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）の潜在的な神経保護効果を評価するために、学習、記憶、感覚運動統合、および適応反応を必要とする一連の確立された行動テストを使用して、ラットを評価した。
【００７２】
選択されたテストは、１）スクロース嗜好試験および２）強制水泳試験であった。
スクロース嗜好試験
スクロース嗜好試験（ＳＰＴ）は、ラットの自然な傾向を利用して、通常の水よりも砂糖の水を好む。快楽を求める行動（快感）またはそれの欠如（快感）を測定する確立されたテストであり、水道水と１％スクロース水を含むボトルの左右の配置の変化に動物が適応する必要がある。ＳＰＴは１４日目と１５日目に行われた。
【００７３】
ラットは、ＳＰＴの前に餌と水（各ケージに１本の水筒）を自由に利用できるように個別に飼育した。ＳＰＴの順応部分については、２本の水ボトルを各ラットのホームケージに５〜６日間導入した。水ボトルには漏れを最小限に抑えるシッパーチューブが取り付けられ、約２４時間ごとに重量が測定された。順応段階に続いて、１つの水ボトルに約２００ｍＬの１％スクロース溶液を満たし、もう１つの水ボトルに約２００ｍＬの水道水を入れた。２４時間後、各ボトルに残っている液体の量を記録した。次に、ボトルのＬ／Ｒ配置を切り替え、２４時間後に各ボトルに残る液体の量を再度記録した。消費されたスクロース溶液の量（ｍＬ）は、２つの２４時間の各期間にわたって消費された流体（ショ糖水と水）の合計量のパーセントとして表され、グループと日で比較された。
【００７４】
ＳＰＴの結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。試験の２日目（１５日目）に、陽性対照群（５０分で水）は、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）を投与された４群のうち３群とは対照的に、スクロースに対する嗜好を維持しなかった。
【００７５】
強制水泳試験
強制水泳試験（ＦＳＴ）は、げっ歯動物における抗うつ薬の有効性を迅速にスクリーニングする方法として、１９７０年代後半にＰｏｒｓｏｌｔによって開発された。未治療（「正常な」）げっ歯動物で５分間のＦＳＴの終わり頃に生じる不動の増加は、「行動の絶望」を反映すると解釈された。ただし、このテストの構成概念の妥当性は、次のような多くの理由で疑問視される。２）ＦＳＴの従属変数は、試験に対する動物の急性反応であり、動物の特性ではない。３）浮遊行動の「行動的絶望」としての解釈は擬人化される。現在、未処理のラットで見られる進行性の不動は、逃げる可能性のない容器に入れられる急性ストレスに対する適応反応を反映すると考えられる。
【００７６】
ＦＳＴでは、水（高さ３０ｃｍ、２５°Ｃ）で満たされたガラス円筒チャンバー（４６ｃｍＨｘ３０ｃｍＤ）で遊泳活動と不動性が測定された。温度計を使用して、すべての動物の水温が常に２４〜２６°Ｃになるようにした。最初の１５分間の「試験前」として２回の水泳セッションが実行され、２４時間後に２回目の５分間の「試験」が行われた。試験セッションはビデオ録画された。ＦＳＴの１分ごとに、積極的に泳ぐ時間と不動の時間を記録した。
【００７７】
ＦＳＴは、２５日目と２６日目に実施した。２５日目は、各ラットを水で満たされたプレキシガラスシリンダーに１５分間入れた。研究２６日目に、５分間の試験のために、各ラットを水で満たされたプレキシガラスシリンダーに戻した。テストの各分の間、各ラットの移動と不動に費やされた時間を記録した。ＦＳＴの結果を図３に示す。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）投与群は、陰性対照（治療なし）群と同様の傾向、つまり５分間の試験期間中の不動時間の漸進的な増加を示した。
【００７８】
神経行動学的検査の順序
神経行動学的検査の順序は、最もストレスの少ないものから最もストレスの多いものへと進んだ。同じ日に２つの試験は実行されなかった。すべての試験は午前中に行われた。試験は次のように実行された（チャレンジの日としての研究１日目以降）。
ｏ研究８日目、スクロース嗜好試験（最長８日間）
ｏ調査２５日目の強制水泳試験（最後の２日間）
【００７９】
試験が行われた動物の順序はランダム化され、両方の試験を受けているラットのグループのアイデンティティはマスクされ、これらの試験を実施する技術者は治療グループを盲目にした。テストの結果のスコアリングは、ビデオテープを使用して行われた。
【００８０】
安楽死および組織の収穫と処理
研究２９日目の各グループについて、生存しているすべてのラットに、２００ｍｇ／ｋｇ未満のケタミンと２０ｍｇ／ｋｇ未満のキシラジンの目標用量のＩＰ注射で麻酔をかけた。ラットを０．４％パラホルムアルデヒドに続いてヘパリン添加生理食塩水で経心的に灌流した（灌流プロトコルはＲａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００６）。各ラットの心臓を採取し、評価のために固定液で保存した。
【００８１】
組織収集後、動物の死体はＳＯＰ  ＭＲＩ−１５２６「動物の死骸と医療廃棄物のスペンサー動物保護施設での処分」に従って処分された。
【００８２】
脳は、パラホルムアルデヒド固定液に４°Ｃで少なくとも４日間は一晩残った後、氷パックに固定液を入れた個々のバイアルに入れて、評価のためにＨＳＲＬ、Ｉｎｃ．に一晩出荷した。Ｒａｏ、ｅｔ  ａｌ（２０１４）およびＢｏｌｏｎ、ｅｔ  ａｌ（２０１３）に記載されるように、各脳を均一に７つのセクションにトリミングして、ソマンおよび他の有機リン神経剤の影響を受けることが知られる領域を含む脳全体の最大解剖学的表示を取得した（例えば、梨状皮質、嗅内皮質、海馬、扁桃体、視床、小脳）。切片は日常的に処理され、５ミクロンで切片にされ、パラフィンに包埋され、ヘマトキシリンとエオシンで染色された。職員は用量群と治療について知らされなかった。
【００８３】
神経病理学
各ラットの７つの脳切片を、６点半定量スコアリングシステムを使用して顕微鏡で評価しました。顕微鏡的病変は６点スケールで等級付けされた：
０＝通常
１＝４０Ｘの顕微鏡視野あたり１−５個の細胞が影響を受けた
２＝４０Ｘの顕微鏡視野あたり６−２０の細胞が影響を受けた
３＝４０Ｘの顕微鏡視野あたり２１−５０個の細胞が影響を受けた
４＝４０Ｘの顕微鏡視野あたり５０％−８０％の細胞が影響を受けた
５＝４０Ｘの顕微鏡視野あたり＞８０％の細胞が影響を受けた
【００８４】
表３は、グループごとの壊死スコアあたりの動物の割合を示す、前頭頭頂皮質の病理データのセットである。
【表３】
2020532555.tif 000009
【００８５】
前頭頭頂皮質の平均壊死スコアを図４に示す。
【００８６】
顕微鏡写真を図５Ａおよび５Ｂに示す。図５Ａは、グループＥの動物、陽性対照、ＳＥ発症５０分後の水の顕微鏡写真を示す。矢印は、色あせた縮んだニューロンを示す。この動物の壊死スコアは４だった。図５Ｂは、ＳＥ発症２０分後のグループＤの動物、３０ｍｇ／ｋｇ  ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）の顕微鏡写真である。矢印は正常なニューロンを示す。この動物の壊死スコアは０だった。
【００８７】
表４に顕微鏡の病理所見を示す。グループＦの動物（未治療）には有意な所見はなかった。グループＥ（陽性対照）には所見が期待された。陽性対照（グループＥ）と比較した、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）投与ラットの前頭頭頂皮質の壊死範囲の減少は、文献報告と一致した。
【表４】
2020532555.tif 000010
【００８８】
結論
全体的に、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）投与動物は、非投与動物と比較して、神経行動学的試験で優れたパフォーマンスを示した。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）処理動物は、非処理動物と比較して、脳皮質の細胞壊死レベルが低かった。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）処理動物は、細胞死に影響を与える用量依存的および時間依存的な治療効果を示した。これらの神経行動学的検査と神経病理学的所見は一貫しており、直接相関しているようだ。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）はすべてのグループで忍容性が良好であり、新しい安全性シグナルは観察されなかった。
【実施例２】
【００８９】
研究の概要
この研究の目的は、ラットの確立されたＧＤ（ソマン）生存モデルにおいてＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）が神経保護作用を有するかどうかを判断することである。ソマン誘発性発作の発症後２０または６０分に、ボーラスＩＶ注射により１０または３０ｍｇ／ｋｇＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）の単回投与が行われる。生存は、皮下（ＳＱ）ソマン注射の３０分前の塩化アソキシム（ＨＩ−６）、ＳＱソマン注射の１分後のアトロピン硝酸メチル、硫酸アトロピン、塩化プラルドキシム（２−ＰＡＭ−Ｃｌ）、および少なくとも３のＲａｃｉｎｅスコアを達成するソマン誘発性発作の発症から２０分後のミダゾラムでの治療によって促進される。コントロールには、２つの別個のグループが含まれ、未処理（ナイーブ）ラットのグループ（ネガティブコントロール）の１グループ、及び滅菌水または滅菌水とマンニトールビークル、ソマン誘発性発作の発症後６０分のいずれかを投与する別のグループである。
【００９０】
２日目、すべてのラットは、失血と心臓内灌流による麻酔下で犠牲にされる。脳は顕微鏡による神経病理検査のために各ラットから収集され、心臓は病理検査のために各ラットから収集される。
【００９１】
実験対象者は、暴露の日に体重３００−５００ｇのカニューレ挿入された８週齢以上のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）になる。
【００９２】
材料
Ｓｏｍａｎ（ＧＤ）−０．９％塩化ナトリウムで希釈。ソマンは、酵素と付加体を形成することによりアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を不活性化する有機リン神経剤です。
?化学名：ピナコリルメチルホスホノフルオリデート
?化学式：Ｃ７Ｈ１６ＦＯ２Ｐ
?分子量：１８２．１７
?ＭＲＩＧｌｏｂａｌロット番号：ＧＤ０９０４１５−ＤＯＣ−１
?プライマリ標準ＩＤ：１３９７２−４９−３
?純度：１００％
?保管条件：＜４°Ｃ
【００９３】
このモデルで生存を促進する治療法は、１）塩化アソキシム（ＨＩ−６）、２）トロピン硝酸メチル、３）硫酸ストロピン；４）塩化プラルドキシム、５）ミダゾラムである。ＨＩ−６は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）からソマンなどの有機リン酸を置換し、それによって酵素を再活性化できるＡＣｈＥ反応性物質である。硫酸アトロピンは、ムスカリン性アセチルコリン受容体の中枢で作用する競合的かつ可逆的な拮抗薬である。アトロピン硝酸メチルは、ムスカリン性アセチルコリン受容体の末梢で作用する競合的かつ可逆的な拮抗薬である。両方は、ソマンおよび他の有機リン酸神経剤によって誘発される急性コリン作動性症候群に対抗するために臨床的に使用される。ミダゾラムは、発作の治療のためのベンゾジアゼピンである。オキシム、アトロピン、およびベンゾジアゼピンが、急性神経剤／有機リン酸塩毒性の臨床治療として受け入れられているため、これらの薬剤が選択される。プラリドキシム（ＡＣｈＥ反応性物質）、アトロピン、およびジアゼパム（ベンゾジアゼピン）から成る３剤レジメンは、現在ＦＤＡが承認した軍人向けの対策である。
【００９４】
ＨＩ−６：化学名：［（Ｅ）−［１−［（４−カルバモイルピリジン−１−イウム−１−イル）メトキシメチル］ピリジン−２−イリデン］メチル］−オキソアザニウム；メタンスルホネート（塩化アソキシム）
構造：
【化４】
2020532555.tif 000011
化学式：Ｃ１４Ｈ１６Ｃｌ２Ｎ４Ｏ３
分子量：３５９．２０７
【００９５】
アトロピン硝酸メチル：化学名：（８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）３−ヒドロキシ−２−フェニルプロパノエート；硝酸塩
構造：
【化５】
2020532555.tif 000012
化学式：Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６
分子量：３６６．４１４
【００９６】
ミダゾラム：化学名：８−クロロ−６−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−４Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン
構造：
【化６】
2020532555.tif 000013
化学式：Ｃ１８Ｈ１３ＣｌＦＮ３
分子量：３２５．７７１
【００９７】
ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）（ダントロレンナトリウム）は、適切な支援手段と組み合わせた悪性高体温の治療および高リスク患者の悪性高体温の予防のためのＦＤＡ承認薬である。
【００９８】
ダントロレンナトリウム：化学名：１−［［［［５−（４−ニトロフェニル）−２−フラニル］メチレン］アミノ］−２，４−イミダゾリジンジオンナトリウム塩の水和物
構造：
【化７】
2020532555.tif 000014
分子量：３９９
【００９９】
賦形剤：マンニトール（２５ｍｇ／ｍＬ）ポリソルベート８０（５ｍｇ／ｍＬ）；ポビドンＫ１２（０．８ｍｇ／ｍＬ）
５％マンニトール溶液：５％マンニトール溶液（滅菌水中）
化学式：Ｃ６Ｈ１４Ｏ６
【０１００】
動物
この研究では、１２０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（合計１４０匹のエキストラ／交換２０匹、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、生後８週齢以上、ベンダーによって移植された頸静脈血管カテーテル付き３００−５００ｇが使用される。ラットは、固有の英数字の記号が付いたテールマーキングまたはイヤータグによって識別される。（例えば、ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５０４、「動物およびケージの識別手順」を参照）。
【０１０１】
研究に含まれるすべてのラットは健康であり、臨床疾患の兆候はなく、研究開始時の投与に適した特許カテーテルがある。出産後、動物は不健康な兆候がないか検査され、４８時間以上は従来の動物施設で隔離される。獣医師は動物の健康状態を調べ、研究のためにそれらを解放する（例えば、ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５０１、「動物の気候変動および／または検疫手順」を参照）。動物は出産後３日以内に体重を測定する。動物が到着してから翌日までの全期間を通じて、ラットはスタッフが毎日少なくとも２回、順応と研究の一貫性を保つために取り扱う。
【０１０２】
すべてのラットには、供給元、ロット番号、および分析証明書が自由に識別されるＬａｂ  Ｄｉｅｔ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  ｄｅｎｔ歯類食品が提供される。分析証明書によって検証されるように、研究の結果に影響を与える可能性のある汚染物質は飼料に存在しない（各ロットについて、ベンダーにより提供される。例えば、ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５１０、「動物への給餌手順」を参照）。調査期間中、水道水（１本の水筒／ケージ）に水道水が提供される。
【０１０３】
動物は、順化／検疫および生存期間中、ワイヤートップ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、フェニックスビル、ペンシルバニア州）を備えたポリカーボネートＴｅｃｎｉｐｌａｓｔケージに収容される。カテーテルへの損傷を防ぐために、動物は１匹ずつ収容される。ラットは、環境制御された部屋に収容され、１時間あたり少なくとも１０回の換気が行われる。部屋は、６８．０°Ｆから７９．０°Ｆの温度と５０％±２０％の相対湿度で、１日あたり１２時間の明暗サイクルで維持される。室温、湿度、および光のサイクル（１２時間：１２時間逆光／暗）は、ＡｍｅｇａＶｉｅｗモニタリングシステムによって２４時間／日、または研究中にＨｙｇｒｏｔｈｅｒｍｏｇｒａｐｈによって監視される（例えば、ＳＯＰ  ＭＲＩ−１１７０、「温度および動物室での湿度監視」）。
【０１０４】
投与量
ＨＩ−６、ソマン、硫酸アトロピン、硝酸アトロピンメチル、２−ＰＡＭ  Ｃｌ、およびミダゾラム：ＨＩ−６の単回投与（ＩＰ、１２５ｍｇ／ｋｇ）；ソマン（ＳＣ、１５４μｇ／ｋｇ、１．４ｘＬＤ５０）、アトロピン硝酸メチル（ＩＭ、２ｍｇ／ｋｇ）；硫酸アトロピン（０．４５ｍｇ／ｋｇ）、２−ＰＡＭ  Ｃｌ（２５ｍｇ／ｋｇ）、およびミダゾラム（ＩＭ、１．８ｍｇ／ｋｇ）は、モデルの以前の経験に基づいて選択される。適切な生存を確保するには、ＨＩ−６、硝酸アトロピン、およびミダゾラムを含める必要がある。このレジメンは、少なくとも３のＲａｃｉｎｅスコアと追跡調査のための容認可能な数の生存者を達成する痙攣をもたらすと予想される。
【０１０５】
ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）：ラットの単回投与耐容性評価では、頸静脈カニューレ挿入ラットの各グループに、１２、４０、および６０ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス用量を投与する。ラットでの１０および３０ｍｇ／ｋｇのＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）用量は、それぞれ約２および６ｍｇ／ｋｇのヒト用量と同等である。
【０１０６】
投与計画
下の表に示すように、合計１２０匹に加えて、ベンダーによって移植された頸静脈カテーテルを備えた最大２０匹の追加のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが６つのグループで使用される。動物は２０の分隊で実行される。すべてのグループ割り当ては、各分隊が各分隊の少なくとも１つの動物によって表されるという規定でランダムに割り当てられる。
表．グループごとの治療割り当て
【表５】
2020532555.tif 000015
【０１０７】
投与準備
ＧＤは、例えばＳＯＰ  ＭＲＩ−５８２１「研究開発および試験評価（ＲＤＴＥ）希釈溶液からの標準およびサンプルの調製」に従って、氷冷０．９％塩化ナトリウムで調製される。
【０１０８】
ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）は、５ｍＬの注射用滅菌水（静菌剤なし）を１バイアルの凍結乾燥製品に加えることにより調製される。
【０１０９】
注射可能なバイアルに滅菌０．９％生理食塩水を加えることにより、ＨＩ−６を２５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製する。
【０１１０】
注射用バイアルに滅菌注射用水（ＷＦＩ）を添加することにより、硝酸アトロピンメチルを４ｍｇ／ｍＬの濃度に調製する。
【０１１１】
硫酸アトロピンは、滅菌生理食塩水で０．８ｍｇ／ｍＬの濃度に調製する。
【０１１２】
２−ＰＡＭ  Ｃｌは、滅菌生理食塩水で１００ｍｇ／ｍＬの濃度に調製する。
【０１１３】
次に、硫酸アトロピンと２−ＰＡＭ  Ｃｌを１：１で混合し、０．５ｍＬ／ｋｇでＩＭを投与する。
【０１１４】
ミダゾラムは、ベンダーから１０ｍｇ／ｍＬの溶液として調達され、そのまま投与する。
【０１１５】
実験計画
動物の準備
試験１日目（ＧＤ曝露の日）の前またはその日に、ラットを試験場所に移す。
【０１１６】
投与量
研究１日目に、すべての動物は最も近いグラムに重み付けされ、すべての治療用量はそれらの体重に基づいて計算される。グループＡ〜Ｅは、ＧＤチャレンジの３０分前に腹腔内（ＩＰ）経路を介してコリンエステラーゼ活性化剤ＨＩ−６（１２５ｍｇ／ｋｇ）を受け取る。グループＡ〜Ｅのすべてのラットは、１回の皮下注射でＧＤ（１５４μｇ／ｋｇ（３０８ｕｇ／ｍＬ）〜１．４ｘＬＤ５０）に曝露される。グループＡ−Ｅの約１分間のＧＤ注射後、硝酸アトロピン（ＡＭＮ）がＩＭ経路（２．０ｍｇ／ｋｇ）で投与される。上記の表に定義されているＧＤ暴露後の発作活動の開始から約２０分後、グループＡＥのすべての動物は、２−ＰＡＭ−Ｃｌ（２５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内に混合した硫酸アトロピン（０．４５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１．８ｍｇ／ｋｇの用量でミダゾラムを筋肉内投与する。グループＦは、ＨＩ−６、ＧＤ、ＡＭＮ、ミダゾラム、およびＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）を投与しない。ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）は、投与される投与量に応じて、１００ｕＬ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｙｒｉｎｇｅまたはＬｕｅｒ  ｌｏｃｋ  ｓｙｒｉｎｅ（１ｃｃ）を介して投与される。その後、カテーテルを少なくとも０．２ｍＬの滅菌水でフラッシュし、静脈への完全な送達を確保する。
【０１１７】
発作活動の開始は、以下で説明するように、Ｒａｃｉｎｅスケールで「３」のスコアによって定義された。
１＝固定化と凝視
２＝うなずき、「ぬれた犬が震える」
３＝前肢のクローヌス、まばたきと顔のクローヌスを伴う耳のリミティックフリック
４＝両側前肢のクローン
５＝両側前肢のクローン、飼育およびバランスの喪失
【０１１８】
ラットがＧＤ暴露から約２０分後にこの「３」のスコアを達成しない場合、研究で置き換えられる。
【０１１９】
上記の表に示すように、グループＡおよびＣのラットには１０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）ＩＶが投与され、グループＢおよびＤのラットは、発作の発症（「３」のラシーン尺度）６０分または２０分後に３０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）ＩＶが投与される。グループＥのラットは、発作の発症後６０分に最高用量のＲＹＡＮＯＤＥＸに匹敵する量の対照（無菌水または５％マンニトール溶液（３０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＹＡＮＯＤＥＸ商標登録）により送達されるマンニトールの量）を注射用無菌水に）投与される。
【０１２０】
グループＡ−ＥのＧＤチャレンジ後約６時間で、回復を助けるためにラットに乳酸リンゲル液５ｍＬを投与する。
【０１２１】
体重
体重は、各動物について、ベンダーからの受領後最初の７２時間以内に研究で記録され、その後再び研究１および２日に記録される。受領時の最初の体重測定から研究1日目の体重測定までの間に体重が増加しない動物はすべて交換される。
【０１２２】
臨床所見
一般的な健康状態の観察は、検疫と順応期間を通して毎日行われる。動物は、検疫と順応期間中、および生涯を通して毎日２回扱われる。研究１日目に、ラットを観察し、暴露前に体重を測定する。ＧＤ暴露後、発作の発症を記録するためにラットを継続的に監視する。ミダゾラム、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（商標登録）および／またはコントロール溶液の投与後、動物は発作発症後１、２、４、および６時間で、安楽死の日に少なくとも１回観察される。かがんだ姿勢、脱水、粗い被毛、食欲不振などの臨床所見が評価され、記録される。該当する場合、Ｒａｃｉｎｅスコアは各観測ポイントで記録される。他の異常な臨床的観察も、この時点で、例えばＳＯＰ  ＭＲＩ−１５２８「動物観察の手順」に従って、研究ノートまたは適切なデータ収集フォームに記録される。死亡時刻が記録され、死亡した動物は、発見された時点で記録される。
【０１２３】
安楽死および組織の収穫と処理
研究２日目の各グループについて、生存しているすべてのラットに、７５ｍｇ／ｋｇ以上のペントバルビタール溶液をＩＰ注射することにより、深く麻酔をかける。ラットは、ヘパリン生理食塩水に続いて０．４％パラホルムアルデヒドまたは１０％中性緩衝ホルマリンで経心的に灌流される（灌流プロトコルはＲａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００６）に従う。各ラットの心臓は、評価のために固定液で収集および保存される。
【０１２４】
組織採取後、動物の死体は、例えば、ＳＯＰ  ＭＲＩ−１５２６「動物の死骸と医療廃棄物のスペンサー動物保護施設での処分」に従って処分される。
【０１２５】
翌日、脳は４℃のパラゴルアルデヒドで一晩保存され、排出され、冷ＰＢＳで置き換えられ、４℃で一晩保存される。翌日、ＰＢＳを排出し、１０％スクロース溶液と交換し、４℃で一晩保存し、１０％中性緩衝ホルマリンに一晩移す。あるいは、脳は室温で少なくとも４日間１０％ホルマリン固定液のままで、その後出荷される。Ｒａｏら（２０１４）およびＢｏｌｏｎら（２０１３）に記載されているように、各脳は均一に７つのセクションにトリミングされ、ソマンおよび他の有機リン神経剤の影響を受けることが知られる領域を含む脳全体の最大解剖学的表示を取得する（例、梨状皮質、嗅内皮質、海馬、扁桃体、視床、小脳）。切片は日常的に処理され、５ミクロンで切片にされ、パラフィンに包埋され、ヘマトキシリンとエオシンで染色される。職員は用量群と治療について知らされていない。
【０１２６】
神経病理学
各ラットの７つの脳切片は、６点の半定量スコアリングシステムを使用して顕微鏡で評価される。微視的病変は６点スケールで等級付けされる。
神経行動学的検査
【０１２７】
必要に応じて、安楽死の前、しかし１日目のＧＤ暴露後、ラットは、実施例１に記載のような神経障害試験を受ける。
【図１】
2020532555.tif 000016
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020532555.tif 000022
【国際調査報告】
2020532555.tif 000023
2020532555.tif 000024