(57)【要約】ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性および／または標的ゲノム遺伝子座の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するための方法および組成物が提供される。方法および組成物は、Ｃａｓタンパク質が構成的に利用可能であり得るか、または組織特異的もしくは時間特異的様式で利用可能であり得るような、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットなどのＣａｓ発現カセットを含む細胞および非ヒト動物を使用する。非ヒト動物へのガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によりｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するためのこれらの非ヒト動物の使用を含む、これらの非ヒト動物を作製および使用するための方法および組成物も提供される。
2020532952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
（ａ）非ヒト動物に、前記標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップであって、
前記非ヒト動物が、１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含み、
前記ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入される、ステップ；および
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座の前記改変を評価するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり、ステップ（ｂ）が、肝臓において前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＡＶがＡＡＶ８である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＡＶの前記非ヒト動物への投与経路が、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において外因性ドナー核酸が導入され、前記外因性ドナー核酸が、前記標的ゲノム遺伝子座と組み換わるように設計されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記外因性ドナー核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的ゲノム遺伝子座が標的遺伝子を含み、ステップ（ｂ）が、前記標的遺伝子の発現または前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中の前記標的ゲノム遺伝子座を配列決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から標的器官または組織を単離すること、および前記標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、前記標的器官または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から非標的器官または組織を単離すること、および前記非標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記Ｃａｓ発現カセット中の前記ポリアデニル化シグナルが、組織特異的様式で切り出されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流の前記ポリアデニル化シグナルが、肝臓中で切り出されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記リコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ヒト動物が、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子が、表２に記載のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されている、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記方法が、リコンビナーゼを、組織特異的様式で前記非ヒト動物に導入するステップをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リコンビナーゼが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって導入される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃａｓ発現カセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および前記蛍光タンパク質コード配列を含むマルチシストロン性核酸を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記マルチシストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および緑色蛍光タンパク質コード配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含まない、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃａｓタンパク質がタンパク質タグを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｃａｓ発現カセットの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｃａｓ発現カセットが、内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｃａｓ発現カセットが、外因性の構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号１３、１６、１９、または２２に記載の配列を含むタンパク質をコードする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号２８、２９、３０、または３１に記載の配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、または２１に記載の配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｃａｓ発現カセットが、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてホモ接合性である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記非ヒト動物が、マウスであり、
前記ＡＡＶが、静脈内注射によって前記非ヒト動物に送達されるＡＡＶ８であり、
前記Ｃａｓ発現カセットが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓ９タンパク質のコード配列を含み、
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中での前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の前記請求項のいずれかに記載の方法を実施するステップ；
（ＩＩ）変数を変更し、第２の非ヒト動物において変更された前記変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変と、ステップ（ＩＩ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変とを比較し、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つまたは複数を有する標的ゲノム遺伝子座の改変をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項４０】
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ＡＡＶ血清型である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ガイドＲＮＡを前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸の濃度または量である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物。
【請求項５０】
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物細胞。
【請求項５１】
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物ゲノム。
【請求項５２】
相同アームによって挟まれたＣａｓ発現カセットを含む標的化ベクターであって、前記Ｃａｓ発現カセットが、１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含み、前記相同アームが、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である、標的化ベクター。
【請求項５３】
請求項４９に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含むように、非ヒト動物の多能性細胞のゲノムを改変するステップ；
（ｂ）前記Ｃａｓ発現カセットを含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；
（ｃ）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および
（ｄ）代理母に前記非ヒト動物宿主胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。
【請求項５４】
請求項４９に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含むように非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを改変するステップ；
（ｂ）前記Ｃａｓ発現カセットを含む遺伝子改変された１細胞期胚を選択するステップ；および
（ｃ）代理母に前記遺伝子改変された１細胞期胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年７月３１日に出願された米国特許出願第６２／５３９，２７５号の利益を主張する。
【０００２】
ＥＦＳ  ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５１６５６９ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は１７８キロバイトであり、２０１８年７月３０日に作成され、本明細書により参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、有望かつ新しい治療モダリティである。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤による突然変異生成または標的遺伝子改変の効率を評価するより良好な手段が必要である。ｉｎ  ｖｉｖｏで系を試験する１つの制限は、全ての構成成分を生きている生物体に同時に導入する必要があることである。これらの構成成分を侵入させる典型的な方法は、適切なＲＮＡおよびタンパク質を生成する細胞中にＤＮＡ構築物を一過的にトランスフェクトすることである。細胞が、Ｃａｓ９タンパク質がｓｇＲＮＡ構成成分と相互作用するために利用可能となる前に、最初に転写を受けた後、翻訳を受けるプラスミドＤＮＡ構築物に依拠しなければならないため、有効であるが、この手法は固有の欠点も有する。導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤の活性をより効率的に評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の組織または細胞型を標的にするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法および手段が必要である。
【０００４】
さらに、対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤などの生物活性剤の送達は、構成成分が標的細胞または組織に到達する困難性によって阻害されることが多い。これらの制限の結果、例えば、ある結果を達成するのに望ましいものよりもはるかに高い濃度の薬剤を使用する必要があり、毒性効果および副作用のリスクを増大させ得る。改善された送達方法およびｉｎ  ｖｉｖｏでそのような送達方法を評価する方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
Ｃａｓ９導入非ヒト動物が提供され、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ作用剤の能力を評価するための方法および組成物が提供される。一態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）非ヒト動物に、標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップであって、非ヒト動物が、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含み、ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入される、ステップ；および（ｂ）標的ゲノム遺伝子座の改変を評価するステップを含む。一部のそのような方法は、（ａ）非ヒト動物に、標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップであって、非ヒト動物が、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含み、ガイドＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって導入される、ステップ；および（ｂ）標的ゲノム遺伝子座の改変を評価するステップを含む。
【０００６】
一部のそのような方法では、ＡＡＶは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり、ステップ（ｂ）は、肝臓において標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む。必要に応じて、ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。
【０００７】
一部のそのような方法では、ＡＡＶの非ヒト動物への投与経路は、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である。
【０００８】
一部のそのような方法では、ステップ（ａ）において外因性ドナー核酸が導入され、外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座と組み換わるように設計されている。必要に応じて、外因性ドナー配列は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである（ｓｓＯＤＮ）。
【０００９】
一部のそのような方法では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。必要に応じて、非ヒト動物は、マウスである。
【００１０】
一部のそのような方法では、標的ゲノム遺伝子座は、標的遺伝子を含み、ステップ（ｂ）は、標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含む。
【００１１】
一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中の標的ゲノム遺伝子座を配列決定することを含む。
【００１２】
一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物から標的器官または組織を単離すること、および標的器官または組織中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む。必要に応じて、ステップ（ｂ）は、標的器官または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む。
【００１３】
一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物から非標的器官または組織を単離すること、および非標的器官または組織中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む。
【００１４】
一部のそのような方法では、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列は、ＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列である。
【００１５】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、ポリアデニル化シグナルは、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、Ｃａｓ発現カセット中のポリアデニル化シグナルは、組織特異的様式で切り出されている。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセット中のＮＬＳコード配列の上流のポリアデニル化シグナルは、肝臓中では切り出されている。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセット中のリコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼである。必要に応じて、非ヒト動物は、ゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ発現カセットをさらに含み、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現カセットは、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含む。必要に応じて、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、表２に記載のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されている。
【００１６】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、ポリアデニル化シグナルは、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、この方法は、リコンビナーゼを組織特異的様式で非ヒト動物に導入するステップをさらに含む。必要に応じて、リコンビナーゼは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって導入される。必要に応じて、リコンビナーゼは、ＡＡＶ８媒介性送達によって導入される。必要に応じて、リコンビナーゼは、肝臓に導入される。
【００１７】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、蛍光タンパク質コード配列をさらに含む。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられたＮＬＳ−Ｃａｓコード配列および蛍光タンパク質コード配列を含むマルチシストロン性核酸を含む。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセット中のマルチシストロン性核酸は、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられたＮＬＳ−Ｃａｓコード配列および緑色蛍光タンパク質コード配列を含む。一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、蛍光タンパク質コード配列をさらに含まない。一部のそのような方法では、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列は、タンパク質タグを含むＣａｓタンパク質をコードする。
【００１８】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、内因性プロモーターに作動可能に連結されている。一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、外因性の構成的プロモーターに作動可能に連結されている。
【００１９】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットの５’末端は、３’スプライシング配列をさらに含む。
【００２０】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、配列番号１３、１６、１９、または２２に記載の配列を含むタンパク質をコードする。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、配列番号２８、２９、３０、または３１に記載の配列を含む。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、配列番号１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、または２１に記載の配列を含む。
【００２１】
一部のそのような方法では、Ｃａｓ発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。必要に応じて、セーフハーバー遺伝子座は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれる。
【００２２】
一部のそのような方法では、非ヒト動物は、Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性である。一部のそのような方法では、非ヒト動物は、Ｃａｓ発現カセットについてホモ接合性である。
【００２３】
一部のそのような方法では、非ヒト動物はマウスであり、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、Ｃａｓ発現カセットは、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）ＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列を含み、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の肝臓中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む。一部のそのような方法では、非ヒト動物はマウスであり、ＡＡＶは静脈内注射によって非ヒト動物に送達されるＡＡＶ８であり、Ｃａｓ発現カセットは、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）ＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列を含み、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の肝臓中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む。
【００２４】
別の態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法が提供される。一部のそのような方法は、（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目のｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する上記方法のいずれかを実施するステップ；（ＩＩ）変数を変更し、第２の非ヒト動物において変更された変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）の方法を実施するステップ；および（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における標的ゲノム遺伝子座の改変と、ステップ（ＩＩ）における標的ゲノム遺伝子座の改変とを比較し、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つまたは複数を有する標的ゲノム遺伝子座の改変をもたらす方法を選択するステップを含む。
【００２５】
一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、ＡＡＶ血清型である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、ガイドＲＮＡを非ヒト動物に導入する投与経路である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの形態または配列）である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、外因性ドナー核酸を非ヒト動物に導入する送達方法である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、外因性ドナー核酸を非ヒト動物に導入する投与経路である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量と比較した、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸（例えば、外因性ドナー核酸の形態）である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、５’から３’に向かって、３’スプライシング配列；第１のｌｏｘＰ部位；ネオマイシン耐性遺伝子；ポリアデニル化シグナル；第２のｌｏｘＰ部位；ＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列；Ｐ２Ａペプチドコード配列；およびＧＦＰコード配列を含む、Ｃａｓ９対立遺伝子（ＭＡＩＤ２５９９；正確な縮尺ではない）を示す。
【００２７】
【図２】図２Ａは、必要に応じて、Ｃａｓ９プラスミドの導入と共に、第１の標的遺伝子の開始および停止コドン領域を標的とする２つのｓｇＲＮＡの導入後の、ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘネオマイシンカセットを含む、および含まない野生型Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）およびＣａｓ９導入ｍＥＳＣ（それぞれ、ＭＡＩＤ２５９９およびＭＡＩＤ２６００）におけるＮＨＥＪ活性を示す。左パネルでは、５’カット効率を測定し、中央パネルでは、３’カット効率を測定し、右パネルでは、介在ＤＮＡが完全に欠失される比率を測定した。
【００２８】
図２Ｂは、必要に応じて、Ｃａｓ９プラスミドと共に、点突然変異ドナーとしての一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）と共に第２の標的遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（プラスミド形態で、またはＲＮＡとして）の導入後のカット効率（左パネル）およびＨＤＲ効率（右パネル）を示す。
【００２９】
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、野生型マウスおよびヘテロ接合性Ｃａｓ９導入マウス（ＭＡＩＤ２６００）に由来する肝臓（図３Ａ）、腎臓（図３Ｂ）、および脳（図３Ｃ）組織の明視野画像、ならびに野生型マウスおよびＣａｓ９導入マウス（ＭＡＩＤ２６００）における肝臓（図３Ｄ）、腎臓（図３Ｅ）、および脳（図３Ｆ）組織のＧＦＰ蛍光画像を示す。
【００３０】
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定されたヘテロ接合性Ｃａｓ９導入マウス（ＭＡＩＤ２６００）から単離された様々な組織におけるＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。ｙ軸は、脳組織に由来する平均Ｃａｓ９  Ｃｔと比較したデルタＣｔ＋１を示す。
【００３１】
【図４Ｂ】図４Ｂは、野生型マウスおよびヘテロ接合性Ｃａｓ９導入マウス（ＭＡＩＤ２６００）から単離された様々な組織におけるＣａｓ９タンパク質発現を示す。アクチンを、対照として使用した。
【００３２】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定されたヘテロ接合性Ｃａｓ９導入マウス（ＭＡＩＤ２６００）から単離された様々な組織におけるＣａｓ９平均Ｃａｓ９およびベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ｍＲＮＡ発現レベルを示す。それぞれの組織型から試験した試料の数を、バーの上に示す。
【００３３】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよび対照（死滅した）ｓｇＲＮＡ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよび標的遺伝子３のｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび標的遺伝子３のｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達後の、野生型マウス（図５Ａ）およびカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００；図５Ｂ）から単離された初代肝細胞中での第３の標的遺伝子（標的遺伝子３）でのＮＨＥＪ活性のパーセント（インデル頻度）を示す。１５．６、６２．５、２５０、および１０００ｎｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度を試験した。
【００３４】
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、尾静脈注射による流体力学的ＤＮＡ送達（ＨＤＤ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達による標的遺伝子３のｓｇＲＮＡの野生型マウス（ｍｓＣａｓ９−）またはカセット欠失Ｃａｓ９導入マウス（ｍｓＣａｓ９＋；ＭＡＩＤ２６００）への導入後の、肝臓によって分泌され、血清中に見出され、第３の標的遺伝子（標的遺伝子３）によってコードされるタンパク質の血清レベルを示す。一部の場合、Ｃａｓ９も導入した（ＬＮＰ送達についてはｍＲＮＡの形態で、ならびにＨＤＤ（Ｃａｓ９プラスミド）およびＡＡＶ送達についてはＤＮＡの形態で）。未処理のマウス、ＬＮＰ対照マウス、ＡＡＶ対照マウス、およびＨＤＤ対照マウスを、陰性対照として使用した。ＬＮＰ媒介性送達については、３群のマウスを試験した：（１）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；２ｍｇ／ｋｇの対照ガイドＲＮＡ＋ＧＦＰ  ｍＲＮＡ）；（２）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；２ｍｇ／ｋｇの標的遺伝子３のためのガイドＲＮＡ＋ＧＦＰ  ｍＲＮＡ）；および（３）ＷＴマウス（３匹のオス＋３匹のメス；２ｍｇ／ｋｇの標的遺伝子３のためのガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ）。ＡＡＶ媒介性送達については、２群のマウスを試験した：（１）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；ＡＡＶ８−標的遺伝子３のためのガイドＲＮＡ）；および（２）ＷＴマウス（３匹のオス＋３匹のメス；ＡＡＶ８−標的遺伝子３のためのガイドＲＮＡ＋ＡＡＶ８−Ｃａｓ９）。ＨＤＤについては、２群のマウスを試験した：（１）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；標的遺伝子３のためのガイドＲＮＡ）；および（２）ＷＴマウス（３匹のオス＋３匹のメス；標的遺伝子３のためのガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９）。標的遺伝子３によってコードされるタンパク質の血清レベルを、オスのマウス（図６Ａおよび図６Ｂ）およびメスのマウス（図６Ｃおよび図６Ｄ）において測定し、７日目（図６Ａおよび図６Ｃ）および２１日目（図６Ｂおよび図６Ｄ）に測定した。
【００３５】
【図７】図７は、ｓｇＲＮＡのみ、もしくはＣａｓ９  ｍＲＮＡと一緒のｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達、ｓｇＲＮＡプラスミドのみ、もしくはＣａｓ９プラスミドと一緒のｓｇＲＮＡプラスミド、またはＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡのみ、もしくはＡＡＶ８−Ｃａｓ９と一緒のＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡの流体力学的送達（ＨＤＤ）の１ヶ月後の、野生型マウス（ｍｓＣａｓ９−）およびカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ｍｓＣａｓ９＋；ＭＡＩＤ２６００）中の肝臓における標的遺伝子３でのＮＨＥＪ活性のパーセント（インデル頻度）を示す。
【００３６】
【図８Ａ】図８Ａは、尾静脈注射によるｓｇＲＮＡのＡＡＶ８送達の３〜４週間後のカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）の肝臓における標的遺伝子４の遺伝子座でのＮＨＥＪ活性のパーセント（インデル頻度）を示す。ＵＮＴ＝未処置対照。
【００３７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、尾静脈注射によるｓｇＲＮＡのＡＡＶ８送達の３〜４週間後のカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）から単離された肝臓組織におけるＴＡＱＭＡＮ分析によって決定された標的遺伝子４の発現の相対レベルを示す。ＷＴマスターミックスは、一緒に混合され、陰性対照として野生型マウスに注射された５つ全部のｓｇＲＮＡウイルスを指す。
【００３８】
【図９】図９は、ＬＮＰ−Ｃｒｅを尾静脈注射により注射した１週間後に単離された肝臓、脾臓、および腎臓試料中でのＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）におけるＣａｓ９発現のウェスタンブロットを示す。ＬＮＰ−Ｃｒｅを注射されていないマウスを、陰性対照として使用した。カセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）を、陽性対照として使用した。
【００３９】
【図１０】図１０は、単独で、またはＬＮＰ−Ｃｒｅと一緒に、ＡＡＶ８によってＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）に標的遺伝子３のｓｇＲＮＡを注射した１週間および３週間後の、肝臓によって分泌され、血清中に見出され、第３の標的遺伝子（標的遺伝子３）によってコードされるタンパク質の血清レベルを示す。ＬＮＰ−ＣｒｅもＡＡＶ８−ｇＲＮＡも注射されていないマウスを、陰性対照として使用した。全ての条件を、カセット欠失マウス（ＲＯＳＡ  Ｃａｓ９；ＭＡＩＤ２６００）においても試験した。
【００４０】
【図１１】図１１は、単独で、またはＬＮＰ−Ｃｒｅと一緒に、ＡＡＶ８によってＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）に標的遺伝子３のｓｇＲＮＡを注射した３週間後に単離された肝臓における標的遺伝子３の遺伝子座でのＮＨＥＪ活性のパーセント（インデル頻度）を示す。ＬＮＰ−ＣｒｅもＡＡＶ８−ｇＲＮＡも注射されていないマウスを、陰性対照として使用した。全ての条件を、カセット欠失マウス（ＲＯＳＡ  Ｃａｓ９；ＭＡＩＤ２６００）においても試験した。
【００４１】
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）およびＬＳＬ−Ｃａｓ９／Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスから単離された肝臓におけるＣａｓ９に関するウェスタンブロットを示す。アクチンを、ローディング対照として使用した。
【００４２】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）およびＬＳＬ−Ｃａｓ９／Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスから単離された脳におけるＣａｓ９に関するウェスタンブロットを示す。アクチンを、ローディング対照として使用した。
【００４３】
【図１３】図１３は、ＡＡＶ８により、ＷＴマウス、カセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＲＯＳＡ  Ｃａｓ９；ＭＡＩＤ２６００）、ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）、アルブミン−Ｃｒｅマウス、またはＬＳＬ−Ｃａｓ９／Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスに標的遺伝子３のｓｇＲＮＡを注射した１週間後の、肝臓によって分泌され、血清中に見出され、第３の標的遺伝子（標的遺伝子３）によってコードされるタンパク質の血清レベルを示す。
【００４４】
【図１４】図１４は、ＭＡＩＤ２５９９対立遺伝子（一度、ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットが欠失されたＭＡＩＤ２６００）、ＭＡＩＤ２６５８対立遺伝子（一度、ＬＳＬカセットが欠失されたＭＡＩＤ２６５９）、ＭＡＩＤ２６６０対立遺伝子（一度、ＬＳＬカセットが欠失されたＭＡＩＤ２６６１）、およびＭＡＩＤ２６７２対立遺伝子（一度、ＬＳＬカセットが欠失されたＭＡＩＤ２６７３）を含む、４つの異なるＣａｓ９対立遺伝子（正確な縮尺ではない）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。
【００４６】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言える。「Ｎ末端」という用語は、遊離のアミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質またはポリペプチドの出発点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端とする、アミノ酸の鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終了点に関する。
【００４７】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含めた、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。これらの用語は、プリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにポリマーを含む。
【００４８】
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその近くの３’酸素にリン酸ジエステル連結によって一方向に付着するように反応してオリゴヌクレオチドが生じるので、「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結していなければ、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と連結していなければ、「３’末端」と称される。核酸配列も、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われ得る。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれでも、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’側にあると称される。
【００４９】
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム中に組み込まれるように、細胞中に導入された核酸を指す。細胞のゲノム中への核酸の安定な組込みのために任意のプロトコールを使用することができる。
【００５０】
「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、特定の宿主細胞または生物中での作動可能に連結されたコード配列の発現にとって必要な適切な核酸配列に作動可能に連結された所望のコード配列を含有する組換え核酸を指す。原核生物中での発現にとって必要な核酸配列は通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、およびリボソーム結合部位、ならびに他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用することが一般に公知であるが、必要な発現を犠牲にすることなく、一部のエレメントを欠失させ、他のエレメントを付加することができる。
【００５１】
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入することができる組換え核酸を指す。
【００５２】
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングにとって十分な、またはそれを許容するエレメントを含む組換え核酸を指す。ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中に移動させる目的で、ベクターおよび／または粒子を使用することができる。いくつかの形態のウイルスベクターが公知である。
【００５３】
タンパク質、核酸、および細胞に関して「単離された」という用語は、タンパク質、核酸、または細胞の実質的に純粋な調製物に至るまで、およびそれを含めた、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて通常存在し得る他の細胞性または生物性構成成分に関して比較的精製されたタンパク質、核酸、および細胞を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有しないタンパク質および核酸または化学的に合成された、かくして、他のタンパク質もしくは核酸が実質的に混入していないタンパク質もしくは核酸も含む。「単離された」という用語はまた、それらが天然では付随する多くの他の細胞性構成成分または生物性構成成分（例えば、他の細胞タンパク質、核酸、または細胞性もしくは細胞外構成成分）から分離または精製されたタンパク質、核酸、または細胞も含む。
【００５４】
「野生型」という用語は、正常な状態または状況（突然変異体、疾患にかかっている、変更された状態または状況などとは対照的に）において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、多数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
【００５５】
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物中に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｒｏｓａ２６配列は、非ヒト動物中のＲｏｓａ２６遺伝子座に天然に存在する天然のＲｏｓａ２６配列を指す。
【００５６】
「外因性」分子または配列は、通常は細胞内にその形態では存在しない分子または配列を含む。通常存在するとは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して存在することを含む。外因性分子または配列は、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど細胞内の対応する内因性配列の突然変異バージョンを含んでもよく、または細胞内の内因性配列に対応するが、形態が異なる（すなわち、染色体内にない）配列を含んでもよい。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
【００５７】
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、同じ分子内で天然には一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関連して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列と関連しては見出されない配列に挟まれたコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連しては見出されない、別のペプチド分子内にあるかまたはそれに付着したアミノ酸のセグメント（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）である。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含み得る。
【００５８】
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組合せの多重性によって示される通り、コドンの縮重を活用し、一般に、特定の宿主細胞における発現の増強のために、ネイティブなアミノ酸配列を維持しながらネイティブな配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含めた所与の原核細胞または真核細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。これらの表は、いくつかのやり方で適合させることができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNakamuraら（２０００年）Nucleic  Acids  Research  ２８巻：２９２頁を参照されたい。特定の宿主において発現させるための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００５９】
「プロモーター」は、ＤＮＡの制御領域であり、通常、特定のポリヌクレオチド配列に対して妥当な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写開始率に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であってよい。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生制御型プロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってよい。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
【００６０】
構成的プロモーターは、あらゆる発生段階であらゆる組織または特定の組織において活性であるものである。構成的プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス極初期（ｈＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス極初期（ｍＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α）プロモーター、マウス伸長因子１アルファ（ｍＥＦ１α）プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧまたはＣＢｈ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびベータ２チューブリンプロモーターが挙げられる。
【００６１】
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的制御型プロモーターおよび物理的制御型プロモーターが挙げられる。化学的制御型プロモーターとしては、例えば、アルコール制御型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン制御型プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド制御型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属制御型プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的制御型プロモーターとしては、例えば、温度制御型プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および光制御型プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
【００６２】
組織特異的プロモーターは、例えば、神経特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋肉細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であってよい。
【００６３】
発生制御型プロモーターとしては、例えば、発生の胚形成期の間にのみ、または成体細胞においてのみ活性であるプロモーターが挙げられる。
【００６４】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）が、どちらの構成成分も正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が許容されるように近位にあることを含む。例えば、プロモーターがコード配列の転写のレベルを１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して調節する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している可能性がある。作動可能な連結は、互いと連続しているまたはトランスに作用する配列を含み得る（例えば、制御配列は、コード配列の転写を調節するための距離で作用し得る）。
【００６５】
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖内のヌクレオチド配列が、その核酸塩基群の配向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ内の相補的な塩基は一般にはＡとＴおよびＣとＧである。ＲＮＡでは、相補的な塩基は一般にはＣとＧおよびＵとＡである。相補性は、完全なものまたは実質的／十分なものであり得る。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、２重鎖内のあらゆる塩基が相補的な塩基とワトソン・クリック対形成によって結合した２重鎖を形成できることを意味する。「実質的な」または「十分な」相補性とは、一方の鎖内の配列が対向する鎖内の配列と徹底的におよび／または完全に相補的ではないが、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）の下で２つの鎖上の塩基間に十分な結合が生じて安定なハイブリッド複合体が形成されることを意味する。そのような条件は、ハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するためのシーケンスおよび標準の数学的算出を使用することにより、または常套的な方法を使用することによってＴｍを経験的に決定することにより、予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍを下回る温度ではハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍを上回る温度ではハイブリダイゼーション複合体内の鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、水性１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中のＧ＋Ｃ含有量が分かっている核酸に関しては、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって推定することができるが、他の公知のＴｍコンピュータ計算では、核酸の構造特性を考慮に入れる。
【００６６】
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が第２の核酸鎖と相補鎖相互作用および水素結合によって結合してハイブリダイゼーション複合体が生じる累積的環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性または有機溶液の化学成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度を含む。インキュベート時間の長さまたは反応チャンバーの寸法などの他の因子が環境に寄与し得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrookら、Molecular  Cloning、A  Laboratory  Manual、第２版、１．９０〜１．９１頁、９．４７〜９．５１頁、１１．４７〜１１．５７頁（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor,  N.Y.、１９８９年）を参照されたい。
【００６７】
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、塩基間にミスマッチがある可能性がある。２つの核酸間のハイブリダイゼーションのための妥当な条件は、周知の変数である核酸の長さおよび相補の度合いに依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補の度合いが大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きい。短い相補性のひと続き（例えば、３５ヌクレオチドもしくはそれ未満、３０ヌクレオチドもしくはそれ未満、２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、２２ヌクレオチドもしくはそれ未満、２０ヌクレオチドもしくはそれ未満、または１８ヌクレオチドもしくはそれ未満にわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置が重要になる（Sambrookら、上記、１１．７〜１１．８頁を参照されたい）。一般には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長としては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。さらに、相補領域の長さおよび相補の度合いなどの因子に応じて、必要に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができる。
【００６８】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸のポリヌクレオチド配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように１つまたは複数のセグメントを超えてハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域と相補的であり、したがって、それと特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性になる。この例では、残りの非相補性ヌクレオチドは、密集していても相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いとまたは相補的なヌクレオチドと連続している必要はない。
【００６９】
核酸内の核酸配列の特定のひと続き間のパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら（１９９０年）J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁；ZhangおよびMadden（１９９７年）Genome  Res.、７巻：６４９〜６５６頁）を使用して、または、SmithおよびWaterman（Adv.  Appl.  Math.、１９８１年、２巻、４８２〜４８９頁）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用したＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用することにより、常套的に決定することができる。
【００７０】
本明細書において提示される方法および組成物では、種々の異なる構成成分を使用する。説明全体を通して、一部の構成成分は、活性なバリアントおよび断片を有し得る。そのような構成成分としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれについての生物活性は本明細書の他の箇所に記載されている。「機能的」という用語は、生物活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片もしくはバリアント）の固有の能力を指す。そのような生物活性または機能は、例えば、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合するＣａｓタンパク質の能力を含んでもよい。機能的断片またはバリアントの生物機能は、元のものであるが、基本的な生物機能を保持するものと比較して、同じであってよいか、または実際には、変化していてもよい（例えば、その特異性もしくは選択性もしくは効能に関して）。
【００７１】
「バリアント」という用語は、集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のヌクレオチドが）異なるヌクレオチド配列または集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のアミノ酸が）異なるタンパク質配列を指す。
【００７２】
タンパク質を言う場合の「断片」という用語は、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸を言う場合の「断片」という用語は、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であってもよい。
【００７３】
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関しては、２つの配列内の、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なっており、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的性質は変化しない。配列が保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行う方法は周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、パーセンテージ配列同一性を増大させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１を付し、非保存的置換にはスコアゼロを付す場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアを付す。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行される通り算出される。
【００７４】
「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を含み、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。別段の指定がない限り（例えば、短い方の配列は連結した異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列の短い方の全長である。
【００７５】
別段の指定のない限り、配列同一性／類似性値は、ＧＡＰバージョン１０を以下のパラメーターを使用して得られる値を含む：ギャップ重みづけ５０および長さ重みづけ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；ギャップ重みづけ８および長さ重みづけ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはその任意の等価のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生じた対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生じさせる任意の配列比較プログラムを含む。
【００７６】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、サイズ、電荷、または極性が同様の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基による別の極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリシンの間の置換、グルタミンとアスパラギンの間の置換、またはグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基による別の酸性残基の置換が保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基によるシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換および／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を以下で表１に要約する。
【００７７】
【表１】
2020532952.tif 000003
【００７８】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境（例えば、試験管）内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、細胞または生物体または体）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、個体の体から取り出された細胞およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を包含する。
【００７９】
「リポーター遺伝子」という用語は、内因性もしくは異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたリポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化にとって必要な因子を含有する（または含有するようにすることができる）細胞に導入された場合、容易かつ定量可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には、酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。リポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「リポータータンパク質」は、リポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００８０】
本明細書で使用される「蛍光リポータータンパク質」という用語は、リポータータンパク質に直接由来する、蛍光性基質上のリポータータンパク質の活性に由来する、または蛍光タグ付き化合物への結合に対する親和性を示すタンパク質に由来するものであってよい、蛍光に基づいて検出可能であるリポータータンパク質を意味する。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、ならびに細胞中での存在をフローサイトメトリー法によって検出することができる任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。
【００８１】
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存的ＤＮＡ修復経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって起こる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKasparekおよびHumphrey（２０１１年）Seminars  in  Cell  &  Dev.  Biol.、２２巻：８８６〜８９７頁を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含んでもよい。
【００８２】
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こってもよい。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によって起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断が生じた分子）を修復するための鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導く核酸修復の形態を含む。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行には、切断された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、合成に依存する鎖アニーリング、および／または関連するプロセスが伴い得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０〜９１８頁；Mandalosら（２０１２年）PLOS  ONE、７巻：ｅ４５７６８：１〜９頁；およびWangら（２０１３年）Nat  Biotechnol.、３１巻：５３０〜５３２頁を参照されたい。
【００８３】
ＮＨＥＪは、切断末端を互いとまたは外因性配列と、相同な鋳型を必要とせずに直接ライゲーションすることによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。連続していない配列のＮＨＥＪによるライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位付近に欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、切断末端と外因性ドナー核酸の末端の直接ライゲーションによる外因性ドナー核酸の標的化組込みももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）に外因性ドナー核酸を挿入するために好ましい可能性がある。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域（Ｃａｓ媒介性切断によって創出される突出部を越える）に関する知見は必要なく、これは、ゲノム配列に関する知見が限られているゲノムを有する生物体への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションによって、または、切断されるゲノム配列においてＣａｓタンパク質によって生成されるものと適合する突出部に挟まれた外因性ドナー核酸を使用した粘着末端（すなわち、５’または３’突出部を有する）のライゲーションによって進行し得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびMarescaら（２０１３年）Genome  Res.、２３巻（３号）：５３９〜５４６頁を参照されたい。平滑末端をライゲーションする場合、断片接合に必要なマイクロホモロジーの生成領域に標的および／またはドナー切除が必要な場合があり、これにより、標的配列に望ましくない変更が生じる可能性がある。
【００８４】
１つまたは複数の記載されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲が、請求項に記載されている指定の要素ならびに特許請求された発明の基本および新規の特性（単数または複数単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない要素を包含するものと解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本発明の請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００８５】
「必要に応じた」または「必要に応じて」とは、その後に記載されている事象または状況が生じる場合と生じない場合があること、ならびに、当該説明が、事象または状況が生じる例および事象または状況が生じない例を含むことを意味する。
【００８６】
値の範囲の明示は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、および範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
【００８７】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の標準の測定の誤差限界（例えば、ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
【００８８】
「および／または」という用語は、関連する列挙されている項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈される場合には組合せがないことを指し、それを包含する。
【００８９】
「または（ｏｒ）」という用語は、特定の一覧のうちの任意の１メンバーを指し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
【００９０】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の冠詞は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「１つの（ａ）Ｃａｓタンパク質」または「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）Ｃａｓタンパク質」という用語は、それらの混合物を含めた複数のＣａｓタンパク質を含み得る。
【００９１】
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５であることを意味する。
【００９２】
詳細な説明
Ｉ．概要
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ゲノム操作のための強力な手段である。ｉｎ  ｖｉｖｏでのこの系の１つの制限は、全ての構成成分を生きている生物体に同時に導入する必要があることである。これらの構成成分を侵入させる典型的な方法は、適切なＲＮＡおよびタンパク質を生成する細胞中にＤＮＡ構築物を一過的にトランスフェクトすることである。細胞が、Ｃａｓ９タンパク質がｓｇＲＮＡ構成成分と相互作用するために利用可能となる前に、最初に転写を受けた後、翻訳を受けるプラスミドＤＮＡ構築物に依拠しなければならないため、有効であるが、この手法は固有の欠点も有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤の活性をより効率的に評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の組織または細胞型を標的にするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法および手段が必要である。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性および／または標的ゲノム遺伝子座の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するための方法および組成物が提供される。方法および組成物は、Ｃａｓタンパク質が構成的に利用可能であり得る、または例えば、組織特異的もしくは時間特異的様式で利用可能であり得るようなＣａｓ発現カセット（例えば、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセット）を含む細胞および非ヒト動物を使用する。
【００９４】
Ｃａｓ発現カセットを含む非ヒト動物は、ガイドＲＮＡのみが非ヒト動物に導入される必要があるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分の送達および活性を試験するためのプロセスを単純化する。さらに、Ｃａｓ発現カセットは、必要に応じて、特定の組織または発生段階において選択的に発現させ、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｓ媒介性毒性のリスクを低減することができるか、または任意かつ全ての細胞型、組織型、および器官型における活性の試験を可能にするために構成的に発現させることができる、条件的Ｃａｓ発現カセットであってもよい。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験および測定するためのこれらの非ヒト動物を作製および使用するための方法および組成物も提供される。ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験および測定する一部のそのような方法では、ガイドＲＮＡを、ＡＡＶ媒介性送達によってＣａｓ導入非ヒト動物に送達することができる。実施例１に示されるように、ガイドＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへのＡＡＶ媒介性送達、特に、肝臓へのＡＡＶ８媒介性送達は、ガイドＲＮＡのＬＮＰもしくはＨＤＤによるＣａｓ９導入マウスへの送達またはＣａｓ９とガイドＲＮＡの両方の野生型マウスへの送達よりも、驚くほど高レベルのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的化をもたらす。
【００９６】
ＩＩ．Ｃａｓ発現カセットを含む非ヒト動物
本明細書に開示される方法および組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分（例えば、非ヒト動物または細胞に導入されるガイドＲＮＡ）の能力を評価するために、Ｃａｓ発現カセットを含む非ヒト動物または細胞を使用する。
【００９７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、転写物、およびＣａｓ遺伝子の発現に関与する、またはＣａｓ遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系であり得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型系（例えば、Ｖ−Ａ亜型またはＶ−Ｂ亜型）であり得る。本明細書に開示される組成物および方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、それらの天然に存在する状態から変更もしくは突然変異させたか、自然には天然に付随する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないか、または、天然には付随しない少なくとも１つの他の構成成分が付随する系の１つまたは複数の構成成分などの、人間の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、天然には一緒に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質、天然には存在しないＣａｓタンパク質、または天然には存在しないｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用することができる。
【００９８】
本明細書に開示される方法および組成物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、外因性ドナー核酸の存在下での相同組換え修復により、または修復もしくは組換えの任意の他の手段により、標的ゲノム遺伝子座を改変するためにｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座内で部位特異的切断事象を誘導するＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）の能力を試験することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する。
【００９９】
Ａ．Ｃａｓ９導入非ヒト動物
本明細書に開示される細胞および非ヒト動物は、Ｃａｓ発現カセットを含む。Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下でより詳細に記載されている）と相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。Ｃａｓタンパク質は、標的核酸に二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を創出させるのに十分な切断活性を有してもよく、標的核酸において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
【０１００】
Ｃａｓ発現カセットを含む細胞または非ヒト動物は、標的ゲノム遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性改変を検出するためにガイドＲＮＡの送達のみを必要とする利点を有する。
【０１０１】
（１）Ｃａｓ発現カセット
本明細書に記載の細胞および非ヒト動物は、Ｃａｓ発現カセットを含む。Ｃａｓ発現カセットを、細胞もしくは非ヒト動物のゲノム（すなわち、染色体）中に安定に組み込むか、または染色体の外部に位置させることができる（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ）。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、ゲノム中に安定に組み込まれる。安定に組み込まれるＣａｓ発現カセットを、非ヒト動物のゲノム中に無作為に組み込むか（すなわち、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定の領域中に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、本明細書の他の箇所に記載のセーフハーバー遺伝子座中に安定に組み込まれる。Ｃａｓ発現カセットが安定に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性であるか、またはＣａｓ発現カセットについてホモ接合性であってもよい。
【０１０２】
Ｃａｓ発現カセットによってコードされるＣａｓタンパク質は、任意のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）であってよく、その例は、以下に記載される。コードされるＣａｓタンパク質は、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳ）をさらに含んでもよく、Ｃａｓタンパク質をコードする配列を、以下に記載される細胞または非ヒト動物についてコドン最適化することができる。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１９に記載のＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。コード配列は、配列番号３０に記載のＣａｓ９コード配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。
【０１０３】
Ｃａｓ発現カセットの例は、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれるポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの下流にＣａｓコード配列を含む。ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、Ｃａｓタンパク質の転写および発現を防止する。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼへの曝露の際に、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは切り出され、Ｃａｓタンパク質が発現され得る。
【０１０４】
Ｃａｓ発現カセットのためのそのような構成は、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが組織特異的または発生段階特異的様式で切り出される場合、Ｃａｓ発現カセットを含む非ヒト動物における組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にし得る。これは、細胞もしくは非ヒト動物中でのＣａｓタンパク質の長期的発現、または望ましくない発生段階での、または非ヒト動物内の望ましくない細胞もしくは組織型におけるＣａｓタンパク質の発現に起因する毒性を低減することができる。例えば、毒性は、オフターゲット部位の切断および破壊の結果生じ得る。例えば、Parikh  et  al.  (2015)  PLos  One  10(1):  e0116484を参照されたい。ある特定の組織（例えば、免疫細胞など）において一部の遺伝子を編集する可能性は、免疫応答を潜在的に引き起こすと共に、有害であり得るため、誘導性発現も有益であり得る。例えば、一部の場合、遺伝子が個体の至る所で突然変異する場合、それは致死的であり得るが、それが特定の組織または細胞型において突然変異する場合、それは有益であり得る。Ｃａｓ発現カセットを含む非ヒト動物が、組織特異的または発生段階特異的プロモーター（例えば、肝臓特異的発現についてはアルブミンプロモーターまたは膵臓特異的発現についてはインスリン２プロモーター）に作動可能に連結された部位特異的リコンビナーゼをさらに含む場合、組織特異的または発生段階特異的様式でのポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの切り出しを達成することができる。同様に、肝臓または他の組織に特異的なＬＮＰ製剤を使用して、リコンビナーゼを送達することができるか、または特定の組織に特異的なＡＡＶ送達方法もしくはＡＡＶ血清型（例えば、肝臓についてはＡＡＶ８、もしくは膵臓についてはＡＡＶの直接注射）を使用して、リコンビナーゼを送達することができる。次いで、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、これらの組織またはこれらの発生段階においてのみ切り出され、Ｃａｓタンパク質の組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にする。一例では、Ｃａｓタンパク質を、肝臓特異的様式で発現させることができる。非ヒト動物のそのような「リコンビナーゼ欠失」株を開発するために使用されたそのようなプロモーターの例は、本明細書の他の箇所に開示される。
【０１０５】
任意の転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを使用することができる。本明細書で使用される場合、「転写ターミネーター」は、転写の終結を引き起こすＤＮＡ配列を指す。真核生物では、転写ターミネーターは、タンパク質因子によって認識され、終結の後、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ転写物にポリ（Ａ）尾部を付加するプロセスであるポリアデニル化が起こる。哺乳動物のポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、切断およびポリアデニル化効率を増強するように働く多様な補助配列によって挟まれていてもよい、約４５ヌクレオチド長のコア配列からなる。コア配列は、切断およびポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）によって認識される、ポリＡ認識モチーフまたはポリＡ認識配列と呼ばれる、ｍＲＮＡ中の高度に保存された上流エレメント（ＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＵＡＡＡ）、ならびに切断刺激因子（ＣｓｔＦ）によって結合される、きちんと定義されていない下流の領域（ＵまたはＧおよびＵに富む）からなる。使用することができる転写ターミネーターの例としては、例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウ
サギベータ−グロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、または真核細胞中での遺伝子発現を調節するのに好適であることが公知の任意の転写終結配列が挙げられる。
【０１０６】
部位特異的リコンビナーゼは、２つの組換え部位が単一の核酸内で物理的に隔てられているか、または別々の核酸上にある、リコンビナーゼ認識部位間の組換えを容易にすることができる酵素を含む。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンが、原核細胞中でのその発現を防止するためにイントロンによって隔てられているＣｒｅｉである。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を容易にする核局在化シグナル（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）をさらに含んでもよい。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象のための基質として働くことができるヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【０１０７】
非ヒト動物中、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のために、Ｃａｓ発現カセットを、任意の好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。非ヒト動物は、本明細書の他の箇所に記載される任意の好適な非ヒト動物であってもよい。一例として、Ｃａｓ発現カセットを、Ｒｏｓａ２６プロモーターなどの、標的ゲノム遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓ発現カセットを、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーターもしくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサーと結合したニワトリベータアクチンプロモーター／エンハンサー（ＣＡＧＧ））、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、時間制限的プロモーター（例えば、発生調節されるプロモーター）、または空間制限的プロモーター（例えば、細胞特異的もしくは組織特異的プロモーター）などの、外因性プロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなプロモーターは周知であり、本明細書の他の箇所で考察される。例示的なＣＡＧＧプロモーターは、配列番号３８に記載されるか、または配列番号３８に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、もしくはそれからなる。
【０１０８】
本明細書に開示されるＣａｓ発現カセットは、他の構成成分を同様に含んでもよい。Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓ発現カセットの５’末端に３’スプライシング配列を、および／またはＣａｓ発現カセットの３’末端のＣａｓタンパク質のコード配列の後に第２のポリアデニル化シグナルをさらに含んでもよい。Ｃａｓ発現カセットは、例えば、薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットをさらに含んでもよい。好適な選択マーカーの例として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）が挙げられる。必要に応じて、選択カセットは、部位特異的リコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれていてもよい。Ｃａｓ発現カセットが上記のＣａｓコード配列の上流のポリアデニル化シグナルを挟むリコンビナーゼ認識部位も含む場合、必要に応じて、異なるリコンビナーゼによって認識される異なるセットのリコンビナーゼ認識部位が、選択カセットを挟むために使用される。あるいは、同じセットのリコンビナーゼ認識部位は、Ｃａｓコード配列の上流のポリアデニル化シグナルと、選択カセットとの両方を挟むことができる。例示的なｎｅｏｒ−ポリアデニル化配列は、配列番号３７に記載されるか、または配列番号３７に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、もしくはそれからなる。
【０１０９】
Ｃａｓ発現カセットはまた、３ｘＦＬＡＧタグなどのタンパク質タグをコードする核酸を含んでもよい。そのようなタグの例は、必要に応じて、配列番号３４によってコードされる配列番号２３に記載されている。例えば、タグは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、またはＣａｓタンパク質の内部にあってよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号２２に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９タンパク質配列または配列番号１６に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。コード配列は、それぞれ、配列番号３１に記載の３ｘＦＡＬＧ−Ｃａｓ９コード配列または配列番号２９に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰコード配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。
【０１１０】
Ｃａｓ発現カセットはまた、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）などの、１つまたは複数のリポータータンパク質をコードする核酸を含んでもよい。任意の好適なリポータータンパク質を使用することができる。例えば、本明細書の他の箇所で定義される蛍光リポータータンパク質を使用するか、または非蛍光リポータータンパク質を使用することができる。蛍光リポータータンパク質の例は、本明細書の他の箇所に提供される。非蛍光リポータータンパク質としては、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼ、およびＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ）、およびベータ−グルクロニダーゼなどの、組織化学アッセイまたは生物発光アッセイにおいて使用することができるリポータータンパク質が挙げられる。Ｃａｓ発現カセットは、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができるリポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光リポータータンパク質）および／または組織化学的アッセイにおいて検出することができるリポータータンパク質（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質）を含んでもよい。そのような組織化学的アッセイの一例は、青色の沈降物をもたらす、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）の加水分解によるｉｎ  ｓｉｔｕでのベータ−ガラクトシダーゼ発現の組織化学的可視化、またはベータ−メチルウンベリフェリルガラクトシド（ＭＵＧ）およびフルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光性基質の使用である。
【０１１１】
そのような場合におけるＣａｓ発現カセットは、マルチシストロン性核酸を含んでもよい。例えば、そのような核酸は、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられたＣａｓタンパク質コード配列およびリポータータンパク質コード配列（いずれかの順序で）であってもよい。マルチシストロン性発現構築物は、同じｍＲＮＡから２つまたはそれより多い別々のタンパク質（すなわち、同じプロモーターから産生される転写物）を同時に発現する。タンパク質のマルチシストロン性発現のための好適な戦略としては、例えば、２Ａペプチドの使用および内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用が挙げられる。例えば、そのような核酸は、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた２つまたはそれより多いリポータータンパク質のコード配列を含んでもよい。一例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にするための１つまたは複数の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することができる。別の例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つまたは複数の２Ａペプチドを使用することができる。これらのペプチドは、一般に、１８〜２２アミノ酸の長さを有する小さい「自己切断性」ペプチドであり、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子を産生する。リボソームは、２Ａペプチドと、そのすぐ下流のペプチドとの間の「切断」をもたらす、２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップする。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKim  et  al.  (2011)  PLos  One  6(4):  e18556を参照されたい。「切断」は、Ｃ末端上に見出されるグリシン残基とプロリン残基の間で起こり、これは、上流のシストロンが末端に付加される２〜３個の追加の残基を有するが、下流のシストロンがプロリンから始まることを意味している。結果として、「切断除去される」下流のペプチドは、そのＮ末端にプロリンを有する。２Ａにより媒介される切断は、全ての真核細胞中での普遍的な現象である。２Ａペプチドは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルスおよびＣ型ロタウイルスから同定されている。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSzymczak  et  al.  (2005)  Expert  Opin  Biol  Ther  5:  627-638を参照されたい。使用することができる２Ａペプチドの例としては、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）；ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；およびＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）が挙げられる。例示的なＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａ配列は、以下のもの：Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号２）；Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号３）；Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号４）；およびＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号５）を含む。ＧＳＧ残基を、これらのペプチドのいずれかの５’末端に付加して、切断効率を改善することができる。５’末端にＧＳＧ残基が付加���れたＰ２Ａの例示的なコード配列は、配列番号３２に記載されるか、または配列番号３２に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、もしくはそれからなる。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１３に記載のＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列または配列番号１６に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。コード配列は、それぞれ、配列番号２８に記載のＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰコード配列または配列番号２９に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰコード配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。
【０１１２】
Ｃａｓ発現カセットはまた、Ｃａｓコード配列の下流に転写後調節エレメントまたはポリアデニル化シグナルなどの他のエレメントを含んでもよい。例示的な転写後調節エレメントは、配列番号３５に記載されるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であるか、または配列番号３５に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、もしくはそれからなる。例示的なポリアデニル化シグナルは、配列番号３６に記載されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルであるか、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、それから本質的になる、もしくはそれからなる。
【０１１３】
１つの例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）リコンビナーゼのための第１および第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）によって挟まれたポリアデニル化シグナル；（ｃ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）；（ｄ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｐ２Ａコード配列）；および（ｅ）リポータータンパク質のコード配列（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光リポータータンパク質）を含む。例えば、図１および図１４中のＭＡＩＤ２５９９を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１３に記載のＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１１４】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）；（ｃ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｐ２Ａコード配列）；および（ｄ）リポータータンパク質のコード配列（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光リポータータンパク質）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６００を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号１２に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１３に記載のＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１１５】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）リコンビナーゼのための第１および第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）によって挟まれたポリアデニル化シグナル；および（ｃ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６６０を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号１７に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１９に記載のＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１１６】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）３’スプライシング配列；および（ｂ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６６１を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号１８に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１９に記載のＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１１７】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）外因性プロモーター（例えば、ＣＡＧＧプロモーターなどの構成的プロモーター）；（ｂ）リコンビナーゼのための第１および第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）によって挟まれたポリアデニル化シグナル；（ｃ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、必要に応じて、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグなどの、Ｎ末端またはＣ末端にタグを有すると共に、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）；（ｄ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｐ２Ａコード配列）；および（ｅ）リポータータンパク質のコード配列（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光リポータータンパク質）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６５８を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号１４に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１６に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１１８】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）外因性プロモーター（例えば、ＣＡＧＧプロモーターなどの構成的プロモーター）；（ｂ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、必要に応じて、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグなどの、Ｎ末端またはＣ末端にタグを有すると共に、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）；（ｃ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｐ２Ａコード配列）；および（ｄ）リポータータンパク質のコード配列（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光リポータータンパク質）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６５９を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号１５に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号１６に記載の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１１９】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）外因性プロモーター（例えば、ＣＡＧＧプロモーターなどの構成的プロモーター）；（ｂ）リコンビナーゼのための第１および第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）によって挟まれたポリアデニル化シグナル；および（ｃ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、必要に応じて、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグなどの、Ｎ末端またはＣ末端にタグを有すると共に、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６７２を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号２０に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号２２に記載の３ｘＦＬＡＧ-Ｃａｓ９タンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１２０】
別の例示的なＣａｓ発現カセットは、５’から３’に向かって、（ａ）外因性プロモーター（例えば、ＣＡＧＧプロモーターなどの構成的プロモーター）；および（ｂ）Ｃａｓタンパク質コード配列（例えば、必要に応じて、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグなどの、Ｎ末端またはＣ末端にタグを有すると共に、Ｎ末端にＮＬＳを有する、およびＣ末端にＮＬＳを有するものなどのＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列）を含む。例えば、図１４中のＭＡＩＤ２６７３を参照されたい。そのような発現カセットは、配列番号２１に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなってもよい。例えば、そのような発現カセットは、配列番号２２に記載の３ｘＦＬＡＧ-Ｃａｓ９タンパク質配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードしてもよい。
【０１２１】
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットは、任意の形態にあってもよい。例えば、Ｃａｓ発現カセットは、ウイルスベクターなどのベクターまたはプラスミド中にあってもよい。Ｃａｓ発現カセットを、上流のポリアデニル化シグナルの除去時にＣａｓタンパク質の発現を方向付けることができる発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓ発現カセットは、本明細書の他の箇所で定義される標的化ベクター中にあってもよい。例えば、標的化ベクターは、Ｃａｓ発現カセットを挟む相同アームであって、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である相同アームを含んでもよい。
【０１２２】
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにあってもよく、それらはｅｘ  ｖｉｖｏ（例えば、ゲノムに組み込まれるか、もしくは染色体外にある）で細胞（例えば、胚性幹細胞）内にあってもよいか、またはそれらはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、ゲノムに組み込まれるか、もしくは染色体外にある）で生物（例えば、非ヒト動物）中にあってもよい。ｅｘ  ｖｉｖｏの場合、Ｃａｓ発現カセットは、胚性幹細胞（例えば、マウスもしくはラット胚性幹細胞）または人工多能性幹細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）などの、全能性細胞などの、任意の生物に由来する任意の細胞型中にあってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、Ｃａｓ発現カセットは、任意の型の生物（例えば、本明細書の他の箇所にさらに記載される非ヒト動物）中にあってもよい。
【０１２３】
（２）Ｃａｓタンパク質およびＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下でより詳細に記載されている）と相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。一部のそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来するものであってもよい。他のそのようなドメインを付加して、改変Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は５ヌクレオチド５’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の２３番目の塩基の後ろで起こる。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を創出させる完全な切断活性を有してもよいか、またはそれは標的ゲノム遺伝子座において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
【０１２４】
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
【０１２５】
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、一般には、保存的アーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈ���ｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられる）は例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられる）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに由来するＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられる）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKimら（２０１７年）Nat.Comm.８巻：１４５００頁を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９より小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。
【０１２６】
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  １由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特有のアルギニンリッチクラスターに対する対応物と一緒に、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列では連続しており、それとは対照的に、Ｃａｓ９ではＨＮＨドメインを含む長い挿入断片を含有する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるZetscheら（２０１５年）Cell、１６３巻（３号）：７５９〜７７１頁を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．  ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ｑ７Ｑ２に割り当てられる）は例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
【０１２７】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の断片であってよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片であってもよい。触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位をカットする能力を保持し、したがって、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
【０１２８】
Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つまたは複数が増大または低減するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または性質が変化するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変するか、欠失させるか、または不活化することもでき、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除くため、またはＣａｓタンパク質の活性または性質を最適化する（例えば、増強するか、または低下させる）ために短縮することもできる。
【０１２９】
改変Ｃａｓタンパク質の一例は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された変更（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を担持するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の高忠実度バリアントである改変ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKleinstiverら（２０１６年）Nature  ５２９巻（７５８７号）：４９０〜４９５頁を参照されたい。改変Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSlaymakerら（２０１６年）Science  ３５１巻（６２６８号）：８４〜８８頁を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントとしては、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。
【０１３０】
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配置にある標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインも含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、それぞれ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡにおける二本鎖切断を生じさせることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるJinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６〜８２１頁を参照されたい。
【０１３１】
ヌクレアーゼドメインの１つまたは複数を欠失させるかまたは突然変異させ、その結果、もはや機能的でなくなるかまたは低下したヌクレアーゼ活性を有するようにすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの１つを欠失させるかまたは突然変異させる場合、得られるＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼと称することができ、二本鎖ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ標的配列に一本鎖切断を生じさせることができるが、二本鎖切断を生じさせることはできない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）突然変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位においてヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位においてヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位においてアスパラギンからアラニンへ）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対応する突然変異が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSapranauskasら（２０１１年）Nucleic  Acids  Research、３９巻：９２７５〜９２８２頁およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。そのような突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生じさせることができる。ニッカーゼを創出させる他の突然変異の例は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができる。
【０１３２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメイン中の不活化突然変異の例も公知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するためのＮ５８０位における置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位における置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。
【０１３３】
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメイン中の不活化突然変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７（ＭｂＣｐｆ１、Ｃｐｆ１）に由来するＣｐｆ１タンパク質を参照すると、そのような突然変異は、ＡｓＣｐｆ１の９０８位、９９３位、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２位、９２５位、９４７位、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置に突然変異を含んでもよい。そのような突然変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の突然変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する突然変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。
【０１３４】
Ｃａｓタンパク質を異種ポリペプチドに作動可能に連結して融合タンパク質とすることもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を切断ドメインまたはエピジェネティック改変ドメインと融合することができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【０１３５】
一例として、Ｃａｓタンパク質を、細胞内局在化をもたらす１つまたは複数の異種ポリペプチドと融合することができる。そのような異種ポリペプチドとしては、例えば、核へのターゲティングのための単節型ＳＶ４０  ＮＬＳおよび／または双節型アルファ−インポーチンＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへのターゲティングのためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるLangeら（２００７年）J.  Biol.  Chem.、２８２巻：５１０１〜５１０５頁を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のひと続きを含んでよく、また、一分配列であっても二分配列であってもよい。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、アルファ−インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む、２つまたはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳおよび／またはＣ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。
【０１３６】
Ｃａｓタンパク質を細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインと作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
【０１３７】
Ｃａｓタンパク質を蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ
Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
【０１３８】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。
【０１３９】
（３）ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の場所にターゲティングするＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したひと続きなどの、分子の区画または領域を含む。Ｃａｓ９に対するものなどの一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「活性化因子−ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「標的化因子−ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ，」または「ｓｇＲＮＡ」とも称され得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。Ｃａｓ９に関しては、例えば、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡ（例えば、リンカーを介して）を含み得る。Ｃｐｆ１に関しては、例えば、標的配列への結合および／または標的配列の切断を実現するためにはｃｒＲＮＡのみが必要である。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、２重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
【０１４０】
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「標的化因子−ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「活性化因子−ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ  ２重鎖の片方を形成するヌクレオチドのひと続き（すなわち、ｃｒＲＮＡ尾部）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’側）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２５）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを配列番号２５の５’末端に接合してｃｒＲＮＡを形成することができる。
【０１４１】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子−ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ  ２重鎖のあとの半分を形成するヌクレオチドのひと続きを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ  ２重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号２６）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１４２】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡがｇＲＮＡになることができる。ｃｒＲＮＡは、逆の鎖（すなわち、相補鎖）とハイブリダイズすることにより、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをさらにもたらす。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的になるように設計することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Maliら（２０１３年）Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Jinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６〜８２１頁；Hwangら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.、３１巻：２２７〜２２９頁；Jiangら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.、３１巻：２３３〜２３９頁；およびCongら（２０１３年）Science、３３９巻：８１９〜８２３頁を参照されたい。
【０１４３】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列と相補的なヌクレオチド配列（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列と逆の鎖上のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖）を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡと配列特異的にハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変動させることができ、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。主題のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物体に応じて異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に挟まれた２１〜７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントを含有する（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合では、ＤＲは３６ヌクレオチドの長さであり、標的化セグメントは３０ヌクレオチドの長さである。３’側に位置するＤＲが対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、ハイブリダイズし、それが今度はＣａｓタンパク質に結合する。
【０１４４】
ＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約８０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで、または約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで（例えば、約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまで、または約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６から２０ヌクレオチドの間の長さまたは１７から２０ヌクレオチドの間の長さである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１から２３ヌクレオチドの間の長さである。Ｃｐｆ１に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチドの長さまたは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
【０１４５】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）および様々な長さであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、一次転写産物またはプロセシングされた形態を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部としてかまたは２分子ｇＲＮＡの一部としての別々の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約２６ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約３２ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４８ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約５４ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６３ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６７ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約８５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）の全部または一部を含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deltchevaら（２０１１年）Nature、４７１巻：６０２〜６０７頁；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョンに見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、最大＋ｎヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。
【０１４６】
ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、約２０個連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では１４個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチドの長さとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では７個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、７ヌクレオチドの長さとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化配列内の少なくとも１７ヌクレオチドが標的ＤＮＡと相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化配列は２０ヌクレオチドの長さであり得、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とのミスマッチを１つ、２つ、または３つ含み得る。必要に応じて、ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接しない（例えば、ミスマッチはＤＮＡ標的化配列の５’末端にあるか、またはミスマッチはＰＡＭ配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）。
【０１４７】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いと相補的な２つのヌクレオチドのひと続きを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ  ２重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。主題のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に方向付ける。
【０１４８】
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を有する。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的化セグメントおよび３’足場配列を有する。例示的な足場配列は、
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号２７）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号６）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号７）；およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号８）
を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡとしては、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかと融合したガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡ標的化セグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを配列番号２７、６、７または８のいずれか１つの５’末端と接合して、単一のガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の箇所で開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、および４は、それぞれ足場バージョン１、２、３、および４と接合したＤＮＡ標的化セグメントを指す。
【０１４９】
ガイドＲＮＡは、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いた追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の制御を可能にするため）；安定性調節配列；ｄｓＲＮＡ  ２重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にターゲティングする改変または配列；追跡をもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めたＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位をもたらす改変または配列；およびこれらの組合せが挙げられる。改変の他の例としては、工学的に操作されたステムループ２重鎖構造、工学的に操作されたバルジ領域、ステムループ２重鎖構造の工学的に操作されたヘアピン３’、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される２重鎖内の対合していないヌクレオチドの領域であり得る。バルジは、２重鎖の片側に対合していない５’−ＸＸＸＹ−３’（配列中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは逆の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る）、および、他方の側の２重鎖に対合していないヌクレオチド領域を含み得る。
【０１５０】
非改変核酸は、分解されやすくてもよい。外因性核酸は、先天性免疫応答を誘導することもできる。改変は、安定性を導入し、免疫原性を低減させるのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、下記：（１）ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素および／または１つもしくは複数の連結リン酸酸素の一方または両方の変更または置換え；（２）リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更または置換えなどのリボース糖の構成要素の変更または置換え；（３）脱ホスホリンカーとのリン酸部分の置換え；（４）天然に存在する核酸塩基の改変または置換え；（５）リボース−リン酸骨格の置換えまたは改変；（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変（例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは置換えまたは部分のコンジュゲーション）；ならびに（７）糖の改変のうちの１つまたは複数を含む、改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドを含んでもよい。他の可能なガイドＲＮＡ改変としては、ウラシルまたはポリ−ウラシルトラクトの改変または置換えが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ  ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に対して行うことができる。
【０１５１】
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含んでもよい（例えば、塩基はホスホロチオエート基である改変リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４個の末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を含んでもよい。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変を有してもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４個の末端ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル改変を含んでもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁を参照されたい。１つの特定例では、ガイドＲＮＡは、最初の３個の５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’−Ｏ−メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。別の特定例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しない全ての２’ＯＨ基が２’−Ｏ−メチル類似体で置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限に相互作用するガイドＲＮＡの尾部領域が５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結で改変されるように改変される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYinら（２０１７年）Nat.  Biotech.  ３５巻（１２号）：１１７９〜１１８７頁を参照されたい。
【０１５２】
ガイドＲＮＡは、任意の形態でもたらすことができる。例えば、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）としてかまたは１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかでもたらすことができ、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態でもたらすことができる。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態でもたらすこともできる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）をコードしていてもよく、別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子としてもたらすこともでき、それぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子としてもたらすこともできる。
【０１５３】
ｇＲＮＡをＤＮＡの形態でもたらす場合、ｇＲＮＡを細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞のゲノムに安定に組み込み、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの、異種核酸を含むベクター内に入れることができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。そのような発現構築物に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってもよい。適切なプロモーターの特定の例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
【０１５４】
あるいは、ｇＲＮＡを、他の様々な方法によって調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された合成的に産生された分子であってもよい。
【０１５５】
（４）ガイドＲＮＡ認識配列およびガイドＲＮＡ標的配列
「ガイドＲＮＡ認識配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在すればｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列を包含する。ガイドＲＮＡ認識配列という用語は、本明細書で使用される場合、標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（すなわち、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する非相補鎖上の対応する配列）を包含する。「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上（すなわち、ＰＡＭの上流または５’側）の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列に対応する非相補鎖上の配列を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと等しいが、ウラシルの代わりにチミンである。一例として、Ｃａｓ９酵素に対するガイドＲＮＡ標的配列は、５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指すことになる。ガイドＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計された配列を含み、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列のハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、下でより詳細に記載されているＣａｓタンパク質の切断部位も含む。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１５６】
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡによって標的とすることができる（すなわち、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡが結合することができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡがハイブリダイズすることができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡが相補的であり得る）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、細胞において通常存在する生理的条件が挙げられる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）が公知である（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるMolecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版（Sambrookら、Harbor  Laboratory  Press、２００１年）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡと相補的であり、それとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称することができ、「相補鎖」と相補的な（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡとは相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「鋳型鎖」と称することができる。
【０１５７】
Ｃａｓタンパク質は、核酸を、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の内部または外部の部位で切断し得る。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質により一本鎖切断または二本鎖切断が生じる、核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）の形成により、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列内またはその付近（例えば、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多くの塩基対の範囲内）での一方または両方の鎖の切断がもたらされ得る。切断部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外部にある場合、切断部位はなお「ガイドＲＮＡ認識配列」またはガイドＲＮＡ標的配列内にあるとみなされる。切断部位は、核酸の一方の鎖上のみにあってもよく、両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端が生じる）、各鎖上の異なる部位にあってもよい（付着末端（すなわち、突出部）が生じる）。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生じさせる２つのＣａｓタンパク質を使用し、それにより、二本鎖切断を生じさせることによって生じさせることができる。例えば、第１のニッカーゼにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、第２のニッカーゼにより、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、その結果、突出部配列が創出される。一部の場合では、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
【０１５８】
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および／または切断は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対合相補性および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの両方によって決定される場所で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする鎖と逆の非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭが隣接し得る。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列の５’末端にＰＡＭが隣接し得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０または約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であり得る。一部の場合では（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９を使用する場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’（配列中、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドである）であり得、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ３’側（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’側）である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ２−３’（配列中、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドである）になり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ５’側である。一部のそのような場合では、Ｎ１とＮ２は相補的であり得、Ｎ１−Ｎ２塩基対は任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、およびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、ＲはＧまたはＡであり得る）であり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであってよく、ＲはＧまたはＡであってよい）であってよい。一部の場合では（例えば、ＦｎＣｐｆ１に関して）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流であり得、配列５’−ＴＴＮ−３’を有し得る。
【０１５９】
ガイドＲＮＡ標的配列またはＰＡＭ配列に加えてガイドＲＮＡ標的配列の例を以下に提示する。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり得る。そのようなガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号９）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号１０）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。５’末端のグアニンにより、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にすることができる。ガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の他の例としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にするための、５’末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号１１）を挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列は、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号９〜１１の４〜２２ヌクレオチドの長さを有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号９〜１１の１４から２０ヌクレオチドの間の長さを有し得る。
【０１６０】
ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列の場合もあり、非コード配列（例えば、制御配列）の場合もあり、両方を含む場合もある。
【０１６１】
Ｂ．Ｃａｓ発現カセットを含む細胞および非ヒト動物
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットを含む細胞および非ヒト動物も提供される。Ｃａｓ発現カセットを、細胞もしくは非ヒト動物のゲノム（すなわち、染色体）中に安定に組み込むか、または染色体の外部に位置させることができる（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ）。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、ゲノム中に安定に組み込まれる。安定に組み込まれるＣａｓ発現カセットを、非ヒト動物のゲノム中に無作為に組み込むか（すなわち、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定の領域中に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。必要に応じて、Ｃａｓ発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座などの、ゲノムの所定の領域中に安定に組み込まれる。Ｃａｓ発現カセットが安定に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性であるか、またはＣａｓ発現カセットについてホモ接合性であってもよい。二倍体の生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子が存在する場合にはホモ接合体と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合にはヘテロ接合体と記載される。
【０１６２】
本明細書に提供される細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む、例えば、真核細胞であってもよい。「動物」という用語は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であってもよい。他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、畜産動物（例えば、雌ウシ、去勢雄ウシなどのウシ種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられる。家畜動物および農業動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを排除する。
【０１６３】
また、細胞は、任意の型の未分化または分化状態であってもよい。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞もしくはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、１種よりも多くの分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であってよい。ＥＳ細胞は、胚に導入されると発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から引き出すことができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれの細胞にも分化させることができる。
【０１６４】
ヒト多能性細胞の例としては、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発生制限されたヒト前駆細胞、およびヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、例えば、プライミングされたヒトｉＰＳ細胞およびナイーブなヒトｉＰＳ細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞は、分化した成体細胞から直接誘導することができる多能性幹細胞を含む。例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリーの転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリーの転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ様ファミリー（ＫＬＦ）の転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、ならびに／またはＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、および／もしくはＧｌｉｓ１などの関連する転写因子を含んでもよい、特定のセットの再プログラミング因子を細胞に導入することによって、ヒトｉＰＳ細胞を生成することができる。また、例えば、転写因子の作用を模倣する低分子であるｍｉＲＮＡ、または分化系列指定子の使用によって、ヒトｉＰＳ細胞を生成することもできる。ヒトｉＰＳ細胞は、３つの脊椎動物胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、または中胚葉の任意の細胞に分化するその能力を特徴とする。ヒトｉＰＳ細胞はまた、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で無制限に増殖するその能力を特徴とする。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるTakahashiおよびYamanaka（２００６年）Cell、１２６巻：６６３〜６７６頁を参照されたい。プライミングされたヒトＥＳ細胞およびプライミングされたヒトｉＰＳ細胞は、埋込み後の胚盤葉上層細胞のものと類似する特徴を発現し、分化系列指定および分化を約束された細胞を含む。ナイーブなヒトＥＳ細胞およびナイーブなヒトｉＰＳ細胞は、埋込み前の胚の内部細胞塊のＥＳ細胞のものと類似する特徴を発現し、分化系列指定を約束されていない細胞を含む。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNicholsおよびSmith（２００９年）Cell  Stem  Cell、４巻：４８７〜４９２頁を参照されたい。
【０１６５】
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有糸分裂性細胞または有糸分裂不活性細胞、減数分裂性細胞または減数分裂不活性細胞であってもよい。同様に、細胞はまた、初代体細胞であってもよく、または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞を含む。例えば、細胞は、肝臓細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラニン細胞、単球、単核細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、赤血球−巨核球、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、導管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色もしくは褐色脂肪細胞、または眼細胞（例えば、小柱網細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周皮細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜実質細胞、水晶体上皮細胞、非色素性毛様体上皮細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、光受容体細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、もしくは無軸索細胞）であってもよい。
【０１６６】
本明細書で提供される好適な細胞は、初代細胞も含む。初代細胞は、生物体、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず不死でもない細胞を含む。初代細胞は、以前に組織培養物中で継代されていないかまたは以前に組織培養物中で継代されているが、組織培養物中で無制限に継代することはできない、生物体、器官、または組織から得られる任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技法によって単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、および平滑筋細胞を含む。例えば、初代細胞は、結合組織、筋組織、神経系組織、または上皮組織に由来してよい。
【０１６７】
本明細書で提供される他の好適な細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常無制限には増殖しないが、突然変異または変更に起因して、正常な細胞の老化を逃れ、その代わりに分裂し続け得る多細胞生物に由来する細胞を含む。そのような突然変異または変更は、天然に起こり得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞）、およびマウス胚線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多数の型の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞は、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現のために一般に使用される細胞を含む。
【０１６８】
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精した卵母細胞または受精卵）も含む。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスについては、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはその組合せ）に由来するものであってもよく、新鮮であるか、または凍結されていてもよく、自然交配またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精から誘導されたものであってもよい。
【０１６９】
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってもよく、または疾患を有するか、もしくは突然変異体を担持する細胞であってもよい。
【０１７０】
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物を、本明細書の他の箇所に記載の方法によって作製することができる。「動物」という用語は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および畜産動物（例えば、雌ウシおよび雄の仔牛などのウシ種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルなどが挙げられる。家畜動物および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを排除する。好ましい非ヒト動物としては、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類が挙げられる。
【０１７１】
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景に由来するものであってもよい。例えば、好適なマウスは、１２９株、Ｃ５７ＢＬ／６株、１２９とＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ株、またはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ株に由来するものであってもよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Festingら（１９９９年）Mammalian  Genome、１０巻：８３６頁を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ，Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。適切なマウスはまた、上述の１２９系統および上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来してよい。同様に、適切なマウスは、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来してよい。
【０１７２】
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含めた任意のラット系統に由来してよい。ラットはまた、上記の２種またはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統から得ることもできる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してよい。ＡＣＩラット系統は、黒色アグーチを有し、腹部および足が白色であり、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。一部の場合では、適切なラットは、近交系ラット系統に由来してよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
【０１７３】
Ｃ．標的ゲノム遺伝子座
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットを、細胞または非ヒト動物中の標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込むことができる。遺伝子を発現することができる任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。
【０１７４】
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットを安定に組み込むことができる標的ゲノム遺伝子座の例は、非ヒト動物のゲノム中のセーフハーバー遺伝子座である。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムとの相互作用は、組込みの信頼性および安全性を制限し、標的遺伝子改変に起因しないが、その代わりに、周囲の内因性遺伝子に対する組込みの意図しない効果に起因する明白な表現型効果をもたらし得る。例えば、無作為に挿入される導入遺伝子を、位置効果およびサイレンシングにかけて、その発現を信頼できない、かつ予測できないものにすることができる。同様に、染色体遺伝子座への外因性ＤＮＡの組込みは、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響し、それによって、細胞挙動および表現型を変更することができる。セーフハーバー遺伝子座は、細胞挙動または表現型を明白に変更することなく（すなわち、宿主細胞に対するいかなる有害な効果もなく）、導入遺伝子または他の外因性核酸を目的の全ての組織中で安定かつ確実に発現させることができる染色体遺伝子座を含む。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSadelainら（２０１２年）Nat.Rev.Cancer  １２巻：５１〜５８頁を参照されたい。必要に応じて、セーフハーバー遺伝子座は、挿入される遺伝子配列の発現が、近隣の遺伝子からの任意のリードスルー発現によって乱されないものである。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、外因性ＤＮＡが、内因性遺伝子構造または発現に有害に影響することなく、予測可能な様式で組み込み、機能し得る染色体遺伝子座を含んでもよい。セーフハーバー遺伝子座は、例えば、非必須であり、欠けてもよく、または明白な表現型結果なしに破壊することができる遺伝子内の遺伝子座などの、遺伝子外領域または遺伝子内領域を含んでもよい。
【０１７５】
例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座およびヒトにおけるその等価物は、あらゆる組織においてオープンなクロマチン構成を提供し、胚発生の間および成体において遍在的に発現される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるZambrowiczら（１９９７年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９４巻：３７８９〜３７９４頁を参照されたい。さらに、Ｒｏｓａ２６遺伝子座を高効率で標的にすることができ、Ｒｏｓａ２６遺伝子の破壊は明白な表現型をもたらさない。セーフハーバー遺伝子座の他の例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、およびアルブミンが挙げられる。例えば、それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；第８，５８６，５２６号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；第２００５／０２０８４８９号；第２００５／００２６１５７号；第２００６／００６３２３１号；第２００８／０１５９９９６号；第２０１０／００２１８２６４号；第２０１２／００１７２９０号；第２０１１／０２６５１９８号；第２０１３／０１３７１０４号；第２０１３／０１２２５９１号；第２０１３／０１７７９８３号；第２０１３／０１７７９６０号；および第２０１３／０１２２５９１号を参照されたい。Ｒｏｓａ２６遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座の二対立遺伝子標的化は、負の結果を有さず、したがって、異なる遺伝子またはリポーターを２つのＲｏｓａ２６対立遺伝子に標的化することができる。一例では、Ｃａｓ発現カセットは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンなどの、Ｒｏｓａ２６遺伝子座のイントロンに組み込まれる。
【０１７６】
Ｄ．リコンビナーゼ欠失非ヒト動物
本明細書に開示される部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれたポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの下流にＣａｓコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含む細胞または非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼの発現を駆動するリコンビナーゼ発現カセットをさらに含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼは、２つの組換え部位が単一の核酸内で物理的に隔てられているか、または別々の核酸上にある、リコンビナーゼ認識部位間の組換えを容易にすることができる酵素を含む。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンが、原核細胞中でのその発現を防止するためにイントロンによって隔てられているＣｒｅｉである。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を容易にする核局在化シグナル（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）をさらに含んでもよい。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象のための基質として働くことができるヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【０１７７】
Ｃａｓ発現カセットと、リコンビナーゼ発現カセットとを、異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込むか、またはそれらを同じ標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロン中に組み込まれたものなどの、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）でゲノムに組み込むことができる。例えば、細胞または非ヒト動物は、Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのそれぞれについてヘテロ接合性であってよく、Ｃａｓ発現カセットを含む標的ゲノム遺伝子座に１つの対立遺伝子、およびリコンビナーゼ発現カセットを含む標的ゲノム遺伝子座に第２の対立遺伝子を有する。
【０１７８】
リコンビナーゼ発現カセット中のリコンビナーゼ遺伝子を、任意の好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に開示されている。例えば、プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、肝臓特異的発現についてはアルブミンプロモーターもしくは膵臓特異的発現についてはインスリン２プロモーター）または発生段階特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターによってもたらされる利点は、Ｃａｓ発現を、所望の組織において選択的に、または所望の発生段階においてのみ活性化することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣａｓ媒介性毒性の可能性を低減することができるということである。マウスリコンビナーゼ欠失株のための例示的プロモーターの非限定例は、表２に提供される。
【０１７９】
【表２−１】
2020532952.tif 000004
【表２−２】
2020532952.tif 000005
【表２−３】
2020532952.tif 000006
【表２−４】
2020532952.tif 000007
【０１８０】
ＩＩＩ．ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価する方法
生きている動物の組織および臓器へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を評価するため、およびその中でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法により、本明細書の他の箇所に記載のＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物を使用することができる。
【０１８１】
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験するための方法
本明細書に記載のＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼまたはヌクレアーゼの能力を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト動物に、標的ゲノム遺伝子座でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップ；および（ｂ）標的遺伝子座の改変を評価するステップを含んでもよい。ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を、標的ゲノム遺伝子座に方向付け、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、細胞による修復を誘発する場合（例えば、ドナー配列が存在しない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による）、標的ゲノム遺伝子座の改変が誘導されると予測される。
【０１８２】
必要に応じて、それぞれ、標的ゲノム遺伝子座内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計された、２つまたはそれより多いガイドＲＮＡを導入することができる。例えば、２つのガイドＲＮＡを、２つのガイドＲＮＡ標的配列間のゲノム配列を切り出すように設計することができる。第１のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的ゲノム遺伝子座に方向付け、第２のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的ゲノム遺伝子座に方向付け、第１のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、第２のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、介在配列の切り出しをもたらす場合、標的ゲノム遺伝子座の改変が誘導されると予想される。あるいは、それぞれ、異なる標的ゲノム遺伝子座の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計された、２つまたはそれより多いガイドＲＮＡを導入することができる（すなわち、多重化）。
【０１８３】
必要に応じて、標的ゲノム遺伝子座と組み換わり、それを改変することができる外因性ドナー核酸も、非ヒト動物に導入される。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質を、本明細書の他の箇所に記載の外因性ドナー核酸に係留することができる。必要に応じて、それぞれ、異なる標的ゲノム遺伝子座と組み換わり、それを改変することができる、２つまたはそれより多い外因性ドナー核酸が導入される。例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を、標的ゲノム遺伝子座に方向付け、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、標的ゲノム遺伝子座が、外因性ドナー核酸と組み換わって、標的ゲノム遺伝子座を改変する場合、標的ゲノム遺伝子座の改変が誘導されると予想される。外因性ドナー核酸は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）またはＮＨＥＪ媒介性挿入によって、標的ゲノム遺伝子座と組み換わり得る。任意の型の外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書の他の箇所に提供される。
【０１８４】
同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための上記で提供された様々な方法を使用して、本明細書の他の箇所に記載のＣａｓ発現カセットを含む細胞を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性をｅｘ  ｖｉｖｏで評価することもできる。
【０１８５】
ガイドＲＮＡ、および必要に応じて、外因性ドナー核酸を、本明細書の他の箇所に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。特定の方法では、ガイドＲＮＡ（または複数のガイドＲＮＡ）は、ＡＡＶ媒介性送達によって送達される。例えば、肝臓が標的化される場合、ＡＡＶ８を使用することができる。
【０１８６】
標的ゲノム遺伝子座の改変を評価するための方法は、本明細書の他の箇所に提供され、周知である。標的ゲノム遺伝子座の改変の評価は、本明細書の他の箇所に開示される任意の細胞型、任意の組織型、または任意の臓器型におけるものであってもよい。一部の方法では、標的ゲノム遺伝子座の改変は、肝臓細胞中で評価される（例えば、肝臓細胞中の標的ゲノム遺伝子座によって発現される分泌タンパク質の血清レベルを評価する）。例えば、標的ゲノム遺伝子座は、標的遺伝子を含み、評価は、標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含んでもよい。あるいは、またはさらに、評価は、非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中の標的ゲノム遺伝子座を配列決定することを含んでもよい。評価は、非ヒト動物から標的器官または組織を単離すること、および標的器官または組織中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含んでもよい。評価はまた、標的器官または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含んでもよい。同様に、評価は、非ヒト動物から非標的器官または組織（例えば、２つまたはそれより多い非標的器官または組織）を単離すること、および非標的器官または組織中で標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含んでもよい。
【０１８７】
（１）外因性ドナー核酸
本明細書に開示される方法および組成物は、Ｃａｓタンパク質を用いた標的ゲノム遺伝子座の切断後に標的ゲノム遺伝子座を改変するために外因性ドナー核酸を使用する。そのような方法では、Ｃａｓタンパク質により標的ゲノム遺伝子座が切断されて一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断が創出され、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性ライゲーションまたは相同組換え修復事象によって外因性ドナー核酸が標的ゲノム遺伝子座と組み換えられる。必要に応じて、外因性ドナー核酸を用いた修復により、ガイドＲＮＡ標的配列またはＣａｓ切断部位が除去または破壊され、その結果、標的化された対立遺伝子がＣａｓタンパク質によって再度標的化されることができなくなる。
【０１８８】
外因性ドナー核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖形態であっても環状形態であってもよいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYoshimiら（２０１６年）Nat.  Commun.、７巻：１０４３１頁を参照されたい。例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さであるか、約５０ヌクレオチド〜約３ｋｂの長さであるか、または約５０〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。他の例示的な外因性ドナー核酸は、約４０〜約２００ヌクレオチドの長さである。例えば、外因性ドナー核酸は、約５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、または１９０〜２００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、約５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、約１〜１．５、１．５〜２、２〜２．５、２．５〜３、３〜３．５、３．５〜４、４〜４．５、または４．５〜５ｋｂの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、１ｋｂ以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、または５０ヌクレオチド以下の長さであってよい。また、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）は、より長くてもよい。
【０１８９】
一実施例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの間の長さのｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチドから約３ｋｂの間の長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれが約４０ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドの間の長さである相同アームを有してよい。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれが約３０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さである相同アームを有してもよい。相同アームは、対称的であってもよく（例えば、それぞれが４０ヌクレオチド、またはそれぞれが６０ヌクレオチドの長さである）、非対称的であってもよい（例えば、３６ヌクレオチドの長さの相同アームが１つと９１ヌクレオチドの長さの相同アームが１つ）。
【０１９０】
外因性ドナー核酸は、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；蛍光標識を用いた追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つまたは複数の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはこれらの組合せを含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの、１つまたは複数の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含み得る。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドの標識のために広範囲の蛍光色素が商業的に入手可能である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）を、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合する突出末端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸の５’末端にＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）をコンジュゲートすることができる。
【０１９１】
外因性ドナー核酸はまた、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入断片も含み得る。標的ゲノム遺伝子座への核酸挿入断片の組込みにより、標的ゲノム遺伝子座への目的の核酸配列の付加、標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、または標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の置換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらすことができる。一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座におけるいかなる対応する欠失も伴わずに標的ゲノム遺伝子座に核酸挿入断片が挿入されるように設計される。他の外因性ドナー核酸は、核酸挿入断片のいかなる対応する挿入も伴わずに標的ゲノム遺伝子座において目的の核酸配列が欠失するように設計される。さらに他の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座において目的の核酸配列が欠失し、それが核酸挿入断片で置き換えられるように設計される。
【０１９２】
核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は種々の長さであってよい。例示的な核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、約１ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さまたは約１ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、または１９０〜１２０ヌクレオチドの長さであってもよい。同様に、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドの長さであってもよい。同様に、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、約１〜１．５、１．５〜２、２〜２．５、２．５〜３、３〜３．５、３．５〜４、４〜４．５、もしくは４．５〜５ｋｂの長さまたはそれより長くてもよい。
【０１９３】
核酸挿入断片は、置換えの標的とされる配列の全部または一部と相同またはオーソロガスである配列を含んでもよい。例えば、核酸挿入断片は、標的ゲノム遺伝子座における置換えの標的とされる配列と比較して１つもしくは複数の点突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多い）を含む配列を含んでもよい。必要に応じて、そのような点突然変異は、コードされたポリペプチド中での保存的アミノ酸置換（例えば、グルタミン酸［Ｇｌｕ、Ｅ］とのアスパラギン酸［Ａｓｐ、Ｄ］の置換）をもたらし得る。
【０１９４】
（２）非相同末端結合媒介性挿入のためのドナー核酸
一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓタンパク質媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。これらの突出部は、５’および３’相同アームとも称され得る。例えば、一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座の５’および／または３’標的配列におけるＣａｓタンパク質媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’末端のみに有するかまたは３’末端のみに有する。例えば、一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列において創出される突出部に相補的な５’末端のみに有するかまたは標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列において創出される突出部に相補的な３’末端のみに有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有し、これらは、例えば、それぞれ標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓ媒介性切断によって生じる第１および第２の突出部に相補的である。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖の相補的な領域を、ドナー核酸の上鎖の５’末端およびドナー核酸の下鎖の５’末端から伸長させ、それにより、各末端に５’突出部を創出することができる。あるいは、一本鎖の相補的な領域をドナー核酸の上鎖の３’末端および鋳型の下鎖の３’末端から伸長させ、それにより、３’突出部を創出することができる。
【０１９５】
相補的な領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸の間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相補的な領域は、約１〜約５ヌクレオチドの長さ、約１〜約２５ヌクレオチドの長さ、または約５〜約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的な領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、相補的な領域は、約５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、または１４０〜１５０ヌクレオチドの長さであってよい、またはそれより長くてよい。
【０１９６】
そのような相補的な領域は、ニッカーゼの２つの対によって創出される突出部と相補的であってよい。ＤＮＡの逆の鎖を切断して第１の二本鎖切断を創出する第１および第２のニッカーゼ、ならびにＤＮＡの逆の鎖を切断して第２の二本鎖切断を創出する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、付着末端を有する２つの二本鎖切断を創出することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列を、第１の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第１の切断部位が第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列を、第２の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第２の切断部位が第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。必要に応じて、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列ならびに／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックにより、突出部を創出するニックをオフセットすることができる。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐであるかまたはそれよりも大きくてよい。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ranら（２０１３年）Cell、１５４巻：１３８０〜１３８９頁；Maliら（２０１３年）Nat.  Biotech.、３１巻：８３３〜８３８頁；およびShenら（２０１４年）Nat.  Methods、１１巻：３９９〜４０４頁を参照されたい。そのような場合では、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによってならびに第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって創出される突出部に相補的である一本鎖の相補的な領域を有するように設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸を非相同末端結合媒介性ライゲーションによって挿入することができる。
【０１９７】
（３）相同組換え修復によって挿入するためのドナー核酸
一部の外因性ドナー核酸は、相同アームを含む。外因性ドナー核酸が核酸挿入断片も含む場合、相同アームにより核酸挿入断片が挟まれていてよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを５’および３’（すなわち、上流および下流の）相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー核酸内の核酸挿入断片に対する相同アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称される標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応する。
【０１９８】
相同アームおよび標的配列は、当該２つの領域が互いに対して相同組換え反応の基質としての機能を果たすのに十分なレベルの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるかまたは配列同一性を共有するＤＮＡ配列を包含する。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見出される対応する相同アームの間の配列同一性は、相同組換えが起こるのを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）の相同アームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってよい。さらに、相同アームと対応する標的配列の間の対応する相同領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相同アームは、約２５ヌクレオチド〜約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド〜約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５〜約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与の相同アーム（もしくは相同アームのそれぞれ）および／または対応する標的配列は、相同アームが標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、または４５０〜５００ヌクレオチドの長さの対応する相同領域を含み得る。あるいは、所与の相同アーム（もしくは各相同アーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、または約２ｋｂ〜約２．５ｋｂの長さの対応する相同領域を含み得る。例えば、相同アームはそれぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであってよい。相同アームは対称的であってもよく（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）、非対称的であってもよい（一方が他方よりも長い）。
【０１９９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、５’および３’標的配列は、必要に応じて、Ｃａｓ切断部位における一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際の標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生が促進されるように、Ｃａｓ切断部位（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列の十分近くにある）に対して十分に近傍に位置する。「Ｃａｓ切断部位」という用語は、Ｃａｓ酵素（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が創出されるＤＮＡ配列を包含する。外因性ドナー核酸の５’および３’相同アームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、Ｃａｓ切断部位における一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生が促進されるような距離にあれば、Ｃａｓ切断部位に対して「十分に近傍に位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’および／または３’相同アームに対応する標的配列は、例えば、所与のＣａｓ切断部位から少なくとも１ヌクレオチドの範囲内または所与のＣａｓ切断部位から少なくとも１０ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの範囲内であり得る。例として、Ｃａｓ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方のすぐ隣にあり得る。
【０２００】
外因性ドナー核酸の相同アームに対応する標的配列とＣａｓ切断部位の空間的関係は変動し得る。例えば、標的配列がＣａｓ切断部位の５’側に位置する場合もあり、標的配列がＣａｓ切断部位の３’側に位置する場合もあり、標的配列がＣａｓ切断部位を挟んでいる場合もある。
【０２０１】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的ゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法
細胞もしくは非ヒト動物へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を最適化するため、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）第１の非ヒト動物または第１の細胞中で１回目の上記の標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験する方法を実施するステップ；（ｂ）変数を変更し、変更された変数を用いて、第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞中で２回目のこの方法を実施するステップ；および（ｃ）ステップ（ａ）における標的ゲノム遺伝子座の改変と、ステップ（ｂ）における標的ゲノム遺伝子座の改変とを比較し、標的ゲノム遺伝子座のより有効な改変をもたらす方法を選択するステップを含んでもよい。
【０２０２】
標的ゲノム遺伝子座のより有効な改変は、非ヒト動物または細胞内での所望の効果に応じて異なることを意味してもよい。例えば、標的ゲノム遺伝子座のより有効な改変は、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つもしくは複数または全部を意味してもよい。より高い有効性とは、標的遺伝子座の改変のレベルがより高いことを指す（例えば、より高いパーセンテージの細胞が、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的器官内で標的化される）。より高い精度とは、標的ゲノム遺伝子座のより正確な改変を指す（例えば、余分な意図しない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）を含まない、同じ改変を有するか、または所望の改変を有する、より高いパーセンテージの標的化された細胞）。より高い一貫性とは、１つより多い細胞型、組織型、または器官型が標的化される場合、異なる型の標的化された細胞、組織、または器官間での標的ゲノム遺伝子座のより一貫した改変（例えば、標的器官内でのより多い数の細胞型の改変）を指す。特定の器官を標的にする場合、より高い一貫性はまた、器官内の全ての位置を通してより一貫した改変を指してもよい。より高い特異性とは、標的化されるゲノム遺伝子座もしくは複数の遺伝子座に関するより高い特異性、標的化される細胞型に関するより高い特異性、標的化される組織型に関するより高い特異性、または標的化される器官に関するより高い特異性を指してもよい。例えば、ゲノム遺伝子座特異性の増大は、オフターゲットゲノム遺伝子座の少ない改変（例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変の代わりに、またはそれに加えて、意図しない、オフターゲットゲノム遺伝子座での改変を有する標的化された細胞のパーセンテージがより低い）を指す。同様に、細胞型、組織、または器官型特異性の増大は、特定の細胞型、組織型、または器官型が標的化される場合、オフターゲット細胞型、組織型、または器官型の改変が少ない（例えば、特定の器官が標的化される場合（例えば、肝臓）、意図した標的ではない器官または組織中の細胞の改変が少ない）ことを指す。
【０２０３】
変更された変数は、任意のパラメーターであってもよい。一例として、変更された変数は、ガイドＲＮＡ（またはＡＡＶ中にパッケージングされたガイドＲＮＡ）および外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であってもよい。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの、送達方法の例は、本明細書の他の箇所に開示される。例えば、変更された変数は、ＡＡＶ血清型であってもよい。別の例として、変更された変数は、細胞または非ヒト動物へのガイドＲＮＡ（例えば、ＡＡＶ中にパッケージングされた）および外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部の導入のための投与経路であってもよい。静脈内、硝子体内、実質内、および点鼻などの投与経路の例は、本明細書の他の箇所に開示される。
【０２０４】
別の例として、変更された変数は、導入されるガイドＲＮＡ（例えば、ＡＡＶ中にパッケージングされた）および導入される外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部の濃度または量であってもよい。別の例として、変更された変数は、導入される外因性ドナー核酸の濃度または量に対する、導入されるガイドＲＮＡ（例えば、ＡＡＶ中にパッケージングされた）の濃度または量であってもよい。
【０２０５】
別の例として、変更された変数は、１つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性を測定するタイミングに対する、ガイドＲＮＡ（例えば、ＡＡＶ中にパッケージングされた）および外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部を導入するタイミングであってもよい。別の例として、変更された変数は、ガイドＲＮＡ（例えば、ＡＡＶ中にパッケージングされた）および外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部が導入される回数または頻度であってもよい。別の例として、変更された変数は、外因性ドナー核酸の導入のタイミングに対する、ガイドＲＮＡの導入のタイミングであってもよい。
【０２０６】
別の例として、変更された変数は、ガイドＲＮＡおよび外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部が導入される形態であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡを、ＤＮＡの形態で、またはＲＮＡの形態で導入することができる。外因性ドナー核酸は、一本鎖、二本鎖、線状、環状などのＤＮＡ、ＲＮＡであってもよい。同様に、それぞれの構成成分は、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどに、安定性に関する様々な組合せの改変を含んでもよい。別の例として、変更された変数は、導入されるガイドＲＮＡ（例えば、異なる配列を有する異なるガイドＲＮＡを導入すること）および導入される外因性ドナー核酸（例えば、異なる配列を有する異なる外因性ドナー核酸を導入すること）のうちの１つもしくは複数または全部であってもよい。
【０２０７】
Ｃ．細胞および非ヒト動物へのガイドＲＮＡおよび他の構成成分の導入
本明細書に開示される方法は、細胞または非ヒト動物に、ガイドＲＮＡおよび外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部を導入することを含む。「導入」は、細胞または非ヒト動物に、核酸またはタンパク質が細胞の内部または非ヒト動物内の細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で核酸またはタンパク質を提示することを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、２つまたはそれより多い構成成分（例えば、２つの構成成分、または全部の構成成分）を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、外因性ドナー核酸を、ガイドＲＮＡの導入の前に細胞もしくは非ヒト動物に導入するか、またはガイドＲＮＡの導入後にそれを導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸を、ガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、または７２時間前または後に投与することができる）。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたい。さらに、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ送達方法または異なる送達方法によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、非ヒト動物に導入することができる。
【０２０８】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ）の形態でまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡを、ＡＡＶによって送達し、Ｕ６プロモーターの下でｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。そのようなＤＮＡは、１つまたは複数の発現構築物中にあってよい。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成成分であってよい。あるいは、それらは２つまたはそれよりも多くの核酸分子中の任意の組合せで分けることができる（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードするＤＮＡ、および１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡが別々の核酸分子の構成成分であってよい）。
【０２０９】
ガイドＲＮＡをコードする核酸を、発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列の発現を方向付けることができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。発現構築物に使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、ガイドＲＮＡの一方向の発現および別の構成成分の他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。ガイドＲＮＡと別の構成成分とをコードする遺伝子を同時に発現させるための双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
【０２１０】
外因性ドナー核酸またはガイドＲＮＡの安定性を増大させる（例えば、所与の保存条件下（例えば、−２０℃、４℃、もしくは周囲温度）で分解生成物が閾値未満、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満に留まる期間を延長させる；またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を増大させる）担体を含む組成物中で、外因性ドナー核酸およびガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）を提供することができる。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管（ｌｉｐｉｄ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）が挙げられる。
【０２１１】
核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入を可能にするための様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸を種々の細胞型に導入するための方法は当該分野で公知であり、それらとして、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
【０２１２】
トランスフェクションプロトコールならびに核酸配列を細胞に導入するためのプロトコールは変動し得る。非限定的なトランスフェクション方法として、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Grahamら（１９７３年）Virology、５２巻（２号）：４５６〜６７頁、Bacchettiら（１９７７年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７４巻（４号）：１５９０〜４頁、およびKriegler,  M（１９９１年）、Transfer  and  Expression:A  Laboratory  Manual.  New  York：  W.  H.  Freeman  and  Company、９６〜９７頁）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ−デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する、化学に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子銃の使用、または磁石補助トランスフェクションが挙げられる（Bertram（２００６年）Current  Pharmaceutical  Biotechnology、７巻、２７７〜２８頁）。ウイルスによる方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
【０２１３】
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーションによって、細胞質内注射によって、ウイルス感染によって、アデノウイルスによって、アデノ随伴ウイルスによって、レンチウイルスによって、レトロウイルスによって、トランスフェクションによって、脂質媒介性トランスフェクションによって、またはヌクレオフェクションによって媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基体を細胞質だけでなく核膜を通って、および核内にも送達することを可能にする、改善されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、一般には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションでは７百万個であるのと比較してたった約２百万個）。一例では、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用してヌクレオフェクションを実施する。
【０２１４】
核酸またはタンパク質の細胞（例えば、接合体）への導入は、微量注射によって実現することもできる。受精卵（すなわち、１細胞期胚）中で、微量注射は、母系および／もしくは父系前核または細胞質へのものであってよい。微量注射が一方だけの前核へのものである場合、父系前核は、そのサイズがより大きいため、好ましい。あるいは、核／前核と細胞質の両方への注射によって、微量注射を実行することができる：針を最初に核／前核に導入し、第１の量を注入することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、第２の量を細胞質に注入することができる。微量注射を実行するための方法は周知である。例えば、Nagyら（Nagy  A、GertsensteinM、Vintersten  K、Behringer  R.、２００３年、Manipulating  the  Mouse  Embryo.  Cold  Spring  Harbor、New  York：  Cold  Spring  Harbor  LaboratoryPress）を参照されたい；Meyerら（２０１０年）Proc.Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０７巻：１５０２２〜１５０２６頁およびMeyerら（２０１２年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０９巻：９３５４〜９３５９頁も参照されたい。
【０２１５】
核酸またはタンパク質を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋込み型デバイス媒介性送達を挙げることができる。特定の例として、核酸またはタンパク質をポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体に入れて細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達の一部の特定例としては、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）、および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
【０２１６】
核酸およびタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって実現することができる。流体力学的送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞内ＤＮＡ送達のための方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達のためには、必須のＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射し、現行のウイルスおよび合成ベクターに付随する安全性の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは血液が到達可能な種々の組織中の細胞に到達することが可能である。流体力学的送達では、大きく膜不浸透性の化合物が実質細胞に進入することを妨げる内皮および細胞膜の物理的関門を克服するために大きな体積の溶液を循環中の非圧縮性血液中に急速注射することによって生じる力を使用する。この方法は、ＤＮＡ送達に加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bonamassaら（２０１１年）Pharm.  Res.、２８巻（４号）：６９４〜７０１頁を参照されたい。
【０２１７】
ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などのウイルス媒介性送達によって、核酸の導入を達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、またはあるいは、宿主ゲノムに組み込まれない。そのようなウイルスを、免疫原性が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有してもよいか、または複製欠損性であってもよい（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングのさらなるラウンドにとって必要な１つまたは複数の遺伝子の欠損）。ウイルスは、一過的発現、長期的に続く発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、もしくは３ヶ月間）、または永続的発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
【０２１８】
ｓｓＤＮＡ  ＡＡＶゲノムは、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの反転末端リピートによって挟まれた、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐからなる。ＡＡＶ導入プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２個のＩＴＲの間に置かれ、ＲｅｐおよびＣａｐはｉｎ  ｔｒａｎｓに供給することができる。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶは、アデノウイルスに由来する遺伝子を含有するヘルパープラスミドを必要としてもよい。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介した。例えば、導入プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドを、アデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を産生することができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド中で組み合わせることができる。同様のパッケージング細胞および方法を、レトロウイルスなどの他のウイルスのために使用することができる。
【０２１９】
ＡＡＶの複数の血清型が同定されている。これらの血清型は、それらが感染する細胞型（すなわち、その向性）において異なり、特定の細胞型の選択的形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。心臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。腎臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ２が挙げられる。肺組織のための血清型としては、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が挙げられる。膵臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ８が挙げられる。光受容体細胞のための血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。網膜色素上皮組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。骨格筋組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。肝臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特に、ＡＡＶ８が挙げられる。
【０２２０】
向性は、異なるウイルス血清型に由来するキャプシドとゲノムとの混合物である、偽型化によってさらに精緻化することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５に由来するキャプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。偽型化されたウイルスの使用は、形質導入効率を改善する、ならびに向性を変更することができる。異なる血清型から誘導されるハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルス向性を変更することもできる。例えば、ＡＡＶ−ＤＪは、８つの血清型に由来するハイブリッドキャプシドを含有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで広範囲の細胞型にわたって高い感染性を示す。ＡＡＶ−ＤＪ８は、ＡＡＶ−ＤＪの特性を示すが、脳による取込みが増強されている別の例である。ＡＡＶ血清型を、突然変異によって改変することもできる。ＡＡＶ２の突然変異による改変の例としては、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の突然変異による改変の例としては、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の突然変異による改変の例としては、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。他の偽型化／改変されたＡＡＶバリアントとしては、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが挙げられる。
【０２２１】
導入遺伝子発現を促進するために、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するための細胞のＤＮＡ複製機構に依存するため、導入遺伝子発現は遅延し得る。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補配列を含有するｓｃＡＡＶを使用して、宿主細胞のＤＮＡ合成に関する要件を除去することができる。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを使用することもできる。
【０２２２】
パッケージング能力を増大させるために、より長い導入遺伝子を、第１は３’スプライスドナーを有し、第２は５’スプライスアクセプターを有する、２つのＡＡＶ導入プラスミドの間に分裂させてもよい。細胞の同時感染の際に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これはより長い導入遺伝子発現を可能にするが、発現はあまり効率的ではない。能力を増大させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子を、２つの導入プラスミド間に分割することができるが、同時発現が相同組換えおよび完全長導入遺伝子の発現を誘導するように実質的な配列が重複する。
【０２２３】
核酸およびタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。例えば、ＬＮＰ媒介性送達を使用して、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを送達することができる。そのような方法による送達は、ガイドＲＮＡの一過的な存在をもたらし、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、許容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、その細胞取込みを改善しながら、生体分子を分解から保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合する複数の脂質分子を含む粒子である。これらのものは、ミクロスフェア（単層および多層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン、ミセル中の分散相、または懸濁液中の内部相を含む。そのような脂質ナノ粒子を使用して、送達のための１つまたは複数の核酸またはタンパク質を封入することができる。陽イオン脂質を含有する製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含有させることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを増加させるステルス脂質である。好適な陽イオン脂質、中性脂質、陰イオン脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例を、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、陽イオン脂質および１つまたは複数の他の構成成分を含んでもよい。一例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意選択の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含んでもよい。
【０２２４】
ＬＮＰは、下記：（ｉ）封入およびエンドソーム脱出のための脂質；（ｉｉ）安定化のための中性脂質；（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質；ならびに（ｉｖ）ステルス脂質のうちの１つもしくは複数または全部を含有してもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、および外因性ドナー核酸を含んでもよい。
【０２２５】
封入およびエンドソーム脱出のための脂質は、陽イオン脂質であってもよい。脂質は、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であってもよい。好適な脂質の一例は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートである、リピドＡまたはＬＰ０１である。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）である、リピドＢである。好適な脂質の別の例は、２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）である、リピドＣである。好適な脂質の別の例は、３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエートである、リピドＤである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）としても公知である）が挙げられる。
【０２２６】
本明細書に記載のＬＮＰ中での使用にとって好適な一部のそのような脂質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰとしては、少なくとも７５％の脂質が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが挙げられる。別の例として、少なくとも５０％のＬＮＰが、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失する。
【０２２７】
そのような脂質は、それらが中にある培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地中では、脂質はプロトン化され、かくして、正電荷を担持し得る。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などの、わずかに塩基性の培地中では、脂質はプロトン化されず、かくして、電荷を担持しなくてもよい。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。電荷を担持するそのような脂質の能力は、その固有のｐＫａと関連する。例えば、脂質は、独立に、約５．８〜約６．２の範囲のｐＫａを有してもよい。
【０２２８】
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、そのプロセシングを改善するように機能する。好適な中性脂質の例としては、様々な中性非荷電または両性イオン性脂質が挙げられる。本開示における使用にとって好適な中性リン脂質の例としては、限定されるものではないが、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、およびその組合せが挙げられる。例えば、中性リン脂質を、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択することができる。
【０２２９】
ヘルパー脂質としては、トランスフェクションを増強する脂質が挙げられる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性の増強を含んでもよい。ある特定の場合、ヘルパー脂質は、膜融合性を増強することができる。ヘルパー脂質としては、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが挙げられる。好適なヘルパー脂質の例としては、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。一例では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはコレステロールヘミスクシネートであってもよい。
【０２３０】
ステルス脂質としては、ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを変更する脂質が挙げられる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減させること、および粒径を制御することによって製剤プロセスを補助することができる。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性をモジュレートすることができる。好適なステルス脂質としては、脂質部分に親水性頭部基が連結された脂質が挙げられる。
【０２３１】
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。ある特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、ＰＥＧ２０００とも呼ばれる、ＰＥＧ−２Ｋである。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
【０２３２】
ステルス脂質の脂質部分を、例えば、鎖が、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含んでもよい、約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立に含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものなどの、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから誘導することができる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含んでもよい。
【０２３３】
一例として、ステルス脂質を、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール））、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）、および１，２−ジステアリールオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択することができる。１つの特定例では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってよい。
【０２３４】
ＬＮＰは、製剤中に異なるそれぞれのモル比の構成成分脂質を含んでもよい。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４２モル％〜約４７モル％、または約４５％であってもよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４１モル％〜約４６モル％、または約４４モル％であってもよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約２０モル％、約５モル％〜約１５モル％、約７モル％〜約１２モル％、または約９モル％であってもよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約１０モル％、約１モル％〜約５モル％、約１モル％〜約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってもよい。
【０２３５】
ＬＮＰは、封入しようとする核酸の生分解性脂質の正荷電アミノ基（Ｎ）と、負荷電リン酸基（Ｐ）との異なる比を有してもよい。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５〜約１００、約１〜約５０、約１〜約２５、約１〜約１０、約１〜約７、約３〜約５、約４〜約５、約４、約４．５、または約５であってもよい。
【０２３６】
一部のＬＮＰでは、カーゴは、外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡを含んでもよい。外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡは、異なる比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１〜約１：２５の範囲、約１０：１〜約１：１０の範囲、約５：１〜約１：５の範囲、または約１：１の外因性ドナー核酸  対  ｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１〜約１：５、約５：１〜約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸  対  ｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸  対  ｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。
【０２３７】
好適なＬＮＰの特定例は、４．５の窒素のリン酸に対する（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性陽イオン脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含有する。生分解性陽イオン脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであってもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁を参照されたい。好適なＬＮＰの別の特定例は、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ−ＤＭＧを含有する。
【０２３８】
送達様式は、免疫原性を低下させるように選択することができる。例えば、ｇＲＮＡおよび外因性ドナー核酸を、異なる様式（例えば、二様式送達）によって送達することができる。これらの異なる様式は、対象に送達される分子（例えば、ｇＲＮＡもしくは核酸をコードする、または外因性ドナー核酸／修復鋳型）に対して異なる薬力学的特性または薬物動態特性を提供することができる。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。一部の送達様式（例えば、自律的複製またはゲノム組込みによって細胞中で持続する核酸ベクターの送達）は、この分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過的であり、あまり持続的ではない（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えば、ＲＮＡまたはタンパク質としての、より一過的な様式での構成成分の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が短期間だけ存在し、活性であることを確保し、免疫原性を低減させることができる。そのような一過的送達はまた、オフターゲット改変の可能性を低減することもできる。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。全身性投与様式としては、例えば、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路の例としては、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。特定例は、静脈内輸注である。局部投与様式としては、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状もしくは果核中）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回もしくはＣＡ３領域中）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、蓋、被蓋、または黒質への局部実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および経強膜的経路が挙げられる。有意により少量の構成成分（全身的手法と比較して）は、全身的に（例えば、静脈内）投与される場合と比較して、局部的に（例えば、実質内または硝子体内）投与される場合に効果を発揮し得る。局部投与様式はまた、治療有効量の構成成分が全身的に投与される場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減するか、または除去することもできる。
【０２４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。特定例は、静脈内輸注である。点鼻および硝子体内注射は、他の特定例である。ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）を含む組成物を、１つまたは複数の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または助剤が製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに対して実質的に有害でないことを意味する。
【０２４１】
投与の頻度および投与回数は、他の因子の中でも、外因性ドナー核酸またはガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、１回またはある期間にわたって多数回実施することができる。例えば、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、導入を実施することができる。
【０２４２】
Ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の測定および標的ゲノム遺伝子座の改変の評価
本明細書に開示される方法は、標的ゲノム遺伝子座の改変を評価するステップをさらに含んでもよい。発現または活性を検出または測定するための方法は、改変される標的ゲノム遺伝子座に依存すると予想される。
【０２４３】
例えば、標的ゲノム遺伝子座がＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子を含み、意図される改変がコードされたＲＮＡまたはタンパク質の発現を変更することである場合、標的ゲノム遺伝子座の改変を評価する方法は、コードされたＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性を測定するステップを含んでもよい。例えば、コードされたタンパク質が、血清中に放出されるタンパク質である場合、コードされたタンパク質の血清レベルを測定することができる。ＲＮＡおよびタンパク質のレベルおよび活性を測定するためのアッセイは、周知である。
【０２４４】
あるいは、本明細書に開示される方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる切断後に非相同末端結合によって配列が改変された（例えば、小さい挿入もしくは欠失（インデル）の存在）、２つのガイドＲＮＡ標的配列間の標的ゲノム遺伝子座にある配列が切り出された、または外因性ドナー核酸との組換えによって標的ゲノム遺伝子座が改変された、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞を同定するステップをさらに含んでもよい。種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞を同定することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含み得る。適切な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
【０２４５】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）をスクリーニングに使用することもできる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「大規模並列処理配列決定」または「ハイスループットな配列決定」とも称され得る。ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニング手段としてＮＧＳを使用して、標的化遺伝子改変の正確な性質およびそれが細胞型または組織型または臓器型にわたって一貫しているかどうかを定義することができる。
【０２４６】
非ヒト動物における標的ゲノム遺伝子座の改変の評価は、任意の組織または器官に由来する任意の細胞型におけるものであってもよい。例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変を、同じ組織もしくは器官に由来する複数の細胞型において、または組織もしくは器官内の複数の位置に由来する細胞において評価することができる。これは、標的組織または器官内のどの細胞型が改変されているか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが組織もしくは器官のどの部分に到達し、それらが改変されているかに関する情報を提供することができる。別の例として、標的ゲノム遺伝子座の改変を、複数の組織型または複数の器官において評価することができる。特定の組織または器官が標的化される方法では、これは、どれぐらい効率的にその組織または器官が標的化されるか、および他の組織または器官においてオフターゲット効果があるかどうかに関する情報を提供することができる。
【０２４７】
一部の特定例では、Ｃａｓ９導入非ヒト動物を使用して、様々なガイドＲＮＡの編集率を評価することができる。ガイドＲＮＡを、単一ガイドＲＮＡ（改変および非改変）もしくは二本鎖ＲＮＡとして導入するか、またはＵ６プロモーターの下で（例えば、ＡＡＶによる）発現させることができる。また、Ｃａｓ９導入非ヒト動物を、疾患モデリングにおける評価のために、ヒト化対立遺伝子を含む非ヒト動物、ガイドＲＮＡを発現する非ヒト動物と交配させることもできる。
【０２４８】
ＩＶ．Ｃａｓ発現カセットおよび／またはリコンビナーゼ発現カセットを含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書の他の箇所に開示されるＣａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変生物を産生するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに好適である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるChoら（２００９年）Current  Protocols  in  Cell  Biology４２巻：１９．１１：１９．１１．１〜１９．１１．２２頁およびGama  Sosaら（２０１０年）Brain  Struct.  Funct.  ２１４巻（２〜３号）：９１〜１０９頁を参照されたい。そのような遺伝子改変非ヒト動物を、例えば、標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６などのセーフハーバー遺伝子座）での遺伝子ノックインによって、または無作為に組み込まれる導入遺伝子の使用によって生成することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０９３６２２およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。ある構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座に標的化する方法は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／００１７２９０、ＵＳ２０１１／０２６５１９８、およびＵＳ２０１３／０２３６９４６に記載されている。
【０２４９】
例えば、本明細書の他の箇所に開示されるＣａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；ならびに（４）宿主胚を代理母に埋め込み、懐胎させるステップを含んでもよい。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を、胚盤胞期までインキュベートした後、代理母に埋め込み、懐胎させて、Ｆ０非ヒト動物を産生することができる。次いで、代理母は、Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
【０２５０】
この方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含んでもよい。種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
【０２５１】
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を評価するための定量的アッセイを含んでもよい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含んでもよい。
【０２５２】
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
【０２５３】
好適な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞を、例えば、（ａ）５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む、挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを細胞中に導入すること；ならびに（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を同定することによって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞を、（ａ）細胞中に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤；ならびに（ｉｉ）標的配列の十分近くに位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを導入すること；ならびに（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１個の細胞を同定することによって生成することができる。ニックまたは二本鎖切断を所望の標的配列に誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
【０２５４】
ドナー細胞を、胚盤胞期または桑実胚前期（すなわち、４細胞期もしくは８細胞期）などの、任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
【０２５５】
あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用してＣａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように１細胞期胚のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変された胚を選択すること；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母に埋め込み、懐胎させることを含んでもよい。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
【０２５６】
核移植技術を使用して、非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップ；（２）除核された卵母細胞と混合しようとするドナー細胞または核を単離または提供するステップ；（３）この細胞または核を、除核された卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成させるステップ；（４）再構成された細胞を、動物の子宮に埋め込んで、胚を形成させるステップ；および（５）胚を発生させるステップを含んでもよい。そのような方法では、卵母細胞は、一般には死んだ動物から回収されるが、それらを生きている動物の卵管および／または卵巣から単離することもできる。卵母細胞を、除核前に様々な周知の媒体中で成熟させることができる。卵母細胞の除核を、いくつかの周知の様式で実施することができる。再構成された細胞を形成するための除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射によるものであってもよい。接触／融合平面をわたるＤＣ電気パルスの適用（電気融合）によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスを用いて、融合を誘導することができる。核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、間、および／または後の電気的および／または非電気的手段によって、再構成された細胞を活性化することができる。活性化法としては、電気パルス、化学誘導性ショック、精子による貫通、卵母細胞中の二価陽イオンレベルの増大、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤を手段とする）が挙げられる。活性化された再構成された細胞、または胚を、周知の培地中で培養した後、動物の子宮に移すことができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【０２５７】
本明細書に提供される様々な方法は、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞がＣａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にする。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を有するＦ０動物内の細胞数は変化することが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による、対応する生物に由来する桑実胚前期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入により、Ｆ０動物のより高いパーセンテージの細胞集団が標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を含む細胞を含むようになる。例えば、非ヒトＦ０動物の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の細胞寄与が、標的化改変を有する細胞集団を含んでもよい。
【０２５８】
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、Ｃａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部についてヘテロ接合性であってもよいか、またはＣａｓ発現カセットおよびリコンビナーゼ発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部についてホモ接合性であってもよい。
【０２５９】
上文または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。違う時間に受託番号に異なるバージョンの配列が関連付けられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り本出願の有効な出願日時点で直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明を明瞭さおよび理解のために図表および例によって少し詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかになろう。
【０２６０】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）３’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
【０２６１】
【表３】
2020532952.tif 000008
【実施例】
【０２６２】
（実施例１）
Ｃａｓ９導入マウスの検証
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、そのＲＮＡガイドの結合部位でのＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）の創出を触媒する。例示的なＲＮＡガイドは、８７ヌクレオチドのトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と結合する４２ヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）からなってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと相補的であり、それと塩基対を形成して、機能的なｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡガイドを形成する。この二本鎖ＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に結合して、ｃｒＲＮＡの２０ヌクレオチドのガイド部分との相補性についてゲノムに問い合わせることができる活性なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するようになる。鎖切断のための第２の要件は、Ｃａｓ９タンパク質がｃｒＲＮＡのガイド部分と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ標的配列）と直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識しなければならないということである。あるいは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを共有的に連結することによって形成された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と置き換えることによって、活性なＲＮＰ複合体を形成させることもできる。例えば、プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡ配列に直接的にｃｒＲＮＡの２０ヌクレオチドのガイド部分を融合することによって、このようなｓｇＲＮＡを形成させることができる。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖が行うのと同じ方法で、また、類似する効率でＣａｓ９タンパク質とＤＮＡの両方と相互作用することができる。ＣＲＩＳＰＲ細菌自然防御メカニズムは、哺乳動物細胞中で効率的に機能し、切断誘導性内因性修復経路を活性化することが示されている。二本鎖切断がゲノム中で起こる場合、修復経路は、カノニカルもしくは代替的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路または適切な鋳型が利用可能である場合、相同組換え修復（ＨＤＲ）とも呼ばれる相同組換えによってＤＮＡを修正することを試みると予想される。本発明者らは、これらの経路を活用して、哺乳動物細胞におけるゲノム領域の部位特異的欠失または外因性ＤＮＡの挿入またはＨＤＲを容易にすることができる。
【０２６３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ゲノム操作のための強力な手段である。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のためのこの系の１つの制限は、全ての構成成分を生きている生物体に同時に導入する必要があることである。これらの構成成分を細胞に導入する典型的な方法は、適切なＲＮＡおよびタンパク質を生成する細胞中にＤＮＡ構築物を一過的にトランスフェクトすることである。細胞が、Ｃａｓ９タンパク質がｓｇＲＮＡ構成成分と相互作用するために利用可能となる前に、最初に転写を受けた後、翻訳を受けるプラスミドＤＮＡ構築物に依拠しなければならないため、有効であるが、この手法は固有の欠点も有する。本発明者らは、Ｃａｓ９により誘導される突然変異の頻度および組換えの頻度を、構成的に利用可能であるタンパク質を有することによって大きく改善することができると考えている。
【０２６４】
野生型Ｃａｓ９コード配列（ＣＤＳ）を、マウスにおける発現のためにコドン最適化した。次いで、Ｎ末端一成分核局在化（ＮＬＳ）シグナル、Ｃ末端二成分ＮＬＳ、およびＣ末端Ｐ２Ａ結合ＧＦＰ蛍光リポーターを組み込んだ。Ｃａｓ９発現カセット（ＭＡＩＤ２５９９）は、図１および図１４および配列番号１に記載される。Ｐ２Ａ−ＧＦＰを、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｓ９発現のより良い追跡のために使用した。これらの構成成分を、適切なスプライシングシグナルおよび強力なポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを有する先行するフロキシングされたネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏカセット）と共に、マウスゲノムのＲｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロン中に操作した。Ｃａｓ９発現カセットの構成成分を、５’から３’に向かって、表４に示し、フロキシングされたネオマイシンカセットの除去後のＣａｓ９対立遺伝子の構成成分を、表５に示す。対立遺伝子によってコードされるＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列を、配列番号１３に記載する。
【０２６５】
【表４】
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【０２６６】
【表５】
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【０２６７】
Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるカセットの除去の前に、ネオマイシン耐性遺伝子は通常、効率的に転写および翻訳される；しかしながら、Ｃａｓ９  ＣＤＳは通常、ランスルー転写を効率的に遮断することができる強力なポリ（Ａ）領域の存在のため、発現されない。Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるｎｅｏカセットの除去の際に、Ｃａｓ９とＧＦＰタンパク質とのハイブリッドｍＲＮＡは、通常、Ｒｏｓａ２６プロモーターによって構成的に発現される。ｎｅｏカセット除去の前後の標的細胞を、Ｒｏｓａ２６遺伝子座での標的化ベクターの単一の、部位特異的組込みを検出するための対立遺伝子喪失スクリーニングによって最初に実証した。標的化されたｍＥＳＣから全ＲＮＡを抽出した後、逆転写して、ｃＤＮＡを生成し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲを行って、逆転写されたｃＤＮＡを検出する（ＲＴ−ｑＰＣＲ）ことによって、Ｃａｓ９およびＧＦＰ発現を検証した。総合すると、創出された系は、ｍＥＳＣおよびそれから誘導されたマウスにおいて、一貫したレベルのＣａｓ９タンパク質を継続的または条件的に（ネオマイシン耐性カセットの除去を必要とすることによって）発現することができる。
【０２６８】
Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＭＡＩＤ２６６０）を含まない別のバージョンを設計した。図１４を参照されたい。Ｃａｓ９発現カセットの構成成分を、５’から３’に向かって、表６に示し、フロキシングされたネオマイシンカセットの除去後のＣａｓ９対立遺伝子の構成成分を、表７に示す。対立遺伝子によってコードされるＣａｓ９タンパク質配列を、配列番号１９に記載する。
【０２６９】
【表６】
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【０２７０】
【表７】
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【０２７１】
さらに、外因性ＣＡＧＧプロモーターおよび３ｘＦＬＡＧタグ配列を有する２つのバージョンを設計した。第１のバージョンは、Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＭＡＩＤ２６５８）を含み、Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＭＡＩＤ２６７２）を含まない第２のバージョンを設計した。図１４を参照されたい。第１のバージョンのＣＡＧＧ−Ｃａｓ９発現カセットの構成成分を、５’から３’に向かって、表８に示し、フロキシングされたネオマイシンカセットの除去後の第１のバージョンのＣＡＧＧ−Ｃａｓ９対立遺伝子の構成成分を、表９に示す。この対立遺伝子によってコードされる３ｘＦＬＡＧ-Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｅＧＦＰタンパク質配列を、配列番号１６に記載する。第２のバージョンのＣＡＧＧ-Ｃａｓ９発現カセットの構成成分を、５’から３’に向かって、表１０に示し、フロキシングされたネオマイシンカセットの除去後の第２のバージョンのＣＡＧＧ-Ｃａｓ９対立遺伝子の構成成分を、表１１に示す。この対立遺伝子によってコードされる３ｘＦＬＡＧ-Ｃａｓ９タンパク質配列を、配列番号２２に記載する。
【０２７２】
【表８】
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【０２７３】
【表９】
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【０２７４】
【表１０】
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【０２７５】
【表１１】
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【０２７６】
ＭＡＩＤ２５９９／ＭＡＩＤ２６００系を検証するために、ネオマイシンカセットを含む、および含まないＣａｓ９  ｍＥＳＣ（それぞれ、ＭＡＩＤ２５９９およびＭＡＩＤ２６００）に、第１の標的遺伝子の開始および停止コドン領域を標的とする２つのｓｇＲＮＡをトランスフェクトした。図２Ａを参照されたい。次いで、ｇＲＮＡ標的化Ｃａｓ９切断部位に挿入−欠失突然変異を有するｍＥＳＣクローンの割合を評価するための対立遺伝子喪失スクリーニングによって、Ｃａｓ９切断効率をアッセイした。Ｃａｓ９切断部位間のＤＮＡを欠失させたｍＥＳＣクローンの割合、またはヌル突然変異を引き起こす両方の標的対立遺伝子も決定した。Ｃａｓ９は、ネオマイシンカセットおよびポリ（Ａ）（停止配列）が除去された場合にのみ、これらのゲノム変化を誘導することができた（ＭＡＩＤ２６００）。相同組換え修復に関するゲノム編集能力をより良好に評価するために、点突然変異ドナーとして一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）と共に、第２の標的遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを導入した。図２Ｂを参照されたい。本明細書に記載の構成的Ｃａｓ９発現系を、ｓｓＯＤＮと共にプラスミドによりＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを導入する伝統的な方法と比較した。本明細書に記載のＣａｓ９発現系は、ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドと組み合わせた場合、切断誘導性内因性修復経路を活性化して、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方を外因性プラスミドから発現させた場合のものと同等である頻度で本発明者らの所望の点突然変異を組み込むことができた。しかしながら、本明細書に記載のＣａｓ９発現系を、直接送達されるｓｇＲＮＡと組み合わせた場合、それは、プラスミド送達方法のほぼ２倍の効率で、相同性挿入突然変異誘発を誘導した。
【０２７７】
生きているマウスにおける内因的に発現されるＣａｓ９の有効性を決定するために、これらの標的化されたｍＥＳＣを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して、８細胞のマウス胚に微量注射した。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号；第７，６５９，４４２号；第７，２９４，７５４号；ＵＳ２００８／００７８００；およびPoueymirouら（２００７年）Nature  Biotech.  ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい。具体的には、透明帯に小さい孔を創出して、標的化されたｍＥＳＣの注射を容易にした。これらの注射された８細胞胚を、代理母に移して、導入遺伝子を担持する生きた子を産生した。代理母での懐胎の際に、注射された胚は、検出可能な宿主胚の寄与を担持しないＦ０マウスを産生した。完全にＥＳ細胞に由来するマウスは、正常で、健康で、繁殖力があった（生殖細胞系列伝達を有する）。ＧＦＰ可視化、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ発現、およびＣａｓ９タンパク質発現のために、カセット欠失Ｆ０マウス（ＭＡＩＤ２６００）から、組織を収穫した。図３Ａ〜３Ｆ（明視野およびＧＦＰ可視化）ならびに図４Ａ〜４Ｃ（図４Ａおよび図４Ｃ中のＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現、ならびに図４Ｂ中のタンパク質発現）を参照されたい。図３Ｄは、ヘテロ接合性Ｒｏｓａ２６Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）中でのｅＧＦＰ発現を示すが、野生型マウスの肝臓においては対応するｅＧＦＰ発現が欠如していることを示し、図３Ｅは、ヘテロ接合性Ｒｏｓａ２６Ｃａｓ９マウス中でのｅＧＦＰ発現を示すが、野生型マウスの腎臓においては対応するｅＧＦＰ発現が欠如していることを示し、図３Ｆは、ヘテロ接合性Ｒｏｓａ２６Ｃａｓ９マウス中でのｅＧＦＰ発現を示すが、野生型マウスの脳においては対応するｅＧＦＰ発現が欠如していることを示す。同様に、ＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイされたＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現は、ヘテロ接合性Ｒｏｓａ２６Ｃａｓ９マウスの脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、大腿四頭筋、脾臓、および胸腺において観察されたが、野生型マウスに由来する対応する組織においてはＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現は観察されなかった。図４Ａおよび図４Ｃを参照されたい。実験では、それぞれの組織に由来する等しい質量のＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイした。データは、Ｃａｓ９導入マウスが全ての組織において容易に検出可能なレベルでＣａｓ９  ｍＲＮＡを発現することを示す。様々な組織を、Ｃａｓ９導入マウスから収穫した。３つの組織を、１４匹のマウスから収穫し、さらに５つの組織を、４匹のマウスから収穫して、マウス間の差異ならびにマウス内の組織間の差異を評価した。これらの組織のそれぞれから、ＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲ反応にカウントされないように、ゲノムＤＮＡは分解された。ＲＮＡを逆転写した後、Ｃａｓ９に特異的なアッセイを使用して、Ｃａｓ９転写物を検出した。予想通り、Ｃａｓ９マウスは、有意な発現（３０より低いｃｔ値）を示したが、ＷＴマウスは、３０およびそれより高いｃｔ値を示し、これは、Ｃａｓ９タンパク質の内因性発現がないことを示している。
【０２７８】
同様に、１：２５０の希釈率でＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｃａｓ９抗体ＭＡ５−２３５１９を使用する、および対照としてアクチンを使用するウェスタンブロットにより決定されたＣａｓ９タンパク質発現は、ヘテロ接合性Ｒｏｓａ２６Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）の脾臓、肝臓、および脳においてはＣａｓ９タンパク質発現を示したが、野生型マウスの同じ組織においては、Ｃａｓ９タンパク質は観察されなかった。図４Ｂを参照されたい。３つ全ての試験が、全てのアッセイされた組織における一貫した発現レベルを示した。
【０２７９】
次いで、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達によってカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）から単離された初代肝細胞にｓｇＲＮＡを導入することによって、肝臓により分泌され、血清中に見出されるタンパク質をコードする、標的遺伝子３をノックアウトする実験を行った。図５Ｂを参照されたい。対照として、ｓｇＲＮＡ導入の同じ方法を、野生型（ＷＴ）マウスから単離された初代肝細胞中での外因性Ｃａｓ９発現と対合させた。図５Ａを参照されたい。次いで、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって非相同末端結合を評価して、標的遺伝子３遺伝子座でのインデル頻度を測定した。実験では、３つの条件：（１）ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよび対照（すなわち、死滅した）ｓｇＲＮＡのＬＮＰ媒介性送達；（２）ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよび標的遺伝子３のｓｇＲＮＡのＬＮＰ媒介性送達；ならびに（３）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび標的遺伝子３のｓｇＲＮＡのＬＮＰ媒介性送達が存在していた。それぞれの条件について、４つの濃度のｍＲＮＡを試験した：１５．６ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、および１０００ｎｇ／ｍＬ。野生型初代マウス肝細胞では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと標的遺伝子３のｓｇＲＮＡの両方が導入された場合にのみ、挿入／欠失頻度の用量依存的増加が見られた。対照的に、Ｃａｓ９導入初代マウス肝細胞では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの代わりに、標的遺伝子３のガイドＲＮＡを対照ＧＦＰ  ｍＲＮＡと共に導入した場合に、同様の用量依存的効果が見られ、挿入／欠失頻度のレベルは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡも導入した場合に見られたレベルと本質的に同一であった。
【０２８０】
次いで、流体力学的ＤＮＡ送達（ＨＤＤ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達によってｓｇＲＮＡをカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）に導入することにより、または尾静脈注射によるｓｇＲＮＡ発現配列を担持するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の導入により、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子３をノックアウトする実験を行った。図６Ａ〜６Ｄを参照されたい。対照として、ｓｇＲＮＡ導入の同じ方法を、野生型（ＷＴ）マウスにおける外因性Ｃａｓ９発現と対合させた。ＬＮＰ媒介性送達については、３群のマウスを試験した：（１）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；２ｍｇ／ｋｇの対照ｓｇＲＮＡ＋ＧＦＰ  ｍＲＮＡ）；（２）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；２ｍｇ／ｋｇの標的遺伝子３のためのｓｇＲＮＡ＋ＧＦＰ  ｍＲＮＡ）；および（３）ＷＴマウス（３匹のオス＋３匹のメス；２ｍｇ／ｋｇの標的遺伝子３のためのｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ）。ＡＡＶ媒介性送達については、２群のマウスを試験した：（１）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；ＡＡＶ８−標的遺伝子３のためのｓｇＲＮＡ）；および（２）ＷＴマウス（３匹のオス＋３匹のメス；ＡＡＶ８−標的遺伝子３のためのｓｇＲＮＡ＋ＡＡＶ８−Ｃａｓ９）。ＨＤＤについては、２群のマウスを試験した：（１）Ｃａｓ９導入マウス（３匹のオス＋３匹のメス；標的遺伝子３のためのｓｇＲＮＡ）；および（２）ＷＴマウス（３匹のオス＋３匹のメス；標的遺伝子３のためのｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９）。Ｃａｓ９導入マウスは、外因性Ｃａｓ９発現を示すＷＴマウスよりも一貫して、かつ有意により標的化された遺伝子不活化を有していた。
【０２８１】
驚くべきことに、標的遺伝子３のｓｇＲＮＡのＣａｓ９導入マウス（ＭＡＩＤ２６００）へのＡＡＶ８媒介性送達は、肝臓標的遺伝子３を標的にする際にＬＮＰ媒介性送達またはＨＤＤよりも有効であった。図６Ａ〜６Ｄを参照されたい。さらに、標的遺伝子３のｓｇＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへのＡＡＶ８媒介性送達は、標的遺伝子３のｓｇＲＮＡとＣａｓ９の両方のＷＴマウスへのＡＡＶ８媒介性送達よりも有効であったが、ＬＮＰ媒介性送達またはＨＤＤを使用する両条件の間では大きな差異は観察されなかった。図６Ａ〜６Ｄを参照されたい。これらの結果は、ガイドＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへのＡＡＶ媒介性送達が、ｉｎ  ｖｉｖｏでｇＲＮＡ活性を試験するための特に有効な手段であり得ることを示している。標的遺伝子３によってコードされるタンパク質（すなわち、標的タンパク質３）の血清レベルを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分の導入後、７日目および２１日目にメスおよびオスのマウスにおいて測定した。試験したマウスは、Ｃａｓ９導入マウスと野生型マウスを含んでいた。対照は、Ｃａｓ９導入マウスと、Ｃａｓ９も標的遺伝子３のｓｇＲＮＡも導入されていないＷＴマウスを含んでいた。ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９とガイドＲＮＡとの組合せの流体力学的送達は、Ｃａｓ９もガイドＲＮＡも導入されていない対照ＷＴマウスと比較して有意な方法で標的タンパク質３の血清レベルを低下させなかった。ＬＮＰ媒介性送達については、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへの導入は、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方が導入されたＷＴマウスと比較して同様の血清レベルの標的タンパク質をもたらし、これらの条件はそれぞれ、Ｃａｓ９もガイドＲＮＡも導入されていないＣａｓ９導入対照マウスと比較して、標的タンパク質３の血清レベルの約５０％の低下をもたらした。しかしながら、ＡＡＶ８媒介性送達については、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへの送達は、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方が導入されたＷＴマウスと比較して、標的タンパク質３の血清レベルの数倍の低下をもたらし、Ｃａｓ９もガイドＲＮＡも導入されていない対照ＷＴマウスと比較して、さらにより劇的な低下をもたらした。２１日目までに、標的タンパク質３の血清レベルは、ｓｇＲＮＡがＡＡＶ８によって導入されたＣａｓ９導入マウスにおいて検出限界の近くまで低下した。
【０２８２】
図７は、ｓｇＲＮＡのみ、もしくはＣａｓ９  ｍＲＮＡと一緒のｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達、ｓｇＲＮＡプラスミドのみ、もしくはＣａｓ９プラスミドと一緒のｓｇＲＮＡプラスミド、またはＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡのみ、もしくはＡＡＶ８−Ｃａｓ９と一緒のＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡの流体力学的送達（ＨＤＤ）の１ヶ月後の、野生型マウスおよびカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）中の肝臓における標的遺伝子３遺伝子座でのＮＨＥＪ活性のパーセント（インデル頻度）を示す。遺伝子座に挿入／欠失（インデル）を有する肝臓細胞のパーセンテージを、ＮＧＳによって測定した。ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９とガイドＲＮＡとの組合せの流体力学的送達は、低いパーセンテージのインデルをもたらした。ＬＮＰ媒介性送達については、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへの導入は、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方が導入されたＷＴマウスと比較して、類似するパーセンテージのインデルをもたらし、これらの条件はそれぞれ、約４０％であるインデルのパーセンテージレベルをもたらした。しかしながら、ＡＡＶ８媒介性送達については、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９導入マウスへの送達は、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方が導入されたＷＴマウス（約３５％）と比較して、はるかにより大きいパーセンテージのインデル（約７５％）をもたらし、Ｃａｓ９もガイドＲＮＡも導入されていない対照ＷＴマウスと比較して、さらにより劇的な増加をもたらした。
【０２８３】
さらに、収穫した組織において、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）も実施した。次いで、アンプリコン配列決定を使用して、収穫した組織の編集の量を評価する。ガイドの予想カット部位の周辺の中心からわずかに外れた約３００ｂｐの生成物を産生するように標的特異的プライマーを設計する。次いで、それらに「アダプター」配列が付加されたプライマーは、二次ＰＣＲ反応において個々の試料をバーコード化することを可能にする。バーコードが付加されたら、試料を全て一緒にプールし、ＭｉＳｅｑ上にロードする。５０００〜１００００のリードが、目的の領域にわたって予想される。次いで、情報プログラムを実行して、リードをマッピングして、それぞれの編集の正確な配列を決定する。次いで、プログラムは、ＷＴ（未編集）リードの数を計測し、全ての編集されたリードに対して行った編集の型の切断（予測される編集領域中で付加および／または欠失された塩基対の数の評価）を提供する。
【０２８４】
次いで、標的遺伝子４のエクソン２を標的にするｓｇＲＮＡを含むＣａｓ９を、野生型（ＷＴ）マウスから単離された初代肝細胞に導入することによって、ＩＩ型膜結合糖タンパク質をコードする標的遺伝子４をノックアウトする実験を行った。５つの異なるｓｇＲＮＡ（ガイド１〜５）を試験した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、リポフェクタミンにより細胞に導入した。次いで、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって非相同末端結合を評価して、標的遺伝子４遺伝子座でのインデル頻度を測定した。編集率（％）は、全リードにわたる全ＮＨＥＪ事象の尺度である。ＮＨＥＪ事象は、カット部位の前後２０ｂｐで起こる全ての編集（挿入、欠失、塩基変化）であると考えられる。ガイド１〜５に関する編集率（％）は、以下の通りであった：それぞれ、３５．４％、３７．４％、４３．８％、５１．２％、および５５．８％（データは示さない）。
【０２８５】
次いで、同じ５つのｓｇＲＮＡを、ＡＡＶ８により別々のカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）に導入することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子４をノックアウトする実験を行った。具体的には、Ｕ６プロモーターによって発現される個々のガイドを、ＡＡＶ８中でパッケージングし、尾静脈注射によって６〜１２週齢のカセット欠失Ｃａｓ９マウスに導入した。導入されたウイルス量は、５０〜１００μＬのおよその容量中で、１ｘ１０１１〜１ｘ１０１２であった。肝臓を、注射の３〜４週間後に収穫した。編集率（％）を、それが初代肝細胞中にあったものとして算出したが、それは図８Ａに示される。編集レベルは、初代肝細胞中で観察された編集レベルと一致し、実際はそれより高かった。標的遺伝子４から転写されるｍＲＮＡの発現レベルも試験した。図８Ｂに示されるように、それぞれのｇＲＮＡは、注射の３〜４週間後に収穫された肝臓において標的遺伝子４から転写されたｍＲＮＡの相対レベルを低下させた。
【０２８６】
肝臓中のいくつかの他の標的遺伝子における編集率（％）を試験するための実験も行った。それぞれの実験において、マウスの週齢は、約６〜１２週齢であった。それぞれの標的遺伝子について、５つの異なるガイドＲＮＡを、重要なエクソンに対して設計した。ガイドＲＮＡを、５０〜１００μＬのおよその容量中の１ｘ１０１１〜１ｘ１０１２のウイルス量を用いる尾静脈注射によって、ＡＡＶ８により送達した。肝臓を、注射の３〜４週間後に収穫した。上で説明したように、編集率（％）を決定した。ＡＡＶ８−ｇＲＮＡの送達によるカセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）の肝臓中での編集率（％）を、表１２に示す。それぞれの遺伝子に関する最良のｇＲＮＡにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓中での４８％〜７０％の編集が得られた。
【０２８７】
【表１２】
2020532952.tif 000017
【０２８８】
（実施例２）
Ｃａｓ９導入マウスの誘導性の検証
実施例１に記載されたＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子（ＭＡＩＤ２５９９）は、Ｃａｓ９コード配列の上流にフロキシングされた強力なポリ（Ａ）領域（ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ、またはＬＳＬ）を含む。Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるカセットの除去の前に、ネオマイシン耐性遺伝子は通常、効率的に転写および翻訳される；しかしながら、Ｃａｓ９  ＣＤＳは通常、ランスルー転写を効率的に遮断することができる強力なポリ（Ａ）領域の存在のため、発現されない。Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるｎｅｏカセットの除去の際に、Ｃａｓ９とＧＦＰタンパク質とのハイブリッドｍＲＮＡは、通常、Ｒｏｓａ２６プロモーターによって構成的に発現される。これにより、Ｃａｓ９対立遺伝子は誘導性になる。これは、いくつかの理由から有益である。ある特定の組織（例えば、免疫細胞など）において一部の遺伝子を編集する可能性は、免疫応答を潜在的に引き起こすと共に、有害であり得る。さらに、ある特定の環境では、標的個体を通じた遺伝子の突然変異は致死的であり得るが、特定の組織または細胞型における遺伝子の突然変異は有益であり得る。ＭＡＩＤ２５９９対立遺伝子の誘導的性質により、どの組織および細胞型が、組織特異的または細胞特異的様式でＣａｓ９を活性化することによってのみ編集されているかに関してより高い特異性が可能となる。
【０２８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの肝臓におけるＣａｓ９発現の誘導性を試験するために、ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ上で製剤化した。ＴｒｉｌｉｎｋからのＣｒｅ  ｍＲＮＡ（カタログ番号７２１１）を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム中で希釈し、５０：１０：３８．５：１．５のモル比の陽イオン脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧの脂質混合物と、３：１でＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒカセットを介して混合した。この製剤は、肝臓によって容易に吸収される。得られるＬＮＰ−Ｃｒｅを、１ｍｇ／ｋｇでＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２５９９）の尾静脈を介して注射した。対照マウスでは、ＬＮＰ−Ｃｒｅを注射しなかった。１週間後、マウスを犠牲にし、抗Ｃａｓ９（７Ａ９）モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＭＡ５−２３５１９）および抗アクチン（Ｃ４）モノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａカタログ番号ＭＡＢ１５０１）を使用するウェスタン分析のために器官を収穫した。カセット欠失Ｃａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００）に由来する器官を、陽性対照として使用した。これらのマウスでは、ＬＳＬカセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって既に除去されている。結果を図９に示すが、肝臓特異的遺伝子編集のためのＬＮＰ−Ｃｒｅ送達を用いた、肝臓特異的Ｃａｓ９活性化に関する概念実証を示す。
【０２９０】
次いで、Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集の誘導性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。上記のようにＬＮＰ−Ｃｒｅを製剤化した。以下の群：（１）ＬＮＰ−ＣｒｅおよびＡＡＶ８−ｇＲＮＡで処置された３匹のＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス；（２）ＬＮＰ−ＣｒｅおよびＰＢＳで処置された３匹のＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス；（３）ＰＢＳおよびＡＡＶ８−ｇＲＮＡで処置された３匹のＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス；（４）ＰＢＳのみで処置された３匹のＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス；（５）ＬＮＰ−Ｃｒｅで処置された３匹のカセット欠失Ｃａｓ９マウス；（６）ＡＡＶ８−ｇＲＮＡで処置された３匹のカセット欠失Ｃａｓ９マウス；（７）ＰＢＳで処置された３匹のカセット欠失Ｃａｓ９マウス；ならびに（８）３匹のＷＴマウス（未処置）のマウスに、標的遺伝子３を標的とするＬＮＰ−ＣｒｅおよびＡＡＶ８−ｇＲＮＡを投与した（尾静脈注射による同時注射）。ＬＮＰ−Ｃｒｅを送達した群では、それは１ｍｇ／ｋｇの濃度で送達された。ＡＡＶ８−ｇＲＮＡを送達した群では、それは約２ｘ１０１１のウイルス量で送達された。注射の１週後および３週後、血清化学のために、および標的タンパク質３の循環血清レベルを測定するために、マウスを出血させた。また、３週で、ＮＧＳおよびウェスタン分析のために組織を収穫した。標的タンパク質３の血清レベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果を、図１０に示す。ＡＡＶ８−ｇＲＮＡと一緒にＬＮＰ−ＣｒｅをＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスに送達することにより、ＡＡＶ８−ｇＲＮＡを送達したカセット欠失Ｃａｓ９マウスにおいて観察された低下と一致して、標的タンパク質３の血清レベルが低下した。これらのＥＬＩＳＡの結果は、注射の３週間後のマウスから単離された肝臓中での標的遺伝子３における編集率（％）に関するＮＧＳの結果と一致していた。図１１を参照されたい。
【０２９１】
次に、ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスを、アルブミンプロモーターがＣｒｅリコンビナーゼコード配列に作動可能に連結され、肝臓におけるその発現を駆動するＪａｘからのアルブミン−Ｃｒｅマウス（３６０１−Ｔｇ（Ａｌｂ−ｃｒｅ）２１Ｍｇｎ；ＭＡＩＤ３６０１）と交配した。交配後、いくつかの組織を、ウェスタンブロット分析のためにマウスから収穫した。対応する組織を、アルブミン−Ｃｒｅマウスと交配しなかったＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスから収穫した。次いで、肝臓および脳におけるＣａｓ９発現を測定するウェスタンブロットを実施した。アクチンを、ローディング対照として使用した。Ｃａｓ９の予測サイズは１５０．４８ｋＤであり、アクチンの予測サイズは４１．２５ｋＤであった。１７．５μｇの肝臓タンパク質溶解物および脳タンパク質溶解物を使用した。ＴｒｕＣｕｔ  ｖ２  Ｃａｓ９（１７．５μｇ）を、陽性対照として使用した。図１２Ａに示されるように、Ｃａｓ９発現は、ＬＳＬ−Ｃａｓ９／Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓中では観察されたが、ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの肝臓中では観察されなかった。Ｃａｓ９発現は、いずれのマウスに由来する脳組織中でも観察されなかった（図１２Ｂを参照されたい）が、Ｃａｓ９発現は、肝臓において特異的に誘導された。
【０２９２】
これらのマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣａｓ９媒介性遺伝子編集を試験するための実験を行った。実験は、尾静脈注射により標的遺伝子３を標的とするＡＡＶ８−ｇＲＮＡを注射した５群の８〜１２週齢のマウスを含んでいた：（１）３匹のＬＳＬ−Ｃａｓ９：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（ＭＡＩＤ２５９９  Ｈｅｔ、ＭＡＩＤ３６０１  Ｈｅｔ）；（２）３匹のＷＴ：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（ＭＡＩＤ２５９９  ＷＴ、ＭＡＩＤ３６０１  Ｈｅｔ）；（３）３匹のＬＳＬ−Ｃａｓ９：ＷＴマウス（ＭＡＩＤ２５９９  Ｈｅｔ、ＭＡＩＤ３６０１  ＷＴ）；（４）３匹のＣａｓ９マウス（ＭＡＩＤ２６００  ＨｅｔまたはＨｏｍ）；および（５）３匹の７５／２５マウス（５０５００ＷＴ）。各群に由来するマウスを、ＡＡＶ８−ｇＲＮＡを注射しなかった対照としても使用した。ＡＡＶ８−ｇＲＮＡを送達した群では、それは約２ｘ１０１１のウイルス量で送達された。注射の１週間後、血清化学およびＥＬＩＳＡのためにマウスを出血させた。注射の３週間後、マウスを出血させ、組織を収穫した。その結果を、図１３に示す。ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスをアルブミン−Ｃｒｅマウスと交配させた後、ＡＡＶ８−ｇＲＮＡを注射することにより、ＡＡＶ８−ｇＲＮＡを送達したカセット欠失Ｃａｓ９マウスにおいて観察された低下と一致して、標的タンパク質３の血清レベルが低下した。
【０２９３】
本明細書に記載のＣａｓ９導入マウス系は、Ｃａｓ９の外因性導入に依拠する他の方法よりもロバストな遺伝子編集を誘導することができる。さらに、この系は、ネオマイシンカセットの欠失に基づいてＣａｓ９を条件的に発現することができる。この系と、様々なＣｒｅ欠失マウス株とを組み合わせることにより、Ｃａｓ９誘導性ゲノム編集のタイミングを制御し、組織特異的Ｃａｓ９発現をｉｎ  ｖｉｖｏで提供することができる。
（項目１）
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
（ａ）非ヒト動物に、前記標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップであって、
前記非ヒト動物が、ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含み、
前記ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入される、ステップ；および
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座の前記改変を評価するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり、ステップ（ｂ）が、肝臓において前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＡＡＶがＡＡＶ８である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＡＶの前記非ヒト動物への投与経路が、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
ステップ（ａ）において外因性ドナー核酸が導入され、前記外因性ドナー核酸が、前記標的ゲノム遺伝子座と組み換わるように設計されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記外因性ドナー核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記非ヒト動物がマウスである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記標的ゲノム遺伝子座が標的遺伝子を含み、ステップ（ｂ）が、前記標的遺伝子の発現または前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中の前記標的ゲノム遺伝子座を配列決定することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から標的器官または組織を単離すること、および前記標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｂ）が、前記標的器官または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から非標的器官または組織を単離すること、および前記非標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列が、ＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記Ｃａｓ発現カセット中の前記ポリアデニル化シグナルが、組織特異的様式で切り出されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列の上流の前記ポリアデニル化シグナルが、肝臓中で切り出されている、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記リコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼである、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記非ヒト動物が、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子が、表２に記載のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されている、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記方法が、リコンビナーゼを組織特異的様式で前記非ヒト動物に導入するステップをさらに含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記リコンビナーゼが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって導入される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記Ｃａｓ発現カセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列および前記蛍光タンパク質コード配列を含むマルチシストロン性核酸を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記マルチシストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列および緑色蛍光タンパク質コード配列を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含まない、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＮＬＳ−Ｃａｓコード配列が、タンパク質タグを含むＣａｓタンパク質をコードする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記Ｃａｓ発現カセットの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
前記Ｃａｓ発現カセットが、内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓ発現カセットが、外因性の構成的プロモーターに作動可能に連結されている、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号１３、１６、１９、または２２に記載の配列を含むタンパク質をコードする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号２８、２９、３０、または３１に記載の配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、または２１に記載の配列を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｃａｓ発現カセットが、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてホモ接合性である、項目１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記非ヒト動物が、マウスであり、
前記ＡＡＶが、静脈内注射によって前記非ヒト動物に送達されるＡＡＶ８であり、
前記Ｃａｓ発現カセットが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）ＮＬＳ−Ｃａｓ９コード配列を含み、
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中での前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の前記項目のいずれかに記載の方法を実施するステップ；
（ＩＩ）変数を変更し、第２の非ヒト動物において変更された前記変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変と、ステップ（ＩＩ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変とを比較し、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つまたは複数を有する標的ゲノム遺伝子座の改変をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
（項目４０）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ＡＡＶ血清型である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ガイドＲＮＡを前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目３９に記載の方法。
（項目４５）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目３９に記載の方法。
（項目４６）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸の濃度または量である、項目３９に記載の方法。
（項目４７）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、項目３９に記載の方法。
（項目４８）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、項目３９に記載の方法。
【図１】
2020532952.tif 000018
【図２】
2020532952.tif 000019
【図３Ａ】
2020532952.tif 000020
【図３Ｂ】
2020532952.tif 000021
【図３Ｃ】
2020532952.tif 000022
【図３Ｄ】
2020532952.tif 000023
【図３Ｅ】
2020532952.tif 000024
【図３Ｆ】
2020532952.tif 000025
【図４Ａ】
2020532952.tif 000026
【図４Ｂ】
2020532952.tif 000027
【図４Ｃ】
2020532952.tif 000028
【図５】
2020532952.tif 000029
【図６】
2020532952.tif 000030
【図７】
2020532952.tif 000031
【図８Ａ】
2020532952.tif 000032
【図８Ｂ】
2020532952.tif 000033
【図９】
2020532952.tif 000034
【図１０】
2020532952.tif 000035
【図１１】
2020532952.tif 000036
【図１２Ａ】
2020532952.tif 000037
【図１２Ｂ】
2020532952.tif 000038
【図１３】
2020532952.tif 000039
【図１４】
2020532952.tif 000040
【配列表】
2020532952000001.app
【国際調査報告】
2020532952.tif 000041
2020532952.tif 000042
2020532952.tif 000043
2020532952.tif 000044
2020532952.tif 000045
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