(57)【要約】ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン（そのうちの少なくとも１つのが、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインである）、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドが、本明細書に記載される。また、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である第１のポリペプチドおよび共刺激性シグナルを誘発する第２のポリペプチドを発現する遺伝学的に操作された免疫細胞、ならびに対象における抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を高める方法であって、治療上有効な量の治療抗体および有効な量の抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞）を、それを必要とする対象に投与することを特徴とする方法が本明細書に記載される。【選択図】なし
2020506697.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、
（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインであって、そのうちの少なくとも１つがＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインであるドメイン、および
（ｉｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドであって、膜貫通ドメイン（ｉｉ）が、ＣＤ８膜貫通ドメインである場合、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないか、または２つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含むものである、前記ポリペプチド
【請求項２】
ヒンジドメインをさらに含み、前記ヒンジドメインが、１〜６０アミノ酸残基の長さである、請求項１に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項３】
前記ヒンジドメインが、１〜３０アミノ酸残基の長さである、請求項２に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項４】
前記ヒンジドメインが、３１〜６０アミノ酸残基の長さである、請求項２に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項５】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ１６Ａヒンジドメイン、非ＣＤ１６Ａ受容体ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせである、請求項２に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項６】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ２８ヒンジドメインを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項７】
前記膜貫通ドメイン（ｉｉ）が、ＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項８】
（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン；および（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項９】
配列番号：９、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、または配列番号：２７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１０】
２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、１つが、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインであり、他の１つが、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインまたはＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインである、請求項１または２に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメイン（ｉｉ）が、ＣＤ８膜貫通ドメインである、請求項１０に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＤ８ヒンジドメインをさらに含む、請求項１１に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１３】
非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まない、請求項１に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１４】
（ｉ）ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および
（ｉｉｉ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドであって、前記ＡＣＴＲポリペプチドが、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないものである、前記ポリペプチド。
【請求項１５】
いずれのヒンジドメインを含まない、請求項１４に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１６】
１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１３または１４に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１７】
前記１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０からなる群から選択される、請求項１６に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１８】
２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１６または１７に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項１９】
２つの共刺激性シグナル伝達ドメインのうちの１つが、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインであり、他のもう１つが、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激性シグナル伝達ドメイン、またはＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達ドメインである、請求項１８に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２０】
前記他の共刺激性シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインである、請求項１９に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２１】
前記４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する、請求項２０に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２２】
前記他の共刺激性シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインである、請求項１９に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する、請求項２２に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２４】
単一の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、前記単一の共刺激性シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８に由来するものである、請求項１６に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２５】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインである、請求項２４に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＡＣＴＲポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：１３、または配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＡＣＴＲポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＡＣＴＲポリペプチドである第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２８】
共刺激性シグナルを誘発する第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
前記第２のポリペプチドが、共刺激受容体、そのリガンド、または共刺激受容体に対する結合部位を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
前記第２のポリペプチドが、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、またはＣＤ２８に対する結合部分を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３１】
前記結合部分が、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項２９または３０に記載の核酸。
【請求項３２】
前記第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３３】
前記第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬを含む、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
前記第１のポリペプチドが、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記第２のポリペプチドが、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第３のヌクレオチド配列が、リボソームスキッピング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または第２のプロモーターをコードする、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３６】
前記リボソームスキッピング部位が、Ｐ２Ａペプチドである、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
ベクター中に存在する、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３８】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項３７または３８に記載の核酸。
【請求項４０】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項３７または３８に記載の核酸。
【請求項４１】
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
請求項２７〜４１のいずれか１項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項４３】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドである第１のポリペプチドを発現する、免疫細胞。
【請求項４４】
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項４３に記載の免疫細胞。
【請求項４５】
共刺激ドメインまたは共刺激受容体のリガンドを含む第２のポリペプチドをさらに発現する、請求項４３または４４に記載の免疫細胞。
【請求項４６】
前記第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４５に記載の免疫細胞。
【請求項４７】
前記第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬを含む、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項４８】
対象における抗体依存性細胞傷害性を高める方法であって、（ｉ）有効な量の請求項４３〜４７のいずれかに記載の免疫細胞または請求項３７〜４１のいずれか１項に記載のベクター、および（ｉｉ）有効な量の治療抗体を、抗体依存性細胞傷害性を高める必要がある対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項４９】
前記治療抗体が、ＴＮＦ−アルファ、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＰＤＧＦ−Ｒ−アルファ、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、ＢＬｙＳ、ＣＤ３０、ＩＬ１−Ｂ、ＥＧＦＲ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＤ２、Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ５、アルファ−４インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＩｇＥ、ＲＳＶ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、インテグリン アルファ４−ベータ７、またはＰＳＭＡに対して特異的である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記治療抗体が、アダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツマブエムタンシン、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブからなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫細胞が、前記対象から単離された自己Ｔ細胞である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｔ細胞が、同種異系である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｔ細胞が、阻害されるか、除去される内在性Ｔ細胞受容体を有する、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｔ細胞が、投与前にエクスビボで増殖されるか、および／または活性化される、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、癌に罹っているか、または罹りやすいヒト患者である、請求項４８〜５４のいずれかに１項記載の方法。
【請求項５６】
抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現する免疫細胞の製造方法であって、請求項２７〜４１のいずれか１項に記載の核酸を、免疫細胞の集団に導入することを特徴とする方法。
【請求項５７】
前記ＡＣＴＲを発現する免疫細胞を同定し、または単離することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸が、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーションからなる群から選択される方法によって前記免疫細胞に導入される、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
（ｉ）抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である第１のポリペプチドであって、前記ＡＣＴＲがＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメインを含む、前記ポリペプチド；および
（ｉｉ）共刺激性シグナルを誘発する第２のポリペプチド
を発現する、遺伝学的に操作された免疫細胞。
【請求項６０】
前記ＡＣＴＲが、いずれの共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない、請求項５９に記載の遺伝学的に操作された免疫細胞。
【請求項６１】
前記第２のポリペプチドが、共刺激受容体、そのリガンド、または共刺激受容体に対する結合部分を含む、請求項５９または６０に記載の遺伝学的に操作された免疫細胞。
【請求項６２】
前記結合部分が、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項６１に記載の遺伝学的に操作された免疫細胞。
【請求項６３】
固形腫瘍の治療方法であって、
（ｉ）有効な量の１つまたはそれ以上のリンパ球枯渇剤を、それを必要とする対象に投与し；
（ｉｉ）抗ＣＤ２０抗体を（ｉ）後に前記対象に投与し；次いで
（ｉｉｉ）抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現する免疫細胞を、（ｉｉ）後に前記対象に投与すること
を特徴とし、前記ＡＣＴＲが、
（ａ）ＣＤ１６のＦｃ結合ドメイン、
（ｂ）ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および
（ｃ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン
を含むものである、方法。
【請求項６４】
前記ＡＣＴＲが、（ａ）と（ｂ）の間に位置するＣＤ２８に由来するヒンジドメインおよび／またはＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＤ１６が、ＣＤ１６Ｖアイソフォームである、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＡＣＴＲが、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記固形腫瘍が、リンパ腫である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、再発性または難治性ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫に罹っているヒト患者である、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記再発性または難治性ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫が、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、グレード３ｂ濾胞性リンパ腫（Ｇｒ３ｂ−ＦＬ）、および組織学的形質転換された濾胞性リンパ腫（ＴＨ−ＦＬ）からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記１つまたはそれ以上のリンパ球枯渇剤が、フルダラビンおよびシクロホスファミドである、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＡＣＴＲを発現するＴ細胞が、４０ｘ１０６個の細胞、８０ｘ１０６個の細胞、１５０ｘ１０６個の細胞、または３００ｘ１０６個の細胞の用量で前記対象に投与されるものである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象が、工程（ｉｉｉ）の前および後に抗ＣＤ２０抗体で投与されるものである、請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＡＣＴＲを発現する免疫細胞が、前記対象から免疫細胞を回収し、次いで前記ＡＣＴＲをコードする核酸を、前記ＡＣＴＲの発現のために前記免疫細胞に導入することによって調製される、請求項６３〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記回収工程が、白血球除去輸血を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記対象が、疾患管理のための化学療法を受けたか、または当該化学療法中である、請求項６３〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
対象における細胞傷害性を誘発するための方法であって、
（ｉ）活性化Ｔ細胞の表面上で発現される抗原に特異的な抗体；および
（ｉｉ）抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現するＴ細胞
を誘発を必要とする対象に投与することを特徴とし、前記ＡＣＴＲが、
（ａ）Ｆｃ結合ドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン；
（ｃ）少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメイン；および
（ｄ）免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含み、（ｃ）または（ｄ）が、前記キメラ受容体のＣ末端に位置するものである、方法。
【請求項７９】
前記Ｆｃ結合ドメインが、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記共刺激性シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢまたはＣＤ２８のものである、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＡＣＴＲが、（ａ）と（ｂ）との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項７８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζのものである、請求項７８〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＡＣＴＲが、
（ａ）ＣＤ１６のＦｃ結合ドメイン；
（ｂ）ＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、またはこれらの組み合わせ；
（ｃ）ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および
（ｄ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＡＣＴＲが、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体が、ＣＤ３８、ＣＤ７、またはＣＤ５に特異的である、請求項７８〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＡＣＴＲを発現するＴ細胞が、インビトロで増殖される、請求項７８〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
（ｉ）活性化Ｔ細胞上で発現される抗原に特異的な抗体、および
（ｉｉ）抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現するＴ細胞
を含む、キットであって、前記ＡＣＴＲが、
（ａ）Ｆｃ結合ドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン；
（ｃ）少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメイン；および
（ｄ）免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含み、（ｃ）または（ｄ）が、前記キメラ受容体のＣ末端に位置するものである、キット。
【請求項８９】
前記Ｆｃ結合ドメインが、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである、請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６である、請求項８９に記載のキット。
【請求項９１】
前記共刺激性シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢまたはＣＤ２８のものである、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９２】
前記ＡＣＴＲが、（ａ）と（ｂ）との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項８８〜９１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９３】
前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζのものである、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９４】
前記ＡＣＴＲが、
（ａ）ＣＤ１６のＦｃ結合ドメイン；
（ｂ）ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；
（ｃ）ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および
（ｄ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、請求項８８〜９３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９５】
前記ＡＣＴＲが、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記抗体が、ＣＤ３８、ＣＤ７、またはＣＤ５に特異的である、請求項８８〜９５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９７】
前記ＡＣＴＲを発現するＴ細胞が、インビトロで増殖される、請求項８８〜９６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月３０日提出の米国仮出願番号第６２／４５１，９９２号および２０１７年１０月２８日提出の米国仮出願番号第６２／５７８，４２９号の出願日の利益を請求する。これらの関連出願の各々の全内容は出典明示により本明細書に取り込まれるものである。
【背景技術】
【０００２】
開示の背景
癌免疫療法（細胞に基づく治療、抗体治療およびサイトカイン治療を含む）は、正常組織を残しつつ腫瘍細胞を攻撃する免疫応答を引き起こすために用いられる。これは、薬物耐性の遺伝学的および細胞メカニズムを逃れ、正常組織を残しつつ腫瘍細胞を標的とする可能性のため、種々のタイプの癌を治療するための有望な選択肢である。Ｔリンパ球は、血液学的悪性腫瘍に対する同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の結果によって示されるように大きな抗腫瘍効果を発揮することができ、Ｔ細胞介在の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、疾患再発を逆に併い、そしてドナーリンパ球の免疫抑制の中止または注入は、再発を含みうる。Weiden et al., NEnglJ Med. 1979; 300(19):1068-1073; Porter et al., NEnglJ Med. 1994; 330(2):100-106; Kolb et al., Blood. 1995;86(5):2041-2050; Slavin et al., Blood. 1996;87(6):2195-2204; およびAppelbaum, Nature. 2001;4 11(6835):385-389.
【０００３】
細胞に基づく治療は、癌細胞に傾いている反応性を有する細胞傷害性Ｔ細胞に関しうる。Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 1993;90(2):720-724; Geiger et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003;9(3):279-286; Cooper et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644; およびImai et al., Leukemia. 2004;18:676-684.１つのアプローチは、１つまたはそれ以上のＴ細胞活性化シグナル伝達ドメインに融合させた抗原結合ドメインを有するキメラ受容体を発現させることである。癌抗原の抗原結合ドメインを介した結合は、Ｔ細胞の活性化を生じ、細胞傷害性の引き金となる。キメラ受容体発現自己Ｔリンパ球の注入による臨床試験の最近の結果により、これらの臨床的可能性の有力な証拠が示された。Pule et al., Nat. Med. 2008;14(11):1264-1270; Porter et al., N Engl J Med; 2011; 25;365(8):725-733; Brentjens et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828; Till et al., Blood. 2012;119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720; およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138.  
【０００４】
別のアプローチとして、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）において、細胞外Ｆｃ結合ドメインを含有する抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）タンパク質を発現させることである。ＡＣＴＲを発現するＴ細胞（「ＡＣＴＲＴ細胞」とも呼ばれる）が抗癌抗体とともに対象に投与されると、それらは、その抗体のＦｃドメインへのこれらの結合によりその抗体が標的とする癌細胞に対する毒性を高めうる。Kudo et al., Cancer Research (2014) 74:93-103.
【０００５】
抗体に基づく免疫療法、例えば、モノクローナル抗体、抗体融合タンパク質、および抗体薬物抱合（ＡＤＣ）は、多くのタイプの癌を含む多種多様な疾患を治療するために用いられる。このような治療は、正常細胞（例えば、非癌細胞）と比較して、除去が望まれている細胞（例えば、癌細胞などの標的細胞）上で異なって発現されている細胞表面分子の認識に依存しうる。抗体に基づく免疫療法剤の癌細胞への結合は、種々のメカニズム、例えば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、または抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）のペイロードによる直接的な細胞傷害活性により、癌細胞の死を引き起こすことができる。
【発明の概要】
【０００６】
開示の概要
本開示は、優れたインビトロおよび／またはインビボ生物学的活性（治療活性を含む）を示した改善された抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）の開発に基づくものである。このような改善されたＡＣＴＲ構築物は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含みうる。代替として、または加えて、本明細書に記載される改善されたＡＣＴＲ構築物は、ヒンジドメインを有しないか、短いヒンジドメインを有していてもよい。本明細書に記載される改善されたＡＣＴＲ構築物を発現するＴ細胞は、単独で、または共刺激性シグナル伝達を誘発することができる別のポリペプチドと組み合わせて、優れたインビボおよびインビトロ生物学的活性（細胞傷害性、細胞増殖、および活性化（例えば、ＩＬ−２産生、ＣＤ３＋細胞の割合）を含む）および／またはインビボ抗腫瘍活性を示した。
【０００７】
従って、１つまたはそれ以上の生物学的活性が高まったＡＣＴＲポリペプチド、これをコードする核酸、前記ＡＣＴＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）、ならびに必要に応じて、共刺激性シグナル伝達を誘発することができる別のポリペプチド、および免疫療法において、治療抗体とともに前記ＡＣＴＲの使用が、本明細書において提供される。
【０００８】
従って、本開示の１つの態様は、（ｉ）ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン（そのうちの少なくとも１つは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインである）、および（ｉｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドを特徴とする。
【０００９】
本開示の別の態様は、（ｉ）ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン（そのうちの少なくとも１つは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインである）、および（ｉｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドを特徴とする。前記膜貫通ドメイン（ｉｉ）が、ＣＤ８膜貫通ドメインである場合、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないか、または２つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含むものである。
【００１０】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、ヒンジドメインを含み、前記ヒンジドメインは、１〜６０アミノ酸残基の長さ（例えば、１〜３０アミノ酸残基の長さまたは３１〜６０アミノ酸残基の長さ）であってもよい。他の実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないものであってもよい。ある例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、いずれのヒンジドメインも含まないものでありうる。
【００１１】
ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ１６Ａヒンジドメイン、非ＣＤ１６Ａ受容体ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせである。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメインを含む。
【００１２】
ある実施態様において、前記膜貫通ドメイン（ｉｉ）は、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。この場合、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないものであってもよく、および／または２つ以上の共刺激ドメインを含んでいてもよい。
【００１３】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン；および（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１４】
ある例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：９、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、または配列番号：２７で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含むものであって、１つは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインであり、他のもう１つは、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインまたはＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、前記他の共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、前記４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する。ある実施態様において、前記４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する。ある実施態様において、前記他の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、前記ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する。ある実施態様において、前記ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する。
【００１６】
ある実施態様において、前記膜貫通ドメイン（ｉｉ）は、ＣＤ８膜貫通ドメインである。
【００１７】
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれもが、ＣＤ８ヒンジドメインをさらに含みうる。ある例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：７または配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
１の態様において、本開示は、（ｉ）ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドを提供する。このようなＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないものであってもよい（例えば、いずれのヒンジドメインも含まない）
【００１９】
ある実施態様において、ＡＣＴＲポリペプチドは、１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインをさらに含む。ある実施態様において、前記１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０からなる群から選択される。
【００２０】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインのうちの１つは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインであり、他のもう１つは、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激性シグナル伝達ドメイン、またはＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、前記他の共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、前記４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する。ある実施態様において、前記４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する。ある実施態様において、前記他の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、前記ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に位置する。ある実施態様において、前記ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する。
【００２１】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、単一（すなわち、わずか１つ）の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、前記単一の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来する。ある実施態様において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。特定の実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：２、配列番号：１３、または配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
１の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドである第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、適宜、共刺激性シグナルを誘発する第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含んでいてもよい、核酸を提供する。ある実施態様において、前記第２のポリペプチドは、共刺激性シグナル伝達ドメイン、共刺激受容体、共刺激受容体に対する結合部分、または共刺激受容体のリガンドを含む。ある実施態様において、前記第２のポリペプチドは、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、またはＣＤ２８に対する結合部分（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ））を含みうる。ある実施態様において、前記第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、前記第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬであってもよい。
【００２３】
ある例において、前記第１のポリペプチドは、配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記第２のポリペプチドは、配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含む。ある例において、前記第１のポリペプチドは、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記第２のポリペプチドは、配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ある実施態様において、前記核酸は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列をさらに含むものであって、前記第３のヌクレオチド配列は、リボソームスキッピング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または第２のプロモーターをコードするものである。ある実施態様において、前記リボソームスキッピング部位は、Ｐ２Ａペプチドである。
【００２５】
ある実施態様において、前記核酸は、ベクター中に存在する。ある実施態様において、前記ベクターは、発現ベクターである。ある実施態様において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ある実施態様において、前記ベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【００２６】
１の態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸を含む、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、前記宿主細胞は、免疫細胞である。
【００２７】
１の態様において、本開示は、本明細書に記載される抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である第１のポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を提供する。ある実施態様において、前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、共刺激ドメインまたは共刺激受容体のリガンドを含む第２のポリペプチドをさらに発現する。ある実施態様において、前記第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、前記第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬを含む。
【００２８】
１の態様において、本開示は、対象における抗体依存性細胞傷害性を高めるための方法であって、有効な量の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または本明細書に記載されるベクター、および有効な量の治療抗体を、これを必要とする対象に投与することを特徴とする方法を提供する。
【００２９】
ある実施態様において、前記治療抗体は、ＴＮＦ−アルファ、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＰＤＧＦ−Ｒ−アルファ、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、ＢＬｙＳ、ＣＤ３０、ＩＬ１−Ｂ、ＥＧＦＲ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＤ２、Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ５、アルファ４インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＩｇＥ、ＲＳＶ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＦＯＬＲ１（葉酸受容体アルファ）、ルイスＹ、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）、Ｂ７−Ｈ２（ＰＤ−ＤＣ、ＣＤ２７３）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３８（シンデカン−１）、インテグリン アルファ４−ベータ７、またはＰＳＭＡに特異的である。
【００３０】
ある実施態様において、前記治療抗体は、アダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツマブエムタンシン、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブからなる群から選択される。
【００３１】
ある実施態様において、前記免疫細胞は、対象から単離された自己Ｔ細胞である。他の実施態様において、前記免疫細胞は、同種異系Ｔ細胞である。ある実施態様において、前記免疫細胞は、阻害されるか、または除去される内在性Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞である。
【００３２】
ある実施態様において、前記免疫細胞は、投与前にエクスビボで増殖され、および／または活性化されるＴ細胞である。
【００３３】
ある実施態様において、前記対象は、癌に罹っているか、または罹りやすいヒト患者である。
【００３４】
別の態様において、本開示は、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現する免疫細胞を製造するための方法であって、本明細書に記載される核酸のいずれかを免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団に導入することを含む方法を提供する。ある実施態様において、前記方法は、前記ＡＣＴＲを発現する免疫細胞を同定し、または単離することをさらに含む。
【００３５】
ある実施態様において、前記核酸は、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーション、およびＲＮＡエレクトロポレーションからなる群から選択される方法によって免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に導入される。
【００３６】
１の態様において、本開示は、（ｉ）抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）（例えば、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメインを含むＡＣＴＲ）である第１のポリペプチド；および（ｉｉ）共刺激性シグナルを誘発する第２のポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された免疫細胞を提供する。ある例において、前記第２のポリペプチドは、共刺激受容体、そのリガンド、または共刺激受容体に対する結合部分（例えば、一本鎖抗体）を含みうる。例として、下記に限定されないが、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２７もしくはＣＤ２８、これらのリガンド、またはこのような受容体に対する結合部分が含まれる。
【００３７】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲは、共刺激性シグナル伝達ドメインのいずれも含まない。
【００３８】
別の態様において、本開示は、固形腫瘍（例えば、リンパ腫）を治療するための前記ＡＣＴＲ発現免疫細胞を抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用する方法を提供する。ある実施態様において、前記方法は、（ｉ）有効な量の１つまたはそれ以上のリンパ球枯渇剤（例えば、フルダラビン、シクロホスファミド、またはこれらの組み合わせ）を、使用を必要とする対象に投与し；（ｉｉ）（ｉ）後に抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）を前記対象に投与し；次いで（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を前記対象に投与することを含む。前記ＡＣＴＲは、（ａ）ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ｖアイソフォーム）のＦｃ結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および（ｃ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。所望により、前記ＡＣＴＲは、（ａ）と（ｂ）との間に位置する、ＣＤ２８に由来するヒンジドメインおよび／またはＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインをさらに含みうる。１の例において、前記ＡＣＴＲは、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
この方法によって治療される対象は、再発性または難治性ＣＤ２０＋リンパ腫、例えば、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、グレード３ｂ濾胞性リンパ腫（Ｇｒ３ｂ−ＦＬ）、および組織学的形質転換された濾胞性リンパ腫（ＴＨ−ＦＬ）に罹っているヒト患者でありうる。ある例において、前記患者は、疾患管理のための化学療法を受けていたか、または当該化学療法中である。ある実施態様において、前記免疫細胞は、４０ｘ１０６個の細胞、８０ｘ１０６個の細胞、１５０ｘ１０６個の細胞、または３００ｘ１０６個の細胞の用量で前記対象に投与することができるＴ細胞である。ある実施態様において、前記対象は、工程（ｉｉｉ）の前または後に抗ＣＤ２０抗体が投与される。
【００４０】
前記ＡＣＴＲを発現する免疫細胞は、免疫細胞を前記対象から回収し、次いで前記ＡＣＴＲをコードする核酸を前記ＡＣＴＲの発現のための免疫細胞に導入することによって製造しうる。ある場合において、前記回収工程は、白血球除去輸血を含む。
【００４１】
さらに、本開示は、活性化Ｔ細胞上にも存在する表面抗原を発現する細胞に関連する疾患を治療するための方法およびキットを提供する。例えば、細胞傷害性を対象に導入するための方法であって、（ｉ）活性化Ｔ細胞の表面上で発現される抗原（例えば、ＣＤ５、ＣＤ３８、またはＣＤ７）に特異的な抗体；および（ｉｉ）抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現するＴ細胞を、導入を必要とする対象に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。前記ＡＣＴＲは、（ａ）Ｆｃ結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６などのＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン）；（ｂ）（例えば、ＣＤ２８の）膜貫通ドメイン；（ｃ）少なくとも１つの（例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢの）共刺激性シグナル伝達ドメイン；および（ｄ）免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）（例えば、ＣＤ３ζのもの）を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。（ｃ）または（ｄ）は、前記キメラ受容体のＣ末端に位置する。ある例において、前記ＡＣＴＲは、（ａ）と（ｂ）との間に位置するヒンジドメイン（例えば、ＣＤ２８に由来するもの）をさらに含みうる。ある例において、前記ＡＣＴＲは、（ａ）ＣＤ１６のＦｃ結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ２８のヒンジおよび膜貫通ドメイン；（ｃ）ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および（ｄ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。１の例において、前記ＡＣＴＲは、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲを発現するＴ細胞は、インビトロで増殖される。
【００４２】
活性化Ｔ細胞上で発現される抗原（例えば、ＣＤ５、ＣＤ３８、またはＣＤ７）に特異的な抗体、および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現するＴ細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含むキットもまた、本明細書において提供される。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲを発現するＴ細胞は、インビトロで増殖される。
【００４３】
本開示の１つまたはそれ以上の実施態様の詳細は、下記の記載で説明されている。本開示の他の特徴または利点は、いくつかの実施態様の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに示すために含まれるものであり、１つまたはそれ以上のこれらの図面を、本明細書で示される特定の実施態様の詳細な説明と合わせて参照することによりさらによく理解することができる。
【図１】図１は、ＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞とＣＤ２０特異的抗体リツキシマブとを組み合わせてインキュベートさせたＣＤ２０発現ラージ標的細胞の細胞傷害性を示す一連のグラフを含む。細胞傷害性の用量依存的な増加が、ＡＣＴＲ変異体（（Ａ）配列番号：７、（Ｂ）配列番号：８、（Ｃ）配列番号：９、（Ｄ）配列番号：１３）をコードするヌクレオチドの発現で観察された。
【図２】図２は、ＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞とＨＥＲ２特異的抗体トラスツマブとを組み合わせてインキュベートさせたＨＥＲ２発現ＨＣＣ１９５４標的細胞の細胞傷害性を示す一連のグラフを含む。細胞傷害性の用量依存的な増加が、ＡＣＴＲ変異体（（Ａ）配列番号：７、（Ｂ）配列番号：８、（Ｃ）配列番号：９、（Ｄ）配列番号：１３、および（Ｅ）配列番号：３８／配列番号：３９）をコードするヌクレオチドの発現で観察された。
【図３】図３は、ＣＤ２０発現ラージ標的細胞およびＣＤ２０特異的抗体リツキシマブでインキュベートさせたＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞によるＩＬ−２産生を示す一組のグラフである。ＩＬ−２放出の用量依存的な増加が、ＡＣＴＲ変異体（（Ａ）配列番号：７、（Ｂ）配列番号：８、（Ｃ）配列番号：９、（Ｄ）配列番号：１３、および（Ｅ）配列番号：３８／配列番号：３９）をコードするヌクレオチドの発現で観察された。モック細胞は、ＩＬ−２の増加を示されなかった（Ｄ、Ｅ）。
【図４】図４は、ＨＥＲ２発現ＨＣＣ１９５４標的細胞およびＨＥＲ２特異的抗体トラスツマブでインキュベートさせたＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞によるＩＬ−２産生を示す一組のグラフである。ＩＬ−２放出の用量依存的な増加が、ＡＣＴＲ変異体（（Ａ）配列番号：７、（Ｂ） 配列番号：８、（Ｃ）配列番号：９、（Ｄ）配列番号：１３、および（Ｅ）配列番号：３８／配列番号：３９）をコードするヌクレオチドの発現で観察された。モック細胞は、ＩＬ−２の増加を示さなかった（Ｄ、Ｅ）。
【図５】図５は、ＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を、ＣＤ２０発現ラージ標的細胞とＣＤ２０特異的抗体リツキシマブの存在もしくは非存在下でインキュベートさせ、７日間インキュベートさせた場合の開始時のＴ細胞数と比較したＣＤ３＋細胞数の増加を示す一組のグラフである。０日目の細胞数と比較したＣＤ３＋細胞の増加を、各条件ごとにプロットした。ＣＤ３＋細胞における抗体依存的な増加が、ＡＣＴＲ変異体（（Ａ）配列番号：７、（Ｂ）配列番号：９、（Ｃ）配列番号：１３、および（Ｄ）配列番号：３８／配列番号：３９）をコードするヌクレオチドの発現で観察された。
【図６】図６は、ＡＣＴＲ変異体（配列番号：７、９、１３、および３８／配列番号：３９）を発現するＴ細胞の抗腫瘍活性を示す一組のグラフである。マウスにラージ腫瘍細胞を接種し、５つの処理群に分け、そしてベヒクルコントロール（生理食塩水；白丸および黒色実線）、リツキシマブ抗ＣＤ２０抗体のみ（１００μｇ／マウスまたは５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、４、１１、１８、２５日目；灰色の塗りつぶした四角形と実線）、ＡＣＴＲ Ｔ細胞変異体のみ（１ｘ１０７細胞、ＩＶ、５、１２日目；白色三角と黒色点線）、または同一薬剤として同一の用量と日数でリツキシマブとＡＣＴＲ Ｔ細胞変異体との組み合わせ（黒塗り円形と黒色実線）、あるいは抗ＣＤ１９ ＣＡＲ変異体を発現するＴ細胞（１ｘ１０７細胞、ＩＶ、５、１２日目；灰色のダイヤ形と点線）のいずれかで処理した。次いで、マウスを、ＩＶＩＳスペクトラムを用いて腫瘍の生物発光のために１週間に２回イメージ化した。光子／秒として表される腫瘍組織量を時間経過とともにプロットする。**ｐ＜０．０１、****ｐ＜０．０００１（リツキシマブコントロールと比較、シダック多重比較検定に用いた二因子ＡＮＯＶＡ）
【図７】図７は、リツキシマブでオプソニン化された標的細胞とＡＣＴＲ変異体をコードする核酸の配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：３８／配列番号：３９、およびＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞とで３〜４日ごとに刺激を繰り返した後のＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図８】図８は、ＡＣＴＲ変異体（配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１３、および配列番号：３８／配列番号：３９、ならびにＣＤ１９ ＣＡＲ）をコードする核酸を発現するＴ細胞による各再刺激後のリツキシマブでオプソニン化されたラージ標的細胞に対する細胞傷害性を示す一組のグラフである。前回時点における標的細胞数と比較したラージ標的細胞数の倍率変化を時間に応じてプロットする。前記データは、線グラフ（Ａ）および棒グラフ（Ｂ）としてプロットする。１未満の値は、標的細胞の増殖と細胞傷害性のコントロールを示す。
【図９】図９は、ＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を新鮮なＣＤ２０＋ラモス腫瘍細胞およびリツキシマブで３〜４日ごとに誘発した「ストレス試験」で刺激を繰り返したときのＡＣＴＲ変異体 配列番号：９の活性を示すグラフである。合計のＴ細胞および標的細胞の数を時間に応じてプロットする。
【図１０】図１０は、複数の細胞株および症状におけるＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の腫瘍標的抗体と組み合わせたＴ細胞活性（ＩＬ−２放出、増殖）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、リツキシマブ、ＣＤ２０＋腫瘍細胞、およびＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を用いた結合アッセイの結果を示す一組のグラフである。図１１、パネルＡは、フローサイトメトリーにより調べられるように、リツキシマブのＣＤ２０＋リンパ腫腫瘍細胞ラージ、ダウディ、およびＲＬに対して結合を示すが、ＣＤ２０陰性細胞株Ｋ５６２に対してはほとんどか全く結合を示さない。図１１、パネルＢは、フローサイトメトリーにより調べられるように、リツキシマブのＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞に対する結合を示す。
【図１２】図１２は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞の活性化についての仮説モデルの図を示す。低親和性天然Ｔ細胞受容体およびＦｃ受容体と同様に、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＡＣＴＲが腫瘍細胞の表面に結合した複数のリツキシマブ分子に結合する場合に構造親和性による活性化される。
【図１３】図１３は、（Ａ、Ｂ）モックまたはＡＣＴＲ変異体 配列番号：９発現Ｔ細胞のいずれかの増加細胞用量および１μｇ／ｍＬのリツキシマブの存在下のＣＤ２０＋腫瘍細胞を用いた細胞傷害性アッセイの結果；および（Ｃ）ＣＴＲ発現Ｔ細胞および２：１のＥ：Ｔ（エフェクター対標的細胞）比におけるリツキシマブの増加濃度の存在下のＣＤ２０＋腫瘍細胞を用いた細胞傷害性の結果を示す一組のグラフである。
【図１４】図１４は、（Ａ、Ｂ）ＣＤ２０＋腫瘍細胞および２：１のＥ：Ｔ（エフェクター対標的細胞）比におけるリツキシマブの増加濃度の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞についてのサイトカイン放出アッセイの結果；および（Ｃ）ＣＤ２０＋腫瘍細胞および１：１のＥ：Ｔ（エフェクター対標的細胞）比におけるリツキシマブの増加濃度の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の増殖アッセイの結果を示す一組のグラフである。
【図１５】図１５は、ＣＤ２０＋ラモスまたはＣＤ２０陰性腫瘍細胞およびリツキシマブまたはトラスツマブ（抗ＨＥＲ２）の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の（Ａ）細胞傷害性、（Ｂ）ＩＬ−２産生、および（Ｃ）Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示す一組のグラフである。抗体は、４μｇ／ｍＬの最終濃度で用いた。これらのグラフでは、強力なＡＣＴＲ Ｔ細胞活性は、抗体（リツキシマブ）および同種抗原を発現する標的（ＣＤ２０発現ラモス細胞）の存在下でのみ観察されることを示す。
【図１６】図１６は、ラージ細胞、１μｇ／ｍＬのリツキシマブ、および増加濃度（０ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ）のヒトＩｇＧ（３６００倍未満のリツキシマブ）の存在下のモックＴ細胞およびＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞についてのサイトカイン産生アッセイの結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、（Ａ）正常な免疫細胞および多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９におけるＩＬ−６Ｒのフローサイトメトリー定量化；および（Ｂ）トシリズマブ（抗ＩＬ−６Ｒ抗体）のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞またはモックＴ細胞に対する結合アッセイの結果を示す一組のグラフである。
【図１８】図１８は、ＩＬ−６Ｒ＋ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞およびトシリズマブの増加濃度とともにＴ細胞の非存在下またはＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞もしくはモックＴ細胞の存在下の（Ａ）細胞傷害性および（Ｂ）サイトカイン放出アッセイの結果を示す一組のグラフである。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞および抗ＣＤ３８陽性コントロール抗体の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞が陽性コントロールと同一条件下で示される。
【図１９】図１９は、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞を、異なる用量のリツキシマブ、抗ＣＤ１９−ＣＡＲを発現するＴ細胞、リツキシマブのみ、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞のみ、またはコントール処理と組み合わせて用いた侵襲性ラージ異種移植片を有するマウスの生存率を示すグラフである。リツキシマブは、腫瘍接種後４日目、その後１週間に１回で合計４回の用量を投薬した。Ｔ細胞（ＡＣＴＲまたはＣＡＲ）の１ｘ１０７個の用量を腫瘍接種後５日目に投与した。
【図２０】図２０は、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の１または２回用量を、リツキシマブ、リツキシマブのみ、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞のみ、またはコントロール処理と組み合わせて用いた侵襲性ラージ異種移植片を有するマウスの生存率を示すグラフである。リツキシマブ（１００μｇ）は、腫瘍接種後４日目、その後１週間に１回で合計４回の用量を投薬した。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の１ｘ１０７個の１回もしくは２回用量をリツキシマブ投与後５日目または５日目および１２日目、１日目に付与した。
【図２１】図２１は、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現する３種類の特有の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）ドナー（ＮＨＬ１、ＮＨＬ２、およびＮＨＬ３）に由来するＴ細胞を用いた実験の結果を示す一組のグラフである。図２１、パネルＡは、３種類の特有の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）ドナーのＰＢＭＣから作成したＴ細胞におけるＡＣＴＲ変異体 配列番号：９の発現レベルを示す。１：１のＥ：ＴにおけるＣＤ２０＋腫瘍細胞およびリツキシマブの増加濃度の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９発現Ｔ細胞によるサイトカイン放出を図２１、パネルＢに示す。１：１のＥ：Ｔ比におけるＣＤ２０＋腫瘍細胞およびリツキシマブの増加濃度の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の増殖を図２１、パネルＣに示す。
【図２２】図２２は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞を例示的な治療抗体としてのリツキシマブと組み合わせた再発性または難治性ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫に罹っている患者のための例示的な治療スケジュールを示す図である。
【図２３】図２３は、ＨＥＲ２増殖細胞株（ＯＥ１９、Ｎ８７、およびＳＫＢＲ３）および非ＨＥＲ２増殖細胞株（ＭＣＦ７およびＫＡＴＯＩＩＩ）におけるＨＥＲ２タンパク質の発現を示すグラフである。ＨＥＲ２発現レベルは、抗ヒトＨＥＲ２抗体による染色後にフローサイトメトリーにより調べた。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、各細胞株についてプロットする。
【図２４】図２４は、ＨＥＲ２増殖および非ＨＥＲ２増殖細胞株ならびにトラスツマブ（抗ＨＥＲ２）の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞における（Ａ）細胞傷害性、（Ｂ）サイトカイン産生、および（Ｃ）Ｔ細胞の増殖についてのアッセイの結果を示す一組のグラフである。抗体は、５μｇ／ｍＬの最終濃度で用いた。
【図２５】図２５は、ＨＥＲ２増殖および非ＨＥＲ２増殖細胞株の存在下のトラスツマブに基づくＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞の（Ａ）細胞傷害性、（Ｂ）サイトカイン産生、および（Ｃ）Ｔ細胞の増殖についてのアッセイの結果を示す一組のグラフである。
【図２６】図２６は、（Ａ）トラスツマブならびにＨＥＲ２増殖および非ＨＥＲ２増殖細胞株の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の増殖；ならびに（Ｂ）ＨＥＲ２増殖および非ＨＥＲ２増殖細胞株の存在下のＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖についてのアッセイの結果を示す一組のグラフである。０日目における合計のＴ細胞の入力は、１００，０００個の細胞であった。Ｔ細胞は、ＣＤ３についての染色後のフローサイトメトリーにより６日目に定量化し、合計のＴ細胞は、ＡＣＴＲによる実験についての各標的細胞株に対する抗体濃度に応じて（Ａ）、またはＣＡＲ Ｔ細胞による実験についての標的細胞に応じて（Ｂ）プロットする。
【図２７】図２７は、約８０ｍｍ３の開始体積の皮下にＮ８７胃異種移植された腫瘍を有する雌ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスにおける、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞をトラスツマブと組み合わせたインビボ投薬計画を示す図である。トラスツマブ（１００μｇ／マウス、ＩＰ）は、腫瘍接種後７日に開始して１週間に１回で４週間投薬した。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞またはトラスツマブに基づくＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞（１．５ｘ１０７個の合計Ｔ細胞）は、腫瘍細胞接種後８日目に介して１週間に１回で２週間投薬した。コントロールマウスに同一のスケジュールでベヒクルのみを投与した。
【図２８】図２８は、図２７に示す結果を示すグラフである。平均腫瘍体積は、処理群：ベヒクル、トラスツマブのみ、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞のみ、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞とトラスツマブ、および抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞について時間に応じてプロットする。
【図２９】図２９は、ＨＥＲ２増殖腫瘍系（Ｎ８７）細胞；非ＨＥＲ増殖腫瘍系（ＭＣＦ７）細胞；ＨＥＲ２陰性細胞株（ダウディ）細胞；および種々の正常細胞株（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、または腎臓上皮）におけるＨＥＲ２発現を示す図である。ＨＥＲ２レベルは、抗ヒトＨＥＲ２抗体による染色後にフローサイトメトリーにより測定した。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図３０】図３０は、（Ａ）ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞とトラスツマブ（５μｇ／ｍＬ）との組み合わせ；または（Ｂ）トラスツマブに基づくＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた細胞傷害性アッセイの結果を示す一組のグラフである。標的細胞は、Ｎ８７（ＨＥＲ２増殖）、ＭＣＦ７（ＨＥＲ２低）、ダウディ（ＨＥＲ２陰性）、および正常細胞株（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、または腎臓上皮）である。
【図３１】図３１は、トラスツマブ（Ａ）および抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｂ）の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞および正常な初代細胞（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、または腎臓上皮）のサイトカイン放出プロフィール（ＩＬ−２）を示す一組のグラフである。ＨＥＲ２増殖腫瘍系（Ｎ８７）細胞；非ＨＥＲ増殖腫瘍系（ＭＣＦ７）細胞；およびＨＥＲ２陰性細胞系（ダウディ）細胞をコントロールとして示す。
【図３２】図３２は、トラスツマブ（Ａ）および抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｂ）の存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞および正常な初代細胞（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、または腎臓上皮）のサイトカイン放出プロフィール（ＩＦＮ−γ）を示す一組のグラフである。ＨＥＲ２増殖腫瘍系（Ｎ８７）細胞；非ＨＥＲ増殖腫瘍系（ＭＣＦ７）細胞；およびＨＥＲ２陰性細胞系（ダウディ）細胞をコントロールとして示す。
【図３３】図３３は、フローサイトメトリーにより調べられるように、（Ａ）多発性骨髄腫およびリンパ腫細胞株（ＣＤ３８陰性コントロール細胞株としてＵ２６６Ｂ１とともに）；（Ｂ）多発性骨髄腫患者に由来する形質細胞（ＲＰＭＩ−８２２６、ＫＭＳ−２０、およびＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞株との比較）；（Ｃ）２人の健常ドナーに由来するＰＢＭＣ部分集団；および（Ｄ）５人の健常ドナーに由来する赤血球の表面上のＣＤ３８発現を示す一組のグラフである。平均蛍光強度は、評価した各細胞型についてプロットする。
【図３４】図３４は、フローサイトメトリーにより測定されるように、活性化させたＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞の表面上のＣＤ３８発現を示す一組のグラフである。結果は、ダウディ標的細胞のみ、リツキシマブのみ（１μｇ／ｍＬ）、またはダウディ標的細胞およびリツキシマブ（１μｇ／ｍＬ）で刺激したＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞について示す。前記平均蛍光強度は、合計のＴ細胞（Ａ）およびＡＣＴＲ陽性Ｔ細胞（Ｂ）について時間に応じてプロットする。
【図３５】図３５は、抗ヒトＣＤ３および抗ヒトＣＤ２８活性化抗体で活性化させ、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で１０日間増殖させたＴ細胞の倍率増殖（fold expansion）（Ａ）、生存能力（Ｂ）、細胞サイズ（Ｃ）、およびＣＤ３８発現（Ｄ）を示す一組のグラフである。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞、およびＣＤ３８標的ＴＨＢ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、必要に応じて３日目にＡＣＴＲまたはＣＡＲをコードするウイルスを用いて形質導入し；モックＴ細胞は、形質導入しなかった。
【図３６】図３６は、ダラツムマブの存在下で（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ９２９、（Ｂ）ＭＭ．１Ｓ、（Ｃ）ＲＰＭＩ−８２２６、または（Ｄ）ダウディ標的細胞と培養したモックＴ細胞またはＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞について観察された細胞傷害性を示す一組のグラフである。細胞傷害率は、抗体濃度に応じてプロットする。
【図３７】図３７は、ダラツムマブでオプソニン化させたＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在下でインキュベートしたＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞からのＩＬ−２（Ａ）およびＩＦＮ−γ（Ｂ）の産生を示す一組のグラフである。モックＴ細胞によるサイトカインの産生（プロットせず）は、標準曲線の線の範囲より下であった。
【図３８】図３８は、ダラツムマブでオプソニン化させたＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ 標的細胞の存在下のモックＴ細胞またはＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞についての増殖アッセイの結果を示す一組のグラフである。合計のＴ細胞数は、パネルＡおよびＢにおいてダラツムマブ抗体濃度に応じてプロットする。図３８、パネルＣにおいて、ＣＤ１６＋細胞の頻度（％）は、合計のＣＤ３＋Ｔ細胞のゲート（gate）内で算出し、ダラツムマブ抗体濃度に応じてプロットした。
【図３９】図３９は、ドナー適合ＰＢＭＣおよびＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞（ＭＭ細胞）および１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのダラツムマブとインキュベートさせたモックＴ細胞（Ａ）またはＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞（Ｂ）についての抗体特異的な細胞傷害性アッセイの結果を示す一組のグラフである。反応物をフローサイトメトリーにより分析して、異なるＰＢＭＣサブタイプにおける細胞傷害性効果を同定した。細胞傷害率は、細胞型に応じてプロットする。
【図４０】図４０は、自己ＰＢＭＣまたは自己ＰＢＭＣおよびＲＰＭＩ−８２２６標的細胞、ならびに増加濃度のダラツムマブの存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞についてのＩＦＮ−γ（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）の放出アッセイの結果を示す一組のグラフである。
【図４１】図４１は、フローサイトメトリーによる赤血球におけるＣＤ３８発現の評価（Ａ）；フローサイトメトリーによるダラツムマブの赤血球への結合の評価（Ｂ）；およびＡＣＴＲおよび赤血球共培養アッセイを用いたＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞を介した溶血の評価を示す一組のグラフである。
【図４２】図４２は、トラスツマブおよびＨＥＲ２を発現するＨＣＣ１９５４またはＳＫＢＲ３標的細胞の存在下におけるＡＣＴＲ変異体 配列番号：２、９、１３、１９、２０、２１、２２、および２７を発現する２つの異なるドナーに由来するＴ細胞をＡＣＴＲ変異体 配列番号：２からのものと比較した平均ＩＬ−２産生を示す一組のグラフである。
【図４３】図４３は、ＨＥＲ２標的抗体トラスツマブの増加濃度ならびにＨＥＲ２発現標的ＢＴ２０およびＳＫＢＲ３の存在下のモックＴ細胞およびＡＣＴＲ変異体 配列番号：９および配列番号：２６を発現するＴ細胞によるＩＬ−２（Ａ）およびＩＦＮ−γ（Ｂ）の放出を示す一組のグラフである。
【図４４】図４４は、抗ヒトＣＤ３および抗ヒトＣＤ２８活性化抗体で活性化させ、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で１０日間増殖させたＴ細胞についての時間に応じた増殖倍率（Ａ）、細胞サイズ（Ｂ）、および生存能力（Ｃ）を示す一組のグラフである。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞、およびＣＤ３８標的ＴＨＢ７ ＣＡＲおよび０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞は、必要に応じて３日目にＡＣＴＲまたはＣＡＲをコードするウイルスを用いて形質導入し；モックＴ細胞は、形質導入しなかった。
【図４５】図４５は、フローサイトメトリーにより測定されるように、抗ヒトＣＤ３および抗ヒトＣＤ２８活性化抗体で活性化させ、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で１０日間増殖させたＴ細胞における６、８、および１０日目のＣＤ３８発現を示す一組のグラフである。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞、およびＣＤ３８標的ＴＨＢ７ ＣＡＲおよび０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞は、必要に応じて３日目にＡＣＴＲまたはＣＡＲをコードするウイルスを用いて形質導入し；モックＴ細胞は、形質導入しなかった。
【図４６】図４６は、ダラツムマブの非存在または存在下で（Ａ）ダウディまたは（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞と培養させたモックＴ細胞、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞、ＴＨＢ７ ＣＡＲ Ｔ細胞、および０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞について観察された細胞傷害性を示す一組のグラフである。細胞傷害率は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比に応じてプロットする。
【図４７】図４７は、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、またはダウディ標的細胞と培養させたダラツムマブの存在下のモックＴ細胞、ダラツムマブの存在下のＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞、ＴＨＢ７ ＣＡＲ Ｔ細胞、および０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞についてのＩＦＮ−γ（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）の産生を示す一組のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本開示の詳細な説明
抗体に基づく免疫療法は、多くのタイプの癌を含む多種多様の疾患を治療するために使用される。このような療法は、除去が望まれる細胞（例えば、癌細胞などの標的細胞）上で正常な細胞（例えば、非癌細胞）と比較して特異的に発現される細胞表面分子の認識に依存することが多い（Weiner et al. Cell (2012) 148(6): 1081-1084）。いくつかの抗体に基づく免疫療法は、標的細胞（例えば、癌細胞）の抗体依存性細胞介在性細胞傷害を促進することがインビトロで示されており、一般に、このことはインビボの作用機序でも同様であると考えられている。ＡＤＣＣは、細胞を介在する自然免疫メカニズムであり、これにより免疫系のエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、単球細胞、マクロファージ、または好酸球）は、特異的抗体によって認識される標的細胞（例えば、癌細胞）を活発に溶解する。
【００４６】
本開示はまた、少なくとも一部は、ＡＣＴＲポリペプチド（ＣＤ１６Ａ細胞外ドメインおよびＣＤ２８共刺激ドメインを含む）またはＡＣＴＲポリペプチド（ＣＤ１６Ａ細胞外ドメインおよび短縮されたヒンジドメインを含むか、またはヒンジドメインを含まない）が優れた生物学的活性を示すという予想外の知見に基づくものである。さらに、本開示はまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲ技術が、同胞効果により、活性化Ｔ細胞上に存在する抗原を標的とする従来のＣＡＲ−Ｔ細胞に付随するインビトロ増殖／製造の問題を解決するという知見に基づくものである。このような抗原に特異的な抗体と組み合わせて、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ５、ＣＤ３８、またはＣＤ７）上にも存在する表面抗原を発現する細胞に関連する疾患を治療するために用いることができる。
【００４７】
従って、本開示は、改善されたＡＣＴＲポリペプチド、これらを発現する遺伝学的に操作された免疫細胞、および治療上有効な量の治療抗体および治療上有効な量の本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫリンパ球）を含む併用療法を用いて対象における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を高める方法を提供する。本開示はまた、ＡＣＴＲポリペプチドおよび共刺激性シグナルを誘発することができる別の外因性ポリペプチドを発現することができる免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞）を提供する。
【００４８】
本明細書で用いられるように、ＡＣＴＲポリペプチドまたは構築物は、宿主細胞の表面上で発現することができ、Ｆｃ部分を含む標的分子に結合することができる細胞外ドメイン（例えば、ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン）およびＡＣＴＲポリペプチド（前記ＡＣＴＲポリペプチドの少なくとも２つのドメインは、異なる分子に由来するものであってもよい）を発現する免疫細胞のエフェクター機能の誘発するための１つまたはそれ以上の細胞質シグナル伝達ドメインを含む、非天然分子を意味する。前記ＡＣＴＲポリペプチドは、Ｆｃ部分を含む標的分子に結合することができるＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。前記共刺激性シグナル伝達ドメインの少なくとも１つは、ＣＤ２８共刺激ドメインであってもよい。前記ＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないか、または膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインである場合、２つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうる。
【００４９】
記載される方法に用いられる抗体は、標的細胞（例えば、癌細胞）の表面上でタンパク質に結合することができる。このようなＦｃ含有分子に結合することができる受容体（例えば、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチド分子）を発現する免疫細胞は、標的細胞に結合する抗体を認識し、この受容体／抗体の結合は、免疫細胞を刺激して、エフェクター機能（例えば、細胞傷害性顆粒分子の放出または細胞死誘導分子の発現など）を発揮し、標的細胞の細胞傷害性の亢進を引き起こす。
【００５０】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチド、細胞、および方法は、多くの利点を付与するであろう。例えば、Ｆｃに結合するＣＤ１６Ａ細胞外ドメインを介することにより、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、特異的な標的抗原（例えば、癌抗原）に直接結合するよりむしろ、標的細胞に結合する抗体のＦｃ部分に結合することができる。よって、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞は、治療抗体によって結合される細胞のいずれものタイプの細胞の細胞死を誘導／亢進することができるであろう。さらに、改善されたＡＣＴＲ構築物は、本明細書に記載されるように、優れた生物学的活性を示すことが示された。よって、このような改善されたＡＣＴＲ構築物を発現する免疫細胞および治療抗体に関する組み合わせ療法は、標的疾患細胞、例えば、癌細胞に対して優れた治療効果を発揮することが予想される。
【００５１】
Ｉ．ＡＣＴＲ構築物
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物（ＡＣＴＲポリペプチドとも呼ばれる）は、免疫グロブリンのＦｃ部分に対して結合親和性および特異性を有する細胞外ドメイン（「Ｆｃ結合体」または「Ｆｃ結合ドメイン」）、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む）を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインをさらに含みうる。前記ＡＣＴＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現される場合、細胞外リガンド−結合ドメインが、標的分子およびＩＴＡＭを含有する細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために細胞外に位置するように構成される。任意の共刺激性シグナル伝達ドメインは、活性化および／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために細胞質に位置しうる。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインを含む。他の実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメイン、および少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【００５２】
本明細書に記載される方法および組成物と一緒に用いるための例示的なＡＣＴＲ構築物は、例えば、本明細書および図中で見出されてもよく、あるいはこの目的のために出典明示により本明細書に取り込まれるＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ２０１６０４０４４１Ａ１中にで見出されてもよい。
【００５３】
改善された本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、免疫グロブリン（「Ｆｃ結合体」または「Ｆｃ結合ドメイン」）のＦｃ部分に対して結合親和性および特異性を有するＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインをさらに含んでいてもよく、そのうちの少なくとも１つは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインである。前記ＡＣＴＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現される場合、細胞外リガンド−結合ドメインが、標的分子およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために細胞外に位置するように構成される。前記共刺激性シグナル伝達ドメインは、活性化および／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために細胞質に位置しうる。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン）、膜貫通ドメイン、任意の１つまたはそれ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激性シグナル伝達ドメイン、またはＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達ドメイン）、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。
【００５４】
本明細書で用いられるように、用語「タンパク質Ｘ膜貫通ドメイン」（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン）は、所定のタンパク質、すなわち、膜中で熱力学的に安定な膜貫通タンパク質Ｘのいずれかの部分を意味する。
【００５５】
本明細書で用いられるように、用語「タンパク質Ｘ細胞質シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、細胞またはオルガネラの内部と相互作用し、シグナルを中継することができるタンパク質（タンパク質Ｘ）のいずれかの部分を意味する。
【００５６】
本明細書で用いられるように、用語「タンパク質Ｘ共刺激性シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナルを免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に伝達することができる所定の共刺激タンパク質（タンパク質Ｘ、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、またはＩＣＯＳ）の部分を意味する。
【００５７】
ある実施態様において、ＡＣＴＲポリペプチドの膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインである場合、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含んでいてなくてもよく、あるいは短縮されたヒンジドメインを含んでいてもよい。あるいはもしくは加えて、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、２つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうる。
【００５８】
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメインのＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端に位置しうるヒンジドメインをさらに含みうる。他の実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａヒンジドメイン有していてもよいか、あるいはヒンジドメインを一切有していなくてもよい。さらに他の態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、短縮されたヒンジドメイン（例えば、２５アミノ酸残基までを含む）を有しうる。
【００５９】
あるいはもしくは加えて、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、相互に連結しているか、またはＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインによって分離されていてもよい２つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうる。ＡＣＴＲポリペプチド中の細胞外Ｆｃ結合体、膜貫通ドメイン、任意の共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、直接またはペプチドリンカーを介して、相互に連結していてもよい。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含みうる。
【００６０】
本明細書および添付の請求項で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で特に示されていなければ、複数の対象を含む。
【００６１】
Ａ．Ｆｃ結合ドメイン
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、すなわち、適当な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはサル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ）のＦｃ部分に結合することができるＦｃ結合ドメインである細胞外ドメインを含む。適当なＦｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体または一定の細菌タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ）などの天然タンパク質に由来していてもよい。さらに、Ｆｃ結合ドメインは、高い親和性と特異性を有する本明細書に記載される抗体のいずれかのＦｃ部分に特異的に結合するように設計された合成ポリペプチドであってもよい。例えば、このようなＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントでありうる。例として、下記に限定されないが、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、またはナノボディが挙げられる。あるいは、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃ部分に特異的に結合する合成ペプチド、例えば、Ｆｃに対する結合活性についてのペプチドコンビナトリーライブラリーをスクリーニングすることによって同定されうるクニッツドメイン、小モジュラー免疫薬タンパク質（ＳＭＩＰ）、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ダーピン（DARPin）、またはアンチカリン（anticalin）であってもよい。
【００６２】
ある実施態様において、前記Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。本明細書で用いられるように、「Ｆｃ受容体」は、多くの免疫細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、および好酸球を含む）の表面上で発現され、抗体のＦｃドメインに結合特異性を示す細胞表面結合受容体である。Ｆｃ受容体は、一般に、抗体のＦｃ（フラグメント結晶化可能）部分に対して結合特異性を有する少なくとも２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインで構成される。ある例において、Ｆｃ受容体の抗体のＦｃ部分への結合は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を誘発しうる。本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを構築するために用いられるＦｃ受容体は、野生型対応物と比較してＦｃに対して高いかもしくは低い親和性を有しうる天然多型変異体（例えば、ＣＤ１６ Ｖ１５８変異体）であってもよい。あるいは、前記Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分に対する結合親和性を変化させる１つまたはそれ以上の突然変異（例えば、１０個までのアミノ酸残基置換（１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の突然変異を含む））を保有する野生型対応物の機能性変異体であってもよい。ある場合において、前記突然変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターンを変化させ、それによりＦｃに対する結合親和性を変化させうる。
【００６３】
下記表は、本明細書に記載される方法または構築物のいずれかに用いられうるＦｃ受容体細胞外ドメインの多くの例示的な多型（例えば、Kim et al., J. Mol. Evol. 53:1-9,2001）を記載する：
表１．Ｆｃ受容体における例示的な多型
【表１】
2020506697.tif 000003
【００６４】
Ｆｃ受容体は、それが結合できる抗体のアイソタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、一般に、ＩｇＧ抗体、例えば、１つまたはそれ以上のそのサブタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に結合し；Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲ）は、一般に、ＩｇＡ抗体に結合し；ならびにＦｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）は、一般に、ＩｇＥ抗体に結合する。ある実施態様において、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃ−ガンマ受容体、Ｆｃ−アルファ受容体、またはＦｃ−イプシロン受容体である。Ｆｃ−ガンマ受容体の例として、下記に限定されないが、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、およびＣＤ１６Ｂが含まれる。Ｆｃ−アルファ受容体の一例は、ＦｃαＲ１／ＣＤ８９である。Ｆｃ−イプシロン受容体の例として、下記に限定されないが、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３が挙げられる。下記表は、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを構築するときに用いるための例示的なＦｃ受容体および対応するＦｃドメインに対するそれらの結合活性を記載する：
表２．例示的なＦｃ受容体
【表２】
2020506697.tif 000004
【００６５】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いるためのＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は、当業者にとって明らかである。例えば、それは、Ｆｃ受容体の結合が所望される抗体のアイソタイプおよび所望される結合相互作用の親和性などの因子に依存しうる。
【００６６】
ある例において、前記Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃに対する親和性を調節しうる天然に存在する多型が含まれうるＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。ある例において、前記Ｆｃ結合ドメインは、１５８位において多型（例えば、バリンまたはフェニルアラニン）が含まれたＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。ある実施態様において、前記Ｆｃ結合ドメインは、そのグリコシル化状態およびそのＦｃに対する親和性を変化させる条件下で調製される。
【００６７】
ヒトＣＤ１６Ａ Ｆ１５８およびＣＤ１６Ａ Ｖ１５８変異体のアミノ酸配列は、太字と下線で強調したＦ１５８およびＶ１５８残基とともに下記に供される（シグナルペプチドをイタリックで示した）:
ＣＤ１６Ａ Ｆ１５８（配列番号：３６）:
【化１】
2020506697.tif 000005
ＣＤ１６Ａ Ｖ１５８（配列番号：３７）:
【化２】
2020506697.tif 000006
【００６８】
ある実施態様において、前記Ｆｃ結合ドメインは、ＡＣＴＲポリペプチドをＩｇＧ抗体のサブセットに特異的にする修飾が取り込まれたＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を高めるか、低くする突然変異が取り込まれうる。 
【００６９】
本明細書に記載されるＦｃ結合ドメインのいずれかは、治療抗体のＦｃ部分に対して適当な結合親和性を有しうる。本明細書で用いられるように、「結合親和性」は、見掛けの結合定数またはＫＡを意味する。前記ＫＡは、解離定数ＫＤの逆数である。本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド−結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に対して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和性Ｋｄを有しうる。ある実施態様において、前記Ｆｃ結合ドメインは、抗体、抗体のアイソタイプ、またはこれらのサブタイプに対して、別の抗体、抗体のアイソタイプ、またはこれらのサブタイプに対するＦｃ結合ドメインの結合親和性と比較して、高い結合親和性を有する。ある実施態様において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体、抗体のアイソタイプ、またはこれらのサブタイプに対して、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの別の抗体、抗体のアイソタイプ、またはこれらのサブタイプへの結合と比較して、特異性を有する。
【００７０】
当該技術分野で知られている他のＦｃ結合ドメインもまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物、例えば、ＷＯ２０１５０５８０１８Ａ１に記載されているもの（その関連する開示は、本明細書の目的および参照される対象について出典明示によって本明細書に取り込まれる）において用いられてもよい。
【００７１】
Ｂ．膜貫通ドメイン
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドの膜貫通ドメインは、当該技術分野で知られているいずれかの形態でありうる。本明細書で用いられるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは、真核細胞の細胞膜中で熱力学的に安定なタンパク質構造を意味する。本明細書で用いられるＡＣＴＲポリペプチドにおける使用のために適合する膜貫通ドメインは、天然タンパク質から得られうる。あるいは、合成された非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜中で熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメントでありうる。
【００７２】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、２つ以上のアルファヘリックスの複合体、ベータバレル、または細胞のリン脂質二重層を貫通することができる他の安定な構造のいずれかを形成しうる。さらに、膜貫通ドメインはまた、もしくはあるいは、膜貫通ドメイントポロジー（膜貫通ドメインが膜を横断する通過数およびタンパク質の方向を含む）に基づいて分類されうる。例えば、単回通過膜タンパク質は、細胞膜を１回横断し、複数回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の回数）を横断する。
【００７３】
膜タンパク質は、細胞の内部および外部と比較したこれらの末端および膜通過セグメントのトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型として定義されうる。Ｉ型膜タンパク質は、単回膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように位置付けられている。ＩＩ型膜タンパク質はまた、単回膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ末端が、細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように位置付けられている。ＩＩI型膜タンパク質は、複数回膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数およびＮおよびＣ末端の位置に基づいてさらに細分類されうる。
【００７４】
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドの膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質に由来する。単回通過膜タンパク質としては、下記に限定されないが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂが挙げられる。ある実施態様において、前記膜貫通ドメインは、下記から選択される膜タンパク質に由来する：ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ。ある例において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８のもの（例えば、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのものである）。ある例において、前記膜貫通ドメインは、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７のものである。他の例において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８のものである。この場合において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まないものでありうる。ある場合において、このようなＡＣＴＲポリペプチドは、いずれのヒンジドメインも含まないものでありうる。あるいはもしくは加えて、このようなＡＣＴＲポリペプチドは、２つまたはそれ以上の本明細書に記載される共刺激領域を含みうる。他の例において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ３４のものである。さらなる他の例において、前記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８αに由来しないものである。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドの膜貫通ドメインは、単回通過アルファヘリックスである。
【００７５】
複数回通過膜タンパク質に由来する膜貫通ドメインはまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いるために適合しうる。複数回通過膜タンパク質は、複合体アルファヘリックス構造（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個またはそれ以上のアルファヘリックス）またはベータシート構造を含みうる。好ましくは、複数回通過膜タンパク質のＮ末端およびＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。複数回通過膜タンパク質に由来する１または複数個のヘリックス通過は、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを構築するために用いることができる。
【００７６】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドで用いられるための膜貫通ドメインはまた、合成された非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部を含むことができる。ある実施態様において、前記膜貫通ドメインは、合成された非天然アルファヘリックスまたはベータシートである。ある実施態様において、前記タンパク質セグメントは、少なくとも約２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、例えば、米国特許第７，０５２，９０６ Ｂ１号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６ Ａ２号（これらの関連する記載は、出典明示により本明細書に取り込まれる）において当該技術分野で知られている。
【００７７】
ある実施態様において、前記膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、システイン残基を含まない。ある実施態様において、前記膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、１つのシステイン残基を含む。ある実施態様において、前記膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、２つのシステイン残基を含む。ある実施態様において、前記膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、３つ以上のシステイン残基（例えば、３、４、５、またはそれ以上）を含む。
【００７８】
前記膜貫通ドメインは、前記膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する膜貫通領域および細胞質領域を含みうる。前記膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つまたはそれ以上のアミノ酸を含んでいてもよく、ある実施態様において、脂質二重層中の膜貫通ドメインを位置付けることを助ける。ある実施態様において、１つまたはそれ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。ある実施態様において、１つまたはそれ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。ある実施態様において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、陽性に荷電したアミノ酸を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリン、およびリジンを含む。
【００７９】
ある実施態様において、前記膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。ある実施態様において、前記膜貫通領域は、主に、疎水性アミノ酸残基（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリン）を含む。ある実施態様において、前記膜貫通領域は、疎水性である。ある実施態様において、前記膜貫通領域は、ポリロイシン−アラニン配列を含む。
【００８０】
タンパク質またはタンパク質セグメントのヒドロパシー、または疎水性もしくは親水性特性は、当該技術分野で知られている方法、例えば、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシー分析によって評価されることができる。
【００８１】
Ｃ．共刺激性シグナル伝達ドメイン
多くの免疫細胞は、抗原特異的なシグナルの刺激に加えて、細胞増殖、分化および生存を促進し、ならびに前記細胞のエフェクター機能を活性化するための共刺激を必要とする。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうる。本明細書で用いられる用語「共刺激性シグナル伝達ドメイン」は、細胞内のシグナル変換を介して、エフェクター機能などの免疫応答を誘導する共刺激性シグナル伝達タンパク質の少なくともフラグメントを意味する。当該技術分野で知られているように、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化は、２つのシグナルを必要とすることが多い：（１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および抗原提示細胞によって提示される抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体の結合によって誘発される抗原特異的シグナル（典型的には、ＴＣＲ複合体の構成要素の１つとしてのＣＤ３ζによって促進される）；および（ｉｉ）共刺激受容体とそのリガンドとの間の相互作用によって誘発される共刺激性シグナル。共刺激受容体は、ＴＣＲで誘発されるシグナル伝達へのさらなる因子として共刺激性シグナルを誘導し、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）によって介在される応答を調節する。
【００８２】
宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激性シグナル伝達ドメインの活性化は、前記細胞を誘導して、サイトカインの産生および分泌、食細胞特性、増殖、分化、生存、および／または細胞傷害性を増加させ、または減少させうる。共刺激分子の共刺激性シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いるために適合でありうる。共刺激性シグナル伝達ドメインのタイプは、ＡＣＴＲポリペプチドが発現されうる免疫細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）および所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）などの因子に基づいて選択される。前記ＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いられるための共刺激性シグナル伝達ドメインの例としては、下記に限定されないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、およびＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシンアルファ／ＴＮＦベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦアルファ、およびＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、およびＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；ならびに他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、およびＮＫＧ２Ｃを含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインでありうる。ある実施態様におい���、前記共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）またはＣＤ２、あるいはこれらの変異体のものでありうる。
【００８３】
共刺激性シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができるような本明細書に記載される共刺激性シグナル伝達ドメインのいずれの変異体もまた、本開示の範囲内である。ある実施態様において、前記共刺激性シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して１０個まで（例えば、１、２、３、４、５、または８個）のアミノ酸残基突然変異（例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加）を含む。このような１つまたはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加）を含む共刺激性シグナル伝達ドメインは、変異体と呼ばれうる。
【００８４】
前記共刺激性シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、前記突然変異を含まない共刺激性シグナル伝達ドメインと比較してシグナル伝達の増加と免疫応答の刺激の亢進を生じうる。前記共刺激性シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、前記突然変異を含まない共刺激性シグナル伝達ドメインと比較してシグナル伝達の減少と免疫応答の刺激の低下を生じうる。例えば、天然ＣＤ２８アミノ酸配列の残基１８６および１８７の突然変異は、ＡＣＴＲポリペプチドの共刺激ドメインによる共刺激活性の増加と免疫応答の誘導を生じうる。ある実施態様において、前記突然変異は、ＣＤ２８共刺激ドメインの１８６および１８７位の各々でリジンのグリシン残基による置換であって、これはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体と呼ばれる。前記ドメインの共刺激活性を高めるか、または低下しうる共刺激性シグナル伝達ドメインでなされうるさらなる突然変異は、当業者にとって明らかである。ある実施態様において、前記共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体のものである。
【００８５】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、単一の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２７共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、またはＯＸ４０共刺激ドメインを含みうる。
【００８６】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）の共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうる。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、２つまたはそれ以上の同一の共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメインの２コピーを含む。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、異なる共刺激タンパク質に由来する２つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される共刺激タンパク質のいすれか２つまたはそれ以上）を含む。共刺激性シグナル伝達ドメインのタイプの選択は、前記ＡＣＴＲポリペプチドで用いられる宿主細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）および所望の免疫エフェクター機能などの因子に基づくものであってもよい。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメインの２コピーを含む。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、異なる共刺激受容体に由来する２つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載される共刺激受容体のいずれか２つまたはそれ以上、例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ、ＣＤ２８およびＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体および４−１ＢＢ、ＣＤ２８およびＯＸ４０、またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体およびＯＸ４０を含みうる。ある実施態様において、前記２つの共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８および４−１ＢＢである。ある実施態様において、前記２つの共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体および４−１ＢＢである。ある実施態様において、前記２つの共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８およびＯＸ４０である。ある実施態様において、前記２つの共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体およびＯＸ４０である。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物は、ＣＤ２８およびＩＣＯＳＬの組み合わせを含みうる。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物は、ＣＤ２８およびＣＤ２７の組み合わせを含みうる。ある実施態様において、前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する。
【００８７】
１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含むか、またはこのようなシグナル伝達ドメインを含まない本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）において、共刺激性シグナルを誘発することができる１つまたはそれ以上の別のポリペプチド、例えば、共刺激受容体、そのリガンド、または共刺激受容体に対する結合部分を含むポリペプチド（例えば、一本鎖抗体）とトランスで共発現されうる。非限定的な例として、前記１つまたはそれ以上の別のポリペプチドには、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＣＤ７０、これらのフラグメント、またはこれらの組み合わせが含まれうる。ある実施態様において、前記１つまたはそれ以上の別のポリペプチドには、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、これらのフラグメント、これらの組み合わせが含まれうる。さらに他の実施態様において、前記別のポリペプチドには、本明細書に記載される共刺激受容体またはリガンドのいずれかに特異的な結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）が含まれうる。非限定的な例として、１つまたはそれ以上の別のポリペプチドには、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、またはＣＤ２８に結合するｓｃＦｖが含まれうる。例えば、前記１つまたはそれ以上の別のポリペプチドには、アゴニスト抗４−１ＢＢ ｍＡｂに由来するｓｃＦｖが含まれうる。
【００８８】
一例として、４−１ＢＢＬのアミノ酸が下記に供される：
４−１ＢＢＬ配列（配列番号：２４）
【化３】
2020506697.tif 000007
【００８９】
Ｄ．免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメイン
免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを製造するために用いることができる。本明細書で用いられる「ＩＴＡＭ」は、一般に、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子の尾部に存在する保存されたタンパク質モチーフである。前記モチーフは、６〜８アミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉ（式中、各ｘは、独立して、いずれかのアミノ酸である）の２回繰り返しを含み、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉを生じうる。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、少なくとも部分的に、シグナル伝達分子の活性化後のＩＴＡＭにおけるチロシン残基のリン酸化によって介在される細胞内のシグナル変換にとって重要である、ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質に対するドッキング部位として機能しうる。ある例において、ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γのものである。他の例において、ＩＴＡＭを含有する細胞質シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζに由来するものではない。さらに他の例において、前記ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、同一のＡＣＴＲポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメインがＣＤ１６Ａに由来する場合、Ｆｃ受容体に由来するものではない。
【００９０】
１の特定の実施態様において、いくつかのシグナル伝達ドメインは、相加もしくは相乗効果のために一緒に融合させることができる。有用なさらなるシグナル伝達ドメインの非限定的な例は、１つまたはそれ以上ののＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩｙ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、およびＣＤ４０の一部または全てを含む。
【００９１】
Ｅ．ヒンジドメイン
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインをさらに含む。ヒンジドメインは、一般に、タンパク質の２つのドメイン間に見出されるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の可撓性およびお互いに対して前記ドメインの１つまたは両方の動きを可能にしうる。ＡＣＴＲポリペプチドの膜貫通ドメインに対してＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのこのような可撓性および動きを供するアミノ酸を使用することができる。
【００９２】
前記ヒンジドメインは、約１〜１００アミノ酸、例えば、約１〜６０アミノ酸（１〜３０アミノ酸または３１〜６０アミノ酸を含む）または約５０〜１００アミノ酸（５１〜７５アミノ酸または７６〜１００アミノ酸を含む）を含みうる。非限定的な例として、前記ヒンジは、１〜１５アミノ酸、１５〜７５アミノ酸、２０〜５０アミノ酸、または３０〜６０アミノ酸であってもよい。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸長であってもよい。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物は、ヒンジドメインを含まない。
【００９３】
用語「約（about）」または「およそ（approximately）」は、当業者によって調べられる特定の数値の許容される誤差の範囲内を意味し、一部は、数値が測定され、または調べられる方法、すなわち、測定系の限界に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における実施ごとに許容される標準偏差内を意味しうる。あるいは、「約」は、所定の数値の±２０％以内、好ましくは±１０％以内、さらに好ましくは、±５％以内、ならびにさらに好ましくは、±１％以内の範囲を意味しうる。あるいは、特に、生物学的系または方法に関して、前記用語は、数値の一桁以内、好ましくは２倍以内を意味しうる。特定の数値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記されていない限り、用語「約」は、黙示的であり、この文脈において、特定の数値の許容される誤差の範囲内を意味する。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、天然タンパク質のヒンジドメインである。
【００９４】
ヒンジドメインを含む当該技術分野で公知のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いられるために適合する。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、天然タンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、ＡＣＴＲポリペプチドに対して可撓性を付与する。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ８のものである。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ８のヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８のヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個）の連続したアミノ酸を含有するフラグメントである。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ２８のものである。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ２８のヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ２８のヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個）の連続したアミノ酸を含有するフラグメントである。
【００９５】
ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＣＤ１６Ａ受容体のもの、例えば、ＣＤ１６Ａ受容体の全部のヒンジドメインまたはその一部であり、ＣＤ１６Ａ受容体の４０個以下（例えば、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個）の連続したアミノ酸残基からなりうる。このようなＡＣＴＲ構築物は、異なる受容体（非ＣＤ１６Ａ受容体）に由来するヒンジドメインを含まないものであってもよい。
【００９６】
抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体のヒンジドメインはまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いるために適合する。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジドメインである。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、抗体のものであり、前記抗体のヒンジドメインおよび前記抗体の１つまたはそれ以上の定常領域を含む。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインおよび前記抗体のＣＨ３定常領域を含む。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインおよび前記抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。ある実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。ある実施態様において、前記ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。ある実施態様において、前記ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。
【００９７】
非天然ペプチドもまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのためのヒンジドメインとして用いられてもよい。ある実施態様において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド−結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、ペプチドリンカー、例えば、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカー［式中、ｘおよびｎは、独立して、３〜１２（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上を含む）の整数でありうる］である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号：２５）［式中、ｎは、３〜６０（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０を含む）の整数でありうる］である。ある実施態様において、ｎは、６０以上の整数でありうる。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号：２８）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号：２９）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号：３０）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１２（配列番号：３１）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１５（配列番号：３２）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３０（配列番号：３３）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４５（配列番号：３４）である。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６０（配列番号：３５）である。
【００９８】
他の実施態様において、前記ヒンジドメインは、様々な長さの親水性残基（例えば、１０〜８０アミノ酸残基）からなる構造不定のポリペプチドである、伸長した組み換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）である。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は、当業者にとって明らかであり、例えば、米国特許第８，６７３，８６０号（出典明示によりその関連する記載が本明細書に取り込まれる）中に見出すことができる。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸を含む。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸を含む。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸を含む。ある実施態様において、前記ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸を含む。
【００９９】
Ｆ．シグナルペプチド
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドはまた、前記ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（シグナル配列としても知られている）を含む。一般的に、シグナル配列は、細胞内の所望の部位に対するポリペプチドを標的とするペプチド配列である。ある実施態様において、前記シグナル配列は、前記ＡＣＴＲポリペプチドを、細胞の分泌経路に対して標的とし、前記ＡＣＴＲポリペプチドの脂質二重層への組み込むおよびアンカーを可能にする。本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドにおいて用いられるために適合である天然タンパク質のシグナル配列または合成された非天然シグナル配列を含むシグナル配列は、当業者にとって明らかである。ある実施態様において、前記シグナル配列は、ＣＤ８αに由来する。ある実施態様において、前記シグナル配列は、ＣＤ２８に由来する。他の実施態様において、前記シグナル配列は、マウスカッパ鎖に由来する。さらなる他の実施態様において、前記シグナル配列は、ＣＤ１６に由来する。
【０１００】
Ｇ．ＡＣＴＲポリペプチドの例
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのある例は、例えば、ＣＤ１６Ａ Ｆｃ結合ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを有しうる。このようなＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはこれらの組み合わせをさらに含みうる。ある例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ８αに由来していてもよいシグナル配列をさらに含みうる。１の特定の例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順に：ＣＤ８αのシグナル配列、ＣＤ１６Ａ Ｆｃ結合ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号：９を含む。ある実施態様において、上記に記載されるＡＣＴＲポリペプチド（例えば、配列番号：９）は、例えば、４−１ＢＢＬドメインを含む本明細書に記載される共刺激性シグナルを供する別のポリペプチド（例えば、配列番号：３９）と組み合わされてもよい。
【０１０１】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドの他の例は、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含んでいなくてもよい（例えば、ヒンジドメインを有していなくてもよい）。このようなＡＣＴＲポリペプチドは、例えば、ＣＤ１６Ａ Ｆｃ結合ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを有するが、ヒンジドメインを有していなくてもよい。ある例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ８膜貫通ドメインをさらに含みうる。ある例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ８αに由来するものであってもよいシグナル配列をさらに含みうる。１の特定の例において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に順に：ＣＤ８αのシグナル配列、ＣＤ１６Ａ Ｆｃ結合ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号：１３または配列番号：３８を含む。ある場合において、ＡＣＴＲポリペプチドは、第２のポリペプチド（例えば、共刺激性シグナルを誘発することができるポリペプチド）とともに発現されうる。ＡＣＴＲポリペプチドとこのような第２のポリペプチドとの発現のための構築物は、本明細書に記載されている。
【０１０２】
表３は、例示的な本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを提供する。これらの例示的な構築物は、Ｎ末端からＣ末端に順に、シグナル配列、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン）、ヒンジドメイン、および膜貫通を有する一方、任意の共刺激ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインの位置は切り替えることができる。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：１〜２２、２６、２７、３８、または４０のいずれか１つを含みうる。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：１〜２２、２６、２７、３８、または４０のいずれか１つからなりうる。
表３：例示的なＡＣＴＲポリペプチド
【表３】
2020506697.tif 000008
2020506697.tif 000009
【０１０３】
例示的なＡＣＴＲポリペプチドのアミノ酸配列は、下記に供される（シグナル配列をイタリックで示した）。
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１
【化４】
2020506697.tif 000010
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２
【化５】
2020506697.tif 000011
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：３
【化６】
2020506697.tif 000012
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：４
【化７】
2020506697.tif 000013
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：５
【化８】
2020506697.tif 000014
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：６
【化９】
2020506697.tif 000015
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：７
【化１０】
2020506697.tif 000016
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：８
【化１１】
2020506697.tif 000017
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９
【化１２】
2020506697.tif 000018
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１１
【化１３】
2020506697.tif 000019
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１２
【化１４】
2020506697.tif 000020
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１３
【化１５】
2020506697.tif 000021
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１４
【化１６】
2020506697.tif 000022
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１５
【化１７】
2020506697.tif 000023
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１６
【化１８】
2020506697.tif 000024
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１７
【化１９】
2020506697.tif 000025
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：１９
【化２０】
2020506697.tif 000026
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２０
【化２１】
2020506697.tif 000027
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２１
【化２２】
2020506697.tif 000028
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２２
【化２３】
2020506697.tif 000029
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２６
【化２４】
2020506697.tif 000030
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２７
【化２５】
2020506697.tif 000031
【０１０４】
トランス型の例示的なＡＣＴＲ構築物（ＡＣＴＲポリペプチドおよび共刺激性シグナル伝達を供する別のポリペプチドをトランスで含む）がさらに下記で供される。
【０１０５】
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：３８／配列番号：３９
ＡＣＴＲポリペプチド
【化２６】
2020506697.tif 000032
トランス共刺激因子ポリペプチド（４−１ＢＢＬを含む）
【化２７】
2020506697.tif 000033
ＡＣＴＲ変異体 配列番号：４０／配列番号：３９
ＡＣＴＲポリペプチド
【化２８】
2020506697.tif 000034
トランス共刺激因子ポリペプチドは、上記で供される配列番号：３９である。
【０１０６】
配列番号：３８、３９、および４０におけるイタリック領域と下線領域の説明は、配列番号：１８と配列番号：１０と合わせて下記で供する。
【０１０７】
Ｈ．ＡＣＴＲ構築物をコードする核酸
本開示はまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲ受容体をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドとともに、本開示はまた、このようなポリヌクレオチドを含むベクター（このようなポリヌクレオチドが少なくとも１つのキメラ受容体の発現のための調節エレメントに作動可能に連結されたベクターを含む）を提供する。本開示の有用なベクターの非限定的な例には、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、およびレンチウイルスベクターを含む）が含まれる。
【０１０８】
ある場合において、本明細書に記載される核酸は、２つのコード配列を含みうるものであって、１つは、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドをコードし、他のもう１つは、共刺激性シグナルを誘発することができるポリペプチドをコードする。このようなポリペプチドは、共刺激受容体（例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、またはこれらの組み合わせ）に由来する共刺激ドメインを含みうる。あるいはもしくは加えて、前記ポリペプチドは、共刺激受容体のリガンド、例えば、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＣＤ７０、これらの機能性フラグメント、またはこれらの組み合わせを含みうる。
【０１０９】
本明細書に記載される２つのコード配列を含む核酸は、前記２つのコード配列によってコードされるポリペプチドが、独立した（および物理的に別の）ポリペプチドとして発現することができるように構成されうる。この目的を達成するために、本明細書に記載される核酸は、第１と第２のコード配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列を含みうる。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、リボソームスキッピング部位ををコードしていてもよい。リボソームスキッピング部位は、正常なペプチド結合の形成を障害する配列である。このメカニズムは、１つのメッセンジャーＲＮＡからさらなるオープンリーディングフレームの翻訳を生じる。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、またはＦ２Ａペプチドをコードしていてもよい（例えば、Kim et al., PLoS One. 2011;6(4):e18556）。非限定的な例として、例示的なＰ２Ａペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGPのアミノ酸配列（配列番号：２３）を有しうる。
【０１１０】
別の実施態様において、前記第３のヌクレオチド配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードしていてもよい。ＩＲＥＳは、末端非依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントであり、１つのメッセンジャーＲＮＡからさらなるオープンリーディングフレームの翻訳も可能にするものである。
【０１１１】
別の実施態様において、前記第３のヌクレオチド配列は、第２のポリペプチドの発現を調節する第２のプロモーターをコードしていてもよい。
【０１１２】
前記第３のヌクレオチド配列はまた、２つ以上のリボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、さらなるプロモーター配列、またはこれらの組み合わせをコードしていてもよい。
【０１１３】
前記核酸はまた、さらなるコード配列（以下に限定されないが、第４および第５のコード配列を含む）も含んでいてもよく、さらなるコード配列によってコードされるポリペプチドが、さらに独立し、物理的に別のポリペプチドとして発現されるように構成されうる。この目的のため、前記さらなるコード配列は、１つまたはそれ以上のリボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、またはさらなるプロモーター配列をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列によって他のコード配列から分離されていてもよい。
【０１１４】
ある例において、本明細書に記載される核酸は、ＡＣＴＲポリペプチドおよび共刺激性シグナルを誘発することができる第２のポリペプチド（これらは、Ｐ２Ａペプチドによって連結されている）をコードしていてもよい。発現中、前記ＡＣＴＲおよび前記第２のポリペプチドは、Ｐ２Ａ部位の存在のため、独立し、物理的に別のポリペプチドとして産生される。非限定的な例の一組として、配列番号：１０および配列番号：１８をコードするヌクレオチド配列の発現（両方ともＰ２Ａリボソームスキッピング部位を有する）は、２つの物理的に別のタンパク質を産生し：１つは、ＡＣＴＲタンパク質（各々、配列番号：４０および配列番号：３８）を含み、他のもう１つは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）タンパク質（配列番号：３９）を含む。１の実施態様において、配列番号：１８をコードするヌクレオチド配列の発現によって産生される２つのタンパク質は、配列番号：３８および配列番号：３９として示される。他の実施態様において、配列番号：１０をコードするヌクレオチド配列の発現によって産生されるタンパク質は、配列番号：４０および配列番号：３９として示される。
ＡＣＴＲ配列＋リンカー＋Ｐ２Ａ＋４−１ＢＢＬ
【化２９】
2020506697.tif 000035
ＡＣＴＲ配列＋リンカー＋Ｐ２Ａ＋４−１ＢＢＬ
【化３０】
2020506697.tif 000036
【０１１５】
上記の配列番号：１０および１８において、Ｎ末端のイタリックのフラグメントは、シグナルペプチドであり、続くドメインは、ＡＣＴＲポリペプチド領域であり、イタリックのＧＳＧペプチドはリンカーであり、下線のペプチドは、Ｐ２Ａリボソームスキッピング部位であり、そして太字のＣ末端ドメインは、４−１ＢＢＬドメインである。リボソームのスキッピングによって、４−１ＢＢＬドメインを含有するポリペプチドには、Ｎ末端と残りのリンカーに余分な「Ｐ」残基が含まれ、Ｐ２Ａ配列は、ＡＣＴＲポリペプチドのＣ末端に結合している。
【０１１６】
Ｉ．ＡＣＴＲポリペプチドを含む医薬組成物の製造
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれも、組み換え技術などの通常の方法によって調製することができる。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドの製造方法は、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド−結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、前記ＡＣＴＲポリペプチドのドメインの各々を含む、ポリペプチドをコードする核酸の作成に関する。前記核酸構築物はまた、１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。ある実施態様において、前記核酸はまた、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド−結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジドメインをコードする。前記ＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸はまた、シグナル配列をコードしていてもよい。ある実施態様において、前記核酸配列は、配列番号：１−２２、２６、２７、３８、または４０によって供される例示的なＡＣＴＲポリペプチドのいずれか１つをコードする。
【０１１７】
前記ＡＣＴＲポリペプチドの構成エレメントの各々の配列は、当該技術分野で知られている種々の供給源のいずれか１つから通常の技術（例えば、ＰＣＲ増幅）により取得されうる。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドの１つまたはそれ以上の構成エレメントの配列は、ヒト細胞から取得される。あるいは、前記ＡＣＴＲポリペプチドの１つまたはそれ以上の構成エレメントの配列は、合成することができる。構成エレメント（例えば、ドメイン）の各々の配列は、直接的または間接的に連結させて（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を用いて）、ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を用いて前記ＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸配列を作成することができる。あるいは、前記ＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸は、合成されてもよい。ある実施態様において、前記核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様において、前記核酸は、ＲＮＡである。
【０１１８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の公知の制限は、標的抗原の制限である。ＣＡＲ−Ｔ細胞がＴ細胞の抗原に特異的である場合、このようなＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ増殖は、同種殺しにより実質的に損なわれるため、このようなＣＡＲ−Ｔ細胞をインビトロで製造することを困難にする。例えば、Ｄｕｓｓｅａｕｘらは、「正常な活性化Ｔ細胞におけるＣＤ３８の発現は、このタンパク質に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の開発の大きなハードである」と報告した。Dusseaux et al. European Hemalogical Association; June 2016, Poster 365. さらに、Ｇｏｍｅｓ−Ｓｉｌｖａらはまた、「ＣＤ７特異的なＣＡＲの発現は、残りのＣＤ７発現とそれに続く同族殺しのため、形質導入されたＴ細胞の増殖を損なわせた」と報告した。Gomes-Silva et al., Blood, 2017, 130: 285-296. 同様に、ＣＤ５については、Mamonkin et al., Cancer Immunol Res., 2018, 6:47-58を参照のこと。対照的に、本発明のＡＣＴＲ Ｔ細胞は、標的細胞の表面抗原を直接的に標的とせず。それゆえ、インビトロで増殖させても同族殺し効果を有しない。 
【０１１９】
ＩＩ．ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを発現する遺伝学的に操作された宿主細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞）（ＡＣＴＲ発現細胞、例えば、ＡＣＴＲ Ｔ細胞）は、Ｆｃ含有抗腫瘍抗体によって結合される標的細胞を認識することができる細胞の特定の集団を提供する。１の実施態様において、このような宿主細胞で発現されるＡＣＴＲポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメインと抗腫瘍抗体のＦｃ部分との結合は、活性化シグナルを、ＡＣＴＲポリペプチドの任意の共刺激性シグナル伝達ドメインおよび／またはＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインに伝達し、次いで宿主細胞の細胞増殖および／またはエフェクター機能（例えば、宿主細胞によって誘発されるＡＤＣＣ効果）を活性化する。他の実施態様において、このような宿主細胞で発現されるＡＣＴＲポリペプチドの細胞外Ｆｃ結合ドメインと抗体のＦｃ部分との結合は、活性化シグナルを、ＡＣＴＲポリペプチドのＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインおよび／またはこのような宿主細胞で共発現される１つまたはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインに伝達し、次いで宿主細胞の細胞増殖および／またはエフェクター機能（例えば、宿主細胞によって誘発されるＡＤＣＣ効果）を活性化する。共刺激性シグナル伝達ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメイン（ＩＴＡＭを含む）の組み合わせは、細胞内の複数のシグナル伝達経路強力な活性化を可能にしうる。ある実施態様において、前記宿主細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）である。ある実施態様において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞である。ある実施態様において、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施態様において、前記免疫細胞は、樹立された細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞でありうる。
【０１２０】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれもは、共刺激性シグナルを供するための１つまたはそれ以上の別の本明細書に記載されるポリペプチド、例えば、１つまたはそれ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激因子の共刺激ドメインまたはリガンド）を含むポリペプチドを免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）中でトランスに共発現されてもよい。非限定的な例として、前記１つまたはそれ以上の別のポリペプチドは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＣＤ７０、これらのフラグメント、またはこれらの組み合わせを含みうる。１の例において、前記１つまたはそれ以上の別のポリペプチドは、４−１ＢＢＬをコードしていてもよい。
【０１２１】
免疫細胞の集団は、いずれの供給源、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、または組織（例えば、脾臓、リンパ節、胸腺、幹細胞、または腫瘍組織など）からも得ることができる。所望の宿主細胞のタイプを得るための適当な供給源は、当業者にとって明らかである。ある実施態様において、免疫細胞の集団は、ＰＢＭＣに由来する。所望の宿主細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞およびＮＫ細胞）は、細胞を刺激性分子と一緒にインキュベートすることによって得られた細胞の集団内で増殖されてもよい。非限定的な例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞の増殖のために用いられうる。
【０１２２】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する免疫細胞を構築するために、ＡＣＴＲポリペプチドの安定的もしくは一過的な発現のための発現ベクターは、本明細書に記載される慣用の方法により調製され、免疫宿主細胞に導入されうる。例えば、前記ＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸は、適当な発現ベクター、例えば、適当なプロモーターに操作可能に連結されたウイルスベクターにクローニングされうる。前記核酸およびベクターは、適当な条件下で制限酵素と接触されて、相互に対をなしうる各分子において相補的な末端が作成され、リガーゼで結合されうる。あるいは、合成された核酸リンカーは、前記ＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸の末端にライゲーションすることができる。前記合成リンカーは、ベクター中の特定の制限酵素認識部位に対応する核酸配列を含みうる。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、前記ＡＣＴＲポリペプチドの発現のための宿主細胞のタイプによるが、真核細胞における組み込みと複製に適当である必要がある。 
【０１２３】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドの発現に用いることができる種々のプロモーターには、下記に限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ、例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、または単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターが含まれる。前記ＡＣＴＲポリペプチドの発現のためのさらなるプロモーターは、免疫細胞中で構成的に活性なプロモーターを含む。あるいは、調節可能なプロモーターは、その発現が免疫細胞内で調節されるように用いられうる。
【０１２４】
さらに、前記ベクターは、例えば、下記のうちのいくつかまたは全てを含んでいてもよい：選択可能なマーカー遺伝子（例えば、宿主細胞における安定的もしくは一過的な形質導入体の選択のためのネオマイシン遺伝子またはカナマイシン遺伝子）；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子に由来するエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０に由来する転写終結およびＲＮＡプロセッシングシグナル；適正なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマウイルス複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多目的マルチクローニングサイト；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター；誘発されると、このベクターを保有する細胞を死滅させる「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼまたは誘導カスパーゼ（例えば、ｉＣａｓｐ９））、およびＡＣＴＲポリペプチドの発現を評価するためのレポーター遺伝子。
【０１２５】
１の特定の実施態様において、このようなベクターはまた、自殺遺伝子を含む。本明細書で用いられるように、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞に死を引き起こす遺伝子を意味する。前記自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に応じて薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を与え、前記細胞が前記薬剤と接触されるか、または前記薬剤に曝露されると前記細胞を死滅させる遺伝子でありうる。自殺遺伝子は当該技術分野で公知であり（例えば、Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews,Springer,Caroline J. Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK),Humana Press,2004を参照のこと）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、およびカスパーゼ（例えば、カスパーゼ８）が挙げられる。
【０１２６】
適当なベクターおよび導入遺伝子を含有するベクターを製造するための方法は、当該技術分野で周知であり、利用可能である。ＡＣＴＲポリペプチドの発現のためのベクターの製造の例は、例えば、出典明示によりその内容が本明細書に取り込まれるＵＳ２０１４／０１０６４４９において見出すことができる。
【０１２７】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターのいずれもが、本開示の範囲内である。このようなベクター、またはこれらに含まれるＡＣＴＲポリペプチドをコードする配列は、いずれかの適当な方法によって宿主細胞（例えば、宿主免疫細胞）に送達されうる。ベクターを免疫細胞に送達する方法は、当該技術分野で周知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、試薬（例えば、リポソーム）を用いるトランスフェクション、またはウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）が挙げられうる。
【０１２８】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドの発現のためのベクターは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）によって宿主細胞に送達される。例示的な送達のためのウイルスの方法としては、下記に限定されないが、組み換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；およびＷＯ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０および４，７７７，１２７号；ＧＢ特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ特許番号０３４５２４２号）、アルファウイルスに基づくベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４；およびＷＯ９５／００６５５号を参照のこと）が含まれる。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドの発現のためのベクターは、レトロウイルスである。ある実施態様において、ＡＣＴＲポリペプチドの発現のためのベクターは、レンチウイルスである。
【０１２９】
レトロウイルス形質導入を記載する参考文献の例としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４６号；ＭａｎｎらのCell 33:153 (1983)；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，９８０，２８９号；Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988)；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第５，１２４，２６３号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる１９９５年３月１６日に公開の国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８；およびＫｕｏらのBlood 82:845 (1993)が挙げられる。国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８は、初代Ｂリンパ球の高い効率の形質導入を記載する。ＷＯ２０１６０４０４４１Ａ１（出典明示により本明細書で参照される目的と対象のために本明細書に取り込まれる）も参照のこと。 
【０１３０】
ＡＣＴＲポリペプチドをコードするベクターがウイルスベクターを用いて宿主細胞に導入される例において、免疫細胞に感染することができ、ベクターを保有するウイルス粒子は、当該技術分野で公知の方法によって作成され、例えば、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２、ＷＯ１９９８／００９２７１Ａ１号、および米国特許第６，１９４，１９１号で見出すことができる。前記ウイルス粒子は、細胞培養物の上清から回収され、単離され、および／または精製されて、このウイルス粒子を免疫細胞と接触させうる。
【０１３１】
ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかをコードするＲＮＡ分子は、慣用の方法（例えば、インビトロ転写）によって調製され、次いで公知の方法（例えば、Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035）により適当な宿主細胞（例えば、本明細書に記載されているもの）に導入されうる。
【０１３２】
宿主細胞への本明細書で供されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかをコードするベクターまたはキメラベクターをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子）の導入後、前記細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養されうる。ＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸が調節可能なプロモーターによって調節される例において、前記宿主細胞は、調節可能なプロモーターが活性化される条件で培養されうる。ある実施態様において、前記プロモーターは、誘導プロモーターであり、前記免疫細胞は、誘導分子の存在下、または誘導分子が産生される条件下で培養される。ＡＣＴＲポリペプチドが発現されるかどうかの決定は、当業者によって明らかであり、いずれかの公知の方法、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によるＡＣＴＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出またはウェスタンブロッティング、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリーを含む方法によるＡＣＴＲポリペプチドタンパク質の検出によって評価されうる。あるいは、ＡＣＴＲポリペプチドの発現は、免疫細胞が対象に投与された後にインビボで起こりうる。
【０１３３】
本明細書で用いられるように、用語「対象」は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または飼育哺乳動物などのいずれかの哺乳類を意味する。例えば、前記対象は、霊長類であってもよい。好ましい態様において、前記対象は、ヒトである。
【０１３４】
あるいは、本明細書に記載される免疫細胞のいずれかにおけるＡＣＴＲポリペプチドの発現は、ＡＣＴＲポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を導入することによって達成することができる。このようなＲＮＡ分子は、インビトロ転写または化学合成によって調製することができる。次いで、前記ＲＮＡ分子は、例えば、エレクトロポレーションによって免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞およびＮＫ細胞の両方）のような適当な宿主細胞に導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、Rabinovich et al., Human Gene Therapy, 17:1027-1035およびＷＯ２０１３／０４０５５７に記載される方法に従って、合成し宿主免疫細胞に導入することができる。
【０１３５】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドを含むベクターまたはＲＮＡ分子は、インビボで宿主細胞または免疫細胞に導入されうる。非限定的な例として、これは、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドをコードするベクターまたはＲＮＡ分子を対象に直接投与して（例えば、静脈内投与により）、ＡＣＴＲポリペプチドを含む宿主細胞をインビボで産生することによって達成されうる。
【０１３６】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞の製造方法はまた、前記宿主細胞をエクスビボで活性化することを含みうる。宿主細胞の活性化は、宿主細胞を、前記細胞がエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を実行できうる活性化状態に刺激することを意味する。宿主細胞を活性化する方法は、ＡＣＴＲポリペプチドの発現のために用いられる宿主細胞のタイプによる。例えば、Ｔ細胞は、下記に限定されないが：抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、および／またはフィトヘマグルチニンを含む１つまたはそれ以上の分子の存在下において、エクスビボで活性化されうる。他の例において、ＮＫ細胞は、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−２1、および／またはＫ５６２細胞などの１つまたはそれ以上の分子の存在下において、エクスビボで活性化されうる。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを発現する宿主細胞（ＡＣＴＲ発現細胞）は、対象への投与前にエクスビボで活性化される。宿主細胞が活性化されるかどうかの決定は、当業者にとって明らかであり、細胞活性化、サイトカインの発現または分泌、および細胞形態に関連する１つまたはそれ以上の細胞表面マーカーの発現を評価することを含みうる。
【０１３７】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞の製造方法は、宿主細胞をエクスビボで増殖することを含みうる。宿主細胞の増殖は、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する細胞数の増加を生じ、例えば、前記宿主細胞を増殖させるか、または前記宿主細胞を刺激して増殖させる方法に関しうる。宿主細胞の増殖を刺激するための方法は、ＡＣＴＲポリペプチドの発現のために用いられる宿主細胞のタイプにより、当業者にとって明らかである。ある実施態様において、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞は、対象への投与前にエクスビボで増殖される。
【０１３８】
ある実施態様において、前記ＡＣＴＲポリペプチドを発現する宿主細胞は、前記細胞の対象への投与前にエクスビボで増殖され、活性化される。宿主細胞の活性化および増殖は、ウイルスベクターのゲノムへの組み込みおよび本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にするために用いられうる。ｍＲＮＡエレクトロポレーションが用いられる場合、エレクトロポレーションが、活性化された細胞で行われるときにより有効となりうるが、活性化および／または増殖は必要とされ得ない。ある例において、、ＡＣＴＲポリペプチドは、適当な宿主細胞中で一過的に発現される（例えば、３〜５日間）。一過的な発現は、潜在的な毒性が存在する場合に有効であり得、副作用の可能性について臨床試験の最初の段階で助けとなりうる。
【０１３９】
前記ＡＣＴＲポリペプチドを発現する宿主細胞のいずれかが医薬的に許容される担体と混合されて、本開示の範囲内でもある医薬組成物が生成されうる。
【０１４０】
用語「医薬的に許容される」は、本開示の組成物について用いられるように、生理学的に許容され、一般に、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されても有害反応を生じない化合物およびこのような組成物の他の成分を意味する。好ましくは、本明細書で用いられるように、用語「医薬的に許容される」は、哺乳動物、より具体的には、ヒトにおける使用のために、連邦政府の監督官庁または州政府によって認可され、または米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に記載されることを意味する。「許容される」は、前記担体が、組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療抗体）に適合し、その組成物が投与される対象に悪影響を及ぼさないことを意味する。本発明の方法で用いられる医薬組成物のいずれもが、医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で含むことができる。
【０１４１】
医薬的に許容される担体（緩衝液を含む）は、当該技術分野で周知であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖類；二糖類；および他の炭水化物；金属錯体；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤を含みうる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins、Ed. K. E. Hooverを参照。
【０１４２】
本開示の医薬組成物はまた、治療される特定の症状および／またはＡＤＣＣの亢進、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない相補的活性によるもののために必要に応じて、１つまたはそれ以上のさらなる活性化合物を含みうる。可能なさらなる活性化合物の非限定的な例として、例えば、ＩＬ−２、ならびに当該技術分野で公知であり、下記の併用療法の記載で列挙される種々の薬剤が挙げられる。
【０１４３】
本開示の文脈において、本明細書に記載される疾患状態のいずれかに関する限り、用語「治療する」、「治療」などは、このような状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減し、または緩和すること、あるいはこのような状態の進行を遅延させ、または逆転させることを意味する。本開示の意義の範囲内において、用語「治療する」はまた、疾患の進行または悪化を停止し、その開始（すなわち、疾患の臨床症状前の期間）を遅延させ、および／またはそのリスクを減少させることを意味する。例えば、癌に関しては、用語「治療する」は、患者の腫瘍組織量を排除し、もしくは減少させ、あるいは転移を予防し、遅延させ、または阻害することなどを意味しうる。
【０１４４】
ＩＩＩ．ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞および治療抗体の併用免疫療法
本開示の例示的なＡＣＴＲポリペプチドは、Ｔリンパ球に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の能力を付与し、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣを高める。前記受容体が、細胞に結合した抗体に結合されると、結合した細胞に対して、Ｔ細胞活性化、持続的な増殖、および特異的な細胞傷害性を誘発する。
【０１４５】
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性の程度は、ＡＤＣＣおよびそれによる抗体免疫療法に対する臨床反応の重要な決定因子である。Ｉｇに対して高い結合親和性を有し、優れたＡＤＣＣを介在するＶ１５８多型を有するＣＤ１６が一例として選択された。Ｆ１５８受容体は、Ｔ細胞増殖およびＡＤＣＣの誘導においてＶ１５８受容体より低い効力を有するが、Ｆ１５８受容体は、Ｖ１５８受容体より低いインビボ毒性を有しており、ある臨床状況で有用となる。
【０１４６】
本開示のＡＣＴＲポリペプチドおよび方法は、癌抗原に特異的に結合する抗体と組み合わせると、１の単一の受容体を全ての癌について使用することを可能にすることによってＴ細胞治療を容易なものとする。抗体に対する細胞傷害性は、抗体投与を単に使用中止することによって定めるようにいつでも停止しうる。臨床的な安全性は、可能性のある自己免疫反応性を制限するために、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを用いて一過的にＡＣＴＲポリペプチドを発現させることによってさらに高めることができる。
【０１４７】
よって、１の実施態様において、本開示は、必要とする対象における癌の抗体に基づく免疫療法の有効性を高めるための方法であって、この対象は、抗原発現細胞に結合することができ、ヒトＣＤ１６に結合することができるヒト化Ｆｃ部分を有する抗体で治療されるものであり、前記対象に、治療上有効な量の抗体および治療上有効な量のＴリンパ球またはＮＫ細胞を取り込むことを特徴とし、このＴリンパ球またはＮＫ細胞は、本開示のＡＣＴＲポリペプチドを含むものである方法を提供する。
【０１４８】
本明細書で用いられるように、用量または量に用いられる用語「治療上有効な」は、それを必要とする対象への投与により所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量を意味する。活性成分の組み合わせが投与される場合（例えば、抗体を含む第１の医薬組成物、および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物を発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団を含む第２の医薬組成物）、前記組み合わせの有効な量は、個々に投与された場合に有効であろう各成分の量を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよいことに留意すべきである。本開示の文脈内において、用語「治療上有効な」は、本開示の方法によって治療される障害の少なくとも１つの症状の兆候を遅延させ、前記症状の進行を停止させ、前記症状を軽減し、もしくは緩和するのに十分な化合物または医薬組成物の量を意味する。
【０１４９】
Ａ．免疫療法の有効性の亢進
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、免疫細胞）は、対象におけるＡＤＣＣを高めるために、および／または抗体に基づく免疫療法の有効性を高めるために有用である。ある実施態様において、前記対象は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または飼育哺乳動物などの哺乳動物である。ある実施態様において、前記対象は、ヒトである。ある実施態様において、前記対象は、ヒト癌患者である。ある実施態様において、前記対象は、本明細書に記載される治療抗体のいずれかで治療されていたか、または治療されている。 
【０１５０】
本明細書に記載される方法を実施するために、有効な量の本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する免疫細胞（ＮＫ細胞および／またはＴリンパ球）および有効な量の抗体またはその組成物は、適当な経路（例えば、静脈内投与など）により治療を必要とする対象に投与されうる。本明細書で用いられるように、有効な量は、投与により前記対象において治療効果を与えるそれぞれの薬剤（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドを発現するＮＫ細胞および／またはＴリンパ球、抗体、またはこれらの組成物）の量を意味する。本明細書に記載される細胞または組成物の量が治療効果を奏するかどうかの決定は、当業者にとって明らかである。有効な量は、当業者によって認識されるように、特定の治療される状態、病気の重症度、各患者のパラメーター（年齢、健康状態、大きさ、性別、性、および体重を含む）、治療期間、同時療法の特徴（もしあれば）、具体的な投与経路、医師の知識と専門知識内の因子などに応じて変動する。ある実施態様において、前記有効な量は、対象における疾患または障害を緩和し、軽減し、寛解し、改善し、その症状を減少し、またはその進行を遅延する。ある実施態様において、前記対象は、ヒトである。ある実施態様において、治療を必要とする対象は、ヒト癌患者である。
【０１５１】
本開示の方法は、いずれの癌の治療のために用いられてもよい。本開示の方法によって治療することができる癌の具体的な非限定的な例として、例えば、リンパ腫、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、グリア芽腫、甲状腺癌、肝細胞癌、食道癌、子宮頚癌、および神経芽腫が挙げられる。ある実施態様において、前記癌は、固形腫瘍でありうる。
【０１５２】
ある実施態様において、前記免疫細胞は、ＡＤＣＣ活性を、少なくとも２０％までおよび／または少なくとも２倍まで高め、例えば、ＡＤＣＣを５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上まで高めるのに有効な量で対象に投与される。
【０１５３】
前記免疫細胞は、抗体が結合する抗原を発現する細胞を標的とするために、治療抗体と共投与される。抗体に基づく免疫療法は、前記免疫療法が対象に有用と考えられる疾患または障害を治療し、緩和し、またはその症状を減少するために用いられうる。
【０１５４】
抗体（複数の形で交換可能に用いられる）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的（例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられるように、用語「抗体」には、無傷な（すなわち、全長）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみではなく、Ｆｃ領域を含むその抗原結合フラグメント、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、ナノボディ、線状（linear）抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および必要とされる特異性の抗原認識部位およびＦｃ領域を含む免疫グロブリン分子の他の修飾された立体構造（抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合で修飾された抗体を含む）も含まれる。抗体として、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などのいずれかのクラスの抗体、およびいずれの特定のクラスでもない抗体が挙げられる。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類されうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常ドメインは、各々、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびｍｕと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。本開示において用いるための抗体には、併用されるＡＣＴＲ Ｔ細胞によって認識できるＦｃ領域が含まれる。前記Ｆｃ領域は、ヒトまたはヒト化Ｆｃ領域でありうる。
【０１５５】
本明細書に記載される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。「モノクローナル抗体」は、同種抗体の集団を意味し、「ポリクローナル抗体」は、異種抗体の集団を意味する。これらの２つの用語は、抗体の供給源またはそれが製造される方法を限定するものではない。
【０１５６】
１の例において、本明細書に記載される方法で用いられる抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその抗原結合フラグメント（非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を意味する。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、アフィニティー、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、前記ヒト化抗体には、レシピエント抗体にも持ち込まれるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されないが、抗体の能力をさらに高め、最適化するために含まれる残基が含まれうる。一般に、前記ヒト化抗体には、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てが含まれる。ヒト化抗体にはまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの一部が含まれる。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように改変されたＦｃ領域を有しうる。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変化している１つまたはそれ以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）のＣＤＲを有し、前記ＣＤＲは、元の抗体からの１つまたはそれ以上のＣＤＲ「に由来する」１つまたはそれ以上のＣＤＲとも呼ばれる。ヒト化抗体は、親和性成熟に関連しうる。
【０１５７】
別の例において、本明細書に記載される抗体は、を含むヒト抗体に由来する重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含むことができるキメラ抗体である。キメラ抗体は、第１の種に由来する可変領域または可変領域の一部および第２の種に由来する定常領域を有する抗体を意味する。一般に、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物）のうちの一種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常領域部分は、別の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列と同種である。ある実施態様において、アミノ酸の修飾は、可変領域および／または定常領域でなされうる。
【０１５８】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞）は、Ｆｃを含有する抗体で治療されていたか、または治療されている対象に投与されうる。例えば、前記免疫細胞は、抗体と同時にヒト対象に投与されうる。あるいは、前記免疫細胞は、抗体に基づく免疫療法の過程中にヒト対象に投与されうる。ある例において、前記免疫細胞および抗体は、少なくとも４時間離れて、例えば、少なくとも１２時間離れて、少なくとも１日離れて、少なくとも３日間離れて、少なくとも１週間離れて、少なくとも２週間離れて、または少なくとも１ヶ月離れて、ヒト対象に投与することができる。
【０１５９】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、対応する標的抗原またはそのエピトープに特異的に結合する。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野で十分に認識されている用語である。分子は、別の標的と反応する場合より、特定の標的抗原とより長い期間および／またはより高い親和性をもってより高い頻度でより迅速に反応する場合、その分子は「特異的結合」を示すとされる。抗体は、他の物質に結合するより、より高い親和性、結合活性、より容易に、および／またはより長い期間で結合する場合、標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。例えば、抗原または抗原エピトープに特異的（または優先的）に結合する抗体は、同一の抗原における他の抗原または他のエピトープに結合するよりより高い親和性、結合活性、より容易に、および／またはより長い期間でこの標的抗原に結合する抗体である。この定義により、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合してもよく、または結合しなくてもよいものと理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は、（それを含むことができるが）必ずしも排他な結合を必要とするものではない。ある例において、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、同一の抗原における他の抗原または他のエピトープに結合しなくてもよい。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、ＴＮＦ−アルファ、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＰＤＧＦ−Ｒ−アルファ、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、ＢＬｙＳ、ＣＤ３０、ＩＬ１−Ｂ、ＥＧＦＲ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＤ２、Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ５、アルファ４インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＩｇＥ、ＲＳＶ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、インテグリンアルファ４ベータ７、またはＰＳＭＡに特異的に結合する。
【０１６０】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、標的抗原（例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＰＤＧＦ−Ｒ−アルファ、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、ＢＬｙＳ、ＣＤ３０、ＩＬ１−Ｂ、ＥＧＦＲ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＤ２、Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ５、アルファ４ インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＩｇＥ、ＲＳＶ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、インテグリンアルファ４ベータ７、またはＰＳＭＡ）またはその抗原エピトープに対して適当な結合親和性を有する。本明細書で用いられるように、「結合親和性」は、見掛けの結合定数またはＫＡを意味する。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載される方法において用いられる抗体は、標的抗原または抗原エピトープに対して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれ以下の結合親和性（ＫＤ）を有しうる。より高い結合親和性は、より低いＫＤに相当する。第２の抗原と比較して第１の抗原に対する抗体のより高い親和性結合は、第２の抗原への結合のＫＡ（またはＫＤ値）より第１の抗原への結合のより高いＫＡ（またはより低いＫＤ値）によって示すことができる。このような場合において、前記抗体は、第２の抗原（例えば、第２の立体構造もしくはその模倣物における同一の第１のタンパク質；または第２のタンパク質）と比較して第１の抗原（例えば、第１の立体構造またはその模倣物における第１のタンパク質）に対して特異性を有する。結合親和性（例えば、特異性または他の比較に関する）における相違は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、または１０５倍でありうる。ある実施態様において、前記抗体のいずれかは、さらに親和性成熟されて、標的抗原またはその抗原エピトープに対する抗体の結合親和性が高められてもよい。
【０１６１】
結合親和性（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを用いる）を含む様々な方法により決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）中である。これらの技術は、結合した結合タンパク質の濃度を標的タンパク質の濃度に応じて測定するために用いることができる。結合した結合タンパク質の濃度（［結合濃度］）は、下記式によって遊離の標的タンパク質の濃度（［遊離濃度］）に一般に関連している：
［結合濃度］＝［遊離濃度］／（Ｋｄ＋［遊離濃度］）
【０１６２】
ＫＡを正確に決定することは、例えば、ＫＡに比例するＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を用いて決定された親和性の定量的な測定を得ることが十分であることもあるため、必ずしも必要ではなく、それゆえ、高い親和性が、例えば、２倍高いかどうかを決定するなどの比較を用いて、親和性の定性測定を得るか、または例えば、機能アッセイ（例えば、インビトロまたはインビボアッセイ）における活性によって親和性の推測を得ることができる。
【０１６３】
本明細書に記載される免疫療法の方法において用いるための抗体は、特定の領域またはその中の抗原エピトープに結合しうる（例えば、特異的に結合する）。
【０１６４】
本明細書に記載される組成物および方法で用いるための例示的な抗体として、ＴＮＦアルファ、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＰＤＧＦ−Ｒ−アルファ、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、ＢＬｙＳ、ＣＤ３０、ＩＬ１−Ｂ、ＥＧＦＲ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＤ２、Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ５、アルファ４ インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＩｇＥ、ＲＳＶ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、インテグリンアルファ４ベータ７、またはＰＳＭＡに特異的な抗体、ならびに他の公知の抗体が挙げられる。非限定的な例として、本明細書に記載される組成物および方法で用いるための抗体は、下記：アダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツマブエムタンシン、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブのうちの１つまたはそれ以上でありうる。
【０１６５】
抗体に基づく免疫療法の有効性は、当該技術分野で公知の方法のいずれかにより評価されてもよく、当該医療分野の当業者にとって明らかである。例えば、抗体に基づく免疫療法の有効性は、対象における生存率、あるいは対象またはその組織もしくはサンプルにおける腫瘍もしくは癌の量により評価されうる。ある実施態様において、前記免疫細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞および／または抗体の非存在下での有効性と比較して、少なくとも２０％までおよび／または少なくとも２倍まで抗体に基づく免疫療法の有効性を高めるために、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上まで抗体に基づく免疫療法の有効性を高めるために有効な量において、治療を必要とする対象に投与される。 
【０１６６】
本明細書に記載される組成物または方法のいずれかにおいて、前記免疫細胞（例えば、ＮＫおよび／またはＴ細胞）は、対象の自己のものであってもよく、すなわち、前記免疫細胞は、治療を必要とする対象から取得され、ＡＣＴＲポリペプチドの発現のために遺伝学的に操作され、次いで同一の対象に投与されてもよい。１の特定の実施態様において、対象に再度取り込む前に、自己の免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）は、エクスビボで活性化され、および／または増殖される。自己の細胞の対象への投与は、非自己の細胞の投与と比較して宿主細胞の拒絶反応を減らしうる。
【０１６７】
あるいは、前記宿主細胞は、同種異系細胞であり、すなわち、前記細胞は、第１の対象から取得され、ＡＣＴＲポリペプチドの発現のために遺伝学的に操作され、次いで第１の対象とは異なるが、同一の種である第２の対象に投与される。例えば、同種異系免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、前記ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与されうる。特定の実施態様において、前記Ｔリンパ球は、内在性Ｔ細胞受容体の発現が阻害され、または除去された同種異系Ｔリンパ球である。１の特定の実施態様において、前記対象に取り込む前に、前記同種異系Ｔリンパ球は、エクスビボで活性化され、および／または増殖される。Ｔリンパ球は、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２、および／またはフィトヘマグルチニンの存在下において、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって活性化することができる。
【０１６８】
ＮＫ細胞は、例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質、およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１つまたはそれ以上の薬剤の存在下において、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって活性化することができる。例えば、ＮＫ細胞を増殖させるための有用な方法の記載について米国特許第７，４３５，５９６号および第８，０２６，０９７号を参照のこと。例えば、本開示の組成物または方法で用いられるＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉおよび／またはＩＩ分子を欠失するか、またはこれらの発現が乏しく、膜結合ＩＬ−１５および４−１ＢＢリガンド（ＣＤＩ３７Ｌ）を発現するように遺伝学的に改変された細胞に暴露することによって優先的に増殖されうる。このような細胞株として、必ずしも下記に限定されないが、Ｋ５６２［ＡＴＣＣ，ＣＣＬ２４３；Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975)；Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)］、およびウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（Fehniger et al., Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001)；Harada H、et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)）、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌腫細胞株Ｌｕ−１３０およびＬｕ−１３４−Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ１９およびＮ１３６９、精巣に由来する胚性癌腫細胞株ＮＥＣ１４、子宮頚癌細胞株ＴＣＯ−２、および骨髄転移神経芽腫細胞株ＴＮＢ１［Harada, et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)］が挙げられる。好ましくは、用いられる細胞株は、ＭＨＣＩおよびＩＩ分子の両方を欠失しているか、またはこれらの発現が乏しく、例えば、Ｋ５６２およびＨＦＷＴ細胞株などである。固体支持体が細胞株の代わりに用いられてもよい。このような支持体は、好ましくは、その表面上において、ＮＫ細胞に結合し、最初の活性化事象および／または増殖性応答を引き起こすことができるか、またはこのような効果を有する分子に結合し、それにより足場として作用することができる少なくとも１つの分子に結合しているべきである。前記支持体は、その表面上において、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５受容体抗体に結合していてもよい。好ましくは、前記支持体は、その表面上に結合したＩＬ−１５受容体抗体およびＣＤ１３７抗体を有する。
【０１６９】
記載される組成物または方法の１つの実施態様において、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞またはＴリンパ球、およびＮＫ細胞を前記対象に取り込み（または再度取り込み）、続いて治療上有効な量のＩＬ−２を前記対象に投与する。
【０１７０】
本開示に従って、患者は、本開示のＡＣＴＲポリペプチドを含む免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）の治療上有効な用量を、体重１キログラムあたり約１０５〜１０１０個またはそれ以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で注入することによって治療することができる。前記注入は、所望の反応が達成されるまで患者が耐容できる限り何度でも繰り返すことができる。適当な注入の用量およびスケジュールは、患者ごとに変動するが、特定の患者のために治療する医師により決定することができる。一般に、約１０６細胞／Ｋｇの開始用量が注入され、１０８個またはそれ以上の細胞／Ｋｇまで漸増させる。ＩＬ−２は、注入された細胞を増加させるために共投与することができる。ＩＬ−２の量は、体表面の１平方メートル当たり約１〜５ｘ１０６の国際単位でありうる。
【０１７１】
ある実施態様において、前記抗体は、約１００〜５００ｍｇ、５００〜１０００ｍｇ、１０００〜１５００ｍｇ、または１５００〜２０００ｍｇの１用量またはそれ以上で前記対象に投与される。ある実施態様において、前記抗体は、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、または約９００ｍｇの１用量またはそれ以上で前記対象に投与される。ある実施態様において、前記抗体は、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、または約１８００ｍｇの１用量またはそれ以上で前記対象に投与される。ある実施態様において、前記抗体は、約１６００ｍｇの１用量またはそれ以上で前記対象に投与される。
【０１７２】
本明細書に記載される方法で用いられる具体的な投薬計画、すなわち、用量、時期および頻度は、その具体的な対象およびその対象の病歴に依存する。用いられる抗体の適当な用量は、治療される癌のタイプ、病気の重症度および進行、過去の治療、患者の病歴および抗体に対する応答性、ならびに担当医の判断に依存する。抗体は、一度に、または一連の治療にわたり患者に投与することができる。本開示の治療過程は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターすることができる。
【０１７３】
抗体の投与は、全身投与ならびに疾患部位（例えば、腫瘍）への直接投与を含む適当な経路のいずれかによって行うことができる。
【０１７４】
ある実施態様において、前記方法は、１回の用量で前記抗体を前記対象に投与することに関する。ある実施態様において、前記方法は、複数回投与（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８回の用量）で前記抗体を前記対象に投与することに関する。ある実施態様において、前記抗体は、前記抗体の最初の用量が、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与約１、２、３、４、５、６、または７日前に前記対象に投与される複数回投与で前記対象に投与される。ある実施態様において、前記抗体の最初の用量は、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与約２４〜４８時間前に前記対象に投与される。
【０１７５】
ある実施態様において、前記抗体は、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与前、その後約２週間ごとに前記対象に投与される。ある実施態様において、前記抗体の最初の２回の用量は、約１週間（例えば、約６、７、８、または９日間）離れて投与される。ある実施態様において、第３回目とその後の用量は、約２週間ごとに投与される。
【０１７６】
本明細書に記載される実施態様のいずれにおいても、前記抗体の投与時期は、幅があり、示される日の３日前および３日後（例えば、３週間ごとの投与には、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、または２４日目の投与が含まれる）が含まれる。
【０１７７】
本明細書に記載される組成物または方法の有効性は、当該技術分野で公知の方法により評価されてもよく、当該医療分野の当業者にとって明らかである。例えば、抗体に基づく免疫療法の有効性は、対象の生存率あるいは対象またはその組織もしくはサンプル中の癌の量により評価されうる。ある実施態様において、前記抗体に基づく免疫療法は、例えば、対象の健康全般および／または有害事象の存在または有害事象の重症度によって、治療（例えば、抗体およびＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与）の安全性または毒性に基づいて評価される。
【０１７８】
Ｂ．併用療法
本開示に記載される組成物および方法は、他のタイプの癌のための治療、例えば、化学療法、外科手術、放射線、遺伝子治療などとともに用いられてもよい。このような治療は、本開示による免疫療法と同時にまたは連続して（いずれの順番においても）投与することができる。
【０１７９】
さらなる治療剤と共投与される場合、各薬剤の適当な治療上有効な用量は、相加または相乗効果により減少されうる。
【０１８０】
本開示の治療は、例えば、治療用ワクチン（以下に限定されないが、ＧＶＡＸ、ＤＣに基づくワクチンなどを含む）、チェックポイント阻害剤（以下に限定されないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを阻害する薬剤を含む）、または活性化因子（以下に限定されないが、４１ＢＢ、ＯＸ４０などを亢進する薬剤を含む）などの他の免疫調節療法と組み合わせることができる。
【０１８１】
本開示の免疫療法との組み合わせに有用な他の治療剤の非限定的な例として、（ｉ）抗血管形成剤（例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼ組織阻害因子（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６−Ｋｄフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８−Ｋｄフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、形質転換増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、ならびにCarmeliet and Jain (2000)に列挙のもの）；（ｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害因子、およびこれらの組み合わせ；ならびに（ｉｉｉ）化学療法化合物、例えば、ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、およびシタラビン）、プリンアナログ、葉酸アンタゴニストおよびその関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖性／抗有糸分裂剤（天然産物を含む）、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管崩壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビン、エピポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、それら自身のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を除去するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；抗増殖性／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびそのアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（methylmelamines）（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびそのアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（trazenes-dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；抗増���性／抗有糸分裂代謝拮抗剤、例えば、葉酸アナログ（メトトレキサート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩およびトロンビンの他の阻害剤）；血栓溶解薬（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走性薬剤；抗分泌性薬剤（ブレフェルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管形成化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）、および増殖因子阻害剤（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツマブ）；細胞周期阻害剤、および分化誘導体（トレチノイン）；ＡＫＴ阻害剤（例えば、ＭＫ−２２０６ ２ＨＣｌ、ペリホシン（ＫＲＸ−０４０１）、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ（ＧＤＣ−００６８）、ＡＺＤ５３６３、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、またはトリシリビン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、およびイリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、およびプレドニゾロン）；増殖因子シグナル変換キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤およびカスパーゼ活性化剤；ならびにクロマチン崩壊剤が挙げられる。
【０１８２】
さらなる有用な薬剤の例は、Physician's Desk Reference,59.sup.th edition,(2005),Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill,NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.Jを参照のこと。
【０１８３】
Ｃ．ＡＣＴＲ−Ｔ細胞を抗腫瘍抗体と組み合わせて用いる固形腫瘍の治療計画
本明細書に記載される方法はまた、少なくとも一部は、ＡＣＴＲ（例えば、配列番号：９で示されるＡＣＴＲ）を発現する免疫細胞および抗腫瘍抗体（例えば、リツキシマブまたはトラスツズマブ）の組み合わせが、ＣＤ２０またはＨＥＲ２のような腫瘍抗原を発現する抗体結合標的癌細胞に応答して免疫細胞の増殖および活性化を生じ、ならびに前記増殖および活性化が抗体依存性であり、自己限定であるという知見に基づくものである。抗腫瘍抗体（例えば、リツキシマブ）への適切な暴露による依存は、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の活性が、抗体の用量および投与スケジュールによって調節することができることを示しており、以前から用いられているＣＡＲ Ｔ細胞を超えた本明細書に記載される方法の利点を供する。
【０１８４】
従って、本開示はまた、固形腫瘍（例えば、リンパ腫、特に、再発性および／または難治性リンパ腫）を治療するためにＡＣＴＲ−Ｔ細胞および抗腫瘍（例えば、抗ＣＤ２０）抗体の組み合わせを用いる治療計画を提供する。この治療において、治療を必要とする対象は、条件付け処置（例えば、リンパ球枯渇療法）、続いて組み合わせ抗腫瘍抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）／ＡＣＴＲ−Ｔ細胞治療（抗腫瘍抗体（例えば、リツキシマブなどのＣＤ２０抗体）の投与およびＡＣＴＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の注入を含む）に付されてもよい。下記は、ＣＤ２８共刺激ドメインおよび抗ＣＤ２０抗体を有するＡＣＴＲポリペプチドを発現するＴ細胞を用いる例示であって、非限定的な例である。
【０１８５】
前記治療に適当な対象は、通常の医療行為によって同定されうる。このような対象は、ＣＤ２０＋リンパ腫、特に、再発性または難治性ＣＤ２０＋リンパ腫に罹っているヒト患者でありうる。リンパ腫は、リンパ系細胞から発生する一群の血球腫瘍を意味する。ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫は、２つの主なタイプのリンパ腫である。リンパ腫は、リンパ腫細胞がそのリンパ腫に対する治療を経た後に対象の骨髄に存在する場合、「難治性」とされうる。あるいは、リンパ腫は、そのリンパ腫の寛解後に、リンパ腫細胞の復帰が骨髄中で検出され、正常な血球数の減少が存する場合、「再発性」とされる。ある実施態様において、前記再発性または難治性ＣＤ２０＋リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫である。ある実施態様において、前記ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、グレード３ｂ濾胞性リンパ腫（Ｇｒ３ｂ−ＦＬ）、または組織学的形質転換された濾胞性リンパ腫（ＴＨ−ＦＬ）である。
【０１８６】
抗ＣＤ２０／ＡＣＴＲ治療前に、ヒト固形腫瘍（例えば、リンパ腫）患者などの対象は、対象の内在性リンパ球を減少させ、または枯渇させるためのリンパ球枯渇療法などの条件付け処置に付されてもよい。
【０１８７】
リンパ球枯渇は、免疫移植および免疫療法前に一般に用いられる内在性リンパ球および／またはＴ細胞の破壊を意味する。リンパ球枯渇は、放射線照射および／または化学療法によって行うことができる。「リンパ球枯渇剤」は、対象に投与されると、内在性リンパ球および／またはＴ細胞を減少させ、枯渇させ、または除去させることができるいずれかの分子でありうる。ある実施態様において、前記リンパ球枯渇剤は、前記薬剤の投与前のリンパ球の数と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％までリンパ球の数を減少させるために有効な量で投与される。ある実施態様において、前記リンパ球枯渇剤は、対象におけるリンパ球の数が検出限界未満となるようにリンパ球の数を減少させるために有効な量で投与される。ある実施態様において、前記対象は、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）のリンパ球枯渇剤で投与される。ある実施態様において、前記リンパ球枯渇剤は、リンパ球を特異的に死滅させる細胞傷害性剤である。リンパ球枯渇剤の例としては、下記に限定されないが、フルダラビン、シクロホスファミド、ベンダムスチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ダカルバジン、メルファラン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、リン酸エトポシド、ミトキサントロン、クラドリビン、デニロイキンジフチトクス、またはＤＡＢ−ＩＬ−２が挙げられる。ある例において、前記リンパ球枯渇剤は、低用量の放射線照射を伴いうる。条件付け処置のリンパ球枯渇効果は、通常の実務によりモニタリングすることができる。
【０１８８】
ある実施態様において、リンパ球枯渇療法には、１つまたはそれ以上のリンパ球枯渇剤、例えば、フルダラビンおよびシクロホスファミドが含まれる。本明細書に記載される方法によって治療される対象は、条件付け段階で適当な期間（例えば、２〜５日間）の１つまたはそれ以上のリンパ球枯渇剤の複数回投与を受容しうる。
【０１８９】
条件付け処置（リンパ球枯渇療法）後、前記対象は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）の投与およびＡＣＴＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の注入を含む抗ＣＤ２０／ＡＣＴＲ治療計画に付される。
【０１９０】
抗ＣＤ２０治療は、ＡＣＴＲ発現免疫細胞の治療前に本明細書に記載される対象に行うことができる。ＣＤ２０は、全ての段階のＢ細胞の表面上で発現されるＢリンパ球抗原である。ＣＤ２０陽性細胞は、ホジキン病、骨髄腫、および胸腺腫の場合に見出される。ヒトＣＤ２０は、ＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードされる。当該技術分野で公知の抗ＣＤ２０抗体は、本明細書において提供される方法で用いられうる。抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０分子（例えば、Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ２０分子）に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。１の例において、前記抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。医療分野の当業者に公知の慣用的な方法は、前記抗ＣＤ２０抗体を含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与するために用いることができる。この組成物はまた、他の慣用的な経路により投与することができ、例えば、非経口的に投与することができる。本明細書で用いられる用語「非経口」には、皮下、皮膚内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。
【０１９１】
前記抗ＣＤ２０治療後、前記対象は、例えば、注入によりＡＣＴＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を受容する。ＡＣＴＲを発現するＴ細胞は、治療上有効な用量で対象に投与されうる。非限定的な例の一組として、前記ＡＣＴＲを発現するＴ細胞は、４０ｘ１０６個の細胞、８０ｘ１０６個の細胞、１５０ｘ１０６個の細胞、または３００ｘ１０６個の細胞の用量で対象に投与されうる。１用量または２用量以上のＡＣＴＲを発現するＴ細胞（例えば、１、２、３、４、５、６、または７用量）が同一の対象に投与されうる。
【０１９２】
本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物のいずれもがこの方法に用いられうる。ある実施態様において、この治療に用いられるＡＣＴＲ構築物は、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ｖアイソフォーム）などのＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含みうる。特定の例において、前記ＡＣＴＲ構築物は、配列番号：９でありうる。
【０１９３】
ＡＣＴＲ−Ｔ細胞治療後、１サイクルまたはそれ以上の抗ＣＤ２０治療は、必要に応じて行われてもよく、医師により決定することができる。例えば、さらなる１サイクルの抗ＣＤ２０抗体治療は、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞治療後に行うことができる。用量制限毒性（ＤＬＴ）評価は、前記対象に行うことができる。そして、前記対象は、さらに別のサイクルの抗ＣＤ２０抗体治療、続いて応答評価に付されうる。前記抗ＣＤ２０抗体治療は、疾患進行が見られるならば、さらに２１日間継続しうる。
【０１９４】
図２２は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞をリツキシマブと組み合わせて用いる再発性または難治性ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫に罹っている患者を治療するための例示的な治療スケジュールを示す図である。下記の組織学的サブタイプのうちの１つの組織学的に確認された再発性または難治性ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫に罹っている対象が適格でありうる：ＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ、ＰＭＢＣＬ、Ｇｒ３ｂ−ＦＬ、ＴＨ−ＦＬ。
【０１９５】
本明細書に記載され方法の有効性は、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって評価され、医療分野の当業者にとって明らかである。例えば、抗体に基づく免疫療法の有効性は、対象の生存率、あるいは対象またはその組織もしくはサンプルにおける癌の量によって評価されうる。ある実施態様において、前記抗体に基づく免疫療法は、例えば、対象の健康全般および／または有害事象の存在または有害事象の重症度によって、対象における治療（例えば、抗ＣＤ２０抗体およびＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与）の安全性または毒性に基づいて評価される。
【０１９６】
Ｄ．活性化Ｔ細胞の抗原に関する疾患の治療
従来のＣＡＲ−Ｔ治療は、細胞表面抗原に特異的なＣＡＲ構築物の使用に関するものであり、それによりこのような抗原を発現する病理学的細胞を排除するものである。ＣＡＲ−Ｔ細胞が活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ５、ＣＤ３８、またはＣＤ７）上に存在する表面抗原を標的とする場合、このようなＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ増殖は、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞もまた、このような表面抗原を発現するため、損なわれ、別のＣＡＲ−Ｔ細胞によって死滅させられる（同族殺し効果（fratricide effect））。よって、ＣＡＲ−Ｔ治療の開発は、それが標的とする細胞抗原によって限定されている。
【０１９７】
ＡＣＴＲ−Ｔ治療は、このような抗原の制限がない。ＡＣＴＲ−Ｔ細胞は、病理学的細胞を直接標的とせず、抗体を介在因子として使用する。従って、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞のインビトロ増殖は、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞が標的とする抗原のタイプによって制限されることはない。
【０１９８】
従って、本開示はまた、活性化Ｔ細胞の表面上で発現される抗原に特異的な抗体；および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現するＴ細胞の組み合わせた使用に関する対象における細胞傷害性を誘導するための方法を提供する。この方法は、活性化Ｔ細胞上にも存在する表面抗原を発現する細胞に関する疾患の治療に利益をもたらす。
【０１９９】
いずれのＡＣＴＲ構築物、例えば、当該技術分野で公知であるか、または本明細書に記載されるものが、この方法で用いられうる。例えば、この方法で用いられるＡＣＴＲ構築物には、（ａ）Ｆｃ結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；（ｃ）少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメイン；および（ｄ）細胞質シグナル伝達ドメイン（免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む）が含まれてもよく、（ｃ）または（ｄ）は、キメラ受容体のＣ末端に位置する。ある実施態様において、前記ＡＣＴＲは、（ａ）と（ｂ）との間に位置しうるヒンジドメインをさらに含みうる。
【０２００】
本明細書に記載されるＦｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、および／またはヒンジドメインのいずれもが、この方法で用いられるＡＣＴＲを構築するために用いることができる。
【０２０１】
上記に記載のＣＤ２８の共刺激ドメインに加えて、他の共刺激ドメインもまた、この方法で用いられるＡＣＴＲ構築物を作成するために用いることができる。例として、下記に限定されないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、およびＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば，４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、およびＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、およびＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；ならびに他の共刺激分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリ アルファ４ ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、およびＮＫＧ２Ｃ）が含まれる。ある実施態様において、前記共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）、またはＣＤ２、あるいはこれらの変異体のいずれかのものである。
【０２０２】
対象における細胞傷害性を誘導するための方法で用いられるための例示的なＡＣＴＲ構築物は、例えば、本明細書および図面（例えば、配列番号：９）で見出されうるか、またはこの目的のために出典明示により本明細書に取り込まれる国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９１２６で見出されうる。 
【０２０３】
ある実施態様において、細胞傷害性を誘導するための方法で用いられるＡＣＴＲ−Ｔ細胞は、例えば、本明細書に記載される方法に従ってインビトロで増殖される。
【０２０４】
Ｔ細胞の表面上で発現される抗原に特異的な抗体は、Ｔ細胞の表面上で発現される抗原のいずれかに対する抗体を含んでいてもよい。例えば、前記抗体は、ＣＤ３８またはＣＤ７に結合してもよい。非限定的な例の別の組として、前記抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、またはＣＤ５に結合してもよい。Ｔ細胞の表面上で発現される抗原に結合する抗体には、下記に限定されないが、ダラツムマブ、ＳＡＲ６５０９８４、シプリズマブ、ＢＴＩ−３２２、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、ゾリモマブアリトックス、テリモマブアリトクス（telimomab aritox）が含まれうる。
【０２０５】
ＩＶ．治療用途のためのキット
本開示はまた、本明細書に記載される組成物の使用のためのキットを提供する。例えば、本開示はまた、抗体依存性細胞傷害性を高め、抗体に基づく免疫療法を高めるための抗体および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物を発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）の集団の使用のためのキットを提供する。このようなキットは、抗体および医薬的に許容される担体を含む第１の医薬組成物、および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物（例えば、本明細書に記載されるもの）を発現するＴリンパ球および／またはＮＫ細胞の集団を含む第２の医薬組成物を含む１つまたはそれ以上の容器を含みうる。Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞の集団は、共刺激因子の共刺激ドメインまたはリガンドを含む外因性ポリペプチドをさらに発現しうる。
【０２０６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるキットは、インビトロで増殖されるＡＣＴＲ−Ｔ細胞、および活性化Ｔ細胞上に存在する細胞表面抗体に特異的な抗体（例えば、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ７抗体）を含む。前記ＡＣＴＲ−Ｔ細胞は、当該技術分野で公知であるか、または本明細書に記載されるＡＣＴＲ構築物のいずれかを発現しうる。１の例において、前記ＡＣＴＲ−Ｔ細胞は、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現する。
【０２０７】
ある実施態様において、前記キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための説明書をさらに含みうる。含まれる説明書は、目的の活性を達成する（例えば、対象において、ＡＤＣＣ活性を高め、および／または抗体に基づく免疫療法の有効性を高める）ための第１および第２の医薬組成物の対象への投与の説明を含みうる。前記キットは、対象が治療を必要とするかどうかの同定に基づいて治療に適切な対象を選別するための説明をさらに含みうる。ある実施態様において、前記説明書は、第１および第２の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与するための説明を含む。 
【０２０８】
本明細書に記載される第１および第２の医薬組成物の使用に関する説明は、一般に、目的とする治療についての用量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。前記容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数用量包装）または部分単位用量でありうる。本開示のキットで供される説明書は、一般に、表示または添付文書における書面の説明である。前記表示または添付文書は、当該医薬組成物が、対象における疾患または障害を治療し、発症を遅延させ、および／または緩和するために用いられることを表示する。
【０２０９】
本明細書において提供されるキットは適当な包装中に存在する。適当な包装には、下記に限定されないが、バイアル、ボトル、ビン、フレキシブルな（flexible）包装などが含まれる。特定の装置、例えば、吸入器、経鼻投与用装置、または注入器と組み合わせて用いるための包装もまた包含される。キットは、無菌アクセスポートを備えうる（例えば、前記容器は、皮下注射針により貫通できるストッパーを備えた静脈輸液バッグもしくはバイアルでありうる）。前記容器はまた、無菌アクセスポートを備えうる。第１の医薬組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本明細書に記載される抗体である。第２の医薬組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本明細書に記載される抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物を発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）の集団である。
【０２１０】
キットは、適宜、緩衝液や説明の情報などのさらなる構成要素を供しうる。通常、キットは、容器および容器上もしくはこれに付随した表示または添付文書を含む。ある実施態様において、本開示は、上記に記載のキットの内容物を含む製品を提供する。
【０２１１】
一般的な技術
本開示の実施は、特に記載のない限り、当該技術分野の範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣用の技術を用いる。このような技術は、文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986); and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)で十分に説明されている。
【０２１２】
さらに説明することなく、当業者は、上記の記載に基づいて本開示を最大の範囲まで用いることができると認められる。それゆえ、下記の特定の実施態様は、単なる例示であって、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての公開文献は、本明細書で参照される目的または対象のために出典明示により本明細書に取り込まれるものである。
【実施例】
【０２１３】
実施例１：標的細胞に対するＡＣＴＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイ
表３におけるＡＣＴＲ変異体をコードしたガンマレトロウイルスを作成した。これらのウイルスを用いて初代ヒトＴ細胞に感染させ、これらのＡＣＴＲ変異体を感染した細胞のの表面上で発現した細胞を作出した。次に、該細胞は、ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＣＤ２０陽性ラージ標的細胞およびＣＤ２０標的リツキシマブ、またはホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＨＥＲ２陽性ＨＣＣ１９５４細胞およびＨＥＲ２標的トラスツマブとともに細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２１４】
Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびラージ標的細胞（標的；Ｔ）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ ウシ胎児血清を補充）の２００μＬの反応容量中の異なる濃度のリツキシマブ（０〜１０μｇ／ｍＬ）の存在下において、４：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のエフェクター細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。全ての反応を２回行った。反応物を３７℃でＣＯ２（５％）インキュベーター内にて４０〜４８時間インキュベートした。１００μＬ容量の上清を各反応物から取り除いた。１００μＬ容量のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州のマディソン）を残りの反応物に加え、室温で１０分間インキュベートした。次に、発光をマルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；マサチューセッツ州、ウォルサム）を用いて測定した。生存細胞率は、所定のサンプルの発光シグナルを、各Ｔ細胞型についての抗体の非存在下での発光シグナルで割り、１００を掛けることによって決定した。細胞傷害率は、１００から生存細胞率を引くことによって決定した。
【０２１５】
別の実験において、Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびＨＣＣ１９５４標的細胞（標的；Ｔ）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ ウシ胎児血清を補充）の２００μＬの反応容量中の異なる濃度のトラスツマブ（０〜１μｇ／ｍＬ）の存在下において、１：４のエフェクター対標的比（３０，０００個のエフェクター細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。全ての反応を２回行った。反応物をＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃にて２０〜２４時間インキュベートした。上記のように、ルシフェラーゼアッセイを行い、、発光を測定し、次いで細胞傷害率を決定した。
【０２１６】
標的ラージ細胞を、配列番号：７、８、９、および１３の変異体を発現するＡＣＴＲ Ｔ細胞、および増加濃度のリツキシマブとともにインキュベートした場合、細胞傷害性の濃度依存的な増加が見られた（図１）。標的ＨＣＣ１９５４細胞を、配列番号：７、８、９、１３、および配列番号：３８／配列番号：３９の変異体をコードする核酸を発現するＡＣＴＲ Ｔ細胞、および増加濃度のトラスツマブとともにインキュベートした場合においても、細胞傷害性の濃度依存的な増加が見られた（図２）。
【０２１７】
同様の実験において、細胞傷害性は、両方の細胞株におけるさらなるＡＣＴＲ変異体を用いても見られた。細胞傷害率は、抗体濃度に応じてプロットし、非線形回帰分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで作成し、ＥＣ５０値を決定するために用いた。これらの実験の最大細胞傷害率およびＥＣ５０は、下記の表４で見出すことができる。ＣＤ２８共刺激ドメインを含むさらなるＡＣＴＲ変異体もまた評価した。Ｃ２８共刺激ドメインを含むＡＣＴＲ変異体は、ラージ標的細胞およびリツキシマブとともに用いたＥＣ５０値の範囲（０．０２〜０．３８μｇ／ｍＬ）、ならびにＨＣＣ１９５４標的細胞およびトラスツマブとともに用いたＥＣ５０値の範囲（０．００３〜０．０９μｇ／ｍＬ）を示す。これらの実験により、ＡＣＴＲ変異体は、抗体に対する同種の標的を発現する細胞株に対して抗体依存性細胞傷害性を示すことが示される。
表４：異なるＡＣＴＲ変異体による細胞傷害性
【表４】
2020506697.tif 000037
＊ｎ．ｄ．＝調べていない
＊＊ＡＣＴＲ構築物 配列番号：３８と配列番号：３９をトランスに発現
【０２１８】
実施例２：標的細胞の存在下におけるＡＣＴＲ−Ｔ細胞によるＩＬ−２サイトカイン放出
表３におけるＡＣＴＲ変異体をコードするガンマレトロウイルスを作成した。これらのウイルスを用いて初代ヒトＴ細胞に感染させ、これらのＡＣＴＲ変異体を感染した細胞の表面上に発現する細胞を作出した。次いで、これらの細胞を、ＣＤ２０陽性ラージ標的細胞およびＣＤ２０標的リツキシマブ、またはＨＥＲ２陽性ＨＣＣ１９５４標的細胞およびＨＥＲ２標的トラスツマブとともにＩＬ−２放出アッセイで使用した。モックＴ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をこの実験のコントロールとして使用した。
【０２１９】
Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびラージ標的細胞（標的；Ｔ）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ ウシ胎児血清を補充）の１００μＬの反応容量中の異なる濃度のリツキシマブ（０〜１０μｇ／ｍＬ）の存在下において、４：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のエフェクター細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。全ての反応を２回行った。反応物をＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃にて２０〜２４時間インキュベートした。
【０２２０】
別の実験において、Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびＨＣＣ１９５４標的細胞（標的；Ｔ）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ ウシ胎児血清を補充）の１００μＬの反応容量中の異なる濃度のトラスツマブ（０〜１μｇ／ｍＬ）の存在下において、１：４のエフェクター対標的比（３０，０００個のエフェクター細胞；１２０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。全ての反応を２回行った。反応物をＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃にて２０〜２４時間インキュベートした。
【０２２１】
各実験において、放出されたサイトカインＩＬ−２の量は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ−ＰｌｅｘヒトＩＬ−２キットを製造業者のプロトコールに従って用いて上清から測定した。簡単に説明すると、炎症性パネル１キャリブレーターブレンド（Proinflammatory Panel 1 Calibrator Blend）、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ検出抗体、およびＲｅａｄ緩衝液を製造業者のプロトコールに従って調製した。共培養上清を氷上で解凍し、ＲＰ１０（ＲＰＭＩ１６４０（１０％ ウシ胎児血清を補充））培地で希釈して、該アッセイの線形範囲内の数値にした。次に、前記炎症性キャリブレーターブレンドまたはサンプル（５０μＬ）をＭＳＤプレートに加えた。続いて、該プレートを密封し、ホイルで覆い、室温撹拌機で６００ｘｇにて２時間インキュベートした。次いで、該プレートを１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有）で３回洗浄し、ヒトＩＬ−２ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ検出抗体（２５μＬ）を該プレートに加えた。該プレートを密封し、ホイルで覆い、室温撹拌機で６００ｘｇにて２時間インキュベートした。該プレートを１５０μＬのＰＢＳＴ３回洗浄した。Ｒｅａｄ緩衝液（１５０μＬ）を該プレートに加え、該プレートをＭＳＤ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ１２０にかけた。
【０２２２】
生データは、Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｌｅｘ ＩＬ−２ ＭＳＤキットのために作成したプレートレイアウトを用いてＭＳＤワークベンチで解析した。標準曲線は、解析した各プレートについてキットのロットに合わせるために調整した。光の単位の生データは、前記炎症性キャリブレーター標準曲線を用いてサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）を推定した。サイトカインデータは、抗体濃度に応じてプロットした。
【０２２３】
標的ラージ細胞を、配列番号：７、８、９、１３、および配列番号：３８／配列番号：３９の変異体をコードする核酸を発現するＡＣＴＲ Ｔ細胞および増加濃度のリツキシマブとともにインキュベートした場合、ＩＬ−２放出の抗体依存的および濃度依存的な増加が見られた（図３）。同様に、標的ＨＣＣ１９５４細胞を、配列番号：７、８、９、１３、および配列番号：３８／配列番号：３９の変異体をコードする核酸を発現するＡＣＴＲ Ｔ細胞および増加濃度のトラスツマブとともにインキュベートした場合、ＩＬ−２放出の濃度依存的な増加が見られた（図４）。モックＴ細胞は、ＩＬ−２放出をほとんどまたは全く示さなかった。同様の実験において、ＩＬ−２放出は、両方の細胞株／抗体ペアとともにさらなるＡＣＴＲ変異体によっても見られ、これらの実験からの最大ＩＬ−２放出は表５で見出すことができる。Ｃ２８共刺激ドメインを含むＡＣＴＲ変異体は、ラージ標的細胞およびリツキシマブの存在下で最大ＩＬ−２放出の範囲（２８０〜３６００ｐｇ／ｍＬ）、ならびにＨＣＣ１９５４標的細胞およびトラスツマブの存在下で最大ＩＬ−２放出の範囲（５０〜７００ｐｇ／ｍＬ）を示す。これらの実験により、ＡＣＴＲ変異体は、その抗体に対する同種の標的を発現する細胞株の存在下で抗体依存性サイトカイン放出を示すことが示される。
表５：ＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞のＩＬ−２放出
【表５】
2020506697.tif 000038
2020506697.tif 000039
＊ＡＣＴＲ構築物 配列番号：４０と配列番号：３９をトランスに発現
＊＊ＡＣＴＲ構築物 配列番号：３８と配列番号：３９をトランスに発現
【０２２４】
実施例３：ＡＣＴＲ−Ｔ細胞の増殖
表３におけるＡＣＴＲ変異体をコードするガンマレトロウイルスを作成した。これらのウイルスを用いて初代ヒトＴ細胞に感染させ、これらのＡＣＴＲ変異体を感染した細胞の表面上で発現した細胞を作出した。次いで、これらの細胞は、ＣＤ２０陽性ラージ標的細胞およびＣＤ２０標的リツキシマブとともに増殖アッセイに使用した。
【０２２５】
Ｔ細胞および標的細胞は、培養培地（１０％ ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地）の２００μＬの反応容量中の４μｇ／ｍＬのリツキシマブの存在下でまたは抗体を加えずに、１：１の割合（各３０，０００個の細胞）で混合した。反応物をＣＯ２（５％）インキュベーター内にて３７℃で７日間インキュベートし；７０μＬの培地を４日目に各反応物に加えた。細胞を遠心分離で沈殿させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで固定可能な生存率色素ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。細胞を細胞染色緩衝液（ウシ血清アルブミンおよびアジ化ナトリウムを含有）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で２回洗浄した。続いて、細胞を抗ＣＤ１６Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−６４７（クローン３Ｇ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＣＤ３−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８（クローンＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。細胞を細胞染色緩衝液で２回洗浄し、２００μＬの染色緩衝液に再懸濁した。
【０２２６】
染色した細胞は、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメーターを用いてフローサイトメトリーにより分析した。単一の生存ＣＤ３陽性Ｔ細胞を用いて増殖を評価する。０日目と比較した７日目における細胞数の倍増加を条件に応じてプロットした（図５）。標的ラージ細胞を、配列番号：７、８、９、１３、および配列番号：３８／配列番号：３９の変異体をコードする核酸を発現するＡＣＴＲ Ｔ細胞およびリツキシマブとともにインキュベートした場合、ＣＤ３＋細胞数の抗体依存的な増加が見られ、このことは、抗体依存的なＴ細胞増殖を示す（図５）。さらなる実験において、Ｔ細胞増殖を、多くの異なるＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いて上記に記載の条件と同様の条件において、５μｇ／ｍＬのリツキシマブの存在下で評価した。抗体なしの反応物と比較したＣＤ３＋細胞数の増加を調べた。これらのＡＣＴＲ変異体は、抗体依存的な増殖を示した（表６）。ＣＤ２８共刺激ドメインをコードするさらなるＡＣＴＲ変異体についても評価した。Ｃ２８共刺激ドメインを含むＡＣＴＲ変異体は、抗体なしの反応物と比較してＣＤ３＋細胞数の増加した範囲を示す（２．５〜１５倍）。これらの実験により、ＡＣＴＲ変異体は、抗体についての同種の標的を発現する細胞株の存在下において抗体依存的な増殖を示すことが示される。 
表６：異なるＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞の抗体依存的な増殖
【表６】
2020506697.tif 000040
2020506697.tif 000041
＊ＡＣＴＲ構築物 配列番号：４０と配列番号：３９をトランスに発現
＊＊ＡＣＴＲ構築物 配列番号：３８と配列番号：３９をトランスに発現
【０２２７】
実施例４：ラージ腫瘍動物モデルにおけるＡＣＴＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果
ラージモデル
ラージ細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−８６）は、ヒトバーキットリンパ腫細胞株であり、免疫不全マウスに静脈内、腹腔内または皮下移植によって腫瘍を形成する。この実施例の実験において、ラージ細胞は、ＲｅｄｉＦｅｃｔ ＦＦＬｕｃ−ピューロマイシン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）レンチウイルス粒子を用いて、ホタルルシフェラーゼとともに形質導入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％の加熱不活性化ウシ胎児血清を補充）および１μｇ／ｍＬ ピューロマイシン中で３７℃の５％ ＣＯ２加湿チャンバー内において維持した。腫瘍細胞の生存率は、接種のための収集によると９８％であった。 
【０２２８】
６週齢の雌ＮＳＧ（登録商標）（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州、バーハーバー）から入手した。これらのマウス（機能的なＴ、Ｂ、およびＮＫ細胞を欠失している）は、ヒト腫瘍の生着に特によく適しており、ＡＣＴＲ Ｔ細胞などのヒトＴ細胞で効率的に再構成する。受け取った後、前記マウスを実験開始前８日間順化させた。前記マウスは、到着後または実験開始まで疾患または病気の兆候を示さなかった。前記動物は、完全独立型マイクロアイソレーターラック内の各々換気されたイノバイブケージにおいて１ケージあたり５匹を飼育した。
【０２２９】
静脈内ラージ異種移植モデルは、ルシフェラーゼ発現ラージ細胞の懸濁液を雌のＮＳＧ（登録商標）マウスに接種することによって作成した。０．１ｍＬのＤＰＢＳ中に懸濁したラージ細胞（１匹のマウスあたり１ｘ１０５個の細胞）を側面の尾静脈に静脈内注射した。マウスは、主に骨髄（脊柱、頭蓋、長管骨）に局在する検出可能な腫瘍を６日内に発症した。
【０２３０】
マウスに１００μｇのリツキシマブ（１００μＬ容量）を４、１１、１８、および２５日目に腹腔内に投薬した。５および１２日目に、マウスに１ｘ１０７個のＴ細胞（ＡＣＴＲ変異体 配列番号：７、９、１３、および配列番号：３８／配列番号：３９をコードする核酸を発現するＴ細胞）を１００μＬで静脈内に投与した。１のマウスの群に、ＣＤ１９標的ＣＡＲ（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を発現するＴ細胞を投薬した（これらのマウスにリツキシマブを投薬しなかった）。腫瘍組織量は、細胞接種６日目から開始し、ＩＶＩＳスペクトラムイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、生物発光イメージングにより１週間に２回モニターした。マウスの健康をモニタリングするために、マウスの重量を１週間に２回測定した。平均光子／秒を時間に対してプロットした（図６）。安楽死の基準は、体重減少もしくは増加および臨床症状、特に、後肢麻痺を基づいた。マウスを実験終了（５５日目）まで生存させた。
【０２３１】
治療群として、ベヒクルコントール、リツキシマブ抗ＣＤ２０抗体のみ（Ｒｏｃｈｅ、１００μｇ／マウスまたは５ｍｇ／ｋｇ）、ＡＣＴＲ変異体のみ、ＣＤ１９ＣＡＲ、またはリツキシマブとＡＣＴＲ変異体 Ｔ細胞の組み合わせで処理したマウスが含まれる。
【０２３２】
コントロールマウスは、１８または１９日目に疾患の負担により死亡した。リツキシマブ治療のみでは、腫瘍組織量が減少し、マウスの生存が２４日間まで延長した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞のみによる治療は、試験したＡＣＴＲ変異体にかかわらず、腫瘍組織量または生存に顕著な減少を供しなかった。ＣＤ１９ＣＡＲによる治療は、リツキシマブのみで見られた腫瘍組織量の減少と同様の減少を生じた。
【０２３３】
ＡＣＴＲ変異体をリツキシマブと組み合わせた治療は、ベヒクルコントロール、ＡＣＴＲ変異体のみ、またはリツキシマブのみより非常に大きい腫瘍増殖阻害を生じた。リツキシマブのみと比較した差異は、全てのＡＣＴＲ変異体について統計学的有意に達した（シダック多重比較検定を用いた二因子ＡＮＯＶＡ）（７、ｐ＜０．０００１；９、ｐ＜０．０１；１３、ｐ＜０．０００１；および１８、ｐ＜０．０００１）（図６）。
【０２３４】
実施例５：繰り返し刺激増殖アッセイ
ＡＣＴＲ−Ｔ細胞またはＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、前記アッセイのためにＲＰＭＩ−１０培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中において１ｘ１０６細胞／ｍＬで作成し、調製した。ＡＣＴＲおよびＣＡＲ発現をフローサイトメトリーにより調べ（下記を参照）、ドナー適合モックＴ細胞で３０％ ＡＣＴＲ／ＣＡＲ陽性細胞に調整して、全ての変異体についてＡＣＴＲ／ＣＡＲ発現を正規化した。
【０２３５】
ラージ腫瘍細胞を収集し、カウントし、次いでＲＰＭＩ−１０培地で２ｘ１０６個の細胞／ｍＬに調整した。リツキシマブ抗体を１μｇ／ｍＬのアッセイで最終抗体濃度４μｇ／ｍＬに希釈した。Ｔ細胞（５５０μＬ）を２４ウェルプレートに加え、次いで１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比のための２７５μＬのラージ細胞、および２７５μＬのリツキシマブまたは培地コントロールを加えた。細胞を十分に混合し、７０μＬのアリコートをフローサイトメトリー分析のために採取した（ベースラインカウント）。該プレートを３７℃で３〜４日間インキュベートして、標的細胞をＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞およびＴ細胞増殖によって死滅させた。
【０２３６】
３または４日目において、各培養物のアリコート（７０μＬ）を取り出し、Ｔ細胞および腫瘍細胞数についてフローサイトメトリーにより分析した。残りの培養物を遠心分離（５００ｘｇで５分間）により沈殿させ、所定容量の新鮮な培地に再懸濁した。３〜４日間のインキュベーション期間中に増殖したＴ細胞を含む培養物を約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬに再調整し、１２ウェルプレートに移した。非増殖培養物を１〜１．２５ｍｌの新鮮な培地に再懸濁し、２４ウェルプレートで維持した。新鮮なラージ細胞を４ｘ１０６個の細胞／ｍＬで調製し、適当な容量を混合したＴ細胞／腫瘍細胞培養物に加えて、必要に応じて、Ｅ：Ｔ細胞比を１：１に戻した。リツキシマブを１μｇ／ｍＬの最終濃度で刺激したウェルに加え、一方で。培地のみをコントロールウェルに加えた。培養物を再度３〜４日間インキュベートした。この再刺激プロセスを３〜４日間ごとに合計４回刺激繰り返した。
【０２３７】
１４日目において、全ての培養物を収集し、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）および腫瘍細胞（ＣＤ３−）数についてフローサイトメトリーにより分析した。累積的なＴ細胞の増殖および腫瘍の死滅を時間とともに分析した。
【０２３８】
フローサイトメトリー分析について、各培養物を十分に混合し、7０μＬを取り出し、９６ウェル丸底ポリプロピレンプレートに移した。各２５μＬの２アリコートを、１５０μＬのＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中の抗ヒトＣＤ３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｔ細胞マーカー；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ヒトＣＤ１６ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＡＣＴＲマーカー；クローン３Ｇ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。サンプルを混合し、暗室内で４℃にて１５分間インキュベートした。次いで、サンプルを２５μＬのＭＡＣＳ緩衝液中のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液でインキュベートし、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で分析した。１００μＬ容量を各サンプルについて得た。フローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて行った。生存した単一の細胞集団を用いて、生存したＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ３陰性ラージ細胞の絶対数をさらに決定した。
【０２３９】
Ｔ細胞の開始数と比較したＴ細胞数の倍率変化を時間に応じてプロットした（図７）。全ての試験したＡＣＴＲ変異体が標的細胞およびリツキシマブの存在下で増殖した。全てのＡＣＴＲ Ｔ細胞変異体は、ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：８を除いて、ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞より増殖させた。ＡＣＴＲ Ｔ細胞変異体は、抗体オプソニン化標的細胞による急速な再刺激下における１４日のアッセイ期間で３〜８倍増殖し、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９が最も高い増殖率を示した。抗体の非存在下にて標的細胞で刺激したＡＣＴＲ Ｔ細胞は増殖せず、標的細胞による異常増殖がなされた（データは示していない）。
【０２４０】
前回時点での標的細胞数と比較したラージ標的細胞数の倍率変化を時間に応じてプロットした（図８、パネルＡおよびＢ）。ラージ標的細胞は、最初の刺激後に増殖し続けた。ＡＣＴＲ変異体およびＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、２回目の刺激後にラージ標的細胞を様々な程度で制御し、死滅させ始めた。ラージ標的細胞は、リツキシマブ抗体の非存在下でのＡＣＴＲ変異体の存在下では増殖し続けた（データは示していない）。
【０２４１】
実施例６：インビトロおよびインビボでＣＤ２０を発現する腫瘍細胞株を用いたＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞とリツキシマブとの組み合わせ使用
この実施例は、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９（この実施例を通してＡＣＴＲと称する）を発現するＴ細胞が、リツキシマブと組み合わされると、インビトロで抗腫瘍細胞活性およびインビボで侵襲性ＣＤ２０＋リンパ腫腫瘍退縮を継続的に介在したことを示す。この構築物を用いた実験の詳細と結果を下記に示す。
【０２４２】
ＡＣＴＲの開始実験
ＡＣＴＲを発現するＴ細胞の活性は、実施例５に記載の手順と同様の手順を用いて、ＡＣＴＲ変異体発現Ｔ細胞を新鮮なＣＤ２０＋ラモス腫瘍細胞およびリツキシマブで３日ごとに誘発した繰り返し刺激「ストレス試験」で分析した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、３回の繰り返し刺激後に増殖し続け、標的ラモス細胞に対して細胞傷害し、４回目の刺激後に増殖および細胞傷害能力を失い始めた（図９）。
【０２４３】
サイトカイン放出（ＩＬ−２）および増殖アッセイは、血液学的腫瘍および固形腫瘍疾患環境で発現される６つの異なる標的に特異的な抗体および同種の標的を発現する細胞株を用いて、実施例２および３に記載される方法と同様の方法で行い；Ｔ細胞活性は、ＩＬ−２放出および増殖の両方により測定されるように、複数の細胞株および症状にわたり示された（図１０）。
【０２４４】
リツキシマブは、ＣＤ２０＋腫瘍細胞およびＡＣＴＲ Ｔ細胞に結合する
ラージ、ダウディ、およびＲＬ ＣＤ２０＋リンパ腫腫瘍細胞へのリツキシマブの結合は、細胞をリツキシマブおよびフルオロクロム標識抗ヒトＦｃ検出抗体で染色することによってフローサイトメトリーにより分析した（図１１、パネルＡ）。特異的な結合はＣＤ２０陰性細胞株Ｋ５６２について見られなかった。ＡＣＴＲ Ｔ細胞に結合するリツキシマブの能力もまた、異なる濃度のリツキシマブをＡＣＴＲ発現Ｔ細胞とインキュベートすることによってを評価した。結合したリツキシマブをフルオロクロム標識抗ヒトＦｃ抗体で検出し、フローサイトメトリーにより分析した。リツキシマブは、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞に濃度依存的に結合する（図１１、パネルＢ）。リツキシマブのＡＣＴＲ Ｔ細胞への明確な親和性は、６８９±８２ｎＭである。
【０２４５】
理論に束縛されることなく、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞活性化の推測される作用機序の仮説モデルを図１２に示す。低親和性天然Ｔ細胞受容体およびＦｃ受容体と同様に、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＡＣＴＲが腫瘍細胞の表面に結合した複数のリツキシマブ分子と結合すると、構造的な親和性により活性化されうる。
【０２４６】
細胞傷害性アッセイは、１μｇ／ｍＬのリツキシマブの存在下でモック（ＡＣＴＲなし）およびＡＣＴＲ発現Ｔ細胞ならびにＣＤ２０＋腫瘍細胞を用いて行った。Ｔ細胞および標的細胞を異なるエフェクター（Ｅ）対標的（Ｔ）比で混合し、５％ ＣＯ２インキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートした。反応物を細胞生存率色素、抗ヒトＣＤ３、および抗ヒトＣＤ１９抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞傷害率は、Ｔ細胞、標的細胞、およびリツキシマブを含む反応物中の生存ＣＤ１９＋細胞数を、Ｔ細胞を含まないコントロール反応物中の生存ＣＤ１９＋細胞数により割り、１から生じた数値を引き、そして１００を掛けることによって決定した。細胞傷害率は、モック細胞（図１３、パネルＡ）およびＡＣＴＲ発現Ｔ細胞（図１３、パネルＢ）を用いた異なるＥ：Ｔ比についての標的細胞に応じてプロットする。これらの実験の結果により、強力な細胞傷害性は、モック細胞では細胞傷害性がほとんどもしくは全く見られないため、ＡＣＴＲ依存的であり、細胞傷害性は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞の用量に依存することが示された（図１３、パネルＡおよびＢ）。同様の実験を、ＡＣＴＲ Ｔ細胞およびＣＤ２０＋標的細胞を２：１のＥ：Ｔ比において、様々な濃度のリツキシマブとともに行った。上清をサイトカイン分析のためにこれらの反応物から取り出した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＣＤ２０＋腫瘍細胞リツキシマブ用量依存的な細胞傷害性を介在する（図１３、パネルＣ）。
【０２４７】
上清を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ−ＰｌｅｘヒトＩＦＮ−γおよびＶ−ＰｌｅｘヒトＩＬ−２キットを製造業者のプロトコールに従って用いて、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２について分析した。簡単に説明すると、炎症性パネル１キャリブレーターブレンド、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ検出抗体、およびＲｅａｄ緩衝液を製造業者のプロトコールに従って調製した。共培養上清を氷上で解凍し、ＲＰ１０（ＲＰＭＩ１６４０（１０％ ウシ胎児血清を含有））培地で希釈して、このアッセイの線形範囲内の数値とした。炎症性キャリブレーターブレンドまたはサンプル（５０μＬ）を該ＭＳＤプレートに加えた。該プレートを密封し、ホルムで覆い、次いで室温撹拌機で６００ｘｇにて２時間インキュベートした。該プレートを１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）で３回洗浄した。ヒトＩＦＮ−γまたはヒトＩＬ−２ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ検出抗体（２５μＬ）を該プレートに加えた。該プレートを密封し、ホイルで覆い、次いで室温撹拌機において６００ｘｇで２時間インキュベートした。該プレートを１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）で３回洗浄した。Ｒｅａｄ緩衝液（１５０μＬ）を該プレートに加え、該プレートをＭＳＤ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０にかけた。 
【０２４８】
生データは、Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｌｅｘ ＩＦＮ−γおよびＳｉｎｇｌｅ Ｐｌｅｘ ＩＬ−２ ＭＳＤキットのために作成したプレートレイアウトを用いてＭＳＤワークベンチで解析した。標準曲線は、解析した各プレートについてキットのロットに合わせるために調整した。光の単位の生データは、前記炎症性キャリブレーター標準曲線を用いてサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）を推定した。サイトカインデータは、抗体濃度に応じてプロットした（図１４、パネルＡおよびＢ）。リツキシマブの濃度依存的なＩＬ−２およびＩＦＮ−γサイトカイン放出がＡＣＴＲ発現Ｔ細胞で見られた。
【０２４９】
増殖アッセイは、増加濃度のリツキシマブの存在下でＡＣＴＲ発現Ｔ細胞およびＣＤ２０＋標的細胞（ラージ、ラモス、ダウディ、ＲＬ）を１：１のＥ：Ｔ比において、５％ ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で７日間インキュベートすることによって行った。細胞を生存率色素および抗ＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。生存ＣＤ３＋細胞をリツキシマブ濃度に応じてプロットする（図１４、パネルＣ）。ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞は、リツキシマブ依存的および抗体濃度依存的に増殖することが示された。
【０２５０】
ＡＣＴＲ活性の特異性
細胞傷害性、ＩＬ−２産生、およびＴ細胞増殖アッセイは、ＣＤ２０＋ラモス細胞またはＣＤ２０陰性Ｋ５６２細胞およびＣＤ２０標的リツキシマブまたはＨＥＲ２標的トラスツマブの存在下でモックまたはＡＣＴＲ Ｔ細胞を用いて、上記に記載されるように行った（ラモスおよびＫ５６２細胞の両方は、ＨＥＲ２陰性である）。細胞傷害性およびＩＬ−２放出実験は、２：１のＥ：Ｔ比で行い、増殖実験は、１：１のＥ：Ｔ比で行った。抗体は、４μｇ／ｍＬの最終濃度で用いた。これらの実験の結果を図１５のパネルＡ〜Ｃに示す。細胞傷害性、ＩＬ−２放出、および増殖は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞、リツキシマブ、およびＣＤ２０＋細胞の存在下で観察され；Ｔ細胞活性は、試験した他の反応条件のいずれにおいてもほとんどもしくは全く見られなかった。これらの実験は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞活性が、ＡＣＴＲ発現および標的結合抗体に依存することを示す。
【０２５１】
ＡＣＴＲ活性もまた、非標的ＩｇＧの存在下で評価した。これらの実験において、モックＴ細胞またはＡＣＴＲ発現Ｔ細胞をＣＤ２０発現ラージ細胞とともに４：１のＥ：Ｔ比で混合した。細胞を、血清（０〜３．６ｍｇ／ｍＬ）中で１μｇ／ｍＬのリツキシマブおよび増加濃度の非標的ヒトＩｇＧとインキュベートした。ＩｇＧは、プールしたヒトＡＢ血清およびＩｇＧを枯渇させた血清を混合して、反応物中の異なる最終ＩｇＧ濃度とすることによって用量設定した。反応物を５％ ＣＯ２インキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートした。ＩＦＮ−γ放出を上記に記載されるように測定した。モックＴ細胞は、ＩＬ−２放出をほとんどもしくは全く示されず；ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、強力なＩＬ−２放出を示し、試験した全ての非標的ＩｇＧ濃度にわたり同様であった（図１６）。これらの実験は、非標的ＩｇＧが、抗体標的ＡＣＴＲ活性にほとんどもしくは全く影響を与えないことを示す。
【０２５２】
種々の抗体の存在下におけるＡＣＴＲ−Ｔ細胞の活性化
トシリズマブは、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の効果を緩和するためのＴ細胞療法の治療計画で用いられる抗ＩＬ６受容体（ＩＬ−６Ｒ）抗体である。ＩＬ−６Ｒ発現細胞の存在下でのトシリズマブのＡＣＴＲ結合は、ＣＲＳに関連する毒性を悪化させうる。これらの実験は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞が、ＩＬ−６Ｒ発現細胞の存在下でトシリズマブと増殖性で結合しないことを示す。
【０２５３】
正常な免疫細胞および多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９におけるＩＬ−６Ｒの受容体定量化は、フローサイトメトリーによって調べた（図１７、パネルＡ）。これらの実験は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞が、正常な免疫細胞と比較して１細胞あたり同等数またはそれ以上のＩＬ−６Ｒを発現することを示す。トシリズマブによる結合アッセイは、リツキシマブのＡＣＴＲ発現Ｔ細胞への結合について上記に記載される方法と同様の方法で行った。トシリズマブは、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞に用量依存的に結合する一方、ＡＣＴＲを発現しないモックＴ細胞は、トシリズマブへの結合を示さなかった（図１７、パネルＢ）。
【０２５４】
細胞傷害性およびＩＬ−２放出アッセイは、上記に記載されるように行った。これらの実験について、モックまたはＡＣＴＲ発現Ｔ細胞を、増加濃度のトシリズマブ（０〜２５μｇ／μＬ）の存在下にてＮＣＩ−Ｈ９２９細胞と４：１のＥ：Ｔ比でインキュベートした。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞もまた、Ｔ細胞の非存在下にて増加濃度のトシリズマブとインキュベートした。コントロール実験は、ＡＣＴＲＴ細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞、および抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブを用いて行った（ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞は、ＣＤ３８を発現する）。これらの実験の結果により、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＩＬ−６Ｒ＋ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞および増加濃度のトシリズマブの存在下において、モックＴ細胞またはＴ細胞の非存在下で見られる細胞傷害以上の細胞傷害を介在しないことが示された（図１８、パネルＡ）。また、これらの実験の結果により、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、モックＴ細胞またはＴ細胞の非存在下で見られるＩＬ−２放出と同様に、ＩＬ−６Ｒ＋ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞および増加濃度のトシリズマブの存在下でＩＬ−２放出を介在しないことが示された（図１８、パネルＢ）。
【０２５５】
ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、同一条件下でのコントロール実験において、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞および抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブの存在下で細胞傷害性およびサイトカイン放出を介在することが示された。
【０２５６】
インビボＡＣＴＲ活性
別の実験において、ＡＣＴＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を、ＮＳＧ（登録商標）（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスにおける侵襲性ラージ異種移植片で測定した。ラージ−ｌｕｃ細胞をこの実験のために解凍し、限定された継代数について増殖させた。ラージ−ｌｕｃ細胞（０．１ｍＬの血清を含まない培地中で１匹のマウスあたり１ｘ１０５個の細胞）を雌ＮＳＧマウスの側面の尾静脈に静脈内注射した。細胞接種後４日目に、マウスを治療群に無作為化した（ｎ＝５）。各群における各マウスは、耳のパンチにより同定した。腫瘍組織量は、細胞接種６日目から開始し、ＩＶＩＳスペクトラム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、生物発光イメージングによりモニターした。マウスの体重量は、１７．１〜２３．５（２０．５＋/−１．３、平均＋/−ＳＤ）グラムの範囲であった。平均腫瘍放射輝度（光子／秒）および体重量（グラム）は、時間経過とともに測定し、安楽死の基準は、体重喪失および臨床症状に基づくが、生物発光カットオフには基づかない。全ての動物実験は、ユーナム実験動物管理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたプロトコールに従って実施した。全ての手順は、実験動物の管理と使用のためのガイド（研究評議会）に従って実施した。
【０２５７】
実験群は、治療なし（コントロール）、ＡＣＴＲのみ、リツキシマブのみ（１用量あたり２０μｇ、５０μｇ、または１００μｇ）、およびＡＣＴＲ＋リツキシマブ（１用量あたり２０μｇ、５０μｇ、および１００μｇのリツキシマブ）であった。ＣＤ１９ ＣＡＲ（４−１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに連結した抗ＣＤ１９のＦｃ）を発現するＴ細胞もまた、この実験で評価した。リツキシマブを受容した群において、抗体をまず、腫瘍細胞接種後４日間投薬し、１週間ごとに合計４用量で投薬した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞を受容した群において、１ｘ１０７個のＡＣＴＲ Ｔ細胞の単回投与を５日目（最初のリツキシマブ投薬後１日目）に付与した。該生存率は、全ての実験群について時間に応じてプロットした（図１９）。抗腫瘍効果は強力であり、リツキシマブ用量依存的であった（図１９）。治療したマウスの生存率を示す。
【０２５８】
同様の実験により、ＡＣＴＲ＋リツキシマブの抗腫瘍効果は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞用量依存的であることが示された。これらの実験群は、治療なし（コントロール）、リツキシマブのみ、ＡＣＴＲのみ（２用量）、ＡＣＴＲ（１用量）＋リツキシマブ、およびＡＣＴＲ（２用量）＋リツキシマブであった。リツキシマブを受容した群において、抗体をまず、腫瘍細胞接種後４日間投薬し、１週間ごとに合計４用量で投薬した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞を受容した群において、１ｘ１０７個のＡＣＴＲ Ｔ細胞の単回投与を５日目（最初のリツキシマブ投薬後１日目）に付与し；ＡＣＴＲ Ｔ細胞の２用量を受容した群を１ｘ１０７個のＡＣＴＲ Ｔ細胞で１２日目に再度治療した。該生存率は、全ての実験群について時間に応じてプロットした（図２０）。ＡＣＴＲおよびリツキシマブの両方で治療した群は、生存率の上昇によって示されるように強力な抗腫瘍活性を示した。生存率は、１用量のＡＣＴＲで治療した群と比較して２用量のＡＣＴＲで治療した群においてより高まり、このことは、ＡＣＴＲ活性が用量依存的であることを示す。
【０２５９】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）ドナーから調製したＴ細胞におけるＡＣＴＲ活性
ＡＣＴＲをコードするガンマレトロウイルスを、３種類の特有の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）ドナーのＰＢＭＣから作成したＴ細胞に形質導入し、Ｔ細胞の表面上のＡＣＴＲの発現を、抗ＣＤ１６検出抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した（図２１、パネルＡ）。ＩＬ−２放出および増殖実験は、増加濃度のリツキシマブの存在下でラージ標的細胞および１：１のＥ：Ｔ比を用いて上記に記載される方法と同様の方法で行った。ＮＨＬドナーから作成したＡＣＴＲ Ｔ細胞は、リツキシマブ濃度依存的なＩＬ−２放出（図２１、パネルＢ）および増殖（図２１、パネルＣ）を介在することが示された。
【０２６０】
結果の概要
リツキシマブと組み合わせると、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞は、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞株の存在下で、強力な活性化、増殖、サイトカイン産生、および腫瘍に対する細胞傷害性を示した。ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞のインビトロ活性は、リツキシマブに依存し、用量設定可能であった。ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスの侵襲性ラージリンパ腫異種移植モデルにおいて強力なインビボ抗腫瘍効果を示した。このような抗腫瘍活性は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞およびリツキシマブ用量依存的であり、より高いＴ細胞数と抗体濃度により応答が改善された。総合すれば、これらのデータは、標的とする種々の癌抗原に対するＡＣＴＲ発現Ｔ細胞治療法の特異性および万能性を示す。
【０２６１】
実施例７：トラスツマブをＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞と組み合わせたＨＥＲ２増殖癌の有効な標的化
試験細胞株におけるＨＥＲ２発現
ＨＥＲ２増殖細胞株（ＯＥ１９、Ｎ８７、およびＳＫＢＲ３）および非ＨＥＲ２増殖細胞株（ＭＣＦ７およびＫＡＴＯＩＩＩ）におけるＨＥＲ２タンパク質の発現を、抗ヒトＨＥＲ２抗体による染色後にフローサイトメトリーによって評価した。染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を評価した各細胞株についてプロットする（図２３）。ＨＥＲ２増殖細胞株は、抗ＨＥＲ２抗体による強力な染色を示す一方で、非ＨＥＲ２増殖細胞では最小の染色が見られた。これらの結果は、これらの細胞株について報告したコピー数データと一致する（下記を参照）。
【０２６２】
種々の細胞株ならびにそれらの組織起源のＨＥＲ２コピー数（ｌｏｇ２）を表７に示す。前記ＨＥＲ２遺伝子は、ＯＥ１９、Ｎ８７およびＳＫＢＲ３細胞株中で増殖し、ＭＣＦ７およびＫａｔｏＩＩＩ細胞株中で増殖しない。ＨＥＲ２コピー数は、このような細胞株のその記載について出典明示により取り込まれるthe 癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）に記載された。
表７：増殖または非増殖細胞株におけるＨＥＲ２遺伝子発現
【表７】
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トラスツマブと組み合わせたＡＣＴＲは、ＨＥＲ２増殖腫瘍細胞株に対して選択的なインビトロ活性を有する。
【０２６３】
細胞傷害性、ＩＬ−２放出、およびＩＦＮ−γ放出は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞、ならびにＨＥＲ２増殖細胞株（ＯＥ１９、Ｎ８７、およびＳＫＢＲ３）および非ＨＥＲ２増殖細胞株（ＭＣＦ７およびＫＡＴＯＩＩＩ）で評価した。反応は、２００μＬの反応容量において、５μｇ／ｍＬの抗ＨＥＲ２抗体トラスツマブの存在下で２：１のＥ：Ｔ比にて、５％ ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて行った。上清を２４時間で取り出し、均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いてＩＬ−２およびＩＦＮ−γについて分析した。簡単に説明すると、前記サイトカイン標準物および抱合体を製造業者のプロトコールに従って調製した。低容量３８４ウェルプレートにおいて、１０μＬ容量の抱合体および１０μＬ容量の細胞上清（ＩＬ−２について１：４に希釈、ＩＦＮ−γについて１：１６に希釈）を２４時間共インキュベートした。蛍光シグナルは、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ標識プレートリーダーを用いて測定し、データを製造業者の推奨に従って分析した。４８時間後、細胞傷害性を、ＡＴＰｌｉｔｅワンステップ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を生存する標的細胞の測定法として用いて評価した。以前の実験により、Ｔ細胞のＡＴＰｌｉｔｅシグナルへの最小の寄与が示された。細胞傷害率は、ＡＣＴＲおよび抗体によるウェル中のＡＴＰｌｉｔｅシグナルを、抗体の非存在下におけるコントロールウェルと比較することによって決定した。これらの実験は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞＋トラスツマブが、ＨＥＲ２増殖細胞株ＯＥ１９、Ｎ８７、およびＳＫＢＲ３の存在下で強力な細胞傷害性、ＩＬ−２放出、およびＩＦＮ−γ放出を示すが、非増殖細胞株ＭＣＦ７およびＫａｔｏＩＩＩの存在下では示されないことを示す（図２５）。
【０２６４】
同様の実験を抗ＨＥＲ２ ＣＡＲを発現するＴ細胞に用いて行った。このＣＡＲ変異体は、トラスツマブ配列（４Ｄ５）、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに由来するｓｃＦｖから構成された。細胞傷害性およびサイトカイン放出実験は、トラスツマブの非存在下にて２：１のＥ：Ｔ比で上記に記載されるように行った。これらの実験は、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＨＥＲ２増殖細胞株ＯＥ１９、Ｎ８７、およびＳＫＢＲ３の存在ならびに非増殖細胞株ＭＣＦ７およびＫａｔｏＩＩＩの存在下で強力な細胞傷害性、ＩＬ−２放出、およびＩＦＮ−γ放出を介在することを示す。
【０２６５】
これらの実験は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞＋トラスツマブが、ＨＥＲ２増殖細胞株に対して選択的な活性を示す一方、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞が、標的細胞に対してＨＥＲ２発現に応じた選択的な活性を示さないことを示す。
【０２６６】
ＡＣＴＲ Ｔ細胞およびＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖腫瘍細胞株で増殖する
増殖アッセイは、実施例６に記載される方法と同様の方法において、２：１のＥ：Ｔ比で６日間行い、１ウェルあたり１００，０００個のＴ細胞で開始した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞による実験は、増加濃度のトラスツマブ（０〜５μｇ／ｍＬ）で行い；抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞による実験は、トラスツマブの非存在下で行った。Ｔ細胞の増殖は、ＨＥＲ２増殖細胞株（ＯＥ１９、Ｎ８７、およびＳＫＢＲ３）および非ＨＥＲ２増殖細胞株（ＭＣＦ７およびＫＡＴＯＩＩＩ）の存在下で評価した。これらの実験の結果により、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖細胞株、Ｎ８７およびＯＥ１９の存在下でトラスツマブ用量依存的な増殖を示し（図２６、パネルＡ）；およびＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｎ８７およびＯＥ１９標的細胞で同等の増殖を示すこと（図２６、パネルＢ）が示された。ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７、およびＫａｔｏＩＩＩ標的細胞では、ほとんどもしくは全く増殖が見られなかった。
【０２６７】
トラスツマブと組み合わせたＡＣＴＲ Ｔ細胞は、Ｎ８７胃異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を介在する
実験は、約８０ｍｍ３の開始容量の皮下Ｎ８７（ヒト胃癌細胞株）腫瘍を保有する雌ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスにおいて、トラスツマブと組み合わせたＡＣＴＲ発現Ｔ細胞のインビボ投薬計画を用いて行った。全てのインビボ方法は、実施例６に記載されるように、ＩＡＣＵＣで認可されたプロトコールおよび基準に従って実施した。該投薬計画を図２７に詳細に示す。この実験の実験群は、ベヒクル（コントロール；治療なし）、トラスツマブのみ、ＡＣＴＲ Ｔ細胞のみ、ＡＣＴＲ Ｔ細胞＋トラスツマブ、および抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞であった。
【０２６８】
抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ中のｓｃＦｖは、トラスツズマに由来し、それゆえ、トラスツズマと同一のＨＥＲ２におけるエピトープに結合する。よって、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞およびトラスツマブの併用は、それらが、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞への結合についてお互いに対して競合しうるため、インビボで抗腫瘍活性を高めることは予想されることないであろう。
【０２６９】
トラスツマブを受容する群には、ＩＰ投与により１００μｇを、腫瘍接種後７日目から開始して１週間に１回で４週間投薬した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞または抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容する群には、腫瘍接種後８日目および１５日目に１．５ｘ１０７個のＴ細胞を投薬した。コントロールマウスには、両抗体（ベヒクルは、ＰＢＳ）およびＴ細胞（ベヒクルは、血清非含有培地）について同一スケジュールでベヒクルのみを投与した。平均腫瘍体積は、実験を通して測定し、時間に応じてプロットした（図２８）。
【０２７０】
トラスツマブと組み合わせたＡＣＴＲ Ｔ細胞は、トラスツマブまたはＡＣＴＲ Ｔ細胞のみと比較して強力な抗腫瘍活性を示し、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞で見られた抗腫瘍速度よりより早い抗腫瘍速度を示した。
【０２７１】
腫瘍細胞株と比較した正常な細胞におけるＨＥＲ２発現
ＨＥＲ２増殖腫瘍株（Ｎ８７）細胞、非ＨＥＲ増殖腫瘍株（ＭＣＦ７）細胞、ＨＥＲ２陰性細胞株（ダウディ）細胞、および種々の正常な細胞株（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、または腎臓上皮）におけるＨＥＲ２発現は、抗ヒトＨＥＲ２抗体による染色後にフローサイトメトリーにより測定した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各細胞型についてプロットした（図２９）。予想されるように、Ｎ８７細胞は、高レベルのＨＥＲ２発現を示し、ＭＣＦ７細胞は、低レベルのＨＥＲ２発現を示し、そしてダウディ細胞は、ＨＥＲ２発現をほとんど示さなかった。正常な細胞株の中で、乳房上皮細胞が中間レベルのＨＥＲ２発現を示したが、他の全てのものは、低レベルのＨＥＲ２発現を示した。
【０２７２】
正常な細胞における抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較したＡＣＴＲとトラスツマブを組み合わせた異なるインビトロ活性は、ＡＣＴＲ＋トラスツマブの有益な治療指数を示す
細胞傷害性アッセイは、ＡＣＴＲ Ｔ細胞または抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞および標的細胞を２：１のＥ：Ｔで４８時間用いて上記に記載されるように行った（ＡＣＴＲ Ｔ細胞による実験には、トラスツマブ（０〜５μｇ／ｍＬ）を含有させた）。この実験で表した標的細胞は、Ｎ８７（ＨＥＲ２増殖）、ＭＣＦ７（ＨＥＲ２低）、ダウディ（ＨＥＲ２陰性）、および正常な細胞株（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、および腎臓上皮）であった。ＡＣＴＲ Ｔ細胞とトラスツマブは、ＨＥＲ２増殖Ｎ８７細胞に対して強力な細胞傷害性を介在し、低発現または陰性標的細胞株および正常な細胞株に対しては活性をほとんどあるいは全く示さなかった（５μｇ／ｍＬのトラスツマブによるデータを図３０、パネルＡでプロットした）。対照的に、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖Ｎ８７細胞、ＨＥＲ２低発現ＭＣＦ７細胞、およびいくつかの正常な細胞株に対して強力な細胞傷害性を示した（図３０、パネルＢ）。これらの結果は、トラスツマブと組み合わせたＡＣＴＲ Ｔ細胞が、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較すると高い腫瘍選択性を有することを示す。
【０２７３】
上清を細胞傷害反応物から取り出し、上記に記載されるように、ＩＬ−２およびＩＦＮγ放出について分析した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖Ｎ８７細胞の存在下でトラスツマブ濃度依存的なＩＬ−２放出を示し、および試験した他の標的細胞（正常な細胞株を含む）の存在下でＩＬ−２放出をほとんどもしくは全く示さなかった（図３１、パネルＡ）。対照的に、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖Ｎ８７細胞およびＨＥＲ２低ＭＣＦ７細胞の存在下で強力なＩＬ−２放出を示し、正常な肺動脈平滑筋細胞および心筋細胞の存在下でＩＬ−２放出を示した（図３１、パネルＢ）。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖Ｎ８７細胞の存在下でトラスツマブ濃度依存的なＩＦＮγ放出を示し、試験した他の標的細胞（正常な細胞株を含む）の存在下でＩＦＮγ放出をほとんどもしくは全く示さなかった（図３２、パネルＡ）。対照的に、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖Ｎ８７細胞およびＨＥＲ２低ＭＣＦ７細胞の存在下で強力なＩＦＮγ放出を示し、正常な肺動脈平滑筋細胞および心筋細胞の存在下でＩＦＮγ放出を示した（図３２、パネルＢ）。これらの結果は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞が、トラスツマブおよび正常な初代細胞（乳房上皮、肺動脈平滑筋、心筋細胞、気管支上皮、または腎臓上皮）の存在下でサイトカインを放出しない一方で、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の存在下におけるこれらの正常な細胞でサイトカイン放出が見られることを示す。
【０２７４】
結果の概要
上記に示されるように、トラスツマブと組み合わせると、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖標的細胞株に対して強力な増殖、サイトカイン産生、および腫瘍に対する細胞傷害性を示すが、非増殖ＭＣＦ７およびＫＡＴＯＩＩＩ細胞株に対しては活性が減少した。トラスツマブに基づく（４Ｄ５ｓｃＦｖ）ＨＥＲ２標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＥＲ２増殖および非増殖細胞株の両方で細胞傷害性およびサイトカイン放出を示し、このことは、ＨＥＲ２発現の異なる閾値が、ＨＥＲ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＡＣＴＲ Ｔ細胞の活性化に必要とされることを示す。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスの皮下Ｎ８７胃癌異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示し、この活性は、ＨＥＲ２ＣＡＲ−Ｔと同等であった。トラスツマブの存在下で正常な細胞とインキュベートすると、ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、細胞傷害性またはサイトカイン放出をあまり示さなかった。対照的に、ＨＥＲ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞は、サイトカインを放出し、これらの正常な細胞に対する細胞傷害性を介在した。総合すれば、これらのデータは、ＡＣＴＲ Ｔ細胞＋トラスツマブの有効性を支持し、トラスツマブに基づくＨＥＲ２標的ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してこの組み合わせで「オンターゲット／オフ腫瘍（on target/off tumor）」傷害性のリスクを減少させることを示す。
【０２７５】
実施例８：ダラツムマブをＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を発現するＴ細胞と組み合わせたＣＤ３８増殖癌の有効な標的化
多発性骨髄腫およびリンパ腫細胞株、多発性骨髄腫形質細胞、免疫細胞、および赤血球の表面上のＣＤ３８発現
ＣＤ３８発現をフローサイトメトリーにより癌細胞株、患者由来細胞、および正常な細胞の表面上で評価した。
【０２７６】
ＣＤ３８発現を、リンパ腫細胞株ダウディ、ラージ、ラモス、およびＲＬ、ならびに多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＯＰＭ２、ＲＰＭＩ８２２６、およびＵ２６６Ｂ１について評価した。細胞株をＰＢＳ（ＢＳＡを含有）（染色緩衝液）で２回洗浄し、続いてヒトＦｃブロックで１０分間インキュベーションした。次いで、該細胞を１０μｇ／ｍＬのダラツムマブと室温で２０分間インキュベートした。その後、染色緩衝液中で２回洗浄し、ＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２二次抗体と４℃で３０分間インキュベートした。染色緩衝液中で２回洗浄後、染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を各細胞株についてプロットした（図３３、パネルＡ）。全ての細胞株は、ＣＤ３８発現について陰性であるＵ２６６Ｂ１を除いて様々な程度でＣＤ３８発現を示す。
【０２７７】
また、ＣＤ３８発現を、フローサイトメトリーにより、初代ＭＭ患者由来骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）サンプルとともにＮＣＩ−Ｈ９２９、ＫＭＳ−２０、およびＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株について評価した。患者由来ＢＭＭＣおよびＭＭ細胞株をＰＢＳで１回洗浄し、次いで生存／死滅（Live/Dead）ｅＦｌｕｏｒ−７８０色素を用いて４℃で３０分間染色した。生存率染色後、細胞を１回洗浄し、ヒトＦｃブロック（５０μＬ）と室温で1０分間インキュベートした。次に、該細胞を、ＡＦ４８８抱合抗ヒトＣＤ３８抗体およびブリリアントバイオレット５１０抱合抗ヒトＣＤ２７抗体からなる抗体カクテルの１００μＬで染色した。３０分の染色インキュベーション後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーによりを評価した。多発性骨髄腫細胞株およびＭＭ患者由来ＢＭＭＣを入れたフローサイトメトリーは、２回排除と死滅細胞の排除後に行った。ＣＤ３８発現は全ての細胞で検出され、最も高い発現は、患者由来ＢＭＭＣ細胞で観察された（図３３、パネルＢ）。
【０２７８】
また、ＣＤ３８発現を、フローサイトメトリーにより、ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫、ダウディリンパ腫、および２人のドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サブセットについて評価した。ＰＢＭＣを回答し、染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合抗ヒトＣＤ３、ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ１９、ＰＥ−Ｃｙ７抱合抗ヒトＣＤ１４、ブリリアントバイオレット４２１抱合抗ヒトＣＤ５６、およびＰＥ抱合抗ヒトＣＤ３８抗体からなる抗体カクテルの１００μＬで染色した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーにより評価した。２回の排除後、ＣＤ３８のｇＭＦＩをＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ１９＋（Ｂ細胞）、ＣＤ３−ＣＤ５６＋（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、およびＣＤ３−ＣＤ１４＋（単球）集団内で算出した。ＰＢＭＣサブセットのＣＤ３８発現レベルをダウディおよびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のＣＤ３８発現（ｇＭＦＩ）レベルと比較した。両方のドナーにおいて、ＮＫ細胞は、免疫細胞サブセットのうちの最も高いＣＤ３８の発現を示したが、ＣＤ３８発現レベルは、ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫およびダウディリンパ腫細胞で観察されたものより著しく低かった（図３３、パネルＣ）。
【０２７９】
ＣＤ３８発現はまた、５人の異なる健常ドナーに由来する赤血球（赤血球）の表面上で評価した。５人の健常ドナーに由来する全血を、細胞染色緩衝液（アジ化ナトリウムを含有）で１：１００００に希釈した。細胞を１回洗浄し、次いで１００μＬの抗体カクテル（ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ２３５ａ、ブリリアントバイオレット６０５抱合抗ヒトＣＤ４５、およびＰＥ抱合抗ヒトＣＤ３８抗体からなる）で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を細胞染色緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーにより評価した。低ＣＤ３８発現（ｇＭＦＩ）がＣＤ２３５ａ＋赤血球の表面上で観察された（図３３、パネルＤ）
【０２８０】
活性化ＡＣＴＲ Ｔ細胞の表面上のＣＤ３８発現
ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびダウディ標的細胞（標的；Ｔ）を、１μｇ／ｍＬのＣＤ２０標的抗体リツキシマブの存在下において、１：１のエフェクター対標的比（３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を３７℃／５％のＣＯ２インキュベーター内で１、２、または３日間インキュベートし、次いでフローサイトメトリー分析のために染色した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて固定可能な生存率色素ｅＦｌｕｏｒ４５０で染色した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、次いで１００μＬの抗体カクテル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合抗ヒトＣＤ３、ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ１６およびＰＥ抱合抗ヒトＣＤ３８抗体を含有する）とインキュベートした。２０分間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、データをフローサイトメーターで取得した。ＣＤ３８のｇＭＦＩは、ＣＤ３＋合計Ｔ細胞について、ならびにＣＤ３＋ＣＤ１６＋ＡＣＴＲ＋Ｔ細胞、およびダウディ標的細胞に調べた。ＣＤ３８のｇＭＦＩは、刺激後の時間経過に応じてプロットした（図３４）。ＣＤ３８のｇＭＦＩは、リツキシマブの非存在下でインキュベートした細胞と比較して、リツキシマブおよびダウディ細胞の存在下において活性化後に合計Ｔ細胞（全てのＣＤ３＋細胞）について時間に応じて増加したが、ＣＤ３８発現は、ダウディ標的細胞の当該発現より著しく低下した（図３４、パネルＡ）。ＣＤ３８のｇＭＦＩは、リツキシマブの存在下でＡＣＴＲ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１６＋細胞）で刺激後２４時間のピーク発現において顕著に上流調節され、ダウディ標的細胞で見られたものと同様であった（図３４、パネルＢ）。これらの実験は、標的抗体および前記抗体の同種抗原を発現する標的細胞による活性化によりＡＣＴＲ Ｔ細胞で上流調節されることを示す。
【０２８１】
モック、ＡＣＴＲ、Ｔ細胞、およびＣＤ３８標的ＣＡＲ−Ｔ細胞の作成
Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＰＢＭＣから作成した。細胞に、４−１ＢＢ共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結したＴＨＢ７単一鎖可変フラグメントで構成されるＡＣＴＲまたはＣＤ３８標的ＣＡＲ配列（ＴＨＢ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）をコードしたガンマレトロウイルスを活性化後３日目に形質導入し（Mihara et al. 2009. J Immunother. 32(7):737-43.）；モックＴ細胞は、ウイルスを形質導入しなかった。増殖倍率（図３５、パネルＡ）、生存率（図３５、パネルＢ）、および細胞サイズ（図３５、パネルＣ）を、ヌクレオカウンターＮＣ−２００細胞カウンターを用いて増殖過程を通してモニターした。また、ＣＤ３８発現を、増殖５、７、および１０日目にフローサイトメトリーにより評価した（図３５、パネルＤ）。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳ（ＢＳＡを含む）（染色緩衝液）で１回洗浄し、続いて１００μＬの抗体カクテル（ＡＰＣ−Ｃｙ７抱合抗ヒトＣＤ３、ブリリアントバイオレット４２１抱合抗ヒトＣＤ４、ＰＥ抱合抗ヒトＣＤ８、ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ１６およびＦＩＴＣ抱合抗ヒトＣＤ３８を含有）と２０分間インキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄後、検出をフローサイトメトリーにより行った。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して高まった増殖（図３５、パネルＡ）、生存率（図３５、パネルＢ）、細胞直径（図３５、パネルＣ）、およびＣＤ３８発現（図３５、パネルＤ）を示す。
【０２８２】
同様の実験において、さらに抗ＣＤ３８ ＣＡＲを評価した。前記０５６ ＣＡＲは、４−１ＢＢ共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結した０５６単一鎖可変フラグメントで構成される（０５６−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）（Drent et al. 2016. Haematologica. 101(5):616-25）。Ｔ細胞に、ＡＣＴＲ、ＴＨＢ７ ＣＡＲ、または０５６ ＣＡＲをコードしたガンマレトロウイルスを形質導入し；モックＴ細胞は、ウイルスを形質導入しなかった。増殖倍率（図４４、パネルＡ）、細胞サイズ（図４４、パネルＢ）、および細胞生存率（図４４、パネルＣ）を、ヌクレオカウンターＮＣ−２００細胞カウンターを用いて増殖過程を通してモニターした。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、両方の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ変異体を発現するＴ細胞と比較して高まった増殖（図４４、パネルＡ）、細胞直径（図４４、パネルＢ）、および細胞生存率（図４４、パネルＣ）を示した。
【０２８３】
また、ＣＤ３８発現を、増殖６、８、および１０日目にフローサイトメトリーにより評価した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳ（ＢＳＡを含有）（染色緩衝液）で１回洗浄し、続いて１００μＬの抗体カクテル（ＡＰＣ−Ｃｙ７抱合抗ヒトＣＤ３、ブリリアントバイオレット４２１抱合抗ヒトＣＤ４、ＰＥ抱合抗ヒトＣＤ８、ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ１６およびＦＩＴＣ抱合抗ヒトＣＤ３８を含有）で２０分間インキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄後、検出をフローサイトメトリーにより行った。各Ｔ細胞の増殖についてのＣＤ３８発現を表すヒストグラムを図４５に示す。モックおよびＡＣＴＲ Ｔ細胞の両方のヒストグラムは、増殖過程にわたりより低いＣＤ３８発現への方向性を示すが、実験を通して強力なＣＤ３８発現を維持する。ＴＨＢ７ ＣＡＲおよび０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方のヒストグラムは、実験過程を通してＣＤ３８発現の顕著な減少を示し、両方のＣＡＲ変異体について８日目および１０日目でＣＤ３８発現がほとんどあるいは全く見られず、このことは、ＣＤ３８陽性Ｔ細胞のＣＡＲを介在した枯渇を示す。
【０２８４】
これらの実験は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ Ｔ細胞の産生が、ＣＤ３８標的介在自己溶解によって阻害されるが、ＡＣＴＲ Ｔ細胞の産生は阻害されないことを示す。
【０２８５】
ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して高まった細胞傷害性およびサイトカイン産生を示す
上記に記載の実験で作成したＴ細胞は、ＣＤ３８を発現する標的細胞による活性実験で評価した。ＡＣＴＲ−およびＣＡＲ−発現細胞は、モックＴ細胞による適合した形質導入効率について正規化した。これらの実験について、モックＴ細胞、ＡＣＴＲ Ｔ細胞、ＴＨＢ７ ＣＡＲ Ｔ細胞、および０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ３８発現ダウディ、ＮＣＩ−Ｈ９２９、またはＲＰＭＩ−８２２６標的細胞と異なるＥ：Ｔ比（１：４、１：２、１：１、２：１、および４：１）でインキュベートした。モックおよびＡＣＴＲ Ｔ細胞による実験は、ダラツムマブの非存在下および存在（１μｇ／ｍＬ）下で行った。反応物を５％ ＣＯ２インキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートした。上清（１００μＬ）をサイトカイン分析のために取り出した。
【０２８６】
細胞傷害性は、フローサイトメトリーにより評価した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて 固定可能な生存率色素で染色した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、続いて１００μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合抗ヒトＣＤ３抗体でインキュベートした。３０分間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、データをフローサイトメーターで取得した。生存標的細胞数は、生存率色素陰性のＣＤ３細胞を入れることにより調べた。生存標的細胞率は、所定のサンプルに由来する生存標的細胞数を、標的細胞のみのウェルにおける生存標的細胞数で割ることにより決定した。細胞傷害率は、１００から前記生存細胞率を差し引くことによって決定した。細胞傷害率をＥ：Ｔ比に応じてプロットした（図４６）。
【０２８７】
細胞傷害性におけるエフェクター細胞の用量依存的増加は、ダウディ（図４６、パネルＡ）およびＮＣＩ−Ｈ９２９（図４６、パネルＢ）細胞で培養したＡＣＴＲとダラツムマブ、ＴＨＢ７ ＣＡＲ、および０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞について見られた。モックＴ細胞のみおよびＡＣＴＲ Ｔ細胞のみでは、標的細胞株のいずれに対しても細胞傷害性がほとんどあるいは全く示されなかった。ダラツムマブの存在下でのモックＴ細胞は、ダウディ細胞に対していくらかの細胞傷害性を示し、このことは、ダラツムマブのみでも、これらの標的細胞に対して細胞傷害効果を有しうることを示す（図４６、パネルＡ）。ダラツムマブの存在下でのＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ダウディおよびＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞の両方とともにより低いＥ：Ｔ比でＴＨＢ７および０５６ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方に対して優れた細胞傷害性を示した（図４６、パネルＡおよびＢ、各々）。
【０２８８】
これらの実験からの上清を、Ｃｉｓｂｉｏ均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いてＩＦＮγおよびＩＬ−２について分析した。簡単に説明すると、サイトカイン標準物および抱合体は、製造業者のプロトコールに従って調製した。低容量３８４ウェルプレートにおいて、１０μＬ容量の抱合体および１０μＬ容量の細胞上清を２時間（ＩＬ−２）または２４時間（ＩＦＮγ）共インキュベートした。プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ標識プレートリーダーで読み取った。１：１のＥ：Ｔ比で行った反応物からの細胞上清において測定したＩＦＮγまたはＩＬ−２の濃度は、標的細胞に応じてプロットする（図４７）。
【０２８９】
強力なＩＦＮγ産生は、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在中のダラツムマブ、ＴＨＢ７ ＣＡＲ Ｔ細胞、および０５６ＣＡＲ Ｔ細胞の存在下におけるＡＣＴＲ Ｔ細胞について見られた（図４７、パネルＡ）。ダラツムマブの存在下でのモックＴ細胞によるＩＦＮγ産生は、非常に低いか、またはアッセイの定量化限界以下であった。強力なＩＬ−２産生は、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在中のダラツムマブの存在下におけるＡＣＴＲ Ｔ細胞について見られた（図４７、パネルＢ）。低いレベルのＩＬ−２産生は、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在下におけるＴＨＢ７ＣＡＲ、０５６ＣＡＲ、およびモック（ダラツムマブの存在下）Ｔ細胞について見られた（図４７、パネルＢ）
【０２９０】
これらの実験は、ダラツムマブの存在下でのＡＣＴＲ Ｔ細胞が、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して優れた細胞傷害性およびサイトカイン産生を有することを示す。
【０２９１】
ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ細胞に対して介在されるＡＣＴＲ Ｔ細胞の細胞傷害性は、ダラツムマブの存在下で濃度依存的であり、ＡＣＴＲ特異的である
ＡＣＴＲまたはモックＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を、増加濃度のＣＤ３８標的抗体ダラツムマブの存在下で２：１のＥ：Ｔ比でインキュベートした。これらの実験において、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞を用いた。反応物をＣＯ２（５％）インキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートし、次いでフローサイトメトリーのために染色した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで固定可能な生存率色素で染色した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、続いて１００μＬの抗体カクテル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合抗ヒトＣＤ３およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抱合抗ヒトＣＤ１６抗体を含有）とインキュベートした。３０分間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、データをフローサイトメーターにより取得した。生存標的細胞数は、生存率色素陰性のＣＤ３ＣＤ１６−細胞を入れることにより決定した。生存標的細胞率は、所定のサンプルに由来する生存標的細胞数を、標的細胞のみのウェルにおける生存標的細胞数で割ることによって決定した。細胞傷害率は、１００から前記生存細胞率を差し引くことによって決定した。細胞傷害率を抗体濃度に応じてプロットした（図３６）。
【０２９２】
細胞傷害性の抗体用量依存的な増加は、ダラツムマブの存在下でＮＣＩ−Ｈ９２９（図３６、パネルＡ）、ＭＭ．１Ｓ（図３６、パネルＢ）、ＲＰＭＩ−８２２６（図３６、パネルＣ）、およびダウディ（図３６、パネルＤ）標的細胞と培養したＡＣＴＲ Ｔ細胞について見られた。細胞傷害性の増加は、モックＴ細胞を増加濃度のダラツムマブの存在下で培養した場合に見られなかった。
【０２９３】
ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６およびダウディ細胞、ならびにダラツムマブの存在下でのＡＣＴＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出は、抗体用量依存的である
ＡＣＴＲまたはモックＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を、増加濃度のＣＤ３８標的抗体ダラツムマブの存在下において１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートした。細胞上清を３７℃／５％のＣＯ２インキュベーター内での２４時間のインキュベーション後に収集した。上清を、Ｃｉｓｂｉｏ均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いてＩＦＮγおよびＩＬ−２について分析した。簡単に説明すると、サイトカイン標準物および抱合体を製造業者のプロトコールに従って調製した。低容量３８４ウェルプレートにおいて、１０μＬ容量の抱合体および１０μＬ容量の細胞上清を２時間（ＩＬ−２）または２４時間（ＩＦＮγ）共培養した。プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ標識プレートリーダーで読み取った。細胞上清で測定したＩＦＮガンマまたはＩＬ−２の濃度は、ダラツムマブ濃度に応じてプロットする。
【０２９４】
強力なＡＣＴＲ Ｔ細胞のＩＬ−２（図３７、パネルＡ）およびＩＦＮγ（図３７、パネルＢ）産生が、ダラツムマブでオプソニン化されたＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在下で見られた。モックＴ細胞によるサイトカイン産生（プロットせず）は、標準曲線の線形範囲未満であった。
【０２９５】
ダラツムマブでオプソニン化されたＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在下におけるＡＣＴＲ Ｔ細胞特異的な増殖
Ｔ細胞に、ＡＣＴＲをコードするガンマレトロウイルスを形質導入し；フローサイトメトリー実験により、これらの細胞の２４〜３２％がＡＣＴＲについて陽性であることが示された。ＡＣＴＲまたはモックＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を、増加濃度のＣＤ３８標的抗体ダラツムマブの存在下において１：１のエフェクター対標的比でインキュベートした。反応物を３７℃／５％のＣＯ２インキュベーター内で７日間インキュベートし、フローサイトメトリーのために染色した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて固定可能な生存率色素ｅＦｌｕｏｒ４５０で染色した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、続いて１００μＬの抗体カクテル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合抗ヒトＣＤ３およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抱合抗ヒトＣＤ１６抗体を含有）とインキュベートした。３０分間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、データをフローサイトメーターにより取得した。生存Ｔ細胞数は、生存率色素陰性のＣＤ３＋細胞を入れることにより決定した。図３８、パネルＡおよびＢにおいて、合計Ｔ細胞数をダラツムマブ抗体濃度に応じてプロットする。モックＴ細胞は、ダラツムマブ、ならびにＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の非存在または存在下で増殖しなかった（図３８、パネルＡ）。ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ダラツムマブの存在中のＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ−８２２６、およびダウディ標的細胞の存在下で強力な増殖を示したが、ダラツムマブの非存在下では示さなかった（図３８、パネルＢ）。図３８、パネルＣにおいて、ＣＤ１６＋細胞率は、合計ＣＤ３＋Ｔ細胞ゲート内で算出し、ダラツムマブ抗体濃度に応じてプロットした。ＡＣＴＲ＋Ｔ細胞率は、抗体用量依存的に増加し、このことは、ＡＣＴＲ＋Ｔ細胞が増殖中に形質導入していない細胞を超えて優先的に富化されることを示す。
【０２９６】
ＡＣＴＲ Ｔ細胞の細胞傷害性およびサイトカイン放出は、自己ＰＢＭＣサブセットに対して最小であるが、ＣＤ３８を発現する標的細胞株に特異的である
ＡＣＴＲ Ｔ細胞を、ＡＣＴＲ Ｔ細胞、自己ＰＢＭＣ、およびＣＤ３８発現多発性骨髄腫標的細胞株を含有した共培養アッセイにおけるＣＤ３８標的ダラツムマブの存在下でのＰＢＭＣおよびＰＢＭＣサブセットの標的化の可能性について評価した。上記に記載されるように、ＣＤ３８の低発現が、いくつかのＰＢＭＣサブセットで見られる（図３３、パネルＣ）。
【０２９７】
ＡＣＴＲまたはモックＴ細胞は、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫標的細胞（２５，０００個の細胞）を４：１のＥ：Ｔ比で存在するか、または非存在下において、自己ＰＢＭＣの存在下において１：１のＥ：Ｔ比（各１００，０００個の細胞）でインキュベートした。反応物を、ダラツムマブの存在または非存在下にて３７℃／５％のＣＯ２で２０時間インキュベートした。２０〜２４時間後、細胞上清の半分をサイトカイン分析のために回収し、該細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。
【０２９８】
簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて固定可能な生存率色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で染色した。生存率染色後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの抗体カクテル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合抗ヒトＣＤ３、ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ１９、ＰＥ−Ｃｙ７抱合抗ヒトＣＤ１４、ブリリアントバイオレット４２１抱合抗ヒトＣＤ５６、およびブリリアントバイオレット５１０抱合抗ヒトＣＤ１３８からなる）と３０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーにより評価した。２回の排除と死滅した細胞の排除の後、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３−ＣＤ１４＋単球、およびＣＤ３−ＣＤ１３８＋Ｍ標的細胞の数を調べた。生存標的細胞率は、各特定された細胞サブセットについて、所定のサンプルウェル中の生存標的細胞数を、抗体の非存在下での生存標的細胞数により割ることによって算出した。抗体特異的な細胞傷害性は、１００から生存細胞率を差し引くことによって決定した。抗体特異的な細胞傷害性（％）は、１または１０μｇ／ｍＬのダラツムマブの存在下でのモックＴ細胞（図３９、パネルＡ）およびＡＣＴＲ Ｔ細胞（図３９、パネルＢ）との反応物の種々の細胞サブセットについて抗体濃度に応じてプロットする。データは、３人のドナーの代表的な値である。細胞傷害性はモックＴ細胞でほとんどあるいは全く見られず；ＡＣＴＲ Ｔ細胞は、ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＭＭ細胞）に対して強力な細胞傷害性を示したが、自己ＰＢＭＣサブセットに対して細胞傷害性をほとんどあるいは全く示さなかった。
【０２９９】
上清からのサイトカインを上記に記載されるように分析した。簡単に説明すると、細胞上清の半分（１００μＬ）を、Ｃｉｓｂｉｏ均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いてＩＦＮγおよびＩＬ−２サイトカイン分析のために収集した。サイトカイン標準物および抱合体は、製造業者のプロトコールに従って調製した。低容量３８４ウェルプレートにおいて、１０μＬ容量の抱合体および１０μＬ容量の細胞上清を、２時間（ＩＬ−２）または２４時間（ＩＦＮγ）共インキュベートした。プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ標識プレートリーダーで読み取った。細胞上清について測定したサイトカイン濃度を、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の存在下または非存在下でのＡＣＴＲ Ｔ細胞およびＰＢＭＣとの反応物についてダラツムマブ抗体濃度に応じてプロットする（図４０）。ＩＦＮγ（図４０、パネルＡ）およびＩＬ−２（図４０、パネルＢ）産生の増加は、ＡＣＴＲ Ｔ細胞をＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞の存在下でダラツムマブと培養した場合に見られたが、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞の非存在下では見られなかった。これらの実験は、ＰＢＭＣサブセットにおける低い発現のＣＤ３８が、ダラツムマブの存在下でのＡＣＴＲ活性化を介在するのに十分ではないことを示す。
【０３００】
ダラツムマブと組み合わせたＡＣＴＲ Ｔ細胞は溶血を介在しない。
ＣＤ３８発現をフローサイトメトリーにより赤血球について評価した。５人の健常ドナーからの新鮮な全血を、細胞染色緩衝液（アジ化ナトリウムを含有）（細胞染色緩衝液）で１：１００００に希釈した。細胞を細胞染色緩衝液で１回洗浄し、続いて１００μＬの抗体カクテル（ＡＰＣ抱合抗ヒトＣＤ２３５ａ、ブリリアントバイオレット６０５抱合抗ヒトＣＤ４５、およびＰＥ抱合抗ヒトＣＤ３８またはアイソタイプコントロール抗体からなる）で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を細胞染色緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ３８発現をＣＤ２３５ａ＋赤血球の表面上で評価し、図４１、パネルＡでプロットする。抗ＣＤ３８抗体で染色した赤血球の得られたヒストグラムは、アイソタイプコントロールによる染色と比較してわずかなシフトが見られ、このことは、赤血球における少量のＣＤ３８発現を示す。 
【０３０１】
また、ダラツムマブの赤血球への結合をフローサイトメトリーにより評価した。５人の健常ドナーからの新鮮な全血を、細胞染色緩衝液で１：１０００に希釈した。希釈した全血（１００μＬ）を９６ウェル丸底プレートに入れ、２００ｘｇで５分間遠心分離することによって沈殿させた。細胞を、細胞染色緩衝液（８μｇ／ｍＬの最終濃度で調製したダラツムマブを含有）中において３７℃／５％のＣＯ２で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を細胞染色緩衝液で２回洗浄し、ＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２二次抗体と室温で２０分間インキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄後、ＰＥ検出をフローサイトメトリーにより行った。最大ダラツムマブ結合は、試験した５人のドナーのうちの１人について示し、二次抗体のみと比較する（図４１、パネルＢ）。得られたヒストグラムの小さなシフトが、二次抗体のみと比較してダラツムマブの存在下で見られ、このことは、ダラツムマブの赤血球へのいくらかの結合を示す。
【０３０２】
ＡＣＴＲ Ｔ細胞により介在される溶血を、ＡＣＴＲおよび赤血球共培養アッセイを用いて評価した。ＡＣＴＲ Ｔ細胞を、５人の健常ドナーに由来する赤血球の存在下でインキュベートして、約１：２００のＡＣＴＲ＋Ｔ細胞：赤血球比とした。形質導入されていないモックＴ細胞およびダラツムマブ、ならびにＴ細胞の非存在下でのダラツムマブのみによる反応物を、この実験のコントロールとして用いた。反応物を、６００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、６６．７μｇ／ｍＬ、２２．２μｇ／ｍＬ、７．４μｇ／ｍＬまたは０μｇ／ｍＬでのダラツムマブの存在下において３７℃／５％のＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。２４時間の共培養後、生存可能な赤血球を、５００ｘｇで１０分間遠心分離することにより沈殿させた。上清（６０μＬ）をヘモグロビンＥＬＩＳＡにおける分析（細胞上清中で測定されたヘモグロビンは赤血球溶解を示す）のために収集した。簡単に説明すると、洗浄緩衝液、希釈溶液、酵素抗体抱合体、およびヘモグロビン標準物は、製造業者の説明書に従って調製した。サンプルおよび標準物（１００μＬ）をＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で２０分間インキュベートした。該プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄し、次いで１００μＬの酵素抗体抱合体と２０分間インキュベートした。該プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で再度４回洗浄し、次いで１００μＬのＴＭＢ発色基質溶液と１０分間インキュベートした。停止液（１００μＬ）をそれぞれのウェルに加え、４５０ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｉ３Ｘを用いて決定した。各サンプルウェルで測定したヘモグロビン濃度を、全溶解を生じる２％ トリトンＸ添加剤と比較した（コントロールは点線）。ヘモグロビン濃度をダラツムマブ濃度に応じてプロットした（図４１、パネルＣ）。ヘモグロビンは、反応物からの上清中でほとんどもしくは全く検出されず、ＡＣＴＲ Ｔ細胞、モックＴ細胞、またはダラツムマブのみによる反応物の間で差異は存在しなかった。これらの実験は、ダラツムマブの存在下でのＡＣＴＲ Ｔ細胞が赤血球を溶解しないことを示す。
【０３０３】
実施例９：ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞からのＩＬ−２産生
配列番号：２、９、１３、１９、２０、２１、２２、および２７を有するＡＣＴＲ変異体をコードしたガンマレトロウイルスを作成した。これらのウイルスを用いて２人の異なるドナーに由来する初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染させた細胞の表面上でこれらのＡＣＴＲ変異体を発現した細胞を作成した。次いで、これらの細胞を、ＨＥＲ２陽性ＨＣＣ１９５４またはＳＫＢＲ３標的細胞およびＨＥＲ２標的トラスツマブによるＩＬ−２放出アッセイに用いた。
【０３０４】
Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびＨＣＣ１９５４標的細胞（標的；Ｔ）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のウシ胎児血清を補充）の２００μＬの反応容量中で１μｇ／ｍＬのトラスツマブの存在下において１：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のエフェクター細胞；１２０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）およびＳＫＢＲ３標的細胞（標的；Ｔ）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のウシ胎児血清を補充）の１００μＬの反応容量中で１μｇ／ｍＬのトラスツマブの存在下において１：１のエフェクター対標的比（３０，０００個のエフェクター細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物をＣＯ２（５％）インキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートした。
【０３０５】
上清を、均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いてＩＬ−２について分析した。簡単に説明すると、サイトカイン標準物および抱合体は、製造業者のプロトコールに従って調製した。低容量３８４ウェルプレートにおいて、１０μＬ容量の抱合体および１０μＬ容量の細胞上清を２４時間共インキュベートした。蛍光シグナルをは、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ標識プレートリーダーを用いて測定し、データは、製造業者の推奨する方法に従って分析した。
【０３０６】
各標的／ドナーペアについて、放出されたＩＬ−２の量を、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２で放出された量に正規化した。平均相対ＩＬ−２を、図４２においてＡＣＴＲ変異体に応じてプロットする。試験した全てのＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞は、Ｔ細胞活性の指標であるＩＬ−２の産生を示した。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９は、他のＡＣＴＲ変異体と比較して優れたＩＬ−２産生を示した。
【０３０７】
実施例１０：ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９および配列番号：２６によるサイトカイン産生
サイトカインを生成するＡＣＴＲ変異体 配列番号９および２６の能力を、多くの異なる抗体標的ペアの存在下で評価した。これらの実験において、配列番号：９または配列番号：２６を発現するＡＣＴＲ Ｔ細胞を、標的細胞および様々な濃度の標的抗体と１：１のＥ：Ｔ比で５％のＣＯ２インキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートした。ＡＣＴＲを発現しなかったモックＴ細胞をコントロールとして含めた。上清を取り出し、実施例６に記載されるように、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ−ＰｌｅｘヒトＩＦＮ−γおよびＶ−ＰｌｅｘヒトＩＬ−２キットを用いて、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γについて分析した。ＨＥＲ２を発現するＢＴ２０およびＳＫＢＲ３標的細胞による実験については、トラスツマブを０〜０．５μｇ／ｍＬで用量設定し；ＣＤ２０を発現するダウディ、ラージ、およびＲＬ標的細胞による実験については、リツキシマブを０〜１０μｇ／ｍＬで用量設定し；Ｂ７Ｈ３を発現するＢＴ４７４標的細胞による実験については、抗Ｂ７Ｈ３抗体ｈｕ８Ｈ９−６ｍを用いた（Ahmed et al. 2015. J. Biol. Chem., 290, pp.30018-30029）。リツキシマブおよびトラスツマブは、商標的供給源から入手した。該抗Ｂ７Ｈ３抗体ｈｕ８Ｈ９−６ｍは、抗体の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドをフリースタイル２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクトし、前記抗体を、プロテインＡアフィニティーを用いて細胞培養上清物から精製することによって作成した。
【０３０８】
ＨＥＲ２発現細胞株による実験について、ＩＬ−２（図４３、パネルＡ）およびＩＦＮ−γ（図４３、パネルＢ）値を、異なるトラスツマブ濃度と標的細胞株について試験したＴ細胞に応じてプロットした。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９およびＡＣＴＲ変異体 配列番号：２６の両方は、抗体依存的にＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ放出の両方は、トラスツマブおよびＨＥＲ２発現標的細胞とともに、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２６を用いた場合よりＡＣＴＲ変異体 配列番号：９を用いた場合の方がより高かった。同様の結果は、リツキシマブおよびＣＤ２０発現標的細胞、ならびに抗Ｂ７Ｈ３抗体およびＢ７Ｈ３発現標的細胞を用いて得られた。ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９およびＡＣＴＲ変異体 配列番号：２６を用いて試験した最も高い抗体における各標的抗体ペアについて産生された相対ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを表８に示す。同様の実験をさらなる標的抗体ペアを用いて行い、ＡＣＴＲ変異体 配列番号：２６と比較してＡＣＴＲ変異体 配列番号：９による増加したサイトカイン放出が示された。
表８：ＡＣＴＲ変異体 配列番号：９および２６による相対的なサイトカイン放出
【表８】
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【０３０９】
この実験の結果は、ＣＤ２８共刺激ドメイン（および適宜、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよび／またはＣＤ２８ヒンジドメインを含んでいてもよい）を含有するＡＣＴＲ構築物を発現するＴ細胞が、サイトカイン放出プロファイルのような一定の優れた効果を示したことを示し、このことは、このようなＡＣＴＲ構築物が、一定の優れた治療態様（例えば、共刺激性分子の発現を欠如した癌（造血または非造血）の治療のため）を有しうることを示す
【０３１０】
他の実施態様
本明細書に記載される特徴の全ては、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に記載される各特徴は、同一、同等、または同様の目的を供する代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、特に明確に示されていない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例に過ぎないものである。
【０３１１】
上記の記載から、当業者は、本開示の必要な特性を容易に確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、本開示の種々の変更と修飾をなして、それを様々な使用および条件で用いることができる。よって、他の実施態様もまた、本特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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