(57)【要約】  本発明は、試験管内または生体内において葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断における使用、または癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療における使用のための、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-5-メチルテトラヒドロ葉酸放射性医薬品に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験管内または生体内において葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断における使用、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療における使用のための、式IaまたはIb：
【化１】
2020511477.tif 000016
（式中、R1およびR2は互いに独立してHまたは直鎖もしくは分岐C1〜C6アルキルであり、R3およびR4は互いに独立してH、ホルミルまたはメチルである。）で表される化合物、または、その医薬的に許容される塩。
【請求項２】
R1およびR2が互いに独立してHまたは直鎖もしくは分岐C1〜C6アルキルであり、R3がメチルであり、R4がHである、請求項１に記載の使用のための化合物、または、その医薬的に許容される塩。
【請求項３】
式IIaまたは式IIb：
【化２】
2020511477.tif 000017
（式中、R1およびR2は互いに独立してHまたはC1〜C12アルキルである。）で表される請求項１に記載の使用のための請求項１に記載の化合物、または、その医薬的に許容される塩。
【請求項４】
式IIIaまたは式IIIb：
【化３】
2020511477.tif 000018
で表される先のいずれかの請求項に記載の使用のための化合物、または、その医薬的に許容される塩。
【請求項５】
立体異性体純度が99%を超える、好ましくは立体異性体純度が99.5%を超える、先のいずれかの請求項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
医薬的に許容される塩が、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩である、先のいずれかの請求項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断の方法であって、請求項１〜６に記載の少なくとも1つの化合物を画像診断量で投与する工程、および前記細胞または細胞集団の診断画像を得る工程を含む方法。
【請求項８】
試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断を行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒト卵巣癌細胞の画像診断を行う、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
組織サンプル中の葉酸受容体を発現する細胞を試験管内で検出する方法であって、前記組織サンプルを、請求項１〜６に記載の化合物と、結合を起こさせるのに効果的な量、充分な時間および条件で接触させること、およびオートラジオグラフィー等のような技術によりそのような結合を検出することを含む方法。
【請求項１１】
被験者を画像診断またはモニタリングする方法であって、(i)請求項１〜６に記載の少なくとも1つの化合物を画像診断量で投与する工程、および(ii)該少なくとも1つの化合物からの信号を検出することによりPETを用いて画像診断を行う工程を含む方法。
【請求項１２】
被験者における癌または炎症性および自己免疫性疾患の治療をモニタリングする方法であって、(i)請求項１〜６に記載の少なくとも1つの化合物を、それを必要としている被験者に、画像診断量で、治療活性成分と組み合わせて投与する工程、および(ii)該少なくとも1つの化合物からの信号を検出することによりPETを用いて画像診断を行って、癌または炎症性および自己免疫性疾患の治療の経過を追跡する工程を含む方法。
【請求項１３】
癌または炎症性および自己免疫性疾患を診断または治療する任意の他の方法と組み合わせて用いられる、請求項１〜６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の診断および癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療における、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断薬または治療薬のようなエフェクター部分の送達のための受容体特異的標的化は、広く研究されている分野であり、非侵襲性の診断および／または治療医学用途の開発につながっている。特に、ガンマ線のような電磁放射線を放出する放射性材料または放射線を放出する粒子を用いる核医学の処置および治療の分野において、特定の組織を可視化して、疾患を評価および／または治療処置の効果をモニタリングするための高い信号強度、または、他の組織、例えば健康な組織における放射線障害／放射線毒性のリスク無しに、電離放射線の適切な線量を特定の疾患部位に送達するための高い放射線量を達成するために、標的細胞または組織におけるこれらの放射性材料の選択的局在化が必要とされる。したがって、細胞特異的構造、特にがん（すなわち腫瘍）または炎症性および自己免疫性疾患の場合に存在する構造、例えば、それぞれの生物学的媒体によって特異的に標的化することができる受容体、抗原、ハプテンなどを決定および評価することが非常に重要である。
【０００３】
過去20年で、多くの葉酸ベースの放射性医薬品が、葉酸受容体（FR）陽性腫瘍組織を画像化するそれらの能力について調べられた（Low, P. S., Henne, W., and Doorneweerd, D. (2008) Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Acc. Chem. Res. 41, 120-129; Philip Stewart Low, S. A. K. (2009) Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 256-262; Mueller, C. (2013) Folate-Based Radiotracers for PET Imaging - Update and Perspectives. Molecules 18, 5005-5031, and Mueller, Folate based radiopharmaceuticals for imaging and therapy of cancer and inflammation., C. Curr Pharm Des. 2012; 18(8): 1058-83）。FR-αは、卵巣がん、子宮がん、腎臓がん、乳がん、肺がんおよび結腸直腸がんのようなさまざまな種類の上皮がんでは過剰発現するが、腎臓、脈絡叢、唾液腺、肺および胎盤を含む健康な組織では制限された程度にしか発現されないので、腫瘍画像化の最適な標的となる（Parker, N., Turk, M. J., Westrick, E., Lewis, J. D., Low, P. S., and Leamon, C. P. (2005) Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Anal. Biochem. 338, 284-293.）。葉酸ベースの放射性トレーサーには、FR-αに対する高い結合親和性のために、腎臓および他のFR陽性組織に大幅に蓄積するという欠点がある（IC50＝約1nM）（Mueller, C. (2013) Folate-Based Radiotracers for PET Imaging - Update and Perspectives. Molecules 18, 5005-5031.）。さらに、これらの葉酸ベースの放射性トレーサーは、炎症に関与する活性化マクロファージで上方制御されるFR-βアイソフォームにも同様の高い親和性で結合する（Nakashima-Matsushita, N., Homma, T., Yu, S., Matsuda, T., Sunahara, N., Nakamura, T., Tsukano, M., Ratnam, M., and Matsuyama, T. (1999) Selective expression of folate receptor β and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 42, 1609-1616; Paulos, C. M., Turk, M. J., Breur, G. J., and Low, P. S. (2004) Folate receptor-mediated targeting of therapeutic and imaging agents to activated macrophages in rheumatoid arthritis. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 1205-1217.）。この非選択性により、がんの診断または追跡調査の結果が偽陽性になる可能性がある。したがって、選択的な葉酸ベースの放射性医薬品は、間違った結果を減らすか、さらには回避するために、非常に重要であろう。
【０００４】
しかし、これまでのところ、限られた数の還元葉酸しか画像化研究のために放射性標識されてこなかった。Vaitilingamらは、99mTcで標識された5,10-ジメチルテトラヒドロ葉酸誘導体（DMTHF）について報告したが、DMTHF誘導体のジアステレオマー比に関する情報は提供されなかった（Vaitilingam, B., Chelvam, V., Kularatne, S. a., Poh, S., Ayala-Lopez, W., and Low, P. S. (2012) A Folate Receptor-α-Specific Ligand That Targets Cancer Tissue and Not Sites of Inflammation. J. Nucl. Med. 53, 1127-1134.）。著者は、38nMのKD値を報告しており、これは、対応する酸化型と比較して4倍高かった（EC20, KD＝12nM）。FR-α陽性腫瘍と炎症の動物モデルを使用した試験管内および生体内実験において、FR-βを超えるFR-αへの選択性が示された。DMTHF誘導体のほかに、Saeedらは、Nuclear Medicine and Biology 39（5）：697-701, January 2012において、炭素-11で標識された別の還元された葉酸放射性トレーサーについて報告したが、試験管内または生体内実験の結果は発表されていない。Vaitlingamらと同様に、放射性標識製品のジアステレオマー比に関する情報は提供されなかった。FR-βを含む炎症性部位において腫瘍に関わるFR-αを選択的に標的とするがFR-βは標的としないフッ素18標識葉酸PETトレーサーが、大きな感度と特異性を提供するために非常に興味深いであろう。
【０００５】
Wangらは、Biochemical Pharmacology, vol. 44, No. 9, pp. 1898-1901, 1992において、還元された5-メチル-(6R)-と-(6S)-THFの結合親和性の4倍の相違を報告した。
【０００６】
Betzelらは、最近、FR-陽性癌組織の画像化のために、3'-アザ-2'-[18F]フルオロ葉酸と表示される有望なフッ素-18標識葉酸誘導体を報告した（Betzel, T., Muller, C., Groehn, V., Muller, A., Reber, J., Fischer, C. R., Kramer, S. D., Schibli, R., and Ametamey, S. M. (2013) Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3´-aza-2´-[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjug. Chem. 24, 205-214.）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、既知の18F-葉酸放射性医薬品は有望な結果を示したが、高いFR-α-特異性を示し、日常の臨床応用に適しているが、高い放射化学的収率で効率的かつ多用途な方法で得られる化合物が、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
出願人は、今回、FR-α-陽性組織への高い特異性を、3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸の生理学的（6R）-型のような異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸誘導体を用いて達成し得ることを発見した。
【０００９】
還元された生理学的葉酸形態の誘導体である3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸のような異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸誘導体は、高い親和性でFRに結合し、それぞれの酸化葉酸誘導体よりも、50倍高いFR-αへの選択性を示す。FR-βを含む炎症部位においてFR-βではなく腫瘍関連FR-αを選択的に標的とするPETトレーサーは、有意な感度と特異性を提供している。腫瘍関連FR-αを選択的に標的とするPETトレーサーから得られる非特異的PETトレーサーの写真から推測すると、FR-βを含む炎症部位に関する情報を得ることができる。
【００１０】
したがって、本発明は、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断における、異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の使用、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療におけるその使用に関する。
【００１１】
本発明は、第１の実施形態において、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品の、試験管内または生体内において葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断における使用、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療における使用に関する。
【００１２】
好ましくは、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、それらの異性体的に純粋な(6S)-または(6R)-型である。
【００１３】
さらにより好ましくは、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸または異性体的に純粋な18F-標識された5-メチル-(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品である。
【００１４】
特定の実施形態では、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、異性体的に純粋な3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸または異性体的に純粋な3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-メチル-(6R)-テトラヒドロ葉酸である。
【００１５】
一つの特定の実施形態では、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断に使用するため、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療において使用するための、式IaまたはIb：
【００１６】
【化１】
2020511477.tif 000002
【００１７】
（式中、R1およびR2は互いに独立してHまたは直鎖もしくは分岐C1〜C6アルキルであり、R3およびR4は互いに独立してH、ホルミルまたはメチルである。）で表される化合物、またはその医薬的に許容される塩が提供される。
【００１８】
好ましい実施形態では、R1およびR2が互いに独立してHまたは直鎖もしくは分岐C1〜C6アルキルであり、R3がメチルであり、R4がHであり、または、その医薬的に許容される塩。
【００１９】
より具体的には、本発明は、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断で使用するための、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療で使用するための、式IIaまたはIIb：
【００２０】
【化２】
2020511477.tif 000003
【００２１】
（式中、R1およびR2は互いに独立してHまたはC1〜C12アルキルである。）で表される化合物、またはその医薬的に許容される塩に関する。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明は、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断で使用するための、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療において使用するための、式IIIaまたはIIIb：で表される化合物、またはその医薬的に許容される塩に関する。
【００２３】
【化３】
2020511477.tif 000004
【００２４】
特定の実施形態において、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩に関する。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、診断または治療、好ましくは癌または炎症性および自己免疫性疾患の診断または治療における、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品（またはその医薬組成物）の使用に関する。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、(i)葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品を、それを必要としている被験者に、画像診断量で、治療活性成分と組み合わせて投与する工程、および(ii)前記少なくとも1つの化合物からの信号を検出することによりPETを用いて画像診断を行って、癌または炎症性および自己免疫性疾患の治療の経過を追跡する工程を含む、被験者における癌または炎症性および自己免疫性疾患の治療のモニタリングにおける、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品（またはその医薬組成物）の使用に関する。
【００２７】
さらに別の局面において、本発明は、葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断における、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環よって置換されている異性体的に純粋な18F-標識された(6S)-または(6R)-テトラヒドロ葉酸放射性医薬品（またはその医薬組成物）の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】前駆体N2-アセチル-3'-アザ-2'-クロロ-5-メチルテトラヒドロフォレート-ジ-tert-ブチル-ブチルエステル6S-2および6R-2（A）および保護された参照体N2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ-5-メチルテトラヒドロフォレート-ジ-tert-ブチルエステル6S-2および6R-2（B）のキラルHPLCクロマトグラムである。
【図２】400nm〜200nmで測定した6S-および6R-5-MTHF（A）および6R-1および6S-1（B）のCDスペクトルである。
【図３】6S-5-MTHFおよび6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHF（A）および6R-5-MTHFおよび6R-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHF（B）のCDスペクトルの重ね合わせを示す。
【図４】6S／6R-[18F]1を注射した60分後における参照放射性トレーサー6S／6R-[18F]1（A）、肝臓サンプル（B）、血漿（C）および尿サンプル（D）の放射性UPLCクロマトグラムである。保持時間をピーク上に示す。
【図５】注射の30分、60分および90分後におけるいくつかの選択された組織での6R-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（A）および6S-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（B）の放射能蓄積を示す。
【図６】6R-[18F]1および6S-[18F]1の腫瘍対腎臓（A）、腫瘍対血液（B）および腫瘍対肝臓（C）の比の比較を示す。
【図７】18F-6R-5Me-アザ-THFを注射した30分、60分および90分後における組織分布プロフィールである。
【図８】18F-6S-5Me-アザ-THFを注射した30分、60分および90分後における組織分布プロフィールである。
【図９】18F-6R-5Me-アザ-THF（6R-型）および18F-6S-5Me-アザ-THF（6S-型）の組織分布プロフィールの比較を示す。
【図１０】18F-6R-5Me-アザ-THF（6R-型）および18F-6S-5Me-アザ-THF（6S-型）の腫瘍対血液の比の比較を示す。
【図１１】18F-6R-5Me-アザ-THF（6R-型）および18F-6S-5Me-アザ-THF（6S-型）の腫瘍対肝臓の比の比較を示す。
【図１２】18F-6R-5Me-アザ-THF（6R-型）および18F-6S-5Me-アザ-THF（6S-型）の腫瘍対腎臓の比の比較を示す。
【図１３】18F-6R-アザ-5Me-THFを注射した1時間、2時間および3時間後におけるKB腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Li=肝臓、Ki=腎臓、白矢印=胆嚢）。
【図１４】18F-6R-アザ-5Me-THFを注射した1時間、2時間および3時間後におけるKB腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Li=肝臓、Ki=腎臓、白矢印=胆嚢）。
【図１５】18F-6R-アザ-5Me-THFの前に過剰の葉酸の注射した1時間、2時間および3時間後におけるKB腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す（Li=肝臓、白矢印=胆嚢）。
【図１６】18F-6S-アザ-5Me-THFを注射した1時間、2時間および3時間後におけるKB腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Ki=腎臓、SG=唾液腺、白矢印=胆嚢、緑矢印=脈絡叢）。
【図１７】18F-6S-アザ-5Me-THFを注射した1時間、2時間および3時間後におけるKB腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Ki=腎臓、SG=唾液腺、白矢印=胆嚢、緑矢印=脈絡叢）。
【図１８】18F-6S-アザ-5Me-THFの前に過剰の葉酸を注射した1時間、2時間および3時間後におけるKB腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Bl=膀胱、白矢印=胆嚢）。
【図１９】18F-アザ-Fol、18F-5Me-6S-アザ-THFおよび18F-5Me-6R-アザ-THFを注射した1時間後のIGROV-1（ヒト卵巣癌細胞株）腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Ki=腎臓、SG=唾液腺、白矢印=胆嚢、緑矢印=脈絡叢）。
【図２０】18F-アザ-Fol、18F-5Me-6S-アザ-THFおよび18F-5Me-6R-アザ-THFを注射した2時間後のIGROV-1（ヒト卵巣癌細胞株）腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Ki=腎臓、SG=唾液腺、白矢印=胆嚢、緑矢印=脈絡叢）。
【図２１】18F-アザ-Fol、18F-5Me-6S-アザ-THFおよび18F-5Me-6R-アザ-THFを注射した3時間後のIGROV-1（ヒト卵巣癌細胞株）腫瘍を有するマウスのPET/CTスキャンを示す。（Tu=腫瘍異種移植片、Ki=腎臓、SG=唾液腺、白矢印=胆嚢、緑矢印=脈絡叢）。
【図２２】37℃で1時間、2時間または3時間インキュベートしたFR陽性KB細胞を有する6R-[18F]1（A）または6S-[18F]1（B）の取込量と内在化を示す。過剰な葉酸を用いてブロッキング試験を実施した。
【図２３】RT16（FR-α）およびD4（FR-β）細胞株を用いた18F-アザ-Folの総取込量と内在化を示す。
【図２４】RT16（FR-α）およびD4（FR-β）細胞株を用いた6R-3-アザ-2-18F-5-MTHFの総取込量と内在化を示す。
【図２５】RT16（FR-α）およびD4（FR-β）細胞株を用いた6S-3-アザ-2-18F-5-MTHFの総取込量と内在化を示す。
【図２６】還元された18F-葉酸および非フッ素化異性体の構造と立体化学的名称を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、第１の実施形態において、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品の、試験管内または生体内において葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断における使用、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療における使用に関する。
【００３０】
本明細書で使用される「テトラヒドロ葉酸」または「テトラヒドロ葉酸（複数形）」という用語は、5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸の構造に基づく化合物を含む。5-メチル-THFとしてのテトラヒドロ葉酸（THFと略記）は、異性体（6S）-および（6R）-型に導くC6における追加のキラル中心により葉酸などの酸化型と区別される。グルタミン酸部分のα炭素は、天然に存在する形態で本明細書で定義される葉酸およびテトラヒドロ葉酸の両方にある。本発明に従って使用するための化合物は、好ましくは異性体的に純粋な型である。
【００３１】
本明細書で使用されるテトラヒドロ葉酸は、テトラヒドロ葉酸の酸型を含み、それぞれのエステル型も含む。
【００３２】
本明細書で使用する「異性体的に純粋」または「立体異性体的に純粋」という用語とは、一方の型の他方の型に対する[（6R）-型の（6S）-型に対するまたは（6S）-型の（6S）-型に対する]異性体過剰が約80%を超える、好ましくは約90%を超える、好ましくは約95%を超える、より好ましくは約97%を超える、さらにより好ましくは約99%以上、最も好ましくは100%までであり、残りが他の異性体の１種または２種以上である本発明の化合物を意味する。
【００３３】
一つの特定の実施形態では、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断に使用するための、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療において使用するための、一般式IaまたはIbで表される18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品またはその医薬的に許容される塩が提供される：
【００３４】
【化４】
2020511477.tif 000005
【００３５】
（式中、R1およびR2は互いに独立してHまたは直鎖もしくは分岐C1-C6アルキルであり、R3およびR4は互いに独立してH、ホルミルまたはメチルである。）。
【００３６】
「アルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて使用される場合、典型的には1から6個、好ましくは1から4個の炭素原子を含む指定された数のC原子を含む直鎖または分岐アルキル基を指し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、t-ブチル等である。
【００３７】
医薬的に許容される塩は、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、硫酸塩またはスルホン酸塩などの酸性塩、好ましくは硫酸塩であってもよい。
【００３８】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断で使用するための、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療で使用するための、式IIaまたはIIbで表される化合物、またはその医薬的に許容される塩に関する。
【００３９】
【化５】
2020511477.tif 000006
【００４０】
（式中、R1およびR2は互いに独立してHまたはC1〜C12アルキルである。）。
【００４１】
さらにより具体的には、本発明は、試験管内または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断で使用するための、あるいは癌または炎症性および自己免疫性疾患のモニタリングおよびその治療において使用するための、式IIIaまたはIIIbで表される化合物、またはその医薬的に許容される塩に関する。
【００４２】
【化６】
2020511477.tif 000007
【００４３】
葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品が、驚くことにFRに匹敵する結合親和性を示すことがわかった。
【００４４】
さらに驚くべきことに、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品が異なる生体内分布を示すことがわかった。試験管内のデータが両方の異性体について同様のFR親和性を示したため、これは非常に驚くべきことである。
【００４５】
葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、腫瘍の取込量、生体内分布および生体内安定性の点で、対応する酸化葉酸ベースの誘導体よりも優れていた。
【００４６】
全体として、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている異性体的に純粋な18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、FR陽性組織において非常に特異的に蓄積する。18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、実際にはキャリアシステムを介して組織に輸送されるため、このような蓄積は期待できなかった。特に、（6S）型は、この点に関して、酸化型と同様の振る舞いを示す。
【００４７】
特に、葉酸構造内のフェニル基が18F-標識されたN-ヘテロ環によって置換されている18F-標識されたテトラヒドロ葉酸放射性医薬品の（6R）-型については、開示された著しく改善された腫瘍対腎臓比は非常に驚くべきことであり、期待できなかった。
【００４８】
さらなる局面において、本発明は、葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団の画像診断の方法であって、式Ia、Ib、IIa、IIb、IIIaまたはIIIbの少なくとも1つの化合物を画像診断量で投与する工程、および前記細胞または細胞集団の診断画像を得る工程を含む方法に関する。
【００４９】
さらに別の局面において、本発明は、画像診断を必要とする被験者への便利で効果的な投与のための異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の使用を提供する。
【００５０】
したがって、本発明は、葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団を画像診断する方法であって、本発明の少なくとも1つの異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品を画像診断量で投与する工程、および前記細胞または細胞集団の診断画像を得る工程を含む方法を提供する。
【００５１】
そのような画像化は、試験管内または生体外（生検）または生体内で葉酸受容体を発現する細胞または細胞集団で実施することができる。葉酸受容体-αを過剰発現する典型的な細胞または細胞集団は、卵巣癌、子宮癌、腎臓癌、乳癌、肺癌および結腸直腸癌などの上皮癌のタイプである。
【００５２】
したがって、本発明は、組織サンプル中で葉酸受容体を発現する細胞を試験管内で検出する方法であって、前記組織サンプルを、有効量の本発明の少なくとも1つの異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品と、結合を起こさせるための充分な時間および条件で接触させること、およびPET画像化によりそのような結合を検出することを含む方法を提供する。
【００５３】
さらなる局面において、本発明は、癌治療または炎症性および自己免疫性疾患の治療の画像診断またはモニタリングを必要とする被験者への便利で効果的な投与のための本発明の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の使用を提供する。
【００５４】
もう一つの局面において、本発明は、診断と治療とを同時に行う方法であって、診断有効量の本発明の少なくとも1つの異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品をそれを必要とする被験者に治療活性成分と組み合わせて投与する工程、および前記組織の診断画像を得て治療の経過を追跡する工程を含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の方法の被験者は、好ましくは、動物またはヒトなどの哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００５６】
投与量は、所望の効果の性質、例えば、診断または治療の形態、治療の種類と頻度、診断器具、製剤の適用形態、およびレシピエントの年齢、体重、栄養と状態、もしあれば、同時治療の種類に依存する。
【００５７】
しかしながら、過度の実験をすることなく、当業者により理解され決定されるように、最も好ましい投与量は個々の被験者に合わせて調整することができる。これには、通常、標準用量の調整、たとえば患者の体重が低い場合の用量の減少が含まれる。
【００５８】
治療は、最適な量を下回る、より少ない量で開始でき、最適な効果を達成するために増やすことができる。PETスキャナーでの画像化手順は、放射性トレーサーの投与後数分から2-4時間以内に行われる。スケジュールは、画像化ターゲットと放射性トレーサーの動態、および必要な情報に依存する。
【００５９】
本発明の異性体的に純粋な18F-標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の好ましい投与経路は、非経口的、例えば静脈内注射によるものである。
【００６０】
注射に適した形態には、本発明の上記の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の滅菌水溶液または分散液が挙げられる。通常、放射性医薬品は生理学的緩衝液中で製剤化される。
【００６１】
異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、当該分野で認められた技術により滅菌され、抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの抗菌剤の添加を含むがこれらに限定されない。好ましくは、それらは投与の前に滅菌ろ過を受け、追加の滅菌剤の必要性を排除する。
【００６２】
溶液を注入するための好ましい単位投与量は、約0.01ml〜約10mlである。非経口投与後、必要に応じて、放射標識試薬を被験者に投与して十分な量の投与量を選択された標的領域において蓄積させてから数分から2〜4時間以内に生体内での臓器または腫瘍の画像化を行うことができる。
【００６３】
本発明の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品は、被験者から採取された組織生検において葉酸受容体を発現する細胞の試験管内検出にも使用され得る。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、組織サンプル中の、葉酸受容体を発現する細胞、例えば腫瘍細胞を試験管内検出するための方法であって、前記組織サンプルを有効量の本発明の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品と、結合を起こさせるために充分な時間および条件で接触させること、および画像化技術によりそのような結合を検出することを含む方法を提供する。
【００６４】
サンプルは、当業者に知られている手順、例えば、組織生検または体液を収集すること、気管または肺のサンプルを吸引することなどにより収集することができる。
【００６５】
試験対象の組織サンプルには、腫瘍細胞、上皮細胞、腎臓、胃腸または肝胆道系その他のような、葉酸受容体を発現する細胞を含むと疑われる組織が含まれる。サンプルは、顕微鏡検査や観察を容易にするために、例えばミクロトームで切片化できる。また、サンプル組織の組織学的品質を改善するために、本発明の18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品の1つと共にインキュベーションする前または後に、サンプルを適切な固定剤で固定することができる。
【００６６】
本発明の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品が細胞上の葉酸受容体に結合するための充分な時間および条件には、標準的な組織培養条件が含まれる。すなわち、サンプルを試験管内培養し、生理学的媒体中において本発明の複合体または組成物の一つと共にインキュベートすることができる。そのような条件は、当業者に周知である。あるいは、サンプルを固定し、次いで、等張性または生理的緩衝液中において本発明の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品とともにインキュベートすることができる。
【００６７】
すべての用途において、本発明の異性体的に純粋な18F標識テトラヒドロ葉酸放射性医薬品を、使用する場所またはその近くで調製するのが便利である。
【００６８】
本明細書に開示および特許請求される化合物および／または方法のすべては、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行することができる。本発明の範囲から逸脱することなく本発明に変形を適用できることは当業者には明らかであろう。本明細書で提供される実施例は、例示的であることを意図しており、網羅的ではなく、したがって、例示された実施例は、決して本発明を限定するものと見なされるべきではない。
【実施例】
【００６９】
[材料および方法]
[全般]
試薬と溶媒は、Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Acros Organisから購入し、精製せずに使用した。構成要素は、ABCR-Chemicals、Apollo Scientific、Fluka-Chemie and Merck & Cie(Schaffhausen, Switzerland)から購入した。6R-10-ホルミル-5-メチルテトラヒドロプテロイン酸（6R-10-ホルミル-5-MTHP）は、Merck＆Cie（Schaffhausen, Switzerland）により提供された。これらの構成要素の品質管理は、1H-NMR、13C-NMR、cosygpおよびHR-MSを用いて行った。
フラッシュクロマトグラフィーの実施、反応混合物の移送、抽出および洗浄プロセス用の溶媒は、ETHの燃料貯蔵所から直接購入した。
【００７０】
[分析方法]
核磁気共鳴スペクトルを、内部標準として対応する溶媒信号を使用して、Bruker400または500MHz分光計で記録した。化学シフトは、テトラメチルシラン（0.00ppm）に対する百万分率（ppm）で報告する。結合定数（J）の値は、ヘルツ（Hz）で与え；1H NMRの説明についてはこのセクションでは以下の略語を使用する：一重線（s）、二重線（d）、三重線（t）、四重線（q）、多重線（m）、二重線の二重線（dd）、二重線の二重線の二重線（ddd）およびブロードシグナル（bs）。複合的な多重線の化学シフトは、その発生範囲として与える。
【００７１】
高分解能質量スペクトル（HR-MS）を、ETH ZuerichのLaboratorium fuer Organische ChemieのMSサービスにより、Varian IonSpec Ultima MALDI-FT-ICRまたはBruker Daltonics Ultra-Flex II MALDI-TOFに記録した。トランス-2-[3-（4-tert-ブチルフェニル）-2-メチル-2-プロペニリデン]マロノニトリル（DCTB）および3-ヒドロキシピリジン-2-カルボン酸（3-HPA）が、MALDI質量分析用のマトリックスとして作用した。ESI質量スペクトルを、Bruker FTMS 4.7 T BioAPEXII（ESI）で記録した。
【００７２】
分取HPLCを、D7000インターフェイス、L-7400 UV検出器およびL-7150ポンプを装備したMerck-Hitachiシステムを使用して、Ultimate XB-C18カラム(150×21.2mm、5μm)(Ultisil、Welch Materials)を15mL/分(280nm)の流量で用いて行った。
【００７３】
分析HPLCを、D-7000インターフェイス、L-7400 UV検出器およびL-7100ポンプを備えたMerck-Hitachiシステムを使用して、サンファイアC18カラム（4.6×150mm、5μm）を用いて行った。特に記載がない場合、反応制御を、10mM NH4HCO3溶液（溶媒A）およびMeCN（溶媒B）を用いて、次のグラジエント：0〜30分：100〜60％A、30〜35分：60％A、35〜36分：60〜100％A、36〜40分：100％Aにて、流量1mL／分および280nmで、分析HPLCにより行った。
【００７４】
半分取HPLCを、D-7000インタフェース、L-7400 UV検出器およびL-7100ポンプを備えるMerck-Hitachiシステムを使用して、溶媒系として10mM NH4HCO3緩衝液（溶媒A)およびMeCN(溶媒B)を用いてサンファイヤC18カラム(10×150mm、5μm)を使用して、流量4mL／分および280nmで行った。
【００７５】
分析放射性HPLCを、100μL-lopおよびGabiStar radiodetector(Raytest)を備えるAgilent 1100シリーズHPLCシステムにおいて行った。分析Phenomenex Gemini C18カラム（4.6×250mm、5μm、110Å、プレカラムなし）を流量1mL／分および280nmで使用した。分析HPLCを、溶媒系として10mM NH4HCO3（溶媒A）およびMeCN（溶媒B）を用いて、次のグラジエント：0〜20分：95〜60％A、20〜25分：60％A、25〜26分：60〜95％A、26〜30分：95％Aで行った。
【００７６】
反応制御を、放射性高性能液体クロマトグラフィー（放射性UPLC、Waters）を利用して、Acquity UPLC BEH C18カラム（2.1×50mm、1.7μM、Waters）および付属の一致検出器(FlowStar LB513、Berthold)を使用して、溶媒系として10mM NH4HCO3溶液(溶媒A)およびMeCN(溶媒B)を用いて、以下のグラジエント：0〜0.3分：90％A、0.3〜3.0分：90％〜50％A、3.0〜3.1分：50〜20％A、3.1〜3.5分：20％A、3.5〜3.6分：20〜90％A、3.6〜4.0分：90％Aで、流量0.6mL／分および280nmで行った。
【００７７】
[放射化学：乾燥[18F]フッ化物の生成]
同位体濃縮[18O]H2O（930μL、97％、Cambridge Isotope Laboratories）で満たされた液体ターゲットを、18/9サイクロトロン(IBA、Belgium)上で18MeVプロトンビームを照射することによりキャリアを加えていない[18F]フッ化物を得た。放射能（36〜45GBq）を、ヘリウムの連続的な流れによって合成ホットセルに転送した。[18F]フッ化物水溶液を、前処理なしでSep-Pak Light Accell Plus carb QMAカートリッジ（Waters）にトラップした。溶出は、H2O（0.6mL)およびMeCN（1.4mL)の混合物中の、K2CO3（1.2mg、8.7μモル）およびクリプトフィックス(Kryptofix)（10mg、26.6μモル）またはCs2CO3（2.8mg、8.6μモル）およびクリプトフィックス（5mg、13.3μモル）の溶液を用いて行った。溶出液を密閉したWheaton反応器（5 mL）に回収し、溶媒を95℃で減圧および穏やかな窒素気流下で10分間蒸発させた。その後、MeCN（1mL）を3回加え、95℃で3分以内に蒸発乾固させた。最後に、窒素気流のない完全真空を95℃で5分間適用した。
【００７８】
[生体内分布試験]
細胞接種の2週間後に生体内分布試験を実施した。18F-葉酸放射性トレーサー（約5MBq／マウス）を外側尾静脈に100μLの体積で注射した。動物は、放射性トレーサーの投与の30分、60分および90分後に屠殺された。選択した組織および臓器を収集し、重量を測定し、γカウンターを使用して放射能を測定した。結果は、組織質量1グラムあたりの注射された放射能の割合（％IA／g）として列挙され、同時に測定された元の注射溶液の定義された体積のカウントを使用して、減衰補正値が得られた。
【００７９】
[PET/CT画像化試験]
マウスは生体内分布試験と同じ方法で準備した。マウスのPET/CTスキャンには、ベンチトップの前臨床PETスキャナー（Genisys8, Sofie Biosciences, U.S.およびPerkin Elmer, U.S.）を使用した。エネルギーウィンドウは150〜650keVに設定した。マウスには、18F-放射性トレーサーを静脈内注射した（100μL中に約5MBq）。10分間続いたスキャン中に、イソフルランと酸素の混合物を使用してマウスに麻酔をかけた。スキャンは、G8取得ソフトウェア（バージョン2.0.0.10）を使用して18F-放射性トレーサーの注入の1時間、2時間および3時間後に実行した。画像を、最大尤度期待値最大化（MLEM）により再構築した。PET/CT画像を提示するために、画像のスケールを調整して、腫瘍組織と腎臓の視覚化を最適にした。（下位スケールで約10％がカットされた）。
【実施例１】
【００８０】
[6S-および6R-N2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ／2'-クロロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸ジ-tert-ブチルエステルの合成および分離（キラルHPLCによる）]
【００８１】
【化７】
2020511477.tif 000008
【００８２】
溶媒としてメチルtert-ブチルエーテルおよびテトラヒドロフランを用いて、文献（“Reactions of Sodium Borohydride in Acidic Media. I. Reduction of Indoles and Alkylation of Aromatic Amines with Carboxylic Acids”, G.W. Gribble, P. D. Lord, J. Skotnicki, S. E. Dietz, J.T. Eaton, J. L. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, p. 7812）に記載の一般的方法と同様にして、N2-アセチル-3'-アザ-2'-クロロ-葉酸-ジ-tert-ブチルエステルおよびN2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ-葉酸-ジ-tert-ブチルエステルの還元的メチル化（スキーム1a）により、6S-および6R-N2-アセチル-3'-アザ-2'-クロロ-5-MTHF-ジ-tert-ブチルエステルと6S-および6R-N2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHF-ジ-tert-ブチルエステルとの1:1ジアステレオ異性体混合物の合成を達成した。生成物を、LC-MS、1H-NMRおよびHPLCによって特徴付けた。N2-アセチル-3'-アザ-2'-クロロ-葉酸-ジ-tert-ブチルエステルおよびN2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ-葉酸-ジ-tert-ブチルエステルの合成はWO 2013／167653により行った。両混合物の2つのジアステレオ異性体をスキーム1bに開示のように化合物にキラル分離することは、通常相（アイソクラティック、ヘキサン／イソプロパノール1：1 、図1）で運転されているReprosil 100 Chiral-NR HPLCカラムを使用して達成した。6R-N2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸-ジ-tert-ブチルエステル（6R-2）は、14.0分に最初に溶出したジアステレオ異性体を意味し、6S-N2-アセチル-3'-アザ-2'-フルオロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸-ジ-tert-ブチルエステル（6S-2）は17.5分に2番目に溶出した異性体を意味する。
【実施例２】
【００８３】
[6R-3'-アザ-2'-フルオロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸の合成]
純粋なジアステレオマー6R-2および6S-2が、キラル分離（図1）後に得られ、6R-1および6S-1の合成の出発物質として使用した。アセトン中における6R-2および6S-2の酸性脱保護により、精製後、6R-および6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHF（6R-1および6S-1）を、それぞれ81%および87%の化学的収率で得た（スキーム1c）。
【００８４】
【化８】
2020511477.tif 000009
【００８５】
6R-2（7.00mg、11.1μモル）を、アセトン（200μL）および4M HCl（500μL）に溶解し、70℃で1時間撹拌した（スキーム1b）。反応完了後、溶液を4M NaOHで中和し、生成物を半分取HPLCにより精製した。生成物画分の凍結乾燥により、6R-γ-1が白色固体として、87％の収率（4.62mg）で、95％を超える高い化学的およびジアステレオマー純度で得られた。
【実施例３】
【００８６】
[6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-メチルテトラヒドロ葉酸の合成]
6S-2（8.00mg、12.6μモル）をアセトン（200μL）および4M HCl（500μL）に溶解し、70℃で1時間撹拌した（スキーム1b）。反応完了後、溶液を4M NaOHで中和し、生成物を半分取HPLCにより精製した。生成物画分の凍結乾燥により、6S-γ-1が白色固体として、81％の収率（4.96mg）で、95％を超える高い化学的およびジアステレオマー純度で得られた。
【実施例４】
【００８７】
[円二色性（CD）による2つの参照ジアステレオ異性体（6R-1および6S-1）の絶対配置の決定]
6S-および6R-5-MTHFおよび2つの参照化合物6R-および6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHF（6R-1および6S-1）のCDスペクトルを記録した（図2Aおよび2B）。葉酸の2つの対の各々の2つの対応する6R-および6S-ジアステレオマーについては、反対のスペクトルが得られた。6S-および6R-5-MTHFのスペクトルは、これらの2つの物質の立体化学が知られているので、参照スペクトルとして役立つ。プテリンが、345nm前後に代表的吸収バンドを示し、280nmに第2のバンドを示すことが文献に報告されている。これらの2つの典型的吸収バンドは、4つの記録されたCDスペクトルの全てにおいても見られる。6S-および6R-5-MTHFの参照スペクトルを、2つの参照ジアステレオマー6R-および6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHFのスペクトルと関連付けることができた（図３）。6R-5-MTHFおよび6R-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHFの310nmにおけるピークはいずれも陰性であり、280nmにおけるピークはいずれも陽性であるので、6R-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHFは6R-異性体（図３A）であると推測することができる。これらの吸収は、立体中心を有するプテリンから生じるからである。6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHFおよび6S-5-MTHFについて同じ関連付けをすることができ（図３B)、310nmにおけるピークが陽性であり280nmにおける両方のピークが陰性である。これらの結果に基づけば、6S-3'-アザ-2'-フルオロ-5-MTHFは６位においてS-型であると結論付けることができる。
【実施例５】
【００８８】
[6S-および6R-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（6S-および6R-[18F]1）aの調製]
【００８９】
【化９】
2020511477.tif 000010
【００９０】
6S-および6R-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHFの放射性合成を、文献（Betzel et al, (2013) Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3'-Aza-2'-[18F]fluorofolic Acid: A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjug. Chem. 24, 205-214.）に既に記載されている3'-アザ-2'-[18F]フルオロ葉酸の放射性合成と同様にして行った。前駆体6R-または6S-N2-アセチル-3'-アザ-2'-クロロ-5-MTHF-ジ-tert-ブチルエステル（6R-または6S-2、2.50mg、3.85μモル）を無水DMSO（300μL）に溶解し、共沸乾燥した[18F]フッ化物-クリプテート錯体（30〜35GBq）に加えた。反応混合物を160℃で10分間加熱した。次に、溶液を5分間冷却し、H2O（5mL）を加えた。中間体6R-または6S-[18F]2をトラップするために、溶液をSep-Pak Plus tC18カートリッジ（Waters製、5mLのMeOH、続いて10mLのH2Oで予備処理）に通した。カートリッジをH2O（8mL）で濯ぐことにより、未反応の[18F]フッ化物を除去した。MeCN（2.5mL）をカートリッジを通過して他の密閉されたWheaton反応器（5mL）に通すことにより、標識された中間体6R-または6S-[18F]2を溶出した。減圧下に窒素を流して90℃で、MeCNをほぼ乾燥するまで蒸発させた。4M HCl溶液（1.25mL）を反応瓶に加え、70℃で10分間加熱することにより、保護基を切断して、6R-または6S-[18F]1を得た。反応混合物を2分間冷却し、50mg／mLのNa-(+)-L-アスコルビン酸塩（2.5mL）を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）および4M NaOH（1.0mL）を加えることにより、それぞれ、生成物を安定化、および酸性溶液を中和した。半分取放射性HPLCによって生成物を精製した。生成物画分を集め、滅菌フィルターを通して、無菌かつ発熱物質を含まないバイアルに送った。分析用放射性HPLCにおいて6R-または6S-[18F]1を品質管理した。合成の最後に、最終放射性トレーサー350〜1600MBq（d.c.収率1〜5％）が得られた。SAは46〜250GBq／μモルの範囲で、放射化学的純度は95％を超えていた。
【００９１】
溶媒系として10mM NaH2PO4／Na2HPO4（pH7.4）中の0.1％EtOHおよび50mg／mLのNa-（+）-L-アスコルビン酸塩（溶媒A）および10mM NaH2PO4／Na2HPO4（pH7.4）中の40％EtOHおよび50mg／mLのNa-（+）-L-アスコルビン酸塩（溶媒B）を使用して、グラジエントを0〜15分：100〜85％A；15〜40分：85％Aとして、流量4mL／分（280nm）で、半分取放射性HPLC精製を行った。溶媒系として50mM NaH2PO4（pH6.5）（溶媒A）および50mM NaH2PO4中30％MeCN（pH8.0）（溶媒B）を用いて、グラジエントを0〜14分：100〜45％A、14〜17分：45〜0％A、17〜25分：0％A、25〜26分：0〜100％A、26〜32分：100％Aとして、流量1mL／分（280nm）で分析用放射性HPLCを行った。
【実施例６】
【００９２】
[分配係数の決定]
6S-[18F]1および6R-[18F]1の分配係数（logD7.4）を、文献（Boss et al, (2015) Comparative Studies of Three Pairs of α- and γ-Conjugated Folic Acid Derivatives Labeled with Fluorine-18. Bioconjug. Chem. acs.bioconjchem.5b00644; Wilsonet al, (2001) An admonition when measuring the lipophilicity of radiotracers using counting techniques. Appl. Radiat. Isot. 54, 203-208.）で報告されている振とうフラスコ法を用いて決めた（表1）。簡単に述べると、放射性トレーサーを、リン酸緩衝液（500μL、pH7.4）とn-オクタノール（500μL）との混合物に室温で加えた。サンプルをオーバーヘッドシェーカーで15分間振盪し、5000rpmで3分間遠心分離して2つの相を分離した。両相の一部（50μL）をエッペンドルフ管に加え、次に、γ-カウンター（Wizard, PerkinElmer）において分析した。分配係数は、n-オクタノールとリン酸緩衝液相の放射能濃度（cpm／mL）の間の比として表される。値は、2つの独立した実験からの6要素の平均±標準偏差を表す。
【００９３】
【表１】
2020511477.tif 000011
【実施例７】
【００９４】
[試験管内での特徴付け]
非放射性参照化合物6R-1および6S-1の結合親和性を、[3H]葉酸による置換アッセイでKB細胞を使用して決定した。結果（表2）は、2つの参照ジアステレオ異性体6R-1および6S-1がFR-αへの同様の高い親和性を持ち、6S-および6R-5-MTHFの値と同様であることを示した。同じ実験条件下での葉酸についてのIC50値が0.6±0.1nMであることが見出されたのに対し、3'-アザ-2'-[18F]フルオロ葉酸は、1.4±0.5nMのIC50値を示した。酸化型と比較して、対応する還元型アザ-葉酸誘導体6R-1および6S-1は、約17倍低いFR-αへの親和性を示す。
【００９５】
【表２】
2020511477.tif 000012
【実施例８】
【００９６】
[細胞の取込量と内在化]
FR特異的細胞取込量および内在化を試験するために、FR-陽性KB細胞を用いて6R-[18F]1および6S-[18F]1の細胞取込および内在化を行った。細胞取込が、両方のジアステレオ異性体について時間と共に絶えず増加し、37℃でのインキュベーションの3時間後に加えた合計放射能の約60%の取込量（タンパク質0.3mg当たりの計算）となった（図２２）。内在化活性は6R-[18F]1については約8%であり、6S-[18F]1については約2倍高い（16%）ことが分かった。6R-[18F]1および6S-[18F]1は高い生体内安定性を示した。放射性トレーサーの注射の30分後に採取したサンプルにおいては、無傷の親化合物のみが見られた。6R-および6S-[18F]1は、酸化型葉酸トレーサーよりもかなり安定であり、肝臓中の放射性代謝産物が検出された。過剰の葉酸と共に放射性トレーサーを一緒にインキュベーションすることによりFR-αをブロッキングすると、放射性葉酸の取込が0.2%未満まで阻害された。
【実施例９】
【００９７】
[代謝産物の試験]
葉酸放射性トレーサー6S/6R-[18F]5（比1:1、53.7〜52.3MBq;約0.62〜1.15ナノモル）を、トレーサーの生体内安定性を決めるために、マウスに静脈内注射した。トレーサーの注射の60分後にマウスを屠殺し、血液、尿および肝臓を採取し分析した。10mg／mLの2-メルカプトエタノールと0.025％（v/v）の水酸化アンモニウムを含む氷冷メタノールを血漿、均質化肝臓および尿に加えて、タンパク質を沈殿させた。遠心分離後、血漿、肝臓および尿サンプルの上清を放射性UPLCで分析した（図４）。サンプルの分析により、放射性トレーサー注射の60分後に、無傷の親トレーサー6S/6R-[18F]1しか見つからなかった。
【実施例１０】
【００９８】
[18F-ベースの還元型葉酸、6R-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（6R-[18F]1）および6S-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（6S-[18F]1）の生体内試験]
6R-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（6R-[18F]1）または6S-3'-アザ-2'-[18F]フルオロ-5-MTHF（6S-[18F]1）の注射後に15匹のKB腫瘍を有するマウスを用いて生体内分布試験を行った。3つの時点（放射性トレーサーの注射の30分、60分および90分後）の値を表３および表４に示す。ブロッキング実験については、マウスにトレーサーの10分前に葉酸100μgを注射し、注射の60分後に屠殺した。
【００９９】
【表３】
2020511477.tif 000013
【０１００】
【表４】
2020511477.tif 000014
【０１０１】
生体内分布の研究により、6R-および6S-の両方のジアステレオ異性体の高い腫瘍取込量が明らかになった。既に注射の30分後に、6R-[18F]1については13.3±1.80％IA/g、6S-[18F]1については11.13±0.90％IA/gの高い腫瘍取込量が観察された（図５）。腫瘍の取込量は経時的にさらに増加し、注射の90分後では、6R-異性体では23.9±2.74％IA/g、6S-異性体では19.2±4.16％IA/gとなった。この値は、酸化型トレーサー3'-アザ-2'-[18F]フルオロ葉酸から得られる放射能蓄積の量（12.59±1.77％IA/g）の約2倍である。腫瘍の取込量は、葉酸の事前注入によって効率的にブロックされた。腫瘍結合の特異性は、R-および6S-異性体でそれぞれ85％および89％であった。注射の30分後、6S-トレーサー（8.10±1.16％IA/g）と比較して著しく高い放射能量が6R-トレーサーについて肝臓においてみられた（14.3±1.36％IA/g）。注射の90分後では、肝臓における放射能取込量は6R-異性体については僅かに増加した（16.8±3.58％IA/g）が、S-異性体については放射能水準は低下した（5.86±1.11％IA/g）。脾臓取込量は、6R-異性体については注射の30分後に既に著しく増加しており、注射の90分後では、6S-異性体の（1.82±0.49％IA/g）と比較して7倍高い取込量が6R-異性体について観察された（13.0±4.14％IA/g）。これに対して、腎臓取込量は、注射の30分後に、6R-[18F]1と比較して6S-[18F]1ではかなり高く（6R-型：34.5±2.45％IA/g、6S-型：42.5±2.73％IA/g）、両方のジアステレオ異性体について経時的にほとんど一定のままであった（注射の90分後：6R-型：29.8±7.46％IA/g、6S-型：42.3±7.05％IA/g）。しかしながら、どちらの値も、3'-アザ-2'-[18F]フルオロ葉酸（57.3±8.40％IA/g）と比べるとかなり低かった。2つのジアステレオ異性体について唾液腺取込量における有意な差も観察され、注射の90分後の唾液腺では6S-異性体の3倍多い量が見られた（6R-型：7.31±1.17％IA/g、6S-型：21.4±4.59％IA/g）。
【０１０２】
腫瘍対腎臓比は、6S-[18F]1では著しく低く（注射の30分後：0.26±0.01％IA/g）、注射の90分後では1.7倍に増加して0.45±0.07％IA/gの値になった（図６）。これに対して、6R-[18F]1の腫瘍対腎臓比は、注射の30分後に既に0.39±0.05％IA/gであり、注射の90分後には2.1倍に増加して0.83±0.17％IA/gとなった。したがって、6R-[18F]1の腫瘍対腎臓比は、6S-[18F]1および3'-アザ-2'-[18F]フルオロ葉酸と比較して、それぞれ、約2倍および4倍高い。6S-[18F]1の肝臓取込量が少ないので、全ての検査時点において、6R-異性体と比較して6S-異性体では腫瘍対肝臓比が高い。したがって、肝臓においては注射の90分後に、6S-異性体と比較して6R-[18F]1の3倍多い蓄積（6R-型：16.8±3.58％IA/g、6S-型：5.86±1.11％IA/g）が観察された。肝臓におけるS-異性体の取込量が少ないことは、肝臓の近くに位置するFR陽性腫瘍の輪郭を描くことができるため、画像化の観点から有利である。腫瘍対血液比は両方の異性体について経時的に絶えず増加し、6S-異性体の比率は6R-異性体と比較して著しく高かった。
【０１０３】
最も関連のある臓器および組織の時間依存性組織分布を図7および8に示す。
異なる臓器および組織における2つの18F-葉酸トレーサーの蓄積された活性を図9に示す。
各トレーサーの注射の30分、60分および90分後における腫瘍対バックグラウンドの比を、図１０〜１２に示す。
【実施例１１】
【０１０４】
[PET/CT画像化試験]
実験計画を表５に示す。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
放射性トレーサーの注射の1時間、2時間および3時間後にスキャンした各マウスのPET/CT画像（最大強度投影（MIP））を図１３〜１８に示す。
【０１０７】
既に注射の1時間後に両方のトレーサーについてKB腫瘍異種移植片の高い取込量が観察され、注射の3時間後には、両方の化合物について高い強度で腫瘍が非常によく可視化されていた。肝臓における放射能の蓄積は主に6R-異性体で観察されたが、注射の3時間後には、肝臓への取込はほとんど見えなかった。FR陽性の腎臓は、6R-[18F]1では注射の1時間後にはっきりと視覚化されたが、注射の3時間後にはほとんど見えなかった。これに対して、試験したすべての時点で、6S-[18F]1について高い腎臓蓄積が観察された。さらに、唾液腺での高い放射能取込量が明らかであった。放射性トレーサーの投与の10分前に葉酸を注入することによりブロッキング試験を行い、すべてのFR陽性組織で6R-[18F]1および6S-[18F]1の取込量が著しく減少した（KB腫瘍異種移植片、腎臓、唾液腺および脈絡叢）（図１５および図１７）。
【０１０８】
生体内分布とPET画像化の結果に基づくと、6S-異性体は好ましくは腎経路を介して排泄されるのに対し、6R-異性体は主に肝胆道を介して排泄されると結論付けることができる。
【実施例１２】
【０１０９】
[細胞の取込および内在化の試験を、RT16およびD4細胞と呼ばれるFR-αおよびFR-β形質移入ＣＨＯ細胞で実施した]
FR-αおよびFR-βをそれぞれ発現するD4およびRT16細胞における酸化型（18F-アザ-Fol）および還元型18F-葉酸（18F-5-Me-アザ-THFの6S-異性体および6R-異性体）の取込および内在化を試験した。両方の細胞株が、Larry Matherly Wayne State University, Detroit, U.S.; Golani et al., J Med Chem, 2016, 59, 7856から親切に提供された。
【０１１０】
FR-αを発現するRT16腫瘍細胞を使用すると、3つの18F-葉酸トレーサー（酸化型および還元型）のすべてが同様の取込量を示し、1時間のインキュベーション後に43〜50％、3時間のインキュベーション後に56〜66％の範囲であった。放射性トレーサーの内在化画分は、1時間後に8〜10％に達し、3時間のインキュベーション後、最大9〜12％にわずかに増加した。
【０１１１】
FR-βを発現するD4細胞を使用する場合、18F-アザ-Folおよび還元型放射性トレーサーの6S-異性体の取込量は、1時間のインキュベーション後に約70％、3時間のインキュベーション後に80％に達した。1時間のインキュベーション後、18F-アザ-Folおよび還元型の6S-異性体の内在化画分は、それぞれ20％および12％であった。インキュベーション時間が3時間に延長されると、これらの数値はわずかに増加した。しかし、このD4細胞を使用することにより、還元型葉酸放射性トレーサー（6R-異性体）の3％しか取り込まれず、約1％が内在化したことが明らかになった。さらに2時間インキュベーションした後、変化は観察されなかった。
【０１１２】
RT16（FR-α）細胞を使用した場合、およびD4細胞（FR-β）細胞を使用した場合に、18F-アザ-Folおよび放射性トレーサーの還元型（6S-異性体）の有意な取込量が観察された（図２３）。還元型葉酸の6R-異性体はRT16細胞へのより高い取込量を示し、D4細胞への取込量が非常に低いのにFR-α選択性を示した（図２４および図２５）。これらの結果は、6R-異性体（6S-5Me-THFと称される還元型葉酸の自然のバージョンに相当する）が、FR-αに選択的に結合されるという仮説と一致していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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