(57)【要約】  本発明は、化学療法薬ゲムシタビン（ＧＥＭ）と所定の誘導体、タウロコール酸（ＴＣＡ）製剤、及びヒスチジン−リジンポリマー（ＨＫＰ）コンジュゲートを含む、ＲＮＡｉがん治療の増強のための薬学的組成物を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウロコール酸（ＴＣＡ）分子と静電気引力状態にあるゲムシタビン（ＧＥＭ）分子を含む薬学的組成物。
【請求項２】
ヒスチジン−リジンポリマー（ＨＫＰ）に化学的に結合したゲムシタビン（ＧＥＭ）分子を含む薬学的組成物。
【請求項３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーを更に含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＲＮＡｉトリガーが、哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉ効果を活性化するための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）オリゴ、又はアンタゴミルオリゴを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ｍＴＯＲ遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性を有し、ｍＴＯＲ遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ｍＴＯＲ遺伝子ｍＲＮＡ：ｍＴＯＲ−ｓｉＲＮＡ：センス，５’−ｒ（ＣＡＣＵＡＣＡＡＡＧＡＡＣＵＧＧＡＧＵＵＣＧＡ）−３’、アンチセンス，５’−ｒ（ＵＣＵＧＧＡＡＣＵＣＣＡＧＵＵＣＵＵＧＵＡＧＵＧＵＧ）−３’と特定の配列相同性を有し、ｍＴＯＲ遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ｓｉＲＮＡオリゴがＴＧＦ−β１遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性を有し、ＴＧＦ−β１遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ＴＧＦ−β１遺伝子ｍＲＮＡ，ＴＧＦ−β１−ｓｉＲＮＡ：センス，５’−ｒ（ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣＵ）−３’、アンチセンス，５’−ｒ（ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ）−３’と特定の配列相同性を有し、ＴＧＦ−β１遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡオリゴがＣＯＸ−２遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性を有し、ＣＯＸ−２遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ＣＯＸ−２遺伝子ｍＲＮＡ，ＣＯＸ−２−ｓｉＲＮＡ：センス，５’−ｒ（ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ）−３’、アンチセンス，５’−ｒ（ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ）−３’と特定の配列相同性を有し、ＣＯＸ−２遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
第一のものとは異なる第二のＲＮＡｉトリガーを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
ｍｉＲＮＡオリゴが、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、又はｍｉＲ−１５５を含むか、又はそれらと相同性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
アンタゴミルが、アンタゴミル−１３２、アンタゴミル−１５０、又はアンタゴミル−１５５を含むか、又はそれらと相同性を有する、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項１５】
タウロコール酸が、タウリンと共にデオキシコール酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
ゲムシタビン分子がゲムシタビン遊離塩基を含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
ＧＥＭとＴＣＡが約０．０：０．１〜１．０：２．０のモル比にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ＧＥＭとＨＫＰが、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学によりＧＥＭ−ＨＫＰに化学的に結合されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
ＧＥＭ−ＴＣＡが、それ自体でがん治療のための化学療法薬として投与されうるか、又はがん治療のための組合せ治療薬としてＲＮＡｉ又はＤＮＡオリゴをパッケージ化しうる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＧＥＭ−ＨＫＰが、それ自体でがん治療のための化学療法薬として投与されうるか、又はがん治療のための組合せ治療薬としてＲＮＡ又はＤＮＡオリゴをパッケージ化しうる、請求項２に記載の組成物。
【請求項２１】
ｓｉＲＮＡオリゴが表１の配列を含む、請求項４、５、１９、又は２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ｓｉＲＮＡオリゴが表２の配列を含む、請求項４、５、１９、又は２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
ゲムシタビン分子とタウロコール酸分子を含む薬学的組成物。
【請求項２５】
タウロコール酸が、タウリンと共にデオキシコール酸を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ゲムシタビンがゲムシタビン遊離塩基を含む、請求項２４又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
ゲムシタビン分子とヒスチジン−リジンポリマーを含む薬学的組成物。
【請求項２８】
ゲムシタビンがゲムシタビン遊離塩基を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ＲＮＡ干渉トリガーを更に含む、請求項２４から２８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
第一のものとは異なる第二のＲＮＡｉトリガーを更に含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＲＮＡ干渉トリガーが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）オリゴ、又はアンタゴミルオリゴからなる群から選択される、請求項２９又は３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ｍＴＯＲ遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性を有し、ｍＴＯＲ遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ｍＴＯＲ遺伝子ｍＲＮＡ：ｍＴＯＲ−ｓｉＲＮＡ：センス，５’−ｒ（ＣＡＣＵＡＣＡＡＡＧＡＡＣＵＧＧＡＧＵＵＣＣＡＧＡ）−３’、アンチセンス，５’−ｒ（ＵＣＵＧＧＡＡＣＵＣＣＡＧＵＵＣＵＵＧＵＡＧＵＧＵＧ）−３’と特定の配列相同性を有し、ｍＴＯＲ遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
ｓｉＲＮＡオリゴがＴＧＦ−β１遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性を有し、ＴＧＦ−β１遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ＴＧＦ−β１遺伝子ｍＲＮＡ，ＴＧＦ−β１−ｓｉＲＮＡ：センス，５’−ｒ（ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣＵ）−３’、アンチセンス，５’−ｒ（ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ）−３’と特定の配列相同性を有し、ＴＧＦ−β１遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
ｓｉＲＮＡオリゴがＣＯＸ−２遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性を有し、ＣＯＸ−２遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３７】
ｓｉＲＮＡオリゴが、ＣＯＸ−２遺伝子ｍＲＮＡ，ＣＯＸ−２−ｓｉＲＮＡ：センス，５’−ｒ（ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ）−３’、アンチセンス，５’−ｒ（ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ）−３’と特定の配列相同性を有し、ＣＯＸ−２遺伝子発現に対する阻害活性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３８】
ｍｉＲＮＡオリゴが、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、又はｍｉＲ−１５５を含むか、又はそれらと相同性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３９】
アンタゴミルが、アンタゴミル−１３２、アンタゴミル−１５０、又はアンタゴミル−１５５を含むか、又はそれらと相同性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４０】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項２４から３９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１から４０の何れか一項に記載の組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物のがんを治療するか、又は哺乳動物の新生物もしくは腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４２】
請求項１から４０の何れか一項に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の新生物もしくは腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項４３】
請求項１から４０の何れか一項に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、がんを有する哺乳動物のＧＥＭに対する化学療法感受性を増強する方法。
【請求項４４】
がんが膵臓がんである、請求項４１から４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物が実験動物である、請求項４１から４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物がヒトである、請求項４１から４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
組成物が、肺がん異種移植マウスモデル（Ａ５４９細胞）を用いてＧｅｍＺａｒよりも腫瘍増殖を阻害する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項４８】
組成物が、膵臓がん異種移植マウスモデル（ＰＡＮＣ−１細胞）を用いてＧｅｍＺａｒよりも腫瘍増殖を阻害する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項４９】
ＧＥＭ−ＴＡＣとＳＴＰ３０２を含む薬学的組成物。
【請求項５０】
ＧＥＭ−ＴＡＣと組合せてヒトＰＤＬ−１遺伝子発現に対抗するｓｉＲＮＡオリゴを含む薬学的組成物。
【請求項５１】
ＧＥＭ−ＴＡＣと組合せてヒトＰＤＬ−２遺伝子発現に対抗するｓｉＲＮＡオリゴを含む薬学的組成物。
【請求項５２】
請求項４７から５１の何れか一項に記載の組成物の治療的有効量をヒトに投与する工程を含む、ヒトのがんを治療するか、又はヒトの新生物もしくは腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項５３】
がんが膵臓がんである、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連特許出願への相互参照］
この出願は、その全体が出典明示によりここに援用される２０１７年３月１９日出願の米国仮特許出願第６２／４７３４４１号の利益と優先権を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、ゲムシタビン系化合物、組成物、及び製剤、並びに単独で又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物と併用してのがん治療薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
［膵臓がん治療には緊急の満たされていないニーズがある］
膵臓がんは、侵襲性浸潤、早期転移、及び既存の化学療法薬と放射線療法に対するほぼ完全な耐性のために、予後が最も悪い悪性腫瘍の一つである（１）。過去数年間、ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン）の使用により、膵臓がん患者において臨床症状が改善され、全生存期間が僅かに長くなることが示されてきた。従って、ゲムシタビンは膵臓がんに対する第一選択治療選択肢になった（２）。しかし、ゲムシタビンに対する化学療法抵抗性は増加しており、膵臓がんに対する臨床治療の失敗の主な原因となっている。ゲムシタビンに対する耐性は、主にアポトーシスに対する耐性の増加に起因していると提案されている（３）。従って、アポトーシスを誘導し、ゲムシタビンに対する化学療法感受性を増強するための新しい治療戦略が、この疾患において緊急に必要とされている。
【０００４】
［ｓｉＲＮＡがん治療薬］
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子阻害の内因性過程であり、事実上あらゆる遺伝子の発現を阻害する強力な手段を提供する。ＲＮＡｉ技術は、細胞培養及び動物疾患モデルにおける機能遺伝学のための広く受け入れられたツールになっており、従って、治療応用に大きな期待がかけられている。膵臓がんの増殖と発生における経路に関与するＴＧＦ−β１、ＣＯＸ−２、ｍＴＯＲ、ＥＧＦＲ、及びＲＡＦ１の重要な役割の理解により、我々は代替治療アプローチとしてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を検討するよう促された。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）薬の一つの利点は、タンパク質レベルの低下が阻害を増幅するはずであるため、その遺伝子標的に対する強力な阻害効果である。別の利点は、経路の様々なメンバーの阻害を評価し、よって最も効率的な標的をより効率的に識別する能力である。
【０００５】
［ｍｉＲＮＡがん治療薬］
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、その主な機能がコーディングｍＲＮＡ転写産物の翻訳を調節することである、１８−２４ヌクレオチドの非コーディングＲＮＡのクラスである。ｍｉＲＮＡによる細胞トランスクリプトームの生理学的調節は、発生中及び成熟組織恒常性において重要な役割を果たしている。ｍｉＲＮＡの異常な発現はヒトがんにおいて一般的であり、ｍｉＲＮＡは正常細胞に比べて腫瘍細胞で過剰発現し又は過少発現する可能性がある（４，５）。がんにおける異常なｍｉＲＮＡ発現の基礎をなすものは、ゲノム変化（増幅と欠失）、エピジェネティックな機構、又は転写因子調節変化を含み、多様でありうる（５，６）。多くの場合、異常なｍｉＲＮＡのコーディングｍＲＮＡ標的が解明されており、そのタンパク質産物ががん細胞における重要な細胞増殖、細胞死、及び転移機構を調節する転写産物が含まれている（４−９）。
【０００６】
一つのｍｉＲＮＡ分子であるｍｉＲ−１３２は、Ｒａｓの分子ブレーキであるｐ１２０ ＲａｓＧＡＰをダウンレギュレートすることにより、病的血管新生を促進すると特徴付けられている。ｍｉＲ−１３２を合成アンタゴミルオリゴでターゲティングすると、複数の腫瘍モデルにおいて血管新生と腫瘍量が減少した。最近の研究では、ｍｉＲ−１３２が膵臓がんで増加し、網膜芽細胞腫の腫瘍抑制因子を標的にしたことが示された（３）。別のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１５５は、生存率の低下に関連している膵腫瘍での発現上昇を示した（４）。ｍｉＲ−１５５は初期の膵腫瘍のバイオマーカーであると思われ、膵臓がんのバイオマーカーとして更に評価する必要がある（５）。ｍｉＲ−１５５の役割は、ｐ５３を介した腫瘍抑制の後退に関連しており（６）、他の腫瘍タイプでの腫瘍形成活性を伴うことも示されている（７，８）。最近、我々は、改変ＲＮＡオリゴであるアンタゴミル−１３２とアンタゴミル−１５５をヒスチジン−リジン共重合体（ＨＫＰ）と共にナノ粒子中にパッケージ化し、ヘルペス間質性角膜炎のウイルス誘発マウスモデルを用いてこの二重標的阻害剤を試験した（１０）。この二重標的ｍｉＲ−１３２及びｍｉＲ−１５５アプローチの著明な抗血管新生効果は、全ての処置マウスで観察された。
【０００７】
オリゴヌクレオチド治療薬の開発は、アンタゴミルオリゴなどの医薬品有効成分の効率的な送達に依存している。我々は、ヒトＢｘＰＣ−３又はＰａｎｃ−１膵腫瘍細胞を用いたマウス異種移植腫瘍モデルを使用して、二重標的アンタゴミル−１３２／１５５の全身送達についてＨＫＰを試験する（１１−１４）。
【０００８】
［化学療法薬及びＲＮＡｉ送達システム］
多くの化学療法薬の適用が、膵臓がん及び他のがんタイプの治療に対してなされてきた。化学療法耐性及び化学療法薬毒性の懸念により、その治療可能性が制限されてきた。この発明は、ＲＮＡｉ治療薬と、既に臨床適用されている化学療法薬であるゲムシタビンの強みを、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの送達のためにゲムシタビン誘導体を使用して組合せている。
【０００９】
ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン）は、抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類似体である。ゲムシタビンは細胞期特異性を示し、主にＤＮＡ合成（Ｓ期）を受ける細胞を殺し、Ｇ１／Ｓ期境界を通る細胞の進行を遮断する。ゲムシタビンは、ヌクレオシドキナーゼによって細胞内で代謝され、活性な二リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）及び三リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）ヌクレオシドになる。ゲムシタビンの細胞傷害性効果は、二リン酸ヌクレオシドと三リン酸ヌクレオシドの二つの作用の組合せに起因し、これがＤＮＡ合成の阻害につながる。第一に、ゲムシタビン二リン酸が、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害し、これが、ＤＮＡ合成のためにデオキシヌクレオシド三リン酸を生成する反応を触媒する役割を果たす。二リン酸ヌクレオシドによるこの酵素の阻害により、ｄＣＴＰを含むデオキシヌクレオチドの濃度が低下する。第二に、ゲムシタビン三リン酸が、ＤＮＡへの取り込みについてｄＣＴＰと競合する。（二リン酸の作用による）ｄＣＴＰの細胞内濃度の減少が、ゲムシタビン三リン酸のＤＮＡへの取り込みを向上させる（自己増強）。ゲムシタビンヌクレオチドがＤＮＡに取り込まれた後、たった一つの追加のヌクレオチドが、成長しているＤＮＡ鎖に付加される。この付加後、更なるＤＮＡ合成が阻害される。ＤＮＡポリメラーゼεは、ゲムシタビンヌクレオチドを除去できず、成長しているＤＮＡ鎖を修復できない（マスクされた鎖終結）。ＣＥＭ Ｔリンパ芽球様細胞では、ゲムシタビンはプログラム細胞死の特徴の一つであるヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を誘導する。
【００１０】
ゲムシタビンは、出典明示によりその全体がここに援用される米国特許第４８０８６１４号において、抗ウイルス化合物として最初に記載された。ゲムシタビンの抗腫瘍特性は、出典明示によりその全体がここに援用される米国特許第５４６４８２６号において後に記載された。出典明示によりその全体がここに援用される米国特許第４８０８６１４号及び同第５４６４８２６号の製剤教示には、その請求項に記載の化合物を非経口投与することができること、またその後に水溶液で再構成される乾燥粉末が好ましいことが、記載されている。現在、ゲムシタビンは、注射又は注入による投与の前に投与管理者によってその後に再構成される、凍結乾燥された非経口薬として市販されている。
ここで使用される「ゲムシタビン」という用語は、ゲムシタビン遊離塩基と所定のゲムシタビン誘導体を意味する。これら誘導体は、僅かな修飾に関連する化学構造であり、同じプロドラッグ特性を持つ。
【００１１】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、１９９６年にＧＥＭＺＡＲ（ジェムザール）（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）という商品名で注射用製剤として米国で販売されるゲムシタビン塩酸塩を最初に承認した。その臨床製剤は、静脈内使用のためのみの滅菌形態で提供される。ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）のバイアルには、２００ｍｇ又は１ｇのゲムシタビンＨＣｌ（遊離塩基として表される）がマンニトール（それぞれ２００ｍｇ又は１ｇ）と酢酸ナトリウム（それぞれ１２．５ｍｇ又は６２．５ｍｇ）と共に滅菌凍結乾燥粉末として処方されて含まれている。ｐＨ調整のために、塩酸及び／又は水酸化ナトリウムが添加されている場合がある。
【００１２】
ゲムシタビンは、インビトロでシスプラチンとの用量依存的な相乗作用を示す。ゲムシタビン三リン酸蓄積又はＤＮＡ二本鎖切断に対するシスプラチンの効果は観察されなかった。インビボでは、ゲムシタビンは、ＬＸ−１及びＣＡＬＵ−６ヒト肺異種移植片に対してシスプラチンと組合せて活性を示したが、ＮＣＩ−Ｈ４６０又はＮＣＩ−Ｈ５２０異種移植片で見られたのは最小の活性であった。ゲムシタビンは、ルイス肺マウス異種移植片においてシスプラチンと相乗的であった。シスプラチンの４時間前にゲムシタビンに曝露する連続曝露が最大の相互作用をもたらした。
【００１３】
ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）は、局所進行性（ステージＩＩＩＡ又はＩＩＩＢ）又は転移性（ステージＩＶ）ＮＳＣＬＣの患者の第一選択治療に対してシスプラチンと組合せて適用される。ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）は、患者の局所進行性（切除不能なステージＩＩ又はステージＩＩＩ）又は転移性膵臓がん（ステージＩＶ）の治療の第一選択治療としても利用できる。しかし、ゲムシタビンの毒性が、患者に投与できる薬物の投薬量を制限する。ゲムシタビンＨＣＬはまた患者における半減期が非常に短い（短期注入の半減期は３２〜９４分であった）。半減期と分布容積は、年齢、性別、注入期間に依存する。更に、ゲムシタビンに曝露された細胞における多剤耐性の発生が、その有効性を制限する場合がある。従って、ゲムシタビンの半減期を十分に延長し、例えば、治療細胞の多剤耐性を最小にし、その毒性を制限することにより、その治療効果を最大にするゲムシタビンの製剤が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗がん化学療法薬をＲＮＡｉ治療薬送達ビヒクルとして使用するという概念の概略図。ゲムシタビン（ＧＥＭ）がヒスチジン−リジンポリマー（ＨＫＰ）と化学的に結合されて新化学物質ＧＥＭ−ＨＫＰを形成する。このＧＥＭ−ＨＫＰは、ナノ粒子製剤で腫瘍標的遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを運ぶことができる。ゲムシタビン及びがん遺伝子抑制性ｓｉＲＮＡを介したこのしかるべき抗がん活性が、新規のがん治療アプローチとなりうる。
【図２】２５ｍｅｒと２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖間のサイレンシング効力の比較。最も強力な２５ｍｅｒと２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡを、６組の各セットから最初に選択した。比較は、Ｌｉｐｏ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いたインビトロトランスフェクションとそれに続くＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、ヒトＶＥＧＦタンパク質を発現する２つの腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１（結腸がん）及びＭＢＡ−ＭＤ−４３５（乳がん））で実施した。０．３μｇ又は２．０μｇ用量の何れかで、特に２．０μｇで、２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡが２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡよりも強い阻害活性を示した。
【図３】ｍＴＯＲを標的とする強力なｓｉＲＮＡの選択。（Ａ）下方パネルは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びマウスＣＴ２６細胞中にトランスフェクトした８つの２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ二重鎖の選択を対照ｓｉＲＮＡと共に示している。２４時間後、ｍＲＮＡを収集し、標準対照遺伝子標的Ｒｉｇｓ１５を用いるＱ−ＲＴ−ＰＣＲに供した。パネルは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びマウスＣＴ２６細胞のトランスフェクション後にＱ−ＲＴ−ＰＣＲを使用した強力なｍＴＯＲ−ｓｉＲＮＡの選択を証明している。
【図４】マウスの眼におけるアンタゴミル−１３２ナノ粒子によるｍｉＲ−１３２のノックダウン。アンタゴミル−１３２治療レジメンは、角膜においてピークｍｉＲ−１３２ノックダウンをもたらした（Ａ）（プール化ｎ＝６マウス／群）。ボンフェローニの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、有意水準を計算した。Ｐ≦０．０５（＊）。６つの角膜を収集し、ＱＰＣＲ又はＷＢによる分析のためにプール化した。（Ｂ）アンタゴミル−１３２及びスクランブル配列をＨＳＶ感染マウスに結膜下注入し、異なる群から単離した角膜からのＲａｓＧＡＰ ｍＲＮＡの定量を実施した（ｎ＝６マウス／群）。有意水準は、スチューデントｔ検定（独立）によって決定した。＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図５】強力な抗血管新生活性が、二重標的アンタゴミル−１３２／１５５で観察された。ＷＴマウスとｍｉＲ−１５５ＫＯマウスの片眼にＨＳＶ−１ ＲＥを感染させた。抗血管新生効果を、１２日目と１５日目ｐ．ｉ．に血管新生スコアを用いて測定した。二重標的アンタゴミル−１３２／１５５は、１５日目ｐ．ｉ．に３群全てで最も強力な活性を示す。有意水準は、スチューデントｔ検定（独立）によって決定した。Ｐ≦０．００１（＊＊＊）；Ｐ≦０．０１（＊＊）；Ｐ≦０．０５（＊）。エラーバーは平均±ＳＥを表す。これらの実験は２回繰り返した。
【図６】ゲムシタビンとタウロコール酸の組合せの概略図。ＧＥＭ−ＴＣＡ中に製剤化できるゲムシタビンとタウロコール酸の化学構造。この新規な製剤は二重の機能を持ち、抗がん剤とＲＮＡｉ送達ビヒクルの両方として機能する。
【図７】ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）とＧＥＭ−ＴＣＡの細胞傷害性の比較。１×１０３のＨｅＬａ細胞を１５０ｕｌのＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中の９６ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、培地に、同じ培地で希釈した０．１ｎＭ−１００ｕＭのＧＥＭＺＡＲ（登録商標）又はＧＥＭ−ＴＣＡを補充した。化学物質曝露の７２時間後、細胞傷害性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図８】ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）とＧＥＭ−ＴＣＡの細胞傷害性の比較。２×１０３のＰａｎｃ−１及びＨｅｐＧ２細胞を、１５０ｕｌのＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中の９６ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、培地に、同じ培地で希釈した０．１ｎＭ−１００ｕＭのＧＥＭＺＡＲ（登録商標）又はＧＥＭ−ＴＣＡを補充した。化学物質曝露の７２時間後、細胞傷害性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図９】ＧＥＭ−ＴＣＡに対するＰａｎｃ−１細胞の化学療法感受性に関するｍＴＯＲｓｉＲＮＡによるフォワードトランスフェクションの効果。５×１０３のＰａｎｃ−１細胞を、１００ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳの９６ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、細胞に、製造業者の推奨に従ってｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００複合体をトランスフェクトした。５〜６時間で、培地を変えた。翌日、様々な濃度のＧＥＭ−ＴＣＡをトランスフェクト細胞に適用した。化学物質曝露の７２時間後、細胞傷害性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。＊対照、非標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞とは異なる（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）
【図１０】ＧＥＭ−ＴＣＡに対するＰａｎｃ−１細胞の化学療法感受性に関するＴＧＦ−β１ｓｉＲＮＡ及びｍＴＯＲｓｉＲＮＡによるフォワードトランスフェクションの効果。翌日、培地に、同じ培地で希釈した３．９ｎＭ〜１０００ｎＭのＧＥＭ−ＴＣＡを補充した。化学物質曝露の４８時間後、細胞傷害性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。対応サンプル両側スチューデントｔ検定を使用して有意性を判定した。
【図１１】ＧＥＭ−ＴＣＡ／ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤の粒子サイズ測定。ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）／ｓｉＲＮＡ製剤と比較したｓｉＲＮＡペイロードに対する様々な比率のＧＥＭ−ＴＣＡでのナノ粒子サイズの測定。
【図１２】ＧＥＭ−ＴＣＡ／ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤の粒子ゼータ電位測定。ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）／ｓｉＲＮＡ製剤と比較したｓｉＲＮＡペイロードに対する様々な比率のＧＥＭ−ＴＣＡでのナノ粒子ゼータ電位及びサイズの測定。
【図１３】新規抗がんアプローチとしてのゲムシタビンへの結合のためのＨＫＰ（Ｈ３Ｋ４ｂ）の化学構造
【図１４】ゲムシタビンとのＨＫＰの化学結合経路。これはゲムシタビンとＨＫＰの間に共有結合を形成する一般的な概念である。窒素の孤立電子対がカルボニルに移動し、最終的にＣ＝Ｎ二重結合とヒドロキシルを形成するという特別な特性がある。実際には、アミドは酸触媒によりカルボキシルへ加水分解される。これは、ＨＫＰの「Ｃ末端」のみが酸条件でカルボキシル基に戻ることを意味する。これは、修飾のために我々が利用できるユニークなブレイクアウトになる。我々はＣ末端カルボキシル基を介してＨＫＰを修飾できる。
【図１５】ゲムシタビンとＨＫＰの結合のためのＥＤＣ−ＮＨＳ化学。ＥＤＣ−ＮＨＳ化学を使用する利点：１．ＥＤＣ−ＮＨＳ反応が、酸条件で最も効果的に起こる。２．ＨＫＰは酸条件下でカルボキシル基を生成する。３．ＥＤＣ−ＮＨＳ反応は、−ＮＨ３＋よりも−ＮＨ２を優先する。ゲムシタビンの−ＮＨ２は、ｐＫａの値が低い（約２．８）ため、酸条件でＨＫＰの干渉アミンに抵抗し、これがＨＫＰの自己結合の代わりにゲムシタビンをＨＫＰと結合させる。
【図１６】ＨＫＰ及びＧＥＭ−ＨＫＰの波長。ＨＫＰと比較すると、ゲムシタビンはより小さい分子（４０×小さい）であり、提案された反応機構に示されるように、ＨＫＰ上に加えられたゲムシタビン１分子はＨＫＰピーク位置を遅らせない。また、ゲムシタビンは、約２０５ｎｍにも吸光度を有しているが、等モルレベルならば、ＨＫＰと比較してその吸光度は無視できる。更に、より長い又は短い時点（０〜６０分）で他の強いピークは見つからなかった。ＨＰＬＣ及びＵＶの結果に基づいて、以下の結論を下すことができる：提案されたＨＫＰ−ゲムシタビン（ＧＥＭ−ＨＫＰ）化合物は正常に合成された。新規化合物は、一つのＨＫＰに結合する一つのゲムシタビンを有している。有意な副産物は観察されなかった。
【図１７】異なるＵＶ吸光度でのサイズ排除によるＨＫＰ、ゲムシタビン、ＨＫＰ／ゲムシタビン混合物、及びＧＥＭ−ＨＫＰコンジュゲートの測定。ＨＫＰ及びゲムシタビンは異なる分子量で示される：ＨＫＰ（９．６ｋＤ）及びゲムシタビン（２３６Ｄ）。サイズ排除カラムでの測定により、我々は、ＨＫＰとゲムシタビンが異なる時点で出てくることを見出した。ＨＫＰピークは約１９分に現れたが、ゲムシタビンピークは約５分に現れた。ゲムシタビンは、約１９分で全く吸光しない。しかし、ＧＥＭ−ＨＫＰを測定すると、この単一化合物は２０５ｎｍと２７２ｎｍの両方で吸光度を示し、約１９分に２つのピークを一緒に示す。
【図１８】ＧＥＭ−ＨＫＰの物理化学的特性の測定。ＧＥＭ−ＨＫＰ水溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を４：１の比率で混合した場合のナノ粒子製剤の粒子サイズとゼータ電位。スクランブルｓｉＲＮＡをＧＥＭ−ＨＫＰと共に使用してナノ粒子を形成し、元のＨＫＰを同じ条件下で陽性対照として使用した。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ９０Ｐｌｕｓ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒを使用して、ナノ粒子のサイズとゼータ電位を測定した：ＧＥＭ−ＨＫＰの平均粒子サイズは７８．４ｎｍで、ゼータ電位は２５ｍＶである。ＧＥＭ−ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡと同様のゼータ電位を有するが、粒子サイズはより小さい。
【図１９】ＧＥＭ−ＨＫＰはＰａｎｃ−１細胞にｓｉＲＮＡを送達する。我々は次にレポーターとしてＡＦ４８８ ｓｉＲＮＡ（蛍光ＡＦ４８８で修飾したスクランブルｓｉＲＮＡ）を使用して、ＧＥＭ−ＨＫＰと共にナノ粒子を形成し、インビトロｓｉＲＮＡトランスフェクションに対するその能力を評価した。ＨＫＰ−ｓｉＲＮＡナノ粒子を対照として使用した。我々の新規化合物ＧＥＭ−ＨＫＰは、ＨＫＰと同様の効率でｓｉＲＮＡを細胞中に送達する能力を持っている。Ｐａｎｃ−１細胞株をこの評価のためのモデルとして使用した。
【図２０】腫瘍細胞を死滅させるためのＧＥＭ−ＨＫＰ細胞傷害活性。非特異的なＡＦ４８８標識ｓｉＲＮＡをＰａｎｃ−１細胞に、ＨＫＰ又はＧＥＭ−ＨＫＰと共に４．５：１の担体：ｓｉＲＮＡ比でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション剤又は薬物のみを含む培地を新鮮培地と置き換えた。トランスフェクションの４８時間後と７２時間後に、細胞死滅の評価のために細胞増殖の画像を撮影した。細胞殺活性はトランスフェクション後２４時間ではあまり明確ではなかったが、ＧＥＭ−ＨＫＰ担持ｓｉＲＮＡナノ粒子は強力な細胞殺活性を示した。この結果は、ＧＥＭ−ＨＫＰがｓｉＲＮＡ送達（ＨＫＰ機能）と腫瘍細胞死滅（ゲムシタビン機能）の特性を保持できることを示唆している。従って、ＧＥＭ−ＨＫＰは治療用ｓｉＲＮＡ薬をまた送達する新規の抗腫瘍剤になりうる。
【図２１】処置の７２時間後でのＰａｎｃ−１細胞培養におけるゲムシタビン及びＧＥＭ−ＨＫＰコンジュゲートの投薬量依存性細胞傷害性。ゲムシタビン単独、ＧＥＭ−ＨＫＰコンジュゲートへのＰａｎｃ−１細胞の暴露後、各処置の細胞傷害性を、「Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存性アッセイ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。この研究では、各ポイントでのＨＫＰ濃度は、Ｇｅｍ／ＨＫＰでのその濃度に等しい。図に示されるように、ＧＥＭ−ＨＫＰの細胞傷害性はゲムシタビンの細胞傷害性に匹敵するが、ＨＫＰは細胞傷害性を示さなかった。
【図２２】Ａ５４９（肺がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＣＡは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝６。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。
【図２３】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝５。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。
【図２４】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝８。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣの治療ベネフィット間には有意な差がある。
【図２５】処置後３７日目の全腫瘍重量によるＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝８。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣの治療ベネフィット間には有意な差がある。
【図２６】腫瘍内注射によるＬｏＶｏ（ヒト結腸がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＳＴＰ３０２は、ｍｉｒ１５０／ＨＫＰ製剤を用いたｍｉＲＮＡ治療薬候補である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝６。ＧＥＭ−ＴＡＣ＋ＳＴＰ３０２の組合せは、その個々の使用よりも優れた効果をもたらした。
【図２７】腫瘍内注射により、注射後１６日目に採取したＬｏＶｏ（ヒト結腸がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＳＴＰ３０２は、ｍｉｒ１５０／ＨＫＰ製剤を用いたｍｉＲＮＡ治療薬候補である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホートグループＮ＝６。ＧＥＭ−ＴＡＣ＋ＳＴＰ３０２の組合せは、その個々の使用よりも優れた効果をもたらした。
【図２８】腫瘍内注射によるＬｏＶｏ（ヒト結腸がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝８。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣの治療ベネフィット間には有意な差がある。
【図２９】腫瘍内注射により、注射後１８日目で測定したＬｏＶｏ（ヒト結腸がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝８。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣの治療ベネフィット間には有意な差がある。
【図３０】ヒトＰＤＬ−１に対する陽性ｓｉＲＮＡ配列を同定した。ヒト子宮頸がん細胞株であるＣａｓｋｉ細胞培養を使用して、複数のｓｉＲＮＡ配列をＰＤＬ−１遺伝子発現の阻害についてスクリーニングした。陽性ｓｉＲＮＡ配列に星印を付した。
【図３１】ヒトＰＤＬ−１に対する更なる陽性ｓｉＲＮＡ配列を同定した。ヒト子宮頸がん細胞株であるＣａｓｋｉ細胞培養を使用して、複数のｓｉＲＮＡ配列をＰＤＬ−１遺伝子発現の阻害についてスクリーニングした。陽性ｓｉＲＮＡ配列に星印を付した。
【図３２】ヒトＰＤＬ−２に対する陽性ｓｉＲＮＡ配列を同定した。ヒト子宮頸がん細胞株であるＣａｓｋｉ細胞培養を使用して、ＰＤＬ−２遺伝子発現の阻害について複数のｓｉＲＮＡ配列をスクリーニングした。陽性ｓｉＲＮＡ配列に星印を付した。
【図３３】ヒトＰＤＬ−２に対する陽性ｓｉＲＮＡ配列を同定した。ヒト子宮頸がん細胞株であるＣａｓｋｉ細胞培養を使用して、ＰＤＬ−２遺伝子発現の阻害について複数のｓｉＲＮＡ配列をスクリーニングした。陽性ｓｉＲＮＡ配列に星印を付した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、がん治療のため及びＲＮＡｉがん治療薬の増強のための、化学療法薬ゲムシタビン（ＧＥＭ）と所定の誘導体、タウロコール酸（ＴＣＡ又はＴＡＣ）製剤、及びヒスチジン−リジンポリマー（ＨＫＰ）コンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。第一の実施態様は、哺乳動物、より具体的にはヒトのがんなどの様々なタイプのがんの治療のための、ＧＥＭ及びＴＣＡ製剤（ＧＥＭ−ＴＣＡ）、抗がん治療用組成物を含む。第二の実施態様は、様々なタイプのがんの治療のためのＧＥＭ及びＨＫＰコンジュゲート（ＧＥＭ−ＨＫＰ）を含む。第三の実施態様は、効率的なｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ送達又はその両方のためのＧＥＭ−ＴＣＡを含む治療用組成物を含む。第四の実施態様は、効率的なｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ送達又はその両方のためのＧＥＭ−ＨＫＰを含む治療用組成物を含む。第五の実施態様は、がん治療薬を含む、様々な治療状態のためにこれら薬学的化合物、製剤、及び組成物を使用する方法を含む。
【００１６】
ここで使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、一又は複数を指す。
【００１７】
本発明は、ゲムシタビン誘導体とＲＮＡｉトリガーを含む薬学的組成物を含む。この実施態様の一態様では、ゲムシタビン誘導体は、タウロコール酸分子と静電気引力状態にあるゲムシタビン分子を含む。この実施態様の別の態様では、ゲムシタビンは、デオキシコール酸をタウリンと共に含むタウロコール酸組成物と組み合わされる。また別の態様では、ゲムシタビンとタウロコール酸は約０．０：０．１〜１．０：２．０のモル比にある。この実施態様の別の態様では、ゲムシタビン誘導体は、ゲムシタビン分子とヒスチジン−リジンポリマーを含む化学的コンジュゲートを含む。ゲムシタビンは遊離塩基の形態でありうる。また別の態様では、組成物は、第一のものとは異なる第二のＲＮＡｉトリガーを更に含む。
【００１８】
ヒスチジン−リジンポリマーは、出典明示によりそれらの全体がここに援用される米国特許第７０７０８０７Ｂ２号、同第７１６３６９５Ｂ２号、及び同第７７７２２０１Ｂ２号に記載されている。この実施態様の一態様では、ＨＫＰは構造（Ｒ）Ｋ（Ｒ）−Ｋ（Ｒ）−（Ｒ）Ｋ（Ｘ）を含み、ここでＲ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ、Ｋ＝リジン、及びＨ＝ヒスチジンである。
【００１９】
ＲＮＡｉトリガーは、ヒト細胞又は他の哺乳動物細胞においてＲＮＡｉ効果を活性化する任意の分子である。このようなＲＮＡｉトリガーには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）オリゴ、又はアンタゴミルオリゴが含まれる。
【００２０】
ここで使用される場合、「ｓｉＲＮＡオリゴ」、「ｓｉＲＮＡ分子」又は「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、分子が細胞中に導入された後、細胞内の遺伝子の発現を妨害し、あるいはウイルス遺伝子の発現を妨害する、二重鎖オリゴヌクレオチド、すなわち短い二本鎖ポリヌクレオチドである。例えば、それは、一本鎖（ｓｓ）標的ＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列を標的にして、それに結合する。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に合成されるか又は当業者に知られている技術によって構築等される。そのような技術は、出典明示によりその全体がここに援用される米国特許第５８９８０３１号、同第６１０７０９４号、同第６５０６５５９号、同第７０５６７０４号、及び欧州特許第１２１４９４５号及び同第１２３０３７５号に記載されている。当該分野の慣例により、ｓｉＲＮＡオリゴが特定のヌクレオチド配列によって特定される場合、その配列は二重鎖分子のセンス鎖を指す。
【００２１】
分子を含む一又は複数のリボヌクレオチドは、当該分野で知られている技術により化学的に修飾されうる。その個々のヌクレオチドの一又は複数のレベルで修飾されることに加えて、オリゴヌクレオチドの骨格が修飾されうる。更なる修飾には、ｓｉＲＮＡ分子への結合のための小分子（例えば、糖分子）、アミノ酸、ペプチド、コレステロール、及び他の大きな分子の使用が含まれる。
【００２２】
一態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１７から約２７塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドである。更なる一態様では、分子は１９から２５塩基対の長さの二本鎖オリゴヌクレオチドである。別の態様では、分子は２５塩基対の長さの二本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの全ての態様において、分子は、両端に平滑末端を、又は両端にオーバーハングを持つ粘着末端（主鎖を超えて伸びる不対塩基）を、又は一端に平滑末端、他端に粘着末端を有しうる。特定の一態様では、分子は両端に平滑末端を有する。別の特定の態様では、分子は２５塩基対（２５ｍｅｒ）の長さを有し、両端に平滑末端を有する。
【００２３】
この実施態様の一態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、表１のセンス配列によって特定される分子である。
【００２４】
この実施態様の別の態様では、ｓｉＲＮＡオリゴは、ｍＴＯＲ遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性（好ましくは１００％）を有し、ｍＴＯＲ遺伝子発現に対する阻害活性を有する。そのようなｓｉＲＮＡオリゴの例は、ｍＴＯＲ−ｓｉＲＮＡ：
センス，５’−ｒ（ＣＡＣＵＡＣＡＡＡＧＡＡＣＵＧＧＡＧＵＵＣＣＡＧＡ）−３’、
アンチセンス，５’−ｒ（ＵＣＵＧＧＡＡＣＵＣＣＡＧＵＵＣＵＵＵＧＵＡＧＵＧ）−３’
である。
【００２５】
この実施態様のまた別の態様では、ｓｉＲＮＡオリゴは、ＴＧＦ−β１遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性（好ましくは１００％）を有し、ＴＧＦ−β１遺伝子発現に対する阻害活性を有する。そのようなｓｉＲＮＡオリゴの例は、ＴＧＦ−β１−ｓｉＲＮＡ：
センス，５’−ｒ（ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣＵ）−３’、
アンチセンス，５’−ｒ（ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ）−３’
である。
【００２６】
この実施態様のまた別の態様では、ｓｉＲＮＡオリゴは、ＣＯＸ−２遺伝子ｍＲＮＡと特定の配列相同性（好ましくは１００％）を有し、ＣＯＸ−２遺伝子発現に対する阻害活性を有する。そのようなｓｉＲＮＡオリゴの例は、ＣＯＸ−２−ｓｉＲＮＡ：
センス，５’−ｒ（ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ）−３’、
アンチセンス，５′−ｒ（ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ）−３’
である。
【００２７】
この実施態様の更なる態様では、ｍｉＲＮＡオリゴは、ｍｉＲ−１３２（ａｃｃｇｕｇｇｃｕｕｕｃｇａｕｕｇｕｕａｃｕ）、ｍｉＲ−１５０（ｕｃｕｃｃｃａａｃｃｃｕｕｇｕａｃｃａｇｕｇ）、又はｍｉＲ−１５５（ｕｕａａｕｇｃｕａａｕｃｇｕｇａｕａｇｇｇｇｕｕ）を含むか又はこれに対して相同性（好ましくは１００％）を有する。
【００２８】
この実施態様の更に別の態様では、アンタゴミルは、アンタゴミル−１３２（ａｃｃｇｕｇｇｃｕｕｕｃｇａｕｕｇｕｕａｃｕ）、アンタゴミル−１５０（ｕｃｕｃｃｃａａｃｃｃｕｕｇｕａｃｃａｇｕｇ）、又はアンタゴミル−１５５（ｕｕａａｕｇｃｕａａｕｃｇｕｇａｕａｇｇｇｇｕｕ）を含むか又はこれに対して相同性（好ましくは１００％）を有する。
【００２９】
この実施態様の別の態様では、組成物は薬学的に許容される担体と組み合わされる。そのような担体は、ここに含まれる教示が与えられると、当業者によって決定可能である。
【００３０】
本発明はゲムシタビン分子とタウロコール酸分子を含む薬学的組成物をまた含む。ゲムシタビンは遊離塩基の形態でありうる。この実施態様の一態様では、タウロコール酸は、タウリンと共にデオキシコール酸を含む。この実施態様の更なる態様では、組成物は、上記のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーを更に含む。この実施態様のまた更なる態様では、組成物は、第一のものとは異なる第二のＲＮＡｉトリガーを含む。この実施態様の別の態様では、組成物は薬学的に許容される担体と組み合わされる。そのような担体は、ここに含まれる教示が与えられると、当業者によって決定可能である。
【００３１】
本発明はゲムシタビン分子及びヒスチジン−リジンポリマー（ＨＫＰ）を含む薬学的組成物を更に含む。ゲムシタビンは遊離塩基の形態でありうる。この実施態様の一態様では、組成物は、上記のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーを更に含む。この実施態様の別の態様では、組成物は、第一のものとは異なる第二のＲＮＡｉトリガーを含む。この実施態様の更なる態様では、組成物は薬学的に許容される担体と組み合わされる。そのような担体は、ここに含まれる教示が与えられると、当業者によって決定可能である。
【００３２】
本発明の組成物は、ヒト及び他の哺乳動物におけるがん及び他の新生物性疾患の治療に有用である。
【００３３】
本発明は、本発明の組成物の何れかの治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物のがんを治療し又は哺乳動物の新生物又は腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本発明の一態様では、新生物又は腫瘍細胞は膵臓がん細胞である。
【００３４】
本発明はまた本発明の組成物の何れかの有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における新生物又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法をまた提供する。本発明の一態様では、新生物又は腫瘍細胞は膵臓がん細胞である。
【００３５】
本発明は、本発明の組成物の何れかの有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、がんを有する哺乳動物のＧＥＭに対する化学療法感受性を増強する方法を更に提供する。本発明の一態様では、がんは膵臓がんである。
【００３６】
哺乳動物には、ヒトと実験動物、例えば非ヒト霊長類、イヌ及びげっ歯類などが含まれる。本発明の一実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【実施例】
【００３７】
次の実施例は、本発明の所定の態様を例証するものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３８】
実施例１．化学療法薬送達ｓｉＲＮＡを用いた標的がん治療薬
多くの化学療法が、膵臓がん及び他のタイプのがんの治療に使用されている。化学療法抵抗性及び化学療法薬毒性の懸念により、その治療可能性が制限されている。この発明は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの送達のために、ＲＮＡｉ治療薬とゲムシタビン（既に臨床適用されている化学療法薬）の強みを組み合わせたものである。図１は、ゲムシタビンとポリペプチド担体ＨＫＰを、インビトロ及びインビボでの腫瘍細胞死滅とｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ送達という二成分の特性を保って、化学的に結合させることができる概略プロセスを示す。この新規化合物ＧＥＭ−ＨＫＰを水溶液中で所定の比率でｍＴＯＲ特異的ｓｉＲＮＡと混合すると、ｍＴＯＲ標的ｓｉＲＮＡ治療薬と、ゲムシタビンを介した腫瘍細胞死滅の特性を備えた自己組織化ナノ粒子が形成される（図１）。
【００３９】
実施例２．２５ｍｅｒは２１ｍｅｒより強い阻害活性を示した
最初に、我々は、標的遺伝子サイレンシングに対して２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡが２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡよりも強力であることを見出した。実験の一つにおいて、我々は、６組の二重鎖の各セットから選択された２５ｍｅｒと２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ間でサイレンシング効果を比較した。Ｌｉｐｏ２０００を用いたインビトロトランスフェクションとそれに続くＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、ヒトＶＥＧＦタンパク質をプリプレスする２つの腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１（ヒト結腸がん）とＭＢＡ−ＭＤ−４３５（ヒト乳がん））で比較を行った。図２に見られるように、０．３ｕｇ及び２．０ｕｇの両方の投薬量で、２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡよりも強い阻害活性を示した。加えて、我々は、眼の血管新生マウスモデルを通じて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、及びＶＥＧＦＲ２を標的とするカクテルｓｉＲＮＡが単一のｓｉＲＮＡ阻害剤よりも強い抗血管新生活性を示すことを実証した。更に、ｓｉＲＮＡをＨＫＰナノ粒子にパッケージ化することで、ｓｉＲＮＡの全身送達システムがもたらされた。ＭＢＡ−ＭＤ−４３５異種移植腫瘍モデルを通じて実証されたＨＫＰ−Ｒａｆ１−ｓｉＲＮＡ及びＨＫＰ−ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡの抗腫瘍活性は、ＨＫＰを使用して、膵臓がんの治療のためのＥＧＦＲ−ＲＡＦ１−ｍＴＯＲ又はＶＥＧＦＲ２−ＲＡＦ１−ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡカクテル治療効果を増強するという我々の努力を強く支持する。
【００４０】
実施例３．ｍＴＯＲ遺伝子発現を標的とする強力なｓｉＲＮＡの選択
がん治療にナノ粒子を介したｓｉＲＮＡカクテルを使用するという我々の概念実証及び実現可能性の研究において、我々は、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＲＡＦ−１及びｍＭＴＯＲ遺伝子（ヒト及びマウスの両方）を標的とする最も強力なｓｉＲＮＡ二重鎖が同定され、細胞培養とそれに続くＱ−ＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット分析によって検証されたことを最初に見出した。ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡの選択では、我々はｓｉＲＮＡオリゴ合成のためにインシリコスクリーニングで選択された８つのｓｉＲＮＡ配列を最初に使用する。ついで、我々は、これらのｓｉＲＮＡをヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びマウスＣＴ２６細胞中にトランスフェクトした。２４時間後、全ｍＲＮＡを収集し、標準対照遺伝子標的Ｒｉｇｓ１５を用いてｑＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。図３から、ｍＴＯＲを標的とする強力なｓｉＲＮＡ二重鎖（ヒト及びマウスｍＲＮＡの両方）が選択されたことが分かる。
【００４１】
実施例４．潜在的な抗がん治療薬のためのｍｉＲ−１３２及びｍｉＲ−１５５のノックダウン
アンタゴミル−１３２治療レジメンは、角膜においてピークｍｉＲ−１３２ノックダウンをもたらした（Ａ）（プール化ｎ＝６マウス／群）。ボンフェローニの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して有意水準を計算した。Ｐ≦０．０５（＊）。６つの角膜を収集し、ＱＰＣＲ又はＷＢによる分析のためにプール化した。（Ｂ）アンタゴミル−１３２及びスクランブル配列をＨＳＶ感染マウスに結膜下注入し、異なる群から単離した角膜からのＲａｓＧＡＰ ｍＲＮＡの定量を実施した（ｎ＝６マウス／群）。有意水準は、スチューデントｔ検定（独立）によって決定した。＊＊＊Ｐ≦０．００１（図４）。
【００４２】
マウス膵臓がん組織及び膵臓がん患者の血漿中のｍｉＲ−１５５の増加が、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、マウス正常及び膵臓がん組織（ＰＤＡＣ）における標的遺伝子ｍＲＮＡ及びｍｉＲ−１５５の発現との相関関係と共に観察された。膵臓がん患者、非がん対照、及び他のＧＩがんの患者からのヒト血漿サンプル中のｍｉＲ−１５５レベルの検出で、膵臓がん対膵臓疾患を伴う非がん対照、膵臓疾患を伴わない非がん対照、上部ＧＩがん、結腸がん、及び肝臓がん。＊ｐ，０．０５。ＷＴマウスとｍｉＲ−１５５ＫＯマウスの片眼にＨＳＶ−１ ＲＥを感染させた。抗血管新生効果を、１２日目と１５日目ｐ．ｉ．に血管新生スコアを用いて測定した。二重標的アンタゴミル−１３２／１５５は、１５日目ｐ．ｉ．に３群全てで最も強力な活性を示す。有意水準は、スチューデントｔ検定（独立）によって決定した。Ｐ≦０．００１（＊＊＊）；Ｐ≦０．０１（＊＊）；Ｐ≦０．０５（＊）。エラーバーは平均±ＳＥを表す（図５）。
【００４３】
実施例５．ゲムシタビンとタウロコール酸の組合せ製剤
ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）は、デオキシシチジンの類似体である新規の抗がんヌクレオシドである。それはプロドラッグであり、細胞内に輸送されると、デオキシシチジンキナーゼによりリン酸化されて活性型になるはずである。ゲムシタビン二リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）とゲムシタビン三リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）は双方ともＤＮＡ合成に必要とされるプロセスを阻害する。ｄＦｄＣＴＰのＤＮＡへの取り込みは、ゲムシタビンが細胞死を引き起こす主要な機構である可能性が最も高い。伸長するＤＮＡ鎖の末端にゲムシタビンヌクレオチドが取り込まれた後、もう一つのデオキシヌクレオチドが加えられ、その後、ＤＮＡポリメラーゼが進行できなくなる。プルーフリーディング酵素はこの位置からゲムシタビンを除去できないため、この作用（「マスクされた終結」）は明らかに薬物をＤＮＡ中にロックする。更に、ゲムシタビン代謝産物が細胞の調節プロセスに及ぼす独特の作用が、細胞増殖に対する全体的な阻害活性を高めるのに役立つ。この相互作用は「自己増強」と呼ばれ、非常に少ない他の抗がん剤で証明されている。
【００４４】
ゲムシタビン、（２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン；１−（４アミノ−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−１−イル）−２−デオキシ−２，２−ジフルロ−Ｄ−シトジン；ｄＦｄＣ；ＣＡＳ番号９５０５８−８１−４；Ｃ９ＨＵＦ２Ｎ３Ｏ４，Ｍｒ２６３．２）は、米国薬局方における公式承認基準物質である（「ゲムシタビン塩酸塩」及び「注射用ゲムシタビン」に関して、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，ＵＳＰ２７，第１追補ＵＳＰ ＮＦ，ｐ ３０６０−６１）。ゲムシタビンは次の化学構造を有する：化学式：Ｃ２６Ｈ４５ＮＯ７Ｓ；モル質量：５１５．７０５８ｇ／ｍｏｌ；融点：１２５．０℃（２５７．０°Ｆ；３９８．１Ｋ）。ゲムシタビンの構造を図６に示す。
【００４５】
タウロコール酸は強力な生物学的洗剤であり、脂質を溶解し、膜結合タンパク質を遊離するために使用できる。それは細菌学の培地成分であり、ＭａｃＣｏｎｋｅｙブロスの幾つかの形態で使用される。また、リパーゼ活性を加速することができる。ワクチンの製造において、また薬物及びワクチンの送達を支援するためのビヒクルとして可能性を有している。タウロコール酸は胆汁酸であり、コール酸とタウリンの結合産物である。そのナトリウム塩は、肉食動物の胆汁の主要成分である。それは、脂肪の乳化に関与する潮解性の黄色がかった結晶性胆汁酸である。それは、哺乳動物の胆汁中にナトリウム塩として生じる。医療用途では、胆汁促進薬（cholagogue）及び胆汁分泌促進薬（choleretic）として投与される。タウロコール酸の加水分解により、タウリンが生成される。タウロコール酸の構造を図６に示す。
【００４６】
本発明は、リポソームが、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡオリゴなどの様々な負に荷電した分子の何れかを含みうる、ゲムシタビンと配位したタウロコール酸の組成物を提供する。複合体形成物質は、グリココール酸、又はコリルグリシン、又はタウロ脂質、セラミド−１スルホン酸塩などの両親媒性分子である。ここで使用される「ゲムシタビン」という用語はゲムシタビン遊離塩基とゲムシタビン誘導体を意味する。
【００４７】
組成物は、有利には、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ、抗腫瘍剤、抗真菌剤、他の活性剤の中でも特に抗生物質、特にシスプラチン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ビノレルビン、エピルビシンを含むゲムシタビン以外の二次治療薬と組み合わせて使用できる。本発明は、薬学的に許容される賦形剤中の治療的有効量の本発明の複合体がヒトなどの哺乳動物に投与される方法を特に考慮する。図６に示されるように、我々はこの新しく作成された構造をＧＥＭ−ＴＣＡと名付ける。
【００４８】
実施例６．ゲムシタビン−タウロコール酸（ＧＥＭ−ＴＣＡ）の製剤
製剤化には２つの工程が含まれる：
［ゲムシタビン遊離塩基の調製］  ゲムシタビン塩酸塩は、多くの商品名で販売されている医薬品中の有効成分である。ゲムシタビンの遊離塩基を調製するには、ゲムシタビン塩酸塩（５．０ｇ）と炭酸カリウム（４．０ｇ、１．５モル当量）を１．０Ｌの丸底フラスコに加える。次に、ジクロロメタン（３５０ｍＬ）とエタノール（３００ｍＬ）を加える。フラスコの内容物を室温で一晩激しく攪拌する。フリット漏斗で乳白色の溶液をきれいなボトルに濾過する。強制乾燥空気の助けを借りて、蒸発により溶媒の大部分を除去する。固形物を高真空下に３０℃において８時間置く。遊離塩基は白色固体粉末であり、検証は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。
【００４９】
［ゲムシタビン−タウロコール酸塩（１：１），プロドラッグの調製］  ０．３０ｇ（１．１３９ｍｍｏｌ）のゲムシタビン遊離塩基を５０℃においてエチルアルコール（２０ｍＬ；２００ｐｒｏｏｆ）に溶解する。別のフラスコで、タウロコール酸（０．５８ｇ；１．１２４ｍｍｏｌ）をエチルアルコール（１０ｍＬ；２００ｐｒｏｏｆ）に溶解する。ＴＣ溶液をゲムシタビンに滴下して加える。１０ｍＬのエタノールを加え、沈殿が生じるまで５０℃において溶液を攪拌する（約３０分）。室温で溶液を冷却する。沈殿した固形物を真空濾過で収集し、真空デシケーターで乾燥させる。その結果、白色固体の外観になる。
【００５０】
望ましくは、組成物及び方法は、次の利点の一又は複数を示す：１）アニオン性ステロイドとゲムシタビンの間の強い静電気相互作用を達成する、２）溶解性の問題を回避する、３）ゲムシタビン−タウロコレート複合体の高い安定性、４）ゲムシタビンを高濃度でボーラス又は短期注入として投与する能力、５）ゲムシタビンの半減期の延長、６）ゲムシタビンの毒性の減少、７）ゲムシタビンの治療効果の増加、及び８）がん細胞における多剤耐性の調節。
【００５１】
実施例７．ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）とＧＥＭ−ＴＣＡの細胞傷害性の比較
ＧＥＭ−ＴＣＡ製剤を入手した後、承認された抗がん剤であるＧＥＭＺＡＲ（登録商標）と比較して、その腫瘍細胞殺効力を試験した。１０％ＦＢＳを補充した１５０ｕｌのＥＭＥＭで処理する前日に、１×１０３のＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、５０ｕＬのＧＥＭＺＡＲ（登録商標）又はＧＥＭ−ＴＣＡを同じ培地で希釈し、細胞に加えた（０．１ｎＭ〜１００ｕＭ）。化学物質曝露の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞傷害性を評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す（図７）。明らかに、ＧＥＭ−ＴＣＡは、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度を用いたＨｅｌａ細胞培養研究において、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）と同じ抗がん（腫瘍細胞死滅）活性を示した。
【００５２】
実施例８．ＨｅｐＧ２及びＰａｎｃ−１細胞培養におけるＧＥＭＺＡＲ（登録商標）とＧＥＭ−ＴＣＡの比較
我々は、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）及びＧＥＭ−ＴＣＡの腫瘍細胞殺効力を、ＨｅｐＧ２（高分化型肝細胞がんを患っている１５歳の白人男性の肝組織に由来する、ヒト肝がん細胞からなる永久細胞株）及びＰａｎｃ−１（５６歳の白人男性の管由来の膵臓がんから樹立された細胞株）細胞培養を用い、その後に細胞生存率を測定することにより更に比較した。ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）とＧＥＭ−ＴＣＡの細胞傷害性の比較は、次の工程で実施した。２×１０３のＰａｎｃ−１及びＨｅｐＧ２細胞を１５０ｕｌのＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳの９６ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、培地に、同じ培地で希釈した０．１ｎＭ〜１００ｕＭのＧＥＭＺＡＲ（登録商標）又はＧｅｍＴｃを補充した。化学物質曝露の７２時間後、細胞傷害性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。再び、ＧＥＭ−ＴＣＡは、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度においてＨｅｐＧ２とＰａｎｃ−１の両方の細胞培養試験で同じ腫瘍細胞殺効力を示した（図８）。
【００５３】
実施例９．ＧＥＭ−ＴＣＡに対するＰａｎｃ−１細胞の化学療法感受性に関するｍＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡによるフォワードトランスフェクションの効果
膵腫瘍は最も致命的なタイプの消化器がんであり、５年生存率は５％である。アジュバント化学療法はゲムシタビン単独又は放射線療法を伴う５−フルオロウラシル注入との併用のままである。膵臓がんが転移すると、それは一様に致命的であり、診断から典型的には６ヶ月の全生存期間である。ゲムシタビンは、局所進行性及び転移性の両方の疾患において標準となっている。チロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブの追加は、生存期間中央値を僅か２週間延長する。ゲムシタビンベースのレジメンは現在、局所進行性又は転移性膵臓腺がんの患者の標準的な第一選択治療として受け入れられているが、第二選択の設定での治療に関するコンセンサスはない。最近、チロシンキナーゼ阻害剤スニチニブとｍＴＯＲ阻害剤エベロリムスの２つの標的薬剤が、膵神経内分泌腫瘍に対してＦＤＡにより承認された。
【００５４】
ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びマウスＣＴ２６細胞を用いた細胞培養試験と、それに続くｑＲＴ−ＰＣＲ分析により強力なｍＴＯＲ特異的ｓｉＲＮＡを同定した：ｍＴＯＲ−ｓｉＲＮＡ：
センス：５’−ｒ（ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ）−３’
アンチセンス：５’−ｒ（ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ）−３’
【００５５】
発がん性遺伝子標的ノックダウンがＧＥＭ−ＴＣＡに対するＰａｎｃ−１細胞の化学療法感受性を誘導しうるという独自の仮説を実現するために、次の手順で実験を行った。５×１０３のＰａｎｃ−１細胞を、１００ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳの９６ウェルプレートのウェルに播種した。翌日、製造業者の推奨に従って、細胞にｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００複合体をトランスフェクトした。５〜６時間で培地を変えた。翌日、様々な濃度のＧＥＭ−ＴＣＡが、トランスフェクトされた細胞に適用される。化学物質曝露の７２時間後、細胞傷害性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は、対照、非標的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞とは異なる各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す（ｐ＜０．０５，スチューデントｔ検定）。図９の観察に基づいて、２つの固定ｍＴＯＲ−ｓｉＲＮＡ濃度：１０ｎＭ及び２０ｎＭで、ＧＥＭ−ＴＣＡによる腫瘍細胞死滅が１２．３ｎＭ〜１μＭの濃度で有意に改善されたことが分かる。
【００５６】
実施例１０．低用量ＧＥＭ−ＴＣＡに曝露されたＰａｎｃ−１細胞の化学療法感受性に対するＴＧＦ−β１ｓｉＲＮＡ及びｍＴＯＲｓｉＲＮＡの効果
ＴＧＦ−β１ｓｉＲＮＡとｍＴＯＲｓｉＲＮＡがＰａｎｃ−１細胞のＧＥＭ−ＴＣＡに対する化学的感受性を誘導するという性質をよく理解するために、我々は、これらの２つのｓｉＲＮＡ二重鎖を３０ｎＭの固定濃度で試験し、更に細胞を３．９ｎＭ〜１μＭまでの様々な濃度でＧＥＭ−ＴＣＡに曝露した。翌日、培地に、同じ培地で希釈した３．９ｎＭ〜１０００ｎＭのＧｅｍＴｃを補充した。化学物質曝露の４８時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞傷害性を評価した。未処理細胞（ブランク）から得られた値を１００％に設定した。全ての値は各希釈に対して４回反復の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。対応サンプル両側スチューデントｔ検定を使用して有意性を判定した。ＴＧＦ−β１ｓｉＲＮＡは、複数のインビトロ及びインビボアッセイを用いて以前に同定され検証された：
センス：５’−ｒ（ＣＣＵＣＡＡＵＵＣＡＧＵＣＵＣＵＣＡＵＣＵＧＣＧＣＡＡ）−３’
アンチセンス：５’−ｒ（ＵＵＧＣＡＧＡＵＧＡＧＡＧＡＣＵＧＡＡＵＵＧＡＧＧ）−３
【００５７】
図１０の観察から、我々は、ＴＧＦ−β１ｓｉＲＮＡとｍＴＯＲｓｉＲＮＡの両方が、低濃度（３．９ｎＭ）でＧＥＭ−ＴＣＡ処理に対してＰａｎｃ−１細胞を有意に感作することができることを見出した。ＧＥＭ−ＴＣＡ濃度が１５．６ｎＭに増加すると、ｍＴＯＲｓｉＲＮＡ処置の感作効果は消失した。しかし、ＧＥＭ−ＴＣＡ濃度が６２．５ｎＭに増加した場合でも、感作効果は依然として有意であった。何れの場合も、最大細胞死滅は６０％で止まった。これらの結果に基づいて、我々は、ＧＥＭ−ＴＣＡが腫瘍細胞殺特性を保持しており、その抗腫瘍活性はｍＴＯＲｓｉＲＮＡ又は他の腫瘍標的サイレンシングｓｉＲＮＡによって更に増強されうると結論付ける。
【００５８】
実施例１１．ＧＥＭ−ＴＣＡ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の特徴付け
我々は、１０／１、又は２０／１、又は３０／１、又は４０／１、又は５０／１の比率のＧＥＭ−ＴＣＡ／ｓｉＲＮＡ製剤の粒子サイズとゼータ電位を更に測定した。その結果、ＧＥＭ−ＴＣＡ／ｓｉＲＮＡが１０／１の比率の場合、平均粒子サイズは約１５３．２ｎｍ（図１１）で、ゼータ電位は約−１０．６２（図１２）である。従って、ＧＥＭ−ＴＣＡはｓｉＲＮＡを分子量１０／１の比率でナノ粒子にパッケージ化できる。
【００５９】
実施例１２．ゲムシタビンとＨＫＰの結合戦略のデザイン
残基反復及び分岐ペプチドのポリアミンとして、ＨＫＰは修飾が非常に困難である。３種類の官能性アミン（ペプチド結合のアミンを除く）がある：４８個のイミダゾール基、２０個のイプシロン−アミン、及び５個のＮ末端アルファ−アミン。それらのアミンを介してＨＫＰを修飾したい場合、それらが互いに干渉し、最終的に様々な分岐を持つ複数の中間体が生成される。我々は、ＨＫＰのＣ末端に、他の全ての官能性アミン基とは異なる特別なアミンが一つあることを見出した。それは、Ｃ末端カルボキシルのヒドロキシル（−ＯＨ）であった位置であったが、ＨＫＰではアミドと呼ばれるアミンに置き換えられた（図１３）。窒素の孤立電子対がカルボニルに移動し、最終的にＣ＝Ｎ二重結合とヒドロキシルを形成するという特別な特性がある。実際、アミドは酸触媒によりカルボキシルへ加水分解される。これは、ＨＫＰの唯一の「Ｃ末端」が酸条件下でカルボキシル基に戻ることを意味する。これは、修飾に利用することができる独特のブレイクアウトになる。我々はＣ末端のカルボキシル基を介してＨＫＰを修飾できる。
【００６０】
ゲムシタビンはヌクレオシド類似体である。ゲムシタビンの殆どの化学修飾は、専ら２つの部位、４−（Ｎ）及び５’−（ＯＨ）を介しており、様々なゲムシタビン誘導体が開発されている。プロドラッグとして、その２つの部位を介した修飾により、ゲムシタビンが体内で活性薬物として放出され、送達効率が改善される。図１４で提案されるように、我々は、ＨＫＰとゲムシタビンを結合させる戦略としてＥＤＣ−ＮＨＳ化学を選択することにした。これはカルボジイミド架橋剤化学である。ＥＤＣ（ＥＤＡＣとも呼ばれる）は１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）で、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【００６１】
ＥＤＣ−ＮＨＳ化学を使用する利点：
１．ＥＤＣ−ＮＨＳ反応が、酸条件で最も効果的に生じる。
２．ＨＫＰは酸条件下でカルボキシル基を生成する。
３．ＥＤＣ−ＮＨＳ反応は、−ＮＨ３＋よりも−ＮＨ２を優先する。
４．ゲムシタビンの−ＮＨ２は、ｐＫａの値が低い（約２．８）ため、酸条件でＨＫＰの干渉アミンに抵抗し、これがＨＫＰの自己結合の代わりにゲムシタビンをＨＫＰと結合させる（図１５）。
【００６２】
実施例１３．ＧＥＭ−ＨＫＰ構造及び分子量の特徴付け
図１６に見られるように、ＨＫＰ分子は約２００ｎｍに特徴的なＵＶ吸収ピークを持ち、これが主にヒスチジンに起因する一方、ゲムシタビンは、シトシンに対してそれぞれ２０９ｎｍと２７２ｎｍに糖を表す２つのピークを持つ。そこで、我々は、ゲムシタビンの指標として２７２ｎｍのピーク波長を選択し、ＨＫＰの指標として２０５ｎｍを選択した。次に、図１７に示されるように、純粋なＨＫＰとゲムシタビンに対してＨＰＬＣアッセイを実行した。ＨＫＰ（９．６ｋＤ）とゲムシタビン（２３６Ｄ）の分子量には大きな違いがあるため、それらは異なる時点でカラムから出てきた。ＨＫＰのピークは約１９分に現れ、ゲムシタビンのピークは約５分に現れた。ゲムシタビンは、約１９分で全く吸収がない。しかし、ＧＥＭ−ＨＫＰを測定した場合、この単一化合物は２０５ｎｍと２７２ｎｍの両方で吸光度を示し、共に約１９分に２つのピックを示す。
【００６３】
ＨＫＰとゲムシタビンを結合させた後、生成された状態の化合物は、約１９分の同じ時点で、２７２ｎｍと２０５ｎｍの両方の波長に２つの強いピークを示した。ＨＫＰと比較すると、ゲムシタビンはかなり小さい分子（４０倍小さい）であり、提案された反応機構に示されるように、ＨＫＰに加わった１分子のゲムシタビンはＨＫＰピーク位置を余り遅らせない。また、ゲムシタビンは約２０５ｎｍにも吸光度を有するが、等モルレベルの場合、ＨＫＰと比較してその吸光度は無視できる。更に、我々は、より長い又はより短い時点（０〜６０分）では他の強いピークを見出さなかった。
ＨＰＬＣ及びＵＶの結果に基づいて、我々は以下の結論を出すことができる：
１．提案されたＨＫＰ−ゲムシタビン（ＨＫＰ−ＧＥＭ）化合物は成功裡に合成される。
２．新規化合物では、一つのＨＫＰに一つのゲムシタビンが結合している。
３．有意な副産物は観察されなかった。
【００６４】
実施例１４．ＧＥＭ−ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡナノ粒子製剤特性
我々は、ＨＫＰ−ＧＥＭ水溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を４：１の比率で混合したときのナノ粒子製剤の物理化学的特性（粒子サイズとゼータ電位）を更に測定する。スクランブルｓｉＲＮＡをＧＥＭ−ＨＫＰと共に使用してナノ粒子を形成し、元のＨＫＰを同じ条件下で陽性対照として使用した。ナノ粒子のサイズとゼータ電位は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ９０Ｐｌｕｓ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒを使用して測定した。図１６に示されるように、ＧＥＭ−ＨＫＰの平均粒子サイズは７９ｎｍで、ゼータ電位は２５ｍＶである。ＧＥＭ−ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡと同様のゼータ電位を有するが、粒子サイズは異なる（図１８）。しかし、これは新規化合物であるため、最適な比率は少し変わる可能性があり、それは後で解決される可能性がある。ナノサイザーの結果に基づいて、新規化合物ＨＫＰ−ＧＥＭのナノ粒子形成能を検証した。
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【００６５】
実施例１５．ＧＥＭ−ＨＫＰはｓｉＲＮＡをＰａｎｃ−１細胞中に送達する
我々は、次に、レポーターとしてＡＦ４８８ｓｉＲＮＡ（蛍光ＡＦ４８８で修飾されたスクランブルｓｉＲＮＡ）を使用して、ＧＥＭ−ＨＫＰと共にナノ粒子を形成し、インビトロｓｉＲＮＡトランスフェクションに対するその能力を評価した。ＨＫＰ−ｓｉＲＮＡナノ粒子を対照として使用した。図１９に示されるように、我々の新規化合物ＧＥＭ−ＨＫＰには、ＨＫＰと同様の効率でｓｉＲＮＡを細胞中に送達する能力がある。Ｐａｎｃ−１細胞株をこの評価のモデルとして使用した。
【００６６】
実施例１６．ＧＥＭ−ＨＫＰは腫瘍細胞殺活性を示す
図１９の観察に基づいて、腫瘍細胞を殺すためのその細胞傷害活性についてＧＥＭ−ＨＫＰを試験することに更に移った。非コーディングＡＦ４８８標識ｓｉＲＮＡを、Ｐａｎｃ−１細胞に、ＨＫＰ又はＧＥＭ−ＨＫＰと共に４．５：１の担体：ｓｉＲＮＡ比でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション剤又は薬物のみを含む培地を新鮮培地と置き換えた。トランスフェクションの４８時間後と７２時間後に、細胞死滅の評価のために細胞増殖の画像を撮影した（図２０）。細胞殺活性はトランスフェクション後２４時間ではあまり明確ではなかったが、ＧＥＭ−ＨＫＰ担持ｓｉＲＮＡナノ粒子は強力な細胞殺活性を示した。この結果は、ＧＥＭ−ＨＫＰがｓｉＲＮＡ送達（ＨＫＰ機能）と腫瘍細胞死滅（ゲムシタビン機能）の特性を保持できることを示唆している。従って、ＧＥＭ−ＨＫＰは新規の抗腫瘍剤でありながら、治療用ｓｉＲＮＡ薬を送達できる。
【００６７】
実施例１７．ＧＥＭ−ＴＡＣは、ＧｅｍＺａｒよりも強力なＡ５４９異種移植腫瘍モデルにおける活性腫瘍増殖阻害剤である
Ａ５４９（肺がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験は、ＭＯＤが治療なしの腫瘍モデル群であることを実証した。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＣＡは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝６。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した（図２２）。
【００６８】
実施例１８．ＧＥＭ−ＴＡＣは、ＧｅｍＺａｒよりも強力なＰＡＮＣ−１異種移植腫瘍モデルにおける活性腫瘍増殖阻害剤である
ＰＡＮＣ−１（膵臓がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験は、ＭＯＤが治療なしの腫瘍モデル群であることを実証した。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＣＡは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝６。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した（図２３、２４、２５）。
【００６９】
実施例１９．ＧＥＭ−ＴＡＣは、Ｌｏｖｏ細胞異種移植腫瘍モデルにおいてＳＴＰ３０２と組み合わせて抗腫瘍活性を増強することができる
Ｌｏｖｏ細胞（結腸がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験は、ＭＯＤが治療なしの腫瘍モデル群であることを実証した。ＳＴＰ３０２は、ｍｉｒ１５０／ＨＫＰ製剤を使用したｍｉＲＮＡ治療薬候補である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝６。ＧＥＭ−ＴＡＣ＋ＳＴＰ３０２の組合せは、その個々の使用よりも優れた効果をもたらした（図２６、２７）。
【００７０】
実施例２０．ＧＥＭ−ＴＡＣは、Ｌｏｖｏ細胞異種移植腫瘍モデルにおいてＳＴＰ３０２と組み合わせて抗腫瘍活性を増強することができる
Ｌｏｖｏ細胞（結腸がん）細胞異種移植マウスモデルを用いた腫瘍抑制試験は、ＭＯＤが治療なしの腫瘍モデル群であることを実証した。ＭＯＤは治療なしの腫瘍モデル群である。ＧＥＭは、ＧｅｍＺａｒで治療された腫瘍モデル群である。ＧＥＭ−ＴＡＣは、ゲムシタビン−タウロコール酸製剤で治療された腫瘍モデル群である。コホート群Ｎ＝８。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣを同じ投薬量で使用した。ＧｅｍＺａｒとＧＥＭ−ＴＡＣの治療ベネフィット間には有意な差がある（図２８、２９）。
【００７１】
実施例２１．Ｃａｓｋｉ細胞培養研究を使用して、ヒトＰＤＬ−１遺伝子に対して強力なｓｉＲＮＡ配列を選択した
ヒト子宮頸がん細胞株，Ｃａｓｋｉ細胞培養を使用して、ＰＤＬ−１遺伝子発現の阻害について複数のｓｉＲＮＡ配列をスクリーニングした。陽性のｓｉＲＮＡ配列に星印を付した（図３０、３１）。Ｈｕｍａｎ＿ＰＤＬ１＿３．  ５’−ＵＣＧＣＣＡＡＡＣＵＡＡＡＣＵＵＧＣＵＧＣＵＵＡＡ−３’（１５３３）；Ｈｕｍａｎ＿ＰＤＬ１＿６．  ５’−ＡＡＧＣＡＵＡＡＡＧＡＵＣＡＡＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵ−３’（１６３５）＊＊。
【００７２】
実施例２２．Ｃａｓｋｉ細胞培養研究を使用して、ヒトＰＤＬ−２遺伝子に対して強力なｓｉＲＮＡ配列を選択した
ヒト子宮頸がん細胞株，Ｃａｓｋｉ細胞培養を使用して、ＰＤＬ−２遺伝子発現の阻害について複数のｓｉＲＮＡ配列をスクリーニングした。陽性のｓｉＲＮＡ配列に星印を付した（図３２、３３）。Ｈｕｍａｎ＿ＰＤＬ１＿６．  ５’−ＡＡＧＣＡＵＡＡＡＧＡＵＣＡＡＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵ−３’（１６３５）＊＊＊；Ｈ＿ＰＤＬ２（９１８）５’−ＣＡＧＧＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’＊＊＊。
【００７３】
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2020511540.tif 000005
【００７４】
［文献］
１．Makrilia, N., K. N. Syrigos, M. W. Saif. Updates on Treatment of Gemcitabine-Refractory Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Pancreas, 2011, 12(4):351-354.
２．Saif M. M. Pancreatic Neoplasm in 2011, An Update. Journal of the Pancreas, 2011, 12(4): 316-321.
３．Park JK, Henry JC, Jiang J, Esau C, Gusev Y, Lerner MR, Postier RG, Brackett DJ, Schmittgen TD. miR-132 and miR-212 are increased in pancreatic cancer and target the retinoblastoma tumor suppressor. Biochem Biophys Res Commun. 2010, 406(4):518-23.
４．Greither T, Grochola LF, Udelnow A, Lautenschlager C, Wurl P, Taubert H. Elevated expression of microRNAs 155, 203, 210 and 222 in pancreatic tumors is associated with poorer survival. Int J Cancer. 2010 Jan 1;126(1):73-80.
５．Habbe N, Koorstra JB, Mendell JT, Offerhaus GJ, Ryu JK, Feldmann G, Mullendore, ME, Goggins MG, Hong SM, Maitra A. MicroRNA miR-155 is a biomarker of early pancreatic neoplasia. Cancer Biol Ther. 2009, 8(4):340-6.
６．Gironella M等 Tumor protein 53-induced nuclear protein 1 expression is repressed by miR-155, and its restoration inhibits pancreatic tumor development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007, 104(41):16170-5.
７．Han ZB, Chen HY, Fan JW, Wu JY, Tang HM, Peng ZH. Up-regulation of microRNA-155 promotes cancer cell invasion and predicts poor survival of hepatocellular carcinoma following liver transplantation. J Cancer Res Clin Oncol. 2012,138(1):153-61. 
８．Donnem T, Eklo K, Berg T, Sorbye SW, Lonvik K, Al-Saad S, Al-Shibli K, Andersen S, Stenvold H, Bremnes RM, Busund LT. Prognostic impact of MiR-155 in non-small cell lung cancer evaluated by in situ hybridization. J Transl Med. 2011, 9:6.
９．Joseph J. LaConti., Anton Wellstein, et al. Tissue and Serum microRNAs in the KrasG12D Transgenic Animal Model and in Patients with Pancreatic Cancer. Plos ONE, 2011, Vol.6(6): 1-9. 
１０．Bhela S, Lu PY, Rouse BT.等Role of miR-155 in the pathogenesis of herpetic stromal keratitis. Am J Pathol. 2015 Apr;185(4):1073-84.
１１．Ying-Ying Lu, Da-Dao Jing, Ming Xu, Kai Wu, Xing-Peng Wang. Anti-tumor activity of erlotinib in the BxPC-3 pancreatic cancer cell line. World J Gastroenterol. 2008. 14(35): 5403-5411.
１２．Guopei Luo等 RNA interference of MBD1 in BxPC-3 human pancreatic cancer cells delivered by PLGA-poloxamer nanoparticles. Cancer Biology & Therapy. 2009. 8(7):1-5. 
１３．Kyonsu Son, Shuichi Fujioka, Tomonori Iida, Kenei Furukawa, Tetsuji Fujita, Hisashi Yamada, Paul J. Chiao And Katsuhiko Yanaga. Doxycycline Induces Apoptosis in PANC-1 Pancreatic Cancer Cells. Anticancer Research, 2009. 29: 3995-4004.
１４．Weibo Niu, Xiangqun Liu, Zhaoyang Zhang, Kesen Xu, Rong Chen, Enyu Liu, Jiayong Wang, Cheng Peng And Jun Niu. Effects of αvβ6 Gene Silencing by RNA Interference in PANC-1 Pancreatic Carcinoma Cells. Anticancer Research. 2010. 30:135-142.
１５．Chuan Ding, Muhammad Khan, Bin Zheng, Jingbo Yang, Lili Zhong and Tonghui Ma1.  Casticin induces apoptosis and mitotic arrest in pancreatic carcinoma PANC-1 cells. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2012. 6(6):412-418.
１６．Leng, Q., P Scaria, PY Lu, Woodle MC,及びA. J. Mixson: Systemic delivery of HK Raf -1siRNA Polyplexes Inhibits MDA-MB-435 Xenografts. Cancer Gene Therapy. 2008, 1-11.
１７．Yan, ZW, PY Lu及びLY Li等 The Human Rhomboid Family-1 Gene RHBDF1 Is Essential to Cancer Cells Survival and Critical in EGFR Activation. Molecular Cancer Therapeutics, 2008; 7(6):1355-64.
１８．Raymond M. Schiffelers, PY Lu, Puthupparampil V. Scaria,及びMartin C. Woodle等(2004): Cancer siRNA Therapy by Tumor Selective Delivery With Ligand-Targeted Sterically-Stabilized Nanoparticle. Nucleic Acid Research, Vol. 32, No.19.
１９．Hertel, L. W., Kroin, J. S., Misner, J. W.及びTustin, J. M. Synthesis of 2-deoxy-2,2-difluoro-D-ribose and 2-deoxy-2,2’-difluoro-D-ribofuranosyl nucleosides. J. Org. Chem. 53, 2406-2409 (1988).
２０．Guo Zw, Z.及びGallo, J. M. Selective Protection of 2’,2’-Difluorodeoxycytidine (Gemcitabine). J. Org. Chem. 64, 8319-8322 (1999).
２１．Moysan, E., Bastiat, G.及びBenoit, J.-P. Gemcitabine versus Modified Gemcitabine: A Review of Several Promising Chemical Modifications. Mol. Pharm. 10, 430-444 (2013)
【００７５】
発行された特許及び公開特許出願を含む、ここで特定される全ての刊行物、及びｕｒｌアドレス、アクセッション番号などによりここで特定される全てのデータベースエントリの開示は、その全体が出典明示によりここに援用される。
【００７６】
この発明をその所定の実施態様に関連して記載し、多くの詳細を例示目的で説明したが、本発明は追加の実施態様を受け入れる余地が高く、ここに記載の詳細の所定のものは本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変更することができることは当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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