(57)【要約】  本発明は、微生物細胞中で発現された封入体からの組換え抗体断片の精製方法に関する。より詳しくは、本発明は、微生物細胞中で発現された封入体からの組換えヒト化（ｒＨｕ）抗体断片ラニビズマブの精製方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞において封入体または可溶性形態のいずれかとして発現された組換えヒト化（ｒＨｕ）ラニビズマブの抗体断片を精製する方法であって、前記方法は以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）組換え宿主細胞からのｒＨｕラニビズマブの軽鎖および重鎖を含有する封入体を可溶化して、可溶化したｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｂ）工程（ａ）の可溶化したｒＨｕラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｃ）限外濾過により工程（ｂ）のリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを濃縮し、濃縮したリフォールディングしたラニビズマブを得ること；
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮したリフォールディングした／可溶性形態のｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィーに供することであって、前記クロマトグラフィー工程は以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む；
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌまたは２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する工程（ｃ）の濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ、不純物を除去すること、
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムまたは２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下で、ｒＨｕラニビズマブを溶出プール中に溶出すること；
ここで、精製されたラニビズマブは、５％未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のラニビズマブ、および２％未満の凝集形態のラニビズマブを有する；
（ｉｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、４．５〜６．５の範囲内のｐＨを有する工程（ｉｉ）の溶出プールからのｒＨｕラニビズマブを、マルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉すること；
（ｉｖ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液を用いてｒＨｕラニビズマブを溶出すること；
ここで、精製されたｒＨｕラニビズマブが、０．１％未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のｒＨｕラニビズマブ、および０．３％未満の凝集形態のｒＨｕラニビズマブを有する
【請求項２】
マルチモードクロマトグラフィーのモードが、フロースルーマルチモードクロマトグラフィーおよび結合−溶出マルチモードクロマトグラフィーを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）マルチモードクロマトグラフィーの結合溶出モードのｐＨ条件が８．０〜１０．０の範囲内であり、かつ
（ｉｉ）マルチモードクロマトグラフィーのフロースルーモードのｐＨ条件が４．０〜６．５の範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
フロースルーモードを利用するマルチモードクロマトグラフィーが、
（ｉ）６．０ｍＳ／ｃｍ〜１２ｍＳ／ｃｍの範囲内のインプット電導度を工程（ｃ）の濃縮したリフォールディングしたラニビズマブに適用すること、および
（ｉｉ）６．０ｍＳ／ｃｍ〜１２ｍＳ／ｃｍの範囲内のインプット電導度を工程（ｉｉ）において得られた組換えラニビズマブに適用すること
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）における前記マルチモードクロマトグラフィー樹脂が、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、およびＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標） ＸＷＰ ５００ Ｐｏｌｙ ＰＥＩ−３５および／またはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ樹脂を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉｉ）における前記マルチモードクロマトグラフィー樹脂が、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、およびＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標） ＸＷＰ ５００ ＰｏｌｙＣＳＸ−３５および／またはＣａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）および工程（ｉｉ）が、それぞれ、工程（ｉｉｉ）および工程（ｉｖ）と交換可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
マルチモードクロマトグラフィーの第１の段階の後のｒＨｕラニビズマブを含む前記溶出プールのｐＨが、逐次的なマルチモードクロマトグラフィー段階におけるｐＨの範囲に対応して調整され、前記工程が、
（ａ）マルチモードクロマトグラフィーの工程（ｉ）および（ｉｉ）の第１の段階の後に前記溶出プールのｐＨを４〜６の範囲内のｐＨに調整すること、または
（ｂ）マルチモードクロマトグラフィー方法の工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の第１の段階の後に前記溶出プールのｐＨを８〜１０の範囲内のｐＨに調整すること
を含む、請求項１または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法により得られる組換えヒト化ラニビズマブ。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体と共に、請求項９に記載のラニビズマブを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、微生物細胞中で発現された封入体から組換え抗体断片を精製する方法に関する。より詳しくは、本発明は、微生物細胞中で発現された封入体から組換えヒト化（ｒＨｕ）抗体断片ラニビズマブを精製する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
バイオ医薬品の研究および開発における最近の傾向は、抗体断片の開発により集中している。多数のバイオシミラー治療用タンパク質がこれまでになく開発中であるが、バイオシミラー製品の開発における重大な課題は、下流工程の高いコスト、方法および製造物に関連する不純物の非選択的な除去、製造物のタンパク質分解などである。抗体断片は、全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療剤と比べてある特定の利点、例えば、向上した腫瘍深部への侵入、全長ｍＡｂではアクセスできない特定のエピトープへの結合などの利点を提供する。Ｆａｂは、臨床開発に入った抗体断片候補の大部分を占め、３つが米国食品医薬品局により承認されている。上流工程における進歩、例えば、高力価クローンおよび連続的なバイオ製造は、バイオ医薬品産業の焦点を、全体的な下流工程経済の改善に移行させた。下流工程は、モノクローナル抗体治療剤の全製造コストの約６０〜７０％を占める。下流の捕捉、中間および最終精製工程は、様々なクロマトグラフィー操作の大規模な使用を伴う。
【０００３】
ラニビズマブは、活性型のヒト血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に結合し、その生物学的機能を阻害するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストである。ＶＥＧＦ−Ａの過度なアップレギュレーションは、ＶＥＧＦ−Ａを新しい血管の成長に不可欠なものとし、血管新生および血管の透過性亢進につながる。血管の透過性は、黄斑浮腫および脈絡膜血管新生をもたらす可能性があり、滲出型の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を引き起こし得る。したがって、血管の透過性亢進の病的状態を制御および治療するために、ＶＥＧＦ−ＡをＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで阻害することが必須である。ラニビズマブは、ルセンティス（登録商標）として市販されており、硝子体内注入で投与される。それは、眼内で使用するために特別に設計および製造されている。ラニビズマブは、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）の治療に眼内で使用するために設計された組換えヒト化ＩｇＧ１κアイソタイプモノクローナル抗体断片である。
【０００４】
ラニビズマブの分子量は約４８．３７ｋＤａで、すなわち、軽鎖および重鎖はそれぞれ２３．４３ｋＤａおよび２４．９５ｋＤａである。ヒト化モノクローナル抗体断片は、組換えＤＮＡ技術により大腸菌細胞中で発現され、ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を標的とする。ラニビズマブでは、２１４残基の軽鎖がそのＣ末端におけるジスルフィド結合により２３１残基の重鎖のＮ末端セグメントに連結している。先行技術文献は、抗体断片の発現およびその精製に焦点を当てた証拠を提供する。しかし、大腸菌細胞を使用して製造される組換えヒト化（ｒＨｕ）ラニビズマブは、不溶性タンパク質凝集物の形態の封入体を形成する。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１６／０２８９３１４号明細書には、ラニビズマブの調製のためのクローニング、発現および精製方法が開示されている。その精製方法は、単に、可溶化させた封入体の、還元、酸化およびインビトロでのリフォールディングと、それに続く、限外濾過およびダイアフィルトレーション−Ｉ、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過およびダイアフィルトレーション−ＩＩ、ならびに濾過の段階的処理を含む。この方法の複数の精製工程は、低スループット操作につながり、それにより、方法をやっかいなものとする。
【０００６】
したがって、精製された抗体断片を得るための簡便な下流工程を提供する差し迫った必要性がある。先行技術で開示された下流の精製手順の欠点に鑑みて、本発明者らは、抗体断片の精製方法を提供することを試みた。本発明により得られる精製された抗体断片は、標準的なラニミズマブの純度および活性基準を満たす。
【０００７】
発明の目的
したがって、本発明の主な目的は、抗体断片を精製する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、マルチモードクロマトグラフィー精製工程をｒＨｕラニビズマブの下流工程と一体化させることによる組換えラニビズマブを精製する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、既存の製造方法と比べて生産性のほぼ２倍の向上をもたらす方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、開発された精製プラットフォームがインビトロでリフォールディングさせた抗体断片と可溶性発現された抗体断片の両者に適用可能である方法を提供することである。
【００１１】
発明の概要
本発明は、組換え抗体断片の精製方法を提供する。
【００１２】
一態様では、本発明は、組換え宿主細胞からの組換えヒトラニビズマブの精製方法に関し、前記方法は、封入体の形態で組換え宿主細胞からｒＨｕラニビズマブを得ること；可溶化緩衝液を使用して封入体を可溶化して、可溶化したｒＨｕラニビズマブを得ること；リフォールディング緩衝液を使用して可溶化したｒＨｕラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを得ること；限外濾過によりリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを濃縮し、濃縮したｒＨｕラニビズマブを得ること；濃縮したｒＨｕラニビズマブを逐次的なマルチモードクロマトグラフィー精製工程に供し、製造物に関連する不純物、宿主細胞のタンパク質および宿主細胞の核酸を除去すること、その後、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過を行ない、精製されたｒＨｕラニビズマブを得ることを含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィーに供し、２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌまたは２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去する工程；
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムまたは２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下で、ｒＨｕラニビズマブを溶出プール中に溶出させる工程、
ここで、精製されたラニビズマブが、５％未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のラニビズマブおよび２％未満の凝集形態のラニビズマブを有する；
（ｉｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、４．５〜６．５の範囲内のｐＨを有する工程（ｉｉ）から得たｒＨｕラニビズマブを、マルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、不純物をさらに除去する工程；
（ｉｖ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下でｒＨｕラニビズマブを溶出する工程、
ここで、精製されたｒＨｕラニビズマブが、０．１％未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のｒＨｕラニビズマブおよび０．３％未満の凝集形態のｒＨｕラニビズマブを有する；
を含む、マルチモードクロマトグラフィー精製を提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、マルチモードクロマトグラフィーの第Ｉ相および第ＩＩ相の順序が交換可能である、マルチモードクロマトグラフィーを提供する。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、ラニビズマブ精製の下流工程により得られる組換えヒト化ラニビズマブを提供する。
【００１６】
この要約は、組換えヒト抗体断片（ｒＨｕラニビズマブ）を精製する方法に関する概念を導入するために提供される。この要約は、請求項にかかる発明の必須の特徴を特定することを意図せず、また請求項にかかる発明の範囲の決定または限定における使用を目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、特許請求の範囲に記載されたマルチモードクロマトグラフィー精製プラットフォームの処理工程を示す。
【図２】図２は、マルチモードクロマトグラフィーＩのクロマトグラムを示す。溶出ピークＩ：精製されたｒＨｕラニビズマブ、溶出ピークＩＩ：製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）。
【図３】図３は、マルチモードクロマトグラフィーＩＩのクロマトグラムを示す。フロースルーおよび溶出ピークＩ：処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）。溶出ピークＩＩ：精製されたｒＨｕラニビズマブ、溶出ピークＩＩＩ：製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）。
【図４】図４は、フロースルーモードのマルチモードクロマトグラフィーＩのクロマトグラムを示す（フィード材料の電導度：６．０ｍＳ／ｃｍ、平衡緩衝液：ｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブは５．０ＣＶの塩勾配で溶出させた）。フロースルー：精製されたｒＨｕラニビズマブ（純度２９．６９％）；溶出ピークＩ：ｒＨｕラニビズマブを含む、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）、溶出ピークＩＩ：ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブならびに処理に関連する不純物。
【図５】図５は、フロースルーモードのマルチモードクロマトグラフィーＩのクロマトグラムを示す（フィード材料の電導度：１２．０ｍＳ／ｃｍ、平衡緩衝液：ｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブは５．０ＣＶの塩勾配で溶出させた）。フロースルー：精製されたｒＨｕラニビズマブ（３３．１２％）；溶出ピークＩ：処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）、溶出ピークＩＩ：ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブならびに処理に関連する不純物。
【図６】図６は、マルチモードクロマトグラフィーＩのクロマトグラムを示す（平衡緩衝液：ｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを段階勾配により溶出させ、第１の工程は１２．５％の溶出緩衝液、第２の工程はｐＨ９．０の２０ｍＭのトリスと１．０ＭのＮａＣｌを含む１００％の溶出緩衝液であった）。溶出ピークＩ：精製されたｒＨｕラニビズマブ（純度３８．２５％）、溶出ピークＩＩ：製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物。
【図７】図７は、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブに関連した低分子量および高分子量の不純物と、特徴付けのための非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：本発明のマルチモードクロマトグラフィーを使用して精製されたリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブ、レーン２：タンパク質分子量マーカー、およびレーン３：標準的なラニビズマブ。
【図８】図８は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：精製されたリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブ、レーン２：タンパク質分子量マーカー、およびレーン３：標準的なラニビズマブ。
【図９】図９は、マルチモードクロマトグラフィーＩからの溶出ピークの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。１：タンパク質分子量マーカー。２：標準的なｒＨｕラニビズマブ。３：溶出ピーク１（低分子量の不純物を有する純度３８．２５％のリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブ、４８ｋＤａ、）、４：溶出ピーク２（全ての他の処理に関連する不純物を示す）、（マルチモードクロマトグラフィーＩの条件：ｐＨ９．０の平衡緩衝液、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブは５ＣＶの塩勾配において溶出させた）、５：溶出ピーク１、６：溶出ピーク２、（条件、ｐＨ１０．０の平衡緩衝液、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを５ＣＶの塩勾配において溶出させた）；７：溶出ピーク１、８：溶出ピーク２、（条件、ｐＨ１０．０の平衡緩衝液、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを７．５ＣＶの塩勾配において溶出させた）；９：溶出ピーク１、１０：溶出ピーク２、（条件、ｐＨ１０．０の平衡緩衝液、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを１０ＣＶの塩勾配において溶出させた）。
【図１０】図１０は、精製された可溶性発現されたｒＨｕラニビズマブの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。１：標準的なｒＨｕラニビズマブ、３：本発明の精製されたｒＨｕラニビズマブ。
【図１１】図１１は、精製されたｒＨｕラニビズマブの純度分析についての逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。Ａ：標準的なｒＨｕラニビズマブ。Ｂ：精製されたｒＨｕラニビズマブ。
【図１２】図１２は、精製されたｒＨｕラニビズマブのサイズ排除クロマトグラムを示す。Ａ：標準的なｒＨｕラニビズマブ。Ｂ：精製されたｒＨｕラニビズマブ。
【図１３】図１３は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるインタクト質量分析を示す。Ａ：標準的なｒＨｕラニビズマブ、Ｂ：精製されたｒＨｕラニビズマブ。
【００１８】
発明の詳細な説明
これから、本発明をいくつかの好ましい任意の態様と結び付けて詳細に説明し、それにより、その様々な側面は、より充分に理解され、および認識されるであろう。
【００１９】
定義：
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語をここにまとめる。
【００２０】
「封入体」という用語は、標的組換えタンパク質の不溶性の凝集物を意味する。標的タンパク質の封入体は、ミスフォールディングしたタンパク質と部分的にフォールディングしたタンパク質との組合せを含む。タンパク質のリフォールディングは、タンパク質がその天然の三次元構造、生物学的に機能的なコンホメーションを獲得する過程である。
【００２１】
「還元剤」という用語は、タンパク質のジスルフィド結合の還元を引き起こし、分子内および分子間の両方のジスルフィド結合を化学的に破壊されたままとする物質を意味する。
【００２２】
「カオトロピック剤」という用語は、タンパク質のコンホメーションを変化させてより水溶性にすることができる物質を意味する。そのようなカオトロピック剤の例としては、エタノール、ブタノール、尿素、グアニジウム塩酸、チオ尿素、塩化マグネシウム、過塩素酸リチウムなどを含む。
【００２３】
「宿主細胞のタンパク質」という用語は、発酵または細胞培養プロセスの過程の間に標的タンパク質とは別に宿主細胞により発現される全てのタンパク質を意味する。
【００２４】
ここで使用される「マルチモードクロマトグラフィー」という用語は、イオン性相互作用、疎水性相互作用または水素結合を含む複数のタイプの相互作用により、リガンドとタンパク質が相互作用するクロマトグラフィー技術を意味する。
【００２５】
本発明は、組換え宿主細胞からの組換えモノクローナル抗体断片の精製方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）可溶化緩衝液を使用して組換え宿主細胞から得られた抗体断片を含有する封入体を可溶化し、可溶化した抗体断片を得ること；
（ｉｉ）リフォールディング緩衝液を使用して可溶化した抗体断片をリフォールディングし、リフォールディングした抗体断片を得ること；
（ｉｉｉ）限外濾過によりリフォールディングした抗体断片を濃縮し、濃縮した抗体断片を得ること；ならびに
（ｉｖ）濃縮した抗体断片を逐次的なマルチモードクロマトグラフィー精製に供して、製造物に関連する不純物、すなわち、宿主細胞のタンパク質、および宿主細胞の核酸を除去した後に、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過を行って、精製されたｒＨｕ抗体断片を得ること
を含む。
【００２６】
組換えラニビズマブは、組換え宿主細胞中で、好ましくは等しい割合の重鎖および軽鎖の濃度において、前記タンパク質の発現により得られる。本発明において使用される組換え宿主細胞は大腸菌である。本発明において使用される大腸菌宿主株は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。前記株は、Merck Milliporeから入手した。
【００２７】
本発明は、ｒＨｕラニビズマブの軽鎖および重鎖の可溶化した混合物を得るために、可溶化緩衝液の存在下で組換えヒト化（ｒＨｕ）ラニビズマブの等しいまたは等しくない割合の軽鎖および重鎖を含有する、可溶化した封入体を提供する。組換え宿主細胞から抽出されたｒＨｕ封入体は、カオトロピック界面活性剤、還元剤および変性剤を含む可溶化緩衝液を使用して可溶化させた。
【００２８】
カオトロピック試薬は、尿素およびグアニジウム塩酸塩を含む。可溶化緩衝液のｐＨを７〜１０の範囲内に維持した。可溶化された封入体の還元は、ジチオトレイトール、β-メルカプトエタノールを含む還元剤の組合せを３０分〜２時間使用して達成された。
【００２９】
カオトロピック界面活性剤、還元剤および変性剤は、当該技術分野において従来使用されるものから選択される。
【００３０】
可溶化のための方法は、最初に、ラニビズマブタンパク質を含有する組換え宿主細胞から得られた封入体を１５ｍｌの可溶化緩衝液中に可溶化させることを含む。可溶化緩衝液は、ｐＨ９．０の０．１Ｍのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡおよび変性剤として６Ｍのグアニジン塩酸を含有し、これらでの３０分間の処理の後に、５ｍＭのＤＴＴの存在下で１時間還元させる。可溶性かつ還元された封入体溶液に１０ｍＭの酸化グルタチオンを加えることにより酸化した。
【００３１】
別の態様では、可溶化したｒＨｕラニビズマブのインビトロでのリフォールディングは、リフォールディング緩衝液の存在下で得られる。リフォールディング緩衝液は、タンパク質フォールディング剤、ポリオールおよび界面活性剤を含み、ここでｐＨは８．０〜１０．０に維持される。
【００３２】
ここで言及される「インビトロでのタンパク質リフォールディング」は、ミスフォールディングしたラニビズマブを正しくフォールディングした形態に変換する方法に関する。ラニビズマブのリフォールディングは、ｐＨ９．０の０．１Ｍのトリス、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトールおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するリフォールディング緩衝液中、５℃〜２０℃で７５倍希釈を使用して達成された。
【００３３】
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質は、５ｋＤａの限外濾過Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（商標） Ｌａｂ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎデバイスを使用する限外濾過によりさらに濃縮され、その後、ｐＨ９．０の２０ｍＭのトリスに緩衝液が交換される。次いで、緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのためのインプットとして使用した。
【００３４】
最も好ましい態様では、本発明は、
（ａ）組換え宿主細胞からのｒＨｕラニビズマブの軽鎖および重鎖を含有する封入体を可溶化し、可溶化したｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｂ）可溶化したｒＨｕラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｃ）限外濾過によりリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを濃縮し、濃縮したリフォールディングしたラニビズマブを得ること；
（ｄ）濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィーに供することであって、前記クロマトグラフィー工程が、
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌまたは２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する工程（ｃ）の濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去すること；
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムまたは２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下で、ｒＨｕラニビズマブを溶出プール中に溶出させること、
ここで、精製されたラニビズマブが、５％未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のラニビズマブおよび２％未満の凝集形態のラニビズマブを有し；
（ｉｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、４．５〜６．５の範囲内のｐＨを有する工程（ｉｉ）からのｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去すること；
（ｉｖ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下でｒＨｕラニビズマブを溶出させること、
ここで、精製されたｒＨｕラニビズマブが、０．１％未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のｒＨｕラニビズマブ、および０．３％未満の凝集形態のｒＨｕラニビズマブを有する；
を含む、組換え宿主細胞からの組換えヒト化（ｒＨｕ）ラニビズマブの抗体断片の精製方法を提供する。
【００３５】
上述の方法の工程（ｉ）および（ｉｉ）におけるマルチモードクロマトグラフィー精製の段階をマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相と称し、上述の方法の工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）におけるマルチモードクロマトグラフィー精製の段階をマルチモードクロマトグラフィー第ＩＩ相と称する。ｒＨｕラニビズマブに伴う様々な方法および製造物に関連する不純物を除去するために、マルチモードクロマトグラフィーの第Ｉ相および第ＩＩ相は、順次行われ、または、任意にその順序を交換してもよい。
【００３６】
マルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相（処理工程（ｉ）および（ｉｉ））および第ＩＩ相（処理工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、ｒＨｕラニビズマブの精製のためにそれぞれ２つの工程を伴う。
【００３７】
一態様では、本発明は、マルチモードクロマトグラフィーの結合溶出モードおよびマルチモードクロマトグラフィーのフロースルーモードを含むマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、マルチモードクロマトグラフィーの結合溶出モードおよびマルチモードクロマトグラフィーのフロースルーモードを含むマルチモードクロマトグラフィー第ＩＩ相を提供する。
【００３９】
マルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相：
第Ｉ相において利用されるマルチモードクロマトグラフィーモードは、結合溶出クロマトグラフィーモードまたはフロースルーモードから選択される。マルチモードクロマトグラフィー樹脂Ｉは、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、およびＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標） ＸＷＰ ５００ Ｐｏｌｙ ＰＥＩ−３５またはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ樹脂からなる群から選択される。
【００４０】
本発明は、
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂Ｉに結合させ、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去すること；
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下でｒＨｕラニビズマブを溶出プール中に溶出させること
を含む、クロマトグラフィーの結合溶出モードを伴うマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相を提供する。
【００４１】
結合−溶出クロマトグラフィーを伴うマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相の第１のステージは、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの結合と精製されたリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの溶出を含む。マルチモードクロマトグラフィー樹脂Ｉでは、８．０〜１０．０での試料インプットｐＨの変化と５ＣＶ〜１０ＣＶの異なる塩勾配での溶出は、不純物の除去および精製方法の最適化に重要な役割を果たす。
【００４２】
マルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相の結合および溶出モードにおいて、８．０〜１０．０での平衡緩衝液のｐＨの変化は、タンパク質の電荷分布と三次元コンホメーションを変化させる。イオン性相互作用、疎水性相互作用および異なる塩勾配における溶出の組合せにより、ｐＨ９．０の平衡緩衝液および５ＣＶの塩勾配において、純度３８．７９％の製造物を６７．５６％の回収率で得られた。
【００４３】
一態様では、本発明は、
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、および
（ｉｉ）０ｍＭ〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム
を含み、
８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する、ｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂Ｉに結合させるために使用される結合緩衝液を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、および
（ｉｉ）０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウム
を含み、
８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する、ｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂Ｉから溶出プール中に溶出させるために使用される溶出緩衝液を提供する。
【００４５】
本発明は、
（ｉ）濃縮したリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを、２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用い、６．０ｍＳ／ｃｍ〜１２ｍＳ／ｃｍの範囲内のインプット電導度でマルチモードクロマトグラフィー樹脂Ｉにフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去すること；ならびに
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下で、不純物を溶出プール中に溶出させること；
を含む、クロマトグラフィーのフロースルーモードを伴うマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相を提供する。
【００４６】
マルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相のフロースルーモードにおいて、組換えラニビズマブのリフォールディングした濃縮画分のインプット電導度の変化は、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブおよび不純物の結合親和性の変化をもたらす。試料インプット電導度が１２ｍＳ／ｃｍでは、不純物は樹脂に結合し、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブはフロースルー中に溶出された。そのような条件下で純度３３．１２％の製造物を７６．９８％の回収率で得られた。
【００４７】
マルチモードクロマトグラフィー第ＩＩ相：
ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去するために、マルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相の溶出液から得られたｒＨｕラニビズマブを４．５〜６．５の範囲内のｐＨに調整し、２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、マルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩにフィードする。
【００４８】
本発明は、結合溶出クロマトグラフィーを利用して行われるマルチモードクロマトグラフィー第ＩＩ相を提供し、前記方法は、
（ｉ）４．５〜６．５の範囲内のｐＨを有し、６．０ｍＳ／ｃｍ〜１２ｍＳ／ｃｍの範囲内のインプット電導度を有するマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相の溶出プールから得られたｒＨｕラニビズマブを、２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、マルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩにフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去すること；
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテートおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む、４．０〜６．５の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下でｒＨｕラニビズマブを溶出させること
を含む。
【００４９】
本発明は、マルチモードクロマトグラフィーのフロースルーモードを利用して行われるマルチモードクロマトグラフィー第ＩＩ相を提供し、前記方法は、
（ｉ）８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有するマルチモードクロマトグラフィー第Ｉ相の溶出プールから得られたｒＨｕラニビズマブを、２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび０ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて、マルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩにフィードし、ｒＨｕラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去すること；ならびに
（ｉｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび０ｍＭ〜１０００ｍＭのＮａＣｌを含む、８．０〜１０．０の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液の存在下でｒＨｕラニビズマブを溶出させること
を含む。
【００５０】
１つのさらなる態様では、本発明は、
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのアセテート、および
（ｉｉ）０ｍＭ〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム
を含み、
４．０〜６．０の範囲内のｐＨを有する、ｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩに結合させるために使用される結合緩衝液を提供する。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）２０ｍＭ〜５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、および
（ｉｉ）０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩化ナトリウム
を含み、
４．０〜６．０の範囲内のｐＨを有する、ｒＨｕラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩから溶出プール中に溶出させるために使用される溶出緩衝液を提供する。
【００５２】
マルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩは、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、およびＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）ＸＷＰ ５００ ＰｏｌｙＣＳＸ−３５またはＣａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂からなる群から選択される。マルチモードクロマトグラフィー樹脂ＩＩの結合および溶出モードにおいて、４．０から６．５への平衡緩衝液のｐＨの変化は、タンパク質の電荷分布および三次元コンホメーションの変化をもたらす。イオン性相互作用、疎水性相互作用および試料インプット電導度の組合せにより、ｐＨ５．５および６．０ｍＳ／ｃｍの試料インプット電導度の平衡緩衝液で、純度９９．５０％の製造物を４６．５７％の回収率で得られた。
【００５３】
【表１】
2020511516.tif 000002
【００５４】
上記表１は、異なる実験で回収されたｒＨｕラニビズマブについて条件の最適化のために調べた平衡緩衝液のｐＨおよび塩濃度の異なる条件を列記する。
【００５５】
ｐＨの増加は、ｒＨｕラニビズマブの負電荷を増加させ、ｒＨｕラニビズマブと樹脂リガンドとのより強い静電相互作用につながる。
【００５６】
塩勾配は、ｒＨｕラニビズマブの選択的な溶出において不可欠な役割を果たす。ｐＨ９．０の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液を含む溶出緩衝液および５ＣＶの塩溶出勾配が、３８．２５％の高度に純粋なｒＨｕラニビズマブの製造に役立つことが観察された。そのような条件において、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの最大純度が観察され、試料のインプット電導度と溶出における塩濃度は、不純物と樹脂の疎水性相互作用に対して不可欠な影響力を有し、最大の精製されたリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを溶出する。
【００５７】
【表２】
2020511516.tif 000003
【００５８】
表２は、マルチモードクロマトグラフィーＩＩにおいて溶出されるｒＨｕラニビズマブの回収率および純度に対する平衡緩衝液の異なるｐＨおよび試料負荷条件の影響を示す。ｐＨの減少は、ｒＨｕラニビズマブ上の正電荷を増加させる役割を果たし、ｒＨｕラニビズマブと樹脂リガンドとのより強い静電相互作用につながる。タンパク質分子の疎水性は、異なる溶液電導度において異なるように変化し、それが最終的に樹脂との異なる結合親和性につながる。ｐＨ５．５および６．０ｍＳ／ｃｍの試料負荷電導度における２０ｍｍの酢酸緩衝液を含む溶出緩衝液は、９９．５０％の高度に純粋なｒＨｕラニビズマブの製造に役立つことが観察された。
【００５９】
【表３】
2020511516.tif 000004
【００６０】
【表４】
2020511516.tif 000005
【００６１】
精製されたラニビズマブが、図２の溶出ピークＩに、マルチモード樹脂クロマトグラフィーカラムＩからの溶出後に純度３８．７９％で観察された。溶出ピークＩＩは、ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブならびに、宿主細胞のタンパク質および核酸といった処理に関連する不純物を含有する。
【００６２】
図３より、宿主細胞のタンパク質および核酸を含む処理に関連する不純物が、フロースルーおよび溶出ピークＩに観察され、精製されたラニビズマブが純度９９．５０％で溶出ピークＩＩ中に観察され、製造物に関連する不純物、例えば、ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブが溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認される。
【００６３】
別の好ましい態様では、本発明は、
（ｉ）封入体の形態で組換え宿主細胞からｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｉｉ）可溶化緩衝液を使用して封入体を可溶化し、可溶化したｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｉｉｉ）リフォールディング緩衝液を使用して可溶化したｒＨｕラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｉｖ）限外濾過によりリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを濃縮し、濃縮したｒＨｕラニビズマブを得ること；
（ｖ）濃縮したｒＨｕラニビズマブを一連のマルチモードクロマトグラフィー精製工程に供し、製造物に関連する不純物、宿主細胞のタンパク質、および宿主細胞核酸を除去し、かつ精製されたｒＨｕラニビズマブを得ること
を含む、精製方法により得られるラニビズマブを含む医薬組成物を提供する。
【００６４】
１つのより好ましい態様では、本発明は、本発明の方法により得られた組換えヒト化ラニビズマブを提供する。
【００６５】
１つのさらなる態様では、本発明は、本発明の方法から得られたラニビズマブを含む、硝子体内投与のための水性組成物を提供し、前記組成物は、加齢黄斑変性症および関連疾患の治療および制御において利用される。
【００６６】
［実施例］
以下の実施例は、例による説明のためにのみ行うもので、したがって、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６７】
例１：結合／溶出モードのマルチモードクロマトグラフィー
（ｉ）封入体の可溶化
本発明では、大腸菌中で発現させた組換えヒトラニビズマブを使用した。最初に、ｐＨ９．０の０．１Ｍのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡおよび変性剤として６Ｍのグアニジン塩酸を含有する４０ｍｌの可溶化緩衝液中で、０．８ｇの封入体を３０分間可溶化した。マグネチック攪拌機を用い、２５℃で３０分間、封入体を可溶化した。可溶化後、ＩＢを７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、孔径１．０μｍの濾紙を使用して濾過した。可溶化緩衝液中の０．５Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が５．０ｍＭとなるように還元剤としてＤＴＴを加えた。還元のために、２５℃で３０分間、溶液を撹拌し続けた。１０．０ｍＭの酸化グルタチオンを加えることにより、可溶性かつ還元された封入体溶液を３時間、酸化し続けた。
【００６８】
（ｉｉ）ラニビズマブを含む可溶化したＩＢのリフォールディング
０．１Ｍのトリス、０．６Ｍのアルギニン、５．０％のソルビトールおよび２ＭＭのＥＤＴＡ、０．６０ｍＭのシスチンおよび０．７５ｍＭのシステインを含むｐＨ９．０の９６０ｍＬのリフォールディング緩衝液に、約４０ｍＬの可溶化、還元および酸化された封入体溶液を加えた。リフォールディング処理を１０±２℃で１２０時間、５０ｒｐｍで実行した。
【００６９】
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を５ｋＤａ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）Ｌａｂ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎデバイスを使用する限外濾過により濃縮した。継続したダイアフィルトレーション操作を使用して、濃縮タンパク質の緩衝液をｐＨ９．０の２０ｍＭのトリスに交換した。次いで、緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのインプットとして使用した。
【００７０】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのｐＨを９．０に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ９．０の２０ｍＭのトリス、続いて、１ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ９．０の２０ｍＭのトリスによる３ＣＶの塩勾配で実行した。そのような条件下では、タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブが溶出ピークＩに観察されたことが確認された（純度３８．７９％）（図２）。溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。図２において、マルチモードクロマトグラフィーの溶出ピーク１は、精製されたｒＨｕラニビズマブを含有し、これは、図９のＳＤＳ ＰＡＧＥのレーン番号３において４８ｋＤａで特徴付けられた。
【００７１】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５０の１０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーＩＩのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５０に調整した。１ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５０の１０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０％勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを４５％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され（純度９９．５０％）、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された（図３）。製造物の品質をＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を使用して検証し、標準的なラニビズマブの品質と良好に一致していた。（図７のレーン番号１、４８ｋＤａ）
【００７２】
例２：結合−溶出マルチモードクロマトグラフィーＩおよびＩＩ
ｒＨｕラニビズマブのリフォールディングおよびその前処理
（ｉ）封入体の可溶化
大腸菌中で発現された組換えヒトラニビズマブを含む０．４ｇのＩＢを、ｐＨ９．０の０．１Ｍのトリス、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび変性剤として６．０Ｍのグアニジン塩酸を含有する２０ｍＬの可溶化緩衝液中に３０分間溶解した。さらなる処理は、例１（ｉ）の方法のとおりに行った。
【００７３】
（ｉｉ）可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングは、例１（ｉｉ）に開示される方法にしたがって行った。
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーションは、例１（ｉｉｉ）に開示される方法のとおりに行った。
【００７４】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのｐＨを１０．０に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ１０．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ１０．０の２０．０ｍＭのトリスによる５．０ＣＶの塩勾配で実行した。タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブが溶出ピークＩに観察されたことが確認された（純度３７．９７％）。溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。
【００７５】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーＩＩのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５の１０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０％勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを４５％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され（純度９９．５０％）（図３）、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。
【００７６】
例３：フロースルーモードのマルチモードクロマトグラフィーＩならびに結合および溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩＩ
ｒＨｕラニビズマブのリフォールディングおよび前処理：
（ｉ）封入体の可溶化
大腸菌中で発現された組換えヒトラニビズマブをこの研究において使用した。０．２６７ｇの封入体（ＩＢ）を１３．３ｍＬの可溶化緩衝液中に溶解させた。さらなる処理は、例１（ｉ）において行った方法のとおりである。
（ｉｉ）可溶化した封入体のリフォールディング
１３．３ｍＬの可溶化、還元および酸化された封入体を９８６．７ｍＬのリフォールディング緩衝液中に加え、その方法を例１（ｉｉ）のとおりに行った。
【００７７】
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を５ｋＤａ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）Ｌａｂ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎデバイスを使用する限外濾過により濃縮した。継続したダイアフィルトレーション操作を使用して、濃縮タンパク質の緩衝液をｐＨ８．０の２０ｍＭのトリスに交換した。次いで、緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのインプットとして使用した。
【００７８】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのｐＨを８．０に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ８．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の２０．０ｍＭのトリスによる５．０ＣＶの塩勾配で実行した。そのような条件下では、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブがフロースルー中に観察されたことが確認された（純度３１．２４％）。溶出ピークＩおよび溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）をそれぞれ含有する。
【００７９】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩのフロースルーを、マルチモードクロマトグラフィーＩＩのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０％勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを４５％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され（純度９９．５０％）、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。
【００８０】
例４：フロースルーモードのマルチモードクロマトグラフィーＩならびに結合および溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩＩ
（ｉ）封入体の可溶化
可溶化を例２（ｉ）の方法のとおりに行った。
（ｉｉ）可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングを例２（ｉｉ）の方法のとおりに行った。
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を５ｋＤａ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）Ｌａｂ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎデバイスを使用する限外濾過により濃縮させた。次いで、濃縮したタンパク質試料をマルチモードクロマトグラフィーＩのインプットとして使用した。
【００８１】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いフロースルーモードで行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのｐＨを９．０に調整し、電導度を６．０ｍＳ／ｃｍに調整し、フィード材料として使用した。フロースルー中のリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、不純物を除去するために、平衡緩衝液としてｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリスによる５．０ＣＶの塩勾配で実行した。この実験条件下では、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブがフロースルー中に観察されたことが確認された（純度２９．６９％。溶出ピークＩおよび溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。図４は、ｒＨｕラニビズマブの精製のために行ったマルチモードクロマトグラフィーＩのクロマトグラムを示す。
【００８２】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５０の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩの溶出プールをマルチモードクロマトグラフィーＩＩのためのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。１ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０．０％の勾配中での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを４５．０％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され（純度９９．５０％）、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。
【００８３】
例５：フロースルーモードのマルチモードクロマトグラフィーＩならびに結合および溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩＩ
（ｉ）封入体の可溶化
封入体の可溶化を例２（ｉ）の方法のとおりに行った。
（ｉｉ）可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングを例２（ｉｉ）の方法のとおりに行った。
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過を例４（ｉｉｉ）の方法のとおりに行った。
【００８４】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いフロースルーモードで行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのｐＨを９．０に調整し、電導度を１２．０ｍＳ／ｃｍに調整し、フィード材料として使用した。フロースルー中のリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、不純物を除去するために、平衡緩衝液としてｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリスによる５．０ＣＶの塩勾配で実行した。この実験条件下で、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブがフロースルー中に観察されたことが確認された（純度３３．１２％）（図５）。溶出ピークＩおよび溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。図５は、ｒＨｕラニビズマブの精製のために行ったマルチモードクロマトグラフィーＩのクロマトグラムを示す。
【００８５】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩの溶出プールをマルチモードクロマトグラフィーＩＩのためのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５の１０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０．０％勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを４５．０％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され（純度９９．５０％）、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。
【００８６】
例６：結合および溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩＩならびにその後の結合および溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩ
（ｉ）封入体の可溶化
可溶化工程を例１（ｉ）の処理のとおりに行った。
（ｉｉ）可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディング工程を例１（ｉｉ）の方法のとおりに行った。
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を５ｋＤａ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）Ｌａｂ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎデバイスを使用する限外濾過により濃縮させた。次いで、濃縮したタンパク質試料のｐＨを氷酢酸を用いｐＨ５．５に調整した。濃縮したリフォールディングしたタンパク質試料の電導度を１０．０ｍＳ／ｃｍに調整した。宿主細胞のタンパク質をｐＨ５．５で沈殿させた。沈殿した宿主細胞のタンパク質を、８０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離により除去し、その後、リフォールディングしたタンパク質の上清をマルチモードクロマトグラフィーＩＩのインプットとして使用した。
【００８７】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５０の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０％勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを４５％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。
【００８８】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いフロースルーモードで行った。マルチモードクロマトグラフィーＩＩのアウトプットのｐＨをｐＨ９．０に調整した。フロースルー中のリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、不純物を除去するために、平衡緩衝液としてｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリスを用いる５ＣＶの塩勾配で実行した。この実験条件下で、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブはフロースルー中に観察されたことが確認された。溶出ピークＩおよび溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。
【００８９】
例７：結合−溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩおよびＩＩ
インビボでのｒＨｕラニビズマブの可溶性発現および前処理：
（ｉ）突然変異型大腸菌中での可溶性ｒＨｕラニビズマブの発現
発現した組換えヒトラニビズマブを含む大腸菌細胞を回収し、１：１０（ｗ／ｖ）の細胞ペレット：緩衝液の比で、溶解緩衝液（２０．０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）中に再懸濁した。細胞溶解は、高圧ホモジナイザーを使用し、１５０００ｂａｒで２０分間行った。細胞溶解液の上清を得るために、細胞溶解液を４℃で３０分間１００００ｒｐｍにおいて遠心分離した。
【００９０】
（ｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
連続的なダイアフィルトレーション操作を使用して、可溶性ｒＨｕラニビズマブの緩衝液をｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリスに交換した。緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのためのインプットとして使用した。
【００９１】
（ｉｉｉ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーをｐｏｌｙＰＥＩ−３５樹脂を用いて行った。濃縮した可溶性ｒＨｕラニビズマブのｐＨを９．０に調整し、フィード材料として使用した。可溶性ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリスによる５．０ＣＶの塩勾配で実行した。この実験条件下では、タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩ中に観察されたことが確認された（純度３８．７９％）。溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。
【００９２】
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをｐｏｌｙＣＳＸ−３５樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５０の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーＩＩのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５０に調整した。１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５０の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。１０．０％塩勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なｒＨｕラニビズマブを４５．０％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され（図３）、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。製造物の品質をＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を使用して検証し、標準的なラニビズマブの品質と良好に一致していた。（図１０のレーン番号３、４８ｋＤａ）
【００９３】
例８：結合および溶出モードのマルチモードクロマトグラフィーＩおよびＩＩ
（ｉ）封入体の可溶化
可溶化を例１（ｉ）のとおりに行った。
（ｉｉ）可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングを例１（ｉｉ）のとおりに行った。
（ｉｉｉ）リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
濾過を例１（ｉｉｉ）のとおりに行った。
（ｉｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩをＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのｐＨを９．０に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリス、続いて、１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ９．０の２０．０ｍＭのトリスを用いる５．０ＣＶの塩勾配で実行した。この実験条件下では、タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩ中に観察されたことが確認された（純度３８．７９％）。溶出ピークＩＩは、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）ならびに処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）を含有する。
【００９４】
（ｖ）マルチモードクロマトグラフィーＩＩ
マルチモードクロマトグラフィーＩＩをＣａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂を使用して行った。ｒＨｕラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてｐＨ５．５０の１０．０ｍＭの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーＩの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーＩＩのためのフィード材料として使用した。フィード材料のｐＨを氷酢酸を用いてｐＨ５．５０に調整した。１．０ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５．５０の１０ｍＭの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で溶出を行った。１０．０％の塩勾配中での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なｒＨｕラニビズマブを４５．０％の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、処理に関連する不純物（宿主細胞のタンパク質および核酸）はフロースルーおよび溶出ピークＩ中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークＩＩ中に観察され、製造物に関連する不純物（ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ）は溶出ピークＩＩＩ中に観察されたことが確認された。
【００９５】
例９：組換えラニビズマブの分析的特徴付け
（ｉ）ラニビズマブ試料のＡ２８０での吸光度測定
２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度測定を使用して、リフォールディングし、クロマトグラフィーのアウトプット中に存在する総タンパク質を決定した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００とＵＶ−１８００ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ可視分光光度計を使用して、全ての回収画分を２８０ｎｍで読み取った。
【００９６】
（ｉｉ）ラニビズマブの総タンパク質推定のためのブラッドフォードアッセイ
総タンパク質推定のために使用したオルソゴナルな技術は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００を使用した５９５ｎｍにおけるブラッドフォードアッセイであった。５μｌの試料を２５０μｌのブラッドフォード試薬に加えた後、シェーカーで３０秒間混合を行った。混合後、試料を色素の存在下で２５分間インキュベートし、５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００９７】
（ｉｉｉ）ラニビズマブの定量のための逆相ＨＰＬＣ分析
Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムにおいて４．６ｍｍ×１５０ｍｍのＡｅｒｉｓ（商標）３．６ｕｍ ＷＩＤＥＰＯＲＥ ＸＢ Ｃ１８カラムを使用して、様々なクロマトグラフィーのアウトプット中のｒＨｕラニビズマブの濃度を決定した（図１１）。移動相は、水中の０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ（溶媒Ａ）および水中の０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ、７０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル、２０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール（溶媒Ｂ）からなるものであった。２１４ｎｍの波長においてＢに対するＡの直線勾配を使用して流速を１ｍｌ／分に維持した。本発明の方法により得られた図１１（ｂ）の精製されたリフォールディングしたラニビズマブについて、ピーク（保持時間：２８．１分）は、標準的なラニビズマブについて図１１（ａ）において得られたピークに類似する。
【００９８】
（ｉｖ）ラニビズマブ試料のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
濃縮ゲルは定電圧１２０Ｖ、分離ゲルは定電圧１００Ｖ条件で、非還元（図７）および還元（図８）条件下において、１２％（厚さ１ｍｍ）の分離ゲルを使用して、ラニビズマブについての方法および製造物に関連する不純物の同定のためのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を実行した。ゲルに試料を流す前に、各試料を開始緩衝液中で１０分間煮沸した。ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動分離後、４：１：５（水：氷酢酸：メタノール）中の０．０５％（ｗ／ｖ）のクマシーブリリアントブルーＧ−２５０をタンパク質の検出に使用した。図７におけるゲルの解析は、精製されたリフォールディングしたタンパク質についてレーン１では４８ｋＤａのタンパク質のバンドの存在を示し、それにより、ｒＨｕラニビズマブの存在が確認される。図８における還元ゲルの結果は、ラニビズマブの軽鎖および重鎖の存在を示す。図７および図８は、標準的なラニミズマブとのバイオシミラリティーを示す。
【００９９】
（ｖ）ラニビズマブ試料のインビトロでの生物活性定量のためのＥＬＩＳＡ分析
免疫酵素アッセイ（Alpha diagnostic international社, ＵＳＡのヒト用のルセンティス/ラニミビズマブ、抗ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ キット）。精製されたリフォールディングしたラニビズマブを含有する試料を、プレート上に被覆したＶＥＧＦ抗原と反応させた。結合したラニビズマブを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素標識抗ヒトＩｇＧで検出した。免疫学的反応は、固相ＶＥＧＦ結合抗体−ラニビズマブ酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。未結合の反応物を除去するために、マイクロタイターストリップを洗浄した。次いで、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を反応させる。加水分解された基質の量を、４５０ｎｍにおいてマイクロタイタープレートリーダーで読み取り、この量は存在するラニビズマブの濃度に直接的に比例する。
【０１００】
（ｖｉ）ラニビズマブの宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）定量のためのＥＬＩＳＡ分析
陰イオン交換クロマトグラフィーのフロースルー中の宿主細胞のタンパク質による汚染を二部位免疫酵素アッセイ（Ｃｙｇｎｕｓ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＣＰ分析キットＦ４１０）を使用して分析した。アフィニティー精製した捕捉抗大腸菌抗体をコーティングしたマイクロタイターストリップ中で、大腸菌ＨＣＰを含有する試料をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素標識した抗大腸菌抗体と同時に反応させた。免疫学的反応は、固相抗体−ＨＣＰ−酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。未結合の反応物を除去するために、マイクロタイターストリップを洗浄した。次いで、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を反応させた。加水分解された基質の量を、４５０ｎｍにおいてマイクロタイタープレートリーダーで読み取り、この量は存在する大腸菌ＨＣＰの濃度に直接的に比例する。
【０１０１】
（ｖｉｉ）ラニビズマブ試料のＳＥ ＨＰＬＣ分析：
様々なアウトプット中の凝集物含有量を、Ｙａｒｒａ（商標）３ｕｍ ＳＥＣ−２０００（３００×７．８ｍｍ ＩＤ）カラムを使用して行ったＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して決定した（図１２）。移動相は、ｐＨ５．５０における５０ｍＭの塩化ナトリウム緩衝剤を含む２０ｍＭの酢酸緩衝液からなる。分析をイソクラティックモードで０．５ｍｌ／分の流速を用いて２５℃において行った。タンパク質の検出は、フォトダイオードアレイ検出器を使用して２８０ｎｍにおいて行った。
【０１０２】
（ｖｉｉｉ）二本鎖ＤＮＡの推定：
アウトプット試料中のＤＮＡの存在をＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ピコグリーンアッセイ（Invitrogen BioServices India Private Limited社、インド）を使用して推定した。標準曲線を二本鎖λＤＮＡを使用して作製した。０．５ｍｌのアウトプット試料を０．５ｍｌの希釈したＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標） ｄｓＤＮＡ ＢＲ試薬に加え、反応混合物を５分間インキュベートした。５分後、蛍光分光光度計（励起波長４８０ｎｍおよび蛍光波長５２０ｎｍ）を使用して蛍光を測定した。
【０１０３】
（ｖｉｉｉ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）による精製されたｒＨｕラニビズマブのインタクト質量分析
標準的なおよび精製されたｒＨｕラニビズマブをシナピン酸マトリックスと１：１の比で混合してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。マトリックスシナピン酸（１０ｍｇ／ｍｌ）は、高純度の水中の３０％ｖ／ｖのアセトニトリル、０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ中で調製した。試料とマトリックスとの１μｌのホモジナイズ混合物を清浄な３８４ウェルＭＡＬＤＩプレート上に置いた。プレートをＡＢ ＳＣＩＥＸ ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）５８００機器に挿入した。機器をポジティブイオンモードにおいて使用した。イオン化源として３３７ｎｍの窒素レーザーを用いた。４０００〜５０００のレーザー強度を試料の分析のために使用した。結果の解析はＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）ソフトウェアを使用して行った（図１３）。図１３は、開発した精製プラットフォームを使用して得られた精製されたｒＨｕラニビズマブと標準的なラニビズマブ分子とのインタクト質量の比較を示す。
【０１０４】
（ｉｘ）ＬＣ−ＭＳによるペプチドフィンガープリンティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からのクマシー染色タンパク質バンドをガラスプレート上でメスを用いて切断し、小片に切り刻んだ。１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用いてゲル片を洗浄し、２００μｌの５０％のアセトニトリルおよび５０％の５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を加えて留置し、ボルテックスし、１０分間インキュベートした。液体を除去し、ゲル片を脱水するために、１００％のアセトニトリルで再び洗浄した。アセトニトリルを除去し、ドラフトチャンバー中で１０分間空気乾燥した。還元およびアルキル化のために、５６℃で１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５０μｌ、１０ｍＭのＤＴＴで４５〜６０分間ゲル片を覆った。ＤＴＴ溶液を除去し、１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５０μｌの５５ｍＭのヨードアセトアミドを加え、暗所・室温で４５分間インキュベートした。ヨードアセトアミドを除去した。１００μｌの１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用いた後、ボルテックスと共に５分間５０％のアセトニトリル＋５０％の５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で５分間ボルテックスを２回行い、ゲル片を洗浄した。上記のように１００μｌのアセトニトリルを用いてゲルを脱水した。残った液体を除去し、ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて乾燥させた。トリプシン消化のために、ゲル片をちょうど覆うまで２０μｌのトリプシン（１２．５ｎｇ／μｌ）溶液を加えた。５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３およびトリプシンを含有する緩衝液中に、４℃で３０分間ゲル片を再水和させた。ゲル片を３７℃で終夜消化した。ペプチド抽出のために消化された上清を清浄な１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。３０μＬの５０％のアセトニトリルおよび２％のギ酸をゲル片に加え、２０分間インキュベートした。ペプチド溶液を水浴中で加熱することなく５分間超音波処理した。上清を除去し、初期消化溶液と合わせた。次いで、ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置でペプチド溶液を乾燥させた。ペプチド試料を高純水中の３．０％ｖ／ｖのアセトニトリル、０．１％ｖ／ｖのギ酸中に再構成させた。４μＬの試料（２．５μｇ）をＡｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＲＲＨＤ ３００ＳＢ−Ｃ１８、０．３×１００ｍｍ、３μｍカラムに流し、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムにより分析した。
【０１０５】
本発明の利点
・既存の製造方法と比べて生産性のほぼ２倍の向上が、ｒＨｕラニビズマブの下流工程にマルチモードクロマトグラフィー精製工程を組み合わせることにより得られた。
・直交分析試験により、本発明を使用して得られた精製された薬物と標準的なラニミズマブとの間の分析学的同等性／同質性が確立された。
・開発された精製プラットフォームは、インビトロでリフォールディングした抗体断片と可溶性発現された抗体断片の両者に適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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