(57)【要約】  ＤＮＡシーケンシングという用語は、一般的に、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド塩基である、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順序を決定するために使用されているいくつかの方法および技術に適用されている。ヒトゲノムのシーケンシングにおける、およびヒトゲノムプロジェクトにおける診断、バイオテクノロジー、法生物学、および生物学的体系学などの、多数の分野に適用される多くの用途を有する。本発明のマシンでは、通常のＰＣＲ技法によってＤＮＡ試料断片を増幅する。個々のヌクレオチドを、新生短鎖ＤＮＡに添加する。試験されるＤＮＡ断片にヌクレオチドが相補的である場合、添加されたヌクレオチドの濃度の変化を調べることができる。この変化は、相補的ヌクレオチドを示す任意の方法によって検出することができる。最後に、組み合わせたデータを使用して、コンピュータシステムによるシーケンスの読み出しを生成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡシーケンシング用のデバイスであって、核酸試料を受容するように構成されている試料ホルダと、前記試料の温度を上昇させるように構成されている加熱システムと、前記試料の温度を下げるように構成されている冷却システムと、所望の時間−温度プロファイルを通じて前記デバイスがサイクルを行うように前記加熱システムおよび前記冷却システムを制御するように構成されている制御器と、を含む、デバイス。加えて、任意の種類のセンサが、前記反応チャンバの任意の内側部分または外側部分に設置されて、好適な液体および水移動システムを使用して、各ヌクレオチドの添加前後のｄＮＴＰ濃度についての情報を提供することができる。
【請求項２】
任意の種類の前記センサが、前記反応チャンバの任意の内側部分または外側部分に設置されて、温度および他の要素を含む、前記反応チャンバ内の前記試料の状態についての情報を提供することができる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
ソフトウェアプログラミング用の入力ユニットに接続されている、前記反応チャンバで実行されるすべてのプロセスを制御するための前記制御ユニット、および前記データを収集し、前記制御ユニットに前記データを送信する、前記反応チャンバ内側または外側の前記センサ、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記入力ユニットが、ソフトウェアプログラミングおよびパラメータの選択用にマシン内側に設置されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記反応チャンバの前記温度が、任意の種類の加熱および冷却システムによって制御されて、前記反応チャンバの前記温度を制御する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
より正確かつ再現性の高い結果のために、多くの対照試料が、前記反応チャンバの内側に設置され得る、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
任意の種類のセンサが、前記反応チャンバの任意の内側部分または外側部分に設置されて、各ヌクレオチドの添加前後の前記濃度についての情報を提供することができる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
試料の数が限定されない、請求項１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、添加されたヌクレオチドの反応前後の濃度の変化の測定に基づくＤＮＡシーケンシング方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
シーケンシング原理：
ＤＮＡシーケンシング用に以前開発された２つの主な方法：
１−合成によるシーケンシング：
−サンガー／ジデオキシチェーンターミネーション（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
−パイロシーケンシング（Ｒｏｃｈｅ／４５４）
−可逆化ターミネータ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
−ゼロモードウェーブガイド（Ｚｅｒｏ  Ｍｏｄｅ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）第３世代シーケンシング
２−オリゴライゲーション検出によるシーケンシング
−ＳＯＬｉＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
以下は、これらの方法のより詳細な説明である。
【０００３】
１−チェーンターミネーション（サンガー）シーケンシング：
この方法では、ジデオキシヌクレオチド、およびｄｄＮＴＰにホスホジエステル結合の形成に必要な３’−ＯＨ基がないことによって鎖の成長が終結されている、改変されているＤＮＡ複製反応。酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の添加により、プライマーが、ｄｄＮＴＰに遭遇するまで伸長される。鎖は、ｄｄＮＴＰの組み込みで終了する。適切なｄＮＴＰ：ｄｄＮＴＰ比により、鎖はテンプレート全体の長さで終結する。終結された鎖すべては、その反応で添加されたｄｄＮＴＰで終了する。得られた終結された鎖を、電気泳動によって解析する。４つのｄｄＮＴＰ各々に対して、別個の染料または「色素」が使用される。ヌクレオチドの末端は色素によって区別することができるため、４つすべての反応は、単一の管で実施することができる。
【０００４】
２−パイロシーケンシング：
各ヌクレオチドが、各サイクルで順番に添加される。そのとき４つのうちの１つのみが光シグナルを生成する。次のサイクルを準備するために、酵素を用いて残りのヌクレオチドを除去する。光シグナルをピログラムで記録する。
【０００５】
パイロシーケンシングは、ヌクレオチド添加時のピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を介する光シグナルの生成に基づいている。
【０００６】
・ＤＮＡｎ＋ｄＮＴＰ→ＤＮＡｎ＋１＋ＰＰ１
・ＰＰｉは、アデノシンホスホ硫酸（ＡＰＳ）からのＡＴＰの生成に使用される。
【０００７】
・ＡＰＳ＋ＰＰ１→ＡＴＰ
ＡＴＰおよびルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換によって光を生成する。
【０００８】
３−ゼロモードウェーブガイド：
この方法は、各ヌクレオチドが、ＤＮＡの成長鎖に組み込まれた直後に各ヌクレオチドの同一性を検出することに基づく、単一分子リアルタイムシーケンシングである。
【０００９】
４−ライゲーションによるシーケンシング
プローブシーケンス（オリゴヌクレオチドの代わりにＤＮＡ断片）に結合するリガーゼをポリメラーゼの代わりに使用する。プローブを添加すると、蛍光シグナルが産生される。蛍光に基づき、ヌクレオチドの同一性を推測することができる。シーケンシング方法は、一塩基のみに従来とは異なる２つ以上のプライマーを含む。
【００１０】
５−ナノポアシーケンシング
モノマーが配列しているポリマー分子を、非常に小さい体積の空間に順番に通して移動させるナノスケールのデバイスを利用する。移動させるポリマーの特徴的な特色を電気シグナルに直接変換する検出器を含む。１分子ごとのベースで、変換および識別がリアルタイムで行われる。これは、数千の異なる分子を数分でプローブすることができる。非常に長いＤＮＡの長さをプローブすることができる。
【００１１】
６−合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）：
ＳＢＳは、各ヌクレオチドをポリメラーゼ反応中のＤＮＡの成長鎖に組み込んだ直後に各ヌクレオチドの同一性を検出することを含む。ＳＢＳは、「蛍光インサイチュシーケンシング」（ＦＩＳＳＥＱ）およびパイロシーケンシング方法を含む。
【００１２】
光切断リンカーを通じて４つの塩基の各々に異なる蛍光色素を結合する。ＤＮＡポリメラーゼにより、相補的な単一ヌクレオチド類似体が組み込まれる。検出される特有の蛍光発光は、組み込まれたヌクレオチドによる。続いて光化学によって蛍光色素を除去し、化学的に３−ＯＨ基を再生成し、そのサイクルを続けて行う。
【００１３】
この用途におけるこの新規の方法の目的：
シーケンシング原理およびシーケンシングマシンは、非常に高価なツールおよび機器を含む。加えて、一般的な研究施設では、かかる技術を入手することは容易ではない。これらの方法のうちのほとんどは、困難であり、これらの実験の費用を増加させる、特殊な酵素または蛍光染料など特殊な標識方法を必要とする。これらの理由から、これらの技術を簡易化し、関連費用を減少させるために、新規の方法を開発および導入する必要がある。
【００１４】
３−本発明の開示内容：
新規の原理：
ＤＮＡシーケンシングという用語は、一般的に、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド塩基である、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順序を決定するために使用されているいくつかの方法および技術に適用されている。ヒトゲノムのシーケンシングにおける、およびヒトゲノムプロジェクトにおける診断、バイオテクノロジー、法生物学、および生物学的体系学などの、多数の分野に適用される多くの用途を有する。本発明のマシンでは、通常のＰＣＲ技法によってＤＮＡ試料断片を増幅する。個々のヌクレオチドを、新生短鎖ＤＮＡに添加する。試験されるＤＮＡ断片にヌクレオチドが相補的である場合、添加されたヌクレオチドの濃度の変化は、任意の方法によって調べることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ゲノムＤＮＡ断片を、固体支持体上に固定する。各ＤＮＡ断片をＰＣＲ技法によって増幅して、ＤＮＡのクラスターを産生する。ＰＣＲ技法では、反応混合物の温度は、ＰＣＲサイクル中９５℃〜４０°〜６０℃、ある特定のサイクル数では最終的には〜７２℃と変動する場合がある。単一ＤＮＡ断片に由来する各クラスターは、単一シーケンシング反応として機能する。シーケンシング反応では、一回にヌクレオチドのうちの１つを添加することによって、ＤＮＡクラスターを試験する。ヌクレオチドが相補的である場合、添加されたｄＮＴＰの濃度の変化を調べることができる。この変化は、シーケンシングチャンバの任意の部分で直接試験することができる。
【００１６】
シーケンシングチャンバの詳細な説明：
１．増幅され、次いで相補的ヌクレオチドについて試験されるゲノムＤＮＡ断片を担持する固体支持体このチャンバは、電熱器および冷却システムを備える。
【００１７】
２．各ＤＮＡ断片をＰＣＲ技法によって増幅して、ＤＮＡのクラスターを産生する。ＰＣＲ技法では、反応混合物の温度は、ＰＣＲサイクル中９５℃〜４０°〜６０℃、ある特定のサイクル数では最終的には〜７２℃と変動する場合がある。
【００１８】
３．増幅されるＤＮＡクラスターに４つの種類のヌクレオチドのうちの１つを添加するのに必要とされる、構成成分すべてを各々担持している４つの異なる溶液を、４つの異なる容器内に入れる。
【００１９】
４．シーケンシング反応では、一回にヌクレオチドのうちの１つを添加することによって、ＤＮＡクラスターを試験する。ヌクレオチドが相補的である場合、濃度の変化を調べることができる。この変化は、シーケンシングチャンバの任意の内側部分または外側部分で直接試験することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】任意の方法により増幅されるゲノムＤＮＡ断片を担持している固体支持体を収容している反応チャンバ（１）、  反応チャンバの温度を制御するための、任意の種類の加熱および冷却システム（２）、  ソフトウェアプログラミング用の入力ユニットに接続されている反応チャンバで実行されるすべてのプロセスを制御するための制御ユニット（４）、およびデータを収集し、制御ユニットにデータを送信する、反応チャンバ内側または外側のセンサ（５）、（６）、  一回にヌクレオチドのうちの１つを添加することによって、相補的ヌクレオチドのＤＮＡクラスターを試験するために必要なすべての溶液を担持している液体および水移動（３）システム、  ヌクレオチドが相補的であるかどうかを試験し、調べることができる濃度のあらゆる変化を検出するのに必要な、すべての種類のセンサを含む、センサ（５）および（６）に接続されている測定ユニットこの変化は、シーケンシングチャンバの内側部分または外側部分で試験することができる。次いで、データを収集し、メイン制御ユニットに送信することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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