(57)【要約】本発明は、対象におけるメタロチオネインポリペプチドまたはメタロチオネインポリヌクレオチドのレベル、発現、または活性を増加させる工程を含む、リソソームの疾患または障害の処置または予防のための組成物および方法を提供する。2020505446.tif 000006
2020505446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるメタロチオネインポリペプチドまたはメタロチオネインポリヌクレオチドのレベル、発現、または活性を参照と比べて増加させる工程
を含む、対象におけるリソソーム蓄積症またはリソソーム蓄積障害を処置する方法。
【請求項２】
リソソーム蓄積障害が、神経セロイドリポフスチン症、グロボイド白質ジストロフィー（globoid leukodystrophy）、GM1ガングリオシドーシス、若年性ヘキソサミニダーゼA欠損、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、多種スルファターゼ欠損、テイ・サックス/GM2ガングリオシドーシスである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
対象が、参照と比べて対象の試料中のメタロチオネイン（MT）ポリヌクレオチドまたはMTポリペプチドのレベルを増加していることを検出することによって予め選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
メタロチオネインが、メタロチオネイン1A（MT1A）、メタロチオネイン1B（MT1B）、メタロチオネイン1E（MT1E）、メタロチオネイン1F（MT1F）、メタロチオネイン1G（MT1G）、メタロチオネイン1H（MT1H）、メタロチオネイン1I偽遺伝子（MT1IpまたはMTE）、メタロチオネイン1L（LT1LまたはMT1R）、メタロチオネイン1M（MT1MまたはMT1K）、メタロチオネイン1X（MT1X）、メタロチオネイン2（MT2）、メタロチオネイン2A（MT2A）、メタロチオネイン3（MT3）、およびメタロチオネイン4（MT4）のうちの1種または複数種である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
造血幹細胞（HSC）またはレンチウイルスベクターを対象へ投与する工程
を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、それぞれ、2017年1月17日出願の米国仮出願第62/447,341号および2017年11月6日出願の第62/582,247号に基づく優先権およびその恩典を主張するものであり、それらの開示は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
中枢神経系（CNS）関与を含む大部分のリソソーム蓄積障害（LSD）は、有効な治癒的な処置を欠いており、患者は、最終的には、それらの荒廃的な疾患に屈する。多くの場合、疾患発病は、極めて初期の乳児期に起こり、微細な徴候を特徴とするため、進行した段階でないとしても、明らかに症候性の段階において診断される。LSDは、特に、早期発病型においては、急速な初期の疾患進行も特徴とする。これらの理由のため、例えば、クラッベ病における造血細胞移植（HCT）または異染性白質ジストロフィー（MLD）における造血幹細胞（HSC）遺伝子治療（HSC GT）を含む、症状が出現する前のLSD小児において、ある程度の成功をもって適用されている治療アプローチは、LSD患者の大多数にとっては有益でなく、その利益は、症状が出現する前または初期症候性の症例において適用された手技に、ほぼ排他的に関連している。これらのHSCに基づくアプローチが、急速進行性LSD脳疾患の寛解において失敗している重要な理由のうちの一つは、既存のCNS組織マクロファージ/組織球およびミクログリアの、移植された造血細胞の子孫による置換のペースが、一次性神経学的疾患の急速な進行と比較して遅いことである。実際、ドナー由来細胞による内臓マクロファージの迅速な再構築が、HCT後に明らかに証明されているが、脳実質においては、より限定された、より遅いドナー細胞の浸潤が起こると推測されている。さらに、異なる細胞型による取り込みの効率、および酵素欠損に関連した固有の病理学的機序は、酵素補充によって完全には克服されず、クロスコレクション（cross correction）が、移植された患者において観察される残存する長期進行性の疾患の原因となり得る。重要なことに、LSDの大多数において、リソソーム酵素欠損は、神経炎症、酸化ストレス経路の活性化、および結果としての神経変性に最終的に至るイベントのカスケードを誘発する。これらの機序は、処置に対する応答に決定的に影響し、包括的アプローチのための重要な治療標的でもある。従って、リソソーム蓄積障害に罹患した患者のための新しい組成物および処置方法が、必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
概要
下記のように、対象におけるメタロチオネインポリペプチドまたはメタロチオネインポリヌクレオチドのレベル、発現、または活性を増加させることによる、リソソーム蓄積障害（例えば、神経セロイドリポフスチン症）の処置または予防のための組成物および方法が、本明細書中に開示される。いくつかの態様において、方法は、タンパク質送達または局所的炎症および酸化ストレスの制御等のような異なる機序によって疾患寛解に寄与することができるドナー由来細胞または改変型細胞のいずれかによって、患者の内在性ミクログリアを置換することを含む。
【０００４】
従って、一つの局面において、対象におけるメタロチオネインポリペプチドまたはメタロチオネインポリヌクレオチドのレベル、発現、または活性を参照と比べて増加させる工程を含む、対象におけるリソソーム蓄積症またはリソソーム蓄積障害を処置する組成物および方法が、本明細書中に開示される。
【０００５】
本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、CNS関与を含むリソソーム蓄積障害は、神経セロイドリポフスチン症、グロボイド白質ジストロフィー、GM1ガングリオシドーシス、若年性ヘキソサミニダーゼA欠損、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、多種スルファターゼ欠損、テイ・サックス/GM2ガングリオシドーシスである。
【０００６】
本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、対象は、参照と比べて対象の試料中のメタロチオネイン（MT）ポリヌクレオチドまたはMTポリペプチドのレベルを増加していることを検出することによって予め選択される。
【０００７】
本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、メタロチオネインは、メタロチオネイン1A（MT1A）、メタロチオネイン1B（MT1B）、メタロチオネイン1E（MT1E）、メタロチオネイン1F（MT1F）、メタロチオネイン1G（MT1G）、メタロチオネイン1H（MT1H）、メタロチオネイン1I偽遺伝子（MT1IpまたはMTE）、メタロチオネイン1L（LT1LまたはMT1R）、メタロチオネイン1M（MT1MまたはMT1K）、メタロチオネイン1X（MT1X）、メタロチオネイン2（MT2）、メタロチオネイン2A（MT2A）、メタロチオネイン3（MT3）、およびメタロチオネイン4（MT4）のうちの1種または複数種である。
【０００８】
本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、方法は、1種または複数種のMTを対象へ投与する工程を含む。
【０００９】
本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、方法は、1種または複数種のMTをコードする造血幹細胞（HSC）によって、対象の脳およびCNS外組織において持続性の混合造血キメリズムを生成する工程を含む。本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、方法は、例えば、CD34+、CD38-のうちの一つまたは複数である造血幹細胞（HSC）を投与することによって、リソソーム蓄積障害を有する対象またはそれを発症するリスクが高い対象を処置する工程を含み、ここで、HSCは、破壊的前処置と組み合わせて、静脈内に（IV）または脳室内（ICV）注射によって投与される。本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、CD34+、CD38-のうちの一つまたは複数である単離されたHSCは、1種または複数種の治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドを発現するベクターによって形質転換される。様々な態様において、HSCは、1種または複数種のメタロチオネイン+/-（標的疾患において欠損している）関心対象のリソソーム酵素を発現するよう、組み込みベクター、即ち、レンチウイルスベクターによって改変される。本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、方法は、対象において内在性の骨髄系細胞およびミクログリアならびに/またはそれらの前駆細胞を前処置計画によって破壊する工程、ならびにHSC生着によってミクログリアを再構成する工程を含む。本明細書中に記述されたいずれかの局面の様々な態様において、HSCは、破壊的前処置と組み合わせて投与される。様々な態様において、破壊的前処置は、細胞傷害性薬剤を対象へ投与する工程を含む。様々な態様において、アルキル化剤は、ブスルファンである。様々な態様において、破壊的前処置は、HSCを投与する前に実施される。
【００１０】
本発明のその他の特色および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１１】
定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参照が、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を、当業者に提供する：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書中で使用されるように、他に特記されない限り、以下の用語は、以下においてそれらに与えられる意味を有する。
【００１２】
「薬剤」とは、低分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００１３】
「寛解させる」とは、疾患の発症または進行を減少させるか、抑制するか、減弱させるか、縮小させるか、阻止するか、または安定化することを意味する。
【００１４】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用されるように、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子をさす。「抗体断片」という用語は、完全抗体の一部分をさし、かつ完全抗体の抗原性決定可変領域をさす。
【００１５】
「変更」または「変化」とは、増加または減少を意味する。変更は、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％と少なくてもよいし、または40％、50％、60％であってもよいし、または70％、75％、80％、90％、もしくは100％と多くてもよい。
【００１６】
「生物学的試料」とは、生物に由来する組織、細胞、液体、またはその他の材料を意味する。
【００１７】
「捕獲試薬」とは、核酸分子またはポリペプチドを選択するかまたは単離するため、核酸分子またはポリペプチドと特異的に結合する試薬を意味する。
【００１８】
本明細書中で使用されるように、「決定」、「査定」、「アッセイ」、「測定」、および「検出」という用語は、定量的決定および定性的決定の両方をさし、従って、「決定」という用語は、「アッセイ」、「測定」等と交換可能に本明細書中で使用される。定量的決定が意図される場合、分析物等の「量の決定」という語句が使用される。定性的決定および/または定量的決定が意図される場合、分析物の「レベルの決定」または分析物の「検出」という語句が使用される。
【００１９】
「検出する」とは、検出すべき分析物の存在、欠如、または量を同定することをさす。
【００２０】
「検出可能標識」とは、関心対象の分子に連結された時に、その分子を、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段を介して検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、（例えば、ELISAにおいて一般的に使用される）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
【００２１】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損なうかまたはそれに干渉する状態または障害を意味する。
【００２２】
「有効量」とは、未処置の患者と比べて、疾患の症状を寛解させるために必要とされる量を意味する。疾患の治療的処置のため、本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および全身健康状態に依って変動する。最終的には、主治医または獣医が、適切な量および投薬計画を決定するであろう。そのような量は、「有効」量と呼ばれる。
【００２３】
「断片」とは、参照タンパク質または参照核酸と実質的に同一であるタンパク質または核酸の一部分を意味する。いくつかの態様において、その一部分は、本明細書中に記載された参照タンパク質または参照核酸の生物学的活性の少なくとも50％、75％、もしくは80％、またはより好ましくは、90％、95％、もしくはさらには99％を保持している。
【００２４】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、そのネイティブ状態において見出される通常それに付随している成分が、様々な程度に除去されている材料をさす。「単離する」とは、最初の起源または環境からのある程度の分離を示す。「精製する」とは、単離より高度の分離を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がそのタンパク質の生物学的特性に実利的に影響せず、その他の有害な結果も引き起こさないよう、他の材料が十分に除去されている。即ち、組換えDNA技術によって作製された時には、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地が、化学合成された時には、化学的前駆物質もしくはその他の化学物質が、実質的に除去されている場合、本発明の核酸またはペプチドは、精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを与えることを意味し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受ける可能性のあるタンパク質については、異なる修飾が異なる単離されたタンパク質を生じさせる場合があり、それらは別々に精製され得る。
【００２５】
「単離されたポリペプチド」とは、天然にそれに付随している成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、天然に会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子が、少なくとも60重量％、除去されている時、そのポリペプチドは単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、より好ましくは、少なくとも90重量％、最も好ましくは、少なくとも99重量％、本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然起源からの抽出、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現；またはタンパク質の化学合成によって得られてよい。純度は、適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定され得る。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、「リソソーム蓄積障害（SD）」とは、リソソームにおける基質（例えば、スルファチド、ヘパラン硫酸、糖脂質、セラミド）の貯留をもたらす異常な代謝に起因する疾患の群のいずれかをさす。例えば、リソソーム蓄積障害（LSD）は、一般的には、脂質、糖タンパク質（糖含有タンパク質）、またはいわゆるムコ多糖の代謝のために必要とされる酵素の欠損の結果として、リソソーム機能不全によって引き起こされる。
【００２７】
「マーカー」とは、疾患、障害、または状態に関連した変更を有する臨床的指標、タンパク質、代謝物質、またはポリヌクレオチドを意味する。
【００２８】
「ミクログリア」とは、中枢神経系の免疫細胞を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、「神経変性疾患」とは、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造および/または機能の進行性の喪失を特徴とする疾患をさす。
【００３０】
「増殖の増加」とは、インビボまたはインビトロの細胞の細胞分裂の増加を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」等の用語は、ある障害または状態を有していないが、それを発症するリスクを有するかまたは発症しやすい対象において、その障害または状態の発症の確率を低下させることをさす。
【００３２】
「対象」または「患者」という用語は、処置、観察、または実験の対象である動物をさす。例に過ぎないが、対象には、ヒト、または非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコのような非ヒト哺乳類を含むが、これらに限定されるわけではない、哺乳類が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
「低下させる」とは、少なくとも10％、25％、50％、75％、または100％の負の変更を意味する。
【００３４】
「参照」とは、比較の基準または対照条件を意味する。
【００３５】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書中に記載されたアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書中に記載された核酸配列のいずれか1つ）との少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸の分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、少なくとも60％、より好ましくは、80％もしくは85％、より好ましくは、90％、95％、96％、97％、98％、もしくはさらに99％、またはそれ以上、比較のために使用された配列とアミノ酸レベルまたは核酸レベルで同一である。
【００３６】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center（1710 University Avenue,Madison,Wis.53705）のSequence Analysis Software Package、BLASTプログラム、BESTFITプログラム、GAPプログラム、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および/またはその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムが使用され得、e-3〜e-100の確率スコアが、密接に関連した配列を示す。
【００３７】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100％同一である必要はなく、典型的には、実質的同一性を示すであろう。内在性配列との「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1本の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件の下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載された遺伝子）またはそれらの一部分と対合して二本鎖分子を形成することを意味する（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照すること）。
【００３８】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウムより低く、好ましくは、約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウムより低く、より好ましくは、約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウムより低い。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得られ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは、少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で得られ得る。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは、少なくとも約37℃、最も好ましくは、少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの内含または不含のような様々な付加的なパラメータは、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDSにおいて、30℃で行われるであろう。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）において、37℃で行われるであろう。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAにおいて、42℃で行われるであろう。これらの条件の有用な変動は、当業者に容易に明白であろう。
【００３９】
大部分の適用について、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーに関して変動するであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義され得る。前記と同様に、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少または温度の増加によって増加し得る。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウムより低く、最も好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウムより低いであろう。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは、少なくとも約42℃、さらに好ましくは、少なくとも約68℃の温度を含むであろう。好ましい態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて、25℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて、42℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて、68℃で行われるであろう。これらの条件の付加的な変動は、当業者に容易に明白であろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkに記載されている。
【００４０】
「特異的に結合する」とは、試料、例えば、生物学的試料において、ある分子（例えば、ポリペプチド）を認識し、それに結合するが、他の分子は実質的に認識せず結合しない化合物（例えば、ペプチド）を意味する。
【００４１】
本明細書中で使用されるように、「処置する」、「処置すること」、「処置」等の用語は、障害および/またはそれに関連した症状を低下させるかまたは寛解させることをさす。不可能ではないが、障害または状態の処置は、障害、状態、またはそれらに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが認識されるであろう。
【００４２】
特記されるかまたは前後関係から明白でない限り、本明細書中で使用されるように、「約」という用語は、当技術分野において通常許容される範囲内、例えば、平均値の2標準偏差以内と理解される。約とは、明記された値の10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、または0.01％以内と理解されてもよい。前後関係から他のことが明らかでない限り、本明細書中に提供される数値は、全て、約という用語によって修飾される。
【００４３】
本明細書中に提供される範囲は、範囲内の全ての値の略記であることが理解される。例えば、1〜50の範囲には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲が含まれることが理解される。
【００４４】
本明細書中に提供される化合物、組成物、または方法は、本明細書中に提供される他の組成物および方法のいずれか一つまたは複数と組み合わせられてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用されるように、単数形「1つ（a）」、「1つ（an）」、および「その（the）」には、前後関係がそうでないことを明らかに指示しない限り、複数形が含まれる。従って、例えば、「1つのバイオマーカー（a biomarker）」の言及には、複数のバイオマーカーの言及が含まれる。
【００４６】
特記されるかまたは前後関係から明白でない限り、本明細書中で使用されるように、「または」という用語は、包括的であることが理解される。
【００４７】
「を含む（including）」という用語は、「を含むが、それらに限定されるわけではない」を意味するために本明細書中で使用され、「を含むが、それらに限定されるわけではない」という語句と交換可能に使用される。
【００４８】
本明細書中で使用されるように、「を含む（comprises）」、「を含む（comprising）」、「を含有する（containing）」、「を有する（having）」等の用語は、米国特許法においてそれらに与えられた意味を有することができ、「を含む（includes）」、「を含む（including）」等を意味することができ；「から本質的になる」または「本質的になる」も、同様に、米国特許法において与えられた意味を有することができ、その用語は非限定的であり、列挙されたものの基本または新規の特徴が、列挙されたもの以外の存在によって変化しない限り、列挙されたもの以外の存在を可能にするが、先行技術の態様は除外する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】LSDにおける治療剤としてのMTの前臨床試験のための疾患モデル選択を示す。図1Aは、示されるように、GLD患者、MLD患者、NPC患者、およびNCL患者に由来する死後脳試料におけるMT免疫反応性の代表的な写真を示す。白質ジストロフィーについては灰白質および白質（GMおよびWM）が示され、NPCおよびNCLについてはGMのみが示されている。MT免疫反応性は、皮質および白質の両方においてアストロサイトに主として関連している。ニューロンは、NCL脳試料においてのみMT免疫反応性を示し（＊）、MT陽性組織球（#）は、MLDにおいてのみ観察された。倍率40倍。
【図１Ｂ】LSDにおける治療剤としてのMTの前臨床試験のための疾患モデル選択を示す。図1Bは、年齢が等しい正常ドナー（ND）試料と比較した、神経学的関与を含むLSDの脳におけるLrp2 mRNAの相対存在量を提供するグラフである。平均値±SEM。一元配置のAnovaおよびボンフェローニの事後検定（post-test）、＊＊＝P値＜0.01。GLD n＝2、NPC n＝3、MLD n＝3、NCL n＝4、ND＝12。
【図１Ｃ】LSDにおける治療剤としてのMTの前臨床試験のための疾患モデル選択を示す。図1Cは、4種のLSD脳（GLD n＝1、NPC n＝1、MLD n＝1、NCL n＝2）および3種のNDに由来するタンパク質抽出物におけるメガリン/Lrp2タンパク質についての免疫反応性を示すウエスタンブロットである。αアクチン免疫反応性は、タンパク質負荷についての対照として査定された。
【図１Ｄ】LSDにおける治療剤としてのMTの前臨床試験のための疾患モデル選択を示す。図1Dは、LSDマウスモデルにおけるMT1 mRNA発現レベルを示すグラフである。mMT1レベルは、以下のLSDマウスモデル：GLD（n＝6、40日）、MLD（n＝4、10ヶ月）、サンドホフ（SD、n＝4、3.5ヶ月）、INCL（n＝4、200日）、MPSI（n＝4、10ヶ月）、MPSII（n＝3、10ヶ月）、MPSIII（n＝4、40日）、多種スルファターゼ欠損（MSD、n＝5、2〜3週）において測定され、異なる齢の20匹のWTマウスと比較された。一元配置のAnova、ダネットの補正、＊＊＝P値＜0.01、＊＝P値＜0.05。
【図２Ａ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Aは、ナイーブおよびMTトランスジェニックのGalc-/-マウスおよびPpt1-/-マウスにおけるMT脳発現を示すグラフである。MTtgマウス（n＝8）、GLDマウス（n＝8）、MT-GLDマウス（n＝8）、INCLマウス（n＝5）、およびMT-INCLマウス（n＝5）におけるMT-1発現レベル（MT-1 mRNA存在量）を、WTレベルに対する倍率として計算した。平均値およびSEM。一元配置のANOVAおよびボンフェローニの事後検定：＊＊＝P値＜0.01、＊＝P値＜0.05。両方のナイーブ動物疾患モデルにおいて、MT発現は、反応性疾患機序のため、野生型レベルより増加している；MT発現は、影響されたマウスのMTトランスジェニック系統との交配によって、さらに増加する。
【図２Ｂ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Bは、アストロサイト（GFAP−赤）、メタロチオネイン（MT−緑）、およびDAPIについて染色されたPND36のMT-GLDマウスの橋領域の代表的な共焦点画像を示し、アストロサイトにおける発現のMT特異性を確認している。倍率20倍（左）および40倍（右）。
【図２Ｃ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Cは、ミクログリア（IBA−赤）、メタロチオネイン（MT−緑）、およびDAPIについて染色されたPND36のGLDマウスおよびMT-GLDマウスの橋領域の代表的な共焦点画像を示し、両方の動物においてミクログリアシグナルと共局在するMT陽性細胞はほとんど存在しないこと、およびMT-GLD試料においてMT染色がより強いことを示している。倍率20倍。
【図２Ｄ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Dおよび図2Eは、MT1トランスジェニック（過剰発現）マウスを、それぞれ、リソソーム蓄積症であるグロボイド細胞白質ジストロフィー（またはクラッベ病）および神経セロイドリポフスチン症1型の動物モデルであるGalc-/-マウスまたはPpt1-/-マウスのいずれかと交配させた実験を示す。図2Dは、MT-GLDマウスおよびGLDマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を提供する。データは、ログランク（マンテル・コックス）検定によって分析された；P値＜0.0001。図2Eは、MT-INCLマウスおよびINCLマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を提供する。データは、ログランク（マンテル・コックス）検定によって分析される；P値＜0.0001。非トランスジェニックの影響されたマウスに対するトランスジェニックの（MTを過剰発現している）影響された動物の生存優位性を示す、ナイーブおよびMTトランスジェニックのGalc-/-マウス（図2D）およびPpt1-/-マウス（図2E）の生存曲線を生成した。
【図２Ｅ】図２Ｄの説明を参照のこと。
【図２Ｆ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Fは、MT-INCLマウスおよびINCLマウスの疾患重症度スコア（DSS）を示すグラフである。INCL、n＝10およびMT-INCL、n＝10。二元配置のANOVA反復測定の後のボンフェローニ補正：＊P値＜0.05、＊＊＊P値＜0.001。生存250日目までのナイーブおよびMTトランスジェニックのPpt1-/-マウスにおける平均疾患スコア。疾患スコアは、運動機能、筋肉強度、および発作の発生頻度を考慮に入れたものである。
【図２Ｇ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Gは、GLDおよびMT-GLDの両方のデータセットを含む、図2Dの生存データと、図2Aに提示された（WTレベルに対する倍率として表された）MTレベルとの相関を示すグラフである。図は、生存増進に関連した最小MTレベルを同定する、同一の動物におけるMT発現レベルと共に内挿された自然発生疾患モデルの最大生存を表す。GLDマウスおよびMT-GLDマウスにおいて検出されたMTレベルの範囲も、ここに示される。
【図２Ｈ】GLD動物モデルおよびINCL動物モデルにおけるMTの表現型効果を示す。図2Hは、INCLおよびMT-INCLの両方のデータセットを含む、図2Eの生存データと、図2Aに提示された（WTレベルに対する倍率として表された）MTレベルとの相関を示すグラフである。図は、生存増進に関連した最小MTレベルを同定する、同一の動物におけるMT発現レベルと共に内挿された自然発生疾患モデルの最大生存を表す。INCLマウスおよびMT-INCLマウスにおいて検出されたMTレベルの範囲も、ここに示される。
【図３Ａ】MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおける抗炎症遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、および抗酸化ストレス遺伝子のモジュレーションを示す。図3Aは、4種の試験された群におけるディファレンシャルに発現された遺伝子、アップレギュレートされた遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子を表す階層的クラスタリングを提供する。バーで示されるように、過剰発現は赤色のシェードで、過少発現は青色のシェードで可視化された。トランスクリプトームアレイは、全てPND36で分析された以下のマウスに由来する小脳抽出物に対して実施された：3匹のWT、3匹のMTtg、3匹のMT-GLD、および3匹のGLD。
【図３Ｂ】MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおける抗炎症遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、および抗酸化ストレス遺伝子のモジュレーションを示す。図3B、図3C、および図3Dは、LSDおよびMT-LSDの脳試料におけるIfi44（図3B）、Hpgd（図3C）、およびCasp4（図3D）の発現変動を示すグラフである。図3B−図3C−図3Dの左のパネルは、トランスクリプトーム分析データから計算された示された対における発現変化倍率を示し；MT-GLD対GLDのIfi44の変化倍率は-2,5528であり（P値＜0.001）；MT-GLD対GLDのHpgdの変化倍率は-2,24130（P値＜0.001）であり；MT-GLD対GLDのCasp4の変化倍率は-1,75215（P値＜0.01）である。図3B、図3C、および図3Dの中央および右のパネル、Ifi44（図3B）、Hpgd（図3C）、およびCasp4（図3D）は、MTtgマウス、GLDマウス、およびMT-GLDマウス（中央のパネル）ならびにMT-Tgマウス、INCLマウス、およびMT-INCLマウス（右のパネル）においてqPCRによって計算された相対mRNA存在量を示す；各群n＝4マウス；平均値およびSEM；一元配置のAnovaおよびボンフェローニの事後検定によって分析、＊P値＜0.05、＊＊P値＜0.01、＊＊＊P値＜0.001。Casp4の発現は、ナイーブの影響された対照と比較して、トランスジェニックの影響されたマウスにおいて低下している。
【図３Ｃ】図３Ｂの説明を参照のこと。
【図３Ｄ】図３Ｂの説明を参照のこと。
【図３Ｅ】MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおける抗炎症遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、および抗酸化ストレス遺伝子のモジュレーションを示す。図3Eは、WTマウス、GLDマウス、およびMT-GLDマウスの脳切片におけるニトロチロシン（ニトロ）染色の代表的な写真を示す。他の領域は同一の発現パターンで分析された。全ての動物がPND36で分析された。倍率40倍。
【図３Ｆ】MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおける抗炎症遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、および抗酸化ストレス遺伝子のモジュレーションを示す。図3Fは、WT（n＝3）に対する倍率として表された、PND36のGLD（n＝3）およびMT-GLD（n＝3）のCNS（小脳、脳梁、および脳幹が分析された）、1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域におけるニトロチロシン免疫陽性領域の定量化を示すグラフである。データは、MT-GLD対GLDを比較する独立t検定によって分析された。＊＊＊P値＜0.001。平均値およびSEM。ニトロチロシンの発現は、ナイーブの影響された対照と比較して、トランスジェニックの影響されたマウスにおいて低下している。
【図３Ｇ】MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおける抗炎症遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、および抗酸化ストレス遺伝子のモジュレーションを示す。図3Gは、マウス脳（WT n＝5、GLD n＝5、およびMT-GLD n＝5）から単離された骨髄系細胞と共にインキュベートされた蛍光色素H2DCFDAによって測定され、フローサイトメトリーで分析された細胞内活性酸素種（ROS）を示すグラフおよびヒストグラムを含む。図3G（左のパネル）は、全生存骨髄系細胞のうちの％DCFDA陽性細胞として提示された結果を示す。平均値およびSEM。（Gの右のパネル）陽性対照（Co+、H2O2が補足されたWT細胞）を含む、代表的なヒストグラム。DCDFAの発現は、ナイーブの影響された対照と比較して、トランスジェニックの影響されたマウスにおいて低下している。
【図４−１】MT-GLDモデルおよびMT-INCLモデルの両方においてプルキンエ細胞喪失が救済されることを示す。図4A、図4B、図4C、図4D、および図4Eは、Galc-/-マウスまたはPpt1-/-マウスにおけるMTの神経保護効果を示す代表的な画像およびグラフである。野生型マウスならびにナイーブおよびMTトランスジェニックのGalc-/-マウス（図4A、図4B）およびPpt1-/-マウス（図4C）に由来する小脳切片が示される。プルキンエ細胞は、陽性カルビンディン（CALB）染色（A）およびクリスタルバイオレットでの形態学的特性（C）によって検出可能である。プルキンエ細胞を定量化したところ、疾患動物において著しく低下しているが、疾患MTトランスジェニックマウスにおいては低下していないことが示された。図4Aは、WTマウス、GLDマウス、およびMT-GLDマウスの小脳のスライスにおけるカルビンディン染色の代表的な写真を示す。全ての動物がPND36で分析された。図4Bは、100μm（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）内の細胞数として表された、PND36のWTマウス（n＝3）、GLDマウス（n＝3）、およびMT-GLDマウス（n＝3）の小脳におけるカルビンディン陽性細胞の定量化を示すグラフである。平均値およびSEM。データは、一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正によって分析される；＊＊＊P値＜0.001。図4Cは、PND36のWT、GLD、およびMT-GLDの小脳におけるパルブアルブミン染色の代表的な写真を示す。核はTopro IIIで染色された。図4Dは、100μm（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）内の細胞数として表された、PND36のWTマウス（n＝3）、GLDマウス（n＝3）、およびMT-GLDマウス（n＝3）の小脳におけるパルブアルブミン陽性細胞の定量化を示すグラフである。平均値およびSEM。データは、一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正によって分析される；＊＊＊＊P値＜0.0001。図4Eは、WT、INCL、およびMT-INCLの小脳におけるプルキンエ細胞を検出するためのニッスル染色の代表的な写真を示す。全ての動物が、200日の中間疾患段階で分析された。図4Fは、100μm（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）内の細胞数として表された、PND200のWT（n＝5）、INCL（n＝5）、およびMT-INCL（n＝5）のカルビンディンカウントを示すグラフである。平均値およびSEM。データは一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正によって分析される；＊＊＊＊P値＜0.001。図4Gは、WT（n＝3）、GLD（n＝3）、およびMT-GLD（n＝3）の橋領域（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）におけるレクチン陽性領域の定量化を示すグラフである（しかし、小脳および脳梁のような他の脳領域においても同一の発現パターンが検出された）。データは、WTレベルに対する比として表される。平均値およびSEM。データは一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正によって分析される。図4Hは、PND200のWT（n＝5）、INCL（n＝5）、およびMT-INCL（n＝5）の異なる脳領域（皮質、視床、海馬）（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）における自己蛍光陽性領域の定量化を示すグラフである。データはWTに対する比として表され、核はDAPIによって染色された。平均値およびSEM。データは一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正によって分析される。
【図４−２】図４−１の説明を参照のこと。
【図５−１】MTがGLDおよびINCLにおいて抗炎症M2様ミクログリア表現型を誘導することを示す。図5Aは、WT、GLD、およびMT-GLDの橋領域におけるGFAP染色の代表的な写真を示す。全ての動物がPND36で分析された。倍率20倍。図5Bは、PND36のWT（n＝3）、GLD（n＝3）、およびMT-GLD（n＝3）の橋領域におけるGFAP免疫陽性領域の定量化を示すグラフである（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）。INCLモデルについて、分析は、PND200のWT（n＝3）、INCL（n＝5）、およびMT-INCL（n＝5）に対して実施された（視床、皮質、および海馬に由来する1匹当たり1領域当たり3スライス、1スライス当たり2領域）。データは、各モデルについてWTに対する比として提示され、独立t検定によって分析される。平均値およびSEM。図5Cは、WT、GLD、およびMT-GLDの橋領域におけるIBA染色の代表的な写真を示す。全ての動物がPND36で分析された。倍率20倍。図5Dは、PND36のWT（n＝3）、GLD（n＝3）、およびMT-GLD（n＝3）の橋領域におけるIBA免疫陽性領域の定量化を示すグラフである（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）。INCLモデルについて、分析は、PND200のWT（n＝3）、INCL（n＝5）、およびMT-INCL（n＝5）に対して実施された（視床、皮質、および海馬に由来する1匹当たり1領域当たり3スライス、1スライス当たり2領域）。データは、各モデルについてWTに対する比として提示され、独立t検定によって分析される。平均値およびSEM。
【図５−２】MTがGLDおよびINCLにおいて抗炎症M2様ミクログリア表現型を誘導することを示す。図5E、図5F、図5G、図5H、および図5Iは、Galc-/-マウスまたはPpt1-/-マウスにおけるミクログリア表現型に対するトランスジェニックMT過剰発現の効果を示すグラフである。野生型動物、ナイーブの影響された動物、およびMTトランスジェニックの影響された動物の脳からミクログリアを選別し、リストされた遺伝子の発現について試験した。ナイーブの影響された動物は、MTトランスジェニックの影響された動物において低下する、優位な炎症誘発性ミクログリア表現型（IL1βおよびTNFαの増加した発現）を有する。MTトランスジェニックの影響された動物においては、神経保護ミクログリア表現型に関連したマーカー（CD206、ARG1、YM1）の発現の増加も観察される。PND36のWTマウス（n＝6）、MTtgマウス（n＝3）、GLDマウス（n＝5）、およびMT-GLDマウス（n＝5）、ならびにPND200のINCLマウス（n＝5）およびMT-INCLマウス（n＝5）の脳から選別によって単離された全骨髄系集団におけるCD206（図5E）、アルギナーゼ1（図5F）、YM1（図5G）、IL1β（図5H）、TNFα（図5I）のmRNAの相対存在量を示すグラフ。データは、一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正によって分析された、WTレベルに対する倍率として表される；＊＊＊＊P値＜0.001。平均値およびSEM。図5Jは、WT（n＝3）、GLD（n＝3）、およびMT-GLD（n＝3）の橋領域（1匹当たり3スライス、1スライス当たり2領域）におけるCD206免疫陽性領域の定量化を示すグラフである。データは、WTに対する比として表され、MT-GLD対GLDを比較する独立t検定によって分析される；＊＊P値0.0085。
【図５−３】MTがGLDおよびINCLにおいて抗炎症M2様ミクログリア表現型を誘導することを示す。図5Kは、IBAシグナルのCD206との共局在を示す、MTtgマウス、GLDマウス、およびMT-GLDマウスの橋領域の代表的な写真を示す。倍率40倍。
【図６−１】AAV-PHP.BベクターによるMT送達がGLD表現型を寛解させることを示す。図6Aは、UT試料に対する倍率として報告された、2回の独立した実験（デュプリケート）における1コピーのMT-1（AAV-MT）および4コピーのMT-1（AAV-4MT）をコードするAAV-PHP.B（AAV）によって形質導入されたHEK293TにおけるMT1の相対mRNA存在量を示すグラフである。一元配置のANOVAおよびボンフェローニ補正；＊P値＜0.05、＊＊＊P値＜0.001。平均値およびSEM。図6Bは、2群間の有意差を示す、対照としてのPBSを注射されたマウス（n＝5）と比較した、AAV-4MTを静脈内（IV）注射されたGLDマウス（IV AAV）（n＝7）のカプラン・マイヤー生存曲線である。データは、ログランク（マンテル・コックス）検定によって分析された。P値0.0059。図6Cは、MTtg過剰発現トランスジェニックマウス（n＝8）、AAV-4MTベクターを注射されたGLDマウス（IV AAV）（n＝7）、対照としてのPBSを注射されたGLDマウス（n＝5）の脳におけるMT-1の相対mRNA存在量を示すグラフである。平均値およびSEM。
【図６−２】AAV-PHP.BベクターによるMT送達がGLD表現型を寛解させることを示す。図6Dは、GLDおよびAAV-GLDの両方のデータセットを含む、図6Bの生存データと、同一のマウスにおいて測定されたMTレベルとの相関を示すグラフである。図は、生存増進に関連した最小MTレベルを同定する、同一の動物におけるMT発現レベルと共に内挿された自然発生疾患モデルの最大生存を表す。GLDマウスおよびAAV-GLDマウスにおいて検出されたMTレベルの範囲も、ここに示される。図6E、図6F、および図6Gは、WT試料に対する倍率として報告された、AAV-4MTまたはPBSをIV注射されたGLDマウスの脳におけるIfi44（図6E）、Hpgd（図6F）、およびCasp4（図6G）の相対mRNA存在量を示すグラフを含む。＊P値＜0.05、独立t検定による。平均値およびSEM。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明は、リソソームの疾患および障害（例えば、神経セロイドリポフスチン症）の処置および予防のために有用な組成物および方法を特色とする。様々な態様において、方法は、対象におけるメタロチオネインポリペプチドまたはメタロチオネインポリヌクレオチドのレベル、発現、または活性を増加させる工程を含む。いくつかの態様において、方法は、ミクログリアの破壊および/または再構成の工程を含む。
【００５１】
本発明は、本明細書中に記載されたいくつかの発見に少なくとも一部分基づく。メタロチオネインポリペプチドのレベルの増加が、リソソームの疾患または障害を有する対象において治療的利益を有することが見出された。
【００５２】
リソソーム蓄積障害（LSD）は、特異的なリソソーム酵素の活性の欠損によって引き起こされる遺伝性代謝疾患の広いクラスである。中枢神経系（CNS）徴候は、LSD患者の約50％に存在し、患者にとってのアンメット・メディカル・ニーズを表す。神経保護役割が報告されている新たに同定されたタンパク質のファミリー、メタロチオネイン（MT）の治療的可能性を、CNS関与を含む2種のLSDのマウスモデルにおいて探究する組成物および方法が、本明細書中に開示される。
【００５３】
40年以上分類され研究されているにも関わらず、臨床徴候を担う病理学的機序に関しても、しばしば致命的である転帰を寛解させ得る治療アプローチに関しても、依然として多くの知識が欠けている。現在の治療には、健常適合性ドナーからの造血細胞移植および酵素補充が含まれるが、それらは、中枢神経系を効率的に標的とすることができず、神経変性にタイミングよく干渉することもできないため、大部分のLSDについて、疾患に関連した神経学的症状の処置において有効でない（Escolar et al,2005）。改変された自己造血細胞を使用した遺伝子治療は、移植された子孫細胞がレシピエントの脳に移動する能力と、同一の組織浸潤細胞による超生理学的レベルの酵素発現に到達する可能性とをカップリングした、新興の有望な戦略である。いくつかのLSDについて、それは、正の臨床的転帰を有することが既に立証されている（Sessa M et al,2016）。
【００５４】
メタロチオネイン（MT）は、急性および慢性の脳疾患のための神経保護分子および可能性のある治療ツールとして記載されているが、現在までのところ、神経細胞障害性LSDの処置のためには提唱されていない。MTは、疾患脳において抗酸化機能および神経保護機能を発揮することが公知である金属結合非酵素タンパク質のファミリーであり、疾患脳において、アストロサイトから放出され、受容体Lrp2/メガリンを通してアストロサイト自体およびニューロンに再び取り込まれる（Chung et al,2008）。生理学的レベルより高いMTの全身投与または局所投与は、急性脳損傷に対する保護効果に関連していることが常に示されているが、より最近、多くのグループが、パーキンソン病（Ebadi et al,2005）、筋萎縮性側索硬化症（Tokuda et al,2014）、およびアルツハイマー病（Manso et al,2016）のような慢性疾患におけるMT過剰発現の有益な役割を報告した。本発明者らは、最近、メタロチオネインファミリーのメンバーが、LSDによって影響された患者およびマウスの中枢神経系において高発現していることを同定し、この観察は、これらの疾患における神経傷害の病原においてMTが果たす推定上の役割を示唆している（Cesani et al,2014）。本発明者らおよびその他のグループのデータに基づき、メタロチオネインは、神経学的状態の治療剤として大きい可能性を有することが明らかになりつつある。
【００５５】
この可能性を完全に活用するため、MTの治療的役割を、LSDにおける神経学的傷害の軽減において調査した。LSDバックグラウンドにおける構成的に高いレベルのMTの効果を査定するため、全ての組織においてMT-1を過剰発現するトランスジェニックマウス（B6.Cg-Tg(Mt1)174Bri/J系統、The Jackson Laboratory）を、グロボイド細胞白質ジストロフィー（GLD）の自然発生マウスモデル（Twitcherマウスとも呼ばれる）（Suzuki,1995）と交配させた。GLDは、急速な進行性の脱髄およびニューロン変性を特徴とする、βガラクトセレブロシダーゼ（GALC）の活性の欠損によって引き起こされる、典型的な神経細胞障害性リソソーム蓄積症である。疾患脳においてMTによって発揮される可能性のある保護特色に関する手掛かりを獲得するため、交配させられた動物の中枢神経系病理を特異的に分析した。単独の保護剤は、GLDのような重度のLSDを治癒させないと予想されるにも関わらず、MTは、増加した生存をもたらす有益な効果を発揮することが示された。さらに、ニューロンは、MTによって媒介される神経保護によって主に標的とされる細胞型であるため、具体的なニューロン疾患（Gupta et al,2001）においてMTによって媒介される効果を査定するため、同一のMT過剰発現戦略を、乳児神経セロイドリポフスチン症（INCL）マウスモデルに適用した。MT追加の一貫した有益な効果が確認された。MTの記載された機能と一致して、それらの効果は、抗炎症、抗酸化、および抗アポトーシスの機序に広範囲に関連している。
【００５６】
リソソーム蓄積症（LSD）
リソソーム蓄積障害（LSD）には、リソソーム機能の崩壊を特徴とする40種を超える異なる疾患が含まれる。これらの状態の大部分が、深刻な神経変性を特徴とする（Platt FM,Nature 2014；510（7503））。リソソーム機能不全は、アポトーシスをもたらす、細胞の器質的傷害および/または細胞ホメオスタシスの変化を引き起こす、不完全に分解された基質の貯留に至る（Futerman AH et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 2004;5(7)）。さらに、複雑な細胞シグナリング機序の撹乱が、LSDにおける組織傷害に寄与する炎症のような二次的な構造的変化および生化学的変化を起こさせる。中枢神経系（CNS）徴候は、LSDの約50％に存在し、患者にとっての未解決の医学的必要を表す。
【００５７】
現在利用可能な治療には、健常適合性ドナーからの造血細胞移植、酵素補充療法、および基質低下戦略が含まれる。これらのアプローチは、一般に、CNSを効率的に標的とすることができず、神経傷害にタイミングよく干渉することができず、特に、症候性の患者において、複雑なLSD脳病理を標的とすることができないため、LSDの神経学的症状の処置において全くまたは部分的にしか有効でない（Musolino PL et al.,Neuropediatrics 2014;45(3)）。革新的な治療戦略が、初期臨床試験の情況において試験されたことがあり、現在も試験されている。これらの新規のアプローチは、LSD CNSへの効果的な酵素送達を目標としており、脳指向性酵素補充戦略（即ち、ClinicalTrials.gov番号NCT02055118）、直接実質内/くも膜下腔内遺伝子移入によるインビボ遺伝子治療（即ち、ClinicalTrials.gov番号NCT01801709およびNCT02725580）、または、即ち、造血幹細胞に基づく、エクスビボ遺伝子治療（即ち、ClinicalTrials.gov番号NCT01560182）を含む。興味深いことに、後者の戦略によって、症状が出現する前の段階において処置された患者において、有望な結果が観察された。（Biffi A.,Hum Mol Genet 2016;25(R1)；Sessa M.et al.,Lancet 2016;388(10043)）。しかしながら、これらの初期の有望な所見にも関わらず、CNS関与を含む大部分のLSD患者は、治癒的処置を欠く。
【００５８】
リソソーム蓄積症には、非限定的に、神経セロイドリポフスチン症（NCL）、GM1ガングリオシドーシスおよびGM2ガングリオシドーシス、αマンノース症、グロボイド細胞白質ジストロフィー（GLD）、神経セロイドリポフスチン症（NCL）、異染性白質ジストロフィー（MLD）、ムコ多糖症（MPS）、多種スルファターゼ欠損（MSD）、ならびにニーマン・ピック病が含まれる。上にリストされた例の場合のように、LSDの約50％が、CNS関与を含む。例示的なSDおよびそれらの関連する欠陥タンパク質の非限定的なリストは、表1に提供される。
【００５９】
（表１）リソソーム蓄積障害（LSD）およびそれらの関連する欠陥タンパク質
2020505446.tif 000003
【００６０】
一つの局面において、本発明のいくつかの局面において記載されるHSC移植プロトコルの使用に特に関連した数種のLSDの情報が、本明細書中に開示される。
【００６１】
神経セロイドリポフスチン症（NCL）
神経セロイドリポフスチン症は、進行性の神経学的変性をもたらす遺伝性蓄積障害のクラスである。遅発性乳児型NCL（LINCL）のようないくつかのバリアントは、リソソーム酵素の欠損によって引き起こされる。LINCLは、膜タンパク質の分解を担うリソソーム酵素TPP-Iの欠損をもたらす、CLN2遺伝子の変異によって引き起こされる。ニューロンは、この蓄積材料のリソソーム貯留に特に感受性であり、LINCLを有する個体は、脳の全ての部分に広範囲の進行性の神経変性を有し、それは、8〜12歳までに植物状態および死をもたらす。
【００６２】
異染性白質ジストロフィー（MLD）
アリールスルファターゼA（ARSA）遺伝子の変異による脱髄性LSDである異染性白質ジストロフィー（MLD）は、神経系における未分解基質の進行性の貯留ならびに二次的な神経炎症および変性を含むLSDの原型的な例である。MLDの遺伝子伝達は、常染色体劣性であり、その全体発生率は、1:40,000〜1:100,000と推測される。
【００６３】
重度の深刻な運動および認知の障害からなる臨床的徴候ならびに疾患進行は、早期発症型臨床的バリアントにおいてより重度であり、一般的には、生後10年以内に死に至る。MLD患者の表現型と、患者が持つARSA変異の型との間の相関が、証明されている。自己HSC形質導入のためのレンチウイルスベクターおよび全身ブスルファン前処置への曝露を利用したHSC遺伝子治療は、最も重度のMLDバリアントによって影響され、症状発病前に処置された子供において、疾患徴候の予防または緩和において有効であることが示された。
【００６４】
グロボイド細胞白質ジストロフィー（GLD）
クラッベ病としても公知のグロボイド細胞白質ジストロフィー（GLD）は、重要なミエリン成分であるガラクトシルセラミド（GalCer）の異化を触媒するリソソーム酵素ガラクトセレブロシダーゼ（GALC）の欠損によって引き起こされる常染色体劣性LSDである。GLDは、約1/100,000出生において発生する。典型的には、乳児において発生し、急速に致命的な経過を辿るが、稀な後期発病型も存在する。この壊滅的な神経変性障害は、GALC欠損によって引き起こされたスフィンゴ糖脂質異化の変更によるものであり、その結果として生じた不完全に代謝されたGalCerの貯留は、CNSおよび末梢神経系（PNS）の両方に影響する進行性の白質疾患に至る。ガラクトシルスフィンゴシン（またはサイコシン）も、GALCの基質であり、病原において重要な役割を果たすと考えられている。GLD子供は、症状が出現する前かつ4ヶ月齢未満である時、疾患発病を遅らせ、徴候を減弱する、健常適合性ドナーからのHCTによって処置され得る20。HSC遺伝子治療も、GLD前臨床モデルにおいて有効である可能性があることが立証された21。
【００６５】
ムコ多糖症（MPS）
ムコ多糖症（MPS）は、グリコサミノグリカンを分解するために必要とされるリソソーム酵素の欠如または機能異常によって引き起こされるLSDの群である。MPS Iは、症状の重症度に基づき、三つの亜型へ分割される。三つの型は、全て、酵素α-L-イズロニダーゼの欠如または不十分なレベルに起因する。（ハーラー症候群またはα-L-イズロニダーゼ欠損とも呼ばれる）MPS I Hは、MPS I亜型の中で最も重度であり、MPS I S、シャイエ症候群は、MPS Iの最も軽症の型である。MPS I H-S、ハーラー・シャイエ症候群は、ハーラー症候群単独より軽症である。MPS II、ハンター症候群またはイズロン酸スルファターゼ欠損は、酵素イズロン酸スルファターゼの欠如によって引き起こされる。MPS III、サンフィリポ症候群は、重度の神経学的症状を特徴とする。サンフィリポ症候群には、四つの異なる型が存在し、それらは、各々、ヘパラン硫酸糖鎖を完全に分解するために必要とされる異なる酵素の変更によって引き起こされる。サンフィリポAは、MPS III障害のうち最も重度であり、酵素ヘパランN-スルファターゼの欠如または変更によって引き起こされる。サンフィリポAを有する子供は、MPS III障害を有するものの中で最短の生存率を有する。サンフィリポBは、酵素α-Nアセチルグルコサミニダーゼの欠如または欠損によって引き起こされる。サンフィリポCは、酵素アセチル-Coα-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼの欠如または変更に起因する。サンフィリポDは、酵素N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼの欠如または欠損によって引き起こされる。MPS IV、モルキオ症候群は、ケラタン硫酸糖鎖を分解するために必要とされる酵素N-アセチルガラクトサミン6-スルファターゼ（A型）またはβガラクトシダーゼ（B型）の欠如または欠損に起因する。MPS VI、マロトー・ラミー症候群は、ハーラー症候群において見出される身体症状の多くを共有し、酵素N-アセチルガラクトサミン4-スルファターゼの欠損によって引き起こされる。ムコ多糖症の最も希な型のうちの一つであるスライ症候群、MPS VIIは、酵素βグルクロニダーゼの欠損によって引き起こされる。健常適合性ドナーからのHCTから利益を得ることが示されたMPS患者も存在し、一部のMPSについては、HSC GT戦略が最適化されている途中である22。
【００６６】
LSDにおける神経変性徴候
神経変性疾患は、ニューロンの構造および/もしくは機能の進行性の喪失ならびに/またはニューロン細胞死を特徴とする。炎症は、いくつかの神経変性疾患における役割について関与が示されている。運動ニューロンおよび感覚ニューロン、ならびに精神が感覚情報を外部オブジェクトへ差し向ける能力の進行性の喪失が、種々の神経変性疾患において影響される。医療専門家は、対象における神経変性疾患の一つまたは複数の症状の査定によって、対象が神経変性疾患を有することを診断することができる。対象における神経変性疾患の非限定的な症状には、足およびつま先の前部を上げることの困難；腕、脚、足、または足首の脱力；手の脱力または不器用；不明瞭発語；嚥下困難；筋痙攣；腕、肩、および舌における攣縮；咀嚼困難；呼吸困難；筋肉麻痺；部分的または完全な視力喪失；複視；身体の一部における刺痛または疼痛；頭部移動によって発生する感電感覚；振戦；不安定歩行；疲労；眩暈；記憶喪失；見当識喪失；空間的関係の誤解；読み書きの困難；集中および思考の困難；判断および意思決定の困難；慣習的作業の計画および遂行の困難；うつ；不安；引きこもり；気分変動；易刺激性；攻撃性；睡眠習慣の変化；徘徊；認知症；自動運動の喪失；姿勢およびバランスの障害；筋硬直；動作緩慢；眼球運動の遅延または異常；不随意筋反射運動または苦悶運動（舞踏病）；不随意持続性筋拘縮（ジストニア）；柔軟性の欠如；衝動コントロールの欠如；ならびに食欲の変化が含まれる。医療専門家は、対象の神経変性疾患の家族歴に、一部分、基づき、診断を行うこともできる。医療専門家は、医療施設（例えば、診療所または病院）への患者の紹介によって、対象が神経変性疾患を有することを診断してもよい。いくつかの場合において、医療専門家は、対象が介護施設に入院している間、対象が神経変性疾患を有することを診断してもよい。典型的には、医師は、一つまたは複数の症状の呈示後に、対象における神経変性疾患を診断する。
【００６７】
メタロチオネイン
メタロチオネイン（MT）は、いくつかの異なる病理学的状態において、疾患脳において抗酸化機能および神経保護機能を発揮することが公知の金属結合非酵素タンパク質のファミリーである（Ebadi MH et al.,Brain Res Mol Brain Res 2005;134(1)；Tokuda E.et al.,Hum Mol Genet 2014;23(5)；Manso Y.et al.,J Alzheimers Dis 2016;51(1)）。MTは、アストロサイトから放出され、受容体Lrp2/メガリンを通してアストロサイト自体およびニューロンによって再び取り込まれる（Chung,RS.et al.,J Neurochem 2008;104(1)）。最近、MTファミリーのメンバーがLSDによって影響された患者およびマウスのCNSにおいて高発現していることが示され、この観察はLSD神経変性過程におけるMTの推定上の役割を示唆している（Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014;75(1):127-137）。機械論的には、LSDにおけるMT発現は、リソソーム機能不全によって引き起こされたオートファジーの阻害に関連している酸化過程および炎症過程に対する応答であることが証明された（Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014;75(1)；Baird SK.et al.,Biochem J 2006;394(Pt 1)）。MTのアップレギュレーションは、LSDに関連した炎症および酸化ストレスに拮抗し、最終的に神経保護効果を発揮するための内因的な機序を表し得る（Filippon L.et al.Mol Genet Metab 2011;103(2)）。これらの仮定およびデータに基づき、MTの送達が治療効果を発揮し、LSDにおける神経傷害を軽減し得るか否かが調査された。CNSを含む全ての身体組織における構成的に高いレベルのMTの存在を特徴とする、（バッテン病としても公知の神経セロイドリポフスチン症（NCL）およびクラッベ病としても公知のグロボイド細胞白質ジストロフィー（GLD））の2種のMTトランスジェニック疾患モデルを生成し、分析した。単独の保護剤は、ここで研究されたもののような重度の先天性代謝異常を治癒させないと予想されるにも関わらず、MTは、疾患マウス表現型に対する有益な効果を発揮した。この有益な効果は、MTをコードするAAV-PHP.Bベクターの全身投与によって、MT転写物が変異体LSDマウスに送達された時にも達成され（Deverman BE.et al.,Nat Biotechnol 2016;34(2)）、LSD CNSにおいてMTによって発揮される抗炎症効果、抗酸化効果、および抗アポトーシス効果に広範囲に関連していた。
【００６８】
従って、一つの局面において、本明細書中に開示された組成物および方法は、データによって支持されたように、外因的に送達されたMTが、疾患に関連した神経傷害の機序をモジュレートすることによって、CNSに重度に影響するLSDにおいて治療的役割を発揮し得ることを示している。
【００６９】
処置の方法
本発明は、対象におけるメタロチオネインポリペプチドまたはメタロチオネインポリヌクレオチドのレベル、発現、または活性を増加させる工程を含む、対象におけるリソソーム蓄積症またはリソソーム蓄積障害を処置する方法を提供する。メタロチオネイン（MT）は、酵母から哺乳類まで広範囲の種において進化的に高度に保存されている、25〜30％システイン残基を含有している小さい（約6〜7kDaの）耐熱性タンパク質のファミリーである。MTは、グルココルチコイド、酸化ストレス、ならびに銅、カドミウム、水銀、および亜鉛のような多様な重金属によってアップレギュレートされる（Andrews(2000)Biochem.Pharmacol.59,95-104）。アイソフォームは、MT-1からMT-4まであり、わずかに異なるアミノ酸組成を有する。MTは、汚染水に由来する魚、節足動物、および軟体動物のような水生種において最初に証明されたように、金属に結合し、その毒性に対して保護する。重金属との結合とは別に、MTは、抗酸化剤として作用すると考えられているが、その機序は決定されていない。従って、MTは、酸化ストレス、エトポシド、シスプラチン、ドキソルビシン、およびX線照射によって誘導されるアポトーシス/壊死に対して保護することが見出されている（Cai et al.(2004)Toxicol.Lett.146,217-226；Chimienti et al.(2001)Free Radicals Biol.Med.31,1179-1190；Wang et al.(2001)J.Pharmacol.Exp.Ther.298,461-468）。
【００７０】
本明細書中に記載されたMTの転写物およびタンパク質は、例えば、メタロチオネイン1A（MT1A）、メタロチオネイン1B（MT1B）、メタロチオネイン1E（MT1E）、メタロチオネイン1F（MT1F）、メタロチオネイン1G（MT1G）、メタロチオネイン1H（MT1H）、メタロチオネイン1I偽遺伝子（MT1IpもしくはMTE）、メタロチオネイン1L（LT1LもしくはMT1R）、メタロチオネイン1M（MT1MもしくはMT1K）、メタロチオネイン1X（MT1X）、メタロチオネイン2（MT2）、メタロチオネイン2A（MT2A）、メタロチオネイン3（MT3）、またはメタロチオネイン4（MT4）から選択され得る。
【００７１】
ファミリーの主要なメンバーのNCBIタンパク質アクセッション番号は、以下の通りである：NP_005937（MT1A）；NP_005938（MT1B）；NP_783316（MT1E）；NP_005940（MT1F）；NP_005941（MT1G）；NP_005942（MT1H）；NP_789846（MT1M）；NP_005943（MT1X）；NP_005944（MT2）；NP_005945（MT3）；およびNP_116324（MT4）。さらに、MT1A、MT1E、MT2A、およびMTE-MT1IPのNCBIアクセッション番号は、以下のものを含む：それぞれ、NM_005946、NM_075617、NM_005953、およびNR_0303669。
【００７２】
本発明は、本明細書中に記載されたHSCを含む薬学的組成物を、治療的に有効な量、対象（例えば、ヒトのような哺乳類）へ投与する工程を含む、疾患および/もしくは障害またはそれらの症状を処置する方法も提供する。従って、一つの態様は、疾患もしくは障害またはそれらの症状に罹患している対象またはそれらにかかりやすい対象を処置する方法である。方法は、疾患または障害が処置されるような条件の下で、疾患もしくは障害またはそれらの症状を処置するために十分な治療的な量の本明細書中の細胞を哺乳類へ投与する工程を含む。
【００７３】
本明細書中の方法は、本明細書中に記載された細胞または本明細書中に記載された組成物を、そのような効果を生ずるために有効な量、（そのような処置を必要とすることが同定された対象を含む）対象へ投与する工程を含む。そのような処置を必要とする対象の同定は、対象または医療専門家の判断によってよく、主観的なもの（例えば、見解）であってもよいし、または（例えば、テストもしくは診断の方法によって測定可能な）客観的なものであってもよい。
【００７４】
移植された細胞の生着は、ポリペプチドまたはその他の治療剤の発現または活性を提供する。例えば、リソソーム酵素の欠損または機能喪失が、リソソーム蓄積障害をもたらす。治療用タンパク質（例えば、酵素）を内因的にまたは組換え法を介して発現する移植された造血細胞は、生着し、ミクログリアへ分化し、それによって、酵素の欠損を矯正する。さらに、移植された細胞は、治療用ポリペプチド（例えば、1種または複数種のメタロチオネインポリペプチド）のための媒体として機能し得る。
【００７５】
ある種の態様において、生着は、存在しているミクログリアおよび/またはそれらの前駆細胞を（例えば、アルキル化剤によって）破壊することによって増強される。
【００７６】
本明細書中の方法は、本明細書中に記載された化合物または本明細書中に記載された組成物を、そのような効果を生ずるために有効な量、（そのような処置を必要とすることが同定された対象を含む）対象へ投与する工程を含む。そのような処置を必要とする対象の同定は、対象または医療専門家の判断によってよく、主観的なもの（例えば、見解）であってもよいし、または（例えば、テストもしくは診断の方法によって測定可能な）客観的なものであってもよい。そのような処置は、疾患、障害、またはそれらの症状に罹患しているか、それを有するか、それにかかりやすいか、またはそのリスクを有する対象、具体的には、ヒトへ適当に投与されるであろう。「リスクを有する」対象の決定は、診断テストまたは対象もしくは医療提供者の見解（例えば、遺伝子テスト、酵素またはタンパク質マーカー、（本明細書中に定義される）マーカー、家族歴等）による客観的または主観的な決定によってなされ得る。
【００７７】
抗体
本明細書中に報告されるように、（例えば、ミクログリア細胞またはその前駆細胞の）マーカーに特異的に結合する抗体は、治療方法を含む本発明の方法において有用である。具体的な態様において、本発明は、ミクログリア細胞のマーカーに特異的に結合する捕獲分子を有し、細胞傷害性薬剤（例えば、アルキル化剤）を含有しているナノ粒子と、ミクログリアを接触させる工程を含む、ミクログリアを破壊する方法を提供する。
【００７８】
抗体は、天然起源または組換え起源に由来する完全免疫グロブリンであってもよいし、完全免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。四量体は、天然に存在するものであってもよいし、または単鎖抗体もしくは抗体断片から再構成されてもよい。本明細書中で使用されるように、「抗体」という用語は、完全抗体分子のみならず、免疫原結合能力を保持している抗体分子の断片も意味する。そのような断片も、当技術分野において周知であり、インビトロおよびインビボの両方で、頻繁に利用されている。抗体断片の例には、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、標的に対する十分な親和性を示すVLドメインまたはVHドメインのいずれかから構成されたラクダ科抗体（Riechmann,1999,Journal of Immunological Methods 231:25-38）のようなシングルドメイン抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７９】
本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab、およびF(ab')2、ならびに単鎖抗体（scFv）、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む多様な形態で存在し得る（Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426）。例えば、完全抗体のFc断片を欠くF(ab')2断片およびFab断片は、より迅速に循環血中から排出され、完全抗体より少ない非特異的組織結合を有し得る（Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316 325(1983)）。従って、本発明の抗体には、非限定的に、完全ネイティブ抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；Fab断片、Fab'断片、単鎖V領域断片（scFv）、融合ポリペプチド、および非従来型抗体が含まれる。
【００８０】
非従来型抗体には、ナノボディ、直鎖抗体（Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062,1995）、シングルドメイン抗体、単鎖抗体、ならびに複数の価を有する抗体（例えば、ジアボディ、トリアボディ（tribodies）、テトラボディ（tetrabodies）、およびペンタボディ（pentabodies））が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ナノボディは、軽鎖の非存在下で完全に機能性であるよう進化させられた、天然に存在する重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、単鎖Fv断片のサイズの半分のみであるが、従来型抗体の親和性および特異性を有する。極度の安定性およびヒト抗体フレームワークとの高度の相同性と組み合わせられた、この独特の構造の結果として、ナノボディは、従来型抗体が到達可能でない治療標的に結合することができる。複数の価を有する組換え抗体断片は、癌細胞に対する高い結合アビディティおよび独特のターゲティング特異性を提供する。約60〜100kDaのサイズの低分子は、より速い血中からの排出および迅速な組織取り込みを提供するため、これらの多量体scFv（例えば、ジアボディ、テトラボディ）は、親抗体と比べた改善を提示する。Power et al.,(Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy.Methods Mol Biol,207,335-50,2003)；およびWu et al.(Anti-carcinoembryonic antigen(CEA)diabody for rapid tumor targeting and imaging.Tumor Targeting,4,47-58,1999)を参照すること。
【００８１】
非従来型抗体を作成し、使用するための様々な技術が記載されている。ロイシンジッパーを使用して作製された二重特異性抗体は、Kostelny et al.(J.Immunol.148(5):1547-1553,1992)によって記載されている。ジアボディテクノロジーは、Hollinger et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993)によって記載されている。単鎖Fv（sFv）ダイマーの使用によって二重特異性抗体断片を作成するためのもう一つの戦略は、Gruber et al.(J.Immunol.152:5368,1994)によって記載されている。三重特異性抗体は、Tutt et al.(J.Immunol.147:60,1991)によって記載されている。単鎖Fvポリペプチド抗体は、Huston,et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)によって記載されたように、直接接合されているか、またはペプチドをコードするリンカーによって接合されている、VHコード配列およびVLコード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合で連結されたVH::VLヘテロダイマーを含む。米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、および第4,956,778号；ならびに米国特許公開第20050196754号および第20050196754号も参照すること。
【００８２】
様々な態様において、抗体はモノクローナルである。あるいは、抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製および使用も、当業者に公知である。本発明には、重鎖および軽鎖の一方の対が第1の抗体から得られ、重鎖および軽鎖の他方の対が異なる第2の抗体から得られるハイブリッド抗体も包含される。そのようなハイブリッドは、ヒト化された重鎖および軽鎖を使用して形成されてもよい。そのような抗体は、しばしば「キメラ」抗体と呼ばれる。
【００８３】
一般に、完全抗体は、「Fc」領域および「Fab」領域を含有していると言われる。Fc領域は、補体活性化に関与し、抗原結合には関与しない。「F(ab')2」断片と名付けられた、Fc'領域が酵素的に切断された抗体、またはFc'領域を含まずに作製された抗体は、完全抗体の抗原結合部位の両方を保持している。同様に、「Fab」断片と名付けられた、Fc領域が酵素的に切断された抗体、またはFc領域を含まずに作製された抗体は、完全抗体の抗原結合部位のうちの1個を保持している。Fab断片は、共有結合で結合した、抗体軽鎖と、「Fd」と表記される抗体重鎖の一部分とからなる。Fd断片は、抗体特異性の主要な決定基である（1種のFd断片は抗体特異性の変更なしに、10種までの異なる軽鎖と会合し得る）。単離されたFd断片は、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保持している。
【００８４】
抗体を調製する方法は、免疫科学の当業者に周知である。抗体は、可溶性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を免疫原として利用する、当技術分野において公知の方法のいずれかによって作成され得る。抗体を得る一つの方法は、免疫原によって適当な宿主動物を免疫し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の作製のための標準的な手法に従うことである。免疫原は、免疫原の細胞表面上への提示を容易にするであろう。適当な宿主の免疫は、多数の方式で実施され得る。ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列が、宿主の免疫細胞によって取り込まれる送達媒体で宿主に提供されてもよい。次に、細胞がポリペプチドを発現し、それによって、宿主において免疫原性応答を生成するであろう。あるいは、ヒトポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列を、インビトロで細胞において発現させ、その後、ポリペプチドを単離し、抗体が作製される適当な宿主へポリペプチドを投与してもよい。
【００８５】
あるいは、抗体は、所望により、抗体ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい。ヒト抗体遺伝子と組み合わせられた時にヒト抗体タンパク質をディスプレイするよう改変され得るバクテリオファージは、細菌を感染させ、その内部で繁殖することができる。ファージディスプレイは、ファージに、ヒト抗体タンパク質を表面上に「ディスプレイ」させる過程である。ヒト抗体遺伝子ライブラリーに由来する遺伝子が、ファージの集団へ挿入される。各ファージは、異なる抗体の遺伝子を保有しており、従って、表面上に異なる抗体をディスプレイする。
【００８６】
次いで、当技術分野において公知の方法によって作成された抗体を、宿主から精製することができる。抗体精製方法には、（例えば、硫酸アンモニウムによる）塩沈殿、（例えば、好ましくは、中性pHで実行され、増加するイオン強度の段階勾配によって溶出させられる、陽イオン交換カラムまたは陰イオン交換カラムにおける）イオン交換クロマトグラフィ、（ゲルろ過HPLCを含む）ゲル濾過クロマトグラフィ、ならびにプロテインA、プロテインG、ハイドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリンのようなアフィニティ樹脂におけるクロマトグラフィが含まれ得る。
【００８７】
抗体は、抗体を発現するよう改変されたハイブリドーマ細胞から便利に作製され得る。ハイブリドーマを作成する方法は、当技術分野において周知である。ハイブリドーマ細胞を、適当な培地において培養することができ、消費（spent）培地を抗体起源として使用することができる。次に、関心対象の抗体をコードするポリヌクレオチドを、その抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、次いで、これらのDNA配列から合成または組換えによって抗体を作製することができる。大量の抗体の作製のためには、腹水を得ることが一般により便利である。腹水を作製する方法は、一般に、免疫学的にナイーブの組織適合性または免疫寛容性の哺乳類、具体的には、マウスへ、ハイブリドーマ細胞を注入する工程を含む。適当な組成物（例えば、プリスタン）の事前投与によって、腹水作製のために哺乳類を予備刺激することができる。
【００８８】
本発明の方法によって作製されたモノクローナル抗体（Mab）は、当技術分野において公知の方法によって「ヒト化」され得る。「ヒト化」抗体とは、よりヒト免疫グロブリンに類似するよう、配列の少なくとも一部がその初期の型から変更された抗体である。抗体をヒト化する技術は、非ヒト動物（例えば、マウス）抗体が生成される時、特に有用である。マウス抗体をヒト化する方法の例は、米国特許第4,816,567号、第5,530,101号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第5,859,205号に提供されている。
【００８９】
造血細胞移植（HCT）
最近の前臨床および臨床における証拠は、造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）および/またはその子孫が、脳内の骨髄系細胞集団の代謝回転に寄与することによって、脳血液関門を介した治療用分子送達のための媒体として機能し得ることを示している。しかしながら、移植後に再構成された細胞の分化および機能的特徴は、未だ決定されておらず、特に、移植後にドナー細胞子孫によって真のミクログリアが再構成され得るか否かは、査定されていない。最近30年間に、造血細胞移植（HCT）および造血幹細胞（HSC）に基づく遺伝子治療は、リソソーム蓄積症（LSD）および神経変性疾患のような神経系に影響する非血液疾患および非腫瘍疾患によって影響された患者に、いくらかの利益をもって適用された。これらの初期の臨床的証拠は、前臨床の支持データと共に、造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）および/またはその子孫が、脳血液関門（BBB）を介した治療用分子送達のための媒体として機能し得ることを示唆している。実際、HSPCおよび/またはその子孫は、おそらくミクログリアを含む、脳内の骨髄系細胞集団の代謝回転に寄与することができ、これらの障害の進行および転帰におけるその重大な役割が、広範囲に記載されている。重要なことに、影響された組織に組み込まれた後、移植片に由来する細胞は、即ち、移植されたマウスまたは患者の脳において治療用分子を放出することによって、局所環境に有利に影響することが立証された。この概念は、HSC遺伝子治療によって処置された脱髄性LSD異染性白質ジストロフィーによって影響された患者において証明された。患者において欠損しており、その発現が患者HSCおよびそれらの子孫に組み込まれたレンチウイルスベクター（LV）によって誘導されるアリールスルファターゼA酵素の正常な活性または正常を超えた活性が、処置の長時間後に、処置された子供の脳脊髄液（CSF）において測定された。注目すべきことに、酵素は、それ自体はBBBを効率的に通過することができない。症状が出現する前の段階において処置された患者における著しい臨床的利益に関連しているこれらの所見は、遺伝子を補正されたHSPC子孫細胞が、患者の脳に播種されたことを正式に立証している。
【００９０】
メタロチオネインファミリーのメンバーは、LSDによって影響された患者およびマウスの中枢神経系において高発現していることが最近同定され、この観察は、これらの疾患における神経傷害の病原においてMTが果たす推定上の役割を示唆している（Cesani et al,2014）。本明細書中に開示されるように、メタロチオネインは、神経学的状態の治療剤として大きい可能性を有することが明らかになりつつある。
【００９１】
組換えポリペプチド発現
本発明のポリペプチドを発現させるため、本明細書中に記載された方法のいずれかまたは当技術分野において公知の方法によって得られたDNA分子を、当技術分野において周知の技術によって、適切な発現ベクターに挿入することができる。例えば、合成DNAリンカーの使用を含む制限酵素連結またはブラントエンドライゲーションによって、二本鎖DNAを適当なベクターにクローニングすることができる。DNA分子をライゲートするため、一般的には、DNAリガーゼが使用され、アルカリホスファターゼによる処理によって、望ましくない接合を回避することができる。
【００９２】
従って、本発明は、本明細書中に記載される核酸分子（例えば、遺伝子または遺伝子をコードする組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えプラスミド）を含む。「組換えベクター」という用語には、その組換えベクターが由来したネイティブまたは天然の核酸分子に含まれるものより大きいか、少ないか、または異なる核酸配列を含有するよう、変更、修飾、または改変されたベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ウイルス、コスミド、フォスミド、またはその他の精製された核酸ベクター）が含まれる。例えば、組換えベクターは、本明細書中で定義されるように、制御配列、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列等に機能的に連結された、ポリペプチドまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。含まれる遺伝子または核酸の発現を可能にする組換えベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００９３】
本明細書中に記載された本発明の分子のいくつかにおいて、本発明の1種または複数種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する1種または複数種のDNA分子は、原核宿主細胞に所望のDNA分子を組み込むことができる1種または複数種の制御配列に機能的に連結される。導入されたDNAによって安定的に形質転換された細胞は、例えば、発現ベクターを含有している宿主細胞の選択を可能にする1種または複数種のマーカーを導入することによって選択され得る。選択可能マーカー遺伝子は、発現させるべき核酸配列に直接連結されてもよいし、または同時トランスフェクションによって同一の細胞に導入されてもよい。付加的な要素も、本明細書中に記載されたタンパク質の最適な合成のために必要とされ得る。使用すべき付加的な要素は、当業者に明白であろう。
【００９４】
具体的なプラスミドまたはウイルスベクターの選択において重要な因子には、そのベクターを含有しているレシピエント細胞を、認識し、そのベクターを含有していないレシピエント細胞から選択する容易さ；具体的な宿主において望まれるベクターのコピーの数；および異なる種の宿主細胞の間でベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否かが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００９５】
ベクターが発現のためのDNA配列を含むよう構築された後、それは、例えば、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、および直接微量注入等を含むが、これらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の多様な適当な方法のうちの1種または複数種によって、適切な宿主細胞に導入され得る。
【００９６】
1種または複数種のベクターの導入の後、宿主細胞は、一般的には、ベクターを含有している細胞の増殖によって選択する選択培地において培養される。組換えタンパク質の発現は、ウエスタンブロット分析、イムノブロット、および免疫蛍光を含むイムノアッセイによって検出され得る。組換えタンパク質の精製は、当技術分野において公知であるかまたは本明細書中に記載された方法のいずれか、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィ、および電気泳動を含む従来の手法によって実施され得る。タンパク質を精製するために使用され得るさらなる精製手法は、標的タンパク質に結合するモノクローナル抗体を使用したアフィニティクロマトグラフィである。一般に、組換えタンパク質を含有している粗調製物を、適当なモノクローナル抗体が固定化されているカラムに通す。タンパク質は、一般的に、特異的な抗体を介してカラムに結合し、不純物は、素通りする。カラムを洗浄した後、タンパク質は、例えば、pHまたはイオン強度を変化させることによってゲルから溶出させられる。
【００９７】
治療効力を評価する方法
一つのアプローチにおいて、処置の効力は、例えば、処置された器官の生物学的機能（例えば、ニューロン機能）を測定することによって評価される。そのような方法は、当技術分野において標準的であり、例えば、Textbook of Medical Physiology,Tenth edition,(Guyton et al.,W.B.Saunders Co.,2000)に記載されている。具体的には、本発明の方法は、組織または器官の生物学的機能を、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、またはさらには300％、400％、もしくは500％も増加させる。好ましくは、組織はニューロン組織であり、好ましくは、器官は脳である。
【００９８】
もう一つのアプローチにおいて、本発明の方法の治療効力は、対応する対照の組織または器官（例えば、処置を受けていない組織または器官）と比較した、処置された組織または器官における細胞数の増加を測定することによってアッセイされる。好ましくは、組織または器官における細胞数は、対応する組織または器官と比べて少なくとも5％、10％、20％、40％、60％、80％、100％、150％、または200％増加する。細胞増殖をアッセイする方法は、当業者に公知であり、例えば、Bonifacino et al.,(Current Protocols in Cell Biology Loose-leaf,John Wiley and Sons,Inc.,San Francisco,Calif.)に記載されている。例えば、細胞増殖についてのアッセイは、細胞複製中のDNA合成の測定を含み得る。一つの態様において、DNA合成は、細胞（または動物）に添加される[3H]-チミジンまたは5-ブロモ-2＊-デオキシウリジン［BrdU］のような標識されたDNA前駆体を使用して検出され、次いで、細胞周期のS期（複製）におけるこれらの前駆体のゲノムDNAへの取り込みが検出される（Ruefli-Brasse et al.,Science 302(5650):1581-4,2003；Gu et al.,Science 302(5644):445-9,2003）。
【００９９】
キット
本発明は、対象における1種または複数種のメタロチオネインポリペプチドのレベル、発現、または活性を増加させることによる、リソソーム蓄積症またはリソソーム蓄積障害（例えば、神経セロイドリポフスチン症）の処置または予防のためのキットを提供する。一つの態様において、キットは、1種または複数種のメタロチオネインポリペプチドを発現する単離された造血幹細胞を含有している組成物を含む。もう一つの態様において、キットは、内在性ミクログリア細胞の破壊的前処置のためのナノ粒子を含む。
【０１００】
いくつかの態様において、キットは、治療用または予防用の細胞組成物を含有している無菌容器を含み；そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の適当な容器型であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート加工紙、金属箔、または医薬を収容するために適当なその他の材料で作成されていてよい。
【０１０１】
所望により、本発明の薬剤は、中枢神経系の神経学的な疾患または障害を有するかまたはそれを発症するリスクを有する対象へ薬剤を投与するための説明書と共に提供される。説明書は、一般に、疾患または障害の処置または予防のための組成物の使用に関する情報を含むであろう。他の態様において、説明書は、以下のうちの少なくとも一つを含む：治療剤の説明；神経学的疾患またはその症状の処置または予防のための投薬スケジュールおよび投与；注意；警告；適応症；禁忌；過剰投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに/または参照。説明書は、容器（存在する場合）に直接、または容器に適用されたラベルとして、または容器内にもしくは容器と共に供給された別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとしてプリントされていてよい。
【０１０２】
本発明の実施は、他に示されない限り、十分に当業者の範囲内である（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用する。そのような技術は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",second edition(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney,1987)；"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,1987)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis,1994)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)のような文献において十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であり、従って、本発明の作成および実施において考慮され得る。具体的な態様のための特に有用な技術は、以下のセクションにおいて記述されるであろう。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法を作成し使用する方法の完全な開示および説明を、当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例1：LSDにおける治療剤としてのメタロチオネインの前臨床試験のための疾患モデル選択
本発明者らの以前の所見（Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014;75(1)）に基づき、白質および灰白質の両方の関与を含むLSDを、CNS関与を含むLSDのための可能性のある神経保護剤としてMTを試験するための良好な候補と見なすことができた。本発明者らの戦略のための適切な標的疾患を同定するため、LSD患者由来のヒト脳試料を調査した。4種の異なるLSDによって影響された患者に由来する試料を査定した。2種は、一次性白質傷害を特徴とするもの、即ち、アリールスルファターゼA遺伝子（OMIM番号250100）の変異によって引き起こされるMLD、およびガラクトセレブロシダーゼ遺伝子（OMIM番号245200）の変異によって引き起こされるGLD；2種は、灰白質関与を特徴とするもの、即ち、C型NPC（OMIM番号257220）およびNCLであった。MT免疫反応性は、全ての試験されたLSD脳において実証された（図1A）。MTシグナルは、MLDおよびGLDのものを含む全てのLSD脳試料の灰白質に主に検出された。アストロサイトは、全ての試験された試料において主なMT過剰発現細胞として作用した。MLD試料においては、組織球にも、MTシグナルが同定された。興味深いことに、MT免疫反応性は、NCL脳試料においてはニューロンにのみ同定された。理論によって拘束はされないが、これは、この特定の疾患における進行中の再取り込みの可能性のある機序を示す。次いで、同一の試料において、ニューロンによるMT取り込みおよび神経保護活性を担うことが公知のMT受容体Lrp2の発現を測定した。RNAおよびタンパク質の両方の分析が、灰白質関与（図1Bおよび図1C）を含む2種のLSDに由来する試料、特に、INCL脳において、Lrp2アップレギュレーションを証明した。高いMT転写物レベルも、（パルミトイルプロテインチオエステラーゼ1（PPT1）欠損を特徴とする）INCLによって影響されたマウスから回収された脳組織において測定された（図1D）。従って、これらの所見に基づき、本発明者らは、LSDにおけるMTの神経保護役割を試験するために有益である可能性のある疾患プラットフォームとしてINCLを選択し、具体的には、本発明者らは、INCL動物モデルを利用した。さらに、MTが他のLSDにおいても同様に有益であるか、それとも主として白質に影響するのかを理解するため、免疫反応性のヒトデータおよびマウスMT転写物レベルに基づき、さらなる実験のために、（ガラクトセレブロシダーゼGALC欠損による）GLDを選択したところ、MTは、疾患進行と共に、そして治療的処置によって、変動することが示された（Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014;75(1)）。
【０１０５】
実施例2：GLDおよびINCLの動物モデルにおけるメタロチオネインの表現型効果
INCLマウスおよびGLDマウスのCNSへの外因的なMT送達が疾患表現型に有利に影響するか否かを査定するため、複数コピーのMT-1遺伝子を持ち（Palmiter RD.et al.,Mol Cell Biol 1993;13(9)）、脳および末梢組織の両方において高いMT-1転写物レベルを発現するMT-1過剰発現トランスジェニックマウス（MTtg）を活用した（Comes G.et al.,Int J Mol Sci 2017;18(2)；および示されないデータ）。MTtgマウスをGLDおよびINCLのヘテロ接合性動物と交配させて、組織に構成的に高いMT-1レベルを有するGLDおよびINCLのホモ接合性欠損マウスを生成した（それぞれ、MT-GLDおよびMT-INCL）。高レベルのMT-1発現（図2A）が、これらのマウスの脳において測定された。興味深いことに、両方の状況において、MT-1発現レベルは、MTトランスジェニック背景および疾患状況自体の両方の寄与に起因した。疾患トランスジェニック脳におけるMTシグナルは、脳における優先的に記載された発現パターンと一致して、主にアストロサイトと共局在し（Vela JM et al.,Brain Res 1997;767(2)）（図2B）、ミクログリア細胞のごく一部のみがMT免疫染色を示した（図2C）。興味深いことに、MT過剰発現は、両方の調査されたモデルにおいて治療的利益を決定した。実際、極めて短い平均余命および非常に重度の表現型を有する非トランスジェニックの影響されたGLD対照と比較して、MT-GLDトランスジェニックマウスは、有意に増加した生存を示した（約10％、中央生存はMT-GLDで40.5日、GLDで37.5日）（図2D）。同様に、MT-INCLマウスは、非トランスジェニックの影響されたINCLマウスと比較して増加した生存（図2E）（約5％、中央生存はMT-INCLで248日、INCLで235.5日）を示し、疾患特異的重症度スコアによって実証されるような表現型の寛解（図2F）も示した。2種の試験された動物モデルにおける生存増加に関連した脳内のMT転写物レベルの最小の増加を同定するため、MT発現レベルを、LSDマウスおよびMT-LSDマウスの両方において収集された生存データに対してプロットした（図2Gおよび2H）。これらのデータの分析は、野生型MT発現レベルの10〜20倍以上であるMTレベルが、それぞれ、対応するINCL動物およびGLD動物に対するMT-INCLマウスおよびMT-GLDマウスの増加した生存に関連していることを示した（図2Gおよび2H）。最初の背景における両方の疾患モデルは、疾患に関連した高い脳内MT発現を特徴とするため、利益のためのこの閾値は、それぞれ、GLDおよびINCLの基底疾患レベルの1.5〜2倍にMT発現レベルを増加させる必要として解釈される（図2Gおよび2H）。
【０１０６】
実施例3：MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおける抗炎症遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、および抗酸化ストレス遺伝子のモジュレーション
MT過剰発現によってモジュレートされる複雑な神経変性LSD過程の局面を同定するため、完全トランスクリプトーム分析を、野生型（WT）マウス、MTtgマウス、GLDマウス、およびMT-GLDマウス（各群n＝3）に由来する脳抽出物に対して実施した。変化倍率カットオフ値を2に設定し、関連するRefSeq IDを有する遺伝子のみを考慮し、条件内発現プロファイルを同定することを目的とした階層的クラスタリングを生成して、ディファレンシャルに発現された遺伝子のリストを生成した。この分布は、4種の試験された群におけるディファレンシャルな遺伝子発現を反映し、MT-GLDにおいては他のものと比較して主要な違いがあった。MT-GLDマウスにおいて、GLD群と比較して、多くのダウンレギュレートされた遺伝子が同定された（図3A）。少数の遺伝子が、WTと比較して、MTtg試料において過剰発現され、それらは、大部分がAffymetrixプラットフォームに含まれる非コード転写物であった。GLDに対してMT-GLDモデルにおいてダウンレギュレートされた遺伝子は、神経伝達物質受容体活性、イオンチャネル活性（電位開口型カリウムチャネルおよび電位開口型カルシウムチャンネル）、輸送チャンネル等に関連しており、このことから、脳ネットワーク安定性を制御するMT作用の可能性のある新しい機序が示された。炎症およびアポトーシスの経路に関与する他の遺伝子は、トランスクリプトームアレイにおいてGLDマウスに対してMT-GLDにおいて有意にダウンレギュレートされていた（図3B、図3C、図3D）。これらの遺伝子は、qPCRを通してバリデートされた（図3B、図3C、図3D）。それらには、誘導された神経膠炎症、DNA傷害、および変性において役割を果たすタンパク質Ifi44（インターフェロン誘導タンパク質44）（Pachiappan A.et al.,Toxicon 2005;46(8)）；炎症および酸化ストレスを含むいくつかの生物学的過程の強力なメディエーターであるHPGD（ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ）（Nakao R.et al.,Chronobiol Int 2015;32(4)）；アポトーシスカスケードの一部であることが公知のCasp4（この遺伝子はCasp11として歴史的に公知である）（Villani GR et al.,J Neurosci Res 2007;85(3)）；常に炎症および酸化ストレスの経路に関与するが、バリデーションリストに含まれていないNdst4、IL33、Dgkk等をコードする遺伝子が含まれる（表2）。この同一の遺伝子のセットが、中間疾患段階のMT-INCLマウスにおいて試験され（図3B、図3C、図3D）、INCL試料に対して同様にダウンレギュレートされていることが示された。
【０１０７】
（表２）GLD脳に対してMT-GLD脳においてディファレンシャルに発現された遺伝子
2020505446.tif 000004
2020505446.tif 000005
【０１０８】
開示されたモデルにおいて酸化ストレスを和らげるMTの能力をさらに探求するため、免疫蛍光を通して、MT-GLDマウスおよび対照マウスの脳において、細胞傷害、炎症、および一酸化窒素産生のマーカーであるニトロチロシンを測定した（図3Eおよび3F）（Hidalgo J.et al.,Exp Biol Med(Maywood)2006;231(9)）。ニトロチロシンシグナルは、ナイーブGLD動物と比較して、MT-GLD脳の多くの領域（小脳、脳梁、脳幹）において有意に広範囲に低下していた（図3Eおよび3F）。MT-GLD脳細胞は、DCFDA（DCFDA 6-カルボキシ-2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）によって染色された時、ROS低下の傾向も示した（図3G）。
【０１０９】
実施例4：MT-GLDマウスおよびMT-INCLマウスにおいてプルキンエ細胞喪失が救済される
プルキンエ細胞喪失は、GLDの重度の複雑な表現型に寄与することが公知であり、この現象はアポトーシスに厳密に関連していることが公知である（Lin DS et alGene 2015;571(1)）。プルキンエ細胞は、GLDマウスにおいて初期症候性段階から明白に症候性の段階まで次第に失われることが確認された。重要なことに、MT-GLDマウスの脳において、プルキンエ細胞喪失の防止が観察された（図4Aおよび図4B）。この救済は、進行した疾患段階において得られたGLDおよびMT-GLDの小脳スライスにおけるカルビンディン・パルブアルブミンシグナルの定性的測定および定量的測定の両方を通して証明された（図4Cおよび図4D）。
【０１１０】
プルキンエ細胞体の変性および初期ニューロン喪失を表す樹枝状分岐を含む、ヒト疾患経過と一致して、INCLマウス（Macauley SL.et al.,Exp Neurol 2009;217(1)）においても、著明な小脳病理が存在する。MT-INCLマウスの脳においても、中間疾患段階（200日）において既に、プルキンエ細胞の変性および喪失の防止が観察され、このニューロン区画に対するMTの特異的な効果が示唆された（図4Eおよび図4F）。
【０１１１】
実施例5：メタロチオネイン過剰発現は原疾患の欠陥に影響を与えない
MT過剰発現は、分析された2種のLSDモデルの二次的な疾患の局面をモジュレートすることが、本明細書中に示された。しかしながら、両方のモデルについて、原疾患機序は、疾患を引き起こすリソソーム加水分解酵素の欠陥による蓄積材料の貯留によって表される。MTは未分解基質の蓄積に影響を及ぼさないことが予想されたが、いずれにしても、本発明者らは、それが起こるか否かを査定した。予想通り、MTは、MT-GLD動物において分析された全ての脳領域において細胞内ガラクトリピド蓄積に有意に影響しなかった（図4G）。MT-INCLモデルにおいても、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析によって分析された、実験群における自己蛍光蓄積材料の貯留の変化は観察されなかった（図4H）。
【０１１２】
実施例6：メタロチオネインはGLDおよびINCLにおける抗炎症M2様ミクログリア表現型を誘導する
次に、MTがGLDマウスおよびINCLマウスにおいて神経炎症に影響し得るか否かを調査した。アストロサイトおよびミクログリアのマーカーについての免疫蛍光は、中間疾患段階（MT-INCLおよびINCL）および進行した疾患段階（PND36、MT-GLD、およびGLD）において分析された、MT-LSDマウスおよびナイーブLSD動物におけるアストログリオーシスおよびミクログリオーシスの類似したレベルを明らかにし（図5A、図5B、図5C、図5D）、このことから、MTが、アストロサイトによって主に産生されるにも関わらず、これらの細胞の表現型に影響し得ないことが示された。本発明者らのモデルにおいて神経炎症をさらに探究するため、骨髄系細胞/ミクログリア集団を、MT-GLDマウスおよび対照マウスの脳から単離し、これらの試料におけるミクログリア活性化のいくつかの周知のマーカーのmRNAレベルを定量化した。興味深いことに、抗炎症マーカーであるアルギナーゼ1、CD206、および（M2骨髄系細胞マーカーとも呼ばれる）YM1の発現の有意な増加が、対照のGLDおよびINCLの試料と比べて、MT-GLD細胞およびMT-INCL細胞において検出された（図5E、図5F、図5G）。さらに、ナイーブLSD対照に対して、MT-LSD試料において、（M1骨髄系細胞マーカーとも呼ばれる）活性化ミクログリアによって産生される炎症誘発性サイトカインIL1βおよびTNFαの減少が観察された（図5Hおよび図5I）。MTtgマウスに由来する試料におけるこれらの分子の発現のレベルは、そうではなく、WT対照に類似しており、その効果が疾患情況において排他的に存在することが示唆された。M2表現型に関連したC型レクチン炭水化物結合タンパク質であるCD206受容体（Perego C.et al.,J Neuroinflammation 2011;8:174）の発現も、免疫蛍光によって分析されたMT-GLD脳切片において確認された（図5Jおよび図5K）。ナイーブGLD動物と比較して、CD206陽性シグナル領域は、MT-GLDマウス脳骨髄系細胞において増加していた。
【０１１３】
全体として、これらのデータは、MTが、ミクログリアのM2様抗炎症状態への偏向を誘導し、従って、疾患進行に対抗することができる神経保護環境の確立を誘導することを示唆している。
【０１１４】
実施例7：AAVベクターによるメタロチオネイン送達はGLD表現型を寛解させる
本明細書中に開示されるように、MT-LSDトランスジェニックマウスにおけるMT-1の構成性過剰発現に関するデータは、LSDにおいて治療目的のため神経保護剤としてMTを活用し得ることを示唆している。従って、成体マウスにおいて高い効率でCNS遺伝子を全身送達することができる最近開発されたカプシドAAV-PHP.B（Deverman BE et al.,Nat Biotechnol 2016;34(2):204-9）によって作製されたMT-1発現アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターをGLDマウスに注射して、単純な概念実証実験を実施した。HEK-293細胞において1コピーまたは4コピーのいずれかのMT-1 cDNAを保有するAAVベクターを比較したところ、予想通り、後者のベクターが、より高いMT-1発現レベルをもたらした（図6A）。従って、本発明者らは、インビボ研究のためにAAV-4MTベクターを選択した。2日齢（PND2）GLDマウスに、2×1010vgのAAV-4MTベクターを全身注射し、次いで、終末期までモニタリングした。興味深いことに、AAVによって処置されたマウスの生存には、PBSを注射されたGLDマウスと比較して有意な増加が存在し（図6B）、それは、MT-GLDトランスジェニック動物において観察されたものと一致していた。この増加した生存は、AAVを注射された動物の脳における、対照と比べて増加したMT-1定量化と平行していた（図6C）。このケースにおいても、MTの外因的な送達のための治療的な標的レベルを同定することを試みて、PBSを注射されたマウスおよびAAVを注射されたマウスの両方について、生存に対してMT発現レベルをプロットした（図6D）。興味深いことに、生存増進に関連した最小増加倍率は、基底GLD関連MT転写物レベルに対して3.3倍であり、MT-LSDモデルにおいて観察されたものと一致する範囲内であった。重要なことに、生存増進は、MT-GLDマウスにおいて観察されたように、AAVによって処置されたマウスにおける炎症遺伝子、酸化ストレス遺伝子、およびアポトーシス遺伝子のダウンレギュレーションに関連していた（図6E、図6F、図6G）。理論によって拘束はされないが、これは、MTが、外因的なAAVによって媒介される送達によっても媒介される同一経路の制御に影響したことを示す。
【０１１５】
MTは、多様なLSDにおいて、疾患進行および処置に対する応答の間に発現を動的に修飾する脳疾患のバイオマーカーとして、以前に同定され特徴決定された（Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014;75(1):127-137）。アストロサイトにおけるMTの発現レベルが、抗炎症薬の投与によって増加するため、MTは、疾患脳において保護的な役割を発揮し得る。MTは、神経保護能力を有することが、急性脳傷害において示され（West AK et al.,Neurotoxicology 2008;29(3)）、より最近では、パーキンソン病（Ebadi MH et al.,Brain Res Mol Brain Res 2005;134(1)）、筋萎縮性側索硬化症（Tokuda E.et al.,Hum Mol Genet 2014;23(5)）、およびアルツハイマー病（Manso Y.et al.,J Alzheimers Dis 2016;51(1)）のような慢性疾患においても示された。これらの指摘に基づき、重度の神経学的関与を特徴とするLSDにおいて、神経保護を発揮するためにMTを活用する可能性を探究した。
【０１１６】
MTは、疾患脳において抗酸化機能、抗炎症機能、および抗アポトーシス機能を発揮することが記載されているが、MTによって活性化される経路およびこの区画におけるその作用機序に関しては、ほとんど未知である（Ito Y.et al.,Curr Pharm Biotechnol 2013;14(4)）。実験的証拠は、炎症誘発刺激および酸化誘発刺激によって疾患脳においてアストロサイトから合成されるMTは、主にニューロン傷害の情況において、受容体Lrp2/メガリンを通してニューロンによって取り込まれ、次いで、解毒活性を発揮することができるという仮説を支持している（Chung RS et al.,J Biol Chem 2008;283(22)）。興味深いことに、ヒト脳LSD試料およびマウスLSD脳試料において、特に、NCLのようなニューロン関与を含む疾患において、MTのレベルのみならず、Lrp2のレベルも増加していることが実証された。従って、もし存在すれば、LSD脳におけるMTの有益な効果を査定し、インビボのMT-Lrp2軸の役割を査定することを試みて、MTtg過剰発現マウスをINCLマウスモデルと交配させた。興味深いことに、MT構成性発現は、MTtg疾患モデルにおいてINCL表現型を寛解させた。MT-INCLマウスの改善された表現型および増加した生存は、この疾患環境における初期仮説およびMT（およびLrp2）の役割を支持した。重要なことに、MTの類似した有益な効果が、極めて重度のGLD動物モデルにおいても観察され、その生存も改善された。これらの結果は、疾患を引き起こす一次リソソーム酵素欠損を標的とする治療的介入の非存在下で、MTの付加のみによるものであり、全く驚くべきことである。注目すべきことに、原疾患に関連した自然発生過剰発現に加えての、MT発現レベルの比較的わずかな増加が、両方の試験された動物モデルにおいて有益な効果および生存増進を決定するために十分であった。
【０１１７】
重要なことに、生存増進には、MT-LSD脳において観察された一貫した転写/発現変化が伴っていた。これらの変化は、少なくとも調査された部位において、神経炎症、ミクログリア活性化、および酸化ストレスのモジュレーション、ならびにニューロンの保護によって表された。両方のモデルにおいて、変性およびアポトーシスから十分に救済されたプルキンエ細胞において、著明な特異的な効果が観察された。多くのインビトロ研究が、MTがニューロンおよび小脳顆粒ニューロン細胞培養系の両方、即ち、全てのニューロン細胞型に起因する培養系において神経保護を発揮し得ることを示した（Ambjorn M.et al.,J Neurochem 2008;104(1)）。プルキンエ細胞層におけるニューロン保護および全体的な表現型改善の機序は、MTの周知の作用機序の多くを含み得る。
【０１１８】
MTの最も顕著な効果のうちの一つは、ジストロフィン異常症のマウスモデルにおいて示されたように（Di Foggia V.et al.,J Exp Med 2014;211(13)）、酸化ストレスおよび関連経路の低下である。酸化ストレス応答および炎症に関与する異なる経路の制御異常が、オートファジーのブロックの結果としてLSDにおいて起こることも広く受け入れられている（Settembre C.et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 2013;14(5)）。最後に、MTは、酸化ストレスによって誘導されたリソソーム不安定化に対して保護することが示された（Baird SK.et al.,Biochem J 2006;394(Pt 1)）。これらの証拠および本明細書中に開示されたデータに基づき、MTは、リソソーム機能不全によって引き起こされた酸化ストレスおよび炎症に応答して過剰発現される可能性がある。従って、LSDモデルにおいてMTによって発揮された治療効果は、これらのイベントをモジュレートする能力によって媒介された可能性がある。実際、本発明者らのモデルにおいて実施された測定は、MTが、傷害を受けたプルキンエ層に有益である可能性がある、リソソーム機能不全に関連した酸化ストレスをダウンモジュレートし、和らげることができることを示している。
【０１１９】
さらに、疾患モデルにおけるアストロサイトーシスおよびミクログリオーシスに対するMTの効果を証明することができなかった巨視的な測定にも関わらず、より詳細な観察によって、（アルギナーゼ1およびCD206の発現の増加を含む）M2様マーカーを獲得し、IL1βおよびTNFαの発現をダウンレギュレートしたミクログリアの表現型の変化が、両方のMT-LSDモデルにおいて検出された。古典的なM1様炎症誘発性のものと比較して、オルタナティブに活性化されたM2様ミクログリアマーカーのこの増加は、LSD環境において、MTが過剰発現された時、炎症から神経保護に向かって、ミクログリア表現型の再形成が起こり、おそらくは、機能の再形成も起こったことを示す。M1/M2パラダイムが神経変性疾患に関連しており、GLD環境にはより多く関連していることを支持するデータが出現している（Nicaise AM et al.,J Neurosci Res 2016;94(11)）。MTtg-LSD脳におけるM1/M2バランスに対するMTの可能性のある影響は、M2特色を賦与されたMT-GLDマウスに由来するミクログリア細胞における酸化ストレスの低下の証拠によっても、さらに確認され、この現象は、文献中に広く記載されている（Rojo AI.et al.,Antioxid Redox Signal 2014;21(12)）。注目すべきことに、MTによって駆動される神経保護の媒介におけるミクログリアの関与は、本明細書中に初めて報告される。
【０１２０】
特に、INCLモデルにおける、本明細書中に開示された所見の解釈において関連性があり得るもう一つの局面は、異なるNCLマウスモデルにおけるバイオメタル脱制御の最近の証拠である。実際、変更されたバイオメタルホメオスタシスが、INCLを含むNCLの3種の異なる動物モデルにおいて同定され、それらは、バイオメタルである亜鉛、銅、マンガン、鉄、およびコバルトの有意な貯留を示した。各モデルにおけるバイオメタル貯留のパターンは、有意な神経変性に先行し、各モデルについて公知の疾患の相対的な重症度に平行していた40。同様に、MTは、アストロサイト内の銅ホメオスタシス不全の正常化に関連している可能性のある保護的役割をALS疾患経過において果たし、運動ニューロンの生存を促進するという仮説が立てられた（Tokuda E.et al.,Hum Mol Genet 2014;23(5)）。類似した疾患機序が、LSDの情況においても起こり得るが、未だ探究されていない。
【０１２１】
全体として、これらのデータは、外因的に送達されたMTが、疾患に関連した神経傷害機序をモジュレートすることによって、CNSに重度に影響するLSDにおいて治療的役割を発揮し得ることを示している可能性がある。しかしながら、遺伝子組換えによって極めて高いレベルでMTを構成性発現させた、利用されたモデルの人工的な性質は、本発明者らの所見の臨床移行可能性を正確に予測することを可能にし得ない。従って、本発明者らは、LSDマウス、将来的には、LSD患者へのMT送達の実行可能性および治療的適切さの査定を目的とした単純な概念実証実験を実施することによって、この限界に取り組んだ。最近、新たに開発されたAAV-PHP.Bカプシドが、成体マウスにおいて血管内投与によって高い効率で広範なCNS遺伝子移入を媒介することが示された（Deverman BE.et al.,Nat Biotechnol 2016;34(2)）。従って、本明細書中に開示されるように、1コピーのMTまたは3種の異なる2Aペプチドによって連結された4コピーのMTを含有しているAAV-PHP.Bベクターを生成し、RNAレベルおよびタンパク質レベルの両方において、4コピーを含む発現系の方が、増加したMT発現の駆動において性能が高いことを確認した。GLD動物にインビボで注射された時、このAAV-4MTベクターは、MTtg-GLDマウスにおいて観察された所見を再現しバリデートした。実際、MT-1 cDNAのAAVによって媒介される送達および影響されたGLD脳におけるその発現は、有意に改善された生存、炎症および酸化ストレスのモジュレーション、ならびにGLD中枢神経系において発揮された抗アポトーシス効果を含む、遺伝子組換えによる構成性発現と類似した効果を発揮した。従って、これらの所見は、LSDにおける治療剤としてMTがさらに探究され得るという概念をバリデートする。
【０１２２】
結論として、現在までに記載された神経保護特色は、LSDのための新規の治療剤および/または標的としてMTを活用するために有望である。MT補充治療は、神経保護戦略としてクリニカルトランスレーションに関して利用可能な任意の形態で構想され、最終的には、酵素活性再構成を目標とする他のアプローチとカップリングされ得る。
【０１２３】
本明細書中の前記の結果は、以下の方法および材料を使用して得られた。
【０１２４】
ヒト研究
LSD（グロボイド細胞白質ジストロフィー（GLD）n＝2、異染性白質ジストロフィー（MLD）n＝2、NCL n＝2、ニーマン・ピック病（NPC）n＝2）によって影響された患者、ならびに年齢および性別が等しい対照4人に由来する死後急速凍結ホルマリン固定ヒト脳試料を、NICHD Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders at University of Maryland（Baltimore）から得た。死亡と組織試料採取との間隔は、全ての試料について24時間未満であった。RNA抽出は、本発明者らの以前の研究において既に記載されたように実施された（Cesani et al.,2014）。免疫組織化学的分析のため、MTクローンE9（Dako）を1:1000希釈で利用した。Lrp2 mRNA定量化のため、TaqmanアッセイHs00189741_m1を使用した。ウエスタンブロットは、1:1000で使用された一次ウサギ抗体αLrp2（Abcam製）によって実施された（例えば、Cesani et al.,2014を参照すること）。
【０１２５】
マウス研究
全ての手法が、Fondazione San Raffaele del Monte Tabor（IACUC 573）ならびにDana Farber Cancer Institute Committee on Animals（IACUC 15-024および15-042）の実験動物委員会によって承認された。マウスMT1レベルは、以下のLSDマウスモデル：GLD（n＝6、40日）、MLD（n＝4、10ヶ月）、サンドホフ（SD、n＝4、3.5ヶ月）、乳児NCL（INCL、n＝4、200日）、I型ムコ多糖症（MPS I、n＝4、10ヶ月）、MPS II（n＝3、10ヶ月）、MPS III（n＝4、40日）、多種スルファターゼ欠損（MSD、n＝5、2〜3週）において測定され、異なる齢の20匹の野生型（WT）マウスと比較された。
【０１２６】
マウスMT-1を保有するトランスジェニックマウス（B6.Cg-Tg(Mt1)174Bri/J系統、ストック番号002210）は、Jackson Laboratoryから購入された。MT-1マウスは、C57BL/6J背景で維持された。ヘテロ接合性GLDマウスをヘミ接合性MT-1と交配させた。次いで、第二世代から出発して、MT-1を保有するGLD病理によって影響された二重トランスジェニックマウス（ホモ接合性欠損変異体マウス）を得た。同一の戦略をINCLマウスモデルに適用した。INCLマウスは、（Peviani et al., Hematopoietic cell transplantation can mitigate neuronal pathology in a mouse model of infantile neuronal ceroid lipofuscinosis（投稿中）に広範囲に記載されている）バリデートされた疾患重症度スコアを使用することによって、症状出現による疾患進行についてスコア化された。
【０１２７】
免疫蛍光およびIHC研究。36日齢のGLDマウス、MT-GLDマウス、および日齢が等しいWTマウス、200日齢のINCLマウス、MT-INCLマウス、および日齢が等しいWTマウスを、深い麻酔の下で屠殺し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で灌流した。脳を単離し、4％パラホルムアルデヒドで16時間固定し、48時間、PBS中の10〜30％ショ糖勾配において平衡化し、次いで、急速冷凍のためOCT化合物で包埋した。16ミクロンのクリオスタット切片を、一次抗体：メタロチオネインに対するマウスモノクローナル（DAKO）1:100；ウサギ抗グリア線維酸性タンパク質（GFAP）（MCA1909；Serotec Ltd）1:500；ウサギ抗Iba1（Wako）1:100、マウスモノクローナル抗ニトロチロシン（Abcam）1:500；ラット抗マウスCD206（AbD Serotec）1:200；ウサギ抗カルビンディン（Swant）1:700；ウサギ抗パルブアルブミン（Swant）1:700と共に4℃で一晩インキュベートし；次いで、二次抗体：ヤギ抗マウスAlexa Fluor488 1:1000；ウサギ抗ヤギAlexa Fluor488 1:1000、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor546 1:1000、ヤギ抗マウスAlexaFluor546 1:1000（Molecular Probes）と共にRTで1時間30分間インキュベートした。試料を、Zeiss Axioskop2顕微鏡および3レーザー共焦点顕微鏡（Radiance 2100；BioRad TCS SP2）で可視化した。1個の光学セクションからの蛍光シグナルを、陰性染色対照に基づき定義された、各チャンネルのための一定の設定を使用して、連続的に取得した。クリオスタット切片を、染色および計数のため、以前に記載された方法に従って、レクチン組織化学のためにも加工した（Visigali et al.,Neurobiol Dis 2009;34(1):51-62；Neri et al.,Stem Cells 2011;29(10):1559-1571）。DAB（3,3'-ジアミノベンジジン）およびクレシルバイオレットによる免疫組織化学を、以前に記載されたように実施した（Peviani et al.,Neurobiol Dis 2014;62:218-32）。コンピューター支援画像分析のため、ImageJソフトウェアを、共焦点画像上のシグナル陽性領域の伸展を定量化するために使用した（全シグナル陽性領域）。適切な比較のため、シグナル定量化のために比較すべきスライスを染色し、画像を同時に取得した。
【０１２８】
ミクログリア集団の選別。灌流後の脳を、記載されたように加工した（Capotondo et al.,Intra-cerebral ventricular delivery of hematopoietic stem and progenitor cells allows efficiently generating microglia-like cells in myeloablated recipients）。
【０１２９】
DCFDAアッセイ。細胞内活性酸素種（ROS）のレベルを、蛍光プローブH2DCFDAの酸化に起因する蛍光の変化から決定した。簡単に説明すると、Percoll選択によって単離された骨髄系細胞を、FBS不含DMEMで1回洗浄し、蛍光プローブH2DCFDAの50μM溶液において37℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞をFBS不含培地で2回洗浄し、細胞内ROSに対応する蛍光をFITCチャンネル（LSR Fortessa）におけるフローサイトメトリーで分析した。
【０１３０】
RNA抽出。選別されたミクログリアに由来するRNAは、RNeasy plus Microキット（Qiagen）によって抽出され、完全トランスクリプトームアッセイのために使用された小脳に由来するRNA（200μg）は、RNeasy Lipid Tissue Miniキットによって抽出され、DNase I（Qiagen）によって処理された。定量的PCRは、以下の遺伝子について実施された：MT1（Mm00496660_g1）、IL1β（Mm00434228_m1）、TNFα（Mm00443258_m1）、Ifi44（Mm00505670_m1）、アルギナーゼ（Mm00477592_m1）、CD206（Mm01329362_m1）、YM1（Mm00657889_mH）、Hpgd（Mm00515121_m1）、Casp4（Mm00432304_m1）。
【０１３１】
完全トランスクリプトーム分析。全RNAが、36日齢GLDマウス（n＝3）、同齢MT-GLDマウス（n＝3）、日齢が等しいWTマウス（n＝3）、およびMTtg過剰発現マウス（n＝3）の小脳から抽出された。全RNAの質が、Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies,Palo Alto,CA）を使用して、最初に査定された。ビオチン標識されたcDNA標的が、150ngの全RNAから出発して合成された。二本鎖cDNA合成および関連cRNAは、GeneChip（登録商標）WT Plusキット（Affymetrix,Santa Clara,CA）によって実施された。センス鎖cDNAは、同キットで合成され、次いで、断片化され、標識された。DNAマイクロアレイハイブリダイゼーション、ならびに画像の取得、加工、およびバイオインフォマティクス分析が実施された。ハイブリダイゼーションは、標的希釈のためのミックス、7％の最終濃度のDMSO、ならびに、それぞれ、50pM、1.5pM、5pM、25pM、および100pMの最終濃度の予め混合されたビオチン標識された対照オリゴB2、およびbioB対照、bioC対照、bioD対照、およびcre対照（Affymetrixカタログ番号900299）を含有しているGeneChip（登録商標）Hybridization,Wash and Stainキットを使用して実施された。標的は、25ng/μlの濃度にハイブリダイゼーション緩衝液で希釈され、99℃で5分間変性させられ、次いで、45℃で5分間インキュベートされ、遠心分離された。次いで、単一のGeneChip（登録商標）マウストランスクリプトームアレイ1.0に、各ビオチン標識センス標的がハイブリダイズさせられた。
【０１３２】
ハイブリダイゼーションは、ロティサリーオーブンにおいて45℃で16時間実施された。GeneChip（登録商標）カートリッジは、FS450_0002標準プロトコルに従って、Affymetrix Fluidics Station 450において、GeneChip（登録商標）Hybridization,Wash and Stainキットで洗浄され染色された。プロトコルは以下の工程を含んでいた：（1）（洗浄）30℃で洗浄緩衝液Aとの2回/サイクルの混合を10サイクル；（2）（洗浄）50℃で洗浄緩衝液Bとの15回/サイクルの混合を6サイクル；（3）35℃でSAPE溶液における5分間のプローブアレイの染色；（4）（洗浄）30℃で洗浄緩衝液Aによる4回/サイクルの洗浄を10サイクル；（5）35℃で抗体溶液における5分間のプローブアレイの染色；（6）35℃でSAPE溶液における5分間のプローブアレイの染色；（7）（最終洗浄）35℃で洗浄緩衝液Aによる4回/サイクルの洗浄を15サイクル；（8）プローブアレイにArray Holding緩衝液を充填。
【０１３３】
画像の取得、加工、およびバイオインフォマティクス分析。GeneChipアレイが、デフォルトパラメータを使用して、Affymetrix GeneChip（登録商標）Scanner 3000 7Gを使用してスキャンされた。Affymetrix GeneChip（登録商標）Command Consoleソフトウェア（AGCC）が、GeneChip（登録商標）画像を取得し、.DATファイルおよび.CELファイルを生成するために使用され、それらのファイルが、専用ソフトウェアによるその後の分析のために使用された。
【０１３４】
MT-1をコードするAAV-PHP.Bベクターを利用した前臨床研究
1コピーのMT-1または2Aペプチドによって隔てられた4コピーのMT-1のいずれかをコードするカセットが、AAV-CBA.GFP-Wpreプラスミドにおいて、GFPの代わりにクローニングされた。AAV-PHP.Bベクターは、移入プラスミド、Fd6ヘルパープラスミド、ならびにAAV2 repおよび最近記載されたAAV-PHP.B cap遺伝子を保有するSena-Esteves実験室において生成されたプラスミドによるHEK-293細胞の一過性三重トランスフェクションによって作製された13。ベクターは、イオジキサノール勾配遠心分離後の7K MWCO Zeba Spin Desaltingカラム（Thermo Scientific）を使用したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）への緩衝液交換によって精製され、最後に、100K Amicon Ultra-15遠心フィルター（Merck Millipore,Cork,Ireland）によって濃縮された。力価は、プライマーを使用したqPCRおよびBGHポリアデニル化シグナルに対するプローブによって決定された。AAVベクターは、記載されたように（Capotondo et al,2017（投稿中））2日齢（PND2）GLDマウスの浅側頭静脈を介して注射された。対照マウスはPBSを受容した。
【０１３５】
他の態様
以上の説明から、様々な使用および条件にそれを採用するため、本明細書中に記載された本発明に、変動および修飾が施され得ることは明白であろう。そのような態様も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１３６】
本明細書中の変数の定義における要素のリストの列挙は、単一の要素またはリストされた要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書中の態様の列挙は、単一の態様として、または他の態様もしくはその一部分と組み合わせて、その態様を含む。
【０１３７】
本願は、米国特許出願第62/408,693号に一部分関連していてよく、その開示は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
本明細書中で言及された特許、公開、およびアクセッション番号は、全て、各々独立の特許、公開、およびアクセッション番号が、参照によって組み入れられると具体的に個々に示されたのと同一の程度に、参照によって本明細書中に組み入れられる。
【図１Ａ】
2020505446.tif 000007
【図１Ｂ】
2020505446.tif 000008
【図１Ｃ】
2020505446.tif 000009
【図１Ｄ】
2020505446.tif 000010
【図２Ａ】
2020505446.tif 000011
【図２Ｂ】
2020505446.tif 000012
【図２Ｃ】
2020505446.tif 000013
【図２Ｄ】
2020505446.tif 000014
【図２Ｅ】
2020505446.tif 000015
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2020505446.tif 000017
【図２Ｈ】
2020505446.tif 000018
【図３Ａ】
2020505446.tif 000019
【図３Ｂ】
2020505446.tif 000020
【図３Ｃ】
2020505446.tif 000021
【図３Ｄ】
2020505446.tif 000022
【図３Ｅ】
2020505446.tif 000023
【図３Ｆ】
2020505446.tif 000024
【図３Ｇ】
2020505446.tif 000025
【図４−１】
2020505446.tif 000026
【図４−２】
2020505446.tif 000027
【図５−１】
2020505446.tif 000028
【図５−２】
2020505446.tif 000029
【図５−３】
2020505446.tif 000030
【図６−１】
2020505446.tif 000031
【図６−２】
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【国際調査報告】
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