(57)【要約】  本発明はインスリンアナログ結合体及びその用途に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される、結合体：
［化１］
Ｘ−Ｌａ−Ｆ  （１）
（式中、Ｘが、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸、Ｂ鎖の２５番アミノ酸、Ａ鎖の１４番アミノ酸及びＡ鎖の１９番アミノ酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸の変異を含む、インスリンアナログであり；
Ｌが、リンカーであり；
ａが、０または自然数であり、ただしａが２以上の時、それぞれのＬは互いに独立であり；
Ｆが、Ｘの半減期を増加させうる物質であり；
前記結合体でＸ、Ｌ及びＦが一般式（１）の順に共有結合で互いに連結される。）
【請求項２】
前記Ｘが、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸への変異；天然型インスリンＢ鎖の２５番アミノ酸であるフェニルアラニンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異；天然型インスリンＡ鎖の１４番アミノ酸であるチロシンのヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸への変異；及び天然型インスリンＡ鎖の１９番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、またはトレオニンへの変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含む、
請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記Ｘが、下記一般式（２）で表される配列番号：５５のＡ鎖と下記一般式（３）で表さわされる配列番号：５６のＢ鎖を含むインスリンアナログである、
請求項１または２に記載の結合体：
［化２］
Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ｘａａ２１（配列番号：５５）（２）
（前記一般式（２）において、
Ｘａａ１が、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５が、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１２が、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１４が、チロシン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１６が、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９が、チロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、
Ｘａａ２１が、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、またはアラニンである。）
［化３］
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘａａ２５− Ｔｙｒ−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：５６）  （３）
（前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６が、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２５が、フェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、
Ｘａａ２７が、トレオニンであるか、不存在であり、
Ｘａａ２８が、プロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不存在である。
ただし、ここでＡ鎖が配列番号：５３と一致して、Ｂ鎖も配列番号：５４のＢ鎖と一致するペプチドは除く。）
【請求項４】
前記一般式（２）において、
Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８は、プロリンである、
請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記一般式（２）において、
Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、またはセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８は、プロリンである、
請求項３または４に記載の結合体。
【請求項６】
前記Ｘが、一般式（２）で表される配列番号：５５のＡ鎖と配列番号：５４のＢ鎖とを含むインスリンアナログである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項７】
前記Ｘが、配列番号：５３のＡ鎖と一般式（３）で表される配列番号：５６のＢ鎖とを含むインスリンアナログである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項８】
前記Ｘが、
（１）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はヒスチジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（２）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はリジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（３）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（４）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（５）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（６）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（７）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はセリンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（８）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はトレオニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（９）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１０）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１１）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１２）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１３）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、
請求項３に記載の結合体。
【請求項９】
前記Ｘが、配列番号：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインスリンアナログである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１０】
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、請求項３に記載の結合体。
【請求項１１】
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、請求項３に記載の結合体。
【請求項１２】
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、請求項３に記載の結合体。
【請求項１３】
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、請求項３に記載の結合体。
【請求項１４】
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、請求項３に記載の結合体。
【請求項１５】
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、請求項３に記載の結合体。
【請求項１６】
Ｆが、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin ）、糖類（saccharide）、ヘパリン、及びエラスチンからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１７】
前記高分子重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１８】
前記Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１９】
前記Ｆが、ＩｇＧ Ｆｃ領域である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２０】
前記Ｌが、ペプチド、脂肪酸、糖類（saccharide）、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２１】
前記高分子重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２２】
前記Ｌが、ポリエチレングリコールである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２３】
前記高分子重合体が、１〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項２０に記載の結合体。
【請求項２４】
インスリンアナログのＢ鎖のＮ末端またはインスリンアナログのリジン残基にリンカーが連結された、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２５】
前記Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域であり、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端にリンカーが連結された、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２６】
前記Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記結合体はリンカーの両末端がそれぞれインスリンアナログのＢ鎖のＮ末端と免疫グロブリンＦｃのＮ末端に連結された構造である、
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２７】
前記インスリンアナログが、天然型インスリンに比べて天然型インスリン受容体に対する結合力が低下された、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２８】
前記インスリンアナログの天然型インスリン受容体に対する結合力が、天然型インスリンの約１０％〜約９０％である、請求項２７に記載の結合体。
【請求項２９】
前記結合体が、Ｆが免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ｌがポリエチレングリコールであり、天然型インスリン受容体に対する結合力は天然型インスリンの０．１％〜５０％である、請求項２７に記載の結合体。
【請求項３０】
前記結合体が、Ｆが免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ｌがポリエチレングリコールであり、ＸがＡ鎖の１４番アミノ酸がアスパラギン酸であること以外は、天然型インスリンと配列が同一であるインスリンアナログである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の結合体を含む、糖尿病の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の結合体またはこれを含む組成物を糖尿病の治療を必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンアナログ結合体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のタンパク質は、血液中のタンパク質分解酵素によって分解されたり、腎臓を介して排泄もしくは受容体により除去されるなど、いくつかの経路を経て除去されることが知られている。そこで、前記のようなタンパク質除去機序を回避して生理活性タンパク質の半減期を増加させて治療学的効能を高めようと多様な試みが行われている。
【０００３】
一方、インスリンは人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンであって、血液内の余剰ブドウ糖を細胞に移し、細胞にエネルギー源を供給する一方、血糖を正常な水準に維持させる役割をする。しかし、糖尿病患者の場合、これらのインスリンが不足したり、インスリン抵抗性及びベータ細胞の機能消失により、インスリンが正常な機能を行っていない。そのため、糖尿病患者は、血液内のブドウ糖をエネルギー源として利用せず、血液中のブドウ糖の水準が高い高血糖の症状を示し、最終的に尿に糖を排出するようになり、これは、さまざまな合併症の原因となっている。したがって、インスリンの生成に異常があったり（Ｔｙｐｅ Ｉ）、インスリン耐性による（Ｔｙｐｅ ＩＩ）糖尿病患者は、インスリン治療が必要であり、インスリン投与により血糖値を正常水準に調節することができる。
【０００４】
しかし、インスリンの場合、他のタンパク質やペプチドホルモンのように生体内半減期が極めて短く、持続的な治療効果を示さず、効果を発揮するためには持続的に反復投与をしなければならないという欠点がある。このような頻繁な投与は患者に多大な苦痛や不便さを引き起こすことになるため、患者の順応性、安全性及び利便性の面で改善が求められている。
【０００５】
ここで、インスリンのようなタンパク質薬物の生体内半減期を増加させて投与回数を減らすことにより、患者の生活の質と治療的効果を高めるための様々なタンパク質の剤形化研究と化学的結合体（例えば、脂肪酸結合体）などに対する研究が進められている。
既存の報告によると、５０％以上のインスリンは腎臓で除去され、残りのインスリンは筋肉、脂肪、肝臓などの作用部位（target site）で受容体媒介クリアランス（receptor mediated clearance、RMC）工程を介して除去される。
【０００６】
これに関連して、非特許文献１及び２などでインスリンのＲＭＣを避けるため、インビトロ活性を弱化させることによって、血中濃度を増加させるなどのいくつかの報告があるが、非特許文献１の場合は、提示されたインスリンアナログは２つ以上のアミノ酸を置換したり、または具体的な結果を提示しておらず、非特許文献２の場合、インスリンアナログは受容体結合力で変化がないか、インスリン受容体に直接関与するアミノ酸を置換して活性が減少したことが報告されるなど、依然として持続性が増大されたインスリンアナログの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開第ＷＯ ９７／３４６３１号
【特許文献２】国際特許公開第９６／３２４７８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J Pharmacol Exp Ther（1998）286：959、Diabetes Care（1990）13：923
【非特許文献２】Diabetes（1990）39：1033
【非特許文献３】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一つの目的は、インスリンアナログの結合体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含む形質転換体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記結合体の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記インスリンアナログの結合体を含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記インスリンアナログの結合体を含む天然型インスリンの結合体に比べて生体内持続性及び／または安定性が増大された、持続性製剤を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記インスリンアナログの結合体を含むインスリン関連疾患、例えば糖尿病の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記インスリンアナログの結合体またはその組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含むインスリン関連疾患、例えば糖尿病を治療する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、薬剤の製造において、前記インスリンアナログの結合体の用途を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、インスリン関連疾患、具体的には、糖尿病の治療において、前記インスリンアナログの結合体の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するための本発明の一つの様態は、インスリンアナログの結合体である。
【００１２】
より具体的には、本発明の一つの様態は、下記一般式（１）で表される結合体である：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ   （１）
ここで、Ｘは、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸、Ｂ鎖の２５番アミノ酸、Ａ鎖の１４番アミノ酸及びＡ鎖の１９番アミノ酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸の変異を含む、インスリンアナログであり；
Ｌは、リンカーであり；
ａは、０または自然数であり、ただしａが２以上の時、それぞれのＬは互いに独立であり；
Ｆは、Ｘの半減期を増加させうる物質である。
【００１３】
一つの具体例として、前記Ｘは、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸への変異；天然型インスリンＢ鎖の２５番アミノ酸であるフェニルアラニンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異；天然型インスリンＡ鎖の１４番アミノ酸であるチロシンのヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸への変異；及び天然型インスリンＡ鎖の１９番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、またはトレオニンへの変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含むことを特徴とする。
【００１４】
他の具体例として、前記Ｘは、下記一般式（２）で表される配列番号：５５のＡ鎖と下記一般式（３）で表される配列番号：５６のＢ鎖の任意の組み合わせを含むインスリンアナログであって、天然型インスリンを除くこと、すなわちＡ鎖が配列番号：５３と一致すると同時に、Ｂ鎖も配列番号：５４と一致するペプチドを除くことを特徴とする。
【００１５】
Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ｘａａ２１（配列番号：５５）（２）
前記一般式（２）において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１２は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１４は、チロシン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１６は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９は、チロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、
Ｘａａ２１は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、またはアラニンである。
【００１６】
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘａａ２５−Ｔｙｒ−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：５６）  （３）
前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６は、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２５は、フェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、
Ｘａａ２７は、トレオニンであるか、不存在であり、
Ｘａａ２８は、プロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不存在である。
【００１７】
他の具体例として、前記Ｘは、前記一般式（２）で表される配列番号：５５のＡ鎖と配列番号：５４のＢ鎖を含むインスリンアナログであることを特徴とする。
【００１８】
他の具体例として、前記Ｘは、前記配列番号：５３のＡ鎖と一般式（３）で表される配列番号：５６のＢ鎖を含むインスリンアナログであることを特徴とする。
【００１９】
他の具体例として、前記一般式（２）において、
Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、 
前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２０】
他の具体例として、
前記一般式（２）において、
Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、またはセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２１】
他の具体例として、
前記Ｘは、
（１）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はヒスチジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（２）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はリジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（３）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（４）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（５）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（６）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（７）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はセリンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（８）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はトレオニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（９）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１０）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１１）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１２）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１３）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２２】
他の具体例として、前記Ｘは、配列番号：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインスリンアナログであることを特徴とする。
他の具体例として、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２３】
他の具体例として、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２４】
他の具体例として、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２５】
他の具体例として、
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２６】
他の具体例として、
前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２７】
他の具体例として、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであることを特徴とする。
【００２８】
他の具体例として、前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、糖類（saccharide）、ヘパリン、及びエラスチンからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２９】
他の具体例として、前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【００３０】
他の具体例として、前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であることを特徴とする。
他の具体例として、前記Ｆは、ＩｇＧ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
他の具体例として、前記Ｌは、ペプチド、脂肪酸、糖類（saccharide）、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
他の具体例として、前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【００３１】
他の具体例として、前記Ｌは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
他の具体例として、前記高分子重合体は、１〜１００ｋＤａの分子量を有することを特徴とする。
他の具体例として、前記インスリンアナログのＢ鎖のＮ末端またはインスリンアナログ内のリジン残基にリンカーが連結されたことを特徴とする。
他の具体例として、前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端にリンカーが連結されたことを特徴とする。
【００３２】
他の具体例として、前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記結合体は、リンカーの両末端がそれぞれインスリンアナログのＢ鎖のＮ末端と免疫グロブリンＦｃのＮ末端に連結された構造であることを特徴とする。
他の具体例として、前記インスリンアナログは、天然型インスリンに比べて天然型インスリン受容体に対する結合力が低下したことを特徴とする。
他の具体例として、前記インスリンアナログの天然型インスリン受容体に対する結合力は、天然型インスリンの約１０％〜約９０％であることを特徴とする。
他の具体例として、前記結合体は、Ｆが免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ｌがポリエチレングリコールであり、天然型インスリン受容体に対する結合力は天然型インスリンの０．１％〜５０％であることを特徴とする。
【００３３】
他の具体例として、前記結合体は、Ｆが免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ｌがポリエチレングリコールであり、ＸがＡ鎖１４番アミノ酸がアスパラギン酸であること以外は、天然型インスリンと配列が同一のインスリンアナログであることを特徴とする。
本発明を具現する別の様態は、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含む形質転換体である。
本発明を具現する別の様態は、前記結合体の製造方法である。
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記結合体を含む組成物である。
一つの具体例として、前記組成物は薬学的組成物であることを特徴とする。
他の具体例として、前記組成物はインスリン関連疾患の予防または治療用薬学的組成物であることを特徴とする。
【００３４】
他の具体例として、前記組成物は糖尿病の予防または治療用薬学的組成物であることを特徴とする。
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記インスリンアナログの結合体を含む、天然型インスリンの結合体に比べて生体内持続性及び／または安定性が増大された持続性製剤である。
【００３５】
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記インスリンアナログの結合体またはその組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含むインスリン関連疾患を治療する方法である。
一つの様態として、前記インスリン関連疾患は糖尿病であることを特徴とする。
本発明を具現するための他の一つの様態は、薬剤の製造において、前記インスリンアナログの結合体の用途である。
一つの様態として、前記薬剤はインスリン関連疾患の予防または治療用であることを特徴とする。
【００３６】
別の様態としては、前記薬剤は糖尿病の予防または治療用であることを特徴とする。
本発明を具現するための他の一つの様態は、インスリン関連疾患、具体的には、糖尿病の治療において前記インスリンアナログの結合体の用途である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係る非天然型であるインスリンアナログの結合体は、インスリン投与を必要とする患者の利便性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】インスリンアナログの純度をタンパク質電気泳動で分析した結果を示した図である。代表として、インスリンアナログである９、１０、１１、１２番のアナログに対する結果である。１番レーン：切片サイズ表示（size marker）、２番レーン：天然型インスリン、３番レーン：インスリンアナログ９番、４番レーン：インスリンアナログ１０番、５番レーン：インスリンアナログ1１番、６番レーン：インスリンアナログ１２番
【図２ａ−２ｄ】インスリンアナログの純度を高圧クロマトグラフィーで分析した結果である。代表として、インスリンアナログ９、１０、１１、１２番のアナログの結果を順に示した（図２ａ〜２ｄ）。各図面で、上から順番にＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４）及びＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図３ａ−３ｃ】本発明に係る代表的なインスリンアナログ結合体である「インスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ」と天然型インスリン結合体である「天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ」結合体との間の薬物動態学的特性を通常のマウス（図３ａ）、ＳＤラット（図３ｂ）、及びビーグル犬（図３ｃ）で比較して確認した結果を示したものである。
【図４】本発明に係る代表的なインスリンアナログ結合体である「インスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ」と天然型インスリン結合体である「天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ」結合体との間の血糖降下能力をＤＩＯ／ＳＴＺラットで確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下では、本発明をさらに詳細に説明する。
一方、本願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。つまり、本願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記記述される具体的な叙述によって、本発明のカテゴリが制限されることはない。
【００４０】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用して本出願に記載された本発明の特定の様態に対する多数の等価物を認識するか、確認することができる。さらに、これらの等価物は、本発明に含まれるものと意図される。
【００４１】
一方、本明細書全般を通じて、アミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられる。また、本明細書で略語で言及されたアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に基づいて記載された。
【００４２】
本発明を具現するための一つの様態は、インスリンアナログの結合体を提供する。
【００４３】
具体的には、前記インスリンアナログの結合体は、インスリンアナログにその生体内半減期を増加させるための生体適合性物質が結合された結合体の形態であってもよい。本明細書において、前記生体適合性物質はキャリアと混用してもよい。
【００４４】
本発明において、前記インスリンアナログの結合体はキャリアが結合されない前記インスリンアナログに比べて増加した効果の持続性を示すことができ、本発明では、これらの結合体を「持続型結合体」と称する。
【００４５】
一方、このような結合体は非自然的（non-naturally occurring）なものであってもよい。
より具体的には、本発明は下記一般式（１）で表される結合体を提供する：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ （１）
ここで、Ｘは、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸、Ｂ鎖の２５番アミノ酸、Ａ鎖の１４番アミノ酸及びＡ鎖の１９番アミノ酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸の変異を含む、インスリンアナログであり；
Ｌは、リンカーであり；
ａは、０または自然数であり、ただしａが２以上の時、それぞれのＬは互いに独立であり；
Ｆは、Ｘの半減期を増加させうる物質である。
【００４６】
本発明において、用語、「インスリンアナログ（insulin analog）」とは、天然型インスリンと異なる非天然型インスリンを意味する。前記インスリンアナログは、天然型ヒトインスリンと異なる非天然型ヒトインスリンを含む。前記インスリンアナログは、本発明の結合体を構成する一部分（moeity）であって、前記一般式（１）において、Ｘに該当する。
これらのインスリンアナログは、天然型インスリンの一部のアミノ酸を付加、欠失または置換の形態に変形させたアナログを含む。
【００４７】
具体的には、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリン配列と配列同一性を比較したとき、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、 ９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の配列同一性を有するものであってもよい。また、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリン配列と前記の配列同一性を有しながら、天然型インスリンに比べて天然型インスリン受容体に対する結合力が低下したものであってもよい。また、前記インスリンアナログは天然型インスリンのようにグルコース吸収能を保有するものであってもよいか／あってもよく、生体内で血中グルコースを降下させる能力を保有してもよい。本発明では、天然型インスリン受容体に対する任意のインスリンアナログの結合力とは、天然型インスリン受容体に対する任意の探知者リガンドの結合が天然型インスリンまたは該当インスリンアナログの存在下で抑制される競争的受容体結合阻害（competitive inhibition of receptor binding ）条件下で結合阻害度を測定したとき、天然型インスリンが示す結合阻害度とインスリンアナログの結合阻害度の百分比を意味する。ここで、結合阻害度は適切な基準に基づいてインスリン受容体のリガンド結合によって表される信号が有効に変化するのかを測定した数値で間接的に定義してもよい。例えば、放射能同位元素などの標識で標識したインスリンがインスリン受容体に結合するとき、この標識から発生する信号が標識がない天然型インスリンやインスリンアナログの付加後、それぞれどのくらい減ったり増えたりするか測定（例えば、天然型インスリンやインスリンアナログの信号の減少のためのＩＣ50値の測定）して得られた測定値の百分比（例えば、該当インスリンアナログのＩＣ50に対する天然型インスリンのＩＣ50の百分比）で結合力を定義することができる。これらの競争的な阻害を介した受容体結合力の測定はこの分野でよく知られている。本発明の具体的な実施形態で、これらの測定に必要な天然型インスリン受容体としては、ヒト天然型インスリン受容体（ＡアイソフォームまたはＢアイソフォームまたは両方）を発現する細胞膜、例えば、遺伝工学的方法を介してヒト天然型インスリン受容体を過発現するように操作した細胞の細胞膜を用いてもよく、探知者リガンドとしては、ヨウ素−１２５を標識した天然型インスリンを用いてもよい。本発明のより具体的な実施形態では、受容体結合の競争的な阻害の測定には、シンチレーション近接アッセイ（scintillation proximity assay、ＳＰＡ）を用いてもよい。さらに具体的な実施形態では、実験例１の方法でインスリン受容体に対する結合力を測定してもよい。
【００４８】
より具体的には、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのインスリン受容体結合力（１００％）と比較して約９９％またはそれ以下、約９５％またはそれ以下、約９０％またはそれ以下、約８５％またはそれ以下、約８０％またはそれ以下、約７５％またはそれ以下、約７０％またはそれ以下、約６５％またはそれ以下、約６０％またはそれ以下、約５５％またはそれ以下、約５０％またはそれ以下、約４５％またはそれ以下、約４０％またはそれ以下、約３５％またはそれ以下、約３０％またはそれ以下、約２５％またはそれ以下、約２０％またはそれ以下、約１５％またはそれ以下、約１０％またはそれ以下、約９％またはそれ以下、約８％またはそれ以下、約７％またはそれ以下、約６％またはそれ以下、約５％またはそれ以下、約４％またはそれ以下、約３％またはそれ以下、約２％またはそれ以下、約１％またはそれ以下、または約０．１％またはそれ以下のインスリン受容体に対する結合力を示してもよい（ただし、本発明のインスリンアナログはインスリン受容体に対する結合力が０％に該当することはない）。本発明の一つの具体的な実施形態では、インスリンアナログの天然型インスリン受容体に対する結合力は、天然型インスリンの約１０％〜約９０％であることが適切であるが、その数値は限定されず、結合力が天然型インスリンに比べて弱ければ本発明のカテゴリに属する。結合力が天然型インスリンに比べて弱い場合、インスリン受容体によるインスリンアナログの除去が弱化されて血中半減期が向上され、効力の持続力を期待することができる。
【００４９】
本発明の一実施形態において、インスリンアナログ結合体はリンカーがポリエチレングリコールであり、半減期を増加させうる物質が免疫グロブリンＦｃ領域であり、天然型インスリン受容体に対する結合力が天然型インスリンの約９９％またはそれ以下、約９５％またはそれ以下、約９０％またはそれ以下、約８５％またはそれ以下、約８０％またはそれ以下、約７５％またはそれ以下、約７０％またはそれ以下、約６５％またはそれ以下、約６０％またはそれ以下、約５５％またはそれ以下、約５０％またはそれ以下、約４５％またはそれ以下、約４０％またはそれ以下、約３５％またはそれ以下、約３０％またはそれ以下、約２５％またはそれ以下、約２０％またはそれ以下、約１５％またはそれ以下、約１０％またはそれ以下、約９％またはそれ以下、約８％またはそれ以下、約７％またはそれ以下、約６％またはそれ以下、約５％またはそれ以下、約４％またはそれ以下、約３％またはそれ以下、約２％またはそれ以下、約１％またはそれ以下、または約０．１％またはそれ以下のインスリン受容体に対する結合力を示してもよい（ただし、本発明のインスリンアナログ結合体は、インスリン受容体に対する結合力が０％に該当することはない）。本発明の１つの具体的な実施形態では、インスリンアナログ結合体の天然型インスリン受容体に対する結合力は、天然型インスリンの０．１〜５０％であることが適切であるが、その数値は限定されず、結合力が天然型インスリンに比べて弱ければ、本発明のカテゴリに属する。結合力が天然型インスリンに比べて弱い場合、インスリン受容体によるインスリンアナログ結合体の除去が弱化されて血中半減期が向上され、効力の持続力を期待することができる。
【００５０】
本発明において、用語、「約」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であり、約という用語の後に出てくる数値と同等または類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。
また、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのようにグルコース吸収能を保有してもよい。
具体的には、本発明に係るインスリンアナログは、天然型インスリンのグルコース吸収能（１００％）に比べて、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１１０％以上、約１２０％以上、約１３０％以上、約１４０％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１７０％以上、約１８０％以上、約１９０％以上、または約２００％以上のグルコース吸収能を有するものであってもよい。
【００５１】
グルコース吸収能の測定は、当業界に公知された様々なグルコース吸収能の測定方法を用いて達成してもよい。
具体的には、前記インスリンアナログは、天然型のＡ鎖とＢ鎖にそれぞれ対応する２つの配列の部位が１つのポリペプチド鎖の中に連結されている短鎖であるか、これらの配列の部位がそれぞれ独立したポリペプチド鎖からなる２つのポリペプチド鎖の形態であってもよい。以下、本明細書でインスリンアナログのＡ鎖またはＢ鎖と称するときには、当該インスリンアナログが２つのポリペプチド鎖の形態である時のその構成Ａ鎖またはＢ鎖を指すだけではなく、アナログが短鎖の形態である時も、当該短鎖ポリペプチド内で天然型Ａ鎖に対応する配列部位あるいは天然型Ｂ鎖に対応する配列部位をそれぞれ指している意味での場合に合わせて解釈しなければならない。本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのＡ鎖またはこれに対応するポリペプチドから選択する１つと天然型インスリンのＢ鎖もしくはこれに対応するポリペプチドから選択される一鎖との組み合わせである短鎖または２つのポリペプチド鎖の形態であってもよい。ここで、前記天然型インスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖に対応するということは、例えば、当該ポリペプチドのいずれか１つを天然型インスリンのＡ鎖またはＢ鎖と配列同一性を比較したとき、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の配列同一性を有する場合であるが、特にこれに制限されず、当該ポリペプチドを構成する配列と天然型インスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖の配列との比較を介して、当業者が容易に把握することができる。
【００５２】
前述したように、ここに記載された内容は、インスリンアナログの下位概念の説明にもすべて適用されるものと意図される。
天然型インスリンは、膵臓から分泌されるホルモンであって、一般的に細胞内グルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制して、体内の血糖を調節する役割をする。インスリンは血糖調節機能のないプロインスリン（proinsulin）前駆体の形態からプロセッシングを経て、血糖調節機能を有するインスリンになる。インスリンは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ２１個及び３０個のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖で構成されており、これらは２つのジスルフィド架橋で相互連結されている。天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖は、それぞれ下記の配列番号：５３及び５４で表されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
Ａ鎖：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号：５３）
Ｂ鎖：
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ− Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：５４）
本発明の一実施形態によれば、本願に記述されたインスリンアナログは、天然型インスリンのように生体内で血糖調節機能を保有しながら、受容体結合力が低下したものであってもよい。より具体的には、前記インスリンアナログは、生体内での血中グルコースを降下させる能力を保有してもよい。
【００５４】
また、本発明の一実施様態では、前記インスリンアナログは、低い受容体媒介内在化（receptor-mediated internalization）または受容体媒介クリアランス（receptor-mediated clearance）を示すことができれば、特にその種類及び大きさに制限されなくてもよい。これにより、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンに比べて増加した血中半減期を示してもよい。
【００５５】
本発明のインスリンアナログは、逆方向インスリン、天然型インスリンの誘導体、天然型インスリンの断片などを含む。これらのインスリンアナログは、遺伝子組換え法だけでなく、固相（solid phase）の方法でも製造することができ、これに制限されるものではない。
【００５６】
本発明において、用語、「天然型インスリンの誘導体」は、天然型インスリンと比較してアミノ酸配列に１つ以上の差のあるペプチド、天然型インスリン配列を改質（modification）を介して変形させたペプチド、天然型インスリンのように生体内の血糖調節機能を調節する天然型インスリンの模倣体を含む。これらの天然型インスリンの誘導体は、生体内の血糖調節機能を有するものであってもよい。
具体的には、天然型インスリンの誘導体は天然型インスリンから一部のアミノ酸が置換（substitution）、追加（addition）、削除（deletion）及び修飾（modification）のいずれか１つの方法またはこれらの方法の組み合わせを介して変形させてもよい。
【００５７】
具体的には、天然型インスリンのＡ鎖、Ｂ鎖と、それぞれ少なくとも８０％以上のアミノ酸配列から相同性を示すものであってもよく／あってもよいか、インスリンのアミノ酸一残基の一部のグループが化学的に置換（例えば、alpha-methylation 、alpha-hydroxylation）、削除（例えば、deamination）または修飾（例えば、N-methylation）された形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
誘導体の製造のためのいくつかの方法の組み合わせで、本発明に適用される天然型インスリンの誘導体を製造してもよい。
【００５８】
また、天然型インスリンの誘導体の製造のためのこれらの変形は、Ｌ型またはＤ型アミノ酸、及び／または非天然型アミノ酸を用いた変形；及び／または天然型配列を改質あるいは翻訳後の変形（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合など）することにより変形することをすべて含む。
また、前記天然型インスリンの誘導体は、天然型インスリンのアミノ及び／またはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたものをすべて含む。
【００５９】
前記置換または追加されたアミノ酸は、ヒトタンパク質で通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然発生アミノ酸を用いてもよい。非定型アミノ酸の商業源はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ及びＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれたペプチドと定型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、または韓国のＡｎｙｇｅｎを介して合成および購入可能であるが、特にこれに制限されない。
【００６０】
本発明において、用語、「天然型インスリンもしくは天然型インスリンの誘導体の断片」は、天然型インスリンもしくは天然型インスリンの誘導体のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去された形態をいう。これらのインスリン断片は、体内で血糖調節機能を保有しうる。
【００６１】
また、本発明のインスリンアナログは、前記天然型インスリンの誘導体及び断片の製造に用いられるそれぞれの製造方法が、独立して用いられたり、組み合わせて用いられて製造されたものであってもよい。
【００６２】
具体的には、本発明に係るインスリンアナログは、前記のような天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖で特定アミノ酸残基の変形を含むもので、具体的には、天然型インスリンのＡ鎖の特定アミノ酸残基が変形されて／されたり、Ｂ鎖の特定アミノ酸残基が変形されたものであってもよい。
【００６３】
具体的には、前記インスリンアナログは、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸、Ｂ鎖の２５番アミノ酸、Ａ鎖の１４番アミノ酸、Ａ鎖の１９番アミノ酸からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、その例としてグルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、またはアラニンに置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００６４】
具体的には、前記記述されたアミノ酸のうち１以上、２以上、３以上、または４つが本来のアミノ酸ではなく、他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【００６５】
具体的には、前記変異は、インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸への変異；インスリンＢ鎖の２５番アミノ酸であるフェニルアラニンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異；インスリンＡ鎖の１４番アミノ酸であるチロシンのヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸への変異；またはインスリンＡ鎖の１９番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、またはトレオニンへの変異であってもよい。
【００６６】
したがって、前記インスリンアナログは、天然型インスリンＢ鎖の１６番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸への変異；及び／または天然型インスリンＢ鎖の２５番アミノ酸であるフェニルアラニンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異；及び／または天然型インスリンＡ鎖の１４番アミノ酸であるチロシンのヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸への変異；及び／または天然型インスリンＡ鎖の１９番アミノ酸であるチロシンのグルタミン酸、セリン、またはトレオニンへの変異を含んでもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【００６７】
より具体的には、前記インスリンアナログは、下記一般式（２）で表される配列番号：５５のＡ鎖と下記一般式（３）で表される配列番号：５６のＢ鎖を含むインスリンアナログであってもよい。これらのインスリンアナログは、Ａ鎖とＢ鎖の配列がジスルフィド結合で相互連結された形態であるか、プロインスリンの形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００６８】
Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ｘａａ２１（配列番号：５５）（２）
前記一般式（２）において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１２は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１４は、チロシン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ１６は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９は、チロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、
Ｘａａ２１は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、またはアラニンである。
【００６９】
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘａａ２５− Ｔｙｒ−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：５６）  （３）
前記一般式（３）において、
Ｘａａ１６は、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２５は、フェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、
Ｘａａ２７は、トレオニンであるか、不存在であり、
Ｘａａ２８は、プロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不存在である。
【００７０】
ここで、Ａ鎖が配列番号：５３と一致しながら、Ｂ鎖が配列番号：５４のＢ鎖と一致するペプチドは、除外されてもよい。また、前述した特徴的なアミノ酸残基、特にＡ鎖の１４番アミノ酸及び／または１９番のアミノ酸及び／またはＢ鎖の１６番アミノ酸、及び／または２５番アミノ酸の特徴的な変異（すなわち、天然型インスリンに存在しないアミノ酸残基）を含みつつ、前記一般式（２）のＡ鎖及び一般式（３）のＢ鎖を含むインスリンアナログと７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上の相同性を有し、天然型インスリンに比べて受容体結合力が減少されたペプチドも本発明のカテゴリに含まれる。
【００７１】
本発明において、用語、「相同性（homology）」は、天然型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチド配列との類似度を示すためのものであり、本発明のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と前記のようなパーセント以上の同一配列を有する配列を含む。これらの相同性は２つの配列を肉眼で比較して決定してもよいが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析してくれる生物情報アルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定してもよい。前記２つのアミノ酸配列間の相同性はパーセントで表示してもよい。便利な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group、Madison、W、USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。前記モジュールの自動化された配列アルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ＆ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列のアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴとＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。
【００７２】
具体的な一つの様態例において、前記インスリンアナログは、前記一般式（２）で表される配列番号：５５のＡ鎖と、配列番号：５４のＢ鎖とを含むものであってもよく、前記配列番号：５３のＡ鎖と一般式（３）で表される配列番号：５６のＢ鎖とを含むインスリンアナログであってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【００７３】
より具体的には、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンである、インスリンアナログであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７４】
より具体的には、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、またはセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７５】
より具体的には、前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４は、チロシンまたはアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシン、グルタミン酸、セリン、またはトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７６】
具体的な一実施形態によれば、本発明に係るインスリンアナログは、下記に該当してもよい：
【００７７】
（１）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はヒスチジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００７８】
（２）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はリジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００７９】
（３）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８０】
（４）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８１】
（５）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８２】
（６）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８３】
（７）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はセリンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８４】
（８）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はトレオニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８５】
（９）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８６】
（１０）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８７】
（１１）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８８】
（１２）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００８９】
（１３）前記一般式（２）において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、前記一般式（３）において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるインスリンアナログである。
【００９０】
また、具体的な実施形態によれば、前記インスリンアナログは、配列番号：２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインスリンアナログであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００９１】
本発明に係るインスリンアナログは、前記記述された特定配列を含むもの、前記記述された特定配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００９２】
また、本願で「特定配列番号で構成されたペプチド」と記載されていたとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一、あるいは相応する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列の追加または自然に発生しうる突然変異、あるいはそのサイレント変異（silent mutation）を除くものではなく、このような配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属することが自明である。
【００９３】
一方、前記インスリンアナログは、ペプチドそれ自体、その塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、またはそれらの溶媒和物の形態をすべて含む。
さらに、ペプチドは薬学的に許容される任意の形態であってもよい。
前記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが望ましいが、特にこれに制限されるものではない。
前記用語、「薬学的に許容される」は、医薬的な判断の範囲内で過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応などを引き起こさず、目的の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
【００９４】
本発明において、用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。適切な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。適切な塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土金属、及びアンモニウムなどを含んでもよい。
【００９５】
また、本発明で用いられる用語、「溶媒和物」は、本発明に係るペプチドまたはその塩が溶媒分子と複合体を形成したものをいう。
【００９６】
前記インスリンアナログは、ペプチドの製造について当業界に公知された方法を用いて当業者が容易に生産することができる。例えば、次のような段階を含む方法で製造することができる。
【００９７】
ａ）前記インスリンアナログをコードする核酸を含む形質転換体を培養して、インスリンアナログを発現させる段階；及び
ｂ）発現されたインスリンアナログを分離及び精製する段階。
【００９８】
本発明において、形質転換体の培養に用いられる培地は適切な方法で宿主細胞の培養の要件を満たす必要がある。宿主細胞の生長のために培地中に含まれうる炭素源は、製造された形質転換体の種類に応じて当業者の判断により適宜選択することができ、培養時期及び量を調節するために適した培養条件を採用することができる。
【００９９】
用いられてもよい糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が含まれる。これらの物質は、個別に、または混合物として用いられてもよい。
【０１００】
用いられてもよい窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別に、または混合物として用いられてもよい。
【０１０１】
用いられてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。
【０１０２】
最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記された原料は培養中に培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加されてもよい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で使用して培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）を注入する。
【０１０３】
本発明に係る形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃の温度で行われる。また、培養は所望のインスリンアナログの生成量が最大に得られるまで持続されるが、このような目的のために培養は、通常１０〜１６０時間持続されてもよい。
【０１０４】
前述したように、宿主細胞に応じて適切な培養条件を造成すれば、本発明に係る形質転換体はインスリンアナログを生産するようになり、ベクターの構成及び宿主細胞の特徴に基づいて生産されたインスリンアナログは宿主細胞の細胞質内、ペリプラズム空間（periplasmic space）または細胞外に分泌されてもよい。
【０１０５】
宿主細胞内または宿主細胞外で発現されたタンパク質は、通常の方法で精製してもよい。精製方法の例としては、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（例えば、アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質画分沈殿など）、透析、ゲルろ過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー及び限外ろ過などの手法を単独または組み合わせて適用してもよい。
【０１０６】
本発明の具体例では、形質転換体から封入体の形態で発現されたインスリンアナログを分離及び精製するために下記段階をさらに含んでもよい：
ｂ−１）前記ａ）段階の培養液から形質転換体を収穫して破砕する段階；
ｂ−２）破砕された細胞溶解物から発現されたインスリンアナログを回収してリフォールディングする段階；
ｂ−３）リフォールディングされたインスリンアナログを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階；
ｂ−４）精製されたインスリンアナログをトリプシン及びカルボキシペプチダーゼＢで処理する段階；
ｂ−５）処理されたインスリンアナログを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフィーで順次精製する段階。
【０１０７】
本発明において、前記インスリンアナログをコードする核酸は、具体的には、配列番号：２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、及び５１で記載される塩基配列を含む。本発明は、一実施様態において、配列番号：２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、及び５１に記載される塩基配列だけでなく、前記配列と７０％以上の相同性、具体的には、８０％以上の相同性、より具体的には、９０％以上の相同性、さらに具体的には、９５％以上の相同性、最も具体的には、9８％以上の相同性を示す配列であって、実質的に核酸がコードしたペプチドが生体内の血糖調節機能を保有しつつ、天然型インスリンに比べて受容体結合力が低下したものをすべて含む。
【０１０８】
本発明に係る組換えベクターは、典型的にはクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されてもよく、原核細胞または真核細胞を宿主細胞にして構築されてもよい。
【０１０９】
本発明において、用語、「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる組換えベクターであって、核酸挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須な調整要素を含む核酸構造物（construct）を意味する。本発明は、インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを製造しうるが、前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換（transformation）または形質感染（transfection）させることで、本発明のインスリンアナログを得ることができる。
【０１１０】
本発明でインスリンアナログをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。
【０１１１】
本発明に係るインスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを形質転換させるための方法は、前記例に限定されず、当業界で一般的に用いられる形質転換または形質感染方法が制限なく用いられてもよい。
【０１１２】
目的核酸であるインスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを宿主細胞内に導入することにより、本発明の形質転換体（transformant）を獲得することができる。
【０１１３】
本発明に適した宿主は、本発明の核酸を発現するようにする限り、特に制限されない。本発明に用いられてもよい宿主の特定の例としては、大腸菌（E. coli）のようなエシェリキア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞；及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどの動物細胞がある。具体的には、宿主細胞として大腸菌を用いてもよいが、これに制限されない。
【０１１４】
一方、前記結合体でＦはＸの半減期を増加させうる物質であって、本発明の前記結合体を構成する一部分の一構成に該当する。
【０１１５】
前記ＦはＸと共有化学結合または非共有化学結合で互いに結合されるものであってもよく、共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせでＬを介してＦとＸが互いに結合されるものであってもよい。
【０１１６】
より具体的には、ＸとＬ、及びＬとＦは共有結合で互いに連結されるものであってもよく、この時、前記結合体は、一般式（１）の順に、Ｘ、Ｌ、及びＦが共有結合を介して、それぞれ連結された結合体である。
【０１１７】
前記Ｘの半減期を増加させうる物質は、生体適合性物質であってもよく、例えば、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、糖類（saccharide）、ヘパリン、及びエラスチンからなる群から選択されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。
【０１１８】
前記エラスチンの場合、水溶性前駆体であるヒトトロポエラスチン（tropoelastin）であってもよく、これらのうち、一部の配列または一部繰り返し単位の重合体であってもよく、例えば、エラスチン様ポリペプチドである場合をすべて含むが、特にこれに制限されるものではない。
【０１１９】
前記高分子重合体の例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される高分子重合体が挙げられるが、特にこれに制限されない。
【０１２０】
前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコール同種重合体、ＰＥＧ共重合体、またはモノメチル置換されたＰＥＧ重合体（ｍＰＥＧ）の形態をすべて包括する用語であるが、特にこれに制限されるものではない。
【０１２１】
また、前記生体適合性物質は、ポリリジン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸のようなポリアミノ酸を含むが、これに制限されるものではない。
【０１２２】
また、脂肪酸は、生体内アルブミンと結合力を有するものであってもよいが、特にこれに制限されない。
【０１２３】
より具体的な例として、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域であってもよく、より具体的には、ＩｇＧ Ｆｃ領域であってもよいが、特にこれに制限されない。
インスリンアナログの生体内での可溶性及び／または半減期を増加させて/させるか、生体利用率を増加させるために、本発明のインスリンアナログ内の１つ以上のアミノ酸の側鎖に生体適合性物質に接合されてもよい。このような変形は、治療学的タンパク質及びペプチドのクリアランス（clearance）を減少させうる。
前述した生体適合性物質は、水溶性（両親媒性または親水性）及び／または無毒性及び／または薬学的に許容可能なものであってもよい。
【０１２４】
前記ＦはＸと直接的に連結されるか（すなわち、前記一般式（１）において、ａが０であるか）、またはリンカー（Ｌ）を介して連結されたものであってもよい。
具体的には、前記Ｌはペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであってもよい。
前記Ｌがペプチド性リンカーである時、１つ以上のアミノ酸を含んでもよく、例えば、１個から１０００個のアミノ酸を含んでもよいが、特にこれに制限されるものではない。本発明では、ＦとＸを連結するために公知の様々なペプチドリンカーが、本発明に用いられてもよく、その例として[ＧＳ]ｘリンカー、[ＧＧＧＳ]ｘリンカー及び[ＧＧＧＧＳ]ｘリンカーなどを含み、ここで、ｘは１以上の自然数であってもよい。しかし、前記の例に制限されるものではない。
【０１２５】
本発明において、「非ペプチド性リンカー」は、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を含む。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体の一部分をなす一構成であってもよく、前記一般式（１）でＬに該当する。本発明で、Ｌが非ペプチド性リンカーであって、生体適合性重合体であるときには、非ペプチド性リンカーの末端部にはこのリンカーＬをインスリンアナログＸ及び／またはＦと共有結合で連結させるための連結要素をさらに含んでもよい。この連結要素は、前記生体適合性重合体の繰り返し単位ではなく、原子または原子団として前記生体適合性重合体とＸ及び／またはＦを共有結合で連結するのに適切なものであれば、特に制限はない。
【０１２６】
前記Ｌａでａは１以上であってもよく、ａが２以上のとき、それぞれのＬは独立であってもよい。
【０１２７】
本発明で、前記非ペプチド性リンカーは非ペプチド性重合体と混合して用いられてもよい。
また、１つの具体的な実施形態では、前記結合体は両方の末端にＦ、具体的に免疫グロブリンＦｃ領域及びＸと結合されうる反応基を含む非ペプチド性リンカーを介してＦとＸが互いに共有結合で連結されたものであってもよい。
【０１２８】
具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、脂肪酸、糖類（saccharide）、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。
特にこれに制限されないが、本発明において、前記高分子重合体は、０を超え、約１００ｋＤａの範囲、具体的には、約１〜約１００ｋＤａの範囲、より具体的には、約１〜約２０ｋＤａの範囲であってもよいが、これに制限されない。
【０１２９】
特にこれに制限されないが、前記非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、 ＰＬＡ（polylactic acid）及びＰＬＧＡ（polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されるものであってもよい。
【０１３０】
より具体的な実施形態では、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであってもよいが、これに制限されない。また、当該分野で既に知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も、本発明の範囲に含まれる。
【０１３１】
本発明で用いられてもよい非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば、制限なく用いてもよい。非ペプチド性重合体の分子量は、０を超え、約１００ｋＤａの範囲、具体的には、約１〜約１００ｋＤａの範囲、より具体的には、約１〜約２０ｋＤａの範囲であるが、これに制限されない。
【０１３２】
本発明において、用語、「約」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であって、約という用語の後に出てくる数値と同等または類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。
また、前記Ｆに該当するポリペプチドと結合される本発明の非ペプチド性リンカーは、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
【０１３３】
前述したように、一つの具体的な実施形態では、前記非ペプチド性リンカーの両末端は連結要素を介して、それぞれＦとＸに連結されうる。例えば、この具体的な実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域のアミン基またはチオール基及びＸのアミン基またはチオール基の化学反応を起こして共有結合を形成しうる（すなわち、結合体の連結要素に変換される）反応基をその末端に保有した非ペプチド性重合体（反応基保有非ペプチド性重合体）と免疫グロブリンＦｃ領域及び／またはインスリンアナログとを反応（連結反応）させて、本発明のインスリンアナログ結合体を製造する。つまり、ここで反応基保有非ペプチド性重合体は、連結反応を介して結合体の一部を構成する非ペプチド性リンカーになるが、このとき、結合体の中でこの非ペプチド性リンカーは、前記反応基保有非ペプチド性重合体の繰り返し単位と連結要素からなる。
【０１３４】
具体的には、前記結合体の製造のために用いてもよい反応基保有非ペプチド性重合体としては、両方の末端にそれぞれＦ（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）及びＸと結合できる反応基、具体的には、Ｘ、あるいはＦ（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）のＮ末端またはリジンに位置するアミン基、またはシステインのチオール基と結合されうる反応基のある非ペプチド性重合体を用いてもよいが、これに制限されない。
【０１３５】
また、Ｆ、例えば免疫グロブリンＦｃ領域及びＸと共有結合を形成できる前記非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体で構成された群から選択されてもよいが、これに制限されない。
前記で、アルデヒドに、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を例として挙げられるが、これに制限されない。
【０１３６】
前記で、スクシンイミド誘導体にはスクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカルボネートが用いられてもよいが、これに制限されない。
【０１３７】
非ペプチド性リンカーは、これらの反応基の変換を介してＸとＦに連結要素を経てつながってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【０１３８】
また、アルデヒド結合による還元性アミン化で生成された最終的な産物は、アミド結合で連結されたものよりもはるかに安定的である。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基と共有結合を形成しうる。
【０１３９】
また、前記反応基保有非ペプチド性重合体の両側末端の反応基は、互いに同一または互いに異なってもよく、例えば、一方の末端にはマレイミド基、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を有してもよい。しかし、反応基保有非ペプチド性重合体の各末端にＦ、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域とＸが結合することができれば、特にこれに制限されない。
【０１４０】
例えば、前記反応基保有非ペプチド性重合体の一端には、反応基としてマレイミド基を含み、もう一方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基などを含んでもよい。
【０１４１】
両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記様々な反応基で活性化するか、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて、本発明の持続型タンパク質結合体を製造してもよい。
【０１４２】
一つの具体的な実施形態において、前記非ペプチド性重合体は、Ｘ、すなわちインスリンアナログのＮ末端領域またはリジン残基に連結されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。具体的には、インスリンアナログのＮ末端領域、具体的には、最末端アミノ酸のアミン基、またはインスリンアナログの内部に存在するリジンのアミン基に前記非ペプチド性重合体、具体的には、ＰＥＧが連結されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。
【０１４３】
また、具体的な実施形態において、前記非ペプチド性重合体は、Ｆ、例えば免疫グロブリンＦｃのＮ末端領域に連結されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。具体的には、前記免疫グロブリンＦｃのＮ末端領域、具体的には、最末端アミノ酸のアミン基に前記非ペプチド性重合体が連結されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。
前記の用語、「Ｎ末端領域」は、インスリンアナログまたは免疫グロブリンＦｃのアミノ末端領域を意味するもので、本発明の目的上、リンカーと結合しうる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｎ末端領域の最末端アミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端アミノ酸残基の周辺のアミノ酸残基をすべて含んでもよく、具体的には、最末端から最初〜２０番目のアミノ酸残基を含んでもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【０１４４】
もし、前記反応基保有非ペプチド性重合体のいずれか１つの末端にアルデヒド基が存在して、このアルデヒド基をインスリンアナログのＮ末端に位置したアミン基に連結する場合には、還元性アミン化反応を介して連結してもよく、前記反応基保有非ペプチド性重合体の他の一つの末端にアルデヒド基が存在して、免疫グロブリンＦｃのＮ末端に位置するアミン基に連結する場合も、還元性アミン化反応を介して互いに連結してもよい。
【０１４５】
本発明の結合体の一つの具体的な実施形態では、前記結合体は、製造に用いた反応基保有非ペプチド性重合体が両末端にアルデヒド基反応基を備えたＰＥＧである場合であって、還元的アミン化を介してＸとＦのアミノ基に連結されて結合体を形成したものであり、この時この結合体は、次のような形態の構造である。
【０１４６】
Ｘ−ＮＨＣＨ2−Ｗ−ＰＥＧ一部分−Ｚ−ＣＨ2ＮＨ−Ｆ
ここで、−ＣＨ2Ｗ−は非ペプチド性重合体とＸを、−Ｚ−ＣＨ2−は非ペプチド性重合体とＦを結ぶ連結要素としてＷとＺは不存在であるか、またはアルキレンなどの２価作用基である。−ＣＨ2Ｗ−と−Ｚ−ＣＨ2−のメチレンは、それぞれのアルデヒド反応基に由来したものであり、Ｘ−ＮＨとＮＨ−Ｆの窒素原子は、それぞれ連結反応に用いられたインスリンアナログとＦのアミノ基から由来する。
【０１４７】
前記構造でＰＥＧ一部分は、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−構造だけでなく、連結要素とこの−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−間に介在する酸素原子を含んでもよい。
【０１４８】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び／または重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の結合体の一部分をなす一構成であってもよい。
【０１４９】
これらの免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含んでもよいが、これに制限されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等であるか、または改善された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
【０１５０】
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインのうち１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせは、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【０１５１】
また、１つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形態（dimeric form）であってもよく、二量体の形態の１つのＦｃ領域にＸの１分子が共有結合で連結されてもよく、この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、非ペプチド性重合体によって互いに連結されてもよい。一方、二量体の形態の一つのＦｃ領域にＸの２分子が対称的に結合することも可能である。この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、非ペプチド性リンカーによって互いに連結されてもよい。しかし、前記記述された例に制限されるものではない。
【０１５２】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。
【０１５３】
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番アミノ酸残基が変形のために適した部位として用いられてもよい。
【０１５４】
また、ジスルフィド結合を形成しうる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されることもあり、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されることもある。これらの免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献１及び２などに開示されている。
【０１５５】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸交換は当該分野で知られている（非特許文献３）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミド化（amidation）などで修飾（ modification）されてもよい。
【０１５６】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
【０１５７】
さらに、これらのＦｃ領域は、ヒト、牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、またはモルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得られることもあり、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して取得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃとＦ（ａｂ）2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態では、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１５８】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。これらの免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法を用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（Ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるので、生体内での不要な免疫反応を誘発しない。この点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により合致する形態は、糖鎖が除去されるか、または非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域であるだろう。
【０１５９】
本発明において、「糖鎖の除去（Deglycosylation）」は、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、より具体的な実施形態では、大腸菌で生産して糖鎖化されていないＦｃ領域を意味する。
【０１６０】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物由来であってもよく、より具体的な実施形態では、ヒト由来である。
【０１６１】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態では、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態では、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来である。さらに具体的な実施形態では、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態では、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域であるが、これに制限されるものではない。
【０１６２】
一方、本発明で「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一由来の短鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる由来の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択される２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【０１６３】
本発明を具現する別の様態は、前記結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含む形質転換体を提供する。
【０１６４】
前記結合体については、先に説明した通りである。
【０１６５】
前記ポリヌクレオチドは、融合タンパク質の形態の結合体をコードするものであってもよい。
【０１６６】
また、前記結合体をコードする分離されたポリヌクレオチドは、該当配列と７５％以上、具体的には８５％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を本発明のカテゴリに含む。  
前記ベクター、形質転換体について、前記した説明が本様態にも適用される。
【０１６７】
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記結合体の製造方法を提供する。
前記結合体については、先に説明した通りである。
具体的には、前記の方法は、
（ａ）２以上の末端反応基を有する非ペプチド性重合体とインスリンアナログまたはキャリアのいずれか１つとを反応させてインスリンアナログまたはキャリアが一方の末端に取り付けられ、もう一方の末端に反応基（reactive end group）を有する非ペプチド性重合体を製造する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で製造された、インスリンアナログ、またはキャリアが一方の末端に取り付けられ、もう一方の末端に末端反応基を有する、非ペプチド性重合体とキャリアまたはインスリンアナログ中のもう一方を反応させて、インスリンアナログとキャリアが非ペプチド性重合体を介して連結された、結合体を製造する段階を含んでもよい。
【０１６８】
前記非ペプチド性重合体、キャリア、インスリンアナログとこれらの連結の構成については、先に記述した説明がすべて適用される。
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記結合体を含む組成物を提供する。
前記結合体については、先に説明した通りである。
本発明において、前記組成物は薬学的組成物であってもよい。より具体的には、前記組成物はインスリン関連疾患の予防または治療用薬学的組成物であってもよい。より具体的には、前記組成物は糖尿病の予防または治療用薬学的組成物であってもよい。
本発明において、用語、「インスリン関連疾患」は、インスリンの生理活性がないか、または低くて発生、進行する疾患であって、例えば、糖尿病が挙げられるが、特にこれに制限されない。
【０１６９】
本発明において、用語「予防」は、前記結合体またはこれを含む組成物の投与によりインスリン関連疾患の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、前記結合体またはこれを含む組成物の投与によりインスリン関連疾患の症状が好転したり有利になるすべての行為を意味する。
【０１７０】
本発明に係るインスリンアナログ結合体を含む薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。これらの担体は、非自然に存在するものであってもよい。
【０１７１】
本発明において、用語、「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を示すことができるほどの十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時使用される薬物などの医学分野でよく知られている要素に応じて、当業者によって容易に決定されてもよい。
【０１７２】
薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、及び香料などを用いてもよく、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤などを混合して用いてもよく、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、及び保存剤などを用いてもよい。本発明の薬学的組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造されてもよい。例えば、経口投与の時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウエハーなどの形態で製造してもよく、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造してもよい。その他にも溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、及び徐放性製剤などで剤形化してもよい。
【０１７３】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが用いられてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
【０１７４】
本発明において、「投与」は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体の投与経路は薬物が目的の組織に到達できる限り、いかなる一般的な経路を介して投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、及び直腸内投与などになってもよいが、これに制限されない。しかし、経口投与時のペプチドは、消化されるため経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように製剤化することが望ましい。具体的には、注射剤の形態で投与されてもよい。また、薬学的組成物は、有効成分が標的細胞に移動しうる任意の装置によって投与されてもよい。
【０１７５】
また、本発明の薬学的組成物は、治療疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、及び疾患の中等度などのいくつかの関連因子と一緒に、有効成分である薬物の種類に応じて決定される。
【０１７６】
本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（single dose）で患者に投与されてもよく、多重投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）によって投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて、有効成分の含量を異にすることができる。具体的には、本発明の結合体の望ましい全体用量は１日に患者の体重１ｋｇ当たり約０.０００１ｍｇ〜５００ｍｇであってもよい。しかし、前記結合体の用量は薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率などのさまざまな要因を考慮して、患者に対する有効投与量が決定されるので、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【０１７７】
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記インスリンアナログの結合体を含む、天然型インスリンの結合体に比べて生体内持続性及び／または安定性が増大された、持続性製剤を提供する。
【０１７８】
前記インスリンアナログと結合体については、先に説明した通りである。
【０１７９】
本発明を具現するための他の一つの様態は、前記インスリンアナログの結合体またはその組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、インスリン関連疾患を治療する方法を提供する。
【０１８０】
前記インスリンアナログ及び結合体については、先に説明した通りである。
【０１８１】
一つの様態として、前記インスリン関連疾患は、糖尿病であるが、特にこれに限定されない。
本発明を具現するための他の一つの様態は、薬剤の製造において、前記インスリンアナログの結合体の用途を提供する。
【０１８２】
一つの様態として、前記薬剤はインスリン関連疾患の予防または治療用であるが、特にこれに制限されない。
【０１８３】
別の様態としては、糖尿病の予防または治療用であるが、特にこれに制限されない。
【０１８４】
本発明を具現するための他の一つの様態は、インスリン関連疾患、具体的に糖尿病の治療において、前記インスリンアナログの結合体の用途を提供する。
【０１８５】
前記インスリンアナログ、結合体、インスリン関連疾患には、先に説明した通りである。
以下、下記の実施例により本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれに制限されるものではない。
【０１８６】
実施例１：短鎖インスリンアナログ発現ベクターの作製
保有中の天然型インスリン発現ベクターを鋳型とし、Ａ鎖またはＢ鎖のアミノ酸を１つずつ変形させたインスリンアナログを作製するために、順方向及び逆方向オリゴヌクレオチドを合成した後（表２）、ＰＣＲを行い、それぞれのアナログ遺伝子を増幅した。
【０１８７】
表１に、それぞれのＡ鎖またはＢ鎖のアミノ酸の変化配列及びアナログ名を示した。つまり、アナログ１の場合は、Ａ鎖の１４番チロシン（Ｙ）がヒスチジン（Ｈ）に置換、アナログ６の場合、Ｂ鎖の１６番チロシンがグルタミン酸（Ｅ）に置換された形態である。
【０１８８】
【表１】
2020511513.tif 000003
インスリンアナログ増幅のためのプライマーは下記表２に示した。
【０１８９】
【表２】
2020511513.tif 000004
2020511513.tif 000005
インスリンアナログ増幅のためのＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６分であり、このプロセスを１８回繰り返した。このような条件で得られたインスリンアナログ断片は、細胞内の封入体形態で発現させるためにｐＥＴ２２ｂベクターに挿入されており、このように得られた発現ベクターをｐＥＴ２２ｂインスリンアナログ１〜１３と命名した。前記発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの調節下でインスリンアナログ１〜１３のアミノ酸配列をコードする核酸を含む。前記発現ベクターを含む宿主内でのインスリンアナログタンパク質を封入体形態で発現させた。
【０１９０】
表３に、それぞれのインスリンアナログ１〜１３のＤＮＡ配列とタンパク質配列を示した。
【０１９１】
それぞれの配列変更確認はＤＮＡ配列分析を介して確認し、その結果、それぞれのインスリンアナログが目的とするところにより、配列が変更になったことが確認できた。
【０１９２】
【表３】
2020511513.tif 000006
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【０１９３】
実施例２：組換えインスリンアナログの融合ペプチドの発現
Ｔ７プロモーター調節下の組換えインスリンアナログの発現を行った。それぞれの組換えインスリンアナログ発現ベクターにＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３（E.coli B F-dcm ompT hsdS（rB-mB-）galλDE3）；ノヴァジェン）を形質転換した。形質転換の方法は、ノヴァジェン社で推薦する方法に従った。各組換え発現ベクターが形質転換された個々の単一コロニーを取り、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２×ルリアブロス（Luria Broth、ＬＢ）培地に接種し、３７℃で１５時間培養した。組換え菌株の培養液と３０％グリセロールを含む２×ＬＢ培地を１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合して、各１ｍｌずつクライオチューブに分注して、−１４０℃で保管した。これを組換え融合タンパク質の生産のための細胞ストック（cell st℃k）として使用した。
【０１９４】
遺伝子組換えインスリンアナログの発現のためには、各細胞ストック１バイアルを溶かし、５００ｍｌの２×ルリアブロスに接種し、３７℃で１４〜１６時間振とう培養した。ＯＤ６００の値が５．０以上を示すと培養を終了し、これを種培養液として用いた。５０Ｌ発酵器（MSJ-U2、B.E.MARUBISHI、日本）を用いて、種培養液を１７Ｌの発酵培地に接種し、初期バス（bath）発酵を開始した。培養条件は、温度３７℃、空気量２０Ｌ／分（１ｖｖｍ）、攪拌速度５００ｒｐｍ及び３０％アンモニア水を用いてｐＨ６．７０に維持した。発酵の進行は、培養液内の栄養素が制限されたとき、追加培地（feeding solution）を添加して流加培養を行った。菌株の成長は、ＯＤ値によってモニタリングし、ＯＤ値が１００以上で最終濃度５００μＭのＩＰＴＧで導入した。培養は導入後、約２３〜２５時間までさらに進行し、培養終了後、遠心分離器を用いて組換え菌株を収穫して使用時まで−８０℃で保管した。
【０１９５】
実施例３：組換えインスリンアナログの回収及びリフォールディング（refolding）
前記実施例２で発現させた組換えインスリンアナログを可溶性の形態に変えるために、細胞を破砕してリフォールディングした。細胞ペレット１００ｇ（wet weight）を１Ｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％トリトンＸ−１００）に再浮遊した。微細溶液化プロセッサＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Microfluidic Corp. Model M-110EH-30）を用いて１５，０００ｐｓｉの圧力で実行して、細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を７，０００ｒｐｍで４〜８℃で２０分間遠心分離して上澄み液を捨て、３Ｌの洗浄緩衝液（０．５％トリトンＸ−１００及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）に再浮遊した。７,０００ｒｐｍで４〜８℃で２０分間遠心分離してペレットを蒸留水に再浮遊した後、同様の方法で遠心分離した。ペレットを取り、緩衝液（１Ｍ Ｌ−Ｇｌｙｃｉｎｅ、３．７８ｇ Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ１０．６）に再浮遊して、室温で１時間攪拌した。再浮遊された遺伝子組換えインスリンアナログの回収のために８Ｍウレアを追加した後、３〜５時間攪拌した。可溶化された組換えプロインスリンアナログのリフォールディング（refolding）のために７，０００ｒｐｍで４〜８℃で３０分間遠心分離した後、上澄み液を取った後、還元剤（１５ｍＭ Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ）を１時間処理し、ここで一定の倍数の蒸留水を蠕動ポンプ（peristaltic pump）を利用して入れながら４〜８℃で１２時間以上攪拌した。
【０１９６】
実施例４：陽イオン交換クロマトグラフィー精製
４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液で平衡化されたＳＰ ＦＦ（GE healthcare社）カラムにリフォールディングが終わった試料を結合させた後、塩化カリウム０．５Ｍと４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液を用いて濃度が０％から１００％になるように１０カラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログタンパク質を溶出した。
【０１９７】
実施例５：トリプシン（Trypsin）とカルボキシぺプチダーゼＢ（Carboxypeptidase Ｂ）の処理
溶出された試料を限外ろ過膜で塩を除去し、緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に交替した。得られた試料タンパク量の約３０，０００モル比に該当するトリプシンと約３，０００モル比に該当するカルボキシぺプチダーゼＢを添加した後、４〜８℃で１６時間以上攪拌した。
【０１９８】
実施例６：陽イオン交換クロマトグラフィーの精製
反応が終わった試料を４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液で平衡化されたＳＰ ＨＰ（GE healthcare社）カラムに再び結合させた後、塩化カリウム０．５Ｍと４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液を用いて濃度が０％から１００％になるように１０カラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログタンパク質を溶出した。
【０１９９】
実施例７：逆相クロマトグラフィーの精製
前記実施例６で得られた試料から純粋なインスリンアナログを純粋分離するために、リン酸ナトリウムとイソプロパノールを含むバッファーで平衡化された逆相クロマトグラフィーＳｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ（GE healthcare、米国）に結合させた後、リン酸ナトリウムとイソプロパノールを含む緩衝液を用いて線形濃度勾配でインスリンアナログタンパク質を溶出した。
【０２００】
このように精製されたインスリンアナログは、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、図１）及び高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、このうち代表として、インスリンアナログ９番、１０番、1１番、１２番の純度分析の結果を示すた（図２）。
【０２０１】
実施例８：持続型インスリンアナログ結合体の製造
前記実施例１〜７を介して製造したインスリンアナログの結合体を以下のような方法で製造した。
代表的に、アナログ１０の持続型結合体を次のように製造した。
【０２０２】
３．４Ｋ ｐｒｏｐｉｏｎ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を１つずつ有している３．４ｋＤａのＰＥＧ、アメリカＮＯＦ社）をインスリンアナログ１０のＢ鎖のＮ末端にＰＥＧ化させるために、インスリンアナログ１０ ：ＰＥＧのモル比を１：４で、インスリンアナログ１０の濃度を５ｍｇ／ｍｌで４℃で約２時間反応させた。この時、反応は５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と４５％イソプロパノールの混合溶媒で、３ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride（ＮａＣＮＢＨ3））還元剤を添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％ＥｔＯＨを含むバッファーとＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ−ＨＰ（GE Healthcare）カラムを用いて精製した。
【０２０３】
次に、前記インスリンアナログが付着したＰＥＧを免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結させるために、前記精製されたモノＰＥＧ化された（mono-PEGylated）インスリンアナログと免疫グロブリンＦｃ断片とのモル比が１：１．２になるようにして、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌにし、２５℃で１５時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭヘぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ８．２）と塩化ナトリウムに還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。
【０２０４】
反応が終結した後、反応液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）バッファーとＮａＣｌ濃度勾配を用いて、Ｑ−ＨＰ（GE、米国）カラムに適用し、硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）とTris−HCl（ｐＨ７.５）の濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（GE、米国）に適用し、インスリンアナログ１０−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
【０２０５】
比較例：持続型天然型インスリン結合体の製造
天然型インスリン（インドBiocon社）Ｂ鎖のＮ末端に３．４Ｋ ｐｒｏｐｉｏｎ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を１つずつ有している３．４ｋＤａのＰＥＧ、アメリカＮＯＦ社）をＰＥＧ化させるために、実施例８のようにＰＥＧ化反応と精製カラムを適用してモノＰＥＧ化された（mono-PEGylated）天然型インスリンを精製した。
【０２０６】
次に、前記天然型インスリンが付着したＰＥＧを免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結させるために、前記精製されたモノＰＥＧ化された（mono-PEGylated）天然型インスリンと免疫グロブリンＦｃ断片を実施例８と同様の反応条件と精製カラムを適用し、天然型インスリン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造した。
【０２０７】
実験例１：インスリンアナログのインスリン受容体に対する結合力の比較
インスリンアナログのインスリン受容体に対する結合力を測定するために、ＳＰＡ（Scintillation proximity assay）方法を用いて分析した。まず、インスリン受容体Ｂアイソフォームが発現された細胞膜を獲得するためにリポフェクタミン（Life technology社、米国）を用いてＣＨＯ細胞株にトランスファクションさせ、インスリン受容体Ｂアイソフォームが過発現されたＣＨＯ細胞株を作製し、作製された細胞株からホモジナイザー（Wheaton社、米国）で均質化した後、ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｕｓｈｉｏｎ法で細胞膜を分離して獲得した。獲得したヒト天然型インスリン受容体Ｂアイソフォームが発現されたＣＨＯ細胞株の細胞膜とＰＶＴ ＳＰＡビーズを９６ウェルピコプレート（PerkinElmer社、モデル番号6005162、米国）に一緒に入れて、競争者として１０種類以上の濃度で反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  、０．１％ＢＳＡ）に希釈したヒトインスリンまたはそれぞれのインスリンアナログ、及び探知者リガンドとして放射性同位元素であるヨウ素１２５で標識したヒト天然型インスリン（PerkinElmer社、モデル番号NEX-420、米国）を一緒に入れた後、常温で４時間競争反応させた。４時間後、ベータカウンター（PerkinElmer社、モデル番号C9904V1、アメリカ）を用いて、インスリン受容体の結合力を測定した。ベータカウンターで測定された数値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いて実験した各物質のＩＣ50を算出し、ヒトインスリンのインスリン受容体結合力に対するインスリンアナログのインスリン受容体ＩＣ50の百分比を結合力として数値化した。
【０２０８】
その結果、ヒトインスリンに比べてインスリンアナログ（１番）は９０％、インスリンアナログ（２番）は９５％、インスリンアナログ（３番）は１．０％、インスリンアナログ（４番）は＜０．１％、インスリンアナログ（６番）は２０％、インスリンアナログ（７番）は８．５％、インスリンアナログ（９番）は７９％、インスリンアナログ（１０番）は７９％、インスリンアナログ（１１番）は２４％、インスリンアナログ（１２番）は＜０．１％、インスリンアナログ（１３番）は＜０．１％の受容体結合力が確認された（表４）。このように、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンに比べてインスリン受容体結合力が減少したことを観察した。
【０２０９】
【表４】
2020511513.tif 000013
実験例２：持続型インスリンアナログ結合体の受容体結合力の確認
前記実験例１に記載された方法で持続型インスリンアナログのインスリン受容体とＩＧＦ−１受容体に対する結合力を確認した。
【０２１０】
その結果、ヒト天然型インスリンに比べてインスリン受容体に対する結合力は、天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体が２．４±０．４％、インスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体が１．３±０．２％と確認され、ＩＧＦ−１受容体に対する結合力は天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の両方がヒト天然型ＩＧＦ−１に対して１％未満であることを確認した。このように、本発明のインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に比べてインスリン受容体結合力が減少し、２つの物質両方がＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合を介して低いＩＧＦ−１受容体結合力を有することを確認した。
【０２１１】
【表５】
2020511513.tif 000014
１）容量反応曲線が最も高い濃度でも飽和に達していなかったので、正確な値は測定されなかった
実験例３：持続型インスリンアナログ結合体の薬物動態学的分析
持続型インスリンアナログ結合体の薬物動態学を確認するために、一定期間実験室に適応した正常のラット（ＳＤラット、オス、６週齢）、正常マウス、及び犬から時間による血中濃度の比較試験を行った。
【０２１２】
天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ１０ −ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を、マウスには４３．０５ｎｍｏｌ／ｋｇ、ラットには６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇそれぞれ単回皮下投与した後、０、１、４、８ 、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間で採血した。天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ１０ −ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を、犬には６．３ｎｍｏｌ／ｋｇでそれぞれ単回皮下投与した後、０、１、４、８、２４、４８、７２、 ９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０時間で採血した。
【０２１３】
各時間での天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ１０ −ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の血中内の残りの濃度は、酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ、enzyme linked immunosorbent assay）を用いて測定し、用いられたキットは、Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ（ALPCO、アメリカ）を用いた。ただし、測定抗体（detection antibody）ではｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Alpha Diagnostic Intl、Inc．、米国）を用いた。
【０２１４】
その結果、天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に比べて、インスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、マウス、ラット、犬での半減期がそれぞれ１．９倍、１．２倍、１．６倍に増加し、ＭＲＴは２．５倍、１．９倍、２．０倍増加した。このように、本発明のインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に比べて血中持続性が増加する結果を確認した。
【０２１５】
【表６】
2020511513.tif 000015
実験例４：持続型インスリンアナログ結合体のグルコース降下効果の確認
持続型インスリンアナログ結合体の薬力学を２型糖尿病モデルで確認するために、正常ラット（ＳＤラット、オス、７週齢）に２週間高脂肪食飼料（６０％Ｆａｔ）を与えた後、膵臓ベータ細胞を破壊できるＳＴＺを３０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間の間隔で計２回投与し、第２型糖尿病モデルを作製した（以下、ＤＩＯ／ＳＴＺラット）。製作したモデルは、持続的に糖尿病を維持するために高脂肪食飼料の摂取を続行した。
【０２１６】
天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体をＤＩＯ／ＳＴＺラットにそれぞれ１２．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、８．０９ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与を行い、３日間隔で反復投与を行った。天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体による血中グルコース降下効果を確認するために、投与後０日、１日、３日、６日、７日、９日、 １０日、１２日、１３日、１５日、１６日、２１日、２２日、２４日、２５日、２７日、２８日に微静脈から血液を採取し、血中グルコース測定器（OneTouch Ultra、LifeScan 、Inc.、USA）を用いて血中グルコース数値を確認した。
【０２１７】
その結果、天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に比べてインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＤＩＯ／ＳＴＺラットで５０％少ない用量を投与しても同等の血中グルコース降下効果を有することを確認した。これにより、本発明のインスリンアナログ１０−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の改善された血中持続性が、天然型インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に比べて少ない用量だけでも優れた血中グルコース降下効果を継続的に維持しうることを確認した。
【０２１８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、制限的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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