(57)【要約】  本発明は、放射性標識物質であって、ポリマー、放射性同位体、および固定化剤を含み、固定化剤がポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化することができ、固定化剤が複数のペンダント金属キレート化側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である放射性標識物質に関する。本発明はまた、放射性標識物質を作製するためのプロセス、癌の治療および／または放射線画像化のための医薬の調製のための放射性標識物質の使用、ならびに癌治療における放射性標識物質の使用に関する。ポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化するための固定化剤の使用をさらに記載する。【選択図】図１
2020504106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）放射性同位体；および
（ｉｉｉ）固定化剤；
を含み、
前記ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
前記固定化剤が前記ポリマー上または前記ポリマー中に放射性同位体を固定化することができ、前記固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である、放射性標識物質。
【請求項２】
前記ポリカチオンが、２〜６個のアミノ酸残基間隔で共有結合したペンダント側鎖を有するポリペプチド骨格を有する、請求項１に記載の放射性標識物質。
【請求項３】
前記金属キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）、６−ヒドラジノプリジン−３−カルボン酸（Ｈｙｎｉｃ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、デフェロキサミン（デスフェラール（ｄｅｓｆｅｒｒａｌ））、サルコファギン（ＳａｒＡｒ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレン）ホスホン酸（ＤＯＴＭＰ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレン）ホスホン酸；１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレン）ホスホン酸；ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−五酢酸およびその異性体誘導体；クリプタート［２，２，２］、クリプタート［３，２，２］、クリプタート［２，２，１］ならびにそのモノ−およびジ−ベンゾ誘導体；電子に富む（ドナー）基（ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミド（ａｍｉｄ）、アミン）を含む架橋カリックス［４］アレーン；１，１０−ジアザ−４，７，１３，１６−テトラオキサシクロオクタデカン−１，１０−Ｎ，Ｎ’−ビス−酢酸；および１，１０−ジアザ−４，７，１３，１６テトラオキサシクロオクタデカン−１，１０−Ｎ，Ｎ’−ビス−マロナートからなる群から選択される、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項４】
前記金属キレート剤がＤＯＴＡおよびＤＴＰＡから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項５】
前記金属キレート剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下での前記選択した放射性同位体（複数可）の固定化を維持するように選択される、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項６】
前記高分子が、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）またはポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項７】
前記固定化剤が、ＤＴＰＡまたはＤＯＴＡの複数の共有結合したペンダント側鎖を有するＰＤＬまたはＰＬＯである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項８】
前記ポリマーが、スルファート基、スルホナート基、カルボキシラート基、およびホスファート基のうちの少なくとも１つを含む陽イオン交換樹脂である、請求項１に記載の放射性標識物質。
【請求項９】
ポリマーがポリスチレンスルホナートである、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項１０】
前記ポリマーが、０．５〜１００ミクロンの中央径を有する微粒子ミクロスフェアの形態である、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項１１】
前記微粒子ミクロスフェアの中央径が０．５〜５０ミクロンである、請求項１０に記載の放射性標識物質。
【請求項１２】
前記微粒子ミクロスフェアの中央径が最大３５ミクロンである、請求項１０または１１に記載の放射性標識物質。
【請求項１３】
前記微粒子ミクロスフェアの中央径が０．５〜３５ミクロンである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項１４】
前記微粒子ミクロスフェアの中央径が８〜１２ミクロンである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項１５】
前記微粒子ミクロスフェアの中央径が８ミクロンである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項１６】
前記放射性同位体により画像化および／または治療が可能である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項１７】
前記画像化にはＳＰＥＣＴ画像化および／またはＰＥＴ画像化が含まれる、請求項１６に記載の放射性標識物質。
【請求項１８】
前記放射性同位体が、Ａｃ−２２５、Ａｕ−１９８、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｏ−５７、Ｃｒ−５１、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｅ−５９、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ−１５３、Ｈｏ−１６６、ｌｎ−１１１、Ｉｒ−１９２、Ｌｕ−１７７、Ｐｄ−１０３、Ｒｂ−８１、Ｒｂ−８６、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｕ−１０３、Ｓｃ−４７、Ｓｍ−１５３、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｒ−８９、Ｔｂ−１６１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｔｌ−２０１、Ｙ−９０、Ｙｂ−１６９、およびＺｒ−８９からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項１９】
前記放射性同位体が、周期表の１３族から選択される、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項２０】
前記放射性同位体が、Ｇａ−６７、Ｉｎ−１１１、Ｌｕ−１７７、またはＹ−９０からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の放射性標識物質。
【請求項２１】
画像化および／または治療を可能にするための少なくとも２つの放射性同位体の組み合わせを含む、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項２２】
前記放射性同位体の組み合わせが、Ｇａ−６８とＬｕ−１７７；Ｇａ−６７とＹ−９０；Ｇａ−６８とＹ−９０；Ｉｎ−１１１とＹ−９０；Ｌｕ−１７７とＹ−９０、およびＧａ−６７とＴｂ−１６１から選択される、請求項２１に記載の放射性標識物質。
【請求項２３】
少なくとも１つの非放射性担体金属をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項２４】
前記非放射性担体金属が、ＢｉおよびＦｅから選択される、請求項２３に記載の放射性標識物質。
【請求項２５】
前記非放射性担体金属によりＭＲＩ画像化および／またはＸ線造影が可能である、請求項２３または２４に記載の放射性標識物質。
【請求項２６】
前記非放射性担体金属がＭＲＩ画像化を可能にするためのＦｅであり、かつ／または前記非放射性担体金属がＸ線造影を可能にするためのＢｉである、請求項２３に記載の放射性標識物質。
【請求項２７】
前記放射性同位体が、γ線、β線、および／または陽電子を放出する、先行請求項のいずれかに記載の放射性標識物質。
【請求項２８】
二重放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）第１の放射性同位体；
（ｉｉｉ）第２の放射性同位体；
（ｉｖ）第１の固定化剤；および
（ｖ）第２の固定化剤；
を含み、
前記ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
前記第１の固定化剤が前記ポリマー上または前記ポリマー中に前記第１の放射性同位体を固定化することができ、前記第１の固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子であり；前記第２の固定化剤が前記ポリマー上または前記ポリマー中に前記第２の放射性同位体を固定化することができ、前記第２の固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である、二重放射性標識物質。
【請求項２９】
二重放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）第１の放射性同位体；
（ｉｉｉ）第２の放射性同位体；および
（ｉｖ）固定化剤；
を含み、
前記ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
前記固定化剤が前記ポリマー上または前記ポリマー中の前記第１の放射性同位体および前記第２の放射性同位体を固定化することができ、前記固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である、二重放射性標識物質。
【請求項３０】
請求項１に記載の放射性標識物質を作製するプロセスであって、
（ｉ）先行請求項のいずれかに記載のポリマーを先行請求項のいずれかに記載の固定化剤と混合する工程と；
（ｉｉ）任意選択的に、前記得られた混合物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）先行請求項のいずれかに記載の放射性同位体をさらに添加する工程と； 
（ｉｖ）任意選択的に、前記得られた混合物を洗浄する工程と
を含む、プロセス。
【請求項３１】
ポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化するための固定化剤の使用であって、前記固定化剤、前記放射性同位体、および前記ポリマーが請求項１〜２７のいずれか１項に記載のものである、使用。
【請求項３２】
癌の治療および／または放射線画像化のための医薬の製造のための請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質の使用。
【請求項３３】
患者の放射線治療方法であって、前記患者に治療有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を投与する工程を含む、方法。
【請求項３４】
前記放射線治療が肺のための内部照射療法である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記放射線治療が、原発性および／または転移性の肺腫瘍の治療のためのものである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
前記癌が、原発性肉腫、原発性または続発性の黒色腫、原発性頭頸部癌、原発性または続発性の脳腫瘍、原発性または続発性の肺癌、原発性または続発性の肝臓癌、原発性または続発性の乳癌、原発性または続発性の腎臓癌（腎癌）、原発性または続発性の卵巣癌、原発性または続発性の前立腺癌、または神経内分泌癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を静脈内注射によって投与する、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を腫瘍内直接注射によって投与する、請求項３３、３６、または３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を腹腔内注射によって投与する、請求項３３、３６、または３７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を動脈内注射によって投与する、請求項３３、３６、または３７に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を含む医療機器。
【請求項４３】
ミクロスフェア、シード、ステント、カテーテル、ワイヤ、またはウェーハである、請求項４２に記載の医療機器。
【請求項４４】
患者における医学的手順を画像化する方法であって、前記患者に請求項１〜２７のいずれか１項に記載の放射性標識物質または請求項２８もしくは２９に記載の二重放射性標識物質を投与する工程と、前記被験体内の前記放射性標識物質を検出する工程と、を含む、方法。
【請求項４５】
前記検出する工程が、前記放射活性のガンマカメラ画像化を含む、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的用途で用いる放射性標識物質（放射性標識されたポリマーなど）の調製に関する。特に、本発明は、局所性の標的照射療法および放射性画像化における放射性標識物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射性物質の局所投与を、癌、特に、手術のみでは首尾よく治療することが困難な癌のための治療として使用することができる。放射性物質を微粒子、シード、およびワイヤなどのデバイスに組み込み、癌に直接移植する。
【０００３】
選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）は、放射線治療の一形態であり、腫瘍に血液を供給する動脈に放射性物質のミクロスフェアを注射する工程を含む。
【０００４】
例えば、樹脂ベースの「ＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）」（ＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、Ｓｉｒｔｅｘ  ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄの登録商標である）ミクロスフェアは、９０Ｙ同位体を保有し、ＳＩＲＴのために使用される。ＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、特に肝臓癌の治療において適用されている。９０Ｙは、半径１〜２ｍｍ以内の腫瘍細胞を死滅させるので、β線治療に非常に適切である。しかし、β線は画像化が非常に困難である。制動放射線画像化（β崩壊中に生成された粒子が組織内の他の荷電粒子によって偏向されたときの減速およびその後の運動エネルギー損失によって生成された光子を使用する）は、同位体の実際の存在位置を真に示しておらず、得られる画像が低解像度であるので、あまり正確ではない。したがって、放射線が標的臓器に首尾よく送達されたかどうかおよび送達の程度を確認することは困難であり得る。
【０００５】
ＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、特に肝臓癌の治療において適用されている。治療への適用および画像化への適用の両方のために、他の標的臓器への放射性同位体の標的投与が依然として必要とされている。
【０００６】
肺癌は、全ての癌の中で最も侵襲性の高い癌の１つであり、５年生存率はわずかおよそ１０％である。肺癌患者では手術は稀であり、いくつかの化学療法が利用可能であるにもかかわらず、肺癌治療の改善が依然として必要とされている。いくつかの他のタイプの癌は肺に転移するので、肺癌治療の改善が必要とされるさらなる理由となっている。しかし、上記で考察されるように、ＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、画像化特性を欠くので、肺癌の治療に特に適切というわけではない。さらに、９０Ｙは非常に高エネルギーの同位体であり、肝臓の場合ほどには肺に適していない。肺は、損傷後の再生能力をいくらか有する肝臓よりも照射に対する感受性が高い。
【０００７】
ＷＯ２００９／１２９５７７号には、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）コーティングしたＴｃ−９９ｍナノ粒子（ＦｉｂｒｉｎＬｉｔｅ）の投与が肺の血管網内に放射性標識を特異的に蓄積させるための有効な方法であり、したがって、上記血管網の画像化が可能であることを示していた。ポリ−Ｄ−リジン処置したＴｃ−９９ｍ  ＦｉｂｒｉｎＬｉｔｅは、肺診断／予後のための標的造影剤の一例である。しかし、Ｔｃ−９９ｍはγ線画像化技術にのみ適しているので、これらのポリ−Ｄ−リジンコーティングしたＴｃ−９９ｍナノ粒子は、治療への適用に適していない。さらに、ＰＤＬコーティングしたＦｉｂｒｉｎＬｉｔｅナノ粒子は、およそ３時間の半減期の間のみ肺内に保持される。３時間の半減期は造影剤には適切であるが、治療に適用するためには、治療線量の放射線を提供するためにより長期間にわたって放射性標識物質が肺内に保持される必要がある。
【０００８】
治療線量のβ線を送達させるためにより長い期間にわたって肺内に放射性標識を保持するための別の放射性標識および手段が依然として必要である。さらに、使用される粒子は、呼吸に影響を及ぼす塞栓症や閉塞症を引き起こしてはならない。
【０００９】
既存の処置は、以下の問題も引き起こす。
【００１０】
放射性元素は、しばしば、半減期が短く、放射性物質の製造と患者への投与との間に経過した時間により、放射能が有意に喪失し得る。これにより、放射性物質の製造ならびに病院および患者への輸送に関連する費用が高くなる。
【００１１】
デバイス上への放射性核種の保持が不完全であることにより、放射性核種が浸出し、非標的臓器に意図しない播種を招き得る。したがって、健康な組織よりも優先して標的器官に放射線を送達させるために、放射線の照射を可能な限り最大限に制御することが望ましい。
【００１２】
放射性物質は、しばしば、２つ以上の放射性元素よりもむしろ１つの特定の放射性元素しか収容できず、このことが治療プログラムの多用途性を制限し得る。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、１つまたは複数の上記問題を克服する、癌、特に肺癌の治療のための放射性標識物質を提供することである。特に、その後の治療用ミクロスフェアの臓器分布をより正確に予想することができる方法を開発することが望ましい。さらに、治療用ミクロスフェアを投与する場合、治療の有効性および将来の治療の必要性を判断するために、患者の体内における正確な放射線被曝部位を判断するための信頼できる方法を有することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の態様では、放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）放射性同位体；および
（ｉｉｉ）固定化剤；
を含み、
ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
固定化剤がポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化することができ、固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である放射性標識物質を提供する。
【００１５】
本発明の第２の態様では、
二重放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）第１の放射性同位体；
（ｉｉｉ）第２の放射性同位体；
（ｉｖ）第１の固定化剤；および
（ｖ）第２の固定化剤；
を含み、
ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
第１の固定化剤がポリマー上またはポリマー中に第１の放射性同位体を固定化することができ、第１の固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子であり；第２の固定化剤がポリマー上またはポリマー中に第２の放射性同位体を固定化することができ、第２の固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である二重放射性標識物質を提供する。
【００１６】
本発明の第３の態様では、二重放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）第１の放射性同位体；
（ｉｉｉ）第２の放射性同位体；および
（ｉｖ）固定化剤；
を含み、
ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
固定化剤がポリマー上またはポリマー中の第１の放射性同位体および第２の放射性同位体を固定化することができ、固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である二重放射性標識物質を提供する。
【００１７】
本発明の第４の態様では、上記の第１の態様の放射性標識物質を作製するプロセスであって、
（ｉ）上記の第１の態様のポリマーを上記の第１の態様の固定化剤と混合する工程；
（ｉｉ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程；
（ｉｉｉ）第１の態様の放射性同位体をさらに添加する工程；および
（ｉｖ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程
を含むプロセスを提供する。
【００１８】
上記のプロセス中の工程の順序は制限されておらず；工程の順序はまた、以下であり得る：
（ｉ）上記の第１の態様のポリマーを上記の第１の態様の放射性同位体と混合する工程；
（ｉｉ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程；
（ｉｉｉ）第１の態様の固定化剤をさらに添加する工程；および
（ｉｖ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程。
【００１９】
本発明の第５の態様では、ポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化するための固定化剤の使用であって、固定化剤、放射性同位体、およびポリマーは、本発明の第１の態様の通りである使用を提供する。
【００２０】
本発明の第６の態様では、癌の治療および／または放射線画像化のための医薬の製造のための本発明の第１の態様の放射性標識物質または本発明の第２もしくは第３の態様の二重放射性標識物質の使用を提供する。
【００２１】
第７の態様では、本発明は、患者の放射線治療方法であって、上記患者に治療有効量の本発明の第１の態様の放射性標識物質または本発明の第２もしくは第３の態様の二重放射性標識物質を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
一実施形態では、放射線治療は、肺のための内部照射療法である。例えば、放射線治療は、原発性および／または転移性の肺腫瘍の治療のためのものである。
【００２３】
本発明の第６の態様では、癌を治療する方法であって、治療有効量の本発明の第１の態様の放射性標識物質または本発明の第２もしくは第３の態様の二重放射性標識物質を必要とする患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
一実施形態では、癌は、原発性肉腫、原発性または続発性の黒色腫、原発性頭頸部癌、原発性または続発性の脳癌、原発性または続発性の肺癌、原発性または続発性の肝臓癌、原発性または続発性の乳癌、原発性または続発性の腎臓癌（腎癌）、原発性または続発性の卵巣癌、原発性または続発性の前立腺癌、または神経内分泌癌である。
【００２５】
一実施形態では、癌は、原発性または続発性の肺癌である。
【００２６】
本発明の第７の態様では、本発明の第１の態様の放射性標識物質または本発明の第２もしくは第３の態様の二重放射性標識物質を含む医療機器を提供する。
【００２７】
一実施形態では、医療機器は、ミクロスフェア、シード、ステント、カテーテル、ワイヤ、またはウェーハである。
【００２８】
第８の態様では、本発明は、患者における医学的手順を画像化する方法であって、上記の患者に本発明の第１の態様の放射性標識物質または本発明の第２もしくは第３の態様の二重放射性標識物質を投与する工程、および上記被験体内の上記放射性標識物質または上記二重放射性標識物質を検出する工程を含む方法を提供する。
【００２９】
一実施形態では、検出する工程は、上記放射活性のガンマカメラ画像化を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）に共有結合したＤＴＰＡに基づくポリマー固定化剤の図である。ＰＬＯ骨格を、アミド結合を介して連結したＤＴＰＡのペンダント置換基を有するコイルとして左側に示す。示しているように、置換されていないＰＬＯのアミノ基は、自由にプロトンを受容し、正電荷を形成する。
【図２】異なる試薬濃度で調製された５つの構築物について、ＰＬＯの５ｋＤの分子量に関して、ＰＬＯに対するＤＴＰＡのモル比を示す。（注意：５ｋＤ  ＰＬＯポリマーは、４３〜４４個のオルニチン残基を含む）。
【図３】ポリスチレンスルホナートミクロスフェア（１ｍｇ）との混合後の異なる量の蛍光標識されたＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定化剤についての結合収率を示す。
【図４】１７７Ｌｕ−ＤＰＴＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射後の５匹の解剖したマウスの屠体のガンマカメラ画像を示す。その摘出した心臓／肺、肝臓、および脾臓を図４Ａに示す。図４Ｂは、肺から心臓を除去した後の肺および心臓のガンマカメラ画像を示す。
【図５】１７７Ｌｕ−ＤＰＴＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射後の肺および骨格／屠体の組織重量１グラムあたりの注入量の百分率（％ＩＤ）を示す。
【図６】生理食塩水中でオートクレーブ処理した１７７Ｌｕ−ＤＰＴＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物を投与したマウスの肺において見出された放射能レベルが、水中でオートクレーブ処理した１７７Ｌｕ−ＤＰＴＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物を投与したマウスの肺において見出された放射能レベルと比較して増加したことを示す。
【図７】２５０００個、５００００個、または１０００００個の４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞を含むハンクス平衡塩類溶液を（尾静脈を介して）静脈内注射したマウスの肺由来の生物発光流測定を示す。肺腫瘍成長を、細胞注射後３、６、９、および１３日目に測定した。マウスに、ルシフェリンを腹腔内（ＩＰ）注射し、マウスを麻酔し、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システムを使用して測定した。
【図８】マウス肺４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＰＴＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部電離放射線の影響を示す。以下の２つのマウス群についての結果を示す：１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した処置群（１７７Ｌｕ）；および１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与したネガティブコントロール群（Ｃｔｒｌ）。
【図９】マウス肺４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長を遅延させるために１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを使用した福祉エンドポイントに対する生存期間の改善を示す。
【図１０】マウス肺４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の３つの異なる線量の内部電離放射線の影響を示す。以下の４つのマウス群についての結果を示す：１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与したネガティブコントロール群（Ｃｔｒｌ）；ならびに０．８２、１．１、および１．３７ＭＢｑの放射活性を有する１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した３つの処置群。
【図１１】マウス肺Ｂ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部電離放射線の影響を示す。以下の２つのマウス群についての結果を示す：１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した処置群（１７７Ｌｕ）；および１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与したネガティブコントロール群（Ｃｔｒｌ）。
【図１２】静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに２４日間曝露した正常マウス由来の肺の組織学を示す。図１２は、倍率が４０倍のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したマウス由来の肺組織を示す。いくつかのミクロスフェアを矢印で強調し、白色バーは５０ミクロン（μｍ）を示す。
【図１３】静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに５日間曝露した４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍を有するマウス肺の組織学を示す。図１３は、倍率が４０倍のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したマウス由来の肺組織を示す。いくつかのミクロスフェアを矢印で強調している。
【図１４】５日間にわたる全血球数に及ぼす静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの影響を示す。全白血球数、リンパ球数、および好中球数に及ぼす内部照射の影響を、図１４Ａ、Ｂ、およびＣにそれぞれ示す。
【図１５】５日間にわたる静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＤＮＡ損傷の分析結果を示す。単離ＰＢＭＣを、共焦点顕微鏡法を使用して画像化し、ＤＮＡ損傷フォーカスを、γＨ２ＡＸ抗体（左）および５３ＢＰ１抗体（右）を使用して同定した。
【図１６】３ヶ月後のマウスの全血球数に及ぼす静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの影響を示す。全白血球数、リンパ球数、および好中球数に及ぼす内部照射の影響を、図１６Ａ、Ｂ、およびＣにそれぞれ示す。
【図１７】３ヶ月後の静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＤＮＡ損傷の分析結果を示す。単離ＰＢＭＣを、共焦点顕微鏡法を使用して画像化し、ＤＮＡ損傷フォーカスを、γＨ２ＡＸ抗体（左）および５３ＢＰ１抗体（右）を使用して同定した。
【図１８】麻酔下で１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３．９ｍｇ／ｋｇ）を（耳静脈を介して）静脈内注射した２羽のウサギのガンマカメラ画像を示す。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを５％デキストロース溶液に含めて注射した。ガンマカメラ画像を、麻酔下で注射直後ならびに注射１、２、および３時間後に得た。可視化のために画像のカウントを５０倍にした。
【図１９】麻酔下で１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３ｍｇ／ｋｇ）を（耳静脈を介して）静脈内注射した２羽のウサギのガンマカメラ画像を示す。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを生理食塩水に含めて注射した。ガンマカメラ画像を、それぞれの場合において麻酔下で注射直後ならびに注射１、６、１２、および１９日後に得た。可視化のために画像のカウントを５０倍にした。
【図２０】１７７Ｌｕ−ＤＰＴＡ−ＰＬＯミクロスフェアの静脈内注射後のウサギの肺、骨格、および腎臓に送達された組織の湿重量１グラムあたりの注入量の百分率（％ＩＤ）の１９日間にわたる経時変化を示す。
【図２１】ウサギの全血球数に及ぼす静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの経時的影響を示す。全白血球数、リンパ球数、および好中球数に及ぼす内部照射の影響を、図２１Ａ、Ｂ、およびＣにそれぞれ示す。
【図２２】静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに３ヶ月間曝露したウサギ肺の組織学を示す。図１３は、倍率が４０倍のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したウサギ由来の肺組織を示す。１羽のウサギは、肺実質全体に無作為に分散した小さな肉芽腫を有していたが（左）、この肉芽腫はいかなる他のウサギ試料にも存在しなかった。いくつかのミクロスフェアを矢印で強調している。
【図２３】１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの点滴注入後の２つのＶＸ２腫瘍を有する摘出したウサギ肝臓のガンマカメラ画像を示す。
【図２４】腫瘍内直接注射および４日間の曝露後のマウス皮下腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（１μｍ；１５ｍｇ／ｋｇ）の影響を示す。注射前に腫瘍を８日間成長させ、腫瘍表面積の変化を、腫瘍成長の８日目と１２日目の間にルシフェリンを腹腔内注射した後、４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞由来の生物発光領域の変化として測定した。コントロール群に、同一のサイズおよび量の非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
略語および定義
便宜上、本明細書中で使用した以下の略語を以下に列挙する。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「ＳＰＥＣＴ」は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法の略語である。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「ＰＥＴ」は、陽電子放出断層撮影の略語である。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「ＣＴ」は、コンピュータ断層撮影法の略語である。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「ＭＲＩ」は、磁気共鳴画像法の略語である。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「ＳＩＲＴ」は、選択的内部照射療法の略語である。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「ＰＤＬ」は、ポリ−Ｄ−リジンの略語である。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「ＰＬＯ」は、ポリ−Ｌ−オルニチンの略語である。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸の略語である。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「ＤＯＴＡ」は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸の略語である。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「ＤＴＰＡ」は、ジエチレントリアミン五酢酸の略語である。
【００４２】
本明細書中で使用される金属「キレート剤」または「キレーター」という用語は、単一の中心原子、特に、放射性同位体と2つ以上の個別の配位結合を形成する多座配位子をいう。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「治療有効量」には、その意味の範囲内に、所望の治療効果を得るための、本発明で用いる化合物または組成物の無毒であるが十分な量が含まれる。正確な必要量は、治療を受ける種、被験体の年齢、体重、および全身状態、共存症、治療される病態の重症度、投与される特定の薬剤、ならびに投与様式などの要因に応じて被験体毎に変動するであろう。したがって、任意の所与の場合について、適切な「有効量」を、当業者は、常法のみを使用して決定することができる。
【００４４】
本明細書の文脈において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「主に含むが必ずしも単独ではない」ことを意味する。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形形態は、それに応じて様々な意味を有する。それ故、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変形形態は、追加の整数または特徴が、整数Ａを含む、または整数ＡおよびＢを含むと記載される組成物、方法などに任意選択的に存在し得るように排他的な意味よりもむしろ包含的に用いられる。
【００４５】
本明細書の文脈において、用語「約」は、当業者によって所与の値から結び付けられる通常の許容範囲を示すと理解されるであろう。
【００４６】
本明細書の文脈において、ある範囲がパラメータについて記載されている場合、そのパラメータは、その範囲の記載の端点を含めて、記載の範囲内の全ての値を含むと理解されるであろう。例えば、「５〜１０」の範囲は、５、６、７、８、９、および１０という値ならびに記載の範囲内の任意の部分範囲（６〜１０、７〜１０、６〜９、７〜９などの部分範囲など）、記載の範囲の文脈において妥当な整数間の任意の値および範囲（５．５、６．５、７．５、５．５〜８．５、および６．５〜９など）が含まれると理解されるであろう。
【００４７】
本明細書の文脈において、用語「複数」は、１を超える任意の数を意味する。
【００４８】
許容される範囲で、本明細書中に引用された全ての参考文献は、その全体が参照により援用される。
【００４９】
本明細書中の医学での使用という言葉がヒトおよび非ヒト（動物適用など）への適用に等しく適用可能であると理解されることに留意されたい。それ故、他に示される場合を除き、患者、被験体、または個体という言葉がヒトまたは非ヒト（社会的、経済的、または研究において重要な任意の種（ウサギ目、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類、およびげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない）の個体など）を意味すると理解されるであろう。
【００５０】
同様に、本明細書中の「医療」機器という言葉が、ヒトおよび非ヒトでの使用（動物適用など）に適切な医療機器に等しく適用可能であると理解されることに留意されたい。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「デバイス」は、治療（実際の病態または症状の予防および治療が含まれる）で使用することができるデバイスおよび診断（患者の身体上または体内で診断を行う場合および患者の身体から得た試料上または試料を使用して診断を行う場合が含まれる）で使用することができるデバイスが含まれると理解されるであろう。したがって、本明細書中で使用される用語「デバイス」には、治療デバイスおよび診断デバイスが含まれる。
【００５２】
本明細書中で使用される「診断」は、治療の有無を問わない疾患または病態の初期の調査、予後、進行などのために疾患または病態が疑われる環境およびかかる疑いは存在しないが、健康診断、集団検診、または研究の目的などのために調査が望まれる環境で行われる調査手順が含まれると理解されるであろう。
【００５３】
詳細な説明
本発明は、放射性標識物質であって、
（ｉ）ポリマー；
（ｉｉ）放射性同位体；および
（ｉｉｉ）固定化剤；
を含み、
ポリマーがアニオン性置換基を含む陽イオン交換樹脂であり；
固定化剤がポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化することができ、固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である放射性標識物質を提供する。
【００５４】
固定化剤
固定化剤は、ポリマー上またはポリマー内に放射性同位体を固定化することができる化合物である。一実施形態では、固定化剤は、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である。
【００５５】
一実施形態では、高分子は、組織特異的な、臓器特異的な、細胞型特異的な、または病状特異的な高分子である。一実施形態では、高分子は、肺に特異的である。一実施形態では、高分子は、肺内のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。一実施形態では、高分子はポリカチオンである。一実施形態では、ポリカチオンは、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）から選択される。一実施形態では、ポリカチオンはＰＤＬである。一実施形態では、ＰＤＬの分子量は約４ｋＤ〜約１５ｋＤである。別の実施形態では、ポリカチオンはＰＬＯである。一実施形態では、ＰＬＯの分子量は、約５ｋＤ〜約１５ｋＤである。
【００５６】
固定化剤は、好ましくは、内因性プロテイナーゼによって分解不可能であるという利点を付与するためにＰＤＬまたはＰＬＯで構成されたポリペプチド骨格を含むポリカチオン性高分子である。好ましくは、ポリカチオン性高分子は、２〜６個のアミノ酸残基の間隔でペンダント側鎖が存在し、且つその間に非置換の正電荷のアミノ酸側鎖が存在するように、ポリペプチド骨格の長さに沿って間隔をあけて共有結合したペンダント側鎖を有するポリペプチド骨格を有する。一実施形態では、ポリカチオンは、肺内のＨＳＰＧに対するポリカチオンの結合親和性に影響を及ぼさないようにポリペプチド骨格に沿って十分に正電荷のアミノ酸側鎖を保持している。
【００５７】
好ましくは、共有結合したペンダント側鎖は、金属キレーターを含む。
【００５８】
一実施形態では、固定化剤は、金属キレート剤の複数の共有結合した側鎖を有するポリカチオンである。一実施形態では、固定化剤は、金属キレート剤の複数の共有結合した側鎖を有するポリアミノ酸である。一実施形態では、固定化剤は、金属キレート剤の複数の共有結合した側鎖を有するＰＤＬまたはＰＬＯから選択される。
【００５９】
一実施形態では、金属キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）、６−ヒドラジノプリジン−３−カルボン酸（Ｈｙｎｉｃ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、デフェロキサミン（デスフェラール（ｄｅｓｆｅｒｒａｌ））、サルコファギン（ＳａｒＡｒ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレン）ホスホン酸（ＤＯＴＭＰ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレン）ホスホン酸；１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレン）ホスホン酸；ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−五酢酸およびその異性体誘導体；クリプタート［２，２，２］、クリプタート［３，２，２］、クリプタート［２，２，１］ならびにそのモノ−およびジ−ベンゾ誘導体；電子に富む（ドナー）基（ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミド（ａｍｉｄ）、アミン）を含む架橋カリックス［４］アレーン；１，１０−ジアザ−４，７，１３，１６−テトラオキサシクロオクタデカン−１，１０−Ｎ，Ｎ’−ビス−酢酸；および１，１０−ジアザ−４，７，１３，１６テトラオキサシクロオクタデカン−１，１０−Ｎ，Ｎ’−ビス−マロナート；ならびに当業者に公知のこれらの金属キレート剤のうちのいずれかの誘導体、および任意の他の多座配位または大環状の金属キレート剤からなる群から選択される。
【００６０】
好ましくは、金属キレート剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下での選択した放射性同位体の固定化を維持するように選択される。
【００６１】
当業者は、金属キレート剤の選択がキレート化される放射性同位体に依存することを認識するであろう。ある放射性同位体に適切な金属キレートが必ずしも別の放射性同位体に最適な金属キレートではないであろう。
【００６２】
ＤＴＰＡまたはＤＯＴＡの共有結合したペンダント側鎖を有するＰＤＬまたはＰＬＯは、内因性プロテアーゼによって生分解が不可能であるので、本発明の好ましい固定化剤である。
【００６３】
一実施形態では、ペンダント金属キレート剤はＤＴＰＡであり、ポリカチオンはＰＬＯである。別の実施形態では、ペンダント金属キレート剤はＤＯＴＡであり、ポリカチオンはＰＬＯである。さらなる実施形態では、ペンダント金属キレート剤はＤＴＰＡであり、ポリカチオンはＰＤＬである。別の実施形態では、ペンダント金属キレート剤はＤＯＴＡであり、ポリカチオンはＰＤＬである。
【００６４】
一実施形態では、ポリカチオン鎖中の２〜６個のアミノ酸残基毎に１つのペンダントキレーター分子が存在する。一実施形態では、ポリカチオン鎖中の２、３、４、５、または６個のアミノ酸残基毎に１つのペンダントキレーター分子が存在する。一実施形態では、ポリカチオン鎖中の２〜５個のアミノ酸残基毎に１つのペンダントキレーター分子が存在する。別の実施形態では、ポリカチオン鎖中の２〜４個のアミノ酸残基毎に１つのペンダントキレーター分子が存在する。
【００６５】
一実施形態では、ペンダント金属キレート剤のポリカチオンに対するモル比は、約７〜２０である。別の実施形態では、ペンダント金属キレート剤のポリカチオンに対するモル比は、約１２〜１８である。さらなる実施形態では、ペンダント金属キレート剤のポリカチオンに対するモル比は、約１３〜１７である。
【００６６】
一実施形態では、ペンダント金属キレート剤はＤＴＰＡであり、ポリカチオンはＰＬＯである。一実施形態では、ＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比は、約７〜２０である。別の実施形態では、ＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比は、約１２〜１８である。さらなる実施形態では、ＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比は、約１３〜１７である。
【００６７】
ポリマー
本発明のポリマーは、血液と生体適合性を示す（すなわち、いわゆる内因系経路による血液凝固や血小板接着の促進による血栓症を促進しない）表面を有する任意のポリマーであり得る。
【００６８】
一実施形態では、本発明のポリマーは、ポリカチオンに結合するためのアニオン性置換基（スルファート基、スルホナート基、カルボキシラート基、およびホスファート基など）を含む陽イオン交換樹脂である。
【００６９】
例えば、ポリマーは、当該分野で公知の任意の血液生体適合性ポリマー（ポリスチレン、ポリスチレンスルホナート、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ）（ＰＴＦＥ）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｏｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）（ＥＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、テフロン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタラート、ポリ（ブチレンテレフタラート）（ＰＢＴ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリジオキサノン、トリメチレンカルボナート、ポリ酸無水物、およびポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシル）プロパン：セバシン酸が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。好ましくは、ポリマーはポリスチレンスルホナートである。
【００７０】
特に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ）（ＰＴＦＥ）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｏｕｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）（ＥＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリスチレン、およびテフロンを、本発明でポリマーとして使用することができる。
【００７１】
人工血管のために使用することができるポリマーには、ポリエステル、例えば、ポリエチレンテレフタラート、ポリウレタン、およびポリテトラフルオロエチレンが含まれる。
【００７２】
ポリマーは、カテーテル、繊維、ロッド、またはフィラメント、ワイヤ、メンブレン、ウェーハ、メッシュ、ガーゼ、多孔質スポンジ、チューブ、ステント、ビーズ、カプセル、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、およびリポソームに接着することができるか、これらの形態であり得る。好ましくは、ポリマーは、ミクロスフェア、シード、ステント、カテーテル、ワイヤ、またはウェーハの形態である。ステントを、術後の短期間に起こる再閉塞を防止するために、血管内近接照射療法のための放射性同位体と共に使用することができ、ここで、ステントは、平滑筋細胞の増殖を抑制するための放射性同位体を含む。
【００７３】
ポリマーミクロスフェアは、肺動脈網の前毛細血管レベルで保持されるのに適切なサイズである。ミクロスフェアの中央径は、０．５〜２００ミクロン、０．５〜５０ミクロン、最大３５ミクロン、または０．５〜３５ミクロンであることが好ましい。放射性核種含有ミクロスフェアの例は、米国特許出願第１１／１９２，２９９号に記載されている。
【００７４】
一実施形態では、ポリマーは、中央径が０．５ミクロンと１００ミクロンとの間である微粒子ミクロスフェアの形態である。一実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、０．５〜５０ミクロンである。一実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、最大３５ミクロンである。一実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、０．５〜３５ミクロンである。一実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、８〜１２ミクロンである。別の実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、８ミクロンである。さらなる実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、１ミクロンである。１つのなおさらなる実施形態では、微粒子ミクロスフェアの中央径は、３０ミクロンである。
【００７５】
本発明で用いるポリマーミクロスフェアには、ポリスチレンスルホナートから構成される樹脂ベースのミクロスフェアであるＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）（ＳＩＲ−ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、Ｓｉｒｔｅｘ  ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄの登録商標である）ミクロスフェアの製造で使用されるものが含まれる。
【００７６】
放射性同位体
本発明の放射性同位体は、画像化および／または治療が可能である。好ましくは、画像化には、ＳＰＥＣＴ画像化および／またはＰＥＴ画像化が含まれる。
【００７７】
単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）は、γ線を使用する核医学断層画像化技術であり、真の３Ｄ情報を提供することができる。情報は、しばしば、患者を横断する断面切片として提供される。同位体のγ線放出のために、放射性標識物質が患者の体内に蓄積されている場所を観察することが可能である。かかる真の３Ｄ表示は、腫瘍画像化で役立ち得る。
【００７８】
陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）は、３Ｄ画像を生成する核医学画像化技術であり、伝統的なＳＰＥＣＴ画像化より感度が高い。このシステムは、体内に導入された陽電子放出放射性核種（トレーサー）によって間接的に放出されたγ線ペアを検出する。次いで、体内のトレーサー濃度の３Ｄ画像をコンピュータ解析によって構築し、３Ｄ画像化は、しばしば、同一の装置内で同一のセッション中に患者に対して実施されるコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）Ｘ線スキャンを活用して行われる。陽電子放出同位体をＣＴと併せて使用して、標識した医療機器の解剖学的分布の３Ｄ画像を得ることもできる。
【００７９】
一実施形態では、放射性同位体により画像化および／または治療が可能である。一実施形態では、画像化には、ＳＰＥＣＴ画像化、および／またはＰＥＴ画像化が含まれる。一実施形態では、放射性同位体は、Ａｃ−２２５、Ａｕ−１９８、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｏ−５７、Ｃｒ−５１、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｅ−５９、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｉｎ−１１１、Ｉｒ−１９２、Ｌｕ−１７７、Ｐｄ−１０３、Ｒｂ−８１、Ｒｂ−８６、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｕ−１０３、Ｓｃ−４７、Ｓｍ−１５３、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｒ−８９、Ｔｂ−１６１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｔｌ−２０１、Ｙ−９０、Ｙｂ−１６９、およびＺｒ−８９から選択される。一実施形態では、放射性同位体は、周期表の１３族から選択される。一実施形態では、放射性同位体は、Ｇａ−６７、Ｉｎ−１１１、Ｌｕ−１７７、Ｔｌ−２０１、またはＹ−９０である。
【００８０】
本発明の放射性同位体には、放射性金属同位体または放射性半金属同位体が含まれ得る。好ましくは、放射性同位体は、水溶性金属カチオンである。
【００８１】
適切な本発明の放射性金属同位体の例には、Ａｃ−２２５、Ａｕ−１９８、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｏ−５７、Ｃｒ−５１、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｅ−５９、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ−１５３、Ｈｏ−１６６、ｌｎ−１１１、Ｉｒ−１９２、Ｌｕ−１７７、Ｐｄ−１０３、Ｒｂ−８１、Ｒｂ−８６、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｕ−１０３、Ｓｃ−４７、Ｓｍ−１５３、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｒ−８９、Ｔｂ−１６１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｔｌ−２０１、Ｙ−９０、Ｙｂ−１６９、およびＺｒ−８９が含まれる。
【００８２】
特に、本発明の放射性同位体には、周期表の１３族（ホウ素族）の元素（ＧａおよびＩｎが含まれる）が含まれる。
【００８３】
特に、好ましい放射性同位体には、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０、およびＩｎ−１１１が含まれる。最も好ましくは、放射性同位体は、Ｌｕ−１７７およびＹ−９０である。一実施形態では、放射性同位体はＬｕ−１７７である。
【００８４】
本発明の放射性同位体には、遷移金属（Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、およびＴｂ−１６１など）も含まれる。好ましくは、放射性同位体は、Ｌｕ−１７７またはＹ−９０である。
【００８５】
本発明の同位体は、親同位体も含まれると理解される。
【００８６】
本発明の放射性標識物質は、画像化および／または治療を可能にするための少なくとも２つの放射性同位体の組み合わせを含むことができる。放射性同位体の組み合わせを、Ｇａ−６８とＬｕ−１７７；Ｇａ−６７とＹ−９０；Ｇａ−６８とＹ−９０；Ｉｎ−１１１とＹ−９０；Ｌｕ−１７７とＹ−９０、およびＧａ−６７とＴｂ−１６１から選択することができる。
【００８７】
本発明は、少なくとも１つの非放射性の非毒性担体金属の使用をさらに含むことができる。例えば、担体金属を、ＢｉおよびＦｅから選択することができる。
【００８８】
特に、非放射性担体金属により、ＭＲＩ画像化（例えば、Ｆｅ）またはＸ線造影（例えば、Ｂｉ）が可能である。
【００８９】
担体金属のさらなる例には、３価ビスマスが含まれる。３価ビスマスによりミクロスフェアがさらにＸ線造影され、その結果、ミクロスフェアをＣＴで画像化することができる。
【００９０】
本発明の放射性標識物質は、α線、β線、γ線、および／または陽電子を放出することができる。
【００９１】
放射性標識物質
本発明の放射性標識物質は、ポリマー、放射性同位体、および固定化剤を含み、固定化剤はポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化することができ、固定化剤は複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である。
【００９２】
本発明の一実施形態では、放射性標識物質は、共有結合した複数のペンダント金属キレート剤をポリマー表面に係留するためのイオン対として固定化剤のポリカチオンを使用する。一実施形態では、ポリマーは、アニオン性ポリスチレンスルホナートミクロスフェアであり、固定化剤のポリカチオンは、ポリマーミクロスフェアのアニオン性スルホン化表面とイオン対を形成する。固定化剤のポリカチオン側鎖のキレート置換は、ポリマーのスルホン化表面へのイオン対付着のためのポリカチオン特性が十分に保存されるように最小限にとどめる。次いで、ポリカチオン：スルホナート多部位相互作用は、複合材料を保持する強力な「ジッパー」としての機能を果たし、放射性同位体はペンダントキレートに結合している。この手段により、本発明者らは、治療域の線量を達成するのに十分な放射性同位体の放射能を長期間負荷することが可能であり、放射性同位体がｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でポリマー上に安定に保持されていることを見出した。
【００９３】
本発明の固定化剤は、ポリマー上に１つまたは複数の放射性元素を固定化することが可能であり、各放射性元素は、異なるレベルおよびタイプの放射線（γ線およびβ線など）を生成し、異なる半減期を有する。したがって、本発明の放射性標識物質は、（ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴなどによって）画像化することができるようにするための放射性同位体および／または治療できるようにするための放射性同位体を含み得る。したがって、同一のポリマー粒子を、調査画像化手順（すなわち、「模倣」粒子として）および治療手順で使用することができる。このような方法で、模倣粒子は、治療用粒子の臓器分布を正確に予測して治療用粒子に適切と見なされる患者数を正確に評価することができる。
【００９４】
一実施形態では、本発明の放射性標識物質は、二重放射性標識物質であって、ポリマー、第１の放射性同位体、第２の放射性同位体、および固定化剤を含み、固定化剤がポリマー上またはポリマー中の第１の放射性同位体および第２の放射性同位体を固定化することができ、固定化剤が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である二重放射性標識物質である。一実施形態では、固定化剤は、複数の第１のペンダント金属キレート化側鎖および複数の第２のペンダント金属キレート化側鎖を有するポリカチオンを含む。一実施形態では、第１の金属キレート化側鎖は第１の放射性同位体を固定化し、第２の金属キレート化側鎖は第２の放射性同位体を固定化する。一実施形態では、第１の放射性同位体は画像化を可能にし、第２の放射性同位体は治療を可能にする。
【００９５】
一実施形態では、本発明の二重放射性標識物質は、ポリマー、第１の放射性同位体、第２の放射性同位体、第１の固定化剤、および第２の固定化剤を含み、第１の固定化剤がポリマー上またはポリマー中に第１の放射性同位体を固定化することができ、第２の固定化剤がポリマー上またはポリマー中の第２の放射性同位体を固定化することができ、第１の固定化剤および第２の固定化剤は、その各々が、複数のペンダント金属キレート剤側鎖を有するポリカチオンを含む高分子である。一実施形態では、第１の固定化剤はＤＰＴＡ−ＰＬＯであり、第２の固定化剤はＤＯＴＡ−ＰＬＯである。
【００９６】
さらに、本発明の固定化剤は、ポリマー上に画像化および治療に適切な１つまたは複数の放射性同位体を同時に固定化することが可能である。患者の体内の正確な治療放射線被曝部位を判断することができる画像化技術を使用することができ、したがって、治療の有効性およびさらなる治療の必要性を決定することが可能である。
【００９７】
固定化剤は、ポリマーからの放射性同位体の浸出を実質的に減少させる。したがって、ポリマーミクロスフェア上に画像化および治療に十分な比放射活性（単位質量あたりの放射活性）を得ることができ、その結果、ミクロスフェア数を最少にすることができる。これにより、画像化または治療線量を達成するための過剰数のミクロスフェアの使用が回避される。回避されない場合、非常に多数の血管が閉塞し、それ故、臓器の血液灌流が損なわれ、血管内のミクロスフェアの局所的蓄積または凝集塊によって画像解像度および治療有効性も低下し得る。さらに、ミクロスフェアからの治療用同位体の浸出の減少により、非標的臓器における意図しない組織損傷が減少する。
【００９８】
例えば、本発明の固定化剤は、重要且つ臨床的に有用な放射性同位体Ｌｕ−１７７に結合することが可能である。Ｌｕ−１７７は、β線およびγ線の両方を放出し、それにより、いくつかの腫瘍の治療および画像化の両方に適切である。Ｌｕ−１７７の半減期は６日である。この比較的長い半減期は、放射性標識物質の製造から、放射性元素の放射能が有意に喪失する前に患者へ投与するまでに利用できる時間がより長いので有利であり、したがって、関連するコストを抑えられる。Ｌｕ−１７７は、組織細胞傷害距離が短く、たった０．２ｍｍである。したがって、Ｌｕ−１７７は、画像化能力および治療能力の両方が提供される適切な同位体の好ましい例である。
【００９９】
さらなる一例として、本発明の固定化剤は、重要且つ臨床的に有用なガリウムの同位体Ｇａ−６７（ＳＰＥＣＴ画像化用）およびＧａ−６８（ＰＥＴ画像化用）をポリマーに結合することが可能である。Ｇａ−６７は、崩壊するにつれてγ線を放出する。したがって、放射性同位体からのガンマ放射線を検出するためのガンマカメラを使用する、光子放出から作成したＳＰＥＣＴまたはシンチグラフィの画像を使用して放射の位置を確認することができる。Ｇａ−６８は、崩壊するにつれて陽電子を放出する。陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）はより最近の核医学画像化法であり、ＳＰＥＣＴより画像解像度が優れており、より一般的に使用されるようになってきてもいる。Ｇａ−６７の半減期は３．２６日であり、したがって、輸送および送達の間に十分な放射能を維持するのにさらに有利である。
【０１００】
一実施形態では、固定化剤は、１つの物質中の（ＳＰＥＣＴおよび／またはＰＥＴなどのために）最適な画像化同位体および（軟β線源または硬β線源などのために）最適な治療用同位体を結合することが可能である。好ましくは、固定化剤は、同程度の半減期を有する少なくとも２つの同位体に結合することが可能である。放射性標識物質の画像化特性および治療特性の両方が使用部位への輸送および送達に必要な期間にわたって同様に保存されるので、このことは有利である。例えば、Ｉｎ−１１１の半減期は２．８日であり、これは、治療用同位体Ｙ−９０の半減期（２．６７日）と同程度である。
【０１０１】
本発明の好ましい組み合わせは、Ｇａ−６７またはＩｎ−１１１（ＳＰＥＣＴ画像化）とＬｕ−１７７（ＳＰＥＣＴ画像化およびβ治療）；Ｇａ−６７またはＩｎ−１１１（ＳＰＥＣＴ画像化）とＹ−９０（β治療）；およびＧａ−６８（ＰＥＴ画像化）とＹ−９０（β治療）が含まれる。最も好ましい例は、Ｇａ−６７とＹ−９０である。
【０１０２】
異なる放射性同位体を固定化する能力により、より多用途の癌治療プログラムも得られる。固定化剤を、固定化すべき放射性同位体に適するように調整することができ、同位体または同位体の組み合わせを、癌のタイプおよび体内の腫瘍部位に適するように都合よく選択することができる。
【０１０３】
固定化剤は酸性ｐＨで機能し、したがって、放射性同位体はポリマーのアニオン性基から外されない。さらに、固定化剤は、ｐＨ４〜７の範囲にわたって血液への曝露後にｉｎ  ｖｉｖｏで放射性同位体をポリマー上に保持することが可能である。
【０１０４】
固定化剤の合成
本発明の固定化剤を、当業者は、当該分野で公知の方法および材料ならびに標準的なテキストブック（“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”  ｂｙ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ（第３版，１９８５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）または“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ（１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）など）を使用して容易に調製することができる。
【０１０５】
例えば、固定化剤を、ポリカチオン高分子上のアミノ基と金属キレート剤上のカルボン酸との間の反応による標準的なアミド形成によって調製することができる。一実施形態では、カップリング剤を使用して、カルボン酸を活性化し、それにより、第一級アミンとカルボン酸との間のカップリングを促進してアミド結合を形成することができる。一実施形態では、カップリング剤は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である。ＥＤＣは水溶性カルボジイミドであるので、カップリング剤はＥＤＣであることが好ましい。
【０１０６】
さらなる実施形態では、アミド結合形成を促進するために、カップリング剤に加えて活性化剤を使用することができる。一実施形態では、活性化剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、およびペンタフルオロフェノールからなる群から選択される。一実施形態では、活性化剤は、水溶性スルホ−ＮＨＳである。アミド結合形成を触媒するための代替条件を、文献（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３）中に見出すことができる。
【０１０７】
一実施形態では、固定化剤を、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの存在下でのポリカチオン（ＰＬＯまたはＰＤＬなど）および金属キレート剤（ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、またはＥＤＴＡなど）の反応によって調製する。
【０１０８】
スキーム１に、反応を触媒するためにＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを使用したＰＬＯのＤＴＰＡとの反応によって調製される固定化剤の代表的合成を示す。スキーム１では、ｍ＋ｎは、ＰＬＯポリカチオン中のオルニチン残基数を示す。例えば、５ｋＤポリオルニチンは４３〜４４個のオルニチン残基を有するので、ｍ＋ｎ＝４３〜４４である。固定化剤生成物では、ｍは非置換のアミノ基側鎖数を示し、ｎは固定化剤のポリカチオン骨格上の金属キレート剤数を示す。
【化１】
2020504106.tif 000003
スキーム１
【０１０９】
当業者は、種々の試薬の量を変化させることにより、ポリカチオン骨格上に組み込まれる金属キレート剤数を変化させることができると認識するであろう。例えば、連結剤（ＥＤＣ）濃度を変更する一方で全ての他の反応条件を一定に保持することにより、異なる金属キレート剤のポリカチオンに対するモル比を有する異なるＰＬＯ−ＤＴＰＡ構築物を調製することができる。各ポリカチオン鎖上の金属キレート剤数を平均値として計算し、反応生成物を分離しない。さらに、当業者は、スキーム１に示す固定化剤は単なる代表例である−金属キレート剤側鎖はポリオルニチン骨格の長さに沿って分布すると認識するであろう。
【０１１０】
固定化剤に組み込まれる金属キレート剤の数を、当業者に公知の標準的な方法を使用して計算することができる。一実施形態では、錯滴定結合アッセイを使用して、固定化剤中の金属キレート剤数を計算することができる。
【０１１１】
一実施形態では、２〜６個のアミノ基側鎖毎に１個の金属キレート剤が存在する。換言すれば、金属キレート剤のポリカチオンに対するモル比は、約７〜約２０である。ポリカチオン側鎖のキレート置換を、ポリマーのスルホン化表面へのイオン対付着のためのポリカチオン特性が十分に保存されるように最小限に維持する。
【０１１２】
当業者は、代替のポリカチオンおよび金属キレート剤の選択によって代替の固定化剤を調製することができると認識するであろう。当業者はまた、２つの異なるペンダント金属キレート剤を使用して固定化剤を調製することができると認識するであろう。例えば、ポリカチオンを２つの異なる金属キレート剤と反応させて、２つの異なる金属キレート剤を有する固定化剤を生成することができ、それぞれが２つの異なる放射性同位体を固定化するように最適化されている。る。例えば、複数の第１のペンダント金属キレート化側鎖および複数の第２のペンダント金属キレート化側鎖を有するポリカチオンを含む固定化剤を調製することができる。
【０１１３】
一実施形態では、固定化剤を、他のレポーター分子と共有結合性に標識することができる。例えば、蛍光タグ（フルオレセインなど）を、固定化剤に抱合することができる。一実施形態では、蛍光標識した固定化剤を使用して、ポリマーへの固定化剤の結合を定量することができる。
【０１１４】
放射性標識物質の調製プロセス
本発明はまた、上記の放射性標識物質を作製するプロセスであって、
（ｉ）上記の「ポリマー」と題する節中のポリマーを上記の「固定化剤」と題する節中の固定化剤と混合する工程と；
（ｉｉ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）上記の「放射性同位体」と題する節中の放射性同位体をさらに添加する工程と；
（ｉｖ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程と
を含むプロセスを提供する。
あるいは、工程の順序は以下であり得る：
（ｉ）上記の「ポリマー」と題する節中のポリマーを上記の「放射性同位体」と題する節中の放射性同位体と混合する工程；
（ｉｉ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程
（ｉｉｉ）上記の「固定化剤」と題する節中の「固定化剤」をさらに添加する工程；および
（ｉｖ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程。
あるいは、工程の順序は以下であり得る：
（ｉ）上記の「固定化剤」と題する節中の固定化剤を上記の「放射性同位体」と題する節中の放射性同位体と混合する工程；
（ｉｉ）上記の「ポリマー」と題する節中のポリマーをさらに添加する工程；および
（ｉｉｉ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程。
【０１１５】
一実施形態では、放射性同位体を酸性溶液に添加する。一実施形態では、放射性標識を０．０５Ｍ  ＨＣｌ溶液に添加する。一実施形態では、プロセスは、懸濁液のｐＨを中性に調整するさらなる工程を含む。一実施形態では、懸濁液のｐＨを、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を使用して中性に調整する。
【０１１６】
一実施形態では、固定化剤の濃度は、約０．５〜１００μｇ／ｍｇポリマーである。別の実施形態では、固定化剤の濃度は、約１〜５０μｇ／ｍｇポリマーである。さらなる実施形態では、固定化剤の濃度は、約５〜３０μｇ／ｍｇポリマーである。別の実施形態では、固定化剤の濃度は、約１０〜３０μｇ／ｍｇポリマーである。さらなる実施形態では、固定化剤の濃度は約２０μｇ／ｍｇポリマーである。
【０１１７】
放射性標識物質を調製するプロセスの一実施形態では、プロセスは、以下のさらなる工程を含む：
（ｖ）得られた混合物を水中または生理食塩水中でオートクレーブ処理し、滅菌サイクルに供する工程；
（ｖｉ）任意選択的に、得られた混合物を洗浄する工程；および
（ｖｉｉ）任意選択的に、得られた混合物を溶液に再懸濁する工程。
【０１１８】
工程（ｖ）の一実施形態では、得られた混合物を水中でオートクレーブ処理する。工程（ｖ）の別の実施形態では、得られた混合物を生理食塩水中でオートクレーブ処理する。
【０１１９】
本発明はまた、ポリマー上またはポリマー中に放射性同位体を固定化するための固定化剤の使用であって、固定化剤、放射性同位体、およびポリマーが上記の通りである使用を提供する。
【０１２０】
本発明はまた、二重放射性標識物質を提供する。一実施形態では、ポリマーを、第１の固定化剤および第２の固定化剤と混合する。一実施形態では、第１および第２の固定化剤をポリマーと同時に混合する。別の実施形態では、第１および第２の固定化剤をポリマーと順次混合する。一実施形態では、第１の固定化剤は第１の放射性因子を固定化し、第２の固定化剤は第２の放射性因子を固定化する。
【０１２１】
放射性標識物質の治療上の使用
放射性標識物質を使用して、高分子の疾患マーカーとの特異的な生物学的相互作用に基づいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで所定の疾患部位に治療用同位体を蓄積させることができる。一実施形態では、標的疾患部位は肺である。一実施形態では、本発明の放射性標識物質は、強力な肺結合力を有する高分子（ＰＤＬおよびＰＬＯから選択されるポリカチオンなど）を含む。
【０１２２】
選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）は、カテーテルを介した標的臓器の血液供給動脈内へのポリマーミクロスフェアの投与を含み、したがって、標的内部照射療法が腫瘍に直接送達される。好ましくは、ミクロスフェアは、腫瘍の脈管構造内に留まる。これにより、放射線が標的臓器にゆっくりかつ連続的な様式で優先的に送達されるという利点が得られる。（周囲の健康な組織よりもむしろ）標的臓器への放射線レベルを増加させるために、適切な薬物を使用して血液供給を操作することも可能である。前述のように、本発明の固定化剤は浸出を実質的に防止し、したがってミクロスフェアが標的臓器に到達した時点で、適切な放射線が腫瘍に送達される。
【０１２３】
しかし、カテーテルを介した標的臓器の血液供給動脈へのポリマーミクロスフェアの投与は、侵襲的手順である。本発明の放射性標識物質の好ましい実施形態では、放射性標識物質は、肺に高い特異性を有する。一実施形態では、本発明の放射性標識物質を、肺癌治療のために肺を標的するために静脈内投与することができ、これははるかに侵襲性の低い投与様式である。全ての静脈は血液を右心に戻し、次いで、この血液は肺動脈を通って肺に導かれるので、静脈内投与された任意の放射性標識物質は、最終的に肺に血液を供給する動脈に入り、それにより、放射性標識物質は肺に送達されて、この物質を身体の他の部分に排出すると考えられる左心に入ることなく肺内に留まる。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、放射性標識物質は、肺内の保持に高い特異性を有し、他の臓器への任意の損傷を最小限にする。一実施形態では、放射性標識物質は、放射性標識物質の静脈内投与後に投与線量の９０％超が肺内に保持され、１０％未満が肝臓に到達する。別の実施形態では、放射性標識物質は、放射性標識物質の静脈内投与後に肝臓内で検出されない。
【０１２５】
肺癌治療において治療上有用であるために、治療線量の放射線を得るのに十分に長期間にわたって放射性標識物質が肺内に保持される必要がある。一実施形態では、５０％を超える放射性標識物質は、放射性標識物質の静脈内投与から最大２日間肺内に保持される。別の実施形態では、５０％を超える放射性標識物質は、放射性標識物質の静脈内投与から最大３日間肺内に保持される。さらなる実施形態では、５０％を超える放射性標識物質は、放射性標識物質の静脈内投与から最大４日間肺内に保持される。別の実施形態では、５０％を超える放射性標識物質は、放射性標識物質の静脈内投与から最大５日間肺内に保持される。
【０１２６】
一実施形態では、放射性標識物質は、依然として肺内に保持されながら、腫瘍血管形成の微細血管に分散される。
【０１２７】
肺を標的にする場合、放射性標識物質の投与質量は、肺機能（すなわち、呼吸）に重大な影響を及ぼさないことを確実にする必要がある。本発明の一実施形態では、肺機能に影響を及ぼさないようにするために、治療線量の放射性同位体、特にＬｕ−１７７を、十分に小さな質量の放射性標識物質中に保有することができる。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本発明の放射性標識物質を、肝臓などの他の内部臓器に投与することができる。これは、肝腫瘍または他の内部臓器に存在する腫瘍の治療のための内部照射療法の任意の潜在的な臨床用途に適合する。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明の放射性標識物質を、皮下腫瘍または身体の表面にあるか手術によって容易に接近可能な他の固形腫瘍に、腫瘍への直接注射によって投与することができる。
【０１３０】
本発明はまた、癌の治療および／または放射線画像化のための医薬の製造のための上記の本発明の放射性標識物質の使用を提供する。一実施形態では、癌は、原発性または続発性の肺癌である。
【０１３１】
本発明はまた、患者の放射線治療方法であって、上記患者に治療有効量の本発明の第１の態様の放射性標識物質を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１３２】
一実施形態では、放射線治療は、肺のための内部照射療法である。例えば、放射線治療は、原発性および／または転移性の肺腫瘍の治療のためのものである。
【０１３３】
本発明は、癌を治療する方法であって、有効量の本発明の上記の放射性標識物質を必要とする患者に投与する工程を含む方法をさらに提供する。
【０１３４】
癌は、原発性肉腫、原発性または続発性の黒色腫、原発性頭頸部癌、原発性または続発性の脳癌、原発性または続発性の肺癌、原発性または続発性の肝臓癌、原発性または続発性の乳癌、原発性または続発性の腎臓癌（腎癌）、原発性または続発性の卵巣癌、原発性または続発性の前立腺癌、または神経内分泌癌であり得る。
【０１３５】
本発明の方法の一実施形態では、本発明の放射性標識物質を、静脈内注射によって投与する。
【０１３６】
本発明の方法の別の実施形態では、本発明の放射性標識物質を腫瘍内直接注射によって投与する。
【０１３７】
一実施形態では、癌は、原発性または続発性の肺癌である。
【０１３８】
原発性肺癌または肺内の転移性腫瘍の静脈内注射治療の好ましい例は、ＤＴＰＡキレーターのペンダント側鎖を有するＰＬＯを含む固定化剤でコーティングされ、腫瘍にβ粒子を照射するためのＬｕ−１７７同位体またはＹ−９０同位体が負荷された直径８ミクロンのポリスチレンスルホナートミクロスフェアである。
【０１３９】
身体に表在するか、手術によって容易に接近可能な固形腫瘍の腫瘍内直接注射治療の好ましい例は、ＤＴＰＡキレーターのペンダント側鎖を有するＰＬＯを含む固定化剤でコーティングされ、腫瘍にβ粒子を照射するためのＬｕ−１７７同位体またはＹ−９０同位体が負荷された直径１ミクロンのポリスチレンスルホナートミクロスフェアである。
【０１４０】
本発明はまた、患者における医学的手順を画像化する方法であって、上記患者に本発明の放射性標識物質を投与する工程、および上記被験体内の上記放射性標識物質を検出する工程を含む方法を提供する。
【０１４１】
一実施形態では、検出する工程は、上記放射活性のガンマカメラ画像化を含む。
【０１４２】
本発明は、本発明の上記放射性標識物質を含む医療機器をさらに提供する。
【０１４３】
医療機器は、ミクロスフェア、シード、ステント、カテーテル、ワイヤ、またはウェーハであり得る。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の放射性標識物質を、注射によって投与することができる。注射液の場合、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）など）、これらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって適した流動性を維持することができる。種々の抗菌剤および／または抗真菌剤を含めることによって微生物の作用を防止することができる。適切な薬剤は当業者に周知であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、およびチロメサールなどが含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいかもしれない。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含めることによって注射用組成物の吸収を延長することができる。
【０１４５】
一実施形態では、本発明の放射性標識物質を、静脈内注射によって投与する。静脈内投与に適切なビヒクルには、等張生理食塩水、５％デキストロース、ハートマン液、ハンクス平衡塩類溶液、または当業者に公知の静脈内使用に適切な類似の溶液が含まれる。
【０１４６】
一実施形態では、身体の腹膜腔内に放射性標識物質を導入するために、放射性標識物質を腹腔内注射によって投与する。一実施形態では、身体の腹膜腔内への放射性標識物質の導入を使用して、腹水として腹膜腔に集合し、腹部内蔵の外側に転移する原発性腫瘍部位から離れた播種性腫瘍細胞を治療することができる。一実施形態では、播種性腫瘍細胞は播種性卵巣癌細胞である。腹水の過形成を遅延させ、それにより、腹腔内で成長している癌の重篤な症状を緩和することが癌の待機療法における共通の問題である。一実施形態では、本発明の放射性標識された（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ）材料は、腹膜腔内に注射されたとき、これらの症状の緩和に役立ち得る。
【０１４７】
一実施形態では、肺以外の臓器内の腫瘍の治療のために、放射性標識物質を動脈内投与する。例えば、肝腫瘍の治療のために、放射性標識物質を肝臓に動脈内投与する。動脈内注射に適切なビヒクルには、等張生理食塩水、５％デキストロース、ハートマン液、ハンクス平衡塩類溶液、または当業者に公知の静脈内使用に適切な類似の溶液が含まれる。
【０１４８】
一実施形態では、例えば、固形腫瘍が皮下にあるか、身体に表在するか、手術によって容易に接近可能である場合、本発明の放射性標識物質を腫瘍への直接注射によって投与する（すなわち、本発明の放射性標識物質を腫瘍内投与する）。腫瘍への直接注射に適切なビヒクルには、等張生理食塩水、５％デキストロース、ハートマン液、ハンクス平衡塩類溶液、または当業者に公知の静脈内使用に適切な類似の溶液が含まれる。
【０１４９】
本発明の放射性標識物質を単回投与または複数回投与することができる。一実施形態では、本発明の放射性標識物質は、分割服薬および段階的反復服薬に適切である。当業者は、日常的実験法により、放射性標識物質を適用可能な疾患および／または感染の治療に適切な、有効な非毒性投薬レベルの本発明の放射性標識物質および投与パターンを決定することが可能であろう。
【０１５０】
さらに、所定日数での１日あたりの本発明の放射性標識物質の投与回数などの最適な治療過程を、従来の一連の治療決定試験を使用して確認することができることが当業者に明らかであろう。
【０１５１】
一般に、２４時間あたりの有効投薬量は、約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲；例えば、約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ体重；約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重；または約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。より適切には、２４時間あたりの有効投薬量は、約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重；約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重；約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重；約１．０ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重；約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重；約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重；または約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。一実施形態では、２４時間あたりの有効投薬量は、約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重；または約３．０〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【０１５２】
本発明の放射性標識物質を、治療レジメンの一部として他の薬物と共に投与することができる。例えば、特定の疾患または状態を治療することを目的として活性化合物の組み合わせを投与することが望ましいかもしれない。したがって、２つ以上の薬学的組成物（少なくとも１つは本発明の放射性標識物質を含む）を、組成物の同時投与に適切なキットの形態で組み合わせることができることは本発明の範囲に含まれる。
【０１５３】
本明細書の説明を、好ましい実施形態および実施例を参照して説明している。本明細書中の記載に基づいて、当業者は、代替物（放射性同位体、固定化剤、およびポリマーを含むそのような代替物）を使用する場合、適切な条件を経験的に決定することができると認識するであろう。
【０１５４】
以下の非限定的な実施例を参照して、単なる例示として、本発明をここにさらに詳細に説明するであろう。実施例は、本発明を例示するのに役立つことを意図し、本明細書を通して説明している開示の一般性を限定すると解釈されるべきではない。
【０１５５】
実施例
実施例１：ポリマーＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定化剤の合成
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，２０１３．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を使用して、ポリ−Ｌ−オルニチン骨格（ＰＬＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ４５３８；分子量５〜１５ｋＤ）に沿ってランダムな第一級アミノ基に共有結合させた。例えば、ＰＬＯ（１０ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）を、ＤＴＰＡ（２０ｍＭ）、ＥＤＣ（２０ｍＭ）、およびスルホ−ＮＨＳ（１０ｍＭ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）のリン酸緩衝液（ｐＨ７）（０．０２Ｍ、５００μＬ）溶液に添加した。溶液を室温で２時間混合し、次いで、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）で精製した。
【０１５６】
図１は、ＰＬＯに共有結合したＤＴＰＡに基づくポリマー固定化剤の図である。ＰＬＯ骨格を、アミド結合を介して連結したＤＴＰＡのペンダント置換基を有するコイルとして左側に示す。示しているように、置換されていないＰＬＯのアミノ基は、自由にプロトンを受容し、正電荷を形成する。
【０１５７】
連結剤（ＥＤＣ）の濃度を変更する一方で全ての他の反応条件を保持することにより、金属キレート剤のポリカチオンに対するモル比が異なる５つの異なるＤＴＰＡ−ＰＬＯ構築物を調製した（図２）。
【０１５８】
実施例２：固定化剤についてのＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比の計算
錯滴定指示薬キシレノールオレンジ（ＸＯ）およびそのＦｅ３＋との有色錯体（Ｃ．Ｇａｙ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｇｅｂｉｃｋｉ，鉄（ＩＩＩ）−キシレノールオレンジ錯体を用いた溶液中の鉄の測定，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３（１９９９）１４３−１４８．ｄｏｉ：１０．１００６／ａｂｉｏ．１９９９．４２０７）を使用して、連結キレーター（ＤＰＴＡ）のポリカチオンポリマー（ＰＬＯ）に対するモル比を決定した。既知濃度のキレート−ポリカチオンを既知濃度のＦｅＣｌ３溶液に添加し、遊離Ｆｅ３＋を、有色ＸＯ：Ｆｅ３＋錯体の形成によって決定した。試料の吸光度は、μＭ範囲でＦｅ３＋濃度に比例するＸＯ：Ｆｅ３＋錯体の検量線と関連していた。
【０１５９】
実施例３：ポリマーＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定化剤への蛍光タグの付加
ポリマーＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定化剤を、他のレポーター分子で共有結合性に標識することができる。例えば、蛍光タグであるフルオレセインを、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ  Ｆ４２７４）との反応によって抱合することができる。簡潔に述べれば、ＤＴＰＡ−ＰＬＯ（１．４ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）を、ＦＩＴＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）の炭酸緩衝液（ｐＨ９）（０．０２Ｍ、５００μＬ）の溶液に添加した。溶液を４℃で一晩放置し、１Ｍ塩化アンモニウム（５０μＬ）の添加によって反応を停止させた。蛍光標識したポリカチオンを、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）によって精製した。
【０１６０】
実施例４：ＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定化剤のポリスチレンスルホナートミクロスフェアへの結合の定量
上記の実施例３にあるように調製した蛍光標識したＤＴＰＡ−ＰＬＯを使用して、固定化剤のポリスチレンスルホナートミクロスフェアの表面への結合を定量した。種々の量の蛍光ＤＴＰＡ−ＰＬＯ（５、１０、２０、３０μｇ）を、ポリスチレンスルホナートミクロスフェア（１ｍｇ、直径８μｍ）と水または生理食塩水（１ｍＬ）中にて室温で１時間混合した。ミクロスフェアを、３０００ｇで２分間の遠心分離によってペレット化し、上清（２００μＬ）中の蛍光を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸマルチモードプレートリーダー（励起波長４８５ｎｍ；発光波長５２５ｎｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ測定した。
【０１６１】
図３は、ポリスチレンスルホナートミクロスフェアとの混合後の異なる量の蛍光標識されたＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定化剤ついての結合収率を示す。１ｍｇの８μｍミクロスフェアと混合した１０μｇまでのＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ＦＩＴＣについて完全な結合が認められ、１７〜１８μｇのポリカチオンで飽和するようであった。特に、おそらくＤＴＰＡカルボキシラート基とＰＬＯアミン基との間の分子内結合が妨害され、それ故に固定化剤の高次構造の結合範囲がより広くなるので、生理食塩水の存在下でポリカチオンの結合量を増加させることができ、これにより、より多くのポリカチオンの正電荷の基が負電荷のミクロスフェアに結合し、したがって、結合がより強固になるであろう。生理食塩水の存在下で、ミクロスフェアへのＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ＦＩＴＣ結合の飽和が２５μｇで認められ、それにより、１ｍｇのミクロスフェアあたりの固定化剤の結合量がおよそ３９％増加した。
【０１６２】
実施例５：１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの調製
表１は、１７７Ｌｕ放射性標識ミクロスフェアの調製のための例示的プロセスを示す。
【０１６３】
【表１】
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【０１６４】
実施例６：静脈内注射したミクロスフェアの肺分布および安全性への影響
ｉｎ  ｖｉｖｏでのミクロスフェアの最適な肺負荷および反復肺ミクロスフェア負荷ストラテジーの安全性を、２コホートのＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して調査した。第１のコホートについて、５匹の健康なマウスから構成される３群に、５％デキストロース溶液中の非放射性ミクロスフェア（直径８μｍ）を（尾静脈を介して）静脈内に単回負荷した。群におけるミクロスフェア負荷を、６ｍｇ／ｋｇから９ｍｇ／ｋｇに、次いで１２ｍｇ／ｋｇに漸増させた。マウスの福祉を毎日慎重にモニタリングし、マウスを、いくつかの標準的なマウスモデル基準に対してスコアリングした（０〜３）。注射７日後に、マウスを選別し、組織学のためにその肺を採取した。各群由来の２つの肺を組織学のために公認の動物病理研究所に送り、有資格病理学者による報告を受けた。
【０１６５】
マウスの福祉を慎重にモニタリングし、静脈内ミクロスフェア注射に起因する顕著な影響はなかった。肺組織学の結果の要約を表２に示し、病理学者の報告では、以下のように述べられている：ミクロスフェアは肺全体の間質組織に広範に分布した。単体のミクロスフェアの周囲に炎症は非常に少なく、複数のミクロスフェアの周囲に炎症はほぼ存在しなかった。ミクロスフェアは間質組織全体に無作為に分散し、大血管の周囲に密集していないようであり、大気道に隣接して密集してもいなかった。マウス１〜６におけるミクロスフェアの分散のいかなる明らかな違いも間違いなく全く認められなかった。ミクロスフェアは全て無作為に分散しており、分布には実質的な違いはないようであった。おそらく、ミクロスフェアの数が増えるにつれて、ミクロスフェアが２つまたは３つの小さなクラスターで見出される傾向がいくつかあった。しかしこれは非常に主観的見解である。ミクロスフェアの数が増加しても明らかな炎症は認められなかった。
【０１６６】
第２コホートのマウスに、放射活性が存在しないミクロスフェアを注射によって分割負荷させた。負荷を分割し、３ｍｇ／ｋｇを静脈内注射にて７日間間隔で３回にわたって送達させ（総負荷９ｍｇ／ｋｇ）、マウスを最後の注射後さらに７日間モニタリングした。また、マウスの福祉を慎重にモニタリングし、静脈内ミクロスフェア注射に由来する顕著な影響は認められなかった。
【０１６７】
【表２】
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【０１６８】
実施例７：異なる１７７Ｌｕ調製物の生体内分布および排出
３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから構成される４群に、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（８μｍ；３ｍｇ／ｋｇ；群１）、ミクロスフェアなしの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ（群２）、ミクロスフェアに直接結合し、ポリマー固定剤を含まない１７７Ｌｕ（３ｍｇ／ｋｇ；群３）、または遊離１７７ＬｕＣｌ３（群４）のいずれかを使用して（尾静脈を介して）静脈内注射した。３時間後、１２匹の全てのマウスを安楽死させ、解剖して肺、肝臓、脾臓、および屠体の放射活性を測定した。結果を表３に示す。
【０１６９】
１７７Ｌｕ放射性同位体の異なる調製物；１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（群１）；ミクロスフェアなしの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ（群２）、ミクロスフェアに直接結合し、ポリマー固定剤を含まない１７７Ｌｕ（群３）、または遊離１７７ＬｕＣｌ３（群４）を投与した４群のマウスについての肺、肝臓／脾臓、および屠体に存在する放射活性を表３に示す。１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（群１）について高レベルの肺内１７７Ｌｕ保持（９３％）が認められ、一方で、他の調製物は肺内に保持されなかったが、その代りに屠体において高レベルで見出され、これは骨格内に局在化していた。ポリマー固定剤を含まないミクロスフェアに結合した１７７Ｌｕ（群３）は屠体放射能が高く、これは遊離１７７ＬｕＣｌ３（群４）と非常に似ており，ＤＴＰＡ−ＰＬＯ固定剤が標識されたミクロスフェアの高いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性に不可欠であることを証明している。屠体骨格への取り込みに加えて、ＤＴＰＡ−ＰＬＯと錯体形成しているがミクロスフェアを含まない１７７Ｌｕ（群２）も肝臓／脾臓によって血液から除去され、測定された放射能の３２％を含んでいた。しかし、群２についての総カウント（８７３）は、平均して、他の群の総カウントの２５％であり、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯは主に別経路、おそらく腎臓系によって排出されることを示していた。
【０１７０】
【表３】
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【０１７１】
実施例８：ｉｎ  ｖｉｖｏでの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの安定性試験−長期マウス肺保持試験
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、１ミリグラムあたり２６ＭＢｑの１７７Ｌｕが負荷されている。各マウスが１．６６ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、このミクロスフェアを、５％デキストロース溶液の懸濁液（０．１７ｍＬ）として注射した。注射５日後に、マウスを安楽死させ、解剖して肺、肝臓、および屠体中の放射活性を測定した。解剖したマウスを、Ｉｎｆｉｎｉａ  Ｈａｗｋｅｙｅ４  ＳＰＥＣＴスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して画像化し、肺内の放射能を、ＣＲＣ−Ｕｌｔｒａ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃａｐｉｎｔｅｃ）を使用して測定した。結果を図４および表４にまとめている。
【０１７２】
５つの解剖したマウス屠体のガンマカメラ画像を、摘出した心臓／肺、肝臓、および脾臓と共に図４Ａに示す。視覚化するために、画像のカウントを２０倍にした。明らかに、注射５日後でさえも、心臓／肺内の１７７Ｌｕ保持は高い。肺からの心臓の除去により（図４Ｂ）、ミクロスフェアが実際に心臓から消失し、肺の毛細血管網内に留まったことが明確に証明された。
【０１７３】
表４は、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの静脈内注射５日後の５匹のマウスの肺、肝臓、および屠体中に存在する放射活性を示す。注射５日後に、注射された放射能の５７％が依然としてマウスの摘出された肺内に存在していた（放射性崩壊に対して時間を補正）。ガンマ画像由来の目的の領域（図４Ａ）は、５日後のマウス内に残存する放射能の領域を示し、７９％が肺に存在し、２０％が屠体に存在し、１％が肝臓／脾臓に存在していた（表４）。
【０１７４】
【表４】
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【０１７５】
実施例９：１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアについてのマウスにおける平均ｉｎ  ｖｉｖｏ肺保持および吸収線量のまとめ
一連のいくつか（ｎ＝８）の個別の実験にわたって、合計で６４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、各マウスが１．６ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、５％デキストロース溶液（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。注射後の種々の時点で（２４〜５５２時間）、マウスを安楽死させ、解剖して肺、肝臓、および屠体中の放射活性を測定した。解剖したマウスを、Ｉｎｆｉｎｉａ  Ｈａｗｋｅｙｅ４  ＳＰＥＣＴスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して画像化し、肺内の放射能を、ＣＲＣ−Ｕｌｔｒａ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃａｐｉｎｔｅｃ）を使用して測定した。結果を表５および図５にまとめている。
【０１７６】
表５は、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを注射した６４匹のマウスの経時的な肺放射能およびガンマカメラカウントをまとめている。注射５日後の肺内の平均放射能は、注射された放射能の５３％であった（崩壊に対して時間を補正）。注射２３日後までに、平均肺保持は依然として注射した放射能の１６％であったが、１７７Ｌｕの半減期が６．６４７日であることを考慮すると、肺内の実際の放射能は注射した放射能のたった１％であった。
【０１７７】
表５由来のデータを使用して、肺および骨格／屠体についての１グラムの組織重量あたりの注入量の百分率（％ＩＤ）を計算した（図５）。これを、マウス肺については０．１８ｇの平均組織湿重量、およびマウス骨格についての１．５ｇの重量を仮定して計算した（２０ｇマウスの７．５％；Ｄｉ  Ｍａｓｓｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｅｌｏｒｉａ，Ｇ．Ｃ．＆  Ｆｏｎｔ，Ｍ．Ｔ．，１９９８．身体の構造についての拮抗的選択を用いたマウスにおける骨の形態的特色、大腿測定、および骨塩沈着．Ｂｏｎｅ，２２（５），ｐｐ．５３９−５４３）。明らかに、肺は、経時的に１グラムの組織あたり大部分の線量を照射されていた。放射線吸収線量を、医療体内放射線量（ＭＩＲＤ）スキーマを使用し、そして１７７Ｌｕからのγ線放出の軽微な寄与を無視して評価した。２３日間にわたる１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアにおいて１．６ＭＢｑの放射能を注射した肺に照射された吸収線量は、７５．４Ｇｒａｙと評価され、一方で、骨格への吸収線量はたった２．８Ｇｒａｙと評価された。
【０１７８】
【表５】
2020504106.tif 000008
【０１７９】
実施例１０：ｉｎ  ｖｉｖｏマウス肺保持に及ぼす固定化剤のＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比の影響
いくつかの異なるＤＴＰＡ−ＰＬＯ構築物を、ＤＴＰＡのＰＬＯに対する異なるモル比を用いて構築した（実施例１）。これらのポリマーのうちのＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比が１７．５、１３．８、および７．３である３つのポリマーを使用して、３つの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（直径８μｍ）を構築した。これらを、各マウスが０．９ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、５％デキストロース溶液（０．１５ｍＬ）の懸濁液として４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから構成される３群に（尾静脈を介して）静脈内注射した。注射４日後に、マウスを安楽死させ、解剖して、肺内の放射活性をＣＲＣ−Ｕｌｔｒａ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃａｐｉｎｔｅｃ）を使用して測定した。肺保持の結果を表６にまとめている。
【０１８０】
表６中の結果は、４日間にわたってマウス肺内の放射性同位体（１７７Ｌｕ）の保持を高くするためには、ＤＴＰＡのＰＬＯに対するモル比をより高くする必要があることを示す。モル比１３．８で最も高い注射放射能の保持率５７％が得られた。モル比を増加させると、保持率がわずかに減少した。しかし、モル比７．３では４日間にわたる注射放射能の保持率はたった５％であった。ＤＴＰＡのＰＬＯポリカチオンに対する最適比が存在するようであり、この最適比により、１７７Ｌｕを保持し、さらに同時に固定化剤のポリスチレンスルホナートミクロスフェアへの強固な結合を容易にするのに十分な遊離アミン基の数をＰＬＯ上に提供するのに十分なＤＴＰＡ分子が存在する。モル比３の構築物（図２）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性試験においてさえ十分に機能せず、これらの構築物は、血液中に存在する２ｍＭ  Ｃａ２＋を模倣しているハートマン液の存在下でミクロスフェア上に１７７Ｌｕを保持できなかった。
【０１８１】
【表６】
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【０１８２】
実施例１１：滅菌条件の最適化
滅菌１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物を、滅菌材料から出発し、滅菌技術（工程１〜５）を使用した実施例５中の方法にしたがって生成することができる。しかし、完全な調製物が標準的なオートクレーブ条件に安定であり（工程６、実施例５）、依然として高いｉｎ  ｖｉｖｏ保持を示す場合は有利であろう。そのような調製物の任意の臨床使用には、最終調製物を患者への配布および静脈内注射前にオートクレーブ処理によって滅菌することが必要であろう。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４つの異なる滅菌調製物のｉｎ  ｖｉｖｏ肺保持を、種々の時点での１グラムの組織の湿重量あたりの注入量の百分率として図６にまとめている。滅菌条件下で調製した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアのデータを、×記号として近似指数曲線と共に示す（実施例８由来のデータ）。これらのデータに加えて、３つの異なるオートクレーブ処理した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物を生成した。第１に（＋データポイント）、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを、水中で行う工程２および６を使用して調製した（実施例５）。第２に（△のデータポイント）、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを、水中で行う工程２、および生理食塩水中で行う工程６を使用して調製した（実施例５）。第３に（○データポイント）、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを、生理食塩水中で行う工程２および６の両方を使用して調製した（実施例５）。これら３つの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物を、各マウスが１．３ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから構成される３群に、生理食塩水（０．１７ｍＬ）の懸濁液として（尾静脈を介して）静脈内注射した。注射６日後に、各群由来の５匹のマウスを安楽死させ、解剖して、肺内の放射活性をＣＲＣ−Ｕｌｔｒａ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃａｐｉｎｔｅｃ）を使用して測定した。注射１２日後に、各群の残りの５匹のマウスについてこれを繰り返した。
【０１８３】
図６は、水中でオートクレーブ処理した調製物を投与されたマウスの肺内で見出された放射能と比較して生理食塩水中でオートクレーブ処理した調製物を投与されたマウスの肺内で見出された放射能レベルが増加したことを示す；この増加は、実験期間中維持された。これらの結果は、生理食塩水中でのミクロスフェア調製物のオートクレーブ処理が好ましい滅菌方法であることを示していた。
【０１８４】
実施例１２：マウス肺におけるマウス４Ｔ１−ｌｕｃ２乳癌細胞株の成長
マウス４Ｔ１−ｌｕｃ２乳癌細胞株は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を非侵襲性に画像化可能であるので、一般的に使用されている肺転移モデルである。細胞株はホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２）でトランスフェクトされており、その結果、ルシフェリンの存在下で、生細胞が生物発光カメラを使用して検出することができる光を発する。この肺転移モデルを使用して調査を開始するために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを３つの群に分け、２５０００、５００００、または１０００００個の４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞を含むハンクス平衡塩類溶液（１５０μＬ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。肺腫瘍成長を、細胞注射の３、６、９、および１３日後に測定した。簡潔に述べれば、マウスに、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを腹腔内（ＩＰ）注射し、次いで、マウスを麻酔し、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。マウス肺由来の生物発光流の測定値を図７に示す。５００００個の細胞の注射により、都合の良い範囲の生物発光流の成長曲線が得られることが見出され、この細胞数をさらなる実験による調査のために採用した。
【０１８５】
実施例１３：マウス肺におけるマウス４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部照射の影響
４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞（５００００細胞）を（尾静脈を介して）静脈内注射することによって腫瘍を１８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内で腫瘍を成長させた。腫瘍成長の５日目に、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定し、マウスを以下の２群に分けた；処置群（ｎ＝９）およびほぼ等しい総腫瘍量を保有するネガティブコントロール群（ｎ＝９）。次いで、処置群のマウスに、各マウスが１．５９ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ネガティブコントロール群のマウスに、非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを５％デキストロース溶液（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。成長１１日目に（内部照射への曝露の６日後に）、腫瘍生物発光を測定し、結果を図８に示す。
【０１８６】
マウス肺４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部電離放射線の影響を図８に示す。以下の２つのマウス群についての結果を示す：１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した処置群（１７７Ｌｕ）；および１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与したネガティブコントロール群（Ｃｔｒｌ）。処置マウスは、ルシフェラーゼをトランスフェクトした腫瘍細胞によって生成される生物発光流の変化の減少によって測定した場合、５日目と１１日目との間の腫瘍成長が統計的に有意に低下した（ｐ＝０．００１２）。ネガティブコントロール群の生物発光の変化の中央値は、処置群の６．５８倍であった。
【０１８７】
実施例１４：マウス肺４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長を遅延させるために１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを使用した福祉エンドポイントに対する生存期間の改善
４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞（５００００細胞）の（尾静脈を介した）静脈内注射によって２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内に腫瘍を成長させた。腫瘍成長の５日目に、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定し、マウスを以下の２群に分けた；処置群およびほぼ等しい総腫瘍量を保有するネガティブコントロール群。次いで、処置群のマウスに、各マウスが１．５９ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ネガティブコントロール群のマウスに、非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを５％デキストロース溶液（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。マウスの福祉を毎日慎重にモニタリングし、マウスを、いくつかの標準的なマウスモデル基準に対してスコアリングした（０〜３）。マウスをスコアリングする者は、どのマウスが各群に割り当てられているのかを知らず、全ての基準にわたって全スコアが３以上に到達した場合、肺生物発光を直ちに測定し、動物を選別した。エンドポイントにしばしば寄与する一般的基準は、毛の外観、活動、動き、呼吸、および体重であった。マウスを選別した時点を使用して２群の生存関数を評価し、これを図９に示す。
【０１８８】
図９に示した生存関数は、マウス肺腫瘍の内部照射療法によって福祉エンドポイントまでのマウスの生存が延長されたことを明確に示す。生存日数の差の中央値は４日間であり、これは統計的に有意であった（ｐ＝０．０２）。
【０１８９】
実施例１５：マウス肺内のマウス４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍成長に及ぼす異なる線量の内部照射の影響
１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア上の異なる放射活性に曝露されたマウス肺腫瘍の成長に及ぼす影響を調査した。４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞（５００００細胞）の（尾静脈を介した）静脈内の注射によって４０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内で腫瘍を成長させた。腫瘍成長の５日目に、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定し、マウスを以下の４群に分けた；ネガティブコントロール群（ｎ＝１０）およびほぼ等しい総腫瘍量を保有する３つの処置群（３×ｎ＝１０）。次いで、３つの処置群のマウスに、各マウスが０．８２、１．１、または１．３７ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ネガティブコントロール群のマウスに、非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを５％デキストロース溶液（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。成長１１日目に（内部照射への曝露の６日後に）、腫瘍生物発光を測定し、結果を図１０に示す。
【０１９０】
マウス肺４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の３つの異なる線量の内部電離放射線の影響を図１０に示す。以下の４つのマウス群についての結果を示す；１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与したネガティブコントロール群（Ｃｔｒｌ）；ならびに０．８２、１．１、および１．３７ＭＢｑの放射活性を有する１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した３つの群。３つの処置群（０．８２、１．１、および１．３７ＭＢｑ）の各々について、ルシフェラーゼをトランスフェクトした腫瘍細胞によって生成される生物発光流の変化の減少によって測定した場合、５日目と１１日目との間の腫瘍成長が統計的に有意に低下した（それぞれ、ｐ＝０．０１１、０．０２６、および０．００１７）。ネガティブコントロール群の生物発光の変化の中央値は、処置群（０．８２、１．１、および１．３７ＭＢｑ）のそれぞれ１．９、１．８、および２．３倍であった。
【０１９１】
実施例１６：マウス肺内でのマウスＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部照射の影響
肺は、患者予後が非常に不良である最も頻繁な黒色腫遠隔転移部位と見なされている（Ｔａｓ，Ｆ．，＆  Ｅｒｔｕｒｋ，Ｋ．（２０１７）．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｐａｔｔｅｒｎ，ｔｉｍｉｎｇ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（２），１３４−１３９．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９７／ＣＭＲ．０００００００００００００３３２）。Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢ１６黒色腫は、一般的に使用されているマウス肺転移モデルである。ＢＡＬＢ／ｃマウス肺内のルシフェラーゼでトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２細胞株の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部照射の影響を調査した。
【０１９２】
Ｂ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２細胞（１０００００細胞）の（尾静脈を介した）静脈内注射によって１８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内に腫瘍を成長させた。腫瘍成長の７日目に、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定し、マウスを以下の２群に分けた；処置群（ｎ＝１０）およびほぼ等しい総腫瘍量を保有するネガティブコントロール群（ｎ＝１０）。次いで、処置群のマウスに、各マウスが１．６０ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ネガティブコントロール群のマウスに、非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを生理食塩水（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。成長１２日目に（内部照射への曝露の５日後に）、腫瘍生物発光を測定し、各マウスについての２つの測定値の間の生物発光の相違を計算した。これらの結果を図１１に示す。
【０１９３】
マウス肺Ｂ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア由来の内部電離放射線の影響を図１１に示す。以下の２つのマウス群についての結果を示す：１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与した処置群（１７７Ｌｕ）；および１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを投与したネガティブコントロール群（Ｃｔｒｌ）。ルシフェラーゼをトランスフェクトした腫瘍細胞よって生成される生物発光流の変化の減少によって測定した場合、処置マウスは、７日目と１２日目との間に統計的に有意な腫瘍成長の低下を示した（ｐ＝０．０００４）。ネガティブコントロール群の生物発光の変化の中央値は、処置群の５．５６倍であった。
【０１９４】
実施例１７：静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに２４日間曝露した正常マウス由来の肺の組織学
本研究では腫瘍を持たない正常なマウス肺に及ぼす内部照射処置の影響を試験し、いくつかの耐性の証拠を得た。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３匹のマウス）または１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（２匹のマウス）のいずれかを（尾静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、３ｍｇ／ｋｇを負荷する５％デキストロース溶液（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。１７７Ｌｕを照射されたマウスは、１．６６ＭＢｑの平均放射能を照射された。上記の腫瘍を有するマウスについて記載のように、マウスの福祉を毎日慎重にモニタリングし、マウスを、いくつかの標準的なマウスモデル基準に対してスコアリングした（０〜３）。注射２４時間後に、マウスを安楽死させ、肺を取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。各マウス由来の単一の肺を組織学のために公認の動物病理研究所に送り、どのマウスが内部照射処置を受けており、そしてどのマウスがコントロール処置を受けているのかを知らされていない有資格病理学者による報告を受けた。
【０１９５】
本研究から得た結果は、第１に、２４日間の慎重な毎日のモニタリングにより、正常マウスの福祉に及ぼす内部照射療法の影響は無視できるほどであることを示した。処置マウスおよびコントロールマウスの一般的な挙動および状態は、識別不可能であった。第２に、組織学的所見に関して、図１２は、倍率が４０倍のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したマウス由来の肺組織を示す。いくつかのミクロスフェアを矢印で強調し、白色バーは５０μｍを示す。病理学者の報告では、以下のように述べられていた：「肺全体に広範且つ無作為に分散している多数のミクロスフェアが存在していた。全体的に見て、５匹の各マウス由来の肺試料は、本質的に同一であった。ミクロスフェアに関連する炎症の組織学的に有意な証拠はなかった。肺内に線維症の証拠もなかった。さらに、フィブリン沈着の証拠および肺巨核球（血小板）の証拠はなかった。本研究のマウスの肺組織において放射線被曝に起因するいかなる有害作用も認められなかった。」
【０１９６】
実施例１８：静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに５日間曝露した４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍を有するマウス肺の組織学
４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞（５００００細胞）の（尾静脈を介した）静脈内注射によって２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内に腫瘍を成長させた。腫瘍成長の５日目に、肺生物発光を、ＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定し、マウスを以下の２群に分けた；処置群（ｎ＝９）およびほぼ等しい総腫瘍量を保有するネガティブコントロール群（ｎ＝９）。次いで、処置群のマウスに、各マウスが１．６ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。ネガティブコントロール群のマウスに、非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを５％デキストロース溶液（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。成長１０日目に（内部照射への曝露の５日後に）、マウスを選別し、組織学的分析のためにその肺を取り出した。各群由来の４つの肺を組織学のために公認の動物病理研究所に送り、どのマウスが内部照射処置を受けており、そしてどのマウスがコントロール処置を受けているのかを知らされていない有資格病理学者による報告を受けた。
【０１９７】
第１に、一連の実験にわたってマウスを慎重にモニタリングし、その福祉に及ぼす内部照射療法由来の影響はなかった。第２に、組織学的所見に関して、図１３は、倍率が４０倍のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したマウス由来の肺組織を示す。いくつかのミクロスフェアを矢印で強調している。病理学者の報告では、以下のように述べられていた：「ミクロスフェアは、肺全体に広範且つ無作為に分布していた。概して、腫瘍内よりも肺の両方の間質組織内により多くが存在していた。異なるマウス由来の結果は合理的に一貫していることが見出され、任意のマウス間の相違は真に識別不可能であった。単体のミクロスフェアの周囲に炎症は非常に少なく、複数のミクロスフェアの周囲に炎症はほぼ存在しなかった。あるいは、複数のミクロスフェアの周囲に炎症はなかった。あるいは、いくつかのマウスにおいて、少数のミクロスフェアの周囲に非常に軽度の好中球浸潤が認められた。全てのマウスは、腫瘍内にミクロスフェアを有していた。ミクロスフェアはまた、腫瘍に隣接して認められた。腫瘍内のミクロスフェアの有無にかかわらず、全ての腫瘍に細胞死および細胞壊死が認められた。本病理学者は、肺に対する放射線損傷の可能性を評価するために肺全体の炎症を調査した。有意な肺組織全体の炎症は存在しないと考えられ、したがって、肺への明らかな照射は認められないと考えられた。肺合胞体細胞の証拠および肺内の線維症の証拠は認められなかった。腫瘍内に炎症が認められ、これは、腫瘍内のミクロスフェアの有無にかかわらず、本質的に同一の軽度の炎症であった。腫瘍細胞の変性および壊死が認められた。本病理学者は、どのマウスが処置マウスであり、そしてどのマウスがコントロールマウスであるのかという知識を持たずにこれらの症例を再検討した。しかし、全てのマウスは本質的に同一であり、マウス間に有意差はないようであった。」
【０１９８】
実施例１９：５日間にわたるマウスの全血球数に及ぼす静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの短期の影響
ＢＡＬＢ／ｃマウス系統は、肺に及ぼす内部照射の生物学的影響を調査するための最も適切なモデルではないかもしれない。ＣＢＡマウス系統は、放射線肺臓炎および肺線維症を調査するためのよりよいモデルと示唆されている（Ｄａｂｊａｎ，Ｍ．Ｂ．ら，２０１６．マウスにおける放射線傷害のモデル化における変化傾向の調査：良好、不良、および不明を明らかにする．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９６（９），ｐｐ．９３６−９４９）。
【０１９９】
本研究では全血球数に及ぼす内部照射処置の短期影響を試験し、耐性の証拠をさらに得た。５匹のＣＢＡマウスから構成される５群に、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（３×５マウス）または１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（５匹のマウス）のいずれかを（尾静脈を介して）静脈内注射した。残りの５匹のマウスを、静脈内ミクロスフェア注射の影響を調査するための非注射コントロールとして放置した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、３ｍｇ／ｋｇを負荷する生理食塩水（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。１７７Ｌｕを投与されたマウスは、１．６ＭＢｑの平均放射能を照射された。マウスの福祉を毎日慎重にモニタリングし、マウスを、いくつかの標準的なマウスモデル基準に対してスコアリングした（０〜３）。注射５時間後、２４時間後、および５日後に、３つの処置群マウスを麻酔し、心穿刺によって抗凝固薬を予め負荷したシリンジ中に採血した。注射５時間後に、ネガティブコントロールマウスを麻酔し、心穿刺によって抗凝固薬を予め負荷したシリンジ中に採血した。同一の手順によって非注射コントロールマウス群からも採血した。採取した血液を、Ａｄｖｉａ２１２０血液学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で分析し、結果を図１４に示す。
【０２００】
全白血球数、リンパ球数、および好中球数に及ぼす内部照射処置の影響を、それぞれ、図１４Ａ、Ｂ、およびＣに示す。内部照射への曝露５時間後に細胞数のわずかな減少が認められた；しかし、これは統計的に有意ではなく、細胞レベルは２４時間後に回復した。曝露５日後に、好中球レベルのわずかな上昇が測定されたが、これも統計的に有意ではなかった。全赤血球数ならびにヘモグロビン、平均赤血球容積、およびヘマトクリットの測定値などのパラメータの他の変化は認められなかった。
【０２０１】
また、マウスのコントロール群および処置群から採取した血液を処理して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、これを使用してＤＮＡ損傷を評価した。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離し、顕微鏡スライドに接着し、γＨ２ＡＸ抗体および５３ＢＰ１抗体で染色して、フォーカスと呼ばれる二本鎖ＤＮＡの破壊の存在を示した。ＰＢＭＣを、共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ１，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して画像化し、ＤＮＡ損傷フォーカスを、Ｆｉｊｉ画像化ソフトウェアを使用して定量した。フォーカス分析は、γＨ２ＡＸマーカーおよび５３ＢＰ１マーカーについて最少で１００個のＰＢＭＣを定量することが目的であった。
【０２０２】
内部照射処置に対するＰＢＭＣのＤＮＡ損傷応答の分析結果を、図１５に示す。γＨ２ＡＸフォーカスおよび５３ＢＰ１フォーカスを有するＰＢＭＣの百分率の増加が注射５時間後の処置群５において認められた。しかし、この増加はネガティブコントロール群と比較したときに統計的に有意ではなく、注射５日後のネガティブコントロール群と類似のレベルに戻った。１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを注射したネガティブコントロールマウスは、非注射マウスと比較してフォーカスの百分率が増加したが、この増加は、統計的に有意ではなかった。
【０２０３】
実施例２０：３ヵ月にわたるマウスの全血球数に及ぼす静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの長期の影響
本研究では全血球数に及ぼす肺内部照射処置の長期影響を評価し、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの耐性のさらなる証拠を得た。ＣＢＡマウスから構成される３群に、１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（群１、３匹のマウス、非放射性コントロール）、０．５５ＭＢｑの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（群２、５匹のマウス）、または１．１ＭＢｑの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（群３、５匹のマウス）のいずれかを（尾静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、３ｍｇ／ｋｇを負荷する生理食塩水（０．１７ｍＬ）の懸濁液として注射した。１７７Ｌｕを投与されたマウスは、群２および３についてそれぞれ０．５１ＭＢｑおよび１．０ＭＢｑの平均放射能を照射された。推定平均肺吸収線量を、群２および３についてそれぞれ２３．２Ｇｙおよび４６．１Ｇｙである過去の保持データに基づいて計算した。マウスの福祉を１４日間毎日慎重にモニタリングし、その後に１周間に２回福祉評価を行った。マウスを、いくつかの標準的なマウスモデル基準に対してスコアリングした（０〜３）。注射３ヶ月後に、マウスを麻酔し、心穿刺によって抗凝固薬（０．１８％ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液）を予め負荷したシリンジ中に採血した。採取した血液試料を、Ａｄｖｉａ２１２０血液学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で分析し、結果を図１６に示す。
【０２０４】
総白血球数、リンパ球数、および好中球数に及ぼす内部照射処置の影響を、それぞれ図１６Ａ、Ｂ、およびＣに示す。群３のマウスは、白血球数がわずかに増加したが、しかし、これは統計的に有意ではなかった。コントロール群と１７７Ｌｕ注射群との間のリンパ球数および好中球数は、有意に変化しなかった。赤血球数またはヘモグロビン、平均赤血球容積、およびヘマトクリットの測定値などの他のパラメータの変化は認められなかった。
【０２０５】
また、マウスのコントロール群および処置群から採取した血液を処理して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、これを使用してＤＮＡ損傷を評価した。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離し、顕微鏡スライドに接着し、γＨ２ＡＸ抗体および５３ＢＰ１抗体で染色して、フォーカスと呼ばれる二本鎖ＤＮＡの破壊の存在を示した。ＰＢＭＣを、共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ１，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して画像化し、ＤＮＡ損傷フォーカスを、Ｆｉｊｉ画像化ソフトウェアを使用して定量した。フォーカス分析は、γＨ２ＡＸマーカーおよび５３ＢＰ１マーカーについて最少で１００個のＰＢＭＣを定量することが目的であった。
【０２０６】
内部照射処置に対するＰＢＭＣのＤＮＡ損傷応答の分析結果を、図１７に示す。コントロール群と１７７Ｌｕ注射群との間にγＨ２ＡＸフォーカスおよび５３ＢＰ１フォーカスの百分率の有意差は認められなかった。
【０２０７】
実施例２１：３ヶ月間静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに曝露されたマウス肺の組織学
実施例２０に記載のように、３つのＣＢＡマウス群に、１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（群１、３匹のマウス、非放射性コントロール）、０．５５ＭＢｑの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（群２、５匹のマウス）、または１．１ＭＢｑの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア調製物（群３、５匹のマウス）のいずれかを（尾静脈を介して）静脈内注射した。マウスの福祉を１４日間毎日慎重にモニタリングし、その後に１周間に２回福祉評価を行った。マウスを、いくつかの標準的なマウスモデル基準に対してスコアリングした（０〜３）。注射３ヶ月後および採血後（実施例２０）に、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させ、肺および心臓を採取した。各マウス由来の肺組織および心臓組織の試料を組織学のために公認の動物病理研究所に送り、どのマウスが内部照射処置を受けており、そしてどのマウスがコントロール処置を受けているのかを知らされていない有資格病理学者による報告を受けた。
【０２０８】
本研究から得た結果は、第１に、２４日間の慎重な毎日のモニタリングにより、正常マウスの福祉に及ぼす内部照射療法の影響は無視できるほどであることを示した。処置マウスおよびコントロールマウスの一般的な挙動および状態は、識別不可能であった。第２に、組織学的所見に関して、病理学者の報告では、以下のように述べられていた：「試験したマウスは、３１、４１、５１、２３、２４、４５、１５、４２、４４であった。全ての肺はミクロスフェアを含んでいた。心臓および心膜も試験した。他の隣接組織（食道、気管、骨格筋、および気管支リンパ節が含まれる）も試験した。全マウスの全ての肺内の肺胞マクロファージ数が軽度に増加した。これは肺水腫に起因すると考えられ、安楽死に関連する偶発的所見かもしれない。肺において、ミクロスフェア中またはその周囲に、炎症、フィブリン沈着物、血小板合胞体、壊死、または線維症の証拠はなかった。心臓または心膜におけるいかなる炎症、壊死、放射線被曝に関連する他の組織反応の証拠もなかった。食道、気管、骨格筋、または気管支リンパ節などの他の関連組織におけるいかなる炎症や壊死の証拠もなかった。」病理学者の報告のまとめを、表７に見ることができる。
【０２０９】
【表７】
2020504106.tif 000010
【０２１０】
実施例２２：ｉｎ  ｖｉｖｏでの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの安定性試験−短期ウサギ肺保持試験
前述の試験は全てマウスモデルについて言及しており、異なる動物種、好ましくは、非げっ歯類で生体内分布および安定性の結果を確証することが望ましかった。以下のためにウサギを選択した：ａ）サイズがより大きく、関連臓器内の生体内分布のより良好な画像化が可能であること、およびｂ）異なる静脈内注射経路を介した（すなわち、耳静脈による）ミクロスフェアの投与が可能であること。２羽のニュージーランドホワイト系ウサギに、麻酔下で１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３．９ｍｇ／ｋｇ）を（耳静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、各ウサギが１０７ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、５％デキストロース溶液（３ｍＬ）で注射した。ウサギのガンマカメラ画像を、麻酔下で注射直後、ならびに注射１、２、および３時間後に得た（図１８）。視覚化するために、画像のカウントを、５０倍にした。さらに、２羽のニュージーランドホワイト系ウサギに、麻酔下で、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯポリマー（ミクロスフェアなし）を、そして２羽のウサギに遊離１７７ＬｕＣｌ３を、それぞれ１２０ＭＢｑおよび１１２ＭＢｑの平均放射活性を有する５％デキストロース溶液で（耳静脈を介して）静脈内注射した。
【０２１１】
１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアは、肺循環の限界径に留まっており、その場所でγ線放射性同位体が存続していた。図１８は、肺血管網内に捕捉されたミクロスフェア上に放射性標識が効率的に保持されていることを示す。３時間後、動物を選別し、肺および肝臓を解剖した。臓器および屠体の個別のガンマカメラ画像により、総放射活性の９５．７±０．３％が肺内に、０．２±０．０２％が肝臓内に、そして、４．１±０．２％が屠体内に保持されることが明らかとなった（表８）。対照的に、遊離１７７ＬｕＣｌ３は、肺内に保持されず、屠体の骨に迅速に付随した。ミクロスフェアに結合していないポリマー１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯも肺内に保持されなかったが、ウサギの腎臓および膀胱内で高レベルの放射活性（それぞれ、１１．５および６３．３％）が見出された。これは、１７７Ｌｕのポリマー結合形態が腎臓系を介して迅速に排出されることを示す。
【０２１２】
【表８】
2020504106.tif 000011
【０２１３】
実施例２３：ｉｎ  ｖｉｖｏでの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの安定性試験−長期ウサギ肺保持試験
２羽のニュージーランドホワイト系ウサギに、麻酔下で１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３ｍｇ／ｋｇ）を（耳静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、各ウサギが７４．９ＭＢｑの平均放射能を照射されるように、生理食塩水（３ｍＬ）に含めて注射した。ウサギのガンマカメラ画像を、麻酔下でそれぞれの場合において、注射直後、ならびに注射１、６、１２、および１９日後に得た（図１９）。視覚化するために、画像のカウントを、５倍にした。ウサギの一般的な挙動および状態を注射後に毎日綿密にモニタリングして、福祉に及ぼす任意の影響を評価した。図１９中のウサギガンマカメラ画像から、個別の臓器のガンマカウントを、画像上に目的の領域を描くことによって得た。これらを、既知の線源を用いた一点校正によって実際の放射能に変換した。これらのデータを表９にまとめている。
【０２１４】
上記のマウス実験と同様に、ウサギ肺内の放射性ミクロスフェアの静脈内注射および持続は、１９日間にわたって高い忍容性が認められた；福祉に識別可能な影響を及ぼさなかった。投与中のウサギのガンマカメラ画像化により、耳静脈経路を介して注射した放射性標識ミクロスフェアは、定量的に静脈を通過して、心臓、右心腔にも戻り、次いで、肺内に保持されたことが証明された（図１９）。６日後に肺内に相当量の放射能（注射された放射能の平均４０．９％（崩壊に対して補正））が保持され、この量は、マウスの肺内の放射性ミクロスフェアの保持（４４．６％、表５）に匹敵することが明らかである。
【０２１５】
【表９】
2020504106.tif 000012
【０２１６】
実施例２４：静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに曝露されたウサギ臓器に送達された吸収線量
表９に示したニュージーランドホワイト系ウサギの肺、骨格、および腎臓についてのガンマカウントおよび放射能を使用して、経時的に１９日間にわたって臓器に送達された１グラムの組織の湿重量あたりの注入量の百分率を計算した（図２０）。これを、ウサギ肺については２０ｇ、腎臓については１５ｇ、およびウサギ骨格については２６５．２ｇの平均組織湿重量を仮定して計算した（平均ウサギ重量の６％；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｗ  Ｂａｒｔｈｏｌｄ，２０１５．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。マウスと同様に、ウサギ肺は経時的に１グラムの組織あたり大部分の線量を照射される。放射線吸収線量を、医療体内放射線量（ＭＩＲＤ）スキーマを使用し、そして１７７Ｌｕからのγ線放出の軽微な寄与を無視して評価した。１９日間にわたって１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア上の７４．９ＭＢｑの放射能を注射した肺が照射された吸収線量は３１．１Ｇｒａｙと推定され、一方で、腎臓および骨格への吸収線量は、それぞれたった１．５および１．１Ｇｒａｙであると推定された。
【０２１７】
実施例２５：ウサギの全血球数に及ぼす静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの経時的影響
本研究では全血球数に及ぼす内部照射処置の影響を試験し、忍容性の証拠をさらに得た。１０羽のニュージーランドホワイト系ウサギに、麻酔下で１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（２ｍｇ／ｋｇ；２×４ウサギ）またはネガティブコントロールとしての１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（２ｍｇ／ｋｇ；２ウサギ）のいずれかを（耳静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを生理食塩水（３ｍＬ）に含めて注射し、１７７Ｌｕを注射したウサギに４７ＭＢｑまたは９４ＭＢｑのいずれかの平均放射能を照射した。ウサギの一般的な挙動および状態を注射後に毎日綿密にモニタリングして、福祉に及ぼす任意の影響を評価した。注射直前ならびに注射５時間後、２４時間後、７日後、１４日後、および２１日後に、耳静脈を介して抗凝固薬を予め負荷したシリンジ中に採血した。採取した血液を、Ａｄｖｉａ２１２０血液学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で分析し、結果を図２１に示す。
【０２１８】
全白血球数、リンパ球数、および好中球数に及ぼす内部照射処置の影響を、それぞれ、図２１Ａ、Ｂ、およびＣに示す。内部照射処置への曝露５時間で、最高放射能群（９４ＭＢｑ）について平均総白血球数が増加したが、これは同一群内で非常にばらつきがあった（ｎ＝４）。両処置群についてリンパ球の減少および好中球の増加も測定され、これらの細胞数は２４時間後までに正常レベルに戻った。全赤血球数ならびにヘモグロビン、平均赤血球容積、およびヘマトクリットの測定値などのパラメータの他の変化は認められなかった。
【０２１９】
実施例２６：静脈内注射した１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアに３ヶ月間曝露したウサギ肺の組織学
３群のニュージーランドホワイト系ウサギに、麻酔下で１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（群１、１羽のウサギ）または３ｍｇ／ｋｇを負荷する１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（群２および３、各２羽のウサギ）のいずれかを（耳静脈を介して）静脈内注射した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、生理食塩水（３ｍＬ）に含めて注射し、群２および３はそれぞれ３９ＭＢｑおよび９０ＭＢｑの平均放射活性を照射された。ウサギの一般的な挙動および状態を注射後に毎日綿密にモニタリングして、福祉に及ぼす任意の影響を評価した。注射３ヶ月後に、ウサギを選別し、心臓および肺を採取した。肺、心臓、および心膜由来の組織試料を、組織学のために公認の動物病理研究所に送り、どのウサギが内部照射処置を受けており、そしてどのウサギがコントロール処置を受けているのかを知らされていない有資格病理学者による報告を受けた。
【０２２０】
第１に、一連の実験にわたってウサギを慎重にモニタリングし、その福祉に及ぼす内部照射療法由来の影響はなかった。第２に、組織学的所見に関して、図２２は、倍率が４０倍のヘマトキシリンおよびエオシンで染色したウサギ由来の肺組織を示す。群２由来の１羽のウサギは、ミクロスフェアにしばしば関連する中等度の炎症応答を示した（図２２、左）。しかし、これは群２の他のウサギや、より高い線量の放射活性を照射された群３のウサギでは存在しなかった。
【０２２１】
病理学者の報告では、以下のように述べられていた：「ウサギ２５４は、肺実質全体に無作為に分散した複数の小さな十分に明確な肉芽腫を有していた。これらの肉芽腫は、しばしば、その中心にミクロスフェアを含んでいた。肉芽腫は、マクロファージおよびリンパ球の凝集によって形成されていたが、壊死またはフィブリン沈着の有意な証拠はなかった。ウサギ２６０、２６３、２７４、２７２には有意な肺病変は認められなかったが、肺全体に広く分散した多数のミクロスフェアが存在していた。すなわち、線維症、細胞死、血小板合胞体、フィブリン沈着物、または炎症もしくは肺組織球増殖症は認められなかった。ウサギ２５４、２６０、２６３、２７４、２７２の心膜または心臓に組織学的病変は存在しなかった。より具体的には、線維症、細胞死、血小板合胞体、フィブリン沈着物、または炎症は存在しなかった。肺と接触している心臓の側面および肺と接触していない心臓の側面に組織学的相違は存在しなかった。」報告のまとめを表１０に示す。
【０２２２】
【表１０】
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【０２２３】
実施例２７：ｉｎ  ｖｉｖｏでの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの安定性試験−短期ウサギ肝臓保持試験
ミクロスフェアが肺内に保持された上記の全ての結果とは対照的な異なる内部臓器の環境下（すなわち、肝臓内）での標識ミクロスフェアの安定性の指標としてこの試験を行った。これは、肝腫瘍処置において本発明の内部照射療法が臨床的に使用可能かどうかに関する。５羽のニュージーランドホワイト系ウサギを、イソフルランで麻酔し、挿管し、流体（ハートマン液）を静脈内投与し、外科手術用の加温したエアベット上に置いた。肝動脈を正中線開腹術（観血手術）によって露呈し、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（３羽のウサギ）または１７７ＬｕＣｌ３（２羽のウサギ）のいずれかの点滴注入のために顕微手術によってカテーテルを挿入した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、１０９ＭＢｑの平均放射活性で１３ｍｇ／ｋｇの平均負荷の５ｍＬの５％デキストロース溶液に含めて注射した。１７７ＬｕＣｌ３を、１０５ＭＢｑの平均放射能で５ｍＬの５％デキストロース溶液に含めて注射した。肝臓への通常の血流を再建し、ウサギをＩｎｆｉｎｉａ  Ｈａｗｋｅｙｅ４  ＳＰＥＣＴスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で画像化した。手術および画像化の１時間後、ウサギを依然として麻酔下でのペントバルビトンナトリウムを使用した心臓内致死注射によって安楽死させ、さらなるＳＰＥＣＴ画像化のために臓器を取り出した。臓器カウントを表１１に示す。
【０２２４】
これらの結果により、ウサギ肺と比較してウサギ肝臓内でのミクロスフェアの短期保持率がより一層高いことが確認され（それぞれ、９９．７％対９５．７％）、このことは、肝腫瘍の内部照射療法における標識ミクロスフェアの重要な適用要件を満たすことが明らかである。対照的に、可溶性１７７Ｌｕは肝臓から迅速に枯渇され、屠体内全体に分布した。
【０２２５】
【表１１】
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【０２２６】
実施例２８：ｉｎ  ｖｉｖｏでの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの安定性試験−短期ウサギ肝臓ＶＸ２腫瘍保持試験
肝臓ＶＸ２腫瘍を、栓孔手術を使用してニュージーランドホワイト系ウサギの主要肝葉の１つに移植して、２つのおよそ１ｍｍ３の立方体腫瘍組織を小さな切開部に植え込んだ。肝臓移植レシピエントに対する全ての手術を、無菌手術野を用いてオートクレーブ処理した器具で行い、ウサギをイソフルランで麻酔した。３週間の腫瘍成長後、９羽のウサギウサギを、イソフルランで麻酔し、挿管し、流体（ハートマン液）を静脈内投与し、外科手術用の加温したエアベット上に置いた。肝動脈を正中線開腹術（観血手術）によって露呈し、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェア（７羽のウサギ）または１７７ＬｕＣｌ３（２羽のウサギ）のいずれかの点滴注入のために顕微手術によってカテーテルを挿入した。ミクロスフェアは直径８μｍであり、このミクロスフェアを、１１２ＭＢｑの平均放射能で１２ｍｇ／ｋｇの平均負荷の５ｍＬの５％デキストロース溶液に含めて注射した。１７７ＬｕＣｌ３を、８２ＭＢｑの平均放射能で５ｍＬの５％デキストロース溶液に含めて注射した。肝臓への通常の血流を再建し、ウサギをＩｎｆｉｎｉａ  Ｈａｗｋｅｙｅ４  ＳＰＥＣＴスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で画像化した。手術および画像化の１時間後、ウサギを依然として麻酔下でのペントバルビトンナトリウムを使用した心臓内致死注射によって安楽死させ、さらなるＳＰＥＣＴ画像化のために臓器を取り出した。臓器カウントを表１２に示す。
【０２２７】
摘出した肝臓のガンマカメラ画像化（図２３）は、おそらく腫瘍によって誘発された血管新生神経叢中の２つの植え込んだ腫瘍の末梢成長帯に放射活性が増強された円形ハローを示していた。動脈内投与した可溶性１７７Ｌｕは、正常な肝臓については上記のように肝臓から迅速に失われ、有用な腫瘍画像を得られなかった。
【０２２８】
【表１２】
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【０２２９】
実施例２９：ｉｎ  ｖｉｖｏでの１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの安定性試験−長期皮下マウス４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍保持試験
本研究を、肺腫瘍および肝腫瘍を用いた上記実施例と異なる皮下腫瘍の処置における有用性に関する情報を得るために行った。ポリマーミクロスフェア（直径１μｍ）を、固定化剤としてＤＴＰＡ−ＰＬＯを使用して１７７Ｌｕで放射性標識した。ミクロスフェアの懸濁液（１６．７ｍｇ／ｍＬ；２４５ＭＢｑ／ｍＬ；１８μＬ）を、成長８日目に皮下で成長したマウス４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍内に直接注射した。腫瘍を、２００００００個の４Ｔ１−ｌｕｃ２細胞を含む３０μＬのハンクス平衡塩類溶液の皮下注射から成長させた。腫瘍成長のさらに４日後に、マウスを解剖し、腫瘍、肝臓、および屠体内の放射活性の分布を、Ｉｎｆｉｎｉａ  Ｈａｗｋｅｙｅ４  ＳＰＥＣＴスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したガンマカメラ画像化によって決定した。結果を表１３に示す。摘出した腫瘍は、１２日目に（すなわち、同位体注射の４日後に）高い比率（平均９７．４％）の総放射活性を含むことが見出された。
【０２３０】
【表１３】
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【０２３１】
実施例３０：皮下マウス４Ｔ１−ｌｕｃ２腫瘍成長に及ぼす１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアの影響
ルシフェリン注射（ＩＰ）後の腫瘍生物発光を測定するＩＶＩＳスペクトルｉｎ  ｖｉｖｏ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して麻酔したマウスにおいて測定したマウス４Ｔ１−ｌｕｃ２皮下腫瘍の成長に及ぼす１７７Ｌｕ放射性標識ミクロスフェアの影響を図２４に示す。以下の腫瘍を有する２群のマウスについての結果を示す；無処置群（Ｃｔｒｌ；ｎ＝１０）に、非放射性１７５Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを８日目に腫瘍内注射し、処置群（１７７Ｌｕ；ｎ＝９）に、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアを８日目に腫瘍内注射した。ミクロスフェアは直径１μｍであり、このミクロスフェアを、４．４ＭＢｑの平均放射活性で０．３ｍｇの負荷の１８μＬの５％デキストロース溶液に含めて注射した。各腫瘍自体をコントロールとして使用し、成長の増加を、１２日目に画像化した領域から８日目の腫瘍中の画像化された生物発光領域を差し引くことによって計算した。１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−ＰＬＯ−ミクロスフェアで処置したマウス皮下腫瘍は、そのサイズが５９％小さかった（ｐ＝０．０５８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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