(57)【要約】  本発明は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントが、薬物部分に、場合によってはリンカーを介して結合されている抗体薬物結合体を提供する。本発明はさらに、抗体薬物結合体を含む医薬組成物；ならびにそのような医薬組成物を製造する方法、およびそのような医薬組成物を、造血幹細胞の除去を必要とする患者において造血幹細胞を除去するのに用いる方法を提供する。
2020504112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の結合体、またはその薬学的に許容可能な塩であって；
Ａ−（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）ｙ
式（Ｉ）；
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり；
ＬＢは、リンカーであり；
Ｄは、細胞毒性剤であり；
ｎは、１から１０の整数であり、
ｙは、１から１０の整数である、結合体。
【請求項２】
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
ｙは、１、２、３、または４である、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
各Ｄは、オーリスタチン、アマニチン、マイタンシノイド、またはサポリンから独立して選択される細胞毒性剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項５】
各Ｄは、オーリスタチン、アマニチン、またはマイタンシノイドから独立して選択される細胞毒性剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項６】
各Ｄは、オーリスタチンまたはアマニチンから独立して選択される細胞毒性剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項７】
各ＬＢは、切断可能なリンカーまたは切断可能でないリンカーから独立して選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項８】
各ＬＢは、切断可能なリンカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項９】
各ＬＢは、切断可能でないリンカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１０】
式（Ｃ）の構造を有し：
【化１】
2020504112.tif 000212
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化２】
2020504112.tif 000213
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化３】
2020504112.tif 000214
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ３は、
【化４】
2020504112.tif 000215
であり；
Ｘ４は、
【化５】
2020504112.tif 000216
であり；
Ｒ４０は、
【化６】
2020504112.tif 000217
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化７】
2020504112.tif 000218
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＨ３、およびフェニルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される、結合体。
【請求項１１】
【化８】
2020504112.tif 000219
から選択される、請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
式（Ｄ）の構造を有し：
【化９】
2020504112.tif 000220
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ１は、
【化１０】
2020504112.tif 000221
であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ７）２−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化１１】
2020504112.tif 000222
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１２】
2020504112.tif 000223
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１３】
2020504112.tif 000224
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１４】
2020504112.tif 000225
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＨ３、およびフェニルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される、結合体。
【請求項１３】
【化１５】
2020504112.tif 000226
から選択される、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
式（Ｅ）の構造を有し：
【化１６】
2020504112.tif 000227
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｘは、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）２、またはＳであり；
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＤ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、または−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化１７】
2020504112.tif 000228
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１８】
2020504112.tif 000229
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１９】
2020504112.tif 000230
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化２０】
2020504112.tif 000231
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＨ３、およびフェニルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される、結合体。
【請求項１５】
【化２１】
2020504112.tif 000232
【化２２】
2020504112.tif 000233
から選択される、請求項１４に記載の結合体。
【請求項１６】
【化２３】
2020504112.tif 000234
【化２４】
2020504112.tif 000235
【化２５】
2020504112.tif 000236
から選択され、
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり、
ｙは、１から１０の整数である、結合体。
【請求項１７】
【化２６】
2020504112.tif 000237
【化２７】
2020504112.tif 000238
から選択され、
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり、ｙは、１から１０の整数である、結合体。
【請求項１８】
前記抗体フラグメントは、ヒトｃＫＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１１２）に特異的に結合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１９】
前記抗体フラグメントは、ヒトｃＫＩＴのドメイン１〜３（配列番号１１３）中のエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２０】
前記抗体フラグメントは、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２１】
前記抗体フラグメントは：
（１）（ｉ）（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）；（ｂ）配列番号２のＨＣＤＲ２（重鎖相補性決定領域２）；および（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３（重鎖相補性決定領域３）を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１６のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２（軽鎖相補性決定領域２）；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３（軽鎖相補性決定領域３）を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２）（ｉ）（ａ）配列番号４のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１９のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（３）（ｉ）（ａ）配列番号６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（４）（ｉ）（ａ）配列番号７のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号２２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（５）（ｉ）（ａ）配列番号２７のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（６）（ｉ）（ａ）配列番号３０のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４４のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（７）（ｉ）（ａ）配列番号３２のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（８）（ｉ）（ａ）配列番号３３のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３４のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（９）（ｉ）（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１０）（ｉ）（ａ）配列番号４のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５２のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１９のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１１）（ｉ）（ａ）配列番号６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１２）（ｉ）（ａ）配列番号７のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５３のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号２２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１３）（ｉ）（ａ）配列番号６０のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号７５のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７６のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１４）（ｉ）（ａ）配列番号６３のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６４のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号７８のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７９のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号８０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１５）（ｉ）（ａ）配列番号６５のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号７５のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７６のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１６）（ｉ）（ａ）配列番号６６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６７のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号８１のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７９のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１７）（ｉ）（ａ）配列番号８６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号８７のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０１のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１８）（ｉ）（ａ）配列番号８９のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（１９）（ｉ）（ａ）配列番号９１のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号８７のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０１のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２０）（ｉ）（ａ）配列番号９２のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９３のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０７のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２１）配列番号１０を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２２）配列番号３６を含むＶＨ、および配列番号４７を含むＶＬを含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２３）配列番号５４を含むＶＨ、および配列番号２３を含むＶＬを含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２４）配列番号６９を含むＶＨ、および配列番号８２を含むＶＬを含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２５）配列番号９５を含むＶＨ、および配列番号１０８を含むＶＬを含むＦａｂまたはＦａｂ’；
（２６）配列番号１４を含む重鎖、および配列番号２５を含む軽鎖を含むＦａｂ’；
（２７）配列番号４０を含む重鎖、および配列番号４９を含む軽鎖を含むＦａｂ’；
（２８）配列番号５８を含む重鎖、および配列番号２５を含む軽鎖を含むＦａｂ’；
（２９）配列番号７３を含む重鎖、および配列番号８４を含む軽鎖を含むＦａｂ’；
（３０）配列番号９９を含む重鎖、および配列番号１１０を含む軽鎖を含むＦａｂ’；
（３１）配列番号１１８を含む重鎖、および配列番号１２２を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３２）配列番号１１８を含む重鎖、および配列番号１２３を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３３）配列番号１２４を含む重鎖、および配列番号１２８を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３４）配列番号１２４を含む重鎖、および配列番号１２９を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３５）配列番号１３０を含む重鎖、および配列番号１３４を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３６）配列番号１３０を含む重鎖、および配列番号１３５を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３７）配列番号１３６を含む重鎖、および配列番号１４０を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３８）配列番号１４１を含む重鎖、および配列番号１４５を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（３９）配列番号１１９、１２０、または１２１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（４０）配列番号１２５、１２６、または１２７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（４１）配列番号１３１、１３２、または１３３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（４２）配列番号１３７、１３８、または１３９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むＦａｂ；
（４３）配列番号１４２、１４３、または１４４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むＦａｂ；
のいずれかから選択される、請求項１〜１７および請求項２０のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２２】
前記抗体フラグメントは、ヒトＦａｂもしくはヒトＦａｂ’、またはヒト化Ｆａｂもしくはヒト化Ｆａｂ’である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２３】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ’であり、前記リンカー（ＬＢ）は、前記Ｆａｂ’のヒンジ領域中の天然のシステイン残基に取り付けられている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２４】
前記抗体フラグメントは、定常領域中に導入された少なくとも１つの非天然のシステインを含み、前記リンカー（ＬＢ）は、前記非天然のシステインに取り付けられている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２５】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ’であり、Ｌ２０が、前記Ｆａｂ’のヒンジ領域中の天然のシステイン残基に取り付けられている、請求項１０、１１、１４、および１５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２６】
前記抗体フラグメントは、定常領域中に導入された少なくとも１つの非天然のシステインを含み、Ｌ２０が、前記非天然のシステインに取り付けられている、請求項１０、１１、１４、および１５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２７】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ’であり、Ｌ３０が、前記Ｆａｂ’のヒンジ領域中の天然のシステイン残基に取り付けられている、請求項１２または１３に記載の結合体。
【請求項２８】
前記抗体フラグメントは、定常領域中に導入された少なくとも１つの非天然のシステインを含み、Ｌ３０が、前記非天然のシステインに取り付けられている、請求項１２または１３に記載の結合体。
【請求項２９】
前記抗体フラグメントは、位置（全ての位置がＥＵナンバリングによる）：
（ａ）重鎖の位置１５２、
（ｂ）カッパ軽鎖の位置１１４もしくは１６５、または
（ｃ）ラムダ軽鎖の位置１４３
の１つ以上にてシステインを含む、請求項２４、２６、および２８のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項３０】
前記結合体の半減期は、約２４〜４８時間未満である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項３１】
前記結合体は、肥満細胞脱顆粒を誘導しない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合体、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項３３】
別の治療薬をさらに含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記組成物は、凍結乾燥品である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
造血幹細胞の除去を必要とする患者において造血幹細胞を除去する方法であって、前記患者に、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合体、または請求項３２もしくは３３に記載の医薬組成物の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記患者は、造血幹細胞移植レシピエントである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法は、前記患者への造血幹細胞移植前に実行される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
造血幹細胞移植患者のコンディションを整える方法であって：前記患者に、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合体、または請求項３２もしくは３３に記載の医薬組成物の有効な量を投与することと、前記患者に造血幹細胞移植を実行する前に、前記結合体による、前記患者の循環系からの一掃のための十分な期間を許容することとを含む方法。
【請求項３９】
前記患者は、遺伝性の免疫不全疾患、自己免疫疾患、造血障害、または先天性代謝異常を有する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記造血障害は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性単球白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、無形成性貧血、赤芽球癆、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコーニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球貧血、重症複合型免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球増多症から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記先天性代謝異常は、ムコ多糖症、ゴーシェ病、異染性ロイコジストロフィ、または副腎脳白質ジストロフィから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者は、重症無形成性貧血（ＳＡＡ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ハーラー症候群、ＦＨＬ、ＣＧＤ、コストマン症候群、重症免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、他の自己免疫疾患、例えばＳＬＥ、多発性硬化症、ＩＢＤ、クローン病、シェーグレン症候群、脈管炎、狼瘡、重症性筋無力症、ウェゲナー病、先天性代謝異常、および／または他の免疫不全から選択される非悪性疾患または症状を有する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性単球白血病（ＡＭｏＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大型顆粒リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、前駆体Ｔ細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、菌状息肉腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、他に規定されない限り、ホジキンリンパ腫のホジキンリンパ腫混合細胞亜型の結節性硬化症形態から選択される悪性疾患または症状を有する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
造血幹細胞の除去を必要とする患者において造血幹細胞を除去するための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合体、または請求項３１もしくは３２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４５】
造血幹細胞の除去を必要とする患者において造血幹細胞を除去するための医薬の製造における、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合体、または請求項３１もしくは３２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４６】
ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、前記抗体または前記抗体フラグメントは：
（１）（ｉ）（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）；（ｂ）配列番号２のＨＣＤＲ２（重鎖相補性決定領域２）；および（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３（重鎖相補性決定領域３）を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１６のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２（軽鎖相補性決定領域２）；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３（軽鎖相補性決定領域３）を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２）（ｉ）（ａ）配列番号４のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１９のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（３）（ｉ）（ａ）配列番号６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（４）（ｉ）（ａ）配列番号７のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号２２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（５）（ｉ）（ａ）配列番号２７のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（６）（ｉ）（ａ）配列番号３０のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４４のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（７）（ｉ）（ａ）配列番号３２のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４２のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（８）（ｉ）（ａ）配列番号３３のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３４のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号４６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２０のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（９）（ｉ）（ａ）配列番号６０のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号７５のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７６のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１０）（ｉ）（ａ）配列番号６３のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６４のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号７８のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７９のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号８０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１１）（ｉ）（ａ）配列番号６５のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６１のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号７５のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７６のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１２）（ｉ）（ａ）配列番号６６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６７のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号８１のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７９のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１３）（ｉ）（ａ）配列番号８６のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号８７のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０１のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１４）（ｉ）（ａ）配列番号８９のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１５）（ｉ）（ａ）配列番号９１のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号８７のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号８８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０１のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１６）（ｉ）（ａ）配列番号９２のＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９３のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）（ｄ）配列番号１０７のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１７）配列番号１０を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１８）配列番号３６を含むＶＨ、および配列番号４７を含むＶＬを含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（１９）配列番号６９を含むＶＨ、および配列番号８２を含むＶＬを含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２０）配列番号９５を含むＶＨ、および配列番号１０８を含むＶＬを含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２１）配列番号１４を含む重鎖、および配列番号２５を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２２）配列番号４０を含む重鎖、および配列番号４９を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２３）配列番号７３を含む重鎖、および配列番号８４を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２４）配列番号９９を含む重鎖、および配列番号１１０を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２５）配列番号１１８を含む重鎖、および配列番号１２２を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２６）配列番号１１８を含む重鎖、および配列番号１２３を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２７）配列番号１２４を含む重鎖、および配列番号１２８を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２８）配列番号１２４を含む重鎖、および配列番号１２９を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（２９）配列番号１３０を含む重鎖、および配列番号１３４を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（３０）配列番号１３０を含む重鎖、および配列番号１３５を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（３１）配列番号１３６を含む重鎖、および配列番号１４０を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（３２）配列番号１４１を含む重鎖、および配列番号１４５を含む軽鎖を含む抗体もしくは抗体フラグメント；
（３３）配列番号１２を含む重鎖、および配列番号２５を含む軽鎖を含む抗体；
（３４）配列番号３８を含む重鎖、および配列番号４９を含む軽鎖を含む抗体；
（３５）配列番号７１を含む重鎖、および配列番号８４を含む軽鎖を含む抗体；または
（３６）配列番号９７を含む重鎖、および配列番号１１０を含む軽鎖を含む抗体
のいずれかから選択される、抗体または抗体フラグメント。
【請求項４７】
請求項４６に記載の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸。
【請求項４８】
請求項４７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
抗体または抗体フラグメントを生成するプロセスであって、請求項４９に記載の宿主細胞を培養することと、前記培養から前記抗体または前記抗体フラグメントを回収することとを含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６２／４３７，６２２号明細書および２０１７年６月１６日出願の米国仮特許出願第６２／５２０，８５４号明細書の利益を主張し、これらの出願の内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、抗ｃＫＩＴ抗体薬物結合体、およびその、造血幹細胞の除去を必要とする患者、例えば造血幹細胞移植レシピエントにおいて造血幹細胞を除去するための使用に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピー（２０１７年１２月１４日作成）は、ＰＡＴ０５７４００−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２０９，９３８バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
ｃＫＩＴ（ＣＤ１１７）は、単一の膜貫通受容体チロシンキナーゼであり、リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合する。ＳＣＦは、ｃＫＩＴのホモ二量体化を誘導し、これは、そのチロシンキナーゼ活性、ならびにＰＩ３−ＡＫＴ経路およびＭＡＰＫ経路の双方を介するシグナルを活性化する（Ｋｉｎｄｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈ．１９９８  １５２（５）：１２５９）。ｃＫＩＴは最初に、ネコレトロウイルスによって発現される切断型形態としてのオンコジーンとして発見された（Ｂｅｓｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８６  ３２０：４１５−４２１）。対応するヒト遺伝子のクローニングにより、ｃＫＩＴは、受容体チロシンキナーゼのクラスＩＩＩ型のメンバであることが実証され、これは、ファミリメンバ、ＦＬＴ３、ＣＳＦ−１受容体、およびＰＤＧＦ受容体の１つに数えられる。ｃＫＩＴは、造血細胞、胚細胞、肥満細胞、およびメラニン細胞の発達に必要とされる。造血前駆細胞、例えば骨髄中の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、細胞表面上で高レベルのｃＫＩＴを発現する。加えて、肥満細胞、皮膚内のメラニン細胞、および消化管内のカハールの間質細胞が、ｃＫＩＴを発現する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、移植レシピエントにおいて全ての血液細胞および免疫細胞を再生させることができるので、治療潜在性は大きい。造血幹細胞移植が、白血病、リンパ腫、および他の致命的な疾患の治療法として、広く用いられている。しかしながら、多くのリスクが、そのような移植に付随し、不十分な移植、免疫拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、または感染症が挙げられる。同種造血幹細胞移植には、通常、移植片の免疫拒絶を阻止するための、腫瘍縮小処理によるレシピエントのコンディション調整が必要とされる。現行のコンディション調整レジメンは多くの場合、宿主に有毒であるので、移植患者の大グループにとって禁忌であり、かつ／または移植片対宿主疾患を阻止するのに十分な量で提供され得ない。ゆえに、コンディション調整方法および移植方法を向上させ、造血幹細胞移植に付随するリスクを低下させ、かつ種々の障害についてのその有効性を増大させることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）が、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている抗体薬物結合体を提供する。当該抗体薬物結合体は、ｃＫＩＴを発現する細胞、例えば造血幹細胞に細胞毒性剤を選択的に送達することによって、患者、例えば造血幹細胞移植レシピエントにおいて当該細胞を選択的に除去することができる。好ましくは、ｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、患者の循環系において長い時間、存在しない、かつ／または有効でないような薬物動態学的特性を有するので、造血幹細胞移植前の、造血幹細胞移植レシピエントのコンディション調整に用いられ得る。一部の実施形態において、本明細書中で提供されるのは、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を含む結合体である。驚くべきことに、本発明者らは、完全長の抗ｃＫＩＴ抗体（例えば完全長ＩｇＧ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびそれらの毒物結合体が、肥満細胞脱顆粒を引き起こす一方、Ｆａｂフラグメントを認識する既存の抗薬物抗体を患者が産生させ、またはこれを有する場合に観察され得るように、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’またはＦａｂ−毒物結合体が、肥満細胞脱顆粒を引き起こさないことを見出した。本開示はさらに、抗体薬物結合体を含む医薬組成物、ならびにそのような医薬組成物を製造する方法、およびそのような医薬組成物を、造血幹細胞の除去を必要とする患者、例えば造血幹細胞移植レシピエントにおいて造血幹細胞を除去するのに用いる方法を提供する。
【０００７】
一態様において、本開示は、式（Ｉ）の結合体に関し：
Ａ−（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）ｙ  式（Ｉ）；
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメントであり；
ＬＢは、リンカーであり；
Ｄは、細胞毒性剤であり；
ｎは、１から１０の整数であり、ｙは、１から１０の整数である。
【０００８】
一態様において、本開示は、式（Ｃ）の構造を有する結合体に関し：
【化１】
2020504112.tif 000003
式中、Ａ、Ｌ２０、ｙ、およびＲ２は、本明細書中で定義される通りである。
【０００９】
一態様において、本開示は、式（Ｄ）の構造を有する結合体に関し：
【化２】
2020504112.tif 000004
式中、Ａ、Ｌ３０、ｙ、Ｒ１、およびＲ２は、本明細書中で定義される通りである。
【００１０】
一態様において、本開示は、式（Ｅ）の構造を有する結合体に関し：
【化３】
2020504112.tif 000005
式中、Ａ、Ｌ４０、ｙ、Ｘ、Ｒ５、およびＲ６は、本明細書中で定義される通りである。
【００１１】
別の態様において、本明細書中で提供されるのは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）である。そのような抗ｃＫＩＴ抗体および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、本明細書中に記載されるあらゆる結合体に用いられ得る。
【００１２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、ヒトｃＫＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１１２）に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）である。
【００１３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、ヒトｃＫＩＴのドメイン１〜３（配列番号１１３）中のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）である。
【００１４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１に記載される抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）である。
【００１５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号１のＨＣＤＲ１；配列番号２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【００１６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号４のＨＣＤＲ１；配列番号５のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１９のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６のＨＣＤＲ１；配列番号２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号８のＨＣＤＲ２；配列番号９のＨＣＤＲ３；配列番号２２のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号２７のＨＣＤＲ１；配列番号２８のＨＣＤＲ２；配列番号２９のＨＣＤＲ３；配列番号４２のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む。
【００２０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３０のＨＣＤＲ１；配列番号３１のＨＣＤＲ２；配列番号２９のＨＣＤＲ３；配列番号４４のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号４５のＬＣＤＲ３を含む。
【００２１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３２のＨＣＤＲ１；配列番号２８のＨＣＤＲ２；配列番号２９のＨＣＤＲ３；配列番号４２のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む。
【００２２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３３のＨＣＤＲ１；配列番号３４のＨＣＤＲ２；配列番号３５のＨＣＤＲ３；配列番号４６のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む。
【００２３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号１のＨＣＤＲ１；配列番号５１のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【００２４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号４のＨＣＤＲ１；配列番号５２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１９のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む。
【００２５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６のＨＣＤＲ１；配列番号５１のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号５３のＨＣＤＲ２；配列番号９のＨＣＤＲ３；配列番号２２のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【００２７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６０のＨＣＤＲ１；配列番号６１のＨＣＤＲ２；配列番号６２のＨＣＤＲ３；配列番号７５のＬＣＤＲ１；配列番号７６のＬＣＤＲ２；および配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む。
【００２８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６３のＨＣＤＲ１；配列番号６４のＨＣＤＲ２；配列番号６２のＨＣＤＲ３；配列番号７８のＬＣＤＲ１；配列番号７９のＬＣＤＲ２；および配列番号８０のＬＣＤＲ３を含む。
【００２９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６５のＨＣＤＲ１；配列番号６１のＨＣＤＲ２；配列番号６２のＨＣＤＲ３；配列番号７５のＬＣＤＲ１；配列番号７６のＬＣＤＲ２；および配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む。
【００３０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６６のＨＣＤＲ１；配列番号６７のＨＣＤＲ２；配列番号６８のＨＣＤＲ３；配列番号８１のＬＣＤＲ１；配列番号７９のＬＣＤＲ２；および配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む。
【００３１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号８６のＨＣＤＲ１；配列番号８７のＨＣＤＲ２；配列番号８８のＨＣＤＲ３；配列番号１０１のＬＣＤＲ１；配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む。
【００３２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号８９のＨＣＤＲ１；配列番号９０のＨＣＤＲ２；配列番号８８のＨＣＤＲ３；配列番号１０４のＬＣＤＲ１；配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および配列番号１０６のＬＣＤＲ３を含む。
【００３３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号９１のＨＣＤＲ１；配列番号８７のＨＣＤＲ２；配列番号８８のＨＣＤＲ３；配列番号１０１のＬＣＤＲ１；配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む。
【００３４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号９２のＨＣＤＲ１；配列番号９３のＨＣＤＲ２；配列番号９４のＨＣＤＲ３；配列番号１０７のＬＣＤＲ１；配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む。
【００３５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００３６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００４０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１４０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１１９、１２０、または１２１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１２５、１２６、または１２７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１３１、１３２、または１３３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１３７、１３８、または１３９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１４２、１４３、または１４４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６３】
一部の実施形態において、本明細書中で提供されるのは、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）（抗ｃＫＩＴ  ＦａｂまたはＦａｂ’）を含む結合体である。抗ｃＫＩＴ  ＦａｂまたはＦａｂ’は、本明細書中に記載されるＦａｂまたはＦａｂ’のいずれか、例えば、表１中のＦａｂまたはＦａｂ’のいずれかであってよい。本明細書中に記載されるように、そのような抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’またはＦａｂ−毒物結合体は、ヒトＨＳＣ細胞をインビトロかつインビボで除去することができる一方、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、肥満細胞脱顆粒を引き起こさない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、試験した全ての抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−（１）ＤＡＲ４結合体（結合体の詳細について、表２参照）が、ヒト幹細胞および前駆体細胞（ｃＫＩＴ＋／ＣＤ９０＋細胞）をインビトロで、おおよそ等しい効力で死滅させたことを示す線グラフである：Ｊ３（正方形）；Ｊ２（上向き三角形）；Ｊ１（下向き三角形）。対照ＡＤＣ、Ｊ６（菱形）は、ＰＢＳ対照（円）と比較して、ヒトＨＳＣを死滅させなかった。
【図２】図２は、Ｊ４（正方形）抗ｃＫＩＴ結合体およびＪ５（三角形）抗ｃＫＩＴ結合体の双方が、マウス長期ＨＳＣ（ｃＫＩＴ＋細胞）を死滅させたことを示す線グラフである。Ｊ５（三角形）は、本マウスＨＳＣ死滅アッセイにおいて、Ｊ４（正方形）よりも強力であった。対照ＡＤＣ、Ｊ６（菱形）は、ＰＢＳ対照（円）と比較して、マウスＨＳＣを死滅させなかった。
【図３−１】図３：図３Ａ〜図３Ｌは、ヒト末梢血ＨＳＣ由来肥満細胞およびベータ−ヘキソサミニダーゼ放出を読出しとして用いた、インビトロヒト肥満細胞脱顆粒アッセイの代表的な結果を示す線グラフである（４０５ｎｍでの吸光度によって評価し、ベースライン減算は、６２０ｎｍでの参照吸光度に基づいた）。ここに示すデータは、ＳＣＦの不在下で収集した。図３Ａは、種々の抗ｃＫＩＴクローンについての抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−（１）ＤＡＲ４結合体（塗り潰した記号、実線）または完全長抗ｃＫＩＴ抗体（白抜きの記号、破線）：抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４／Ｆａｂ’４（円）、抗ｃＫＩＴ  Ａｂ３／Ｆａｂ’３（正方形）、抗ｃＫＩＴ  Ａｂ２／Ｆａｂ’２（上向き三角形）、抗ｃＫＩＴ  Ａｂ１／Ｆａｂ’１（下向き三角形）、および対照抗Ｈｅｒ２  Ａｂ／Ｆａｂ’（菱形）の滴定を示す線グラフである。図３Ｂは、肥満細胞脱顆粒の陽性対照として、抗ＩｇＥの滴定を示す線グラフである。肥満細胞脱顆粒を、試験した抗ＩｇＥの全濃度について観察した。図３Ｃ〜図３Ｊは、抗体試験剤上のＦａｂ部分に特異的な抗体を用いて試験剤を架橋させた場合の、種々の濃度：不在（白抜き菱形および破線）；０．００６ｎＭ（三角形）；０．０９８ｎＭ（菱形）；１．５６ｎＭ（円）；および２５ｎＭ（正方形）の抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−（１）ＤＡＲ４結合体（表２に記載）または完全長ＩｇＧ抗ｃＫＩＴ  Ａｂ対照（表８に記載）によってトリガされた肥満細胞脱顆粒レベルを示す線グラフである（ｘ軸上が滴定）。図３Ｃおよび図３Ｄは、肥満細胞脱顆粒が、試験した全濃度にてＪ４結合体によってトリガされなかった（図３Ｃ）が、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした（図３Ｄ）ことを示す。図３Ｅおよび図３Ｆは、肥満細胞脱顆粒が、試験した全濃度にてＪ１結合体によってトリガされなかった（図３Ｅ）が、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ１が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした（図３Ｆ）ことを示す。図３Ｇおよび図３Ｈは、肥満細胞脱顆粒が、試験した全濃度にてＪ２結合体によってトリガされなかった（図３Ｇ）が、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ２が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした（図３Ｈ）ことを示す。図３Ｉおよび図３Ｊは、肥満細胞脱顆粒が、試験した全濃度にてＪ３結合体によってトリガされなかった（図３Ｉ）が、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ３が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした（図３Ｊ）ことを示す。図３Ｋおよび図３Ｌは、肥満細胞脱顆粒が、対照結合体Ｊ６（図３Ｋ）または完全長抗Ｈｅｒ２抗体（図３Ｌ）（架橋された場合）によって引き起こされなかったことを示す線グラフである。
【図３−２】（上記の通り。）
【図３−３】（上記の通り。）
【図３−４】（上記の通り。）
【図３−５】（上記の通り。）
【図３−６】（上記の通り。）
【図３−７】（上記の通り。）
【図３−８】（上記の通り。）
【図３−９】（上記の通り。）
【図３−１０】（上記の通り。）
【図３−１１】（上記の通り。）
【図３−１２】（上記の通り。）
【図４】図４は、種々の剤による処理後のヒト化ＮＳＧマウスの骨髄中に存在するヒトＨＳＣの相対数を示すドットプロットである。Ｊ７結合体は、ＰＢＳ対照（円）に対して、ヒトＨＳＣを枯渇させた（正方形）が、対照Ｊ８結合体（菱形）は、骨髄中のヒトＨＳＣを枯渇させなかった。
【図５】図５は、種々の剤による処理後のヒト化ＮＳＧマウスの骨髄中に存在するヒトＨＳＣの相対数を示すドットプロットである。抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−（１）ＤＡＲ４結合体は、ＰＢＳ対照（円）に対して、ヒトＨＳＣを枯渇させた。試験した抗ｃＫＩＴ結合体（表２に記載）は：Ｊ３（正方形）；Ｊ２（上向き三角形）；Ｊ１（下向き三角形）であった。Ｊ６（菱形）で処理した対照マウスは、骨髄中のヒトＨＳＣを枯渇させなかった。
【図６】図６は、種々の剤による処理後のＣ５７Ｂｌ／６マウスの骨髄中に存在するＨＳＣの相対数を示す棒グラフである。棒Ａ＝Ｊ４結合体処理マウス、棒Ｂ＝Ｊ５結合体処理マウス、棒Ｃ＝ＰＢＳ処理マウス。
【図７−１】図７：図７Ａ〜図７Ｉは、ヒト末梢血ＨＳＣ由来肥満細胞およびベータ−ヘキソサミニダーゼ放出を読出しとして用いた、インビトロヒト肥満細胞脱顆粒アッセイの代表的な結果を示す線グラフである（４０５ｎｍでの吸光度によって評価し、ベースライン減算は、６２０ｎｍでの参照吸光度に基づいた）。ここに示すデータは、ＳＣＦの不在下で収集した。線グラフは、抗体試験剤上のＦａｂ部分に特異的な抗体を用いて試験剤を架橋させた場合の、種々の濃度：０．００６ｎＭ（三角形）；０．０９８ｎＭ（菱形）；１．６ｎＭ（円）；および２５ｎＭ（正方形）の抗体または抗体フラグメントによってトリガされた肥満細胞脱顆粒レベルを示す（ｘ軸上が滴定）。図７Ａ〜図７Ｃは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）（図７Ａ）、および化合物（４）と結合した抗ｃＫＩＴ  Ｆ（ａｂ’４）２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメント（図７Ｂ）が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、肥満細胞脱顆粒が、Ｆａｂ４（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントによって、試験した全濃度にてトリガされなかった（図７Ｃ）ことを示す。図７Ｄ〜図７Ｆは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ３（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）（図７Ｄ）、および化合物（５）に結合したＦ（ａｂ’３）２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメント（図７Ｅ）が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、肥満細胞脱顆粒が、化合物（４）に結合したＦａｂ３（Ｅ１５２Ｃ）フラグメントによって、試験した全ての濃度にてトリガされなかった（図７Ｆ）ことを示す。図７Ｇ〜図７Ｉは、肥満細胞脱顆粒が、抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）（図７Ｇ）、化合物（４）に結合した抗Ｈｅｒ２−Ｆ（ａｂ’）２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメント（図７Ｈ）、または化合物（７）に結合した抗Ｈｅｒ２−Ｆａｂ（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメント（図７Ｉ）（架橋された場合）によって引き起こされなかったことを示す線グラフである。
【図７−２】（上記の通り。）
【図７−３】（上記の通り。）
【図７−４】（上記の通り。）
【図７−５】（上記の通り。）
【図７−６】（上記の通り。）
【図７−７】（上記の通り。）
【図７−８】（上記の通り。）
【図７−９】（上記の通り。）
【図８−１】図８：図８Ａ〜図８Ｏは、ヒト末梢血ＨＳＣ由来肥満細胞およびベータ−ヘキソサミニダーゼ放出を読出しとして用いた、インビトロヒト肥満細胞脱顆粒アッセイの代表的な結果を示す線グラフである（４０５ｎｍでの吸光度によって評価し、ベースライン減算は、６２０ｎｍでの参照吸光度に基づいた）。ここに示すデータは、ＳＣＦの不在下で収集した。線グラフは、抗体試験剤上のＦａｂ部分に特異的な抗体を用いて試験剤を架橋させた場合の、種々の濃度：０．００６ｎＭ（三角形）；０．０９８ｎＭ（菱形）；１．６ｎＭ（円）；および２５ｎＭ（正方形）の抗体または抗体フラグメントによってトリガされた肥満細胞脱顆粒レベルを示す（ｘ軸上が滴定）。参照用に、架橋剤抗体単独を、各グラフ上にプロットする（白抜き菱形、破線）。図８Ａ〜図８Ｃは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４（図８Ａ）および抗ｃＫＩＴ  Ｆ（ａｂ’４）２フラグメント（図８Ｂ）が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、肥満細胞脱顆粒が、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ４（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントによって、試験した全濃度にてトリガされなかった（図８Ｃ）ことを示す。図８Ｄ〜図８Ｆは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ１（図８Ｄ）および抗ｃＫＩＴ  Ｆ（ａｂ’１）２フラグメント（図８Ｅ）が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、肥満細胞脱顆粒が、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ１（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントによって、試験した全濃度にてトリガされなかった（図８Ｆ）ことを示す。図８Ｇ〜図８Ｉは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ２（図８Ｇ）および抗ｃＫＩＴ  Ｆ（ａｂ’２）２フラグメント（図８Ｈ）が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、肥満細胞脱顆粒が、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントによって、試験した全濃度にてトリガされなかった（図８Ｉ）ことを示す。図８Ｊ〜図８Ｌは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ３（図８Ｊ）および抗ｃＫＩＴ  Ｆ（ａｂ’３）２フラグメント（図８Ｋ）が、架橋された場合、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、肥満細胞脱顆粒が、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ３（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントによって、試験した全濃度にてトリガされなかった（図８Ｌ）ことを示す。図８Ｍ〜図８Ｏは、肥満細胞脱顆粒が、抗Ｈｅｒ２抗体（図８Ｍ）、抗Ｈｅｒ２−Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（図８Ｎ）、または抗Ｈｅｒ２−Ｆａｂ（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメント（図８Ｏ）（架橋された場合）によって引き起こされなかったことを示す線グラフである。
【図８−２】（上記の通り。）
【図８−３】（上記の通り。）
【図８−４】（上記の通り。）
【図８−５】（上記の通り。）
【図８−６】（上記の通り。）
【図８−７】（上記の通り。）
【図８−８】（上記の通り。）
【図８−９】（上記の通り。）
【図８−１０】（上記の通り。）
【図８−１１】（上記の通り。）
【図８−１２】（上記の通り。）
【図８−１３】（上記の通り。）
【図８−１４】（上記の通り。）
【図８−１５】（上記の通り。）
【図９−１】図９：図９Ａ〜図９Ｃは、ヒト細胞を用いたインビトロ死滅アッセイの結果を表す。動員した末梢血ＨＳＣを、成長因子および述べた試験剤と共に７日間培養して、生存度を、フローサイトメトリおよび細胞カウントによって測定した。抗ｃＫｉｔ  Ｆａｂ’ＤＡＲ４試験剤を、様々なＦａｂ：抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’１（図９Ａ）、Ｆａｂ’２（図９Ｂ）、またはＦａｂ’３（図９Ｃ）で調製した。試験したペイロードは、Ｃ１（白抜き正方形）、ｍｃ−ＭＭＡＦ（白抜き円）、Ｃ５（菱形）、またはＣ２（三角形）であった。データは、平均と標準偏差、および同実験で測定した３反復についての３パラメータ応答曲線適合を表す。
【図９−２】（上記の通り。）
【図９−３】（上記の通り。）
【図１０−１】図１０：図１０Ａ〜図１０Ｄは、移植したマウスから採った血液サンプル中のドナー細胞キメラ化の確立の経時変化を示す線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（抗ｃＫｉｔ処理群についてｎ＝５、またはＰＢＳ処理群についてｎ＝２）に、１０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（三角形）、２０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（円）、またはＰＢＳ（正方形）を７日にわたって注入により投薬してから２日後に、ＣＤ４５．１＋ドナー細胞を移植した。２頭の対照動物に、移植の１日前に１１００ＲＡＤＳを照射した（菱形）。線グラフは、各時点にて採った血液サンプルのＦＡＣＳ分析による、全細胞（図１０Ａ）、骨髄細胞（図１０Ｂ）、Ｂ細胞（図１０Ｃ）、またはＴ細胞（図１０Ｄ）の集団において測定したドナー細胞（ＣＤ４５．１＋）パーセントを示す。データは、平均と標準誤差を表す。
【図１０−２】（上記の通り。）
【図１０−３】（上記の通り。）
【図１０−４】（上記の通り。）
【図１１−１】図１１：図１１Ａ〜図１１Ｂは、移植したマウスから採った血液サンプル中のドナー細胞キメラ化を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（抗ｃＫｉｔ処理群についてｎ＝５、またはＰＢＳ処理群についてｎ＝２）に、１０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（横縞）、２０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ  Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（縦縞）、４０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（塗潰し）、４０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−ｍｃ−ＭＭＡＦ（格子縞）、またはＰＢＳ（白抜き、黒縁）を５日にわたって注入により投薬してから１日後に、ＣＤ４５．１＋ドナー細胞を移植した。２頭の対照動物に、移植の１日前に１１００ＲＡＤＳを照射した（ハッチング）。グラフは、移植後２８日目（各群について左の棒）または５６日目（各群について右の棒）に採った血液サンプルのＦＡＣＳ分析による、全細胞（図１１Ａ）または骨髄細胞（図１１Ｂ）の集団において測定したドナー細胞（ＣＤ４５．１＋）パーセントを示す。データは、平均と標準誤差を表す。
【図１１−２】（上記の通り。）
【図１２−１】図１２：図１２Ａ〜図１２Ｂは、移植したマウスから採った血液サンプル中のドナー細胞キメラ化の確立の経時変化を示す線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（抗ｃＫｉｔ処理群についてｎ＝５、またはＰＢＳ処理群についてｎ＝２）に、３００ＲＡＤＳを照射してから３日後に、投薬せず（正方形）、または１０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（三角形）もしくは２０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（円）を３日にわたって注入により投薬してから２日後に、ＣＤ４５．１＋ドナー細胞を移植した。５頭の動物の追加の群に、１０ｍｇ／ｋｇ抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’５−ＤＡＲ４−Ｃ１（白抜き正方形）のみを３日にわたる注入により投薬してから、２日後に移植した。２頭の対照動物に、移植１日前に１１００ＲＡＤＳを照射して（菱形）、２頭の対照動物を、移植前に処理しなかった（白抜き菱形）。線グラフは、各時点にて採った血液サンプルのＦＡＣＳ分析による、全細胞（図１２Ａ）または骨髄細胞（図１２Ｂ）の集団において測定したドナー細胞（ＣＤ４５．１＋）パーセントを示す。データは、平均と標準誤差を表す。
【図１２−２】（上記の通り。）
【図１３】図１３は、種々の剤による処理後のヒト化ＮＳＧマウスの骨髄中に存在するヒトＨＳＣの相対数を示すドットプロットである。抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−ＤＡＲ４結合体は、ＰＢＳ対照（菱形）に対して、ヒトＨＳＣを枯渇させた。試験した抗ｃＫＩＴ結合体（表２に記載）は：ＪＷ（円）；ＪＸ（正方形）；ＪＹ（上向き三角形）；ＪＺ（下向き三角形）であった。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本開示は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）が、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている抗体薬物結合体を提供する。当該抗体薬物結合体は、ｃＫＩＴを発現する細胞、例えば造血幹細胞に細胞毒性剤を選択的に送達することによって、患者、例えば造血幹細胞移植レシピエントにおいて当該細胞を選択的に除去することができる。好ましくは、ｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、患者の循環系において長い時間、存在しない、かつ／または有効でないような薬物動態学的特性を有するので、造血幹細胞移植前の、造血幹細胞移植レシピエントのコンディション調整に用いられ得る。一部の実施形態において、本明細書中で提供されるのは、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を含む結合体である。驚くべきことに、本発明者らは、完全長の抗ｃＫＩＴ抗体（例えば完全長ＩｇＧ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびそれらの毒物結合体が、肥満細胞脱顆粒を引き起こす一方、Ｆａｂフラグメントを認識する既存の抗薬物抗体を患者が産生させ、またはこれを有する場合に観察され得るように、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’またはＦａｂ−毒物結合体が、肥満細胞脱顆粒を引き起こさないことを見出した。本開示はさらに、抗体薬物結合体を含む医薬組成物、ならびにそのような医薬組成物を製造する方法、およびそのような医薬組成物を、造血幹細胞の除去を必要とする患者、例えば造血幹細胞移植レシピエントにおいて造血幹細胞を除去するのに用いる方法を提供する。
【００６６】
定義
特に明記されない限り、本明細書中で用いられる以下の用語およびフレーズは、以下の意味を有することが意図される：
【００６７】
用語「アルキル」は、特定の炭素原子数を有する一価の飽和炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜６アルキルは、１から６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。代表的な分枝状アルキル基は、１本、２本、または３本の枝を有する。アルキル基の例として、以下に限定されないが、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチル、およびネオペンチル）、およびヘキシルが挙げられる。
【００６８】
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであっても、多重鎖であっても単鎖であっても、無傷の免疫グロブリンであってもよく、そして天然の源に由来しても、組換え源に由来してもよい。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に連結される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと省略した）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと省略した）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に再分割され得、より保存されている、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主の組織または因子への結合を媒介し得る（免疫系の種々の細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が挙げられる）。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物の抗体、またはキメラ抗体であってよい。抗体は、あらゆるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。
【００６９】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、互換的に、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗体鎖の標的タンパク質結合部位であり、これは、そのような標的タンパク質に対する特異性を保有する。３つのＣＤＲ（Ｎ末端から順に番号を付けられる、ＣＤＲ１〜３）が、ヒトの各ＶＬまたはＶＨ中に存在し、可変ドメインの約１５〜２０％を構成する。ＣＤＲは、その領域および順序によって呼ばれ得る。例えば、「ＶＨＣＤＲ１」または「ＨＣＤＲ１」は双方とも、重鎖可変領域の第１のＣＤＲを指す。ＣＤＲは、構造的に、標的タンパク質のエピトープと相補的であるので、結合特異性を直接担う。ＶＬまたはＶＨの残りの範囲、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列においてあまり変異を示さない（Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）。
【００７０】
所定のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界が、いくつかの周知のスキームのいずれかを用いて判定され得、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）によって記載されるものが挙げられる。例えば、古典的フォーマットについて、Ｋａｂａｔ下では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号を付けられ；そして軽鎖変数ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号を付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａ下では、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号を付けられ；そしてＶＬ中のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号を付けられる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの双方のＣＤＲ定義を組み合わせることによって、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおいてアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、そしてヒトＶＬにおいてアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴ下では、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、おおよそ２６〜３５（ＣＤＲ１）、５１〜５７（ＣＤＲ２）、および９３〜１０２（ＣＤＲ３）と番号を付けられ、そしてＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、おおよそ２７〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＣＤＲ３）と番号を付けられる（「Ｋａｂａｔ」に従うナンバリング）。ＩＭＧＴ下では、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを用いて判定され得る。
【００７１】
軽鎖および重鎖は双方とも、構造的相同領域および機能的相同領域に分割される。用語「定常」および「可変」は、機能的に用いられる。この点に関して、軽（ＶＬ）鎖部分および重（ＶＨ）鎖部分の双方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することは勿論である。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３、および、場合によってはＣＨ４）の定常ドメインは、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤運動能、Ｆｃ受容体結合、補体結合、ＦｃＲｎ受容体結合、半減期、および薬物動態を付与する。表記規則によって、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれ、増大する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端では定常領域である；ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインはそれぞれ、実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。
【００７２】
本明細書中で用いられる用語「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗原（例えばｃＫＩＴ）のエピトープと特異的に（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）相互作用する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。抗体フラグメントの例として、以下に限定されないが、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメイン、およびヒンジ領域からなる一価のフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；ジスルフィドブリッジによって結合される単一の重鎖および単一の軽鎖を含むハーフ抗体；Ｆｃ領域に結合されるＦａｂフラグメントを含むワンアーム抗体；ＣＨ３ドメインダイマーに結合された２つのＦａｂフラグメントを含む、ＣＨ２ドメイン欠失抗体（Ｇｌａｓｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５；２８０（５０）：４１４９４−５０３参照）；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体のシングルアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合フラグメント。例えば、Ｆａｂフラグメントは、抗体の重鎖のアミノ酸残基１〜２２２（ＥＵナンバリング）を含み得る；一方、Ｆａｂ’フラグメントは、抗体の重鎖のアミノ酸残基１〜２３６（ＥＵナンバリング）を含み得る。抗体のＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントは、組換えにより、または親抗体の酵素的消化によって、生成され得る。組換えにより生成されるＦａｂまたはＦａｂ’は、部位特異的結合のためにアミノ酸を導入するように操作され得、例えばシステイン（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８，２６，９２５）、ピロリン−カルボキシ−リジン（Ｏｕ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１１；１０８（２６）：１０４３７−４２）、または非天然アミノ酸（例えば、Ｔｉａｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１４，１１１，１７６６，Ａｘｕｐ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１２，１０９，１６１０１）がある。同様に、突然変異またはペプチドタグが、結合を促進するために、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５，２６，２５５４）、ホルミルグリシン形成酵素（Ｄｒａｋｅ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，２５，１３３１）、トランスグルタミナーゼ（Ｓｔｒｏｐ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３，２０，１６１）、ソルターゼ（Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ��Ｒ．；Ｈｅｌｌ，Ｔ．；Ｍｅｒｋｅｌ，Ａ．Ｓ．；Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ，Ｕ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１５，１０，ｅ０１３１１７７）、または他の酵素的結合戦略を介して加えられ得る。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いて、合成リンカーによって結合され得、これは、２つのドメインを、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として製造することを可能にする（単一鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３，１９８８参照）。そのような単鎖抗体もまた、用語「抗原結合フラグメント」内に包含されることが意図される。これらの抗原結合フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、そして当該フラグメントは、無傷の抗体であるのと同じ様式で、実用性の有無に関してスクリーニングされる。
【００７３】
抗体フラグメントまたは抗原結合フラグメントはまた、単一のドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖ中に組み込まれてもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６，２００５参照）。抗原結合フラグメントは、ポリペプチドに基づくスカフォールド、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）中に融合（ｇｒａｆｔｅｄ）されてよい（米国特許第６，７０３，１９９号明細書（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載）参照）。
【００７４】
抗体フラグメントまたは抗原結合フラグメントは、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子中に組み込まれてよく、これは、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２，１９９５；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００７５】
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ポリペプチドを指し、実質的に同じアミノ酸配列を有し、または同じ遺伝的源に由来する抗体および抗原結合フラグメントが挙げられる。当該用語はまた、単一の分子組成の抗体分子の調製物を含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００７６】
本明細書中で用いられる用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方が、ヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含有するならば、定常領域もまた、例えば、ヒト生殖細胞系配列、もしくはヒト生殖細胞系配列の突然変異バージョン、または、例えばＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００に記載されている、ヒトフレームワーク配列分析に由来する抗体含有コンセンサスフレームワーク配列のようなヒト配列に由来する。
【００７７】
本開示のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異、あるいは安定性または製造を促進する保存的置換）を含んでよい。
【００７８】
本明細書中で用いられる用語「認識する」は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、そのエピトープを見つけ出してそれと相互作用する（例えば結合する）ことを指し、当該エピトープは、直鎖状であるか立体配座的であるかは問わない。用語「エピトープ」は、本開示の抗体または抗原結合フラグメントが特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、隣接アミノ酸、またはタンパク質の三次折畳みによって並べられる非隣接アミノ酸の双方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露直後に保持されるが、三次折畳みによって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理直後に失われる。エピトープは典型的に、特有の空間的立体配座において少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体配座を判定する方法として、当該技術における技術、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴が挙げられる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照）。「パラトープ」は、抗原のエピトープを認識する抗体の部分である。
【００７９】
抗原（例えばタンパク質）と、抗体、抗体フラグメント、または抗体由来の結合剤との相互作用を説明する文脈において用いられる場合のフレーズ「特異的に結合する」または「選択的に結合する」は、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団における、例えば、生体サンプル、例えば、血液、血清、血漿、または組織サンプルにおける、抗原の存在で決定的となる結合反応を指す。ゆえに、指定された特定の免疫アッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、特定の抗原に、バックグラウンドの少なくとも２倍結合し、実質的に、サンプル中に存在する他の抗原に多量に結合しない。一態様において、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、特定の抗原に、バックグラウンドの少なくとも１０倍結合し、実質的に、サンプル中に存在する他の抗原に多量に結合しない。そのような条件下での抗体または結合剤への特異的な結合は、抗体または剤が、その、特定のタンパク質に対する特異性について、選択されていることを必要とする場合がある。所望され、または適切であるならば、この選択は、分子と交差反応する抗体を、他の種（例えば、マウスまたはラット）または他のサブタイプから取り去ることによって、達成され得る。これ以外にも、一部の態様において、特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体フラグメントが選択される。
【００８０】
本明細書中で用いられる用語「親和性」は、単一の抗原部位での抗体と抗原との相互作用の強度を指す。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、抗原と、多数の部位にて、弱い非共有結合力を介して相互作用する；相互作用が多いほど、親和性は強い。
【００８１】
用語「単離された抗体」は、抗原特異性が異なる他の抗体が実質的にない抗体を指す。しかしながら、ある抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原への交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞の物質および／または化学物質が実質的にない場合もある。
【００８２】
用語「対応するヒト生殖細胞系の配列」は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他の全ての知られている可変領域のアミノ酸配列との比較において判定された、参照可変領域のアミノ酸配列またはサブ配列との最も高いアミノ酸配列同一性を共有する、ヒト可変領域のアミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖細胞系の配列はまた、評価された他の全ての可変領域アミノ酸配列との比較において、参照可変領域のアミノ酸配列またはサブ配列とのアミノ酸配列同一性が最も高い、ヒト可変領域のアミノ酸配列またはサブ配列を指し得る。対応するヒト生殖細胞系の配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セグメント（先で定義される）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであってよい。配列同一性が、本明細書中に記載される方法を用いて判定され得、例えば、当該技術において知られているＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または別のアラインメントアルゴリズムを用いて２つの配列をアラインするものがある。対応するヒト生殖細胞系の核酸配列またはアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸配列またはアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。
【００８３】
種々の免疫アッセイフォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するのに用いられてよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するのにルーチン的に用いられる（特異的な免疫反応性を判定するのに用いられ得る免疫アッセイのフォーマットおよび条件の説明について、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９８）参照）。典型的には、特異的な、または選択的な結合反応が、シグナルを、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍生じさせることとなる。
【００８４】
用語「平衡解離定数（Ｋｄ［Ｍ］）」は、会合速度定数（ｋａ［ｓ−１，Ｍ−１］）で割った解離速度定数（ｋｄ［ｓ−１］）を指す。平衡解離定数は、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて測定され得る。本開示の抗体は通常、平衡解離定数が約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、一部の態様では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、または１０−１３Ｍ未満となるであろう。
【００８５】
用語「バイオアベイラビリティ」は、患者に投与される薬物の所定の量の全身的アベイラビリティ（すなわち血液／血漿レベル）を指す。バイオアベイラビリティは、投与された剤形から全身循環系に達する薬物の時間（速度）および総量（程度）の双方の測定値を示す絶対値である。
【００８６】
本明細書中で用いられるフレーズ「から本質的になる」は、方法または組成物中に含まれる活性薬剤の属または種、および当該方法または組成物の使用目的について不活性のあらゆる賦形剤を指す。一部の態様において、フレーズ「から本質的になる」は明示的に、本開示の抗体薬物結合体以外の１つ以上の追加の活性剤の包含を除外する。一部の態様において、フレーズ「から本質的になる」は明示的に、本開示の抗体薬物結合体および同時投与される第２の剤以外の１つ以上の追加の活性剤の包含を除外する。
【００８７】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、および非天然のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体、および天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸模擬物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝的コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα−炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模擬物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００８８】
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の双方に用いられる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同じ、もしくは本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸を、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同じ配列を指す。遺伝的コードの縮重によって、多数の機能的に同じ核酸が、所定のいずれかのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、コドンによってアラニンが特定される全ての位置にて、コドンは、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得、コードされるポリペプチドを変更することはない。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の一種である。また、ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列が、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外）が、機能的に同じ分子を産するように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が、記載される各配列内に潜在する。
【００８９】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミノ酸でアミノ酸を置換する、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失、または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表が、当該技術において周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、多型の変異体、異種間相同体、および対立遺伝子にも加えられ、これらを排除しない。以下の８つの群が、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。一部の態様において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に大きく影響を及ぼさない、またはこれを大きく変更しないアミノ酸修飾を指すのに用いられる。
【００９０】
本明細書中で用いられる用語「最適化された」は、産生細胞または産生生物、通常真核細胞、例えば、酵母細胞、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属細胞、真菌細胞、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好まれるコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変更されたヌクレオチド配列を指す。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている出発ヌクレオチド配列によって元々コードされるアミノ酸配列を完全に、または可能な限り保持するように操作されている。
【００９１】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「同じパーセント」または「パーセント同一性」は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じである程度を指す。２つの配列は、比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの配列が同じであるならば、「同じである」。２つの配列は、比較ウィンドウ、または指定された領域上で、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動のアラインメントおよび視覚による検査によって測定されて、最大一致について比較かつアラインされた場合に、アミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージが同じである（すなわち、特定の領域にわたって、または、特定されない場合には、配列全体にわたって、６０％の同一性、場合によっては６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）ならば、「実質的に同じである」。場合によっては、同一性は、長さが少なくとも約３０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域、より好ましくは長さが１００〜５００ヌクレオチドまたは１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、２００アミノ酸以上）である領域にわたって存在する。
【００９２】
配列比較について、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いて、試験配列および参照配列がコンピュータに入力されて、必要に応じて、サブ配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが用いられてもよいし、代替パラメータが指定されてもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００９３】
本明細書中で用いられる「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適にアラインされた後に、配列が、同じ数の隣接位置の参照配列と比較され得る、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに通常約１００〜約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列アラインメント方法が、当該技術において周知である。比較のための最適な配列アラインメントが、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ（１９７０）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化されたインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アラインメントおよび視覚による検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３参照）によって行われ得る。
【００９４】
パーセント配列同一性および配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの２つの例として、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから一般に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、高いスコアリング配列対（ＨＳＰ）を、クエリ配列中の長さＷのショートワードを特定することによって特定することを包含し、これは、データベース配列において同じ長さのワードとアラインされた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴにマッチし、またはこれを満たすものである。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。これらの最初の近隣ワードヒットは、これを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始させるシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアが、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチング残基についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを算出するのに用いられる。各方向におけるワードヒットの延長は、次の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ落ちた場合；累積スコアが、１つ以上の負の値のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して、ゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の端部に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を判定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の予想（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長、および１０の予想（Ｅ）、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予想（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を用いる。
【００９５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一尺度が、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間のマッチが偶然によって起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、参照配列に類似すると考える。
【００９６】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムを用いて（これは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている）、ＰＡＭ１２０加重残留表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いて判定され得る。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）アルゴリズムを用いて（これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）において、ＧＡＰプログラムに組み込まれている）、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて判定され得る。
【００９７】
先で注目された配列同一性のパーセンテージ以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同じであることの別の指標として、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記のように、免疫学的に、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して高められた抗体と交差反応性であることがある。ゆえに、ポリペプチドは典型的に、第２のポリペプチドと、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、実質的に同じである。２つの核酸配列が実質的に同じであることの別の指標として、下記のように、２つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることがある。２つの核酸配列が実質的に同じであることのさらに別の指標として、配列を増幅させるのに同じプライマーが用いられ得ることがある。
【００９８】
用語「核酸」は、本明細書中で、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に用いられ、一本鎖の形態または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。当該用語は、知られているヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含し、これらは、合成核酸、天然に存在する核酸、および天然に存在しない核酸であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。そのような類似体の例として、限定されないが、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラルメチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００９９】
特に明記されない限り、特定の核酸配列はまた、暗に、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列を包含する。具体的には、以下で詳述されるように、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【０１００】
核酸の文脈における用語「作動可能に結合される」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型例として、転写調節配列の、転写される配列との機能的関係を指す。例えば、プロモータまたはエンハンサ配列は、適切な宿主細胞または他の発現系において、コード配列の転写を刺激または調節するならば、コード配列に作動可能に結合されている。通常、転写される配列に作動可能に結合されるプロモータ転写調節配列は、転写される配列に物理的に隣接している、すなわちシス作用性である。しかしながら、一部の転写調節配列、例えばエンハンサは、転写を増強するコード配列に物理的に隣接する必要もないし、それに近接して位置決めされる必要もない。
【０１０１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに、本明細書中で互換的に用いられる。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模擬物であるアミノ酸ポリマーに、そして天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに用いられる。特に明記されない限り、特定のポリペプチド配列はまた、暗に、その保存的に修飾された変異体を包含する。
【０１０２】
本明細書中で用いられる用語「結合体」または「抗体薬物結合体」は、抗体またはその抗原結合フラグメントの、別の剤、例えば、化学療法剤、毒物、免疫療法剤、およびイメージングプローブとの結合を指す。結合は、共有結合、または非共有結合性の相互作用、例えば静電力を介するものがあり得る。当該技術において知られている種々のリンカーが、結合体を形成するのに使用され得る。加えて、結合体は、結合体をコードするポリヌクレオチドから発現され得る融合タンパク質の形態で提供され得る。本明細書中で用いられる「融合タンパク質」は、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドが挙げられる）を元々コードする２つ以上の遺伝子または遺伝子フラグメントの結合を介して生じたタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、機能特性が元の各タンパク質に由来する単一のタンパク質をもたらす。
【０１０３】
用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物として、全ての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が挙げられる。示される場合以外は、用語「患者」または「対象」は、本明細書中で互換的に用いられる。
【０１０４】
本明細書中で用いられる用語「毒物」、「細胞毒素」、または「細胞毒性剤」は、細胞の成長および増殖に有害であり、かつ細胞または悪性腫瘍を弱め、阻害し、または破壊するように作用し得るあらゆる剤を指す。
【０１０５】
本明細書中で用いられる用語「抗癌剤」は、細胞増殖障害、例えば癌を処置するのに用いられ得るあらゆる剤を指し、以下に限定されないが、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的抗癌剤、ならびに免疫療法剤が挙げられる。
【０１０６】
本明細書中で用いられる用語「薬物部分」または「ペイロード」は、抗体または抗原結合フラグメントに結合される化学部分を指し、あらゆる治療薬または診断薬、例えば、抗癌剤、抗炎症薬、抗感染薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）、または麻酔薬が挙げられ得る。特定の態様において、薬物部分は、Ｅｇ５インヒビタ、Ｖ−ＡＴＰアーゼインヒビタ、ＨＳＰ９０インヒビタ、ＩＡＰインヒビタ、ｍＴｏｒインヒビタ、微小管スタビライザ、微小管デスタビライザ、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外移行のインヒビタ、ＤＰＰＩＶインヒビタ、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応のインヒビタ、タンパク質合成インヒビタ、キナーゼインヒビタ、ＣＤＫ２インヒビタ、ＣＤＫ９インヒビタ、プロテアソームインヒビタ、キネシンインヒビタ、ＨＤＡＣインヒビタ、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡマイナーグルーブバインダ、ＲＮＡポリメラーゼインヒビタ、アマニチン、スプライセオソームインヒビタ、トポイソメラーゼインヒビタ、およびＤＨＦＲインヒビタから選択される。これらのそれぞれを、本開示の抗体および方法と適合するリンカーに取り付ける方法が、当該技術において知られている。例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．５２５，４４５−４５７参照。加えて、ペイロードは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プローブ、アフィニティプローブ、キレータ、分光学的プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体フラグメント、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖、または多糖であってよい。
【０１０７】
用語「癌」は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が、対象の体内で、元の腫瘍の部位以外の部位に移行しなかったもの）および続発性悪性腫瘍（例えば、転移（元の腫瘍の部位と異なる第２の部位への腫瘍細胞の移行）から生じたもの）を含む。
【０１０８】
用語「ｃＫＩＴ」（ＫＩＴ、ＰＢＴ、ＳＣＦＲ、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ１１７としても知られている）は、受容体チロシンキナーゼＩＩＩファミリのメンバであるチロシンキナーゼ受容体を指す。ヒトｃＫＩＴアイソフォームの核酸配列およびアミノ酸配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋにおいて以下の登録番号で公開されている：
ＮＭ＿０００２２２．２→ＮＰ＿０００２１３．１  肥満／幹細胞成長因子受容体キットアイソフォーム１前駆体；
ＮＭ＿００１０９３７７２．１→ＮＰ＿００１０８７２４１．１  肥満／幹細胞成長因子受容体キットアイソフォーム２前駆体。
構造的に、ｃＫＩＴ受容体は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメイン中にシグナルペプチド、５  Ｉｇ様Ｃ２ドメインを含有し、かつその細胞内ドメイン中にプロテインキナーゼドメインを有する。本明細書中で用いられる用語「ｃＫＩＴ」は、ｃＫＩＴタンパク質の天然に存在する全てのアイソフォームまたはその変異体をまとめて指すのに用いられる。
【０１０９】
用語「変異体」は、参照ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有し、または実質的に同じヌクレオチド配列によってコードされ、かつ参照ポリペプチドの１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。例えば、変異体は、参照ポリペプチドとの配列同一性が約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であり得る一方、参照ポリペプチドの１つ以上の活性を保持し得る。
【０１１０】
本明細書中で用いられる用語、いずれかの疾患または障害を「処置する」、「処置すること」、またはその「処置」は、一態様において、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患の進行、またはその臨床病徴の少なくとも１つを遅らせ、抑制し、または軽減すること）を指す。別の態様において、「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、患者によって識別され得ないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減または改善することを指す。さらに別の態様において、「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、物理的に（例えば、識別できる病徴の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメータの安定化）、または両方で、疾患または障害を調節することを指す。さらに別の態様において、「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、疾患または障害の発症または進行を予防し、または遅延させることを指す。
【０１１１】
用語「治療的に許容可能な量」または「治療的に有効な用量」は、互換的に、所望の結果（すなわち、腫瘍サイズの引下げ、腫瘍増殖の阻害、転移の予防、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫感染の阻害または予防）をもたらすのに十分な量を指す。一部の態様において、治療的に許容可能な量は、不所望の副作用を誘導も引起しもしない。治療的に許容可能な量は、最初に低い用量を投与してから、当該用量を、所望の効果が達成されるまで段々に増大させることによって、決定され得る。本開示の分子の「治療的に有効な投薬量」は、癌と関連する病徴が挙げられる病徴の発症を予防することができ、または病徴の重症度を軽減することができる。
【０１１２】
用語「同時投与」は、個人の血液中での２つの活性剤の同時の存在を指す。同時投与される活性剤は、同時に送達されても、順次送達されてもよい。
【０１１３】
本明細書中で用いられる用語「チオールマレイミド」は、チオールの、マレイミドとの反応によって形成される基を指し、以下の式を有する：
【化４】
2020504112.tif 000006
式中、ＹおよびＺは、チオールマレイミド結合を介して連結されることとなる基であり、リンカー成分、抗体、またはペイロードを含み得る。チオールマレイミドは、以下の開環構造体
【化５】
2020504112.tif 000007
を形成し得る。
【０１１４】
本明細書中で用いられる「切断可能な」は、結合基またはリンカー成分が、共有結合によって２つの部分を連結するが、生理的に適切な条件下で分解して、部分間の共有結合を切断することを指し、典型的には、切断可能な結合基は、細胞外よりも細胞内の環境においてインビボでより迅速に切断されて、ペイロードの放出を標的細胞の内側で選択的に起こす。切断は、酵素的であっても非酵素的であってもよいが、通常、抗体を分解させることなくペイロードを抗体から放出する。切断は、結合基またはリンカー成分の一部分を、ペイロードに取り付けたままにし得、または結合基のいかなる残基もなくペイロードを放出し得る。
【０１１５】
本明細書中で用いられる「切断可能でない」は、結合基またはリンカー成分が、生理学的条件下での分解に特に感受性でないことを指し、例えば結合基またはリンカー成分は、少なくとも、結合体の抗体または抗原結合フラグメント部分と同じくらい安定している。そのような結合基は時折、「安定している」と呼ばれ、これは、抗体または抗原結合フラグメントそれ自体が少なくとも部分的に分解される、すなわち、抗体または抗原結合フラグメントの分解が、インビボでの結合基の切断に先行するまで、ペイロードを抗体または抗原結合フラグメントに連結されたままで維持するほど、分解に対して十分に耐性を示すことを意味する。安定した、または切断可能でない結合基を有するＡＤＣの抗体部分の分解は、結合基の一部または全て、例えば、抗体由来の１つ以上のアミノ酸基を、インビボで送達されるペイロードまたは薬物部分に取り付けたままにし得る。
【０１１６】
リンカー−薬物部分（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）
一態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、リンカー（ＬＢ）に共有結合的に取り付けられた１つ以上の細胞毒素を含み、１つ以上の細胞毒素は、オーリスタチン、アマニチン、マイタンシノイド、およびサポリンから独立して選択される。
【０１１７】
別の態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、リンカー（ＬＢ）に共有結合的に取り付けられた１つ以上の細胞毒素を含み、１つ以上の細胞毒素は、オーリスタチンおよびアマニチンから独立して選択される。
【０１１８】
一態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、リンカー（ＬＢ）に共有結合的に取り付けられた１つ以上の細胞毒素を含み、リンカー（ＬＢ）は、切断可能なリンカーであり、１つ以上の細胞毒素は、オーリスタチン、アマニチン、マイタンシノイド、およびサポリンから独立して選択される。
【０１１９】
別の態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、リンカー（ＬＢ）に共有結合的に取り付けられた１つ以上の細胞毒素を含み、リンカー（ＬＢ）は、切断可能なリンカーであり、１つ以上の細胞毒素は、オーリスタチンおよびアマニチンから独立して選択される。
【０１２０】
一態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、リンカー（ＬＢ）に共有結合的に取り付けられた１つ以上の細胞毒素を含み、リンカー（ＬＢ）は、切断可能でないリンカーであり、１つ以上の細胞毒素は、オーリスタチン、アマニチン、マイタンシノイド、およびサポリンから独立して選択される。
【０１２１】
別の態様において、薬物部分（Ｄ）は、サポリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ブリオジン１、ボウガニン、ゲロニン、リシン、アブリン、ヤドリギレクチン、モデシン、ヴォルケンシン、アスパリン（ａｓｐａｒｉｎ）、モモルジン、エブリン（ｅｂｕｌｉｎ）、ビスキュミン、志賀毒素、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属外毒素（ＰＥ）から選択されるタンパク質毒素である。そのようなタンパク質毒素は、リボソームを不活化することによって、または伸長因子２（ＥＦ２）機能に干渉することによってタンパク質合成を阻害することによって、細胞を死滅させることができる（Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００６；８（３）Ａｒｔｉｃｌｅ  ６３；Ｇａｄａｄｈａｒ  ａｎｄ  Ｋａｒａｎｄｅ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｏｆ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ  １−３１参照）。一部の実施形態において、タンパク質毒素は、サポリンである。そのようなタンパク質毒素は、切断可能なリンカー（ＬＢ）または切断可能でないリンカー（ＬＢ）に、共有結合的に取り付けられ得る。
【０１２２】
別の態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、リンカー（ＬＢ）に共有結合的に取り付けられた１つ以上の細胞毒素を含み、リンカー（ＬＢ）は、切断可能でないリンカーであり、１つ以上の細胞毒素は、オーリスタチンまたはアマニチンから独立して選択される。
【０１２３】
一態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、式（Ａ）の構造を有する化合物、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容可能な塩であり、
【化６】
2020504112.tif 000008
式中：
Ｒ１は、
【化７】
2020504112.tif 000009
であり、Ｒ３は、−ＯＨであり；
または
Ｒ１は、
【化８】
2020504112.tif 000010
であり、Ｒ３は、−Ｌ５Ｒ１４であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−Ｌ１Ｒ１４、−Ｌ２Ｒ２４、−Ｌ２Ｒ３４、または−Ｌ３Ｒ４４であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ２は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ３は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ７）２−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化９】
2020504112.tif 000011
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１０】
2020504112.tif 000012
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ３は、
【化１１】
2020504112.tif 000013
であり；
Ｘ４は、
【化１２】
2020504112.tif 000014
であり；
Ｒ１４は、
【化１３】
2020504112.tif 000015
−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、ＳＨ、−ＳＳＲ１３、−Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、
【化１４】
2020504112.tif 000016
−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化１５】
2020504112.tif 000017
【化１６】
2020504112.tif 000018
であり；
Ｒ２４は、
【化１７】
2020504112.tif 000019
であり；
Ｒ３４は、−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化１８】
2020504112.tif 000020
であり；
Ｒ４４は、
【化１９】
2020504112.tif 000021
または−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｒ８であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
Ｒ８は、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＨＲ９ＮＨ２であり；
Ｒ９は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ７であり；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
Ｒ１３は、２−ピリジルまたは４−ピリジルであり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１２４】
別の態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、式（Ｂ）の構造を有する化合物、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容可能な塩であり、
【化２０】
2020504112.tif 000022
式中：
Ｒ５４は、−Ｌ６Ｒ１４、−Ｌ７Ｒ２４、−Ｌ７Ｒ３４、または−Ｌ８Ｒ４４であり；
Ｘは、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）２、またはＳであり；
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＤ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、または−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ７は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、または−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ８は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、または−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化２１】
2020504112.tif 000023
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化２２】
2020504112.tif 000024
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ１４は、
【化２３】
2020504112.tif 000025
−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、ＳＨ、−ＳＳＲ１３、−Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、
【化２４】
2020504112.tif 000026
−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化２５】
2020504112.tif 000027
【化２６】
2020504112.tif 000028
であり；
Ｒ２４は、
【化２７】
2020504112.tif 000029
であり；
Ｒ３４は、−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化２８】
2020504112.tif 000030
であり；
Ｒ４４は、
【化２９】
2020504112.tif 000031
または−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｒ８であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
Ｒ８は、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＨＲ９ＮＨ２であり；
Ｒ９は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ７であり；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
Ｒ１３は、２−ピリジルまたは４−ピリジルであり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１２５】
本発明のリンカー−薬物部分の特定の態様および例が、追加の、列挙される実施形態の以下のリストに記載される。各実施形態において特定された特徴が、他の特定された特徴と組み合わされて、本発明の更なる実施形態が提供され得ることが認識されよう。
【０１２６】
実施形態１．式（Ａ−１）の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する、式（Ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化３０】
2020504112.tif 000032
式中：Ｒ４は、先で定義された通りである。
【０１２７】
実施形態２．式（Ａ−２）もしくは式（Ａ−３）の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する、式（Ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化３１】
2020504112.tif 000033
式中：Ｌ５およびＲ１４は、先で定義された通りである。
【０１２８】
実施形態３．式（Ａ−１ａ）の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する、式（Ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化３２】
2020504112.tif 000034
式中：Ｒ４は、先で定義された通りである。
【０１２９】
実施形態４．式（Ａ−２ａ）もしくは式（Ａ−３ａ）の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する、式（Ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化３３】
2020504112.tif 000035
式中：Ｌ５およびＲ１４は、先で定義された通りである。
【０１３０】
実施形態５．式（Ａ）、式（Ａ−１）、もしくは式（Ａ−１ａ）、の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、
式中：
Ｒ４は、−Ｌ１Ｒ１４、−Ｌ２Ｒ２４、−Ｌ２Ｒ３４、または−Ｌ３Ｒ４４であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ２は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ３は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は
【化３４】
2020504112.tif 000036
であり、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は
【化３５】
2020504112.tif 000037
であり、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ３は
【化３６】
2020504112.tif 000038
であり；
Ｘ４は
【化３７】
2020504112.tif 000039
であり；
Ｒ１４は、
【化３８】
2020504112.tif 000040
−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、ＳＨ、−Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、
【化３９】
2020504112.tif 000041
−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化４０】
2020504112.tif 000042
【化４１】
2020504112.tif 000043
であり；
Ｒ２４は、
【化４２】
2020504112.tif 000044
であり；
Ｒ３４は、−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化４３】
2020504112.tif 000045
であり；
Ｒ４４は、
【化４４】
2020504112.tif 000046
または−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｒ８であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
Ｒ８は、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＨＲ９ＮＨ２であり；
Ｒ９は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ７であり；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌおよび−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１３１】
実施形態６．式（Ａ）、式（Ａ−２）、式（Ａ−３）、式（Ａ−２ａ）、もしくは式（Ａ−３ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、
式中：
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化４５】
2020504112.tif 000047
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化４６】
2020504112.tif 000048
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ１４は、
【化４７】
2020504112.tif 000049
−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、ＳＨ、−Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、
【化４８】
2020504112.tif 000050
−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化４９】
2020504112.tif 000051
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１３２】
実施形態７．式（Ａ）、式（Ａ−１）、もしくは式（Ａ−１ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、式中：
Ｒ４は、−Ｌ１Ｒ１４であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４であり；
Ｘ１は、
【化５０】
2020504112.tif 000052
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ１４は、
【化５１】
2020504112.tif 000053
−ＯＮＨ２、
【化５２】
2020504112.tif 000054
であり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１３３】
実施形態８．式（Ａ）、式（Ａ−２）、式（Ａ−３）、式（Ａ−２ａ）、もしくは式（Ａ−３ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、式中：
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４であり；
Ｘ１は、
【化５３】
2020504112.tif 000055
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ１４は、
【化５４】
2020504112.tif 000056
−ＯＮＨ２、
【化５５】
2020504112.tif 000057
であり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１３４】
実施形態９．以下から選択される式（Ａ）の化合物：
【化５６】
2020504112.tif 000058
【０１３５】
実施形態１０．式（Ｂ−１）の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する、式（Ｂ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化５７】
2020504112.tif 000059
式中：Ｒ５４、Ｒ５、およびＲ６は、先で定義された通りである。
【０１３６】
実施形態１１．式（Ｂ−１ａ）の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する、式（Ｂ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化５８】
2020504112.tif 000060
式中：Ｒ５４、Ｒ５、およびＲ６は、先で定義された通りである。
【０１３７】
実施形態１２．式（Ｂ）、式（Ｂ−１）、もしくは式（Ｂ−１ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、
式中：Ｒ５４は、−Ｌ６Ｒ１４、−Ｌ７Ｒ２４、−Ｌ７Ｒ３４、または−Ｌ８Ｒ４４であり；
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＤ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ７は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ８は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化５９】
2020504112.tif 000061
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化６０】
2020504112.tif 000062
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ１４は、
【化６１】
2020504112.tif 000063
−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、ＳＨ、−Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２（ＣＨ＝ＣＨ２）、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｉ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、
【化６２】
2020504112.tif 000064
−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化６３】
2020504112.tif 000065
であり；
Ｒ２４は、
【化６４】
2020504112.tif 000066
であり；
Ｒ３４は、−Ｎ３、−ＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、
【化６５】
2020504112.tif 000067
であり；
Ｒ４４は、
【化６６】
2020504112.tif 000068
または−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｒ８であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
Ｒ８は、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＨＲ９ＮＨ２であり；
Ｒ９は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ７であり；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１３８】
実施形態１３．式（Ｂ）、式（Ｂ−１）、もしくは式（Ｂ−１ａ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、式中：
Ｒ５４は、−Ｌ６Ｒ１４であり；
Ｒ５は、−ＣＨ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２であり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化６７】
2020504112.tif 000069
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ１４は、
【化６８】
2020504112.tif 000070
−ＯＮＨ２、
【化６９】
2020504112.tif 000071
であり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１３９】
実施形態１４．以下から選択される式（Ｂ）の化合物：
【化７０】
2020504112.tif 000072
【０１４０】
別の態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、以下から選択される：
【化７１】
2020504112.tif 000073
【０１４１】
別の態様において、本発明のリンカー−薬物部分は、以下から選択される：
【化７２】
2020504112.tif 000074
【０１４２】
抗体薬物結合体
本開示は、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）が、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている抗体薬物結合体を提供する。一態様において、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、リンカーによる共有結合的取付けを介して、細胞毒性剤である薬物部分に結合される。
【０１４３】
抗体薬物結合体は、細胞毒性剤を、ｃＫＩＴ、例えば造血幹細胞を発現する細胞に選択的に送達することによって、患者、例えば造血幹細胞移植レシピエントにおいて当該細胞を選択的に除去することができる。好ましくは、ｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、半減期が短くて、患者の循環系から一掃されることとなるので、造血幹細胞移植前の、造血幹細胞移植レシピエントのコンディション調整に用いられ得る。
【０１４４】
一部の実施形態において、本明細書中で開示されるｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、肥満細胞脱顆粒を誘導する能力が引き下げられるように修飾される。例えば、本明細書中で開示されるｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、完全長ｃＫＩＴ抗体、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦ（ａｂ）２フラグメント、またはそれらの結合体と比較して、肥満細胞脱顆粒を誘導する能力が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％引き下げられるように修飾される。一部の実施形態において、本明細書中で開示されるｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、抗ｃＫＩＴ  ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを含んでよい。一部の実施形態において、本明細書中で開示される抗ｃＫＩＴ抗体薬物結合体は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、肥満細胞脱顆粒を誘導する活性が最小であり得、例えば、ベータ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイにおいて、ベースライン補正されたＯ．Ｄ．読出しが、０．２５未満、例えば、０．２未満、０．１５未満、または０．１未満であり得る。
【０１４５】
一部の実施形態において、本明細書中で提供されるのは、薬物部分（例えば細胞毒性剤）に、場合によってはリンカーを介して結合されている、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）（抗ｃＫＩＴ  ＦａｂまたはＦａｂ’）を含む結合体である。本明細書中に記載されるように、そのような抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’またはＦａｂ−毒物結合体は、ヒトＨＳＣ細胞をインビトロかつインビボで除去することができる一方、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、肥満細胞脱顆粒を引き起こさない。
【０１４６】
一態様において、本開示は、式（Ｉ）の結合体を提供し：
Ａ−（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）ｙ  式（Ｉ）；
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）であり；
ＬＢは、リンカーであり；
Ｄは、細胞毒性剤であり；
ｎは、１から１０の整数であり、
ｙは、１から１０の整数であり、
リンカー−薬物部分（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）は、抗体フラグメント（Ａ）に共有結合的に取り付けられている。
【０１４７】
一態様において、本開示は、式（ＩＩ）の結合体に関し：
【化７３】
2020504112.tif 000075
Ａ１は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）または鎖（例えば、ＨＣまたはＬＣ）であり；
Ａ２は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）または鎖（例えば、ＨＣまたはＬＣ）であり；
ＬＢは、リンカーであり；
Ｄは、細胞毒性剤であり、
ｎは、１から１０の整数であり、
リンカー−薬物部分（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）は、抗体フラグメントＡ１およびＡ２を共有結合的に連結する。
【０１４８】
一態様において、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の結合体中の１つ以上の薬物部分、Ｄは、オーリスタチン、アマニチン、マイタンシノイド、およびサポリンから独立して選択される。
【０１４９】
別の態様において、式（Ｉ）の結合体中の１つ以上の薬物部分、Ｄは、オーリスタチンおよびアマニチンから独立して選択される。
【０１５０】
式（Ｉ）の結合体において、１つ以上のリンカー−薬物部分（ＬＢ−（Ｄ）ｎ）は、抗体フラグメントＡ（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）に共有結合的に取り付けられることによって、１つ以上の薬物部分Ｄが、抗体フラグメントＡ（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）に、リンカーＬＢを介して共有結合的に取り付けられ得る。ＬＢは、抗体フラグメントＡ（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を、１つ以上の薬物部分Ｄに結合することができるあらゆる化学部分である。１つ以上の薬物部分Ｄが抗体フラグメントＡ（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）に共有結合されている式（Ｉ）の結合体は、同じ、または異なる１つ以上の反応性官能基を有する二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬を用いて形成され得る。二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬の反応性官能基の１つが用いられて、抗体フラグメントＡ上の基、一例として、チオールまたはアミン（例えば、システイン、Ｎ末端またはアミノ酸側鎖、例えばリジン）と反応して、リンカーＬＢの一端部との共有結合を形成する。二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬のそのような反応性官能基として、以下に限定されないが、マレイミド、チオール、およびＮＨＳエステルが挙げられる。二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬の他の反応性官能基が用いられて、１つ以上の薬物部分ＤがリンカーＬＢに共有結合的に取り付けられる。
【０１５１】
式（ＩＩ）の結合体において、抗体フラグメントＡ１およびＡ２上のペンダントチオール、ならびに１，３−ジハロアセトン、例えば１，３−ジクロロアセトン、１，３−ジブロモアセトン、１，３−ジヨードアセトン、および１，３−ジヒドロキシアセトンのビススルホン酸エステルの反応によってケトン架橋が形成されることによって、抗体フラグメントＡ１およびＡ２が共有結合的に連結される。このケトン架橋部分は、１つ以上の薬物部分Ｄを、リンカーＬＢを介して抗体フラグメントＡ１およびＡ２に共有結合的に取り付けるのに用いられる。ＬＢは、抗体フラグメントＡ１およびＡ２を、１つ以上の薬物部分Ｄに結合することができるあらゆる化学部分である。１つ以上の薬物部分Ｄが抗体フラグメントＡ１およびＡ２に共有結合されている式（ＩＩ）の結合体は、同じ、または異なる１つ以上の反応性官能基を有する二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬を用いて形成され得る。一実施形態において、二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬の反応性官能基の１つが、アルコキシアミンであり、これは、ケトン架橋と反応してリンカーＬＢの一端部とのオキシム結合を形成するのに用いられ、そして二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬の他の反応性官能基が用いられて、１つ以上の薬物部分ＤがリンカーＬＢに共有結合的に取り付けられる。別の実施形態において、二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬の反応性官能基の１つが、ヒドラジンであり、これが、ケトン架橋と反応してリンカーＬＢの一端部とのヒドラゾン結合を形成するのに用いられ、そして二機能リンカー試薬または多機能リンカー試薬の他の反応性官能基が用いられて、１つ以上の薬物部分ＤがリンカーＬＢに共有結合的に取り付けられる。
【０１５２】
一態様において、ＬＢは、切断可能なリンカーである。別の態様において、ＬＢは、切断可能でないリンカーである。一部の態様において、ＬＢは、酸に不安定なリンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼ切断可能リンカー、エステラーゼ切断可能リンカー、グリコシダーゼ切断可能リンカー、ホスホジエステラーゼ切断可能リンカー、ジスルフィド結合還元可能リンカー、親水性リンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーである。
【０１５３】
別の態様において、薬物部分（Ｄ）は、サポリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ブリオジン１、ボウガニン、ゲロニン、リシン、アブリン、ヤドリギレクチン、モデシン、ヴォルケンシン、アスパリン、モモルジン、エブリン、ビスキュミン、志賀毒素、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属外毒素（ＰＥ）から選択されるタンパク質毒素である。そのようなタンパク質毒素は、リボソームを不活化することによって、または伸長因子２（ＥＦ２）機能に干渉することによってタンパク質合成を阻害することによって、細胞を死滅させることができる（Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００６；８（３）Ａｒｔｉｃｌｅ  ６３；Ｇａｄａｄｈａｒ  ａｎｄ  Ｋａｒａｎｄｅ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｏｆ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ  １−３１参照）。一部の実施形態において、タンパク質毒素は、サポリンである。タンパク質毒素は、切断可能なリンカー（ＬＢ）または切断可能でないリンカー（ＬＢ）を介して、抗ｃＫＩＴ抗体フラグメント（Ａ）に共有結合的に取り付けられ得る。一部の実施形態において、タンパク質毒素は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を介して抗ｃＫＩＴ抗体フラグメントに結合される。
【０１５４】
薬物対抗体比は、特定の結合体分子について、正確な整数値（例えば、式（Ｉ）中のｎおよびｙの積、ならびに式（ＩＩ）中のｎ）を有する一方、値は多くの場合、典型的には結合工程と関連する、幾らかの不均質性に起因して、多くの分子を含有するサンプルを説明するのに用いられる場合の平均値になろうことが理解される。結合体のサンプルについての平均ローディングは、本明細書中で、薬物対抗体（またはＦａｂ’）比、または「ＤＡＲ」と呼ばれる。一部の態様において、ＤＡＲは、約１〜約５、典型的には約１、２、３、または４である。一部の態様において、サンプルの少なくとも５０重量％が、平均ＤＡＲプラスマイナス２を有する化合物であり、好ましくは、サンプルの少なくとも５０％が、平均ＤＡＲプラスマイナス１を含有する結合体である。他の態様は、ＤＡＲが約２である結合体を含む。一部の態様において、「約ｙ」のＤＡＲは、ＤＡＲについて測定された値が、式（Ｉ）中のｎおよびｙの積の２０％以内であることを意味する。一部の態様において、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲについて測定された値が、式（ＩＩ）中のｎの２０％以内であることを意味する。
【０１５５】
一態様において、式（Ｉ）の結合体中の薬物の、抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦａｂ’）に対する平均モル比（すなわち、薬物対抗体比（ＤＡＲ）としても知られている、ｎおよびｙの積の平均値）は、約１〜約１０、約１〜約６（例えば、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０）、約１〜約５、約１．５〜約４．５、または約２〜約４である。
【０１５６】
一態様において、式（ＩＩ）の結合体中の薬物の、抗体フラグメントＡ１およびＡ２に対する平均モル比（すなわち、薬物対抗体比（ＤＡＲ）としても知られている、ｎの平均値）は、約１〜約１０、約１〜約６、（例えば、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０）、約１〜約５、約１．５〜約４．５、または約２〜約４である。
【０１５７】
本開示によって提供される一態様において、結合体は、実質的に高い純度を有し、以下の特徴の１つ以上を有する：（ａ）結合体種の約９０％超（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上）、好ましくは約９５％超が、単量体である、（ｂ）結合体調製物中の非結合型リンカーレベルが、約１０％未満（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％以下）（総リンカーに対して）である、（ｃ）結合体種の１０％未満が架橋されている（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％以下）、（ｄ）結合体調製物中の遊離型薬物（例えば、オーリスタチン、アマニチン、マイタンシノイド、またはサポリン）レベルが、約２％未満（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、または０％以下）（総細胞毒性剤に対してｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
【０１５８】
一態様において、本発明の結合体は、式（Ｃ）の構造を有し：
【化７４】
2020504112.tif 000076
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化７５】
2020504112.tif 000077
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化７６】
2020504112.tif 000078
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ３は、
【化７７】
2020504112.tif 000079
であり；
Ｘ４は、
【化７８】
2020504112.tif 000080
であり；
Ｒ４０は、
【化７９】
2020504112.tif 000081
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化８０】
2020504112.tif 000082
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＨ３、およびフェニルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１５９】
別の態様において、本発明の結合体は、式（Ｄ）の構造を有し：
【化８１】
2020504112.tif 000083
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ１は、
【化８２】
2020504112.tif 000084
であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ７）２−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＸ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化８３】
2020504112.tif 000085
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化８４】
2020504112.tif 000086
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ３は、
【化８５】
2020504112.tif 000087
であり；
Ｘ４は、
【化８６】
2020504112.tif 000088
であり；
Ｒ４０は、
【化８７】
2020504112.tif 000089
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化８８】
2020504112.tif 000090
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＨ３、およびフェニルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１６０】
別の態様において、本発明の結合体は、式（Ｅ）の構造を有し：
【化８９】
2020504112.tif 000091
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｘは、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）２、またはＳであり；
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＤ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＸ１（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐＣＨ２）ｍＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２−、または−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ７）２ＳＳ（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化９０】
2020504112.tif 000092
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化９１】
2020504112.tif 000093
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化９２】
2020504112.tif 000094
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化９３】
2020504112.tif 000095
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＨ３、およびフェニルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１６１】
本発明の結合体の特定の態様および例が、追加の、列挙される実施形態の以下のリストに記載される。各実施形態において特定された特徴が、他の特定された特徴と組み合わされて、本発明の更なる実施形態が提供され得ることが認識されよう。
【０１６２】
実施形態１５．式（Ｃ）の構造を有する結合体は、（Ｃ−１）の構造を有する結合体であり：
【化９４】
2020504112.tif 000096
式中：Ａ、ｙ、およびＬ２０は、先で定義された通りである。
【０１６３】
実施形態１６．式（Ｃ）または式（Ｃ−１）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｘ４Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−、−Ｘ３Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化９５】
2020504112.tif 000097
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化９６】
2020504112.tif 000098
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ３は、
【化９７】
2020504112.tif 000099
であり；
Ｘ４は、
【化９８】
2020504112.tif 000100
であり；
Ｒ４０は、
【化９９】
2020504112.tif 000101
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１００】
2020504112.tif 000102
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１６４】
実施形態１７．式（Ｃ）または式（Ｃ−１）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化１０１】
2020504112.tif 000103
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１０２】
2020504112.tif 000104
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１０３】
2020504112.tif 000105
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１０４】
2020504112.tif 000106
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１６５】
実施形態１８．式（Ｃ）または式（Ｃ−１）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；
Ｌ１は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化１０５】
2020504112.tif 000107
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１０６】
2020504112.tif 000108
であり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１６６】
実施形態１９．以下から選択される式（Ｃ）または式（Ｃ−１）の構造を有する結合体：
【化１０７】
2020504112.tif 000109
【０１６７】
実施形態２０．式（Ｄ）の構造を有する結合体は、式（Ｄ−１）または式（Ｄ−２）の構造を有する結合体であり：
【化１０８】
2020504112.tif 000110
式中：Ａ、ｙ、およびＬ３０は、先で定義された通りである。
【０１６８】
実施形態２１．式（Ｄ）の構造を有する結合体は、式（Ｄ−１ａ）または式（Ｄ−２ａ）の構造を有する結合体である：
【化１０９】
2020504112.tif 000111
式中：Ａ、ｙ、およびＬ３０は、先で定義された通りである。
【０１６９】
実施形態２２．式（Ｄ）、式（Ｄ−１）、式（Ｄ−２）、式（Ｄ−１ａ）、または式（Ｄ−２ａ）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化１１０】
2020504112.tif 000112
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１１１】
2020504112.tif 000113
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１１２】
2020504112.tif 000114
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１１３】
2020504112.tif 000115
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１７０】
実施形態２３．式（Ｄ）、式（Ｄ−１）、式（Ｄ−２）、式（Ｄ−１ａ）、または式（Ｄ−２ａ）の構造を有する結合体：
式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｘ１は、
【化１１４】
2020504112.tif 000116
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１１５】
2020504112.tif 000117
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１１６】
2020504112.tif 000118
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１１７】
2020504112.tif 000119
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１７１】
実施形態２４．式（Ｄ）、式（Ｄ−１）、式（Ｄ−２）、式（Ｄ−１ａ）、または式（Ｄ−２ａ）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｌ５は、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４であり；
Ｘ１は、
【化１１８】
2020504112.tif 000120
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１１９】
2020504112.tif 000121
であり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１７２】
実施形態２５．以下から選択される式（Ｄ）、式（Ｄ−１）、式（Ｄ−２）、式（Ｄ−１ａ）、または式（Ｄ−２ａ）の構造を有する結合体：
【化１２０】
2020504112.tif 000122
【０１７３】
実施形態２６．式（Ｅ）の構造を有する結合体は、式（Ｅ−１）の構造を有する結合体である：
【化１２１】
2020504112.tif 000123
式中：Ａ、ｙ、Ｒ５、Ｒ６、およびＬ４０は、先で定義された通りである。
【０１７４】
実施形態２７．式（Ｅ）の構造を有する結合体は、式（Ｅ−１ａ）の構造を有する結合体であり：
【化１２２】
2020504112.tif 000124
式中：Ａ、ｙ、Ｒ５、Ｒ６、およびＬ４０は、先で定義された通りである。
【０１７５】
実施形態２８．式（Ｅ）、式（Ｅ−１）、または式（Ｅ−１ａ）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＤ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化１２３】
2020504112.tif 000125
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１２４】
2020504112.tif 000126
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１２５】
2020504112.tif 000127
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１２６】
2020504112.tif 000128
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１７６】
実施形態２９．式（Ｅ）、式（Ｅ−１）、または式（Ｅ−１ａ）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ３、または−ＣＤ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化１２７】
2020504112.tif 000129
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｘ２は、
【化１２８】
2020504112.tif 000130
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１２９】
2020504112.tif 000131
−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＲ７Ｓ（＝Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２、−ＮＲ７Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｓ−、
【化１３０】
2020504112.tif 000132
であり；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２、および−ＯＨから独立して選択され；
各Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されたＣ１〜４アルキルから独立して選択され；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１７７】
実施形態３０．式（Ｅ）、式（Ｅ−１）、または式（Ｅ−１ａ）の構造を有する結合体、式中：
Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数であり；
Ｒ５は、−ＣＨ３であり；
Ｒ６は、−ＮＨ２であり；
Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；
Ｌ６は、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍ、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ１Ｌ４−、−Ｌ４ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（（ＣＨ２）ｍＯ）ｐ（ＣＨ２）ｍＸ２Ｌ４−、または−（ＣＨ２）ｍ−であり；
Ｌ４は、−（（ＣＨ２）ｍであり；
Ｘ１は、
【化１３１】
2020504112.tif 000133
であり、式中、＊は、Ｌ４に対する付着点を示し；
Ｒ４０は、
【化１３２】
2020504112.tif 000134
であり；
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から独立して選択され、
各ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４から独立して選択される。
【０１７８】
実施形態３１．以下から選択される式（Ｅ）、式（Ｅ−１）、または式（Ｅ−１ａ）の構造を有する結合体：
【化１３３】
2020504112.tif 000135
【化１３４】
2020504112.tif 000136
【０１７９】
本発明の抗体薬物結合体の別の態様が、以下から選択される：
【化１３５】
2020504112.tif 000137
【化１３６】
2020504112.tif 000138
【化１３７】
2020504112.tif 000139
式中、Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数である。
【０１８０】
本発明の抗体薬物結合体の別の態様が、以下から選択される：
【化１３８】
2020504112.tif 000140
【化１３９】
2020504112.tif 000141
式中、Ａは、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を表し；
ｙは、１から１０の整数である。
【０１８１】
例示的なリンカー−薬物化合物の合成
実施例１：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパノイル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（Ｃ１）の合成
【化１４０】
2020504112.tif 000142
工程１：ＢｏｃＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＯＨ（１．００ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）の０℃のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．６７７ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）および１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）（０．７３１ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）を加えた。次に、生じた溶液を、５分間撹拌して、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルＨＣｌ塩（０．３７７ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２２６ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）の０℃のＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を室温に温めて、さらに３０分間撹拌してから濃縮した。残留物を、ＩＳＣＯ系、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製して、２０〜９０％アセトニトリル水で溶出して、ＢｏｃＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＰｈｅＯＭｅを得た：ＭＳ  ｍ／ｚ  ７３３．４（Ｍ＋１）；保持時間  １．４７分間．
【０１８２】
工程２：工程１で得たＢｏｃＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＰｈｅＯＭｅ（０．６８３ｇ、０．９３２ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液に、ＨＣｌ（１，４−ジオキサン中４Ｎ、１６ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温にて７時間撹拌して、濃縮した。残留物をジオキサン中に溶解させて、凍結乾燥させてＶａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＰｈｅＯＭｅ  ＨＣｌ塩を得た：ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３３．４（Ｍ＋１）；保持時間  ０．９６分間．
【０１８３】
工程３：（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボン酸（１２．６ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を、１５ｍｌ丸底フラスコ内でＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解させた。ＤＩＥＡ（１２．３ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１９ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌して、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＰｈｅＯＭｅ  ＨＣｌ塩（３０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌した。ＬＣＭＳ分析により、反応が完了したことが示され、生じた混合物を、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製して、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する２０〜９０％アセトニトリル−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分をプールして濃縮して、（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−（（（Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソへプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボキシレートを得た：ＭＳ  ｍ／ｚ  ８５６．６（Ｍ＋１）；保持時間  １．６７分間．
【０１８４】
工程４：工程３で得た生成物を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２．０ｍＬ）中に溶解させて、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）で処理した。反応混合物を、室温にて１時間撹拌した。ＬＣＭＳ分析により、反応が完了したことが示された。反応混合物を、ロータリエバポレータによって濃縮して、（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノアートがＴＦＡ塩として得られた：ＭＳ  ｍ／ｚ  ７５６．６（Ｍ＋１）；保持時間  １．２２分間．
【０１８５】
工程５：２５ｍＬ丸底フラスコ内に、（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノアートＴＦＡ塩（３８．４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）、ＬｉＯＨ一水和物（５０．０ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）、およびＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（２：１、４．０ｍＬ）の溶媒混合物を加えた。混合物を、室温にて６０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析により、反応が完了したことが示された。反応混合物を濃縮して、逆相ＨＰＬＣ、Ｃ１８カラムによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有するアセトニトリル−Ｈ２Ｏ（１０〜７０％）で溶出した。所望の生成物を含有する画分を組み合わせて濃縮して、（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸がＴＦＡ塩として得られた、ＭＳ  ｍ／ｚ  ７４２．５（Ｍ＋１）．保持時間  １．１５分間．
【０１８６】
工程６：３−（２−（マレイミド）エトキシ）プロパン酸（２．２ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、ＨＡＴＵ（３．７ｍｇ、０．００９８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３．６ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を５分間撹拌してから、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）中（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（８ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌してから濃縮して、分取用ＨＰＬＣ（０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜６０％アセトニトリル−Ｈ２Ｏ）によって精製して、（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）プロパノイル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（Ｃ１）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９３７．５（Ｍ＋Ｈ）．保持時間  １．１３８ｍｉｎ．
【０１８７】
実施例２：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（Ｃ２）
【化１４１】
2020504112.tif 000143
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（２）を、実施例１の方法に従って製造したが、工程６において、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（ＥＭＣＡ）（１．２ｍｇ、０．００５８ｍｍｏｌ）を、３−（２−（マレイミド）エトキシ）プロパン酸の代わりに用いたことを除く。（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（２）ＭＳ  ｍ／ｚ  ９３５．６（Ｍ＋１）．保持時間  １．１７分間．
【０１８８】
実施例３：（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）プロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−メチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド（Ｃ３）
【化１４２】
2020504112.tif 000144
工程１：アジ化ナトリウム（３．５０ｇ、５３．８ｍｍｏｌ）の撹拌水（２５ｍＬ）溶液に、１，３−プロパンスルホン（６．１０ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温にて２４時間撹拌して、濃縮して乾燥させた。生じた固形物をジエチルエーテル（１００ｍＬ）中に懸濁させて、１時間還流させながら撹拌した。懸濁液を室温に冷却して、固形物を濾過によって収集して、アセトンおよびジエチルエーテルで洗浄して、減圧下で乾燥させて、３−アジド−１−プロパンスルホン酸が得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  １８８．１（Ｍ＋１）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ３．４７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０７−２．００（ｍ，２Ｈ）．
【０１８９】
工程２：３−アジド−１−プロパンスルホン酸（２．０７ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を、トルエン中に懸濁させた。ＰＣｌ５（２．６１ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、３時間還流させながら加熱した。反応混合物を室温に冷却して、濾過して不溶物を取り出した。濾過ケーキを、ＤＣＭで洗浄した。組み合わせた濾液を濃縮して、３−アジドプロパン−１−スルホニルクロリドが暗黄色の油として得られ、これを、さらに精製することなく次の工程に用いた。
【０１９０】
工程３：０℃に冷却したＮＨ４ＯＨ（５ｍＬ）に、３−アジドプロパン−１−スルホニルクロリド（１．７５ｇ、９．５３ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、反応混合物を室温に温めて、同じ温度にて３時間撹拌した。油性の混合物が澄明になった。反応混合物をＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相をブラインで洗浄して、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濃縮した。残留溶媒をさらに、高減圧下で１８時間除去して、３−アジドプロパン−１−スルホンアミドが得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  １８７．１（Ｍ＋１）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ４．８３（ｓ，２Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１７−２．１０（ｍ，２Ｈ）．
【０１９１】
工程４：（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−フェニルプロパン酸（１００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解させてから、ＤＩＥＡ（０．３９５ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３５８ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、３−アジドプロパン−１−スルホンアミド（１８６ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間撹拌し、この時点にて、ＬＣＭＳ分析により反応の完了が示された。次に、生じた混合物を、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜９０％アセトニトリル−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分をプールして凍結乾燥させて、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）カルバマートを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１２．１（Ｍ＋１−Ｂｏｃ）．保持時間  １．１５分間．このように得た生成物（７２．４ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）を、３Ｍメタノール性ＨＣｌ（５ｍＬ）中に溶解させた。溶媒を、減圧下で除去した。残留物を、アセトニトリルおよびＨ２Ｏ中に取って、凍結乾燥させて、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３−アジドプロピル）スルホニル）−３−フェニルプロパンアミドが、ピンクがかった、黄色がかった固形物として得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１２．１（Ｍ＋１）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４２−７．３１（ｍ，５Ｈ），４．１６−４．１３（ｍ，１Ｈ），３．５１−３．４７（ｍ，４Ｈ），３．３２−３．２６（ｍ，１Ｈ），３．１３−３．０８（ｍ，１Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，２Ｈ）．
【０１９２】
工程５：ＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解したＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＯＨ（１９５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ（１３２ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１０８ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて１５分間撹拌してから、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３−アジドプロピル）スルホニル）−３−フェニルプロパンアミド（５９．２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温にてさらに２時間撹拌した。次に、逆相ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物が得られた（９５ｍｇ、６５％の収率、ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６５．４（Ｍ＋１），保持時間  １．４３分間）。生成物を、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中３Ｍ  ＨＣｌ中に溶解させた。溶媒を、減圧下で除去した。次に、アセトニトリルおよびＨ２Ｏを残留物に加えて、溶液を凍結乾燥させて、所望の生成物（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−２−アミノ−３−メチル−１−オキソブタンを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７６５．４（Ｍ＋１）．保持時間  １．０４分間．
【０１９３】
工程６：ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボン酸（１６．５ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ（１７．６ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（２１．６ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温にて１０分間撹拌してから、（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−２−アミノ−３−メチル−１−オキソブタン（２０ｍｇ、ＴＦＡ塩、０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温にて２時間撹拌し、この時点にて、ＬＣＭＳ分析により反応の完了が示された。次に、生じた混合物を、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜９０％ＡＣＮ−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分をプールして、凍結乾燥させて、（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミドを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９８８．５（Ｍ＋１）．保持時間  １．５１分間．このように得た生成物（９．４ｍｇ、０．００９５ｍｍｏｌ）を、メタノール性ＨＣｌ（３Ｍ、２．０ｍＬ）中に溶解させた。溶媒を、減圧下でゆっくり除去した。残留物をアセトニトリルおよびＨ２Ｏ中に溶解させて、凍結乾燥させて、（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミドがＨＣｌ塩として得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  ８８８．５（Ｍ＋１）．保持時間  １．１０分間．
【０１９４】
工程７：（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド（８．８ｍｇ、０．００９９ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２．０ｍＬ）中に溶解させた。パラホルムアルデヒド（１０．１ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）および酢酸（０．０１０２ｍＬ）に続いて、ナトリウムシアノボロハイドライド（２１．２ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、撹拌しながら１時間、５０℃にて加熱した。さらにパラホルムアルデヒド（１０．１ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）、酢酸（０．０１０２ｍＬ）、およびナトリウムシアノボロハイドライド（２１．２ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）を加えた。５０℃にて１時間後に、ＬＣＭＳ分析により、反応の完了が示された。次に、生じた混合物を、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜９０％ＡＣＮ−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分をプールして、凍結乾燥させて、（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−メチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミドを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９０２．５（Ｍ＋１）．保持時間  １．１２分間．
【０１９５】
工程８：（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−メチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド（５．２ｍｇ、０．００５８ｍｍｏｌ）、１−（プロパ−２−イン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（１．５６ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、およびＣｕＳＯ４（０．７ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）溶液を、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩（２．５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）で処理して、室温にて２時間撹拌した。さらにＣｕＳＯ４（０．７ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）およびＬ−アスコルビン酸ナトリウム塩（２．５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を加えた。室温にてさらに２時間後、ＬＣＭＳ分析により、反応の完了が示された。次に、生じた混合物を、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜９０％アセトニトリル−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分をプールして、凍結乾燥させて、（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）プロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−２−メチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−３−カルボキサミド（Ｃ３）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １０３７．４（Ｍ＋１）．保持時間  １．００分間．
【０１９６】
実施例４：（Ｓ）−２−（（ビス（ジメチルアミノ）メチレン）アミノ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）プロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン（Ｃ４）の合成
【化１４３】
2020504112.tif 000145
工程１：アジ化ナトリウム（３．５ｇ、５４ｍｍｏｌ）の撹拌水（２５ｍｌ）溶液に、１，３−プロパンスルホン（６．１ｇ、５０ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物を、室温にて２４時間撹拌して、濃縮した。生じた固形物を、ジエチルエーテル（１００ｍｌ）中に懸濁させて、１時間還流させながら撹拌した。懸濁液を、室温に冷却した。固形物を、濾過によって収集して、アセトンおよびジエチルエーテルで洗浄して、減圧下で乾燥させて、３−アジド−１−プロパンスルホン酸が得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  １８８．１（Ｍ＋２３）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ３．４７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０７−２．００（ｍ，２Ｈ）．
【０１９７】
工程２：３−アジド−１−プロパンスルホン酸（２．０７ｇ、１３ｍｍｏｌ）を、トルエン中に懸濁させた。ＰＣｌ５（２．６１ｇ、１３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、３時間還流させながら加熱した。反応物を、室温に冷却した。不溶性の物質を濾過によって取り出して、ＤＣＭで洗浄した。組み合わせた濾液を濃縮して、３−アジドプロパン−１−スルホニルクロリドが黄褐色の油として得られ、これを、さらに精製することなく次の工程に用いた。
【０１９８】
工程３：ＮＨ４ＯＨ（２８％、５ｍＬ）を、０℃に冷却した。３−アジドプロパン−１−スルホニルクロリド（１．７５ｇ、９．５３ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、反応物を室温に温めてから、室温にて３時間撹拌した。二相が均質になった。反応混合物を、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。組み合わせた有機相をブラインで洗浄して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、ロータリエバポレータに続いて高減圧下で１８時間濃縮して、３−アジドプロパン−１−スルホンアミドが得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  １８７．１（Ｍ＋２３）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ４．８３（ｓ，２Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１７−２．１０（ｍ，２Ｈ）．
【０１９９】
工程４：（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−フェニルプロパン酸（１００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解させた。ＤＩＥＡ（０．３９５ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３５８ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、３−アジドプロパン−１−スルホンアミド（１８６ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を、２時間撹拌した。ＬＣＭＳにより反応の完了が示された。反応混合物を、１０〜９０％勾配を用いた分取用ＨＰＬＣによって精製して、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）カルバマートを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１２．１（Ｍ＋１−Ｂｏｃ）．保持時間  １．１５ｍｉｎ．このように得た生成物（７２．４ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）を、メタノール性ＨＣｌ（３Ｍ、５ｍＬ）中に溶解した。溶媒を、蒸発によって除去した。残留物を、アセトニトリルおよびＨ２Ｏから凍結乾燥させて、（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３−アジドプロピル）スルホニル）−３−フェニルプロパンアミドが、ピンクがかった、黄色がかった固形物として得られた。ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１２．１（Ｍ＋１）１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４２−７．３１（ｍ，５Ｈ），４．１６−４．１３（ｍ，１Ｈ），３．５１−３．４７（ｍ，４Ｈ），３．３２−３．２６（ｍ，１Ｈ），３．１３−３．０８（ｍ，１Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，２Ｈ）．
【０２００】
工程５：ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＯＨ（１９５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ（１３２ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１０８ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温にて１５分撹拌した。（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３−アジドプロピル）スルホニル）−３−フェニルプロパンアミド（５９．２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を、室温にて２時間撹拌した。粗物質を、分取用ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物が得られた（９５ｍｇ、６５％の収率、ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６５．４（Ｍ＋１），保持時間  １．４３分間）。生成物を、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中３Ｍ  ＨＣｌ中に溶解させた。溶媒を、蒸発によって除去した。残留物を、アセトニトリル−水から凍結乾燥させて、（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−２−アミノ−３−メチル−１−オキソブタン
【化１４４】
2020504112.tif 000146
を、ＨＣｌ塩として得た、ＭＳ  ｍ／ｚ  ７６５．４（Ｍ＋１），保持時間  １．０４ｍｉｎ．
【０２０１】
工程６：ＤＭＦ（２ｍＬ）中（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−２−アミノ−３−メチル−１−オキソブタンＨＣｌ塩（２０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ（０．０２４ｍＬ、０．１４ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（２１．６ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を、室温にて２時間撹拌した。ＬＣＭＳにより反応の完了が示された。次に、生じた混合物を、１０〜９０％勾配を用いた分取用ＨＰＬＣによって精製して、（Ｓ）−２−（（ビス（ジメチルアミノ）メチレン）アミノ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタンをＴＦＡ塩として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６３．５（Ｍ＋１）．保持時間  １．１６９ｍｉｎ．
【０２０２】
工程７：（Ｓ）−２−（（ビス（ジメチルアミノ）メチレン）アミノ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−アジドプロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタンＴＦＡ塩（８７．４ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）および１−（プロパ−２−イン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（２４．２ｍｇ、０．０１７９ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢｕＯＨおよび水のそれぞれ３．０ｍＬ中に懸濁させた。反応器を、Ｎ２よる５回の減圧−充填サイクルによってＮ２で充填した。Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（１７．７ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）の脱ガスＨ２Ｏ（２．４ｍｌ）溶液およびＣｕＳＯ４（２．８６ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の脱ガスＨ２Ｏ（０．６ｍｌ）溶液を逐次加えて、反応物を室温にて５時間撹拌した。ＬＣＭＳにより反応の完了が示された。粗物質を、２０〜４５％勾配を用いた分取用ＨＰＬＣによって精製して、（Ｓ）−２−（（ビス（ジメチルアミノ）メチレン）アミノ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−Ｎ−１−（３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）プロピルスルホンアミド）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン（Ｃ４）をＴＦＡ塩として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９９８．５（Ｍ＋１）．保持時間  １．０１４ｍｉｎ．
【０２０３】
実施例５：６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（２３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチン（Ｃ５）、７’Ｃ−（（２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチン（Ａ−３）、および６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチン（Ａ４）の合成
【化１４５】
2020504112.tif 000147
工程１：ホルムアルデヒド（０．０３５ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ）および２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサン−１−チオール（３５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、α−アマニチン（２０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に加えた。トリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）および酢酸（０．２５ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）を、反応混合物に加えて、Ｎ２ガスで３回フラッシュした。反応混合物を、４０℃にて２日間撹拌した。次に、真空内での濃縮後、残留物をＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥させて、７’Ｃ−（（２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチンが得られた。ＭＳ（ｍ＋１）＝１３４２．４，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．８３４ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，５００ＭＨｚ）δ  １０．６５（ｓ，１Ｈ），８．８１（ｍ，１Ｈ），８．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．４５（ｍ，２Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），６．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），５．２５（ｍ，１Ｈ），５．１２（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｂｓ，１Ｈ），４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５および１２．０Ｈｚ），４．５１（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５および２３．０Ｈｚ），４．０９（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．３８〜３．７３（ｍ，４３Ｈ），３．２９（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），２．９１（ｍ，１Ｈ），２．５６（ｍ，２Ｈ），２．３９（ｍ，２Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｍ，１Ｈ），０．９４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），０．８５（ｍ，６Ｈ）．
【０２０４】
工程２：７’Ｃ−（（２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチン（１４．０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）を、ヨウ化メチル（０．０００７ｍＬ）およびＫ２ＣＯ３（１．５ｍｇ）で室温にて処理して、室温にて１時間撹拌した。追加のヨウ化メチル（０．０００７ｍＬ）およびＫ２ＣＯ３（１．５ｍｇ）を室温にて加えて、室温にて２時間撹拌した。再度、追加のヨウ化メチル（０．０００７ｍＬ）およびＫ２ＣＯ３（１．５ｍｇ）を室温にて加えて、室温にて２時間撹拌した。次に、反応混合物を、ＲＰ−Ｃ１８  ＩＳＣＯによって精製して、凍結乾燥させて、６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチンが得られた。ＭＳ（ｍ＋２／２）＝６７９．０，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．８８７ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，５００ＭＨｚ）δ  １０．７５（ｓ，１Ｈ），８．８３（ｍ，１Ｈ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），８．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），８．３６（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．６９（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），５．３３（ｍ，１Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｂｓ，１Ｈ），４．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５および９．５Ｈｚ），４．５６（ｍ，２Ｈ），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０および１８．５Ｈｚ），４．１０〜４．２１（ｍ，３Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．４５〜３．７９（ｍ，４２Ｈ），３．３５〜３．４４（ｍ，３Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ），２．４４（ｍ，２Ｈ），２．０６（ｍ，１Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．２１（ｍ，１Ｈ），０．９９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０（ｍ，６Ｈ）．
【０２０５】
工程３：６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（２３−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチン（８ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）および１−（プロパ−２−イン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を、ｔ−ブタノール（０．５ｍＬ）に加えて、反応混合物をＮ２ガスで５回フラッシュした。次に、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩（１ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（０．２ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ）、および０．５ｍＬのＨ２Ｏを加えた。反応混合物をＮ２ガスで５回フラッシュして、室温にて４時間撹拌してから、ＲＰ−Ｃ１８  ＩＳＣＯによって精製して、６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（２３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコサンチオ）メチル）−α−アマニチン（Ｃ５）が得られた。ＭＳ（ｍ＋２／２）＝７４６．５，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．８５０ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，５００ＭＨｚ）δ  １０．７４（ｓ，１Ｈ），８．８３（ｍ，１Ｈ），８．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），８．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），８．３６（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．９４（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．８３（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｍ，１Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｂｓ，１Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），４．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０および９．５Ｈｚ），４．５６（ｍ，２Ｈ），４．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０および１８．５Ｈｚ），４．０８〜４．２０（ｍ，３Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．３９〜３．７８（ｍ，３８Ｈ），３．１０（ｍ，１Ｈ），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０および１５．０Ｈｚ），２．６１（ｍ，２Ｈ），２．４１（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），１．５７〜１．６８（ｍ，２Ｈ），１．２０（ｍ  ，１Ｈ），０．９９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９１（ｍ，６Ｈ）．
【０２０６】
実施例６：６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（４−（３−（２３−（（４−マレイミド）メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）ウレイド）ブチルチオ）メチル）−α−アマニチン（Ｃ６）の合成
【化１４６】
2020504112.tif 000148
工程１：ホルムアルデヒド（０．０２７ｍＬ、０．３３ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル（４−メルカプトブチル）カルバマート（ｉ−７）（３４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、４０ｍＬバイアル中のα−アマニチン（Ａ）（１５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．４６ｍＬ、３．２６ｍｍｏｌ）溶液に加えて、反応混合物を４０℃にて３日間撹拌した。真空内での濃縮後、残留物を、２ｍＬのＭｅＯＨ中に溶解させて、ジエチルエーテル中４０８μＬの２Ｍトリメチルシリルジアゾメタンを加えて、混合物を室温にて２時間撹拌した。次に、別のジエチルエーテル中４０８μＬの２Ｍトリメチルシリルジアゾメタンを加えて、室温にて２時間撹拌した。反応混合物を、ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥させて、６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（４−ｔ−ブトキシカルボニルアミノブチルチオ）メチル）−α−アマニチン（Ａ−４）が得られた。
【化１４７】
2020504112.tif 000149
ＭＳ（ｍ＋２−ｂｏｃ／２）＝５２５．８，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．９３６ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４，４００ＭＨｚ）δ  １０．７８（ｓ，１Ｈ），８．８４（ｍ，１Ｈ），８．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），８．４８（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ），８．３５（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．２８（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），４．７３（ｂｓ，１Ｈ），４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６および８．４Ｈｚ），４．５１（ｍ，２Ｈ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８および１８．４Ｈｚ），４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．３５〜３．７５（ｍ，１４Ｈ），３．０５（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｍ，３Ｈ），２．４９（ｍ，４Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），１．３９〜１．６５（ｍ，８Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｍ，１Ｈ），０．９３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．８４（ｍ，６Ｈ）．
【０２０７】
工程２：ＴＦＡ（１ｍＬ）を、４０ｍＬバイアル中の８ｍｇの化合物（Ａ−４）に加えて、生じた溶液を室温にて２分間静置してから、減圧下で濃縮して、６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（４−アミノブチルチオ）メチル）−α−アマニチン（Ａ−５）が得られ、
【化１４８】
2020504112.tif 000150
これを、さらに精製することなく用いた。ＭＳ（ｍ＋１）＝１０５０．４，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．６３５ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４，４００ＭＨｚ）δ  ８．８７（ｍ，１Ｈ），８．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ），８．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），８．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），５．２５（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），４．７３（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６および９．２Ｈｚ），４．４９（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８および１８．４Ｈｚ），４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９９（ｓ，２Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．８３（ｓ，１Ｈ），３．６０〜３．７２（ｍ，４Ｈ），３．３０〜３．６０（ｍ，１０Ｈ），３．００〜３．２０（ｍ，２Ｈ），２．９０（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｍ，２Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），１．５０〜１．７５（ｍ，７Ｈ），１．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．１５（ｍ，１Ｈ），０．９４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８５（ｍ，６Ｈ）．
【０２０８】
工程３：トリエチルアミン（３Ｌ、１８ｍｏｌ）を、化合物（Ａ−５）（７．５ｍｇ、７ｍｏｌ）および４−ニトロフェニル（２３−（４−（（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）カルバマート（５．０ｍｇ、７ｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に加えて、反応混合物を室温にて２時間撹拌して、ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥させて、６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（４−（３−（２３−（（４−マレイミド）メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）ウレイド）ブチルチオ）メチル）−α−アマニチン（Ｃ６）が得られた。ＭＳ（ｍ＋２／２）＝８０３．５，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．８３４  ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４，４００ＭＨｚ）δ  １０．７６（ｓ，１Ｈ），８．８４（ｍ，１Ｈ），８．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．４９（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．７９（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｍ，１Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ），４．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２および９．６Ｈｚ），４．４９（ｍ，４Ｈ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８および１８．４Ｈｚ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．３５〜３．７５（ｍ，３８Ｈ），２．９０〜３．１０（ｍ，４Ｈ），２．９２（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｍ，４Ｈ），２．０１（ｍ，１Ｈ），１．３８〜１．６５（ｍ，６Ｈ），１．１５（ｍ，１Ｈ），０．９４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８５（ｍ，６Ｈ）．
【０２０９】
実施例７：６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（４−（３−（カルボキシ）プロパンカルボキサミド）ブチルチオ）メチル）−α−アマニチンのテトラフルオロフェニルエステル（Ｃ７）の合成
【化１４９】
2020504112.tif 000151
（Ａ−５）（５ｍｇ、５μｍｏｌ）およびＤＭＦ（１ｍＬ）を、４０ｍＬバイアル内で組み合わせて、澄明な溶液が得られた。ビス（２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）グルタラート（２ｍｇ、５μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４μＬ、２０μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間撹拌した後、反応混合物を、ＨＰＬＣによって精製して、６’Ｏ−メチル−７’Ｃ−（（４−（３−（カルボキシ）プロパンカルボキサミド）ブチルチオ）メチル）−α−アマニチンのテトラフルオロフェニルエステル（Ｃ−７）が得られた。ＭＳ（ｍ＋１）＝１３１３．３，ＨＰＬＣピーク  ＲＴ＝０．９９６ｍｉｎ，１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  １０．７８（ｓ，１Ｈ），８．８５（ｍ，１Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），８．３５（ｂｓ，１Ｈ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６９（ｂｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３６（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．２７（ｍ，１Ｈ），５．１４（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｂｓ，１Ｈ），４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２および９．６Ｈｚ），４．５１（ｍ，２Ｈ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４および１８．０Ｈｚ），４．１２（ｍ，１Ｈ），４．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９１（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．３４〜３．７０（ｍ，９Ｈ），３．０８（ｍ，４Ｈ），２．９１（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ），１．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．９２〜２．０４（ｍ，１Ｈ），１．４０〜１．６０（ｍ，６Ｈ），１．１６（ｍ，１Ｈ），０．９４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８７（ｍ，６Ｈ）．．
式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ａ−３）、式（Ｂ−１）、式（Ａ−１ａ）、式（Ａ−２ａ）、式（Ａ−３ａ）、または式（Ｂ−１ａ）の他の化合物を、実施例１〜実施例７の方法および適切な出発材料を用いて製造することができる。
【０２１０】
実施例８：リンカーペイロードＭＰＥＴ．ＤＭ４の調製：
【化１５０】
2020504112.tif 000152
分析方法
特に明記しない限り、以下のＨＰＬＣ法およびＨＰＬＣ／ＭＳ法を、中間体および実施例の調製に用いた。
ＬＣ／ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００ｓｌ／６１４０系で実行した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＳＳ  Ｔ３  Ｃ１８、５０×２．０、１．８μｍ
【０２１１】
【表１】
2020504112.tif 000153
【０２１２】
【表２】
2020504112.tif 000154
【０２１３】
（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ（ｏｘａｚｉｎａｎａ）−３（２，３）−オキシラナ（ｏｘｉｒａｎａ）−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン（ｂｅｎｚｅｎａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃａｐｈａｎｅ）−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニナート
【化１５１】
2020504112.tif 000155
工程１：（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−アミノエチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニナートの調製
【０２１４】
ＰＢＳバッファ（１０．５ｍＬ）および無水ＴＨＦ（２１ｍＬ）中に溶解させたＤＭ４（４８０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）に、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタン−１−アミン（１５１ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２７ｍＬ、１．５４ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。反応混合物を室温にて３０分間撹拌して、真空内で濃縮した。水性残留物を、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）で希釈して、逆相ＩＳＣＯによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜６０％アセトニトリル−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分を凍結乾燥させて、所望の生成物（５５５ｍｇ、９３％の収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）δ  ｐｐｍ  ０．８３（ｓ，３Ｈ）１．２１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ）１．２５（ｓ，３Ｈ）１．２８（ｓ，３Ｈ）１．３０（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ）１．４５−１．５５（ｍ，３Ｈ）１．６７（ｓ，３Ｈ）１．８４−１．８８（ｍ，１Ｈ）１．９５−２．０１（ｍ，１Ｈ）２．１４（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）２．３７−２．４３（ｍ，１Ｈ）２．５３−２．５９（ｍ，１Ｈ）２．６４（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）２．８２−２．８９（ｍ，５Ｈ）２．９１（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）３．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１０．０Ｈｚ，２Ｈ）３．２０（ｓ，３Ｈ）３．２３（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）３．３５（ｓ，３Ｈ）３．５５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）３．５８（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）４．１５−４．２０（ｍ，１Ｈ）４．６４（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１０．０Ｈｚ，１Ｈ）５．４３（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ）５．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ））６．５８（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）６．６５（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）６．６６（ｓ，１Ｈ）７．１１（ｂｓ，１Ｈ）７．２８（ｂｓ，１Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ  ８５５．３（Ｍ＋Ｈ），保持時間  ０．９８８分間．
【０２１５】
工程２：（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニナートの調製。
無水ＤＭＳＯ（７ｍＬ）中に溶解させた（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−アミノエチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニナート（５５５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノアート（１７１ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２４９ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。反応混合物を室温にて１５分間撹拌して、ＴＦＡを用いて中和した。混合物を氷浴で０℃に冷却してから、ＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）を加えて、次に逆相ＩＳＣＯによって精製して、０．０５％ＴＦＡを含有する１０〜７０％アセトニトリル−Ｈ２Ｏで溶出した。所望の生成物を含有する画分を凍結乾燥させて、所望の生成物（４３０ｍｇ、６６％の収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ｐｐｍ  ０．８１（ｓ，３Ｈ）１．２３（ｓ，３Ｈ）１．２４（ｓ，３Ｈ）１．２５（ｓ，１Ｈ）１．２８（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ）１．３１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ）１．４３−１．４９（ｍ，１Ｈ）１．６１（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ）１．６４（ｓ，３Ｈ）１．８１−１．８７（ｍ，１Ｈ）１．９４−２．０１（ｍ，１Ｈ）２．１９（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）２．３０−２．３６（ｍ，１Ｈ）２．５４（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ）２．６１（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）２．７０（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ）２．８８（ｓ，３Ｈ）３．００（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）３．１３（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）３．２１（ｓ，３Ｈ）３．５５（ｓ，３Ｈ）３．４５（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ）３．４９（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）３．６２（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）３．８３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）３．９８（ｓ，３Ｈ）４．３２（ｍ，１Ｈ）４．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１０．０Ｈｚ，１Ｈ）５．２８（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）５．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ））６．２２（ｂｓ，１Ｈ）６．４２（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）６．５０（ｓ，１Ｈ）６．６３（ｓ，１Ｈ）６．６６（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）６．７０（ｓ，２Ｈ）６．８３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ  ９８８．３（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ），保持時間  １．１４５分間．
【０２１６】
３．ＡＤＣの結合および調製
式（Ｉ）の抗体結合体を製造するプロセス
式（Ｉ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１に示す：
【化１５２】
2020504112.tif 000156
式中：ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、リンカー−薬物部分に取り付けられた適合する反応基、ＲＧ２と反応することによって、抗体フラグメントＡを１つ以上のリンカー−薬物部分に共有結合する。ＲＧ１基およびＲＧ２基のそのような反応の非限定的な例として、マレイミド（ＲＧ２）がチオール（ＲＧ１）と反応してスクシンイミド環を与えるもの、またはヒドロキシルアミン（ＲＧ２）がケトン（ＲＧ１）と反応してオキシムを与えるものがある。
【０２１７】
式（ＩＩ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム２に示す：
【化１５３】
2020504112.tif 000157
式中：Ａ１、Ａ２、ＬＢ、Ｄ、およびｎは、本明細書中で定義される通りであり、１，３−ジハロアセトンは、１，３−ジクロロアセトン、１，３−ジブロモアセトン、および１，３−ジヨードアセトンから選択され、還元工程は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）から選択される還元剤を用いて達成される。
【０２１８】
式（Ｃ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム３に示す：
【化１５４】
2020504112.tif 000158
式中：Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；Ｒ４は、−Ｌ１Ｒ１４、−Ｌ２Ｒ２４、または−Ｌ２Ｒ３４であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ）の化合物の適合するＲ１４、Ｒ２４、またはＲ３４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１４、Ｒ２４、Ｒ３４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２１９】
式（Ｃ−１）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム４に示す：
【化１５５】
2020504112.tif 000159
式中：Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；Ｒ４は、−Ｌ１Ｒ１４、−Ｌ２Ｒ２４、または−Ｌ２Ｒ３４であり、ＲＧ１は、式（Ａ−１）の化合物の適合するＲ１４、Ｒ２４、またはＲ３４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する反応基である。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１４、Ｒ２４、Ｒ３４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２０】
式（Ｃ−１ａ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム５に示す：
【化１５６】
2020504112.tif 000160
式中：Ｌ２０は、−Ｌ１Ｒ４０であり；Ｒ４は、−Ｌ１Ｒ１４、−Ｌ２Ｒ２４、または−Ｌ２Ｒ３４であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ−１ａ）の化合物の適合するＲ１４、Ｒ２４、またはＲ３４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１４、Ｒ２４、Ｒ３４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２１】
式（Ｄ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム６に示す：
【化１５７】
2020504112.tif 000161
式中：Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり；Ｒ３は、−Ｌ５Ｒ１４であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ）の化合物の適合するＲ１４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｒ２、Ｌ５、Ｒ１４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２２】
式（Ｄ−１）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム７に示す：
【化１５８】
2020504112.tif 000162
式中：Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ−２）の化合物の適合するＲ１４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｌ５、Ｒ１４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２３】
式（Ｄ−１ａ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム８に示す：
【化１５９】
2020504112.tif 000163
式中：Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ−２）の化合物の適合するＲ１４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｌ５、Ｒ１４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２４】
式（Ｄ−２）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム９に示す：
【化１６０】
2020504112.tif 000164
式中：Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ−３）の化合物の適合するＲ１４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｌ５、Ｒ１４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２５】
式（Ｄ−２ａ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１０に示す：
【化１６１】
2020504112.tif 000165
式中：Ｌ３０は、−Ｌ５Ｒ４０であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ａ−３ａ）の化合物の適合するＲ１４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｌ５、Ｒ１４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２６】
式（Ｅ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１１に示す：
【化１６２】
2020504112.tif 000166
式中：Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；Ｒ５４は、−Ｌ６Ｒ１４、−Ｌ７Ｒ２４、または−Ｌ７Ｒ３４であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ｂ）の化合物の適合するＲ１４、Ｒ２４、またはＲ３４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、Ｘ、Ｒ５、Ｒ６、Ｌ６、Ｌ７、Ｒ１４、Ｒ２４、Ｒ３４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２７】
式（Ｅ−１）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１２に示す：
【化１６３】
2020504112.tif 000167
式中：Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；Ｒ５４は、−Ｌ６Ｒ１４、−Ｌ７Ｒ２４、または−Ｌ７Ｒ３４であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ｂ−１）の化合物の適合するＲ１４、Ｒ２４、またはＲ３４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、ｙ、Ｒ５、Ｒ６、Ｌ６、Ｌ７、Ｒ１４、Ｒ２４、Ｒ３４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２８】
式（Ｅ−１ａ）の結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１３に示す：
【化１６４】
2020504112.tif 000168
式中：Ｌ４０は、−Ｌ６Ｒ４０であり；Ｒ５４は、−Ｌ６Ｒ１４、−Ｌ７Ｒ２４、または−Ｌ７Ｒ３４であり、ＲＧ１は、反応基、ほんの一例として、チオール、アミン、またはケトンであり、これらは、式（Ｂ−１ａ）の化合物の適合するＲ１４、Ｒ２４、またはＲ３４基と反応して、対応するＲ４０基を形成する。一例として、マレイミドがチオールと反応してスクシンイミド環を与え、またはヒドロキシルアミンがケトンと反応してオキシムを与える。Ａ、ｙ、Ｒ５、Ｒ６、Ｌ６、Ｌ７、Ｒ１４、Ｒ２４、Ｒ３４、およびＲ４０は、本明細書中で定義される通りである。
【０２２９】
マイタンシノイド部分を含む結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１４に示す：
【化１６５】
2020504112.tif 000169
式中、１つ以上のリンカー−ペイロードの１つ以上のＮＨＳエステルは、Ａ（すなわち、（Ａ’−（ＮＨ２）ｙ）上の１つ以上の遊離アミンと反応することによって結合体を形成する。Ａは、本明細書中で定義される通りであり、Ａ’は、遊離アミン部分を含まないＡの部分である。
【０２３０】
マイタンシノイド部分を含む結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１５に示す：
【化１６６】
2020504112.tif 000170
式中、１つ以上のリンカー−ペイロードの１つ以上のＮＨＳエステルは、Ａ（すなわち、（Ａ’−（ＮＨ２）ｙ）上の１つ以上の遊離アミンと反応することによって結合体を形成する。Ａは、本明細書中で定義される通りであり、Ａ’は、遊離アミン部分を含まないＡの部分である。
【０２３１】
マイタンシノイド部分を含む結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１６に示す：
【化１６７】
2020504112.tif 000171
式中、１つ以上のリンカー−ペイロードの１つ以上のＮＨＳエステルは、Ａ（すなわち、（Ａ’−（ＮＨ２）ｙ）上の１つ以上の遊離アミンと反応することによって結合体を形成する。Ａは、本明細書中で定義される通りであり、Ａ’は、遊離アミン部分を含まないＡの部分である。
【０２３２】
マイタンシノイド部分を含む結合体の形成のための一般的な反応スキームを、以下のスキーム１７に示す：
【化１６８】
2020504112.tif 000172
式中、１つ以上のリンカー−ペイロードの１つ以上のマレイミドは、Ａ（すなわち（Ａ’−（ＳＨ）ｙ）上の１つ以上の遊離チオールと反応することによって結合体を形成する。Ａは、本明細書中で定義される通りであり、Ａ’は、遊離チオール部分を含まないＡの部分である。
【０２３３】
４．所望の抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣの特性評価および選択
ＤＡＲの判定およびＡＤＣの凝集
ｃＫＩＴ  ＡＤＣのＤＡＲ値を、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって評価した。化合物対抗体比を、還元かつ脱グリコシル化された（必要に応じて、すなわち、Ｆｃが含まれる場合）サンプルについてのＬＣ−ＭＳデータから推測した。ＬＣ−ＭＳにより、結合体サンプル中の抗体に取り付けられたリンカー−ペイロード（化合物）の平均分子数の定量が可能となる。
【０２３４】
本発明の抗体薬物結合体を、分析方法を用いて評価した。そのような分析方法論および結果は、結合体が有利な特性、例えば、製造するのをより容易にし、患者に投与するのをより容易にし、より有効にし、かつ／または患者にとって潜在的により安全にするであろう特性を有することを実証することができる。一例が、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による分子サイズの判定であり、そこでは、サンプル中の所望の抗体種の量が、サンプル中に存在する高分子量の混入物（例えば、ダイマー、マルチマー、または凝集抗体）または低分子量の混入物（例えば、抗体フラグメント、分解生成物、または個々の抗体鎖）の量と比較して判定される。一般に、例えば、抗体サンプルの他の特性、例えば、以下に限定されないが、クリアランス速度、免疫原性、および毒性に及ぼす凝集体の影響に起因して、より大量のモノマー、およびより少量の、例えば凝集抗体を有することが所望される。更なる例が、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）による疎水性の判定であり、そこでは、サンプルの疎水性が、一組の標準的な抗体の知られている特性と比較して評価される。一般に、抗体サンプルの他の特性に及ぼす疎水性の影響、例えば、以下に限定されないが、凝集、経時的な凝集、表面への付着、肝毒性、クリアランス速度、および薬物動態学的曝露に起因して、低い疎水性を有することが所望される。Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；２６（８）：８８４−８８５；Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１５；３２（１１）：３５４１−７１参照。
【０２３５】
抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣの選択
本明細書中に記載される方法に用いるのに適した抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣを選択するために、インビトロヒト造血幹細胞死滅アッセイを用いて、抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣを有効性および効力についてスクリーニングすることができる。例えば、実施例５に記載される方法を用いて、抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣをスクリーニングすることができる。適切な抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣを、ＥＣ５０に基づいて選択することができ、例えば、ＥＣ５０が５００μｇ／ｍｌ未満、例えば、１００μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌ未満、または５μｇ／ｍｌ未満の抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣである。
【０２３６】
さらに、肥満細胞上でのｃＫＩＴ発現、および幹細胞因子（ＳＣＦ）（ｃＫＩＴのリガンド）が、ラット腹膜肥満細胞の直接的脱顆粒をインビトロで、そしてインビボで誘導すると報告されている（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９５  Ｎｏｖ；８６（３）：４２７−３３）。ＳＣＦはまた、ヒト肥満細胞脱顆粒をインビボで誘導する（Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９６；１８３（６）：２６８１−６）。移植レシピエントにおいて肥満細胞脱顆粒によって引き起こされる潜在的に有害な作用を回避するために、選択したｃＫＩＴ  ＡＤＣを、肥満細胞脱顆粒をインビトロで誘導する能力について試験することができる。例えば、実施例６に記載する実験を用いて、ｃＫＩＴ  ＡＤＣをスクリーニングすることができ、そして適切な抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣを、最小の肥満細胞脱顆粒に基づいて選択することができ、例えば、ベータ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイにおいて、ベースライン補正されたＯ．Ｄ．読出しが、０．２５未満、例えば、０．２未満、０．１５未満、または０．１未満のものである。
【０２３７】
ｃＫＩＴ抗体および抗体フラグメント
本開示は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）を提供する。本開示の抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）として、以下に限定されないが、以下に記載するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントが挙げられる。
【０２３８】
一部の実施形態において、本開示の抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、完全長抗ｃＫＩＴ抗体と比較して、肥満細胞脱顆粒を引き起こす能力が引き下げられている。一部の実施形態において、本明細書中で開示される抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、肥満細胞脱顆粒を誘導する能力が引き下げられるように修飾される。例えば、本明細書中で開示される抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、完全長抗ｃＫＩＴ抗体、またはそのＦ（ａｂ’）２もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントと比較して、肥満細胞脱顆粒を誘導する能力が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％引き下げられるように修飾される。一部の実施形態において、本明細書中で開示される抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）は、抗ｃＫＩＴ  ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを含んでよい。一部の実施形態において、本明細書中で開示される抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合フラグメント）は、より大きな複合体に架橋かつ／または多量体化された場合でさえ、肥満細胞脱顆粒を誘導する能力が最小であり得、例えば、ベータ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイにおいて、ベースライン補正されたＯ．Ｄ．読出しが、０．２５未満、例えば、０．２未満、０．１５未満、または０．１未満であり得る。
【０２３９】
本明細書中で提供される抗体薬物結合体は、ヒトｃＫＩＴ−結合抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を含む。一部の実施形態において、本明細書中で提供される抗体薬物結合体は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合するヒト抗体フラグメントまたはヒト化抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を含む。一部の実施形態において、本明細書中で提供される抗体薬物結合体は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合するヒトＦａｂ’またはヒト化Ｆａｂ’を含む。一部の実施形態において、本明細書中で提供される抗体薬物結合体は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合するヒトＦａｂまたはヒト化Ｆａｂを含む。
【０２４０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１に記載されるあらゆるＶＨドメインのアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む（例えば、配列番号１０、３６、５４、６９、９５）。他の適切な抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１に記載されるＶＨドメインのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するＶＨドメインを含み得る。
【０２４１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１中で一覧にされるＶＨ  ＣＤＲ（またはＨＣＤＲ）のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ（またはＨＣＤＲ）を含む。特定の態様において、本開示は、表１中で一覧にされるＶＨ  ＣＤＲ（またはＨＣＤＲ）のいずれかのアミノ酸配列を有する、１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のＶＨ  ＣＤＲ（またはＨＣＤＲ）を含む（または代わりに、これらからなる）抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供する。
【０２４２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１に記載されるいずれかのＶＬドメインのアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む（例えば、配列番号２３、４７、８２、１０８）。他の適切な抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１に記載されるＶＬドメインのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を有するＶＬドメインを含み得る。
【０２４３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１中で一覧にされるＶＬ  ＣＤＲ（またはＬＣＤＲ）のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ（またはＬＣＤＲ）を含む。特定の態様において、本開示は、表１中で一覧にされるＶＬ  ＣＤＲ（またはＬＣＤＲ）のいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のＶＬ  ＣＤＲ（またはＬＣＤＲ）を含む（または代わりに、これらからなる）抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供する。
【０２４４】
本明細書中で開示される他の抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、突然変異しているが、表１に記載される配列中に示されるＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５パーセントの配列同一性をＣＤＲ領域内に有するアミノ酸を含む。一部の態様において、これは、表１に記載される配列中に示されるＣＤＲ領域と比較した場合に、１、２、３、４、または５つ以下のアミノ酸がＣＤＲ領域内で突然変異している突然変異アミノ酸配列を含む。
【０２４５】
本開示はまた、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＨ、ＶＬ、重鎖、および軽鎖をコードする核酸配列を提供する。そのような核酸配列は、哺乳類細胞中での発現のために最適化され得る。
【０２４６】
【表３】
2020504112.tif 000173
【０２４７】
【表４】
2020504112.tif 000174
【０２４８】
【表５】
2020504112.tif 000175
【０２４９】
【表６】
2020504112.tif 000176
【０２５０】
【表７】
2020504112.tif 000177
【０２５１】
【表８】
2020504112.tif 000178
【０２５２】
【表９】
2020504112.tif 000179
【０２５３】
【表１０】
2020504112.tif 000180
【０２５４】
【表１１】
2020504112.tif 000181
【０２５５】
【表１２】
2020504112.tif 000182
【０２５６】
【表１３】
2020504112.tif 000183
【０２５７】
【表１４】
2020504112.tif 000184
【０２５８】
【表１５】
2020504112.tif 000185
【０２５９】
【表１６】
2020504112.tif 000186
【０２６０】
【表１７】
2020504112.tif 000187
【０２６１】
【表１８】
2020504112.tif 000188
【０２６２】
【表１９】
2020504112.tif 000189
【０２６３】
【表２０】
2020504112.tif 000190
【０２６４】
【表２１】
2020504112.tif 000191
【０２６５】
【表２２】
2020504112.tif 000192
【０２６６】
【表２３】
2020504112.tif 000193
【０２６７】
【表２４】
2020504112.tif 000194
【０２６８】
【表２５】
2020504112.tif 000195
【０２６９】
【表２６】
2020504112.tif 000196
【０２７０】
本明細書中で開示される他の抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）として、アミノ酸、またはアミノ酸をコードする核酸が突然変異しているが、表１に記載される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５パーセントの同一性を有するものが挙げられる。一部の態様において、これは、表１に記載される配列中に示される可変領域と比較した場合に、１、２、３、４、または５つ以下のアミノ酸が可変領域内で突然変異している突然変異アミノ酸配列を含む一方、実質的に同じ治療活性を保持する。
【０２７１】
これらの抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）はそれぞれ、ｃＫＩＴに結合することができるので、ＶＨ、ＶＬ、重鎖、および軽鎖の配列（アミノ酸配列、およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）は、他のｃＫＩＴ−結合抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を生じさせるように「混合かつマッチ」され得る。そのような「混合かつマッチ」されたｃＫＩＴ−結合抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、当該技術において知られている結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例の項において記載される他のアッセイ）を用いて試験され得る。これらの鎖が混合かつマッチされる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列が、構造的に類似するＶＨ配列で置換されるべきである。同様に、特定の重鎖／軽鎖対由来の重鎖配列が、構造的に類似する重鎖配列で置換されるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列が、構造的に類似するＶＬ配列で置換されるべきである。同様に、特定の重鎖／軽鎖対由来の軽鎖配列が、構造的に類似する軽鎖配列で置換されるべきである。
【０２７２】
したがって、一態様において、本開示は：配列番号１０、３６、５４、６９、および９５（表１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２３、４７、８２、および１０８（表１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する単離された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供し；当該抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する。
【０２７３】
別の態様において、本開示は：配列番号１２、３８、５６、７１、および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに配列番号２５、４９、８４、および１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する単離された抗体を提供する。
【０２７４】
別の態様において、本開示は：配列番号１４、４０、５８、７３、および９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに配列番号２５、４９、８４、および１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する単離された抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）を提供する。
【０２７５】
別の態様において、本開示は、表１に記載される重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含むｃＫＩＴ−結合抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供する。抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＨ  ＣＤＲ１（またはＨＣＤＲ１）のアミノ酸配列は、配列番号１、４、６、７、２７、３０、３２、３３、６０、６３、６５、６６、８６、８９、９１、および９２に示される。抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＨ  ＣＤＲ２（またはＨＣＤＲ２）のアミノ酸配列は、配列番号２、５、８、２８、３１、３４、５１、５２、５３、６１、６４、６７、８７、９０、および９３に示される。抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＨ  ＣＤＲ３（またはＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、配列番号３、９、２９、３５、６２、６８、８８、および９４に示される。抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＬ  ＣＤＲ１（またはＬＣＤＲ１）のアミノ酸配列は、配列番号１６、１９、２２、４２、４４、４６、７５、７８、８１、１０１、１０４、および１０７に示される。抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＬ  ＣＤＲ２（またはＬＣＤＲ２）のアミノ酸配列は、配列番号１７、２０、７６、７９、１０２、および１０５に示される。抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）のＶＬ  ＣＤＲ３（またはＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、配列番号１８、２１、４３、４５、７７、８０、１０３、および１０６に示される。
【０２７６】
これらの抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）はそれぞれ、ヒトｃＫＩＴに結合することができ、そしてその抗原−結合特異性が主に、ＣＤＲ１、２、および３の領域によって提供されるならば、ＶＨ  ＣＤＲ１、２、および３の配列（またはＨＣＤＲ１、２、３）、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２、および３の配列（またはＬＣＤＲ１、２、３）は、「混合かつマッチ」され得る（すなわち、各抗体が、ＶＨ  ＣＤＲ１、２、および３、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有して、ｃＫＩＴ−結合抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を生じさせなければならないが、様々な抗体由来のＣＤＲが混合かつマッチされ得る）。そのような「混合かつマッチ」されたｃＫＩＴ−結合抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、当該技術において知られている結合アッセイを用いて試験され得る。ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合かつマッチされる場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３の配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列で置換されるべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が混合かつマッチされる場合、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３の配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列で置換されるべきである。１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の配列を、本明細書中で示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似する配列で置換することによって、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列が生じ得ることは、当業者に容易に明らとなろう。
【０２７７】
したがって、本開示は、配列番号１、４、６、７、２７、３０、３２、３３、６０、６３、６５、６６、８６、８９、９１、および９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；配列番号２、５、８、２８、３１、３４、５１、５２、５３、６１、６４、６７、８７、９０、および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；配列番号３、９、２９、３５、６２、６８、８８および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；配列番号１６、１９、２２、４２、４４、４６、７５、７８、８１、１０１、１０４、および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；配列番号１７、２０、７６、７９、１０２、および１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；ならびに配列番号１８、２１、４３、４５、７７、８０、１０３、および１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む単離された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供し；当該抗体は、ｃＫＩＴに特異的に結合する。
【０２７８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号１のＨＣＤＲ１；配列番号２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【０２７９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号４のＨＣＤＲ１；配列番号５のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１９のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６のＨＣＤＲ１；配列番号２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号８のＨＣＤＲ２；配列番号９のＨＣＤＲ３；配列番号２２のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号２７のＨＣＤＲ１；配列番号２８のＨＣＤＲ２；配列番号２９のＨＣＤＲ３；配列番号４２のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３０のＨＣＤＲ１；配列番号３１のＨＣＤＲ２；配列番号２９のＨＣＤＲ３；配列番号４４のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号４５のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３２のＨＣＤＲ１；配列番号２８のＨＣＤＲ２；配列番号２９のＨＣＤＲ３；配列番号４２のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３３のＨＣＤＲ１；配列番号３４のＨＣＤＲ２；配列番号３５のＨＣＤＲ３；配列番号４６のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号４３のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号１のＨＣＤＲ１；配列番号５１のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号４のＨＣＤＲ１；配列番号５２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１９のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６のＨＣＤＲ１；配列番号５１のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３；配列番号１６のＬＣＤＲ１；配列番号１７のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【０２８９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号５３のＨＣＤＲ２；配列番号９のＨＣＤＲ３；配列番号２２のＬＣＤＲ１；配列番号２０のＬＣＤＲ２；および配列番号１８のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６０のＨＣＤＲ１；配列番号６１のＨＣＤＲ２；配列番号６２のＨＣＤＲ３；配列番号７５のＬＣＤＲ１；配列番号７６のＬＣＤＲ２；および配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６３のＨＣＤＲ１；配列番号６４のＨＣＤＲ２；配列番号６２のＨＣＤＲ３；配列番号７８のＬＣＤＲ１；配列番号７９のＬＣＤＲ２；および配列番号８０のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６５のＨＣＤＲ１；配列番号６１のＨＣＤＲ２；配列番号６２のＨＣＤＲ３；配列番号７５のＬＣＤＲ１；配列番号７６のＬＣＤＲ２；および配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６６のＨＣＤＲ１；配列番号６７のＨＣＤＲ２；配列番号６８のＨＣＤＲ３；配列番号８１のＬＣＤＲ１；配列番号７９のＬＣＤＲ２；および配列番号７７のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号８６のＨＣＤＲ１；配列番号８７のＨＣＤＲ２；配列番号８８のＨＣＤＲ３；配列番号１０１のＬＣＤＲ１；配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号８９のＨＣＤＲ１；配列番号９０のＨＣＤＲ２；配列番号８８のＨＣＤＲ３；配列番号１０４のＬＣＤＲ１；配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および配列番号１０６のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号９１のＨＣＤＲ１；配列番号８７のＨＣＤＲ２；配列番号８８のＨＣＤＲ３；配列番号１０１のＬＣＤＲ１；配列番号１０２のＬＣＤＲ２；および配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号９２のＨＣＤＲ１；配列番号９３のＨＣＤＲ２；配列番号９４のＨＣＤＲ３；配列番号１０７のＬＣＤＲ１；配列番号１０５のＬＣＤＲ２；および配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む。
【０２９８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２９９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３００】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３０１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３０２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０３０３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３０４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３０５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３０６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３０７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３０８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１１９、１２０、または１２１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３０９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１２５、１２６、または１２７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１３１、１３２、または１３３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１３７、１３８、または１３９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体フラグメント（例えばＦａｂ’）は、配列番号１４２、１４３、または１４４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１３】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１４】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３１８】
特定の態様において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、表１に記載される抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）である。
【０３１９】
１．同じエピトープに結合する抗体
本開示は、ヒトｃＫＩＴ受容体の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供する。特定の態様において、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、ヒトｃＫＩＴ細胞外ドメインのドメイン１〜３内のエピトープに結合し得る。
【０３２０】
本開示はまた、表１に記載される抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）と同じエピトープに結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供する。したがって、ｃＫＩＴ結合アッセイにおいて他の抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）と交差競合する（例えば、その結合を、統計学的に有意に、競合的に阻害する）能力に基づいて、追加の抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）が同定され得る。交差競合に基づいて抗体を「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」する高スループットプロセスが、国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットに記載されている。本明細書中で開示される抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の、ｃＫＩＴタンパク質（例えばヒトｃＫＩＴ）への結合を阻害する試験抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の能力は、試験抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）が、ｃＫＩＴへの結合について、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）と競合することができること；そのような抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）が、非限定的な理論に従って、競合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）と同じ、または関連する（例えば、構造的に類似する、または空間的に近位の）、ｃＫＩＴタンパク質上のエピトープに結合し得ることを実証する。特定の態様において、本明細書中で開示される抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）と同じ、ｃＫＩＴ上のエピトープに結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、ヒト抗体もしくはヒト抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）またはヒト化抗体もしくはヒト化抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）である。そのようなヒト抗体もしくはヒト抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）またはヒト化抗体もしくはヒト化抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、本明細書中で記載されるように調製かつ単離され得る。
【０３２１】
２．フレームワークの修飾
本明細書中で開示される抗体薬物結合体は、例えば抗体薬物結合体の特性を向上させるような、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対する修飾を含む、修飾されたｃＫＩＴ−結合抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を含んでよい。
【０３２２】
一部の実施形態において、フレームワーク修飾は、抗体または抗体薬物結合体の免疫原性を低下させるようになされる。例えば、一アプローチとして、１つ以上のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異」させるものがある。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって、特定され得る。フレームワーク領域配列を、所望の生殖細胞系の構成に「マッチ」させるために、残基を、例えば部位特異的突然変異誘発によって、対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異」した抗体または抗体薬物結合体もまた、本発明によって包含されることが意図される。
【０３２３】
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内の、または１つ以上のＣＤＲ領域内の、１つ以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去することによって、抗体または抗体薬物結合体の潜在的免疫原性を引き下げることを包含する。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０３２４】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて、またはその代わりに、抗体は、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合を変更するように操作され得る。さらに、抗体は、ここでも抗体の１つ以上の機能的特性を変更するように、化学的に修飾されてもよい（例えば、１つ以上の化学部分が、抗体に取り付けられてよい）し、そのグリコシル化を変更するように修飾されてもよい。これらの態様のそれぞれが、以下でさらに詳細に説明される。
【０３２５】
一態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、変更、例えば増減されるように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進して、抗体の安定性を増大させ、もしくは低下させ、または別の分子への結合を可能にするように、変更される。
【０３２６】
一部の実施形態において、本明細書中で開示される抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、薬物部分への結合のための部位として、修飾または操作されたアミノ酸残基、例えば、１つ以上のシステイン残基を含む（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８，２６：９２５−９３２）。一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される位置でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含む、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を提供する。システイン置換のための部位が、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の定常領域中にあるので、種々の抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）に適用可能であり、そして当該部位は、安定した、かつ均質な結合体を提供するように選択される。修飾された抗体またはフラグメントは、１つ、２つ、またはそれ以上のシステイン置換を有してよく、これらの置換は、本明細書中に記載される他の修飾方法および結合方法と組み合わせて用いられ得る。抗体の特定の位置にシステインを挿入する方法が、当該技術において知られている。例えば、Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，３：７０３−７０８、国際公開第２０１１／００５４８１号パンフレット、国際公開第２０１４／１２４３１６号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８６１５号パンフレット参照。特定の実施形態において、修飾された抗体は、抗体の重鎖の位置１１７、１１９、１２１、１２４、１３９、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６９、１７１、１７４、１８９、１９１、１９５、１９７、２０５、２０７、２４６、２５８、２６９、２７４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９３、３２０、３２２、３２６、３３３、３３４、３３５、３３７、３４４、３５５、３６０、３７５、３８２、３９０、３９２、３９８、４００、および４２２から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられている。特定の実施形態において、修飾された抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の重鎖の位置１２１、１２４、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６９、１７１、１７４、１８９、および２０７から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられている。特定の実施形態において、修飾された抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の重鎖の位置１２４、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１７４、１８９、および２０７から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられている。
【０３２７】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１０７、１０８、１０９、１１４、１２６、１２７、１２９、１４２、１４３、１４５、１５２、１５４、１５６、１５７、１５９、１６１、１６５、１６８、１６９、１７０、１８２、１８３、１８８、１９７、１９９、および２０３から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１０７、１０８、１１４、１２６、１２７、１２９、１４２、１５９、１６１、１６５、１８３、および２０３から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１１４、１２９、１４２、１４５、１５２、１５９、１６１、１６５、および１９７から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１０７、１０８、１０９、１２６、１４３、１４５、１５２、１５４、１５６、１５７、１５９、１８２、１８３、１８８、１９７、１９９、および２０３から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１４５、１５２、および１９７から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１１４および１６５から選択される、その定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。
【０３２８】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１４３、１４５、１４７、１５６、１５９、１６３、１６８から選択されるその定常領域上でのシステインによる１つ以上のアミノ酸の置換を含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ヒトラムダ軽鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖の位置１４３（ＥＵナンバリングによる）にシステインを含み、当該軽鎖は、ヒトラムダ軽鎖である。
【０３２９】
特定の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、その定常領域上でのシステインによる２つ以上のアミノ酸の置換の組合せを含み、当該位置の組合せは、先で一覧にされたあらゆる位置から選択され得る。
【０３３０】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、以下の位置：重鎖の位置１２４、重鎖の位置１５２、重鎖の位置１５３、重鎖の位置１５５、重鎖の位置１５７、重鎖の位置１６４、重鎖の位置１７４、軽鎖の位置１１４、軽鎖の位置１２９、軽鎖の位置１４２、軽鎖の位置１５９、軽鎖の位置１６１、または軽鎖の位置１６５の１つ以上にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、以下の位置：重鎖の位置１２４、重鎖の位置１５２、重鎖の位置１５３、重鎖の位置１５５、重鎖の位置１５７、重鎖の位置１６４、重鎖の位置１７４、軽鎖の位置１１４、軽鎖の位置１２９、軽鎖の位置１４２、軽鎖の位置１５９、軽鎖の位置１６１、または軽鎖の位置１６５の４つにてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。
【０３３１】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、重鎖の位置１５２にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられている。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、重鎖の位置１２４にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられている。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、軽鎖の位置１６５にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、軽鎖の位置１１４にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、軽鎖の位置１４３にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ラムダ鎖である。
【０３３２】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、重鎖の位置１５２および軽鎖の位置１６５にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、重鎖の位置１５２および軽鎖の位置１１４にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、重鎖の位置１５２および軽鎖の位置１４３にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、ラムダ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、重鎖の位置１２４および位置１５２にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられている。
【０３３３】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、以下の位置：重鎖の位置１５５、重鎖の位置１８９、重鎖の位置２０７、軽鎖の位置１４５、軽鎖の位置１５２、または軽鎖の位置１９７の１つ以上にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、以下の位置：重鎖の位置１５５、重鎖の位置１８９、重鎖の位置２０７、軽鎖の位置１４５、軽鎖の位置１５２、または軽鎖の位置１９７の２つ以上（例えば、２、３、４つ）にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。
【０３３４】
一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、以下の位置：重鎖の位置１２４、重鎖の位置１５２、重鎖の位置１５３、重鎖の位置１５５、重鎖の位置１５７、重鎖の位置１６４、重鎖の位置１７４、軽鎖の位置１１４、軽鎖の位置１２９、軽鎖の位置１４２、軽鎖の位置１５９、軽鎖の位置１６１、または軽鎖の位置１６５の１つ以上にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。一部の実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、以下の位置：重鎖の位置１２４、重鎖の位置１５２、重鎖の位置１５３、重鎖の位置１５５、重鎖の位置１５７、重鎖の位置１６４、重鎖の位置１７４、軽鎖の位置１１４、軽鎖の位置１２９、軽鎖の位置１４２、軽鎖の位置１５９、軽鎖の位置１６１、または軽鎖の位置１６５の２つ以上（例えば、２、３、４つ）にてシステインを含み、当該位置は、ＥＵ系に従って番号を付けられており、当該軽鎖は、カッパ鎖である。
【０３３５】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３３６】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３３７】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３３８】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１２９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３３９】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３４０】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３４１】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１４０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３４２】
一部の実施形態において、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する修飾された抗体フラグメント（例えばＦａｂ）は、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０３４３】
３．ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメントの生成
抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）は、当該技術において知られているあらゆる手段によって生成され得、以下に限定されないが、組換え発現、化学合成、または完全長モノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ生成または組換え生成によって得られ得る）の酵素的消化が挙げられる。組換え発現は、当該技術において知られている適切なあらゆる宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞に由来し得、または無細胞系（例えば、Ｓｕｔｒｏ’ｓ  Ｘｐｒｅｓｓ  ＣＦ（商標）Ｐｌａｔｆｏｒｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｔｒｏｂｉｏ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／）によって製造され得る。
【０３４４】
本開示はさらに、本明細書中に記載される抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書中に記載される、相補性決定領域を含む重鎖または軽鎖の可変領域または可変セグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の態様において、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１、３７、５５、７０、および９６からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の態様において、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４、４８、８３、および１０９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０３４５】
一部の態様において、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３、３９、５７、７２、および９８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の態様において、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６、５０、８５、および１１１のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０３４６】
一部の態様において、Ｆａｂ’重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５、４１、５９、７４、および１００のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の態様において、Ｆａｂ’軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６、５０、８５、および１１１のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０３４７】
本開示のポリヌクレオチドは、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の可変領域の配列のみをコードしてよい。また、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の可変領域および定常領域の双方をコードしてもよい。ポリヌクレオチド配列の一部が、例示される１つの抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の重鎖および軽鎖の双方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。
【０３４８】
ポリヌクレオチド配列は、抗ｃＫＩＴ抗体またはその結合フラグメントをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載される配列）のデノボ固相ＤＮＡ合成によって、またはＰＣＲ突然変異誘発によって生成され得る。核酸の直接的化学合成が、当該技術において知られている方法によって達成され得、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持法がある。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；およびＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１に記載されるようにして実行され得る。
【０３４９】
また、本開示において提供されるのが、上述の抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）を生成するための発現ベクターおよび宿主細胞である。種々の発現ベクターを使用して、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの双方が、哺乳類宿主細胞において抗体を生成するのに用いられ得る。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系として、プラスミドまたはエピソームベクター（典型的には、タンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを有する）およびヒト人工染色体が挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７参照）。例えば、哺乳類（例えばヒト）細胞における抗ｃＫＩＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとして、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ，Ｂ  ＆  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ，Ｂ  ＆  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、および他のタンパク質を発現させるための当該技術において知られている多数の他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバールウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２参照。
【０３５０】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることとなる意図される宿主細胞に依存する。典型例として、発現ベクターは、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されているプロモータおよび他の調節配列（例えばエンハンサ）を含有する。一部の態様において、誘導プロモータを使用して、挿入された配列の発現を、誘導条件下以外では防止する。誘導プロモータとして、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ、またはヒートショックプロモータが挙げられる。形質転換された生物の培養体は、非誘導条件下で、集団を、発現産物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について偏らせることなく、増殖し得る。また、プロモータに加えて、他の調節要素が、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の効率的な発現に必要とされてよく、または所望されてよい。当該要素として、典型的に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列が挙げられる。加えて、発現の効率が、使用される細胞系に適したエンハンサの包含によって増強され得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；およびＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサまたはＣＭＶエンハンサを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させることができる。
【０３５１】
発現ベクターはまた、挿入された抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列位置を提供し得る。多くの場合、挿入される抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）配列は、ベクター内に含まれる前に、シグナル配列に結合される。また、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする配列を受け入れるのに用いられることとなるベクターは時折、定常領域またはその部分をコードする。そのようなベクターは、定常領域との融合タンパク質として可変領域を発現することによって、無傷の抗体またはそのフラグメントを生成し得る。
【０３５２】
抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の鎖を保有かつ発現させるための宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングして発現させるのに有用な一原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主として、桿菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ならびに他の腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、および種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種が挙げられる。これらの原核生物宿主において、当業者であれば発現ベクターを構築することもでき、これは典型的に、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば複製起点）を含有する。加えて、任意の数の種々の周知のプロモータが存在することとなり、例えば、ラクトースプロモータ系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、ベータ−ラクタマーゼプロモータ系、またはファージラムダ由来のプロモータ系がある。プロモータは典型的に、場合によってはオペレータ配列と共に、発現を制御し、そしてリボソーム結合部位配列等を有しており、転写および翻訳を開始して完了させる。また、他の微生物、例えば酵母を使用して、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）ポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞を用いることもできる。
【０３５３】
他の態様において、哺乳類宿主細胞を用いて、本開示の抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）ポリペプチドを発現させて生成することができる。例えば、哺乳類宿主細胞は、内因性の免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば、実施例に記載されている骨髄腫ハイブリドーマクローン）であってもよいし、外因性の発現ベクターを保有する哺乳類の細胞株（例えば、以下で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）であってもよい。これらとして、死に至る標準的な、または不死の標準的もしくは異常な、あらゆる動物細胞またはヒト細胞が挙げられる。例えば、無傷の免疫グロブリンを分泌することができる適切ないくつかの宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞、およびハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現させるための哺乳類組織細胞培養の使用が、概して、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７において考察されている。哺乳類宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモータ、およびエンハンサ（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８，１９８６参照）、ならびに必須のプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ配列を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類の遺伝子に、または哺乳類のウイルスに由来するプロモータを含有する。適切なプロモータは、構成的であり得、細胞型特異的であり得、ステージ特異的であり得、かつ／または調整可能もしくは調節可能であり得る。有用なプロモータとして、以下に限定されないが、メタロチオネインプロモータ、構成的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン誘導ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモータ、構成的ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン誘導ＣＭＶプロモータ（例えばヒト即初期ＣＭＶプロモータ）、構成的ＣＭＶプロモータ、および当該技術において知られているプロモータ−エンハンサの組合せが挙げられる。
【０３５４】
対象となるポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の型に応じて変わる。例えば、塩化カルシウム形質移入が、原核細胞に一般的に利用されるが、リン酸カルシウム処理または電気穿孔法が、他の細胞宿主に用いられ得る（概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前掲参照）。他の方法として、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射およびマイクロインジェクション、バリスティック法、ウイロゾーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、剤によるＤＮＡ吸収増強（ａｇｅｎｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ＤＮＡ）、ならびにイクスビボ形質導入が挙げられる。多くの場合、組換えタンパク質の長期的多収産生のために、安定した発現が所望されることとなる。例えば、抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’）の鎖を安定して発現する細胞株が、ウイルスの複製起点または内因性の発現要素を含有する発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を用いて、調製され得る。ベクターの導入後、細胞を、富化培地中で１〜２日間増殖させてから、選択培地にスイッチすることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、そしてその存在により、選択培地において、導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長が可能となる。耐性を示す、安定して形質移入された細胞が、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖され得る。
【０３５５】
抗体フラグメント、例えばＦａｂまたはＦａｂ’が、酵素、例えばパパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）、またはペプシン（Ｆａｂ’フラグメントを生成するため）その他を用いた、免疫グロブリン分子のタンパク質分解開裂によって生成され得る。また、Ｆａｂフラグメントと比較して、Ｆａｂ’フラグメントは、免疫グロブリン分子の２つの重鎖間にジスルフィド結合を形成する２つの天然システインを含むヒンジ領域を含有する。
【０３５６】
治療用途
本開示の結合体は、種々の用途に有用であり、以下に限定されないが、造血幹細胞の除去を必要とする患者、例えば、造血幹細胞移植レシピエントにおいて、造血幹細胞を除去する用途が挙げられる。したがって、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるいずれかの結合体の有効な量を、造血幹細胞の除去を必要とする患者に投与することによる、患者において造血幹細胞を除去する方法である。また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるいずれかの結合体の有効な量を患者に投与して、患者に造血幹細胞移植を実行する前に、結合体による、患者の循環系からの一掃のための十分な期間を許容することによる、造血幹細胞移植患者（例えば移植レシピエント）のコンディション調整方法である。結合体は、患者に静脈内投与され得る。また、提供されるのは、本明細書中に記載される結合体または医薬組成物のいずれかの、造血幹細胞の除去を必要とする患者において造血幹細胞を除去するための使用である。さらに提供されるのは、本明細書中に記載される結合体または医薬組成物のいずれかの、造血幹細胞の除去を必要とする患者において造血幹細胞を除去するための医薬の製造における使用である。
【０３５７】
内因性の造血幹細胞は、通常、骨髄洞様毛細血管内に存在する。幹細胞が存在する物理的環境は、幹細胞微環境または幹細胞ニッチと呼ばれる。このニッチに含まれる間質細胞および他の細胞は、可溶性の、かつ結合する要因を与え、これが多数の影響を及ぼす。造血幹細胞とそのニッチとの相互作用について、種々のモデルが提唱されてきた。例えば、幹細胞が分裂する場合に、たった１つの娘細胞がニッチ内に残って、他の娘細胞がニッチを去って分化するモデルが示唆されてきた。移植の効率が、内因性の造血幹細胞の選択的な枯渇によって増強されることによって、ドナー幹細胞の移植のための幹細胞ニッチが開き得ることが提唱されてきた（例えば、国際公開第２００８／０６７１１５号パンフレット参照）。
【０３５８】
造血幹細胞（ＨＳＣ）移植、または骨髄移植（早期（ｅａｒｌｉｅｒ）と呼ばれる）は、体の血液幹細胞を襲う広範な疾患、例えば白血病、重度の貧血、免疫欠乏、および一部の酵素欠損疾患のための確立された処置である。これらの疾病により、多くの場合、患者は、新しい、健康な血球によって骨髄が置き換えられなくてはならない。
【０３５９】
ＨＳＣ移植は多くの場合、同種間であり、これは、患者が、同じ種の別の個人、きょうだいの、適合血縁の、同ハプロの血縁または非血縁のボランティアドナーから幹細胞を受け取ることを意味する。造血幹細胞移植が必要な患者の約３０％が、組織型が適合性であるきょうだいを利用してきたと推定される。患者のその他７０％は、非血縁のボランティアドナーのマッチング、または同ハプロの血縁ドナーのアベイラビリティに頼らなければならない。ドナーおよび患者細胞の特性が比較可能であることが重要である。造血幹細胞移植はまた、自己由来であってもよく、移植される細胞が対象自身に由来することとなる、すなわち、ドナーとレシピエントが同じ個人である。さらに、移植は、同系であってよく、すなわち、遺伝的に同じ個人、例えば双子に由来してよい。更なる態様において、移植は異種間であってよく、すなわち、異なる種に由来してよく、これは、例えば臓器移植用の、同じ種のドナーが十分でない場合に、対象となる。
【０３６０】
ＨＳＣ移植前に、患者は通常、前処置またはコンディション調整方法を経験する。この前処置またはコンディション調整の目的は、体内のできるだけ多くの不所望の細胞（例えば悪性／癌細胞）を除去すること、拒絶を最小にすること、かつ／または幹細胞ニッチを、内因性のＨＳＣの枯渇によって開けて、当該ニッチ中にドナー幹細胞を効率的に移植することである。次に、ドナーの健康なＨＳＣが、患者の静脈内に、または場合によっては骨内に与えられる。しかしながら、不十分な移植、免疫拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、または感染症が挙げられる多くのリスクが、ＨＳＣ移植に付随する。ドナーおよび患者の細胞が、組織型に関して等しいと思われる、例えば、ＭＨＣ分子がマッチする（または同ハプロである）といえども；これらの個人間になお軽微な差異があり、免疫細胞が危険であると認められる場合がある。これは、新しい免疫系（新しい幹細胞由来の白血球）が、新しい体を「異質である」と認めて、免疫攻撃を誘発することを意味する。移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）と呼ばれるこの反応は、患者にとって致命的になる虞がある。ＨＳＣ移植後の患者はまた、新しい骨髄が機能し始める前の白血球の不在に起因して、感染のリスクが増大する。この期間は、場合によっては、新しい免疫系が成熟するまで何ヶ月も続く場合がある。これらの日和見感染の一部が、致命的となる虞がある。
【０３６１】
ゆえに、コンディション調整方法および移植方法を向上させ、かつＨＳＣ移植に伴うリスクを低下させ、かつ種々の障害についての有効性を増大させることが必要とされている。本明細書中で提供されるのは、新しい抗体薬物結合体であり、これは、移植の前に、レシピエントの内因性のＨＳＣを、全てではないが他の免疫細胞を除いて、特異的に死滅させることによって、部分的に活性な免疫防御を維持して、移植直後の感染と戦うが、同時に、対象が、自身のＨＳＣ由来の新しい免疫細胞を形成できないことに起因する、間接的な免疫抑制効果を提供する。前処置は、化学療法または放射線よりも軽度であり得、そして副作用があまり重篤でないので、移植患者においてＧＶＨＤをあまり誘導し得ない。
【０３６２】
本明細書中に記載される抗体薬物結合体は、例えば、造血幹細胞の移植前の前処置／コンディション調整方法において、内因性の造血幹細胞を除去するのに用いられ得る。例えば、本発明の結合体は、幹細胞移植が有益であり得るあらゆる非悪性症状／障害、例えば、重症無形成性貧血（ＳＡＡ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ハーラー症候群、家族性食血細胞性リンパ球組織球形成症（ＦＨＬ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、コストマン症候群、重症免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、他の自己免疫疾患、例えばＳＬＥ、多発性硬化症、ＩＢＤ、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、脈管炎、狼瘡、重症性筋無力症、ウェゲナー病、先天性代謝異常、および／または他の免疫不全を処置するのに用いられ得る。
【０３６３】
さらに、本発明の結合体は、幹細胞移植が有益であり得るあらゆる悪性症状／障害、例えば、血液病、血液悪性腫瘍、または固形腫瘍（例えば、腎癌、肝癌、膵癌）を処置するのに用いられ得る。特許請求される方法および抗体で処置され得る血液疾患／悪性腫瘍の共通する型は、白血病、リンパ腫、および骨髄異形成症候群である。白血病は、芽球細胞と呼ばれる未発達の白血球の異常な増加によって特徴付けられる血液または骨髄の癌のタイプであり、用語白血病は：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性単球白血病（ＡＭｏＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および他の白血病、例えば有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大型顆粒リンパ性白血病、および成人Ｔ細胞白血病を含む。本発明の一態様において、処置される白血病は、急性白血病である。更なる態様において、白血病は、ＡＬＬ、ＡＭＬ、またはＡＭｏＬである。リンパ腫として、前駆体Ｔ細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、菌状息肉腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、他に規定されない限り、ホジキンリンパ腫のホジキンリンパ腫混合細胞亜型の結節性硬化症形態が挙げられる。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄中の造血細胞が損傷を受けたときに生じる一群の症状の名前である。この損傷は、１つ以上の血球型の数の低下に至る。ＭＤＳは、７つのカテゴリーに再分割される；単系列の形成異常を伴う不応性血球減少（ＲＣＵＤ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多系列の形成異常を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ）、過剰な芽球−１を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−１）、過剰な芽球−２を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−２）、骨髄異形成症候群、分類不能（ＭＤＳ−Ｕ）、および単独ｄｅｌ（５ｑ）を伴う骨髄異形成症候群。
【０３６４】
一部の実施形態において、造血幹細胞を除去することが必要な患者（例えば造血幹細胞移植レシピエント）は、遺伝性の免疫不全疾患、自己免疫疾患、造血障害、または先天性代謝異常を有し得る。
【０３６５】
一部の実施形態において、造血障害は、以下のいずれかから選択され得る：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性単球白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、無形成性貧血、赤芽球癆、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコーニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球貧血、重症複合型免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球増多症。
【０３６６】
先天性代謝異常はまた、遺伝性代謝病（ＩＭＢ）または先天性代謝病としても知られており、これらは、遺伝的疾患の一クラスであり、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝の先天性障害、またはリソソーム蓄積症が挙げられる。一部の実施形態において、先天性代謝異常は、ムコ多糖症、ゴーシェ病、異染性ロイコジストロフィ、または副腎脳白質ジストロフィから選択される。
【０３６７】
さらに、本発明の結合体は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、例えば、ｃＫＩＴ陽性であるＧＩＳＴを処置するのに用いられ得る。一部の実施形態において、本発明の結合体は、野生型ｃＫＩＴを発現するＧＩＳＴを処置するのに用いられ得る。一部の実施形態において、本発明の結合体は、処置、例えば、イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）／Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））に耐性を示すＧＩＳＴを処置するのに用いられ得る。
【０３６８】
併用療法
特定の例において、本開示の抗体薬物結合体は、別のコンディション調整連隊、例えば、放射線治療または化学療法と併用され得る。
【０３６９】
特定の例において、本開示の抗体薬物結合体は、別の治療薬、例えば、抗癌剤、制吐剤（または鎮吐薬）、鎮痛剤、動員剤（ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、またはそれらの組合せと併用され得る。
【０３７０】
併用療法での使用が考えられる一般的な化学療法薬として、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）、またはＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポゾーム注射（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ，Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンシトラートリポゾーム注射（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ、（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロサン２０カルムスチンインプラント（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ  ２０  ｗｉｔｈ  ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔ）（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用の塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
【０３７１】
一部の実施形態において、本開示の抗体薬物結合体は、ＣＤ４７遮断薬、例えば、抗ＣＤ４７抗体またはそのフラグメントと組み合わせて用いられ得る。ＣＤ４７とシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ）との相互作用を遮断する抗ＣＤ４７ミクロボディが、裸の抗ｃＫＩＴ抗体によって、内因性のＨＳＣの枯渇を増強し得ることが報告された（Ｃｈｈａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８（３５１），３５１ｒａ１０５）。
【０３７２】
一部の実施形態において、本開示の抗体薬物結合体は、造血幹細胞または造血前駆細胞に特異的に結合する別の抗体またはそのフラグメント、例えば、抗ＣＤ４５抗体もしくはそのフラグメント、抗ＣＤ３４抗体もしくはそのフラグメント、抗ＣＤ１３３抗体もしくはそのフラグメント、抗ＣＤ５９抗体もしくはそのフラグメント、または抗ＣＤ９０抗体もしくはそのフラグメントと組み合わせて用いられ得る。一部の実施形態において、本開示の抗体薬物結合体は、Ｄｙｒｋ１ａインヒビタ、例えば、Ｈａｒｍｉｎｅ、ＩＮＤＹ、ＭＬ  ３１５ヒドロクロリド、ＰｒｏＩＮＤＹ、Ｔｏｃｒｉｓ（商標）ＴＣ−Ｓ  ７０４４、Ｔｏｃｒｉｓ（商標）ＴＧ  ００３、ＦＩＮＤＹ、ＴＢＢ、ＤＭＡＴ、ＣａＮＤＹその他と組み合わせて用いられ得る。
【０３７３】
一部の実施形態において、本開示の抗体薬物結合体は、１つ以上の免疫サプレッサ、例えば、グルココルチコイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾン；細胞増殖抑制剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシンその他；イムノフィリンに作用する薬物、例えば、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）、Ａｓｔｏｇｒａｆ  ＸＬ（登録商標）、またはＥｎｖａｒｓｕｓ  ＸＲ（登録商標））、シロリムス（ラパマイシンまたはＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標））、およびエベロリムス；インターフェロン；オピオイド；ＴＮＦ結合タンパク質；ミコフェノラート；フィンゴリモド；ミリオシン；その他と組み合わせて用いられ得る。一部の実施形態において、本開示の抗体薬物結合体は、Ｔ細胞を特異的に枯渇させる１つ以上の剤、例えば、フルダラビン、シクロスポリン、抗ＣＤ５２抗体、例えば、アレムツズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ３抗体もしくはそのフラグメント、抗ＣＤ４抗体もしくはそのフラグメント、抗ＣＤ８抗体もしくはそのフラグメント、または抗ヒトＴｃＲα／β抗体もしくはそのフラグメントと組み合わせて用いられ得る。Ｔ細胞枯渇治療は、移植の拒絶に至り得る宿主対移植片反応を低下させることができる。
【０３７４】
一部の実施形態において、本開示の抗体薬物結合体は、プレリキサホル（ＡＭＤ３１００、Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）としても知られている）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、例えば、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））、または顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えば、フィルグラスチムまたはペグフィルグラスチム（Ｚａｒｚｉｏ（登録商標）、Ｚａｒｘｉｏ（登録商標）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）、Ｎｕｆｉｌ（登録商標）、Ｒｅｌｉｇｒａｓｔ（登録商標）、Ｅｍｇｒａｓｔ（登録商標）、Ｎｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｇｒａｆｅｅｌ（登録商標）、Ｉｍｕｍａｘ（登録商標）、Ｆｉｌｃａｄ（登録商標））から選択される１つ以上の剤と組み合わせて用いられ得る。
【０３７５】
一態様において、本開示の抗体薬物結合体は、医薬的組合せ製剤、または併用療法としての投薬レジメンにおいて、抗癌特性を有する第２の化合物と組み合わされる。医薬的組合せ製剤または投薬レジメンの第２の化合物は、互いに悪影響を及ぼさないように、組合せの結合体に対する補完的な活性を有し得る。
【０３７６】
本明細書中で用いられる用語「医薬的組合せ」は、一投薬量単位形態の固定された組合せ、または併用投与用の非固定組合せもしくはパーツのキットを指し、２つ以上の治療薬は、同時に独立して、またはある時間間隔内で別々に投与され得、とりわけ当該時間間隔により、組合せパートナーは、協働的な効果、例えば相乗効果を示し得る。
【０３７７】
用語「併用療法」は、本開示に記載される治療の症状または障害を処置するための、２つ以上の治療薬の投与を指す。そのような投与は、実質的に同時の、例えば、活性成分の比率が固定されている単一のカプセルでの、当該治療薬の同時投与を包含する。これ以外にも、そのような投与は、各活性成分について複数回の、または別々のコンテナ（例えば、カプセル、粉末、および液体）での同時投与を包含する。粉末および／または液体が、投与前に所望の用量に再構成されても希釈されてもよい。加えて、そのような投与はまた、各タイプの治療薬の、おおよそ同時での、または異なる時点での、逐次的な使用を包含する。いずれにせよ、処置レジメンは、本明細書中に記載される症状または障害を処置する際に、薬物組合せの有益な効果を提供することとなる。
【０３７８】
併用療法は、「相乗効果」を提供し得、かつ「相乗効果的」であること、すなわち、活性成分が一緒に用いられる場合に達成される効果が、化合物を別々に用いることに由来する効果の和よりも大きいことを立証し得る。活性成分が：（１）同時調合されて、組み合わされた、ユニット投薬量の製剤で同時に投与もしくは送達され；（２）交互に、もしくは別々の製剤として同時に送達され；または（３）他の何らかのレジメンによる場合に、相乗効果が達成され得る。交互療法で送達される場合、化合物が、例えば別々のシリンジでの異なる注射によって、順次投与または送達される場合に、相乗効果が達成され得る。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効な投薬量が順次、すなわち連続的に投与されるが、併用療法において、２つ以上の活性成分の有効な投薬量が、一緒に投与される。
【０３７９】
医薬組成物
本明細書中に記載される１つ以上の抗体薬物結合体を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、提供された結合体は、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と混合され得る。
【０３８０】
治療薬および診断薬の製剤が、例えば凍結乾燥された粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸濁液の形態の、生理的に許容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２０００；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９３；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９０；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９０；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２０００参照）。
【０３８１】
一部の実施形態において、本発明の抗体結合体を含む医薬組成物は、凍結乾燥調製物である。特定の実施形態において、抗体結合体を含む医薬組成物は、抗体結合体、ヒスチジン、スクロース、およびポリソルベート２０を含有するバイアル内の凍結乾燥品である。特定の実施形態において、抗体結合体を含む医薬組成物は、抗体結合体、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベート２０を含有するバイアル内の凍結乾燥品である。特定の実施形態において、抗体結合体を含む医薬組成物は、抗体結合体、トレハロース、シトラートおよびポリソルベート８を含有するバイアル内の凍結乾燥品である。凍結乾燥品は、注射用に、例えば水、生理食塩水で再構成され得る。特定の実施形態において、溶液は、約５．０のｐＨにて、抗体結合体、ヒスチジン、スクロース、およびポリソルベート２０を含む。別の特定の実施形態において、溶液は、抗体結合体、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む。別の特定の実施形態において、溶液は、約６．６のｐＨにて、抗体結合体、トレハロース無水物、シトラート無水物、クエン酸、およびポリソルベート８を含む。静脈内投与用に、得られた溶液は通常、キャリア溶液中にさらに希釈されることとなる。
【０３８２】
治療薬についての投与レジメンの選択は、いくつかの因子に依存し、実体の血清または組織代謝回転速度、病徴のレベル、実体の免疫原性、および生体マトリックス内での標的細胞のアクセシビリティが挙げられる。特定の実施形態において、投与レジメンは、患者に送達される治療薬の量を、副作用の許容可能なレベルに合わせて最大にする。したがって、送達される生物製剤の量は、特定の実体、および処置されることとなる症状の重症度に部分的に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択するガイダンスが入手可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，１９９６；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１；Ｂａｃｈ（ｅｄ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３；Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８，２００３；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３，１９９９；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２，２００１；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９，２０００；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２，２００３；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２，２０００参照）。
【０３８３】
適切な用量の決定は、例えば、当該技術において知られている、または推測される、処置に影響を及ぼす、または処置に影響を及ぼすと予測されるパラメータまたは因子を用いて、臨床医によってなされる。通常、用量は、適量よりも幾分少ない量から始めて、その後、所望の、または最適な効果が達成されるまで、あらゆる負の副作用に対して、小さな増分で増やされる。重要な診断尺度として、例えば、生成される炎症サイトカインの炎症またはレベルの、病徴の尺度が挙げられる。
【０３８４】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式にとって所望される治療反応を、患者に有毒であることなく達成するのに有効である活性成分の量を得るように変わり得る。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時点、使用されることとなる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、および／または材料、処置されることとなる患者の年齢、性別、体重、症状、健康状態、および先の病歴、ならびに当該医療技術において知られているような因子が挙げられる、種々の薬物動態学的因子に依存することとなる。
【０３８５】
本発明の抗体結合体を含む組成物が、連続注入によって、あるいは、例えば、１日、１週の間隔での、または１週あたり１〜７回、隔週、３週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回、もしくは８週毎に１回の用量によって、提供され得る。用量は、静脈内に、皮下に、または骨内に提供されてよい。具体的な用量プロトコルは、不所望の大きな副作用を回避する最大用量または用量頻度を包含するものである。
【０３８６】
本発明の抗体結合体について、患者に投与される投薬量は、０．０００１ｍｇ／患者の体重ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであってよい。投薬量は、０．００１ｍｇ／患者の体重ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであってよい。抗体結合体の投薬量は、患者の体重キログラム（ｋｇ）に、投与されることとなる用量ｍｇ／ｋｇを乗じて算出され得る。
【０３８７】
本発明の抗体結合体の服用が繰り返されてもよく、そして投与は、１日未満、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヵ月、７５日、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、または少なくとも６ヵ月区切られてよい。一部の実施形態において、本発明の抗体結合体は、週に２回、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、またはより少ない頻度で投与される。
【０３８８】
特定の患者に有効な量は、処置されることとなる症状、患者の総合的な健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重症度等の要因に応じて変わり得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９６；Ｄｅｎｔ，Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００１参照）。
【０３８９】
投与経路は、例えば、局所塗布または皮膚塗布、皮下注射または皮下注入、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内投与によってもよいし、持続的放出系またはインプラントによってもよい（例えば、Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６，１９８３；Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，１９８１；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，１９８２；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２，１９８５；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４，１９８０；米国特許第６，３５０，４６６号明細書および米国特許第６，３１６，０２４号明細書参照）。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤もしくは局所的麻酔薬、例えば注射部位の痛みを和らげるリドカイン、または双方を含んでもよい。加えて、肺投与も使用され得、例えば、インヘラーまたはネブライザの使用、およびエアロゾル化剤での調合によるものがある。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号明細書、米国特許第５，９８５，３２０号明細書、米国特許第５，９８５，３０９号明細書、米国特許第５，９３４，２７２号明細書、米国特許第５，８７４，０６４号明細書、米国特許第５，８５５，９１３号明細書、米国特許第５，２９０，５４０号明細書、および米国特許第４，８８０，０７８号明細書；ならびに国際公開第９２／１９２４４号パンフレット、国際公開第９７／３２５７２号パンフレット、国際公開第９７／４４０１３号パンフレット、国際公開第９８／３１３４６号パンフレット、および国際公開第９９／６６９０３号パンフレット参照（これらの出願はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３９０】
第２の治療薬、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線（例えば全身照射（ＴＢＩ））との同時投与または同時処置方法が、当該技術において知られている（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  （ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．；Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．参照）。有効な量の治療薬が、病徴を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％低下させ得る。
【０３９１】
本発明の抗体結合体と組み合わせて施され得る追加的な治療が、本発明の抗体結合体から５分未満離れて、３０分未満離れて、１時間離れて、約１時間離れて、約１〜約２時間離れて、約２時間〜約３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約５時間〜約６時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８時間〜約９時間離れて、約９時間〜約１０時間離れて、約１０時間〜約１１時間離れて、約１１時間〜約１２時間離れて、約１２時間〜１８時間離れて、１８時間〜２４時間離れて、２４時間〜３６時間離れて、３６時間〜４８時間離れて、４８時間〜５２時間離れて、５２時間〜６０時間離れて、６０時間〜７２時間離れて、７２時間〜８４時間離れて、８４時間〜９６時間離れて、または９６時間〜１２０時間離れて施されてよい。２つ以上の治療が、１回の同じ患者来院中に施されてよい。
【０３９２】
本発明は、医薬組成物の投与プロトコルであって、それを必要とする対象への、本発明の抗体結合体を単独で、または他の治療と組み合わせて含む投与プロトコルを提供する。本発明の併用療法の治療は、対象に、同時に施されてもよいし、順次施されてもよい。本発明の併用療法の治療はまた、周期的に施されてもよい。サイクリング治療は、第１の治療をしばらくの間施してから、第２の治療をしばらくの間施し、そしてこの逐次的な施しを繰り返して（すなわちサイクル）、治療（例えば剤）の１つに対する耐性の発達を低下させて、治療（例えば剤）の１つの副作用を回避し、もしくは和らげ、かつ／または治療の有効性を向上させることを包含する。
【０３９３】
本発明の併用療法の治療は、対象に同時に施されてよい。
【０３９４】
用語「同時に」は、正確に同時に治療を施すことに限られず、むしろ、本発明の抗体または抗体結合体が、他の治療と一緒に作用して、普通に施されるよりも利益が増すような順序で、かつ時間間隔内で、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物が対象に投与されることを意味する。例えば、各療法は、同時に、または異なる時点にてあらゆる順序で順次、対象に施されてよい；しかしながら、同時に施されないならば、所望の治療効果をもたらすほど十分に近い時間で施されるべきである。各療法は、対象に別々に、あらゆる適切な形態で、かつあらゆる適切な経路によって投与され得る。種々の実施形態において、治療は、５分未満離れて、１５分未満離れて、３０分未満離れて、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１時間〜約２時間離れて、約２時間〜約３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約５時間〜約６時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８時間〜約９時間離れて、約９時間〜約１０時間離れて、約１０時間〜約１１時間離れて、約１１時間〜約１２時間離れて、２４時間離れて、４８時間離れて、７２時間離れて、または１週離れて、対象に投与される。他の実施形態において、２つ以上の治療が、同じ患者来院中に施される。
【０３９５】
併用療法は、対象に、同じ医薬組成物で施されてよい。これ以外にも、併用療法の治療薬は、対象に、別個の医薬組成物で同時に投与されてもよい。治療薬は、同じ投与経路または異なる投与経路によって、対象に投与されてよい。
【０３９６】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、説明の目的でしかないこと、そしてそれを考慮した種々の修飾または変更が、当業者に示唆されることとなり、かつ本願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれ得ることが理解される。
【実施例】
【０３９７】
実施例１：抗ｃＫＩＴ  ＡＤＣの生成
部位特異的システイン突然変異を有する、または有していない抗ｃＫｉｔ抗体および抗体フラグメントの調製
以前に国際公開第２０１４１５０９３７号パンフレットおよび国際公開第２０１６０２０７９１号パンフレットに記載されるようにして、ヒト抗ｃＫＩＴ抗体および抗体フラグメントを生成した。
【０３９８】
抗ｃＫｉｔ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、ファージディスプレイベースのスクリーニングで単離したベクターから増幅して、ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の定常領域を含有する哺乳類発現ベクター中にクローニングした。ベクターは、ＣＭＶプロモータおよびシグナルペプチド（重鎖用のＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１５１）および軽鎖用のＭＳＶＬＴＱＶＬＡＬＬＬＬＷＬＴＧＴＲＣ（配列番号１５２））、ならびに、細菌宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファ細胞中でのＤＮＡの増幅、哺乳類細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞中での一過性発現、または哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞中への安定した形質移入に適したシグナル配列および選択配列を含有する。Ｃｙｓ突然変異を導入するために、部位特異的突然変異誘発ＰＣＲを、重鎖コーディング配列または軽鎖コーディング配列の定常領域内の特定の部位にて単一のＣｙｓ残基を置換するように設計したオリゴで行った。Ｃｙｓ置換突然変異の例として、重鎖のＥ１５２ＣもしくはＳ３７５Ｃ；カッパ軽鎖のＥ１６５ＣもしくはＳ１１４Ｃ；またはラムダ軽鎖のＡ１４３Ｃ（全てＥＵナンバリング）がある。場合によっては、２つ以上のＣｙｓ突然変異を組み合わせて、複数のＣｙｓ置換、例えばＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ、ラムダＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ、カッパＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ、またはカッパＬＣ−Ｓ１１４Ｃ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ（全てＥＵナンバリング）を有する抗体を製造した。抗体フラグメントをコードするプラスミドを生成するために、突然変異誘発ＰＣＲを、重鎖定常領域の一部を除去し、または修飾するように設計したオリゴで行った。例えば、Ｆａｂフラグメント用の発現構築体を製造するために、終止コドンが残基２２１（ＥＵ番号）の直後にコードされるように、重鎖定常領域の残基２２２〜４４７（ＥＵナンバリング）を除去するＰＣＲを実行した。例えば、ＩｇＧ１ヒンジの２つのＣｙｓ残基を含むＦａｂ’フラグメント用の発現構築体を製造するために、終止コドンが残基２３２（ＥＵ番号）の直後にコードされるように、重鎖定常領域の残基２３３〜４４７（ＥＵナンバリング）を除去するＰＣＲを実行した。
【０３９９】
抗ｃＫｉｔ抗体、抗体フラグメント、およびＣｙｓ突然変異抗体または抗体がフラグメントを、以前に記載される一過性形質移入法（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．７５：１９７−２０３（２００１））を用いて、重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを同時形質移入することによって、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞中で発現させた。発現された抗体を、細胞上清から、適切な樹脂、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、Ｃａｐｔｏ−Ｌ樹脂、またはＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を用いた標準的な親和性クロマトグラフィ法によって精製した。これ以外にも、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをＣＨＯ細胞中に同時に形質移入することによって、抗ｃＫｉｔ抗体、抗体フラグメント、およびＣｙｓ突然変異抗体または抗体フラグメントを、ＣＨＯ内で発現させた。細胞は選択を経験し、そして次に、安定して形質移入された細胞を、抗体産生用に最適化された条件下で培養した。抗体を、上記のように細胞上清から精製した。
【０４００】
抗ｃＫｉｔ抗体および抗体フラグメントの還元、再酸化、および毒物への結合
抗体または抗体フラグメント上のチオール基（Ｃｙｓ側鎖）への反応のための反応性部分、例えばマレイミド基、記載したリンカー、および官能部分、例えばオーリスタチンまたは他の毒物で構成される化合物を、天然の、または以前に記載される方法（例えば、国際公開第２０１４１２４３１６号パンフレット、国際公開第２０１５１３８６１５号パンフレット、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：９２５−９３２（２００８））を用いて操作した抗体中のＣｙｓ残基に結合させた。
【０４０１】
哺乳類細胞内で発現される抗体中の操作されたＣｙｓ残基が、生合成中に付加物（ジスルフィド）、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）および／またはシステインによって修飾される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）ので、最初に発現される修飾されたＣｙｓは、チオール反応性試薬、例えばマレイミド、またはブロモアセトアミド基もしくはヨードアセトアミド基に非反応性である。操作されたＣｙｓ残基に結合するために、グルタチオン付加物またはシステイン付加物が、ジスルフィドを還元することによって除去される必要があり、通常、発現された抗体内の全てのジスルフィドを還元することを要する。また、抗体および抗体フラグメント中の天然のＣｙｓ残基は、通常、抗体または抗体フラグメント中の他のＣｙｓ残基に対してジスルフィド結合を形成するので、ジスルフィドが還元されるまで、チオール反応性試薬に対して非反応性である。ジスルフィドの還元は、最初に、抗体を還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）に曝すことによって、達成され得る。場合によっては、還元剤を除去することで、抗体または抗体フラグメントの全ての天然のジスルフィド結合の再酸化が、官能抗体構造を回復かつ／または安定化させ得る。
【０４０２】
抗体または抗体フラグメントが、操作されたＣｙｓ残基にのみ結合して、天然のジスルフィド結合、および操作されたＣｙｓ残基のシステイン付加物またはＧＳＨ付加物間のジスルフィド結合が低下した場合、新たに調製したＤＴＴを、Ｃｙｓ突然変異精製抗体に加えて、１０ｍＭまたは２０ｍＭの最終濃度にした。ＤＴＴによる３７℃での１時間の抗体インキュベーションの後、混合物を、毎日のバッファ交換により３日間、ＰＢＳに対して透析して、ＤＴＴを除去して、天然のジスルフィド結合を再酸化した。再酸化プロセスを、逆相ＨＰＬＣによって監視した。これは、抗体四量体を、個々の重鎖分子および軽鎖分子から分離することができる。反応を、８０℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓ  ４０００Ａカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）上で分析して、カラム溶出を、０．１％ＴＦＡを含有する水中３０〜６０％アセトニトリルの直線勾配によって、１．５ｍｌ／分の流量にて実行した。カラムからのタンパク質の溶出を、２８０ｎｍにて監視した。再酸化が完了するまで、透析を続けた。再酸化により、鎖内ジスルフィドおよび鎖間ジスルフィドが回復する一方、透析により、新たに導入されたＣｙｓ残基に連結したシステインおよびグルタチオンは、透析されて除かれる（ｄｉａｌｙｚｅ  ａｗａｙ）。再酸化の後、マレイミド含有化合物を、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）中の再酸化された抗体または抗体フラグメントに、操作されたＣｙｓに対して典型的には１．５：１、２：１、または５：１の比率にて加えて、インキュベーションを１時間実行した。典型例として、過剰な遊離化合物を、標準的な方法によるプロテインＡまたは他の適切な樹脂上での精製に続く、ＰＢＳ中へのバッファ交換によって、除去した。
【０４０３】
これ以外にも、操作されたＣｙｓ部位を有する抗体または抗体フラグメントを、オン−レジン法（ｏｎ−ｒｅｓｉｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて還元かつ再酸化した。プロテインＡセファロースビーズ（抗体１０ｍｇあたり１ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム塩もマグネシウム塩もない）中で平衡化してから、抗体サンプルにバッチモードで加えた。３．４ｇのＮａＯＨを２５０ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０に加えることによって調製した溶液の１０ｍｌ中に、８５０ｍｇのシステインＨＣｌを溶解させることによって、０．５Ｍシステインのストックを調製してから、２０ｍＭシステインを抗体／ビーズスラリーに加えて、室温にて３０〜６０分間穏やかに混合した。ビーズを重力カラムにロードして、ＰＢＳの５０床容量で３０分未満で洗浄した。次に、カラムを、ＰＢＳの１床容量中に再懸濁したビーズでキャッピングした。再酸化の速度を調節するために、場合によっては、５０ｎＭ〜１μＭ塩化銅を加えた。樹脂の小試験サンプルを取り出して、ＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ）中に溶出して、先で説明したＲＰ−ＨＰＬＣによって分析することによって、再酸化の進行を監視した。再酸化が所望の完全性にまで進行したならば、操作されたシステイン上に２〜３モル過剰の化合物を加えることによって直ちに結合を開始させることができ、混合物は、室温にて５〜１０分間反応し得、それからカラムを、ＰＢＳの少なくとも２０カラム容量で洗浄した。抗体結合体を、ＩｇＧ溶出バッファで溶出して、０．１容量の０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０で中和して、ＰＢＳにバッファ交換した。一部の例において、樹脂上で抗体との結合を開始する代わりに、カラムを、ＰＢＳの少なくとも２０カラム容量で洗浄して、抗体を、ＩｇＧ溶出バッファで溶出して、バッファｐＨ８．０で中和した。次に、抗体を、結合反応に用い、または今後の使用のために急速凍結した。
【０４０４】
一部の例において、天然のＣｙｓ残基、例えば、重鎖対軽鎖の鎖間ジスルフィド結合を通常形成するものに、そして、抗体のヒンジ領域において、重鎖対重鎖の鎖間ジスルフィド結合を通常形成するＣｙｓ残基に、操作されたＣｙｓ残基の不在下で、または、操作されたＣｙｓ残基に結合が向けられるのと同時に、結合することが所望される。これらの場合、５倍過剰のＴＣＥＰを、ジスルフィド結合に加えることによって、抗体または抗体フラグメントを還元して、サンプルを、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、サンプルを、直ちに結合させ、または今後の結合のために＜−６０℃にて凍結した。マレイミド含有化合物を、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）中の抗体または抗体フラグメントに、結合に用いられるＣｙｓ残基に対して典型的には２：１の比率にて加えて、インキュベーションを１時間実行した。典型例として、過剰な遊離化合物を、脱塩カラムに続く、ＰＢＳへのより大量のバッファ交換によって除去した。
【０４０５】
抗体または抗体フラグメントを、アミン反応基、例えばＮＨＳエステルまたはテトラフルオロフェニルエステルを含むリンカー−薬物化合物（例えば、化合物（７）、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはＳＰＤＢ−ＤＭ４）と反応させることによって、リジン残基への結合を調製することができる。一例として、化合物（７）を、抗ＨＥＲ２  Ｆａｂ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ上のリジン残基に結合した。具体的には、抗ＨＥＲ２  Ｆａｂ−ＨＣ−Ｅ１５２Ｃを、一過性形質移入によってＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。Ｆａｂを、ｃａｐｔｏ−Ｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）親和性精製によって培地から捕捉して、ＩｇＧ溶出バッファ（Ｐｉｅｒｃｅ）中に溶出して、超濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）によってＰＢＳにバッファ交換した。Ｆａｂ溶液（５．８ｍｇ／ｍｌ）に、２倍のモル過剰の化合物（７）を加えた。混合物を室温にて３０分間インキュベートしてから、混合物を５０ｍＭトリスｐＨ８でクエンチした。次に、生じた結合体を、分取用ＳＥＣによってＰＢＳ中に精製した。
【０４０６】
完全長抗体からの抗体フラグメントの生成
一部の例において、抗体フラグメントを、先に記載されるように、発現の産物が抗体のフラグメントであるような抗体重鎖コード配列の遺伝的操作によって生成した。他の例において、抗体を、完全長抗体の酵素的消化によって生成した。
【０４０７】
出発抗体の残基１〜２２２（ＥＵナンバリング）を含むＦａｂフラグメントを生成するために、完全抗体を、固定化パパイン樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、メーカーのプロトコルに従って処理した。手短に言えば、ｐＨ７．０に調整した、新たに溶解した２０ｍＭシステイン−ＨＣｌの消化バッファ中での平衡化によって、固定化パパイン樹脂を調製する。抗体を、おおよそ１０ｍｇ／ｍｌに調整して、消化バッファにバッファ交換して、樹脂に、樹脂１ｍｌあたり４ｍｇのＩｇＧの比率にて加えて、３７℃にて５〜７時間インキュベートする。次に、樹脂を取り出して、抗体フラグメントを、適切な親和性樹脂によって精製し、例えば、プロテインＡ樹脂への結合によって、無傷のＩｇＧおよびＦｃフラグメントをＦａｂフラグメントから分離し、または分離を、サイズ排除クロマトグラフィによって行う。
【０４０８】
出発抗体の残基１〜２３６（ＥＵナンバリング）を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために、完全抗体を、タンパク質分解酵素で処理した。手短に言えば、抗体を、ＰＢＳ中におおよそ１０ｍｇ／ｍｌにて調製する。酵素を、１：１００の重量／重量比にて加えて、３７℃にて２時間インキュベートする。抗体フラグメントを、適切な親和性樹脂によって精製し、例えば、無傷のＩｇＧおよびＦｃフラグメントを、Ｆａｂ’フラグメントから、プロテインＡ樹脂への結合によって分離し、または分離を、サイズ排除クロマトグラフィによって行う。
【０４０９】
抗ｃＫｉｔ−毒物抗体および抗体フラグメント結合体の特性
抗体および抗体フラグメント結合体を分析して、結合の程度を判定した。化合物対抗体比を、還元かつ脱グリコシル化された（必要に応じて）サンプルについてのＬＣ−ＭＳデータから推測した。ＬＣ／ＭＳにより、結合体サンプル中の抗体に取り付けられたリンカー−ペイロード（化合物）の平均分子数の定量化が可能となる。高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、抗体を軽鎖および重鎖に分離し、そして還元条件下で、鎖あたりのリンカー−ペイロード群の数に従って、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を分離する。質量スペクトルデータにより、混合物中の構成要素種、例えば、ＬＣ、ＬＣ＋１、ＬＣ＋２、ＨＣ、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２その他の同定が可能となる。ＬＣ鎖およびＨＣ鎖上の平均ローディングから、化合物対抗体の平均比率を、抗体結合体について算出することができる。所定の結合体サンプルについての化合物対抗体比が、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する四量体抗体に取り付けた化合物（リンカー−ペイロード）分子の平均数を表す。
【０４１０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および／またはＰｒｏｔｅｉｎ  ＫＷ−８０３  ５μｍ  ３００×８ｍｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）のカラム上での分析サイズ排除クロマトグラフィ（ＡｎＳＥＣ）を用いて、結合体をプロファイルした；凝集度を、分析サイズ排除クロマトグラフィに基づいて分析した。
【０４１１】
例示的な抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ−毒物結合体の調製
抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−毒物ＤＡＲ４結合体または抗Ｈｅｒ２  Ｆａｂ−毒物ＤＡＲ４対照結合体を生成するために、５０ｍｇの完全ＩｇＧ（ＷＴ、導入したシステインなし）を、タンパク質分解酵素で消化した。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でのＳＥＣによって精製した。これ以外にも、抗ＨＥＲ２対照結合体または抗ｃＫｉｔ  Ｆａｂ’−毒物ＤＡＲ４結合体を生成するために、Ｆａｂ’ＨＣをコードするベクターを、ＣＨＯ中に、Ｆａｂ’ＬＣをコードするベクターと同時形質移入した。発現されたＦａｂ’を、プロテインＧ樹脂上での捕捉によって精製した。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’を、ＴＣＥＰの付加（鎖間ジスルフィドに対して５×過剰）によって還元して直ちに、本発明の化合物（遊離Ｃｙｓ残基に対して２．５×過剰）と反応させた。反応を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって監視して、化合物の追加の１×当量を、反応が完了するまで加えた。遊離化合物を、ＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって除去した。ＤＡＲは、≧３．９であると実験的に判定された。記載する実施例においてさらに研究した具体的な結合体を、表２中で一覧にする。
【０４１２】
抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ−毒物ＤＡＲ２結合体を生成するために、Ｃｙｓ残基を導入したＦａｂ  ＨＣ（Ｅ１５２ＣであるＨＣ１〜２２１、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターを、Ｃｙｓ残基を導入したＦａｂ  ＬＣ（カッパＬＣ  Ｋ１０７Ｃ、カッパＬＣ  Ｓ１１４Ｃ、またはカッパＬＣ  Ｅ１６５Ｃ、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターと、ＨＥＫ２９３中に同時形質移入した。抗Ｈｅｒ２  Ｆａｂ−毒物ＤＡＲ２対照結合体を生成するために、Ｃｙｓ残基を導入したＦａｂ  ＨＣ（Ｅ１５２ＣであるＨＣ１〜２２２、およびＣ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６２）、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターを、Ｃｙｓ残基を導入したＦａｂ  ＬＣをコードするベクター（カッパＬＣ  Ｋ１０７Ｃ、カッパＬＣ  Ｓ１１４Ｃ、またはカッパＬＣ  Ｅ１６５Ｃ、ＥＵナンバリングによる）と、ＨＥＫ２９３中に同時形質移入した。発現されたＦａｂを、Ｃａｐｔｏ−Ｌ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での捕捉、および標準的なＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ）による溶出によって精製した。Ｆａｂを、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。ＦａｂをＤＴＴで還元して、室温にて再酸化した。鎖間ジスルフィド結合の再形成の後、Ｆａｂを、化合物６に結合させた（遊離Ｃｙｓ残基に対して３×過剰）。反応を、室温にて３０分間進めて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって３１０ｎｍでの検出で監視した。結合したＦａｂを、プロテインＡ（抗ｈｅｒ２）またはｃａｐｔｏ−Ｌ（抗ｃＫｉｔ）の樹脂上で精製して、ＰＢＳ＋１％トリトンＸ−１００で洗浄して、大量のＰＢＳで洗浄してから、ＩｇＧ溶出バッファ中に溶出した。次に、Ｆａｂを、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。記載する実施例においてさらに研究した具体的な結合体を、実験的に判定したＤＡＲ値と共に、以下の表２中で一覧にする。
【０４１３】
抗ｃＫＩＴ  Ｆ（ａｂ’）２−毒物ＤＡＲ２結合体を生成するために、Ｃｙｓ残基を導入したＨＣ（Ｅ１５２ＣおよびＳ３７５Ｃ、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターを、Ｆａｂ  ＬＣをコードするベクターと、ＣＨＯ中に同時形質移入した。抗Ｈｅｒ２  Ｆ（ａｂ’）２−毒物ＤＡＲ２対照結合体を生成するために、Ｃｙｓ残基を導入したＨＣ（Ｅ１５２ＣおよびＳ３７５Ｃ、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターを、Ｆａｂ  ＬＣをコードするベクターと、ＨＥＫ２９３中に同時形質移入した。発現されたＩｇＧを、プロテインＡまたはｍａｂｓｅｌｅｃｔｓｕｒｅの樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での捕捉、および標準的なＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ）による溶出によって精製した。完全ＩｇＧを、ＤＴＴで室温にて還元して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって監視して、ＤＴＴの除去の後に再酸化した。次に、再酸化したＩｇＧを、タンパク質分解酵素で消化して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成した。抗ｃＫＩＴフラグメントについて、Ｆ（ａｂ’）２を、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。抗ＨＥＲ２フラグメントについて、Ｆ（ａｂ’）２画分を、分取用ＨＩＣによって濃縮してから、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。Ｆ（ａｂ’）２を、化合物４または化合物５に結合させた（遊離Ｃｙｓ残基に対して４×過剰）。反応を、室温にて３０分間進めて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって３１０ｎｍでの検出で監視した。結合したＦ（ａｂ’）２を、ｃａｐｔｏ−Ｌ（抗ｃＫｉｔ  Ａｂ３）樹脂上で精製して、ＰＢＳ＋１％トリトンＸ−１００で洗浄して、大量のＰＢＳで洗浄してから、ＩｇＧ溶出バッファ中に、または分取用ＳＥＣ（抗ｈｅｒ２および抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４）によって溶出した。次に、Ｆ（ａｂ’）２を濃縮して、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。記載する実施例においてさらに研究した具体的な結合体を、実験的に判定したＤＡＲ値と共に、以下の表２中で一覧にする。
【０４１４】
抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ−毒物ＤＡＲ１結合体を生成するために、Ｃｙｓ残基を導入したＨＣ（Ｅ１５２Ｃ、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターを、Ｆａｂ  ＬＣをコードするベクターと、ＨＥＫ２９３中に同時形質移入した。発現されたＩｇＧを、プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での捕捉、および標準的なＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ）による溶出によって精製した。完全ＩｇＧを、ＤＴＴで室温にて還元して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって監視して、ＤＴＴの除去後に再酸化した。ＩｇＧを、固定化パパイン（Ｔｈｅｒｍｏ）で消化して、Ｆａｂフラグメントを生成した。Ｆａｂを、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。Ｆａｂを、化合物４に結合させた（遊離Ｃｙｓ残基に対して４×過剰）。反応を、室温にて３０分間進めて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって３１０ｎｍでの検出で監視した。結合したＦａｂを、分取用ＳＥＣによってＰＢＳ中に精製した。
【０４１５】
抗Ｈｅｒ２  Ｆａｂ−毒物ＤＡＲ１対照結合体を生成するために、Ｃｙｓ残基を導入したＦａｂ  ＨＣ（Ｅ１５２Ｃ、ＥＵナンバリングによる）をコードするベクターを、Ｆａｂ  ＬＣをコードするベクターと、ＨＥＫ２９３中に同時形質移入した。発現されたＦａｂを、Ｃａｐｔｏ−Ｌ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での捕捉、および標準的なＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ）による溶出によって精製した。Ｆａｂを、Ａｍｉｃｏｎウルトラデバイスを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。Ｆａｂを、化合物７に結合させた（Ｆａｂに対して２×モル過剰）。反応を、室温にて３０分間進めて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって３１０ｎｍでの検出で監視した。結合を、５０ｍＭトリスｐＨ８．０でクエンチした。結合したＦａｂを、分取用ＳＥＣによってＰＢＳ中に精製した。
【０４１６】
【表２７】
2020504112.tif 000197
【０４１７】
【表２８】
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【０４１８】
【表２９】
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【０４１９】
【表３０】
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【０４２０】
【表３１】
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【０４２１】
【表３２】
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【０４２２】
実施例２：ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、マウス、およびラットのｃＫＩＴ細胞外ドメインタンパク質の、そして結合アッセイ用のｃＫＩＴサブドメイン１〜３および４〜５の生成
ヒト、マウス、およびラットのｃＫＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔのデータベース由来のアミノ酸配列（以下の表３参照）に基づいて遺伝子合成した。カニクイザルｃＫＩＴおよび１ＥＣＤ  ｃＤＮＡテンプレートを、種々のカニクイザル組織由来のｍＲＮＡを用いて生成したアミノ酸配列情報（例えばＺｙａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；以下の表４）に基づいて遺伝子合成した。全ての合成したＤＮＡフラグメントを、適切な発現ベクター、例えば、精製を可能にするＣ末端タグを有するｈＥＦ１−ＨＴＬＶベースのベクター（ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ−Ｆｃ２）中にクローニングした。
【０４２３】
【表３３】
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【０４２４】
【表３４】
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【０４２５】
【表３５】
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【０４２６】
【表３６】
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【０４２７】
組換えｃＫＩＴ  ＥＣＤタンパク質の発現
所望のｃＫＩＴ組換えタンパク質を、以前に懸濁培養に適合した、ＨＥＫ２９３由来の細胞株（２９３ＦＳ）内で発現させて、無血清培地ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ−２９３（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１２３３８０１８）中で増やした。小スケールのタンパク質生成および大スケールのタンパク質生成の双方を、一過性形質移入を介して、複数のシェーカーフラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ）内で、それぞれ最大１Ｌまで、プラスミドキャリアとして２９３Ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１２３４７０１９）と共に実行した。総ＤＮＡおよび２９３Ｆｅｃｔｉｎを、１：１．５（ｗ：ｖ）の比率にて用いた。ＤＮＡ対培養液比は、１ｍｇ／Ｌであった。細胞培養上清を、形質移入後３〜４日で収穫して、遠心分離して、滅菌濾過してから精製した。
【０４２８】
タグ付けしたＥＣＤタンパク質の精製
組換えＦｃタグ付きｃＫＩＴ細胞外ドメインタンパク質（例えば、ヒトｃＫＩＴ  ＥＣＤ−Ｆｃ、ヒトｃＫＩＴ（ＥＣＤサブドメイン１〜３、４〜５）−Ｆｃ、カニクイザルｃＫＩＴ−ｍＦｃ、ラットｃＫＩＴ−ｍＦｃ、マウスｃＫＩＴ−ｍＦｃ）を、細胞培養上清から精製した。澄明にした上清を、ＰＢＳで平衡化したプロテインＡセファロース（登録商標）カラムに通過させた。ベースラインにまで洗浄した後に、結合材料を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）低ｐＨ溶出バッファ、または１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）で溶出して、直ちに、１ＭトリスｐＨ９．０の１／８溶出容量で中和した。必要に応じて、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心濃縮器を、１０ｋＤまたは３０ｋＤの名目上の分子量カットオフで用いて、プールしたタンパク質を濃縮した。次に、プールを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００  ２６／６０カラムを用いたＳＥＣによって精製して、凝集体を除去した。次に、精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（マルチアングルレーザー光散乱）によって特徴付けた。濃度を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩによって配列から算出される理論上の吸収係数を用いた、２８０ｎｍでの吸光度によって判定した。
【０４２９】
実施例３：ｃＫＩＴ  ＥＣＤサブドメインへのｃＫＩＴ  Ｆａｂの結合
ｃＫＩＴ抗体の結合部位の定義を補助するために、ヒトｃＫＩＴ  ＥＣＤを、サブドメイン１〜３（リガンド結合ドメイン）およびサブドメイン４〜５（二量体化ドメイン）に分けた。どのサブドメインが結合されたかを判定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ｃＫＩＴサブドメイン１〜３、サブドメイン４〜５、または完全長ｃＫＩＴ  ＥＣＤに相当する、１×リン酸緩衝生理食塩水中に希釈した１μｇ／ｍｌ  ＥＣＤを、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４−ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃３８５５、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）上にコーティングして、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  １０１−０７８１）入り１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄した。プレートを、１×ＰＢＳ中に希釈した２８０μｌ／ウェル３％ウシ血清アルブミンで、室温にて２時間ブロックした。プレートを、洗浄バッファで３回洗浄した。抗体を、洗浄バッファ中に２μｇ／ｍｌにて調製して、８ポイントについて５倍希釈して、１００μｌ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに３反復で加えた。プレートを、室温にて１時間、２００ｒｐｍで振盪するオービタルシェーカ上でインキュベートした。アッセイプレートを、洗浄バッファで３回洗浄した。二次抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔ＃１０９−０３６−０８８、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、洗浄バッファ中に１：１０，０００で調製して、１００μｌ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートを、室温にて１時間、オービタルシェーカ上で２００ｒｐｍにて振盪させて、二次抗体とインキュベートした。アッセイプレートを、洗浄バッファで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルを発現させるために、１００μｌ／ウェルのＳｕｒｅ  ｂｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  Ｃａｔ＃５２−００−０３、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をプレートに加えて、室温にて１０分間インキュベートした。反応を止めるために、５０μｌの１Ｎ塩酸を、各ウェルに加えた。吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにて測定した。各抗体の結合応答を判定するために、光学密度測定値を、Ｅｘｃｅｌを用いて平均して、標準偏差値を得てグラフ化した。ｃＫＩＴに対する個々の抗ｃＫＩＴ抗体の結合特性を、表５中で見出すことができる。
【０４３０】
実施例４：ｃＫＩＴ抗体の親和性測定
ｃＫＩＴ種オーソログに対する、そしてまたヒトｃＫＩＴに対する抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をＣＭ５センサーチップと用いたＳＰＲ技術を用いて判定した。
【０４３１】
手短に言えば、２％Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキングバッファ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を補充したＨＢＳ−Ｐ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を、ランニングバッファとして全ての実験に用いた。固定レベルおよび分析物の相互作用を、応答単位（ＲＵ）によって測定した。パイロット実験を実行して、抗ヒトＦｃ抗体（カタログナンバーＢＲ１００８３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の固定化の実現可能性、および試験抗体の捕捉を試験かつ確認する。
【０４３２】
動態測定用に、抗体を、固定した抗ヒトＦｃ抗体を介してセンサーチップ表面に捕捉する実験を実行して、遊離溶液中で結合するｃＫＩＴタンパク質の能力を判定した。手短に言えば、２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体ｐＨ５を、ＣＭ５センサーチップ上に、アミン結合を介して、双方のフローセルで５μｌ／分の流量にて、１０，５００ＲＵに達するように固定した。次に、０．１〜１μｇ／ｍｌの試験抗体を、１０μｌ／分にて１分間注入した。抗体の捕捉レベルを、概して２００ＲＵ未満に維持した。その後、３．１２５〜５０ｎＭのｃＫＩＴ受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、２倍で段階希釈して、参照フローセルおよび試験フローセルの双方にわたって４０μｌ／分の流量にて３分間注入した。試験したＥＣＤの表を、以下で一覧にする（表５）。ＥＣＤ結合の解離を、１０分間続けた。各注入サイクルの後、チップ表面を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２で１０μｌ／分にて３０秒間再生した。全ての実験を２５℃にて実行して、応答データを、単純な１：１相互作用モデル（Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２（登録商標）ソフトウェアバージョン２．０ｂ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた）と包括的にフィットさせて、速度（ｋａ）、オフ−速度（ｋｄ）、および親和性（ＫＤ）の推定値を得た。表６は、選択した抗ｃＫＩＴ抗体のドメイン結合および親和性を一覧にしている。
【０４３３】
【表３７】
2020504112.tif 000207
【０４３４】
【表３８】
2020504112.tif 000208
【０４３５】
実施例５  ｃＫＩＴ  ＡＤＣによるインビトロヒトおよびマウスＨＳＣ細胞死滅アッセイ
インビトロＨＳＣ生存度アッセイ
ヒト動員末梢血造血幹細胞（ＨＳＣ）を、ＨｅｍａＣａｒｅ（カタログナンバーＭ００１Ｆ−ＧＣＳＦ−３）から得た。各バイアルの約１００万細胞を解凍して、１０ｍｌの１×ＨＢＳＳ中に希釈して、１２００ｒｐｍにて７分間遠心分離した。細胞ペレットを、３つの成長因子を含有する１８ｍｌの成長培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログナンバー０９６５０）（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログナンバー２８８−ＴＰ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログナンバーＰＨＣ９４１３）、およびＩＬ−６（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログナンバーＰＨＣ００６３）入り、アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログナンバー１０３７８−０１６）を補充）中に再懸濁させた。
【０４３６】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の骨髄細胞を、大腿骨および脛骨から収穫して、ＩＭＤＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログナンバーＳＨ３０２２８．０１）中に再懸濁させて、プールした。細胞を、３００ｇにて１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＡｕｔｏＭＡＣＳバッファ（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に、４０μｌ中１億細胞の濃度にて再懸濁させた。リネージ抗体カクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログナンバー１３０−０９０−８５８）を、１億細胞あたり１０μｌの濃度にて加えた。細胞を、低温室内で１０分間インキュベートしてから、１億細胞あたり３０μｌのＡｕｔｏＭＡＣＳバッファおよび２０μｌのビオチン化磁気ビーズを加えた。この新しい懸濁液を、低温室内で１５分間インキュベートした。細胞を、３００ｇにて１０分間遠心分離した。ペレットを、２ｍｌのＡｕｔｏＭＡＣＳバッファ中に再懸濁させて、細胞ストレーナに通過させた。細胞を、「枯渇」プロトコルを用いてＡｕｔｏＭＡＣＳ上で選択した。ソート由来の陰性画分を、３００ｇにて１０分間遠心分離して、１ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー５５０９９４）、抗ＣＤ４８−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログナンバー１１−０４８１−８２）、抗ＣＤ１５０−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログナンバー１１５９０４）、および抗Ｓｃａ−１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー５６０６５３）で染色した。細胞を、室温にて３０分間インキュベートして、３００ｇにて５分間遠心分離して、７００μｌのＦＡＣＳバッファ中にソーティング用に再懸濁させた。Ｓｃａ−１＋細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ上で陽性ソートした。ソートの後、細胞を、３つの成長因子を含有する成長培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログナンバー２８８−ＴＰ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログナンバーＰＨＣ９４１３）、およびＩＬ−６（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログナンバーＰＨＣ００６３）入り、アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログナンバー１０３７８−０１６）を補充）中に入れた。
【０４３７】
試験剤を、３８４ウェル黒色アッセイプレート中に、５μｌの最終容量に２反復で希釈して、１０μｇ／ｍｌから始めて１：３で段階希釈した。先に由来する細胞を、各ウェルに、４５μｌの最終容量にて加えた。細胞を、３７℃、５％酸素にて７日間インキュベートした。培養終了後、アッセイプレートを１２００ｒｐｍにて４分間遠心分離することによって、細胞を染色用に収穫した。次に、上清を吸引して、細胞を洗浄して、異なる３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＴＣ処理済み、黒色透明フラット、カタログナンバー７８１０９２）に移した。
【０４３８】
ヒト細胞アッセイ用に、各ウェルを、抗ＣＤ３４−ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー３４０６６６）および抗ＣＤ９０−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー５５９８６９）で染色して、洗浄して、ＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させて、５０μｌの最終容量にした。マウス細胞アッセイ用に、各ウェルを、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー５５０９９４）、抗ＣＤ４８−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログナンバー１１−０４８１−８２）、抗ＣＤ１５０−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログナンバー１１５９０４）、抗ｃＫＩＴ−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー５５３３５６）、および抗Ｓｃａ−１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログナンバー５６０６５３）で染色して、洗浄して、ＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させて、５０μｌの最終容量にした。次に、細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ上で分析して、分析用に定量化した。
【０４３９】
ｃＫＩＴを認識する抗体および抗体フラグメントの毒物結合体は、このアッセイで判定して、ＨＳＣを死滅させた。ＦＡＣＳによる細胞の定量化は、ＰＢＳで、または抗体もしくは抗体フラグメントのアイソタイプ対照毒物結合体で処理した対照ウェル中よりも、抗ｃＫＩＴ−毒物結合体で処理したウェル中で、より少ない生存細胞を示した。データを、図１、図２、および図９に示し、そして表７に要約する。本明細書中で用いた命名規則は、Ｊ＃であり、表２中に記載する特定の結合体Ｎｏ．に対応する。
【０４４０】
【表３９】
2020504112.tif 000209
【０４４１】
【表４０】
2020504112.tif 000210
【０４４２】
実施例６  ヒト肥満細胞脱顆粒のインビトロアッセイ
成熟した肥満細胞を、動員末梢血由来のＣＤ３４＋前駆体を用いて生成した。ＣＤ３４＋細胞を、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、組換えヒトインターロイキン６（ｒｈＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、組換えヒトＩＬ−３（３０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２ｎｍ、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。組換えｈＩｌ−３を、培養の第１週の間のみ加えた。第３週の後、培地の半分を、毎週、ｒｈＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するフレッシュな培地で置換した。成熟肥満細胞の純度を、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦＣεＲＩ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ１１７（ＢＤ）の表面染色によって評価した。培養の第８週から第１２週までの細胞を用いた。
【０４４３】
取り出した肥満細胞を洗浄して、ＳＣＦを除去して、細胞の必要とされる量を、ｒｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を有する、または有していない、ｒｈＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する肥満細胞培地中で一晩インキュベートした。肥満細胞脱顆粒の陽性対照として、細胞の一部を、ヒト骨髄腫ＩｇＥ（１００ｎｇ／ｍｌ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で感作した。翌日、抗ｃＫＩＴ抗体もしくは抗体フラグメント、またはその毒物結合体、マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ１（Ｆａｂ特異的、Ｓｉｇｍａ）、ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Ａｂｃａｍ）、および化合物４８／８０（Ｓｉｇｍａ）希釈剤を、０．０４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を補充したＨＥＰＥＳ脱顆粒バッファ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、５．６ｍＭグルコース、ｐＨを７．４に調整、そして１．８ｍＭ塩化カルシウムおよび１．３ｍＭ硫酸マグネシウムと混合）中に調製した。試験剤および抗ＩｇＧ１を、Ｖ底３８４ウェルアッセイプレート内で一緒に混合した一方、抗ＩｇＥおよび化合物４８／８０を単独で試験した。アッセイプレートを、３７℃にて３０分インキュベートした。インキュベーションの間、細胞を、ＨＥＰＥＳ脱顆粒バッファ＋０．０４％ＢＳＡで３回洗浄して、培地および非結合ＩｇＥを除去した。細胞を、ＨＥＰＥＳ脱顆粒バッファ＋０．０４％ＢＳＡ中に再懸濁させて、アッセイプレート内のウェルあたり３０００細胞にて播種して、５０μｌの最終反応容量にした。ＩｇＥで感作した細胞を、脱顆粒の陽性対照として、抗ＩｇＥのみと用いた。アッセイプレートを、３７℃にて３０分インキュベートして、脱顆粒を起こさせた。このインキュベーションの間、３．５ｍｇ／ｍｌのｐＮＡＧをクエン酸バッファ（４０ｍＭクエン酸、２０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中で超音波処理することによって、ｐ−ニトロ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（ｐＮＡＧ、Ｓｉｇｍａ）バッファを調製した。２０μｌの細胞上清を４０μｌのｐＮＡＧ溶液と平底３８４ウェルプレート内で混合することによって、β−ヘキソサミニダーゼの放出を測定した。このプレートを、３７℃にて１．５時間インキュベートして、反応を、４０μｌの停止溶液（４００ｍＭグリシン、ｐＨ１０．７）の付加によって停止した。プレートリーダーをλ＝４０５ｎｍにて用いて吸光度を読み、参照フィルタはλ＝６２０ｎｍであった。
【０４４４】
肥満細胞脱顆粒アッセイに用いた完全長ＩｇＧ対照を、表８に記載する。
【０４４５】
【表４１】
2020504112.tif 000211
【０４４６】
図３Ａに示すように、アンタゴニスト抗ｃＫＩＴ抗体クラスの特定のクローンは、肥満細胞脱顆粒を引き起こしそうにない。さらに、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントは、肥満細胞脱顆粒を引き起こし得ないことが示唆される。Ｆａｂ特異的抗体と架橋して直ぐに（図３Ｃ〜図３Ｊ）、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−毒物ＤＡＲ４フォーマットではなく完全長ＩｇＧは、脱顆粒の増大を示す。このことは、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを認識する既存の抗薬物抗体を患者が産生させ、または有する場合に観察され得るように、より大きな複合体に結合かつ多量体化された場合でさえ、Ｆａｂ’フラグメントが肥満細胞脱顆粒を引き起こさないことを示唆している。
【０４４７】
実施例７  マウス宿主からのヒトＨＳＣのインビボ除去
ヒトＨＳＣに対するインビボ有効性について試験剤を評価するために、重度免疫不全のマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストックナンバー００５５５７、ＮＳＧとしても知られている）に、亜致死照射（１３７Ｃｓガンマ発光体で２５０ＲＡＤＳ）の後、ヒトＨＳＣを移植した。ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログナンバーＣＢ００８Ｆ−Ｓ）から得た。各バイアルの約１００万細胞を解凍して、１０ｍｌの１×ＨＢＳＳ中に希釈して、１２００ｒｐｍにて７分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＨＢＳ中に１００，０００細胞／ｍｌにて再懸濁させた。１マウスあたり総数２０，０００細胞を、照射の２４時間後に、レトロオービタル注射を介して移植した。ヒトＨＳＣを、ＮＳＧマウス内に、少なくとも４週間植え付けた。ヒトキメラ化パーセントを、血液サンプルのフローサイトメトリによって判定した。このために、血液を以下の抗体で染色した：抗ヒトＣＤ４５−ｅ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃４８−０４５９−４２）、抗マウスＣＤ４５−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５９８６４抗ヒトＣＤ３３−Ｐｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃３４７７８７）、抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５５４２２）、および抗ヒトＣＤ３−ＰｅＣｙ７（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５７８５１）。ヒトキメラ化が確認されれば、ヒト化ＮＳＧマウスに、試験剤を腹膜内に１日２回投薬した。ヒトキメラ化の程度を、投薬後に再評価した。ヒトＨＳＣの有無を評価するために、マウスを安楽死させて、骨髄を単離して、以下の抗体で染色した：抗ヒトＣＤ４５−ｅ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃４８−０４５９−４２）、抗マウスＣＤ４５−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５９８６４）、抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃３４８０５７）、抗ヒトＣＤ３８−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃３４０９２６）、抗ヒトＣＤ１１ｂ−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５５３８８）、抗ヒトＣＤ３３−ＰｅＣｙ７（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃３３３９４６）、抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５５４１２）、および抗ヒトＣＤ３−ＰｅＣｙ７（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５７８５１）。細胞集団を、フローサイトメトリを介して評価して、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
【０４４８】
特定の一実験において、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの結合体Ｊ７（表２に記載）を１、２、もしくは４日間、１日２回、またはアイソタイプ対照結合体Ｊ８を４日間、１日２回投薬した。マウスを２１日目に安楽死させて、骨髄を分析した。図４に示すように、ビヒクル（ＰＢＳ）処理群との比較に基づいて、結合体Ｊ７で処理したマウスは、１日であっても、ヒトＨＳＣ（ヒトＣＤ４５＋、ヒトＣＤ３４＋、ヒトＣＤ３８−）の枯渇を示した一方、アイソタイプ対照結合体Ｊ８で処理したマウスは、処理前のヒト化の変動におそらく起因して、多様なキメラ化を示した。
【０４４９】
特定の一実験において、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｃＫＩＴ結合体Ｊ１、Ｊ２、もしくはＪ３を、またはアイソタイプ対照結合体Ｊ６を２日間投薬した。マウスを２１日目に安楽死させて、骨髄を分析した。図５に示すように、抗ｃＫＩＴ結合体Ｊ１、Ｊ２、またはＪ３で処理したマウスは、ヒトＨＳＣ（ヒトＣＤ４５＋、ヒトＣＤ３４＋、ヒトＣＤ３８−）の低下を示した一方、アイソタイプ対照結合体Ｊ６で処理したマウスは、多様なキメラ化を示した。
【０４５０】
特定の一実験において、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｃＫＩＴ結合体ＪＷ、ＪＸ、ＪＹ、またはＪＺを２日間投薬した。マウスを２１日目に安楽死させて、骨髄を分析した。図１３に示すように、抗ｃＫＩＴ結合体ＪＷ、ＪＸ、ＪＹ、またはＪＺで処理したマウスは、ヒトＨＳＣ（ヒトＣＤ４５＋、ヒトＣＤ３４＋、ヒトＣＤ３８−）の低下を示した。
【０４５１】
これらの３つの実験は共に、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ−毒物結合体または抗ｃＫｉｔ  Ｆａｂ’−毒物結合体が、ＨＳＣを骨髄から枯渇させることができたことを示している。抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ−アマニチン結合体（例えばＪ７）および抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−オーリスタチン結合体（例えば、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、ＪＷ、ＪＸ、ＪＹ）は、ヒトＨＳＣをインビボ除去することができた。
【０４５２】
実施例８  免疫コンピテントマウスにおけるマウスＨＳＣのインビボ除去
マウスＨＳＣに対するインビボ有効性について試験剤を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃０００６６４）に、試験剤を腹膜内に１日２回投薬した。血液学的プロファイルを、標準的な方法による最後の服用後１日という早い時期に、または最後の服用後の２１日目まで、評価した。マウスＨＳＣの有無を評価するために、マウスを安楽死させて、骨髄を単離して、以下の抗体で染色した：抗マウスＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５０９９４）、抗マウスｃＫＩＴ−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５３３５６）、抗マウスＣＤ４８−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃１１−０４８１−８２）、抗マウスＣＤ１５０−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ＃１１５９０４）、抗マウスＳｃａ−Ｖ４５０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５６０６５３）、抗マウスＬｉｎ−ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ＃１２０−００１−５４７）、およびＰｅ−Ｃｙ７−ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃５５７５９８）。細胞集団を、フローサイトメトリを介して評価して、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
【０４５３】
特定の一実験において、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｃＫＩＴ結合体Ｊ４もしくはＪ５（表２に記載）、またはＰＢＳを４日間、１日２回投薬した。１３日目に、骨髄分析のために、マウスを安楽死させた。抗ｃＫＩＴ結合体Ｊ４またはＪ５で処理した群は、ＰＢＳ処理済みの対照群と比較して、骨髄中の幹細胞および前駆体（ｃＫＩＴ＋）細胞のレベルの有意な低下を示した（図６）。このことは、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−オーリスタチン結合体、例えばＪ４またはＪ５による処理が、正常なマウスにおいてＨＳＣをインビボで除去することができたことを実証している。
【０４５４】
本発明の抗ｃＫＩＴ抗体または抗体フラグメント結合体による除去が、移植を可能にするのに十分であるかを判定するために、上記のように処理したマウスにその後、ＨＳＣを移植することができる。例えば、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−毒物結合体で処理したＣＤ４５．２マウスに、ＣＤ４５．１マウス由来のドナーＨＳＣを、投薬のおおよそ１週後に移植することができる。別の例において、抗ｃＫＩＴ  Ｆａｂ’−毒物結合体で処理したマウスを、免疫抑制剤、例えば、Ｔ細胞枯渇を引き起こす剤で、投薬のおおよそ１週後に、そしてＣＤ４５．１マウス由来のドナーＨＳＣを移植するおおよそ１〜２日前に処理することができる。Ｔ細胞枯渇の一方法が、マウスに、１マウスあたり０．５ｍｇの抗マウスＴＣＲβ鎖抗体（クローンＨ５７−５９７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を２日間、１日４回投薬するものである。血液サンプルを、投薬後の血液学的プロファイリングのために採ることによって、Ｔ細胞枯渇を確認することができる。そのような例において、血液サンプル中のＣＤ４５．１キメラ化を探索することによって、移植の進行を監視することとなる。そのような例において、ＣＤ４５．１  ＨＳＣおよびＣＤ４５．２  ＨＳＣの集団を探索する骨髄分析のために、移植のおおよそ３〜４ヵ月後または５〜６ヵ月後にマウスを安楽死させることによって、移植の成功を判定することができる。これ以外にも、第１の移植、および十分に照射した宿主マウスに実行した第２の移植の少なくとも４または６ヵ月後にマウスを安楽死させて、第２の移植後の血液サンプル中のＣＤ４５．１キメラ化を探索することによって、移植の成功を判定することができる。
【０４５５】
実施例９  完全長抗ｃＫＩＴ抗体、そのＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメント、ならびにそれらの結合体による、ヒト肥満細胞脱顆粒のインビトロアッセイ
実施例６に記載するように、成熟肥満細胞を生成して、抗ｃＫＩＴ抗体、ならびにＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメント、またはそれらの毒物結合体で試験した。
【０４５６】
図７Ａ〜図７Ｃに示すように、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）および化合物（４）と結合したＦ（ａｂ’４）２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントは、架橋された場合に、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、Ｆａｂ４（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントは、試験した全ての濃度にて、肥満細胞脱顆粒をトリガしなかった。図７Ｄ〜図７Ｆは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ３（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）および化合物（３）と結合したＦ（ａｂ’３）２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントが、架橋された場合に、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、化合物（４）と結合したＦａｂ３（Ｅ１５２Ｃ）フラグメントが、全ての試験した濃度にて、肥満細胞脱顆粒をトリガしなかったことを示している。このことは、Ｆａｂフラグメントを認識する既存の抗薬物抗体を患者が産生させ、またはこれを有する場合に観察され得るように、より大きな複合体に結合かつ多量体化された場合でさえ、Ｆａｂフラグメントまたはその結合体が、肥満細胞脱顆粒を引き起こさないことを示唆している。他方、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび結合体は、より大きな複合体に結合かつ多量体化された場合、完全長抗ｃＫＩＴ抗体と類似のレベルにて肥満細胞脱顆粒を引き起こす。
【０４５７】
実施例１０  完全長抗ｃＫＩＴ抗体、ならびにそのＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメントによるヒト肥満細胞脱顆粒のインビトロアッセイ
実施例６に記載するように、成熟肥満細胞を生成して、抗ｃＫＩＴ抗体、ならびにＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメントで試験した。
【０４５８】
図８Ａ〜図８Ｃに示すように、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ４およびＦ（ａｂ’４）２フラグメントは、架橋された場合に、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、Ｆａｂ４（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントは、試験した全ての濃度にて、肥満細胞脱顆粒をトリガしなかった。図８Ｄ〜図８Ｆは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ１およびＦ（ａｂ’１）２フラグメントが、架橋された場合に、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、Ｆａｂ１（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントが、試験した全ての濃度にて、肥満細胞脱顆粒をトリガしなかったことを示している。図８Ｇ〜図８Ｉは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ２およびＦ（ａｂ’２）２フラグメントが、架橋された場合に、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、Ｆａｂ２（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントが、試験した全ての濃度にて、肥満細胞脱顆粒をトリガしなかったことを示している。図８Ｊ〜図８Ｌは、完全長抗ｃＫＩＴ  Ａｂ３およびＦ（ａｂ’３）２フラグメントが、架橋された場合に、肥満細胞脱顆粒を引き起こした一方、Ｆａｂ３（ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ）フラグメントが、試験した全ての濃度にて、肥満細胞脱顆粒をトリガしなかったことを示している。このことは、Ｆａｂフラグメントを認識する既存の抗薬物抗体を患者が産生させ、またはこれを有する場合に観察され得るように、より大きな複合体に結合かつ多量体化された場合でさえ、Ｆａｂフラグメントが、肥満細胞脱顆粒を引き起こさないことを示唆している。他方、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、より大きな複合体に結合かつ多量体化された場合、完全長抗ｃＫＩＴ抗体と類似のレベルにて肥満細胞脱顆粒を引き起こす。
【０４５９】
実施例１１  免疫コンピテントマウスにおける同系骨髄移植
特定の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＣＤ４５．２、雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃０００６６４）マウスに、背中の皮下に配置したミニポンプ（Ａｌｚｅｔ、カタログ＃２００１）内の２．５、５、または１０ｍｇ／ｍｌ抗ｃ−ＫＩＴ  Ｆａｂ’５−（１）（Ｆａｂ’−ＤＡＲ４）を投薬した。ミニポンプは、２００μｌの容量を保持しており、７日にわたって１μｌ／時の一定の速度にて注入した。ミニポンプを、埋め込んだ７日後に取り出して、それ以上の薬物の投与を停止した。ミニポンプ取出しの４８時間後に、マウスに、ＣＤ４５（ＣＤ４５．１、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ、雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃００２０１４）でコンジェニックにマークされているドナーマウス由来の骨髄を移植した。ＣＤ４５．１キメラ化を１ヵ月間隔で探索することによって、移植の進行を末梢血中で監視した。この実験では、血中キメラ化を、図１０に示すように４ヵ月間監視した。末梢血中のキメラ化を、フローサイトメトリによって評価した。血液サンプルを、抗ｍＣＤ４５．１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（１：１００、ＢＤ＃５６０５８０）、抗ｍＣＤ４５．２−ＢＵＶ３９５（１：１００、ＢＤ＃５６４６１６）、抗Ｍａｃ−ＰＥ（１：５００、ＢＤ＃５５３３３１）、抗ＧＲ１−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ＃５５３１２７）、抗Ｂ２２０−ＡＰＣ（１：４００、ＢＤ＃５５３０９２）、および抗ＣＤ３−Ｖ４５０（１：１００、ＢＤ＃５６０８０１）で染色して、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で捕捉して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。キメラ化のレベルを、ＣＤ４５．２（宿主）またはＣＤ４５．１（ドナー）について陽性である集団を比較することによって判定した。総ドナーキメラ化は、全白血球集団を表した。加えて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞の亜集団をさらに、ドナーキメラ化について評価した。Ｔ細胞ドナーキメラ化は、ＣＤ３＋細胞におけるＣＤ４５．２（宿主）対ＣＤ４５．１（ドナー）の調査に基づいた。Ｂ細胞ドナーキメラ化は、ＣＤ４５Ｒ＋細胞におけるＣＤ４５．２（宿主）対ＣＤ４５．１（ドナー）の調査に基づいた。骨髄キメラ化は、Ｍａｃ−１＋／Ｇｒ−１＋細胞におけるＣＤ４５．２（宿主）対ＣＤ４５．２（ドナー）の調査に基づいた。この実験は、抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’結合体でコンディションを整えたマウスに、骨髄、Ｂ細胞、およびＴ細胞系統を再構成するドナー細胞を植え付けて、ＨＳＣ移植の成功が示され得ることを示している。
【０４６０】
別の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＣＤ４５．２、雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃０００６６４）マウスに、背中の皮下に配置したミニポンプ（Ａｌｚｅｔ、カタログ＃２００１）内の２．５、５、もしくは１０ｍｇ／ｍｌ抗ｃ−ＫＩＴ  Ｆａｂ’５−（１）（Ｆａｂ’−ＤＡＲ４）、または１０ｍｇ／ｍｌ抗ｃ−ＫＩＴ  Ｆａｂ’５−ｍｃ−ＭＭＡＦ（Ｆａｂ’−ＤＡＲ４）を投薬した。ミニポンプは、２００μｌの容量を保持しており、７日にわたって１μｌ／時の一定の速度にて注入した。ミニポンプを、埋め込んだ５日後に取り出して、それ以上の薬物の投与を停止した。ミニポンプ取出し後の２４時間以内に、マウスに、ＣＤ４５（ＣＤ４５．１、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ、雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃００２０１４）でコンジェニックにマークされているドナーマウス由来の骨髄を移植した。ＣＤ４５．１キメラ化を１ヵ月間隔で探索することによって、移植の進行を末梢血中で監視した。この実験では、血中キメラ化を、図１１に示すように２ヵ月間監視した。末梢血中のキメラ化を、フローサイトメトリによって評価した。血液サンプルを、抗ｍＣＤ４５．１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（１：１００、ＢＤ＃５６０５８０）、抗ｍＣＤ４５．２−ＢＵＶ３９５（１：１００、ＢＤ＃５６４６１６）、抗Ｍａｃ−ＰＥ（１：５００、ＢＤ＃５５３３３１）、抗ＧＲ１−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ＃５５３１２７）、抗Ｂ２２０−ＡＰＣ（１：４００、ＢＤ＃５５３０９２）、および抗ＣＤ３−Ｖ４５０（１：１００、ＢＤ＃５６０８０１）で染色して、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で捕捉して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。キメラ化のレベルを、ＣＤ４５．２（宿主）またはＣＤ４５．１（ドナー）について陽性である集団を比較することによって判定した。総ドナーキメラ化は、全白血球集団を表した。加えて、末梢血中の骨髄細胞をさらに、ドナーキメラ化について評価した。骨髄キメラ化は、Ｍａｃ−１＋／Ｇｒ−１＋細胞におけるＣＤ４５．２（宿主）対ＣＤ４５．２（ドナー）の調査に基づいた。この実験は、抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’結合体でコンディションを整えたマウスに、ドナー細胞を植え付けて、致死照射でコンディションを整えたマウスと同程度の骨髄コンパートメントの再構成が成功し得ることを示している（図１１Ｂ）。抗ｃＫｉｔでコンディションを整えたマウスの総ドナーキメラ化の、照射したマウスに対するレベルの低下（図１１Ａ）は、長命のＣＤ４５．２＋Ｂ細胞およびＴ細胞を循環系から除去しない抗ｃＫｉｔコンディション調整剤のより的を絞った（ｍｏｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ）性質におそらく起因する。
【０４６１】
別の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＣＤ４５．２、雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃０００６６４）マウスを、３００ＲＡＤＳで照射した。３日後、背中の皮下に配置したミニポンプ（Ａｌｚｅｔ、カタログ＃２００１）内の２．５または５ｍｇ／ｍｌ抗ｃ−ＫＩＴ  Ｆａｂ’５−（１）（Ｆａｂ’−ＤＡＲ４）を投薬した。１群を、照射のみで処理し、そして１群を、２．５ｍｇ／ｍｌ抗ｃ−ＫＩＴ  Ｆａｂ’５−（１）（Ｆａｂ’−ＤＡＲ４）のみで処理した。ミニポンプは、２００μｌの容量を保持しており、７日にわたって１μｌ／時の一定の速度にて注入した。ミニポンプを、埋め込んだ３日後に取り出して、それ以上の薬物の投与を停止した。ミニポンプ取出し後の４８時間以内に、マウスに、ＣＤ４５（ＣＤ４５．１、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ、雄、１０週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック＃００２０１４）でコンジェニックにマークされるドナーマウス由来の骨髄を移植した。ＣＤ４５．１キメラ化を１ヵ月間隔で探索することによって、移植の進行を末梢血中で監視した。この実験では、血中キメラ化を、図１２に示すように４ヵ月間監視した。末梢血中のキメラ化を、フローサイトメトリによって評価した。血液サンプルを、抗ｍＣＤ４５．１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（１：１００、ＢＤ＃５６０５８０）、抗ｍＣＤ４５．２−ＢＵＶ３９５（１：１００、ＢＤ＃５６４６１６）、抗Ｍａｃ−ＰＥ（１：５００、ＢＤ＃５５３３３１）、抗ＧＲ１−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ＃５５３１２７）、抗Ｂ２２０−ＡＰＣ（１：４００、ＢＤ＃５５３０９２）、および抗ＣＤ３−Ｖ４５０（１：１００、ＢＤ＃５６０８０１）で染色して、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で捕捉して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。キメラ化のレベルを、ＣＤ４５．２（宿主）またはＣＤ４５．１（ドナー）について陽性である集団を比較することによって判定した。総ドナーキメラ化は、全白血球集団を表した。加えて、末梢血中の骨髄細胞をさらに、ドナーキメラ化について評価した。骨髄キメラ化は、Ｍａｃ−１＋／Ｇｒ−１＋細胞におけるＣＤ４５．２（宿主）対ＣＤ４５．２（ドナー）の調査に基づいた。この実験は、抗ｃＫｉｔ−Ｆａｂ’結合体がコンディション調整剤として、他の剤、例えば低線量照射と組み合わせて用いられ得ること、そしてこのようにコンディションを整えたマウスへのドナー細胞の移植が成功し得ることを示している。
【０４６２】
特に定義されない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語は、本開示が属する分野に精通する専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０４６３】
特に明記されない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、および操作は、当業者に明らかであるように、それ自体知られている様式で実行され得、かつ実行されてきた。ここでも例えば、本明細書中に記載される標準的なハンドブックおよび一般的な背景技術を、そして本明細書中で引用される更なる参考文献を参照する。特に明記されない限り、本明細書中で引用される参考文献はそれぞれ、その全体が参照によって組み込まれる。
【０４６４】
本発明の特許請求の範囲は、非限定的であり、以下に記載される。
【０４６５】
特定の態様および特許請求の範囲が本明細書中で詳細に開示されているが、これは説明の目的でのみ一例とされており、添付される特許請求の範囲、またはあらゆる対応する更なる出願の特許請求の範囲の主題の範囲に関して、限定となることは意図されていない。特に、種々の置換、変更、および修飾が、特許請求の範囲によって定義されるように、本開示の精神および範囲から逸脱することなく本開示になされてよいことが、本発明者らによって意図されている。核酸出発材料、注目するクローン、またはライブラリ型の選択は、本明細書中に記載される態様の知識を有する当業者にとってルーチン作業であると考えられる。他の態様、利点、および修飾が、以下の特許請求の範囲の範囲内であるとみなされる。当業者であれば、ルーチンの実験のみを用いて、本明細書中に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するであろうし、かつ確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。後に出願される対応する出願における特許請求の範囲の再起案（Ｒｅｄｒａｆｔｉｎｇ）は、種々の国々の特許法による制限による場合があり、特許請求の範囲の主題を放棄するものと解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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