(57)【要約】  本開示は、例えば、膵臓インスリン産生細胞等の、その後に成熟細胞型に方向付けられ得る及び分化され得る胚体内胚葉（ＤＥ）の形成を促進するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）を含むヒト幹細胞等の細胞のための培地を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培地組成物であって、以下：
ａ）１つ以上の基礎組織培養培地；
ある量のグルタミン又はその類似体；
ある量の１つ以上の非必須アミノ酸； 及び任意に
ある量のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤又はある量のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼの阻害剤； 又は
ｂ）１つ以上の基礎組織培養培地；
ある量のグルタミン又はその類似体；
ある量のセレン； 及び任意にある量のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤又はある量のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼの阻害剤； 又は
ｃ）１つ以上の基礎組織培養培地；
ある量のグルタミン又はその類似体；
ある量の１つ以上の脂質；
ある量の１つ以上の非必須アミノ酸；
ある量の１つ以上のチオール；
ある量の１つ以上のインスリン、トランスフェリン又はセレン； 及び
ある量のポリビニルアルコール、
を含む、細胞培地組成物。
【請求項２】
ある量のアクチビンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アクチビンの量が、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ある量のＷＮＴシグナル伝達の活性剤又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤をさらに含む、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＷＮＴシグナル伝達の活性剤又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣＨＩＲ９９０２１の量が、約１μＭ〜約３μＭである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記グルタミンの類似体が、ジペプチドを含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記グルタミン又はその類似体の量が、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂質の量が、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記チオールが、モノチオグリセロールを含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記チオールの量が、約１００μＭ〜約９００μＭを含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
インスリン、トランスフェリン及びセレンを含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリビニルアルコールが、約８０，０００〜約１０５，０００の分子量を有する、請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリビニルアルコールの量が、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
基礎組織培養培地のうちの１つが、ＤＭＥＭを含む、請求項１〜１４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
基礎組織培養培地のうちの1つが、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、請求項１〜１４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
基礎組織培養培地のうちの1つが、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）を含む、請求項１〜１６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
幹細胞をさらに含む、請求項１〜１７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
幹細胞において胚体内胚葉分化を誘導する方法であって、以下：
幹細胞、請求項１〜１７の何れか１項に記載の培地、並びに前記細胞における原始線条形成を誘導するために有効な、ある量のアクチビン及びある量のＧＳＫ３阻害剤を組み合わせ、それによって原始線条形成を有する細胞を含む混合物を提供する工程； 及び
前記混合物又はその一部又は原始線条形成を有する前記細胞、請求項１〜１７の何れか１項に記載の培地、並びに胚体内胚葉分化を誘導するために有効な、ある量のアクチビン及びある量のＡＭＰ活性化キナーゼの阻害剤を組み合わせ、それによって胚体内胚葉細胞を提供する工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記胚体内胚葉細胞を、後部前腸前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤又は条件下で処理することをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
後部前腸前駆細胞を、膵臓前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤又は条件下で処理することをさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
膵臓前駆細胞を、内分泌前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤又は条件下で処理することをさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
内分泌前駆細胞を、インスリン産生細胞を提供する１つ以上の薬剤又は条件下で処理することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記原始線条形成の誘導が、約１日で起こる、請求項２０〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記原始線条形成の誘導が、約２日以内で起こる、請求項２０〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記胚体内胚葉形成の誘導が、約１日で起こる、請求項２０〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記胚体内胚葉形成の誘導が、約２日以内で起こる、請求項２０〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記原始線条形成の誘導及び前記胚体内胚葉形成の誘導が、約２日で起こる、請求項２０〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記原始線条形成の誘導及び前記胚体内胚葉形成の誘導が、３日以内で起こる、請求項２０〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞が、前記細胞において、原始線条形成を誘導するために有効な前記ある量のアクチビン及び前記ある量のＧＳＫ３阻害剤を含む前記培地と組み合わされる、請求項２０〜３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
原始線条形成を有する細胞を有する前記混合物が、胚体内胚葉の分化を誘導するために有効な前記ある量のアクチビン及び前記ある量のＡＭＰ活性化キナーゼの阻害剤を有する前記培地と組み合わされる、請求項２０〜３２の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対しての相互参照
この出願は、２０１７年９月７日に出願された米国出願第６２／５５５，２５９号の出願の日の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
様々な臓器の細胞型に分化するヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の可能性は、治療用途でのｉＰＳ細胞の使用可能性に関して多くの興奮させるものを生み出した。その中で膵臓等の胚体内胚葉に由来する器官は、非常に興味深い。
【０００３】
胚体内胚葉は、気道及び消化管の上皮層、並びに甲状腺、胸腺、肺、肝臓、及び膵臓を生じさせる。それは、原腸形成中に形成され、多能性胚盤葉上層細胞は、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉の３つの主要な胚葉に割り当てられる。このプロセスの開始は、後部胚盤葉上層における原始線条の出現によって証明される。原始線条を通る胚盤葉上層細胞は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受け、中胚葉又は胚体内胚葉の何れかになる。これら２つの細胞型は、中内胚葉と呼ばれる原始線条の共通の前駆体から生じることが示唆されているが、哺乳類において、両能性を有する単一の胚細胞の存在は、証明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cho et al. Development. 2012 Aug 15; 139(16): 2866-2877.
【非特許文献２】Loh et al. Cell Stem Cell. 2014 Feb 6; 14(2): 237-252.
【非特許文献３】Xu et al. Mech Dev. 2011 Sep-Dec;128(7-10):412-27.
【非特許文献４】McGaugh et al. J. Vis. Exp. 2017 Mar 7;(121
【非特許文献５】Ninomiya et al. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2015 Jan;51(1):1-8
【非特許文献６】Yabe et al. J. Diabetes. 2017 Feb;9(2):168-179.
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、成熟内胚葉誘導体への効率的な分化の前に、幹細胞、例えばヒトｉＰＳ細胞を含むヒト幹細胞を胚体内胚葉系統に方向付けることに焦点を合わせている。分化中の幹細胞培養、例えばｉＰＳ細胞培養における胚体内胚葉形成のプロセスは、見かけの上皮間葉転換及び脊椎動物の原腸形成を暗示する動的遺伝子発現プロファイルを含む。これらの発見は、治療目的のためのｉＰＳ細胞等の幹細胞の使用、及び創薬及び毒性試験のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとしての使用を促進する可能性がある。
【０００６】
特に、本開示は、一実施形態において、培養培地の存在下でのｉＰＳ細胞由来の胚体内胚葉の富化培養物の生産を提供する。少なくとも３日間の分化を伴う複雑な培地での胚体内胚葉分化のための現在のｉｎ ｖｉｔｒｏプロトコールとは対照的に、本開示は、成熟胚体内胚葉のより速い誘導（例えば、約２日超）のための改善された培地を提供し、これはまた、一実施形態において膵臓前駆体を生じさせる。加えて、培地組成は、多くの異なる幹細胞、例えば、多くの異なるｉＰＳ細胞株のより多くの分化を可能にし、異なる遺伝的背景からの薬物スクリーニング及び基礎研究のプラットフォームをもたらす。当該データはまた、胚体内胚葉へのｉＰＳ細胞の分化に対する特徴的な遺伝子発現の時系列が、脊椎動物の原腸形成中に胚体内胚葉の分化の過程で起こる遷移に類似しているため、ヒトの発達を模倣及び研究するモデルになることを示している。
【０００７】
従って、本開示は、一実施形態において、膵臓のインスリン産生細胞の産生のために、ヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞から胚体内胚葉を生成する組成物及び方法を提供する。一実施形態において、培地は、ＳＴＭＸ−ＤＥの複数の成分を含む。
【０００８】
一実施形態において、本開示は、以下の複数を含む細胞培地組成物、例えば、無血清組成物を提供する： 1つ以上の基礎組織培養培地； ある量のグルタミン又はその類似体； ある量の1つ以上の脂質； ある量の1つ以上の非必須アミノ酸； ある量の1つ以上のチオール； ある量の1つ以上のインスリン又はインスリン様化合物、トランスフェリン又はセレン； 又はある量のポリビニルアルコール、又はそれら何れかの組み合わせ。一実施形態において、組成物、例えば無血清組成物は、以下の３つ以上を含む：基礎組織培養培地； グルタミン又はその類似体； 1つ以上の脂質； 1つ以上の非必須アミノ酸； 1つ以上のチオール； 1つ以上のインスリン又はインスリン様化合物、トランスフェリン又はセレン； 又はポリビニルアルコール。一実施形態において、組成物、例えば無血清組成物は、基礎組織培養培地及びグルタミン又はその類似体、及び2つ以上の： 脂質；非必須アミノ酸； チオール； インスリン又はインスリン様化合物； トランスフェリン； セレン； 又はポリビニルアルコール、を含む。一実施形態において、組成物、例えば、無血清組成物は、基礎組織培養培地、グルタミン又はその類似体、並びに必須アミノ酸及び任意に脂質； チオール； インスリン又はインスリン様化合物、トランスフェリン及び／又はセレン； 又はポリビニルアルコールの1つ以上を含む。一実施形態において、組成物、例えば、無血清組成物は、基礎組織培養培地、グルタミン又はその類似体、及びインスリン又はインスリン様化合物、トランスフェリン又はセレン及び任意に脂質； チオール； 非必須アミノ酸； 又はポリビニルアルコールの1つ以上を含む。一実施形態において、組成物は、無血清である。
【０００９】
一実施形態において、組成物は、アクチビン、例えば、アクチビンＡ又はアクチビンＡ／Ｂをさらに含む。一実施形態において、アクチビンＡの量は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬである。一実施形態において、アクチビンＡの量は、約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬである。一実施形態において、アクチビンＡの量は、約８０ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬである。一実施形態において、組成物は、ある量のＷＮＴシグナル伝達の活性剤又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤をさらに含む。一実施形態において、ＷＮＴシグナル伝達の活性剤又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤は、1つ以上の３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ−Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＣＨＩＲ ９９０２１三塩酸塩、インジルビン−３’−オキシム、ＩＭ−１２、ＭｅＢＩＯ、ビキニ、ケンパウロン、Ｌ８０３、炭酸リチウム、ＮＳＣ ６９３８９８、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＣ−Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＤＺＤ−８、ＴＷＳ １１９、チデグルシブ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、又はＣＨＩＲ９８０１４、又はそれら何れかの組み合わせ、を含む。一実施形態において、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＹ２０９０３１４又はＳＢ２１６７６３を含む。一実施形態において、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤は、アミノピリジンである。一実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の量は、約１μＭ〜約３μＭである。一実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の量は、約１．５μＭ〜約２．５μＭである。一実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の量は、約０．５μＭ〜約５μＭである。一実施形態において、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤の量は、約０．５μＭ〜約２．５μＭである。一実施形態において、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害の量は、約２μＭ〜約４μＭである。一実施形態において、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害の量は、約１．５μＭ〜約４μＭである。一実施形態において、グルタミンの類似体は、ジペプチド、例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む。一実施形態において、組成物中のグルタミン又はその類似体の量は、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む。一実施形態において、組成物中のグルタミン又はその類似体の量は、約１００ｍＭ〜３００ｍＭのグルタミン又はその類似体を含む。一実施形態において、組成物中のグルタミン又はその類似体の量は、約０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約３％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む。一実施形態において、組成物中のグルタミン又はその類似体の量は、約１５０ｍＭ〜４００ｍＭのグルタミン又はその類似体を含む。一実施形態において、組成物中のグルタミン又はその類似体の量は、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭを含む。一実施形態において、1つ以上の脂質の量は、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む。一実施形態において、脂質は、脂質濃縮物である。一実施形態において、１つ以上の脂質の量は、約０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約３％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む。一実施形態において、１つ以上のチオールは、モノチ���グリセロールを含む。一実施形態において、１つ以上のチオールの量は、約１００μＭ〜約９００μＭを含む。一実施形態において、１つ以上のチオールの量は、約３００μＭ〜約８００μＭを含む。一実施形態において、１つ以上のチオールの量は、約３００μＭ〜約６００μＭを含む。一実施形態において、組成物は、インスリン、トランスフェリン及びセレンの組み合わせを含む。一実施形態において、組成物中のインスリン、トランスフェリン及びセレンの組み合わせの量は、約０．５％〜５％ｖｏｌ／ｖｏｌであり、ここで、インスリンは、約５００ｍｇ／Ｌ〜約１５００ｍｇ／Ｌ、例えば、１０００ｍｇ／ｍＬ、トランスフェリンは、約４００ｍｇ／Ｌ〜約７００ｍｇ／Ｌ、例えば５５０ｍｇ／Ｌであり、及びセレンは、約０．３〜約１．０ｍｇ／Ｌ、例えば約０．６７ｍｇ／Ｌである。一実施形態において、ポリビニルアルコールは、約８０，０００〜約１０５，０００の分子量を有する。一実施形態において、ポリビニルアルコールは、約８５，０００〜約１００，０００の分子量を有する。一実施形態において、ポリビニルアルコールの量は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬを含む。一実施形態において、ポリビニルアルコールの量は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬを含む。一実施形態において、基礎組織培養培地の１つは、ＤＭＥＭ、例えば、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。一実施形態において、基礎組織培養培地の１つは、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）を含む。一実施形態において、組成物は、幹細胞、例えば人工多能性幹細胞をさらに含む。
【００１０】
幹細胞において胚体内胚葉の分化を誘導する方法がさらに提供される。当該方法は、幹細胞、本明細書に記載の組成物、及び細胞における原始線条形成を誘導するために有効な量のアクチビン及びＧＳＫ阻害剤を組み合わせることを含み、それによって、原始線条形成細胞を含む混合物を提供することを含む。原始線条形成を伴う細胞の混合物又はその一部は、胚体内胚葉の分化を誘導するために有効な量のアクチビン及びＡＭＰ活性化キナーゼ阻害剤を組み合わせることを含み、それによって、胚体内胚葉細胞を提供する。一実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。一実施形態において、当該方法は、胚体内胚葉細胞を、後部前腸前駆細胞形成を提供する１つ以上の薬剤で、及び／又は温度、成長因子を含む化合物又は時間の長さ等の条件下で処理することをさらに含む。一実施形態において、当該方法は、後部前腸前駆細胞を、膵臓前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤で及び／又は条件下で処理することをさらに含む。一実施形態において、当該方法は、膵臓前駆細胞を、内分泌前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤で、及び／又は条件下で処理することをさらに含む。一実施形態において、当該方法は、内分泌前駆細胞を、インスリン産生細胞を提供する１つ以上の薬剤で、及び／又は条件下で処理することをさらに含む。一実施形態において、原始線条形成の誘導は、約１日で起こる。一実施形態において、原始線条形成の誘導は、約２日以内に起こる。一実施形態において、胚体内胚葉の形成の誘導は、約１日で起こる。一実施形態において、胚体内胚葉形成の誘導は、約２日以内に起こる。一実施形態において、原始線条形成の誘導及び、胚体内胚葉形成の誘導は、約２日で起こる。一実施形態において、原始線条形成の誘導及び、胚体内胚葉形成の誘導は、３日以内で起こる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、様々な成長培地での１日目に胚体内胚葉誘導を受ける４つの例示的な細胞株の比較を示す。
【図２】図２は、様々な成長培地での２日目に胚体内胚葉誘導を受ける４つの例示的な細胞株の比較を示す。
【図３】図３は、様々な例示的な成長培地における内胚葉誘導の２日目の１つの細胞株（ｉＰＳＣ−６）の比較を示す。
【図４】図４は、堅牢な胚体内胚葉形成の指標であるバイオマーカーＳＯＸ１７（ｈＳＯＸ１７タンパク質の免疫染色）の存在を示す。
【図５】図５は、分化２日目でのＧＩＢＣＯ培地と比較したＳＴＭＸ−ＤＥ培地での１〜３日目の細胞の遺伝子発現パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
図１に関して、これは、様々な例示的な成長培地（ＳＴＭＸ−ＤＥベースの培地、ＧＩＢＣＯ及びＡｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ）における胚体内胚葉誘導を受ける４つの細胞株の１日目での比較を示す。未分化細胞は、ビトロネクチン被覆プレートにおけるＥ８培地に示される。多能性ｉＰＳＣのコロニーは、均等に分布し、１日目には４０％以下の培養密度に達する。分化の最初の日は、発達中にｉｎ ｖｉｖｏで観察される原始線条誘導に関係する。全ての株は、ＳＴＭＸ−ＤＥ及びＧＩＢＣＯ培地上では成長するが、Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ培地では、望ましくない形態を示す。
【００１３】
図２は、様々な成長培地（ＳＴＭＸ−ＤＥ、ＧＩＢＣＯ及びＡｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ）における胚体内胚葉誘導を受ける４つの例示的な細胞株の２日目での比較を示す。全ての細胞株は、ＧＩＢＣＯ培地と比較してＳＴＭＸ−ＤＥ培地で優れた性能を発揮する。Ａｄ−ＤＭＥＭは、ｉＰＳ細胞におけるＤＥ誘導に適した培地ではない。
【００１４】
図３は、様々な成長培地における内胚葉誘導の１つの細胞株（ｉＰＳＣ−６）の２日目での比較を示す。ＧＩＢＣＯ培地と比較して、ＳＴＭＸ−ＤＥ培地では、完全に分化した胚体内胚葉細胞の増強された分化及び高収量が観察された。ＳＴＭＸ−ＤＥにおいて観察される胚体内胚葉細胞の典型的な形態学的特徴は、非常にコンパクトな多角形細胞の出現である。対照的に、Ａｄ−ＤＭＥＭは、上皮細胞への非効率的な分化を示すが、これは、胚体内胚葉前駆細胞の特徴ではない。
【００１５】
図４は、堅牢な胚体内胚葉形成を示すバイオマーカーＳＯＸ１７（ｈＳＯＸ１７タンパク質の免疫染色）の存在を示す。画像は、イメージエクスプレスハイスループットイメージングシステム（Ｉｍａｇｅ−Ｘｐｒｅｓｓ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて撮影された：ｉＰＳＣ株及び条件ごとに２５枚の画像（１０倍の対物レンズ）。全ての株は、ｉＰＳＣ株に応じて異なる効率でＳＯＸ１７の均等な発現を示す。ＧＩＢＣＯ培地において分化に抵抗性を有するいくつかの株（ｉＰＳ−６）は、ＳＴＭＸ−ＤＥ培地においてより多くのＳＯＸ１７陽性細胞を示す。
【００１６】
図５は、分化２日目のＧＩＢＣＯ培地と比較したＳＴＭＸ−ＤＥ培地での１〜３日目の細胞の遺伝子発現パターンを示す。結果は、各株のリファレンスコントロールとしてＥ８培地での未分化コントロールを使用したｑＰＣＲ結果の代表例である。胚体内胚葉分化のマスター遺伝子であるＳｏｘ１７は、全ての株で高く発現されており、遺伝的な違いにより予想されるように、株に応じて発現レベルに微妙な違いを有する。ＭｉｘＬ１は、全ての細胞株で中内胚葉誘導が確認できる、分化の１日目においてＳＴＭＸ−ＤＥ培地で発現される。ＳＴＭＸ−ＤＥ培地での２日目及び３日目のＭｉｘＬ１発現の欠如は、胚体内胚葉誘導中の中胚葉前駆細胞の欠如が確認される。Ｎａｎｏｇの発現は、ＳＴＭＸ−ＤＥ培地で下方制御され、細胞の分化が確認される；しかしながら、ＧＩＢＣＯ培地において、Ｎａｎｏｇの発現の残留により、分化能力の低下が推測される。
【実施例】
【００１７】
例示的な実施形態
一実施形態において、細胞培地組成物は、1つ以上の基礎組織培養培地、ある量のグルタミン又はその類似体、例えば約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、及びある量の1つ以上の非必須アミノ酸、及び任意に1つ以上のある量の脂質； ある量の1つ以上のチオール； ある量の1つ以上のインスリン、トランスフェリン及び／又はセレン； 又はある量のポリビニルアルコール、又はそれら何れかの組み合わせ、を含む。一実施形態において、組成物は、ある量のアクチビン、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬをさらに含む。一実施形態において、組成物は、ある量のＷＮＴシグナル伝達の活性剤又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤をさらに含む。一実施形態において、組成物は、例えば、約１μＭ〜約３μＭのある量のＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む。一実施形態において、組成物は、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂質を含む。一実施形態において、組成物は、例えば、約１００μＭ〜約９００μＭのモノチオグリセロール等のチオールを含む。一実施形態において、組成物は、分子量が約８０，０００〜約１０５，０００、任意に約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコールを含む。一実施形態において、組成物は、ＤＭＥＭを含む。一実施形態において、組成物は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。一実施形態において、組成物は、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）を含む。一実施形態において、組成物は、幹細胞、例えば、ヒト人工多能性幹細胞をさらに含む。
【００１８】
一実施形態において、細胞培地組成物は、１つ以上の基礎組織培養培地、ある量のグルタミン又はその類似体、例えば、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、及びある量のセレン、及び任意に１つ以上のある量の１つ以上の脂質； ある量の１つ以上のチオール； ある量の１つ以上の非必須アミノ酸； ある量のトランスフェリン； ある量のインスリン； 又はある量のポリビニルアルコール、又はそれら何れかの組み合わせ、を含む。一実施形態において、組成物は、ある量のアクチビン、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬをさらに含む。一実施形態において、組成物は、ある量のＷＮＴシグナル伝達の活性剤又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤をさらに含む。一実施形態において、組成物は、例えば、約１μＭ〜約３μＭのある量のＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む。一実施形態において、組成物は、約０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ〜約５％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂質を含む。一実施形態において、組成物は、例えば、約１００μＭ〜約９００μＭのモノチオグリセロール等のチオールを含む。一実施形態において、組成物は、分子量が約８０，０００〜約１０５，０００、任意に約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコールを含む。一実施形態において、組成物は、ＤＭＥＭを含む。一実施形態において、組成物は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。一実施形態において、組成物は、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）を含む。一実施形態において、組成物は、幹細胞、例えば、ヒト人工多能性幹細胞をさらに含む。
【００１９】
一実施形態において、幹細胞の胚体内胚葉分化を誘導する方法が提供される。当該方法は、幹細胞、本明細書に開示される基礎培地の１つ、並びに細胞に原始線条形成を誘導するために有効なある量のアクチビン及びある量のＧＳＫ３阻害剤の組み合わせを含み、それによって、原始線条形成を有する細胞を含む混合物を提供することを含む。その混合物又はその一部又は原始線条形成を有する細胞は、本明細書に開示される培地の１つ、並びに胚体内胚葉分化を誘導するために有効な量のある量のアクチビン及びある量のＡＭＰ活性化キナーゼの阻害剤と組み合わされ、それによって胚体内胚葉細胞を提供する。一実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。一実施形態において、胚体内胚葉細胞は、後部前腸前駆体形成を提供する１つ以上の薬剤で又は条件下で処理される。一実施形態において、後部前腸前駆細胞は、膵臓前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤で又は条件下で処理される。一実施形態において、膵臓前駆細胞は、内分泌前駆細胞を提供する１つ以上の薬剤又は条件で処理される。一実施形態において、内分泌前駆細胞は、インスリン産生細胞を提供する１つ以上の薬剤又は条件で処理される。一実施形態において、原始線条形成の誘導は、約１日で起こる。一実施形態において、原始線条形成の誘導は、約２日以内に起こる。一実施形態において、胚体内胚葉形成の誘導は、約１日で起こる。一実施形態において、胚体内胚葉形成の誘導は、約２日以内に起こる。一実施形態において、原始線条形成の誘導及び胚体内胚葉形成の誘導は、約２日で起こる。一実施形態において、原始線条形成の誘導及び胚体内胚葉形成の誘導は、約３日以内で起こる。一実施形態において、幹細胞は、細胞において原始線条形成を誘導するために有効な量のある量のアクチビン及びある量のＧＳＫ３阻害剤を含む培地と組み合わされる。原始線条形成を有する細胞又は混合物は、胚体内胚葉分化を誘導するために有効なある量のアクチビン及びある量のＡＭＰ活性化キナーゼの阻害剤を有する培地と組み合わされる。
【００２０】
表１は、例示的な培地（ＳＴＭＸ−ＤＥ）対Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）に開示された培地の比較を示す。
【表１】
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【００２１】
ＤＥ細胞（ステージ１）を得るために、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、又はＴＯＣＲＩＳ）、２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、及びＧＳＫ−３阻害剤で細胞を２４時間処理することにより、分化１日目に原始線条（ＰＳ）形成が誘導される。ＰＳが関与した後、細胞は、分化の２日目にさらに２４時間、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、及び１００ｎＭドルソモルフィン（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）で処理された。
【００２２】
ステージ１の分化のために、細胞は、ＳＴＭＸ−ＤＥ培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）及びＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ）を１：１で混合、１％ｖｏｌ／ｖｏｌグルタマックス、１％ ｖｏｌ／ｖｏｌ濃縮脂質（ＧＩＢＣＯ）、４５０μＭモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、１％インスリン−トランスフェリン−セレンＩＴＳサプリメント（ＧＩＢＣＯ）、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ＧＩＢＣＯ）及び１ｍｇ／ｍＬポリビニルアルコールＭｗ８９，０００〜９８，０００，９９＋加水分解（Ｓｉｇｍａ）で増殖させた。ＰＶＡは、４℃で一晩溶解される。
【００２３】
細胞は、Ｃａ及びＭｇ（ＧＩＢＣＯ）１：１００（最終濃度：５μｇ／ｍＬ）で希釈したビトロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間（室温）被覆された処理プレートで増殖させる。
【００２４】
１日目：細胞にＳＴＭＸ−ＤＥ培地＋アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）を与えた。
【００２５】
２日目：ＳＴＭＸ−ＤＥ培地＋アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ドルソモルフィン（１００ｎＭ）を細胞に再供給した。
【００２６】
例示的な培地
ＳＴＭＸ−ＤＥ
・ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）／ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ）１：１の混合
・１％グルタマックス（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
・１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ＧＩＢＣＯ）（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
・１％濃縮脂質（ＧＩＢＣＯ）（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
・１％インスリン−トランスフェリン−セレン：ＩＴＳサプリメント（ＧＩＢＣＯ）
・４５０μＭモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ）
・１ｍｇ／ｍＬポリビニルアルコールＭｗ８９，０００〜９８，０００、９９＋％加水分解（ＳＩＧＭＡ）
【００２７】
ＳＴＭＸ−ＤＥ： ＳＴＭＸ−ＤＥ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ｓｔｅｍｇｅｎｔ、又はＴＯＣＲＩＳ）、及び２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１ ＧＳＫ−３阻害剤（ＴＯＣＲＩＳ）。
【００２８】
ＳＴＭＸ−ＤＥ２： ＳＴＭＸ−ＤＥ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ｓｔｅｍｇｅｎｔ、又はＴＯＣＲＩＳ）、及び１００ｎＭドルソモルフィン（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）。
【００２９】
要約すると、ｉＰＳ細胞から胚体内胚葉前駆細胞の高度に富化された培養物を産生するアプローチが提供される。この研究は、ｉＰＳ細胞の分化が脊椎動物の初期発生のモデルとして役立つ可能性があることを示唆する。ｉＰＳ細胞由来の胚体内胚葉の産生は、肝細胞及び膵臓内分泌細胞及び外分泌細胞等、胚体内胚葉系統の科学的及び治療的に有用な細胞を生成する工程でもある。
【００３０】
全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の説明において、本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、例示のために詳細の多くを説明してきたが、本発明は追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載の特定の説明は、本発明の基本的な原理から逸脱することなく大幅に変更できることは当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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