(57)【要約】  様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法である。抗体に結合されたマイクロバブルは容器に順次適用され、異なる抗体に結合された次のマイクロバブルを適用する前に、使用されたマイクロバブルを破砕する。プランジャと閉鎖可能な開口部とを有する注射器状の容器を含むシステムである。さらに、免疫学的シナプスを生成するために、抗原提示細胞を模倣する柔軟な脂質シェルを有する抗原提示マイクロバブルを適用することによって、単離されたＴ細胞を活性化および増殖する方法である。【選択図】なし
2020501569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法であって、
ａ）サンプルを容器に入れる工程、
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第１の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｃ）第１抗体と第１細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第１抗体を第１細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｄ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第１マイクロバブルおよび第１マイクロバブルに結合した細胞の第１サブセットを分離することを可能にする工程、
ｅ）サンプルにおける細胞の第１サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程、
ｆ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第１マイクロバブルを破壊する工程、
ｇ）気体を包囲する内部気泡壁と、細胞の第１サブセットに含まれる細胞の第２サブセットの第２細胞表面マーカーに結合することができる第２抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第２の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｈ）第２抗体と第２細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第２抗体を少なくとも一つの第２細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｉ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第２マイクロバブルおよび第２マイクロバブルに結合した細胞の第２サブセットを分離することを可能にする工程、および
ｊ）細胞の第１サブセットにおける細胞の第２サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程
を含む、浮力による分離方法。
【請求項２】
第１および第２の細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３およびＣＤ２８のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｋ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第２マイクロバブルを破壊する工程、および
ｌ）細胞の第３サブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程ｇ）から工程ｋ）までを繰り返す工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞表面マーカーは、ＣＤ８＋、ＤＣ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋であり、細胞のスパースサブセットは、ナイーブＴ細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞のｎ番目のサブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程Ｉ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
容器の底部から廃棄物を除去することを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
望ましくない細胞をそれぞれのマイクロバブルと結合させ、容器の上部に浮揚させ、容器の上部から、これらのそれぞれのマイクロバブルに結合した望ましくない細胞を除去することによって、望ましくない細胞としての廃棄物を容器から除去することにより、ネガティブ選択で容器から廃棄物を除去する工程をさらに含み、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
容器内でプランジャを移動させることを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
容器内でプランジャを移動させることを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロバブルが受ける圧力を増加させることを含む、第１、第２およびその後のマイクロバブルを破壊する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
容器内でプランジャを移動させることを含む、マイクロバブルが受ける圧力を増加させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞のスパースサブセットは、Ｔ細胞を含んでおり、
ｍ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、スパースサブセットに加える工程、
ｏ）Ｔ細胞のスパースサブセットを活性化および増殖するために、十分な時間スパンにわたってＴ細胞およびリガンド提示マイクロバブルをインキュベートする工程、
ｐ）組換えＭＨＣに結合したユニークなペプチド、および抗ＣＤ２８または組換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組み合わせることで、特異的Ｔ細胞の活性化を達成する工程、および
ｑ）抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８または組み換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組み合わせることで、非特異的Ｔ細胞活性化を達成する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルは、ヒトもしくは動物の血液、他のヒトもしくは動物の体液、または人工緩衝液からのＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞、幹細胞、および癌細胞のうちの１つまたはそれらの組合せのような様々な異なる細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
様々な異なる細胞を含むサンプルから細胞のスパースサブセットを単離することは、ポジティブ選択、ネガティブ選択、またはその両方の逐次的組合せによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法を実行するためのシステムであって、
内部容器空間を画定する内壁を有する容器（３）、
内壁と密封的に接続され、内壁に対して可動なプランジャ（５）、
内部空間を周囲空間に接続させ、気体、液体および固体材料を内部空間に送り込んだり内部空間から送り出したりすることを可能にする、開閉可能な弁（８、９）を備えたポート、および
内部容器空間における柔軟なマイクロバブル（２）
を含み、
前記マイクロバブル（２）は、気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える、
システム。
【請求項１６】
プランジャ（５）は、凹状、凸状または平坦状のうちの１つの形状を有する前面を備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
プランジャ（５）は、凸状、凸状または平坦状を想定するような形状に変更するように適した調整可能な前面を有し、
システムは、システムの使用中に前面の形状を変更するための調整機構をさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
容器（３）は、滅菌状態である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
容器（３）は、サンプルの細胞（４）および生物学的因子を生存可能な状態に維持するように適した滅菌溶液を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
プランジャ（５）を動かすように構成された機械的プランジングシステムをさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
プランジングシステムは、自動化またはコンピュータ化されている、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２２】
ａ）気体を包囲する内部気泡壁と、単離されたＴ細胞上で細胞接触依存性のジュクスタクリンシグナル伝達を達成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、
を含む、単離されたＴ細胞を活性化および増殖するための方法。
【請求項２３】
リガンド提示マイクロバブルは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）細胞療法のような養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リガンド提示マイクロバブルは、ペプチド／ＭＨＣおよび抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
単離された細胞の活性化または阻害化のために、十分な時間スパンにわたって、前記細胞およびリガンド提示マイクロバブルをインキュベートする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４３５，０８３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述）
本発明は、国立衛生研究所によって授与された１Ｒ４３ＣＡ１７６８９２−０１Ａ１、３Ｒ４３ＣＡ１７６８９２−０１Ａ１Ｓ１、２Ｒ４４ＣＡ１７６８９２、１Ｒ４３ＨＬ１２６２８５−０１、２Ｒ４４ＨＬ１２６２８５−０２Ａ１、およびＨＨＳＮ２６１２０１７０００５１Ｃに基づく、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、細胞および他の生物学的因子の大量単離、連続多重マーカー選別、刺激、操作、培養、および増殖のための単純なエンドツーエンドの装置およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
すべての細胞療法にとっての大きな課題は、費用対効果が高く効率的な製造および供給能力、例えば、Ｔ細胞のサブセットを単離するためのスケーラブルで自動化された閉鎖システムの作成などを開発する必要にある。例えば、マウスおよびヒトにおける研究では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて遺伝子操作された低分化型Ｔ細胞の注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）が、優れた細胞増殖、持続性、および癌排除をもたらすことを示す。Ｔ細胞のサブセット（例えば、ナイーブＣＤ８＋細胞）を選別および単離することは、多重マーカー（例えば、ＣＤ８、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡ）を必要とするが、これらはスケールアップおよび自動化することが困難である。
【０００５】
ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、蛍光活性化細胞選別）は、個々の細胞の詳細な分析に最もよく使用される製品である。ＦＡＣＳの使用において、細胞の大量単離のためにスケールアップすることが困難である。磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）技術、特に、ミルテニーシステムは、大量の標的細胞単離のために使用される。マイクロビーズ（例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ））に結合した細胞は、混合管の外側の外部磁石によって引き出すことができる。しかし、抗体単独または抗体共役ナノビーズではなく、抗体共役マイクロビーズを細胞に結合させると、プロセスが遅くなる。したがって、ほとんどの市販の磁気細胞選別システムは、マイクロビーズ共役抗体ではなく、ナノビーズを使用している。ＭＡＣＳに関する最大の問題の１つは、磁気微粒子（＞１μｍ）と結合した単離細胞が破壊されることが多いことである。
【０００６】
既存のＭＡＣＳ技術は、強い外部磁石によって生成された磁場において、高勾配磁気細胞分離カラムを適用して、ナノビーズ標識細胞を磁化する。ＭＡＣＳは、強磁気のスチールウール充填カラムを使用して、低磁気ナノビーズと外部磁石との間の長距離相互作用を強化する。しかしながら、このシステムにおけるスチールウール充填カラムを使用すると、カラム詰まりや製造コストの増加などの他の技術的問題が生じる。さらに、ＭＡＣＳナノビーズは、エンドサイトーシスによって、細胞表面または内部のいずれかで標的細胞に付着する。これにより、ＭＡＣＳの適用は、主に単一の表面マーカーに基づく細胞濃縮に限定される。
【０００７】
国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１７５３４４  Ａ１号のパンフレットに記載されているように、細胞単離のための標的マイクロバブルを適用することにより、ＢＵＢＬＥＳ（浮揚が可能な分離）または浮揚活性化細胞選別（ＢＡＣＳ）技術が細胞単離のために開発されている。
【０００８】
マルチパラメータＭＡＣＳとして、従来技術は、細胞と親和性リガンドに共役した磁気ビーズとの可逆的結合を可能にするいくつかの方法を含む。これらは、複数の細胞表面マーカーを逐次的に標的とすることによって開発された。例えば、ストレプタマー（Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）技術は、ストレプタグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）と融合するように設計されているストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）多量体化低親和性一本鎖抗体に結合することにより、磁気微粒子（約１μｍ）の可逆的標的細胞結合を可能にする。従来技術における他の技術は、細胞または磁気ビーズから解離できる修飾抗体を使用する。これらの方法は、通常、目的の抗体に対する広範な修飾を必要とし、ＦＡＣＳ、ＢＡＣＳおよび他の形態の親和性精製のようなＭＡＣＳ以外のプラットフォームに適用され得る。
【０００９】
ＷＯ２０１５／１７５３４４Ａ１には、臨床応用のために、循環腫瘍細胞および臍帯血幹細胞の単離を含むＢＡＣＳ法が開示されている。この技術は、大量な細胞分離の実行において、他の従来技術に対していくつかの利点を有する。第一に、その脂質シェルマイクロバブルは、最も圧縮性と柔軟性に優れたシェルクラスのマイクロバブル（さらにアルブミン、ポリマー、ガラスなどを含む）であるため、外力（例えば、超音波および結合細胞）に対する自己成形的である。ガスコアと共役すると、細胞を単離するための非常に優しい材料となる。第二に、マイクロバブルと結合した細胞が自動的に液体の上面に浮揚するので、その使用するマイクロバブルは「自己運転ビークル」である。第三に、その使用する脂質シェルマイクロバブルは、水性溶液から自己分離し、他のマイクロバブルに自己濃縮／凝集する。第四に、細胞に結合したマイクロバブルを扱うという技術のユーザは、周囲の気圧を上げることによって、細胞にダメージを与えることなく、内部の結合を破壊することができる。
【００１０】
乳化は、リン脂質シェル内にペルフルオロヘキサンガスマイクロバブル（ＭＢ）を調製するために使用される。マイクロバブル膜においてＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−マレイミドを使用して、抗体をマイクロバブルに共役させる。それは、抗体あたり１〜２個のチオール基を有するＦｃフラグメント特異的ＩｇＧを用いて、マイケル付加を介して、抗体をマレイミド活性化ＭＢに共役させる。この技術は、連結のために、上皮起源の循環腫瘍細胞を単離するための最も広く受け入れられているマーカーである抗ＥｐＣＡＭなどの標的抗体を使用する。このプロセスにおいて、ほとんどのＭＢの直径が３〜１０μｍである。各ＭＢは、平均３６７，０００の抗ＦｃＩｇＧ分子を有する。
【００１１】
ＢＡＣＳ（またはＢＵＢＬＥＳ）は、革新的な細胞単離／選別プラットフォームであって、挑戦的なタスクのために単独でまたは従来技術における他の２つの主要なプラットフォーム（ＦＡＣＳおよびＭＡＣＳ）と組合せて使用することができる。その好ましい実施形態では、本開示は、単一の容器装置において、ヒト細胞の大量の単離、多重マーカー選別および操作を行うために、ＢＡＣＳを使用する。他の実施形態では、本開示は、前記単離、選別および操作プロセスを行うために、ＢＡＣＳとＦＡＣＳまたはＭＡＣＳとを組合せて使用する。
【００１２】
細胞ベースの治療法は、急速に発展している研究であり、また、患者の利益に大きな可能性がある。現在の臨床試験における細胞療法の大部分は、造血幹細胞もしくは間葉系幹細胞や、遺伝性疾患および癌に対する免疫Ｔ細胞であり、これらの標的細胞は、非常にまれなサブセットであること、および血液またはヒト組織中の不均質な細胞混合物からの特異的分離のための複数の細胞表面マーカーの必要があることという共通のよく知られている特徴を有し、また、単離、増殖およびインビトロ操作の際に、細胞分化の進行の調節または細胞の幹細胞性（ｓｔｅｒｎｎｅｓｓ）の維持は非常に困難である。本発明は、これらの多くの課題を克服することを意図している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、他の多くの目的以外、全ての細胞療法に対する２つの主な課題、すなわち、（１）十分な量の標的細胞を費用効果的にスケールアップするための堅牢な製造手順、および（２）患者への臨床投与の前に標的細胞の生物学的特徴を制御と維持する能力という課題を克服することを目的とする。本発明の他の目的は、簡単なエンドツーエンド装置およびシステムにより、これらの２つの課題を克服／改善するための技術を提供して、上記の目的（１）および（２）を達成することであり、さらに具体的には、前述の目的を達成するための一連の工程で、汚染から安全な無菌環境における細胞の大量単離、連続多重マーカー選別、刺激、操作、培養、および増殖を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第一態様によれば、様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法であって、ａ）サンプルを容器に入れる工程、ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第１の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、ｃ）第１抗体と第１細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第１抗体を第１細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、ｄ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第１マイクロバブルおよび第１マイクロバブルに結合した細胞の第１サブセットを分離することを可能にする工程、ｅ）サンプルにおける細胞の第１サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程、ｆ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第１マイクロバブルを破壊する工程、ｇ）気体を包囲する内部気泡壁と、細胞の第１サブセットに含まれる細胞の第２サブセットの第２細胞表面マーカーに結合することができる第２抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第２の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、ｈ）第２抗体と第２細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第２抗体を少なくとも一つの第２細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、ｉ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第２マイクロバブルおよび第２マイクロバブルに結合した細胞の第２サブセットを分離することを可能にする工程、およびｊ）細胞の第１サブセットにおける細胞の第２サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程を含む、浮力による分離方法が作成される。
【００１５】
本発明の第二態様によれば、前記の方法を実行するためのシステムであって、「内部容器空間を画定する内壁を有する容器」、「内壁と密封的に接続され、内壁に対して可動なプランジャ」、「内部空間を周囲空間に接続させ、気体、液体および固体材料を内部空間に送り込んだり内部空間から送り出したりすることを可能にする、開閉可能な弁を備えたポート」、および「内部容器空間における柔軟なマイクロバブル」を含み、前記マイクロバブルは、気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える、システムが作成される。
【００１６】
本発明の第三態様によれば、ａ）気体を包囲する内部気泡壁と、単離されたＴ細胞上で細胞接触依存性のジュクスタクリンシグナル伝達を達成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、およびｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、を含む、単離されたＴ細胞を活性化および増殖するための方法が作成される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、循環腫瘍細胞、臍帯血幹細胞およびＴリンパ球の単離を含む、臨床応用のための浮力による分離方法およびシステム（以下、その頭字語であるＢＵＢＬＥＳで参照される）に関する。この技術は、大量な細胞分離の実行において、他の技術と比較していくつかの利点を有する。第一に、その脂質シェルマイクロバブルは、例えば、アルブミン、ポリマーまたはガラスと比較して、最も圧縮性と柔軟性に優れたシェルのマイクロバブルであるため、外力（例えば、超音波および結合細胞）に対する自己成形的である。ガスコアと共役すると、細胞を単離するための非常に優しい材料となる。第二に、マイクロバブルと結合した細胞が自動的に液体の上面に浮揚するので、その使用するマイクロバブルは「自己運転ビークル」である。第三に、その使用する脂質シェルマイクロバブルは、水性溶液から自己分離し、他のマイクロバブルに自己濃縮／凝集する。第四に、細胞に結合したマイクロバブルは、周囲の気圧を上げることによって、細胞にダメージを与えることなく、内部の結合を破壊することができる。以下、マイクロバブルのこれらのユニークな利点は、細胞治療の課題の解決にどのように役立つかを説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
実施形態は、例として示され、添付の図面の図に限定されず、図面において同じ参照符号で同じ要素を示す。
【図１】本発明の一つの実施形態によるシステムを第１構成で示す。
【図２】本発明の一つの実施形態によるシステムを第２構成で示す。
【図３】本発明の一つの実施形態によるシステムを第３構成で示す。
【図４】本発明の一つの実施形態によるシステムを第４構成で示す。
【図５】本発明の一つの実施形態によるシステムに含まれる接続／閉鎖機構を概略的に示す。
【図６】本発明の一つの実施形態によるシステムに含まれる別の接続／閉鎖機構を概略的に示す。
【図７】本発明の一つの実施形態によるシステムに含まれるプランジャを概略的に示す。
【図８】本発明の一つの実施形態によるシステムに含まれる別のプランジャを概略的に示す。
【図９】従来技術と比較して、マイクロバブルを含む本発明の好ましい実施形態の細胞増殖の結果を示す。
【図１０】従来技術と比較して、マイクロバブルを含む本発明の好ましい実施形態の細胞生存率の結果を示す。
【図１１】先行技術と比較して、マイクロバブルを含む本発明の好ましい実施形態の細胞増殖の結果の倍率変化の結果を示す。
【図１２】血中の稀な集団であるナイーブＴ細胞の例を記載する。
【図１３】組織（ここでは骨髄）中の稀な集団である幹細胞の例を記載する。
【図１４】他の望ましくない細胞混合物と混合された低い標的細胞濃度をもたらす第一の従来技術の選択戦略を示す。
【図１５】他の望ましくない細胞混合物と混合された低い標的細胞濃度をもたらす第二の従来技術の選択戦略を示す。
【図１６】他の望ましくない細胞混合物と比較的少ない程度しか混合され得ない高い標的細胞濃度をもたらす選択戦略を示す。
【図１７】ポジティブ連続選択による細胞療法における製造工程を示す。
【図１８】Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間のリガンドおよび受容体の相互作用を概略的に示す。
【図１９】免疫学的シナプスにおける受容体−リガンド対が、極性および対称性を含む独特のパターンで組織化されていることを概略的に示す。
【図２０】Ｔ細胞とＡＰＣとの間の免疫学的シナプス、および本発明の実施形態に従う、Ｔ細胞とＡＰＣを似たマイクロバブルとの間の免疫学的シナプスを概略的に示す。
【図２１】異なる献血者による１回以上の再刺激において、抗ＣＤ３／ＣＤ２８共役ダイナビーズおよび抗ＣＤ３／ＣＤ２８共役マイクロバブルを使用することによるＴ細胞増殖の比較を示す。
【図２２】蛍光染色によるＴ細胞と抗ＣＤ３／ＣＤ２８共役マイクロバブルとの間の免疫学的シナプスの形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の説明および図面は例示的なものであり、限定的に解釈されるべきではない。徹底的な理解を提供するために、多数の特定の詳細が記載されている。しかしながら、場合によっては、説明が曖昧になることを避けるために、よく知られている詳細または従来の詳細は説明されていない。本開示における一つの（ｏｎｅまたはａｎ）実施形態への参照は、必ずしも同じ実施形態への参照ではなく、そのような参照は少なくとも１つを意味する。
【００２０】
本明細書における見出しの使用は、単に参照を容易にするために提供されており、決して本開示または添付の特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００２１】
本明細書において「一つの（ｏｎｅ）実施形態」または「一つの（ａｎ）実施形態」などへの参照は、その実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書の様々な箇所における「一つの実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照しているわけではなく、他の実施形態を相互に排除する別個のまたは代替の実施形態でもない。さらに、他の実施形態によってではなく、いくつかの実施形態によって示されてもよい様々な特徴が説明される。同様に、他の実施形態に対する要件ではなく、いくつかの実施形態に対する要件であり得る様々な要件が説明される。
【００２２】
本開示は、単一の容器における細胞および他の生物学的因子の大量単離、選別、刺激、増殖、および操作のための装置およびシステムを含む。その好ましい実施形態では、本開示は、単一の密閉容器において、ヒト細胞を繰り返し単離、選別、刺激、増殖または操作するために、マイクロバブルに添付した抗体ベースの親和性リガンドと連続ＢＡＣＳ（またはＢＵＢＬＥＳ）とを使用する。
【００２３】
図１〜４は、本開示の好ましい実施形態の１つのバリエーションを示す。ここで、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１である試料細胞１は、注射器状の容器３の中で抗ＣＤ８マイクロバブル２と混合してインキュベートする。マイクロバブル２および標的細胞４は徐々に液面に浮揚する（図２）。標的細胞４の集団（ＣＤ８＋細胞）は、容器の開口部６が地面に向くように（図２）、プランジャ５（図３）を押すことによって保持される（ポジティブ選択）。このポジティブ選択のために、液体の大部分は廃棄される。続いて、容器内の空気空間０における周囲空気圧を増加させることによってマイクロバブル２が破壊され、当該周囲空気圧は、キャップ７が容器の開口部に取り付けられたとき（図４）に空気を圧縮すること、例えば、プランジャを動かすことによって作り出される。ＢＡＣＳの次のサイクルでは、緩衝液を含む第２種の標的マイクロバブル２（抗ＣＤ６２Ｌ）を抗ＣＤ８選別細胞と混合する。プロセスは前述のようにリスタートされる（図２〜４）。抗ＣＤ４５ＲＡマイクロバブル２を用いた３回目のサイクルの後、注射器状の容器３におけるナイーブＣＤ８＋のＴ細胞集団（ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）は、培地において抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共役マイクロバブル２に連結させることによって、刺激および増殖される。その後の操作（例えば、キメラ抗原受容体によるウイルス形質導入）も同じ容器３で行うことができる。
【００２４】
上記の図では、３つの連続するポジティブ選択が適用される。他の出願は、マイクロバブル２に結合した標的細胞を除去するためのネガティブ選択工程を紹介できる。ネガティブ選択は、容器の開口部６が、図２に示された状態ではなく、図１に示すように地面と反対側に向く配向を採用することによって、達成される。国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１７５３４４  Ａ１号および図６に記載されているように、ネガティブ選択に特に適した他の装置またはアダプタに関連する。
【００２５】
本発明のシステムにおける接続／閉鎖機構の好ましい実施形態は、多数の医療器具および実験室器具とインターフェースする標準のルアーロック８を備える。アダプタ９または１１は、注射器状の容器３の一端部の開口部６を密封することにより、親和性リガンドに共役したマイクロバブルおよび細胞内容物を操作して、採取された細胞を集め、また、プランジャ５は、形状が凸状または凹状になるように修飾されたプランジャ先端部１０を有し、親和性リガンドに共役したマイクロバブル２と溶液中の細胞との間の空間を満たし、容器３の他方の端部に挿入される。プランジャは自動的または手動で操作できる。プランジャ先端部１０の形状は、プランジャ５の前面形状の変化前後を示す図７と図８との間の矢印で概略的に示されるように、ダイヤフラム弁の機構によって調節または調整することができる。プランジャの形状は、選択プロセスの異なる工程の間におけるユーザのニーズに対応するように、システムの使用中に調整することができる。例えば、プランジャは、より多くの浮揚マイクロバブルを収容するように凹状に調整すること、および最終製品からより多くの廃棄物を排出させるように凸状に調整することができる。これらのプランジャの前面形状も、各工程の性能を高めるために、プロセス中に調整される。プランジャを異なる工程に完全に交換することもでき、すなわち、プランジャの選択を含むキットが提供される。これにより設計の簡単化を提供しているが、工程の間においてプランジャを交換することは、キャップ７、ルアーロック８またはアダプタ９を介すこと以外、容器を開くことを含むので、無菌性の観点から好ましくない。
【００２６】
本開示の装置の他の実施形態は、異なる硬質または軟質の密閉容器、異なる構成タイプの注射器状の容器３、異なるタイプのアダプタまたはプラグ、異なる親和性リガンドの組合せ、および異なる角度で反転するまたは全く反転しないプランジャからなり得る。他の実施形態は、他の種類の細胞および生物学的因子を単離、選別、操作、刺激および増殖することもできる。最後に、本開示の他の実施形態では、ＢＡＣＳと併せて、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを使用することができる。
【００２７】
図１〜４は、本開示の好ましい実施形態の一つのバリエーションを示す。これらの図において、密閉の容器３は、上述のように、プランジャを有する単一の注射器状の構成からなり、キャップで密封されてもよい。容器３内には、サンプル細胞または生物学的因子を単離、選別、操作、刺激または増殖するために使用される親和性リガンドに共役したマイクロバブル２の溶液がある。単一の容器３における多重マーカー選別のための連続ＢＡＣＳ（またはＢＵＢＬＥＳ）の使用は上記の通りである。
【００２８】
標的マイクロバブルを用してナイーブＴ細胞の連続多重マーカー単離を示すために、注射器において、０．２％ＢＳＡ緩衝液中の１０８／ｍｌのＰＢＭＣを最初に抗ＣＤ８ＭＢ（マイクロバブル）と共にインキュベートした。注射器内の混合物を４℃で２０分間穏やかに回転させた。続いて、注射器を図２に示すような位置に１０分間保持した後、プランジャを穏やかに押すことにより、溶液における望ましくない細胞を除去して、図３に示されるように浮力があるＭＢ層を保持した。０．２％ＢＳＡ緩衝液を補充することにより、保持されたＭＢ層を１回洗浄した。最後に、注射器を図４に示されるように保持し、その開口部をキャップで密封した。マイクロバブルは、プランジャを押して周囲圧力を約２〜３気圧に上昇させることにより、破壊された。同じ手順は、抗ＣＤ６２Ｌ  ＭＢ、続いて抗ＣＤ４５ＲＡ  ＭＢを適用することにより繰り返された。ＦＡＣＳ分析により、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ４５ＲＡ＋集団のいずれかについて、各単一マーカー単離の細胞純度が８０％を超えることを証明した。概念実証の連続多重マーカー単離では、ＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋トリプルポジティブ細胞集団が、２％（元ＰＢＭＣ）から約６０（４０〜８０）％まで濃縮された。
【００２９】
図５は、本開示の１つの好ましい実施形態からの装置の頂部を示す。ここで、部分的に密閉容器を含む注射器状の構成は、装置が様々な医療器具および実験器具とインターフェースすることを可能にする、ルアーロック８が使用される。
【００３０】
図６は、円筒状アダプタ９を注射器状の容器３の開口部６に接続させることにより、容器を密封し、図４に示されるようにプランジャを押すことによって高い周囲圧力を作り出すことにより、マイクロバブルを破壊することを示す。
【００３１】
図６は、本開示のもう一つの好ましい実施形態からの装置の上半部を示す。ここで、単離、選別、操作、増殖、または刺激された細胞サンプルを収集するための、異なる反転アダプタ１１が使用される。なお、その他の点では図６は図５と同一である。
【００３２】
他の種類のアダプタ、例えば、汎用の２方向、３方向または４方向のルアーロックコネクタは、注射器状の容器３の開口部６に接続され、密閉容器においてＢＡＣＳを繰り返し適用した後、分類、単離、操作、刺激、または拡張されたサンプルを大量に収集する。ここで、親和性リガンドに共役したマイクロバブルの溶液はサンプルに注入され、当該サンプルはヒト血液および他の体液または組織からの標的細胞集団からなる。
【００３３】
図７は、好ましい実施形態のプランジャ５を示す。この好ましい実施形態では、プランジャ５のプランジャ先端部１０は、ダイアフラム弁または他の類似の装置を制御する機構を介して、相互に変換して、凹状を形成することができる。先端部は、プランジャ５内に液体または空気圧を加えることによって、修飾される。プランジャ先端部５の構成は、標的マイクロバブル２および注入されたヒト細胞を操作するために使用される。
【００３４】
図８は、他の好ましい実施形態のプランジャ５を示す。ここで、プランジャのプランジャ先端部１０は、ダイアフラム弁または他の類似の装置を制御する機構を介して、相互に変換して、凸状を形成することができる。なお、その他の点では図８は図７と同一である。
【００３５】
図５〜図８は、本開示の１つの好ましい実施形態に使用されるシステムを示す。このシステムは、ＢＡＣＳを適用し、親和性リガンドに共役したマイクロバブル２を使用して、密閉容器３において、細胞や他の生物学的因子の大量の分離、選別、操作、増殖、または刺激を繰り返し行う。この特定の好ましい実施形態で使用されるシステムを操作する際に、ユーザは、図１または図２に示す工程から始まり、図３に示す工程に進み、最後に図４に示す工程に続く。図４に示す工程が完了された後、ユーザは、図２〜４に示す工程に戻ることによって、別の種類の標的マイクロバブル２を用いてプロセスを再開することができる。これらの工程は、サンプル生物学的因子の大量の単離、選別、操作、刺激、または増殖を達成するために繰り返し行われる。
【００３６】
図１〜４は、標的マイクロバブルが注入されたマイクロバブルを使用する、本開示のＢＡＣＳシステムの好ましい実施形態を示す。装置の好ましい実施形態において、ＢＡＣＳシステムは、ルアーロックと、プラグではないアダプタと、反転先端を有するプランジャとを使用する密閉容器を含む注射器状の構成で適用される。
【００３７】
図９〜１０は、本開示の溶液の他の実施形態および従来技術に存在するマイクロバブル溶液と比較して、本開示のマイクロバブル溶液の好ましい実施形態の細胞生存率および増殖の結果を示す。この本開示のマイクロバブル溶液の好ましい実施形態において、Ｔ細胞の単離、選別、増殖、操作、または刺激のために、ＣＤ３／ＣＤ２８親和性リガンドの組合せに共役したマイクロバブルが注入される。マイクロバブルに共役したＣＤ３／ＣＤ２８およびダイナビーズに共役したＣＤ３／ＣＤ２８の両方は、開始時点およびグラフ上の矢印が示す時点で、細胞培養物に添加される。図９〜１０は、この好ましい実施形態が、本開示の他の実施形態および従来技術（ダイナビーズ）で使用される溶液よりも高い細胞生存率および細胞増殖を達成することを示す。この優れた結果は、免疫学的シナプスを再現するためのマイクロバブルとＴ細胞の間のより自然な相互作用を反映する可能性がある。
【００３８】
図１１は、本開示のマイクロバブル溶液の好ましい実施形態を示す。図１１において、単一の容器内で細胞単離が行われた後、ＣＤ３／ＣＤ２８リガンドの組合せに共役したマイクロバブルがマイクロバブル溶液に注入される。この抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロバブル溶液は、従来技術で開発された抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズよりも高い効率および品質でＴ細胞を増殖することに適用することができる。表１において、細胞増殖プロファイル（ＣＤ８／ＣＤ４Ｔ細胞比）は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後の癌免疫療法での使用に適する。
【００３９】
ＰＢＭＣ単独（ＰＢＭＣグループ）、ＰＢＭＣ＋抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（ビーズグループ）およびＰＢＭＣ＋抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロバブル（ＭＢグループ）の結果を比較し、特に、複数の刺激回数の場合のビーズおよびＭＢの性能を比較し、以下の表１にまとめられているように、ＭＢは、特に２回目の再刺激のような高次の再刺激では、ＰＢＭＣおよびビーズよりも著しく優れていることが明らかになった。
【００４０】
【表１】
2020501569.tif 000003
【００４１】
本開示の他の実施形態では、マイクロバブルは、類似の細胞接触依存性シグナル伝達用途のために、他の種類のリガンドに共役することができる。
【００４２】
本開示の実施形態では、好ましいか否か及び示されるか否かに関わらず、マイクロバブルに注入された親和性リガンドの組合せは、経時的に分裂させること、または高い周囲圧力をかけることによってより正確に制御されることが可能であるので、便利なフィーダー細胞・フリー無細胞・接触依存性細胞の培養システムの製造を可能にする。
【００４３】
堅牢な製造手順を提供するためのＢＵＢＬＥＳ技術の実用化
リン脂質シェルを有するペルフルオロヘキサンガスマイクロバブル（ＭＢ）を調製するためのＢＵＢＬＥＳ（またはＢＡＣＳ）技術による乳化法としては、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１７５３４４  Ａ１に記載されているように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ３４００−マレイミドが膜に含まれることにより、抗体あたり１〜２個のチオール基を有するＦｃフラグメント特異的ＩｇＧと抗体とを共役させ、マイケル付加により、マレイミド活性化ＭＢに共役させた。抗ＥｐＣＡＭのような標的抗体を２番目の工程で結合させた。大部分のＭＢは、３〜１０μｍの直径を有する（ほとんどの哺乳動物細胞のサイズと類似する）。各ＭＢは、平均３６７，０００の抗ＦｃＩｇＧ分子を有する。最近、出願者らと他の人々は、同じアプローチを使用して、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３４、ＰＤ１などを含む他の細胞表面タンパク質を標的とするマイクロバブルの製造に成功した。出願者の以前の刊行物に記載されているように、ＭＢと磁気ビーズの結合効率を並べて比較すると、両者が同等の効率で標的細胞とロゼットを形成することを示した。しかしながら、ＭＢはより速い結合を示し、１分間の混合後に、８５％を超える細胞がＭＢに付着した。
【００４４】
ＢＵＢＬＥＳは、革新的な細胞単離／選別プラットフォームであり、困難な課題のために、単独で使用することも、他の２つの主要なプラットフォームであるＦＡＣＳおよびＭＡＣＳと組み合わせて使用することもできる。その概要は、主に、単一の容器装置内において、ヒト細胞の大量単離、多重マーカー選別、および操作のために、細胞治療の臨床応用におけるＢＵＢＬＥＳの使用に関する説明および討論に注目している。ただし、他の臨床または研究の状況では、ＢＵＢＬＥＳを単独またはＦＡＣＳやＭＡＣＳと組み合わせて使用することにより、最適な結果を得ることもできる。
【００４５】
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）は、個々の細胞の詳細な分析に最もよく使用される製品であるが、細胞の大量単離のためにスケールアップには使用されていない。磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）技術、特に、ミルテニーシステムは、大量の標的細胞単離のために使用される。マイクロビーズ（例えば、ダイナビーズ）に結合した細胞は、混合管の外側の外部磁石によって引き出すことができる。ＭＡＣＳに関する最大の問題の１つは、磁気微粒子（＞１μｍ）と結合した単離細胞が破壊されることが多いことである。したがって、ほとんどの市販の磁気細胞選別システムは、マイクロビーズ共役抗体ではなく、ナノビーズを使用している。既存のＭＡＣＳ技術は、強い外部磁石によって生成された磁場中において、高勾配磁気細胞分離カラムを適用して、ナノビーズ標識細胞を磁化する。ＭＡＣＳは、強磁気のスチールウール充填カラムを使用して、低磁気ナノビーズと外部磁石との間の長距離相互作用を強化する。しかしながら、このシステムにおけるスチールウール充填カラムを使用すると、カラム詰まりや製造コストの増加などの他の技術的問題が生じる。さらに、ＭＡＣＳナノビーズは、エンドサイトーシスによって、細胞表面または内部のいずれかで標的細胞に付着する。これにより、ＭＡＣＳの適用は、主に単一の表面マーカーに基づく細胞濃縮に限定される。
【００４６】
ＢＵＢＬＥＳ技術は、異種細胞混合物から希な標的細胞を単離するための連続的なポジティブまたはネガティブ選択を提供する
現在の臨床試験における細胞療法の大部分は、血液または組織中の稀な集団である幹細胞または免疫Ｔ細胞であり、例としては図１２および図１３に記載されている。腫瘍リダイレクトの低分化度のＴ細胞サブセットによる利点が圧倒的な前臨床データにより示されるにもかかわらず、臨床試験では、単一選択を用いたＭＡＣＳによる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のＣＡＲ工学的Ｔ細胞（ＣＡＲ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ）が主に使用されている。この選択戦略は、図１４および図１５に記載されるように、他の望ましくない細胞混合物と混合された低い標的細胞からなる一貫性のない細胞製品を生成する。標的細胞注入の治療用量が不十分であると、患者に次善の臨床的利益をもたらす可能性が高い。連続選択は、図１６に記載されるように、標的細胞を高純度で生成してその量を濃縮することができる。最近、細胞と親和性リガンドに共役した磁気ビーズとの可逆的結合を可能にする戦略が報告されている。例えば、ストレプタマー技術は、ストレプタグと融合するように設計されたストレプタクチン多量体化低親和性一本鎖抗体に共役することによって、磁気微粒子またはナノ粒子の標的細胞との可逆的結合を可能にする。他の技術では、細胞または磁気ビーズから解離することができる修飾抗体を使用する。これらの方法では、通常、標的抗体に対する大規模な修飾を必要とし、操作手順と複雑さを大幅に増大させる。一方、ＢＵＢＬＥＳ技術は、特別な研究および臨床的必要に基づいて、十分に確立された抗体、容易に商業的な入手が可能な抗体または特定の抗体などの任意の望まれる抗体に共役できる方法を使用している。装置内に高い周囲圧力（例えば、哺乳動物細胞によく耐えられる）を加えることによってマイクロバブルを破壊できるというＢＵＢＬＥＳ技術の有する利点は、多重の細胞表面マーカーの連続ポジティブまたはネガティブ選択を可能とし、細胞混合物から標的細胞を単離し精製できる。さらに、細胞への物理的な悪影響を及ぼさないこの方法は、細胞の活性と特徴を保存するための付加的な利益をもたらし、これについては、以下でさらに説明する。
【００４７】
ＢＵＢＬＥＳ技術により、単一容器において、選択、選別、培養、遺伝子導入、およびその他の多くのインビトロ操作を可能にする
ＧＭＰ製造細胞療法の最も重要な概念の１つは、収集および製造プロセスを通じて、製品の無菌性を維持するために、外部環境に閉鎖的なシステムに細胞を維持することである。ＢＵＢＬＥＳの明確な４つの利点は、細胞療法生産のために、簡単な操作と費用対効果的な方法で、１つの単一容器において、多数のインビトロ操作を可能にする。ここでは、ＣＡＲ−Ｔ−ＣＤ１９細胞療法を例として使用して、図１７に記載されるような製造工程を説明する。図１７において、Ａで表示される第１構成が示されており、血液バンクまたは臨床センターから得られた出発物質であるアフェレーシスＰＢＭＣ（８〜９ｍｌにおいては〜約１０９個細胞）が、ＢＵＢＬＥＳ注射器状の容器３に移される。マイクロバブル２を加え、当該マイクロバブル２は、試料としてＰＢＭＣにおける細胞混合物のスペースサブセットである標的細胞の第１の細胞表面マーカーを標的とする。注射器状の容器３内の内容積の約３分の１の空間は、空間０として残される。この構成Ａでは、ＰＢＭＣとマイクロバブル２との混合物は、例えば、１０〜６０分間インキュベートすることができる。場合により、希釈のために緩衝液または培地を添加してもよい。この構成Ａでは、ＰＢＭＣサンプル、マイクロバブル２の第１セットおよび任意に希釈剤および／または媒体を容器３の中に入れた後、図５に示されるように、装置の頂部は、キャップ７またはルアーロック８／アダプタ９の組み合わせによって閉鎖される。構成Ｂに示されるように、次いで容器３が反転され、プランジャ５を押し下げることによって廃棄物１２が廃棄される。図３による構成に示されるように、プランジャ５を押す距離によって容器３における内容物のどれくらいの量を廃棄するかを決定するので、マイクロバブル２に結合しなかった非標的細胞を含む廃棄物１２が廃棄され、マイクロバブル２およびマイクロバブル２に結合した細胞が容器３に残るようにプランジャを押す。有用であれば、細胞選択工程の次の工程に進む前に、細胞洗浄工程を適用することができる。次の工程は、構成Ｃによって示され、すなわち、注射器状の容器３の向きが再び変えられ、プランジャ５が引き抜かれて、容器３内のＡＬ容積を増大させる。次の工程として、キャップ７またはルアーロック８／アダプタ９の組み合わせが再び取り付けられて、容器３を密封するので、構成Ｄにより示される次の工程においては、プランジャ５を押し上げることによって、容器内の空気圧が上昇し、容器３内の空気量を減少させる。これにより、マイクロバブル２が破壊され、構成Ｅにより示されるように、これまでに選択された細胞混合物がマイクロバブル２から分離される。必要に応じて希釈剤または媒体を再度添加した後、図１７のシステム構成Ａ〜Ｅにより示される工程は、標的細胞の第２細胞表面マーカーを標的とするマイクロバブルの第２セットについて繰り返すことができる。
【００４８】
図１７に示されるように、マイクロバブルに共役した抗体、緩衝液または培地、サイトカインなどを含む材料は、ルアーロック機構を通して添加または廃棄し、閉鎖系の無菌性を維持することができる。特に、マイクロバブルは、自己浮揚ビークルとして機能し、自己凝集／集合特性を有し、また、ＢＵＢＬＥＳシステムは、容器を簡単に反転させることによって同じ容器内の所望の画分を分離して濃縮することができ、さらに、周囲圧力を加えることでバブルを破壊すると、抗体共役を容易に破壊して、１つの容器内で連続選択を可能にすることができる。なお、操作全体を自動化モードに簡単に設定して、ＧＭＰメーカーをスリム化することができる。
【００４９】
複数のサブ配列選択による選択工程は、標的細胞を動かすことなく同一の容器内で行われるので、本発明による方法およびシステムは、全体のプロセスで無菌環境を維持するという利点をさらに提供する。この利点は、さらに拡張して、同じ無菌環境、すなわち、複数のサブ配列選択プロセスが完了した後に細胞のスペースサブセットを高濃度で保持する容器内で、細胞活性化および細胞増殖を提供することもできる。この目的のために、キャップ７またはルアーロック８／アダプタ９の組み合わせを空気フィルターで置き換えることができ、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法のために、単離された細胞にレトロウイルスベクターを加えることによって、容器３においてＣＡＲ遺伝子形質導入を行うことができる。さらに、場合によっては、マイクロバブルは、ＣＤ１９細胞表面マーカーを有するＣＤ１９発現Ｔ細胞に結合する。代替的または追加的に、選択された細胞は、培養バッグに移されて細胞をスケールアップすることもできるが、これらの工程は、代替として容器３内で実行することもできる。次いで、濃縮のための追加のマイクロバブルは容器に添加してもよく、また、緩衝液は、単離や増殖／活性化した細胞を作製するために、患者への投与に適した交換緩衝液と交換してもよい。同じ容器３内で全ての工程を実行しないことが選択した場合でも、これらの工程の少なくとも大部分はその容器内で実行できるので、選択＋拡張／活性化プロセスの過程において汚染の危険性が著しく低い。
【００５０】
一方、他の方法およびプラットフォーム（ＭＡＣＳまたはストレプタマーなど）では、各工程においてバッグまたは容器を変えることを必要とし、緩衝液を変えるかまたは細胞を濃縮するために洗浄および遠心分離を必要とする。比較のために、従来技術の方法は、１つのダイナビーズに対して３つのＣＤ３＋細胞の比で、アフェレーシス生成物と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８常磁性ダイナビーズとをインキュベートすること、および磁石への暴露によりＣＤ３＋細胞画分を単離することを含む。選択した細胞を洗浄して、低ＩＬ−２濃度を有する開始培地で再懸濁し、培養２日間後、レトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）で処理された培養バッグに細胞およびビーズを添加し、抗ＣＤ１９ＣＡＲの新しい培養バッグおよびウイルスベクターが充填されて、少なくとも２４時間インキュベートした。翌日、この形質導入工程を繰り返し、次いで細胞およびビーズを新しい培養バッグに移し、さらに９日間増殖させた。細胞増殖が完了した時に、再び磁石を適用することで、ビーズを除去して廃棄し、細胞を洗浄して注入のために調製した。
【００５１】
ＭＡＣＳ、ストレプタマーおよびマイクロバブルの３つの方法の間の比較は、以下の表２に要約されている。
【００５２】
【表２】
2020501569.tif 000004
【００５３】
操作の余分な工程は、細胞製品の収量に影響を及ぼし、細胞の健康と活動に直接ストレスを加える。自動化によって操作できるいくつかの工程以外、それらの複雑で複数の工程の適切な実行を確実にするために、多大な労力が必要とされる。さらに、現在のＭＡＣＳシステムは、これらのＧＭＰ材料を大量に必要とするので、培養バッグおよび滅菌チューブが高価である。ストレプタマーシステムは、広範囲で予測不可能な抗体工学作業に加えて、複数の複雑な手順について同様の要求も必要とされる。
【００５４】
マイクロバブルが４つの異なる特性を有するので、記載されているＢＵＢＬＥＳシステムは、診療所で使用されている現在利用可能なシステムに対して様々な利点を提供し、例えば、（１）表面マーカーの連続ポジティブまたはネガティブ選択を使用して、血液またはヒト組織から希な標的細胞サブセットを選択、単離、精製、および濃縮すること、（２）Ａｂを設計するための余分な作業はなく、容易に入手できる任意の抗体を使用し、このシステムの使用を多くの種類の細胞療法に容易に拡張すること、（３）全ての操作を単一の容器で行うことが可能であるので、閉鎖系で製造手順を単純化し制御すること、（４）自動化モードに簡単に設定すること、（５）ＧＭＰグレードのチューブや材料を節約するので費用対効果が高いことを含む。ここで、システムについてＣＡＲ−Ｔ細胞療法を例として説明しているが、マイクロバブルが様々な抗体と容易に結合して特定の稀な細胞のサブセットを連続選択できることにより、臨床的需要を満たすことができるので、このシステムは、他の細胞療法、例えば、様々な造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、免疫Ｔ細胞、または免疫的樹状細胞にも非常に役立つ。遺伝子工学は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法において必要とされ、このシステムの単一の容器中で行われることができる。他の細胞治療用途では、膨大な量の細胞が必要な場合に、ＢＵＢＬＥＳシステムは、手順の流れに培養バッグを組み込むことで柔軟に適用することができる。
【００５５】
インビトロ／エクスビボ操作中の細胞特性の維持
幹細胞の古典的な定義は、自己複製性および多能性の特性を有するということである。体性幹細胞は、未分化状態のままで細胞分裂を行う能力を有する稀な細胞サブセットであり、受けた分化シグナルに応じて様々な成熟細胞型に発達する多能性がある。結果として、細胞治療の最終的な成功は、注入細胞の幹細胞の特徴の維持（ｓｔｅｒｎｎｅｓｓ、すなわち、幹細胞性）程度に左右される。ＢＵＢＬＥＳは、インビトロ／エクスビボ操作過程において、標的細胞への物理的損傷を最小限に抑えるだけでなく、さらに重要なことには、生物学的意義のメカニズムを通して細胞効力を維持および刺激するという明確な利点も提供する。ここで、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を例としてこの課題を具体的に説明しているが、患者の再生機能を達成するために注入された細胞の幹細胞活性の維持が重要であるため、類似の原理は、ＨＳＣ、ＭＳＣ、神経幹細胞などを含む他の幹細胞療法にも適用されることに留意されたい。
【００５６】
単一の容器操作により、細胞への機械的損傷を最小限に抑える
第一に、ＢＵＢＬＥＳシステムは、インビトロ操作工程を最小限に抑え、前記のように、単一容器内において、標的細胞の単離および濃縮、細胞の培養および増殖、遺伝子形質導入、ならびに他の操作を含み、さらに、工程間で細胞を洗浄、遠心分離、再懸濁する必要がない。また、最も圧縮性／柔軟性の高い脂質コートマイクロバブルは、ガスコアと共役して、外力（例えば、超音波および結合細胞）に対して自己成形性があり、細胞にとって非常に優しい材料である。簡単な例として、風船（マイクロバブル）で緩和された卵（細胞）である。ＢＵＢＬＥＳシステムのこれらの有利な利点は、操作上および物理的な便益を提供して、細胞の損傷を大幅に最小限に抑える。
【００５７】
低分化度のＴ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に望ましい細胞サブセットである
Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）は、メモリーリンパ球の稀なサブセットであり、自己再生する幹細胞様能力、およびメモリーとエフェクターＴ細胞サブセットの全スペクトルを再構成する多能性能力を有する。Ｔ細胞は、増殖能力の連続的な喪失を受けるが、抗原未経験のナイーブ細胞（ＴＮ）からＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー（ＴＣＭ）、ＣＤ６２Ｌ−エフェクターメモリー（ＴＥＭ）およびエフェクター（ＴＥ）Ｔ細胞サブセットへの分化の過程において、エフェクター機能の獲得が起こる。ヒトＴ細胞分化の階層モデルを示す表は、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１２；１２（１０）：６７１−６８４から以下の表３として提供される。
【００５８】
【表３】
2020501569.tif 000005
【００５９】
ヒトＴ細胞分化の階層モデルでは、抗原プライミングの後、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞は、次第に多様なメモリーＴ細胞サブ集団に、最終的には最終分化エフェクターＴ（ＴＴＥ）細胞に分化する。Ｔ細胞サブセットは、示された表面マーカーの組み合わせ発現によって区別される。ＴＮ細胞はＴＴＥ細胞型に漸進的に分化するにつれて、特定の機能および代謝属性を失うかまたは獲得する。上の表で使用されている用語として、ＴＳＣＭ細胞はＴメモリー幹細胞を表し、ＴＣＭ細胞はセントラルメモリＴ細胞を表し、ＴＥ細胞はエフェクターメモリーＴ細胞を表す。
【００６０】
これは、ＴＮおよびＴＣＭの選択がより高い治療効力をもたらす可能性があることを示唆する。多くの前臨床試験では、ＣＡＲ−Ｔ免疫療法の採用においてナイーブＴ細胞が理想的な細胞集団であることが確認されているが、循環中の相対的な不足のナイーブＴ細胞を分離するという技術的困難、およびインビトロでこの細胞型を生成および維持することができる堅牢な臨床グレードの製造プロトコルの欠如により、臨床試験では、選択されていない末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のＴ細胞集団が主に採用されている。低分化度のＴ細胞集団の単離には、より明確なＴ細胞製品を再現性よく生成するという利点もあり、ＴＥＭおよびエフェクター細胞を高い割合で含む選択されていない集団は、インビトロでの細胞増殖が不十分なため、実行可能な臨床製品を生成できない可能性がある。ＢＵＢＬＥＳシステムは、堅牢な製造手順を提供することによってナイーブＴ細胞を生成し、当該ナイーブＴ細胞はサイトカインのパネルの添加により所望のＴＳＣＭ細胞に分化するように駆動される。
【００６１】
マイクロバブルは、免疫学的シナプスにおけるＡＰＣとＴ細胞の相互作用を再現する
Ｔ細胞のインビトロ細胞培養は、免疫療法に十分な用量を達成するための受容体工学および細胞増殖に不可欠である。しかしながら、ナイーブで低分化度のＴ細胞は、細胞培養および増殖期間中に急速な喪失および成熟期を経験し、異なる分化プロトコールによって各Ｔ細胞サブセットの異なる結果を提示する。培地および血清に加えて、培養物には、様々なサイトカインおよび抗体／刺激物質が含まれる必要がある。典型的に、Ｔ細胞増殖を促進するためにはＩＬ−２の添加が必要であるが、ある程度のＴ細胞成熟をも誘導するので、メモリーＴ細胞表現型を維持するためにＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を補足する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激により標的Ｔ細胞の機能と活性を確保するために、インビトロ培養の期間においてＴ細胞受容体活性を維持することが重要であり、抗ＣＤ３（またはプラス抗ＣＤ２８）は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の免疫学的シナプス形成を模倣するために、図１８に示されるように、人工合成材料（例えば、磁性微粒子）またはフィーダー細胞（例えば、ＰＢＭＣまたはＫ５６２細胞）のいずれかの表面に提示する必要がある。非専門的細胞（フィーダー細胞）または固体微粒子に由来する人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は様々な程度の成功が報告されている。堅牢なスケールアップ製造プロトコルのためのより制御されたシステムを得るために、インビトロアッセイおよび大規模生産を開発するための合成ａＡＰＣを使用することが好ましい。実際に、生体細胞上でのＨＬＡの発現は経時的に変動することが報告されている。一方、固体粒子に基づくａＡＰＣは、リガンドの不動性という別の問題を抱えており、これは免疫学的シナプス形成の動的過程を妨げることになる。研究では、インビトロＴ細胞増殖へのダイナビーズ−ＣＤ３／ＣＤ２８の添加が、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の急速な喪失を引き起こすことも示された。
【００６２】
免疫学的シナプス
物理的なＴ細胞−ＡＰＣ接触は、このモードのジャクスタクリン（ｊｕｘｔａｃｒｉｎｅ）シグナル伝達に固有するＴＣＲ、接着分子、キナーゼ、細胞骨格要素および細胞小器官の分極軸を設定する。さらに、ＴＣＲと接着分子を放射状対称コンパートメントに横方向に組織化し、免疫学的シナプスは、Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用の持続時間を制御するために、交差する対称面と規制された対称性の破れの可能性を明らかにした。免疫学的シナプスは、シグナル伝達機構の組織化に加えて、サイトカインおよび細胞溶解剤の偏極輸送および分泌を支配してシナプス間隙を横切り、また、受容ＡＰＣおよび環境中の他の細胞に機能的に影響を与える生物活性微小胞（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）の生成およびエキソサイトーシス放出のための部位であり、図１８および１９を参照する。
【００６３】
図１８に示されるように、Ｔ細胞媒介性免疫応答はペプチドの提示から始まり、当該ペプチドは、病原体または他の生物学的構造に由来し、ＡＰＣ表面上で主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣともいう。ｐＭＨＣを生成する）に載せられた。このｐＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体によって認識され、細胞内シグナル伝達のカスケードを開始する。免疫学的シナプス（ＩＳ）のこの小さな（〜７５μｍ２）領域において、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の多くのさらなる受容体−リガンド複合体が観察されており、また、この相互作用に参加しているＴ細胞とＡＰＣの種類や環境中の可溶性因子の存在などを含む多くの要因に応じて変化する可能性がある。しかしながら、ＴＣＲ−ｐＭＨＣに加えて、２つの重要なシグナル伝達システムが主な焦点である。それらの一つ目は、Ｔ細胞表面に提示されるタンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であるＣＤ２８である。ＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかと連結すると、ＣＤ２８は、ＴＣＲに基づくシグナル伝達を増強する共刺激シグナルを提供し、ナイーブＴ細胞の完全な活性化には必須である。二つ目のシステムは、受容体のインテグリンファミリーの一員であるＬＦＡ−１であり、これはＡＰＣ上のＩＣＡＭ−１に結合し、細胞間接着および共刺激機能を提供する。ＴＣＲとＬＦＡ−１および／またはＣＤ２８との同時関与は、多くの種類のＴ細胞の活性化を提供し、これらの３つの受容体は、Ｔ細胞機能のインビトロ還元的な研究に非常に適しているシグナルのコアセットを形成する。
【００６４】
図１９に示されるように、ＩＳの顕著な特徴は、この界面内の受容体−リガンド対が、周辺超分子活性化クラスター（ｐＳＭＡＣ）によって囲まれたマイクロメートルスケール中心超分子活性化クラスター（ｃＳＭＡＣ）領域からなるマイクロメートルスケールおよびそれよりも小さい独特のパターンで組織化され、上記のマイクロメートルスケール中心超分子活性化クラスター（ｃＳＭＡＣ）および周辺超分子活性化クラスター（ｐＳＭＡＣ）は、濃縮したＴＣＲ−ｐＭＨＣおよびＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の結合の区域にそれぞれ対応する。特に、図１９は、成熟免疫学的シナプスにおける極性および対称性を示す。最も重要なことには、免疫学的シナプス内のＴＣＲとＡＰＣとの間の相互作用複合体の動的成分および分子成分が、その後のＴ細胞の増殖および系統の運命を決定する。異なるＴ細胞−ＡＰＣ相互作用は異なる結果をもたらし、ＩＳのマイクロスケールおよびナノスケールの組織化はＴ細胞とＡＰＣとの間の伝達言語の一部を伝えることが示唆される。重要なことに、これらの構造は、「成熟した」ＩＳで観察され、最初の数分間の相互作用にわたって高度に動的なＩＳが観察されている。ＩＳの構造やダイナミクスがＴ細胞機能に与える影響およびその根底にあるメカニズムを理解することは、ＩＳ構造の動的な複雑さをより正確に再現できる有用な実験ツールがないため、免疫細胞生物学に対する現代的な課題である。
【００６５】
別の根本的な課題は、ＴＣＲ、ＣＤ２８およびＬＦＡ−１の下流のシグナル伝達が、細胞質ゾルに可溶な中間体を伴うリン酸化カスケードと主に関連することである。そのような分子は、通常、タンパク質活性を調節できる速度に比べて、高い移動度（μｍ２／ミリ秒程度の拡散係数）を示し、また、ＩＳを規定するマイクロメートルスケールの距離にわたってこれらの分子の段階的濃度の活性を得ることは困難である。さらに、ＴＣＲ／ＣＤ２８／ＬＦＡ−１シグナル伝達は、膜貫通ドメインを介して安定的に、または脂質の翻訳後付着を介して一過性に、または特定の膜成分への結合により、細胞膜と関連する中間体を伴うので、通常、μｍ２／秒のオーダーの拡散係数を示し、その値はこれらのスケールで空間的に分解された細胞シグナル伝達を妥当なものにする。ＴＣＲシグナル伝達は、細胞骨格の組み立て、分解、および活性を調節する経路の活性化を伴い、マイクロメートルおよびそれよりも小さいの規模で、シグナル伝達の空間的調節を可能にする。
【００６６】
細胞接触依存性相互作用のための人工表面
細胞外環境の特定のアスペクトを捉える人工または工学的表面は、細胞−細胞接触（ジャクスタクリン）シグナル伝達の研究において中心的な役割を果たす。上記の背景の概要で簡単に要約したように、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体はリガンド−受容体相互作用を模倣するためのコアＴＣＲ複合体として使用できるが、人工システムは少なくとも、（１）原型ＩＳ構造の動的複雑性、（２）細胞内の下流シグナル伝達をよりよく誘発するための細胞膜上の分子の移動性および空間的相互作用、ならびに（３）数μｍ〜数十ｎｍの範囲の複数の距離スケールで膜タンパク質と相互作用する基礎細胞骨格ネットワーク、を要約する必要もある。
【００６７】
例えば、制御された弾性のエラストマーおよびヒドロゲルは、間質細胞がＥＣＭの剛性をどのように感知するかを理解するという文脈の中で、非常にうまく使用されてきたが、そのように工学化されたシステムは、さらなる機械的応答および細胞特性を示すＴ細胞とＡＰＣとの間の相互作用を捕獲することが困難であることが証明されている。ＩＳ内でＴＣＲ複合体に対してリガンドのパターンを提示するマイクロパターン化表面および多成分マイクロパターン化表面の使用は、細胞シグナル伝達を理解するための次のステップであるが、根本的な制限は、そのようなシステムがＡＰＣ表面に沿ったタンパク質の自然な移動性を捕獲しないことである。図１９は、成熟した免疫学的シナプスにおける極性および対称性を示す。超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の界面に示される。指向性分泌の軸は、ＳＭＡＣを通過するスペアである。対称面は、免疫学的シナプスの面であり、安定しているときに放射状に対称である。Ｔ細胞は、接着リングが対称性を破ると、移動する。この技術は、固定化がシグナル伝達イベントに影響を与えるという事実により、細胞シグナル伝達および情報伝達の研究理解における使用において制限され、大規模なＴ細胞活性化には適していない。３番目の例は、リン脂質の自己組織化平面二層構造である。水和、ファンデルワールス、および他の力の組み合わせにより、その二層を適切な基材、最も一般的にはガラスに近接させて維持する。薄い（サブナノメートル）水層が二層と支持体を分離し、二層の平面においてリン脂質および他の膜成分（係留されたタンパク質を含む）の横方向の移動性を付与する。
【００６８】
Ｔ細胞表面上の受容体に対する表面固定化リガンドおよび膜係留リガンドは、細胞構造のマイクロスケールおよびナノスケールの詳細により、２つの実験的極値を表し、実際のＡＰＣ膜はこれらの状態の間のどこかにある。４番目の方法において、二層構成を支持するほんの少数の材料のうちの１つである酸化ケイ素の表面は、金属またはプラスチックのような二層構成を支持しない他の材料のナノスケールバリアでパターン形成する。このモデルは工業規模で使用するには複雑すぎる。
【００６９】
上記の例は、研究の理解のために使用されており、極端に低いスループットスケールおよびそのようなシステムを形成する材料の複雑さのために、工業的用途に変換することは実際的ではない。Ｔ細胞活性化のための現在の標準的なプロトコルは、上記のように、人工活性化因子として作用するＣＤ３抗体またはプラスＣＤ２８抗体に共役したダイナビーズの添加である。マイクロスケール磁気ビーズは、ＡＰＣを模倣するために類似の細胞サイズを有するように設計され、ＣＤ３およびＣＤ２８の共役は、リガンド−ＴＣＲ結合を引き起こすことにより、ＴＣＲ複合体を介して刺激シグナルを刺激する。しかしながら、研究により、ダイナビーズ−ＣＤ３／ＣＤ２８のインビトロＴ細胞増殖への添加がナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の急速な喪失を引き起こすことが示された。簡単な例としては、岩（微粒子）で挟まれた卵（細胞）がある。したがって、現在市販の磁気細胞選別システムの大部分は、細胞分離用の砂（ナノ粒子）で囲まれた卵（細胞）に類似したナノビーズを使用している。しかしながら、これらのリガンドに共役したナノ粒子は、おそらくナノビーズの硬い性質のためだけでなく、小さいサイズの粒子が免疫学的シナプスの形成を誘導することができないため、Ｔ細胞を活性化するのに不十分である。免疫学的シナプスの複雑さを理解すると、ダイナビーズがＡＰＣの生物学的機能を再現するという問題は、磁気ビーズの剛性と沈殿性の両方のために、Ｔ細胞で適切なシグナル伝達経路を誘発できないことに起因する可能性がある。潜在的には、ＭＢの可動性脂質表面は、リガンド−ＴＣＲの関与の際に、必要な動的ＩＳ構造を提供することができる。
【００７０】
実験演示
Ｔ細胞活性化に対する効果は、ダイナビーズ対マイクロバブルを用いて、試験した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８に共役したマイクロバブルは、特に２回目の刺激後に、Ｔ細胞増殖において、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズより優れた。図２１に示されるように、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞は、最初の２週間以内に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８に共役したダイナビーズまたはマイクロバブルで最初に刺激した後に強く増殖した。注目すべきことに、マイクロバブルに基づくＴ細胞増殖は、その後の２回の刺激でも同じ傾向を続けたが、ダイナビーズベースに基づく増殖は、２回目の刺激後に劇的に減少した（図２１の（ａ））。Ｔ細胞増殖は、２回目の刺激が行われた際に、刺激試薬が添加されなかったときに停止したので、抗ＣＤ３／ＣＤ２８に依存する（図２１、模擬グループまたは対照グループ）。結果は、同じドナー（図２１の（ａ）および（ｂ））または異なるドナー（図２１の（ｂ）、（ｃ）および（ｄ））からのＰＢＭＣを使用することで再現可能である。Ｌｉらの研究では、Ｆｃ受容体担持フィーダー細胞の存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズおよび可溶性抗ＣＤ３で刺激されたＴ細胞応答の比較において、「急速拡張プロトコル（Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＲＥＰ）」が指定された類似の観察が報告されており、フィーダー細胞は、抗ＣＤ３（そのＦｃ受容体と結合した）およびＢ７（抗ＣＤ２８に相当するＣＤ８０およびＣＤ８６）を提示するためのＡＰＣとして機能する。マイクロバブルおよびフィーダー細胞は、刺激後のＴ細胞生存、増殖、および表現型の応答がＲＥＰおよびマイクロバブルと類似するように、液体脂質表面によって囲まれている。一方、フィーダー細胞は培養物から除去される必要があるが、ＭＢに基づくＴ細胞活性化においては除去は必要とされない。したがって、マイクロバブルに基づくａＡＰＣには、次の表４に示されるように、ダイナビーズおよびＲＥＰより多くの利点がある。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
図２２は、免疫蛍光アッセイによるＴ細胞（Ｔ１およびＴ２で示す）と抗ＣＤ３／ＣＤ２８に共役したマイクロバブル（矢印でＭＢ）との間の免疫学的シナプス形成のスケッチを示す。Ｔ細胞の形状は、Ｆ−アクチン染色パネルに見られるように、ＭＢとの接触ゾーン付近のＦ−アクチン重合バンドで分極化されていることに留意されたい。ＭＢと関連しないＴ細胞（Ｔ３）は、細胞内に典型的に均一に分布したＦアクチン染色を有する。細胞の完全性を示すために、細胞核はＤＡＰＩで染色される。
【００７３】
さらに、マイクロバブルは、３７℃の標準培養条件では１０〜１６時間以内に自然に破裂する。このマイクロバブルの独特な特性は、ＩＳの形成がほんの数時間しか必要としていないことが示されているので、Ｔ細胞活性の消尽につながる可能性があるＴ細胞の過剰刺激を回避すること、および免疫学的シナプス形成期間をより模倣することなどのダイナビーズを超えるさらなる利点を提供できる。さらに、このマイクロバブルの興味深い性質は、ビーズ除去の必要性を排除するだけでなく、汚染の可能性および自動化の複雑さを減少させる。
【００７４】
マイクロバブルに基づく技術は他の生物学的システムのための強力なツールとして役立つ
ＩＳシグナリ伝達における空間的考慮の重要性は、あらゆる種類の細胞−細胞の通信および細胞−ＥＣＭの通信においても見られる。細胞間の情報伝達は、シグナル伝達分子自体だけでなく、シグナルが分配され受容体に提示される方法から生じる多くの文脈的および位置的合図によっても行われる。膜貫通型および分泌型増殖因子は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分およびインテグリンと接触依存的に関連して、それらの受容体にシグナル伝達する。シグナル伝達分子は、シナプス様構造を介して標的細胞と接触し、活性化するサイトネームを介して離れた位置にある細胞に到達することもできる。上記の免疫学的シナプスシステム以外、他の多くの細胞−細胞および細胞−マトリックスの接触システムは、さまざまな生物学的機能を調節するための重要な役割を果たす。
【００７５】
同様に、マイクロバブルに共役した選択されたリガンドは、これらの相互作用を再現するための人工細胞として役立ち得る。
【００７６】
開示された実施形態の上記の説明は、当業者が本開示を製造または使用することを可能にするために提供される。これらの実施形態に対する様々な修飾は、当業者には容易に明らかとなり、本明細書に記載された一般的な原理は、本開示の精神または範囲から逸脱することなく他の実施形態に適用され得る。したがって、本明細書に記載されている説明および図面は、本開示の現在の好ましい実施形態を表しているため、本開示によって広く企図されている主題の代表であることを理解されたい。本開示の範囲は、当業者に明らかになり得る他の実施形態を完全に包含することがさらに理解される。
【００７７】
さらなる実施形態は、以下の段落に示される。
１．様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法であって、
ａ）サンプルを容器に入れる工程、
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第１の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｃ）第１抗体と第１細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第１抗体を第１細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｄ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第１マイクロバブルおよび第１マイクロバブルに結合した細胞の第１サブセットを分離することを可能にする工程、
ｅ）サンプルにおける細胞の第１サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程、
ｆ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第１マイクロバブルを破壊する工程、
ｇ）気体を包囲する内部気泡壁と、細胞の第１サブセットに含まれる細胞の第２サブセットの第２細胞表面マーカーに結合することができる第２抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第２の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｈ）第２抗体と第２細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第２抗体を少なくとも一つの第２細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｉ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第２マイクロバブルおよび第２マイクロバブルに結合した細胞の第２サブセットを分離することを可能にする工程、および
ｊ）細胞の第１サブセットにおける細胞の第２サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程
を含む、浮力による分離方法。
【００７８】
２．第１および第２の細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３およびＣＤ２８のうちの１つである、実施形態１による方法。
【００７９】
３．ｋ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第２マイクロバブルを破壊する工程、および
ｌ）細胞の第３サブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程ｇ）から工程ｋ）までを繰り返す工程
をさらに含む、実施形態１による方法。
【００８０】
４．細胞表面マーカーは、ＣＤ８＋、ＤＣ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋であり、細胞のスパースサブセットは、ナイーブＴ細胞である、実施形態３による方法。
【００８１】
５．細胞のｎ番目のサブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程Ｉ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態４による方法。
【００８２】
６．容器の底部から廃棄物を除去することを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、実施形態１〜５のいずれか１つの方法。
【００８３】
７．望ましくない細胞をそれぞれのマイクロバブルと結合させ、容器の上部に浮揚させ、容器の上部から、これらのそれぞれのマイクロバブルに結合した望ましくない細胞を除去することによって、望ましくない細胞としての廃棄物を容器から除去することにより、ネガティブ選択で容器から廃棄物を除去する工程をさらに含み、実施形態１〜５のいずれか１つの方法。
【００８４】
８．容器内でプランジャを移動させることを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、実施形態６または７の方法。
【００８５】
９．マイクロバブルが受ける圧力を増加させることを含む、第１、第２およびその後のマイクロバブルを破壊する工程をさらに含む、前記の実施形態のいずれかの方法。
【００８６】
１０．容器内でプランジャを移動させることを含む、マイクロバブルが受ける圧力を増加させることをさらに含む、実施形態９の方法。
【００８７】
１１．  細胞のスパースサブセットは、Ｔ細胞を含んでおり、
ｍ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、スパースサブセットに加える工程、
ｏ）Ｔ細胞のスパースサブセットを活性化および増殖するために、十分な時間スパンにわたってＴ細胞およびリガンド提示マイクロバブルをインキュベートする工程、
ｐ）組換えＭＨＣに結合したユニークなペプチド、および抗ＣＤ２８または組換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組合せることで、特異的Ｔ細胞の活性化を達成する工程、および
ｑ）抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８または組み換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組合せることで、非特異的Ｔ細胞活性化を達成する工程
を含む、前記の実施形態のいずれかの方法。
【００８８】
１２．サンプルは、ヒトもしくは動物の血液、他のヒトもしくは動物の体液、または人工緩衝液からのＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞、幹細胞、および癌細胞のうちの１つまたはそれらの組合せのような様々な異なる細胞を含む、前記の実施形態のいずれかの方法。
【００８９】
１３．様々な異なる細胞を含むサンプルから細胞のスパースサブセットを単離することは、ポジティブ選択、ネガティブ選択、またはその両方の逐次的組合せによって行われる、前記の実施形態のいずれかの方法。
【００９０】
１４．前記の実施形態のいずれかの方法を実行するためのシステムであって、
内部容器空間を画定する内壁を有する容器（３）、
内壁と密封的に接続され、内壁に対して可動なプランジャ（５）、
内部空間を周囲空間に接続させ、気体、液体および固体材料を内部空間に送り込んだり内部空間から送り出したりすることを可能にする、開閉可能な弁（８、９）を備えたポート、および
内部容器空間における柔軟なマイクロバブル（２）
を含み、
前記マイクロバブル（２）は、気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える、システム。
【００９１】
１５．  プランジャ（５）は、凹状、凸状または平坦状のうちの１つの形状を有する前面を備える、実施形態１４によるシステム。
【００９２】
１６．プランジャ（５）は、凸状、凸状または平坦状を想定するような形状に変更するように適した調整可能な前面を有し、システムは、システムの使用中に前面の形状を変更するための調整機構をさらに含む実施形態１４によるシステム。
【００９３】
１７．容器（３）は、滅菌状態である、実施形態１４〜１６のうちの１つによるシステム。
【００９４】
１８．容器（３）は、サンプルの細胞（４）および生物学的因子を生存可能な状態に維持するように適した滅菌溶液を含む、実施形態１４〜１７のうちの１つによるシステム。
【００９５】
１９．プランジャ（５）を動かすように構成された機械的プランジングシステムをさらに含む、実施形態１４〜１８のうちの１つによるシステム。
【００９６】
２０．プランジングシステムは、自動化またはコンピュータ化されている、実施形態１４〜１８のうちの１つによるシステム。
【００９７】
２１．ａ）気体を包囲する内部気泡壁と、単離されたＴ細胞上で細胞接触依存性のジュクスタクリンシグナル伝達を達成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示マイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程
を含む、単離されたＴ細胞を活性化および増殖するための方法。
【００９８】
２２．リガンド提示マイクロバブルは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）細胞療法のような養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、実施形態２１の方法。
【００９９】
２３．リガンド提示マイクロバブルは、ペプチド／ＭＨＣおよび抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、請求項２１に記載の方法。
【０１００】
２４．単離された細胞の活性化または阻害化のために、十分な時間スパンにわたって、前記細胞およびリガンド提示マイクロバブルをインキュベートする工程をさらに含む、実施形態２１〜２３のうちの１つによる方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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