(57)【要約】ＴｒｋＢの細胞外ドメインの１つに含有されるエピトープに結合し、ＴｒｋＢを活性化することが可能である単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体であって、該細胞外ドメインは、ＴｒｋＢの細胞外Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５ドメインおよび膜近傍のドメインを含む、上記抗体が提供される。対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減することにおいてＴｒｋＢアゴニスト抗体を使用する方法であって、前記状態は、細胞分化、シナプスの発生、神経傷害の修復および／または軸索突起の分岐から選択される、上記方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｒｋＢの細胞外ドメインの１つに含有されるエピトープに結合し、ＴｒｋＢを活性化することが可能である単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体であって、該細胞外ドメインは、ＴｒｋＢの、配列番号２の配列を有する細胞外Ｄ１ドメイン、配列番号３の配列を有するＤ２ドメイン、配列番号４の配列を有するＤ３ドメイン、配列番号５の配列を有するＤ４ドメイン、配列番号６の配列を有するＤ５ドメイン、および配列番号７の配列を有する膜近傍のドメインを含む、上記抗体。
【請求項２】
膜近傍のドメインに含有されるエピトープに結合し、配列番号８の配列を有する短縮化されたＴｒｋＢを活性化することが可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体であって、配列番号９〜２６、２９〜３４、３７〜４２、４５〜５０、５３〜５８、６１〜６６、および６９〜７４から選択される１、２、３、４、５もしくは６つのＣＤＲ、またはそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体を含む、上記抗体。
【請求項４】
１）配列番号１２〜１４、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；２）配列番号１８〜２０、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；３）配列番号２４〜２６、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；４）配列番号３２〜３４、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；５）配列番号４０〜４２、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；６）配列番号４８〜５０、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；７）配列番号５６〜５８、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；８）配列番号６４〜６６、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；または９）配列番号７２〜７４、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体からなる群から選択される３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
１）配列番号９〜１１、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；２）配列番号１５〜１７、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；３）配列番号２１〜２３、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；４）配列番号２９〜３１、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；または５）配列番号３７〜３９、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；６）配列番号４５〜４７、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；７）配列番号５３〜５５、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；８）配列番号６１〜６３、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体；または９）配列番号６９〜７１、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同体からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
１）配列番号１２〜１４、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；２）配列番号１８〜２０、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；３）配列番号２４〜２６、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；４）配列番号３２〜３４、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；５）配列番号４０〜４２、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；６）配列番号４８〜５０、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；７）配列番号５６〜５８、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；８）配列番号６４〜６６、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；または９）配列番号７２〜７４、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアントからなる群から選択される３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
１）配列番号９〜１１、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；２）配列番号１５〜１７、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；３）配列番号２１〜２３、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；４）配列番号２９〜３１、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；または５）配列番号３７〜３９、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；６）配列番号４５〜４７、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；７）配列番号５３〜５５、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；８）配列番号６１〜６３、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；または９）配列番号６９〜７１、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアントからなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２８、３６、４４、５２、６０、６８、７６またはそれらのヒト化型からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５またはそれらのヒト化型からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４の場合とは異なるエピトープに結合することによって、相加効果でＴｒｋＢを活性化することが可能であり、ここで該相加効果は、ＴｒｋＢがＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４によるピークの活性化状態のときに、前記抗体によって追加のＴｒｋＢ活性化の増加がもたらされることである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がＴｒｋＢに結合すると、ＴｒｋＢは、ＴｒｋＢのＹ５１５、Ｙ７０１、Ｙ７０５、Ｙ７０６およびＹ８１６の少なくとも１つのアミノ酸残基でリン酸化される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
少なくとも１２時間の半減期（Ｔ１／２）でＴｒｋＢに結合することが可能な、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープに結合するか、または請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体と競合結合する、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体。
【請求項１４】
３ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
ビアコアによって測定した場合、４．５ｎＭ未満のＫＤ値のＴｒｋＢに対する親和性を有する、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体。
【請求項１６】
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５または膜近傍に結合する、請求項１２、１４および１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
Ｐ７５ニューロトロフィン受容体（Ｐ７５ＮＴＲ）、チロシン受容体Ａ（ＴｒｋＡ）またはチロシン受容体Ｃ（ＴｒｋＣ）に結合しない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
神経細胞の生存を強化すること、シナプスの発生および／または可塑性を調節すること、軸索突起の伸長を強化すること、またはそれらの組合せが可能である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記神経細胞が、ＰＣ１２細胞、海馬ニューロン、網膜神経節細胞、運動ニューロン、およびドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識された抗体、２価抗体、または抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
単一ドメイン抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、ＶＮＡＲ、ナノボディ、操作されたヒトＶＨ／ＶＬ単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲおよび２価ドメイン抗体からなる群から選択される抗原結合フラグメントである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
治療有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体および製剤用担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４を含む第２の治療剤をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドによってコードされた抗体を生産する、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
ＴｒｋＢに関連する状態を診断すること、予防すること、遅らせること、または治療することにおける、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項２９】
ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体を生産する方法であって、ＴｒｋＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、請求項２７に記載の宿主細胞に導入すること、および該ポリヌクレオチドが発現される条件下で該宿主細胞を培養することを含む、上記方法。
【請求項３０】
対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を該対象に投与すること、それによって該状態を治療することを含む、上記方法。
【請求項３１】
前記状態が、神経変性疾患、視神経症、網膜変性状態、聴力損失を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重の調節の障害、筋障害、代謝性疾患または脳傷害である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記状態が、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、緑内障、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、運動ニューロン疾患、レヴィ小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパチー、緑内障、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症、ミトコンドリア性視神経症、中毒性視神経症、外傷性視神経症、遺伝性視神経症、視神経炎、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、神経性難聴、迷路性難聴、耳鳴り、感覚神経聴力損失、複合型の聴力損失、不安、気分障害、うつ病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー−ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、思春期やせ症、悪液質、不要な体重の減少、サルコペニア、肥満症、オピオイドによって誘発された嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、てんかん、多発性硬化症、片頭痛、神経傷害、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）および卒中からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細胞分化および／またはシナプスの発生を強化する方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
【請求項３４】
神経傷害の修復および／または軸索突起の分岐を強化する方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
【請求項３５】
細胞のアポトーシスおよび／またはネクロトーシスを予防する方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
【請求項３６】
細胞生存を強化する方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
【請求項３７】
対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための方法であって、細胞表面上で請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体を発現する細胞、または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明の開示は、全般的に、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合する新規の抗ＴｒｋＢ抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]神経変性疾患は、最もよく知られた神経疾患であるが、その医療介入はほとんど進歩していない。アルツハイマー病（ＡＤ）は、破滅的な疾患として、ますます多くの患者と家族において大きな重荷になっているが、それに対応する創薬は大きな問題に直面している。病原性の毒素（アミロイドβ）を標的化するＡＤ治療の現在の戦略は失敗に終わっている。それゆえに本発明者らは、目的意識を病態生理学に切り替え、神経修復のための候補として、神経栄養因子、例えばＢＤＮＦを活用しようと努めている。これらの神経栄養因子は、ニューロンの発達、生存およびシナプス可塑性において有意な役割を果たし、したがって神経疾患の治療において最も可能性の高い分子とみなされている。しかしながら、これらの天然産物には、治療剤としてのそれらの使用を妨げるその生化学的特性に基づき限界がある。わずかな臨床試験も全て残念な結果に終わっている。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]本発明の開示で提供されるＴｒｋＢに特異的な抗体は、受容体の二量体化を容易にし、神経分化誘導性の特性を有する下流シグナル伝達経路を活性化することができる。スクリーニング後、優れた薬物動態学と低い有効濃度を有する抗体を候補抗体薬物として選択することができる。これらの候補は、生物学的機能を呈示するが、以下の点でＢＤＮＦより優れている：（１）物理化学的な特性：ＴｒｋＢアゴニスト抗体（ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ）は標的に容易に拡散するが、ＢＤＮＦは拡散するには粘性が高すぎる；（２）特異性：ＢＤＮＦは、ＴｒｋＢだけでなくｐ７５ＮＴＲも活性化し、それによりニューロンの死とシナプス阻害を引き起こすが、それに対してＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂはＴｒｋＢに特異的である；（３）薬物動態：ＢＤＮＦの半減期は数時間であるが、ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂでは数週間である；（４）ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂは、ＢＤＮＦより製造コストがかなり低い。本発明の開示は、抗体のスクリーニング、選択、ならびにＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂの生物学的および医薬特性評価を提供する。また本発明の開示では、複数の神経障害におけるＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂのインビトロおよびインビボの作用の両方も試験した。ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂは、ＡＤ、卒中および他の神経変性疾患、例えばＡＬＳ、緑内障、ハンチントン病などの治療において臨床的に使用することができる。
【０００４】
[0004]本発明の開示は、新規のモノクローナルＴｒｋＢアゴニスト抗体、それをコードするポリヌクレオチド、それを使用する方法、およびそれらのヒトＴｒｋＢタンパク質と結合するエピトープを提供する。
【０００５】
[0005]本発明の開示は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインの１つに含有されるエピトープに結合し、ＴｒｋＢを活性化することが可能である単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体であって、該細胞外ドメインは、ＴｒｋＢの、配列番号２の配列を有する細胞外Ｄ１ドメイン、配列番号３の配列を有するＤ２ドメイン、配列番号４の配列を有するＤ３ドメイン、配列番号５の配列を有するＤ４ドメイン、配列番号６の配列を有するＤ５ドメイン、および配列番号７の配列を有する膜近傍のドメインを含む、上記抗体を提供する。
【０００６】
[0006]特定の実施態様において、抗体は、膜近傍のドメインに含有されるエピトープに結合し、配列番号８の配列を有する短縮化されたＴｒｋＢを活性化することが可能である。
【０００７】
[0007]本発明の開示は、本明細書で開示される抗体と同じエピトープに結合するか、または本明細書で開示される抗体と競合結合する、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体を提供する。
【０００８】
[0008]特定の実施態様において、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体であって、配列番号９〜２６、２９〜３４、３７〜４２、４５〜５０、５３〜５８、６１〜６６、および６９〜７４から選択される１、２、３、４、５もしくは６つのＣＤＲ、またはそれらの少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体を含む、上記抗体が本明細書で提供される。特定の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢ抗体は、１）配列番号１２〜１４、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；２）配列番号１８〜２０、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；３）配列番号２４〜２６、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；４）配列番号３２〜３４、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；５）配列番号４０〜４２、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；６）配列番号４８〜５０、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；７）配列番号５６〜５８、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；８）配列番号６４〜６６、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；または９）配列番号７２〜７４、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体からなる群から選択される３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０００９】
[0009]特定の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢ抗体は、１）配列番号９〜１１、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；２）配列番号１５〜１７、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；３）配列番号２１〜２３、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；４）配列番号２９〜３１、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；５）配列番号３７〜３９、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；６）配列番号４５〜４７、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；７）配列番号５３〜５５、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；８）配列番号６１〜６３、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体；または９）配列番号６９〜７１、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する相同体からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１０】
[0010]特定の実施態様において、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体であって、１）配列番号１２〜１４、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；２）配列番号１８〜２０、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；３）配列番号２４〜２６、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；４）配列番号３２〜３４、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；５）配列番号４０〜４２、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；６）配列番号４８〜５０、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；７）配列番号５６〜５８、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；８）配列番号６４〜６６、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；または９）配列番号７２〜７４、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアントからなる群から選択される１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、上記抗体が本明細書で提供される。
【００１１】
[0011]特定の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢ抗体は、１）配列番号９〜１１、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；２）配列番号１５〜１７、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；３）配列番号２１〜２３、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；４）配列番号２９〜３１、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；または５）配列番号３７〜３９、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；６）配列番号４５〜４７、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；７）配列番号５３〜５５、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；８）配列番号６１〜６３、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアント；または９）配列番号６９〜７１、または１、２または３つのアミノ酸改変を有するそのバリアントからなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１２】
[0012]特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、配列番号２８、３６、４４、５２、６０、６８、７６またはそれらのヒト化型からなる群から選択される重鎖可変領域を含む。特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、配列番号２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５またはそれらのヒト化型からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
[0013]特定の実施態様において、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４の場合とは異なるエピトープまたは異なるドメイン（例えばＴｒｋＢのＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４または膜近傍のドメイン）に結合することによって、相加効果でＴｒｋＢを活性化することが可能であり、ここで相加効果は、ＴｒｋＢがＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４によるピークの活性化状態のときに、本抗体によって追加のＴｒｋＢ活性化の増加がもたらされることである。ＢＤＮＦ結合のためのＴｒｋＢ上のエピトープは、Ａｓｐ３４９、Ａｓｎ３５０、Ｔｙｒ３２９、Ａｓｐ２９８、Ｃｙｓ３０２、Ｃｙｓ３４５およびＨｉｓ２９９を包含する。特定の実施態様において、ＢＤＮＦと異なるエピトープは、ＴｒｋＢのＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５または膜近傍のドメイン内である。
【００１４】
[0014]特定の実施態様において、抗体がＴｒｋＢに結合すると、ＴｒｋＢは、ＴｒｋＢの、Ｔｙｒ５１５（すなわちＹ５１５）、Ｔｙｒ７０１（すなわちＹ７０１）、Ｔｙｒ７０５（すなわちＹ７０５）、Ｔｙｒ７０６（すなわちＹ７０６）、Ｔｙｒ８１６（すなわちＹ８１６）、Ｔｙｒ４９０（すなわちＹ４９０）、Ｔｙｒ６７０（すなわちＹ６７０）、Ｔｙｒ６７４（すなわちＹ６７４）、Ｔｙｒ６７５（すなわちＹ６７５）、Ｔｙｒ７７１（すなわちＹ７７１）、Ｔｙｒ７８３（すなわちＹ７８３）、Ｔｙｒ７８５（すなわちＹ７８５）、Ｔｙｒ１２５４（すなわちＹ１２５４）の少なくとも１つのアミノ酸残基で、自己リン酸化される。
【００１５】
[0015]特定の実施態様において、本抗体によるＴｒｋＢの活性化は、ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４によるＴｒｋＢの活性化より低い。特定の実施態様において、本抗体によるＴｒｋＢの活性化は、ＴｒｋＢ自己リン酸化のレベル、ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫまたはＰＬＣγのシグナル伝達経路におけるリン酸化のレベル、またはそれらの組合せによって決定した場合、ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４によるＴｒｋＢの活性化の、５％〜１００％（例えば８０％〜１００％、７０％〜１００％、６０％〜１００％、５０％〜１００％、４０％〜１００％、３０％〜１００％、２０％〜１００％、１０％〜１００％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％）である。
【００１６】
[0016]特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、少なくとも１２時間の（例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３６、４２、４８時間の、またはそれより長い）半減期（Ｔ１／２）で、ＴｒｋＢまたはその細胞外ドメイン（例えば、Ｄ１〜Ｄ５ドメイン）に結合することが可能である。
【００１７】
[0017]特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢまたはその細胞外ドメイン（例えば、Ｄ１〜Ｄ５ドメイン）に結合することに関して、４ｎＭ未満（例えば３．５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２．５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満）のＥＣ５０を有する。特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ビアコア（Biacore）によって測定した場合、４．５ｎＭ未満（例えば４ｎＭ未満、３．５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２．５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０９ｎＭ未満、０．０８ｎＭ未満、０．０７ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、または０．０５ｎＭ未満）のＫＤ値の、ＴｒｋＢまたはその細胞外ドメイン（例えば、Ｄ１〜Ｄ５ドメイン）への親和性を有する。
【００１８】
[0018]特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、Ｐ７５ニューロトロフィン受容体（Ｐ７５ＮＴＲ）、チロシン受容体Ａ（ＴｒｋＡ）またはチロシン受容体Ｃ（ＴｒｋＣ）に結合しない。
【００１９】
[0019]特定の実施態様において、本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体は、神経細胞の生存を強化すること、シナプスの発生および／または可塑性を調節すること、軸索突起の伸長を強化すること、またはそれらの組合せが可能である。特定の実施態様において、神経細胞は、ＰＣ１２細胞、海馬ニューロン、網膜神経節細胞、運動ニューロン、およびドーパミン作動性ニューロンを含む。特定の実施態様において、シナプス可塑性の調節は、シナプスの増加、シナプス伝達の強化、長期相乗作用（ＬＴＰ）の強化、およびγ振動の強化を含む。
【００２０】
[0020]本発明の開示はまた、治療有効量の本明細書で提供される単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体および製剤用担体を含む医薬組成物も提供する。特定の実施態様において、医薬組成物は、第２の治療剤をさらに含む。特定の実施態様において、第２の治療剤は、ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４である。
【００２１】
[0021]一形態において、本発明の開示は、ＴｒｋＢに関連する状態を診断すること、予防すること、遅らせること、または治療する（処置する、treating）ことにおける、ＴｒｋＢアゴニスト抗体または医薬組成物を含むキットを提供する。
【００２２】
[0022]一形態において、本発明の開示は、単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。一形態において、本発明の開示は、該ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一形態において、本発明の開示は、該ベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。特定の実施態様において、宿主細胞は、該ポリヌクレオチドによってコードされた抗体を生産する。
【００２３】
[0023]一形態において、本発明の開示は、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体を生産する方法であって、ＴｒｋＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入すること、および該ポリヌクレオチドが発現される条件下で該宿主細胞を培養することを含む、上記方法を提供する。
【００２４】
[0024]一形態において、本発明の開示は、対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための方法であって、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体または医薬組成物を対象に投与すること、それによって該状態を治療することを含む、上記方法を提供する。特定の実施態様において、状態は、神経変性疾患、精神障害、代謝性疾患および脳傷害を含む。特定の実施態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、緑内障、ハンチントン病（ＨＤ）、およびパーキンソン病（ＰＤ）を含む。特定の実施態様において、精神障害は、うつ病、自閉症、統合失調症、および心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）を含む。特定の実施態様において、精神障害は、うつ病、自閉症、統合失調症、および心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）を含む。
【００２５】
[0025]特定の実施態様において、本明細書に記載のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識された抗体、２価抗体、または抗イディオタイプ抗体である。特定の実施態様において、抗体は、単一ドメイン抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、ＶＮＡＲ、ナノボディ、操作されたヒトＶＨ／ＶＬ単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ−ダイアボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲおよび２価ドメイン抗体からなる群から選択される抗原結合フラグメントである。
【００２６】
[0026]一形態において、本発明の開示は、細胞分化および／またはシナプスの発生を強化する方法であって、本明細書で提供される抗体または医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法を提供する。
【００２７】
[0027]一形態において、本発明の開示は、神経傷害の修復および／または軸索突起の分岐を強化する方法であって、本明細書で提供される抗体または医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法を提供する。
【００２８】
[0028]一形態において、本発明の開示は、細胞のアポトーシスおよび／またはネクロトーシスを予防する方法であって、本明細書で提供される抗体または医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法を提供する。
【００２９】
[0029]一形態において、本発明の開示は、細胞生存を強化する方法であって、本明細書で提供される抗体または医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法を提供する。
【００３０】
[0030]特定の実施態様において、細胞は、様々な分化段階にある神経幹細胞または最終分化した神経細胞を含む神経細胞、例えばニューロン、星状細胞および希突起膠細胞である。特定の実施態様において、ニューロンは、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロンである。一部の実施態様において、生体サンプルは、細胞または組織（例えば生検によって得られた臓器からの組織）、腫瘍細胞、または体液（例えば血液または血清）から得られる。
【００３１】
[0031]別の形態において、本発明の開示は、対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、細胞表面上で本明細書で提供される抗体を発現する細胞、または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】[0032]図１Ａ〜１Ｆは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４（図１Ａ）、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２（図１Ｂ）、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３（図１Ｃ）、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３（図１Ｄ）、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４（図１Ｅ）およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８（図１Ｆ）に関してＥＬＩＳＡ分析によって測定した場合のヒトＴｒｋＢに対する抗体特異性を提示する棒グラフである。
【図２】[0033]図２Ａ〜２Ｂは、短縮化されたＴｒｋＢおよびＴｒｋＢアゴニスト抗体の標的ドメインを例示する。図２Ａは、ＴｒｋＢの５つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の短縮化されたベクターを表す。図２Ｂは、免疫沈降によって測定されたＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ４１８のための結合ドメインを例示する。
【図３】[0034]図３は、Ａｌｐｈａｌｉｓａによって測定した場合のＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂによるＴｒｋＢの活性化を示す。
【図４】[0035]図４は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ方法によって測定した場合の、それぞれＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４）およびＢＤＮＦによるＴｒｋＢのＴｒｙ５１５リン酸化を示す。
【図５】[0036]図５は、Ｔｒｙ５１５におけるＴｒｋＢリン酸化に基づき計算された時間経過曲線を例示する。Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は応答の比率を表す。
【図６−１】図６Ａ〜Ｂ  [0037]異なる濃度および期間でのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂおよびＢＤＮＦを介したキナーゼシグナル伝達経路ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＰＬＣγのリン酸化を示す。図６Ａ（０．５６ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１）、図６Ｂ（２．３ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４）。
【図６−２】図６Ｃ〜Ｄ  異なる濃度および期間でのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂおよびＢＤＮＦを介したキナーゼシグナル伝達経路ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＰＬＣγのリン酸化を示す。図６Ｃ（０．８３ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３）、図６Ｄ（１．３ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３）。
【図６−３】図６Ｅ  異なる濃度および期間でのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂおよびＢＤＮＦを介したキナーゼシグナル伝達経路ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＰＬＣγのリン酸化を示す。図６Ｅ（０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭおよび１０ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２）。
【図７】[0038]図７は、Ａβ（２５〜３５）で処置した場合のラット海馬ニューロンにおける細胞生存の比率を例示する。図７Ａは、異なる濃度のＡβ（２５〜３５）で処置される海馬ニューロンにおける細胞生存の比率を示す。図７Ｂは、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂのいずれかと共に添加されたＡβ（２５〜３５）で処置した海馬ニューロンの救済のパーセンテージを示す。
【図８】[0039]図８Ａ〜８Ｃは、マウスから単離した運動ニューロンの細胞生存率は、血清枯渇条件で、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂにより改善することができることを示す。図８Ａは、異なる培養条件における運動ニューロンの画像を示す。図８Ｂは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２のアポトーシス低減を示し、図８Ｃは、それぞれ１ｎＭおよび３ｎＭの異なる濃度、ならびに１６時間および２４時間の異なる期間中における、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２のアポトーシス低減を示す。
【図９】[0040]図９は、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢアゴニスト抗体を使用した網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存アッセイを提示する。
【図１０】[0041]図１０Ａ〜１０Ｆは、実施例１の実験プロトコールで示されるような異なる濃度のＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２で処置した場合のラットＡＬＳモデルにおける剥離運動ニューロンの生存率を示す。
【図１１】[0042]図１１Ａおよび１１Ｂは、マウス緑内障モデルにおけるＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２で処置したＲＧＣの生存を示す。図１１Ａは、逆行性標識マーカー（４％フルオロゴールド）が注射されたＲＧＣの蛍光画像を例示し、図１１Ｂは、画像の結果に従って計数した生きたＲＧＣを示す。
【図１２】[0043]図１２Ａおよび１２Ｂは、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルにおけるＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２で処置したラット脳の梗塞体積の低減を示す。図１２Ａは、ＩｇＧまたはＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２のいずれかで処置した例示的なＴＴＣで染色されたラット脳切片を例示する。図１２Ｂは、ＴＴＣで染色された切片に基づく梗塞体積を定量する棒グラフである。
【図１３】[0044]図１３Ａおよび１３Ｂは、接着除去試験におけるＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２で処置したラット卒中モデルの感覚および運動機能の回復を示す。図１３Ａは、異なるタイムポイントにおける１ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２処置後の機能が損なわれた前肢の感覚機能の回復を表す。図１３Ｂは、異なるタイムポイントにおける１ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２処置後の機能が損なわれた前肢の運動機能の回復を表す。
【図１４】[0045]図１４は、切断されたカスパーゼ−３／プロカスパーゼ３の相対強度によって測定されたＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２によって抑制されたアポトーシスを提示する。
【図１５】[0046]図１５Ａおよび１５Ｂは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ投与が、ＭＬＫＬリン酸化の低減を付与することを示す。図１５Ａは、ＭＣＡＯ再灌流後２４時間における動物の傷害のある皮質組織におけるＭＬＫＬの相対的なリン酸化を示す。図１５Ｂは、永続的なＭＣＡＯ後７２時間における動物の傷害のある皮質組織におけるＭＬＫＬの相対的なリン酸化を示す。
【図１６−１】[0047]図１６は、本発明の開示において提供される配列を示す。
【図１６−２】[0047]図１６は、本発明の開示において提供される配列を示す。
【図１６−３】[0047]図１６は、本発明の開示において提供される配列を示す。
【図１６−４】[0047]図１６は、本発明の開示において提供される配列を示す。
【図１６−５】[0047]図１６は、本発明の開示において提供される配列を示す。
【図１７】[0048]図１７Ａおよび１７Ｂは、ＢＤＮＦまたは様々なＴｒｋＢ抗体（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ）を添加した後の海馬ニューロンの軸索突起の伸長を表す。図１７Ａは、軸索突起の全長を示し、図１７Ｂは、軸索突起の分岐点の数を示す。
【図１８】[0049]図１８Ａおよび１８Ｂは、血漿および脳組織におけるＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂの薬物動態を示す。血漿（図１８Ａ）および脳組織（図１８Ｂ）における異なるタイムポイントで測定されたＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂの濃度を示した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
[0050]以下の本開示の説明は、単に本開示の様々な実施態様を例示することを意図したものである。そのようなものとして、論じられた具体的な改変は、本開示の範囲への限定として解釈されないものとする。当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変更および改変をなすことができることが理解できるものと予想され、このような均等な実施態様は本明細書に包含されることが理解される。公報、特許および特許出願を含む本明細書において引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３４】
定義
[0051]用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、あらゆる免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、または二重特異性（２価）抗体、または特異的な抗原に結合するそれらの機能的な部分を包含する。自然の無傷抗体は、ジスルフィド結合で相互に接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）および第１、第２、および第３の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなり、一方で各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）からなる。哺乳類重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類され、哺乳類軽鎖は、λまたはκとして分類される。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。両方の鎖の可変領域はさらに、一般的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性を有する３つの領域に分割される（軽（Ｌ）鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、重（Ｈ）鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む）。本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントのＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって定義または同定することができる（Al-Lazikani, B.、Chothia, C.、Lesk, A. M.、J. Mol. Biol.、273（4）、927（1997）；Chothia, C.ら、J Mol Biol. 12月5日；186（3）：651〜63（1985）；Chothia, C.およびLesk, A.M.、J.Mol.Biol.、196,901 （1987）；Chothia, C.ら、Nature. Dec 21-28；342（6252）：877-83（1989）；Kabat E.A.ら、National Institutes of Health、メリーランド州ベセスダ（1991））。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知の両端のストレッチ間に挿入されており、このフレームワーク領域は、ＣＤＲより高度に保存されており、高度可変ループを支持するための足場を形成する。それゆえに、各ＶＨおよびＶＬは、以下の順番（アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端にかけて）：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成される。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を呈示する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμ重鎖の存在を特徴とするそれらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づく５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられる。主要な抗体クラスのうちいくつかのサブクラスは、例えばＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、またはＩｇＡ２（α２重鎖）である。
【００３５】
[0052]用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれより多くのＣＤＲを含む抗体のフラグメントから形成された抗体フラグメント、または抗原に結合するが自然の無傷抗体の構造を含まない他のあらゆる抗体の一部を指す。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントの例としては、これらに限定されないが、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（２価ダイアボディ）、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、ＶＮＡＲ、ナノボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲおよび２価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合フラグメントは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合することが可能である。特定の実施態様において、抗原結合フラグメントは、特定のヒト抗体由来の１つまたはそれより多くのＣＤＲを含んでいてもよい。
【００３６】
[0053]抗体に関する「Ｆａｂ」は、ジスルフィド結合により単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域に結合した、単一の軽鎖（可変領域と定常領域の両方）からなる抗体の１価の抗原結合フラグメントを指す。Ｆａｂは、ヒンジ領域の重鎖間におけるジスルフィド結合のＮ末端の近位にある残基で抗体をパパイン消化することにより得ることができる。
【００３７】
[0054]「Ｆａｂ’」は、ヒンジ領域の一部を包含するＦａｂフラグメントであって、ヒンジ領域の重鎖間におけるジスルフィド結合のＣ末端の近位にある残基で抗体をペプシン消化することにより得ることができるものを指し、したがってこれは、ヒンジ領域中の少数の残基（１つまたはそれより多くのシステインを包含する）においてＦａｂと異なっている。
【００３８】
[0055]「Ｆ（ａｂ’）２」は、２つの軽鎖と２つの重鎖の一部とを含むＦａｂ’の二量体を指す。
[0056]抗体に関する「Ｆｃ」は、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２および第３の定常領域に結合した、第１の重鎖の第２および第３の定常領域からなる抗体の一部を指す。ＩｇＧおよびＩｇＭＦｃ領域は、３つの重鎖定常領域（各鎖において第２、第３および第４の重鎖定常領域）を含有する。これは、抗体のパパイン消化により得ることができる。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣやＣＤＣなどの様々なエフェクター機能に関与するが、抗原結合において機能しない。
【００３９】
[0057]抗体に関する「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む抗体の最小フラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントであって、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域との連結がジスルフィド結合であるものを指す。
【００４０】
[0058]「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、互いに直接的に、またはペプチドリンカー配列を介して接続された軽鎖可変領域と重鎖可変領域とからなる操作された抗体を指す（Huston JSら、Proc Natl Acad Sci USA、85：5879（1988））。「ｓｃＦｖ二量体」は、２つの重鎖可変領域と２つの軽鎖可変領域とをリンカーと共に含む単一の鎖を指す。特定の実施態様において、「ｓｃＦｖ二量体」は、２価ダイアボディまたは２価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）であって、ＶＨの１つの成分がＶＬの他の成分と協調して、同じ抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的化できる２つの結合部位を形成するように別のＶＨ−ＶＬ成分と二量体化されたＶＨ−ＶＬ（ペプチドリンカーによって連結された）を含むものである。他の実施態様において、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＨ１−ＶＬ２（ペプチドリンカーによって連結された）と、これに会合したＶＬ１−ＶＨ２（これもペプチドリンカーによって連結された）を含む二重特異性ダイアボディであって、ＶＨ１とＶＬ１が協調し、ＶＨ２とＶＬ２が協調し、それぞれの協調した対が異なる抗原特異性を有するようなものである。
【００４１】
[0059]「単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に接続されたｓｃＦｖからなる操作された抗体を指す。
[0060]「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」、例えば「ラクダ単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、「ナノボディ」、「ＨＣＡｂ」または「ＶＮＡＲ」は、１２〜１５ｋＤａの低い分子量を有する、２つのＶＨドメインを含有し軽鎖を含有しない抗体を指す（Riechmann L.およびMuyldermans S.、J Immunol Methods. 12月10日；231（1〜2）：25〜38（1999）； Muyldermans S.、J Biotechnol. Jun；74（4）：277〜302（2001）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は元々、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ、ＶＨＨ）、サメ種（新しい抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ））、または特異的な以下の突然変異：Ｆ３７、Ｅ４４、Ｒ４５、およびＦ４７を有するヒト抗体から得た。ヒトＶＨ／ＶＬ単一ドメイン抗体は、再配列されたＶＨ／ＶＬドメインの合成ランダム化を介して構築されたファージディスプレイによって、操作された抗体ドメインライブラリーから単離することができる（Henry KAら、Stability-Diversity Tradeoffs Impose Fundamental Constraints on Selection of Synthetic Human VH/VL Single-Domain Antibodies from In Vitro Display Libraries. Front Immunol. 2017年12月12日；8：1759）。したがって単一ドメイン抗体は、少なくとも４つのフレームワーク領域を含有し、それらの間に３つの高度可変ＣＤＲ領域が存在することから、結果として以下の典型的な抗体可変ドメイン構造になる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。単一のドメインは、軽鎖抗体可変領域と相互作用して、重鎖および軽鎖抗原結合ＶＩＩ構造の従来のヘテロ二量体を形成しない。
【００４２】
[0061]「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを包含し、このようなフラグメントは、単一のポリペプチド鎖中でＶＬドメインに接続されたＶＨドメイン（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む（例えば、Holliger P.ら、Proc Natl Acad Sci U S A. 7月15日；90（14）：6444〜8（1993）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照）。同じ鎖における２つのドメインは、リンカーが短すぎるため対合できず、したがってこれらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合することになり、それにより２つの抗原結合部位が作り出される。これらの抗原結合部位は、異なる抗原（またはエピトープ）の同じものを標的化することができる。
【００４３】
[0062]「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する抗体フラグメントを指す。特定の実施態様において、２つまたはそれより多くのＶＨドメインは、ペプチドリンカーと共有結合で合体して、２価または多価のドメイン抗体を形成する。２価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同一または異なる抗原を標的化することができる。
【００４４】
[0063]特定の実施態様において、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖を含み、２つのＶＨ成分がペプチドリンカーによって連結され、ジスルフィド架橋によって２つのＶＬ成分に拘束されている。
【００４５】
[0064]特定の実施態様において、「二重特異性ｄｓダイアボディ」は、ＶＨ１とＶＬ１との間のジスルフィド架橋を介して、ＶＨ１−ＶＬ２（ペプチドリンカーによって連結された）と、それに結合したＶＬ１−ＶＨ２（これもペプチドリンカーによって連結された）を含む。
【００４６】
[0065]特定の実施態様において、「二重特異性ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’」は、３つのペプチド鎖、ＶＨ１−ＶＨ２成分を含み、それにおいて重鎖が、ペプチドリンカー（例えば長いフレキシブルなリンカー）で拘束されており、ジスルフィド架橋を介してそれぞれＶＬ１およびＶＬ２成分に対合している。それぞれのジスルフィドで対合した重鎖および軽鎖は、異なる抗原特異性を有する。
【００４７】
[0066]用語「ヒト化」または「ヒト化型」は、本明細書で使用される場合、抗体または抗原結合フラグメントに関して、抗体または抗原結合フラグメントが、非ヒト動物（例えばげっ歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマ、またはニワトリ）由来のＣＤＲ、ヒト由来のＦＲ領域、および適用可能な場合、ヒト由来の定常領域を含むことを指す。特定の実施態様において、ヒト抗体由来の定常領域は、非ヒト可変領域に融合されている。ヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトの治療剤として有用である。それはなぜなら、特定の実施態様において、非ヒト種抗体と比較して、ヒトにおいて免疫原性が低減されるか、または免疫応答を誘導する可能性がそれほど高くないためである。一部の実施態様において、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、モルモット、ハムスター、または非ヒト霊長類（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）もしくは類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、サルまたはサル（affen）））である。一部の実施態様において、ヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて、実質的に全てのヒト配列で構成される。一部の実施態様において、ヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、抗体の性能、例えば結合または結合親和性を改善するように改変される。例えば、１つまたはそれより多くの非ヒトＣＤＲにおける１つまたはそれより多くのアミノ酸残基を変更して、ヒトにおいて起こり得る免疫原性を低減させることができ、この場合、変更されたアミノ酸残基はいずれも、免疫特異的な結合にとって重要ではないか、またはそのような変更は、ヒト化抗体の抗原への結合が顕著な影響を受けないように、保存的変化である。一部の実施態様において、ヒト由来のＦＲ領域は、そのもととなるヒト抗体と同じアミノ酸配列を含んでいてもよいし、またはいくつかのアミノ酸変化、例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸変化を含んでいてもよい。一部の実施態様において、このようなアミノ酸における変化は、重鎖ＦＲ領域のみ、軽鎖ＦＲ領域のみ、または両方の鎖に存在していてもよい。一部の好ましい実施態様において、ヒト化抗体は、ヒトＦＲ１〜３およびヒトＪＨおよびＪκを含む。
【００４８】
[0067]用語「キメラ」は、本明細書で使用される場合、１つの種由来の重鎖および／または軽鎖の一部、ならびに異なる種由来の重鎖および／または軽鎖の残部を有する抗体または抗原結合フラグメントを指す。説明に役立つ例において、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域、および非ヒト種、例えばマウス由来の可変領域を含んでいてもよい。
【００４９】
[0068]「ＴｒｋＢアゴニスト抗体」または「ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ」は、本明細書で使用される場合、ＴｒｋＢ（例えばヒトまたは非ヒトＴｒｋＢ）の細胞外ドメインまたは膜近傍のドメインの１つに、診断および／または治療的使用をもたらすのに十分な親和性で特異的に結合することにより、ＴｒｋＢの細胞内活性を活性化することが可能な抗体であって、ＢＤＮＦ細胞内シグナル伝達経路を活性化し、細胞または生物中で、ＴｒｋＢの発現または利用可能性を上方調節するか、またはＴｒｋＢ媒介ＢＤＮＦシグナル伝達によって調節された遺伝子の発現または利用可能性を上方調節する抗体を指す。
【００５０】
[0069]「実質的に」、「実質的に同じ」は、本明細書で使用される場合、２つの数値間の高度な類似性を指し、当業者であれば、２つの値の間の有意差またはその値によって示される統計および／または生物活性に関するわずかな差を認識したりまたは考慮に入れたりしないしないと予想される。対照的に、「より実質的に低い」は、数値が、参照値に対して約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満であることを意味する。
【００５１】
[0070]用語「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、２つの分子間の、例えば抗体と抗原との間の無作為ではない結合反応を指す。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトおよび／または非ヒトＴｒｋＢと、約０．０１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、０．０１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、０．０１ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭ、０．０１ｎＭ〜約１ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１ｎＭまたは約０．０１ｎＭ〜約０．１ｎＭの結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合する。ＫＤは、本明細書で使用される場合、会合速度に対する解離速度の比率（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、これは、例えばビアコアなどの機器を使用する表面プラズモン共鳴方法を使用して決定することができる。
【００５２】
[0071]「結合をブロックする」または「同じエピトープに関して競合する」能力は、本明細書で使用される場合、２つの分子（例えばヒトＴｒｋＢおよびＴｒｋＢアゴニスト抗体）間の結合相互作用をあらゆる検出可能な程度に阻害する抗体または抗原結合フラグメントの能力を指す。特定の実施態様において、２つの分子間の結合をブロックする抗体または抗原結合フラグメントは、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。特定の実施態様において、この阻害は、６０％より大きくてもよく、７０％より大きくてもよく、８０％より大きくてもよく、または９０％より大きくてもよい。
【００５３】
[0072]用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、原子の特異的な基（例えば糖側鎖、ホスホリル基、スルホニル基）または抗体などの抗原結合タンパク質によって拘束された抗原上のアミノ酸を指す。エピトープは、コンフォメーショナルエピトープであってもよいし、またはリニアエピトープであってもよい。特定の実施態様において、ＴｒｋＢの細胞外ドメインの１つに含有されるエピトープは、コンフォメーショナルエピトープであってもよいし、またはリニアエピトープであってもよい。コンフォメーショナルエピトープは、３次元のタンパク質の３次フォールディングのために、隣接していないが空間的に並列しているアミノ酸残基を含んでいてもよく、その場合、これらの残基は相互作用の親和性に直接的に寄与しており、変性溶媒に曝露されると相互作用能力を失うことになる。対照的に、リニアエピトープの全ての相互作用点は、タンパク質上の１次アミノ酸残基に沿って直線的に配置され、隣接したアミノ酸の小さいセグメントは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との抗原結合により消化される場合もあるし、または変性溶媒に曝露されても保持される場合もある（Salmeron Aら、J Immunol. 1991年11月1日；147（9）：3047〜52；Goldsbyら、Immunology（第5版）、ニューヨーク：W. H. Freeman and Company、57〜75頁、ISBN0-7167-4947-5）。本発明の開示の一実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢ抗体によって拘束されたエピトープは、コンフォメーショナルエピトープである。本発明の開示の他の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢ抗体によって拘束されたエピトープは、リニアエピトープである。２つの抗体が、１種の抗原との競合結合を呈示する場合、これらの抗体は、その抗原内の同じエピトープと結合する可能性がある。例えば、抗体または抗原結合フラグメントが、本発明の開示の例示的な抗体、例えばＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ５７０２、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１６、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３７、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ９０１、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ５０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ４１８、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ６９１６、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ４０１４、およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ７４３１、それらのキメラ抗体、それらのヒト化抗体のヒトまたは非ヒトＴｒｋＢへの結合をブロックする場合、その抗体または抗原結合フラグメントは、その例示的な抗体と同じエピトープと結合するとみなすことができる。
【００５４】
[0073]エピトープ内の特定のアミノ酸残基は、例えばアラニンスキャニング変異により突然変異させることができ、タンパク質結合を低減したりまたは防いだりする突然変異が同定される。「アラニンスキャニング変異」は、エピトープとそれに結合する別の化合物またはタンパク質との相互作用に影響を与えるタンパク質の特定の残基または領域を同定するために実行できる方法である。タンパク質内の標的残基の残基または基は、中性アミノ酸または負電荷を有するアミノ酸で置き換えられる（最も好ましくはアラニンもしくはポリアラニン、または保存的アミノ酸の置換）。他の突然変異より、タンパク質の結合を閾値を超えて低減させるかまたはタンパク質の結合を最大限に低減させるアミノ酸残基またはそれをコードするコドンのあらゆる突然変異が、タンパク質によって拘束されたエピトープ内にある可能性が高い。
【００５５】
[0074]後述される配列は、図１６に見出すことができる。
[0075]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２」は、本明細書で使用される場合、配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１３（ＣＤＲ２）、配列番号１４（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号９（ＣＤＲ１）、配列番号１０（ＣＤＲ２）、配列番号１１（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有するウサギモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ１ドメインに結合する。
【００５６】
[0076]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３」は、本明細書で使用される場合、配列番号１８（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、配列番号２０（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号１５（ＣＤＲ１）、配列番号１６（ＣＤＲ２）、配列番号１７（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ３ドメインに結合する。
【００５７】
[0077]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３」は、本明細書で使用される場合、配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、配列番号２６（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）、配列番号２３（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有するウサギモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ５ドメインに結合する。
【００５８】
[0078]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８」は、本明細書で使用される場合、配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３３（ＣＤＲ２）、配列番号３４（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号２９（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）、配列番号３１（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号３６の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ５ドメインに結合する。
【００５９】
[0079]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４」は、本明細書で使用される場合、配列番号４０（ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＣＤＲ２）、配列番号４２（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号３７（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）、配列番号３９（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号４４の重鎖可変領域および配列番号４３の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ１ドメインに結合する。
【００６０】
[0080]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ９０１」は、本明細書で使用される場合、配列番号４８（ＣＤＲ１）、配列番号４９（ＣＤＲ２）、配列番号５０（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号４５（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）、配列番号４７（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号５２の重鎖可変領域および配列番号５１の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ９０１は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ５ドメインに結合する。
【００６１】
[0081]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ５７０２」は、本明細書で使用される場合、配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号５７（ＣＤＲ２）、配列番号５８（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＣＤＲ２）、配列番号５５（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号６０の重鎖可変領域および配列番号５９の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ５７０２は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ５ドメインに結合する。
【００６２】
[0082]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ６９１６」は、本明細書で使用される場合、配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、配列番号６６（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、配列番号６３（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号６８の重鎖可変領域および配列番号６７の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ６９１６は、ＴｒｋＢタンパク質のＤ５ドメインに結合する。
【００６３】
[0083]「ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ７４３１」は、本明細書で使用される場合、配列番号７２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、配列番号７４（ＣＤＲ３）の３つの重鎖可変領域のＣＤＲと、配列番号６９（ＣＤＲ１）、配列番号７０（ＣＤＲ２）、配列番号７１（ＣＤＲ３）の３つの軽鎖可変領域のＣＤＲとを有し、配列番号７６の重鎖可変領域および配列番号７５の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ７４３１は、ＴｒｋＢタンパク質の膜近傍の領域に結合する。
【００６４】
[0084]アミノ酸配列に関する「保存的置換」は、類似の生理化学特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えること、またはポリペプチドの活性にとって重要ではないアミノ酸の置換を指す。例えば、保存的置換は、非極性側鎖を有するアミノ酸残基（例えばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）間、非荷電性極性側鎖を有する残基（例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＧｌｎ）間、酸性側鎖を有する残基（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）間、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばＨｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）間、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＩｌｅ）間、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸（例えば，ＣｙｓおよびＭｅｔ）間、または芳香族側鎖を有する残基（例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓおよびＰｈｅ）間でなすことができる。特定の実施態様において、置換、欠失または付加も、「保存的置換」とみなすことができる。挿入されるまたは欠失したアミノ酸の数は、約１〜５の範囲であってもよい。当業界で公知のように、保存的置換は通常、タンパク質の立体構造において有意な変化を引き起こさないため、タンパク質の生物活性を保持することができる。
【００６５】
[0085]アミノ酸配列（または核酸配列）に関する「パーセント（％）配列同一性」は、最大の対応が達成されるように配列を並べ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基に同一な候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一な残基とみなしてもよいし、またはみなさなくてもよい。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、公共的に入手可能なツール、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにおいて入手可能、また、Altschul S.F.ら、J. Mol. Biol.、215：403〜410（1990）；Stephen F.ら、Nucleic Acids Res.、25：3389〜3402（1997）も参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトにおいて入手可能、また、Higgins D.G.ら、Methods in Enzymology、266：383〜402（1996）；Larkin M.A.ら、Bioinformatics（オックスフォード、イングランド）、23（21）：2947〜8（2007）も参照）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメーターを使用してもよいし、または例えば好適なアルゴリズムなどを選択することによって、必要に応じてアライメントに関するパラメーターをカスタマイズしてもよい。
【００６６】
[0086]「相同体配列」および「相同配列」は、本明細書で使用される場合、置き換え可能に使用され、任意選択で並べられた場合、別の配列に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。
【００６７】
[0087]「エフェクター機能」または「抗体エフェクター機能」は、本明細書で使用される場合、抗体のＦｃ領域がＣ１複合体やＦｃ受容体などのそのエフェクターに結合することに起因する生物活性を指す。例示的なエフェクター機能としては、Ｃ１複合体における抗体とＣ１ｑとの相互作用により誘導された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；エフェクター細胞における抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体への結合により誘導された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；および貪食が挙げられる。「エフェクター機能を低減または枯渇させる」は、抗体エフェクター機能が、親抗体から少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）低減されることを指す。特定の実施態様において、エフェクター機能は、グリコシル化を排除するようなＦｃ領域における突然変異、例えばＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ（Shieldsら、J. Biol. Chem. 276（9）：6591〜6604（2001）を参照）、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを介して、排除される。「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。
【００６８】
[0088]状態を「治療（処置）すること」、状態の「治療（処置、treatment）」または「療法」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができ、治療的処置、防止または予防措置、例えば、状態の予防または軽減、発病または状態の進行速度を遅らせること、状態の発生リスクを低減させること、状態に関連する症状の発生を予防または遅らせること、状態に関連する症状を低減させるまたは終わらせること、状態の完全または部分寛解をもたらすこと、状態を治すこと、またはそれらのいくつかの組合せを包含する。
【００６９】
[0089]用語「ＴｒｋＢ」は、本明細書で使用される場合、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）を指し、またチロシン受容体キナーゼＢ、またはＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体または神経分化誘導性チロシンキナーゼ受容体２型としても公知であり、ヒトではＮＴＲＫ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴｒｋＢは、細胞膜に配置されており、リガンドが受容体の細胞外ドメインに結合することによって活性化される。ＴｒｋＢは、哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）において３つのアイソフォームを有し、全長アイソフォームは、典型的なチロシンキナーゼ受容体であるが、２つのＣ末端ＴｒｋＢアイソフォームは、全長アイソフォームと同じ細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび最初の１２個の細胞内アミノ酸配列を有するが、Ｃ末端配列においてそれぞれ１１（Ｔ１アイソフォーム）および９（Ｔ２アイソフォーム）アミノ酸が異なる。本発明の開示において、ＴｒｋＢタンパク質は、上述した３つのアイソフォームのいずれかを指す。ＴｒｋＢは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のための受容体であり、リガンド特異的な方式でＢＤＮＦと結合する。ＢＤＮＦがＴｒｋＢに結合すると、その細胞内ドメインにおけるコンフォメーション変化およびチロシン残基の自己リン酸化を介してその二量体化が始まり、結果としてマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびホスホリパーゼＣ−ガンマ１（ＰＬＣ−ガンマ１）を含む３つの主要なシグナル伝達経路の活性化が起こる。数種のニューロトロフィン、例えばＢＤＮＦ、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）およびニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）が、ＴｒｋＢを活性化し、それによってニューロンの分化、ニューロン修復、ニューロン可塑性、増殖および生存などの複数の作用を活性化することが報告されている。ＢＤＮＦおよびＮＴ−４はどちらも、ＴｒｋＢに結合でき、多くの共通のシグナル伝達経路を活性化することができる。特定の実施態様において、ＴｒｋＢは、本明細書で使用される場合、受託番号Ｓ７６４７３．１を有する遺伝子配列を有するヒトＴｒｋＢ、または非ヒト動物ＴｒｋＢ、例えばマウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ、ウサギＴｒｋＢである。
【００７０】
[0090]用語「短縮化されたＴｒｋＢ」は、本明細書で使用される場合、部分的なフラグメント（例えば細胞外ドメイン）を欠失しているが細胞内シグナル伝達におけるＴｒｋＢ受容体の主要な機能を保持するＴｒｋＢタンパク質を指す。特定の実施態様において、短縮化されたＴｒｋＢは、Ｄ１〜Ｄ５ドメインを欠失しており、配列番号８に記載の配列を有する。
【００７１】
[0091]「ＢＤＮＦ」は、ヒトにおいてＢＤＮＦ遺伝子によってコードされ、標準的な神経成長因子に関する増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである。ＢＤＮＦは、脳、例えば海馬、皮質、および前脳基底部で見出され、それにおいて、ニューロンにおける生存および分化活性を媒介し、ＴｒｋＢの結合および活性化によりニューロンのシナプスの機能を調節し、同様に末梢神経系、例えば網膜、運動ニューロン、腎臓、唾液、および前立腺でも見出される。ＢＤＮＦは、細胞表面上の少なくとも２つの受容体、例えばＴｒｋＢおよびｐ７５（ＬＮＧＦＲとしても公知）と結合する。全てのニューロトロフィンは、ｐ７５受容体と相互作用することができる。ｐ７５が活性化されると、ｐ７５受容体を発現するがＴｒｋ受容体が欠失した細胞において、ｐ７５は生存経路ではなくアポトーシスを引き起こす。ＢＤＮＦはまた、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣとも結合し、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣは、ＴｒｋＢと共にプロテインキナーゼのサブファミリーに属する。「プロＢＤＮＦ」は、１２９アミノ酸のプロドメインおよび１１８アミノ酸の成熟ドメインからなるＢＤＮＦの切断されていない前駆体を指す。保存されたＲＶＲＲ配列におけるプロコンバターゼの作用を介して無傷のプロＢＤＮＦからプロドメインが切断されると、二量体の成熟ドメインが放出されるが、これは、成熟ＢＤＮＦ、または単にＢＤＮＦと呼ばれる。ｐ７５受容体は、プロＢＤＮＦの成熟ドメイン領域に結合し、成熟ＢＤＮＦによって惹起された作用の逆作用、例えば細胞死、成長円錐の退縮、成熟海馬シナプスにおける長期抑圧の容易化、および筋神経連結のシナプス排除を誘導することが報告されている（Hempstead BL、Trans Am Clin Climatol Assoc. 2015；126：9〜19）。特定の実施態様において、ＢＤＮＦは、本発明の開示で使用される場合、成熟ＢＤＮＦを指す。特定の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体は、成熟ＢＤＮＦに結合し、プロＢＤＮＦに結合しない。
【００７２】
[0092]ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）はまた、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）としても公知であり、これは、ＴｒｋＢ受容体を介して優勢にシグナル伝達する神経栄養因子である。ヒトにおいて、ＮＴ−４は、ＮＴＦ４遺伝子によってコードされる。ＮＴ−４は、ニューロンの生存および分化の制御に関与する。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−３を含む他のニューロトロフィンのノックアウトは、早期の出生後の発達中では致死性であるが、ＮＴＦ５欠損マウスのみが、わずかな細胞の欠損を示し、正常に成人期に発達することから、その機能は、他のニューロトロフィンによって補償できることが示唆される。
【００７３】
[0093]「ＴｒｋＢに関連する状態」は、本明細書で使用される場合、ＴｒｋＢ（例えばヒトＴｒｋＢ）の発現または活性の増加または減少によって引き起こされる、それによって悪化する、またはそれ以外でそれに関連するあらゆる状態、またはＢＤＮＦシグナル伝達、またはＴｒｋＢを介して活性化される他のあらゆる細胞内シグナル伝達カスケードの減少によって引き起こされる、またはそれによって悪化する障害を指す。神経障害および精神障害の例としては、神経変性疾患（これらに限定されないが、アルツハイマー病とそれに関連する認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、レヴィ小体病とそれに関連する運動障害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障およびフリードライヒ運動失調症とそれに関連する脊髄小脳失調症など）、うつ病、不安、自閉症、統合失調症、および心的外傷後ストレス障害、ＣＮＳ傷害、卒中および外傷性脳傷害などが挙げられる。代謝性疾患の例としては、肥満症および多食症が挙げられる。「がん」または「がん性状態」は、本明細書で使用される場合、悪性細胞の成長または新生物、異常な増殖、浸潤または転移を特徴とするあらゆる医学的状態を指し、そのようなものとしては、固形腫瘍がんおよび非固形がん（血液系腫瘍）の両方、例えば白血病が挙げられる。固形腫瘍としては、肉腫および癌腫が挙げられる。肉腫は、血管、骨、脂肪組織、靱帯、リンパ管、筋肉または腱における非上皮性腫瘍であり、それに対して癌腫は、皮膚、腺および臓器の内層における上皮性腫瘍である。「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、新生物および／または悪性細胞の固体塊を指す。
【００７４】
[0094]「単離された」物質は、天然状態から手作業で改変させたものである。「単離された」組成物または物質が天然に存在するものの場合、そのような組成物または物質は、その元の環境を変化させたりまたはその環境から取り出されたりしたものであるか、またはその両方である。例えば、「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含まず、自然環境においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドに随伴する天然の要素を伴っていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。特定の実施態様において、「単離された」抗体は、電気泳動方法（例えばクーマシーブルーまたは銀染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点分画法、キャピラリー電気泳動）、クロマトグラフ法（例えばイオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣ）またはローリー法によって決定した場合、少なくとも１回の工程で、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度に精製される。
【００７５】
[0095]用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞中でそのタンパク質が発現されるように作動可能に挿入して輸送することができる媒体を指す。ベクターは、宿主細胞中でそれが含む遺伝学的エレメントの発現が起こるように、宿主細胞を形質転換する、形質導入する、またはトランスフェクトするのに使用することができる。ベクターの例示的なタイプとしては、これらに限定されないが、プラスミド（例えばファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ））、ウイルスベクター（バクテリオファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージ、または動物ウイルス）、細菌ベクター、または非エピソーム性哺乳類ベクターが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーとしては、レトロウイルス（例えばレンチウイルスなど）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、発現を制御するための様々なエレメントを含有していてもよく、そのようなエレメントとして、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なエレメント、およびレポーター遺伝子が挙げられる。加えて、ベクター（例えば細菌ベクターまたはエピソーム哺乳類ベクター）は、複製起点を含有していてもよい。またベクターは、その細胞への侵入に役立つ物質を包含していてもよく、そのような物質としては、これらに限定されないが、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングなどが挙げられる。
【００７６】
[0096]「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが、１つまたはそれより多くの外因性タンパク質を発現するように導入された細胞を指す。「宿主細胞」は、特定の対象細胞とその後代の両方を指すことを目的とする。宿主細胞は、原核生物、真核生物、植物細胞、動物細胞またはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞は、望ましいレベルでタンパク質を発現しないが、その核酸を含む細胞であってもよく、その場合、調節因子が細胞に導入されるか、または調節配列が核酸と作動可能に連結されるように調節配列が宿主細胞に導入されれば、望ましいレベルでタンパク質を発現する。
【００７７】
[0097]「医薬組成物」は、丸剤、錠剤、カプセル剤、または針または類似の器具で注射するための液体製剤の形態での、本明細書に記載される化合物、またはその医薬的に許容される塩の１つまたはそれより多くと、他の化学成分、例えば生理学的に許容される担体および賦形剤との混合物を指す。医薬組成物の１つの目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。管理機関によって承認された組成物に限定することは意図しておらず、栄養補給剤や他の製剤を包含することが意図される。
【００７８】
[0098]用語「治療有効量」または「有効投薬量」は、本明細書で使用される場合、ヒトＴｒｋＢに関連する疾患または状態を治療するのに有効な薬物の投薬量または濃度を指す。例えば、がんを治療するための本明細書で開示される抗体または抗原結合フラグメントの使用に関して、治療有効量は、腫瘍体積を低減させること、腫瘍の全てまたは一部を根絶すること、腫瘍増殖またはがん細胞の他の臓器への浸潤を阻害するかもしくは遅らせること、がん性状態を媒介する細胞の成長または増殖を阻害すること、腫瘍細胞転移を阻害するかもしくは遅らせること、腫瘍またはがん性状態に関連するあらゆる症状またはマーカーを緩和すること、腫瘍またはがん性状態の発生を予防するかもしくは遅らせること、またはいくつかのそれらの組合せが可能な、抗体または抗原結合フラグメントの投薬量または濃度である。
【００７９】
[0099]用語「医薬的に許容される」は、指定された担体、媒体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、全体として製剤を構成する他の成分と化学的および／または物理的に適合しており、そのレシピエントと生理学的に適合していることを示す。「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８０】
[00100]「細胞分化」は、本明細書で使用される場合、ある細胞型から異なる細胞型に発達することである。例えば、二分化能を有する細胞、多能性細胞、または全能性細胞は、神経細胞に分化することができる。分化は、増殖を伴う場合もあるし、またはそれと独立している場合もある。「分化」は、一般的に、発生的に明確ではない細胞型、例えばニューロンまたはリンパ球からの成熟細胞型の表現型の獲得を指すが、１つの成熟細胞型が別の成熟細胞型に、例えばニューロンがリンパ球に変換する可能性がある分化転換を除外しない。
【００８１】
ＢＤＮＦ／ＮＴ−４−ＴｒｋＢシグナル伝達経路
[00101]ニューロトロフィンファミリーのメンバーは、高度に相同な二量体の増殖因子であり、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）などがある（McAllisterら、1999）。ニューロトロフィンは、多様な機能を有する。細胞におけるニューロトロフィンの合成プロセス中、ニューロトロフィンは、最初に前駆体（プロニューロトロフィン）として合成され、それらが切断されて成熟ニューロトロフィンが生産され、これがＴｒｋ受容体チロシンキナーゼを活性化することによってニューロンの生存を促進し、シナプス可塑性を強化する（NagappanおよびLu、2005）。プロニューロトロフィンは、ｐ７５ＮＴＲ（ｐ７５神経栄養因子受容体、ｐ７５ＮＴＲ）と結合することにより細胞のアポトーシスを引き起こす傾向がある（Wooら、2005）。全ての他のチロシンキナーゼ受容体のように、Ｔｒｋ受容体は、二量体化を介して活性化され、それにより細胞内チロシン残基の自己リン酸化が生じ、シグナル伝達カスケードが開始される。Ｔｒｋによって活性化されたシグナル伝達経路は、Ｒａｓ／細胞外調節キナーゼ（Ｅｒｋ）経路、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）／Ａｋｔ経路およびＰＬＣγ／ＰＫＣ経路を包含する（HuangおよびReichardt、2001；KaplanおよびMiller、2000）。
【００８２】
[00102]ニューロトロフィン受容体のなかでも、ＴｒｋＢおよびその内因性のリガンドＢＤＮＦ／ＮＴ−４は、それらのシナプス可塑性の調節に関してかなりの懸念がある。ニューロトロフィンは、非共有結合によって連結された安定な二量体として存在する。二量体化されたリガンドは、受容体の単量体を一緒に引き付け、受容体の二量体化と受容体のチロシン残基のリン酸化を誘導する。次いで受容体の自己リン酸化は、シグナル伝達カスケードを活性化する（Ibanezら、1993；McDonaldら、1991；Radziejewskiら、1992）。ＴｒｋＢは、５つのドメインを包含する細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞内キナーゼドメインによって構成される。第１の３つの細胞外ドメインＤ１〜Ｄ３は、２つのシステインリッチ領域を両端にもつロイシンリッチ領域からなる。ドメイン４および５（Ｄ４、Ｄ５）の両方は、免疫グロブリン様ドメインである。結晶学調査データは、Ｄ５が、ＢＤＮＦがＴｒｋＢに結合する領域であることを示す（Banfieldら、2001）。リガンド結合は、受容体の細胞内キナーゼドメインにおいて、受容体の二量体化と、５つのチロシン残基Ｔｙｒ５１５、Ｔｙｒ７０１、Ｔｙｒ７０５、Ｔｙｒ７０６およびＴｙｒ８１６のリン酸化とを誘導する（McCartyおよびFeinstein、1998）。細胞内の膜近傍領域における５１５位におけるチロシンのリン酸化は、それらのリン酸化チロシン結合（ＰＴＢ）ドメインを介してＳｈｃアダプター分子を補充する（Eastonら、1999）。ＴｒｋＢのＴｙｒ５１５がＦで置き換えられている場合、ＴｒｋＢは、Ｓｈｃと相互作用できない（Eastonら、1999）。８１６位も、ＴｒｋＢのＣ末端でリン酸化され、それによりホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）がＳｒｃ−相同性２（ＳＨ２）ドメインを介して８１６位に結合し、リン酸化される（McCartyおよびFeinstein、1998）。
【００８３】
[00103]下流は、３つの主要な細胞内シグナル伝達カスケード：Ｒａｓ−マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ経路およびＰＬＣγ−Ｃａ２＋経路である。ＴｒｋＢは、ＭＡＰＫ経路を介してニューロンの分化およびシナプスの発生を調節する（Cowleyら、1994）。Ｔｙｒ５１５におけるＳｈｃアダプターの補充およびリン酸化により、増殖因子受容体結合タンパク質２（ＧＲＢ２）およびセブンレスの息子（ＳＯＳ：son of sevenless）の結合が起こり、ｃ−Ｒａｆ／Ｂ−Ｒａｆ／Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２／ｐ３８ＭＡＰＫなどを含むＲａｓ−ＭＡＰＫ下流経路が活性化される（BallifおよびBlenis、2001）。ＴｒｋＢは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を介して細胞の発生および生存を調節し、樹状突起棘が中心としてＡｋｔと共に成長するのを促進する。ＰＩ３ＫとＴｒｋＢとの会合および活性化は、間接的に、補充されたＧＲＢ結合バインダー−１（ＧＡＢ１：recruited GRB-associated binder-1）、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１：insulin-receptor substrate 1）およびＩＲＳ２を介してＰＩ３Ｋを活性化する。この会合に応答して、３−ホスホイノシチドがＰＩ３Ｋにより生成し、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１（ＰＤＰＫ１）を活性化する。ＰＤＰＫ１は、これらの３−ホスホイノシチドと共にプロテインキナーゼＡｋｔを活性化し、これがカスパーゼ−９、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）およびＦＫＨＲファミリーメンバーなどの数種のタンパク質をリン酸化する（van Weerenら、1998）。
【００８４】
[00104]ＴｒｋＢシグナル伝達経路の活性化レベルを低くすることは、樹状突起棘の軸索および分岐を著しく損なう可能性がある。このプロセスには、足場タンパク質であるＡＲＭＳおよびＲｈｏＡが関与する（Linら、2011）。ＰＬＣγ経路は、ＴｒｋＢにおけるＴｙｒ８１６のリン酸化から始まる。ＰＬＣγ経路は主として、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を補充する（Guptaら、2013）。ＤＡＧは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化することができ、ＩＰ３は、カルシウム流入を引き起こす。これらはは協調して、軸索突起の分岐を調節する。しかしながら、Ｔｙｒ８１６における遺伝子ノックアウトは、軸索突起の分岐を完全にブロックすることはできないことから、このプロセスには他のシグナル伝達経路も参加している可能性があることを示す。
【００８５】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体
[00105]ＢＤＮＦによるＴｒｋＢの活性化シグナル伝達経路は神経分化誘導性の機能を有するにもかかわらず、ＢＤＮＦは、同時にｐ７５ＮＴＲにも多少の親和性を有する。この受容体の活性化は、ＪＮＫを含む下流因子の活性化をもたらし、細胞傷害性を引き起こすことになり、したがって細胞死を誘導することができる。加えて、ＢＤＮＦそのものの生化学的性質は、非常に不安定である。その血漿半減期は、わずか約１０分である。工業的生産に関して、ＢＤＮＦの調製は、かなりの費用を要する。それゆえに、ＢＤＮＦ二量体がその受容体の二量体化および自己リン酸化を媒介するメカニズムによれば、抗体分子（主としてＩｇＧ）も同様に２価である（２つの同じＦａｂドメインを有する）ことから、それらは類似の活性化を達成することができる。１９９６年に、Lucidi-Phillipiらが最初に、動物において抗ＴｒｋＡポリクローナル抗体がＴｒｋＡを活性化し、コリン作動性ニューロンの致死を阻害できることを報告した（Lucidi-Phillipiら、1996）。同じ年に、LeSauteurは、ＴｒｋＡのモノクローナル抗体を報告した。この抗ヒトＴｒｋＡ抗体はＮＧＦドッキング部位を認識し、ＴｒｋＡとその下流分子ＰＩ３−Ｋと結合し、それらを活性化する（LeSauteurら、1996）。Ｑｉａｎらは最初に、ＴｒｋＢ抗体アゴニストの発生を報告した。研究者によってスクリーニングされた５つのモノクローナル抗体のなかでも、ＴｒｋＢが各抗体に結合する部位は異なっていたが、それらは全て、程度は異なるが細胞生存および軸索突起の伸長を促進することができた。より重要なことに、これらの抗体はｐ７５ＮＴＲを活性化しない（Qianら、2006）。これらの抗体の１つとして、２９Ｄ７が、様々な神経疾患において治療作用を有することが見出されている。Katsukiは、２９Ｄ７を硝子体に入れることによって、視神経のダメージの外科手術中における網膜神経節細胞の死を低減できることを見出した（Huら、2010）。新生児ラットの低酸素虚血性の外科手術後、２９Ｄ７は、細胞死を低減し、感覚運動機能の長期回復を促進することができることから、脳性麻痺を有する子供への臨床的な治療に有意である（Kimら、2014）。加えてＴｏｄｄは、２９Ｄ７が、突然変異ハンチンチンタンパク質によって引き起こされる線条体細胞の障害を低減させることができることを証明したことから（Toddら、2014）、２９Ｄ７は、ハンチントン病の治療における見込みのある薬物になりつつある。
【００８６】
[00106]発明の開示は、一形態において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、本発明の開示は、例示的なモノクローナル抗体である、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ５７０２、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１６、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３７、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ９０１、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ５０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ４１８、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ６９１６、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ４０１４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ７４３１、それらのキメラ抗体、およびそれらのヒト化抗体を提供する。
【００８７】
[00107]当業者であれば、本明細書で提供されるＣＤＲ配列は、得られた抗体が１つまたはそれより多くの特性において改善され（例えば、結合または結合親和性の改善、薬物動態の半減期の増加、ｐＨ感受性、コンジュゲーションへの適合性、ＣＤＲ残基におけるグリコシル化および／または脱アミノのリスク低減、および免疫原性の低減）、それ以外の点では親抗体と同等であるか（すなわち抗体が、上述の改変または変化を除いて、ＣＤＲ配列の同じセットを有する）、または親抗体の抗原結合特性が少なくとも実質的に保持されるように、アミノ酸残基の１つまたはそれより多くの置換（または挿入または欠失）を含有するように改変されていてもよい（または用語「改変」を使用してもよい）ことを理解するものと予想される。例えば、抗体バリアント（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖバリアント）のライブラリー（またはレパートリー）は、ファージディスプレイ技術で生成し発現させ、次いでヒトＴｒｋＢへの結合または結合親和性に関してスクリーニングすることができる。別の例に関して、抗体のヒトＴｒｋＢへの結合を仮想的にシミュレートし、結合面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定するのに、コンピューターソフトウェアを使用してもよい。このような残基は、結合または結合親和性の低減を防ぐように置換において回避されるか、またはより強い結合をもたらすために置換の標的となるかのいずれであってもよい。特定の実施態様において、ＣＤＲ配列における置換の少なくとも１つ（または全て）は、保存的置換である。
【００８８】
[00108]特定の実施態様において、抗体およびその抗原結合フラグメントは、本明細書で提供されるＣＤＲ配列に、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、一方で、対応するＣＤＲ配列が本明細書で提供されるＣＤＲ配列と１００％の配列同一性を有することを除いて実質的に同じ配列を有するその親抗体に類似するかまたはそれよりさらに高いレベルで、ヒトＴｒｋＢに対する結合活性または結合親和性を保持する、１つまたはそれより多くのＣＤＲ配列を含む。
【００８９】
[00109]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、キメラである。キメラ抗体は、抗体由来の１つまたはそれより多くの領域と、他の抗体または種由来の１つまたはそれより多くの領域とを含有する。特定の実施態様において、キメラＴｒｋＢアゴニスト抗体の少なくとも１つのＣＤＲは、１つの種由来である。特定の実施態様において、ＣＤＲの全てが、別の種由来である。特定の実施態様において、キメラＴｒｋＢアゴニスト抗体の可変領域は、１つの種由来であり、別の種の抗体の定常領域に連結されている。キメラ抗体は、親抗体の結合活性または結合親和性を保持する。
【００９０】
[00110]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。特定の実施態様において、非ヒト種が元になっているヒト化抗体、および重鎖および軽鎖のフレームワークおよび定常領域における数個のアミノ酸残基は、ヒトにおいて免疫原性を低減または回避するように突然変異している。特定の実施態様において、非ヒト種の可変領域は、ヒト抗体の定常領域に融合されている。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティング、すなわちヒト抗体のＣＤＲを対応する非ヒト抗体のＣＤＲで置き換えることによって作り出される。したがって、ヒトにおけるヒト化抗体の免疫原性は低い。特定の実施態様において、ヒトフレームワーク領域は、例えば結合活性または結合親和性が改善または保持されるように、ＣＤＲ配列の元となる非ヒト抗体（例えばマウスフレームワーク領域）由来の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基で置換される。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、親抗体の結合活性または結合親和性を保持するかまたは増加させる。
【００９１】
[00111]一部の実施態様において、結合親和性は、ＫＤ値によって表すことができ、ＫＤ値は、抗原と抗原結合分子との結合が平衡に達する場合の解離速度の会合速度に対する比率（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として計算される。抗原結合親和性（例えばＫＤ）は、当業界において公知の好適な方法を使用して適切に決定することができ、このような方法としては、例えば、ビアコアなどの機器を使用するプラズモン共鳴結合アッセイが挙げられる（例えば、Murphy, M.ら、Current protocols in protein science、第19章、ユニット19.14、2006を参照）。
【００９２】
[00112]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインに、４ｎＭ未満（例えば３．５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２．５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満）のＥＣ５０（すなわち５０％が結合する濃度）で結合することが可能である。抗体のヒトＴｒｋＢへの結合は、当業界において公知の方法によって測定することができ、そのような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、表面プラズモン共鳴、ＧＳＴプルダウン、エピトープタグ、免疫沈降、Ｆａｒ−ウェスタン、蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検査法、ラテックス凝集反応、ウェスタンブロット、および免疫組織化学または他の結合アッセイが挙げられる。説明に役立つ例において、試験抗体（すなわち第１の抗体）を、固定されたヒトＴｒｋＢまたはヒトＴｒｋＢを発現する細胞に結合させ、未結合の抗体を洗浄して除いた後、結合した第１の抗体の検出に結合でき、このようにして結合した第１の抗体の検出が可能な標識された二次抗体を導入する。検出は、固定されたＴｒｋＢが使用される場合、マイクロプレートリーダーを用いて、またはヒトＴｒｋＢを発現する細胞が使用される場合、ＦＡＣＳ分析を使用することによって実行することができる。
【００９３】
[00113]特定の実施態様において、本抗体によるＴｒｋＢの活性化は、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４によるＴｒｋＢの活性化より低い。上述したように、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の二量体は、その細胞内ドメインにおけるコンフォメーション変化とチロシン残基の自己リン酸化を介してＴｒｋＢの二量体化を開始させ、それによってマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびホスホリパーゼＣ−ガンマ１（ＰＬＣ−ガンマ１）を含む３つの主要なシグナル伝達経路を媒介する。したがって、ＴｒｋＢの活性化は、上記の３つのシグナル伝達経路の活性化、またはＴｒｋＢのリン酸化（ｐＴｒｋＢ）を測定することによって決定することができる。飽和したＢＤＮＦまたはＮＴ−４（例えば１０ｎＭまたは１００ｎＭ）は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントの非存在下における１００％のＴｒｋＢの活性化をベンチマーク化するのに使用することができる。ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメント、および飽和したＢＤＮＦまたはＮＴ−４溶液の存在下における相加効果（または相乗作用）は、１００％より多くのＢＤＮＦまたはＮＴ−４によって誘導されたＴｒｋＢ活性化と定義することができる。特定の実施態様において、相加効果は、ベンチマークのＴｒｋＢの活性化の、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、または少なくとも１５０％であり得る。特定の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体は、少なくとも１２０％の相加効果を有する。特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３である。
【００９４】
[00114]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢへの結合に関して、ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４と競合する。特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢへの結合に関して、ＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４と競合しない。ＴｒｋＢアゴニスト抗体とＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４との競合は、上述したようにＴｒｋＢの活性化を測定することによって決定することができる。代替として、ＴｒｋＢアゴニスト抗体とＢＤＮＦおよび／またはＮＴ−４との競合は、ＴｒｋＢ結合アゴニストおよびＢＤＮＦが同じまたはオーバーラップするエピトープに結合するかどうか、結合の立体的な阻害があるかどうか、または第１の分子の結合が、第２の分子の結合を妨害または低減するＴｒｋＢのコンフォメーション変化を誘導するかどうかを試験するように設計された、競合ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはビアコア（BIAcore）アッセイによって決定することができる。
【００９５】
[00115]例えば、ＢＤＮＦと競合しないＴｒｋＢ結合アゴニストは、飽和ＢＤＮＦ濃度（例えば１０ｎΜ、ＥＣ１００）の存在下でアゴニストの濃度を増加させたときにＴｒｋＢリン酸化の変化を引き起こさないと予想される。ＢＤＮＦと競合するＴｒｋＢ結合アゴニストは、飽和ＢＤＮＦ濃度（例えば１０ｎΜ、ＥＣ１００）の存在下でアゴニスト濃度を増加させたときに、ＴｒｋＢリン酸化の低減を引き起こすと予想される。一実施態様において、アゴニストおよび飽和濃度（ＥＣ１００）のＢＤＮＦの存在下におけるリン酸化されたＴｒｋＢの総レベルが、飽和濃度のＢＤＮＦ単独の存在下におけるリン酸化されたＴｒｋＢのレベル、すなわち総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００のＢＤＮＦ＋アゴニスト）、総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００のＢＤＮＦ）に類似している場合、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＢＤＮＦと非競合的である。同様に、一実施態様において、アゴニストおよび飽和濃度（ＥＣ１００）のＮＴ−４の存在下におけるリン酸化されたＴｒｋＢの総レベルが、飽和濃度のＮＴ−４単独の存在下におけるリン酸化されたＴｒｋＢのレベル、すなわち総ｐＴｒｋＢ（ＥＣ１００のＮＴ−４＋アゴニスト）、総ｐＴｒｋＢ（ＥＧ１００のＮＴ−４）に類似している場合、ＴｒｋＢ結合アゴニストは、ＮＴ−４と非競合的である。アゴニストおよびＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢがその範囲内（ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢ±３標準偏差）である場合、リン酸化されたＴｒｋＢのレベルは、類似しているとみなされる。一実施態様において、アゴニストおよびＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢは、その範囲内（ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢ±２標準偏差）である。別の実施態様において、アゴニストおよびＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢは、その範囲内（ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢ±１標準偏差）である。前述の実施態様において、リン酸化されたｐＴｒｋＢの平均の総レベルは、少なくとも３回の読み取りに基づき計算され、２つの標準偏差（すなわちアゴニストの存在下で計算された標準偏差およびアゴニストの非存在下で計算された標準偏差）のうち大きい方が使用される。別の実施態様において、アゴニストおよびＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢと、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢとが１０％未満で異なる場合、リン酸化されたＴｒｋＢのレベルは、類似しているとみなされる。別の実施態様において、アゴニストおよびＢＤＮＦまたはＮＴ−４のいずれかの飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢと、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４の飽和レベルの存在下で測定された平均の総ｐＴｒｋＢとが５％未満で異なる場合、リン酸化されたＴｒｋＢのレベルは、類似しているとみなされる。ＴｒｋＢへの結合に関してＢＤＮＦまたはＮＴ−４と競合しない���ｒｋＢ結合アゴニストは、ＴｒｋＢアゴニストはＴｒｋＢを活性化することができ、低減したレベルのＢＤＮＦ（またはＮＴ−４）と競合しないため、臨床的な状況において有益である。したがって、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４は、ＴｒｋＢ結合アゴニストに加えて、生理学的な役割を継続的に果たすことができる。
【００９６】
[00116]報告されているＴｒｋＢにおけるＢＤＮＦまたはＮＴ−４／５結合エピトープの主要な残基は、Ａｓｐ３４９、Ａｓｎ３５０、Ｔｙｒ３２９、Ａｓｐ２９８、Ｃｙｓ３０２、Ｃｙｓ３４５およびＨｉｓ２９９である（Banfieldら、2001）。ＥＲＫ、ＡｋｔおよびＰＬＣガンマに加えてＴｒｋＢのリン酸化の検出は、ウェスタンブロットなどの当業界公知の方法によって、様々なタイムポイントで、例えば０分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間または３６時間で実行することができる。特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体によって開始されるＡｋｔのリン酸化は、ウェスタンブロットによって測定した場合、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のリン酸化の９０％（例えば８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％またはそれよりさらに低い）に類似しているか、またはそれより低い。特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体によって開始されるＥｒｋのリン酸化は、ウェスタンブロットによって測定した場合、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のリン酸化の９０％（例えば８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％またはそれよりさらに低い）に類似しているか、またはそれより低い。特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体によって開始されるＰＬＣガンマのリン酸化は、ウェスタンブロットによって測定した場合、ＢＤＮＦまたはＮＴ−４のリン酸化の９０％（例えば８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％またはそれよりさらに低い）に類似しているか、またはそれより低い。特定の実施態様において、Ｅｒｋのリン酸化は、Ｅｒｋ１のＴｈｒ２０２および／またはＴｙｒ２０４（Ｅｒｋ２のＴｈｒ１８５および／またはＴｙｒ１８７）で測定される。特定の実施態様において、Ａｋｔのリン酸化は、Ｔｈｒ３０８および／またはＳｅｒ４７３で測定される。特定の実施態様において、ＰＬＣ−ガンマのリン酸化は、Ｔｙｒ７７１、Ｔｙｒ７７５、Ｔｙｒ７８３、Ｓｅｒ１２４８、またはそれらの組合せで測定される。特定の実施態様において、ＴｒｋＢの自己リン酸化は、Ｔｙｒ５１５、Ｔｙｒ７０１、Ｔｙｒ７０５、Ｔｙｒ７０６、Ｔｙｒ８１６、Ｔｙｒ４９０、Ｔｙｒ６７０、Ｔｙｒ６７４、Ｔｙｒ６７５、Ｔｙｒ７７１、Ｔｙｒ７８３、Ｔｙｒ７８５、Ｔｙｒ１２５４、またはそれらの組合せで測定される。
【００９７】
[00117]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、併用療法に組み入れることができ、併用療法としては、標準的な化学および放射線療法（例えば放射線療法、Ｘ線療法）、標的ベースの小分子療法（例えばモノクローナル抗体、光線力学療法）、免疫療法（例えば、腫瘍マーカーに対する抗体、例えば、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シリアルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢおよびｐ１５５、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、Ｆｚｄ７、またはＷｎｔ、ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３またはＲＳＰＯ４に対する抗体）、出現する他の免疫チェックポイントモジュレーター療法（例えばワクチン）、ホルモン療法、血管新生阻害（血管形成抑制薬）、遺伝子治療（細胞増殖の誘導物質、細胞増殖の阻害剤、またはプログラム細胞死の調節因子）、緩和ケア（すなわち、痛み（例えばモルヒネおよびオキシコドン）、吐き気、嘔吐（例えばオンダンセトロンおよびアプレピタント）、下痢および出血を低減するためのケアの質を改善することを目的とした治療）および外科手術が挙げられる。特定の実施態様において、抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗体−薬物コンジュゲート、二重特異性抗体または多価抗体のベースとして使用することができる。
【００９８】
[00118]本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、標識された抗体、２価抗体、または抗イディオタイプ抗体であってもよい。組換え抗体は、動物中ではなく組換え方法を使用してインビトロで調製された抗体である。二重特異性または２価抗体は、２種の異なるモノクローナル抗体のフラグメントを有する人工抗体であり、２種の異なる抗原に結合することができる。「２価」の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、２つの抗原結合部位を含む。抗体または抗原結合フラグメントが「二重特異性」であることを特徴とする場合、２つの抗原結合部位は、同じ抗原に結合することもできるし、またはそれらがそれぞれ異なる抗原に結合することもできる。
【００９９】
[00119]一部の実施態様において、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒト化されているかまたはキメラ抗体である。特定の実施態様において、ヒト化またはキメラ抗体は、組換え方法を使用して調製される。例えば、非ヒト動物は、適した抗原、例えばヒトＴｒｋＢタンパク質で免疫化されてもよい。抗原に結合する抗体可変領域をコードする遺伝子フラグメントをマウスのモノクローナル抗体の遺伝子から切り出し、この部分を、ヒト／非ヒト動物ＩｇＧ１由来の抗体の定常領域の遺伝子に作動可能に連結させる。組換え遺伝子フラグメントを発現ベクターに取り込ませ、次いでこれをキメラ抗体生産のための宿主細胞に導入する（米国特許第４，８１６，３９７号；４，８１６，５６７号；５，８０７，７１５号を参照）。
【０１００】
[00120]「ヒト化抗体」は、可変領域のフレームワークおよび定常領域が、存在する場合、全体的または実質的にヒト抗体配列由来になるように、非ヒト由来の抗体のＣＤＲ遺伝子をヒト抗体遺伝子にグラフト化することにより得られた抗体である。ヒト化抗体を調製するための方法は、当業界において公知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，８５９，２０５号、米国特許第６，８８１，５５７号、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、およびＷＯ９６／０２５７６を参照）。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、ヒト化された重鎖およびヒト化された軽鎖を含む。特定の実施態様において、ヒト化されたＴｒｋＢアゴニスト抗体におけるグラフト化されたＣＤＲの配列は、対応するＣＤＲと、少なくとも６０％、７０％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９５％または１００％同一である。特定の実施態様において、ヒト化されたＴｒｋＢアゴニスト抗体のＣＤＲ中で、３個以下の保存的アミノ酸置換が存在する。特定の実施態様において、ヒト化されたＴｒｋＢ抗体の可変領域フレームワークのアミノ酸残基は、配列の最適化のために置換される。特定の実施態様において、ヒト化されたＴｒｋＢアゴニスト抗体鎖の可変領域フレームワーク配列は、対応するヒト可変領域フレームワーク配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。
【０１０１】
[00121]一部の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、単一ドメイン抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、ＶＮＡＲ、ナノボディ、操作されたヒトＶＨ／ＶＬ単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲまたは２価ドメイン抗体である。
【０１０２】
[00122]一部の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。一部の実施態様において、免疫グロブリンの定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１−ＣＨ２、またはＣＨ１−ＣＨ３領域を含む。一部の実施態様において、定常領域は、望ましい特性を付与するための１つまたはそれより多くの改変をさらに含んでいてもよい。例えば、定常領域は、１つまたはそれより多くのエフェクター機能を低減または枯渇させるため、ＦｃＲｎ受容体結合を改善するため、または１つまたはそれより多くのシステイン残基を導入するために改変されてもよい。
【０１０３】
[00123]一部の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントはさらに、抗体−薬物−コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成する。様々なペイロードが、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントに連結できることが予期される（例えば、「Conjugate Vaccines」、Contributions to Microbiology and Immunology、J. M. CruseおよびR. E. Lewis, Jr.（編）、Carger Press、ニューヨーク（1989）を参照）。「ペイロード」という用語は、「薬物」と置き換え可能に使用され、これらのペイロードは、他の方法のなかでも特に、共有結合、親和性結合、挿入、配位結合、錯化、会合、ブレンド、または付加によって抗体または抗原結合フラグメントに連結することができる。特定の実施態様において、本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントを、１つまたはそれより多くのペイロード、例えばペプチド、核酸分子、薬物、細胞毒素、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、ハプテン、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、放射性同位体およびレポーター基への結合のために利用できる、エピトープ結合部分の外側の特異的な部位が含有されるように操作することができる。例えば、このような部位は、ペイロードへの共有結合による連結を容易にするために、１つまたはそれより多くの反応性アミノ酸残基、例えばシステインまたはヒスチジン残基などを包含していてもよい。特定の実施態様において、抗体は、間接的にリンカーを介して、または別のペイロードを介してペイロードに連結されていてもよい。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、ビオチンにコンジュゲートされ、次いで間接的に、アビジンにコンジュゲートした第２のペイロードにコンジュゲートされていてもよい。ペイロードは、レポーター基もしくは検出可能な標識、薬物動態学的な改変成分、精製成分、または細胞傷害性成分であってもよい。検出可能な標識の例としては、検出のための、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、またはテキサスレッド）、酵素−基質標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素またはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、放射性同位体（例えば１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、および３２Ｐ、他のランタニド、発光性標識）、色素産生性成分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または金を挙げることができる。特定の実施態様において、ペイロードは、抗体の半減期の増加を助けるＰＥＧなどの薬物動態学的な改変成分であってもよい。他の好適なポリマーとしては、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。特定の実施態様において、ペイロードは、精製成分、例えば磁気ビーズであってもよい。「細胞傷害性」成分のペイロードは、細胞に有害であるか、または細胞にダメージを与えたりまたは致死させたりすることができるあらゆる薬剤であってもよい。細胞傷害性成分の例としては、これらに限定されないが、化学療法剤、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、薬物、毒素、例えばタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびそれらの類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、白金系（例えば、シスプラチンおよびオキサリプラチン）、植物性アルカロイド（例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサン、およびエピポドフィロトキシン）およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。用語「ローディング」または「薬物のローディング」または「ペイロードのローディング」は、本明細書で使用される場合、抗体１つ当たりの薬物／ペイロードの平均数を指す。薬物のローディングは、当業界において好適な方法、例えば質量分析、ＵＶ／可視分光法、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣによって決定した場合、抗体１当たり１〜２０個（例えば１〜１５、１〜１０、２〜１０、１〜８、２〜８、２〜６、２〜５または２〜４個）の範囲内の薬物（薬物と抗体との比率ともいう）であってもよい。特定の実施態様において、薬物のローディングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
【０１０４】
ポリヌクレオチドおよび組換え方法
[00124]本発明の開示は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の開示において提供されるＣＤＲ配列をコードする１つまたはそれより多くのヌクレオチド配列を含む。
【０１０５】
[00125]抗体は、当業者公知の様々な技術のいずれかによって調製することができる。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照されたい。特定の実施態様において、モノクローナルＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するプロセスとしては、好適な動物を、ヒトＴｒｋＢタンパク質またはｈＴｒｋＢアゴニストを生産する細胞で免疫化することが挙げられる。動物は、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット、例えば、Ｖｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ｋｙｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ａｌｉｖａ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）、ＨｕＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ｏｍｎｉｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ｏｍｎｉｒａｔ（登録商標）またはＭｅＭｏ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモットなどであってもよい。免疫動物の脾臓またはリンパ節を使用するかまたはＢ細胞を集めてハイブリドーマを生成し、ＴｒｋＢアゴニスト抗体のタイターを測定する。免疫動物由来のハイブリドーマまたはＢ細胞クローンから、好適なタイターを有するＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドをクローニングする。クローニングまたは改変された（例えばキメラ、ヒト化された）ポリヌクレオチドを好適なベクターに組み込み、次いでこれを宿主細胞に導入して、本開示の抗体を生産する。本明細書で提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、宿主細胞を培養し、続いて宿主細胞または培養液（例えば上清）を分離および精製することによって、実質的に純粋で均一な形態で得ることができる。抗体またはその抗原結合フラグメントの分離および精製のために、ポリペプチド精製に使用される通常の方法を採用することができる。モノクローナル抗体は、例えば、KohlerおよびMilstein、Eur. I Immunol. 6：511〜519、1976の技術、またはその改変法を使用して調製することができる。また、マウスなどのトランスジェニック動物を利用して、宿主動物以外の異なる種の抗体、例えばヒト抗体を発現させる方法も挙げられる。例えば、Neubergerら、Nature Biotechnology 14：826、1996； Lonbergら、Handbook of Experimental Pharmacology 113：49〜101、1994；およびLonbergら、Internal Review of Immunology 13：65〜93、1995を参照されたい。このような例としては、ＲＥＧＥＮＥＲＥＸ（登録商標）により開発されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）プラットフォームが挙げられる。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、（１）上記の免疫動物からのリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、抗体を発現するハイブリドーマを生成すること；（２）上記の免疫動物のリンパ球から抗原特異的なＢ細胞を単離し、ＰＣＲを介して抗体をクローニングし、抗体を発現させること；または（３）上記の免疫動物のリンパ球からｍＲＮＡを単離して、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、イーストディスプレイ、細菌ディスプレイ、バキュロウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、またはｍＲＮＡディスプレイライブラリーを介して抗体を得ることから選択されるプロセスの少なくとも１つを介して得られる（例えば、米国特許第７，２４４，５９２号；Chaoら、Nature Protocols. 1：755〜768、2006を参照）。これらのディスプレイ方法は、全て当業界における従来の技術であり、それらの具体的な操作は、対応する教本または操作マニュアルに見出すことができる。例えばMondon Pら、Front. Biosci. 13：1117〜1129、2008を参照されたい。特定の実施態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントの結合部位は、複数の４鎖抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｄＡｂ、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含むかまたはからなる多数の結合部位（例えば、そのライブラリー）から選択される。
【０１０６】
[00126]ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドは、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、当業界において公知の組換え技術を使用して、ベクターに挿入することができる。別の実施態様において、抗体は、当業界において公知の相同組換えによって生産してもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター要素としては、一般的に、これらに限定されないが、以下：シグナル配列（例えば翻訳シグナルまたはリーダー配列）、複製起点、１つまたはそれより多くの選択可能マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）、および転写終結配列の１つまたはそれより多くが挙げられる。
【０１０７】
[00127]一部の実施態様において、ベクター系としては、哺乳類、細菌、酵母系などが挙げられ、例えば、これらに限定されないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ−１、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ−Ｂｏｓなど、ならびに他の実験用および市販の発現ベクターなどのプラスミドを含む。好適なベクターとしては、プラスミド、またはウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を挙げることができる。ベクターは、単一のコピーまたは複数コピーで維持されてもよいし、または宿主細胞ゲノムに統合されてもよい。抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、複製または遺伝子発現のための宿主細胞に導入することができる。本明細書においてベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞は、上述される原核生物、酵母、昆虫細胞またはより高等な真核生物細胞である。この目的のために好適な原核生物としては、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科、例えばエシェリキア属、例えば大腸菌（E.coli）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア属、例えばセラチア・マルセセンス（Serratia marcescans）、および赤痢菌属、加えてバチルス属（Bacilli）、例えば枯草菌（B.subtilis）およびＢ．リケニフォルミス（B.licheniformis）、シュードモナス属、例えば緑膿菌（P.aeruginosa）、およびストレプトマイセス属、バチルス属（Bacillus）、連鎖球菌属、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、クロストリジウム属、ゲオバチルス属、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、シュードモナス属、サルモネラ属、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、フラボバクテリウム属、フゾバクテリウム属、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属、およびウレアプラスマ属が挙げられる。好適な昆虫細胞としては、キイロショウジョウバエ属のシュナイダーＳ２（Schnieder S2）細胞およびＳｆ９が挙げられる。好適な酵母としては、Ｐ．メタノリカ（P.methanolica）、Ｐ．パストリス（P.pastoris）、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）または一般的なパン酵母が挙げられる。好ましい哺乳類細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、リンパ球および骨髄腫が挙げられる。特定の実施態様において、抗体のためのグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合、抗体は、細菌中で生産することができる。
【０１０８】
[00128]上記の例に加えて、多数の他の属、種、および株が一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。そのようなものとしては、例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）；クルイベロマイセス属の宿主、例えば、Ｋ．ラクティス（K.lactis）、Ｋ．フラギリス（K.fragilis）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（K.bulgaricus）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッカーラミイ（K.wickeramii）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルテイ（K.waltii）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（K.drosophilarum）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（K.thermotolerans）、およびＫ．マルキシアヌス（K.marxianus）など；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（Pichia pastoris）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesia）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Neurospora crassa）；シュワニオミセス属、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）；ならびに糸状菌（filamentous fungi）、例えばアカパンカビ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、およびアスペルギルス属の宿主、例えばＡ．ニデュランス（A.nidulans）およびＡ．ニガー（A.niger）などが挙げられる。
【０１０９】
[00129]本明細書で提供されるグリコシル化抗体または抗原フラグメントの発現のために好適な宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（幼虫）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）（蚊）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ミバエ）、およびカイコガ（Bombyx mori）などの宿主由来の、多数のバキュロウイルス株およびバリアント、ならびに対応する複製可能な昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株が公共的に入手可能であり、そのような株としては、例えば、アウトグラファ・カリフォルニカＮＰＶ（Autographa californica NPV）のＬ−１バリアント、およびカイコガＮＰＶ（Bombyx mori NPV）ＮＰＶのＢｍ−５株が挙げられ、このようなウイルスは、本発明に従って本明細書に記載のウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用することができる。また、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０１１０】
[00130]しかしながら、脊椎動物細胞に最大の関心が寄せられており、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖が慣例的な手順になりつつある。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株（懸濁培養中での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Grahamら、J. Gen Virol. 36：59（1977））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216（1980））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather、Biol. Reprod. 23：243〜251（1980））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci. 383：44〜68（1982））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ＰＣ１２；マウス胚線維芽細胞株（３Ｔ３）；ＮＳＯ骨髄腫細胞（いかなる機能的な免疫グロブリン鎖も内因的に生産しないマウス骨髄腫細胞株）である。様々な宿主細胞が、翻訳後プロセシングならびにタンパク質および遺伝子産物の改変に関する多様な特徴およびメカニズムを有する。それゆえに、発現される抗体の正しい改変およびプロセシング（例えば一次転写、グリコシル化、およびリン酸化）を確実にするために、好適な細胞株を宿主細胞として選ぶことができる。一部の好ましい実施態様において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。一部の好ましい実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０１１１】
[00131]宿主細胞を、上述したＴｒｋＢアゴニスト抗体産生のための発現またはクローニングベクターで形質転換し、必要に応じてプロモーターの誘導、形質転換株の選択、または望ましい配列をコードする遺伝子の増幅のために改変された従来の栄養培地中で培養する。特定の実施態様において、ベクターは、形質転換、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポフェクションなどの当業界において公知の方法によって宿主細胞に移行させてもよい。特定の実施態様において、ベクターの真核生物へのトランスフェクションとしては、リン酸カルシウム共沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびウイルス感染が挙げられる。真核宿主細胞は、抗体をコードする第２のポリヌクレオチドと共に形質転換させてもよい。特定の実施態様において、移行したベクターを含有する宿主細胞は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を一時的に発現することができる。
【０１１２】
[00132]本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを生産するのに使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（シグマ（Sigma））、最小必須培地（ＭＥＭ）（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマ）、ルリア液体培地（ＬＢ）、およびテリフィック培地（Terrific Broth）（ＴＢ）などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに好適である。加えて、Hamら、Meth. Enz.58：44 （1979）、Barnesら、Anal. Biochem. 102：255（1980）、米国特許第４，７６７，７０４号；４，６５７，８６６号；４，９２７，７６２号；４，５６０，６５５号；または５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれかを、宿主細胞のための培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源が補充されていてもよい。また他のあらゆる必要な補充物質が、当業者公知と予想される適切な濃度で包含されていてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、これまでに発現のために選択された宿主細胞で使用されてきたものであり、当業者には明らかであると予想される。
【０１１３】
[00133]組換え技術を使用する場合、抗体およびその抗原結合フラグメントは、細胞内で、ペリプラズム間隙中で生産することができ、または培地に直接分泌させることもできる。抗体が細胞内に生産される場合、第１の工程として、微粒子の破片、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかは、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carterら、Bio/Technology 10：163〜167（1992）は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌された抗体を単離するための手順を記載している。簡単に言えば、細胞のペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分にわたり融解させる。死細胞片は、遠心分離によって除去することができる。抗体およびその抗原結合フラグメントが培地に分泌される場合、一般的に、このような発現系からの上清をまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン（Amicon）またはミリポア（Millipore）のペリコン（Pellicon）限外ろ過ユニットを使用して濃縮する。前述の工程のいずれかに、タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を取り入れてもよく、外因性の汚染菌の増殖を防ぐために抗生物質を取り入れてもよい。
【０１１４】
[00134]細胞から調製した抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、免疫沈降、等電点分画法、再結晶およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプによって決まる。プロテインＡは、ヒトガンマ．１、ガンマ．２、またはガンマ．４重鎖をベースとした抗体を精製するのに使用することができる（Lindmarkら、J. Immunol. Meth. 62：1〜13（1983））。プロテインＡカラムの例としては、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびセファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス（GE Healthcare Biosciences））が挙げられる。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトガンマ．３に推奨されている（Gussら、EMBO J. 5：1567 1575（1986））。親和性リガンドを付着させるマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば制御多孔質ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成できるものより速い流速とより短いプロセシング時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（J.T.Baker、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラムでの精留、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、回収しようとする抗体に応じて利用可能である。
【０１１５】
[00135]あらゆる予備的な精製工程後、目的の抗体および汚染物質を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨで溶出緩衝液を使用する低いｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよく、好ましくは、低い塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実行される。
【０１１６】
キット
[00136]本発明の開示は、さらに別の形態において、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を含むキットを提供する。一部の実施態様において、キットは、生体サンプル中のＴｒｋＢの存在またはレベルを検出するのに有用である。生体サンプルは、細胞または組織を含んでいてもよい。
【０１１７】
[00137]一部の実施態様において、キットに含まれるＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識（例えば、蛍光性、放射性または酵素標識）とコンジュゲートされている。特定の他の実施態様において、キットは、非標識ＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または非標識ＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を含み、非標識ＴｒｋＢアゴニスト抗体に結合可能な二次標識抗体をさらに含む。キットはさらに、標識を検出する手段（例えば、蛍光標識、酵素標識のための酵素基質などを検出するためのフィルターセット）を包含していてもよい。キットは、特定の方法の実行のために使用される追加の試薬および緩衝液を含んでいてもよい。キットは、使用説明書、およびキット中の構成要素のそれぞれを隔てるパッケージをさらに含んでいてもよい。特定の実施態様において、キットは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を検出するためのイムノアッセイを含む。
【０１１８】
[00138]特定の実施態様において、キットに含まれるＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントは、サンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、またはイムノグラフィックアッセイにおいて有用な基板またはデバイスと連結されている。有用な基板またはデバイスは、例えば、マイクロタイタープレートおよび試験ストリップであり得る。
【０１１９】
[00139]特定の実施態様において、キットは、ＴｒｋＢタンパク質レベルを検出するために提供される。一部の実施態様において、キットは、ＴｒｋＢに関連する状態を予測する、診断する、予防する、または治療するために使用される。
【０１２０】
医薬組成物および治療方法
[00140]本発明の開示はさらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントおよび１種またはそれより多くの医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２１】
[00141]本明細書で開示される医薬組成物での使用に医薬的に許容される担体としては、例えば、医薬的に許容される液体、ゲル、もしくは固形担体、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、封鎖剤またはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助剤、当業界において公知の他の成分、または様々なそれらの組合せが挙げられる。
【０１２２】
[00142]好適な成分としては、例えば、抗酸化剤、潤滑剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、潤滑剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または安定剤、例えば糖およびシクロデキストリンが挙げられる。好適な抗酸化剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルが挙げられる。本明細書で開示されたように、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントおよびコンジュゲートを含む組成物中に、１種またはそれより多くの抗酸化剤、例えばメチオニンを包含させることにより、抗体または抗原結合フラグメントの酸化が減少する。この酸化の低減は、結合活性または結合親和性の損失を防ぐかまたは低減させ、それによって抗体の安定性を改善し、貯蔵寿命を最大化する。それゆえに、特定の実施態様において、本明細書で開示される１種またはそれより多くの抗体または抗原結合フラグメント、および１種またはそれより多くの抗酸化剤、例えばメチオニンを含む組成物が提供される。さらに、抗体または抗原結合フラグメントを、１種またはそれより多くの抗酸化剤、例えばメチオニンと混合することによって、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントの酸化を予防する、貯蔵寿命を延長する、および／または効能を改善するための方法が提供される。好適な潤滑剤としては、エチレングリコール、グリセリン、またはソルビトールが挙げられる。好適な潤滑剤としては、例えば、セチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムもしくは白蝋、またはそれらの２種またはそれより多くの混合物が挙げられる。好適な乳化剤としては、カルボマー、ポリオキシエチレン−２０−ステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ステアリン酸ジグリコール、ステアリン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラノリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、メチルセルロース、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ソルビタンエステルまたはステアリン酸が挙げられる。
【０１２３】
[00143]医薬的に許容される担体をさらに例示すれば、例えば、水性媒体、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、またはデキストロースおよび乳酸加リンゲル注射液、非水性媒体、例えば植物性不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、または落花生油、静菌性または静真菌性濃度の抗微生物剤、等張剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース、緩衝液、例えばリン酸またはクエン酸緩衝液、抗酸化剤、例えば硫酸水素ナトリウム、局所麻酔剤、例えば塩酸プロカイン、懸濁剤および分散剤、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）、封鎖剤またはキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸が挙げられる。複数用量用容器中の医薬組成物中に、担体として利用される抗微生物剤が添加されてもよく、このような抗微生物剤としては、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシケイ皮酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールが挙げられる。好適な非毒性の補助剤としては、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、もしくはシクロデキストリンなどの薬剤が挙げられる。
【０１２４】
[00144]医薬組成物は、液状の液剤、懸濁液、乳剤、ローション剤、フォーム、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤、軟膏剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアロゾル、または粉剤であってもよい。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを包含していてもよい。
【０１２５】
[00145]特定の実施態様において、医薬組成物は、注射用組成物に製剤化される。注射用医薬組成物は、例えば液体溶液、懸濁液、乳剤、または液体溶液、懸濁液もしくは乳剤を作製するのに好適な固体の形態などのあらゆる従来の形態で調製することができる。注射用の調製物としては、注射にすぐに使用できる滅菌および／または非発熱性溶液、滅菌乾燥された可溶性製品、例えば使用直前に溶媒とすぐに合わせることができる凍結乾燥粉末、例えば、皮下錠剤、注射にすぐに使用できる滅菌懸濁液、使用直前に媒体とすぐに合わせることができる滅菌乾燥された不溶性製品、ならびに滅菌および／または非発熱性乳剤などを挙げることができる。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。
【０１２６】
[00146]特定の実施態様において、単位用量の非経口製剤は、アンプル、バイアルまたはシリンジ中に針と共にパッケージ化される。全ての非経口投与のための製剤は、当業界公知であり当業界で実施されるように、滅菌され、発熱性であると予想される。
【０１２７】
[00147]特定の実施態様において、滅菌された凍結乾燥粉末は、本明細書で開示される抗体または抗原結合フラグメントを好適な溶媒中に溶解させることによって調製される。溶媒は、安定性を改善する賦形剤、または粉剤または粉剤から調製した再溶解した溶液の他の薬理学的な成分を含有していてもよい。使用できる賦形剤としては、これらに限定されないが、水、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の好適な物質が挙げられる。溶媒は、中性ｐＨで、一実施態様においてほぼ中性ｐＨで、緩衝剤、例えばクエン酸塩、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムまたは当業者公知の他の緩衝剤を含有していてもよい。それに続く溶液のろ過滅菌と、当業者公知の標準条件下における凍結乾燥により、望ましい製剤が提供される。一実施態様において、得られた溶液は、凍結乾燥のためのバイアルに分配されることになる。各バイアルは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらの組成物の単回投薬量または複数回投薬量を含有していてもよい。正確なサンプルの引き出しと正確な投与が容易になるように、１回の用量または一連の用量に必要な量を少し超える量（例えば、約１０％）でバイアルを満たすことが許容される。凍結乾燥粉末は、適切な条件下で、例えば約４℃から室温で貯蔵することができる。
【０１２８】
[00148]凍結乾燥粉末の注射用水での再溶解は、非経口投与で使用するための製剤を提供する。一実施態様において、再溶解のために、凍結乾燥粉末に、滅菌および／または非発熱性の水または他の液状の好適な担体が添加される。正確な量は、与えられている選択された療法によって決まり、経験的に決定することができる。
【０１２９】
[00149]ＴｒｋＢに関連する状態を治療するための治療方法も提供され、本方法は、対象に、治療有効量の本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを投与すること、それによってＴｒｋＢに関連する状態または障害を治療または予防することを含む。別の実施態様において、対象におけるＴｒｋＢの活性化によって利益を得ると予想される状態を治療するための方法が提供され、本方法は、治療有効量の本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１３０】
[00150]治療有効量（単独で、または化学療法剤などの他の薬剤と組み合わせて使用される場合）の本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、治療しようとする疾患のタイプ、抗体のタイプ、体重、年齢、過去の病歴、現在の薬物療法、対象の健康状態、免疫状態、ならびに交差反応、アレルギー、過敏症および有害な副作用の可能性、それに加えて、投与経路およびタイプ、疾患の重症度および発症ならびに主治医または獣医師の裁量などの当業界において公知の様々な要因によって決まると予想される。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの治療上有効な投薬量で、１日当たり１回またはそれより多くの回数で（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇで、１日当たり１回またはそれより多くの回数で）投与されてもよい。特定の実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、約５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の投薬量で投与され、特定には、投薬量は、２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、３ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、０．３ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、０．２ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、または０．１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満である。特定の実施態様において、投与量は、治療の経過にわたり変更することができる。例えば、特定の実施態様において、最初の投与量は、その後の投与量より多くてもよい。特定の実施態様において、投与量は、治療の経過にわたり、対象の反応に応じて変更することができる。
【０１３１】
[00151]投薬レジメンは、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）が提供されるように調整することができる。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、１回で、または一連の治療にわたり対象に投与される。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、疾患のタイプおよび重症度に応じて、１つまたはそれより多くの別々の投与によって、または連続的な点滴によって対象に投与される。指針は、例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；５，２０６，３４４号；５，２２５，２１２号に見出すことができる。
【０１３２】
[00152]本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントは、例えば非経口（例えば、皮下、経皮（例えば、パッチにより）、体外、腹膜内、静脈内、例えば静脈内注入、筋肉内、または皮内注射など）経路、または非経口（例えば、口腔内、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸、または局所）経路などの当業界において公知のあらゆる経路、によって投与することができる。本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントは、中枢神経系（例えば、脳（大脳内または脳室内）、脊髄、または髄液）、またはそれらのあらゆる組合せに投与することができる。
【０１３３】
[00153]特定の実施態様において、本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントは、制御放出式で投与されてもよい。制御放出式の非経口製剤は、インプラント、油性注射剤または微粒子系（例えばマイクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子）として作製することができる（Banga, A. J.、Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation, Processing, and Delivery Systems、Technomic Publishing Company, Inc.、ペンシルベニア州ランカスター（1995）；Kreuter, J.、Colloidal Drug Delivery Systems、J. Kreuter編、Marcel Dekker, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク、219〜342頁（1994）；TiceおよびTabibi、Treatise on Controlled Drug Delivery、A. Kydonieus編、Marcel Dekker, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク、315〜339頁（1992）を参照）。特定の実施態様において、本明細書で開示されるＴｒｋＢアゴニスト抗体および抗原結合フラグメントは、分解可能な、または非分解性のポリマーマトリックス中で投与されてもよい（Langer、Accounts Chem. Res. 26：537〜542、1993を参照）。
【０１３４】
[00154]ＴｒｋＢに関連する状態は、がんまたは腫瘍であり得る。特定の実施態様において、状態は、固形腫瘍、血液学的疾患、感染症、自己免疫疾患または線維性疾患である。特定の実施態様において、固形腫瘍としては、例えば、非小細胞肺がん（扁平上皮／非扁平上皮）、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、結腸がん、卵巣がん、乳がん（例えば基底乳癌、腺管癌および乳房の小葉癌）、膵臓がん、胃癌、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、膠芽腫、子宮頸がん、胸腺癌、黒色腫、骨髄腫、菌状息肉腫、メルケル細胞がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ性悪性腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、クロム親和性細胞腫、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫が挙げられる。血液学的な障害としては、例えば、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、真性多血症、肥満細胞由来の腫瘍、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭癌、およびＨＨＶ８関連原発性滲出液リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および脊髄形成異常、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、例えば中枢神経系原発リンパ腫、脊髄軸椎腫瘍、脳幹グリオーマ、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫ならびに網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０１３５】
[00155]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ニューロンの疾患、例えば神経変性疾患、精神障害、代謝性疾患、脳傷害、視神経症および網膜変性状態、聴力損失障害、神経発達障害、体重調節の障害、筋障害および他のＣＮＳ障害を治療するのに使用することができる。
【０１３６】
[00156]神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（例えば進行性筋萎縮症）、パーキンソン病、プリオン病、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病（ＯＤ）、レヴィ小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症（例えば前頭側頭型認知症）およびタウオパチーが挙げられる。より特定の神経変性障害としては、ＡＬＳ、ハンチントン病および運動ニューロン疾患が挙げられる。
【０１３７】
[00157]精神障害としては、不安、気分障害、うつ病（例えば大うつ病性障害）、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害および統合失調症が挙げられる。
【０１３８】
[00158]神経発達障害としては、アンジェルマン症候群、プラダー−ウィリー症候群、自閉性障害およびレット症候群が挙げられる。
[00159]特定の視神経症としては、緑内障（例えば開放角緑内障、広隅角緑内障、閉塞隅角緑内障（急性および慢性）、正常眼圧緑内障）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）（例えば、非動脈炎性虚血性視神経症（ＮＡＩＯＮ））、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症（例えば、乳頭浮腫）、浸潤性視神経症、外傷性視神経症、ミトコンドリア性視神経症、中毒性視神経症、遺伝性視神経症（例えば、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ；Ｋｊｅｒ型の視神経萎縮症）、レーバー遺伝性視神経症、ローゼンバーグ−チュトリアン症候群、ウォルフラム症候群、視神経形成不全）、視神経炎（例えば、視神経脊髄炎、乳頭炎）が挙げられる。網膜変性性障害としては、遺伝性のジストロフィー（例えば網膜色素変性症）、または加齢性黄斑変性症（滲出型およびドライ型）などの後天性の状態が挙げられる。一実施態様において、視神経症としては、例えば、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および／または視神経に影響を与える状態が挙げられる。特定の視神経症としては、緑内障（例えば開放角緑内障、広隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、非動脈炎性（non-anterior）虚血性視神経症（ＮＡＩＯＮ）、外傷性視神経症およびレーバー遺伝性視神経症が挙げられる。網膜変性性障害としては、加齢性黄斑変性症（滲出型およびドライ型）などの遺伝性または後天性の状態が挙げられる。
【０１３９】
[00160]聴力損失障害としては、感覚神経聴力損失（ＳＮＨＬ）（両側、片側だけ、および不特定）および複合型の聴力損失（それにおいて、感覚神経的な、および伝導性の損失要素がある；両側、片側だけ、および不特定）が挙げられる。感覚神経聴力損失としては、感覚的な（蝸牛関連の）または神経性の（第八神経関連の）聴力損失が挙げられる。感覚神経聴力損失は、終末器官の病変に起因する可能性がある。感覚神経聴力損失に関連する終末器官の病変としては、音響性外傷（例えば８５デシベル（ｄｂ）より大きいノイズによる）、ウイルス性内リンパ迷路炎、メニエール病、第八神経の小脳橋角腫瘍、第八神経神経節の細菌またはウイルス感染（例えば耳帯状疱疹を伴う）、急性中耳炎から生じる化膿性迷路炎、化膿性髄膜炎、慢性中耳炎、突発性難聴（例えばウイルスに起因するものなど、例えば、流行性耳下腺炎、麻疹、インフルエンザ、水痘、単核症およびアデノウイルスなどのウイルスによって引き起こされるウイルス性内リンパ迷路炎）および一過性虚血性難聴、中耳に伸びる側頭骨の骨折、および鼓膜の破裂、場合によっては耳小骨連鎖の破裂、蝸牛に影響を及ぼす骨折、ならびに一般的に第八神経の聴神経または前庭神経部分のいずれかから生じるシュヴァン細胞に起因する腫瘍である聴神経鞘腫が挙げられる。終末器官の病変による聴力損失は、先天性であってもよく、例えば、風疹、出生時の無酸素症、分娩中の外傷による内耳への出欠、母親に投与された耳毒性薬物、胎児赤芽球症、ならびにワールデンブルグ症候群およびハーラー症候群などの遺伝性の状態によって引き起こされるものであってもよい。代替として、感覚神経聴力損失は、加齢に関連した聴力損失であってもよく、例えば老人性難聴（例えば老年難聴）であり、これは、老化の正常な現象として起こる感覚神経聴力損失である。感覚神経聴力損失は、耳毒性の聴力損失（内耳の聴神経、特にコルチ器官に影響を与える耳毒性薬物（例えば特定の抗生物質、特定の化学療法剤、特定のサリチル酸塩化合物、特にアスピリン、特定の利尿薬、一般的なループ利尿薬、および特定のキニーネ）によって生じる聴力損失）であり得る。
【０１４０】
[00161]筋障害としては、サルコペニアが挙げられる。
[00162]他のＣＮＳ障害としては、糖尿病性神経障害、てんかん、多発性硬化症、片頭痛、神経傷害（例えば外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脊髄の傷害および末梢神経傷害）、末梢神経障害、神経筋疾患（例えば重症筋無力症および筋無力症症候群）、睡眠障害および卒中が挙げられる。一例において、末梢神経障害としては、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）が挙げられる。ＣＩＰＮは、多くの抗がん薬の主要な用量を制限する副作用である。
【０１４１】
[00163]特定の実施態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、これらに限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、卒中、脊髄の傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン障害、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、認知症、タウオパチー、末梢神経障害、神経傷害、末梢神経傷害、パーキンソン病、プリオン病、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、精神障害、統合失調症、多発性硬化症、レット症候群、レヴィ小体病、多系統萎縮症、重症筋無力症、糖尿病性神経障害、網膜変性、緑内障、聴力損失、体重の調節、思春期やせ症、悪液質、神経筋疾患、気分および抑うつ障害、心的外傷後ストレス障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、不安、自閉性障害、痛み、体重の調節を含む障害、思春期やせ症、悪液質、不要な体重の減少、およびオピオイドによって誘発された嘔吐などの疾患、障害または状態の治療において、または疾患、障害または状態を治療するための医薬の製造において使用することができる。
【０１４２】
アルツハイマー病
[00164]現在、神経変性疾患の病因は、遺伝子レベルでおよそ２種に分けることができる：一方の病因は、毒素の蓄積を引き起こす病原性の遺伝子突然変異であり、他方は、自己修復能力を有する遺伝子の突然変異または調節障害である。現在の神経変性疾患研究は、疾患の病因、すなわちいかにしてニューロンの死を引き起こす神経毒を低減させるかに注目する傾向がある。しかしながら、この概念に基づいて老人性認知症を治療するための医薬開発は、近年の５つの大規模ＩＩＩ相臨床試験を含め、全て失敗に終わっている（KarranおよびHardy、2014；Mullard、2012）。主な理由は、薬物が標的とするのは病原性の毒素である点である。しかしながら、疾患の症状が現れると、毒素は、数年間、または何十年にもわたりニューロンに毒の作用を与え続け、ニューロンは、深刻なダメージを受け、または死に至ることさえある。そのときになって毒素を低減させても遅すぎる。新しいアプローチは、疾患の症状に直接関連する病態生理学を研究することである（Luら、2013a）。これまで、シナプスの損失は、神経変性疾患において共通する主要な病態生理学的特徴であり、脳の認知機能のダメージを引き起こし、その一方でニューロンは次第に致死し、それにより、より重篤な認知能力の損失に加えて他の状態も生じる。疾患の生理学的プロセスにおける前者は、可逆的であるため、治療が簡単である。したがって、シナプス修復は、アルツハイマー病の治療を研究するための最も現実的な入り口の１つである（Shengら、2012）。
【０１４３】
[00165]生物それ自身は、主に脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦによってシナプシスを保護し、シナプスのダメージを修復する。遺伝子の異常または異常な発現は、早発性のアルツハイマー病の機会を増加させ、疾患の発生を促進する可能性がある（Luら、2013a）。神経の発達におけるニューロトロフィンファミリーの最も重要なメンバーとして、ＢＤＮＦは、ニューロンの生存、神経の可塑性および他の重要な機能において非常に重要な役割を果たす。その主要な機能は、高親和性受容体ＴｒｋＢによって媒介される（ChaoおよびLee Huang、2004；Reichardt、2001；Poo、2001）。ＢＤＮＦ遺伝子の共通のバリアント（単一ヌクレオチド多形、ＳＮＰ）である６６位におけるＶａｌからＭｅｔへのアミノ酸変化（Eganら、2003）は、突然変異保因者の海馬および扁桃核を小さくし、シナリオ記憶および視空間記憶など様々な種類の記憶のレベルを下げる。これらの症状とより低いＢＤＮＦレベルは、アルツハイマー病を有するモデルマウスおよび患者において同時に検出することができ、これは、アルツハイマー病研究におけるＢＤＮＦに関する調査が特に必要であることを示す（Dennisら、Sanchezら、2011；al．、2011；Voineskosら、Yangら、2011；al．、2012）。アルツハイマー病を有するげっ歯類および霊長類モデルにおいて、ウイルスの使用におけるＢＤＮＦの過剰発現は、ニューロンの死を阻害することができる（Nagaharaら、2009）。より重要なことに、最後の数年の調査において、本発明者らは、ＢＤＮＦＭｅｔ６６遺伝子型の保因者であるＡｐｏＥ４陽性の健康なヒトおよび患者（欧州人）において、脳の側頭葉および前頭前皮質におけるより高いレベルのベータプラークが生産され凝集すると予想されることを見出した（上記を参照）。同時に、海馬の体積とエピソード記憶能力が、より速く低下する。これは、ＢＤＮＦが、アルツハイマー病の修復および治療にとって非常に重要であることを示す。したがって、ＢＤＮＦは、非常に有望な治療標的である（Luら、2013a；NagaharaおよびTuszynski、2011）。本発明の開示は、本明細書において、アルツハイマー病および他の認知症を予防する、治療する、緩和する、その発病を遅らせる、またはそれに進行するリスクを低減すること、例えば認知機能衰退の進行を遅延させることにおいて、ＢＤＮＦと同様に、またはそれより効果的に機能するＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、細胞生存を強化する、軸索突起の伸長を促進する、および／またはシナプス可塑性を調節することができる。
【０１４４】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
[00166]筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、最も一般的なタイプの運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）であり、上位および下位運動ニューロンの両方が影響を受ける（WijesekeraおよびLeigh、2009）。病理学的に言えば、ＡＬＳ患者は、脊髄前角、脳幹および運動皮質における運動ニューロン数の減少を示す。運動ニューロンの損失は、筋肉の除神経および萎縮を引き起こす。患者は、筋力低下および嚥下困難を含む運動機能の進行性消失を特徴とし、最終的に呼吸不全で死亡する（Boilleeら、2006；MitchellおよびBorasio、2007）。ＡＬＳのケースの大半は散在性であり、５〜１０％は家族性のケースである。ＳＯＤ１は、最初に同定されたＡＬＳ関連の遺伝子であり、その突然変異が、２０％もの家族性のケースの原因となっている（Rosen、1993）。これまで、２０種を超える遺伝子が、突然変異すると家族性ＡＬＳの原因を引き起こすことが見出されており、遺伝子の突然変異は、散在性のケースでも確認されている（Couthouisら、2011；WijesekeraおよびLeigh、2009）。遺伝学的な不均質性はあるが、罹患した領域におけるタンパク質沈着は、ＡＬＳに共通する一般的特徴である。
【０１４５】
[00167]現在のところＡＬＳの治療法はないが、グルタミン酸放出阻害剤であるリルゾールが、生存を数ヶ月改善することにおいて中程度の作用を示す（Carlesiら、2011；Millerら、2007）。長期にわたり調査がなされているが、ＡＬＳの発症メカニズムにおける共通見解は未だなく、それが有効な療法の開発を阻んでいる。運動ニューロンの死をもたらす病原性プロセスを特異的にブロックするというより、固有のニューロトロフィン経路を活性化することを介して運動ニューロンの生存を促進するという代替戦略が試みられている（Luら、2013）。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、トロポミオシン関連キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）と高親和性で結合し、それらの下流経路は細胞生存と軸索成長を促進する（HuangおよびReichardt、2003；Reichardt、2006）。病的な状態における異常なＢＤＮＦ−ＴｒｋＢシグナル伝達を示す証拠が存在する。初期の報告は、ＡＬＳ患者の脊髄において、ＴｒｋＢのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは対照より高かったが、ＴｒｋＢタンパク質はそれほどリン酸化されていないことを示す（Mutohら、2000）。またＢＤＮＦのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、ＡＬＳ患者の筋肉における上昇も示した（Kustら、2002）。また肉腫（ＦＵＳ）遺伝子内に融合した突然変異も、ＡＬＳを引き起こす（Kwiatkowskiら、2009；Vanceら、2009）。近年、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳは、ＢＤＮＦの発現およびオルタナティブスプライシングの調節への関与が示されており（Lagier-Tourenneら、2012；Qiuら、2014）、これは、疾患を引き起こす突然変異と機能が低下したニューロトロフィンシグナル伝達とが相関することを示唆している。突然変異ＦＵＳを発現するマウスでは、ＢＤＮＦのｍＲＮＡ前駆体のスプライシングが損なわれ、ＢＤＮＦタンパク質およびＴｒｋＢリン酸化のレベルが減少した（Qiuら、2014）。
【０１４６】
[00168]神経疾患および精神病性の疾患を治療するためのＢＤＮＦおよび関連分子を開発する多くの努力がなされてきた。ＢＤＮＦの作用は、いくつかの神経変性疾患で検査されてきた（Baiら、2010；Gharamiら、2008；NagaharaおよびTuszynski、2011；Luら、2013）。ＢＤＮＦのトランスジェニックまたはウイルス発現は、神経変性疾患モデルにプラスの効果を有するようであるが、その低い薬物動態学的および物理的な特徴のために単純なＢＤＮＦ投与ではそうならない（Gharamiら、2008；Xieら、2010；Thoenenら、2002）。本発明の開示は、神経変性疾患の創薬のためだけでなく、ＴｒｋＢのシグナル伝達および構造に関する将来性のある科学的な調査のためにも、いくつかのＴｒｋＢアゴニストモノクローナル抗体を製造し選別するシステムを確立することである。
【０１４７】
[00169]ＢＤＮＦ−ＴｒｋＢシグナル伝達の活性化は、動物モデルの脊髄傷害を治療することにおいて有効であることが証明されている（Granseeら、2013；Kishinoら、1997；Mantillaら、2013）。しかしながら、ＡＬＳのげっ歯類モデルにおいて、ＢＤＮＦの投与は、疾患進行を遅くすることができず、ＢＤＮＦは、臨床試験においてＡＬＳ患者に利益を与えることはできない（1999；Ochsら、2000）。これは、ＢＤＮＦの高い局所濃度をもたらし、最終的にＴｒｋＢ発現の減少を引き起こすＢＤＮＦの薬物動態および拡散性の停滞に起因する可能性がある（Dittrichら、1996；Knuselら、1997）。いくつかの低分子化合物が、ＴｒｋＢを刺激することを報告されており、もしかすると一部の神経変性疾患で使用できるようになる可能性がある（LongoおよびMassa、2013）。しかしながら、多少混乱した結果を報告する論文も一つある（Toddら、2014）。さらに、ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢ複合体の構造に応じてＢＤＮＦの二量体化作用を模擬する低分子化合物を発明することは、不可能であると考えられている。以前の報告は、特異的な抗体は、２つの単量体受容体を架橋し、天然リガンドを模擬することによって受容体チロシンキナーゼを活性化できることを示した（Claryら、1994；LeSauteurら、1996）。ＢＤＮＦと比較すれば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、より高い特異性、より長い半減期などの利点を有する。ＴｒｋＢアゴニストモノクローナル抗体は特にＴｒｋＢを活性化するが、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣを活性化しない。より重要なことに、ＴｒｋＢアゴニストＭａｂはｐ７５ＮＴＲと結合せず、したがってＢＤＮＦ−ｐ７５ＮＴＲによって誘発される可能性があるいかなる負の作用も誘導しない（Luら、2005）。本発明の開示は、本明細書において、ＡＬＳを予防する、治療する、緩和する、その発病を遅らせる、またはそれに進行するリスクを低減すること、例えば運動ニューロンの生存および機能を促進することにおいて、ＢＤＮＦと同様に、またはそれより効果的に機能するＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１４８】
緑内障
[00170]緑内障は、視神経乳頭（視神経円板）および視神経における病理学的変化を伴う神経変性性眼疾患であり、典型的には視野の損失およびＩＯＰ上昇を伴う（NICE、2009）。緑内障は、過去３０年にわたり世界的に失明の主な原因であってきた（DandonaおよびDandona、2006；Quigley、1996；QuigleyおよびBroman、2006）。英国における失明登録のおよそ１０％は、緑内障が原因である（Cassonら、2012；NICE、2009）。疫学分野では、緑内障患者人口は急速に増えつつあり（図２および表１）、社会が急速に高齢化し、情報化時代において眼精疲労の罹患率が増加している。中国における緑内障患者の総推定数は、２０２０年代には約２１８０万人に達すると予想され、これは中国の４０歳を超える全人口の３．０５％にあたり、世界平均の２．８６％を超えることになる。緑内障性によるＲＧＣおよび視神経のダメージは回復不能であるため、あらゆる種類の緑内障が、最終的に失明に至る可能性が極めて高い。しかしながら今日の中国における医療状況によれば、ほとんどの人は、健康保険がないために、早期段階の緑内障の状態で自身の目を検査するために病院に行くことはない。したがって、医療状況および緑内障の進行性失明に基づき、中国における緑内障患者の増加は、家族と社会に莫大な重荷を科すことになる。本発明者らの究極的な目的は、従来の臨床療法では緑内障の進行が回復不能であると考えられてきた後期段階の緑内障において、緑内障の進行性の失明の進行を遅くし回復させ、さらにダメージを受けたＲＧＣおよび軸索を再生するために、神経向性経路を標的化する有効な医薬または抗体を探索することである。
【０１４９】
[00171]１９３０年代、Barkanは初めて、緑内障を閉塞隅角緑内障と開放角緑内障とに分けた（Barkan、1938）。今日、緑内障の分類は複雑化しているように見えるが、２つの比較的単純な基準に基づいている。一方はＩＯＰ値であり、他方は、解剖学的な虹彩線維柱帯接触があるかどうかである（Cassonら、2012）。全ての種類の緑内障が同じ特徴、ＧＯＮを有し、これは、いくつかの目の臨床的方法、例えば神経網膜の縁の厚さを測定すること、網膜および視神経乳頭における異常をスキャンすること、および水平の幅を試験することによって検出および診断することができる（NICE、2009）。必ずしも全ての緑内障患者が上昇したＩＯＰに罹っているわけではないが（患者ＩＯＰの一部は早期段階で観察されないが）、全ての緑内障患者のＩＯＰを低くすることは、患者の視力にプラスの作用を有し、最終的な失明を遅らせ、ＲＧＣ損失を少なくする（Heijlら、2002；Leskeら、1999）。したがって、ＩＯＰの上昇は常に、多くの国において緑内障の早期段階またはその疑いの重要なマーカーとして認識されている。
【０１５０】
[00172]緑内障性の進行がＩＯＰの上昇を伴う理由は、現在あまり明らかになっていない。説得力のある仮説は、圧力によって誘発された軸索輸送閉塞であり（Johnsonら、2000）、それによれば、網膜およびＲＧＣの生存は、下流の脳領域から、例えば上丘（ＳＣ）、および外側膝状体核（ＬＧＮ）からのニューロトロフィンの逆行性輸送によって保護されると述べられている。いくつかの研究により、ＩＯＰの上昇が、視神経乳頭におけるＢＤＮＦおよびＮＴ４／５の分布の減少およびグリア増殖の増加を伴うことを確認する多数の免疫染色または同位体実験が示されている（Johnsonら、2000；Quigleyら、2000）。他にも、緑内障モデルにおいて、ＴｒｋＢの軸索輸送は閉塞している（Peaseら、2000b）。したがって、いくつかの研究で閉塞したニューロトロフィン輸送の仮説は、一部の免疫染色またはインサイチュハイブリダイゼーション実験に基づき十分有効ではないと述べてられいるにもかかわらず（Guoら、2009）、ニューロトロフィンの閉塞した逆行性輸送の救済は、緑内障を治すのに有望な方法とみなされる。
【０１５１】
[00173]以前の調査に基づいて、ＴｒｋＡ−ＮＧＦシグナル伝達（Shiら、2007；Sposatoら、2008）、ＴｒｋＢ−ＢＤＮＦシグナル伝達（Guoら、2009；Iwabeら、2007；Peaseら、2000a）、ＴｒｋＣおよびｐ７５シグナル伝達（Baiら、2010a）などの実験的な緑内障進行に関連するいくつかの神経分化誘導性経路が研究されている。他にも、近年、緑内障の進行中における小グリア細胞の機能的な変化が注目されてきた（Srinivasanら、2004）。いずれにしても、神経向性経路は、軸索再生およびＲＧＣ機能の回復を助ける緑内障療法における重要な突破口と予想され、その異常が、網膜、脳核、および領域の緑内障によるダメージに関連する、さらには全脳の機能的なシフトにも関連する主な理由として認識される（Frezzottiら、2014；Georgiouら、2010；Williamsら、2013）。本発明の開示は、ＲＧＣの生存および軸索突起の伸長に関する主要なシグナル伝達経路であるＴｒｋＢ−ＢＤＮＦシグナル伝達に焦点を当てるが（Guoら、2009；Iwabeら、2007；Peaseら、2000a）、他の因子もまた非常に重要である。このシグナル伝達経路は、比較的明確であり、小グリア細胞のような他の非ニューロン性細胞型と混同されない。以前の緑内障進行に関するニューロトロフィン輸送閉塞仮説に基づいて（Guoら、2009；Iwabeら、2007；Peaseら、2000a）、ＲＧＣ末端におけるＴｒｋＢのエンドサイトーシスは、ニューロン生存において役割を果たす。本発明の開示は、本明細書において、緑内障を予防する、治療する、緩和する、その発病を遅らせる、またはそれに進行するリスクを低減することにおいて、ＢＤＮＦと同様に、またはそれより効果的に機能するＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１５２】
卒中(Stroke)
[00174]卒中は、脳血管の破裂または凝固によって引き起こされる神経血管疾患である。これは世界的な健康問題であり、中国では第一の死因である。毎年、約２５０万人が卒中になり、１６０万より多くの人がこの疾患により死亡する。脳の毛細血管の高い密度のために、卒中は脳のあらゆる領域で起こる可能性があり、それにより様々な続発症が生じ、なかでも最も一般的なによく見られるのは片麻痺である。したがって、この疾患の治療に関する調査は、緊急の必要性がある。
【０１５３】
[00175]虚血性発作の主要なメカニズムとしては、ＡＴＰ依存性イオンチャンネルの失敗、カルシウムの過剰負荷、興奮毒性、フリーラジカル形成、アポトーシスおよび免疫応答が挙げられる。これらの相互作用する経路の複雑さのために、どちらかといえば長い治療時間枠で細胞生存を調節し神経形成を促進する標的、例えばＴｒｋＢは、有望な標的である可能性がある。
【０１５４】
[00176]卒中モデルにおいて、ＢＤＮＦが梗塞量と細胞死を効果的に低減させ、行動に関するアウトカムを改善することが報告されている。それとは逆に、ＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ経路の遮断は、疾患を悪化させる。細胞生存の調節の他にも、ＢＤＮＦは軸索成長も促進し、シナプスの機能を改善し、神経形成、分化および移動を促進する。これは、ＢＤＮＦが、治療時間枠を卒中後数日に延長できることを示す。本発明の開示は、本明細書において、卒中を予防する、治療する、緩和する、その発病を遅らせる、またはそれに進行するリスクを低減することにおいて、ＢＤＮＦと同様に、またはそれより効果的に機能するＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１５５】
使用方法
[00177]本発明の開示はさらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法を提供する。
【０１５６】
[00178]一部の実施態様において、本発明の開示は、対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療する方法であって、治療有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与することを含む、上記方法を提供する。特定の実施態様において、対象が、ＴｒｋＢアゴニストに応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている。特定の実施態様において、本発明の開示は、ＴｒｋＢに関連する状態を予防する、検出する、または診断する方法であって、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを、ＴｒｋＢに関連する状態を有する疑いがある、またはそれを有するもしくはそのリスクがある対象から得られた生体サンプルと接触させること、および生体サンプル中の、ＴｒｋＢに結合するＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントのレベルを決定することを含む、上記方法を提供する。
【０１５７】
[00179]ＴｒｋＢに関連する状態の治療に関して、対象は、ＴｒｋＢ発現に関して陽性として試験されるか、またはＴｒｋＢ発現の上昇したレベルを有するとして試験される。個体からの試験生体サンプル中のＴｒｋＢの存在またはレベルを決定するために、様々な方法を使用することができる。例えば、試験生体サンプルを、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントに曝露させてもよく、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントは、発現されたＴｒｋＢタンパク質に結合して、それを検出する。代替として、ＴｒｋＢはまた、核酸発現レベルで、例えばｑＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、ＦＩＳＨなどの方法を使用して検出することもできる。一部の実施態様において、生体サンプルは、細胞または組織（例えば臓器から生検によって得られた組織）、腫瘍細胞、または体液（例えば血液または血清）から得られる。特定の実施態様において、試験生体サンプルにおけるＴｒｋＢの存在または上方調節されたレベルは、応答の可能性を示す。用語「上方調節された」は、本明細書で使用される場合、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを使用して検出する場合、同じ抗体を使用して検出された参照サンプル中のＴｒｋＢタンパク質レベルと比較して、試験サンプル中のＴｒｋＢのタンパク質レベルにおける、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上またはそれより大きい全体的な増加を指す。参照サンプルは、健康なまたは罹患していない個体から得られた対照サンプル、または試験サンプルを得たのと同じ個体から得られた健康なまたは罹患していないサンプル、または状態の治療中の初期のタイムポイントで同じ個体から得られたサンプルであってもよい。例えば、参照サンプルは、試験サンプルに隣接するかまたは試験サンプルの近傍にある罹患していないサンプルであってもよい。
【０１５８】
[00180]本明細書で開示される抗体または抗原結合フラグメントは、単独で投与されてもよいし、または１種またはそれより多くの追加の治療手段または治療剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本明細書で開示される抗体または抗原結合フラグメントは、第２の療法、例えば放射線療法、化学療法、標的療法、遺伝子治療、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケア、がん治療のための外科手術（例えば、腫瘍摘出）、１種またはそれより多くの制吐薬、もしくは化学療法により生じる合併症のための他の治療、またはＴｒｋＢによって媒介されるあらゆる医療上の障害の治療で使用するための第２の治療剤、例えば、別のニューロトロフィン、例えばＢＤＮＦ、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４／５、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、別の抗体、治療用ポリヌクレオチド、化学療法剤、抗血管形成剤、サイトカイン、他の細胞傷害性物質、増殖阻害剤と組み合わせて投与されてもよい。これらの実施態様のうち特定のものにおいて、１種またはそれより多くの追加の治療剤と組み合わせて投与される本明細書で開示される抗体または抗原結合フラグメントは、１種またはそれより多くの追加の治療剤と同時に投与してもよく、これらの実施態様のうち特定のものにおいて、抗体または抗原結合フラグメントおよび追加の治療剤は、同じ医薬組成物の一部として投与されてもよい。しかしながら、別の治療剤と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合フラグメントは、薬剤として同じ組成物と同時に、またはそのような組成物で投与されるべきではない。別の薬剤の前または後に投与される抗体または抗原結合フラグメントは、その薬剤と「組み合わせて」投与されるとみなされ、これは、本明細書においてそのような語句は、抗体または抗原結合フラグメントおよび第２の薬剤が異なる経路を介して投与されるとしても使用されるためである。可能性がある場合、本明細書で開示される抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせて投与される追加の治療剤は、追加の治療剤の製品情報シートに列挙されたスケジュールに従って、または医師用添付文書集２００３（医師用添付文書集、第57版；Medical Economics社；ISBN：1563634457；第57版（2002年11月））もしくは当業界において周知のプロトコールに従って投与される。
【０１５９】
[00181]一部の実施態様において、抗体およびその抗原結合フラグメントを使用する方法は、細胞のアポトーシスおよび／またはネクロトーシスを予防する、または細胞生存を強化する方法を包含する。一実施態様において、本方法は、本明細書で提供される抗体または医薬組成物を、ＴｒｋＢを発現する生体サンプルと接触させることを含む。
【０１６０】
[00182]一部の実施態様において、抗体およびその抗原結合フラグメントを使用する方法は、対象におけるＴｒｋＢに関連する状態を治療する、またはそのリスクを低減するための細胞ベースの療法を包含する。一実施態様において、本方法は、細胞表面上で本明細書で提供される抗体を発現する細胞、または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１６１】
[00183]本明細書で提供される抗体を発現するように細胞を操作するための方法は、前述のセクションに記載されている。抗体を発現するように操作して細胞ベースの方法で使用できる好適な細胞は、移植や細胞療法に適合するあらゆる細胞であり得る。一部の好ましい実施態様において、細胞は、療法を受ける対象から得られる。一部の実施態様において、細胞は、対象由来の多能性細胞から得られる。一部の実施態様において、多能性細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳ）である。
【０１６２】
[00184]以下の実施例は、特許請求された発明をよりよく例示するために提供され、本発明の範囲の限定として解釈されないものとする。後述される全ての具体的な組成物、材料、および方法は、全体として、または部分的に、本発明の範囲内に含まれる。これらの具体的な組成物、材料、および方法は、本発明を限定するのではなく、単に本発明の範囲内に含まれる具体的な実施態様を例示することを意図する。当業者は、発明的な能力を要する作業を行うことなく、さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、均等な組成物、材料、および方法を開発することができる。本明細書において記載された手順において、本発明の範囲内にとどまりながらも多くの変更をなすことができることが理解されると予想される。このような変更が本発明の範囲内に包含されることが、発明者らの意図である。
【実施例】
【０１６３】
実施例１：材料および方法
[00185]１．ハイブリドーマ技術によるマウスモノクローナル抗体の生産
[00186]（１）抗原の調製
[00187]ＴｒｋＢ細胞外ドメインのコード配列をシグナルペプチドを含有するＰｆａｓｔｂａｃベクターにクローニングし、昆虫ｓｆ９細胞株を使用してタンパク質を精製した。異なるタグを有する２種のタンパク質：動物を免疫化するためのＴｒｋＢ−ＥＣＤ−ｈＦｃ、およびスクリーニング抗原として使用されるＴｒｋＢ−ＥＣＤ−Ｈｉｓを調製した。
【０１６４】
[00188]（２）動物の免疫化
[00189]抗原（組換えＴｒｋＢ−ＥＣＤ−ｈＦｃ）をＤＰＢＳ中で溶解し、これを使用して、全ての注射につき皮下経路を介して約６〜８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した。迅速な免疫化手順中、これらのマウスを約８回免疫化した。
【０１６５】
[00190]（３）リンパ球の単離
[00191]免疫化後、タイターＥＬＩＳＡ試験によって動物を収集のために選択した。簡単に言えば、免疫化されたマウスまたはナイーブマウスからの血清を、ＴｒｋＢ−ＥＣＤ−ｈｉｓタンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加した。各マウスのタイターを、４５０ｎｍでの光学密度から決定した。免疫化されたマウスを致死させ、リンパ節を収集した。このリンパ系細胞をＤＭＥＭ中に懸濁し、その後、骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４と融合させた。
【０１６６】
[00192]（４）細胞融合
[00193]リンパ系細胞を、ＰＥＧ（Ｐ７３０６、シグマ）の媒介によりＳｐ２／０−Ａｇ１４と融合した。次いで融合した細胞をＨＡＴ選択培地（２１０６０−０１７、ギブコ）中に懸濁した。ハイブリドーマは、無限増殖能力での選択培地に耐性を有し得るものであった。７日目または１０日目に、２分の１の培地を交換した。
【０１６７】
[00194]（５）ハイブリドーマのハイスループットスクリーニングおよびサブクローニング
[00195]選択培養の約１４日の後、ハイブリドーマ上清をＴｒｋＢ特異的なモノクローナル抗体に関してスクリーニングした。抗体の親和性を分析するのにＥＬＩＳＡを使用し、活性ＴｒｋＢアゴニストを選択するのにＮＦＡＴアッセイを使用した。陽性細胞プールの選択の後、サブクローニングを古典的な限界希釈によって行った。
【０１６８】
[00196]（６）モノクローナル抗体アイソタイプの同定およびハイブリドーマのシーケンシング
[00197]ＥＬＩＳＡキット（ＢＡＴ０２９６、シノ（Sino））を使用して、モノクローナル抗体のアイソタイプを同定した。５’ＲＡＣＥキット（カタログ番号６３４８５８および６３４８５９、クロンテック（Clontech））を用いてハイブリドーマのシーケンシングを実行した。
【０１６９】
[00198]２．イーストディスプレイによるウサギモノクローナル抗体の生産
[00199]抗原（組換えヒトＴｒｋＢ−ＥＣＤ）をＤＰＢＳ中に溶解し、これを使用して、全ての注射につき皮下経路を介して約６〜８週齢のウサギを免疫化した。免疫化後、タイターＥＬＩＳＡ試験によって動物をＢ細胞調製のために選択した。免疫化したウサギを致死させ、リンパ節を収集した。軽（Ｖ−Ｌ）および重（Ｖ−Ｈ）鎖の再配列された可変ドメインのコンビナトリアルクローニングによって、免疫化されたウサギのＢ細胞免疫グロブリンレパートリーを不死化し、これを酵母に導入し、酵母表面上に単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）として提示させた。ＦＡＣＳを用いたｓｃＦＶ抗体の親和性選択を行い、続いてそれらをＩｇＧ抗体の完全なテンプレートに再構成した。ＮＦＡＴアッセイを用いて、アゴニスト抗体に関するさらなるスクリーニングすることを行った。例示的なウサギモノクローナル抗体は、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３である。
【０１７０】
[00200]３．タンパク質の発現および精製
[00201]ヒトＴｒｋＢ遺伝子（受託番号Ｓ７６４７３．１）のＴｒｋＢ−ＥＣＤ４３０の遺伝子フラグメント（３０〜４３０のアミノ酸配列、すなわち全長細胞外ドメインに相当）およびＴｒｋＢ−ＥＣＤ３６５（３０〜３６５のアミノ酸配列、細胞外の膜近傍（ＥＪＭ）領域を含まない細胞外ドメインのＤ１〜Ｄ５に相当）を、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有するｐＦａｓｔＢａｃデュアルにクローニングした。上記のＴｒｋＢ−ＥＣＤ遺伝子を含有するバキュロウイルスを、インビトロジェン（Invitrogen）からのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを使用して生産した。ＳＦ９細胞に感染させた後、培養物をＭＳＦ１培地中で２７℃でインキュベートした。
【０１７１】
[00202]７２時間のインキュベーション後、培養物の上清を収集し、４℃、４，０００ｒｐｍで２０分遠心分離した。上清に超音波をかけて、細胞膜を破壊した。これをさらに高速で遠心分離し、上清をタンパク質精製に使用した。ニッケルカラム（７０５０１−５、Beaver）および分子篩をタンパク質精製に使用した。ニッケルカラムを１×ＴＢＳ緩衝液平衡化し、その後、標的タンパク質を含有する上清をローディングした。標的タンパク質をカラムに特異的に結合させながら、非特異的なタンパク質を緩衝液で洗浄して除いた。標的タンパク質を濃縮イミダゾール緩衝液で溶出させた。次いで溶離剤を分子篩上にローディングし、高分子量のタンパク質を低分子量タンパク質より早く溶出させた。本発明者らは、標的タンパク質精製にスーパーデックス（Superdex）２００（１７５１７５０１、ＧＥ）を適用した。
【０１７２】
[00203]４．ＮＦＡＴ
[00204]実験を、ＣＨＯ−ｈＴｒｋＢ  ＮＦＡＴキット（K１０９５、ライフテクノロジーズ（Life Technologies））によって提供されたプロトコールに従って行った。実験の前の日に、ＣＨＯ−ｈＴｒｋＢ細胞（Ｋ１４３５、ライフテクノロジーズ）を３８４−ウェルプレート中に３２μｌの培地と共にシーディングした。３７℃でのＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ処理の５時間後、培養物を８μｌ基質と共に室温で２時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（エンヴィジョン（Envision）、パーキンエルマー（PerkinElmer））を用いてシグナルを得た。
【０１７３】
[00205]５．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ
[00206]これまでに記載されたようにして細胞を溶解させた。白色の不透明なプレート中で、１０μｌのドナービーズ（６７６０６１７Ｍ、パーキンエルマー）および１０μｌのビオチン化抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体（ＢＡＦ３９７、Ｒ＆Ｄ）を各ウェルに添加し、薄明かりの下、３７℃で３０分インキュベートした。１０μｌの溶解産物、１０μｌの抗ＴｒｋＢ抗体（ａｂ５１１８７、アブカム（Abcam））および１０μｌのアクセプタービーズ（６７６０６１７Ｍ、パーキンエルマー）を調和のとれたウェルに添加し、薄明かりの下、３７℃で１時間インキュベートした。エンヴィジョン（パーキンエルマー）を用いてシグナルを測定し、その後分析した。
【０１７４】
[00207]６．Ｄｅｌｆｉａ
[00208]炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）中の抗ｐＴｒｋＢ抗体（４６２１Ｓ、ＣＳＴ）を、マイクロプレート−９６ウェル（１６３３２０、ヌンク（NUNC））にコーティングする。プレートを４℃で一晩インキュベートする。プレートを２回洗浄する。プレートをブロッキング緩衝液で３７℃で２時間ブロックする。次いでプレートをＰＢＳＴで２回洗浄する。
【０１７５】
[00209]検出：５０μｌ溶解産物を一次抗体でコーティングしたプレートに添加する。プレートを室温（ＲＴ）で２時間、ゆっくり振盪しながらインキュベートする。プレートに、溶解緩衝液（ＣＳＴ）中の５０μｌ／ウェルの４μｇ／ｍｌビオチンヤギ抗ＴｒｋＢ抗体（ＢＡＦ３９７、Ｒ＆Ｄ）を添加する。プレートを室温で１時間、ゆっくり振盪しながらインキュベートする。次いでプレートを３回洗浄する。洗浄緩衝液を徹底的に除去し、アッセイ緩衝液中の１００μｌ／ウェルの２００ｎｇ／ｍｌのＥｕ標識ストレプトアビジン（１２４４−３６０、パーキンエルマー）を添加する。溶液を室温で３０分、ゆっくり振盪しながらインキュベートする。次いでプレートを５回洗浄する。５０μｌ／ウェルの強化溶液を添加し、続いてゆっくり振盪しながら１０分インキュベートする。デフォルト化したＤＥＬＦＩＡプロトコールを用いてエンヴィジョンで検出する。
【０１７６】
[00210]７．ビアコア（ＳＰＲ）（ビアコアＴ２００、ＧＥ）
[00211]超音波をかけながらＰＢＳ中でＣＭ５チップを洗浄する。候補抗体および標的タンパク質の緩衝液を同じＰＢＳで置き換える。固相として標的タンパク質を１μｇ／μＬに希釈し、液相として候補抗体を７倍希釈まで連続希釈した。シグナルを得た後、ビアコア評価ソフトウェアを使用して、フィッティング曲線を作成した。カイ２＜Ｒｍａｘ／１０が、優れた信頼水準であることを示す。
【０１７７】
[00212]８．一次海馬ニューロンの培養および処理
[00213]ＨＢＳＳ中の胎児（Ｅ）１８日目ＳＤラットから皮質を分離し、次いでクモ膜を剥離し、解剖して海馬を消化培地（０．１２５％トリプシン、インビトロジェン、１５０５００６５）中に取り出した。３７℃で２０分消化した後、完全培地（１０％ＦＢＳおよびグルタマックス（GlutaMax、ギブコ）が補充されたＤＭＥＭ培地）によって反応を止めた。組織を混濁するまで穏やかに粉砕し、数分静置した。混濁した上清を別のチューブに移した。この工程を組織が見えなくなるまで繰り返した。懸濁液を混合し、血球計算器を使用して懸濁液中の細胞を計数した。１００ｎｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシンでコーティングした（シグマ、０３０Ｍ５０２１Ｖ）直径３．５ｃｍのプレート上でニューロンを、細胞１０００，０００個／ウェルでプレーティングした。４〜６時間インキュベートした後、完全培地を完全に吸引し、維持培地（Ｂ２７およびグルタマックス、ギブコが補充された神経細胞培養用培地）で交換した。維持培地を３日毎に半分維持培地に変えた。ニューロンを１０〜１４日間培養し、次いでＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ刺激のために加工した。
【０１７８】
[00214]９．細胞株の培養
[00215]全ての細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターでインキュベートした。ＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳ（１６００００４４、ライフテクノロジーズ）が補充されたＦＫ−１２Ｋ培地（２１１２７−０２２、ギブコ）中で培養した。５％ＦＢＳ、１０％ウマ血清（ＨＳ）が補充されたＰＣ１２細胞をＤＭＥＭ培地中で培養した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１５％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。一次ニューロンの完全培地は、１０％ＦＢＳおよび１％グルタマックス−Ｉ（３５０５００６１、ギブコ）が補充されたＤＭＥＭ培地であった。一次ニューロンの維持培地は、２％Ｂ−２７および１％グルタマックス−Ｉが補充されたＮｅｕｒｏＢａｓａｌ（１０８８８０２２、サーモフィッシャー・サイエンティフィック（Thermofisher Scientific））培地であった。全てのこれらの培地には、０．２％ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された。ＣＨＯ−ｈＴｒｋＢを、５μｇ／ｍＬブラスチシジン（Ｒ２１０−０１、インビトロジェン）が添加された培地中で培養した。細胞が継代したら、ＨＢＳＳを使用して培地を洗浄して取り除き、０．０５％ＥＤＴＡトリプシンを使用して細胞を消化した。次いで実験または維持のために細胞をプレート上でプレーティングした。
【０１７９】
[00216]１０．細胞のトランスフェクション
[00217]本発明者らは、リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００キット（１１６６８−０１９、インビトロジェン）を使用して細胞をトランスフェクトし、全ての操作は説明書に従った。細胞濃度は約９０％であった。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（３１９８５−０７０、インビトロジェン）を使用して、プラスミドおよびリポフェクトアミン２０００（１１６６８−０１９、インビトロジェン）をそれぞれ希釈し、次いで本発明者らは、希釈したプラスミドを希釈したリポフェクタミン２０００に穏やかに添加し、室温で３０分インキュベートした。最後に本発明者らは、混合物を細胞培地に添加し、穏やかに混合した。トランスフェクトされた細胞をインキュベーター中で２４時間インキュベートした。
【０１８０】
[00218]１１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
[00219]細胞を冷ＰＢＳによって３回洗浄し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．５％デオキシコレート、０．１％のＳＤＳ、およびプロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics））を含有する緩衝液中で氷上で３０分溶解させた。遠心分離して不溶性物質を除去した後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して溶解産物中のタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｐ（Immobilon-P）、ミリポア（Millipore））に移した。０．１％トウィーン（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理的食塩水中の５％ＢＳＡで膜をブロックし、ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡで希釈した抗体と共に穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、最初にＴＢＳＴで、次いでＴＢＳで洗浄し、スーパーシグナル・ウェスト・ピコ（SuperSignal West Pico）化学発光基質（３４０８０、ピアース（Pierce））を用いて展開した。
【０１８１】
[00220]１２．共免疫沈降反応
[00221]細胞を冷ＰＢＳによって３回洗浄し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．５％デオキシコレート、０．１％のＳＤＳ、およびプロテアーゼ阻害剤（４６９３１３２００１、ロシュ）（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含有する緩衝液中で氷上で２０分溶解させた。遠心分離して不溶性物質を除去した後、溶解産物中のタンパク質を、標的タンパク質と共に４℃で一晩インキュベートした。２０μｌのプロテインＡビーズ（ｓｃ−２００３、サンタクルース（Santacruz））を、タンパク質混合物に添加した。これらの混合物を４℃で４〜５時間インキュベートした後、本発明者らは、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄した。次いで上清を除去し、２０μｌのローディング緩衝液を沈着ビーズに添加した。タンパク質とカップリングしたビーズを変性させ、１０分の９５℃の過熱により脱カップリングさせた。
【０１８２】
[00222]１３．運動ニューロンの培養および細胞死アッセイ
[00223]Ｅ１３妊娠マウスを頸部脱臼によって安楽死させた。子宮から胎児を慎重に取り出し、氷冷したＨＢＳＳ中で維持する。断頭し、一対のピンセットで尾部を除去する。胎児の背側を上にして置く。外部の薄い皮膚の包皮を除去し、一対のピンセットで脊髄の中央溝を開く。単離された脊髄を新しい神経細胞培養用培地を含有する培養皿に移し、脊髄を背側を上にして置く。後根神経節（ＤＲＧ）と包皮する髄膜を取り出す。次いで単離された脊髄を小片に細断し、消化溶液（神経細胞培養用培地中のパパインおよびＤＮアーゼ）中で３７℃で２０分インキュベートする。消化溶液を遠沈して捨て、新鮮な神経細胞培養用培地中で細胞集合体を５ｍＬピペットで穏やかにすりつぶす。得られた懸濁液をまず室温、６００ｒｐｍで５分遠心分離して、死細胞片を除去した。次いで、Grahamによって公開されたプロトコールから改変したＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｄ１５５６、シグマ、米国）ベースの密度勾配遠心分離（Graham、2002）を使用して運動ニューロンを濃縮した。上清を捨て、ペレットをＨＢＳＳに再懸濁し、懸濁液を３ｍＬの１０．４％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐのクッション上に層状に重ね、４００×ｇで室温で２５分遠心分離した。運動ニューロンが濃縮されたトップ層を収集し、次いで１０ｍＬの神経細胞培養用培地を添加し、次いで１２００ｒｐｍで室温で１０分遠心分離して、細胞を収集した。最後に細胞ペレットを運動ニューロン完全培地（神経細胞培養用培地中、１０％ウマ血清、１×Ｂ２７、および１×グルタマックス）中に懸濁した。適切な数の細胞を、ＰＤＬおよびラミニンでコーティングした培養皿またはカバーガラス上にプレーティングした。細胞を培養皿の表面に付着させた後、培地を完全培地（神経栄養因子または抗体を含有する）で慎重に交換する。
【０１８３】
[00224]インサイチュ細胞死検出キット（１１６８４７９５９１０、ロシュ）を説明書に従って使用して、細胞死をアッセイした。簡単に言えば、細胞をＰＢＳ中の４％ＰＦＡで２０固定し、透過性し、次いでＴＵＮＥＬ反応溶液中でインキュベートした。ＣｈＡＴとフルオレセインで二重標識した細胞を、高含量スキャンおよび分析システムを使用してスコア付けした。
【０１８４】
[00225]１４．免疫細胞化学
[00226]コリン作用性の運動ニューロンは、他の脊髄細胞とは異なり、コリンアシルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の高発現レベルによって同定することができる（CamuおよびHenderson、1992）。細胞をＰＢＳ中のＰＦＡの４％溶液で２０分固定し、免疫染色を、ヤギ抗ＣｈＡＴ抗体（ＡＢ１４３、メルクミリポア（Merk Millipore）、米国）を用いた標準的なプロトコールに従って行った。免疫標識された細胞のパーセンテージを決定することによって培養物の純度を評価した。通常。ニューロンのクラスＩＩＩｂ−チューブリンに対する抗体（ＡＴ−８０９、Beyotime Biotechnology、中国）で細胞を免疫標識した後、軸索突起の数および長さを決定した。高含量スキャンおよび分析システム（ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ７００、サーモ、米国）、それに続き以下のニューロンプロファイルＶ４プロトコールを使用して、軸索突起の長さを測定した。
【０１８５】
[00227]１５．イムノパニングによるマウスＲＧＣの精製および培養
[00228]出生後７日のマウス網膜を、４℃、ＤＰＢＳ（ギブコ、１４０４０−２１６）中で解剖した。１０μＬの１ＭのＮａＯＨによってｐＨを７．４に調整したパパイン（ワージントンバイオケミカル（Worthington Biochemical）ＬＳ００３１２６）溶液（１０ｍＬのＤＰＢＳ中のパパイン５０μＬ、ＤＮアーゼ０．４％、Ｌ−システイン（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）Ｃ７４７７）中、３７℃で網膜を消化する。パパイン溶液を除去し、細胞を低ｏｖｏ溶液および高ｏｖｏ溶液中に別々に再懸濁し、その後、１０００ｒ／分、２５℃で１２分遠心分離した。低および高ｏｖｏの１０×ストックは、３ｇのＢＳＡ（シグマ−アルドリッチＡ８８０６）＋３ｇトリプシン阻害剤（ワージントンＬＳ００３０８６）または６ｇのＢＳＡ＋６ｇのトリプシン阻害剤を２００ｍｌのＤＰＢＳ中に溶解させ、ｐＨを７．４に調整することによって調製される。
【０１８６】
[00229]細胞をパニング緩衝液（１８ｍＬのＤ−ＰＢＳ、２ｍＬの０．２％のＢＳＡ、および５７μＬのインスリン（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｐ３３７６）中に再懸濁し、ＢＳＬ−１溶液（ＢＳＬ−１（ベクターラボ（Vector Labs）Ｌ−１１００）２０μＬのＢＳＬ−１および２０ｍＬのＤ−ＰＢＳ）でコーティングした陰性パニングプレート中でパニングを４℃で一晩実行する。１５分毎に穏やかに３０分振盪した後、非結合細胞を収集する。同じ方法で、１０分間、またはＲＧＣがプレートに連結されたように見えるまで、二次陰性パニングを続ける。収集した細胞懸濁液は、４℃で二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）１１５−００５−０４４）（１：２５０）でコーティングされ、一次抗体マウス抗マウスＴｈｙ１．２（ＣＤ９０）ＩｇＭ（セロテック（Serotec）ＭＣＡ０２Ｒ）（１：１０００）でコーティングされた陽性パニングプレートに通過させ、その後および前にプレートをＤＰＢＳで３回濯ぐ。
【０１８７】
[00230]細胞インキュベーター中で３７℃で４分パニングした後、１００μＬのトリプシンストックを４ｍＬの温めたＥＢＳＳに添加する。細胞を２０ｍＬの万能チューブに移し、４ｍｌのＦＢＳ溶液（ＤＰＢＳ中の３０％ＦＢＳ）を添加してトリプシン処理を止める。細胞を１０００ｒ／分、２５℃で１２分間遠心分離し、ＲＧＣ成長培地中に細胞を再懸濁する。それぞれ１００μＬの細胞懸濁液を含む９６ウェルのプレート中でプレーティングする。９６ウェルのプレートを、３７℃のインキュベーターで一晩、それぞれ１００μＬ／ウェルのマウスラミニン溶液（１０μＬのラミニンストックを５ｍＬの神経細胞培養用培地に添加することによる、ラミニン（１ｍｇ／ｍＬ）から５０μｇ／ｍＬの最終濃度）およびＰＤＬ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；１００×）でコーティングする。
【０１８８】
[00231]１６．ＲＧＣ培養によるニューロン生存アッセイ
[00232]ＲＧＣ生存率は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（サーモ、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ７００）によってＤＩＶ７初代培養物で実行される。ＤＩＶ７初代培養物をＰＦＡ（４％）によって固定し、ＤＡＰＩ、Ｂｒｎ３ａ、およびＴｕｊ−１によって免疫染色する。生存ＲＧＣは、ニューロンの形態によって認識することができる。パニング後、９６ウェルプレートの各ウェルに約３０，０００個のＲＧＣをプレーティングし、１日おきに細胞にフィードして培地の半分の体積を新しくし、５つのウェルで平行して、１ｎＭのＢＤＮＦ、１ｎＭのＣＮＴＦ、５μＭのフォルスコリンまたはこれらの基質混合物を含む異なる薬物で処理する。
【０１８９】
[00233]１７．脊髄神経根剥離傷害
[00234]この研究に、成体雌スプラギーダーレー（ＳＤ：Sprague Dawley）ラット（２５０〜３００ｇの体重、７０〜９０日齢）を使用した。ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹膜内注射することによって動物を麻酔した。右背骨の区域から第５〜第７頸椎（Ｃ５〜Ｃ７）を露出させた。Ｃ６層上で背側の椎弓切除術を実行して、Ｃ７後根を露出させた。硬膜を開いた後、細いガラスフックを使用して右側Ｃ７根（背根と腹根の両方）を剥離させた。別の切開を遠位Ｃ７脊髄神経で行い、剥離させたＣ７背根および腹根を、脊髄神経の小さい断片と共に除去した。即座に、傷害を受けた脊髄表面上に、５μｇのＢＤＮＦ、５μｇのＴｒｋＢアゴニストまたは同体積のＰＢＳに浸漬したゲルフォームを穏やかに置いた。その後、ゲルフォームと同じ溶液で充填された浸透圧ミニポンプを皮下の傷害部位の近傍に埋め込んだ。ポンプをチューブと接続し、放出された薬物はチューブにより傷害を受けた脊髄表面に導かれた。グループ分けおよびサンプルサイズを以下に示す。
【０１９０】
[00235]１）疑似（Ｎ＝７）：
剥離なし＋ゲルフォーム（５μｌのＰＢＳを含む）＋ポンプ（１２μｌ／日のＰＢＳの放出）、
２）ＰＢＳで処理した陰性対照（Ｎ＝７）：
Ｃ７剥離＋ゲルフォーム（５μｌのＰＢＳを含む）＋ポンプ（１２μｌ／日のＰＢＳの放出）、
３）ＢＤＮＦで処理した陽性対照（Ｎ＝８）：
Ｃ７剥離＋ゲルフォーム（５μｇのＢＤＮＦを含む）＋ポンプ（１日当たり１μｇ、１２μｌのＢＤＮＦの放出）、
４）ＴｒｋＢアゴニスト（低濃度）（Ｎ＝８）：
Ｃ７剥離＋ゲルフォーム（５μｇのＴｒｋＢアゴニストを含む）＋ポンプ（１日当たり１μｇ、１２μｌのＴｒｋＢアゴニストの放出）、
５）ＴｒｋＢアゴニスト（高濃度）（Ｎ＝８）：
Ｃ７剥離＋ゲルフォーム（５μｇのＴｒｋＢアゴニストを含む）＋ポンプ（１日当たり６μｇ、１２μｌのＴｒｋＢアゴニストの放出）。
【０１９１】
[00236]腹側脊髄Ｃ６〜Ｃ８の灌流および断片化を２０μｍの厚さで実行した。４つ毎の腹側脊髄の節にニッスル染色を適用した。明確な核と３０μｍを超える細胞直径を有するものだけを運動ニューロンとして計数した。
【０１９２】
[00237]１８．常磁性ビーズ、緑内障マウスモデル
[00238]常磁性ビーズ（２０１６００００−１、ｂｉｏＷＯＲＬＤ）の眼球内注射の前に、ＲＧＣは、蛍光マーカーによって標識されることになる。本発明者らは、上丘における両側の脳の定位的注入による逆行性の標識付けのために、４％フルオロゴールド（ＡＢ１５３、メルクミリポア）溶液を選択する。部位の配置は、ブレグマの６．０ｍｍ後方、横方向に１．０ｍｍ、深さ４．５ｍｍであり、それぞれの側に３３Ｇのスチール製針で１μＬが与えられる。外科手術後、マウスは、眼球内注射の前にホームケージ中で２週間安静にさせると予想される。本発明者らは、常磁性ビーズの眼球内注射を実行するのに３０ゲージの針を使用する（Samselら、2011）。２分未満で、本発明者らは、針を使用して、レンズを傷つけないように、４５°の角度、ガラス体の深さ２ｍｍで角膜輪部の後ろの角膜に穴をあけた。２０μＬの常磁性ビーズを片側の目の前房に注射し、およそ０．３〜０．６ｍｇのビーズを送達する。常磁性ビーズは、磁石によって前角にガイドされると予想される。他方の側の目には２０μＬの生理的食塩水を注射して、陰性対照を作製する。
【０１９３】
実施例２：モノクローナルＴｒｋＢアゴニスト抗体の生成およびスクリーニング
[00239]モノクローナルＴｒｋＢ抗体をハイブリドーマ技術によって生成した。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）生産の第１の工程は、抗原で動物免疫系を刺激することである。これは、マウスにおけるＴｒｋＢ−ＥＣＤ（細胞外ドメイン）の抗原（配列番号１を参照）を用いた迅速な免疫化プロトコール（方法に記載されている）を使用してなされた。免疫化されたマウスからのリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマクローンを作製した。ハイブリドーマ上清を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてＴｒｋＢ特異的なモノクローナル抗体に関してスクリーニングし、次いでＮＦＡＴアッセイを用いてアゴニスト抗体に関してスクリーニングした。ＴｒｋＢを活性化する作用を有する培養上清を決定した後、クローンをモノクローナル細胞株にサブクローニングした。最後に、ＥＬＩＳＡおよびＮＦＡＴアッセイを用いて、全てのサブクローンを、陽性のものに関して再度スクリーニングした。十分な量の抗体の生産のために、これらの望ましい安定なクローンを大量に増殖させた。抗体の精製後、これらの精製した抗体のアイソタイプを以下の表１で同定した。
【０１９４】
【表１】
2020513806.tif 000003
【０１９５】
実施例３：抗体の特徴付け−生化学
[00241]３．１  特異性
[00242]ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＴｒｋＢに特異的に結合することができるが、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣまたはＰ７５に結合しない。図１Ａ〜１Ｆに、例示的な抗体ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８のデータを示す。プレートの各ウェル上に５０μＬの１ｇ／ｍｌタンパク質をコーティングし、５０μＬの１０ｎＭ、１ｎＭまたは０．１ｎＭ抗体を添加して、ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。
【０１９６】
[00243]３．２  親和性
[00244]ビアコアを使用して、抗原−抗体相互作用の親和性を分析した。以下の表２にデータを示す。
【０１９７】
【表２】
2020513806.tif 000004
【０１９８】
[00246]３．３  抗原エピトープ同定
[00247]５つの細胞外ドメインが短縮化されたＴｒｋＢコンストラクトを図２Ａで示されるように設計し、それぞれの発現のために２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。溶解産物を収集した。免疫沈降を使用して、ＧＦＰとコンジュゲートした短縮化されたＴｒｋＢに結合するできない抗体を試験した（図２Ｂを参照）。結果から、Ｄ１およびＤ２ドメインは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２のＴｒｋＢへの抗体結合に必要な可能性があることが示唆された。その他のもの、例えばＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ４１８抗体は、Ｄ５ドメインに結合することができる。Δ１は、Ｄ１ドメイン（Ｃｙｓ１で表される）を欠失しており、Δ２は、Ｄ１およびＤ２（ＬＡＭで表される）ドメインを欠失しており、Δ３は、Ｄ１〜Ｄ３（Ｃｙｓ２で表される）ドメインを欠失しており、Δ４は、Ｄ１〜Ｄ４（Ｉｇ１で表される）ドメインを欠失しており、Δ５は、Ｄ１〜Ｄ５（Ｉｇ２で表される）ドメインを欠失している。「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、「Ｃ」は、対照（ブランク、空のベクター）を表す。ＦＬは、全長遺伝子（ＷＴ）を表す。表３に、本明細書で提供されるＴｒｋＢアゴニスト抗体に関するＴｒｋＢの標的結合ドメインを示す。
【０１９９】
【表３】
2020513806.tif 000005
【０２００】
[00249]抗体とＢＤＮＦとの競合の程度を評価するためのＡｌｐｈａｌｉｓａの実験において、飽和ＢＤＮＦ溶液（１０ｎＭ）を０．０１から１００ｎＭに希釈した一連の抗体溶液と共に使用して、ＴｒｋＢで安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＴｒｋＢ−ＣＨＯ細胞）を処理した。抗体がＴｒｋＢに競合的に結合する場合、高濃度（例えば１０〜１００ｎＭ）の抗体と共に１０ｎＭのＢＤＮＦにより誘導された活性化は、１０ｎＭのＢＤＮＦ単独により誘導された作用ほど強くない可能性があり（競合作用）、これは、ＢＤＮＦは通常、ＴｒｋＢを活性化することにおいて抗体より有効であるためである。しかしながら、ＢＤＮＦプラス抗体がＢＤＮＦ単独より強いＴｒｋＢ活性化を誘導できる場合、その抗体は、相加効果または相乗作用を示す。ここで本発明者らは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３がこの特徴を呈示することを見出した（図３を参照）。
【０２０１】
[00250]３．４  ＴｒｋＢ活性化−Ｔｒｙ５１５リン酸化
[00251]ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢ細胞内ドメインのチロシン残基をリン酸化するＴｒｋＢのチロシンキナーゼを活性化することができる。シグナル伝達経路を誘導することができる最も重要な部位がＴｒｙ５１５部位であるという理由で、本発明者らは、リン酸化の強度を定量することができるＡｌｐｈａｌｉｓａ方法によって、ＴｒｋＢ活性化を示すＴｒｙ５１５リン酸化レベルを試験する。本発明者らは、ヒトＴｒｋＢでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ｈＴｒｋＢ−ＣＨＯ細胞）を、異なる濃度のＢＤＮＦまたはＴｒｋＢアゴニスト抗体で３０分処理し、タンパク質サンプル収集して、ＴｒｋＢリン酸化レベルを試験した。これらの結果に従って、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢアゴニスト抗体の用量曲線を計算した。図４および表４に、試験した抗体を示す。
【０２０２】
【表４】
2020513806.tif 000006
【０２０３】
[00253]用量曲線に従って（図４を参照）、５０％有効濃度（ＥＣ５０）を計算し（表４を参照）、次いで本発明者らは、ＥＣ５０値によって決定した濃度で細胞を処理した。処理した細胞から、タンパク質サンプルを異なるタイムポイントで収集して、Ａｌｐｈａｌｉｓａ方法を使用してリン酸化を測定し、時間経過曲線を計算した（図５を参照）。次いで本発明者らは、時間経過曲線を用いてインビトロでの半減期（Ｔ１／２）を計算した（表５を参照）。
【０２０４】
【表５】
2020513806.tif 000007
【０２０５】
[00255]３．５  ＴｒｋＢアゴニスト抗体シグナル伝達経路活性化
[00256]ＴｒｋＢは、細胞内チロシン残基のリン酸化によって活性化され、ＴｒｋＢ活性化は、キナーゼシグナル伝達経路ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＰＬＣγを誘導する。Ｅｒｋ４２／４４、Ａｋｔ、およびＰＬＣγのリン酸化レベルは、それぞれこれらの３つのシグナル伝達経路の活性化を示すことができる。ｈＴｒｋＢ−ＣＨＯ細胞密度が６０〜７０％に達したら、本発明者らは、細胞をＢＤＮＦ（１ｎＭ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ３０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０３、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２、図６Ａ〜６Ｅを参照）で処理し、２４時間以内に異なる時間でサンプルを収集した。ＴｒｋＢ（Ｔｙｒ５１５）、Ｅｒｋ４４／４２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびＰＬＣγ（Ｔｙｒ７８３）のリン酸化レベルをウェスタンブロットによって試験した。ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ１０４も、ＢＤＮＦとしてＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化できるという結果が示された（図６を参照）。
【０２０６】
実施例４：抗体の特徴付け−細胞生物学
[00257]４．１  細胞生存実験
[00258]４．１．１  ＰＣ１２細胞
[00259]ヒトＴｒｋＢを発現するＰＣ１２細胞株を使用して、細胞生存アッセイを実行した。ヒトＴｒｋＢ−ＰＣ１２細胞を９６ウェルのプレート中に１日かけてシーディングし、次いで培地を、ＰＣ１２細胞死を誘導できる血清非含有培地に交換した。ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２は、飢餓細胞の死から細胞を保護する可能性がある。カスパーゼ３−基質キット（プロメガ（Promega）、Ｇ７５７３）およびセロミクスアレイスキャンを使用して、細胞生存の質を定量した。
【０２０７】
[00260]４．１．２  海馬ニューロン
[00261]周知のニューロン毒素としてＡβ（２５〜３５）を使用して、培養したラット海馬ニューロンを処理して、ＡＤ細胞モデルを確立した。以前の研究によれば、Ａβ（２５〜３５）は、インビボまたはインビトロの実験のいずれかで細胞毒素としてＡβ（１〜４２）を模擬でき、それゆえに本発明者らは、Ａβ（２５〜３５）（ＧＬバイオケム（GL Biochem））を、培養ラット海馬ニューロンを処理して、インビトロでのＡＤ細胞モデルを確立するのに使用して、ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂのニューロンを保護する機能を試験した。本発明者らは、ニューロンを異なる濃度のＡβ（２５〜３５）で４８時間処理し、生きた細胞の数を示すＡＴＰレベルを試験するためにセルタイター−Ｇｌｏキット使用した。５〜４０μＭのＡβ（２５〜３５）で処理した細胞のＡＴＰレベルが、対照（Ａβ（２５〜３５）で処理されていない海馬ニューロン）に対して約６０〜７０％であるという結果が示された（図７Ａ）。次いで本発明者らは、Ａβ（２５〜３５）を５μＭの毒性濃度で使用した。これは、この細胞死のパーセンテージで救済作用がより優れていると予想されたためである。
【０２０８】
[00262]この細胞生存実験において、Ｅ１８ラット海馬ニューロンをインビトロで８日間培養した後、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ９０１）を添加して３０分前処理し、次いで５ＭのＡβ（２５〜３５）を培地に添加し、ニューロンをさらに４８時間培養した。セルタイター−Ｇｌｏキットを使用して、細胞生存レベルを試験した。ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂまたはＢＤＮＦのいずれかが、ＥＣ５０で海馬ニューロンを有意に保護することができる（図７Ｂを参照）。＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２０９】
[00263]４．１．３  運動ニューロン
[00264]運動ニューロンに対するＴｒｋＢ抗体アゴニストの作用を調査するために、インビトロのモデルを確立した。１３日齢の胎児マウスから運動ニューロンを単離し、インビトロで培養した。血清枯渇は、インビトロにおいて運動ニューロンの死を引き起こすこと報告されている（Wieseら、2010）。運動ニューロンを３日間培養し（ＤＩＶ３）、次いで培地（方法を参照）を血清（ウマ血清、ＨＳ）非含有培地で交換した。１６または２４時間後の残存する細胞の数およびアポトーシス細胞のパーセンテージによって細胞生存率を推測した。アポトーシスを、トランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって決定した。以前の報告と一致して、血清枯渇は、驚くべき細胞損失とアポトーシス上昇をもたらした（図８Ａ〜８Ｃを参照）。細胞の核（Ｎｕ）をＤＡＰＩで染色した。血清枯渇なしで培養した対照と比較して、血清枯渇グループ中でより多くのＴＵＮＥＬ標識細胞が検出され、一方でＢＤＮＦ処理は、アポトーシス細胞のパーセンテージを有意に低減させた。本発明者らは、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０２およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２につき２種のアゴニスト抗体を試験した。両方のアゴニスト抗体が、アポトーシスの低減によって実証された通り、ニューロンの保護的作用を示した（図８Ｃを参照）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１０】
[00265]４．１．４  網膜神経節細胞
[00266]イムノパニング方法を使用して出生後の７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスから網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を調製した。純度９０％を有するＲＧＣを得た。ＲＧＣは、神経栄養因子がないと致死すると予想され、それゆえに細胞生存アッセイを、ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢアゴニスト抗体を添加することによって実行した。選択された抗体ＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂ１０２およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２の機能を同定するために、本発明者らは、機能的な分析のためにＲＧＣ生存アッセイを事前に行った（図９を参照）。ＲＧＣを、１ｎＭのＢＮＤＦ（ｎ＝６）、０．５ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２（ｎ＝６）および３０ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１（ｎ＝６）；ゼロ対照としてＤＰＢＳ（ｎ＝９）および陰性対照としてＫ２５２ａ（ｎ＝６）によって１日おきに別々に処理する。０．５ｎＭのＴｒｋＢ−Ａｇｏ２０２または３０ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１０１での処理は、生存率を増加させた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１１】
[00267]４．２  軸索突起の生長
[00268]４．２．１  ＰＣ１２細胞
[00269]ヒトＴｒｋＢ発現ＰＣ１２細胞株を使用して、軸索突起生長アッセイを実行する。ＰＣ１２細胞は、標準状態で軸索突起を有さないが、軸索突起は、ＰＣ１２細胞がＮＧＦによって刺激されると出現する。ヒトＴｒｋＢ−ＰＣ１２細胞は、ＢＤＮＦ刺激の後、同じ作用を有する。ヒトＴｒｋＢ−ＰＣ１２細胞を１日かけて９６ウェルプレートにシーディングし、次いで培地を、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂを添加した１％ウマ血清培地に交換する。７２時間の処理後、細胞をセロミクスアレイスキャンによって試験して、細胞の軸索突起を定量する。
【０２１２】
[00270]４．２．２  海馬ニューロン
Ｅ１８ラット海馬ニューロンをインビトロで２日間培養した後、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ＡｇｏＡｂをニューロンに添加し、さらに４８時間培養した。蛍光顕微鏡を使用する形態測定分析のために、本発明者らは培養物を固定し、ＭＡＰ２に対する抗体（ミリポア、ＭＡＢ３４１８）でニューロンを免疫染色した。軸索成長を、２つのパラメーター：総軸索突起長さおよび分岐点の数によって定量化した。ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂはどちらも、軸索突起の全長および分岐点数を増加させることができる（図１７Ａおよび１７Ｂ）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１３】
実施例５：抗体の特徴付け−動物モデル
[00271]５．１  ＡＬＳ動物モデル
[00272]脊髄神経根剥離傷害を使用して、ＡＬＳの運動ニューロン傷害を模擬した。本発明者らは、ＢＤＮＦシグナル伝達を回復させるためにＢＤＮＦおよびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２を利用した。剥離から２週間後、ＰＢＳで処理した動物では傷害を受けた運動ニューロンのわずか３０．７％が生きたままであったが、ＢＤＮＦ処理は、それらの７７．２％が生存可能であった。ＢＤＮＦと同様に、ＴｒｋＢアゴニストの低（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２（Ｌ））および高（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２（Ｈ））用量（方法を参照）の両方が、傷害のある運動ニューロンを救済することにおいて高い効率を実証し、それらの生存はそれぞれ７６．２％および８０．９％であった（図１０Ｆを参照）。加えて、ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢ−Ａで処理した運動ニューロンでは、ニッスル染色によって、大きい核、暗く染色された粗面小胞体および大きい細胞質を含む健康な細胞内構造がよく示された（図１０Ａ、１０Ｃ、１０Ｄおよび１０Ｅを参照）。対照的に、ＰＢＳで処理した細胞では、認識できる細胞内構造を含まない異常な細胞の出現が観察された。さらに、ＰＢＳで処理した脊髄の灰白質中に多数のグリア細胞が存在したが（図１０Ｂ）、ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２で処理した脊髄ではほとんど検出されなかった。ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２で処理したグループからのわずかな運動ニューロンが肥大を呈示したが、細胞直径においてグループ間に統計学的差異は観察されなかった。＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１４】
[00273]５．２  緑内障動物モデル
[00274]常磁性ビーズの眼球内注射により誘導された上昇した眼圧（ＩＯＰ）を使用して、緑内障動物モデルを確立した。注射の前に、ＲＧＣを蛍光マーカーによって標識した。上丘における両側の脳の定位的注入による逆行性の標識付けのために、４％フルオロゴールド溶液を選択した。３０ゲージの針を使用して、常磁性ビーズの眼球内注射を実行した。常磁性ビーズを磁石によって前角にガイドした。他方の側の目に２０μｌの生理的食塩水を注射して、陰性対照を作製した。眼球内注射の後、動物をホームケージ中で安静にさせ、ＩＯＰを１日おきに試験した。マイクロビーズの眼球内注射の２週間後、両方の目に、１μｌの生理的食塩水またはＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２（１μｇ）を眼球内注射する。全てのマウスを１ヶ月後に致死させ、網膜を浮遊させる錠剤を作製した。逆行した標識付けによって生じた蛍光シグナルに基づき（図１１Ａを参照）、ＲＧＣ数を計数した。ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２は、ＲＧＣ生存に対して有意な強化を示した（図１１Ｂを参照）。＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１５】
[00275]５．３  卒中
[00276]スプラギーダーレーラット（約２００ｇ）を、２時間の右側中大脳動脈閉塞とそれに続く再灌流（Ｉ／Ｒ）に供し、それぞれＰＢＳ（偽操作）、１ｍｇ／ｋｇ体重の正常ウサギＩｇＧ、１ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２および０．２ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２を投与した。動物を、感覚および運動機能に関して１４日間試験し、梗塞体積測定のために安楽死させた。３日目に、ウェスタンブロットアッセイのために追加のセットの動物を安楽死させた。
【０２１６】
[00277]梗塞体積を測定するために、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）を使用して、脳切片を染色した。ＴＴＣは、正常な組織では呼吸鎖中のデヒドロゲナーゼの存在下で赤く変色し、一方で死んだ組織では白色のままになる。虚血後の１４日目に、１ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２は、通常のＩｇＧ処理と比較して梗塞体積を有意に低減させた（＊Ｐ＜０．０５。各グループにおいてｎ≧７。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される）。また０．２ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２も、統計学的に有意ではなかったが梗塞体積を低減させた（図１２Ａおよび１２Ｂを参照）。
【０２１７】
[00278]本発明者らは次いで、接着除去試験による虚血後の行動に関するアウトカムを評価した。接着剤を感知し除去する時間は、反比例的に、調和のとれた脳の半球によって調節された感覚運動機能の状態を示す。外科手術後の最初の５日に、虚血／再灌流に供した動物は全て、疑似と比較して左前肢の感覚運動機能における障害を示した。しかしながら、通常のＩｇＧ処理と比較して、１ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２処理は、３日目および５日目に感覚機能の改善を促進し、それと共に５日目に除去に要する時間が短くなったことから、運動機能におけるより優れた改善が示される。これは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２が、卒中後に機能的な回復を促進したことを示す（図１３Ａおよび１３Ｂを参照）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。グループ各においてｎ≧９。データは平均±ＳＥＭとして提示され、二元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１８】
[00279]ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２作用の可能性のあるメカニズムを分析するために、本発明者らは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２がアポトーシスの経路に影響を与えるかどうかの発見を試みた。カスパーゼ−３は、アポトーシスを実行するものであり、このタイプの細胞死のマーカーとして使用されることが多い。活性化されると、３２ｋＤａのプロカスパーゼ−３が切断されることにより、活性化された１７ｋＤａの形態が生じる。ウェスタンブロットからの半定量的な結果を比較すると、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２は、部分的にアポトーシス経路を介して細胞死を低減させることが示される（図１４を参照）。＊ｐ＜０．０５、各グループにおいてｎ≧５。データは平均±ＳＥＭとして提示され、一元配置ＡＮＯＶＡで分析される。
【０２１９】
[00280]混合系キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）は、その活性化がＭＬＫＬのリン酸化に依存するネクロソーム（necrosome）の構成要素である。虚血／再灌流または永続的な虚血のいずれかを受けた皮質組織において、ＭＬＫＬリン酸化は、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２処理によって有意に低減した（図１５Ａおよび１５Ｂを参照）。これは、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂによってＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化することが、壊死／ネクロトーシス経路を抑制することを示す。
【０２２０】
[00281]５．４  血漿および脳組織におけるＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂの薬物動態
[00282]血漿および脳組織におけるＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ（ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ１１０４、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２９０８、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂＢ９０１、およびＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ２０２）の薬物動態を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにそれらを尾静脈を介して注射により投与した。異なるタイムポイント（１日目、３日目、７日目、１５日目および３０日目）に１グループ当たり３匹のマウスを致死させて、血液サンプルおよび脳組織を収集した。血液サンプルから即座に血漿を調製した。脳組織を収集する前、マウスを少なくとも２０ｍｌのＰＢＳで灌流した。血漿サンプルおよび脳組織を液体窒素によって急速冷凍し、−８０℃の冷凍庫で貯蔵した。異なるタイムポイントの全てのサンプルを収集した後、ＥＬＩＳＡ方法を使用して、各サンプルの抗体濃度を検出した。ベースライン（０）の濃度を対照マウス（注射なし）によって決定した。図１８によれば、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂは、７〜３０日後に血液から除去され（図１８Ａを参照）、１５日より後に脳から除去された（図１８Ｂを参照）。約０．１〜０．５％の血中濃度のＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂが脳血液バリア（ＢＢＢ）を通って脳組織に透過し、脳中の濃度が、ＴｒｋＢリン酸化および下流キナーゼシグナル伝達経路を活性化し、神経の生存を促進するのに有効な濃度である。例えば、ＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂの血中濃度が３ｍｇ／ｋｇである場合、脳組織に透過する濃度は、０．１〜０．２μｇ／ｇであるかまたはそれより高く（約１ｎＭに相当）、一方でインビトロにおける０．３〜１ｎＭのＴｒｋＢ−ａｇｏＡｂ濃度は、十分に有効である（図６および８を参照）。
【０２２１】
[00283]具体的な実施態様（その一部は、好ましい実施態様である）を参照しながら本開示を具体的に示し説明したが、当業者であれば、本明細書で開示される本発明の開示の本質および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変化をなすことができることを理解しているものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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