(57)【要約】  本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａを制御するためのバクテリオシン（サルモシン）に関する。バクテリオシンはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに由来する。サルモシンは植物で発現され得、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法で使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下のアミノ酸配列セグメントのうちの少なくともいずれか１つを含むタンパク質：
（ａ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメント、
（ａ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメント、
（ａ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメント、
（ａ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメント、
（ａ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメント、もしくは
（ａ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメント、
または
（ｂ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも７７％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
または
（ｃ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも８５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも８５％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
または
（ｄ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して１〜２５個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。
【請求項２】
以下の活性の任意の１つまたは複数を有する細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質：膜細孔形成活性、ＤＮａｓｅ活性、ＲＮａｓｅ活性または細胞壁分解活性。
【請求項３】
以下のアミノ酸配列セグメントのいずれか１つを含む細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む、請求項１または２に記載のタンパク質：
（ａ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメント、
（ａ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメント、
（ａ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメント、
（ａ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメント、
（ａ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメント、もしくは
（ａ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメント、
または
（ｂ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
または
（ｃ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
または
（ｄ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して、１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、それからなるタンパク質：
（Ａ−ｉ）配列番号１、
（Ａ−ｉｉ）配列番号２、
（Ａ−ｉｉｉ）配列番号３、
（Ａ−ｉｖ）配列番号４、
（Ａ−ｖ）配列番号５、もしくは
（Ａ−ｖｉ）配列番号６、
または
（Ｂ−ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｖ）配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
（Ｂ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または
（Ｃ−ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｖ）配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列類似性を有するアミノ酸配列、もしくは
（Ｃ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
または
（Ｄ−ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列に対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｖ）配列番号５のアミノ酸配列に対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
（Ｄ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
または
（Ｅ−ｉ）配列番号１の少なくとも４７０個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｉｉ）配列番号２の少なくとも４７０個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも４７０個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｉｖ）配列番号４の少なくとも３９０個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｖ）配列番号５の少なくとも４２５個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
（Ｅ−ｖｉ）配列番号６の少なくとも２５０個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列。
【請求項５】
項目
−それぞれ場合により請求項３と組み合わせた、（ａ−ｉｖ）、（ｂ−ｉｖ）、（ｃ−ｉｖ）、（ｄ−ｉｖ）または
−（Ａ−ｉｖ）、（Ｂ−ｉｖ）、（Ｃ−ｉｖ）、（Ｄ−ｉｖ）もしくは（Ｅ−ｉｖ）
のものである、請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
項目
−それぞれ場合により請求項３と組み合わせた、（ａ−ｖ）、（ｂ−ｖ）、（ｃ−ｖ）、（ｄ−ｖ）または
−（Ａ−ｖ）、（Ｂ−ｖ）、（Ｃ−ｖ）、（Ｄ−ｖ）もしくは（Ｅ−ｖ）
のものである、請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができる、請求項１から６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる感染または汚染を処置する方法で使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａに対する、請求項１、特に請求項１のクラス（ｂ）から（ｄ）に記載のタンパク質の毒性が、感受性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ株のｃｍ２あたり１ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬの０．１４ｍＬ細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、５マイクロリットルのクラス（ｂ）から（ｄ）の前記タンパク質および配列番号１のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後３７℃で寒天プレートをインキュベートしてから１２時間に、前記タンパク質および配列番号１のタンパク質が、同じ直径の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｎｅｗｐｏｒｔ株ＡＴＣＣ（登録商標）６９６２（商標）＊の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成するというようなものであり、クラス（ｂ）から（ｄ）のタンパク質の濃度が、配列番号１のタンパク質の比較溶液のものの最大で５倍である、請求項１から８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の１種または複数のタンパク質を含む組成物。
【請求項１１】
−請求項１に記載の項目（ａ−ｉｖ）、（ｂ−ｉｖ）、（ｃ−ｉｖ）もしくは（ｄ−ｉｖ）に記載の、および／または項目（ａ−ｖ）、（ｂ−ｖ）、（ｃ−ｖ）もしくは（ｄ−ｖ）に記載のタンパク質；ならびに
−項目（ａ−ｉ）、（ｂ−ｉ）、（ｃ−ｉ）または（ｄ−ｉ）に記載のタンパク質
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
項目（ａ−ｉｉｉ）、（ｂ−ｉｉｉ）、（ｃ−ｉｉｉ）または（ｄ−ｉｉｉ）に記載のタンパク質をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
−請求項４に記載の項目（Ａ−ｉｖ）、（Ｂ−ｉｖ）、（Ｃ−ｉｖ）、（Ｄ−ｉｖ）もしくは（Ｅ−ｉｖ）に記載の、および／または項目（Ａ−ｖ）、（Ｂ−ｖ）、（Ｃ−ｖ）、（Ｄ−ｖ）もしくは（Ｅ−ｖ）に記載のタンパク質；ならびに
−項目（Ａ−ｉ）、（Ｂ−ｉ）、（Ｃ−ｉ）、（Ｄ−ｉ）または（Ｅ−ｉ）に記載のタンパク質
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
項目（Ａ−ｉｉｉ）、（Ｂ−ｉｉｉ）、（Ｃ−ｉｉｉ）、（Ｄ−ｉｉｉ）または（Ｅ−ｉｉｉ）に記載のタンパク質をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質が請求項２から９のいずれか１項によってさらに記載される通りである、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記１種または複数のタンパク質がＳｃｏｌＥ１ａもしくはＳｃｏｌＥ１ｂまたはＳｃｏｌＥ１ａもしくはＳｃｏｌＥ１ｂの誘導体であるか、これらを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、より好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる感染を処置する方法で使用するための、請求項１０から１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が植物材料またはその抽出物であり、植物材料が、前記タンパク質を発現した植物、好ましくは、前記タンパク質を発現した食用植物由来の材料であり、または前記組成物が、前記タンパク質を含む水溶液である、請求項１０から１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法であって、請求項１から５もしくは６から９のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１０から１８のいずれか１項に記載の組成物と前記対象物を接触させることを含む方法。
【請求項２０】
前記対象物が前記水溶液で噴霧される、もしくは前記水溶液中に浸漬される、または前記対象物が少なくとも１０秒間、好ましくは少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、前記タンパク質の水溶液中に浸漬される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象物が食品もしくは動物飼料である、または前記食品が動物の死体全体、肉、卵、生の果物もしくは野菜である、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
それらを必要とする対象のＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる感染を処置する方法であって、請求項１から５もしくは６から９のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１０から１８のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記ＳａｌｍｏｎｅｌｌａがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａである、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から９のいずれか１項に記載のタンパク質を含む組成物を生成する方法であって、
（ｉ）植物、好ましくは食用植物またはＮｉｃｏｔｉａｎａ中で前記タンパク質を発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物から発現タンパク質を含む植物材料を採取するステップ、
（ｉｉｉ）水性バッファーを使用して前記植物材料から前記タンパク質を抽出して、前記タンパク質を含む組成物を得るステップ、
（ｉｖ）場合により前記組成物から望ましくない混入物を除去するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルモシン（ｓａｌｍｏｃｉｎｓ）と称される、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質を提供する。本発明は、医薬組成物を含めた、前記タンパク質の１種または複数を含む組成物も提供する。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法、それを必要とする対象または患者のＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる感染を処置する方法、および該タンパク質を含む組成物を生成する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の桿状グラム陰性細菌である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａは基準種であり、６つの亜種にさらに分けられ、２５００を超える血清型を含む亜種ＩとしてＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａを含む。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染はよく見られ、無症候性状態から非常に重度の疾患に及ぶ多様な臨床症状をもたらし得る。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａは、米国で毎年推定１００万人の疾病を引き起こし、推定１９，０００人の入院および３８０人の死亡をもたらす。過去５年間で、４６回のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの大発生が米国で記録され、食中毒の多くは、汚染した家禽または野菜が原因であるが、赤肉および魚も原因である（ＣＤＣウェブサイト）。
【０００３】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の予防またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる食品の汚染の減少は、農場における農業生産から商業施設と家庭の台所の両方における食品の処理、製造および調製までのフードチェーンのすべての段階において、制御手段を必要とする。優れた衛生習慣はＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる食品の汚染を減少させるが、生成物にＳａｌｍｏｎｅｌｌａが存在しないことを保証しない。家庭におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対する予防手段は、他の食品由来の細菌に対して使用されるものと類似している。「完全に調理する」などの基本的な食品衛生習慣は、サルモネラ症に対する予防手段として推奨される。ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ１３９／ｅｎ／でＷＨＯを参照されたい。
【０００４】
抗菌療法は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を罹患しているヒトまたは動物を処置するのに使用され得る。しかし、抗菌剤抵抗性は世界的な公衆衛生上の懸念であり、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、フードチェーンに影響を及ぼす、いくつかの抵抗性血清型が出現している微生物のうちの１つである。
【０００５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を予防もしくは処置する、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる汚染を減少させる上述の方法の多くは、特定の病原性細菌から、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの特定の血清型から本質的に独立している方法である。これは、対策をとるのに先だって、問題になっている特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型の事前知識がほとんど必要とされないという利点がある。しかし、加熱などの、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を予防するまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる汚染を減少させる上述の方法は、必ずしも適用可能とは限らず、または処理された商品または食品を望ましくない形で変える。他の方法は、特定の患者で非効果的な結果になった可能性がある。したがって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染または汚染を予防もしくは処置するさらなる方法、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる、特に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる対象物の汚染を減少させるもしくは予防する方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
食品由来のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染などのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を予防または処置するための方法を提供することが、本発明の一目的である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物、特に食品の汚染を予防するまたは減少させるための方法を提供することが、別の目的である。幅広いＳａｌｍｏｎｅｌｌａ血清群に対して効果的な、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染を予防もしくは処置するための方法および／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の汚染を減少させるための方法を提供することが、さらなる目的である。さらに、そのような方法のための化合物、薬剤および組成物が所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、以下を提供する：
（１）好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質であって、以下のアミノ酸配列セグメント（ａ−ｉ）から（ａ−ｖｉ）または（ｂ−ｉ）から（ｂ−ｖｉ）、（ｃ−ｉ）から（ｃ−ｖｉ）もしくは（ｄ−ｉ）から（ｄ−ｖｉ）で定義されるそれらの誘導体のうちの少なくともいずれか１つを含むタンパク質：
（ａ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメント、
（ａ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメント、
（ａ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメント、
（ａ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメント、
（ａ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメント、もしくは
（ａ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメント、
または
（ｂ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも７７％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
または
（ｃ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも８５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも８５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
または
（ｄ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して１〜２５個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント。
（２）以下の活性の任意の１つまたは複数を有する細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む、（１）に記載のタンパク質：膜細孔形成活性、ＤＮａｓｅ活性、ＲＮａｓｅ活性または細胞壁分解活性、例えばムラミダーゼ活性。
（３）以下のアミノ酸配列セグメント（ａ−ｉ）’から（ａ−ｖｉ）’、または（ｂ−ｉ）’から（ｂ−ｖｉ）’、（ｃ−ｉ）’から（ｃ−ｖｉ）’もしくは（ｄ−ｉ）’から（ｄ−ｖｉ）’で定義されるそれらの誘導体もしくはアミノ酸配列セグメントのいずれか１つを含むか、それからなる細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む、（１）または（２）に記載のタンパク質：
（ａ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメント、
（ａ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメント、
（ａ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメント、
（ａ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメント、
（ａ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメント、もしくは
（ａ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメント、
または
（ｂ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
または
（ｃ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
または
（ｄ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して１〜２０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して１〜２０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して１〜２０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して１〜２０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して１〜２０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して、１〜２０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント。
（４）以下のアミノ酸配列セグメント（ａ−ｉ）’’から（ａ−ｖ）’’、または（ｂ−ｉ）’’から（ｂ−ｖ）’’、（ｃ−ｉ）’’から（ｃ−ｖ）’’もしくは（ｄ−ｉ）’’から（ｄ−ｖ）’’で定義されるそれらの誘導体（もしくはアミノ酸配列セグメント）のいずれか１つを含む（または、それからなる）転移ドメインを含む、（１）、（２）または（３）のいずれか１つに記載のタンパク質：
（ａ−ｉ）’’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４３〜３１３のセグメント、
（ａ−ｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３５〜３１５のセグメント、
（ａ−ｉｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４３〜３１６のセグメント、
（ａ−ｉｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１〜１７０のセグメント、もしくは
（ａ−ｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１〜１９５のセグメント、
または
（ｂ−ｉ）’’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４３〜３１３のセグメントに対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３５〜３１５のセグメントに対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４３〜３１６のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１〜１７０のセグメントに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１〜１９５のセグメントに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
または
（ｃ−ｉ）’’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４３〜３１３のセグメントに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３５〜３１５のセグメントに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４３〜３１６のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１〜１７０のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１〜１９５のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
または
（ｄ−ｉ）’’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４３〜３１３のセグメントに対して、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３５〜３１５のセグメントに対して、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）’’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４３〜３１６のセグメントに対して、アミノ酸残基３５〜３１５のセグメントのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失に対して、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント；
（ｄ−ｉｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１〜１７０のセグメントに対して、アミノ酸残基３５〜３１５のセグメントのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失に対して、１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖ）’’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１〜１９５のセグメントに対して、アミノ酸残基３５〜３１５のセグメントのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失に対して、１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント。
（５）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる感染または汚染を処置する方法で使用するための、（１）〜（４）のいずれか１つに記載のタンパク質。
（６）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａに対する、請求項１、特に請求項１のクラス（ｂ）から（ｄ）に記載のタンパク質の毒性が、感受性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ株のｃｍ２あたり１ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬの０．１４ｍＬ細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、５マイクロリットルのクラス（ｂ）から（ｄ）の前記タンパク質および配列番号１のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後３７℃で寒天プレートをインキュベートしてから１２時間に、前記タンパク質および配列番号１のタンパク質が、同じ直径の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｎｅｗｐｏｒｔ株ＡＴＣＣ（登録商標）６９６２（商標）＊の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成するというようなものであり、クラス（ｂ）から（ｄ）のタンパク質の濃度が、配列番号１のタンパク質の比較溶液のものの最大で５倍である、（１）〜（５）のいずれか１つに記載のタンパク質。
（７）（１）〜（６）のいずれか１つに記載の１種または複数のタンパク質を含む組成物。
（８）前記１種または複数のタンパク質がＳｃｏｌＥ１ａもしくはＳｃｏｌＥ１ｂまたはＳｃｏｌＥ１ａもしくはＳｃｏｌＥ１ｂの誘導体であるか、これらを含む、（７）に記載の組成物。
（９）請求項１で定義される少なくとも２つの異なるクラス（ｉ）から（ｖｉ）から選択される２つ以上のタンパク質を含む、（７）または（８）に記載の組成物。
（１０）（クラス（ａ）〜（ｄ）のいずれかの）サブクラス（ｉ）のタンパク質および（クラス（ａ）〜（ｄ）のいずれかの）サブクラス（ｖ）のタンパク質を少なくとも含む、（９）に記載の組成物。
（１１）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、より好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる感染を処置する方法で使用するための、（７）〜（１０）のいずれか１つに記載の組成物。
（１２）前記組成物が植物材料またはその抽出物であり、植物材料が、前記タンパク質を発現した植物、好ましくは、前記タンパク質を発現した食用植物由来の材料である、（７）〜（１１）のいずれか１つに記載の組成物。
（１３）前記植物材料がホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、サトウダイコン、リーフィービート、アマランス、Ｎｉｃｏｔｉａｎａからなる群から選択される植物由来の材料である、および／または前記植物材料が１つもしくは複数の葉、根、塊茎もしくは種子、もしくは前記葉、根、塊茎もしくは種子の破砕された、製粉された、もしくは粉砕された生成物である、（１２）に記載の組成物。
（１４）前記組成物が、前記タンパク質を含む水溶液である、（７）〜（１３）のいずれか１つに記載の組成物。
（１５）前記タンパク質、または組成物が２つ以上の異なるタンパク質を含む場合は前記水溶液中の前記タンパク質の濃度が、０．０００１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００５〜０．０５ｍｇ／ｍｌである、または０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ食品、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ食品である、（１４）に記載の組成物。
（１６）ＳｃｏｌＥ１ａおよび／もしくはその誘導体、もしくはＳｃｏｌＥ１ａもしくはその誘導体を含む、または項目（Ａ−ｉｖ）、（Ｂ−ｉｖ）、（Ｃ−ｉｖ）、（Ｄ−ｉｖ）もしくは（Ｅ−ｉｖ）に記載のタンパク質、および／もしくは以下で定義される項目（Ａ−ｖ）、（Ｂ−ｖ）、（Ｃ−ｖ）、（Ｄ−ｖ）もしくは（Ｅ−ｖ）に記載のタンパク質を含む、または項目（Ａ−ｉｖ）、（Ｂ−ｉｖ）、（Ｄ−ｉｖ）もしくは（Ｅ−ｉｖ）に記載のタンパク質、および／もしくは以下で定義される項目（Ａ−ｖ）、（Ｂ−ｖ）、（Ｄ−ｖ）もしくは（Ｅ−ｖ）に記載のタンパク質を含む、または項目（Ａ−ｉｖ）、（Ｂ−ｉｖ）、（Ｄ−ｉｖ）もしくは（Ｅ−ｉｖ）に記載のタンパク質、および以下で定義される項目（Ａ−ｖ）、（Ｂ−ｖ）、（Ｄ−ｖ）もしくは（Ｅ−ｖ）に記載のタンパク質を含む、（７）〜（１５）のいずれか１つに記載の組成物であって、本明細書で定義される好ましい実施形態が本項目（１６）で定義される実施形態と組み合わされてもよい、組成物。
（１７）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法であって、（１）〜（６）のいずれか１つに記載のタンパク質または（７）〜（１６）のいずれか１つに記載の組成物と前記対象物を接触させることを含む方法。
（１８）前記対象物が前記水溶液で噴霧される、または前記水溶液中に浸漬される、（１７）に記載の方法。
（１９）前記対象物が少なくとも１０秒間、好ましくは少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、前記タンパク質の水溶液中に浸漬される、（１７）〜（１８）に記載の方法。
（２０）前記対象物が食品または動物飼料である、（１７）〜（１９）のいずれか１つに記載の方法。
（２１）前記食品が動物の死体全体、肉、卵、生の果物または野菜であり、好ましくは前記食品が肉、生の果物または野菜であり、より好ましくは前記食品が肉である、（２０）に記載の方法。
（２２）それらを必要とする対象のＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる感染を処置する方法であって、（１）〜（６）のいずれか１つに記載のタンパク質または（７）〜（１６）のいずれか１つに記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
（２３）前記ＳａｌｍｏｎｅｌｌａがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａである、（１７）〜（２２）のいずれか１つに記載の方法。
（２４）（１）〜（６）のいずれか１つに記載のタンパク質を含む組成物を生成する方法であって、
（ｉ）植物、好ましくは食用植物またはＮｉｃｏｔｉａｎａ中で前記タンパク質を発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物から発現タンパク質を含む植物材料を採取するステップ、
（ｉｉｉ）水性バッファーを使用して前記植物材料から前記タンパク質を抽出して、前記タンパク質を含む組成物を得るステップ、
（ｉｖ）場合により前記組成物から望ましくない混入物を除去するステップ
を含む方法。
【０００８】
本明細書において、その誘導体とともに「サルモシン」と称されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａのバクテリオシンは、他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株を死滅させる、またはその増殖を阻害する、ある種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株によって生成される天然の非抗生物質の抗菌タンパク質である。比較的よく研究されているコリシンと呼ばれるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉタンパク質類似体と異なり、サルモシンはほとんど注目されていなかった。公的に利用可能なゲノムデータベースに、コリシン配列に類似性を有するいくつかのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ配列が存在し、それらの多くは、コリシンＭ、Ｉａ、Ｉｂ、５および１０に高い同一性を示す。本発明者らは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる、特に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる感染または汚染を予防するまたは減少させるのに使用され得る、コリシンと類似しているが異なるサルモシンを同定した。
【０００９】
本発明者らは、試験したすべてのサルモシンが植物中で効率的に発現され得ることを発見した。本研究で使用されるもののような発現方法は、既にＧＭＰコンプライアンスのレベルに至っており、現在、製造方法として様々な臨床試験で使用されている。ほとんどのサルモシンは、高収量（新鮮なグリーンバイオマス１キログラムあたり１．７ｇ活性タンパク質まで）で発現され、これは、商業的に実行可能な低い製造費を意味する。生産は、特に、タバコおよび食用植物、例えば、リーフビートまたはホウレンソウを使用して行われ得る。様々なサルモシンの中で、サルモシンＥ１ａ（ＳｃｏｌＥ１ａ）およびＥ１ｂ（ＳｃｏｌＥ１ｂ）またはそれらの誘導体が好ましく、これは、これらが、主な病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株に対して最も広い抗菌活性を有することが発見されたからである。これらの２種のサルモシンのそれぞれはまた、試験したすべての３６種の主な病原性株に対して非常に高い活性を示す。低い量のコリシン（例えば、処理される食品製品１ｋｇあたり１０ｍｇ未満のコリシン）による処理は、用いられたアッセイにおいて、様々な病原性株の細菌負荷を３〜＞６ｌｏｇ減少させる。２〜４種の病原体血清型をスパイクとして添加した家禽の肉を使用するスパイク実験において、コリシン（コリシンＭ、Ｉａおよび５）は病原性細菌のタイターを効率的に減少させた。したがって、上述のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型に対して、言及したコリシンより高い抗菌活性を有するサルモシンは、家禽に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ汚染のタイターをさらに一層効果的に減少させることが期待される。
【００１０】
本発明の実験データは、非抗生物質の抗菌性サルモシンが、臨床試験を現在受けている複数の生物製剤の標準的な製造宿主であるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａなどの植物において、非常に高いレベルで発現され得、植物で発現されたタンパク質は明らかに十分に活性であることを示す。ほとんどの場合の発現レベルは、方法の最適化なしで、全可溶性タンパク質の３７％または新鮮葉バイオマスの１．７４ｇ／ｋｇに達し、これは、サルモシンが植物に対して毒性がないこと、および安価な、トランスジェニック宿主におけるトランスフェクションまたは誘導の最適化された産業的手順が開発され得ることを意味する。これに対して、細菌宿主においてバクテリオシンタンパク質を高レベルで発現させようとする試みは、通常、同種の細菌種以外の種においてでさえも、このバクテリオシンクラスの一般的な毒性に遭う（例えば、Ｍｅｄｉｎａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１；６（８）：ｅ２３０５５；Ｄｉａｚら、１９９４）。したがって、植物はサルモシンを製造するための優れた宿主である。
【００１１】
本発明のデータは、サルモシンが、実際の曝露モデリング下で、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａのほとんどまたはすべての主な病原性血清型を効率的に制御することができることを示す。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって生成されるサルモシンの間では、多様性が限られている。研究されたサルモシンは、より研究されたＥ．ｃｏｌｉのコリシンと類似した、一般的な３つのドメイン（移行、受容体および細胞傷害性ドメイン）構成内にかなり多様な構造を有する。驚いたことに、事実上すべての試験されたサルモシンおよびコリシンは、単独で、または抗毒素（免疫タンパク質）とともに、植物で非常によく発現する。これは、植物細胞に対するサルモシンおよびコリシンの低毒性によって、ならびに「天然変性タンパク質（ｉｎｈｅｒｅｎｔｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」（細菌の細胞壁および膜への移行の間にアンフォールド／リフォールドする能力に必須な特色）の古典的な代表であるこれらのバクテリオシンタンパク質は、おそらく植物細胞の翻訳および翻訳後の機構に異常な要求を課さないという事実によって、説明することができる。
【００１２】
本出願人らが知る限りでは、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの主な腸管病原性株に対するサルモシンの阻害効果に関する最初の研究を含む。Ｅ．ｃｏｌｉによる食中毒の歴史的解析に基づいてＦＤＡによって定義された主なＥ．ｃｏｌｉ株のリストと異なって、食品由来の主なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株のリストは規制当局によって定められておらず、これは、主として、大発生に関与する病原型の多様性がより高いからである。従来技術にこのガイダンスがないことに直面して、本発明者らは、それらの有病率および中毒重症度に基づいて病原型をランク付けした３つの現行の主な研究をプールすることを決めた。本発明者らの研究では、３６種の血清型が選択されて解析され、そのうちの２９種が、２００３〜２０１２年に疾病管理センターに報告された少なくとも１００の発生の原因となり（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ、２０１３（ＣＤＣ、２０１６年６月）：２００３〜２０１２年にＣＤＣに報告された実験室で確認されたヒトＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染（米国））、１７種はＣＤＣの上位２０リストの最も周知の病原型であり、その数はＦＤＡによって定められたＥ．ｃｏｌｉ病原型の数（７）よりも５倍多かった。
【００１３】
本特許出願で提示するデータは、主な病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を制御するそれらの能力に基づいて、５つの異なるＳａｌｍｏｎｅｌｌａのサルモシンが３つの群に分けられ得ることを示す。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのサルモシンＥ１ａおよびＥ１ｂは普遍的に活性であることが分かり、それぞれ、試験したすべての病原型を死滅させることができ、最高の平均活性を示す。試験したすべての株に対する２つのサルモシンの平均活性は１０７ＡＵ／μｇを超えた。例えば、サルモシンＥ１ａの個々の活性は、３６株のうちの３５株について＞１０３ＡＵ／μｇであり、３６株のうちの２４株について＞１０４ＡＵ／μｇであり、３６株のうちの１３株について＞１０６ＡＵ／μｇであった。残りのサルモシンは２つの群に入り、サルモシンＥ２およびＥ７は８０％を超える株について阻害性であったが、１００倍低い平均活性（１０５ＡＵ／μｇ未満）を有しており、一方でサルモシンＥ３は、より低い平均活性（約１０２ＡＵ／μｇ）で約６０％の株を阻害した。
【００１４】
コリシン（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によって生成されるサルモシン類似体）が７種のＥ．ｃｏｌｉ病原型に対してはるかに狭い抗菌活性スペクトルを示し、ＦＤＡによって定められた７種すべてのＳＴＥＣ血清型を効率的に阻害するためには、２〜５種のコリシンの混合物が好ましくは使用されなければならないので、これらの結果は予想外である。コリシンはまた、ヨーロッパにおいて２０１１年に大規模な大発生を引き起こした株Ｈ１０４：Ｈ４（＞１０５ＡＵ／μｇ）および一般的な実験室株に対してはるかに高い活性が観察されたが、「ビッグセブン（Ｂｉｇ  Ｓｅｖｅｎ）」ＳＴＥＣ株に対してはるかに低い平均活性を示した（平均＜１０３ＡＵ／μｇ）。
【００１５】
それぞれＥ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対するサルモシンおよびコリシンの交差特異的活性の本発明者らの解析は、異なる属／種の細菌に対して低い活性を示す。特に、いくつかのサルモシン（例えば、Ｅ２、Ｅ７およびＥ１ｂであるが、驚いたことにＥ１ａではない）は、Ｈ１０４：Ｈ４（１０３ＡＵ／μｇ）および実験室株ＤＨ１０Ｂ（１０５ＡＵ／μｇ）に対してかなり活性であったが、「ビッグセブン」ＳＴＥＣ株に対するサルモシンの活性は低かった（１０２ＡＵ／μｇ未満）。同様に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病原型に対するコリシンの活性は低く、コリシンＩａおよびＩｂは８０％を超える株に対して活性であるが、コリシンＩａのみの平均活性は３×１０３ＡＵ／μｇよりも高い（または、サルモシンＥ１ａ／ｂよりも３〜４桁低かった）ことが分かった。本発明者らは、これらの研究から、両方の病原性種と戦うためには、コリシンとサルモシンの混合物を使用しなければならないと結論する。これらの結果はまた、異なる属の細菌間における競合におけるコリシン様タンパク質の生態学的効果の最近の研究（Ｎｅｄｉａｌｋｏｖａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１４年１月；１０（１）：ｅ１００３８４４）と部分的に一致しないように思われる。
【００１６】
本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを制御するための新規の薬剤および組成物を提供する。本発明のサルモシンは、複雑でない方法で販売許可が得られ得るという利点を有する。例えば、ＦＤＡは、最近、植物で生成したコリシンにＧＲＡＳ（一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）ステータスを承認した（ＧＲＮ５７３、ＦＤＡウェブサイト）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの制御のための天然の非抗生物質の抗菌薬に対する未だ対処されていない必要性のために、本発明者らは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのバクテリオシン（「サルモシン」）を探求することを構想した。それによって、本発明は達成された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】実施例で使用されるサルモシンおよび対応する免疫タンパク質の発現のためのウイルスベクターを概略的に示す図である。サルモシンの発現のためのコンストラクトはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づくが、免疫タンパク質の発現のためのコンストラクトはジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づく。  サルモシン発現ベクターとしては、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３およびＳｃｏｌＥ７の発現のためのｐＮＭＤ２８１６１、ｐＮＭＤ２８１５１およびｐＮＭＤ２８１７２（図１Ａ）、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔの発現のためのｐＮＭＤ２８１９１、ｐＮＭＤ２８２０４およびｐＮＭＤ２８１８２（図１Ｂ）が挙げられる。  ＲＢおよびＬＢは、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡのライトボーダーおよびレフトボーダーを示す。Ｐａｃｔ２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアクチン２遺伝子のプロモーター；ｏ：ＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス）の５’末端；ＲｄＲｐ：ｃｒ−ＴＭＶ（アブラナ感染性トバモウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＭＰ：ｃｒ−ＴＭＶ由来の移行タンパク質のＯＲＦ；ＳｃｏｌＥ２：サルモシンＳｃｏｌＥ２のコード配列；ＳｃｏｌＥ３：サルモシンＳｃｏｌＥ３のコード配列；ＳｃｏｌＥ７：サルモシンＳｃｏｌＥ７のコード配列；ＳｃｏｌＥ１ａ：サルモシンＳｃｏｌＥ１ａのコード配列；ＳｃｏｌＥ１ｂ：サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂのコード配列；Ｓｐｓｔ：サルモシンＳｐｓｔのコード配列；Ｎ：ｃｒ−ＴＭＶ由来の３’非翻訳領域；Ｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのノパリン合成酵素ターミネーター；ＲｄＲｐおよびＭＰのＯＲＦ中で灰色セグメントを中断している白色セグメントは、植物細胞の細胞質におけるＲＮＡレプリコン形成の可能性を高めるためにこれらのＯＲＦ中に挿入されたイントロンを示し、これは、ＷＯ２００５０４９８３９に詳細に記載されている。イントロンは、ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３およびＳｃｏｌＥ７のＯＲＦ中にも、プラスミドクローニングで使用されるＥ．ｃｏｌｉ細胞に対するこれらのタンパク質の細胞傷害性作用を防ぐために挿入された。  免疫タンパク質の発現のためのＰＶＸベースのベクターとしては、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の免疫タンパク質の発現のためのｐＮＭＤ２８２２２およびｐＮＭＤ２８２３２が挙げられる（図１Ａ）。Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；ＰＶＸ−ｐｏｌ：ＰＶＸ由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＣＰ：コートタンパク質ＯＲＦ；２５Ｋ、１２Ｋおよび８Ｋは、一緒に、ＰＶＸからの２５ｋＤａ、１２ｋＤａおよび８ｋＤａの３重遺伝子ブロックモジュールを示す；Ｎ：ＰＶＸ由来の３’非翻訳領域。ＳＩｍｍＥ２およびＳＩｍｍＥ７は、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の免疫タンパク質のコード配列を表す。
【図１Ｂ】実施例で使用されるサルモシンおよび対応する免疫タンパク質の発現のためのウイルスベクターを概略的に示す図である。サルモシンの発現のためのコンストラクトはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づくが、免疫タンパク質の発現のためのコンストラクトはジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づく。  サルモシン発現ベクターとしては、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３およびＳｃｏｌＥ７の発現のためのｐＮＭＤ２８１６１、ｐＮＭＤ２８１５１およびｐＮＭＤ２８１７２（図１Ａ）、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔの発現のためのｐＮＭＤ２８１９１、ｐＮＭＤ２８２０４およびｐＮＭＤ２８１８２（図１Ｂ）が挙げられる。  ＲＢおよびＬＢは、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡのライトボーダーおよびレフトボーダーを示す。Ｐａｃｔ２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアクチン２遺伝子のプロモーター；ｏ：ＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス）の５’末端；ＲｄＲｐ：ｃｒ−ＴＭＶ（アブラナ感染性トバモウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＭＰ：ｃｒ−ＴＭＶ由来の移行タンパク質のＯＲＦ；ＳｃｏｌＥ２：サルモシンＳｃｏｌＥ２のコード配列；ＳｃｏｌＥ３：サルモシンＳｃｏｌＥ３のコード配列；ＳｃｏｌＥ７：サルモシンＳｃｏｌＥ７のコード配列；ＳｃｏｌＥ１ａ：サルモシンＳｃｏｌＥ１ａのコード配列；ＳｃｏｌＥ１ｂ：サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂのコード配列；Ｓｐｓｔ：サルモシンＳｐｓｔのコード配列；Ｎ：ｃｒ−ＴＭＶ由来の３’非翻訳領域；Ｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのノパリン合成酵素ターミネーター；ＲｄＲｐおよびＭＰのＯＲＦ中で灰色セグメントを中断している白色セグメントは、植物細胞の細胞質におけるＲＮＡレプリコン形成の可能性を高めるためにこれらのＯＲＦ中に挿入されたイントロンを示し、これは、ＷＯ２００５０４９８３９に詳細に記載されている。イントロンは、ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３およびＳｃｏｌＥ７のＯＲＦ中にも、プラスミドクローニングで使用されるＥ．ｃｏｌｉ細胞に対するこれらのタンパク質の細胞傷害性作用を防ぐために挿入された。  免疫タンパク質の発現のためのＰＶＸベースのベクターとしては、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の免疫タンパク質の発現のためのｐＮＭＤ２８２２２およびｐＮＭＤ２８２３２が挙げられる（図１Ａ）。Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；ＰＶＸ−ｐｏｌ：ＰＶＸ由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＣＰ：コートタンパク質ＯＲＦ；２５Ｋ、１２Ｋおよび８Ｋは、一緒に、ＰＶＸからの２５ｋＤａ、１２ｋＤａおよび８ｋＤａの３重遺伝子ブロックモジュールを示す；Ｎ：ＰＶＸ由来の３’非翻訳領域。ＳＩｍｍＥ２およびＳＩｍｍＥ７は、それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の免疫タンパク質のコード配列を表す。
【図２】ウイルスベクターを保有するアグロバクテリアをＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物にインフィルトレーションした後のサルモシンの発現の比較ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５倍容量のバッファーで植物葉材料を抽出した。タンパク質抽出物を１２％ポリアクリルアミドゲル中で分離した。ゲルローディングのために、０．４ｍｇ新鮮重の植物組織に対応する抽出物量を含む一定分量を使用した。ゲルにローディングする前に、タンパク質抽出物の一定分量を２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと１：１の比例で混合し、９５℃で１０分間インキュベートした。上記ゲルレーンの上の数字は、以下の組換えタンパク質を発現する植物組織からのタンパク質抽出物を表す：１−サルモシンＳｃｏｌＥ２；２−サルモシンＳｃｏｌＥ３；３−サルモシンＳｃｏｌＥ７；４−サルモシンＳｃｏｌＥ１ａ；５−サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂ；６−サルモシンＳｐｓｔ。数字７は、陰性対照としての非感染葉組織からの抽出物に対応する。Ｌ−ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）プレステインドタンパク質ラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）、＃ＳＭ０６７１）。矢印は、発現した組換えコリシンに対応する特異的タンパク質バンドを示す。
【図３】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対する、サルモシン含有植物抽出物の特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験した。サルモシン感受性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株のパーセンテージ（平均３回の独立の実験）をサルモシン：１−サルモシンＳｃｏｌＥ２；２−サルモシンＳｃｏｌＥ３；３−サルモシンＳｃｏｌＥ７；４−サルモシンＳｃｏｌＥ１ａ；５−サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂ；６−サルモシンＳｐｓｔについて示す。
【図４】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対する、サルモシン含有植物抽出物の平均抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、組換えサルモシンを発現する植物バイオマスのｍｇ新鮮重（ＦＷ）あたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。それによって、これは、バイオマスの単位あたりの特異的活性薬剤の収量、すなわち、宿主の特異的生産能力を反映する。任意単位は、放射拡散アッセイにおいて検出可能なクリアリング作用をもたらすタンパク質抽出物の最高の希釈に対する希釈係数として計算される。試験した組換えサルモシンを、１−サルモシンＳｃｏｌＥ２；２−サルモシンＳｃｏｌＥ３；３−サルモシンＳｃｏｌＥ７；４−サルモシンＳｃｏｌＥ１ａ；５−サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂ；６−サルモシンＳｐｓｔとして示す。
【図５】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシン含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μｇの組換えサルモシンあたりの任意単位（ＡＵ）で計算し（平均３回の独立の実験）、これは、特定の株に対する特異的サルモシンの活性を反映し、すなわち、サルモシンの特異的抗菌効力が評価される。試験した組換えサルモシンを、１−サルモシンＳｃｏｌＥ２；２−サルモシンＳｃｏｌＥ３；３−サルモシンＳｃｏｌＥ７；４−サルモシンＳｃｏｌＥ１ａ；５−サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂ；６−サルモシンＳｐｓｔとして示す。
【図６】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ２含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、ｍｇ  ＦＷ植物バイオマスあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図７】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ２含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μｇの組換えサルモシンあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図８】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ３含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、ｍｇ  ＦＷ植物バイオマスあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図９】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ３含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μｇの組換えサルモシンあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１０】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ７含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、ｍｇ  ＦＷ植物バイオマスあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１１】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ７含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μｇの組換えサルモシンあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１２】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ１ａ含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、ｍｇ  ＦＷ植物バイオマスあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１３】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ１ａ含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μｇの組換えサルモシンあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１４】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ１ｂ含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、ｍｇ  ＦＷ植物バイオマスあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１５】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３６種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株に対するサルモシンＳｃｏｌＥ１ｂ含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μｇの組換えサルモシンあたりの任意単位（ＡＵ）で計算した（平均３回の独立の実験）。
【図１６】実施例で使用されるコリシンの発現のための、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づくウイルスベクターを概略的に示す図である。コリシン発現ベクターとしては、それぞれコリシンｃｏｌＳ４、ｃｏｌ５、ｃｏｌ１０、ｃｏｌＩａ、ｃｏｌＩｂおよびｃｏｌＭの発現のための、ｐＮＭＤ２５８５６、ｐＮＭＤ１５３１１、ｐＮＭＤ２５８４８、ｐＮＭＤ１９１４１、ｐＮＭＤ２５８６１およびｐＮＭＤ１０２２１が挙げられる。  ＲＢおよびＬＢは、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡのライトボーダーおよびレフトボーダーを示す。Ｐａｃｔ２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアクチン２遺伝子のプロモーター；ｏ：ＴＶＣＶの５’末端（カブ葉脈透化ウイルス）；ＲｄＲｐ：ｃｒ−ＴＭＶ（アブラナ感染性トバモウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＭＰ：ｃｒ−ＴＭＶ由来の移行タンパク質のＯＲＦ；ｃｏｌＳ４：コリシンＳ４のコード配列；ｃｏｌ５：コリシン５のコード配列；ｃｏｌ１０：コリシン１０のコード配列；ｃｏｌＩａ：コリシンＩａのコード配列；ｃｏｌＩｂ：コリシンＩｂのコード配列；ｃｏｌＭ：コリシンＭのコード配列；Ｎ：ｃｒ−ＴＭＶ由来の３’非翻訳領域；Ｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍノパリン合成酵素ターミネーター；ＲｄＲｐおよびＭＰのＯＲＦ中で灰色セグメントを中断している白色セグメントは、植物細胞の細胞質におけるＲＮＡレプリコン形成の可能性を高めるためにこれらのＯＲＦ中に挿入されたイントロンを示し、これは、ＷＯ２００５０４９８３９に詳細に記載されている。
【図１７】表５Ａおよび５Ｂに列挙される３５種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株（番号１〜３５）に対する、コリシン含有植物抽出物の特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験した。コリシン感受性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株のパーセンテージ（平均３回の独立の実験）をコリシン：１−コリシンＳ４；２−コリシン５；３−コリシン１０；４−コリシンＩａ；５−コリシンＩｂ；６−コリシンＭについて示す。
【図１８】コリシンＭ、コリシンＩａおよびコリシン５を含む３成分コリシン混合物での処理による、汚染したニワトリの胸肉片におけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞集団の減少を示す図である。肉は、それぞれ血清型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓのＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株ＡＴＣＣ（登録商標）１４０２８（商標）＊およびＡＴＣＣ（登録商標）１３０７６（商標）＊の２株混合物で汚染させた。星印は細菌数の統計的に有意な差を示す。
【図１９】コリシンＭ、コリシンＩａおよびコリシン５を含む３成分コリシン混合物での処理による、汚染したニワトリの胸肉片におけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ細胞集団の減少を示す図である。肉は、それぞれ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡｎａｔｕｍおよびＮｅｗｐｏｒｔのＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株ＡＴＣＣ（登録商標）１４０２８（商標）＊、ＡＴＣＣ（登録商標）１３０７６（商標）＊、ＡＴＣＣ（登録商標）９２７０（商標）＊およびＡＴＣＣ（登録商標）６９６２（商標）＊の４株混合物で汚染させた。星印は細菌数の統計的に有意な差を示す。
【図２０Ａ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａツール（Ｆａｓｔ、ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ．（２０１１年10月１１日）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９）を使用して作成した、サルモシンアミノ酸配列の複数配列のアラインメントを示す図である。ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔは、それぞれ配列番号１〜６を指す。色標識は、アミノ酸残基の性質を示す（ＡＶＦＰＭＩＬＷとしての赤色の残基（小型、疎水性および芳香族−Ｙ）；ＤＥとしての青色残基（酸性）；ＲＫとしてのマゼンタ残基（塩基性）およびＳＴＹＨＣＮＧＱとしての緑色残基（ヒドロキシルスルフヒドリルアミンおよびＧ））。コンセンサス記号＊（アステリスク）は、単一の完全に保存された残基を有する、アラインメント中の位置を示し、：（コロン）は強く類似した性質の群間の保存を示し、．（ピリオド）は弱く類似した性質の群間の保存を示す。
【図２０Ｂ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａツール（Ｆａｓｔ、ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ．（２０１１年10月１１日）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９）を使用して作成した、サルモシンアミノ酸配列の複数配列のアラインメントを示す図である。ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔは、それぞれ配列番号１〜６を指す。色標識は、アミノ酸残基の性質を示す（ＡＶＦＰＭＩＬＷとしての赤色の残基（小型、疎水性および芳香族−Ｙ）；ＤＥとしての青色残基（酸性）；ＲＫとしてのマゼンタ残基（塩基性）およびＳＴＹＨＣＮＧＱとしての緑色残基（ヒドロキシルスルフヒドリルアミンおよびＧ））。コンセンサス記号＊（アステリスク）は、単一の完全に保存された残基を有する、アラインメント中の位置を示し、：（コロン）は強く類似した性質の群間の保存を示し、．（ピリオド）は弱く類似した性質の群間の保存を示す。
【図２０Ｃ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａツール（Ｆａｓｔ、ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ．（２０１１年10月１１日）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９）を使用して作成した、サルモシンアミノ酸配列の複数配列のアラインメントを示す図である。ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔは、それぞれ配列番号１〜６を指す。色標識は、アミノ酸残基の性質を示す（ＡＶＦＰＭＩＬＷとしての赤色の残基（小型、疎水性および芳香族−Ｙ）；ＤＥとしての青色残基（酸性）；ＲＫとしてのマゼンタ残基（塩基性）およびＳＴＹＨＣＮＧＱとしての緑色残基（ヒドロキシルスルフヒドリルアミンおよびＧ））。コンセンサス記号＊（アステリスク）は、単一の完全に保存された残基を有する、アラインメント中の位置を示し、：（コロン）は強く類似した性質の群間の保存を示し、．（ピリオド）は弱く類似した性質の群間の保存を示す。
【図２１】安定な植物形質転換に使用されるＳｃｏｌＥ１ｂをコードするプラスミドコンストラクト（ｐＮＭＤ３５５４１）のＴ−ＤＮＡ領域の概略図である。Ｔ−ＤＮＡ領域は、１）カナマイシン抵抗性トランスジェニック植物の選択マーカーの構成的発現、２）ａｌｃＲ転写活性化因子の構成的発現、３）サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂのエタノール誘導性発現および４）ＴＭＶ  ＭＰのエタノール誘導性発現のための４つの発現カセットから構成される。矢印は発現カセットの方向を示す。非誘導性状態におけるウイルスレプリコン活性化の厳しい制御のために、ウイルスベクターは２成分、すなわちレプリコンおよびＭＰ（発現カセット３および４）に分解される（Ｗｅｒｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８、１４０６１〜１４０６６（２０１１）。ＬＢおよびＲＢ、それぞれバイナリーのレフトボーダーおよびライトボーダー；ＴｎｏｓおよびＰｎｏｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターおよびプロモーター；ＮＰＴＩＩ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；Ｐｓｔｌｓ、ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子のプロモーター；ａｌｃＲ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのａｌｃＲ  ＯＲＦ；Ｔａｃｔ２、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのアクチン２ターミネーター；Ｔ３５Ｓ、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター；３’ＴＭＶ、ＴＭＶの３’非翻訳領域；ＲｄＲｐ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ｐＡｌｃＡ、ＳｃｏｌＥ１ｂ、サルモシンＥ１ｂ（ＳｃｏｌＥ１ｂ）のコード配列；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアルコール脱水素酵素（ａｌｃＡ）プロモーター；ＭＰ、移行タンパク質；Ｔｏｃｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍオクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター；［  ］発現カセット３におけるＭＰの欠失。
【図２２】安定なトランスジェニックＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるサルモシンＳｃｏｌＥ１ｂの誘導性発現の結果を示す図である。粗抽出物のローディングは、（レーン１、３、５、７）非誘導性植物材料または（レーン２、４、６、８）エタノールでの誘導から４日目の植物材料からの、２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで抽出した３ｍｇ  ＦＷに相当する。（レーン１、２）Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  ＷＴ植物、（レーン３、４）、（レーン５、６）、（レーン７、８）Ｔ０世代の単一コピーＴ−ＤＮＡ挿入に対する異なるトランスジェニック植物候補（ＳｃｏｌＥ１ｂについて＃４、１２、３７）。矢印は組換えタンパク質に印を付ける。
【図２３】ＴＭＶまたはＴＭＶおよびＰＶＸベクターを保有するアグロバクテリアの注射器によるインフィルトレーションの際の、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｃｖ．Ｆｒｕｈｅｓ  Ｒｉｅｓｅｎｂｌａｔｔにおけるサルモシンの一過的発現の結果を示す図である。ＴＳＰ抽出物のローディングは、５倍容量の１５０ｍＭ  ＮａＣｌで抽出した３ｍｇ  ＦＷの植物材料に相当する。植物材料は、（ａ）ＳｃｏｌＥ１ｂについて５ｄｐｉ（インフィルトレーション後の日数）、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７およびＳｃｏｌＥ１ａについて６ｄｐｉもしくはＳｃｏｌＥ２について７ｄｐｉ、または（ｂ）ＳｃｏｌＥ１ｂについて４ｄｐｉ、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７およびＳｃｏｌＥ１ａについて５ｄｐｉならびにＳｃｏｌＥ２について６ｄｐｉ、または（ｄ）ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂについて８ｄｐｉに採取した。（ａ、ｂ、ｄ）解析抽出物は、ＳｃｏｌＥ２（レーン１）、ＳｃｏｌＥ３（レーン２）、ＳｃｏｌＥ７（レーン３）、ＳｃｏｌＥ１ａ（レーン４）およびＳｃｏｌＥ１ｂ（レーン５）を発現する植物材料から、または（ＷＴ）非トランスフェクト葉組織から調製した。ＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７はそれらのそれぞれの免疫タンパク質と共発現した。矢印は組換えタンパク質に印を付ける。
【図２４】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａおよびＥ．ｃｏｌｉビッグセブンＳＴＥＣ血清型に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＥ．ｃｏｌｉ由来のバクテリオシンの活性スペクトルを示す図である。表９に列挙される３６種（ａ、ｅ）もしくは３５種（ｂ、ｆ）のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株または表１０に列挙される７種のＥ．ｃｏｌｉビッグセブンＳＴＥＣ株（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ）に対する、（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）サルモシン−および（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）コリシン−含有植物抽出物のスポットオンローン法による放射拡散アッセイによる、特異的抗菌活性の半定量的評価。試験したすべての株に対して、バクテリオシン感受性株のパーセンテージ（ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）について、およびμｇの組換えタンパク質あたりの任意単位（ＡＵ）で計算される特異的バクテリオシン活性（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）について、Ｎ＝３およびＮ＝２の独立実験の平均およびＳＴＤＶをそれぞれ（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）および（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ）に示す。１−ＳｃｏｌＥ２（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはｃｏｌＳ４（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）；２−ＳｃｏｌＥ３（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはｃｏｌ５（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）；３−ＳｃｏｌＥ７（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはｃｏｌ１０（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）；４−ＳｃｏｌＥ１ａ（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはｃｏｌＩａ（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）；５−ＳｃｏｌＥ１ｂ（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）またはｃｏｌＩｂ（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）；６−ｃｏｌＭ（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）。
【図２５】サルモシンによる、新鮮なニワトリ胸肉の切り身におけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ汚染の減少を示す図である。（ａ）スプレー塗布によって汚染した肉の、サルモシン処理してからすぐに１０℃で様々な期間にわたって保存した際の肉から回収された細菌集団（０時間の黒色バー、初期汚染レベル；白色バー、担体処理；１時間、２４時間、４８時間および７２時間：ライトグレーバー、バクテリオシン処理、３ｍｇ／ｋｇ肉の濃度のＳｃｏｌＥ１ａ；灰色バー、バクテリオシン処理、３＋１＋１＋１ｍｇ／ｋｇ肉の濃度のＳｃｏｌＥ１ａ＋ＳｃｏｌＥ１ｂ＋ＳｃｏｌＥ２＋ＳｃｏｌＥ７；ダークグレーバー、バクテリオシン処理、０．３＋０．１＋０．１＋０．１ｍｇ／ｋｇ肉の濃度のＳｃｏｌＥ１ａ＋ＳｃｏｌＥ１ｂ＋ＳｃｏｌＥ２＋ＳｃｏｌＥ７）。エラーバーは生物学的反復、Ｎ＝４の標準偏差を示す。（ｂ）（ａ）で使用したニワトリの胸肉のトリム。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のタンパク質はＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を有するタンパク質であり、「サルモシン」と本明細書で言及される。サルモシンは、一般に、標的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞の表面受容体構造へのサルモシンの結合を可能にする結合ドメイン（「受容体結合ドメイン」とも称される）を少なくとも有する。サルモシンは、触媒ドメインまたは孔形成ドメインでもよい細胞傷害性ドメインをさらに有する。触媒ドメインはＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ触媒活性、細胞壁ペプチドグリカン（ムレイン）生合成に対する阻害活性を有し得、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞壁構造を分解することができる。さらに、サルモシンは、サルモシンが、その細胞傷害性機能を発揮する区画に移行するように、標的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞の膜タンパク質と相互作用することができる移行ドメインを有し得る。
【００１９】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対する特異性にとって、結合ドメインは重要であり、（特に）サルモシンを他の類似したコリシンから区別する。したがって、本発明のタンパク質は、上記の項目（１）または請求項１で定義されるアミノ酸配列セグメントのいずれか１つを含む、またはそれらからなる、またそれらに含まれる結合ドメインを少なくとも有することによって定義され得る。項目（１）または請求項１の項目（ａ−ｉ）から（ａ−ｖ）は、それぞれ、サルモシンＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂの結合ドメインを定義する。Ｓｐｓｔの結合ドメインは、請求項１の項目（ａ−ｖｉ）で定義されるアミノ酸配列セグメント中に含まれる。サルモシンＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１〜６として与えられる。上記の項目（１）の項目（ｂ）から（ｄ）は、誘導体結合ドメイン（またはアミノ酸配列セグメント）を有するか含む、ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔの誘導体を定義する。類似して、以下で定義される項目（ｂ）から（ｄ）、項目（Ｂ）から（Ｅ）および項目（α）から（δ）は、ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔの誘導体を定義する。ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔの誘導体は、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができる。本発明では、サルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂおよび本明細書で定義されるそれらの誘導体が好ましい。
【００２０】
本明細書では、アミノ酸配列セグメント（または、手短に言えばセグメント）は、セグメントよりも多くの数のアミノ酸残基を有するタンパク質またはポリペプチドの複数の連続的なアミノ酸残基を指す。ドメインは本明細書では、「アミノ酸配列セグメント」または手短に言えば「セグメント」とも称する。
【００２１】
本発明のタンパク質は、結合ドメインを少なくとも含む。項目（ｂ）から（ｄ）のそれぞれの以下の項目（ｉ）から（ｖ）は、好ましい結合ドメインを定義する。以下の項目（ｂ）から（ｄ）のそれぞれの項目（ｖｉ）、すなわちサブ項目（ｂ−ｖｉ）、（ｃ−ｖｉ）および（ｄ−ｖｉ）は、結合ドメインを含み、サルモシンＳｐｓｔの誘導体である、好ましいアミノ酸配列セグメントを定義する。本発明のタンパク質は、以下のアミノ酸配列セグメントのいずれか１つを好ましくは含む：
（ｂ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント。一実施形態では、配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２５０個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント；さらなる実施形態では、さらなる実施形態では、タンパク質は、配列番号６の（全）アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる；
または
（ｃ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント。一実施形態では、配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２５０個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント；さらなる実施形態では、タンパク質は、配列番号６の（全）アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる；
または
（ｄ−ｉ）ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して、１〜３０個、好ましくは１〜２９個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｖ）ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｖ）ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖｉ）配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。一実施形態では、配列番号６のＳｐｓｔの少なくとも２５０個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント；さらなる実施形態では、タンパク質は、配列番号６の（全）アミノ酸配列に対して、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質を提供し、前記タンパク質のアミノ酸配列は、上記の項目（ａ−ｉ）から（ａ−ｖｉ）、（ｂ−ｉ）から（ｂ−ｖｉ）、（ｃ−ｉ）から（ｃ−ｖｉ）、または（ｄ−ｉ）から（ｄ−ｖｉ）のいずれか１つで定義された通りである。
【００２３】
タンパク質が、アミノ酸置換、付加、挿入または欠失の数または数の範囲によって本明細書で定義される場合、アミノ酸置換、付加、挿入または欠失は組み合わされてもよいが、所与の数または数の範囲は、すべてのアミノ酸置換、付加、挿入および欠失の合計を指す。アミノ酸置換、付加、挿入および欠失の中で、アミノ酸置換、付加および欠失が好ましい。用語「挿入」は、参照配列の、すなわち、ＣまたはＮ末端における付加を除いたアミノ酸配列内の挿入に関する。付加という用語は、参照配列のアミノ酸配列のＣまたはＮ末端における付加を意味する。欠失は、参照配列の末端または内部のアミノ酸残基の欠失でもよい。本明細書では、タンパク質またはその任意のドメインが、セグメントの示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、付加、挿入または欠失の数または数の範囲によって定義される場合、さらなる実施形態では、タンパク質またはドメインは、セグメントの示されるアミノ酸配列に対して、１つからいくつかのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有し得る。
【００２４】
本発明のタンパク質の細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインは、上記の項目（３）で定義された通りでもよい。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、以下のアミノ酸配列セグメントのいずれか１つを含むか、それからなる細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む：
（ｂ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
（ｂ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（ｂ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するセグメント、
または
（ｃ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
（ｃ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（ｃ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するセグメント、
または
（ｄ−ｉ）’ＳｃｏｌＥ２（配列番号１）のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉ）’ＳｃｏｌＥ３（配列番号２）のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して１〜２０個、好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｉｉ）’ＳｃｏｌＥ７（配列番号３）のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して１〜２０個、好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｉｖ）’ＳｃｏｌＥ１ａ（配列番号４）のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（ｄ−ｖ）’ＳｃｏｌＥ１ｂ（配列番号５）のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（ｄ−ｖｉ）’Ｓｐｓｔ（配列番号６）のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。
【００２５】
本明細書では、任意の項目（ｘ−ｙ）’において、プライム‘は触媒ドメインまたはセグメントを示す。プライムを欠く項目（ｘ−ｙ）は、結合ドメインまたはセグメントを示す。ダブルプライム’’を保有する項目（ｘ−ｙ）’’は、転移ドメインまたはセグメントを示す。項目（ａ）から（ｄ）の中で、項目（ａ）、（ｂ）および（ｄ）のものが好ましく、項目（ａ）および（ｄ）がより好ましい。同様に、項目（ａ）’から（ｄ）’の中で、項目（ａ）’、（ｂ）’および（ｄ）’のものが好ましく、項目（ａ）’および（ｄ）’がより好ましい。同様に、項目（ａ）’’から（ｄ）’’の中で、項目（ａ）’’、（ｂ）’’および（ｄ）’’のものが好ましく、項目（ａ）’’および（ｄ）’’がより好ましい。
【００２６】
本発明のタンパク質が、本明細書で定義される結合ドメインおよび本明細書で定義される触媒ドメインを含む場合、上記で定義された任意の結合ドメイン（またはセグメント）は、任意の触媒ドメイン（またはセグメント）と組み合わされてもよい。好ましい実施形態では、（ｉ）から（ｖｉ）の任意のサブ項目の結合ドメインは、それぞれ、サブ項目（ｉ）’から（ｖｉ）’の触媒ドメインと組み合わされ、それによって、触媒ドメインはタンパク質のＣ末端側に存在し得る。一実施形態では、任意の項目（ａ）から（ｄ）の結合ドメインは、それぞれ、項目（ａ）’から（ｄ）’の触媒ドメインと組み合わされ、それによって、触媒ドメインはタンパク質のＣ末端側に存在し得る。
【００２７】
ある種の実施形態では、本発明のタンパク質は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができ得、該タンパク質は、アミノ酸配列セグメントの以下の組み合わせの少なくとものいずれか１つを、好ましくはタンパク質のＮ末端からＣ末端への所与の順序で含む：
（α−ｉ）配列番号１のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントおよび配列番号１のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメント、
（α−ｉｉ）配列番号２のＳｃｏｌＥ３のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントおよび配列番号２のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメント、
（α−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントおよび配列番号３のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメント、
（α−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントおよび配列番号４のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメント、
（α−ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントおよび配列番号５のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメント、もしくは
（α−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントを含む、配列番号６の少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメント、
または
（β−ｉ）配列番号１のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号１のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（β−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号２のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（β−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも７７％の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号３のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（β−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号４のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
（β−ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号５のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、もしくは
（β−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメントを含む、配列番号６の少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するセグメント、
または
（χ−ｉ）配列番号１のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して少なくとも８５％の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号１のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（χ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号２のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（χ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して少なくとも８５％の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号３のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（χ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号４のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
（χ−ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号５のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、もしくは
（χ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメントを含む、配列番号６の少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するセグメント、
または
（δ−ｉ）配列番号１のアミノ酸残基３１６〜４４９のセグメントに対して１〜２５個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号１のアミノ酸残基４５３〜５８２のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（δ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基３１５〜４８３のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号２のアミノ酸残基５０１〜５８４のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（δ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基３１８〜４５１のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号３のアミノ酸残基４５５〜５８４のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（δ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１７４〜２９７のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号４のアミノ酸残基３０６〜４７８のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
（δ−ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１９８〜３２２のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号５のアミノ酸残基３５０〜５２２のセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
（δ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１１２〜２８８のセグメントに対して１〜３０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントを含む、配列番号６の少なくとも２００個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して１〜４０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。
【００２８】
これらすべての実施形態は、本明細書で定義されるそれぞれのセグメントの、最小配列同一性もしくは類似性についての好ましい値、またはアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失の好ましい数と組み合わされてもよい。
【００２９】
上記の項目（４）は、ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、Ｓｃｏｌ  Ｅ７、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥｂの転移ドメインおよびそれらの誘導体を定義する。転移ドメインおよびそれらの誘導体の定義は、細胞傷害性ドメインおよび結合ドメインまたはそれらの誘導体の定義と組み合わされてもよい。転移ドメインおよびそれらの誘導体の定義は、特に以下で定義されるタンパク質の定義と組み合わされてもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質は、項目（ａ−ｉ）から（ａ−ｖｉ）のいずれか１つによる、または項目（ｂ−ｉ）から（ｂ−ｖｉ）、（ｃ−ｉ）から（ｃ−ｖｉ）もしくは（ｄ−ｉ）から（ｄ−ｖｉ）の誘導体のいずれかによる、結合ドメイン（または結合セグメント）を有し得る。任意のそのような結合ドメインは、いずれか１つの項目（ａ−ｉ）’から（ａ−ｖｉ）’、（ｂ−ｉ）’から（ｂ−ｖｉ）’、（ｃ−ｉ）’から（ｃ−ｖｉ）’または（ｄ−ｉ）’から（ｄ−ｖｉ）’による触媒／細胞傷害性ドメインと組み合わされてもよい。サルモシンのドメイン構造は、本発明の様々なサルモシン由来のドメインまたは本明細書で定義されるそれらの誘導体が組み合わされて新規なサルモシン（キメラサルモシン）を形成する、人工サルモシンの確立を可能にする。そのようなキメラサルモシンでは、Ｎ末端からＣ末端に、転移ドメイン（存在すれば）、結合ドメインおよび触媒または活性ドメインの、天然サルモシンのドメイン配列は維持されても、されなくてもよく、好ましくは、これは維持される。したがって、本発明のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、項目（ａ−ｉ）から（ａ−ｖｉ）のいずれか１つの、または項目（ｂ−ｉ）から（ｂ−ｖｉ）、（ｃ−ｉ）から（ｃ−ｖｉ）もしくは（ｄ−ｉ）から（ｄ−ｖｉ）の誘導体のいずれかによる結合ドメイン、および項目（ａ−ｉ）’から（ａ−ｖｉ）’、（ｂ−ｉ）’から（ｂ−ｖｉ）’、（ｃ−ｉ）’から（ｃ−ｖｉ）’または（ｄ−ｉ）’から（ｄ−ｖｉ）’のいずれか１つの触媒ドメイン（セグメント）を含む。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、項目（ａ−ｉ）’’から（ａ−ｖ）’’、（ｂ−ｉ）’’から（ｂ−ｖ）’’、（ｃ−ｉ）’’から（ｃ−ｖ）’’または（ｄ−ｉ）’’から（ｄ−ｖ）’’のいずれか１つの転移ドメイン、項目（ａ−ｉ）から（ａ−ｖｉ）のいずれか１つの、または項目（ｂ−ｉ）から（ｂ−ｖｉ）、（ｃ−ｉ）から（ｃ−ｖｉ）もしくは（ｄ−ｉ）から（ｄ−ｖｉ）の誘導体のいずれかによる結合ドメイン、および項目（ａ−ｉ）’から（ａ−ｖｉ）’、（ｂ−ｉ）’から（ｂ−ｖｉ）’、（ｃ−ｉ）’から（ｃ−ｖｉ）’または（ｄ−ｉ）’から（ｄ−ｖｉ）’のいずれか１つの触媒ドメイン（セグメント）を含む。
【００３１】
サルモシンの３種の細胞傷害性活性、ヌクレアーゼ、孔形成およびムラミダーゼ（表１）内で、ドメインは、同じタイプの細胞傷害活性のサルモシン間で好ましくは交換される。例えば、ＲＮａｓｅタイプの細胞傷害性を有する新規サルモシンは、ＳｃｏｌＥ２またはＳｃｏｌＥ７の移行ドメインおよび結合ドメイン（または、これらのドメインの誘導体）ならびにＳｃｏｌＥ３の細胞傷害性ドメインから形成されてもよい。しかし、好ましくは、サブ項目（ｉ）から（ｖｉ）の結合ドメインは、天然サルモシンに対する類似性を高めるために、それぞれ、サブ項目（ｉ）’から（ｖｉ）’の触媒ドメインと、好ましくは、項目（ａ）から（ｄ）のいずれかのそれぞれと組み合わされる。しかし、より好ましくは、サブ項目（ｉ）から（ｖ）の結合ドメインは、天然サルモシンに対する類似性を高めるために、好ましくは、項目（ａ）から（ｄ）のいずれかの、それぞれサブ項目（ｉ）’から（ｖ）’の触媒ドメイン、およびそれぞれサブ項目（ｉ）’’から（ｖ）’’の転移ドメインと組み合わされる。
【００３２】
本発明は、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質も提供し、前記タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、それからなる：
（Ａ−ｉ）配列番号１、
（Ａ−ｉｉ）配列番号２、
（Ａ−ｉｉｉ）配列番号３、
（Ａ−ｉｖ）配列番号４、
（Ａ−ｖ）配列番号５、もしくは
（Ａ−ｖｉ）配列番号６、
または
（Ｂ−ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９３％、より一層好ましくは少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（Ｂ−ｖ）配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
（Ｂ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または
（Ｃ−ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
（Ｃ−ｖ）配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、もしくは
（Ｃ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列、
または
（Ｄ−ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列に対して１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
（Ｄ−ｖ）配列番号５のアミノ酸配列に対して１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
（Ｄ−ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
または
（Ｅ−ｉ）配列番号１の少なくとも４７０個、好ましくは少なくとも５２５個、より好ましくは少なくとも５５５個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｉｉ）配列番号２の少なくとも４７０個、好ましくは少なくとも５２５個、より好ましくは少なくとも５５５個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも４７０個、好ましくは少なくとも５２５個、より好ましくは少なくとも５５５個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｉｖ）配列番号４の少なくとも３９０個、好ましくは少なくとも４３５個、より好ましくは少なくとも４６０個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
（Ｅ−ｖ）配列番号５の少なくとも４２５個、好ましくは少なくとも４７５個、より好ましくは少なくとも５００個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
（Ｅ−ｖｉ）配列番号６の少なくとも２５０個、好ましくは少なくとも２７０個、より好ましくは少なくとも２８２個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質を提供し、前記タンパク質のアミノ酸配列は、項目（Ａ−ｉ）から（Ａ−ｖｉ）、（Ｂ−ｉ）から（Ｂ−ｖｉ）、（Ｃ−ｉ）から（Ｃ−ｖｉ）、（Ｄ−ｉ）から（Ｄ−ｖｉ）または（Ｅ−ｉ）から（Ｅ−ｖｉ）のいずれか１つで定義された通りである。
【００３４】
配列番号１〜６の全配列に関するタンパク質の上記の定義は、利用可能な場合、１つまたは複数の特定のドメイン、例えば、結合および／もしくは触媒もしくは細胞傷害性ドメインならびに／または転移ドメインに基づいて、タンパク質の上記の定義と組み合わされてもよい。
【００３５】
本明細書では、配列同一性および類似性の決定は、Ａｌｉｇｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ２．６．１＋）（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ  ＭｉｌｌｅｒおよびＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２．）を使用して行われる。
【００３６】
項目（ｂ）から（ｄ）、（ｂ）’から（ｄ）’、（ｂ）’’から（ｄ）’’、または項目（Ｂ）から（Ｄ）もしくは（Ｅ）において上記で定義された本発明のドメインおよび／またはタンパク質の誘導体は、上記で定義された実施形態によって可能になる配列多様性にもかかわらず、以下で定義されるアミノ酸残基を保存し得る。好ましい実施形態では、アミノ酸残基（複数可）は、以下のものに対応する。
配列番号４の残基１２５はＡｓｎもしくはＳｅｒである；
配列番号４の残基１４５はＬｙｓもしくはＡｒｇである；
配列番号４の残基１５１はＡｌａもしくはＧｌｙである；
配列番号４の残基１５４はＡｌａ、ＳｅｒもしくはＧｌｙである；
配列番号４の残基１５５はＰｈｅ、ＬｅｕもしくはＩｌｅである；
配列番号４の残基１５８はＡｌａもしくはＧｌｙである；
配列番号４の残基１６３はＧｌｕ、ＡｓｐもしくはＳｅｒである；
配列番号４の残基１６５はＡｌａ、ＴｈｒもしくはＶａｌである；
配列番号４の残基１６７はＡｒｇである；
配列番号４の残基１７２はＴｈｒ、ＡｌａもしくはＳｅｒである；
配列番号４の残基１７５はＧｌｎである；
配列番号４の残基１７６はＶａｌもしくはＬｅｕである；
配列番号４の残基１７８はＧｌｎである；
配列番号４の残基１８１はＧｌｕもしくはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕである；
配列番号４の残基１８４はＡｒｇもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｒｇである；
配列番号４の残基１９２はＡｌａもしくはＴｈｒである；
配列番号４の残基１９５はＡｌａもしくはＶａｌである；
配列番号４の残基１９６はＧｌｕもしくはＧｌｎ、好ましくはＧｌｕである；
配列番号４の残基１９８はＡｌａもしくはＴｈｒである；
配列番号４の残基２０９はＬｅｕもしくはＩｌｅ、好ましくはＬｅｕである；
配列番号４の残基２７３はＬｅｕもしくはＩｌｅである；
配列番号４の残基２８０はＡｒｇである；
配列番号４の残基２８３はＬｙｓである；
配列番号４の残基２８６はＧｌｎもしくはＬｙｓである；
配列番号４の残基２９０はＡｌａもしくはＴｈｒである；
配列番号４の残基２９９はＡｓｐ、ＡｓｎもしくはＧｌｕである；
配列番号４の残基３０１はＬｅｕである；
配列番号４の残基３０２はＡｓｎもしくはＡｓｐである；
配列番号４の残基３４６はＡｓｎ、ＡｓｐもしくはＧｌｕである；
配列番号４の残基３６３はＬｙｓもしくはＡｓｎである；または
配列番号４の残基３６４はＬｙｓもしくはＧｌｎである。
【００３７】
表現「アミノ酸残基…に対応するアミノ酸残基（複数可）」は、図２０Ａ〜Ｃに示すアラインメントを指し、配列番号４のアミノ酸残基、または前記アラインメントにおいて配列番号４の示されるアミノ酸残基と同じ位置（すなわち、互いに上部に書かれている）を有する配列番号１〜３、５もしくは６のアミノ酸残基を意味する。
【００３８】
ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂの誘導体ならび／またはＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂの誘導体ドメインでは、図２０のＳｃｏｌＥ１ａとＳｃｏｌＥ１ｂのアラインメント中で同じである対応するアミノ酸残基は、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂと同じアミノ酸残基であり得、ならびに／またはＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂの中で異なるアミノ酸残基に対応する場合、そのような異なるアミノ酸残基のいくつかまたはすべては、ＳｃｏｌＥ１ａまたはＳｃｏｌＥ１ｂと同様のアミノ酸残基であり得る（しかし、別のアミノ酸残基ではない）。
【００３９】
ＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の誘導体ならびに／またはＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の誘導体ドメインでは、図２０のＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７のアラインメントで同じである対応するアミノ酸残基は、ＳｃｏｌＥ２もしくはＳｃｏｌＥ７と同じアミノ酸残基であり得、ならびに／またはＳｃｏｌＥ２とＳｃｏｌＥ７の中で異なるアミノ酸残基に対応する場合は、そのような異なるアミノ酸残基のいくつかまたはすべては、ＳｃｏｌＥ２またはＳｃｏｌＥ７と同様のアミノ酸残基であり得る（しかし、別のアミノ酸残基ではない）。
【００４０】
本発明によるサルモシンは、付加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸配列ストレッチ、例えば精製用タグを、例えば６個以上の連続的なヒスチジン残基のＨｉｓタグとして、含むことができ、該誘導体は、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸残基付加を有さない。
【００４１】
本発明のタンパク質（サルモシン）は、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、特に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、より好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａに対して、細胞傷害性作用を発揮することができる。この条件が満たされるかどうかは、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して実験的に試験することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａに対する、試験されるタンパク質の細胞傷害性は、感受性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ株のｃｍ２あたり１×１０７ｃｆｕ／ｍＬの０．１４ｍＬ細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、５マイクロリットルの前記試験されるタンパク質および配列番号１のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後３７℃で寒天プレートをインキュベートしてから１２時間後に、前記タンパク質および配列番号１のタンパク質が、同じ直径の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｎｅｗｐｏｒｔ株ＡＴＣＣ（登録商標）６９６２（商標）＊の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成するというようなものであり、試験されるタンパク質の濃度は、タンパク質配列番号１の比較溶液のものの最大で５倍である。好ましい実施形態では、参照のポイントは配列番号１のタンパク質ではなく、その他の点では同一の条件下での配列番号４または５のタンパク質である。
【００４２】
本発明の組成物は、上記のタンパク質（サルモシン）および場合により、必要に応じて担体などのさらなる成分を含む。組成物は、好ましくは、ＳｃｏｌＥ１ａおよび／もしくはＳｃｏｌＥ１ｂまたは上記のその誘導体、ならびに場合により、必要に応じて担体などのさらなる成分を含む。組成物は、本明細書で定義される１種または複数の異なるタンパク質（サルモシン）、例えば、本明細書で定義される２種、３種または４種の異なるタンパク質（サルモシン）を含むことができる。「異なる」は、タンパク質が、少なくとも１つのアミノ酸残基が異なることを意味する。組成物は、上記の項目（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つによって代表される同じクラス由来の、または、好ましくは、上記の項目（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つによって代表される異なるクラス由来の、２種、３種またはそれ以上のサルモシンを含むことができる。組成物は、クラス（ｉ）のタンパク質およびクラス（ｉｖ）または（ｖ）のタンパク質を少なくとも含むことができる。組成物は、例えば、ＥＨＥＣなどの病原性Ｅ．ｃｏｌｉを同時に制御するために、例えば、ＥＰ３０９７７８３Ａ１に記載されているような１種または複数のＥ．ｃｏｌｉコリシンまたはその誘導体をさらに含むことができる。
【００４３】
本発明のタンパク質は植物またはその細胞における発現によって好ましくは生成されるので、組成物は植物材料またはその抽出物でもよく、植物材料は、本タンパク質を発現した植物、好ましくは、前記タンパク質を発現したＮｉｃｏｔｉａｎａまたは食用植物由来の材料である。植物材料の抽出物は、前記植物材料中に存在するか、前記植物材料中で発現している本発明のサルモシンを含めた水溶性タンパク質を含む水溶液であるか、そのような水溶液の乾燥生成物である。抽出物は、好ましくは、例えば濾過または遠心分離によって除去される、植物材料の水不溶性成分を有する。植物材料は、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、サトウダイコン、リーフィービート、アマランス、Ｎｉｃｏｔｉａｎａからなる群から選択される植物由来の材料でもよく、および／または前記植物材料は、１つもしくは複数の葉、根、塊茎もしくは種子、もしくは前記葉、根、塊茎もしくは種子の破砕された、製粉された、もしくは粉砕された生成物である。
【００４４】
組成物または植物材料からの前記抽出物は、前記サルモシン（複数可）を含む固体または液体組成物、例えば、溶液または分散体でもよい。液体組成物は、水性、例えば水溶液でもよい。前記水性分散体または溶液中の前記タンパク質の濃度は、０．０００１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００５〜０．０５ｍｇ／ｍｌでもよい。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して細胞傷害性作用を発揮することができる１種より多いサルモシンが用いられる場合、これらの濃度はすべてのそのようなサルモシンの合計濃度に関する。
【００４５】
水溶液は、１種または複数のサルモシンの他に、バッファーを含むことができる。バッファーは、無機酸もしくは有機酸またはそれらの塩でもよい。無機酸の例はリン酸またはその塩である。有機酸の例は、ＨＥＰＥＳ、酢酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、桂皮酸、グリコール酸、乳酸、クエン酸およびアスコルビン酸である。好ましい有機酸は、リンゴ酸、乳酸、クエン酸およびアスコルビン酸である。溶液のｐＨは一般に、４〜８、好ましくは５〜８、より好ましくは６．０〜７．５でもよい。組成物が適用される対象物が肉である場合、溶液のｐＨは、一般に、４〜８、好ましくは４．５〜７、より好ましくは５．０〜６．５、さらにより好ましくは５．０〜６．０でもよい。さらに、溶液は、グリセロールまたは塩などの等張剤を含むことができる。使用するのに好ましい塩は塩化ナトリウムである。１種または複数のサルモシンを含む水溶液は、さらなる溶質、例えば塩、例えば、５０〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは１００〜２００ｍＭ  ＮａＣｌを含むことができる緩衝化水溶液でもよい。水溶液は、スルフヒドリル化合物、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、チオエタノールまたはグルタチオン、好ましくはＤＴＴをさらに含むことができる。水溶液中のスルフヒドリル化合物の合計の濃度は、１〜５０ｍＭ、好ましくは２〜２０ｍＭ、より好ましくは４〜１０ｍＭでもよい。
【００４６】
本発明の組成物が固体組成物である場合、それは、上述の抽出物または溶液の凍結乾燥により得られる凍結乾燥化固体組成物などの粉末でもよい。粉末は、水溶液について上述したものなどのさらなる固体成分を含むことができる。使用前に、これは、適切な液体、例えば水またはバッファーで再構成され得る。固体組成物は、バッファー、塩または前述の他の成分を含むことができ、その結果、固体組成物の再構成または溶解の際に、上述される濃度が達成され得る。
【００４７】
組成物の担体の例は、溶媒、例えば水または水性バッファー（上記の通り）、塩、糖、例えば単糖類および二糖類、糖アルコール、ならびに他の担体、例えば医薬組成物で既知であるものである。後者の例は、デンプン、セルロースおよび他のタンパク質、例えばアルブミンである。糖の例は、グルコース、フルクトース、ラクトース、ショ糖およびマルトースである。
【００４８】
本発明の組成物は、組成物中のタンパク質の総重量に基づいて、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも２０重量％、より好ましくは少なくとも３０重量％、より一層好ましくは少なくとも５０重量％、より一層好ましくは少なくとも７５重量％の１種または複数の本発明のサルモシンを含むことができる。組成物中のサルモシン（複数可）含量は、組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、染色後に、ゲルのバンドの強度を決定することによって得られたゲルを解析することによって、決定され得る。それによって、サルモシンによるバンドの強度が、組成物中のすべてのタンパク質によるバンドの強度の合計に対して決定され得る。組成物中の全タンパク質含量は、周知のブラッドフォードプロテインアッセイを使用して決定され得る。
【００４９】
一実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、本発明の１種または複数のサルモシン（複数可）の他に、場合により、Ｅ．ｃｏｌｉコリシンおよび／または１種もしくは複数の医薬的に許容可能な適切な賦形剤を含むことができる。
【００５０】
本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法であって、１種または複数の上記のタンパク質（サルモシン）または上記の組成物と前記対象物を接触させることを含む方法を提供する。対象物は、任意の非有機対象物または有機対象物、例えば食品の表面でもよい。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の汚染は、対象物への生存可能なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞の付着を意味する。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる汚染を減少させることは、対象物に付着している生存可能なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞の数を減らすことを意味する。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる対象物の汚染の確認は、一般的知識の一部である。例えば、実施例で行われるような、ホモジナイズした食品の溶液もしくは分散体の希釈プレーティング、または他の対象物の水洗溶液の希釈プレーティングを使用することができ、それに続いて細菌コロニーを数える。好ましくは、対象物は食品または動物飼料である。食品は、肉、例えば、家禽の死体全体、生肉、調理肉および挽肉、卵、例えば、生卵、全卵、殻をむいた調理卵、炒り卵、目玉焼き、生の果物、または生のもしくは調理された野菜でもよい。
【００５１】
対象物を前記タンパク質もしくは組成物で処理する、または前記タンパク質もしくは組成物と接触させるために、上記のタンパク質の溶液または液体組成物は、一般に対象物と接触させられる。例えば、前記対象物は、本発明の組成物としての水溶液で噴霧されるか、または水溶液中に浸漬される。対象物は、少なくとも１０秒間、好ましくは少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、水溶液中に浸されてもよい。対象物を液体組成物と接触させることは、対象物の表面上に組成物を分布させるのに役立つ。十分に均一な分布を達成することができる場合、例えば、肉を細かく切ると、本発明による固体組成物と対象物を接触させることが可能である。
【００５２】
本発明は、それらを必要とする対象のＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる感染を処置する方法であって、１種または複数の上記のタンパク質（サルモシン）または上記の組成物を前記対象に投与することを含む方法も提供する。対象は、ヒトまたは哺乳動物、例えば家畜でもよい。家畜の例は家禽およびウシである。一般に、サルモシン（複数可）および場合により上記のさらなる成分を含む液体または固体の医薬組成物は、動物またはヒトに投与するために調製される。液体組成物は上記の水溶液でもよい。固体組成物は、例えば凍結乾燥形態の、少なくとも１種のサルモシン（複数可）を含む粉末、またはそのような粉末から得られる錠剤、またはそのような粉末で満たされたカプセルでもよい。投与は経口でもよい。この場合、医薬調製物は、胃の酸媒体によって攻撃されることなしに胃の通過を可能にするものである。次いで、サルモシン（複数可）は、腸で医薬調製物から放出されなければならない。そのような医薬調製物は当技術分野で既知である。例は、胃の酸媒体に抵抗性の錠剤およびカプセルである。生物材料、例えば、発現されたサルモシン（複数可）を含むＥ．ｃｏｌｉまたは植物材料を経口的に患者に投与することがさらに可能である。サルモシン（複数可）は、ヒト患者に対して１日あたり１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１日あたり１０ｍｇ〜２５０ｍｇの量で、ヒトの成人に投与され得る。そのような量はまた、動物に投与されてもよい。プロバイオティックアプローチでは、少なくとも１種のサルモシン（複数可）を発現する遺伝子修飾微生物を患者に投与することによって、患者は処置され得る。遺伝子修飾微生物は、遺伝子修飾された非病原性Ｅ．ｃｏｌｉまたは乳製品の発酵で一般に用いられる乳酸産生微生物でもよい。乳酸産生微生物の例は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。別の投与経路は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる感染を予防するための、患者の血流中への注射による。この目的のために、サルモシン（複数可）は生理食塩水中に溶解されてもよく、この溶液は無菌化される。
【００５３】
上記の方法では、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａである。
【００５４】
サルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂは、以下の実施例で実証されるように、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの、特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａの、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａの多くの異なる血清型に対して特に広い活性を有する。したがって、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂまたはそれらの誘導体は、好ましくは、任意のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、好ましくは任意のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａによる感染を処置する、またはこれらによる汚染を予防するもしくは減少させるのに使用される。サルモシンＥ２、Ｅ３、Ｅ７およびＳｐｓｔも標的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して広い活性を有する。しかし、ＳｃｏｌＥ２およびそれらの誘導体は、表５Ａおよび５Ｂで定義される株１、３、４、１５、２０、２２〜３０に対して好ましくは使用され得る。ＳｃｏｌＥ３およびそれらの誘導体は、表５Ａおよび５Ｂで定義される株１、３、４、１７および２０〜２５に対して好ましくは使用され得る。ＳｃｏｌＥ７およびそれらの誘導体は、表５Ａおよび５Ｂで定義される株１、３、４、５、１５、２０、２２〜３０および３２に対して好ましくは使用され得る。
【００５５】
本発明によるサルモシンは、標準的な発現系におけるタンパク質発現の既知の方法によって生成されてもよい。サルモシンを生成するためには、それをコードするヌクレオチド配列が適切な宿主生物で発現され得る。目的のタンパク質を生成および精製するのに使用可能な方法は従来技術で説明されており、任意のそのような方法が使用され得る。例えば、一般に当技術分野で既知のＥ．ｃｏｌｉ発現系が使用され得る。真核生物の発現系が使用される場合、クローニングに使用される細菌生物に対する毒性を予防するために、サルモシンのコード配列中に１種または複数のイントロンが挿入され得る。
【００５６】
特に効率的な発現方法は、従来技術でも知られている植物発現系である。本発明によるサルモシンを発現させるのに使用可能な植物発現系は実施例に記載されている。植物において目的のヌクレオチド配列の発現を達成する可能な方法は、サルモシンをコードするヌクレオチド配列を含む自己複製（ウイルス）レプリコンの使用である。サルモシンのコード配列は、植物または発現宿主として使用される特定の植物における発現のためにコドン最適化されてもよい。植物ウイルス発現系は、多くの刊行物、例えば、ＷＯ２０１２０１９６６０、ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ２００６０１２９０６、ＷＯ０２１０１００６、ＷＯ２００７１３７７８８またはＷＯ０２０６８６６４に記載されており、多くのさらなる刊行物がこれらの文献で引用されている。一過的発現のために、ＤＮＡ分子などの核酸分子を植物または植物部分に導入するための様々な方法は、既知である。アグロバクテリアは、例えば、アグロインフィルトレーションまたはアグロバクテリア懸濁液のスプレーによって、核酸分子（ベクター）または核酸コンストラクトを植物にトランスフェクトするのに使用され得る。参考文献については、ＷＯ２０１２０１９６６０、ＷＯ２０１４１８７５７１，またはＷＯ２０１３１４９７２６を参照されたい。
【００５７】
目的のタンパク質としてのサルモシンの強い発現が所望される実施形態では、サルモシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトは、植物細胞中で複製してウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードすることができる。複製するために、ウイルスベクターおよびレプリコンは、植物細胞中に存在する核酸ポリメラーゼによって、例えば、レプリコンから発現されたウイルスポリメラーゼによって認識され得る複製開始点を含むことができる。ＲＮＡウイルスベクター（「ＲＮＡレプリコン」と称される）の場合は、レプリコンは、植物細胞の核にＤＮＡコンストラクトが導入された後に、植物細胞におけるプロモーター活性の制御下にある転写によって、ＤＮＡコンストラクトから形成され得る。ＤＮＡレプリコンの場合は、レプリコンは、例えば、ＷＯ００／１７３６５およびＷＯ９９／２２００３に記載されているように、ＤＮＡコンストラクト中のウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２つの組換え部位間の組換えによって形成され得る。レプリコンがＤＮＡコンストラクトにコードされる場合は、ＲＮＡレプリコンが好ましい。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡまたはＲＮＡレプリコン）の使用は、長年にわたって文献に広範に記載されている。いくつかの実施例は以下の特許公報である：ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００７１３７７８８、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ０２０９７０８０、ＷＯ０２０８８３６９、ＷＯ０２０６８６６４。ＤＮＡウイルスベクターの例は、ジェミニウイルスに基づくものである。本発明については、ウイルスベクターまたはレプリコンは、植物ＲＮＡウイルス、特にプラス−センス一本鎖ＲＮＡウイルスに基づくものが好ましくは使用され得る。したがって、ウイルスレプリコンはプラス−センス一本鎖ＲＮＡレプリコンでもよい。そのようなウイルスベクターの例は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびポルテクスウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づくものである。「に基づく」は、ウイルスベクターがレプリカーゼおよび／またはこれらのウイルスの複製に関与する他のタンパク質などの複製系を使用することを意味する。ポルテクスウイルスに基づくウイルスベクターおよび発現系は、ＥＰ２０６１８９０またはＷＯ２００８／０２８６６１に記載されている。
【００５８】
サルモシンは多細胞植物またはその一部、特に、高等植物またはその一部で発現され得る。単子葉植物と双子葉（作物）植物の両方が使用され得る。目的のタンパク質を発現させるのに使用可能な一般的な植物としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、ホウレンソウ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クレソン、アルグラ、カラシナ、イチゴ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ、レタス、ヒマワリ、キュウリ、ハクサイ、キャベツ、ニンジン、ネギ、タマネギ、ダイコン、レタス、フィールドピー、カリフラワー、ブロッコリー、ゴボウ、カブ、トマト、ナス、カボチャ、スイカ、プリンスメロンおよびメロンが挙げられる。好ましい植物は、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、サトウダイコン、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａである。食用植物における発現は、植物またはそれから作られた食品のＳａｌｍｏｎｅｌｌａによる汚染を予防するのに使用され得る。一実施形態では、通常はヒトまたは動物のフードチェーンに入らない植物、例えば、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍおよびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａなどのＮｉｃｏｔｉａｎａ種が使用される。
【００５９】
一般に、目的のタンパク質としてのサルモシンは、植物または植物部分の細胞サイトゾルで発現される。この場合、目的のタンパク質を特定の区画に導くシグナルペプチドはタンパク質に加えられない。あるいは、目的のタンパク質は植物の葉緑体で発現され得るか、そこにターゲッティングされ、後者では、プラスチドトランジットペプチドまたは葉緑体ターゲティングペプチドと一般に称されるＮ末端プレ配列が、目的のタンパク質としてのサルモシンのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に加えられる。
【００６０】
サルモシンは、植物組織に対する毒性を防ぐために、特にサルモシンがヌクレアーゼ活性を有する場合、実験セクションに記載されている免疫タンパク質とともに共発現され得る。共発現される得る適切な免疫タンパク質は、以下の表２に示されるものである。
【００６１】
少なくとも１種のサルモシンを含む組成物を生成する方法では、サルモシンは、第１ステップでは、植物または植物の細胞、例えば食用植物中で発現される。次のステップでは、サルモシンを発現した植物から発現サルモシンを含む植物材料が採取される。植物材料は、例えば、葉、根、塊茎もしくは種子、または葉、根、塊茎もしくは種子の破砕された、製粉された、もしくは粉砕された生成物でもよい。ステップ（ｉｉｉ）では、水性バッファーを使用してサルモシンが植物材料から抽出される。これは、植物材料がホモジナイズされること、および遠心分離または濾過によって不溶性物質が除去され得ることを含むことができる。サルモシンを含む可溶性成分は水性バッファー中に抽出されて、水性バッファー中のサルモシン溶液をもたらす。水性バッファーは、無機酸もしくは有機酸またはそれらの塩を含むことができ、本発明の組成物としての水溶液について上記で定義されたｐＨを有し得る。さらに、水性バッファーは、同様に本発明の組成物としての水溶液について上に記載した塩および／またはスルフヒドリル化合物を含むことができる。比較的純粋のサルモシン組成物が所望される場合、水性バッファー中のサルモシン溶液は、タンパク質精製の既知の方法に従ってステップ（ｉｖ）で望ましくない成分を除去することによって、さらに精製され得る。
【００６２】
したがって、本発明は、本発明によるタンパク質を含む組成物を生成する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）上記の植物、好ましくは食用植物またはＮｉｃｏｔｉａｎａ中で前記タンパク質を発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物から発現タンパク質を含む植物材料を採取するステップ、
（ｉｉｉ）水性バッファーを使用して前記植物材料から前記タンパク質を抽出して、前記タンパク質を含む組成物を得るステップ、
場合により、前記組成物から望ましくない混入物を除去するステップ
を含む。
【００６３】
サルモシンが植物で発現される場合、タンパク質を発現する植物またはその組織が採取され、組織はホモジナイズされてもよく、不溶性物質は遠心分離または濾過によって除去されもよい。比較的純粋なサルモシンが所望される場合、サルモシンは他の宿主細胞タンパク質および植物代謝産物、例えば、アルカロイドおよびポリフェノールを除去することができるタンパク質精製の一般に既知の方法によって、例えば、クロマトグラフィー方法によって、さらに精製されてもよい。精製されたサルモシン溶液は、濃縮および／または凍結乾燥されてもよい。
【００６４】
サルモシンが食用植物中で発現される場合は、食用植物からの粗製タンパク質抽出物または半精製された濃縮物が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる食品などの対象物の汚染を予防するまたは減少させるのに使用され得る。
【実施例】
【００６５】
実施例１：プラスミドコンストラクト（サルモシン）
４つの活性群を代表する６種のサルモシンを選択した（表１）。
【００６６】
【表１】
2020513822.tif 000002
【００６７】
このリストは、サルモシンＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｐｓｔを含む。それぞれのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋから取得し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａについて最適化されたコドン使用頻度を有する対応するヌクレオチド配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．が合成した。サルモシンＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３およびＳｃｏｌＥ７の場合は、クローニングに使用されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞における細胞傷害性を防ぐために、コード配列をｃａｔ１イントロン（カタラーゼＣａｔ１に対するＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓｃａｔ１遺伝子の第１イントロン（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ２１１６１．１、ヌクレオチド位置６７９から８６７））の挿入によって中断した。サルモシンのコード配列をＴＭＶベースのアセンブルしたウイルスベクターｐＮＭＤ０３５（ＷＯ２０１２／０１９６６０に詳しく記載されている）に挿入して、図１Ａ〜Ｂに描写するプラスミドコンストラクトを得た。
【００６８】
予備的な発現研究において、ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ）活性を有するバクテリオシンは、通常、それが発現している植物組織に対して非常に有毒であることが分かった。その発現は、組織の壊死および組換えタンパク質の不十分な蓄積をもたらした。しかし、適切な免疫タンパク質との共発現は毒性作用を低減させ、これらのバクテリオシンの蓄積を劇的に増大させた。本発明者らの研究で使用したサルモシン免疫タンパク質を表２に列挙する。
【００６９】
【表２】
2020513822.tif 000003
【００７０】
それぞれサルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７に対する免疫タンパク質ＳＩｍｍＥ２およびＳＩｍｍＥ７。免疫タンパク質のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋから取得し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａについて最適化されたコドン使用頻度を有する対応するヌクレオチド配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．が合成し、ＷＯ２０１２／０１９６６０に記載されているＰＶＸベースのアセンブルしたウイルスベクターｐＮＭＤ６７０にサブクローニングした。得られたプラスミドコンストラクトを図１Ａに示す。
【００７１】
実施例２：サルモシンの発現スクリーニング
針なし注射器を使用して、サイトゾル性サルモシン発現のためのＴＭＶベースのアセンブルしたベクターを保有する希釈したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養物を６週齢のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物にインフィルトレートした。サルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７の場合は、サルモシン発現のためのＴＭＶベースのベクターを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物を対応する免疫タンパク質の発現のためのＰＶＸベースのベクターを保有する他の培養物と等比率で混合した。それぞれの一晩培養物をＯＤ６００＝１．５に調整し、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含むインフィルトレーションバッファーでさらに１：１００に希釈した。本実験で使用したプラスミドコンストラクトを表３に概説する。最適な採取時点を決定するために、インフィルトレーション後のいくつかの時点で植物材料を採取し、これを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５倍容量のバッファーを用いるタンパク質抽出に使用した。ブラッドフォードアッセイを使用して全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の濃度を決定し、クマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＴＳＰ抽出物を解析した。本発明者らの実験では、試験したすべてのサルモシンは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質との比較によって決定した場合に、１．２から１．８ｍｇ組換えコリシン／ｇ  ＦＷの間または１８から４７％のＴＳＰの間で変動して、適度に高レベルで発現していた（表４）。
【００７２】
【表３】
2020513822.tif 000004
【００７３】
【表４】
2020513822.tif 000005
【００７４】
実施例３：サルモシンの活性スクリーニング
本発明者らは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａの３３の異なる血清型の３６株に対して、植物で作られた組換えサルモシンの抗菌活性を解析した。本実験で使用した株の詳細を表５Ａおよび５Ｂに示す。
【００７５】
【表５】
2020513822.tif 000006
【００７６】
組換えサルモシン含有植物抽出物の抗菌活性をスポットオンローン法による放射拡散アッセイで試験した。この目的のために、試験されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の細胞を含む軟寒天で覆われた寒天プレートを調製した。１０×１０ｃｍの正方形ペトリ皿に１５〜２０ｍｌのＬＢ寒天培地（１．５％ｗ／ｖ寒天）を注いだ。ＬＢ軟寒天培地（０．８％（ｗ／ｖ）寒天）を溶かし、２０ｍｌの一定分量を５０ｍｌプラスチックチューブに移し、その温度を５０〜５５℃に合わせた。ＬＢ培地でＯＤ６００＝１．０に調整したＳａｌｍｏｎｅｌｌａの一晩培養物を１：１００の比で軟寒天培地に加えて、最終的にＯＤ６００＝０．０１またはおよそ１×１０７細胞／ｍｌにし、事前に注がれたＬＢプレート上にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ試験株を含む２０ｍｌのＬＢ軟寒天を注いで、ｃｍ２あたり１×１０７ｃｆｕ／ｍＬの０．１４ｍＬ細菌溶液を得た。
【００７７】
実施例２に記載されているように植物葉材料を抽出した。同じ抽出バッファーを使用して、無希釈の試料から出発して、植物抽出物の１：１希釈系列を調製した。ＴＳＰ希釈系列の５μｌの一定分量を寒天プレートに加え、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。抗菌活性をクリアリングゾーンに基づいて評価した。
【００７８】
６種の試験したサルモシンの中で、１種は狭い抗菌活性を示し（Ｓｐｓｔ−１２％の株を阻害した）、１種のサルモシンは中間の活性スペクトルを有し（ＳｃｏｌＥ３−６０％の株を阻害した）、他の４種は広い活性スペクトルを有していた：ＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７−約９０％の株を阻害した。ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂ−１００％の株を阻害した（図３）。
【００７９】
サルモシンＳｃｏｌＥ１およびＳｃｏｌＥ１ｂは、試験したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株に対して、広いだけでなく、著しく高い活性も示した（図４、５）。
半定量的な比較のために、任意単位（ＡＵ）での組換えコリシンの相対抗菌活性を示し、これは、放射拡散アッセイにおいて検出可能なクリアリング作用をもたらすタンパク質抽出物の最高の希釈に対する希釈係数として計算した。植物組織のｍｇ  ＦＷあたりのＡＵで計算したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株に対するサルモシンの抗菌活性を、それぞれ、ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂについて、図６、８、１０、１２および１４に示す。これによって、バイオマスの単位あたりの特異的活性薬剤の収量、すなわち、宿主の特異的生産能力が反映される。
【００８０】
図７、９、１１、１３および１５は、それぞれ、組換えサルモシンタンパク質ＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ３、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂのμｇあたりのＡＵで計算した同じ活性を示し、これは、サルモシンの特異的抗菌効力を反映する。
【００８１】
実施例４：プラスミドコンストラクト（コリシン）
２つの活性群を代表する６種のコリシンを選択した（表６）。このリストは、コリシンｃｏｌＳ４、ｃｏｌ５、ｃｏｌ１０、ｃｏｌＩａ、ｃｏｌＩｂおよびｃｏｌＭを含む。それぞれのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋから取得し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａについて最適化されたコドン使用頻度を有する対応するヌクレオチド配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．が合成した。コリシンコード配列をＴＭＶベースのアセンブルしたウイルスベクターｐＮＭＤ０３５（ＷＯ２０１２／０１９６６０に詳しく記載されている）に挿入して、図１６に描写するプラスミドコンストラクトを得た。コリシンＭのコード配列を、ｃａｔ１イントロン（カタラーゼＣａｔ１に対するＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓｃａｔ１遺伝子の第１イントロン（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ２１１６１．１、ヌクレオチド位置６７９から８６７））の挿入によって中断した。
【００８２】
【表６】
2020513822.tif 000007
【００８３】
実施例５：コリシンの発現スクリーニング
針なし注射器を使用して、サイトゾル性コリシン発現のためのＴＭＶベースのアセンブルしたベクターを保有する希釈したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養液を６週齢のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物にインフィルトレートした。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ一晩培養物をＯＤ６００＝１．５に調整し、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含むインフィルトレーションバッファーでさらに１：１００に希釈した。本実験で使用したプラスミドコンストラクトを表７に概説する。最適な採取時点を決定するために、インフィルトレーション後のいくつかの時点で植物材料を採取し、これを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５倍容量のバッファーを用いるタンパク質抽出に使用した。ブラッドフォードアッセイを使用して全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の濃度を決定し、クマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＴＳＰ抽出物を解析した。本発明者らの実験では、試験したすべてのコリシンは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質との比較によって決定した場合に、１．５から４．７ｍｇ組換えコリシン／ｇ  ＦＷの間または１６から４１％のＴＳＰの間で変動して、適度に高レベルで発現していた（表８）。
【００８４】
【表７】
2020513822.tif 000008
【００８５】
【表８】
2020513822.tif 000009
【００８６】
実施例６：コリシンの活性スクリーニング
本発明者らは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａの３２の異なる血清型の３５株に対して、植物で作られた組換えコリシンの抗菌活性を解析した。本発明者ら実験で使用した株の詳細を表５Ａおよび５Ｂ（株番号１〜３５）に示す。
【００８７】
組換えコリシン含有植物抽出物の抗菌活性を、実施例３に記載されているスポットオンローン法による放射拡散アッセイで試験した。
６種の試験したコリシンの中で、１種は狭い抗菌活性を示し（ｃｏｌＳ４−２５％の株を阻害した）、３種のコリシンは中間の活性スペクトルを有し（ｃｏｌ５、ｃｏｌ１０およびｃｏｌＭ−それぞれ４８％、４６％および４２％の株を阻害した）、２種のコリシンは広い活性スペクトルを有していた：ｃｏｌＩａおよびｃｏｌＩｂ−それぞれ９６％および８９％の株を阻害した（図１７）。
【００８８】
実施例７：肉マトリックスに加えたＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａの病原性株に対するバクテリオシン（コリシン混合物）の殺菌作用の効果の決定
植物で生成したコリシンを、病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａで汚染したニワトリ胸肉の切り身の試料に対する抗菌活性について試験した。
【００８９】
効果の評価は、汚染した肉試料（後に、植物で作られた組換えコリシンの混合物または同じ生産宿主であるがコリシンを含まない植物抽出物からなる対照担体溶液で処理し、処理した肉試料を４℃で様々な期間にわたって保存した）における病原性Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ集団の解析を包含する。
【００９０】
代表的な消費者向製品でバクテリオシン活性が評価されることを確実にするために、肉試料の特別な供給源は使用しない。生のニワトリ胸肉の切り身は実験の１日前に小売店で購入する（これらの研究については、ＡＬＤＩ  ｓｕｐｅｒｍａｒｋｅｔ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。肉は４℃で保存し、実験的曝露の前に洗浄または前処理しない。
【００９１】
肉試験マトリックスは、それぞれ血清型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）９２７０（商標）＊、ＡＴＣＣ（登録商標）１３０７６（商標）＊）またはＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＮｅｗｐｏｒｔおよびＡｎａｔｕｍ（ＡＴＣＣ（登録商標）９２７０（商標）＊、ＡＴＣＣ（登録商標）１３０７６（商標）＊、ＡＴＣＣ（登録商標）６９６２（商標）＊およびＡＴＣＣ（登録商標）９２７０（商標）＊）を代表する２または４種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株の１：１または１：１：１：１混合物で、実験的に汚染させる（それぞれ、図１８および１９）。肉の汚染より前に、これらの株をＯＤ６００＝０．３まで個々に増殖させ、１：１または１：１：１：１で混合する。株混合物を、約２×１０４ｃｆｕ／ｇ肉の初期接種菌液を得るための肉汚染懸濁液として使用するために、所望の細胞数（ＯＤ６００＝０．００５〜０．００１、２×１０６〜１．８×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）までＬＢブロスでさらに希釈する。ニワトリの胸肉のトリム（約２５ｇ重量の３片）を１２ｍｌの細菌懸濁液中に浸し、裏返して再び浸して、両面に接種する。３０分間、汚染した肉は乾燥させ、細菌は、マトリックス試料に室温でコロニー形成させ、その間、ニワトリの胸肉のトリムを１５分ごとに裏返す。
【００９２】
汚染した肉は、アトマイザーフラスコを使用する低圧スプレー（２〜４バール）によって、担体またはコリシン混合溶液（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの非処理植物材料もしくはコリシン発現のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを注射器で接種した際の植物材料のいずれか由来の、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  Ｋアセテート、５ｍＭ  Ｍｇアセテート、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、３００ｍＭ  ＮａＣｌで調製されたＴＳＰ抽出物）のいずれかで処理する。提唱される添加量はコリシンＭについて３ｍｇ／ｋｇならびに混合物中で使用される任意の他のコリシンについて１ｍｇ／ｋｇ（コリシンＩａおよびコリシン５）である。肉を１５分ごとに裏返しながら室温で３０分間さらにインキュベートする。
【００９３】
コリシンを加えてから３０分後に、約２５ｇのニワトリの胸肉のトリムの一定分量を反復して無菌試料袋（ＢａｇＦｉｌｔｅｒ（登録商標）４００Ｐ）中に入れ、各試料の正確な重量を記録し、試料袋を閉じクリップ（ＢａｇＣｌｉｐ（登録商標）４００）を使用して閉じる。全体で、肉試料をコリシン処理してすぐに室温で１時間インキュベートしてから、次いで、密閉した肉試料を４℃で保存する。
【００９４】
マトリックス上の微生物汚染レベルを決定するために、４℃で１時間、４８時間および７２時間の保存で肉試料をサンプリングする。肉試料から病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを回収するために、肉試料の各約２５ｇの一定分量に約１００ｍｌの緩衝化ペプトン水を加える。実験用ブレンダー（ＢａｇＭｉｘｅｒ（登録商標）４００ＣＣ（登録商標）；設定：ギャップ０、時間３０秒、スピード４）中で試料をホモジナイズする。保存袋の濾過部からの微生物懸濁液を収集し、１：１０希釈系列を調製する。無希釈のまたは希釈した微生物懸濁液の１００μｌの一定分量をＸＬＤ寒天状上にプレーティングする。このプレートを３７℃で１８〜２４時間インキュベートし、ＣＦＵ（コロニー形成単位）を数える。ｇ試料あたりのＣＦＵ数を以下のように計算する：
全ＣＦＵ＝実際のＣＦＵ×濃度係数×希釈係数×実際のｍｌペプトン水
ｇ肉        ０．１ｍｌプレーティング量        実際のｇ試料
実験的に汚染させた肉試料中の生存可能な病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの数の減少におけるコリシン処理の効果を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．６．０１を使用して一元配置ＡＮＯＶＡ（チューキーの多重比較検定）および独立パラメトリックｔ検定によって、担体処理対照試料およびコリシン処理試料で得られたデータを比較することにより評価する。
【００９５】
それぞれ２株または４株のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの汚染について、細菌数の結果を図１８および１９に示す。細菌集団の最も著しい減少（１．８ｌｏｇ）は、コリシン処理してすぐに１時間保存した後に既に生じた。
【００９６】
要約すると、汚染した肉におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ集団の統計学的に有意な減少は、コリシン混合物で肉を処理することによって達成することができる。
サルモシン混合物またはサルモシン／コリシン混合物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａからの食品製品の汚染除去について試験され、食品産業においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ汚染を減少させるのに使用されることが計画される。サルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂは、試験したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株に対して最も広い抗菌活性を示す。したがって、これらは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの制御のためのサルモシンカクテルの主要成分として使用することができる。
【００９７】
実施例８：安定なトランスジェニック宿主におけるサルモシンの生産
サルモシン発現のために、Ｔ０世代トランスジェニック植物の切り離した葉のＥｔＯＨ誘導性の導入遺伝子の発現および誘導のためのベクターを使用するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性リーフディスク形質転換によって、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを形質転換した。これは、Ｓｃｈｕｌｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１２、Ｅ５４５４〜Ｅ５４６０（２０１５）に記載されているように行った。
【００９８】
ＳｃｏｌＥ１ｂ発現のためにエタノールによって二重誘導が可能なＴＭＶベースウイルスベクターのゲノム挿入を含む安定なトランスジェニックＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（図２１）は、正常な生育および発生を示し、選択されたトランスジェニック系統は、エタノールで誘導すると期待されるレベルまでサルモシンを蓄積した（図２２）。
【００９９】
実施例９：ホウレンソウにおけるサルモシンの生産
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｃｖ．Ｆｒｕｈｅｓ  Ｒｉｅｓｅｎｂｌａｔｔ植物を温室（それぞれ１９〜２３℃および１７〜２０℃の昼および夜の温度、１２時間光および３５〜７０％湿度）で生育させた。６週齢の植物を実施例２に記載されている注射器によるインフィルトレーションに使用した。組換えタンパク質の発現は、クマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して確認した（図２３）。
【０１００】
実施例１０：拡張サルモシン活性スクリーニング
本発明者らは、実施例６に記載されているように、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの他の株に対して植物で作られた組換えサルモシンの抗菌活性をさらに解析した。サルモシンの抗菌活性スペクトルを決定するために、１０５種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型を代表する１０９株を選択し、スクリーニングした（表９）。スクリーニングは、２００３年〜２０１２年にヒトＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の少なくとも１００の発生を引き起こしたとして米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎａｔｉｏｎａｌｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ／ｐｄｆｓ／ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ−ａｎｎｕａｌ−ｒｅｐｏｒｔ−２０１３−５０８ｃ．ｐｄｆ）で記述されている、（血清型ＴｙｐｈｉおよびＩ４，５：１２：ｒ：−を除いて）すべての血清型のそれぞれ１株、血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＪａｖｉａｎａの２株ならびに１００未満の発生を引き起こした、またはＣＤＣに報告されていない６血清型を含んでいた。
【０１０１】
【表９−１】
2020513822.tif 000010
【０１０２】
【表９−２】
2020513822.tif 000011
【０１０３】
【表９−３】
2020513822.tif 000012
【０１０４】
【表９−４】
2020513822.tif 000013
【０１０５】
【表１０】
2020513822.tif 000014
【０１０６】
活性スペクトルの幅を推定するために、すべての株を少なくとも１回試験し、続いて、３６または３５株を、それぞれサルモシンおよびコリシンを用いて、３連実験で再スクリーニングした（図２４）。最も広い抗菌活性スペクトルが、サルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂについて再び確認され、これらは、それぞれ評価したすべての株の１００％および９９％に対して、正の抗菌活性を示した。活性の有意な幅は、図２４ｅに示される３６株のサブセットに対するそれらの活性に反映されるように、サルモシンＳｃｏｌＥ２（９４％）、ＳｃｏｌＥ３（７０％）およびＳｃｏｌＥ７（９５％）についても観察された。
【０１０７】
解析した５種のサルモシンは、主な病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を制御するそれらの能力に基づいて、４つの群に分けられた。サルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂは普遍的に活性であり、それぞれ、試験したすべての病原型を死滅させることができ、試験したすべての株に対して１０５ＡＵ／μｇ組換えタンパク質より高い（図２４ａ）、ほとんどの場合個々の株に対して１０３ＡＵ／μｇタンパク質より高い、最高の平均活性を示した。残りのサルモシンは２つの群に入り、１つの群のサルモシンＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７は１００倍低い平均活性（＜１０５ＡＵ／μｇタンパク質、図２４ａ）を有し、別の群のＳｃｏｌＥ３は実質的により低い平均活性（１０２ＡＵ／μｇ、図２４ａ）を示す。
【０１０８】
腸管病原性Ｓ  ｅｎｔｅｒｉｃａ株の阻害におけるサルモシンの高い効力と対照的に、コリシンＩａ、Ｉｂ、Ｍ、５、１０およびＳ４の特異的活性（表６）は２〜４桁低かった（２〜３ｌｏｇ  ＡＵ／μｇ、図２４ｂ）が、１０９株の多くはコリシンＩａ（９２％）およびＩｂ（９０％）によって阻害され、約１／３の株はコリシンＳ４（４５％）、５（２５％）、１０（２９％）およびＭ（３４％）によって阻害され、これは、３５株のサブセットの感受性パターンにも反映される（図２４ｆ）。一般に、サルモシンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して、Ｅ．ｃｏｌｉコリシンよりも高く、広い活性を示した。逆に、サルモシンは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴＥＣ（表１０）株に対して、種間では低い（１０２ＡＵ／μｇ未満）狭い活性を示した（図２４ｃ、ｇ）。
【０１０９】
実施例１１：個別のサルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびサルモシン混合物は汚染したニワトリ肉マトリックスにおいてＳａｌｍｏｎｅｌｌａを制御する
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ汚染した肉表面の制御のための、植物で生成した個別のサルモシンＳｃｏｌＥ１ａおよびサルモシン混合物の殺菌効果をシミュレーション研究で解析した。
【０１１０】
ニワトリ胸肉の切り身は地域のスーパーマーケットから購入した。Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（株ＡＴＣＣ（登録商標）１３０７６（商標）＊）、Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（株ＡＴＣＣ（登録商標）１４０２８（商標）＊）、Ｎｅｗｐｏｒｔ（株ＡＴＣＣ（登録商標）６９６２（商標）＊）、Ｊａｖｉａｎａ（株ＡＴＣＣ（登録商標）１０７２１（商標）＊）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（株ＡＴＣＣ（登録商標）８３２６（商標）＊）、Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１６７５（商標）＊）およびＭｕｅｎｃｈｅｎ（株ＡＴＣＣ（登録商標）８３８８（商標）＊）のナリジクス酸抵抗性変異体の株を２５μｇ／ｍｌナリジクス酸を補充したＬＢ培地中で定常期まで個々に増殖させ、新鮮なＬＢで希釈し、対数期まで増殖させた。家禽の汚染のために、細菌培養物をＬＢ培地でＯＤ６００＝０．００１（約２×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）に希釈し、１：１：１：１：１：１：１で混合した。約２０ｇ重量の小片に切られたニワトリ胸肉の切り身のプールに、１００ｇの肉あたり約２×１０５ｃｆｕ／ｍｌの密度で７種のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株の１ｍｌの混合物を室温で接種し、約３ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの病原性Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａの７種の血清型の混合物の、肉マトリックスの初期汚染レベルを得て、細菌を肉表面へ３０分間室温で付着させた。続いて、植物抽出物対照（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  Ｋアセテート、５ｍＭ  Ｍｇアセテート、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、３００ｍＭ  ＮａＣｌで調製された、サルモシンがないＷＴ  Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物材料のＴＳＰ抽出物）またはサルモシン溶液（植物抽出物対照と同じバッファーで調製された、サルモシンＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂ、ＳｃｏｌＥ２およびＳｃｏｌＥ７を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物材料の個々のＴＳＰ抽出物またはこれらのＴＳＰ抽出物の混合物のいずれか）のいずれかを３ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ１ａまたは３ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ１ａ、１ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ１ｂ、１ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ２、１ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ７または０．３ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ１ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ１ｂ、０．１ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ２および０．１ｍｇ／ｋｇ  ＳｃｏｌＥ７の濃度でスプレーする（１０ｍｌ／ｋｇ）ことによって、ニワトリの胸肉のトリムを処理した。処理した肉のトリムをさらに室温で３０分間インキュベートした。約４０ｇに相当する肉のトリムの一定分量をＢａｇＦｉｌｔｅｒ（登録商標）４００Ｐ無菌袋（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に詰め、１時間、１日および３日間１０℃で保存し、これは、細菌の増殖について許容されているが最適以下である現実的な産業的肉加工条件に相当する。
【０１１１】
全体で、サルモシン処理の間に肉試料を室温で１．５時間インキュベートしてから、これらを密閉し、１０℃で保存した。細菌集団の解析のために、Ｂａｇ  Ｍｉｘｅｒ（登録商標）４００ＣＣ（登録商標）ホモジナイザー（設定：ギャップ０、時間３０秒、スピード４；Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、家禽の一定分量を４倍容量のペプトン水でホモジナイズし、微生物懸濁液の段階希釈物のプレーティングの後に、２５μｇ／ｍｌナリジクス酸を補充したＸＬＤ培地（Ｓｉｆｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上でＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を数えた。試料は４連で解析した。
【０１１２】
実験的に汚染させた肉試料中の生存可能な病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの数の減少におけるサルモシン処理の効果を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．６．０１を使用して、自由度６を用いる両側独立パラメトリックｔ検定によって、担体処理対照試料およびサルモシン処理試料で得られたデータを比較することにより評価した。
【０１１３】
サルモシン処理した（３ｍｇ／ｋｇ肉の添加量の個別のＳｃｏｌＥ１ａおよびそれぞれ３＋１＋１＋１ｍｇ／ｋｇ肉で加えたＳｃｏｌＥ１ａ＋ＳｃｏｌＥ１ｂ＋ＳｃｏｌＥ２＋ＳｃｏｌＥ７からなるサルモシン混合物）肉試料に対するサルモシン処理の効果（両方とも植物抽出物対照処理した肉に対する）を病原性細菌集団レベルの減少の程度について評価し、解析したすべての時点において２〜３ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ肉の生存可能数の統計学的に有意な正味の減少が見出された（図２５）。細菌集団の減少の最高のレベルは、４種のサルモシンの混合物（３＋１＋１＋１ｍｇ／ｋｇ肉の濃度）について観察され、４時間の保存で最大３．３９平均対数減少対担体処理であり、これは、細菌の９９．６平均パーセント減少に相当する。単一のサルモシン、ＳｃｏｌＥ１ａ（３ｍｇ／ｋｇ肉で加えた）は、２倍の濃度（６ｍｇ／ｋｇ肉の全サルモシン）で加えた４種のサルモシンの混合物と同様の効果で肉のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ汚染を制御することができた。非常に低用量（全サルモシン０．６ｍｇ／ｋｇ肉；ＳｃｏｌＥ１ａ＋ＳｃｏｌＥ１ｂ＋ＳｃｏｌＥ２＋ＳｃｏｌＥ７の混合物について０．３＋０．１＋０．１＋０．１ｍｇ／ｋｇ肉）のサルモシンによる処理でさえも、最大で４８時間の保存の間、約１ｌｏｇ  ＣＦＵという細菌集団の統計学的に有意な減少をもたらした。細菌汚染の初期の減少の後、生存可能な細菌の再増殖が７２時間後に観察され、これは、サルモシンは食品に対して急速に作用するが、長期の技術的効果を有さないことを示唆する。
【０１１４】
実施例１２：組換えサルモシンは植物によって正確に発現される
植物ＴＳＰ抽出物中に含まれる植物発現性組換えサルモシンの、翻訳後修飾を含めた一次構造を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量解析（ＭＳ）によって解析した。
【０１１５】
タンパク質消化のために、５倍容量の２０ｍＭ  Ｎａクエン酸、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を用いてサルモシンを発現する植物材料から調製したＴＳＰ抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、５μｇのタンパク質を含む、クマシー染色されたＳＤＳゲルバンドを切り取り、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３および１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３のアセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ２Ｏ（５０；５０、ｖ／ｖ）溶液で連続して洗浄することによって脱染色した。１０ｍＭ  ＤＴＴを用いて５０℃で４５分間ジスルフィド結合を還元し、それに続いて、１０ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミドを用いて６０分間アルキル化した。次いで、異なるシーケンシンググレードのエンドプロテイナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を用いて、脱染色およびアルキル化したゲルバンドをタンパク質消化にかけた。消化溶液のプロテアーゼ：タンパク質比を１：２０（ｗ／ｗ）に調整し、１２時間２５℃（キモトリプシン）または３７℃（Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、トリプシン）で消化を行った。それぞれＨ２Ｏ、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／トリフルオロ酢酸（５０；４５；５、ｖ／ｖ／ｖ）およびＡＣＮで連続して洗浄することによって、タンパク分解性ペプチドを抽出した。抽出溶液を混合し、真空遠心分離機中で濃縮し、Ｈ２Ｏ／酢酸（９０；１０、ｖ／ｖ）中に再可溶化した。
【０１１６】
上記のように得られたタンパク分解性サルモシンペプチドまたは植物で生成した精製されたインタクトなサルモシンＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｃｏｌＥ７タンパク質を、Ｃ４またはＣ１８結合シリカ材料（ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して固相抽出によって、質量解析のために精製し、２，５−ジヒドロキシアセトフェノンおよび２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＭＡＬＤＩグラウンドスチールターゲットで溶出液を共結晶化した。
【０１１７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量解析計（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＳｐｅｅｄＴＭ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、分子量の決定についてリニアモードで、およびインソース分解（ＩＳＤ）解析によるタンパク質シーケンシングのためにリフレクターモードで、正極性で質量スペクトルを得た。３５５ｎｍの発光波長で、１ｋＨｚのパルス速度に設定して、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｓｍａｒｔ  ｂｅａｍ−ＩＩＴＭ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をマトリックス結晶に照射した。
【０１１８】
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルは、それぞれ（試料スポットあたり）少なくとも５０００または１００００レーザーショットの蓄積によって、ｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ（バージョン３．４、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で記録した。レーザーエネルギーは、ＭＳ実験については閾値のわずかに上に設定し、ＭＳ／ＭＳ解析については最大に設定した。スペクトル処理は、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ（バージョン３．４、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＴｏｐＨａｔアルゴリズムを用いてベースライン減算を適用すること、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いてスムージングすること、およびＳＮＡＰアルゴリズムを用いてピーク検出することによって、行った。
【０１１９】
質量解析計は、既知の質量を有する標準のペプチドおよびタンパク質のセット（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して較正した。
【０１２０】
インタクトな分子量の決定は、単一および複数の荷電分子イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいた。
タンパク質末端のシーケンシングはＩＳＤ解析によって行った。ＩＳＤフラグメントスペクトルのアノテーションは、ＢｉｏＴｏｏｌｓ（バージョン３．２、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、フラグメントイオンに対するｍ／ｚ値のインシリコ生成および得られたＩＳＤスペクトル内に観察されるフラグメントシグナルのｍ／ｚ値とのそれらの比較によって、行った。このアプローチは、末端アミノ酸配列の特定および存在する修飾の特定を可能にした。
【０１２１】
タンパク質シーケンシング解析については、タンパク分解性ペプチドの特定のためにフラグメント（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルのみを使用し、アノテーションはＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏ（バージョン７．５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｔｅｒｌｏｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて行った。タンパク質の特定およびそのアミノ酸配列の検証は、それぞれサルモシンの配列が加えられている、ＮＣＢＩ  ｎｒデータベースおよびＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対して、ＭＳ／ＭＳデータを検索することによって実施した。データベース検索は、５０ｐｐｍの親質量誤差許容度および０．５Ｄａのフラグメント質量誤差許容度を用いて実施した。１つのタンパク質分解フラグメントに対する誤った切断と翻訳後修飾の両方の最大数は３に設定した。非特異的切断は、両タンパク質末端について許可した。
【０１２２】
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対する、サルモシンのタンパク分解性ペプチドからの各ＭＳ／ＭＳデータセットの検索結果によって、解析したサルモシンのそれぞれの同一性が確認された（表１１）。ＩＳＤおよび分子量決定方法を使用して、ＭＳベースのタンパク質末端のシーケンシングによって、精製されたサルモシンＳｃｏｌＥ１ａ、ＳｃｏｌＥ１ｂおよびＳｃｏｌＥ７の完全性をさらに解析し、これによって、植物発現の際にすべてのサルモシンタンパク質がインタクトであることが確認された。観察された翻訳後修飾はＳｃｏｌＥ２、ＳｃｏｌＥ７、ＳｃｏｌＥ１ａおよびＳｃｏｌＥ１ｂの場合はＮ末端メチオニンの切断に、ＳｃｏｌＥ７およびＳｃｏｌＥ１ａについてはＮ末端アセチル化に限られていた（表１１）。
【０１２３】
【表１１】
2020513822.tif 000015
【０１２４】
その優先権が主張される欧州特許出願第１７１６２７８４．７号は、記載全体、特許請求の範囲および図を含めて、参照によって本明細書に組み込まれる。
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号１  サルモシンＳｃｏｌＥ２のアミノ酸配列
MSGGDGIGHN SGAHSTGGVN GSSSGRGGSS SGGGNNPNSG PGWGTTHTPD GHDIHNYNPG EFGGGGHKPG GNGGNHSGGT GDGQPPGAAM AFGFPALVPA GAGGLAVTVS GDALAAAIAD VLAVLKGPFK FGAWGIALYG ILPTEIAKDD PRMMSKIVTS LPADAVTESP VSSLPLDQAT VSVTKRVTDV VKDERQHIAV VAGVPASIPV VDAKPTTHPG VFSVSVPGLP DLQVSTVKNA PAMTALPRGV TDEKDRTVHP AGFTFGGSSH EAVIRFPKES GQAPVYVSVT DVLTPEQVKQ RQDEENRRQQ EWDATHPVEV AERNYRLASD ELNRANVDVA GKQERQIQAA QAVAARKGEL DAANKTFADA KEEIKKFERF AHDPMAGGHR MWQMAGLKAQ RAQNEVNQKQ AEFNAAEKEK ADADAALNVA LESRKQKEQK AKDASDKLDK ENKRNHPGKA TGKGQPVGDK WLEDAGKEAG APVPDRIADK LRDKEFKNFD DFRKKFWEEV SKDPELSKQF IPGNKKRMSQ GLAPRARNKD TVGGRRSFEL HHDKPISQDG GVYDMDNIRV TTPKLHIDIH RGK
配列番号２  サルモシンＳｃｏｌＥ３のアミノ酸配列
MSGGDGRGHN TGAHSTSGNI NGGPTGLGVS GGASDGSGWS SENNPWGGGS GSGIHWGGGS GRGNGGGNGN SGGGSGTGGN LSAVAAPVAF GFPALSTPGA GGLAVSISAS ELSAAIAGII AKLKKVNLKF TPFGVVLSSL IPSEIAKDDP NMMSKIVTSL PADDITESPV SSLPLDKATV NVNVRVVDDV KDERQNISVV SGVPMSVPVV DAKPTERPGV FTASIPGAPV LNISVNNSTP AVQTLSPGVT NNTDKDVRPA GFTQGGNTRD AVIRFPKDSG HNAVYVSVSD VLSPDQVKQR QDEENRRQQE WDATHPVEVA EREYENARAE LEAENKNVHS LQVALDGLKN TAEGLALSDA GRHPLTSSES RFVAVPGYSG GGVHFDATAT VDSRDRLNSL LSLGGAAYVN NVLELGEVSA PTEDGLKVGN AIKNAMIEVY DKLRQRLITR QNEINHAQVS LNTAIESRNK KEEKKRSAEN KLNEERNKPR KGTKDYGHDY HPAPETEEIK GLGDIKKGIP KTPKQNGGGK RKRWIGDKGR KIYEWDSQHG ELEGYRASDG QHLGSFDPKT GKQLKGPDPK RNIKKYL
配列番号３  サルモシンＳｃｏｌＥ７のアミノ酸配列
MSGGDGIGHN SGAHSTGGVN GSSSGSGGSS SGSGNNPNSG PGWGTTHTPN GDIHNYNPGE FGGGGNKPGG HGGNSGNHDG SSGNGQPSAA PMAFGFPALA PAGAGSLAVT VSGEALSAAI ADIFAALKGP FKFGAWGIAL YGIMPTEIAK DDPNMMSKIM TSLPADTVTD TPVSSLPLDQ ATVSVTKRVA DVVKDERQHI AVVAGVPMSV PVVDAKPTTR PGIFSATVPG LPALEVSTGK SIPASTALPR GITEDKDRTE HPAGFTFGGS SHDAVIRFPK ESGQAPVYVS VTDVLTPEQV KQRQDEESRR QQEWDATHPV EVAERNYRLA SDELNRVNAD VAGKQERQAQ AGQAVAARKG ELDAANKTFA DAKEEIKKFE HFARDPMAGG HRMWQMAGLK AQRAQNEVNQ KQAEFDAAEK EKADADAALN AALESRKQKE QKAKDTKERL DKENKRNQPG KATGKGQPVS DKWLEDAGKE SGSPIPDSIA DKLRDKEFRN FDDFRKKFWE EVSKDPELSK QFIKGNRDRM QVGKAPKSRK KDAAGKRTSF ELHHDKPVSQ DGGVYDMDNL RITTPKRHID IHRGQ
配列番号４  サルモシンＳｃｏｌＥ１ａのアミノ酸配列
MADNTIAYYE DGVPHSADGK VVIVIDGKMP VDTGAGGTGG GGGGKVGGTS ESSAAIHATA KWSTAQLKKT LAEKAARERE TAAAMAAAKA KRDALTQHLK DIVNDVLRHN ASRTPSATDL AHANNMAMQA EAQRLGRAKA EEKARKEAEA AELAFQEAER QREEAVRQLA ETERQLKQAE EEKRLAALSD EARAVENARK NLDTAKSELA NVDSDIERQR SQLSSLDADV KKAEENLRLT MRIKGRIGRK MQAKSQAIVD DKKRIYSDAE NVLNTMTVNR NLKAQQVTDA ENELKVAIDN LNSSQMKNAV DATVSFYQTL TEKYGEKYSL IAQELAEKSK GKKIGNVDEA LAAFEKYKDV LDKKFSKADR DAIVNALKSF NYDDWAKHLD QFAKYLKITG HVSFGYDVVS DVLKASETGD WKPLFITLEQ KVLDTGMSYL VVLMFSLIAG TTLGIFGVAI ITAILCSFVD KYILNALNDA 
LGI
配列番号５  サルモシンＳｃｏｌＥ１ｂのアミノ酸配列
MSDNTIAYYE DGVPYSADGQ VVIVIDGKMP VDTGAGGTGG GGGGKVGGTS ESSAAIHATA KWSKAQLQKS LEEKAARERE TAAAMAAAKA KRDALTQHLK DIVNDVLRYN ASRTPSATDL AHANNMAMQA EAQRLGRAKA EEKARKEAEA AEKSLQEAER QREEAARQRA EAERQLKQAE AEEKRLAALS EEARAVEITQ KNLAAAQSEL SKMDGEIKSL NVRLSTSIHA RDAEMNSLSG KRNELAQESA KYKELDELVK KLEPRANDPL QNRPFFDATS RRARAGDTLA EKQKEVTASE TRINELNTEI NQVRGAISQA NNNRNLKVQQ VTETENALKV AIDNLNSSQM KNAVDATVSF YQTLTAKYGE KYSLIAQELA EQSKGKKISN VDEALAAFEK YKDVLDKKFS KADRDAIVNA LKSVDYADWA KHLDQFSRYL KISGRVSTGY DIYSDIRKGM DTNDWRPLFL TLEKLAVDAG VGYIVALGFS VIASTALGIW GVAIITGVIC SFVDKKDLEK LNEALGI
配列番号６  サルモシンＳｐｓｔのアミノ酸配列
MFIKSGGNLT IRTFGGLGVG GDFDSDTWRR RSTDSWVPYS EYIAIECIVA PNQLYQLLTD VAQVETVAAQ LAQVGYQYLQ GRLRLVREDG SCTDFSGKAM LDNLLNKSKD ILDLDFLHVS EGYRSEAYWP GQSSGITIGY GVDIGHQSEE GLHKWGVPQS IIDKIKDYFG ITGEAANTLL KGLKDKTLGL SDREIKQFSD IVKKQATADI INKYNAATKG ITFDKIPYNT RTAIIDLFYQ YSAPKGAPKS WGFIINNDWN GFYNELMNFG DKHTTRRERE AALVLSDIVN NQYIYK
配列番号７  サルモシンＳｃｏｌＥ２免疫タンパク質ＳＩｍｍＥ２のアミノ酸配列
MELKKSISDY TEAEFKKIIE AIINCEGDEK TQDDNLEFFI RVTEYPSGSD LIYYPEGDND GSTEAIIKEI KEWRAANGKP GFKQADSSYF VSFDYRDGDW
配列番号８  サルモシンＳｃｏｌＥ７免疫タンパク質ＳＩｍｍＥ７のアミノ酸配列
MELKNSISDY TEAEFIEFMK EIDKENVAET DDKLDLLLNH FEQVTEHPDG TDLIYYAASD AESTPEAITK KIKEWRAANG KPGFKQG
配列番号９  コリシンＳ４のアミノ酸配列
MAKELSVYGP TAGESMGGTG ANLNQQGGNN NSNSGVHWGG GSGSGNGGRE HGSQTGWGWS KTNNPDVPPY VDDNGQVRIT ITNGLVKTPV YGVPGAGGNS DVQGGYIPEN PNDEVARKWD KNNLPREIDV SIDGFKYRVT LNDNGRAIGI LRTGVRPYVG SEKAKAGIME KINHKTPEEI YEALGFNKDE SQRQEKAKQQ AEDAWDRLPP NVRKFDVDVE QFHYLVVLDD YGNVLSVTRT GVRPYVGSEK AKAGIMDKVD HKTPEEIYEA LGFNNEEPQR QNQAKKAAYD VFYSFSMNRD RIQSDVLNKA AEVISDIGNK VGDYLGDAYK SLAREIADDV KNFQGKTIRS YDDAMASLNK VLSNPGFKFN RADSDALANV WRSIDAQDMA NKLGNISKAF KFADVVMKVE KVREKSIEGY ETGNWGPLML EVESWVLSGI ASAVALGVFS ATLGAYALSL GAPAIAVGIV GILLAAVVGA LLDDKFADAL NKEIIKPAH
配列番号１０  コリシン５のアミノ酸配列
MDKVTDNSPD VESTESTEGS FPTVGVDTGD TITATLATGT ENVGGGGGAF GGASESSAAI HATAKWSTAQ LKKHQAEQAA RAAAAEAALA KAKSQRDALT QRLKDIVNDA LRANAARSPS VTDLAHANNM AMQAEAERLR LAKAEQKARE EAEAAEKALR EAERQRDEIA RQQAETAHLL AMAEAAEAEK NRQDSLDEEH RAVEVAEKKL AEAKAELAKA ESDVQSKQAI VSRVAGELEN AQKSVDVKVT GFPGWRDVQK KLERQLQDKK NEYSSVTNAL NSAVSIRDAK KTDVQNAEIK LKEAKDALEK SQVKDSVDTM VGFYQYITEQ YGEKYSRIAQ DLAEKAKGSK FSSVDEALAA FEKYKNVLDK KISKVDRDAI FNALESVNYD ELSKNLTKIS KSLKITSRVS FLYDVGSDFK NAIETGNWRP LFVTLEKSAV DVGVAKIVAL MFSFIVGVPL GFWGIAIVTG IVSSYIGDDE LNKLNELLGI
配列番号１１  コリシン１０のアミノ酸配列
MDKVTDNSPD VESTESTEGS FPTVGVDTGD TITATLATGT ENVGGGGGAF GGASESSAAI HATAKWSTAQ LKKHQAEQAA RAAAAEAALA KAKSQRDALT QRLKDIVNDA LRANAARSPS VTDLAHANNM AMQAEAERLR LAKAEQKARE EAEAAEKALR EAERQRDEIA RQQAETAHLL AMAEAAEAEK NRQDSLDEEH RAVEVAEKKL AEAKAELAKA ESDVQSKQAI VSRVAGELEN AQKSVDVKVT GFPGWRDVQK KLERQLQDKK NEYSSVTNAL NSAVSIRDAK KTEVQNAEIK LKEAKDALEK SQVKDSVDTM VGFYQYITEQ YGEKYSRIAQ DLAEKAKGSK FNSVDEALAA FEKYKNVLDK KFSKVDRDDI FNALESITYD EWAKHLEKIS RALKVTGYLS FGYDVWDGTL KGLKTGDWKP LFVTLEKSAV DFGVAKIVAL MFSFIVGAPL GFWGIAIITG IVSSYIGDDE LNKLNELLGI
配列番号１２  コリシンＩａのアミノ酸配列
MSDPVRITNP GAESLGYDSD GHEIMAVDIY VNPPRVDVFH GTPPAWSSFG NKTIWGGNEW VDDSPTRSDI EKRDKEITAY KNTLSAQQKE NENKRTEAGK RLSAAIAARE KDENTLKTLR AGNADAADIT RQEFRLLQAE LREYGFRTEI AGYDALRLHT ESRMLFADAD SLRISPREAR SLIEQAEKRQ KDAQNADKKA ADMLAEYERR KGILDTRLSE LEKNGGAALA VLDAQQARLL GQQTRNDRAI SEARNKLSSV TESLNTARNA LTRAEQQLTQ QKNTPDGKTI VSPEKFPGRS STNHSIVVSG DPRFAGTIKI TTSAVIDNRA NLNYLLTHSG LDYKRNILND RNPVVTEDVE GDKKIYNAEV AEWDKLRQRL LDARNKITSA ESAVNSARNN LSARTNEQKH ANDALNALLK EKENIRNQLA GINQKIAEEK RKQDELKATK DAINFTTEFL KSVSEKYGAK AEQLAREMAG QAKGKKIRNV EEALKTYEKY RADINKKINA KDRAAIAAAL ESVKLSDISS NLNRFSRGLG YAGKFTSLAD WITEFGKAVR TENWRPLFVK TETIIAGNAA TALVALVFSI LTGSALGIIG YGLLMAVTGA LIDESLVEKA NKFWGI
配列番号１３  コリシンＩｂのアミノ酸配列
MSDPVRITNP GAESLGYDSD GHEIMAVDIY VNPPRVDVFH GTPPAWSSFG NKTIWGGNEW VDDSPTRSDI EKRDKEITAY KNTLSAQQKE NENKRTEAGK RLSAAIAARE KDENTLKTLR AGNADAADIT RQEFRLLQAE LREYGFRTEI AGYDALRLHT ESRMLFADAD SLRISPREAR SLIEQAEKRQ KDAQNADKKA ADMLAEYERR KGILDTRLSE LEKNGGAALA VLDAQQARLL GQQTRNDRAI SEARNKLSSV TESLKTARNA LTRAEQQLTQ QKNTPDGKTI VSPEKFPGRS STNHSIVVSG DPRFAGTIKI TTSAVIDNRA NLNYLLTHSG LDYKRNILND RNPVVTEDVE GDKKIYNAEV AEWDKLRQRL LDARNKITSA ESAINSARNN VSARTNEQKH ANDALNALLK EKENIRSQLA DINQKIAEEK RKRDEINMVK DAIKLTSDFY RTIYDEFGKQ ASELAKELAS VSQGKQIKSV DDALNAFDKF RNNLNKKYNI QDRMAISKAL EAINQVHMAE NFKLFSKAFG FTGKVIERYD VAVELQKAVK TDNWRPFFVK LESLAAGRAA SAVTAWAFSV MLGTPVGILG FAIIMAAVSA LVNDKFIEQV NKLIGI
配列番号１４  コリシンＭのアミノ酸配列
METLTVHAPS PSTNLPSYGN GAFSLSAPHV PGAGPLLVQV VYSFFQSPNM CLQALTQLED YIKKHGASNP LTLQIISTNI GYFCNADRNL VLHPGISVYD AYHFAKPAPS QYDYRSMNMK QMSGNVTTPI VALAHYLWGN GAERSVNIAN IGLKISPMKI NQIKDIIKSG VVGTFPVSTK FTHATGDYNV ITGAYLGNIT LKTEGTLTIS ANGSWTYNGV VRSYDDKYDF NASTHRGIIG ESLTRLGAMF SGKEYQILLP GEIHIKESGK R
配列番号１５  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ２の発現に使用したヌクレオチド配列
atgtctggtggtgatggtatcggtcacaatagcggtgctcattctactggtggtgtgaacggttcttcatctggtaggggtggtagttcttcaggtggtggtaacaaccctaactctggtcctggttggggtactactcatactcctgatggtcacgatatccacaactacaaccctggtgagtttggtggtggtggacataagcctggtggaaacggtggtaatcactctggtggtactggtgatggacaacctcctggtgctgctatggcttttggtttccctgctcttgttcctgctggtgctggtggtcttgctgttactgtttctggtgatgctctggctgctgcaattgctgatgtgcttgctgttctgaagggacctttcaagtttggtgcttggggtatcgctctgtacggtattcttcctaccgagatcgctaaggatgatccaaggatgatgagcaagatcgtgacctctttgcctgctgatgctgtgactgagtctcctgtgtcatctctgcctcttgatcaggctactgtgagcgttaccaagagggttaccgatgtggttaaggatgagaggcagcacattgctgttgttgctggtgtgcctgcttctatccctgttgttgatgctaagcctactacccaccctggtgtgttctctgtttctgttcctggtctgcctgatctgcaggtttcaactgtgaagaacgctcctgctatgactgctttgcctaggggtgttactgatgagaaggataggactgttcaccctgctggtttcaccttcggtggttcttctcatgaggctgtgatcaggttccctaaagagtctggtcaggctcctgtttacgtgtcagtgaccgatgttcttacccctgagcaggttaagcagagacaggatgaagagaatagaaggcagcaagagtgggatgctactcaccctgttgaagtggctgagaggaattacaggctggcttctgatgagctgaacagggctaatgtggatgtggctggtaagcaagagaggcagattcaagctgctcaagctgttgctgctagaaagggtgaactggatgctgctaacaagaccttcgctgatgctaaagaagagatcaagaagttcgagaggttcgctcacgatcctatggctggtggacacagaatgtggcaaatggctggtcttaaggctcagagggctcagaatgaggttaaccagaaacaagctgagttcaacgctgctgagaaagaaaaggctgatgcagatgctgctctgaacgtggcacttgagtctaggaagcagaaagaacaaaaggcaaaggatgctagcgataagctggataaggaaaacaagaggaaccaccctggaaaggctactggtaagggtcaacctgttggtgataagtggcttgaggatgctggtaaagaagctggagcacctgttccagataggatcgctgataagctgagagataaggaattcaagaacttcgatgattttaggaagaagttctgggaagaggtaaatttctagtttttctccttcattttcttggttaggacccttttctctttttatttttttgagctttgatctttctttaaactgatctattttttaattgattggttatggtgtaaatattacatagctttaactgataatctgattactttatttcgtgtgtctatgatgatgatgataactgcaggttagcaaggatcctgagctgagcaagcagttcatccctggtaacaagaaaaggatgagccagggtcttgctcctagggctagaaacaaggatactgtgggtggtagaagatccttcgagctgcatcacgataagccaatctctcaggatggtggtgtttacgatatggataacatcagggtgaccaccccaaagctgcacatcgatattcataggggaaagtaa
配列番号１６  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ３の発現に使用したヌクレオチド配列
atgtctggtggtgatggtaggggtcataataccggtgctcatagcaccagcggtaacattaacggtggtcctactggtcttggtgtgtcaggtggtgcttctgatggttctggttggtcctctgagaacaatccttggggtggtggtagcggttctggtattcactggggaggtggaagtggtagaggtaatggtggtggaaacggtaacagtggtggtggttctggaactggtggtaacctttctgctgttgctgctcctgttgctttcggtttccctgctctttctactcctggtgctggtggtttggctgtgtctatttctgcttctgagctgagcgctgctatcgctggtattatcgctaagctgaagaaggtgaacctgaagttcacccctttcggtgtggtgctgtcctctttgattcctagcgagatcgctaaggatgatcctaacatgatgagcaagatcgtgaccagcctgcctgctgatgatattaccgagtctcctgtgtcctctctgcctcttgataaggctactgtgaatgtgaacgtgagggtggtggatgatgtgaaggatgagaggcagaacatcagcgttgtgtctggtgttcctatgtctgtgcctgttgtggatgctaagcctactgaaaggcctggtgtgttcaccgcttctattccaggtgctcctgtgctgaacatctccgtgaacaattctacccctgctgtgcagactctttctcctggtgtgactaacaacaccgataaggatgttaggcctgctggtttcactcagggtggtaataccagggatgctgtgatcaggttccctaaggattctggtcacaacgcagtgtacgtgtccgtgtctgatgtgttgtctccagatcaggttaagcagaggcaggatgaagagaatagaaggcagcaagagtgggatgctactcaccctgttgaagttgctgagagagagtacgagaacgctagagctgaacttgaggctgaaaacaagaacgtgcacagccttcaggtggcacttgatggtcttaagaataccgctgagggtctggctctttctgatgctggtagacatcctctgaccagcagcgagtctagatttgttgctgtgcctggttactccggtggtggtgttcattttgatgctaccgctaccgtggatagcagggataggcttaactctcttctgtctcttggtggtgctgcttacgtgaacaacgtgttggagcttggtgaggtgtcagctcctactgaggatggtttgaaggtgggaaacgctatcaagaacgctatgatcgaggtgtacgataagctgaggcagaggcttattaccaggcagaacgagatcaaccacgctcaggtgtcacttaacaccgctatcgagtctaggaacaagaaagaggaaaagaagaggtccgcagagaacaagctgaacgaagagagaaacaagcctagaaagggtactaaggattacggacacgattaccatcctgctccagagactgaagaaatcaagggtctgggtgatatcaagaagggtatccctaagacccctaagcagaacggtggtggtaagagaaagagatggatcggagataagggtagaaagatctacgagtgggatagccagcatggtgagcttgaaggtaaatttctagtttttctccttcattttcttggttaggacccttttctctttttatttttttgagctttgatctttctttaaactgatctattttttaattgattggttatggtgtaaatattacatagctttaactgataatctgattactttatttcgtgtgtctatgatgatgatgataactgcaggttatagggcttcagatggtcagcacctgggaagctttgatcctaagactggtaagcagctgaagggtcctgatccaaagaggaacatcaagaagtacctttaa
配列番号１７  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ７の発現に使用したヌクレオチド配列
atgtctggtggtgatggtatcggtcacaatagcggtgctcattctactggtggtgtgaacggttcctcttctggttctggtggaagctcatctggaagcggtaacaaccctaattctggtcctggttggggtactactcatacccctaacggtgatatccacaactacaaccctggtgagtttggtggtggtggaaacaagcctggtggacatggtggtaactctggtaaccacgatggtagctctggaaacggtcaaccttctgctgctcctatggcttttggtttccctgctcttgctcctgctggtgctggttctcttgctgttactgtttctggtgaggctctgtctgctgctatcgctgatattttcgctgctctgaagggacctttcaagttcggtgcttggggtattgctctgtacggtattatgcctaccgagatcgctaaggatgatcctaacatgatgagcaagatcatgaccagcctgcctgctgatactgtgactgatactcctgtgtcctctctgcctcttgatcaggctactgtgtctgtgactaagagggttgcagatgtggtgaaggatgagaggcagcatattgctgttgttgctggtgtgcctatgtctgtgcctgttgttgatgctaagcctaccactaggcctggtatcttctctgctactgttcctggacttcctgctttggaggtgtcaaccggtaagtctattcctgcttctaccgctctgcctaggggtattactgaggataaggataggactgagcaccctgctggtttcactttcggtggttcttctcacgatgctgtgatcaggttccctaaagagtctggtcaggctccagtttacgtgtcagtgactgatgtgcttacccctgagcaggttaagcagagacaggatgaagagtctagaaggcagcaagagtgggatgctactcatcctgttgaagtggctgagaggaactacaggcttgcttctgatgagctgaacagggtgaacgctgatgtggctggtaagcaagaaagacaagctcaagctggacaggctgttgctgctagaaagggtgaacttgatgctgctaacaagaccttcgctgatgctaaagaagagatcaagaagttcgagcacttcgctagggatccaatggctggtggtcatagaatgtggcagatggctggtcttaaggctcagagggctcagaatgaggttaaccagaaacaagctgagttcgatgctgcagagaaagaaaaggctgatgctgatgcagctctgaacgctgctcttgaatctaggaagcagaaagagcagaaggctaaggataccaaagagaggctggataaggaaaacaagaggaatcagcctggtaaggctaccggtaagggtcagccagtttctgataagtggcttgaggatgctggtaaagagagcggttctcctatccctgatagcattgctgataagcttagagataaggaattcagaaacttcgatgattttaggaagaagttctgggaggaagttagcaaggatcctgagctgagcaagcagttcatcaagggtaacagagataggatgcaggtaaatttctagtttttctccttcattttcttggttaggacccttttctctttttatttttttgagctttgatctttctttaaactgatctattttttaattgattggttatggtgtaaatattacatagctttaactgataatctgattactttatttcgtgtgtctatgatgatgatgataactgcaggttggaaaggctcctaagtccagaaagaaggatgctgctggtaagaggacctctttcgagcttcatcacgataagcctgtgagccaggatggtggtgtttacgatatggataacctgaggatcaccacccctaagaggcacatcgatattcataggggacagtaa
配列番号１８  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ１ａの発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号１９  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ１ｂの発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号２０  実施例でサルモシンＳｐｓｔの発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号２１  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ２免疫タンパク質ＳＩｍｍＥ２の発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号２２  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ７免疫タンパク質ＳＩｍｍＥ７の発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号２３  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ１ａの発現に使用したＴＭＶベースのバイナリーベクターのヌクレオチド配列
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配列番号２４  実施例でサルモシンＳｃｏｌＥ２免疫タンパク質ＩｍｍＳｃｏｌＥ２の発現に使用したＰＶＸベースのバイナリーベクターのヌクレオチド配列
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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