(57)【要約】  代謝化合物のＩＲＯＡマトリックスが開示される。その化合物はそれぞれ、２０００ＡＭＵ以下の分子量を有し、２つの所定のアイソトポマーバランスで等しく存在する第１および第２のアイソトポマーとして存在し、それぞれ２〜１０％の第１の同位体、および９０〜９８％の第２の同位体を含有する。天然存在度質量スペクトル分析代謝産物試料をＩＲＯＡ試料に転換するための試薬対もまた開示され、試薬対は、それぞれ２〜１０％の第１の同位体および９０〜９８％の第２の同位体を含有する第１および第２のアイソトポマーを構成する２つの反応的に同一の試薬を含む。試薬対はそれぞれ、生物学的に生成した代謝化合物の組成物中に存在する１種または複数種の化合物の官能基と反応して、それに結合する同じ反応基を含有する。上記および関連材料を作製および使用する方法もまた開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に生成した代謝化合物のＩＲＯＡマトリックス組成物であって、前記代謝化合物がそれぞれ、約２０００ＡＭＵ以下の分子量を有し、前記代謝化合物のそれぞれが、２つの所定のアイソトポマーバランスで等しく存在する第１および第２のアイソトポマーとして存在し、前記第１のアイソトポマーが、約２〜約１０％の第１の同位体を含有し、前記第２のアイソトポマーが、約９０〜約９８％の同じ原子の第２の同位体を含有し、前記第１および第２の同位体が、放射性崩壊に対して安定であり、水素および重水素以外であることを特徴とするＩＲＯＡマトリックス組成物。
【請求項２】
前記生物学的に生成した代謝化合物が、単細胞または多細胞生物の培養物から得られた細胞溶解物調製物から得られ、これらの分子が、無作為および普遍的に標識化されている、請求項１に記載のＩＲＯＡマトリックス組成物。
【請求項３】
前記細胞溶解物調製物の細胞が、単細胞生物の培養物から得られ、これらの分子が、無作為および普遍的に標識化されている、請求項２に記載のＩＲＯＡマトリックス組成物。
【請求項４】
同じ原子の前記第１および第２の同位体が、炭素（１２Ｃおよび１３Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏ、１７Ｏ、または１８Ｏ）、硫黄（３２Ｓ、３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓ）、塩素（３５Ｃｌおよび３７Ｃｌ）、マグネシウム（２４Ｍｇ、２５Ｍｇおよび２６Ｍｇ）、ケイ素（２７Ｓｉ、２８Ｓｉおよび２９Ｓｉ）、カルシウム（４０Ｃａ、４２Ｃａ、４３Ｃａ、および４４Ｃａ）、ならびに臭素（７９Ｂｒおよび８１Ｂｒ）の同位体からなる群から選択される１種または複数種の元素である、請求項１に記載のＩＲＯＡマトリックス組成物。
【請求項５】
同じ原子の前記第１および第２の同位体が、１２Ｃおよび１３Ｃである、請求項１に記載のＩＲＯＡマトリックス組成物。
【請求項６】
前記代謝化合物のそれぞれが、約１５００ＡＭＵ以下の分子量を有する、請求項１に記載のＩＲＯＡマトリックス組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のＩＲＯＡマトリックス中の化合物の同一性データの参照ライブラリを作成する方法であって、
１）装置の分解能および感度内の前記ＩＲＯＡマトリックスの化合物の同一性を質量分析により決定して、その対称ＩＲＯＡピークパターンを提供し、また、
ａ）存在する化合物のガスおよび／または液体クロマトグラフィー特性、
ｂ）存在する化合物のイオン移動度、ならびに
ｃ）存在する化合物のＩＲＯＡ断片化パターン
の１つまたは複数をさらに決定する工程と、
２）そのようにして決定された化合物同一性データを、後に分析される試料中の同じ化合物の１つまたは複数の同定に使用するために維持する工程と、
を含む方法。
【請求項８】
前記ＩＲＯＡマトリックスの化合物の同一性が、化合物の衝突断面によりさらに決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＲＯＡマトリックスの化合物の同一性が、存在する化合物のＩＲＯＡ断片化パターンによりさらに決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７のＩＲＯＡマトリックス中の化合物の同一性データの参照ライブラリ。
【請求項１１】
ＩＲＯＡマトリックス組成物のより重い分子量の同位体を含有する化合物を約９０〜約９８％含有するアイソトポマーと同じ化学組成であり、天然存在度試料中に挿入される内部標準を使用して、天然存在度試料中の化合物を定量化および同定する方法であって、そのようにして組み合わされた試料が、少なくとも質量スペクトル分析により分析され、前記内部標準中の各化合物自体が、請求項１０に記載の同一性データの参照ライブラリにおいて同定される方法。
【請求項１２】
内部標準中の各化合物のＩＲＯＡ特性が、各化合物の同一性を裏付けるために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
各天然存在度試料化合物の量が決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
各天然存在度試料化合物の量が、前記内部標準と比較して決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
質量分析装置および関連したイオン移動度チャネル、ならびに存在する場合はクロマトグラフィー装置の動作上の恒常性に関する品質保証および／または品質管理を測定する方法であって、
請求項１に記載のＩＲＯＡマトリックス組成物の試料を評価する工程と、
対称ＩＲＯＡ質量スペクトルピークの同じセットおよび振幅が、各分析において存在するかどうかを決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記生物学的に生成した代謝化合物が、細胞溶解物調製物から得られる、請求項１５に記載の品質保証および／または品質管理を決定する方法。
【請求項１７】
前記細胞溶解物調製物の細胞が、単細胞または多細胞生物の培養物から得られる、請求項１５に記載の品質保証および／または品質管理を決定する方法。
【請求項１８】
同じ原子の前記第１および第２の同位体が、炭素（１２Ｃおよび１３Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏ、１７Ｏ、または１８Ｏ）、硫黄（３２Ｓ、３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓ）、塩素（３５Ｃｌおよび３７Ｃｌ）、マグネシウム（２４Ｍｇ、２５Ｍｇおよび２６Ｍｇ）、ケイ素（２７Ｓｉ、２８Ｓｉおよび２９Ｓｉ）、カルシウム（４０Ｃａ、４２Ｃａ、４３Ｃａ、および４４Ｃａ）、ならびに臭素（７９Ｂｒおよび８１Ｂｒ）の同位体からなる群から選択される、請求項１５に記載の品質保証および／または品質管理を決定する方法。
【請求項１９】
同じ原子の前記第１および第２の同位体が、１２Ｃおよび１３Ｃである、請求項１５に記載の品質保証および／または品質管理を決定する方法。
【請求項２０】
前記代謝化合物のそれぞれが、約１５００ＡＭＵ以下の分子量を有する、請求項１５に記載の品質保証および／または品質管理を決定する方法。
【請求項２１】
天然存在度質量スペクトル分析試料の生物学的に生成した代謝化合物を、第１および第２のアイソトポマーを構成する２つの反応的に同一の試薬を含むＩＲＯＡ試料に転換することができる試薬対であって、前記第１のアイソトポマーが、約２〜約１０％の第１の同位体を含有し、前記第２のアイソトポマーが、約９０〜約９８％の同じ原子の第２の同位体を含有し、前記第１および第２の同位体が、放射性崩壊に対して安定であり、水素および重水素以外であり、前記試薬対のそれぞれが、生物学的に生成した代謝化合物の組成物中に存在する１種または複数種の化合物の官能基と反応して、それに結合する同じ反応基を含有し、前記代謝化合物がそれぞれ、約２０００ＡＭＵ以下の分子量を有する試薬対。
【請求項２２】
前記反応基が、アミン、アルデヒドまたはケトン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボン酸の１つまたは複数からなる群から選択される官能基と反応して、それに結合する、請求項２１に記載の試薬対。
【請求項２３】
前記反応基が、アミン官能基と反応して、それに結合する、請求項２２に記載の試薬対。
【請求項２４】
前記反応基が、イソチオシアネートである、請求項２３に記載の試薬対。
【請求項２５】
前記イソチオシアネートが、フェニルイソチオシアネートである、請求項２４に記載の試薬対。
【請求項２６】
前記反応基が、ケトンまたはアルデヒド基と反応して、それに結合する、請求項２２に記載の試薬対。
【請求項２７】
前記反応基が、ヒドラジンまたはセミカルバジドである、請求項２６に記載の試薬対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその開示が組み込まれる、２０１７年２月２４日に出願された仮特許出願第６２／４６３１５３号、名称「メタボロミクスのためのＩＭＳ支援ＩＲＯＡの実装」の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
代謝産物は、生物系における様々な代謝経路および細胞制御プロセスにおいて、構成成分として使用される、または最終生成物として生成される低分子量化合物（約２０００Ｄａ未満、より一般的には約１０００Ｄａ未満）である。生物系における代謝産物の全ての集合は、細胞、経路または生物レベルであるかに関わらず、「メタボローム」として知られる。メタボロームにおけるこれらの代謝産物のレベルは、生物系のゲノム、プロテオーム、および／またはトランスクリプトームにより決定付けられ、または環境変動に影響され、表現型の変化をもたらす。したがって、表現型の改変の原因をマッピングまたは同定し、「オミクス」間の相関を理解するために、メタボロミクスが適用され得る。Dwivedi, et al., Int J Mass Spectrom 2010 298:78-90を参照されたい。
所与の代謝産物または断片における炭素情報の特性決定を可能にするために、同位体比異常値分析（Ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｒａｔｉｏ  Ｏｕｔｌｉｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＩＲＯＡ）が開発された。他の安定同位体標識化法とは異なり、対照および実験集団に対してそれぞれ天然存在度の基材（天然の炭素原子では１．１％の１３Ｃアイソトポマーが見られる）および９８〜９９％濃縮基材を利用するのではなく、原栄養酵母（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ）を用いたＩＲＯＡは、炭素源として無作為化９５％１２Ｃグルコース（５％１３Ｃ）、および９５％無作為化１３Ｃグルコース（５％１２Ｃ）を使用する。この戦略は、質量スペクトルにおける観察可能な同位体ピークのためのより予測可能で診断的なパターンをもたらす。［Qiu et al., Metabolites 2018 8:9。］
【０００３】
代謝表現型検査へのＩＲＯＡの有望性は、モデル生物試験において実証されている。ＣＥＮ．ＰＫバックグラウンドにおける原栄養野生型株、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）［Brauer et al., Mol. Biol. Cell 2005, 16:2503-2517］を、全ての代謝産物のアイソトポマーパターンが標識化グルコースを反映するように、主要炭素源として無作為９５％１２Ｃ、または９５％１３Ｃグルコースを含有する最小酵母窒素ベース（ＹＮＢ）培地中で成長させた［Qiu et al., Anal. Chem. 2016, 88:2747-2754］が、これは微生物種試験に容易に適合され得るプロトコルである。
多数の９５％１３Ｃ試料（Ｍn-1、Ｍn-2等、１３Ｃエンベロープ）中の軽質アイソトポログまたは９５％１２Ｃ試料（Ｍ0+1、Ｍ0+2等、１２Ｃエンベロープ）中の重質アイソトポログは、初期基材濃縮に基づき、生成された代謝産物中で１３Ｃの二項分布に従う。１２Ｃ（Ｍ0）同位体ピークと１３Ｃ（Ｍn）同位体ピークとの間の質量差は、代謝産物の炭素骨格中の炭素数（ｎ）を示す。これは、化学式生成（ＣＦＧ）、ならびに対照（１３Ｃ）および処理された（１２Ｃ）群との間の正規化の可能性を狭める。［Qiu et al., Metabolites 2018 8:9。］
【０００４】
ＩＲＯＡ基本プロトコル、もしくはＩＲＯＡ表現型プロトコル（最適）等のメタボロミクス技術［de Jong and Beecher, C. Bioanalysis 2012, 4 (18):2303-2314］、または標準的なメタボロミクス技術を使用して、生物学的試料中の数百またはさらには数千もの化合物を同定および大まかに定量化することが可能である。しかしながら、そのような測定を行い、任意の２つ以上の試料からの測定値を比較するには、理想的には１日で、全ての試料が単一バッチで分析される必要がある。これは、日差変動が大きすぎて別の方法では克服できず、絶対的な定量化、すなわち既知の標準と比較した定量化が保証され得ないためである。
【０００５】
現在、同じ機器で数日間隔を置いて測定された試料を比較することは定量的には許容されず、異なる機器で、または異なる方法に基づいて生成されたデータを比較することは不可能である。機器ドリフト、クロマトグラフィードリフト、およびさらには環境条件が、同じ機器であっても再現性を得るのが困難であるほど十分結果を改変し得る。これらの定量化の問題に加えて、多くの質量スペクトル技術にわたる任意の化合物の同定は、極めて慎重な較正がなされ、信頼性のある標準が測定されない限り、それだけでは成功する可能性が低い。これは、同じ厳密な質量を有するために混同され得る複数の生物学的化合物が存在するためだけでなく、さらにより問題なことに、しばしば、生物学的同重体同等物と構造的に異なるが正確な質量、またはさらには式を共有し得るより多くのアーチファクトまたは断片的化合物が存在するためである。
【０００６】
本明細書において以下に開示される発明は、２０１０年１０月２６日発行の以降でＩＲＯＡ９６３と称される基本ＩＲＯＡ特許である米国特許第７，８２０，９６３号；２０１０年１０月２６日発行の以降でＩＲＯＡ９６４と称される米国特許第７，８２０，９６４号；２０１２年５月１日発行の以降でＩＲＯＡ９４５と称される米国特許第８，１６８，９４５号；２０１３年９月１７日発行の以降でＩＲＯＡ５２０と称される米国特許第８，５３６，５２０号；および２０１５年３月３日発行の以降でＩＲＯＡ２５１と称される米国特許第８，９６９，２５１号に記載の方法にまで及ぶ。これらの特許およびそれに引用されている技術は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
ＩＲＯＡプロトコルは、試料が質量スペクトル分析に供された場合に個々の化学成分のより良好な同定および定量化を提供するために、生物学的試料に情報を挿入するような数学的情報を提供する同位体パターンの作成に依存する。従来の方法は、最善の定量精度を達成するために、クロマトグラフィー的にクリーンな、すなわち「ベースライン」の分離を必要としていたが、ＩＲＯＡプロトコルはそれを必要とせず、したがって、そのような分離が一貫して可能ではない化学的に極めて複雑な試料の定量化に使用することができる。
試験された例示的試料は、適切な同位体により均一および普遍的に標識化された。酵素または生体系によって大きく区別されない２つの安定な同位体を有する元素が好ましくは使用される。本明細書において、炭素（具体的には１２Ｃおよび１３Ｃ）がその汎用性により例示のために使用される。しかしながら、さらなる例は、当業者に周知である。
最小限の生物学的同位体効果を示す同位体の使用が重要である。例えば、重水素（Ｄ）等の水素の同位体の使用は、重水素同位体が水素の２倍の質量を有し、したがっていくつかの酵素機構の反応速度の低下をもたらすことから、代謝に観察可能な効果をしばしばもたらすため、好適ではない。三重水素（Ｔ）は放射性であり、したがって崩壊に対して安定ではない。
【０００８】
これらのプロトコルの多くにおいて、ＩＲＯＡパターンの生成は、分子内の全炭素の確率が、同位体確率に近い範囲まで慎重に制約されている分子の形成に依存している。例示的には、炭素の安定な同位体［炭素−１２（１２Ｃ）および炭素−１３（１３Ｃ）］を使用した系では、この例の同位体比は、具体的には、一方の炭素同位体の他方の炭素同位体における５〜１０パーセントの希釈を含み、すなわち、一方の試料は、以降で「Ｃ−１２培地」と呼ばれる、炭素−１２（１２Ｃ）が９５％および炭素−１３（１３Ｃ）が５％でありうる炭素源（培地中の栄養物）で成長させ、そのような状況では、他方の試料は、以降で「Ｃ−１３培地」と呼ばれる９５％の炭素−１３および５％の炭素−１２を含有する栄養物を培地中に含有する反転した培地中で成長させる。これらの場合のそれぞれにおいて、生物系は、培地中の栄養物を取り込み、それを元に自身を転換するような様式で成長し、したがってその部分が全てその起源に対して明確に同定可能となる。２つの異なる所定の同位体比で存在する第２の原子の２つの同位体の第２のセットを栄養物組成物に組み込むことにより、さらなる情報を得ることができる場合がある。
【０００９】
２つの試料を混合する、混ぜる、または別の方法で複合化すると、複合試料は、「対照」（実質的過半数、例えば９０％〜９５％の１２Ｃで構成される）および「実験」（実質的過半数、例えば９０％〜９５％の１３Ｃで構成される）の両方からの分子を含有する。この方法により教示される９０％〜９５％の比から著しく逸脱すると、ＩＲＯＡ９６３において教示されるような解釈の可能性が低減するが、９８％および２％の炭素同位体が成功裏に使用されている。
さらにより具体的には、確率は、例示的なＩＲＯＡ標準試料において９５％Ｃ−１３に設定することができる。そのような標準では、それに含有される分子の全てが、その炭素の確率が達成可能な限り９５％１３Ｃに近くなる特性を示す。そのようなＩＲＯＡ分子は、以下のような多くのスペクトル特性を有する。
【００１０】
１）１２Ｃ対１３Ｃの同位体バランスが、約１．１％の天然存在度確率よりはるかに高いが、特に１００％に近くはなく、したがって、各分子は、その分子のアイソトポマーセットの集合として存在し、各セットの質量は、厳密に１つの炭素中性子の質量、すなわち約１．００３３５ＡＭＵだけ異なる。これらのセットは、天然存在度同等物よりも著しく大きく複雑であり、容易に同定可能である。
２）上記セットにわたるアイソトポマーの分布は、分子内の炭素数、およびそれぞれのそのような位置における１３Ｃの確率の関数である。水素、酸素、窒素等の他の天然存在度源に由来するアイソトポマーセットの存在は非常に低いため、それらのパターンは等しく分布し、Ｃ１３アイソトポマーセットには重要ではない。
３）各ＩＲＯＡ分子のアイソトポマーの量は、質量分析器においてピークの高さとして推定することができ、したがって、全てのアイソトポマーセットの相対濃度は、各分子のピークのパターンを形成する。このパターンは、パーセント（ｘ）および炭素数（ｎ）の二項分布として有効に定義され、したがって確率（（１−ｘ）＋（ｘ））nとして計算され得る。
４）これらのＩＲＯＡパターンは、ＩＲＯＡ試料の任意の質量スペクトル分析の主要な特徴である。パターン自体は極めて複雑となり得るため、無作為ピークノイズによるその発生は効果的に消滅する。これらのパターンを高い精度で同定するソフトウェアが開発された。
５）そのような分子のＣ１２およびＣ１３モノアイソトピック質量を観察することはできないが、観察されるパターンの形状の検査によって決定することができる。炭素数によって効果的に制約されるモノアイソトピック質量は、分子の分子式の一意的決定因子であり、天然存在度分子に必要な多項式を解こうとするよりもはるかに正確である。
６）そのアイソトポマーセットの質量差以外、分子は別の方法では区別不可能であり、したがって、ほぼ全ての処理を通して極めて類似した挙動を示し、一般に同じ物理的特性を有する。ＩＲＯＡピークのこの特性が、ＩＲＯＡ同定技術の基本である。
これらの特性に基づく多くのＩＲＯＡプロトコルが存在する。以下の２つのＩＲＯＡプロトコルは、本発明に関連する。
【００１１】
基本ＩＲＯＡプロトコル
基本ＩＲＯＡプロトコル（ＩＲＯＡ９６３、ならびに引き続きＩＲＯＡ９４５およびＩＲＯＡ５２０に記載されている）は、大きく異なる量、典型的にはそれぞれ９０〜９５％および１０〜５％の第１および第２の同位体、ならびに１０〜５％の第１の同位体および９０〜９５％の第２の同位体を含有するＩＲＯＡ分子の２つの集団を形成する。水素および重水素以外の同位体が好ましく、例えば、約５％のＣ１２および約９５％のＣ１３と共に使用される約５％のＣ１３および約９５％のＣ１２が特に好ましい。
【００１２】
両方の集団において、あらゆる化合物中のＣ１３の分布は無作為および普遍的であり、炭素がＣ１２またはＣ１３のいずれかである確率は上述の値であり、ここでは約５％または９５％のいずれかである。分子の実験「基本」集団（Ｃ１２−Ｂ）では、約５％がＣ１３であり、残りの炭素（９５％）はＣ１２である。対照の「内部標準」集団（Ｃ１３−ＩＳ）試料は、約９５％のＣ１３および５％のＣ１２で構成される。
【００１３】
Ｃ１２−ＢおよびＣ１３−ＩＳは共に、ＩＲＯＡ分子で構成されるため、
１）所与の分子に対して、そのそれぞれのピークパターンは異なるが、両方とも同じ分子式に分解される。Ｃ１２−Ｂモノアイソトピックピークは、明確なＭ＋１ピーク、Ｍ＋２ピーク、およびおそらくはさらなるＭ＋ｎピークを有する。Ｃ１３−ＩＳモノアイソトピックピークは、明確なＭ−１ピーク、Ｍ−２ピーク、および同様にさらなるＭ−ｎピークを有する。
２）重水素に基づくアイソトポマーとは異なり、これらのアイソトポマーをコクロマトグラフィーに供すると、質量を除いて非常に類似した物理的特性を示す。
３）ＩＲＯＡ化合物ピークは、ほとんどの実験系において生物学的手段によってのみ形成され得る（ＩＲＯＡ５２０）が、意図的な合成ＩＲＯＡ化合物（ＩＲＯＡ９６４）もまた調製および追加され得る。このワークフローにおいて、ＩＲＯＡ信号の存在は、全てのＩＲＯＡパターンがＣ１３−ＩＳまたはＣ１２−Ｂにのみ由来し得るが、常に天然存在度同位体特性に基づくアーチファクト、電子的ノイズ、または任意のスプリアス信号からすぐに区別され得ることを保証する。
４）Ｃ１２−Ｂ試料およびＣ１３−ＩＳの両方からの同じ分子に由来するパターンが同じ試料中に見出される場合、対の信号は三重冗長性情報系であり、
ａ）分子内の炭素数は、実験試料に由来するＩＲＯＡ分子のＣ１２−Ｂモノアイソトピックピークに対するＭ＋１の高さの比によって決定することができ、
ｂ）分子内の炭素数は、Ｃ１３−ＩＳ試料に由来するＩＲＯＡ分子のＣ１３−ＩＳモノアイソトピックピークに対するＭ−１の高さの比によって決定することができ、
ｃ）分子内の炭素数は、実験試料に由来する分子のモノアイソトピック質量と、Ｃ１３−ＩＳに由来するモノアイソトピック質量との間の質量差により決定することができる。
これらの計算の３つ全てが同じ炭素数を示す場合、パターンが正しく検出され、誤差の確率が極めて低い可能性が極めて高い。これらのパターンの発見は完全にソフトウェア主導となり得るため、そのようなピークの発見は完全に自動化可能な作業である（ＩＲＯＡ９４５）。
【００１４】
基本ＩＲＯＡプロトコルは、実験試料の完全に公正な（または標的化されていない）分析を可能にし、Ｃ１２−Ｂは、実験計画の生物学的効果の発見の目的でそのような実験計画に従い変動するようにされてもよい。そのような試料では、Ｃ１２−Ｂ集団は実験試料から得られ、もし分子がＣ１３−ＩＳまたはＣ１２−Ｂ試料中にない場合でも、分子の存在および可能性の高い同定がまだ可能であり、他方における分子の非存在が確立され得る事実である。
【００１５】
三重冗長性ではないが、無作為に形成された（すなわちアーチファクトの）ＩＲＯＡピークの存在は非常に低く、したがって単一のＩＲＯＡピークがそのように容易に同定され、定量化が可能である。したがって、この基本ＩＲＯＡプロトコルは、Ｃ１２−ＢｌまたはＣ１３−ＩＳのいずれかにおける生物由来の全てのピークを検出および特性決定する能力が存在する実験状況に適しており、それにより分子が一方には存在するが他方には存在しない状況を特定する。
基本ＩＲＯＡプロトコルの三重冗長性は、単にピーク形状要件を強化することにより非常に強いノイズの存在下であっても非常に弱い信号を検出することができるような強力なアルゴリズムである。
【００１６】
意図的にＣ１２−ＢおよびＣ１３−ＩＳ側が共に等しい化学組成および一致する同位体バランスのものであるマトリックスの場合、対称性の要件によって、深いノイズの状況下でもほとんど誤差の可能性なしに多くの微小なピークを検出することが容易になる。したがって、マトリックスは、その特性が、それから得られた情報を特に再現性のあるものにし、極めて低い検出レベルであっても見出され得るように予測可能である、ＩＲＯＡ基本プロトコルの特殊な場合を示す。
ＩＲＯＡワークフローは、この固有の特性に基づいている。マトリックスの材料の源は、生物学的または合成のいずれであってもよい。ＩＲＯＡ同定技術は、基礎となる化合物の同定をさらに強化するために、任意のＩＲＯＡピークに適用することができる。
【００１７】
表現型ＩＲＯＡプロトコル
表現型ＩＲＯＡプロトコルは、実験試料自体の標識化は実現可能ではない、または実用的ではないが、共通の一貫した９５％（＋／−３％）ＩＲＯＡ内部標準、例えば上述のＣ１３−ＩＳが、分子の正確な同定および正確な定量化を保証するために使用される状況に対するプロトコルである。表現型プロトコルは、人間（臨床）試料、農業的試料、工業的試料、または実験試料のサイズもしくは源が、それらを標識化することが単に実現可能ではないようなものである他の状況の分析に有用である。しかしながら、表現型プロトコルは、共通する厳密なＩＲＯＡ内部標準を提供することにより、試料の天然存在度単離物中に見出される多数の化合物の同定および定量化のためのより正確な経路を提供する。
基本ＩＲＯＡの「公正」または「標的化されていない」分析とは異なり、表現型ＩＲＯＡは、化学的に非常に複雑なＩＲＯＡ内部標準（ＩＳ）に基づく極めて多数の化合物の標的化された定量分析である。Ｃ１３−ＩＳは、１０００を十分超える化合物（潜在的には無限）を含有し得るが、以前に概説したＩＲＯＡ特性は、ＩＳ中に含有される化合物の全ての同一性および定量化の両方を保証するために完全なクロマトグラフィー分離を必要としない。
表現型プロトコルは、ＩＲＯＡ内部標準をあらゆる天然存在度試料中に組み込み、Ｃ１３−ＩＳからの二重の情報、１３Ｃ−モノアイソトピック質量および炭素数を使用して、同じ化合物の天然存在度アイソトポマーを特定する。次いで、検出されたピークの天然存在度時間分解クロマトグラフィープロファイル、およびその天然存在度同位体形態の相関を使用して、ＩＲＯＡベースの同定が裏付けられる。
【００１８】
ＩＲＯＡピークは情報的に自己完結しているため、複数の同時溶出ピークを正確に同定および定量化することが可能である。表現型プロトコルの場合、ＩＳは、実験系の固有の定量化の必要性に対する支援を提供するために作業者により作製され得る。したがって、小麦の研究者は、小麦の生化学をより反映する化学プロファイルを含有するために使用され得る小麦Ｃ１３−ＩＳを作製することができるが、このＣ１３−ＩＳは主に、小麦におけるＩＲＯＡピークを検出および同定し、その天然存在度の対応物を定量化するために使用される。基本ＩＲＯＡプロトコルの三重冗長性は表現型プロトコルには存在しないが、信号は依然として、９５％Ｃ１３−ＩＳが、天然存在度モノアイソトピック信号が検出される厳密な場所を決定するために質量および炭素数を提供するほど冗長性である（図１０Ｆを参照されたい）。
【００１９】
ＩＲＯＡワークフローでは、マトリックスおよび臨床または実験試料の両方において同じＣ１３−ＩＳが使用され、マトリックス試料から得られた化学的情報は、臨床または実験（表現型）試料において検出された化合物を検証およびその有効性を実証するために使用される。表現型試料は、マトリックス試料と同程度まで化学的情報に関して分析され得るが、これは必須ではない。例えば、マトリックス試料は、その中に存在するあらゆる化合物を完全に特性決定するように分析される必要があるが、実験または臨床試料中で同じ化合物を検出するためには、マトリックスの分析から得られた質量および保持情報を使用すれば十分となり得、マトリックス試料において可能なものより高い取得速度を使用しても十分より高い定量精度を達成することができる。
【発明の概要】
【００２０】
一態様において、本発明は、生物学的に生成した代謝化合物のＩＲＯＡマトリックス組成物を企図する。それらの代謝化合物はそれぞれ、約２０００ＡＭＵ以下の分子量を有する。代謝化合物はそれぞれ、２つの所定のアイソトポマーバランスで等しく存在する第１および第２のアイソトポマーとして存在する。第１のアイソトポマーは、約２〜約１０％の第１の同位体を含有し、第２のアイソトポマーは、約９０〜約９８％の同じ原子の第２の同位体を含有する。第１および第２の同位体は、放射性崩壊に対して安定であり、水素および重水素以外である。
【００２１】
生物学的に生成した代謝化合物は、単細胞または多細胞生物の培養物から得られた細胞溶解物調製物から得られ、分子は、炭素（１２Ｃおよび１３Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏ、１７Ｏ、または１８Ｏ）、硫黄（３２Ｓ、３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓ）、塩素（３５Ｃｌおよび３７Ｃｌ）、マグネシウム（２４Ｍｇ、２５Ｍｇおよび２６Ｍｇ）、ケイ素（２７Ｓｉ、２８Ｓｉおよび２９Ｓｉ）、カルシウム（４０Ｃａ、４２Ｃａ、４３Ｃａ、および４４Ｃａ）、ならびに臭素（７９Ｂｒおよび８１Ｂｒ）の同位体からなる群から選択される１種または複数種の元素の同位体対で無作為および普遍的に標識化されている。
【００２２】
本発明の別の企図される態様は、上述のようなＩＲＯＡマトリックス中の化合物の同一性データの参照ライブラリを作成する方法であり、１）装置の分解能および感度内のＩＲＯＡマトリックスの化合物の同一性を質量分析により決定して、その対称ＩＲＯＡピークパターンを提供し、ａ）存在する化合物のガスおよび／または液体クロマトグラフィー特性、ｂ）存在する化合物の衝突断面（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ）、およびｃ）存在する化合物の断片化パターンの１つまたは複数をさらに決定する工程を含む。そのようにして決定された化合物同一性データは、後に分析される試料中の同じ化合物の１つまたは複数の同定に使用するために維持される。ＩＲＯＡマトリックス中の化合物の同一性データの参照ライブラリ自体もまた企図される。質量スペクトル同定と併せて化合物衝突断面および断片化パターンの一方または両方を使用することが好ましい。
さらに企図される発明は、ＩＲＯＡマトリックス組成物のより重い分子量の同位体を含有する化合物を約９０〜約９８％含有するアイソトポマーと同じ化学組成であり、天然存在度試料中に挿入される内部標準を使用して、天然存在度試料中の化合物を定量化および同定する方法である。内部標準中の各化合物自体は、以前に説明された同一性データの参照ライブラリにおいて同定される。天然存在度試料の各同定可能な化合物の量が決定されることが好ましく、より好ましくは、各天然存在度試料化合物の量は、内部標準と比較して決定される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、質量分析装置および関連したイオン移動度チャネル、ならびに存在する場合はクロマトグラフィー装置の動作上の恒常性に関する品質保証および／または品質管理を測定する方法である。その方法は、上述のようなＩＲＯＡマトリックス組成物の試料を評価する工程と、各分析において同じセットおよび振幅(amplitude)の対称ＩＲＯＡ質量スペクトルピークが存在するかどうかを決定する工程とを含む。ＩＲＯＡマトリックス組成物に関する上記の優先性は、ここでも、およびマトリックス組成物またはその成分が本明細書において使用されるたびに繰り返される。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、天然存在度質量スペクトル分析代謝産物試料をＩＲＯＡ試料に転換することができる試薬対を企図する。その試薬対は、第１および第２のアイソトポマーを構成する２つの反応的に同一の試薬を含む。第１のアイソトポマーは、約２〜約１０％の第１の同位体を含有し、第２のアイソトポマーは、約９０〜約９８％の同じ原子の第２の同位体を含有する。第１および第２の同位体は、放射性崩壊に対して安定であり、水素および重水素以外である。試薬対はそれぞれ、生物学的に生成した代謝化合物の組成物中に存在する１種または複数種の化合物の官能基と反応して、それに結合する同じ反応基を含有する。天然存在度質量スペクトル分析試料の生物学的に生成した代謝化合物はそれぞれ、約２０００ＡＭＵ以下の分子量を有する。
【００２５】
試薬対反応基は、アミン、アルデヒドまたはケトン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボン酸の１つまたは複数からなる群から選択される生物学的に生成した代謝産物の官能基と反応して、それに結合する。好ましくは、反応基は、アミン官能基と反応して、それに結合する。好ましい反応基は、イソチオシアネート反応基であり、試薬対は、第１のアイソトポマーが約２〜約１０％の第１の同位体を含有し、第２のアイソトポマーが約９０〜約９８％の第２の同位体を含有する、フェニルイソチオシアネートのアイソトポマーである。代替の試薬対は、天然存在度質量スペクトル分析代謝産物試料中に存在するアルデヒドのカルボニル基およびケトン基と反応およびそれらに結合する、ヒドラジンまたはセミカルバジドのＩＲＯＡアイソトポマーである。
図面は、本開示の一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】天然存在度の量の１２Ｃおよび１３Ｃを含有するラクトースの分析において得られた質量スペクトルピークを示す図である。
【図１Ｂ】９５％の１２Ｃおよび５％の１３Ｃを含有するラクトースの分析において得られた質量スペクトルピークを示す図である。
【図１Ｃ】５％の１２Ｃおよび９５％の１３Ｃを含有するラクトースの分析において得られた質量スペクトルピークを示す図である。
【図１Ｄ】５％の１３Ｃおよび９５％の１２Ｃを含有するラクトースならびに９５％の１３Ｃおよび５％の１２Ｃを含有するラクトースを等量で含有するラクトースの分析において得られた質量スペクトルピークを示す図である。
【図２】天然存在度の１２Ｃおよび１３Ｃの両方を含有するラクトースのスペクトル、ならびに９５％の１３Ｃを含有するラクトースから得られたピークを示し、１２ＡＭＵである２つのベースピークのｍ／ｚ値の差により、評価された分子内の炭素原子の数を示す図である。
【図３】ＩＲＯＡピークの対称配置を示す図である。２つのベースピークのｍ／ｚ値の間の差が評価された化合物中に存在する炭素原子の数を定義している。例えば、de Jong, F. A.; Beecher, C. Bioanalysis 2012, 4 (18), 2303-2314を参照されたい。
【図４】溶媒に可溶な（通常は水溶性の）細胞溶解物が調製される主要源として５％の１３Ｃまたは９５％の１３Ｃを含有する培地中で成長させたサッカロマイセス・セレビシエから分離して調製されたＩＲＯＡ試料の調製における工程を概略的に例示する図である。存在する同量の各酵母代謝化合物を含有し、５％の１３Ｃまたは９５％の１３Ｃを含有する２つの溶液が提供され、次いでこれらが組み合わされてプールされた抽出物を形成し、これがフリーズドライされて、本明細書において「マトリックス」と称される再構成可能なＩＲＯＡ標準が形成される。例えば、Qiu, et al., J. Anal. Chem.2016, 88 (5), 2747-2754を参照されたい。
【図５】上部はＩＭ装置ドリフト管の概略図である。分析物イオンは破線の四角内にあり、未知起源のイオンはその破線の四角外にあり、模擬イオン移動度分光分析（ＩＭＳ）支援ＩＲＯＡ質量スペクトルは、未知起源のイオンに起因するピークを示すために上に×’が付されたピークを含有し、検出されたＩＲＯＡ質量に干渉するがイオン移動度により分離された未知起源のイオンは、黒丸で示されている。
【図６】図５と同様の図である。但し、この図は、シミュレーションであり、２つの異性体が検出され、上の概略ＩＭドリフト管に見られるように、その分離された分析物は２つの破線の四角内に示され、未知起源のイオンはそれらの破線の四角外にあり、図５と同じ意味を有し、それらに対しＩＲＯＡ内部標準が存在するため、それらは独立して定量化することができ、これはＩＲＯＡ内部標準およびイオン移動度の両方がなければ不可能である。例えば、ＩＭＳ支援質量分析の使用を議論している、Dwivedi et al., Int. Jounal Mass Spectrom. 2010, 298 (1-3):78-90を参照されたい。
【図７Ａ】図４において議論したように、および以降でより詳細に議論するように調製されたプールされた酵母抽出物（ＩＲＯＡマトリックス）の一部のＬＣ−ＩＭ−ＭＳ分析を示す図である。囲い内のＬＣ分離の部分は、質量分析により分析された部分であり、囲い線の下の線は、溶出溶媒勾配を示す。
【図７Ｂ】分析されたＬＣ分離の一部（囲われたピーク）を示す図である。ＬＣトレースの隣に１１炭素化合物の得られた質量スペクトルが示されている。
【図７Ｃ】上部に保持時間、質量範囲およびドリフト時間等の分離およびＭＳ分析のさらなる詳細を、ならびにＩＲＯＡピークパターン、特定のドリフト時間および分析された化合物中の炭素数を容易に示すＩＭ分析を示す図である。
【図８Ａ】ＬＣ分離からの別のピーク（囲われている）のＬＣ−ＩＭ−ＭＳ分析を示す図である。５炭素化合物が分析物であった。
【図８Ｂ】ＬＣ−ＭＳ分離を使用した１つのＩＲＯＡ認識パターンを示す図である。ＩＭデータから２つの化合物が存在することを示すさらなる詳細が示されている。
【図９Ａ】図の左側の囲われたＬＣピークから得られた化合物中の重複するＭＳピークパターンを示す図である。
【図９Ｂ】解析されたスペクトルを示す図である。ＩＭデータは、２つの９炭素化合物が同じ化学式を有し、ドリフト時間が同一性データ参照ライブラリと一致し、１０炭素化合物もまた存在したことを示している。
【図９Ｃ】同定された３つの化合物のそれぞれの質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ａ】Ｃ１２およびＣ１３が天然存在度で存在するアルギニンの質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ｂ】９５％のＣ１２および５％のＣ１３を含有するアルギニンを使用した同様のスペクトルを示す図である。
【図１０Ｃ】９５％のＣ１３および５％のＣ１２を含有するアルギニンの質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ｄ】９５％のＣ１２および５％のＣ１３を含有する化合物、ならびに９５％のＣ１３および５％のＣ１２を含有する化合物が等量で存在する場合の、アルギニンの基本ＩＲＯＡスペクトルを示す図である。
【図１０Ｅ】アルギニン天然存在度ノイズの三重冗長性ＩＲＯＡピークパターンを示す図である。Ｃ１２Ｍ＋１、Ｃ１３Ｍ−１の高さ、および２つのモノアイソトピックピークの間の質量差が全て、同じ炭素数が分子内に存在することを示す場合、モノアイソトピックピーク間の関係が保証される。
【図１０Ｆ】表現型「冗長性」を示す図である。天然存在度ピークの同一性は、１３Ｃモノアイソトピックピークの分子式、および、Ｃ１３−ＩＳ試料を分析用試料に混合することにより提供されるそのＭ−１の高さにより示される炭素数の両方によって確認される。アルギニンに関連するピークには、図１０Ａ〜Ｄの各スペクトルにおいて星印（＊）が付されている。
【図１１Ａ】等量の９５％のＣ１２および５％のＣ１３を含有する化合物ならびに９５％のＣ１３および５％のＣ１２を含有する化合物を含有する試料を使用してアデノシンが評価された場合に存在する質量スペクトルピークを示す図である。
【図１１Ｂ】等量の９５％のＣ１２および５％のＣ１３を含有する化合物ならびに９５％のＣ１３および５％のＣ１２を含有する化合物を含有する試料を使用してフェニルアラニンが評価された場合に存在する質量スペクトルピークを示す図である。存在する炭素原子の数は、各スペクトルにおけるベースピークに対するｍ／ｚ値の差により提供されることに留意されたい。
【図１２Ａ】等量の５％Ｃ１２および９５％Ｃ１３のフェニルアラニンならびに９５％Ｃ１２および５％Ｃ１３のフェニルアラニンの混合物の使用に基づく、フェニルアラニンの質量スペクトルＩＲＯＡピークパターンを示す図である。
【図１２Ｂ】ＳＷＡＴＨ断片化後の同じフェニルアラニン試料の質量スペクトルＩＲＯＡピークパターンを示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｂのピークからの断片の解釈によるＩＲＯＡ診断構造情報を示す図である。
【図１３Ａ】同位体標識化ＩＲＯＡ化合物を使用して誘導体化された場合（図１３Ａ）、または９５％Ｃ１３フェニルチオカルバミル（ＰＩＴＣ）群等の同位体標識化試薬で誘導体化された天然存在度の化合物を用いた場合（図１３Ｂ）、アルギニンの誘導体化ピークが、イオン移動度におけるＩＲＯＡ特性を維持する［微分移動度分光法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＤＭＳ）あり、およびなし］ことを示す図である。アイソトポマーの集合は、イオン移動度、ここではＳｃｉｅｘ  ＳｅｌｅｘＩｏｎ（商標）において一体として現れる。
【図１３Ｂ】同位体標識化ＩＲＯＡ化合物を使用して誘導体化された場合（図１３Ａ）、または９５％Ｃ１３フェニルチオカルバミル（ＰＩＴＣ）群等の同位体標識化試薬で誘導体化された天然存在度の化合物を用いた場合（図１３Ｂ）、アルギニンの誘導体化ピークが、イオン移動度におけるＩＲＯＡ特性を維持する［微分移動度分光法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＤＭＳ）あり、およびなし］ことを示す図である。アイソトポマーの集合は、イオン移動度、ここではＳｃｉｅｘ  ＳｅｌｅｘＩｏｎ（商標）において一体として現れる。
【図１４Ａ】同様に調製および評価されたチロシン誘導体のＩＲＯＡ特性の同様の維持を示す図である。
【図１４Ｂ】同様に調製および評価されたチロシン誘導体のＩＲＯＡ特性の同様の維持を示す図である。
【図１５Ａ】特に複雑なスペクトルをその個々の成分のスペクトルに分離するためにイオン移動度と併せたＩＲＯＡの能力を例示する図である。このように、ＩＲＯＡピークのアイソトポマー集合は、ここではドリフト管ＩＭ（ＤＴ−ＩＭ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  ６５６０（イオン移動度飛行時間型）ＩＭ−ＱＴＯＦ機器を使用して、ＩＭにおいてＩＲＯＡピークを維持する。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ソフトウェアは、前ＩＭ質量スペクトル（図１５Ａ）における質量差に基づいて重複ＩＲＯＡピークを分離するが、ここで、そのＩＲＯＡ特性に基づき、完全な化合物スペクトル同定（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）のために２つの同時溶出ＩＲＯＡピークがＩＭにおいてクリーンに分離される（図１５Ｂ）。
【図１５Ｂ】特に複雑なスペクトルをその個々の成分のスペクトルに分離するためにイオン移動度と併せたＩＲＯＡの能力を例示する図である。このように、ＩＲＯＡピークのアイソトポマー集合は、ここではドリフト管ＩＭ（ＤＴ−ＩＭ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  ６５６０（イオン移動度飛行時間型）ＩＭ−ＱＴＯＦ機器を使用して、ＩＭにおいてＩＲＯＡピークを維持する。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ソフトウェアは、前ＩＭ質量スペクトル（図１５Ａ）における質量差に基づいて重複ＩＲＯＡピークを分離するが、ここで、そのＩＲＯＡ特性に基づき、完全な化合物スペクトル同定（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）のために２つの同時溶出ＩＲＯＡピークがＩＭにおいてクリーンに分離される（図１５Ｂ）。
【図１５Ｃ】特に複雑なスペクトルをその個々の成分のスペクトルに分離するためにイオン移動度と併せたＩＲＯＡの能力を例示する図である。このように、ＩＲＯＡピークのアイソトポマー集合は、ここではドリフト管ＩＭ（ＤＴ−ＩＭ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  ６５６０（イオン移動度飛行時間型）ＩＭ−ＱＴＯＦ機器を使用して、ＩＭにおいてＩＲＯＡピークを維持する。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ソフトウェアは、前ＩＭ質量スペクトル（図１５Ａ）における質量差に基づいて重複ＩＲＯＡピークを分離するが、ここで、そのＩＲＯＡ特性に基づき、完全な化合物スペクトル同定（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）のために２つの同時溶出ＩＲＯＡピークがＩＭにおいてクリーンに分離される（図１５Ｂ）。
【図１５Ｄ】特に複雑なスペクトルをその個々の成分のスペクトルに分離するためにイオン移動度と併せたＩＲＯＡの能力を例示する図である。このように、ＩＲＯＡピークのアイソトポマー集合は、ここではドリフト管ＩＭ（ＤＴ−ＩＭ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  ６５６０（イオン移動度飛行時間型）ＩＭ−ＱＴＯＦ機器を使用して、ＩＭにおいてＩＲＯＡピークを維持する。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ソフトウェアは、前ＩＭ質量スペクトル（図１５Ａ）における質量差に基づいて重複ＩＲＯＡピークを分離するが、ここで、そのＩＲＯＡ特性に基づき、完全な化合物スペクトル同定（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）のために２つの同時溶出ＩＲＯＡピークがＩＭにおいてクリーンに分離される（図１５Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
本明細書において使用される場合、「１３Ｃ」、「Ｃ１３」および「13Ｃ」という略語は全て、１３ＡＭＵの原子量を有する元素炭素の同位体を指す。同様に、「１２Ｃ」、「Ｃ１２」および「12Ｃ」という略語は全て、１２ＡＭＵの原子量を有する元素炭素の同位体を指す。
クロマトグラフィーは、これらに限定されないが、全ての形態の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、イオン移動度（ＩＭ）、固相抽出（ＳＰＥ）等を含む任意の形態の化学的分離を意味し得る。
【００２８】
化合物同定は、これらに限定されないが、質量分析（ｍｓ）、断片化（ｍｓｍｓ）、電荷および電子特性（ｍｓ、ＩＭ等）、形状（ＩＭ、ドリフト等）、結合および振動特性（各種分光法）、ならびにそのＩＲＯＡ形態（基本質量および炭素数）を含む、化学化合物の物理的特性を決定する任意の方法を意味する。
【００２９】
マトリックスは、同化産物および異化産物分子を含む代謝産物等の化合物、または所与の試験において利用もしくは存在する他の化合物の標準的で明確に定義された基本ＩＲＯＡ混合物であり、少なくとも１分子量（ＡＭＵ）だけＡＭＵが異なる、１対の同じ元素の安定な同位体を有する少なくとも１種の化合物を含有する。２つの同位体は、その少なくとも１種の化合物の分子内に、それらの同位体の天然存在比以外の所定の比で存在する。
様々なマトリックスが存在するが、各マトリックスは、例えば血漿、ヒト生検試料、小麦、尿等の特定の分析系を支持する。さらに、同じ特定の分析系に対して複数のマトリックスを調製することができる。
ライブラリは、マトリックス中に存在することが分かっている化合物の群である。
【００３０】
内部標準（ＩＳ）は、代謝産物、マトリックス試料のそのサブセット、または所与の試験のマトリックス試料中に存在するまたは利用される他の化合物等のＩＲＯＡ化合物のより軽い、またはより重いセットを代表し得る化合物の化学混合物であり、分析されるあらゆる試料に外から挿入される。マトリックスのように、ＩＳは、標準的で明確に定義された化合物の混合物である。マトリックスおよびＩＳの両方の化学組成は、理想的には同一である。
本明細書において使用される場合、所定の第１および第２の安定同位体の量は、すぐ上で議論されたもの等、好ましくは互いの「逆転した比率」で存在し、第１の比率の分子の数字は、第２の比率の分母の数字であり、第１の比率の分母の数字は、第２の比率の分子の数字である。
【００３１】
９５％および５％の上記比率を例に挙げると、第１の比率は、Ｃ−１２培地における９５／５の１２Ｃ／１３Ｃであり、一方第２の逆転した比率は、Ｃ−１３培地における５／９５の１２Ｃ／１３Ｃである。企図される比率のセットは、９５／５および５／９５である必要はなく、それらの量が特に好ましいものの、それらは本明細書において便宜上使用されることを理解されたい。
マトリックスまたは任意の他の外から提供される組成物、例えば内部標準に存在する第１および第２の安定同位体は、各同位体のそれぞれの量と同様に所定のものであることを理解されたい。その結果、「所定」および「安定」という単語は、冗長性を最小限にするために本明細書において稀にしか使用されないが、それらの存在が暗示される。
【００３２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の第１の態様は、同化産物および異化産物分子を含む生物学的に生成した代謝産物のＩＲＯＡマトリックス組成物を企図し、これは、典型的には、水性媒体中に分散可能または可溶な室温固体である（以降で定義される通り）。個々の代謝産物は、約２０００ＡＭＵ未満、好ましくは約１５００ＡＭＵ以下、より好ましくは約１０００ＡＭＵ未満の分子量を有する。企図される代謝産物の分子量の下限は、酢酸およびグリシンのように、約６０〜７５ＡＭＵである。
【００３３】
どの化合物も、２つの所定のアイソトポマーバランスの両方で等しく存在し、したがって、アイソトポマーはそれぞれ、約２〜約１０％の同位体１および約９０〜約９８％の同位体２で存在する。同じ原子の例示的な有用な第１および第２の同位体は、炭素（１２Ｃおよび１３Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏ、１７Ｏ、または１８Ｏ）、硫黄（３２Ｓ、３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓ）、塩素（３５Ｃｌおよび３７Ｃｌ）、マグネシウム（２４Ｍｇ、２５Ｍｇおよび２６Ｍｇ）、ケイ素（２７Ｓｉ、２８Ｓｉおよび２９Ｓｉ）、カルシウム（４０Ｃａ、４２Ｃａ、４３Ｃａ、および４４Ｃａ）、ならびに臭素（７９Ｂｒおよび８１Ｂｒ）の同位体を含む１種または複数種の元素である。第１および第２の同位体は、放射性崩壊に対して安定であり（可能な放射線障害からの追加的な保護なしに研究室内で使用され得る）、水素および重水素以外である。
特に好ましい同位体であるＣ１２およびＣ１３に関してより明示的に述べると、アイソトポマーの一方の群は、約２〜約１０％のＣ１３を含有し、他方の群は、約９０〜約９８％のＣ１３を含有する。好ましくは、第１の群は、約５〜約１０％のＣ１３を含有し、第２の群は、約９０〜約９５％のＣ１３を含有し、残りの炭素原子はそれぞれの場合においてＣ１２である。第１の群が約５％のＣ１３を含有し、第２の群が約９５％のＣ１３を含有し、残りの炭素原子がＣ１２であることが特に好ましい。これは、各化合物のＩＲＯＡピーク形状が、理想的には完全にバランスの取れた対照的なピークの集合として構成され、それぞれの半分が他方の鏡像であることを意味する。
【００３４】
上述のパーセンテージは、使用される２つの同位体の天然存在度の量とは識別可能なほど異なることが意図されることを理解されたい。したがって、Ｃ１２の天然存在度が９８．８９％であり、Ｃ１３の天然存在度が１．１１％である炭素同位体の場合、一方の同位体に約９０〜約９８％を使用し、他方の同位体に約２〜約１０％を使用することにより、分析機器は、天然存在度ピークとＩＲＯＡマトリックスにより提供されたピークとの間を容易に区別することができる。存在する一方または他方のアイソトポマーのパーセンテージに対する「約」という用語の使用は、述べられた量の±３％以内であることが意図される。したがって、上記の同位体のパーセンテージが既知であり所定のものであるが、述べられた範囲内の特定の量の使用は、ほぼ便宜上のものである。
【００３５】
また、ＩＲＯＡ試験に使用される元素、ここでは炭素の微量の不純物もまた、その元素の原子の中に存在し得ることを理解されたい。そのような微量は、典型的には、試験に重大な影響を与えない。例えば、Handbook of Chemistry and Physics, 54th ed., CRC Press, Cleveland, OH, page B251, 1973-1974には、Ｃ１２およびＣ１３の天然存在度がそれぞれ９８．８９パーセントおよび１．１１パーセントであり、Ｃ１４の存在が報告されているがパーセント量ではないことが示されている。
さらに、同位体およびそれらを含有し得るいくつかの組成物に関する「第１」および「第２」という単語の使用は、単に同位体を区別するための明確性を目的としており、任意の操作を行う順番に関することの暗示を意図しないことを理解されたい。
ＩＲＯＡマトリックスは、各バッチが多くのスペクトル分析にわたり利用され得るように、比較的大量に、例えば工業規模では約１０〜約１００ｇ、および実験室規模では約１０〜約１０００ｍｇの量で調製されることが好ましい。得られるマトリックス組成物は、その化学的安定性および分析再現性を最大化するために、好ましくは使用されるまで例えば−８０℃で冷凍保存される。
【００３６】
本発明の別の企図される態様は、上述のようなＩＲＯＡマトリックス中の化合物の同一性データの参照ライブラリを作成する方法であり、１）装置の分解能および感度内のＩＲＯＡマトリックスの化合物の同一性を質量分析により決定して、その対称ＩＲＯＡピークパターンを提供し、ａ）存在する化合物のガスおよび／または液体クロマトグラフィー特性、ｂ）存在する化合物の衝突断面、ならびにｃ）存在する化合物の断片化パターンの１つまたは複数をさらに決定する工程を含む。そのようにして決定された化合物同一性データは、後に分析される試料中の同じ化合物の１つまたは複数の同定に使用するために維持される。ＩＲＯＡマトリックス中の化合物の同一性データの参照ライブラリ自体もまた企図される。質量スペクトル同定と併せて化合物衝突断面および断片化パターンの一方または両方を使用することが好ましい。
【００３７】
さらに企図される発明は、ＩＲＯＡマトリックス組成物のより重い分子量の同位体を含有する化合物を約９０〜約９８％含有するアイソトポマーと同じ化学組成であり、天然存在度試料中に挿入される内部標準を使用して、天然存在度試料中の化合物を定量化および同定する方法である。内部標準中の各化合物自体は、以前に説明された同一性データの参照ライブラリにおいて同定される。天然存在度試料の各同定可能な化合物の量が決定されることが好ましく、より好ましくは、各天然存在度試料化合物の量は、内部標準と比較して決定される。
本発明の別の態様は、質量分析装置および関連したイオン移動度チャネル、ならびに存在する場合はクロマトグラフィー装置の動作上の恒常性に関する品質保証および／または品質管理の方法を企図する。この方法は、異なる試料の分析を行う間に複数のマトリックス試料に対して質量スペクトル分析を行うこと、および、各分析において同じセットの対称ＩＲＯＡ質量スペクトルピークが存在するかどうかを決定することを企図する。例示的には、マトリックス試料は、実験試料が分析される前、実験試料が分析された後、次の実験試料が分析された後に分析され得る。これらのマトリックス分析の解釈は、本明細書の別の箇所で議論される。
【００３８】
上記の技術を使用することにより、使用者は、事前のベースライン分離を必要とすることなく、複雑な混合物中に存在する化合物の有効性の実証およびその定量化を同時に行うことができる。この技術は、任意の化合物のアイソトポマーイオンの集合、例えばＣ−１３ベース同位体比異常値分析（ＩＲＯＡ）ピーク、ＩＲＯＡプールピーク、または同じ分子のアイソトポマー形態の任意の他の組合せから、Ｃ−１３モノアイソトピックピークと対となったＣ−１２モノアイソトピックアイソトポマーの二重の集合、またはさらには、他の元素、例えば窒素、酸素、硫黄もしくはその他のアイソトポマーに基づくアイソトポマーに至るまでが、同じ衝突断面（ＣＣＳ）を共有することから利益を得る。その結果、アイソトポマーイオンは、イオン移動度（ＩＭ）チャネル、例えば高電場非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）、微分移動度分光法（ＤＭＳ）、無損失イオン操作のための構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｓｓｌｅｓｓ  ｉｏｎ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、ＳＬＩＭ）、捕捉イオン移動度分光法（ｔｒａｐｐｅｄ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＴＩＭＳ）、ならびに他のドリフト管および／またはイオン移動度分光（ＩＭＳ）技術を通過して、進入した同じ集合が出ると同時に発生する、またはそこから予測可能な様式で発生する。
次いで、イオンのそのような集合全体が断片化に供され得、これが断片イオンを生成し、その全ては元の集合と同じ数のアイソトポマーを有する。元の化合物の同一性は得られる断片化パターンによって確認され、その取得された移動度情報はこの確認に寄与し得る。
【００３９】
任意の化合物の絶対量は、集合のサブセットのいずれかの量が既知である場合、比較により決定され得る。イオン集合の進入前に液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離を使用することにより、所与の時点でＩＭチャネルに進入するイオン集合の数が低減され、これは役立ち得るが必須ではない。この技術は、極めて複雑な混合物、例えば人間または人間以外の組織、細胞、生検試料、または生体液の定量分析に使用され得る。
そのような場合、固定または既知濃度の多数の同じ化合物を含有する適切なアイソトポマー内部標準（ＩＳ）、ＩＲＯＡまたは他のものが生体材料に添加されてもよい。得られるプールされた混合物は、現行の方式で必要とされるクロマトグラフィーベースライン分離を必要とすることなく分析および定量化され、同一性を完全に確認することができる。
【００４０】
この方法の好ましい実施形態は、生物学的試料の調製、アイソトポマー混合物の添加、プールされた材料の分離を含み得、これは、最初は高速ＬＣ（ＨＰＬＣ）分離、一般的には質量分析と連結されたＬＣ（ＬＣ／ＭＳ）、続いてＩＭチャネル、そして最後にＭＳ／ＭＳによる断片化によって行われる。他の分離方法、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、または同様の、もしくは非クロマトグラフィーシステム、例えば固相抽出（ＳＰＥ）もしくはオンライン法等もまた、補助のために使用することができるが、必須ではない。ＩＳ中に存在する任意の化合物が、ＭＳまたはＭＳ／ＭＳのレベルで定量化され得る。同一性は、ＭＳ／ＭＳにより確認される。例えば、Stupp, et al., Anal. Chem. 2013, 85 (24), 11858-11865を参照されたい。
【００４１】
企図される発明の別の態様は、以前に議論した表現型ＩＲＯＡプロトコルに新たな態様を提供する。この態様は、天然存在度質量スペクトル分析試料の生物学的に生成した代謝化合物を、ＩＲＯＡ試料に転換することができる試薬対を企図する。この試薬対は、第１および第２のアイソトポマーを構成する２つの反応的に同一の試薬を含む。
第１のアイソトポマーは、約２〜約１０％の第１の同位体を含有し、第２のアイソトポマーは、約９０〜約９８％の同じ原子の第２の同位体を含有する。第１および第２の同位体は、放射性崩壊に対して安定であり、水素および重水素以外である。
試薬分子は、選択される同位体の一方または他方であってもよい４個以上の原子を含有することが好ましい。そのような原子の上限は、典型的には便宜上のものであり、選択される異なり得る同位体の６〜１０個の原子を含有し得る試薬が好ましい。
【００４２】
試薬対はそれぞれ、生物学的に生成した天然存在度の代謝化合物の組成物中に存在する１種または複数種の化合物の官能基と反応して、それに結合する同じ反応基を含有する。それらの代謝化合物はそれぞれ、約２０００ＡＭＵ以下、好ましくは約１５００ＡＭＵ以下、より好ましくは約１０００ＡＭＵ以下の分子量を有する。
「官能基と反応して、それに結合する反応基」という語句は、互いに反応すると反応基および官能基はもはや存在せず、したがってそれらは互いに結合し得ないことから、化学的には正確ではないことに留意されたい。むしろ、それは互いに結合するそれぞれの基の残基である。後者の語句は煩わしいと思われるため、より化学的に正確な後者の語句が意図されることを理解した上で前者の引用語句が使用される。
【００４３】
試薬対の反応基は、アミン、アルデヒドまたはケトン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボン酸の１つまたは複数からなる群から選択される官能基と反応して、それに結合する。それらの反応性官能基は、タンパク質性代謝産物および糖を含有する化合物、ならびにほぼ酸化された炭素質縮合生成物、例えばリモネン、カルボンおよびゲラニオール等のテルペノイド中に存在する。
特に好ましい反応基は、オリゴペプチド、アミノ酸、ならびにメスカリン、セロトニンおよびドーパミン等の環外窒素原子を有する化合物のアミノ末端として存在するようなアミン基と反応して、それに結合する。
【００４４】
１つのそのような特に好ましい反応基は、イソチオシアネート基である。イソチオシアネート合成は、当技術分野において周知であり、所望のパーセンテージの１３Ｃを含有するイソチオシアナト基は、それ自体所望のパーセンテージの１３Ｃを含有するように調製され得る炭素質基に連結し得、したがってアイソトポマーの所望の対が容易に調製され得る。特に好ましいイソチオシアネートは、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）である。
別の好ましい試薬対において、反応基は、ケトンまたはアルデヒド基と反応して、それに結合する。ここで、反応基は、代謝産物のケトンまたはアルデヒドとヒドラゾンまたはセミカルバジドを形成するヒドラジンまたはセミカルバジンである。これらの反応基含有化合物の合成もまた周知であり、それらもまた、所望量の１３Ｃを含有する炭素質部分に連結し得る。
【００４５】
課題および解決される課題
生物学的試料中の数百またはさらには数千の化合物を同定および大まかに定量化するために、メタボロミクス技術、例えばＩＲＯＡ基本プロトコル、またはＩＲＯＡ表現型プロトコル（最適）、または標準メタボロミクス技術を使用することができる。しかしながら、本発明に至るまでは、そのような測定を行い、任意の２つ以上の試料からの測定値を比較するために、理想的には１日で、全ての試料が単一バッチで分析される必要があった。、これは、日差変動が大きすぎて別の方法では克服できず、絶対的な定量化、すなわち既知の標準と比較した定量化が保証され得ないためである。
現在、同じ機器で数日間隔を置いて評価された試料を比較することは定量的には許容されず、異なる機器で、または異なる方法に基づいて生成されたデータを比較することは不可能である。機器ドリフト、クロマトグラフィードリフト、およびさらには環境条件が、同じ機器であっても再現性を得るのが困難であるほど十分結果を改変し得る。
【００４６】
これらの定量化の問題に加えて、多くの質量スペクトル技術にわたる任意の化合物の同定は、極めて慎重な較正がなされ、信頼性のある標準が測定されない限り、それだけでは成功する可能性が低い。これは、同じ厳密な質量を有するために混同され得る複数の生物学的化合物が存在するためだけでなく、さらにより問題なことに、しばしば、生物学的同重体同等物と構造的に異なるが正確な質量、またはさらには式を共有し得るより多くのアーチファクトまたは断片的な化合物が存在するためである。ＩＲＯＡワークフローは、これらの問題、および他の問題に多くのレベルで直接対応し、それらを克服する。
【００４７】
ＩＲＯＡワークフローは、分析セッションの間に複数回詳しく分析される「マトリックス試料」と呼ばれる「標準試料」を提供する。マトリックス試料は、実験または臨床試料と無作為に混ぜられる。このマトリックス試料中の化合物の同一性および挙動は、共有するＩＲＯＡパターンに基づいて実験試料中の同じ化合物の全てを同定するために使用される。異なる分析状況に対して異なるマトリックス試料型が存在してもよく、すなわち、血漿用「マトリックス」、ヒト肝臓用「マトリックス」またはさらには小麦用「マトリックス」が存在してもよい。マトリックス試料は、ＩＲＯＡ９６３、ＩＲＯＡ９６４、およびＩＲＯＡ２５１に記載のような状況において、合成ＩＲＯＡパターンを含有してもよい。
マトリックス試料は、同じ慎重に制御された化合物の混合物として常に構成される。異なる化合物が異なる濃度で存在してもよいが、所与の「マトリックス」バッチにおいて、それぞれの個々の化合物は、全ての等分されたマトリックス試料中に常に同じ濃度で存在する。マトリックス試料中に存在する化合物は全て、極めて明確化されている。
【００４８】
マトリックス試料は、基本ＩＲＯＡ試料であり、したがってどの化合物も、両方の所定のアイソトポマーバランス、例えば好ましくは５％のＣ１３および９５％のＣ１３で等しく存在する。これは、各化合物のＩＲＯＡピーク形状が、理想的には完全にバランスの取れた対照的なピークの集合として構成され、それぞれの半分が他方の鏡像であることを意味する。
マトリックスにおけるＩＲＯＡピークの対称性のために、マトリックス試料は完全に一覧化され得、さもなければ判別することができるレベルを大きく下回る極めて低いレベルの、質量スペクトルノイズに埋もれたピークであっても、同定および特性決定され得る。基本ＩＲＯＡピークの三重冗長性は、あらゆる分析における一貫した解釈および同定を保証する。
マトリックス試料中に存在する化合物が全て一覧化され得るため、またそれらが所与のマトリックスにおいて一貫しているため、それらのクロマトグラフィー挙動、イオン化効率、イオン移動度（ＩＭ）特性、断片化挙動等を評価することができ、これらの値は、分析システムが同様である場合、またはさらにはそれが極めて異なっている場合でも、任意の日差変動に対して較正するために使用される。
【００４９】
これらの化合物の大半は、極めて異なる分析プラットフォームにわたって、すなわち異なるクロマトグラフィー、イオン化または検出システムを用いて検出されるため、ＩＲＯＡ一次走査のＩＲＯＡ特性、およびＩＲＯＡ二次化学特性は、イオン移動度、ＳＷＡＴＨ［Gillet et al., Mol Cell Proteomics, 11:011.016717 (June 01, 2012)を参照されたい］または他の断片化システムにおいて見られるように、マトリックス中のどの化合物も任意の分析システムから任意の他の分析システムにマッピングされ得ることを保証し、それによって、任意の２つのマトリックス試料の完全マトリックス化学組成を、またそれによりそれらが支持する任意の臨床または実験試料を直接比較するための機構が提供される。
所望のＩＲＯＡ化合物ピークの全てを通過させるように設定されたＳＷＡＴＨのウィンドウ幅を例示する表を、以下に示す。
【表１】
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【００５０】
上に示すように設定されたＳＷＡＴＨウィンドウ等のウィンドウスキームにより、全てのＩＲＯＡピークがそれを通過して、図１２Ａに示されるような完全ＩＲＯＡピークセットパターンの単離を提供することができる。これは、中心質量の質量を有する任意の既知の代謝産物における炭素の最大数に基づき、ウィンドウ（最小および最大）を設定し、それに応じて重複する。図１２Ｂは、図１２Ｃから分かるような診断構造情報を提供するフェニルアラニン断片化パターンを示す。
マトリックス試料の化学的構成、ひいてはクロマトグラフィー挙動は、実験試料に適用され同じバッチ内で分析された内部標準と同一であるため、マトリックス試料から得られたより詳細で情報的に増強された三重冗長性化学同定情報を使用し、それを実験試料に適用することが可能である。
【００５１】
マトリックス試料を分析して、それに含有される化合物の全てに対し、全ての同定物理的特性を極めて高い精度および感度をもって検出、同定および収集することができる。あらゆる三重冗長性ＩＲＯＡピークに対して、物理的情報は、これらに限定されないが、以下の一時ｍｓ走査からの情報を含み得る。
保持時間（ＲＴ）、１２Ｃモノアイソトピック質量、１３Ｃモノアイソトピック質量、分子内に含有される炭素数；
インソースおよびポストソース断片化特性；
流出物ストリームに適用された他の方法、例えばＩＲ、ＵＶから収集された任意の物理的特性；
例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、ＳＷＡＴＨ等、誘導（データ依存的取得−ＤＤＡ）、非依存的（非データ依存的取得（ＤＩＡ）を問わない、例えばＭＳｅ、ＳＷＡＴＨ等、イオン移動度（ＩＭ）を含む、様々なポストソース断片化方法；
または、このＩＲＯＡピークの同定を裏付ける情報を提供し得る任意の他の技術。
実験または臨床試料は、生化学的に複雑であり、多種多様な化合物を含有するが、これらの化合物の炭素同位体バランスは、天然存在度のＣ１３レベル、すなわち約１．１％のＣ１でのみ存在する。
【００５２】
マトリックス試料の９５％Ｃ１３（または他の好適な）アイソトポマー部分と濃度および化学組成が同一である内部標準（ＩＳ）が、各臨床試料に添加される。この添加は、各実験試料がこれで表現型ＩＲＯＡプロトコルに適合するため、各実験試料が表現型ＩＲＯＡ試料として分析され得ることを意味する。
【００５３】
マトリックスおよび実験試料の両方に同じＣ１３アイソトポマーＩＲＯＡ信号が存在し、またクロマトグラフィーがその両方にわたって一貫しているため、マトリックスにおいて観察および検証される化学化合物同定および物理的特性が、直接実験試料にマッピングされ得る。冗長性表現型試料中に入れられたＩＳにおけるＩＲＯＡ信号の一意性によって、マッピングは、実験試料がまた二次的な物理学的特徴を有することを必要とせず、むしろ使用者は、同時に分析されたマトリックス試料への参照に基づいてそれらの二次的な物理学的特徴を推測することができる。
マトリックスおよび実験試料は、単一試料セットに無作為に組み入れられ（例えば、約１０回の実験試料注入毎に１回マトリックスが注入されるように）、試料セット全体が分析される。
【００５４】
試料は分析中完全および無作為に混合されるため、全てのピーク対の一覧、それらのＲＴ、炭素数、ＩＭおよび断片化特性が、これらの同じＩＲＯＡピークのそれぞれが実験試料中で検出された情報を提供する。天然存在度ピークは、含有する炭素数に中性子の質量を乗じたものを差し引いたＩＲＯＡ  13Ｃモノアイソトピックピークの質量である質量においてそのＩＲＯＡピークと並置するため、容易に特定および定量化される。
ＩＲＯＡワークフローに従って分析された全ての試料の品質管理、再現性、および精度は、以下を理由に保証される。
マトリックス試料は常に同じ「標準」試料であり、毎日のマトリックス分析毎に検出された全てのＩＲＯＡピークの一覧は、毎日の分析の機器の性能特性を定量化する方法を提供し、任意の器差を補正する、または所与の日における誤差が許容され得なかったことを決定するための機構を提供する。
あらゆる試料に導入されるＩＳの量はマトリックス中の量と同一で、また全ての試料にわたって同じであり、ＩＳにおける全ての信号の合計は一定で、試料が他で正規化されていない場合はそれらを正規化するために使用され得る。
【００５５】
直交する第２段階の分析を含めることにより、および追加的な物理的特性を詳細に示すデータ、例えばイオン移動度、断片化、例えばＳＷＡＴＨ、ＵＶ、またはＩＲ等を収集することにより、極めて異なる分析条件下で分析された２つのセットのマトリックス試料中で検出された化合物は、一方から他方へ明白にマッピングされ得、したがって、それらのそれぞれのマトリックス試料に関連した臨床または実験試料の定量的比較が提供され得る。
このワークフローは、マトリックス試料中の化合物の三重冗長性、ならびに臨床試料の冗長性および等価性により全体的に自動化され得る。
したがって、ＩＲＯＡワークフローは、２つのＩＲＯＡベースプロトコルの長所を組み合わせて、１）単回の分析実行において測定される極めて多数の化合物の定量化のための方法を提供し、２）使用される分析システムとは無関係にいかなる定量誤差も補正する機構を提供し、３）全ての化合物の同定が時間および分析プラットフォームにわたり一貫することを保証する機構を提供する。
【００５６】
表現型ＩＲＯＡプロトコル
表現型ＩＲＯＡプロトコルは、実験試料自体の標識化が実現可能ではない、または実用的ではないが、共通の一貫した９５％（＋／−３％）ＩＲＯＡ内部標準、例えば上述のＣ１３−ＩＳが、分子の正確な同定および正確な定量化を保証するために使用される状況に対するプロトコルである。表現型プロトコルは、人間（臨床）試料、農業的試料、工業的試料、または実験試料のサイズもしくは源が、それらを標識化することが単に実現可能ではないようなものである他の状況の分析に有用である。しかしながら、表現型プロトコルは、共通する厳密なＩＲＯＡ内部標準を提供することにより、試料の天然存在度単離物中に見出される多数の化合物の同定および定量化のためのより正確な経路を提供する。
【００５７】
基本ＩＲＯＡの「公正」または「標的化されていない」分析とは異なり、表現型ＩＲＯＡは、化学的に非常に複雑なＩＲＯＡ内部標準（ＩＳ）に基づく極めて多数の化合物の標的化された定量分析である。Ｃ１３−ＩＳは、１０００を十分超える化合物（潜在的には無限）を含有し得るが、以前に概説したＩＲＯＡ特性は、ＩＳ中に含有される化合物の全ての同一性および定量化の両方を保証するために完全なクロマトグラフィー分離を必要としない。
表現型プロトコルは、ＩＲＯＡ内部標準をあらゆる天然存在度の試料中に組み込み、Ｃ１３−ＩＳからの二重の情報、１３Ｃ−モノアイソトピック質量および炭素数を使用して、同じ化合物の天然存在度アイソトポマーを特定する。次いで、検出されたピークの天然存在度時間分解クロマトグラフィープロファイル、およびその天然存在度同位体形態の相関を使用して、ＩＲＯＡベースの同定が裏付けられる。
【００５８】
ＩＲＯＡピークは情報的に自己完結しているため、複数の同時溶出ピークを正確に同定および定量化することが可能である。表現型プロトコルの場合、ＩＳは、実験系の固有の定量化の必要性に対する支援を提供するために作業者により作製され得る。したがって、小麦の研究者は、小麦の生化学をより反映する化学プロファイルを含有するために使用され得る小麦Ｃ１３−ＩＳを作製することができるが、このＣ１３−ＩＳは主に、小麦におけるＩＲＯＡピークを検出および同定し、その天然存在度の対応物を定量化するために使用される。基本ＩＲＯＡプロトコルの三重冗長性は表現型プロトコルには存在しないが、信号は、９５％Ｃ１３−ＩＳが、天然存在度モノアイソトピック信号が検出される厳密な場所を決定するために質量および炭素数を提供するという点で、依然として冗長性である（図５および６を参照されたい）。
【００５９】
ＩＲＯＡワークフローにおいて、マトリックスおよび臨床または実験試料の両方において同じＣ１３−ＩＳが使用され、マトリックス試料から得られた化学的情報は、臨床または実験（表現型）試料において検出された化合物を検証およびその有効性を実証するために使用される。表現型試料は、マトリックス試料と同程度まで化学的情報に関して分析され得るが、これは必須ではない。例えば、マトリックス試料は、その中に存在するあらゆる化合物を完全に特性決定するように分析される必要があるが、実験または臨床試料中で同じ化合物を検出するためには、マトリックスの分析から得られた質量および保持情報を使用すれば十分となり得、マトリックス試料において可能なものより高い取得速度を使用しても十分より高い定量精度を達成することができる。
ＩＲＯＡワークフロー
ＩＲＯＡワークフローは、２つの前述のＩＲＯＡプロトコル、基本ＩＲＯＡおよび表現型ＩＲＯＡの長所を組合せ、それらを利用して、化学的同一性を決定し、データを正規化し、同様であるか異なるかを問わず試料間およびプラットフォームにわたる再現性を高める追加的な能力を付与する。
【００６０】
ＩＲＯＡワークフローは、マトリックス中の化合物の全て、ひいてはＣ１３−ＩＳ（これは基本および表現型試料の両方で共通し一貫している）を一覧化し、その有効性を実証し、また特性決定するために、基本ＩＲＯＡ信号を最も有効に利用する。表現型臨床または実験試料中の同じＣ１３−ＩＳを使用することにより、マトリックス試料、基本ＩＲＯＡ試料の全ての化学的同定および有効性の実証を、表現型試料である実験または臨床試料に適用することができる。
さらに、ＩＲＯＡワークフローは、マトリックスにおける各ＩＲＯＡピークに対して、追加的な直交する同定第２段階、例えばイオン移動度、インソースまたはポストソース断片化、ＵＶ、ＩＲ、または他の化学的特性の収集を適用し、マトリックス試料中のあらゆる化合物に追加的な一意の物理的属性を提供する。マトリックス中のあらゆる化合物が一意に同定され、あらゆる臨床または実験試料にマッピング可能である場合、このシステムは、分析プラットフォームに関わらず完全に再現可能な化合物同定を支援する。
【００６１】
したがって、実験試料におけるＣ１３−ＩＳは、ベースラインクロマトグラフィーによる解決法を必要としない、またこれらの試料に対して同じ直交する同定システムを使用することを必要としない、完全な同定および定量化の解決法の両方を提供することができる。これは、二次システムは時間分解能を低下させ得、それにより分析測定の精密性を低下させ得るが、化学的属性のマッピングおよび同定目的にはマトリックスでの測定が必要であるため、重要である。マトリックスの定量化は、精密性のレベルがより低い場合にのみ必要である。
【００６２】
一方、臨床または実験試料に対して、定量化の精密性は可能な限り高くなるべきである。この全体的な解決法は、以下を有する。
１）ＩＳの存在により実験試料中に見出され、マトリックス中の対応する化合物にマッピングされる化合物の同定および定量化の極めて高いレベルの精度、
２）マトリックス試料中の全ての化合物の極めて正確で精密な同定、ならびに
３）人間に関連する臨床生化学測定を行う上で必要とされる、臨床または実験試料に適用される全ての機器パラメータ（これもマトリックス試料から得られる）の十分および継続的な品質保証／品質管理（ＱＡ／ＱＣ）。
【００６３】
二次分析ストリーム、例えばイオン移動度、断片化、または他のＵＶ／ｖｉｓ等から得られた各マトリックス注入における化合物の化学的同定は、各化合物がこれらの二次的特徴に基づいて一意に同定され得るような十分な特性決定を提供する。したがって、ＩＲＯＡパターンと、その多くもまたＩＲＯＡベースであるこの二次データとの組合せは、大幅に異なる分析プラットフォームにわたり試料を比較する、または機器の日差変動に対して調節するために、ならびに異なるプラットフォームにわたり化合物の同一性および定量化の両方を保証するために必要な再現性（定量的および定性的）を提供するための方法を提供する。
このワークフローは、基本ＩＲＯＡプロトコルの態様および一貫したマトリックス試料を使用して、機器またはクロマトグラフィーシステムとは独立した（新たな）（ＱＡ／ＱＣ）を提供する。
これらの２つのプロトコルのそれぞれの利益が単一のプロトコルに組み合わされた場合、それらは、三重冗長性基本ＩＲＯＡプロトコルの長所をもって極めて標準化された「マトリックス」試料から標的化されたライブラリを構築し、次いでそれらは、臨床試料の二重冗長性表現型分析において使用される。
【００６４】
マトリックスおよび臨床試料は共に、同じ濃度の同じ９５％Ｃ１３−ＩＳを含有する。マトリックス試料は同じ化学的プロファイルを有する一致するＣ１２−Ｂを追加的に含有しているため、それらの組み合わされた同位体信号は対照的であり、数学的にバランスがとれ、明確に検出される。より高いレベルの厳密さで基本ＩＲＯＡ試料において形成されたこれらのライブラリ（検出された全ての化合物の一覧）が使用され得、質量スペクトルノイズに深く埋もれているものでさえ、はるかにより広い多様な化合物が検出され得る。表現型試料は同じ９５％Ｃ１３内部標準に依存しているため、これらのライブラリは、予測される完全な一致を伴って同時に測定される試料に適用され得、それらの共通マトリックス参照により非同時試料と比較され得る。
このアプローチの新規性は、ＩＲＯＡピークの前述した属性に起因し、すなわち、追加的な中性子が電場、電荷分布、または電子配置にほとんど影響しないため、特定の化合物のアイソトポマーの全てが質量以外、ＵＶおよび限定的にＩＲを含む事実上同一の化学的および物理的属性を共有することに起因する。したがって、ＩＲＯＡピークは、コクロマトグラフィーに供するとＭＳ走査においてＩＲＯＡピークとして観察され、また両方のイオン移動度、ＳＷＡＴＨ断片化および他のプロセスを通って完全に一体として移動する。この点において、ＭＳレベルを超えてそれらを検出する能力は、ＩＲＯＡワークフローが、分析および同定プロセスの全ての段階でＩＲＯＡピークを定性分析および解釈するためにこれらのＩＲＯＡ属性を使用するのを可能にする新規の所見であり、ＩＲＯＡワークフローを可能にする。
【００６５】
マトリックスおよびＣ１３−ＩＳは常に、同じ濃度の同じ化学混合物であり、したがってこれらのライブラリは、異なる研究室で調製された試料を異なる方法を使用して比較することを可能にする、新たなプラットフォーム間の、機器間の、および時間的に独立したＱＡ／ＱＣのための基礎を提供する。マトリックスおよびＣ１３−ＩＳは、生物学的または化学的に生成されたものであってもよい。
【００６６】
マトリックス化合物の同定
各マトリックスは、それが最初に調製された際に、それに関連したライブラリを有する。ライブラリは、マトリックス試料がクロマトグラフィー分離された際に再現可能に観察され得る化合物であり、その中の基本ＩＲＯＡピークが検査される。可能な化学構造の極めて高い多様性を考慮して、クロマトグラフィー分離のみから生成された質量スペクトルデータは、ほとんどの化合物を同定するのに不十分であり、さらにほとんどの分子に対して一意の分子式を同定するのにも不十分である。
基本ＩＲＯＡピークは、分子内の炭素の厳密な数をモノアイソトピック質量に追加し、これは、代謝産物ライブラリ等のほとんどの利用されているライブラリにおいて、一意の分子式を提供するのに十分である。しかしながら、多くの分子式において、所与の式は、多数の化合物に共有され得、したがって、ＩＲＯＡは保証された式を提供するが、それ自体は保障された同定を提供しない。
【００６７】
ＩＲＯＡワークフローは、定期的にマトリックスを分析する。各ＩＲＯＡピークに対する分子式に加えて、マトリックス中の各化合物およびそれに含有されることが分かっている化合物のライブラリの衝突断面（ＩＭからのＣＣＳ）、断片化データ（ＳＷＡＴＨもしくは他の技術からのｍｓ／ｍｓ）、ＵＶ、ＩＲまたは任意の他の物理的特性を追加することができれば、保証される分子式およびこれらの物理的属性の組合せは、各化合物の一意の同定因子となる。
ＩＲＯＡワークフローは、マトリックス試料を分析して、マトリックスおよびＩＳ中の全てのライブラリ化合物のクロマトグラフィー挙動を日常的に決定する。マトリックスおよびＩＳ中の化合物の濃度、ならびにそれらのクロマトグラフィー挙動は同一であるため、マトリックスにおいてなされたいかなる同定もＩＳにマッピングすることができる。マトリックスの使用への鍵は、明瞭なＩＲＯＡフォーマット化ピークがｍｓｍｓを通してその完全性を維持し、全ての断片がＩＲＯＡ断片化として表れること、および同様にＩＭを通してその完全性を維持し、全てのＩＲＯＡピークが共通のＣＣＳを共有することである。
【００６８】
マトリックスおよびＩＳの例示的調製
マトリックス（およびＩＳ）は、任意の試料に完全に一致するように形成され得るが、ほとんどの生物は共通する中核的代謝を共有しており、したがって広範な試料の種類において広範な化合物を同定および定量化するのに好適な「総合的」マトリックスを生成することができる。例えば、ほぼ全ての生物は、同じ２０のアミノ酸および同じヌクレオチドを使用し、同じ生化学的経路のほとんどを共有している。したがって、正当な経済的理由から、所与の試料の種類に対して特定のマトリックス（およびＩＳ）を形成せず、総合的マトリックス（およびＩＳ）を使用することを選択することができる。妥当なマトリックス（およびＩＳ）は、単細胞または多細胞生物から形成され得る。発酵プロセスの効率を慎重に制御することができる単細胞生物、例えば発酵性の酵母、細菌または藻類等が好ましい。
ここで、特に好ましいマトリックス（およびＩＳ）の調製を例示するが、同様のプロセスに従ってより具体的なマトリックスを形成することができる。
【００６９】
１）Ｓ２８８Ｃまたは同様のもの等の最小培地で十分に成長するサッカロマイセス・セレビシエの株が、生化学的に最も適格であり、それが主要炭素源として９５％１３Ｃ  Ｕ−グルコースで成長することを保証するために選択および試験される。それがこの試験に合格し、発酵に精通した者から見て正常な生育習性に近い場合、これは好適であるとみなされる。
【００７０】
２）選択された株は、大量発酵を開始するのに十分な細胞が利用可能となるまで逐次的に大きい容器内、例えば２０リットル以上の発酵槽内で連続的に成長させてもよい。これらの早期発酵のための培地は、同位体濃縮グルコースであり、ミネラルが添加され、硝酸塩または他の窒素源およびビタミンを含む。５０ｍｌの後期段階成長等、十分な細胞が達成されたら、この材料を、成長のための主要炭素源が同位体標識化グルコース、硝酸塩または他の窒素源、ミネラルおよびビタミンである２０Ｌの発酵槽に移す。エタノール産生を低下させ、利用可能なＣＯ2が同位体標識化グルコースから生成されたものだけであることを保証するために、発酵層を発酵期間の間二酸化炭素不含空気で好気的にスパージする。発酵中、消費分を置き換えるために、追加の同位体標識化グルコースを連続的に添加する。発酵工程を通して、発酵流体のアリコートを分析のために取り出し、細胞密度を決定し、培地化学を制御する。発酵が最適密度の後期対数期成長を達成したが老化に至る前に、細胞塊全体を採取する。濾過細胞（酵母）塊を培地から回収し、−８０℃で凍結させる。
３）凍結した酵母塊を冷凍庫から取り出し、２回蒸留後のイオン不含水中に再懸濁させ、フレンチプレスまたは他の細胞破壊方法により少なくとも３回、すなわち酵母細胞の実質的に全てが破壊されたと思われるまで押し出す。この破壊された溶解物を、４５℃で２４時間自己消化させ、すなわちそれ自身の酵素により消化させ、「酵母抽出調製物」を形成させる。
【００７１】
４）得られた酵母抽出物調製物の固体部分を、１つの画分として遠心分離する。上澄みを濾過して微粒子を除去し、次いで「酵母抽出物」として凍結乾燥させる。得られる酵母抽出物は、安定な生化学物質およびその中間体のほとんどを含有する非常に富化された生化学的混合物である。これは総合的な抽出物であることが意図されるため、不安定な生化学的中間体の存在は最小限である。これらの比較的不安定な生化学物質、例えばＡＴＰ等が求められる場合、特別なマトリックスが必要である。
【００７２】
マトリックス用に、上記プロセスを行って９５％酵母抽出物（主要炭素源として９５％１３Ｃ  Ｕ−グルコースを用いて成長させた酵母から生成される）を生成し、別個の作業として５％酵母抽出物（主要炭素源として５％１３Ｃ  Ｕ−グルコースを用いて成長させた酵母から生成される）を生成する。９５％酵母抽出物をマトリックスのＣ１３半体として使用し、マトリックスはまたＩＳでもあり、すなわち、これらの２つの組成物は、化学的に同一となるために厳密に同じ均質材料から得られる。（注：それらは共に、マトリックスおよび実験試料の両方において厳密に同じ濃度（４０ｍｌ当たり２０ｍｇ）で存在する。５％酵母抽出物（５％ＹＥ）を９５％酵母抽出物（９５％ＹＥ）に等しい割合で添加し、マトリックスを生成する。したがって、マトリックスは、質量スペクトル分析において、完全に対称なピークのセットを生成する。内部標準は化学的に同一であり、その成分はマトリックス中のものと同じ濃度で存在するが、ＩＳは５％Ｃ１２材料のみを含有する。実験試料の添加は、測定されるＣ１２材料の源を提供する。
マトリックスおよびＩＳを作製するための方法は、以下の通りである。
１）厳密な量、例えば９０ｍｇの９５％ＹＥを量り分ける。これを、適量の５０／５０水／エタノールを添加することにより溶解し、１ｍｌ当たり１０ｍｇの溶液を形成し、この例では厳密に９ｍｌの９５％ＹＥが作製される。
２）厳密な量、例えば３０ｍｇの５％ＹＥを量り分ける。これを、適量の５０／５０水／エタノールを添加することにより溶解し、１ｍｌ当たり１０ｍｇの溶液を形成し、この例では厳密に３ｍｌの５％ＹＥが作製される。
３）マトリックスを作製するために、等量の９５％ＹＥ溶液および５％ＹＥ溶液を添加する。したがって、この例では、３ｍｌの９５％ＹＥを３ｍｌの５％ＹＥに添加して、マトリックス前駆体を形成する。
ａ）４ｍｌのマトリックス前駆体を各注入バイアル内に等分し、窒素下で乾燥および封止し、−８０℃で保存する。
４）ＩＳを作製するために、５０μｌの９５％ＹＥを２ｍｌのバイアル内に等分し、窒素下で乾燥および封止し、−８０℃で保存する。
【００７３】
マトリックスの場合、乾燥マトリックス注入バイアルは、２０μｌの９５％ＹＥおよび２０μｌの５％ＹＥを含有する。それを注入用に、例えば４０μｌのｄＨ２Ｏの添加により溶解し、質量スペクトル分析すると、得られるスペクトルは、極めて対称的で、極めて同定可能なＩＲＯＡピークを有する。
【００７４】
ＩＳの場合、２ｍｌのバイアルは、０．５ｍｇ（または０．５００ｍｇ）の９５％ＹＥを含有する。これを１．２ｍｌ（１２００μｌ）に溶解し、この溶液の４０μｌを乾燥した調製実験試料に添加すると、それぞれの得られる実験試料は、マトリックス中と同量の２０ｍｇの９５％ＹＥを含有する。実験試料もまたマトリックスおよびＩＳと同じ化合物を含有するが、それらは天然存在度のＣ１３レベル、約１．１％で存在する。マトリックスの質量スペクトル分析は、マトリックス化合物、ひいてはＩＳ化合物の全ての同一性を提供したため、天然存在度ピークの厳密な位置はあらゆる化合物に対して既知である。天然存在度化合物の高さまたは面積は、その同一性の完全な知識により、および９５％アイソトポマーの標準量と相対的に測定される。
【００７５】
例示的な事例１
病院／臨床検査室における血液検査
過去１０年間で、質量分析法は、柔軟性、感度、および費用が一般に従来法よりも有利であることから、臨床測定の分野に否応なしに導入されている。しかしながら、測定を行うためには、通常、内部標準を使用し、測定対象化合物と、イオン化効率に影響し得る、または予想外の箇所で、すなわち測定期間中に偶発的に出現することにより混乱を招き得る他の化合物との間のクリーンなベースライン分離を得ることが必要である。
その理由は単純である。質量スペクトルイオン源は潜在的に変動性であり、質量スペクトル信号は同調、イオン抑制、溶媒の変動性、またはさらには大気条件に敏感であるため、内部標準が重要である。ほぼ全ての非ＩＲＯＡ標準等の単一ピークを有する内部標準では、その単一ピークが、極めて類似した質量を有するアーチファクトと混合またはそれで汚染され得る。
【００７６】
天然存在度の分析物を測定する場合、このリスクは通常、ａ）クロマトグラフィーにより分析物を全ての他の化合物から分離し、ｂ）内部標準を含めるという２重のアプローチによって軽減される。内部標準が分析物と共にコクロマトグラフィーに供され、潜在的な交絡因子から分離される限り、誤測定のリスクは、結果が認められるのに十分低いとみなされる。これらの工程は、単一化合物が測定されている場合には許容されるレベルまでリスクを低下させることができるが、数百もの化合物を同時に測定することが必要な場合には、リスクは著しく増大し、ベースライン分離は保証され得ない。
したがって、以下のようなより安全なシステムが必要とされる。
内部標準（ＩＳ）が１つまたは複数の一意の同定特性を有する場合、それが特定の化合物に対する内部標準であり、アーチファクトと間違えられ得ないことを保証することができる；
ＩＳが標的化合物とコクロマトグラフィーに供された場合、全ての源、および標的化合物の分析変動性を受け、また定量的比較の完全な点を提供する；ならびに
ＩＳがコクロマトグラフィーに供され、全ての分析変動性を共有し、その標的に一意に一致し得る場合、良好な分析測定を行うためにクリーンなベースライン分離はもはや必要ではない。
【００７７】
ＩＲＯＡ  Ｃ１３−ＩＳは、これらの基準の全てに適合し、１）各化合物に対してＩＲＯＡクラスターの形状がその式によって完全に決定され、２）Ｃ１３−ＩＳ中の化合物がその天然存在度（臨床もしくは実験試料の場合）または他のＣ１２−Ｂ（マトリックスの場合）アイソトポマーと共にコクロマトグラフィーに供され、３）その他化学的に同一である。
【００７８】
発見例１
例示として、Ｃ１３-１Ｓおよびマトリックスが乾燥粉末として分配されることを仮定する。Ｃ１３−ＩＳは、５００μｇのＣ１３−ＩＳを含有する２ｍｌバイアル内の乾燥粉末であり、マトリックスは、２０μｇのＣ１３−ＩＳおよび２０μｇのＣ１２−Ｂを含有する、ガラスインサートを有するガラス注入バイアル内の乾燥粉末である。
さらに、以下のような標準的血漿調製プロトコルを使用した５０の血漿試料が分析されることを仮定する。
５０の血漿試料のそれぞれ５０μＬを、５０個の１．８ｍｌエッペンドルフ管に入れる。これらは、５０の分析対象試料を構成する。
４００μＬの冷析出溶液（８：１：１のアセトニトリル：メタノール：アセトン）をリピーターピペットで添加し、１：８（試料：溶媒）の比の溶液を作製する。
【００７９】
確実に混合するために試料をボルテックスし、試料を４℃で３０分間冷却してタンパク質をさらに析出させ；１０℃未満で２０，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離してタンパク質のペレットを形成させ；確実にタンパク質ペレットを残しつつ３７５μＬの上澄みを新しいラベル付きの管に移す。
Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＭｕｌｔｉＶａｐ（登録商標）または同様の装置内で、窒素、アルゴンまたは使用した条件下で反応に対し不活性な他のガスを使用して液体試料を乾燥させ、キャッピングされた乾燥試料を、再構成の準備が整うまで−８０℃で保存する。
【００８０】
Ｃ１３-１Ｓおよびマトリックスが乾燥粉末として分配されることを仮定する。Ｃ１３−ＩＳは、５００μｇのＣ１３−ＩＳを含有する２ｍｌバイアル内の乾燥粉末であり、マトリックスは、２０μｇのＣ１３−ＩＳおよび２０μｇのＣ１２−Ｂを含有する、ガラスインサートを有するガラス注入バイアル内の乾燥粉末である。
Ｃ１３−ＩＳを、１．２５ｍｌの冷８０％水メタノール、５０μｌ当たり２０μｇの添加により再構成し、確実に混合するためにボルテックスし、次いで４℃で１０分間静置する。
５０μｌの再構成されたＣ１３−ＩＳを使用して、それぞれのキャッピングされた乾燥試料を再構成する。試料をボルテックスし、１分間静置し、ガラスインサートを有するガラス注入バイアルに４０μｌを移す。
マトリックスを５０μｌの８０％水メタノール中で再構成し、ボルテックスし、１分間静置する。
マトリックスおよび５０の実験試料をクロマトグラフィー分離およびＭＳ分析のために質量分析計に移す。全ての試料注入は４μｌの注入であり、したがって同じ濃度のＣ１３−ＩＳを含有する。マトリックス試料は、一連の実験試料内で無作為に少なくとも５回注入する。
【００８１】
これらの分析からのデータセットを、以下のように分析する。
ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ソフトウェア（ＩＲＯＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）等のソフトウェアを使用して、複数のマトリックス注入にわたり検出され得るＩＲＯＡピークの全てを検出および特性決定することができる。ソフトウェアは、保持時間（ＲＴ）、Ｃ１２モノアイソトピック質量、Ｃ１３モノアイソトピック質量、分子内の炭素数、イオン移動度特性、断片化特性（インソースおよびポストソース）、あらゆるＩＲＯＡピークにおける各ピークの振幅、全てのＩＲＯＡピーク間の関係、ならびに記録された任意の追加の物理的特性を含む、検出された全てのＩＲＯＡピークの全ての関連した同定特性を蓄積する。ソフトウェアは、検出された情報の全てを使用して各ピークを同定する。ほとんどのピークは周知であり、以前に十分に特性決定されているが、おそらくソフトウェアは新たな同定因子を形成する必要がある。各ピークの分子式は、そのＩＲＯＡ特性から導出される。
【００８２】
ソフトウェアは、検出された各化合物に関する所見を要約したファイル（典型的には記述された）を提供する。ファイルは、ＲＴ（平均および範囲、ピークの開始からピークの終了まで）、Ｃ１２モノアイソトピック質量（平均および範囲）、Ｃ１３モノアイソトピック質量（平均および範囲）、式および同一性を含み得る。Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｉｅｘ等により製造されたもの等の今日利用可能な標準的高分解能機器では、検出される範囲は極めて狭い。
【００８３】
このファイルは、各実験ファイルの標的化分析の基礎であり、したがってマトリックス試料において検出されたあらゆる化合物に対して詳細な標的化分析が実行される。Ｃ１３−ＩＳはあらゆる試料において同じであるため、あらゆる試料において検出される。その天然存在度Ｃ１３モノアイソトピックの質量は既知であるため、その存在を正確に定量化することが可能である。
Ｃ１３−ＩＳが観察されるが天然存在度が観察されない場合、非存在として分類され得る。
Ｃ１３−ＩＳは存在しないがマトリックス中に観察された場合、品質管理問題を示し得る。
Ｃ１３−ＩＳおよび天然存在度クラスター内の全てのピークの合計は、数値出力である。
各バイアル内のＣ１３−ＩＳの絶対量は同一であるため、各バイアル内の全てのＣ１３−ＩＳピークの合計は、同一ではなくとも極めて近い。この合計における偏差は、注入（ただ１つのファイルがそれを示す場合）、または機器（それが傾向を示す場合）における問題を示す。
正規化が必要である場合、天然存在度側の面積の合計がほぼ等しいと推定することができ、Ｃ１３−ＩＳの合計が比較的一定である場合、天然存在度の合計はＣ１３−ＩＳの合計に正規化され得る。（注：これは極端な場合にのみ必要となる。）
この分析の結果は、実験（または臨床）試料中に存在する化合物の全ての標準化された尺度である。各試料に対して、関連した品質尺度が存在する。一貫したマトリックス試料に対する標準化は、試料セット内で、同様の機器内での日にわたって、またはさらには多種多様な機器にわたって命名を保証するが、異なる機器にわたる性能の差は、機器の源、レンズ、検出器等に起因して、十分に特性決定され得るいくつかの一貫した差をもたらす可能性がある。それにもかかわらず、化合物の大多数が広く異なるプラットフォームにわたりマッピング可能であると推測される。
【００８４】
例示的な事例２
病院／臨床検査室における尿検査
いくつかの類似性はあるものの、尿の化学は血漿の化学とは非常に異なるため、マトリックスが尿用に特別設計されるＩＲＯＡワークフロー１の変型例を例示するために尿を使用する。
【００８５】
１つの可能な変型例として以下を考慮する。
５００リットル（またはそれ以上）の尿を得、乾燥させる。次いで、粉末の天然存在度の尿を２つのアリコートに分割し、一方は得られた総量の９０％を表し（アリコートＡ）、他方はその総量の１０％を表す（アリコートＢ）。フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）等のＩＲＯＡベース誘導体化試薬を用いて各アリコートを誘導体化するが、他の多くの試薬が使用されてもよい。得られるフェニルチオカルバミル反応生成物には７個の炭素があり、したがって５％13Ｃ  ＰＩＴＣおよび９５％13Ｃ  ＰＩＴＣの両方を使用して誘導体化が行われた場合、得られる生成物を一緒に混合して、７炭素ＩＲＯＡピークパターンを生成することができる。
【００８６】
同様に、それぞれ６個の炭素原子を含有する５％13Ｃフェニルヒドラジンおよび９５％13Ｃフェニルヒドラジンを使用して、ＰＩＴＣに関して上で議論したように、尿等の試料中のアルデヒドおよびケトンを誘導体化することができる。過剰のフェニルヒドラジンの存在下で、いくつかの糖が２つのフェニルヒドラジン基を付加して、ジフェニルオサゾンを形成する。７個の炭素原子を含有するフェニルセミカルバジドを同様に使用して、分析対象試料中に存在するケトンおよびアルデヒドと反応させることができる。
【００８７】
上で議論した試薬は、それぞれ一級アミンおよびアルデヒド／ケトンと反応して、それに結合する。当業者は、Green et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed., John Wiley & Sons, Inc. New York, 1999、またはLundblad, Techniques in Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, 1995等の一般的な文献を容易に参考にして、全ての天然存在度試料の化合物中に存在するヒドロキシル基、チオールおよびカルボン酸等の他の官能基を、本明細書において議論されるａｎ７  ＩＲＯＡ試料に変換するために使用され得るさらなる試薬を同定することができる。
したがって、必要とされる量を鑑みて、９５％13Ｃ  ＰＩＴＣを有するアリコートＡおよび５％13Ｃ  ＰＩＴＣを有するアリコートＢを反応させると２つの混合生成物が生成され、尿中の全てのアミン含有化合物は、そのフェニルチオカルバミル同等物に変換されている。アリコートＡおよびアリコートＢからの材料を等量で混合すると尿特定のマトリックスが形成され、一方アリコートＡからの追加の材料は、実験試料に添加された場合に同等のＣ１３−ＩＳを提供する。
【００８８】
これらの試薬が手元にあれば、例示的な事例１のプロトコルと同様のプロトコルに従って、アミン含有化合物が豊富な尿中のアミン含有化合物の全てを定量化することができる。異なる誘導体化試薬を使用して、他の化学官能基を強調することができる。実際、生成物が互いに安定で比較的非反応性である場合、２つ以上が個々に形成され、次いでプールされてより複雑なマトリックスを形成することができる。
本明細書において引用された特許、特許出願および記事はそれぞれ、参照により組み込まれる。冠詞「ａ」または「ａｎ」の使用は、１つまたは複数を含むように意図される。
上記説明および例は、例示的であることを意図し、限定として解釈されるべきではない。本発明の精神および範囲内のさらに他の変型例が可能であり、当業者に容易に明らかとなる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【国際調査報告】
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2020511671.tif 000041
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