(57)【要約】眼に影響を及ぼす障害（例えば、角膜混濁または瘢痕、ドライアイ疾患、および眼表面の炎症）の処置における使用のための、アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含有する有効量の融合タンパク質を含む医薬組成物が開示される。アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含む融合タンパク質が開示される。一部の実施形態は、融合タンパク質をコードし得る単離された核酸分子を含む。眼に影響を及ぼす障害（例えば、角膜混濁または瘢痕、ドライアイ疾患、および眼表面の炎症）を有する被験体を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に開示されている融合タンパク質を被験体の眼に投与するステップを含む方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための、アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、
（１）前記アンカードメインが、レクチン炭水化物結合アンカードメイン、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）コラーゲン結合アンカードメイン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）コラーゲン結合アンカードメイン、またはヘパリン結合（ＨＳ）アンカードメインを含み、かつ
前記治療的ポリペプチドが、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチドもしくはインターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニストを含むか；または
（２）前記アンカードメインが、レクチン炭水化物結合アンカードメイン、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）コラーゲン結合アンカードメイン、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）コラーゲン結合アンカードメインを含み、かつ
前記治療的ポリペプチドが、ＩＬ−１０もしくはインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記レクチン炭水化物結合アンカードメインが、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、ジャカリン（Ｊａｃ）またはコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）炭水化物結合アンカードメインである、眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体を含み；
前記ＴＮＦαアンタゴニストが、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＮＦαに特異的に結合する抗体を含み；
前記ＩＬ−１βアンタゴニストが、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体を含み；
前記ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体を含み；
前記ＩＦＮγアンタゴニストが、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含み；および／または
前記Ｉｇ結合ポリペプチドが、プロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはそれらのＩｇ結合性断片を含む、眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
（１）前記アンカードメインが、レクチン炭水化物結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１０、ＩＬ−１Ｒａ、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含み；
（２）前記アンカードメインが、前記ｖＷＦコラーゲン結合アンカードメイン、または前記ＣｏｌＨコラーゲン結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、Ｐ１７、Ｐ１４４、または前記Ｉｇ結合ポリペプチドを含み；または
（３）前記アンカードメインが、前記ＨＳアンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤を含む、眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記レクチン炭水化物結合アンカードメインが、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含み；
前記ｖＷＦコラーゲン結合アンカードメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み；
前記ＣｏｌＨコラーゲン結合アンカードメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含み；および／または
前記ＨＳアンカードメインが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項１から４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
（１）前記アンカードメインが、前記ｖＷＦコラーゲン結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、Ｐ１７、Ｐ１４４、または前記Ｉｇ結合ポリペプチドを含み；または
（２）前記アンカードメインが、前記レクチン炭水化物結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＧＦβに特異的に結合する抗体を含む、
角膜混濁または角膜瘢痕の処置における使用のための請求項１から５までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
（１）前記アンカードメインが、前記ｖＷＦコラーゲン結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記Ｉｇ結合ポリペプチド、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、またはＩＬ−１０を含み；または
（２）前記アンカードメインが、前記レクチン炭水化物結合アンカードメイン、または前記ＣｏｌＨコラーゲン結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１０、ＩＬ−１Ｒａ、またはＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する前記抗体を含み；または
（３）前記アンカードメインが、前記ＨＳアンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤を含む、ドライアイまたは眼の眼表面における炎症の処置における使用のための請求項１から５までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記アンカードメインと前記治療的ポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含む、眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項１から７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項１から８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
異種プロモーターに作動可能に連結した、眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
眼に影響を及ぼす障害の処置における使用のための請求項１０に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
眼に影響を及ぼす障害を有する被験体を処置するための方法であって、
（１）治療有効量の請求項１に記載の融合タンパク質を前記被験体の眼に投与するステップであって、前記治療的ポリペプチドが、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、Ｐ１７、Ｐ１４４、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む、ステップ；あるいは
（２）治療有効量の
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記治療的ポリペプチドが、Ｉｇ結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質、および
（ｂ）任意の治療的に有効な抗体
を前記被験体の眼に投与するステップ
を含み、それにより、眼に影響を及ぼす前記障害を処置する、方法。
【請求項１３】
前記被験体が角膜混濁または角膜瘢痕を有し、前記方法が、
（１）治療有効量の請求項１に記載の融合タンパク質を前記被験体の眼に投与するステップであって、前記治療的ポリペプチドが、前記Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体を含む、ステップ；あるいは
（２）治療有効量の
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記治療的ポリペプチドが、Ｉｇ結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質、および
（ｂ）ＴＧＦβに特異的に結合する抗体
を前記被験体の眼に投与するステップ
を含み、それにより、角膜混濁または角膜瘢痕を処置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体がドライアイを有し、前記方法が、
（１）治療有効量の請求項１に記載の融合タンパク質を前記被験体の眼に投与するステップであって、前記治療的ポリペプチドが、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む、ステップ；あるいは
（２）治療有効量の
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記治療的ポリペプチドが、Ｉｇ結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質、および
（ｂ）ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体
を前記被験体の眼に投与するステップ
を含み、それにより、ドライアイを処置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体が、シェーグレン症候群を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
眼に影響を及ぼす前記障害が眼の眼表面における炎症を含み、前記方法が、
（１）治療有効量の請求項１に記載の融合タンパク質を前記被験体の眼に投与するステップであって、前記治療的ポリペプチドが、ＩＬ−１０、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、またはＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む、ステップ；あるいは
（２）治療有効量の
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記治療的ポリペプチドが、Ｉｇ結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質、および
（ｂ）ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体
を前記被験体の眼に投与するステップ
を含み、それにより、眼の眼表面におけるまたは眼内の前記炎症を処置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症が、アカントアメーバ、細菌、真菌またはウイルス感染によって引き起こされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
眼の眼表面における前記炎症が、細菌感染によって引き起こされる角膜炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
眼への外部および／または局部投与のために製剤化された、治療有効量の請求項１から８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
（１）前記アンカードメインが、前記レクチン炭水化物結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する前記抗体を含み；
（２）前記アンカードメインが、前記ｖＷＦコラーゲン結合アンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、ＩＬ−１０、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、Ｐ１７、またはＰ１４４を含み；または
（３）前記アンカードメインが、前記ＨＳアンカードメインを含み、前記治療的ポリペプチドが、前記ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、配列番号１７または配列番号１８を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
（１）治療的タンパク質が、Ｉｇ結合ポリペプチドを含み；
（２）前記医薬組成物が、治療的に有効な抗体をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記治療的に有効な抗体が、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記アンカードメインが、ｖＷＦコラーゲン結合アンカードメインを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
配列番号１５または配列番号１６を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
計量された液滴中に請求項２０から２５までのいずれか一項に記載の医薬組成物を分配するための単位用量ディスペンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年９月２０日に出願された米国仮出願第６２／３９６，９５８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
これは、角膜混濁および瘢痕、ドライアイ疾患、ならびに眼炎症などの眼の障害を処置するための使用のための、タンパク質に基づく薬物の分野に関する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）に認定された助成金番号ＡＩ０８５５７０の下で政府支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
眼の表面の疾患は一般的である。角膜混濁は、視力を低減または消失させ、多くの眼疾患および外科的介入の重篤な合併症であり、世界中で失明の主な原因である（Ｂｏｕｒｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｇｌｏｂ  Ｈｅａｌｔｈ、１巻：ｅ３３９〜３４９頁、２０１３年；Ｏｌｉｖａら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、６０巻：４２３〜４２７頁、２０１２年）。持続性の角膜混濁は、最も一般的には、角膜実質細胞の、大量の無秩序な細胞外マトリクスを合成する筋線維芽細胞への形質転換を刺激し、それにより、角膜の正常な構造および透明度を破壊する、腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦβ）の過剰な活性によって引き起こされる（Ｔｏｒｒｉｃｅｌｌｉら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、１４２巻：１１０〜１１８頁、２０１６年；Ｔｏｍａｓ−Ｊｕａｎら、Ｊ  Ｏｐｔｏｍ、８巻、１４９〜１６９頁、２０１５年；Ｈｉｎｚ  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、１４２巻：５６〜７０頁、２０１６年）。したがって、ＴＧＦβの活性を遮断することに、かなり関心が持たれてきた。いくつかの遮断剤が存在するが（Ｆｉｎｎｓｏｎら、Ａｄｖ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ  （Ｎｅｗ  Ｒｏｃｈｅｌｌｅ）、２巻：１９５〜２１４頁、２０１３年）、角膜における混濁を処置または予防するために現在使用されているものはない。
【０００５】
ドライアイは、成人集団の最大で３分の１が罹患し、少しいらいらする強度から日常生活を強く妨害する強度まで変動し得る（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎら、Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ、１５巻：３３４〜３６５頁、２０１７年）。大衆点眼薬が一般的であるが、それらが任意の実際の薬理学的効果を有するという証拠はほとんどない（Ｐｕｃｋｅｒら、Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２巻、２０１６年）。ドライアイは、基本的には炎症性疾患であり（Ｂｒｏｎら、Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ、１５巻：４３８〜５１０頁、２０１７年）、多数の生物学的試薬がこの状態を処置するために使用され得る（Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｃｅｌｌ、１５７巻：２２７〜２４０頁、２０１４年）。しかし、これらの試薬を使用することは、眼表面への有効な送達方法の欠如によって排除されてきた。
【０００６】
他の角膜疾患が共通して失明を引き起こす。生物学的薬物の開発によって、薬理科学において最近驚異的な進歩があり（Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐ．  Ｔｏｘｏｃｏｌ．、３４巻：１２７９〜１２８５頁、２０１５年；Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｃｅｌｌ、１５７巻：２２７〜２４０頁、２０１４年）、これらは、関節リウマチ、乾癬、一部の形態のがん、および他の状態を処置するために現在使用されている。これらの薬物の多くは、眼表面の疾患を管理するために非常に有用であり得る。しかし、問題は送達であり、まばたきと組み合わせた涙液膜の除去作用は、２〜５分以内に治療剤を除去することから、ほとんどの薬物は、点眼薬中で適用した場合、なんらかの顕著な効果を有するにはあまりに迅速に除去される（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、１９０巻、１７２〜１８１頁、２０１４年）。
【０００７】
多数の様々な実験的眼薬物送達系が開発中であり、これは、眼への薬物送達の重要性を考慮すれば驚くべきことではない（Ｋｉｍ，  Ｙ．  Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９０巻：１７２〜１８１頁、２０１４年；Ｓｏｕｚａ，  Ｊ．  Ｇ．ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６６巻：５０７〜５３０頁、２０１４年）。以前の研究の限界は、送達が、担体に基づくデバイスの一部の形態に依存することである。これらの多くの製造は、有機溶媒が関与する過酷な条件を必要とし、ほとんどは、低分子量化合物を送達するためにのみ適している。タンパク質を送達するために提唱された系（Ｖａｉｓｈｙａ，  Ｒ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ、１２巻：４１５〜４４０頁、２０１５年；Ａｇａｒｗａｌ，  Ｐ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、１８巻：３３７〜３４９頁、２０１３年）としては、種々の形態のゲルおよびペレットまたは透過性コンタクトレンズが挙げられ、これらは、厄介でありおよび／または視力に干渉し、実施ではめったに使用されない。したがって、特に、視力が破壊されないような、眼表面への有効な薬物送達が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖａｉｓｈｙａ，Ｒ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ（２０１５年）１２巻：４１５〜４４０頁
【非特許文献２】Ａｇａｒｗａｌ，Ｐ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ（２０１３年）１８巻：３３７〜３４９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
例えば、これだけに限定されないが、角膜混濁および瘢痕、ドライアイ疾患、ならびに眼炎症などの眼に影響を及ぼす障害を処置するために使用され得る、アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含む融合タンパク質が、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメイン、例えば、レクチン炭水化物結合ポリペプチド、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）コラーゲン結合ポリペプチド、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）コラーゲン結合ポリペプチドまたはヘパリン結合（ＨＳ）ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチドまたはインターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニストを含み得る。他の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメイン、例えば、レクチン炭水化物結合ポリペプチド、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）コラーゲン結合ポリペプチドまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）コラーゲン結合ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドは、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）またはインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を含み得る。一部の例では、この融合タンパク質は、アンカードメインと治療的ポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含み得る。これらの融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が、本明細書でさらに開示される。
【００１０】
眼に影響を及ぼす障害を有する被験体を処置するための方法もまた、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、この方法は、治療有効量の本明細書に開示されている融合タンパク質を被験体の眼に投与するステップを含む。非限定的な例では、この治療的ポリペプチドとしては、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、Ｐ１７、Ｐ１４４、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体が挙げられ得る。他の実施形態では、この治療的ポリペプチドは、Ｉｇ結合ポリペプチドである。これらの方法は、治療有効量の抗体を被験体に投与するステップもまた含み得る。
【００１１】
眼への外部および／または局部投与のために製剤化された、治療有効量の本明細書に開示されている融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた、本明細書に開示されている。医薬組成物を分配するための単位用量ディスペンサーが、本明細書でさらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、アンカードメインが、異種タンパク質を眼の表面に迅速に結合させるために使用できることを示す。図１Ａ：コラーゲンカラムへの融合タンパク質の結合。図１Ｂ：創傷を受けたウサギ眼への融合タンパク質の結合。
【００１３】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、病変を有する眼へのレクチンの結合を示す。図２Ａ：２つの実験におけるレクチン結合の結果が示される。図２Ｂ：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｎＡｃ；すなわち、ＷＧＡに対する受容体糖）ありおよびなしの、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）結合についての結果が示される。
【００１４】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、眼疾患を処置するための例示的な融合タンパク質の模式図を示す。図３Ａは、角膜混濁および瘢痕を処置するための融合タンパク質の一部の実施形態を示す。図３Ｂは、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）および炎症を処置するための融合タンパク質の一部の実施形態を示す。
【００１５】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、標的分子への融合タンパク質の結合を示す。図４Ａは、ヘパリン結合（ＨＳ）ポリペプチドを有する融合タンパク質がヘパリン結合活性を保持することを示す。図４Ｂは、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合ポリペプチドを有する融合タンパク質がコラーゲン結合活性を保持することを示す。
【００１６】
【図５】図５Ａは、ＧｌｎＡｃアガロースへのＷＧＡとコンジュゲートしたポリクローナル抗体の結合を示す。図５Ｂは、ＧｌｎＡｃアガロースへのＷＧＡとコンジュゲートした治療的抗体の結合を示す。
【００１７】
【図６】図６Ａは、創傷を受けたウサギ眼が、Ｐ１７およびＰ１４４を含む融合タンパク質に結合することを示す。図６Ｂは、創傷を受けたウサギ眼が、ＷＧＡとコンジュゲートした抗体に結合することを示す。
【００１８】
【図７】図７Ａは、ＷＧＡとコンジュゲートした抗体への標識したＩＬ−１βの結合を示す。図７Ｂは、アダプター（Ｉｇ結合ポリペプチド）が、コラーゲンへの抗体の結合を媒介することを示す。
【００１９】
【図８】図８は、眼の表面において長時間にわたってＷＧＡが残存することを示す、結合したＷＧＡの時間経過を示す。
【００２０】
【図９】図９は、レクチンであるジャカリンおよびコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）が、抗体に共有結合した場合に結合活性を示すことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、２０１７年９月１９日に作成された１８．４ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：
【００２２】
配列番号１は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号２は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号３は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）由来のコラーゲン結合アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号４は、ヘパリン結合（ＨＳ）アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号５は、ヘパリン結合（ＨＳ）アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号６は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）由来の炭水化物結合アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号７は、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）由来の炭水化物結合アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号８は、ジャカリン（Ｊａｃ）由来の炭水化物結合アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号９は、リンカーのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１０は、プロテインＡ免疫グロブリン（Ｉｇ）結合性断片のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１１は、プロテインＧ免疫グロブリン（Ｉｇ）結合性断片のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１２は、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１３は、Ｐ１４４ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１４は、Ｐ１７ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１５は、Ｉｇ結合ポリペプチドとしてプロテインＧポリペプチドを含み、アンカードメインとしてｖＷＦポリペプチドを含む融合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１６は、Ｉｇ結合ポリペプチドとしてプロテインＧポリペプチドを含み、アンカードメインとしてｖＷＦポリペプチドを含む融合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１７は、治療的ポリペプチドとして２コピーのＰ１４４を含み、アンカードメインとしてｖＷＦポリペプチドを含むアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１８は、治療的ポリペプチドとして２コピーのＰ１７を含み、アンカードメインとしてｖＷＦポリペプチドを含むアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１９は、リンカーのアミノ酸配列である。
【００４１】
薬物開発における進歩は、疾患機構を理解および標的化することにますます依存しており、多数のタンパク質に基づく薬物、例えば、モノクローナル抗体、分子トラップおよびサイトカインが、現在臨床的に使用されている（Ｌｅａｄｅｒ，  Ｂ．ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、７巻：２１〜３９頁、２００８年；Ｋｌｉｎｇ，  Ｊ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３２巻：１２１〜１２４頁、２０１４年；Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｌ．ら、Ｈｕｍ  Ｅｘｐ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、３４巻：１２７９〜１２８５頁、２０１５年）。これらの薬剤は、自己免疫障害、感染および不適切な血管新生などの多くの疾患を処置するために使用されるが、涙の流れおよびまばたきによる迅速なクリアランスが、眼表面疾患を処置するためのそれらの使用を排除してきた。本明細書に開示されている融合タンパク質は、より長い期間にわたる、眼における、特に眼表面における治療的タンパク質の保持を可能にする。
【００４２】
本明細書の組成物および方法は、眼への局所的薬物送達を提供し；標準的な点眼薬の形態で局所的薬物送達を可能にするので、送達デバイスを必要とせず（送達デバイスと共に使用できるが）；視力を妨害しない。これらの特徴は、患者の承諾および服薬遵守を増強し、現行の送達系を超える重要な改善であり、現代の生物学的試薬を使用するために眼科医にとって入手可能な治療薬の供給（ａｒｓｅｎａｌ）を拡張させる。本明細書の組成物および方法は、全身的薬物送達を回避し、さもなければ許容されない副作用を有する薬物の使用を可能にする。
【００４３】
標的化される眼表面上の領域は、アンカードメインを使用して正確に調節できる。疾患プロセスは一般に、上皮被覆を破壊し、コラーゲンに対する親和性を有するアンカードメインは、そのような部位に特異的に結合する。ヘパラン硫酸に結合するアンカーは、上皮が剥皮された領域に濃縮することが予測されるが、角膜上皮および結膜の外側表面にも結合する。適切なレクチンもまた、上皮のグリコカリックスに結合し、眼表面全体を標的化するために使用され得る。
【００４４】
例えば、これだけに限定されないが、角膜混濁および瘢痕、ドライアイ疾患、ならびに眼炎症などの眼に影響を及ぼす障害を処置するために使用され得る、アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含む融合タンパク質が、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメイン、例えば、レクチン炭水化物結合ポリペプチド、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）コラーゲン結合ポリペプチド、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）コラーゲン結合ポリペプチドまたはヘパリン結合（ＨＳ）ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチドまたはインターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニストを含み得る。他の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメイン、例えば、レクチン炭水化物結合ポリペプチド、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）コラーゲン結合ポリペプチドまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）コラーゲン結合ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドは、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）またはインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を含み得る。一部の例では、この融合タンパク質は、アンカードメインと治療的ポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含み得る。これらの融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が、本明細書でさらに開示される。
【００４５】
一部の非限定的な例では、この融合タンパク質は、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、ジャカリン（Ｊａｃ）またはコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）由来のレクチン炭水化物結合ポリペプチドを含み得る。他の非限定的な例では、ＴＧＦβアンタゴニストは、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体を含み得る；ＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＮＦαに特異的に結合する抗体を含み得る；ＩＬ−１βアンタゴニストは、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体を含み得る；ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体を含み得る；ＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含み得る；および／またはＩｇ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはそれらのＩｇ結合性断片を含み得る。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書の融合タンパク質は、アンカードメインとしてレクチン炭水化物結合タンパク質を含み得、治療的ポリペプチドとして、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１０、ＩＬ−１Ｒａ、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含み得る。他の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてｖＷＦコラーゲン結合ポリペプチドまたはＣｏｌＨコラーゲン結合ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとして、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＩｇ結合ポリペプチドを含み得る。なおさらなる実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてＨＳポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとしてＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤を含み得る。一部の例では、レクチン炭水化物結合ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含み；ｖＷＦコラーゲン結合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＣｏｌＨコラーゲン結合ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；および／またはＨＳポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
一部の例では、この融合タンパク質は、角膜混濁または角膜瘢痕の処置において使用される。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてｖＷＦコラーゲン結合ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとして、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＩｇ結合ポリペプチドを含み得る。他の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてレクチン炭水化物結合ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとしてＴＧＦβに特異的に結合する抗体を含み得る。
【００４８】
他の例では、融合タンパク質は、ドライアイまたは眼表面における炎症の処置に使用される。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてｖＷＦコラーゲン結合ポリペプチドを含み、治療的ポリペプチドとして、Ｉｇ結合ポリペプチド、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１ＲａまたはＩＬ−１０を含む。他の実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてレクチン炭水化物結合ポリペプチドを含み、治療的抗体として、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、またはＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む。なおさらなる実施形態では、この融合タンパク質は、アンカードメインとしてＨＳポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとして、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤を含み得る。
【００４９】
さらなる例では、この融合タンパク質は、Ｉｇ結合ポリペプチド、例えば、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬである治療的タンパク質を含む。これらの実施形態では、処置の方法は、目的のポリペプチドに特異的に結合する治療有効量の抗体を投与するステップもまた含む。
【００５０】
これらの融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が、本明細書でさらに開示される。一部の例では、この単離された核酸分子は、異種プロモーターに作動可能に連結する。なおさらなる例では、この単離された核酸分子は、発現ベクター中に含まれ得る。
【００５１】
眼に影響を及ぼす障害を有する被験体を処置するための方法もまた、本明細書に開示されている。一部の例では、この方法は、本明細書に開示されている治療有効量の融合タンパク質を被験体の眼に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、治療的ポリペプチドとして、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、Ｐ１７、Ｐ１４４、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含み得る。他の実施形態では、この方法は、治療有効量の、治療的ポリペプチドとしてＩｇ結合ポリペプチドを有する融合タンパク質および任意の治療的に有効な抗体を被験体の眼に投与するステップを含み得る。
【００５２】
一部の例示的な方法では、この被験体は、角膜混濁または角膜瘢痕を有する。一部の非限定的な実施形態では、この方法は、治療有効量の、治療的ポリペプチドとしてＰ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体を有する本明細書に開示されている融合タンパク質を被験体の眼に投与するステップを含む。他の非限定的な実施形態では、この方法は、治療有効量の、治療的ポリペプチドとしてＩｇ結合ポリペプチドを有する本明細書に開示されている融合タンパク質およびＴＧＦβに特異的に結合する抗体を被験体の眼に投与するステップを含む。
【００５３】
他の例示的な方法では、この被験体は、ドライアイまたは眼表面の炎症を有する。一部の非限定的な実施形態では、この方法は、治療有効量の、治療的ポリペプチドとしてＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を有する本明細書に開示されている融合タンパク質を、被験体の眼に投与するステップを含み得る。他の非限定的な実施形態では、この方法は、治療有効量の、治療的ポリペプチドとしてＩｇ結合ポリペプチドを有する本明細書に開示されている融合タンパク質およびＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を、被験体の眼に投与するステップを含む。一部の例では、この被験体は、シェーグレン症候群を有する。他の例では、この被験体は、アカントアメーバ、細菌、真菌、蠕虫、トキソプラズマまたはウイルス感染によって引き起こされる炎症を有する。一部の非限定的な例では、この被験体は、細菌感染によって引き起こされる角膜炎を有する。他の非限定的な例では、この被験体は、緑内障、ブドウ膜炎、黄斑変性症、糖尿病網膜症または他の網膜の問題によって引き起こされる炎症を有する。
【００５４】
眼への外部および／または局部投与のために製剤化された、治療有効量の本明細書に開示されている融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本明細書に開示されている。医薬組成物を分配するための単位用量ディスペンサーが、本明細書でさらに開示される。
【００５５】
一部の例では、医薬組成物は、アンカードメインとしてレクチン炭水化物結合タンパク質を含み得、治療的ポリペプチドとして、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、またはＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含み得る。他の例では、医薬組成物は、アンカードメインとしてｖＷＦコラーゲン結合ポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとして、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、Ｐ１７、またはＰ１４４を含み得る。なおさらなる例では、医薬組成物は、アンカードメインとしてＨＳポリペプチドを含み得、治療的ポリペプチドとしてＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤を含み得る。ある特定の例では、医薬組成物は、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列との融合タンパク質を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、この医薬組成物は、治療的タンパク質としてＩｇ結合ポリペプチドを含む。医薬組成物がＩｇ結合ポリペプチドを含む一部の実施形態では、この医薬組成物は、治療的に有効な抗体もまた含む。一部の非限定的な例では、この医薬組成物は、治療的に有効な抗体として、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６もしくはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む。他の非限定的な例では、アンカードメインは、ｖＷＦコラーゲン結合ポリペプチドを含む。ある特定の例では、この医薬組成物は、配列番号１５または配列番号１６を含む。
【００５７】
Ｉ．用語
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ  Ｂ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、１９９９；Ｋｅｎｄｒｅｗら、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４；Ｍｅｙｅｒｓ  Ｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５；および他の類似の参考文献において見いだすことができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、単数形および複数形の両方を指す。
【００５９】
本明細書に記載のものと同様または同等である多くの方法および材料を使用することができるが、特定の適切な方法および材料が下に記載されている。矛盾する場合は、用語の説明を含め、本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
【００６０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含め、本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
【００６１】
種々の実施形態についての精査を容易にするために、以下の用語の説明を提示する：
【００６２】
アカントアメーバ角膜炎：恒久的な視力障害または失明を生じ得る、眼の稀であるが重篤な感染症。この感染症は、アカントアメーバと称される微視的な自由生活性アメーバ（単細胞生物体）によって引き起こされる。
【００６３】
投与／送達：被験体に、任意の有効な経路によって薬剤を提供するかまたは与えること。投与の例示的な経路としては、これだけに限定されないが、点眼薬などの局部適用が挙げられる。例えば、選択された経路が局所的である場合、組成物は、被験体の眼の中に、例えば、眼表面上に組成物を導入することによって投与される。この用語は、例えば、連続放出製剤を使用して達成される、長期投与もまた包含する。
【００６４】
眼への眼薬物療法の送達の３つの主な方法は、局部に、眼に局所的に、および全身的になされる。投与の最も適切な方法は、薬物治療される眼の領域に依存する。結膜、角膜、前眼房および虹彩は、典型的には、局部療法に良好に応答する。典型的には、眼瞼は、局部療法で処置できるが、全身的療法をより頻繁に必要とする。
【００６５】
アミノ酸置換：ペプチド中の１つのアミノ酸の、異なるアミノ酸による置き換え。
【００６６】
薬剤：目的または結果を達成するために有用な任意の物質または物質の任意の組み合わせ。薬剤としては、タンパク質、核酸分子、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物、または目的の他の分子、例えば、組換えウイルスなどのウイルスが挙げられる。薬剤としては、治療剤、診断剤または医薬品が挙げられ得る。治療剤は、健康を回復または維持することによって、例えば、疾患もしくは生理的障害と関連する症状を緩和すること、疾患の進行もしくは発症を遅延させること（予防することを含む）、または生物学的機能を有する特定の分子が局所的に保持されるのを可能にすることによって、いくらかの治療効果を実証する物質である。一部の実施形態では、この薬剤は、ポリペプチド剤である。例えば、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬは、治療的抗体に結合でき、したがって、モノクローナルまたはポリクローナル抗体と共に使用した場合に治療有効性を達成できるので、これらは治療剤である。当業者は、１つよりも多くの結果を達成するために特定の薬剤が有用であり得ることを理解する。
【００６７】
アンカードメイン：細胞もしくは組織に結合し得る、または細胞外分子、例えば、コラーゲン、ヘパラン硫酸もしくはグリコカリックスに結合することによる、タンパク質ドメイン。アンカードメインは一般に、非共有結合を介して眼表面の分子に結合する。
【００６８】
動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物生物体。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも含む。同様に、「被験体」という用語は、ヒト被験体および獣医学的被験体のどちらも含む。
【００６９】
抗体：分析物（抗原）に特異的に結合しそれを認識する免疫グロブリン遺伝子（単数または複数）によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片。免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。
【００７０】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、および種々のペプチダーゼによる消化によって産生される十分特徴付けられたいくつかの断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ＳＣＦｖ）として存在する。インタクトな免疫グロブリン、ならびに、当技術分野で周知のそれらのバリアントおよび部分、例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）などが含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域をリンカーによって結合させた融合タンパク質であり、一方、ｄｓＦｖは、鎖の会合を安定化するために、ジスルフィド結合が導入されるように鎖を変異させたものである。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの、遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  ＣａｔａｌｏｇおよびＨａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。
【００７１】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合物からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。これらの融合された細胞およびそれらの子孫は、「ハイブリドーマ」と称される。モノクローナル抗体としては、ヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。一部の例では、モノクローナル抗体は、被験体から単離される。そのような単離されたモノクローナル抗体のアミノ酸配列は、決定され得る。
【００７２】
「ポリクローナル抗体」は、体内の異なるＢ細胞系列によって分泌される抗体である（一方、モノクローナル抗体は、単一の細胞系列に由来する）。これは、各々が異なるエピトープを同定する、特異的抗原に対して反応する免疫グロブリン分子の収集物を含む。
【００７３】
抗原：動物中に注射または吸収されるポリペプチドを含む、動物における抗体の産生およびＴ細胞応答を刺激し得るポリペプチド。抗原は、開示される抗原などの異種抗原によって誘導されるものを含む、特異的体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原の領域を指す。エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に際して保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理に際して失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的コンフォメーションにある少なくとも３、より通常は少なくとも５、約９または約８〜１０アミノ酸を含む。
【００７４】
自己免疫障害：自己免疫疾患は、人の免疫系が自身の細胞、組織および／または器官に対する不適切な応答を生じ、炎症および損傷を結果として生じる広範な関連疾患である。８０を超える異なる自己免疫疾患が存在する。一部の自己免疫疾患は、体の１つの部分が主に罹患し（例えば、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺疾患および１型糖尿病）、他の自己免疫疾患は、体の多くの部分が罹患し得る（例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性血管炎およびシェーグレン症候群）。
【００７５】
細菌性角膜炎：疼痛、視力の低減、光感受性、および眼からの流涙または眼脂を引き起こす、角膜（すなわち、眼の虹彩および瞳孔を覆う透明な丸いドーム）の細菌感染によって引き起こされる角膜炎。細菌性角膜炎は、コンタクトレンズ使用または眼への傷害によって引き起こされる感染から生じる場合が多く、通常は、非常に迅速に発達し、未処置のままにすると失明を引き起こし得る。表層角膜炎には、角膜の最上部層が関与する。この形態の角膜炎が治癒すると、角膜上には通常瘢痕は存在しない。深層角膜炎は、より深い角膜層に影響を及ぼす。治癒後に瘢痕が残り得るが、これは、瘢痕がどこに位置するかに依存して、視力に影響する場合もしない場合もある。角膜炎は、アカントアメーバ、真菌およびウイルス感染によっても引き起こされ得る。
【００７６】
慢性状態：持続性のもしくはその影響が他の方法で長期持続するヒトの健康状態もしくは疾患、または時間と共に現れる疾患。慢性という用語は、疾患の過程が３カ月よりも長く持続する場合に適用する場合が多い。一般的な慢性疾患としては、シェーグレン症候群などの自己免疫疾患が挙げられる。
【００７７】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）：それらの生化学特性および酵素特性について広く研究されたいくつかの細菌コラゲナーゼのうちの１つ。これは、三重らせんＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラーゲンを生理的条件下で単純なペプチドへと消化することができるメタロプロテイナーゼである。配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、ＣｏｌＨの例示的なヌクレオチドおよびタンパク質配列を提供する、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号Ｄ２９９８１．１およびＢＡＡ０６２５１．１）；他の例は、本明細書で入手可能である（例えば、配列番号３）。
【００７８】
コラーゲン：動物の体中の種々の結合組織中の細胞外空間中の主要な構造タンパク質。結合組織の主要構成成分として、これは、全身タンパク質含量の２５％〜３５％を構成する、哺乳動物において最も豊富なタンパク質である。鉱化作用の程度に依存して、コラーゲン組織は、剛性（骨）、柔軟（腱）であり得、または剛性から柔軟までの勾配を有し得る（軟骨）。コラーゲンは、伸長した原線維の形態で、線維組織、例えば、腱、靱帯および皮膚において主に見いだされる。これは、角膜、軟骨、骨、血管、腸、椎間板、および歯の象牙質中にも豊富である。筋肉組織では、これは、筋内膜の主要構成成分として機能する。コラーゲンは、筋肉組織の１〜２パーセントを構成し、強い腱筋肉の重量の６％を占める。線維芽細胞は、コラーゲンを創出する最も一般的な細胞である。２８の型のコラーゲンが同定されている。コラーゲンとしては、線維状（Ｉ、ＩＩ、ＩＩ、Ｖ、ＸＩ型）および非線維状コラーゲンが挙げられる。
【００７９】
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）：タチナタマメＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のレクチン（炭水化物結合タンパク質）。これは、内部および非還元性末端α−Ｄ−マンノシルおよびα−Ｄ−グルコシル基に主に結合する。ＣｏｎＡは、多くの細胞型の表面に結合し、細胞の表面上の糖タンパク質および他の糖含有分子を特徴付けるために、生物学および生化学において広く使用されている。これは、アフィニティークロマトグラフィーによって糖タンパク質を精製するためにも使用される。ＣｏｎＡ配列は、公的に入手可能である。２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＬ０９４３２．１およびＡＦ３０８７７７．１は、それぞれ、例示的なタチナタマメＣｏｎＡタンパク質およびヌクレオチド配列を提供する。他の例は、本明細書で入手可能である（例えば、配列番号６）。
【００８０】
接触：固体形態および液体形態の両方を含む、直接的な物理的会合状態にある配置。接触としては、１つの分子と別の分子との間の接触、例えば、別のポリペプチドと接触する、治療的ペプチドなどの１つのポリペプチドの表面上のアミノ酸が挙げられる。接触としては、例えば、ペプチドを細胞と直接的な物理的会合状態に置くことによる、細胞との接触も挙げられ得る。
【００８１】
対照：参照標準。一部の実施形態では、対照は、健康な患者から得られた試料である。他の実施形態では、対照は、眼障害と診断された患者から得られた組織試料である。なお他の実施形態では、対照は、歴史的対照または標準参照値もしくは値の範囲（例えば、既知の予後もしくは転帰を有する以前に試験された対照試料、またはベースラインもしくは正常値を示す試料の群）である。試験試料および対照において測定したパラメータの値の間の差異は、増加または減少であり得る。この差異は、質的差異または量的差異、例えば、統計的有意差であり得る。一部の例では、差異は、対照と比較して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または５００％より大きな増加または減少である。
【００８２】
結膜：眼瞼の内側表面を被覆する（すなわち、眼瞼結膜）、および眼の外側表面（すなわち、眼球または球結膜）を被覆する、薄い透明な湿った膜。結膜は、眼瞼の内側を覆っており、強膜（すなわち、眼の白い部分）を覆う；これは、杯細胞および重層円柱上皮と共に、非角化重層円柱上皮から構成される。結膜は、画像化研究のために容易にアクセス可能な多くの微小血管によって高度に血管新生される。結膜は、涙の体積は涙腺よりも少ないものの、粘液および涙を産生することによって眼を潤滑にすることを助ける。これは、免疫監視にも寄与し、微生物が眼に入るのを防止する助けになる。
【００８３】
角膜疾患：角膜の感染、変性、および遺伝の結果として大部分が生じ得る多くの他の障害を含む、角膜が主に罹患する種々の状態。角膜は、眼の透明な保護的外層である。これは、眼の繊細な構成成分を害し得る汚れ、微生物および他の粒子に対する関門として機能する。「角膜」は、太陽の紫外線光の一部をフィルターして除去することも可能であり、視力において重要な役割を果たす。光は、眼に入る際に、角膜の外部形状によって屈折、すなわち、曲げられる。この外層の湾曲は、眼が物体に近寄っておよび物体から離れて焦点を合わせることがどのくらい良くできるかを決定する助けになる。眼の角膜が疾患、感染または傷害を介して損傷されると、生じた瘢痕は、眼に入る際に光を遮断するまたは歪めることによって、視力を妨害し得る。
【００８４】
角膜混濁：角膜の濁ったまたは不透明な外観（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１４３，３１５号および米国特許出願公開第２００３／０１５３５２４号を参照されたい）。眼のこの部分は、疾患、感染または傷害を介して損傷され得、生じた瘢痕は、眼に入る際に光を遮断するまたは歪めることによって、視力を妨害し得る。角膜は通常透明であり、したがって、角膜混濁は、視力を大きく損ない得る。混濁は角膜のいずれの部分でも生じ得るが、実質と称される角膜のより厚い中間層内で見いだされる場合が最も多い。角膜混濁は、視力を、ぼやけた、焦点の合わないまたは不明瞭なものにし得る。これにより、特に夜間または暗中で、光の周りのハローが眼に見えるようにもなり得る。角膜混濁は、外傷、感染または外科手術を受けた後に出現する場合が最も多い。これは通常、眼の内側で活性化される炎症細胞によって引き起こされる。角膜混濁は、レーザー視力矯正手順の間にも時折生じる。
【００８５】
角膜瘢痕：角膜に対する傷害（擦過傷、裂傷、熱傷または感染）によって引き起こされる瘢痕；瘢痕の程度に依存して、視力は、ぼやけから全盲までの範囲であり得る（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１４３，３１５号および米国特許出願公開第２００３／０１５３５２４号を参照されたい）。非常に痛くはあるが、表面擦過傷は、透明に治癒し、瘢痕を残さない。より深い擦過傷および潰瘍化／裂傷は、角膜組織の喪失を生じ、これは瘢痕組織によって置き換えられる。熱傷由来の瘢痕は、熱傷の型および深さに依存する；沸騰水またはヘアアイロンは、表層瘢痕を残し、酸またはアルカリは、即座に中和しない限り、より深い損傷を引き起こす。疾患（通常は炎症）由来の瘢痕は、典型的には、治癒プロセスを補助するための、透明な角膜中への新たな血管の増殖の結果である。
【００８６】
サイトカイン：細胞シグナル伝達において重要な小さいタンパク質（およそ５〜２０ｋＤａ）の広いカテゴリー。それらの放出は、それらの周囲の細胞の挙動に対して影響を有する。サイトカインは、免疫調節剤として、自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子が挙げられるが、一般には、ホルモンでも増殖因子でもない。サイトカインは、免疫細胞、例えば、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および種々の間質細胞を含む広範な細胞によって産生される；所与のサイトカインは、１つよりも多くの型の細胞によって産生され得る。サイトカインは、健康および疾患において、特に、感染に対する宿主応答、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、がんおよび生殖において重要である。これらは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である；サイトカインは、体液性免疫応答と細胞に基づく免疫応答との間のバランスをモジュレートし、特定の細胞集団の成熟化、成長および応答性を調節する。サイトカインとしてはインターロイキンが挙げられる。
【００８７】
欠損した神経支配：涙腺の交感神経性もしくは副交感神経性の感覚神経支配または眼表面の感覚神経支配のいずれかが機能障害性である場合。眼の欠損した神経支配は、炎症、外傷または外科手術から生じ得る。
【００８８】
糖尿病網膜症：糖尿病性眼疾患としても公知の、糖尿病に起因して網膜に損傷が生じる場合；これは、最終的に失明をもたらし得る。糖尿病網膜症は、２０年またはそれよりも長きにわたって糖尿病を有してきた全ての患者の最大で８０パーセントが罹患する、糖尿病の眼症状発現である。しかし、新たな症例の少なくとも９０％は、眼の適切で注意深い処置およびモニタリングによって低減され得る。人がより長く糖尿病を有するほど、その人が糖尿病網膜症を発生させる確率はより高くなり、糖尿病網膜症は、２０〜６４歳の人についての失明の主な原因である。
【００８９】
ドメイン：タンパク質のドメインは、共通の構造的、生理化学的および機能的特徴、例えば、疎水性、極性、球状、らせん状のドメインまたは特性を共有するタンパク質の一部である（例えば、コラーゲン結合、炭水化物結合またはヘパラン硫酸結合ドメイン）。ドメインはまた、特定の酵素活性または特徴を有する機能的ドメイン、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体に結合するプロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬのドメインであり得る。
【００９０】
ドライアイ：眼が十分な涙を産生しない場合、または涙があまりに急速に蒸発する場合のいずれかに生じる状態。これは、マイボーム腺機能不全、アレルギー、妊娠、シェーグレン症候群、ビタミンＡ欠乏、ＬＡＳＩＫ外科手術、ある特定の薬物療法（例えば、抗ヒスタミン薬）、ある特定の血圧薬物療法、ホルモン補充療法、および抗うつ薬から生じ得る。例えば、タバコ煙曝露または感染由来の慢性結膜炎もまた、ドライアイをもたらし得る。診断は、症状、涙分泌の評価、および／または眼表面の染色に基づく。
【００９１】
ドライアイ疾患（ＤＥＤ）：眼表面への潜在的な損傷と共に不快感、視覚障害および涙液膜不安定性を生じる、涙および眼表面の多因子性疾患である、ドライアイ症候群（ＤＥＳ）、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）および乾性角膜炎（ｋｅｒａｔｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）としても公知の状態。ドライアイ症候群は、眼表面疾患（ＯＳＤ）の一般的な形態であり、ＯＳＤの他の原因、例えば、眼アレルギーおよびマイボーム腺機能不全（ＭＧＤ）と重複する場合がある。ドライアイ症候群としては、複数の状態、例えば、乾性角結膜炎、シェーグレン症候群、角膜傷害、加齢性ドライアイ、スティーブンス・ジョンソン症候群、先天性無涙液症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｌａｃｈｒｉｍａ）、薬物（１種または複数）の副作用、感染、ライリー・デイ症候群、結膜線維症（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、眼のストレス、腺および組織の破壊、眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃａｌ  ｐｅｍｐｈｏｇｏｉｄ）、眼瞼炎、自己免疫性および他の免疫不全障害、アレルギー、糖尿病、涙腺欠損症、ループス、パーキンソン病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、酒さ、過剰に乾燥した空気への環境曝露、浮遊微小粒子、煙、スモッグ、ならびにまばたきできないことによって引き起こされる症状が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０２８１７３９号を参照されたい）。ＤＥＤの症状としては、灼熱感、眼の痒み、疼痛感覚（ａｃｈｉｎｇ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）、重い瞼（ｈｅａｖｙ  ｅｙｅ）、眼の疲れ、ただれ眼（ｓｏｒｅ  ｅｙｅ）、乾燥感、眼の充血、羞明（光感受性）、ぼやけた視力、異物感（すなわち、砂粒または一部の他の物体もしくは物質が眼の中にある感覚）および涙目が挙げられる。
【００９２】
上皮：上皮組織は、体中の血管および器官の腔および表面を覆っている。これらの組織は、扁平、円柱状もしくは立方状のいずれかの単純な上皮としての細胞の単層、または扁平、円柱状もしくは立方状のいずれかの重層化（層状）上皮としての２つもしくはそれを超える深さの細胞の層で、配置され得る。全ての腺は、上皮細胞で構成される。上皮細胞の機能としては、分泌、選択的吸収、保護、経細胞輸送および感知が挙げられる。上皮層は血管を含まない；したがって、これらは、根底にある結合組織からの基底膜を介した物質の拡散を介して栄養物を受け取らなければならない。
【００９３】
「角膜上皮」は、上皮組織で構成され、角膜の前面を覆う。これは、角膜を保護するための関門として作用して、涙からの流体の自由な流れに対抗し、細菌が上皮および角膜実質に入るのを防止する。
【００９４】
発現：タンパク質への核酸の翻訳。タンパク質は、発現されてび細胞内にとどまり得、細胞表面膜の構成成分になり得、または細胞外マトリクスもしくは培地中に分泌され得る。
【００９５】
発現制御配列：作動可能に連結した異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写を制御および調節し、必要に応じて核酸配列の翻訳を制御および調節する場合、核酸配列に作動可能に連結している。したがって、発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しい読み枠の維持、および終止コドンが挙げられ得る。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に影響し得る構成成分を含み、その存在が有利である追加の構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列もまた含み得ることが意図される。発現制御配列としては、プロモーターが挙げられ得る。
【００９６】
プロモーターは、転写を導くのに十分な最小配列である。プロモーター依存性遺伝子発現を、細胞型特異性もしくは組織特異性のために制御可能なものにするのに十分である、または外部シグナルもしくは薬剤によって誘導性であるプロモーターエレメントもまた含まれる；そのようなエレメントは、遺伝子の５’または３’領域中に位置し得る。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年を参照されたい）。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生されるプロモーターもまた、核酸配列の転写を提供するために使用され得る。
【００９７】
発現ベクター：発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【００９８】
発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系中で供給され得る。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを取り込む当該分野で公知の全てのもの、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソーム中に含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【００９９】
眼障害：眼の機能または構造における任意の混乱、欠損または異常、例えば、角膜混濁および瘢痕、ドライアイ疾患、または眼炎症。眼障害は、先天性、遺伝性、または外傷、例えば傷害、病気、炎症、自己免疫疾患、感染（例えば、アカントアメーバ、ウイルス、細菌または真菌感染）、異物、紫外線光曝露、コンタクトレンズの過剰装着もしくは薬物の結果であり得る。
【０１００】
融合タンパク質：通常は一緒に共有結合されない２つ（またはそれよりも多くの）別個の異種ポリペプチドから構成された複合タンパク質。したがって、融合タンパク質は、２つの完全に別個のアミノ酸配列または２つの類似もしくは同一のポリペプチド配列を含有する単一のアミノ酸配列を含み得るが、ただし、これらの配列が、天然に見いだされる単一のアミノ酸配列中では同じ構成で通常は一緒に見いだされないことを条件とする。融合タンパク質は一般に、組換え核酸を使用して、または当該分野で周知の化学合成方法（すなわち、化学的コンジュゲーション）によって、調製され得る。融合タンパク質は、アンカードメインおよび治療的ポリペプチド、ならびに任意選択で、アンカードメインと治療的ポリペプチドとの間のリンカーを含み得る。
【０１０１】
緑内障：視神経への損傷および視力喪失を生じる一群の眼疾患。最も一般的な型は、疼痛を伴わずに時間をわたりゆっくりと発達する開放隅角緑内障である。側方視野が減少し始め、次に中心視野が減少し、処置しない場合には失明を生じ得る。あまり一般的でない形態の閉塞隅角緑内障は、徐々にまたは突然に提示され得る；突然の提示は、重症の眼の疼痛、ぼやけた視力、中度に散大した瞳孔、眼の充血および悪心を含み得る。緑内障による視力喪失は、一旦生じると、恒久的である。
【０１０２】
グリコカリックス：グリコカリックスは、ある特定の細菌、上皮および他の細胞の細胞膜を取り囲む糖タンパク質−多糖被覆である。ほとんどの動物上皮細胞は、それらの原形質膜の外部表面上に綿毛様外被を有する。この外被は、支持のための骨格分子として機能する膜糖脂質および糖タンパク質のいくつかの炭水化物部分からなる。一般に、原形質膜の表面上で見いだされる糖脂質の炭水化物部分は、これらの分子が細胞−細胞認識、連絡および細胞間接着に寄与するのを助ける。
【０１０３】
ヘパリン：抗凝固薬として広範に使用される、肥満細胞中に存在する多糖（Ｏｄｕａｈ，  Ｅ．Ｉ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、９巻、３８頁；ｄｏｉ：１０．３３９０、２０１６年）。これは、ヘパラン硫酸と構造的に非常に類似しており、ＨＳドメインは、高い親和性で、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に結合する。
【０１０４】
ヘパラン硫酸（ＨＳ）：２つまたは３つのＨＳ鎖が細胞表面または細胞外マトリクスタンパク質に非常に近接して結合したプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）として存在する、全ての動物組織において見いだされる直鎖多糖。この形態で、ＨＳは、種々のタンパク質リガンドに結合し、発生プロセス、血管新生、血液凝固、ＧｒＢ（グランザイムＢ）による脱離活性の消失、および腫瘍転移を含む、多種多様な種々の生物学的活性を調節する。ヘパラン硫酸は、いくつかのウイルスに対する細胞受容体でもある。これは、ヘパリンと構造的に非常に類似している。
【０１０５】
免疫グロブリン：抗体活性を示し、高い程度の特異性で他の分子と結合する、血漿および他の体液中で見いだされるタンパク質のクラス；免疫グロブリンは、構造および生物学的活性に基づいて、５つのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に分けられる。免疫グロブリンおよびそのある特定のバリアントは、公知であり、多くが、組換え細胞培養物中で調製されてきた（例えば、米国特許第４，７４５，０５５号；米国特許第４，４４４，４８７号；ＷＯ８８／０３５６５；ＥＰ２５６，６５４；ＥＰ１２０，６９４；ＥＰ１２５，０２３；Ｆａｏｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６，  １９８２；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３：７９３，  １９７９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２３９，  １９８４を参照のこと。これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０６】
天然に存在する免疫グロブリンは、４つのポリペプチド鎖から構成される。約５０キロダルトンと７５キロダルトンとの間の重さの「重」鎖または「Ｈ」鎖と称される２つの長い鎖、および約２５キロダルトンの重さの「軽」鎖または「Ｌ」鎖と称される２つの短い鎖が存在する。これらの鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に連結されて、「Ｙ」型分子を形成する。各重鎖および軽鎖は、可変領域および定常領域へと分割され得る。Ｆｃ領域は、重鎖および軽鎖の定常領域を含むが、可変領域は含まない。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合する受容体である。
【０１０７】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）：ＩＦＮＧ、ＩＦＧおよびＩＦＮ免疫（ＩＦＩ；例えば、ＯＭＩＭ  １４７５７０）としても公知。ＩＦＮγは、ＩＦＮγ受容体（ＩＦＮγＲ）に結合するサイトカインであり、抗ウイルス、抗細菌および抗原生動物活性を示す。ＩＦＮγは、Ｔ細胞などの白血球によって主に発現され、ＩＦＮγの異常な発現は、種々の自己炎症性および自己免疫疾患に関与している。ＩＦＮγの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＡＡＢ５９５３４．１およびＮＭ＿０００６１９．２）。
【０１０８】
インターロイキン１−ベータ（ＩＬ−１β）：ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１−ベータ、白血球性発熱物質、白血球内因性メディエーター、単核細胞因子およびリンパ球活性化因子（例えば、ＯＭＩＭ  １４７７２０）としても公知。ＩＬ−１βは、活性化されたマクロファージによって産生されるサイトカインであり、炎症応答の重要なメディエーターである。ＩＬ−１βは、細胞の増殖、分化およびアポトーシスを含む種々の細胞活性に関与する。ＩＬ−１βの増加した産生および／または活性は、複数の自己炎症性症候群を引き起こし、がんおよび結核に対する感受性と関連している。ＩＬ−１βの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＮＰ＿０００５６７．１およびＮＭ＿０００５７６．２）。
【０１０９】
インターロイキン（ＩＬ）−１受容体アンタゴニスト（Ｒａ）：ＩＬ−１サイトカインファミリーのメンバー。ＩＬ−１Ｒａは、免疫細胞、上皮細胞および脂肪細胞を含む種々の型の細胞によって分泌され、ＩＬ１βの炎症促進効果の天然の阻害剤である。このタンパク質は、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）およびインターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）の活性を阻害し、種々のインターロイキン１関連免疫および炎症応答をモジュレートする。ＩＬ−１Ｒａの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１８日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＣＡＡ３６２６２．１およびＡＪ００５８３５．１）。
【０１１０】
インターロイキン６（ＩＬ−６）：インターフェロンベータ−２；ＩＦＮＢ２、Ｂ細胞分化因子、Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）、肝細胞刺激因子（ＨＳＦ）およびハイブリドーマ増殖因子（ＨＧＦ；例えば、ＯＭＩＭ  １４７６２０）としても公知。ＩＬ−６は、炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性マイオカインの両方として作用するインターロイキンである。ＩＬ−６は、Ｔ細胞およびマクロファージによって分泌されて、免疫応答を刺激し（例えば、感染の間、および外傷、特に、熱傷、または炎症をもたらす他の組織損傷の後）、種々の疾患の炎症および自己免疫プロセスに関与している。ＩＬ−６の例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号Ｐ０５２３１．１およびＮＭ＿００１３１８０９５．１）。
【０１１１】
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）：ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ；例えば、ＯＭＩＭ  １２４０９２）としても公知。ＩＬ−１０は、抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−１０は、２つのＩＬ−１０受容体−１および２つのＩＬ−１０受容体２タンパク質からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。炎症性疾患などの複数の疾患状態は、低レベルのＩＬ−１０と関連するが、ＩＬ−１０は主に、生理的状況に依存して、免疫抑制効果を有するが、免疫賦活効果もまた有し得ることが示されている。配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、ＷＧＡの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列を提供する、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＡＡＩ０４２５３．１およびＮＭ＿０００５７２．２）。当業者は、ＩＬ−１０の生物学的活性（例えば、抗炎症活性）を保持するＩＬ−１０バリアントを含む、追加のＩＬ−１０の核酸およびタンパク質配列を同定できる。
【０１１２】
炎症：有害な刺激、例えば、病原体、損傷細胞または刺激物に対する体の組織の複雑な生物学的応答。炎症は、免疫細胞、血管および分子メディエーターが関与する防御応答である。炎症の機能は、細胞傷害の初期原因を排除し、元の傷害および炎症プロセスから損傷を受けた壊死細胞および組織を取り除き、組織修復を開始させることである。
【０１１３】
急性炎症の古典的な徴候は、体熱、疼痛、潮紅、腫脹（熱、痛み、発赤および腫れ）、および機能の喪失である。炎症は、包括的な応答であり、したがって、各病原体に対して特異的な獲得免疫とは対照的に、自然免疫の機構とみなされる。「慢性炎症」として公知の長期にわたる炎症は、単核細胞などの炎症の部位に存在する細胞の型における進行性のシフトをもたらし、炎症プロセス由来の組織の同時の破壊および治癒を特徴とする。
【０１１４】
「眼炎症」は、眼の炎症である。眼の慢性炎症は、眼表面の完全性の喪失をもたらし得、これには、視覚を脅かす結果、例えば、角化、瘢痕、潰瘍化および感染がさらに合併し得る。眼炎症は、感染（例えば、細菌、真菌、ウイルスまたは寄生生物感染、例えば、眼瞼炎、霰粒腫、結膜炎、涙嚢炎、虹彩炎、角膜炎、眼窩周囲蜂巣炎、強膜炎、副鼻腔炎、およびものもらいまたは麦粒腫（ｂｏｒｄｅｏｌｕｍ））、アレルギー（例えば、慢性または急性アレルギーを含む、薬物アレルギー、食物アレルギー、枯草熱またはアレルゲンに対するアレルギー反応、および昆虫咬傷アレルギー）、自己免疫障害（例えば、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、皮膚筋炎、グレーブス病、若年性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬性関節炎、ライター症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスおよびウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  ｇｒａｎｕｌａｔｏｍａｔｏｓｉｓ））、移植片対宿主病、ドライアイ症候群、角膜縁幹細胞不全、刺激、ならびに例えば、鈍的外傷、角膜擦過傷または潰瘍、外来の物体または物質、血腫、昆虫咬傷または刺傷、刺激物および眼窩骨折（ｏｒｂｉｔａｌ  ｂｏｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）に起因する、眼または眼瞼への傷害または外傷を含むいくつかの状態によって引き起こされ得る（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３３６５５７号を参照されたい）。眼の炎症の症状は、一方または両方の眼において生じ得、根底にある状態の型および重症度に依存して、数分間から数年間にわたり得る。眼炎症の症状としては、掻痒、過剰な涙産生、眼脂、疼痛、発赤、腫脹、流涙、および／または異常な温熱感もしくは熱が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３３６５５７号を参照されたい）。
【０１１５】
疾患を阻害または処置すること：例えば、角膜混濁もしくは瘢痕、ドライアイ疾患、または眼炎症などの疾患のリスクがある被験体における、疾患または状態の完全な発生を阻害すること。「処置」は、疾患または病的な状態の徴候または症状を、それが発生し始めた後に好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）治療介入を指す。疾患または病的な状態に関して、「好転させる」という用語は、処置の任意の観察可能な有益な効果を指す。この有益な効果は、例えば、感受性の被験体における疾患の臨床症状の発症の遅延によって、疾患の臨床症状の一部もしくは全部の重症度の低下によって、より遅い疾患の進行によって、被験体の全体的な健康もしくは幸福の改善によって、または特定の疾患に特異的な当技術分野で周知の他のパラメータによって証明することができる。「予防的」処置は、病理を発生させるリスクを減少させることを目的として、疾患の徴候を示さないまたは早期の徴候のみを示す被験体に投与される処置である。
【０１１６】
単離された：「単離された」生物学的構成成分は、当該構成成分が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的構成成分、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡならびにタンパク質から実質的に分離されたもの、それらとは別に産生されたもの、またはそれらから精製されたものである。したがって、「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質とは、標準の精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【０１１７】
ジャカリン（Ｊａｃ）：強力なＴ細胞マイトジェン、および免疫グロブリンの分泌のためのヒトＢ細胞の見かけ上Ｔ細胞には依存しないアクチベーターの両方である、ジャックフルーツ種子由来のレクチン。ジャカリンは、Ｄ−Ｇａｌ結合性レクチンであり、ジャカリン様レクチンドメインを含有するガラクトース結合性レクチンのファミリーに属する。このレクチンは、ノイラミニダーゼ処理後に血液型非特異的であり、ヒト赤血球を凝集させる。ジャカリンの翻訳後タンパク質分解的修飾は、ａ−鎖のＮ末端が関与する新規の炭水化物結合部位を生じる。Ｊａｃ配列は、公的に入手可能である。２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＡ３２６８０．１およびＬ０３７９８．１は、それぞれ、例示的なジャックフルーツＪａｃタンパク質およびヌクレオチド配列を提供する。
【０１１８】
レクチン：レクチンは、糖部分に対して高度に特異的であり、天然に遍在的に存在する巨大分子である、炭水化物結合タンパク質である。ほとんどのレクチンは酵素活性を有さないが、可溶性炭水化物、または糖タンパク質もしくは糖脂質の一部である炭水化物部分に結合し得る。これらは、典型的には、ある特定の動物細胞を凝集させるおよび／または複合糖質を沈殿させる。例示的なレクチンとしては、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）およびジャカリン（Ｊａｃ）が挙げられる。
【０１１９】
角化：哺乳動物表皮の最外層の細胞の細胞質がケラチンによって置き換えられるプロセス。
【０１２０】
角膜炎：角膜の炎症。
【０１２１】
核酸：ホスホジエステル結合によって連結した、ヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造バリアント、および合成の天然に存在しないその類似体）で構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造バリアント、ならびに合成の天然に存在しないその類似体。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されている場合、これは、「Ｕ」で「Ｔ」が置き換えられるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されよう。
【０１２２】
本明細書では、ヌクレオチド配列を記載するために従来の表示法が使用されている：一本鎖のヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり、二本鎖ヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物に対するヌクレオチドの５’から３’への付加方向は、転写方向と称される。
【０１２３】
さらに、「コードする」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列の、生物学的プロセスにおけるヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義された配列またはアミノ酸の定義された配列のいずれかおよびそれから生じる生物学的性質を有する他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する固有の性質を指す。したがって、遺伝子により産生されるｍＲＮＡの転写および翻訳によって細胞または他の生物系においてタンパク質が産生される場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表に提示されるヌクレオチド配列であるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」とは、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【０１２４】
眼表面：角膜、結膜、およびそれらに接続する涙管、ならびに眼瞼を含む、眼の表面。
【０１２５】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、当該プロモーターは、当該コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、必要であれば、２つのタンパク質コード領域が同じ読み枠内で接合している。
【０１２６】
薬学的に許容される担体：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に公知の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性物質、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、染料などの材料およびそれらの組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１２８９〜１３２９頁、１９９０年を参照されたい）。任意の従来の担体が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物または医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１２７】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に左右される。例えば、投与は、局所的であり得る。局所的形式の投与としては、局部適用、例えば点眼薬、または眼への投与のために製剤化された任意の他の医薬剤形が挙げられる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
【０１２８】
医薬品：被験体または細胞に適正に投与された場合に所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学化合物、生物製剤または組成物。
【０１２９】
ポリペプチド：３つまたはそれよりも多くの共有結合したアミノ酸。この用語は、タンパク質、タンパク質断片およびタンパク質ドメインを包含する。「コラーゲン結合」ポリペプチドは、コラーゲンに特異的に結合する能力を有するポリペプチドである。
【０１３０】
「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質、ならびに組換え的にまたは合成的に産生されるタンパク質を網羅することを具体的に意図される。「ポリペプチドの機能的な断片」という用語は、ポリペプチドの活性を保持するポリペプチドの全ての断片を指す。生物学的に機能的な断片は、例えば、抗体分子に結合することができるエピトープほどの小さいポリペプチド断片から、細胞内の表現型変化の特徴的誘導またはプログラミングに関与することができる大きいポリペプチドまで、サイズが変動し得る。
【０１３１】
保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能、例えば、タンパク質がその標的に結合する能力および／または被験体に投与した場合にタンパク質が治療効果を発揮する能力に実質的に影響を与えることもそれを減少させることもない置換である。保存的バリエーションという用語は、未置換の親アミノ酸の代わりの、置換されたアミノ酸の使用もまた含む。さらに、コードされた配列中の単一のアミノ酸または小さい百分率のアミノ酸（例えば、５％未満、一部の実施形態では１％未満）を変化、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、これらの変化が、１つのアミノ酸の、化学的に類似のアミノ酸による置換を生じる場合、保存的バリエーションである。
【０１３２】
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１３３】
非保存的置換は、タンパク質の活性または機能、例えば、被験体に投与した場合に相乗的応答を誘導する能力を低減させる置換である。例えば、アミノ酸残基がタンパク質の機能にとって必須である場合、他の場合には保存的である置換であっても、その活性を破壊し得る。したがって、保存的置換は、目的のタンパク質の基本的機能を変化させない。
【０１３４】
プロテインＡは、任意の形態のプロテインＡポリペプチド、または免疫グロブリン結合活性を保持するそのバリエーションを指す。例えば、プロテインＡは、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの細胞壁中で元々見いだされた４２ｋＤａの表面タンパク質、および／またはプロテインＡもしくはそのバリアントを含む組換えタンパク質であり得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡは、ｓｐａ遺伝子によってコードされ、３ヘリックス束へとフォールディングされる５つの相同なＩｇ結合ドメインから構成され、その各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、最も著しくは免疫グロブリンＧに結合できる。プロテインＡは、免疫グロブリンに結合できるので、生化学的研究において使用される；プロテインＡは、ほとんどの免疫グロブリンのＦｃ領域内およびヒトＶＨ３ファミリーのＦａｂ領域内の重鎖に結合する。配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、プロテインＡの例示的なヌクレオチドおよびタンパク質配列を提供する、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により組み込まれる、受託番号Ｘ６１３０７．１およびＡＡＢ０５７４３．１）；他の例は、本明細書で入手可能である（例えば、配列番号９）。
【０１３５】
プロテインＧは、任意の形態のプロテインＧポリペプチド、または免疫グロブリン結合活性を保持するそのバリエーションを指す。例えば、プロテインＧは、プロテインＡと同様に、相同であるが異なる結合特異性を有する複数のＩｇ結合ドメインを有する、Ｃ群およびＧ群の連鎖球菌細菌において発現される免疫グロブリン結合タンパク質、および／またはプロテインＡもしくはそのバリアントを含む組換えタンパク質であり得る。プロテインＧは、ＦａｂおよびＦｃ領域へのその結合を介して抗体を精製するために使用され得る６５ｋＤａ（Ｇ１４８プロテインＧ）および５８ｋＤａ（Ｃ４０プロテインＧ）の細胞表面タンパク質であり得る。配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、プロテインＡの例示的なヌクレオチドおよびタンパク質配列を提供する、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により組み込まれる、受託番号Ｙ００４２８．１およびＣＡＡ３７４１０．１）；他の例は、本明細書で入手可能である（例えば、配列番号１０）。
【０１３６】
プロテインＬは、任意の形態のプロテインＬポリペプチド、または免疫グロブリン結合活性を保持するそのバリエーションを指す。例えば、プロテインＬは、カッパ軽鎖に結合する４つもしくは５つのＩｇ結合ドメインを含有する、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ単離体のおよそ１０％の表面で発現される抗体結合タンパク質、および／またはプロテインＡもしくはそのバリアントを含む組換えタンパク質であり得る。配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、プロテインＡの例示的なヌクレオチドおよびタンパク質配列を提供する、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により組み込まれる、受託番号Ｌ０４４６６．１およびＡＡＡ６７５０３．１）。
【０１３７】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたタンパク質調製物は、言及されたタンパク質が、細胞内のその天然の環境中にあるタンパク質よりも純粋である調製物である。例えば、タンパク質の調製物は、そのタンパク質が調製物の総タンパク質含量の少なくとも５０％を示すように精製される。同様に、精製されたオリゴヌクレオチド調製物は、そのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの複雑な混合物を含む環境中よりも純粋である調製物である。核酸またはタンパク質の精製された集団は、それぞれ、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも高く、もしくは１００％純粋である、または他の核酸もしくはタンパク質を含まない。
【０１３８】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有する核酸、または他の方法で分離された配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する核酸である。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、またはより一般的には、例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、達成され得る。組換えタンパク質は、細菌または真核生物細胞などの宿主細胞中に導入された異種（例えば、組換え）核酸によってコードされるタンパク質である。核酸は、例えば、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現させることができるシグナルを有する発現ベクター上で導入され得、または核酸は、宿主細胞染色体中に統合され得る。
【０１３９】
配列同一性：アミノ酸配列または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性に関連して表現され、他に配列同一性とも称される。配列同一性は、百分率同一性（または類似性もしくは相同性）に関連して頻繁に測定される；百分率が高くなるほど、２つの配列はより類似である。ポリペプチドのホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合、比較的高い程度の配列同一性を有する。
【０１４０】
比較のために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムがＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２，  １９８１；  ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３，  １９７０；  ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：２４４４，  １９８８；  ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ，  ７３：２３７，  １９８８；  ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ，  ５：１５１，  １９８９；  Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １６：１０８８１，  １９８８；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：２４４４，  １９８８に記載される。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  ６：１１９，  １９９４は配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提供する。
【０１４１】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３頁、１９９０年）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連した使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法についての記載は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
【０１４２】
ポリペプチドのホモログおよびバリアントは、典型的には、デフォルトパラメータに設定したＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、ギャップ付きｂｌａｓｔｐを使用して、要素のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数される、少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸よりも大きいアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数が、デフォルトパラメータ（１１のギャップ存在コスト（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｃｏｓｔ）および１の残基当たりギャップコスト（ｐｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔ））に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して採用される。短いペプチド（およそ３０アミノ酸よりも小さい）をアラインメントする場合、このアラインメントは、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１のペナルティ）に設定したＰＡＭ３０マトリクスを採用し、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を使用して実施すべきである。参照配列に対するさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、百分率同一性の増加、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す。配列全体未満が配列同一性について比較される場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０〜２０アミノ酸の短いウインドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に依存して、少なくとも８５％または少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有し得る。そのような短いウインドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。当業者は、これらの配列同一性範囲が、ガイダンスのために提供されるにすぎないことを理解する；提供された範囲の外側に入る強く顕著なホモログを取得し得ることが、完全に可能である。
【０１４３】
シェーグレン症候群：唾液および涙を産生する外分泌腺を免疫細胞が攻撃および破壊する全身性自己免疫疾患。この障害の特質的症状は、口内乾燥症（口内乾燥）および眼球乾燥症（乾性結膜炎、ドライアイ）である。シェーグレン症候群は、皮膚、鼻および腟の乾燥も引き起こし得、腎臓、血管、肺、肝臓、膵臓および脳を含む体の他の器官が罹患し得る。シェーグレン症候群は、女性および男性の両方の全ての年齢群において生じ得る。しかし、１０人のシェーグレン患者のうち９人は女性であり、発症の平均年齢は４０代後半である。シェーグレン症候群は、独立して発生し、原発性シェーグレン症候群と称され得、または関連するリウマチ性障害の発症の数年後に発生し、二次性シェーグレン症候群と称され得る。
【０１４４】
口内乾燥症および眼球乾燥症は通常、シェーグレン症候群の最初に検出される症状である（Ｆｏｘら、Ｌａｎｃｅｔ、１巻、１４３２〜１４３５頁、１９８５年）。素因のある個体において自己抗原を曝露させる免疫学的に活性化されたまたはアポトーシス性の腺上皮細胞は、自己免疫媒介性組織傷害を駆動できると推論されている（例えば、Ｖｏｕｌｇａｒｅｌｉｓら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、６巻、５２９〜５３７頁、２０１０年；Ｘａｎｔｈｏｕら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１８巻、１５４〜１６３頁、１９９９年を参照されたい）。この患者における免疫活性化は、管上皮細胞の近位の限局的な単核（Ｔ、Ｂおよびマクロファージ）細胞浸潤物として存在し得（上皮炎（ｅｐｉｔｈｅｌｉｔｉｓ））、唾液腺炎を生じる。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、唾液腺に浸潤する単核細胞の６０〜７０パーセントを構成する（Ｓｋｏｐｏｕｌｉら、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、１８巻、２１０〜２１４頁、１９９１年）。炎症性促進性Ｔｈ１細胞（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒｅｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ、６巻、Ｒ４４７〜Ｒ４５６頁、２００４年；Ｖｏｓｔｅｒｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、６０巻、３６３３〜３６４１頁、２００９年）およびＴｈ１７細胞（例えば、Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５８巻、７３４〜７４３頁、２００８年を参照されたい）の異常な活性化は、ヒトまたは状態において、および動物モデルにおいて報告されている。
【０１４５】
低分子量化合物（小分子）：生物学的プロセスを調節する助けになり得る低分子量（＜９００ダルトン）有機化合物。小分子についての分子量上限は、およそ９００ダルトンであり、それらが細胞内作用部位に到達できるように細胞膜を横切って迅速に拡散する可能性を与える。さらに、この分子量カットオフは、経口バイオアベイラビリティに必要ではあるが十分ではない条件である。この用語は、特異的生物学的標的、例えば、特異的タンパク質または核酸に結合し、エフェクターとして作用して、標的の活性または機能を変化させる分子もまた含み得る。小分子は、種々の生物学的機能を有し得、細胞シグナル伝達分子、医学における薬物、農業における農薬として、および多くの他の役割で機能する。
【０１４６】
特異的結合剤：規定された標的、例えば、タンパク質（例えば、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ＲまたはＩＦＮγ）、酵素、多糖、核酸または小分子のみに実質的にまたは優先的に結合する薬剤（例えば、タンパク質またはポリペプチド）。例えば、タンパク質に特異的に結合する薬剤は、規定されたタンパク質、またはタンパク質内の特異的領域のみに実質的に結合する。例えば、「ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ＲまたはＩＦＮγに特異的に結合する薬剤」としては、それぞれ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ＲまたはＩＦＮγに実質的に結合する抗体および他の薬剤が挙げられる。特定の薬剤が特異的ポリペプチドのみに実質的に結合することの決定は、慣用的な手順を使用しまたは適応させることによって容易に行われ得る。１つの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ウエスタンブロッティング手順を使用する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年を含む、多くの標準的な教科書に記載されている）。
【０１４７】
被験体：本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、哺乳動物を指し、被験体としては、これだけに限定することなく、ヒト、家畜（例えば、イヌまたはネコ）、農場動物（例えば、ウシ、ウマまたはブタ）および実験動物（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウサギ、イヌまたはサル）が挙げられる。
【０１４８】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）結合タンパク質１（ＴＢＰ１）は、任意の形態のＴＢＰ１を指す。これは、タンパク質分解によって遍在性の膜受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体１）から誘導される可溶性タンパク質であり、ＴＮＦαに結合する。受容体１由来のＴＢＰ１の商標は、ＯＮＥＲＣＥＰＴ（登録商標）である。
【０１４９】
ＴＮＦα：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、腫瘍壊死因子α、ＴＮＦα、カヘキシン（ｃａｃｈｅｘｉｎ）またはカケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ））は、全身性炎症に関与する細胞シグナル伝達タンパク質（サイトカイン）であり、急性期反応を構成するサイトカインの１つである。これは、活性化されたマクロファージによって主に産生されるが、多くの他の細胞型、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞、好酸球およびニューロンによって産生され得る。ＴＮＦαの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号Ｐ０１３７５．１およびＮＭ＿００１１９９０５４．１）。
【０１５０】
トランスフォーミング増殖因子ベータ−受容体（ＴＧＦβｒ１）：ＴＧＦＢＲ１およびアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎｇ）受容体様キナーゼ５（ＡＬＫ５；例えば、ＯＭＩＭ  １９０１８１）としても公知。ＴＧＦβｒ１は、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）に対するセリン／スレオニンキナーゼ受容体である。ペプチドＰ１７およびＰ１４４を含む、ＴＧＦβｒ１の阻害剤が開発されている（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２０３１５２５６号を参照されたい）。
【０１５１】
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）：ＴＧＦＢ１（例えば、ＯＭＩＭ  １９０１８０）としても公知。ＴＧＦβは、ＴＧＦスーパーファミリーのサイトカインである。活性化されたＴＧＦβは、異なる下流の基質および調節タンパク質を活性化し、多くの免疫細胞の細胞分化、走化性、増殖および活性化のために、異なる標的遺伝子の転写を誘導する。ＴＧＦβは免疫抑制機能を示すので、ＴＧＦβ発現における増加は、がん悪性疾患と相関する場合が多く、その免疫抑制機能の調節不全は、自己免疫疾患に関与する。ＩＦＮγの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＮＰ＿０００６５１．３およびＮＭ＿０００６６０．６）。
【０１５２】
涙液膜：眼球の曝露された領域を覆う、脂質層によって覆われた水性層を含む流体の層。
【０１５３】
治療剤：「治療剤」または「治療的」という用語は、一般的な意味で使用する場合、処置剤、予防剤および補充剤（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）を含む。
【０１５４】
治療的タンパク質：被験体に、例えば、被験体の眼に投与した場合に所望の効果を達成するタンパク質。治療的タンパク質は、サイトカインなど、直接的効果を有し得、または所望の治療効果を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体に結合できる、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、もしくはグラム陽性細菌の表面上で見いだされる類似のタンパク質など、間接的影響を有し得る。
【０１５５】
治療有効量：「治療有効量」という用語は、そのような処置を必要とする哺乳動物に投与した場合に処置をもたらすのに十分な活性成分（例えば、融合タンパク質）の量を指す。治療有効量は、処置される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに依存して変動し、処方する医師によって容易に決定され得る。
【０１５６】
処置する、処置および療法：任意の客観的または主観的パラメータ、例えば、症状の軽減、寛解、減少、もしくは状態を患者にとってより許容できるものにすること、変性もしくは減退の速度における緩徐化、変性の最終点をあまり消耗性でないものにすること、被験体の肉体的もしくは精神的な幸福を改善すること、または視力を改善することを含む、傷害、病理または状態の減弱または好転における任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査、神経学的試験または精神医学的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメータによって評価され得る。
【０１５７】
潰瘍化：角膜潰瘍または潰瘍性角膜炎は、角膜実質の関与を伴うその上皮層の破壊が関与する、角膜の炎症、またはより重篤には、角膜の感染性もしくは非感染性の状態である。
【０１５８】
ブドウ膜炎：網膜内層と強膜および角膜から構成される外側線維層との間に存在する色素層であるブドウ膜の炎症。ブドウ膜は、虹彩、毛様体および脈絡膜を有する、眼の色素血管構造の中間層を含む。ブドウ膜炎は、眼科的緊急事態であり、検眼士または眼科医による徹底的な試験および炎症を制御するための緊急処置を必要とする。
【０１５９】
ベクター：宿主細胞に導入されると、それにより、形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の治療的遺伝子および／または複数の選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターは、グラム陰性菌細胞およびグラム陽性菌細胞における発現のためのプラスミドを含めた、プラスミドベクターを含む。例示的なベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおける発現のためのベクターが挙げられる。ベクターとしては、これだけに限定されないが、レトロウイルス、オルソポックス、トリポックス（ａｖｉｐｏｘ）、鶏痘、カプリポックス、スイポックス（ｓｕｉｐｏｘ）などのポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターも挙げられる。ベクターとしては、酵母細胞における発現のためのベクターも挙げられる。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換しまたは細胞に感染し、それにより、細胞に、細胞にとってネイティブなもの以外の核酸および／またはタンパク質を発現させることができる。ベクターとしては、任意選択で、細胞中への核酸の進入を達成するのを助ける材料、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質外被などが挙げられる。ベクターは、ウイルスベクターであり得る。
【０１６０】
フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）：第ＶＩＩＩ因子−フォン・ヴィルブランド因子（Ｆ８ＶＷＦ；例えば、ＯＭＩＭ  ６１３１６０）としても公知。ｖＷＦは、コラーゲン結合ドメインを含む、止血に関与する血液糖タンパク質である。ｖＷＦの主な機能は、他のタンパク質、特に第ＶＩＩＩ因子に結合することであり、これは、創傷部位への血小板接着において重要である。ｖＷＦは、コラーゲンと相互作用することが示されている。ｖＷＦ配列は、公的に入手可能である。例えば、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＢ５９４５８．１、ＡＡＰ４１９５０．１およびＱ６２９３５．２は、例示的なヒト、ラットおよびマウスのｖＷＦタンパク質配列を開示し、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０００５５２．４、ＡＪ２２４６７３．１およびＮＭ＿０１１７０８．４は、例示的なヒト、ラットおよびマウスのｖＷＦヌクレオチド配列を開示する。
【０１６１】
コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）：レクチン（炭水化物結合タンパク質は、昆虫、酵母および細菌からコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）を保護するレクチンである。これは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびシアル酸に結合する。哺乳動物では、ＷＧＡが結合するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、他の場所の中でも軟骨および角膜において見いだされ、シアル酸は、粘膜（例えば、鼻内部および消化管の内層）において見いだされる。配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、ＷＧＡの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列を提供する、２０７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＡＡＡ３４２５６．１およびＭ２５５３６．１）；他の例は、本明細書で入手可能である（例えば、配列番号１３）。
【０１６２】
本開示の実施または試験のための適切な方法および材料は、以下に記載される。そのような方法および材料は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。本明細書に記載のものと同様または同等である他の方法および材料を使用することができる。例えば、開示される発明が関係する当該技術分野で周知の従来の方法は、種々の一般的かつより具体的な参考文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１；  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  １９９２  （および２０００年の補遺）；  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第４版，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９などに記載される。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
【０１６３】
ＩＩ．融合タンパク質
ヒト被験体の眼への治療的化合物の局所的適用は、これらの化合物が顕著な効果を有するにはあまりに迅速に洗い流されるので、特に困難である。眼表面上に保持され、したがって、延長された期間にわたって作用できるように、治療的タンパク質を角膜にアンカーするドメインを結合させることは、眼の多くの状態を処置するために適用できる多目的な解決法を示す。アンカードメインおよび治療的タンパク質を含む融合タンパク質のための方法および組成物は、本明細書に開示されている。本明細書に記載される方法および組成物は、医薬組成物中の融合タンパク質を被験体の眼に投与するステップを含む。
【０１６４】
本明細書に開示されている方法は、アンカードメインおよび治療的タンパク質を含む融合ポリペプチドを利用する。一部の実施形態では、アンカータンパク質は、コラーゲン結合ポリペプチド、ヘパリン結合ポリペプチドまたはレクチンを含む。他の実施形態では、治療的タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチド、インターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニスト、ＩＬ−１ＲａまたはＩＬ−１０を含む。
【０１６５】
Ａ．アンカードメイン
開示されている融合タンパク質は、非共有結合を介して融合タンパク質を眼表面に接着させるアンカードメインを含む。これらのアンカードメインは、コラーゲン、ヘパリン、ヘパラン硫酸または炭水化物に結合できる。フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来の例示的なコラーゲン結合アンカードメインは、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＢ５９４５８．１、ＡＡＰ４１９５０．１およびＱ６２９３５．２において見いだされ、以下の通りである：
【化１】
2020501510.tif 000002
【０１６６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）由来の例示的なコラーゲン結合アンカードメインは、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＢＡＡ０６２５１．１において見いだされ、以下の通りである：
【化２】
2020501510.tif 000003
【０１６７】
例示的なヘパリン結合（ＨＳ）アンカードメインは、以下の通りである：
【化３】
2020501510.tif 000004
【０１６８】
炭水化物結合アンカードメインとしては、レクチンおよびその断片が挙げられる。例示的なレクチンは、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）およびジャカリン（Ｊａｃ）である。ＣｏｎＡ由来の例示的な炭水化物結合アンカードメインは、
【化４】
2020501510.tif 000005
である。
【０１６９】
ＷＧＡ由来の例示的な炭水化物結合アンカードメインは、
【化５】
2020501510.tif 000006
である。
【０１７０】
Ｊａｃ由来の例示的な炭水化物結合アンカードメインは、
【化６】
2020501510.tif 000007
である。
【０１７１】
当業者は、これらのアンカードメインの断片およびバリアントを容易に同定できる。以下を参照されたい。このアンカードメインは、治療的ポリペプチドに直接結合され得、またはリンカーが、アンカードメインと治療的ポリペプチドとの間に挿入され得る。リンカーを含む例示的なポリペプチドは、以下に示される：
【化７】
2020501510.tif 000008
【０１７２】
Ｂ．治療的ポリペプチド
開示されている融合タンパク質は、治療的ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、この治療的ポリペプチドは、例えば、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチド、インターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニスト、ＩＬ−１ＲａまたはＩＬ−１０であり得る。一部の非限定的な例では、この治療的ポリペプチドは、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＴＮＦαに特異的に結合する抗体、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＬであり得る。
【０１７３】
当業者は、使用される治療的ポリペプチドを容易に同定できる。一部の実施形態では、この治療的タンパク質はＩＬ−１０である。ヒトＩＬ−１０のアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、それぞれ、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿０００５６３．１およびＣＲ５４２０２８に提供され、これらは各々、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる。マウスＩＬ−１０およびこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、それぞれ、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＥＤＬ３９７２２．１およびＭＵＳＩＬ１０Ｚに提供され、これらは各々、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕｊｉｏ，  Ｋ．ら、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０５巻：９９〜１３０頁、２０１０年もまた参照されたい。
【０１７４】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質はプロテインＡである。例示的なプロテインＡ免疫グロブリン結合ポリペプチドは、
【化８】
2020501510.tif 000009
である。
【０１７５】
さらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｘ６１３０７．１に提供される。
【０１７６】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質はプロテインＧである。例示的なプロテインＧ免疫グロブリン結合ポリペプチドは、
【化９】
2020501510.tif 000010
である。
【０１７７】
さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＸ７８０５のプロテインＧのアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｙ００４２８．１に提供される。
【０１７８】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質プロテインＬである。Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａのプロテインＬのアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｍ８６６９７．１に提供される。
【０１７９】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤である。この阻害剤の例示的なポリペプチド配列は、
【化１０】
2020501510.tif 000011
である。
【０１８０】
さらに、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドのヒト阻害剤のアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、それぞれ、２０１７年９月１４日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１０５６およびＮＧ＿００７５０６に提供される。
【０１８１】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＴＧＦβの阻害剤である。例えば、この阻害剤は、ヒトＴＧＦβ１のＩＩＩ型受容体のアミノ酸７３０〜７４３を含み得る。ＴＧＦβ１のヒトおよびラット阻害剤（例えば、Ｐ１４４）のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５８２，６０９号に提供される。例えば、このタンパク質は、配列ＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮ（配列番号１３）を含み得る。ＴＧＦβ１の阻害剤（例えば、Ｐ１７）のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２２２８０号に提供される。例えば、このタンパク質は、配列ＫＲＩＷＦＩＰＲＳＳＷＹＥＲＡ（配列番号１４）を含み得る。
【０１８２】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質はＩＬ−１Ｒａである。ＩＬ−１Ｒａの例示的な配列は、当該分野で公知である。例えば、ＩＬ−１Ｒａのタンパク質およびヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）において入手可能である（例えば、それぞれ、２０１７年９月１８日に利用可能になった、参照により本明細書に組み込まれる、受託番号ＣＡＡ３６２６２．１およびＡＪ００５８３５．１）。
【０１８３】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＴＧＦβに特異的に結合する抗体である。これらの抗体は、当該分野で公知である。ＴＧＦβ１に特異的に結合する抗体の例示的なアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５２７，７９１号に提供される。一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＴＮＦαに特異的に結合する抗体である。ＴＮＦαに特異的に結合する抗体の例示的なアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２５８，５６２号に提供される。
【０１８４】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体である。これらの抗体は、当該分野で公知である。ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体の例示的なアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２３，３６７号に提供される。
【０１８５】
一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体である。これらの抗体は、当該分野で公知である。ＩＬ−６に特異的に結合する抗体の例示的なアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９１，７２１号に提供される。一部の実施形態では、この治療的タンパク質は、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体である。ＩＦＮγに特異的に結合する抗体の例示的なアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８４，２５７号に提供される。
【０１８６】
上に開示されたアンカードメイン、治療的ポリペプチドおよびリンカーと類似するペプチド、ならびに治療活性を保持するそれらの断片が使用され得る。これらのアンカードメインおよび治療的ポリペプチドは、置換、欠失または付加を含有し得る。これらの差異は、好ましくは、異なる種間で顕著には保存されていない領域中にある。そのような領域は、種々の動物種由来の関連タンパク質のアミノ酸配列をアラインメントすることによって同定できる。一般に、ペプチドの生物学的効果は保持される。例えば、これらのポリペプチドのうち１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリペプチドが利用され得る。多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドが使用される。一般に、ネイティブポリペプチドの生物学的機能の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を保持し、またはネイティブポリペプチドと比較して増加した生物学的機能を有する限り、そのようなポリペプチドが使用される。
【０１８７】
一部の実施形態では、治療的タンパク質の断片が利用される。一般に、使用される断片は、ネイティブポリペプチドの生物学的機能の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を保持し、またはネイティブポリペプチドと比較して増加した生物学的機能を有する。
【０１８８】
Ｃ．融合タンパク質
本明細書に開示されている方法において使用される融合タンパク質は、少なくとも２つの構成成分：アンカードメインおよび治療的タンパク質を含む。一部の実施形態では、このアンカードメインは、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号９）などのリンカーポリペプチドによって、治療的タンパク質に結合され得る。一実施形態では、この治療的タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含む。別の実施形態では、この治療的タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、治療的ポリペプチドおよびアンカードメインを含む。これらの実施形態のいずれかでは、リンカーが、アンカードメインと治療的ポリペプチドとの間に含まれ得る。任意選択で、他の構成成分、例えば、溶解度および／または精製に使用される標識またはドメインが、Ｎ末端またはＣ末端に含まれ得る。他の実施形態では、この融合タンパク質は、１または複数コピーのアンカードメイン、治療的ポリペプチド（例えば、１または複数コピーのＰ１４４もしくはＰ１７、例えば、少なくとも約１、２、３、４もしくは５コピーのＰ１４４もしくはＰ１７、または約２コピーのＰ１４４もしくはＰ１７）、またはリンカー（例えば、１または複数コピーの配列番号９もしくは配列番号１９、例えば、少なくとも約１、２、３、４もしくは５コピーの配列番号９もしくは配列番号１９、または約２コピーの配列番号９もしくは配列番号１９）を含み得る。治療的ポリペプチドおよび融合タンパク質に関する追加の情報は、以下に提供される。
【０１８９】
異種ペプチド、例えば、ポリペプチドを検出；精製；安定化または可溶化するために使用され得るペプチドに融合された治療的ポリペプチドもまた、本明細書に包含される。特定の非限定的な例では、可溶化ドメインが、溶解度を増強するために含まれ得る。適切な可溶化ドメインとしては、マルトース結合タンパク質および低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）が挙げられる。
【０１９０】
一部の実施形態では、この融合タンパク質は、コラーゲン結合ドメイン、例えば、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）由来のコラーゲン結合ポリペプチド、ならびにプロテインＡ、プロテインＧおよび／またはプロテインＬ由来の治療的に有効なＩｇ結合ポリペプチドを含む。このＩｇ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧおよび／もしくはプロテインＬ全体、またはそれらのＩｇ結合性断片を含み得る。Ｉｇ結合ポリペプチドとしてプロテインＧポリペプチドを含み、アンカードメインとしてｖＷＦポリペプチドを含む例示的なポリペプチドは、以下の通りである：
【化１１】
2020501510.tif 000012
【０１９１】
他の実施形態では、この治療的に有効なポリペプチドは、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤またはＴＧＦβの阻害剤由来のポリペプチドであり得る。ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤またはＴＧＦβの阻害剤由来のポリペプチドは、阻害剤タンパク質全体またはその治療的に有効な断片を含み得る。一部の例では、アンカードメインはｖＷＦポリペプチドであり得、治療的ポリペプチドはＴＧＦβの阻害剤であり得る。阻害剤としてそれぞれＰ１４４およびＰ１７のタンデムリピートを含み、アンカードメインとしてｖＷＦポリペプチドを含む例示的なポリペプチドは、以下の通りである：
【化１２】
2020501510.tif 000013
【０１９２】
さらなる実施形態では、この融合タンパク質は、コラーゲン結合ドメイン、例えば、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）もしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）由来のコラーゲン結合ポリペプチドまたはヘパラン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）結合ドメイン、およびＩＬ−１０由来の治療的に有効なポリペプチドを含む。ＩＬ−１０由来のポリペプチドは、ＩＬ−１０タンパク質全体またはその治療的に有効な断片を含み得る。
【０１９３】
例えば、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ペグ化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化によって合成の間またはその後に示差的に改変された、アンカードメイン、治療的に有効なポリペプチドおよび／または融合タンパク質のペプチド誘導体もまた含まれる。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｄ立体異性体である少なくとも１つのアミノ酸または全てのアミノ酸を含み得る。他のペプチドは、反転された少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。反転されたアミノ酸は、Ｄ立体異性体であり得る。ペプチドの全てのアミノ酸が反転され得、および／または全てのアミノ酸がＤ立体異性体であり得る。
【０１９４】
開示されているアンカードメイン、治療的に有効なポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれも、当該分野で周知の自動固相手順によって容易に合成できる。固相合成のための技術および手順は、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．  ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．  Ｃ．  Ｓｈｅｐｐａｒｄ、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが出版、１９８９年に記載されている。代替的に、これらのペプチドは、例えば、Ｌｉｕら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３７：９３３−９３６，  １９９６；  Ｂａｃａら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７：１８８１−１８８７，  １９９５；  Ｔａｍら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４５：２０９−２１６，  １９９５；  ＳｃｈｎｏｌｚｅｒおよびＫｅｎｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１−２２５，  １９９２；  ＬｉｕおよびＴａｍ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６：４１４９−４１５３，  １９９４；  Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：６５８４−６５８８，  １９９４；ならびにＹａｍａｓｈｉｒｏおよびＬｉ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３１：３２２−３３４，  １９８８）に記載されるようなセグメント濃縮の方法によって調製され得る。本開示のペプチドを合成するのに有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０７巻：７０８７〜７０９２頁、１９８５年に記載されている。
【０１９５】
Ｄ．ポリヌクレオチドおよび宿主細胞
本明細書に開示されている融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。これらのポリヌクレオチドとしては、融合タンパク質をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が挙げられる。コード配列としては、それにより１つよりも多いコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）から生じるバリアントが挙げられる。したがって、例えば、ロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡまたはＴＴＧによってコードされ得；セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣによってコードされ得；アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得；アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得；システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得；アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによってコードされ得；グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得；チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得；イソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣまたはＡＴＡによってコードされ得る。標準的な遺伝暗号を示す表は、種々の供給源において見いだされ得る（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．  ５  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ＮＹを参照されたい）。
【０１９６】
融合タンパク質をコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）によって、クローニングまたは増幅され得る。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その分子のＤＮＡ配列に基づくプライマーを使用するｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離され得る。多種多様なクローニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法体系は、当業者に周知である。ＰＣＲ法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．、５１巻：２６３頁、１９８７年；およびＥｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年）に記載されている。ポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、所望のポリヌクレオチドの配列から選択されるプローブを用いてゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても単離され得る。
【０１９７】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列と作動可能に連結していてよい。コード配列と作動可能に連結した発現制御配列を、発現制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートする。発現制御配列としては、これだけに限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、転写制御因子（例えば、ＡｒａＣおよびＬａｃＩ）、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするための、当該遺伝子の適正な読み枠の維持、および終止コドンが挙げられる。
【０１９８】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、自律的に複製するプラスミドのベクター中もしくはウイルス中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれる、あるいは他の配列とは独立した別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する、組換えＤＮＡが挙げられる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの改変形態であり得る。この用語は、一本鎖または二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【０１９９】
一実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓなどの酵母における発現のためにベクターを使用する。構成的プロモーター原形質膜Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ１）、および多面的薬剤耐性ポンプ（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｕｍｐ）（ＰＤＲ５）などのいくつかのプロモーターが酵母発現系において使用されることが公知である。さらに、ＧＡＬ１−１０（ガラクトースによって誘導される）、ＰＨＯ５（低細胞外無機ホスフェートによって誘導される）、およびタンデムな熱ショックＨＳＥエレメント（３７℃への温度上昇によって誘導される）などの、多くの誘導性プロモーターが使用される。滴定可能な誘導因子に応答して可変な発現を導くプロモーターとしては、メチオニン応答性ＭＥＴ３およびＭＥＴ２５プロモーターならびに銅依存性ＣＵＰ１プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターのいずれかを、多コピー（２μ）または単一コピー（ＣＥＮ）プラスミドにクローニングして、追加的なレベルの発現レベルの制御をもたらすことができる。プラスミドは、酵母における選択のための栄養マーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＡＤＥ３、ＨＩＳ１、およびその他など）、ならびに細菌における繁殖のための抗生物質耐性（例えば、ＡＭＰなど）を含んでよい。Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける発現のためのプラスミドは、例えばｐＫＬＡＣ１など、公知である。したがって、一例では、細菌における増幅後、プラスミドを、対応する酵母栄養要求株に細菌形質転換と同様の方法によって導入することができる。ポリヌクレオチドは、昆虫細胞にいて発現するように設計されてもよい。
【０２００】
融合タンパク質は、種々の酵母株において発現させることができる。例えば、７種の多面的薬剤耐性輸送体、ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ５、ＹＣＦ１、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、およびＰＤＲ１５を、それらの活性化転写因子、ＰＤＲ１およびＰＤＲ３と共に、酵母宿主細胞において同時欠失させ、それにより、得られる株を薬物に対して感受性にする。エルゴステロール生合成に欠陥のあるｅｒｇ６変異体などの、原形質膜の脂質組成が変化している酵母株も利用することができる。他の液胞ヒドロラーゼの活性化を制御する主要液胞エンドペプチダーゼＰｅｐ４を欠く酵母株において、タンパク質分解に対する感受性が高いタンパク質を発現させることができる。対応するヌル変異体が生存不能である場合には、遺伝子の温度感受性（ｔｓ）対立遺伝子を有する株における異種発現を使用することができる。
【０２０１】
ウイルスベクターは、本明細書に開示される融合タンパク質をコードするように調製することもできる。ポリオーマ、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：１５３３〜１５３６頁、１９９２年）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｃｕｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：３９〜６頁、１９９２年；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６１６〜６２９頁、１９９８年；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：４４０７〜４４１２頁、１９９２年；Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：２５８１〜２５８４頁、１９９２年；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁、１９９２年；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：２２３３〜２２３９頁、１９９２年；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１巻：２４１〜２５６頁、１９９０年）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４巻：４９５〜４９９頁、１９９２年）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：９１〜１２３頁、１９９２年；Ｏｎら、Ｇｅｎｅ、８９巻：２７９〜２８２頁、１９９０年）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含めたヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：６７〜９０頁、１９９２年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２９５２〜２９６５頁、１９９２年；Ｆｉｎｋら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３巻：１１〜１９頁、１９９２年；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１巻：３３７〜３７１頁、１９８７年；Ｆｒｅｓｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０巻：２１８９〜２１９９頁、１９９０年）、シンドビスウイルス（Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、６巻：１１６１〜１１６７頁、１９９５年；米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１巻：１８〜２２頁、１９９３年；Ｉ．Ｆｒｏｌｏｖら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：１１３７１〜１１３７７頁、１９９６年）、ならびにトリ起源のレトロウイルス（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４巻：７４９〜７５４頁、１９８４年；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：３３９１〜３３９７頁、１９９２年）、マウス起源のレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：１〜２４頁、１９９２年；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５巻：４３１〜４３７頁、１９８５年；Ｓｏｒｇｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４巻：１７３０〜１７３７頁、１９８４年；Ｍａｎｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５４巻：４０１〜４０７頁、１９８５年）、およびヒト起源��レトロウイルス（Ｐａｇｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６４巻：５３７０〜５２７６頁、１９９０年；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁、１９９２年）を含めた、いくつものウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも当技術分野で公知であり、商業的な供給源（例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から得ることができる。
【０２０２】
したがって、一実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをウイルスベクター中に含める。適切なベクターとしては、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、トリポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターが挙げられる。
【０２０３】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞中へのＤＮＡ導入によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。この細胞は、原核生物または真核生物であり得る。この用語は、対象宿主細胞の任意の子孫も含む。複製の間に変異が生じ得るので、全ての子孫が親細胞と同一であるわけではないことが理解される。外来ＤＮＡが宿主において持続的に維持されることを意味する安定な導入の方法は、当該分野で公知である。
【０２０４】
宿主細胞としては、微生物、昆虫および哺乳動物宿主細胞も挙げられ得る。原核生物において真核生物またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は、当該分野で周知である。適切な宿主細胞の非限定的な例としては、細菌、古細菌、昆虫、真菌（例えば、酵母）、植物および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト）が挙げられる。使用される例示的な細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ならびに不死化した哺乳動物骨髄系およびリンパ系細胞株が挙げられる。培養物中での哺乳動物細胞の繁殖のための技術は周知である（ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、第５８巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、Ｎ．Ｙ．、１９７９年を参照されたい）。一般的に使用される哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞株であるが、より高い発現の望ましいグリコシル化パターン、または他の特徴を提供するように設計された細胞などの細胞株が使用され得る。上で議論したように、酵母細胞の形質転換のための技術、例えば、ポリエチレングリコール形質転換、プロトプラスト形質転換および遺伝子銃もまた、当該分野で公知である（ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３５０巻：８７〜９６頁、２００２年を参照されたい）。
【０２０５】
組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技法によって行うことができる。宿主がこれに限定されないがＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数成長期後に回収し、その後、当技術分野で周知の手順を使用してＣａＣｌ２法によって処理した細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。形質転換は、所望であれば宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、または電気穿孔によって実施することもできる。
【０２０６】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、微量注射などの従来の機械的手順、電気穿孔、リポソームまたはウイルスベクターに封入したプラスミドの挿入などのＤＮＡトランスフェクション方法を使用することができる。真核細胞はまた、Ｃ末端エンドスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子を用いて同時形質転換することができる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して真核細胞を一過性に感染させるか形質転換し、タンパク質を発現させるものである（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２年を参照されたい）。
【０２０７】
Ｅ．化学的コンジュゲーション
分子的方法が融合タンパク質を合成するために使用され得るが、化学的方法が、アンカードメインを治療的ポリペプチドに連結することによって、融合タンパク質を合成するために代替的に使用され得る。一部の例では、アンカードメイン（例えば、レクチン炭水化物結合ドメイン、例えば、ＷＧＡ、ｃｏｎＡおよびＪａｃ、またはコラーゲンもしくはヘパリン結合ドメイン）は、化学的コンジュゲーションを介して、治療的ポリペプチド（例えば、Ｉｇ結合ポリペプチド、またはＴＧＦβアンタゴニスト、ＴＮＦαアンタゴニスト、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニストもしくはＩＦＮγアンタゴニスト）に共有結合され得る。種々の型の化学的試薬が使用され得る（例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｄｏら、ＪＢＣ、２８７巻（３１号）：２６３７７〜２６３８７頁、２０１２年および米国特許出願公開第２００３／００４０４９６号を参照されたい）。一部の例では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が、化学的コンジュゲーションに使用される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｄｏら、ＪＢＣ、２８７巻（３１号）：２６３７７〜２６３８７頁、２０１２年を参照されたい）。一部の非限定的な例では、少なくとも約１〜２、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５もしくは２５〜３０ｍＭまたは少なくとも約２、５、６、１０、１５、２０もしくは２５ｍＭのＥＤＣが使用され得る。さらなる非限定的な実施形態では、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）が、ＥＣＤに加えて使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｄｏら、ＪＢＣ、２８７巻（３１号）：２６３７７〜２６３８７頁、２０１２年を参照されたい）。一部の例では、少なくとも約５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜７５、７５〜１００もしくは１００〜２００ｍＭまたは少なくとも約５、１０、２５、５０もしくは１００ｍＭのスルホ−ＮＨＳが、ＥＣＤに加えて使用され得る。
【０２０８】
他の実施形態では、代替的化学的コンジュゲーション（すなわち、架橋結合）試薬が、アミノ基とチオール基との間に共有結合を形成するため、およびタンパク質中にチオール基を導入するために使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００４０４９６号を参照されたい）。追加の代替的化学的コンジュゲーション（すなわち、架橋結合）試薬は、そのような試薬の調製および使用を記載し、そのような試薬の商業的な供給源を提供する、ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴＡＬＯＧ、ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９２年〜１９９３年中に見いだすことができる（これは参照により本明細書に組み込まれる；例えば、Ｃｕｍｂｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：３９７−４０１，  １９９２；  Ｔｈｏｒｐｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７：５９２４−５９３１，  １９８７；  Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ８４：３０８−３１２，  １９８７；  Ｗａｌｄｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：１９１−１９７，  １９８６；  Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １７３：７２３−７３７，  １９７８；  Ｍａｈａｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２：１６３−１７０，  １９８７；  Ｗａｗｒｙｚｎａｃｚａｋら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６６：３６１−３６６，  １９９２；  Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎ．  ６０：５８４−５８９，  １９９２も参照のこと。これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）。これらの試薬としては、これだけに限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）；スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル６−［アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−−メチル−−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）；スルホスクシンイミジル６［−メチル−−２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｍｉｄｙｌ）（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｂｕｔｙａｔｅ）（スルホ−ＳＭＰＢ）；およびアジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が挙げられる。
【０２０９】
ＩＩＩ．医薬組成物および処置の方法
眼に影響を及ぼす障害を有する哺乳動物被験体（例えば、ヒトまたは獣医被験体）などの被験体を処置するための組成物および方法が、本明細書に開示されている。一部の例では、この方法は、被験体において眼に影響を及ぼす障害（例えば、角膜混濁もしくは瘢痕、ドライアイ、および／または眼の眼表面における炎症）の徴候または症状を好転できる。融合タンパク質を投与することは、眼に影響を及ぼす障害を処置、阻害および／または予防するのに十分である。
【０２１０】
この方法は、治療有効量の、アンカードメインおよび治療的ポリペプチドを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。一部の例では、このアンカードメインは、レクチン由来の炭水化物結合アンカードメインであり得る。眼の眼表面（例えば、角膜）に特異的に結合する任意のレクチン由来の炭水化物結合アンカードメインが使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｕｕｓｉｔａｌｏら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２６巻：７８７〜７９８頁、１９９４年を参照されたい）。レクチンの非限定的な例としては、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、ジャカリン（ｊａｃ）およびコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）が挙げられ得る。他の例では、このアンカードメインは、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）由来のコラーゲン結合アンカードメインである。他の例では、このアンカードメインは、ヘパリン結合アンカードメインであり得る。
【０２１１】
一部の例では、この治療的ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチド、インターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニスト、もしくはＩＬ−１０、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）またはそれらの有効な断片もしくはバリアントであり得る。一部の非限定的な例では、このＴＧＦβアンタゴニストは、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体であり得る。他の例では、このＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＮＦαに特異的に結合する抗体であり得る。さらなる例では、このＩＬ−１βアンタゴニストは、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体であり得る。追加的な例では、このＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体であり得る。一部の他の例では、このＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体であり得る。なおさらなる例では、このＩｇ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはそれらの有効な断片もしくはバリアントであり得る。
【０２１２】
Ｉｇ結合ポリペプチドが治療的ポリペプチドとして投与されるさらなる実施形態では、追加的な治療有効量の抗体が投与される。一部の例では、この抗体は、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＩＦＮγに特異的に結合する抗体であり得る。
【０２１３】
一部の実施形態では、この方法は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合アンカードメインまたはＣｏｌＨコラーゲン結合アンカードメイン、およびＴＧＦβアンタゴニスト、Ｉｇ結合ポリペプチド、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１ＲａまたはＩＬ−１０を含む融合タンパク質を投与するステップを含む。ある特定の例では、このＴＧＦβアンタゴニストは、Ｐ１７またはｐ１７７であり得る。他の例では、このＩｇ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはそれらの有効な断片であり得る。
【０２１４】
他の実施形態では、この方法は、アンカードメインとしてＷＧＡ由来の炭水化物結合アンカードメインを含み、治療的ポリペプチドとしてＴＧＦβアンタゴニスト、ＴＮＦαアンタゴニスト、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、インターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニスト、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１０またはＩＬ−１Ｒａを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。一部の非限定的な例では、このＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβに特異的に結合する抗体であり得る。他の例では、このＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦαに特異的に結合する抗体であり得る。さらなる例では、このＩＬ−１βアンタゴニストは、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体であり得る。追加的な例では、このＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体であり得る。一部の他の例では、このＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体であり得る。
【０２１５】
さらなる実施形態では、この方法は、アンカードメインとしてのヘパリン結合アンカードメイン、およびＴＮＦαアンタゴニストを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。一部の非限定的な例では、このＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤であり得る。
【０２１６】
追加的な実施形態では、眼に影響を及ぼす少なくとも１つの障害を有するまたはそのリスクがある被験体が選択される。この被験体は、一方または両方の眼において障害を有し得、この障害は、慢性または急性障害であり得る。眼の障害を有する被験体を選択するための方法は、医療分野で公知であり、本明細書に記載される被験体を選択するために使用され得る。一部の非限定的な例では、この障害は、角膜混濁もしくは瘢痕、ドライアイ、および／または炎症であり得る。この方法は、融合タンパク質を、眼に影響を及ぼす障害を有する被験体に投与するステップを含む。
【０２１７】
一部の実施形態では、この方法は、角膜混濁または瘢痕を有する被験体を選択するステップを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１４３，３１５号および米国特許出願公開第２００３／０１５３５２４号）。角膜混濁または瘢痕に罹患される角膜組織の任意の部分が処置され得る。一部の非限定的な例では、角膜の中間層（すなわち、実質）が影響を受ける。さらに、角膜混濁または瘢痕は、任意の状態に起因し得る。非限定的な例では、角膜混濁は、外傷、感染または外科手術に起因し得る。他の非限定的な例では、角膜瘢痕は、傷害に起因する。ある特定の実施形態では、角膜瘢痕を引き起こす傷害は、擦過傷、裂傷、熱傷または疾患である。
【０２１８】
被験体が角膜混濁または瘢痕を有する一部の非限定的な実施形態では、この方法は、ＴＧＦβアンタゴニストを含む融合タンパク質を投与するステップ、または免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチドを含む融合タンパク質およびＴＧＦβに特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。一部の非限定的な例では、このＴＧＦβ１アンタゴニストは、Ｐ１７、Ｐ１４４、またはＴＧＦβに特異的に結合する抗体であり得る。一部の他の例では、このＩｇ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬの抗体結合ポリペプチドであり得る。一部の非限定的な実施形態では、この方法は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合アンカードメインおよびＴＧＦβアンタゴニスト（例えば、Ｐ１７およびＰ１４４）またはＩｇ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにＴＧＦβに特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。他の非限定的な実施形態では、この方法は、アンカードメインとしてのＷＧＡ由来の炭水化物結合アンカードメイン、およびＴＧＦβアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦβに特異的に結合する抗体）を含む融合タンパク質を投与するステップを含む。一部の例では、この方法は、角膜混濁および／または瘢痕の徴候および症状を低減または好転させるために使用され得る。被験体が角膜混濁を有する一部の非限定的な例では、この方法は、ぼやけた、焦点の合わないもしくは不明瞭な視力および／または光の周りの眼に見えるハローを低減または好転させるために使用され得る。被験体が角膜瘢痕を有する他の非限定的な例では、この方法は、ぼやけた視力または全盲を低減または好転させるために使用され得る。
【０２１９】
一部の実施形態では、この方法は、ドライアイ疾患（ＤＥＤ；例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２８１７３９号を参照されたい）を有する被験体を選択するステップを含む。ＤＥＤは、任意の状態によって引き起こされ得る。一部の非限定的な例では、ＤＥＤは、乾性角結膜炎、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、角膜傷害、加齢性ドライアイ、スティーブンス・ジョンソン症候群、先天性無涙液症、薬理学的副作用、感染、ライリー・デイ症候群、結膜線維症、眼のストレス、腺および組織の破壊、眼瘢痕性類天疱瘡、眼瞼炎、自己免疫性および他の免疫不全障害、アレルギー、糖尿病、涙腺欠損症、ループス、パーキンソン病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、酒さ、過剰に乾燥した空気への環境曝露、浮遊微小粒子、煙、スモッグ、ならびに／またはまばたきできないことによって引き起こされ得る。
【０２２０】
一部の実施形態では、被験体は、シェーグレン症候群を有し得る。ドライアイは、シェーグレン症候群の特質である；この疾患は、現行の療法に対して高度に不応性であり、生活の質における顕著な減退と一般に関連する（Ｌｅ，  Ｑら、ＢＭＣ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、１２巻：２２頁、２０１２年；Ｌｉ，  Ｍら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５３巻：５７２２〜５７２７頁、２０１２年）。重症疾患では、慢性炎症によって惹起される眼表面の完全性の喪失には、視覚を脅かす結果、例えば、角化、瘢痕、潰瘍化および感染がさらに合併し得る（Ｆｏｕｌｋｓ，  Ｇ．  Ｎ．ら、Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ、１３巻：１１８〜１３２頁、２０１５年；ＭｃＮａｍａｒａ，  Ｎ．  Ａ．、Ｏｐｔｏｍ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、８７巻：２３３〜２３８頁、２０１０年；Ｓｔｅｒｎ，  Ｍ．  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２巻：１９〜４１頁、２０１３年）。現在の処置選択肢、例えば、広く使用される人工涙液補充剤は、症状の中程度で一時的な軽減を提供できるが、疾患機構を標的化していない；例えば、ＤＥＤ（ドライアイ疾患）に対するＦＤＡ承認された眼科製剤であるシクロスポリンＡは、患者のたった１５％（プラセボでの５％に対して）に恩恵を与える（Ｓａｌｌ，  Ｋ．ら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１０７巻：６３１〜６３９頁、２０００年；Ａｍｅｓ，  Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  （Ｌｏｎｄ）、５巻：２６７〜２８５頁、２０１５年）。本明細書に開示されている方法は、シェーグレン症候群に対する他の処置、例えば、人工涙液またはステロイドと組み合わせて使用され得る。
【０２２１】
さらなる実施形態では、眼の炎症（例えば、眼の慢性炎症）を有する被験体が、処置のために選択される。一部の例では、炎症は、緑内障、ブドウ膜炎、黄斑変性症、糖尿病網膜症、他の網膜の問題、感染（例えば、細菌、真菌、ウイルスまたは寄生生物感染、例えば、眼瞼炎、霰粒腫、結膜炎、涙嚢炎、虹彩炎、角膜炎、眼窩周囲蜂巣炎、強膜炎、副鼻腔炎、およびものもらいまたは麦粒腫）、アレルギー（例えば、慢性または急性アレルギーを含む、薬物アレルギー、食物アレルギー、枯草熱またはアレルゲンに対するアレルギー反応、および昆虫咬傷アレルギー）、自己免疫障害（例えば、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、皮膚筋炎、グレーブス病、若年性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬性関節炎、ライター症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスおよびウェゲナー肉芽腫症）、移植片対宿主病、ドライアイ症候群、角膜縁幹細胞不全、刺激、ならびに例えば、鈍的外傷、角膜擦過傷または潰瘍、外来の物体または物質、血腫、昆虫咬傷または刺傷、刺激物および眼窩骨折に起因する、眼または眼瞼への傷害または外傷によって引き起こされ得る（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３３６５５７号を参照されたい）。他の実施形態では、この被験体は、炎症（例えば、慢性炎症）に起因する角化、瘢痕、潰瘍化および感染を有し得る、またはそのリスクがあり得る。
【０２２２】
被験体がＤＥＤおよび／または眼の炎症（例えば、慢性炎症）を有する場合、この方法は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、インターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニスト、ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１Ｒａを含む融合タンパク質を投与するステップ、または免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチドを含む融合タンパク質、およびＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＩＦＮγに特異的に結合する抗体を投与するステップを含む。一部の例では、このＩｇ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬ由来の抗体結合ポリペプチド、またはそれらのＩｇ結合性断片であり得る。ある特定の非限定的な例では、このＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、またはＴＮＦαに特異的に結合する抗体を含む。他の例では、このＩＬ−１βアンタゴニストは、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体を含む。追加的な例では、このＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体を含む。なおさらなる例では、このＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、この方法は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合アンカードメインおよびＩｇ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびに追加的な治療有効量の抗体（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＩＦＮγに特異的に結合する抗体）を投与するステップを含む。追加的な非限定的な実施形態では、この方法は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）由来のコラーゲン結合アンカードメインおよびＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤、ＩＬ−１０またはＩＬ−１Ｒａを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。他の非限定的な実施形態では、この方法は、アンカードメインとしてＷＧＡ由来の炭水化物結合アンカードメインを含み、治療的ポリペプチドとしてＴＮＦαアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦαに特異的に結合する抗体、またはＴＮＦ受容体１由来のＴＮＦαポリペプチドの阻害剤）、ＩＬ−１βアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１βに特異的に結合する抗体）、ＩＬ−６アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−６に特異的に結合する抗体）、インターフェロンＩＦＮγアンタゴニスト（例えば、ＩＦＮγに特異的に結合する抗体）、ＩＬ−１０またはＩＬ−１Ｒａを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。
【０２２３】
一部の例では、開示されている方法は、ＤＥＤおよび／または眼の炎症の徴候または症状を低減または好転させるために使用され得る。被験体がＤＥＤを有する一部の例では、この方法は、灼熱感、眼の痒み、疼痛感覚、重い瞼、眼の疲れ、ただれ眼、乾燥感、眼の充血、羞明（光感受性）、ぼやけた視力、異物感（すなわち、砂粒または一部の他の物体もしくは物質が眼の中にある感覚）および涙目を低減または好転させるために使用され得る。被験体が炎症（例えば、慢性炎症）を有する一部の例では、この方法は、掻痒、過剰な涙産生、眼脂、疼痛、発赤、腫脹、流涙、および／または異常な温熱感もしくは熱を低減または好転させるために使用され得る（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３３６５５７号を参照されたい）。
【０２２４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、局所的に投与される。局所的形式の投与としては、局部適用、例えば点眼薬、または眼への投与のために製剤化された任意の他の医薬剤形が挙げられる。投与としては、例えば、融合タンパク質の解離による、またはコラーゲンが結合される場合にはコラゲナーゼによるコラーゲンの消化を介した、延長放出製剤が挙げられ得る。ある実施形態では、（全身的アプローチと比較して）顕著に少ない量の治療的ポリペプチドが、その治療的ポリペプチドが全身的に（例えば、静脈内で）投与される場合と比較して、局所的に（例えば、角膜に局部的に）投与される場合に効果を発揮し得る。一部の実施形態では、開示されている組成物は、結膜、角膜および／または前眼房に局部的に投与される。
【０２２５】
一部の実施形態では、投与は、眼またはそのサブコンパートメントへの送達のために特に適応された眼送達デバイスからである。例えば、このデバイスは、眼における埋め込みのために構成された無菌および／または生物学的に不活性な材料で作製され得る。このデバイスは、内部レザバ（例えば、眼内または眼外位置に配置された移植片から（米国特許第５，４４３，５０５号および同第５，７６６，２４２号を参照されたい））を使用し得、または外部レザバ（例えば、静脈内バッグから）を使用し得る。眼の内側に構成成分を局所的に投与するのに適切な種々のデバイスが、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，２５１，０９０号、米国特許第６，２９９，８９５号、米国特許第６，４１６，７７７号、米国特許第６，４１３，５４０号およびＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ００／２８１８７号を参照されたい。眼への薬剤の投与のための方法は、医療分野で公知であり、本明細書に記載される構成成分を投与するために使用され得る。
【０２２６】
レクチン由来の炭水化物結合アンカードメイン、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）もしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）由来のコラーゲン結合アンカードメイン、またはヘパリン結合アンカードメインおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニスト、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、インターロイキン（ＩＬ）−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、免疫グロブリン結合（Ｉｇ）ポリペプチド、インターフェロン（ＩＦＮ）γアンタゴニスト、ＩＬ−１ＲａもしくはＩＬ−１０またはそれらの有効な断片もしくはバリアントが挙げられる治療的ポリペプチドを含有する融合タンパク質の適切な局部製剤は、例えば、約０．１、１、１０、１００、１，０００または１０，０００μＭなどの融合タンパク質を含有する点眼薬である。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、単回用量または分割用量のいずれかとして、１日当たり約０．１、１、１０、１００、１，０００または１０，０００μＭの範囲の用量で投与され得る。具体的な非限定的な例では、この用量は、１日に約１、２または３回投与される。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４日間、または３もしくは４週間にわたって投与される。
【０２２７】
医薬組成物は、単回単位用量として、または複数の単回単位用量として、バルクで調製、パッケージングまたは販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の別々の量である。活性成分の量は一般に、被験体に投与される活性成分の投薬量、またはそのような投薬量の都合の良い一部、例えば、そのような投薬量の半分もしくは３分の１などに等しい。本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体および任意の追加的な成分の相対的な量は、処置される被験体の正体、サイズおよび状態に依存し、組成物が投与される経路にさらに依存して、変動する。例として、この組成物は、０．１％と１００％（ｗ／ｗ）との間の活性成分を含み得る。
【０２２８】
主要活性成分に加えて、ビヒクルおよび組成物は、種々の製剤成分、例えば、抗微生物防腐剤および張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。例えば、抗微生物防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、ＥＤＴＡ、ソルビン酸、ＰＯＬＹＱＵＡＤ（登録商標）および当業者に等しく周知の他の薬剤が挙げられる。そのような防腐剤は、使用される場合、典型的には、約０．０００１重量％〜１．０重量％の量で使用される。組成物の張度または質量オスモル濃度を調整するために使用され得る適切な薬剤としては、マンニトール、デキストロース、グリセリンおよびプロピレングリコールが挙げられる。使用される場合、そのような薬剤は、約０．１重量％〜１０．０重量％の量で使用される。しかし、この組成物は、角膜などの眼に有害な影響を与えるまたは眼を刺激することが公知の防腐剤も張度剤も含まない。
【０２２９】
活性成分に加えて、医薬組成物は、１種または複数の追加的な薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。本発明の医薬組成物の制御放出または持続放出製剤は、従来技術を使用して作製され得る。
【０２３０】
局部投与に適切な製剤としては、これだけに限定されないが、液体または半液体調製物、例えば、リニメント剤、ローション、水中油または油中水エマルション、例えば、クリーム剤、軟膏剤またはペースト、および液剤または懸濁剤が挙げられる。局部的に投与可能な製剤は、例えば、約０．０１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解度限界と同様の高さであり得る。局部投与のための製剤は、本明細書に記載される追加的な成分のうちの１種または複数をさらに含み得る。
【０２３１】
この医薬組成物は、無菌の水性または油性の懸濁剤または液剤の形態で調製、パッケージングまたは販売され得る。この懸濁剤または液剤は、公知の技術に従って製剤化され得、活性成分に加えて、追加的な成分、例えば、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤または懸濁化剤を含み得る。そのような無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどを使用して調製され得る。他の許容される希釈剤および溶媒としては、これだけに限定されないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液および不揮発性油、例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリドが挙げられる。有用な他の非経口的に投与可能な製剤としては、微結晶形態中に、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の構成成分として活性成分を含む製剤が挙げられる。持続放出または埋め込みのための組成物は、薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、やや難溶性のポリマーまたはやや難溶性の塩を含み得る。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、眼の投与に適切な製剤で調製、パッケージングまたは販売され得る。例えば、そのような製剤は、例えば、水性または油性液体担体中の活性成分の０．０１％〜１０％（ｗ／ｗ）液剤または懸濁剤を含む点眼薬の形態であり得る。そのような点眼薬は、緩衝剤、塩、または１種もしくは複数の本明細書に記載される他の追加的な成分をさらに含み得る。有用な他の投与可能な製剤としては、微結晶形態中またはリポソーム調製物中に活性成分を含む製剤が挙げられる。
【０２３３】
本明細書で使用される場合、「追加的な成分」としては、これだけに限定されないが、以下のうち１つまたは複数が含まれる：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；着色剤；防腐剤；生理的に分解性の組成物、例えば、ゼラチン；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝液；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；ならびに薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含まれ得る他の「追加的な成分」は、当該分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５年および米国特許第６，５３４，０５９号に記載されている。一部の実施形態では、追加的な薬学的に活性な薬物は、眼科組成物を作製するためにそのビヒクル中に含まれ得る。ビヒクル中で送達され得る薬物としては、これだけに限定されないが、ステロイド、増殖因子、抗酸化剤、アルドースレダクターゼ阻害剤、非ステロイド性抗炎症性薬、イムノモジュレーター、抗アレルギー薬、抗微生物薬およびベータ−遮断薬が挙げられる。
【０２３４】
投与処置は、上で特定した量を最終的に送達するために、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。これらの用量は、間欠性であり得る。さらに、被験体には、適切とされるだけの用量が投与され得る。一部の実施形態では、この被験体には、状態の発症の前に、融合タンパク質が投与される。投与は、単回投与または周期的ボーラスとして提供され得る。したがって、開示されている組成物は、毎時間、１日に１、２、３もしくは４回、毎日、１日おきに、または毎週投与され得る。開示されている組成物は、被験体が疾患状態の「再燃」を経験する場合に投与され得る。
【０２３５】
個々の用量は、典型的には、被験体に対して測定可能な効果を生じるために必要な量以上であり、対象組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝および排泄（「ＡＤＭＥ」）についての薬物動態学および薬理学に基づいて、したがって、被験体内での組成物の処分に基づいて決定され得る。これは、局所的適用のために調整され得る投与の経路ならびに投与量の考慮を含む。用量および／または用量レジメンの有効量は、前臨床アッセイ、安全性および上昇および用量範囲試験、個々の臨床医−患者関係、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイから、経験的に容易に決定され得る。一般に、これらのアッセイは、炎症、涙形成の速度、染料で染色することによる角膜上皮の完全性、または炎症もしくは涙形成の速度に影響を与える生物学的構成成分（サイトカイン、特定の炎症細胞、ミクログリアなど）の発現を評価する。
【０２３６】
一部の実施形態では、この方法は、治療利益、例えば、眼の障害および／もしくは炎症の発生を予防すること、その進行を停止させること、ならびに／またはその進行を逆転させることを生じる。被験体は、任意の形態の眼の障害、例えば、これだけに限定されないが、ドライアイ、シェーグレン症候群、角膜混濁または角膜瘢痕を有し得る。この被験体は、任意の形態の眼の炎症、例えば、緑内障、ブドウ膜炎、黄斑変性症、糖尿病網膜症、他の網膜の問題、または細菌もしくはウイルス感染、例えば、細菌性角膜炎感染によって引き起こされる炎症を有し得る。治療利益は、慢性炎症に起因する角化、瘢痕、潰瘍化および感染のリスクを低減させ得る。
【０２３７】
一部の実施形態では、この方法は、治療利益が達成されたことを検出するステップを含む。治療有効性の尺度は、改変される特定の疾患に適用可能であり、治療有効性を測定するために使用される適切な検出方法を認識する。適切な試験は以下に開示され、そのような試験としては、ドライアイの存在についての試験、例えば、シルマー試験、あるいはラクトフェリンもしくはリゾチーム含量、またはフルオレセインもしくは他の型の染料を含有する点眼薬が眼の外に流される速度を測定することが挙げられる。他の実施形態では、治療有効性の尺度としては、フルオレセイン、ＬＩＳＳＡＭＩＮＥ（商標）ｇｒｅｅｎまたは他の染料を使用して角膜上皮損傷を測定することが挙げられる。
【０２３８】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０２３９】
以下の実施例は、ある特定の実施形態の特定の特徴を例示するために提供されるが、特許請求の範囲は、例示された特徴に限定すべきではない。
【０２４０】
（実施例１）
この実施例は、ＴＮＦαをｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害するために、アンカードメインを有するＴＮＦαトラップを使用することを開示する。大量の結合タンパク質を固定化して、細胞外シグナル伝達分子のためのシンクを提供する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、角膜においてＬＰＳによって強く上方制御される、炎症の強力なメディエーターである（Ｓｅｋｉｎｅ−Ｏｋａｎｏ，  Ｍ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、３７巻：１３０２〜１３１０頁、１９９６年；Ｇｕｐｔａ，  Ｄ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５３巻：６５８９〜６５９９頁、２０１２年；Ｖｉｊ，  Ｎ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４６巻：８８〜９５頁、２００５年；Ｋａｌｌｉｏｌｉａｓ，  Ｇ．  Ｄ．ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、１２巻：４９〜６２頁、２０１６年；Ｗａｔｅｒｓ，  Ｊ．  Ｐ．ら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２３０巻：１３２〜１４７頁、２０１３年）。ＴＮＦαのためのシンクを、ＴＮＦα結合タンパク質ＴＢＰ１（Ｙｔｈｉｅｒ，  Ａ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、５巻：４５９〜４６２頁、１９９３年；Ｌｏｕ，  Ｊ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、７７巻：１０７〜１１５頁、１９９７年；Ｓａｋｉｍｏｔｏ，  Ｔ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５５巻：２４１９〜２４２３頁、２０１４年）とコラーゲンに結合するアンカードメインとの融合物（ＴＢＰ１ＣＯＬと略称する）を使用して創出する。
【０２４１】
Ｌ９２９線維芽細胞の７０〜８０％を死滅させるのに十分なＴＮＦαの量を、種々の量のＴＢＰ１ＣＯＬと共にプレインキュベートし、次いで、線維芽細胞に対するＴＮＦα活性を、記載されるようにアッセイする（Ｓｈｉａｕ，  Ｍ．  Ｙ．ら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ、１０巻：１９９〜２０８頁、２００１年）。比較のために、市販のタグなしＴＢＰ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を並行して力価測定（ｔｉｔｒａｔｅ）する。一部のＴＮＦαタンパク質を、樹脂に結合したままで、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８アミノ反応性染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識する（Ｈｕａｎｇ，  Ｓ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２５巻：７７９〜７８４頁、２００４年）（実施例９を参照されたい）。標識したＴＢＰ１ＣＯＬがＴＮＦα活性を中和する活性を上記のように試験する。
【０２４２】
結果：ＴＢＰ１ＣＯＬは、２つの機能性を有する。エフェクタードメインの機能を、市販のＴＢＰ１と類似し、高い結合親和性と一致する濃度でＴＮＦαを中和するその能力に基づいてアッセイする。アンカードメインの機能を、固定化されたコラーゲンＩＩＩへの結合に基づいてアッセイする（ＭｃＫｅｎｎａ，  Ｓ．  Ｄ．ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、３２２巻：８２２〜８２８頁、２００７年）。
【０２４３】
（実施例２）
この実施例は、ＬＰＳ誘導性炎症をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するために、アンカードメインを有するＴＮＦαトラップを使用することを開示する。
【０２４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏモデル：マウスを、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔し、創傷を、以前に記載されたようにＡｌｇｅｒＢｒｕｓｈ  ＩＩを用いて作製した（Ｂａｓｕ，  Ｓ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、６巻：２６６ｒａ１７２頁、２０１４年）。１滴の塩酸プロパラカイン（０．５％）を、デブリードマンの直前に各眼に添加し、２μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２０μｇのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、創傷を受けた角膜に適用する。市販のＬＰＳは汚染している；したがって、ＬＰＳを、以前に記載されたように精製する（Ｂｒｏｔｈｅｒｓ，  Ｋ．  Ｍ．ら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ、５巻：１４００３頁、２０１５年）。
【０２４５】
ＴＢＰ１ＣＯＬ用量：最大結合に必要な用量を、漸増量（０．１〜１０４μｇ／ｍｌ）の蛍光標識したＴＢＰ１ＣＯＬを２頭のマウスの角膜に添加することによってアッセイし、結合したタンパク質の相対的な量を、青色光光源および固定した距離にあるデジタルカメラを備えた解剖顕微鏡を用いて写真撮影することによって分析する。眼中の標識の相対的な量を、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて決定する。
【０２４６】
ＴＢＰ１ＣＯＬの単回用量の効果の時間経過：創傷形成の３〜４時間後に、４頭のマウスをビヒクルで処置し、４頭のマウスを、蛍光標識したＴＢＰ１ＣＯＬで処置する。マウスが麻酔から回復したときに、マウスをＬＰＳで処置する。次に、２、４、８、１６および３２時間後に、マウスの角膜を、上記のように解剖顕微鏡を用いて写真撮影する。涙液洗液を、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する１．５μｌのＰＢＳを結膜嚢中に滴下注入することによって収集し（Ｌｕｏ，  Ｌ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４５巻：４２９３〜４３０１頁、２００４年）、涙液および緩衝液を、外眼角において涙液メニスカスから１μｌ体積のガラス毛細管で収集し、３０μｌのＰＢＳ中に希釈し、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＩＰ−２およびＫＣについての多重イムノビーズのカスタムパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｕｐｓｔａｔｅ）によるサイトカインの決定に使用する（Ｃｏｒｒａｌｅｓ，  Ｒ．  Ｍ．ら、Ｃｏｒｎｅａ、２６巻：５７９〜５８４頁、２００７年）。結果を読み取る。
【０２４７】
治療効果を測定するための時点：マウスを、１、２、３および５日間にわたってビヒクルまたは未標識のＴＢＰ１ＣＯＬで１日に１〜３回（上記時間経過からの結果に依存して）処置する。涙液を上記のように収集および分析し、創傷のサイズを、フルオレセインによる染色後に写真撮影することによってモニターする。各時点において、角膜を、２頭のＴＢＰ１ＣＯＬ処置マウスおよび２頭の対照マウスから回収し、プロテアーゼ阻害剤を補充した２００μｌの組織タンパク質抽出試薬（ＴＰＥＲ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で手動マイクロホモジナイザーでホモジナイズし（Ｓｔａｐｌｅｓ，  Ｅ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３９４巻：１〜９頁、２０１３年）、遠心分離によって清澄化し、サイトカインプロファイルを上記のように分析する。試料の一部を、抗ＴＢＰ１抗体によるウエスタンブロッティングにも使用する。
【０２４８】
治療効果を決定する：実験群は以下の通りである（各々５頭のマウス）：（１）創傷なし、（２）ＰＢＳ単独、ＬＰＳなし（３）ＬＰＳ、（４）アンカードメインなしのＬＰＳ＋ＴＢＰ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、（５）ＬＰＳ＋未標識のＴＢＰ１ＣＯＬ、および（６）ＬＰＳ＋０．１％デキサメタゾン、全て内毒素を含まないＰＢＳ中。マウスを安楽死させ、読み出しは以下である：ａ）涙洗液中のサイトカインの濃度、ｂ）フルオレセインによる染色によって検出される創傷のサイズ（創傷が存在し、コラーゲンがＴＢＰ１ＣＯＬへの結合のためにアクセス可能であることを確実にするため）、ｃ）好中球の流入の尺度としてＥＬＩＳＡ（ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって決定される角膜抽出物中のサイトカインおよびミエロペルオキシダーゼ濃度（Ｌｅｅ，  Ｒ．  Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１１１巻：１６７６６〜１６７７１頁、２０１４年）。さらに、限定的な組織学的分析を以下のように使用する。マウスを、（３）〜（５）のように処置し（各群２頭のマウス）、角膜の切片を、コラーゲンＩまたはＩＶに対する抗体を用いて免疫染色し、同時に、ＴＢＰ１に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色してＴＢＰ１ＣＯＬを限局化し、対比染色としてＤＡＰＩで染色する。
【０２４９】
プロトコール：角膜におけるＬＰＳによる炎症の誘導は常に、ある形態の創傷形成を必要とし、創傷形成モデルが使用される（Ｂａｓｕ，  Ｓ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、６巻：２６６ｒａ１７２頁、２０１４年）。基底膜を穿通すると、創傷は治癒に４〜６日かかり（Ｂａｓｕ，  Ｓ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、６巻：２６６ｒａ１７２頁、２０１４年）、これにより、実質中のコラーゲンＩおよび／または基底中のコラーゲンＩＶに結合するアンカードメインが、これらおよび将来の実験において分析されるという実験的利点を提供する。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＬＰＳを使用する。なぜなら、それは、これが細菌性角膜炎と関連する臨床的に重要な病原体であり（Ｏｎｇ，  Ｈ．  Ｓ．ら、Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ  Ｊ、９１巻：５６５〜５７１頁、２０１５年；Ｆｌｅｉｓｚｉｇ，  Ｓ．  Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｔｏｍ、８５巻：２７１〜２７８頁、２００２年；Ｐｅｒｅｉｒａ，  Ｒ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｒｅｓ、７６巻：４１９〜４２７頁、２０１５年）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが、深層角膜潰瘍を引き起こす場合が多いからである（Ｔａｌｌａｂ，  Ｒ．  Ｔ．ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１００巻：７３１〜７３５頁、２０１６年；Ｐａｌｉｏｕｒａ，  Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１０巻：１７９〜１８６頁、２０１６年；Ｈａｚｌｅｔｔ，  Ｌ．  Ｄ．、Ｃｈｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ、９２巻：１８５〜１９４頁、２００７年）。
【０２５０】
読み出しは、炎症を特徴付ける重要なパラメータである。涙中のサイトカインの測定は、マウスの屠殺を必要としないが、材料の量は限定される。涙における顕著な測定値が、本明細書で使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｕｐｓｔａｔｅ試薬を用いてＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６について報告されている（Ｃｏｒｒａｌｅｓ，  Ｒ．  Ｍ．ら、Ｃｏｒｎｅａ、２６巻：５７９〜５８４頁、２００７年；Ｗｅｉ，  Ｙ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５２巻：４７８０〜４７８８頁、２０１１年）。ＬＰＳによって誘導される角膜炎症の特質である好中球の流入（Ｓｏｎｏｄａ，  Ｋ．  Ｈ．ら、Ｃｏｒｎｅａ、２４巻：Ｓ５０〜Ｓ５４頁、２００５年；Ｐｅａｒｌｍａｎ，  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２巻：４〜１８頁、２０１３年）を、ミエロペルオキシダーゼを測定することによって定量化する。ＭＩＰ−２およびＫＣは、ＬＰＳによって角膜において高度に上方制御されるケモカインであり、好中球の動員において主要な役割を有する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｃ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４６巻：５８９〜５９５頁、２００５年）。デキサメタゾンを、細菌誘導性炎症を処置するための標準治療陽性対照として使用する（Ｔａｌｌａｂ，  Ｒ．  Ｔ．ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１００巻：７３１〜７３５頁、２０１６年；Ｐａｌｉｏｕｒａ，  Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１０巻：１７９〜１８６頁、２０１６年；Ｈａｚｌｅｔｔ，  Ｌ．  Ｄ．、Ｃｈｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ、９２巻：１８５〜１９４頁、２００７年）。
【０２５１】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、創傷形成モデルについて元々報告されたように使用する（Ｂａｓｕ，  Ｓ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、６巻：２６６ｒａ１７２頁、２０１４年）。このマウス系統は、ＬＰＳによって一部媒介される穿孔性潰瘍の誘導により、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染に対して強く応答する（Ｈａｚｌｅｔｔ，  Ｌ．  Ｄ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４１巻：８０５〜８１０頁、２０００年）。角膜における自然免疫応答は、社会的ストレスによって強く影響され（Ｄｏｎｇ−Ｎｅｗｓｏｍ，  Ｐ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  Ｉｍｍｕｎ、２４巻：２７３〜２８０頁、２０１０年）、雌マウスでは比較的その懸念がないことから、雄マウスは回避する。最終実験のための群のサイズを、ＬＰＳ処置群ならびにＬＰＳおよびＴＢＰ１ＣＯＬ処置群（群３および５）における好中球の流入の厳密比較の検出力分析によって決定した。前提は、同様に創傷を受けＬＰＳで処置したマウスの研究から導出した、測定されたミエロペルオキシダーゼの半減の最小効果サイズ（ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｉｚｅ）、０．４の標準偏差（Ｖｉｊ，  Ｎ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４６巻：８８〜９５頁、２００５年）、対応のないｔ検定（ＰＳソフトウェア）を使用したα＝０．０５および０．９の検出力（Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｗ．  Ｄ．ら、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒｉａｌｓ、１９巻：５８９〜６０１頁、１９９８年）であった。データを、一元配置分散分析とその後の適切な比較のＴｕｋｅｙ事後検定によって分析する。
【０２５２】
結果：アンカーされていない構築物による処置は、対照と比較して効果がわずかである〜効果がなく（群３対群４）、アンカーされたＴＢＰ１ＣＯＬ構築物による処置は、はるかに大きい効果を有する（群３対群５）。最も直接的な尺度は、ＴＢＰ１ＣＯＬによる涙液膜からのＴＮＦαの除去である。ＬＰＳ処理した角膜においてＴＮＦαを遮断することで、炎症を低減させる。ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６は相互に関係するサイトカインであり、ＴＮＦαを遮断することは、炎症した角膜においてＩＬ−１βおよびＩＬ−６の発現を低減させ、好中球流入を低減させることが示されている（Ｊｉ，  Ｙ．  Ｗ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５４巻：７５５７〜７５６６頁、２０１３年）。
【０２５３】
（実施例３）
この実施例は、生物学的影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで遮断するために、アンカードメインに結合させたＩＬ−１０を使用することを開示する。アンカードメインに結合したＩＬ−１０は、持効性放出系を創出するためにコラーゲンに結合するシグナル伝達分子である。強力な抗炎症性サイトカインＩＬ−１０（Ｓａｂａｔ，  Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ、２１巻：３３１〜３４４頁、２０１０年）とコラーゲンに結合するアンカードメインとの融合物（ＩＬ−１０ＣＯＬ）を創出する；結合後、これは、解離および／またはコラーゲンのタンパク質分解によって緩徐に放出される。
【０２５４】
構築および精製：２つの構築物を、ヒトＩＬ−１０（これは、マウス細胞に対して活性である）を用いて創出する（Ｌｉｕ，  Ｙ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２巻：１８２１〜１８２９頁、１９９４年）：この２つは、いずれかの末端においてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーを介して接続された、上で使用したコラーゲン結合アンカードメインを有する。これらの構築物は、Ｈｉｓ６タグもまた含有し、タンパク質を、上記（実施例２）のように、製造者の指示（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎを使用するニッケル−キレートクロマトグラフィーによって、粗製抽出物から精製する。
【０２５５】
活性の測定：活性を、補因子としてＩＬ−４を用いたＭＣ／９細胞の成長の共刺激によってアッセイし（Ｄｏｌｌ，  Ｆ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ、１５巻：Ｒ１３８頁、２０１３年）、効力を市販の組換えＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と比較する。
【０２５６】
必要な用量：選択した構築物を、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８で標識し（実施例９を参照されたい）、用量を、実施例２と同様に力価測定する。
【０２５７】
理論的根拠：ＩＬ−１０は、多様な炎症プロセスにおいて強力な抗炎症的役割を有し、ＩＬ−１０の局所投与は、強力な治療薬として作用し得る（Ｓａｂａｔ，  Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ、２１巻：３３１〜３４４頁、２０１０年；Ｓａｘｅｎａ，  Ａ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７４巻：２７〜３４頁、２０１５年）。これは、活性を保持したまま、いずれかの末端においてタグ付けされている（Ｇｕｏ，  Ｙ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、８３巻：１５２〜１５６頁、２０１２年；Ｄｏｌｌ，  Ｆ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ、１５巻：Ｒ１３８頁、２０１３年；Ｔａｋａｇｉ，  Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：８５３０〜８５３４頁、１９９２年）。遺伝子導入によるＩｌ−１０の送達は、角膜同種移植片の生存時間を延長させるので、ＩＬ−１０は、角膜において効果を発揮することが以前に示されている（Ｓａｘｅｎａ，  Ａ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７４巻：２７〜３４頁、２０１５年；Ｋｌｅｂｅ，  Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７１巻：１２１４〜１２２０頁、２００１年）。
【０２５８】
結果：構築物の生物学的活性を評価する。
【０２５９】
（実施例４）
この実施例は、炎症をｉｎ  ｖｉｖｏで遮断するために、アンカードメインに結合させたＩＬ−１０を使用することを開示する。
【０２６０】
アンカーされたＩＬ−１０構築物のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果：アンカーされたＩＬ−１０は、実施例１および２で使用したアンカーされたＴＢＰ１とは原則として異なる機構によって炎症に対抗するが、実験は類似である。２つの構築物が存在し活性である時間の長さを、最初にアッセイする。
【０２６１】
結果：読み出しは、実施例２と同一であり、成功の判断基準は同じである。
【０２６２】
（実施例５）
この実施例は、角膜における炎症を管理するための融合タンパク質を創出することを記載する。アンカードメインおよび抗体に結合するドメイン（プロテインＡ、ＧまたはＬ由来）からなるアダプタータンパク質を創出する。これらのアダプターを、眼の重症炎症を引き起こす多くの病原性細菌によって産生されるリポ多糖で処置したマウスの角膜において試験する（Ｗｉｌｌｃｏｘ，  Ｍ．  Ｄ．、Ｏｐｔｏｍ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、８４巻：２７３〜２７８頁、２００７年）。任意の抗体を、アダプターを使用して眼の表面に結合させることができる。眼において炎症を引き起こすタンパク質に対する抗体（腫瘍壊死因子−αならびにインターロイキン−１βおよび６に特異的に結合する）を使用する（Ｊｉ，  Ｙ．  Ｗ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５４巻：７５５７〜７５６６頁、２０１３年；Ｓａｋｉｍｏｔｏ，  Ｔ．ら、Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＩＬ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ａｌｋａｌｉ  ｂｕｒｎ、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、９７巻：９８〜１０４頁、２０１２年；Ｏｋａｎｏｂｏ，  Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１５４巻：６３〜７１頁、２０１２年）。以下の群を比較する：１）処置なし、２）ステロイド（現行では最良の処置選択肢）、３）アダプター単独、４）各々の抗体単独、および５）アダプターありの抗体。転帰を、炎症をモニターするために従来より使用されている一連のパラメータを用いて測定する。アダプターなしの遊離抗体は、軽微な効果を有するかまたは効果を有さないが、固定化された抗体は、炎症を顕著に低減させる。
【０２６３】
（実施例６）
この実施例は、アンカードメインが、異種タンパク質を眼の表面に迅速に結合させるために使用され得ることを開示する。図１Ａについて、融合タンパク質を、フォン・ヴィルブランド因子由来の配列ＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）（Ａｎｄｒａｄｅｓ，  Ｊ．  Ａ．ら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２５０巻：４８５〜４９８頁、１９９９年）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコラゲナーゼ由来の２０ｋＤａの結合ドメイン（Ｎｉｓｈｉ，  Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９５巻：７０１８〜７０２３頁、１９９８年）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼ由来のコラーゲン結合ドメイン（Ｕｃｈｉｄａ，  Ｋ．ら、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ、１０２巻、１７３７〜１７４３頁、ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍ．ａ．３４８４１（２０１４年））、人工コラーゲン結合ドメイン（ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，  Ｓ．  Ｊ．およびＢｒｅｎｔａｎｉ，  Ｒ．  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ｓｅｎｓｅ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６７巻、１３７６３〜１３７６７頁（１９９２年））、またはＨＳ結合ドメイン（配列番号４）と共にＧＧＧＧＳリンカー（配列番号９）を使用して産生した。ｗｔは、アンカードメインなしの対照である。これらのタンパク質は、Ｈｉｓ６タグもまた含有した。粗製抽出物を、Ｂ−ＰＥＲ（商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および超音波処理を使用して作製し、タンパク質を、製造者の指示（ＲＯＣＨＥ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎを使用するニッケル−キレートクロマトグラフィーによって精製した。タンパク質を、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移した。精製されたタンパク質を、担体としての５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＰＢＳ中２００μｌ（およそ）カラムのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）またはコラーゲンＩＩＩアガロース（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標））に適用した。カラムを洗浄し、２ＭのＮａＣｌおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する同じ緩衝液で溶出した。画分中のＬａｃＺ活性を、オルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを使用する標準的な比色アッセイによってアッセイし、測定値を、カラムフロースルー（Ｆｔ）および溶出物（Ｅｌｕ）画分の活性測定値に対する高い塩の影響について調整した。データは、４回の決定の平均で��り、エラーバーは標準偏差である。
【０２６４】
図１Ｂについて、ウサギ眼（ＰＥＬＦＲＥＥＺ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ（商標））を、サンドペーパーでこすって、角膜の内部部分（「実質」）中のコラーゲンを曝露させることによって創傷形成した。酵素活性によって決定した等量のＬａｃＺ融合タンパク質を、２μｌのＰＢＳ中で２分間眼に適用し、眼を洗浄し、タンパク質を、ＬａｃＺの存在下で青色になるＸ−ｇａｌで検出した（上の列）。眼を写真撮影し、染色強度を、ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して決定した。これらの値は、４回の決定の平均であり、エラーバーは標準偏差である。
【０２６５】
考察：このデータは、ｖＷＦ因子およびＣｏｌＨのアンカードメインが、角膜中のコラーゲンへの迅速な結合を媒介し得ることを示している。一部の潜在的アンカードメイン（ａＣＢＤおよびＦＮ）が眼に結合できないことは、緩徐な結合動態に起因し得、および／または一部の潜在的結合部位が、例えばコラーゲン結合分子によってマスクされることに起因する。
【０２６６】
（実施例７）
この実施例は、眼の表面に迅速に結合するレクチンを開示する。図２Ａについて、０．１％ＢＳＡを有する１０μｌのＰＢＳ中の等量のフルオレセイン標識したレクチン（ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｌａｂｓ）を、ウサギ眼の表面に２分間適用し、眼を洗浄し、蛍光実体顕微鏡を使用して写真撮影した。２回の実験からの結果が示される。眼は、前日にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに曝露されており、眼の多くにおいて病変が誘導されている。図２Ｂについて、眼を、結合の競合相手である競合的阻害剤、０．２ＭのＧｌｎＡｃの存在下または非存在下で、図２Ａに示されるようにインキュベートした。二連の試料の一方が示される。
【０２６７】
考察：眼表面へのＷＧＡ結合に関する文献はあいまいであるため、この分析を実施した。Ｇｉｐｓｏｎら（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、９６巻：３３７〜３４５頁、１９８３年）は、角膜の表層上皮細胞中にはＷＧＡ反応性が存在しないことを報告しており、これは、局部的に適用されたＷＧＡアンカードメインを有する融合タンパク質が角膜に結合できないことを意味している。しかし、Ｈｏｌｍｅｓら（Ｃｏｒｎｅａ、４巻：３０〜３４頁、１９８５年）およびＷｅｌｌｓら（Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、４６巻：４８５〜４９７頁、１９８８年）は、これらの細胞におけるＷＧＡ反応性を報告している。Ｔｕｏｒｉら（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ、２６巻：７８７〜７９８頁、１９９４年）は、一連の１１のレクチンの中で、角膜における弱いＷＧＡ反応性を見いだしている。これらの研究は全て、平衡または近平衡条件におけるレクチンへの長い曝露を用いる組織化学的技術を使用して実施されたが、これは、短い曝露後の局部的に投与されたレクチンへの結合の評価を可能にしない。Ｃｈｅｎらは、器官培養物中の非固定角膜表面への結合レクチンを分析し、別のレクチン（コンカナバリンＡ）と比較したＷＧＡの最小結合を報告している。Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら（Ｃｌｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、４巻：９２５〜９３０頁、２０１０年）は、ヒトボランティアにおいて眼表面におけるグリコカリックスの構造を研究し、ＷＧＡの結合を報告したが、他のレクチンとの比較は提供していない。したがって、レクチン（複数可）が、点眼薬として角膜に適用される場合に治療的タンパク質のアンカーとして有用であることを予測することは、不可能であった。
【０２６８】
これらの実験は、ＷＧＡへの短時間の曝露が、試験したレクチンの中で最大の結合を生じたことを示している。特に、ＷＧＡは、角膜および強膜の両方の表面に結合し、創傷を受けた領域に強く結合する。ジャカリンおよびＣｏｎＡは、顕著な程度まで結合する。
【０２６９】
（実施例８）
この実施例は、眼疾患を処置するために産生された化合物を開示する。図３Ａは、以下のように、混濁を防止するためにＴＧＦβの活性を遮断するために使用され得る試薬を示す（上から下に）：Ｐ１４４についてはリンカー：
【化１３】
2020501510.tif 000014
、Ｐ１７についてはリンカー：
【化１４】
2020501510.tif 000015
を介してｖＷＦアンカードメインに融合させた、２つの遮断性ペプチドＰ１７およびＰ１４４（Ｄｏｔｏｒら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、３９巻：１０６〜１１５頁、２００７年；Ｅｚｑｕｅｒｒｏら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２２巻：１２〜２０頁、２００３年）。Ｐ１７およびＰ１４４ペプチドを二重にして、ＴＧＦβ結合を最大化する。２つのＰ１７ドメイン間にはリンカー
【化１５】
2020501510.tif 000016
があり、２つのＰ１４４ドメイン間にはリンカー
【化１６】
2020501510.tif 000017
がある。「アダプター」は、非共有結合相互作用を介して抗ＴＧＦβ抗体を含む大きなレパートリーの抗体に結合するプロテインＧの抗体結合ドメインに、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳリンカーを介してカップリングされたｖＷＦアンカードメインからなる（図７Ｂもまた参照されたい）。したがって、このアダプターは、抗体をコラーゲンに固定化するための一般的な分子デバイスとして機能し得る。あるいは、ＷＧＡへの抗体の共有結合性コンジュゲーションは、眼の表面への結合を可能にするアンカーを提供する（図２Ａ〜２Ｂを参照されたい）。図３Ｂは、ドライアイの病因にとって基本的な炎症を遮断するために使用され得る試薬を示す（Ｂｒｏｎら、Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ、１５巻：４３８〜５１０頁、２０１７年）。図３Ｂは、上から下に、以下を示す：アンカーされた形態の腫瘍壊死因子−α結合タンパク質１（ＴＢＰ１；ＯＮＥＲＣＥＰＴ（登録商標）としても公知）、ならびにアダプターを介してまたはＷＧＡの共有結合性コンジュゲーションによってアンカーされた、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＮＦγに対する抗体。
【０２７０】
（実施例９）
この実施例は、ＨＳ由来アンカーおよびｖＷＦ由来アンカーが、それらの同族リガンドへの治療的タンパク質の結合活性を付与することを例示している。図４Ａに例示される実験では、およそ１０μｌのヘパリンとコンジュゲートしたアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標））を、タンパク質なしで、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識したＩＬ−１Ｒａと共にインキュベートした。標識を、０．０５〜０．２５ｍｇ／ｍｌのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８カルボン酸、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標））と共に室温で１時間、１００ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ８．９中で精製されたタンパク質をインキュベートすることによって実施した。過剰なフルオロフォアを除去し、タンパク質を、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ、１０ｋＤａカットオフ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））における遠心分離によってＰＢＳに移した。いずれかの末端でタグ付けした等量のＡｎａｋｉｎｒａを、室温で２０分間、ビーズと共にインキュベートした。示される場合、ヘパリン（およそ１ｍｇ／ｍｌ）を競合相手として含めた。図４Ｂでは、ｖＷＦアンカードメインでタグ付けしたＰ１７を、ＩＬ−１Ｒａ（上記）と同じ様式でＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８で標識した。さらに、１０μｌのコラーゲンＩＩＩアガロース（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標））を、室温で２０分間、タンパク質なしで、または標識したＰ１７と共にインキュベートした。また対照として、タンパク質を、無関係のリガンドＧｌｎＡｃ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標））に結合したアガロースと共にインキュベートした。
【０２７１】
考察：このデータは、これらの薬理学的的に活性なタンパク質およびペプチドが、それらの同族リガンドに結合できるように、アンカードメインに結合され得ることを実証している。
【０２７２】
（実施例１０）
この実施例は、ＷＧＡが、レクチンの結合活性を維持したままで抗体に共有結合され得ることを例示している。ＷＧＡを架橋結合するために、１００〜２５０μｇのＷＧＡを０．５ｍｌのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）ＭＷ遠心分離デバイス、１０ｋＤａカットオフ中に配置し、５０〜１００μｌの最終体積になるように、５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸；２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０（緩衝液１）に移した。さらに、２０ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）および１００ｍＭのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を、水中に溶解させ、１／１０体積でＷＧＡ溶液と即座に混合し、室温で１０分間インキュベートした。反応物を、遠心分離デバイス中で緩衝液１で２回洗浄し、次いで、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５でもう１回洗浄した。次いで、抗体を、最小体積のＰＢＳ中で添加した。反応を室温で２時間進行させ、次いで、１００ｍＭのエタノールアミン１０μｌを添加することによってクエンチした。次いで、反応物を、１００ｋＤａ  ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）遠心分離デバイスに移し、ＰＢＳで洗浄して、ＷＧＡの単量体および二量体ならびに過剰なエタノールアミンを除去した。
【０２７３】
図５Ａは、ＧｌｎＡｃアガロースビーズへの市販のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））のＷＧＡ−コンジュゲートの結合特性を示す。上の写真は、ビーズ単独のバックグラウンド蛍光を示す。下の３枚の写真は、０．５Ｍのグルコース（これは、結合について競合しない）、０．５ＭのＧｌｎＡｃ（これは、結合について競合する）の存在下で、または添加なしで、ＷＧＡとコンジュゲートした抗体と共にインキュベートしたビーズを示す。
【０２７４】
図５Ｂは、図５Ａのデータを生成するために使用した実験と同様に実施した実験を使用して決定した、炎症性サイトカインへの中和抗体の結合を示す。データは、上から下に、以下の通りである：１Ｄ１１抗ＴＧＦβ１抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））、ＭＭ４２５Ｂ抗ＩＬ−１β抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））、ＭＰ６−ＸＴ２２抗ＴＮＦα抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））、抗ＩＬ−６  ＭＰ５−２０Ｆ３抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標））およびＨ２２抗ＩＮＦγ抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標））。
【０２７５】
考察：このデータは、ＷＧＡのためのカップリング手順が多目的であること、およびこれらのコンジュゲートがＧｌｎＡｃに対して強く特異的な結合活性を有することを実証している。図５Ｂは、コンジュゲートが糖リガンドに結合する能力を保持するように、治療的に価値がある５つの異なる標的に対する抗体がＷＧＡにコンジュゲートされ得ることを示している。ビーズはある程度の自己蛍光を有し、結合がビーズの周りの「リング」として現れることに留意されたい。
【０２７６】
（実施例１１）
この実施例は、眼の表面に、局部的に適用される治療的タンパク質を結合させるためのアンカードメインの使用を開示する。図６Ａは、２０ゲージ針を使用した実質（角膜の内側部分）への３０〜４０回の引っ掻きによってｅｘ  ｖｉｖｏで創傷形成したウサギ眼を示す。次いで、眼を、ｖＷＦアンカーに結合させ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８で標識したＰ１７またはＰ１４４と共にインキュベートした（実施例９を参照されたい）。タンパク質を、０．１％ＢＳＡを有する１０μｌのＰＢＳ中で２分間インキュベートした。図６Ｂは、図６Ａと類似の様式で創傷形成し、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））と共にインキュベートしたウサギ眼を示す。上の試料は、結合の競合相手として０．５ｍＭのＧｌｎＡｃをさらに含有した。
【０２７７】
考察：これらのデータは、アンカードメインに結合させた場合、治療的タンパク質が眼表面に結合できることを明らかにしている。ｖＷＦは、その高いコラーゲン濃度に起因して予測されたように、角膜中の創傷に強く結合する（Ｈａｓｓｅｌｌら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、９１巻：３２６〜３３５頁、２０１０年）。
【０２７８】
（実施例１２）
この実施例は、治療的タンパク質が、それらの生物学的および生化学的活性を維持したままでアンカーに結合され得ることを開示する。図７Ａについて、１０μｌのＧｌｎＡｃアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ（登録商標））を、ＷＧＡにコンジュゲートした未標識のＭＭ４２５Ｂ抗ＩＬ−１β抗体と共に（実施例１５を参照されたい）またはＷＧＡにコンジュゲートした無関係の抗体（抗ＴＧＦβ１  １Ｄ１１抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）））と共に２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２０分間時々振盪しながら、０．１％ＢＳＡを有する５μｌのＰＢＳ中で、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８（実施例９を参照されたい）で標識したＩＬ−１βと共にインキュベートした。ビーズを０．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて写真撮影した。図７Ｂについて、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．１％ＢＳＡを有する３０μｌのＰＢＳ中でアンカードメインありまたはなしで、１０倍モル濃度過剰なアダプターと共に２時間インキュベートした。遊離アダプターを、１００ｋＤａカットオフＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒデバイス（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））における遠心分離によって除去し、０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳで洗浄した。試料を、同じ緩衝液中で５０μｌになるように希釈し、アンカーありおよびなしの同じ量のアダプターを、一定の攪拌を伴って、コラーゲンＩコーティングしたＢＩＯＣＯＡＴ（登録商標）９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））のウェル中で２時間インキュベートした。広範な洗浄後に、結合した抗体を、パラ−ニトロフェニルホスフェートを用いた標準的な比色アッセイを使用して検出した。上のグラフは、コラーゲンでコーティングしたプレートに結合した活性を示し、下のグラフは、インプット活性を示す。
【０２７９】
考察：これらの実験は、抗体の結合活性が、ＷＧＡにコンジュゲートされたままで保持されることを示している。アダプターは、抗体をコラーゲンに結合させる一般的な手段として使用され得る。
【０２８０】
（実施例１３）
この実施例は、ＷＧＡが延長された期間にわたって眼表面上に残留することを開示する。図８について、７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／ｃは、屠殺の１１日前に、記載されたように（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｃｏｒｎｅａ、３３巻：１３３６〜１３４１頁、２０１４年）、涙腺を除去する手術を受けた。２ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン標識したＷＧＡの（ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１マイクロリットルを、眼に２分間適用し、マウスを、１０分後または７時間後に屠殺した。眼の周囲の領域をＰＨＢで洗浄して、可視化を妨害する、顕著な量の結合したコンジュゲートレクチンを除去した。眼を、蛍光実体顕微鏡を使用して写真撮影した。
【０２８１】
考察：このデータは、ＷＧＡが、眼表面における延長された滞留時間を促進するのに有用なアンカーであることを示している。
【０２８２】
（実施例１４）
この実施例は、混濁の形成をｉｎ  ｖｉｖｏで遮断するためにＴＧＦβ遮断剤（例えば、図３Ａに示されるＴＧＦβ遮断剤）を使用することを開示する。
【０２８３】
角膜混濁のマウスモデルが開発され、幹細胞移植の効果を分析するために広範に使用されてきた（Ｄｕら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２７巻：１６３５〜１６４２頁、２００９年；Ｂａｓｕら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、６巻：２６６ｒａ１７２頁、２０１４年）。混濁を誘導するために、マウスの角膜を、回転穿子を使用してサビを除去するために元々設計された装置を用いて基底膜を通して創傷形成する（ＡＬＧＥＲＢＲＵＳＨ（登録商標）ＩＩＲ；Ｓｔｅｐｐら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、１２１巻：１７８〜１９３頁、２０１４年）。混濁は、手術の２週間後に明確に明らかであり、筋線維芽細胞の大量の発生と関連し、これは、屈折矯正手術によって誘導される後の混濁と類似している（Ｔｏｒｒｉｃｅｌｌｉら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、１４２巻：１１０〜１１８頁、２０１６年；Ｔｏｍａｓ−Ｊｕａｎら、Ｊ  Ｏｐｔｏｍ、８巻：１４９〜１６９頁、２０１５年）。
【０２８４】
最適な結合のための用量を、眼１つ当たり１〜２μｌを使用して、ＰＢＳ中の漸増する用量、例えば、１、３．３、１０、３３、１００、３３０および１０００μｇ／ｍｌで、蛍光標識した化合物（実施例１４を参照されたい）を使用して最初に決定し、次いで、実施例２と同様に、結合した蛍光を写真撮影および定量化する。
【０２８５】
次いで、マウスを、最適な用量の蛍光標識した化合物で処置し、蛍光の保持を、例えば、１５分後、１、３、８、２４、４８および９６時間後に、時間をわたりモニターする。一部のマウスを回収し、角膜を、適切な抗体を用いたイムノブロッティングに使用して、タンパク質の完全性を決定する。
【０２８６】
混濁に対する効果を決定するために、マウスを、最適な用量の化合物で処置する。処置の頻度は、保持時間経過の結果に依存する。一部の例では、マウスを１日に２回処置し、これは、ヒト患者のための処置レジメンと適合性である。マウスが麻酔から回復した後で処置を開始し、創傷が閉じるまで継続する（手術後１〜３日）。創傷は、フルオレセインまたはＬｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎによる染色によって決定する。処置群（各々６頭のマウス）は、モック処置および各々の化合物による処置を含む。処置の後に、モック処置、ならびにアンカードメインありおよびなしの化合物（複数可）による処置を比較する同様の実験を行う。アンカーを有する化合物は、アンカードメインなしの対応する化合物よりもはるかに高い効果を発揮すると予測される。
【０２８７】
角膜デブリードマンの２および４週間後に、眼を収集し、眼球全体を、間接照明を用いて解剖顕微鏡を使用して画像化する（Ｈｅｒｔｓｅｎｂｅｒｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１２巻：ｅ０１７１７１２頁、２０１７年）。角膜の画像をカメラで捕捉し、混濁を含む眼画像の面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してマスクされた観察者が決定する。値の統計分析を、ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用して、Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（登録商標））を用いて実施する。線維化マーカー発現を、平滑筋アクチン、コラーゲンＩＩＩ型およびテネイシンｃを検出するプライマーを使用するｑＰＣＲによって測定し（Ｈｅｒｔｓｅｎｂｅｒｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１２巻：ｅ０１７１７１２頁、２０１７年）、筋線維芽細胞の存在を、標準的な技術を使用して抗平滑筋アクチンを用いて組織学的スライドを染色することによって決定する。
【０２８８】
これらの実験は、創傷形成誘導性角膜混濁を処置するための化合物をアッセイする。
【０２８９】
（実施例１５）
この実施例は、ドライアイを遮断するために化合物（例えば、図３Ｂのドライアイ遮断剤）を使用することを開示する。ドライアイは、基本的に自己免疫疾患であり、重要な炎症性サイトカインを遮断するための試薬を選択する（Ｂｒｏｎら、Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ、１５巻：４３８〜５１０頁、２０１７年）。
【０２９０】
２つのマウスモデルを使用する。一方のモデルでは、涙腺を外科的切除によって除去し（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｃｏｒｎｅａ、３３巻：１３３６〜１３４１頁、２０１４年）、他のモデルは、自己免疫調節因子遺伝子ノックアウトモデルである。両方のモデルが、ドライアイ疾患の優れたモデルとして確立されている（Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、９２巻：５５６〜５７０頁、２０１２年；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｃｏｒｎｅａ、３３巻：１３３６〜１３４１頁、２０１４年）。モデル１では、マウスが麻酔から回復した後で処置を開始し、１４日間継続する。モデル２では、マウスが５〜６週齢のときに処置を開始し、１４日間継続する。用量および処置レジメンは、実施例１４の記載と同様である。さらに、標準処置の比較として、追加の群を０．１％デキサメタゾン溶液で処置すること以外、処置群は同様である。
【０２９１】
処置を開始して２週間後、眼を、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎまたはフルオレセインで染色して、角膜上皮への損傷の程度を決定する（Ｗｏｌｆｆｓｏｈｎら、Ｏｃｕｌ  Ｓｕｒｆ、１５巻：５３９〜５７４頁、２０１７年）。炎症細胞浸潤を、フローサイトメトリーを使用して決定し、このとき、角膜を回収し、コラゲナーゼで解離させ、一連のフルオロフォアとコンジュゲートした抗体で染色して、好中球、マクロファージおよび単球ならびにＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４５＋細胞を検出する（Ｙｕｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８８巻：７８７０〜７８８０頁、２０１４年）。杯細胞密度は、ドライアイのマーカーであり、過ヨウ素酸シッフ染色プロトコールを使用して決定する（Ｚｈａｎｇら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、１１８巻：１１７〜１２４頁、２０１４年；Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、５６巻：７５４５〜７５５０頁、２０１５年）。これらの実験は、ドライアイ処置について治療的タンパク質をアッセイする。
【０２９２】
（実施例１６）
この実施例は、レクチンであるジャカリンおよびｃｏｎＡ（コンカナバリンＡ）が、レクチンの結合活性を維持したままで抗体に共有結合され得ることを例示している。レクチンを、実施例１０と同様に、市販の抗体、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））に架橋結合させ、針で引っ掻いたウサギ眼上で実施例１１と同様にインキュベートした。この実施例で使用した眼を凍結した。眼は、上皮の残遺物（白の矢印）から引っ掻きの内側への結合を示す（図９）。競合実験のために、競合相手である０．２Ｍのガラクトース（ジャカリン）または０．２Ｍのメチルα−Ｄ−マンノピラノシド（ｃｏｎＡ）を添加した（図９）。
【０２９３】
考察：このデータは、レクチンのためのカップリング手順がジャカリンおよびｃｏｎＡに使用され得、得られたコンジュゲートが眼中の組織に結合することを実証している。結合は、同族リガンドとの競合を示すので、特異的である。したがって、抗体をレクチンにコンジュゲートすることは、抗体を眼中の組織に結合させるための汎用的な手順である。
【図１】
2020501510.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020501510.tif 000024
【図８】
2020501510.tif 000025
【図９】
2020501510.tif 000026
【配列表】
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【国際調査報告】
2020501510.tif 000027
2020501510.tif 000028
2020501510.tif 000029
2020501510.tif 000030
2020501510.tif 000031