(57)【要約】  化合物を産生する微生物の分析のための方法であって、以下の方法を含む：ａ．目的の化合物を産生する微生物と、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を提供すること；ここで、目的の前記化合物を生産する微生物と、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、単一の液滴に組み合わされ、各液滴は、各株の少なくとも一つの細胞を含む；ｂ．マイクロ流体システムへ液滴を供すること；ｃ．検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）のレポーター遺伝子の活性化について液滴を分析すること；発現されたレポーター遺伝子を有する検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む、液滴をソートし収集すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の化合物を産生する微生物の分析のための方法に関し、以下の方法を含む：
ａ．目的の化合物を産生する微生物と、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を提供すること；ここで、目的の前記化合物を生産する微生物と、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、単一の液滴に組み合わされ、各液滴は、各株の少なくとも一つの細胞を含む；
ｂ．マイクロ流体システムへ液滴を供すること；
ｃ．検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）のレポーター遺伝子の活性について、液滴を分析すること；
ｄ．発現されたレポーター遺伝子を有する検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む、液滴をソートし収集すること。
【請求項２】
化合物を産生する微生物および／または検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）が、細菌、真菌、酵母、藻類、真核生物、原核生物または昆虫の菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子の前記産物が、蛍光シグナルを生成する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの変異体、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＹＦＰの変異体、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＲＦＰの変異体、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＣＦＰの変異体のような蛍光タンパク質をコードするか、または、レポーター遺伝子オペロンが、ルクス（ｌｕｘ）オペロンのような発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）オペロンである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
インキュベーションが、マイクロ流体システム内で実行される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
化合物が、
Ｌ-およびＤ-アミノ酸；
Ｌ-アラビノース、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン、Ｎ-アセチル-Ｄ-マンノサミン、Ｎ-アセチルノイラミネート、ラクトース、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-グルコース-６-ホスフェート、Ｄ-キシロース、Ｄ-ガラクトース、グリセロール、マルトース、マルトトリオースおよび、メリビオース、のような糖および炭素源；
シチジン、グアニン、アデニン、チミジン、グアノシン、アデノシンなどのヌクレオシド；
ヘキサデカノエートおよびグリセリン−三リン酸などの脂質；
インドール、マルトヘキソース、マルトペントース、プトレシン、スペルミジン、オルニチン、テトラデカノエート、およびニコチンアミド  アデニンジヌクレオチド
を含み、これらに限定されない、一次代謝産物：または、
二次代謝産物である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２種類の細胞を共封入することができるマイクロ流体デバイスであって、そのデバイスは以下を含む：
ａ．第１の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
ｂ．第２の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
ｃ．培養培地と不混和の相のための少なくとも１つの入口；
ｄ．各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成し、そして、液滴を、不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適している、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー；
ｅ．所望によって、液滴を、一定または可変の温度でインキュベートする手段；
ｆ．所望により、レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
ｇ．所望により、液滴をソートするための手段と結合した出口。
【請求項８】
少なくとも二つのタイプの細胞を共封入することができる、請求項７に記載のマイクロ流体デバイスであって、このデバイスは以下を含む。
ａ．第１の培地の液滴を生成し、そして、その液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
ｂ．第２の培地の液滴を生成し、そして、その液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
ｃ．第１の培地の液滴を、第２の培地の液滴と混合し、そして、続いて、前記液滴を融合させて、第１の培地と第２の培地の混合物を含むより大きな液滴を生成するためのチャンバー。
【請求項９】
少なくとも二つのタイプの細胞を共封入することができる、請求項７に記載のマイクロ流体デバイスであって、このデバイスは以下を含む。
ａ．第１の培地の液滴を生成し、そして、その液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
ｂ．第１の培地の液滴を、第２の培地と、ピコインジェクション（ｐｉｃｏ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって混合し、第１の培地と第２の培地の混合物を含む液滴を生成するためのチャンバー。
【請求項１０】
検出器が、蛍光検出器である、請求項７乃至９のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
検出器が蛍光検出器であり、そして、蛍光強度を定量化することができる、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記検出器がコンピューティングデバイス（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）に結合されている、請求項７乃至１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記デバイスが、液滴を、１８℃から５０℃の間の温度範囲でインキュベートするための手段を含む、請求項７乃至１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
液滴をソートするための前記手段が、液滴の誘電ソート（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を含む、請求項７乃至１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法における、請求項７乃至１４のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は細胞培養分析の分野に関係する。より正確には、単一細胞レベル（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ）での細胞培養分析の分野である。
本出願は、また、マイクロ流体工学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の分野、特に、マイクロ流体分析およびデバイスの分野でもある。
【０００２】
技術背景
今日、糖、アミノ酸、抗生物質、炭素源または窒素源などの生物学的化合物および他の化学的ビルディングブロックの生産は、しばしば微生物において効率的に行われている。
遺伝子工学のツールを使用することで、化合物の増産のために微生物を最適化することが可能である。
これらの最適化された微生物は、遺伝的に改変された生物の大きなライブラリーを作製することができる、様々な変異原性（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）／コンビナトリアルの戦略を用いて作製される。
【０００３】
しかし、すべての戦略の障害（ｄｒａｗｂａｃｋ）またはボトルネックは、個々のライブラリメンバーを分析するために使用されるスクリーニング方法である。
関連するスクリーニング方法は、製造される分子に依存するが、一般に、スクリーニング方法は、クロマトグラフィーおよびその後の検出、多くの場合、質量分析に基づいている。
これの大きな欠点は、分析できるクローンの数が限られているため、並列化（ｐａｒａｌｌｅｌｉｚａｔｉｏｎ）と高スループット（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）を達成するのが難しいことである。
したがって、化合物、特にアミノ酸または糖などの小分子または中間の化学ビルディングブロックの製造において改善された特性を示す株の検出を可能にする、新しいスクリーニング方法が必要とされている。
【０００４】
１つのアプローチは、生産培地中の小分子の分析または同定のためのバイオセンサーの使用であった。
Ｐｆｌｅｇｅｒは（Ｐｆｌｅｇｅｒ  Ｂ．Ｆ．ら（２００７）、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．９：３０−３８）、メバロン酸バイオセンサーとして好適であり、そして、細胞外環境中のメバロネートの定量的検出を可能にする、メバロネートの存在下にＧＦＰを発現する、大腸菌株の生成を開示する。
ベルテルスは（Ｂｅｒｔｅｌｓ  Ｆ．ら、（２０１２）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（７）：ｅ４１３４９）、ｅＧＦＰ遺伝子を含む、栄養要求性大腸菌株に基づく、アミノ酸に対するバイオセンサーの開発を開示する。
ＵＳ９，２７９，１３９Ｂ２は、ｌｕｘオペロンを含む、大腸菌グルタミンバイオセンサーを開示する。
しかしながら、これらの方法の全ては、コロニーの大きなライブラリーの迅速な分析を可能にしないので、依然として制限されている。
したがって、微生物ライブラリーのハイスループットスクリーニングを可能にする、改善されたスクリーニング方法が依然として必要とされている。
【０００５】
発明の簡単な説明
【０００６】
本発明は、マイクロ流体デバイスと伝統的なスクリーニング手法を組み合わせ、これにより、細胞培養の代わりに、単一細胞レベルに分析を落とし込むことにより、この問題を解決することを目的とする。
【０００７】
本発明は、微生物、好ましくは、目的の化合物を生成する微生物、の分析および／または選択をするための方法に関し、その方法は、以下を含む：
ａ．目的の化合物を生産する微生物と、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を提供すること、
ここで、目的の前記化合物を生産する微生物と、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、単一の液滴に組み合わされ、各液滴は、各株の少なくとも一つの細胞を含む；
ｂ．マイクロ流体システムへ液滴を供し；
ｃ．検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）のレポーター遺伝子の活性について、液滴を分析し；
ｄ．活性なレポーター遺伝子を持つ検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む、液滴をソートし収集すること。
【０００８】
本発明はさらに、目的の化合物を産生する、変異微生物（ｍｕｔａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の分析のための方法の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、少なくとも２種類の細胞を同時にカプセル化する（ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）ことができるマイクロ流体デバイスに関し、そのデバイスは以下を含む：
a.  第１の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
c.  所望により、不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）のための少なくとも１つの入口；
d.  各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成するのに適しており、そして、所望により、液滴を、不混和性相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適している、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー；
e.  所望により、液滴を、一定または可変の温度でインキュベートする手段；
f.  所望により、レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
g.  所望により、液滴をソートするための手段とソートされた液滴のための出口。
本発明はさらに、前記マイクロ流体デバイスの使用に関する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、改良された性質について微生物を分析するための方法に関する。
本発明は、特に、生物学的化合物を産生することができる微生物のスクリーニング方法に関する。
他のスクリーニング方法とは対照的に、クレームされたスクリーニング方法は単一細胞レベルでの分析を可能にする。
本発明はさらに、その方法を実行するのに適したマイクロ流体デバイスに関する。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、化合物を産生する微生物の分析および／または選択のための方法に関し、以下の方法を含む：
a.  目的の化合物を産生する微生物と、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ    ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を提供すること；ここで、目的の前記化合物を生産する微生物と、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、単一の液滴に組み合わされ、各液滴は、各株の少なくとも一つの細胞を含む；
b.  マイクロ流体システムへ液滴を供すること；
c.  検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）のレポーター遺伝子の活性について液滴を分析すること；
d.  活性なレポーター遺伝子を有する検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む、液滴をソートし収集すること。
本発明の文脈において、活性化されたレポーター遺伝子またはレポーター遺伝子の活性は、検出可能な遺伝子産物の発現を指す。
前記遺伝子産物は連続的に発現されていてもよく、または発現は特定の条件下で誘発されてもよい。
【００１１】
前記方法の好ましいワークフローの一般的な概略を、図１〜３に示した。
この方法は、単一細胞レベルで処理することができる、任意の種類の微生物に適している。
化合物を産生する微生物と検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）とは同種でも異種でもよい。
この方法は、所望の化合物の産生を最適化するために、突然変異しているかまたは遺伝子操作されている微生物の分析に特に適している。
【００１２】
本発明の一実施形態では、化合物を産生する微生物は、したがって、突然変異または遺伝子操作された生物である。
突然変異生物または遺伝子操作生物は、当業者に公知の手段によって作製することができる。
微生物に突然変異を誘発するサンプルの方法は、放射線への暴露、特に、ＵＶ放射線や放射性放射線；ストレス、ファージやウイルス、トランスポゾン、突然変異誘発；相同組換え；代謝工学、または化学的突然変異誘発を含み、これらに限定されない。
あるいは、化合物を産生する微生物は、修飾または突然変異された、酵素または生合成経路を含むプラスミドまたはコスミドを含む。
【００１３】
変異された又は化合物を製造する、適当な微生物は、細菌株、古細菌株、真菌株、酵母株、藻類、植物プロトプラスト、原核生物または真核細胞、胞子、昆虫細胞または昆虫株を含むが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施形態では、目的の化合物を生産する微生物は、細菌株、真菌株又は酵母株である。
最も好ましい実施形態では、化合物を生産する微生物は、細菌または真菌株である。
本発明の好ましい実施形態では、目的の化合物を産生する微生物のライブラリーを作製し、分析する。
本発明の方法は、特に、微生物のライブラリーにおける、化合物のより高い生産性と化合物のより高い最終力価を発揮する微生物をスクリーニングするのに適している。
目的の化合物の化学的性質は本発明の方法の性能に影響を及ぼさないので、Ｗａｎｇ（Ｗａｎｇ  Ｂ．Ｌ．ら．（２０１４）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（５）：４７３−４７８）に開示された、細胞外での化合物の製造に基づく、細胞の培養及び選択のためのマイクロ流体システムに対する、本明細書に開示された方法の重要な利点は、その汎用性にある。
それ故、製造された目的の化合物は、微生物によって、培地に、エクスポートまたは分泌されることができ、そして、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）によって検出することができる、任意の化合物であることができる。
化合物は、好ましくは、直接商業的価値を有するか、または商業的価値を有する別の化合物の製造における中間体として提供することができる。
【００１４】
適切な化合物には、一次代謝産物：
Ｌ-およびＤ-アミノ酸；
Ｌ-アラビノース、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン、Ｎ-アセチル-Ｄ-マンノサミン、Ｎ-アセチルノイラミネート、ラクトース、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-グルコース-６-ホスフェート、Ｄ-キシロース、Ｄ-ガラクトース、グリセロール、マルトース、マルトトリオースおよび、メリビオース、のような糖および炭素源；
シチジン、グアニン、アデニン、チミジン、グアノシン、アデノシンなどのヌクレオシド；
ヘキサデカノエートおよびグリセリン−三リン酸などの脂質；
インドール、マルトヘキソース、マルトペントース、プトレシン、スペルミジン、オルニチン、テトラデカノエート、およびニコチンアミド  アデニンジヌクレオチド
を含み、これらに限定されない。
【００１５】
目的のさらなる関連化合物としては、二次代謝産物が挙げられるが、これに限定されない。
そのような代謝産物は、生産微生物（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）によって天然に生産され得るが、遺伝子工学によって微生物に導入された異種生合成経路によっても生成され得る。
【００１６】
二次代謝産物の例としては、
ポリケタイド（エリスロマイシン及びアベルメクチンなど）、
小分子（レスベラトロール、ステビオール、及びアルテミセニンなど）、または非リボソームペプチドを含み、これらに限定されない。
検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）はまた、単一細胞レベルで取り扱われ得る任意の生物であり得る。
変異された、または遺伝子操作されてもよい適切な微生物は、細菌株、古細菌株、真菌株、酵母株、藻類、植物プロトプラスト、原核または真核細胞、胞子、昆虫細胞または昆虫株を含み、これらに限定されない。
好ましくは、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、目的の化合物を産生する株とは異なる微生物である。
より好ましくは、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は細菌株である。
最も好ましくは、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は大腸菌株である。
検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含まなければならない。
好ましくは、前記レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンは、目的の化合物を検出するための検出可能なシグナルを生成する。
【００１７】
一実施形態では、前記検出可能なシグナルの強度は、生成された化合物の量と相関する。
別の実施形態では、前記シグナルの強度は、産生される化合物の量とは無関係である。
好ましい態様において、検出可能なシグナルは蛍光シグナルである。
一実施形態では、前記蛍光シグナルは、レポーター遺伝子産物またはレポーター遺伝子オペロンによって生成される。
好ましい態様において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの変異体、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＹＦＰの変異体、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＲＦＰの変異体、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＣＦＰの変異体のような蛍光タンパク質をコードするか、または、レポーター遺伝子オペロンは、ルクス（ｌｕｘ）オペロンのような発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）オペロンである。
【００１８】
前記タンパク質の相同体を使用することができるかは、当業者に知られている。
好ましくは、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は大腸菌株である。
より好ましい態様において、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、目的の化合物の検出用に最適化された、変異された大腸菌株である。
大腸菌株は、標準および既知の技術によって、容易に変異させることができる。
目的の化合物の検出には２つの一般的な可能性がある。
本発明の第１の態様において、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）のレポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンは、前記化合物の存在下で活性化され得る。
可能な例は、タンパク質発現に利用される、修飾されたｌａｃ−オペロンであろう。
化合物および生物に応じて、適切ないくつかの可能なオペロンが当業者に知られている。
一般に、適切なオペロンは、通常、化合物の分解または代謝を引き起こす。
【００１９】
１つのさらなる可能性は、Ｔａｙｌｏｒ（Ｔａｙｌｏｒ  Ｎ．Ｄ．ら、（２０１６）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３：１７７〜１８３）によって記載されているような、修飾アロステリック転写因子の使用であるか、または、Ｒｏｇｅｒｓ（Ｒｏｇｅｒｓ  Ｊ．Ｋ．ら、（２０１５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３：７６４８〜７６６０）によって記載されているような合成バイオセンサーの使用である。
代替の好ましい検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、化合物に対して栄養要求性であり得る、すなわち、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、前記化合物の外因的供給なしには生存できない。
この場合、レポーター遺伝子は継続的に活性化され得る。
【００２０】
本発明の第１の側面の他の実施形態によれば、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、目的の化合物に対して栄養要求性である。
化合物Ａに対して栄養要求性である検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、化合物Ａが、培養培地中に存在しない限り、成長することができない。
そのような微生物は、その微生物に１つ以上の遺伝子のノックアウトを介して生成することができる。
これらの遺伝子が存在しないと、該微生物は、化合物Ａを合成することができないであろう。
場合によっては、化合物Ａは成長に直接必要である。
他の場合において、化合物Ａは、成長に必要とされる化合物Ｂの合成のための中間体として提供される。
したがって、化合物Ａの合成を妨げることは、化合物Ｂの合成を妨げ、そして細胞増殖を妨げる。
【００２１】
栄養要求性微生物を生成する方法は、当業者に知られている。
適切な方法は、ノックアウト突然変異体の生成またはランダム突然変異誘発を含む。
あるいは、いくつかの天然の微生物は、特定の化合物に対して栄養要求性である。
ほとんどの場合、前記微生物は、アミノ酸に対して栄養要求性である。
ゲノムスケールモデル（ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｏｄｅｌｓ）が利用可能である場合、感知され得る（ｓｅｎｓｅｄ）化合物および栄養要求性を達成するためにしなければならない対応する遺伝子ノックアウトは、利用可能なゲノムスケールモデル（ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｏｄｅｌｓ）の周囲に定式化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）計算最適化（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）問題に基づいて決定され得る（例えば、Ｔｅｐｐｅｒら、（２０１１）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（１）：ｅ１６２７４）。
遺伝子ノックアウトは、相同的組換え、ＰＣＲ産物による遺伝子不活性化（例えば、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）、ＰＮＡＳ  ９７（１２）：６６４０−６６４５）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、トランスポゾン突然変異誘発およびファージ形質導入を含むが、これらに限定されない様々な方法により達成され得る。
したがって、栄養要求性センサー株は、わずかな労力と時間で、今日生成することができる。
生成した栄養要求性微生物はまた、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質またはその誘導体（例えば、ｅＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質またはその誘導体（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、シアン蛍光タンパク質またはその誘導体、黄色蛍光タンパク質またはその誘導体）またはその発現が発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）をもたらす遺伝子のオペロン（ｌｕｘオペロンなど）であり得るレポーター分子を発現するように操作することもできる。
好ましい実施形態において、生成した栄養要求性微生物はまた、蛍光タンパク質（ｅＧＦＰのような緑色蛍光タンパク質又はその誘導体、ｍＣｈｅｒｒｙのような赤色蛍光タンパク質またはその誘導体、シアン蛍光タンパク質またはその誘導体、黄色蛍光タンパク質またはその誘導体）またはその発現が発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）をもたらす遺伝子のオペロン（ｌｕｘオペロンなど）であっても良い、レポーター分子を発現するように操作される。
【００２２】
本発明の第１の態様の他の実施形態によれば、目的の化合物を産生する微生物およびレポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）が培地中に提供される。微生物の培養は当業者に知られている。一般に、微生物は、液体培地中または固体培地上で培養される。一般に、固体培地は液体培地に基づいている。分析前に、細胞は、任意の適切な培地で培養することができる。適切な培養培地は、微生物に依存する。
当業者は、一般に、例えばＬＢ培地などの未規定の培地と、規定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）、特にＭ９最少培地またはＭＯＰＳ最小培地などの最少培地とを区別する。
【００２３】
未規定培地は、通常、水、炭素源、蛋白質及び窒素源および塩を含む。
一般に、炭素、タンパク質および窒素源は、抽出物、例えば酵母および／または牛肉抽出物またはトリプトンやペプトンなどのタンパク質の加水分解物であり得る。具体的な（ｅｘａｃｔ）アミノ酸組成物および、塩の濃縮物または組成物は通常未知である。
一方、規定された培地は正確に知られている。規定培地では、使用されるすべての化学物質は既知であり、そして、他の化合物の濃度は既知である。
最少培地の特定の場合において、培地は、一般的に、アミノ酸が存在せずに、コロニー成長のための可能な最小の栄養素を含む。
総ての生物はどの培地でも増殖することができないので、使用する微生物の種類に、選択された培地を適応させることが必要である。
分析には、両方の微生物の生存を可能にする培地が必要である。
選択された微生物によって、当業者は、正しい増殖培地を知っており、そして、選択することができる。
従って、この方法は、あらゆる微生物の組み合わせには適していない。例えば、高塩濃度の培地を必要とする微生物を、低塩濃度を必要とする微生物と一緒に培養することは不可能である。
したがって、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は、目的の化合物を産生する微生物に応じて選択する必要がある。
本発明の別の実施形態によれば、培養培地は、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）および目的の化合物を産生する微生物を培養するのに適している。
好ましくは、分析前に、本発明の方法に従って、微生物を適切な培地中で別々に培養する。
本発明の一実施形態において、微生物は培養され、そして完全培地中でインキュベートされる。
別の実施形態では、微生物は規定培地、好ましくは最少培地で培養される。
本発明の別の実施形態では、目的の化合物を産生する微生物は、完全培地中で培養され、そして、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は規定培地中、好ましくは最少培地中で培養される。
本発明者らは、検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）と目的化合物を産生する微生物を含む培養培地中に含まれる栄養素を調整する手段によって、目的の化合物を産生する前記微生物を含む液滴を区別することが可能であることを見出した。
次いで、分析のために、微生物はそれぞれの培地中で使用されるか、または分析培地中に移される。好ましくは、前記分析培地は規定培地である。より好ましい実施形態では、前記分析培地は最少培地である。
当業者は、細胞培養物を異なる培地に移す方法を知っている。
一実施形態では、異なる培養培地を単に混合して新しい培養培地を形成する。
好ましい態様において、微生物は、細胞を標的培地に懸濁することを含む、いくつかの遠心分離および洗浄工程を用いて移される。
分析培地中の微生物は、次に希釈されおよび／または単一の液滴に封入される。
液滴生成は当業者に知られている。好ましくは、前記液滴はマイクロ流体デバイスを用いて生成される。好ましくは、液滴生成中に、化合物を産生する微生物と検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）とが一緒にされる。あるいは、化合物を産生する微生物および検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）を、別々の液滴に希釈し、そして、それぞれが微生物のうちの１つを含む２つの液滴を単一の液滴にまとめる。
液滴生成の方法にかかわらず、最終的な液滴の大部分は、各種類の少なくとも１つの微生物、すなわち、目的の化合物を産生する少なくとも１つの微生物および少なくとも１つの検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含むことが好ましい。好ましくは、液滴の大部分は各微生物の１つの細胞を含む。
検出用微生物と目的の化合物を産生する微生物の両方の微生物の増殖を補助するため、および産生微生物による前記化合物の産生を補助するために、液滴がすべての必要な化合物をさらに含むことが不可欠である。
【００２４】
微生物を含む液滴は、環境から内容物を分離するためにさらに封入されてもよい。封入の可能な方法は、ＷＯ２０１０／０６３９３７Ａ１のパンフレットに記載されている。好ましい実施形態では、液滴は柔らかいアルギン酸塩シェルに封入される。あるいは、液滴は、液滴を分離または封入するために、培地と不混和の相を使用して環境から分離される。一実施形態では、前記不混和相は油である。より好ましい実施形態では、前記不混和相はフッ素化油である。
一の実施形態では、目的の化合物を産生する微生物と、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む液滴は、１ｐＬおよび１μＬとの間の体積を有する。
本発明者らはまた、液滴サイズを制御すること、特に単分散集団（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を維持することが重要であることも見出した。
一貫した液滴サイズは、微生物が同等の環境にさらされるように液滴間で一貫した条件を維持するために重要である。
液滴を希釈し、所望により、封入した後、微生物を、適切な時間、インキュベートする。
前記インキュベーションは、マイクロ流体デバイス内で直接行われてもよく、またはマイクロ流体デバイスとは分離されて行われてもよい。
インキュベーションは可能な限り行われる。
しかしながら、液滴がインキュベーション中に無傷のままであることが重要である。
安定な液滴は、マイクロ流体デバイスの外側でインキュベートされ、そして、その後再びマイクロ流体デバイスに供されてもよい。
独立して液滴と微生物が培養されるところから、その微生物は、適切な温度でインキュベートされることが好ましい。
適切な温度は、液滴中の微生物および化合物を製造するための要件に依存する。
例えば、大腸菌などの細菌培養物は、通常、２０〜３７℃の温度を必要とする。
一実施形態では、インキュベーション温度は１８℃から５０℃の間である。
好ましい実施形態では、インキュベーション温度は、２０から４８℃の間である。
より好ましい態様において、インキュベーション温度は、２５〜４５℃である。
さらにより好ましい態様において、インキュベーション温度は、３５〜４０℃の間である。
最も好ましい態様において、インキュベーション温度は３７℃である。
温度は、インキュベーション中に変化してもよく、または一定であってもよい。
本発明の一の実施形態では、微生物を含む液滴を一定温度でインキュベートする。
別の実施形態では、微生物を含む液滴は、様々な温度でインキュベートされる。
インキュベーション時間はそれに応じて選択する必要がある。
一般的には、インキュベーション時間は、微生物が成長し、目的の化合物を生産し、検出できるように、十分に長くする必要がある。時間は、培地、温度および微生物によって変わる。
「富化」培地と、微生物の最適温度に近い温度は、短いインキュベーション時間を齎す。
インキュベーションの後、液滴は、マイクロ流体デバイスで分析され、レポーター遺伝子の活性化についてスクリーニングする。
【００２５】
検出方法はレポーター遺伝子に依存する。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質または蛍光シグナルを発生するレポーターオペロンである場合、検出方法は蛍光検出である。
具体的には、より高い蛍光を示す液滴（Ｄｒｏｐｌｅｔｓ）は、蛍光タンパク質の高濃度に、そして従って、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の細胞のより高い数に相関する。
あるいは、より多数の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）細胞を含有する液滴はまた、より多量の目的化合物を生成する産生株細胞を含有する。
したがって、本発明の第１の態様の別の実施形態によれば、本明細書に開示された液滴中の微生物の分析のための方法は、目的の化合物の定性及び／又は定量的な分析を提供することが可能である。
好ましくは、インキュベーションの後、各液滴中のレポーター分子の濃度は蛍光または発光測定によって決定される。
そのような測定は、液滴が生成されたのと同じマイクロ流体デバイス上で、または第１のマイクロ流体チップとは異なる第２のマイクロ流体デバイス上で実行され得る。好ましくは、改善された生産株は、バイオセンサー株を親生産株と一緒に封入することによって生産された液滴から測定されたものより上の蛍光または発光によって同定することができる。
検出後、活性化されたレポーター遺伝子または生存検出微生物（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含むものとして同定された液滴が選択され、さらなる分析のために分離される。
液滴をソートするための潜在的な機構は、当業者に知られている。
一実施形態では、細胞は、誘電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用してソートされる。
本発明はまた、前記方法で使用されるいくつかのデバイスに関する。
【００２６】
第２の態様において、本発明は、少なくとも二つのタイプの細胞を共封入することができるマイクロ流体デバイスに関する：デバイスは以下を含む（図４を参照）：
a.  第１の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
c.  培養培地と混和しない相のための少なくとも１つの入口；
d.  各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成し、そして、所望により、液滴を、不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適している、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー。
別の実施形態において、本発明は、少なくとも二つのタイプの細胞を共封入することができるマイクロ流体デバイスに関する：デバイスは以下を含む（図５を参照）
a.  第１の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
c.  培養培地と混和しない相のための少なくとも１つの入口；
d.  各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成し、所望により、液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適している、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも二つのタイプの細胞を共封入することができるマイクロ流体デバイスに関する：デバイスは以下を含む、
a.  第１の培地の液滴を生成し、そして、その液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
b.  第２の培地の液滴を生成し、そして、その液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
c.  第１の培地の液滴を、第２の培地の液滴と混合し、そして、続いて、前記液滴を融合させて、第１の培地と第２の培地の混合物を含むより大きな液滴を生成するためのチャンバー。
一の実施形態では、各培地の少なくとも１個の細胞を含む液滴は、第１の微生物の少なくとも１個の細胞を含む液滴を生成し、そして、前記チャンバーにおいて、前記第２の微生物を前記液滴に、ピコインジェクティング（ｐｉｃｏ  ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ）することによって生成される（図６参照）。
代替の実施形態では、液滴は、第１の微生物を含む液滴および第２の微生物を含む液滴を生成し、そして、チャンバー内で、液滴を、単一の液滴に組み合わせ、および／または融合することによって生成される。
マイクロ流体デバイスは、所望により、さらなる入口を含んでもよい。
前記入口は、液滴をさらに変更するため、例えば、培養培地に追加の成分を添加するためのものであり得る。
あるいは、前記追加の入口は、液滴の混合、その後の融合のためのストリームに他の液滴の添加、さらに別の液滴を分離するために、スペーシングオイル（ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｉｌ）の追加などの液滴の修飾のために使用される。
【００２８】
前記マイクロ流体デバイスは、独立型デバイスでも、または、より大型のマイクロ流体デバイスの一部でもよい。前記マイクロ流体デバイスが独立型デバイスである場合、当該デバイスを他のデバイス、好ましくは他のマイクロ流体デバイスに接続することができることが好ましい。
一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、微生物を含む培養培地を、所望の温度に維持するために、温度を制御するための手段を含む。
好ましくは、マイクロ流体デバイスは、微生物を含む培養培地を、一定の温度に維持するために、温度を制御するための手段を含む。
より好ましくは、マイクロ流体デバイスは、液滴生成プロセス全体の間、微生物を含む培養培地を、一定の温度に維持するために、温度のための手段を含む。
好ましい実施形態では、マイクロ流体デバイスは、液滴サイズの制御を可能にする。
より好ましい実施形態では、マイクロ流体デバイスは、可変サイズの液滴の生成を可能にする。
最も好ましい実施形態では、マイクロ流体デバイスは、液滴の単分散集団（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の生成を可能にする。
所望により、マイクロ流体デバイスは、試薬の注入、細胞の注入、温度制御、オンチップインキュベーション（ｄｅｌａｙ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｏｎ  ｃｈｉｐ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）のための遅延線、液滴のソートのための追加の手段など、液滴をさらに処理するための手段を含む。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも２種類の細胞を共封入することができるマイクロ流体デバイスに関し、そのデバイスは以下を含む：
a.  第１の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地用の少なくとも１つの入口；
c.  所望により、培養培地と不混和性の相のための少なくとも１つの入口；
d.  各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成し、そして、所望により、液滴を不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適している、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー；
e.  所望によって、液滴を、一定または可変の温度でインキュベートする手段；
f.  所望により、レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
g.  所望により、液滴をソートするための手段と結合した出口。
特定の一実施形態では、本発明は、細胞を含む液滴を生成、インキュベートおよび分析および／またはソートするための、マイクロ流体デバイスに関する：前記デバイスは以下を含む；
a.  第１の微生物を含む培養培地のための第１の入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地のための第２の入口；
c.  培養培地と不混和性の相のための第三の入口；
d.  各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成し、そして、その液滴を油に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適した、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー；
e.  所望によって、液滴を一定または可変の温度でインキュベートする手段；
f.  レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
g.  液滴をソートするための手段と連結した出口。
特定の実施形態において、本発明は、細胞を含む液滴を生成、インキュベートし、および、ソートするためのマイクロ流体デバイスに関する。そして、デバイスは、下記を備える：
a.  第１の微生物を含む培養培地のための第１の入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地のための第２の入口；
c.  油のための第３の入口；
d.  各微生物の少なくとも１つの細胞を含む液滴を生成し、そして、その液滴を油に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）のに適した、第１および第２の培地を組み合わせるためのチャンバー；
e.  所望によって、液滴を、一定または可変の温度でインキュベートする手段；
f.  所望により、レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
g.  所望により、液滴をソートするための手段と連結された出口。
別の特定の実施形態において、本発明は、細胞を含む液滴を、生成、インキュベートし、およびソートするためのマイクロ流体デバイスに関係し、そのデバイスは以下を含む：
a.  第１の微生物を含む培養培地のための第１の入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地のための第２の入口；
c.  油のための第３の入口；
d.  油のための第四の入口；
e.  第１の培地の液滴を油中に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
f.  第２の培地の液滴を油中に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー。
g.  第１の培地の液滴と第２の培地の液滴とを組み合わせ、そして液滴を、第１の培地と第２の培地との混合物を含むより大きな液滴に融合させるためのチャンバー；
h.  所望により、液滴を、一定または可変の温度でインキュベートするための手段；
i.  所望により、レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
j.  所望により、液滴をソートするための手段と結合した出口。
別の特定の実施形態において、本発明は、細胞を含む液滴を、生成、インキュベートし、およびソートするためのマイクロ流体デバイスに関係し、そのデバイスは以下を含む：
a.  第１の微生物を含む培養培地のための第１の入口；
b.  第２の微生物を含む培養培地のための第２の入口；
c.  油のための第３の入口；
d.  油のための第４の入口；
e.  第１の培地の液滴を油中に封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）ためのチャンバー；
f.  ピコインジェクション（ｐｉｃｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、第１の培地の液滴を第２の培地と混合し、第１の培地と第２の培地の混合物を含む、より大きな液滴を生成するためのチャンバー；
g.  所望により、液滴を一定または可変の温度でインキュベートするための手段；
h.  所望により、レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
i.  所望により、液滴をソートするための手段と結合した出口。
【００３０】
本発明によるマイクロ流体デバイスは、好ましくは、少なくとも３つの入口を含み、１つ目は、好ましくは化合物を産生する第１の微生物を含む、培養培地用の、もう１つは、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子オペロンを含む、第２の微生物を含む、第２の培養培地用の、および不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）のための第三の入口である。
本発明の第２の態様の別の実施形態によれば、第１または第２の微生物を含む、培養培地のための前記第１および第２の入口は、温度制御のための手段を含む。
本発明の第２の態様の別の実施形態によれば、第１または第２の微生物を含む培養培地のための、前記第１および第２の入口は、培養培地の組成を制御する手段を含む。
本発明の文脈において、「培養培地の組成を制御するための手段」という用語は、微生物の増殖のために栄養素を供給するための手段、温度およびｐＨを制御するための手段を指す。
培養培地を富化するための栄養素は、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸および脂質を含む。
前記不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）は油またはガスであり得る。
好ましくは、前記不混和相（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｈａｓｅ）は、油、好ましくはフッ素化油である。
他の好ましい実施形態では、前記不混和相は気体である。
一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、微生物を含む培養培地を、所望の温度に維持するために、温度制御するための手段を含む。
好ましくは、マイクロ流体デバイスは、微生物を含む培養培地を、一定の温度に維持するために、温度制御するための手段を含む。
より好ましくは、マイクロ流体デバイスは、液滴生成プロセス全期間中、微生物を含む培養培地を、一定の温度に維持するための温度のための手段を含む。
好ましい実施形態では、マイクロ流体デバイスは液滴サイズの制御を可能にする。
より好ましい実施形態では、マイクロ流体デバイスは、可変サイズの液滴の生成を可能にする。
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは液滴をインキュベートすることを可能にする。
インキュベーション手段は当業者に知られている。
可能な方法は、温度制御されたインキュベーションを可能にする温度制御ループであろう。
好ましい実施形態では、デバイスはインキュベーション温度を制御することを可能にする。
本発明の一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、一定温度でのインキュベーションを可能にする。
代替の実施形態では、デバイスは可変温度でのインキュベーションを可能にする。
代替実施形態では、マイクロ流体デバイスは、インキュベーションのための液滴を除去し、そして、液滴をマイクロ流体デバイスに再挿入することを可能にする、出口含むおよび／または追加の入口を含む。
一実施形態では、少なくとも２つのポート、１つの入口と１つの出口を使用することができる。
代替実施形態では、１つのポートが入口と出口として機能してもよい。
デバイスは、好ましくは、レポーター遺伝子の活性化を検出するための手段を含む。
レポーター遺伝子が、蛍光シグナルを提供することが好ましいので、前記手段は、好ましくは、蛍光の検出、そして、より好ましくは、蛍光強度のさらなる決定を可能にする。
好ましい実施形態では、検出器は計算デバイスに結合されている。
最後に、デバイスは、液滴をソートすることを可能にする、出口を、所望により含むことが好ましい。
好ましくは、出口は、他の液滴と比較して、増加した蛍光を示す、液滴のソートを可能にする。
好ましい実施形態では、前記出口は、誘電泳動によるソートを可能にする手段を含む。好ましい実施形態では、前記出口は計算デバイスに結合されている。
【００３１】
本発明は、さらに、単一細胞、好ましくは、化合物を産生する各微生物の単一細胞、および検出微生物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む液滴を分析するためのマイクロ流体デバイスに関する。
マイクロ流体デバイスは以下を含む。
a.  液滴の入口；
b.  定義された温度で液滴を維持するための、所望の手段；
c.  レポーター遺伝子の活性を検出するための検出器；
d.  少なくとも１つの出口。
好ましい実施形態では、デバイスは温度を制御することを可能にする。
本発明の一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、液滴を一定の温度に保つことを可能にする。
代替の実施形態では、デバイスは、液滴を可変温度に保つことを可能にする。
デバイスは、レポーター遺伝子の活性化を検出するための手段を含む。
レポーター遺伝子が蛍光シグナルを提供することが好ましいので、前記手段は、好ましくは蛍光の検出、より好ましくは蛍光強度のさらなる決定を可能にする。
好ましい実施形態では、検出器は計算デバイスに結合されている。
デバイスは、好ましくは、少なくとも一つの出口を含む。
好ましくは、出口は液滴のソートを可能にする。
好ましい実施形態では、前記出口は、誘電泳動による液滴のソートを可能にする。
好ましい実施形態では、前記出口は計算デバイスに結合されている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図の凡例：
【図１】図１〜３：本方法の好ましいワークフローの概略例。
【図２】図１〜３：本方法の好ましいワークフローの概略例。
【図３】図１〜３：本方法の好ましいワークフローの概略例。
【図４】図４〜６：液滴生成のためのマイクロ流体デバイスの概略。
【図５】図４〜６：液滴生成のためのマイクロ流体デバイスの概略。
【図６】図４〜６：液滴生成のためのマイクロ流体デバイスの概略。  破線は、液滴が、さらに、マイクロ流体デバイス内またはマイクロ流体デバイスのいずれかでさらに処理され得る位置を表す。
【００３３】
実施例
【００３４】
実施例１
大腸菌の株（例えば、ＭＧ１６５５）を、強力な構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下で、ｔｒｐＡＢＣＤＥオペロンを含有するプラスミド（本明細書ではｐＴｒｐと命名）で形質転換する。
ｐＴｒｐを保有する（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）大腸菌株は、Ｌ−トリプトファン過剰産生し、周囲の培養培地に、アミノ酸を分泌することができ、以下、「生産株（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）」と称する。
Ｌ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンに対して栄養要求性であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株（例えば、Ｗ３０３およびその誘導体）を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰなど）のコード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むプラスミド（ここでは、ｐＦｌｕｏｒと命名）で、強力な構成的プロモーター（例えば、ＰTEF1）ならびにＬ−ロイシンの細胞内産生を可能にする遺伝子または遺伝子オペロンの制御下に、形質転換する。
Ｌ−ロイシン栄養要求性のそのような相補性は、ｐＦｌｕｏｒプラスミドを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のポジティブセレクションを可能にする。
Ｌ-トリプトファンの存在下であるが、Ｌ-ロイシンの非存在下で培養されると、ｐＦｌｕｏｒを保有する栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、増殖し、そして、細胞内で蛍光タンパク質を発現する。
この菌株の増殖は、蛍光測定、すなわち、ある波長またはある範囲の波長の光で細胞を照らすこと、および使用した波長よりも大きい波長またはある範囲の波長で細胞によって放出される光量を測定することによってモニターできる。
この栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、以後「検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）」と呼ぶ。
【００３５】
生産株（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）を、最少培地（例えば、４ｇ／Ｌ−グルコースを含むＭ９最少培地）に接種する。
この培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４〜８時間増殖させ、次いで、同じ最少培地を用いて、０．０２のＯＤ600に希釈する。
Ｌ−トリプトファン（細胞増殖を可能にする）を含み、Ｌ−ロイシン（ｐＦｌｕｏｒプラスミドの維持を確実にする）が欠落している合成規定培地に、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）を、接種する。
この検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で、４〜８時間増殖させる。
次いで、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、等張緩衝液で洗浄し、そして、Ｌ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンの両方を欠く合成規定培地を用いて再懸濁する。
【００３６】
最少培地で希釈された生産株を含む水相が、フッ素化界面活性剤を含有するフッ素化油（例えば、ＨＦＥ７５００）によって液滴に分離されるマイクロ流体システムを使用して、体積２０ｐＬのマイクロ流体液滴が生成される。
これらのマイクロ流体液滴を収集し、そして、ピコインジェクションに供し、そこで、検出株培養物の少量の規定体積（５ｐＬ）を、各マイクロ流体液滴に添加し、それによって、生産株の細胞を、マイクロ流体液滴内で、検出株の細胞と接触させる。
【００３７】
次いで、ピコインジェクションされた（ｐｉｃｏｉｎｊｅｃｔｅｄ）液滴を収集し、そして、３０℃でインキュベートして、生産株（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）の増殖、Ｌ−トリプトファンの産生、その後の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の増殖、およびそれに伴う蛍光タンパク質の産生を可能にする。
次いで、マイクロ流体システムを用いて、マイクロ流体液滴を分析する。
目的の蛍光タンパク質の励起極大に対応する波長を有するレーザーで、液滴を照射し、そして、発光／励起に使用される波長よりも長い波長範囲で、液滴によって放出される光量を測定することによって、各液滴の蛍光を分析する。
より高い蛍光を示す液滴は、より高濃度の蛍光タンパク質を含み、したがって、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の細胞をより多く含むことになる。
より多数の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）細胞を含有する液滴はまた、より多量のＬ−トリプトファンを生成した生産株細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｅｌｌｓ）も含有することも推測され得る。
マイクロ流体システムを使用して、高レベルの蛍光を示す液滴を、液滴プールの残りから分離し、さらなる分析のために収集する。
【００３８】
実施例２
大腸菌株は、天然のｔｒｐＡＢＣＤＥプロモーターを強力な構成的プロモーターで置換することにより、Ｌ−トリプトファンを過剰生産するように操作されている。しかしながら、フィードバック調節（ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、この遺伝子操作された大腸菌株によって産生され得るＬ−トリプトファンの量を制限することが示されている。
Ｌ-トリプトファン産生を制限し得る、このフィードバック調節および他の調節現象を克服するために、遺伝子操作された株をＵＶ-誘発ランダム突然変異誘発に供し、Ｌ-トリプトファン産生大腸菌株のライブラリーを作製する。
生成後、このライブラリーは固体培地上で培養される。
固体培地上にプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）する前に、ライブラリーは、インキュベーション期間後、クローン単離物（ｃｌｏｎａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ）が固体培地上で得られるように十分に希釈する。
【００３９】
Ｌ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンに対して栄養要求性である、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株（例えば、Ｗ３０３およびその誘導体）を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰなど）のコード配列を含むプラスミド（ここではｐＦｌｕｏｒと命名）で、強力な構成的プロモーター（例えば、ＰTEF1）ならびにＬ−ロイシンの細胞内産生を可能にする遺伝子または遺伝子オペロンの制御下に形質転換する。
Ｌ−ロイシン栄養要求性のそのような相補性は、ｐＦｌｕｏｒプラスミドを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のポジティブセレクションを可能にする。
Ｌ-トリプトファンの存在下であるが、Ｌ-ロイシンの非存在下で培養すると、ｐＦｌｕｏｒを保有する栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、細胞内で増殖しそして蛍光タンパク質を発現する。
この菌株の増殖は、蛍光測定、すなわち、ある波長またはある範囲の波長の光で細胞を照らすこと、および発光のために使用した波長よりも大きい波長またはある範囲の波長で、細胞によって放出される光量を測定することによってモニターすることができる。
この栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、以後「検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）」と呼ぶ。
生産株ライブラリーを、固体培地から回収し、次いで希釈し、そして、最少培地（例えば、４ｇ／Ｌグルコースを含むＭ９最少培地）に接種する。
この培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で、４〜８時間増殖させ、次いで同じ最少培地を用いて、０．０２のＯＤ600に希釈する。
検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、Ｌ−トリプトファン（細胞増殖を可能にする）を含むが、Ｌ−ロイシン（ｐＦｌｕｏｒプラスミドの維持を確実にする）が欠落している合成規定培地に接種される。
この検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で、４〜８時間増殖させる。
次いで、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、等張緩衝液で洗浄し、そしてＬ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンの両方を欠く合成規定培地を用いて再懸濁する。
【００４０】
最少培地で希釈された生産株を含む水相が、フッ素化界面活性剤を含有するフッ素化油（例えば、ＨＦＥ７５００）によって液滴に分離されるマイクロ流体システムを使用して、体積２０ｐＬのマイクロ流体液滴が生成される。
これらのマイクロ流体液滴を収集し、そして、ピコインジェクションに供し、そこで、検出株培養物の少量の規定体積（５ｐＬ）を、各マイクロ流体液滴に添加し、それによって、生産株の細胞を、マイクロ流体液滴内で、検出株の細胞と接触させる。
次いで、ピコインジェクトされた液滴を収集し、そして、３０℃で、インキュベートして、生産株の増殖、Ｌ−トリプトファンの産生、その後の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の増殖、およびそれに伴う蛍光タンパク質の産生を可能にする。
次いで、マイクロ流体システムを用いて、マイクロ流体液滴を分析する。
目的の蛍光タンパク質の励起極大に対応する波長を有するレーザーで、液滴を照射し、そして、照射／励起に使用される波長よりも長い波長範囲で、液滴によって放出される光量を測定することによって、各液滴の蛍光を分析する。
より高い蛍光を示す液滴は、より高濃度の蛍光タンパク質を含み、そして、したがって、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の細胞をより多く含む。
より多数の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）細胞を含有する液滴は、また、より多量のＬ−トリプトファンを生成した生産株細胞も含有することも推測され得る。
【００４１】
マイクロ流体システムを使用して、高レベルの蛍光を示す液滴を、液滴プールの残りから分離して収集する。
次いで、これらの液滴を固体培地上に広げ、次いでこれをインキュベートして、Ｌ−トリプトファンのより高い産生を示す生産株の変異体を回収する。
次いで、個々のクローン単離物を、二次スクリーニングで分析して、Ｌ−トリプトファン産生の増加を確認する：コロニーを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、そして、数日間培養し、そして、培養上清を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ｌ−トリプトファン濃度について分析する。
【００４２】
実施例３
大腸菌株は、天然のｔｒｐＡＢＣＤＥプロモーターを、強力な構成的プロモーターで置換することにより、Ｌ−トリプトファンを過剰生産するように遺伝子操作されている。
しかしながら、フィードバック調節は、この遺伝子操作された大腸菌株によって産生され得るＬ−トリプトファンの量を制限することが示されている。
このフィードバック調節およびＬ-トリプトファンの産生を制限し得る他の調節現象を克服するために、遺伝子操作された株を、ＵＶ-誘発ランダム突然変異誘発に供し、Ｌ-トリプトファン産生大腸菌株のライブラリーを作製する。
生成後、このライブラリーは固体培地上で培養される。
固体培地上にプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）する前に、ライブラリーは、クローン単離物が、インキュベーションの期間後、固体培地上で得られるように、十分に希釈される。
Ｌ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンに対して栄養要求性であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株（例えば、Ｗ３０３およびその誘導体）を、強力な構成的プロモーター（例えば、ＰTEF1）ならびにＬ−ロイシンの細胞内産生を可能にする遺伝子または遺伝子オペロンの制御下に、強力なタンパク質の制御下でルクス発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）オペロンのコード配列を含むプラスミド（ここではｐＬｕｘと命名）で、形質転換する。
Ｌ−ロイシン栄養要求性のそのような相補性は、ｐＬｕｘプラスミドを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のポジティブ選択を可能にする。
【００４３】
Ｌ-トリプトファンの存在下であるが、Ｌ-ロイシンの非存在下で培養されると、ｐＬｕｘを有する栄養要求性サッカロミセス・セレビシエ株が増殖し、そして発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を生じさせるのに必要な機構を生成する。
この菌株の増殖は、発光測定、すなわち所与のｌｕｘルミネセンスオペロン（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｐｅｒｏｎ）に適した波長または波長範囲で、細胞によって放出される光の量を測定することによってモニターすることができる。
この栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、本明細書では以後「検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）」と呼ぶ。
生産株ライブラリーを固体培地から回収し、次いで希釈し、最少培地（例えば、４ｇ／Ｌグルコースを含むＭ９最少培地）に接種する。
【００４４】
この培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で、４〜８時間増殖させ、次いで同じ最少培地を用いて０．０２のＯＤ600に希釈する。
検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）は、Ｌ−トリプトファン（細胞増殖を可能にする）を含むが、Ｌ−ロイシン（ｐＬｕｘプラスミドの維持を確実にする）が欠落している合成規定培地に接種される。
この検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で、４〜８時間増殖させる。
次いで、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、等張緩衝液で洗浄し、そして、Ｌ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンの両方を欠く合成規定培地を用いて再懸濁する。
最少培地で希釈された生産株を含む水相が、フッ素化界面活性剤を含有するフッ素化油（例えば、ＨＦＥ７５００）によって液滴に分離されるマイクロ流体システムを使用して、体積２０ｐＬのマイクロ流体液滴が生成される。
【００４５】
これらのマイクロ流体液滴を収集し、そして、ピコインジェクションに供し、そこで、検出株培養物の少量の規定体積（５ｐＬ）を、各マイクロ流体液滴に添加し、それによって、生産株の細胞を、マイクロ流体液滴内で、検出株の細胞と接触させる。
次いで、ピコインジェクトされた液滴を収集し、そして、３０℃で、インキュベートして、生産株の増殖、Ｌ−トリプトファンの産生、その後の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の増殖、およびそれに伴う蛍光タンパク質の産生を可能にする。
次いで、マイクロ流体システムを用いて、マイクロ流体液滴を分析する。
【００４６】
各液滴の発光は、選択されたｌｕｘルミネセンスに適した波長範囲にわたって、各液滴によって放出された光の量を測定することによって分析される。
より高いルミネセンスを示す液滴は、より高濃度のルミネセンス機構を含み、そして、したがって、より多くの検出株の細胞を含む。
より多数の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）細胞を含有する液滴はまた、より多量のＬ−トリプトファンを生成した生産株細胞を含有することも推測され得る。
マイクロ流体システムを使用して、高レベルの発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を示す液滴を、液滴プールの残りから分離して、収集する。
次いで、これらの液滴を固体培地上に広げ、次いでこれをインキュベートして、Ｌ−トリプトファンのより高い産生を示す生産株の変異体を回収する。
次いで、個々のクローン単離物（ｃｌｏｎａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ）を、二次スクリーニングで分析して、Ｌ−トリプトファン産生の増加を確認する：コロニーを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、そして、数日間培養し、そして、培養上清を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ｌ−トリプトファン濃度について分析する。
【００４７】
実施例４
Ｌ-トリプトファンの新規生産者を同定するために、土壌環境試料を等張緩衝液で洗浄して、試料中に存在する細菌を回収する。
これらの細菌は、次いで、Ｌ−トリプトファンを含まない化学定義培地を使用して希釈され、潜在的な生産株のライブラリーが生成する。
Ｌ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンに対して栄養要求性である、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株（例えば、Ｗ３０３およびその誘導体）を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰなど）のコード配列を含むプラスミド（ここではｐＦｌｕｏｒと命名）で、強力な構成的プロモーター（例えば、ＰTEF1）ならびにＬ−ロイシンの細胞内産生を可能にする遺伝子または遺伝子オペロンの制御下に形質転換する。
Ｌ−ロイシン栄養要求性のそのような相補性は、ｐＦｌｕｏｒプラスミドを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のポジティブセレクションを可能にする。
【００４８】
Ｌ-トリプトファンの存在下であるが、Ｌ-ロイシンの非存在下で培養されると、ｐＦｌｕｏｒを保有する栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は増殖し、そして、蛍光タンパク質を細胞内で発現する。
この菌株の増殖は、蛍光測定、すなわち、ある波長またはある範囲の波長の光で細胞を照らすこと、および発光に使用した波長よりも大きい、波長または波長の範囲で、細胞によって放出される光量を測定することによってモニターできる。
この栄養要求性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、以後「検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）」と呼ぶ。
検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）を、Ｌ-トリプトファン（細胞増殖を可能にするため）を含有するが、Ｌ-ロイシン（ｐＦｌｕｏｒプラスミドの維持を確実にするため）を欠く合成規定培地に接種する。
【００４９】
この検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で、４〜８時間増殖させる。
次いで、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）培養物を、等張緩衝液で洗浄し、そしてＬ-トリプトファンおよびＬ-ロイシンの両方を欠く合成規定培地を用いて再懸濁する。
体積２０ｐＬのマイクロ流体液滴は、マイクロ流体システムを用いて生成され、そこで、化学規定培地中に希釈された生産株のライブラリーを含む水相が、フッ素化界面活性剤を含むフッ素化油（例えばＨＦＥ７５００）によって、液滴に分離される。
これらのマイクロ流体液滴を収集し、ピコインジェクションに供し、そこで、少量の規定体積（５μＬ）の検出株培養物を、各マイクロ流体液滴に添加し、それによって、生産株の細胞を、マイクロ流体液滴内の検出株の細胞と接触させる。
【００５０】
次いで、ピコインジェクトされた液滴を収集し、そして、３０℃でインキュベートして、生産株の増殖、Ｌ−トリプトファンの産生、その後の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の増殖、および蛍光タンパク質の付随する生成を可能にする。
次いで、マイクロ流体システムを用いて、マイクロ流体液滴を分析する。
目的の蛍光タンパク質の励起極大に対応する波長を有するレーザーで、液滴を照射し、そして、照射／励起に使用される波長よりも長い波長範囲で、液滴によって放出される光量を測定することによって、各液滴の蛍光を分析する。
より高い蛍光を示す液滴は、より高濃度の蛍光タンパク質を含み、そして、したがって、検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）の細胞をより多く含む。
より多数の検出株（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）細胞を含有する液滴はまた、より多量のＬ−トリプトファンを生成した生産株細胞も含有することも推測され得る。
【００５１】
マイクロ流体システムを使用して、高レベルの蛍光を示す液滴を、液滴プールの残りから分離して収集する。
次いで、これらの液滴を固体培地上に広げ、次いでこれをインキュベートして、Ｌ−トリプトファンのより高い産生を示す生産株の変異体を回収する。
次いで、個々のクローン単離物を、二次スクリーニングで分析して、Ｌ−トリプトファン産生の増加を確認する：コロニーを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、そして、数日間培養し、そして、培養上清を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ｌ−トリプトファン濃度について分析する。
【図１】
2020513793.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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