(57)【要約】  本発明は抗Ｔａｕナノボディに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴマー型であるＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、軽鎖を欠いている前記ナノボディ。
【請求項２】
（ｉ）アミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡであるアミノ酸配列ＧＲＴＦＳＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）をＣＤＲ１として含み、
（ｉｉ）アミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、アミノ酸Ｘ２がＳ又はＶであるアミノ酸配列ＩＳＸ１ＳＧＧＸ２Ｔ（配列番号２）をＣＤＲ２として含み、且つ、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）又はＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）をＣＤＲ３として含む
ナノボディとオリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合するものである、請求項１に記載のナノボディ。
【請求項３】
（ａ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）を含むナノボディ、又は
（ｂ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）を含むナノボディ
から選択されるナノボディとオリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合するものである、請求項１又は２に記載のナノボディ。
【請求項４】
（ｉ）アミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡであるアミノ酸配列ＧＲＴＦＳＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）をＣＤＲ１として含み、
（ｉｉ）アミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、アミノ酸Ｘ２がＳ又はＶであるアミノ酸配列ＩＳＸ１ＳＧＧＸ２Ｔ（配列番号２）をＣＤＲ２として含み、且つ、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）又はＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）をＣＤＲ３として含む
ものである、請求項１〜３の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項５】
（ａ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）、又は
（ｂ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）
を含むものであるか、又は
配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の配列、又は配列番号６、配列番号７、及び配列番号８の配列のうちの１つ、２つ、又は３つの配列においてそれぞれ１アミノ酸又は２アミノ酸の保存的置換を含む、（ａ）又は（ｂ）において規定されるナノボディの機能保存的変異体である、請求項１〜４の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項６】
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号９のアミノ酸配列を含むものである、請求項１〜５の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項７】
検出可能マーカーに結合しているものである、請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項８】
前記検出可能マーカーが放射性元素である、請求項７に記載のナノボディ。
【請求項９】
非侵襲的インビボ医用イメージングの造影剤として使用される請求項１〜８の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項１０】
診断又は予後診断のための方法、好ましくはタウオパチーの診断又は予後診断のための方法に使用される請求項１〜９の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項１１】
医薬として使用される請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディ。
【請求項１２】
試料中のオリゴマー型Ｔａｕタンパク質のインビトロ検出のための請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディの使用。
【請求項１３】
請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディを薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディをコードする核酸配列を備える核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターによって形質移入、形質導入、又は形質転換された細胞。
【請求項１７】
請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディを発現する組換え宿主細胞を作製するための方法であって、
（ｉ）請求項１４に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターをコンピテント宿主細胞にインビトロ又はエクスビボで導入する工程、
（ｉｉ）得られた前記組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養する工程、及び
（ｉｉｉ）所望により前記ナノボディを発現及び／又は分泌する前記細胞を選別する工程
を含む前記方法。
【請求項１８】
請求項１〜６の何れか一項に記載のナノボディを発現する組換え宿主細胞を作製するための方法であって、
（ｉ）前記ナノボディを発現させるために適切な条件下で請求項１６に記載の形質導入細胞又は形質移入細胞又は形質転換細胞を培養する工程、及び
（ｉｉ）発現した前記ナノボディを回収する工程
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗Ｔａｕナノボディに関する。
【０００２】
現在、孤発性アルツハイマー病（ＡＤ）を前臨床段階の無症状状態から認知及び記憶テストによって、また様々なバイオマーカーによっても臨床的に特徴が明らかにされる病状まで連続的なものであると見る一致した意見が存在する（Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  １３，  ６１４−６２９  （２０１４））。しかしながら、治療が必要な患者を選択し、且つ、治療効果を管理するために神経変性の兆候をリスクの有る集団において早期検出し、且つ、モニターすることを可能にする診断方法が新しい治療戦略の開発に要求される。
【０００３】
ＡＤは進行性認知症症候群と２種類の特徴的な脳の病変、すなわちアミロイドペプチド（Ａβ）から構成される細胞外老人斑（ＡＰ）と高リン酸化Ｔａｕタンパク質凝集体から構成される神経原線維変性（ＮＦＤ）の組合せによって規定される。ＮＦＤは大脳皮質においてＡＰが認められる前に嗅内皮質構造体に現れる（Ｂｒａａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ７０  （１１）：  ９６０−９６９  （２０１１））。さらに、皮質におけるＮＦＤの分布と数はＡＤの患者の記憶障害と相関している（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ７１  （５）；  ３６２−３８１  （２０１２））。近年、オリゴマー型のＴａｕが漸進的な神経細胞の汚染によるＡＤ等のタウオパチーの進展（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １４：  ４９５  （２０１４））に関与する有毒型であることが示された（Ｕｓｅｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ３５  （４２）：  １４２３４−１４２５０  （２０１５））。
【０００４】
核脳イメージング（単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）はＡＤに付随する分子的病変の存在と進行を判定するための適切なツールである（Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ，  １２  （３）：  ２９２−３２３  （２０１６））。幾つかの放射性トレーサーが利用可能であるようにＡＰの放射性リガンドが既に利用可能である（Ｃａｔａｆａｕ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌｉｃｈ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  ３  （１）：  ３９−５５  （２０１５））。現在ではＮＦＤ内のβ−シートを標的とするトレーサーが開発中である。それらのトレーサーのうちの２つである１８Ｆ−ＡＶ−１４５１（Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒａｉｎ，  １３９  （５）：  １５５１−１５６７  （２０１６））と１８Ｆ−ＴＨＫ５１１７（Ｊｏｎａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ５７  （４）：  ５７４−５８１  （２０１６））によってＮＦＤ型の病変を患う患者の層別化が容易になる可能性がある。他方、可溶性オリゴマー型のＴａｕを検出及びモニターすることはそれらのトレーサーのいずれによっても不可能である。
【０００５】
生理的条件下で高可溶性Ｔａｕタンパク質は微小管と相互作用してそれらを安定化するが、部分的リン酸化によって逆に微小管から解離する。Ｔａｕタンパク質は通常では非常に可溶性であり、且つ、非構造化された形態である。ある特定の病的状態にある場合にＴａｕの翻訳後修飾、特に高リン酸化によってそのタンパク質は構造体化され、且つ、ダイマー、オリゴマーといった凝集体やＮＦＤを形成することになる螺旋フィラメント対とい
った線維を形成することになる。現在ではＴａｕオリゴマーは毒性とＡＤ及び他のタウオパチーの病変の進展の両方の観点から非常に重要であると考えられている。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１５／０２６６９４７号明細書にオリゴマー型、特に二量体型及び三量体型のＴａｕタンパク質に対するｓｃＦｖが記載されている。約３０ｋＤａのサイズのこれらのｓｃＦｖは線維型のＴａｕに対するものではない。
【０００７】
様々な凝集体型のＴａｕ分子を標的とした核イメージングのために病理型Ｔａｕに対する新しいマーカーを開発することを目標として本発明者らは病理型Ｔａｕ、特に早期病理型Ｔａｕ、中でも特にオリゴマー型Ｔａｕ、場合によっては線維型Ｔａｕを標的とすることによりナノボディ（Ｎｂ）、特にＶＨＨを開発した。したがってこれらのナノボディによってＡＤの診断とモニタリングを改善することが可能になり、有望な治療法の効果の評価を改善することも可能になる。
【０００８】
ＡＤ以外のタウオパチーにおいて病理型Ｔａｕを標的とし、したがってその存在を特定することもこれらのナノボディによって可能になる。本発明のナノボディはＶＨＨ型であり、ある特定のラクダ科動物抗体の重鎖可変ドメインに対応する抗体小断片である。本発明のナノボディは抗原結合ドメインを有する免疫グロブリンに由来する最小の機能性要素（１０〜１５ｋＤａ）であり、約１ナノモル濃度の抗原に対する親和性を示す。本発明のナノボディのＦｃ型ドメインを有しない単純な構造と低分子量のため、それらは血液脳関門を通過する好適なツールである（Ｃａｌｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  １６５  （７）：  ２３４１−２３５３  （２０１２））。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明は病理型Ｔａｕタンパク質、特に早期病理型Ｔａｕ、例えばオリゴマー型Ｔａｕ、場合によっては線維型Ｔａｕに結合するナノボディに関する。
【００１０】
したがって、本発明の対象はオリゴマー型Ｔａｕタンパク質と線維型Ｔａｕタンパク質に対するナノボディである。
【００１１】
本発明はオリゴマー型であるＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、軽鎖を欠いている前記ナノボディにも関する。
【００１２】
したがって、本発明の対象は病理型、特にオリゴマー型のＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ｉ）アミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡであるアミノ酸配列ＧＲＴＦＳＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）をＣＤＲ１として含み、
（ｉｉ）アミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、Ｘ２がＳ又はＶであるアミノ酸配列ＩＳＸ１ＳＧＧＸ２Ｔ（配列番号２）をＣＤＲ２として含み、且つ、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）又はＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）をＣＤＲ３として含む
ナノボディとオリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合する前記ナノボディである。
【００１３】
本発明はさらに病理型、特にオリゴマー型のＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ａ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）、及びＣＤＲ３として
のアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）、又は
（ｂ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）
を含むナノボディとオリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合する前記ナノボディに関する。
【００１４】
本発明はＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ｉ）アミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡであるアミノ酸配列ＧＲＴＦＳＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）をＣＤＲ１として含み、
（ｉｉ）アミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、アミノ酸Ｘ２がＳ又はＶであるアミノ酸配列ＩＳＸ１ＳＧＧＸ２Ｔ（配列番号２）をＣＤＲ２として含み、且つ、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）又はＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）をＣＤＲ３として含む
前記ナノボディにも関する。
【００１５】
本発明はさらに
（ａ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）、又は
（ｂ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）
を含むＴａｕタンパク質に対するナノボディ、又は
配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の配列、又は配列番号６、配列番号７、及び配列番号８の配列のうちの１つ、２つ、又は３つの配列においてそれぞれ１アミノ酸又は２アミノ酸の保存的置換を含む、（ａ）又は（ｂ）において規定されるナノボディの機能保存的変異体に関する。
【００１６】
本発明は上記で規定されているナノボディであって、非侵襲的インビボ医用イメージングの造影剤として使用される、診断又は予後診断の方法、好ましくはタウオパチーの診断又は予後診断のための方法に使用される、又は医薬として使用される前記ナノボディにも関する。
【００１７】
本発明の対象はまた試料中のＴａｕタンパク質、特に病理型、好ましくは早期病理型、中でも特にオリゴマー型、場合によっては線維型のＴａｕタンパク質のインビトロ検出のための本ナノボディの使用でもある。
【００１８】
最後に、本発明は本ナノボディを薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＥＬＩＳＡアッセイの結果とそれによる２Ｃ５ナノボディのＴａｕ−Ｏ（Ｔａｕオリゴマー）、Ｔａｕ−Ｆ（Ｔａｕ線維）、模倣物（重合化ＴａｕのＲ３領域）、及びＴａｕ−Ｎ（天然型Ｔａｕ）に対する親和性についての曲線を示すグラフである。
【図２】重合化Ａβ１−４２アミロイドペプチドに対する親和性が存在しないことを示すグラフである。
【図３】ＡＤ症例の側頭皮質の切片に対する比較免疫組織化学を示す図である。（Ａ）ＡＴ８はＳｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５におけるＰＨＦリン酸化に対するモノクローナル抗体であり、（Ｂ）２Ｃ５はオリゴマー型Ｔａｕに対する本発明のナノボディであり、（Ｃ）Ｔ２２はＴａｕオリゴマーに対するモノクローナル抗体であり、（Ｄ）Ａｂ４Ｇ８は凝集体型のアミロイドβペプチドに対するモノクローナル抗体である。
【図４】本発明のナノボディの可変配列のアラインメントを示す図である。
【図５】ＥＬＩＳＡアッセイの結果とその結果による２Ｃ５ナノボディ（放射性標識無し）のＴａｕタンパク質のＲ３配列の重合体に対する親和性についての曲線を示すグラフである。
【図６】ＥＬＩＳＡアッセイの結果とその結果による２Ｃ５ナノボディ（ヨウ素１２５で放射性標識済み）のＴａｕタンパク質のＲ３配列の重合体に対する親和性についての曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
タウオパチー
「タウオパチー」という用語は、Ｔａｕタンパク質、特に病理型Ｔａｕタンパク質の脳内沈積物の存在を共通して有し、且つ、臨床的、病理的、生化学的、及び遺伝的類似性を共有する約２０種類の病的状態をひとまとめにしている。「Ｔａｕタンパク質の脳内沈積物」という用語はＴａｕ凝集体の存在を意味しており、したがって病理型Ｔａｕの存在を意味している。
【００２１】
ある特定のタウオパチー、例えば進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病はアルツハイマー病の神経原線維変性と区別できない神経原線維変性（ＮＦＤ）が存在することを特徴としている。この場合、「Ｔａｕタンパク質の脳内沈積物」又は「病理型Ｔａｕの存在」という用語は例えば神経原線維変性（ＮＦＤ）の存在を表している。
【００２２】
ピック病は例えばピック小体と呼ばれる球状神経封入体を特徴としている。これらのピック小体は組織化されていない直線状フィラメントから成り、したがって病理型Ｔａｕから成るものである。
【００２３】
「神経原線維変性」（神経原線維のもつれとしても知られる）は、例えば大脳皮質内において、細胞核の周辺かつ細胞伸長中に、神経細胞集団が螺旋フィラメント対（ＰＨＦ）及び／又は直線状フィラメント（ＳＦ）から成る原線維のもつれを示している領域を意味する。
【００２４】
ＮＦＤ形成には「原線維凝集」又は「原線維形成」としても知られるＴａｕの凝集が含まれることに留意されたい。この過程でＴａｕタンパク質はオリゴマーの形態に組織化され、次に螺旋フィラメント対の形態及び直線状フィラメントの形態に組織化される線維形態に組織化される。それらの螺旋フィラメント対の形態及び直線状フィラメントの形態がＮＦＤを構成する。
【００２５】
「病理型Ｔａｕ」という用語にはオリゴマー型、線維型、螺旋フィラメント対型、及び直線状フィラメント型のＴａｕタンパク質が包含される。しかしながら、中間凝集型、すなわちオリゴマー型Ｔａｕ及び線維型Ｔａｕは有毒であり、オリゴマー型が最も有毒であることが発見されている。それらのＴａｕは「早期病理型Ｔａｕ」という用語に包含され、その用語はしたがって特にオリゴマー型及び線維型のＴａｕ、中でも特にオリゴマー型のＴａｕを意味する。
【００２６】
Ｔａｕタンパク質は細胞内タンパク質はであるが、しかしながらある特定の事例では病理型Ｔａｕは細胞外に存在する場合がある。
【００２７】
１つの特定の実施形態では病理型Ｔａｕ、好ましくはオリゴマー型Ｔａｕが細胞外に存在する。
【００２８】
結果として１つの実施形態では「病理型Ｔａｕ」はオリゴマー型、線維型、螺旋フィラメント対型、及び／又は直線状フィラメント型のＴａｕを指す。病理型Ｔａｕは早期病理型Ｔａｕ、中でも特にオリゴマー型Ｔａｕ、場合によっては線維型Ｔａｕ、例えばオリゴマー型Ｔａｕ又は線維型Ｔａｕであることが好ましい。
【００２９】
１つの実施形態では「タウオパチー」は上記で規定されている病理型Ｔａｕの存在と関連する疾患を意味する。タウオパチーはアルツハイマー病、進行性核上性麻痺（又はスティール・リチャードソン・オルゼウフキー病）、大脳皮質基底核変性症、ピック病、Ｃ型ニーマン・ピック病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、及び染色体１７突然変異連鎖前頭側頭型変性から選択され、好ましくはアルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病から選択され、特に好ましくはアルツハイマー病である。
【００３０】
Ｔａｕ
「Ｔａｕタンパク質」又は「Ｔａｕ」という用語は哺乳類動物タンパク質であるＴａｕ（微小管結合単位）タンパク質を意味する。Ｔａｕタンパク質は微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）ファミリーのメンバーである。そのタンパク質は１７番染色体上の位置１７ｑ２１に位置するＭＡＰＴ遺伝子によってコードされる。Ｔａｕタンパク質はＭＳＴＤ、ＰＰＮＤ、ＤＤＰＡＣ、ＭＡＰＴＬ、ＭＴＢＴ１、ＭＴＢＴ２、ＦＴＤＰ−１７、ＰＰＰ１Ｒ１０３としても知られる。ヒトではＴａｕタンパク質は基本的に神経細胞において合成される。
【００３１】
Ｔａｕの一次転写物は１６個のエクソンを含む。脳では幾つかのエクソンが翻訳されない。第２エクソン、第３エクソン、及び第１０エクソンが選択的スプライシングを受け、それらのエクソンは成人の脳組織に特異的である。これらの３個のエクソンの選択的スプライシングにより６つの可能な組合せ（２−３−１０−〜２＋３＋１０＋）が作製される。したがってタンパク質レベルでは６種類のＴａｕタンパク質のアイソフォームが成人の脳に存在する。Ｔａｕタンパク質発現は発生過程において制御されることに留意されたい。したがって、胎児型アイソフォームと呼ばれる単一のアイソフォームが誕生時に存在し、第２エクソン、第３エクソン、又は第１０エクソンによってコードされる挿入断片を含まない。他のアイソフォームは後続の発生過程において出現する。それらの配列の長さは３５２アミノ酸から４４１アミノ酸までの範囲である。
【００３２】
Ｔａｕタンパク質のアミノ末端部分はプロジェクションドメインとしても知られ、まだよく分かっていない役割を有する。このプロジェクションドメインは原形質膜及びミトコンドリアなどのある特定のオルガネラと相互作用する可能性がある。カルボキシ末端ドメインはチューブリン結合ドメインの保存されたモチーフを含む特異的結合ドメインである（３Ｒ又は４Ｒと呼ばれる）３リピート断片（第１０エクソンを含まない）又は４リピート断片（第１０エクソンを含む）を含み、そのドメインによって微小管安定性が制御される。これらのＲモチーフは微小管上のＴａｕタンパク質の固定点を構成する。第１０エクソンによってコードされる配列を含まない（１０−）３種類のアイソフォームは３つの微小管結合ドメイン（３Ｒ）を有し、２Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ、及び０Ｎ３Ｒとも呼ばれ、アミノ末端部分の点で異なっている。第１０エクソンによってコードされる配列を含む３種類のアイソフォームは４つの微小管結合ドメイン（４Ｒ）を有し、２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ、及び０Ｎ４Ｒと呼ばれ、これらもアミノ末端部分の点で異なっている。チューブリン二量体との相互作用はこの第４ドメインによってさらに強くなり、それによって微小管をさらに安定にし、神経突起伸展長を調整することができ、神経可塑性も調整することができる。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では前記Ｔａｕタンパク質は２Ｎ４Ｒアイソフォーム、１Ｎ４Ｒアイソフォーム、０Ｎ４Ｒアイソフォーム、２Ｎ３Ｒアイソフォーム、１Ｎ３Ｒアイソフォーム、及び０Ｎ３Ｒアイソフォームからなる群より選択される。Ｔａｕタンパク質は好ましくは２Ｎ４Ｒアイソフォームのものである。
【００３４】
Ｔａｕ−Ｆ又はＴａｕ４４１又はｈｔａｕ４０とも呼ばれる２Ｎ４ＲアイソフォームのＴａｕタンパク質のアミノ酸配列は４４１アミノ酸を含み、Ｐ１０６３６−８（配列番号２１）の受け入れ番号で２０１６年１１月１６日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔＫｂデータベース上に見出すことができる。
【００３５】
Ｔａｕ−Ｅ又はＴａｕ４１２とも呼ばれる１Ｎ４ＲアイソフォームのＴａｕタンパク質のアミノ酸配列は４１２アミノ酸を含み、Ｐ１０６３６−７（配列番号２２）の受け入れ番号で２０１６年１１月１６日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔＫｂデータベース上に見出すことができる。
【００３６】
Ｔａｕ−Ｄ又はＴａｕ３８３とも呼ばれる０Ｎ４ＲアイソフォームのＴａｕタンパク質のアミノ酸配列は３８３アミノ酸を含み、Ｐ１０６３６−６（配列番号２３）の受け入れ番号で２０１６年１１月１６日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔＫｂデータベース上に見出すことができる。
【００３７】
Ｔａｕ−Ｃ又はＴａｕ４１０とも呼ばれる２Ｎ３ＲアイソフォームのＴａｕタンパク質のアミノ酸配列は４１０アミノ酸を含み、Ｐ１０６３６−５（配列番号２４）の受け入れ番号で２０１６年１１月１６日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔＫｂデータベース上に見出すことができる。
【００３８】
Ｔａｕ−Ｂ又はＴａｕ３８１とも呼ばれる１Ｎ３ＲアイソフォームのＴａｕタンパク質のアミノ酸配列は３８１アミノ酸を含み、Ｐ１０６３６−５（配列番号２５）の受け入れ番号で２０１６年１１月１６日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔＫｂデータベース上に見出すことができる。
【００３９】
胎児型Ｔａｕ又はＴａｕ３５２とも呼ばれる０Ｎ３ＲアイソフォームのＴａｕタンパク質のアミノ酸配列は３５２アミノ酸を含み、Ｐ１０６３６−２（配列番号２６）の受け入れ番号で２０１６年１１月１６日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔＫｂデータベース上に見出すことができる。
【００４０】
Ｔａｕタンパク質は軸索に局在することが多く、樹状突起に局在することは比較的に少なく、細胞体に局在することは例外的な神経タンパク質である。天然型ではＴａｕは組織化されていない単量体型のタンパク質である。その結果、本発明との関係において「天然型Ｔａｕ」という用語は単量体型のＴａｕタンパク質を意味し、その反対も成り立つ。天然型のＴａｕタンパク質の機能は、特異的結合ドメイン（３Ｒ及び４Ｒ）を介して微小管と相互作用し、微小管の集合と安定を促進することである。微小管とのＴａｕタンパク質の相互作用は主にリン酸化によって制御される。Ｔａｕは約８０か所の潜在的なリン酸化部位を含むリン酸化タンパク質である。Ｔａｕタンパク質のリン酸化状態の制御はプロテインキナーゼとプロテインホスファターゼの結合活性の結果である。
【００４１】
一般的にＴａｕタンパク質の高リン酸化特に特異的結合ドメイン（３Ｒ及び４Ｒ）内の高リン酸化によって微小管に対するＴａｕタンパク質の親和性が低下し、それによって微小管の不安定化が引き起こされ、結果として細胞骨格の解体が引き起こされることになり得る。さらに、この高リン酸化によって「タウオパチー」の節において先に説明したよう
にＴａｕの凝集が引き起こされ、したがってＮＦＤの形成が引き起こされることになり得る。
【００４２】
当業者はＴａｕタンパク質の異常リン酸化と高リン酸化を区別する。
【００４３】
「異常リン酸化」は生理的条件下ではリン酸化の対象ではない部位におけるリン酸化から成る。非生理的エピトープに言及すると、これらは例えばＡＴ１００抗体及びＴＧ−３抗体によって認識されるエピトープである。
【００４４】
他方、「高リン酸化」という用語は正常な成人の脳におけるレベルよりも高いレベルでの生理的エピトープのリン酸化、又は所与の部位については高いパーセンテージのＴａｕタンパク質がリン酸化されている場合のリン酸化を意味する。
【００４５】
Ｔａｕタンパク質の高リン酸化によって微小管からのＴａｕの解離及びＴａｕの細胞内濃度の増加が引き起こされる可能性があり、螺旋フィラメント対及び直線状フィラメントが形成されるまでオリゴマー、次に線維の形成が引き起こされ、その線維のもつれが原線維変性を構成する。その結果は神経細胞におけるＴａｕタンパク質の蓄積であり、タウオパチーと呼ばれる２０種類を超える様々な神経変性疾患を伴う。Ｔａｕタンパク質の蓄積がそのようなタウオパチーの唯一の原因であることもある。
【００４６】
非リン酸化Ｔａｕタンパク質を使用することによってＴａｕの凝集を研究することが可能であることが当業者に知られている（Ｘｕ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．  ２０１０  Ｍａｒ；  ６  （２）：  １１０−７、Ｋｕｍａｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１４  Ｊｕｌ  １８；  ２８９  （２９）：  ２０３１８−３２、Ｆｌａｃｈ，  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１２  Ｄｅｃ  ２１；  ２８７  （５２）：  ４３２２３−３３）。
【００４７】
本発明の発明者らは非リン酸化Ｔａｕタンパク質、特にオリゴマー型のものに対する本発明のナノボディを開発した。しかしながら、免疫組織化学によって実証されるように、本発明のナノボディはまたＴａｕタンパク質がリン酸化状態で存在するヒト脳の切片中の神経原線維変性内のＴａｕタンパク質にも特異的に結合する。
【００４８】
結果として本発明の１つの実施形態ではＴａｕタンパク質は非リン酸化及び／又はリン酸化されている。
【００４９】
ある特定の脳内Ｔａｕタンパク質沈積物では前記タンパク質は分解され、Ｎ末端部分を失う一方で微小管結合ドメインを保持している可能性もある。この短縮型Ｔａｕタンパク質はＴａｕタンパク質のカルボキシ末端部分を含み、したがって出発アイソフォームに依存して３Ｒ領域（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）又は４Ｒ領域（Ｒ１、Ｒ３及びＲ４）のどちらかを含む。このタンパク質分解によって線維の形成が促進され、次に不溶性になり、且つ、ある特定のタウオパチーの指標でもある螺旋フィラメント対の凝集が促進される。
【００５０】
結果として１つの実施形態ではＴａｕタンパク質は、Ｔａｕタンパク質のカルボキシ末端部分、特にＴａｕのリピートモチーフのＲ３領域又はＲ４領域、好ましくはＲ３領域を含む短縮型Ｔａｕタンパク質である。短縮型Ｔａｕタンパク質はＮ末端ドメインを欠いていることが好ましい。１つの特定の実施形態ではＴａｕタンパク質は上記で規定されているＴａｕの４４１アミノ酸のうちのアミノ酸３０６〜３２３に対応するアミノ酸配列ＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧ（配列番号２７）を有するペプチドを含むか、又はそのペプチドから成る。
【００５１】
抗Ｔａｕナノボディ
本発明との関係において「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は同じ意味を有し、区別なく使用される。従来の抗体では２本の重鎖がジスルフィド架橋によって相互に連結されており、且つ、それぞれの重鎖がジスルフィド架橋によって軽鎖に連結されている。２種類の軽鎖、すなわちラムダ（λ）軽鎖とカッパ（κ）軽鎖が存在する。抗体の機能活性を決定する５種類の主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥが存在する。それぞれの鎖は異なる配列を有するドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（まとめてＣＨと呼ばれるＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む。重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）が結合認識と抗原特異性を決定する。軽鎖定常領域（ＣＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ）のドメインは抗体鎖会合、分泌、経胎盤移行、補体結合、及びＦｃ受容体結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は軽鎖と重鎖の可変部分から成る免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分である。抗体の特異性は抗体結合部と抗原決定基との間の構造的相補性に依存する。抗体結合部は主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から構成される。時折、非超可変領域又は「フレームワーク」（ＦＲ）領域に由来する残基がそのドメインの全体的構造に影響し、結果として結合部に影響することがあり得る。
【００５２】
本発明との関係において「ＣＤＲ」という用語は免疫グロブリンの天然結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖はそれぞれＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲをそれぞれ有する。したがって、抗原結合部位は重鎖可変領域と軽鎖可変領域の全てのＣＤＲを含む６つのＣＤＲを含む。
【００５３】
抗体の配列又はナノボディの配列におけるＣＤＲの位置はこれまでに説明された技術を用いて当業者によって決定され得る。典型的には、それらのＣＤＲは３７３０ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃなどの適切な系で抗体又はナノボディのＤＮＡをシーケンシングし、次にＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ又はＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ  （２００３）  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：  ５５、又はＫａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州、１９９１年））などの専用データベース、好ましくはＩＭＧＴを使用して得られた配列を分析することにより特定され得る。
【００５４】
本発明との関係において「フレームワーク領域」、「フレームワーク」、又は「ＦＲ」という用語はＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。
【００５５】
本発明との関係において「ナノボディ」、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ抗体断片」、及び「単一ドメイン抗体」という用語は区別なく使用され、自然状態で軽鎖を欠いているラクダ科動物に見られる種類の抗体の単一の重鎖の可変ドメインを意味する。軽鎖が存在しない状態でナノボディはそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを有する。本発明のナノボディは特にラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、又はアルパカのナノボディであり得る。本発明のナノボディはラマナノボディであることが好ましい。
【００５６】
本明細書において「Ｔａｕタンパク質に対するナノボディ」という表現は「Ｔａｕ」の節において規定されたようにＴａｕタンパク質に選択的に結合することが可能なナノボディを意味するものとする。そのナノボディはＴａｕ特異的であること、すなわち他のあら
ゆる分子を除外するようにＴａｕに結合することが優先される。
【００５７】
本発明者らはオリゴマー型、場合によっては線維型のＴａｕタンパク質などの病理型Ｔａｕタンパク質に対するナノボディを作製した。それらのナノボディは線維型の短縮型Ｔａｕタンパク質を指向することも可能である。
【００５８】
特に、本発明者らはオリゴマー型Ｔａｕタンパク質を富化したＴａｕタンパク質調製物、線維型Ｔａｕタンパク質を富化したＴａｕタンパク質調製物、及び線維型の短縮型Ｔａｕタンパク質を富化した短縮型Ｔａｕタンパク質調製物でラマを免疫した。その後、本発明者らはＴａｕを指向し、且つ、他の抗Ｔａｕナノボディが有さない意外な追加的特徴を有する２つのナノボディを比較的に正確に特定した。具体的にはこれらの２つのナノボディである２Ｃ５及びＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６、特に２Ｃ５はオリゴマー型、場合によっては線維型のＴａｕを認識する。線維型Ｔａｕタンパク質が上記で規定されている短縮型Ｔａｕタンパク質であるときにもそのタンパク質は認識される。同時にこれらの２つのナノボディである２Ｃ５及びＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６、特に２Ｃ５は単量体型である天然型Ｔａｕタンパク質には結合しない。加えて、これらの２つのナノボディである２Ｃ５及びＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６、特に２Ｃ５はアミロイドβペプチド線維に結合しない。
【００５９】
結果として１つの好ましい実施形態では本ナノボディはオリゴマー型のＴａｕタンパク質に対するものである。
【００６０】
本発明との関係において「オリゴマー」という用語は本出願の実施例において記載されるようなインビトロ線維形成過程によって得られるＴａｕ調製物に関する。Ｔａｕ線維形成（４０μＭ）は緩衝液中、例えば最終体積が１．５ｍｌであることが典型的である典型的にはヘパリン（１０μＭ）とＮａＮ３（４％）が存在する典型的には２０ｍＭ、典型的にはｐＨ７のＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）の中で例えば３７℃で実施されることが典型的である。その線維形成はオリゴマー型Ｔａｕを得るために典型的には４８時間後に試料を−８０℃で凍結することにより停止されることが典型的である。その厳密な線維形成時間に依存してこのＴａｕタンパク質調製物にはオリゴマー型Ｔａｕタンパク質が富化されることになる。
【００６１】
「オリゴマー型Ｔａｕタンパク質を富化した」という用語はオリゴマー型Ｔａｕタンパク質の調製物であって、５０％を超えるＴａｕタンパク質がオリゴマー型であるものを意味する。例えば、５０％超、５５％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超のＴａｕタンパク質がオリゴマー型である。オリゴマー型Ｔａｕタンパク質を富化した調製物は天然型Ｔａｕタンパク質及び線維型Ｔａｕタンパク質も含むことが当業者に知られている。
【００６２】
結果として１つの実施形態ではオリゴマー型Ｔａｕタンパク質は単量体型、オリゴマー型、及び線維型のＴａｕタンパク質の混合物であり、その中で５０％を超えるＴａｕタンパク質がオリゴマー型であり、特に５５％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超のＴａｕタンパク質がオリゴマー型である。
【００６３】
例えばサイズ排除クロマトグラフィーを含む当業者に知られている幾つかの方法を用いてそのような調製物からオリゴマー型Ｔａｕタンパク質を精製することが可能であることも当業者に知られている。
【００６４】
前記オリゴマーは２個と４５個の間のＴａｕ単位を含むことが好ましい。２〜８個のＴａｕ単位を有するオリゴマーは可溶性オリゴマーと呼ばれ、８個より多く、最大で４５個のＴａｕ単位を有するオリゴマーは顆粒状オリゴマーと呼ばれ、可溶性又は不溶性であり
得る。１つの実施形態ではこれらのオリゴマーは約１２〜２９ｎｍの直径を有する円い小点として原子間力顕微鏡法又は電子顕微鏡法を用いて特徴を描写することができる。
【００６５】
別の実施形態ではこれらのオリゴマーは約１２〜３５ｎｍの直径を有する球状の分子であるとサイズ排除クロマトグラフィーを用いて特徴を描写することができる。
【００６６】
結果として本発明との関係において「オリゴマー」という用語は２個から最大で５０個のＴａｕ単位、特に２〜２０個、好ましくは２〜１２個のＴａｕ単位を有するＴａｕの凝集体又は重合体、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、又は十二量体のＴａｕ、又は２０〜４５個、好ましくは３０〜４５個のＴａｕ単位、例えば３５〜４５個、好ましくは３８〜４２個のＴａｕ単位を有する凝集体若しくは重合体を指す。ある特定の実施形態ではＴａｕタンパク質は二量体又は三量体である。ある特定の実施形態ではオリゴマー型Ｔａｕタンパク質は可溶性及び／又は不溶性であり、可溶性であることがより好ましい。
【００６７】
１つの実施形態では本発明のナノボディは≦２０ｎＭ、例えば≦１０ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、又は≦５ｎＭであるオリゴマー型Ｔａｕタンパク質に対する親和性、例えば０．１ｎＭ〜２０ｎＭ、特に１ｎＭ〜１０ｎＭ、又は１ｎＭ〜７ｎＭ、例えば５ｎＭの親和性を有する。
【００６８】
「親和性」という用語は巨大分子とそれが結合する抗原との間の結合能力、特にナノボディとそれが結合する抗原との間、例えば本発明のナノボディと上記で規定されている病理型Ｔａｕタンパク質との間の結合能力を意味するものとする。
【００６９】
本発明のナノボディが例えばオリゴマー型又は線維型のＴａｕタンパク質に結合する親和性、及びしたがってその結合能力は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、特にスウェーデン、ウプサラのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社のＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器を使用するＳＰＲ）をはじめとする幾つかの方法によって、又は例えば実施例に記載されるようにＥＬＩＳＡアッセイによってインビトロで測定可能である。
【００７０】
１つの実施形態では本発明のナノボディは線維型Ｔａｕタンパク質にも結合する。
【００７１】
本発明との関係において「線維」という用語は本出願の実施例において記載されるような線維形成過程によって得られるＴａｕタンパク質調製物に関する。Ｔａｕ（４０μＭ）の線維形成は緩衝液中、例えば最終体積が１．５ｍｌであることが典型的である典型的にはヘパリン（１０μＭ）とＮａＮ３（４％）が存在する典型的には２０ｍＭ、典型的にはｐＨ７のＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）の中で例えば３７℃で実施されることが典型的である。その線維形成は線維型Ｔａｕを得るために典型的には７２時間後に試料を−８０℃で凍結することにより停止されることが典型的である。したがって、線維型Ｔａｕタンパク質のそのような調製物は線維型Ｔａｕタンパク質を富化したＴａｕタンパク質調製物である。
【００７２】
「線維型のＴａｕを富化した」という用語は線維型Ｔａｕタンパク質の調製物であって、５０％を超えるＴａｕタンパク質が線維型であるものを意味する。例えば、５０％超、５５％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超のＴａｕタンパク質が線維型である。線維型Ｔａｕタンパク質を富化した調製物は天然型Ｔａｕタンパク質及びオリゴマー型Ｔａｕタンパク質も含むことが当業者に知られている。
【００７３】
結果として１つの実施形態では線維型Ｔａｕタンパク質は単量体型、オリゴマー型、及び線維型のＴａｕタンパク質の混合物であり、その中で５０％を超えるＴａｕタンパク質
が線維型であり、特に５５％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超のＴａｕタンパク質が線維型である。
【００７４】
例えばサイズ排除クロマトグラフィーを含む当業者に知られている幾つかの方法を用いてそのような調製物から線維型Ｔａｕタンパク質を精製することが可能であることも当業者に知られている。
【００７５】
本発明との関係において「線維」という用語は、インビボのＴａｕ線維形成を模倣しており、したがってＮＦＤを構成する螺旋フィラメント対と直線状フィラメントを模倣している人工的に得られるＴａｕの重合体又は凝集体を表す。その結果、本発明との関係において使用されるＴａｕ線維という用語には螺旋フィラメント対及び直線状フィラメントが包含される。これらの線維は糸状の外観を有すると電子顕微鏡法によって特徴付けることができる。１つの実施形態では本発明のナノボディは≦２０ｎＭ、例えば≦１０ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、又は≦６ｎＭである線維型Ｔａｕタンパク質に対する親和性、例えば０．１ｎＭ〜２０ｎＭ、特に１ｎＭ〜１０ｎＭ、又は１ｎＭ〜８ｎＭ、例えば６ｎＭの親和性を有する。
【００７６】
別の実施形態では本発明のナノボディは短縮型Ｔａｕタンパク質にも結合する。この短縮型タンパク質は線維型であることが好ましく、これをＲ３ペプチド線維と呼ぶこともできる。短縮型Ｔａｕタンパク質は「Ｔａｕ」の節において先に規定された通りである。特に、この短縮型Ｔａｕタンパク質は配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列から成る。
【００７７】
１つの実施形態では本発明のナノボディは≦１００ｎＭ、例えば≦８０ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６０ｎＭ、又は≦５０ｎＭである線維型の短縮型Ｔａｕタンパク質に対する親和性、例えば１ｎＭ〜１００ｎＭ、特に１ｎＭ〜８０ｎＭ、又は４０ｎＭ〜６０ｎＭ、例えば５０ｎＭの親和性を有する。
【００７８】
１つの実施形態では本発明のナノボディは≦１００ｎＭである線維型の短縮型Ｔａｕタンパク質に対する親和性、例えば１ｎＭ〜１００ｎＭの親和性、特に１ｎＭ〜８０ｎＭ、１ｎＭ〜２０ｎＭの親和性、例えば１０〜２０ｎＭの親和性を有する。
【００７９】
本発明との関係において「線維型の短縮型Ｔａｕタンパク質」又は「Ｒ３ペプチド線維」は本出願の実施例において記載されるようなインビトロ線維形成過程によって得られるＲ３ペプチドの調製物に関する。典型的には、Ｒ３（０．４μＭ）の線維形成は、例えば最終体積が１．５ｍｌであるである、典型的にはヘパリン（０．４μＭ）とＮａＮ３（４％）が存在する緩衝液中、典型的にはｐＨ７のＰＢＳ（５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）の中で、例えば３７℃で実施される。その線維形成は線維型の短縮型Ｔａｕ（Ｒ３）を得るために典型的には７２時間後に試料を−８０℃で凍結することにより停止されることが典型的である。
【００８０】
一例では線維型の短縮型Ｔａｕタンパク質に対する親和性は、例えばリン酸緩衝生理食塩水緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＯＰ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）であって、例えば１％のＢＳＡを含み、且つ、例えばｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水緩衝液の中で例えばＥＬＩＳＡにより測定される。
【００８１】
本発明者らはまた、本発明のナノボディについて、アルツハイマー病の患者における、海馬、嗅内皮質及び側頭皮質の、細胞体の特異的標識を示した。
【００８２】
結果として１つの実施形態では本発明のナノボディは螺旋フィラメント対及び／又は直
線状フィラメントにも結合する。
【００８３】
「螺旋フィラメント対」という用語は少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個のＴａｕ単位、特に少なくとも５０個又は少なくとも６０個のＴａｕ単位を含む螺旋状に対合したフィラメントを意味する。これらのフィラメントは電子顕微鏡法による観察が可能であり、且つ、８〜２０ナノメートルの直径、例えば１０〜２０ｎｍの直径と約８０ｎｍの螺旋ピッチ、例えば７０から最大で９０ｎｍの螺旋ピッチを有することが通常である。
【００８４】
「直線状フィラメント」という用語は、螺旋状に対合しておらず、且つ、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個のＴａｕ単位、特に少なくとも５０個又は少なくとも６０個のＴａｕ単位を含むフィラメントを意味する。これらのフィラメントは電子顕微鏡法による観察が可能であり、且つ、約１０ナノメートルの直径、例えば８〜１７ｎｍ、特に９〜１２ｎｍ、例えば１０ｎｍの直径を有することが通常である。
【００８５】
ＮＦＤを構成する螺旋フィラメント対及び直線状フィラメントは可溶性ではない。
【００８６】
別の実施形態では本発明のナノボディは重合化アミロイドβ１−４２タンパク質と実質的に相互作用しない。
【００８７】
１つの実施形態では本ナノボディは単量体型Ｔａｕタンパク質と実質的に相互作用しない。
【００８８】
オリゴマー型Ｔａｕタンパク質に対する親和性と単量体型Ｔａｕタンパク質又は重合化アミロイドβ１−４２タンパク質に対する親和性が非常に異なっている場合、ナノボディはタンパク質、例えば重合化アミロイドβ１−４２タンパク質又は単量体型Ｔａｕタンパク質と「実質的に相互作用していない」。一例では単量体型Ｔａｕタンパク質に対する親和性は結合応答が非常に弱いために測定不可能である。別の例では同じ実験条件及び同じナノボディ濃度において単量体型Ｔａｕとのナノボディの結合応答がオリゴマー型Ｔａｕとの同じナノボディの結合応答の５％未満である場合、そのナノボディは単量体型Ｔａｕタンパク質又は重合化アミロイドβ１−４２タンパク質と実質的に相互作用していない。実際には使用するナノボディ濃度はＥＣ５０濃度、又は飽和プラトーに達するために必要な濃度であり得る。
【００８９】
例えば、本発明のナノボディの単量体型Ｔａｕタンパク質に対する親和性は＞１２００ｎＭ、例えば＞１４００ｎＭ、＞１６００ｎＭ、＞１８００ｎＭ、特に＞１８００ｎＭである。
【００９０】
例えば、本発明のナノボディの重合化アミロイドβ１−４２タンパク質に対する親和性は＞５０００ｎＭ、例えば＞８０００ｎＭ、＞９０００ｎＭ、＞１００００ｎＭ、特に＞１００００ｎＭである。
【００９１】
本発明のナノボディはシーケンシングされている。
２Ｃ５ナノボディは次のアミノ酸配列を有する。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＤＴＬＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＳＰＳＧＧＶＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＬＬＱＭＮＳＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）
Ｓ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディは次のアミノ酸配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＳＲＳＧＧＳＴＲＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＮＮＴＶＹＬＬＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
【００９２】
これらの２つのナノボディのＣＤＲはさらに特異的にシーケンシングされており、それらは以下のものである。
【００９３】
２Ｃ５
ＣＤＲ１：ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）
ＣＤＲ２：ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）
ＣＤＲ３：ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）
Ｓ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６
ＣＤＲ１：ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）
ＣＤＲ１：ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）
ＣＤＲ１：ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）
【００９４】
当業者によく知られているように抗原結合部位を規定するためにはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組合せで充分である。同じ抗原を認識する２つのナノボディはこの抗原への結合について競合していることも当業者に知られている。
【００９５】
結果として本発明の対象は病理型、特にオリゴマー型のＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ｉ）アミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡであるアミノ酸配列ＧＲＴＦＳＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）をＣＤＲ１として含み、
（ｉｉ）アミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、アミノ酸Ｘ２がＳ又はＶであるアミノ酸配列ＩＳＸ１ＳＧＧＸ２Ｔ（配列番号２）をＣＤＲ２として含み、且つ、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）又はＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）をＣＤＲ３として含む
ナノボディであって、オリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合する前記ナノボディに関する。
【００９６】
Ｔａｕタンパク質、例えばオリゴマー型Ｔａｕへの結合について上記で規定されている２Ｃ５ナノボディ及び／又はＳ２Ｔ２ＭＥ＿Ｅ６ナノボディのＣＤＲを含むナノボディ（以後、「基準」ナノボディ）と競合する候補ナノボディの能力は、例えば、抗原（すなわちオリゴマー型Ｔａｕタンパク質）が固相支持体に結合しており、且つ、候補ナノボディと基準ナノボディをそれぞれ含む２種類の溶液が添加され、且つ、それらのナノボディが抗原に結合するために競合することになる競合ＥＬＩＳＡによって容易に検証され得る。その後、その抗原に結合した基準ナノボディの量を測定し、陰性対照（例えば候補ナノボディを欠く溶液）に対して測定したときの前記抗原に結合した基準ナノボディの量と比較することができる。陰性対照が存在する状態で結合した基準ナノボディの量と比較して候補ナノボディが存在する状態で結合した基準ナノボディの量が減少することは、オリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について候補ナノボディが競合することを示している。結合した基準ナノボディの検出を容易にするために（例えば蛍光により）基準ナノボディが標識可能であることが理想的である。候補ナノボディ及び／又は基準ナノボディの連続希釈物を使用して反復測定することが可能である。
【００９７】
本発明の別の対象では本発明は病理型、特にオリゴマー型のＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ａ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）を含むナノボディ、又は（ｂ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）を含むナノボディから選択されるナノボディであって、オリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合する前記ナノボディに関する。
【００９８】
本発明の対象はＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ｉ）アミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡであるアミノ酸配列ＧＲＴＦＳＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）をＣＤＲ１として含み、
（ｉｉ）アミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、アミノ酸Ｘ２がＳ又はＶであるアミノ酸配列ＩＳＸ１ＳＧＧＸ２Ｔ（配列番号２）をＣＤＲ２として含み、且つ、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）又はＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）をＣＤＲ３として含む
アミノ酸配列を含む前記ナノボディに関する。
【００９９】
本発明はＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、
（ａ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＳＤＴ（配列番号３）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＰＳＧＧＶＴ（配列番号４）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＮＲＤＰＫＹＧＮＴＲＹ（配列番号５）を含むナノボディ、又は
（ｂ）ＣＤＲ１としてのアミノ酸配列（ｉ）ＧＲＴＦＳＲＹＡ（配列番号６）、ＣＤＲ２としてのアミノ酸配列（ｉｉ）ＩＳＲＳＧＧＳＴ（配列番号７）、及びＣＤＲ３としてのアミノ酸配列（ｉｉｉ）ＴＡＲＲＲＩＳＧＴＰＱＷＨＹ（配列番号８）を含むナノボディ、又は
配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の配列、又は配列番号６、配列番号７、及び配列番号８の配列のうちの１つ、２つ、又は３つの配列においてそれぞれ１アミノ酸又は２アミノ酸の保存的置換を含む、（ａ）又は（ｂ）において規定されるナノボディの機能保存的変異体
にも関する。
【０１００】
１つの好ましい実施形態ではこのＴａｕタンパク質はオリゴマー型であり、場合によっては線維型である。
【０１０１】
本発明者らは２Ｃ５ナノボディ及びＳ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６ナノボディの「フレームワーク」（ＦＲ）領域をシーケンシングした。対応する配列は以下のものである。
【０１０２】
２Ｃ５
ＦＲ１領域：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１１）
ＦＲ２領域：ＬＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳ（配列番号１２）
ＦＲ３領域：ＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＬＬＱＭＮＳＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号１３）
ＦＲ４領域：ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
【０１０３】
Ｓ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６
ＦＲ１領域：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１５
）
ＦＲ２領域：ＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳ（配列番号１６）
ＦＲ３領域：ＲＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＮＮＴＶＹＬＬＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号１７）
ＦＲ４領域：ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１８）
【０１０４】
１つの特定の実施形態では本発明は病理型、特にオリゴマー型のＴａｕタンパク質に対するナノボディであって、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む複数のナノボディから選択されるナノボディとオリゴマー型Ｔａｕタンパク質への結合について競合する前記ナノボディに関する。
【０１０５】
１つの特定の実施形態では本発明は本発明者らによって特定されたナノボディのうちの１つの上記で規定されているＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の一連の配列を含むか、又はその一連の配列から成るナノボディに関する。
【０１０６】
したがって、本発明のナノボディは配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列から成るナノボディであるか、又は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列にそれぞれ含まれるＣＤＲのうちの１つ、２つ、又は３つのＣＤＲにおいてそれぞれ１アミノ酸又は２アミノ酸の保存的置換を含む前記ナノボディの機能保存的変異体であることが好ましい。上記で規定されている機能保存的変異体は１つ以上の置換を含んでもよく、特に配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列のそれぞれのＣＤＲではない領域、例えば「フレームワーク」領域、特に、上で規定された「フレームワーク」領域に１つ以上の保存的置換を含んでもよい。本発明のナノボディは配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列から成るナノボディであることがより好ましい。本発明のナノボディは配列番号９のアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列から成るナノボディであることが最も好ましい。
【０１０７】
本発明との関係において「機能保存的変異体」という表現は本発明のナノボディ内の所与のアミノ酸がそのナノボディの全体的な立体構造及び機能を損なわずに置換されている、１つのアミノ酸の類似する特性（例えば極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族基の存在など）を有する別のアミノ酸による置換を含む変異体を指す。類似の特性を有するアミノ酸は当業者によく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンは親水性塩基性アミノ酸であり、相互に置き換え可能である。同様にイソロイシンは疎水性アミノ酸であり、ロイシン、メチオニン、又はバリンによって置き換え可能である。そのような変更はそのナノボディの見かけの分子量又は等電点にほとんど、又は全く影響を与えないことが必要である。Ｄ体のアミノ酸、又はβ−アミノ酸若しくはγ−アミノ酸などの非天然アミノ酸によって天然アミノ酸を置き換えることが可能である。
【０１０８】
保存的置換の例を下の表１に示す。
【０１０９】
【表１】
2020505056.tif 000002
【０１１０】
あるいは保存的  アミノ酸  を下の表２に示されているようにＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（１９７５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、７１〜７７頁）に記載されるようなグループに分けることができる。
【０１１１】
【表２】
2020505056.tif 000003
【０１１２】
別の代替法により保存的置換の例を下の表３に示す。
【０１１３】
【表３】
2020505056.tif 000004
【０１１４】
これらの機能保存的変異体はＴａｕタンパク質、特にオリゴマー型、場合によっては線維型のＴａｕタンパク質に結合する能力を保持している。これらの機能保存的変異体は対応するナノボディと比較して同等以上のＴａｕ、特にオリゴマー型、場合によっては線維型のＴａｕとの結合親和性を有することが優先される。
【０１１５】
目的のナノボディのアミノ酸配列は当業者に知られているので当業者は従来のポリペプチド作製技術によって本発明のナノボディ、特に上で規定された２Ｃ５ナノボディ及びＳ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６ナノボディを作製することが可能である。例えば、周知の固相合成方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６２）  Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘ．  Ｂｏｉｌ．  
２１：  ４１２；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：  ２１４９、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０５：  ６４４２）を用いて、好ましくは市販のペプチド合成機（カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のペプチド合成機等）を使用し、製造業者の指示に従ってそれらのナノボディを合成することが可能である。
【０１１６】
あるいは本発明のナノボディは当業者に周知の組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州、５１〜５４頁及び４１２〜４３０頁）によって合成可能である。例えば、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、その目的のポリペプチドを発現することになる適切な原核生物又は真核生物の宿主にこれらのベクターを導入した後にＤＮＡ発現産物として本発明のナノボディを得ることができ、当業者に周知の技術を用いて前記宿主から本発明のナノボディを単離することが可能である。当業者によく知られているように組換えＤＮＡ技術によってタンパク質を合成する場合、そのタンパク質の精製を容易にするタグを連結してそのタンパク質を合成することが一般的である。そのようなタグは当業者によく知られており、例えば、ヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｍｙｃタグ、又はインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）がそのようなタグに含まれる。本発明のナノボディはｍｙｃタグ及び／又はヘキサヒスチジンタグを含むことが好ましい。結果として本発明の対象は、配列番号９及び配列番号１０の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列から成り、Ｃ末端又はＮ末端、好ましくはＣ末端にｍｙｃタグ及び／又は６ヒスチジン残基タグ、より好ましくはｍｙｃタグと６ヒスチジン残基タグも含むナノボディからも成る。当業者によく知られているようにタンパク質の精製を容易にするタグにそのタンパク質を連結する場合、そのようなタンパク質はそのタンパク質とこのタグの間での酵素切断を可能にする配列をその天然配列とこのタグの間に含む。したがって、配列番号１９及び配列番号２０の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列から成るナノボディは本発明の一部である。
【０１１７】
本発明の別の対象は本発明のナノボディをコードする核酸配列を含む核酸に関する。
【０１１８】
１つの特定の実施形態では本発明の核酸は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列のうちの１つによって規定されるナノボディをコードする核酸配列を含むか、又はその核酸配列から成る。本発明の核酸は配列番号９のアミノ酸配列によって規定されるナノボディをコードする核酸配列を含むか、又はその核酸配列から成ることが好ましい。
【０１１９】
前記核酸はＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であることが典型的であり、その分子はプラスミドベクター、コスミドベクター、エピソームベクター、人工染色体ベクター、ファージベクター、又はウイルスベクターなどのあらゆる適切なベクターに包含可能である。
【０１２０】
「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」という用語は宿主を形質転換し、導入した配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するように宿主細胞にＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を導入することを可能にする担体を意味する。
【０１２１】
結果として本発明の別の対象は本発明の核酸を含むベクターに関する。
【０１２２】
そのようなベクターはポリペプチドの発現を引き起こすため、又はその発現を管理するためにプロモーター、アクチベーター、ターミネーター等の調節配列を含むことができる。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びアクチベーターの例にはＳＶ
４０初期プロモーター及びアクチベーター（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０１：  １３０７−１３１０）、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲプロモーター及びアクチベーター、免疫グロブリン鎖プロモーター（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｃｅｌｌ  ４１：  ４７９−４８７）及びアクチベーター（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｃｅｌｌ  ３３：  ７１７−７２８）等が挙げられる。
【０１２３】
動物細胞用のあらゆる発現ベクターが使用可能である。適切なベクターの例にはｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３：  １３３−１４０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０１：  １３０７−１３１０）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｇｅｎｅ  ２７：  ２２３−２３２）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：  １５２７−１５３１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｍｉｙａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：  １３３−１４０）等が挙げられる。
【０１２４】
プラスミドの他の例には、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等のような、複製起点を含む複製性プラスミド又は組込みプラスミドが挙げられる。
【０１２５】
ウイルスベクターの他の例にはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターが挙げられる。そのような組換えウイルスは当業者に周知の技術によって作製可能であり、例えばパッケージ細胞の形質移入、又はヘルパープラスミド若しくはヘルパーウイルスとの一時的形質移入によって作製可能である。ウイルスパッケージ細胞の典型的な例にはＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等が挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを作製する詳細なプロトコルを例えば国際公開第９５／１４７８５号パンフレット、国際公開第９６／２２３７８号パンフレット、米国特許第５８８２８８７号明細書、米国特許第６０１３５１６号明細書、米国特許第４８６１７１９号明細書、米国特許第５２７８０５６号明細書、及び国際公開９４／１９４７８号パンフレットに見出すことが可能である。
【０１２６】
本発明の別の対象は本発明の核酸及び／又はベクターで形質移入された、形質導入された、又は形質転換された細胞に関する。
【０１２７】
「形質転換」という用語は「外来性」（すなわち外因性又は細胞外性）遺伝子又はＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の宿主細胞への導入によってその宿主細胞が目的の物質、典型的には導入された遺伝子又は配列がコードするタンパク質を産生するようにその導入された遺伝子又は配列を発現することを意味する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受容し、且つ、発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【０１２８】
本発明の核酸は適切な発現系において本発明のナノボディを産生するめに使用可能である。「発現系」という用語は適切な条件下で適合可能な宿主細胞とベクター、例えばベクターによって担持され、且つ、宿主細胞に導入される外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のためのそのベクターとその宿主細胞を意味する。
【０１２９】
従来の発現系には大腸菌宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、及び哺乳類宿主細胞とそれらの細胞のベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例には原核細胞（細菌等）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等）が挙げられる。具体的な例には大腸菌、クリベロマイセス属又はサッカロマイセス属の酵母、及び哺乳類細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細
胞等）が挙げられ、初期哺乳類細胞培養物又は樹立哺乳類細胞培養物（例えばリンパ芽球、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から作製された培養物）も挙げられる。マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）等も例に挙げられる。
【０１３０】
本発明は、本発明のナノボディを発現する組換え宿主細胞を作製するための方法であって、
（ｉ）上記の核酸をコンピテント宿主細胞にインビトロ又はエクスビボで導入する工程、
（ｉｉ）得られた前記組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養する工程、及び
（ｉｉｉ）所望により前記ナノボディを発現及び／又は分泌する前記細胞を選別する工程
を含む前記方法にも関する。本発明のナノボディの生産のためにそのような組換え宿主細胞を使用することができる。
【０１３１】
当業者に知られているあらゆる技術、例えばあらゆる化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術を単独で、又は組み合わせることにより本発明のナノボディを生産することができる。
【０１３２】
特に、本発明は、本発明のナノボディを生産するための方法であって、
（ｉ）前記ナノボディを発現させるために適切な条件下で本発明の形質導入細胞又は形質移入細胞又は形質転換細胞を培養する工程、及び
（ｉｉ）発現した前記ナノボディを回収する工程
を含む前記方法にも関する。
【０１３３】
本発明のナノボディは従来の免疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティー透析又はアフィニティークロマトグラフィー等によって培地から適切に分離可能である。
【０１３４】
標識化ナノボディ
本発明のナノボディは、医用イメージングに特に有用である。この関係で検出可能マーカーにナノボディを連結させることが特に有利である。本発明者らは２Ｃ５ナノボディ及びＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディ、特に２Ｃ５ナノボディが検出可能マーカーに連結されているときにそれらの特性を保持していることを示した。
【０１３５】
したがって、本発明は検出可能マーカーに結合した上記で規定されているナノボディにも関する。
【０１３６】
本明細書において「検出可能マーカーに結合したナノボディ」という用語は、その検出可能マーカーが直接的または間接的に、例えば切断可能リンカーペプチド又は非切断可能リンカーペプチドを介してそのナノボディに結合しているか、又はそのナノボディに組み込まれていることを意味するものとする。特にその検出可能マーカーは置換（例えばチロシン残基のレベルでＨをＩに置換することにより）、複合体化又はキレート化によりそのナノボディに結合可能である。
【０１３７】
本明細書において「検出可能マーカー」という用語は検出可能なシグナルを発する化合物を意味するものとする。トレーサーに連結するとそのトレーサーに起こることを生体内
でモニターすることが可能になる。検出可能マーカーＭＲＩ造影剤、シンチグラフィー造影剤、Ｘ線撮影造影剤、超音波診断造影剤、光学イメージング造影剤であり得る。検出可能マーカーの例には放射性元素；フルオレセイン、アレクサ（Ａｌｅｘａ）又はシアニンなどのフルオロフォア；ルミノールなどの化学発光化合物；ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼなどの生物発光化合物；及びナノパーティクル又はガドリニウムなどの造影剤が挙げられる。適切な検出可能マーカーの選択は使用する検出系に依存し、当業者の範囲内にある。例として、検出系がＭＲＩである場合には、検出可能マーカーは酸化鉄ナノ粒子又はガドリニウムであることが好ましく；検出系が蛍光イメージングである場合に検出可能マーカーはフルオレセイン、アレクサ（Ａｌｅｘａ）又はシアニンであることが好ましく；検出系が化学発光イメージングである場合に検出可能マーカーはルミノールであることが好ましく；検出系が生物発光イメージングである場合に検出可能マーカーはルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼであることが好ましく；検出系が核イメージングである場合に検出可能マーカーは放射性元素、例えばＰＥＴイメージング向けのガリウム（６８Ｇａ）又はＳＰＥＣＴイメージング向けのテクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）であることが好ましい。
【０１３８】
前記検出可能マーカーは放射性元素であることが好ましい。放射性元素の例、中でも特に核イメージング法に使用される放射性元素の例にはテクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、フッ素１８（１８Ｆ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、及びヒトに使用可能な他のあらゆる放射性元素が挙げられる。結果として前記放射性元素は９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１８Ｆ、及び６８Ｇａからなる群より選択されることが好ましい。前記放射性元素は９９ｍＴｃ又は６８Ｇａであることがより好ましく、９９ｍＴｃであることが最も好ましい。
【０１３９】
造影剤としての使用
本発明者らは２Ｃ５ナノボディによってアルツハイマー病の患者及び純粋タウオパチーの患者の海馬、嗅内皮質及び側頭皮質の神経細胞体が特異的に標識されることを示した。したがって、本発明者らは本発明のナノボディ、特に２Ｃ５が病理型Ｔａｕタンパク質、特に早期病理型Ｔａｕ、例えばオリゴマー型、場合によっては線維型のＴａｕに特異的なトレーサーを構成し、イメージングによるその検出を可能にすることを示した。
【０１４０】
したがって、医用イメージング、特に非侵襲的インビボ医用イメージングにおいて造影剤として使用される上記で規定されているナノボディが本発明により提供される。
【０１４１】
本発明は医用イメージング、特に非侵襲的インビボ医用イメージングに使用される造影剤を製造するための上記で規定されているナノボディの使用にも関する。
【０１４２】
本明細書において「造影剤」という用語は生体に投与されると医用イメージング時に造影剤が無いとほとんど見えないか、又は全く見えない器官又は構造体（組織、細胞、受容体）を検出できるように標識することを可能にする物質又は組成物を意味するものとする。さらに言うと、上記で規定されているマーカーに連結されたトレーサーを意味するために「造影剤」という表現が使用される。
【０１４３】
本発明との関係において「イメージング法」は生体の内側又は生体の器官を画像化することを可能にする方法を指す。イメージング法の例には血管内エコー法などの侵襲性技法、並びに磁気共鳴イメージング法、Ｘ線撮影、超音波診断、光学イメージングなどの非侵襲性技法、又はシンチグラフィー、特に単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの核医学が挙げられる。本発明のイメージング法はシンチグラフィー、特にＳＰＥＣＴ又はＰＥＴシンチグラフィーであることが好ましい。
【０１４４】
シンチグラフィーは放射性元素で標識されたトレーサーから成る放射性医薬品とも呼ばれる造影剤の投与（一般的には静脈内投与）に基づいている。次に放射されるγ線又はβ線を検出することにより生体内でのこの造影剤の特異的局在を決定する。
【０１４５】
単一光子放射断層撮影及び陽電子放射断層撮影法はシンチグラフィーに基づき、且つ、患者の周りを回転する一組のカメラによって器官とそれらの代謝の三次元画像と再構成像を作り出すことを可能にする断層撮影核医用イメージング法である。
【０１４６】
本発明は上記で規定されているナノボディを患者に投与する医用イメージング法、特に非侵襲的インビボ医用イメージング法にも関する。本発明の医用イメージング法は患者の体の領域における前記ナノボディの結合又は結合の不在を検出する工程、及びナノボディの結合を検出することができる患者の体の領域を画像化する工程を含むこともできる。
【０１４７】
本発明との関係において「患者」はヒト、又はげっ歯類動物（ラット、マウス、ウサギ）、霊長類動物（チンパンジー）、ネコ科動物（ネコ）、若しくはイヌ科動物（イヌ）などの非ヒト哺乳類動物を意味する。前記個体はヒトであることが好ましい。
【０１４８】
１つの特定の実施形態では「患者」という用語はタウオパチーに関連する症状を提示するヒトを意味する。タウオパチーに依存してこれらの症状は例えばパーキンソン症候群、軸性ジストニア、エイリアンハンド現象、又は患者の認知障害であり得る。
【０１４９】
当業者に知られているあらゆる投与方法を使用して本発明のナノボディを患者に投与することが可能である。特に、本ナノボディは例えば吸入により経口的に、又は（特に静脈内注射により）非経口的に投与可能である。非経口経路が選択された場合、ナノボディは注射可能な溶液及び懸濁液の形態であり得、ナノボディをバイアル又はボトルに詰めることができる。非経口投与剤形は本発明のナノボディを緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、及び懸濁化剤と混合することにより従来通りに得られる。公知の技術によってこれらの混合物を滅菌し、静脈内注射剤形に包装することができる。当業者は例えばリン酸塩系緩衝液を緩衝剤として使用することができる。懸濁化剤の例にはメチルセルロース、アカシアガム、及びナトリウムカルボキシメチルセルロースが挙げられる。安定化剤の例には亜硫酸ナトリウム及び二亜硫酸ナトリウムが挙げられ、保存剤の例にはｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾール、及びクロロクレゾールが挙げられる。
【０１５０】
投与されるナノボディの量は投与経路、患者の身長及び／又は体重、並びに使用する検出法に当然に依存する。
【０１５１】
本発明との関係において「体の領域」という用語は生物の所与の領域を指す。体の領域は例えば器官、器官の一部、又は組織、例えば脳、特に海馬、嗅内皮質、又は側頭皮質であり得る。
【０１５２】
１つの特定の実施形態では本発明のナノボディは患者の病理型Ｔａｕタンパク質を画像化するため、特にオリゴマー、線維、螺旋フィラメント対、及び直線状フィラメントから選択される形態、好ましくはオリゴマー及び線維、さらにより好ましくはオリゴマーの形態のＴａｕを画像化するための医用イメージングの造影剤として使用される。
【０１５３】
１つの実施形態では、本発明のナノボディは患者の神経原線維変性（ＮＦＤ）を画像化するための医用イメージングの造影剤として使用される。
【０１５４】
一例では、例えば皮質におけるＮＦＤの分布と数が、例えばＡＤの患者の記憶障害と相
関する。
【０１５５】
診断的使用
上記で規定されている病理型Ｔａｕタンパク質の出現がタウオパチーのマーカーである。加えて、病理型Ｔａｕの検出、特に早期病理型、例えばオリゴマー、場合によっては線維型のＴａｕタンパク質の検出によってタウオパチーのうちの１つの疾患の進展又は発症にかかわる有毒型の存在を特定することが可能になる。したがって、病理型、特に早期病理型、例えばオリゴマー、場合によっては線維型のＴａｕを特定することがタウオパチーの特徴を解析し、且つ／又はタウオパチーの発生を特定することになる。さらに、以前に特定された病理型Ｔａｕの進展、すなわち進行又は退行をイメージングによりモニターできることがタウオパチーと診断された患者における治療の効力を評価するための方法に相当する。
【０１５６】
したがって、本発明は診断法又は予後診断法において使用される上記で規定されているナノボディにも関する。
【０１５７】
本明細書において「診断方法」又は「診断」という用語は個体が病気を患っているか判断することを可能にする方法を意味するものとする。
【０１５８】
本明細書において「予後診断方法」又は「予後診断」という用語は個体が病気を発症する危険性を有するか判定することを可能にする方法を意味するものとする。
【０１５９】
タウオパチーの診断又は予後診断のために上記で規定されているナノボディを使用することが好ましい。
【０１６０】
タウオパチーは上記で規定された通りである。アルツハイマー病の診断又は予後診断のために本発明のナノボディを使用することが好ましい。
【０１６１】
例えばオリゴマー型Ｔａｕが存在することで対象はタウオパチー、特にアルツハイマー病を発症するリスクにさらされる。したがって、本発明のナノボディは患者におけるタウオパチー、特にアルツハイマー病の発生リスクを検出するために利用可能である。
【０１６２】
本明細書において「発生リスク」という用語は個体が病気を発症する確率を意味するものとする。
【０１６３】
本発明は患者におけるタウオパチーの診断及び／又はタウオパチーの発生リスクの検出のための方法であって、上記で規定されているナノボディを前記患者に投与する工程、及び前記患者の体内の前記ナノボディを検出する工程を含み、脳における前記ナノボディの優先的局在の検出がタウオパチーの指標、及び／又はタウオパチーの発生リスクの指標である前記方法にも関する。
【０１６４】
１つの実施形態では前記方法はアミロイドプラークマーカーを前記患者に投与する工程、及び前記患者の体内の前記アミロイドプラークマーカーを検出する工程も含み、脳における前記ナノボディ及び前記アミロイドプラークマーカーの優先的局在の検出がタウオパチーの指標、及び／又はタウオパチー、特にアルツハイマー病の発生リスクの指標である。
【０１６５】
結果として本発明は患者におけるタウオパチー、特にアルツハイマー病の診断、及び／又はタウオパチー、特にアルツハイマー病の発生リスクの検出のための方法であって、
（ｉ）前記患者に本発明のナノボディを投与し、前記患者の体内の前記ナノボディを検出
する工程、及び
（ｉｉ）前記患者にアミロイドプラークマーカーを投与し、前記患者の体内の前記アミロイドプラークマーカーを検出する工程
を含み、脳における前記ナノボディ及び前記アミロイドプラークマーカーの優先的局在の検出がタウオパチー、特にアルツハイマー病の指標、及び／又はタウオパチー、特にアルツハイマー病の発生リスクの指標である前記方法にも関する。
【０１６６】
１つの実施形態ではタウオパチーの診断のためのこれらの方法はインビボの方法である。
【０１６７】
「アミロイドプラークマーカー」という用語はアミロイドプラークに特異的に結合する検出可能マーカーに結合されており、且つ、非侵襲的インビボ医用イメージングの造影剤として使用可能であるトレーサーを意味するものとする。アミロイドプラークマーカーは例えば１８Ｆ−フロルベタピル（ｆｌｏｒｂｅｔａｐｉｒ）、１８Ｆ−フロルベタベン（ｆｌｏｒｂｅｔａｂｅｎ）、１８Ｆ−フルテメタモル（ｆｌｕｔｅｍｅｔａｎｏｌ）、及び１８Ｆ−ＡＺＤ４６９４マーク（ｍａｒｑｕｅ）などの１８Ｆトレーサーである。
【０１６８】
特定のタウオパチーに依存した病理型Ｔａｕの存在によって影響を受ける脳の領域が先行技術文献に記載されており、したがって当業者に知られている。神経原線維変性又は他の病理型Ｔａｕの脳における局在、及びおそらくはアミロイドプラークの脳における局在が数種類のタウオパチーについて例えばＣａｔａｆａｕ，  ＡＭ及びＢｕｌｌｉｃｈ，  Ｓ（Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ２０１５；  ３  （１）：  ３９−５５．２０１５年１月２１日に電子出版）又はＴｒａｎｃｈａｎｔ，  Ｃ．（ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａ１９９７；  １３：  ９８９−９７）内に記載されている。
【０１６９】
「優先的局在」という用語は脳内、特に例えば海馬、前頭新皮質、嗅内皮質、及び側頭皮質の神経細胞体に検出されるナノボディの量が生体内におけるナノボディの非特異的局在に相当するバックグラウンドノイズよりも多いことを意味するものとする。
【０１７０】
例えば、進行性核上性麻痺は脳幹及び前頭新皮質におけるＮＦＤの存在を特徴とする。
【０１７１】
別の例では大脳皮質基底核変性症は頭頂皮質におけるＮＦＤの存在を特徴とする。
【０１７２】
別の例ではアルツハイマー病は嗅内皮質構造体におけるＮＦＤの存在を特徴とする。
【０１７３】
本発明はタウオパチーと診断された対象におけるタウオパチーの治療モニタリングに使用される本発明のナノボディにも関する。
【０１７４】
本発明はタウオパチーと診断された対象におけるタウオパチーの治療モニタリングに使用される造影剤を製造するための本発明のナノボディの使用にも関する。
【０１７５】
本明細書において「治療モニタリング」という用語は対象に施された治療に対する前記対象の応答の観察を意味するものとする。治療の治療効果には疾患の進行の遅延化又は抑制、又は疾患若しくはこの疾患に付随する１つ以上の症状の反転が伴うことが一般的である。逆に、治療効果の不在によって疾患又はその疾患の症状のうちの１つ以上の安定した進行又は進行の加速化さえ生じ得る。例えば、病理型Ｔａｕの存在によってタウオパチーが診断されている場合、病理型Ｔａｕの消失、退化、維持、又は成長を観察することにより治療モニタリングを実施することができる。したがって、本発明に従う使用は
（ａ）病理型Ｔａｕが検出された対象に上記で規定されているナノボディを投与する工程、
（ｂ）前記病理型Ｔａｕへのナノボディの結合を検出する工程、
（ｃ）前記対象への加療の前後に工程（ａ）と（ｂ）を繰り返す工程
を含んでよく、前記病理型Ｔａｕに対する前記ナノボディの結合の不在又は減少が治療効果を有する治療の指標である。
【０１７６】
「病理型Ｔａｕ」は上の「タウオパチー」の節で規定された通りである。
【０１７７】
前記治療はタウオパチーの治療であり、且つ、例えばＴａｕ凝集阻害剤の使用を含むことが好ましい。別の例ではタウオパチーの前記治療は本発明のナノボディの使用を含む。
【０１７８】
医薬としての使用
近年、病理型Ｔａｕ、例えば細胞外性有毒型Ｔａｕは漸進的な神経細胞の汚染による脳におけるＡＤなどのタウオパチーの進展に関与する（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）有毒型のＴａｕ（Ｕｓｅｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）であることが示された。その結果、有毒型のＴａｕの凝集を阻害し、それにより螺旋フィラメント対（ＰＨＦ）及び直線状フィラメント（ＳＦ）の形成を阻害するために有毒型のＴａｕをターゲティングすることがタウオパチー、特にアルツハイマー病の有望な治療法である。
【０１７９】
結果として本発明は医薬、特にタウオパチーの治療を目的とした医薬を製造するための上記で規定されているナノボディの使用にも関する。上記で規定されているナノボディの治療有効量の必要とする患者への投与を含む治療方法も本発明の一部である。
【０１８０】
したがって、抗Ｔａｕナノボディの使用によりＴａｕ凝集の進行を抑制することが可能になる。
【０１８１】
タウオパチーの「治療」という用語はタウオパチーの進行の遅延化又は抑制を含むタウオパチーの「治療的処置」（又は治癒的処置）を意味するものとする。その用語は特にＮＦＤ形成の抑制を含むタウオパチーの「予防的処置」も意味するものとする。
【０１８２】
「予防」という用語はタウオパチーに付随する臨床的又は生化学的兆候の発生の防止又は遅延化、又はそれらの兆候の強度の低下を意味するものとする。
【０１８３】
当業者は、一般的な知識に基づき、所与のタウオパチーと関連する、且つ、改善（治療）可能であるか、そうでなければ予防、遅延化、又は強度の低下（予防）が可能である、臨床的又は生化学的兆候の判定方法知っている。タウオパチーとの関係では目的の生物学的パラメーターは病理型Ｔａｕ、特に早期病理型Ｔａｕ、例えば、オリゴマー型Ｔａｕタンパク質、場合によっては線維型Ｔａｕの存在と局在であり得る。
【０１８４】
本発明は、中でも特に、タウオパチーの治療及び／又はタウオパチーの予防、好ましくはアルツハイマー病の治療及び／又は予防のために使用される上記で規定されているナノボディに関する。
【０１８５】
本発明はタウオパチーを提示しやすい患者におけるタウオパチーの治療及び／又はタウオパチーの予防を目的とした医薬の製造のための上記で規定されているナノボディの使用にも関する。
【０１８６】
本発明は必要とする患者におけるタウオパチーの治療のため及び／又はタウオパチーの予防のための方法であって、上記で規定されているナノボディの治療有効量の必要とする患者への投与を含む前記方法にも関する。
【０１８７】
本発明のナノボディは病理型Ｔａｕ、特に早期病理型、例えばオリゴマー型Ｔａｕ、場合によっては線維型Ｔａｕを治療するために使用されることが優先される。
【０１８８】
本発明のナノボディは、適切な形態で例えば経口的に、吸入により、非経口的に（特に静脈内注射により）、投与可能である。非経口経路を考えると、本ナノボディは、バイアル又はボトルに詰められた、注射可能な溶液及び懸濁液の形態であってよい。非経口投与のための剤形は本ナノボディを緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、及び懸濁化剤と混合することにより従来通りに得られる。公知の技術によって後にこれらの混合物を滅菌し、静脈内注射剤形に包装する。緩衝剤として当業者は有機リン酸塩系の緩衝剤を使用してよい。懸濁化剤の例にはメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アカシアガム、及びナトリウムカルボキシメチルセルロースが包含される。また、本発明に従って使用される安定化剤は亜硫酸ナトリウム及び二亜硫酸ナトリウムであり、保存剤としてｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾール、及びクロロクレゾールに言及することができる。
【０１８９】
投与されるナノボディの量は投与方法、患者の身長及び／又は体重、及びナノボディと組み合わせられる場合がある細胞傷害剤の性質に当然に依存する。
【０１９０】
本発明は上記で規定されているナノボディを薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。
【０１９１】
「薬学的に」又は「薬学的に許容可能な」という用語は哺乳類動物、特にヒトに投与されると副反応、アレルギー反応、又は他の好ましくない反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。
【０１９２】
本発明との関係において「薬学的に許容可能な担体」という表現にはあらゆる溶媒、分散媒、被覆材、抗菌又は抗真菌剤、等張剤、又は吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質へのそのような媒体及び薬剤の使用が当業者によく知られている。活性成分と従来の媒体又は薬剤が適合しない場合を除いて医薬組成物にそれらを使用することが考えられている。前記組成物に追加活性成分を組み込んでもよい。
【０１９３】
インビトロでＴａｕを検出するための使用
本発明は試料中のオリゴマー型Ｔａｕタンパク質のインビトロ検出のための上記で規定されているナノボディの使用にも関する。
【０１９４】
「試料」という用語はより大きな要素の一部を本明細書において意味するものとする。その試料は生物起源の物質であることが好ましい。生物試料の例には、限定されることはないが、脳、特に海馬、嗅内皮質又は側頭皮質、血液、特に脳血液、脳脊髄液などの器官の一部又は組織の一部が挙げられる。本発明との関係において試料は脳試料に関係することが好ましい。
【０１９５】
以下の図面、配列、及び実施例によって本発明をさらに詳細に例示する。
【０１９６】
配列の簡単な説明
【０１９７】
配列番号１はアミノ酸Ｘ１がＳ又はＲであり、アミノ酸Ｘ２がＤ又はＹであり、且つ、アミノ酸Ｘ３がＴ又はＡである本発明のナノボディのコンセンサスＣＤＲ１アミノ酸配列を示す。
【０１９８】
配列番号２はアミノ酸Ｘ１がＰ又はＲであり、且つ、アミノ酸Ｘ２がＳ又はＶである本
発明のナノボディのコンセンサスＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０１９９】
配列番号３は２Ｃ５ナノボディのＣＤＲ１アミノ酸配列を示す。
【０２００】
配列番号４は２Ｃ５ナノボディのＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０２０１】
配列番号５は２Ｃ５ナノボディのＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。
【０２０２】
配列番号６はＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディのＣＤＲ１アミノ酸配列を示す。
【０２０３】
配列番号７はＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディのＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０２０４】
配列番号８はＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディのＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。
【０２０５】
配列番号９は２Ｃ５ナノボディの可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０２０６】
配列番号１０はＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディの可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０２０７】
配列番号１１は２Ｃ５ナノボディのＦＲ１領域のアミノ酸配列を示す。
【０２０８】
配列番号１２は２Ｃ５ナノボディのＦＲ２領域のアミノ酸配列を示す。
【０２０９】
配列番号１３は２Ｃ５ナノボディのＦＲ３領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１０】
配列番号１４は２Ｃ５ナノボディのＦＲ４領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１１】
配列番号１５はＳ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６ナノボディのＦＲ１領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１２】
配列番号１６はＳ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６ナノボディのＦＲ２領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１３】
配列番号１７はＳ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６ナノボディのＦＲ３領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１４】
配列番号１８はＳ２Ｔ２Ｍ２＿Ｅ６ナノボディのＦＲ４領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１５】
配列番号１９はｍｙｃタグ及び６ヒスチジン残基タグを含む２Ｃ５ナノボディの可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１６】
配列番号２０はｍｙｃタグ及び６ヒスチジン残基タグを含むＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディの可変領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１７】
配列番号２１は４４１アミノ酸を含むＴａｕ−Ｆとも呼ばれる、Ｔａｕタンパク質の２Ｎ４Ｒアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【０２１８】
配列番号２２は４１２アミノ酸を含むＴａｕ−Ｅとも呼ばれる、Ｔａｕタンパク質の１Ｎ４Ｒアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【０２１９】
配列番号２３は３８３アミノ酸を含むＴａｕ−Ｄとも呼ばれる、Ｔａｕタンパク質の０Ｎ４Ｒアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【０２２０】
配列番号２４は４１０アミノ酸を含むＴａｕ−Ｃとも呼ばれる、Ｔａｕタンパク質の２
Ｎ３Ｒアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【０２２１】
配列番号２５は３８１アミノ酸を含むＴａｕ−Ｂとも呼ばれる、Ｔａｕタンパク質の１Ｎ３Ｒアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【０２２２】
配列番号２６は３５２アミノ酸を含む胎児型Ｔａｕとも呼ばれる、Ｔａｕタンパク質の０Ｎ３Ｒアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【０２２３】
配列番号２７はＴａｕタンパク質の３Ｒ領域から成る短縮型Ｔａｕタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０２２４】
１．ナノボディの作製
（１）ラクダ科動物の免疫に必要な抗原の調製
Ｔａｕの最長アイソフォーム（４４１アミノ酸；４５．８ｋＤａ）をコードするｃＤＮＡ（ｈｔａｕ４０）をプラスミドｐＲＫ１７２のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にクローニングした。大腸菌ＢＬ２１細菌（Ｇｏｅｄｅｒｔ、  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ、  ３（４）：  ５１９−５２６  （１９８９）より取得）（パリのＩＮＳＥＲＭのＢａｕｌｉｅｕ教授のチームから供給された細菌）を、その組換えプラスミドで形質転換した。２ステップのＦＰＬＣ（ファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィー）、すなわち（１）  ＳＯ４−負荷陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ−ＸＬ；Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、次に（２）排除クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  カラム；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによりタンパク質を精製した。インビボＴａｕ線維形成を模倣する様々な重合体型のＴａｕ（オリゴマー型及び線維型）を富化した調製物を得るためにＦｌａｃｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１２，  （２８７）５２：  ４３２２３−４３２３３）によって改変されたＨａａｓｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ８８（６）：  １５０９−１５２０，  ２００４）の方法を使用した。最終体積が１．５ｍＬであるヘパリン（１０μＭ）とＮａＮ３（４％）が存在するｐＨ７の２０ｍＭのＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液の中でＴａｕ（４０μＭ）の線維形成を３７℃で実施する［２１］［１４］。上で記載されたようにその線維形成を分析する。４８時間及び７２時間後に試料を−８０℃で凍結することにより線維形成を停止する。重合過程の持続期間は（ａ）オリゴマー及び（ｂ）線維の生産に適合している。並行してＴａｕのＲ３領域リピートモチーフを含むペプチドを合成し、同じように重合化した。特に最終体積が１．５ｍｌであるヘパリン（０．４μＭ）とＮａＮ３（４％）が存在するｐＨ７の５０ｍＭのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液の中でＲ３（０．４μＭ）の線維形成を３７℃で実施する。線維型の短縮型Ｔａｕ（Ｒ３）を得るために典型的には７２時間後に試料を−８０℃で凍結することにより線維形成を停止する。
【０２２５】
（２）ラマの免疫
同じ条件下でＴａｕオリゴマー及びＴａｕ線維及びまたＲ３重合体から成る混合物（（ａ）、（ｂ）、（ｃ））でラマを免疫した。３回の連続注射を０日目、９日目、１８日目に実施した。２８日目と４２日目に血液試料を採取する。リンパ球を分離及び単離するためにフィコール勾配で血液バッグを遠心分離し、全ＲＮＡを抽出する。
【０２２６】
（３）ナノボディの生産とスクリーニング
ナノボディの生産とスクリーニングは複数のステップ、すなわち
−ラマリンパ球ｍＲＮＡの増幅と生産
−それまでに免疫したヒトコブラクダのナノボディを発現するファージライブラリーの作
製
−抗Ｔａｕオリゴマーナノボディを発現するファージのＥＬＩＳＡアッセイ及びＦＡＣＳによる選別
−選択されたクローンのシーケンシングと個々のクローンの特定
−Ｎｂの配列の決定
−Ｃ末端Ｍｙｃタグ及びヒスチジンタグを含むＮｂをコードするｍＲＮＡ断片の構築化と生産
−細菌への挿入とＮｂのバルク製剤
を含む。
【０２２７】
２．ナノボディのインビトロ特性解析
前記ナノボディを２つの工程により親和性と特異性について特性解析した。
【０２２８】
（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイＩ：
出発抗原として、Ｔａｕオリゴマーを富化した調製物、Ｔａｕ線維を富化した調製物、重合化Ｒ３、並びに天然Ｔａｕタンパク質及びアミロイドβペプチド線維（市販のペプチドから作製）を使用する。前記ナノボディの結合定数はこれらの免疫原の各々について決定されている。
【０２２９】
（ｂ）免疫組織化学：ヒト解剖病理学（ジュネーブのメンタルヘルス及び精神医学局との共同研究）に由来するパラフィン組織切片について。これらの切片はより重篤なタウオパチーまたはそれほど重篤ではないタウオパチーといった様々な症例をカバーする。
【０２３０】
（ｃ）
組織切片を脱パラフィン化し、次にＰＢＳ−０．２％トリトン緩衝液中での透過処理及び市販のマスキング解除溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｈ−３３００）による抗原のマスキング解除の後に浮遊切片として処理した。一次抗体（Ｎｂ）を様々な濃度（２０ｎＭ以上）で一晩にわたって４℃で負荷する。洗浄後にウサギ抗ヒスチジン抗体を室温で１時間にわたって負荷し、次に洗浄後にヤギ抗ウサギ三次抗体を最終的に１時間にわたって負荷する。アビジンビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣキット）及び次にジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣキット）が存在する２工程のインキュベーション工程によって可視化を実施する。一次抗体（Ｎｂ）が存在しない状況で対照切片を体系的に調製する。それらの切片をスライドグラス上に載せ、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０２３１】
（ｄ）ＥＬＩＳＡアッセイＩＩ：ヨウ素１２５で２Ｃ５ナノボディを放射性標識した。リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＯＰ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）、１％ＢＳＡ、ｐＨ＝７．５の中でＴａｕタンパク質Ｒ３配列重合体に対する親和性アッセイをＥＬＩＳＡにより実施する。放射性標識．の前（図５）と後（図６）にそれらのＥＬＩＳＡを実施する。放射性標識後に前記リガンドはその標的に対して良好な親和性を保持している（図６）ことが注目される。
【０２３２】
３．結果
早期病理型Ｔａｕタンパク質（オリゴマー型及び線維型）を特異的に指向する低分子量（１５ｋＤａ）の単一の可変ドメインを有する複数のラクダ科動物抗体（Ｎｂ）である２Ｃ５（ＶＨＨ）とＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６（ＶＨＨ）を作製した。
【０２３３】
２Ｃ５  Ｎｂの配列を解析し、ＶＨＨとして特徴を明らかにし、且つ、インビトロで特性解析した。その抗体はオリゴマー型、線維型、及び重合化短縮型のＴａｕに対してそれぞれ５ｎＭ、６ｎＭ、及び５０ｎＭの親和性（Ｋｄ）を示す。このＮｂは天然型Ｔａｕタンパク質（Ｋｄ＞１８００ｎＭ）にもアミロイドβペプチド線維（Ｋｄ＞１００００ｎＭ
）にも結合しない（図１及び図２）。
【０２３４】
解剖病理学（異なるグレードのアルツハイマー病及びタウオパチー）に由来するヒト脳の切片に対する免疫組織化学によってこのＮｂを試験した。その抗体によってアルツハイマー病の患者と純粋タウオパチーを有する認知症の１症例において海馬、嗅内皮質、及び側頭皮質の神経細胞体の特異的標識が示されている（表４及び図３）。
【０２３５】
これのＳｄＡｂのテクネチウム９９ｍ放射性標識の実施に成功した。
【０２３６】
低分子量Ｔａｕ重合体に対する親和性のためにＳ２Ｔ２Ｍ３＿Ｅ６ナノボディを選択した。
【０２３７】
【表４】
2020505056.tif 000005
【図１】
2020505056.tif 000006
【図２】
2020505056.tif 000007
【図３】
2020505056.tif 000008
【図４】
2020505056.tif 000009
【図５】
2020505056.tif 000010
【図６】
2020505056.tif 000011
【配列表】
2020505056000001.app
【国際調査報告】
2020505056.tif 000012
2020505056.tif 000013
2020505056.tif 000014
2020505056.tif 000015
2020505056.tif 000016
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2020505056.tif 000019
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2020505056.tif 000021