(57)【要約】  本明細書は、特定の細胞表面マーカーを発現する細胞型を特定し除去するための組成物および治療方法を記載する。１つの実施形態においては、該組成物は、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を含み、ここで、該ポリペプチド構築物は、操作された細胞において発現される。【選択図】図11
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物であって、該ポリペプチド構築物が細胞において発現される、医薬組成物。
【請求項２】
ポリペプチド構築物がＣＤ２７７のＪ配置に、該Ｊ配置にはないＣＤ２７７分子と比較して高い選択性で結合する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
標的細胞が癌細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
標的細胞が白血病細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
γ−ＴＣＲポリペプチド配列がγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
δ−ＴＣＲポリペプチド配列がδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＣＤ２７７が二量体として存在する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象における癌の治療方法であって、該ＣＤ２７７分子がＪ配置で存在し、該ポリペプチド構築物が、所望により、細胞において発現されてもよい、治療方法。
【請求項１１】
ＣＤ２７７がＪ配置にある場合の癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物の有効量または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞の有効量を対象に投与することを含む、癌細胞の除去を要する対象において癌細胞を除去する方法。
【請求項１２】
ポリペプチド構築物がＣＤ２７７のＪ配置を、該Ｊ配置にはないＣＤ２７７分子と比較して高い選択性で認識する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
該Ｊ配置の形成が、少なくとも、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用および／またはＣＤ２７７の区画化を要する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１４】
該Ｊ配置の形成が、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用の後、細胞内リン酸化抗原とＣＤ２７７との相互作用を要する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つを含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強する物質を投与することを含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１８】
該方法が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを調節する物質を投与することを含み、該物質がＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）およびグアニンヌクレオチド解離インヒビター（ＧＤＩ）の少なくとも１つを標的化する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１９】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性と相関する突然変異に関して対象の遺伝子型を決定することを更に含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項２０】
該方法が、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）およびグアニンヌクレオチド解離インヒビター（ＧＤＩ）から選択されるタンパク質をコードする遺伝子から選択される遺伝子の遺伝子型を決定することを更に含み、該タンパク質がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを調節する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項２１】
ａ）少量の追加的（本有的）な共受容体を発現する免疫細胞を準備し、
ｂ）γ９−Ｔ細胞受容体鎖をコードする核酸配列およびδ２−Ｔ細胞受容体鎖をコードする核酸配列を準備し、ここで、γ９−Ｔ細胞受容体鎖およびδ２−Ｔ細胞受容体鎖は、ＣＤ２７７がＪ配置にある場合のＣＤ２７７に選択的に結合し、
ｃ）工程ｂ）の核酸配列をＴ細胞内に導入して、工程ｂ）のγ９−Ｔ細胞受容体鎖と工程ｂ）のδ２−Ｔ細胞受容体鎖とを含むγ９δ２Ｔ細胞受容体を含有する操作された細胞を得ること
を含む、細胞を操作する方法。
【請求項２２】
ａ）Ｔ細胞受容体を発現する細胞を標的細胞と接触させ、
ｂ）Ｔ細胞受容体を発現する細胞の免疫活性化のレベルを検出し、
ｃ）ｉ）免疫活性化が閾値レベル未満である場合には、遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有するもの、または
ｉｉ）免疫活性化が閾値レベルを超えている場合には、遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有さないもの
の１つとして、標的細胞を特定し、
ｄ）免疫活性化が閾値レベル未満である場合には、標的細胞遺伝子型を対照遺伝子型と比較して、遺伝的またはエピジェネティック変異を特定すること
を含む、Ｔ細胞受容体認識の欠如をもたらす遺伝的またはエピジェネティック変異に関して標的細胞をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
標的細胞が癌細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞受容体がＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
免疫活性化のレベルの検出が、Ｔ細胞受容体を発現する細胞による少なくとも１つのサイトカインの産生を定量することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
サイトカインがインターフェロン−γおよびＴＮＦαの少なくとも１つである、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
遺伝的またはエピジェネティック変異が一塩基多型である、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
標的細胞の接合性が、前記の遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有すること、または前記の遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有さないことと相関する、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
遺伝的またはエピジェネティック変異の近位の遺伝子を特定する工程を更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
遺伝子が遺伝的またはエピジェネティック変異から約３００，０００塩基対以内に位置する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子の発現を調節し、Ｔ細胞受容体発現細胞の免疫活性化の量に対する調節の効果を評価する工程を更に含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
該調節が、遺伝子をノックアウトすることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞受容体発現細胞がαβＴ細胞またはγδＴ細胞の少なくとも１つである、請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
対照遺伝子型が対照細胞の遺伝子型であり、ここで、対照細胞は、Ｔ細胞受容体発現細胞と接触すると、Ｔ細胞受容体発現細胞の免疫活性化を引き起こす、請求項２２記載の方法。
【請求項３５】
Ｔ細胞受容体発現細胞の免疫活性化がサイトカインの産生における少なくとも２倍の増加または類似した機能的読取り情報により特徴づけられる、請求項２２記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞受容体発現細胞の免疫活性化がサイトカインの産生における少なくとも１０倍の増加または類似した機能的読取り情報により特徴づけられる、請求項２２記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞受容体発現細胞の免疫活性化がサイトカインの産生における少なくとも１００倍の増加または類似した機能的読取り情報により特徴づけられる、請求項２２記載の方法。
【請求項３８】
該接触が、Ｔ細胞受容体発現細胞および対照細胞を同じ容器に加えることを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３９】
該接触が、Ｔ細胞受容体発現細胞および対照細胞を同じ容器に加えることを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
標的細胞がＢ細胞白血病細胞系である、請求項２２記載の方法。
【請求項４１】
標的細胞がエプスタインバーウイルス形質転換細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項４２】
遺伝的突然変異が、ＲｈｏＧＴＰアーゼを調節するタンパク質をコードする遺伝子に位置する、請求項２２記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質がＧＴＰアーゼ活性化タンパク質またはグアニンヌクレオチド交換因子である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
遺伝的突然変異がＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用の低減または抑制をもたらす、請求項２２記載の方法。
【請求項４５】
ａ）タンパク質をコードする遺伝子における突然変異に関して対象をスクリーニングし、ここで、該タンパク質は対象の標的細胞においてＲｈｏＧＴＰアーゼを翻訳後に調節し、
ｂ）該突然変異がＣＤ２７７におけるＪ配置の形成を低減も抑制もしない場合には、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞媒介療法で対象を治療すること
を含む方法。
【請求項４６】
標的細胞が癌細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
標的細胞が白血病細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質がＧＴＰアーゼ活性化タンパク質またはグアニンヌクレオチド交換因子である、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
スクリーニングが、遺伝子またはその一部の遺伝子型を決定することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
スクリーニングが、核酸増幅、配列決定およびオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションから選択される方法を含む、請求項４５記載の方法。
【請求項５１】
ａ）対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を対象に投与すること、および
ｂ）Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞を投与すること
を含む、癌細胞の除去を要する対象において癌細胞を除去する方法。
【請求項５２】
該物質が癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強する、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
該物質が癌細胞の細胞膜にＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを維持する、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
該物質が癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強する、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
該物質が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強する、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
該物質がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強する、請求項５１記載の方法。
【請求項５７】
該物質がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＣＤ２７７との相互作用を増強する、請求項５１記載の方法。
【請求項５８】
該物質がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化する、請求項５１記載の方法。
【請求項５９】
該物質がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強する、請求項５１記載の方法。
【請求項６０】
該物質がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減する、請求項５１記載の方法。
【請求項６１】
該物質が癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させる、請求項５１記載の方法。
【請求項６２】
該物質が癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性を増加させる、請求項５１記載の方法。
【請求項６３】
癌細胞上の細胞表面分子に結合する部分に該物質を結合させ、それにより、該物質を癌細胞に標的化する、請求項５１記載の方法。
【請求項６４】
該部分が小分子化合物を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
該部分がペプチドを含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
該部分が抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
該物質が癌細胞における細胞内リン酸化抗原の量を増加させる、請求項５１記載の方法。
【請求項６８】
癌細胞における細胞内リン酸化抗原の量を増加させる追加的物質を投与することを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項６９】
該追加的物質はメバロン酸経路インヒビターである、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
メバロン酸経路インヒビターがアミノビスホスホネートである、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
アミノビスホスホネートがパミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つである、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
対象が固形癌および白血病の少なくとも１つを有する、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
白血病は急性骨髄性白血病である、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
対象が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性の低下をもたらす遺伝子における突然変異を有する、請求項５１記載の方法。
【請求項７５】
対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を対象に投与することを含む、癌細胞の除去を要する対象において癌細胞を除去する方法。
【請求項７６】
Ｔ細胞を対象に投与することを含む、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
Ｔ細胞がＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現する、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
Ｔ細胞が、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現するように操作されており、または遺伝的に修飾されている、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
Ｔ細胞が、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を過剰発現するように操作されており、または遺伝的に修飾されている、請求項７６記載の方法。
【請求項８０】
サイトカインの剤形を投与することを更に含む、請求項５１記載の方法。
【請求項８１】
ａ）標的細胞における受容体の活性化を含む表現型を誘導する細胞を特定し、
ｂ）該表現型を示す細胞の接合性を特定し、
ｃ）該細胞に関する遺伝子型情報を得、ここで、該遺伝子型情報は、種々の細胞に関する複数の遺伝子座のそれぞれにおける遺伝子型を定め、
ｄ）特定された細胞接合性を、それらの細胞にわたる複数の遺伝子座の１つにおける遺伝子型と相関させて、活性化遺伝子座を特定すること
を含む、標的細胞における受容体の活性化に関連した遺伝子座を特定するための方法。
【請求項８２】
遺伝子型情報が複数の遺伝子座のそれぞれにおける一塩基多型を定める、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
受容体がＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体またはその断片である、請求項８１記載の方法。
【請求項８４】
標的細胞が癌細胞である、請求項８１記載の方法。
【請求項８５】
標的細胞が白血病細胞である、請求項８１記載の方法。
【請求項８６】
表現型がＩＦＮγの産生である、請求項８１記載の方法。
【請求項８７】
遺伝子が前記の複数の遺伝子座の少なくとも１つの近位に位置する、請求項８１記載の方法。
【請求項８８】
受容体の活性化が、細胞型の細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する標的細胞のポリペプチド構築物を伴う、請求項８１記載の方法。
【請求項８９】
Ｊ配置が活性化遺伝子座と相関している、請求項８１記載の方法。
【請求項９０】
ａ）対象からの標的細胞を得、
ｂ）該標的細胞を、外因性ポリペプチド構築物を発現する少なくとも１つの修飾エフェクター細胞と接触させ、
ｃ）該ポリペプチド構築物を発現する前記修飾エフェクター細胞の免疫活性化のレベルを検出し、
ｄ）該免疫活性化が閾値レベルを超えている場合、ヌクレオチド配列多型を有するものとして標的細胞を特定すること
を含む方法。
【請求項９１】
標的細胞の１以上が癌細胞である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
外因性ポリペプチド構築物がＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体またはその断片を含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
免疫活性化のレベルの前記検出が、外因性ポリペプチド構築物を発現する修飾エフェクター細胞による少なくとも１つのサイトカインの産生を定量することを含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９４】
サイトカインがインターフェロン−γである、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
ヌクレオチド配列多型が一塩基多型である、請求項９０記載の方法。
【請求項９６】
ヌクレオチド配列多型の近位の遺伝子を特定する工程を更に含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９７】
遺伝子がヌクレオチド配列多型から約３００，０００塩基対以内に位置する、請求項９０記載の方法。
【請求項９８】
外因性ポリペプチド構築物の有効量で対象を治療する工程を更に含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９９】
ポリペプチド構築物を発現する修飾エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項９０記載の方法。
【請求項１００】
外因性ポリペプチド構築物を発現する少なくとも１つの修飾エフェクター細胞と標的細胞を接触させることが、該標的細胞の少なくとも１つの表面上のＣＤ２７７分子を該外因性ポリペプチド構築物と接触させることを含む、請求項９０記載の方法。
【請求項１０１】
外因性ポリペプチド構築物がＣＤ２７７分子のＪ配置に選択的に結合する、請求項９０記載の方法。
【請求項１０２】
ａ）ＣＤ２７７を発現する標的細胞を対象から得、
ｂ）ＣＤ２７７分子のＪ配置に選択的に結合する外因性ポリペプチド構築物を発現する細胞と標的細胞を接触させ、
ｃ）該ポリペプチド構築物によるＣＤ２７７分子のＪ配置の認識を検出することを含む方法。
【請求項１０３】
標的細胞の１以上が癌細胞である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】
ポリペプチド構築物がＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体またはその断片を含む、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０５】
ＣＤ２７７分子のＪ配置の認識を検出することが、該ポリペプチド構築物を発現する細胞による少なくとも１つのサイトカインの産生を定量することを含む、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０６】
サイトカインがインターフェロン−γである、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
ポリペプチド構築物の有効量を対象に投与することを含む、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０８】
ポリペプチド構築物を発現する細胞がＴ細胞である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０９】
ａ）患者の標的細胞を、ＲｈｏＢの活性に関連したヌクレオチド配列多型を有するものとして特定し、
ｂ）ヌクレオチド配列多型を有するものとしての標的細胞の前記特定に基づいて陽性治療応答を示す対象を予測すること
を含む、ＣＤ２７７を認識しうるポリペプチド構築物または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞での治療に対する対象における陽性治療応答を予測する方法。
【請求項１１０】
ポリペプチド構築物がＣＤ２７７のＪ配置を認識する、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
ポリペプチド構築物を対象に投与することを更に含む、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１２】
標的細胞の１以上が癌細胞である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１３】
ヌクレオチド配列多型が一塩基多型である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１４】
ＲｈｏＢの活性が、ヌクレオチド配列多型を欠く対象におけるＲｈｏＢ活性と比較して高い活性である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１５】
ヌクレオチド配列多型を欠くものとして第２の対象の標的細胞を特定することに基づいて、第２の対象における治療応答不良を予測する工程を更に含む、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１６】
ａ）ＣＤ２７７分子を発現する細胞の第１セットを第１対象から得、
ｂ）ｉ）第２対象から得られた標的細胞の第２セットと比較して高いＲｈｏＢ活性、および、
ｉｉ）高いＲｈｏＢ活性に関連したヌクレオチド配列多型
の少なくとも１つを有するものとして、細胞の第１セットを特定し、
ｃ）第２群の細胞上のＣＤ２７７配置と比較して第１セットの細胞上のＣＤ２７７配置に対する選択的アフィニティを有するポリペプチド構築物、または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を、第１対象に投与することを含む方法。
【請求項１１７】
第１群の細胞の１以上が癌細胞である、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１８】
第１群の細胞の１以上が白血病細胞である、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１９】
第１セットの細胞上のＣＤ２７７配置がＪ配置である、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２０】
ヌクレオチド配列多型が一塩基多型である、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２１】
ａ）ＣＤ２７７分子を発現する標的細胞を対象から得、
ｂ）標的細胞において発現されたＣＤ２７７分子のＪ配置を特定し、
ｃ）ＣＤ２７７分子のＪ配置の前記特定に基づいて、陽性治療応答を示す対象を予測すること
を含む、ＣＳ２７７分子を認識しうるポリペプチド構築物または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞での治療に対する対象における陽性治療応答を予測する方法。
【請求項１２２】
ポリペプチド構築物を対象に投与する工程を更に含む、請求項１２１記載の方法。
【請求項１２３】
第２対象の標的細胞のＣＤ２７７分子をＪ配置を欠くものとして特定することに基づいて、第２対象における治療応答不良を予測する工程を更に含む、請求項１２１記載の方法。
【請求項１２４】
標的細胞の１以上が癌細胞である、請求項１２１記載の方法。
【請求項１２５】
標的細胞におけるＲｈｏＢの活性に関連したヌクレオチド配列多型を特定する工程を更に含む、請求項１２１記載の方法。
【請求項１２６】
ＲｈｏＢの活性が、ヌクレオチド配列多型を欠く対象におけるＲｈｏＢ活性と比較して高い活性である、請求項１２５記載の方法。
【請求項１２７】
ヌクレオチド配列多型が一塩基多型である、請求項１２５または１２６記載の方法。
【請求項１２８】
該予測がＣＤ２７７分子のＪ配置の特定とヌクレオチド配列多型の特定との両方に基づく、請求項１２５または１２６記載の方法。
【請求項１２９】
ＣＤ２７７陽性である癌細胞を有する対象における癌の治療方法であって、該癌細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する薬学的に許容される物質を含む医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む治療方法。
【請求項１３０】
薬学的に許容される物質が、該癌細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つを含む、請求項１３０記載の方法。
【請求項１３２】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む、請求項１３０記載の方法。
【請求項１３３】
γ−ＴＣＲポリペプチド配列がγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項１３２記載の方法。
【請求項１３４】
δ−ＴＣＲポリペプチド配列がδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項１３２記載の方法。
【請求項１３５】
薬学的に許容される物質が、Ｊ配置ではないＣＤ２７７分子と比較して高い選択性でＣＤ２７７のＪ配置に結合する、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３６】
標的細胞が癌細胞である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３７】
標的細胞が白血病細胞である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３８】
ＣＤ２７７が二量体として存在する、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３９】
ａ．癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物の剤形、または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する細胞の剤形、および
ｂ．ｉ．癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、
ｉｉ．癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形との少なくとも１つ
を含む医薬組成物。
【請求項１４０】
医薬組成物が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、リン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４１】
医薬組成物が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、リン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを含み、ここで、リン酸化抗原の活性を増強する物質が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の前、同時または後に投与される、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４２】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを癌細胞の細胞膜に維持し、癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＣＤ２７７との相互作用を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減し、癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させ、癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性を増加させ、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４３】
ＣＤ２７７がＪ配置で存在する、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４４】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つを含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４５】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４６】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、γ−ＴＣＲポリペプチド配列がγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４７】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、δ−ＴＣＲポリペプチド配列がδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４８】
医薬組成物が、固形癌および白血病の少なくとも１つを含む対象に投与される、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１４９】
医薬組成物が、急性骨髄性白血病を含む対象に投与される、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５０】
医薬組成物が対象に投与され、対象が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性と相関する遺伝子における突然変異を含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５１】
医薬組成物が対象に投与され、対象が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性の低下と相関する遺伝子における突然変異を含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５２】
医薬組成物が対象に投与され、対象が、ＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用の低減または抑制と相関する遺伝子における突然変異を含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５３】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼに間接的または直接的に結合することにより機能する、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５４】
リン酸化抗原の活性を増強する物質が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼに間接的または直接的に結合することにより機能する、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５５】
ポリペプチド構築物の剤形は、表３または表４の配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含む、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５６】
リン酸化抗原の活性を増強する物質がメバロン酸経路インヒビターである、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５７】
リン酸化抗原の活性を増強する物質がアミノビスホスホネートである、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５８】
リン酸化抗原の活性を増強する物質が、パミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つである、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１５９】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを癌細胞の細胞膜に維持し、癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＣＤ２７７との相互作用を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減し、癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させ、癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性を増加させ、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす、請求項１３９記載の医薬組成物。
【請求項１６０】
治療を要する対象に請求項１３９〜１５９のいずれか１項記載の医薬組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項１６１】
対象が、ＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用の低減または抑制と相関する遺伝子における突然変異を含む、請求項１６０記載の治療方法。
【請求項１６２】
対象が固形癌および白血病の少なくとも１つを含む、請求項１６０記載の治療方法。
【請求項１６３】
対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質からなる群から選択される物質を含む医薬組成物、または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物を、治療を要する対象に投与することを含む治療方法。
【請求項１６４】
治療を要する対象の癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質を、治療を要する対象に投与することを更に含む、請求項１６６記載の方法。
【請求項１６５】
ａ．癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物の剤形または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する細胞の剤形、および
ｂ．ｉ．癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、
ｉｉ．癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形との少なくとも１つ
を、治療を要する対象に投与することを含む治療方法。
【請求項１６６】
治療が、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、リン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを投与することを含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１６７】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質がメバロン酸経路インヒビターである、請求項１６５記載の方法。
【請求項１６８】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が、アミノビスホスホネートであるメバロン酸経路インヒビターである、請求項１６５記載の方法。
【請求項１６９】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が、パミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つであるメバロン酸経路インヒビターである、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７０】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７１】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、γ−ＴＣＲポリペプチド配列がγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７２】
ポリペプチド構築物がγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、δ−ＴＣＲポリペプチド配列がδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７３】
細胞がαβＴ細胞である、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７４】
リン酸化抗原の活性を増強する物質が、リン酸化抗原に間接的または直接的に結合することにより機能する、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７５】
サイトカインを含む剤形を投与することを更に含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７６】
ポリペプチド構築物の剤形が、表３または表４の配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７７】
対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む医薬組成物と、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現する細胞を含む医薬組成物とを、治療を要する対象に投与することを含む治療方法であって、対象から単離されたＴ細胞が、該投与を受けていない同等の対象から単離された同等のＴ細胞と比較して、小さなタンパク質を少なくとも１倍分泌する、治療方法。
【請求項１７８】
小さなタンパク質がサイトカインである、請求項１７７記載の方法。
【請求項１７９】
小さなタンパク質がサイトカインであり、ＩＦＮγである、請求項１７７記載の方法。
【請求項１８０】
対象から単離されたＴ細胞が、該投与を受けていない同等の対象から単離された同等のＴ細胞と比較して、小さなタンパク質を少なくとも５倍分泌する、請求項１７７記載の方法。
【請求項１８１】
対象から単離されたＴ細胞が、該投与を受けていない同等の対象から単離された同等のＴ細胞と比較して、小さなタンパク質を少なくとも１０倍分泌する、請求項１７７記載の方法。
【請求項１８２】
癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを、治療を要する対象に投与することを含む治療方法。
【請求項１８３】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質がメバロン酸経路インヒビターである、請求項１８５記載の方法。
【請求項１８４】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が、アミノビスホスホネートであるメバロン酸経路インヒビターである、請求項１８５記載の方法。
【請求項１８５】
ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質が、パミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つであるメバロン酸経路インヒビターである、請求項１８５記載の方法。
【請求項１８６】
リン酸化抗原の活性を増強する物質が、リン酸化抗原に間接的または直接的に結合することにより機能する、請求項１８５記載の方法。
【請求項１８７】
癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物の剤形、または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する細胞の剤形を投与することを更に含む、請求項１８２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞標的化療法のための組成物および方法に関する。
【０００２】
相互参照
本出願は、２０１７年５月１８日付け出願の米国仮特許出願第６２／５０８，２７２号および２０１７年５月１９日付け出願の米国仮特許出願第６２／５０８，８３３号に対する優先権を主張するものである。それらのぞれぞれの全体をあらゆる目的で参照により本明細書に組み入れることとする。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。２０１８年５月１７日付けで作成された該ＡＳＣＩＩコピーは５１８８７−７０６ ６０１ ＳＬ．ｔｘｔと称され、２７，６８９バイトのサイズを有する。
【背景技術】
【０００４】
操作された抗腫瘍特異性または抗病原体特異性を有するＴ細胞の養子移入が開発中である。そのような戦略においては、外因性免疫受容体、例えばアルファベータＴ細胞受容体またはガンマデルタＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体であって、特定の抗腫瘍特異性または特定の抗病原体特異性を有するものを、患者からの自己Ｔ患者の細胞に、あるいは、患者への同種幹細胞移植の場合には対応同種Ｔ細胞に移植する。また、例えば、血液幹細胞移植を受けている白血病患者は治療中にリンパ球枯渇状態になる。したがって、そのような患者も、例えば特異的抗白血病Ｔ細胞受容体を発現するように操作されたドナーＴ細胞の注入による利益を受けうる。本明細書に記載されている組成物および方法は、１以上のＭＨＣ関連遺伝子により発現されるタンパク質における特有の配置（構成）を選択的に認識する受容体を発現する細胞を含み、ここで、前記の特有の配置は１以上の病態に関連している。
【０００５】
参照による援用
本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許および特許出願を、各個の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明は、がん（以下、癌と表記される）細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物の剤形（投与形態）、または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する細胞の剤形、および（ｉ）該癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、（ｉｉ）該癌細胞におけるリン酸化抗原（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）の活性を増強する物質の剤形との少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。１つの態様においては、医薬組成物は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、リン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを含む。１つの態様においては、医薬組成物は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、リン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを含み、ここで、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の前、同時または後に投与される。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを癌細胞の細胞膜に維持し、癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＣＤ２７７との相互作用を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減し、癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させ、癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性（アベイラビリティ）を増加させ、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす。１つの態様においては、ＣＤ２７７はＪ配置で存在しうる。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つを含む。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、ここで、γ−ＴＣＲポリペプチド配列はγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片でありうる。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、ここで、δ−ＴＣＲポリペプチド配列はδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片でありうる。１つの態様においては、医薬組成物は、固形癌および白血病の少なくとも１つを含む対象に投与されうる。１つの態様においては、医薬組成物は、急性骨髄性白血病を含む対象に投与されうる。１つの態様においては、医薬組成物は対象に投与されうる。対象は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性と相関する遺伝子における突然変異を含みうる。１つの態様においては、医薬組成物は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性の低下と相関する遺伝子における突然変異を含む対象に投与されうる。１つの態様においては、医薬組成物は���ＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用の低減または抑制と相関しうる遺伝子における突然変異を含む対象に投与されうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼに間接的または直接的に結合することにより機能しうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼに間接的または直接的に結合することにより機能しうる。１つの態様においては、ポリペプチド構築物の剤形は、表３または表４の配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含む。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質はメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質はアミノビスホスホネートでありうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、パミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つでありうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを癌細胞の細胞膜に維持し、癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強し、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＣＤ２７７との相互作用を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強し、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減し、癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させ、癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性を増加させ、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす。
【０００７】
本明細書は、治療を要する対象に医薬組成物を投与することを含む治療方法を開示する。１つの態様においては、対象は、ＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用の低減または抑制と相関する遺伝子における突然変異を含む。１つの態様においては、対象は固形癌および白血病の少なくとも１つを含む。
【０００８】
本明細書は、対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質からなる群から選択される物質を含む医薬組成物、または該癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物を、治療を要する対象に投与することを含む治療方法を開示する。１つの態様においては、方法は、治療を要する対象の癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質を、治療を要する対象に投与することを更に含みうる。
【０００９】
本明細書は、癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物の剤形または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する細胞の剤形、および（ｉ）癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、（ｉ）癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形との少なくとも１つを、治療を要する対象に投与することを含む治療方法を開示する。１つの態様においては、治療は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、リン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを投与することを含む。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質はメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、アミノビスホスホネートでありうるメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質はパミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つでありうるメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、ここで、γ−ＴＣＲポリペプチド配列はγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片でありうる。１つの態様においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含み、ここで、δ−ＴＣＲポリペプチド配列はδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片でありうる。１つの態様においては、細胞はαβＴ細胞でありうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、リン酸化抗原に間接的または直接的に結合することにより機能しうる。１つの態様においては、方法は、サイトカインを含む剤形を投与することを更に含みうる。１つの態様においては、ポリペプチド構築物の剤形は、表３または表４の配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含む。
【００１０】
本明細書は、対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む医薬組成物と、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現する細胞を含む医薬組成物とを、治療を要する対象に投与することを含む治療方法を開示し、ここで、対象から単離されたＴ細胞は、該投与を受けていない同等の対象から単離された同等のＴ細胞と比較して、小さなタンパク質を少なくとも１倍分泌する。１つの態様においては、小さなタンパク質はサイトカインでありうる。１つの態様においては、小さなタンパク質はサイトカインであることが可能であり、ＩＦＮγである。１つの態様においては、対象から単離されたＴ細胞は、該投与を受けていない同等の対象から単離された同等のＴ細胞と比較して、小さなタンパク質を少なくとも５倍分泌する。１つの態様においては、対象から単離されたＴ細胞は、該投与を受けていない同等の対象から単離された同等のＴ細胞と比較して、小さなタンパク質を少なくとも１０倍分泌する。
【００１１】
本明細書は、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質の剤形と、癌細胞におけるリン酸化抗原の活性を増強する物質の剤形とを、治療を要する対象に投与することを含む治療方法を開示する。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質はメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、アミノビスホスホネートでありうるメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、パミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つでありうるメバロン酸経路インヒビターでありうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、リン酸化抗原に間接的または直接的に結合することにより機能する。１つの態様においては、方法は、癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物の剤形、または癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合する前記ポリペプチド構築物を発現する細胞の剤形を投与することを更に含みうる。
【００１２】
本発明は、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置またはＪコンファーメーションに選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を含む組成物を提供する。幾つかの場合には、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する本明細書に記載されているポリペプチド構築物を提供し、ここで、該ポリペプチド構築物は、操作された細胞において発現される。また、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する本明細書に記載されているポリペプチド構築物を含むヌクレオチド配列も提供する。
【００１３】
本発明は、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む方法および組成物、該ポリペプチド構築物をコードするヌクレオチドを含む方法および組成物、または該ポリペプチド構築物を発現する細胞を含む方法および組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に結合するポリペプチド構築物は少なくとも１つのγδＴ細胞受容体またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１４】
本発明は、癌細胞のような窮迫（ｄｉｓｔｒｅｓｓｅｄ）細胞における代謝変化の結果として形成されるＣＤ２７７の配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を含む組成物を提供し、ここで、該代謝変化は、トランスフォーメーションまたは窮迫に際してアップレギュレーションされる一般的ストレス分子の発現を引き起こす。ある実施形態においては、この配置はＪ配置でありうる。幾つかの場合には、ＣＤ２７７のＪ配置は前記窮迫細胞内でのＲｈｏＢの移行の結果として生じる。
【００１５】
本発明は、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片を含むポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を提供する。ある場合においては、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片はＶγ９およびＶδ２鎖の少なくとも１つおよびその断片を含む。幾つかの場合には、本明細書に記載されている操作された細胞は、哺乳類メバロン酸経路の中間体（例えば、イソペンテニルピロホスファート（ＩＰＰ））および微生物２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリチトール  ４−リン酸（ＭＥＰ）経路の中間体から選択される少なくとも１つの追加的な物質と共に対象に投与されうる。
【００１６】
本発明は、特定の細胞、例えば腫瘍細胞における所定受容体の活性化のメディエーターを特定する不偏性ゲノムワイドスクリーニング法を提供する。不偏性ゲノムワイドスクリーニング法における使用のための系およびキットを提供する。更に、本明細書は、本明細書に記載されているスクリーニング方法により特定されたメディエーターを標的化する組成物を開示する。特定の実施形態においては、所定の受容体、例えばＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲの最適な活性化を増強または回復するのに有用な組成物を提供する。
【００１７】
ある実施形態においては、標的細胞クリアランスから利益を受ける状態、例えば癌に対する有効な治療をもたらす方法を提供し、該方法は、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を含む、またはそれをコードするヌクレオチドを含む、またはそれを発現する細胞を含む、そして所望により、ＣＤ２７７のＪ配置の形成または該Ｊ配置への該ポリペプチド構築物の結合を増強するのに有用な少なくとも１つの物質を含む組成物を提供することを含む。
【００１８】
本発明は、標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物を提供し、ここで、該ポリペプチド構築物は、操作された細胞において発現される。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチド構築物は、前記Ｊ配置ではないＣＤ２７７分子と比較して高い選択性でＣＤ２７７のＪ配置に結合する。幾つかの実施形態においては、標的細胞は癌細胞である。幾つかの実施形態においては、標的細胞は白血病細胞である。
【００１９】
幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、γ−ＴＣＲポリペプチド配列もしくはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つ、またはγ−ＴＣＲポリペプチド配列もしくはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体もしくは断片を含む。幾つかの実施形態においては、γ−ＴＣＲポリペプチド配列はγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である。幾つかの実施形態においては、δ−ＴＣＲポリペプチド配列はδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である。更にもう１つの実施形態においては、ＣＤ２７７は二量体として存在する。
【００２０】
本発明は、ＣＤ２７７分子がＪ配置にある場合の癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象における癌の治療方法を提供し、ここで、該ポリペプチド構築物は、所望により、操作された細胞において発現されてもよい。本発明は更に、ＣＤ２７７がＪ配置にある場合の癌細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む医薬組成物の有効量または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞の有効量を対象に投与することを含む、癌細胞の除去を要する対象において癌細胞を除去する方法を提供する。
【００２１】
幾つかの場合には、該ポリペプチド構築物は、Ｊ配置ではないＣＤ２７７分子と比較して高い選択性でＣＤ２７７のＪ配置を認識する。幾つかの実施形態においては、該Ｊ配置の形成は、少なくとも、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用および／またはＣＤ２７７の区画化を要する。幾つかの実施形態においては、該Ｊ配置の形成は、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との前記相互作用の後、細胞内リン酸化抗原とＣＤ２７７との相互作用を要する。幾つかの場合には、該ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列もしくはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つ、またはγ−ＴＣＲポリペプチド配列もしくはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体もしくは断片を含む。
【００２２】
幾つかの場合においては、該方法は、該癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強する物質を投与すること、またはＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを調節する物質を投与することを含み、ここで、該物質はＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）およびグアニンヌクレオチド解離インヒビター（ＧＤＩ）の少なくとも１つを標的化する。幾つかの場合には、該方法は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性と相関する突然変異に関して対象の遺伝子型を決定することを含む。幾つかの場合には、該方法は、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）およびグアニンヌクレオチド解離インヒビター（ＧＤＩ）から選択されるタンパク質をコードする遺伝子から選択される遺伝子の遺伝子型を決定することを含み、ここで、該タンパク質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを調節（モジュレーション）する。
【００２３】
本発明は、ａ）少量の追加的（本有的）な共受容体を発現する免疫細胞を準備し、ｂ）γ９−Ｔ細胞受容体鎖をコードする核酸配列およびδ２−Ｔ細胞受容体鎖をコードする核酸配列を準備し、ここで、γ９−Ｔ細胞受容体鎖およびδ２−Ｔ細胞受容体鎖は、ＣＤ２７７がＪ配置にある場合のＣＤ２７７に選択的に結合し、ｃ）工程ｂ）の核酸配列をＴ細胞に導入して、工程ｂ）のγ９−Ｔ細胞受容体鎖と工程ｂ）のδ２−Ｔ細胞受容体鎖とを含むγ９δ２Ｔ細胞受容体を含有する操作されたＴ細胞を得ることを含む、Ｔ細胞を操作する方法を提供する。
【００２４】
本発明は更に、ａ）Ｔ細胞受容体を発現する細胞を標的細胞と接触させ、ｂ）Ｔ細胞受容体を発現する細胞の免疫活性化のレベルを検出し、ｃ）ｉ）免疫活性化が閾値レベル未満である場合には、遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有するもの、またはｉｉ）免疫活性化が閾値レベルを超えている場合には、遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有さないものの１つとして、標的細胞を特定し、ｄ）免疫活性化が閾値レベル未満である場合には、標的細胞遺伝子型を対照遺伝子型と比較して、遺伝的またはエピジェネティック変異を特定することを含む、Ｔ細胞受容体認識の欠如をもたらす遺伝的またはエピジェネティック（後成的）変異に関して標的細胞をスクリーニングする方法を提供する。
【００２５】
幾つかの実施形態においては、標的細胞は癌細胞である。幾つかの場合には、Ｔ細胞受容体はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体である。幾つかの場合には、免疫活性化のレベルの検出は、Ｔ細胞受容体を発現する細胞による少なくとも１つのサイトカインの産生を定量することを含む。幾つかの実施形態においては、サイトカインはインターフェロン−γおよびＴＮＦαの少なくとも１つである。幾つかの場合には、遺伝的またはエピジェネティック変異は一塩基多型である。幾つかの場合には、標的細胞の接合性は、前記の遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有すること、または前記の遺伝的もしくはエピジェネティック変異を有さないことと相関する。幾つかの場合には、該方法は更に、遺伝的またはエピジェネティック変異の近位の遺伝子を特定する工程を含む。幾つかの場合には、該遺伝子は遺伝的またはエピジェネティック変異から約３００，０００塩基対以内に位置する。
【００２６】
幾つかの実施形態においては、該方法は更に、該遺伝子の発現を調節し、Ｔ細胞受容体発現細胞（Ｔ細胞受容体を発現する細胞）の免疫活性化の量に対する調節の効果を評価する工程を含む。幾つかの場合には、該調節は、該遺伝子をノックアウトすることを含む。幾つかの場合には、Ｔ細胞受容体発現細胞および標的細胞はＴ細胞である。幾つかの場合には、対照遺伝子型は対照細胞の遺伝子型であり、ここで、対照細胞は、Ｔ細胞受容体発現細胞と接触すると、Ｔ細胞受容体発現細胞の免疫活性化を引き起こす。幾つかの場合には、Ｔ細胞受容体発現細胞の前記免疫活性化はサイトカインの産生における少なくとも２倍の増加または類似した機能的読取り情報により特徴づけられる。幾つかの場合には、Ｔ細胞受容体発現細胞の前記免疫活性化はサイトカインの産生における少なくとも１０倍の増加または類似した機能的読取り情報により特徴づけられる。幾つかの場合には、Ｔ細胞受容体発現細胞の前記免疫活性化はサイトカインの産生における少なくとも１００倍の増加または類似した機能的読取り情報により特徴づけられる。幾つかの場合には、前記接触は、Ｔ細胞受容体発現細胞および対照細胞を同じ容器に加えることを含む。幾つかの場合には、接触は、Ｔ細胞受容体発現細胞および対照細胞を同じ容器に加えることを含む。
【００２７】
幾つかの実施形態においては、標的細胞はＢ細胞白血病細胞系である。幾つかの実施形態においては、標的細胞はエプスタインバーウイルス形質転換（トランスフォーム）細胞である。幾つかの実施形態においては、遺伝的突然変異は、ＲｈｏＧＴＰアーゼを調節するタンパク質をコードする遺伝子に位置する。幾つかの場合には、タンパク質はＧＴＰアーゼ活性化タンパク質またはグアニンヌクレオチド交換因子である。幾つかの場合には、遺伝的突然変異はＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用の低減または抑制をもたらす。
【００２８】
本発明は、ａ）タンパク質をコードする遺伝子における突然変異に関して対象をスクリーニングし、ここで、該タンパク質は対象の標的細胞においてＲｈｏＧＴＰアーゼを翻訳後に調節し、ｂ）該突然変異がＣＤ２７７におけるＪ配置の形成を低減も抑制もしない場合には、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞媒介療法で対象を治療することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態においては、標的細胞は癌細胞である。幾つかの実施形態においては、標的細胞は白血病細胞である。幾つかの態様においては、該タンパク質はＧＴＰアーゼ活性化タンパク質またはグアニンヌクレオチド交換因子である。幾つかの実施形態においては、スクリーニングは、遺伝子またはその一部の遺伝子型を決定することを含む。幾つかの実施形態においては、スクリーニングは、核酸増幅、配列決定およびオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションから選択される方法を含む。
【００２９】
本発明は、ａ）対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を対象に投与すること、およびｂ）Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞を投与することを含む、癌細胞の除去を要する対象において癌細胞を除去する方法を提供する。幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強する。幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞の細胞膜にＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを維持する。幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増強する。幾つかの実施形態においては、該物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強する。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強する。幾つかの実施形態においては、該物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＣＤ２７７との相互作用を増強する。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化する。幾つかの実施形態においては、該物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強する。幾つかの実施形態においては、該物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減する。
【００３０】
幾つかの場合には、該物質は癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させる。幾つかの場合には、該物質は癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性を増加させる。幾つかの場合には、癌細胞上の細胞表面分子に結合する部分に該物質を結合させ、それにより、該物質を癌細胞に標的化する。幾つかの場合には、該部分は小分子化合物を含む。幾つかの場合には、該部分はペプチドを含む。幾つかの場合には、該部分は抗体または抗原結合性フラグメントを含む。幾つかの場合には、該物質は癌細胞における細胞内リン酸化抗原の量を増加させる。
【００３１】
幾つかの場合には、該方法は、癌細胞における細胞内リン酸化抗原の量を増加させる追加的物質を投与することを含む。幾つかの場合には、該追加的物質はメバロン酸経路インヒビターである。幾つかの実施形態においては、該メバロン酸経路インヒビターはアミノビスホスホネートである。幾つかの実施形態においては、該アミノビスホスホネートはパミドロネートおよびゾレドロネートの少なくとも１つである。幾つかの場合には、対象は固形癌および白血病の少なくとも１つを有する。幾つかの場合には、白血病は急性骨髄性白血病である。幾つかの場合には、対象は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの発現または活性の低下をもたらす遺伝子における突然変異を有する。
【００３２】
本発明は、対象の癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を対象に投与することを含む、癌細胞の除去を要する対象における癌細胞を除去する方法を提供する。幾つかの場合には、該方法は、Ｔ細胞を対象に投与することを含む。幾つかの場合には、該Ｔ細胞はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現する。幾つかの場合には、該Ｔ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を発現するように操作されており、または遺伝的に修飾されている。幾つかの場合には、該Ｔ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体を過剰発現するように操作されており、または遺伝的に修飾されている。
【００３３】
本発明は、ポリペプチド構築物と細胞傷害性細胞とを含む系を提供し、ここで、該ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７が標的細胞上のＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼと複合体化された場合、標的細胞上のＣＤ２７７に選択的に結合し、該ポリペプチド構築物は、操作された細胞において発現される。
【００３４】
更に、本発明は、標的細胞における受容体の活性化に関連した遺伝子座を特定するための方法を提供し、該方法は、ａ）標的細胞における受容体の前記活性化を含む表現型を誘導する細胞を特定し、ｂ）該表現型を示す細胞の接合性を特定し、ｃ）該細胞に関する遺伝子型情報を得、ここで、該遺伝子型情報は、種々の細胞に関する複数の遺伝子座のそれぞれにおける遺伝子型を定め、ｄ）特定された細胞接合性を、それらの細胞にわたる複数の遺伝子座の１つにおける遺伝子型と相関させて、活性化遺伝子座を特定することを含む。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、該遺伝子型情報は複数の遺伝子座のそれぞれにおける一塩基多型を定める。幾つかの場合には、該受容体はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体またはその断片である。幾つかの場合には、標的細胞は癌細胞である。幾つかの場合には、標的細胞は白血病細胞である。幾つかの場合には、該表現型はＩＦＮγの産生である。幾つかの場合には、遺伝子は前記の複数の遺伝子座の少なくとも１つの近位に位置する。幾つかの場合には、該受容体の前記活性化は、該細胞型の細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する標的細胞のポリペプチド構築物を伴う。幾つかの場合には、該Ｊ配置は活性化遺伝子座と相関している。
【００３６】
本発明は、ａ）対象からの標的細胞を得、ｂ）該標的細胞を、外因性ポリペプチド構築物を発現する少なくとも１つの修飾エフェクター細胞と接触させ、ｃ）該ポリペプチド構築物を発現する前記修飾エフェクター細胞の免疫活性化のレベルを検出し、ｄ）該免疫活性化が閾値レベルを超えている場合、ヌクレオチド配列多型を有するものとして標的細胞を特定することを含む方法を提供する。
【００３７】
幾つかの場合には、標的細胞の１以上は癌細胞である。幾つかの場合には、外因性ポリペプチド構築物はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体またはその断片を含む。幾つかの場合には、免疫活性化のレベルの前記検出は、外因性ポリペプチド構築物を発現する修飾エフェクター細胞による少なくとも１つのサイトカインの産生を定量することを含む。幾つかの場合には、サイトカインはインターフェロン−γである。幾つかの場合には、ヌクレオチド配列多型は一塩基多型である。
【００３８】
幾つかの場合には、該方法は更に、ヌクレオチド配列多型の近位の遺伝子を特定する工程を含む。幾つかの場合には、該遺伝子はヌクレオチド配列多型から約３００，０００塩基対以内に位置している。幾つかの実施形態においては、該方法は更に、該外因性ポリペプチド構築物の有効量で対象を治療する工程を含む。幾つかの場合には、ポリペプチド構築物を発現する修飾エフェクター細胞はＴ細胞である。幾つかの場合には、外因性ポリペプチド構築物を発現する少なくとも１つの修飾エフェクター細胞と標的細胞を接触させることは、該標的細胞の少なくとも１つの表面上のＣＤ２７７分子を該外因性ポリペプチド構築物と接触させることを含む。幾つかの場合には、該外因性ポリペプチド構築物はＣＤ２７７分子のＪ配置に選択的に結合する。
【００３９】
本発明は、ａ）ＣＤ２７７を発現する標的細胞を対象から得、ｂ）ＣＤ２７７分子のＪ配置に選択的に結合する外因性ポリペプチド構築物を発現する細胞と標的細胞を接触させ、ｃ）該ポリペプチド構築物によるＣＤ２７７分子のＪ配置の認識を検出することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態においては、標的細胞の１以上は癌細胞である。幾つかの場合には、ポリペプチド構築物はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞受容体またはその断片を含む。幾つかの場合には、ＣＤ２７７分子のＪ配置の認識を検出することは、ポリペプチド構築物を発現する細胞による少なくとも１つのサイトカインの産生を定量することを含む。幾つかの場合には、サイトカインはインターフェロン−γである。幾つかの場合には、該方法は更に、該ポリペプチド構築物の有効量を該対象に投与することを含む。幾つかの場合には、ポリペプチド構築物を発現する細胞はＴ細胞である。
【００４０】
本発明は、ＣＤ２７７を認識しうるポリペプチド構築物または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞での治療に対する対象における陽性治療応答を予測する方法を提供し、該方法は、ａ）患者の標的細胞を、ＲｈｏＢの活性に関連したヌクレオチド配列多型を有するものとして特定し、ｂ）ヌクレオチド配列多型を有するものとしての標的細胞の前記特定に基づいて陽性治療応答を示す対象を予測することを含む。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物はＣＤ２７７のＪ配置を認識し、それに直接的に、または１以上の追加的な生物学的因子を介して間接的に結合する。
【００４１】
幾つかの実施形態においては、該方法は更に、ポリペプチド構築物を対象に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、標的細胞の１以上は癌細胞である。幾つかの場合には、ヌクレオチド配列多型は一塩基多型である。幾つかの場合には、ＲｈｏＢの前記活性は、該ヌクレオチド配列多型を欠く対象におけるＲｈｏＢ活性と比較して高い活性である。幾つかの場合には、該方法は更に、該ヌクレオチド配列多型を欠くものとして第２の対象の標的細胞を特定することに基づいて、第２の対象における治療応答不良を予測する工程を含む。
【００４２】
本発明は、ａ）ＣＤ２７７分子を発現する細胞の第１セットを第１対象から得、ｂ）ｉ）第２対象から得られた標的細胞の第２セットと比較して高いＲｈｏＢ活性と、ｉｉ）高いＲｈｏＢ活性に関連したヌクレオチド配列多型との少なくとも１つを有するものとして細胞の第１セットを特定し、ｃ）第２群の細胞上のＣＤ２７７配置と比較して第１セットの細胞上のＣＤ２７７配置に対する選択的アフィニティを有するポリペプチド構築物、または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を第１対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４３】
幾つかの場合には、前記の第１群の細胞の１以上は癌細胞である。幾つかの場合には、第１群の細胞の１以上は白血病細胞である。幾つかの場合には、前記の第１セットの細胞上のＣＤ２７７配置はＪ配置である。幾つかの実施形態においては、ヌクレオチド配列多型は一塩基多型である。
【００４４】
本発明は、ＣＳ２７７分子を認識しうるポリペプチド構築物または該ポリペプチド構築物を発現する操作された細胞での治療に対する対象における陽性治療応答を予測する方法を提供し、該方法は、ａ）ＣＤ２７７分子を発現する標的細胞を対象から得、ｂ）標的細胞において発現されたＣＤ２７７分子のＪ配置を特定し、ｃ）ＣＤ２７７分子のＪ配置の前記特定に基づいて、陽性治療応答を示す対象を予測することを含む。
【００４５】
幾つかの場合には、該方法は更に、ポリペプチド構築物を対象に投与する工程を含む。幾つかの場合には、該方法は更に、第２対象の標的細胞のＣＤ２７７分子をＪ配置を欠くものとして特定することに基づいて、第２対象における治療応答不良を予測する工程を含む。幾つかの場合には、標的細胞の１以上は癌細胞である。幾つかの場合には、該方法は更に、標的細胞におけるＲｈｏＢの活性に関連したヌクレオチド配列多型を特定する工程を含む。幾つかの場合には、ＲｈｏＢの前記活性は、ヌクレオチド配列多型を欠く対象におけるＲｈｏＢ活性と比較して高い活性である。幾つかの場合には、ヌクレオチド配列多型は一塩基多型である。幾つかの実施形態においては、該予測はＣＤ２７７分子のＪ配置の前記特定とヌクレオチド配列多型の前記特定との両方に基づく。
【００４６】
本発明は、ＣＤ２７７陽性である癌細胞を有する対象における癌の治療方法であって、直接的に又は１以上の追加的生物学的因子を介して間接的に該癌細胞上のＣＤ２７７のＪ配置またはＪコンファメーションに選択的に結合する薬学的に許容される物質を含む医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む治療方法を提供する。幾つかの実施形態においては、薬学的に許容される物質は、前記癌細胞上のＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つを含む。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物はγ−ＴＣＲポリペプチド配列またはδ−ＴＣＲポリペプチド配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む。幾つかの場合には、γ−ＴＣＲポリペプチド配列はγ９−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である。幾つかの場合には、δ−ＴＣＲポリペプチド配列はδ２−ＴＣＲポリペプチド配列またはその断片である。
【００４７】
幾つかの場合には、薬学的に許容される物質は、Ｊ配置ではないＣＤ２７７分子と比較して高い選択性で、直接的に又は１以上の追加的生物学的因子を介して間接的に、ＣＤ２７７のＪ配置に結合する。幾つかの実施形態においては、標的細胞は癌細胞である。幾つかの実施形態においては、標的細胞は白血病細胞である。幾つかの場合には、ＣＤ２７７は二量体として存在する。
【００４８】
本発明の特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のより深い理解は、例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明（これにおいては本開示の原理が用いられる）および添付図面を参照することにより得られるであろう。
【００４９】
発明の詳細な説明
１つの態様においては、本発明は、頑強（ｒｏｂｕｓｔ）な抗腫瘍応答を誘発するＴ細胞を提供する。抗腫瘍応答は、γ９δ２  ＴＣＲのような受容体を発現する免疫細胞と腫瘍細胞のような標的との結合によりもたらされうる。免疫細胞への腫瘍細胞の結合は受容体−標的相互作用の改善により増強されうる。１つの態様においては、本発明が提供するのは、γ９δ２  ＴＣＲを発現する免疫細胞と標的との結合を増強する組成物および方法でありうる。１つの態様においては、方法は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強することを含みうる。１つの態様においては、方法は、リン酸化抗原の活性（例えば、蓄積）を増強することを含みうる。ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼおよびリン酸化抗原は腫瘍細胞表面のＣＤ２７７の発現の増強に関与し、それにより、ＣＤ２７７を発現する腫瘍細胞とγ９δ２  ＴＣＲを含む免疫細胞との相互作用を改善し、または可能にする。１つの態様においては、本発明が提供するのは、腫瘍細胞のインサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）シグナル伝達を改善し、それにより、それが免疫細胞により認識されることを可能にすることを含む方法でありうる。１つの態様においては、本発明が提供するのは、表面上のＣＤ２７７の発現を増強することにより、腫瘍細胞のインサイドアウト・シグナル伝達を増強する物質でありうる。物質はＣＤ２７７に直接的に、または間接的に作用しうる。ＣＤ２７７の発現は、腫瘍細胞におけるリン酸化抗原およびＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを刺激することにより増強されうる。１つの態様においては、物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼに直接的に、または間接的に作用しうる。１つの態様においては、物質はリン酸化抗原に直接的に、または間接的に作用しうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ、リン酸化抗原またはそれらの組合せの活性を増強しうる物質は間接的または直接的に作用しうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ、リン酸化抗原またはそれらの組合せの活性を増強しうる物質は二次因子に結合することが可能であり、そしてこれがＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼおよび／またはリン酸化抗原の活性を増強しうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ、リン酸化抗原またはそれらの組合せの活性を増強しうる物質は幾つかの上流因子に結合することが可能であり、そしてこれらがＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼおよび／またはリン酸化抗原の活性を増強しうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼまたはリン酸化抗原の上流の最大１０個の因子が刺激されることが可能であり、そしてＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼおよび／またはリン酸化抗原の活性が増強される。
【００５０】
１つの態様においては、本発明が提供するのは、γ９δ２  ＴＣＲを含む免疫細胞の組成物、ならびにＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼおよびリン酸化抗原の活性を増強する物質を含む組成物でありうる。１つの態様においては、γ９δ２  ＴＣＲ媒介性応答はパミドロネートのような物質により、あるいは追加的な接着物質の発現により増強されうる。幾つかの態様においては、活性化の後、ＣＤ２７７を発現する癌細胞のような標的の認識が生じうる。標的の認識は、γ９δ２ＴＣＲのＣＤＲ３領域、およびＣＤ２７７の配置変化によりもたらされうる。幾つかの態様においては、Ｔ細胞活性化は膜の柔軟性を利用して、Ｔ細胞と腫瘍細胞とを含むシナプスを形成しうる。幾つかの態様においては、Ｔ細胞活性化はγ９δ２ＴＣＲの相互作用による細胞膜におけるＣＤ２７７のマイクロクラスタリングを含みうる。
【００５１】
全ての用語は、それらが当業者により理解されるとおりに理解されると意図される。特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本開示に関連する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００５２】
本明細書中で用いる節の見出しは編成上の目的のためのものであるに過ぎず、記載されている内容を限定すると解釈されるべきではない。
【００５３】
本発明の種々の特徴は単一の実施形態の文脈で記載されているかもしれないが、それらの特徴は別々に又は任意の適切な組合せでも記載されうる。逆に、本発明は、明瞭化のために、別々の実施形態の文脈で本明細書に記載されているかもしれないが、本発明は単一の実施形態においても実施されうる。
【００５４】
以下の定義は当技術分野におけるものを補完するものであり、本出願に関するものであり、関連する又は関連しないいずれの場合（例えば、いずれの共有特許または出願）にも帰属されるべきではない。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料が本開示の試験の実施に使用されうるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載されている。したがって、本明細書中で用いる用語は、特定の実施形態を記載することを目的としたものであるに過ぎず、限定的であるとは意図されない。
【００５５】
本出願においては、特に示されていない限り、単数形の使用は複数形を含む。本明細書中で用いる単数形表現は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形対象物を含むことに留意しなければならない。本出願においては、「または」の使用は、特に示されていない限り、「および／または」を意味する。更に、「含む」なる語ならびに「含み」、「含んでいて」および「含まれる」のような他の形態の使用は限定的なものではない。
【００５６】
本明細書中で用いる「自己」なる語およびその文法的等価体は、同じものに由来することを意味しうる。例えば、サンプル（例えば、細胞）を取り出し、処理し、後で同じ対象（例えば、患者）に戻すことが可能である。自己プロセスは、ドナーとレシピエントとが異なる対象である同種異系プロセスとは区別される。
【００５７】
本明細書中で用いる「活性化」およびその文法的等価体は、細胞が休止状態から活性状態へと移行する過程を意味しうる。この過程は抗原に対する応答、移動および／または機能的に活性な状態への表現型変化もしくは遺伝的変化を含みうる。例えば、「活性化」なる語はＴ細胞活性化の段階的過程を意味しうる。例えば、Ｔ細胞は、完全に活性化されるためには少なくとも２つのシグナルを要しうる。第１のシグナルは抗原−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの嵌合の後に生じうる。第２のシグナルは共刺激分子の関与（嵌合）により生じうる。インビトロで抗ＣＤ３は第１のシグナルを模倣することが可能であり、抗ＣＤ２８は第２のシグナルを模倣することが可能である。
【００５８】
本明細書における「幾つかの実施形態」、「実施形態」、「１つの実施形態」または「他の実施形態」に対する言及は、該実施形態に関して記載されている特定の特徴、構造または特性が少なくとも幾つかの実施形態に含まれることを意味し、必ずしも本発明の全ての実施形態に含まれるわけではない。
【００５９】
本明細書および特許請求の範囲において用いる「含む」（ならびに「含み」および「含まれ」のような、含むの任意の形態）、「有する」（ならびに「有し」および「有され」のような、有するの任意の形態）、「包含する」（ならびに「包含し」および「包含され」のような、包含するの任意の形態）または「含有する」（ならびに「含有し」および「含有され」のような、含有するの任意の形態）は包括的または拡張可能（オープンエンド）であり、追加的な、挙げられていない要素または方法工程を除外するものではない。本明細書に記載されている任意の実施形態は本発明の任意の方法または構成に関して実施可能であり、逆も同様であると想定される。更に、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用されうる。
【００６０】
本明細書中で用いる基準数値およびその文法的等価物に関する「約」なる語は該数値自体およびその数値の上下（プラスまたはマイナス）１０％の値の範囲を含みうる。例えば、「約１０」なる量は１０および９〜１１の任意の量を含む。例えば、基準数値に関する「約」なる語はその値の上下（プラスまたはマイナス）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の値の範囲をも含みうる。
【００６１】
本明細書中で用いる「細胞傷害性」なる語は、細胞の正常状態における、意図されない又は望ましくない変化を意味しうる。細胞の正常状態は、細胞傷害性組成物、物質および／または状態に細胞がさらされる前に現れる又は存在する状態を意味しうる。一般に、正常状態にある細胞は恒常性状態の細胞である。細胞の正常状態における、意図されない又は望ましくない変化は、例えば、細胞死（例えば、プログラム細胞死）、複製能の低下、細胞の完全性（例えば、膜の完全性）の低下、代謝活性の低下、発生能力の低下または本出願に開示されている細胞傷害性効果のいずれかの形態で現れうる。
【００６２】
「単離（された）」は、核酸がその天然環境から取り出されることを意味する。「精製（された）」は、ある与えられた核酸が、天然状態から取り出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）なのか、または合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）なのか、および／または実験室条件下で増幅されたものなのかには無関係に、純度において増加していることを意味し、ここで、「純度」は「絶対純度」ではなく、相対的な用語である。しかし、核酸およびタンパク質は希釈剤またはアジュバントと共に製剤化可能であり、尚も、実際の目的には、単離可能であると理解されるべきである。例えば、核酸は、典型的には、細胞内への導入に使用される場合、許容される担体または希釈剤と混合される。
【００６３】
本明細書中で用いる「同一性の割合（％）」は、配列をアライメント（整列）させ、必要に応じてギャップを導入して最大同一性（％）を得た後（すなわち、ギャップは、最適なアライメントのために候補配列および参照配列の一方または両方に導入可能であり、比較目的には非相同配列は無視されうる）、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基の割合（％）を意味する。同一性の割合を決定する目的でのアライメントは、当技術分野の技量の範囲内の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成されうる。ＢＬＡＳＴを使用して試験配列を比較配列とアライメントさせ、比較配列の同じ位置のアミノ酸またはヌクレオチドと同一であるアライメントされた試験配列内のアミノ酸またはヌクレオチドの数を決定し、同一アミノ酸またはヌクレオチドの数を比較配列内のアミノ酸またはヌクレオチドの数で割り算することにより、２つの配列の同一性の割合は計算されうる。
【００６４】
本明細書中で用いる「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）なる語およびその文法的等価体は、血液（例えば、末梢血）中で循環するリンパ球を意味しうる。末梢血リンパ球は、臓器に局在していないリンパ球を意味しうる。末梢血リンパ球はＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはそれらの任意の組合せを含みうる。
【００６５】
本明細書中で用いる「表現型」なる語およびその文法的等価体は、生物の形態学的特徴、発生、生化学的または生理学的特性、生物季節学、行動および行動の結果のような、生物の観察可能な特徴または形質の複合体を意味しうる。文脈に応じて、「表現型」なる語は、時には、母集団の観察可能な特徴または形質の複合体を意味しうる。
【００６６】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。この用語は分子の一次構造のみを示す。したがって、この用語は二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡを含む。それは、例えばメチル化および／またはキャッピングにより修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドをも含む。この用語は、天然に存在しないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む分子をも含むと意図される。
【００６７】
本明細書中で用いる「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）なる語およびその文法的等価体は、血液（例えば、末梢血）中で循環するリンパ球を意味しうる。末梢血リンパ球は、臓器に局在していないリンパ球を意味しうる。末梢血リンパ球はＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはそれらの任意の組合せを含みうる。
【００６８】
「ポリペプチド」は「１以上のポリペプチド」および「タンパク質」なる語と互換的に用いられ、アミノ酸残基の重合体を意味する。「成熟タンパク質」は、完全長のタンパク質であって、所定の細胞環境におけるタンパク質に典型的なグリコシル化または他の修飾を含んでいてもよいタンパク質である。
【００６９】
核酸および／または核酸配列が「相同」であると言えるのは、それらが、共通の祖先核酸または核酸配列から天然で又は人工的に誘導される場合である。タンパク質および／またはタンパク質配列が相同であると言えるのは、それらのコードＤＮＡが、共通の祖先核酸または核酸配列から天然で又は人工的に誘導される場合である。相同分子はホモログと称されうる。例えば、本明細書に記載されているる天然に存在する任意のタンパク質は、利用可能な任意の突然変異誘発法により修飾されうる。この突然変異誘発された核酸は、発現されると、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は、一般に、２以上の核酸またはタンパク質（またはそれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性の確立に有用な配列間の同一性の厳密な割合は問題の核酸およびタンパク質によって異なるが、僅か２５％の配列同一性が、相同性を確立するために通常用いられる。より高いレベルの配列同一性、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％またはそれ以上の配列同一性も、相同性を確立するために用いられうる。
【００７０】
２つの核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列の場合の「同一」または「配列同一性」なる語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大合致が得られるようにアライメントされた場合に同一である、それらの２つの配列における残基に関するものである。１つのクラスの実施形態においては、本明細書におけるポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用してＢＬＡＳＴＰ（またはＣＬＵＳＴＡＬもしくは任意の他の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定された場合に、参照ポリペプチドまたはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％、９９％または１００％同一である。同様に、核酸も出発核酸に基づいて記載されうる。例えば、それらは、デフォルトパラメータを使用してＢＬＡＳＴＮ（またはＣＬＵＳＴＡＬもしくは任意の他の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定された場合に、参照核酸またはその断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％または１００％同一でありうる。１つの分子が、より大きな分子に対して或る割合の配列同一性を有すると記載されている場合、それは、それらの２つの分子が最適にアライメントされた場合に、それらの２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、小さいほうの分子における前記割合の残基が、大きいほうの分子におけるマッチ（一致）残基において見出されることを意味する。
【００７１】
本明細書中で用いる「Ｔ細胞」なる語およびその文法的等価体は、任意の起源に由来するＴ細胞を意味しうる。例えば、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば自己Ｔ細胞、細胞系などでありうる。また、Ｔ細胞はヒトＴ細胞または非ヒトＴ細胞でありうる。
【００７２】
本明細書中で用いる「ＴＩＬ」または腫瘍浸潤リンパ球なる語およびその文法的等価体は、腫瘍から単離された細胞を意味しうる。例えば、ＴＩＬは、腫瘍へ移動した細胞でありうる。ＴＩＬはまた、腫瘍に浸潤した細胞でありうる。ＴＩＬは、腫瘍内で見出される任意の細胞でありうる。例えば、ＴＩＬはＴ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそれらの任意の組合せでありうる。ＴＩＬは細胞の混合集団でありうる。ＴＩＬの集団は種々の表現型の細胞、種々の分化度の細胞、種々の系統の細胞またはそれらの任意の組合せを含みうる。
【００７３】
「トランスポゾン」または「転位因子」（ＴＥ）は、ゲノム内の自身の位置を変化させるベクターＤＮＡ配列であって、時には突然変異を生成または逆転させ、細胞のゲノムサイズを変化させうるものである。転位は、しばしば、ＴＥの複製をもたらす。クラスＩ  ＴＥは２段階でコピーされる。まず、それらはＤＮＡからＲＮＡへと転写され、ついで、生じたＲＮＡはＤＮＡへと逆転写される。このコピーされたＤＮＡはゲノム内の新たな位置に挿入される。該逆転写段階は、ＴＥ自体によりコードされうる逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴はＨＩＶのようなレトロウイルスに類似している。クラスＩＩ  ＴＥのカット・アンド・ペースト（ｃｕｔ−ａｎｄ−ｐａｓｔｅ）転位メカニズムはＲＮＡ中間体を含まない。転位は幾つかのトランスポサーゼ酵素により触媒される。ＤＮＡにおける任意の標的部位に非特異的に結合するトランスポサーゼもあれば、特異的ＤＮＡ配列標的に結合するトランスポサーゼもある。トランスポサーゼは、標的部位において、互い違いの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）切断を生成して、一本鎖５’または３’ＤＮＡオーバーハング（粘着末端）を生成する。この段階はＤＮＡトランスポゾンを切り出し、ついでこれは新たな標的部位に連結される。この過程は、ギャップを埋めるＤＮＡポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格を閉じるＤＮＡリガーゼの活性とを含む。これは標的部位の複製をもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡにおける互い違いの切断とＤＮＡポリメラーゼによる埋め合わせ（フィルイン）とにより生成されうる短い直列反復（ダイレクトリピート）、およびそれに続く、トランスポサーゼによるＴＥ切除に重要な一連の逆方向反復により特定されうる。供与部位は既に複製されているが、標的部位は未だ複製されていない、細胞周期のＳ期において、カット・アンド・ペーストＴＥの転位が生じると、カット・アンド・ペーストＴＥが複製されうる。クラスＩ  ＴＥおよびクラスＩＩ  ＴＥのどちらにおいても、転位は「自律性」または「非自律性」のいずれかとして分類されうる。自律性ＴＥは独力で移動可能であり、一方、非自律性ＴＥは、移動するためには別のＴＥの存在を要する。これは、多くの場合、非自律性ＴＥがトランスポサーゼ（クラスＩＩの場合）または逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くからである。
【００７４】
「トランスポサーゼ」は、トランスポゾンの末端に結合しカット・アンド・ペースト・メカニズムまたは複製転位メカニズムによりゲノムの別の部位へのトランスポゾンの移動を触媒する酵素を意味する。幾つかの実施形態においては、トランスポサーゼの触媒活性は、遺伝子をベクターからゲノムに移動させるために利用されうる。
【００７５】
本明細書において開示または想定されている核酸配列およびベクターは「トランスフェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質導入」により細胞内に導入されうる。本明細書中で用いる「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」は、物理的または化学的方法を用いて１以上の外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することを意味する。多数のトランスフェクション技術が当技術分野で公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈（例えば、Ｍｕｒｒａｙ  Ｅ．Ｊ．（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照されたい）、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、タングステン粒子促進性微粒子射撃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６−７７７（１９９０））、およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈（Ｂｒａｓｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：２０３１−２０３４（１９８７））、およびヌクレオフェクション（Ｔｒｏｍｐｅｔｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７４：２４５−２５６（２００３））を包含する。適切なパッケージング細胞（それらの多くは商業的に入手可能である）における感染性粒子の増殖の後、ファージまたはウイルスベクターを宿主細胞内に導入することが可能である。
【００７６】
「プロモーター」は、コード配列の転写を開始するポリヌクレオチドの領域を意味する。プロモーターは、ＤＮＡ上の同じ鎖の上流（センス鎖の５’領域に対して）の、遺伝子の転写開始部位の近くに位置する。細胞におけるあらゆる状況で活性である構成的なプロモーターもあれば、特定の刺激に応答して活性になるように調節されるプロモーター、例えば誘導性プロモーターもある。
【００７７】
「プロモーター活性」なる語は、活性が測定されるプロモーターに機能的に連結されたヌクレオチド配列の発現の度合を意味する。プロモーター活性は、例えばノーザンブロット分析により、産生ＲＮＡ転写物の量を決定することにより直接的に、または、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列のような連結核酸配列にコードされる産物の量を決定することにより間接的に測定されうる。
【００７８】
本明細書中で用いる「誘導性プロモーター」は、転写調節因子、例えば生物的または非生物的因子の存在または非存在により活性状態へと誘導されるプロモーターを意味する。誘導性プロモーターが有用であるのは、それに機能的に連結された遺伝子の発現が生物の発生の或る段階または特定の組織において可能または不能になりうるからである。誘導性プロモーターの例としては、アルコール調節プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、病因調節プロモーター、温度調節プロモーターおよび光調節プロモーターが挙げられる。１つの実施形態においては、誘導性プロモーターは遺伝的スイッチの一部である。
【００７９】
本明細書中で用いる「エンハンサー」なる語は、例えば、それが機能的に連結されている核酸配列の転写を増強するＤＮＡ配列を意味する。エンハンサーは核酸配列のコード領域から数キロベース離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターンまたはＤＮＡ構造の変化をもたらしうる。多種多様な起源に由来する多数のエンハンサーが当技術分野でよく知られており、（例えば、ＡＴＣＣのような寄託機関および他の商業的または個人的な供給源から）クローン化ポリヌクレオチドとして又はクローン化ポリヌクレオチド内で入手可能である。プロモーター（例えば、一般的に使用されるＣＭＶプロモーター）を含む多数のポリヌクレオチドもエンハンサー配列を含む。エンハンサーはコード配列の上流、内部または下流に位置しうる。「Ｉｇエンハンサー」なる語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマッピングされたエンハンサー領域に由来するエンハンサー要素を意味する［そのようなエンハンサーには、例えば、重鎖（ミュー）５’エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’エンハンサー、カッパおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’エンハンサーが含まれる］（全般的には、Ｐａｕｌ  Ｗ．Ｅ．（編），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３），ｐ．３５３−３６３；および米国特許第５，８８５，８２７号を参照されたい）。
【００８０】
本明細書中で用いる「コード配列」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを意味する。その領域または配列は、５’末端付近で開始コドンにより、そして３’末端付近で終止コドンにより、境界が定められる。コード配列はオープンリーディングフレームとも称されうる。
【００８１】
本明細書中で用いる「機能的に連結（された）」は、ＤＮＡセグメントが別のＤＮＡセグメントに物理的および／または機能的に連結されていて、それらのセグメントがそれらの意図される様態で機能するようにされていることを意味する。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列が調節配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが、直接的または間接的に該ＤＮＡ配列の転写の調節を可能にする様態で該調節配列、例えばプロモーター、エンハンサーおよび／またはサイレンサーに連結されている場合である。例えば、ＤＮＡ配列がプロモーターに機能的に連結されていると言えるのは、それが、転写開始部位に対して適切なリーディングフレームで、該プロモーターの転写開始部位の下流で該プロモーターに連結されており、該ＤＮＡ配列にわたって転写伸長が進行する場合である。エンハンサーまたはサイレンサーが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ＤＮＡ配列の転写をそれぞれ増強または低減するように該ＤＮＡ配列に連結されている場合である。エンハンサーおよびサイレンサーはＤＮＡ配列のコード領域の上流に、または下流に、または該コード領域内に埋め込まれて位置しうる。シグナル配列のＤＮＡが、ポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に連結されていると言えるのは、該シグナル配列が、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合である。調節配列へのＤＮＡ配列の連結は、典型的には、適切な制限部位における、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して該配列内に挿入されたアダプターもしくはリンカーを介した連結により達成される。
【００８２】
「転写調節因子」なる語は、ある環境条件下でプロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を妨げ又は抑制するように作用する生化学的要素（例えば、リプレッサーまたは核抑制性タンパク質）、あるいは、ある環境条件下でプロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を許容または刺激するように作用する生化学的要素（例えば、誘導因子またはエンハンサー）を意味する。
【００８３】
「誘導」なる語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーター活性および／または発現の、何らかの基底転写レベルに対する増強を意味する。
【００８４】
「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子（ＧＯＩ）」は、遺伝子導入により宿主細胞内に導入される遺伝子を意味する。ある場合には、本明細書に記載されているポリペプチド構築物は、操作された細胞において、１以上の異種遺伝子としてコードされる。
【００８５】
本明細書中で用いる「リコンビナーゼ」は、定められた複数の部位の間の部位特異的組換えを促進しうる一群の酵素を意味し、ここで、それらの部位は単一ＤＮＡ分子上で物理的に隔てられており、あるいは、それらの部位は別々のＤＮＡ分子上に存在する。定められた組換え部位のＤＮＡ配列は必ずしも同一ではない。組換えの開始はタンパク質−ＤＮＡ相互作用に依存し、該群内には、ファージ組込みおよび切除（例えば、λインテグラーゼ、．φＣ３１）、環状プラスミドの分解（例えば、Ｔｎ３、ガンマデルタ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ）、代替遺伝子の発現のためのＤＮＡ逆位（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ）、発生中の遺伝子の集合（例えば、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）窒素固定遺伝子）および転位（例えば、ＩＳ６０７トランスポゾン）を触媒する多数のタンパク質が存在する。ほとんどの部位特異的リコンビナーゼは、進化的およびメカニズム的な関連性に基づいて、２つのファミリーの１つに分類される。これらはλインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ（例、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｘｅｒ  Ｄ）およびレゾルバーゼ／インテグラーゼファミリーまたはセリンリコンビナーゼファミリー（例えば、φＣ３１、ＴＰ９０１−１、Ｔｎ３、ガンマデルタ）である。
【００８６】
「組換え付着部位」は、本明細書に記載されているリコンビナーゼ酵素により認識される特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的には、２つの異なる部位が関与し（「相補的部位」と称される）、１つは標的核酸（例えば、真核生物または原核生物の染色体またはエピソーム）に存在し、もう１つは、標的組換え部位に組込まれる核酸上に存在する。本明細書中で用いる「ａｔｔＢ」および「ａｔｔＰ」なる語は、元々はそれぞれ細菌標的およびファージドナーに由来する付着（または組換え）部位を意味するが、個々の酵素の組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的には、コアまたはスペーサー領域により隔てられた左アームおよび右アームを含む。したがって、ａｔｔＢ組換え部位はＢＯＢ’からなり、ここで、ＢおよびＢ’は、それぞれ、左アームおよび右アームであり、Ｏはコア領域である。同様に、ａｔｔＰはＰＯＰ’であり、ここで、ＰおよびＰ’はアームであり、Ｏは同様にコア領域である。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組換え、および標的における核酸の付随的組込みの後、組込まれたＤＮＡに隣接する組換え部位は「ａｔｔＬ」および「ａｔｔＲ」と称される。したがって、前記の用語を用いると、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位は、それぞれ、ＢＯＰ’およびＰＯＢ’からなる。本明細書における幾つかの表現においては、「Ｏ」は省略され、例えば、ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、ＢＢ’およびＰＰ’と称される。
【００８７】
本明細書中で用いる「ＣＲＩＳＰＲ」なる語は、ゲノムＤＮＡ内の認識部位にハイブリダイズすることによりカスパーゼのＤＮＡ切断を導くガイドＲＮＡ、およびＣａｓ９のようなカスパーゼを含む、カスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを意味する。
【００８８】
本明細書中で用いる「窮迫（ｄｉｓｔｒｅｓｓｅｄ）細胞」または「ストレス化細胞」なる語は、疾患状態または障害状態を示す細胞を意味する。窮迫（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）の発現は、正常または非ストレス状態と比較した場合の細胞機能の任意の変化、例えば、遺伝子の転写または翻訳、転写後または翻訳後の修飾、タンパク質または酵素活性、ポリペプチドのコンホメーション、細胞接着、細胞表面特性、および他の細胞を認識する又は他の細胞により認識される能力の変化を含みうる。幾つかの実施形態においては、窮迫細胞の特定の表現型（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）は細胞内異常、例えば遺伝的突然変異に関連している。他の実施形態においては、窮迫細胞の表現型は細胞外環境における異常またはストレッサーに関連している。窮迫細胞の一例は腫瘍細胞である。特定の実施形態においては、窮迫細胞は細胞膜へのＲｈｏＢの移行により特徴づけられうる。ある場合には、窮迫細胞は細胞表面上のＣＤ２７７のＪ配置の存在により特徴づけられる。
【００８９】
本明細書中で用いる「エピジェネティック変化」または「エピジェネティック修飾」は、ＤＮＡ配列における変化以外の、ＤＮＡの任意の共有または非共有結合修飾を意味する。ある実施形態においては、エピジェネティック変化は１以上の遺伝子の調節および／または発現に影響を及ぼし、または変化させる。エピジェネティック変化は、エピジェネティック修飾の染色体部位に対して比較的近位（例えば、１Ｍｂｐ以内）にある、またはエピジェネティック修飾の部位に対して遠位（例えば、同じ染色体沿いに１Ｍｂｐ超離れた又は異なる染色体上）にある遺伝子の調節に影響を及ぼしうると想定される。エピジェネティック変化の非限定的な例には、ＤＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化、ヒストン修飾、例えばリジンアセチル化、リジンおよびアルギニンメチル化、セリンおよびスレオニンリン酸化、ならびにリジンユビキチン化およびスモイル化、ならびにクロマチン構造の変化が含まれる。
【００９０】
１つの態様において提供するのは、γδＴ細胞を含む組成物でありうる。γδＴは、γδＴ細胞受容体を発現する特殊なＴ細胞集団でありうる。γδＴは、ＴＣＲにより確保された特異性と広範な非ＨＬＡ制限抗腫瘍反応性とを併せ持つものであることが可能であり、そのような特徴は癌免疫療法における新たな道を切り開きうるものである。例えば、腫瘍浸潤性γδＴ細胞の検出は癌患者における正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の臨床成績に関連づけられている。１つの態様においては、γδＴ細胞は早期癌免疫監視に関与しうる。１つの態様においては、γδＴは機能および受容体発現に関して異種でありうる。１つの態様においては、γδＴＣＲは免疫細胞内に導入されうる。例えば、γδＴＣＲはαβＴ細胞内に導入されうる。１つの態様においては、γδＴＣＲをαβＴ細胞のような免疫細胞内に導入することを含む方法は、γδＴＣＲに基づく治療の持続性を改善しうる。１つの態様においては、γδＴＣＲをαβＴ細胞のような免疫細胞内に導入することを含む方法は、γδＴＣＲに基づく治療用物質の増殖（拡散）を改善しうる。１つの態様においては、γδＴＣＲをαβＴ細胞のような免疫細胞内に導入することを含む方法は進行癌患者における腫瘍細胞のクローン不均一性を克服することが可能であり、これは、αβＴＣＲに基づくアプローチに対する改善に相当する。１つの態様においては、この改善は、脂質代謝の変化のような、γδＴＣＲの別個のＨＬＡ非依存的活性化刺激によるものでありうる。１つの態様においては、γδＴＣＲ治療用物質は、低い突然変異荷重を有する癌を含む対象に投与されうる。
【００９１】
１つの態様においては、本発明が提供するのは、癌細胞上のＣＤ２７７のような標的に結合するγδＴＣＲ治療用物質でありうる。γδＴＣＲ治療用物質の結合は、標的上で発現されたＣＤ２７７における空間的変化および／またはコンホメーション変化を含みうる。１つの態様においては、結合は直接的な相互作用を意味しうる。１つの態様においては、結合は間接的な相互作用を意味しうる。結合は、ＣＤ２７７の上流に結合する物質を意味しうる。１つの態様においては、ＣＤ２７７の上流に結合する物質は、ＣＤ２７７から約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ファクター（ｆａｃｔｏｒ）離れて結合しうる。幾つかの態様においては、ＣＤ２７７のＪ配置またはＣＤ２７７Ｊと称される、ＣＤ２７７の活性化状態につながる一連の事象は、、ＴＣＲ依存的γ９δ２Ｔ細胞活性化を誘導しうる。
【００９２】
１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲのＣＤＲ３領域における多様性はγ９δ２  Ｔ細胞集団内の機能不均一性および追加的な共受容体の発現に寄与しうる。１つの態様においては、γ９δ２  Ｔ細胞集団内の機能不均一性は、異なる表現型および転写プロファイルに起因しうる。１つの態様においては、腫瘍細胞に対する多様なγ９δ２Ｔ細胞レパートリー内に含まれる異なる活性化閾値のクローンレベルが存在しうる。αβＴ細胞においてγδＴＣＲを発現させることにより、γ９δ２  Ｔ細胞クローンの機能における変動が生じうる。幾つかの態様においては、この変動は、異なるγ９δ２ＴＣＲによりもたらされる機能的アビディティと相関しているだけではないかもしれない。１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲとＣＤ２７７Ｊとの低いアフィニティの相互作用が存在しうる。１つの態様においては、γδＴＣＲのその標的に対する初期スキャンモードが存在しうる。この初期スキャンはＣＤＲ３依存的であることが可能であり、γδＴＣＲの他の接触残基を利用しうる。１つの態様においては、スキャンはパミドロネート誘導性接着分子をも利用しうる。スキャンモードの後、ＣＤＲ３依存的同族体認識を行うことが可能であり、これは、ＣＤ２７７Ｊ配置および標的側の可能な追加的膜分子からなるナノクラスターのセンシングを可能にする、シナプス形成中の高密度リクルートメントおよびγ９δ２ＴＣＲの膜柔軟性を利用することが可能である。１つの態様においては、ＴＣＲは表４における配列に対して約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大約１００％の同一性の割合を含みうる。１つの態様においては、γ９δ２は表４における配列に対して約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大約１００％の同一性の割合を含みうる。１つの態様においては、γ９δ２は、表３に含まれる配列を使用して、あるいは表３における配列に対して約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大約１００％の同一性の割合を含む配列を使用して得られうる。
【００９３】
１つの態様においては、ナイーブ臍帯血由来γδＴ細胞と健常成人の末梢血から単離されたγδＴ細胞との間のγδＴＣＲレパートリー多様性の比較は、選択されたクロノタイプの優先的増殖を示しうる。１つの態様においては、少数の優勢なクロノタイプへのレパートリーの傾きは或る機能的利益を示唆している可能性がある。１つの態様においては、クロノタイプ頻度とそれぞれのクローンの抗腫瘍機能的潜在能との間に相関性は存在しないかもしれない。１つの態様においては、異なる表現型プロファイルの取得と並行して生じるレパートリー・フォーカシング（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）は、選択されたクローンのインビトロ効力ではなく、個体のＴ細胞抗原刺激履歴を反映したものでありうる。１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲ以外の他の受容体はγ９δ２Ｔ細胞クローンの寛容性の誘導に関与している可能性がある。
【００９４】
１つの態様においては、親クローンの環境の外部から得られたγ９δ２ＴＣＲは、悪性疾患に非常に効率的に標的化するために使用されうる。１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲのアフィニティは、同じバックグラウンドで発現された場合のαβＴＣＲの活性化能の決定因子となりうる。１つの態様においては、親γδＴ細胞クローンの本質的能力と相関しない可能性があるγ９δ２ＴＣＲ媒介性機能的アビディティにより測定された場合、活性化能における本質的な差異が存在しうる。
【００９５】
１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲのアフィニティは、αβＴＣＲのものより一層低い範囲でありうる。例えば、ビーズ表面に１０４個を超えるγ９δ２ＴＣＲを含有するＹＧビーズのサイズへの漸増価数のγ９δ２ＴＣＲ多量体にのみ結合する検出可能なＴＣＲを達成することにより行われうる。１つの態様においては、十分な相互作用アビディティが得られたら、個々のγ９δ２ＴＣＲの間の結合アフィニティの差が有意となりうる。１つの態様においては、細胞外ＣＤ２７７ドメインとγ９δ２ＴＣＲとの間の直接的な相互作用が生じうる。
【００９６】
１つの態様においては、ＣＤ２７７は空間的変化およびコンホメーション変化を受けうる。１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲはＣＤ２７７との流体細胞膜相互作用に関与することが可能であり、これは、より高い局所密度を生成し、細胞間相互作用を安定化しうる。１つの態様においては、癌細胞のパミドロネート刺激は癌細胞上の接着分子のアップレギュレーションをもたらして、細胞間接触を増強し、シナプスを安定化させ、結果としてアビディティを安定化させうる。１つの態様においては、γ９δ２ＴＣＲのＣＤＲ３領域はＣＤ２７７発現癌細胞のシナプスへのリクルートメントに関与しうる。１つの態様においては、本発明が提供する物質はＣＤ２７７における空間的変化およびコンホメーション変化を直接的または間接的に誘発しうる。
【００９７】
１つの態様においては、ＢＴＮ３Ａ１のクラスターサイズの増加およびクラスター密度の低下が生じうる。１つの態様においては、クラスター密度の変化はＢＴＮ３Ａクラスター内の追加的タンパク質のための大部分のスペースを生成する。１つの態様においては、クラスター表面の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上がＢＴＮ３Ａ二量体により占有されうる。１つの態様においては、ＣＤ２７７シナプスに移動する追加的因子の関与、およびＲｈｏＢを介して調整されるＣＤ２７７のコンホメーション変化が生じうる。
【００９８】
１つの態様においては、γ９δ２Ｔ細胞の機能的多様性および「レパートリー・フォーカシング」が生じうる。ベクター。
【００９９】
直接的に又は１以上の追加的な生物学的因子を介して間接的にＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているベクター内に組込まれうる。「発現ベクター」または「ベクター」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下で複製可能である）または細胞染色体内への挿入により複製可能にされる任意の遺伝的要素、例えばプラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであり、それに別のポリヌクレオチドセグメントを結合させて、該結合セグメントの複製および／または発現を引き起こさせる。適切なベクターには、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージおよびコスミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、ベクターの連結または所望の宿主細胞へのベクターの挿入を行うのに、および結合セグメントの発現をもたらのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。そのような配列は宿主生物によって異なる。それらには、転写をもたらすプロモーター配列、転写を増強するエンハンサー配列、リボソーム結合部位配列、ならびに転写および翻訳終結配列が含まれる。あるいは、発現ベクターは、宿主細胞ＤＮＡ配列内へのベクターの連結または組込みを伴うことなく、それにおいてコードされる核酸配列産物を直接発現することが可能でありうる。
【０１００】
ベクターは「選択マーカー遺伝子」をも含みうる。本明細書中で用いる「選択マーカー遺伝子」なる語は、核酸配列を発現する細胞が対応選択因子の存在下で特異的に選択されることを可能にする核酸配列を意味する。適切な選択マーカー遺伝子は当技術分野で公知であり、例えば以下のものに記載されている：国際特許出願公開ＷＯ  １９９２／０８７９６およびＷＯ  １９９４／２８１４３；Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８１）；Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４）；Ｋｅｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：９０１−９０３（１９８７）；Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７）；Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６（１９６２）；Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ，２２：８１７（１９８０）；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号および第５，７７０，３５９号。
【０１０１】
幾つかの実施形態においては、ベクターは「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」であり、これは宿主細胞内で複製可能であり、適切な選択圧の存在下、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する（例えば、Ｃｏｎｅｓｅら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：１７３５−１７４２（２００４）を参照されたい）。代表的な商業的に入手可能なエピソーム発現ベクターには、エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）のベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７およびｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりにＴ抗原およびＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例である。
【０１０２】
ベクター修飾
本明細書に記載されている方法および組成物に有用なポリヌクレオチドベクターは優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）適合ベクターでありうる。例えば、ＧＭＰベクターは非ＧＭＰベクターより高純度でありうる。幾つかの場合には、純度はバイオバーデンにより測定されうる。例えば、バイオバーデンはベクター組成物中の好気性菌、嫌気性菌、胞子形成菌、真菌またはそれらの組合せの存在または非存在でありうる。幾つかの場合には、純粋なベクターは低エンドトキシンまたは無エンドトキシンでありうる。純度は二本鎖プライマーウォーキング配列決定によっても測定されうる。プラスミド同一性に基づいてベクターの純度が決定されうる。本発明のＧＭＰベクターは非ＧＭＰベクターより１０％〜９９％高い純度を有しうる。ＧＭＰベクターは、バイオバーデン、エンドトキシンの存在、配列決定またはそれらの組合せにより測定された場合、非ＧＭＰベクターより１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％高い純度を有しうる。
【０１０３】
幾つかの場合には、第１の遺伝子プログラムの末端におけるターミネーター配列が使用される。ターミネーター配列は、第２の遺伝子プログラムを開始する前に転写産物が終結していることを保証しうる。例えば、発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有しうる。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合によっては３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有しうる。発現ベクターを含む細胞は、インビボまたはインビトロのいずれかで、所望のポリペプチドの発現をもたらす条件下で増殖される。
【０１０４】
幾つかの場合には、スペーサー配列は、ベクター内のポリヌクレオチドによりコードされる第１ポリペプチドの末端において使用されうる。他の場合には、スペーサー配列はベクター内の第２遺伝子の末端において使用されうる。スペーサー配列はベクター内の第１遺伝子および第２遺伝子の後でも使用されうる。
【０１０５】
これらのベクターは、遺伝子により、または目的の遺伝子の一部によりコードされるポリペプチドを発現させるために使用されうる。一部の遺伝子または遺伝子は、ウイルス使用またはウイルス不使用の任意の方法を用いて挿入されうる。例えば、方法は、ウイルスに基づかない技術でありうる。
【０１０６】
リンカー
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドリンカーが使用されうる。ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むベクターと適合する末端構造を得るために付加されうる所望の制限部位を含有するＤＮＡの二本鎖セグメントでありうる。幾つかの場合には、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むベクターを修飾するのに有用でありうる。例えば、ポリヌクレオチドリンカーを含むベクター修飾はマルチクローニング部位における変化またはポリヒスチジンテールの付加でありうる。ポリヌクレオチドリンカーは、付着末端を有する制限酵素切断ベクターへのクローニングのために、平滑インサートＤＮＡの末端を適合させるためにも使用されうる。ポリヌクレオチドリンカーの使用はベクター内への平滑連結より効率的であり、下流用途におけるベクターからのインサートの遊離のための方法を提供しうる。幾つかの場合には、インサートは、治療用途に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でありうる。
【０１０７】
ポリヌクレオチドリンカーはオリゴマーでありうる。ポリヌクレオチドリンカーはＤＮＡ二本鎖、一本鎖またはそれらの組合せでありうる。幾つかの場合には、リンカーはＲＮＡでありうる。ポリヌクレオチドリンカーは、幾つかの場合にはＴ４リガーゼにより、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むベクターに連結されうる。連結を促進するために、インサートとベクターとを含む組成物に過剰のポリヌクレオチドリンカーが加えられうる。幾つかの場合には、インサートおよびベクターを前処理した後、リンカーを導入する。例えば、メチラーゼによる前処理はインサートＤＮＡの望ましくない切断を予防しうる。
【０１０８】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているポリヌクレオチドにおいてはリンカーが使用されうる。リンカーは柔軟なリンカー、剛性のリンカー、インビボで切断可能なリンカー、またはそれらの任意の組合せでありうる。幾つかの場合には、リンカーは（柔軟なリンカーおよび剛性のリンカーの場合のように）機能的ドメインを互いに連結し、または、インビボで切断可能なリンカーの場合のように、遊離性機能的ドメインをインビボで遊離しうる。
【０１０９】
リンカーは生物活性を改善し、発現収率を増加させ、望ましい薬物動態プロファイルを達成しうる。リンカーはヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィドまたはチオエステルをも含みうる。
【０１１０】
幾つかの場合には、本明細書に記載されているリンカー配列は柔軟なリンカーを含みうる。柔軟なリンカーは、結合されるドメインが或る程度の移動または相互作用を要する場合に適用されうる。柔軟なリンカーは小さな無極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸から構成されうる。柔軟なリンカーは、主にＧｌｙおよびＳｅｒ残基の伸長からなる配列を有しうる（「ＧＳ」リンカー）。柔軟なリンカーの一例は（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１）の配列を有しうる。コピー数「ｎ」を調節することにより、この例示的なＧＳリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成し、または必要なドメイン間相互作用を維持することが可能である。ＧＳリンカーに加えて、他の柔軟なリンカーも組換え融合タンパク質に使用されうる。幾つかの場合には、柔軟なリンカーはＧｌｙおよびＳｅｒのような小さな又は極性のアミノ酸をも豊富に含みうるが、柔軟性を維持するためにＴｈｒおよびＡｌａのような追加的なアミノ酸を含有しうる。他の場合には、溶解性を改善するために、ＬｙｓおよびＧｌｕのような極性アミノ酸が使用されうる。
【０１１１】
ＣＤ２７７のＪ配置
本明細書においては、「ＣＤ２７７」は、本明細書に記載されている操作された細胞のリン酸化抗原誘導性活性化における鍵分子である膜発現タンパク質ブチロフィリンＢＴＮ３Ａ１を意味する。ＣＤ２７７タンパク質は、例えば本出願の図１１に示されているとおり、複数の立体配置（「配置」）をとりうる細胞表面タンパク質である。ＧＴＰ結合ＲｈｏＢが、ＣＤ２７７のＢ３０．２ドメイン近位連結領域に結合する形質膜における細胞骨格捕捉を促進することにより、ＣＤ２７７の空間的再分布を促進すると、ＣＤ２７７のＪ配置またはＪコンファメーションが促進される。ＧＴＰ結合ＲｈｏＢの解離とＣＤ２７７のＢ３０．２ドメインへの細胞内リン酸化抗原（ｐＡＧ）の対応結合とが、本明細書においてＣＤ２７７のＪ配置と称される、ＣＤ２７７の細胞外領域のコンホメーション変化を誘発する。Ｊ配置は腫瘍細胞および他の窮迫細胞において特徴的に観察され、この場合、代謝変化が或るストレス分子の発現を引き起こして、腫瘍細胞または窮迫細胞内のＲｈｏＢの移行をもたらし、最終的にはＣＤ２７７のＪ配置の形成を引き起こしうる。本明細書においては、いずれかの関連特許および／または特許出願の場合と同様に、「Ｊ配置」、「Ｊコンホメーション」および「Ｊコンファメーション」なる語は互換的に用いられる。
【０１１２】
ある実施形態においては、本発明は、そのような腫瘍細胞および窮迫細胞の表面上のＣＤ２７７のＪ配置に特異的に結合するポリペプチド構築物を含む方法および組成物を提供する。ある実施形態においては、本明細書に記載されているポリペプチド構築物はガンマデルタＴＣＲまたはその断片を含む。ある実施形態においては、本明細書に記載されているポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドをコードするベクターを提供する。幾つかの場合には、本明細書に記載されているポリペプチド構築物をコードする操作された細胞を提供する。
【０１１３】
ポリペプチド構築物
幾つかの態様においては、本発明は、ポリペプチド構築物を含む医薬組成物を提供し、ここで、ポリペプチド構築物は標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置と特異的に相互作用する。ある実施形態においては、ポリペプチド構築物は、操作された細胞上で発現される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ２７７はヒトＣＤ２７７である。幾つかの場合には、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７の前記Ｊ配置に、ＣＤ２７７の他の配置より少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％高い選択性で結合する。幾つかの場合には、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７のＪ配置に、ＣＤ２７７の他の配置と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍または８倍のアフィニティで結合する。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７のＪ配置へのＣＤ２７７のコンホメーション変化の際にＣＤ２７７に結合し、このコンホメーション変化は、細胞膜へのＲｈｏＢ−ＧＴＰアーゼの移行の際のＣＤ２７７とＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとの相互作用により誘発される。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼと相互作用した後に、ＣＤ２７７に結合する。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７がリン酸化抗原と相互作用している際に、ＣＤ２７７に結合する。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２７７がリン酸化抗原と相互作用している際、かつ、ＣＤ２７７がＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼと相互作用した後に、ＣＤ２７７に結合する。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼが標的細胞の細胞膜に局在化している場合に、ＣＤ２７７に結合する。幾つかの態様においては、ポリペプチド構築物は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼが標的細胞の核から離れて局在化している場合に、ＣＤ２７７に結合する。
【０１１４】
ＣＤ２７７のＪ配置に関して本明細書に記載されてるポリペプチド構築物の選択性またはアフィニティは当業者に公知の任意の方法により決定されうる。例えば、ＣＤ２７７−ポリペプチド構築物複合体形成の存在、およびＣＤ２７７のＪ配置へのポリペプチド構築物の結合の度合または強度を検出するために、リガンド結合アッセイが用いられうる。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物とＣＤ２７７のＪ配置との結合のアフィニティを決定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が用いられる。ＦＲＥＴは、典型的には接近して配置された１組の感光性分子（例えば、フルオロフォア）間のエネルギー移動を検出し測定しうる。一方の感光性分子であるドナー分子（例えば、ドナーフルオロフォア）は最初は電子励起状態で存在し、他方の感光性分子であるアクセプター分子（例えば、アクセプターフルオロフォア）にエネルギーを移動させうる。ドナーからアクセプターへのエネルギー移動は、例えば、双極子−双極子カップリングによるものでありうる。アクセプター分子からドナー分子に移動したエネルギーの測定を行って、アクセプターとドナーとの間の距離を推定することが可能であり、これは、エネルギー移動の効率（すなわち、ＦＲＥＴ効率）がドナーとアクセプターとの間の距離の６乗に反比例することに基づいている。ＦＲＥＴの測定は、例えば、蛍光検出顕微鏡（例えば、共焦点顕微鏡）または蛍光感受性細胞選別（例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別）によるものでありうる。ＦＲＥＴを使用する蛍光の定量は、増感発光、アクセプター光退色、蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）ＦＲＥＴ、スペクトルイメージングならびに／またはホモＦＲＥＴおよび偏光異方性イメージングを含む多数の技術の任意の１以上によるものでありうる。幾つかの実施形態においては、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを使用して、ＦＲＥＴを行う。幾つかの実施形態においては、細胞表面上の抗原に特異的な１以上の蛍光標識抗体を使用して、ＦＲＥＴを行う。幾つかの実施形態においては、形質膜のような疎水性細胞成分に結合しうる、疎水性である１以上の蛍光標識色素を使用して、ＦＲＥＴを行う。幾つかの実施形態においては、１以上の蛍光標識抗体と１以上の疎水性蛍光色素との組合せを使用して、ＦＲＥＴを行う。幾つかの実施形態においては、ＣＤ２７７タンパク質上のエピトープに特異的な蛍光標識抗体と組合せて、蛍光脂質コンジュゲートＢＯＤＩＰＹ  ＦＬを使用する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているポリペプチド構築物の、ＣＤ２７７に対する選択性を検出するために、他のリガンド結合アッセイを、単独で、またはＦＲＥＴと組合せて使用する。本発明において想定されるリガンド結合アッセイの非限定的な例には、蛍光に基づく他の方法、例えば、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴を用いる細胞表面成分からの光反射角の変化の検出、放射能に基づくリガンドアッセイ、ならびに抗体標識細胞表面成分の免疫沈降およびそれに続く構造解析が含まれる。
【０１１５】
幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているポリペプチド構築物は細胞において発現される。幾つかの実施形態においては、前記ポリペプチド構築物は、細胞の細胞膜上で発現される。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は細胞と相互作用しうる。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は細胞の細胞表面タンパク質により結合されうる。幾つかの実施形態においては、細胞は細胞傷害性細胞である。細胞傷害性細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体の少なくとも機能的部分（例えば、免疫活性を伝達するもの）を発現する細胞、およびナチュラルキラー細胞が含まれる。幾つかの実施形態においては、細胞はＴ細胞受容体を発現する。幾つかの実施形態においては、細胞はＴ細胞受容体の少なくとも一部分を発現し、ここで、該部分はＴ細胞機能（例えば、免疫調節）を有する。幾つかの実施形態においては、細胞は、Ｔ細胞受容体の少なくとも１つの鎖を発現するように操作されており、または遺伝的に修飾されている。前記の少なくとも１つの鎖はγ−Ｔ細胞受容体鎖でありうる。前記の少なくとも１つの鎖はδ−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片でありうる。前記の少なくとも１つの鎖はγ９−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片でありうる。前記の少なくとも１つの鎖はδ２−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片でありうる。したがって、幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、少なくとも１つの鎖またはその断片（例えば、γ−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片、δ−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片、γ９−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片、またはδ２−Ｔ細胞受容体鎖またはその断片）を有するＴＣＲである。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、２以上の鎖を有するＴＣＲ（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）でありうる。
【０１１６】
幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているポリペプチド構築物は細胞によって発現されない。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は合成物である（例えば、細胞によって産生されない）。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物はインビトロで産生される。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、本明細書に開示されている標的細胞および細胞傷害性細胞に結合しうる。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、本明細書に開示されている標的細胞および細胞傷害性細胞に結合可能であり、それにより、細胞傷害性細胞が標的細胞に対して細胞傷害性となるのに十分な程度に、標的細胞を細胞傷害性細胞の近傍に配置する。
【０１１７】
本明細書に開示されているポリペプチドおよびタンパク質（その機能的部分および機能的変異体を含む）は１以上の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含みうる。そのような合成アミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ  ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−およびトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを包含する。
【０１１８】
本明細書中で用いる「抗体」はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を意味する。全抗体は、典型的には、４つのポリペプチド、すなわち、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーおよび軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーからなる。重鎖のそれぞれは１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含有し、各軽鎖は１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含有する。軽鎖および重鎖の各ペアの可変領域は抗体の抗原結合部位を形成する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は類似した一般的構造を有し、各領域は４つのフレームワーク領域を含有し、それらの配列は比較的保存されている。フレームワーク領域は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として公知の３つのＣＤＲは、抗原結合をもたらす、抗体の「超可変領域」を形成する。
【０１１９】
「抗原認識部分またはドメイン」は、抗原に特異的に結合する分子または分子の一部分を意味する。１つの実施形態においては、抗原認識部分は抗体、抗体様分子またはその断片であり、抗原は腫瘍抗原である。
【０１２０】
「抗体様分子」は、例えば、相手に選択的に結合しうるＩｇスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。ＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体はそのような分子である。１つの実施形態においては、抗体様分子はＴＣＲである。
【０１２１】
「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、「抗体の機能的フラグメント」および「抗原結合性部分」は本明細書においては互換的に用いられ、抗原に特異的に結合する能力を保有する、抗体のフラグメントまたは部分の１以上を意味する（全般的には、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（９）：１１２６−１１２９（２００５）を参照されたい）。抗体フラグメントは、望ましくは、例えば、１以上のＣＤＲ、可変領域（またはその一部）、定常領域（またはその一部）またはそれらの組合せを含む。抗体フラグメントの例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価断片であるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ストーク（ｓｔａｌｋ）領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）２つのドメインが単一ポリペプチド鎖として合成されることを可能にする合成リンカーにより連結されたＦｖフラグメントの２つのドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）からなる１価分子である一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＯｓｂｏｕｒｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７７８（１９９８）を参照されたい）；および（ｖ）ポリペプチド鎖の二量体であるジアボディ；ここで、各ポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーによりＶＬに連結されたＶＨを含み、該ペプチドリンカーは、同一ポリペプチド鎖上でＶＨとＶＬとのペア形成を可能にするには短すぎるため、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメイン間のペア形成を導いて、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子を与える。抗体フラグメントは当技術分野で公知であり、例えば米国特許第８，６０３，９５０号に更に詳細に記載されている。
【０１２２】
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
幾つかの実施形態においては、ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、操作されたＴＣＲまたはその断片を含む。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上でペア形成してヘテロ二量体受容体を形成する２つの鎖（αβまたはγδ）から構成される。αβＴＣＲは体内のほとんどのＴ細胞で発現され、特異的ＭＨＣ制限抗原の認識に関与することが公知である。それぞれのαおよびβ鎖は２つのドメインから構成され、すなわち、タンパク質を細胞膜に固定しＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットに結合する定常ドメイン（Ｃ）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される６つのループにより抗原認識をもたらす可変ドメイン（Ｖ）とから構成される。Ｖドメインのそれぞれは３つのＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことが可能であり、ＣＤＲ３を超可変領域として含有する。これらのＣＤＲは、主要組織適合複合体（ｐｅｐＭＨＣ）（例：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１複合体）によりコードされるタンパク質に結合した抗原ペプチドの間で形成された複合体と相互作用する。幾つかの場合には、定常ドメインは、定常ドメインを可変ドメインに連結する連結領域を更に含む。幾つかの場合には、ベータ鎖は、結合領域の一部を構成する短い多様性領域を更に含む。
【０１２３】
幾つかの場合には、そのようなＴＣＲは、特定の腫瘍抗原、例えばＮＹ−ＥＳＯ、Ｍａｇｅ  Ａ３、Ｔｉｔｉｎに対して反応性である。他の場合には、そのようなＴＣＲは、患者の腫瘍内で発現される特定のネオ抗原（すなわち、腫瘍により発現される患者特異的、体細胞性、非同義突然変異）に対して反応性である。幾つかの場合には、操作されたＴＣＲは、アフィニティが増強されうる。
【０１２４】
幾つかの実施形態においては、ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法を用いて示され、ＴＣＲ配列のＩＭＧＴ公共データベースにリンクする。例えば、フレームワーク、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列により区別される幾つかのタイプのアルファ鎖可変（Ｖα）領域および幾つかのタイプのベータ鎖可変（Ｖβ）領域が存在しうる。したがって、ＩＭＧＴ命名法では、Ｖαタイプは特有（ユニーク）のＴＲＡＶ番号により言及されうる。例えば、「ＴＲＡＶ２１」は、特有のフレームワークならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と、ＴＣＲ間で保存されたアミノ酸配列により部分的に定められるがＴＣＲ間で変動するアミノ酸配列をも含むＣＤＲ３配列とを有するＴＣＲ  Ｖα領域を定める。同様に、「ＴＲＢＶ５−１」は、唯一のフレームワークならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を有するＴＣＲ  Ｖβ領域を定めるが、ＣＤＲ３配列は部分的に定められているに過ぎない。
【０１２５】
幾つかの場合には、ベータ鎖多様性領域はＩＭＧＴ命名法ではＴＲＢＤなる略語により言及される。
【０１２６】
幾つかの場合には、ＩＭＧＴ命名法により定められる特有の配列は広く知られており、ＴＣＲ分野の当業者には理解されうる。例えば、それらはＩＭＧＴ公共データベースおよび“Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）ＬｅＦｒａｎｃ  ａｎｄ  ＬｅＦｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−１２−４４１３５２−８において見出されうる。
【０１２７】
幾つかの態様においては、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの両方を有する完全長鎖としてトランスフェクトされる。幾つかの場合には、ＴＣＲは、例えばＷＯ  ２００６／０００８３０に記載されているとおり、それぞれの定常ドメインの残基間に、導入されたジスルフィド結合を含有する。
【０１２８】
幾つかの場合には、本明細書に記載されているＴＣＲは一本鎖形態である。例えば、ＷＯ  ２００４／０３３６８５を参照されたい。一本鎖形態には、Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ、Ｖα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβタイプのαβ  ＴＣＲポリペプチドが含まれ、ここで、ＶαおよびＶβは、それぞれ、ＴＣＲαおよびβ可変領域であり、ＣαおよびＣβは、それぞれ、ＴＣＲαおよびβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。ある実施形態においては、本開示の一本鎖ＴＣＲは、ＷＯ  ２００４／０３３６８５に記載されているとおり、それぞれの定常ドメインの残基間に、導入されたジスルフィド結合を有しうる。
【０１２９】
αβＴＣＲとは対照的に、γδＴＣＲは１つのγ鎖および１つのδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、αβＴ細胞より遥かに少量しか体内に存在しないが、強力な抗腫瘍エフェクター機能と、広範に発現される腫瘍関連分子の認識とを併せ持ち、したがって、癌免疫療法における臨床応用の有力な候補である。γδＴ細胞の大部分はＭＨＣ非依存的に活性化され、抗原プロセシングを要さず、これはＭＨＣ制限αβＴ細胞とは対照的である。その代わりに、γδＴ細胞は抗原提示細胞との細胞間接触に依存し、無傷タンパク質または非ペプチド化合物の形態の抗原を直接的に認識する。この相互作用では、可変領域のＣＤＲ３ドメインが特に重要である。この相互作用では、可変領域のＣＤＲ３ドメインが特に重要である。γδＴＣＲの可変領域（Ｖ）および定常（Ｃ）領域の配向は、αβＴＣＲまたは抗体と比較して独特であり、ＶγドメインとＣγドメインと間の小さな角度から生じる。γδＴＣＲ  Ｖドメインの構造はαβＴＣＲのものに類似しているが、γδＴＣＲ  Ｃドメインは顕著に異なる。ＣγおよびＣδ（それらの間のジスルフィド結合の位置を含む）における構造的差異は、αβＴＣＲとは異なる認識／シグナル伝達複合体をγδＴＣＲが形成することを可能にしうる（Ａｌｌｉｓｏｎら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  γδ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｎａｔｕｒｅ，４１１：８２０−８２４）。標的細胞上のＴＣＲ媒介性抗原認識によるγδＴ細胞の活性化はサイトカインおよびケモカインの産生ならびに標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の細胞溶解をもたらしうる。
【０１３０】
ヒト末梢血における主要γδＴ細胞サブセットであるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、Ｖγ９およびＶδ２鎖から構成されるγδＴＣＲを発現し、哺乳類メバロン酸経路の中間体、例えばイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、または微生物２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール  ４−リン酸（ＭＥＰ）経路の中間体によって特異的に活性化される。細胞内リン酸化抗原（ｐＡｇ）レベルは、メバロン酸経路の調節不全により、または微生物感染の際に腫瘍細胞において上昇して、Ｖγ９Ｖδ２細胞による形質転換細胞または感染細胞の標的化を可能にする。同様に、メバロン酸経路インヒビター、例えばアミノビスホスホネート（ＡＢＰ）で細胞を処理し、それによりＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞による認識に対して細胞を感作することにより、細胞内ｐＡｇレベルを薬学的に上昇させることが可能である。
【０１３１】
幾つかの実施形態においては、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞により内因的に発現されるＴＣＲは、１以上のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現することによりαβＴ細胞を再プログラミングするように操作されたαβＴ細胞において発現されうる。例えば、１つの定められたＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現するように操作されたＣＤ４＋  αβＴ細胞を使用して、Ｔ細胞認識に重要なタンパク質に関して腫瘍細胞を機能的にスクリーニングして、多様なγδＴＣＲレパートリーによる認識における変動を排除することが可能である。
【０１３２】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）により発現されるＣＤ２７７（ＢＴＮ３Ａ１）タンパク質を認識する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲは、標的細胞の表面上で発現されるＣＤ２７７タンパク質のＪ配置を含むエピトープを認識する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲは、標的細胞の表面上で発現されるＣＤ２７７タンパク質のＪ配置に限定されたエピトープを認識する。
【０１３３】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている医薬組成物は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の細胞表面上のＣＤ２７７タンパク質を認識しうるγ−ＴＣＲアミノ酸配列またはδ−ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つを含むＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲを含むポリペプチド構築物を含む。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物は、標的細胞の細胞表面上のＣＤ２７７タンパク質を認識しうるγ−ＴＣＲアミノ酸配列またはδ−ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つの変異体または断片を含む。本開示は、ＣＤ２７７細胞表面分子を介して標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を認識しうるγδＴＣＲの任意の部分または断片または変異体を含むポリペプチド構築物を想定している。幾つかの態様において、ポリペプチド構築物はＣγまたはＣδ領域の少なくとも一部およびγδＴＣＲのＶγまたはＶδ領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物はＣγまたはＣδ領域の少なくとも一部およびγδＴＣＲのＶγまたはＶδドメインの少なくともＣＤＲ３ドメインを含む。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物はＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲの全ＣＤＲ領域を含み、該ＣＤＲ領域の全ては標的細胞の表面上の細胞表面分子（例えば、ＣＤ２７７分子）への結合に関与しうる（例えば、Ｗａｎｇら，“Ｖ｛ｇａｍｍａ｝２Ｖ｛ｄｅｌｔａ｝２  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｎｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ａｌｌ  ＣＤＲｓ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８４，６２０９−６２２２（２０１０）を参照されたい）。
【０１３４】
本明細書に記載されているＴＣＲは、検出可能な標識、治療用物質またはＰＫ修飾部分に結合されうる。
【０１３５】
診断目的のための例示的な検出可能な標識には、蛍光標識、放射能標識、酵素、核酸プローブおよびコントラスト試薬が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３６】
エフェクター細胞
本明細書に開示されているポリペプチド構築物をコードする１以上の遺伝子または異種遺伝子を発現するように修飾されたエフェクター細胞を提供し、ここで、該ポリペプチド構築物はＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する。
【０１３７】
「αβＴ細胞」または「アルファベータＴ細胞」は、種々の細胞の表面上で発現されるＭＨＣ分子（主要組織適合複合体）に結合したペプチドを認識するαβＴＣＲを発現するＴリンパ球の機能に関して定義されうる。ＭＨＣは、細胞のタンパク質に由来するペプチドを提示する。例えば、細胞がウイルスに感染すると、ＭＨＣはウイルスペプチドを提示し、αβＴＣＲとＭＨＣ複合体との相互作用が特定のタイプのＴ細胞を活性化し、これは、感染細胞を排除する免疫応答を始動させる。したがって、αβＴ細胞は、ＭＨＣ分子に結合したペプチドを認識しうる細胞として機能的に定義されうる。αβＴ細胞は、例えば後記のようなαβＴ細胞受容体に特異的な抗体（例えば、ヒトαβＴＣＲに特異的なＢＷ２４２抗体）を使用して特定されうる。Ｔ細胞の大部分はαβＴＣＲを有するため、αβＴ細胞は、例えばＣＤ３抗原を介して末梢血から選択されうる。そのような選択はγδＴ細胞をも含むであろう。そのような選択された細胞から、αＴ細胞受容体鎖およびβＴ細胞受容体鎖に対応する核酸（またはアミノ酸）配列が決定されうる。したがって、αβＴ細胞は、αＴ細胞受容体鎖および／またはβＴ細胞受容体鎖に対応する核酸（またはアミノ酸）配列を含む細胞としても定義されうる。
【０１３８】
「γδＴ細胞」または「ガンマデルタＴ細胞」は、それらの活性化を誘発する抗原分子がほとんど知られていないＴ細胞の小さなサブセットを表す。ガンマデルタＴ細胞は、それがＴＣＲ遺伝子を再構成して接合部多様性を生み出し記憶表現型を発生させるという点で、適応免疫の成分とみなされうる。しかし、また、制限されたＴＣＲがパターン認識受容体として使用される場合、種々のサブセットが自然免疫の一部とみなされうる。γδＴ細胞は、γδＴ細胞受容体に特異的な抗体を使用して特定されうる。ＦＡＣＳに適した抗体は広く入手可能である。陰性および／または陽性細胞の選択を可能にする、抗体製造業者により提供されるような条件が選択される。適切でありうる抗体の具体例は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ，１  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ＵＳＡ）、ＴＣＲ−ＡＰＣ（クローンＢ１，＃５５５７１８）から入手可能であり、あるいはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ｐａｎ−ＴＣＲ−ＰＥ（クローンＩ  ＭＭＵ５１０，＃Ｉ  Ｍ１４１８Ｕ）から入手可能である。また、そのような選択された細胞から、γＴ細胞受容体鎖および／またはδＴ細胞受容体鎖に対応する核酸（またはアミノ酸配列）配列が決定されうる。したがって、γδＴ細胞は、γＴ細胞受容体鎖に対応する核酸（またはアミノ酸）配列を含む細胞としても定義されうる。
【０１３９】
１つの態様においては、本明細書に開示されている組成物は細胞を利用することが可能である。細胞は初代細胞でありうる。細胞は組換え細胞でありうる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から入手可能である。例えば、任意のＴ細胞系が使用されうる。あるいは、細胞は、健常ドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来しうる。もう１つの実施形態においては、細胞は、異なる表現型特性を示す細胞の混合集団の一部でありうる。細胞は細胞治療バンクからも入手可能である。免疫抑制治療に耐性である破壊細胞が入手可能である。望ましい細胞集団は修飾前にも選択されうる。選択は磁気分離、フローサイトメトリー選択、抗生物質選択の少なくとも１つを含みうる。前記の１以上の細胞は、任意の血液細胞、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、単球またはマクロファージでありうる。前記の１以上の細胞は任意の免疫細胞、例えばリンパ球、Ｂ細胞またはＴ細胞である。細胞はホールフード、アフェレーシス、または対象の腫瘍サンプルからも入手可能である。細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）でありうる。幾つかの場合には、アフェレーシスは白血球アフェレーシスでありうる。白血球アフェレーシスは、血液から血液細胞を単離する操作である。白血球アフェレーシス中に、対象の腕における針から血液を取り出し、赤血球、血漿およびリンパ球に全血を分離する装置内で循環させ、ついで血漿および赤血球を他方の腕における針を介して対象に戻すことが可能である。幾つかの場合には、治療レジメおよび細胞療法の実施の後で細胞を単離する。例えば、アフェレーシスは細胞投与と連続的または同時に行われうる。幾つかの場合には、アフェレーシスは細胞製品の投与前および投与後約６週間まで行われる。幾つかの場合には、アフェレーシスは、細胞製品の投与の−３週間、−２週間、−１週間、０、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年または最大約１０年後に行われる。幾つかの場合には、アフェレーシスにより得られた細胞は、特異的細胞溶解、サイトカイン放出、メタボロミクス研究、生体エネルギー研究、サイトカイン産生の細胞内ＦＡＣ、ＥＬＩＳＡスポットアッセイおよびリンパ球サブセット分析のための試験に付されうる。幾つかの場合には、細胞製品またはアフェレーシス産物のサンプルは注入細胞表現型および機能の遡及的分析のために凍結保存されうる。
【０１４０】
１つの態様においては、本発明が提供する組成物はＴＩＬを含みうる。ＴＩＬは、癌に罹患した器官から単離されうる。脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靭帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節またはリンパ管でありうる、癌を有する器官から、１以上の細胞が単離されうる。１以上のＴＩＬは脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸または膵臓に由来しうる。ＴＩＬは膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺または心臓に由来しうる。ＴＩＬは膵臓に由来しうる。前記の１以上の細胞は膵島細胞、例えば膵β細胞でありうる。幾つかの場合には、ＴＩＬは胃腸癌に由来しうる。ＴＩＬ培養は多数の方法で調製されうる。例えば、腫瘍は非癌性組織または壊死領域から切り取られうる。ついで腫瘍は約２〜３ｍｍの長さに断片化されうる。幾つかの場合には、腫瘍は約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約２ｍｍ〜約３ｍｍ、約３ｍｍ〜約４ｍｍ、または約４ｍｍ〜約５ｍｍのサイズで断片化されうる。ついで腫瘍断片は、培地および細胞刺激剤、例えばサイトカインを使用して、インビトロで培養されうる。幾つかの場合には、腫瘍断片からＴＩＬを増殖させるために、ＩＬ−２が使用されうる。
【０１４１】
幾つかの実施形態においては、修飾エフェクター細胞は、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現させるために特定の核酸配列をコードするように修飾されたＴ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を含む修飾免疫細胞である。
【０１４２】
本明細書に記載されている外因性免疫受容体を含有する操作されたＴ細胞は、例えばＣＤ２７７のＪ配置に特異的に結合するポリペプチド構築物のような外因性受容体を発現するように操作されたＴ細胞である。外因性受容体は内因性遺伝子座からではなくトランスジーン構築物から発現されうる。外因性受容体は、異なる起源に由来することが可能であり、すなわち、外因性受容体を含有する操作されたＴ細胞を得るために操作されたＴ細胞の起源とは別の種に由来することが可能である。外因性受容体は、同じ起源に由来することが可能であり、すなわち、外因性受容体を含有する操作されたＴ細胞を得るために操作されたＴ細胞の起源と同じ種に由来することが可能である。外因性受容体はまた、操作されたγδＴ細胞受容体、または操作されたαβＴ細胞受容体であることが可能であり、それらは、ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するように操作されている。
【０１４３】
幾つかの場合には、操作されたＴ細胞受容体は、修飾されたアミノ酸配列を有するＴ細胞受容体であり、それは、内因性Ｔ細胞受容体の対応アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を補助する。幾つかの場合には、ＴＨ細胞は、細胞表面上でＣＤ４糖タンパク質を発現することから、ＣＤ４＋  Ｔ細胞として公知である。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子がペプチド抗原でヘルパーＴ細胞に提示すると、ヘルパーＴ細胞は活性化される。ヘルパーＴ細胞は、活性化されると、急速に分裂し、サイトカイン（これは能動的免疫応答を調節または補助する）と称される小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含む幾つかのサブタイプの１つに分化することが可能であり、それらは異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を促進する。
【０１４５】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）はウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、それらの表面上でＣＤ８糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連した抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、および調節性Ｔ細胞により分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋  細胞はアネルギー状態へと不活性化され、これは自己免疫疾患を予防する。
【０１４６】
記憶Ｔ細胞は、感染が消散した後も長期間存続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、同種抗原に再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に増殖して、過去の感染に対する「記憶」を免疫系に付与する。記憶Ｔ細胞は幾つかのサブタイプ、すなわち、幹記憶Ｔ細胞（ＴＳＣＭ）、中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかでありうる。記憶Ｔ細胞は細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＣＲ７を発現しうる。
【０１４７】
サプレッサーＴ細胞として以前公知であった調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は免疫寛容の維持において或る役割を果たす。それらの主な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞媒介性免疫を遮断すること、および胸腺における負の選択の過程を逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１４８】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は適応免疫系と自然免疫系との橋渡しをする。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと称される分子により提示される糖脂質抗原を認識しる。これらの細胞は、活性化されると、Ｔｈ細胞とＴｃ細胞との両方に起因する機能（すなわち、サイトカイン産生および細胞溶解性／細胞殺傷性分子の放出）を果たしうる。また、それらは幾つかの腫瘍細胞およびヘルペスウイルス感染細胞を認識し除去しうる。
【０１４９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は自然免疫系の細胞傷害性リンパ球の一種である。幾つかの場合には、ＮＫ細胞はウイルス感染および／または腫瘍形成に対する第一線の防御をもたらす。ＮＫ細胞は、感染細胞または癌細胞上に提示されたＭＨＣを検出し、サイトカインの放出を引き起こし、ついで細胞溶解およびアポトーシスを誘導しうる。更に、ＮＫ細胞は抗体および／またはＭＨＣの非存在下でストレス化細胞を見出すことが可能であり、それにより、迅速な免疫応答を可能にする。
【０１５０】
幾つかの場合には、細胞療法において使用されうる細胞、または本発明で提供される方法において使用されうる細胞は、所定の因子に関して陽性または陰性でありうる。幾つかの実施形態においては、細胞はＣＤ３＋  細胞、ＣＤ３−  細胞、ＣＤ５＋  細胞、ＣＤ５−  細胞、ＣＤ７＋  細胞、ＣＤ７−  細胞、ＣＤ１４＋  細胞、ＣＤ１４−  細胞、ＣＤ８＋  細胞、ＣＤ８−  細胞、ＣＤ１０３＋  細胞、ＣＤ１０３−  細胞、ＣＤ１１ｂ＋  細胞、ＣＤ１１ｂ−  細胞、ＢＤＣＡ１＋  細胞、ＢＤＣＡ１−  細胞、Ｌ−セレクチン＋  細胞、Ｌ−セレクチン−  細胞、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５−  細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ２７−  細胞、ＣＤ２８＋  細胞、ＣＤ２８−  細胞、ＣＤ４４＋  細胞、ＣＤ４４−  細胞、ＣＤ５６＋  細胞、ＣＤ５６−  細胞、ＣＤ５７＋  細胞、ＣＤ５７−  細胞、ＣＤ６２Ｌ＋  細胞、ＣＤ６２Ｌ−  細胞、ＣＤ６９＋  細胞、  ＣＤ６９−  細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋  細胞、ＣＤ４５ＲＯ−  細胞、ＣＤ１２７＋  細胞、ＣＤ１２７−  細胞、ＣＤ１３２＋  細胞、ＣＤ１３２−  細胞、ＩＬ−７＋  細胞、ＩＬ−７−  細胞、ＩＬ−１５＋  細胞、ＩＬ−１５−  細胞、レクチン様受容体Ｇ１陽性細胞、レクチン様受容体Ｇ１陰性細胞、またはその分化もしくは脱分化細胞でありうる。細胞により発現される因子の例は限定的であるとは意図されず、当業者は、細胞が、当技術分野で公知の任意の因子に関して陽性または陰性でありうると理解するであろう。幾つかの実施形態においては、細胞は２以上の因子に関して陽性でありうる。例えば、細胞はＣＤ４＋かつＣＤ８＋でありうる。幾つかの実施形態においては、細胞は２以上の因子に関して陰性でありうる。例えば、細胞はＣＤ２５−かつＣＤ４４−かつＣＤ６９−でありうる。幾つかの実施形態においては、細胞は１以上の因子に関して陽性であり、かつ、１以上の因子に関して陰性でありうる。例えば、細胞はＣＤ４＋かつＣＤ８−でありうる。ついで、選択された細胞は対象の体内に注入されうる。幾つかの実施形態においては、細胞は、１以上の所定因子を有する又は有さないことに関して選択されうる（例えば、細胞は、１以上の因子の存在または非存在に基づいて分離されうる）。幾つかの実施形態においては、選択された細胞はインビトロでも増殖されうる。選択された細胞は注入前にインビトロで増殖されうる。本明細書に開示されている方法のいずれかにおいて使用される細胞は、本明細書に開示されている細胞のいずれかの混合物（例えば、２以上の異なる細胞）でありうると理解されるべきである。例えば、本開示の方法は、ＣＤ４＋  細胞とＣＤ８＋  細胞との混合物である細胞を含みうる。もう１つの例では、本開示の方法は、ＣＤ４＋  細胞とナイーブ細胞との混合物である細胞を含みうる。幾つかの場合には、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ−７Ｒα＋から構成される幹記憶ＴＳＣＭ細胞であることが可能であり、幹記憶細胞はＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３およびＬＦＡ−１をも発現することが可能であり、幹記憶細胞に特有の多数の機能的属性を示しうる。操作された細胞はまた、Ｌ−セレクチンとＣＣＲ７とを含む中央記憶ＴＣＭ細胞であることが可能であり、該中央記憶細胞は例えばＩＬ−２を分泌しうるが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４を分泌できない。操作された細胞はまた、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクター記憶ＴＥＭ細胞であることが可能であり、例えばＩＦＮγおよびＩＬ−４のようなエフェクターサイトカインを産生しうる。幾つかの場合には、細胞の集団が対象に導入されうる。例えば、細胞の集団はＴ細胞とＮＫ細胞との組合せでありうる。他の場合では、集団はナイーブ細胞とエフェクター細胞との組合せでありうる。細胞の集団はＴＩＬでありうる。
【０１５１】
特に、Ｔ細胞集団は、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体または抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性フラグメントとの接触により、あるいはカルシウムイオノフォアと組合されることもあるプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触により、インビトロで刺激されうる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用されうる。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激しうる条件下、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることが可能である。幾つかの場合には、細胞を刺激するために、４−１ＢＢが使用されうる。例えば、細胞は４−１ＢＢおよびＩＬ−２１または別のサイトカインで刺激されうる。ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が使用されうる。例えば、シグナルを与える物質は溶液中に存在し、または表面に結合されうる。細胞に対する粒子の比は標的細胞に対する粒子サイズに左右されうる。他の実施形態においては、Ｔ細胞のような細胞を物質被覆ビーズと組合せることが可能であり、ここで、該ビーズおよび該細胞は次いで分離され、所望により培養されうる。各ビーズは抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体のいずれかで、あるいは幾つかの場合にはそれらの２つの組合せで被覆されうる。もう１つの実施形態においては、培養前に、物質被覆ビーズおよび細胞は分離されず、一緒に培養される。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合しうる常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞と接触させることにより、細胞表面タンパク質が連結されうる。幾つかの場合には、細胞およびビーズ（例えば、１：１の比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ）をバッファー、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中（例えば、カルシウムおよびマグネシウムのような２価カチオンの非存在下）で一緒にする。任意の細胞濃度が用いられうる。該混合物は数時間（例えば、約３時間）〜約１４日間またはその間の任意の整数の時間にわたって培養されうる。もう１つの実施形態においては、該混合物は約２１日間または約２１日間まで培養されうる。Ｔ細胞培養に適した条件は、増殖および生存に必要な因子を含有しうる適切な培地（例えば、基礎培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ））を含むことが可能であり、それらは、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＴＧＦベータおよびＴＮＦアルファまたは細胞の成長のための任意の他の添加物を含みうる。細胞の成長のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されるものではない。培地には、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１  ＭＶ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、オプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）が含まれることが可能であり、それらにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添��されることが可能であり、無血清であり、または適量の血清（または血漿）もしくは所定の組合せのホルモン、ならびに／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインで補足されていることが可能である。幾つかの場合には、８６５ｍＬのＲＰＭＩボトルは１００ｍＬのヒト血清、２５ｍＬのＨｅｐｅｓ  １Ｍ、１０ｍＬの１０，０００Ｕ／ｍＬおよび１０，０００μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、ならびに０．２ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有しうる。添加物の添加後、ＲＰＭＩ培地は、０．２μｍ×１Ｌフィルターを使用して濾過され、４℃で保存されうる。幾つかの実施形態においては、抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは実験培養においてのみ配合されるが、対象の体内に注入される細胞の培養には配合されない。幾つかの場合には、ヒト血清は３７℃の水浴内で解凍され、ついで熱で不活性化されうる（例えば、１００ｍＬボトルの場合には５６℃で３０分間）。血清は培地の添加の前に０．８μｍおよび０．４５μｍのフィルターで濾過されうる。
【０１５２】
１つの態様においては、細胞は、成長を支持するのに必要な条件［例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％  ＣＯ２）］下で維持されうる。幾つかの場合には、種々の刺激時間にさらされたＴ細胞は種々の特性を示しうる。幾つかの場合には、ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２またはそれらの任意の組合せに対する可溶性単一特異性四量体抗体が使用されうる。
【０１５３】
修飾エフェクター細胞の用量
本発明は、細胞表面ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物をコードする修飾エフェクター細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、修飾エフェクター細胞の或る量が、それを要する対象に投与され、その量は、サイトカイン関連毒性を誘発する可能性および有効性に基づいて決定される。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０３〜約１０１０  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０４〜約１０８  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は、約１０５〜約１０７  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０６〜約１０９  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０６〜約１０８  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は、約１０７〜約１０８  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０５〜約１０６  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０６〜約１０７  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０７〜約１０８  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０８〜約１０９  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０９  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は、約１０８修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０７  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０６  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、修飾エフェクター細胞の量は約１０５  修飾エフェクター細胞／ｋｇを含む。
【０１５４】
幾つかの実施形態においては、修飾エフェクター細胞は、ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するガンマデルタＴＣＲまたはその断片をコードする修飾Ｔ細胞である。幾つかの場合には、操作されたガンマデルタＴＣＲ  Ｔ細胞の量は約１０５〜約１０９  ガンマデルタＴＣＲ細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、操作されたガンマデルタＴＣＲ細胞の量は約１０５〜約１０８  ガンマデルタＴＣＲ細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、操作されたガンマデルタＴＣＲ細胞の量は約１０７〜約１０９  ガンマデルタＴＣＲ細胞／ｋｇを含む。幾つかの場合には、操作されたガンマデルタＴＣＲ細胞の量は約１０５〜約１０６  ガンマデルタＴＣＲ細胞／ｋｇを含む。
【０１５５】
サイトカイン
本発明は、本明細書に記載されているポリペプチド構築物およびサイトカインまたはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを含む方法および系を提供する。サイトカインは、細胞シグナル伝達に関与する約５〜２０ｋＤａの小さなタンパク質の一種である。幾つかの場合には、サイトカインにはケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子または腫瘍壊死因子が含まれる。幾つかの実施形態においては、ケモカインは、細胞の遊走を導く化学誘引物質としての役割を果たし、４つのサブファミリー、すなわち、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣに分類される。例示的なケモカインには、ＣＣサブファミリー：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７およびＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリー：ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリー：ＸＣＬ１およびＸＣＬ２；ならびにＣＸ３ＣサブファミリーＣＸ３ＣＬ１からのケモカインが含まれる
インターフェロン（ＩＦＮ）はインターフェロンＩ型（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−ω）、インターフェロンＩＩ型（例えば、ＩＦＮ−γ）およびインターフェロンＩＩＩ型を含む。幾つかの実施形態においては、ＩＦＮ−αは更に、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１を含む約１３個のサブタイプに分類される。
【０１５６】
インターロイキンは白血球により発現され、それはＴおよびびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイカインには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５およびＩＬ−３６が含まれる。
【０１５７】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、アポトーシスを調節するサイトカインの一群である。幾つかの場合には、ＴＮＦファミリー内には、ＴＮＦα、リンホトキシン−アルファ（ＬＴ−アルファ）、リンホトキシン−ベータ（ＬＴ−ベータ）、Ｔ細胞抗原ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）（これらに限定されるものではない）を含む約１９個のメンバーが存在する。
【０１５８】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、造血幹細胞の表面上の受容体タンパク質と相互作用する分泌糖タンパク質であり、ついでこれは細胞増殖および特定の種類の血液細胞への分化を調節する。幾つかの場合には、ＣＳＦはマクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）またはプロメガポエチンを含む。
【０１５９】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている１以上の方法はサイトカインの投与を更に含む。幾つかの場合には、サイトカインはケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子または腫瘍壊死因子を含む。幾つかの場合には、本明細書に記載されている１以上の方法は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子または腫瘍壊死因子から選択されるサイトカインの投与を更に含む。
【０１６０】
適応症
幾つかの実施形態においては、本明細書は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドをコードする修飾エフェクター細胞を、障害、例えば癌を有する対象に投与する方法を開示する。幾つかの場合には、癌は転移癌である。他の場合には、癌は再発性癌または難治性癌である。
【０１６１】
幾つかの場合には、癌は固形腫瘍または血液悪性疾患である。幾つかの場合には、癌は固形腫瘍である。他の場合には、癌は血液悪性疾患である。
【０１６２】
幾つかの場合には、癌は固形腫瘍である。例示的な固形腫瘍には、肛門癌、虫垂癌、胆管癌（すなわち、胆管細胞癌）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、原発不明癌（ＣＵＰ）、食道癌、眼癌、卵管癌、消化器癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、髄芽腫、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺疾患、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌または外陰癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
幾つかの場合には、癌は血液悪性疾患である。幾つかの場合には、血液悪性疾患には、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはＢ細胞悪性疾患が含まれる。幾つかの場合には、血液悪性疾患には、リンパ腫、白血病または骨髄腫が含まれる。幾つかの場合には、例示的な血液悪性疾患には、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発滲出性リンパ腫またはリンパ腫様肉芽腫症が含まれる。幾つかの実施形態においては、血液悪性疾患は骨髄性白血病を含む。幾つかの実施形態においては、血液悪性疾患は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。
【０１６４】
幾つかの場合には、本明細書は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発滲出性リンパ腫またはリンパ腫様肉芽腫症から選択される血液悪性腫瘍を有する対象に、本明細書に記載されている修飾エフェクター細胞を投与する方法を開示する。。幾つかの場合には、本明細書は、ＡＭＬまたはＣＭＬから選択される血液悪性疾患を有する対象に修飾エフェクター細胞を投与する方法を開示する。
【０１６５】
免疫エフェクター細胞源
ある態様においては、本明細書に記載されている実施形態は、細胞表面ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、ついで、所望により、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して細胞を増殖させることを含む、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ  Ｔ細胞）の製造方法および／または増殖方法を含む。ある態様においては、細胞表面ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチドを発現するように操作される細胞（または細胞集団）は幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫エフェクター細胞またはこれらの細胞の前駆体である。
【０１６６】
免疫エフェクター細胞の供給源は同種供給源および自己供給源の両方を含みうる。幾つかの場合には、免疫エフェクター細胞は幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化されうる。したがって、本実施形態による操作のための細胞は臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞またはｉＰＳＣから単離されうる。例えば、同種Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（および所望により、機能的ＴＣＲを欠くように）修飾されうる。幾つかの態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞のような初代ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血から、または骨髄もしくは臍帯血からのＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）での刺激の後で集められうる。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲ発現構築物を使用）の後、細胞は直ちに注入されることが可能であり、あるいは凍結保存されることが可能である。ある態様においては、トランスフェクション後、細胞内への遺伝子導入後約１、２、３、４、５日以内またはそれ以上の期間以内に、細胞は、バルク集団としてエクスビボで数日間、数週間または数ヶ月間増殖されうる。もう１つの態様においては、トランスフェクション後、トランスフェクタントをクローニングし、組込まれた又はエピソーム的に維持された単一の発現カセットまたはプラスミドの存在およびキメラ抗原受容体の発現を示すクローンをエクスビボで増殖させる。増殖のために選択されたクローンは、抗原発現標的細胞を特異的に認識し細胞溶解する能力を示す。該組換えＴ細胞は、ＩＬ−２、または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１など）での刺激により増殖されうる。該組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞での刺激により増殖されうる。該組換えＴ細胞は人工抗原提示細胞上で増殖可能であり、あるいはＴ細胞表面上のＣＤ３を架橋するＯＫＴのような抗体を使用して増殖可能である。該組換えＴ細胞のサブセットは、磁気ビーズに基づく単離方法および／または蛍光活性化細胞選別技術を用いて更に選択可能であり、ＡａＰＣの存在下で更に培養可能である。もう１つの態様においては、遺伝的に修飾された細胞は凍結保存されうる。
【０１６７】
Ｔ細胞は、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球）を含む多数の起源からも入手可能である。本開示の或る実施形態においては、当技術分野で利用可能な多数のＴ細胞系が使用されうる。本開示の特定の実施形態においては、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離のような当業者に公知の多数の技術を用いて、対象から集められた血液のユニットから得られうる。幾つかの実施形態においては、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスにより得られる。アフェレーシス製品は、典型的には、リンパ球、例えばＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含有する。１つの実施形態においては、アフェレーシスにより集められた細胞を洗浄して、血漿画分を取り出し、後の処理ステップのために適切なバッファーまたは培地内に細胞を配置することが可能である。本開示の１つの実施形態においては、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。もう１つの実施形態においては、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠くことが可能であり、あるいは、全てでなくとも多数の２価カチオンを欠くことが可能である。カルシウムの非存在下の初期活性化工程は活性化の増強をもたらす。当業者が容易に理解するとおり、洗浄工程は、当業者に公知の方法により、例えば半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー，Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造業者の説明に従い使用することにより達成されうる。洗浄後、細胞は、例えば種々の生体適合性バッファー、例えばＣａ２＋非含有、Ｍｇ２非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、またはバッファーを含有する若しくは含有しない他の塩類溶液中に再懸濁されうる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培地内に直接的に再懸濁させることが可能である。
【０１６８】
もう１つの実施形態においては、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配による遠心分離により、または向流遠心溶出法により、赤血球を細胞溶解し、単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球からＴ細胞が単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞はポジティブまたはネガティブ選択技術により更に単離されうる。
【０１６９】
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の富化は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せにより達成されうる。１つの方法は、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、ネガティブ選択によりＣＤ４＋  細胞を富化させる場合、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する調節性Ｔ細胞を富化させ、またはポジティブ選択することが望ましいことがある。あるいは、ある実施形態においては、Ｔ調節性細胞は抗ＣＤ２５結合ビーズまたは他の類似選択方法により枯渇される。
【０１７０】
ポジティブまたはネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズのような粒子）の濃度を変化させることが可能である。ある実施形態においては、細胞とビーズとの最大接触を確保するために、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましいことがある。例えば、１つの実施形態においては、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。１つの実施形態においては、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。もう１つの実施形態においては、１億細胞／ｍｌを超える濃度が使用される。もう１つの実施形態においては、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。更にもう１つの実施形態においては、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。もう１つの実施形態においては、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用されうる。高濃度の使用は細胞収量、細胞活性化および細胞増殖の増加をもたらしうる。更に、高い細胞濃度の使用は、目的標的抗原を弱く発現しうる細胞、例えばＣＤ２８陰性Ｔ細胞の、より効率的な捕捉を可能にし、あるいは多数の腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病血液、腫瘍組織など）からの、より効率的な捕捉を可能にする。そのような細胞集団は治療的価値を有し、得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用は、より弱いＣＤ２８発現を通常示すＣＤ８＋  Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能にする。
【０１７１】
関連実施形態においては、より低い細胞濃度を使用することが望ましいかもしれない。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズのような粒子）との混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合する所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞の場合より高いレベルのＣＤ２８を発現し、薄い濃度では、より効率的に捕捉される。１つの実施形態においては、使用される細胞濃度は５×１０６／ｍｌである。他の実施形態においては、使用される濃度は約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌおよびその間の任意の整数値でありうる。
【０１７２】
他の実施形態においては、細胞は、２〜１０℃または室温で、種々の長さの時間にわたって、種々の速度の回転装置上でインキュベートされうる。
【０１７３】
また、刺激のためのＴ細胞は洗浄工程後に凍結されうる。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、細胞は凍結溶液に懸濁されうる。多数の凍結溶液およびパラメーターが当技術分野で公知であり、この場合に有用であるが、１つの方法は、２０％  ＤＭＳＯおよび８％  ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または以下のものを含有する培地：１０％  デキストラン４０および５％  デキストロース、２０％  ヒト血清アルブミンおよび７．５％  ＤＭＳＯ、または３１．２５％  Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％  デキストロース５％、０．４５％  ＮａＣｌ、１０％  デキストラン４０および５％  デキストロース、２０％  ヒト血清アルブミン、および７．５％  ＤＭＳＯ、または例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含み、ついで該細胞は１℃／分の速度で−８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存される。制御凍結の他の方法、および直ちに−２０℃にする又は液体窒素中での無制御凍結も用いられうる。
【０１７４】
ある実施形態においては、凍結保存細胞は、本明細書に記載されているとおりに解凍され、洗浄され、本開示の方法を使用する活性化の前に室温で１時間静置される。
【０１７５】
また、本明細書に記載されている増殖細胞が必要とされうる前の時期の対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス産物のコレクション（収集物）も本開示の場合に想定される。したがって、増殖される細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集可能であり、Ｔ細胞のような所望の細胞は単離され、例えば本明細書に記載されているもののようなＴ細胞療法から利益を受ける多数の疾患または状態に対するＴ細胞療法における後の使用のために凍結される。１つの実施形態においては、血液サンプルまたはアフェレーシスは一般に健康な対象から採取される。ある実施形態においては、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発生するリスクを有するが疾患を未だ発生していない一般に健康な対象から採取され、目的の細胞は単離され、後の使用のために凍結される。ある実施形態においては、Ｔ細胞を増殖され、凍結され、後に使用されうる。ある実施形態においては、サンプルは、本明細書に記載されている個々の疾患の診断の直後かつ治療前に、患者から収集される。もう１つの実施形態においては、薬剤、例えばナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラートおよびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫切除（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射での治療（これらに限定されるものではない）を含む多数の関連治療法の前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから細胞を単離する。これらの薬物はカルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害し（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または成長因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，（１９９１）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ  ７３：３１６−３２１，（１９９１）；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ  ５：７６３−７７３，（１９９３））。もう１つの実施形態においては、細胞を患者のために単離し、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンのような化学療法剤を使用するＴ細胞切除療法、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのような抗体と共に後に使用するために凍結する。もう１つの実施形態においては、細胞を単離し、ＣＤ２０と反応する物質、例えばリツキサンでのＢ細胞除去療法の後の治療のための後の使用のために凍結することが可能である。
【０１７６】
本開示のもう１つの実施形態においては、Ｔ細胞は治療直後の患者から得られる。これに関しては、ある癌治療、特に、免疫系を損傷する薬物での治療の後、患者が治療から正常に回復している期間中の治療の直後に、得られるＴ細胞の品質は、そのエクスビボ増殖能に関して最適でありうる又は改善したものでありうる。同様に、本明細書に記載されている方法を用いるエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖の増強のための好ましい状態となりうる。したがって、この回復段階において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血系の他の細胞を含む血液細胞を収集することが、本開示の場合に想定される。更に、ある実施形態においては、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）および条件付けレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖が特に治療後の一定の時間ウィンドウ中に好ましい対象者における状態を生成させることが可能である。例示的な細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞が含まれる。
【０１７７】
Ｔ細胞の活性化および増殖
ある実施形態においては、ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する本明細書に記載されているポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞を提供する。所望のポリペプチド構築物を発現させるためのＴ細胞の遺伝的修飾の前であるか後であるかには無関係に、Ｔ細胞は、一般に、例えば以下のものに記載されている方法を用いて活性化され、増殖されうる：米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号。
【０１７８】
「養子Ｔ細胞移入」は、ワクチン接種のみ又は患者の自然腫瘍応答により得られうるものより多数のＴ細胞を得るための、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離およびエクスビボ増殖を意味する。現在の開示に関しては、腫瘍特異的Ｔ細胞は、例えば、細胞表面ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合する本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現するようにＴ細胞を操作することにより得られうる。ついで、癌を攻撃し殺しうるＴ細胞により残存腫瘍に打ち勝つ能力を癌患者の免疫系に付与するために、腫瘍特異的Ｔ細胞を癌患者に注入することが可能である。多数の形態の養子Ｔ細胞療法が癌治療に用いられており、それらにおいては、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬを培養し、１つの特定のＴ細胞またはクローンを単離し増殖させ、更に、腫瘍を強力に認識し攻撃するように操作されたＴ細胞を使用する。
【０１７９】
医薬組成物および剤形
幾つかの実施形態においては、本明細書は、対象における投与のための、本明細書に開示されているポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチドまたはそれを発現する操作された細胞を含む組成物を開示する。幾つかの場合には、本明細書に開示されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする、そして所望により、サイトカインおよび／または追加的治療用物質、例えば、哺乳類メバロン酸経路の中間体、例えばイソペンテニルピロホスファート（ＩＰＰ）、および微生物２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール  ４−リン酸（ＭＥＰ）経路の中間体を含む修飾エフェクター細胞組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、対象の標的細胞（例えば、癌細胞）におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含みうる。幾つかの実施形態においては、該物質は、癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増加させうる。幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞の細胞膜においてＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを維持しうる。幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行を増加させうる。幾つかの態様においては、該物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増強しうる。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増強しうる。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＢＮＴ３タンパク質との相互作用を増強しうる。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化しうる。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＴＰとの相互作用を増強しうる。幾つかの実施形態においては、該物質はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼとＧＤＰとの相互作用を低減しうる。幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞におけるＧＴＰの量を増加させうる。幾つかの実施形態においては、該物質は、癌細胞におけるＧＴＰの利用可能性を増加させうる。幾つかの実施形態においては、該物質は、癌細胞上の細胞表面分子に結合する部分に結合されることが可能であり、それにより、該物質を癌細胞に標的化する。幾つかの実施形態においては、該部分は小分子化合物、ペプチド、または抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含む。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を刺激する二次因子に結合することにより間接的にそれを行う。二次因子はＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ活性化カスケードに関与しうる。１つの態様においては、二次因子はシグナル伝達、構造変化、コンホメーション変化、立体配置変化などに関与しうる。１つの態様においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの刺激経路の上流の任意の部位において活性を増強しうる。例えば、物質は「Ａ」であり、これが次に「Ｂ」を刺激し、これが次に「Ｃ」を刺激し、これが次にＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを刺激しうる。１つの態様においては、物質は、二次因子のいずれの関与も無しに、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを直接的に刺激する。物質は、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ刺激物質を伴わない同等の方法または組成物と比較して、ＲｈｏＢ  ��ＴＰアーゼの活性を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または最大約１００％増加させうる。
【０１８０】
幾つかの実施形態においては、該物質は癌細胞内の細胞内リン酸化抗原の量を増加させうる。幾つかの実施形態においては、追加的物質はメバロン酸経路インヒビターである。メバロン酸経路のインヒビターは、メバロナートの生成に関与する因子を阻害しうる。１つの態様においては、メバロン酸経路のインヒビターは、メバロン酸経路に関与する反応を阻害しうる。１つの態様においては、メバロン酸インヒビターは、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸−５−リン酸、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、メバロン酸−５−キナーゼ、メバロン酸−３−リン酸−５−キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸−５−ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ＡＴＰのような酵素およびそれらの組合せを阻害しうる。幾つかの実施形態においては、メバロン酸経路インヒビターはアミノビスホスホネートである。１つの態様においては、物質は硫化水素（Ｈ２Ｓ）でありうる。１つの態様においては、物質はＤＭ−２２でありうる。幾つかの実施形態においては、アミノビスホスホネートはゾレドロネートである。１つの態様においては、物質はスタチンでありうる。１つの態様においては、スタチンはメバロン酸経路を阻害しうる。１つの態様においては、物質は、骨疾患、多発性骨髄腫またはそれらの組合せを治療するために使用されうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質はリン酸化抗原に直接的に結合して、その活性を刺激しうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、腫瘍細胞の細胞質におけるリン酸化抗原の活性または蓄積を刺激する二次因子に結合することにより間接的にそれを行う。二次因子はリン酸化抗原産生カスケードに関与しうる。１つの態様においては、二次因子は翻訳、シグナル伝達、構造変化、コンホメーション変化、立体配置変化などに関与しうる。１つの態様においては、リン酸化抗原の活性を増強する物質は、リン酸化抗原の経路の上流の任意の部位において活性を増強しうる。例えば、物質は「Ａ」であり、これが次に「Ｂ」を刺激し、これが次に「Ｃ」を刺激し、これが次にリン酸化抗原を刺激して細胞質における蓄積をもたらす。１つの態様においては、物質は、二次因子のいずれの関与も無しに、リン酸化抗原の蓄積を直接的に刺激する。物質は、リン酸化抗原刺激物質を伴わない同等の方法または組成物と比較して、リン酸化抗原の活性、例えばリン酸化抗原蓄積を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または最大約１００％増加させうる。
【０１８１】
１つの態様においては、腫瘍細胞傷害のための相乗的方法が本発明で提供されうる。１つの態様においては、治療方法は、細胞表面上のＣＤ２７７の発現を増強する１以上の物質を投与することを含みうる。ＣＤ２７７の発現を増強しうる物質は、腫瘍細胞の細胞質におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼおよび／またはリン酸化抗原の活性を増強することにより作用しうる。１つの態様においては、腫瘍の細胞傷害性は、リン酸化抗原刺激物質またはＲｈｏＧＴＰアーゼ刺激物質またはそれらの組合せを伴わない同等の方法または組成物と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または最大約１００％増加されうる。
【０１８２】
１つの態様においては、ＣＤ２７７の内側部分に結合する細胞内因子の活性を増強することを含む、腫瘍細胞表面上のＣＤ２７７の発現を増強する方法が提供されうる。
【０１８３】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている種々の薬学的に活性な成分が、同じ医薬組成物において、それを要する対象に投与されうる。例えば、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、ポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチドまたはそれを発現する操作された細胞として、同じ医薬組成物において投与されうる。したがって、複数の薬学的に活性な成分を含有するそのような医薬組成物においては、複数の薬学的に活性な成分は、それを要する対象に、同時に投与される。他の実施形態においては、本明細書に記載されている異なる薬学的に活性な成分は、異なる医薬組成物において、それを要する対象に投与されうる。例えば、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質は、ポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチドまたはそれを発現する操作された細胞として、異なる医薬組成物において投与されうる。そのような組成物においては、第１の薬学的に活性な成分を含む第１の組成物は、第２の薬学的に活性な成分を含む第２の組成物の前、後またはそれと同時に投与されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチド構築物またはそれを発現する操作された細胞を含む第１の組成物は、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む第２の組成物の投与の前に、それを要する対象に投与される。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチド構築物またはそれを発現する操作された細胞を含む第１の組成物は、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む第２の組成物の投与の後で、それを要する対象に投与される。幾つかの実施形態においては、ポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチド構築物またはそれを発現する操作された細胞を含む第１の組成物は、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む第２の組成物の投与と同時に、それを要する対象に投与される。幾つかの場合には、第１の薬学的に活性な分を含む第１の組成物は、第２の薬学的に活性な成分を含む第２の組成物に対する所定の時間間隔で投与されうる。幾つかの場合には、ポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチド構築物またはそれを発現する操作された細胞を含む第１の組成物は、１日１回、単一用量で対象に投与され、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む第２の組成物は、日中の種々の時点で、複数用量で投与される。幾つかの場合には、標的細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの活性を増強する物質を含む組成物は所定期間にわたる徐放のための制御放出製剤として投与され、本明細書に記載されているポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチド構築物または操作された細胞を含む第２の組成物は前記の所定期間中に種々の間隔で投与される。
【０１８４】
１つの態様においては、細胞を含む組成物は細胞の剤形を含みうる。本出願を手にすれば、当業者であれば、投与のための細胞の治療的有効量を決定することが可能である。幾つかの場合には、約５×１０１０細胞が対象に投与される。幾つかの場合には、約５×１０１０細胞は、対象に投与される細胞の中央値を表す。幾つかの実施形態においては、約５×１０１０細胞を対象に導入されうる。幾つかの実施形態においては、少なくとも約１×１０６細胞、少なくとも約２×１０６細胞、少なくとも約３×１０６細胞、少なくとも約４×１０６細胞、少なくとも約５×１０６細胞、少なくとも約６×１０６細胞、少なくとも約６×１０６細胞、少なくとも約８×１０６細胞、少なくとも約９×１０６細胞、１×１０７細胞、少なくとも約２×１０７細胞、少なくとも約３×１０７細胞、少なくとも約４×１０７細胞、少なくとも約５×１０７細胞、少なくとも約６×１０７細胞、少なくとも約６×１０７細胞、少なくとも約８×１０７細胞、少なくとも約９×１０７細胞、少なくとも約１×１０８細胞、少なくとも約２×１０８細胞、少なくとも約３×１０８細胞、少なくとも約４×１０８細胞、少なくとも約５×１０８細胞、少なくとも約６×１０８細胞、少なくとも約６×１０８細胞、少なくとも約８×１０８細胞、少なくとも約９×１０８細胞、少なくとも約１×１０９細胞、少なくとも約２×１０９細胞、少なくとも約３×１０９細胞、少なくとも約４×１０９細胞、少なくとも約５×１０９細胞、少なくとも約６×１０９細胞、少なくとも約６×１０９細胞、少なくとも約８×１０９細胞、少なくとも約９×１０９細胞、少なくとも約１×１０１０細胞、少なくとも約２×１０１０細胞、少なくとも約３×１０１０細胞、少なくとも約４×１０１０細胞、少なくとも約５×１０１０細胞、少なくとも約６×１０１０細胞、少なくとも約６×１０１０細胞、少なくとも約８×１０１０細胞、少なくとも約９×１０１０細胞、少なくとも約１×１０１１細胞、少なくとも約２×１０１１細胞、少なくとも約３×１０１１細胞、少なくとも約４×１０１１細胞、少なくとも約５×１０１１細胞、少なくとも約６×１０１１細胞、少なくとも約６×１０１１細胞、少なくとも約８×１０１１細胞、少なくとも約９×１０１１細胞、または少なくとも約１×１０１２細胞が対象に投与される。
【０１８５】
１つの態様においては、対象は追加的な治療または治療用物質の投与を受けうる。本明細書に開示されている組成物および方法は他の物質の投与を含みうる。例えば、追加的な物質は細胞毒性／抗腫瘍物質および抗血管新生物質を含みうる。細胞毒性／抗腫瘍物質は、癌細胞を攻撃し殺す物質として定義されうる。幾つかの細胞毒性／抗腫瘍物質は、腫瘍細胞における遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤であることが可能であり、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジンおよびダカバジンでありうる。他の細胞毒性／抗腫瘍物質は腫瘍細胞に対する代謝拮抗物質、例えばシトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプライムおよびプロカルバジンでありうる。他の細胞毒性／抗腫瘍物質は、抗生物質、例えばドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣおよびダウノマイシンでありうる。これらの化合物に関しては、商業的に入手可能な多数のリポソーム製剤が存在する。更に他の細胞毒性／抗腫瘍物質は有糸分裂インヒビター（ビンカアルカロイド）でありうる。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびエトポシドが含まれる。他の細胞毒性／抗腫瘍物質には、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロンおよびビンデシンが含まれる。
【０１８６】
幾つかの場合には、物質は免疫刺激物質を含みうる。免疫刺激物質は特異的または非特異的でありうる。特異的免疫刺激物質は、ワクチンまたは抗原のように、抗原特異性をもたらしうる。非特異的免疫刺激物質は免疫応答を増強し、または免疫応答を刺激しうる。非特異的免疫刺激物質はアジュバントでありうる。免疫刺激物質はワクチン、コロニー刺激物質、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激物質、免疫原性物質、免疫調節物質または免疫療法物質でありうる。免疫刺激物質はサイトカイン、例えばインターロイキンでありうる。１以上のサイトカインが本発明の細胞に導入されうる。サイトカインは、細胞傷害性Ｔリンパ球（養子移植腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含む）を増強して腫瘍微小環境内で増殖させるために使用されうる。幾つかの場合には、本明細書に記載されている細胞の増殖を促進するために、ＩＬ−２が使用されうる。ＩＬ−１５のようなサイトカインも使用されうる。免疫療法の分野における他の関連サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはそれらの任意の組合せも使用されうる。幾つかの場合には、本発明の細胞を培養するために、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が使用される。インターロイキンはＩＬ−２またはアルデスコイキンでありうる。アルデスロイキンは低用量または高用量で投与されうる。高用量のアルデスロイキン療法は、忍容性に応じて、８時間ごとに約０．０３７ｍｇ／ｋｇ（６００，０００  ＩＵ／ｋｇ）で最大約１４用量のアルデスロイキンを静脈内投与することを含みうる。免疫刺激物質（例えば、アルデスロイキン）は細胞投与後２４時間以内に投与されうる。免疫刺激物質（例えば、アルデスロイキン）は、細胞注入後約４日までの間、約８時間ごとに約１５分にわたって注入として投与されうる。免疫刺激物質（例、アルデスロイキン）は約１００，０００  ＩＵ／ｋｇから、２００，０００  ＩＵ／ｋｇ、３００，０００  ＩＵ／ｋｇ、４００，０００  ＩＵ／ｋｇ、５００，０００  ＩＵ／ｋｇ、６００，０００  ＩＵ／ｋｇ、７００，０００  ＩＵ／ｋｇ、８００，０００  ＩＵ／ｋｇ、９００，０００  ＩＵ／ｋｇまたは約１，０００，０００  ＩＵ／ｋｇまでの用量で投与されうる。幾つかの場合には、アルデスロイキンは約１００，０００  ＩＵ／ｋｇ〜３００，０００  ＩＵ／ｋｇ、３００，０００  ＩＵ／ｋｇ〜５００，０００  ＩＵ／ｋｇ、５００，０００  ＩＵ／ｋｇ〜７００，０００  ＩＵ／ｋｇ、７００，０００  ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００  ＩＵ／ｋｇの用量で投与されうる。免疫刺激物質（例えば、アルデスロイキン）は１用量〜約１４用量で投与されうる。
【０１８７】
幾つかの場合には、追加的物質は治療レジメの一部としての免疫抑制物質を含みうる。免疫抑制物質は放射線治療薬、生物製剤または化学物質を指す。幾つかの場合には、免疫抑制物質は化学物質を含みうる。例えば、化学物質は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミトラマイシンからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含みうる。化学物質はシクロホスファミドまたはフルダラビンでありうる。
【０１８８】
また、免疫抑制物質には、グルココルチコイド、細胞増殖抑制物質、抗体、抗イムノフィリンまたはそれらの任意の誘導体が含まれうる。グルココルチコイドはアレルギー反応、炎症および自己免疫状態を抑制しうる。グルココルチコイドはプレドニゾン、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンでありうる。免疫抑制療法は、免疫系を抑制する任意の治療を含みうる。免疫抑制療法は、レシピエントにおける移植拒絶を緩和、最小化または排除するのに役立ちる。例えば、免疫抑制療法は免疫抑制薬を含みうる。移植の前、途中および／または後に使用されうる免疫抑制薬には、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０、ＡＳＫＰ１２４０、ＣＣＦＺ５３３Ｘ２２０１）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ）、抗ＩＬ−６抗体（サリルマブ、オロキズマブ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、エベロリムス、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ−ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスペルグアリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＤ１２２抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。更に、１以上の免疫抑制物質／薬が一緒に又は連続的に使用されうる。１以上の免疫抑制物質／薬が導入療法または維持療法に使用されうる。導入および維持段階では、同じまたは異なる薬物が使用されうる。幾つかの場合には、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が導入療法に使用され、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）が維持療法に使用されうる。ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）は導入療法にも使用可能であり、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は維持療法に使用可能である。免疫抑制は、全身照射、胸腺照射ならびに脾臓全摘および／または部分摘除（これらに限定されるものではない）を含む非薬物レジメンを用いても達成されうる。
【０１８９】
幾つかの場合には、医薬組成物は、薬学的に使用されうる製剤への活性化合物の加工を容易にする補助物質および賦形剤を含む１以上の生理的に許容される担体を使用して、通常の方法で製剤化（処方）される。適切な製剤は、選択される投与経路に左右される。本明細書に記載されている医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ編（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）において見出される。
【０１９０】
医薬組成物は、所望により、従来の方法で、例えば単なる例示としては、通常の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、粉末化、乳化、カプセル化、封入または圧縮プロセスにより製造される。
【０１９１】
ある実施形態においては、組成物はまた、１以上のｐＨ調節剤またはバッファー、例えば酸、例えば酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸；塩基、例えば水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン；ならびにバッファー、例えばシトラート／デキストロース、重炭酸ナトリウムおよび塩化アンモニウムを含みうる。そのような酸、塩基およびバッファーは、組成物のｐＨを許容範囲に維持するのに必要な量で含まれる。
【０１９２】
他の実施形態においては、組成物は、組成物の浸透圧を許容範囲内にするのに必要な量の１以上の塩を含みうる。そのような塩には、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムカチオンおよびクロリド、シトラート、アスコルバート、ボラート、ホスファート、ビカルボナート、スルファート、チオスルファートまたはビスルフィットアニオンを含有するものが含まれ、適切な塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムが含まれる。
【０１９３】
本明細書に記載されている医薬組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内または頭蓋内）、鼻腔内、頬側、舌下または直腸投与経路（これらに限定されるものではない）を含む任意の適切な投与経路により投与される。幾つかの場合には、医薬組成物は非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内または頭蓋内）投与用に製剤化される。
【０１９４】
本明細書に記載されている医薬組成物は、治療される個体による経口摂取のための水性経口分散剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、エリキシル剤、スラリー剤、懸濁剤など、固体経口剤形、エアロゾル剤、制御放出製剤、急速溶解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、散剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、拍動放出製剤、多粒子製剤ならびに混合即時放出および制御放出製剤（これらに限定されるものではない）を含む任意の適切な剤形に製剤化される。幾つかの実施形態においては、医薬組成物はカプセル剤に製剤化される。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は溶液（例えば、ＩＶ投与用）に製剤化される。幾つかの場合には、医薬組成物は輸液（注入剤）として製剤化される。幾つかの場合には、医薬組成物は注射剤として製剤化される。
【０１９５】
本明細書に記載されている医薬固体剤形は、所望により、本明細書に記載されている化合物、および１以上の薬学的に許容される添加物、例えば適合性担体、結合剤、充填剤、懸濁化剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、潤滑剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑剤、安定剤、浸透促進剤、加湿剤、消泡剤、抗酸化剤、保存剤またはそれらの１以上の組合せを含んでいてもよい。
【０１９６】
更に他の態様においては、標準的なコーティング（被覆）法、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００）に記載されている方法を用いて、組成物の周囲にフィルムコーティングが施される。幾つかの実施形態においては、組成物は粒子（例えば、カプセル剤による投与用）に製剤化され、粒子の一部または全部がコーティングされる。幾つかの実施形態においては、組成物は粒子（例えば、カプセル剤による投与用）に製剤化され、粒子の一部または全部はマイクロカプセル化されず、コーティングされない。
【０１９７】
ある実施形態においては、本発明で提供される組成物は、微生物活性を抑制するための１以上の保存剤を含みうる。適切な保存剤には、水銀含有物質、例えばメルフェンおよびチオメルサール、安定化二酸化塩素、ならびに四級アンモニウム化合物、例えば塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルピリジニウムが含まれる。
【０１９８】
本明細書中で言及される「増殖性疾患」は、過剰な細胞増殖および細胞マトリックスの代謝回転が、癌を含む幾つかの疾患の病因に有意に寄与することを示す統一概念を意味する。
【０１９９】
本明細書中で用いる「対象」または「患者」は、例えば癌または自己免疫状態または感染のような生理学的状態を有する若しくは発生している又はその疑いがあると診断された哺乳動物対象を意味する。幾つかの実施形態においては、「患者」または「対象」なる語は、癌を発生する可能性が平均より高い哺乳動物類対象を意味する。例示的な患者はヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類および本明細書に開示されてい治療から利益を受けうる他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト対象は男性および／または女性でありうる。
【０２００】
「投与」は、本明細書においては、本開示の組成物を患者に与えることを意味する。限定的でない例示として示すと、組成物の投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射により行われうる。１以上のそのような経路が用いられうる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射により、または時間をかけて徐々に灌流することにより行われうる。代替的または同時に、投与は経口経路によるものでありうる。また、投与は細胞のボーラスもしくはペレットの外科的沈着または医療装置の配置によるものでありうる。
【０２０１】
「それを要する対象」または「それを要する患者」は、本明細書においては、疾患または障害、限定的なものではないが例えば増殖障害、例えば癌を有する又はその疑いがあると診断された対象または患者を意味する。１つの実施形態においては、対象または患者は固形腫瘍または白血病を有する又はそれを発生する可能性が高い。幾つかの実施形態においては、白血病は例えば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）でありうる。
【０２０２】
本開示の組成物は、ＣＤ２７７のＪ配置に結合するポリペプチド構築物をコードする核酸配列を発現する操作された細胞または該核酸配列を含むベクターを、増殖性疾患を治療または予防するのに有効な量で含みうる。本明細書中で用いる「治療」、「治療する」などの語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。幾つかの実施形態においては、効果は治療的である。すなわち、効果は、疾患および／または疾患に起因する有害な症状を部分的または完全に治癒させる。この目的のために、本発明の方法は、本発明の核酸配列を発現する宿主細胞または本発明の核酸配列を含むベクターを含む「治療的有効量」の組成物を投与することを含む。
【０２０３】
「治療的有効量」は、必要な用量および期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。治療的有効量は、個体の病態、年齢、性別および体重ならびに個体において所望の応答を誘発する本発明の核酸配列の能力のような要因によって異なりうる。
【０２０４】
あるいは、薬理学的および／または生理学的効果は「予防的」であることが可能であり、すなわち、該効果が疾患またはその症状を完全または部分的に予防することが可能である。
【０２０５】
「予防的有効量」は、必要な用量および期間で、所望の予防結果（例えば、疾患開始の予防）を達成するのに有効な量を意味する。
【０２０６】
「消泡剤」は、水性分散液の凝固、最終被膜における気泡をもたらしたり又は一般に加工を損ないうる、加工中の発泡を低減する。例示的な消泡剤には、シリコンエマルジョンまたはセスキオレイン酸ソルビタンが含まれる。
【０２０７】
「抗酸化剤」には、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびトコフェロールが含まれる。ある実施形態においては、抗酸化剤は、必要に応じて化学的安定性を増強する。
【０２０８】
本明細書に記載されている製剤は抗酸化剤、金属キレート剤、チオール含有化合物および他の一般的な安定化剤から利益を受けうる。そのような安定化剤の例には、（ａ）約０．５％〜約２％  ｗ／ｖ  グリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％  ｗ／ｖ  メチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％  ｗ／ｖ  モノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％  ｗ／ｖ  アスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％  ｗ／ｖ  ポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％  ｗ／ｖ  ポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサンおよび他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛のような二価カチオン、または（ｎ）それらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０９】
「結合剤」は凝集性を付与し、例えば以下のものを包含する：アルギン酸およびその塩；セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））および微結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））；微結晶性デキストロース；アミロース；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファ化デンプン；トラガカント、デキストリン、糖、例えばスクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））およびラクトース；天然または合成ガム、例えばアカシア、トラガカント、ガッティガム、イサポール殻の粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツアラボガラクタン、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、ポリエチレングリコール、ワックス、アルギン酸ナトリウムなど。
【０２１０】
「担体」または「担体物質」は、医薬における任意の一般に使用される賦形剤を包含し、イブルチニブおよび抗癌剤の化合物のような本明細書に開示されている化合物に対する適合性および所望の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選択されるべきである。例示的な担体物質には、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤などが含まれる。「薬学的に適合性のある担体物質」には、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼインナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスホチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが含まれうるが、これらに限定されるものではない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照されたい。
【０２１１】
「分散剤」および／または「粘度調節剤」には、造粒方法もしくはブレンド方法または液体媒体にわたる薬物の拡散および均質性を制御する物質が含まれる。幾つかの実施形態においては、これらの物質はコーティングまたは侵食マトリックスの有効性をも促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤には、例えば以下のものが含まれる：親水性高分子、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０または８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として商業的に公知）、および炭水化物に基づく分散剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬおよびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５ＭおよびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセタートステアラート（ＨＰＭＣＡＳ）、非結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体（Ｓ６３０）、エチレンオキシドおよびホルムアルデヒドとの４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール重合体（チロキサポールとしても公知）、ポロキサマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｆ８８（登録商標）およびＦ１０８（登録商標）；これらはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロック共重合体である）；ならびにポロキサミン（例えば、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標）；Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）としても公知；これは、エチレンジアミンへのプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドの逐次付加から誘導される四官能性ブロック共重合体である（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは約３００〜約６０００または約３３５０〜約４０００または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ガム、例えばトラガカントガムおよびアカシアガム、グアーガム、キサンタン、例えばキサンタンガム、糖、セルロース系物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウラート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウラート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギナート、キトサンおよびそれらの組合せ。セルロースまたはトリエチルセルロースのような可塑剤も分散剤として使用されうる。リポソーム分散液および自己乳化分散液において特に有用な分散剤としては、ジミリス��イルホスファチジルコリン、卵由来天然ホスファチジルコリン、卵由来天然ホスファチジルグリセロール、コレステロールおよびミリスチン酸イソプロピルが挙げられる。
【０２１２】
１以上の拡散促進剤との１以上の浸食促進剤の組合せも本組成物において使用されうる。
【０２１３】
「希釈剤」なる語は、送達前に目的化合物を希釈するために使用される化学物質を意味する。希釈剤は、より安定な環境をもたらしうるため、化合物を安定化するためにも使用されうる。緩衝溶液中に溶解した塩（これはｐＨの制御または維持をももたらしうる）は、リン酸緩衝食塩水（これに限定されるものではない）を含む当技術分野における希釈剤として使用される。ある実施形態においては、希釈剤は組成物の体積を増加させて、圧縮を促進し、またはカプセル充填のための均質混合のための十分な体積を生成する。そのような化合物には、例えば以下のものが含まれる：ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、微結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファ化デンプン、圧縮性糖、例えばＤｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸ステアリン酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースに基づく希釈剤、製菓用糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストラート；加水分解穀物固体、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなど。
【０２１４】
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどのような化合物が含まれる。
【０２１５】
「潤滑剤」および「流動促進剤」は、物質の接着または摩擦を予防、低減または抑制する化合物である。例示的な潤滑剤には、例えば以下のものが含まれる：ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ステアリルフマル酸ナトリウム、炭化水素、例えば鉱油、または硬化植物油、例えば硬化大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））、高級脂肪酸ならびにそれらのアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）またはメトキシポリエチレングリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、グリセリルベヘナート、ポリエチレングリコール、マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、コロイドシリカ、例えばＳｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）、デンプン、例えばコーンスターチ、シリコーンオイル、界面活性物質など。
【０２１６】
「可塑剤」は、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化してそれらの脆弱性を低下させるために使用される化合物である。適切な可塑剤には、例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０およびＰＥＧ８００、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロースならびにトリアセチンが含まれる。幾つかの実施形態においては、可塑剤は分散剤または湿潤剤としても機能しうる。
【０２１７】
「可溶化剤」には、例えば以下のような化合物が含まれる：トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００−６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコールおよびジメチルイソソルビド。
【０２１８】
「安定剤」には、任意の抗酸化剤、バッファー、酸、保存剤のような化合物が含まれる。
【０２１９】
「懸濁化剤」には、例えば以下のような化合物が含まれる：ポリビニルピロリドン、例えばポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは約３００〜約６０００または約３３５０〜約４０００または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸ステアリン酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート−８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ガム、例えばトラガカントガムおよびアカシアガム、グアーガム、キサンタン、例えばキサンタンガム、糖、セルロース系物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウラート、ポビドンなど。
【０２２０】
「界面活性剤」には、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドキュサート、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリソルベート、ポラキソマー、胆汁酸塩、グリセリルモノステアラート、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などのような化合物が含まれる。幾つかの他の界面活性物質には、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、および植物油、例えばポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油、ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えばオクトキシノール１０、オクトキシノール４０が含まれる。幾つかの実施形態においては、物理的安定性を増強するために、または他の目的のために、界面活性剤が配合されうる。
【０２２１】
「粘度増強剤」には、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセタートステアラート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギナート、アカシア、キトサンおよびそれらの組合せが含まれる。
【０２２２】
「湿潤剤」には、例えばオレイン酸、グリセリルモノステアラート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ナトリウムドキュサート、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムナトリウムドキュサート、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などのような化合物が含まれる。
【０２２３】
キット／製造品
ある実施形態においては、本明細書は、本明細書に記載されている１以上の方法で使用するためのキットおよび製造品を開示する。そのようなキットは、担体、パッケージ、または１以上の容器を収容するために区画化された容器（例えば、バイアル、チューブなど）を含み、該容器のそれぞれは、本明細書に記載されている方法で使用される別々の要素の１つを含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。１つの実施形態においては、容器は、種々の材質、例えばガラスまたはプラスチックから形成される。
【０２２４】
本発明で提供される製造品は包装（パッケージング）材を含有する。医薬品包装材の例には、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択された製剤と意図される投与および治療方法とに適した任意の包装材が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２５】
例えば、容器は、ＣＤ２７７のＪ配置に選択的に結合するポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を含み、そして所望により更に、本明細書に開示されているサイトカインおよび／または化学療法剤および／または追加的な物質、例えば、哺乳類メバロン酸経路の中間体、例えばイソペンテニルピロホスファート（ＩＰＰ）、および微生物の２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリチトール  ４−リン酸（ＭＥＰ）経路の中間体を含んでいてもよい。そのようなキットは、所望により、識別表示もしくはラベル、または本明細書に記載されている方法におけるその使用に関する説明を含んでいてもよい。
【０２２６】
キットは、典型的には、内容物および／または使用説明を示すラベル、ならびに使用説明付きの添付文書を含む。典型的には、一組の説明書も含まれる。
【０２２７】
幾つかの実施形態においては、ラベルは容器の表面に存在し、または容器に添付される。１つの実施形態においては、ラベルが容器の表面に存在するのは、ラベルを構成する文字、数字もしくは他の符号が容器自体に貼られ、成形され、またはエッチングされている場合であり、ラベルが容器に添付されるのは、それが、例えば添付文書として、容器を収容する受容器または担体内に存在する場合である。１つの実施形態においては、ラベルは、内容物が特定の治療用途に使用されることを示すために使用される。ラベルはまた、例えば本明細書に記載されている方法における内容物の使用説明を示す。
【０２２８】
認識表現型
本発明で提供される或る実施形態においては、ポリペプチド構築物、それをコードするヌクレオチドおよび／またはそれを含有する操作された細胞は標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を認識しうる。幾つかの実施形態においては、操作されたＴ細胞は、標的細胞の表面上で発現される特定の抗原（例えば、ＣＤ２７７）に特異的なＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現しうる。標的細胞上の特定の抗原を認識しうる１以上のＴ細胞を特定するための方法を本明細書に記載する。特定の抗原を認識しうるＴ細胞またはＴ細胞集団は、Ｔ細胞のＴＣＲ（例えば、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ）と、標的細胞の表面上で発現されるタンパク質、抗原、リガンドまたは細胞表面分子（例えば、ＣＤ２７７）との間の物理的相互作用の結果として生じる認識表現型に関してアッセイすることにより特定されうる。幾つかの実施形態においては、認識表現型は、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲによる標的細胞の認識の結果としてＴ細胞において生じる細胞状態の変化でありうる。例えば、細胞状態の変化には、Ｔ細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性活性化により生じるインターフェロン（ＩＦＮ）γ産生レベルの変化が含まれることが可能であり、これは、当技術分野で公知の方法（例えば、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析）により検出可能である。他の例においては、認識表現型を示す細胞状態の変化は、標的細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識から生じる遺伝子発現（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析により特定される）および／またはタンパク質発現（例えば、ウエスタンブロットまたは免疫細胞化学アッセイにより特定される）の定性的または定量的変化を含む分子変化を伴いうる。他の実施形態においては、認識表現型はＴ細胞のＴＣＲと標的細胞の細胞表面タンパク質、リガンドまたは抗原との間の相互作用の物理的発現を含みうる。例えば、認識表現型は、Ｔ細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲと標的細胞の細胞表面タンパク質、リガンドまたは抗原との物理的結合を伴いうる。ある実施形態においては、認識表現型は、標的細胞の表面上のＣＤ２７７分子のＪ配置とＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲとを含む物理的複合体の形成を伴う。認識表現型が受容体とリガンドとを含む複合体の形成を伴う場合、表現型は、免疫沈降、細胞選別または免疫細胞化学法を含む公知方法により特定されうる。
【０２２９】
本明細書に記載されている実施形態においては、認識表現型は、異なる対象間および／または異なる対象から得られた細胞の間で様々でありうる。例えば、幾つかの実施形態においては、異なる対象から得られた標的細胞は、操作された細胞において発現されたＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲが（例えば、標的細胞の表面で発現されたＣＤ２７７を介して）標的細胞を認識する度合において様々でありうる。幾つかの対象から得られた標的細胞の表面分子は、操作された細胞において発現されたＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲによって、高いアフィニティで認識されうる。他の対象から得られた標的細胞の場合、標的細胞の表面分子は低いアフィニティで認識可能であり、または全く認識されない。異なる対象の標的細胞間のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲによる認識の変動は、それらの細胞により発現される認識表現型の変動において現れる。例えば、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現するＴ細胞への曝露の後、異なる対象の標的細胞は、ＩＦＮ−γの産生の量、遺伝子もしくはタンパク質の発現レベルもしくはパターン、および／またはＴ細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲと標的細胞の細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ２７７）との間の物理的相互作用の度合において変動しうる。
【０２３０】
本明細書に記載されているポリペプチド構築物、それをコードするポリヌクレオチドおよびそれを含有する操作された細胞は、それを要する対象を治療するために使用された場合に、種々の治療効果を示しうる。本明細書は、患者または患者の細胞により示される個々の表現型の強度に基づく、複数の治療群への患者集団（例えば、癌患者集団）の層別化を含む方法を開示する。幾つかの実施形態においては、患者を治療群に層別化するために使用される表現型は認識表現型である。例えば、ＩＦＮ−γの産生レベルまたは遺伝子発現の定量的もしくは定性的パターンを含む、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現するＴ細胞への曝露の後に患者から得られた標的細胞における認識表現型の存在、非存在または度合に基づいて、幾つかの群に患者集団が層別化されうる。幾つかの実施形態においては、患者を治療群に層別化するために使用される表現型は、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現するＴ細胞と標的細胞との間の認識の度合に基づく認識表現型ではない。その代わりに、層別化の基礎として使用される表現型は、Ｔ細胞への曝露の前に標的細胞に存在するマーカー（すなわち、バイオマーカー）でありうる。例えば、細胞表面発現ＣＤ２７７分子におけるＪ配置の存在または非存在は、患者の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の間で変動する表現型であることが可能であり、したがってそれは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物が投与された場合に治療成功の種々の可能性を有する種々の群に患者を分離または層別化するための基礎として使用されうる。
【０２３１】
幾つかの実施形態においては、患者は、陽性（良好な）治療予後を有する層別化群と不良治療予後を有する層別化群とを含む少なくとも２つの治療群に層別化される。幾つかの実施形態においては、陽性治療予後の層別化群に分類される患者は、ＩＦＮ−γ産生のような認識表現型およびＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲと標的細胞のＣＤ２７７分子との間の物理的相互作用を（例えば、該ＴＣＲと該ＣＤ２７７分子との両方を含む複合体の形態で）示す標的細胞を有する。幾つかの実施形態においては、陽性治療予後の層別化群に分類される患者は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞との接触の前にＪ配置を有するＣＤ２７７細胞表面分子を示す標的細胞を有する。幾つかの実施形態においては、陽性治療予後の層別群に分類される患者は、１以上の認識表現型（例えば、ＩＦＮ−γ産生）の発現を欠く若しくは該発現の低下を示す標的細胞、またはＪ配置を有するＣＤ２７７細胞表面分子を示さない標的細胞を有する。
【０２３２】
多型変異および遺伝的関連
「ヌクレオチド多型」、「遺伝的多型」および「ヌクレオチド配列多型」なる語は本明細書において互換的に用いられ、単一個体における又は個体間のゲノムの特定の位置（すなわち、「遺伝子座」）におけるヌクレオチド配列の変動を意味する。幾つかの場合には、遺伝的多型は個体の細胞内の遺伝子座に存在する（すなわち、該個体は特定のヌクレオチド配列に関する遺伝子座においてヘテロ接合である）。他の場合には、個体の特定の遺伝子座におけるヌクレオチド配列は不変である（すなわち、該個体は特定の遺伝子座にけるヌクレオチド配列に関してホモ接合である）が、該遺伝子座におけるヌクレオチド配列は、第２の個体のＤＮＡと比較した場合に多型である。ある実施形態においては、ヌクレオチド多型には、遺伝子座における単一ヌクレオチドにおける変異が含まれる。そのような場合には、ヌクレオチド多型は一塩基多型またはＳＮＰと称される。他の実施形態においては、ヌクレオチド多型は、ＳＮＰの代わりに又はそれに加えて、他のタイプのＤＮＡ変異を含みうる。本明細書においては、「多型」なる語は、一塩基多型、ならびに構造的変異、例えば挿入、欠失、逆位および重複を含む、任意の形態のＤＮＡ変異を想定している。
【０２３３】
ある実施形態においては、ヌクレオチド多型（例えば、ＳＮＰ）は、該多型の種々の形態を含有する細胞、組織または生物の間の表現型差異を引き起こす機能的変異でありうる。例えば、ＳＮＰは遺伝子のオープンリーディングフレーム内に位置し、それにより、該遺伝子によりコードされるタンパク質に組込まれたアミノ酸の配列に直接的な影響を及ぼしうる。他の非限定的な例では、多型は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライシングを改変することにより（例えば、ＳＮＰがスプライス部位に位置する場合）、または遺伝子の発現のレベルを改変することにより（例えば、ＳＮＰが遺伝子のプロモーター内に位置する場合）、またはタンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼすことにより（例えば、ＳＮＰが、別のタンパク質の翻訳後修飾をもたらす因子の発現または機能に影響を及ぼす場合）、個体間の表現型差異をもたらしうる。ある他の実施形態においては、ヌクレオチド多型は、該多型の種々の形態を含有する個体の間の表現型差異に直接的につながらない非機能的または中立的変異でありうる。
【０２３４】
ある実施形態においては、遺伝的多型は（機能的または非機能的のいずれの場合も）、特定の形質（例えば、細胞、組織または生物表現型）と関連するものとして関連解析において特定されうる。本明細書においては、「遺伝的関連性」が存在すると言えるのは、個体の集団内または異なる個体に由来する細胞の集団内の１以上の遺伝子型が、偶発的事象だと予想されるものより頻繁に表現型形質と共に生じる場合である。幾つかの実施形態においては、表現型形質は、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現するＴ細胞による標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の認識の結果として現れる認識表現型を含みうる。幾つかの実施形態においては、表現型形質は、標的細胞の、１以上の細胞表面分子ののコンホメーションを含みうる。幾つかの実施形態においては、表現型形質は、標的細胞の細胞表面ＣＤ２７７分子におけるＪ配置の存在または非存在を含みうる。幾つかの実施形態においては、表現型形質は特定の遺伝子座における特定の個体の接合性を含みうる。幾つかの実施形態においては、表現型形質は標的細胞（例えば、腫瘍細胞）におけるＲｈｏＢの活性を含みうる。本明細書においては、「活性」なる語は、タンパク質（例えば、ＲｈｏＢ）に関して用いられる場合、タンパク質の細胞機能を意味する。タンパク質の活性は、該タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子が突然変異している場合）、遺伝子の転写のレベルおよび時機、転写されるｍＲＮＡのスプライシングのパターン、該タンパク質の翻訳後修飾、細胞における該タンパク質または該タンパク質をコードするｍＲＮＡの移行のパターン、ならびにその機能に影響を及ぼす細胞因子との該タンパク質の適切な相互作用［これは、例えば、そのコンホメーションおよび／または活性を変化させることにより、あるいは細胞の適切な位置（例えば、細胞表面）に該タンパク質を配置してその機能を発現させることによりもたらされる］を含む多数の細胞事象および因子により影響される。したがって、タンパク質の活性の変化（例えば、タンパク質活性の増加または減少）は、細胞内で果たされるタンパク質の機能の変化をもたらしうる任意の細胞メカニズムを想定している。例えば、ＲｈｏＢに関しては、幾つかの実施形態においては、癌細胞の細胞膜へのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行に影響を及ぼすことにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼが癌細胞の細胞膜に維持されるかどうかに影響を及ぼすことにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、癌細胞の核からのＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの移行の増加または減少をもたらすことにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子または転写産物の発現を増加または減少させることにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、転写産物の修飾を変化させることにより（例えば、選択的スプライシング）、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、細胞内のＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの安定性を増加または減少させることにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼと第２のタンパク質（例えば、ＢＮＴ３タンパク質）との相互作用を増加または減少させることにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを活性化または非活性化することにより、活性が変化されうる。幾つかの実施形態においては、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼと非タンパク質小分子（例えば、ＧＴＰ）との相互作用を増加または減少させることにより、活性が変化されうる。
【０２３５】
幾つかの実施形態においては、１以上のヌクレオチド配列多型の存在または非存在は、治療群に患者を層別化するために用いられ、それらは、本明細書に開示されているポリペプチド構築物での治療に対する患者らの治療応答において異なりうる。例えば、ＳＮＰの特定の形態の存在は、治療の成功を予測することが知られている表現型形質（例えば、Ｊ配置の存在／非存在または比較的高い若しくは低いＲｈｏＢ活性）に関連していることが見出されうる。特定された遺伝的関連に基づいて、本明細書に開示されている特定の治療を受ける候補である患者は、表現型形質と相関する多型の存在または非存在に関してスクリーニング（すなわち、遺伝子型決定）されうる。ついで、スクリーニングされた患者は、多型の存在または非存在に基づいて複数の患者集団または群に分類されうる。各患者集団は層別化群を表すことが可能であり、該層別化群は、該層別化群内の特定の患者が特定の治療的介入に陽性応答または不良応答で応答する確率を表しうる（すなわち、異なる階層化群における患者は、治療に陽性応答する、異なる確率に割り当てられる）。本明細書においては、「陽性」なる語は、治療応答または層別化群に関して用いられる場合、治療が適用される目的を達成または部分達成する治療結果を意味する。例えば、幾つかの実施形態においては、治療に対する患者の陽性応答は、本明細書に記載されている組成物への曝露による少なくとも幾つかの癌細胞の除去を伴う。本明細書においては、「陽性」応答は「不良」応答と比較して用いられ、これは、幾つかの実施形態においては、陽性応答を示す第２層別化群の応答より低い層別化群の治療応答である。幾つかの実施形態においては、患者は少なくとも２つの患者群に層別化されることが可能であり、第１の患者群は治療に対する陽性応答を示すと予測され（すなわち、陽性治療予後層別化群）、一方、第２の患者群は比較的不良な治療応答を示すと予測される（すなわち、不良治療予後層別化群）。
【０２３６】
患者の標的細胞のヌクレオチド配列多型および／または或る表現型形質（例えば、ＣＤ２７７のＪ配置、ＲｈｏＢ活性）は、本明細書に開示されている組成物の投与を含む治療に対する患者の治療応答を予測または予後判定する１以上のバイオマーカーを表しうることが、前記説明から理解されるであろう。幾つかの実施形態においては、患者は、患者の標的細胞におけるバイオマーカーの存在または非存在に基づいて、異なる層別化群に層別化されうる。幾つかの実施形態においては、バイオマーカーはヌクレオチド配列多型（例えば、ＳＮＰ）またはエピジェネティック修飾であり、ヌクレオチド配列多型またはエピジェネティック修飾を有する患者は陽性層別化群に層別化され、一方、ヌクレオチド配列多型またはエピジェネティック修飾を欠く患者は不良層別化群に層別化される。幾つかの実施形態においては、バイオマーカーはヌクレオチド配列多型（例えば、ＳＮＰ）またはエピジェネティック修飾であり、ヌクレオチド配列多型またはエピジェネティック修飾を欠く患者は陽性層別化群に層別化され、一方、ヌクレオチド配列多型またはエピジェネティック修飾を有する患者は不良層別化群に層別化される。幾つかの実施形態においては、前記のとおり、バイオマーカーは、不良または陽性治療応答に関連した認識表現型（例えば、ＩＦＮ−γの産生）または標的細胞表現型（例えば、細胞表面ＣＤ２７７分子におけるＪ配置の存在）である。幾つかの実施形態においては、１つのバイオマーカーは、患者を異なる層別化群に層別化するために使用される。他の実施形態においては、複数のバイオマーカーは、患者を層別化するために使用される。例えば、患者の標的細胞が特定のヌクレオチド配列多型またはエピジェネティック修飾と特定の認識表現型または標的細胞表現型との両方を示す場合に、患者は陽性層別化群に層別化されうる。
【０２３７】
本開示は、ヌクレオチド配列、多型の存在および同一性ならびに特定の遺伝子座における接合性を含むゲノム情報をアーカイブしたデータコレクションの使用を想定している。データコレクションの一例は、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｔｕｄｅ  ｄｕ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  Ｈｕａｉｎ（ＣＥＰＨ）からの細胞系のライブラリであり、これは、幾つかの家系から得られ数百万個のＳＮＰに関して遺伝子型決定されたエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞系（ＥＢＶ−ＬＣＬ）の大規模コレクションを含む。データコレクションのもう１つの例は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐプロジェクトにより作成されたハプロタイプ地図である。幾つかの実施形態においては、データコレクションは仮定的または予測ゲノムパラメータをアーカイブしうる。例えば、候補遺伝子座に関する仮定的接合性は、家系内からの古典的メンデル遺伝パターンを使用して推定されうる。
【０２３８】
更に、本明細書は、個々の治療応答を予測または予後判定する、対象の標的細胞における遺伝的およびエピジェネティック変異を特定するための方法を開示する。例えば、患者の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）は以下のとおりにスクリーニングされうる。Ｔ細胞受容体を発現する操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む組成物と該細胞を接触させ、ついで、該組成物への曝露の結果としての該細胞の免疫活性化のレベル（例えば、ＩＦＮ−γのレベルまたは活性）のような認識表現型を検出することが可能である。該組成物への曝露に対する標的細胞の応答に応じて、対象は特定（例えば、陽性）の層別化群に分類されうる。例えば、該組成物への標的細胞の曝露がＴ細胞における免疫活性化を誘発する場合、患者は陽性層別化群に分類されうる。幾つかの実施形態においては、標的細胞における免疫活性化の存在または非存在は標的細胞における遺伝的および／またはエピジェネティック変異と関連づけられうる。幾つかの実施形態においては、標的細胞の特定の表現型形質（例えば、認識表現型）を遺伝的またはエピジェネティック変異体と関連づけるために、標的細胞に関する遺伝子型またはエピジェネティック情報が（例えば、データコレクションから）得られる。本開示は、遺伝的またはエピジェネティック変異を特定の認識表現型および／または予測治療応答と関連づけるために、別の患者の細胞と比較して患者の標的細胞における遺伝的またはエピジェネティック変異を特定するための任意の方法を想定している。例えば、特定の遺伝的変異体（例えば、ＳＮＰ）が標的細胞の表現型形質（例えば、認識表現型）に関連しているかどうかを決定するために、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）が行われうる。他の場合には、認識表現型および／または治療応答に関連づけられうる候補エピジェネティックマークを特定するために、種々の対象の標的細胞からのＤＮＡのエピジェネティックデータ（例えば、メチル化状態）が比較される。更に他の例では、特定の表現型形質に関連づけられうる候補遺伝子座を特定するために、家系からのデータを使用して特定の遺伝子座における接合性が仮定されうる。
【０２３９】
特定の実施形態においては、複数の遺伝子座における予測接合性はＣＥＰＨ個体のＳＮＰ遺伝子型と相関し、例えばｓｓＳＮＰｅｒのようなソフトウェアツールを使用して計算されうる。例えば、連鎖不平衡に関する閾値としてｒ２＝０．８を使用して、ＳＮＰ注釈およびプロキシ検索（ＳＮＰ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｘｙ  Ｓｅａｒｃｈ）（ＳＮＡＰ）ツールに照会することにより、ｙ  ｓｓＳＮＰｅｒにより生成されたＳＮＰの５００ｋｂ以内のプロキシＳＮＰが収集されうる。ｓｓＳＮＰｅｒ  ＳＮＰおよびそれらのプロキシのｅＱＴＬ分析が、Ｇｅｎｅｖａｒ（ＧＥＮｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＶＡＲｉａｔｉｏｎ）ツールを使用して行われうる。
【０２４０】
ＳＡＰＰＨＩＲＥ（サファイア）
本明細書は、ＳＡＰＰＨＩＲＥ（ＳＮＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｈｕｎｔ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）と称される技術を用いて、受容体媒介性標的細胞認識に関連した遺伝子座を特定する方法を開示する。例えば、腫瘍細胞の遺伝的バックグラウンドにおける差異はＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ操作Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載されている細胞）によるこれらの細胞の認識に影響を及ぼしうる。幾つかの実施形態においては、幾つかの家系から得られ数百万個のＳＮＰに関して遺伝子型決定されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＥＢＶ−ＬＣＬ）の大規模コレクションを含む細胞系のライブラリーが使用されうる（Ｄａｕｓｓｅｔら，Ｃｅｎｔｒｅ  ｄ’ｅｔｕｄｅ  ｄｕｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ  ｈｕｍａｉｎ  （ＣＥＰＨ）：ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９０；６：５７５−７；ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＨＡＰＭＡＰ，Ｃ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２６：７８９−９６）。Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬの認識表現型はＩＦＮγ産生により評価されうる。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞のいずれかを使用して、表現型分析に対するＮＫ様受容体の効果が低減または増強されうる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は少量のＮＫ様受容体を発現して分析を容易にする。候補遺伝子座に関する仮定的接合性は、ＣＥＰＨファミリートリオ内の古典的メンデル遺伝パターンを使用して推定可能であり、この場合、受容体媒介性認識、例えばＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識に対する候補対立遺伝子の影響が支配的であると仮定されうる。１つの実施形態においては、ＩＦＮγ産生により評価されるＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬの認識表現型はＥＢＶ−ＬＣＬのサブセットに関する活性化表現型およびＥＢＶ−ＬＣＬの別のサブセットに関する非活性化表現型を示しうる。ついで、ＣＥＰＨ細胞系の家系と組合された認識表現型を使用して、活性化および非活性化ＥＢＶ−ＬＣＬサブセットの接合性が予測されうる。ついで、仮定的遺伝子座接合性が研究集団内のＳＮＰの利用可能な遺伝子型情報と相関されて、予測接合性に対する強い相関性を示す遺伝子型を有するＳＮＰの特定をもたらしうる。本明細書における「強い相関性」は、幾つかの実施形態においては、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超または９９％超を意味しうる。
【０２４１】
幾つかの実施形態においては、特定されたＳＮＰは、Ｔ細胞受容体を発現する細胞（例えば、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞）の免疫活性化に（例えば、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションにより）影響を及ぼしうる対応遺伝子に近位の染色体上に位置しうる。幾つかの実施形態においては、「近位」は１０，０００ｂｐ超、５０，０００ｂｐ超、１００，０００ｂｐ超、２００，０００ｂｐ超、３００，０００ｂｐ超、５００，０００ｂｐ超または１Ｍｂｐ超を意味する。他の実施形態においては、特定されたＳＮＰは、Ｔ細胞受容体を発現する細胞（例えば、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞）の免疫活性化に（例えば、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションにより）影響を及ぼしうる対応遺伝子とは異なる染色体上に位置しうる。
【０２４２】
本明細書および実施例は本発明の実施形態を詳細に例示している。本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって変動可能であると理解されるべきである。本発明の範囲内に含まれる、本発明の多数の変形および修飾が存在する、と当業者は認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、所定の受容体（例えば、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識）を発現する操作された細胞に関連した遺伝子座を特定するために使用されるＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系を示す。図１Ａは、３つの独立した実験においてＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞によりＥＢＶ−ＬＣＬ系が認識される（＋）か又は認識されない（−）かを示す認識表現型を示す。図１Ｂは、ＥＢＶ−ＬＣＬの認識表現型がＩＦＮγ−ＥＬＩスポットアッセイにより評価されたことを示し（黒色棒グラフ：活性化無し；灰色棒グラフ：活性化）、この場合、ＥＢＶ−ＬＣＬを、ＡＢＰパミドロネートの存在下、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞に対する標的として使用した。図は代表的な実験のＩＦＮγスポットの数を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、所定の受容体（例えば、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識）を発現する操作された細胞に関連した遺伝子座を特定するために使用されるＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系を示す。図１Ａは、３つの独立した実験においてＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞によりＥＢＶ−ＬＣＬ系が認識される（＋）か又は認識されない（−）かを示す認識表現型を示す。図１Ｂは、ＥＢＶ−ＬＣＬの認識表現型がＩＦＮγ−ＥＬＩスポットアッセイにより評価されたことを示し（黒色棒グラフ：活性化無し；灰色棒グラフ：活性化）、この場合、ＥＢＶ−ＬＣＬを、ＡＢＰパミドロネートの存在下、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞に対する標的として使用した。図は代表的な実験のＩＦＮγスポットの数を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、特定の細胞における所定の受容体の活性化に関連した遺伝子座を特定するためのＳＡＰＰＨＩＲＥ（ＳＮＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｍＰｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｈｕｎｔ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を示す。図２Ａは、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系の認識が、各細胞系における候補遺伝子座の仮定的接合性を推定するための基礎をもたらしたことを示している（黒色：認識された；白色：認識されなかった；正方形：男性；円形：女性；＋／−：ヘテロ接合体；／−：ホモ接合陰性；＋／：未決定）。２つのＣＥＰＨファミリーのメンバーが例示として示されている。細胞系のＣＥＰＨ  ＩＤ番号に関しては、図１Ａを参照されたい。図２Ｂは、遺伝子関連解析が、細胞系の予想接合性と１００％（ｒ２＝１）相関した遺伝子型を有する１７個のＳＮＰを示したことを示している。ＳＮＰの位置および最も近い隣接遺伝子が示されている。Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲクローンＧ１１５またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１−制限ＷＴ１１２６ １３４特異的ａβＴＣＲのいずれかが導入されたＴ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８の認識に対する候補遺伝子のノックダウンの効果が黒丸（Ｔ細胞活性化に対する有意な効果）および白丸（効果無し）で示されている。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識を試験するために、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８系にＷＴ１１２６ １３４ペプチドを添加した。図２Ｃは、関連解析から得られたＳＮＰの、候補遺伝子に対する関連付けを示す。ＲｈｏＢに隣接するＳＮＰの遺伝的領域が一例として示されている。各棒グラフ（バー）は１つのＳＮＰを表し、ｒ２値は予想接合性とＳＮＰ遺伝子型との相関性を表す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、特定の細胞における所定の受容体の活性化に関連した遺伝子座を特定するためのＳＡＰＰＨＩＲＥ（ＳＮＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｍＰｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｈｕｎｔ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を示す。図２Ａは、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系の認識が、各細胞系における候補遺伝子座の仮定的接合性を推定するための基礎をもたらしたことを示している（黒色：認識された；白色：認識されなかった；正方形：男性；円形：女性；＋／−：ヘテロ接合体；／−：ホモ接合陰性；＋／：未決定）。２つのＣＥＰＨファミリーのメンバーが例示として示されている。細胞系のＣＥＰＨ  ＩＤ番号に関しては、図１Ａを参照されたい。図２Ｂは、遺伝子関連解析が、細胞系の予想接合性と１００％（ｒ２＝１）相関した遺伝子型を有する１７個のＳＮＰを示したことを示している。ＳＮＰの位置および最も近い隣接遺伝子が示されている。Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲクローンＧ１１５またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１−制限ＷＴ１１２６ １３４特異的ａβＴＣＲのいずれかが導入されたＴ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８の認識に対する候補遺伝子のノックダウンの効果が黒丸（Ｔ細胞活性化に対する有意な効果）および白丸（効果無し）で示されている。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識を試験するために、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８系にＷＴ１１２６ １３４ペプチドを添加した。図２Ｃは、関連解析から得られたＳＮＰの、候補遺伝子に対する関連付けを示す。ＲｈｏＢに隣接するＳＮＰの遺伝的領域が一例として示されている。各棒グラフ（バー）は１つのＳＮＰを表し、ｒ２値は予想接合性とＳＮＰ遺伝子型との相関性を表す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、特定の細胞における所定の受容体の活性化に関連した遺伝子座を特定するためのＳＡＰＰＨＩＲＥ（ＳＮＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｍＰｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｈｕｎｔ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を示す。図２Ａは、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系の認識が、各細胞系における候補遺伝子座の仮定的接合性を推定するための基礎をもたらしたことを示している（黒色：認識された；白色：認識されなかった；正方形：男性；円形：女性；＋／−：ヘテロ接合体；／−：ホモ接合陰性；＋／：未決定）。２つのＣＥＰＨファミリーのメンバーが例示として示されている。細胞系のＣＥＰＨ  ＩＤ番号に関しては、図１Ａを参照されたい。図２Ｂは、遺伝子関連解析が、細胞系の予想接合性と１００％（ｒ２＝１）相関した遺伝子型を有する１７個のＳＮＰを示したことを示している。ＳＮＰの位置および最も近い隣接遺伝子が示されている。Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲクローンＧ１１５またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１−制限ＷＴ１１２６ １３４特異的ａβＴＣＲのいずれかが導入されたＴ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８の認識に対する候補遺伝子のノックダウンの効果が黒丸（Ｔ細胞活性化に対する有意な効果）および白丸（効果無し）で示されている。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識を試験するために、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８系にＷＴ１１２６ １３４ペプチドを添加した。図２Ｃは、関連解析から得られたＳＮＰの、候補遺伝子に対する関連付けを示す。ＲｈｏＢに隣接するＳＮＰの遺伝的領域が一例として示されている。各棒グラフ（バー）は１つのＳＮＰを表し、ｒ２値は予想接合性とＳＮＰ遺伝子型との相関性を表す。
【図３Ａ】図３Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＢを２９３ＨＥＫ細胞においてノックアウトし、単細胞クローンを安定な完全ノックアウト表現型として選択し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識に対する完全ノックアウトの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、細胞内フローサイトメトリーを用いて決定した（右パネル）。データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図３Ｂが示しているのは、ＲｈｏＢを標的化するｓｈＲＮＡをレンチウイルスによりＤａｕｄｉ（ダウディ）細胞に導入し、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による表面ＣＤ２７７発現細胞の認識に対するＲｈｏＢノックダウンの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。無関係なｓｈＲＮＡをコードするベクターを陰性対照として用いた。ＲｈｏＢのノックダウンレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した（右パネル）。図３Ｃが示しているのは、２９３  ＨＥＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＡ、ＢおよびＣをノックアウトしたことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。図は代表的実験を示す。図３Ｄが示しているのは、認識（すなわち、認識される）ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８および９１ならびに非認識（すなわち、認識されない）系２２および９３においてウェスタンブロット分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。β−チューブリンをローディング対照として用いた。図は代表的実験を示す。図３Ｅが示しているのは、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系６、１２、４８、６９、７０および９９ならびに非認識系２２、８３、９３および３７において細胞内フローサイトメトリー分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。データは少なくとも３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図３Ｆが示しているのは、Ｃ３トランスフェラーゼ処理後の２９３ＨＥＫ細胞のＲｈｏ抑制を、Ｇ−Ｌｉｓａを使用して測定したことである。図は、未処理サンプルと比較した場合のＲｈｏＡ活性の相対的抑制の代表的実験を示す。
【図３Ｂ】図３Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＢを２９３ＨＥＫ細胞においてノックアウトし、単細胞クローンを安定な完全ノックアウト表現型として選択し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識に対する完全ノックアウトの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、細胞内フローサイトメトリーを用いて決定した（右パネル）。データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図３Ｂが示しているのは、ＲｈｏＢを標的化するｓｈＲＮＡをレンチウイルスによりＤａｕｄｉ（ダウディ）細胞に導入し、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による表面ＣＤ２７７発現細胞の認識に対するＲｈｏＢノックダウンの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。無関係なｓｈＲＮＡをコードするベクターを陰性対照として用いた。ＲｈｏＢのノックダウンレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した（右パネル）。図３Ｃが示しているのは、２９３  ＨＥＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＡ、ＢおよびＣをノックアウトしたことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。図は代表的実験を示す。図３Ｄが示しているのは、認識（すなわち、認識される）ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８および９１ならびに非認識（すなわち、認識されない）系２２および９３においてウェスタンブロット分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。β−チューブリンをローディング対照として用いた。図は代表的実験を示す。図３Ｅが示しているのは、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系６、１２、４８、６９、７０および９９ならびに非認識系２２、８３、９３および３７において細胞内フローサイトメトリー分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。データは少なくとも３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図３Ｆが示しているのは、Ｃ３トランスフェラーゼ処理後の２９３ＨＥＫ細胞のＲｈｏ抑制を、Ｇ−Ｌｉｓａを使用して測定したことである。図は、未処理サンプルと比較した場合のＲｈｏＡ活性の相対的抑制の代表的実験を示す。
【図３Ｃ】図３Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＢを２９３ＨＥＫ細胞においてノックアウトし、単細胞クローンを安定な完全ノックアウト表現型として選択し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識に対する完全ノックアウトの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、細胞内フローサイトメトリーを用いて決定した（右パネル）。データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図３Ｂが示しているのは、ＲｈｏＢを標的化するｓｈＲＮＡをレンチウイルスによりＤａｕｄｉ（ダウディ）細胞に導入し、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による表面ＣＤ２７７発現細胞の認識に対するＲｈｏＢノックダウンの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。無関係なｓｈＲＮＡをコードするベクターを陰性対照として用いた。ＲｈｏＢのノックダウンレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した（右パネル）。図３Ｃが示しているのは、２９３  ＨＥＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＡ、ＢおよびＣをノックアウトしたことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。図は代表的実験を示す。図３Ｄが示しているのは、認識（すなわち、認識される）ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８および９１ならびに非認識（すなわち、認識されない）系２２および９３においてウェスタンブロット分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。β−チューブリンをローディング対照として用いた。図は代表的実験を示す。図３Ｅが示しているのは、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系６、１２、４８、６９、７０および９９ならびに非認識系２２、８３、９３および３７において細胞内フローサイトメトリー分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。データは少なくとも３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図３Ｆが示しているのは、Ｃ３トランスフェラーゼ処理後の２９３ＨＥＫ細胞のＲｈｏ抑制を、Ｇ−Ｌｉｓａを使用して測定したことである。図は、未処理サンプルと比較した場合のＲｈｏＡ活性の相対的抑制の代表的実験を示す。
【図３Ｄ】図３Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＢを２９３ＨＥＫ細胞においてノックアウトし、単細胞クローンを安定な完全ノックアウト表現型として選択し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識に対する完全ノックアウトの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、細胞内フローサイトメトリーを用いて決定した（右パネル）。データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図３Ｂが示しているのは、ＲｈｏＢを標的化するｓｈＲＮＡをレンチウイルスによりＤａｕｄｉ（ダウディ）細胞に導入し、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による表面ＣＤ２７７発現細胞の認識に対するＲｈｏＢノックダウンの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。無関係なｓｈＲＮＡをコードするベクターを陰性対照として用いた。ＲｈｏＢのノックダウンレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した（右パネル）。図３Ｃが示しているのは、２９３  ＨＥＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＡ、ＢおよびＣをノックアウトしたことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。図は代表的実験を示す。図３Ｄが示しているのは、認識（すなわち、認識される）ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８および９１ならびに非認識（すなわち、認識されない）系２２および９３においてウェスタンブロット分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。β−チューブリンをローディング対照として用いた。図は代表的実験を示す。図３Ｅが示しているのは、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系６、１２、４８、６９、７０および９９ならびに非認識系２２、８３、９３および３７において細胞内フローサイトメトリー分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。データは少なくとも３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図３Ｆが示しているのは、Ｃ３トランスフェラーゼ処理後の２９３ＨＥＫ細胞のＲｈｏ抑制を、Ｇ−Ｌｉｓａを使用して測定したことである。図は、未処理サンプルと比較した場合のＲｈｏＡ活性の相対的抑制の代表的実験を示す。
【図３Ｅ】図３Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＢを２９３ＨＥＫ細胞においてノックアウトし、単細胞クローンを安定な完全ノックアウト表現型として選択し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識に対する完全ノックアウトの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、細胞内フローサイトメトリーを用いて決定した（右パネル）。データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図３Ｂが示しているのは、ＲｈｏＢを標的化するｓｈＲＮＡをレンチウイルスによりＤａｕｄｉ（ダウディ）細胞に導入し、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による表面ＣＤ２７７発現細胞の認識に対するＲｈｏＢノックダウンの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。無関係なｓｈＲＮＡをコードするベクターを陰性対照として用いた。ＲｈｏＢのノックダウンレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した（右パネル）。図３Ｃが示しているのは、２９３  ＨＥＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＡ、ＢおよびＣをノックアウトしたことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。図は代表的実験を示す。図３Ｄが示しているのは、認識（すなわち、認識される）ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８および９１ならびに非認識（すなわち、認識されない）系２２および９３においてウェスタンブロット分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。β−チューブリンをローディング対照として用いた。図は代表的実験を示す。図３Ｅが示しているのは、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系６、１２、４８、６９、７０および９９ならびに非認識系２２、８３、９３および３７において細胞内フローサイトメトリー分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。データは少なくとも３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図３Ｆが示しているのは、Ｃ３トランスフェラーゼ処理後の２９３ＨＥＫ細胞のＲｈｏ抑制を、Ｇ−Ｌｉｓａを使用して測定したことである。図は、未処理サンプルと比較した場合のＲｈｏＡ活性の相対的抑制の代表的実験を示す。
【図３Ｆ】図３Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＢを２９３ＨＥＫ細胞においてノックアウトし、単細胞クローンを安定な完全ノックアウト表現型として選択し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識に対する完全ノックアウトの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、細胞内フローサイトメトリーを用いて決定した（右パネル）。データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図３Ｂが示しているのは、ＲｈｏＢを標的化するｓｈＲＮＡをレンチウイルスによりＤａｕｄｉ（ダウディ）細胞に導入し、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による表面ＣＤ２７７発現細胞の認識に対するＲｈｏＢノックダウンの効果をＩＦＮγの測定により評価したことである（左パネル）。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。無関係なｓｈＲＮＡをコードするベクターを陰性対照として用いた。ＲｈｏＢのノックダウンレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した（右パネル）。図３Ｃが示しているのは、２９３  ＨＥＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＲｈｏＡ、ＢおよびＣをノックアウトしたことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。ノックアウトのレベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。図は代表的実験を示す。図３Ｄが示しているのは、認識（すなわち、認識される）ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８および９１ならびに非認識（すなわち、認識されない）系２２および９３においてウェスタンブロット分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。β−チューブリンをローディング対照として用いた。図は代表的実験を示す。図３Ｅが示しているのは、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系６、１２、４８、６９、７０および９９ならびに非認識系２２、８３、９３および３７において細胞内フローサイトメトリー分析によりＲｈｏＢタンパク質レベルを測定したことである。データは少なくとも３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図３Ｆが示しているのは、Ｃ３トランスフェラーゼ処理後の２９３ＨＥＫ細胞のＲｈｏ抑制を、Ｇ−Ｌｉｓａを使用して測定したことである。図は、未処理サンプルと比較した場合のＲｈｏＡ活性の相対的抑制の代表的実験を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＤ２７７のＪ配置へのポリペプチド構築物の結合に基づいて、ＲｈｏＢ活性が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞認識と相関することを示す。図４Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して腎癌細胞系ＭＺ１８５１ＲＣにおいてＲｈｏＢを部分的にノックアウトしたことである。ＭＺ１８５１ＲＣ細胞をパミドロネートまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＷＴ１Ｉ  ２６  ＋１３４ペプチドのいずれかで処理し、それぞれ、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞およびＷＴ１  ｏ４３ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する効果をＩＦＮγ産生の測定により決定した。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡをノックアウトに関する対照として使用し、一方、中程度または無関係なペプチドがローデイングされた腫瘍細胞をＴ細胞刺激に関する対照として使用した。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ノックアウトのレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した。図４Ｂが示しているのは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による認識に対する２９３ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＡ、ＢおよびＣのノックアウトの効果をＩＦＮγ産生の測定により評価したことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。図は、重複サンプルにおける３回の独立した実験の、無関係なノックアウトサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。図４Ｃが示しているのは、非認識（黒色棒グラフ）または認識（白色棒グラフ）ＥＢＶ−ＬＣＬおよび腫瘍細胞系のいずれかにおいて、ＲｈｏＢのＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより測定したことである。データは２つの反復実験の代表例である。図４Ｄが示しているのは、非認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３または認識ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８を、パミドロネートまたはＩＰＰと組合されたカルペプチンまたはＣ３トランスフェラーゼのいずれかで前処理し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の刺激に対する効果をＩＦＮγの測定により評価したことである。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＷＴ１Ｉ  ２６＋１３４ペプチド添加ＥＢＶ−ＬＣＬ４８細胞の認識に対するＲｈｏ調節性化合物の効果を並行して測定した。データは少なくとも３つの独立した実験の平均−１（４Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図４Ｅが示しているのは、ドミナントネガティブＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＤＮ）、構成的に活性なＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＣＡ）または野生型ＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＷＴ）でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、パミドロネートの存在下のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する活性変異体の効果をＩＦＮγの測定により決定したことである。図は３つの独立した実験の野生型ＲｈｏＢサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。データの有意性は、図４Ａ、ＢおよびＤに関してはマン−ホイットニー検定により、図４Ｅに関してはクニスルタル−ワリス（Ｋｎｉｓｌｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定およびダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定により分析されている。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＤ２７７のＪ配置へのポリペプチド構築物の結合に基づいて、ＲｈｏＢ活性が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞認識と相関することを示す。図４Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して腎癌細胞系ＭＺ１８５１ＲＣにおいてＲｈｏＢを部分的にノックアウトしたことである。ＭＺ１８５１ＲＣ細胞をパミドロネートまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＷＴ１Ｉ  ２６  ＋１３４ペプチドのいずれかで処理し、それぞれ、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞およびＷＴ１  ｏ４３ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する効果をＩＦＮγ産生の測定により決定した。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡをノックアウトに関する対照として使用し、一方、中程度または無関係なペプチドがローデイングされた腫瘍細胞をＴ細胞刺激に関する対照として使用した。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ノックアウトのレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した。図４Ｂが示しているのは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による認識に対する２９３ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＡ、ＢおよびＣのノックアウトの効果をＩＦＮγ産生の測定により評価したことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。図は、重複サンプルにおける３回の独立した実験の、無関係なノックアウトサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。図４Ｃが示しているのは、非認識（黒色棒グラフ）または認識（白色棒グラフ）ＥＢＶ−ＬＣＬおよび腫瘍細胞系のいずれかにおいて、ＲｈｏＢのＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより測定したことである。データは２つの反復実験の代表例である。図４Ｄが示しているのは、非認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３または認識ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８を、パミドロネートまたはＩＰＰと組合されたカルペプチンまたはＣ３トランスフェラーゼのいずれかで前処理し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の刺激に対する効果をＩＦＮγの測定により評価したことである。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＷＴ１Ｉ  ２６＋１３４ペプチド添加ＥＢＶ−ＬＣＬ４８細胞の認識に対するＲｈｏ調節性化合物の効果を並行して測定した。データは少なくとも３つの独立した実験の平均−１（４Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図４Ｅが示しているのは、ドミナントネガティブＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＤＮ）、構成的に活性なＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＣＡ）または野生型ＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＷＴ）でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、パミドロネートの存在下のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する活性変異体の効果をＩＦＮγの測定により決定したことである。図は３つの独立した実験の野生型ＲｈｏＢサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。データの有意性は、図４Ａ、ＢおよびＤに関してはマン−ホイットニー検定により、図４Ｅに関してはクニスルタル−ワリス（Ｋｎｉｓｌｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定およびダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定により分析されている。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＤ２７７のＪ配置へのポリペプチド構築物の結合に基づいて、ＲｈｏＢ活性が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞認識と相関することを示す。図４Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して腎癌細胞系ＭＺ１８５１ＲＣにおいてＲｈｏＢを部分的にノックアウトしたことである。ＭＺ１８５１ＲＣ細胞をパミドロネートまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＷＴ１Ｉ  ２６  ＋１３４ペプチドのいずれかで処理し、それぞれ、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞およびＷＴ１  ｏ４３ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する効果をＩＦＮγ産生の測定により決定した。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡをノックアウトに関する対照として使用し、一方、中程度または無関係なペプチドがローデイングされた腫瘍細胞をＴ細胞刺激に関する対照として使用した。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ノックアウトのレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した。図４Ｂが示しているのは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による認識に対する２９３ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＡ、ＢおよびＣのノックアウトの効果をＩＦＮγ産生の測定により評価したことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。図は、重複サンプルにおける３回の独立した実験の、無関係なノックアウトサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。図４Ｃが示しているのは、非認識（黒色棒グラフ）または認識（白色棒グラフ）ＥＢＶ−ＬＣＬおよび腫瘍細胞系のいずれかにおいて、ＲｈｏＢのＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより測定したことである。データは２つの反復実験の代表例である。図４Ｄが示しているのは、非認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３または認識ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８を、パミドロネートまたはＩＰＰと組合されたカルペプチンまたはＣ３トランスフェラーゼのいずれかで前処理し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の刺激に対する効果をＩＦＮγの測定により評価したことである。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＷＴ１Ｉ  ２６＋１３４ペプチド添加ＥＢＶ−ＬＣＬ４８細胞の認識に対するＲｈｏ調節性化合物の効果を並行して測定した。データは少なくとも３つの独立した実験の平均−１（４Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図４Ｅが示しているのは、ドミナントネガティブＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＤＮ）、構成的に活性なＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＣＡ）または野生型ＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＷＴ）でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、パミドロネートの存在下のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する活性変異体の効果をＩＦＮγの測定により決定したことである。図は３つの独立した実験の野生型ＲｈｏＢサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。データの有意性は、図４Ａ、ＢおよびＤに関してはマン−ホイットニー検定により、図４Ｅに関してはクニスルタル−ワリス（Ｋｎｉｓｌｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定およびダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定により分析されている。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＤ２７７のＪ配置へのポリペプチド構築物の結合に基づいて、ＲｈｏＢ活性が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞認識と相関することを示す。図４Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して腎癌細胞系ＭＺ１８５１ＲＣにおいてＲｈｏＢを部分的にノックアウトしたことである。ＭＺ１８５１ＲＣ細胞をパミドロネートまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＷＴ１Ｉ  ２６  ＋１３４ペプチドのいずれかで処理し、それぞれ、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞およびＷＴ１  ｏ４３ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する効果をＩＦＮγ産生の測定により決定した。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡをノックアウトに関する対照として使用し、一方、中程度または無関係なペプチドがローデイングされた腫瘍細胞をＴ細胞刺激に関する対照として使用した。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ノックアウトのレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した。図４Ｂが示しているのは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による認識に対する２９３ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＡ、ＢおよびＣのノックアウトの効果をＩＦＮγ産生の測定により評価したことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。図は、重複サンプルにおける３回の独立した実験の、無関係なノックアウトサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。図４Ｃが示しているのは、非認識（黒色棒グラフ）または認識（白色棒グラフ）ＥＢＶ−ＬＣＬおよび腫瘍細胞系のいずれかにおいて、ＲｈｏＢのＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより測定したことである。データは２つの反復実験の代表例である。図４Ｄが示しているのは、非認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３または認識ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８を、パミドロネートまたはＩＰＰと組合されたカルペプチンまたはＣ３トランスフェラーゼのいずれかで前処理し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の刺激に対する効果をＩＦＮγの測定により評価したことである。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＷＴ１Ｉ  ２６＋１３４ペプチド添加ＥＢＶ−ＬＣＬ４８細胞の認識に対するＲｈｏ調節性化合物の効果を並行して測定した。データは少なくとも３つの独立した実験の平均−１（４Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図４Ｅが示しているのは、ドミナントネガティブＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＤＮ）、構成的に活性なＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＣＡ）または野生型ＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＷＴ）でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、パミドロネートの存在下のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する活性変異体の効果をＩＦＮγの測定により決定したことである。図は３つの独立した実験の野生型ＲｈｏＢサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。データの有意性は、図４Ａ、ＢおよびＤに関してはマン−ホイットニー検定により、図４Ｅに関してはクニスルタル−ワリス（Ｋｎｉｓｌｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定およびダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定により分析されている。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＤ２７７のＪ配置へのポリペプチド構築物の結合に基づいて、ＲｈｏＢ活性が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞認識と相関することを示す。図４Ａが示しているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して腎癌細胞系ＭＺ１８５１ＲＣにおいてＲｈｏＢを部分的にノックアウトしたことである。ＭＺ１８５１ＲＣ細胞をパミドロネートまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＷＴ１Ｉ  ２６  ＋１３４ペプチドのいずれかで処理し、それぞれ、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞およびＷＴ１  ｏ４３ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する効果をＩＦＮγ産生の測定により決定した。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡをノックアウトに関する対照として使用し、一方、中程度または無関係なペプチドがローデイングされた腫瘍細胞をＴ細胞刺激に関する対照として使用した。データは重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ノックアウトのレベルを細胞内フローサイトメトリーにより決定した。図４Ｂが示しているのは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による認識に対する２９３ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＡ、ＢおよびＣのノックアウトの効果をＩＦＮγ産生の測定により評価したことである。無関係な配列を標的化するガイドＲＮＡを対照として使用した。図は、重複サンプルにおける３回の独立した実験の、無関係なノックアウトサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。図４Ｃが示しているのは、非認識（黒色棒グラフ）または認識（白色棒グラフ）ＥＢＶ−ＬＣＬおよび腫瘍細胞系のいずれかにおいて、ＲｈｏＢのＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより測定したことである。データは２つの反復実験の代表例である。図４Ｄが示しているのは、非認識ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３または認識ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８を、パミドロネートまたはＩＰＰと組合されたカルペプチンまたはＣ３トランスフェラーゼのいずれかで前処理し、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の刺激に対する効果をＩＦＮγの測定により評価したことである。ＷＴ１  ａβＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＷＴ１Ｉ  ２６＋１３４ペプチド添加ＥＢＶ−ＬＣＬ４８細胞の認識に対するＲｈｏ調節性化合物の効果を並行して測定した。データは少なくとも３つの独立した実験の平均−１（４Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。図４Ｅが示しているのは、ドミナントネガティブＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＤＮ）、構成的に活性なＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＣＡ）または野生型ＲｈｏＢ（ＲｈｏＢ−ＷＴ）でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、パミドロネートの存在下のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的細胞認識に対する活性変異体の効果をＩＦＮγの測定により決定したことである。図は３つの独立した実験の野生型ＲｈｏＢサンプルに対して正規化されたＩＦＮγ産生を示す。データの有意性は、図４Ａ、ＢおよびＤに関してはマン−ホイットニー検定により、図４Ｅに関してはクニスルタル−ワリス（Ｋｎｉｓｌｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定およびダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定により分析されている。
【図５Ａ】図５は、ＲｈｏＢの細胞内分布が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞におけるＣＤ２７７のＪ配置の認識と相関することを示す。図５Ａが示しているのは、非認識健常Ｔ細胞、白血病細胞系ＭＬ−１およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞、ならびに認識白血病細胞系Ｋ５６２、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ７０細胞をパミドロネートで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングしたことである。付着細胞を固定し、透過処理し、ＲｈｏＢ特異的抗体を使用して染色し、ついでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体を使用して染色した。ついでＲｈｏＢ分布を共焦点顕微鏡検査で分析した。代表的なイメージが示されている（白色：ＲｈｏＢ、暗色：核［ＤＡＰＩ］）。図５Ｂが示しているのは、健常ドナーからのＴ細胞、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、４８および７０、腫瘍細胞系ＭＬ−１、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｒａｊｉ、原発性ＡＭＬ芽球ＡＭＬ２９１３、ＡＭＬ２９０７、ＡＭＬ２８８９、ＡＭＬ２９０５ならびにマウスおよびヒトＤＣをパミドロネートで処理し、共焦点顕微鏡検査でＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析したことである。白色棒グラフは、非活性化表現型を有する標的細胞を表し、黒色棒グラフは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を活性化しうる標的細胞を示す。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、核区画と核外区画とのＲｈｏＢシグナル比を測定した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＰＢＬと比較した統計的有意性をクラスカル−ワリス検定およびダンの多重比較検定を用いて決定した。図５Ｃは細胞内ＲｈｏＢ分布を示す。図５Ｄは核外／核ＲｈｏＢシグナル比を示し、この場合、ＡおよびＢと同様にして、認識ＡＢＰ／ＩＰＰ感受性ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８のＡＢＰパミドロネートおよび可溶性ＩＰＰ感作を分析した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。未処理ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定した。図５Ｅが示しているのは、２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下、細胞内ＲｈｏＢ分布を決定したことである。骨髄由来マウス樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＬＰＳ処理ヒトＤＣと比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いることにより決定した。図５Ｆが示しているのは、４名の患者、すなわち、白血病芽細胞が認識された患者（ＡＭＬ  ２８８９、ＡＭＬ  １６６５、ＡＭＬ  ２５７５）および白血病芽細胞が認識されなかった患者（ＡＭＬ  ２９０７）からＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  白血病幹細胞を選別し、核外ＲｈｏＢシグナルと核ＲｈｏＢシグナルとの比を測定したことである。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  健常幹細胞と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定���た。
【図５Ｂ】図５は、ＲｈｏＢの細胞内分布が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞におけるＣＤ２７７のＪ配置の認識と相関することを示す。図５Ａが示しているのは、非認識健常Ｔ細胞、白血病細胞系ＭＬ−１およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞、ならびに認識白血病細胞系Ｋ５６２、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ７０細胞をパミドロネートで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングしたことである。付着細胞を固定し、透過処理し、ＲｈｏＢ特異的抗体を使用して染色し、ついでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体を使用して染色した。ついでＲｈｏＢ分布を共焦点顕微鏡検査で分析した。代表的なイメージが示されている（白色：ＲｈｏＢ、暗色：核［ＤＡＰＩ］）。図５Ｂが示しているのは、健常ドナーからのＴ細胞、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、４８および７０、腫瘍細胞系ＭＬ−１、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｒａｊｉ、原発性ＡＭＬ芽球ＡＭＬ２９１３、ＡＭＬ２９０７、ＡＭＬ２８８９、ＡＭＬ２９０５ならびにマウスおよびヒトＤＣをパミドロネートで処理し、共焦点顕微鏡検査でＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析したことである。白色棒グラフは、非活性化表現型を有する標的細胞を表し、黒色棒グラフは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を活性化しうる標的細胞を示す。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、核区画と核外区画とのＲｈｏＢシグナル比を測定した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＰＢＬと比較した統計的有意性をクラスカル−ワリス検定およびダンの多重比較検定を用いて決定した。図５Ｃは細胞内ＲｈｏＢ分布を示す。図５Ｄは核外／核ＲｈｏＢシグナル比を示し、この場合、ＡおよびＢと同様にして、認識ＡＢＰ／ＩＰＰ感受性ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８のＡＢＰパミドロネートおよび可溶性ＩＰＰ感作を分析した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。未処理ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定した。図５Ｅが示しているのは、２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下、細胞内ＲｈｏＢ分布を決定したことである。骨髄由来マウス樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＬＰＳ処理ヒトＤＣと比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いることにより決定した。図５Ｆが示しているのは、４名の患者、すなわち、白血病芽細胞が認識された患者（ＡＭＬ  ２８８９、ＡＭＬ  １６６５、ＡＭＬ  ２５７５）および白血病芽細胞が認識されなかった患者（ＡＭＬ  ２９０７）からＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  白血病幹細胞を選別し、核外ＲｈｏＢシグナルと核ＲｈｏＢシグナルとの比を測定したことである。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  健常幹細胞と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定���た。
【図５Ｃ】図５は、ＲｈｏＢの細胞内分布が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞におけるＣＤ２７７のＪ配置の認識と相関することを示す。図５Ａが示しているのは、非認識健常Ｔ細胞、白血病細胞系ＭＬ−１およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞、ならびに認識白血病細胞系Ｋ５６２、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ７０細胞をパミドロネートで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングしたことである。付着細胞を固定し、透過処理し、ＲｈｏＢ特異的抗体を使用して染色し、ついでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体を使用して染色した。ついでＲｈｏＢ分布を共焦点顕微鏡検査で分析した。代表的なイメージが示されている（白色：ＲｈｏＢ、暗色：核［ＤＡＰＩ］）。図５Ｂが示しているのは、健常ドナーからのＴ細胞、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、４８および７０、腫瘍細胞系ＭＬ−１、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｒａｊｉ、原発性ＡＭＬ芽球ＡＭＬ２９１３、ＡＭＬ２９０７、ＡＭＬ２８８９、ＡＭＬ２９０５ならびにマウスおよびヒトＤＣをパミドロネートで処理し、共焦点顕微鏡検査でＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析したことである。白色棒グラフは、非活性化表現型を有する標的細胞を表し、黒色棒グラフは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を活性化しうる標的細胞を示す。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、核区画と核外区画とのＲｈｏＢシグナル比を測定した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＰＢＬと比較した統計的有意性をクラスカル−ワリス検定およびダンの多重比較検定を用いて決定した。図５Ｃは細胞内ＲｈｏＢ分布を示す。図５Ｄは核外／核ＲｈｏＢシグナル比を示し、この場合、ＡおよびＢと同様にして、認識ＡＢＰ／ＩＰＰ感受性ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８のＡＢＰパミドロネートおよび可溶性ＩＰＰ感作を分析した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。未処理ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定した。図５Ｅが示しているのは、２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下、細胞内ＲｈｏＢ分布を決定したことである。骨髄由来マウス樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＬＰＳ処理ヒトＤＣと比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いることにより決定した。図５Ｆが示しているのは、４名の患者、すなわち、白血病芽細胞が認識された患者（ＡＭＬ  ２８８９、ＡＭＬ  １６６５、ＡＭＬ  ２５７５）および白血病芽細胞が認識されなかった患者（ＡＭＬ  ２９０７）からＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  白血病幹細胞を選別し、核外ＲｈｏＢシグナルと核ＲｈｏＢシグナルとの比を測定したことである。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  健常幹細胞と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定���た。
【図５Ｄ】図５は、ＲｈｏＢの細胞内分布が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞におけるＣＤ２７７のＪ配置の認識と相関することを示す。図５Ａが示しているのは、非認識健常Ｔ細胞、白血病細胞系ＭＬ−１およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞、ならびに認識白血病細胞系Ｋ５６２、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ７０細胞をパミドロネートで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングしたことである。付着細胞を固定し、透過処理し、ＲｈｏＢ特異的抗体を使用して染色し、ついでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体を使用して染色した。ついでＲｈｏＢ分布を共焦点顕微鏡検査で分析した。代表的なイメージが示されている（白色：ＲｈｏＢ、暗色：核［ＤＡＰＩ］）。図５Ｂが示しているのは、健常ドナーからのＴ細胞、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、４８および７０、腫瘍細胞系ＭＬ−１、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｒａｊｉ、原発性ＡＭＬ芽球ＡＭＬ２９１３、ＡＭＬ２９０７、ＡＭＬ２８８９、ＡＭＬ２９０５ならびにマウスおよびヒトＤＣをパミドロネートで処理し、共焦点顕微鏡検査でＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析したことである。白色棒グラフは、非活性化表現型を有する標的細胞を表し、黒色棒グラフは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を活性化しうる標的細胞を示す。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、核区画と核外区画とのＲｈｏＢシグナル比を測定した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＰＢＬと比較した統計的有意性をクラスカル−ワリス検定およびダンの多重比較検定を用いて決定した。図５Ｃは細胞内ＲｈｏＢ分布を示す。図５Ｄは核外／核ＲｈｏＢシグナル比を示し、この場合、ＡおよびＢと同様にして、認識ＡＢＰ／ＩＰＰ感受性ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８のＡＢＰパミドロネートおよび可溶性ＩＰＰ感作を分析した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。未処理ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定した。図５Ｅが示しているのは、２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下、細胞内ＲｈｏＢ分布を決定したことである。骨髄由来マウス樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＬＰＳ処理ヒトＤＣと比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いることにより決定した。図５Ｆが示しているのは、４名の患者、すなわち、白血病芽細胞が認識された患者（ＡＭＬ  ２８８９、ＡＭＬ  １６６５、ＡＭＬ  ２５７５）および白血病芽細胞が認識されなかった患者（ＡＭＬ  ２９０７）からＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  白血病幹細胞を選別し、核外ＲｈｏＢシグナルと核ＲｈｏＢシグナルとの比を測定したことである。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  健常幹細胞と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定���た。
【図５Ｅ】図５は、ＲｈｏＢの細胞内分布が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞におけるＣＤ２７７のＪ配置の認識と相関することを示す。図５Ａが示しているのは、非認識健常Ｔ細胞、白血病細胞系ＭＬ−１およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞、ならびに認識白血病細胞系Ｋ５６２、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ７０細胞をパミドロネートで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングしたことである。付着細胞を固定し、透過処理し、ＲｈｏＢ特異的抗体を使用して染色し、ついでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体を使用して染色した。ついでＲｈｏＢ分布を共焦点顕微鏡検査で分析した。代表的なイメージが示されている（白色：ＲｈｏＢ、暗色：核［ＤＡＰＩ］）。図５Ｂが示しているのは、健常ドナーからのＴ細胞、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、４８および７０、腫瘍細胞系ＭＬ−１、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｒａｊｉ、原発性ＡＭＬ芽球ＡＭＬ２９１３、ＡＭＬ２９０７、ＡＭＬ２８８９、ＡＭＬ２９０５ならびにマウスおよびヒトＤＣをパミドロネートで処理し、共焦点顕微鏡検査でＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析したことである。白色棒グラフは、非活性化表現型を有する標的細胞を表し、黒色棒グラフは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を活性化しうる標的細胞を示す。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、核区画と核外区画とのＲｈｏＢシグナル比を測定した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＰＢＬと比較した統計的有意性をクラスカル−ワリス検定およびダンの多重比較検定を用いて決定した。図５Ｃは細胞内ＲｈｏＢ分布を示す。図５Ｄは核外／核ＲｈｏＢシグナル比を示し、この場合、ＡおよびＢと同様にして、認識ＡＢＰ／ＩＰＰ感受性ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８のＡＢＰパミドロネートおよび可溶性ＩＰＰ感作を分析した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。未処理ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定した。図５Ｅが示しているのは、２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下、細胞内ＲｈｏＢ分布を決定したことである。骨髄由来マウス樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＬＰＳ処理ヒトＤＣと比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いることにより決定した。図５Ｆが示しているのは、４名の患者、すなわち、白血病芽細胞が認識された患者（ＡＭＬ  ２８８９、ＡＭＬ  １６６５、ＡＭＬ  ２５７５）および白血病芽細胞が認識されなかった患者（ＡＭＬ  ２９０７）からＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  白血病幹細胞を選別し、核外ＲｈｏＢシグナルと核ＲｈｏＢシグナルとの比を測定したことである。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  健常幹細胞と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定���た。
【図５Ｆ】図５は、ＲｈｏＢの細胞内分布が、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞による標的細胞におけるＣＤ２７７のＪ配置の認識と相関することを示す。図５Ａが示しているのは、非認識健常Ｔ細胞、白血病細胞系ＭＬ−１およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞、ならびに認識白血病細胞系Ｋ５６２、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８およびＥＢＶ−ＬＣＬ  ７０細胞をパミドロネートで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングしたことである。付着細胞を固定し、透過処理し、ＲｈｏＢ特異的抗体を使用して染色し、ついでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体を使用して染色した。ついでＲｈｏＢ分布を共焦点顕微鏡検査で分析した。代表的なイメージが示されている（白色：ＲｈｏＢ、暗色：核［ＤＡＰＩ］）。図５Ｂが示しているのは、健常ドナーからのＴ細胞、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、４８および７０、腫瘍細胞系ＭＬ−１、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｒａｊｉ、原発性ＡＭＬ芽球ＡＭＬ２９１３、ＡＭＬ２９０７、ＡＭＬ２８８９、ＡＭＬ２９０５ならびにマウスおよびヒトＤＣをパミドロネートで処理し、共焦点顕微鏡検査でＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析したことである。白色棒グラフは、非活性化表現型を有する標的細胞を表し、黒色棒グラフは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物を発現する操作された細胞を活性化しうる標的細胞を示す。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、核区画と核外区画とのＲｈｏＢシグナル比を測定した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＰＢＬと比較した統計的有意性をクラスカル−ワリス検定およびダンの多重比較検定を用いて決定した。図５Ｃは細胞内ＲｈｏＢ分布を示す。図５Ｄは核外／核ＲｈｏＢシグナル比を示し、この場合、ＡおよびＢと同様にして、認識ＡＢＰ／ＩＰＰ感受性ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８のＡＢＰパミドロネートおよび可溶性ＩＰＰ感作を分析した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。未処理ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定した。図５Ｅが示しているのは、２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下、細胞内ＲｈｏＢ分布を決定したことである。骨髄由来マウス樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＬＰＳ処理ヒトＤＣと比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いることにより決定した。図５Ｆが示しているのは、４名の患者、すなわち、白血病芽細胞が認識された患者（ＡＭＬ  ２８８９、ＡＭＬ  １６６５、ＡＭＬ  ２５７５）および白血病芽細胞が認識されなかった患者（ＡＭＬ  ２９０７）からＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  白血病幹細胞を選別し、核外ＲｈｏＢシグナルと核ＲｈｏＢシグナルとの比を測定したことである。グラフは少なくとも１０個の異なる細胞の平均比＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  健常幹細胞と比較した統計的有意性を、マン−ホイットニー検定を用いて決定���た。
【図６Ａ】図６Ａは認識および非認識原発性ＡＭＬサンプルにおけるＲｈｏＢの細胞内分布に関する代表的イメージを示す。図６Ｂが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＡ分布をＥＢＶ−ＬＣＬ４８における共焦点顕微鏡検査により測定したことである。図６Ｃが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＢ分布を２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において決定したことである。マウス骨髄由来樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。図６Ｄは細胞内ＲｈｏＢ分布と腫瘍標的細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞活性化能との相関性を示す。腫瘍細胞における核外：核ＲｈｏＢ強度比を、同じ腫瘍細胞を、本明細書記載のポリペプチド構築物を発現する操作された細胞と共培養した場合のＩＦＮｇスポットの数に対してプロットした。
【図６Ｂ】図６Ａは認識および非認識原発性ＡＭＬサンプルにおけるＲｈｏＢの細胞内分布に関する代表的イメージを示す。図６Ｂが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＡ分布をＥＢＶ−ＬＣＬ４８における共焦点顕微鏡検査により測定したことである。図６Ｃが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＢ分布を２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において決定したことである。マウス骨髄由来樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。図６Ｄは細胞内ＲｈｏＢ分布と腫瘍標的細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞活性化能との相関性を示す。腫瘍細胞における核外：核ＲｈｏＢ強度比を、同じ腫瘍細胞を、本明細書記載のポリペプチド構築物を発現する操作された細胞と共培養した場合のＩＦＮｇスポットの数に対してプロットした。
【図６Ｃ】図６Ａは認識および非認識原発性ＡＭＬサンプルにおけるＲｈｏＢの細胞内分布に関する代表的イメージを示す。図６Ｂが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＡ分布をＥＢＶ−ＬＣＬ４８における共焦点顕微鏡検査により測定したことである。図６Ｃが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＢ分布を２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において決定したことである。マウス骨髄由来樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。図６Ｄは細胞内ＲｈｏＢ分布と腫瘍標的細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞活性化能との相関性を示す。腫瘍細胞における核外：核ＲｈｏＢ強度比を、同じ腫瘍細胞を、本明細書記載のポリペプチド構築物を発現する操作された細胞と共培養した場合のＩＦＮｇスポットの数に対してプロットした。
【図６Ｄ】図６Ａは認識および非認識原発性ＡＭＬサンプルにおけるＲｈｏＢの細胞内分布に関する代表的イメージを示す。図６Ｂが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＡ分布をＥＢＶ−ＬＣＬ４８における共焦点顕微鏡検査により測定したことである。図６Ｃが示しているのは、ＡＢＰパミドロネートの存在下または非存在下の細胞内ＲｈｏＢ分布を２名の異なるドナーからの単球由来ヒト樹状細胞において決定したことである。マウス骨髄由来樹状細胞（＞９５％  ＣＤ１１ｃ＋）をＡＢＰパミドロネートで処理し、ＲｈｏＢの細胞内標識に使用した。図６Ｄは細胞内ＲｈｏＢ分布と腫瘍標的細胞のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞活性化能との相関性を示す。腫瘍細胞における核外：核ＲｈｏＢ強度比を、同じ腫瘍細胞を、本明細書記載のポリペプチド構築物を発現する操作された細胞と共培養した場合のＩＦＮｇスポットの数に対してプロットした。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、ＲｈｏＢ活性がＣＤ２７７膜移動性およびアクチン細胞骨格とのその会合を調節し、それによりＣＤ２７７のＪ配置の形成を調節することを示している。図７Ａが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞をＣＤ２７７−ｅｍＧＦＰ融合構築物でトランスフェクトし、培地、ＡＢＰゾレドロネートまたはカルペプチンで処理したことである。また、ＲｈｏＢがＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓによりノックアウトされたＨＥＫ  ２９３  ＣＤ２７７−ｅｍＧＦＰ＋  細胞、またはＣ３−トランスフェラーゼによっても処理された細胞において、ゾレドロネート処理を適用した。図は、処理を行った際（＋）のＣＤ２７７固定画分の割合を示す。記号は２回の実験の単一細胞測定を表す。図７Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞をパミドロネートで又はカルペプチンおよびＢＴＮ３分子で前処理し、繊維状アクチン（Ｆアクチン）を、それぞれ蛍光標識抗ＣＤ２７７抗体および蛍光ファロイジンを使用して染色したことである。ついでＣＤ２７７とＦ−アクチンとの共局在を、両方のシグナルの局在相関性を決定することにより評価した。記号は１回の実験の単一細胞測定を表す。中心線およびエラーバーは平均およびＳＥＭを表し、ｐ値は、マン−ホイットニー検定を用いて分析された有意性を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、ＲｈｏＢ活性がＣＤ２７７膜移動性およびアクチン細胞骨格とのその会合を調節し、それによりＣＤ２７７のＪ配置の形成を調節することを示している。図７Ａが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞をＣＤ２７７−ｅｍＧＦＰ融合構築物でトランスフェクトし、培地、ＡＢＰゾレドロネートまたはカルペプチンで処理したことである。また、ＲｈｏＢがＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓによりノックアウトされたＨＥＫ  ２９３  ＣＤ２７７−ｅｍＧＦＰ＋  細胞、またはＣ３−トランスフェラーゼによっても処理された細胞において、ゾレドロネート処理を適用した。図は、処理を行った際（＋）のＣＤ２７７固定画分の割合を示す。記号は２回の実験の単一細胞測定を表す。図７Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞をパミドロネートで又はカルペプチンおよびＢＴＮ３分子で前処理し、繊維状アクチン（Ｆアクチン）を、それぞれ蛍光標識抗ＣＤ２７７抗体および蛍光ファロイジンを使用して染色したことである。ついでＣＤ２７７とＦ−アクチンとの共局在を、両方のシグナルの局在相関性を決定することにより評価した。記号は１回の実験の単一細胞測定を表す。中心線およびエラーバーは平均およびＳＥＭを表し、ｐ値は、マン−ホイットニー検定を用いて分析された有意性を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｅは、ＲｈｏＢがＣＤ２７７分子と相互作用してＣＤ２７７のＪ配置を形成し、リン酸化抗原処理後に解離することを示している。図８Ａが示しているのは、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞を培地またはＡＢＰパミドロネートのいずれかで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングし、透過処理したことである。ついで、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用を、抗ＲｈｏＢおよび抗ＣＤ２７７抗体を使用するＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡにより評価した。ＲｈｏＢおよびＢＴＮ３に対する抗体の非存在下のＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡを陰性対照として用いた（赤色：ＰＬＡシグナル；青色：核［ＤＡＰＩ］；点線：細胞膜）。図は２つの独立した実験の代表例である。図８Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで処理し、等量の抗ＣＤ２７７−ＰＥ（ドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（アクセプター）抗体で共染色し、細胞におけるＦＲＥＴ効率を、「材料および方法」に記載されているとおりに測定したことである。示されているデータは三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける３つの独立した実験の平均  Ｓ．Ｅ．Ｍであり、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｃが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで前処理し、トリプシン処理し、透過処理し、抗ＲｈｏＢ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＦＲＥＴドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（ＦＲＥＴアクセプター）抗体で染色したことである。ついで、「材料と方法」に記載されているとおりに、フローサイトメトリーによりＦＲＥＴ効率を測定した。データは三重重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｄは、リン酸化抗原ｃＨＤＭＡＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示している。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下（左パネル）またはｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＭ）を用いて測定した。上パネルに示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。図８Ｅは、同じ実験設定を示しているが、この場合、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを含む。左パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている１２．５、２５、５０、１００および２００μＭであった。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。示されているＢ３０．２ドメインの濃度は��灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｅは、ＲｈｏＢがＣＤ２７７分子と相互作用してＣＤ２７７のＪ配置を形成し、リン酸化抗原処理後に解離することを示している。図８Ａが示しているのは、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞を培地またはＡＢＰパミドロネートのいずれかで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングし、透過処理したことである。ついで、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用を、抗ＲｈｏＢおよび抗ＣＤ２７７抗体を使用するＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡにより評価した。ＲｈｏＢおよびＢＴＮ３に対する抗体の非存在下のＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡを陰性対照として用いた（赤色：ＰＬＡシグナル；青色：核［ＤＡＰＩ］；点線：細胞膜）。図は２つの独立した実験の代表例である。図８Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで処理し、等量の抗ＣＤ２７７−ＰＥ（ドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（アクセプター）抗体で共染色し、細胞におけるＦＲＥＴ効率を、「材料および方法」に記載されているとおりに測定したことである。示されているデータは三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける３つの独立した実験の平均  Ｓ．Ｅ．Ｍであり、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｃが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで前処理し、トリプシン処理し、透過処理し、抗ＲｈｏＢ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＦＲＥＴドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（ＦＲＥＴアクセプター）抗体で染色したことである。ついで、「材料と方法」に記載されているとおりに、フローサイトメトリーによりＦＲＥＴ効率を測定した。データは三重重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｄは、リン酸化抗原ｃＨＤＭＡＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示している。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下（左パネル）またはｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＭ）を用いて測定した。上パネルに示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。図８Ｅは、同じ実験設定を示しているが、この場合、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを含む。左パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている１２．５、２５、５０、１００および２００μＭであった。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。示されているＢ３０．２ドメインの濃度は��灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｅは、ＲｈｏＢがＣＤ２７７分子と相互作用してＣＤ２７７のＪ配置を形成し、リン酸化抗原処理後に解離することを示している。図８Ａが示しているのは、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞を培地またはＡＢＰパミドロネートのいずれかで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングし、透過処理したことである。ついで、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用を、抗ＲｈｏＢおよび抗ＣＤ２７７抗体を使用するＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡにより評価した。ＲｈｏＢおよびＢＴＮ３に対する抗体の非存在下のＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡを陰性対照として用いた（赤色：ＰＬＡシグナル；青色：核［ＤＡＰＩ］；点線：細胞膜）。図は２つの独立した実験の代表例である。図８Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで処理し、等量の抗ＣＤ２７７−ＰＥ（ドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（アクセプター）抗体で共染色し、細胞におけるＦＲＥＴ効率を、「材料および方法」に記載されているとおりに測定したことである。示されているデータは三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける３つの独立した実験の平均  Ｓ．Ｅ．Ｍであり、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｃが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで前処理し、トリプシン処理し、透過処理し、抗ＲｈｏＢ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＦＲＥＴドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（ＦＲＥＴアクセプター）抗体で染色したことである。ついで、「材料と方法」に記載されているとおりに、フローサイトメトリーによりＦＲＥＴ効率を測定した。データは三重重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｄは、リン酸化抗原ｃＨＤＭＡＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示している。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下（左パネル）またはｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＭ）を用いて測定した。上パネルに示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。図８Ｅは、同じ実験設定を示しているが、この場合、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを含む。左パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている１２．５、２５、５０、１００および２００μＭであった。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。示されているＢ３０．２ドメインの濃度は��灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｅは、ＲｈｏＢがＣＤ２７７分子と相互作用してＣＤ２７７のＪ配置を形成し、リン酸化抗原処理後に解離することを示している。図８Ａが示しているのは、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞を培地またはＡＢＰパミドロネートのいずれかで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングし、透過処理したことである。ついで、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用を、抗ＲｈｏＢおよび抗ＣＤ２７７抗体を使用するＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡにより評価した。ＲｈｏＢおよびＢＴＮ３に対する抗体の非存在下のＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡを陰性対照として用いた（赤色：ＰＬＡシグナル；青色：核［ＤＡＰＩ］；点線：細胞膜）。図は２つの独立した実験の代表例である。図８Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで処理し、等量の抗ＣＤ２７７−ＰＥ（ドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（アクセプター）抗体で共染色し、細胞におけるＦＲＥＴ効率を、「材料および方法」に記載されているとおりに測定したことである。示されているデータは三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける３つの独立した実験の平均  Ｓ．Ｅ．Ｍであり、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｃが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで前処理し、トリプシン処理し、透過処理し、抗ＲｈｏＢ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＦＲＥＴドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（ＦＲＥＴアクセプター）抗体で染色したことである。ついで、「材料と方法」に記載されているとおりに、フローサイトメトリーによりＦＲＥＴ効率を測定した。データは三重重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｄは、リン酸化抗原ｃＨＤＭＡＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示している。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下（左パネル）またはｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＭ）を用いて測定した。上パネルに示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。図８Ｅは、同じ実験設定を示しているが、この場合、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを含む。左パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている１２．５、２５、５０、１００および２００μＭであった。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。示されているＢ３０．２ドメインの濃度は��灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｅは、ＲｈｏＢがＣＤ２７７分子と相互作用してＣＤ２７７のＪ配置を形成し、リン酸化抗原処理後に解離することを示している。図８Ａが示しているのは、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞を培地またはＡＢＰパミドロネートのいずれかで処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にローディングし、透過処理したことである。ついで、ＲｈｏＢとＣＤ２７７との相互作用を、抗ＲｈｏＢおよび抗ＣＤ２７７抗体を使用するＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡにより評価した。ＲｈｏＢおよびＢＴＮ３に対する抗体の非存在下のＤｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡを陰性対照として用いた（赤色：ＰＬＡシグナル；青色：核［ＤＡＰＩ］；点線：細胞膜）。図は２つの独立した実験の代表例である。図８Ｂが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで処理し、等量の抗ＣＤ２７７−ＰＥ（ドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（アクセプター）抗体で共染色し、細胞におけるＦＲＥＴ効率を、「材料および方法」に記載されているとおりに測定したことである。示されているデータは三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）サンプルにおける３つの独立した実験の平均  Ｓ．Ｅ．Ｍであり、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｃが示しているのは、ＨＥＫ  ２９３細胞を培地またはパミドロネートのいずれかで前処理し、トリプシン処理し、透過処理し、抗ＲｈｏＢ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＦＲＥＴドナー）および抗ＣＤ２７７−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（ＦＲＥＴアクセプター）抗体で染色したことである。ついで、「材料と方法」に記載されているとおりに、フローサイトメトリーによりＦＲＥＴ効率を測定した。データは三重重複サンプルにおける３つの独立した実験の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、この場合、マン−ホイットニー検定を用いて統計的有意性を分析した。図８Ｄは、リン酸化抗原ｃＨＤＭＡＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示している。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下（左パネル）またはｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＭ）を用いて測定した。上パネルに示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。図８Ｅは、同じ実験設定を示しているが、この場合、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを含む。左パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている１２．５、２５、５０、１００および２００μＭであった。動力学フィッティング曲線が黒色で示されている。下パネルにおいては、ｃＨＤＭＡＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。示されているＢ３０．２ドメインの濃度は��灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。
【図９Ａ】図９Ａ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼのゲル濾過プロファイル。１７．８ｍｌから１９．２ｍｌまでのピークは精製ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ単量体を含有していた。図９Ｂは、該ゲル濾過実験から収集されたＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを含有する画分（１７．５〜１９．５ｍｌ、０．５ｍｌ／画分）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図９Ｃはリン酸化抗原ＩＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示す（上パネル）。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ＩＰＰの非存在下（左パネル）またはＩＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて測定した。示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。同じ実験設定を用いたが、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを使用した（下パネル）。左パネルにおいては、ＩＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＣＤ２７７  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭであった。右パネルにおいては、ＩＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。
【図９Ｂ】図９Ａ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼのゲル濾過プロファイル。１７．８ｍｌから１９．２ｍｌまでのピークは精製ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ単量体を含有していた。図９Ｂは、該ゲル濾過実験から収集されたＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを含有する画分（１７．５〜１９．５ｍｌ、０．５ｍｌ／画分）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図９Ｃはリン酸化抗原ＩＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示す（上パネル）。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ＩＰＰの非存在下（左パネル）またはＩＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて測定した。示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。同じ実験設定を用いたが、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを使用した（下パネル）。左パネルにおいては、ＩＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＣＤ２７７  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭであった。右パネルにおいては、ＩＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。
【図９Ｃ】図９Ａ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼのゲル濾過プロファイル。１７．８ｍｌから１９．２ｍｌまでのピークは精製ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ単量体を含有していた。図９Ｂは、該ゲル濾過実験から収集されたＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼを含有する画分（１７．５〜１９．５ｍｌ、０．５ｍｌ／画分）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図９Ｃはリン酸化抗原ＩＰＰの存在下または非存在下のＲｈｏＧＴＰアーゼへの完全長ＣＤ２７７細胞内ドメイン（ＢＦＩ）の濃度依存的結合を示す（上パネル）。ＲｈｏＧＴＰアーゼへのＢＦＩの結合を、ＩＰＰの非存在下（左パネル）またはＩＰＰ（１：１）の存在下（右パネル）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて測定した。示されているＣＤ２７７  ＢＦＩの濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭである。同じ実験設定を用いたが、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを使用した（下パネル）。左パネルにおいては、ＩＰＰの非存在下で相互作用を測定した。示されているＣＤ２７７  Ｂ３０．２の濃度は、灰色で示されている３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭであった。右パネルにおいては、ＩＰＰ（１：１）の存在下で相互作用を測定した。
【図１０Ａ】図１０は、細胞内リン酸化抗原の蓄積がＣＤ２７７の細胞外コンホメーション変化を誘導して、ＣＤ２７７のＪ配置の形成をもたらすことを示している。ＨＥＫ  ２９３細胞を培地、Ｃ３トランスフェラーゼおよび／またはパミドロネートで前処理し、ついで細胞の表面膜を蛍光脂質コンジュゲートＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（ＦＲＥＴドナー）で染色し、ＢＴＮ３分子をクローン２０．１由来またはクローン１０３．２由来のマウス抗ＣＤ２７７  ｍＡｂで標識し、ついで二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４結合Ｆａｂフラグメント（ＧａＭ）（ＦＲＥＴアクセプター）で染色した。ＦＲＥＴ効率をフローサイトメトリーで測定した。データは三重重複サンプルにおける少なくとも３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。データの統計的有意性を、マン−ホイットニー検定により分析した。
【図１０Ｂ】図１０は、細胞内リン酸化抗原の蓄積がＣＤ２７７の細胞外コンホメーション変化を誘導して、ＣＤ２７７のＪ配置の形成をもたらすことを示している。ＨＥＫ  ２９３細胞を培地、Ｃ３トランスフェラーゼおよび／またはパミドロネートで前処理し、ついで細胞の表面膜を蛍光脂質コンジュゲートＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（ＦＲＥＴドナー）で染色し、ＢＴＮ３分子をクローン２０．１由来またはクローン１０３．２由来のマウス抗ＣＤ２７７  ｍＡｂで標識し、ついで二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４結合Ｆａｂフラグメント（ＧａＭ）（ＦＲＥＴアクセプター）で染色した。ＦＲＥＴ効率をフローサイトメトリーで測定した。データは三重重複サンプルにおける少なくとも３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。データの統計的有意性を、マン−ホイットニー検定により分析した。
【図１１】図１１は、本明細書に記載されているポリペプチド構築物ＴＣＲを発現する操作された細胞によるＣＤ２７７のＪ配置の認識をもたらす、腫瘍細胞における２成分メカニズムのモデルを示す。非活性化段階：リン酸化抗原（ｐＡｇ、黄色星印）の蓄積無し。これは核外領域からのＧＤＰ結合ＲｈｏＢ（赤丸＋ＧＤＰ）を維持する。活性化段階成分Ｉ：リン酸化抗原の蓄積の後、より多くのＧＴＰ結合ＲｈｏＢ形成（赤丸＋ＧＴＰ）が生じる。ＧＴＰ結合ＲｈｏＢは細胞内再区画化（黒矢印）を受けて核外領域に蓄積し、ＣＤ２７７（青色六角形）のＢ３０．２ドメイン近位連結領域（ＣＲ）に結合する形質膜における細胞骨格捕捉（膜から伸びる線）の促進によりＣＤ２７７の空間的再分布を促進する。活性化段階成分ＩＩ：ＧＴＰ結合ＲｈｏＢが解離し（黒矢印）、ｐＡｇがＣＤ２７７のＢ３０．２ドメインに結合し、これはＣＤ２７７の細胞外領域（ＥＲ）のコンホメーション変化を誘発して、本明細書に記載されているポリペプチド構築物の結合をもたらす。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは種々の細胞型におけるＲｈｏＢ分布および細胞ストレスの際のその変化を示す。図１２Ａにおいては、ＥＢＶ−ＬＣＬ系９３、ＣＬＭ細胞系Ｋ５６２ならびに末梢血から新たに単離された健常ドナー由来ＣＤ３＋  Ｔ細胞、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ１４＋  細胞を１００μＭ  パミドロネートと共にインキュベートし、ついで共焦点顕微鏡検査によりＲｈｏＢの細胞内分布に関して分析した。核領域の外側と内側とで検出されたＲｈｏＢシグナルの比が示されている。図１２Ｂにおいては、３５００ｃＧｙで照射され１００μＭ  パミドロネートで前処理された細胞をついで、図１２Ａの場合と同様にして、細胞内ＲｈｏＢに関して分析した。比は、非照射細胞と比較した場合のＲｈｏＢ分布の変化を示す。
【図１３Ａ】図１３ＡはＩＦＮγ産生による単離クローンの抗腫瘍反応性を示す。Ｔ細胞を標的細胞系Ｄａｕｄｉ（ダウディ）と共に１：１のＥ：Ｔ比で一晩コインキュベートした。１００μＭ  ＰＡＭの非存在下（上プロット）および存在下（下プロット）、刺激アッセイを行った。棒グラフは１つまたは２つ（この場合、エラーバーが存在する）の実験の代表例である。エラーバーは２つの生物学的重複実験のＳＥＭを表す。矢印は、既知ＴＣＲ配列を有するクローンを示す。図１３Ｂは１００μＭ  ＰＡＭの非存在下または存在下のＤａｕｄｉ対ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系に対するＩＦＮγ産生の散布図を示す。図１３Ｃは、標的としてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用する刺激アッセイを示す。
【図１３Ｂ】図１３ＡはＩＦＮγ産生による単離クローンの抗腫瘍反応性を示す。Ｔ細胞を標的細胞系Ｄａｕｄｉ（ダウディ）と共に１：１のＥ：Ｔ比で一晩コインキュベートした。１００μＭ  ＰＡＭの非存在下（上プロット）および存在下（下プロット）、刺激アッセイを行った。棒グラフは１つまたは２つ（この場合、エラーバーが存在する）の実験の代表例である。エラーバーは２つの生物学的重複実験のＳＥＭを表す。矢印は、既知ＴＣＲ配列を有するクローンを示す。図１３Ｂは１００μＭ  ＰＡＭの非存在下または存在下のＤａｕｄｉ対ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系に対するＩＦＮγ産生の散布図を示す。図１３Ｃは、標的としてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用する刺激アッセイを示す。
【図１３Ｃ】図１３ＡはＩＦＮγ産生による単離クローンの抗腫瘍反応性を示す。Ｔ細胞を標的細胞系Ｄａｕｄｉ（ダウディ）と共に１：１のＥ：Ｔ比で一晩コインキュベートした。１００μＭ  ＰＡＭの非存在下（上プロット）および存在下（下プロット）、刺激アッセイを行った。棒グラフは１つまたは２つ（この場合、エラーバーが存在する）の実験の代表例である。エラーバーは２つの生物学的重複実験のＳＥＭを表す。矢印は、既知ＴＣＲ配列を有するクローンを示す。図１３Ｂは１００μＭ  ＰＡＭの非存在下または存在下のＤａｕｄｉ対ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系に対するＩＦＮγ産生の散布図を示す。図１３Ｃは、標的としてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用する刺激アッセイを示す。
【図１４Ａ】図１４ＡはドナーＣの完全なＴＲＤＶレパートリーを示す。割合はクロノタイプの保有率を示す。１リード（ｒｅａｄ；読取り）／クロノタイプの頻度を有する配列は分析から除外される。図１４Ｂは、ＰＢＭＣ内への導入および選択操作の後の、選択されたＴＣＲ（ｎ＝７）のγδＴＣＲ発現のＭＦＩを、対照ＴＣＲのものと共に示している。図１４Ｃは、細胞系Ｄａｕｄｉに対するＴＥＧ形態の選択されたＴＣＲの機能的アビディティを、対照ＴＣＲのものと共に示している。ＴＥＧは、同等のγδＴＣＲ発現に基づいてグラフに示されている。
【図１４Ｂ】図１４ＡはドナーＣの完全なＴＲＤＶレパートリーを示す。割合はクロノタイプの保有率を示す。１リード（ｒｅａｄ；読取り）／クロノタイプの頻度を有する配列は分析から除外される。図１４Ｂは、ＰＢＭＣ内への導入および選択操作の後の、選択されたＴＣＲ（ｎ＝７）のγδＴＣＲ発現のＭＦＩを、対照ＴＣＲのものと共に示している。図１４Ｃは、細胞系Ｄａｕｄｉに対するＴＥＧ形態の選択されたＴＣＲの機能的アビディティを、対照ＴＣＲのものと共に示している。ＴＥＧは、同等のγδＴＣＲ発現に基づいてグラフに示されている。
【図１４Ｃ】図１４ＡはドナーＣの完全なＴＲＤＶレパートリーを示す。割合はクロノタイプの保有率を示す。１リード（ｒｅａｄ；読取り）／クロノタイプの頻度を有する配列は分析から除外される。図１４Ｂは、ＰＢＭＣ内への導入および選択操作の後の、選択されたＴＣＲ（ｎ＝７）のγδＴＣＲ発現のＭＦＩを、対照ＴＣＲのものと共に示している。図１４Ｃは、細胞系Ｄａｕｄｉに対するＴＥＧ形態の選択されたＴＣＲの機能的アビディティを、対照ＴＣＲのものと共に示している。ＴＥＧは、同等のγδＴＣＲ発現に基づいてグラフに示されている。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５（１×１０５）個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  ＬＭ１もしくはＣＬ５を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）な色素で染色した。細胞を１００μＭ  パミドロネート（＋ＰＡＭ条件）と共に２時間インキュベートした後、染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１５Ｂは、ＴＣＲデキストラマーを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｃは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個の細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ  ＬＭ１、ＣＴＥ−ＣＬ３もしくはＣＴＥ−ＣＬ５に結合しているもの、または結合していないもの）で染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｄは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。２つの抗ＣＤ２７７モノクローナル抗体（２０．１および１０３．２）を使用する結合競合アッセイ。７．５  １０４個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝２）を該抗体と共にプレインキュベートし、ＣＬ５ビーズと共に室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳデータの全ての分析をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａで行い、グラフをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成した。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５（１×１０５）個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  ＬＭ１もしくはＣＬ５を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）な色素で染色した。細胞を１００μＭ  パミドロネート（＋ＰＡＭ条件）と共に２時間インキュベートした後、染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１５Ｂは、ＴＣＲデキストラマーを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｃは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個の細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ  ＬＭ１、ＣＴＥ−ＣＬ３もしくはＣＴＥ−ＣＬ５に結合しているもの、または結合していないもの）で染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｄは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。２つの抗ＣＤ２７７モノクローナル抗体（２０．１および１０３．２）を使用する結合競合アッセイ。７．５  １０４個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝２）を該抗体と共にプレインキュベートし、ＣＬ５ビーズと共に室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳデータの全ての分析をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａで行い、グラフをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成した。
【図１５Ｃ】図１５Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５（１×１０５）個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  ＬＭ１もしくはＣＬ５を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）な色素で染色した。細胞を１００μＭ  パミドロネート（＋ＰＡＭ条件）と共に２時間インキュベートした後、染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１５Ｂは、ＴＣＲデキストラマーを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｃは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個の細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ  ＬＭ１、ＣＴＥ−ＣＬ３もしくはＣＴＥ−ＣＬ５に結合しているもの、または結合していないもの）で染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｄは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。２つの抗ＣＤ２７７モノクローナル抗体（２０．１および１０３．２）を使用する結合競合アッセイ。７．５  １０４個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝２）を該抗体と共にプレインキュベートし、ＣＬ５ビーズと共に室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳデータの全ての分析をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａで行い、グラフをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成した。
【図１５Ｄ】図１５Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５（１×１０５）個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  ＬＭ１もしくはＣＬ５を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）な色素で染色した。細胞を１００μＭ  パミドロネート（＋ＰＡＭ条件）と共に２時間インキュベートした後、染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１５Ｂは、ＴＣＲデキストラマーを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｃは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個の細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ  ＬＭ１、ＣＴＥ−ＣＬ３もしくはＣＴＥ−ＣＬ５に結合しているもの、または結合していないもの）で染色し、図１５Ａの場合と同様にして分析した。図１５Ｄは、ＹＧビーズを使用するＤａｕｄｉ細胞の染色を示す。２つの抗ＣＤ２７７モノクローナル抗体（２０．１および１０３．２）を使用する結合競合アッセイ。７．５  １０４個のＤａｕｄｉ細胞（ｎ＝２）を該抗体と共にプレインキュベートし、ＣＬ５ビーズと共に室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳデータの全ての分析をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａで行い、グラフをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成した。
【図１６】図１６が示しているのは、非機能的ＴＣＲ  ＬＭ１、中アフィニティＣＴＥ−ＣＬ３または高アフィニティＣＴＥ−ＣＬ５のいずれかを発現するＴＥＧをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（これは１００μＭ  パミドロネートまたは培地と共にプレインキュベートされた）と共にコインキュベートしたことである。コインキュベーションは最大１２０分間行い、ついで非結合細胞を洗い落とした。サンプルを抗ＣＤ３ｅ抗体およびＤＡＰＩで免疫染色し、共焦点顕微鏡分析に使用した。イメージをＤＡＰＩ＋  細胞（全細胞）およびＣＤ３陽性細胞（ＴＥＧ）の数に関して定量した。その比率が示されている。少なくとも１０個の独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果は、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。
【図１７Ａ】図１７Ａは免疫シナプスおよび定量方法を示す。図１７Ｂが示しているのは、シナプス領域の内側と外側とのＴＣＲシグナル強度の比を計算することにより、ＩＳにおけるＴＣＲの富化を測定したことである。少なくとも７つの独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果には、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。図１７Ｃおよび図１７Ｄが示しているのは、クラスターサイズの標的ＨＥＫ−２９３ＦＴ腫瘍細胞を１００μＭ  パミドロネートまたは培地で処理し、ＣＤ２７７−ＡＦ６４７で免疫染色したことである。ついでサンプルを超高分解能顕微鏡検査による分析に使用した。イメージをクラスターアルゴリズムＤＢＳＣＡＮで分析した。図１７Ｅは免疫シナプスのクラスターコンパクト性を示す。図１７ＦはＲＯＩ当たりのクラスター数を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａは免疫シナプスおよび定量方法を示す。図１７Ｂが示しているのは、シナプス領域の内側と外側とのＴＣＲシグナル強度の比を計算することにより、ＩＳにおけるＴＣＲの富化を測定したことである。少なくとも７つの独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果には、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。図１７Ｃおよび図１７Ｄが示しているのは、クラスターサイズの標的ＨＥＫ−２９３ＦＴ腫瘍細胞を１００μＭ  パミドロネートまたは培地で処理し、ＣＤ２７７−ＡＦ６４７で免疫染色したことである。ついでサンプルを超高分解能顕微鏡検査による分析に使用した。イメージをクラスターアルゴリズムＤＢＳＣＡＮで分析した。図１７Ｅは免疫シナプスのクラスターコンパクト性を示す。図１７ＦはＲＯＩ当たりのクラスター数を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ａは免疫シナプスおよび定量方法を示す。図１７Ｂが示しているのは、シナプス領域の内側と外側とのＴＣＲシグナル強度の比を計算することにより、ＩＳにおけるＴＣＲの富化を測定したことである。少なくとも７つの独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果には、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。図１７Ｃおよび図１７Ｄが示しているのは、クラスターサイズの標的ＨＥＫ−２９３ＦＴ腫瘍細胞を１００μＭ  パミドロネートまたは培地で処理し、ＣＤ２７７−ＡＦ６４７で免疫染色したことである。ついでサンプルを超高分解能顕微鏡検査による分析に使用した。イメージをクラスターアルゴリズムＤＢＳＣＡＮで分析した。図１７Ｅは免疫シナプスのクラスターコンパクト性を示す。図１７ＦはＲＯＩ当たりのクラスター数を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ａは免疫シナプスおよび定量方法を示す。図１７Ｂが示しているのは、シナプス領域の内側と外側とのＴＣＲシグナル強度の比を計算することにより、ＩＳにおけるＴＣＲの富化を測定したことである。少なくとも７つの独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果には、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。図１７Ｃおよび図１７Ｄが示しているのは、クラスターサイズの標的ＨＥＫ−２９３ＦＴ腫瘍細胞を１００μＭ  パミドロネートまたは培地で処理し、ＣＤ２７７−ＡＦ６４７で免疫染色したことである。ついでサンプルを超高分解能顕微鏡検査による分析に使用した。イメージをクラスターアルゴリズムＤＢＳＣＡＮで分析した。図１７Ｅは免疫シナプスのクラスターコンパクト性を示す。図１７ＦはＲＯＩ当たりのクラスター数を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ａは免疫シナプスおよび定量方法を示す。図１７Ｂが示しているのは、シナプス領域の内側と外側とのＴＣＲシグナル強度の比を計算することにより、ＩＳにおけるＴＣＲの富化を測定したことである。少なくとも７つの独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果には、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。図１７Ｃおよび図１７Ｄが示しているのは、クラスターサイズの標的ＨＥＫ−２９３ＦＴ腫瘍細胞を１００μＭ  パミドロネートまたは培地で処理し、ＣＤ２７７−ＡＦ６４７で免疫染色したことである。ついでサンプルを超高分解能顕微鏡検査による分析に使用した。イメージをクラスターアルゴリズムＤＢＳＣＡＮで分析した。図１７Ｅは免疫シナプスのクラスターコンパクト性を示す。図１７ＦはＲＯＩ当たりのクラスター数を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ａは免疫シナプスおよび定量方法を示す。図１７Ｂが示しているのは、シナプス領域の内側と外側とのＴＣＲシグナル強度の比を計算することにより、ＩＳにおけるＴＣＲの富化を測定したことである。少なくとも７つの独立したイメージに関して分析を行い、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡにより有意性を決定した。結果には、平均値とＳＤ値とを含む個々の測定値を示している。図１７Ｃおよび図１７Ｄが示しているのは、クラスターサイズの標的ＨＥＫ−２９３ＦＴ腫瘍細胞を１００μＭ  パミドロネートまたは培地で処理し、ＣＤ２７７−ＡＦ６４７で免疫染色したことである。ついでサンプルを超高分解能顕微鏡検査による分析に使用した。イメージをクラスターアルゴリズムＤＢＳＣＡＮで分析した。図１７Ｅは免疫シナプスのクラスターコンパクト性を示す。図１７ＦはＲＯＩ当たりのクラスター数を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  「ＬＭ１」もしくは「ＣＬ５」を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能な色素で染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１８Ｂは、デキストラマーを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色した。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、ＹＧビーズを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個のＭＬ１細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ「ＬＭ１」、「ＣＴＥ−ＣＬ３」もしくは「ＣＴＥ−ＣＬ５」に結合しているもの、または結合していないもの）で染色した。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  「ＬＭ１」もしくは「ＣＬ５」を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能な色素で染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１８Ｂは、デキストラマーを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色した。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、ＹＧビーズを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個のＭＬ１細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ「ＬＭ１」、「ＣＴＥ−ＣＬ３」もしくは「ＣＴＥ−ＣＬ５」に結合しているもの、または結合していないもの）で染色した。
【図１８Ｃ】図１８Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  「ＬＭ１」もしくは「ＣＬ５」を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能な色素で染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１８Ｂは、デキストラマーを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色した。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、ＹＧビーズを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個のＭＬ１細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ「ＬＭ１」、「ＣＴＥ−ＣＬ３」もしくは「ＣＴＥ−ＣＬ５」に結合しているもの、または結合していないもの）で染色した。
【図１８Ｄ】図１８Ａは、ＴＣＲ四量体を使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥ四量体（ビオチン対照またはγδＴＣＲ  「ＬＭ１」もしくは「ＣＬ５」を含有するもの）で室温で３０分間染色し、ついで固定可能な生存可能な色素で染色した。染色された細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。図１８Ｂは、デキストラマーを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。１＊１０Λ５個のＭＬ１細胞（ｎ＝４）を１００ｎＭ  ＳＡ−ＰＥデキストラマーで染色した。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、ＹＧビーズを使用するＭＬ１細胞の染色を示す。７．５＊１０Λ４個のＭＬ１細胞（ｎ＝３）を０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＹＧビーズ（γδＴＣＲ「ＬＭ１」、「ＣＴＥ−ＣＬ３」もしくは「ＣＴＥ−ＣＬ５」に結合しているもの、または結合していないもの）で染色した。
【図１９】図１９は、ｓＴＣＲ結合ビーズで染色されたＤａｕｄｉおよびＭＬ１細胞の代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。
【０２４４】
実施例
これらの実施例は単なる例示目的で記載されているに過ぎず、本出願に記載されている特許請求の範囲を限定するものではない。
【０２４５】
実施例１．ＳＡＰＰＨＩＲＥ（ＳＮＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｈｕｎｔ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）によるＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性標的細胞認識に関連する遺伝子座の特定
腫瘍細胞の遺伝的バックグラウンドにおける差異はＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ操作Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載されている細胞）によるこれらの細胞の認識に影響を及ぼす。したがって、幾つかの家系（Ｄａｕｓｓｅｔら，１９９０）から得られ数百万個のＳＮＰ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ，２００３）に関して遺伝子型決定されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＥＢＶ−ＬＣＬ）の大規模コレクションを含むＣｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｔｕｄｅ  ｄｕ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ  Ｈｕｍａｉｎ  （ＣＥＰＨ）からの細胞系のライブラリーを使用した。１つの定められたＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲを発現するように操作されたＣＤ４＋  αβＴ細胞を機能的スクリーニングに使用して、多様なγδＴＣＲレパートリーおよびＮＫ受容体の種々の発現による認識の変動を排除した。Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬの認識表現型をＩＦＮγ産生により評価し、それは３３個のＥＢＶ−ＬＣＬの活性化表現型を示したが、７個は非活性であった（図１Ａおよび１Ｂ）。接合性分析は、非活性化表現型を有するＥＢＶ−ＬＣＬが、ＳＡＰＰＨＩＲＥによる分析で、活性化表現型を有するものより強力であることを示した。候補遺伝子座に関する仮定的接合性を、ＣＥＰＨファミリートリオ内の古典的メンデル遺伝パターンを使用して推定し、この場合、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識に対する候補対立遺伝子の影響が支配的であると仮定された。ＣＥＰＨ細胞系の家系と組合された得られた認識表現型は、多数のＬＣＬ系をスクリーニングする必要性を回避し、１２名のＣＥＰＨ個体の候補遺伝子座の接合性の正確な予測を可能にした（図２Ａ）。ついで仮定的遺伝子座接合性を、研究集団内のＳＮＰの利用可能な遺伝子型情報と相関させて、予測接合性と完全に（１００％）相関する遺伝子型を有する１７個のＳＮＰを特定した（図２Ｂ）。これらの１７個のＳＮＰはいずれも、また、高い連鎖不平衡（ｒ２＞０．８）内のそれらのプロキシＳＮＰも、タンパク質コード配列における変化を引き起こすことによっては遺伝子に直接的な影響を及ぼさなかったため、特定されたＳＮＰは、直接的な役割を果たしているのではなく、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞認識に対する感受性に関連した遺伝的領域に関する代替マーカーに相当しうると推定された。また、それらの１７個のＳＮＰのゲノム近傍を隣接候補遺伝子に関して照会した（図２Ｃ）。
【０２４６】
Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞媒介性標的認識に関するこれらの遺伝子の関連性を試験するために、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞活性化ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８における１７個のＳＮＰ隣接遺伝子の全てをノックダウンした。ついで、ＩＦＮγ産生を測定することにより、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の活性化に対するノックダウンの効果を評価した。ＩＦＮγ産生は３つの遺伝子（ＲＡＢ４Ａ、ＲＨＯＢおよびＵＢＥ３Ｃ）のノックダウンにより低下した（図２Ｂ）。潜在的なノックダウン効果が、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ依存的活性化に選択的に影響を及ぼす遺伝子に対するものであったことを確認するために、ＥＢＶ−ＬＣＬ系４８のそれらの３つのノックダウン変異体にウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）ペプチドを添加し、同族ＷＴ１特異的αβＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞での認識を試験した（Ｋｕｂａｎら，２００７）。小さなＧＴＰアーゼ  ＲｈｏＢの選択的ノックダウンはＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲの活性化に有意な影響を及ぼしたが、ａβＴＣＲが操作されたＴ細胞には影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。原型Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞標的細胞系ＤａｕｄｉにおけるＲｈｏＢの部分的ノックダウンの後（図３Ｂ）、および腎癌細胞系ＭＺ１８５１ＲＣにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性部分的ＲｈｏＢノックアウトの後（図４Ａ）、類似したデータが認められた。興味深いことに、２９３  ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＢの完全なノックアウトでさえ、標的細胞媒介性Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞活性化の部分的枯渇をもたらしたに過ぎなかった（図３Ａ）。また、２９３  ＨＥＫ細胞におけるＲｈｏＡまたはＲｈｏＣ遺伝子のノックアウトは、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞を活性化するそれらの能力に有意な影響を与えず（図４Ｂおよび図３Ｃ）、このことは、ＲｈｏＢが、非重複的役割において、一定のＶγ９Ｖδ２  ＴＣによる腫瘍細胞の認識を調節することを強調している。
【０２４７】
実施例２．本明細書に記載されているポリペプチド構築物による標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置の認識はＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性に依存的である
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼアクチベーターであるカルペプチンまたはインヒビターＣ３トランスフェラーゼの存在下、種々の腫瘍細胞系を予熱することにより、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の活性化に対するＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼ活性の影響を評価した。カルペプチンでの前処理はＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による認識のためにＥＢＶ−ＬＣＬ  ９３細胞を有意に感作したが、逆に、Ｃ３トランスフェラーゼでのＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの阻害は、ＬＣＬ  ４８細胞によるＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の活性化を著しく低下させた（図４Ｄ）。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性の調節はＷＴ１ａβＴＣＲ導入Ｔ細胞によるＷＴ１ペプチド添加ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞の認識に影響を及ぼさなかった。ＲｈｏＢの酵素活性がＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による腫瘍細胞認識を調節することを確認するために、ＧＤＰ結合状態に対応する野生型もしくはドミナントネガティブ形態（ＲｈｏＢ−ＤＮ）で、またはＲｈｏＢのＧＴＰ結合形態に対応する構成的活性形態（ＲｈｏＢ−ＣＡ）（Ｋａｍｏｎら，２００６）で、ＨＥＫ  ２９３細胞をトランスフェクトし、それらをＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞の標的細胞として使用した（図４Ｅ）。ＲｈｏＢ−ＣＡ突然変異体を過剰発現するＨＥＫ細胞は、野生型ＲｈｏＢを発現する細胞よりも有意に強いＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ特異的応答を誘発することが可能であり、一方、ＲｈｏＢ−ＤＮトランスフェクト化ＨＥＫ細胞は、野生型ＲｈｏＢを発現する細胞と比較して、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞を刺激する有意に低下した能力を示した。これらの結果は、癌細胞におけるＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼの生化学的活性の調節が、ＣＤ２７７のＪ配置またはＪコンファメーションに選択的に結合するポリペプチドを発現する操作された細胞、例えばＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  細胞によるそれらの癌細胞の認識に有用であることを示唆している。
【０２４８】
実施例３．標的細胞上のＣＤ２７７のＪ配置の認識はＲｈｏＢの細胞内分布に依存的である
ＲｈｏＢは、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞を活性化しうる細胞内の核領域から選択的に排除された（図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａおよび図６Ｄ）。核からの又は核膜から核外部位へのＲｈｏＢの再局在化は、ＡＢＰにより、および可溶性リン酸化抗原ＩＰＰにより、細胞系において誘導された（図５Ｃおよび図５Ｄ）。このことは、この過程が細胞内リン酸化抗原の蓄積に依存的であることを強調している。ＲｈｏＡのような他のＧＴＰアーゼの均一な細胞内分布はＡＢＰ処理に際して変化しなかった（図６Ｂ）。このことは、ＲｈｏＡのノックダウンがＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識に影響を及ぼさなかったという観察を支持している（図４Ｂ）。ＲｈｏＢはヒトにおいては核から除外されたが、ＡＢＰで選択的に処理されたマウス樹状細胞においては除外されなかった。ＲｈｏＢタンパク質配列が両方の種において同一であるにもかかわらず、それが生じたのである（図５Ｅおよび図６Ｃ）。ＲｈｏＢの再分布が白血病癌幹細胞においてもＡＢＰ処理に際して生じるかどうかを試験するために、白血病芽細胞、癌幹細胞および健常幹細胞を、フローマーカーに基づいて、全く同じドナーから選別し、ＲｈｏＢの分布を定量した。実際、急性骨髄性白血病患者ドナーからの初代芽細胞においては、ＲｈｏＢの局在化は、白血病幹細胞を含むＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ操作Ｔ細胞による認識と相関したが（図５Ｂおよび図６Ａ）、同じドナーからの健常幹細胞の場合には相関しなかった（図５Ｆ）。総合すると、これらの結果は、腫瘍細胞における小さなＧＴＰアーゼＲｈｏＢの細胞内分布の調節（例えば、核からのＲｈｏＢの排除）がＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的化に対するそれらの感受性を増強することを示唆している。
【０２４９】
実施例４．ＲｈｏＢはＣＤ２７７の膜移動性および癌細胞上のＣＤ２７７のＪ配置の形成を調節する
細胞骨格再構成およびアクチンストレスファイバーの形成における重要な作用因子であるＡＢＰおよびＲｈｏＢの、ＣＤ２７７の移動性への影響を試験した。ＡＢＰゾレドロネートでの２９３  ＨＥＫ細胞の処理はＣＤ２７７膜の移動性の低下をもたらした。顕著なことに、カルペプチンでの処理は、ＣＤ２７７の固定化を、ＡＢＰ処理単独の場合に類似したレベルまで誘導し、一方、Ｃ３トランスフェラーゼはこのＡＢＰ効果を相殺した（図７Ａ）。これは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性がメバロン酸経路の上流のＣＤ２７７膜固定化に作用する可能性を示している。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓによるＲｈｏＢの選択的枯渇はＣＤ２７７のＡＢＰ誘導性固定化を培地対照と同等のレベルまで抑制し、このことは、ＣＤ２７７の移動性におけるＡＢＰ媒介性変化がＲｈｏＢに依存的であることを示唆した。
【０２５０】
次に、観察されたＣＤ２７７移動度変化およびＪ配置形成の媒介におけるＲｈｏＢ誘導性細胞骨格再構成の役割を評価するために、ＣＤ２７７分子とＦアクチンとの関係をタンタライゼーション（ｔａｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）実験により調べた。ＨＥＫ  ２９３細胞を蛍光標識抗ＣＤ２７７およびファロイジンで染色し、ＡＢＰおよびカルペプチンでの処理に応じたタンタライゼーション係数を決定した。培地内の細胞においては、ＣＤ２７７とＦ−アクチンとの、可変性であるが相当な共局在化が観察され、ＡＢＰ処理により著しく低減した（図７Ｂ）。顕著なことに、そしてＣＤ２７７膜移動性に対するその効果に類似して、カルペプチンはＣＤ２７７とＦアクチンとの間のタンタライゼーションを、ＡＢＰ処理で観察されたものと同等のレベルまで減少させた。この減少は、リン酸化抗原の蓄積およびＲｈｏの活性化の両方が、細胞骨格に包囲された膜ドメインの形成を誘導し、ここで、ＣＤ２７７分子が捕捉され固定化されてＣＤ２７７のＪ配置を形成しうることを示唆している。重要なことに、Ｃ３−トランスフェラーゼはＡＢＰ誘導性ＣＤ２７７−アクチン分離を妨げ、このことは、再び、この過程における活性Ｒｈｏの重要な関与を示している。総合すると、これらのデータは、細胞骨格再構成およびＣＤ２７７のＪ配置の形成によるＣＤ２７７膜移動性の調節が、Ｊ配置に特異的に結合するポリペプチドを発現する操作された細胞、例えばＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞による標的認識に寄与することを示唆している。
【０２５１】
実施例５．ＲｈｏＢは、本明細書に記載されているポリペプチド構築物、例えばＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲにより認識される癌細胞におけるＣＤ２７７ホモ二量体と相互作用する
Ｊ配置を形成するためにはＣＤ２７７の膜固定化におけるＲｈｂＢ活性が強く要求されることを考慮して、ＣＤ２７７の調節がＲｈｏＢとの直接的な相互作用を伴うかどうかを試験した。インシトゥ／近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を用いて、ＲｈｏＢおよびＣＤ２７７は、ＡＢＰで前処理された場合にのみ、認識ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞において接近していることが観察された（図８Ａ  図５Ａ）。重要なことに、ＰＬＡシグナルは、典型的には、核領域から排除され、形質膜付近に分布していた。これは、ＲｈｏＢが、発現ＣＤ２７７のＪ配置の形成を調節することにより、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞認識に関与するという、本発明者らのデータに合致している。
【０２５２】
ＣＤ２７７が細胞状況で発現された場合にホモ二量体として存在するかどうかを決定するために、およびより一層高い分解能でＲｈｏＢ−ＣＤ２７７相互作用を研究するために、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて近接相互作用を調べた。ＦＲＥＴ適合性融合タンパク質を過剰発現させることにより、またはＦＲＥＴ適合性蛍光色素に結合した抗体で内因性タンパク質を標識することにより、ＡＢＰ感受性ＨＥＫ  ２９３細胞においてフローサイトメトリーＦＲＥＴ測定を行った。これらの実験は、ＣＤ２７７分子が癌細胞の細胞表面上でホモ二量体として発現されることを示したが（図８Ｂ）、ＣＤ２７７分子のペア形成はＡＢＰ誘導性リン酸化抗原蓄積に対して非感受性であった。ＲｈｏＢとＣＤ２７７との近接結合はＡＢＰ未処理ＨＥＫ細胞においては検出不能であったが、細胞をＡＢＰで処理した後には著しく増加した（図８Ｃ）。Ｄ２７７の細胞内ドメイン上のＲｈｏＢに対する可能なドッキング部位を形式的に定めるために、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた。ＲｈｏＢ結合は組換え全長ＢＴＮ３Ａ１細胞内ドメイン（ＢＦＩ）では検出されたが（図８Ｄ；左パネルおよび表１）、膜貫通ドメインへのＮ末端領域連結を欠く組換えＣＤ２７７  Ｂ３０．２ドメインを使用した場合には有意に低減した（図８Ｅ；左パネル）。これらのデータは、ＲｈｏＢ  ＧＴＰアーゼへの結合におけるＣＤ２７７細胞内ドメインの膜近位領域の重要な役割を示している。興味深いことに、ＢＦＩへのＲｈｏＢの結合は、可溶性リン酸化抗原ｃＨＤＭＡＰＰの存在下、ほぼ完全に消失した（図８Ｄ；右パネル）。同じ実験で、生理学的にはより関連しているが遥かに低いアフィニティのｐＡｇ  ＩＰＰを適用した場合、ＢＬＩはＢＦＩからのＲｈｏＢのｐＡｇ誘導性解離を解明できなかった（図９Ｃ）。これは、おそらく、該アッセイの技術的限界によるものであろう。要約すると、これらのデータは、表面膜におけるＲｈｏＢとＣＤ２７７分子との近接相互作用を促進するように設計された方法および組成がＪ配置の形成およびＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲによるその認識を促進することを示している。
【表１】
2020520367.tif 000003
【０２５３】
実施例６．リン酸化抗原の蓄積はＣＤ２７７二量体からＪ配置へのコンホメーション変化に関連している
リン酸化抗原レベルの増加に応答したＪ配置へのＣＤ２７７のコンホメーション変化を調べるために、未刺激またはＡＢＰ刺激ＨＥＫ２９３細胞の表面膜を蛍光脂質コンジュゲートＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（ドナー）で標識し、ついでアクセプター色素標識ＢＴＮ３特異的抗体で氷上で染色して、生理学的状況下でこれらの抗体により引き起こされうるコンホメーション変化を防いだ。ＡＢＰ刺激の非存在下では、染色膜と両抗体との間の強力なＦＲＥＴ効率が観察された（図１０Ｂ）。このことは、ＣＤ２７７  Ｉｇ−Ｖドメインが細胞膜に接近していることを示唆している。しかし、顕著なことに、ＡＢＰでの細胞の処理はＦＲＥＴシグナルの著しい減少をもたらした（図１０Ｂ）。このことは、細胞内リン酸化抗原の蓄積がＢＴＮ３分子のコンホメーション変化に関連していることを示している。この変化は、細胞膜からＩｇ−Ｖドメインが顕著に離れることを含む。重要なことに、細胞のＲｈｏインヒビターＣ３−トランスフェラーゼ処理（図３Ｆ）はＣＤ２７７ホモ二量体のＡＢＰ駆動性コンホメーション変化を妨げず（図１０Ｂ）、このことは、このコンホメーション変化がＲｈｏＢの酵素活性に非依存的であることを示している。これらのデータは、ＣＤ２７７の二量体化を促進する方法および組成物が、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲにより認識される分子シグネチャー、すなわち、ＣＤ２７７のＪ配置として作用し、または該分子シグネチャーに寄与することを示している。
【０２５４】
図１１は、本明細書に示されているデータに基づくＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞活性化のモデルを示す。非活性化段階では、核外領域からのＧＤＰ結合ＲｈｏＢ（丸＋ＧＤＰ）を保持するリン酸化抗原（ｐＡｇ、黄色星印）の蓄積は存在しない。活性化段階成分Ｉにおいては、リン酸化抗原の蓄積の後、より多くのＧＴＰ結合ＲｈｏＢ形成（丸＋ＧＴＰ）が生じる。ＧＴＰ結合ＲｈｏＢは細胞内再区画化（黒矢印）を受けて核外領域に蓄積し、ＣＤ２７７（青色六角形）のＢ３０．２ドメイン近位連結領域（ＣＲ）に結合する形質膜における細胞骨格捕捉（膜から伸びる線）の促進によりＪ配置へのＣＤ２７７の空間的再分布を促進する。活性化段階成分ＩＩにおいては、ＧＴＰ結合ＲｈｏＢが解離し（黒矢印）、ｐＡｇがＣＤ２７７のＢ３０．２ドメインに結合し、これはＣＤ２７７の細胞外領域（ＥＲ）のコンホメーション変化を誘発して、ＣＤ２７７のＪ配置の形成をもたらし、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｔ細胞の活性化を招く。
【０２５５】
実施例７．特定されたＳＮＰはＬＣＬ系の認識だけでなく、固形腫瘍細胞系を含む他の腫瘍細胞系の認識をも予測する。
【０２５６】
ＳＮＰ  Ａ／ＧまたはＧ／Ｇの陽性予測値はＡ／Ａの陰性予測値より強力であり、ＴＣＲのアフィニティに依存的である（表２を参照されたい）。表２においては、クローン５は、クローン１１５によりコードされるγ９δ２  ＴＣＲより高いアフィニティを有するγ９δ２  ＴＣＲをコードしている（Ｍａｒｃｕ−Ｍａｌｌｎａら，“Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  αβ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  γδ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｂｌｏｏｄ，１１８：５０−５９（２０１１））。したがって、このデータに基づけば、ＴＣＲアフィニティが高ければ高いほど、
１）陽性予測値は良好になる（つまり、含まれている患者は、応答者である可能性が高い）。
【０２５７】
２）陰性予測値は不良になる（つまり、応答者である患者が除外されうる）。
【０２５８】
表２のデータに関しては、異なる腫瘍細胞の遺伝子型を配列決定により評価した。腫瘍細胞の認識をＩＦＮα−ＥＬＩｓｐｏｔアッセイまたはＥＬＩＳＡにより評価し、この場合、示されている腫瘍細胞系を、Ｇ１１５またはクローン５鎖を発現するＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞に対する標的として使用した。０は、認識されないことを示す。１は有意な認識を示す。示されたＳＮＰに関する偽陰性および真性陽性認識が計算される。
【０２５９】
これらのデータは、ＲｈｏＢが、定められたγδＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞（すなわち、「ＴＥＧ細胞」）による腫瘍細胞の認識の重要な調節因子であること、およびγ９δ２ＴＣＲのアフィニティの増強がこのメカニズムを部分的に克服しうることを示している。また、照射のようなストレスはメカニズム（細胞膜近傍へのＲｈｏＢの再配置）を誘導せず、また、認識も誘導しない（図１２を参照されたい）。
【表２】
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【０２６０】
実施例８．Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼの外に位置するＳＮＰはＲｈｏ−ＧＴＰアーゼに影響を及ぼしうる
幾つかの場合には、目的遺伝子内に位置する定められたＳＮＰは、遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または機能に直接的な影響を及ぼす。しかし、幾つかの場合には、特定されたＳＮＰはこれらの領域内に直接的には位置せず、スプライス変異体は検出されないかもしれない。
【０２６１】
１つの仮説は、Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼの外に位置するＳＮＰがＲｈｏ−ＧＴＰアーゼの活性に影響を及ぼしうるということである。ＳＡＰＰＨＩＲＥ戦略に使用されるデータベースは完全ではない可能性があり、したがって、全てのＳＮＰを網羅しているとは限らない。マーカーＳＮＰの遺伝子型と相関する遺伝的変異を更に特定するために、主にＲｈｏ−ＧＴＰアーゼのプロモーター領域に焦点を合せた拡張ゲノム配列決定を行う。Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼプロモーター領域はマウスとヒトとで異なるが、Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼ自体の配列は同一である。この観察は、γδ２  Ｔ細胞がマウスにおいて観察されない理由を潜在的に説明しうるであろう。また、最近公開されたＳＡＰＰＨＩＲＥの次世代データベースが使用され、これは、Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼのゲノム領域内に位置するＳＮＰを検出するためのより重要なＳＮＰ分析を可能にする。ＳＡＰＰＨＩＲＥの改良２．０バージョンは、プロキシＳＮＰ（すなわち、ＳＮＰヒットを有する高ＬＤにおけるＳＮＰ；ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｍｐｇ／ｓｎａｐ／ｌｄｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）を含めること、および（プロキシ）ＳＮＰ（例えば、ミスセンス、プロモーター、調節領域など；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔｓｎｐ．ｉｂｍｓ．ｓｉｎｉｃａ．ｅｄｕ．ｔｗ／）の機能を予測することにより開発される。また、ＳＮＰは、発現量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ）分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎｅｖａｒ／）を用いて差次的遺伝子発現と相関され、候補遺伝子間の共通の細胞過程または経路がＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）用語により推定される。特に、ＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子）、ＧＡＰ（ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）およびＧＤＩ（グアニンヌクレオチド交換インヒビター）分子ファミリーに属する約１３０個の遺伝子を含む、Ｒｈｏ調節タンパク質をコードする遺伝子が標的化される。したがって、遺伝子はＲｈｏ−ＧＴＰアーゼと同じ染色体領域に頻繁に位置し、したがって、マーカーＳＮＰにも近い。そのような遺伝子は更なる計算解析および配列解析の対象となる。
【０２６２】
予測結果：例えばマーカーＳＮＰに関連したＲｈｏ−ＧＴＰアーゼのプロモーター領域または調節遺伝子内のＳＮＰが特定されうる。フォローアップ研究は、定められたＳＮＰによるＲｈｏ−ＧＴＰアーゼの差次的調節に関する機能データを得るためのプロモーター研究、またはＲｈｏ−ＧＴＰアーゼの調節タンパク質の過剰発現もしくは阻害の研究を含みうる。
【０２６３】
実施例９．実験手順
細胞および試薬
細胞および試薬  ＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系（ＣＥＵ集団パネル）はＴｕｎａ  Ｍｕｔｉｓ（ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からの親切な贈り物であった。Ｄａｕｄｉ（ダウディ）、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ＦＴおよびＰｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞系はＡＴＣＣから入手した。ＬＣＬ−ＴＭ（ＣＥＰＨパネルとは別のＥＢＶ−ＬＣＬ系）はＰｈｉｌ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって快く提供された。ＭＺ１８５１ＲＣはＢａｒｂａｒａ  Ｓｅｌｉｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって快く提供された。Ｈｅｋ２９３、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ、ＳＷ４８０、ＭＺ１８５１ＲＣ細胞を、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％  ＦＣＳ（Ｂｏｄｉｎｃｏ）で補足されたＤＭＥＭ内で培養し、全ての他の細胞系を、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ内で培養した。新鮮な初代ＰＢＭＣを、Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給されたバフィーコートからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単離した。凍結原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）サンプルはＭａｔｔｈｉａｓ  Ｔｈｅｏｂａｌｄ（Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって快く提供され、ＧＣＰおよびヘルシンキの規制に準拠して収集された。
【０２６４】
以下の試薬を使用した：パミドロネート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ゾレドロン酸一水和物（ｚｏｌｉｄｒｏｎａｔｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カルペプチン（Ｒｈｏ活性化因子ＩＩ  ＣＮ０３，Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  Ｉｎｃ）、Ｃ３トランスフェラーゼを（ＲｈｏインヒビターＩ  ＣＴ０４、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  Ｉｎｃ）、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（ＦＴＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼインヒビター（ＧＧＴＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０２６５】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために使用した抗体には、以下のものが含まれた：パン−γδＴＣＲ−ＰＥ（クローンＩＭＭＵ５１０，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８−ＡＰＣ（ＢＤ）、非コンジュゲート化ウサギポリクローナルＲｈｏＢ（Ａｂｃａｍ社）、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。マウスａ−ＣＤ２７７  ｍＡｂ（クローン＃２０．１および１０３．２）はＤ．Ｏｌｉｖｅｒ（ＩＮＳＥＲＭ  Ｕ８９１，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって快く提供された。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＦＡＣＳＣａｎｔｏ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）で処理し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で分析した。初代白血病幹細胞および健常前駆細胞を、既に記載されているとおりに（Ｔｅｒｗｉｊｎら，２０１４）、表現型マーカーに従い選別した。
【０２６６】
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＳＯＲＰ（赤色、青色および紫色固体レーザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用）を使用して、細胞を選別した。全手順の間、細胞を氷上で維持した。細胞をＡｎｔｉ−ＣＤ４５ＲＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｎｔｉ−ＣＤ３８ＡＰＣ、Ａｎｔｉ−ＣＤ３４  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＶ４２１、Ａｎｔｉ−ＣＤ４５  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ５００（全て、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で標識した。ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  幹細胞を、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいて選別した。ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞は腫瘍性であり、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞は正常造血幹細胞である。更に、ＣＤ３４＋  ＣＤ３８＋  前駆細胞を選別した。
【０２６７】
ＴＣＲのレトロウイルス形質導入
ＴＣＲのレトロウイルス形質導入：  Ｖγ９Ｖδ２−ＴＣＲクローンＧ１１５（Ａｌｌｉｓｏｎら，２００１）およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ＷＴ１１２６−１３４特異的αβＴＣＲ（Ｋｕｂａｌｌら，２００７）を、記載されているとおりに（Ｍａｒｃｕ−Ｍａｌｉｎａら，２０１１，Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉら，２００１）、αβＴ細胞内に導入した。簡潔に説明すると、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏパッケージング細胞をｇａｇ−ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６０）、ｅｎｖ（ｐＣＯＬＴ−ＧＡＬＶ）、およびＴＣＲγ／β鎖−ＩＲＥＳ−ネイマイシンまたはＴＣＲδ／α鎖−ＩＲＥＳ−ピューロマイシンを含有するｐＢｕｌｌｅｔレトロウイルス構築物でトランスフェクトした。αＣＤ３（３０ｎｇ／ｍｌ）（クローンＯＫＴ３，Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）およびＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で前活性化されたＰＢＭＣに、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２および４μｇ／ｍｌ  ポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、４８時間以内にウイルス上清を２回形質導入した。形質導入されたＴ細胞をαＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（０．５×１０６ビーズ／１０６細胞）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）での刺激により増殖させ、８００μｇ／ｍｌ  ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）および５μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１週間選択した。ＣＤ４＋  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、ＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用するＭＡＣＳ選別により単離した。
【０２６８】
形質導入後、形質導入されたＴ細胞を１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ）、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに照射同種ＰＢＭＣ、ＤａｕｄｉおよびＬＣＬ−ＴＭ細胞で隔週で刺激した。新鮮なＩＬ−２を週２回添加した。ＣＤ４＋  集団のトランスジェニックＴＣＲ発現および純度をフローサイトメトリーによって常套的に評価した。
【０２６９】
機能性Ｔ細胞アッセイ
既に記載されているとおりに（Ｓｃｈｅｐｅｒら，２０１３，Ｍａｒｃｕ−Ｍａｌｉｎａら，２０１１）、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを行った。簡潔に説明すると、１５，０００個のＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ形質導入または模擬形質導入Ｔ細胞および５０，０００個の標的細胞（比０．３：１）を、抗ＩＦＮγ抗体（クローン１−Ｄ１Ｋ）（Ｍａｂｔｅｃｈ）で予めコーティング（被覆）されたニトロセルロース底９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で２４時間共培養した。プレートを洗浄し、二次ビオチン化抗ＩＦＮγ抗体（クローン７−Ｂ６−１）（Ｍａｂｔｅｃｈ）と共にインキュベートし、ついでストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。ＩＦＮγスポットをＴＭＢ基質（Ｓａｎｑｕｉｎ）で可視化し、ＥＬＩＳＰＯＴ解析ソフトウェア（Ａｅｌｖｉｓ）を使用してスポットの数を定量した。
【０２７０】
あるいは、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞および標的細胞を丸底９６ウェルプレート内で前記のとおりに共培養し、上清中のＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。示されている場合には、標的細胞をパミドロネート（１００μＭ）、ＩＰＰ（１５μＭ）、ＦＴＩ（１０μＭ）、ＧＧＴＩ（５０μＭ）、カルペプチン（２μｇ／ｍｌ）またはＣ３トランスフェラーゼ（２０μｇ／ｍｌ）で前処理した後、コインキュベーションを行った。ＷＴ１αβＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の刺激を試験するために、ＨＬＡ−Ａ２＋  細胞系ＥＢＶ−ＬＣＬ４８およびＭＺ１８５１ＲＣに１０μＭ  ＷＴ１１２６−１３４  ペプチドを添加した。
【０２７１】
接合性／ＳＮＰ相関分析
Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ形質導入ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＣＥＰＨ  ＥＢＶ−ＬＣＬ系［培地、パミドロネート（１００μＭ）またはＩＰＰ（１５μＭ）のいずれかで前処理されたもの］の認識をＥＬＩＳＰＯＴにより決定した。模擬形質導入Ｔ細胞をエフェクター対照として含めた。模擬形質導入細胞によるＩＦＮγ産生を誘発した任意のＥＢＶ−ＬＣＬ系を該分析から除外した。単一アッセイにおけるＶγ９Ｖδ２  ＴＣＲ＋  Ｔ細胞によるＥＢＶ−ＬＣＬ系の認識は、ＥＢＶ−ＬＣＬ前処理（すなわち、培地、パミドロネートまたはＩＰＰ）に無関係に、健常対照標的細胞の応答において生じたものと比較して、ＩＦＮγスポットにおける少なくとも２倍の増加として定義された。ＥＢＶ−ＬＣＬ系は、５つの独立した実験のうちの少なくとも３つにおいて認識された場合に活性化するものとして定義された。ＣＥＰＨ家系内の古典的メンデル遺伝パターンを使用して、候補遺伝子座に関する仮定的接合性を推定した。その場合、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ媒介性認識に対する候補対立遺伝子の影響が支配的であると仮定された。ついで、既に記載されているとおりに（Ｓｐａａｐｅｎら，２００８）、ソフトウェアツールｓｓＳＮＰｅｒを使用して、ＣＥＰＨ個体のＨａｐｍａｐ  ＳＮＰ遺伝子型との推定接合性の相関性を計算した。連鎖不平衡に関する閾値としてｒ２＝０．８を使用して、ｓｓＳＮＰｅｒにより生成されたＳＮＰの５００ｋｂ以内のプロキシＳＮＰを、ＳＮＰ注釈およびプロキシ検索（ＳＮＡＰ）ツール（Ｊｏｈｎｓｏｎら，２００８）を照会することにより収集した。ｓｓＳＮＰｅｒ  ＳＮＰおよびそれらのプロキシのｅＱＴＬ分析を、Ｇｅｎｅｖａｒ（ＧＥＮｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＶＡＲｉａｔｉｏｎ）ツール（Ｙａｎｇら，２０１０）を使用して行った。
【０２７２】
ｓｈＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集
目的の候補遺伝子に対して、レンチウイルスヘルパー構築物ＶＳＶＧおよびｐｓｐａｘ２と共にｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルス構築物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。機能的Ｔ細胞アッセイの４日前に、ＥＢＶ−ＬＣＬ  ４８細胞にウイルス上清を導入した。標的化遺伝子のノックダウンを、リアルタイムＱ−ＰＣＲを用いて、またはＲｈｏＢの場合はフローサイトメトリーにより確認した。
【０２７３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｉｊｅｒら，２０１４）を使用して、ＭＺ１８５１ＲＣ細胞からＲＨＯＡ、ＲＨＯＢまたはＲＨＯＣをノックアウトした。このために、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、ＰｕｒｏＲ、および抗ＲＨＯＡガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を促進するヒトＵ６プロモーターを共発現するレンチウイルスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター（Ｒｅｆ  Ｗｅｉｊｅｒら）を使用した。ｇＲＮＡ配列の遺伝子特異的領域をＺｈａｎｇ  ｌａｂのＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により設計した。それらの配列はＧＡＡＣＴＡＴＧＴＧＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧ（ＲＨＯＡ）（配列番号２）、ＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＧＴＧ（ＲＨＯＢ）（配列番号３）およびＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴ（ＲＨＯＣ）（配列番号４）であった。対照ｇＲＮＡとして、ＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡ（配列番号５）を含有するｅＧＦＰ遺伝子を標的化した。
【０２７４】
２９３Ｔ細胞において標準的第３世代パッケージングベクターを使用してレンチウイルスを作製した。ＭＺ１８５１ＲＣ細胞に、示されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９レンチウイルスを導入し、細胞を２μｇｍｌ−１のピューロマイシンで選択した。ＲｈｏＢノックアウトの効率を、フローサイトメトリーを用いて評価した。
【０２７５】
ウエスタンブロット分析
ＥＢＶ−ＬＣＬ系２２、４８、９１および９３をパミドロネートで一晩処理し、ＮＰ−４０を含有する細胞溶解バッファーにより細胞溶解した。ライセートを遠心分離して細胞破片を除去し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質含有物をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、ブロッキングバッファー（５％ミルク）中で１時間ブロッキングし、ＲｈｏＢ（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはβ−チューブリン（クローンＤＭ１Ａ）（Ｓｉｇｍａ）に対するウサギポリクローナル抗体と共に一晩インキュベートした。ついでブロットをＨＲＰ結合二次抗体と共にインキュベートし、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｐｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してバンドを可視化した。
【０２７６】
共焦点顕微鏡検査およびデータ分析
ＲｈｏＢの細胞内免疫染色のため、細胞をパミドロネートで一晩処理し（示されている場合）、ポリ−Ｌ−リシンで予め被覆されたカバースリップ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上に付着させた。ついで細胞を透過処理液２（ＢＤ）で透過処理し、ブロッキング血清（ＰＢＳ中の５０％  プール化正常ヒト血清）でブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ＲｈｏＢ抗体（ＡｂＣａｍ）で染色し、ついで二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。細胞をブロッキング血清で洗浄し、４％  パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色し（示されている場合）、Ｍｏｗｉｏｌを使用して顕微鏡スライド上にマウントした。Ｚｅｉｓｓ共焦点レーザー走査顕微鏡ＬＳＭ  ７００を使用してイメージを取得した。ＲｈｏＢの核シグナルと核外シグナルとの比を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）またはＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して決定し、この場合、核を標識するために、利用可能な場合にはＤＡＰＩ染色を用いた。
【０２７７】
ＢＴＮ３分子とアクチン細胞骨格との共局在を判定するために、ＨＥＫ２９３細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆カバースリップ上で増殖させ、カルペプチン（２μｇ／ｍｌ）またはＣ３トランスフェラーゼ（２０μｇ／ｍｌ）のいずれかで前処理した後、サンプルをパミドロネートで処理した。サンプルを固定、透過処理し、ＢＴＮ３およびＦ−アクチンを、それぞれ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０結合ＢＴＮ３抗体（クローンＢＴ３．１、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）およびフルオレセイン結合ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で染色した。ＢＴＮ３とＦ−アクチンシグナルとの相関係数を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェアを使用して、共局在の尺度として決定した。
【０２７８】
ＦＲＡＰ顕微鏡検査
既に記載されているとおりに（Ｈａｒｌｙら，２０１２，Ｓａｎｄｓｔｒｏｍら，２０１４）、ＦＲＡＰ分析を行った。簡潔に説明すると、ＥｍＧＦＰ融合ＣＤ２７７を発現するＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をｍスライド（Ｉｂｉｄｉ）上に配置し、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１  ＲＳ共焦点顕微鏡（６０×ＮＡ  １．４０油浸対物レンズ）を使用して分析した。選択された長方形領域を、レーザー強度の全出力（９０％超の蛍光損失）を用いて、５００ミリ秒間、光退色した。低レーザー強度を用いて、退色の前（３０秒）および後（１２０秒）に、５秒ごとにイメージを収集した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ７．５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）およびＮＩＳ（Ｎｉｋｏｎ）イメージングソフトウェアを使用してイメージを分析した。得られた曲線を、１相指数方程式を用いてフィットさせた。
【０２７９】
フローサイトメトリーＦＲＥＴ
ＲｈｏＢとＢＴＮ３分子との関連性（結合）を調べるために、細胞を、透過処理溶液２（ＢＤ）を使用して透過処理し、ついで、５０％  ヒト血清を含有するＰＢＳでブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ＲｈｏＢ抗体（Ａｂｃａｍ）で標識した。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを、それぞれ、Ａｌｅｘａ５９４結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（アクセプター）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＣＤ２７７−ＰＥ（ドナー）（ＢＴ３．１、Ｂｉｏｌｌｅｇｅｎｄ）で標識した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用してドナー蛍光を測定し、この場合、二重標識サンプルのドナー蛍光を、ドナー抗体のみで標識されたサンプルの蛍光と比較した。アクセプターの存在下のドナー蛍光の僅かな減少から、ＦＲＥＴ効率を計算した。
【０２８０】
ＣＤ２７７分子のホモ二量体化を決定するために、細胞を等量のＰＥ結合抗ＣＤ２７７（ドナー）およびＤｙｌｉｇｔｈ６８０結合抗ＣＤ２７７（アクセプター）で共染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用してサンプルを測定した。Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら（Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら，２００２）による式を用いて、ＦＲＥＴ効率を計算し、この場合、ドナー蛍光を４８８ｎｍで励起し、５７６±２６ｎｍで検出し、アクセプター蛍光を６３５ｎｍで励起し、７８０±６０ｎｍで検出し、一方、ＦＲＥＴ強度を４８８ｎｍで励起し、７８０±６０ｎｍで検出した。異なる蛍光チャンネル間のスペクトル重複に関する補正係数を、非標識細胞および単一標識細胞上で測定されたデータから得た。
【０２８１】
ＢＴＮ３分子のコンホメーション変化を、記載されている方法（Ｇａｓｐａｒら，２００１）と同様にして決定した。細胞を５μｇ／ｍｌ  ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ  ＤＰＨＥ（ドナー）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で氷上で１０分間標識し、ついで３７℃で１０分間標識し、ついで氷冷ＰＢＳで十分に洗浄した。ついで細胞をマウス抗ＣＤ２７７  ｍＡｂｓ（クローン＃２０．１または＃１０３．２のいずれか）およびＡｌｅｘａ５９４結合ヤギ抗マウスＦａｂフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で標識した。洗浄後、細胞を氷冷ＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して直ちに測定した。アクセプターの存在下のドナー蛍光の僅かな減少から、ＦＲＥＴ効率を計算した。
【０２８２】
近接ライゲーションアッセイ
ＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップ上で増殖させ、１００μＭ  パミドロネートで一晩、前処理した後、固定し、透過処理バッファー２（ＢＤ）で１５分間透過処理した。ついで細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５０％  ヒト血清を含むＰＢＳ中で２２℃で３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、５０％  ヒト血清を含有するＰＢＳ中、ウサギ抗ＲｈｏＢ（ＡｂＣａｍ）およびマウス抗ＣＤ２７７（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と共に細胞を２２℃で６０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、二次マウスＰＬＵＳ抗体およびウサギＭＩＮＵＳ抗体と共に３７℃で暗所で１．５時間インキュベートした。細胞をＰＢＳＴ中で３回洗浄した後、インシトゥ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ＰＬＡ検出キット（Ａｂｎｏｖａ）でプローブの検出を行った。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０蛍光顕微鏡上の６３倍対物レンズで細胞を分析した。
【０２８３】
インビトロタンパク質発現および精製
制限酵素部位ＮｄｅｌおよびＸｈｏＩ（５’プライマー：ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＧ（配列番号７）；３’プライマー：ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＣ（配列番号８））を使用して、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグ（配列番号６）およびそれに続くトロンビン切断部位を含有するＰＥＴ  ２８Ａベクター内に全長ＲｈｏＢのタンパク質をクローニングした。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における不適切なプレニル化を防ぐためにＲｈｏＢのＣ末端ＣＫＶＬ（配列番号９）モチーフを欠失させた。該構築物をＢＬ２１株大腸菌内で発現させた。細胞をＴｅｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）内で３７℃でＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、ついで室温（２５℃）に移した。１５分間の回復後、培養液１リットル当たり１ｍｌの１Ｍ  イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で１２〜１６時間にわたり細胞を誘導した。タンパク質を集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中でＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）ＩＭＡＣクロマトグラフィーを使用して精製し、まず、潜在的シャペロンをＲｈｏＢから解離させるために、前記バッファー中で補足された１ｍＭ  ＡＴＰで洗浄し、ついでＡＴＰ非含有バッファーで洗浄し、最後に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４ｍＭ  ＢＭＥで溶出した。Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  アジド、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４ｍＭ  ＢＭＥ中に溶出画分を脱塩させた。１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  アジド、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４ｍＭ  ＢＭＥ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によりタンパク質を更に精製した。ＢＣＡ試験と、理論吸光係数を用いるＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用するＡ２８０シグナルの測定との両方により、タンパク質濃度を測定した。既に記載されているとおりに（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍら，２０１４））、ＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２ドメインを発現させ、精製した。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ（５’プライマー：ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号１０）；３’プライマー：ＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＧＴＣ（配列番号１１））を使用して、３Ｃプロテアーゼ部位およびそれに続くカルボキシル末端６ＨＩＳタグ（配列番号６）を含有するｐＥＴ２８ａ内に、ＢＴＮ３Ａ１全長細胞内ドメインをクローニングした。該構築物をＢＬ２１株大腸菌内発現させた。細胞をＬｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中で３７℃でＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、培養液１リットル当たり１ｍｌの１Ｍ  ＩＰＴＧで室温で４時間誘導した。タンパク質を回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  ＮａＣ��、２０ｍＭ  イミダゾール、４ｍＭ  ＢＭＥ中でＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）ＩＭＡＣクロマトグラフィーを使用して精製し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、４ｍＭ  ＢＭＥで溶出し、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  アジド、４ｍＭ  ＢＭＥ中に脱塩させた。４℃で３Ｃプロテアーゼを使用してタンパク質を一晩切断した。前記のとおりに、タンパク質濃度を測定した（図Ｓ４ＡおよびＳ４Ｂ）。
【０２８４】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）
ＲｈｏＢとＢＴＮ３Ａ１全長細胞内ドメイン（ＢＦＩ）またはＢＴＮ３Ａ１  Ｂ３０．２ドメインとの間の相互作用を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩｔｚ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定した。ベースライン平衡化および解離工程で使用するＢＬＩバッファーを、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  アジド、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＢＭＥを使用して調製した。以下のパラメーターを用いる基本的な速度論法を用いて、２ｍｇ／ｍｌの濃度のＲｈｏＢを、ＢＬＩバッファーで水和されたＮｉ−ＮＴＡバイオセンサー上に固定化した：ベースラインに関しては３０秒、結合に関しては３００秒、および解離に関しては３００秒。ついでＲｈｏＢ配置バイオセンサーを１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡによりブロッキングし、以下のパラメーターを用いる同様の方法を用いてＢＬＩバッファーで平衡化した：ベースラインに関しては３０秒、結合に関しては１２０秒、および解離に関しては１２０秒。バッファーでの実施を後続実験のための基準として用いた。ＲｈｏＢと種々の濃度のＢＦＩ（６．２５、１２．５、２５、５０および１００μＭ）またはＢ３０．２ドメイン（１２．５、２５、５０、１００および２００μＭ）との相互作用を、前記と同じ方法を用いて測定した。（２Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチルペンタ−２−エニル−ピロホスホナート（ｃＨＤＡＭＰＰ）の存在下のＲｈｏＢと種々の濃度のＢＦＩ（３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭ）またはＢ３０．２ドメイン（３．７５、７．５、１５、３０および６０μＭ）との相互作用も、前記と同じ方法で測定した。これらの測定では、ｃＨＤＭＡＰＰとＢＦＩまたはＢ３０．２ドメインとの比を１：１に維持した。結合相互作用に関する速度定数および結合定数はＢｉａｅｖｕｌａｔｉｏｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析された。データを１８０秒に切除し、ドリフトベースラインモデルと共に１：１結合を用いて、ｋａおよびｋｄを同時にフィットさせた。
【０２８５】
Ｇ−Ｌｉｓａ分析
Ｇ−ＬＩＳＡ  ＲｈｏＡ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍキット（カタログ番号ＢＫ１２４；Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳＡ）を製造業者の説明に従い使用して、ＲｈｏＡの活性をアッセイした。簡潔に説明すると、細胞を、プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する氷冷細胞溶解バッファー中で細胞溶解し、ついで１００００×ｇで４℃で１分間遠心分離した。上清を回収し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用してタンパク質濃度を測定し、最終的に氷冷細胞溶解バッファーで１．０ｍｇ／ｍｌに平衡化した。平衡化タンパク質抽出物をＲｈｏ−ＧＴＰ結合タンパク質プレレコートプレートに移した。プレートを０．７２×ｇのオービタルマイクロプレートシェーカー上に４℃で３０分間配置し、ついでモノクローナルマウス抗ヒト抗ＲｈｏＡ一次抗体（カタログ番号ＧＬ０１Ａ；１：２５０；Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）と共に、ついでポリクローナルヤギ抗マウスホースラディッシュ結合二次抗体（カタログ番号ＧＬ０２；１：６２．５；Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）と共に、０．７２×ｇのオービタルマイクロプレートシェーカー（ＳＳＭ１；Ｂｉｂｂｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｇｒｏｕｐ）上で室温で各４５分間インキュベートした。ついでプレートをＨＲＰ検出試薬と共に３７℃で１５分間インキュベートした。ＨＲＰ停止バッファーの添加の後、マイクロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０２８６】
統計分析
特に示されていない限り、全ての実験は、独立して少なくとも３回繰り返した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして示されている。統計的有意性は、マン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）またはクラスカル−ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定およびダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定により分析した。
【０２８７】
本明細書には本開示の好ましい実施形態が示され記載されているが、そのような実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎないことは当業者に明らかであろう。したがって、多数の変形、変更および置換が、本開示から逸脱することなく、当業者において見出されるであろう。本開示の実施においては、本明細書に記載されている実施形態の種々の代替物または本明細書に記載されているこれらの実施形態もしくは態様の１以上の組合せが使用されうると理解されるべきである。後記の特許請求の範囲は本開示の範囲を定め、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が本発明に含まれると意図される。
【０２８８】
実施例１０：実験方法
細胞系
細胞系Ｄａｕｄｉ（ダウディ）、ＬＣＬ−ＴＭ、ＭＬ−１、ＪｕｒＭＡおよびＪｕｒｋａｔ−７６を、１０％  ＦＣＳおよび１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）（Ｇｉｂｃｏ）を補足されたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）内で培養した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系を、１０％  ＦＣＳおよび１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで補足されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）内で培養した。ヒト初代Ｔ細胞クローンを、１０％  プール化ヒト血清および１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで補足されたＲＰＭＩ内で培養した。レトロウイルス形質導入に使用するヒトバルク初代Ｔ細胞を、２，５％  プール化ヒト血清および１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで補足されたＲＰＭＩ内で培養した。全てのヒト初代Ｔ細胞を、２週間の急速増殖プロトコル［ＲＥＰ；照射フィーダー細胞（Ｄａｕｄｉ、ＬＣＬ−ＴＭおよび同種ＰＢＭＣ）＋ＰＨＡ＋ＩＬ−１５＋ＩＬ−２を含む］に従い培養した。
【０２８９】
γ９δ２  Ｔ細胞クローンの作製、増殖および機能試験
ＰＢＭＣをＶδ２に対するモノクローナル抗体（Ｖδ２−ＦＩＴＣクローンＢ６）（ｍＡｂ）で染色した。ｍＡｂ陽性画分はバルクにおいて選別し、ＲＥＰ上で増殖させ、ついで制限希釈（ドナーＡ）によりクローニングし、または９６ウェルプレート内の単細胞の収集を含むＦＡＣＳ選別（ドナーＢ、Ｃ）を用いて単細胞選別した。全てのＦＡＣＳ選別をＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ）で行った。機能試験の前にＲＥＰ上で８〜１２ラウンドの増殖を行った。細胞が十分な数まで増殖したらすぐに、機能試験を行った。５＊１０Λ４  Ｔ細胞を、１００μＭ  パミドロネート二ナトリウム塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ＃５０６６００）の存在下または非存在下、１０％  ＦＣＳおよび１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで補足されたＤＭＥＭ内で１：１のＥ：Ｔ比で標的細胞と共に一晩インキュベートし、翌日、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃８８７３１６８８）を使用してＩＦＮｙ濃度を測定した。
【０２９０】
ＴＣＲの配列決定およびベクターの作製
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔを製造業者の説明に従い使用して、初代Ｔ細胞クローンからＲＮＡを単離した。３’定常領域における特異的プライマー（ＴＲＤＣＲｅｖ  ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡ（配列番号１２））を使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用してｃＤＮＡを精製した。Ｔ１００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）（Ｂｉｏｒａｄ）におけるＱ５（登録商標）高忠実度（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および以下のサイクリングパラメーターを使用して、定常領域における同じリバースプライマー（ＴＲＤＣＲｅｖ  ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡ（配列番号１２））および特異的Ｖδ２フォワードプライマー（ＴＲＤＶ２Ｆｗ  ＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号１３））を使用するＰＣＲ増幅において、ｃＤＮＡを増幅した。
【０２９１】
可変遺伝子セグメントおよび定常遺伝子セグメントに特異的なプライマー［ＴＲＤＶ２Ｆｗ  ＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号１３）、ＴＲＤＣＲｅｖ  ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡ（配列番号１２）、ＴＲＧＶ９Ｆｗ  ＴＣＣＴＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴ（配列番号１４）、ＴＲＧＣＲｅｖ  ＧＧＧＧＡＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡ（配列番号１５）］を使用して、ＴＣＲガンマおよびデルタ鎖を配列決定した。サンガー配列決定をＭａｃｒｏｇｅｎにおいて行った。
【０２９２】
新たなＣＤＲ３配列を導入するために重複伸長ＰＣＲを用いて、特定されたγδＴ細胞クローンの選択のＴＣＲδおよびＴＣＲγ鎖をレトロウイルス発現ベクターにおいて再構成させた。簡潔に説明すると、Ｇ１１５のγまたはδ鎖のいずれかをコードするコドン最適化構築物のＣＤＲ３領域に隣接する不変配列に基づいてプライマーのセットを作製し、クローン特異的ヌクレオチドでプライマーを伸長させた。オーバーハング（突出部）内の１５〜２０ｂｐの伸長を、そのペアプライマーに対する逆相補体となるように設計した（表３を参照されたい）。
【表３】
2020520367.tif 000005
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2020520367.tif 000007
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【０２９３】
ＰＣＲ「Ｒ１」において、制限部位を含みレトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクター内にクローニングされた鋳型鎖δおよびγＴＣＲＧ１１５に結合するフォワードプライマー［Ｇ１１５δＦｗｄ：ＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣ（配列番号７０），Ｇ１１５γＦｗｄ：ＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号７１）；ＮｃｏＩ制限部位がイタリック体で示されている］およびクローン特異的リバースプライマーＲｅｖ  Ｒ１（表３）を使用して、Ｖ−（Ｄ）−Ｊ部分（可変ドメインおよびＣＤＲ３領域の一部）を増幅した。同様に、ＰＣＲ「Ｒ２」において、一定のリバースプライマー［Ｇ１１５δＲｅｖ：ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧ（配列番号７２），Ｇ１１５γＲｅｖ：ＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号７３）；ＢａｍＨＩ制限部位がイタリックで示されている］およびクローン特異的フォワードプライマーＦｗｄ  Ｒ２を使用して、ＴＣＲ鎖の（Ｄ）−Ｊ−Ｃ部分を増幅した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用するゲルベースのサイズ選択および精製の後、Ｇ１１５δＦｗｄ／Ｇ１１５δＲｅｖおよびＧ１１５γＦｗｄ／Ｇ１１５γＲｅｖプライマーペアを使用するＰＣＲ「Ｒ３」において、該ＰＣＲ産物の２つ（Ｒ１およびＲ２）を融合および増幅して、クローン特異的ＣＤＲ３領域を含有するＴＣＲ鎖を得た。全ての反応は、Ｔ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）におけるＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および以下のパラメーターを使用して行った：Ｒ１−Ｒ２の場合：９８℃で１２０秒、９８℃で２０秒、５９℃で２０秒および７２℃で２５秒の３０サイクル、ならびにそれに続く７２℃で６００秒；Ｒ３の場合：９８℃で１２０秒、９８℃で２０秒、５６℃で２０秒および７２℃で４０秒の３０サイクル、ならびにそれに続く７２℃で６００秒。
【０２９４】
別のゲルベースのサイズ選択工程の後、新たに合成さＴＣＲ鎖を精製し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を使用してレトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクター内にクローニングした。ＴＣＲδ遺伝子をｐＢｕｌｌｅｔ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシン内にクローニングし、ＴＣＲγ遺伝子をｐＢｕｌｌｅｔ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ内にクローニングした。配列同一性をサンガー配列決定（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）で確認した。
【０２９５】
プラスミドのレトロウイルス形質導入
目的のＴＣＲ鎖を含有するベクターペアを初代ヒトＴ細胞内に導入した。ＴＥＧ形態のＴＣＲの機能試験を初代クローンの機能試験と同じ方法で行った。
【０２９６】
ＴＣＲδ鎖のハイスループット配列決定
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏｋｉｔを製造業者の説明に従い使用して、ＲＮＡを単離した。３’定常領域における特異的プライマー（ＴＲＤＣＲｅｖ  ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡ（配列番号１２））を使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用してｃＤＮＡを精製した。Ｔ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）におけるＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および以下のサイクリングパラメーターを使用し、定常領域における同じリバースプライマー（ＴＲＤＣＲｅｖ  ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡ（配列番号１２））および特異的Ｖδ２フォワードプライマー（ＴＲＤＶ２Ｆｗ  ＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号１３））を使用するＰＣＲ増幅において、ｃＤＮＡを増幅した：９２℃で３００秒、９２℃で３０秒、６３℃で３０秒および７２℃で４５秒の３０サイクル、ならびにそれに続く７２℃で４２０秒。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰで精製した後、ＧｅｎｄｘのＨＴＳｇｏ−ＩｎｄＸインデックスと共にＨＴＳｇｏ−ＬｉｂｒＸキットを製造業者の推奨に従い使用して、ＨＴＳのライブラリー調製を行った。サンプルのクリーンアップを、ＧＣ  ＢｉｏｔｅｃｈのＨｉｇｈＰｒｅｐ  ＰＣＲビーズを使用して行った。ハイスループット配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシステム５００（２×２５０ｂｐ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行った。ＴＣＲ配列アライメント、集合（アセンブリ）およびクロノタイプ抽出を、ＭｉＸＣＲ（バージョンｖ２．１．１）プログラムを使用して行った。ＴＣＲδレパートリー分析には社内Ｒスクリプトを使用し、データをフィルタリングして、１リード／クロノタイプの頻度でクロノタイプを除外した。
【０２９７】
可溶性ＴＣＲのクローニング、発現および精製
ＴＣＲ鎖の細胞外ドメインは、全長ＴＣＲをコードする合成ＤＮＡから増幅した。ドメイン境界は、Ｖγ９Ｖδ２  ＴＣＲ  Ｇ１１５に関して以前公開されたものに基づいていた。構築物の５’末端におけるμ−ホスファターゼシグナルペプチドと３’末端におけるｆｏｓ（フォス）ジッパーとを含有する修飾ｐＢｕｌｌｅｔベクター内にＴＣＲδ鎖を連結した。５’末端におけるμ−ホスファターゼシグナルペプチドおよび３’ｊｕｎ（ジュン）ジッパーならびにそれに続くビオチンアクセプターペプチドおよびポリヒスチジンタグを含有する修飾ｐＢｕｌｌｅｔベクター内にＴＣＲγ鎖を連結した。また、細菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡをコードする合成ＤＮＡを、シグナルペプチドを含有するｐＢｕｌｌｅｔベクター内に連結した。可溶性γδＴＣＲの発現をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（フリースタイル）２９３−Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において行った。簡潔に説明すると、ＴＣＲδ、ＴＣＲγおよびＢｉｒＡを含有するプラスミドを４５：４５：１０の比で混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と２：３の比で一緒にし、室温で１５分間インキュベートした。ＤＮＡ：ＰＥＩ混合物を１〜１．５μｇプラスミド／１０Λ６細胞の濃度で細胞に添加し、６時間後、培地をＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）および１００μＭ  ビオチンで補足した。トランスフェクションの５日後、培地を回収し、それぞれ２０ｍＭおよび３００ｍＭの最終濃度のリン酸バッファー（ｐＨ７．５）およびＮａＣｌで補足し、１ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥヘルスケア）上にローディングした。イミダゾールの濃度を増加させる多段階勾配を用いて、可溶性ＴＣＲを洗浄し、カラムから溶出した。溶出した可溶性ＴＣＲを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）および２０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐＱカラム（ＧＥヘルスケア）上にローディングした。直線勾配を用いて可溶性ＴＣＲを溶出した。可溶性ＴＣＲを含有する画分をプールし、濃縮した。四量体およびデキストラマーを調製した。簡潔に説明すると、２０分間にわたって４工程でＳＡ−ＰＥの１当量（１μＭ）をｓＴＣＲの６当量（６μＭ）に加えることにより、単量体から四量体を調製した。ＳＡ−ＰＥおよびｓＴＣＲを１：３のモル比で１５分間プレインキュベートし、ついで、生じた三量体にビオチン化デキストラン（分子量５００ｋＤａ；ＮａｎｏＣＳ）を１：８（デキストラン：ＳＡ−ＰＥ）のモル比で添加することにより、デキストラマーを調製した。ビーズの調製では、完全被覆ビーズの１０μｇ  ｓＴＣＲ／ｍｇミクロスフェアが確実に得られるように、該ビオチン化可溶性ＴＣＲをストレプトアビジン結合蛍光黄緑色ミクロスフィア（６μｍ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）と過剰に混合した。
【０２９８】
ｓＴＣＲ多量体細胞結合アッセイ
四量体およびデキストラマー染色のために、１．０＊１０Λ５細胞を３０μｌのテトラマーまたはデキストラマー溶液（ＳＡ−ＰＥに対しては１００ｎＭ）と共に室温で３０分間インキュベートした。ビーズの染色のために、７．５＊１０４  細胞を２０μｌのｓＴＣＲ−ＹＧビーズ（ビーズ０．３３ｍｇ／ｍｌ）と共に３０の時間にわたってインキュベートした。ついで細胞を固定可能生存可能色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で更に３０分間染色した。抗ＣＤ２７７抗体２０．１または１０３．２（Ｄａｎｉｅｌ  Ｏｌｉｖｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅからの親切な贈り物）を使用する阻害アッセイのために、Ｄａｕｄｉ細胞を抗体と共に室温で１５分間プレインキュベートした後、ｓＴＣＲ−ＹＧビーズを加えた。該混合物を、４０μｌの２％  ホルムアルデヒドを加えることにより、１５分間固定した。サンプルを１％  ホルムアルデヒドで１回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）で分析した。
【０２９９】
シナプスへのγδＴＣＲ富化およびコンジュゲート形成
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をμスライドポリ−Ｌ−リジンプレコートチャンバー（Ｉｂｉｄｉ）内に播いて一晩付着させた。翌日、細胞を１００μＭ  ＰＡＭで３７℃で１時間処理した。ＴＥＧをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞上に添加し、３７℃で３０〜１２０分間インキュベートした。コインキュベーション後、チャンバーを直ちに氷上に配置し、４％  ＰＦＡで３０分間固定した。サンプルを１％  ＢＳＡ／ＦＣＳでブロッキングし、２μｇ／ｍＬのＣＤ３ε−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温で２時間標識し、最後に１％  ＰＦＡ＋ＤＡＰＩで固定した。サンプルをＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０でイメージングし、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で分析した。ＨＥＫ２９３ＦＴとＴＥＧ細胞とのコンジュゲートの数を定量するために、撮影したイメージ上でＣＤ３ε陽性物とＤＡＰＩ陽性物との比を計算した。免疫学的シナプスへのガンマデルタＴＣＲの富化を分析するために、６３倍の拡大イメージ上で標的細胞およびエフェクター細胞の接触領域の内側と接触領域の外側とのＣＤ３εシグナル富化の比を計算した。
【０３００】
超分解能イメージング
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバー内でプレーティングして付着させ、１００μＭ  パミドロネートで一晩処理した。超分解能イメージングのために、細胞をＡＦ６４７−ＣＤ２７７で室温で標識した。標識後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％  ＰＦＡおよび０．２％  グルタルアルデヒドで１〜２時間固定した。超分解能イメージングの前に、２００μＬの新鮮なＳＲＢ（超分解能バッファー：５０ｍＭ  トリス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グルコース、１６８．８Ｕ／ｍＬ  グルコースオキシダーゼ、１４０４Ｕ／ｍＬ  カタラーゼ、１０ｍＭ  塩酸システアミン、ｐＨ８．０）を該ウェルに加えた。油浸対物レンズ１．４５−ＮＡ全内部反射蛍光対物レンズ（Ｕ−ＡＰＯ  １５０×；Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ）を備えた倒立顕微鏡（ＩＸ７１；Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して、ｄＳＴＯＲＭイメージングを行った。６３７ｎｍダイオードレーザー（ＨＬ６３１３３ＤＧ；Ｔｈｏｒｌａｂｓ）をＡＦ６４７励起に使用した。サンプルの照明および放射のために、クワッドバンドのダイクロイックおよび放射フィルターセット（ＬＦ４０５／４８８／５６１／６３５−Ａ；Ｓｅｍｒｏｃｋ）を使用した。５８５ｎｍダイクロイック（Ｓｅｍｒｏｃｋ）および追加的な放射フィルター（６９２／４０ｎｍおよび６００／３７）と共に注文製２チャネルスプリッターを使用して、ＡｎｄｏｒＩｘｏｎ  ８９７電子増倍電荷結合デバイス（ＥＭ  ＣＣＤ）カメラ（Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｗｉｎｄｓｏｒ，ＣＴ）の異なる象限に放出光を分離した。倒立顕微鏡（ＩＸ７１；Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）のサンプルチャンバーを、ｘｙｚ軸に沿った０．２ｎｍの分解能を有する３次元ピエゾステージ（Ｎａｎｏ−ＬＰＳ；Ｍａｄ  Ｃｉｔｙ  Ｌａｂｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に取り付けた。注文製ステージ安定化ルーチンを使用して、イメージング手順の全体にわたってサンプルドリフトを補正した。ＴＩＲＦにおいて５７フレーム／秒でイメージを取得し、各イメージ再構成ごとに１０，０００〜２０，０００フレームを収集した。
【０３０１】
超分解能イメージ再構成およびデータ分析
既に記載されているとおりに（Ｓｍｉｔｈら，２０１０，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｈｕａｎｇら，２０１１，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）、ｄＳＴＯＲＭイメージを分析し、特製ＭＡＴＬＡＢ関数で再構築した。各イメージフレームに関して、局所最大強度に基づいて部分領域を選択した。ついで最尤推定量を使用して、各部分領域をピクセル化ガウス強度分布にフィットさせた。各パラメーターのＣｒａｍｅｒ−Ｒａｏ下限値ならびに強度およびバックグラウンドカットオフを使用して推定されたフィット精度および対数尤度比に基づいて、フィットの結果を棄却（拒否）した。ローカルクラスタリングツール（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｍｃ．ｈｅａｌｔｈ．ｕｎｍ．ｅｄｕ）のパッケージの一部として密度ベースのＤＢＳＣＡＮアルゴリズムを使用して、ｄＳＴＯＲＭ  ＣＤ２７７クラスターデータの分析を行った。選択したパラメーターは、イプシロン＝５０ｎｍの隣接クラスター点間の最大距離、および６つの観測値の最小クラスターサイズであった。凸包と該点を囲む最大密集表面との中間の等高線を生成するデフォルト方法論を用い、ＭＡＴＬＡＢ「境界」関数でクラスター境界を生成させた。ついで、これらの境界内のクラスター領域を、より直感的な解釈のために、同等面積の円の半径に変換した。２μｍ×２μｍのサイズの関心領域（ＲＯＩ）を、ＲＯＩごとに同等半径の統計が収集されたイメージのセットから選択した。
【０３０２】
実施例１１：γ９δ２Ｔ細胞の機能的プロファイリング
個々のγ９２δＴ細胞クローンの機能活性に対する個々のγ９δ２ＴＣＲの影響を、より広範囲で評価するために、限界希釈またはＦＡＣＳ選別によりγδＴ細胞クローンを単離した。腫瘍細胞系Ｄａｕｄｉ（ダウディ）に対するＩＦＮγ産生によりインビトロ抗腫瘍活性を決定した。４名の健常ドナーから単離されたγ９δ２Ｔ細胞クローン（Ｎ＝５７）の間で相当な抗腫瘍機能的不均一性が観察され、ＩＦＮｙ濃度の信頼可能な測定のために３０ｐｇ／ｍｌのカットオフを選択した場合、該クローンの約６０％は腫瘍細胞系Ｄａｕｄｉに対して反応性であった（図１３Ａ）。パミドロネート（ＰＡＭ）のようなビスホスホネートは、ＲｈｏＢにより促進されγ９δ２ＴＣＲにより感知されるＣＤ２７７Ｊの誘導によりγ９δ２Ｔ細胞の活性を増強しうる。１００μＭ  ＰＡＭの存在下、調べたγ９δ２Ｔ細胞クローンの反応性は平均１０倍増強され（範囲０，７〜３７，３；中央値８，１）、９５％を超える該クローンが、ＰＡＭを添加した場合、閾値を超える反応性を示した（図１３Ａ）。活性プロファイルが専らＤａｕｄｉ細胞に関して観察されたのか他の標的に関しても有効なのかどうかを評価するために、十分に特徴づけられた追加的なγδＴ細胞標的である細胞系ＨＥＫ２９３ＦＴを、単離されたγδＴ細胞クローンと共にコインキュベートした。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系は、ＰＡＭの非存在下では、遥かに低いサイトカイン分泌を誘発するに過ぎず、γ９δ２Ｔ細胞クローンの約３０％しか、カットオフを上回るＩＦＮｙの分泌をもたらさない。しかし、ＰＡＭの存在下では、全く同じクローンをＤａｕｄｉまたはＨＥＫ２９３ＦＴに対して試験した場合にＩＦＮγ分泌の強い相関性により証明されるとおり、個々のクローンの反応性はＤａｕｄｉに対するそれらの反応性に匹敵した（スピアマンのｒ＝０，８９３、ｐ＜０．０００１（ｎ＝５４）、図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。
【表４】
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【０３０３】
実施例１２：γ９δ２Ｔ細胞のクローン頻度
個々のγ９δ２Ｔ細胞クローンのインビトロ抗腫瘍活性におけるγ９δ２ＴＣＲの役割を更に研究するために、γ９δ２ＴＣＲ配列決定のための５７個のクローンのうちの２０個を選択した。これらのクローンは、図１３Ａに示されているとおり、クローン活性の全範囲を含んでいた。幾つかのクローンペア（Ｂ２およびＢ５、Ｃ４およびＣ１４、Ｃ７およびＣ１１）は同一ＴＣＲを発現することが判明し、合計１７個のユニーク（唯一）クロノタイプが最終的に得られらた。個々のクロノタイプのなかで、全てのδ鎖はユニークであったが、γ鎖においては、ＣＤＲ３領域配列に関して、ドナー内およびドナー間の両方で幾らかの重複が存在していた（図１４Ａ）。
【０３０４】
単細胞選別に使用したのと同じドナーの完全なγ９δ２ＴＣＲレパートリーのハイスループット配列決定（ＨＴＳ）を行った。ドナーＣの例で示されているとおり、ドナーのレパートリー内の或るクロノタイプの頻度（保有率）は、ＤａｕｄｉまたはＨＥＫ２９３ＦＴに対するそれぞれのクローンの機能活性と相関しなかった。最も高い頻度のクローンＣ６は、このドナーから単離された最も反応性であるγ９δ２Ｔ細胞クローンの１つに属し、一方、他の３つの高頻度クロノタイプ（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ１１）はより低い範囲の反応性を示したが（図１４Ｂ）、本発明者らは、示されているδ鎖が、他のγ鎖と組合された場合に、より高い活性を示すことを排除できない。逆に、ドナーＡからの非常に活性なγ９δ２Ｔ細胞クローンは元のドナーにおいては高頻度ではなかった。したがって、クローン頻度は個々のγ９δ２Ｔ細胞の機能活性と相関しなかった。
【０３０５】
実施例１３：親γ９δ２Ｔ細胞の機能活性
配列決定されたγおよびδＴＣＲ遺伝子の選択物を合成し、レトロウイルスｐＢｕｌｌｅｔベクター内にクローニングし、初代αβＴ細胞において発現させて、γδＴ細胞の他の共受容体の非存在下の個々のγδＴＣＲの分析を可能にした。まず、ＣＤＲ３領域内の変異がＴＣＲ表面発現に影響を及ぼすかどうかを評価した。図１４Ｃに示されているとおり、ＴＣＲクローンＡ１〜Ａ６により並びにクローン１３（Ｃｌ１３）、Ｇ１１５、クローン３（Ｃｌ３）およびクローン５（Ｃｌ５）において例示されているとおり、作製した全てのＴＥＧは、類似したレベルのγδＴＣＲを発現した。図１４Ｄに示されているとおり、弱いＴＣＲを含有するように操作されたＴＥＧ（例えば、人工的に設計されたＣＴＥ−Ｃ１３）と、強力なＴＣＲを含有するように操作されたＴＥＧ（ＣＴＥ−Ｃｌ５）との間で、活性における相当な差異が観察されることが可能であった。同様に、天然レパートリーからのγ９δ２ＴＣＲは、ＴＥＧ形態でＩＦＮγ分泌を誘導するそれらの能力において実質的に異なっていた。しかし、ＴＥＧ形態で十分には活性化されないＴＣＲを有する高反応性クローンＡ４、Ａ５およびＣｌ１３により示されているとおり、機能活性は親クローンの機能活性と相関しなかった（図１４Ｄ）。このことは、追加的な共受容体またはエピジェネティック調節のような他の要因がγ９δ２Ｔ細胞クローンの機能的応答に寄与していることを示唆している。
【０３０６】
実施例１４：γ９δ２ＴＣＲ標的相互作用
γδＴＣＲクローン５のγ９およびδ２ＴＣＲ鎖と非機能的な長さの突然変異体ＬＭ１とを含む四量体およびデキストラマーを設計した。ＣＤ２７７Ｊ配置を感知するために使用されるγ９δ２ＴＣＲとそのリガンドとの低いアフィニティの相互作用に合致して、γ９δ２ＴＣＲ四量体もデキストラマーも古典的標的Ｄａｕｄｉには結合しなかった（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。次に、より高い相互作用アビディティを得るために、多量体上のγδＴＣＲの数を増加させた。非機能的な長さの突然変異体ＬＭ１の細胞外ドメイン、ならびにＴＥＧ形態で低および高機能的アビディティをもたらすγδＴＣＲ  ＣＴＥ−Ｃｌ３およびＣＴＥ−Ｃｌ５を、ストレプトアビジン結合黄緑色蛍光ビーズ（本明細書においてはＹＧビーズと称される）に結合させた。これは少なくとも１０４個のγδＴＣＲがＹＧビーズの表面に付着することを可能にした。γ９δ２ＴＣＲを発現するＹＧビーズを使用して、既知陰性標的細胞系ＭＬ１および陽性標的細胞系Ｄａｕｄｉを染色した。ＴＣＲ被覆ビーズのいずれの場合にも、ＭＬ１細胞へのＹＧビーズ結合は観察できなかった（図１９Ａ〜図１９Ｄ）。一方、Ｄａｕｄｉ細胞へのＹＧビーズ結合の量は、ビーズのコーティング（被覆）に使用されるＴＣＲに依存的であった（図１５Ｃおよび図２０）。非機能的γ９δ２ＴＣＲであるＬＭ１は、低機能的アビディティー（ＴＥＧ形態の場合）ＴＣＲ  ＣＴＥ−Ｃｌ３と全く同様に、Ｄａｕｄｉ細胞への結合をほとんど示さなかった。高機能的アビディティγ９δ２ＴＣＲであるＣＴＥ−Ｃｌ５はＤａｕｄｉ細胞への著しく高い結合を示し、このことは、γ９δ２ＴＣＲの機能的アビディティがγ９δ２ＴＣＲリガンドアフィニティに実際に関連していることを示している。γδＴＣＲクローン５に結合したビーズはＣＴＥ−ＣＬ５ビーズと同じ染色パターンを示した（図１９Ｄ）。興味深いことに、ＹＧビーズは腫瘍細胞の一部にのみ結合した（図２０）。これは標的集団自体内のリガンドの不均一性よりもむしろビーズ対細胞比の技術的限界を反映している可能性が高い。γ９δ２ＴＣＲはＣＤ２７７Ｊ配置を検知する。
【０３０７】
Ｄａｕｄｉ細胞へのＣＴＥ−Ｃｌ５  ＹＧビーズの結合は、ＣＤ２７７Ｊがγ９δ２ＴＣＲと直接相互作用しているかどうかの評価を可能にした。ＣＤ２７７に対する２つの一般的に使用されるモノクローナル抗体、すなわち、２０．１および１０３．２の存在下、ＣＴＥ−Ｃｌ５  ＹＧビーズをＤａｕｄｉ細胞と共にインキュベートした。ＤａｕｄｉへのＣＴＥ−Ｃｌ５  ＹＧビーズの結合は両方のモノクローナル抗体により阻害された。このことは、ＣＤ２７７がＶγ９Ｖδ２ＴＣＲと直接相互作用していることを示している（図１５Ｄ）。また、静的ＹＧビーズが、ＰＡＭにより誘導されたＣＤ２７７Ｊを感知しうるかどうかも判定した。ＰＡＭの添加はＤａｕｄｉ細胞へのＴＣＲ−ＹＧ−ビーズの結合の強度を変化させなかった（図１５Ｃ）。このことは、静的ＴＣＲ−ＹＧ−ビーズがＣＤ２７７に対する種々のアフィニティのγ９δ２ＴＣＲを捕捉しうるが、細胞膜内で発現されたγ９δ２ＴＣＲの作用様態を完全には模倣できないことを示している。
【０３０８】
実施例１５：γ９δ２ＴＣＲとその対応物との動的相互作用
ＴＥＧ形態で発現された場合のγ９δ２ＴＣＲの異なる機能的アビディティが、腫瘍細胞標的へのＴＥＧの結合を媒介する能力により調節されるかどうかを更に評価するために、より動的なモデルを利用した。したがって、同等レベルの種々のγδＴＣＲを発現するＪｕｒｍａ細胞をＨＥＫ２９３ＦＴ腫瘍細胞と共にインキュベートした。付着性ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の使用は、インキュベーション後１２０分以内に腫瘍細胞に結合していないＴＥＧの、洗浄による廃棄を可能にし、ついでＤＡＰＩおよび抗ＣＤ３抗体での染色を行った。腫瘍細胞−Ｔ細胞コンジュゲートの数を評価した。ＹＧビーズ染色とは対照的に、ＰＡＭの非存在下、使用されるγ９δ２ＴＣＲのアフィニティとコンジュゲート形成が相関するだけでなく、特に低アフィニティγ９δ２ＴＣＲの場合に、そして驚くべきことに非機能的突然変異体ＬＭ１の場合にも、ＰＡＭ処理はコンジュゲートの数を増加させた（図１６）。この知見は、腫瘍細胞上で発現された一定のタンパク質への異なるγ９δ２ＴＣＲの物理的結合が、γ９δ２ＴＣＲを発現するＴ細胞と腫瘍細胞との連続的コンジュゲート形成を促進することを示唆している。しかし、コンジュゲート形成はγ９δ２ＴＣＲのＣＤＲ３領域に非依存的でありうる。したがって、ＰＡＭは、γ９δ２ＴＣＲに依存的であるがＣＤＲ３には非依存的なコンジュゲート形成を誘発する可能性があるが、これは、Ｔ細胞を完全に活性化するには不十分である。完全なＴ細胞活性化の誘導には追加的な工程が関与する必要がある。
【０３０９】
γ９δ２ＴＣＲを発現するＴ細胞の活性化に必須であると報告されている追加的な工程は腫瘍細胞の細胞膜におけるＣＤ２７７Ｊ配置でありうる。ＣＤ２７７ＪがＴ細胞側のγ９δ２ＴＣＲのクラスター化の増加にも関連しているかどうか、およびそのような過程がγ９δ２ＴＣＲのＣＤＲ３領域に依存的であるのかどうかを調べるために、異なるγδＴＣＲアフィニティの状況での形質膜における空間的変化を分析した。非機能的ＴＣＲ  ＬＭ１、低アフィニティＣＴＥ−Ｃｌ３および高アフィニティＣＴＥ−Ｃｌ５を発現するように操作されたＪｕｒｍａ  Ｔ細胞間で形成された後期免疫学的シナプスの共焦点イメージングを判定した。免疫学的シナプスから離れたＴ細胞膜領域と比較して、腫瘍標的とＴ細胞との間の接触領域に蓄積したγδＴＣＲの量を図１７Ａおよびず１７Ｂに示す。γδＴＣＲのシナプス富化は、ＰＡＭ未処理腫瘍細胞に対するＣＴＥ−Ｃｌ３およびＬＭ１  ＴＣＲと比較した場合、ＣＴＥ−Ｃｌ５に関しては有意に高かった（低いリン酸化抗原レベルにおいて）（図１７Ｂ）。非活性ＴＣＲ  ＬＭ１を発現するＴ細胞は有意な腫瘍細胞結合を示したが（図１６）、腫瘍細胞をＰＡＭで前処理した場合には、高いリン酸化抗原レベルにおいてもＬＭ１  ＴＣＲは免疫学的シナプスにリクルートしなかった（図１７Ｂ）。ＰＡＭ前処理は免疫シナプスへの高アフィニティＣＴＥ−Ｃｌ５  ＴＣＲのリクルートメントに影響を及ぼさなかった。しかし、それはシナプスにおける低アフィニティのＣＴＥ−Ｃｌ３  ＴＣＲの蓄積を有意に増加させた。これが示唆するところによると、γ９δ２ＴＣＲのＣＤＲ３領域は腫瘍細胞とＴ細胞との近接に影響を及ぼさず、一方、それは、より低いアフィニティを有するγ９δ２ＴＣＲの、シナプスへのリクルートメントを支持するのに有用である。この知見は、γ９δ２ＴＣＲのアフィニティが免疫学的シナプスへのそのリクルートメントを決定すること、および完全なシナプス形成がＰＡＭによって更に増強されうることを示唆している。
【０３１０】
最後に、シナプスにおける低アフィニティＣＴＥ−Ｃｌ３  ＴＣＲのリクルートメントの増強がＰＡＭ処理によるＣＤ２７７クラスタリングの変化の結果であったのかどうかを理解するために、約２０ｎｍの分解能をもたらす局在化ベース超分解能イメージング技術である直接確率的光学再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）を行った。ＢＴＮ３Ａ分子をＡＦ６４７−ＣＤ２７７抗体で標識し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の基底膜において超分解能イメージングを取得した。イメージを定量化するために、密度ベース空間クラスタリングアプリケーション（ＤＢＳＣＡＮ）を用いた。ＤＢＳＣＡＮは、それらの相対的局所空間密度に基づいて、局在化をクラスターに分類する。個々のクラスターを特定し、種々の条件にわたるクラスターの分布を比較した。ＰＡＭでの処理は局在化クラスターのサイズ、密度または数を劇的には変化させなかった（図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｅおよび図１７Ｆ）。Ｇｅｔｉｓ−ＧまたはＨｉｅｒａｒｃｈａｌクラスター分析法を用いた場合、結果は類似していた。３０、４０または５０ｎｍのイプシロンまでの隣接クラスター点の間の最大距離の選択は、類似したＢＴＮ３Ａナノクラスタリング結果を与えた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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