(57)【要約】  本発明は、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなる単離されたペプチドであって、上記ペプチドはａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列とからなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する、単離されたペプチドに関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなる単離されたペプチドであって、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）前記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とする、単離されたペプチド（ただし、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く）。
【請求項２】
ａ）配列番号１の残基５〜残基９を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）前記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド（ただし、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く）。
【請求項３】
単球由来のマクロファージの膜に結合することが可能であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列の残基５〜残基９を少なくとも含む５個〜１５個のアミノ酸の配列からなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
α）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）前記配列α）と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド（ただし、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く）。
【請求項６】
Ｃ末端でアミド化されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
医薬として用いられるペプチドであって、前記単離されたペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなり、前記ペプチドは、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）前記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とする、ペプチド。
【請求項９】
前記単離されたペプチドは、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）前記配列α）と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とする、請求項８に記載のその使用のためのペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項８又は９に記載のその使用のためのペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドは、Ｃ末端でアミド化されていることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のその使用のためのペプチド。
【請求項１２】
炎症誘発剤として用いられる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｃ型レクチン受容体、好ましくはマンノース受容体又はデクチン−１受容体により認識される病原体により引き起こされる疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
真菌症、好ましくはカンジダ症の予防又は治療のために用いられる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
癌の治療のために用いられる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離されたペプチド、このペプチドを含む医薬組成物、及びこのペプチド又はこの組成物の医薬としての、特に抗感染症薬又は抗癌薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐性病原体の出現の増加及びこれらの感染症と闘うことが可能な抗感染症薬の不足により、新たな治療方略の開発はこれまでになく緊急を要するものとなっている。
【０００３】
これらの方略の１つは、免疫調節剤、特に病原体に対する免疫系の作用を強化することが可能な免疫調節剤の開発により免疫系を活性化させることを目的としている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ペプチドＰ１７及びその誘導体が免疫調節活性を有することを見出した。
【０００５】
ペプチドＰ１７は、オオシワアリ（Tetramorium bicarinatum ants）の毒液に存在するペプチドである。この１３個のアミノ酸のペプチドは、Riffletら（Identification and characterization of a novel antimicrobial peptide from the venom of the ant Tetramorium bicarinatum. Peptides. 2012 Dec; 38(2):363-70）により記載されたが、このように有用な特性は示されなかった。特に該ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗細菌特性を示さなかった。
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｐ１７及びその誘導体が、炎症誘発性サイトカインの放出を増大させ、酸素フリーラジカルの分泌を助けることを明らかにした。Ｐ１７及びその誘導体により引き起こされる免疫調節は、ヒト単球由来のマクロファージがこうして極性化されることにより、酵母のＣ．アルビカンスのような病原体を排除するとともに、癌細胞の増殖を減少させることができるようなものである。
【０００７】
この免疫調節は、多くの病原体に対する生得免疫応答に介入するマンノース受容体又はデクチン−１受容体のようなＣ型レクチン受容体により媒介される。これらの受容体は、多くの病原体の表面上に存在し、また癌細胞の表面上に異常に発現されるグルカン等の分子パターンを認識するため、Ｐ１７及びその誘導体は、真菌性、細菌性、ウイルス性、又は癌性の病態等の多くの病態の治療又は予防のための特に見込みのある候補である。
【０００８】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなる単離されたペプチドであって、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する、単離されたペプチドに関する。
【０００９】
本発明はまた、
本発明によるペプチドと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含む医薬組成物に関する。
【００１０】
本発明はまた、医薬として使用されることが意図される、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなる単離されたペプチドであって、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する、単離されたペプチドに関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
ペプチド
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなる単離されたペプチドであって、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とする、単離されたペプチドに関する。
【００１２】
アミノ酸の配列の同一性のパーセントは、最大の配列同一性が得られるように必要に応じてスペースを導入することによる、配列のアライメント後に参照配列と同一である比較されるべき配列中のアミノ酸残基のパーセントにより定義される。その際、同一性のパーセントは、以下の式：同一性のパーセント＝１００×［１−（Ｃ／Ｒ）］に従って決定され、ここで、Ｃは参照配列と比較されるべき配列との間の参照配列の全長にわたる差異（ｉ）参照配列中の、比較されるべき配列においてアライメントされた対応するアミノ酸を有しない各アミノ酸、（ｉｉ）参照配列中の各スペース、及び（ｉｉｉ）参照配列中の、比較されるべき配列においてアライメントされたアミノ酸とは異なり、差異をなす各アミノ酸の数であり、またＲは比較されるべき配列とのアライメントの全長（すなわち、参照配列の全長）にわたる参照配列におけるアミノ酸の数であり、ここで、参照配列において生ずる各スペースは１つのアミノ酸として数えられる。配列の同一性のパーセントの決定を考慮した配列のアライメントは、当業者に既知の様々な様式において、例えばＢＬＡＳＴ（Altschul et al, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-）のような入手可能な公開ソフトウェアを使用することによって行うことができる。このソフトウェアは、好ましくはデフォルトのパラメーターで使用される。
【００１３】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなり、上記配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
ａ）配列番号１の残基５〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する。
【００１４】
本発明によるペプチドは、３個〜３０個、３個〜２６個、又はより好ましくは５個〜２０個のアミノ酸、又は更により好ましくは５個〜１５個のアミノ酸を有し得る。例えば、上記単離されたペプチドは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸を有し得る。
【００１５】
有利には、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
ａ）配列番号１の残基５〜残基９を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する。
【００１６】
好ましくは、本発明によるペプチドは、配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、残基５、若しくは残基６〜残基８、残基９、残基１０、残基１１、残基１２、若しくは残基１３を少なくとも含み、又は配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、残基５、若しくは残基６〜残基８、残基９、残基１０、残基１１、残基１２、若しくは残基１３を少なくとも含む、上記ペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸の配列を有する。
【００１７】
より具体的には、本発明によるペプチドは、配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、残基５、又は残基６〜残基８、残基９、残基１０、残基１１、残基１２、又は残基１３を少なくとも含む。
【００１８】
アミノ酸残基の位置は、Ｐ１７の配列（配列番号１）を参照して示される。
【００１９】
１つの実施の形態によれば、上記ペプチドは、上記定義の上記配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【００２０】
好ましくは、上記ペプチドは、単球由来のマクロファージ膜に結合され得る。該ペプチドは、細胞毒性メディエーターの産生の原因となるシグナル伝達経路の引き金となり得る。
【００２１】
好ましくは、上記ペプチドは、単球由来のマクロファージによる酸素フリーラジカル及びＩＬ−１βの産生を誘発し得る。該ペプチドが酸素フリーラジカル及びＩＬ−１βの産生を誘発する能力は、当業者により容易に測定され得る。そのような試験は、特に以下に記載される材料及び方法の項目に記載されている。
【００２２】
有利には、配列番号１のアミノ酸配列の残基５〜残基９を少なくとも含む５個〜１５個のアミノ酸の配列からなる。
【００２３】
１つの実施の形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
α）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記配列α）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％の同一性を有する、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列からなる。
【００２４】
より好ましくは、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
α）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記配列α）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％の同一性を有する３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列からなる。
【００２５】
種々の配列を以下の表１にまとめる：
【００２６】
【表１】
2020504158.tif 000002
【００２７】
有利には、上記ペプチドは、組み換えペプチド又は合成ペプチドである。このように、上記ペプチドは、当業者に既知の従来の技術により、特に固相合成若しくは液相合成により、又は適切な細胞系（真核生物又は原核生物）における組み換えＤＮＡの発現により製造され得る。例えば、上記ペプチドは、Merrifieldら（J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-2154）により最初に記載されたように、固相中でＦｍｏｃ技術に従って合成して、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる。好ましくは、上記ペプチドは合成ペプチドである。
【００２８】
一般的に、本発明は、ペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、改変がなされた本発明によるペプチドを含む。
【００２９】
本発明は特に、Ｐ１７から誘導されたペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、Ｐ１７の配列（配列番号１）における１個以上のアミノ酸の突然変異（挿入、欠失、置換）により得られる天然変異体又は合成ペプチドを含む。
【００３０】
上記ペプチドは、Ｃ末端でアミド化されていてもよい。上記ペプチドは、Ｎ末端でアシル化されていてもよい。好ましくは、上記ペプチドは、Ｃ末端でアミド化されている。「Ｃ末端でアミド化される」とは慣例的に、ペプチドのＣ末端にＮＨ２基（非置換の第一級アミド）が存在することを意味する。
【００３１】
本発明はまた、改変Ｐ１７から誘導された上記ペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、Ｃ末端でのアミド化以外の、以下に記載される改変を有するＣ末端で改変されたペプチドに関する。また、Ｃ末端でアミド化されたペプチドのＣ末端の非置換の第一級アミド（ＲＣＯＮＨ２）を、例えば一置換された第一級アミド（ＲＣＯＮＨＲ１）又は二置換された第一級アミド（ＲＣＯＮＲ１Ｒ２）により置き換えることもできる。
【００３２】
１つの実施の形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつＣ末端でアミド化されたペプチドは除外される。
【００３３】
特に、本発明は、或る特定のアミノ酸が類似の特性を有するアミノ酸により置換された、Ｐ１７から誘導されるペプチド又は上記定義のようなペプチドを含む。例えば、疎水性アミノ酸、例えば残基Ｌ１、残基Ｌ６、及び残基Ｌ１３、残基Ｆ２、残基Ｉ５、残基Ｉ９、及び／又は残基Ａ１１は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、及びｔｅｒｔ−ロイシン等の非天然疎水性アミノ酸からなる群から選択される別の疎水性アミノ酸により置換されてもよく、残基Ｋ３、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は、Ｒ及び／又はＨ等の別の天然の塩基性アミノ酸、又はオルニチン、ホモリジン、及び／又はパラアミノフェニルアラニン等の非天然の塩基性アミノ酸により置換されてもよく、残基Ｅ４及び／又は残基Ｅ７は、Ｄ等の別のアミノ酸、又はパラカルボキシフェニルアラニン等の非天然アミノ酸により置換されてもよい。
【００３４】
上記ペプチドは、例えば、残基Ｌ１、残基Ｌ６、及び残基Ｌ１３、残基Ｆ２、残基Ｉ５、残基Ｉ９、及び／又は残基Ａ１１等の１個以上の疎水性アミノ酸が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、及びｔｅｒｔ−ロイシン等の非天然の疎水性アミノ酸からなる群から選択される別の疎水性アミノ酸により置き換えられている、上記のようなＰ１７の変異体又はＰ１７の誘導体からなり得る。
【００３５】
好ましくは、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は保存されている。より好ましくは、残基Ｋ３、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は保存されている。
【００３６】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００３７】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを除く、
ａ）配列番号１の残基５〜残基８を少なくとも含む５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００３８】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、上記単離されたペプチドは、
α）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記α）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００３９】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、上記単離されたペプチドは、
α）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記α）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
から構成される群から選択されるアミノ酸の配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００４０】
本発明はまた、Ｃ末端でアミド化されている又はＣ末端でアミド化されていない、本発明によるペプチド及び／又は配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの多量体に関する。例えば、本発明は、二量体又は三量体に関し得る。多量体は、ホモマー又はヘテロマーであり得る。
【００４１】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、上記定義のようなペプチド又はペプチドＰ１７をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００４２】
本発明によれば、上記ポリヌクレオチドの配列は、上記ペプチドをコードするｃＤＮＡの配列である。上記配列は、有利には上記ペプチドが発現される宿主においてコドンの使用が最適であるように改変され得る。
【００４３】
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。
【００４４】
好ましくは、上記ベクターは、ペプチドの発現のために必要な全てのエレメントを含む発現ベクターである。例えば、上記ベクターは、適切な転写、或いは翻訳の調節制御下にある上記定義のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、発現カセット（プロモーター、アクチベーター、イントロン、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、スプライシング部位）を含む。
【００４５】
本発明はまた、上記定義のようなペプチド、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む改変された原核宿主又は真核宿主に関する。その細胞は、安定的に又は一過的に改変されていてもよい。
【００４６】
医薬組成物
本発明はまた、上記定義のようなペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
【００４７】
上記組成物はまた、ペプチドＰ１７及び薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。
【００４８】
１つの代替的な実施の形態によれば、上記医薬組成物は、
配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなるペプチドであって、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とするペプチドと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含み得る。
【００４９】
１つの代替的な実施の形態によれば、上記医薬組成物は、
配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなるペプチドであって、
ａ）配列番号１の残基５〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とするペプチドと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含み得る。
【００５０】
上記医薬組成物のペプチドは、３個〜３０個、３個〜２６個、又はより好ましくは５個〜２０個のアミノ酸、又は更により好ましくは５個〜１５個のアミノ酸を有し得る。例えば、上記単離されたペプチドは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸を有し得る。
【００５１】
上記組成物は、特に、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列からなるペプチドであって、
ａ）配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、残基５、又は残基６〜残基８、残基９、残基１０、残基１１、残基１２、又は残基１３を少なくとも含むアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とするペプチドを含み得る。
【００５２】
有利には、上記組成物は、特に、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列からなるペプチドであって、
ａ）配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、又は残基５〜残基９、残基１０、残基１１、残基１２、又は残基１３を少なくとも含むアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とするペプチドを含み得る。
【００５３】
１つの実施の形態によれば、上記医薬組成物は、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記配列α）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％の同一性を有する、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有するペプチドを含む。
【００５４】
好ましい実施の形態によれば、上記医薬組成物は、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記α）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有するペプチドを含む。
【００５５】
１つの実施の形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドは、上記医薬組成物から除外される。１つの実施の形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつＣ末端でアミド化されたペプチドは、上記医薬組成物から除外される。
【００５６】
１つの変形形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。この変形形態の１つの実施の形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつＣ末端でアミド化されている。
【００５７】
上記ペプチドは、組み換えペプチド又は合成ペプチドであり得る。
【００５８】
一般的に、本発明は、ペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、改変がなされた本発明によるペプチドを含む。
【００５９】
本発明は特に、Ｐ１７から誘導されたペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、Ｐ１７の配列（配列番号１）における１個以上のアミノ酸の突然変異（挿入、欠失、置換）により得られる天然変異体又は合成ペプチドを含む。
【００６０】
上記ペプチドはＣ末端でアミド化されていてもよい。上記ペプチドはＮ末端でアシル化されていてもよい。好ましくは、上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。「Ｃ末端でアミド化される」とは慣例的に、ペプチドのＣ末端にＮＨ２基（非置換の第一級アミド）が存在することを意味する。
【００６１】
本発明はまた、Ｐ１７から誘導された改変ペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、上記のＣ末端でのアミド化以外の改変を有するＣ末端で改変されたペプチドに関する。また、アミド化されたペプチドのＣ末端の非置換の第一級アミド（ＲＣＯＮＨ２）を、例えば一置換された第一級アミド（ＲＣＯＮＨＲ１）又は二置換されたアミド（ＲＣＯＮＲ１Ｒ２）により置き換えることもできる。
【００６２】
上記ペプチドは、上述のペプチドの突然変異により得られた天然又は合成の変異体であり得る。上記指摘のように、該変異体は、疎水性アミノ酸、例えば残基Ｌ１、残基Ｌ６、及び残基Ｌ１３、残基Ｆ２、残基Ｉ５、残基Ｉ９、及び／又は残基Ａ１１の、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、及びｔｅｒｔ−ロイシン等の非天然疎水性アミノ酸からなる群から選択される別の疎水性アミノ酸による置換、残基Ｋ３、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２の、Ｒ及び／又はＨ等の別の天然の塩基性アミノ酸、又はオルニチン、ホモリジン、及び／又はパラアミノフェニルアラニン等の非天然の塩基性アミノ酸による置換、及び／又は残基Ｅ４及び／又は残基Ｅ７の、Ｄ等の別のアミノ酸、又はパラカルボキシフェニルアラニン等の非天然アミノ酸による置換を含み得る。
【００６３】
上記ペプチドは、例えば、残基Ｌ１、残基Ｌ６、及び残基Ｌ１３、残基Ｆ２、残基Ｉ５、残基Ｉ９、及び／又は残基Ａ１１等の１個以上の疎水性アミノ酸が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、及びｔｅｒｔ−ロイシン等の非天然の疎水性アミノ酸からなる群から選択される別の疎水性アミノ酸により置き換えられている、上記定義のようなＰ１７の変異体又はＰ１７の誘導体からなり得る。
【００６４】
好ましくは、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は保存されている。より具体的には、残基Ｋ３、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は保存されている。
【００６５】
本発明はまた、Ｃ末端でアミド化されている又はＣ末端でアミド化されていない、本発明によるペプチド及び／又は配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの多量体に関する。例えば、本発明は、二量体又は三量体に関し得る。多量体は、ホモマー又はヘテロマーであり得る。
【００６６】
薬学的に許容可能な賦形剤は、例えば滅菌水、生理食塩溶液、グルコース、デキストロース、又は緩衝溶液から構成される群から選択される担体であり得る。薬学的に許容可能な賦形剤はまた、希釈剤、安定剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、粘度向上添加剤であり得る。ＰＢＳは、薬学的に許容可能な賦形剤から除外され得る。
【００６７】
上記医薬組成物は、予防効果／治療効果を得ることが可能となる有効用量のペプチドを含む。この用量は、被験体の年齢、性別、及び体重等の要因に従って決定及び調節される。上記医薬組成物は一般的に、通常のプロトコル、用量に従って、かつ免疫調節効果を誘発するために十分な期間にわたり投与される。その投与は、皮下投与、筋内投与、静脈内投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、舌下投与、直腸投与、膣内投与、鼻内投与、吸入による投与、又は経皮適用による投与であり得る。
【００６８】
上記医薬組成物は、選択された投与のために適したガレヌス製剤形、すなわち標準的プロトコルに従って調製される滅菌注射液、散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、坐剤の形で示される。
【００６９】
上記医薬組成物は、別の治療剤を更に含み得る。該治療剤は、例えば抗真菌薬、抗癌薬、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、及び抗生物質からなる群から選択され得る。
【００７０】
療法
本発明者らは、Ｐ１７及びその誘導体がヒト末梢血単球由来のマクロファージの細胞毒性機能を活性化させることを明らかにした。こうして、Ｐ１７又はその誘導体により極性化されたマクロファージは、保存された分子構造（ＰＡＭＰ）をその壁上に発現する病原体、及びＣ型レクチン受容体により認識される変化したグリカンパターンを有する腫瘍細胞の高い認識能力及び貪食能力を有する。
【００７１】
Ｃ型レクチン受容体は、多くの病原体、例えば、
細菌（Sukhithasri V. et al., Innate immune recognition of microbial cell wall components and microbial strategies to evade such recognitions, Microbiol Res. 2013 Aug 25;168(7):396-406、Killick KE et al., Receptor-mediated recognition of mycobacterial pathogens, Cell Microbiol. 2013 Sep;15(9)）、
真菌及び酵母（Vautier S et al., C-type lectin receptors and cytokines in fungal immunity, Cytokine. 2012 Apr;58(1):89-99、Drummond RA et al., The role of Dectin-1 in the host defence against fungal infections, Curr Opin Microbiol. 2011 Aug;14(4):392-9）、
寄生虫（Vazquez-Mendoza A. et al., Parasitic infections: a role for C-type lectins receptors, Biomed Res Int. 2013;2013:456352 Epub 2013 Jan 27、Lefevre L. et al., The C-type lectin receptors dectin-1, MR, and SIGNR3 contribute both positively and negatively to the macrophage response to Leishmania infantum. Immunity. 2013 May 23;38(5):1038-49）に対する生得免疫応答、
並びに腫瘍細胞（Dube DH. Et al., Glycans in cancer and inflammation-potential for therapeutics and diagnostics, Nat Rev Drug Discov. 2005 Jun;4(6):477-88、Aarnoudse CA et al., Recognition of tumor glycans by antigen-presenting cells, Curr Opin Immunol. 2006 Feb;18(1):105-11、Chiba S et al. Recognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrates innate immune cells for anti-tumor responses, Elife. 2014 Aug 22;3）に対する生得免疫応答に関与している。
【００７２】
したがって、本発明はまた、医薬として使用されることが意図される、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなるペプチド、及び／又は上記ペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物であって、上記ペプチドが、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ペプチド及び／又は医薬組成物に関する。
【００７３】
本発明は、治療されるべき被験体における治療方法であって、上記被験体に有効量の上記ペプチド又は上記単離されたペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む上記医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００７４】
本発明はまた、上記ペプチド、又は上記ペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む上記医薬組成物の、医薬の製造における使用に関する。
【００７５】
１つの実施の形態によれば、医薬として使用されることが意図される上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個〜３９個のアミノ酸の配列からなり、上記ペプチドは、
ａ）配列番号１の残基５〜残基８を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する。
【００７６】
上記ペプチドは、３個〜３０個、３個〜２６個、又はより好ましくは５個〜２０個のアミノ酸、又は更により好ましくは５個〜１５個のアミノ酸を有し得る。例えば、上記単離されたペプチドは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸を有し得る。
【００７７】
有利には、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列からなり得て、上記ペプチドは、
ａ）配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、残基５、又は残基６〜残基８、残基９、残基１０、残基１１、残基１２、又は残基１３を少なくとも含む３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する。
【００７８】
有利には、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列からなり、上記ペプチドは、
ａ）配列番号１の残基１、残基２、残基３、残基４、又は残基５〜残基９、残基１０、残基１１、残基１２、又は残基１３を少なくとも含むアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有することを特徴とする。
【００７９】
１つの実施の形態によれば、上記ペプチドは、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記配列α）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％の同一性を有する、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、又は３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する。
【００８０】
１つの好ましい実施の形態によれば、医薬として使用されることが意図される上記ペプチドは、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記配列α）と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する３個〜３９個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有する。
【００８１】
１つの好ましい実施の形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。１つの好ましい実施の形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸の配列を有し、かつＣ末端でアミド化されている。
【００８２】
代替的な実施の形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有しない。代替的な実施の形態によれば、上記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつＣ末端でアミド化されているペプチドではない。
【００８３】
上記ペプチドは、組み換えペプチド又は合成ペプチドであり得る。
【００８４】
一般的に、本発明は、ペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、改変がなされた本発明によるペプチドを含む。
【００８５】
本発明は特に、Ｐ１７から誘導されたペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、Ｐ１７の配列（配列番号１）における１個以上のアミノ酸の突然変異（挿入、欠失、置換）により得られる天然変異体又は合成ペプチドを含む。
【００８６】
上記ペプチドは、Ｃ末端でアミド化されていてもよい。上記ペプチドは、Ｎ末端でアシル化されていてもよい。好ましくは、上記ペプチドは、Ｃ末端でアミド化されている。「Ｃ末端でアミド化される」とは慣例的に、ペプチドのＣ末端にＮＨ２基（非置換の第一級アミド）が存在することを意味する。
【００８７】
本発明はまた、Ｐ１７から誘導された上記改変ペプチドがその免疫調節特性を維持する限りは、上記のＣ末端でのアミド化以外の改変を有する、Ｃ末端で改変されたペプチドに関する。また、アミド化されたペプチドのＣ末端の非置換の第一級アミド（ＲＣＯＮＨ２）を、例えば一置換された第一級アミド（ＲＣＯＮＨＲ1）又は二置換されたアミド（ＲＣＯＮＲ１Ｒ２）により置き換えることもできる。
【００８８】
上記ペプチドは、上述のペプチドの突然変異により得られる天然又は合成の変異体であり得る。上記のように、該変異体は、疎水性アミノ酸、例えば残基Ｌ１、残基Ｌ６、及び残基Ｌ１３、残基Ｆ２、残基Ｉ５、残基Ｉ９、及び／又は残基Ａ１１の、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、及びｔｅｒｔ−ロイシン等の非天然疎水性アミノ酸からなる群から選択される別の疎水性アミノ酸による置換、残基Ｋ３、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２の、別の天然の塩基性アミノ酸Ｒ及び／又はＨ、又はオルニチン、ホモリジン、及び／又はパラアミノフェニルアラニン等の非天然の塩基性アミノ酸による置換、及び／又は残基Ｅ４及び／又は残基Ｅ７の、Ｄ等の別のアミノ酸、又はパラカルボキシフェニルアラニン等の非天然アミノ酸による置換を含み得る。
【００８９】
上記ペプチドは、例えば、残基Ｌ１、残基Ｌ６、及び残基Ｌ１３、残基Ｆ２、残基Ｉ５、残基Ｉ９、及び／又は残基Ａ１１等の１個以上の疎水性アミノ酸が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、及びｔｅｒｔ−ロイシン等の非天然の疎水性アミノ酸からなる群から選択される別の疎水性アミノ酸により置き換えられている、上記定義のようなＰ１７の変異体又はＰ１７の誘導体からなり得る。
【００９０】
好ましくは、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は保存されている。より具体的には、残基Ｋ３、残基Ｋ８、残基Ｋ１０、及び／又は残基Ｋ１２は保存されている。
【００９１】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、
ａ）配列番号１の残基６〜残基８を少なくとも含む５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００９２】
より好ましくは、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、
ａ）配列番号１の残基５〜残基８を少なくとも含む５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
ｂ）上記ａ）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００９３】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、上記単離されたペプチドは、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記α）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００９４】
１つの実施の形態によれば、上記単離されたペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から誘導される５個〜２０個のアミノ酸の配列からなり、上記単離されたペプチドは、
α）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、及び配列番号１７と、
β）上記α）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する５個〜２０個のアミノ酸の配列と、
から構成される群から選択されるアミノ酸の配列を有し、かつ上記ペプチドはＣ末端でアミド化されている。
【００９５】
本発明はまた、Ｃ末端でアミド化されている又はＣ末端でアミド化されていない、本発明によるペプチド及び／又は配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの多量体に関する。例えば、本発明は、二量体又は三量体に関し得る。多量体は、ホモマー又はヘテロマーであり得る。
【００９６】
本発明者らは、Ｐ１７及びその誘導体が炎症誘発性サイトカインの産生に導くことを明らかにした。したがって、本発明はまた、炎症誘発剤として用いられる上記ペプチド又は上記医薬組成物に関する。
【００９７】
本発明者らは、Ｐ１７により極性化されたマクロファージがＣ型レクチン受容体の過剰発現を伴うことを明らかにした。これらの受容体は多くの病原体に対する免疫応答に関与している。
【００９８】
したがって、本発明は、Ｃ型レクチン受容体、好ましくはマンノース受容体又はデクチン−１受容体により認識される病原体により引き起こされる疾患の予防又は治療のために用いられる上記ペプチド及び／又は上記医薬組成物に関する。病原体は、
細菌、例えばストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、クレブシエラ・ニューモニエ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、及びマイコバクテリウム・ツベルクロシスからなる群から選択される細菌、
真菌、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、
寄生虫、例えばリーシュマニア・ドノバニ（Leishmania donovani）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、及びクルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）からなる群から選択される寄生虫、
であり得る。
【００９９】
したがって、本発明は、治療されるべき被験体におけるＣ型レクチン受容体により認識される病原体により引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、上記被験体において有効量の上記ペプチド又は上記単離されたペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む上記医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１００】
Ｃ型レクチン受容体により認識される病原体により引き起こされる疾患は、好ましくは真菌症、より好ましくはカンジダ症である。
【０１０１】
Ｃ型レクチン受容体はまた、腫瘍細胞に対する免疫応答にも関与している。したがって、上記ペプチドは、抗癌使用のように癌の治療に使用され得る。
【０１０２】
したがって、本発明はまた、治療されるべき被験体における癌を予防又は治療する方法であって、上記被験体において有効量の上記ペプチド又は上記単離されたペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む上記医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１０３】
本発明を、以下の図面及び実施例により更に説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰ１７により処理された又は未処理のヒト単球由来のマクロファージによるＣ．アルビカンスの除去を示す図である。
【図２】Ｐ１７により処理された又は未処理のヒト単球由来のマクロファージによるＣ．アルビカンスの結合能力及び貪食能力を示す図である。
【図３】Ｃ．アルビカンスによる刺激への応答における、ヒト単球由来のマクロファージによる酸素フリーラジカル（ＯＦＲ）及びサイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１２の産生に対するＰ１７の効果を示す図である。
【図４】Ｃ型レクチン受容体のタンパク質発現に対するＰ１７の効果を示す図である。
【図５】マクロファージの古典的及び選択的分化のマーカー遺伝子の発現に対するＰ１７の効果を示す図である。
【図６】ヒト単球由来のマクロファージにおける、コーディング遺伝子ＰＰＡＲ−γ及びその標的ＳＲＢ１の発現に対するＰ１７の効果、並びにＰＰＡＲ−γの不可逆的アンタゴニストであるＧＷ９６６２の存在下での膜受容体デクチン−１及びＭＲの発現に対するＰ１７の効果を示す図である。
【図７】ヒト単球由来のマクロファージにおけるアラキドン酸の代謝の酵素をコードする遺伝子の発現に対するＰ１７の効果を示す図である。
【図８】ヒト単球由来のマクロファージによるＬＴＢ４の分泌に対するＰ１７の効果を示す図である。
【図９Ａ】陰性試験に関するＰ１７により誘発される細胞内カルシウム濃度を表す図である。
【図９Ｂ】百日咳毒素の存在下でのＰ１７により誘発される細胞内カルシウム濃度を表す図である。
【図９Ｃ】ｆＭＬＰ（ペプチドのＮ−ホルミルメチオニン−ロイシル−フェニルアラニン）で脱感作することによるＰ１７により誘発される細胞内カルシウム濃度を表す図である。
【図１０】Ｐ１７の抗微生物効果、酸素の反応性誘導体（ＲＯＳ）及びＩＬ−１βの放出に対するＢＡＰＴＡ（カルシウム結合物質）の効果を示す図である。
【図１１】Ｃ．アルビカンスにより誘発された胃腸カンジダ症を伴うマウスの体重に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１２】感染６日後の胃腸コロニー形成に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１３Ａ】感染したマウスにおけるその腹腔マクロファージの、カンジダ・アルビカンス除去能力に対するＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１３Ｂ】感染したマウスにおけるその腹腔マクロファージのカンジダ・アルビカンス貪食能力に対するＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１３Ｃ】感染したマウスにおけるその腹腔マクロファージのＲＯＳ産生能力に対するＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１３Ｄ】感染したマウスにおけるその腹腔マクロファージのＩＬ−β放出能力に対するＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１３Ｅ】感染したマウスにおけるその腹腔マクロファージのＩＬ−１２放出能力に対するＰ１７の投与の効果を示す図である。
【図１４】Ｐ１７の作用様式の図解である。
【図１５】Ｐ１７により処理されたマクロファージ又は未処理のマクロファージとの共培養におけるＴリンパ腫細胞（ＥＬ４）の数を示す図である。
【図１６】ＥＬ４腫瘍細胞への応答における、Ｐ１７により処理されたマクロファージ又は未処理のマクロファージのＲＯＳ産生能力を示す図である。
【図１７】Ｃ．アルビカンスへの応答における、ヒト単球由来のマクロファージによるＲＯＳの放出に対するＰ１７の種々の断片の効果を示す図である。
【図１８】ヒト単球由来のマクロファージによるカンジダ・アルビカンスの除去に対するＰ１７の種々の断片の効果を示す図である。
【図１９】Ｃ．アルビカンスへの応答における、マクロファージによるＲＯＳの産生に対するＰ１７のＣ末端アミド化の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
実施例
装置及び方法：
Ｐ１７抗微生物性ペプチド
特段の記載がない限り、以下の図面及び実施例で使用されるペプチドＰ１７は、Ｃ末端でアミド化されている（そのＣ末端にＮＨ２基が存在する）。その配列は、質量分析法及びエドマン分解を使用することによるｄｅ  ｎｏｖｏシーケンシングにより特徴付けられた（Rifflet et al. 2012）。ペプチドＰ１７は、自動式のＬｉｂｅｒｔｙペプチド合成装置（CEM社、フランス、サクレー）において９９％を上回る純度で合成された。合成ペプチドの分子の確実性及び同一性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより試験した。
【０１０６】
ヒト単球由来のマクロファージによりＣ．アルビカンスを除去する研究
ヒト単球由来のマクロファージをペプチドＰ１７又はその断片で処理した後に又は処理せずに、それを３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。これらの細胞をＣ．アルビカンスと一緒に（１マクロファージに対して０．３の酵母の比率で）３７℃で４０分間にわたりインキュベートし、結合されていない酵母を洗浄により除去する。次に、これらのマクロファージを、３７℃で４時間にわたりインキュベートする。インキュベート後に周囲環境（environment）を除去し、細胞を溶解させた。Ｃ．アルビカンスのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、塗布して３７℃で４８時間にわたり培養した後にサブロープレート（Sabouraud box）上で測定した。
【０１０７】
ヒト単球由来のマクロファージによるＣ．アルビカンスの結合及び貪食作用の研究
Ｃ．アルビカンスの結合及び貪食作用の分析のために、ヒト単球由来のマクロファージをペプチドＰ１７で処理した後に又は処理せずに、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。ヒト単球由来のマクロファージを、酵母標識ＧＦＰ（比率１／６）と一緒にした後に、４℃で２０分間にわたりインキュベートして、結合を評価した。貪食作用を、３７℃での１時間のインキュベーションの後に評価した。ヒト単球由来のマクロファージにより結合又は消化されたＣ．アルビカンスの量を、蛍光計（PerkinElmer社のＥｎＶｉｓｉｏｎ）を使用することにより蛍光を測定することによって測定した。
【０１０８】
Ｃ．アルビカンスへの応答におけるヒト単球由来のマクロファージによるＲＯＳの産生の研究
ＲＯＳの産生を分析するために、ヒト単球由来のマクロファージを、ペプチドＰ１７、非アミド化Ｐ１７、又は以下のＰ１７断片Ｐ１７（１−５）、Ｐ１７（１−７）、Ｐ１７（１−９）、Ｐ１７（１−１１）、Ｐ１７（３−１３）、Ｐ１７（５−１３）、Ｐ１７（７−１３）、及びＰ１７（９−１３）で処理し、又は処理しなかった。断片Ｐ１７（１−５）、Ｐ１７（１−７）、Ｐ１７（１−９）、Ｐ１７（１−１１）は、Ｃ末端でアミド化されておらず、断片Ｐ１７（３−１３）、Ｐ１７（５−１３）、Ｐ１７（７−１３）、及びＰ１７（９−１３）は、Ｃ末端でアミド化されている。次いで、こうして処理されたヒト単球由来のマクロファージを、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。酸素の反応性誘導体（ＲＯＳ）の産生を、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ルミノール）の存在下で化学発光により測定した（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、PerkinElmer社）。細胞をルミノール（６６μＭ）と一緒にＣ．アルビカンス（酵母対マクロファージ比：３：１）の存在下又は不存在下にてインキュベートした後に、化学発光の発生を１時間３０分にわたり継続的に測定した。
【０１０９】
マウスＴリンパ腫の腫瘍細胞（ＥＬ４）への応答における、マウスマクロファージによるＲＯＳの産生の研究
ＲＯＳの産生を分析するために、マウス腹腔マクロファージをペプチドＰ１７で処理した後に又は処理せずに、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。酸素の反応性誘導体（ＲＯＳ）の産生を、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ルミノール）の存在下で化学発光により測定した（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、PerkinElmer社）。細胞をルミノール（６６μＭ）と一緒にＥＬ４のＴリンパ腫の腫瘍細胞の存在下又は不存在下にてインキュベートした後に、化学発光の発生を１時間３０分にわたり継続的に測定した。
【０１１０】
Ｃ．アルビカンスへの応答におけるヒト単球由来のマクロファージによるＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１２の産生の研究
ヒト単球由来のマクロファージを、ペプチドＰ１７で２４時間にわたり刺激した後に、ペプチドＰ１７により活性化されたこれらのマクロファージを、Ｃ．アルビカンスにより酵母対マクロファージ比率３：１で８時間にわたり刺激した。細胞上清中のＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１２の産生を、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences社のＯｐｔｉＥＩＡ）により測定した。
【０１１１】
Ｃ型レクチン受容体のタンパク質発現の評価
Ｃ型レクチン受容体のタンパク質レベルの分析のために、ヒト単球由来のマクロファージをペプチドＰ１７（２００μｇ／ｍｌ）で処理した後に又は処理せずに、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。回収された細胞を、１５００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離し、細胞ペレット（nerve cell）を、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＰＢＳ中で懸濁した。それらの細胞を、デクチン−１受容体（モノクローナル抗体、R&D社のＦＡＢ１８５９Ｃ−１００、１／４０）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（モノクローナル抗体、BD Biosciences社の５５１  ２６５、１／２０）、ＣＤ１６（モノクローナル抗体、ＰＮＩＭ  ０８１４、１／２０）、ＣＤ３６（モノクローナル抗体、BD Biosciences社の５５０  ９５６、１／４０）、及びマンノース受容体（特異的ＭＲ（マンノース受容体）リガンド）に結合されたＦＩＴＣ（Sigma社のＡ７７９０、１ｍｇ／ｍｌ、１／１００））に対する、種々の蛍光色素と結合された抗体で標識した。分析は、フローサイトメトリー（Becton Dickinson社のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）により１００００個の細胞集団に関して実施した。
【０１１２】
逆転写及びリアルタイムＰＣＲ
ヒト単球由来のマクロファージを、Ｐ１７（２００μｇ／ｍｌ）で８時間にわたり処理した。ＤＮＡの調製は、キット（Bio Basic社によるＥＺ−１０  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｋｉｔ）を使用することにより製造元の指示に従って実施した。ｃＤＮＡの合成は製造元（Thermo Electron社）の指示に従って実施した。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システムにおいてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Roche Diagnostics社）を使用することにより行った。プライマー（Eurogentec社）は、ソフトウェアのＰｒｉｍｅｒ  ３を用いて作製した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡをコントロールとして使用した。段階希釈されたプールされたｃＤＮＡ試料を、定量のための各系列において外部標準として使用した。
【０１１３】
プライマーの配列を以下の表に示す。
【０１１４】
【表２】
2020504158.tif 000003
2020504158.tif 000004
【０１１５】
細胞内カルシウム濃度の測定
細胞内カルシウム濃度を、Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ蛍光プローブ（Molecular Probe社）を使用することにより測定した。ヒト単球由来のマクロファージ（１．５×１０５）を、１１．５×１０−６ＭのＦｌｕｏ  ３−ＡＭと一緒に３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。細胞質ゾル内のＣａ２＋レベルを、Ｐ１７（２００μｇ／ｍｌ）の添加後に３分間の全期間にわたり０．５秒毎に記録した。脱感作実験において、Ｐ１７のＮ−ホルミルメチオニン−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）細菌性ペプチドの第２の注入を、蛍光の記録の終わりに行い、細胞質ゾル内のＣａ２＋レベルを３分間にわたり更に記録した。或る特定の実験においては、ヒト単球由来のマクロファージを、Ｕ７３１２２（２μＭ）又はＨＢＳＳと一緒にカルシウムなしで１０分間にわたりプレインキュベートした後に、Ｐ１７を添加した。蛍光を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ蛍光測定法（PerkinElmer社）を基礎とするアプローチを使用することにより定量化した。
【０１１６】
実験用の胃腸カンジダ症マウスモデル
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、Ｃ．アルビカンス菌株９８／２６１３５での胃腸感染を、１匹のマウス当たりに５０×１０６個のＣ．アルビカンスを与えることにより確立させた（１群当たりにｎ＝８）。口腔及び胃腸管の粘膜の感染を促すために、抗生物質処理及び免疫抑制剤処理を使用しなかった。該マウスを、Ｃ．アルビカンスによる感染（injection）の１日前、感染の１日後、その後に２日毎（５回の注射）に、ペプチドＰ１７（１匹のマウス当たりに１０μｇ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）処理し、又はコントロール群については生理食塩水で処理した。各マウスの体重を毎日記録した。処理後８日目（感染７日後）に、全てのマウスをＣＯ２での窒息により安楽死させた。
【０１１７】
食道、胃、盲腸、及び肝臓を無菌的に摘出して、Ｃ．アルビカンスによるコロニー形成を評価した。マウスの腹腔マクロファージを採取し、そのｅｘ  ｖｉｖｏでのカンジダ・アルビカンスの除去能力及び貪食能力を測定した。カンジダ・アルビカンスへの応答における、これらのマクロファージによるＲＯＳ、ＩＬ−β、及びＩＬ−１２の産生も評価した。
【０１１８】
マウスマクロファージの存在下でのＴリンパ腫の腫瘍細胞（ＥＬ４）の数の定量
マウス腹腔マクロファージをペプチドＰ１７で処理した後に又は処理せずに、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。これらのマクロファージを、発光性Ｔリンパ腫の細胞（ＥＬ４−ｌｕｃ）と一緒に３７℃で４０分間にわたりインキュベートし、結合されていない細胞を洗浄により除去する。次に、これらのマクロファージを、３７℃で４時間にわたりインキュベートする。インキュベート後に、Ｔリンパ腫の細胞（ＥＬ４−ｌｕｃ）の数を化学発光により評価する。
【０１１９】
結果：
図１は、Ｐ１７の存在が、ヒトマクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣ．アルビカンス除去能力を大幅に高めることを示している。
【０１２０】
これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣ．アルビカンスにより感染されたマウスにおいて確認された。実際に、Ｐ１７により処理された胃腸カンジダ症を伴うマウスは、未処理のマウスに対してより少ない体重減を伴うこととなる（図１１）。矛盾なく、カンジダ・アルビカンスによる胃腸コロニー形成は、Ｐ１７により処理されたマウスにおいて、未処理のマウスに対して有意に低かった（図１２）。
【０１２１】
本発明者らは、Ｐ１７の作用の基礎となる機構を理解しようと努めた。
【０１２２】
Ｐ１７により処理されたヒト単球由来のマクロファージは、より大きなＣ．アルビカンスの認識能力及び貪食能力の両方を有する（図２）。さらに、Ｐ１７は、Ｃ．アルビカンスによる刺激への応答における、より高いＲＯＳの産生、並びにＩＬ−１β及びＴＮＦα等の炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こす（図３）。ペプチドＰ１７によるこれらの細胞毒性メディエーターの産生の増加は、ヒト単球由来のマクロファージの表面上のＣ型レクチン受容体の過剰発現と関連している（図４）。
【０１２３】
Ｐ１７は、マクロファージの抗腫瘍応答を向上させる
図１５に示されるように、Ｐ１７により極性化されたマクロファージの存在下では、ＥＬ４腫瘍細胞の数は有意に減少する。これらの結果により、Ｐ１７により極性化されたマクロファージが、未処理のマクロファージに対して有意に大きい、腫瘍細胞に関する細胞毒性活性を有することが明らかである。
【０１２４】
この腫瘍細胞に関するＰ１７によるマクロファージの細胞毒性活性の誘導は、ＲＯＳの産生増大と相関している（図１６）。
【０１２５】
活性酸素種（ＲＯＳ）の産生及びマクロファージによるカンジダ・アルビカンスの除去に対するＰ１７断片の効果
種々のＰ１７断片により処理されたマクロファージのＣ．アルビカンスへの応答におけるＲＯＳの放出を誘導する能力を試験した。
【０１２６】
Ｃ末端を欠如するペプチド（Ｐ１７（１−５）、Ｐ１７（１−７）、Ｐ１７（１−９）、Ｐ１７（１−１１））により得られた結果は、Ｐ１７によるマクロファージの細胞毒性機能の活性化におけるこの領域の重要性を示している（図１７及び図１８）。実際に、これらの断片によるマクロファージの処理は、ＲＯＳの産生も、カンジダ・アルビカンスの除去も誘導しない。
【０１２７】
試験されたペプチドＰ１７（１−５）、Ｐ１７（１−７）、Ｐ１７（１−９）、Ｐ１７（１−１１）は、Ｐ１７とは異なりＣ末端でアミド化されていなかった。したがって、Ｐ１７の炎症誘発特性に対するＣ末端アミド化の影響を調べるために、アミド化されたＰ１７とアミド化されていないＰ１７との間のＲＯＳ放出の違いを試験した。これらの結果は、Ｐ１７のＣ末端アミド化が、その炎症誘発活性に必須であることを示している（図１９）。
【０１２８】
Ｎ末端部を欠いた断片（Ｐ１７（３−１３）、Ｐ１７（５−１３）、Ｐ１７（７−１３）、Ｐ１７（９−１３））により誘発されるＲＯＳ放出も試験した。断片Ｐ１７（３−１３）及びＰ１７（５−１３）だけが、その活性を維持する（図１７）。これらの結果は、中央のアミノ酸がＰ１７の免疫調節活性に主要な役割を果たすことを示している。
【０１２９】
マクロファージによるＣ．アルビカンスの除去に対する種々の断片の効果も試験した。それらの結果は、ＲＯＳの放出に関して得られた結果と同じである。Ｃ末端部を有しない断片は不活性であり、その一方で断片Ｐ１７（３−１３）及びＰ１７（５−１３）は、Ｐ１７の活性に近い活性を有する。
【図１】
2020504158.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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