(57)【要約】  細胞ベースのスクリーニング方法が提供される。スクリーニング方法は、それぞれの過剰活性化シグナル伝達経路の阻害剤との組み合わせ医薬において、過剰活性化シグナル伝達経路を有する細胞によって特徴づけられるがんの治療のための薬物を同定することを目的とする。特に、ＳＯＸ２の発現レベルが、ＭＡＰＫ及びＥＧＦＲ経路の阻害剤に対する耐性の発生を防止する化合物を同定するために決定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰活性化シグナル伝達経路の阻害剤との組み合わせ医薬において、過剰活性化シグナル伝達経路によって特徴づけられる細胞によって特徴づけられるがんの治療に有効な化合物を同定するための細胞ベースのスクリーニング方法であって、
ａ）前記シグナル伝達経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子において活性化突然変異又は増幅を有する細胞を提供する工程；
ｂ）前記細胞を
ｉ．前記シグナル伝達経路の阻害剤；及び
ｉｉ．試験化合物
と接触させる工程；
ｃ）ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子、特にＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１、及びＲＯＢＯ２を含む群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する工程；及び
ｄ）前記試験化合物にスコアを割り当てる工程であって、
ｉ．ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の前記発現レベルが、前記シグナル伝達経路の前記阻害剤のみで処理したコントロール細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の発現レベルに対応する所定の閾値を下回る場合、前記スコアが高く；
ｉｉ．ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の前記発現レベルが、前記所定の閾値と等しいか又は上回る場合、前記スコアが低い
工程
を含む、細胞ベースのスクリーニング方法。
【請求項２】
ａ）工程ａにおいて、複数の細胞が同時に使用され；
ｂ）前記複数の細胞が一緒に工程ｂに提出され；
ｃ）ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の平均発現レベルが前記複数の細胞について決定され；かつ
ｄ）ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の前記平均発現レベルが、前記シグナル伝達経路の前記阻害剤のみで処理したコントロール細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の平均発現レベルを下回る場合、高いスコアが試験化合物に割り当てられる
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）工程ａにおいて、複数の細胞が同時に使用され；
ｂ）前記複数の細胞が一緒に工程ｂに提出され；
ｃ）前記ＳＯＸ２の発現レベル及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の発現レベルが、未処理細胞について決定された発現レベルを上回る場合、単一細胞は「ＳＯＸ２陽性」と評価され、全細胞に対する「ＳＯＸ２陽性」細胞の比率が、前記複数の細胞について決定され；かつ
ｄ）前記試験化合物で処理された細胞について決定された前記比率が、前記シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理されたコントロール細胞について決定された前記比率を下回る場合、高いスコアが前記試験化合物に割り当てられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＯＸ２の発現レベル及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の発現レベルが、タンパク質発現及び／又はｍＲＮＡ発現の分析によって決定される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル伝達経路の前記阻害剤及び前記試験化合物で処理した前記細胞において、細胞周期の期が決定され、特に細胞周期停止が検出され、かつ、前記細胞が細胞周期停止を起こす場合、高いスコアが前記試験化合物に割り当てられる工程を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記シグナル伝達経路が、ＭＡＰＫ又はＥＧＦＲ経路である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記がんが、ＭＡＰＫ又はＥＧＦＲ経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子における活性化突然変異又は増幅、特に、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ＲＯＳ、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＫＩＴ又はＥＧＦＲにおける活性化突然変異又は増幅を有するがん細胞によって特徴づけられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記がんが、メラノーマ、非小細胞肺がん、前立腺がん、胆管がん、膀胱がん、膵がん、甲状腺がん、卵巣がん、結腸直腸腫瘍、ヘアリー細胞白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、肝がん、乳がん、食道がん、頭頸部がん、及び神経膠腫、特に、メラノーマ及び非小細胞肺がんから選択される、請求項６又は７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ａにおいて提供される前記細胞が、ＢＲＡＦ突然変異、特にＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ又はＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｋ突然変異を有するメラノーマ細胞又は非小細胞肺がん細胞、及び、ＥＧＦＲ突然変異、増幅又は過剰発現を有する非小細胞肺がん細胞から選択される、請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＥＧＦＲ経路の阻害剤（ＥＧＦＲｉ）及びＭＡＰＫ経路の阻害剤（ＭＡＰＫｉ）から選択され、特に、前記ＭＡＰＫｉが、Ｂ−Ｒａｆの阻害剤（ＢＲＡＦｉ）、ＭＥＫの阻害剤（ＭＥＫｉ）、及びＥＲＫの阻害剤（ＥＲＫｉ）から選択される、請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＲＡＦｉが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４７２０、ＴＡＫ−６３２、ＭＬＮ２４８０、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１、及びＲＡＦ２６５を含む群から選択され、
前記ＭＥＫｉが、ＡＺＤ６２４４、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＭＥＫ１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ  ０３２５９０１、ＣＩ−１０４０、及びＴＡＫ−７３３を含む群から選択され、
前記ＥＲＫｉが、ウリキセルチニブ、ＳＣＨ７７２９８４、ＸＭＤ８−９２、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０９９４、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＤＥＬ−２２３７９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４、及びＶＴＸ１１ｅを含む群から選択され、又は
前記ＥＧＦＲｉが、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＡＰ２６１１３、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号８７９１２７−０７−８）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ１３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）、及びＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）を含む群から選択される
請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療に有用な化合物を同定するための、特に、しかし限定されるものではないが、ＭＡＰＫ及びＥＧＦＲ経路の阻害剤と組み合わせた、細胞ベースのモジュラースクリーニングアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
がん細胞の遺伝子変異は、細胞周期の制御、増殖、分化及び／又はシグナル伝達に重要な遺伝子にしばしば影響を及ぼす（Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2000), Cell 100, 57-70; Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2011), Cell 144, 646-674). Oncogenic activation of MAPK pathway is a signature feature of many human cancers, including melanoma, non-small cell lung cancer (NSCLC) and pancreatic cancer (Dhillon, A.S. et al. (2007), Oncogene 26, 3279-3290）。例えば、メラノーマの５０％は、構成的ＭＡＰＫシグナル伝達を活性化するＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ腫瘍性タンパク質によって引き起こされる（Davies, H. et al. (2002), Nature 417, 949-954）。ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ特異的小分子阻害剤は、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ陽性転移性メラノーマの治療のための標準的治療アプローチである。この治療は、最初の数ヶ月間で劇的な腫瘍縮小をもたらす一方、治療を続けるとほとんど全ての患者が抵抗性を獲得する（Flaherty, K.T. et al. (2010), N. Engl. J. Med. 363, 809-819; Johnson et al. (2015), Eur J Cancer, 51(18):2792-9）。無増悪生存期間は、併用療法によって、例えば、ＢＲＡＦと下流のキナーゼＭＥＫなどの第２の阻害剤とを同時標的化することによって延長することができることが示されており、従って、方法が国際公開第２０１１／１１２６７８号（Ａ１）及び国際公開第２０１４／１４７５７３号（Ａ２）において開発されているが、ほとんどの患者は依然として耐性を引き起こす遺伝子変異を獲得しており、これらの分子標的薬の利益を制限している（Flaherty, K.T. et al. (2012), N. Engl. J. Med.367, 1694-1703; Larkin, J. et al. (2014), N. Engl. J. Med. 371, 1867-1876; Long, G.V. et al. (2014), N. Engl. J. Med.371, 1877- 1888）。患者が常に新たな耐性を引き起こす突然変異を獲得するので、同様の臨床的ハードルが、小分子阻害剤又はＥＧＦＲを標的とする抗体を用いたＮＳＣＬＣの治療に直面している（Jaenne et al. (2005), J. Clin. Oncol., 23:3227-3234; Kobayashi et al. (2005), N Engl J Med, 352:786-792）。
【発明の概要】
【０００３】
上記の最新技術に基づいて、本発明の目的は、ＭＡＰＫ及びＥＧＦＲ経路の阻害剤に対する耐性の発生を防止することができる新規化合物を、特に、ＭＡＰＫ及びＥＧＦＲ経路の阻害剤との組み合わせ医薬において、及び／又は同様の薬物耐性メカニズムが出現する他のレジメンにおいて、同定するための手段及び方法を提供することである。この目的は、本明細書の特許請求の範囲によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１Ａ−Ｂ】ＲＮＡ−Ｓｅｑによって分析された、ＭＡＰＫｉを用いた急性治療時の幹細胞性及びＥＭＴ特性の誘導を示す。（Ａ）Ａ３７５−Ｐ細胞をＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）又はＤＭＳＯで６時間処理し、ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ−Ｓｅｑを実施した。散布図は、≧０．５のＲＰＫＭの最小正規化量を有する全ての遺伝子を示す。パスウェイ解析のために選択された差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）は、転写変化の方向に応じて赤と青の点によって表される（赤の遺伝子はＰＬＸ４７２０により誘導され、青の遺伝子はＰＬＸ４７２０により抑制される）。（Ｂ）分析されたＤＥＧの有意なエンリッチメントを伴う５つの最上位パスウェイを示す棒グラフ。より長い棒は、より強い有意性を示す。
【図１Ｃ】ＲＮＡ−Ｓｅｑによって分析された、ＭＡＰＫｉを用いた急性治療時の幹細胞性及びＥＭＴ特性の誘導を示す。（Ｃ）ＰＬＸ４７２０による処理の際の上位の調節解除された遺伝子（左列）。ＰＬＸ４７２０によって誘導及び抑制された上位の遺伝子は別々のリストに示されている。
【図１Ｄ−Ｅ】ＲＮＡ−Ｓｅｑによって分析された、ＭＡＰＫｉを用いた急性治療時の幹細胞性及びＥＭＴ特性の誘導を示す。（Ｄ）指示された細胞株を、１μＭのＰＬＸ４７２０又は０．０１％のＤＭＳＯ（０時間）で、指示された時間処理し、幹細胞性／ＥＭＴに関連する選択された遺伝子の発現変化をｑＰＣＲによって確認した。全ての細胞株は、ＢＲＡＦ阻害時に同様の適応遺伝子プログラムを発現した。示されたデータは、独立した生物学的三つ組の平均値±ＳＥＭを表す。（Ｅ）（Ｄ）に示したものと同じ実験のウエスタンブロット分析。幹細胞性特性のキープレーヤーとして、ＳＯＸ２レベルが評価された。Ｐ−ＥＲＫ１／２レベルは、陽性治療コントロールとして役割を果たした。総ＥＲＫ１／２レベルは、ローディングコントロールとして役割を果たした。
【図１Ｆ−Ｈ】ＲＮＡ−Ｓｅｑによって分析された、ＭＡＰＫｉを用いた急性治療時の幹細胞性及びＥＭＴ特性の誘導を示す。（Ｆ）Ａ３７５−Ｐ細胞を、１μＭのＰＬＸ４７２０、０．５μＭのＡＺＤ６２４４（ＭＥＫ１／２阻害剤）又は０．０１％のＤＭＳＯで、指示された時間処理し、ＳＯＸ２レベルをウエスタンブロット分析によって評価した。ＢＲＡＦの阻害及びＭＥＫ１／２の阻害は同様のＳＯＸ２レベルを誘導し、これは発がん性ＭＡＰＫ阻害の一般的な特徴であることを示唆していることに留意されたい。（Ｇ）Ａ３７５−Ｐ細胞を、１μＭのＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）、０．５μＭのＡＺＤ６２４４（ＭＥＫｉ）、両方の薬物の組み合わせ又は０．０１％のＤＭＳＯで、指示された時間処理し、ＳＯＸ２レベルをウエスタンブロット分析によって評価した。ＢＲＡＦｉ及びＭＥＫｉは、ＳＯＸ２レベルに対して同等の効果を有し、両方の薬物の組み合わせはわずかに高いＳＯＸ２レベルをもたらしたことに留意されたい。（Ｈ）Ａ３７５−Ｐ細胞を、１μＭのＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）、０．５μＭのＡＺＤ６２４４（ＭＥＫｉ）、両方の薬物の組み合わせ又は０．０１％のＤＭＳＯで、２４時間処理し、幹細胞性／ＥＭＴに関連する選択された遺伝子の発現変化をｑＰＣＲによって確認した。ＢＲＡＦｉ及びＭＥＫｉは転写産物レベルに対して同等の効果を有し、両方の薬物の組み合わせは、転写産物誘導においてわずかにより効率的であることに留意されたい。全てのウエスタンブロットについて、個々の時点を少なくとも２回の独立した実験において評価した。代表的なデータが示されている。
【図２Ａ−Ｂ】ＭＡＰＫｉ誘導抗増殖作用からのＳＯＸ２の保護作用を示す。（Ａ）Ａ３７５−Ｐ細胞を、ＳＯＸ２を標的とする１００ｎＭのｓｉＲＮＡ又は陰性コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。次いで細胞をＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）又はＤＭＳＯで４８時間処理した。収集の２時間前に、細胞を３μＭのＥｄＵでパルスし、周期細胞を標識した。ＥｄＵ陽性細胞を、フローサイトメトリーを使用して検出した。ＳＯＸ２ノックダウンは、ＢＲＡＦが活性である場合には（ＤＭＳＯ）細胞増殖に影響を及ぼさないが、ＢＲＡＦｉ条件においては、薬物耐性の、周期細胞のプールを減少させることに留意されたい。代表的なデータが示されている。（Ｂ）実験（Ａ）の定量化。各条件について、ＳＯＸ２のｓｉＲＮＡノックダウン時の周期細胞の百分率を、陰性コントロールｓｉＲＮＡに対して正規化した。示されたデータは、独立した生物学的三つ組の平均値±ＳＥＭを表す。
【図２Ｃ−Ｆ】ＭＡＰＫｉ誘導抗増殖作用からのＳＯＸ２の保護作用を示す。（Ｃ）ｐＴＲＩＰＺ−ＳＯＸ２ベクターで安定的に形質導入されたＡ３７５−Ｐ細胞を、指示された濃度のドキシサイクリンで３日間又は１μＭのＰＬＸ４７２０（ＰＬＸ）で２４時間処理した。ＳＯＸ２過剰発現はウエスタンブロット分析によって確認された。ラミンＡは、ローディングコントロールとして役割を果たした。個々の濃度は、少なくとも２回の独立した実験において評価された。代表的な結果が示されている。（Ｄ）Ａ３７５−Ｐ／ｐＴＲＩＰＺ−コントロール又は−ＳＯＸ２細胞を、０ｎｇ／ｍｌ（陰性コントロール）又は５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間、前処理し、続いてＤＭＳＯ又はＰＬＸ４７２０でさらに４８時間、前処理した。収集の２時間前に、細胞を３μＭのＥｄＵでパルスし、周期細胞を標識した。ＥｄＵ陽性細胞を、フローサイトメトリーを使用して検出した。示されたデータは、ドキシサイクリンの無い条件における周期細胞の百分率に対して正規化されている。示されるのは、独立した生物学的三つ組の平均値±ＳＥＭである。（Ｅ−Ｆ）Ａ３７５−Ｐ／ｐＴＲＩＰＺ−コントロール又は−ＳＯＸ２細胞を、０ｎｇ／ｍｌ（陰性コントロール）又は５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間、前処理し、続いてさらに４日間、ＰＬＸ４７２０の段階希釈によって前処理した。細胞生存率を、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイによって評価し、ＩＣ５０値を計算した。ドキシサイクリンはｐＴＲＩＰＺコントロール細胞に影響を及ぼさないが、ｐＴＲＩＰＺ−ＳＯＸ２細胞において生存曲線を右にシフトさせ、ＳＯＸ２が過剰発現されると薬物感受性が減少することを示していることに留意されたい。ＩＣ５０値は、生存曲線の上に記載されている。示されたデータは、ＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化されている。エラーバーは、３回の独立した実験のＳＥＭを示す。
【図２Ｇ】ＭＡＰＫｉ誘導抗増殖作用からのＳＯＸ２の保護作用を示す。（Ｇ）Ａ３７５−Ｐ／ｐＴＲＩＰＺ−コントロール又は−ＳＯＸ２細胞を、０ｎｇ／ｍｌ（陰性コントロール）又は５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間、前処理し、続いてＤＭＳＯ又はＰＬＸ４７２０でさらに４８時間処理した。生存シグナル伝達は、ウエスタンブロットによって評価した。Ｓ６Ｋ及びＢＡＤを介した生存シグナル伝達は、ＰＬＸ４７２０によって抑制されるが、ＳＯＸ２がドキシサイクリン処理によって過剰発現されると救済される。
【図３】図３は、モジュラースクリーニングアプローチの読み出しを示す。ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異ヒトメラノーマ細胞におけるＳＯＸ２の免疫蛍光染色。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
用語と定義
本明細書の文脈における用語「シグナル伝達経路に含まれるタンパク質」は、細胞内で相互作用して増殖、分化又はアポトーシスなどの特定の細胞機能を制御する分子に関する。１つのシグナル伝達経路に含まれる分子は、協調活性化カスケードの一部である。刺激の際に、経路の最初の分子は、１つ又は複数の下流の分子を活性化する。活性化鎖の最後の分子が活性化され、細胞機能が実行されるまで活性化は伝えられる。
【０００６】
ＭＡＰＫ経路に関して、これは、ＮＧＦ、ＮＲＧ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３／４、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＡＣＮ、ＴｒｋＡ／Ｂ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＲＯＳ、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＫＩＴ、ＧＦＢ２、ＳＯＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲａｓＧＲＦ、ＲａｓＧＲＰ、ＣＮａｓＧＥＦ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、Ｒａｐ１、Ｇ１２、Ｇａｐ１ｍ、ＮＦ１、ｐ１２０ＧＡＦ、ＲａｆＢ、ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、Ｍｏｓ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＰ１、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＰＴＰ、ＭＫＰ、Ｔａｕ、ＳＴＭＮ１、ｃＰＬＡ２、ＭＮＫ１／２、ＲＳＫ２、ＣＲＥＢ、Ｅｌｋ−１、Ｓａｐ１ａ、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＲＦ、及びｃ−ｆｏｓを含む群から選択される特定のリガンド、受容体、及び下流転写因子に関する。
【０００７】
本明細書の文脈における用語「活性化突然変異」は、遺伝子産物の活性の増加をもたらす遺伝子のヌクレオチド配列の改変に関する。活性の増加は、遺伝子産物の増強された酵素活性、延長された半減期又は過剰発現によるものであり得る。
【０００８】
本明細書の文脈における「ＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子」という用語は、ＳＯＸ２が同じ細胞内で発現されない場合の第１の発現レベル、及びＳＯＸ２が同じ細胞内で発現される場合の第２の発現レベルによって特徴づけられる遺伝子に関する。第１の発現レベルは、第２の発現レベルより低い。
【０００９】
特定の実施態様では、ＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子は、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１、及びＲＯＢＯ２を含む群から選択される。
【００１０】
ＳＯＸ２の発現レベル及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の発現レベルは、タンパク質発現及び／又はｍＲＮＡ発現の分析によって決定することができる。
【００１１】
本明細書で使用される用語「治療」は、疾患の少なくとも１つの症状を防止（preventing）、軽減（relieving）、低減（reducing）又は緩和（alleviating）することを意味する。例えば、治療は、障害の１つ若しくはいくつかの症状の減弱、又はがんなどの障害の完全な根絶であり得る。本発明の意味の範囲内で、用語「治療」はまた、発症（すなわち、疾患の臨床症状の前の時点）を抑止すること、遅らせること、及び／又は疾患を発症若しくは悪化させるリスクを減らすことを意味する。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、用語「メラノーマ」は、メラニン形成細胞から発生するがんの形態を指す。メラノーマは、典型的には皮膚に影響を与えるが、口、腸、又は目にも影響を与え得る。メラノーマは、血液又はリンパ系を通じて臓器や骨に広がる（転移する）こともある。メラノーマは、皮膚上の既存のほくろ若しくは他のあざから、又はあざのない皮膚から発生し得る。
【００１３】
本明細書で互換的に使用される「非小細胞肺がん」及び「ＮＳＣＬＣ」という用語は、肺の悪性新生物を指し、これは、燕麦細胞（又は小細胞）型ではなく、限定されないが、腺癌、扁平上皮癌、及び大細胞癌を含む、認識された型の気管支原性肺癌（気管支の内側から生じるもの）を含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「耐性」などは、阻害剤を用いた治療に対する非反応性又は減少した反応性を含む。非反応性又は減少した反応性は、例えば、疾患の少なくとも１つの症状の軽減（relief）、低減（reduction）若しくは緩和（alleviation）の減少又は休止など、治療の利点の欠如又は減少を含み得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「接触」などは、直接的又は間接的のいずれかで、シグナル伝達経路の阻害剤及び／又は試験化合物を、シグナル伝達経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子において活性化突然変異を有する細胞に物理的に接近させることを意味する。細胞を阻害剤及び／又は試験化合物と接触させることは、任意の培地中、及び細胞の生存を促進する任意の培養条件下で起こり得る。接触させることは、例えば、シグナル伝達経路の阻害剤及び／又は試験化合物を、シグナル伝達経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子において活性化突然変異を有する細胞を含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、又はマイクロアレイなどの容器に入れることを含む。あるいは、接触とは、両方の薬剤が互いに相互作用することができるように、薬剤を別の薬剤と極めて接近させることを意味する。例えば、抗体又は他の結合メンバーを細胞内のタンパク質と極めて接近させることができ、抗体がタンパク質に対して結合特異性を有する場合、抗体はタンパク質と結合するであろう。さらに別の例では、第１の核酸を第２の相補的核酸（標的配列を有するプライマー）とごく接近させてもよく、結合が検出され得るように、又は標的配列の増幅が起こり得るようにインキュベートすることができる。
【００１６】
さらに、特許請求の範囲において、単語「含む（comprising）」は、他の要素又は工程を排除するものではなく、文脈上明らかにそうでないと指示しない限り、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ある阻害剤」への言及は、１つ又は複数の阻害剤を含む。
【００１７】
説明
本発明の第一の態様によれば、がんの治療に有効な化合物を同定するための細胞ベースのスクリーニング方法が提供される。がんは、過剰活性化シグナル伝達経路によって特徴づけられる細胞によって特徴づけられる。過剰活性化は、シグナル伝達経路において作用するタンパク質をコードする遺伝子における活性化突然変異又は増幅によって引き起こされる。当業者は、シグナル伝達経路の過剰活性化はまた、ＮＦ１などのシグナル伝達経路の阻害剤をコードする遺伝子における阻害突然変異又は欠失によって引き起こされ得ることを知っている。化合物は、それぞれの過剰活性化シグナル伝達経路の阻害剤を含む組み合わせ医薬におけるがんの治療に有効である。細胞ベースのスクリーニング方法は以下の工程を含む。
ａ．シグナル伝達経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子において活性化突然変異を有する細胞が提供される。
ｂ．細胞を、シグナル伝達経路の阻害剤及び試験化合物と接触させる。
ｃ．ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現レベルが決定される。
ｄ．スコアが試験化合物に対して割り当てられる。スコアは試験化合物の有効性を反映する。
【００１８】
ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子、特にＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１、及びＲＯＢＯ２を含む群から選択される遺伝子の発現レベルが所定の閾値を下回る場合、スコアは高い。所定の閾値は、試験化合物ではなく、シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理されたコントロール細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現レベルに対応する。従って、シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理されたコントロール細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子、例えば、直ぐ上に列挙した遺伝子の１つの発現が、本発明の方法において使用される試験化合物と共に、シグナル伝達経路の阻害剤と接触させた細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現を下回る場合、スコアは高いと判断される。
【００１９】
ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子、特にＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１、及びＲＯＢＯ２を含む群から選択される遺伝子の発現レベルが、所定の閾値と等しいか又は上回る場合、スコアは低い。従って、シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理されたコントロール細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子、例えば、直ぐ上に列挙した遺伝子の１つの発現が、本発明の方法において使用される試験化合物と共に、シグナル伝達経路の阻害剤と接触させた細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現を上回る場合、スコアは低いと判断される。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、他の試験化合物と比較して、ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現が減少するにつれてスコアが増加する。すなわち、ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子のより多くの発現が、上で定義されたコントロール細胞と比較して減少するほど、スコアはより高くなるであろう。同様に、他の試験化合物と比較して、ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現が増加するにつれてスコアが減少する。すなわち、ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子のより多くの発現が、上で定義されたコントロール細胞と比較して増加するほど、スコアはより低くなるであろう。
【００２１】
特定の実施態様では、工程ａからｄは、複数の細胞と同時に実行される。
【００２２】
特定の実施態様では、
ａ．工程ａにおいて、複数の細胞が同時に使用され；
ｂ．複数の細胞が一緒に工程ｂに提出され；
ｃ．ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子、特にＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１、及びＲＯＢＯ２を含む群から選択される遺伝子の平均発現レベルが、複数の細胞において同時に決定され；
ｄ．ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の平均発現レベルが、シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理したコントロール細胞におけるＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の平均発現レベルを下回る場合、高いスコアが試験化合物に割り当てられる。
【００２３】
特定の実施態様では、
ａ．工程ａにおいて、複数の細胞が同時に使用され；
ｂ．複数の細胞が一緒に工程ｂに提出され；
ｃ．ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の発現レベルが、未処理細胞について決定された発現レベルを上回る場合、単一細胞は「ＳＯＸ２陽性」と評価され、全細胞に対する「ＳＯＸ２陽性」細胞の比率が、前記複数の細胞について決定され；かつ
ｄ．試験化合物で処理された細胞について決定された比率が、シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理されたコントロール細胞について決定された比率を下回る場合、高いスコアが試験化合物に割り当てられる。
【００２４】
発明者らは、変異体ＢＲＡＦ及びＭＥＫの阻害剤（以下、まとめてＭＡＰＫ阻害剤、ＭＡＰＫｉと呼ぶ）が、薬物適用後数時間以内にメラノーマ細胞において急性転写反応（すなわち適応耐性プログラム；ＡＲＰ）を誘導することを見出した。これらのＡＲＰは、ＳＯＸ２依存性の幹細胞性、軸索ガイダンス、及びＥＭＴ（上皮間葉転換）遺伝子の転写誘導を伴い、薬物耐性細胞のプールの生成を引き起こす（図１）。これらの薬物耐性細胞は、長期的に獲得耐性の発生を播種することができる。薬物耐性細胞の数は、ＳＯＸ２、幹細胞性の主要制御因子及びＭＡＰＫｉ誘導性ＡＲＰの主要ドライバーのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンによって有意に減少させることができる（図２）。結果として、臨床的状況においてＭＡＰＫｉ誘導性ＳＯＸ２を鈍らせることによってＡＲＰの誘導を防止することは、後天性薬物耐性を防止するために最高の治療的価値を有し、従って臨床的に使用されるＭＡＰＫ阻害剤の耐久性を延長することとなる。
【００２５】
ＳＯＸ２としても知られるＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２は、未分化胚性幹細胞の自己複製、又は多能性を維持するために必須である転写因子である。このタンパク質は、Ｓｏｘファミリーの転写因子のメンバーであり、哺乳類の発達の多くの段階で重要な役割を果たすことが示されている。例えば、Ｓｏｘ２は、気管支樹の分岐形態形成及び肺発生における気道の上皮の分化を制御する。通常の条件下では、Ｓｏｘ２は成人の気管上皮における基底細胞の自己複製及び適切な割合を維持するために重要である。しかしながら、その過剰発現は、広範囲の上皮過形成、並びに最終的には発達中及び成体の両方のマウス肺において癌を引き起こす。さらに、扁平上皮癌では、遺伝子増幅はしばしば３ｑ２６．３領域を標的とする。Ｓｏｘ２の遺伝子はこの領域内にあり、これはＳｏｘ２をがん遺伝子として有効に特徴づける。例えば、Ｓｏｘ２は、胃がんのがん遺伝子として同定されている（Yajun et al. (2014), J. Cancer Res. Clin. Oncol., 140(7):1117-24）。Ｓｏｘ２は、肺扁平上皮癌における重要な上方制御因子であり、腫瘍の進行に関与する多くの遺伝子を導いている。Ｓｏｘ２の過剰発現は、Ｌｋｂ１発現の喪失と連携して、マウスにおける扁平上皮肺がんを促進する。その過剰発現はまた、細胞遊走及び足場非依存性増殖を活性化する。ＳＯＸ２はまた、多形神経膠芽腫にも関与しており、ＳＯＸ２の下流標的が最近ＣｈＩＰ−ｓｅｑ及びマイクロアレイ解析によって同定された（Fang et al. (2011), BMC Genomics, 6;12:11）。Ｓｏｘ２発現はまた、高グリーソングレードの前立腺がんにおいても見出され、去勢抵抗性前立腺がんの増殖を促進する。Ｓｏｘ２は、乳がんのタモキシフェン耐性の発生に関連があることが示されている。さらに、ＳＯＸ２と相互作用するＯＣＴ４は、薬物耐性前立腺がん細胞において上方制御されることが示されている（Fang et al. (2011), Genes Cancer, 1(9): 908-916）。ＳＯＸ２はまた、ＥＧＦＲ阻害剤に曝露されたときに、培養されたＮＳＣＬＣ細胞株において転写的に誘導されることが示されている（Rothenberg, M.S. et al (2015), eLife, vol. 4, 16）。この知識にもかかわらず、ＳＯＸ２の発現レベル及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現レベルを決定することによって、ＭＡＰＫ及びＥＧＦＲ経路の阻害剤に対する耐性の発生を防止する化合物の同定を可能にする細胞ベースのスクリーニング方法はない。これは、発明者らが、驚くべきことに、本明細書に提示されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースのスクリーニング方法によって化合物を見出すことができることを初めて見出したためである。本発明の任意の態様の特定の実施態様では、ＳＯＸ２の発現レベル及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある前記遺伝子の発現レベルは、タンパク質発現及び／又はｍＲＮＡ発現の分析によって決定される。
【００２６】
タンパク質（ＳＯＸ２又はＳＯＸ２の転写制御下にあるタンパク質）は、抗体媒介染色によって直接可視化及び定量化することができる。（ＳＯＸ２又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の）ｍＲＮＡは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって直接可視化することができ、個々のｍＲＮＡ分子を定量化することができる。
【００２７】
従って、本発明の範囲内で、遺伝子発現レベルは、当該技術分野において公知の任意の技術、例えばポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ転写物）のハイブリダイゼーションに基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定又は又はポリヌクレオチドの増幅に基づく方法を使用して決定され得る。
【００２８】
ｍＲＮＡ遺伝子転写物の定量化は、限定されないが、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅプロテアーゼアッセイ、ＰＣＲに基づく方法、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びリアルタイム定量的ＰＣＴ  ｑＲＴ−ＰＣＲなどを使用して行われ得る。あるいは、核酸二重鎖に対して結合特異性を有する抗体を使用して、ｍＲＮＡレベルを決定することができる。目的のＲＮＡに特異的な結合メンバー、例えば目的のＲＮＡに特異的なｃＤＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドプローブ、又は目的のｍＲＮＡに特異的な抗体を使用するマイクロアレイ技術（ここで、特異的結合メンバーは、基板、例えばスライドガラス又はマイクロチップ基板上に蒔かれるか又は整列される）を使用することができる。特異的結合メンバーは、アドレス可能な位置で基板上に提供されてもよく、そのアドレス指定可能な位置の数は、例えば、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００若しくはそれ以上から変動し得る。実施態様では、アドレス指定可能な位置の数は、１０００未満、１００未満、５０未満、１０未満、又は５未満から変動し得る。そのような実施態様では、細胞をアレイと接触させ、整列された特異的結合メンバーは、細胞内の標的と検出可能な相互作用を形成することができる。相互作用は、適切な標識を使用して検出することができる。オリゴヌクレオチドプローブが利用される場合、適切な条件下で、オリゴヌクレオチドプローブは標的核酸配列に「ハイブリダイズ」して、相補的塩基配列を有する核酸分子と塩基対合した二重鎖を形成することができる。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに依存して変化するであろう。
【００２９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、核酸が最小のバックグラウンドで標的核酸に結合するときに起こる。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために、Ｔｍ（分子の半分がそれらのパートナーから解離する融解温度）より約１℃から約２０℃、より好ましくは５℃から約２０℃低い温度が使用される。しかしながら、それは溶液のイオン強度及びｐＨによってさらに定義される。適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、例示的なハイブリダイゼーション条件は、非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列を検出する）−ハイブリダイゼーション  ５×ＳＳＣ、６５℃で約１６時間、高ストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列を検出する）−ハイブリダイゼーション  ５×−６×ＳＳＣ、６５℃で１６時間、及び低ストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列を検出する）−ハイブリダイゼーション  ６×ＳＳＣ、室温で５５℃まで、２０から３０分間である。
【００３０】
高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃で約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２Ｘ塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）洗浄である（ＳＳＣ緩衝液、例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌ及び８８．９ｇのクエン酸ナトリウムを８００ｍｌの蒸留水に溶解し、ＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨをｐＨ７．０に調整し、蒸留水で容量を１Ｌに調整することによって製造された２０×ＳＳＣの説明について、下記のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌを参照のこと）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二重鎖に対する中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃で１５分間である。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二重鎖に対する低ストリンジェンシー洗浄の例は、４−６×ＳＳＣ、４０℃で１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０から５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件は、典型的には約１．５Ｍ未満、より好ましくは約０．０１から１．０Ｍの塩濃度、ｐＨ７．０から８．３のＮａイオン濃度（又は他の塩）を含み、温度は典型的には少なくとも約３０℃、及び長いプローブ（例えば、＞５０ヌクレオチド）については少なくとも約６０℃である。
【００３１】
ＰＣＲ法、例えばＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＴ及びＲＴ−ＰＣＲにおいて使用される方法論は、当業者に周知であろう。
【００３２】
いくつかの方法は、ＲＮＡの単離を必要とし得る。そのような単離技術は当該技術分野において公知であり、Ｑｉａｇｅｎなどの製造業者から市販されているＲＮＡ単離キットを利用することができる。
【００３３】
タンパク質発現免疫組織化学（ＩＨＣ）及びＥＬＩＳＡの測定は、タンパク質発現を検出するために有用な技術である。抗体又は抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の結合断片を、開示された方法及びキットにおいて使用することができる。抗体は、抗体の直接標識によって、又は標的に対する結合特異性を有する一次抗体に特異的な二次抗体を使用することによって検出することができる。二次抗体は、検出可能な部分で標識することができ、又はハプテン（ビオチンなど）にコンジュゲートすることができ、そのハプテンは検出可能なように標識された同族ハプテン結合分子、例えばストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼによって検出可能である。
【００３４】
抗体の結合特異性（特定の抗原、例えばＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある別の遺伝子に対する結合特異性を有する抗体）は、原発腫瘍の取り扱いを模倣したホルマリン固定、パラフィン包埋細胞株の免疫組織化学的分析と並行して、ウエスタンブロッティングを使用して確立することができる（O’Brien et al., 2007, International Journal of Cancer, 120:1434-1443に記載の通り）。
【００３５】
あるいは、タンパク質は、アプタマー（例えば、特異的な配列依存性の形状をとり、高い親和性及び特異性でＦＫＢＰＬタンパク質に結合する一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ））、鏡像アプタマー（ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲＴＭ）、操作された非免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、フィブロネクチン（ＡＤＮＥＣＴＩＮＳＴＭ）、ＣＴＬＡ−１（ＥＶＩＢＯＤＩＥＳＴＭ）、リポカリン（ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳＴＭ）、プロテインＡドメイン（ＡＦＦＩＢＯＤＩＥＳＴＭ）などを含む足場に基づく非免疫グロブリン結合タンパク質を使用して検出され得る。実施態様では、アプタマーは、１００未満のヌクレオチド、７５未満のヌクレオチド、５０未満のヌクレオチド、例えば、２５から５０ヌクレオチド、１０から５０ヌクレオチド、１０から１００ヌクレオチドを含み得る。
【００３６】
特定の実施態様では、ＳＯＸ２タンパク質若しくはＳＯＸ２タンパク質の断片、又はＳＯＸ２タンパク質若しくはその断片に対して結合特異性を有する抗体を含むタンパク質配列を含むアレイが提供され得る。これらのタンパク質配列又は抗体は、基質に結合させることができる。タンパク質発現の変化は、例えば、細胞がアレイと接触したときに、ＳＯＸ２タンパク質及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある別の遺伝子に対して結合特異性を有する抗体に結合する、ＳＯＸ２タンパク質及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある別の遺伝子のレベルを測定することによって検出することができる。
【００３７】
アレイ及びアレイ形式における使用のために適した基板は、当業者に公知であろう。
【００３８】
特定の実施態様では、盲検分析を提供するために、自動画像分析システムを使用してＩＨＣ試料を分析することができる。このために、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全スライドのデジタル画像を最初に２０倍で捕捉することができる。第２に、ポジティブピクセルカウントアルゴリズム（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＳＯＸ２発現の定量的スコアリングモデルを開発することができる。組織マイクロアレイ由来のデータの統計分析は、傾向についてはｖ２検定、ＳＯＸ２発現の比較についてはフィッシャーの直接確率検定及びマンホイットニー検定を使用して実施することができ、カプランマイヤープロットを生存分析のために使用し、曲線をログランク検定を使用して比較することができる。コックス比例ハザード回帰を使用して、比例ハザード比を推定し、前述のように多変量解析を行うことができる。全ての計算は、ＳＰＳＳ  ｖ１１．０（ＳＰＳＳ、ＩＬ）を用いて実行することができる。さらに、個別のマルチマーカー試験の生成を容易にするために、蛍光タグ付き抗体（非重複フルオロフォアを有する）及びさらなる関連バイオマーカーを同時に使用することができる。有利なことに、Ａｐｅｒｉｏから最近開発された蛍光走査システム、例えばＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＦＬシステムを使用することができる。このアッセイ方法は、従来の明視野画像化によって提供されるものよりも定量的な分析を提供することによって、さらなる洗練さの層を提供するであろう。理解されるように、ＳＯＸ２の発現、細胞内のＳＯＸ２の位置、又はＳＯＸ２の活性を検出する方法は、本明細書に記載又は特許請求される本発明の方法のいずれかに関して適用可能であり得る。
【００３９】
本発明の各態様の好ましい特徴及び実施態様は、文脈が他に要求しない限り、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれと同様である。
【００４０】
核酸分子は、例えば、ワトソン−クリック塩基対を形成することによって、鎖が互いに結合する（ハイブリダイズする）とき、２つの分子がかなりの数の相補的ヌクレオチドを共有して安定な二重鎖又は三重鎖を形成する場合、他の核酸分子と相補的であると言われる。相補性は、２つの分子の特定の領域内の２つの核酸分子の間の塩基対の割合の百分率として記述することができる。
【００４１】
検出とは、２つの薬剤、例えば２つのタンパク質又は２つの核酸の間の相互作用が存在するか又は存在しないかを決定することを意味する。これには定量化が含まれ得る。検出は、例えば分光光度法、フローサイトメトリー、又は顕微鏡法を用いて検出することができる薬剤（標識）の使用を含み得る。例示的な標識としては、放射性同位元素（３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｖ、９９Ｔｃ、１１１Ｌｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、フルオロフォア（フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンなど）、発色団、リガンド、化学発光剤、生物発光剤（ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質など）、検出可能な反応生成物を生成することができる酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
特異的結合とは、一方の結合パートナーと他方の結合パートナーとの間の特定の相互作用、例えばプライマーと標的配列、又はタンパク質特異的抗体とタンパク質との間の特定の相互作用とを意味する。一方の結合パートナーと他方の結合パートナーとの間の相互作用は、１つ又は複数、典型的には２つ以上の非共有結合によって媒介され得る。特異的結合を特徴づける例示的な方法は、特異的結合曲線によるものである。特定の実施態様では、方法は、シグナル伝達経路の阻害剤及び試験化合物で処理した細胞において細胞周期の期が決定される工程を含む。特定の実施態様では、細胞周期停止が検出される。処理細胞が細胞周期停止を起こし、その細胞周期停止を克服しない場合、高いスコアが試験化合物に割り当てられる。
【００４３】
特定の実施態様では、過剰活性化シグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ又はＥＧＦＲ経路である。
【００４４】
特定の実施態様では、がんは、ＭＡＰＫ又はＥＧＦＲ経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子において活性化突然変異又は増幅を有するがん細胞によって特徴づけられる。
【００４５】
特定の実施態様では、ＭＡＰＫ又はＥＧＦＲ経路における活性化突然変異又は増幅は、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ＲＯＳ、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＫＩＴ又はＥＧＦＲに影響を及ぼす。
【００４６】
特定の実施態様では、がんは、メラノーマ、非小細胞肺がん、前立腺がん、胆管がん、膀胱がん、膵がん、甲状腺がん、卵巣がん、結腸直腸腫瘍、ヘアリー細胞白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、肝がん、乳がん、食道がん、頭頸部がん、及び神経膠腫から選択される。
【００４７】
特定の実施態様では、がんは、メラノーマ及び非小細胞肺がんから選択される。
【００４８】
特定の実施態様では、過剰活性化シグナル伝達経路において作用し、スクリーニング方法のために選択されるタンパク質をコードする遺伝子の活性化突然変異又は増幅によって特徴づけられる細胞は、ＢＲＡＦ突然変異を有するメラノーマ細胞又は非小細胞肺がん細胞、ＥＧＦＲ突然変異、増幅又は過剰発現を有する非小細胞肺がん細胞から選択される。
【００４９】
特定の実施態様では、ＢＲＡＦ突然変異は、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ又はＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｋ突然変異を含む。両方の突然変異は、コドン６００のバリンがそれぞれグルタミン酸又はリジンで置換されていることによって特徴づけられ、酵素のキナーゼドメインに影響を及ぼす。
【００５０】
特定の実施態様では、過剰活性化シグナル伝達経路の阻害剤は、ＥＧＦＲ経路の阻害剤（ＥＧＦＲｉ）及びＭＡＰＫ経路の阻害剤（ＭＡＰＫｉ）から選択される。
【００５１】
本発明の任意の態様の特定の実施態様では、ＭＡＰＫｉは、Ｂ−Ｒａｆの阻害剤（ＢＲＡＦｉ）、ＭＥＫの阻害剤（ＭＥＫｉ）、及びＥＲＫの阻害剤（ＥＲＫｉ）から選択される。
【００５２】
特定の実施態様では、ＢＲＡＦｉは、ベムラフェニブ（ＣＡＳ番号１０２９８７２−５４−５）、ダブラフェニブ（ＣＡＳ番号１１９５７６５−４５−７）、エンコラフェニブ（ＣＡＳ番号１２６９４４０−１７−６）、ＬＧＸ８１８（ＣＡＳ番号１２６９４４０−１７−６）、ＰＬＸ４７２０（ＣＡＳ番号９１８５０５−８４−７）、ＴＡＫ−６３２（ＣＡＳ番号１２２８５９１−３０−７）、ＭＬＮ２４８０（ＣＡＳ番号１０９６７０８−７１−２）、ＳＢ５９０８８５（ＣＡＳ番号４０５５５４−５５−４）、ＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２、ＣＡＳ番号１０２９８７３−０２−６、ＣＡＳ番号８７０６０３−１６−０）及びＲＡＦ２６５（ＣＡＳ番号９２７８８０−９０−８）を含む群から選択される。
【００５３】
特定の実施態様では、ＭＥＫｉは、ＡＺＤ６２４４（ＣＡＳ番号６０６１４３−５２−６）、トラメチニブ（ＣＡＳ番号８７１７００−１７−３）、セルメチニブ（ＣＡＳ番号６０６１４３−５２−６）、コビメチニブ（ＣＡＳ番号９３４６６０−９３−２）、ビニメチニブ（ＣＡＳ番号６０６１４３−８９−９）、ＭＥＫ１６２（ＣＡＳ番号６０６１４３−８９−９）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＡＳ番号９４６１２８−８８−７）、ＧＤＣ−０６２３（ＣＡＳ番号１１６８０９１−６８−６）、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９）、ＣＩ−１０４０（ＣＡＳ番号２１２６３１−７９−３）及びＴＡＫ−７３３（ＣＡＳ番号１０３５５５５−６３−５）を含む群から選択される。
【００５４】
特定の実施態様では、ＥＲＫｉは、ウリキセルチニブ（ＣＡＳ番号８６９８８６−６７−９）、ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ番号９４２１８３−８０−４）、ＸＭＤ８−９２（ＣＡＳ番号１２３４４８０−５０−２）、ＦＲ１８０２０４（ＣＡＳ番号８６５３６２−７４−９）、ＧＤＣ−０９９４（ＣＡＳ番号１４５３８４８−２６−４）、ＥＲＫ５−ＩＮ−１（ＣＡＳ番号１４３５４８８−３７−１）、ＤＥＬ−２２３７９（ＣＡＳ番号１８１２２３−８０−３）、ＢＩＸ０２１８９（ＣＡＳ番号１２６５９１６−４１−３、１０９４６１４−８５−３）、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４（ＣＡＳ番号１４５３８４８−２６−４）及びＶＴＸ１１ｅ（ＣＡＳ番号８９６７２０−２０−０）を含む群から選択される。
【００５５】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲｉは、セツキシマブ（ＣＡＳ番号２０５９２３−５６−４）、パニツムマブ（ＣＡＳ番号３３９１７７−２６−３）、ザルツムマブ（ＣＡＳ番号６６７９０１−１３−５）、ニモツズマブ（ｈ−Ｒ３、ＢＩＯＭＡｂＥＧＦＲ、ＴｈｅｒａＣＩＭ、Ｔｈｅｒａｌｏｃ、ＣＩＭＡｈｅｒ、ＣＡＳ番号８２８９３３−５１−３）、マツズマブ（ＣＡＳ番号３３９１８６−６８−４）、ゲフィチニブ（ＣＡＳ番号１８４４７５−３５−２）、エルロチニブ（ＣＡＳ番号１８３３２１−７４−６）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ、Ｔｙｖｅｒｂ、ＣＡＳ番号２３１２７７−９２−２、ＣＡＳ番号３８８０８２−７８−８）、ＡＰ２６１１３（ブリガチニブ、ＣＡＳ番号１１９７９５３−５４−０）、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号８７９１２７−０７−８）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ１３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）及びＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）を含む群から選択される。
【００５６】
細胞がシグナル伝達経路の阻害剤と一緒に処理される試験化合物は、ＳＯＸ２及び／又はＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子の発現レベルを阻害する。好ましい実施態様では、第２の化学物質は、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ２からなる群から選択される遺伝子を阻害する。試験化合物は、ＳＯＸ２の発現を阻害することが好ましい。
【００５７】
前記試験化合物は、小分子化合物、核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー、炭水化物、及び脂質を含むが、これらに限定されない。そのような試験化合物は、天然又は合成であり得る。
【００５８】
試験化合物は、合成化合物又は天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得ることができる。特定の実施態様では、試験化合物のライブラリーは、本発明の方法を用いてスクリーニングすることができる。例としては、ペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー、及び小分子ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能であるか又は容易に製造される。さらに、天然の又は合成的に製造されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生化学的手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを製造するために使用され得る。
【００５９】
本明細書中に記述されるようなＭＡＰＫ及びＥＧＦＲ経路の阻害剤に対する耐性の発生を防止する化合物を同定するための方法はまた、ハイスループットスクリーニングに適用され得る。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術は、大規模での細胞の迅速処理を定義するために一般的に使用されている。特定の実施態様では、様々な濃度に対する特異的反応を得るために、複数のスクリーニングを異なる試験化合物濃度と並行して実行することができる。当該技術分野で知られているように、薬剤の有効濃度を決定することは、典型的には、１：１０又は他の対数スケールの希釈から生じる濃度の範囲を使用する。必要ならば、濃度を希釈の第２系列によりさらに精密化することができる。典型的には、これらの濃度のうちの１つは陰性コントロールとして、すなわちゼロ濃度若しくは薬剤の検出レベル未満で、又は表現型に検出可能な変化を与えない薬剤の濃度未満で役割を果たす。場合によっては、陽性コントロールも実行され得る。
【００６０】
本発明は以下の図面によってさらに説明され、これらの図面からさらなる実施態様及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定することを意図していない。
【図１Ａ−Ｂ】
2020501572.tif 000002
【図１Ｃ】
2020501572.tif 000003
【図１Ｄ−Ｅ】
2020501572.tif 000004
【図１Ｆ−Ｈ】
2020501572.tif 000005
【図２Ａ−Ｂ】
2020501572.tif 000006
【図２Ｃ−Ｆ】
2020501572.tif 000007
【図２Ｇ】
2020501572.tif 000008
【図３】
2020501572.tif 000009
【国際調査報告】
2020501572.tif 000010
2020501572.tif 000011
2020501572.tif 000012