(57)【要約】  本願は、腫瘍標的抗ＣＤ３二重特異性抗体と、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体との併用療法、がんの治療のためのこのような併用療法の使用、並びに本併用療法の使用方法に関する。三量体ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ（図１Ｂ）は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと組み合わせたときに最大の腫瘍縮小を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２】
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、請求項１又は２に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項４】
４−１ＢＢアゴニストがＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項５】
４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項６】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項７】
４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項８】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項９】
４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１０】
４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１１】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１２】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１３】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１４】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン,
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１５】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１６】
４−１ＢＢアゴニストが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１７】
４−１ＢＢアゴニストが抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１８】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１９】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項又は請求項１８に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２０】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、請求項１から１０のいずれか一項、又は請求項１８又は１９に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２１】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、請求項１から１０のいずれか一項又は請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２２】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、請求項１から９のいずれか一項又は請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２３】
４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２４】
第１の抗原結合ドメインが、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２５】
第１の抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２６】
重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２７】
第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２８】
第２の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２９】
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３０】
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３１】
抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３２】
重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、及び共通の軽鎖可変領域を含む、請求項１から２５のいずれか一項又は請求項３１に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３３】
第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインが、配列番号１２４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通の軽鎖が、配列番号１２７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１２８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１２９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項１から２５のいずれか一項又は請求項３１又は３２に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３４】
第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３０の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み、第２の抗原結合ドメインが、配列番号１３１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通の軽鎖が配列番号１３２の配列を含む、請求項１から２５のいずれか一項又は請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３５】
抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３６】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤、特に抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体と組み合わせて使用される、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３７】
（Ａ）活性成分としてのＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む、疾患、特にがんの逐次的又は同時の併用療法における使用のための医薬製品。
【請求項３８】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストを含む薬学的組成物。
【請求項３９】
がんの治療又はがんの進行の遅延における使用のため、特に進行性及び／又は転移性固形腫瘍の治療のための、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
増殖性疾患、特にがんを治療するため、又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
【請求項４１】
有効量のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び有効量の４−１ＢＢアゴニストを対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
【請求項４２】
４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、請求項４１に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
【請求項４３】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、請求項４１又は４２に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
【請求項４４】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストが、静脈内投与又は皮下投与される、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
【請求項４５】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、４−１ＢＢアゴニストと同時に、４−１ＢＢアゴニストに先立ち、又は４−１ＢＢアゴニストの後で投与される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
【請求項４６】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項４７】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体、特にアテゾリズマブである、請求項４６に記載の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項４８】
４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項４６又は４７に記載の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項４９】
Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項５０】
配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍標的化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体を用いる併用療法、がんの治療のためのこのような併用療法の使用、並びに本併用療法の使用方法に関する。また、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断する薬剤、特にＰＤ−Ｌ１抗体と共に、及び／又は腫瘍標的化抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体を用いる併用療法が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、世界的に最も多い死因の一つである。治療の選択肢の進歩にも関わらず、進行がん患者の予後は依然として芳しくない。したがって、許容できない毒性を引き起こすことなくがん患者の生存期間を延ばすための最適な治療法に対し、持続的で緊急の医学的必要性が存在する。臨床治験の最近の結果により、免疫療法、特に免疫チェックポイント阻害剤ががん患者の全生存期間を延ばし、持続的応答をもたらすことが示された。このような有望な結果にも関わらず、現行の免疫に基づく治療法は患者の一部にしか効果がなく、治療効果を向上させるために組み合わせ戦略が必要とされている。
【０００３】
がんと闘う患者自身の免疫系を動員するための一つの方法は、Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）である。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、腫瘍細胞に発現されるＣＥＡと、Ｔ細胞上に存在するＣＤ３エプシロン鎖（ＣＤ３ε）とを標的とする分子である。同時結合は、Ｔ細胞活性化とＴ細胞媒介性のＢ細胞の殺傷をもたらす。ＣＥＡ陽性がん細胞の存在下では、循環しているか組織に常駐しているかに関係なく、薬理学的に活性な用量はＴ細胞活性化とそれに関連するサイトカイン放出を引き起こすであろう。腫瘍細胞の枯渇と並行して、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、初回投与後２４時間以内の末梢血中の一過性のＴ細胞減少と、サイトカイン放出のピークを招き、続いて７２時間以内に急速なＴ細胞の回復とサイトカインレベルのベースラインへの回帰が起こる。したがって、腫瘍細胞の完全な排除を達成するためには、Ｔ細胞活性化とがん細胞に対する免疫応答を保存する薬剤を追加することが必要である。
【０００４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、最初、活性化Ｔ細胞によって発現される誘導性分子として同定された（Kwon and Weissman, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 1963-1967）。その後の研究により、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、マスト細胞、樹状細胞（ＤＣ）及び内皮細胞及び平滑筋細胞といった非造血性起源の細胞を含む他の多くの免疫細胞も４−１ＢＢを発現することが実証された（Vinay and Kwon, 2011, Cell Mol Immunol 8, 281-284）。様々な細胞型の４−１ＢＢの発現は、多くが誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガーといった様々な刺激シグナル、並びに炎症性サイトカインの共刺激分子又は受容体を通して誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Diehl et al., 2002, J Immunol 168, 3755-3762; Zhang et al., 2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767）。
【０００５】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は、１９９３年に同定された（Goodwin et al., 1993, Eur J Immunol 23, 2631-2641）。４−１ＢＢＬの発現が、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージといったプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で制限されることが示された。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδＴ細胞サブセットの両方を含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, 2011, J Leukoc Biol 89, 21-29）。
【０００６】
４−１ＢＢ受容体を通した共刺激（例えば４−１ＢＢＬのライゲーションによる）は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方）内部において複数のシグナル伝達カスケードを活性化させ、Ｔ細胞活性化を強力に増大させる（Bartkowiak and Curran, 2015）。ＴＣＲトリガーとの組み合わせにおいて、アゴニストな４−１ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を亢進し、リンホカインの分泌を刺激し、活性化により誘導された細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., 2011, Immunol Rev 244, 197-217）。このような機序は、がん免疫療法における概念の最初の証明としてさらに進歩した。前臨床モデルでは、腫瘍を有するマウスにおける４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Melero et al., 1997, Nat Med 3, 682-685）。その後、蓄積された証拠により、４−１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法剤、腫瘍特異性ワクチン接種又は放射線療法と組み合わせて投与されたときにのみ、抗腫瘍剤としてのその能力を呈することが示唆された（Bartkowiak and Curran, 2015, Front Oncol 5, 117）。
【０００７】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と係合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４−１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Li and Ravetch, 2011, Science 333, 1030-1034）。しかしながら、機能的に活性のＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異性アゴニスト抗体の全身投与は、結果として肝臓毒性に関連付けられるＣＤ８＋  Ｔ細胞の流入を生じさせ（Dubrot et al., 2010, Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233）、それはマウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下で消滅するか又は有意に改善された。臨床現場において、Ｆｃコンピテント４−１ＢＢアゴニストＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）は、グレード４の肝炎を生じさせ、治験の終了に至った（Simeone and Ascierto, 2012, J Immunotoxicol 9, 241-247）。したがって、効果的で安全な４−１ＢＢアゴニストが必要とされている。
【０００８】
４−１ＢＢリガンドの一つの細胞外ドメインと、重鎖のＣ末端に融合した単鎖抗体断片（Hornig et al., 2012, J Immunother 35, 418-429; Muller et al., 2008, J Immunother 31, 714-722）又は単一の４−１ＢＢリガンド（Zhang et al., 2007, Clin Cancer Res 13, 2758-2767）とを含む融合タンパク質が作製された。国際公開第２０１０／０１００５１号には、互いに結合し且つ一つの抗体部分に融合した三つのＴＮＦリガンドのエクトドメインからなる融合タンパク質の生成が開示されている。本発明では、三量体、即ち生物学的に活性な４−１ＢＢリガンド及び腫瘍関連抗原ＦＡＰに特異性の抗原結合ドメイン及びＦｃ非活性ドメインからなる抗原結合分子が、特に安定で頑強であることが示される（本明細書においてＦＡＰ−４−１ＢＢＬと命名する）。ＦＡＰ抗原結合ドメインは、特に肝臓におけるＦｃ媒介性毒性の原因である非特異性のＦｃγＲ媒介性の架橋結合を、ＦＡＰを標的とする特異性架橋結合によって置き換える。腫瘍（ストローマ）抗原による架橋結合は、４−１ＢＢアゴニストの投与を可能にする。
【０００９】
標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子を抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、即ちＣＥＡ  ＴＣＢと組み合わせるとき、４−１ＢＢアゴニズムのよりよい抗腫瘍効果が達成されることが分かった。Ｔ細胞二重特異性抗体は、Ｔ細胞に最初のＴＣＲ活性化シグナル伝達を与え、次いでＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせは抗腫瘍Ｔ細胞免疫のさらなる増強をもたらす。したがって、本発明者らはここに、ＣＥＡを発現する腫瘍（ＣＥＡ陽性がん）のための新規併用療法を記載する。さらに、標的化４−１ＢＢアゴニストＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤のみには観察することのできない強い腫瘍縮小を誘導した。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抗ＣＤ３二重特異性抗体と、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体と組み合わせたその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細には進行性及び／又は転移性固形腫瘍を治療するため或いは進行性及び／又は転移性固形腫瘍の進行を遅らせるための方法におけるその使用に関する。本明細書に記載される併用療法は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のみでの治療より、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍細胞の排除に効果的であることが分かった。
【００１１】
一態様において、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、この腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特に、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。さらなる一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。このように、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、この抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される。
【００１２】
特に、４−１ＢＢアゴニストは腫瘍関連抗原を含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストはＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。腫瘍関連抗原による架橋結合は、非特異的なＦｃγＲ媒介性架橋結合の回避を可能にするので、一般的な４−１ＢＢ抗体と比較して、より高く且つ効果的な用量の４−１ＢＢアゴニストを投与することができる。
【００１３】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、この腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、４−１ＢＢアゴニストとは、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される。
【００１４】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、４−１ＢＢアゴニストはＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する。
【００１５】
別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、この抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢアゴニストと同時に、４−１ＢＢアゴニストに先立ち、又は４−１ＢＢアゴニストの後で投与される。
【００１６】
一態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されたアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。さらに詳細には、４−１ＢＢＬのエクトドメインは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子である。さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【００１８】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原、特にＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００１９】
特定の一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む。
【００２０】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。さらに詳細には、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００２１】
本発明の別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドはＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドはＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【００２３】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２４】
特定の一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【００２６】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【００２８】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００２９】
特定の一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。
【００３０】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。さらに詳細には、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００３１】
本発明の別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【００３３】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００３４】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【００３５】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【００３７】
これらすべての態様において、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体をさらに提供し、この抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。一態様において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。さらに詳細には、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００３８】
さらに詳細には、第２の抗原結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。さらに詳細には、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００３９】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体をさらに提供し、この抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインをさらに含む。特に、第３の抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。さらに詳細には、第３の抗原結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、又は第２の抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００４０】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【００４１】
さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【００４２】
さらなる一態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、この抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００４３】
さらなる一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、この腫瘍関連抗原はＦｏｌＲ１である。このように、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、この抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＦｏｌＲ１に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【００４４】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、及び共通の軽鎖可変領域を含む。
【００４５】
一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通の軽鎖は、配列番号１２７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１２８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１２９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。さらなる一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３０の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通の軽鎖は配列番号１３２の配列を含む。
【００４６】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１３５の共通の軽鎖を含む抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００４７】
さらなる一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、この腫瘍関連抗原はＭＣＳＰである。このように、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＭＣＳＰに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【００４８】
特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。一態様において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。さらに詳細には、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。別の様態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１５１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１５２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１５３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）、及び／又は配列番号１５４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１５５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１５６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む。さらに詳細には、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び／又は配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む。
【００４９】
別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体をさらに提供し、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＭＣＳＰに結合する第３の抗原結合ドメインをさらに含む。特に、第３の抗原結合ドメインは、配列番号１５１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１５２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１５３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）、及び／又は配列番号１５４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１５５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１５６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む。さらに詳細には、第３の抗原結合ドメインは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び／又は配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む。
【００５０】
別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、組み合わせは約一週間から三週間の間隔で投与される。
【００５１】
また別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤はアテゾリズマブである。
【００５２】
さらなる一態様では、本発明は、（Ａ）活性成分としての腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む、疾患の逐次的又は同時の併用療法における使用のため、特にがんの治療のための、医薬製品を提供する。
【００５３】
さらなる一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用を目的としており、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢアゴニストと組み合わせて使用され、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブを用いた前処置は、併用治療に先立って実施され、前処置と併用治療との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、４−１ＢＢアゴニストとを含む薬学的組成物が提供される。一態様では、薬学的組成物は、がんの治療又はがんの進行の遅延における使用を目的とし、特に固形腫瘍の治療を目的としている。さらなる一態様では、薬学的組成物は、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、及び前立腺がんからなる群より選択される疾患の治療における使用を目的としている。
【００５４】
追加の態様では、本発明は、（Ａ）活性成分としての腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体を含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法における前記組成物の使用説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療する又はがんの進行を遅らせるためのキットを提供する。
【００５５】
さらなる一態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんを治療する又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用に関する。
【００５６】
特に、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、及び前立腺がんからなる群より選択される疾患を治療するための医薬の製造における、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用が提供される。
【００５７】
別の態様では、本発明は、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法を提供し、この方法は、対象に対し、有効量の、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとを投与することを含む。特に、本発明は、４−１ＢＢアゴニストが抗原結合分子である、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法に関する。一態様では、４−１ＢＢアゴニストはＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。さらに詳細には、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。別の特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【００５８】
さらなる一態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが提供され、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤はアテゾリズマブである。さらに、本明細書に記載される方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＥＡから選択されるものである。さらに詳細には、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例に使用された特定のＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子と特定の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を示している。これら分子は、実施例１及び２においてそれぞれさらに詳細に記載される。黒い点はノブ・イントゥー・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメインにおけるアミノ酸修飾を表す記号である（いわゆる荷電残基）。図１Ａには、２＋１フォーマットの例示的な二重特異性抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体が示されている（それぞれＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢと呼ぶ）。図１Ｂは、４−１ＢＢＬ二量体及び４−１ＢＢＬ単量体に隣接するＣＨ１及びＣＬドメインに修飾を有する抗原結合分子を含む一価のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ−三量体を示している。これはＦＡＰバインダー４Ｂ９を含んでいたため、本明細書においてｍｏｎｏ  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬと命名した。図１Ｃは、ｂｉ  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬと命名されたバインダーＦＡＰ（４Ｂ９）を含む二価のコンストラクトを示している。図１Ｄ及び１Ｅは、非標的化コントロール分子を示している（ＦＡＰバインダーが非結合ＤＰ４７  Ｆａｂによって置き換えられている）。
【図２】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせで処置した群が、他の群と比較して、腫瘍増殖の阻害という観点から、有効性の向上を示したことを示している。
【図３Ａ−Ｂ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価又は二価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせによる治療が、単剤による治療と比較して、腫瘍中にＣＤ８及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の浸潤を増加させたことを示している。ＡからＪまでの文字は、図２に規定された治療群を指す。
【図３Ｃ−Ｆ】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価又は二価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせによる治療が、単剤による治療と比較して、腫瘍中にＣＤ８及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の浸潤を増加させたことを示している。ＡからＪまでの文字は、図２に規定された治療群を指す。
【図４】試験終了時の組織学的分析、即ち１ｍｍ２当たりのＣＤ８陽性細胞（Ａ）及びＣＤ３陽性細胞（Ｂ）の量を示している。
【図５】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせで処置した群が、単剤で治療した群と比較して、腫瘍増殖の阻害という観点から、有効性の向上を示したことを示している。
【図６】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価又は二価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせによる治療が、単剤による治療と比較して、腫瘍中（Ａ）及び血中（Ｂ）にＣＤ８及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の浸潤を増加させたことを示している。
【図７】異なる用量でのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせによる治療が、単剤による治療と比較して、腫瘍増殖という観点から優れた有効性を媒介することを示している。マウスを、１：１の比のＭＫＮ４５及び３Ｔ３細胞と共にインキュベートした。腫瘍細胞の注入後１７日目に、マウスを無作為化し、ビヒクル、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又は組み合わせにより処置した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬは、他の群と比較して、３及び１ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍増殖という観点から優れた有効性を媒介し、この群の中で、１ｍｇ／ｋｇとの組み合わせは、３ｍｇ／ｋｇとの組み合わせより有効性が高い。
【図８】注入された化合物の第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群につき２匹のマウスから、初回治療の１０分後、６時間後、２４時間後、９６時間後、及び７日後に採血し、注入された化合物をＥＬＩＳＡにより分析した。４−１ＢＢＬは４−１ＢＢ結合により検出し（Ａ）、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは抗ＣＤ３ＣＤＲ抗体への結合により検出した（Ｂ）。化合物を注入したすべての群が、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢのいずれにおいても異なる群の間で分子への同等の曝露を示している（用量依存性）。
【図９Ａ−Ｂ】試験終了時の腫瘍及び脾臓におけるＴ細胞浸潤を示している。２〜５匹のマウス／群の脾臓及び腫瘍を、終了時にフローサイトメトリーにより分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとを組み合わせることにより、実験終了時における腫瘍中のＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４陽性のＴ細胞の浸潤が、他のすべての群と比較して統計的に増大している。脾臓においても、組み合わせは、ビヒクル及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの単剤療法と比較して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の増加をもたらしている。（統計学一元配置分散分析、テューキーの多重比較試験、ｐ＜０．０５）。Ａは腫瘍中のＣＤ３陽性細胞の増加を、Ｂは腫瘍中のＣＤ８陽性細胞の増加を、それぞれ示している。
【図９Ｃ−Ｄ】試験終了時の腫瘍及び脾臓におけるＴ細胞浸潤を示している。２〜５匹のマウス／群の脾臓及び腫瘍を、終了時にフローサイトメトリーにより分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとを組み合わせることにより、実験終了時における腫瘍中のＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４陽性のＴ細胞の浸潤が、他のすべての群と比較して統計的に増大している。脾臓においても、組み合わせは、ビヒクル及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの単剤療法と比較して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の増加をもたらしている。（統計：一元配置分散分析、テューキーの多重比較試験、ｐ＜０．０５）。Ｃは腫瘍中のＣＤ４陽性細胞の増加を、Ｄは脾臓中のＣＤ３陽性細胞の増加を、それぞれ示している。
【図１０Ａ】試験終了時の組織学的分析を示している。ヒト化ＮＯＧマウス図示の治療群に由来する３Ｔ３マウス線維芽細胞が共移植されたヒトＭＫＮ４５胃皮下腫瘍の免疫組織学的画像が生成された。組織試料を、免疫組織化学染色のために調製した。５２日目に動物から皮下腫瘍を回収し、実験期間中にホルマリン１０％（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り取った。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を、抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び抗ヒトＣＤ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に対し、Ｌｅｉｃａのオートステイナー（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０，Ｇｅｒｍａｎｙ）において製造者のプロトコールに従って実施した。ｈｕＣＤ３の定量化を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。統計学を、多重比較試験を用いる一元配置分散分析により分析した。結果は、未処理のマウス由来のＭＮＫ４５／３Ｔ３皮下腫瘍中に極めて少数のＴ細胞を示すものであった。ビヒクル及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ群における陽性ＣＤ３Ｔ細胞の数に有意な増加がある。（統計：一元配置分散分析、テューキーの多重比較試験、ｐ＜０．０５）。組織学分析した動物は、試料の数を増やすため、異なる実験日のものである。（ビヒクル：５×５２日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ：５×５２日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ：２×５２日目、１×３２日目、２×２９日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １ｍｇ／ｋｇ：１×５２日目、２×５０日目、１×３７日目、１×３５日目）。
【図１０Ｂ】試験終了時の組織学的分析を示している。ヒト化ＮＯＧマウス図示の治療群に由来する３Ｔ３マウス線維芽細胞が共移植されたヒトＭＫＮ４５胃皮下腫瘍の免疫組織学的画像が生成された。組織試料を、免疫組織化学染色のために調製した。５２日目に動物から皮下腫瘍を回収し、実験期間中にホルマリン１０％（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り取った。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を、抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び抗ヒトＣＤ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に対し、Ｌｅｉｃａのオートステイナー（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０，Ｇｅｒｍａｎｙ）において製造者のプロトコールに従って実施した。ｈｕＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量化を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。統計学を、多重比較試験を用いる一元配置分散分析により分析した。結果は、未処理のマウス由来のＭＮＫ４５／３Ｔ３皮下腫瘍中に極めて少数のＴ細胞を示すものであった。ビヒクル及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ群におけるＣＤ８Ｔ細胞の数に有意な増加がある。（統計：一元配置分散分析、テューキーの多重比較試験、ｐ＜０．０５）。組織学分析した動物は、試料の数を増やすため、異なる実験日のものである。（ビヒクル：５×５２日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ：５×５２日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ：２×５２日目、１×３２日目、２×２９日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １ｍｇ／ｋｇ：１×５２日目、２×５０日目、１×３７日目、１×３５日目）。
【図１１】ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせ１０ｍｇ／ｋｇが、他の群と比較して、腫瘍増殖という観点から向上した有効性を媒介することを示している。
【図１２Ａ】注入された化合物の第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群当たり２匹のマウスから、初回及び２回目の治療の１時間及び７２時間後に採血した。注入した化合物を、実施例５に記載されるようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【図１２Ｂ】注入された化合物の第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群当たり２匹のマウスから、初回及び２回目の治療の１時間及び７２時間後に採血した。注入した化合物を、実施例５に記載されるようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【図１３Ａ】ＦＡＣＳにより分析した、試験終了時の腫瘍中のＴ細胞浸潤を示している。腫瘍中におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の増加が示されている。
【図１３Ｂ】ＦＡＣＳにより分析した、試験終了時の腫瘍中のＴ細胞浸潤を示している。腫瘍中におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加が示されている。
【図１４Ａ】３３日目における組織学的分析に関する。
【図１４Ｂ】試験終了日である５０日目における組織学的分析に関する。
【図１５】試験終了時のサイトカイン分析を示している（実施例５参照）。
【図１６】１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＣＥＡ−４−１ＢＢＬとの組み合わせが、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、腫瘍増殖という観点から有効性の向上を媒介することが示されている（実施例７参照）。
【図１７Ａ】注入された化合物ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡ−４−１ＢＢＬの第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群当たり２匹のマウスから、初回及び２回目の治療の１時間及び７２時間後に採血した。注入した化合物を、実施例７に記載されるようにＥＬＩＳＡにより分析した。４−１ＢＢＬを、４−１ＢＢ結合により検出した。
【図１７Ｂ】注入された化合物ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡ−４−１ＢＢＬの第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群当たり２匹のマウスから、初回及び２回目の治療の１時間及び７２時間後に採血した。注入した化合物を、実施例７に記載されるようにＥＬＩＳＡにより分析した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの濃度を、抗ＣＤ３  ＣＤＲ抗体への結合により検出した。
【図１８Ａ−Ｂ】ＦＡＣＳにより分析した、試験終了時の腫瘍中のＴ細胞浸潤が示されている（Ａ：ＣＤ３陽性Ｔ細胞、Ｂ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞）。
【図１８Ｃ】ＦＡＣＳにより分析した、試験終了時の腫瘍中のＴ細胞浸潤が示されている（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）。
【図１９Ａ】試験の４４日目における組織学的分析に関する（実施例７参照）。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法及びビヒクルと比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ１０ｍｇ／ｋｇで治療した群及び同３ｍｇ／ｋｇ治療群では、ＣＤ３陽性Ｔ細胞が有意に増加している。
【図１９Ｂ】試験の４４日目における組織学的分析に関する（実施例７参照）。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法及びビヒクルと比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ１０ｍｇ／ｋｇで治療した群及び同３ｍｇ／ｋｇ治療群では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が有意に増加している。
【図２０】様々なヒト免疫細胞調製物によるＴＣＢ媒介性ＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  ｒｅｄ腫瘍細胞の溶解が示されている（実施例８）。異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞、ＮＬＶ特異性ＣＤ８Ｔエフェクター記憶細胞）を、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で４８時間にわたり、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。生存腫瘍細胞の数を、３７℃及び５％  ＣＯ２で、３時間間隔で４８時間にわたる、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相差、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物レンズ）を用いた蛍光顕微鏡ハイコンテンツ生命イメージングにより定量化した。三重測定値（中央値）の健常な腫瘍細胞（ＲＣＵ×μｍ２／画像）の積分赤色蛍光を使用して特異的溶解を計算し、それを使用したＴＣＢ濃度に対してプロットし、Ｔ細胞の細胞溶解性を示した。
【図２１】ＴＣＢ刺激時のＴ細胞上における４−１ＢＢの発現を示している。異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞、ＮＬＶ特異性ＣＤ８Ｔエフェクター記憶細胞）を、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で４８時間にわたり、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。４−１ＢＢの発現を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上においてフローサイトメトリーにより決定した。３重測定値（中央値）の陽性細胞のパーセンテージ（Ａ及びＣ）及びＭＦＩ（Ｂ及Ｄ）を、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ａ及びＢ）及びＣＤ８陽性（Ｃ及びＤ）Ｔ細胞について、使用したＴＣＢ濃度に対してプロットした。エラーバーはＳＥＭを示す。ＴＣＢは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上では比較的程度は低いが、４−１ＢＢの用量依存性の細胞表面発現を媒介する。
【図２２】４−１ＢＢ共刺激がＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの細胞溶解性に影響を与えなかったことを示している。異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（Ｂ：休止ＰＢＭＣ、Ａ：ＣＤ４Ｔ細胞、Ｃ：ＣＤ８Ｔ細胞、Ｄ：ＮＬＶ特異的ＣＤ８Ｔエフェクター記憶細胞）を、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共に４８時間共培養した。生存腫瘍細胞の数を、３７℃及び５％  ＣＯ２での３時間間隔で４８時間にわたるＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相差、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物レンズ）を用いた蛍光顕微鏡ハイコンテンツ生命イメージングにより定量化した。三重測定値（中央値）の健常な腫瘍細胞（ＲＣＵ×μｍ２／画像）の積分赤色蛍光を使用して特異的溶解を計算し、それを、使用したＴＣＢ濃度に対してプロットし、Ｔ細胞の細胞溶解性を示した。ここで、４２時間の時点は例示的に示されている。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２３】４−１ＢＢ共刺激がＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性ＴＮＦ−α放出を増大させたことを示している。休止ＣＤ４Ｔ細胞を、４８時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で、それぞれ固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＴＮＦ−αの量を、ＴＮＦ−αセンサー細胞におけるＧＦＰ誘導として、３７℃及び５％  ＣＯ２での３時間間隔で４２時間のＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相差、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物レンズ）を用いた蛍光顕微鏡ハイコンテンツ生命イメージングにより定量化した。三重測定値（中央値）のＴＮＦ−αセンサー細胞（ＧＣＵ×μｍ２／画像）の積分緑色蛍光を、使用したＴＣＢ濃度に対してプロットし、Ｔ細胞のＴＮＦ−α分泌を定量化した。エラーバーはＳＥＭを示す。Ａは、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬの非存在下におけるＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの結果を示しており、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬの追加による増加がＢに示されている。Ｃ及びＤは、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬを用いた共刺激なし（Ｃ）及びあり（Ｄ）の、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢにより媒介されたＴＮＦ−αの放出を示している。
【図２４】各時点の曲線下面積（ＡＵＣ）の値がプロットされている。ＴＮＦ−αを、蛍光顕微鏡ハイコンテンツ生命イメージングによりＴＮＦ−αセンサー細胞におけるＧＦＰ誘導として定量化した。ＧＦＰのＡＵＣを、各条件及び時点について計算し、各時点に対してプロットし、Ｔ細胞のＴＮＦ−α分泌を定量化した。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（Ａ）及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（Ｂ）により媒介されたＴＮＦ−ａの放出が、ＦＡＰ−４１ＢＢＬの存在を通した４−１ＢＢ共刺激により増加したことが分かる。
【図２５】４−１ＢＢ  共刺激がＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（グラフのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））によるサイトカイン分泌を調節した様子を示している。休止ＣＤ４Ｔ細胞を、４８時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２）の存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１０の分泌量を、４８時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。それぞれのサイトカイン濃度をＴＣＢ濃度に対してプロットした。オフオート−炎症誘発サイトカイン  ＴＮＦ−α（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）及びＩＬ−２（Ｃ）の分泌は、４−１ＢＢ共刺激によって亢進され、免疫抑制ＩＬ−１０（Ｄ）の分泌は減少した。
【図２６】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性サイトカイン分泌について類似のデータを示している。休止ＣＤ４Ｔ細胞を、４８時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＴＮＦα（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＩＬ−２（図２６Ｃ）及びＩＬ−１０（Ｄ）の分泌量を、４８時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。それぞれのサイトカイン濃度をＴＣＢ濃度に対してプロットした。
【図２７】固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしでの高濃度のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ［５０ｎＭ］又はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ［２ｎＭ］（グラフのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の存在下におけるＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ共刺激媒介性のサイトカイン濃度の変化［％］の比較を示している。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−９及びＩＬ−１７Ａの分泌量を、４８時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。サイトカイン濃度の変化をパーセントで計算し、ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ共刺激なしのそれぞれの試料を１００％と考えた。
【図２８Ａ−Ｄ】４−１ＢＢ  共刺激が休止ＣＤ８Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性サイトカイン分泌も調節したことを示している。休止ＣＤ８Ｔ細胞を、７２時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（グラフのＣＥＡ  ＴＣＢ２）の存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＩＬ−２（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）及びＩＬ−４（Ｄ）の分泌量を、７２時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。それぞれのサイトカイン濃度をＴＣＢ濃度に対してプロットした。
【図２８Ｅ−Ｈ】４−１ＢＢ  共刺激が休止ＣＤ８Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性サイトカイン分泌も調節したことを示している。休止ＣＤ８Ｔ細胞を、７２時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（グラフのＣＥＡ  ＴＣＢ２）の存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＩＬ−９（Ｅ）、ＩＬ−１７ａ（Ｆ）、ＭＩＰ−１α（Ｇ）及びＩＬ−１０（Ｈ）の分泌量を、７２時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。それぞれのサイトカイン濃度をＴＣＢ濃度に対してプロットした。
【図２９Ａ−Ｄ】４−１ＢＢ共刺激がＮＬＶ特異的エフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＴＣＢ２）媒介性サイトカイン分泌を調節したことを示している。ＮＬＶ特異的エフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞を、７２時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡ  ＴＣＢ２の存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＩＬ−２（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）及びＩＬ−４（Ｄ）の分泌量を、７２時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。それぞれのサイトカイン濃度をＴＣＢ濃度に対してプロットした。
【図２９Ｅ−Ｈ】４−１ＢＢ共刺激がＮＬＶ特異的エフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＴＣＢ２）媒介性サイトカイン分泌を調節したことを示している。ＮＬＶ特異的エフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞を、７２時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡ  ＴＣＢ２の存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰと共培養した。ＩＬ−９（Ｅ）、ＩＬ−１７ａ（Ｆ）、ＭＩＰ−１α（Ｇ）及びＩＬ−１０（Ｈ）の分泌量を、７２時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。それぞれのサイトカイン濃度をＴＣＢ濃度に対してプロットした。
【図３０】固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしでの高濃度のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ［５０ｎＭ］又はＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ［２ｎＭ］（グラフのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））の存在下におけるＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ共刺激媒介性のサイトカイン濃度の変化［％］の比較を示している。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−９及びＩＬ−１７Ａの分泌量を、４８時間エンドポイントにおいてサイトメトリックビーズアレイ技術を用いて定量化した。サイトカイン濃度の変化をパーセントで計算し、ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ共刺激なしのそれぞれの試料を１００％と考えた。
【図３１】実施例９に記載される、ＣＥＡ及びＰＤＬ−１を発現するＭＫＮ４５細胞並びにＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞とのＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイの結果が示されている（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢについて）。図示のように、増殖ＣＤ４Ｔ細胞のわずかな増加と増殖ＣＤ８Ｔ細胞の大幅な増加が、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせについて観察された。
【図３２】実施例９に記載される、ＣＥＡ及びＰＤＬ−１を発現するＭＫＮ４５細胞並びにＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞とのＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイの結果が示されている（ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢについて）。図示のように、増殖ＣＤ４Ｔ細胞及び増殖ＣＤ８Ｔ細胞のさらに明瞭な増加が、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせにより引き起こされた。
【図３３】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。ＰＢＭＣを、ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞と、Ｔ細胞アクチベーターＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又はコントロール分子ＤＰ４７−４−１ＢＢＬの様々な組み合わせとの存在下において４日間インキュベートした。各記号は一つのウェルを示し（各群を３重に試験した）、各色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、棒グラフはＳＤと共に平均を示す。複数の異なるドナーにより頻度の大きな多様性が示されたため、ドナー毎に一つのグラフを示す。５名の異なるドナーについて、単一成分及び非標的化４−１ＢＢＬ（ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ）と比較した、増殖に対する組み合わせの影響が示されている。
【図３４】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。ＰＢＭＣを、ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞と、Ｔ細胞アクチベーターＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又はコントロール分子ＤＰ４７−４−１ＢＢＬの様々な組み合わせとの存在下において４日間インキュベートした。各記号は一つのウェルを示し（各群を３重に試験した）、各色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、棒グラフはＳＤと共に平均を示す。複数の異なるドナーにより頻度の大きな多様性が示されたため、ドナー毎に一つのグラフを示す。５名の異なるドナーについて、単一成分及び非標的化４−１ＢＢＬ（ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ）と比較した、ＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２５の表面発現に対する組み合わせの影響が示されている。
【図３５】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。ＰＢＭＣを、ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞と、Ｔ細胞アクチベーターＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１（アテゾリズマブ）及び免疫調節剤ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又はコントロール分子ＤＰ４７−４−１ＢＢＬの様々な組み合わせとの存在下において４日間インキュベートした。各記号は一つのウェルを示し（各群を３重に試験した）、各色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、棒グラフはＳＤと共に平均を示す。複数の異なるドナーにより頻度の大きな多様性が示されたため、ドナー毎に一つのグラフを示す。５名の異なるドナーについて、単一成分及び非標的化４−１ＢＢＬ（ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ）と比較した、ＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の表面発現に対する組み合わせの影響が示されている。
【図３６】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。分泌されたサイトカインＩＦＮγを、上清において、インキュベーションの４日後、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＰｒｏヒトサイトカイン８  ｐｌｅｘを用いて分析した。ＩＮＦγの放出の増加が示されている。各記号は一つのウェルを示し（各群を２重に試験した）、各色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、棒グラフはＳＤと共に平均を示す。複数の異なるドナーにより頻度の大きなばらつきが示されたため、ドナー毎に一つのグラフを示す。
【図３７】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。分泌されたサイトカインＧＭ−ＣＳＦを、上清において、インキュベーションの４日後、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＰｒｏヒトサイトカイン８  ｐｌｅｘを用いて分析した。ＧＭ−ＣＳＦ放出の増加が示されている。各記号は一つのウェルを示し（各群を２重に試験した）、各色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、棒グラフはＳＤと共に平均を示す。複数の異なるドナーにより頻度の大きなばらつきが示されたため、ドナー毎に一つのグラフを示す。
【図３８】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。分泌されたサイトカインＴＮＦαを、上清において、インキュベーションの４日後、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＰｒｏヒトサイトカイン８  ｐｌｅｘを用いて分析した。ＴＮＦαの放出が示されている。各記号は一つのウェルを示し（各群を２重に試験した）、各色／パターンは特定の治療組み合わせを示し、棒グラフはＳＤと共に平均を示す。複数の異なるドナーにより頻度の大きなばらつきが示されたため、ドナー毎に一つのグラフを示す。
【図３９】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。１００ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢによる治療と、１００ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び１ｎＭのＦＡＰ−４−１ＢＢＬの組み合わせによる治療との比較を示している。この比較により得られたＴ細胞活性化の改善を分析するため、及びドナーの多様性を考慮して、各ドナー及び各試験パラメーターについて増加率を計算した。各ドナーについて平均を示し、各ドナーを異なる基号で表している。有意な変化は２倍の増加（グレーの領域）と定義する。変化なし（例えば増加率＝１）は点線で示されている。
【図４０】ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせ、並びにＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三重の組み合わせの有効性を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの併用治療が、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ及びＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の三重の併用治療に対して比較されている。ＣＥＡ  ＣＤ３ＴＣＢをＦＡＰ−４−１ＢＢＬ及びＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）と組み合わせることによるＴ細胞活性化の改善を分析するため、及びドナーの多様性を考慮して、各ドナー及び各試験パラメーターについて増加率を計算した。各ドナーについて平均を示し、各ドナーを異なる基号で表している。有意な変化は２倍の増加（グレーの領域）と定義する。変化なし（例えば増加率＝１）は点線で示されている。
【図４１】Ａ及びＢは、ハイブリッド代理ＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬ（被分析物１）の、固定化されたマウス４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰ又はマウスＦＡＰ（被分析物２）それぞれに対する同時結合を示している。Ｃでは、マウス二重特異性ＦＡＰ−４−１ＢＢ抗体ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢ（被分析物１）の、固定化されたマウス４−１ＢＢ及びマウスＦＡＰ（被分析物２）に対する同時結合が示されている。
【図４２】実施例１３に記載の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの単回注入後の、ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの薬物動態プロファイルを示している。安定なＰＫ挙動が観察され、このことにより、化合物を週に１回のスケジュールで投与できることが示唆される。
【図４３】図４２により導かれる、実施例１４に記載されるような、ＭＣ３８−ＣＥＡモデルにおけるｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いる有効性試験の治療スケジュールを示している。
【図４４Ａ−Ｂ】Ａは、ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢのみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ、又は両方の組み合わせで処置したマウスに観察される腫瘍増殖動態（平均＋／−ＳＥＭ）を示している。Ｂは、治療開始から１５日目から３７日目までの、いずれかの動物の腫瘍増殖の変化を示す滝グラフである。
【図４４Ｃ】さらに、すべての治療群の各動物の個々の腫瘍増殖動態を、さらに詳細に示している。ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの単剤療法は、腫瘍増殖の阻害をまったく示さなかった。抗ＰＤ−Ｌ１のみによる治療は一匹のマウスに腫瘍増殖の阻害を誘導し、このマウスは３７日目に腫瘍が無くなった。しかしながら、ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢとａ−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせは、１０匹中５匹のマウスに強力な腫瘍縮小を誘導し、３７日目までに５０％のマウスで腫瘍が無くなった。
【図４５】ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせは、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢのみ又は単剤としての一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬを投与された他の群（Ｂ）と比較して、腫瘍増殖の阻害という観点から有効性の改善を示した。Ａでは、一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬが、非標的化４−１ＢＢＬとして腫瘍増殖の阻害においてはるかに強力であるが、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせの方が強力であることが分かる。
【図４６】注入された化合物の第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群につき２〜３匹のマウスから、初回治療の１０分後、１時間後、８時間後、２４時間後、及び７日後に採血し、注入された化合物をＥＬＩＳＡにより分析した。４−１ＢＢＬを、４−１ＢＢ結合により検出した。化合物を注入したすべての群が、異なる群の間で分子への同等の曝露を示している（用量依存性）。
【図４７】ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢのみ又はＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせによる治療は、４−１ＢＢＬのみによる治療と比較して、腫瘍中に、ＣＤ３＋  Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｃ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（Ｂ）の浸潤の増大を招いたが、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔ細胞の比は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢのみを投与された群（Ｄ）と比較して、組み合わせ群においてはるかに高かったことを示している。
【図４８】試験終了時の組織学的分析、特に最終投与の翌日である４４日目に収集された、皮下ＳＫＯＶ３卵巣腫瘍におけるＣＤ３＋  Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｂ）の定量化に関する。ＣＤ３及びＣＤ８Ｔ細胞の免疫組織化学染色を、ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスの図示の治療群に由来するヒトＳＫＯＶ３卵巣皮下腫瘍において実施した。組織試料を、免疫組織化学染色のために調製した：皮下腫瘍を４４日目に動物から回収し、ホルマリン１０％（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴのために処理した（Ｌｅｉｃａ  １０２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り取った。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を、抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に対し、Ｌｅｉｃａのオートステイナー（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０，Ｇｅｒｍａｎｙ）において製造者のプロトコールに従って実施した。ｈｕＣＤ３及びｈｕＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量化を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。統計をｔ検定により分析した。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢで試験した群に、陽性ＣＤ３及びＣＤ８Ｔ細胞の数の有意な増加がある。ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬの治療は、ＣＤ８とＣＤ３の比を変化させる。
【図４９】ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢと一価又は二価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせで処置した群が、単剤で治療した群と比較して、腫瘍増殖の阻害という観点から、有効性の向上を示したことを示す。
【図５０】注入された化合物の第１週の間の薬物動態プロファイルを示している。１群につき２匹のマウスから、初回治療の１０分後、１時間後、８時間後、２４時間後、及び７日後に採血し、注入された化合物をＥＬＩＳＡにより分析した。４−１ＢＢＬを、４−１ＢＢ結合により検出した。化合物を注入したすべての群が、異なる群の間で分子への同等の曝露を示している。
【図５１Ａ−Ｂ】ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢと一価又は二価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせによる治療が、単剤による治療と比較して、腫瘍中及び血中にＣＤ８（Ａ）及びＣＤ４（Ｂ）陽性Ｔ細胞の浸潤を増加させたことを示している。
【図５１Ｃ】ＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔ細胞の比が、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢのみを投与された群と比較して組み合わせ群においてはるかに高いことを示している。
【図５２】ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ及びＣＤ８＋  Ｔ細胞なしでの又はそれらの存在下での、３名のドナーのＭＶ３メラノーマ細胞のＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性殺傷の比較を示している（実施例１６参照）。三名すべてのドナーについて、腫瘍標的細胞殺傷の有意な増加が観察された。
【図５３】ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ及びｐａｎ  Ｔ細胞なしでの又はそれらの存在下での、３名のドナーのＭＶ３メラノーマ細胞のＴＣＢ媒介性の殺傷の比較を示している。３名すべてのドナーについて、腫瘍標的細胞の殺傷の有意な増加が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆も同じである。
【００６１】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
【００６２】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、並びに、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 即ち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００６４】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００６５】
本願内で使用される用語「価」は、抗原結合分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ二つの結合部位、四つの結合部位及び六つの結合部位の存在を意味する。
【００６６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続いている。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五つのタイプのうちの一つに割り当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００６７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）を参照：また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び  第５５８７４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 （2003）；及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 （1993）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００６８】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらには軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つ同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインと、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位（二つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２  断片を生成する。
【００６９】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」はＦａｂ断片を指し、重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域は交換可能である。クロスオーバーＦａｂ分子の二つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。対して、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は交換されており、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。対して、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００７０】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し；ここで、前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。加えて、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばカバット番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化されることがある。
【００７１】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し、ＶＨとＶＬは一緒に、特に抗原に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばカバット番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化されることがある。
【００７２】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続した、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、並びに溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができるか、又はその逆が可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 （1991） 46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、つまり、機能性抗原結合部位へとＶＬドメインと一緒に集合することのできる、又はＶＬドメインの特性を有する、つまり機能性抗原結合部位へとＶＨドメインと一緒に集合することのできる一本鎖ポリペプチドを含み、それにより完全長抗体の抗原結合特性を提供する。
【００７３】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されている。例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 （2009） and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 （2008）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、プロテインＡに由来する分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ），Ａドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランス体）；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）からなる群より選択される。
【００７４】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質といった疎水性の小分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。これは、異なる標的抗原に結合するように操作することのできる螺旋構造の開放端に多数のループを有する剛性のベータ−シート二次構造を有する。Ａｎｔｉｃａｌｉｎは１６０〜１８０のアミノ酸の大きさであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 （2000）、米国特許第７２５０２９７号及び同第２００７０２２４６３３号を参照されたい。
【００７５】
設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格に対する内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーであるＡｎｋｙｒｉｎに由来する。単一のアンキリン反復は、二つのアルファ螺旋とベータ−ターンからなる３３残基のモチーフである。これらは、各反復の第１のアルファ螺旋とベータ−ターンの残基を無作為化することにより、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。これらの結合面は、モジュールの数を増加せることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 （2003）, PNAS 100（4）, 1700-1705 （2003） 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 （2007）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。
【００７６】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ＶＨＨ断片のナノボディ）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、サメに由来する自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はＶＮＡＲ断片を含む。
【００７７】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照分子の結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は競合アッセイにおいてその抗原に対する抗原結合分子の結合を５０％以上ブロックする。
【００７８】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定部分にのみ結合しうる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７９】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００８０】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 （2000））、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 （2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００８１】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する本質的な結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表され、この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００８２】
用語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞により又は腫瘍ストローマ中に高度に発現されるいずれかの抗原を意味する。特定の腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ又はＦＡＰ、さらには葉酸受容体といった他の標的である。
【００８３】
特に断らない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はＳｅｐｒａｓｅ（ＥＣ３．４．２１）としても知られる用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＦＡＰを指す。用語は、「完全長」の、未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルのＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の登録番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号８０）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に延びている。Ｈｉｓタグを付したヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号８１に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号８２）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に延びている。配列番号８３は、Ｈｉｓタグを付したマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号８４は、Ｈｉｓタグを付したカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されている。
【００８４】
特に断らない限り、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られる用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号８５）に示されている。ＣＥＡは、以前より腫瘍関連抗原として同定されている（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。当初は胎児組織にのみ発現されるタンパク質として同定されたが、ＣＥＡは、今では複数の正常成人組織においても同定されている。これら組織は主に、胃腸、呼吸器官、及び非尿生殖器の細胞、並びに結腸、頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む上皮を起源とする（Nap et al., Tumour Biol., 9（2-3）:145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52（8）:2329-23339, 1992）。上皮起源の腫瘍、並びにその転位は、ＣＥＡを腫瘍関連抗原として含む。ＣＥＡの存在自体はがん性細胞への形質転換を示すものではないが、ＣＥＡの分布は指標となる。正常組織において、ＣＥＡは、通常細胞の先端面に発現され（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9（2）:67-81 （1999））、血流中の抗体に到達することを不可能にする。正常組織と対照的に、ＣＥＡは、がん細胞の表面全体に発現する傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9（2）:67-81 （1999））。このような発現パターンの変化は、ＣＥＡを、がん細胞中に結合する抗体に到達可能にする。加えて、ＣＥＡの発現が、がん細胞において増加する。さらに、増加したＣＥＡ発現は、細胞間接着の増加を促進し、転移を招く（Marshall J., Semin Oncol., 30（a Suppl. 8）:30-6, 2003）。様々な腫瘍エンティティにおけるＣＥＡ発現の出現率は、通常極めて高い。出版されているデータと一致して、組織試料において実施された独自の分析によりその高い出現が確認され、結腸直腸癌（ＣＲＣ）において約９５％、膵臓がんにおいて９０％、胃がんにおいて８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＨＥＲ３と共発現）において６０％、及び乳がんにおいて４０％であった。小細胞肺がん及び膠芽細胞腫では低発現が見られた。
【００８５】
ＣＥＡは、直接又はリンパを介して細胞表面から容易に切断されて腫瘍から血流に流れ込む。このような性質に起因して、血清ＣＥＡのレベルは、がんの診断、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングの臨床マーカーとして使用されている（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12（23）:6985-6988, 2006）。
【００８６】
用語「ＦｏｌＲ１」は、葉酸受容体アルファを指し、多数のがんにおける予後予測及び治療標的として同定されている。特に断らない限り、この用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＦｏｌＲ１を指す。ヒトＦｏｌＲ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１５３２８に示されており、マウスＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ３５８４６のアミノ酸配列を有しており、カニクイザルＦｏｌＲ１はＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｇ７ＰＲ１４に示されるアミノ酸配列を有している。ＦｏｌＲ１は、細胞の原形質膜に発現されるＮグリコシル化タンパク質である。ＦｏｌＲ１は、葉酸及び複数の還元葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、生理的葉酸塩、５−メチルテトラヒドロ葉酸の、細胞内部への送達を媒介する。ＦＯＬＲ１は、正常組織上のＦＯＬＲ１の発現が腎近位尿細管、肺の肺胞胚細胞、膀胱、精巣、脈絡嚢、及び甲状腺の上皮細胞の先端膜に制限されるところ、卵巣がんの大部分、並びに多くの子宮がん、子宮内膜がん、腎がん、膵臓がん、肺がん、及び乳がんに過剰発現されるため、ＦＯＬＲ１指向性がん療法のために望ましい標的である。最近の研究により、ＦｏｌＲ１の発現が特に三種陰性乳がんにおいて高いことが同定された（Necela et al. PloS One 2015, 10（3）, e0127133）。
【００８７】
用語「ＭＣＳＰ」は、コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られるメラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカンを指す。特に断らない限り、この用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＦｏｌＲ１を指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ６ＵＶＫ１に示されている。ＭＣＳＰは、細胞膜上に発現されるＮ−結合型の２８０  ｋＤａ糖タンパク質成分と４５０−ｋＤａコンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン成分とからなる、高度にグリコシル化された内在性膜コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカンである（Ross et al., Arch. Biochem. Biophys. 1983, 225:370-38）。ＭＣＳＰは、多数の正常細胞及び形質転換細胞により広く分布している。特に、ＭＣＳＰは、表皮のほぼすべての基底細胞に見られる。ＭＣＳＰは、メラノーマ細胞に差次的に発現されるもので、分析した良性母斑及びメラノーマ病変の９０％超に発現されることが判明した。ＭＣＳＰは、基底細胞癌，を含む非メラニン細胞起源の腫瘍、神経堤起源の様々な腫瘍、及び乳房癌腫にも発現されることが分かった。
【００８８】
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
【００８９】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象にＴ細胞活性化を誘導することのできる治療剤、特に対象にＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療剤の例には、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＥＡ又は葉酸受容体などの標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。
【００９０】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子とＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００９１】
特に断らない限り、用語「ＣＤ３」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ３を指す。用語は、「完全長」の、未処理のＣＤ３並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ３の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の登録番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号１０６も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．  ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号１０７も参照のこと。
【００９２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む、類似の構造を有する。例えば、Kindt et al.、Kuby Immunology、6th ed.、W.H. Freeman and Co.、page 91(2007)を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。
【００９３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計六つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987））。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。）超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関連して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」（1983） 及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987）により記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及するためにいずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ｂに明記される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
【００９４】
2020504104.tif 000003
【００９５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「カバット番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and ヒトServices, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" （1983）によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従っている。
【００９６】
ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci.  13:1619-1633 （2008）参照。）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。
【００９７】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子より高い親和性を有す抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００９８】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９９】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【０１００】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【０１０１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０１０２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を産むように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【０１０３】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１０４】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びる。一実施態様において、糖（炭水化物）鎖がＣＨ２ドメインに付着している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然型配列のＣＨ２ドメインでも変異体のＣＨ２ドメインでもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域においてＣ末端からＣＨ２ドメインに一連の残基を含む（即ちＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。ここでＣＨ３領域は、天然型配列ＣＨ３ドメインでも変異型ＣＨ３ドメイン（例えばその一つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）と、その他の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）とを有するＣＨ３ドメイン、ここで参照することにより本明細書に明示的に包含される米国特許第５８２１３３３号参照）でもよい。このような変異型ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載されるように、二つの非同一の抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【０１０５】
「ノブ−イントゥ−ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖をそれよりも大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって二量体をさらに安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。
【０１０６】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害性）の媒介能を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から削除することができる。このような変異体は、活性に対する影響を最小化するために、当技術分野において既知の一般則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 （1990）参照）。
【０１０７】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【０１０８】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【０１０９】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（即ち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。したがって、本明細書に定義される４−１ＢＢＬのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）中に延びる４−１ＢＢＬの一部を指すが、、三量体化及び対応する受容体４−１ＢＢへの結合を担う、そのより短い部分又は断片も含む。したがって、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成する４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン又は依然受容体に結合できるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【０１１０】
「４−１ＢＢＬ」又は「４−１ＢＢリガンド」又は「ＣＤ１３７Ｌ」は、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン生成を同時刺激することができる同時刺激性ＴＮＦリガンドのファミリーメンバーである。同時刺激性ＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体と相互作用すると、ＴＣＲシグナルを同時刺激することができ、その受容体との相互作用はＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員をもたらし、それによりシグナル伝達カスケードが開始されてＴ細胞活性化を招く。４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質である。配列番号８６のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定の動機により可能になる。前記動機は、本明細書では、「三量体化領域」と命名される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号８７）のアミノ酸５０〜２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）、配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）、配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）、配列番号７（ヒト４−１ＢＢＬアミノ酸８０−２４８）及び配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、本明細書には三量体化能を有するエクトドメインの他の断片も含まれる。
【０１１１】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「４−１ＢＢ」又は「ＣＤ１３７」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型４−１ＢＢを指す。用語は、「完全長」の、未処理の４−１ＢＢ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを包含する。この用語は、天然に存在する４−１ＢＢの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号８８（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ０７０１１）に示されており、例示的なマウスの４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号８９（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２０３３４）に示されており、例示的なカニクイザル４−１ＢＢのアミノ酸配列（アカゲザル由来）は配列番号９０（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示されている。
【０１１２】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、４−１ＢＢを標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１１３】
用語「ペプチドリンカー」は、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であるか、又は本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４、特に２の数であり、即ちＧＧＧＧＳ（配列番号９１）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９３）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９４）からなる群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号９５）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９６）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１０１）、ＧＧＳＧ（配列番号１０２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１０３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１０４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１０５）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号９１）、（Ｇ４Ｓ）２及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）である。
【０１１４】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【０１１５】
「融合した」又は「接続した」とは、成分（例えば４−１ＢＢＬのエクトドメイン及びポリペプチド）が、ペプチド結合により、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【０１１６】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
【０１１７】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製されうる。このような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させるために作ることができる。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとフレームワーク（ＦＲ）を含む。保存的置換を表Ｃの「好ましい置換」という項目に示し、アミノ酸側鎖クラス（１）から（６）を参照してさらに後述する。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【０１１８】
2020504104.tif 000004
【０１１９】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１２０】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１２１】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子の一又は複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む（例えばヒト化又はヒト抗体）。一般的には、結果として得られ、さらなる研究のために選択された変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）を有する、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、一又は複数のＣＤＲ残基が変異し、変異型抗原結合分子は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は削除は、 これらの改変が抗原に対する抗原結合分子の結合能を実質的に低下させない限り、一又は複数のＣＤＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells （1989） Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の一つの残基又はグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされる又は排除される。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。
【０１２２】
アミノ酸配列挿入は、 一残基から、百以上の残基を含有するポリペプチドの長さにわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体は、抗原結合分子の血清半減期を延ばすポリペプチドに対するＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
【０１２３】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、簡便には、一又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより得られる。抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに付着する糖（炭水化物）が改変されうる。哺乳動物細胞によって生成された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 （1997）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。いくつかの実施態様では、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異体を作成するためになされうる。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着するフコースを欠く糖鎖（炭水化物）構造を有する抗原結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば米国特許出願公開番号第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は同２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。本発明の抗原結合分子のさらなる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に付着する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。このような変異体は、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６６０２６８４号（Umana et al.）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４（Raju, S.）に記載されている。
【０１２４】
特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば、分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作成することが望ましい。特定の実施態様において、置換される残基が分子の到達可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作るために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの一又は複数がシステイン：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）で置換される。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成されうる。
【０１２５】
特定の態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定しないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してよく、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 （2005） 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書に提供される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１２６】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１２７】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【０１２８】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドと言うとき、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、或いは参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端の間のいずれかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１２９】
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１３０】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１３１】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれず、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１３２】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１３３】
本発明による併用療法は相乗効果を有する。二つの化合物の「相乗効果」は、二つの薬剤の組み合わせの効果がそれら個々の効果の和より大きいものであり、コントロール及び単一の薬物とは統計学的に異なる。別の実施態様では、本明細書に開示される併用療法は、相加効果を有する。二つの化合物の「相加効果」は、二つの薬剤の組み合わせの効果がそれら個々の効果の和であるものであり、コントロール及び／又は単一の薬物のいずれとも統計学的に異なる。
【０１３４】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１３５】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１３６】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１３７】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される添加物には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１３８】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１３９】
本明細書において用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１４０】
本明細書において用いられる用語「がん」は、固形腫瘍、又はメラノーマといった増殖性疾患を指す。
【０１４１】
特に断らない限り、「ＣＤ２０」は、Ｂ−リンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られるＢ−リンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号１５９）に示されている。ＣＤ２０は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球に発現される、約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１であり、ＭＳ４Ａ１としても知られる。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンのスプライス境界により特徴づけられ、造血細胞及び非リンパ系組織の中に固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発達及び分化に参画するＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中でも１１ｑ１２に局在する。本遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする二の転写変異体を生じる。用語「ＣＤ２０」は、「完全長」の、未処理のＣＤ２０並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ２０を包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ２０の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
【０１４２】
用語「抗ＣＤ２０抗体」及び「ＣＤ２０に結合する抗体」は、ＣＤ２０を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＣＤ２０に結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＣＤ２０抗体の、無関係な、非ＣＤ２０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＣＤ２０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、異なる種由来のＣＤ２０間で保存されているＣＤ２０のエピトープに結合する。
【０１４３】
「ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体」は、Cragg et al., Blood 103 （2004） 2738-2743; Cragg et al., Blood 101 （2003） 1045-1052, Klein et al., mAbs 5 （2013）, 22-33に記載されたＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性を有する抗ＣＤ２０抗体を意味する。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０上のクラスＩＩエピトープに結合し、ＣＤ２０を脂質ラフトに局在化させず、ＡＤＣＣ活性を示すが、それがＩｇＧ１アイソタイプ抗体である場合は低いＣＤＣを示し、クラスＩのＣＤ２０エピトープに結合する抗体と比較して、Ｂ細胞に対する結合能は低く、同型凝集と強い死誘導を示す。例示的ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体には、例えば、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、トシツモマブ（Ｂ１）、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開２００５／０４４８５９号に開示されるようなキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開２００４／０３５６０７号に開示）及びＡＴ８０  ＩｇＧ１が含まれる。特定の態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである（WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453で推奨のＩＮＮ）。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１の同義語である。商品名は、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）又はＧＡＺＹＶＡＲＯ（登録商標）である。これは、全ての旧版を差し替え（例えばVol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）、元はアフツズマブとして知られていたものである（WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176;Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124で推奨されるＩＮＮ）。一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はトシツモマブである。
【０１４４】
本発明における使用のための例示的抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせたその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細には固形腫瘍を治療するため又は固形腫瘍の進行を遅らせるための方法におけるその使用に関する。本明細書において使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。
【０１４５】
したがって、本明細書において使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
【０１４６】
特定の一態様では、組み合わせにおける使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０１４７】
一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は完全長抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、さらに詳細にはＦａｂ分子である。特定の一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いによって置き換えられている）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒト化抗体である。
【０１４８】
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１４９】
さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１５０】
別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１５１】
さらに詳細には、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１５２】
さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である二重特異性抗体である。
【０１５３】
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している二重特異性抗体である。
【０１５４】
Ｆａｂ分子は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５のアミノ酸長を、一実施態様では５から１００、さらなる実施態様では１０から５０のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的ペプチドリンカーは配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特にＦａｂ分子は、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
【０１５５】
さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１５６】
特定の一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号６３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号６４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号６１のポリペプチド配列、配列番号６２のポリペプチド配列、配列番号６３のポリペプチド配列、及び配列番号６４のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ）。
【０１５７】
さらなる特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号６０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号５７のポリペプチド配列、配列番号５８のポリペプチド配列、配列番号５９のポリペプチド配列及び配列番号６０のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ）。
【０１５８】
特定の二重特異性抗体は、国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている。
【０１５９】
さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））も含む。さらなる一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２００７／０７１４２６号又は国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載される二重特異性抗体である。別の態様では、二重特異性抗体はＭＥＤＩ５６５である。
【０１６０】
本発明における使用のための例示的抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせたその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細には固形腫瘍を治療するため又は固形腫瘍の進行を遅らせるための方法におけるその使用にも関する。本明細書において使用される抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＦｏｌＲ１に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。特に、本明細書において使用される抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１６１】
一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第３の抗原結合ドメイン、及び三倍の共通軽鎖可変領域を含む。
【０１６２】
別の態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；第３の抗原結合ドメインは、配列番号１２４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通軽鎖は、配列番号１２７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１２８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１２９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。別の態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３０の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインは、配列番号１３１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；第３の抗原結合ドメインは、配列番号１３１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通軽鎖は配列番号１３２の配列を含む。
【０１６３】
特定の一態様では、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び三倍の配列番号１３５の共通軽鎖を含む。
【０１６４】
本発明における使用のための例示的抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明はさらに、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせたその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細には固形腫瘍を治療するため又は固形腫瘍の進行を遅らせるための方法におけるその使用に関する。本明細書において使用される抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＭＣＳＰに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。特に、本明細書において使用される抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＭＣＳＰに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１６５】
一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、並びに重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第３の抗原結合ドメイン、及び三倍の共通軽鎖可変領域。
【０１６６】
一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、並びに重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第３の抗原結合ドメイン、及び三倍の共通軽鎖可変領域。さらに詳細には、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０１６７】
別の様態では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１５２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１５３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）、及び／又は配列番号１５４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１５５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１５６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１６８】
さらに詳細には、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び／又は配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び／又は配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１６９】
別の特定の態様では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１５２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１５３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）；及び／又は配列番号１５４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１５５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１５６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１７０】
さらなる一態様では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＣＳＰ）及び／又は配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＣＳＰ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１７１】
さらなる一態様では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１７２】
特定の一態様では、抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１４７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号１４８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号１４９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号１５０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号１４７のポリペプチド配列、配列番号１４８のポリペプチド配列、配列番号１４９のポリペプチド配列、及び配列番号１５０のポリペプチド配列を含む（ＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢ）。
【０１７３】
特定の抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている。
【０１７４】
本発明における使用のための例示的４−１ＢＢアゴニスト
特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬを含む分子である。特に、本発明に使用される４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。
【０１７５】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１７６】
本明細書では、４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原、特にがん細胞上の又はストローマ中の標的に特異的な抗原結合ドメインを含む場合に特に有用であることが示されている。したがって、特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰ又はＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【０１７７】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１７８】
特定の一態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１７９】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。さらに詳細には、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１８０】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１８１】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１８２】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドはＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドはＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０１８３】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり，
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０１８４】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である。
【０１８５】
特に、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である。
【０１８６】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１８７】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）少なくとも一つのＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【０１８８】
特定の二重特異性抗体は、国際公開第２０１６／０７５２７８号又は国際公開第２０１６／１５６２９１号に記載されている。
【０１８９】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０１９０】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。
【０１９１】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。
【０１９２】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定な結合能を有する第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１９３】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン，
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１９４】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドはＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドはＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０１９５】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０１９６】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である。
【０１９７】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１９８】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【０１９９】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体を含む。
【０２００】
本発明における使用のためのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤
本発明の一態様において、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用を目的としており、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、さらにはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせられる。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、標的化４−１ＢＢアゴニストのみと組み合わせられる。これら態様のすべてにおいて、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ−１結合アンタゴニストである。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体である。
【０２０１】
ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＰＤ−Ｌ１、特に「ヒトＰＤ−Ｌ１」を指す。完全ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１１０）において示される。用語「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１、Ｂ７−１といったその結合パートナーのいずれか一又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、ブロック、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１及び／又はＢ７−１に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及びＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１、Ｂ７−１といったその結合パートナーの一又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、ブロック、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１を介したＴリンパ球媒介性シグナル伝達に発現される細胞表面タンパク質により又は同タンパク質を介して媒介される陰性の共刺激シグナルを低減し、機能障害性のＴ細胞の機能障害性を低下させる（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体」又は「アゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。
【０２０２】
特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。特定の一態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ−１１０５からなる群より選択される。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＤＸ−１１０５である。また別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。さらなる態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１３の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１４の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１５の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２０３】
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ−１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＰＤ−Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ１５１１６（配列番号１１１）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ−１を指す。用語「ＰＤ−１結合アンタゴニスト」は、そのリガンド結合パートナーに対するＰＤ−１の結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２両方に対する結合を阻害する。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−１抗体」又は「ヒトＰＤ−１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−１に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ−１」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。
【０２０４】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は抗ＰＤ−１抗体である。特定の一態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＤＸ  １１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ−１０８からなる群より選択され、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１６の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１７の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１８の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１９の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。
【０２０５】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせにおける使用のための例示的４−１ＢＢアゴニスト
本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストにも関し、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用を目的としており、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体であり、特にＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤はアテゾリズマブである。
【０２０６】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせにおける使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、特に腫瘍関連抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＥＡから選択されるものである。さらに詳細には、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。
【０２０７】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせでの、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及びＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０２０８】
特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせでの、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及びＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０２０９】
別の態様では、この方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。さらなる一態様では、この方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０２１０】
さらなる一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせでの、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０２１１】
別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせでの、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドはＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドはＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０２１２】
特定の態様では、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり，
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０２１３】
特定の一態様では、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である。
【０２１４】
別の態様では、本明細書に前述した方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０２１５】
さらなる一態様では、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）少なくとも一つのＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメイン，
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【０２１６】
また別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせでの、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０２１７】
さらなる一態様では、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及びＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。
【０２１８】
特に、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。さらに詳細には、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及びＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０２１９】
さらなる一態様では、本明細書に前述した方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０２２０】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドはＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドはＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０２２１】
さらに詳細には、本方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含むＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である。
【０２２２】
別の態様では、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、及び（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。さらなる態様では、本方法における使用のための、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン，
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【０２２３】
また別の態様では、本方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０２２４】
本発明における使用のための二重特異性抗体の調製
特定の態様では、組み合わせで使用される治療剤は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性は異なる抗原に対するものである。特定の態様では、結合特異性は、同じ抗原上の異なるエピトープに対するものである。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０２２５】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305:537(1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10:3655(1991)を参照）及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229:81(1985)を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553(1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444-6448(1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994)を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147:60(1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０２２６】
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む三又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０２２７】
本明細書における抗体又は断片は、二つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。本明細書には「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」抗体も含まれる（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、又は国際公開第２００９／０８０２５４号参照）。
【０２２８】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技術は、「二重特異性Ｔ細胞誘導」又はＢｉＴＥ（登録商標）手法である（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１、及び同第ＷＯ２００８／１１９５６７号参照）。この手法は、単一のポリペプチド上に配置される二つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一ポリペプチド鎖は、各々が、二つのドメイン間の分子内会合を可能にするために十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離された可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する、二つの短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む。この単一ポリペプチドは、二つのｓｃＦｖ断片の間にポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは異なるエピトープを認識し、各ｓｃＦｖがその同族エピトープと結合するときに二つの異なる細胞型の細胞が近接するか又は繋がるように、これらエピトープは異なる細胞型について特異的でありうる。この手法の一の特定の実施態様には、悪性細胞又は腫瘍細胞といった標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに結合した、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドといった免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖが含まれる。
【０２２９】
単一ポリペプチドであるので、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当技術分野で既知のいずれかの原核細胞又は真核細胞発現系、例えば、ＣＨＯ細胞株を用いて発現されうる。しかしながら、モノマーの意図された活性以外の生物活性を有しうる、単量体の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを他の多量体種から分離するために、特定の精製技術（例えば、ＥＰ１６９１８３３参照）が必要なこともある。一の例示的な精製スキームでは、分泌されたポリペプチドを含有する溶液を、まず金属アフィニティークロマトグラフィーに供し、イミダゾール濃度の勾配を用いてポリペプチドを溶出する。この溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製され、ポリペプチドが、塩化ナトリウム濃度の勾配を用いて溶出される。最後に、この溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、多量体種から単量体を分離する。一態様では、本発明に使用される二重特異性抗体は、ペプチドリンカーにより互いに対して融合した二つの単鎖ＦＶ断片（ｓｃＦＶ）を含む単一ポリペプチド鎖を含む。
【０２３０】
Ｆｃ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０２３１】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特性抗体の望ましくない標的化の原因となることがある。したがって、特定の態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の一態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
【０２３２】
特定の態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
【０２３３】
特定の一態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
【０２３４】
一態様において、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。さらに詳細には、本発明により、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定するための方法も記載されている。
【０２３５】
Ｆｃ受容体の結合が低減した及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二つ以上に置換を有するＦｃ変異を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２３６】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに詳細な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０２３７】
変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０２３８】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組み換え発現により得ることができる。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０２３９】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 （1986）及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 （1985）；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 （1987）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 （1998）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０２４０】
いくつかの態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本発明の二重特異性抗体ががＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. 方法202:163 （1996）; Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 （2003）；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 （2004）を参照）。
【０２４１】
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがってＦｃドメインの二つのサブユニットは、二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれていることがある。これらポリペプチドの組み換え共発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成において本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促す修飾を含めることが有利であろう。
【０２４２】
したがって、特に本発明の態様は、（ａ）腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする二重特異性抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、このＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【０２４３】
特定の一態様では、前記修飾はいわゆる「ノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。したがって、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、ノブ−イントゥ−ホール技術に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはホールを含む。特定の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２４４】
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖をそれよりも大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０２４５】
このように、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。
【０２４６】
またさらなる態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４の位置のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９の位置のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらに二量体を安定させる（Carter(2001)、J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２４７】
代替的な一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
【０２４８】
本明細書に報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端でありうる。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端のアミノ酸残基のうちの一つ又は二つが除去されている、短縮されたＣ末端でありうる。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。本明細書に報告されるすべての態様のうちの一態様において、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に報告されるすべての態様のうちの一態様において、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、本明細書に特定されるように、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２４９】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様において、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、Ｆｃ断片のうちの一つにおいて、可変ドメインＶＨとＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２５０】
一つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 （2011） 11187-1191に詳細に記載されている。それら抗体は、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する不適切な重鎖との不一致により生じる副産物を明らかに低減する（このようなドメイン交換が行われない手法と比較して）。
【０２５１】
一態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含み、それらの各々がＣＨ１又はＣＬドメインに結合することを特徴とする二重特性抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、４−１ＢＢＬに隣接する定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられている。
【０２５２】
別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢ及びＦｃドメインに対する特異的結合能を有する二つのＦａｂ断片を含む抗体の二つの軽鎖及び二つの重鎖、並びに（ｂ）腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する二つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子に関し、前記追加のＦａｂ断片は、各々が（ａ）の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する。特定の一態様では、追加のＦａｂ断片は、ＶＨドメインが軽鎖の一部となり、ＶＬドメインが重鎖の一部となるように、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ断片である。
【０２５３】
別の態様において、正確なペアリングをさらに改善するために、（ａ）腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含み、それらの各々がＣＨ１又はＣＬドメインに結合することを特徴とし、さらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含む二重特性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これら修飾は、交差又は非交差のＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の一態様では、本発明は、ＣＬドメインの一つにおいて位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によってそれぞれ置き換えられており、ＣＨ１ドメインの一つにおいて位置１４７（ＥＵ番号付け）及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２５４】
さらに詳細には、本発明は、４−１ＢＢＬに隣接するＣＬドメインにおいて位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によってそれぞれ置き換えられており、４−１ＢＢＬに隣接するＣＨ１ドメインにおいて位置１４７（ＥＵ番号付け）及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、Ｆａｂを含む二重特異性結合分子に関する。
【０２５５】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載される抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
【０２５６】
本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、二つ以上の）ポリヌクレオチとして発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされる。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０２５７】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２５８】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは単鎖又は二本鎖である。
【０２５９】
組み換え法
本発明に使用される二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1989）; and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. （1989）に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（即ち、コード化領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと動作可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の調節配列と結合するときである。（ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２６０】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２６１】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合させることができる。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置される。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２６２】
後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は末端に含まれうる。
【０２６３】
本発明のさらなる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう操作できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 （2004）,及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 （2006）を参照。
【０２６４】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982）に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を含み、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができる。
【０２６５】
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を生成する方法が提供され、この方法は、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書に提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【０２６６】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原（例えばＦａｂ断片）に対する特異的結合能を有する部分は、少なくとも、抗原に結合することのできる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring 担持する Laboratory, 1988参照）。非天然に存在する抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組み換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２６７】
あらゆる動物種の免疫グロブリンを本発明に使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。融合タンパク質がヒトへの使用を意図している場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来である免疫グロブリンのキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）に総説され、さらに、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 （1988）; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 （1989）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 （1986）; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 （1984）; Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 （1988）; Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 （1988）; Padlan, Molec Immun 31（3）, 169-217 （1994）; Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 （2005） （SDR （a-CDR） 移植術について記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 （1991） （「リサーフェイシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 （2005）（「ＦＲシャフリング」について記載）；及びOsbourn et al., Methods36, 61-68 （2005） and Klimka et al., Br Jがん  83, 252-260 （2000）（ＦＲシャフリングに対する「ガイド付き選択」アプローチについて記載）に概説がある。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 （2001）及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 （2008）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 （2005）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクロー���可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 （1991）参照）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
【０２６８】
特定の態様では、抗体は、例えば、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関連する実施例）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示される方法により亢進された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329（2000））及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229（2002））によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用されうる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris （1996）"Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的競合アッセイでは、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中において、固定化さた抗原がインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗原結合分子が、抗原への結合について第一の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane （1988） Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０２６９】
本明細書に記載されるように調製された本発明の抗体は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用されうる。抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子は、還元型及び非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実証されるように、インタクトであり、且つ適切に集合することが示された。
【０２７０】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
【０２７１】
１．アフィニティーアッセイ
対応する受容体に対する、本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。また、標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子に関して、本方法は、国際公開第２０１６／０７５２７８号にさらに詳細に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２７２】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本明細書に報告されるＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子は、国際公開第２０１６／０７５２７８号にさらに詳細に記載されるように、その抗原結合活性について試験される。
【０２７３】
３．活性のアッセイ
一態様において、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の生物活性を同定するためのアッセイが提供される。
【０２７４】
特定の実施態様では、本明細書に報告される抗体が、実施例８に記載されるヒト免疫エフェクター細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイ、実施例９に記載されるＣＥＡ及びＰＤＬ−１を発現するＭＫＮ４５細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイ、又は実施例１０に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＢＭＣ活性化アッセイにおいてそのような生物活性について試験される。
【０２７５】
薬学的組成物、製剤及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び本明細書に提供される４−１ＢＢアゴニストを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体と、少なくとも一つの薬学的に許容される添加物とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体と、例えば以下に記載される、少なくとも一つの追加の治療剤とを含む。
【０２７６】
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び本明細書に提供される４−１ＢＢアゴニストを含む薬学的組成物が提供される。
【０２７７】
また別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供し、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤はアテゾリズマブである。
【０２７８】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加物中に溶解又は分散された一又は複数の抗体の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに概して非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つの抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書に使用される「薬学的に許容される添加物」には、当業者に既知であるように、いずれか及びすべての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２７９】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な添加物には、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２８０】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２８１】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加物は、介在性薬物分散剤、例えば水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２８２】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２８３】
上記の組成物に加えて、抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２８４】
本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、添加物、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
【０２８５】
本発明の抗体は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２８６】
本明細書の組成物は治療される特定の徴候に必要な一を超える活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するのも含有しうる。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌されていなければならない。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０２８８】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの投与
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方（本明細書ではどちらも物質と呼ぶ）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。しかしながら、本発明の方法は、非経口、特に静脈内点滴により投与される治療剤に関して、特に有用である。
【０２８９】
非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。一実施態様において、治療剤は、非経口的に、特に静脈内に投与される。特定の実施態様では、治療剤は静脈内注入により投与される。
【０２９０】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストは、医学行動規範に準拠する方式で、製剤化、分量、及び投与される。この観点において考慮すべき因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の因子を包含する。Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストの両方は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている一又は複数の薬剤と一緒に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の因子によって決まる。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、使用される。
【０２９１】
疾患の予防又は治療のために、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストの適切な用量は（それらの組み合わせで、又は一又は複数の他の追加的治療剤と共に使用されるとき）、治療される疾患の種類、４−１ＢＢ剤の種類、疾患の重症度及び経過、両薬剤が予防目的で又は治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の病歴及び治療剤に対する応答、並びに主治医の判断に依拠するであろう。各物質は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の個別投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の物質が対象への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日当たりの用量は、上記因子に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。各物質の一つの例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇであろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を対象に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週、二週毎、又は三週毎（例えば対象が約２から約２０、例えば治療剤の約６用量を受けるように）投与してよい。より高い初回負荷用量と、それに続く一又は複数のより低い用量、又はより低い初回用量と、それに続く一又は複数のより高い用量が投与されうる。例示的投与レジメンは、約１０ｍｇの初回用量に続き、隔週約２０ｍｇの治療剤を投与することを含む。しかしながら、他の用量レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易に監視される。
【０２９２】
一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方の投与は単回投与である。特定の態様では、治療剤の投与は複数回投与である。このような一態様では、物質は、毎週、二週毎、又は三週毎、特に二週毎に投与される。一態様において、物質は治療的有効量で投与される。一態様では、物質は、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢアゴニストを投与しない対応する治療レジメンにおけるＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の用量より高い用量で投与される。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初回投与と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の一又は複数回のその後の投与を含み、第２の用量は第１の用量より高い。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初回投与と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の一又は複数回のその後の投与を含み、第１の用量は第２の用量を下回らない。
【０２９３】
一態様では、本発明による治療レジメンにおけるＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、対象に対する前記Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の初回投与である（少なくとも同じ治療の過程内で）。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与の前には、対象に対する４−１ＢＢアゴニストの投与は行われない。別の態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与の前に、対象に４−１ＢＢアゴニストが投与される。
【０２９４】
別の態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせでの使用を目的としており、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブを用いた前処置は、併用治療に先立って実施され、前処置と併用治療との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である。
【０２９５】
Ｔ細胞の活性化は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こすことがある。ＴｅＧｅｎｅｒｏによって実施された第１相試験（Suntharalingam et al., N Engl J Med(2006)355, 1018-1028）では、６名の健常なボランティア全員が、不適切に投与されたＴ細胞刺激性スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の点滴後すぐに、ほとんど致命的な重症のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を経験した。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体といったＴ細胞活性化治療剤の対象への投与に関連付けられるサイトカイン放出は、オビヌツズマブなどのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体を用いた前記対象の前処置により有意に低減しうる。ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）による前処置（Ｇｐｔ）は、投薬開始から腫瘍細胞の排除を媒介するために十分に高いＴ細胞活性化治療剤の曝露レベルをサポートすると同時に、Ｔ細胞活性化治療剤（例えばＣＲＳ）による強い全身性Ｔ細胞活性化に由来する関連性の高い有害事象（ＡＥ）の危険性が低下するように、末梢血及び二次リンパ器官両方におけるＢ細胞の急速な枯渇を助けるであろう。現在まで、進行中のオビヌツズマブ臨床治験において、何百人もの患者でオビヌツズマブの安全性プロファイル（サイトカイン放出を含む）が評価及び管理されてきた。最後に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体などのＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体の安全性プロファイルをサポートすることに加えて、Ｇｐｔは、これら特有の分子への抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の形成の防止にも有用であろう。
【０２９６】
本発明において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせは、治療法においてさらなる薬剤との組み合わせで使用することができる。例えば、少なくとも一つの追加の治療剤は、共投与される。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫療法剤である。
【０２９７】
一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせは、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストとの組み合わせで使用することができる。一態様において、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストからなる群より選択される。特定の様態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストはＰＤ−１結合アンタゴニストである。一様態において、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、選択されたＭＤＸ  １１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ−１０８である。別の特定の様態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストはＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストである。一態様において、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）から選択される。さらに詳細には、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせは、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）との組み合わせにおいて使用することができる。
【０２９８】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストの投与から、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとを含む併用療法の投与までの期間、及び用量は、併用療法の投与に先立って、対象における主要を効果的に縮小するように選択される。
【０２９９】
上記のこのような併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、治療剤の投与が、一又は複数の追加の治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる個別投与とを包含する。一実施態様において、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内又は約１、２、若しくは３週間以内、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に行われる。
【０３００】
腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の投与
腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の両方（本明細書ではどちらも物質と呼ぶ）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに、局所治療に望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。しかしながら、本発明の方法は、非経口、特に静脈内点滴により投与される治療剤に関して、特に有用である。
【０３０１】
非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。一実施態様において、治療剤は、非経口的に、特に静脈内に投与される。特定の実施態様では、治療剤は静脈内注入により投与される。
【０３０２】
腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の両方は、医学行動規範に準拠する方式で、製剤化、分量、及び投与される。この観点において考慮すべき因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の因子を包含する。腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の両方は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている一又は複数の薬剤と一緒に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の因子によって決まる。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、使用される。
【０３０３】
疾患の予防又は治療のために、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の適切な用量は（それらの組み合わせで、又は一又は複数の他の追加の治療剤と共に使用されるとき）、治療される疾患の種類、４−１ＢＢアゴニストの種類、疾患の重症度及び経過、両薬剤が予防目的で又は治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の病歴及び治療剤に対する応答、並びに主治医の判断に依拠するであろう。各物質は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の個別投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の物質が対象への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日当たりの用量は、上記因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。各物質の一つの例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を態様に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週、二週毎、又は三週毎（例えば対象が約２から約２０、例えば治療剤の約６用量を受けるように）投与してよい。より大きな初回負荷用量と、それに続く一又は複数のより低い用量、又はより低い初回用量と、それに続く一又は複数のより高い用量が投与されうる。例示的投与レジメンは、約１０ｍｇの初回投与量に続き、隔週約２０ｍｇの治療剤を投与することを含む。しかしながら、他の用量レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０３０４】
一態様において、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤両方の投与は、単回投与である。特定の態様では、治療剤の投与は複数回投与である。このような一態様では、物質は、毎週、二週毎、又は三週毎、特に二週毎に投与される。一態様において、物質は治療的有効量で投与される。一態様では、物質は、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、４−１ＢＢアゴニストを投与しない対応する治療レジメンのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の用量より高い用量で投与される。別の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、４−１ＢＢアゴニストを投与しない対応する治療レジメンのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の用量より低い用量で投与される。一態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の投与は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の第１の用量の初回投与と、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の第２の用量の一又は複数のその後の投与を含み、第２の用量は第１の用量より高い。一態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の投与は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の第１の用量の初回投与と、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の第２の用量の一又は複数のその後の投与を含み、第１の用量は第２の用量を下回らない。
【０３０５】
一態様において、本発明による治療レジメンの腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの投与は、前記腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの対象への初回投与である（少なくとも同じ治療の過程内で）。一態様において、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の投与前には、対象に対して４−１ＢＢアゴニストの投与は行われない。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤の投与前に、対象に対して４−１ＢＢアゴニストが投与される。
【０３０６】
別の態様では、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤との組み合わせでの使用を目的としており、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブを用いた前処置は、併用治療に先立って実施され、前処置と併用治療との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である。
【０３０７】
本発明において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせは、治療法においてさらなる薬剤との組み合わせで使用することができる。例えば、少なくとも一つの追加の治療剤は、共投与される。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫療法剤である。
【０３０８】
上記のこのような併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、治療剤の投与が、一又は複数の追加的な治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる個別投与とを包含する。一実施態様において、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内又は約１、２、若しくは３週間以内、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に行われる。
【０３０９】
治療方法及び組成物
異なる細胞集団に二つの細胞表面タンパク質を認識する二重特異性抗体は、病原性の標的細胞の破壊のために細胞傷害性免疫細胞を再度方向付けする見込みを保持している。
【０３１０】
一態様において、対象に対し、有効量のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法が提供される。
【０３１１】
このような一態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、対象に対し、有効量のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとを投与することを含む、腫瘍を縮小させるための方法が本明細書に提供される。上記のいずれの態様に記載の「個体」又は「対象」も、好ましくはヒトである。
【０３１２】
さらなる態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストを含むがん免疫療法における使用のための組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの免疫療法における使用のための、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストを含む組成物が提供される。
【０３１３】
本明細書では、さらなる態様において、医薬の製造又は調製における、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストを含む組成物の使用が提供される。一実施態様において、医薬は固形腫瘍の治療を目的とする。さらなる一実施態様では、医薬は、固形腫瘍を有する個体に、有効量の本医薬を投与することを含む、腫瘍縮小方法における使用を目的とする。このような一実施態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる一実施態様では、医薬は固形腫瘍の治療を目的とする。いくつかの態様では、個体はＣＥＡ陽性がんを有する。いくつかの態様では、ＣＥＡ陽性がんは、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、又は前立腺がんである。いくつかの態様では、乳がんは、乳癌、又は乳腺癌である。いくつかの態様では、乳癌は浸潤性乳管癌である。いくつかの態様では、肺がんは肺腺癌である。いくつかの実施態様では、結腸がんは結腸直腸腺癌である。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトである。
【０３１４】
上記の併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、本明細書に報告される抗体の投与が、一又は複数の追加の治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる個別投与とを包含する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストの投与、並びに任意選択的に追加の治療剤の投与は、互いの約１か月以内又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に行われる。
【０３１５】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び本明細書に報告される４−１ＢＢアゴニストの両方（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。
【０３１６】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び本明細書に報告される４−１ＢＢアゴニストは、医学行動規範に準拠する方式で、製剤化、分量、及び投与される。この観点において考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者に既知である他の因子が含まれる。この抗体は、必ずしも必須ではないが任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために目下使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記他の因子によって決まる。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投薬量で及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、使用される。
【０３１７】
製造品（キット）
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有するキットが提供される。このキットは、少なくとも一つの容器、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。キット中の少なくとも二つの活性剤は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び本発明の４−１ＢＢアゴニストである。
【０３１８】
特定の態様では、（Ａ）活性成分としてのＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体を含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法における前記組成物の使用説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるためのキットが提供される。
【０３１９】
ラベル又は添付文書は、選択状態を治療するために組成物がどのように使用されるかを示し、併用療法において組成物を使用するための指示を提供する。さらに、キットは、（ａ）本発明のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）本発明の４−１ＢＢアゴニストを含む組成物を中に含む第２の容器を備えることができる。加えて、キットは、組み合わせて使用することのできるさらなる活性成分を含む一又は複数のさらなる容器を備えてもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０３２０】
代替的に又は追加的に、キットは、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的な及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０３２１】
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【０３２２】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義されるように、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））による番号付けシステムに従って番号付け及び参照される。
【０３２３】
本発明の態様
以下に、本発明の態様のいくつかを列挙する。
【０３２４】
態様１．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、態様１の方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３．Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、態様１又は２の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４．４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されたアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様７．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様８．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様９．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１０．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１１．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１３．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み，
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１７．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１８．４−１ＢＢアゴニストが抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１９．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２０．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２１．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２２．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２３．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２７．４−１ＢＢアゴニストが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２８．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２９．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３０．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３１．重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３２．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３３．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３４．第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３５．第２の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３６．ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３７．第３の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３８．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様３９．（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４０．Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、前記態様の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４１．アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４２．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが、約一週から三週の間隔で投与される、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４３．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的な抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４４．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、態様４３の方法における使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様４５．（Ａ）活性成分としての抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む、疾患、特にがんの逐次的又は同時の併用療法における使用のための、医薬製品。
態様４６．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストを含む薬学的組成物。
態様４７．固形腫瘍の治療における使用のための、態様４６の薬学的組成物。
態様４８．４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様４９．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５０．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５１．腫瘍関連抗原がＦＡＰである、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５２．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５３．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５４．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５５．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５６．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５７．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５８．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様５９．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための薬学的組成物。
態様６０．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み，
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６１．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６３．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６４．４−１ＢＢアゴニストが抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６５．腫瘍関連抗原がＣＥＡである、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６７．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６８．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様６９．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７０．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７１．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７３．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７５．４−１ＢＢアゴニストが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７７．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン，
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７８．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様７９．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８０．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８１．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８２．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８３．第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８４．第２の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８５．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８６．第３の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８７．第３の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは第２の抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８８．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様８９．（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様９０．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様９１．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様９２．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが、約一週から三週の間隔で投与される、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様９３．増殖性疾患、特にがんを治療する、又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるうえでの使用のための、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様９４．結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳房がん、腎臓がん、食道がん、又は前立腺がんの治療における使用のための、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様９５．（Ａ）活性成分としての抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法における前記組成物の使用説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるためのキット。
態様９６．増殖性疾患、特にがんを治療するため、又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
態様９７．固形腫瘍の治療のための医薬の製造における、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
態様９８．対象に対し、有効量の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
態様９９．対象に対し、有効量の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であって、４−１ＢＢアゴニストが抗原結合分子である、方法。
態様１００．４−１ＢＢアゴニストがＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０１．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃγ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０２．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０３．１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０４．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０７．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０８．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１０９．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１０．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、並びに
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１３．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１５．４−１ＢＢアゴニストが抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１７．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１８．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１１９．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２０．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２３．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２４．４−１ＢＢアゴニストが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２６．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２７．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２８．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１２９．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３０．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３１．第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３２．第２の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３３．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３４．第３の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）；及び／又は配列番号４４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、或いは
（ｂ）配列番号４９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）
を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３５．第３の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、或いは配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３６．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３７．（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３８．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１３９．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４０．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが、約一週から三週の間隔で投与される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４１．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４２．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストが、静脈内投与又は皮下投与される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４３．抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、４−１ＢＢアゴニストと同時に、４−１ＢＢアゴニストに先立ち、又は４−１ＢＢアゴニストの後で投与される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４４．腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて、及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４５．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４６．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４７．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤がアテゾリズマブである、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１４８．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、４−１ＢＢアゴニストがＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と相乗的に作用する、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１４９．抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、前記態様の、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５０．重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメイン、重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含む第２の抗原結合ドメイン、及び共通の軽鎖可変領域を含む、前記態様の、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５１．第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み；第２の抗原結合ドメインが、配列番号１２４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１２５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１２６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通の軽鎖が、配列番号１２７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１２８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１２９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、前記態様の、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５２．第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３０の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）を含み、第２の抗原結合ドメインが、配列番号１３１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦｏｌＲ１）を含み；共通の軽鎖が配列番号１３２の配列を含む、前記態様の、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５３．抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＦｏｌＲ１に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、前記態様の、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５４．抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１３５の共通の軽鎖を含む、前記態様の、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様１５５．（Ａ）活性成分としての抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む、疾患、特にがんの逐次的又は同時の併用療法における使用のための、医薬製品。
態様１５６．抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストを含む薬学的組成物。
態様１５７．対象に対し、有効量の抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３抗体及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であって、４−１ＢＢアゴニストが抗原結合分子である、方法。
態様１５８．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１５９．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、態様１５８の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６０．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６１．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤がアテゾリズマブである、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６２．腫瘍関連抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＥＡから選択される、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６３．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６４．４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及びＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６５．４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片及びＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６６．ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６７．Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６８．（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１６９．（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７０．（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み，
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７１．
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７２．（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７３．（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７４．抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７５．４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７６．４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７７．４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７８．ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１７９．Ｆｃ受容体に対する結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８０．（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８１．（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８２．（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８３．配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８４．（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン，
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８５．（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン，
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８６．抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様の方法における使用のための、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト。
態様１８７．疾患、特にがんの、逐次的又は同時の併用療法における使用のための、（Ａ）活性成分としてのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む医薬製品。
態様１８８．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとを含む薬学的組成物。
態様１８９．固形腫瘍の治療における使用のための、態様１８８の薬学的組成物。
態様１９０．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９１．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤が、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９２．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤がアテゾリズマブである、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９３．腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９４．腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９７．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９８．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様１９９．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２００．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０３．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み，
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０４．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０７．４−１ＢＢアゴニストが抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０８．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２０９．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１０．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１１．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１２．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１３．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド，
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１７．４−１ＢＢアゴニストが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１８．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２１９．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２２０．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの薬学的組成物。
態様２２１．増殖性疾患、特にがんを治療するため又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
態様２２２．固形腫瘍の治療のための医薬の製造における、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
態様２２３．対象に対し、有効量のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤及び腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
態様２２４．対象に対し、有効量のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であって、４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、方法。
態様２２５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２２６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２２７．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２２８．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２２９．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３０．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３３．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３５．４−１ＢＢアゴニストが抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、（ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３７．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３８．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３９．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４０．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
をみ、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４３．４−１ＢＢアゴニストが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４５．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４６．がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、４−１ＢＢアゴニストと組み合わせて使用され、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体を用いた前処置が、併用治療に先立って実施され、前処置と併用治療との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２４７．ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体がオビヌツズマブである、態様２４６に記載の方法における使用のための、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体。
態様２４７．対象に対し、有効量の腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、有効量の腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であって、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体を用いた前処置が、併用治療に先立って実施され、前処置と併用治療との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である、方法。
態様２４８．対象に対し、有効量のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１遮断剤と、有効量の腫瘍関連抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であって、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体を用いた前処置が、併用治療に先立って実施され、前処置と併用治療との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である、方法。
態様２４９．ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体がオビヌツズマブである、態様２４７又は２４８の方法。
【実施例】
【０３２５】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【０３２６】
組み換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., （1991） Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
【０３２７】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０３２８】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０３２９】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology(2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.(eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０３３０】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で行い、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＰＢＳ又は２０ｍＭのヒスチジン（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要な場合）、−２０℃又は−８０℃で冷凍し、保存した。試料の一部が、その後のタンパク質分析、及び例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による分析的特徴付けのために提供された。
【０３３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造元の指示に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０３３２】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣ−システム上、２倍のＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。ＵＶ吸光度により、及びピークエリアの統合により、溶出したタンパク質を定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１-１９０１が標準として機能した。
【０３３３】
質量分析
このセクションでは、正確な集合に重きを置いて、ＶＨ／ＶＬ交換を含む多重特異性抗体（ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）の特徴を説明する。予測される一次抗体を、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂの、及び脱グリコシル化／プラスミン消化された、又は別の方法で脱グリコシル化／限定されたＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【０３３４】
ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂを、３７℃で最大１７時間にわたり、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、リン酸又はＴｒｉｓバッファー中Ｎ−ＧグリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂで、それぞれ室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間、行った。質量分析の前に、セファデックス  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨＰＬＣを介して、試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上のＥＳＩ−ＭＳを介して、総質量を決定した。
【０３３５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いた、対応抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定
生成された抗体の、対応抗原に対する結合が、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる表面プラズモン共鳴により調査される。簡潔には、親和性の測定のために、Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、ＪＩＲ  １０９−００５−０９８抗体を、対応抗原に対する抗体の提示のためのアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合は、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐｈ  ７．４）中において、２５℃（又は代替的に３７℃）で測定される。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）は、溶液中様々な濃度で加えた。８０秒から３分の抗原注入により会合を測定し；３〜１０分間にわたりＨＢＳバッファーでチップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを用いてＫＤ値を測定した。システム固有のベースラインドリフトを補正するため及びノイズシグナル低減のために、ネガティブコントロールデータ（例えば緩衝曲線）が試料曲線から差し引かれる。センサーグラムの分析のため及び親和性データの計算のために、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅが使用される。
【０３３６】
実施例１
ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際公開第２０１６／０７５２７８号に記載されるように調製した。
【０３３７】
特に、以下の分子を作製した。
【０３３８】
ａ）一価のＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上にヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681）。４−１ＢＢリガンドの一つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。コンストラクト２．４において、正確なペアリングを向上させるために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに追加的に導入した（荷電変異体）。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０３３９】
ＦＡＰに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローン２８Ｈ１又はクローン４Ｂ９を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖を用いてフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するため、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせにより、集合した三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロダイマーが生成される（図１Ｂ）。これに基づき、生殖系列  ＤＰ４７によってＦＡＰバインダーを置き換えることにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｄ）。
【０３４０】
2020504104.tif 000032
【０３４１】
ａ）二価のＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
ＦＡＰに特異的なバインダーに特異的な重鎖及び軽鎖の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列、クローン２８Ｈ１又はクローン４Ｂ９を、ホールの定常重鎖、ノブ又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖を用いてフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。さらに、４−１ＢＢリガンドの二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させ、４−１ＢＢリガンドの一つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合させた。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド重鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド重鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせにより、集合した三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロダイマーが生成された（図１Ｃ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＦＡＰバインダーを置き換えることにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｅ）。
【０３４２】
2020504104.tif 000033
【０３４３】
ＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、それぞれ国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例１から６に詳細に記載されている。
【０３４４】
実施例２
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製、精製及び特徴づけ
ＴＣＢ分子が、国際公開第２０１４／１３１７１２号又は国際公開第２０１６／０７９０７６号に記載されている方法に従って調製された。
【０３４５】
実験に使用した抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１４／１３１７１２号の実施例３に記載されている。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、二つの異なる重鎖と二つの異なる軽鎖とを含む。ＣＨ３ドメインにおける点突然変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）を、二つの異なる重鎖の集合を促すために導入した。ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨとＶＬドメインとの交換を、二つの異なる軽鎖の正確な集合を促すために行った。２＋とは、分子が、ＣＥＡに特異的な二つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な一つの抗原結合ドメインとを有することを意味する。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢは、同じフォーマットを有するが、別のＣＥＡバインダーを含み、且つＣＤ３バインダーのＣＨ及びＣＬドメインに点突然変異を含み、これにより軽鎖の正確なペアリングがサポートされる。
【０３４６】
ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ  ＴＣＢは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む。２＋１フォーマットの二重特異性抗体の図式的スキームを図１Ａに示す。
【０３４７】
実験に使用した抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＦｏｌＲ１  ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１６／０７９０７６号に記載されている。ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢは、国際公開第２０１６／０７９０７６号の図１Ｄに「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  ２＋１  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  （共通軽鎖）」として示されており、二つの異なる重鎖及び三倍の同じＶＬＣＬ軽鎖（共通軽鎖）を含む。ＣＨ３ドメインにおける点突然変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）を、二つの異なる重鎖の集合を促すために導入した。２  ＋１とは、分子が、ＦｏｌＲ１に特異的な二つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な一つの抗原結合ドメインとを有することを意味する。ＣＤ３バインダーは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、ノブ変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０３４８】
ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び三倍の配列番号１３５の共通軽鎖を含む。
【０３４９】
実験に使用した抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢ）の調製も、国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとしては、それは、「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、二つの異なる重鎖と二つの異なる軽鎖とを含む。ＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢは、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９及び配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。
【０３５０】
実施例３
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＴＣＢの併用療法による強力な抗腫瘍効果
ａ）一価及び二価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬを用いた実験
ヒト一価ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ＦＡＰバインダー４Ｂ９）を、単剤として、及びヒトＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせにおいて、単剤としての及び組み合わせでの二価ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（ｂｉ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ＦＡＰバインダー４Ｂ９）と一価及び二価非標的化４−１ＢＢＬとに対して試験した。ヒト胃ＭＫＮ４５がん細胞を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＮＯＧヒト化マウスにマウス線維芽細胞細胞株（３Ｔ３）と共に皮下に共移植した。
【０３５１】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、もともとＡＴＣＣから取得され、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中において５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中で３７℃で培養した。生存率９７％でｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代９を皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、もともとＡＴＣＣから取得され、Ｒｏｃｈｅ  ＮｕｔｌｅｙでヒトＦＡＰを発現するように操作され、１０％の仔ウシ血清、１×ピルビン酸ナトリウム及び１．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中において培養された。クローン３９をｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代番号１６において、生存率９８％で使用した。
【０３５２】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６  ＭＫＮ４５細胞+１×１０６  ３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、麻酔したマウスの脇腹に、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて皮下注射した。
【０３５３】
ヒト幹細胞を移植したＮＳＧ雌マウスがＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって納入された；マウスは、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（Ｐ  ＺＨ１９３／２０１４）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３５４】
細胞注入の７日前に、マウスから採血し、血液中のヒトｔ−細胞の量についてスクリーニングした。試験０日目に、マウスに、１×１０６個の３Ｔ３線維芽細胞と混合した１×１０６個のＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。腫瘍を、実験期間全体を通して週２〜３回ノギスにより測定した。６日目に、腫瘍サイズ及びヒトＴ細胞数について、血液１μｌ当たりの平均Ｔ細胞数１６５及び平均腫瘍サイズ１９０−２００ｍｍ３でマウスを無作為化した。無作為化の日に、ビヒクル、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ、一価のＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、二価のＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、一価の非標的化（ＤＰ４７）４−１ＢＢＬ、二価の非標的化４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢＬコンストラクトとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせを、３週間、マウスに静脈内注射した。
【０３５５】
すべてのマウスに２００μＬの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にはコンストラクト、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又は組み合わせを含む４−１ＢＢＬを注射した。２００μＬにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡ  ＴＣＢに用いられた用量及びスケジュールが２．５ｍｇ／ｋｇ、週二回であったのに対し、４−１ＢＢＬコンストラクトは、用量１０ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０３５６】
実験は試験２３日目に終了した。腫瘍、血液及び脾臓をＰＢＳ中において回収し、単一細胞の懸濁液を生成し、異なる免疫細胞マーカーについて染色し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０３５７】
終了時、腫瘍の一部をホルマリン固定し、その後パラフィンに包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
【０３５８】
2020504104.tif 000034
【０３５９】
図２は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬとの組み合わせが、他のすべての群と比較して、腫瘍増殖の阻害という観点から優れた有効性を媒介したことを示している。
【０３６０】
2020504104.tif 000035
【０３６１】
試験終了時の腫瘍（図３Ａ及び３Ｂ）、血液（図３Ｃ及び３Ｄ）及び脾臓（図３Ｅ及び３Ｆ）におけるＴ細胞浸潤を分析した。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ化合物とＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせは、単剤療法と比較して腫瘍内Ｔ細胞頻度を上昇させる（ビヒクルと比較して約３００倍の上昇）。このような増加は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞の増加に起因する。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ一価化合物は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと組み合わせたとき、腫瘍内  ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度の上昇を媒介するうえで優れている。腫瘍内ＣＤ８＋／ＣＤ４＋比は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（特に一価のフォーマットでの）とＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの併用治療を受ける群において大幅に増加する。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ化合物（特に一価のフォーマットでの）は、治療したマウスの脾臓及び血液中におけるＴ細胞頻度の上昇も媒介した。腫瘍内Ｔ細胞頻度の大幅な上昇と、それと平行する腫瘍内ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比の大幅な増加は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ化合物の抗腫瘍活性の免疫ＰＤバイオマーカーとして同定することができ、一価のフォーマットは二価のフォーマットより優れた活性を示す。試験終了時点での組織学的分析の結果を、図４に示す。
【０３６２】
ｂ）ＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬを用いた実験
ヒト一価ＦＡＰ（２８Ｈ１）４−１ＢＢＬ（ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ）を、単剤として、及びヒトＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせにおいて、単剤としての及び組み合わせでの二価ＦＡＰ（２８Ｈ１）４−１ＢＢＬ（ｂｉ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ）と一価の非標的化４−１ＢＢＬとに対して試験した。ヒト胃ＭＫＮ４５細胞を、ＴａｃｏｎｉｃからのＮＯＧマウスに皮下注射した。初回治療の２日前に、バフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣをマウスに注射した。
【０３６３】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、もともとＡＴＣＣから取得され、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞は、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養され、細胞は、５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代８を、生存率９７％で皮下注射に使用した。０日目に、５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６  ＭＫＮ４５細胞）を、麻酔したマウスの脇腹に、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて皮下注射した。
【０３６４】
バフィーコートは、Ｚｕｒｉｃｈｅｒ  Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅから得られ、ＰＢＭＣは９日目に注射の前に新しく精製された。１０００万個のＰＢＭＣは、生存率９４，３％で、容積２００ｕｌのＲＰＭＩ中において腹腔内注射された。バフィーコート番号Ｈ０１４０１４３０１９４２８を使用した。
【０３６５】
ＮＯＧ雌マウスがＴａｃｏｎｉｃにより納品された。マウスは、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（Ｐ  ＺＨ１９３／２０１４）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３６６】
試験０日目に、１×１０６個のＭＫＮ４５細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍を、実験期間全体を通して週２〜３回ノギスにより測定した。新しく精製したＰＢＭＣを、最初の療法の２日前である９日目に注入した。無作為化の翌日である１１日目に、ビヒクル、ＣＥＡ  ｔｃｂ、ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ｂｉ−ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ｍｏｎｏ  ｕｎｔａｒｇ．４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢＬコンストラクトとＣＥＡ  ｔｃｂとの組み合わせを、最長３週にわたり、マウスに静脈内注射した。
【０３６７】
すべてのマウスに２００μＬの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にはコンストラクト、ＣＥＡ  ｔｃｂ又は組み合わせを含む４−１ＢＢＬを注射した。２００μＬにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡ  ｔｃｂに用いられた用量及びスケジュールが２．５ｍｇ／ｋｇ、週二回であったのに対し、４−１ＢＢＬコンストラクトは、用量１０ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０３６８】
2020504104.tif 000036
【０３６９】
実験は試験２５日目に終了した。腫瘍、血液及び脾臓をＰＢＳ中において回収し、単一細胞の懸濁液を異なる免疫細胞マーカーについて染色し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０３７０】
終了時、腫瘍の一部をホルマリン固定し、その後パラフィンに包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
【０３７１】
図５は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせが、他のすべての群と比較して腫瘍増殖の阻害という観点から優れた有効性を媒介したことを示している。
【０３７２】
2020504104.tif 000037
【０３７３】
多重比較のための群平均の有意な差について試験するために、ダネットの方法を用いて標準分散分析（ＡＮＯＶＡ）が自動的に生成される。ダネットの方法は、平均がコントロール群の平均と異なるかどうかを試験する。
【０３７４】
2020504104.tif 000038
【０３７５】
試験終了後（２５日目）の腫瘍及び血液におけるＴ細胞浸潤（ＣＤ８／ＣＤ４比）を図６Ａ及び６Ｂに示す。
【０３７６】
実施例４
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異なる濃度のＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＴＣＢとの併用療法
ａ）実験手順
ヒト一価ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ＦＡＰバインダー４Ｂ９）を、ヒトＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせにおいて、２つの異なる濃度で試験した。ヒト胃ＭＫＮ４５がん細胞を、ヒト幹細胞を用いてヒト化したＮＯＧマウスのマウス線維芽細胞細胞株（３Ｔ３）と共に皮下に共移植した。
【０３７７】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、もともとＡＴＣＣから取得され、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養した。生存率９７％でｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代１２を皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、もともとＡＴＣＣから取得され、Ｒｏｃｈｅ  ＮｕｔｌｅｙでヒトＦＡＰを発現するように操作され、１０％の仔ウシ血清、１×ピルビン酸ナトリウム及び１．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中において培養された。クローン３９をｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代番号１８において、生存率９８．２％で使用した。
【０３７８】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６  ＭＫＮ４５細胞+１×１０６  ３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
【０３７９】
実験開始時に５週齢のＮＯＧ雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃから購入）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体当局により承認された（２０１１−１２８）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが毎日実施された。
【０３８０】
ヒト化のために、マウスにブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いて２４時間後に１０００００のヒトＨＳＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を注射した。幹細胞の注射の１５週間後、ヒト化マウスを、血液中のヒトＴ細胞の頻度についてフローサイトメトリーによりスクリーニングし、複数の異なる試験群に無作為化した（５．４参照）。２０％を上回るヒト化率（即ちすべての白血球内部で２０％の循環ヒト免疫細胞）を示したヒト化マウスのみを実験に使用した。
【０３８１】
細胞注入の７〜１４日前に、マウスから採血し、血液中のヒトｔ−細胞の量についてスクリーニングした。１μｌの血液当たり平均Ｔ細胞数７５〜８１でヒトＴ細胞についてマウスを無作為化した。試験０日目に、マウスに、１×１０６個の３Ｔ３線維芽細胞と混合した１×１０６個のＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。腫瘍を、実験期間全体を通して週２〜３回ノギスにより測定した。１６日目、腫瘍サイズについて、平均腫瘍サイズ１５０ｍｍ３でマウスを無作為化した。無作為化の翌日、１７日目に、ビヒクル、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇのＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせを、５週間、マウスに静脈内注射した。
【０３８２】
すべてのマウスに２００μＬの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群には、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせを、２つの異なる用量で注射した。２００μＬにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢに用いられた用量及びスケジュールが２．５ｍｇ／ｋｇ、週二回であったのに対し、４−１ＢＢＬコンストラクトは、用量３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０３８３】
実験は試験５２日目に終了した。ビヒクル群では６／９のマウスが生存していた。ＣＥＡ  ＣＤ３治療群では６／９のマウスが生存していた。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ治療群では３／９が生存していた。また、１ｍｇ／ｋｇの組み合わせ群では２／９のマウスが生存していた。複数のマウスは、実験中の健康状態が不良であったために屠殺しなければならなかった。
【０３８４】
残りすべてのマウス／群の脾臓及び腫瘍を、終了時にフローサイトメトリーにより分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。終了時の腫瘍の一部と、実験中の動物由来の腫瘍の一部とを、ホルマリン固定し、その後パラフィンに包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
【０３８５】
ヒト化ＮＯＧマウスに図示の治療群に由来する３Ｔ３マウス線維芽細胞と共に共移植されたヒトＭＫＮ４５胃皮下腫瘍の免疫組織学的画像が生成された。組織試料を、免疫組織化学染色のために調製した。５２日目に動物から皮下腫瘍を回収し、実験期間中にホルマリン１０％（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り取った。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を、抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び抗ヒトＣＤ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に対し、Ｌｅｉｃａのオートステイナー（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０，Ｇｅｒｍａｎｙ）において製造者のプロトコールに従って実施した。ｈｕＣＤ３及びｈｕＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量化を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。統計は、多重比較試験を用いる一元配置分散分析により分析した。結果は、未治療のマウス由来のＭＮＫ４５／３Ｔ３皮下腫瘍中に極めて少数のＴ細胞を示すものであった。ビヒクル及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ群における陽性ＣＤ３（Ａ）及びＣＤ８（Ｂ）Ｔ細胞の数に有意な増加がある。（統計学一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験、ｐ＜０．０５）。組織学分析した動物は、試料の数を増やすため、異なる実験日のものである。（ビヒクル：５×５２日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ：５×５２日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇ：２×５２日目、１×３２日目、２×２９日目；ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １ｍｇ／ｋｇ：１×５２日目、２×５０日目、１×３７日目、１×３５日目）。
【０３８６】
ｂ）結果
前の実験において既に、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢが、Ｔ細胞依存性の腫瘍細胞殺傷を介して異種移植マウスモデルにおける有効性を媒介できることが示された。本発明のヒトコンストラクトを試験するために、ヒト免疫細胞及び特にＴ細胞がマウス系に存在しなくてはならない。この理由により、本発明者らは、ヒト化マウス、即ちヒト幹細胞を移植したマウスを使用する。これらマウスは、時間の経過と共に、主にＴ及びＢ細胞からなる部分的ヒト免疫系を生じる。
【０３８７】
本発明者らは、腫瘍中の間質成分及びＦＡＰ発現を改善するＭＫＮ４５、ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株、及び３Ｔ３線維芽細胞を共注入した。ＣＥＡは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢによって標的とされ、Ｔ細胞を腫瘍細胞と架橋させ、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞活性化を誘導する。Ｔ細胞の活性化により、４−１ＢＢは、主にＣＤ８陽性Ｔ細胞上で上方制御される。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬは、ＦＡＰ発現線維芽細胞と４−１ＢＢ発現Ｔ細胞を架橋し、したがって４−１ＢＢシグナル伝達を誘導する。これにより、Ｔ細胞の殺傷能、生存及び増殖が向上する。
【０３８８】
本発明者らは、本試験において、３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量のＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの併用療法が、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの単剤療法と比較して、優れた有効性につながることを証明することができた。図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、試験の最後における腫瘍中のＴ細胞浸潤は、フローサイトメトリーにより示される他のすべての群と比較して、組み合わせ群において有意に増加している。組織学では、有意な増加は、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  ３ｍｇ／ｋｇとの組み合わせにおいてのみ観察することができた。
【０３８９】
2020504104.tif 000039
【０３９０】
中央値に基づく腫瘍増殖の阻害を、試験の３５日目、３９日目及び４６日目において計算した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法群では、試験３５日目及び３９日目に９／９のマウスが生存しており、試験４６日目には８／９のマウスが生存していた。３ｍｇ／ｋｇのＦＡＰ−４−１ＢＢＬの組み合わせ群では、３５日目に４／９が、３９日目及び４６日目に３  ／９のマウスが生存していた。１ｍｇ／ｋｇの組み合わせ群では、３５日目に６／９のマウスが、３９及び４６日目に５／９のマウスが生存していた。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １ｍｇ／ｋｇで治療した群は、腫瘍増殖の最大の阻害を示す。
【０３９１】
2020504104.tif 000040
【０３９２】
多重比較のための群平均の有意な差について試験するために、ダネットの方法を用いて標準分散分析（ＡＮＯＶＡ）が自動的に生成される。ダネットの方法は、平均がコントロール群の平均と異なるかどうかを試験する。
【０３９３】
2020504104.tif 000041
【０３９４】
図８Ａ及び８Ｂでは、第１週の間の注射された化合物の薬物動態プロファイルが示されている。試験終了時の腫瘍及び脾臓におけるＴ細胞浸潤を図９に示す。
【０３９５】
実施例５
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異なる濃度のＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡＣＡＭ５  ＴＣＢとの併用療法
ａ）実験手順
ヒト胃ＭＫＮ４５がんモデルにおいて、ヒトＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ＦＡＰバインダー４Ｂ９）を、ヒトＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせで１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの濃度で試験した。ＭＫＮ４５細胞を、ＮＳＧヒト化マウスにおいて、マウス線維芽細胞細胞株（３Ｔ３）を用いて皮下に共移植した。
【０３９６】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、もともとＤＳＭＺから取得され、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養した。生存率９９．２％でｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代１４を皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、もともとＡＴＣＣから取得され、Ｒｏｃｈｅ  ＮｕｔｌｅｙでヒトＦＡＰを発現するように操作され、１０％の仔ウシ血清、１×ピルビン酸ナトリウム及び１．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中において培養された。クローン３９をｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代番号９において、生存率９８．２％で使用した。
【０３９７】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０６  ＭＫＮ４５細胞+１×１０６  ３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
【０３９８】
実験開始時に５週齢のＮＳＧ雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体当局により承認された。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが毎日実施された。
【０３９９】
ヒト化のために、マウスにブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いて２４時間後に１０００００のヒトＨＳＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を注射した。
【０４００】
細胞注入の７〜１４日前に、マウスから採血し、血液中のヒトｔ−細胞の量についてスクリーニングした。１μｌの血液当たり平均Ｔ細胞数４０〜４２でヒトＴ細胞についてマウスを無作為化した。試験０日目に、マウスに、１×１０６個の３Ｔ３線維芽細胞と混合した１×１０６個のＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。腫瘍を、実験期間全体を通して週２〜３回ノギスにより測定した。２３日目、腫瘍サイズについて、平均腫瘍サイズ３５０ｍｍ３でマウスを無作為化した。無作為化当日、ビヒクル、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ１０ｍｇ、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ１ｍｇ／ｋｇ、及びＦＡＰ−４−１ＢＢＬ１０ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせを、４週間、マウスに静脈内注射した。
【０４０１】
2020504104.tif 000042
【０４０２】
すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群には、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又は組み合わせを注射した。２００μｌにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢに用いられた用量及びスケジュールが０．５ｍｇ／ｋｇ、週一回であったのに対し、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬは、用量１０ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０４０３】
さらに四匹のマウスを、ビヒクル群、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ群及び組み合わせ群において処置した。追加のマウスを、３３日目、２回目の処置の７２時間後に、スカウトとして捕獲した。スカウトの腫瘍を、サイトカインについてＭｕｌｔｉｐｌｅｘにより、Ｔ細胞浸潤について組織学及びＦＡＣＳにより、それぞれ分析した。
【０４０４】
実験は試験５０日目に終了した。
【０４０５】
2020504104.tif 000043
【０４０６】
複数のマウスは、実験中の健康状態が不良であったために屠殺しなければならなかった。
【０４０７】
残りすべてのマウス／群の脾臓及び腫瘍を、終了日（５０日目）にフローサイトメトリー及び組織学により分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。終了時の腫瘍の一部と、実験中の動物由来の腫瘍の一部とを、ホルマリン固定し、その後パラフィンに包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
【０４０８】
ｂ）結果
前の実験では、異種移植マウスモデルにおいて、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬがＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの有効性を向上させることができることが示された。この試験において発明者らが確認したかったことは、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬが、主にＴ細胞により媒介されるＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの有効性も増強しうることである。本発明者らは、このコンストラクトが既にそれ自体で極めて強力であることから、準最適供与量のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢを用いた。
【０４０９】
本発明のヒトコンストラクトを試験するために、ヒト免疫細胞及び特にＴ細胞がマウス系に存在しなくてはならない。この理由により、本発明者らは、ヒト化マウス、即ちヒト幹細胞を移植したマウスを使用する。これらマウスは、時間の経過と共に、主にＴ及びＢ細胞からなる部分的ヒト免疫系を生じる。
【０４１０】
本発明者らは、腫瘍における間質成分及びＦＡＰ発現を改善するＭＫＮ４５、ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株、及び３Ｔ３線維芽細胞を共注入した。ＣＥＡは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢによって標的とされ、Ｔ細胞を腫瘍細胞と架橋させ、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞活性化を誘導する。Ｔ細胞の活性化により、４−１ＢＢは、主にＣＤ８陽性Ｔ細胞上で上方制御される。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬは、ＦＡＰ発現線維芽細胞と４−１ＢＢ発現Ｔ細胞を架橋し、したがって４−１ＢＢシグナル伝達を誘導する。これにより、Ｔ細胞の殺傷能、生存及び増殖が改善される。
【０４１１】
本発明者らは、本試験において、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとの併用療法が、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの単剤療法と比較して、やや改善された有効性につながることを証明することができた（図１１参照）。３３日目及び試験終了時のスカウトの腫瘍中のＴ細胞浸潤は、フローサイトメトリー及び組織学により示された他のすべての群と比較して、組み合わせ群においてやや増加している（時点及び分析に応じて一方又は両方で）。ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇとの組み合わせにおいて、３３日目に、スカウトにおいて腫瘍内サイトカイン及びケモカインの大幅な増大を観察することができた。
【０４１２】
2020504104.tif 000044
【０４１３】
多重比較のための群平均の有意な差について試験するために、ダネットの方法を用いて標準分散分析（ＡＮＯＶＡ）が自動的に生成される。ダネットの方法は、平均がコントロール群の平均と異なるかどうかを試験する。
【０４１４】
2020504104.tif 000045
【０４１５】
第１週の間の注入した化合物の薬物動態プロファイルを試験するため、１回目及び２回目の治療の１時間及び７２時間後に、一群当たり２匹のマウスから採血した。注入した化合物をＥＬＩＳＡにより分析した（図１２Ａ及び１２Ｂ参照）。
【０４１６】
（Ａ）ビオチン化ヒト４−１ＢＢ、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＣＨ１抗体及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートする。各段階後にプレートを三回洗浄して未結合の物質を除去する。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化する。４０５ｎｍにおいて測光法で決定される（４９０ｎｍの基準波長）反応生成物の強度は、血清試料中の被分析物濃度に比例する。
【０４１７】
（Ｂ）ビオチン化抗ｈｕＣＤ３  −ＣＤＲ抗体、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＦｃ抗体及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートする。各段階後にプレートを三回洗浄して未結合の物質を除去する。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化する。４０５ｎｍにおいて測光法で決定される（４９０ｎｍの基準波長）反応生成物の強度は、血清試料中の被分析物濃度に比例する。
【０４１８】
４−１ＢＢＬは４−１ＢＢ結合により検出し（Ａ）、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは抗ＣＤ３ＣＤＲ抗体への結合により検出した（Ｂ）。
【０４１９】
化合物を注入したすべての群が、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢのいずれにおいても異なる群の間で分子への同等の曝露を示している（用量依存性）。
【０４２０】
試験終了時の腫瘍中のＴ細胞浸潤を、ＦＡＣＳにより分析した。３〜４匹のマウス／群の腫瘍を、３３日目、及び５０日目の終了時にフローサイトメトリーにより分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。統計方法として、一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙの多重比較検定（ｐ＜０．０５）を用いた（図１３Ａ及び１３Ｂ参照）。
【０４２１】
ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇとＣＥＡＣＡＭ  ＣＤ３  ＴＣＢとを組み合わせることにより、３３日目及び／又は５０日目における腫瘍中のＣＤ８及びＣＤ４陽性Ｔ−細胞の浸潤が、ビヒクル又はＴＣＢと比較して、統計的に増大する（時点により）。
【０４２２】
ヒト化ＮＯＧマウス図示の治療群に由来する３Ｔ３マウス線維芽細胞が共移植されたヒトＭＫＮ４５胃皮下腫瘍の免疫組織学的画像が生成された。組織試料を、免疫組織化学染色のために調製した。皮下腫瘍を、動物から、３３日目（ビヒクル、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ及び組み合わせ）及び実験終了時に回収した（ビヒクルを除き、この時点で入手できたのは一つの腫瘍のみ）。腫瘍をホルマリン１０％（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り取った。ＨｕＣＤ８の免疫組織化学を、製造者のプロトコールに従って、Ｌｅｉｃａ自動染色装置（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０，Ｇｅｒｍａｎｙ）において抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて実施した。ｈｕＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量化を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。統計は、多重比較試験を用いる一元配置分散分析により分析した。結果は、３３日目及び終了日である５０日目における未治療のマウス由来のＭＮＫ４５／３Ｔ３皮下腫瘍中に、極めて少数のＴ細胞を示した。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬの単剤療法も、実験終了時に腫瘍中にＴ細胞の増加を示さない。３３日目において、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １ｍｇ／ｋｇの群には、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、陽性ＣＤ８Ｔ細胞の有意な増加がある（図１４Ａ参照）。５０日目の試験終了時、両方の組み合わせ群は、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、ＣＤ８Ｔ細胞の有意な増加を示す（図１４Ｂ参照）。（統計：一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５）。
【０４２３】
ＣＤ４Ｔ細胞浸潤に差異は観察されなかった（データは示さない）。
【０４２４】
試験終了時における腫瘍及び血清のサイトカイン分析のために、３３日目に血清を収集し、２０〜３０ｍｇの急速冷凍した腫瘍組織を総タンパク質単離のために処理した。簡潔には、組織試料を、総容積１５０ｕｌの溶解バッファー中においてＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒシステム及びステンレス鋼ビーズを用いることによりメッシュ状にした。メッシュ状の試料を、遠心分離により清澄化し、上清中において総タンパク質含有量をＢＣＡタンパク質アッセイキットにより分析した。腫瘍及び脾臓溶解物の合計２００ｕｇの総タンパク質、並びに血清試料の１：１０希釈物を用いて、製造者の指示に従って、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＰｒｏＴＭ  ヒトサイトカイン４０−ｐｌｅｘＡｓｓａｙ，ＢｉｏＲａｄ）により、異なるサイトカイン／ケモカインを分析した。
【０４２５】
ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの単剤療法と比較して、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとを組み合わせた場合に、いくつかのサイトカインの増加が血清及び腫瘍中に観察された。
【０４２６】
ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢのみに対して腫瘍ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ＋ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇにおいて統計的に有意に増加したサイトカインは：ＣＸＣＬ１０、１３、５、ＣＣＬ１、１１、２１、２２、ＩＬ１２、ＭＩＰ−３ａ、ＭＩＰ−１ａ、ＴＥＣＫ、ＭＣＰ３及びＭＣＰ４であった（一元配置分散分析により分析した統計、値は示さない）。
【０４２７】
図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃに、腫瘍内サイトカインの増加の例を示す：ＣＣＬ１、ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、Ｉｌ１６、ＭＩＰ−３ａ。
【０４２８】
実施例６
ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際公開第２０１６／０７５２７８号に記載されるように調製した。
【０４２９】
特に、一価のＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を作製した。
【０４３０】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上にヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant、Zhu et al. 1998、Nature Biotechnol. 16, 677-681）。４−１ＢＢリガンドの一つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。正確なペアリングを改善するために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに追加的に導入した（荷電変異体）。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０４３１】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖を用いてフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＣＥＡ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせにより、集合した三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロダイマーが生成される（図１Ｂ同様、抗ＣＥＡにより抗ＦＡＰを置換）。
【０４３２】
2020504104.tif 000046
【０４３３】
ＣＥＡ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、それぞれ国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例１１から１３に詳細に記載されている。
【０４３４】
実施例７
ｉｎ  ｖｉｖｏ異なる濃度のＣＥＡ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子とＣＥＡ  ＴＣＢとの併用療法
ａ）実験手順
ヒト胃ＭＫＮ４５がんモデルにおいて、ヒトＣＥＡ標的化４−１ＢＢＬ（ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ、ＣＥＡバインダーＴ８４．６６−ＬＣＨＡ又はＣＥＡＣＡＭ５）を、ヒトＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせで、１０、３、及び１ｍｇ／ｋｇの濃度で試験した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢに用いたバインダーは、ＣＨ１Ａ１Ａ  ９８／９９ｘ２Ｆ１であり、ＣＥＡ−４−１ＢＢＬに用いたバインダーと競合しない。ＭＫＮ４５細胞を、ＮＳＧヒト化マウスにおいて、マウス線維芽細胞細胞株（３Ｔ３）と共移植した。
【０４３５】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、もともとＤＳＭＺから取得され、拡張後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養した。生存率９９．１％でｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代１３を皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、もともとＡＴＣＣから取得され、Ｒｏｃｈｅ  ＮｕｔｌｅｙでヒトＦＡＰを発現するように操作され、１０％の仔ウシ血清、１ｘピルビン酸ナトリウム及び１．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中において培養された。クローン３９をｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代番号８において、生存率９７．６％で使用した。
【０４３６】
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１×１０−６個のＭＫＮ４５細胞+１×１０６個の３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を、麻酔したマウスの脇腹に、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて皮下注射した。
【０４３７】
実験開始時に５週齢のＮＳＧ雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体当局により承認された。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが毎日実施された。
【０４３８】
ヒト化のために、マウスにブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いて２４時間後に１０００００のヒトＨＳＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を注射した。
【０４３９】
細胞注入の７〜１４日前に、マウスから採血し、血液中のヒトｔ−細胞の量についてスクリーニングした。１μｌの血液当たり平均Ｔ細胞数１３１でヒトＴ細胞についてマウスを無作為化した。試験０日目に、マウスに、１×１０６個の３Ｔ３線維芽細胞と混合した１×１０６個のＭＫＮ４５細胞を皮下注射した。腫瘍を、実験期間全体を通して週２〜３回ノギスにより測定した。１７日目に、腫瘍サイズについて、平均腫瘍サイズ２５０ｍｍ３でマウスを無作為化した。無作為化当日、ビヒクル、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＣＥＡ−４−１ＢＢＬとの組み合わせを、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量で、最長４週間にわたり、マウスに毎週静脈内注射した。すべてのマウスに２００μＬの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群には、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＣＥＡ−４−１ＢＢＬとの組み合わせを注射した。２００μＬにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢに用いられた用量及びスケジュールが２．５ｍｇ／ｋｇ、週二回であったのに対し、ＣＥＡ−４−１ＢＢＬは、用量１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０４４０】
実験は試験４４日目に終了した。
【０４４１】
2020504104.tif 000047
【０４４２】
複数のマウスは、実験中の健康状態が不良であったために屠殺しなければならなかった。
【０４４３】
残りのマウス／群の３〜４の腫瘍を、腫瘍により十分な材料が提供された場合、終了日（４４日目）にフローサイトメトリー及び組織学により分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。終了時の腫瘍の一部と、実験中の動物由来の腫瘍の一部とを、ホルマリン固定し、その後パラフィンに包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
【０４４４】
ｂ）結果
この試験において本発明者らが初めて証明したかったのは、腫瘍標的化４−１ＢＢＬ（ＣＥＡ）がＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）の有効性を向上させうることである。本発明者らは、異なるが競合しないバインダーを用いるものの、ＴＣＢ並びに４−１ＢＢＬ  ＣＥＡの標的として選んだ。ＣＥＡ−４−１ＢＢＬは、用量依存性を評価するために毎週３つの異なる用量（１０、３及び１ｍｇ／ｋｇ）で投与され、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは、２．５ｍｇ／ｋｇの最適用量で週二回投与された。
【０４４５】
本発明のヒトコンストラクトを試験するために、ヒト免疫細胞及び特にＴ細胞がマウス系に存在しなくてはならない。この理由により、本発明者らは、ヒト化マウス、即ちヒト幹細胞を移植したマウスを使用した。これらマウスは、時間の経過と共に、主にＴ及びＢ細胞からなる部分的ヒト免疫系を生じる。
【０４４６】
本発明者らは、腫瘍における間質成分を改善するＭＫＮ４５、ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株、及び３Ｔ３線維芽細胞を共注入した。ＣＥＡは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢによって標的とされ、Ｔ細胞を腫瘍細胞と架橋させ、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞活性化を誘導する。Ｔ細胞の活性化により、４−１ＢＢは、主にＣＤ８陽性Ｔ細胞上で上方制御される。ＣＥＡ−４−１ＢＢＬは、ＣＥＡ発現腫瘍細胞と４−１ＢＢ発現Ｔ細胞を架橋し、したがって４−１ＢＢシグナル伝達を誘導する。これにより、Ｔ細胞の殺傷能、生存及び増殖が改善される。
【０４４７】
本発明者らは、この試験において、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＡ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせが、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの単剤療法と比較して、有効性を向上させることを証明することができた（図１６参照）。１０ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋのＣＥＡ−４−１ＢＢＬとの組み合わせは、１ｍｇ／ｋｇとの組み合わせより強い腫瘍増殖の阻害をもたらす。終了日である４４日目における腫瘍中のＴ細胞浸潤は、フローサイトメトリーにより示されるビヒクル及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、組み合わせ群において有意に増大している（図１８Ａ−１８Ｃ参照）。組織学による分析は、１０及び３ｍｇ／ｋｇでの組み合わせ群においてのみＣＤ８及びＣＤ３陽性Ｔ−細胞の有意な増加を示し（それぞれ図１９Ａ及び１９Ｂ参照）、１ｍｇ／ｋｇでの組み合わせ群には示さない。
【０４４８】
2020504104.tif 000048
【０４４９】
中央値に基づく腫瘍増殖の阻害を、試験の３６日目、３８日目、４１日目及び４３日目において計算した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇで処置した群が、腫瘍増殖の最も強い阻害を示す。
【０４５０】
2020504104.tif 000049
【０４５１】
多重比較のための群平均の有意な差について試験するために、ダネットの方法を用いて標準分散分析（ＡＮＯＶＡ）が自動的に生成される。４３日目において、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇの組み合わせは、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と有意に相違している（表１９）。
【０４５２】
2020504104.tif 000050
【０４５３】
表２０に示すように、曲線下面積（ＡＵＣ）を考慮すると、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの組み合わせは、４３日目までビヒクルと有意に相違している。
【０４５４】
2020504104.tif 000051
【０４５５】
図１７Ａ及び１７Ｂでは、注射された第１週の間の化合物の薬物動態プロファイルが示されている。第１週の間の注入した化合物の薬物動態プロファイルを試験するため、１回目及び２回目の治療の１時間及び７２時間後に、一群当たり２匹のマウスから採血した。注入した化合物を、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０４５６】
（Ａ）ビオチン化ヒト４−１ＢＢ、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＣＨ１抗体及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートする。各段階後にプレートを三回洗浄して未結合の物質を除去する。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化する。４０５ｎｍにおいて測光法で決定される（４９０ｎｍの基準波長）反応生成物の強度は、血清試料中の被分析物濃度に比例する。
【０４５７】
（Ｂ）ビオチン化抗ｈｕＣＤ３  −ＣＤＲ抗体、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＦｃ抗体及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートする。各段階後にプレートを三回洗浄して未結合の物質を除去する。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化する。４０５ｎｍにおいて測光法で決定される（４９０ｎｍの基準波長）反応生成物の強度は、血清試料中の被分析物濃度に比例する。
【０４５８】
４−１ＢＢＬは４−１ＢＢ結合により検出し（Ａ）、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢは抗ＣＤ３ＣＤＲ抗体への結合により検出した（Ｂ）。
【０４５９】
化合物を注入したすべての群が、ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢのいずれにおいても異なる群の間で分子への同等の曝露を示している（用量依存性）。
【０４６０】
試験終了時の腫瘍中のＴ細胞浸潤を、ＦＡＣＳにより分析した。３〜４匹のマウス／群の腫瘍を、４４日目にフローサイトメトリーにより分析した。単一細胞の懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８について染色し、細胞の量を分析した。統計方法として、一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙの多重比較検定（ｐ＜０．０５）を用いた。試験終了時の腫瘍におけるＴ細胞浸潤を図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃに示す。
【０４６１】
１０、３又は１ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＡ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとを組み合わせることにより、４４日目に、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法と比較して、腫瘍中のＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４陽性Ｔ−細胞の浸潤が統計的に増大する（特に１０ｍｇ／ｋｇのＣＥＡ−４−１ＢＢＬとの組み合わせについて）。
【０４６２】
ヒト化ＮＯＧマウス図示の治療群に由来する３Ｔ３マウス線維芽細胞が共移植されたヒトＭＫＮ４５胃皮下腫瘍の免疫組織学的画像が生成された。組織試料を、免疫組織化学染色のために調製した。４４日目、試験の最後に、動物から皮下腫瘍を回収した（ビヒクル、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び組み合わせ）。腫瘍をホルマリン１０％（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍのパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り取った。ＨｕＣＤ８及びＨｕＣＤ３の免疫組織化学を、抗ヒトＣＤ８（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び抗ヒトＣＤ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に対し、Ｌｅｉｃａのオートステイナー（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０，Ｇｅｒｍａｎｙ）において製造者のプロトコールに従って実施した。ｈｕＣＤ８及びＣＤ３陽性Ｔ細胞の定量化を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。統計は、多重比較試験を用いる一元配置分散分析により分析した。結果は、終了日である４４日目における未治療のマウス由来のＭＮＫ４５／３Ｔ３皮下腫瘍中に、極めて少数のＴ細胞を示した。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ単剤療法及びビヒクルと比較して、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ  １０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群で処置した群ではＣＤ３陽性Ｔ細胞（図１９Ａ）及びＣＤ８陽性Ｔ細胞（図１９Ｂ）が有意に増加している（統計：一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０５）。
【０４６３】
実施例８
ヒト免疫エフェクター細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイ
Ｔ細胞の免疫機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイにおいて、ＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２）、ＣＥＡ  ＴＣＢ  ＣＤ３）及びＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ）の存在下で、ヒト免疫エフェクター細胞（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞、ＮＬＶ特異性ＣＤ８Ｔエフェクター記憶細胞）、標的抗原陽性腫瘍細胞及びＦＡＰ陽性線維芽細胞を用いて試験した。評価された腫瘍細胞株は胃がん細胞株ＭＫＮ−４５であった。ヒトＦＡＰを発現するように形質導入されたマウス胎仔線維芽細胞細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３を、ＦＡＰ陽性線維芽細胞として使用した。エフェクター細胞は、休止ヒトＰＢＭＣ、単離された休止ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞であった。場合によっては、抗原特異性エフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞も使用した。いくつかのアッセイでは、ＴＮＦ−αの誘導をモニターするためにＴＮＦ−αセンサー細胞を加えた。腫瘍細胞溶解（動的ハイコンテント生命イメージング、エンドポイントフローサイトメトリー）、細胞表面活性化の発現及び変異マーカー（エンドポイントフローサイトメトリー）及びサイトカイン分泌（動的ハイコンテント生命イメージング、エンドポイントでのサイトメトリックビーズアレイ）を使用して、ＴＣＢによって誘導され、ＦＡＰ標的化免疫モジュレーターによって調節されたＴ細胞機能の度合いをモニターした。
【０４６４】
ａ）標的細胞株及び線維芽細胞
ＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ（ＮＬＲ）細胞は、天然にＣＥＡを発現する。核に制限されたＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ蛍光タンパク質を安定に発現させるために、製造者の指示に従って、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、ＭＫＮ−４５（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＴＣＰ−１００８）にＥｓｓｅｎ  ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン））を、感染多重度３（ＴＵ／細胞）で形質導入した。これにより、非蛍光性エフェクターＴ細胞又は線維芽細胞から腫瘍細胞を容易に分離し、その成長をハイスループット生命蛍光顕微鏡によりモニターすることができる。したがって、時間の経過に伴うウェル当たりの赤色事象又はメナ積分赤色蛍光の定量化により、腫瘍細胞溶解又は増殖をリアルタイムで評価することができる。
【０４６５】
ＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １６０００−０４４、ガンマ照射、マイコプラズマ−フリー及び５６℃で３５分間熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３５０５０  ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｓ８６３６）及び０．５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ａｎｔ−ｐｒ−１）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ４２４３０−０８２）中で培養した。
【０４６６】
細胞表面ＦＡＰによるＦＡＰ結合抗体の架橋を、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９により提供した。この細胞株は、ｈｕＦＡＰを発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１を用いたマウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）のトランスフェクションにより生成された。細胞を、１０％の仔ウシ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｃ８０５６−５００ｍｌ、ガンマ照射、マイコプラズマ−フリー及び５６℃で３５分間熱不活性化）及び１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ａｎｔ−ｐｒ−１）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．  ４２４３０−０８２）中で培養した。
【０４６７】
ｂ）エフェクター細胞の調製
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから得た。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を単離するために、バフィーコートを同じ容積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １４１９０  ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心管（ＴＰＰ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ９１０５０）に１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  １０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾエートナトリウム、密度１．０７７ｇ／ｍＬに調整）を供給し、バフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重層した。管を、３０分間４００×ｇ、室温且つ低加速度で中断なく遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを、接触面から収集し、ＤＰＢＳで三回洗浄し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ照射、マイコプラズマ−フリー及び５６℃で３５分間熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３５０５０  ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）を供給したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ４２４０１−０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。場合によっては、背景蛍光が低減した改善されたハイコンテントライブ顕微鏡のために、ＲＰＭＩ１６４０をＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ  ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ  Ａ１８９６７−０１）により置き換えた。
【０４６８】
ＰＢＭＣを、単離直後にエフェクター細胞として使用するか（休止ヒトＰＢＭＣｓ）、又は特定の細画分を、休止ＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞として、手つかずのヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａ．Ｎｏ．  １３０−０９６−５３３）と手つかずのヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａ．Ｎｏ．  １３０−０９６−４９５）を、それぞれ製造者の指示に従って用いて単離した。簡潔には、ヒトＰＢＭＣを、８分間４００×ｇ、４℃で遠心分離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ+ＢＳＡ（０．５％  ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ９４１８）＋ＥＤＴＡ（［２ｎＭ］、Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９２６１））で一回洗浄した。ペレットを、それぞれの提供されたストレプトアビジン標識陰性抗体カクテルで再懸濁し、５分間４℃で（１＊１０７個の細胞当たり４０μＬのＭＡＣＳバッファー及び１０μＬ抗体の混合物）インキュベートした後、続いてビオチン化磁気捕捉ビーズ（１＊１０７個の細胞当たり３０μＬのＭＡＣＳバッファー及び２０μＬのビーズ混合物）と共に１０分間４℃でインキュベートした。標識非ＣＤ４又は非Ｃ８Ｔ細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａ．Ｎｏ．  １３０−０４２−４０１）を製造者の指示に従って用いて磁気分離により除去した。非標識休止ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を含むカラム通過画分それぞれを、上述のように、遠心分離し、ＭＡＣＳバッファーを用いて一回洗浄した。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０中又はＦｕｏｒｏｂｒｉｇｈｔ  ＤＭＥＭベースのＴ細胞培地中において２百万個の細胞／ｍＬに調整した。
【０４６９】
ｃ）抗原特異性ＣＤ８Ｔ細胞の単離及び培養
いくつかのアッセイでは、抗原特異性ＣＤ８Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。新鮮な血液を、ＨＬＡ−Ａ２＋  ＣＭＶ感染ボランティアから採取した。ＰＢＭＣを上述のように単離した。ＣＤ８Ｔ細胞を、上述のように、製造者の推奨に従って負の選択ヒトＣＤ８Ｔ細胞単離キットを用いて（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １３０−０９４−１５６）ＰＢＭＣから精製した。一千万個の単離ＣＤ８Ｔ細胞を、１ ％（ｖ／ｖ）のＦＢＳと、ＣＭＶ由来のＮＬＶＰＭＶＡＴＶ  ペプチド（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｆ００８−２Ｂ）を含む５０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ２−五量体とを補充した１ｍＬの滅菌ＤＰＢＳに再懸濁し、１０分間室温でインキュベートした。細胞を、１ ％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを供給した３ｍＬの滅菌ＤＰＢＳで二回洗浄した。細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ（クローンＬＴ８、Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａｂ２８０１０）を含む１ ％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを供給した１ｍＬの細胞ＤＰＢＳに再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、二回洗浄し、１ ％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを供給したＤＰＢＳ中５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁し、３０μｍの分離前ナイロンネットＴ細胞ストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １３０−０４１−４０７）を通して濾過した。ＮＬＶ−ペプチド特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の設定を有するＡＲＩＡセルソーター（ＤＩＶＡソフトウェアを用いるＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるＦＡＣＳソーティングにより単離した：１００μｍのノズル及び純度ソートマスク。ソートされた細胞を、１０ ％（ｖ／ｖ） のＦＢＳ、１ ％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ及び４００ Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給した５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地を含む１５ｍｌのポリプロピレン遠心管（ＴＰＰ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ９１０１５）に収集した。ソートされた細胞を、３５０×ｇ、室温で７分間遠心分離し、同じ培地に０．５３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度になるよう再懸濁した。１００μＬ／ウェルのこの細胞懸濁液を、以前に調製したフィーダープレートの各ウェルに加えた。
【０４７０】
ＰＨＡ−Ｌ活性化照射同種異系フィーダー細胞を、前述のようにＰＢＭＣから調製し（Levitsky et al., 1998）、９６ウェル培養プレートに、１ウェル当たり２×１０５個のフィーダー細胞で分配した。
【０４７１】
培養の一日後、１００μＬの培地／ウェルを、ソートされたＣＤ８＋  Ｔ−細胞を含むウェルから除去し、１０ ％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１ ％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ及び４００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを補充した新しいＲＰＭＩ  １６４０培地で置き換えた。これは、培養中定期的に（２〜４日毎に）繰り返された。細胞は、増殖を開始するとすぐに、２４ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰ、９２０２４）に移された。細胞を、拡張／分割し、新しいフィーダー細胞調製物で定期的に再活性化した。
【０４７２】
ｄ）ＴＮＦ−αセンサー細胞
ＴＮＦ−αセンサー細胞は、ＮＦκＢ感受性のプロモーター要素の制御下において緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレポータープラスミドｐＥＴＲ１４３２７を形質導入したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．ｘｘｘ）であった。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞によって分泌されるＴＮＦ−αが結合できるＴＮＦ受容体を天然に発現する。これにより、ＮＦκＢ用量依存性の活性化と核への転位が生じ、これにより次に用量依存性のＧＦＰ生成が開始される。ＧＦＰ蛍光は、ハイスループット生命蛍光顕微鏡により経時的に定量化することができ、したがって、ＴＮＦ−αの分泌のリアルタイム評価を可能にする。
【０４７３】
ｅ）細胞傷害性及びＴ細胞活性化アッセイ
マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞、ＴＮＦ−αセンサー細胞及びＭＫＮ４５  ＮＬＲ細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  １３１５１−０１４）を１０分間３７℃で用いて回収した。細胞を、ＤＰＢＳで一回洗浄した。後でエフェクター又は腫瘍細胞株が過剰増殖しないように、ＴＮＦ−αセンサー細胞又は線維芽細胞を、Ｘ線照射装置において４５００  ＲＡＤの線量を用いて照射した。標的細胞株、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ、及びいくつかのアッセイにおいてはＴＮＦ−αセンサー細胞を、滅菌９６ウェル平底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ９２０９７）において、Ｔ細胞培地中１ウェル当たり細胞０．１＊１０５個の密度で、一晩３７℃で、及びインキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中５％  ＣＯ２で、培養した。
【０４７４】
休止ヒトＰＢＭＣ、ヒトＣＤ４Ｔ細胞、ヒトＣＤ８Ｔ細胞又はＮＬＶ特異性Ｔ細胞を、上述のように調製し、１ウェル当たり細胞０．５＊１０５個の密度で加えた。段階希釈列でのＴＣＢ（ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（２））及び固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ（２ｎＭ）を、１ウェル当たりの総容積が２００  ｕＬとなるように加えた。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内において、最大７２時間にわたり３７℃及び５％  ＣＯ２で培養した。
【０４７５】
いくつかのアッセイでは、プレートを、３７℃及び５％  ＣＯ２で、３時間間隔で７２時間にわたり、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ位相差、緑色蛍光及び赤色蛍光、１０×対物レンズ）を用いた蛍光顕微鏡ハイコンテンツ生命イメージングによりモニターした。腫瘍細胞の増殖対Ｔ細胞による溶解をモニターするために、ウェル当たりＮＬＲ＋細胞の量に比例する健常な腫瘍細胞の積分赤色蛍光（ＲＣＵ×ｕｍ２／画像）を、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量化した。Ｔ細胞の細胞溶解能に対する効果を分析するために、使用したＴＣＢ濃度に対してれぞれの時点及び条件について値をプロットした。
【０４７６】
ＴＮＦ−αセンサー細胞が存在するいくつかのアッセイでは、ＴＮＦ−αセンサー細胞によるＴＮＦ−α誘導性のＧＦＰの生成をモニターするために、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて積分緑色ＲＣＵ×ｕｍ２／画像を定量化した。Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの分泌に対する効果を分析するために、使用したＴＣＢ濃度に対してれぞれの時点及び条件について値をプロットした。
【０４７７】
７２時間後、上清を、製造者の指示に従ってサイトメトリックビーズアレイを用いて、次に行う選択されたサイトカインの分析のために収集した。評価したサイトカインは、ＩＬ−２（ヒトＩＬ−２  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ａ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５５８２７０）、ＩＬ−１７Ａ（ヒトＩＬ−１７Ａ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５６０３８３）、ＴＮＦ−α（ヒトＴＮＦ−α  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｃ４）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５６０１１２）、ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｅ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５５８２６９）、ＩＬ−４（ヒトＩＬ−４  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ａ５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５５８２７２）、ＩＬ−１０（ヒトＩＬ−１０  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５５８２７４）及びＩＬ−９（ヒトＩＬ−９  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ−  ｓｅｔ（Ｂｅａｄ  Ｂ６）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａ．Ｎｏ．  ５５８３３３）であった。
【０４７８】
その後、すべての細胞を、細胞解離バッファーとの３７℃で１０分間のインキュベーションによりウェルから分離させ、続いて４００×ｇ及び４℃で遠心分離した。ペレットを、氷冷のＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １４１９０  ３２６）ｗ／  ＢＳＡ（０．１％  ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ９４１８）で洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳバッファー中において、蛍光色素−コンジュゲート抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３００５３２）、ＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３０１０４４１）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ−５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３０４８３４）、ＣＤ１２７（クローン０１９Ｄ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ａ０１９Ｄ５）、ＣＤ１３４（クローンＢｅｒ−ＡＣＴ３５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３５０００８）、ＣＤ１３７（クローン４Ｂ４−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３０９８１４）、ＧＩＴＲ（クローン６２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３３１１６０８）及びＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３５６１１２）を用いて２０分間４℃で表面染色した。次いで、それらをＦＡＣＳバッファーで一回洗浄した後、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｓｃ−３５９８）を含む８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、その後５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェア搭載ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して同日に収集した。Ｔ活性化に対する効果を分析するために、生存ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞をゲート（ＤＡＰＩ−、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  ＲＥＤ−、ＣＤ４又はＣＤ８＋）して数え、活性化マーカー（ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５）又は成熟マーカー（ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ）の平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）又は陽性細胞のパーセンテージを、使用したＴＣＢ濃度に対するそれぞれの条件についてブロットした。
【０４７９】
結果
８．１Ｔ細胞二重特異性抗体は、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞上における４−１ＢＢの用量依存性の上方制御を誘導する
異なるヒト免疫エフェクター細胞調製物（休止ＰＢＭＣ、ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞、ＮＬＶ特異性ＣＤ８Ｔエフェクター記憶細胞）を、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で４８時間にわたり、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰを用いて共培養した。生存腫瘍細胞の量を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる蛍光顕微鏡ハイコンテント生命イメージングにより定量化し、健常な腫瘍細胞の積分赤色蛍光を使用して特異的溶解を計算した（図２０）。４−１ＢＢの発現を、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上でフローサイトメトリーにより評価した（図２１Ａ−２１Ｄ）。
【０４８０】
ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢは、図２０に示すように、使用したすべての免疫エフェクター細胞調製物において、４２時間の時点でＭＫＮ４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ赤色細胞の溶解を誘導することができた。ＥＣ５０値及び溶解の規模は、異なるエフェクター細胞調製物間でやや異なっており、単離されたＣＤ８Ｔ細胞で最も大きく、ＣＤ４Ｔ細胞で最も小さかった。腫瘍細胞溶解に付随して，Ｔ細胞は４−１ＢＢを含む活性化マーカーの表面発現を増加させた（図２１Ａ−２１Ｄ）。４−１ＢＢの表面発現は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞で最も高かっただけでなく、それよりも低い度合いでＣＤ４陽性Ｔ細胞にも検出された。４−１ＢＢ発現の度合いは、ヘルパー細胞の存在に依存していなかった（ＰＢＭＣとＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞の単離された集団との間に発現レベルの差はなかった）。４−１ＢＢ発現の度合いは、休止ＣＤ８Ｔ細胞の刺激と比較した場合、完全に分化したエフェクター記憶ＮＬＶ特異性ＣＤ８Ｔ細胞の再刺激では弱かった。しかしながら、記憶細胞とナイーブ細胞の４−１ＢＢの動態学は若干異なるため、このことは、単一のエンドポイント分析に起因している可能性もある。
【０４８１】
８．２  ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬの存在はＴ細胞の細胞溶解性に影響しない
次に、本発明者らは、ＴＣＢ媒介性腫瘍細胞溶解に対する４−１ＢＢ共刺激の影響を評価した。８．１に記載したように、Ｔ細胞を、段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で、それぞれ固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、４８時間にわたりＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ赤色細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰを用いて共培養した。
【０４８２】
生存腫瘍細胞の量を、３時間間隔でＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｔｅｍを用いて蛍光顕微鏡ハイコンテント生命イメージングにより定量化し、健常な腫瘍細胞の積分赤色蛍光を使用して特異性溶解を計算した。
【０４８３】
４−１ＢＢＬ共刺激の存在は、腫瘍細胞溶解を早めることも、腫瘍細胞溶解の規模を増大させることも、特定のパーセンテージの腫瘍細胞の溶解を達成するために必要なＴＣＢ濃度を低下させることもなかった（例えばＥＣ５０値のシフト）。これは評価したすべてのエフェクター細胞調製物に当てはまった。図２２Ａ−２２Ｄに例示的に４２時間の時点を示す。
【０４８４】
８．３  ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬの存在はサイトカインの分泌に影響する
いくつかのアッセイでは、上述の設定に加えてＴＮＦ−αセンサー細胞を培養した。ＴＮＦ−αセンサー細胞はＴＮＦ−α受容体を天然に発現する。これを、ＮＦκＢ感受性プロモーター要素の制御下において、ＧＦＰで遺伝的に修飾した。活性化Ｔ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの結合は、ＮＦκＢの用量依存性の活性化と、その後ＧＦＰの発現とをもたらす。ＧＦＰ蛍光は、ハイスループット生命蛍光顕微鏡により経時的に定量化することができ、したがって、ＴＮＦ−αの分泌のリアルタイム評価を可能にする。８．１において上述したように、休止ＣＤ４Ｔ細胞を、４８時間にわたり、それぞれ段階希釈列のＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、標的細胞であるＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰを用いて共培養した。
【０４８５】
存在するＴＣＢによるＴ細胞の活性化は、ＴＮＦ−αの用量依存性の放出をもたらし、これにより、時間の経過に伴い、ＴＮＦ−αセンサー細胞においてＧＦＰ蛍光が用量依存性に増大した。ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬによる追加刺激は、ＧＦＰ蛍光を、したがって活性化Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌を、さらに増大させた（図２３Ａ−２３Ｄ）。このような効果は、ＴＣＢ媒介性ＴＮＦ−α分泌の規模を増大させたが、ＴＮＦ−αの分泌が誘導されるＴＣＢ濃度自体は低下させなかった。経時的比較をさらに容易にするために、曲線下面積（ＡＵＣ）を、４−１ＢＢ共刺激あり又はなしの各時点について計算し、時間に対してプロットした（図２４Ａ−２４Ｂ）。
【０４８６】
すべての試料の上清を、サイトメトリックビーズアレイシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてエンドポイント（４８時間）において評価し、ＴＮＦ−αを超える複数のサイトカインの分泌に対する効果を定量化した。評価したサイトカインは、一般的なＴ細胞活性化のマーカーとしてのＩＬ−２及びＴＮＦ−α、特定のＴｈサブクラスへの分化をモニターするためのＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）、ＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）、ＩＬ−９（Ｔｈ９サイトカイン）及びＩＬ−１７Ａ（Ｔｈ１７サイトカイン）、並びに免疫抑制サイトカインとしてのＩＬ−１０であった。
【０４８７】
存在するＴＣＢによるＴ細胞の活性化は、ＴＮＦ−αの次に、評価したすべてのサイトカイン、即ちＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７ａ及びＩＬ−１０の用量依存性の放出をもたらした（図２５Ａ−２５Ｄ、図２６Ａ−２６Ｄ）。ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬを用いた追加的な共刺激は、用量依存性のサイトカイン分泌の度合いを調節したが、サイトカイン分泌に必要なＴＣＢ閾値濃度を低下させることはなかった。これにより、炎症誘発ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ分泌の増加が観察され、それにより免疫抑制ＩＬ−１０の濃度が低下した。比較をより容易にするために、ＴＣＢプラトー濃度について共刺激を行わないものに対する４−１ＢＢ共刺激による試料中のサイトカイン濃度の変化を計算した（図２７）。
【０４８８】
本発明者らは、４−１ＢＢＬ共刺激の、休止ＣＤ８Ｔ細胞及び完全に分化したエフェクター記憶ＮＬＶ特異性ＣＤ８Ｔ細胞のサイトカイン分泌を調節する能力も試験した。８．１に記載したように、休止ヒトＰＢＭＣ、単離したＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞及びＮＬＶ特異性ＣＤ８エフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞を、７２時間にわたり、段階希釈列のＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下で、固定濃度のＦＡＰ  ４−１ＢＢＬあり又はなしで、ＭＫＮ−４５  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞及び照射ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰを用いて共培養した。上清を、上述のようにサイトメトリックビーズアレイを使用して７２時間目に評価した。
【０４８９】
４−１ＢＢ共刺激は、休止ヒトＰＢＭＣ、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞における炎症誘発サイトカインの分泌を支持した（用量依存性、図２８Ａ−２８Ｈ及び図２９Ａ−２９Ｈ参照）。最高ＴＣＢ濃度についての比較は図３０を参照。特に顕著な影響は、休止ＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ−２及びＴＮＦ−α生成に示された。それよりも程度は低いが、４−１ＢＢ共刺激は、完全に分化したＣＤ８Ｔ細胞のサイトカイン分泌も調節することができた。
【０４９０】
このように、４−１ＢＢＬを介した共刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおいて、４８〜７２時間の時間範囲でＴ細胞の細胞溶解性を直接上昇させることはないが、サイトカインの分泌能を上昇させるもので、サイトカインの微小環境を調節した。さらに炎症誘発性の高い腫瘍中のサイトカインミローは、腫瘍の微小環境を、免疫が活性化し、免疫抑制性が低下した状態へとシフトさせることができ、例えばＩＬ−１０レベルの低下及びＩＦＮ−γの濃度の増加により、腫瘍中の骨髄細胞は、Ｔｈ１及び細胞傷害性Ｔ細胞支持抗原提示細胞へと成熟することができる。支持的サイトカインネットワークへのシフトは、首尾よく持続性の腫瘍細胞除去を回復するであろう。
【０４９１】
実施例９
ＭＫＮ４５細胞発現ＣＥＡ及びＰＤＬ−１を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイ
ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞を、ＰＢＳベースの解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．−Ｎｏ：１３１５１−０１４）を用いて回収し、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ−Ｎｏ．  ３５０５０−０３８）を供給したＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．−Ｎｏ  ４２４０１−０４２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ｍ７１４５）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるアッセイ培地に再懸濁し、Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  Ｓ  ２０００（Ｒａｄ  ｓｏｕｒｃｅ）を用いて５０Ｇｙで照射した。ＣＥＡＣＡＭ５発現ＭＫＮ４５−ｈｕＰＤ−Ｌ１細胞を回収し、ＰＫＨ−２６  ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ＰＫＨ２６ＧＬ−１ＫＴ）で標識し、アッセイ培地に再懸濁し、５０Ｇｙで照射した。ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離を用いてバフィーコートから単離し、４０ｎＭのＣＦＤＡ−ＳＥを用いて３７℃の温かいＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ−Ｎｏ．  １４１９０−１３６）中において１５分間標識した。標識後、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを洗浄しアッセイ培地に再懸濁した。９６ウェル丸底ＴＣ処理プレートにおいて、各ウェルに、０．０１×１０６個の照射ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞、０．０１×１０６個のＰＫＨ−２６  ｒｅｄ標識及び照射ＭＫＮ４５−ｈｕＰＤＬ−１細胞、０．０５×１０６個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ、１００ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ又は２０ｎＭのＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢ及び１ｎＭのＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又は１ｎＭのＤＰ４７−４−１ＢＢＬ又は抗体なしを、２００ｍＬのアッセイ培地に播種した。細胞を４日間インキュベートした。その後、細胞を、フローサイトメトリー分析のために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＴＨ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ｌ３４９５７）、Ｐｅｒ−ＣＰＣｙ５．５コンジュゲート抗ヒトＣＤ１３７マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３０９８１４）、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ８マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３０１０１２）、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ２５  マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３０２６１０）、ＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＯＸ４０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３５００２２）及びＢＶ４２１コンジュゲート抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ３００５３２）で染色した。細胞を、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｚｙｅｒ  １０（Ｍｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて獲得し、ＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。統計を、有意差検定：１２の技術的複製のＴｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置分散分析を用いて分析した。
【０４９２】
結果を、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢについて図３１に、ＣＥＡＣＡＭ５  ＣＤ３  ＴＣＢについて図３２に示す。
【０４９３】
実施例１０
ＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び／又はアテゾリズマブを組み合わせたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＢＭＣ活性化アッセイ
このアッセイでは、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬを、実施例９に記載したものと類似の、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、抗ヒトＰＤ−Ｌ１特異性ヒト化ヒトＩｇＧ１κ抗体）の存在下又は非存在下において、ヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離し、液体窒素中で凍結及び貯蔵したもの）を活性化させる能力について試験した。腫瘍環境を模倣するために、五名のドナーのＰＢＭＣを、１ｎＭのＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又は１ｎＭのＤＰ４７−４−１ＢＢＬ及び／又は１００ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び／又は８０ｎＭのアテゾリズマブの存在下又は非存在下において、ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ線維芽細胞細胞株及びＣＥＡ発現ＭＫＮ４５−ＰＤＬ１胃がん細胞株と共に四日間インキュベートした。ＰＢＭＣ活性化を決定するために、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、フローサイトメトリーにより、増殖（ＣＦＳＥ希釈）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＰＤ−１発現について分析した。上清を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘにより、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１０について分析した。
【０４９４】
ａ）ＰＢＭＣの調製
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから得た。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １４１９０  ３２６）で希釈した。５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ遠心管（ＴＰＰ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ９１０５０）に１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  １０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾエートナトリウム、密度１．０７７ｇ／ｍＬに調整）を供給し、バフィーコート溶液を１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重層した。管を、３０分間４５０×ｇ、室温且つ低加速度で中断なく遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを、接触面から収集し、ＤＰＢＳで三回洗浄し、２０％のジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ｄ２６５０）、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ照射、マイコプラズマ−フリー、５６℃で３５分間熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３５０５０  ０３８）を供給したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ４２４０１−０４２）からなるＴ細胞凍結培地に再懸濁した。１−１．５ｍＬを、滅菌Ｃｒｙｏｖｉａｌｓに迅速に移し、Ｃｒｙｏｂｏｘｅｓに移し、少なくとも４８時間−８０℃で貯蔵した。その後、バイアルを液体窒素容器又は蒸気相容器に移した。
【０４９５】
８名のドナー由来のバイアルを、解凍し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  Ｍ７１４５）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）を供給したＲＰＭＩ  １６４０培地からなるアッセイ培地において洗浄した。細胞を、数え、ＤＰＢＳで洗浄し、３７℃のＤＰＢＳに１×１０６細胞／ｍＬとなるまで再懸濁した。ＣＦＤＡ−ＳＥを、最終濃度が４０ｎＭになるように加え、１５分間３７℃でインキュベートした。その後、ＦＢＳを加え、細胞を洗浄し、アッセイ培地（２×１０６細胞／ｍＬ）に配置し、６ウェル組織培養プレートにおいて細胞インキュベーター中、３７℃、５％  ＣＯ２で、一晩静置した。翌日、ＰＢＭＣを回収し、数え、アッセイ培地に１×１０６細胞／ｍＬとなるまで再懸濁した。
【０４９６】
ｂ）標的細胞株
ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  クローン１９を含むＴ１５０フラスコを、ＤＰＢＳで洗浄し、酵素を含まないＰＢＳベースの解離バッファーと共に８分間３７℃でインキュベートした。細胞を、回収し、洗浄し、アッセイ培地に再懸濁し、Ｘ線照射装置ＲＳ  ２０００を用いて５０Ｇｙで照射した。細胞を、アッセイ培地中で、０．４×１０６細胞／ｍＬに設定した。
【０４９７】
ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１を含むＴ１５０フラスコを、ＤＰＢＳで洗浄し、酵素を含まないＰＢＳベースの解離バッファーと共に８分間３７℃でインキュベートした。細胞を、収集し、ＤＰＢＳで洗浄し、Ｃ希釈剤に再懸濁した（少なくとも２５０μＬ、８×１０７細胞／ｍＬ以下で）。同量のＣ希釈剤に４μＬ／ｍＬのＰＫＨ−２６色素を供給し、よく混合した。この色素溶液を細胞に加え、直ちによく混合した。細胞を５分間室温でインキュベートした。その後、ＦＢＳを加え、細胞をアッセイで洗浄し、アッセイ培地に再懸濁し、Ｘ線照射装置ＲＳ  ２０００（Ｒａｄ  ｓｏｕｒｃｅ）を用いて５０Ｇｙで照射した。細胞を、アッセイ培地中で、０．４×１０６細胞／ｍＬに設定した。
【０４９８】
ｃ）アッセイの設定
試験化合物のために、マスター溶液を、アッセイ培地中の各成分、即ち４ｎＭのＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、４ｎＭのＤＰ４７−４−１ＢＢＬ、８００ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及び６４０ｎＭのアテゾリズマブから調製した。細胞及び成分を、９６ウェル丸底組織培養プレート（ＴＴＰ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．  ９２０９７）中において、２５μＬのＰＫＨ−２６ｒｅｄ標識ＭＫＮ４５−ＰＤ−Ｌ１（１００００細胞／ウェル）、２５μＬのＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  クローン１９（１００００細胞／ウェル）、一名のドナーの５０μＬのＰＢＭＣ（５００００細胞／ウェル）、５０μＬの４ｎＭ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ又は４ｎＭ  ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ溶液、又はアッセイ培地（最終濃度１ｎＭ）、２５μＬの８００ｎＭ  ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ溶液又はアッセイ培地（最終濃度１００ｎＭ）、及び２５μＬの６４０ｎＭ  アテゾリズマブ溶液又はアッセイ培地（最終濃度８０ｎＭ）の量で混合した。次いでプレートを、加湿した細胞インキュベーター内で四日間にわたり３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。
【０４９９】
四日後、５０μＬの上清を除去し、後でサイトカイン含有量について分析するために−８０℃で貯蔵した（以下参照）。Ｔ細胞増殖及び表面発現のフローサイトメトリー分析を実施するため、プレートを遠心分離し、低温のＤＰＢＳで一回洗浄した。試料を、１：１０００に希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌ  Ｓｔａｉｎを供給した１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中において、３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで一回洗浄した（遠心分離：３５０×ｇ、４分間、４℃、フリックオフ）。細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１３７−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５及び０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＰＤ−１−ＰＥ／Ｃｙ７、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２５−ＡＰＣ、０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７及び０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１を含むＦＡＣＳ−バッファーを含む５０μＬ／ウェルの染色溶液に再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ（遠心分離：３５０×ｇ、４分間、４℃、フリックオフ）で二回洗浄し、４０μＬ／ウェルのＰＢＳ中１％  ＰＦＡに再懸濁し、４℃でインキュベートして染色を固定した。細胞を、遠心分離し、１００μＬのＦＡＣＳ−バッファー中に再懸濁した後、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及び自動化Ｃｙｔｏｍａｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ｓｅｔ  ｔｏ  ４℃）プレートハンドリングシステムを用いて細胞を獲得した。データは、ＰＣ（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）についてＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．３を、増殖ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞（ＣＦＳＥ希釈）、並びにＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及びＰＤ−１発現ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の総数及びパーセンテージについてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｌｕｓ  ２０１０）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を、それぞれ用いて分析した。
【０５００】
上清中に放出されたサイトカインを分析するために、以前に凍結した試料を取り出し、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１０について、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＰｒｏＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８  ｐｌｅｘアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて分析した。解凍試料を以下のように分析した：Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムを、製造者の指示に従って較正した。Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＰｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８  ｐｌｅｘのアッセイバッファー、洗浄バッファー及び試料希釈剤を室温にした。９６ウェルフィルタープレート用のＶａｃｕｕｍマニホールダー（ｍａｎｉｆｏｌｄｅｒ）（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を、−１から−３"  Ｈｇに設定した。標準のバイアルを５００μＬのＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈し、ボルテックスし、氷上で貯蔵した。四倍標準希釈剤を、ブランクコントロール（培地のみ）を含むＴ細胞活性化アッセイ培地において実施した（上清と同じ培地、上記参照）。解凍した上清をＴ細胞活性化アッセイ培地において１：１．２及び１：１．５に希釈した（二つの異なる希釈物を試験した）。１０×Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ連結ビーズをボルテックスし、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファーに希釈して、光からの保護を維持した。
【０５０１】
Ｍｕｌｔｉ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ｆｉｌｔｅｒプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファー及び真空マニホールダーを用いて事前に湿らせた。５０μＬ／ウェルの調製Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ連結ビーズ溶液を加え、フィルタープレートを、真空マニホールダーを用いて１００μＬ／ウェルのＢｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファーで二回洗浄した。希釈した上清、標準及びブランクコントロールを、プレートレイアウトに従ってウェル（５０μＬ／ウェル）に加えた。プレートを、プレートシェーカー（８５０  ｒｐｍ）上において暗所で１時間インキュベートし、サイトカインをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ連結ビーズに結合させた。その間、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ検出抗体をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ検出抗体希釈剤中で１：２０に希釈した。インキュベートしたフィルタープレートを、真空マニホールダーを用いて１００μＬ／ウェルのＢｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファーで三回洗浄した。その後、調製した検出抗体溶液をボルテックスし、２５μＬ／ウェルを加えた。プレートを、プレートシェーカー（８５０  ｒｐｍ）上において暗所で３０分間インキュベートし、ビオチン標識検出抗体を結合させた。その間、ＳＡ−ＰＥ（ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン）溶液を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファー中で１：２００に希釈することにより調製し、光から保護した。インキュベーション後、プレートを、真空マニホールダーを用いて１００μＬ／ウェルのＢｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファーで三回洗浄した。５０μＬ／ウェルのＳＡ−ＰＥ溶液を加え、プレートを、プレートシェーカー（８５０  ｒｐｍ）上において暗所で１０分間インキュベートし、ＳＡ−ＰＥをビオチン標識検出抗体に結合させた。その後、プレートを上述のようにして三回洗浄した。最後に、１００μＬのＢｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイバッファーを各ウェルに加え、プレートをプレートシェーカー上で３０秒間８５０  ｒｐｍで振とうし、次いでＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステムに適用し、分析を開始した。データは、Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＭａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて分析した。
【０５０２】
結果
図３３、３４及び３５に示すように、１０ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ（黒格子の棒グラフ、白い四角形）は、ＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の増殖並びに発現を増大させることができたが、１ｎＭのＦＡＰ−１ＢＢＬのみ（黒と白の斜線の棒グラフ、黒の下向きの三角形）はできなかった。１０ｎＭのＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと１ｎＭのＦＡＰ−１ＢＢＬの組み合わせ（黒の棒グラフ、白い菱形）は、ＣＤ２５及びＣＤ１３７のさらなる増加（比較的低い度合いで）と、ＣＤ８Ｔ細胞の増殖の増大をもたらした。サイトカインの分析において、より強い効果が見られた（図３６、３７及び３８）。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬの組み合わせをＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢのみと比較した場合のサイトカイン放出の倍増を、図３９に示す。これら二つの成分の組み合わせは、増殖、活性化（ＣＤ２５、ＣＤ１３７）及びサイトカイン放出に、主にＣＤ８Ｔ細胞について相乗効果を誘導した（特にＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦα）。ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢと組み合わせた上方制御されたＤＰ４７−４−１ＢＢＬ（赤／白の縞の棒グラフ）は、標的化ＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＣＥＡ−ＴＣＢとの組み合わせと同じ効果を誘導することはできなかった。このことは、ＦＡＰ−４１−ＢＢＬの相乗効果がＦＡＰ標的化及び架橋に依存していることを示している。
【０５０３】
図３３、３４及び３５にさらに示すように、ＣＥＡ−ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）との三つの組み合わせ（グレーの棒グラフ、グレーに塗られた上向きの三角形）は、Ｔ細胞増殖又は活性化（ＣＤ１３７、ＣＤ２５発現）に追加的な効果を有さなかったが、ＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢ及びＦＡＰ−４−１−ＢＢＬの単剤治療又は併用治療と比較した場合に、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＧＭＣ−ＣＳＦの分泌のさらなる増大を誘導することができた（図３６、３７及び３８参照）。三つの組み合わせをＣＥＡ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ−４−１ＢＢＬとの組み合わせと比較するこのようなサイトカインの倍増を図４０に示す。三つの組み合わせは、サイトカイン放出（主にＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦ）に対する極めて強い相乗効果を示した。
【０５０４】
実施例１１
ＦＡＰ標的化マウス４−１ＢＢＬ抗原結合分子（ハイブリッドサロゲート）の調製、精製及び特徴づけ
ハイブリッドサロゲート又はＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬとも呼ばれる、ＦＡＰに対する一価の結合を有するアゴニストマウス４−１ＢＢリガンドを含む二重特異性抗原結合分子を、国際公開第２０１６／０７５２７８号に記載されるようにして調製した。ヒトリガーンドをマウスエクトドメインで置き換えることにより、標的化マウス４−１ＢＢＬを、ヒトリガーンドについて記載されるように調製した。
【０５０５】
マウス４−１ＢＢリガンドのエクトドメインのＤＮＡ配列コード化部分（アミノ酸１０４〜３０９、Ｃ１６０Ｓ変異を含む）を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＱ３Ｕ１Ｚ９−１配列に従って合成した。４−１ＢＢリガンドを標的とするために使用したＦＡＰバインダーはクローン４Ｂ９であった。ハイブリッドサロゲート  ＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬのアミノ酸配は、表２１に見ることができる。
【０５０６】
2020504104.tif 000052
2020504104.tif 000053
【０５０７】
ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中において増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞に、対応する発現ベクターを、１：１：１：１の比（「ベクターＦｃ−ホール重鎖」：「ベクターＦＡＰ軽鎖」：「ベクター４−１ＢＢＬ  Ｆｃ−ノブ重鎖」：「ベクターｍｕ４−１ＢＢＬ軽鎖」）でトランスフェクトした。
【０５０８】
トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｅｖｉＭａｋｅ培地（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）において、無血清で懸濁培養する。５％  ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内に３７℃で７日間置いた後、培養上清を収集して遠心分離により精製し、その溶液を滅菌濾過（０．２２ｍｍのフィルター）して４℃で保存する。
【０５０９】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。未結合のタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．０）の塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配を用いて溶出した。次いでカラムを、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．０）で洗浄した。収集した画分のｐＨを、２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の１／４０（ｖ／ｖ）を加えることにより調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。
【０５１０】
精製された二重特異性コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性コンストラクトの純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳにより分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７）の２５℃のランニングバッファー中において平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０５１１】
2020504104.tif 000054
【０５１２】
１１．１  表面プラズモン共鳴によるハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬの機能的特徴づけ
マウスの４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）とヒト又はマウスＦＡＰとに同時に結合する能力を、国際公開第２０１６／０７５２７８号に記載の方式で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。ビオチン化マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合した。最大６００共鳴ユニット（ＲＵ）の固定化レベルを使用した。
【０５１３】
ＦＡＰ標的化ｍｕ４−１ＢＢＬコンストラクトを、２００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分のフローでフローセルを通して９０秒かけて通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒト又はマウスＦＡＰを、第２の被分析物として、３０μＬ／分のフローでフローセルを通して９０秒かけて５００ｎＭの濃度で注入した。解離を１２０秒間モニターした。いずれのタンパク質も固定化されていない基準フローセルに得られる応答を差し引くことにより、バルク屈折率の差異を修正した。
【０５１４】
図４１Ａ及び４１Ｂのグラフに見ることができるように、ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬは、マウス４−１ＢＢとマウス／ヒトＦＡＰとに同時に結合することができる。
【０５１５】
実施例１２
マウス４−１ＢＢへの二価の結合とＦＡＰへの一価の結合とを有する二重特異性抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
２＋１とも呼ばれる、４−１ＢＢに対する二価の結合とＦＡＰに対する一価の結合とを有する二重特異性アゴニストマウス４−１ＢＢ抗体が、図１Ａ及び１Ｂと同じように調製された。この実施例では、コンストラクトの第１の重鎖ＨＣ１は以下の成分を含んでいた：抗４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１と、それに続く、変異Ｌｙｓ３９２Ａｓｐ及びＬｙｓ４０９Ａｓｐを含むＦｃ（Ｆｃ−ＤＤと呼ぶ）であって、Ｃ末端には抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＶＬ、又はＶＨが融合しているもの。第２の重鎖ＨＣ２は、抗４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１と、それに続く、変異Ｇｌｕ３５６Ｌｙｓ及びＡｓｐ３９９Ｌｙｓ  を含むＦｃ（Ｆｃ−ＫＫと呼ぶ）であって、Ｃ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＶＨ、又はＶＬが融合したものを含んでいた。抗体のＦｃヘテロダイマー形成を増強するＤＤＫＫ変異は、特にGunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010, 19637-19646により記載されている。標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃ  ＤＤと抗４−１ＢＢ−Ｆｃ  ＫＫ鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合部分及び二つのマウスのマウス４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含む、ヘテロダイマーを生成することができる。ＤＡＰＧ変異を、重鎖の定常領域に導入し、例えばBaudino et al. J. Immunol. （2008）, 181, 6664-6669、又は国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載された方法に従って、マウスＦｃガンマ受容体への結合を抑止した。簡潔には、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ａｓｐ２６５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ変異がＦｃ−ＤＤ及びＦｃ−ＫＫ重鎖の定常領域に導入された（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；即ちＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
【０５１６】
２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、Ｆｃ−ＫＫに融合したａ−ＦＡＰ（２８Ｈ１）ＶＨとＦｃ−ＤＤ鎖に融合したＶＬとを有する抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）コンストラクトのアミノ酸配列は、それぞれ表２３に見ることができる。２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、Ｆｃ−ＫＫに融合したａ−ＦＡＰ（２８Ｈ１）ＶＬとＦｃ−ＤＤ鎖に融合したＶＨとを有する抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）コンストラクトのアミノ酸配列は、それぞれ表２４に見ることができる。
【０５１７】
2020504104.tif 000055
2020504104.tif 000056
【０５１８】
2020504104.tif 000057
2020504104.tif 000058
【０５１９】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ抗ＦＡＰ  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中において増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞に、対応する発現ベクターを、１：１：１の比（「ベクターＦｃ−ＤＤ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターＦｃ−ＫＫ重鎖」）でトランスフェクトした。
【０５２０】
トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｅｖｉＭａｋｅ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）培地において、無血清で懸濁培養する。５％  ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内に３７℃で７日間置いた後、培養上清を収集して遠心分離により精製し、その溶液を滅菌濾過（０．２２ｍｍのフィルター）して４℃で保存する。
【０５２１】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。未結合のタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ ｍＭ  クエン酸ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合タンパク質を、１５カラム容積の、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）の上に生成された、塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を用いて溶出した。次いでカラムを、１０カラム容積の、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）で洗浄した。収集した画分のｐＨを、２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の１／４０（ｖ／ｖ）を加えることにより調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１６／６００Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。
【０５２２】
精製された二重特異性コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性コンストラクトの純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳにより分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７）の２５℃のランニングバッファー中において平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０５２３】
2020504104.tif 000059
【０５２４】
１２．１  表面プラズモン共鳴によるマウスサロゲートｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの機能的特徴づけ
マウスの４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）とマウスＦＡＰとに同時に結合する能力を、国際公開第２０１６／０７５２７８号に記載の方式で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。ビオチン化マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合した。最大６００共鳴ユニット（ＲＵ）の固定化レベルを使用した。
【０５２５】
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢコンストラクトを、２００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分のフローでフローセルを通して９０秒かけて通過させ、解離をゼロ秒に設定した。マウスＦＡＰを、第２の被分析物として、３０μＬ／分のフローでフローセルを通して９０秒かけて５００ｎＭの濃度で注入した。解離を１２０秒間モニターした。いずれのタンパク質も固定化されていない基準フローセルで得られる応答を差し引くことにより、バルク屈折率の差異を修正した。図４１Ｃのグラフに見ることができるように、マウスサロゲートｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢはマウス４−１ＢＢとマウスＦＡＰとに同時に結合することができる。
【０５２６】
実施例１３
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける単回注射後のｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの薬物動態プロファイル
ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの単回用量２．５ｍｇ／ｋｇ（実施例１２に従って調製）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌ当たりに適切な量の化合物を得るために、保存溶液（表２６、ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢ）をヒスチジンバッファーで希釈した。一つの時点につき三匹のマウスから、１０分、１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、６日及び９日目に採血した。注射した化合物を血清試料においてＥＬＩＳＡにより分析した。ビオチン化マウス４−１ＢＢ、試験血清試料、ＨＲＰで標識した検出抗体抗ｍｓＩｇＧを、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートした。各段階後にプレートを三回洗浄して未結合の物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化した。反応生成物の強度は、４０５ｎｍにおいて測光法で決定され（４９０ｎｍの基準波長）、血清試料中の被分析物濃度に比例していた。結果を図４２に示す。ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢは、安定な表ＰＫ挙動を示し、これにより、その後の有効性試験に週一回のスケジュールが示唆された。
【０５２７】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢと抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用療法による抗腫瘍効果
ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせを用いる有効性試験を、ＭＣ３８−ＣＥＡモデルにおいて実行した。
【０５２８】
国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０  ＰＤ−Ｌ１抗体（前記文献の図１１に示す配列）に基づく抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルに使用した。この抗体は、ＦｃγＲ相互作用を無効にする、実施例１２に記載のＤＡＰＧ変異を含んでいた。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０の可変領域を、ＤＡＰＧ  Ｆｃ変異を有するマウスのＩｇＧ１定常ドメインに結合させた。この実施例に使用した抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１４５による重鎖と配列番号１４６による軽鎖とを含む。
【０５２９】
ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ（マウスの結腸癌）細胞を、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅから取得し、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｚｕｒｉｃｈにおいて拡張し、１０％のＦＣＳ、４ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン及び５０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを補充したＲＰＭＩ培地において維持した。生存率９６％の継代１０を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞注入に使用した。０．５×１０６細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ（ｗ／ｏ）５０％+ＧＦＲ  マトリゲル５０％に再懸濁し、ｓ．ｃ．（皮下）注射した。
【０５３０】
免疫適格性ヒトＣＥＡ  トランスジェニック／遺伝子組み換え（ｈＣＥＡＴｇ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅからのライセンス契約の下に取得し、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおいて採血した。実験開始時に８−１０週齢のマウスを、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０５３１】
プロトコールに従って（図４３）、上述のように雌ｈＣＥＡＴｇマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週一回治療したところ、腫瘍サイズが約１８０ｍｍ３に到達した（１５日目）。すべてのマウスに週に一回２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。２００μｌにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液（表２６）を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。
【０５３２】
2020504104.tif 000060
【０５３３】
2020504104.tif 000061
【０５３４】
ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢと抗ＰＤ−Ｌ１との併用療法（Ｄ群）のために、治療は同時に注射された。腫瘍増殖は、ノギス（実施例２、図２）を使用して週に三回測定し、腫瘍体積は以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
【０５３５】
試験は、３週間の治療後に停止した（腫瘍細胞注入後３７日目）。図４４Ａは、すべての治療群における腫瘍増殖の動態学（平均  ＋／−  ＳＥＭ）を示しており、すべての群の各動物の個体別腫瘍増殖動態学が図４４Ｃに、１５日目の治療開始から３７日目までの腫瘍増殖の変化を示す滝グラフが図４４Ｂに、それぞれ示されている。ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの単剤療法は、腫瘍増殖の阻害をまったく示さなかった。ａ−ＰＤ−Ｌ１治療のみは、腫瘍増殖の阻害（ＴＧＩ：４０及びＴＣＲ：０．３７）を誘導し、一匹のマウスにおいて３７日目に腫瘍が無くなった。しかしながら、ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢとａ−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせは、１０匹中８匹のマウスに強力な腫瘍縮小を誘導し（ＴＧＩ：９８及びＴＣＲ：０．０５）、３７日目までに５０％のマウスで腫瘍が無くなった。
【０５３６】
統計解析を、ＪＭＰソフトウェアを使用して実施した。
2020504104.tif 000062
【０５３７】
その結果得られたＴＧＩ及びＴＣＲ値を表２８に示す（ＴＧＩは、腫瘍増殖の阻害を意味する、ＴＧＩ＞１００は腫瘍縮小を意味し、ＴＧＩ＝１００は腫瘍の停滞として定義され、ＴＣＲは治療対コントロール比を意味し、ＴＣＲ＝１は効果なしを意味し、ＴＣＲ＝０は完全退縮として定義される）。
【０５３８】
2020504104.tif 000063
【０５３９】
実施例１５
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＡＰ−４−１ＢＢＬとＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢとの併用療法による抗腫瘍効果
ａ）一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬを用いた実験
ヒト一価ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１）を、単剤として、及びヒトＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせにおいて、単剤としての及び組み合わせでの非標的化４−１ＢＢＬ（バインダーＤＰ４７）に対して試験した。ヒト卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３）を、ＴａｃｏｎｉｃからのＮＯＧマウスに皮下移植した。治療開始の２日前に、マウスにヒトＰＢＭＣを注射した。
【０５４０】
ヒトＳＫＯＶ３細胞（卵巣癌）は、もともとＡＴＣＣから取得され、拡張後、Ｒｏｃｈｅ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ中で５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代４２を生存率９６．９％で皮下注射に使用した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（５×１０６個のＳＫＯＶ３細胞）を、麻酔したマウスの脇腹に、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて皮下注射した。
【０５４１】
実験開始時に週齢６〜８（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＳＯＰＦ施設から購入）の７０匹のＮＯＧ雌マウスを、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体のいない条件下で保持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（Ｐ  ２００５０８６）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０５４２】
試験０日目に、５×１０６個のＳＫＯＶ３細胞をマウスに皮下注射し、実験期間を通してノギスにより腫瘍を週に２から３回測定した。バフィーコートは、Ｚｕｒｉｃｈｅｒ  Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅから得られ、ＰＢＭＣは２８日目に注射の前に新しく精製された。９１０万個のＰＢＭＣを、２００μｌの容量のＲＰＭＩで腹腔内注射した。２９日目に開始して、治療を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。その後、試験の最後まで、動物を毎週治療した。無作為化の日に、マウスに対し、ビヒクル、非標的化４−１ＢＢＬ（９．８５ｍｇ／ｋｇ）、ＦＯＬＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ、ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ（９．８５ｍｇ／ｋｇ）、ＦＯＬＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ  ＋非標的化４−１ＢＢＬ（９．８５ｍｇ／ｋｇ）、ＦＯＬＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ（９．８５ｍｇ／ｋｇ）又はＦＯＬＲ１−ＴＣＢ  ＋ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ（０．９８５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。
【０５４３】
すべてのマウスに２００μＬの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にはコンストラクト、ＦＯＬＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ又は組み合わせを含む４−１ＢＢＬを注射した。２００μＬにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＦＯＬＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢに用いられた用量及びスケジュールが５ｍｇ／ｋｇ、週一回であったのに対し、４−１ＢＢＬコンストラクトは、用量９．８５ｍｇ／ｋｇ又は０．９８５ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０５４４】
２〜３匹のマウス／群から、初回治療の１０分、１時間、８時間、２４時間及び７日後に採血し、第１週の間の化合物の薬物動態プロファイルを決定した。マウス血清試料をＥＬＩＳＡ法により分析した。ビオチン化４−１ＢＢ（Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｚｕｒｉｃｈ）、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＣＨ１抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加えた。ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化した。
【０５４５】
実験は、３回目の治療の翌日である試験４４日目に終了した。腫瘍をＰＢＳ中において回収し、単一細胞の懸濁液を生成し、異なる免疫細胞マーカーについて染色し、ＦＡＣＳにより分析した（染色抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：抗ヒトＣＤ４５  ＡＦ４８８、抗ヒトＣＤ３  Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５、抗ヒトＣＤ８  ＰＥ−Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ４  ＢＶ４２１）。
【０５４６】
終了時、腫瘍の一部をホルマリン固定し、その後パラフィンに包埋した。試料を切断し、ＣＤ３及びＣＤ８について染色した。
【０５４７】
2020504104.tif 000064
【０５４８】
2020504104.tif 000065
【０５４９】
2020504104.tif 000066
【０５５０】
図４５は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢと一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせが、ビヒクル群と比較して腫瘍増殖の阻害という観点から優れた有効性を媒介したことを示している。すべての組み合わせ群（ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ+ＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬ及びＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ  ＋非標的化４−１ＢＢＬ）が、ビヒクルコントロールと有意に異なっている。
【０５５１】
2020504104.tif 000067
【０５５２】
ｂ）一価及び二価のＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬを用いた実験
ヒト一価及び二価ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（ｍｏｎｏ  ＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬ及びｂｉ  ＦＡＰ（２８Ｈ１）−４−１ＢＢＬ）を、単剤として及びヒトＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせで、一価及び二価非標的化４−１ＢＢＬ（ｍｏｎｏ  ｕｎｔａｒｇ−４−１ＢＢＬ及びｂｉ  ｕｎｔａｒｇ−４−１ＢＢＬ）に対して試験した。ヒト卵巣ＳＫＯＶ３細胞を、ＴａｃｏｎｉｃからのＮＯＧマウスに皮下注射した。初回治療の２日前に、バフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣをマウスに注射した。
【０５５３】
ヒトＳＫＯＶ３細胞（卵巣癌）は、もともとＡＴＣＣから取得され、拡張後、Ｒｏｃｈｅ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ中で５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの継代４４を生存率９９．３％で皮下注射に使用した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（５×１０６個のＳＫＯＶ３細胞）を、麻酔したマウスの脇腹に、２２Ｇから３０Ｇの針を用いて皮下注射した。
【０５５４】
バフィーコートは、Ｚｕｒｉｃｈｅｒ  Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅから取得し、ＰＢＭＣは２８日目に注射の前に新しく精製した。１０００万個のＰＢＭＣを、２００μｌの容量のＲＰＭＩで腹腔内注射した。
【０５５５】
８０匹のＮＯＧ雌マウスがＴａｃｏｎｉｃにより納品された。マウスは、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下に維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（Ｐ  ２００５０８６）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０５５６】
試験０日目に、１×１０６個のＳＫＯＶ３細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍を、実験期間全体を通して週２〜３回ノギスにより測定した。新しく精製したＰＢＭＣを、最初の治療の２日前である２７日目に注入した。無作為化の翌日である２９日目に、マウスに対し、ビヒクル、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ、ｍｏｎｏ  ｕｎｔａｒｇ−４−１ＢＢＬ、ｂｉ−ｕｎｔａｒｇ−４−１ＢＢＬ、ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ｂｉ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ、ｍｏｎｏ  ｕｎｔａｒｇ−４−１ＢＢＬ+ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ、ｍｏｎｏ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ+ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢ又はｂｉ  ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ+ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢを、最長２週間にわたり静脈内注射した。
【０５５７】
すべてのマウスに２００μＬの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを注射し、治療群にはコンストラクト、ＦＯＬＲ１−ＴＣＢ又は組み合わせを含む４−１ＢＢＬを注射した。２００μＬにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢに用いられた用量及びスケジュールが５ｍｇ／ｋｇ、週一回であったのに対し、４−１ＢＢＬコンストラクトは、用量１０ｍｇ／ｋｇで週一回与えられた。
【０５５８】
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【０５５９】
２匹のマウス／群から、初回治療の１０分、１時間、７時間、７２時間及び７日後に採血し、第１週の間の化合物の薬物動態プロファイルを決定した。マウス血清試料をＥＬＩＳＡ法により分析した。ビオチン化ｈｕ４−１ＢＢ（Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｚｕｒｉｃｈ）、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗ｈｕＣＨ１抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を、９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに段階的に加えた。ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化した。
【０５６０】
実験は、２回目の治療の６日後である試験４２日目に終了した。腫瘍をＰＢＳ中において回収し、単一細胞の懸濁液を生成し、異なる免疫細胞マーカーについて染色し、ＦＡＣＳにより分析した（染色抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：抗ヒトＣＤ４５  ＡＦ４８８、抗ヒトＣＤ３  Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５、抗ヒトＣＤ８  ＰＥ−Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ４  ＢＶ４２１）。
【０５６１】
2020504104.tif 000069
【０５６２】
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【０５６３】
図４９は、ＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢとの組み合わせのすべてが、腫瘍増殖の阻害という観点から、ビヒクル群及びＦｏｌＲ１  ＣＤ３  ＴＣＢのみと比較して、やや改善された有効性を示したことを示している。異なる組み合わせ間に統計的な差異は観察できなかった。
【０５６４】
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【０５６５】
実施例１６
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＣＢ媒介性標的化Ｔ細胞の殺傷を支持するＦＡＰ  ４−１ＢＢＬの能力の評価
ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬの、ＴＣＢ媒介性腫瘍細胞殺傷を支持する能力を評価するために、精製したＣＤ８＋Ｔ細胞又はｐａｎＴ細胞をエフェクター細胞として使用し、ＲＦＰ発現ＭＶ３メラノーマ細胞を腫瘍標的として使用した。エフェクター細胞を、健常なドナーのバフィーコートから負の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により精製した。１ウェル当たり１０５個のエフェクター細胞を、平底９６ウェルプレートにおいて、５０００個のＭＶ３標的細胞を用いて共培養した。５ｐＭのＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢのみ又は１ｎＭのＦＡＰ  ４−１ＢＢＬとの組み合わせの存在下におけるＭＶ３標的細胞の殺傷を、５日間にわたってモニターし、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージャ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて３時間ごとに１ウェル当たり４つの画像を捕捉し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＲＦＰ＋  標的細胞を数えた。経時的な１画像当たりのＲＦＰ＋対象物の数は、標的細胞の死の代理として役立った。ＴＣＢ媒介性の標的細胞殺傷を、エフェクターＴ細胞のみの存在下でのＭＶ３標的細胞数（＝ベースラインコントロール）を経時的にモニターすることにより、標的細胞の自然死から区別した。ＴＣＢによる殺傷を、１００−ｘ（ｘはベースラインコントロールに対する％標的）として計算した。統計的分析は、経時的な％殺傷の曲線下面積（ＡＵＣ）を比較して、スチューデントｔ検定を用いて実施した。
【０５６６】
ＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性標的細胞殺傷は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（３名のドナー中３名）及びｐａｎＴ細胞（３名のドナー中３名）について、ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬにより有意に増加した。実験期間を通してＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢのみによる標的細胞の殺傷が観察できたが、実験終了の時点で殺傷は効果的でなく、標的細胞の増殖は、精製ｐａｎＴ細胞を使用する３／３のドナー及び精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する１／３のドナーにおいてベースラインレベルに到達した。対照的に、標的細胞の殺傷は、ＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢとＦＡＰ  ４−１ＢＢＬとの組み合わせを用いたすべてのドナーにおいて効果的であり、８９％の殺傷（ＣＤ８＋Ｔ細胞）及び７２％の殺傷（ｐａｎＴ細胞）で平均プラトーを達成した。このことは、ＭＣＳＰ  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性標的細胞殺傷に対するＦＡＰ  ４−１ＢＢＬの強力な支持能を示すものであった（図５２及び５３参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ−Ｄ】
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【図２８Ｅ−Ｈ】
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【図２９Ａ−Ｄ】
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【図２９Ｅ−Ｈ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ−Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ａ−Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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