(57)【要約】  本発明は、ｍ２Ｅ６と示されるマウス抗体、キメラｃｈ２Ｅ６、ならびに３つのヒト化形態（２Ｅ６−ＨＬＤ１、２Ｅ６−ＨＬＤ２および２Ｅ６−ＨＬＤ３）およびより高い親和性の抗体を生成するためのＨＬＤ１の親和性成熟形態：７Ａ１０、５Ａ１、９Ｄ７、９Ｇ１１、７Ｃ４、Ｌ３、８Ｄ９、９Ｃ１２または６Ｂ６に関する。
2020504717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−シヌクレインにおけるアミノ酸１２６〜１４０（配列番号２）内のエピトープに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記エピトープへの結合について、抗体ｍ２Ｅ６、ｃｈ２Ｅ６、２Ｅ６−ＨＬＤ１、２Ｅ６−ＨＬＤ２または２Ｅ６−ＨＬＤ３、７Ａ１０、５Ａ１、９Ｄ７、９Ｇ１１、７Ｃ４、Ｌ３、８Ｄ９、９Ｃ１２または６Ｂ６のいずれかと競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体が、無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）およびドメイン抗体（例えば単一のＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特性：
・０．５〜１０ｎＭ、例えば１〜５ｎＭまたは１〜２ｎＭの、α−シヌクレインに対する結合親和性（ＫＤ）；
・神経細胞内のα−シヌクレイン原線維の蓄積を阻害する能力；
・細胞から細胞へのα−シヌクレイン原線維の移動を阻害する能力；
・α−シヌクレインの細胞内シーディングを阻害する能力；
・Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力；
・インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα−シヌクレインのレベルを減少させる能力；
・慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける、視床下核（ＳＴＮ）内の病理学的な不規則なおよびバーストの発火パターンを正常化する能力；および／または
・慢性的に投与されるときの、トランスジェニックα−シヌクレインマウスの海馬中のＰＰＦの障害を改善する能力
の１つ以上を示す、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号６、７および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項１０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
配列番号２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１２および１３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
配列番号２１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
配列番号２１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１５および１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１８および１９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
配列番号２６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項２１および２２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
配列番号２７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
配列番号２７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項２４および２５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
配列番号４５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
配列番号４６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
配列番号４５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項２７および２８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
以下のＣＤＲ：
・配列番号９または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
配列番号９、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項３０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
以下のＣＤＲ：
・配列番号１２または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項３０および３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
配列番号１２、７および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項３２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
配列番号３５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項３０または３１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
配列番号３６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項３２または３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
配列番号３５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項３４および３５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
以下のＣＤＲ：
・配列番号１０または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
配列番号１０、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項３７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項３７または３８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
配列番号６、７および１８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項３９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項３７または３８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
配列番号４０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項３９または４０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４３】
配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項４１および４２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４４】
配列番号４１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項３７または３８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４５】
配列番号４２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項３９および４０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４６】
配列番号４１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項４４および４５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４７】
以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１１または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４８】
配列番号３、４および１１のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項４７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項４７または４８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
配列番号６、７および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項４９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５１】
配列番号３７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項４７または４８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５２】
配列番号３８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項４９または５０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５３】
配列番号３７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項５１および５２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５４】
以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５５】
配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項５４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５６】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号１３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項５４または５５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５７】
配列番号６、１３および１６のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項５６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５８】
配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項５４または５５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５９】
配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項５６または５７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６０】
配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項５８および５９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６１】
以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６２】
配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項６１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６３】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号１４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項６１または６２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６４】
配列番号６、１４および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項６３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６５】
配列番号３３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項６１または６２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６６】
配列番号３４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項６３または６４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６７】
配列番号３３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項６５および６６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６８】
以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６９】
配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項６８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７０】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号１５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項６８または６９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７１】
配列番号６、１５および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項７０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７２】
配列番号４３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項６８または６９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７３】
配列番号４４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項７０または７１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７４】
配列番号４３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項７２および７３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７５】
以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７６】
配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項７５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７７】
以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項７５または７６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７８】
配列番号６、７および１７のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項７７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７９】
配列番号３１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、請求項７５または７６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８０】
配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項７７または７８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８１】
配列番号３１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、請求項７９または８０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８２】
医薬に使用するための、請求項１〜８１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８３】
シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、請求項１〜８１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８４】
パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症を治療するのに使用するための、請求項８３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８５】
シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造における、請求項１〜８１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項８６】
パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症、多系統萎縮症、ならびに自身の遺伝子プロファイルおよび／または将来ＰＤを発症させる可能性が高い非ＰＤ中核症状に基づいてＰＤを発症するリスクのある人々を治療するための薬剤の製造における、請求項８５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項８７】
対象におけるシヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングする方法であって、請求項１〜８１に記載の抗体を、有効量で前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項８８】
前記対象が、パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症、多系統萎縮症に罹患している対象、ならびに自身の遺伝子プロファイルおよび／または将来ＰＤを発症させる可能性が高い非ＰＤ中核症状に基づいてＰＤを発症するリスクのある人々である、請求項８７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−シヌクレインに特異的に結合する新規な種類のモノクローナル抗体、ならびにシヌクレイノパチーの治療および診断にこれらの分子およびそれらのα−シヌクレイン結合フラグメントを使用する方法に関する。
【０００２】
配列表の参照：
本出願は、米国特許法施行規則（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２１条に従う１つまたは複数の配列表（以下参照）を含み、これは、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１０７４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１７年１２月１１日に作成され、４３ｋＢのサイズを有する）で開示され、このファイルは、全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
レビー小体病（ＬＢＤ）としても知られているシヌクレイノパチーは、タンパク質α−シヌクレインが主要成分であるレビー小体（ＬＢ）および／またはレビー神経突起として顕微鏡で見られる細胞内のタンパク質凝集体の堆積によって特徴付けられる（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２  Ｊａｎ；２７（１）：８−３０；ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４）。シヌクレイノパチーとしては、パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）およびびまん性レビー小体（ＤＬＢ）病（レビー小体認知症（ＤＬＢ）としても知られている、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合された（combined）アルツハイマー病およびパーキンソン病（ＰＤ）、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群））が挙げられる。シヌクレイノパチーは、パーキンソン病における主要な運動障害（固縮、運動緩徐、安静時振戦）の原因となるドーパミン作動性黒質線条体系の変性を有することが多いが、中枢神経系、末梢神経系および自律神経系および脳領域ならびに認知症および自律神経系障害などの非運動機能障害に関連する他の器官におけるレビー小体および変性レビー神経突起の広範な発生もある。非運動兆候および症状のいくつかは、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーにおいて運動症状に先立って起こるものと考えられる。このような初期兆候としては、例えば、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）および嗅覚の低下および便秘が挙げられる（Ｍａｈｏｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０１０）７５：４８８−４８９）。シヌクレイノパチーは、高齢化する人口において運動障害および認知力低下の一般的な原因であり続けている（Ｇａｌａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）５１：８８８−９５）。
【０００４】
視床下核（ＳＴＮ）における発火の増加および発火パターンの変化は、ＰＤの症状の一因となるものと考えられ、パーキンソン病状態におけるＳＴＮ放電は、皮質振動活動に強く同期される（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１３  Ａｐｒ  ２４；３３（１７）：７２２０−３３）。ＰＤ患者では、ＳＴＮニューロンが、θ（４〜８Ｈｚ）、α（８〜１２Ｈｚ）およびβ（１２〜３０Ｈｚ）帯域において振動性の発火パターンを変化させ（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２００２；１２５：１１９６−１２０９）、隣接するＳＴＮ単位およびβ帯域のＳＴＮ局所フィールド電位（ＬＦＰ）への同期を増大している（Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２００８；１３１：３３９５−３４０９）。ヒトＰＤと同様に、ＰＤの動物モデルでは、例えば、規則的な発火パターンを有するニューロンのパーセンテージが低下した一方、不規則な、混合された、またはバーストパターンが増加した点で、発火パターンの顕著な変化が、ＳＴＮにおいて観察された（Ｒｙｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２０１１；Ｎｏｖ  １４；５０５（２）：１１３−８）。光遺伝学（Ｏｐｔｏｇｅｎｉｃ）は、高周波刺激を用いてＳＴＮ求心性線維を確実に駆動し、回転行動によって測定されるＰＤ症状を可逆的に改善した（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；Ａｐｒ  １７；３２４（５９２５）：３５４−９）。同様に、ＳＴＮの脳深部刺激は、動物モデル（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）およびヒト患者（Ｈｉｃｋｅｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｃｙ  Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；Ａｐｒ  ２８；１０：１７３において概説されている）においてＰＤ症状を改善することができる。
【０００５】
α−シヌクレインは、β−およびγ−シヌクレインおよびシノレチン（ｓｙｎｏｒｅｔｉｎ）を含むタンパク質のファミリーの１つである。α−シヌクレインは、シナプスに関連して正常な状態で発現され、シナプス小胞放出を調節し、それによって、神経伝達、可塑性、学習および記憶に影響を与えるのに役割を果たすものと考えられる。
【０００６】
いくつかの研究により、α−シヌクレインがＰＤ発症に中心的役割を果たすことが示唆されている。タンパク質は、病的状態において、凝集して細胞内の不溶性原線維を形成し得る。例えば、ＬＢにおいてシヌクレインが蓄積する（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９−４０；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：３６７−７２；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５−８）。稀な家族性パーキンソン病では、α−シヌクレイン遺伝子の突然変異ならびにこの遺伝子の重複および三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が共分離する（Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６−８；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５−７）。
【０００７】
α−シヌクレインが、細胞外液中に分泌され、血漿および脳脊髄液（ＣＳＦ）中に存在し得るという重要な発見があった。例えばＰａｃｈｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）およびその他（Ｐａｃｈｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５  Ｍａｒ；１３２（６）：７３１−４；Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０００）９７：５７１−５７６；Ｖｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２：７８７１−７８７８，２００３）によるいくつかの研究により、細胞外シヌクレインが、脳において病因的役割を果たすことが示唆されている。それらの研究により、細胞外α−シヌクレインオリゴマーが、脳神経細胞膜に対して神経毒性を有することが実証された。シヌクレイン分泌のデータに基づいた別の興味深い仮説は、α−シヌクレインのプリオン様の広がりが、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーの進行の根底にあるというものである（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１４  Ｆｅｂ；１０（２）：９２−８；Ｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉ  ２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｍａｙ；１８（５）：２４８−５５）。これらの発見により、細胞外シヌクレインが、免疫療法によって標的にされ得るという期待が生じた（Ｖｅｋｒｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１  Ｎｏｖ；１０（１１）：１０１５−２５）。
【０００８】
天然α−シヌクレイン自己抗体は、ＰＤ患者および健常対照の両方において存在することが示されている。場合により、これらの群間で有意差はなく（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（１２）：ｅ５２２８５；Ｍａｅｔｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｆｅｂ  ２１；９（２）：ｅ８８６０４，Ｐａｐａｃｈｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００７  Ｍａｙ；１０１（３）：７４９−５６およびＷｏｕｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００２  Ｍａｙ  １４；５８（９）：１４３５−６）、場合により、ＰＤにおいてα−シヌクレインに対する自己抗体の増加されたレベル（Ｇｒｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  Ａｐｒ；２３３（１−２）：２２１−７、Ｇｒｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．２０１２；１９（６）：３３４−４２およびＹａｎａｍａｎｄｒａ  ２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１  Ａｐｒ  ２５；６（４）：ｅ１８５１３）または健常対照と比較してＰＤ患者におけるα−シヌクレインに対する減少された自己抗体が報告された（Ｂｅｓｏｎｇ−Ａｇｂｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１３  Ｊａｎ  ８；８０（２）：１６９−７５）。血中抗α−シヌクレイン自己抗体が、α−シヌクレイン凝集に関して保護的役割を果たし得る可能性が、この自己抗体の発見後、ごく早々に示唆された（Ｗｏｕｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００２  Ｍａｙ  １４；５８（９）：１４３５−６）。
【０００９】
トランスジェニックマウスにおけるα−シヌクレインの過剰発現は、レビー小体病のいくつかの病理学的側面に類似している。α−シヌクレインを過剰発現するマウスのいくつかの異なる遺伝子導入系が、過去１０年間で作成された（以下の報告に記載されている：Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｍａｙ  ３１；８（５）：ｅ６４６４９；Ｆｌｅｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ，２００６，Ｂｅｈａｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６  Ｓｅｐ；１７（５−６）：３８３−９１；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｈｌｅ  ２００６，Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．２００６  Ｓｅｐ；６（５）：４３２−６）。Ｔｈｙ−１およびＰＤＧＦ−βプロモータを有するマウス系統が、運動障害および認知障害を発症し、インビボでα−シヌクレインに対する抗体の神経保護的効果を実証するのに使用されている。しかしながら、ドーパミン作動性ニューロンの確固たる変性を有する遺伝子導入系はなく、多くの場合、運動表現型が、運動ニューロンにおける発現によって駆動され、これは、通常、パーキンソン病において悪化しない。したがって、潜在的疾患調節治療の好結果が、ドーパミン作動性ニューロンまたは他の中枢神経系ニューロンに対する効果を介して仲介されるかどうかは定かではない。
【００１０】
トランスジェニックマウスモデルにおける１つに確固たる発見は、ヒトα−シヌクレインの慢性過剰発現が、シナプス機能を損なうというものであった。インビトロおよびインビボ系の両方における研究を用いて、野生型（ｗｔ）ヒトα−シヌクレインの過剰発現が、海馬におけるシナプス伝達を損なったことが示された（Ｎｅｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｎｅｕｒｏｎ．２０１０  Ｊａｎ  １４；６５（１）：６６−７９；Ｐａｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ａｕｇ  １；８（８）：ｅ７０２７４）。これは、海馬のＣＡ１領域において示され、この領域では、両方の研究が減少した基底シナプス伝達を発見した。この背景にある機構は、シナプス放出の機能不全につながるα−シヌクレインの細胞内蓄積であると考えられた。しかしながら、シナプスにおける細胞外空間中へのα−シヌクレインの分泌およびシナプス機能に対するα−シヌクレインオリゴマーの毒性作用に関する最近の発見は、シナプス機能障害における細胞外α−シヌクレインの役割の可能性を開き、ひいては治療用抗体が障害を救う能力に扉を開くものである。
【００１１】
α−シヌクレインを過剰発現するためのウイルスベクターの使用は、げっ歯類のＰＤをモデル化する重要な方法であるが、その理由は、この手法が、マウスまたはラットにおける遺伝子突然変異によってまだ再現されていない特徴である、黒質線条体ニューロンの比較的速い進行性変性を生じるためである（Ｋｉｒｉｋ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３  Ｊｕｌ；２６（７）：３８６−９２）。さらに、ウイルス遺伝子送達は、ｗｔ  α−シヌクレインが黒質線条体病変を誘発する能力を明らかにし（Ｋｉｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２  Ａｐｒ  １；２２（７）：２７８０−９１）、これは、α−シヌクレイン重複および三重重複を有する家族性のＰＤのエビデンスと一致する発見である（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，２００６，Ｎｅｕｒｏｎ．２００６  Ｏｃｔ  ５；５２（１）：３３−８）。ある研究では、α−シヌクレインに対するヤギ抗体が、ドーパミン作動性細胞死からＮ末端を保護し、パーキンソン病のＡＡＶ−α−シヌクレインに基づくラットモデルの行動障害を改善したことが示されている（Ｓｈａｈａｄｕｚｚａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５  Ｆｅｂ  ６；１０（２）：ｅ０１１６８４１）。
【００１２】
α−シヌクレイン病変のプリオン様の広がりは、α−シヌクレイン病変を発現させ、ドーパミン作動性細胞死も発現させることが最近示された（Ｌｕｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ｎｏｖ  １６；３３８（６１０９）：９４９−５３）。このモデルは、α−シヌクレイン抗体が、この病変を改善することができることを示すのに使用された（Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１４  Ｊｕｎ  ２６；７（６）：２０５４−６５）。このモデルにおいて、抗体治療は、いくつかの脳領域（黒質にドーパミン作動性ニューロンを含む）におけるリン酸化α−シヌクレインの蓄積を減少させ、運動障害の発現を減少させることができた。
【００１３】
突然変異に加えて、α−シヌクレイン遺伝子の選択的スプライシングおよびタンパク質の翻訳後修飾（リン酸化、ユビキチン化、ニトロ化、および切断など）が、α−シヌクレインの凝集および／または毒性形態を形成する強化された能力を有するα−シヌクレインタンパク質形態を生じ得る（Ｂｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ａｒｉｚａ，Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；４７（２）：５０９−２４）。しかしながら、α−シヌクレインの正確な病理学的な種は、依然として不明である。オリゴマーから原線維に及ぶ様々なミスフォールド／凝集／分泌された種、および様々な翻訳後修飾が、毒性と関連付けられているが、実際に１つの毒性種があった場合でさえ、どれが最も重要かについての意見の一致はない。ＰＤ、ＤＬＢおよびＭＳＡに罹患している患者における変化したレベルのα−ｓｙｎスプライスアイソフォームの存在が、最近報告された（Ｃａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２０１４；５６２（６）：４５−４９、およびＢｒｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２０１６．Ｊａｎ；１３６（１）：１７２−８５）。１１２−α−シヌクレインアイソフォームのより高い凝集可能性（Ｍａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１４  Ｊｕｎ  ３；９（６））は、増加したレベルとともに、ＰＤの病態生理またはＭＳＡなどの関連する病変に役割を果たし得る。
【００１４】
全体的に、ヒト、マウス、およびハエなどの様々な動物モデルにおける同様の形態学的および神経学的変化を有するα−シヌクレインの蓄積は、この分子が、レビー小体病の発症において中心的な役割を果たすことを示唆している。
【００１５】
α−シヌクレインに対するいくつかの異なる抗体が、前臨床動物モデルにおいて治療効果を有することが示されている。α−シヌクレイン残基９１〜９９を含むエピトープを標的にする抗体およびα−シヌクレイン残基１１８〜１２６を含むエピトープを標的にする抗体は両方とも、トランスジェニックマウスの運動障害および認知障害に対する効果を与えることが示されている（Ｇａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４  Ｊｕｌ  ９；３４（２８）：９４４１−５４）。最先端のこれらの抗体は、α−シヌクレイン残基１１８〜１２６を含むエピトープを標的にし、現在、臨床試験のフェーズＩの段階にある、マウスモノクローナル抗体９Ｅ４に基づいたヒト化抗体である。α−シヌクレイン残基１２０〜１４０を含むエピトープを標的にするＣ末端抗体２７４（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２  Ｓｅｐ  ２６；３２（３９）：１３４５４−６９）も、前臨床モデルにおいて、細胞から細胞への病変の広がりに対する効果を有することが示された。これらに加えて、α−シヌクレインのオリゴマーおよび原線維などの立体配座種を標的にする抗体は、これらのおそらく毒性のα−シヌクレイン種のレベルを少なくとも低下させることができることが示された（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．２０１４  Ｓｅｐ；６９：１３４−４３およびＳｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｏｃｔ；２２（１０）：１７５３−６７）。ｍａｂ４７などの、インビボでα−シヌクレインオリゴマーレベルを低下させるこれらの立体配座抗体も、アミノ酸１２１〜１２５からの、α−シヌクレインのＣ末端におけるエピトープを標的にすることが示された（米国特許出願公開第２０１２０３０８５７２号明細書）。他の立体配座、原線維およびオリゴマー特異的抗体も、Ｃ末端配列を標的にする（Ｖａｉｋａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．２０１５；７９：８１−９９）。
【００１６】
本発明は、完全長α−シヌクレインに結合するマウス抗体２Ｅ６（およびヒト化、キメラおよび親和性成熟形態）に関する。この抗体は、機能的スクリーニングにおいて、α−シヌクレインに対する５０のモノクローナル抗体の中でも特に優れており、α−シヌクレイン原線維の細胞内蓄積を防ぐのに意外にも効率的であることが分かった。それは、意外にも、ヒト病変脳からの病理学的α−シヌクレインへの結合に優れ、別のα−シヌクレイン抗体９Ｅ４より、α−シヌクレインの多くのより切断されたあるいはスプライシングされた種に結合することも分かった（Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１，Ａｐｒ  ２９；６（４）−米国特許第８６０９８２０号明細書に公開される配列）。抗体２Ｅ６は、インビトロでα−シヌクレイン凝集を防ぐことができ、α−シヌクレインの予め形成された凝集体を溶解させることができる。α−シヌクレインの凝集形態は、抗体とともに免疫複合体を形成することができ、抗体２Ｅ６の存在は、Ｆｃ媒介性食作用を介してこれらの免疫複合体の取り込みを増加させる。抗体２Ｅ６は、原線維に結合し、原線維をブロックするかまたは失活させて、原線維が細胞モデルにおいて新たなα−シヌクレイン凝集体をシーディングするのを防ぐ。インビボで、この抗体は、単回の末梢投与（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｄｏｓｅ）の後、トランスジェニックα−シヌクレインマウスにおけるニューロン発火の障害を改善することができ、数か月にわたって長期間投与されると、この抗体は、小胞放出の障害に対するα−シヌクレイン過剰発現の影響を低減する。この効果は、この抗体で治療されたヒトＰＤ患者におけるシナプス伝達の改善につながり得る。
【００１７】
最後に、本発明者らは、ラットα−シヌクレインパーキンソン病モデルにおいて、２か月間の長期治療の後、抗体２Ｅ６が、ＳＴＮにおいてニューロンの病理学的な不規則な発火を改善することができることを示す。ＳＴＮの病理学的活動が、ＰＤ症状において主な役割を果たすため、皮質視床経路における病理学的変化の改善は、運動障害の改善にとって重要である。
【００１８】
親マウス抗体は、α−シヌクレイノパチーの治療のために治療用抗体を生成するために、ヒト化および親和性成熟されている。ヒト化抗体ならびに親和性成熟形態は、親抗体と同じ結合および細胞ベースの機能を保っている。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、ｍ２Ｅ６と示されるマウス抗体、キメラｃｈ２Ｅ６、ならびに３つのヒト化形態（２Ｅ６−ＨＬＤ１、２Ｅ６−ＨＬＤ２および２Ｅ６−ＨＬＤ３）およびより高い親和性の抗体を生成するためのＨＬＤ１の親和性成熟形態：７Ａ１０、５Ａ１、９Ｄ７、９Ｇ１１、７Ｃ４、Ｌ３、８Ｄ９、９Ｃ１２または６Ｂ６に関する。
【００２０】
本発明は、α−シヌクレイン上のエピトープへの結合について、本明細書に開示される前記抗体、特に２Ｅ６およびＨＬＤ−１と競合することが可能なモノクローナル抗体にも関する。
【００２１】
この特異的モノクローナル抗体は、本明細書の請求項１〜８１に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】スクリーニングカスケードを示す。３匹のマウスを、様々な凝集形態のα−シヌクレインで免疫化した。マウスを、高い力価についてスクリーニングし、モノクローナル細胞株を生成した。α−シヌクレインＥＬＩＳＡを用いて、５０の陽性クローンを、約１０００のウェルから回収した。α−シヌクレインを認識する５０のモノクローナル抗体を、ＳＫ−ｍｅｌ５細胞内の原線維化α−シヌクレインの蓄積を防ぐそれらの能力についてスクリーニングした（実施例１）。意外にも、ごくわずかな（５０のうち４つの）α−シヌクレイン抗体のみが、原線維化α−シヌクレインの蓄積を阻害することができた。ｍ２Ｅ６を、最も効率的な抗体として選択し、ＰＤの細胞および動物モデルにおいてさらにプロファイルした。さらに、ｍ２Ｅ６をヒト化して、２Ｅ６−ＨＬＤ−１、２および３にし（実施例２）、２Ｅ６−ＨＬＤ１をさらに親和性成熟して、ＨＬＤ１−７Ａ１０にした。α−シヌクレインに対する全ての変異体についての動力学的結合データが、表５、６および７に列挙されている（実施例２）。
【図２】α−シヌクレインアミノ酸配列１３６〜１４０からのペプチドに対する抗体ｍ２Ｅ６のエピトープマッピングからのＥＬＩＳＡデータを示す（他の非結合ペプチドは、示されていない）。上側のパネルは、ペプチド配列ＹＥＰＥＡが、抗体ｍ２Ｅ６の完全な結合のために必要とされることを示す。真ん中のパネルは、チロシン残基がニトロ−チロシンで置換された（配列中で番号５として示される）、同じペプチドを示す。チロシン１３６のニトロ化は、ペプチドへの抗体の結合をなくした。下側のパネルは、選択されたアミノ酸の二重アラニンスキャニング変異誘発を示す。配列中に存在する二重アラニン置換は、最後から二番目のアミノ酸Ｐ１３８、Ｅ１３９、およびＡ１４０への重要な役割を示す（実施例３）。
【図３】レビー小体認知症患者（ＤＬＢ）および月齢をマッチさせた健常対照（ＣＴＲ）からの５つの脳ホモジネート間のα−シヌクレインおよびリン酸化（Ｓｅｒ１２９）α−シヌクレインの含量の差を示す。これらのホモジネートは、病理学的形態、すなわち、凝集形態およびＳｅｒ１２９でリン酸化された形態のα−シヌクレインを富化するためのさらなる分別に使用される（実施例４）。
【図４】ｍ２Ｅ６およびｍ２Ｅ６のヒト化形態：２Ｅ６−ＨＬＤ１、２および３抗体を用いた、ＤＬＢ患者（太字の文字のレーン）および月齢をマッチさせた健常対照（ＣＴＲ）（灰色の文字のレーン）からの可溶性画分（Ｓ１）および病理学的形態のα−シヌクレインに富む画分（Ｐ１およびＰ２）からのα−シヌクレインの免疫沈降を示す。この図は、ｍ２Ｅ６およびヒト化変異体２Ｅ６−ＨＬＤ１−３が、比較例のα−シヌクレイン抗体９Ｅ４（マウスおよびヒト化形態の両方）と著しく異なっていることを示す。ｍ２Ｅ６およびヒト化変異体は、切断あるいはスプライス形態のα−シヌクレインを免疫沈降させることができる一方、９Ｅ４は免疫沈降させなかった。さらに、ｍ２Ｅ６およびヒト化変異体は、Ｐ１およびＰ２画分中の病理学的凝集形態のα−シヌクレインを認識する一方、９Ｅ４は認識しない（実施例４）。
【図５】ｍ２Ｅ６によるインビトロでのα−シヌクレイン凝集の阻害を示す。モノマーα−シヌクレインを、数日間にわたって３７℃でインキュベートするとき、アミロイドへのα−シヌクレインの凝集を示すチオフラビン蛍光の増加がある（対照曲線）。モノマーα−シヌクレインと混合される増加する量のｍ２Ｅ６は、チオフラビン蛍光の増加の用量依存的阻害を示す（実施例５）。
【図６】ｍ２Ｅ６によるα−シヌクレイン原線維の解離を示す。予め形成されたα−シヌクレイン原線維を、超音波処理して、それらを分解してより小さい微小原線維にした。抗体ｍ２Ｅ６を、異なるモル比で、超音波処理された原線維に加えた。抗体なしの対照原線維（ａｂなし）またはα−シヌクレイン（Ｂ１２）に結合しないアイソタイプ対照抗体とともにインキュベートされた原線維は、電子顕微鏡法によって視覚化される広範な線維性ネットワークを示す。様々な濃度のｍ２Ｅ６とともにインキュベートされた原線維は、より大きい原線維の用量依存的減少を示す。
【図７−１】ｍ２Ｅ６が、培地中でα−シヌクレイン原線維に結合し、非食細胞内のそれらの蓄積を阻害することを示す。Ａ）細胞培養培地に加えられるα−シヌクレイン原線維の免疫沈降。これは、ｍ２Ｅ６が、α−シヌクレイン原線維を認識し、培地からプルダウンすることができた一方、対照抗体Ｂ１２（非反応性ヒトＩｇＧ）および別のα−シヌクレイン抗体５Ｇ４（Ｒｏｂｏｓｃｒｅｅｎ製）はできなかったことを示した。Ｂ）α−シヌクレイン原線維および抗体で２４時間にわたって処理され、次に、洗浄および溶解されたＳＨＳＹ−５Ｙ細胞のウエスタンブロット。これは、２Ｅ６−ＨＬＤ１が、細胞内に蓄積される原線維の量を減少させた一方、Ｂ１２抗体は減少させなかったことを示した。Ｃ）ＳＫｍｅｌ５細胞内のα−シヌクレイン原線維の蓄積の自動化蛍光イメージング、指示されるとおり、原線維、ｍ２Ｅ６およびα−シヌクレインペプチドとともに２４時間にわたる共インキュベーション。これは、ｍ２Ｅ６が、この細胞内の原線維の蓄積を減少させることを示した。この効果は、それがｍ２Ｅ６のエピトープをカバーするペプチド１２６〜１４０によって阻害され得たが、このエピトープ外のペプチド（アミノ酸１１３〜１２０）によって阻害され得なかったため、特異的である。Ｄ）ＳＫｍｅｌ５細胞内のα−シヌクレイン原線維の蓄積、２４時間、０．１〜１０μｇ／ｍｌの親和性成熟２Ｅ６−ＨＬＤ１抗体、２Ｅ６＿７Ａ１０の用量反応。したがって、２Ｅ６＿７Ａ１０は、溶液中のα−シヌクレイン原線維に結合し、用量依存的にこの細胞内のそれらの蓄積を減少させる。星印（＊＊＊）は、両側ｔ検定において、原線維のみと比較したときの、０．０００１未満のｐ値を示す（実施例６）。
【図７−２】図７−１の説明と同じである。
【図８】ｍ２Ｅ６が、原線維化された、哺乳動物産生α−シヌクレインに培地中で結合し、一次皮質ニューロン内のその蓄積を阻害することを示す。Ａ）は、２Ｅ６変異体の全てが、培地からα−シヌクレインオリゴマー、完全長およびいくつかの切断形態（より弱い低分子量バンド）の両方をプルダウンしたことを示す。比較例の抗体ｍ９Ｅ４も、完全長α−シヌクレインをプルダウンしたが、９Ｅ４のヒト化形態（米国特許出願公開第２００８０１７５８３８号明細書）は、α−シヌクレインの切断形態および１４ｋＤａの完全長形態の両方の免疫沈降においてはるかに効率性が低く、これは、培地中で哺乳動物タンパク質にあまり結合しないことを示す。別の比較例の抗体（Ｂｉｏｇｅｎ製の１２Ｆ４、米国特許第８，９４０，２７６号明細書）は、Ｂ１２対照とそれほど異ならない弱いバンドを示したに過ぎなかった。Ｂ）は、ｍ２Ｅ６抗体によるインキュベーションが、一次皮質ニューロン中の細胞内α−シヌクレイン凝集体の蓄積の減少をもたらすことを示す。Ｃ）およびＤ）は、（同じ実験からの２つの読み取りにおいて）Ｓｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦ（予め形成された原線維＝ＰＦＦ−哺乳動物α−シヌクレインを、原線維にし、それを超音波処理して、ＰＦＦ−前駆体またはシードを生成して、完全な原線維にする）と、非反応性Ｂ１２または比較例の９Ｅ４抗体のいずれかとの共インキュベーションが、細胞内のＳｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦの蓄積を変化させなかった一方、ｍ２Ｅ６または２Ｅ６−ＨＬＤ１による処理は、蓄積のレベルをバックグラウンドレベルまで減少させたことを示す。単独のＳｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦで処理された細胞は、細胞当たり約４．５のスポットを示し（図８Ｄ）；同様に、Ｂ１２またはｈ９Ｅ４は、これを大きく変化させなかった。ｍ２Ｅ６、ｈ２Ｅ６−ＨＬＤ２またはｈ２Ｅ６−ＨＬＤ３による処理は、蓄積のレベルを著しく減少させ（細胞当たり約３スポットまで）、２Ｅ６−ＨＬＤ１は、スポットの数がより少なくなる傾向を示した（実施例６）。
【図９】２Ｅ６が、馴化培地中でα−シヌクレイン原線維に結合し、細胞間の移動を阻害することを示す。Ａ）２４時間にわたってα−シヌクレイン原線維で処理されたＳＫ−ｍｅｌ５細胞からの馴化培地の免疫沈降。培地を採取し、ＩＰ（免疫沈降）に使用した。２Ｅ６は、α−シヌクレインを効率的に免疫沈降させた。Ｂ）培地へのα−シヌクレイン原線維の添加の後、細胞内α−シヌクレイン原線維を蓄積した細胞のパーセンテージを、α−シヌクレインスポットを含有する細胞％として「フィーダー」プレート上で定量し、Ｃ）フィーダー細胞からの培地を、レシピエントプレートに移し、同様に、細胞内α−シヌクレイン原線維を含む細胞のパーセンテージを、「レシピエント」プレート上で定量した。Ｂ）およびＣ）は、ｍ２Ｅ６が、「フィーダー」および「レシピエント」プレートの両方においてα−シヌクレイン凝集体（スポット）を有する細胞の数を有意に減少させることを示す。比較例の抗体１Ｈ７（国際公開第２００５０４７８６０号パンフレット）は、いずれのプレートにも影響を与えなかった。対照抗体（Ｂ１２）は、同様に、影響を与えなかった（実施例６）。
【図１０Ａ】２Ｅ６−ＨＬＤ１が、内因性α−シヌクレインのシーディングを用量依存的に阻害することを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＡタグを有するαシヌクレイン発現プラスミドでトランスフェクトした後、αシヌクレイン原線維のトランスフェクションおよび様々な濃度の２Ｅ６−ＨＬＤ１の添加を行った。４８時間後、細胞溶解物を、超遠心分離によって、ＴｒｉｔｏｎおよびＳＤＳ可溶性画分に分別し、免疫ブロットによって分析した。ＨＡタグを有するαシヌクレインは、１７ＫＤより速く泳動する。ホスホ−シヌクレインおよびβ−アクチンの比率を、不溶性α−シヌクレイン（ＳＤＳ可溶性画分）の定量に使用した。Ａ．ＨＥＫ２９３細胞からのＳＤＳ可溶性画分のウエスタンブロット。上部の画像は、ヒトαシヌクレイン、およびβ−アクチンに対する抗体を検出する、抗体４Ｂ１２を用いた免疫ブロットを示す。下部の画像は、ホスホ−シヌクレインを検出する、抗体Ａｂ５１２５３を用いた免疫ブロットを示す。２Ｅ６−ＨＬＤ１による処理は、対照抗体、Ｂ１２と比較した、α−シヌクレイン凝集およびリン酸化の用量依存的阻害を示す。Ｂ．図１０Ａからのホスホ−シヌクレインにおけるウエスタンブロットの定量。２Ｅ６−ＨＬＤ１は、不溶性画分への可溶性α−シヌクレインの転化を、用量依存的に阻害した（実施例６）。
【図１０Ｂ】図１０Ａの説明と同じである。
【図１１】Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達および二発刺激促通の障害を示す。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度（ａ）の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。短期シナプス可塑性を、二発刺激促通（ｂ）の誘発によって評価し、ここで、様々な刺激間間隔を有する二重の刺激を加え、第２のｆＥＰＳＰおよび第１のｆＥＰＳＰの傾きの間の比率を測定した。全てのデータを、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）（実施例７）。
【図１２】Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達および二発刺激促通の障害に対する９Ｅ４（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の急性効果を示す。図１２において、興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。９Ｅ４は、この障害を部分的に改善することができた。図１３において、短期シナプス可塑性を、二発刺激促通の誘発によって評価し、ここで、様々な刺激間間隔を有する二重の刺激を加え、第２のｆＥＰＳＰおよび第１のｆＥＰＳＰの傾きの間の比率を測定した。９Ｅ４は、この障害を改善することができなかった。全てのデータを、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析した（実施例７）。
【図１３】図１２の説明と同じである。
【図１４】Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達の障害に対するｍ２Ｅ６（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の急性の有益な効果を示す。図１４において、興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。ｍ２Ｅ６は、この障害を完全に改善することができた。
【図１５】短期シナプス可塑性を、二発刺激促通の誘発によって評価し、ここで、様々な刺激間間隔を有する二重の刺激を加え、第２のｆＥＰＳＰおよび第１のｆＥＰＳＰの傾きの間の比率を測定した。ｍ２Ｅ６は、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおけるＰＰＦの障害に対する急性効果を与えなかった（しかしながら、長期治療後の効果が観察された）。全てのデータを、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析した（実施例７）。
【図１６】基底シナプス伝達の障害の改善におけるｍ２Ｅ６の急性の用量依存的効果を示す。Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達の障害に対する５（図１６）および２．５（図１７）ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））でのｍ２Ｅ６の効果。データは、この障害の改善に対するｍ２Ｅ６の用量依存的効果を示す。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰｓ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。全てのデータを、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析した（実施例７）。
【図１７】図１６の説明と同じである。
【図１８】基底シナプス伝達の障害の改善における、キメラ、ｃｈ２Ｅ６（ｍ２Ｅ６可変領域）と比較して、ヒト化２Ｅ６：２Ｅ６−ＨＬＤ１の低用量で向上した有効性を示す。Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達および二発刺激促通の障害に対する２．５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の両方でのｃｈ２Ｅ６および２Ｅ６−ＨＬＤ１の急性効果。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰｓ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。ｃｈ２Ｅ６は、この障害の改善に対する強い傾向を示した一方、同じ低用量のヒト化形態２Ｅ６−ＨＬＤ１は、この障害を完全に改善した。
【図１９】短期シナプス可塑性を、二発刺激促通の誘発によって評価し、ここで、様々な刺激間間隔を有する二重の刺激を加え、第２のｆＥＰＳＰおよび第１のｆＥＰＳＰの傾きの間の比率を測定した。ｍ２Ｅ６で観察されるように、キメラ２Ｅ６は、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおけるＰＰＦの障害に対する顕著な効果を与えなかった。全てのデータを、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析した（実施例７）。
【図２０】ｍ２Ｅ６が、自由運動マウスにおいてα−シヌクレインの細胞外濃度を減少させる一方、９Ｅ４は減少させないことを示す。図２０は、自由運動Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のヒトα−シヌクレインのレベルに対する２Ｅ６または対照アイソタイプ５Ｃ９の全身投与（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の効果を示す。基底ヒトα−シヌクレインを、２つの連続した試料中のヒトα−シヌクレイン濃度の平均として取り（１１．９±２．４ｎｇ／ｍｌ）、それを、同じ動物内で１００％に設定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１；対照アイソタイプ抗体５Ｃ９に対して２Ｅ６。
【図２１】ｍ２Ｅ６が、自由運動マウスにおいてα−シヌクレインの細胞外濃度を減少させる一方、９Ｅ４は減少させないことを示す。図２１は、自由運動Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のヒトα−シヌクレインの細胞外濃度に対するｈ９Ｅ４または対照アイソタイプ抗ｈｅｌの全身投与（両方とも１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の効果を示す。基底ヒトα−シヌクレインを、２〜３つの連続した試料中のヒトα−シヌクレイン濃度の平均として取り（７．８±１．２ｎｇ／ｍｌ）、それを、同じ動物内で１００％に設定した（実施例８）。
【図２２】ラットα−シヌクレインＡＡＶモデルにおける抗体処理、ウイルス感染および電気生理学的測定についての時系列の概略図を示す（実施例９）。
【図２３】１つの脳領域、視床下核内のニューロン活動のパターンが、ヒトα−シヌクレインが過剰発現されたラットにおいて変化されることを示す。ｍ２Ｅ６による処理は、異常なニューロン発火パターンを正常化する。非処理のＧＦＰ過剰発現ラットまたはウイルス注入後８〜１０週間にわたって対照ｍＩｇＧ１またはｍ２Ｅ６（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．）、週に２回）のいずれかで処理されたα−シヌクレイン過剰発現ラットにおけるＳＴＮニューロンの発火パターン。図２３において、スパイク間隔の変動係数（ＣＶ）を、一元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニポストホック検定によって分析した。ｍ２Ｅ６による処理は、それらのＣＶ  ＩＳＩの減少に対する有意でない傾向をもたらした。図２４において、規則的な、不規則なまたはバーストの発火パターンでのニューロン発火の割合を、カイ二乗検定によって分析した。ｍ２Ｅ６による処理は、３つの異なる発火パターンを示すニューロンの割合の有意な正常化を誘発した。Ｎ：動物の数；ｎ：ニューロンの数。＊＊、ＰＢＳで処理されたα−シヌクレインラットを、非処理のＧＦＰラットと比較した、＊＊  ｐ＜０．０１。
【数１】
2020504717.tif 000003
を、α−シヌクレイン過剰発現ラット中のｍＩｇＧ１と比較した、
【数２】
2020504717.tif 000004
（実施例９）。
【図２４】図２３の説明と同じ。
【図２５】Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける二発刺激促通に対する長期治療後のｍ２Ｅ６（１６〜１８週間で１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の有益な効果を示す。Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウスの海馬中のシャファー側枝−ＣＡ１シナプスにおける二発刺激促通に対するｍ２Ｅ６または対照ｍＩｇＧ１（５Ｃ９）による長期治療。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。短期シナプス可塑性を、二発刺激促通（ＰＰＦ）の誘発によって評価し、ここで、様々な刺激間間隔を有する二重の刺激を加え、第２のｆＥＰＳＰおよび第１のｆＥＰＳＰの傾きの間の比率を測定した。全てのデータを、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析した（Ｔｇ−ｓｎｃａ＋５Ｃ９対月齢をマッチさせた対照＋５Ｃ９について、＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；＊＊＊  ｐ＜０．００１；Ｔｇ．ｓｎｃａ＋ｍ２Ｅ６対Ｔｇ−ｓｎｃａ＋５Ｃ９について、
【数３】
2020504717.tif 000005
)（実施例９）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用される際、「α−シヌクレイン」という用語は、α−シヌクレインタンパク質と同義であり、α−シヌクレインタンパク質アイソフォーム（例えば、Ｐ３７８４０、１−３としてＵｎｉＰｒｏｔにおいて同定される）のいずれかを指す。α−シヌクレインのアミノ酸の番号付けは、以下に示されるように配列番号１に対して示され、メチオニン（Ｍ）は、アミノ酸残基１である：
配列番号１：
【化１】
2020504717.tif 000006
【００２４】
本発明は、α−シヌクレイン、特に、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合することが可能な抗体および抗体のフラグメントに関する。特に、抗体およびそのフラグメントは、配列番号２、ヒトα−シヌクレインの１２６〜１４０のエピトープに特異的に結合する能力を示す。
【００２５】
本発明の文脈における「抗体」（Ａｂ）という用語は、分子（「抗原」）のエピトープに特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、または本発明のある実施形態によれば、免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然抗体は、典型的に、通常、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖から構成される四量体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および、３つの領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される重鎖定常領域から構成される。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む任意のアイソタイプのものであり得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。重鎖および軽鎖可変領域が、典型的に、抗原認識に関与する一方、重鎖および軽鎖定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存される配列の領域が散在する「相補性決定領域」と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲ（相補性決定領域）領域および４つのＦＲ領域から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含有する。特に関連があるのは、自然界に存在し得るものと異なる物理的環境中で存在するように「単離され」ているか、またはアミノ酸配列中の天然抗体と異なるように修飾された抗体およびそれらの抗原結合フラグメントである。
【００２６】
本明細書において使用される際、「抗体の抗原結合フラグメント」という用語は、エピトープに特異的に結合することが可能な抗体のフラグメントを意味する。抗原結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の１、２、３、４、５または６つ全てを含有してもよく、このようなエピトープに特異的に結合することが可能であるが、このような抗体のものと異なるこのようなエピトープに対して特異性、親和性または選択性を示し得る。しかしながら、好ましくは、抗原結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の６つ全てを含有するであろう。抗体の抗原結合フラグメントは、単一のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）、またはアミノ末端およびカルボキシル末端（例えば、二重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメントなど）をそれぞれ有する２つ以上のポリペプチド鎖を含んでもよい。抗原結合能力を示す抗体のフラグメントは、例えば、無傷の抗体のプロテアーゼ切断によって得られる。より好ましくは、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、このような遺伝子配列またはそれらのコードｃＤＮＡが、ＶＬおよびＶＨ領域が結合して一価抗原結合分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：５８７９−５８８３を参照）としてそれらが作製されるのを可能にするフレキシブルリンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。あるいは、単一のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨ領域が一緒に結合するのを可能にするには短すぎるフレキシブルリンカー（例えば、約９個未満の残基）を用いることによって、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または同様の分子（２つのこのようなポリペプチド鎖が一緒に結合して、二価抗原結合分子を形成する）を形成することができる（二重特異性抗体の説明については、例えばＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１４），６４４４−８（１９９３）を参照）。本発明の範囲内に包含される抗原結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価フラグメント、または国際公開第２００７０５９７８２号パンフレットに記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域から本質的になるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨ領域から本質的になるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨ領域から本質的になり、ドメイン抗体（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ；２ｉ（ｌｌ）：４８４−９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）またはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒ��  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ；５＿（ｌ）：ｌ  ｌｌ−２４）および（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖抗体または単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）を参照）としてそれらが作製されるのを可能にする合成リンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。本発明の文脈におけるこれらのおよび他の有用な抗体フラグメントは、本明細書においてさらに説明される。抗体という用語は、特に規定されない限り、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに酵素的切断、ペプチド合成、および組み換え技術などの任意の公知の技術によって提供される、抗原（抗原結合フラグメント）に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメントも含むことも理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。本明細書において使用される際、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を指す。このような抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ；所望のエピトープに結合することが可能な好適なフラグメントは、無傷の抗体と同じように有用性について容易にスクリーニングされ得る。
【００２７】
「二重特異性抗体」という用語は、それぞれ独立した標的を標的にする２つの独立した結合領域を含有する抗体を指す。これらの標的は、同じ標的上の異なるタンパク質または異なるエピトープであり得る。二重特異性抗体分子は、親単一特異性二価抗体分子のＨＣの定常領域における補償的アミノ酸改変を用いて作製され得る。得られるヘテロ二量体抗体は、２つの異なる親単一特異性抗体から与えられる１つのＦａｂを含有する。Ｆｃ領域におけるアミノ酸改変は、時間を経ても安定した二重特異性を有するヘテロ二量体抗体の向上した安定性をもたらす（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２８５，１９６３７−１９６４１（２０１０）、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ３：６  ５４６−５５７（２０１１）、Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ  ４２０，２０４−２１９（２０１２）、Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２５：１０  ５７１−５８０（２０１２）、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１０：１１３，５１４５−５１５０（２０１３）、Ｓｐｒｅｔｅｒ  Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ５：５  ６４６−６５４（２０１３））。二重特異性抗体は、ＳｃＦｖ融合を用いて生成される分子も含み得る。次に、２つの単一特異性ｓｃｆｖは、独立して、単一の二重特異性分子を生成するために安定したヘテロ二量体を形成することが可能なＦｃ領域に結合される（Ｍａｂｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＤＳ  ２３：３  １１５−１２７（２０１０）。二重特異性分子は、二重の結合能を有する。例えば、ＣＮＳ疾患を治療するために血液脳関門を横切って治療用抗体を送達するために、治療標的および経細胞輸送表面受容体の両方を標的にする。
【００２８】
本明細書において使用される際の「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、特にキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列など）を指すことが意図される。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲからの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ウサギ、またはラットなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエントにもインポートＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むが、これらは、抗体の性能をさらに改良し、最適化するために含まれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含み、ここで、ＦＲ領域の実質的に全てが、ヒトコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、それは、典型的に、ヒト免疫グロブリンのものである。抗体は、当業者に公知の修飾されたＦｃ領域を有し得る。他の形態のヒト化抗体は、元の抗体に対して改変された１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有し、これらは、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
【００２９】
本明細書において使用される際の「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異によって、または遺伝子再構成中に、または体細胞突然変異によって誘発される突然変異）。
【００３０】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を指す。従来のモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、２つ以上のＦａｂ領域から構成され得、それによって、２つ以上の標的に対する特異性を高める。
【００３１】
抗体「マウス２Ｅ６または「ｍ２Ｅ６」は、軽鎖配列番号１９および重鎖配列番号２０からなる抗体を意味することが意図される。
【００３２】
抗体「キメラ２Ｅ６または「ｃｈ２Ｅ６」は、軽鎖配列番号２１および重鎖配列番号２２からなる抗体を意味することが意図される。
【００３３】
抗体「２Ｅ６−ＨＬＤ−１」または「ｈ２Ｅ６−ＨＬＤ−１」または「Ｈ２Ｅ６−ＨＬＤ−１」または「２Ｅ６−ＨＬＤ１」は、軽鎖配列番号２３および重鎖配列番号２４からなる抗体を意味することが意図される。
【００３４】
抗体「２Ｅ６−ＨＬＤ−２」または「ｈ２Ｅ６−ＨＬＤ−２」またはＨ２Ｅ６−ＨＬＤ−２」または「２Ｅ６−ＨＬＤ２」は、軽鎖配列番号２５および重鎖配列番号２６からなる抗体を意味することが意図される。
【００３５】
抗体「２Ｅ６−ＨＬＤ−３」または「ｈ２Ｅ６−ＨＬＤ−３」またはＨ２Ｅ６−ＨＬＤ−３」または「２Ｅ６−ＨＬＤ３」は、軽鎖配列番号２７および重鎖配列番号２８からなる抗体を意味することが意図される。
【００３６】
抗体「６Ｂ６」は、軽鎖配列番号４５および重鎖配列番号４６からなる抗体を意味することが意図される。
【００３７】
抗体「５Ａ１」は、軽鎖配列番号２９および重鎖配列番号３０からなる抗体を意味することが意図される。
【００３８】
抗体「９Ｄ７」は、軽鎖配列番号３１および重鎖配列番号３２からなる抗体を意味することが意図される。
【００３９】
抗体「９Ｇ１１」は、軽鎖配列番号３３および重鎖配列番号３４からなる抗体を意味することが意図される。
【００４０】
抗体「Ｌ３」または「Ｌ３−１１」（本明細書において同義的に使用される）は、軽鎖配列番号３７および重鎖配列番号３８からなる抗体を意味することが意図される。
【００４１】
抗体「７Ａ１０」は、軽鎖配列番号３９および重鎖配列番号４０からなる抗体を意味することが意図される。
【００４２】
抗体「８Ｄ９」は、軽鎖配列番号４１および重鎖配列番号４２からなる抗体を意味することが意図される。
【００４３】
抗体「９Ｃ１２」は、軽鎖配列番号４３および重鎖配列番号４４からなる抗体を意味することが意図される。
【００４４】
抗体「６Ｂ６」は、軽鎖配列番号４５および重鎖配列番号４６からなる抗体を意味することが意図される。
【００４５】
抗体「７Ｃ４」は、軽鎖配列番号３５および重鎖配列番号３６からなる抗体を意味することが意図される。
【００４６】
本明細書において特に規定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムにしたがって行われる。
【００４７】
本明細書において使用される際、抗体またはその抗原結合フラグメントは、別のエピトープと比べてそのエピトープと、より高頻度で、より迅速に、より長い期間および／またはより高い親和性または結合活性で反応または会合する場合、別の分子（すなわち、エピトープ）の領域に「特異的に」結合するといわれる。一実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、別の分子よりその標的（ヒトαシヌクレイン）に少なくとも１０倍強く；好ましくは、少なくとも５０倍強く、より好ましくは少なくとも１００倍強く結合する。好ましくは、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、生理学的条件下で、例えば、生体内で結合する。したがって、ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２６〜１４０（［配列番号２］）に「特異的に結合する」とは、このような特異性で、および／またはこのような条件下で、アミノ酸１２６〜１４０に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントの能力を含む。このような結合を決定するのに好適な方法は、当業者に公知であり、例示的な方法が、添付の実施例に記載されている。本明細書において使用される際、所定の抗原への抗体の結合の文脈における「結合」という用語は、典型的に、抗原をリガンドとしておよび抗体を検体として用いてＢＩＡｃｏｒｅ３０００またはＴ２００機器のいずれかにおいて例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した際の約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下のＫＤに対応する親和性での結合を指し、所定の抗原または密接に関連している抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性より少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低くなる量は、抗体のＫＤに依存するため、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が非常に特異的である）場合、抗原に対する親和性が、非特異的抗原に対する親和性より低くなる量は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
【００４８】
本明細書において使用される際の「ｋｄ」（秒−１または１／秒）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【００４９】
本明細書において使用される際の「ｋａ」（Ｍ−１×秒−１または１／Ｍ秒）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数を指す。
【００５０】
本明細書において使用される際の「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指し、ｋｄをｋａで除算することによって得られる。
【００５１】
本明細書において使用される際の「ＫＡ」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合平衡定数を指し、ｋａをｋｄで除算することによって得られる。
【００５２】
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸改変が、機能的結合の喪失をもたらし得るということ（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．ｅｔｃ．（１９８２）“Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９（６）：１９７９−１９８３）は、別の機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定するための手段を提供する。このような変異体ＣＤＲを得るための１つの好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが突然変異を起こされて（例えばランダム突然変異によって、または部位特異的方法（例えば、突然変異遺伝子座をコードするプライマーによるポリメラーゼ連鎖媒介性増幅）によって）、置換アミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列中の関連する残基の同一性を、置換される（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の同一性と比較することによって、その置換についてのＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアが特定され得る。ＢＬＯＳＵＭシステムは、信頼できるアラインメントについて配列のデータベースを分析することによって作成されるアミノ酸置換のマトリックスを提供する（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．（２００４）“Ｗｈｅｒｅ  Ｄｉｄ  Ｔｈｅ  ＢＬＯＳＵＭ６２  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｏｍｅ  Ｆｒｏｍ？”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（８）：１０３５−１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）“Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１０９１５−１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９，５５５−５６５。現在、最先端のＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高くなるほど、置換がより保存的になり、ひいては置換が機能に影響を与えない可能性が高くなる）。得られるＣＤＲを含む抗原結合フラグメントが、α−シヌクレインに結合できない場合、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、不十分に保存的であると見なされ、より高い置換スコアを有する新たな置換候補が選択され、生成される。したがって、例えば、元の残基がグルタミン酸塩（Ｅ）であり、非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは０であり、より保存的な変化（アスパラギン酸塩、アスパラギン、グルタミン、またはリジンなどへの）が好ましい。
【００５３】
【表１】
2020504717.tif 000007
【００５４】
したがって、本発明は、改良されたＣＤＲを同定するためのランダム突然変異の使用を想定している。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の３つの表の１つまたは複数に反映されているアミノ酸の種類の範囲内の置換によって定義され得る。
【００５５】
【表２】
2020504717.tif 000008
【００５６】
【表３】
2020504717.tif 000009
【００５７】
【表４】
2020504717.tif 000010
【００５８】
より保存的な置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００５９】
アミノ酸のさらなる基は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理を用いて配合され得る。
【００６０】
ファージディスプレイ技術が、ＣＤＲ親和性を増加させる（または低下させる）のに代わりに使用され得る。親和性成熟と呼ばれるこの技術は、突然変異または「ＣＤＲウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）」を用い、再選択（ｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、標的抗原またはその抗原性の抗原結合フラグメントを使用して、初期抗体または親抗体と比較した際に、抗原に対するより高い（またはより低い）親和性で結合するＣＤＲを有する抗体を同定する（例えばＧｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９０３を参照）。単一のヌクレオチドではなくコドン全体の突然変異誘発は、アミノ酸突然変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。変異体クローンのプールからなるライブラリーが構築され得、変異体クローンのそれぞれが、単一のＣＤＲ中の単一のアミノ酸改変により異なり、各ＣＤＲ残基に対して各可能なアミノ酸置換を提示する変異体を含む。抗原に対する増加した（または低下した）結合親和性を有する突然変異体は、固定化突然変異体を標識抗原と接触させることによってスクリーニングされ得る。当該技術分野において公知の任意のスクリーニング方法が、抗原に対する増加したまたは低下した親和性を有する突然変異体抗体を同定するのに使用され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９５：６０３７；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１９９４を参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングが、使用可能であり得る（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５１を参照）。
【００６１】
このような親和性成熟を達成するための方法は、例えば：Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）“Ａｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｔｏｒｔｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，ＭＢｉｏ．２（１）ｐｉｉ：ｅ００３４５−１０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００３４５−１０；Ｋｕａｎ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｍａｔｕｒｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＢ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０．１００２／ｉｊｃ．２５６４５；Ｈａｃｋｅｌ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  ＣＤＲ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｂｉａｓｅｓ  Ｅｎｒｉｃｈ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０１（１）：８４−９６；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１”，ＭＡｂｓ  １（５）：４６２−４７４；Ｇｕｓｔｃｈｉｎａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＣＤＲ−Ｈ２  Ｌｏｏｐ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｆａｂ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎａｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ  Ｏｆ  Ｇｐ４１  Ｙｉｅｌｄｓ  Ａ  Ｓｅｔ  Ｏｆ  Ｆａｂｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｎｄ  Ｂｒｅａｄｔｈ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９３（１）：１１２−１１９；最後に、Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ＲＡＧＥ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  Ｂｏｔｈ  Ｉｎｓｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｏｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８８（３）：５４１−５５８；Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３５３−３７６；Ｓｔｅｉｄｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ���Ｍ−ＣＳＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣＤＲ−Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（１）：１３５−１４４；およびＢａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｂｙ  Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５（２６）：９０２９−９０３４に記載されている。
【００６２】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、後者ではなく、前者への結合が、変性溶媒の存在下で常に失われる点で区別される。エピトープは、特異的抗原結合ペプチドによって有効に遮断されるアミノ酸残基（言い換えると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）などの、結合に直接関与するアミノ酸残基および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。
【００６３】
本明細書において使用される際の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患または障害の進行または重症度を改善し、遅らせ、または抑制すること、またはこのような疾患または障害の１つまたは複数の症状または副作用を改善し、遅らせ、または抑制することを意味する。本発明の趣旨では、「治療」または「治療すること」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法をさらに意味し、ここで、「有益なまたは所望の臨床結果」としては、限定はされないが、部分的であるかまたは全体的であるか、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、障害または疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化していない）疾患または障害状態、疾患または障害状態の進行の遅延または緩徐化、疾患または障害状態の改善または緩和、および疾患または障害の寛解が挙げられる。
【００６４】
「有効量」は、本発明の抗体に適用される場合、意図される生物学的効果または所望の治療結果（限定はされないが臨床結果を含む）を達成するのに、必要な投与量および期間にわたる、十分な量を指す。「治療的に有効な量」という語句は、本発明の抗体に適用される場合、障害もしくは疾患の状態の進行、または障害もしくは疾患の症状の進行を改善し、緩和し、安定させ、抑制し、遅らせ、または遅延させるのに十分な、抗体の量を表すことが意図される。一実施形態において、本発明の方法は、他の化合物と組み合わせた、抗体の投与を提供する。このような場合、「有効量」は、意図される生物学的効果を引き起こすのに十分な組合せの量である。
【００６５】
抗α−シヌクレイン抗体の治療的に有効な量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに抗α−シヌクレイン抗体が個体における所望の応答を引き起こす能力などの要因に応じて変化し得る。治療的に有効な量はまた、抗体または抗体部分の何らかの毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回る量である。
【００６６】
本発明は、α−シヌクレイン上のエピトープへの結合について、本明細書において２Ｅ６と示される抗体と競合するモノクローナル抗体を提供する。特に、抗体は、アミノ酸１２６〜１４０（配列番号２）内のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体は、Ｐ１３８、Ｅ１３９およびＡ１４０を含むかまたはそれからなるエピトープに結合し得る。
【００６７】
抗体は、好ましくは、ヒト化抗体である。
【００６８】
したがって、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００６９】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００７０】
一実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号２０のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７１】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号２２のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７２】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７３】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列および配列番号２６のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７４】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２７のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７５】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号４６のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号９または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００７７】
モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号１２または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００７８】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００７９】
別の実施形態において、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号１０または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【００８０】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号１８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００８１】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００８２】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号１１または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００８４】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００８５】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号３８のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００８６】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００８７】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号１３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号１６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００８８】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み得る。別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２９のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００８９】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００９０】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号１４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００９１】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み得る。
【００９２】
本発明の一実施形態によれば、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００９３】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号１５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００９４】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含み得る。
【００９５】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、以下のＣＤＲ：
配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【００９６】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲ：
配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
配列番号１７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含み得る。
【００９７】
別の実施形態によれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含み得る。
【００９８】
この抗体は、一実施形態によれば、公知の免疫グロブリン受容体によって免疫応答を誘発することができないことがある。この抗体は、公知の免疫グロブリン受容体と相互作用するその能力を制限または低減するように改変され得る。例えば、この抗体は、脱グリコシル化され得、重鎖定常領域または両方においてアミノ酸変化を含有し得る。
【００９９】
本発明は、患者におけるα−シヌクレイン凝集体形成を減少させる方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療的に有効な量の本発明の抗体を投与する工程を含む方法も提供する。
【０１００】
さらに、抗体は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または安定剤と一緒に組成物中にあり得る。本発明の抗体は、治療に使用され得る。特に、本発明の抗体は、パーキンソン病（特発性、遺伝性パーキンソン病を含む）、ゴーシェ病、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症などのシヌクレイノパチーを治療するのに使用され得る。本発明の抗体はまた、自身の遺伝子プロファイルおよび／または将来ＰＤを発症させる可能性が高い非ＰＤ中核症状に基づいてＰＤを発症するリスクのある人々を治療することが可能であり得る。
【０１０１】
治療は、長期であってもよく、患者は、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上治療され得る。
【０１０２】
本発明の抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記載されているハイブリドーマ方法によって産生されるモノクローナル抗体であってもよく、または組み換えＤＮＡ方法によって産生され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体は、任意の好適な源から得られる。したがって、例えば、モノクローナル抗体は、例えば、表面において抗原を発現する細胞、または該当する抗原をコードする核酸の形態で、該当する抗原で免疫されたマウスから得られるマウス脾臓Ｂリンパ球細胞から調製されるハイブリドーマから得られる。モノクローナル抗体はまた、免疫されたヒトまたは非ヒト哺乳動物（ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、霊長類など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得られる。
【０１０３】
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。α−シヌクレインに対するヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックまたは染色体導入マウスおよび部分的に不活性化されたマウスレパートリーを用いて生成され得る。このようなトランスジェニックおよび染色体導入マウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含む。
【０１０４】
ＨｕＭＡｂマウスは、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と一緒に、再配列されていないヒト重鎖可変および定常（μおよびＹ）ならびに軽鎖可変および定常（κ）鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６−８５９（１９９４））。したがって、このようなマウスは、マウスＩｇＭまたはＩｇＫの減少した発現を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子が、クラススイッチおよび体細胞突然変異を起こして、高親和性ヒトＩｇＧ、κモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、上記参照；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３，４９−１０１（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４  ５３６−５４６（１９９５）に概説されている）。ＨｕＭＡｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，６２８７−６２９５（１９９２）、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，６４７−６５６（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９１２−２９２０（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，５７９−５９１（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に詳細に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットおよび国際公開第０１／０９１８７号パンフレットも参照されたい。
【０１０５】
ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＨＣｏ２０マウスは、それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，（１９９３）に記載されているように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるＣＭＤ破壊（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例１に記載されているように）、およびＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように）を有する。さらに、ＨＣｏ７マウスは、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子（米国特許第５，７７０，４２９号明細書に記載されているように）を有し、ＨＣｏ１２マウスは、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例２に記載されているように）を有し、ＨＣｏ１７マウスは、ＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子（国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載されているように）を有し、ＨＣｏ２０マウスは、ＨＣｏ２０ヒト重鎖導入遺伝子を有する。得られるマウスは、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の破壊のためにバックグラウンドのホモ接合体においてヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖導入遺伝子を発現する。
【０１０６】
ＫＭマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８１１−８２０（１９９３）に記載されているようにホモ接合的に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を保有する。このマウス株は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているように、染色体１４フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖導入染色体も保有する。ＨＣｏ１２−Ｂａｌｂ／ｃ、ＨＣｏ１７−Ｂａｌｂ／ｃおよびＨＣｏ２０−Ｂａｌｂ／ｃマウスは、国際公開第０９／０９７００６号パンフレットに記載されているように、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＨＣｏ２０を、ＫＣｏ５［Ｊ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）に交差させることによって生成され得る。
【０１０７】
これらのトランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、周知の技術にしたがって、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するのに使用され得る。本発明のヒトモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または他の種に由来する本発明の抗体はまた、該当する免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックな別の非ヒト哺乳動物または植物の生成、および回収可能な形態での抗体の産生によって遺伝子導入的に生成され得る。哺乳動物におけるトランスジェニック産生に関連して、抗体は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中で産生され、それから回収され得る。例えば米国特許第５，８２７，６９０号明細書、米国特許第５，７５６，６８７号明細書、米国特許第５，７５０，１７２号明細書および米国特許第５，７４１，９５７号明細書を参照されたい。
【０１０８】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。アイソタイプの選択は、典型的に、ＡＤＣＣ誘導などの所望のエフェクター機能によって導かれる。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、κまたはλのいずれかが使用され得る。必要に応じて、本発明の抗α−シヌクレイン抗体のクラスは、公知の方法によってスイッチされ得る。例えば、元はＩｇＭであった本発明の抗体は、本発明のＩｇＧ抗体にクラススイッチされ得る。さらに、クラススイッチ技術は、あるＩｇＧサブクラスを別のＩｇＧサブクラスに、例えばＩｇＧｌからＩｇＧ２に変換するのに使用され得る。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療的使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体へのアイソタイプスイッチによって変更され得る。一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体、例えばＩｇＧ１、κである。
【０１０９】
一実施形態において、本発明の抗体は、完全長抗体、好ましくは、ＩｇＧ抗体、特に、ＩｇＧ１、κ抗体である。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体である。
【０１１０】
特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体になるように操作される。典型的に、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（または一部）が非ヒト抗体由来であり、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列由来である１つまたは複数の可変領域を含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されて、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善する。
【０１１１】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ  ’ｌＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書、同第７，５２７，７９１号明細書、同第６，９８２，３２１号明細書、および同第７，０８７，４０９号明細書；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．にさらに記載されている。抗体フラグメントは、例えば従来の技術を用いた断片化によって得られ、このフラグメントは、全抗体について本明細書に記載されるのと同じように有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するように処理されて、Ｆａｂ’フラグメントを生成し得る。ＦａｂフラグメントはＩｇＧ抗体をパパインで処理することによって得られ；Ｆａｂ’フラグメントは、ＩｇＧ抗体のペプシン消化により得られる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはまた、チオエーテル結合またはジスルフィド結合により、以下に記載されるＦａｂ’を結合することによって生成され得る。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントである。Ｆａｂ’−フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、ジチオスレイトールなどの還元剤で処理することによって得られる。抗体フラグメントはまた、組み換え細胞におけるこのようなフラグメントをコードする核酸の発現によって生成され得る（例えばＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４、１２３−３８（１９９５）を参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、このような切断された抗体フラグメント分子を生成するために、Ｈ鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、続いて翻訳停止コドンを含み得る。
【０１１２】
一実施形態において、抗α−シヌクレイン抗体は、一価抗体、好ましくは、ヒンジ領域の欠失を有する国際公開第２００７０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている一価抗体である。したがって、一実施形態において、抗体は、一価抗体であり、前記抗α−シヌクレイン抗体は、ｉ）前記一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗α−シヌクレイン抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列およびＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列およびＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結され、ＩｇＧ１サブタイプの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物もしくはヒトに投与されるとき、ＣＬ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともにジスルフィド結合または共有結合を形成することが可能なアミノ酸をＣＬ領域が含まないように修飾されている工程と；ｉｉ）前記一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列およびヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、ヒンジ領域に対応する領域および、Ｉｇサブタイプによって必要とされるように、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物ヒトに投与されるとき、ヒトＩｇのＣＨ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともに、ジスルフィド結合または共有結合または安定した非共有重鎖間結合の形成に関与するアミノ酸残基を含まないように修飾されており、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列および前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結される工程と；ｉｉｉ）前記一価抗体を生成するために細胞発現系を提供する工程と；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞内で（ｉ）および（ｉｉ）の核酸構築物を共発現することによって、前記一価抗体を生成する工程とを含む方法によって構築される。
【０１１３】
同様に、一実施形態において、抗α−シヌクレイン抗体は、
（ｉ）本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域の抗原結合部分、および
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域またはＣＨ２およびＣＨ３領域を含むその抗原結合フラグメント
を含む一価抗体であり、ここで、ＣＨ領域またはその抗原結合フラグメントは、ヒンジ領域に対応する領域および、免疫グロブリンがＩｇＧ４サブタイプでない場合、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、同一のＣＨ領域とともにジスルフィド結合を形成するか、または同一のＣＨ領域とともに他の共有結合または安定した非共有重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。
【０１１４】
さらなる実施形態において、一価抗α−シヌクレイン抗体の重鎖は、ヒンジ全体が欠失しているように修飾されている。
【０１１５】
別のさらなる実施形態において、前記一価抗体の配列は、それがＮ結合型グリコシル化のための受容体部位を含まないように修飾されている。
【０１１６】
別のさらなる実施形態において、シヌクレイン抗体の一価Ｆａｂは、異なるタンパク質を標的にするさらなるＦａｂまたはｓｃｆｖに結合されて、二重特異性抗体を生成する。二重特異性抗体は、二重機能、例えば抗シヌクレイン結合領域によって与えられる治療機能、および血液脳関門などの生物学的障壁を越える輸送を促進するために受容体分子に結合し得る輸送機能を有し得る。
【０１１７】
本発明の抗α−シヌクレイン抗体は、一本鎖抗体も含む。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖Ｆｖ領域が結合されたペプチドである。一実施形態において、本発明は、本発明の抗α−シヌクレイン抗体のＦｖにおける重鎖および軽鎖が、ペプチド一本鎖において（典型的に、約１０、１２、１５つまたはそれ以上のアミノ酸残基の）フレキシブルペプチドリンカーと結合される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供する。このような抗体を産生する方法が、例えば米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，５５２−５５４（１９９０）に記載されている。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合、一価であり、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合、二価であり、または３つ以上のＶＨおよびＶＬが使用される場合、多価であり得る。
【０１１８】
一般的に本明細書に記載される抗α−シヌクレイン抗体は、任意の好適な数の修飾アミノ酸の包含および／またはこのような共役置換基との結合によって修飾され得る。これに関連する適合性は、一般に、非誘導体化親抗α−シヌクレイン抗体に関連するα−シヌクレイン選択性および／または抗α−シヌクレイン特異性を少なくとも実質的に保持する能力によって決定される。１つまたは複数の修飾アミノ酸の包含は、例えば、ポリペプチド血清半減期を増加させ、ポリペプチド抗原性を低下させ、またはポリペプチド貯蔵安定性を増加させるのに有利であり得る。アミノ酸は、例えば、組み換え産生の際に翻訳と同時に（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）もしくは翻訳後に（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾されるか（例えば、哺乳類細胞における発現の際のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ結合型グリコシル化）または合成手段によって修飾される。修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸の修飾の当業者の指針となるのに十分な言及は、文献全体を通して十分にある。例のプロトコルが、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｏｎ  ＣＤ−Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに見られる。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、または有機誘導化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択され得る。
【０１１９】
抗α−シヌクレイン抗体はまた、例えばそれらの血中半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾され得る。例示的なポリマー、およびそれらをペプチドに結合するための方法が、例えば米国特許第４，７６６，１０６号明細書、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，４９５，２８５号明細書および米国特許第４，６０９，５４６号明細書に示されている。さらなる例示的なポリマーとしては、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、約１，０００〜約４０，０００、例えば約２，０００〜約２０，０００、例えば、約３，０００〜１２，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ）が挙げられる。
【０１２０】
抗体は、診断法においてまたは画像診断用リガンドとしてさらに使用され得る。
【０１２１】
一実施形態において、１つまたは複数の放射性標識アミノ酸を含む抗α−シヌクレイン抗体が提供される。放射性標識抗α−シヌクレイン抗体は、診断および治療目的の両方に使用され得る（放射性標識分子への結合は、別の考えられる特徴である）。このような標識の非限定的な例としては、限定はされないが、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ、６０Ｃｏ）、銅（６４Ｃｕ）、ジスプロシウム（１６５Ｄｙ）、エルビウム（１６９Ｅｒ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、金（１９８Ａｕ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、水素（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１５Ｉｎ）、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、イリジウム（１９２Ｉｒ）、鉄（５９Ｆｅ）、クリプトン（８１ｍＫｒ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、窒素（１３Ｎ、１５Ｎ）、酸素（１５Ｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、カリウム（４２Ｋ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルビジウム（８１Ｒｂ、８２Ｒｂ）、ルテニウム（８２Ｒｕ、９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ナトリウム（２４Ｎａ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ、８９Ｓｒ、９２Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）および亜鉛（６５Ｚｎ）が挙げられる。放射性標識アミノ酸および関連するペプチド誘導体を調製するための方法は、当該技術分野において公知である（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））ならびに米国特許第４，６８１，５８１号明細書、米国特許第４，７３５，２１０号明細書、米国特許第５，１０１，８２７号明細書、米国特許第５，１０２，９９０号明細書（米国再発行特許第３５，５００号明細書）、米国特許第５，６４８，４７１号明細書および米国特許第５，６９７，９０２号明細書を参照。例えば、放射性同位体が、クロラミンＴ法によって結合され得る（Ｌｉｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ  Ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｔａｎｎｙｌ）Ｂｅｎｚｏａｔｅ  Ａｓ  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ”，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５（７）：６５９−６６５；Ｋｕｒｔｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｔｏ  Ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｉｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６（９）：１２５５−１２６１；Ｒｅａ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（３  Ｓｕｐｐｌ）：８５７ｓ−８６１ｓ）。
【０１２２】
本発明は、蛍光標識（希土類キレート（例えば、ユウロピウムキレート）など）、フルオレセイン型標識（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン）、ローダミン型標識（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）またはダンシルクロリド）、ＶＩＶＯＴＡＧ  ６８０  ＸＬ  ＦＬＵＯＲＯＣＨＲＯＭＥ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、フィコエリトリン；ウンベリフェロン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ；シアニン；フィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはそれらの類似体（これらは全て、光学的検出に好適である）を用いて検出可能に標識される抗α−シヌクレイン抗体も提供する。化学発光標識が、用いられてもよい（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）。このような診断および検出はまた、本発明の診断用分子を、限定はされないが、様々な酵素、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む酵素を含む検出可能な物質に、または限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族複合体に結合することによって行われ得る。
【０１２３】
化学発光標識が、用いられてもよい（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）。このような診断および検出はまた、本発明の診断用分子を、限定はされないが、様々な酵素、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む酵素を含む検出可能な物質に、または限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族複合体に結合することによって行われ得る。常磁性標識も用いられ得、好ましくは、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を用いて検出される。このような常磁性標識としては、限定はされないが、アルミニウム（Ａｌ）、バリウム（Ｂａ）、カルシウム（Ｃａ）、セリウム（Ｃｅ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ホルミウム（Ｈｏ）、イリジウム（Ｉｒ）、リチウム（Ｌｉ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、酸素（Ｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ナトリウム（Ｎａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、スズ（Ｓｎ）、チタン（Ｔｉ）、タングステン（Ｗ）、およびジルコニウム（Ｚｉ）、特に、Ｃｏ＋２、ＣＲ＋２、Ｃｒ＋３、Ｃｕ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、Ｇａ＋３、Ｍｎ＋３、Ｎｉ＋２、Ｔｉ＋３、Ｖ＋３、およびＶ＋４の常磁性イオン、様々なポジトロン放出型断層撮影法を用いたポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含有する化合物が挙げられる。
【０１２４】
したがって、一実施形態において、本発明の抗α−シヌクレイン抗体は、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識で標識され得る。標識抗体は、対象の脳における前記α−シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使用され得る。この方法は、前記α−シヌクレインに結合された抗α−シヌクレイン抗体のインビボイメージングの検出または測定を含んでもよく、前記α−シヌクレインに結合された前記抗α−シヌクレイン抗体のエクスビボイメージングを含み得る。
【０１２５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、本発明の抗体の組み換え産生に使用され得る。
【０１２６】
本発明の文脈における発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター、および合成核酸ベクター（好適な組の発現制御要素を含む核酸配列）を含む、任意の好適なＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。このようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、およびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態において、抗α−シヌクレイン抗体コード核酸は、例えば、線形発現要素（ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、Ｓｙｋｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １２，３５５−５９（１９９７）に記載されているように）、圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）核酸ベクター（例えば米国特許第６，０７７，８３５号明細書および／または国際公開第００／７００８７号パンフレットに記載されているように）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ  １９／１８、またはｐＵＣ  １１８／１１９、「ミッジ（ｍｉｄｇｅ）」最小サイズ核酸ベクターなどのプラスミドベクター（例えば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ  ３，７９３−８００（２００１）に記載されているように）を含む裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクターにおいて、またはＣａＰＯ４沈殿構築物などの沈殿核酸ベクター構築物（例えば、国際公開第００／４６１４７号パンフレット、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８３，９５５１−５５（１９８６）、Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １４，７２５（１９７８）、およびＣｏｒａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２，６０３（１９８１）に記載されているように）として含まれる。このような核酸ベクターおよびその使用法は、当該技術分野において周知である（例えば米国特許第５，５８９，４６６号明細書および米国特許第５，９７３，９７２号明細書を参照）。
【０１２７】
一実施形態において、ベクターは、細菌細胞における抗α−シヌクレイン抗体またはその抗α−シヌクレイン結合抗原結合フラグメントの発現に好適である。このようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５５０３−５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）など）などの発現ベクターが挙げられる。
【０１２８】
発現ベクターは、さらにまたは代わりに、酵母系における発現に好適なベクターであり得る。酵母系における発現に好適な任意のベクターが用いられてもよい。好適なベクターとしては、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモータを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）、Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３，５１６−５４４（１９８７）
【０１２９】
本発明の発現ベクターにおいて、抗α−シヌクレイン抗体コード核酸は、任意の好適なプロモータ、エンハンサー、および他の発現促進要素を含むかまたはそれらと結合され得る。このような要素の例としては、強力な発現プロモータ（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモータ／エンハンサーならびにＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、およびＨＩＶ  ＬＴＲプロモータ）、有効なポリ（Ａ）終止配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質抵抗性遺伝子、および／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸は、ＣＭＶ  ＩＥなどの構成的プロモータとは対照的に誘導性プロモータも含み得る（当業者は、このような用語が、実際に、特定の条件下における遺伝子発現の程度の記述語であることを認識するであろう）。
【０１３０】
さらに他の態様において、本発明は、本明細書に定義される本発明の抗体または本明細書に定義される本発明の二重特異性分子を産生するトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）などの、組み換え真核生物または原核生物宿主細胞に関する。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、および哺乳類細胞（ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞など）が挙げられる。例えば、一実施形態において、本発明は、本発明の抗α−シヌクレイン抗体またはそのα−シヌクレイン結合抗原結合フラグメントの発現のための配列コードを含む細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の抗α−シヌクレイン抗体の発現のための配列コードを含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素などの、融合されていない核酸を含む細胞を提供する。
【０１３１】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗α−シヌクレイン抗体を産生するための方法であって、ａ）本明細書において上述されるように本発明のハイブリドーマまたは宿主細胞を培養する工程と、ｂ）培地から本発明の抗体を精製する工程とを含む方法に関する。
【０１３２】
さらに他の態様において、本発明は、
−本明細書に定義される抗α−シヌクレイン抗体、および
−薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
【０１３３】
医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，２０１３に開示されているものなどの従来の技術にしたがって、薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤とともに製剤化され得る。
【０１３４】
薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤は、本発明の選択された化合物および選択された投与方法に好適であるべきである。医薬組成物の担体および他の成分のための適合性は、本発明の選択された化合物または医薬組成物の所望の生物学的特性に対する大きな悪影響がないことに基づいて決定される（例えば、抗原結合に対するそれほど大きくない影響（１０％以下の相対的阻害、５％以下の相対的阻害など））。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０などの非イオン性洗浄剤）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成物に含めるのに好適な他の材料も含み得る。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、または非毒性の、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス機能化（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）セファロース、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）などの、大型のゆっくりと代謝される高分子も含み得る。
【０１３６】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、および投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。選択された投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、またはそのアミド、投与経路、投与時期、用いられる特定の化合物の排せつ速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康および過去の病歴、ならびに医療分野において周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に応じて決まる。
【０１３７】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のための非経口、局所、経口または経鼻手段を含む、任意の好適な経路および方法によって投与され得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、非経口的に投与される。本明細書において使用される際の「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常、注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、特に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮内、腹腔内、皮下、表皮下、関節内、くも膜下、脊髄内注射および注入を含む。
【０１３８】
インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与するさらなる好適な経路が、当該技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
【０１３９】
一実施形態において、その医薬組成物は、静脈内または皮下注射または注入によって投与される。
【０１４０】
薬学的に許容できる担体としては、本発明の化合物と生理学的に適合性の、あらゆる好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤、酸化防止剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【０１４１】
本発明の医薬組成物に用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、およびゴマ油などの植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガムおよび注射可能な有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）、および／または様々な緩衝液が挙げられる。他の担体が、医薬品分野において周知である。
【０１４２】
薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤、例えば（１）水溶性酸化防止剤（アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性酸化防止剤（パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）；および（３）金属キレート剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）も含み得る。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は、組成物中に糖類、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール、グリセロールなど）または塩化ナトリウムなどの等張剤も含み得る。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の保存可能期間または有効性を向上させ得る、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、防腐剤または緩衝液などの、選択された投与経路に適切な１つまたは複数の補助剤も含有し得る。本発明の化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの速放性から化合物を保護する担体とともに調製され得る。このような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、生分解性、生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など）を単独でまたはワックスまたは当該技術分野において周知の他の材料とともに含み得る。このような製剤の調製のための方法は、一般に、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１４６】
一実施形態において、本発明の化合物は、インビボでの適切な分配を確実にするように製剤化され得る。非経口投与用の薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。補助的な活性化合物も、組成物に組み込まれ得る。
【０１４７】
注射用の医薬組成物は、典型的に、製造および貯蔵の条件下で、滅菌性かつ安定性でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬剤濃度に好適な他の規則構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）を含有する、水性または非水性溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合、所要の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール（グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収が、抗体の吸収を遅らせる物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、例えば上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および例えば上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１４８】
滅菌注射用溶液は、上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１４９】
治療の上記の方法および本明細書に記載される使用における投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割量が、時間をかけて投与されてもよく、または用量が、治療状況の要件によって示されるように比例的に減少または増加されてもよい。非経口組成物は、投与のしやすさおよび投与の均一性のために単位剤形で製剤化され得る。本明細書において使用される際の単位剤形は、治療される対象のための統一された投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、所要の医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特性および得られる具体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体における敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。
【０１５０】
抗α−シヌクレイン抗体の有効投与量および投与計画は、治療される疾患または病態に応じて決まり、当業者によって決定され得る。いずれの日も所定の投与量が投与され、投与量は、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より通常は約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。したがって、例示的な投与量としては、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ／体重、例えば約０．１５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ／体重が挙げられる。
【０１５１】
当該技術分野において通常の技能を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師は、医薬組成物に用いられる抗α−シヌクレイン抗体の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされるより少ないレベルから開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加し得る。一般に、本発明の組成物の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量であろう。このような有効用量は、一般に、上述される要因に応じて決まる。投与は、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与であり得る。必要に応じて、医薬組成物の有効１日用量は、任意選択的に単位剤形で、１日を通して適切な間隔で、別々に投与される２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の分割用量として投与され得る。本発明の化合物は、単独で投与されることが可能であるが、上述されるように医薬組成物として化合物を投与するのが好ましい。本発明の標識抗体は、疾患または障害を検出、診断、または監視するために、診断目的で使用され得る。本発明は、限定はされないが、アルツハイマー病を含む、神経変性または認知疾患または障害の検出または診断を提供し、（ａ）α−シヌクレインに特異的に結合する１つまたは複数の抗体を用いて、対象の細胞または組織試料内のピログルタミル化Ａβフラグメントの存在を測定する工程と；（ｂ）抗原のレベルを、対照レベル、例えば正常な組織試料におけるレベルと比較し、それによって、抗原の対照レベルと比較した、抗原の測定レベルの増加が、疾患または障害を示すか、または疾患または障害の重症度を示す工程とを含む。
【０１５２】
本発明の抗体は、当該技術分野において周知の免疫組織化学法を用いて、生物学的試料内のα−シヌクレインモノマー、オリゴマー、線維性形態またはα−シヌクレインのフラグメントを測定するのに使用され得る。タンパク質を検出するのに有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）およびメソスケールディスカバリープラットフォーム（ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）ベースのアッセイ（ＭＳＤ）などの免疫測定法が挙げられる。好適な抗体標識が、このようなキットおよび方法に使用され得、当該技術分野において公知の標識としては、酵素標識（アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼなど）；放射性同位体標識（ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）など）；および発光標識（ルミノールおよびルシフェラーゼなど）；および蛍光標識（フルオレセインおよびローダミンなど）が挙げられる。
【０１５３】
標識抗α−シヌクレイン抗体またはそれらのα−シヌクレイン結合フラグメントの存在は、診断目的で、インビボで検出され得る。一実施形態において、診断は、ａ）有効量のこのような標識分子を対象に投与する工程；ｂ）投与後、所定の時間間隔にわたって待機して、標識分子を、Ａβ堆積の部位（もしあれば）で濃縮させ、非結合標識分子が、バックグラウンドレベルになるまで除去されるのを可能にする工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出が、対象が疾患または障害に罹患していることを示すか、または疾患または障害の重症度を示すように、対象中の標識分子を検出する工程を含む。このような実施形態によれば、分子は、当業者に公知の特定のイメージングシステムを用いた検出に好適なイメージング部分で標識される。バックグラウンドレベルは、検出された標識抗体の量を、特定のイメージングシステムのために予め決定された標準値と比較することを含む、当該技術分野において公知の様々な方法によって決定され得る。本発明の診断法に使用され得る方法およびシステムとしては、限定はされないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査法が挙げられる。
【０１５４】
さらなる態様において、本発明は、医薬に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１５５】
さらなる態様において、本発明は、シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１５６】
一実施形態において、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントは、パーキンソン病、特発性パーキンソン病、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治療するのに使用するためのものである。
【０１５７】
さらなる態様において、本発明は、シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造における、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。
【０１５８】
さらなる態様において、本発明は、有効投与量の本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、パーキンソン病または他のシヌクレイノパチーの治療、診断またはイメージングに関する。
【０１５９】
好ましくは、本発明のそれらの態様の使用および方法において、治療は、長期であり、好ましくは、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上にわたる。
【０１６０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。
【０１６１】
2020504717.tif 000011
【０１６２】
2020504717.tif 000012
【０１６３】
本発明の実施形態
本文および実施例から明らかであろうように、本発明はさらに、以下の実施形態に関する。
【０１６４】
実施形態
１．α−シヌクレインにおけるアミノ酸１２６〜１４０（配列番号２）内のエピトープに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６５】
２．前記エピトープへの結合について、抗体ｍ２Ｅ６、ｃｈ２Ｅ６、２Ｅ６−ＨＬＤ１、２Ｅ６−ＨＬＤ２または２Ｅ６−ＨＬＤ３、７Ａ１０、５Ａ１、９Ｄ７、９Ｇ１１、７Ｃ４、Ｌ３、８Ｄ９、９Ｃ１２または６Ｂ６のいずれかと競合する、実施形態１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６６】
３．抗体が、無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、実施形態１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１６７】
４．Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）およびドメイン抗体（例えば単一のＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、実施形態１または２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６８】
５．モノクローナル抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６９】
６．抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特性：
・０．５〜１０ｎＭ、例えば１〜５ｎＭまたは１〜２ｎＭの、α−シヌクレインに対する結合親和性（ＫＤ）；
・神経細胞内のα−シヌクレイン原線維の蓄積を阻害する能力；
・細胞から細胞へのα−シヌクレイン原線維の移動を阻害する能力；
・α−シヌクレインの細胞内シーディングを阻害する能力；
・Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力；
・インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα−シヌクレインのレベルを減少させる能力；
・慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける、視床下核（ＳＴＮ）内の病理学的な不規則なおよびバーストの発火パターンを正常化する能力；および／または
・慢性的に投与されるときの、トランスジェニックα−シヌクレインマウスの海馬中のＰＰＦの障害の改善能力。
【０１７０】
７．ヒトまたはヒト化抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７１】
８．以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７２】
９．配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７３】
１０．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７４】
１１．配列番号６、７および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態１０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７５】
１２．配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７６】
１３．配列番号２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７７】
１４．配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１２および１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７８】
１５．配列番号２１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１７９】
１６．配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８０】
１７．配列番号２１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１５および１６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８１】
１８．配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８２】
１９．配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８３】
２０．配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１８および１９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８４】
２１．配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８５】
２２．配列番号２６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８６】
２３．配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態２１および２２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８７】
２４．配列番号２７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８８】
２５．配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１８９】
２６．配列番号２７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態２４および２５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９０】
２７．配列番号４５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態８または９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９１】
２８．配列番号４６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１０または１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９２】
２９．配列番号４５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態２７および２８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９３】
３０．以下のＣＤＲ：
・配列番号９または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９４】
３１．配列番号９、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態３０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９５】
３２．以下のＣＤＲ：
・配列番号１２または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、実施形態３０および３１のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９６】
３３．配列番号１２、７および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態３２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９７】
３４．配列番号３５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態３０または３１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９８】
３５．配列番号３６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態３２または３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０１９９】
３６．配列番号３５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態３４および３５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２００】
３７．以下のＣＤＲ：
・配列番号１０または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０１】
３８．配列番号１０、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態３７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０２】
３９．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態３７または３８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０３】
４０．配列番号６、７および１８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態３９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０４】
４１．配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態３７または３８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０５】
４２．配列番号４０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態３９または４０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０６】
４３．配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態４１および４２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０７】
４４．配列番号４１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態３７または３８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０８】
４５．配列番号４２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態３９および４０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２０９】
４６．配列番号４１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態４４および４５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１０】
４７．以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１１または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１１】
４８．配列番号３、４および１１のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態４７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１２】
４９．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態４７または４９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１３】
５０．配列番号６、７および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態４９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１４】
５１．配列番号３７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態４７または４８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１５】
５２．配列番号３８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態４９または５０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１６】
５３．配列番号３７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態５１および５２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１７】
５４．以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１８】
５５．配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態５４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１９】
５６．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号１３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態５４または５５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２０】
５７．配列番号６、１３および１６のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態５６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２１】
５８．配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態５４または５５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２２】
５９．配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態５６または５７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２３】
６０．配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態５８および５９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２４】
６１．以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２５】
６２．配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態６１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２６】
６３．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号１４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態６１または６２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２７】
６４．配列番号６、１４および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態６３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２８】
６５．配列番号３３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態６１または６２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２２９】
６６．配列番号３４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態６３または６４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３０】
６７．配列番号３３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態６５および６６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３１】
６８．以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３２】
６９．配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態６８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３３】
７０．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号１５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号８または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態６８または６９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３４】
７１．配列番号６、１５および８のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態７０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３５】
７２．配列番号４３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態６８または６９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３６】
７３．配列番号４４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態７０または７１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３７】
７４．配列番号４３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態７２および７３のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３８】
７５．以下のＣＤＲ：
・配列番号３または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号４または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号５または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２３９】
７６．配列番号３、４および５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態７５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４０】
７７．以下のＣＤＲ：
・配列番号６または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
・配列番号７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１７または４つ以下のアミノ酸の相違、もしくは３つ以下のアミノ酸の相違、もしくは２つ以下のアミノ酸の相違、もしくは１つ以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する実施形態７５または７６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４１】
７８．配列番号６、７および１７のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態７７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４２】
７９．配列番号３１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態７５または７６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４３】
８０．配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態７７または７８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４４】
８１．配列番号３１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態７９または８０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４５】
８２．Ｆｃ領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４６】
８３．物質の生体内半減期を増加させるための部分をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４７】
８４．生体内半減期を増加させるための部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランからなる群から選択される、実施形態８３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４８】
８５．抗体ポリペプチドが、検出可能な部分をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２４９】
８６．検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識である、実施形態８５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５０】
８７．検出可能な部分が、放射性同位体を含むかまたはそれからなる、実施形態８５または８６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５１】
８８．放射性同位体が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ，８９Ｚｒ、１２３Ｉおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される、実施形態８７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５２】
８９．検出可能な部分が、常磁性同位体を含むかまたはそれからなる、実施形態８７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５３】
９０．常磁性同位体が、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅからなる群から選択される、実施形態８９に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５４】
９１．検出可能な部分が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学または超音波イメージングなどのイメージング技術によって検出可能である、実施形態８５〜９０のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５５】
９２．検出可能な部分が、結合部分を介して、間接的に抗体またはその抗原結合フラグメントに結合される、実施形態８５〜９１のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５６】
９３．結合部分が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からなる群から選択される、実施形態９２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２５７】
９４．先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその成分ポリペプチド鎖をコードする単離核酸分子。
【０２５８】
９５．分子がｃＤＮＡ分子である、実施形態９４に記載の核酸分子。
【０２５９】
９６．抗体重鎖またはその可変領域をコードする、実施形態９４または９５に記載の核酸分子。
【０２６０】
９７．抗体軽鎖またはその可変領域をコードする、実施形態９４〜９６のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０２６１】
９８．実施形態９４〜９７のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。
【０２６２】
９９．実施形態９４〜９７のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態９８に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【０２６３】
１００．実施形態１〜６３のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、コードされた抗体またはその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で、実施形態８１に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【０２６４】
１０１．実施形態１〜８１のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【０２６５】
１０２．医薬に使用するための、実施形態１〜８１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２６６】
１０３．シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、実施形態１〜８１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２６７】
１０４．パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症を治療するのに使用するための、実施形態１０３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２６８】
１０５．シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造における、実施形態１〜８１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【０２６９】
１０６．パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症、多系統萎縮症、ならびに自身の遺伝子プロファイルおよび／または将来ＰＤを発症させる可能性が高い非ＰＤ中核症状に基づいてＰＤを発症するリスクのある人々を治療するための薬剤の製造における、実施形態１０５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【０２７０】
１０７．対象におけるシヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングする方法であって、実施形態１０１に記載の医薬組成物を、有効量で前記対象に投与する工程を含む方法。
【０２７１】
１０８．パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症、ならびに自身の遺伝子プロファイルおよび／または将来ＰＤを発症させる可能性が高い非ＰＤ中核症状に基づいてＰＤを発症するリスクのある人々を治療するための、実施形態１０３に記載の使用のための抗体、またはその抗原結合フラグメント、または実施形態１０５に記載の使用、または実施形態１０７に記載の方法。
【０２７２】
１０９．治療が長期である、実施形態１０３、１０５または１０７に記載の使用のための抗体、またはその抗原結合フラグメント；または使用；または方法。
【０２７３】
１１０．長期治療が、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上にわたる、実施形態１０９に記載の使用のための抗体、またはその抗原結合フラグメント；または使用；または方法。
【０２７４】
１１１．対象がヒトである、実施形態１０２〜１１０のいずれか１つに記載の使用のための抗体、またはその抗原結合フラグメント；または使用；または方法。
【０２７５】
１１２．医薬に使用するための、実施形態１〜８１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキット。
【０２７６】
１１３．対象の脳または他の臓器または体液中の前記α−シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使用するための、実施形態８５〜９３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２７７】
１１４．前記検出または測定が、前記α−シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体のインビボイメージングを含む、実施形態１１３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２７８】
１１５．前記検出または測定が、前記α−シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体のエクスビボイメージングを含む、実施形態８５〜９３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【実施例】
【０２７９】
実施例１：抗体の発見
Ａ．免疫化／ハイブリドーマスクリーニング
α−シヌクレインに対するモノクローナル抗体を、例えば反応性アルデヒドで架橋された様々なシヌクレイン凝集体でマウスを免疫することによって生成した。第１の抗原を、Ｒｐｅｐｔｉｄｅ（４２４１  Ｍａｒｓ  Ｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ，Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡ  ３０６２２，ＵＳＡ）製の組み換え凍結乾燥α−シヌクレインで作製した。タンパク質をＰＢＳに溶解させて、７０ｕＭのα−シヌクレインの溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を得ることによって、それを作製した。溶液を、３７℃で１８時間インキュベートし、１００ｕｌのアリコート中で凍結させた。７０マイクロＭの組み換えα−シヌクレインを、２０ｍＭのトリス（ｐＨ＝７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌに溶解させることによって、組み換えα−シヌクレイン（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）から、第２の抗原を、同様に作製した。反応性アルデヒドＯＮＥ（４−オキソ−２−ノネナール、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製のＣａｔ  ＃  １０１８５）を、２０：１のモル比で加えて、α−シヌクレインのオリゴマーを共有結合的に架橋した。溶液を、（振とうなしで）３７℃で１８時間インキュベートした。未反応のＯＮＥを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００スピンカラム（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）によって除去し、試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌに対して透析し、アリコート中で凍結させた。第３の抗原は、凍結乾燥粉末（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ製の原材料）として送られた組み換えα−シヌクレインフラグメントアミノ酸１〜６０（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）であった。簡潔に述べると、３匹の雌マウス（４〜７週齢）を免疫し、最大で３回追加免疫した。尾採血を行い、抗原に対する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって抗シヌクレイン抗体についてスクリーニングした。力価が、ＥＬＩＳＡにおいてベースラインの３倍のＯＤ読み取りを達成することが血清希釈によって定義される。対照に対して１：５０，０００より高い力価を示すマウスを、融合のために選択した。採取された脾細胞を、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞に融合し、希釈し、単細胞融合から平板培養した。上清を、融合の１４日後に採取し、抗体産生についてスクリーニングした。シヌクレインＥＬＩＳＡを用いて、５０の陽性クローンを、約１０００ウェルから回収した。Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ／ＡＰキットを、免疫グロブリンアイソタイピング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）に使用した。５０の抗α−シヌクレイン上清を、実施例６（図７Ｃ）に記載されるように、ＳＫＭＥＬ５細胞アッセイにおいてａｔｔｏ標識α−シヌクレイン凝集体の蓄積の減少についてスクリーニングした。市販の抗体ＬＢ５０９が、陽性対照として含まれていた。５０の抗血清のうち、４つのみの抗血清が、α−シヌクレインの細胞内蓄積を減少させたことが分かり、これらの抗体を、クローニングのために取った。次に、これらの４つの抗体を、アッセイにおいて用量反応で試験した。最も高い効果を有する抗体、２Ｅ６を、ＰＤ関連モデルにおいてさらなる特性評価のために選択した。
【０２８０】
Ｂ．シヌクレインＥＬＩＳＡ
抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、抗体陽性融合を結合について分析した。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６ウェル高結合プレートを、１００ｎｇの凝集シヌクレインで被覆した。ウェルを、室温（ＲＴ）で１時間（ｈｒ）にわたってＰＢＳ中５％のミルクを用いてブロックした。プレートを、ＰＢＳ＋１％のＴｗｅｅｎ  ２０を用いて３回洗浄した。１００マイクロリットルのハイブリドーマ上清を各ウェルに加え、プレートを室温でインキュベートした。その後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的またはγ鎖特異的）二次を各ウェルに加えて、結合された抗シヌクレイン抗体の存在を検出した。定量基質のために、１つの成分ＴＭＢを加え、プレートをＯＤ６２０で測定した。
【０２８１】
Ｃ．抗体ＨＣおよびＬＣ可変領域のＤＮＡ配列の決定
４つの抗αシヌクレイン陽性ハイブリドーマを選択し、ｍＲＮＡを細胞ペレットから抽出した。各ｍＲＮＡ  ｐｒｅｐからのｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、逆転写酵素によって生成した。その後、可変領域プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行って、ＨＣおよびＬＣ遺伝子のＶＨおよびＶＬ領域の両方を増幅した。増幅されたＤＮＡを、アガロースゲル上に分離させ、ＶＨおよびＶＬ産物の両方を単離し、ゲルから精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化し、ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。最小で６つの陽性コロニーを選択し、ＤＮＡシーケンシングによって分析して、ＶＨおよびＶＬ領域の配列を決定した。
【０２８２】
実施例２：抗体工学
モノクローナル抗体の発現
ハイブリドーマクローンの培養物を増殖させ、タンパク質Ｇクロマトグラフィーを用いて、マウスモノクローナル抗体を、培養された上清から精製した。ＨＥＫ２９３細胞への重鎖および軽鎖遺伝子の一過性共トランスフェクション、培養物の増殖、上清の採取およびタンパク質クロマトグラフィーによる精製を用いて、組み換えマウス、ヒトおよびキメラ抗体を産生した。グラム量の抗体が繰り返し必要性とされる場合、安定した細胞株をＣＨＯ細胞中で生成した。これらの安定した細胞株を、必要に応じて増殖させることができ、抗体精製を前述のとおりに行った。
【０２８３】
組み換え抗体のクローニング
組み換えモノクローナル抗体を、重鎖および軽鎖遺伝子（Ｇｅｎｅａｒｔ  Ａ／Ｇ）の遺伝子合成によって生成した。その後、合成された遺伝子を、哺乳動物細胞培養物中での発現のために標準的な発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１）へとクローン化した。
【０２８４】
ヒト化
ｍ２Ｅ６のヒト化を、構造ベースのＣＤＲグラフトによって行った。２Ｅ６  ＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を、ＰＤＢおよびＩＭＧＴデータベース中で見られる全てのヒト抗体ＶＬおよびＶＨフレームワークアミノ酸配列に対する相同性についてスクリーニングした。構造モデリングを、ＰＤＢデータベースからの２０ＳＬ抗体を用いて、ｍ２Ｅ６  Ｆｖ領域について行った。２０ＳＬアミノ酸配列は、２Ｅ６  ＶＨおよびＶＬドメインのそれぞれに対して８２．７％および８３．２％相同である。重要なことには、２０ＳＬの構造を、２．１Åの解像度で決定した。２０ＳＬを用いた２Ｅ６ヒト化フレームワークの構造アラインメントは、立体障害または立体構造力（ｓｔｅｒｉｃ  ｆｏｒｃｅ）によって折り畳みまたは局所構造に潜在的に影響を与え得る、フレームワーク領域中の重要な残基の決定を可能にした。ヒト化抗体の理論的な抗体構造モデリングを用いて、結合特異性および親和性を維持するために、元のマウスアミノ酸として特異的な残基を２Ｅ６のヒト化形態に維持することの潜在的な重要性について示唆した。この構造モデリングを用いて、ヒト化２Ｅ６の活性を最適化した。
【０２８５】
２Ｅ６  ＶＨ領域のヒト化を、ＶＨ  ＣＤＲを、ヒト生殖細胞系列遺伝子、ＩＧＨＶ１−４６＊０１（６９％の相動性）のフレームワーク上にグラフトすることによって行った。マウス２Ｅ６と、選択されたヒトフレームワーク領域との間に２３アミノ酸の相違がある。構造モデリングにより、ヒト残基への変化が２Ｅ６の活性に悪影響を与える可能性を有していた７つのアミノ酸位置を同定した。これらの残基を、元のマウスアミノ酸に復帰突然変異させた。３つの異なる形態のヒト化重鎖を生成した。ヒト化ＨＬＤ−１は、７つ全ての復帰突然変異、Ｍ３７Ｖ、Ｉ４８Ｍ、Ａ６８Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ｖ７２Ｒ、Ｋ７４Ｔ、Ａ７９Ｖを含有し、ＨＬＤ−２は、Ｉ４８Ｍ、Ａ６８Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ｖ７２Ｒ、Ｋ７４Ｔ、Ａ７９Ｖを含有し、ＨＬＤ−３は、Ｍ３７Ｖ、Ｉ４８Ｍ、Ｌ７０Ｍ、Ｖ７２Ｒ、Ｋ７４Ｔ、Ａ７９Ｖを含有する。
【０２８６】
２Ｅ６  ＶＬ領域のヒト化を、ＶＬ  ＣＤＲを、ヒト生殖細胞系列遺伝子、ＩＧＫＶ３−１１＊０１（６４％の相動性）のフレームワーク上にグラフトすることによって行った。マウス２Ｅ６と、選択されたヒトフレームワーク領域との間に２６アミノ酸の相違がある。構造モデリングにより、ヒト残基への変化が２Ｅ６の活性に悪影響を与える可能性を有していた４つのアミノ酸位置、Ｒ４５Ｌ、Ｗ４６Ｌ、Ｖ５７Ｉ、Ｙ７０Ｆを同定した。ＨＬＤ−１、ＨＬＤ−２およびＨＬＤ−３について、４つ全ての残基を、元のマウスアミノ酸に復帰突然変異させた。
【０２８７】
ＨＬＤ−１、ＨＬＤ−２およびＨＬＤ−３を、ＨＥＫ  ２９３細胞内で一過性に発現させた。抗体を、培養された上清から精製し、その後、シヌクレインリガンドフォーマットを用いて、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によって、シヌクレインへの結合について分析した（表５）。
【０２８８】
【表５】
2020504717.tif 000013
【０２８９】
コドン縮重ＰＣＲプライマーによる軽鎖ＣＤＲ３中のランダム化突然変異、および同様に、コドン縮重ＰＣＲプライマーによる重鎖ＣＤＲ３中のランダム化突然変異によって、およびエラープローンＰＣＲによるインビトロ進化を用いて、ＨＬＤ１の親和性成熟を行った。抗体を、培養された上清から精製し、その後、ＣＭ５チップ上に固定された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて捕捉されたＩｇＧを用いて、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によって、シヌクレインへの結合について分析した（表６）。
【０２９０】
【表６】
2020504717.tif 000014
【０２９１】
１回目の親和性成熟の後、本発明者らは、４つの突然変異（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を構築した：Ａ）重鎖ＣＤＲ２（ＫＹＮＶＮＦＫＴをＫＹＮＶＮＩＫＴに突然変異させる）および重鎖ＣＤＲ３（ＬＧＨＹＧＮＬＹＡＭＤＹをＬＧＨＹＧＮＬＹＡＫＤＹに突然変異させる）中の２つの突然変異を組み合わせた；Ｂ）軽鎖ＣＤＲ１突然変異（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨをＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨに突然変異させる）をＬ３−１１軽鎖に組み込んだ；Ｃ）軽鎖フレームワーク突然変異（ＣＤＲ２の直ぐ上流で、ＰＲＲＷＩＹをＰＲＲＬＩＹに突然変異させる）をＬ３−１１軽鎖に組み込んだ；およびＤ）軽鎖ＣＤＲ１突然変異（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨをＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨに突然変異させる）および軽鎖フレームワーク突然変異（ＰＲＲＷＩＹをＰＲＲＬＩＹに突然変異させる）をＬ３−１１軽鎖に組み込んだ。Ｂｉａｃｏｒｅデータおよび抗体配列に基づいて、本発明者らは、様々な組合せで、軽鎖および重鎖の共発現を試験した：
１．Ｌ３−１１軽鎖＋９Ｃ１２重鎖
２．Ｌ３−１１軽鎖＋８Ｄ９重鎖
３．７Ａ１０軽鎖＋９Ｃ１２重鎖
４．Ｌ３−１１軽鎖＋Ａ
５．７Ａ１０軽鎖＋Ａ
９．Ｂ＋９Ｃ１２重鎖
１０．Ｃ＋９Ｃ１２重鎖
１１．Ｄ＋９Ｃ１２重鎖
１２．Ｂ＋８Ｄ９重鎖
１３．Ｃ＋８Ｄ９重鎖
１４．Ｄ＋８Ｄ９重鎖
１５．Ｂ＋重鎖
１６．Ｃ＋重鎖
１７．Ｄ＋重鎖
抗体を、培養された上清から精製し、その後、ＣＭ５チップ上に固定された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて捕捉されたＩｇＧを用いて、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によって、シヌクレインへの結合について分析した（表７）。
【０２９２】
【表７】
2020504717.tif 000015
【０２９３】
実施例３：エピトープマッピング
α−シヌクレインに対する抗体のエピトープマッピングを、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｚｕｉｄｅｒｓｌｕｉｓｗｅｇ  ２  ８２４３  ＲＣ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において一連の重複直鎖ペプチドを用いて行った。合成された２０量体ペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、Ｐｅｐｓｃａｎに基づくＥＬＩＳＡにおいて試験した。α−シヌクレインの全コード配列をカバーする直鎖ペプチドアレイ、ならびに酸化メチオニンまたはニトロシル化チロシンを含む全てのペプチドを、（４℃で一晩）一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、２５℃で１時間にわたって１／１０００希釈率の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ，ｃａｔ．ｎｒ．２０１０−０５）とともにインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３パーセントのＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。データ処理のために、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０〜３０００ｍＡＵのＣＣＤカメラ範囲からの値を得た。結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保存した。時々、ウェルは、偽陽性値をもたらす気泡を含み、カードを手動で調べて、気泡によって生じる値を０として採点する。
【０２９４】
実施例４：レビー小体認知症に罹患した患者および健常対照に由来する帯状皮質のヒト脳ホモジネートからのα−シヌクレインの免疫沈降
レビー小体認知症患者（ＤＬＢ）および月齢をマッチさせた健常対照（ＣＴＲ）に由来する脳ホモジネート中のα−シヌクレインおよびリン酸化（Ｓｅｒ１２９）α−シヌクレインレベル。
【０２９５】
レビー小体認知症患者（ＤＬＢ）に由来する５つの脳からの帯状皮質試料および月齢をマッチさせた健常対照（ＣＴＲ）に由来する５つの脳試料を使用した。約５０〜１００ｍｇの組織ブロックを、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ＣＫ−１４組織ホモジナイザーを用いてＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍの細胞溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で均質化した後、３０分のスピン（３０００ｇ）を行って、Ｓ１およびＰ１画分を得た。上清（Ｓ１）画分は、全洗浄剤可溶性α−シヌクレインを含有し、ペレット（Ｐ１）画分は、洗浄剤不溶性α−シヌクレイン（レビー小体）を含有する。Ｓ１画分のさらなる遠心分離（３０分  ２０，０００ｇ）（Ｐ２）は、α−シヌクレインの洗浄剤可溶性凝集形態を含有し、１８６，０００ｇのスピン（Ｐ３）は、α−シヌクレインのより小さい洗浄剤可溶性凝集形態を含有し、残りの上清（Ｓ２）は、モノマーα−シヌクレインを含有する。
【０２９６】
図３は、Ｓ１、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＳ２画分中の、レビー小体認知症（ＤＬＢ）に罹患した患者に由来する５つの脳ホモジネートおよび５つの月齢をマッチさせた健常対照（ＣＴＲ）中のα−シヌクレインの含量の相違を示す（「α−ｓｙｎ」および「Ｐ−α−ｓｙｎ（Ｓ１２９）」ボックス中の５つのレーンは、５つの異なる患者および５つの対照を表す）。可溶性α−シヌクレインのレベルは、ＤＬＢおよびＣＴＲにおいて同様である一方（図３、左側のパネル、Ｓ１およびＳ２中の「α−ｓｙｎ」）、マウスモノクローナル抗ヒトα−シヌクレイン（４Ｂ１２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出した際にＤＬＢ（Ｐ１画分）中の不溶性α−シヌクレインの量の増加がある。セリン１２９においてリン酸化された不溶性α−シヌクレインのレベル（図３、右側のパネル「Ｐ−α−ｓｙｎ（Ｓ１２９）」は、抗Ｓｅｒ−１２９−リン酸化モノクローナル抗体（ａｂ５１２５３、ａｂｃａｍ）で検出した際にＤＬＢ（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３画分）において増加される。
【０２９７】
病理学的形態のα−シヌクレインに富む画分からのα−シヌクレインの免疫沈降
α−シヌクレインに結合し、５つ全てのＤＬＢ患者からのヒト脳帯状皮質の合わせた画分からの画分Ｓ１、Ｐ１およびＰ２からα−シヌクレインをプルダウンする抗体の能力を、免疫沈降によって分析した。免疫沈降のために、２μｇの抗体を、磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓタンパク質Ｇ上に固定した後、室温で９０分間免疫沈降させた。免疫沈降の収量を、検出抗体、マウスモノクローナル抗ヒトα−シヌクレイン（４Ｂ１２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ウエスタンブロット法によって視覚化した。プルダウンされるα−シヌクレインの量は、マウスｍ２Ｅ６、ヒト化２Ｅ６−ＨＬＤ−１および９Ｅ４抗体（配列番号４７および４８）の間で異なる。また、異なる分子量形態のα−シヌクレインがプルダウンされたことを示すバンドのパターンが、２Ｅ６抗体および比較例の抗体９Ｅ４の間で異なる（図４）。
【０２９８】
ヒト脳からのα−シヌクレインの免疫沈降は、ｍ２Ｅ６およびヒト化変異体２Ｅ６−ＨＬＤ１−３が、９Ｅ４と著しく異なることを示す。２Ｅ６およびヒト化変異体は、より低い分子量の、あるいはスプライスまたは切断された形態のα−ｓｙｎを免疫沈降させることができる一方、９Ｅ４は免疫沈降させない。さらに、２Ｅ６およびヒト化変異体は、Ｐ１およびＰ２画分中の病理学的凝集形態のα−シヌクレインを認識する一方、９Ｅ４は認識しない（図４）。
【０２９９】
実施例５：α−シヌクレイン凝集のインビトロ阻害および予め形成されたα−シヌクレイン原線維の解離
インビトロでのα−シヌクレイン凝集の阻害
α−シヌクレインの、線維集合体、レビー小体およびレビー神経突起（ＬＮ）への凝集は、パーキンソン病の主な特徴である。原線維形成は、単峰性の成長プロファイルによって特徴付けられる、複雑な重合プロセスである。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）方法を用いて、インビトロでのα−シヌクレインの凝集を検出した（Ｇｉｅｈｍ  ＆  Ｏｔｚｅｎ，２０１０，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５；４００（２）：２７０−８１．；Ｇｉｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ；５３（３）：２９５−３０５）。このアッセイにおいて、本発明者らは、様々な比率でα−シヌクレインモノマーとともに共インキュベートしたときの、α−シヌクレイン凝集の減少に対するｍ２Ｅ６の効果を試験した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートに、α−シヌクレインと、ＴｈＴと、抗体との混合物を充填し、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｌｅａｒシールテープ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で密封して、蒸発を回避した。プレートを、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＧｅｎｉｏｓ  Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ）に入れ、３７℃でインキュベートした。撹拌試料を、約５０分／時の期間にわたってオービタルまたは線形撹拌（３００ｒｐｍ）しながら振とうした。ＴｈＴ蛍光を、４５０ｎｍにおける励起光および４８５ｎｍにおける発光により測定した。撹拌試料について、ＴｈＴ発光を、９６ウェルプレートにおいて１０分間隔で測定した。緩衝液シグナルを、全てのデータから差し引いた。結果は、ｍ２Ｅ６が、より高いモル比（抗体：α−シヌクレイン）でほぼ完全にα−シヌクレインの原線維化を阻害したことを示した（図５）。
【０３００】
α−シヌクレイン原線維の解離
マウス−α−シヌクレインの予め形成された原線維（Ｍｏ−ＰＦＦ）を、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｌｅｅ／Ｋｅｌｖｉｎ  Ｌｕｋ  プロトコルを用いて、モノマーマウスα−シヌクレインから生成した（Ｌｕｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，１６；３３８（６１０９）：９４９−５３）。これらのＭｏ−ＰＦＦは、それらの理化学的特性（ウエスタンブロットおよび電子顕微鏡法によって）および生物学的特性（細胞中の取り込みおよび毒性によって）について特徴付けられている。予め形成された原線維（ＰＦＦ）の調製の重要な工程は、細胞によって取り込むことのできないＰＦＦのより大きい凝集体を解離させるための、例えば細胞中での、注入または使用の直前の超音波処理である。最適な超音波処理プロトコル（強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ／ｓｔｒｅｎｇｔｈ）および時間）を決定するために、様々な超音波処理パラダイムを試験した。超音波処理された予め形成された原線維を、２４時間にわたって室温で、様々なモル比で、抗体（ａｂ）とともにインキュベートした。全ての試料は、逆染色法および透過電子顕微鏡法による分析の前に、ドライアイス上で後に貯蔵した。１：１００、１：２０および１：１０のａｂ：シヌクレインのモル比で、増加する濃度のｍ２Ｅ６とα−シヌクレインＰＦＦとのインキュベーションによって、残りの微小原線維は、小さく、線形で、単一であった。試験される全ての濃度のａｂは、微小原線維が、原線維のより大きいネットワークへと再結合しないようにすることができ、おそらく、さらにはそれらをさらに解離させることができた。結果は、増加する濃度のｍ２Ｅ６が、原線維を微小原線維として保つのに増加した効果を示すことを示した（図６）。
【０３０１】
実施例６：細胞モデルデータ
２Ｅ６は、培地においてα−シヌクレイン原線維に結合し、ヒト、神経芽細胞腫および黒色腫、細胞株においてそれらの蓄積を阻害する。
原線維調製の説明
組み換えα−シヌクレインを、ｒＰｅｐｔｉｄｅ（カタログ番号Ｓ−１００１−２）から注文し、製造業者の勧告にしたがって、ダブル蒸留水に溶解させて、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ／１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４中の１ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。Ｓｉｇｍａ（＃３８３７１）製のＡｔｔｏ４８８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いることによって、α−シヌクレインをＡｔｔｏ４８８で蛍光標識した。３０％のＡｔｔｏ４８８で標識されたα−シヌクレインと７０％の非標識α−シヌクレインとの混合物を作製し、次に、この混合物を、２日間にわたって撹拌しながら（３００ｒｐｍ）３７℃でインキュベートし、次に、３日間停止し、次に、１日撹拌し、次に、１日停止し、次に、４日間撹拌した。その後、原線維を採取し、使用するまで−２０℃に保持した。原線維を細胞アッセイに使用する場合、それらを、添加の直前に、ホーンプローブ超音波装置（ｈｏｒｎ  ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて、５．５０％のサイクルを設定して、５分間で常に超音波処理した。
【０３０２】
培地中のα−シヌクレイン原線維の免疫沈降
ＤＭＥＭ培地（細胞アッセイにおいて使用される際）に溶解されたα−シヌクレイン原線維に結合し、それをプルダウンする抗体の能力を、免疫沈降によって分析した。２μｇの抗体を、磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓタンパク質Ｇ上に固定した後、室温で、９０分間で免疫沈降させた。免疫沈降の収量を、検出ａｂ抗ヒトα−シヌクレイン、Ａｂ１９０４を用いたウエスタンブロット法によって視覚化した。これは、ｍ２Ｅ６が、培地からα−シヌクレイン原線維をプルダウンすることができた一方、Ｂ１２（非反応性ヒトＩｇＧ）および５Ｇ４（Ｒｏｂｏｓｃｒｅｅｎ製の抗α−シヌクレイン）はできなかったことを示した（図７Ａ）。
【０３０３】
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞中の蓄積の抗体に仲介される阻害
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２６６（商標））を、ＡＴＣＣから注文し、ＡＴＣＣガイドラインにしたがって培養した。細胞を、４０，０００個の細胞／ウェルの密度で、コラーゲン被覆プレート上で平板培養した。１日の結合の後、細胞を、培地に直接加えられたα−シヌクレイン原線維および抗体（両方とも１０μｇ／ｍｌ）で処理した。次に、細胞を、２４時間にわたってインキュベートさせ、その後、それらを洗浄し、溶解させた。Ａｂｃａｍ製の抗体１９０４を用いて、細胞質画分にウエスタンブロットを行った。これは、２Ｅ６−ＨＬＤ１が、細胞内に蓄積された原線維の量を減少させた一方、α−シヌクレインＢ１２に対する親和性を有さない抗体は、減少させなかったことを示した（図７Ｂ）。
【０３０４】
ＳＫ−ｍｅｌ５細胞中の蓄積の抗体に仲介される阻害
ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ｍｅｌ５（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−７０）を、ＡＴＣＣガイドラインにしたがって増殖させた。細胞を、Ｆａｌｃｏｎ  ＢＤ  ９６ウェルプレート中で、ウェル当たり３０００個の細胞の密度で平板培養し、一晩、付着させた。Ａｔｔｏ４８８で標識されたα−シヌクレイン原線維を、ｍ２Ｅ６抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）およびα−シヌクレインペプチド１１３〜１２５または１２６〜１４０（０．０１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に、細胞（０．０１ｍｇ／ｍｌ）に加えた。２４時間のインキュベーションの後、細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドによって固定した。次に、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎにおいて読み取った。核を、１つのチャネル中で検出し、有効なオブジェクトの数を定義した。Ａｔｔｏ４８８で標識された原線維を、核を取り囲む、したがって細胞の細胞質を表す、予め定義された環で形成された領域において別のチャネル中で検出した。α−シヌクレインスポットを含む細胞のパーセントを定量した。結果は、原線維を与えられない細胞において、スポット含有細胞のごく少ないバックグラウンドがあったに過ぎないことを示す（バックグラウンドは、おそらく自己蛍光によるものであった）（図７Ｃ）。原線維が与えられた細胞のみにおいて、細胞の７５％が、蓄積された細胞内スポットを有していた。原線維およびｍ２Ｅ６抗体とともに共インキュベートされた細胞において、約３０％のみのスポット陽性細胞があった。細胞を、原線維、ｍ２Ｅ６および１２６〜１４０ペプチドとともに共インキュベートしたとき、約６０％の陽性細胞があり、したがって、このペプチドは、ｍ２Ｅ６の効果を有意に阻害した。１１３〜１２０ペプチドと、原線維および２Ｅ６との共インキュベーションは、ｍ２Ｅ６の効果を変化させなかった。ペプチド１１３〜１２０または１２６〜１４０のいずれかと一緒の原線維のインキュベーションは、細胞内の原線維の蓄積に影響を与えなかった。したがって、ｍ２Ｅ６は、溶液中でα−シヌクレイン原線維に結合し、細胞内のそれらの蓄積を阻害する。この効果は、それがペプチド１２６〜１４０によって阻害され得るが、１１３〜１２０によって阻害され得なかったため、特異的である（図７Ｃ）。増加する用量の２Ｅ６−ＨＬＤ１−７Ａ１０による処理は、スポットを有する細胞のパーセンテージの用量依存的な減少を示した。無関係の対照抗体（Ｂ１２）で処理された細胞は、効果を示さなかった（図７Ｄ）。
【０３０５】
ｍ２Ｅ６は、培地において、哺乳動物が産生した、オリゴマー化されたα−シヌクレインに結合し、一次皮質ニューロン中のその蓄積を阻害する。
ＤＭＥＭ培地に溶解されたα−シヌクレインオリゴマーに結合し、それをプルダウンする抗体の能力を、免疫沈降によって分析した。２μｇの抗体を、磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓタンパク質Ｇ上に固定した後、室温で９０分間免疫沈降させた。免疫沈降の収量を、検出抗体、抗ヒトαシヌクレインモノクローナル抗体（４Ｂ１２）（ＭＡ１−９０３４６、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ウエスタンブロット法によって視覚化した。これは、２Ｅ６変異体の全てが、培地からシヌクレインオリゴマーをプルダウンしたことを示した（図８Ａ）。比較例のｍ９Ｅ４およびｈ９Ｅ４も、オリゴマーをプルダウンしたが、ｈ９Ｅ４は、効率がより低いようである（１４ｋＤａにおけるはるかに弱いバンド）。別の比較例のα−シヌクレイン抗体（Ｂｉｏｇｅｎ製の１２Ｆ４）は、対照抗体Ｂ１２と大きく異ならない弱いバンドを示したに過ぎなかった（図８Ａ）。
【０３０６】
皮質領域を解剖し、これらをトリプシン溶液中で均質化することによって、Ｅ１４胚からマウス一次皮質ニューロンを調製した。次に、細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ培地中で再懸濁させ、計数し、ポリ−リジンで予め被覆された９６ウェルプレート中で、ウェル当たり６００００個の細胞で平板培養した。４時間後、培地を、Ｂ２７補給物を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌに変更した。２日間の計数の後、シトアラビノシド（ｃｙｔｏａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）を加えて、星状膠細胞の増殖を阻害した。ＤＩＶ７に、細胞を、２５μｇ／ｍｌの抗体と一緒に、Ｓｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦ（ＤＩＶ＝インビトロ培養物中の日数−ａｓｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦ＝ビオチン受容体ペプチドタグを有するα−シヌクレインの予め形成された原線維）、１０μｇ／ｍｌで処理し、インキュベーションを２４時間行った。その後、細胞を洗浄し、１００μｌの８％のパラホルムアルデヒドの添加によって、ウェル中の１００μｌの培地に直接固定した。透過化、および透過化された細胞に加えられたＢＳＡ（１％）もしくはストレプトアビジン−Ａｔｔｏ４８８（Ｓｉｇｍａ）によるブロッキングの後、細胞において１５Ｇ７−抗体（Ｅｎｚｏ）および二次ＦＩＴＣ標識抗ラット抗体を用いた免疫細胞化学のいずれかによって、細胞内Ｓｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦ凝集体の検出を行った（Ｓｙｎ−ＢＡＰは、ビオチンタグを有し、したがって、ストレプトアビジンによって検出され得る）。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ−染色によって検出した。染色の定量を、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎによって行った。核を、１つのチャネル中で検出し、有効なオブジェクトの数を定義した。緑色のスポットを、核を取り囲む、したがって細胞の細胞質を表す、予め定義された環で形成された領域において別のチャネル中で検出した。細胞当たりのスポットの平均数を計算した。細胞の例が、図８Ｂに示される。Ｓｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦ凝集体のストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐａｔｉｖｉｎ）−Ａｔｔｏ４８８ベースの検出によるいくらかのバックグラウンド染色があったが（非処理の細胞は、細胞当たり平均して１つのスポットを有することが示された）、単独のＳｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦで処理された細胞に依然として有意差があった（それらは、細胞当たり約１．８のスポットを有していた）（図８Ｃ）。Ｓｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦと、非反応性Ｂ１２または９Ｅ４抗体のいずれかとの共インキュベーションは、細胞内のＳｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦの蓄積を変化させなかった一方、ｍ２Ｅ６または２Ｅ６−ＨＬＤ１による処理は、蓄積のレベルを、バックグラウンドレベルまで減少させた（図８Ｃ）。他の実験では、単独のＳｙｎ−ＢＡＰ  ＰＦＦで処理された細胞は、細胞当たり約４．５のスポットを示し；同様に、Ｂ１２または９Ｅ４は、これを有意に変化させなかった。ｍ２Ｅ６、２Ｅ６−ＨＬＤ２または２Ｅ６−ＨＬＤ３による処理は、蓄積のレベルを有意に減少させた（細胞当たり約３つのスポットまで）（図８Ｄ）。
【０３０７】
ヒト黒色腫細胞株内の細胞から細胞へのα−シヌクレイン原線維の移動の抗体に仲介される阻害
本発明者らの抗体が、細胞から細胞へのα−シヌクレイン原線維の移動にも影響を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは、以下のようなアッセイを開発した：ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ｍｅｌ５（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−７０）を、ＡＴＣＣガイドラインにしたがって増殖させた。細胞を、Ｆａｌｃｏｎ  ＢＤ  ９６ウェルプレート中で、ウェル当たり３０００個の細胞の密度で平板培養し、一晩、付着させた。１つのプレート（「フィーダープレート」と命名された）上で、細胞に、２４時間にわたって０．０１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、超音波処理されたＡｔｔｏ４８８で標識されたα−シヌクレイン原線維を与えた。次に、細胞を、新鮮な培地で２回洗浄し、次に、抗体を、培地中で細胞に加えた。２４時間のインキュベーションの後、次に、個々のウェルからの培地を、ＳＫ−ｍｅｌ５細胞の新たなプレート（「レシピエントプレート」）に直接移した。次に、「フィーダープレート」を、４％のパラホルムアルデヒドを加えることによって直ぐに固定した一方、「レシピエントプレート」は、さらに２４時間放置してから、固定した（培地への直接の８％のパラホルムアルデヒドの添加によって）。両方のプレートを暗所に保持し、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、次に、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎで読み取った。核を、１つのチャネル中で検出し、有効なオブジェクトの数を定義した。Ａｔｔｏ４８８で標識された原線維を、核を取り囲む、したがって細胞の細胞質を表す、予め定義された環で形成された領域において別のチャネル中で検出した。細胞を画定する環領域におけるα−シヌクレイン凝集体（スポット）を含有する細胞のパーセントを定量した。
【０３０８】
「フィーダー」プレート上の細胞によってある程度取り込まれるα−シヌクレイン原線維は、同様に省略され、したがって、馴化培地を介して「レシピエント」プレート上の細胞に移されると考えられる。したがって、本発明者らは、「フィーダー」細胞内のクリアランスプロセスに対する抗体の影響（細胞内影響）および「レシピエント」プレート上の細胞への移動の阻害に対する影響を測定することができる。本発明者らは、かなりの量のα−シヌクレイン原線維が、「フィーダー」プレート上の細胞から、「レシピエント」プレート上の細胞に実際に移されることを示すことができる（「フィーダー」における６０％の細胞が陽性−「レシピエント」における３７％が陽性）。
【０３０９】
ｍ２Ｅ６は、原線維と比較して、「フィーダー」および「レシピエント」プレートの両方においてα−シヌクレインスポットを有する細胞の数を有意に減少させることが示された（図９）。比較例の抗体１Ｈ７（国際公開第２００７０２１２５５号パンフレット）は、いずれのプレートにも影響を与えなかった。対照抗体（Ｂ１２）は、同様に、影響を与えなかった。市販の抗体ＬＢ５０９（Ａｂｃａｍ）は、「フィーダー」プレート上のα−シヌクレインの細胞内レベルを減少させることができたが、移されたα−シヌクレインの量を有意に減少させなかった（図９）。
【０３１０】
α−シヌクレインのシーディングの抗体に仲介される阻害
細胞内αシヌクレインのシーディングの抗体に仲介される阻害の効果を示すために、ＨＥＫ２９３細胞ベースのシーディングアッセイを設定した。このアッセイにおいて、１日目に、ＨＥＫ２９３細胞を、対照（ｐｃＤＮＡ）またはα−シヌクレイン（ＷＴ、ＨＡタグを有する）ｃＤＮＡ発現プラスミドでトランスフェクトし、６つのウェルプレート中に平板培養する。２日目に、α−シヌクレイン原線維（シード）を、様々な濃度の抗体と混合し、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて細胞中にトランスフェクトする。３日目に、細胞をトリプシン処理し、分割し、６つのウェル中で再度平板培養する。４日目に、細胞を採取し、ｔｒｉｔｏｎ緩衝液中で溶解させる。細胞溶解物を超遠心機にかけ、上清を、Ｔｒｉｔｏｎまたは可溶性画分として保存する。ペレットを、ＳＤＳ緩衝液中で再懸濁させ、超遠心機にかけ、上清を、ＳＤＳ可溶性または不溶性画分として分類する。両方の画分、可溶性および不溶性画分を、ＳＤＳゲルにおいて電気泳動させ、全α−シヌクレインおよびリン酸化αシヌクレイン（Ｓ１２９Ｐ）を、それぞれ４Ｂ１２／１９０４抗体（全ヒトシヌクレイン）およびＳ１２９Ｐ−ａｓｙｎ抗体（ａｂｃａｍ  ５１２５３）によって検出する。ＳＤＳ可溶性画分中のリン酸化αシヌクレイン／βアクチンの比率を用いて、２Ｅ６−ＨＬＤ１ありと２Ｅ６−ＨＬＤ１なしでの、シードの添加に反応して形成される不溶性凝集α−シヌクレインのレベルを計算する。
【０３１１】
α−シヌクレインプラスミドによるトランスフェクション、続いて、α−シヌクレイン原線維のトランスフェクションは、αシヌクレインの凝集およびリン酸化を促進し、これは、ウエスタンブロットにおいて不溶性画分中のより高い分子量のαシヌクレイン凝集体の存在によって示される。ＨＡタグの存在のため、トランスフェクトされたαシヌクレインは、より速く泳動し、内因性αシヌクレインまたは約１７ｋＤで泳動するトランスフェクトされた原線維と区別される。
【０３１２】
ヒト化形態のｍ２Ｅ６、２Ｅ６−ＨＬＤ１を、αシヌクレイン原線維と混合すると、アイソタイプ対照抗体Ｂ１２と比較して、αシヌクレイン凝集およびリン酸化を減少させる（図１０Ａ）。αシヌクレインリン酸化においてＨＬＤ１による用量依存的な阻害がある（図１０Ｂ）。
【０３１３】
実施例７：Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける急性のインビボデータ
インビボでのα−シヌクレイン抗体の急性の電気生理学的効果
高い発現レベルのヒトα−シヌクレインが、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中に存在する。４〜６月齢の雄Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウスにおける海馬のＣＡ１領域におけるシナプス伝達および可塑性のインビボでの電気生理学的評価は、ｉ）基底シナプス伝達が、月齢をマッチさせた対照マウスと比較してＦ２８  ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいて著しく低下し、ｉｉ）二発刺激促通が、月齢をマッチさせた対照マウスと比較して、Ｆ２８  ｓｎｃａトランスジェニックにおいて著しく高められることを示した（図１１）。
【０３１４】
全ての実験を、実験動物の管理および使用についての欧州共同体理事会指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）（８６／６０９／ＥＥＣ）および動物実験を規制するデンマークの法律に準拠して行った。
【０３１５】
４〜６月齢のＦ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ）を、本研究に使用した。マウスを、制御された温度（２２±１．５℃）および湿度条件（５５〜６５％）において単一の小屋に収容し、１２：１２時間の明／暗サイクル（０６：００ｈで照明をオンにする）で飼育した。食物および水は自由に摂取可能であった。
【０３１６】
動物に、ウレタン（１．２ｇ／ｋｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で麻酔をかけた。次に、マウスを定位フレームに取り付け、マウスの体温を加熱パッドによって３７．５℃に調整し、頭蓋骨を露出させた。白金線を、基準として働くように前頭骨に設置し、ＰａｘｉｎｏｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，２００１）の図解にしたがって以下の配置で、海馬中への記録および刺激電極の挿入のためにさらなる孔を空けた：記録、ブレグマの１．５〜１．７ｍｍ後方、正中線の１．０〜１．２ｍｍ側方、脳の表面の１．４〜１．７ｍｍ下；刺激、ブレグマの１．８〜２．０ｍｍ後方、正中線の１．５〜１．７ｍｍ側方、脳の表面の１．５〜１．７ｍｍ下。動物を、記録の全期間を通して定位フレームに置いたままにし、それらの麻酔のレベルを定期的に調べた。
【０３１７】
電場電位（ｆＥＰＳＰ）を、３０秒ごとのシャファー側枝の電気刺激によってＣＡ１において誘発し、記録電極の深さを、マイナスのｆＥＰＳＰが単極方形パルスに応答して記録されるまで調整した。誘発されたｆＥＰＳＰの傾きを、ｆＥＰＳＰの最大振幅の３０〜７０％で測定した。
【０３１８】
最適なｆＥＰＳＰが誘発されたら、基底シナプス伝達を、刺激強度と誘発されたｆＥＰＳＰの傾きとの間の関係（入出力関係）によって評価した。様々な強度の刺激は、０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、および５００μＡであり、これを低い方から順に連続して加え、各強度で２〜３回繰り返す。基底シナプス伝達は、月齢をマッチさせた対照マウスと比較してＦ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいて著しく低下したことが分かった（図１１ａを参照）。
【０３１９】
シナプス前機構に依存すると考えられる短期シナプス可塑性である二発刺激促通を、Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウスにおいてさらに測定した。簡潔に述べると、２５〜１０００ｍｓで可変の刺激間間隔（ＩＳＩ）で一対の刺激をシャファー側枝に加え、第２のｆＥＰＳＰの傾きを、第１のｆＥＰＳＰの傾きと比較した。全てのＩＳＩで促通が観察され、５０および７５ｍｓのＩＳＩで促通が最大であった。興味深いことに、月齢をマッチさせた対照マウスと比較したときに、２５、５０および７５ｍｓのＩＳＩで、Ｆ２８  ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいて著しく強いＰＰＦが観察された（図１１ｂ）。シャファー側枝が、末端に残留するＣａ２＋による促通を特徴的に示すため、グルタミン酸放出を阻害する操作が、ＰＰＦの増加をもたらし得ることが示唆された。したがって、Ｆ２８トランスジェニックマウスにおける本発明者らの発見は、基底シナプス伝達の障害が、α−シヌクレイン過剰発現の結果としての小胞放出の障害に起因する可能性が高いことを示唆する。
【０３２０】
Ｆ２８  ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達および二発刺激促通の同定された障害を、α−シヌクレイン抗体の有効性を試験するための読み取りとしてさらに使用した。単回用量の抗体（腹腔内（ｉ．ｐ．））の投与の３〜６時間後、全ての実験において記録を行った。基底シナプス伝達および二発刺激促通を、可能であれば各動物の両方の海馬において記録し、個々の実験としてさらに使用した。
【０３２１】
ｈ９Ｅ４（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））による急性治療により、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害のかなりの改善が誘発された（Ｔｇ−ｓｎｃａ＋ｈ９Ｅ４対Ｔｇ−ｓｎｃａ＋ＰＢＳ、ｐ＝０．００２、図１２）。しかしながら、ｈ９Ｅ４による改善は、ＰＢＳで処理された同腹仔と比較して著しく低い基底シナプス伝達によって示されるように部分的であるに過ぎなかった（ｐ＝０．００７）。
【０３２２】
ＰＰＦの有意な増加が、ＰＢＳで処理された同腹仔と比較して、ＰＢＳで処理されたＴｇ−ｓｎｃａにおいて確認された（ｐ＝０．０４４、図１３）。ｈ９Ｅ４による処理は、ＰＢＳで処理されたトランスジェニックマウスと比較して、ＰＰＦに有意な効果を与えなかった（図１３）。
【０３２３】
対照マウスＩｇＧ（５Ｃ９）で処理されたＦ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達は、対照マウスＩｇＧ（５Ｃ９）で処理された、月齢をマッチさせたマウスにおけるより有意に低かった（ｐ＜０．００１、図１０）。１５ｍｇ／ｋｇの用量のｍ２Ｅ６による急性治療により、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害のかなりの改善が誘発された（Ｔｇ−ｓｎｃａ＋ｍ２Ｅ６対Ｔｇ−ｓｎｃａ＋対照ＩｇＧ、ｐ＝０．００４、図１４）。ｍ２Ｅ６で処理されたトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達は、対照ｍＩｇＧで処理された、月齢をマッチさせたマウスにおける基底シナプス伝達と有意に異なっておらず、これは、障害の完全な改善を示している。ｍ２Ｅ６による処理は、非トランスジェニックの、月齢をマッチさせたマウスにおける基底シナプス伝達に対して影響を与えなかった。
【０３２４】
対照マウスＩｇＧで処理された、月齢をマッチさせたマウスと比較して、ＰＰＦの著しい障害が、対照マウスＩｇＧで処理されたＦ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいて確認された（ｐ＝０．０２３）。ｍ２Ｅ６による処理は、対照マウスＩｇＧで処理されたトランスジェニックマウスと比較したときに、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいてＰＰＦ障害に対する有意な効果を与えなかった（図１５）。
【０３２５】
１５ｍｇ／ｋｇのｍ２Ｅ６が、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害の完全な改善を誘発したため、用量反応関係を確立するために、より低い用量を試験した。Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害は、５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の用量のｍ２Ｅ６によって、月齢をマッチさせた対照マウスと有意に異ならないレベルまで有意に改善された（図１６）。対照的に、２．５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の用量のｍ２Ｅ６は、基底シナプス伝達の障害を有意に改善しなかったが、高い刺激強度で強い傾向が観察された（３００、４００および５００μＡでそれぞれ、ｐ＝０．０６６、０．０１０および０．０５０）（図１７）。
【０３２６】
キメラ２Ｅ６、ｃｈ２Ｅ６抗体を、２．５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の用量で試験し、ＰＢＳ処理と比較したときに、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を部分的に改善した（ｐ＝０．０４２、図１８）。この効果は、本発明の一連の実験において２．５ｍｇ／ｋｇの用量のｍ２Ｅ６で得られた改善と有意に異ならなかった（図示せず）。ｍ２Ｅ６で観察されるように、キメラ２Ｅ６は、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおけるＰＰＦの障害に対して有意な効果を与えなかった（図１９）。
【０３２７】
２Ｅ６の親和性成熟されたヒト化形態である、抗体２Ｅ６−ＨＤＬ１は、Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善するために、キメラ２Ｅ６よりかなり効率的であり、ＰＢＳで処理された同腹仔と有意に異ならないレベルまでの完全な改善を誘発した（図１８）。Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおけるＰＰＦの障害の有意な改善は、２Ｅ６−ＨＬＤ１で観察されなかった（図１９）。
【０３２８】
実施例８：覚醒自由運動動物の脳におけるヒトα−シヌクレインを評価するための微小透析
プッシュプル微小透析を用いて、覚醒自由運動Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウスからの脳間質液（ＩＳＦ）ヒトα−シヌクレインを評価した。マウスを、制御された温度（２２±１．５℃）および湿度条件（５５〜６５％）において単一の小屋に収容し、１２：１２時間の明／暗サイクル（０６：００ｈで照明をオンにする）で飼育した。食物および水は自由に摂取可能であった。海馬における微小透析を可能にするために、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、大脳内ガイドカニューレを、脳内に定位に埋め込み、ＰａｘｉｎｏｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎ  ２００１の図解にしたがって、微小透析プローブを海馬内で位置決めした（プローブ先端の配置：ブレグマの３．１ｍｍ後方および２．８ｍｍ側方、および硬膜に対して１．３ｍｍ）。固定ねじおよびアクリルセメントをガイドカニューレの固定に使用した。カニューレの埋め込みの後、マウスを、透析前の２〜３日間にわたって外科手術から回復させた。プローブを、２つの流路を有する微小透析蠕動ポンプ（ＭＡＢ２０；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈ）に連結し、プッシュプルモードで操作した。微小透析プローブの入口管を、プローブに人工ＣＳＦをかん流させる蠕動ポンプに連結した。かん流液を管から引き出すことによる、プローブからのかん流液損失を防ぐために、蠕動ポンプをさらに出口管に連結した。ポンプの実際の流量を、プローブを連結させずに測定した。試料管を、所与の期間にわたってサンプリングする前および後に秤量し、流量を計算した。わずかに異なる方法を用いて、細胞外のヒトα−シヌクレインレベルに対するマウス２Ｅ６およびヒト９Ｅ４の効果を調べた。
【０３２９】
ａ．マウス２Ｅ６：Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウス（約３０週齢）の海馬において行った。実験の当日、２ｍｍ、３０００ｋＤａカットオフブレインリンク（ｂｒａｉｎｌｉｎｋ）プローブを、ガイドカニューレに挿入した。かん流緩衝液として、２５％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を、使用当日に人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ；ｍＭ単位で：１４７ＮａＣｌ、２．７ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ２、０．８５ＭｇＣｌ２）で２％に希釈し、０．１μｍの膜に通してろ過した。ポンプは、０．５μＬ／分の一定流量を有するようにした。６０分のサンプリング計画を、実験期間を通して使用した。組織損傷を避けるために、実験期間を、プローブ埋め込みの１４〜４８時間後に設定した。実験の開始の１４〜１６時間後、２つのベースライン試料を収集し、次に、マウス２Ｅ６または対照アイソタイプ５Ｃ９を、１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、さらなる６つの試料（６時間の収集）を収集した。透析液を、ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＥＬＩＳＡキット）によるヒトα−シヌクレイン決定まで−８０℃で貯蔵した。抗体処理の前の２つの基底値（２時間）の平均を、ベースラインとして取り、各動物について１００％に設定した。反復測定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、相違を測定した。海馬中のヒトα−シヌクレインの基底レベルは、１１．９±２．４ｎｇ／ｍｌであった（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１１、インビトロ透析プローブ回収に対して補正されていない）。対照５Ｃ９−抗体で処理された動物において、海馬中のヒトα−シヌクレインのレベルは、時間とともに有意に変化しなかった（図２０）。ｍ２Ｅ６（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の投与は、海馬中のヒトα−シヌクレインの有意な減少を引き起こした（図２０）。
【０３３０】
ｂ．ヒト９Ｅ４：Ｆ２８ｓｎｃａトランスジェニックマウス（約５０週齢）の海馬において行った。実験の当日、２ｍｍ、１０００ｋＤａカットオフＣＭＡプローブを、ガイドカニューレに挿入した。かん流緩衝液として、２５％のウシアルブミン画分Ｖ（Ｓｉｇｍａ）を、使用当日に人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ；ｍＭ単位で：１４７ＮａＣｌ、２．７ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ２、０．８５ＭｇＣｌ２）で０．２％に希釈し、０．１μｍの膜に通してろ過した。ポンプを、１μＬ／分の一定流量を有するように設定した。１２０分のサンプリング計画を、実験期間を通して使用した。組織損傷を避けるために、実験期間を、プローブ埋め込みの１４〜４８時間後に設定した。実験の開始の１４〜１６時間後、２〜３つのベースライン試料を収集し、次に、ヒト９Ｅ４または対照アイソタイプ抗ｈｅｌを、１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、さらなる６つの試料（１２時間の収集）を収集した。透析液を、ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＥＬＩＳＡキット）によるヒトα−シヌクレイン決定まで−８０℃で貯蔵した。抗体処理の前の２〜３つの基底値（４時間〜６時間）の平均を、ベースラインとして取り、各動物について１００％に設定した。細胞外のヒトα−シヌクレインレベルに対するヒト９Ｅ４または対照アイソタイプ抗ｈｅｌの効果の間に相違は観察されなかった（図２１）。反復測定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、相違を測定した。海馬中のヒトα−シヌクレインの基底レベルは、７．８±１．２ｎｇ／ｍｌであった（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１６、インビトロ透析プローブ回収に対して補正されていない）。
【０３３１】
実施例９
インビボでのα−シヌクレイン抗体の慢性効果
ドーパミン作動性ニューロンを標的にしたヒトα−シヌクレイン過剰発現のラットモデルおよびヒトα−シヌクレイン過剰発現のトランスジェニックマウスモデルにおけるｍ２Ｅ６の効果
【０３３２】
ラット中脳中のドーパミン作動性ニューロンに対するヒトα−シヌクレインの標的化された過剰発現が、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を用いて実現可能であり、黒質中のドーパミン作動性細胞の進行性消失および運動障害に関連している。α−シヌクレイン過剰発現のこのラットＡＡＶベースモデルにおいて、大脳基底核ニューロン発火活動が、パーキンソン病患者において記載されているものと同様に変化された、すなわち、視床下核および黒質網様部の両方において発火の不規則性が増加されたことが示された。
【０３３３】
全ての実験を、実験動物の管理および使用についての欧州共同体理事会指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）（８６／６０９／ＥＥＣ）および動物実験を規制するデンマークの法律に準拠して行った。
【０３３４】
成体雌スプラーグドーリーラット（２２５〜２５０ｇ）を使用した。抗体処理を、ウイルス感染の２〜４日前に開始し、試験の終了まで続けた。同じ体積（５ｍｌ／ｋｇ）におけるＰＢＳ投与を、対照として使用した。抗体を、１５ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回腹腔内投与した（図２２）。ヒト野生型α−ｓｙｎまたはＧＦＰを含有するウイルス（ｒＡＡＶ２／５）を、黒質（ＳＮ）の片側に注射した。動物に、２．０ｍｌ／ｋｇ皮下（ｓ．ｃ．）で、Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標）とＤｏｒｍｉｃｕｍ（登録商標）との組合せで麻酔をかけ、定位フレームに設置した。動物の体温を加熱パッドによって３７．５℃に調整し、頭蓋骨を露出させた。ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ  ＆  Ｗａｔｓｏｎ，１９９８）の図解にしたがって、以下の配置で右ＳＮの上に孔を空けた：ブレグマの５．５ｍｍ後方および２．０ｍｍ側方。３μＬのｒＡＡＶ２／５−α−ｓｙｎまたはｒＡＡＶ２／５−ＧＦＰの単回注入を、定位注入器（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）に連結されたＨａｍｉｌｔｏｎ製シリンジを用いて、硬膜の７．２ｍｍ下の深さで、および０．２μＬ／分の流量で行った。ＳＮにおけるベクターの拡散を可能にするために、針をさらに５分間所定の位置に置いておいた。外科手術の後、動物をホームケージに戻し、加熱された環境に置き、ここで、動物を麻酔から回復させた。
【０３３５】
ＡＡＶ注射の８〜１０週間後、ウレタン麻酔下で、視床下核（ＳＴＮ）において、細胞外の単一単位の記録を行った。全ての記録を、最後の抗体注射の２〜４日後に行った。ガラス電極を、電動式マイクロマニピュレータを用いてＳＴＮ（ブレグマの３．８±０．２ｍｍ後方および＋２．４±０．２ｍｍ側方）中に下ろした。細胞外活動電位を増幅し、弁別し、オシロスコープおよびオーディオモニターでモニターした。ニューロンを記録し、Ｓｐｉｋｅ  ２ソフトウェアを用いて分析した。ＳＴＮにおいて、推定されたグルタミン酸作動性ニューロンは、皮質表面の下方７．０〜７．６ｍｍで見られた。それらは、典型的に、０．５〜４０スパイク／秒の範囲の発火頻度、および狭い活動電位を示した。少なくとも２００の連続したスパイクを、分析に使用した。平均発火頻度、およびＩＳＩの標準偏差と平均ＩＳＩとの比率×１００として定義されるスパイク間隔の変動係数（ＣＶ  ＩＳＩ）を、各ニューロンについて計算した。スパイク密度ヒストグラムおよびオートコレログラムを、各ニューロンについて作成し、それを用いて、既に記載されるように、発火パターンを、規則的な、不規則なまたはバーストのパターンに定性的に分類する（Ｋａｎｅｏｋｅ  ＆  Ｖｉｔｅｋ，１９９６；Ｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０３３６】
ＡＡＶ−α−シヌクレインラットは、スパイク間隔の変動係数（ＣＶ  ＩＳＩ）の有意な増加（図２３）および規則的な、不規則なおよびバーストのパターンで発火する細胞の割合の有意な変化（図２４）によって示されるように、ＡＡＶ−ＧＦＰラットと比較して、ＳＴＮニューロンの発火パターンの変化を示した。興味深いことに、ｍ２Ｅ６による処理は、３つの異なる発火パターンを示すニューロンの割合の有意な正常化（図２４）、ならびにそれらのＣＶ  ＩＳＩの減少の非有意な傾向（図２３）を誘発した。
【０３３７】
ヒトα−シヌクレイン過剰発現のトランスジェニックマウスモデルにおける長期治療後のｍ２Ｅ６の効果
Ｆ２８  ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける二発刺激促通の同定された障害を、長期治療後の抗体の有効性を試験するための読み取りとしてさらに使用した。
【０３３８】
動物に、１６〜１８週間にわたって１５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の用量のｍ２Ｅ６または対照ｍＩｇＧ１のいずれかを週に２回投与した。全ての記録を、実施例７において前述されるのと同様に行ったが、急性実験について行われたように、３〜６時間の代わりに最後の用量の抗体の投与の２〜４日後に記録を行った。二発刺激促通を、可能であれば各動物の両方の海馬において記録し、個々の実験としてさらに使用した。
【０３３９】
５Ｃ９で処理されたマウスと比較して、２Ｅ６で処理された、月齢をマッチさせた対照マウスにおいて、二発刺激促通は有意に異ならなかった。既に報告されるように、５Ｃ９で処理された、月齢をマッチさせた対照マウスと比較して、５Ｃ９で処理されたＦ２８  ｓｎｃａ  Ｔｇマウスにおいて、ＰＰＦの向上が観察された。興味深いことに、１５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の用量の２Ｅ６による処理は、Ｆ２８  ｓｎｃａ  ＴｇマウスにおけるＰＰＦを正常化した（図２５）。
【０３４０】
二発刺激促通（ＰＰＦ）は、シナプス前機構に依存すると考えられる短期シナプス可塑性であり、シャファー側枝が、末端に残留するＣａ２＋による促通を特徴的に示すため、グルタミン酸放出を阻害する操作が、ＰＰＦの増加をもたらし得ることが示唆された。したがって、Ｆ２８トランスジェニックマウスにおける本発明者らの発見は、基底シナプス伝達の障害が、α−シヌクレイン過剰発現の結果としての小胞放出の障害に起因する可能性が高いことを示唆する。抗体２Ｅ６による長期治療のみが、ＰＰＦの障害を改善することができるため、これは、長期の抗体処理が、小胞放出の障害に対するα−シヌクレイン過剰発現の影響を低減し得ることを示唆する。この効果は、抗体療法で治療されたヒトＰＤ患者におけるシナプス伝達の改善につながり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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