(57)【要約】  本出願は、抗ＣＣＲ７抗体、その抗原結合フラグメント、および前記抗体または抗原結合フラグメントの抗体薬物コンジュゲートを開示する。本発明は、抗体、抗原結合フラグメント、および抗体薬物コンジュゲートを使用して、癌を治療または予防する方法にも関する。抗体、抗原結合フラグメント、および抗体薬物コンジュゲートを作製する方法、ならびに抗体および抗原結合フラグメントを診断試薬として使用する方法も、本明細書に開示される。
2020506703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣＲ７タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、同じアイソタイプの野生型抗体と比較して、低下されたエフェクター機能を有するかまたは有意なエフェクター機能を有さない抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性の低下したレベルを有するか、または有意なレベルを有さない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、サイレンシングされたＦｃ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｄ２６５Ａ；Ｐ３２９Ａ；Ｐ３２９Ｇ；Ｎ２９７Ａ；Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ａ；Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ；Ｌ２３４およびＬ２３５Ａ；Ｐ３２９Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；およびＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａから選択されるＦｃ領域における突然変異を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、有意な細胞殺滅活性を有さない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、より低いレベルのＣＣＲ７を発現する細胞より高いレベルのＣＣＲ７を発現する細胞により高い親和性で結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、より低いレベルのＣＣＲ７を発現する正常細胞より高いレベルのＣＣＲ７を発現する癌細胞により高い親和性で結合する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＣＣＲ７を発現する正常な造血細胞を実質的に枯渇させない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ａ．配列番号１のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、配列番号２のＨＣＤＲ２（重鎖相補性決定領域２）、および配列番号３のＨＣＤＲ３（重鎖相補性決定領域３）を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１７のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、配列番号１８のＬＣＤＲ２（軽鎖相補性決定領域２）、および配列番号１９のＬＣＤＲ３（軽鎖相補性決定領域３）を含む軽鎖可変領域；
ｂ．配列番号４のＨＣＤＲ１、配列番号５のＨＣＤＲ２、および配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２、および配列番号２５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号１０のＨＣＤＲ１、配列番号１１のＨＣＤＲ２、および配列番号１２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２６のＬＣＤＲ１、配列番号２７のＬＣＤＲ２、および配列番号２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｅ．配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号４９のＬＣＤＲ１、配列番号５０のＬＣＤＲ２、および配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｆ．配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、および配列番号３８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｇ．配列番号３９のＨＣＤＲ１、配列番号４０のＨＣＤＲ２、および配列番号４１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、および配列番号５７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｈ．配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４３のＨＣＤＲ２、および配列番号４４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号５８のＬＣＤＲ１、配列番号５９のＬＣＤＲ２、および配列番号６０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｉ．配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８１のＬＣＤＲ１、配列番号８２のＬＣＤＲ２、および配列番号８３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｊ．配列番号６８のＨＣＤＲ１、配列番号６９のＨＣＤＲ２、および配列番号７０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８４のＬＣＤＲ１、配列番号８５のＬＣＤＲ２、および配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｋ．配列番号７１のＨＣＤＲ１、配列番号７２のＨＣＤＲ２、および配列番号７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８７のＬＣＤＲ１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｌ．配列番号７４のＨＣＤＲ１、配列番号７５のＨＣＤＲ２、および配列番号７６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号９０のＬＣＤＲ１、配列番号９１のＬＣＤＲ２、および配列番号９２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｍ．配列番号５９６のＨＣＤＲ１、配列番号５９７のＨＣＤＲ２、および配列番号５９８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１２のＬＣＤＲ１、配列番号６１３のＬＣＤＲ２、および配列番号６１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｎ．配列番号５９９のＨＣＤＲ１、配列番号６００のＨＣＤＲ２、および配列番号６０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１５のＬＣＤＲ１、配列番号６１６のＬＣＤＲ２、および配列番号６１７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｏ．配列番号６０２のＨＣＤＲ１、配列番号６０３のＨＣＤＲ２、および配列番号６０４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１８のＬＣＤＲ１、配列番号６１９のＬＣＤＲ２、および配列番号６２０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
ｐ．配列番号６０５のＨＣＤＲ１、配列番号６０６のＨＣＤＲ２、および配列番号６０７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６２１のＬＣＤＲ１、配列番号６２２のＬＣＤＲ２、および配列番号６２３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、ＣＣＲ７に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ａ．配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ．配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ．配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｄ．配列番号６０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ＣＣＲ７に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ａ．配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｂ．配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｃ．配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号９５のアミノ酸配列を含む軽鎖；または
ｄ．配列番号６１０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６２６のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、ＣＣＲ７に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、１つまたは複数のシステイン置換を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの前記重鎖のＳ１５２Ｃ、Ｓ３７５Ｃ、またはＳ１５２ＣおよびＳ３７５Ｃの両方から選択される１つまたは複数のシステイン置換を含み、ここで、位置が、ＥＵ体系にしたがって番号付けされる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
式
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、
Ａｂが、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合抗原結合フラグメントであり；
Ｌがリンカーであり；
Ｄが薬物部分であり；
ｍが、１〜８の整数であり；
ｎが、１〜１２の整数である）
またはその薬学的に許容できる塩を含む抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
前記ｍが１である、請求項１５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
前記ｎが、約３〜約４である、請求項１５または１６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー、およびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、請求項１８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
前記リンカーが、下式（ＩＩＡ）：
【化１】
2020506703.tif 000164
（式中、＊が、前記抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、薬物部分のチオール官能基に結合され；ここで：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、前記メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
で表される、請求項１８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
前記リンカーが、下式：
【化２】
2020506703.tif 000165
（式中、ｙが、１〜１１であり；＊が、前記抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、前記薬物部分のチオール官能基に結合される）
で表される、請求項２０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
前記薬物部分が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、オーリスタチン、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ小溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
前記細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項２３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
下式（ＶＩＩＩ）：
【化３】
2020506703.tif 000166
（式中、Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、前記メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；ここで、ｎが、約３〜約４である）；またはその薬学的に許容できる塩を有する、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２６】
下式：
【化４】
2020506703.tif 000167
（式中、ｎが、約３〜約４であり、Ａｂが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である）；またはその薬学的に許容できる塩を有する抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２９】
癌の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法であって、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記癌がＣＣＲ７を発現する方法。
【請求項３０】
前記抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物が、１つまたは複数のさらなる治療化合物と組み合わせて前記患者に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数のさらなる治療化合物が、標準治療化学療法剤、共刺激分子、またはチェックポイント阻害剤から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記共刺激分子が、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＳＴＩＮＧ、またはＣＤ８３リガンドのアゴニストから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲβの阻害剤から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
薬剤として使用するための、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＣＣＲ７発現癌の治療または予防を、それを必要とする患者において行うのに使用するための、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ＣＣＲ７発現癌の治療または予防を、それを必要とする患者において行うための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３７】
薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３８】
前記癌がＣＣＲ７を発現する、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法、請求項３４もしくは３５に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３６もしくは３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記癌が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えばマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、食道癌、大腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、腎細胞癌、および子宮頸癌からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法、抗体薬物コンジュゲート、または使用。
【請求項４０】
前記癌が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えばマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法、抗体薬物コンジュゲート、または使用。
【請求項４１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項４２】
前記核酸が、配列番号１４、１６、３０、３２、４６、４８、６２、６４、７８、８０、９４、９６、４８１、４８３、４９７、または４９９のヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載のベクター、または請求項４１もしくは４２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４５】
抗体または抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、請求項４４に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記抗体を回収することを含む方法。
【請求項４６】
細胞培養物から前記抗体を回収することが、
ａ）細胞を除去し、前記培養物をろ過する工程と；
ｂ）アフィニティークロマトグラフィーによって、前記培養物を精製する工程と；
ｃ）ｐＨを３．４〜３．６に調整し、次に、ｐＨを５．８〜６．２に再調整することによって前記培養物中のあらゆるウイルスを不活化し、前記培養物をろ過する工程と；
ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーによって前記培養物を精製し、前記培養物のオンカラム還元を行う工程と；
ｅ）前記培養物におけるアニオン交換クロマトグラフィーを行う工程と；
ｆ）ナノろ過によってウイルスを除去する工程と；
ｇ）前記抗体を含有する前記培養物をろ過する工程と；
ｈ）精製された抗体を得る工程と
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法であって、
（ａ）下式：
【化５】
2020506703.tif 000168
（式中：
前記薬物部分が、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４であり、前記薬物部分が、そのチオール官能基を介して前記リンカーに結合され；
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、前記メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
のリンカー−薬物部分を予め形成することと；
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、請求項４６に記載の細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）前記抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む方法。
【請求項４８】
（ｂ）下式：
【化６】
2020506703.tif 000169
のリンカー−薬物部分を予め形成することと、
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、請求項４６に記載の細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）前記抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法であって、
（ａ）下式：
【化７】
2020506703.tif 000170
（式中：
前記薬物部分が、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４であり、前記薬物部分が、そのチオール官能基を介して前記リンカーに結合され；
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、前記メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
のリンカー−薬物部分を予め形成することと；
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）前記抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む方法。
【請求項５０】
抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法であって、
（ａ）下式：
【化８】
2020506703.tif 000171
のリンカー−薬物部分を予め形成することと、
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）前記抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む方法。
【請求項５１】
前記リンカー−薬物部分を予め形成する工程が、
ｃ）薬物部分を、そのチオール官能基を介して、
【化９】
2020506703.tif 000172
と反応させて；
【化１０】
2020506703.tif 000173
を形成することと；
ｄ）前記形成された
【化１１】
2020506703.tif 000174
を、
【化１２】
2020506703.tif 000175
と反応させて；
前記リンカー−薬物部分：
【化１３】
2020506703.tif 000176
（式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、前記メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、前記アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；
ＲＧ１およびＲＧ２が、基Ｘを形成する２つの反応性基である）
を形成することとを含む、請求項４７または４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカー−薬物部分を予め形成する工程が、
ｅ）前記薬物部分を、そのチオール官能基を介して、
【化１４】
2020506703.tif 000177
と反応させて；
【化１５】
2020506703.tif 000178
を形成することと；
ｆ）前記形成された
【化１６】
2020506703.tif 000179
を、
【化１７】
2020506703.tif 000180
と反応させて；
前記リンカー−薬物部分：
【化１８】
2020506703.tif 000181
を形成することとを含む、請求項４８または５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＵＶ分光光度計で測定される、約３〜約４の平均ＤＡＲを有する、請求項４７〜５２のいずれか一項にしたがって作製される抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５４】
抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法であって、
（ａ）ＳＭＣＣまたはＭＰＥＴを、薬物部分ＤＭ−１またはＤＭ−４に化学的に結合して、リンカー−薬物を形成することと；
（ｂ）前記リンカー−薬物を、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体にコンジュゲートすることと；
（ｃ）前記抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む方法。
【請求項５５】
ＵＶ分光光度計で測定される、約３〜約４の平均ＤＡＲを有する、請求項５４にしたがって作製される抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断試薬。
【請求項５７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、放射性標識、フルオロフォア、発色団、イメージング剤、または金属イオンで標識される、請求項５６に記載の診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４５４，４７６号の利益を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０１８年１月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７５９４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、３８７，０５４バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、一般に、抗ＣＣＲ７抗体、抗体フラグメント、およびそのイムノコンジュゲート、ならびに癌の治療または予防のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＣＣ−ケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）は、１９９３年にリンパ球特異的受容体として最初に同定された（例えば、Ｂｉｒｋｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９３  Ａｐｒ；６７（４）：２２０９−２０を参照）。その発現は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナイーブＢ細胞、ＮＫ細胞および成熟抗原提示樹枝状細胞（ＤＣ）などの、免疫細胞のサブセットに限定される。ＣＣＲ７は、リンパ器官へのおよびリンパ器官内の免疫細胞のホーミングを調節し、したがって免疫と耐性とのバランスを取るのに重要な役割を果たす（例えば、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｍａｙ；８（５）：３６２−７１を参照）。
【０００５】
ＣＣＲ７は、２つのリガンド、ＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９を有する、クラスＡ、ロドプシン様Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＣＲ７構造は、完全には解明されていないが、特定のモチーフが、受容体活性に極めて重要であることが分かっている（例えば、Ｌｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ  １を参照）。
【０００６】
ＣＣＲ７および癌
ＣＣＲ７（ＥＢＩ１、ＢＬＲ２、ＣＣ−ＣＫＲ−７、ＣＭＫＢＲ７、ＣＤ１９７およびＣＤｗ１９７とも呼ばれる）は、特に、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、ＣＬＬ、ＭＣＬ、バーキットリンパ腫）、Ｔ細胞悪性腫瘍（例えば、ＡＴＬＬ）、ＨＮＳＣＣ、ＥＳＣＣ、胃癌、ＮＳＣＬＣ、大腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、および子宮頸癌を含む多くの悪性腫瘍において過剰発現されることも知られている。例えば、大腸癌、ＥＳＣＣ、膵臓癌、ＨＮＳＣＣ、および胃癌におけるＣＣＲ７の過剰発現は、進行した腫瘍病期、リンパ節転移および低い生存率に関連していた（例えば、Ｍａｌｉｅｔｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１５；１１２：８６−９２；Ｉｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４，１４：２９１；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５：１５７２−１５７８，２０１３；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｊａｎ；２１（１）：１２３−３１；Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１６  Ｍａｒ  １６を参照）。
【０００７】
さらに、例えば、ＨＮＳＣＣにおけるＣＣＲ７発現は、化学療法に対する耐性において役割を果たすことが示されている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＮＣＩ  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（２００８）１００（７）：５０２−５１２を参照）。膵臓癌および鼻咽頭癌（ＮＰＣ）などの特定の癌型において、ＣＣＲ７は、癌幹様細胞転移およびスフィア形成を促進することが知られている（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  １１（８）；Ｌｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７（１２）を参照）。細胞移動、侵襲性およびＥＭＴ（上皮間葉移行）におけるＣＣＲ７の役割は、インビトロおよびインビボで、乳癌および膵臓癌などの様々な癌型において記載されている（例えば、Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１５）、１−１３）；Ｓｐｅｒｖｅｓｌａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１３１，Ｅ３７１−Ｅ３８１（２０１２）を参照）。ＣＣＲ７シグナル伝達にとって不可欠であることが記載されている主な経路としては、ｂ−アレスチン媒介性ｐ３８／ＥＲＫ１／２およびＲｈｏシグナル伝達が挙げられる（例えば、Ｎｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ２０１２  Ａｐｒ  ２５；９：７７を参照）。
【０００８】
多くの癌に関連する過程が、ＣＣＲ７発現を誘導することが知られている。ＨＮＳＣＣにおいて、ＣＣＲ７発現は、ＣＣＲ７プロモーター内の部位への直接の結合によって、ＮＦ−ｋＢおよびＡＰ１転写因子によって誘導されることが示されている（Ｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７：３５８１−３５９０）。特に、ＣＣＲ７発現は、腫瘍微小環境において様々な因子によって調節される。これに関して、ＣＣＲ７発現は、ＨＮＳＣＣにおいてｂ−デフェンシン３／ＮＦ−ｋＢ経路（例えば、Ｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｏｌ．３２  ｎｏ．２  ｐｐ．１６８−１７４，２０１０を参照）ならびに乳房腫瘍細胞内のエンドセリン受容体Ａおよび低酸素誘導因子−１（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６：１１８０２−１１８０７を参照）を介して誘導されることが知られている。
【０００９】
抗体薬物コンジュゲート
抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）は、癌の治療において細胞毒性剤の局所的送達に使用されている（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９，２００５を参照）。ＡＤＣは、最小の毒性で最大の有効性が達成され得る薬物部分の標的化送達を可能にする。ＡＤＣは、その細胞増殖抑制性または細胞毒性活性のために選択される薬物に関連した、治療的介入の標的とされる細胞に結合するその能力のために選択される抗体を含む。それによって、標的化細胞への抗体の結合は、その治療効果が必要とされる部位に薬物を送達する。
【００１０】
標的化細胞、例えば、癌細胞を認識し、それに選択的に結合する多くの抗体が、ＡＤＣにおける使用について開示されている。ＡＤＣに関する広範囲にわたる研究にもかかわらず、対象とする特定の標的への抗体結合は、ＡＤＣ用途における成功を予測するのに不十分である。ＡＤＣの治療有効性をもたらし得る因子の例（標的に固有の特徴を除く）としては、標的介在性薬物動態（ＴＭＤＤ）と有効性を促進する曝露（ｅｆｆｉｃａｃｙ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）との間のバランスとしての最適な抗体親和性、Ｆｃ介在性機能（抗体依存性細胞介在性細胞毒性、ＡＤＣＣ）の評価、コンジュゲーションの方法（部位特異的であるかまたは部位特異的でない）、各抗体にコンジュゲートする薬物／ペイロード分子の比率（「ＤＡＲ」または「薬物抗体比」）、リンカーの切断性または安定性、ＡＤＣの安定性、およびＡＤＣが凝集する傾向などの、カスタマイズされた微調整を必要とする様々な側面が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
有効なＡＤＣ治療組成物および方法として使用するための向上した特性を有する、抗体、結合方法、および細胞毒性ペイロードが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願は、ヒトＣＣＲ７タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、同じアイソタイプの野生型抗体と比較して、低下されたエフェクター機能を有するかまたは有意なエフェクター機能を有さない抗体またはその抗原結合フラグメントを開示する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性の低下したレベルを有するかまたは有意なレベルを有さない。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、サイレンシングされたＦｃ領域を含む。ある実施形態において、抗体は、Ｄ２６５Ａ；Ｐ３２９Ａ；Ｐ３２９Ｇ；Ｎ２９７Ａ；Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ａ；Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ；Ｌ２３４およびＬ２３５Ａ；Ｐ３２９Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；およびＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａから選択されるＦｃ領域における突然変異を含む。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、有意な細胞殺滅活性を有さない。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、より低いレベルのＣＣＲ７を発現する細胞より高いレベルのＣＣＲ７を発現する細胞により高い親和性で結合する。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、より低いレベルのＣＣＲ７を発現する正常細胞より高いレベルのＣＣＲ７を発現する癌細胞により高い親和性で結合する。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７を発現する正常な造血細胞を実質的に枯渇させない。
【００１３】
一実施形態において、本出願は、
ａ．配列番号１のＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、配列番号２のＨＣＤＲ２（重鎖相補性決定領域２）、および配列番号３のＨＣＤＲ３（重鎖相補性決定領域３）を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１７のＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、配列番号１８のＬＣＤＲ２（軽鎖相補性決定領域２）、および配列番号１９のＬＣＤＲ３（軽鎖相補性決定領域３）を含む軽鎖可変領域；
ｂ．配列番号４のＨＣＤＲ１、配列番号５のＨＣＤＲ２、および配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、および配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２、および配列番号２５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号１０のＨＣＤＲ１、配列番号１１のＨＣＤＲ２、および配列番号１２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２６のＬＣＤＲ１、配列番号２７のＬＣＤＲ２、および配列番号２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｅ．配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、および配列番号３５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号４９のＬＣＤＲ１、配列番号５０のＬＣＤＲ２、および配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｆ．配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、および配列番号３８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、および配列番号５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｇ．配列番号３９のＨＣＤＲ１、配列番号４０のＨＣＤＲ２、および配列番号４１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、および配列番号５７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｈ．配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４３のＨＣＤＲ２、および配列番号４４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号５８のＬＣＤＲ１、配列番号５９のＬＣＤＲ２、および配列番号６０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｉ．配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２、および配列番号６７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８１のＬＣＤＲ１、配列番号８２のＬＣＤＲ２、および配列番号８３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｊ．配列番号６８のＨＣＤＲ１、配列番号６９のＨＣＤＲ２、および配列番号７０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８４のＬＣＤＲ１、配列番号８５のＬＣＤＲ２、および配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｋ．配列番号７１のＨＣＤＲ１、配列番号７２のＨＣＤＲ２、および配列番号７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８７のＬＣＤＲ１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｌ．配列番号７４のＨＣＤＲ１、配列番号７５のＨＣＤＲ２、および配列番号７６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号９０のＬＣＤＲ１、配列番号９１のＬＣＤＲ２、および配列番号９２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｍ．配列番号５９６のＨＣＤＲ１、配列番号５９７のＨＣＤＲ２、および配列番号５９８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１２のＬＣＤＲ１、配列番号６１３のＬＣＤＲ２、および配列番号６１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｎ．配列番号５９９のＨＣＤＲ１、配列番号６００のＨＣＤＲ２、および配列番号６０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１５のＬＣＤＲ１、配列番号６１６のＬＣＤＲ２、および配列番号６１７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｏ．配列番号６０２のＨＣＤＲ１、配列番号６０３のＨＣＤＲ２、および配列番号６０４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１８のＬＣＤＲ１、配列番号６１９のＬＣＤＲ２、および配列番号６２０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
ｐ．配列番号６０５のＨＣＤＲ１、配列番号６０６のＨＣＤＲ２、および配列番号６０７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６２１のＬＣＤＲ１、配列番号６２２のＬＣＤＲ２、および配列番号６２３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、ＣＣＲ７に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを開示する。
【００１４】
本出願のＣＣＲ７に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ａ．配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ．配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ．配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｄ．配列番号６０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
も含み得る。
【００１５】
別の実施形態において、ＣＣＲ７に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ａ．配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｂ．配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｃ．配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号９５のアミノ酸配列を含む軽鎖；または
ｄ．配列番号６１０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６２６のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【００１６】
本明細書に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つまたは複数のシステイン置換を含み得る。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖のＳ１５２Ｃ、Ｓ３７５Ｃ、またはＳ１５２ＣおよびＳ３７５Ｃの両方から選択される１つまたは複数のシステイン置換を含み、ここで、位置が、ＥＵ体系にしたがって番号付けされる。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体であり得る。
【００１７】
本出願は、式：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、
Ａｂが、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合抗原結合フラグメントであり；
Ｌがリンカーであり；
Ｄが薬物部分であり；
ｍが、１〜８の整数であり；
ｎが、１〜１２の整数である）
またはその薬学的に許容できる塩を含む抗体薬物コンジュゲートを開示する。
【００１８】
ある実施形態において、ｍが１である。一実施形態において、ｎが、約３〜約４である。一実施形態において、リンカーは、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー（ｐｒｏｃｈａｒｇｅｄ  ｌｉｎｋｅｒ）、およびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される。
【００１９】
一実施形態において、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する。
【００２０】
他の実施形態において、リンカーは、下式（ＩＩＡ）：
【化１】
2020506703.tif 000003
（式中、＊が、抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、薬物部分のチオール官能基に結合され；ここで：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
で表される。
【００２１】
別の実施形態において、リンカーは、下式：
【化２】
2020506703.tif 000004
（式中、ｙが、１〜１１であり；＊が、抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、薬物部分のチオール官能基に結合される）
で表される。
【００２２】
一実施形態において、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ小溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。ある実施形態において、細胞毒性剤は、メイタンシノイドであり、ここで、メイタンシノイドは、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。
【００２３】
一実施形態において、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートは、下式（ＶＩＩＩ）：
【化３】
2020506703.tif 000005
（式中、Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；ここで、ｎが、約３〜約４である）；またはその薬学的に許容できる塩を含む。
【００２４】
一実施形態において、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートは、下式：
【化４】
2020506703.tif 000006
（式中、ｎが、約３〜約４であり、Ａｂが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である）；またはその薬学的に許容できる塩を有する。
【００２５】
本出願は、本明細書に開示される抗体、またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物も開示する。本出願は、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物も開示する。
【００２６】
本出願は、癌の治療または予防を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を前記患者に投与することを含み、癌がＣＣＲ７を発現する方法も開示する。
【００２７】
癌を治療または予防する方法のある実施形態において、抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる治療化合物と組み合わせて患者に投与される。一実施形態において、１つまたは複数のさらなる治療化合物は、標準治療化学療法剤、共刺激分子、またはチェックポイント阻害剤から選択される。一実施形態において、共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＳＴＩＮＧ、またはＣＤ８３リガンドのアゴニストから選択される。別の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲβの阻害剤から選択される。
【００２８】
本出願は、薬剤として使用するための、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物も開示する。一実施形態において、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物は、ＣＣＲ７発現癌の治療または予防を、それを必要とする患者において行うのに使用するためのものである。
【００２９】
一実施形態において、本出願は、ＣＣＲ７発現癌の治療または予防を、それを必要とする患者において行うための、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメント、抗体薬物コンジュゲート、または医薬組成物の使用を開示する。
【００３０】
一実施形態において、本出願は、薬剤の製造における、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメント、抗体薬物コンジュゲート、または医薬組成物の使用を開示する。
【００３１】
一実施形態において、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えばマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、食道癌、大腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、腎細胞癌、および子宮頸癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えばマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および非小細胞肺癌からなる群から選択される。
【００３２】
本出願は、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸も開示する。一実施形態において、核酸は、配列番号１４、１６、３０、３２、４６、４８、６２、６４、７８、８０、９４、９６、４８１、４８３、４９７、または４９９のヌクレオチド配列を含む。本出願は、核酸を含むベクター、およびベクターまたは核酸を含む宿主細胞も開示する。本出願は、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、宿主細胞を培養し、細胞培養物から抗体を回収することを含む方法も開示する。一実施形態において、細胞培養物から抗体を回収する方法は、
ａ）細胞を除去し、培養物をろ過する工程と；
ｂ）アフィニティークロマトグラフィーによって、培養物を精製する工程と；
ｃ）ｐＨを３．４〜３．６に調整し、次に、ｐＨを５．８〜６．２に再調整することによって培養物中のあらゆるウイルスを不活化し、培養物をろ過する工程と；
ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーによって培養物を精製し、培養物のオンカラム還元を行う工程と；
ｅ）培養物におけるアニオン交換クロマトグラフィーを行う工程と；
ｆ）ナノろ過によってウイルスを除去する工程と；
ｇ）抗体を含有する培養物をろ過する工程と；
ｈ）精製された抗体を得る工程と
を含む。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法であって、
（ａ）下式：
【化５】
2020506703.tif 000007
（式中：
薬物部分が、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４であり、薬物部分が、そのチオール官能基を介してリンカーに結合され；
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
のリンカー−薬物部分を予め形成することと；
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、本明細書に開示される細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む方法である。
【００３４】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）下式：
【化６】
2020506703.tif 000008
のリンカー−薬物部分を予め形成することと、
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、本明細書に開示される細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む。
【００３５】
別の実施形態において、抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法は、
（ａ）下式：
【化７】
2020506703.tif 000009
（式中：
薬物部分が、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４であり、薬物部分が、そのチオール官能基を介してリンカーに結合され；
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
のリンカー−薬物部分を予め形成することと；
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、本明細書に開示される抗体にコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む。
【００３６】
別の実施形態において、抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法は、
（ａ）下式：
【化８】
2020506703.tif 000010
のリンカー−薬物部分を予め形成することと、
（ｂ）前記リンカー−薬物部分を、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲートを産生することと；
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む。
【００３７】
別の実施形態において、前記リンカー−薬物部分を予め形成する工程は、
ａ）薬物部分を、そのチオール官能基を介して、
【化９】
2020506703.tif 000011
と反応させて；
【化１０】
2020506703.tif 000012
を形成することと；
ｂ）形成された
【化１１】
2020506703.tif 000013
を、
【化１２】
2020506703.tif 000014
と反応させて；
リンカー−薬物部分：
【化１３】
2020506703.tif 000015
（式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；
ＲＧ１およびＲＧ２が、基Ｘを形成する２つの反応性基である）
を形成することとを含む。
【００３８】
別の実施形態において、前記リンカー−薬物部分を予め形成する工程は、
ａ）薬物部分を、そのチオール官能基を介して、
【化１４】
2020506703.tif 000016
と反応させて；
【化１５】
2020506703.tif 000017
を形成することと；
ｂ）形成された
【化１６】
2020506703.tif 000018
を、
【化１７】
2020506703.tif 000019
と反応させて；
リンカー−薬物部分：
【化１８】
2020506703.tif 000020
を形成することとを含む。
【００３９】
ある実施形態において、上記の方法にしたがって作製される抗体薬物コンジュゲートは、ＵＶ分光光度計で測定される、約３〜約４の平均ＤＡＲを有する。
【００４０】
別の実施形態において、本出願は、抗ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートを産生するための方法であって、
（ａ）ＳＭＣＣまたはＭＰＥＴを、薬物部分ＤＭ−１またはＤＭ−４に化学的に結合して、リンカー−薬物を形成することと；
（ｂ）前記リンカー−薬物を、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートすることと；
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することと
を含む方法を開示する。
【００４１】
一実施形態において、この方法にしたがって作製される抗体薬物コンジュゲートは、ＵＶ分光光度計で測定される、約３〜約４の平均ＤＡＲを有する。
【００４２】
本出願は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断試薬も開示する。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、放射性標識、フルオロフォア、発色団、イメージング剤、または金属イオンで標識される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】代理ＡＤＣＣレポーターアッセイを用いた、ＣｙｓＭａｂフォーマットの非ヒト化およびヒト化抗ＣＣＲ７抗体のインビトロＡＤＣＣ活性についての実験データを示す。
【図２】代理ＡＤＣＣレポーターアッセイを用いた、非ヒト化抗ＣＣＲ７抗体のＤＡＰＡ  Ｆｃ突然変異型のインビトロＡＤＣＣ活性についての実験データを示す。
【図３】ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いた、ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡフォーマットの抗ＣＣＲ７抗体による組み換えｈＣＣＲ７への結合についての実験データを示す。
【図４−１】図４：アゴニストモード（図４Ａ）およびアンタゴニストモード（図４Ｂ、図４Ｃ）におけるβ−アレスチンアッセイを用いた、親抗ＣＣＲ７抗体の機能性についての実験データを示す。
【図４−２】（上記の通り。）
【図４−３】（上記の通り。）
【図５】ＦＡＣＳアッセイを用いた、ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡフォーマットの抗ＣＣＲ７抗体によるＣＣＲ７リガンドと競合させた実験データを示す。
【図６】突然変異ＣＣＲ７タンパク質を用いた、親抗ＣＣＲ７抗体のエピトープマッピングについての実験データを示す。
【図７−１】図７：ペイロード共役二次抗体フラグメントと複合体を形成する親抗ＣＣＲ７抗体のピギーバックＡＤＣ（ｐｇＡＤＣ）アッセイについての実験データを示す。
【図７−２】（上記の通り。）
【図８】標的陰性細胞株を用いた、ペイロード共役二次抗体フラグメントと複合体を形成する１２１Ｇ１２親Ａｂの細胞傷害効果のピギーバックＡＤＣ（ｐｇＡＤＣ）殺滅アッセイについての実験データを示す。
【図９】抗体単独でまたはオーリスタチン細胞毒素にコンジュゲートされた抗体としての、ＣｙｓＭａｂ野生型ＦｃフォーマットのマウスＣＣＲ７交差反応性１２１Ｇ１２親ＡｂによるＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋Ｔ細胞枯渇を示すグラフを示し、その効果は、ＤＡＰＡサイレンシングされたＦｃフォーマットへの切り替えによって助けられる。
【図１０】ＫＥ９７多発性骨髄腫異種移植モデルにおける抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４および１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４の用量反応有効性を示すグラフを示す。
【図１１】図１０より大きい出発腫瘍組織量で開始される投与による、ＫＥ９７多発性骨髄腫モデルにおける抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４および１２１Ｇ１２．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４の活性を示すグラフを示す。
【図１２】原発性非小細胞肺腫瘍モデルＨＬＵＸ１９３４におけるコンジュゲート１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のインビボ活性を示すグラフを示す。
【図１３】ＫＥ９７多発性骨髄腫異種移植モデルにおけるコンジュゲートされた親６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１の活性を示すグラフを示す。
【図１４−１】図１４：抗ＣＣＲ７  ＡＤＣによる処理後の有糸分裂停止（リン酸化ヒストンＨ３）の誘導を示す、２、５、もしくは１０ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの単回投与の処理の４８時間後の時点におけるＫＥ９７腫瘍にわたる、リン酸化ヒストンＨ３  ＩＨＣ画像（図１４Ａ）および定量化されたリン酸化ヒストンＨ３シグナル（図１４Ｂ）を示す。
【図１４−２】（上記の通り。）
【図１５】ＯＣＩ−ＬＹ３  ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の用量反応有効性を示すグラフを示す。
【図１６】Ｔｏｌｅｄｏ  ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の用量反応有効性を示すグラフを示す。
【図１７】ＤＥＬ  ＡＬＣＬ異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の有効性を示すグラフを示す。
【図１８】ＨＬＵＸ１７８７  ＮＳＣＬＣ患者由来の異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の用量反応有効性を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
定義
特に規定されない限り、本明細書において使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される：
【００４５】
「アルキル」という用語は、特定の数の炭素原子を有する一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜６アルキルは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は、直鎖状または分枝鎖状であり得る。代表的な分枝鎖状アルキル基は、１つ、２つ、または３つの分枝鎖を有する。アルキル基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチル、およびネオペンチル）、ならびにヘキシルが挙げられる。「アルキレン」という用語は、「アルキル」の二価形態である。
【００４６】
本明細書において使用される際の「抗体」という用語は、非共有結合的に、可逆的に、および特異的に対応する抗原に結合することが可能な免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００４７】
「抗体」という用語は、限定はされないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであり得る。
【００４８】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を同義的に指す。ＣＤＲは、このような標的タンパク質に対する特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬまたはＶＨ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けされる）があり、可変ドメインの約１５〜２０％を占める。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補的であり、したがって、結合特異性に直接関与している。ＶＬまたはＶＨの残りの区間、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）。
【００４９】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当該技術分野における様々な周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／でワールドワイドウェブ上にある）、およびＡｂＭ（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２０５−２０６（２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９−８１７（１９９２）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−７４８（１９９７）を参照）を用いて決定され得る。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２１９−２２１（２０００）；およびＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２０７−２０９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５（１９９６）；およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１−１５３（１９９１）；およびＲｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１−１７２（１９９６）。
【００５０】
軽鎖および重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定付けることが理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増加する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインはそれぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを実際に含む。
【００５１】
本明細書において使用される際の「抗原結合フラグメント」という用語は、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の１つまたは複数の部分を指す。結合フラグメントの例としては、限定はされないが、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ラクダ科動物抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ−結合フラグメントが挙げられる。
【００５２】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３，１９８８を参照されたい）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーによって連結され得る。このような一本鎖抗体も、「抗原結合フラグメント」という用語内に包含されることが意図される。これらの抗原結合フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、フラグメントは、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００５３】
抗原結合フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、単一ドメイン抗体、細胞内抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６，２００５を参照）。抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場にグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照）。
【００５４】
抗原結合フラグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込まれ得る（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２，１９９５；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００５５】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝源に由来する抗体および抗原結合フラグメントを含むポリペプチドを指す。この用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５６】
本明細書において使用される際の「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、またはヒト生殖系列配列の突然変異型、または例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００）に記載されるような、ヒトフレームワーク配列分析から得られるコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する。１つまたは複数のＣＤＲが、親和性成熟または製造／ペイロードコンジュゲーションのために突然変異されたヒト配列に由来する抗体も含まれる。Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ”，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９７  Ａｕｇ；１６（４）：３８１−９を参照されたい。
【００５７】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換によって導入される突然変異）。
【００５８】
本明細書において使用される際の「認識する」という用語は、エピトープが線状であるかまたは立体状であるかにかかわらず、そのエピトープを発見し、それと相互作用する（例えば、結合する）抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。「エピトープ」という用語は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントが特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の三次元の折畳みによって並置される連続的アミノ酸または非連続的アミノ酸の両方から形成され得る。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次元の折畳みによって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的に、独特の空間的配置における少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的配置を決定する方法は、当該技術分野における技術、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴を含む（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照）。
【００５９】
本明細書において使用される際の「親和性」という用語は、単一の抗原部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して、多くの部位において抗原と相互作用し；相互作用が大きくなるほど、親和性が強くなる。
【００６０】
「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかしながら、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原との交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００６１】
「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる全ての他の公知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列との最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列はまた、全ての他の評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列との最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列を指し得る。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セグメント（上で定義されるような）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであり得る。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当該技術分野において公知の別のアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列を整列する、本明細書に記載される方法を用いて決定され得る。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸またはアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。対応するヒト生殖系列配列は、例えば、公表されている国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／でワールドワイドウェブ上にある）およびＶ−ｂａｓｅ（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋでワールドワイドウェブ上にある）によって決定され得る。
【００６２】
「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という語句は、抗原（例えば、タンパク質）と、抗体、抗体フラグメント、または抗体由来結合剤との間の相互作用を説明する文脈で使用される際、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中の、例えば、生体試料、例えば、血液、血清、血漿または組織試料中の、抗原の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特定の指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。一実施形態において、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１０倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。このような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、抗体または薬剤が特定のタンパク質に対するその特異性について選択されていることを必要とし得る。所望される場合または適切な場合、この反応は、他の種（例えば、マウスもしくはラット）または他のサブタイプに由来する分子と交差反応する抗体を除去することによって達成され得る。あるいは、ある実施形態において、特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体フラグメントが選択される。
【００６３】
様々なイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用され得るイムノアッセイ形式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。典型的に、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的に、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍、シグナルを生成するであろう。
【００６４】
「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」という用語は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算した値を指す。平衡解離定数は、当該技術分野における任意の公知の方法を用いて測定され得る。本発明の抗体は、一般に、約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、ある実施形態において、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有するであろう。
【００６５】
「バイオアベイラビリティ」という用語は、患者に投与される所与の量の薬物の全身アベイラビリティ（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。バイオアベイラビリティは、投与される剤形から全身循環に達する薬物の時間（速度）および総量（程度）の両方の尺度を示す絶対項である。
【００６６】
本明細書において使用される際、「から本質的になる」という語句は、方法または組成物に含まれる活性薬剤の属または種、ならびに方法または組成物の意図される目的にとって不活性な任意の賦形剤を指す。ある実施形態において、「から本質的になる」という語句は、本発明の抗体薬物コンジュゲート以外の１つまたは複数のさらなる活性薬剤の包含を明示的に除外する。ある実施形態において、「から本質的になる」という語句は、本発明の抗体薬物コンジュゲート以外の１つまたは複数のさらなる活性薬剤および第２の同時投与される薬剤の包含を明示的に除外する。
【００６７】
「アミノ酸」という用語は、天然、合成、および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合されたα−炭素を指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００６８】
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させずに、記載される対応するコドンのいずれかに変化され得る。このような核酸変化は、「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする、本明細書における全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じるように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、それぞれの記載される配列において黙示的なものである。
【００６９】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、あるアミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に対して追加的なものであり、それらを除外しない。以下の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。ある実施形態において、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に実質的に影響しないかまたはそれを変化させないアミノ酸修飾を指すように使用される。
【００７０】
本明細書において使用される際の「最適化された」という用語は、産生細胞または生物、一般に、真核細胞、例えば、酵母細胞、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞、真菌細胞、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変化されたヌクレオチド配列を指す。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている、出発ヌクレオチド配列によって元々コードされるアミノ酸配列を完全にまたはできるだけ多く保持するように操作される。
【００７１】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「パーセント同一である」または「同一性パーセント」という用語は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じである程度を指す。２つの配列は、それらが比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの同じ配列を有する場合、「同一」である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動によるアラインメントおよび視覚的検査によって測定される比較ウインドウ、または指定された領域にわたって、最大の一致のために比較および整列される場合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されない場合、配列全体にわたって、６０％の同一性、任意選択的に、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有する場合、２つの配列は、「実質的に同一」である。任意選択的に、同一性は、長さ少なくとも約３０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００７２】
配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列が、コンピュータに入力され、サブ配列が、指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、または代替パラメータが指定され得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べた試験配列に対する配列同一性パーセントを計算する。
【００７３】
本明細書において使用される際の「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適に整列された後、配列が、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ（１９７０）の部分相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動によるアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３を参照）によって行われ得る。
【００７４】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列される場合、いくつかの正の値の閾値スコア（ｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するか、またはそれを満たす、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始させるためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基のペアに関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するのに使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）アラインメントｓ（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００７５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列と類似すると考えられる。
【００７６】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムを用いて決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量のいずれかを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００７７】
上記の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、後述されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、２つのペプチドの保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは、典型的に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、後述されるように、２つの分子またはその補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを用いて、配列を増幅することができることである。
【００７８】
「核酸」という用語は、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語と同義的に使用され、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。この用語は、合成、天然、および非天然であり、参照核酸と類似する結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似して代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。このような類似体の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）、ホスホン酸メチル、ホスホン酸キラル−メチル、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００７９】
特に示されない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示される配列も包含する。特に、以下に詳述されるように、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、縮重コドン置換が達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【００８０】
核酸の文脈における「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的に、それは、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列が、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、それは、コード配列に作動可能に連結される。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列に対して物理的に連続している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を促進するコード配列に対して物理的に連続しているか、またはそれに近接して位置する必要はない。
【００８１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すために、同義的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーの人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用される。特に示されない限り、特定のポリペプチド配列は、黙示的に、保存的に修飾されたその変異体も包含する。
【００８２】
本明細書において使用される際の「抗体薬物コンジュゲート」または「イムノコンジュゲート」という用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントと、化学療法剤、毒素、免疫治療剤、イメージングプローブなどの別の薬剤との結合を指す。結合は、共有結合、または静電気力などを介した非共有相互作用であり得る。当該技術分野において公知の様々なリンカーが、抗体薬物コンジュゲートを形成するために用いられ得る。さらに、抗体薬物コンジュゲートは、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現され得る融合タンパク質の形態で提供され得る。本明細書において使用される際、「融合タンパク質」は、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）を元々コードしていた２つ以上の遺伝子または遺伝子フラグメントの連結によって生成されるタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のタンパク質をもたらす。
【００８３】
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、およびは虫類を含む。注記されない限り、「患者」または「対象」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
【００８４】
本明細書において使用される際の「細胞毒素」、または「細胞毒性剤」という用語は、細胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少させる、阻害する、または破壊するように働き得る任意の薬剤を指す。
【００８５】
本明細書において使用される際の「抗癌剤」という用語は、限定はされないが、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗癌剤、および免疫療法剤を含む、癌などの細胞増殖性疾患を治療または予防するのに使用され得る任意の薬剤を指す。
【００８６】
本明細書において使用される際の「薬物部分」または「ペイロード」という用語は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートされ、任意の治療剤または診断剤、例えば、抗癌剤、抗炎症剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）、または麻酔薬を含み得る化学部分を指す。例えば、薬物部分は、細胞毒素などの抗癌剤であり得る。特定の実施形態において、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、アマニチン、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ小溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤から選択される。これらの各々を、本発明の抗体および方法と適合するリンカーに結合するための方法が、当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．５２５，４４５−４５７を参照されたい。さらに、ペイロードは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プローブ、親和性プローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体フラグメント、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖または多糖であり得る。
【００８７】
「メイタンシノイド薬物部分」という用語は、メイタンシノイド化合物の構造を有する抗体−薬物コンジュゲートの部分構造を意味する。メイタンシンは、東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から初めて単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。その後、特定の微生物も、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が報告されている。米国特許第４，１３７，２３０号明細書；同第４，２４８，８７０号明細書；同第４，２５６，７４６号明細書；同第４，２６０，６０８号明細書；同第４，２６５，８１４号明細書；同第４，２９４，７５７号明細書；同第４，３０７，０１６号明細書；同第４，３０８，２６８号明細書；同第４，３０８，２６９号明細書；同第４，３０９，４２８号明細書；同第４，３１３，９４６号明細書；同第４，３１５，９２９号明細書；同第４，３１７，８２１号明細書；同第４，３２２，３４８号明細書；同第４，３３１，５９８号明細書；同第４，３６１，６５０号明細書；同第４，３６４，８６６号明細書；同第４，４２４，２１９号明細書；同第４，４５０，２５４号明細書；同第４，３６２，６６３号明細書；および同第４，３７１，５３３号明細書、およびＫａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３４４１−３４５１）（これらはそれぞれ、参照により明示的に援用される）を参照されたい。コンジュゲーションに有用な特定のメイタンシノイドの例としては、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４が挙げられる。
【００８８】
「腫瘍」は、悪性であるかまたは良性であるかにかかわらず、腫瘍性細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
【００８９】
「抗腫瘍活性」という用語は、腫瘍細胞増殖の速度、生存率、または転移活性の低下を意味する。例えば、抗腫瘍活性は、治療なしの対照と比較した、治療中に生じる異常細胞の成長速度の低下または腫瘍サイズの安定性もしくは減少、または治療によるより長い生存によって示され得る。このような活性は、限定はされないが、異種移植モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調べるための当該技術分野において知られている他の公知のモデルを含む、許容されるインビトロまたはインビボ腫瘍モデルを用いて評価され得る。
【００９０】
「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍または癌を指す。本明細書において使用される際、「癌」という用語は、制御不全の（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）または制御されない細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍を含む。例示的な癌としては、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
【００９１】
「癌」という用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が、元の腫瘍部位以外の対象の身体部位に移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位と異なる第２の部位への腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を含む。
【００９２】
「ＣＣＲ７」（ＢＬＲ２、ＣＣ−ＣＫＲ−７、ＣＣＲ−７、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９７、ＣＭＫＢＲ７、ＥＢＩ１、またはＣ−Ｃモチーフケモカイン受容体７としても知られている）という用語は、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーのメンバーを指す。ヒトＣＣＲ７の核酸およびアミノ酸配列は、以下の登録番号ＮＰ＿００１８２９、ＮＰ＿００１２８８６４３、ＮＰ＿００１２８８６４５、ＮＰ＿００１２８８６４６、ＮＰ＿００１２８８６４７（アミノ酸配列）、およびＮＭ＿００１８３８、ＮＭ＿００１３０１７１４、ＮＭ＿００１３０１７１６、ＮＭ＿００１３０１７１７、ＮＭ＿００１３０１７１８（ヌクレオチド配列）でＧｅｎＢａｎｋにおいて公表されている。本明細書において使用される際、「ＣＣＲ７」という用語は、まとめて、ＣＣＲ７タンパク質の全ての天然アイソフォーム、またはその変異体を指すのに使用される。
【００９３】
「変異体」という用語は、参照ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、参照ポリペプチドの１つまたは複数の活性を有することが可能であるポリペプチドを指す。例えば、変異体は、参照ポリペプチドに対する約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る一方、参照ポリペプチドの１つまたは複数の活性を保持する。
【００９４】
本明細書において使用される際、任意の疾患または障害の「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、一実施形態において、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発生を減速するかまたは停止させるかまたは軽減すること）を指す。別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減または改善することを指す。さらに別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害を、身体的に、（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に、（例えば、物理的パラメータの安定化）、またはその両方で調節することを指す。
【００９５】
本明細書において使用される際、任意の疾患または障害の「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、疾患または障害の予防的処置；または疾患または障害の開始または進行を遅延させることを指す。
【００９６】
「治療的に許容できる量」または「治療的に有効な用量」という用語は、所望の結果（すなわち、腫瘍サイズの減少、腫瘍成長の阻害、転移の防止、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫感染の阻害または防止）をもたらすのに十分な量を同義的に指す。ある実施形態において、治療的に許容できる量は、望ましくない副作用を誘導しないか、または引き起こさない。ある実施形態において、治療的に許容できる量は、副作用を誘導するかまたは引き起こすが、患者の状態を考慮して医療提供者によって許容される量に過ぎない。治療的に許容できる量は、最初は低用量を投与し、次に、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加することによって決定され得る。本発明の分子の「予防的に有効な投与量」、および「治療的に有効な投与量」は、癌に関連する症状を含む疾患の症状の、開始を防止するか、またはその重症度の低下をもたらし得る。
【００９７】
「同時投与する」という用語は、個体の血液中の２つの活性薬剤の存在を指す。同時投与される活性薬剤は、同時にまたは連続的に送達され得る。
【００９８】
本発明は、ＣＣＲ７に結合する抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、およびその薬物コンジュゲート、すなわち、抗体薬物コンジュゲートまたはＡＤＣを提供する。特に、本発明は、ＣＣＲ７に結合し、このような結合の際に内在化する抗体および抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供する。本発明の抗体および抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、抗体薬物コンジュゲートを生成するために使用され得る。さらに、本発明は、望ましい薬物動態特性および他の望ましい属性を有し、したがって、ＣＣＲ７を発現する癌を治療または予防するのに使用され得る抗体薬物コンジュゲートを提供する。本発明は、本発明の抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、および癌の治療または予防のためにこのような医薬組成物を作製し、使用する方法をさらに提供する。
【００９９】
抗体薬物コンジュゲート
本発明は、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメントまたはその機能的等価物が、薬物部分に結合された、イムノコンジュゲートとも呼ばれる抗体薬物コンジュゲートを提供する。一態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたはそれらの機能的等価物は、リンカーによる共有結合を介して、抗癌剤である薬物部分に結合される。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、有効用量の抗癌剤（例えば、細胞毒性剤）を、ＣＣＲ７を発現する腫瘍組織に送達することができ、それによって、より高い選択性（およびより低い有効用量）が達成され得る。
【０１００】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、Ａｂが、本明細書に記載されるＣＣＲ７結合抗体を表し；
Ｌがリンカーであり；
Ｄが薬物部分であり；
ｍが、１〜８の整数であり；
ｎが、１〜２０の整数である）
のイムノコンジュゲートを提供する。一実施形態において、ｎが、１〜１０、２〜８、または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎが、２、３、または４である。ある実施形態において、ｍが１であり；他の実施形態において、ｍが、２、３または４である。
【０１０１】
薬物対抗体比は、特定のコンジュゲート分子について正確な値を有するが（例えば、式（Ｉ）のｎとｍを乗算した値）、この値は、典型的にコンジュゲーション工程に関連するある程度の不均一性のため、多い分子を含有する試料を説明するのに使用される場合に平均値であることが多いことが理解される。イムノコンジュゲートの試料に関する平均充填量は、明細書において、薬物対抗体比、または「ＤＡＲ」と呼ばれる。ある実施形態において、薬物がメイタンシノイドである場合、それは、「ＭＡＲ」と呼ばれる。ある実施形態において、ＤＡＲは、約２〜約６、典型的に、約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０である。ある実施形態において、試料の少なくとも５０重量％は、平均ＤＡＲ±２を有する化合物であり、好ましくは、試料の少なくとも５０％は、平均ＤＡＲ±１を含有するコンジュゲートである。実施形態は、ＤＡＲが、約３．５、３．６、３．７、３．８または３．９であるイムノコンジュゲートを含む。ある実施形態において、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測定値が、ｎの２０％以内にあることを意味する。
【０１０２】
本発明は、薬物部分に結合またはコンジュゲートされた、本明細書に開示される抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）およびそれらの機能的等価物を含むイムノコンジュゲートにも関する。一実施形態において、薬物部分Ｄは、構造：
【化１９】
2020506703.tif 000021
（式中、波線が、抗体薬物コンジュゲートのリンカーへの、メイタンシノイドの硫黄原子の共有結合を示す）
を有するものを含むメイタンシノイド薬物部分である。Ｒが、それぞれ、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。アミド基を硫黄原子に結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであり得、すなわち、ｒが、１、２、または３である。（米国特許第６３３，４１０号明細書、米国特許第５，２０８，０２０号明細書、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２；１２７−１３１、Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：８６１８−８６２３）。
【０１０３】
メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわち、メイタンシノイドのキラル炭素におけるＲおよびＳ配置の任意の組合せが、本発明のイムノコンジュゲートについて想定される。一実施形態において、メイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する。
【化２０】
2020506703.tif 000022
【０１０４】
一実施形態において、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１としても知られている）である。ＤＭ１は、以下の構造式によって表される。
【化２１】
2020506703.tif 000023
【０１０５】
別の実施形態において、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３としても知られている）である。ＤＭ３は、以下の構造式によって表される。
【化２２】
2020506703.tif 000024
【０１０６】
別の実施形態において、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４としても知られている）である。ＤＭ４は、以下の構造式によって表される。
【化２３】
2020506703.tif 000025
【０１０７】
薬物部分Ｄは、リンカーＬを介して抗体Ａｂに結合され得る。Ｌは、共有結合を介して、薬物部分を抗体に結合することが可能な任意の化学部分である。架橋試薬は、薬物部分および抗体を結合して、抗体薬物コンジュゲートを形成するのに使用され得る二官能性または多官能性試薬である。抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分および抗体の両方に結合することが可能な反応性官能基を有する架橋試薬を用いて調製され得る。例えば、システイン、チオールまたはアミン、例えば、抗体のリシンなどのＮ末端またはアミノ酸側鎖は、架橋試薬の官能基との結合を形成し得る。あるいは、抗体薬物コンジュゲートは、リンカー−薬物部分（または薬物−リンカー部分、両方の用語は、同義的に使用されている）を予め形成し、リンカー−薬物部分を抗体と反応させることによって調製され得る。ある場合に、リンカー部分は、所望のリンカー−薬物部分を得るまで、いくつかの結合部分を用いて段階的に薬物に組み込まれる。
【０１０８】
一実施形態において、Ｌは、切断性リンカーである。別の実施形態において、Ｌは、非切断性リンカーである。ある実施形態において、Ｌは、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ジスルフィド結合切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー、グリコシダーゼ切断性リンカー、ホスホジエステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
【０１０９】
薬物部分、例えばメイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当該技術分野において周知であり、硫黄原子を含む非切断性リンカー（ＳＭＣＣなど）または硫黄原子を含まないものを形成することができる。薬物部分、例えばメイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分を含む。本発明によれば、このような非切断性リンカーは、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分から誘導されることが記載される。
【０１１０】
マレイミドに基づく部分を含む架橋試薬としては、限定はされないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」類似体であるＮ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＳＡ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（−ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＩＰ）およびＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳなどのポリエチレングリコールスペーサを含有するマレイミドに基づく架橋試薬が挙げられる。これらの架橋試薬は、マレイミドに基づく部分に由来する非切断性リンカーを形成する。マレイミドに基づく架橋試薬の代表的な構造が、以下に示される。
【化２４】
2020506703.tif 000026
【０１１１】
別の実施形態において、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）またはＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳに由来する。
【０１１２】
ハロアセチルに基づく部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。これらの架橋試薬は、ハロアセチルに基づく部分に由来する非切断性リンカーを形成する。ハロアセチルに基づく架橋試薬の代表的な構造が、以下に示される。
【化２５】
2020506703.tif 000027
【０１１３】
一実施形態において、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）またはＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）に由来する。
【０１１４】
薬物部分、例えばメイタンシノイドと、抗体との間で切断性リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当該技術分野において周知である。ジスルフィド含有リンカーは、生理学的条件下で起こり得るジスルフィド交換を介して切断可能なリンカーである。本発明によれば、このような切断性リンカーは、ジスルフィドに基づく部分に由来することが記載される。好適なジスルフィド架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられ、これらの構造が、以下に示される。これらのジスルフィド架橋試薬は、ジスルフィドに基づく部分に由来する切断性リンカーを形成する。
【化２６】
2020506703.tif 000028
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
【化２７】
2020506703.tif 000029
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、
【化２８】
2020506703.tif 000030
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）および
【化２９】
2020506703.tif 000031
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）
【０１１５】
一実施形態において、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）に由来する。
【０１１６】
薬物部分、例えばメイタンシノイドと、抗体との間で荷電リンカーを形成する好適な架橋試薬は、プロチャージ架橋試薬として知られている。一実施形態において、リンカーＬは、プロチャージ架橋試薬ＣＸ１−１に由来する。ＣＸ１−１の構造が、以下に示される。
【化３０】
2020506703.tif 000032
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）
【０１１７】
上に示される架橋試薬の各々は、架橋試薬の一方の末端に、抗体の第一級アミンと反応して、アミド結合を形成するＮＨＳ−エステル、および他方の末端に、メイタンシノイド薬物部分のスルフヒドリルと反応して、チオエーテルまたはジスルフィド結合を形成するマレイミド基またはピリジニルジスルフィド基を含有する。
【０１１８】
別の実施形態において、薬物部分（例えばメイタンシノイド）と、抗体との間で切断性リンカーを形成する好適な架橋部分は、下式（ＩＩ）：
【化３１】
2020506703.tif 000033
（式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
によって表される。
【０１１９】
この実施形態の一態様において、ｙが、５、７、９または１１である。この実施形態の別の態様において、ｙが５未満である。
【０１２０】
さらに別の実施形態において、式Ｉで表される好適な架橋部分は、
【化３２】
2020506703.tif 000034
からなる群から選択され；式中、ｙが、１〜１１である。
【０１２１】
上に示される架橋部分（すなわちＭＢＴ、ＭＰＥＴ、ＭＥＰＥＴ；ＭＭＴＢＴ、ＭＰＰＴ、ＭＰＢＴ）について、マレイミド基は、抗体中のシステインのスルフヒドリル（またはチオール）との反応を可能にし、それによって、チオエーテル結合を形成し；架橋部分のチオール官能基は、メイタンシノイド薬物部分のチオールに結合されて、切断性ジスルフィド結合を形成する。式（Ｉ）の結合部分の交差反応性（チオールおよびマレイミドが交差反応し得る）を考慮して、当業者は、スキーム１に示されるように、結合部分が、薬物部分に段階的に組み込まれる必要があることを理解するであろう。
【０１２２】
上記の実施形態によれば、架橋部分（すなわちＭＢＴ、ＭＰＥＴ、ＭＥＰＥＴ）から得られるリンカーは、以下のように示され得る：
【化３３】
2020506703.tif 000035
式中、＊が、抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、薬物部分のチオール官能基に結合される（例えばメイタンシノイド薬物部分ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）。
【０１２３】
上記の実施形態によれば、架橋部分（すなわちＭＢＴ、ＭＰＥＴ、ＭＥＰＥＴ））から得られるリンカーは、以下のように示され得る：
【化３４】
2020506703.tif 000036
式中、ｙが、１〜１１であり；＊が、抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、薬物部分（例えばメイタンシノイド薬物ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）のチオール官能基に結合される。
【０１２４】
好ましい実施形態において、リンカーは、下式：
【化３５】
2020506703.tif 000037
で表され；
式中、＊が、抗体におけるチオール官能基に結合され、＊＊が、メイタンシノイド薬物（ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）のチオール官能基に結合される。
【０１２５】
一実施形態において、本発明は、式：
【化３６】
2020506703.tif 000038
（式中
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
のリンカー−薬物部分に関する。
【０１２６】
別の実施形態において、本発明は、本明細書のスキーム１に開示されるような、上記のリンカー−薬物コンジュゲートの段階的な形成に関する。
【０１２７】
一実施形態において、本発明は、下式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）：
【化３７】
2020506703.tif 000039
（式中、Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である）
のうちの１つで表されるリンカー−薬物部分化合物に関する。
【０１２８】
一実施形態において、本発明は、下式：
【化３８】
2020506703.tif 000040
から選択されるリンカー−薬物部分化合物に関する。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、下式：
【化３９】
2020506703.tif 000041
から選択されるリンカー−薬物部分化合物に関する。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明のリンカー−薬物は、下式：
【化４０】
2020506703.tif 000042
のいずれか１つによって表され；式中、ｙが、１〜１１、好ましくは、１〜５である。
【０１３１】
一実施形態において、本発明のリンカー−薬物は、以下の構造式：
【化４１】
2020506703.tif 000043
のいずれか１つによって表される。
【０１３２】
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、以下の構造式：
【化４２】
2020506703.tif 000044
【化４３】
2020506703.tif 000045
のいずれか１つによって表され、式中：
Ａｂが、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂの第一級アミンとのアミド結合の形成によってＡｂに結合されたリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ−）基の数を示すｎが、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎが、１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。
【０１３３】
別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、下式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）：
【化４４】
2020506703.tif 000046
のいずれかによって表され；
式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂの第一級アミンとのアミド結合の形成によってＡｂに結合されたリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ−）基の数を示すｎが、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎが、１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１３４】
別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式（ＶＩ）のコンジュゲートのスクシンイミドの開放形態に対応する式（ＶＩＡ）または（ＶＩＢ）：
【化４５】
2020506703.tif 000047
で表され；
式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状である；
Ａｂが、抗体または抗原結合フラグメントであり；
Ａｂの第一級アミンとのアミド結合の形成によってＡｂに結合されたリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ−）基の数を示すｎが、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎが、１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式（ＶＩＩ）のコンジュゲートのスクシンイミドの開放形態に対応する式（ＶＩＩＡ）または（ＶＩＩＢ）：
【化４６】
2020506703.tif 000048
で表され；
式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂの第一級アミンとのアミド結合の形成によってＡｂに結合されたリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ）基の数を示すｎが、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎが、１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１３６】
別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式（ＶＩＩＩ）のコンジュゲートのスクシンイミドの開放形態に対応する式（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）：
【化４７】
2020506703.tif 000049
で表され；
式中：
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂの第一級アミンとのアミド結合の形成によってＡｂに結合されたリンカー−薬物（Ｌ−Ｄ−）基の数を示すｎが、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎが、１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１３７】
一実施形態において、リンカー−薬物部分がスクシンイミドを介して抗体に結合された、本明細書に開示される各抗体薬物コンジュゲートはまた、式（ＶＩＡ）、（ＶＩＢ）、（ＶＩＩＡ）、（ＶＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＡ）および（ＶＩＩＩＢ）に一般に示されるようなスクシンイミドの開放形態として存在し得る。
【０１３８】
さらに別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、以下の構造式：
【化４８】
2020506703.tif 000050
【化４９】
2020506703.tif 000051
【化５０】
2020506703.tif 000052
【化５１】
2020506703.tif 000053
のいずれか１つによって表され；
式中：
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂのスルフヒドリルとのチオエステル結合の形成によってＡｂに結合されたＤ−Ｌ基の数を示すｎが、１〜１２、または１〜８、または好ましくは１〜４の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、以下の構造式：
【化５２】
2020506703.tif 000054
のいずれか１つ；
ならびにスクシンイミドの対応する開放形態によって表され；
式中：
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂのスルフヒドリルとのチオエステル結合の形成によってＡｂに結合されたＤ−Ｌ基の数を示すｎが、１〜１２、または１〜８、または好ましくは１〜４の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１４０】
別の実施形態において；本発明のコンジュゲートは、以下の構造式：
【化５３】
2020506703.tif 000055
のいずれか１つ；
ならびにスクシンイミドの対応する開放形態によって表され；
式中：
ｙが、１〜１１、好ましくは１〜５であり；
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂのスルフヒドリルとのチオエステル結合の形成によってＡｂに結合されたＤ−Ｌ基の数を示すｎが、１〜１２、または１〜８、または好ましくは１〜４の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１４１】
さらに別の実施形態において；本発明のコンジュゲートは、下式：
【化５４】
2020506703.tif 000056
ならびにスクシンイミドの対応する開放形態によって表され；
式中：
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂのスルフヒドリルとのチオエステル結合の形成によってＡｂに結合されたＤ−Ｌ基の数を示すｎが、１〜１２、または１〜８、または好ましくは１〜４の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１４２】
好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、下式：
【化５５】
2020506703.tif 000057
によって表され、式中：
Ａｂが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Ａｂのスルフヒドリルとのチオエステル結合の形成によってＡｂに結合されたＤ−Ｌ基の数を示すｎが、１〜２０の整数である。ある実施形態において、ｎが、１〜１２の整数である。ある実施形態において、ｎが、１〜８の整数である。ある実施形態において、ｎが、１〜４の整数である。特定の実施形態において、ｎが、３または４である。別の実施形態において、平均ｎ値が、約３〜約４である。ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞において発現される抗原に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＣＲ７に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン６、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０１４３】
一実施形態において、コンジュゲート中の薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）対抗体の平均モル比（すなわち、メイタンシノイド抗体比（ＭＡＲ）としても知られている平均ｎ値）は、約１〜約１０、約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、または８．１）、約２．５〜約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、または約４．５〜５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、または約５．５）である。
【０１４４】
本発明の一態様において、本発明のコンジュゲートは、実質的に高い純度を有し、以下の特徴の１つまたは複数を有する：（ａ）約９０％超（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上）、好ましくは約９５％超のコンジュゲート種がモノマーであること、（ｂ）コンジュゲート調製物中の非コンジュゲートリンカーレベルが、（総リンカーに対して）約１０％未満（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％以下）であること、（ｃ）１０％未満のコンジュゲート種が架橋されること（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％以下）、（ｄ）コンジュゲート調製物中の遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）レベルが、約２％未満（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、または０％以下）（総細胞毒性剤に対するｍｏｌ／ｍｏｌ）であること、および／または（ｅ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）のレベルの有意な増加が、貯蔵時に起こらないこと（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約１年、約２年、約３年、約４年、または約５年後）。遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）のレベルの「有意な増加」は、特定の貯蔵時間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約１年、約２年、約３年、約４年、または約５年）後に、遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）のレベルの増加が、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３．７％、または約４．０％未満であることを意味する。
【０１４５】
本明細書において使用される際、「非コンジュゲートリンカー」という用語は、抗体が、リンカーを介して薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）に共有結合されていない、架橋試薬（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に由来するリンカーと共有結合された抗体を指す（すなわち、「非コンジュゲートリンカー」は、Ａｂ−ＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢ、またはＡｂ−ＣＸ１−１によって表され得る）。
【０１４６】
１．薬物部分
本発明は、ＣＣＲ７に特異的に結合するイムノコンジュゲートを提供する。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分、例えば、抗癌剤、自己免疫治療剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または麻酔薬にコンジュゲートされた抗ＣＣＲ７抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物を含む。本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、いくつかの同一のまたは異なる薬物部分にコンジュゲートされ得る。
【０１４７】
特定の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、Ｅｇ５阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ小溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。
【０１４８】
特定の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１５／０９５３０１号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１８９７９１号パンフレット（両方の出願は、参照により本明細書に援用される）に開示されるオーリスタチンである。オーリスタチン薬物部分−リンカー構築物の非限定的な例は、
【化５６】
2020506703.tif 000058
（本出願において開示されるＡＵＲＩＸ２である）；および
【化５７】
2020506703.tif 000059
（本出願において開示されるＡＵＲＩＸ１である）である。
【０１４９】
一実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、限定はされないが、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４などのメイタンシノイド薬物部分である。
【０１５０】
さらに、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物は、所与の生物学的反応を調節する薬物部分にコンジュゲートされ得る。薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されるものと解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質、または例えば、リンホカインなどの生物学的反応調節剤を含み得る。
【０１５１】
一実施形態において、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの薬物部分にコンジュゲートされる。細胞毒素の例としては、限定はされないが、タキサン（例えば、国際（ＰＣＴ）特許出願番号国際公開第０１／３８３１８号パンフレットおよびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５号明細書を参照）、ＤＮＡ−アルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、メイタンシノイド、および反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞毒性剤（例えば、Ｓａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），５３，８７９−８５（２０００）、Ｓｕｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８，２１７５−８４（２０００）、Ｉｃｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４４，１０４５−５３（１９９１）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００３）（印刷出版物に先立って、電子出版物）、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第６，３４０，７０１号明細書、同第６，３７２，７３８号明細書、および同第６，４３６，９３１号明細書、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３  Ａ１号明細書、係属中の米国特許出願第１０／０２４，２９０号明細書および同第１０／１１６，０５３号明細書、および国際（ＰＣＴ）特許出願番号国際公開第０１／４９６９８号パンフレットを参照）、タキソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。治療剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、削摩剤（ａｂｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる（例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの米国特許出願公開第２００９０３０４７２１号明細書を参照）。
【０１５２】
本発明の抗体、抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）または機能的等価物にコンジュゲートされ得る細胞毒素の他の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン、ならびにその誘導体が挙げられる。
【０１５３】
治療剤を抗体にコンジュゲートするための様々なタイプの細胞毒素、リンカーおよび方法が、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５；Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｐａｙｎｅ，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ａｌｌｅｎ，（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３；Ｐａｓｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４を参照されたい。
【０１５４】
本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物はまた、放射性同位体にコンジュゲートされて、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる細胞毒性放射性薬剤を生成し得る。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュゲートされ得る放射性同位体の例としては、限定はされないが、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、イットリウム−９０、およびルテチウム−１７７が挙げられる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は、当該技術分野において確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含め、市販されており、同様の方法を用いて、本発明の抗体を用いて放射性イムノコンジュゲートを調製することができる。特定の実施形態において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合され得る１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は、当該技術分野において一般的に公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（それぞれ全体が参照により援用される）に記載されている。
【０１５５】
本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物はまた、異種タンパク質またはポリペプチド（またはそのフラグメント、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００のアミノ酸のポリペプチド）にコンジュゲートされて、融合タンパク質を生成し得る。特に、本発明は、本明細書に記載される抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ  ＣＤＲ）および異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０１５６】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（まとめて、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術によって生成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、本発明の抗体またはそのフラグメント（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント）の活性を変化させるのに用いられ得る。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ、（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６；およびＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−３１３（これらの特許および刊行物はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組み換え前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によってランダム突然変異誘発に供することによって変化され得る。抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１５７】
さらに、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物は、ペプチドなどのマーカー配列にコンジュゲートされて、精製を容易にし得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチド（配列番号６２８）であり、その多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジン（配列番号６２８）は、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、および「ＦＬＡＧ」タグ（Ａ．Ｅｉｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：４５５−４６５，２００１）が挙げられる。本発明によれば、抗体または抗原結合フラグメントはまた、それらの有効性を高めるために、腫瘍浸透ペプチドにコンジュゲートされ得る。
【０１５８】
他の実施形態において、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物は、診断剤または検出剤にコンジュゲートされる。このようなイムノコンジュゲートは、特定の療法の有効性の血清などの、臨床試験手順の一部として疾患または障害の開始、発生、進行および／または重症度をモニターまたは予後診断するのに有用であり得る。このような診断および検出は、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定はされないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定はされないが、ルミノールなどの発光材料；限定はされないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリンなどの生物発光材料；限定はされないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｓｎなどの放射性材料；および様々なポジトロン放出断層撮影を用いるポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能物質に抗体を結合することによって達成され得る。
【０１５９】
本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体担体に結合され得る。このような固体担体としては、限定はされないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１６０】
２．リンカー
本明細書において使用される際、「リンカー」は、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）または機能的等価物を、薬物部分などの別の部分に結合することが可能な任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性のままである条件下で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、グリコシダーゼ誘導性切断、ホスホジエステラーゼ誘導性切断、ホスファターゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断などの切断を起こしやすいものであり得る（切断性リンカー）。あるいは、リンカーは、切断に対して実質的に抵抗性であり得る（例えば、安定性リンカーまたは非切断性リンカー）。ある態様において、リンカーは、プロチャージリンカー、親水性リンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
【０１６１】
一態様において、本発明において使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋試薬に由来する。
【０１６２】
非切断性リンカーは、安定した、共有結合的な方法でメイタンシノイドなどの薬物を、抗体に結合することが可能であり、かつ切断性リンカーについて上に列挙されるカテゴリーに入らない任意の化学部分である。したがって、非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断に対して実質的に抵抗性である。さらに、非切断性は、メイタンシノイドなどの薬物または抗体がその活性を喪失しない条件で、酸、光不安定性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理学的化合物によって誘導される切断に耐える、リンカー中のまたはリンカーに隣接する化学結合の能力を指す。
【０１６３】
酸不安定性リンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどの特定の細胞内区画は、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、光不安定性リンカーを切断するのに好適な条件を提供する。
【０１６４】
光不安定性リンカーは、光に接近可能である体表面および多くの体腔において有用なリンカーである。さらに、赤外線は組織に浸透し得る。
【０１６５】
いくつかのリンカーは、ペプチダーゼによって切断可能、すなわち、ペプチダーゼ切断性リンカーであり得る。特定のペプチドのみが、細胞の内部または外部で容易に切断される。例えば、Ｔｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，７９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２６−６２９（１９８２）およびＵｍｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．４３  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７７−６８４（１９８９）を参照されたい。さらに、ペプチドは、α−アミノ酸と、化学的には、あるアミノ酸のカルボキシレート基と第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合とから構成される。リシンのカルボキシレート基とε−アミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合ではないものと理解され、非切断性であると考えられる。
【０１６６】
いくつかのリンカーは、エステラーゼ、すなわち、エステラーゼ切断性リンカーによって切断され得る。再度、特定のエステルのみが、細胞の内部または外部に存在するエステラーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸およびアルコールの縮合によって形成される。単純エステルは、脂肪族アルコール、ならびに小環状および低分子芳香族アルコールなどの、単純アルコールを用いて生成されるエステルである。
【０１６７】
プロチャージリンカーは、抗体薬物コンジュゲートへの組み込み後にそれらの電荷を保持する荷電した架橋試薬に由来する。プロチャージリンカーの例は、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号明細書に見出され得る。
【０１６８】
３．ＡＤＣのコンジュゲーションおよび調製
リンカー−ペイロードを抗原結合部分にコンジュゲートする多くの方法が、当該技術分野において公知である（例えば：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０４５，Ｅｄｉｔｏｒ  Ｌ．Ｄｕｃｒｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）において概説される）。従来、薬物は、抗体の天然リシンまたは天然システイン残基にコンジュゲートされる。得られる調製物は、複合混合物である。より最近では、部位特異的コンジュゲーション方法が、ＡＤＣ調製物の治療指数および均一性を改善するために用いられる（Ｆｏｒ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｐａｎｏｗｓｋｉ，Ｓ．；Ｂｈａｋｔａ，Ｓ．；Ｒａａｂ，Ｈ．；Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．；Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ｍＡｂｓ  ２０１４，６，３４）。糖鎖工学（Ｚｈｏｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，２５，５１０；Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．  ｍＡｂｓ  ２０１４，６，１１９０）に加えて；部位特異的ＡＤＣを調製するより一般的な方法のいくつかは、抗体骨格中への操作システイン（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８，２６，９２５；Ｓｈｉｎｍｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１６，２７，１３２４）、非標準アミノ酸（Ｔｉａｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ２０１４，１１１，１７６６；Ａｘｕｐ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ２０１２，１０９，１６１０１）または短鎖ペプチド配列（Ｄｒａｋｅ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，２５，１３３１；Ｓｔｒｏｐ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３，２０，１６１；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１５，１０，ｅ０１３１１７７；Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５，２６，２５５４）の組み込みに基づいている。これらの方法は、従来通りに調製されたＡＤＣと比べて、コンジュゲートのより良好な薬物動態（ＰＫ）、安全性、および有効性プロファイルをもたらす、細胞毒素の化学量論および結合部位に対する制御を提供する。
【０１６９】
本発明のコンジュゲートは、米国特許第７，８１１，５７２号明細書、同第６，４１１，１６３号明細書、同第７，３６８，５６５号明細書、および同第８，１６３，８８８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号明細書、同第２０１１／０１６６３１９号明細書、同第２０１２／０２５３０２１号明細書および同第２０１２／０２５９１００号明細書、ならびにＰＣＴ公報国際公開第２０１４／１２４３１６号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１３８６１５号パンフレットに記載されるものなどの、当該技術分野において公知の任意の方法によって調製され得る。これらの特許および特許出願公報の全教示内容は、参照により本明細書に援用される。
【０１７０】
操作システイン抗体残基へのコンジュゲーションのための方法
本発明のコンジュゲートは、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、抗体中に操作されるシステイン残基を用いて調製され得る。このような部位特異的コンジュゲートは、均質であり、向上した特性を有する（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ＪＲ，Ｒａａｂ  Ｈ，Ｃｌａｒｋ  Ｓ，Ｂｈａｋｔａ  Ｓ，Ｌｅｉｐｏｌｄ  ＤＤ，Ｗｅｉｒ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｍ，Ｔｓａｉ  ＳＰ，Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＳ，Ｌｕ  Ｙ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｎｇ  Ｃ，Ｙａｎｇ  Ｊ，Ｌｅｅ  ＣＣ，Ｄｕｅｎａｓ  Ｅ，Ｇｏｒｒｅｌｌ  Ｊ，Ｋａｔｔａ  Ｖ，Ｋｉｍ  Ａ，ＭｃＤｏｒｍａｎ  Ｋ，Ｆｌａｇｅｌｌａ  Ｋ，Ｖｅｎｏｏｋ  Ｒ，Ｒｏｓｓ  Ｓ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＳＤ，Ｌｅｅ  Ｗｏｎｇ  Ｗ，Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ，Ｖａｎｄｌｅｎ  Ｒ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ，Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ＲＨ，Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ，Ｍａｌｌｅｔ  Ｗ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：９２５−９３２）。
【０１７１】
哺乳類細胞内で発現される抗体中の操作システインが、それらの生合成中に、グルタチオン（ＧＳＨ）および／またはシステインなどの付加物（ジスルフィド）によって修飾されるため（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、最初に発現された産物中の操作システイン残基は、マレイミドまたはブロモ−もしくはヨード−アセトアミド基などのチオール反応性試薬に対して非反応性である。発現後に、操作システインにペイロードをコンジュゲートするために、グルタチオンまたはシステイン付加物は、これらのジスルフィド付加物を還元させる（これは、一般に、発現されるタンパク質中の天然ジスルフィドも還元させることを伴う）ことによって除去される必要がある。付加された操作システインの脱保護は、最初に、抗体を、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ、または還元されたシステインに曝し、続いて、機能的抗体構造を回復および／または安定させるために、抗体の全ての天然ジスルフィド結合の再酸化を可能にする手順によって達成され得る。
【０１７２】
いくつかの方法を用いて、抗体薬物コンジュゲートの調製のために操作Ｃｙｓ残基により抗体を還元および再酸化させることができる。高濃度のＣｕＳＯ４を用いて文献に既に記載されている再酸化プロトコルに従う試みは、タンパク質沈殿をもたらした（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ＪＲ，Ｒａａｂ  Ｈ，Ｃｌａｒｋ  Ｓ，Ｂｈａｋｔａ  Ｓ，Ｌｅｉｐｏｌｄ  ＤＤ，Ｗｅｉｒ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｍ，Ｔｓａｉ  ＳＰ，Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＳ，Ｌｕ  Ｙ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｎｇ  Ｃ，Ｙａｎｇ  Ｊ，Ｌｅｅ  ＣＣ，Ｄｕｅｎａｓ  Ｅ，Ｇｏｒｒｅｌｌ  Ｊ，Ｋａｔｔａ  Ｖ，Ｋｉｍ  Ａ，ＭｃＤｏｒｍａｎ  Ｋ，Ｆｌａｇｅｌｌａ  Ｋ，Ｖｅｎｏｏｋ  Ｒ，Ｒｏｓｓ  Ｓ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＳＤ，Ｌｅｅ  Ｗｏｎｇ  Ｗ，Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ，Ｖａｎｄｌｅｎ  Ｒ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ，Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ＲＨ，Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ，Ｍａｌｌｅｔ  Ｗ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：９２５）。本発明者らは、還元および抗体再酸化のためのいくつかの異なる方法を用いて、抗体薬物コンジュゲートを首尾よく調製および取得した。
【０１７３】
一例において、新たに調製されたＤＴＴが、精製されたＣｙｓ突然変異体抗体に、１０ｍＭの最終濃度になるまで加えられる。１時間にわたる室温での、ＤＴＴとのインキュベーションの後、混合物が、毎日緩衝液を交換しながら、３日間にわたってＰＢＳに対して４℃で透析されて、ＤＴＴを除去し、抗体の天然ジスルフィド結合を再酸化させる。代替的な方法は、ＰＢＳで平衡化された、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５などのカラムを脱塩することによって還元試薬を除去することである。タンパク質が完全に還元されたら、１ｍＭの酸化されたアスコルベート（デヒドロ−アスコルビン酸）が、脱塩された試料に任意選択的に加えられ、再酸化インキュベーションが、２０〜２４時間にわたって行われる。
【０１７４】
別の例示的な方法において、操作Ｃｙｓ残基の脱保護が、プロテインＡ−セファロース樹脂に結合された抗体に、２０ｍＭの濃度の完全に還元されたシステインを加えることによって行われる。Ｃｙｓ付加物の還元は、室温で約３０〜６０分間にわたるインキュベーションによって行われ、次に、還元剤が、ＰＢＳの５０の床で樹脂を洗浄することによって迅速に除去される。還元された抗体の再酸化が、反応促進剤としての５０〜２０００ｎＭのＣｕＣｌ２の添加を伴ってまたは伴わずに、洗浄されたスラリーを室温でインキュベートすることによって行われる。硫酸銅の使用を除いて、本明細書の例は、同様の結果を有する本明細書に記載されるプロトコルのそれぞれを使用する。再酸化は、鎖内ジスルフィドを回復させる一方、透析、脱塩またはプロテインＡクロマトグラフィーは、還元剤ならびにシステインおよび抗体の操作システインに最初に接続されていたグルタチオンを除去する。ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーが、典型的に、再酸化プロセスをモニターするのに用いられる：抗体が、８０℃に加熱されたＰＬＲＰ−Ｓカラム（４０００Å、５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に充填され、１．５ｍＬ／分で０．１％のＴＦＡを含有する水中の３０〜４５％のＣＨ３ＣＮの線形勾配を用いて溶離される。ならびに２１５、２５４、および２８０ｎｍにおけるピーク検出。
【０１７５】
再酸化の後、抗体は、予め形成されたリンカー−薬物部分にコンジュゲートされる。例として、予め形成されたリンカー−薬物部分（例えばＭＭＴＢＴ−ＤＭ４；ＭＰＥＴ−ＤＭ４；ＭＢＴ−ＤＭ４；ＭＥＰＥＴ−ＤＭ４、ＭＰＢＴ−ＤＭ１；および本明細書に記載される他のリンカー−薬物部分など）が、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中の抗体と比べて、１０モル当量で、再酸化されたＣｙｓ突然変異体抗体に加えられる。インキュベーションは、１時間にわたって行われる。コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲートされた抗体をコンジュゲートされていないものから分離することができる逆相ＨＰＬＣによってモニターされる。コンジュゲーション反応混合物は、８０℃に加熱されたＰＲＬＰ−Ｓカラム（４０００Å、５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）において分析され、カラムの溶離が、１．５ｍｌ／分の流量で０．１％のＴＦＡを含有する水中の３０〜６０％のアセトニトリルの線形勾配によって行われる。カラムからのタンパク質の溶離は、２８０ｎｍ、２５４ｎｍおよび２１５ｎｍでモニターされる。
【０１７６】
一実施形態において、システインコンジュゲーションのためのリンカー−薬物部分の例が、スキーム１〜３：
【化５８】
2020506703.tif 000060
にしたがって調製され得、式中：
薬物部分が、チオール官能基を介してリンカーに結合され；
Ｌ１が、Ｃ１〜６アルキレンであり、ここで、メチレン基の１つが、酸素で置換されてもよく；
Ｌ２が、Ｃ１〜６アルキレンであるか、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ここで、ｙが、１〜１１であり；
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−またはトリアゾールであり；
ここで、アルキレンが、直鎖状または分枝鎖状であり；
ＲＧ１およびＲＧ２が、基Ｘを形成する２つの反応性基である。
【０１７７】
アミドまたはトリアゾールを形成する反応性基は、当該技術分野において周知である。
【０１７８】
リンカー−薬物部分を予め形成する１つの例が、スキーム２に表され、式中、薬物部分がＤＭ４であり；ＲＧ１がアミノ基であり、ＲＧ２が、活性化酸であり、アミド結合（Ｘ）：
【化５９】
2020506703.tif 000061
の形成をもたらす。
【０１７９】
リンカー−薬物部分を予め形成する別の例が、スキーム３に表され、式中、薬物部分がＤＭ４であり；ＲＧ１がアジド基であり、ＲＧ２が、アルキン基であり、テトラゾール（Ｘ）：
【化６０】
2020506703.tif 000062
の形成をもたらす。
【０１８０】
Ｃｙｓ突然変異体抗体への結合マレイミドを有する様々な薬物部分のコンジュゲーション効率は、使用される薬物部分の溶解度に応じて変化するが、多くの反応が、９０％超のコンジュゲートをもたらす。凝集状態を評価するために、得られたコンジュゲートが、ＰＢＳ中で、０．１ｍｌ／分の流量で、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、３．２／３０）において分析される。全てのコンジュゲートが、主にモノマーである。コンジュゲートの大部分は、３％未満の二量体およびオリゴマー材料を含有し、これは、Ｃｙｓ突然変異体抗体への結合マレイミドを有する薬物部分のコンジュゲーションが凝集を引き起こさないことを示す。
【０１８１】
イムノコンジュゲートはまた、一般に、薬物対抗体比（ＤＡＲ）と呼ばれる、抗体結合部分に対する薬物部分の平均充填量に関して特性評価される。ＤＡＲ値は、例えば、還元および糖鎖除去された試料についてのＬＣ−ＭＳデータから外挿される。ＬＣ／ＭＳは、ＡＤＣにおいて抗体に結合されたペイロード（薬物部分）の分子の平均数の定量化を可能にする。ＨＰＬＣは、抗体を軽鎖と重鎖とに分離し、また、鎖当たりのリンカー−ペイロード基の数に応じて、重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）とに分離する。質量スペクトルデータは、混合物中の成分種、例えば、ＬＣ、ＬＣ＋１、ＬＣ＋２、ＨＣ、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２などの同定を可能にする。ＬＣおよびＨＣ鎖からの平均充填量から、平均ＤＡＲが、ＡＤＣについて計算され得る。所与のイムノコンジュゲート試料についてのＤＡＲは、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する四量体抗体に結合された薬物（ペイロード）分子の平均数を表す。
【０１８２】
天然システイン抗体残基へのコンジュゲーションのための方法
本明細書に記載されるリンカー−薬物部分はまた、抗体の部分的還元を含む手順を用いて、非操作抗体の天然システイン残基にコンジュゲートされ得る（Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．，Ｔｏｋｉ，Ｂ．Ｅ．，Ｔｏｒｇｏｖ，Ｍ．Ｙ．，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｂ．Ａ．，Ｃｅｒｖｅｎｙ，Ｃ．Ｇ．，Ｃｈａｃｅ，Ｄ．Ｆ．，ＤｅＢｌａｎｃ，Ｒ．Ｌ．，Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｒ．Ｐ．，Ｂｏｖｅｅ，Ｔ．Ｄ．，Ｓｉｅｇａｌｌ，Ｃ．Ｂ．，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，Ｗａｈｌ，Ａ．Ｆ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，７７８−７８４）。以下のプロトコルは、このようなコンジュゲートが以下に調製され得るかの非限定的な例である：（典型的に、５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で）抗体の鎖間および鎖内ジスルフィド結合は、ＴＣＥＰを１０ｍＭの最終濃度になるまで加え、混合物を３７℃で１時間にわたってインキュベートすることによって、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で最初に部分的に還元される。脱塩および１％ｗ／ｖのＰＳ−２０洗浄剤の添加の後、部分的に還元された抗体（１〜２ｍｇ／ｍｌ）が、１０ｍｇの抗体につきリンカーペイロード化合物を含有する０．５〜１ｍｇのマレイミドと、４℃で一晩反応される。得られたコンジュゲートは、標準的な方法およびＰＢＳに交換された緩衝液によるプロテインＡのクロマトグラフィーによって精製され、典型的に、それらの薬物対抗体比、凝集傾向、および疎水性についての、質量分析（ＭＳ）、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＡｎＳＥＣ）、および分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＡｎＨＩＣ）によって、ならびに活性アッセイによって概略を示される。
【０１８３】
リシン抗体残基への架橋のための一工程方法
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、薬物を、抗体におけるリシン残基に架橋するための一工程方法によって調製され得る。本方法は、好適なｐＨで、任意選択的に１つまたは複数の共溶媒を含有する実質的に水性の媒体中で、抗体、薬物および架橋剤を組み合わせることを含む。一実施形態において、本方法は、本発明の抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体および薬物を含む第１の混合物を形成し、次に、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体および薬物を含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を得る工程とを含む。
【０１８４】
一実施形態において、一工程方法は、約６以上（例えば、約６〜約９、約６〜約７、約７〜約９、約７〜約８．５、約７．５〜約８．５、約７．５〜約８．０、約８．０〜約９．０、または約８．５〜約９．０）のｐＨを有する溶液中で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。例えば、本発明の方法は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＨを有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、約７．８のｐＨ（例えば、７．６〜８．０のｐＨまたは７．７〜７．９のｐＨ）を有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
【０１８５】
一工程方法（すなわち、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１と接触させること）は、当該技術分野において公知の任意の好適な温度で行われ得る。例えば、一工程方法は、約２０℃以下（例えば、約−１０℃（例えば、細胞毒性剤および二官能性架橋試薬を溶解させるのに使用される有機溶媒の存在によって、溶液の凍結が防止されるという条件で）〜約２０℃、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）で、室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）で、または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で行われ得る。一実施形態において、一工程方法は、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で行われる。別の実施形態において、一工程方法は、約１５℃以下（例えば、約−１０℃〜約１５℃、または約０℃〜約１５℃）の温度で行われる。例えば、本方法は、例えば、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＰＤＢ  ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１）を溶解させるのに使用される有機溶媒の存在によって、溶液の凍結が防止されるという条件で、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約−１℃、約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約−９℃、または約−１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。一実施形態において、本方法は、約−１０℃〜約１５℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約０℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１０℃〜約１５℃、または約５℃〜約１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。別の実施形態において、本方法は、約１０℃の温度（例えば、８℃〜１２℃の温度または９℃〜１１℃の温度）で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
【０１８６】
一実施形態において、上述される接触は、抗体を提供し、次に、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む第１の混合物を形成し、次に、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることによって行われる。例えば、一実施形態において、抗体は、反応容器中で提供され、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）は、反応容器に加えられ（それによって、抗体を接触させる）、次に、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）は、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物に加えられる（それによって、抗体および薬物を含む混合物を接触させる）。一実施形態において、抗体は、反応容器中で提供され、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）は、抗体を容器に提供した直後に反応容器に加えられる。別の実施形態において、抗体は、反応容器中で提供され、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）は、抗体を容器に提供した後、所定の時間間隔後（例えば、細胞結合剤を空間に提供した約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１日以上後）に、反応容器に加えられる。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）は、迅速に（すなわち、約５分、約１０分などの短い時間間隔内で）またはゆっくりと（ポンプを用いることなどによって）加えられ得る。
【０１８７】
次に、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物は、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させた直後に、または抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させたいくらか後の時点（例えば、約５分〜約８時間以上）のいずれかで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触され得る。例えば、一実施形態において、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）は、抗体を含む反応容器への薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）の添加の直後に、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物に加えられる。あるいは、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物は、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させた約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、またはそれ以上後に、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触され得る。
【０１８８】
抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物が、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触された後、反応は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、またはそれ以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、または約４８時間）にわたって進行される。
【０１８９】
一実施形態において、一工程方法は、未反応の薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）をクエンチするためのクエンチ工程をさらに含む。クエンチ工程は、典型的に、コンジュゲートの精製の前に行われる。一実施形態において、混合物は、混合物を、クエンチ試薬と接触させることによってクエンチされる。本明細書において使用される際、「クエンチ試薬」は、遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および／または架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応する試薬を指す。一実施形態において、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、またはヨードアセトアミドプロピオン酸などの、マレイミドまたはハロアセトアミドクエンチ試薬が、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）中の任意の未反応の基（チオールなど）が確実にクエンチされるように使用され得る。クエンチ工程は、薬物（例えば、ＤＭ１）の二量体化を防止するのに役立ち得る。二量体化されたＤＭ１は、除去するのが困難であり得る。極性の荷電したチオール−クエンチ試薬（４−マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）を用いたクエンチの際、過剰な、未反応のＤＭ１が、精製工程中に共有結合されたコンジュゲートから容易に分離され得る極性の荷電した水溶性付加物に転化される。非極性および中性チオール−クエンチ試薬を用いたクエンチも使用され得る。一実施形態において、混合物は、混合物を、未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応するクエンチ試薬と接触させることによってクエンチされる。例えば、求核試薬が、未反応のＳＭＣＣをクエンチするために混合物に加えられ得る。求核試薬は、好ましくは、リシン、タウリンおよびヒドロキシルアミンなどの、アミノ基含有求核試薬である。
【０１９０】
好ましい実施形態において、反応（すなわち、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）および次に架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）は、混合物をクエンチ試薬と接触させる前に、完了まで進行される。これに関して、クエンチ試薬は、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物が、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触された約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、または約２５時間〜約４８時間）後に混合物に加えられる。
【０１９１】
あるいは、混合物は、混合物のｐＨを、約５．０（例えば、４．８、４．９、５．０、５．１または５．２）に低下させることによってクエンチされる。別の実施形態において、混合物は、ｐＨを、６．０未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満に低下させることによってクエンチされる。あるいは、ｐＨは、約４．０（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２）〜約６．０（例えば、５．８、５．９、６．０、６．１または６．２）、約４．０〜約５．０、約４．５（例えば、４．３、４．４、４．５、４．６または４．７）〜約５．０に低下される。一実施形態において、混合物は、混合物のｐＨを、４．８に低下させることによってクエンチされる。別の実施形態において、混合物は、混合物のｐＨを、５．５に低下させることによってクエンチされる。
【０１９２】
一実施形態において、一工程方法は、不安定に結合されたリンカーを、抗体から遊離させるための保持工程をさらに含む。保持工程は、コンジュゲートの精製の前（例えば、反応工程の後、反応工程とクエンチ工程との間、またはクエンチ工程の後）に混合物を保持することを含む。例えば、本方法は、（ａ）抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）と接触させて、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）を含む混合物を形成し；次に、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）を含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を得る工程と、（ｂ）不安定に結合されたリンカーを、細胞結合剤から遊離させるために、工程（ａ）で調製された混合物を保持する工程と、（ｃ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲートを得る工程とを含む。
【０１９３】
別の実施形態において、本方法は、（ａ）抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）と接触させて、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）を含む混合物を形成し；次に、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）を含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）で調製された混合物をクエンチして、未反応の薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）および／または未反応の薬物架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）をクエンチする工程と、（ｃ）不安定に結合されたリンカーを、細胞結合剤から遊離させるために、工程（ｂ）で調製された混合物を保持する工程と、（ｄ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を得る工程とを含む。
【０１９４】
あるいは、保持工程を、コンジュゲートの精製後に行った後、さらなる精製工程を行うことができる。
【０１９５】
好ましい実施形態において、反応は、保持工程の前に、完了まで進行される。これに関して、保持工程は、抗体および薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）を含む混合物が、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触された約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、または約２４時間〜約４８時間）後に行われ得る。
【０１９６】
保持工程は、好適な期間（例えば、約１時間〜約１週間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約８時間、または約１時間〜約４時間）にわたって好適な温度（例えば、約０℃〜約３７℃）で溶液を維持して、安定的に結合されたリンカーを抗体から実質的に遊離させないまま、不安定に結合されたリンカーを抗体から有利させることを含む。一実施形態において、保持工程は、約２０℃以下（例えば、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）で、室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）で、または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で溶液を維持することを含む。一実施形態において、保持工程は、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態において、保持工程は、約２℃〜約８℃（例えば、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または約１０℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態において、保持工程は、約３７℃（例えば、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃）の温度で溶液を維持することを含む。
【０１９７】
保持工程の持続期間は、保持工程が行われる温度およびｐＨに応じて決まる。例えば、保持工程の持続期間は、高温で保持工程を行うことによって実質的に減少され得、最大温度は、細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートの安定性によって制限される。保持工程は、約１時間〜約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、もしくは約２４時間）、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約５時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約１２時間〜約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、もしくは約７日間）、または約１日〜約１週間にわたって溶液を維持することを含み得る。
【０１９８】
一実施形態において、保持工程は、少なくとも約１２時間から最大で１週間までの期間にわたって、約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態において、保持工程は、一晩（例えば、約１２〜約２４時間、好ましくは約２０時間）、約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。
【０１９９】
保持工程のためのｐＨ値は、好ましくは、約４〜約１０である。一実施形態において、保持工程のためのｐＨ値は、約４以上であるが、約６未満であるか（例えば、４〜５．９）または約５以上であるが、約６未満である（例えば、５〜５．９）。別の実施形態において、保持工程のためのｐＨ値は、約６〜約１０の範囲（例えば、約６．５〜約９、約６〜約８）である。例えば、保持工程のためのｐＨ値は、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０であり得る。
【０２００】
特定の実施形態において、保持工程は、約１２時間〜約１週間にわたって約６〜７．５のｐＨで、２５℃で混合物をインキュベートすること、約５時間〜約５日間にわたって約４．５〜５．９のｐＨで、４℃で混合物をインキュベートすること、または約５時間〜約１日にわたって約４．５〜５．９のｐＨで、２５℃で混合物をインキュベートすることを含み得る。
【０２０１】
一工程方法は、任意選択的に、コンジュゲートの溶解度および回収を増加させるために、反応工程へのスクロースの添加を含み得る。望ましくは、スクロースは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度で加えられる。好ましくは、スクロースは、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度で加えられる。さらに、反応工程は、緩衝剤の添加も含み得る。当該技術分野において公知の任意の好適な緩衝剤が使用され得る。好適な緩衝剤としては、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびリン酸緩衝液が挙げられる。一実施形態において、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２０２】
一実施形態において、一工程方法は、混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を得る工程をさらに含み得る。当該技術分野において公知の任意の精製方法が、本発明のコンジュゲートを精製するのに使用され得る。一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、選択的沈殿、または任意の他の好適な精製方法、ならびにそれらの組合せを使用する。別の実施形態において、コンジュゲートを、上述される精製方法に供する前に、コンジュゲートは、最初に、１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過される。あるいは、コンジュゲートは、コンジュゲートを、上述される精製方法に供した後、１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過される。例えば、一実施形態において、コンジュゲートは、１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過され、次に、タンジェンシャルフローろ過を用いて精製される。あるいは、コンジュゲートは、タンジェンシャルフローろ過を用いて精製され、次に、１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過される。
【０２０３】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）、およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）を含む任意の好適なＴＦＦシステムが、精製に用いられ得る。
【０２０４】
任意の好適な吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製に用いられ得る。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびそれらの組合せが挙げられる。好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）、およびセラミックｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅ（ＣＦＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なＨＣＩＣ樹脂の例は、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）である。好適なＨＩＣ樹脂の例としては、ブチル−セファロース、ヘキシル−セファロース、フェニル−セファロース、およびオクチルセファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）製）、ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−セファロース、ＣＭ−セファロース、およびＱ−セファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）製）、およびＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なミックスモードイオン交換体の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）が挙げられる。好適なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適な色素リガンド樹脂の例としては、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＡｆｆｉ−ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なアフィニティー樹脂の例としては、プロテインＡセファロース樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびレクチンアフィニティー樹脂、例えば、抗体が適切なレクチン結合部位を有するＬｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。好適な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）が挙げられる。
【０２０５】
任意の好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製に用いられ得る。好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、限定はされないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、およびＰ−１００）、および当業者に公知の他のものが挙げられる。
【０２０６】
リシン抗体残基への架橋のための二工程方法およびワンポット法
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、米国特許第７，８１１，５７２号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号明細書に記載されるように調製され得る。本方法は、（ａ）本発明の抗体を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、リンカー（すなわち、Ａｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１）を抗体に共有結合し、それによって、リンカーが結合された抗体を含む第１の混合物を調製する工程と；（ｂ）任意選択的に、第１の混合物を、精製方法に供して、リンカーが結合された抗体の精製された第１の混合物を調製する工程と；（ｃ）約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、リンカーが結合された抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３、またはＤＭ４）と反応させることによって、薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３、またはＤＭ４）を、第１の混合物中のリンカーが結合された抗体にコンジュゲートして、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４）；および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２の混合物を調製する工程と；（ｄ）第２の混合物を、精製方法に供して、第２の混合物の他の成分からコンジュゲートを精製する工程とを含む。あるいは、精製工程（ｂ）は省略され得る。本明細書に記載される任意の精製方法が、工程（ｂ）および（ｄ）に使用され得る。一実施形態において、ＴＦＦが、両方の工程（ｂ）および（ｄ）に使用される。別の実施形態において、ＴＦＦが、工程（ｂ）に使用され、吸着クロマトグラフィー（例えば、ＣＨＴ）が、工程（ｄ）に使用される。
【０２０７】
リシン抗体残基への架橋のための一工程試薬およびインサイチュ方法
一実施形態において、米国特許第６，４４１，１６３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号明細書および同第２００８／０１４５３７４号明細書に記載されるように、本発明のコンジュゲートは、予め形成されたリンカー−薬物化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を、本発明の抗体にコンジュゲートした後、精製工程を行うことによって調製され得る。本明細書に記載される任意の精製方法が、使用され得る。リンカー−薬物化合物は、薬物（例えば、ＤＭ１、ＤＭ３、またはＤＭ４）を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応させることによって調製される。リンカー−薬物化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）は、抗体にコンジュゲートされる前に、任意選択的に、精製に供される。
【０２０８】
抗ＣＣＲ７抗体
本発明は、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供する。本発明の抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）としては、限定はされないが、実施例に記載されるように単離される、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントが挙げられる。
【０２０９】
本発明は、特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供し、前記抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号１３、４５、７７または６０８のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。本発明はまた、特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供し、前記抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、以下の表１および４に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む。特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供し、前記抗体は、以下の表１および４に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（あるいは、からなる）。
【０２１０】
本発明は、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供し、前記抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号２９、６１、９３または６２４のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまた、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供し、前記抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、以下の表１および４に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供し、前記抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、以下の表１および４に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（あるいは、からなる）。
【０２１１】
本発明の他の抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、突然変異しているが、表１および４に記載される配列に示されるＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性をなお有するアミノ酸を含む。ある実施形態において、抗体は、表１および４に記載される配列に示されるＣＤＲ領域と比較した際に、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域において変異されている突然変異体アミノ酸配列を含む。
【０２１２】
本発明はまた、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖、および完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。このような核酸配列は、哺乳類細胞における発現について最適化され得る。
【０２１３】
本出願の本文全体を通して、本明細書の本文と配列表との間に相違があった場合、本明細書の本文が優先されるものとする。
【０２１４】
【表１】
2020506703.tif 000063
【０２１５】
【表２】
2020506703.tif 000064
【０２１６】
【表３】
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【０２１７】
【表４】
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【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
【表６】
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【０２２０】
【表７】
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【０２２１】
【表８】
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【０２２２】
【表９】
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【０２２３】
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が突然変異しているが、表１および４に記載される配列に対する少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性をなお有するものを含む。ある実施形態において、表１および４に記載される配列に示される可変領域と比較した際に、１、２、３、４または５個のアミノ酸が、可変領域において突然変異しているが、表１および４に列挙される抗体と実質的に同じ治療活性を保持している。
【０２２４】
これらの抗体のそれぞれが、ＣＣＲ７に結合し得るため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖、および完全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）は、本発明の他のＣＣＲ７結合抗体を生成するように、「混合および一致」され得る。このような「混合および一致」されたＣＣＲ７結合抗体は、当該技術分野において公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例のセクションに記載される他のアッセイ）を用いて試験され得る。これらの鎖が混合および一致される場合、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列が、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えられるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長重鎖配列が、構造的に類似した完全長重鎖配列で置き換えられるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列が、構造的に類似したＶＬ配列で置き換えられるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長軽鎖配列が、構造的に類似した完全長軽鎖配列で置き換えられるべきである。したがって、一態様において、本発明は、配列番号１３、４５、７７および６０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２９、６１、９３および６２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、ＣＣＲ７に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０２２５】
別の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１５、４７、７９および６１０からなる群から選択される哺乳動物発現系の細胞内の発現について最適化されたアミノ酸配列を含む完全長重鎖；ならびに配列番号３１、６３、９５および６２６からなる群から選択される哺乳動物の細胞内の発現について最適化されたアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する、単離されたモノクローナル抗体；または（ｉｉ）その抗原結合部分を含む機能的タンパク質を提供する。
【０２２６】
別の態様において、本発明は、表１および４に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含むＣＣＲ７結合抗体を提供する。抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１、４、７、１０、３３、３６、３９、４２、６５、６８、７１および７４に示される。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２、５、８、１１、３４、３７、４０、４３、６６、６９、７２および７５に示される。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３、６、９、１２、３５、３８、４１、４４、６７、７０、７３および７６に示される。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１７、２０、２３、２６、４９、５２、５５、５８、８１、８４、８７および９０に示される。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１８、２１、２４、２７、５０、５３、５６、５９、８２、８５、８８および９１に示される。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１９、２２、２５、２８、５１、５４、５７、６０、８３、８６、８９および９２に示される。
【０２２７】
これらの抗体のそれぞれが、ＣＣＲ７に結合し得、抗原−結合特異性が、主にＣＤＲ１、２および３領域によって提供されるものと仮定すると、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、「混合および一致」され得る（すなわち、異なる抗体からのＣＤＲが、混合および一致され得る。このような「混合および一致」されるＣＣＲ７結合抗体は、当該技術分野において公知の結合アッセイおよび実施例に記載されるもの（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて試験され得る。ＶＨ  ＣＤＲ配列が、混合および一致される場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換えられるべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が、混合および一致される場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換えられるべきである。１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似した配列で置き換えることによって、新規なＶＨおよびＶＬ配列が生成され得ることが、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０２２８】
したがって、ある実施形態において、本発明は、配列番号１、４、７、１０、３３、３６、３９、４２、６５、６８、７１、７４、５９６、５９９、６０２および６０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、５、８、１１、３４、３７、４０、４３、６６、６９、７２、７５、５９７、６００、６０３および６０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、６、９、１２、３５、３８、４１、４４、６７、７０、７３、７６、５９８、６０１、６０４および６０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号１７、２０、２３、２６、４９、５２、５５、５８、８１、８４、８７、９０、６１２、６１５、６１８および６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８、２１、２４、２７、５０、５３、５６、５９、８２、８５、８８、９１、６１３、６１６、６１９および６２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１９、２２、２５、２８、５１、５４、５７、６０、８３、８６、８９、９２、６１４、６１７、６２０および６２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＣＲ７に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０２２９】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３０】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３１】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２；配列番号９の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３２】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３３】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３４】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号３６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号３８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３５】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３６】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４４の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３７】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号６５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６７の重鎖ＣＤＲ３；配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号８２の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号８３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３８】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号６８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６９の重鎖ＣＤＲ２；配列番号７０の重鎖ＣＤＲ３；配列番号８４の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号８５の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３９】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号７１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２の重鎖ＣＤＲ２；配列番号７３の重鎖ＣＤＲ３；配列番号８７の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２４０】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号７４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７５の重鎖ＣＤＲ２；配列番号７６の重鎖ＣＤＲ３；配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２４１】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号５９６のＨＣＤＲ１、配列番号５９７のＨＣＤＲ２、および配列番号５９８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１２のＬＣＤＲ１、配列番号６１３のＬＣＤＲ２、および配列番号６１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２４２】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号５９９のＨＣＤＲ１、配列番号６００のＨＣＤＲ２、および配列番号６０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１５のＬＣＤＲ１、配列番号６１６のＬＣＤＲ２、および配列番号６１７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２４３】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号６０２のＨＣＤＲ１、配列番号６０３のＨＣＤＲ２、および配列番号６０４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６１８のＬＣＤＲ１、配列番号６１９のＬＣＤＲ２、および配列番号６２０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２４４】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号６０５のＨＣＤＲ１、配列番号６０６のＨＣＤＲ２、および配列番号６０７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号６２１のＬＣＤＲ１、配列番号６２２のＬＣＤＲ２、および配列番号６２３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２４５】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４６】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４７】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４８】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号６０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４９】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２５０】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２５１】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号９５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２５２】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、配列番号６１０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２５３】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７に特異的に結合する抗体は、表１および４に記載される抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）である。
【０２５４】
１．エピトープおよび同じエピトープに結合する抗体の同定
本発明はまた、表１および４に記載される抗ＣＣＲ７抗体と同じエピトープに特異的に結合するか、または表１および４に記載される抗体と交差競合する抗体および抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供する。したがって、さらなる抗体および抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、例えばＢＩＡＣＯＲＥを介したＣＣＲ７結合アッセイまたは結合を測定するための当業者に公知のアッセイにおいて、本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計学的に有意な方法で、その結合を競合的に阻害する）それらの能力に基づいて同定され得る。ＣＣＲ７（例えば、ヒトＣＣＲ７）への本発明の抗体および抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が、ＣＣＲ７への結合について抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）と競合し得ることを示し；このような抗体は、非限定的理論によれば、それが競合する抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）と同じかまたは関連する（例えば、構造的に類似しているか、または空間的に近いか、または重なっている）、ＣＣＲ７タンパク質上のエピトープに結合し得る。特定の実施形態において、表１および４に記載される抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）と同じ、ＣＣＲ７上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。このようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製され、単離され得る。
【０２５５】
２．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変化
本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対する修飾をさらに含む、修飾された抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。ある実施形態において、フレームワーク修飾が、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｅ）」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定され得る。フレームワーク領域配列を、それらの生殖系列構成に戻すために、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、生殖系列配列に「復帰突然変異」され得る。このような「復帰突然変異」された抗体も、本発明によって包含されることが意図される。
【０２５６】
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、またはさらには１つまたは複数のＣＤＲ領域内の１つまたは複数の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０２５７】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えてまたはその代わりに、本発明の抗体は、典型的に、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）などの、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化させるように、Ｆｃ領域内の修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾され得るか（例えば、１つまたは複数の化学的部分が、抗体に結合され得る）またはそのグリコシル化を変化させ、抗体の１つまたは複数の機能的特性を同様に変化させるように修飾され得る。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳細に記載されている。
【０２５８】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変化される、例えば、増加または減少されるように修飾される。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは低下させるように変化される。
【０２５９】
ある実施形態において、本明細書に開示される抗体または抗体フラグメントは、薬物部分へのコンジュゲーションのための部位として、修飾または操作されたアミノ酸残基、例えば、１つまたは複数のシステイン残基を含む（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８，２６：９２５−９３２）。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される位置においてシステインによる１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む修飾された抗体または抗体フラグメントを提供する。システイン置換のための部位は、抗体または抗体フラグメントの定常領域にあり、したがって、様々な抗体または抗体フラグメントに適用可能であり、これらの部位は、安定したおよび均質なコンジュゲートを提供するように選択される。修飾された抗体またはフラグメントは、１つ、２つ以上のシステイン置換を有することができ、これらの置換は、本明細書に記載される他の修飾およびコンジュゲーション方法と組み合わせて使用され得る。抗体の特定の位置でシステインを挿入するための方法が、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，３：７０３−７０８、国際公開第２０１１／００５４８１号パンフレット、国際公開第２０１４／１２４３１６号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８６１５号パンフレットを参照されたい。特定の実施形態において、修飾された抗体は、抗体の重鎖の位置１１７、１１９、１２１、１２４、１３９、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６９、１７１、１７４、１８９、１９１、１９５、１９７、２０５、２０７、２４６、２５８、２６９、２７４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９３、３２０、３２２、３２６、３３３、３３４、３３５、３３７、３４４、３５５、３６０、３７５、３８２、３９０、３９２、３９８、４００および４２２から選択されるその定常領域におけるシステインによる１つまたは複数のアミノ酸の置換を含み、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされる。ある実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメントは、抗体または抗体フラグメントの軽鎖の位置１０７、１０８、１０９、１１４、１２９、１４２、１４３、１４５、１５２、１５４、１５６、１５９、１６１、１６５、１６８、１６９、１７０、１８２、１８３、１９７、１９９、および２０３から選択されるその定常領域におけるシステインによる１つまたは複数のアミノ酸の置換を含み、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされ、軽鎖は、ヒトκ軽鎖である。特定の実施形態において、修飾された抗体またはその抗体フラグメントは、その定常領域におけるシステインによる２つ以上のアミノ酸の置換の組合せを含み、ここで、組合せは、抗体重鎖の位置３７５、抗体重鎖の位置１５２、抗体重鎖の位置３６０、または抗体軽鎖の位置１０７における置換を含み、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされる。特定の実施形態において、修飾された抗体またはその抗体フラグメントは、その定常領域におけるシステインによる１つのアミノ酸の置換を含み、ここで、置換は、抗体重鎖の位置３７５、抗体重鎖の位置１５２、抗体重鎖の位��３６０、抗体軽鎖の位置１０７、抗体軽鎖の位置１６５または抗体軽鎖の位置１５９であり、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされ、軽鎖は、κ鎖である。特定の実施形態において、修飾された抗体またはその抗体フラグメントは、その定常領域におけるシステインによる２つのアミノ酸の置換の組合せを含み、ここで、組合せは、抗体重鎖の位置３７５および抗体重鎖の位置１５２における置換を含み、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされる。特定の実施形態において、修飾された抗体またはその抗体フラグメントは、抗体重鎖の位置３６０におけるシステインによる１つのアミノ酸の置換を含み、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされる。他の特定の実施形態において、修飾された抗体またはその抗体フラグメントは、抗体軽鎖の位置１０７におけるシステインによる１つのアミノ酸の置換を含み、ここで、位置は、ＥＵ体系にしたがって番号付けされ、軽鎖は、κ鎖である。
【０２６０】
さらなる実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートに有用な抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、天然配列の少なくとも１つのアミノ酸の代わりに、Ｐｃｌ、ピロリシン、ペプチドタグ（Ｓ６、Ａ１およびｙｂｂＲタグなど）、および非天然アミノ酸を含む１つまたは複数の他の反応性アミノ酸（システイン以外）を導入し、それによって、薬物部分またはリンカー−薬物部分へのコンジュゲーションのための抗体または抗原結合フラグメントにおける反応性部位に、相補的反応性を与えるように修飾された抗体などの、修飾または操作された抗体を含む。例えば、抗体または抗体フラグメントは、薬物へのコンジュゲーションのための部位として、Ｐｃｌもしくはピロリシン（Ｗ．Ｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＮＡＳ  １０８（２６），１０４３７−１０４４２；国際公開第２０１４１２４２５８号パンフレット）または非天然アミノ酸（Ｊ．Ｙ．Ａｘｕｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（２０１２），ｐｐ．１６１０１−１６１０６；概説については、Ｃ．Ｃ．Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２０１０）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７９，４１３−４４４；Ｃ．Ｈ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１７，４１２−４１９を参照されたい）を組み込むように修飾され得る。同様に、酵素的コンジュゲーション方法のためのペプチドタグが、抗体に組み込まれ得る（Ｓｔｒｏｐ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１３，２０（２）：１６１−７；Ｒａｂｕｋａ  Ｄ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｄｅｃ；１４（６）：７９０−６；Ｒａｂｕｋａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２，７（６）：１０５２−６７）。１つの他の例は、補酵素Ａ類似体のコンジュゲーションのための４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）（国際公開第２０１３１８４５１４号パンフレット）、および（Ｇｒｕｅｎｅｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２６（１２），２５５４−６２）の使用である。ペイロードまたはリンカー−ペイロードの組合せを用いてこのような修飾または操作された抗体をコンジュゲートするための方法が、当該技術分野において公知である。
【０２６１】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異される。より具体的には、１つまたは複数のアミノ酸突然変異は、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジ領域ＳｐＡ結合と比べて弱いスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域中に導入される。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０２６２】
さらに他の実施形態において、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置換して、抗体のエフェクター機能を変化させることによって変化される。例えば、１つまたは複数のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が変化されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この手法は、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および同第５，６４８，２６０号明細書（両方ともＷｉｎｔｅｒらによる）に記載されている。
【０２６３】
別の実施形態において、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸は、抗体が変化されたＣ１ｑ結合および／または低下もしくは無効化された補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。この手法は、例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書に記載されている。
【０２６４】
別の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸残基は、変化され、それによって、補体を固定する抗体の能力を変化させる。この手法は、例えば、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公報国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに記載されている。アロタイプアミノ酸残基としては、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域ならびにＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．１：３３２−３３８（２００９）によって記載されるようなκアイソタイプの軽鎖の定常領域が挙げられる。
【０２６５】
このような突然変異を含む抗体融合タンパク質複合体は、抗体依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を低下させるかまたはなくすのを媒介する。ある実施形態において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５は、Ａ２３４およびＡ２３５に置換される。ある実施形態において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｎ２６７は、Ａ２６７に置換される。ある実施形態において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｄ２６５およびＰ３２９は、Ａ２６５およびＡ３２９に置換される。特定の実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、任意選択的に、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択される低下されたエフェクター機能を与える、突然変異または突然変異の組合せを含む。特定の実施形態において、イムノコンジュゲートは、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択される低下されたエフェクター機能を与える、突然変異または突然変異の組合せを含む免疫グロブリン重鎖を含む。
【０２６６】
別の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸残基は、変化され、それによって、補体を固定する抗体の能力を変化させる。この手法は、例えば、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公報国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに記載されている。特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの１つまたは複数のアミノ酸は、１つまたは複数のアロタイプアミノ酸残基で置換される。また、アロタイプアミノ酸残基としては、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域ならびにＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．１：３３２−３３８（２００９）に記載されるようなκアイソタイプの軽鎖の定常領域が挙げられる。
【０２６７】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させるように変化され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変化させることによって行われ得る。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換が行われて、それによって、その部位におけるグリコシル化を除去することができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このような手法は、例えば、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書に記載されている。
【０２６８】
別の実施形態において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。様々な手法が可能である。例えば、以下の突然変異の１つまたは複数が、導入され得る：Ｗａｒｄに付与された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載されるＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および同第６，１２１，０２２号明細書に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変化され得る。
【０２６９】
３．ＣＣＲ７抗体の産生
抗ＣＣＲ７抗体およびその抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）は、限定はされないが、組み換え発現、化学合成、および抗体四量体の酵素的消化を含む、当該技術分野において公知の任意の手段によって産生され得るが、完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組み換え生成によって得られる。組み換え発現は、当該技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来し得る。
【０２７０】
本発明は、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、重鎖もしくは軽鎖可変領域または本明細書に記載される相補性決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。ある実施形態において、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４、４６、７８および６０９からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。ある実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３０、６２、９４および６２５からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２７１】
ある実施形態において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６、４８、８０または６１１のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。ある実施形態において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３２、６４、９６または６２７のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２７２】
本発明のポリヌクレオチドは、抗ＣＣＲ７抗体の可変領域配列のみをコードし得る。それらはまた、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードし得る。ポリヌクレオチド配列のいくつかは、例示されるマウス抗ＣＣＲ７抗体の１つの重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。いくつかの他のポリヌクレオチドは、マウス抗体の１つの重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【０２７３】
ポリヌクレオチド配列は、抗ＣＣＲ７抗体またはその結合フラグメントをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載される配列）のデノボ固相ＤＮＡ合成またはＰＣＲ突然変異誘発によって生成され得る。核酸の直接化学合成が、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９、１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体担体法などの、当該技術分野において公知の方法によって行われ得る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入が、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；およびＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１に記載されるように行われ得る。
【０２７４】
上述される抗ＣＣＲ７抗体を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞も、本発明において提供される。様々な発現ベクターが、抗ＣＣＲ７抗体鎖または結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現するのに用いられ得る。ウイルスに基づく発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの両方が、哺乳動物宿主細胞内で抗体を産生するのに使用され得る。非ウイルスベクターおよび系としては、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクター、およびヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５，１９９７を参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内での抗ＣＣＲ７ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ  ＆  Ｃ、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ  ＆  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、および他のタンパク質を発現するための当該技術分野において公知の多くの他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、上掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
【０２７５】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される意図される宿主細胞に応じて決まる。典型的に、発現ベクターは、抗ＣＣＲ７抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。ある実施形態において、誘導性プロモーターが、誘導条件下を除いて挿入された配列の発現を防止するのに用いられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物が、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について集団を偏らせずに非誘導条件下で拡張され得る。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗ＣＣＲ７抗体鎖またはフラグメントの効率的発現のために必要とされるかまたは所望され得る。これらのエレメントは、典型的に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率が、使用の際に細胞系への適切なエンハンサーの包含によって高められ得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；およびＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞内での発現を増加させるのに使用され得る。
【０２７６】
発現ベクターはまた、挿入される抗ＣＣＲ７抗体配列によってコードされるポリペプチドとともに融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供し得る。より頻繁には、挿入される抗ＣＣＲ７抗体配列は、ベクター中への包含の前にシグナル配列に結合される。抗ＣＣＲ７抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターはまた、定常領域またはその部分をコードすることがある。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それによって、無傷の抗体またはそのフラグメントの産生をもたらす。典型的に、このような定常領域はヒトである。
【０２７７】
抗ＣＣＲ７抗体鎖を担持および発現するための宿主細胞は、原核または真核のいずれかであり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現するのに有用な１つの原核宿主である。使用するのに好適な他の微生物宿主としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、ならびにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、および様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、典型的に、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージに由来するプロモーター系などの、任意の数の様々な周知のプロモーターば存在することになる。プロモーターは、典型的に、任意選択的に、オペレーター配列とともに発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、本発明の抗ＣＣＲ７ポリペプチドを発現するのに用いられ得る。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用され得る。
【０２７８】
ある好ましい実施形態において、哺乳動物宿主細胞が、本発明の抗ＣＣＲ７ポリペプチドを発現し、産生するのに使用される。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば、実施例に記載されるような骨髄腫ハイブリドーマクローン）または外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞株（例えば、以下に例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）のいずれかであり得る。これらは、任意の正常な死滅するまたは正常もしくは異常な不死の動物またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞およびハイブリドーマを含む、無傷の免疫グロブリンを分泌することが可能ないくつかの好適な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に一般に記載されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８，１９８６を参照）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、および／または調節可能または制御可能であり得る。有用なプロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当該技術分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
【０２７９】
対象とするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが、原核細胞のために一般的に用いられるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが、他の細胞宿主のために使用され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．を参照）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、ＤＮＡの薬剤促進性取り込み、およびエクスビボ形質導入が挙げられる。組み換えタンパク質の長期の高収率の生成のために、安定した発現が望ましいことが多い。例えば、抗ＣＣＲ７抗体鎖または結合フラグメントを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを含有する本発明の発現ベクターを用いて調製され得る。ベクターの導入後、細胞が、富化培地中で１〜２日間成長されてから、選択培地に切り替えられる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在が、選択培地中で導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長を可能にする。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞が、細胞型にとって適切な組織培養技術を用いて増殖され得る。
【０２８０】
治療的使用
本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、および抗体薬物コンジュゲートは、限定はされないが、固形癌もしくはヘム悪性腫瘍などの、癌の治療または予防を含む様々な用途に有用である。特定の実施形態において、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、および抗体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長の阻害、分化の誘導、腫瘍体積の減少、および／または腫瘍の発癌性の低下にとって有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ方法であり得る。
【０２８１】
一態様において、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、および抗体薬物コンジュゲートは、生体試料中のＣＣＲ７の存在を検出するのに有用である。本明細書において使用される際の「検出すること」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。特定の実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。特定の実施形態において、このような組織は、正常組織および／または他の組織と比べてより高いレベルでＣＣＲ７を発現する癌性組織を含む。
【０２８２】
一態様において、本発明は、生体試料中のＣＣＲ７の存在を検出する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、抗原への抗体の結合を可能にする条件下で、生体試料を抗ＣＣＲ７抗体と接触させ、抗体と抗原との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。
【０２８３】
一態様において、本発明は、ＣＣＲ７の発現の増加に関連する障害を診断する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、試験細胞を抗ＣＣＲ７抗体と接触させること；ＣＣＲ７抗原への抗ＣＣＲ７抗体の結合を検出することによって、試験細胞におけるＣＣＲ７の発現のレベルを（定量的または定性的に）決定すること；および試験細胞におけるＣＣＲ７の発現のレベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞、またはこのような正常細胞と同等のレベルでＣＣＲ７を発現する細胞）におけるＣＣＲ７の発現のレベルと比較することを含み、ここで、対照細胞と比較した、試験細胞におけるＣＣＲ７の発現のより高いレベルは、ＣＣＲ７の発現の増加に関連する障害の存在を示す。特定の実施形態において、試験細胞は、ＣＣＲ７の発現の増加に関連する障害を有することが疑われる個体から得られる。特定の実施形態において、障害は、癌または腫瘍などの細胞増殖性疾患である。特定の実施形態において、本方法は、試験細胞内のＣＣＲ７遺伝子のコピー数を測定することを含む。
【０２８４】
特定の実施形態において、上述されるものなどの、診断または検出の方法は、細胞の表面上で、またはその表面上でＣＣＲ７を発現する細胞から得られる膜調製物中で発現されるＣＣＲ７への抗ＣＣＲ７抗体の結合を検出することを含む。細胞の表面上で発現されるＣＣＲ７への抗ＣＣＲ７抗体の結合を検出するための例示的なアッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
【０２８５】
特定の他の方法が、ＣＣＲ７への抗ＣＣＲ７抗体の結合を検出するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、当該技術分野において周知の抗原結合アッセイが挙げられる。
【０２８６】
特定の実施形態において、抗ＣＣＲ７抗体は標識される。標識としては、限定はされないが、直接検出される標識または部分（蛍光、発色、高電子密度、化学発光、および放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。
【０２８７】
特定の実施形態において、抗ＣＣＲ７抗体は、不溶性マトリックス上に固定される。固定は、溶液中で遊離したままである任意のＣＣＲ７タンパク質から抗ＣＣＲ７抗体を分離することを伴う。これは、アッセイ手順前に抗ＣＣＲ７抗体を不溶化することによって、水不溶性マトリックスもしくは表面への吸着によって（Ｂｅｎｎｉｃｈら、米国特許第３，７２０，７６０号明細書）、または（例えば、グルタルアルデヒド架橋を用いた）共有結合によって、または例えば免疫沈降による、抗ＣＣＲ７抗体とＣＣＲ７タンパク質との複合体の形成後に抗ＣＣＲ７抗体を不溶化することによって、好都合に行われる。
【０２８８】
診断または検出の上記の実施形態のいずれかが、抗ＣＣＲ７抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明のコンジュゲートを用いて行われ得る。
【０２８９】
一実施形態において、本発明は、疾患を治療または予防する方法であって、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、患者における疾患を治療または予防するための、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。ある実施形態において、本発明は、患者における疾患の治療または予防に使用するための、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、患者における疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
【０２９０】
特定の実施形態において、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、および抗体薬物コンジュゲートで治療される疾患は、癌である。特定の実施形態において、癌は、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、および抗体薬物コンジュゲートが結合するＣＣＲ７発現細胞によって特徴付けられる。特定の実施形態において、癌は、健常な患者と比べて、ＣＣＲ７の発現の増加によって特徴付けられる。ある実施形態において、ＣＣＲ７の発現は、ＣＣＲ７  ＲＮＡの増加によって測定され得る。他の実施形態において、癌は、ＣＣＲ７のＤＮＡコピー数の増加によって特徴付けられる。ＣＣＲ７発現のレベルを測定または決定する他の方法が、当業者に公知である。治療および／または予防され得る疾患の例としては、限定はされないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えばマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、食道癌、大腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、腎細胞癌、および子宮頸癌が挙げられる。
【０２９１】
本発明は、癌を治療または予防する方法であって、治療有効量の、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、癌は、固形癌である。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。特定の実施形態において、癌は、耐性癌および／または再発性癌である。特定の態様において、例えば、耐性癌は、チロシンキナーゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤に耐性である。
【０２９２】
特定の実施形態において、本発明は、腫瘍成長を阻害する方法であって、治療有効量の、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートを対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。特定の実施形態において、対象は、腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。特定の実施形態において、腫瘍は、限定はされないが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含む他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性である。
【０２９３】
特定の実施形態において、腫瘍は、抗ＣＣＲ７抗体が結合するＣＣＲ７を発現する。特定の実施形態において、腫瘍は、ヒトＣＣＲ７を過剰発現する。特定の実施形態において、腫瘍は、ＣＣＲ７遺伝子のコピー数の増加を有する。
【０２９４】
本発明はまた、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートによる治療のための患者を選択する方法であって、治療有効量の、前記抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、本方法は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性癌に罹患した患者を選択することを含む。特定の態様において、チロシンキナーゼ阻害剤耐性癌が、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤および／またはＭｅｔ阻害剤に耐性であると想定される。特定の態様において、耐性癌がＨｅｒ２耐性癌であると想定される。特定の態様において、癌がデノボ耐性癌であると想定され、さらに他の態様において、癌が再発性癌であると想定される。本発明の特定の態様において、本方法は、デノボ耐性または再発性癌に罹患した患者を選択し、ＣＣＲ７の発現を測定することを含む。特定の態様において、再発性癌または腫瘍が、初期にはＣＣＲ７発現癌または腫瘍ではなかったが、チロシンキナーゼ阻害剤による治療後に、チロシンキナーゼ耐性または再発性癌または腫瘍であるＣＣＲ７陽性癌になることが想定される。
【０２９５】
疾患の治療または予防のために、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートの適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、以前の療法、患者の病歴などの様々な因子に応じて決まる。抗体または薬剤は、１回で、または数日間から数か月続く一連の治療にわたって、または治癒が行われるかもしくは疾患状態の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与され得る。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定から計算され得、個々の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートの相対的効力に応じて変化する。治療する医師は、体液または組織中での測定された滞留時間および薬物の濃度に基づいて、投与のための反復速度を推定することができる。
【０２９６】
併用療法
特定の場合に、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートは、他の抗癌剤、抗アレルギー剤、抗嘔吐剤（または制吐剤）、疼痛緩和剤、細胞保護剤、およびそれらの組合せなどの他の治療剤と組み合わされる。
【０２９７】
一実施形態において、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートは、抗癌特性を有する第２の化合物と、併用療法として、組合せ医薬品製剤中、または投与計画中で組み合わされる。組合せ医薬品製剤または投与計画の第２の化合物は、それらが互いに悪影響を与えないように、組合せの抗体またはイムノコンジュゲートに対する相補的活性を有し得る。例えば、本発明の抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）、または抗体薬物コンジュゲートは、限定はされないが、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＣＲ７下流シグナル伝達経路阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、Ｍｃｌ１阻害剤、および他のＣＣＲ７阻害剤と組み合わせて投与され得る。
【０２９８】
本明細書において使用される際の「組合せ医薬品」という用語は、１つの単位剤形中の固定的組合せ、または２つ以上の治療剤が、独立して同時に、または特に、組合せパートナーが、協調的な、例えば、相乗効果を示すことを可能にする時間間隔内で別々に投与され得る非固定的組合せもしくは組み合わされた投与のための部分のキットを指す。
【０２９９】
「併用療法」という用語は、本開示に記載される治療的病態または障害を治療または予防するための２つ以上の治療剤の投与を指す。このような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセルなどの、実質的に同時の様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。あるいは、このような投与は、各活性成分について、複数の、または別々の容器（例えば、カプセル、粉末、および液体）中での同時投与を包含する。粉末および／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈され得る。さらに、このような投与は、ほぼ同時にまたは異なる時間に、連続的様式での、それぞれのタイプの治療剤の使用も包含する。いずれの場合も、治療計画は、本明細書に記載される病態または障害を治療または予防する際に薬物の組合せの有益な効果を提供する。
【０３００】
併用療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であることが分かっている、すなわち、活性成分を一緒に使用したときに達成される効果が、化合物を別々に使用することから得られる効果の合計より大きい。活性成分が、（１）組み合わせた単位用量製剤中で、同時に製剤化および投与されるかまたは同時に送達される；（２）別々の製剤として交互に、もしくは同時に送達される；または（３）いくつかの他の計画によるものである場合、相乗効果が達成され得る。交互療法において送達される場合、化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注入によって連続的に投与または送達される場合、相乗効果が達成され得る。一般に、交互療法中、各活性成分の有効な投与量が、連続的に、すなわち、順次投与されるが、併用療法においては、２つ以上の活性成分の有効な投与量が、一緒に投与される。
【０３０１】
併用療法における使用のために考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、およびペメトレキセドが挙げられる。
【０３０２】
一態様において、本発明は、限定はされないが、ＢＴＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤、およびＭｅｔ阻害剤を含む１つまたは複数のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせた、本発明の抗体薬物コンジュゲートを、癌の治療または予防を必要とする対象に投与することによって、癌の治療または予防を行う方法を提供する。
【０３０３】
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定はされないが、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）；エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能な、ＡＢＴ  ８６９としても知られているＮ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）尿素）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ＳＫＩ−６０６としても知られ、米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載される、ボスチニブ（４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）；およびイマチニブまたはメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
【０３０４】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ’’）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ  ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ  ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ  １８７７２４−６１−４）が挙げられる。
【０３０５】
ＥＧＦＲ抗体としては、限定はされないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ  ３３９１５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ  ９４６４１４−０９−１）が挙げられる。
【０３０６】
ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２受容体）（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、またはｐ１８５としても知られている）阻害剤としては、限定はされないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；パーツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エンアミド、ＰＣＴ出願番号国際公開第０５／０２８４４３号パンフレットに記載される）；ラパチニブまたはラパチニブジトシレート（ｄｉｔｏｓｙｌａｔｅ）（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ  ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ  ５９９６２６、ＣＡＳ  ７１４９７１−０９−２）；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５またはＣＩ−１０３３）；およびＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ  ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。
【０３０７】
Ｈｅｒ３阻害剤としては、限定はされないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、ＭＭ−１１１、およびＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。
【０３０８】
ＭＥＴ阻害剤としては、限定はされないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ  ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、以前はＸＬ８８０、ＣＡＳ  ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ  １０００８７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ  ４５８）；クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ  ９４３５４０−７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ  ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ  ９１７８７９−３９−１）；６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ  １０２２１５０−５７−７）；および（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニルメチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ  ４７７５７５−５６−７）が挙げられる。
【０３０９】
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤としては、限定はされないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、およびＢＩ８３６８４５が挙げられる。概説については、例えば、Ｙｅｅ，ＪＮＣＩ，１０４；９７５（２０１２）を参照されたい。
【０３１０】
別の態様において、本発明は、限定はされないが、β−アレスチン阻害剤、ＧＲＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤などを含む、１つまたは複数のＣＣＲ７下流シグナル伝達経路阻害剤と組み合わせた、本発明の抗体薬物コンジュゲートを、癌の治療または予防を必要とする対象に投与することによって、癌の治療または予防を行う方法を提供する。
【０３１１】
例えば、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、限定はされないが、イデラリシブ（Ｚｙｄｅｌｉｇ、ＧＳ−１１０１、Ｃａｌ−１０１）、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ  ０９４１としても知られ、ＰＣＴ出願番号国際公開第０９／０３６０８２号パンフレットおよび国際公開第０９／０５５７３０号パンフレットに記載される）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ  ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ  ２３５としても知られ、ＰＣＴ出願番号国際公開第０６／１２２８０６号パンフレットに記載される）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても知られ、ＰＣＴ出願番号国際公開第２００７／０８４７８６号パンフレットに記載される）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ−０４５７、ＣＡＳ  ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ  ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ  ５０２６３２−６６−８）；および８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ  １５４４４７−３６−６）が挙げられる。
【０３１２】
さらに別の態様において、本発明は、限定はされないが、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣｌ１阻害剤、Ｔｒａｉｌ剤、Ｃｈｋ阻害剤を含む１つまたは複数のポロアポトーシス剤と組み合わせた、本発明の抗体薬物コンジュゲートを、癌の治療または予防を必要とする対象に投与することによって、癌の治療または予防を行う方法を提供する。
【０３１３】
例えば、ＩＡＰ阻害剤は、限定はされないが、ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、およびＴＬ３２７１１が挙げられる。ＩＡＰ阻害剤の他の例としては、限定はされないが、国際公開第０４／００５２８４号パンフレット、国際公開第０４／００７５２９号パンフレット、国際公開第０５／０９７７９１号パンフレット、国際公開第０５／０６９８９４号パンフレット、国際公開第０５／０６９８８８号パンフレット、国際公開第０５／０９４８１８号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／００１４７００号明細書、米国特許出願公開第２００６／００２５３４７号明細書、国際公開第０６／０６９０６３号パンフレット、国際公開第０６／０１０１１８号パンフレット、国際公開第０６／０１７２９５号パンフレット、および国際公開第０８／１３４６７９号パンフレット（これらは全て、参照により本明細書に援用される）に開示されるものが挙げられる。
【０３１４】
ＢＣＬ−２阻害剤としては、限定はされないが、ベネトクラクス（ＧＤＣ−０１９９、ＡＢＴ−１９９、ＲＧ７６０１としても知られている）；４−［４−［［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェニル］スルホニル］ベンズアミド（ＡＢＴ−２６３としても知られ、ＰＣＴ出願番号国際公開第０９／１５５３８６号パンフレットに記載される）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラクス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））；Ｂａｋ  ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンズアミド（ＡＢＴ−７３７、ＣＡＳ  ８５２８０８−０４−９）；およびナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３、ＣＡＳ  ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。
【０３１５】
ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）を含むプロアポトーシス受容体作用薬（ＰＡＲＡ）としては、限定はされないが、デュラネルミン（ＡＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡＳ  ６５８０５２−０９−６）；レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ  ８４５８１６−０２−６）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５、ＣＡＳ  ８９６７３１−８２−１）；およびチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ  ９４６４１５−３４−５、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏから入手可能）が挙げられる。
【０３１６】
チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害剤としては、限定はされないが、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−テトラヒドロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ  ８９１４９４−６３−６）；５−（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ  ８６０３５２−０１−８）；４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ  １２４、ＣＡＳ  ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−ＡＡＤ）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−ピラジニル）尿素（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ  ９１１２２２−４５−２）；スルホラファン（ＣＡＳ  ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ  １３５８９７−０６−２）；およびＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＹＲＳＰＡＭＰＥＮＬ（配列番号６２９））、およびＣＢＰ５０１（（ｄ−Ｂｐａ）ｓｗｓ（ｄ−Ｐｈｅ−Ｆ５）（ｄ−Ｃｈａ）ｒｒｒｑｒｒ）が挙げられる。
【０３１７】
さらなる実施形態において、本発明は、１つまたは複数の免疫調節剤（例えば、共刺激分子の活性化因子または免疫チェックポイント分子の阻害剤のうちの１つまたは複数）と組み合わせた、本発明の抗体薬物コンジュゲートを、癌の治療または予防を必要とする対象に投与することによって、癌の治療または予防を行う方法を提供する。
【０３１８】
特定の実施形態において、免疫調節剤は、共刺激分子の活性化因子である。一実施形態において、共刺激分子のアゴニストが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＳＴＩＮＧ、またはＣＤ８３リガンドのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または可溶性融合物）から選択される。
【０３１９】
特定の実施形態において、免疫調節剤は、免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一実施形態において、免疫調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲ  βの阻害剤である。一実施形態において、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＣＴＬＡ４、またはそれらの任意の組合せを阻害する。「阻害」または「阻害剤」という用語は、所与の分子、例えば、免疫チェックポイント阻害剤の特定のパラメータ、例えば、活性の低下を含む。例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の活性、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１活性の阻害が、この用語に含まれる。したがって、阻害は、１００％である必要はない。
【０３２０】
阻害分子の阻害は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで行われ得る。ある実施形態において、阻害核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）が、阻害分子の発現を阻害するのに使用され得る。他の実施形態において、阻害シグナルを有する阻害剤は、ポリペプチド、例えば、可溶性リガンド（例えば、ＰＤ−１−ＩｇまたはＣＴＬＡ−４  Ｉｇ）、または阻害分子に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント；例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲ  β、またはそれらの組合せに結合する抗体またはそのフラグメント（本明細書において「抗体分子」とも呼ばれる）である。
【０３２１】
一実施形態において、抗体分子は、完全抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））である。さらに他の実施形態において、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域（Ｆｃ）、より特定的に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）の重鎖定常領域を有する。一実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である。一実施形態において、定常領域は、抗体分子の特性を調節する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、もしくは補体機能のうちの１つまたは複数を増加または減少させる）ように、変化され、例えば、突然変異される。
【０３２２】
特定の実施形態において、抗体分子は、二重特異性または多重特異性抗体分子の形態である。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する第１の結合特異性、および第２の結合特異性、例えば、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、またはＰＤ−Ｌ２に対する第２の結合特異性を有する。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１およびＴＩＭ−３に結合する。別の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１およびＬＡＧ−３に結合する。別の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に結合する。さらに別の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。別の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＩＭ−３およびＬＡＧ−３に結合する。上記の分子の任意の組合せが、多重特異性抗体分子、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−１に対する第１の結合特異性、ならびにＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、またはＰＤ−Ｌ２のうちの２つ以上に対する第２および第３の結合特異性を含む三重特異性抗体で作製され得る。
【０３２３】
特定の実施形態において、免疫調節剤は、ＰＤ−１、例えば、ヒトＰＤ−１の阻害剤である。別の実施形態において、免疫調節剤は、ＰＤ−Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１の阻害剤である。一実施形態において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体分子である。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、単独で、または他の免疫調節剤と組み合わせて、例えば、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＣＴＬＡ４の阻害剤と組み合わせて投与され得る。例示的な実施形態において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体分子と組み合わせて投与される。別の実施形態において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＴＩＭ−３阻害剤、例えば、抗ＴＩＭ−３抗体分子と組み合わせて投与される。さらに他の実施形態において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体分子、およびＴＩＭ−３阻害剤、例えば、抗ＴＩＭ−３抗体分子と組み合わせて投与される。ＰＤ−１阻害剤との免疫調節剤の他の組合せ（例えば、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲのうちの１つまたは複数）も、本発明の範囲内である。当該技術分野において公知の、または本明細書に開示される抗体分子のいずれも、チェックポイント分子の阻害剤の上記の組合せで使用され得る。
【０３２４】
一実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブから選択される抗ＰＤ−１抗体である。ある実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブの代替名としては、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８が挙げられる。ある実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的にブロックする完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）およびＰＤ１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書およびＰＣＴ出願番号国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。
【０３２５】
他の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブである。ペムブロリズマブ（商品名ＫＥＹＴＲＵＤＡ、以前はランブロリズマブ、Ｍｅｒｃｋ  ３７４５、ＭＫ−３４７５またはＳＣＨ−９００４７５としても知られている）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブは、例えば、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９（２）：１３４−４４、ＰＣＴ出願番号国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレット、および米国特許第８，３５４，５０９号明細書に開示されている。
【０３２６】
ある実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ピディリズマブである。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＰＣＴ出願番号国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。他の抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書、および／または米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号明細書に開示されている。他の抗ＰＤ１抗体としては、ＡＭＰ  ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
【０３２７】
ある実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤＲ００１または国際公開第２０１５／１１２９００号パンフレットに開示される任意の他の抗ＰＤ−１抗体である。
【０３２８】
ある実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ−ＬｌまたはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。ある実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４である。
【０３２９】
ある実施形態において、ＰＤ−Ｌｌ阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌｌ抗体である。ある実施形態において、抗ＰＤ−Ｌｌ阻害剤は、例えば、国際公開第２０１３／０１７９１７４号パンフレットに開示され、本明細書に開示される配列（またはそれと実質的に同一もしくは類似の配列、例えば、規定される配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一の配列）を有する、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、またはＭＤＸ−１１０５ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ａ０９−２４６−２とも呼ばれる）から選択される。
【０３３０】
一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＸ−１１０５である。ＢＭＳ−９３６５５９としても知られているＭＤＸ−１１０５は、ＰＣＴ出願番号国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載される抗ＰＤ−Ｌｌ抗体である。
【０３３１】
一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、ＰＣＴ出願番号国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレット（それぞれ配列番号２０および２１に示される重鎖および軽鎖可変領域配列）に記載される抗ＰＤ−Ｌｌである。
【０３３２】
一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）である。ＭＤＰＬ３２８０Ａは、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号明細書および米国特許出願公開第２０１２００３９９０６号明細書に開示されている。
【０３３３】
他の実施形態において、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＡＭＰ−２２４である。ＡＭＰ−２２４は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体（Ｂ７−ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ；例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示されている）である。
【０３３４】
一実施形態において、ＬＡＧ−３阻害剤は、抗ＬＡＧ−３抗体分子である。一実施形態において、ＬＡＧ−３阻害剤は、ＢＭＳ−９８６０１６である。
【０３３５】
医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、本発明のイムノコンジュゲートは、薬学的に許容できる担体または賦形剤と混合される。組成物は、ＣＣＲ７発現癌（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、例えばマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、食道癌、大腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌、腎細胞癌、および子宮頸癌を含むがこれらに限定されない）を治療または予防するのに好適な１つまたは複数の他の治療剤をさらに含有し得る。
【０３３６】
治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸濁液の形態で生理学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２０００；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９３；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９０；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９０；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２０００を参照）。
【０３３７】
治療剤のための投与計画の選択は、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性、および生体マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含むいくつかの因子に応じて決まる。特定の実施形態において、投与計画は、許容できる副作用レベルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大にする。したがって、送達される生物製剤の量は、一つには、特定の実体および治療される病態の重症度に応じて決まる。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択する指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，１９９６；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１；Ｂａｃｈ（ｅｄ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３；Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８，２００３；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３，１９９９；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２，２００１；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９，２０００；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２，２００３；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２，２０００を参照）。
【０３３８】
適切な用量の決定は、例えば、治療もしくは予防に影響するかまたは治療もしくは予防に影響すると予測されることが、当該技術分野において知られているかまたは疑われるパラメータまたは因子を用いて、臨床医によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりいくらか少ない量から開始し、その後、何らかの負の副作用と比べて所望のまたは最適な効果が達成されるまで、少しずつ増加される。重要な診断尺度は、例えば、炎症または生成される炎症性サイトカインのレベルの症状のものを含む。
【０３３９】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性にならないように、特定の患者、組成物、および投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排せつ速度、治療の持続期間、用いられる特定の組成物と併用される他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および以前の病歴、および医学の技術分野において公知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に応じて決まる。
【０３４０】
本発明の抗体またはそのフラグメントを含む組成物は、連続注入によって、または例えば、１日、１週間、または週に１〜７回、隔週に１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、または８週ごとに１回の間隔での投与によって提供され得る。用量は、静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔内、直腸、筋肉内、大脳内で、または吸入によって提供され得る。特定の投与プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含むものである。
【０３４１】
本発明のイムノコンジュゲートについて、患者に投与される投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であり得る。投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であり得る。本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量は、患者体重キログラム（ｋｇ）にｍｇ／ｋｇで投与される用量を乗算した値を用いて計算され得る。
【０３４２】
本発明のイムノコンジュゲートの投与は、繰り返されてもよく、投与は、１日未満、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２か月、７５日、３か月、４か月、５か月、または少なくとも６か月の間隔を空けてもよい。ある実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、週に２回、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、またはより少ない頻度で投与され得る。特定の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートの投与は、２週間ごとに繰り返される。
【０３４３】
特定の患者のための有効量は、治療される病態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９６；Ｄｅｎｔ，Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００１を参照）。
【０３４４】
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚適用、皮下、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内投与による注射もしくは注入、または持続放出系もしくは埋め込みによるものであり得る（例えば、Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６，１９８３；Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，１９８１；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，１９８２；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２，１９８５；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４，１９８０；米国特許第６，３５０，４６６号明細書および同第６，３１６，０２４号明細書を参照）。必要に応じて、組成物は、可溶化剤または注射部位における疼痛を軽減するためのリドカインなどの局所麻酔剤、またはその両方も含み得る。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール化剤を含む製剤の使用による経肺投与も用いられ得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号明細書、同第５，９８５，３２０号明細書、同第５，９８５，３０９号明細書、同第５，９３４，２７２号明細書、同第５，８７４，０６４号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，２９０，５４０号明細書、および同第４，８８０，０７８号明細書；およびＰＣＴ出願番号国際公開第９２／１９２４４号パンフレット、国際公開第９７／３２５７２号パンフレット、国際公開第９７／４４０１３号パンフレット、国際公開第９８／３１３４６号パンフレット、および国際公開第９９／６６９０３号パンフレット（これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０３４５】
本発明の組成物はまた、当該技術分野において公知の様々な方法の１つまたは複数を用いて、１つまたは複数の投与経路によって投与され得る。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて変化することになる。本発明のイムノコンジュゲートのために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば注射もしくは注入による他の非経口投与経路が挙げられる。非経口投与は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を表してもよく、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。あるいは、本発明の組成物は、局所、表皮または粘膜投与経路などの非非経口経路によって、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、直腸的、舌下的または局所的に投与され得る。一実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、注入によって投与される。別の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、皮下投与される。
【０３４６】
本発明のイムノコンジュゲートが、制御放出系または持続放出系において投与される場合、ポンプが、制御放出または持続放出を達成するのに使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７，１９８０；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４，１９８９を参照）。ポリマー材料が、本発明の療法の制御放出または持続放出を達成するのに使用され得る（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１，１９８３を参照されたい；また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０，１９８５；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１，１９８９；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５，１９８９；米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；ＰＣＴ出願番号国際公開第９９／１５１５４号パンフレット；およびＰＣＴ出願番号国際公開第９９／２０２５３号パンフレットを参照されたい。持続放出製剤において使用されるポリマーの例としては、限定はされないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態において、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、生分解性である。制御放出系または持続放出系は、予防または治療標的の近くに設置され、したがって、全身用量のごく一部を要するだけで済む（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上掲、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８，１９８４を参照）。
【０３４７】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０による概説で説明されている。当業者に公知の任意の技術が、本発明の１つまたは複数のイムノコンジュゲートを含む持続放出製剤を生成するのに使用され得る。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号明細書、ＰＣＴ公報国際公開第９１／０５５４８号パンフレット、ＰＣＴ公報国際公開第９６／２０６９８号パンフレット、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９，１９９６；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７，１９９５；Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４、１９９７；およびＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０，１９９７（これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０３４８】
本発明のイムノコンジュゲートが、局所投与される場合、それらは、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、スプレー、エアゾール、溶液、乳剤の形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）を参照されたい。スプレー不可能な局所剤形については、局所適用と適合する担体または１つまたは複数の賦形剤を含み、ある場合に、水より高い動的粘度を有する粘性から半固体または固体形態が典型的に使用される。好適な製剤としては、限定はされないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば浸透圧などの様々な特性に影響を与えるための補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、または塩）と混合される、溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬などが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、ある場合に、固体または液体不活性担体と組み合わされた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物中またはスクイーズボトル中に充填されるスプレー可能なエアゾール調製物が挙げられる。必要に応じて、モイスチャライザーまたは保湿剤も、医薬組成物および剤形に加えられ得る。このようなさらなる成分の例は、当該技術分野において周知である。
【０３４９】
イムノコンジュゲートを含む組成物が、鼻腔内投与される場合、それは、エアゾール形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態で製剤化され得る。特に、本発明に係る使用のための予防剤または治療剤が、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス）の使用とともに、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示物の形態で好都合に送達され得る。加圧エアゾールの場合、投与量単位が、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。化合物と、ラクトースまたはでんぷんなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または注入器において使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）が製剤化され得る。
【０３５０】
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線療法との同時投与または治療のための方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．；Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．を参照）。治療剤の有効量は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減することができる。
【０３５１】
本発明のイムノコンジュゲートと組み合わせて投与され得るさらなる療法（例えば、予防剤または治療剤）は、本発明のイムノコンジュゲートから５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、約１２時間〜１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６時間空けて、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時間空けて、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間空けて、または９６時間〜１２０時間空けて投与され得る。２つ以上の療法が、１回の同じ患者の診察中に投与され得る。
【０３５２】
特定の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを確実に通過するために（必要に応じて）、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；および同第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官中に選択的に輸送される１つまたは複数の部分を含み、それによって、標的化薬物送達を促進し得る（例えば、Ｒａｎａｄｅ，（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。例示的な標的化部分としては、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらに付与された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ  １２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられ；Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照されたい。
【０３５３】
本発明は、単独でまたは他の療法と組み合わせた、本発明のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコルを提供する。本発明の併用療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）は、対象に同時にまたは順次投与され得る。本発明の併用療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）はまた、周期的に投与され得る。周期的療法は、療法（例えば、薬剤）の１つに対する耐性の発生を軽減するため、療法（例えば、薬剤）の１つの副作用を回避もしくは軽減するため、および／または療法の有効性を改善するために、所定の期間にわたる第１の療法（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与、続いて、所定の期間にわたる第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）の投与およびこの連続投与の繰り返し、すなわち、サイクルを含む。
【０３５４】
本発明の併用療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）は、対象に同時に投与され得る。
【０３５５】
「同時に」という用語は、正確に同時の療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与に限定されないが、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物が、連続して、および本発明の抗体薬物コンジュゲートが他の療法と一緒に作用して、それらが他の形で投与される場合より増大した利益を提供し得るような時間間隔で対象に投与されることを意味する。例えば、各療法は、同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に対象に投与され得るが；同時に投与されない場合、それらは、所望の治療または予防効果を提供するように、十分に近い時間で投与されるべきである。各療法は、任意の適切な形態で、および任意の好適な経路によって、別々に対象に投与され得る。様々な実施形態において、療法（例えば、予防剤または治療剤）は、５分未満空けて、１５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１時間〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて、対象に投与される。他の実施形態において、２つ以上の療法（例えば、予防剤または治療剤）が、同じ患者の診察中に投与される。
【０３５６】
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与され得る。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で、対象に同時に投与され得る。予防剤または治療剤は、同じかまたは異なる投与経路によって、対象に投与され得る。併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与され得る。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で、対象に同時に投与され得る。予防剤または治療剤は、同じかまたは異なる投与経路によって、対象に投与され得る。
【実施例】
【０３５７】
実施例１：抗ＣＣＲ７抗体の生成
ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルＣＣＲ７についての発現構築物の生成
完全長ヒト、カニクイザルおよびマウスＣＣＲ７遺伝子を、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔデータベース（配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１）からのアミノ酸配列に基づいて合成した。ラットＣＣＲ７  ｃＤＮＡ鋳型を、様々なラット組織から単離されたｍＲＮＡを用いて生成されたアミノ酸配列情報（配列番号１０３）に基づいて遺伝子合成した。全ての合成されたＤＮＡフラグメントを、適切な発現ベクター中にクローニングした。
【０３５８】
【表１０】
2020506703.tif 000072
【０３５９】
【表１１】
2020506703.tif 000073
【０３６０】
【表１２】
2020506703.tif 000074
【０３６１】
ＣＣＲ７を安定的に発現する細胞株の生成
安定したＣＣＲ７発現細胞株を、レトロウイルス導入を用いて生成した。製造業者の推奨にしたがって、Ｆｕｇｅｎｅ  ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ、ｃａｔ＃  Ｅ２６９２）を用いて、２９３Ｔ細胞を、ＣＣＲ７レトロウイルス発現ベクターおよびｐＣＬ−ＥｃｏまたはｐＣＬ−１０Ａ１充填ベクター（Ｎｏｖｕｓ，ＵＳＡ、ｃａｔ＃ＮＢＰ２−２９５４０またはＮＢＰ２−２９５２）と共トランスフェクトした。細胞を、３７℃の加湿されたＣＯ２培養器中でインキュベートし、ウイルス上清を、トランスフェクションの４８時間後に収集した。ＮＩＨ／３Ｔ３および３００．１９細胞を、ほぼコンフルエントの単層に成長させた。成長培地を細胞から除去し、ウイルス上清を、８ｕｇのポリブレン／ｍｌ（最終濃度）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｃａｔ＃ＴＲ−１００３−Ｇ）の存在下で加えた。３７℃で３〜６時間にわたるインキュベーションの後、新鮮な培地を加えた。次に、細胞を、適切な選択条件下で培養して、安定したＣＣＲ７発現細胞株を生成した。
【０３６２】
ウイルス用粒子（ＶＬＰ）の生成、発現および精製
ＨＥＫ２９３ＴまたはＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。ＶＬＰを作製するために、細胞を、４％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に交換し、次に、３：２のμｇ比率で、ＣＣＲ７発現プラスミドおよびレトロウイルスＧａｇ発現プラスミドと共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清を収集し、卓上遠心分離機において５分間にわたって２５００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、氷上に保持した。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ６＋超遠心分離機において、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＷ  ３２  ＴｉローターにおけるＢｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ  ３８ｍｌの遠心分離管（カタログ番号３４４０５８）中で、２０％のスクロースクッションを介して、１００，０００×ｇでの超遠心分離によって、ＶＬＰを精製した。得られたペレットを、３００μｌの低温滅菌ＰＢＳ中で再懸濁させ、ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２５）を用いて定量化した。
【０３６３】
ＣＣＲ７免疫原足場の構造に由来する生成
Ｇ共役タンパク質受容体ファミリーのメンバーは、可変の長さの連結配列によってそれぞれ連結される７つの膜貫通ヘリックス（ＴＭ１・・・ＴＭ７）を含む膜タンパク質である。タンパク質のアミノ末端は、細胞表面のエクト側にあり、これは、タンパク質の４つの領域が、細胞の表面、アミノ末端（Ｎ末端）および３つの細胞外ループ領域（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）に曝される可能性があることを示す。したがって、これらの領域は、抗体に対する抗原として利用可能である。
【０３６４】
これらの４つの項目の１つまたは複数の組合せが、ＣＣＲ７の細胞外に曝される領域と構造的に近似させるために、可溶性タンパク質足場に挿入され得ることが想定された。
【０３６５】
ＣＣＲ７の最適な細胞外領域を決定するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  ｂａｎｋ  Ｅｎｔｒｉｅｓ（３ＯＤＵ、３ＯＥ０、３ＯＥ６、３ＯＥ８、３ＯＥ９）およびモデリングソフトウェアとのＣＸＣＲ４構造の組合せを用いて、近い同族体（ｃｌｏｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）ＣＸＣＲ４（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＸＣＲ４  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＧＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ”．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０：１０６６−１０７１）の結晶構造を用いて、モデルを構築した。連結する膜貫通ヘリックスの間にあるアミノ酸が、タンパク質の表面に曝されるモデルから推測された。これらの領域は、以下の表３に同定されている。
【０３６６】
【表１３】
2020506703.tif 000075
【０３６７】
【表１４】
2020506703.tif 000076
【０３６８】
【表１５】
2020506703.tif 000077
【０３６９】
ループＥＣ１およびＥＣ３の小さいサイズならびに他の３つの領域からのＥＣ３の空間的隔離が、候補エピトープとしてのＮ末端およびＥＣ２ループの使用を優先させた。
【０３７０】
フレームワーク１、ＣＤＲ−Ｈ３またはＣＤＲ３−Ｈ１中などのＦａｂの様々なループ領域に挿入されたＥＣ２配列を有するマウスＦａｂの結晶構造中へのＮ末端配列の融合のモデリングは、ある程度の柔軟性が２つの配列において仮定される場合、これらは、ＣＣＲ７中のこれらの領域の構造に適度に近似し得ることを示した。
【０３７１】
マウス免疫化のための免疫原足場生成
マウス免疫化のための移植構築物を、表３からのＮ末端配列を、マウスＦａｂ足場（ＭＧＦＴＸ１と呼ばれる）の重鎖のＮ末端に融合し、位置２４においてシステイン残基がセリンに突然変異されたＥＣ２配列の改変形態（表３および配列番号１１３の下線＋太字の配列）を、ＭＧＦＴＸ１足場のＣＤＲ３中に移植することによって生成し、次に、重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖の両方を生成して、最終的なタンパク質構築物を作製した。したがって、ＦａｂＣＣＲ７Ｍ１と呼ばれる構築物は、マウス免疫応答が指向されるヒト配列と組み合わされて免疫耐性であるべきであるマウスフレームワークを含んでいた。
【０３７２】
Ｎ末端配列を、ＭＧＦＴＸ１足場の重鎖と直接融合した。ＥＣ２のための挿入点は、利用可能な構造的または相同性モデルデータに基づいて、ＣＤＲループの中間点であると選択された。Ｆａｂ移植タンパク質を、関連する配列をコードする組み換えＤＮＡを用いる標準的な分子生物学方法を用いて生成した。
【０３７３】
例えば、重鎖ＣＤＲ３中に挿入されたＥＣ２を含有する各抗体の可変領域を合成した。可変領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅させ、得られたフラグメントを、軽鎖定常領域または重鎖定常領域およびＦｃ領域のいずれかを含有するベクターへサブクローニングした。このように、Ｎ末端の融合およびＨ３へのＥＣ２の挿入に対応するＦａｂＣＣＲ７Ｍ１タンパク質を作製した。得られた構築物が、表３に示される。重鎖および軽鎖ベクターの適切な組合せのトランスフェクションが、１つのＮ末端および１つのＥＣ２分子を含有する組み換えＦａｂの発現をもたらす。
【０３７４】
どのＣＤＲを移植のために選択するかの選択は、ループおよびＮ末端の近傍の露出のパラメータに基づいて決定される。この時点で、モデリングソフトウェアは、融合および移植後のループの柔軟性のため、どのＣＤＲおよびＣＤＲ中のどの位置が、所望のパラメータをもたらすのかを予測するのに部分的に有用であるに過ぎない。ＥＣ２＿Ｃ２４Ｓ（表３、配列番号１１０）と組み合わせたＭＧＦＴＸ１足場の構造は、配列の大部分について電子密度の不足によって判断されるように、配列が露出され、柔軟であることを示した。
【０３７５】
要約すると、ＣＤＲにおける挿入点は、ＣＤＲへの移植が天然抗原とのある程度の構造的類似性を提供すると仮定して、構造に基づいて選択された。
【０３７６】
ハイブリドーマの生成
Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇｎ（ｂｃｌ−２）２２  ＷＥＨＩ株）を、反復性複数部位免疫化（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｉｔｅｓ）（ＲＩＭＭＳ）（ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ＧＤ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９９７）を必要とする手順を用いて、抗原で免疫化した。簡潔に述べると、マウスに、末梢リンパ節（ＰＬＮ）に近い８つの特定の部位で、１〜３μｇのＣＣＲ７免疫原を注射した。この手順を、１２日間にわたって８回繰り返した。１２日目に、試験血液を収集し、血清抗体力価を、ＦＡＣＳによって分析した。ある場合に、ＢＡＬＢ／ｃおよび／またはＣ５７Ｂｌ／６マウスを、ヒトＣＣＲ７（配列番号９７）を安定的に過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３または３００．１９細胞で免疫化した。動物に、３か月間にわたって月に１回、ＰＢＳ中５×１０６個の細胞を皮下注射し、その後、２５μｇのヒトＣＣＲ７発現ＶＬＰで静脈内追加免疫した。追加免疫の２日後、試験血液を収集し、血清抗体力価を、ＦＡＣＳによって分析した。脾臓およびプールされたＰＬＮを、高力価マウスから除去した。リンパ球を採取するために、脾臓およびＰＬＮを、ＤＭＥＭで２回洗浄し、次に、７０ミクロンのスクリーン（Ｆａｌｃｏｎ  ＃３５２３５０）に通すことによって分離させた。得られたリンパ球を、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地（ＢＴＸｐｒｅｓｓ  Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ（登録商標）電気穿孔培地ｃａｔ＃  ４７００１）中での融合の前に、さらに２回洗浄した。
【０３７７】
融合のために、Ｆ０骨髄腫細胞を、１：４の比率でリンパ球と混合した。細胞混合物を遠心分離し、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地中で懸濁させ、続いて、電気融合チャンバ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｃｏａｘｉａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ９ＭＬ  Ｐａｒｔ  ＃４７００２０）に加えた。電気融合を、ＣＥＥＦ−５０Ｂ  Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ／Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ系（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、製造業者の指示にしたがって、行った。融合された細胞を、チャンバ中で５分間回収させ、ＨＡＴを含まない融合培地（ＤＭＥＭ＋２０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、０．５×ＨＦＣＳ）中で１／１０に希釈し、１時間３７℃に置いた。４×ＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋２０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、４×ＨＡＴ、０．５×ＨＦＣＳ）を加えて、１×溶液を作製し、密度を、１．６７×１０４個の細胞／ｍｌに調整した。細胞を、６０μｌ／ウェルで、３８４ウェルプレート中で平板培養した。
【０３７８】
ＦＡＣＳスクリーニング
融合の１０日後、ハイブリドーマプレートを、フローサイトメトリーを用いてＣＣＲ７特異的抗体の存在についてスクリーニングして、ＣＣＲ７を安定的に過剰発現するかまたは内因性発現する細胞株への候補抗体の特異的結合を確認した。細胞を、ＰＢＳで十分にすすぎ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＣＲ００５）で処理して、成長プレートから剥離させ、低温ＰＢＳ中で再懸濁させた。細胞を、製造業者の指示（ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｌｌ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃  Ｆ−２０６５０；ＰＥ−Ｃｙ７  Ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃  ＳＡ１０１２）にしたがって、蛍光色素でビオチン化標識した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＤＰＢＳ、３％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のアジ化ナトリウム）中で、約１×１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁させた。３８４ウェルプレート中で、２０μＬのハイブリドーマ上清を、予め播種し、２０μＬの細胞懸濁液を加えた。細胞を、４℃で１時間インキュベートし、低温ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２０μＬの１：４００の二次抗体ＦＡＣＳ緩衝液（アロフィコシアニンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃  １０９−１３６−０９８）中で再懸濁させた。４℃で４５分間にわたるさらなるインキュベーションの後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む２０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃  Ｐ４８６４−１０ＭＬ）中で再懸濁させた。幾何平均蛍光強度を、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを用いて、生単細胞において計算した。
【０３７９】
抗体精製
マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体を調製した。さらに、システイン突然変異（例えば、重鎖の位置Ｋ３６０Ｃ、または位置Ｅ１５２ＣおよびＳ３７５Ｃにおけるシステイン）を含むキメラ形態を、本明細書においてさらに詳細に記載されるような、薬物部分およびＡＤＣの調製物のコンジュゲーションのために設計した。ハイブリドーマの可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ＤＮＡ配列を、選択されたハイブリドーマｍＡｂ１２１Ｇ１２、ｍＡｂ５０６Ｅ１５、ｍＡｂ６７４Ｊ１３およびｍＡｂ６８４Ｅ１２のそれぞれについて最適化された配列（例えば、ヒト化、好ましい特性）の生成のために取得した。マウスモノクローナル抗体からの可変領域ＤＮＡを、標準的な方法を用いて、各選択されたハイブリドーマ細胞株から得られたＲＮＡからＲＡＣＥによって増幅した。マウス可変重鎖／軽鎖のそれぞれについてのポリペプチド配列が、６７４Ｊ１３、１２１Ｇ１２、５０６Ｅ１５および６８４Ｅ１２ハイブリドーマのそれぞれについて、それぞれ配列番号１２８／配列番号１４４、配列番号１６０／配列番号１７６、配列番号１９２／配列番号２０８、および配列番号２２４／配列番号２４０に示される。ハイブリドーマのそれぞれについての対応する得られる可変重鎖／軽鎖ヌクレオチド配列が、配列番号１２９／配列番号１４５、配列番号１６１／配列番号１７７、配列番号１９３／配列番号２０９、および配列番号２２５／配列番号２４１に示される。キメラ抗体の調製のために、ハイブリドーマＶＬおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれのヒト野生型または操作されたＣｙｓまたはＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ（ＤＡＰＡ）突然変異重鎖およびヒト軽鎖定常領域配列（ＩｇＧ１、κ）を含有する発現ベクター中にサブクローニングした。
【０３８０】
抗体のヒト化
本明細書においてさらに詳細に記載されるような、薬物部分およびＡＤＣの調製物のコンジュゲーションのためにシステイン突然変異（例えば、重鎖の位置Ｋ３６０Ｃ、または位置Ｅ１５２ＣおよびＳ３７５Ｃにおけるシステイン）を含むように；ならびに低下したＦｃエフェクター機能を有する構築物を含むように、Ｆｃエフェクター突然変異（例えば、Ｆｃ領域におけるＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ突然変異）の修飾のために、およびそれらの組合せのために、可変領域構築物を、配列のヒト化および最適化（例えば、翻訳後修飾、好ましくない部位の除去など）のために設計した。
【０３８１】
モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のためのコドン最適化を含むヒト化ＶＬおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。ＶＬおよびＶＨドメインをコードする配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ由来ベクターから、哺乳類細胞におけるタンパク質産生に好適な発現ベクター中にサブクローニングした。重鎖および軽鎖を、共トランスフェクションを可能にするために、個々の発現ベクター中にクローニングした。
【０３８２】
組み換え抗体（ＩｇＧ１、κ）を、トランスフェクション試薬としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ２５，０００線形、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ、ｃａｔ＃  ２３９６６）を用いた、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中へのベクターの共トランスフェクションによって産生した。ＰＥＩストックを、室温（ＲＴ）で９００ｍｌの細胞培養等級の水に１ｇのＰＥＩを溶解させることによって調製した。ＰＥＩの溶解を容易にするために、溶液を、ＨＣｌの添加によってｐＨ３〜５になるまで酸性化した後、７．０５の最終ｐＨになるまでＮａＯＨで中和した。最後に、体積を１Ｌに調整し、溶液を、０．２２ｕｍのフィルタに通してろ過滅菌し、一定分量に分け、さらなる使用まで−８０℃で凍結した。
【０３８３】
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３細胞（Ｇｉｂｃｏ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ、ｃａｔ＃  Ｒ７９００７）を、５％のＣＯ２で、３７℃の加湿された培養器中で、オービタルシェーカー（１００〜１２０ｒｐｍ）上の振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）におけるＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ、ｃａｔ＃  １２３３８０１８）中で培養した。一過性トランスフェクションのために、細胞を、ある密度または約３×１０６個の細胞／ｍｌに成長させ、次に、１ｕｇのろ過滅菌されたＤＮＡ／ｍｌの培養物（０．５ｕｇの重鎖＋０．５ｕｇの軽鎖）を、ＯｐｔｉＭｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ、＃１１０５８０２１）溶液中の２ｕｇのＰＥＩ／１ｕｇのＤＮＡに加え、室温で８分間インキュベートした。混合物を、穏やかに回転させながら、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３細胞に滴下して加えた。トランスフェクションの後、細胞を、上清からの抗体精製の前に１〜２週間培養した。抗体産生のための安定した細胞株を生成するために、ベクターを、製造業者の推奨を用いて、ＣＨＯ細胞中へのヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６−ｗｅｌｌ  ｓｈｕｔｔｌｅ（商標）；Ｌｏｎｚａ）によって共トランスフェクトし、振とうフラスコ中で最大４週間にわたって選択条件下で培養した。細胞を、遠心分離によって収集し、上清を、抗体精製のために回収した。抗体を、プロテインＡ、プロテインＧまたはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを用いて精製した。上清を充填する前に、樹脂をＰＢＳで平衡化した。試料の結合の後、カラムをＰＢＳで洗浄し、抗体をＴｈｅｒｍｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）ＩｇＧ  ｐＨ２．８（ｃａｔ＃  ２１００４）で溶離した。溶出液画分を、クエン酸三ナトリウム二水和物緩衝液、ｐＨ８．５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ＃  Ｓ４６４１−１Ｋｇ）で中和し、次に、一晩、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で透析した。
【０３８４】
抗体の概要
表４は、マウスハイブリドーマに由来する親およびヒト化抗ＣＣＲ７抗体についての関連する配列情報を記載する。本出願全体を通して、抗体を説明するとき、「ハイブリドーマ」および「親」という用語は、同義的に使用され、ハイブリドーマに由来するＡｂを指す。
【０３８５】
【表１６】
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【０３８６】
【表１７】
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【０３８７】
【表１８】
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【０３８８】
【表１９】
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【０３８９】
【表２０】
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【０３９０】
【表２１】
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【０３９１】
【表２２】
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【０３９２】
【表２３】
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【０３９３】
【表２４】
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【０３９４】
【表２５】
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【０３９５】
【表２６】
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【０３９６】
【表２７】
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【０３９７】
【表２８】
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【０３９８】
【表２９】
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【０３９９】
【表３０】
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【０４００】
【表３１】
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【０４０１】
【表３２】
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【０４０２】
【表３３】
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【０４０３】
【表３４】
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【０４０４】
【表３５】
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【０４０５】
【表３６】
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【０４０６】
【表３７】
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【０４０７】
【表３８】
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【０４０８】
【表３９】
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【０４０９】
【表４０】
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【０４１０】
【表４１】
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【０４１１】
【表４２】
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【０４１２】
【表４３】
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【０４１３】
【表４４】
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【０４１４】
【表４５】
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【０４１５】
【表４６】
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【０４１６】
【表４７】
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【０４１７】
【表４８】
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【０４１８】
【表４９】
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【０４１９】
【表５０】
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【０４２０】
【表５１】
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【０４２１】
【表５２】
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【０４２２】
【表５３】
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【０４２３】
【表５４】
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【０４２４】
【表５５】
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【０４２５】
【表５６】
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【０４２６】
【表５７】
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【０４２７】
【表５８】
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【０４２８】
【表５９】
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【０４２９】
【表６０】
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【０４３０】
【表６１】
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【０４３１】
【表６２】
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【０４３２】
【表６３】
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【０４３３】
【表６４】
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【０４３４】
【表６５】
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【０４３５】
【表６６】
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【０４３６】
【表６７】
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【０４３７】
【表６８】
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【０４３８】
【表６９】
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【０４３９】
実施例２：抗体誘導ＡＤＣＣ活性のインビトロ評価
ＡＤＣＣを媒介する候補抗体の能力を、代理ＡＤＣＣレポーターアッセイを用いて評価した。ＣＣＲ７およびＣＤ２０発現ＪＶＭ２細胞を、標的細胞として使用した。ＪＶＭ２細胞を洗浄し、８×１０４個の細胞／ｍｌ細胞／ｍｌで再懸濁させた。このアッセイにおけるエフェクター細胞は、ＣＤ１６Ｖ１５８およびＮＦＡＴ依存的ルシフェラーゼレポーター（Ｊｕｒｋａｔ−Ｖ１５８）を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞株であり；ルシフェラーゼの発現は、ＣＤ１６を介した標準ＡＤＣＣシグナル伝達の代わりである。簡潔に述べると、懸濁液中で成長されたＪｕｒｋａｔ−Ｖ１５８細胞を、沈降させて、使用済み培地を除去し、ペレットを、アッセイ培地中で再懸濁させ、１．６×１０６個の細胞／ｍｌ細胞／ｍＬに調整した。等体積のエフェクターおよび標的細胞を混合して、細胞のマスターミックスを作製して、１：５または１：２０の標的対エフェクター細胞の比率を生じた。抗体の滴定を、アッセイウェルにおいて５０ｕｇ／ｍＬの最終最高濃度で、アッセイ培地中で希釈した。１２．５ｕＬのＡｂ溶液を、３８４ウェル丸底プレートに加え、次に、１２．５ｕｌのマスター細胞ミックスを加えた。抗体および細胞を、ピペッティングによって十分に混合し、５％のＣＯ２中で、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、１５ｕＬのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７２）を、各ウェルに加え、１０５０ｒｐｍで、室温で５分間振とうした。発光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において読み取った。
【０４４０】
ＣＤ２０標的化抗体が、陽性対照として含まれ、ルシフェラーゼ活性によって測定した際に、かなりのＮＦＡＴシグナル伝達を示した。同様に、候補抗ＣＣＲ７抗体が、かなりのＡＤＣＣ活性を誘導した（図１）。
【０４４１】
以下の表は、ＪＶＭ２およびＪｕｒｋａｔ−Ｖ１５８細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおいて試験される様々な抗体フォーマットについて代表的な結果をまとめている。
【０４４２】
【表７０】
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【０４４３】
正常なＣＣＲ７＋Ｔ細胞上に十分な安全域がある場合、ＡＤＣＣ活性に必要な最小受容体密度を決定するために、ある範囲のＣＣＲ７受容体数を有する様々な細胞株にわたって、代表的なＡＤＣＣが可能な抗ＣＣＲ７抗体として非ヒト化５０６Ｅ１５抗体を用いて、ＡＤＣＣアッセイを実施した。以下の表は、データの一部をまとめている。
【０４４４】
【表７１】
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【０４４５】
データは、正常なＴ細胞におけるＣＣＲ７受容体レベルと同等のごく低いＣＣＲ７受容体レベルでも、有意なＡＤＣＣ活性を可能にするのに十分であったことを示す。また、ＡＤＣＣを、ＣＣＲ７＋癌細胞とのＮＫ細胞の共培養生存アッセイを用いて評価し、同様の結果を収集した（本明細書に記載されていない）。
【０４４６】
これは、Ｔ細胞枯渇がインビボで見られ、ＡＤＣＣ機構によるものであることが分かったという後述の観察に適合する。これらの結果は、ＡＤＣＣモダリティが安全性の観点からＣＣＲ７に好適でないことを示す。結果として、全体的なオンターゲット安全性を改善するために、全ての候補を、Ｆｃサイレント（ＤＡＰＡ）フォーマットに切り替えた。
【０４４７】
ＡＤＣＣインビトロレポーターアッセイを繰り返し、ＤＡＰＡ  Ｆｃ突然変異型の非ヒト化抗ＣＣＲ７抗体についてのＡＤＣＣ活性の不足を確認した（図２）。
【０４４８】
実施例３：抗体の生化学的特性評価
ＣＣＲ７に対する抗ＣＣＲ７抗体の親和性
ＣＣＲ７およびその種オーソログに対する様々な抗体およびＡＤＣの親和性を、ＦＡＣＳを用いて決定した。精製されたＩｇＧを滴定して、細胞表面発現ＣＣＲ７への結合についてのＥＣ５０値を決定した。
【０４４９】
このために、ＣＣＲ７陽性細胞を採取し（接着細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで剥離させた）、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／３％のＦＣＳ／０．０２％のアジ化ナトリウム）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で約２×１０６個の細胞／ｍｌに希釈した。全てのその後の工程を、氷上で行って、受容体の内在化を防止した。１００μｌの細胞懸濁液／ウェルを、９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。２×１０５個の細胞／ウェルを、穏やかに振とうしながら、４℃で６０分間にわたって１００ｎＭ程度から開始して、数ｌｏｇにわたる範囲の対象とする抗ＣＣＲ７抗体の抗体濃度の連続希釈を用いてインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を沈降させ（１２００ｒｐｍ、２分、４℃）、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。フルオロフォアコンジュゲート抗ｈＦｃ  γ−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）検出抗体を、１：４００で加え、試料を、穏やかに振とうしながら、暗所で、氷上で１時間にわたってインキュベートした。最終的な洗浄の後、細胞を、０．２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた後、フローサイトメトリー機械（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｃａｔ＃６４７１７７）で読み取りを行った。生単細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｆｌｏｗｊｏ  １０．０．８において計算し、ＥＣ５０決定のためにＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６にエクスポートした。
【０４５０】
ＣＣＲ７を過剰発現するように操作された同系細胞対ならびにＣＣＲ７パラログ、例えば、ＣＣＲ９、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ８を発現する細胞株に対する見掛けの結合親和性を測定することによって、選択性を評価した。全ての抗ＣＣＲ７抗体は、以下の表７に示されるように、ＣＣＲ７発現細胞のみに特異的に結合する。
【０４５１】
【表７２】
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【０４５２】
同様の実験において、健常なドナーならびにカニクイザル、ＷｉｓｔａｒラットおよびＣＤ−１マウスに由来するいくつかのＰＢＭＣバッチから精製された、操作された同系一致細胞株組（ＮＩＨ３Ｔ３  ｓｅｒｉｅｓ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、抗体を、交差反応性について試験した。以下の表８および９に示されるように、全ての抗体が、同様の見掛けの親和性で、ヒトおよびカニクイザルＣＣＲ７に特異的に結合することが分かった。非ヒト化１２１Ｇ１２抗体のみが、げっ歯類交差反応性である。
【０４５３】
【表７３】
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【０４５４】
【表７４】
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【０４５５】
見掛けの親和性に対する受容体密度の影響、ひいては抗体の細胞結合に対するアビディティーの寄与を決定するために、ＦＡＣＳ滴定実験を、変化される発現レベルを有するヒトＣＣＲ７発現癌細胞株および正常なＣＣＲ７陽性ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を用いて実施した。計数標準としてＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のミクロスフェアを用いて、および製造業者の指示にしたがって、ＦＡＣＳによって受容体定量化を行った。例示的な結果が、以下の表１０に示される。
【０４５６】
【表７５】
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【０４５７】
全ての抗ＣＣＲ７抗体は、見掛けの親和性および結合の強度に対するアビディティーの実質的な寄与が、受容体密度と相関して減少したことを示す。特に、１２１Ｇ１２は、示される代表的なＤＥＬ癌細胞と比較して、正常なＣＤ４＋Ｔ細胞によって表される低ＣＣＲ７発現細胞における有意に弱い結合を示す。
【０４５８】
抗ＣＣＲ７抗体の中で最も強いアビディティー効果を示す、特に１２１Ｇ１２の比較的弱い親和性は、抗体結合を癌細胞に偏らせるように正常細胞と癌細胞との受容体密度差を用いるのに最適である。
【０４５９】
ＥＬＩＳＡにおける組み換えｈＣＣＲ７への結合
結合および親和性も、組み換えＣＣＲ７（Ｏｒｉｇｅｎｅ＃ＴＰ３０６６１４）を用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいて評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中で希釈された３．５μｇ／ｍｌの組み換えＣＣＲ７で被覆した。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０）で３回プレートを洗浄しながら、室温で１時間にわたってＰＢＳ中３％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックした後、一次抗体を、連続希釈で加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、結合抗体を、室温で１時間にわたって西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５−０３５−０９８）にコンジュゲートされた１：５０００の抗ｈＦｃ  γとのインキュベーションによって検出した後、ＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、ＳｕｒｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、＃５２−００−０３）基質を加えた。１５分後、６５０ｎＭにおける吸光度を記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６において分析した。
【０４６０】
全ての試験される抗ＣＣＲ７抗体は、組み換えｈＣＣＲ７に結合することが可能である（表１１；図３）。
【０４６１】
【表７６】
2020506703.tif 000138
【０４６２】
二重ＦａｂＧｒａｆｔへの結合
ＣＣＲ７のＮ末端およびＥＣ２を含む最小エピトープ空間への結合を評価するために、ＦａｂＧｒａｆｔ  ＥＬＩＳＡを行った。簡潔に述べると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｕｎｃ）を、５μｇ／ｍｌのＦａｂＧｒａｆｔで被覆した。他の場合、上述される一般的なＥＬＩＳＡプロトコル指示にしたがった。全ての抗ＣＣＲ７抗体は、以下の表１２に示されるように、二重ＦａｂＧｒａｆｔに結合することが可能である。
【０４６３】
【表７７】
2020506703.tif 000139
【０４６４】
ＶＬＰによるｐＨ依存性ＥＬＩＳＡ
ＣＣＲ７結合ＣＣＬ１９が、受容体−リガンド複合体を内在化することが知られている。しかしながら、ＣＣＲ７が、細胞表面に再循環する一方、ＣＣＬ１９は、分解のためにリソソームに分類され、取り込まれたＣＣＲ７およびそのリガンドと逆の運命を示す（Ｏｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；１７７：２３１４−２３２３）。上首尾の抗ＣＣＲ７  ＡＤＣのために、抗体が、リガンドと同様に挙動する、例えば、迅速に内在化するが、ＣＣＲ７とともに再循環しないことが好ましい。これを行うために、本発明者らは、低ｐＨ条件下でＣＣＲ７へのより弱い結合を示すであろう、ｐｈ依存的抗体を確実に選択する。
【０４６５】
抗ＣＣＲ７抗体のｐＨ依存性を評価するために、ＣＣＲ７発現ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。簡潔に述べると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｕｎｃ）を、２５μｇ／ｍｌのＶＬＰで被覆した。一次抗体を、ｐＨ５．８（１：１；ｄＨ２Ｏ：０．１Ｍのクエン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ）またはｐＨ７．４緩衝液中でインキュベートした。他の場合、上述される一般的なＥＬＩＳＡプロトコル指示にしたがった。
【０４６６】
各候補のためのいくつかのヒト化変異体の中でも、中性（７．４）および酸性（５．８）ｐＨにおける抗体結合の比較は、全てのＣＣＲ７候補抗体が、ｐＨ７．４で改善された親和性を有することを示した（表１３）。以下の実体が、他の特徴の中でも特にそれらの優れたｐｈ依存性に基づいて選択された。
【０４６７】
【表７８】
2020506703.tif 000140
【０４６８】
ｂアレスチンアッセイ
抗ＣＣＲ７抗体の機能性を決定するために、アゴニスト機能の評価のためのアゴニストモードまたはアンタゴニスト機能の評価のためのアンタゴニストモードのいずれかで、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ製のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｆｌａｓｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃９３−０２４７）を用いて、β−アレスチンアッセイを行った。
【０４６９】
アゴニストモードにおいて、ＣＨＯ−ｆｌｐｉｎ−ｈＣＣＲ７（ＰｒｏＬｉｎｋ、β−アレスチン−ＥＡでタグ化されたＤｉｓｃｏｖｅｒＸ発現ｈＣＣＲ７によって作製された細胞株）を、３８４ウェルプレートにおいてＤｏｘ  １００ｎｇ／ｍｌを含む増殖培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＋１０％のＦＢＳ＋０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８＋０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＋５μｇ／ｍｌのブラストサイジン；Ｇｉｂｃｏ）中２０μｌ／ウェルで、８×１０４個の細胞／ウェルで播種し、金属製の蓋で覆い、一晩、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。翌日、１×アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．１％のＢＳＡ／１×ＨＢＳＳ  ｐＨ７．４）の５×標準溶液の連続希釈を、リガンドｈＣＣＬ１９（Ｒ＆Ｄ、３６１／ＭＩ−０２５／ＣＦ）を用いて、試験抗体または陽性対照について行った。５μｌの、抗体またはリガンドの５×標準溶液を各ウェルに加え、短時間にわたって沈降させ、２時間にわたって３７℃／５％のＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの後、２５μｌの検出試薬を、各ウェルに加え、２０分間にわたって振とうしながら、暗所で、室温でインキュベートした。次に、酵素活性についての発光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機械において測定した。最後に、酵素活性を、Ｅｘｃｅｌを用いて分析した。
【０４７０】
アンタゴニストモードにおいて、ＣＨＯ−ｆｌｐｉｎ−ｈＣＣＲ７細胞を、上述されるように播種した。翌日、１×アッセイ緩衝液中の６×標準溶液（０．５μＭ×６＝３．０μＭ）を、各試験抗体または陽性対照ＭＡＢ１９７（Ｒ＆Ｄ参照抗体；リガンドアンタゴニスト）もしくは陰性対照ｈＩｇＧのために作製した。５μｌの、抗体または対照の６×標準溶液を、各ウェルに加え、短時間にわたって沈降させ、３０分間にわたって３７℃／５％のＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション中、１×アッセイ緩衝液中の６×標準溶液の連続希釈を、ｈＣＣＬ１９のために作製した。インキュベーションの後、５μｌの、ｈＣＣＬ１９の６×標準溶液を、各ウェルに加え、短時間にわたって沈降させ、９０分間にわたって３７℃／５％のＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの後、２５μｌの検出試薬を、各ウェルに加え、２０分間にわたって振とうしながら、暗所で、室温でインキュベートした。次に、酵素活性についての発光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機械において測定し、Ｅｘｃｅｌで分析した。
【０４７１】
親抗ＣＣＲ７抗体のいずれも、アゴニストモデルにおいて活性を示さなかった（図４Ａ）。しかしながら、アンタゴニストフォーマットで実施される場合、５０６Ｅ１５および１２１Ｇ１２が、強いアンタゴニスト、例えば、リガンドブロッキング抗体として同定された（図４Ｂ、４Ｃ）。６７４Ｊ１２は、中性の、非リガンドブロッキング抗体である。６８４Ｅ１２は、弱いアンタゴニストである。
【０４７２】
リガンドとのＦＡＣＳ競合アッセイ
ＣＣＲ７リガンドとの抗体競合を確認するために、ＦＡＣＳアッセイを、過剰なリガンド濃度の存在下で実施した。ＦＡＣＳアッセイを、上述されるように行った。いくらかの変更をプロトコルに加え、例えば、ＣＣＬ１９を、１μＭの一定の濃度に保持した一方、一次抗体を、１００ｎＭ程度から開始して数ｌｏｇにわたる範囲のＤＥＬ細胞に同時に適用した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で３０分間のインキュベーション時間の後、細胞を洗浄し、二次抗ｈＦｃ．ＰＥ抗体を、１５分間適用し、ＭＦＩを、上述されるように決定した。
【０４７３】
図５は、ヒト化ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ  ６７４Ｊ１３が、過剰のＣＣＬ１９の存在によって影響されないことを示し、これは、その中性官能性（ｎｅｕｔｒａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を確認している。ヒト化ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ  １２１Ｇ１２および５０６Ｅ１５は、実際に、過剰なリガンドの存在によって、それらの結合親和性に強く影響される。
【０４７４】
ある範囲の受容体密度を有する細胞株の内在化能力
上首尾の抗ＣＣＲ７  ＡＤＣの別の態様は、ＣＣＲ７の発現差分布の最適な使用を確実にすることである。正常なＣＣＲ７発現細胞の代表例として、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、健常なドナーＰＢＭＣから単離した。さらに、ある範囲の受容体密度を示すいくつかのＣＣＲ７陽性癌細胞株を選択した。本発明者らは、ＣＣＲ７＋癌細胞よりＣＣＲ７＋Ｔ細胞においてよりより弱い見掛けのＦＡＣＳ結合親和性を有する抗体を意図的に選択した。さらに、本明細書に記載されるｐＨｒｏｄｏアッセイは、抗ＣＣＲ７抗体において低ｐＨ活性化フルオロフォア標識を用いて、蛍光によって測定される細胞への抗体取り込みが、受容体密度と相関するかどうかを評価する。治療域を最大にするために正常細胞への抗体取り込みを最小限に抑えるのが好ましい。
【０４７５】
簡潔に述べると、マレイミド−ｐＨｒｏｄｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＣｙｓＭａｂフォーマットにおける抗ＣＣＲ７抗体の標識を、製造業者の指示にしたがって行い、ＤＡＲ＝４（薬物、例えば、フルオロフォア対抗体の比率）実体を生じた。ＦＡＣＳアッセイを、上述されるように行った。いくらかの変更を、例えば、内在化を可能にするために、いくらかの変更をプロトコルに加え、一次抗体を、６時間にわたって培地中で、３７℃で細胞とともに５μｇ／ｍｌでインキュベートし、次に、アジ化ナトリウムを含有する氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、反応を停止させた。
【０４７６】
以下の表１４は、一連の細胞株にわたる３つの抗体の内在化能力をまとめている。非標的化ｐＨｒｏｄｏ標識抗体を、対照として使用し、最大で４００ＭＦＩが、シグナルのバックグラウンドノイズ、例えば、非標的媒介性抗体−コンジュゲート取り込みであることが分かった。データは、全ての３つの抗ＣＣＲ７抗体が、正常なＣＤ４＋Ｔ細胞を温存しながら、コンジュゲート物を効率的に内在化し、蓄積するために、ほとんどのＣＣＲ７＋癌株に典型的な範囲のＣＣＲ７受容体レベル、例えば、２０，０００超の受容体を必要とすることを示す。
【０４７７】
【表７９】
2020506703.tif 000141
【０４７８】
Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６系を用いたエピトープビニング
抗ｈＣＣＲ７親抗体のエピトープビニングを、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を測定するＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６系（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＣＣＲ７免疫原足場を、製造業者の推奨にしたがって、ＢｉｒＡビオチンリガーゼを用いる（ＡｖｉＴａｇ（商標）、ＬＬＣ、ＵＳＡ  ｃａｔ＃ＢｉｒＡ５００）によってビオチン化した。ビオチン化免疫原足場を、予め平衡化されたストレプトアビジンセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ＵＳＡ）上に１．５μｇ／ｍｌで充填した。次に、センサーを、１×動力学緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ＵＳＡ）中の１００ｎＭの抗体Ａを含有する溶液に移した。センサーを、１×動力学緩衝液中で短時間洗浄し、１００ｎＭの競合抗体を含有する第２の溶液に移した。結合速度を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６系分析ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ６．３、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ＵＳＡ）を用いて、生データから決定した。抗体を、両方の抗体Ａおよび競合抗体として、全ての対の組合せ（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）で試験した。
【０４７９】
【表８０】
2020506703.tif 000142
【０４８０】
ＣＣＲ７突然変異を用いたエピトープマッピング
さらなるエピトープマッピングを、突然変異体ＣＣＲ７細胞株を用いて行った。ヒトＣＣＲ７の突然変異体を発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞株を生成した。ヒトＣＣＲ７残基を対応するマウスＣＣＲ７残基中に交換するように特定の位置において突然変異を導入した。生成される突然変異は、Ｄ３５Ｅ、Ｆ４４Ｙ、Ｌ４７Ｖ、Ｓ４９Ｆ、Ｄ１９８Ｇ、Ｒ２０１Ｋ、Ｓ２０２Ｎ、Ｓ２０４Ｇ、Ｑ２０６Ｄ、Ａ２０７Ｔ、Ｍ２０８Ｌ、Ｉ２１３Ｖ、Ｔ２１４Ｓ、Ｅ２１５Ａ、およびＨ２１６Ｑを含んでいた。突然変異体ＣＣＲ７プラスミド構築物を、部位特異的突然変異誘発によって生成し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に導入して、安定的に発現する細胞株を生成した。各突然変異体ＣＣＲ７細胞株への候補抗体の特異的結合を、フローサイトメトリーによって評価した。細胞を、ＰＢＳで十分にすすぎ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＳＣＲ００５）で処理して、成長プレートから剥離させ、１×ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３）中で、約１＊１０５個の細胞／９０μＬで再懸濁させた。９６ウェルＵ底プレート中で、１０μＬの、ＦＡＣＳ緩衝液中の１０×抗体溶液を予め播種し、９０μＬの細胞懸濁液を加えた。細胞を、４℃で３０分間インキュベートし、低温ＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの１：５００の二次抗体１×ＦＡＣＳ緩衝液（アロフィコシアニンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９−１３６−０９８）中で再懸濁させた。４℃で１５分間にわたるさらなるインキュベーションの後、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの１×ＦＡＣＳ緩衝液＋４μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃Ｐ３５６６）中で再懸濁させた。幾何平均蛍光強度を、ＦｌｏｗＪｏを用いて生単細胞において計算し、ＷＴ  ＣＣＲ７幾何平均蛍光強度の％としてプロットした。
【０４８１】
点突然変異ＣＣＲ７に対するＥＣ５０に基づく親和性は、全ての試験される抗体が、異なる結合プロファイルを有することを示し、これは、立体構造エピトープの異なる利用を示唆している（図６）。全ての示される抗体のうち、５０６Ｅ１５は、ＭＡＢ１９７と最も類似する結合パターンを有し、例えば、両方は、ＣＣＲ７のＮ末端において残基Ｆ４４またはＬ４７が突然変異される場合、結合親和性の有意な低下を示すが、ＥＣ２ループにおけるＭ２０８またはＩ２１３が突然変異される場合、それを示さない。１２１Ｇ１２および６７４Ｊ１３は、８つの試験される点突然変異のうち少なくとも４つにおいてＭＡＢ１９７と異なるため、立体構造エピトープ空間内の異なる組の重要な接触点を用いるようである。
【０４８２】
実施例４：ＣＣＲ７抗体薬物コンジュゲートの生成および特性評価
以下の節において、ｕＬおよびμＬは、マイクロリットルを指すために同義的に使用される。同様に、ｕＭおよびμＭは、マイクロモルを指すために同義的に使用され；ｕｍは、マイクロメートルを指すのに使用される。
実施例４Ａ：抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の調製
【化６１】
2020506703.tif 000143
精製された１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡおよびＭＰＥＴ．ＤＭ４のコンジュゲーション：
出発材料は、１０ｍＭのヒスチジン塩酸塩緩衝液中で、１２７ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ抗体であった。７．９ｍｌの抗体（１００３ｍｇ）に、１６ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８（Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｓ１２８０）を加え、ｐＨが７未満であると確認され、次に、抗体を、室温で穏やかに回転させながら、２５分間にわたって１００．３ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）に吸収させた。１０ｍｇのＡｂ／ｍｌ床で充填された樹脂を、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ  ５６７−００２０）に通した真空ろ過によって１５床体積の１×ＰＢＳ緩衝液（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３０２５６．０２）で洗浄し、次に、１００．３ｍｌの１×ＰＢＳ中で再懸濁させて、５０％のスラリーを得た。
【０４８３】
スラリーに、０．５ＭのホスフェートｐＨ８中で配合された４３２９ｕｌの０．５Ｍのシステイン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ１２１−０３）を加え、それに、ＮａＯＨ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ａ１６０３７）を、１３．６ｇ／Ｌの比率で加えた。スラリーを、室温で３０分間にわたって時折回転させ、次に、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、５０床体積の１×ＰＢＳで、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニットを通した真空ろ過によって洗浄した。洗浄された樹脂を、１００．３ｍｌの１×ＰＢＳ（５０％のスラリー）中で再懸濁させ、１００３ｕｌの１００ｕＭのＣｕＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５１９４４）を加えて（正味５００ｎＭのＣｕ２＋）、再酸化を開始させた。抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られている参照マレイミド（実施例３、国際公開第２０１５／０９５３０１号パンフレットの１１０頁）の２０ｍＭのストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水に５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０４８４】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、６０分間）、ＤＭＳＯ中のＭＰＥＴ．ＤＭ４の２０ｍＭストック３０１０ｕｌを加え、スラリーを、室温で３０分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０４８５】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離された、フリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（２０１ｍｌ）を、２０．１ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、次に、３，０００×ｇでスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦＣ９０５０２４）を用いて６０ｍｌに濃縮した。次に、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの濃縮物を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化された２４×ＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に濃縮物を適用した。
【０４８６】
安定性試験のために、材料を、同じように調製されたバッチを用いてプールして、２グラムの出発材料を得た。プールされた材料を、１０ｍＭの塩化ヒスチジン緩衝液ｐＨ５（ＪＴＢａｋｅｒ  ２０８０−０５製のヒスチジン）に対して十分に透析し（Ｓｌｉｄｅａｌｙｚｅｒフラスコ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ８７７６２）、約３０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次に、スクロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １．００８９２．１００３）およびＴｗｅｅｎ  ２０（ＪＴＢａｋｅｒ  ４１１６−０４）を、それぞれ２４０ｍＭおよび０．０２％（ｖ／ｖ）になるまで加えた。安定性試験に必要とされるものより過剰な材料は、１×ＰＢＳに再び交換した。試料を一定分量に分け、液体窒素で急速に冷凍し、−８０℃で貯蔵した。最終濃度は、安定性試験のために配合される材料について２３．９ｍｇ／ｍｌであり、１×ＰＢＳ中で配合される材料について１８．９ｍｇ／ｍｌであった。
【０４８７】
得られた試料についての分析は以下のとおりである：
【０４８８】
【表８１】
2020506703.tif 000144
【０４８９】
分析方法：１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０によって、濃度を決定した。発熱性物質を、ＴＥＣＡＮ  Ｓａｆｉｒｅプレートリーダーにおいて読み取られるＫｉｎｅｔｉｃ  ＱＣＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ５０−６５０Ｈ）を用いて決定した。移動相［２０ｍＭのトリス約ｐＨ７．６５（１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１０ｍＭのトリスｐＨ８を用いて準備された）、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のアジ化ナトリウム］で平衡化された、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−Ｇガード（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｃａｔ＃６９６０９５５）およびＫＷ−８０３カラム（ＴＩＣ  Ｃａｔ＃６９６０９４０）において、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集パーセントを決定し、２８０ｎｍにおいてデータを収集した。試料を１×ＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０℃で１０分間にわたってＰＮＧａｓｅＦ（社内）で試料を脱グリコシル化し、プロテインＡへの結合によってＰＮＧａｓｅＦを除去し、１×ＰＢＳで洗浄し、１％のギ酸で溶離することによって、ＤＡＲ決定のために調製された試料のアリコートを調製した。次に、試料を、０．５ｍｌ／分で流れる２０％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の０．１％のギ酸に平衡化された２．１×５０ｍｍ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（８μｍの粒子、１０００Åの細孔径）上に注入した。カラムを、３分間にわたって２０％のＣＨ３ＣＮ／水で洗浄し、次に、１．９分間維持された０．１％のギ酸９０％のＣＨ３ＣＮ／水への０．１分間の勾配で溶離した。質量スペクトルデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０機器で取り、１１０〜１８０ｋＤａの範囲でＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ．０５．００を用いてデコンボリューションした。様々な計算されたＤＡＲ状態に対応するピーク面積を、各ピークのＤＡＲにしたがって重み付けし、次に、合計し、ＤＡＲ４ピークの重み付けされた面積を、全ての重み付けされたピークの合計で除算して、ＤＡＲ値を得た。
【０４９０】
リンカーペイロードＭＰＥＴ．ＤＭ４の調製：
【化６２】
2020506703.tif 000145
分析方法
特に示されない限り、以下のＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ／ＭＳ方法を、中間体および実施例の調製に使用した。ＬＣ／ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００ｓｌ／６１４０システムにおいて行った。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＳＳ  Ｔ３  Ｃ１８、５０×２．０、１．８ｕｍ
【０４９１】
【表８２】
2020506703.tif 000146
【０４９２】
【表８３】
2020506703.tif 000147
【０４９３】
（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ（ｏｘａｚｉｎａｎａ）−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニネート
【化６３】
2020506703.tif 000148
工程１：（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−アミノエチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニネートの調製
ＰＢＳ緩衝液（１０．５ｍＬ）および無水ＴＨＦ（２１ｍＬ）に溶解されたＤＭ４（４８０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）に、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタン−１−アミン（１５１ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２７ｍＬ、１．５４ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応混合物を、室温で３０分間撹拌し、減圧下で濃縮した。水性残渣を、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）で希釈し、１０〜６０％のアセトニトリル−０．０５％のＴＦＡを含有するＨ２Ｏで溶離される逆相ＩＳＣＯによって精製した。所望の生成物を含有する画分を凍結乾燥させて、所望の生成物（５５５ｍｇ、９３％の収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ−ｄ４）δ  ｐｐｍ  ０．８３（ｓ，３Ｈ）１．２１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、３Ｈ）１．２５（ｓ，３Ｈ）１．２８（ｓ，３Ｈ）１．３０（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、３Ｈ）１．４５−１．５５（ｍ，３Ｈ）１．６７（ｓ，３Ｈ）１．８４−１．８８（ｍ，１Ｈ）１．９５−２．０１（ｍ，１Ｈ）２．１４（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ）２．３７−２．４３（ｍ，１Ｈ）２．５３−２．５９（ｍ，１Ｈ）２．６４（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ）２．８２−２．８９（ｍ，５Ｈ）２．９１（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）３．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１０．０Ｈｚ、２Ｈ）３．２０（ｓ，３Ｈ）３．２３（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）３．３５（ｓ，３Ｈ）３．５５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）３．５８（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）４．１５−４．２０（ｍ，１Ｈ）４．６４（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１０．０Ｈｚ、１Ｈ）５．４３（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）５．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ））６．５８（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ）６．６５（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）６．６６（ｓ，１Ｈ）７．１１（ｂｓ，１Ｈ）７．２８（ｂｓ，１Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ  ８５５．３（Ｍ＋Ｈ）、保持時間  ０．９８８分間．
【０４９４】
工程２：（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニネートの調製
無水ＤＭＳＯ（７ｍＬ）に溶解された（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｓ，３３Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）−８６−クロロ−１４−ヒドロキシ−８５，１４−ジメトキシ−３３，２，７，１０−テトラメチル−１２，６−ジオキソ−７−アザ−１（６，４）−オキサジナナ−３（２，３）−オキシラナ−８（１，３）−ベンゼンアシクロテトラデカファン−１０，１２−ジエン−４−イルＮ−（４−（（２−アミノエチル）ジスルファニル）−４−メチルペンタノイル）−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニネート（５５５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノエート（１７１ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２４９ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応混合物を室温で１５分間撹拌し、ＴＦＡを用いて中和した。混合物を、氷浴で０℃に冷却した後、ＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）を加え、次に、１０〜７０％のアセトニトリル−０．０５％のＴＦＡを含有するＨ２Ｏで溶離される逆相ＩＳＣＯによって精製した。所望の生成物を含有する画分を凍結乾燥させて、所望の生成物（４３０ｍｇ、６６％の収率））を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  ｐｐｍ  ０．８１（ｓ，３Ｈ）１．２３（ｓ，３Ｈ）１．２４（ｓ，３Ｈ）１．２５（ｓ，１Ｈ）１．２８（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、３Ｈ）１．３１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、３Ｈ）１．４３−１．４９（ｍ，１Ｈ）１．６１（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ、１Ｈ）１．６４（ｓ，３Ｈ）１．８１−１．８７（ｍ，１Ｈ）１．９４−２．０１（ｍ，１Ｈ）２．１９（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ）２．３０−２．３６（ｍ，１Ｈ）２．５４（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）２．６１（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ）２．７０（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）２．８８（ｓ，３Ｈ）３．００（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）３．１３（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）３．２１（ｓ，３Ｈ）３．５５（ｓ，３Ｈ）３．４５（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）３．４９（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）３．６２（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）３．８３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）３．９８（ｓ，３Ｈ）４．３２（ｍ，１Ｈ）４．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．０および１０．０Ｈｚ、１Ｈ）５．２８（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）５．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ））６．２２（ｂｓ，１Ｈ）６．４２（ｄｄ，Ｊ＝１０．０および１５．０Ｈｚ、１Ｈ）６．５０（ｓ，１Ｈ）６．６３（ｓ，１Ｈ）６．６６（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）６．７０（ｓ，２Ｈ）６．８３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ  ９８８．３（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ）、保持時間  １．１４５分間．
【０４９５】
実施例４Ｂ：抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４の調製
【化６４】
2020506703.tif 000149
２２℃で２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．６（３ｍｌ；滅菌）およびジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ；０．１２ｍｌ）の撹拌溶液に、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６；滅菌）中の１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ；ＭＷ約１４５５４６ｇ／ｍｏｌ；６２ｍｇ（０．４２６μｍｏｌ））の溶液（１．６９５ｍｌ）を加えた。０．２４２ｍｌのＤＭＡｃに溶解されたメイタンシノイドＤＭ４（２．４２ｍｇ（３．１０１μｍｏｌ）を加えた。０．９７０ｍｌのＤＭＡｃに溶解されたリンカースルホＳＰＤＢ（０．９７０ｍｇ（２．３８６μｍｏｌ、アッセイのために補正された）を加えた。１８時間後、反応混合物を、ＳＥＣ−ＵＶおよびＨＰＬＣによって反応の完了について分析した。
【０４９６】
反応混合物を、Ａｍｉｃｏｎ膜細胞上でのろ過によって交換される生成物および緩衝液；洗浄のための１０ｍＭのＰＢＳ−ｐＨ７．４緩衝液（滅菌）を用いたカットオフ３０ｋＤａによって、小分子から精製した。得られたＡｍｉｃｏｎ保持液を組み合わせて、１０ｍｇ／ｍｌ（ＵＶ）に希釈して、１０ｍＭのＰＢＳ−ｐＨ７．４緩衝液（４９％のタンパク質回収率）中の抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の２．９ｍｌの溶液を得た。
【０４９７】
ＳＥＣ−ＵＶによって、薬物抗体比が、ｎ＝３．６であり、モノマー純度が９８．７％であることが分かった。エンドトキシンレベルは、０．１４ＥＵ／ｍｇ（ＢＥＴ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ試験）であった。
【０４９８】
実施例４Ｃ：抗体薬物コンジュゲート６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１の調製
【化６５】
2020506703.tif 000150
抗体（親６８４Ｅ１２）溶液（７．１ｍｇ／ｍＬ、３．４ｍＬ、約４７μＭ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に、ＤＭＡ中の１００μＬの２ｍＭのＤＭ１（０．１７ｍｇ）およびＤＭＡ中の５０μＬの４ｍＭのスルホ−ＳＭＣＣ（０．１５ｍｇ）を加え、混合物をインキュベートし、４℃で一晩穏やかに撹拌した。インキュベーションの後、反応混合物を、流動緩衝液としてＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いてＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で脱塩によって精製し、滅菌ろ過した。精製されたコンジュゲートを、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＤＡＲによって分析したところ、２．６であると推定された。分析ＳＥＣは、試料中に存在する３．７％の凝集（または９６．３％のモノマー）を示し、ＬＡＬ試験（ＰＴＳ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、エンドトキシン値が０．３６ＥＵ／ｍｇであると決定した。
【０４９９】
実施例４Ｄ：抗体薬物コンジュゲート５０６Ｅ１５．ＡＵＲＩＸ１の調製
出発材料は、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で、１８．８ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の５０６Ｅ１５．ＣｙｓＭａｂ（ＷＴ  Ｆｃ）抗体であった。１．７６ｍｌの抗体を、３ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）に吸収させ、得られたスラリーに、０．５ＭのホスフェートｐＨ８中で配合された２４０ｕｌの０．５Ｍのシステイン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ１２１−０３）を加え、それに、ＮａＯＨ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ａ１６０３７）を、１３．６ｇ／Ｌの比率で加えた。スラリーを、室温で３０分間にわたって時折回転させ、次に、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、５０床体積の１×ＰＢＳで、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニットを通した真空ろ過によって洗浄した。洗浄された樹脂を、２ｍｌの１×ＰＢＳ（５０％のスラリー）中で再懸濁させ、６０ｕｌの１００ｕＭのＣｕＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５１９４４）を加えて（正味１００ｎＭのＣｕ２＋）、再酸化を開始させた。４２０分後、さらなる９０ｕｌの１００ｕＭのＣｕＣｌ２を加えて、再酸化をさらに加速させた。抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られている参照マレイミド：（実施例３、国際公開第２０１５／０９５３０１号パンフレットの１１０頁）の２０ｍＭストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水に５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０５００】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、５６５分間）、ＤＭＳＯ中のＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック２２０ｕｌを加え、スラリーを、室温で７０分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０５０１】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離された、フリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（６ｍｌ）を、０．６ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、３，０００×ｇでスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦＣ９０５０２４）を用いて２．５ｍｌに濃縮し、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの濃縮物を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化されたＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。収量は２２ｍｇ（６６％）であった。
【０５０２】
実施例４Ｅ：抗体薬物コンジュゲート５０６Ｅ１５．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＡＵＲＩＸ２の調製
出発材料は、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で、１０ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の５０６Ｅ１５．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ抗体であった。２．０ｍｌの抗体を、２ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）に吸収させ、得られたスラリーに、０．５ＭのホスフェートｐＨ８中で配合された１６０ｕｌの０．５Ｍのシステイン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ１２１−０３）を加え、それに、ＮａＯＨ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ａ１６０３７）を、１３．６ｇ／Ｌの比率で加えた。スラリーを、室温で３０分間にわたって時折回転させ、次に、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、５０床体積の１×ＰＢＳで、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニットを通した真空ろ過によって洗浄した。洗浄された樹脂を、２ｍｌの１×ＰＢＳ（５０％のスラリー）中で再懸濁させ、１０ｕｌの１００ｕＭのＣｕＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５１９４４）を加えて（正味２５０ｎＭのＣｕ２＋）、再酸化を開始させた。抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られている参照マレイミド（実施例３、国際公開第２０１５／０９５３０１号パンフレットの１１０頁）の２０ｍＭストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水への５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０５０３】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、２９５分間）、ＤＭＳＯ中のＡＵＲＩＸ２の２０ｍＭストック８０ｕｌを加え、スラリーを、室温で８５分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０５０４】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離されたフリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（４ｍｌ）を、０．４ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの溶出液を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化された２×ＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。収量は１３．３ｍｇ（６７％）であった。
【０５０５】
実施例４Ｆ：抗体薬物コンジュゲート６７４Ｊ１３．ＣｙｓＭａｂ．ＡＵＲＩＸ１の調製
出発材料は、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で、９ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の６７４Ｊ１３．ＣｙｓＭａｂ（ＷＴ  Ｆｃ）抗体であった。５７．６ｍｌの抗体に、２００ｍＭになるまでＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５０８−０１３）を加え、溶液を、７５分間インキュベートして、Ａｂを強く還元させた。次に、還元されたＡｂを、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの濃縮物を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化されたＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。次に、ＰＤ１０からの溶出液をプールして、新鮮なＰＤ１０カラムに再度適用して、ＤＴＴをより完全に除去した。別個の実験において、カラムが１回のみ使用される場合、ＰＤ１０カラムが、サイズ排除機構のみを通して見られるより、ＤＴＴの除去により有効であることに留意されたい。
【０５０６】
抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られているＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水に５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０５０７】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、１８０分間）、ＤＭＳＯ中のＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック２９０ｕｌを、６ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）樹脂とともに加えた。スラリーを、室温で４０分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０５０８】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離された、フリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（１１．５ｍｌ）を、１．２ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、３，０００×ｇでスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦＣ９０５０２４）を用いて２．５ｍｌに濃縮し、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの濃縮物を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化されたＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。収量は２６ｍｇ（４１％）であった。
【０５０９】
実施例４Ｇ：抗体薬物コンジュゲート６７４Ｊ１３．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＡＵＲＩＸ２の調製
出発材料は、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で、３１．７ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の６７４Ｊ１３．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＲ４．ＤＡＰＡ抗体であった。９．５ｍｌの抗体を、３０．１ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）に吸収させ、得られたスラリーに、１８００ｍｇのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５０８−０１３）を加えて、Ａｂ（正味２００ｍＭのＤＴＴ）を強く還元させた。スラリーを、室温で２０分間回転させ、次に、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、５０床体積の１×ＰＢＳで、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニットを通した真空ろ過によって洗浄した。洗浄された樹脂を、２ｍｌの１×ＰＢＳ中で再懸濁させ、室温で回転させ−銅（これにより、再酸化が過度に加速された）を加えなかった。抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られている参照マレイミド（実施例３、国際公開第２０１５／０９５３０１号パンフレットの１１０頁）の２０ｍＭストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水に５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０５１０】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、８０分間）、ＤＭＳＯ中のＡＵＲＩＸ２の２０ｍＭストック９０３ｕｌを加え、スラリーを、室温で５０分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０５１１】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離されたフリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（６０．２ｍｌ）を、６．０ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、３，０００×ｇでスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦＣ９０５０２４）を用いて１７．５ｍｌに濃縮し、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの濃縮物を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化された７  ＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。収量は２４３ｍｇ（８１％）であった。
【０５１２】
実施例４Ｈ：抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＡＵＲＩＸ１の調製
出発材料は、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で１６．７ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ抗体であった。３．６ｍｌの抗体を、６ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）に吸収させ、得られたスラリーを、室温で１２５分間回転させ、次に、０．５ＭのホスフェートｐＨ８中で配合された５４４ｕｌの０．５Ｍのシステイン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ１２１−０３）を加え、それに、ＮａＯＨ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ａ１６０３７）を、１３．６ｇ／Ｌの比率で加えた。スラリーを、室温で６０分間にわたって時折回転させ、次に、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、５０床体積の１×ＰＢＳで、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニットを通した真空ろ過によって洗浄した。洗浄された樹脂を、２ｍｌの１×ＰＢＳ（５０％のスラリー）中で再懸濁させ、１６ｕｌの１００ｕＭのＣｕＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５１９４４）を加えて（正味２５０ｎＭのＣｕ２＋）、再酸化を開始させた。抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られているＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水に５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０５１３】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、１７０分間）、ＤＭＳＯ中のＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック６７ｕｌを加え、スラリーを、室温で１２０分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０５１４】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離された、フリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（１５ｍｌ）を、１．５ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、３，０００×ｇでスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦＣ９０５０２４）を用いて５ｍｌに濃縮し、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの溶出液を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化された２×ＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。収量は５４ｍｇ（９２％）であった。
【０５１５】
実施例４Ｉ：抗体薬物コンジュゲート１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＡＵＲＩＸ１の調製
出発材料は、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で、１２．５ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０）の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ（Ｆｃ  ＷＴ）抗体であった。４．８ｍｌの抗体を、６ｍｌのＲＭＰプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １−２２３ＢＰＯ／Ｉ）に吸収させ、得られたスラリーを、室温で１２５分間回転させ、次に、０．５ＭのホスフェートｐＨ８中で配合された５９２ｕｌの０．５Ｍのシステイン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ１２１−０３）を加え、それに、ＮａＯＨ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ａ１６０３７）を、１３．６ｇ／Ｌの比率で加えた。スラリーを、室温で６０分間にわたって時折回転させ、次に、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、５０床体積の１×ＰＢＳで、ボトルトップ０．２ｕｍフィルタユニットを通した真空ろ過によって洗浄した。洗浄された樹脂を、２ｍｌの１×ＰＢＳ（５０％のスラリー）中で再懸濁させ、１６ｕｌの１００ｕＭのＣｕＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５１９４４）を加えて（正味２５０ｎＭのＣｕ２＋）、再酸化を開始させた。抗体の再酸化を、スラリーの３０ｕｌのアリコートを除去し、ＲＰＬＣによって抗体ピークを変化させることが知られているＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック１ｕｌを加え、１分間混合し、１０秒間７，０００×ｇで回転させ、上清を除去し、６０ｕｌのＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２１００９）を加え、１０秒間１４，０００×ｇで回転させ、上清を採取し、ＲＰＬＣによって生成物を以下のように分析することによって試験した：２ｕｌの試料を、１．５ｍｌ／分で流れる２９．５％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＸ１２８０Ｐ−１、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ４０７−４）中の０．１％のトリフルオロ酢酸に平衡化された、加熱された（８０℃）４．６×５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（５μｍの粒子、４０００Åの細孔径）中に注入した。カラムを、１．９分間維持された４４．５％のＣＨ３ＣＮ／水に５分間の勾配で溶離し、ピークを２８０ｎｍで検出した。コンジュゲーションのための最適な時間が、主要生成物ピークが最大であり、後で溶出するピークが最小限に抑えられ、先に溶出するピークがまだ増加していない時間として定義される。
【０５１６】
ＲＰＬＣアッセイが、再酸化が最適であることを示した場合（この場合、１６０分間）、ＤＭＳＯ中のＡＵＲＩＸ１の２０ｍＭストック６７ｕｌを加え、スラリーを、室温で１２０分間にわたって時折穏やかに回転させた。次に、スラリーを、少なくとも１０サイクルのろ過および添加において、２０床体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０５１７】
次に、スラリーを、０．５床体積のＴｈｅｒｍｏ  ＩｇＧ溶出緩衝液（廃棄される）で予め溶離された、フリット付きカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ７３７５０２１）に移し、次に、２床体積の同じ緩衝液で溶離した。全溶出液（１５ｍｌ）を、１．５ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ８で中和し、３，０００×ｇでスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦＣ９０５０２４）を用いて５ｍｌに濃縮し、製造業者にしたがって、２．５ｍｌの溶出液を充填し、３．５ｍｌの１×ＰＢＳで溶離しながら、１×ＰＢＳに平衡化された２×ＰＤ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に適用した。収量は５２ｍｇ（８９％）であった。
【０５１８】
分析方法：１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液について１３．７の吸光係数を有するＯＤ２８０によって、濃度を決定した。ＴＥＣＡＮ  Ｓａｆｉｒｅプレートリーダーにおいて読み取られるＫｉｎｅｔｉｃ  ＱＣＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ５０−６５０Ｈ）を用いて、発熱性物質を決定した。移動相［２０ｍＭのトリス約ｐＨ７．６５（１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１０ｍＭのトリスｐＨ８を用いて準備された）、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のアジ化ナトリウム］で平衡化された、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−Ｇガード（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｃａｔ＃６９６０９５５）およびＫＷ−８０３カラム（ＴＩＣ  Ｃａｔ＃６９６０９４０）において、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集パーセントを決定し、２８０ｎｍにおいてデータを収集した。試料を１×ＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０℃で１０分間にわたってＰＮＧａｓｅＦ（社内）で試料を脱グリコシル化し、プロテインＡへの結合によってＰＮＧａｓｅＦを除去し、１×ＰＢＳで洗浄し、１％のギ酸で溶離することによって、試料のアリコートを、ＤＡＲ決定のために調製した。０．５ＭのＴＣＥＰを含有する５Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ５．０の１／４の体積を加え、室温で３０分間インキュベートすることによって、試料を還元させた。次に、試料を、０．５ｍｌ／分で流れる２０％のＣＨ３ＣＮ／水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の０．１％のギ酸に平衡化された２．１×５０ｍｍ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（８μｍの粒子、１０００Åの細孔径）上に注入した。カラムを、３分間にわたって２０％のＣＨ３ＣＮ／水で洗浄し、次に、１．９分間維持された０．１％のギ酸９０％のＣＨ３ＣＮ／水への０．１分間の勾配で溶離した。質量スペクトルデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０機器で取り、１５〜６０ｋＤａの範囲でＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ．０５．００を用いてデコンボリューションした。様々な計算されたＤＡＲ状態に対応するピーク面積を、各ピークのＤＡＲにしたがって重み付けし、次に、合計し、ＤＡＲ４ピークの重み付けされた面積を、全ての重み付けされたピークの合計で除算して、ＤＡＲ値を得た。
【０５１９】
得られた試料の分析は、以下のとおりである：
【０５２０】
【表８４】
2020506703.tif 000151
【０５２１】
実施例４Ｊ：他のＣｙｓＭａｂ抗体を用いたさらなるコンジュゲートの調製
実施例４Ａに記載される方法も、他のシステイン操作抗体とのＭＰＥＴ．ＤＭ４コンジュゲートを生成するのに使用される。
【０５２２】
ＰＣＴ出願番号国際公開第２０１６／２０３４３２号パンフレットに開示される、抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ（Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）、ＮＥＧ００１２（Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）、ＮＥＧ００１３（Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）、ＮＥＧ００１６（Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）、ＮＥＧ００６４（Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）、ＮＥＧ００６７（Ｅ１５２Ｃ−Ｓ３７５Ｃ）、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ（Ｋ３６０Ｃ（ＨＣ）−Ｋ１０７Ｃ（ＬＣ））、ＮＥＧ００１２（Ｋ３６０Ｃ（ＨＣ）−Ｋ１０７Ｃ（ＬＣ））、ＮＥＧ００１３（Ｋ３６０Ｃ（ＨＣ）−Ｋ１０７Ｃ（ＬＣ））、ＮＥＧ００１６（Ｋ３６０Ｃ（ＨＣ）−Ｋ１０７Ｃ（ＬＣ））、ＮＥＧ００６４（Ｋ３６０Ｃ（ＨＣ）−Ｋ１０７Ｃ（ＬＣ））、およびＮＥＧ００６７（Ｋ３６０Ｃ（ＨＣ）−Ｋ１０７Ｃ（ＬＣ））を用いて、抗Ｐ−カドヘリンＡｂ．ＣｙｓＭａｂ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４コンジュゲートを生成するのに、この方法が使用される。
【０５２３】
実施例５：インビトロＡＤＣ特性評価
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、様々な機能的および分析方法によって特性評価した。ＡＤＣは、ＦＡＣＳによって評価した際に、細胞上の標的ＣＣＲ７タンパク質への結合を保持していた。全てのＡＤＣについて、ＦＡＣＳ結合アッセイにおける幾何平均蛍光強度は、非コンジュゲート抗体についての値の２０％以内であった。分析ＳＥＣによって、ＡＤＣが、所望の分子量で９５％超の材料であることが示され；これが初期の反応生成物について観察されなかった場合、分取ＳＥＣの使用が、必要な仕様を達成した。様々なＤＡＲ種の存在度を合計し、各ＤＡＲ種における薬物分子の数（例えば、単一のＤＡＲ２イオンを２と計数し、単一のＤＡＲ１イオンを１と計数する）によって重み付けして、脱グリコシル化された還元抗体試料のＬＣＭＳによって、薬物抗体比（ＤＡＲ）を評価した。２つのシステイン突然変異を含む定常領域を含むコンジュゲートは、少なくともＤＡＲ３．４またはＤＡＲ３．４超であり、最も一般的に、ＤＡＲ３．８またはＤＡＲ３．８超であった。これは、報告されるコンジュゲートにわたって一致していた。
【０５２４】
実施例６：細胞増殖／細胞生存の阻害アッセイ
上記で、本発明者らは、全ての３つの抗ＣＣＲ７抗体のフルオロフォアコンジュゲート形態が、一連の細胞株にわたって細胞の低ｐＨ部分において、ＣＣＲ７を内在化し、コンジュゲートされたフルオロフォアを有効に蓄積することができることを示した。本明細書において、本発明者らは、コンジュゲート物が毒性ペイロードである状況で、細胞内にコンジュゲート物を内在化し、蓄積する抗体の能力を示す。
【０５２５】
ピギーバックＡＤＣ（ｐｇＡＤＣ）状況において、ペイロード共役二次抗体フラグメントと複合体化された抗ＣＣＲ７抗体の細胞傷害効果を、処理の４日後の細胞生存を評価することによって試験した。ＣＣＲ７特異的ＩｇＧの３倍希釈を調製し、一定量のペイロード結合Ｆａｂフラグメントと混合した。ペイロード結合Ｆａｂフラグメントの最終濃度は、０．５μｇ／ｍｌであった。Ｆａｂ試薬は、ＭＭＡＦまたはサポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆａｂ−Ｚａｐ）のいずれかにコンジュゲートされる抗マウスＦｃ指向性Ｆａｂである。室温で３０分間にわたるプレインキュベーションの後、１０μｌ／ウェルの抗体−ペイロード複合体を、３８４ウェル底部白色プレートに３連で加えた。それぞれのＣＣＲ７（＋）細胞を、密度が懸濁細胞について１×１０６個／ｍｌ未満であり、接着細胞について８０％の密集度に達するように播種した。細胞を採取し（接着細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥離させた）、約２×１０４個の細胞／ｍｌになるまで再懸濁させた。細胞を、抗体−ペイロード複合体（２０μｌ／ウェル）の上で、３８４ウェルプレートに加えた。プレートを、３７℃および５％のＣＯ２で４日間インキュベートした。その後、２０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７１）を調製し、細胞に加えた。生存細胞のみが、発光をもたらすルシフェラーゼ反応（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって提供される）に必要とされるＡＴＰを生成している。これによれば、細胞生存は、発光シグナルによって決定され、発光シグナルは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌリーダーを用いて、２２℃および４００ｒｐｍで１０分間のインキュベーションの後に測定された。ＩＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。
【０５２６】
図７Ａおよび図７Ｂは、全ての４つの抗ＣＣＲ７抗体が、ＭＭＡＦコンジュゲート試薬を用いて、ピギーバックアッセイフォーマットにおいて、ＣＣＲ７＋ＫＥ９７細胞の濃度依存的な細胞殺滅が可能であることを示す。以下の表は、ピギーバックペイロードの手段としてＭＭＡＦまたはサポリンを用いた実験からの結果をまとめている。
【０５２７】
【表８５】
2020506703.tif 000152
【０５２８】
ｐｇＡＤＣ殺滅の特異性を、標的陰性細胞株を用いて評価した。一例が、ＦａｂＺａｐ試薬を用いて図８に示される。ＣＣＲ７陰性ＮＩＨ３Ｔ３親細胞またはｍＩｇＧ対照抗体と対照的に、１２１Ｇ１２  ｐｇＡＤＣ活性の特異的なＣＣＲ７依存的増加が、ＫＥ９７およびＮＩＨ３Ｔ３．ｈＣＣＲ７細胞において見られる。
【０５２９】
実施例７：インビボでの正常なマウス造血細胞に対するマウス交差反応性非コンジュゲートまたはＡＵＲＩＸ１コンジュゲート抗ＣＣＲ７抗体の影響
種にわたる正常な組織発現が、血液およびリンパ器官中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む造血系由来の細胞に限定され、これは、特に、ＡＤＣＣおよびリンパ系細胞枯渇につながり得る野生型Ｆｃフォーマットで、ＣＣＲ７標的化ＡＤＣについての潜在的な安全性責任（ｓａｆｅｔｙ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を示す。
【０５３０】
インビボで正常な造血細胞におけるＡＤＣによりＣＣＲ７を標的化することの影響を決定するために、ＡＵＲＩＸ１にコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされたマウス交差反応性１２１Ｇ１２親Ａｂを、野生型またはサイレンス（ＤＡＰＡ）Ｆｃフォーマットのいずれかで、健常な雌６〜８週齢のＣＤ−１マウスにおいて評価した。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの最終用量の、１２１Ｇ１２親．Ｃｙｓ−Ｍａｂ．野生型Ｆｃ．ｈＩｇＧ１（１２１Ｇ１２．ｗｔ．Ｆｃ）、１２１Ｇ１２親．Ｃｙｓ−Ｍａｂ．ＤＡＰＡ．ｈＩｇＧ１（１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．Ｆｃ）、１２１Ｇ１２親．Ｃｙｓ−Ｍａｂ．野生型Ｆｃ．ｈＩｇＧ１．ＡＵＲＩＸ１（１２１Ｇ１２．ｗｔ．Ｆｃ．ＡＵＲＩＸ１）または１２１Ｇ１２．親．Ｃｙｓ−Ｍａｂ．ＤＡＰＡ．ｈＩｇＧ１．ＡＵＲＩＸ１（１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．Ｆｃ．ＡＵＲＩＸ１）の単回の静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。
【０５３１】
処理後２５日目に、脾臓を抽出し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて単一の細胞懸濁液中で分離させた。次に、各試料につき１００万個の細胞を、ＢＵＶ７３７ラット抗マウスＣＤ８ａ抗体、クローン５３−６．７（１：１００）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ、Ｃａｔ＃５６４２９７）およびＢＶ５１０ラット抗マウスＣＤ４、クローンＲＭ４−５（１：２００）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ、Ｃａｔ＃５６３１０６）を含む、Ａｂの混合物で染色して、ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋Ｔ細胞における個々の処理の影響を決定した。試料を、４℃で３０分間インキュベートし、氷冷ＨｙＣｌｏｎｅリン酸緩衝生理食塩水（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中で洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ細胞分析装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において評価した。総脾細胞数を用いて、ＣＤ４＋またはＣＤ８ａ＋Ｔ細胞枯渇を決定した。Ｔ検定を用いて、群間の有意性を決定した。
【０５３２】
表１７および図９に示されるように、脾臓中のＣＤ４＋（ＦＣ  ０．５−０．６）およびＣＤ８ａ＋Ｔ細胞（ＦＣ  ０．３−０．５）の強い還元が、１０ｍｇ／ｋｇで、１２１Ｇ１２．ｗｔ．ＦＣまたは１２１Ｇ１２．ｗｔ．Ｆｃ．ＡＵＲＩＸ１  Ａｂのいずれかによる処理の３日目に観察され、これは、Ｔ細胞枯渇の影響が、ＡＵＲＩＸ１ペイロードの存在と無関係であったことを示唆している。これらの影響は、ＤＡＰＡ突然変異の導入によるＦｃのサイレンシングによって補助される。１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．Ｆｃおよび１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．Ｆｃ．ＡＵＲＩＸ１は両方とも、処理なし群と比べてＴ細胞集団に影響を与えなかった。これらのデータは、抗ＣＣＲ７  ＡＤＣが、ＦｃのＤＡＰＡサイレンシングによって補助され得るＴ細胞枯渇の安全性責任を有し得ることを示す。
【０５３３】
【表８６】
2020506703.tif 000153
【０５３４】
実施例８：直接のコンジュゲートの抗ＣＣＲ７  ＡＤＣ活性
様々なペイロードとの直接コンジュゲートされた抗体（ＡＤＣ）の結合後の細胞傷害効果、およびＣＣＲ７（＋）細胞中へのそれらの内在化を、４日間の処理後の細胞生存を評価することによって試験した。ＡＤＣの３倍希釈を、３８４ウェル底部白色プレートに３連で加えた（１０μｌ／ｍｌ）。それぞれのＣＣＲ７（＋）細胞を、それらの密度が懸濁細胞について１×１０６個／ｍｌであり、接着細胞について８０％の密集度に達するように播種した。細胞を採取し（接着細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥離させた）、約２×１０４個の細胞／ｍｌになるまで再懸濁させた。細胞を、抗体（２０μｌ／ウェル）の上で、３８４ウェルプレートに加えた。プレートを、３７℃および５％のＣＯ２で４日間インキュベートした。その後、２０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７１）を調製し、細胞に加えた。細胞生存は、発光シグナルによって決定され、発光シグナルは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーを用いて、２２℃および４００ｒｐｍで１０分間のインキュベーションの後に測定された。ＩＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。
【０５３５】
以下の表は、ＡＵＲＩＸ１またはＡＵＲＩＸ２にコンジュゲートされた野生型Ｆｃまたはサイレンシングされた（ＤＡＰＡ）Ｆｃフォーマットのいずれかにおける抗ＣＣＲ７  ＣｙｓＭａｂ抗体で測定された細胞生存影響の例を示す。
【０５３６】
【表８７】
2020506703.tif 000154
【０５３７】
標的特異性および受容体レベル依存性についてＡＤＣを評価するために、ＡＤＣ活性を、異なるＣＣＲ７受容体レベルを有する細胞株にわたって試験した。以下の表は、ＡＵＲＩＸ２にコンジュゲートされた、ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡフォーマットにおけるヒト化６７４Ｊ１３抗体についての例を示す。細胞株を、ペイロードと類似の感受性に基づいて選択した。
【０５３８】
【表８８】
2020506703.tif 000155
【０５３９】
ｐＨｒｏｄｏ実験において見られるように、ＡＤＣ活性は、ＡＤＣＣモダリティより高度な受容体数を必要とする。正確な受容体カットオフは、様々なパラメータ（例えば、抗体アビディティー、ペイロード効力）に依存するが、本明細書に示されるデータは、一般概念を説明する。ＤＡＰＡフォーマットのアビディティー依存的抗ＣＣＲ７抗体を用いて、ＡＤＣ活性を、正常なＣＣＲ７＋ＰＢＭＣより癌細胞に対して偏らせ、これは、本明細書において、２，０００未満のＣＣＲ７受容体を有する癌細胞株によって表される。
【０５４０】
実施例９：部位特異的ＭＰＥＴ．ＤＭ４  ＡＤＣの導入
ＤＭ４コンジュゲートＡＤＣは、ＡＤＣ分野において十分に確立されている。本明細書において、本発明者らは、再現性よく均一な、ＤＡＲ制御されるＡＤＣバッチを生じる利点を有する抗体のＣｙｓＭａｂ形態を用いて部位特異的にコンジュゲートされたＭＰＥＴ．ＤＭ４の生成および使用を説明し、ここで、ＤＡＲ（薬物対抗体比）は約４である。非部位特異的コンジュゲートは、高いＤＡＲを有する有意な集団を含有することが多いことが記載されており、これは、疎水性の増加、ひいてはより急速なクリアランス、低いＰＫプロファイルおよび毒性の増加を含む、好ましくない生物物理学的特徴に関連付けられている。以下において、本発明者らは、ＭＰＥＴ．ＤＭ４に基づく抗ＣＣＲ７  ＡＤＣの様々なインビトロおよびインビボ評価を、そのｓＳＰＤＢ．ＤＭ４同等物との比較において示す。
【０５４１】
実施例１０：ＭＰＥＴ．ＤＭ４対ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４  ＡＤＣのＦＡＣＳ結合親和性
非部位特異的コンジュゲーションを上回る部位特異的コンジュゲーションの別の潜在的な改善は、構造的に、必須のＣＳＤ残基の近くにあるリシン−コンジュゲーション部位の潜在的な干渉であり得る。このようなリシン部位へのペイロードコンジュゲーションは、ＡＤＣの結合親和性に影響を与えることが予測され得る。内因性リシンコンジュゲートｓＳＰＤＢ．ＤＭ４に対して、本明細書に記載されるＣｙｓＭａｂコンジュゲートＭＰＥＴ．ＤＭ４を用いてＡＤＣの結合親和性を試験するために、結合親和性を、上述されるようにＦＡＣＳによって決定した。以下の表は、いくつかの代表的な親和性データをまとめており、このデータは、ＭＰＥＴ．ＤＭ４  ＡＤＣに対するｓＳＰＤＢ．ＤＭ４  ＡＤＣの結合親和性の軽度の低下を示す。
【０５４２】
【表８９】
2020506703.tif 000156
【０５４３】
実施例１１：ＭＰＥＴ．ＤＭ４対ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４  ＡＤＣのインビトロ活性
ＡＤＣ  １２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４および１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４（ＤＡＲ３．９）の細胞傷害効果を、上述されるようにインビトロ生存アッセイにおいて評価した。以下の表は、ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４と比較したＭＰＥＴ．ＤＭ４コンジュゲートの同様のわずかに改善した活性を示す。これは、より良好な保存された親和性または他の因子の結果であり得る。
【０５４４】
【表９０】
2020506703.tif 000157
【０５４５】
１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４  ＡＤＣを、様々な指示状況をカバーする様々な癌細胞株においてさらに試験し、ここで、それは、受容体密度に相関する有意な細胞殺滅を達成した。
【０５４６】
【表９１】
2020506703.tif 000158
【０５４７】
実施例１２：ＳＣＩＤ−ベージュマウスにおけるＫＥ９７多発性骨髄腫異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４および１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４の用量依存的インビボ有効性
インビボでの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４および１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４の標的化された抗腫瘍活性を実証するために、各マウスの右脇腹への３×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌ＳＣＩＤ−ベージュマウスにおいて、ＫＥ９７異種移植モデルを確立した。腫瘍が約１３５ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝８）に分けた。マウスに、０．５、２もしくは５ｍｇ／ｋｇの最終用量の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４（ＤＡＲ４）、０．５、２もしくは５ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４（ＤＡＲ３．９）、または５ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。
【０５４８】
試験される全ての試験薬剤は、忍容性が認められ、毒性の明らかな臨床症状または体重減少は、処理群のいずれにおいても観察されなかった（表２３）。
【０５４９】
【表９２】
2020506703.tif 000159
【０５５０】
５ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４による処理後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理は、７８．６２％（０．５ｍｇ／ｋｇ）のΔＴ／ΔＣ値で、用量依存的抗腫瘍有効性をもたらした一方、２および５ｍｇ／ｋｇの用量は、第１の投与の９日後（移植の２３日後）までにそれぞれ３３％および５４％の平均退縮をもたらした。１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４処理はまた、８５．３８％（０．５ｍｇ／ｋｇ）および１３．７７％（２ｍｇ／ｋｇ）のΔＴ／ΔＣ値で、用量依存的抗腫瘍有効性を示した一方、５ｍｇ／ｋｇの用量は、第１の投与の９日後（移植の２３日後）までに３３％の平均退縮をもたらした。移植の２３〜２５日後までに、対照群および０．５ｍｇ／ｋｇ処理群を安楽死させ、残りの群に、移植の２８日後に、２もしくは５ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４または２もしくは５ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４のいずれかの第２の投与を与えた。持続的な腫瘍退縮が、移植の４２日後の試験の終了までを通して、２および５ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４、ならびに５ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４で観察された。１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４について２ｍｇ／ｋｇで、応答がより不均一であり、約２５％のマウスが、持続的な腫瘍退縮を示した一方、群の残りは、病状の安定または腫瘍進行のいずれかを示す（図１０、表２３）。
【０５５１】
実施例１３：より大きい開始腫瘍体積のＫＥ９７多発性骨髄腫モデルにおける１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４対１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４の有効性評価
より高いバーのインビボモデルを、ＫＥ９７多発性骨髄腫細胞株を用いて設定して、第１の投与時により大きい開始腫瘍体積を有する腫瘍における１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４  １２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４（ＤＡＲ３．９）の有効性を比較して、様々な切断性リンカーの抗腫瘍有効性をさらに区別した。各マウスの右脇腹への３×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌ＳＣＩＤ−ベージュマウスにおいて、ＫＥ９７異種移植モデルを確立した。腫瘍が約４５０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に２つの処理群（ｎ＝８）に分けた。マウスに、２ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４または１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。
【０５５２】
２ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４による処理後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理は、単回投与処理によるマウスの７５％（８匹中６匹）で、部分的退縮／長期の静止状態をもたらした（図１１）。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４は、このモデルにおいて１２１Ｇ１２．ＤＡＰＡ．ｓＳＰＤＢ．ＤＭ４より強く性能が優れていた（それぞれ５２４．８３±１４３．２０対１３３７．１３±３５．１３の２５日目の平均腫瘍体積、ｐ＜０．００１；対応のないＴ検定）。
【０５５３】
実施例１４：原発性患者由来非小細胞肺癌ＨＬＵＸ１９３４腫瘍モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のインビボ有効性
１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の抗腫瘍活性を、ＣＣＲ７発現ＨＬＵＸ１９３４原発性非小細胞肺癌異種移植モデルにおいて評価した。雌無胸腺ヌードマウスに、各マウスの右脇腹に腫瘍断片を皮下移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（ｎ＝８）に分けた。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４（ＤＡＲ４）、または１０ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。２週間後に、各抗体の第２の用量を送達した。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。
【０５５４】
１０ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４は、潜在的に、ＨＬＵＸ１９３４モデルにおいてオフターゲットへの抗体の非特異的結合のため、処理なし群（ΔＴ／ΔＣ値５３．０７％）と比べて腫瘍成長をわずかに遅延させたようであった。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理は、第２の用量の投与で持続されたより顕著な有効性をもたらした。１０ｍｇ／ｋｇの用量の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理は、明らかな体重減少を伴わず、移植の３４日後に１８．８３％のΔＴ／ΔＣ値で、良好な忍容性を示した（図１２、表２４）。
【０５５５】
【表９３】
2020506703.tif 000160
【０５５６】
実施例１５：ＳＣＩＤ−ベージュマウスのＫＥ９７多発性骨髄腫異種移植モデルに対する６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１のインビボ有効性
インビボでの６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１の標的化された抗腫瘍活性を実証するために、各マウスの右脇腹への３×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌ＳＣＩＤ−ベージュマウスにおいて、ＫＥ９７異種移植モデルを確立した。腫瘍が約２００ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝８）に分けた。マウスに、２もしくは６ｍｇ／ｋｇの最終用量の親６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１（ＤＡＲ２．６）または６ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＳＭＣＣ．ＤＭ１のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。
【０５５７】
試験される全ての試験薬剤は、忍容性が認められ、毒性の明らかな臨床症状または体重減少は、処理群のいずれにおいても観察されなかった。２ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＳＭＣＣ．ＤＭ１または親６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１による処理後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。親６８４Ｅ１２．ＳＭＣＣ．ＤＭ１  ６ｍｇ／ｋｇ処理は、投与の１１日後に６．７２％のΔＴ／ΔＣ値をもたらした（ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ／テューキーの多重比較検定）（図１３）。
【０５５８】
実施例１６：ＫＥ９７腫瘍モデルにおける１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４によるインビボでのオンターゲット薬力学的マーカー調節
１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４による処理後のリン酸化ヒストンＨ３マーカー陽性腫瘍細胞の蓄積を用いて、インビボでのＧ２／Ｍ停止を誘導する抗ＣＣＲ７  ＡＤＣの能力を評価した。
【０５５９】
試験を行い、ここで、各マウスの右脇腹への３×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌ＳＣＩＤ−ベージュマウスにおいて、ＫＥ９７異種移植モデルを確立した。腫瘍が約１４０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝３）に分けた。マウスに、２、５もしくは１０ｍｇ／ｋｇの最終用量の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４、または１０ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの単回の静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。処理の４８時間後、腫瘍を、後述される免疫組織化学的染色によるリン酸化ヒストンＨ３レベルの評価のために収集した。
【０５６０】
免疫組織化学によってリン酸化ヒストンＨ３陽性核の蓄積を測定するために、ヒトヒストンＨ３のリン酸化セリン１０を囲む残基を標的にするウサギポリクローナル抗体を、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ、Ｃａｔ＃７６０−４５９１）から入手した。ＩＨＣプロトコルは、加熱およびＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  １抗原賦活化試薬への軽い曝露（３２分）を含んでいた。試料を、一次抗体（製造業者によって予め希釈される）とともに室温で６０分間インキュベートした。その後、ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰ二次Ａｂ（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ、Ｃａｔ＃７６０−４３１１）とのインキュベーションを、１２分間行った（製造業者によって予め希釈される）。
【０５６１】
図１４Ａにおいて、代表的な処理なしおよびアイソタイプ対照ＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４は、リン酸化ヒストンＨ３について陽性の時折の腫瘍細胞を示すが、リン酸化ヒストンＨ３免疫染色の着実な用量依存的増加が、１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の投与の４８時間後に検出される。シグナルの定量化を、ＭａｔＬａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ  ＭＡ）を用いて行い、ここで、リン酸化ヒストンＨ３シグナルの総面積（μｍ２）が、核の総面積（μｍ２）によって正規化されて、処理群のそれぞれについて以下に示されるリン酸化ヒストンＨ３比率（％）値を生成する。図１４Ｂ中のこれらのデータは、１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４が、腫瘍異種移植片において強いＧ２／Ｍ停止を引き起こすことが可能であることを示し、これは、ペイロードの予測される作用機序と一致している。
【０５６２】
実施例１７：１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ抗体の産生のための方法
この実施例は、細胞培養物からＣＣＲ７抗体１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡを産生するための方法を説明し、ここで、Ａｂは、Ａｂをコードするベクターから発現される。Ａｂが細胞培養物において発現されたら、Ａｂを、以下のように細胞培養物から精製する：
１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ抗体薬物原料中間体の精製方法の第１の工程は、インライン深層ろ過、続いて０．２μｍろ過による細胞除去からなる。
【０５６３】
第２の工程は、プロテインＡアフィニティー液体クロマトグラフィー工程からなる。バルク生成物の総量に応じて、この工程を、数回の実施で行う。各実施は、約２０ｇ／Ｌカラム体積の最大の充填を可能にする。溶出を、約ｐＨ３．０の５０ｍＭの酢酸を用いて行う。操作温度は、１８〜２８℃である。全ての溶出液をプールし、ウイルス不活化工程の前に、２〜８℃で貯蔵する。
【０５６４】
工程３は、「低ｐＨ処理」ウイルス不活化である。工程２の中間体溶液を、１８〜２８℃に調整し、ｐＨを３．５（３．４〜３．６の範囲）に調整する。次に、生成物中間体溶液を、７０分間（６０〜９０分間の範囲）にわたってウイルス不活化のために保持する。保持時間の後、溶液を、ｐＨ６．０（５．８〜６．２の範囲）に調整する。工程の最後に、溶液を、０．２μｍろ過とともにインラインで深層ろ過し、２〜８℃で貯蔵する。
【０５６５】
第４の工程は、統合されたオンカラム還元を含む結合／溶離モードでのカチオン交換クロマトグラフィーである。力価に応じて、この工程を、数回の実施で行う。各実施は、約３０ｇ／Ｌのカラム体積の充填を可能にする。カラムを、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０を含有する緩衝液Ａで平衡化する。オンカラム還元を、還元緩衝液として、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、７ｍＭのＬ−システイン、ｐＨ７．１を用いて行う。還元緩衝液を、緩衝液Ａで除去し、溶出を、緩衝液Ａおよび１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０を含有する緩衝液Ｂを用いて、１０％〜９０％の線形勾配で行う。溶出液およびプールは、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー工程の前に、２〜８℃で貯蔵され得る。
【０５６６】
方法の第５の工程は、流水式でのアニオン交換クロマトグラフィーである。力価に応じて、この工程を、数回の実施で行う。各実施は、約３５０ｇ／Ｌのカラム体積の最大の充填を可能にする。操作温度は、１８〜２８℃である。平衡化を、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１１９ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で行う。最終的なろ過物を、ウイルス除去工程の前に、２〜８℃で貯蔵する。
【０５６７】
ウイルスろ過、工程６は、０．１μｍのフィルタによる前ろ過、続いて、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎナノフィルタによるウイルスろ過からなる。工程５からの中間体溶液の温度を、ウイルスろ過の前に、１８〜２８℃に調整する。操作温度は、１８〜２８℃である。ナノろ過の後、中間体を、２〜８℃または１８〜２８℃で貯蔵する。
【０５６８】
第７の工程、限外ろ過／透析ろ過は、約７０ｇ／Ｌになるまでの高濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）工程、続いて、１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０による第１の透析ろ過工程からなる。少なくとも７の透析ろ過交換係数を目標にした後、約５０ｇ／Ｌになるまで希釈する。最終的な薬物原料中間体を、０．２μｍでろ過し、２〜８℃で貯蔵する。
【０５６９】
第８の最終工程において、最終的なバルク薬物原料中間体を、好適な容器中にアリコートで充填し、凍結後に−６０℃未満で貯蔵する。
【０５７０】
【表９４】
2020506703.tif 000161
【０５７１】
実施例１８：ＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ−ＬＹ３  ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の用量依存的インビボ有効性
ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬモデルにおけるインビボでの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の標的化された抗腫瘍活性を実証するために、各マウスの右脇腹への１０×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌ＮＳＧマウスにおいて、ＯＣＩ−ＬＹ３異種移植モデルを確立した。腫瘍が約１４０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝６）に分けた。試験の１日目および１５日目に、マウスに、０．５、１もしくは２ｍｇ／ｋｇの最終用量の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４（ＤＡＲ４）または２ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。試験される全ての試験薬剤は、忍容性が認められ、毒性の明らかな臨床症状または体重減少は、処理群のいずれにおいても観察されなかった（表２６）。
【０５７２】
２ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４による処理後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理は、７４．６％（０．５ｍｇ／ｋｇ）および１０．７％（１ｍｇ／ｋｇ）のΔＴ／ΔＣ値で、用量依存的抗腫瘍有効性をもたらした一方、２ｍｇ／ｋｇの用量は、試験の２８日目までに６５．９％の平均退縮をもたらした。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４  ２ｍｇ／ｋｇ群の６匹中３匹のマウスが、完全退縮を示した（図１５）。
【０５７３】
【表９５】
2020506703.tif 000162
【０５７４】
実施例１９：ＳＣＩＤ−ｂｇマウスにおけるＴｏｌｅｄｏ  ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の用量依存的インビボ有効性
ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬモデルにおけるインビボでの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の標的化された抗腫瘍活性を実証するために、各マウスの右脇腹への３×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌Ｓｃｉｄ−ｂｇマウスにおいて、Ｔｏｌｅｄｏ異種移植モデルを確立した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝４）に分けた。試験の１日目および１５日目に、マウスに、２もしくは５ｍｇ／ｋｇの最終用量の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４（ＤＡＲ４）または５ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。試験される全ての試験薬剤は、忍容性が認められ、毒性の明らかな臨床症状または体重減少は、処理群のいずれにおいても観察されなかった（表２７）。
【０５７５】
５ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４による処理後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理は、５２．７％（２ｍｇ／ｋｇ）および２０．６％（５ｍｇ／ｋｇ）のΔＴ／ΔＣ値で、用量依存的抗腫瘍有効性をもたらした（図１６、表２７）。
【０５７６】
【表９６】
2020506703.tif 000163
【０５７７】
実施例２０：ＳＣＩＤ−ｂｇマウスにおけるＤＥＬ  ＡＬＣＬ異種移植モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のインビボ有効性
ＣＣＲ７陽性ＡＬＣＬモデルにおけるインビボでの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の標的化された抗腫瘍活性を実証するために、各マウスの右脇腹への３×１０６個の細胞の皮下注射によって、雌Ｓｃｉｄ−ｂｇマウスにおいて、ＤＥＬ異種移植モデルを確立した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝４）に分けた。試験の１日目および１５日目に、マウスに、２ｍｇ／ｋｇの最終用量の１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４（ＤＡＲ４）または２ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照アイソタイプ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与えた。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。
【０５７８】
２ｍｇ／ｋｇの非特異的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４による処理後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４  ２ｍｇ／ｋｇによる処理は、単回投与後に試験の１４日目までに４０．２％の平均退縮をもたらした（ｐ＜０．０１）。１５日目までに、マウスに、第２の投与を与え、さらに３週間モニターした。１匹の異常値の動物は、第２の投与の処理に応答することができず、腫瘍組織量のため、２８日目までに安楽死させる必要があった。１匹のさらなる動物は、遅い疾患の進行を示し、標的発現の追跡のために２８日目に同様に殺処分した。４匹中２匹のマウスが、腫瘍成長に対する持続的な影響を示し続けた（図１７）。全ての処理は、明らかな体重減少を伴わず、良好な忍容性を示した。
【０５７９】
実施例２１：原発性患者由来小細胞肺癌ＨＬＵＸ１７８７腫瘍モデルに対する１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４のインビボ有効性
１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４の抗腫瘍活性を、ＣＣＲ７発現ＨＬＵＸ１７８７原発性非小細胞肺癌異種移植モデルにおいて評価した。雌ＮＳＧマウスに、各マウスの右脇腹に腫瘍断片を皮下移植した。腫瘍が約１５０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に応じて無作為に処理群（群当たりｎ＝６）に分けた。１日目に、マウスに、０．５、２または５ｍｇ／ｋ１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４（ＤＡＲ４）のいずれかの静脈内（ＩＶ）処理を与え、２週間後の１５日目に、第２の用量を送達した。全ての用量を、個々のマウス体重に合わせて調整した。
【０５８０】
より低い用量のコンジュゲートＡｂでは有意な抗腫瘍有効性は観察されなかったが、部分的退縮または病状の安定が、５ｍｇ／ｋｇの１２１Ｇ１２．ＣｙｓＭａｂ．ＤＡＰＡ．ＭＰＥＴ．ＤＭ４処理で観察された。持続的な腫瘍有効性が、第２の投与の２週間後に観察され、処理の３０日目に１．３％のΔＴ／ΔＣ値が得られた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ／テューキーの多重比較検定）（図１８）。全ての処理は、明らかな体重減少を伴わず、良好な忍容性を示した。
【図１】
2020506703.tif 000182
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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