(57)【要約】  本発明は、脳卒中および関係する疾患の処置に、フィブリン血餅形成および関係するトロンビン活性に、ならびにトロンビンによるフィブリノーゲンの切断を阻害するためのまたは修飾するための化合物、特にペプチドおよびポリペプチドの調製に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、トロンビンのエキソサイトＩＩに結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、血餅関連フィブリン、好ましくはフィブリノーゲンγ’のトロンビンのエキソサイトＩＩへの結合を競合的に阻害する、請求項１〜２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１ａまたは配列番号１ｂの少なくとも１つの残基は、硫酸化チロシン残基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１ａにおける１１位のチロシンは、硫酸化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されている、または配列番号１ｂにおける７位のチロシンは、硫酸化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
式１：
Ａ−Ｂ
のトロンビン阻害剤であって、
Ａは、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するために前記トロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｋの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
ＡおよびＢは、Ｂが前記トロンビン活性部位に結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤。
【請求項９】
Ａは、ＢのＮ末端に位置する、請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１０】
Ｂは、ＡのＮ末端に位置する、請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１１】
式２：
Ａ−Ｂ−Ｃ
のトロンビン阻害剤であって、
Ａは、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するために前記トロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｋの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂが前記トロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤。
【請求項１２】
Ａは、ＣのＮ末端に位置する、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１３】
Ｃは、ＡのＮ末端に位置する、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１４】
式３：
Ａ−Ｃ−Ｂ
のトロンビン阻害剤であって、
Ａは、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するために前記トロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｋの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂが前記トロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤。
【請求項１５】
Ａは、ＢのＮ末端に位置する、請求項１４に記載の阻害剤。
【請求項１６】
Ｂは、ＡのＮ末端に位置する、請求項１４に記載の阻害剤。
【請求項１７】
式４：
Ｂ−Ａ−Ｃ
のトロンビン阻害剤であって、
Ａは、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するために前記トロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｋの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂが前記トロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤。
【請求項１８】
Ｂは、ＣのＮ末端に位置する、請求項１７に記載の阻害剤。
【請求項１９】
Ｃは、ＢのＮ末端に位置する、請求項１７に記載の阻害剤。
【請求項２０】
前記阻害剤は、前記ペプチドおよびヒルジンのモル等量ベースでヒルジンより少なくとも２０％短い出血時間を提供する、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２１】
前記阻害剤は、前記ペプチドおよびヒルジンのモル等量ベースでヒルジンより少なくとも２０％短い凝固時間を提供する、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２２】
薬学的に有効なキャリヤ、希釈剤、または賦形剤と一緒に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載のトロンビン阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜７のペプチドまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載のトロンビン阻害剤をコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含むベクターまたは発現構築物。
【請求項２５】
請求項２３に記載の核酸または請求項２４に記載のベクターもしくは構築物を含む細胞。
【請求項２６】
前記細胞は、チロシン残基の硫酸化を可能にするチロシルプロテインスルホトランスフェラーゼを含む、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
血栓溶解療法において使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載のトロンビン阻害剤または請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記血栓溶解療法は、ｔＰＡ療法を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載のトロンビン阻害剤または請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳卒中および関係する疾患の処置に、フィブリン血餅形成および関係するトロンビン活性に、ならびにトロンビンによるフィブリノーゲンの切断を阻害するためのまたは修飾するための化合物、特にペプチドおよびポリペプチドの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるいかなる先行技術への参照も、この先行技術が、オーストラリアまたは任意の他の管轄区域においてありふれた一般知識の一部を形成するということの認識または何らかの暗示として解釈されず、また解釈されるべきではない。
【０００３】
虚血性脳卒中は、脳循環内での血餅または塞栓の発生によって引き起こされ、世界的には３番目に多い死因である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１４）。脳卒中イベントは、さらに、世界中で、能力障害になってしまう主な原因になっており、時間がかかり、多資源投入型で、かつ費用のかかるリハビリテーションプログラムに関連する（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１４）。
【０００４】
現在、虚血性の脳の迅速な再灌流を促進し、それによって脳卒中イベントを最小限にする脳卒中のための唯一の承認されている薬理学的療法は、血栓溶解剤である組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の静脈内（ｉ．ｖ．）送達である。ｔＰＡは、プラスミノーゲンを活性化してプラスミンにし、プラスミンは、続いて、フィブリンおよび他の血餅関連タンパク質を分解し、それによって、冒された血管を通る血流を改善する（Ｗａｒｄｌａｗ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００５】
臨床での使用が広く普及しているにもかかわらず、ｔＰＡベースの療法は、効能および適用の両方において多くの限界を有する。ｔＰＡ療法後に動脈が完全に再疎通する患者は、わずか２０〜３０％であり、これらの患者のうちの２０〜３０％は、再閉塞を経験するであろうということが特に懸念されている（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ  ＡＶ，Ｇｒｏｔｔａ  ＪＣ．，２００２；Ｒｕｂｉｅｒａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。この問題は、ｔＰＡによって誘導されるプラスミンが血餅中のフィブリンを分解するものの、フィブリノーゲンのフィブリンへの切断のための活性を保持する血餅関連トロンビンから生じると考えられる。
【０００６】
さらなる懸念は、ｔＰＡ療法に関連する頭蓋内出血（ＩＣＨ）の発生率の増加が観察されていることであり、これは、血栓溶解療法のために与えられるｔＰＡの用量を事実上制限する（Ｍｏｌｉｎａ  ＣＡ，Ｓａｖｅｒ  ＪＬ．，２００５）。
【０００７】
ｔＰＡ療法の深刻な限界は、改善された血栓溶解療法の開発への新たな関心の引き金となった。
【０００８】
トロンビンは、主に不溶性のフィブリンの産生を介した血餅形成において中心的な役割を果たす。そのため、トロンビン阻害剤は、ｔＰＡと共に補助療法として使用するための有望な候補として現れた。
【０００９】
現在までに、間接トロンビン阻害剤であるヘパリン（Ｖｏｎ  Ｋｕｍｍｅｒ  Ｒ  ２００４；Ｊａｎｇ  Ｉ−Ｋ  １９９９）ならびに直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）であるヒルジン（Ｋａｒａｂｉｙｉｋｏｇｌｕ  Ｍ  ２００４）およびアルガトロバン（Ｂａｒｒｅｔｏ  ＡＤ  ２０１２）が調査された。血管再疎通における全体的な改善が観察された一方、出血および徴候的なＩＣＨの危険性が、これらの共同療法により増加した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
虚血性脳卒中の予後を改善するために使用することができるトロンビン阻害剤が必要とされる。
【００１１】
虚血性脳卒中の予後を改善するためにｔＰＡと共に使用することができるトロンビン阻害剤もまた、必要とされる。
【００１２】
他の血栓形成性疾患または凝固性障害を改善するために使用することができるトロンビン阻害剤もまた、必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記に言及される必要または限界の１つまたはそれ以上について扱おうと試みるものであり、一実施形態では、配列番号１ａにおいて示されるアミノ酸配列：
ＰＸＹＸＸＸＺＺＰＸＹＺＺＺ
または配列番号１ｂにおいて示されるアミノ酸配列：
ＺＸＺＹＺＸＹＺＸＸＸ
を含むペプチドであって、
Ｚは、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、またはＰであり、
Ｘは、任意のアミノ酸である、ペプチドを提供する。
【００１４】
ペプチドは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示されるアミノ酸配列からなってもよい。
【００１５】
好ましくは、ペプチドは、トロンビンのエキソサイトＩＩに結合する。
【００１６】
より好ましくは、ペプチドは、血餅関連フィブリン、好ましくはフィブリノーゲンγ’のトロンビンのエキソサイトＩＩへの結合を競合的に阻害する。
【００１７】
一実施形態では、ペプチドは、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｇｐ１ｂα、コンドロイチン硫酸、およびヘパリンからなる群から選択される化合物のトロンビンのエキソサイトＩＩへの結合を阻害してもよい。
【００１８】
典型的に、ペプチドの少なくとも１つの残基は、硫酸化チロシン残基である。
【００１９】
好ましくは、配列番号１ａにおける１１位のチロシンは、硫酸化されている。配列番号１ａにおける３位のチロシンは、硫酸化されていなくてもよい。
【００２０】
好ましくは、配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されている。配列番号１ｂにおける７位のチロシンは、硫酸化されていなくてもよい。
【００２１】
好ましくは、配列番号１ｂにおける７位のチロシンは、硫酸化されている。配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されていなくてもよい。
【００２２】
別の実施形態では、配列番号１ａにおける１１位のチロシンは、硫酸化されており、３位のチロシンは、硫酸化されている。
【００２３】
別の実施形態では、配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されており、７位のチロシンは、硫酸化されている。
【００２４】
別の実施形態では、式１のトロンビン阻害剤：
Ａ−Ｂ
であって、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示される配列を有するペプチドであり、上記に記載される１つまたはそれ以上の結合特徴を有し；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ：
ＬＴＹＴＤ
または配列番号１０ｂ：
ＶＶＹＴＤ
または配列番号１０ｃ：
ＤＰＧＲＲＬＧＥ
または配列番号１０ｄ：
ＶＡＥＰＫＭ
または配列番号１０ｅ：
ＥＩＰＧＩＲ
または配列番号１０ｆ：
ＰＴＡＫＰＲ
または配列番号１０ｇ：
ＲＡＬＨＶＫ
または配列番号１０ｈ：
ＥＰＡＫＰＲ
または配列番号１０ｉ：
ＰＲＧＧＰＫ
または配列番号１０ｊ：
ＴＬＩＳＡＲ
において示される配列を有するペプチドであり；
ＡおよびＢは、Ｂがトロンビン活性部位に結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤が提供される。
【００２５】
領域Ａは、ＢのＮ末端に位置してもよい。別の実施形態では、Ｂは、ＡのＮ末端に位置する。
【００２６】
別の実施形態では、式２のトロンビン阻害剤：
Ａ−Ｂ−Ｃ
であって、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示される配列を有するペプチドであり、上記に記載される１つまたはそれ以上の結合特徴を有し；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ：
ＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＱ
または配列番号１１ｂ：
ＥＤＹＡＡＩＥＡＳＬＳＥＴＦ
または配列番号１１ｃ：
ＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬＤＤＥＳ
において示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂがトロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤が提供される。
【００２７】
領域Ａは、ＣのＮ末端に位置してもよい。別の実施形態では、Ｃは、ＡのＮ末端に位置する。
【００２８】
別の実施形態では、式３のトロンビン阻害剤：
Ａ−Ｃ−Ｂ
であって、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示される配列を有するペプチドであり、上記に記載される１つまたはそれ以上の結合特徴を有し；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つの配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂがトロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤が提供される。
【００２９】
領域Ａは、ＢのＮ末端に位置してもよい。別の実施形態では、Ｂは、ＡのＮ末端に位置する。
【００３０】
別の実施形態では、式４のトロンビン阻害剤：
Ｂ−Ａ−Ｃ
であって、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示される配列を有するペプチドであり、上記に記載される１つまたはそれ以上の結合特徴を有し；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂがトロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている、トロンビン阻害剤が提供される。
【００３１】
領域Ｂは、ＣのＮ末端に位置してもよい。別の実施形態では、Ｃは、ＢのＮ末端に位置する。
【００３２】
一実施形態では、式１または式２または式３または式４のペプチドは、ペプチドおよびヒルジンのモル等量ベースでヒルジンより少なくとも２０％短い凝固時間を提供する。
【００３３】
好ましくは、式１または式２または式３または式４のペプチドは、ペプチドおよびヒルジンのモル等量ベースでヒルジンより少なくとも２０％短い出血時間を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、上記に概論的に記載される配列番号１ａもしくは配列番号１ｂのペプチドまたは上記に記載される式１もしくは式２もしくは式３もしくは式４のペプチドおよび薬学的に有効なキャリヤ、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００３５】
別の実施形態では、上記に概論的に記載される配列番号１ａもしくは配列番号１ｂのペプチドまたは上記に記載される式１もしくは式２もしくは式３もしくは式４のペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸、好ましくはｃＤＮＡならびに前記核酸を含有するベクター、発現構築物、および細胞が提供される。
【００３６】
好ましくは、細胞は、チロシンの硫酸化を可能にするスルホトランスフェラーゼを含有する。
【００３７】
一実施形態では、スルホチロシンは、アンバーコドン抑制によって本発明によるペプチドの中に遺伝学的に組み込まれる。
【００３８】
別の実施形態では、血栓溶解療法において使用するための、上記に概論的に記載される配列番号１ａもしくは配列番号１ｂのペプチドまたは上記に記載される式１もしくは式２もしくは式３もしくは式４のペプチドまたは上記に記載される医薬組成物が提供される。
【００３９】
好ましくは、血栓溶解療法は、ｔＰＡ療法を含む。
【００４０】
より好ましくは、血栓溶解療法は、虚血性脳卒中の予後を最小化するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】硫酸化されたトロンビン阻害剤が、強力なインビボ抗凝固活性を持つことを示す図である。ａ）様々な濃度のヒルジンおよび二重に硫酸化されたトロンビン阻害剤によるインビトロＡＰＴＴアッセイ；ｂ）ヒルジンおよび硫酸化されたトロンビン阻害剤（ともに１ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）の投与の後の血栓体積の低下；ｃ）尾出血モデルにおけるヒルジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）および硫酸化されたトロンビン阻害剤ペプチド（０．５ｍｇ／ｋｇ）の等モル濃度の送達後の出血時間；ｄ）血管を針により損傷させた後のヒルジンおよび硫酸化されたトロンビン阻害剤（ともに１ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）の投与の後のフィブリンの低下；ｅ）血管を針により損傷させた後のヒルジン（１ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）および硫酸化されたトロンビン阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）の投与による血小板血栓（赤色）およびフィブリン（黄色）の低下を示す代表的な共焦点画像。
【図２】生の阻害データを添えた、硫酸化されたトロンビン阻害剤の阻害定数（Ｋｉ）の表を示す図である。
【図３】Ａ）ＡＡａ（３１〜６１）断片８８の分析用ＵＰＬＣ：Ｒｔ１．５０分（３分間０〜６０％  Ｂ、溶出液Ｂ、γ＝２３０ｎｍ）；Ｂ）８８の質量スペクトル（ＥＳＩ＋）：（中性）Ｃ１４３Ｈ２２５Ｎ３９Ｏ５６Ｓ２についての計算質量［Ｍ］：３４４９．５，［Ｍ＋２Ｈ］２＋：１７７７．７（１００％），［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１１８５．５（１００．０％）；実測質量（ＥＳＩ＋）［Ｍ＋２Ｈ］２＋：１７７８．０，［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１１８５．６．
【図４】Ａ）ＡＡａ（１〜３０）断片８７の分析用ＵＰＬＣ：Ｒｔ１．５５分（３分間０〜６０％  Ｂ、溶出液Ｂ、γ＝２３０ｎｍ）；Ｂ）８７の質量スペクトル（ＥＳＩ＋）：（中性）Ｃ１４２Ｈ２１０Ｎ３３Ｏ６１Ｓについての計算質量［Ｍ］：３３８６．４，［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１１５０．８（１００％），［Ｍ＋４Ｈ］４＋：８６３．６（１００．０％）；実測質量（ＥＳＩ＋）［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１１５１．０，［Ｍ＋４Ｈ］４＋：８６３．５．
【図５】Ａ）対応するライゲーション産物９５を得るためのＣ−末端ＡＡａ（３１〜６１）断片８７およびＡＡａ（１〜３０）ペプチドチオエステル８６の間のライゲーション反応の粗ＵＰＬＣ−ＭＳ分析（λ＝２３０ｎｍ）。９５について計算した質量（相対存在量１００％）［Ｍ＋４Ｈ］４＋：１６８３．２，［Ｍ＋５Ｈ］５＋：１３４６．７，実測質量（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋：１６８３．３，［Ｍ＋５Ｈ］５＋：１３４７．１．Ｂ）対応する二硫酸ＡＡａ（８６）を得るための１６時間後のライゲーション産物９５のインサイツ脱硫反応の粗ＵＰＬＣ−ＭＳ分析。８６について計算した質量（相対存在量１００％）［Ｍ＋４Ｈ］４＋：１６７５．２，［Ｍ＋５Ｈ］５＋：１３４０．４，［Ｍ＋６Ｈ］６＋：１１１７．１，実測質量（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋：１６７５．８，［Ｍ＋５Ｈ］５＋：１３４０．９，［Ｍ＋６Ｈ］６＋：１１１７．３．
【図６】Ａ）二重に硫酸化されたＡＡａ（８６）の分析用ＵＰＬＣ：Ｒｔ１．８９分（３分間０〜６０％  Ｂ、溶出液Ｂ、γ＝２１４ｎｍ）；Ｂ）８６の質量スペクトル（ＥＳＩ＋）：プロトン化（中性）Ｃ２７５Ｈ４１６Ｎ７２Ｏ１１９Ｓ２についての計算質量［Ｍ］：６６９６．８，［Ｍ＋３Ｈ＋Ｎａ］４＋：１６８０．７（１００％），［Ｍ＋３Ｈ＋２Ｎａ］５＋：１３４９．２（１００．０％）；実測質量（ＥＳＩ＋）［Ｍ＋３Ｈ＋Ｎａ］４＋：１６８１．１，［Ｍ＋３Ｈ＋２Ｎａ］５＋：１３４９．５．［Ｃ２７５Ｈ４１６Ｎ７２Ｏ１１９Ｓ２−Ｈ］−について計算したＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）６６９７．７８９（平均），実測６６９８．２９５．
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、特に、凝固カスケードの内因性構成成分のトロンビンのエキソサイトＩＩへの結合の阻害に関する。トロンビンエキソサイトＩＩに結合し、かつこれらの構成成分のうちのいくつかを競合的に阻害するペプチドが、本明細書において開示される。
【００４３】
これらのペプチド阻害剤は、血餅関連トロンビンによるフィブリン形成を阻害するために利用されてもよく、それによって、ｔＰＡ療法に関連する再疎通に関する問題のうちのいくつかを扱うことが提唱される。ペプチド阻害剤はまた、トロンビン活性部位またはトロンビンエキソサイトＩに結合し、かつその機能をブロックする他のペプチドの結合親和性および／または機能を修飾するために使用されてもよい。
【００４４】
Ａ．定義
「トロンビン」は、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を通して止血において中心的な役割を有するセリンプロテアーゼである。
【００４５】
「トロンビン活性部位」は、フィブリノーゲン、フィブリノペプチド、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）、糖タンパク質Ｖ、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、ＡＤＡＭＴＳ１３、プロテインＣを含む一連の基質を切断する触媒部位である。
【００４６】
「トロンビンエキソサイトＩＩ」（「ヘパリン結合エキソサイト」としても知られている）は、基質および補因子、特にフィブリノーゲン、Ｇｐ１ｂα、およびヘパリンの結合に影響を及ぼす、正に荷電している認識表面である。トロンビンエキソサイトＩＩは、残基Ｒ９３、Ｒ１０１、Ｒ１２６、Ｋ２３６、Ｋ２４０、およびＲ２３３を含んでいてもよい。
【００４７】
「トロンビンエキソサイトＩ」（「フィブリノーゲン結合エキソサイト」としても知られている）は、基質および補因子、特にフィブリノーゲン、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、ＡＤＡＭＴＳ１３、第ＸＩＩＩ因子、ＰＡＲ−１、第ＸＩ因子、およびトロンボモジュリンの結合に影響を及ぼす、正に荷電している認識表面である。トロンビンエキソサイトＩは、残基Ｋ３６、Ｈ７１  Ｒ７３、Ｒ７５、Ｙ７６、およびＲ７７を含んでいてもよい。
【００４８】
トロンビン活性部位ならびにエキソサイトＩおよびＩＩを含むトロンビンは、Ｌａｎｅ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｂｌｏｏｄ  Ｊ．１０６：２６０５−２６１２において概論的に議論される。
【００４９】
「硫酸化チロシン残基」および「チロシン−Ｏ−硫酸」は、硫黄含有基のチロシンのヒドロキシル側鎖への移動から生じる残基である。残基は、チロシルプロテインスルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）の作用から生じてもよい。
【００５０】
「出血時間」は、一般に、出血を停止させるために必要とされる時間を指す。それは、血小板機能を判断するために臨床的に利用されてきた。出血時間を判断するための一連のアッセイは、当技術分野において知られている：全般的にＧｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ  ａｎｄ  Ｈａｅｍ  ８：２８２０−２８２２；Ｌｉｕ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２０１２  ＷＪＥＭ  ２：３０−３６；Ｂｒｏｚｅ  Ｇ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ  ２００１  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８５：７４７−７４８を参照。
【００５１】
「凝固時間」は、一般に、フィブリン血餅の形成に必要とされる時間を指す。典型的に、凝固時間は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験によって判断される。
【００５２】
「ヒルジン」は、６５アミノ酸から構成される低分子量ペプチド（７ｋＤａ）であり（Ｄｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１６５：１８０−４）、これは、エキソサイトＩおよびトロンビン活性部位に結合することによって血液が凝固するのを予防する（Ｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ，１９８６  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５：４６２２−２８）。
【００５３】
「含む」ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などのようなその用語の変形は、さらなる付加物、構成要素、整数、またはステップを除外することを意図するものではない。
【００５４】
Ｂ．エキソサイトＩＩ阻害剤
一実施形態では、配列番号１ａにおいて示されるアミノ酸配列
ＰＸＹＸＸＸＺＺＰＸＹＺＺＺ
を含むまたはそれからなるペプチドであって、
Ｚは、ＤまたはＥであり、
Ｘは、任意のアミノ酸である、ペプチドが提供される。
【００５５】
ペプチドは、
配列番号２（ＰＢＹＸＸＧＺＺＰＸＹＺＺＺ  ＺはＤ／Ｅであり、ＢはＫ／Ｒ／Ｈであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号３（ＰＱＹＪＸＧＺＺＰＯＹＺＺＺ  ＺはＤ／Ｅであり、ＪはＡ／Ｔ／ＳまたはＧであり、ＯはＳまたはＴであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号４（ＰＱＹＡＸＧＺＺＰＯＹＺＺＺ  ＺはＤ／Ｅであり、ＯはＳ／Ｔであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号５（ＰＱＹＡＸＧＺＺＰＯＹＺＺＺＸＸＸＸＺＸＸ  ＺはＤ／Ｅであり、ＯはＳ／Ｔであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号６（ＰＱＹＡＸＧＺＺＰＯＹＺＺＺ（Ｄ／Ｔ）（Ｄ／Ｇ／Ｆ）（Ｄ／Ａ）（Ｓ／Ｄ／Ｅ）（Ｄ／Ｅ）（Ｋ／Ｐ／Ｓ）（Ｌ／Ｖ）  ＺはＤ／Ｅであり、ＯはＳ／Ｔであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号７（ＰＱＹＡＸＧＺＺＰＯＹＺＺＺＤＤＤＤＤ（Ｋ／Ｐ／Ｓ）（Ｌ／Ｖ）  ＺはＤ／Ｅであり、ＯはＳ／Ｔであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号８（ＰＱＹＡＸＧＺＺＰＯＹＺＺＺＤＤＤＥＥ（Ｋ／Ｐ／Ｓ）（Ｌ／Ｖ）  ＺはＤ／Ｅであり、ＯはＳ／Ｔであり、Ｘは任意のアミノ酸である。）
配列番号８ａ（ＰＱＹＡＰＧＤＥＰＳＹＤＥＤ）
配列番号８ｂ（ＰＱＹＡＰＧＥＥＰＳＹＤＥＤ）
配列番号８ｃ（ＰＱＹＴＨＧＥＥＰＥＹＤＥＤ）
配列番号８ｄ（ＰＱＹＡＱＧＥＥＰＴＹＤＥＤ）
配列番号８ｅ（ＰＱＹＡＲＧＤＶＰＴＹＤＥＥ）
において示される配列を有していてもよい。
【００５６】
別の実施形態では、配列番号１ｂにおいて示されるアミノ酸配列
ＺＸＺＹＺＸＹＺＸＸＸ
を含むまたはそれからなるペプチドであって、
Ｚは、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、またはＰであり、
Ｘは、任意のアミノ酸である、ペプチドが提供される。
【００５７】
ペプチドは、
配列番号１２（ＤＡＤＹＤＥＹＥＥＤＧ）
配列番号１３（ＤＧＤＹＤＥＹＤＮＤＥ）
配列番号１４（ＱＧＤＹＤＥＹＤＱＤＥ）
配列番号１５（ＤＡＤＹＤＤＹＤＥＥＧ）
配列番号１６（ＤＶＳＹＤＥＹＥＤＮＧ）
配列番号１７（ＱＤＤＹＤＥＹＤＡＤＥ）
配列番号１８（ＥＴＤＹＤＥＹＥＥＮＥ）
配列番号１９（ＥＳＤＹＤＴＹＰＤＤＮ）
配列番号２０（ＤＤＥＹＤＭＹＥＳＤＧ）
配列番号２１（ＥＴＳＹＥＥＹＰＤＤＳ）
配列番号２２（ＥＳＤＹＤＴＹＰＤＤＮ）
配列番号２３（ＥＲＤＤＥＤＹＤＮＳＮ）
配列番号２４（ＺＸＺＹＺＺＹＺＺＺＺ  ＺはＤ／Ｅであり、ＸはＴ／Ｍ／Ｅ／Ｓ／Ｄ／Ｇ／Ｎ／Ｐである）
配列番号２５  ＺＳＺＹＺＴＹＰＤＤＮ  ＺはＤ／Ｅである）
配列番号２６  ＺＤＺＹＺＭＹＥＳＤＧ  ＺはＤ／Ｅである）
配列番号２７  ＺＴＳＹＺＥＹＰＤＤＳ  ＺはＤ／Ｅである）
配列番号２８  ＺＳＺＹＺＴＹＰＤＤＮ  ＺはＤ／Ｅである）
において示される配列を有していてもよい。
【００５８】
一実施形態では、ペプチドは、約３５アミノ酸以上、好ましくは約３０〜３５アミノ酸、より好ましくは約３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸からなる。
【００５９】
好ましくは、ペプチドは、トロンビンのエキソサイトＩＩに結合する。
【００６０】
ペプチドは、血餅関連フィブリン、好ましくはフィブリノーゲンγ’のトロンビンのエキソサイトＩＩへの結合を競合的に阻害してもよい。ペプチドは、フィブリノーゲンγ’よりトロンビンのエキソサイトＩＩに対して高い親和性を有していてもよい。これは、ペプチドが、ｔＰＡ血栓溶解療法の対象において、血餅から血餅関連トロンビンを表面に（ｏｓｔｅｎｓｉｂｌｙ）溶出させ、それによって、そうでなければｔＰＡ療法に関連する再疎通の低下の発生率を最小限にするのを可能にすると思われる。
【００６１】
一実施形態では、ペプチドは、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｇｐ１ｂα、コンドロイチン硫酸、およびヘパリンからなる群から選択される化合物のトロンビンのエキソサイトＩＩへの結合を阻害してもよい。
【００６２】
典型的に、ペプチドの少なくとも１つの残基は、硫酸化チロシン残基である。
【００６３】
好ましくは、配列番号１ａにおける１１位のチロシンは、硫酸化されている。配列番号１ａにおける３位のチロシンは、硫酸化されていなくてもよい。
【００６４】
別の実施形態では、配列番号１ａにおける１１位のチロシンは、硫酸化されており、３位のチロシンは、硫酸化されている。
【００６５】
本明細書の実施例において記載されるように、どちらかまたは両方のチロシン残基の硫酸化は、トロンビン活性の阻害における改善に関連する。
【００６６】
好ましくは、配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されている。配列番号１ｂにおける７位のチロシンは、硫酸化されていなくてもよい。
【００６７】
好ましくは、配列番号１ｂにおける７位のチロシンは、硫酸化されている。配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されていなくてもよい。
【００６８】
別の実施形態では、配列番号１ｂにおける４位のチロシンは、硫酸化されており、７位のチロシンは、硫酸化されている。
【００６９】
チロシン残基の硫酸化は、チロシルプロテインスルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）を含有する細胞において配列番号１ａまたは配列番号１ｂのペプチドをコードする核酸を発現することによって実現することができる。より詳細には、無機硫酸は、それぞれＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳキナーゼによって、アデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）および３’−ホスホ−アデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）の形態で活性化されてもよい。次いで、活性化された硫酸は、ゴルジ体においてＴＰＳＴによってチロシンに移されてもよい。
【００７０】
本発明によるペプチドにおける硫酸化チロシン残基を得る別のアプローチは、ペプチドの組換え合成の間にスルホチロシンがペプチドの中に組み込まれるのを可能にするアンバーコドン抑制を伴う組換え発現系を利用することである。
【００７１】
本明細書における実施例において、本発明者らは、硫酸化ペプチドの均一の組成物（すなわち、たった１つの硫酸化プロファイルしか有していないペプチドを含有する組成物）の産生を可能にする合成法を提供する。
【００７２】
本明細書において記載されるエキソサイトＩＩ阻害剤は、Ｌｏｖｅｌｙ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．２００２において記載されるように、トロンビン／γ’ペプチド結合アッセイを利用することによってトロンビンエキソサイトＩＩに結合する特異性について試験されてもよい。手短かに言えば、エキソサイトＩＩ阻害剤もしくはバインダーまたは推定上のエキソサイトＩＩ阻害剤もしくはバインダーを標識し、トロンビンと共にインキュベートし、蛍光偏光を測定する。アッセイは、それぞれのエキソサイトＩＩ結合ペプチドの阻害定数の決定を可能にするために競合的阻害剤モデルにおいて使用することができる。
【００７３】
上記に記載されるように、虚血性脳卒中のためのｔＰＡ療法を受ける患者の少なくとも２０〜３０％は、ｔＰＡ療法後に動脈が完全に再疎通し、これらのうち、２０〜３０％は、再閉塞を経験するであろう。これは、ｔＰＡ療法により、エキソサイトＩＩを介して血餅に結合していると理解されている、血餅に閉じ込められたトロンビンが現れる場合に生じ、トロンビンの活性部位がフィブリノーゲンおよびフィブリノペプチドを切断して、血餅を増幅し、構築するのを可能にすると考える人もいる。本明細書において記載されるエキソサイトＩＩ阻害剤は、フィブリン血餅からの血餅関連トロンビンの溶出を可能にし、それによって、そうでなければフィブリン産生および血餅拡大を引き起こすと思われる血餅のトロンビンの量を最小限にするために、ｔＰＡ療法を受けている個人に対して提供される。
【００７４】
したがって、一実施形態では、ｔＰＡ療法の方法において、本明細書において記載されるトロンビンのエキソサイトＩＩ阻害剤を治療有効量で提供するステップが提供される。
【００７５】
典型的に、トロンビンのエキソサイトＩＩ阻害剤は、ｉ．ｖ．投与に適した組成物の形態で提供される。
【００７６】
典型的に、トロンビンのエキソサイトＩＩ阻害剤は、レシピエントについて約１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの量で提供される。
【００７７】
Ｃ．トロンビン阻害剤
さらなる実施形態では、本発明は、トロンビン活性の新規な阻害剤、特に、トロンビンによるフィブリノーゲンまたはフィブリノペプチドの切断を予防するまたは少なくとも最小限にする阻害剤の設計、修飾、および／または産生のための、本明細書において開示されるエキソサイトＩＩ結合ペプチドの利用に関する。これらのエキソサイトＩＩ結合ペプチドは、トロンビン活性部位へのおよび／またはエキソサイトＩへの結合について改善された親和性を有する阻害剤を提供してもよい。
【００７８】
トロンビン阻害剤は、式１：
Ａ−Ｂ
によって説明されてもよく、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示され、上記に概論的に記載される配列を有するエキソサイトＩＩ結合ペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
ＡおよびＢは、Ｂがトロンビン活性部位に結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている。
【００７９】
Ａは、ＢのＮ末端に位置してもよいまたはその代わりにＢは、ＡのＮ末端に位置してもよいことが理解されるであろう。
【００８０】
さらなる実施形態では、トロンビン阻害剤は、式２：
Ａ−Ｂ−Ｃ
によって説明されてもよく、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示され、上記に概論的に記載される配列を有するエキソサイトＩＩ結合性ペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂがトロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている。
【００８１】
Ａは、ＣのＮ末端に位置してもよいまたはその代わりにＣは、ＡのＮ末端に位置してもよいことが理解されるであろう。
【００８２】
さらなる実施形態では、トロンビン阻害剤は、式３：
Ａ−Ｃ−Ｂ
によって説明されてもよく、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示され、上記に概論的に記載される配列を有するエキソサイトＩＩ結合ペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂがトロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている。
【００８３】
Ａは、ＢのＮ末端に位置してもよいまたはその代わりにＢは、ＡのＮ末端に位置してもよいことが理解されるであろう。
【００８４】
さらなる実施形態では、トロンビン阻害剤は、式４：
Ｂ−Ａ−Ｃ
によって説明されてもよく、
Ａは、配列番号１ａまたは配列番号１ｂにおいて示され、上記に概論的に記載される配列を有するエキソサイトＩＩ結合ペプチドであり；
Ｂは、トロンビン活性部位がフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するのを予防するためにトロンビン活性部位に結合するための配列番号１０ａ〜１０ｊの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ｃは、トロンビンのエキソサイトＩに結合するための配列番号１１ａ〜１１ｃの１つにおいて示される配列を有するペプチドであり；
Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂがトロンビン活性部位に結合し、ＣがトロンビンのエキソサイトＩに結合した場合に、ＡがトロンビンのエキソサイトＩＩに結合するのを可能にするように連結されている。
【００８５】
Ｂは、ＣのＮ末端に位置してもよいまたはその代わりにＣは、ＢのＮ末端に位置してもよいことが理解されるであろう。
【００８６】
式１〜４のトロンビン阻害剤は、Ｂ（活性部位結合ペプチド）をＡ（エキソサイトＩＩ結合ペプチド）と；またはＢ（活性部位結合ペプチド）をＣ（エキソサイトＩ結合ペプチド）と；またはＡ（エキソサイトＩＩ結合ペプチド）をＣ（エキソサイトＩ結合ペプチド）と連結する、ペプチド配列（たとえば、ＧｌｙおよびＡｌａなどのような２つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチド）または他のポリマー（たとえばジエチレングリコールリンカー）の形態をしたリンカーを含んでいてもよい。ペプチド配列の例は、ポリＡｌａまたはポリＧｌｙペプチドを含む。リンカーペプチドの長さは、関係のあるトロンビン部位の間の分子の距離によって決定されてもよい。これらの分子の距離は、以下のとおりである：（ｉ）トロンビン活性部位〜エキソサイトＩＩ：３８〜６０オングストローム；（ｉｉ）トロンビン活性部位〜エキソサイトＩ：２７〜４０オングストローム；（ｉｉｉ）エキソサイトＩＩ〜エキソサイトＩ：６５〜１００オングストローム。
【００８７】
上記に記載される阻害剤は、固相ペプチド合成によって調製されてもよい。たとえば、式１の阻害剤は、Ａの固相合成、所望のチロシン硫酸化プロファイルを保持するためのＡの選択的な脱硫、Ｂの固相合成、ならびにＡのＢへのライゲーションまたは最終ステップにおける代わりとして、ＡのリンカーへのライゲーションおよびＡリンカー−Ｂコンジュゲートを形成するためのＡ−リンカーコンジュゲートのＢへのライゲーションのステップを含む方法によって調製されてもよい。
【００８８】
他の実施形態では、阻害剤は、組換えＤＮＡ技術によって合成されてもよい。この技術において使用される細胞株は、（ｉ）無機硫酸の存在下において成長することができ、（ｉｉ）無機硫酸を生物系、特にチロシン残基の翻訳後修飾を伴う系の中に同化して取り込むことができることが特に好ましい。そのような細胞株は、一般に、ゴルジ体にチロシルプロテインスルホトランスフェラーゼを含み、１つまたはそれ以上のチロシン−Ｏ−硫酸残基の形成を可能にする。ある実施形態では、発現産物は、チロシン硫酸化パターンに関して不均一であってもよい。チロシン硫酸化アイソフォームの均一な集団は、チロシン硫酸化表現型に基づいてアイソフォームの区別を可能にする、クロマトグラフィー系を含む様々な分離系で発現産物を精製することによって得ることができる。
【００８９】
本明細書において記載される阻害剤は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、レプチラーゼ、ならびに血液凝固カスケード由来の第Ｘａ因子および活性化プロテインＣを含むプロテアーゼのパネルに対するカウンタースクリーニングによって、トロンビン選択性について調査されてもよい。阻害剤は、上記に記載されるように、蛍光偏光アッセイを使用して、単一濃度（５μＭ）で最初にスクリーニングされる。
【００９０】
本明細書において記載される阻害剤によるトロンビンの認識および阻害についての分子的詳細は、トロンビンとのそれらの複合体の三次元構造を解析することによって決定されてもよい。手短かに言えば、トロンビン−阻害剤複合体を、インビトロにおいて調製し、結晶化条件のための広範囲な超微量（ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｌｉｔｒｅ  ｓｃａｌｅ）スクリーニングにかける。予備的条件は、特注のグリッドスクリーニングを使用して改良を加え、最適化する。凍結保護条件の決定および初期サンプルキャラクタリゼーションは、Ｘ線回折計を使用して実行する。高分解能Ｘ線回析データは、高輝度シンクロトロン放射光源で収集し、結果として生じるモデルにおいて十分な詳細度を確実にする。構造は、コンピュータープラットフォームを使用して、サーチモデルとしてリガンド非結合ヒトトロンビンの座標を使用する分子置換法によって解析し、精密化し、情報を読み取る。これらのデータは、阻害剤の結合モードについての詳細を提供し、トロンビンとの鍵となる相互作用を明らかにする。
【００９１】
本明細書において開示されるトロンビン阻害剤の抗凝固活性は、臨床ＴＴアッセイを使用してインビトロにおいてヒト血漿の凝固を延長する能力を測定することによって決定される。手短かに言えば、健康なドナー由来のヒト血漿（８００μＬ）をある濃度範囲の阻害剤と混合し、凝固をトロンビンの追加によって開始し、凝固時間を凝固計を使用して測定する。５０ｎＭの濃度で≧３０秒間まで凝固時間を延長する化合物は、ＡＰＴＴについてインビトロにおいて／エクスビボにおいてさらに調査されてもよい。手短かに言えば、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス由来のクエン酸塩添加血漿のプールを、様々な濃度（０〜１２μｇ／ｍＬ）の阻害剤と共にあらかじめインキュベートする。それぞれの血漿サンプルのＡＰＴＴを、凝固活性化因子およびＣａＣｌ２の追加後に定量化する。エクスビボアッセイでは、マウスに阻害剤（インビトロＡＰＴＴから決定された固定濃度）をｉ．ｖ．注射し、投与の０、５、３０、および６０分後に全血をクエン酸ナトリウムの中に収集する（約１３０μＬ）。ＡＰＴＴは、ＲＡＮＤＯＸ  ＡＰＴＴキットを使用して、単離した血漿について定量化し、凝固時間を測定するためにフィブリン生成をモニターする。
【００９２】
本発明者らは、実施例において、上記に記載されるエキソサイトＩＩ結合ペプチドを有するポリペプチドが、強力なインビボ抗血栓活性を持ち、既知の抗凝固薬と比較して、凝固時間が低下し、かつ出血時間が低下することを示す。多くの抗血栓性の薬剤が、出血の危険性（脳卒中療法における脳内出血を含む）のためにそれらの使用が限られているので、これは有利である。
【００９３】
出血の危険性が抗凝固療法を受けている患者において著しく増加するので、出血時間は、臨床的に重要な問題である。特に、ヒルジンを含む既知の抗凝固薬によって引き起こされる出血に対抗して利用可能な、有効な処置はない。そのため、出血時間を低下させる薬剤の必要がある。
【００９４】
本発明者らは、本発明による硫酸化されたポリペプチドが、既知の凝血薬ヒルジンと比較して、出血が著しく少ないことを表す驚くべき効果を実証する。
【００９５】
一実施形態では、本発明による硫酸化されたポリペプチドは、ヒルジンと比較した場合、２倍超、出血を低下させる。別の実施形態では、本発明による硫酸化されたポリペプチドは、ヒルジンと比較した場合、３倍超、出血時間を低下させる。別の実施形態では、本発明による硫酸化されたポリペプチドの存在下において出血時間は、１０分以下の間、生じる。
【００９６】
別の実施形態では、本発明による硫酸化されたポリペプチドの存在下における出血時間は、ヒルジンと比較した場合、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上低下する。
【００９７】
開示されるペプチドおよび組成物は、たとえば病的な血栓症を望んでいないヒトなどのような対象においてトロンビン活性を阻害するのに十分な抗血栓性の量で、トロンビン活性を阻害するために使用することができる。組成物は、心筋梗塞、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、播種性血管内凝固症候群、心血管血栓症および脳血管血栓症、術後の外傷に関連する血栓症、肥満、妊娠、経口避妊薬の副作用、長期の拘束、ならびに血液障害、免疫障害、またはリウマチ障害に関連する過凝固状態などのような状態に罹患している対象において使用することができる。その代わりに、対象は、不安定狭心症、動脈硬化症、バルーンカテーテルによる血管形成後の血管の再遮断、または血液透析における血液凝固に罹患していてもよい。
【実施例】
【００９８】
実施例１−硫酸化されたエキソサイトＩＩバインダーの合成
エキソサイトＩＩのみに結合する完全長トロンビン阻害剤の断片をＦｍｏｃ法ＳＰＰＳによって合成した。
【００９９】
樹脂負荷：２−クロロトリチルクロリド樹脂、Ｒｉｎｋアミド樹脂、またはＷａｎｇ樹脂に、メーカーの説明書どおり、標的スルホペプチドのＣ−末端アミノ酸を負荷した。
【０１００】
反復ペプチド構築（Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ）
脱保護：樹脂をピペリジン／ＤＭＦ（１：４、ｖ／ｖ、３ｍＬ、３×５分間）により処置し、ろ過し、次いで、ＤＭＦ（５×３ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×３ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×３ｍＬ）により洗浄した。
【０１０１】
カップリング（標準Ｆｍｏｃ保護アミノ酸）：ＤＭＦ中標準Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）、ＰｙＢＯＰ（４当量）、およびＮＭＭ（８当量）の溶液（最終濃度０．１Ｍ）を樹脂に追加した。１時間後、樹脂をろ過し、ＤＭＦ（５×３ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×３ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×３ｍＬ）により洗浄した。
【０１０２】
硫酸化チロシンの部位特異的な組み込み：硫酸化チロシンは、２つの方法のうちの１つによって所望のペプチド断片の中に組み込んだ：
１）アミノ酸カセット［Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ２ＯＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３）−ＯＨ］のカップリング：ＤＭＦ中Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ２ＯＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３）−ＯＨ（１．２当量）、ＨＡＴＵ（１．２当量）、およびＮＭＭ（２．４当量）の溶液（最終濃度０．１Ｍ）を樹脂に追加した。１８時間後、樹脂をろ過し、ＤＭＦ（５×３ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×３ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×３ｍＬ）により洗浄した。
２）Ｆｍｏｃ−ＴｙｒＯＡｌｌ−ＯＨの組み込み後の固相硫酸化：固相硫酸化は、Ｔａｌｅｓｋｉ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１またはＨｓｉｅｈ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  ２０１４において記載される方法を使用し、イミダゾリウム硫酸化試薬により実行した。
【０１０３】
キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９、ｖ／ｖ、３ｍＬ）を樹脂に追加した。３分後、樹脂をろ過し、ＤＭＦ（５×３ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×３ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×３ｍＬ）により洗浄した。
【０１０４】
切断：硫酸化されたペプチドは、酸性切断カクテル、たとえば９０：５：５  ｖ／ｖ／ｖ  トリフルオロ酢酸／トリイソプロピルシラン／水を使用し、同時の側鎖脱保護と共に、樹脂から切断した。
【０１０５】
硫酸エステル保護基の脱保護：
１）ネオペンチル硫酸エステルの脱保護（カセット法からの）は、Ｚｉａｒｅｋ，Ｊ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３において記載されるように、アジ化ナトリウム溶液または酢酸アンモニウム水溶液による処置によって実行した。
２）ジクロロビニル硫酸エステルおよびトリクロロエチル硫酸エステルの脱保護（固相硫酸化法からの）は、Ｔａｌｅｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ  ２０１１において記載されるように、水素化を使用して実行した。トリフルオロエチル硫酸エステルの脱保護は、Ｈｓｉｅｈ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２０１４において記載されるように、酢酸アンモニウム水溶液を使用して実現した。
【０１０６】
精製：部位特異的に硫酸化されたエキソサイトＩＩ結合ペプチド断片の精製は、逆相ＨＰＬＣ精製を使用して実現した。
【０１０７】
実施例２−式２のトロンビン阻害剤（ＡＡａ）の合成
手法１  ＡＡａ（３１〜６１）断片（８８）の合成
【化１】
2020501561.tif 000002
手法１  つづき
【化２】
2020501561.tif 000003
【０１０８】
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（８４ｍｇ、２５０μｍｏｌ）を標準負荷手順を使用してＣＴＣ樹脂に負荷した。次いで、完全に構築された樹脂結合ＡＡａ（３２〜６１）を得るために、上記に概説されるように、反復Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを実行した。樹脂上のペプチドを分離し、２５μｍｏｌのペプチドを下記の処置において使用した。ペプチドを、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）中２０％ピペリジンによりＦｍｏｃ脱保護し、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＳＴｍｂ，ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２５ｍｇ、５０μｍｏｌ、２．０当量）を、１６時間、室温で、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中ＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ、５０μｍｏｌ、２．０当量）およびＮＭＭ（０．１１ｍＬ、１０１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、４．０当量）を使用し、続いてカップルした。樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）により洗浄した。ペプチドを脱保護し、ＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（４ｍＬ、９０：５：５  ｖ／ｖ／ｖ）を使用して樹脂から切断し、結果として生じる混合物を２時間撹拌した。粗ペプチドを氷冷Ｅｔ２Ｏ（２０ｍＬ）から沈殿させ、逆相分取ＨＰＬＣ（６０分間２０〜８０％  Ｂ、溶出液Ａ）によって精製し、冷凍乾燥後、ＴＦＡ塩（８．８ｍｇ、９．０％）として所望のペプチド８８がもたらされた。図３ＡおよびＢを参照。
手法２  ＡＡａ（１〜３０）断片（８７）の合成
【化３】
2020501561.tif 000004
手法２  つづき
【化４】
2020501561.tif 000005
【０１０９】
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１００ｍｇ、２５０μｍｏｌ）を標準負荷手順を使用してＣＴＣ樹脂に負荷した。次いで、完全に構築された樹脂結合ＡＡａ（１〜３０）を得るために、上記に概説されるように、反復Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを実行した。樹脂上のペプチドを分離し、２５μｍｏｌのペプチドを下記の処置において使用した。保護されたペプチドを、ＨＦＩＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ、７：３  ｖ／ｖ）を使用して樹脂から遊離させた。結果として生じる産物は、一晩、−４０℃で、ＤＭＦ（２ｍＬ）中ＰｙＢＯＰ（６５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、５．０当量）、ｉＰｒ２ＮＥｔ（２２μＬ、１６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、５．０当量）、および３−メルカプトプロピオン酸エチル（１６０μＬ、１７０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、５０当量）により続いて処置した。この時点で、反応混合物を真空中で濃縮した。次いで、ペプチドを、ＴＦＡ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（４ｍＬ、９０：５：５  ｖ／ｖ／ｖ）により脱保護し、反応混合物を２時間撹拌した。結果として生じる粗生成物を氷冷Ｅｔ２Ｏ（２０ｍＬ）から沈殿させ、分取ＨＰＬＣ（６０分間２０〜８０％  Ｂ、溶出液Ａ）によって精製し、冷凍乾燥後、ＴＦＡ塩（１１ｍｇ、１２％）としてペプチドチオエステル８７がもたらされた。図４ＡおよびＢを参照。
【０１１０】
二硫酸ＡＡａのワンポット合成についての一般的な手順
【化５】
2020501561.tif 000006
【０１１１】
手法３  二重に硫酸化されたＡＡａ（８６）のワンポット合成
ライゲーションバッファー（６Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ６．８、３２０μＬ）中ペプチド８８（６．０ｍｇ、１．６μｍｏｌ、１．２当量）の溶液をペプチドチオエステル８７（５ｍｇ、１．３μｍｏｌ、１．０当量）に追加し、ペプチドチオエステル８７の最終５ｍＭ溶液を得た。結果として生じる溶液を、２Ｍ  ＮａＯＨによりｐＨ７．４に注意深く再調整し、その後、ＴＦＥＴ（１０体積％）を追加し、２時間３０℃でインキュベートした。ＵＰＬＣ−ＭＳ分析は、ライゲーションタンパク質９５への完全な変換を示した。次いで、バッファー（６Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、３２０μＬ）中ＴＣＥＰ（０．５Ｍ）およびグルタチオン（１００ｍＭ）の中性溶液を追加し、２．５ｍＭ最終濃度のライゲーション産物を得た。結果として生じる溶液をｐＨ６．５に調整し、次いで、１０分間のＡｒのスパージングによって脱気し、これにより、さらに、反応混合物から過剰なＴＦＥＴが除去された。次いで、ＶＡ−０４４（１０ｍＭ）を固体形態で追加し、反応混合物を穏やかに撹拌し、１６時間３７℃でインキュベートした。この後、ＵＰＬＣ−ＭＳ分析は、二重に硫酸化されたＡＡａ  ８６への完全な変換を示した。粗反応混合物を、分取ＨＰＬＣ精製（６０分間０〜６０％  Ｂ、０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ）にかけ、冷凍乾燥後、酢酸アンモニウム塩（３．９ｍｇ、４３％）として二硫酸ＡＡａ  ８６がもたらされた。図５を参照。
【化６】
2020501561.tif 000007
【０１１２】
実施例３−ヒルジンと比較したＡＡａの凝固時間および出血時間
本発明者らは、インビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイにおける凝固時間を延長する実施例２（ＡＡａ）の阻害剤の能力を調査した（図１Ａ）。これらの研究は、ヒルジンが、２μｇ／ｍＬを上回る濃度で凝固時間において８倍の増加を示した一方、ＡＡａ（５．７倍）は、より安全な凝固時間の範囲内にとどまったことを実証した。
【０１１３】
本発明者らは、そのうえ、ＡＡａが、インビボ針損傷モデルにおいてヒルジンと非常に類似する抗血栓活性を持つ一方（図１Ｂ）、ＡＡａは、尾出血インビボモデルにおいて３倍少ない出血を示す（図１Ｃ）ことを示した。ＡＡａが、血栓からフィブリンを除去することにおいてヒルジンと同様に有効である一方（図１Ｄ）、ＡＡａは、血小板を除去することにおいてそれほど有効でないように思われる（ヒルジンおよびＡＡａの共焦点画像についての図１Ｅを参照）。フィブリンおよび血小板に対するこの効果の差は、予想外であり、ＡＡａで観察された出血における著しい減少について部分的に説明するものかもしれない。
【０１１４】
実施例４−ＡＡａの硫酸化形態によるトロンビンの阻害
本発明者らは、図２ａにおいて示されるように、硫酸化されたペプチドが、約６ｐＭ未満、たとえば３．０ｐＭ未満のＫｉでトロンビンを阻害することを実証する。さらに、これらのペプチドおよびタンパク質の二重に硫酸化された変異体は、硫酸化されていない対応物より、インビトロにおけるヒトトロンビンの阻害剤として、２桁超、強力である。
【０１１５】
参考文献
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Ｔａｌｅｓｋｉ，Ｄ．；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．；Ｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｐａｙｎｅ，Ｒ．Ｊ．Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｉｔｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｕｌｆｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２０１１，６（６），１３１６−１３２０．
Ｈｓｉｅｈ，Ｙ．Ｓ．；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．；Ｗｉｊｅｙｅｗｉｃｋｒｅｍａ，Ｌ．Ｃ．；Ｐｉｋｅ，Ｒ．Ｎ．；Ｐａｙｎｅ，Ｒ．Ｊ．Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｉｒｕｄｉｎ  Ｐ６：Ａ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  Ｌｅｅｃｈ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５３，３９４７−３９５１
【図１Ａ−Ｂ】
2020501561.tif 000008
【図１Ｃ−Ｄ】
2020501561.tif 000009
【図１Ｅ】
2020501561.tif 000010
【図２】
2020501561.tif 000011
【図３】
2020501561.tif 000012
【図４】
2020501561.tif 000013
【図５】
2020501561.tif 000014
【図６】
2020501561.tif 000015
【配列表】
2020501561000001.app
【国際調査報告】
2020501561.tif 000016
2020501561.tif 000017
2020501561.tif 000018
2020501561.tif 000019
2020501561.tif 000020
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