(57)【要約】  組み換えタンパク質薬物は、改変キニノーゲン−１ペプチドと結合された親タンパク質薬物を含む。改変キニノーゲン−１ペプチドは、配列番号２の配列、及び８０％以上の配列同一性を有するホモログを有する。親タンパク質薬物は、架橋ドメインによって第２の標的ドメインと連結された第１の標的ドメインを有する二重特異性抗体である。改変キニノーゲン−１ペプチドは、第１の標的ドメインと架橋ドメインの間、又は架橋ドメインと第２の標的ドメインの間で融合される。タンパク質薬物の血清半減期を増加させる方法は、改変キニノーゲン−１ペプチドと結合されたタンパク質薬物を含む融合タンパク質を構築することを含む。
2020504756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変キニノーゲン−１ペプチドと結合された親タンパク質薬物を含む、
組み換えタンパク質薬物。
【請求項２】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する、
請求項１に記載の組み換えタンパク質薬物。
【請求項３】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが、配列番号２と８５％以上の配列同一性を有する、
請求項１に記載の組み換えタンパク質薬物。
【請求項４】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが配列番号２の配列を有する、
請求項１に記載の組み換えタンパク質薬物。
【請求項５】
前記親タンパク質薬物が、架橋ドメインによって第２の標的ドメインに連結された第１の標的ドメインを有する二重特異性抗体である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質薬物。
【請求項６】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが、前記第１の標的ドメインと前記架橋ドメインとの間、又は前記架橋ドメインと前記第２の標的ドメインとの間で融合される、
請求項５に記載の組み換えタンパク質薬物。
【請求項７】
タンパク質薬物の血清半減期を増加させる方法であって、
前記タンパク質薬物に改変キニノーゲン−１ペプチドを付着させることを含む、
方法。
【請求項８】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドと前記タンパク質薬物とが融合タンパク質を形成する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが、配列番号２の配列と８０％以上の配列同一性を有する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが、配列番号２の配列を有する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質薬物が、架橋ドメインによって第２の標的ドメインと連結された第１の標的ドメインを有する二重特異性抗体である、
請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変キニノーゲン−１ペプチドが、前記第１の標的ドメインと前記架橋ドメインとの間、又は前記架橋ドメインと前記第２の標的ドメインとの間で融合される、
請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する方法、及びかかる方法によって作製されたタンパク質薬物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質薬物（単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）フォーマットの二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）等）の半減期延長は、反復投与の必要性を減少し、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効性を高めることができる。タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭化水素、又は糖ペプチドの付着を含むいくつかのアプローチが利用可能である。
【０００３】
高グリコシル化ペプチドの付着は、タンパク質薬物の流体力学半径を増加させて、血清中でのその保持率を高め得る。このアプローチは、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピンタンパク質に由来する高グリコシル化カルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）を付着させることによって、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の半減期延長に有効となることが示された。複数のＣＴＰがライゲートされた場合、ＦＳＨタンパク質に対するＣＴＰの半減期延長能力は、更に高められた（米国特許第６，２２５，４４９号明細書を参照されたい）。
【０００４】
先行技術の方法は、タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長することができているが、タンパク質薬物の半減期を延長することができるより良い方法に対するニーズが今も存在している。
【特許文献１】米国特許第６，２２５，４４９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の実施形態は、タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する方法、及び半減期延長されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するタンパク質薬物に関する。本発明の実施形態によれば、タンパク質薬物は、そのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するため、高グリコシル化ペプチドによって改変され得る。好ましくは、高グリコシル化ペプチドは天然タンパク質に由来し；より好ましくは、高グリコシル化ペプチドはキニノーゲン等の血漿タンパク質に由来する。
【０００６】
本発明の実施形態によれば、高グリコシル化ペプチドはヒトキニノーゲン−１（ＫＮＧ１）に由来する。特に、高グリコシル化ペプチドは、ＫＮＧ１タンパク質に由来する２つの高グリコシル化領域をつないで生成されたヒトＫＮＧ１由来ペプチドＫ０７であってもよい。７１個のアミノ酸長のＫ０７ペプチドは、少なくとも２個のアスパラギン、３個のセリン及び６個のスレオニンのアミノ酸を含み、非常にグリコシル化されやすい（図２）。この新規なＫ０７ペプチドは、タンパク質薬物（二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）等）にライゲートされ得る。極度にグリコシル化されたＫ０７ペプチドに対するタンパク質薬物のライゲーションは、タンパク質の流体力学半径の増加に起因する、血清保持時間の向上を提供することができる。
【０００７】
本発明の実施形態によれば、タンパク質薬物は抗体（二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ｍＡｂ等を含む）等の任意の生物学的に活性なペプチド又はタンパク質であってもよい。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、架橋ドメインによって連結された２つの特異的結合ドメイン（例えば可変ドメイン、すなわちｓｃＦｖ）を含む。
【０００８】
ｂｓＡｂの一例は、カッパー軽鎖及びリンカーによって共につなげられた抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含んでもよい（図３）。極度にグリコシル化されたＫ０７ペプチドへのｓｃＦｖ  ｂｓＡｂ（＃１５２）のライゲーションは、その流体力学半径を増加させ（嵩の増加）、血清保持時間の延長をもたらし得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明の実施形態は、組み換えタンパク質薬物に関する。本発明の一実施形態による組み換えタンパク質薬物は、改変キニノーゲン−１ペプチドと結合された親タンパク質薬物を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、改変キニノーゲン−１ペプチドは、配列番号２の配列、又は８０％以上の配列同一性を有するそのホモログを有する。本発明のいくつかの実施形態によれば、親タンパク質薬物は、架橋ドメインによって第２の標的ドメインと連結された第１の標的ドメインを有する二重特異性抗体である。本発明のいくつかの実施形態によれば、改変キニノーゲン−１ペプチドは、第１の標的ドメインと架橋ドメインの間、又は架橋ドメインと第２の標的ドメインとの間で融合される。
【００１０】
本発明の一態様では、タンパク質薬物の血清半減期を増加させる方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、改変キニノーゲン−１ペプチドと結合されたタンパク質を含む融合タンパク質薬物を構築することを含む。
【００１１】
本発明の他の態様及び利点は、以下の記載及び添付の特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はヒトキニノーゲン−１タンパク質配列（配列番号１）を示す。太字及び下線は、高グリコシル化されている配列内のアミノ酸を示す。
【００１３】
【図２】図２は本発明の実施形態による、７１個のアミノ酸長のキニノーゲン−１のスプライスされたペプチド（配列番号２）を示す。Ｎ結合型又はＯ結合型のオリゴ糖付着に対して高い可能性を有するアスパラギン、セリン及びトレオニンの残基を太字及び下線で強調する。
【００１４】
【図３】図３は、本発明の一実施形態によるカッパー架橋リンカー及びＫ０７ペプチドを有する二重特異性抗体の例を示す。この例では、二重特異性抗体は、Ｎ末端に抗Ｈｅｒ２ドメイン、及びＣ末端に抗ＣＤ３ドメインを有する。矢印は、この特定の実施形態におけるＫ０７ペプチドに対する挿入位置を示す。
【００１５】
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｂｓＡｂコンストラクトの分析結果を示す。レーン２は、親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２であり、より大きな分子量を有するレーン６はＫ０７ペプチド挿入物を有する精製されたＫ０７−ｂｓＡｂコンストラクトである。
【００１６】
【図５】図５は、結合分析におけるＫ０７含有ｂｓＡｂのＥＬＩＳＡプロファイルを示す。標準曲線を、親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２とＫ０７ペプチド挿入物を有する親ｂｓＡｂ＃１５２（１５２−Ｋ０７）の両方に対して生成する。
【００１７】
【図６】図６は、Ｋ０７含有ｂｓＡｂの薬物動態（ＰＫ）研究を示す。対照抗体は、Ｋ０７ペプチド挿入物を有しないｂｓＡｂ＃１５２として示される。ｂｓＡｂ試料の注射の前（投薬前）、及びその注射の後１１個の時間点（５分〜１９２時間の範囲）で血清試料をマウスから収集した。ｂｓＡｂｓの血清濃度をＥＬＩＳＡで決定し、濃度（ｕｇ／ｍｌ）対時間（時間）として示した。
【００１８】
【図７Ａ】図７Ａは、Ｋ０７含有ｂｓＡｂに由来するペプチドフラグメントにおけるＮ−グリコシル化部位の衝突誘起解離（ＣＩＤ：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）分析（質量分析計を使用する）の結果を示す。抗体は、Ｋ０７ペプチド挿入物を有するｂｓＡｂ＃１５２である。前駆イオンは、個々に１３１１．５ｍ／ｚ及び１０９３．４ｍ／ｚを有する二重荷電イオンである。図は、前駆イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ分析データを示す。ＣＩＤ、電子移動解離（ＥＴＤ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）アノテーション及びオリゴ糖生合成経路によってＮ−グリコシル化部位を決定した。円はＭａｎ（マンノース）を表し、正方形はＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）を表し、破線は糖ペプチドの解離を表す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｋ０７含有ｂｓＡｂに由来するペプチドフラグメントにおけるＮ−グリコシル化部位の衝突誘起解離（ＣＩＤ：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）分析（質量分析計を使用する）の結果を示す。抗体は、Ｋ０７ペプチド挿入物を有するｂｓＡｂ＃１５２である。前駆イオンは、個々に１３１１．５ｍ／ｚ及び１０９３．４ｍ／ｚを有する二重荷電イオンである。図は、前駆イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ分析データを示す。ＣＩＤ、電子移動解離（ＥＴＤ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）アノテーション及びオリゴ糖生合成経路によってＮ−グリコシル化部位を決定した。円はＭａｎ（マンノース）を表し、正方形はＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）を表し、破線は糖ペプチドの解離を表す。
【００１９】
【図８】図８は、Ｋ０７含有ｂｓＡｂに由来するペプチドフラグメント中のＯ−グリコシル化部位の電子移動解離（ＥＴＤ）分析の結果を示す。抗体はＫ０７ペプチド挿入物を有するｂｓＡｂ＃１５２である。上部パネルは、Ｏ−グリコシル化ペプチドに由来する陽イオンの代表的なＥＴＤ分析データを示す。Ｃ及びＺのシリーズイオンは、ＡＳペプチドに付着したＧａｌＮＡｃグリカンを実証した。Ｓ３２６は生合成経路の知識によるとグリコシル化部位である。＃１５２−Ｋ０７タンパク質に由来する糖ペプチドのＥＴＤスペクトルから同定されたグリコシル化部位（太字及び下線で強調される）の要約を表に示す。
【００２０】
【図９】図９は、グリコシル化部位における突然変異を含む又は含まないＫ０７含有ｂｓＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。還元されていない（左）及び還元された（右）試料を作製し、ゲルで泳動した。タンパク質１（レーン１）：親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２；タンパク質２（レーン１）：Ｋ０７ペプチド挿入物を有するｂｓＡｂ＃１５２；タンパク質３（レーン３）：Ｋ０７ペプチド中、１１個のアミノ酸残基をアラニンで置換することによるｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７の突然変異形態（図７及び図８で示され、図２で強調される通り特徴づけられる）。
【００２１】
【図１０】図１０は、グリコシル化部位に突然変異を有する又は有しないＫ０７含有ｂｓＡｂの薬物動態（ＰＫ）研究を示す。対照抗体は、Ｋ０７ペプチド挿入物を含まないｂｓＡｂ＃１５２である。ｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔは、図２で強調されるＫ０７ペプチド中の１１個アミノ酸残基をアラニンで置換することによる、ｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７に由来する突然変異形態である。ｂｓＡｂ試料の注射の前（投薬前）、及びその注射の後の１１個の時間点（５分〜１９２時間の範囲）において、血清試料をマウスから収集した。ｂｓＡｂｓの血清濃度をＥＬＩＳＡで決定し、上部パネルで濃度（μｇ／ｍＬ）対時間（ｈｒ）として示す。親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２、及びグリコシル化部位の突然変異を含む又は含まないＫ０７ペプチド含有ｂｓＡｂ＃１５２を比較するＰＫ研究の要約を下部パネルに示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の実施形態は、新規の高グリコシル化ペプチドに基づくペプチド薬物又はタンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長に関する。ペプチド薬物又はタンパク質薬物は、抗体（又はその結合フラグメント）、ホルモン、サイトカイン等を含んでもよい。本発明の実施形態は、本明細書の簡潔さ及び明瞭さのために、ペプチド薬物とタンパク質薬物の両方を包含するが、「タンパク質薬物」という用語は、ペプチド薬物とタンパク質薬物の両方を含めるように使用される。本発明の実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性（又は多重特異性）抗体、抗体−薬物コンジュゲート等を含み得る。これらの抗体変異体はいずれも、本明細書では「抗体」と称される場合がある。高グリコシル化ペプチドは、キニノーゲン−１（ＫＮＧ１）等の天然糖タンパク質、好ましくは血清タンパク質に由来してもよい。天然タンパク質誘導体（特に血清タンパク質）は、望ましくない免疫応答を誘導する可能性は低い。タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長は、タンパク質の流体力学半径の増加の原理に基づく。
【００２３】
本発明の実施形態によれば、高グリコシル化ペプチドはヒトキニノーゲン−１（ＫＮＧ１）に由来してもよい。例えば、かかる高グリコシル化ペプチドは、ＫＮＧ１からグリコシル化フラグメントをスプライシングすることによって生成され得る。このアプローチに基づき、ＫＮＧ１タンパク質に由来する２つの高グリコシル化領域をつなぐことによって、高グリコシル化ペプチドＫ０７（配列番号２；図２）を生成した。本明細書では、このＫ０７高グリコシル化ペプチドは、本発明の実施形態を解説するための例として使用される。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくその他の修飾及び変化が可能であることから、これは解説のために過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを十分理解する。かかる変化又は修飾は、例えば、Ｋ０７ペプチドのアミノ酸の置換、付加、及び／又は欠失を含み得る。これらの改変Ｋ０７ペプチドはいずれも「ホモログ」と称される
【００２４】
特定の例では、Ｋ０７は、グリコシル化の可能性が高い少なくとも２個のアスパラギン、３個のセリン、及び６個のスレオニンを含む、７１アミノ酸長のペプチドである。このＫ０７ペプチドは、タンパク質薬物（二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）等）にライゲートされ得る。ライゲーションは、化学的手段（例えば架橋又は化学結合）、又は組み換え技術（例えば融合タンパク質）によってなされ得る。極度にグリコシル化されたＫ０７ペプチドに対するタンパク質薬物のライゲーションは、タンパク質薬物の流体力学半径の増加により延長された血清保持時間を提供することができる。本明細書では、かかるライゲートされたタンパク質薬物は、Ｋ０７ペプチド（又はその類縁体）が、組み換え技術を使用して親薬物にライゲートされているかどうかにかかわらず、総称的に「組み換えタンパク質薬物」と称され得る。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、タンパク質薬物は、ホルモン（例えば、インスリン）、サイトカイン、又は抗体若しくはその結合フラグメント等の任意のタンパク質薬物であってもよい。本発明の実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）又は抗体−薬物コンジュゲートを含んでもよい。以下の記載は、本発明の実施形態を解説するために二重特異性抗体を使用する。ここでも、これは解説の明瞭さのためであり、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、その他の修飾及び変化が可能であると十分に理解するであろう。
【００２６】
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、架橋ドメインによって連結された２つの特異的結合ドメイン（例えば可変ドメイン、すなわちｓｃＦｖ）を含んでもよい。ｂｓＡｂの一例は、カッパー軽鎖及びリンカーによって共につなげられた抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含んでもよい（図３）。極度にグリコシル化されたＫ０７ペプチドへのｓｃＦｖ  ｂｓＡｂ（＃１５２）のライゲーションは、血清保持時間を延長することができる。
【００２７】
Ｋ０７ペプチドに関する本発明は、単鎖フラグメント可変体（ｓｃＦｖｓ）等の抗体フラグメントのみならず、小さなペプチド薬物及び治療用タンパク質にも適用され得る。本明細書の後の段落で提示されるＰＫ研究の結果は、様々なペプチド又はタンパク質の血清半減期を増強するためのＫ０７ペプチド又は類似するペプチドの汎用性を示す。
【００２８】
本発明の実施形態を、以下の実施例で更に解説する。当業者は、これらの実施例が解説に過ぎず、本発明の範囲から逸脱することなく、その他の修飾及び変化が可能であることを十分理解するであろう。
【００２９】
実施例１：ヒトキニノーゲン−１タンパク質中の高グリコシル化領域の同定
ヒトキニノーゲン−１タンパク質（図１；配列番号１）は、アミノ酸６４４個のタンパク質である。ＢＬＡＳＴ探索及び分析を使用して、２つの高グリコシル化領域を発見した。これら２つの領域は、図１中、太字及び下線で強調される。本発明の一実施形態によれば、これらの２つのペプチドは、共にスプライスされて、７１個のアミノ酸長の人工ペプチド、ＮＳＱＮＱＳＮＮＱＴ  ＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳ  ＴＴＰＳＡＱＴＱＥＫ  ＴＥＧＰＴＰＩＰＳＬ  ＡＫＰＧＶＴＶＴＦＳ  ＤＦＱＤＳＤＬＩＡＴ  ＭＭＰＰＩＳＰＡＰＩＱ（配列番号２）を生成し、本明細書ではＫ０７と称される（図２）。
【００３０】
このＫ０７ペプチドは、９個の可能性のあるＯ結合型（ｎｉｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ）及び２個のＮ結合型（ｔｗｏ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ）のオリゴ糖付着部位を含む。このＫ０７ペプチドが、グリコシル化可能性を保持すると予想される。したがって、ペプチド薬物又はタンパク質薬物へのこのペプチド又はその誘導体若しくは類縁体の付着は、ペプチド薬物又はタンパク質薬物の流体力学半径を増加させるはずである。
【００３１】
実施例２：Ｋ０７含有ｂｓＡｂベクターの構築
タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する際のＫ０７ペプチドの実用性を解説するため、本発明者らは、Ｋ０７ペプチドを使用して融合タンパク質を構築した。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１６５６３８号Ａ１「軽鎖架橋二重特異性抗体」に記載される手順に従って二重特異性抗体＃１５２（ｂｓＡｂ＃１５２）の発現プラスミドを作製した。簡潔には、１単位／ｍｇ〜１０単位／ｍｇのプラスミドＤＮＡの濃度で、３７℃で１時間〜３時間に亘り、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素（米国マサチューセッツ州イプスウィッチのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を含む適切な反応バッファーでＤＮＡ消化を行った。完了した反応物を、アガロースゲル電気泳動法によって確認した。次いで、切り取ったｂｓＡｂをコードするＤＮＡ断片を、アガロースゲル抽出キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によってアガロースから抽出し、真核生物の発現ベクターｐＴＣＡＥ８．３のＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ切断部位に挿入して、ｂｓＡｂ＃１５２プラスミドを生成した。更なる修飾は、追加のＰＣＲ及びサブクローニング工程によって導入され得る。
【００３２】
この実施例では、親タンパク質薬物として使用されるｂｓＡｂコンストラクトは、ｂｓＡｂ＃１５２と表される（図３）。該コンストラクトは、カッパー軽鎖定常領域（架橋ドメイン）及び短いドメイン間リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４）によって共につなげられた、Ｎ末端の抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ（第１のターゲットドメイン）及びＣ末端の抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ（第２のターゲットドメイン）を有する。
【００３３】
本発明の実施形態によれば、キニノーゲン−１（ＫＮＧ１）由来ペプチドは、図３に示されるように、クローニングによってカッパー架橋とドメイン間リンカーの間に挿入されてもよい。代替的には、ＫＮＧ１由来ペプチドは、第１のターゲットドメインとカッパー架橋の間、又はドメイン間リンカーと第２のターゲットドメインの間等の他の場所で挿入されてもよい。同様に、ＫＮＧ１由来ペプチド（例えば、Ｋ０７）は、二重特異性抗体のＮ末端又はＣ末端に融合され得る。当業者は、ＫＮＧ１ペプチドは、得られたタンパク質の流体力学半径を増加して、タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加するものであることを十分理解し得る。したがって、このペプチドの融合又は挿入場所は決定的ではなく、当業者は、容易に所望の結果を最適化するためのいくつかの選択肢を実際に試すことができる。
【００３４】
実施例３：Ｋ０７含有ｂｓＡｂの発現及び精製
Ｋ０７挿入物（キニノーゲン−１ペプチドをコードするＤＮＡ挿入物）によるｂｓＡｂ＃１５２  ＤＮＡプラスミドの構築の後、該プラスミドを一過性発現用のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３細胞株にトランスフェクトした。Ｇｉｂｃｏ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で細胞を７日間増殖させ、次いで、遠心分離を行って細胞ペレット及び残屑を除去した。抗体を含む上清を０．２２μｍフィルターに通し、次いで、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填して抗体を単離精製した。精製したｂｓＡｂをＡｍｉｃｏｎフィルター（ドイツ国ダームシュタットのＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって更に濃縮し、４℃での保管のためバッファーをＰＢＳに交換した。抗体濃度をＢＣＡアッセイによって確認し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４）。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーカラムによる抗体精製は、９０％超のタンパク質純度をもたらした。
【００３５】
図４では、レーン２（標識１５２）は親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２であり、より大きな分子量（Ｍｗ）を有するレーン６（標識Ｋ０７）は、Ｋ０７ペプチド挿入物を有する精製されたＫ０７−ｂｓＡｂコンストラクトである。Ｋ０７ペプチド配列が与える理論的な分子量の増加はわずか７．５ｋＤａであることから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のこれら２本のバンド間の分子量の劇的な違いは、Ｋ０７ペプチド挿入物が極度にグリコシル化されていることを示す。
【００３６】
実施例４：結合アッセイ
Ｋ０７ペプチドの付着がｂｓＡｂの活性に影響を与えるかどうか調査するため、図５に示されるように酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、Ｈｅｒ２抗原に対するｂｓＡｂ抗体ドメイン親和性を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを行った。ＰＫ時間点から収取されたマウス血清のｂｓＡｂ抗体濃度を定量するため、シグモイド曲線内に直線範囲を確立することが必要となるであろう。最初に、親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２とＫ０７ペプチド挿入物を有する親ｂｓＡｂコンストラクト＃１５２（＃１５２−Ｋ０７）の両方について標準曲線を生成した。
【００３７】
アミノ酸２３〜６５２をコードする組み換えヒトＨｅｒ−２タンパク質（Ｂａｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（デンマーク、ロスキレのＮｕｎｃ  Ｉｎｃ．）の被覆に使用するため、被覆バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌまで希釈した。プレートを恒湿チャンバーにおいて４℃で一晩、タンパク質と共にインキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）バッファーで３回洗浄した後、ウェルを１００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）でブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。更にＰＢＳＴで３回洗浄した後、次いで、Ｈｅｒ−２抗原で被覆したウェルを１００μｌの２倍段階希釈したＫ０７含有ｂｓＡｂと共にインキュベートし、３７℃で１時間インキュベートした。これも、その後ＰＢＳＴで３回洗浄した。ブロッキングバッファーで希釈されたヤギ抗ヒトカッパー軽鎖ＨＲＰ複合抗体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。最後に、１００μｌのＴＭＢ基質（ＢｉｏＲａｄ）を各ウェルに添加し、指示書に従ってインキュベートした。１００μｌの１．０Ｎ  ＨＣｌを添加することによって反応を停止した。ＢｓＡｂ結合親和性を４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの二重の吸光度で測定した。
【００３８】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、親ｂｓＡｂ＃１５２及びｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７がＨｅｒ２抗原に対してロバストな結合親和性を有し、３．５〜３．７５のＯＤ範囲で飽和され得たことを示す。
【００３９】
これらの結果は、高グリコシル化ペプチドの付着が抗体結合を妨げなかっただけでなく、結合シグモイド曲線の（より低い解離定数への）左シフトに示されるように、実際に結合を向上させたことを示す。この知見は予想外である。
【００４０】
実施例５：薬物動態（ＰＫ）研究
本発明者らは、次に、改変ｂｓＡｂの薬物動態（ＰＫ）を調査した。ＰＫ研究では、対照抗体は、Ｋ０７ペプチド挿入物を含まないｂｓＡｂ＃１５２である。これらの抗体をマウスに注射した。注射前（投薬前）、及びｂｓＡｂ試料の注射後１１個の時間点でマウスから血清試料を収集した。ｂｓＡｂの血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、濃度（μｇ／ｍＬ）対時間（時間）として示した。
【００４１】
ＰＫ研究では、８週週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスに３．０ｍｇ／ｋｇの抗体濃度で尾静脈を介して試験ｂｓＡｂｓを注入した。ＰＫ血液試料を、０分（投薬前）、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間及び１９２時間の時間点で収集した。各群マウス３匹であり、約３０μＬの血液試料量を各時間点に採取した。血液を凝固させ、遠心分離した後に血清を収集した。抗体濃度を決定するためのＥＬＩＳＡによる定量分析まで、集めたマウス血清試料を−７０℃で保管した。
【００４２】
図６に示されるように、Ｋ０７ペプチド挿入物を有する又はそれを有しないｂｓＡｂ＃１５２は、最初の注射の後にマウス血清において同様の保持能力（Ｃｍａｘ）を示した。しかしながら、親ｂｓＡｂ＃１５２の濃度は、マウス血清において急速に減少した。Ｋ０７含有ｂｓＡｂ（＃１５２−Ｋ０７）は、対照的に、注射の後、より長い持続期間に亘って血清中でより高い濃度を保持した。薬物については、血液中の比較的速い減衰は、有効濃度を速く減少させすぎ、より頻繁な投与を必要とするであろう。より長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、Ｋ０７含有薬物が、多くの改善された薬物動態学的挙動を有し、頻繁な投与を必要としないであろうということを示す。
【００４３】
実施例６：Ｋ０７ペプチド中の高グリコシル化可能性の確認
特にＫ０７ペプチド挿入物において、Ｋ０７含有ｂｓＡｂのＮ結合型及びＯ結合型のグリコシル化部位におけるグリコシル化状態を理解するため、質量スペクトル分析を行った。グリコシル化部位はいずれも、種々の解離方法を用いるＭＳ／ＭＳスペクトルによって同定される。
【００４４】
ｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７融合タンパク質を生成して、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞株から精製した。１００μｇのタンパク質を、８０℃で１５分間に亘り１０ｍＭ  ＤＴＴで処理し室温で３０分間に亘り５５ｍＭヨード酢酸でアルキル化した。還元されたタンパク質を、５０ｍＭアンモニア重炭酸塩の１００μｌ中、１μｇ／μｌの最終濃度に希釈し、１μｇのプロテアーゼＫで一晩消化した。試料をギ酸で０．１％に希釈し、質量分析に送った。
【００４５】
ＬＣ−ＭＳスペクトル分析のため、試料を分離カラムＢＥＨ  Ｃ１８（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）を備えるＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｈ−ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍに供した。溶液Ａ及び溶液Ｂの組成は、それぞれ、水中０．１％のギ酸及びアセトニトリルであった。移動相は、１００分間で溶液Ｂを５％から９５％に増加した。ＵＰＬＣから分離された試料を、ＥＳＩ−ＭＳ機器、Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓｉ（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）に直接接続した。データを０．５秒のＭＳに続いてデータ依存型取得（トップ５の方法）を用いて収集し、ＭＳフラグメンテーションを衡突誘起解離（ＣＩＤ）又は電子移動解離（ＥＴＤ）のいずれかで生成した。データは、抗体の配列に注目したＦＡＳＴＡフォーマットデータバンクを含むＵｎｉｆｉ（商標）（Ｖ１．８）によって処理した。
【００４６】
質量分析におけるデータ収集の完了後、グリコシル化ペプチドであると同定された成分を予想されるペプチドの質量及びオリゴ糖に由来するシグネチャーイオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎ）に従って計算した。Ｎグリコシル化部位をＮ３１５及びＮ３１９（数字は融合タンパク質配列に基づく；これらの２つの残基は、図２に示される配列のＮ４及びＮ８に対応する）において、これらの部位に対するＣＩＤアノテーション及びＧ０Ｆグリコフォームにより同定した（図７Ａ及び図７Ｂ）。Ｏグリコシル化部位を、Ｕｎｉｆｉソフトウェア及びＥＴＤ  ＭＳ／ＭＳによって識別した。ＥＴＤスペクトルは、全てのグリコシル化部位の場所を示すための十分なｃ及びｚのイオンピークを含んだ。３２６位、３５０位及び３７７位の３個のセリン残基と並んで、３３８位、３４２位、３４６位、３５７位、３５９位及び３７１位の６個のスレオニン残基を配列決定し、割り当てた（図８、太字及び下線で強調される）。１つの代表的なＥＴＤスペクトルアノテーションを図８（上部パネル）に提示した。一連のＣイオン及びＺイオンを標識し、ＧａｌＮａｃイオンをＡＳ部位に位置することを示す。Ｏグリコシル化が、セリン、スレオニン及びチロシンの部位にのみ生じることから、Ｓ３２６はグリコシル化部位である。
【００４７】
まとめると、質量スペクトル分析は、ペプチド又はタンパク質薬物（例えばｂｓＡｂ）に融合され、真核生物細胞株（例えばＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３）で発現される場合、ＫＮＧ１由来ペプチド（例えばＫ０７）は高グリコシル化され得ることを示す。当業者は、ＫＮＧ１ペプチドは、得られた組み換えタンパク質において高グリコシル化の可能性を保持することによって、タンパク質薬物の流体力学半径及びｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させるものであることを十分理解するであろう。したがって、このペプチドのグリカン結合部位の数及びグリカン組成は重大ではなく、当業者は容易に所望の結果を最適化するためのいくつかの選択肢を実際に試すことができる。かかる選択肢は、例えば、Ｋ０７ペプチドの類縁体を得るため、Ｋ０７において示されるグリコシル化部位のいくつかを反復する又は削除することを含んでもよく、それらは同様の特性を与えるであろう。
【００４８】
実施例７：Ｋ０７のグリコシル化度はその薬物動態（ＰＫ）に影響を及ぼす
タンパク質薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する際に極度にグリコシル化されたＫ０７ペプチドを更に示すため、本発明者らは、Ｋ０７ペプチド挿入物において複数のグリコシル化部位に変異導入し、Ｋ０７含有タンパク質のグリコシル化の程度を減少させ、得られたタンパク質を薬物動態（ＰＫ）研究に供した。例えば、ｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔは、Ｋ０７ペプチド挿入物において１１個のアミノ酸残基をアラニンで置換することによるｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７（Ｋ０７  １１  ｍｕｔは配列番号３である）に由来する突然変異体形態である。親ｂｓＡｂ＃１５２、Ｋ０７ペプチド挿入物を有するｂｓＡｂ＃１５２（＃１５２−Ｋ０７）、及び１１個の突然変異を有するｂｓＡｂ＃１５２−Ｋ０７（＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔ）の精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験した（図９）。図９に示されるように、＃１５２−Ｋ０７と比較した場合、＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔのより低い分子量（Ｍｗ）は、Ｋ０７ペプチド領域内のグリコシル化の程度の劇的な減少を示す。しかしながら、＃１５２と比較した場合、更に著しく高い分子量の＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔが、他の（それほど強力でない）グリコシル化部位が存在する可能性があり、１１個の突然変異がＫ０７ペプチド挿入物に導入された場合、グリコシル化され得ることを示唆する。
【００４９】
ＰＫ研究では、８週週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスに３．０ｍｇ／ｋｇの抗体濃度で尾静脈を介して試験ｂｓＡｂｓを注入した。ＰＫ血液試料を、０分（投薬前）、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間及び１９２時間の時間点で収集した。各群マウス６匹であり、各時間点で約３０μＬの血液試料量を採取した。血液を凝固させ、遠心分離した後に血清を収集した。抗体濃度を決定するためのＥＬＩＳＡによる定量分析まで、集めたマウス血清試料を−７０℃で保管した。
【００５０】
図１０に示されるように、Ｋ０７ペプチド挿入物の存在下又は不在下でｂｓＡｂ＃１５２（グリコシル化部位に突然変異を有する又は有しない）は、最初の注射直後のマウス血清において、同様の保持能力（Ｃｍａｘ）を示した。図６の結果のように、親ｂｓＡｂ＃１５２の濃度は急速に減少し、＃１５２−Ｋ０７の濃度は、注射後により長い持続期間に亘って、血清中でより高く保持した。興味深いことに、＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔはより初期の時間点（８時間未満）で最も高い濃度を示したが、＃１５２−Ｋ０７  １１  ｍｕｔの濃度は、＃１５２−Ｋ０７のものより速く、しかし＃１５２のものよりも遅く減少した。Ｋ０７ペプチドが挿入された場合、親ｂｓＡｂ＃１５２の半減期（ｔ１／２）は、８倍に増加した（３．２±０．１時間から２５．７±２．３時間）が；突然変異体Ｋ０７ペプチドが挿入された場合は、４倍の増加（３．２±０．１時間から１２．６±０．８時間）が観察されたに過ぎなかった。これらのデータから、組み換えタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期延長が極度にグリコシル化されたＫ０７ペプチドに起因し得ると結論づけることができる。
【００５１】
７１アミノ酸のＫ０７ペプチド中のグリコシル化部位の１１個のアミノ酸が置換されても、得られたペプチドがなおもタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長することができることに注目することが重要である。これは、Ｋ０７ペプチドにおいて１５％（１１／７１）の突然変異を表し、これらの突然変異は重要な残基（すなわち、グリコシル化部位）を含む。当業者は、非クリティカル残基の突然変異（例えば、相同性残基による置換）の更なる包含が確実に許容され得ることを十分に理解するであろう。したがって、本発明の実施形態において、配列番号２と８０％以上、好ましくは８５％以上；より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＫ０７の類縁体を使用することは合理的である。なおもタンパク質薬物に対するｉｎ  ｖｉｖｏ半減期延長の特性を与えることができるＫ０７ペプチドのこれらの突然変異体は、「Ｋ０７ホモログ」又はＫ０７ペプチドの「ホモログ」と称される。これらのホモログは、図２に示されるＫ０７配列（配列番号２）に対するそれらの同一性の程度（例えば、８０％の配列同一性を有するＫ０７のホモログ、又は９０％配列同一性を有するＫ０７のホモログ）によって更に定義され得る。かかるペプチド又はホモログは、キニノーゲン−１に由来することから、それらも総称的に「改変キニノーゲン−１ペプチド」と称される場合がある。
【００５２】
本発明は限られた数の実施形態に関して記載されているが、本開示の利益を有する当業者は、本明細書に開示される本発明の範囲から逸脱しない他の実施形態を考案することができることを十分に理解する。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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