(57)【要約】直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、高収率で産生され、導入遺伝子の有効な移動および発現に使用され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、発現カセットと、ＡＡＶゲノムに由来する２つの異なるＩＴＲ配列と、を指定された順序で含む。本明細書に提供されるいくつかのｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントをさらに含み、高い遺伝子発現効率をもたらす。さらに、直鎖状で連続的なカプシド不含ＤＮＡベクターの確実かつ効率的な産生のための方法および細胞株が本明細書に提供される。
2020532981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、ｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化され、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方の電気泳動によって分析されたときに、直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドを示す、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３】
前記非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１または２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４】
前記非対称ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５】
前記１つ以上の非対称ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６】
前記非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、合成である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項７】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、請求項１〜３および６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項８】
前記非対称ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項９】
前記欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１０】
前記非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項８または請求項９に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１１】
前記非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１２】
前記非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の一部ならびに／または通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１０または請求項１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１３】
前記非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造と、を含む領域に単一ステムループ構造を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１４】
前記非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造と、を含む前記領域に単一ステムおよび２つのループを含む、請求項１３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１５】
前記非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造と、を含む前記領域に単一ステムおよび単一ループを含む、請求項１３または請求項１４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１６】
少なくとも１つの非対称ＩＴＲが、図２６Ａまたは２６ＢのＩＴＲ、配列番号１０１〜４９９または５４５〜５４７、図２６Ａまたは２６ＢのＩＴＲに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＩＴＲ、ならびに配列番号１０１〜４９９および５４５〜５４７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＩＴＲから選択されるヌクレオチド配列を含む、修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１７】
少なくとも１つの非対称ＩＴＲが、配列番号２、５２、６３、もしくは６４のヌクレオチド配列、または配列番号２、５２、６３、もしくは６４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１８】
５’ＩＴＲが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲであり、３’ＩＴＲが、配列番号２、６４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、４６９〜４８３、および５４６、ならびに図２６Ａに示されるＩＴＲ配列、ならびに前記配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１９】
３’ＩＴＲが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲであり、５’ＩＴＲが、配列番号５２、６３、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、４８４〜４９９、５４５、および５４７、ならびに図２６Ｂに示されるＩＴＲ配列、ならびに前記配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２０】
５’ＩＴＲが、配列番号５２、６３、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、４８４〜４９９、５４５、および５４７、ならびに図２６Ｂに示されるＩＴＲ配列、ならびに前記配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含み、３’ＩＴＲが、配列番号２、６４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、４６９〜４８３、および５４６、ならびに図２６Ａに示されるＩＴＲ配列、ならびに前記配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２１】
ａ．配列番号１および配列番号５２、ならびに
ｂ．配列番号２および配列番号５１から選択される少なくとも２つの非対称ＩＴＲを含む、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２２】
ａ．配列番号１および配列番号５２、ならびに
ｂ．配列番号２および配列番号５１から選択される非対称ＩＴＲの対を含む、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２３】
一方または両方の非対称ＩＴＲが、配列番号２、５２、６３、６４、１１３、１１４、および５５７以外の配列を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２４】
前記異種ヌクレオチド配列の全部または一部が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２５】
少なくとも１つの調節スイッチが、表１１の前記調節スイッチから選択される、請求項２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２６】
前記ベクターが、ナノ担体中に存在する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２７】
前記ナノ担体が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項２６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２８】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、
ａ．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下、ｃｅＤＮＡ発現構築物を内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、前記昆虫細胞内で前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、前記ｃｅＤＮＡベクターをコードする、ステップと、
ｂ．前記ｃｅＤＮＡベクターを前記昆虫細胞から単離するステップと、を含むプロセスから取得される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）。
【請求項２９】
前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、およびｃｅＤＮＡバキュロウイルスから選択される、請求項２８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３０】
前記昆虫細胞が、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、請求項２８または請求項２９に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３１】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項３０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３２】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項３１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターをコードする、ｃｅＤＮＡ発現構築物。
【請求項３４】
ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、またはｃｅＤＮＡバキュロウイルスである、請求項３３に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物。
【請求項３５】
請求項３３または請求項３４に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項３６】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
昆虫細胞である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
Ｓｆ９細胞である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
ａ．前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の前記宿主細胞をインキュベートすることと、
ｂ．前記ｃｅＤＮＡを前記宿主細胞から単離することと、を含む、ｃｅＤＮＡベクターを産生する方法。
【請求項４２】
対象における疾患または障害を治療、予防、改善、監視、または診断するための方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、請求項１〜２５のうちのいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を投与することを含み、前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記疾患または障害を治療、予防、改善、診断、または監視するために選択される、方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されたときに、前記対象における内因性タンパク質の異常な量を補正する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されたときに、前記対象における内因性タンパク質または経路の異常な機能または活性を補正する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドから選択されるヌクレオチド分子をコードするか、または含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードする、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、マーカータンパク質をコードする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記疾患または障害に関連する内因性タンパク質または経路のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、抗体をコードする、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、請求項４２〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
治療タンパク質を対象に送達するための方法であって、前記方法が、
請求項１〜２５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含み、前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、治療タンパク質をコードする、方法。
【請求項５２】
前記治療タンパク質が、治療抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１〜２５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターおよびナノ担体を含み、添付文書とともに容器にパッケージ化される、キット。
【請求項５４】
ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、前記キットが、
ａ．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列の挿入のための少なくとも１つの制限部位、または調節スイッチ、または両方を含む、発現構築物を含み、前記少なくとも１つの制限部位が、非対称逆位反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられており、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、キット。
【請求項５５】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを産生するために好適である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
Ｒｅｐタンパク質の存在下、前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導し得る、ウイルスカプシドコード配列を欠いている昆虫細胞の集団をさらに含む、請求項５４または請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含み、前記ベクターが、昆虫細胞中の前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現するのに好適である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、各々２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５６，３１９号、同第６２／５５６，３２４号、同第６２／５５６，３２９号、同第６２／５５６，３３１号、同第６２／５５６，２８１号、および同第６２／５５６，３３５号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年９月７日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０８０１７０−０９０５８０ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは２０５，９９１バイトである。
【０００３】
本発明は、標的細胞、組織、器官、または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達を含む、遺伝子療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子突然変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠損遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍等をもたらし得る異常調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現から生じる医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠損遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、患者への補正遺伝物質の送達によって治療、予防、または改善され得る。遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または例えば腫瘍溶解効果などの別の結果をもたらし得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の補正遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等）の中で、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
【０００５】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７キロベース（ｋｂ）を含み、非構造的Ｒｅｐ（複製）および構造的Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするキャップ遺伝子内の第２のＯＲＦが特定された。ＡＡＶコード領域に隣接するＤＮＡは、およそ１４５ヌクレオチド長の２つのシス作用性逆位末端反復（ＩＴＲ）配列であり、ＤＮＡ複製のプライマーとして機能するエネルギー的に安定したヘアピン構造に折り畳まれ得る中断パリンドローム配列を有する。ＤＮＡ複製におけるそれらの役割に加えて、ＩＴＲ配列は、細胞ゲノム中のウイルスＤＮＡ組み込み、宿主ゲノムまたはプラスミドからのレスキュー、および成熟ビリオン中のウイルス核酸のカプシド化に関与することが示された（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９）。
【０００６】
ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫反応を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。ＡＡＶベクターはまた、高力価で産生および製剤化され、動脈内、静脈内、または腹腔内注入を介して送達され得、齧歯類（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｆｏｕｇｅｒｏｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｋｏｐｐａｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）およびイヌにおける単回注入による重要な筋領域へのベクター分布および遺伝子導入を可能にする。脊髄性筋萎縮症１型を治療するための臨床研究では、ＡＡＶベクターを、脳を標的とし、明らかな臨床改善をもたらすことを意図して、全身的に送達した。
【０００７】
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ  ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。二本鎖ＤＮＡベクターを構築することによって、この問題を回避することが試みられているが、この戦略は、ＡＡＶベクターに組み込まれ得る導入遺伝子発現カセットのサイズをさらに制限する（ＭｃＣａｒｔｙ，２００８、Ｖａｒｅｎｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００８】
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。トランスにおけるこれらのヘルパープラスミドの導入時に、ＡＡＶゲノムは、宿主ゲノムから「レスキュー」され（すなわち、放出された後に増幅され）、さらにカプシド化されて（ウイルスカプシド）、生物学的に活性なＡＡＶベクターを産生する。しかしながらそのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入することがわかった。カプシドはまた、免疫反応を誘導する。
したがって、遺伝子療法のためのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫反応に起因する）患者への単回投与、関連ＡＡＶカプシドの最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、ならびに遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。ｒＡＡＶ臨床遺伝子療法のための適用は、同系マウスモデルにおける、または他のモデル種における用量反応によって予測されない患者間の変動性によってさらに妨げられる。
組み換えカプシド不含ＡＡＶベクターは、発現可能な導入遺伝子、ならびにＲｅｐ結合部位および末端分解部位を含む２つの野生型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接されるプロモーター領域を含む、単離された直鎖状核酸分子として取得され得る。これらの組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を欠いており、２つの野生型ＩＴＲパリンドローム配列を通して共有結合された一方または両方の末端を有する一本鎖、二本鎖、または二重鎖であり得る（例えば、ＷＯ２０１２／１２３４３０、米国特許第９，５９８，７０３号）。それらは、導入遺伝子能力がはるかに高く、導入遺伝子発現の始まりが速く、患者の免疫系がＤＮＡ分子を一掃されるべきウイルスとして認識するという点で、ＡＡＶ媒介性遺伝子療法の多くを回避する。しかしながら、導入遺伝子の定常発現は、すべての例において望ましくない場合があり、ＡＡＶ正準野生型ＩＴＲは、ｃｅＤＮＡ機能のために最適化されない場合がある。したがって、向上した産生および／または発現特性を有する制御可能な組み換えＤＮＡベクターに対する重要な要求が対処されないままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１２３４３０号
【特許文献２】米国特許第９，５９８，７０３号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載される発明は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターである（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有する相補的ＤＮＡの連続鎖（直鎖状で連続的な非カプシド化構造）およびから形成されたカプシド不含の直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、互いに関して異なるか、または非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含む。
【００１２】
本明細書に記載される技術は、少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および発現可能な導入遺伝子を含有するｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、真核細胞中で産生され得、したがって昆虫細胞中の原核ＤＮＡ修飾および細菌内毒素汚染を欠き得る。
【００１３】
一態様では、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、好ましくは直鎖状二重鎖分子であり、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）の間に操作可能に位置づけられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（時として複製的タンパク質結合部位と称される）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲに関する欠失、挿入、または置換を含む。すなわち、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲに対して非対称である。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ  ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲまたは修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲである。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾型ＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター、および少なくとも１つの導入遺伝子を含む発現カセット、または（２）少なくとも１つの導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、および（３）２つの自己相補的配列、例えば、前述の発現カセットに隣接するＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と関連していない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）（本明細書では「ＲＢＳ」と称される場合もある）およびＡＡＶの末端分解部位（ｔｒｓ）またはＲＢＥの機能的異形、および導入遺伝子に操作可能に連結された１つ以上のシス調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２）などのディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）などのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）などの機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの実施例では、修飾型ＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ｔｒｓの配列、ならびに野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲの対応する配列からの１つのＩＴＲヘアピン二次構造の末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造および位置を保持する。
【００１６】
ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例示的なＩＴＲ配列は、表２〜１０Ａおよび１０Ｂ、または配列番号２、５２、１０１〜４９９、および５４５〜５４７、または図２６Ａ〜２６Ｂに示される部分ＩＴＲ配列のうちのいずれか１つ以上に開示される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００〜５２９から選択される任意の配列を含むＩＴＲを有しない。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書において表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、および１０Ｂのうちのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列またはＩＴＲ部分配列の修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲの修飾を有するＩＴＲを含み得る。
【００１８】
例示的な実施例として、本開示は、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む閉端ＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡは、カプシドタンパク質を欠いており、（ａ）そのヘアピン二次構成（好ましくは、これらの参照配列と比較して、この構成での任意のＡＡＡもしくはＴＴＴ末端ループの欠失を除外する）において配列番号２と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する突然変異型右側ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは配列番号５１と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する突然変異型左側ＡＡＶ２  ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、実施例１〜２および／もしくは図１Ａ〜Ｂを参照）から産生され、（ｂ）実施例１における未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの特定のためのアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡとして特定される。そのような修飾型ＩＴＲ配列の例は、本明細書において表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、および１０Ｂに提供されている。
【００１９】
本明細書に記載される技術はさらに、標的細胞中の１つ以上の導入遺伝子を送達し、コードすることができるｃｅＤＮＡベクターに関し、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、マルチシストロン性配列を含むか、または導入遺伝子およびその未変性ゲノムコンテキスト（例えば、導入遺伝子、イントロン、および内因性未翻訳領域）が一緒に、ｃｅＤＮＡベクターに組み込まれる。導入遺伝子は、タンパク質コード転写物、非コード転写物、または両方であり得る。ｃｅＤＮＡベクターは、複数のコード配列、およびタンパク質コード転写物、非コード転写物、もしくは両方を発現するための非正準翻訳開始部位または２つ以上のプロモーターを含み得る。導入遺伝子は、２つ以上のタンパク質をコードする配列を含み得るか、または非コード転写物の配列であり得る。発現カセットは、例えば、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
【００２０】
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分を含む。例えば、追加の調節構成成分は、本明細書に開示される調節スイッチであり得、ｃｅＤＮＡ感染細胞、ならびに必要に応じて他の誘導性および／または抑制性エレメントを殺傷し得るキルスイッチを含むが、これに限定されない。
【００２１】
本明細書に記載される技術は、ｃｅＤＮＡベクターを使用して１つ以上の導入遺伝子を送達し、効率的かつ選択的に発現する新規の方法をさらに提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドの非存在下で、宿主細胞中に取り込まれるとともに、核中に輸送される能力を有する。さらに、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを欠いているため、カプシド含有ベクターに反応して生じ得る免疫反応を回避する。
【００２２】
本発明の態様は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを産生する方法に関する。他の実施形態では、本明細書に提供される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターに関する。一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）は、第１の５’逆位末端反復（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）、発現カセット、および３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）をこの順に含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むプラスミド（本明細書では「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と称される）から取得され、５’および３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型ＩＴＲであるか、または５’および３’ＩＴＲの両方が修飾されているとき、それらは互いに異なる修飾を有し、同じ配列ではない。
【００２３】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、本開示を読むことにより、熟練者に既知のいくつかの手段によって取得可能である。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、表１２または図１０Ｂを参照）、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＩＴＲの間に操作可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号７）を含み、例えば、導入遺伝子、例えばレポーター遺伝子および／または治療的遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを挿入することができる．いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対応する隣接したＡＡＶ３  ＩＴＲまたは野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列と比較して修飾されたＩＴＲを含有するポリヌクレオチドテンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）から産生され、この修飾は、欠失、挿入、および／または置換のうちのいずれか１つ以上である。
【００２４】
許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを有するポリヌクレオチドテンプレートが複製して、ｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質およびＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、少なくとも１つの機能的ＩＴＲに基づいて、核酸配列に結合し、複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。例えば、複製可能ＩＴＲがＡＡＶ血清型２に由来する場合、対応するＲｅｐは、その血清型と共働するＡＡＶ血清型に由来し、例えばＡＡＶ２  ＩＴＲはＡＡＶ２またはＡＡＶ４  Ｒｅｐと共働するが、ＡＡＶ５  Ｒｅｐとは共働しない。複製時に、共有結合性閉端ｃｅＤＮＡベクターは、許容細胞中で蓄積し続け、ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは標準複製条件下、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、長期間にわたって十分に安定して、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、さらにより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
【００２５】
したがって、本発明の一態様は、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスに関する。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ビリオン強制サイズ制限はない。
【００２６】
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を変性ゲルおよび非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１．共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、ｃｅＤＮＡベクター。
２．ｃｅＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化され、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方の電気泳動によって分析されたときに、直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドを示す、パラグラフ１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３．非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、パラグラフ１または２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４．非対称ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、パラグラフ３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
５．１つ以上の非対称ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
６．非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、合成である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
７．ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、パラグラフ１〜３および６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
８．非対称ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ１〜７のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲの一方または両方は、表１に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域の任意の組み合わせにおいて欠失、挿入、および／または置換を有し得る。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲの一方または両方は、Ｂ領域、および／またはＢ’領域、および／またはＣ領域、および／またはＣ’領域中に欠失、挿入、および／または置換を有し得る。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲの一方または両方は、Ａ領域、および／またはＡ’領域、および／またはＢ領域、および／またはＢ’領域、および／またはＣ領域、および／またはＣ’領域、および／またはＤ領域、および／またはＤ’領域中に１つ以上の欠失、挿入、および／または置換を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、特定アームの全部、例えば、Ａ−Ａ’アームの全部もしくは一部、またはＢ−Ｂ’アームの全部もしくは一部、またはＣ−Ｃ’アームの全部もしくは一部の除去または欠失、あるいはステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去（例えば、ＩＴＲ−６を参照）を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去、およびＢ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起される。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームを欠いている。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームを欠いている。
９．欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、パラグラフ８に記載のｃｅＤＮＡベクター。例えば、いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の相補的塩基対は、Ｃ−Ｃ’アームが切断されるように、Ｃ−Ｃ’アームのＣ部分およびＣ’部分の各々から除去され、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくはそれ以上の塩基対は、Ｃ−Ｃ’アームおよび／もしくはＢ−Ｂ’アームが切断されるように、Ｂ−Ｂ’アームのＢ部分およびＢ’部分の各々から除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＣ’部分のみが残るように、Ｃ−Ｃ’アームのＣ部分から除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＣ部分のみが残るように、Ｃ−Ｃ’アームのＣ’部分から除去される。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＢ’部分のみが残るように、Ｂ−Ｂ’アームのＢ部分から除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＢ部分のみが残るように、Ｂ−Ｂ’アームのＢ’部分から除去される。いくつかの実施形態では、Ｃ領域、Ｃ’領域、Ｂ領域、またはＢ’領域中の任意の欠失は、ステムループの末端ループを依然として保存する。いくつかの実施形態では、末端ループは、少なくとも３つのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｃ−Ｃ’アームおよび／またはＢ−Ｂ’アームの末端ループは、少なくとも３つの連続ＴＴＴまたは３つの連続ＡＡＡを有する。
１０．非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ８またはパラグラフ９に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１１．非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常はＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ８〜１０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１２．非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の一部ならびに／または通常はＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ１０またはパラグラフ１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１３．非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に単一ステムループ構造を含む、パラグラフ１〜１２のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１４．非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に単一ステムおよび２つのループを含む、パラグラフ１３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１５．非対称ＩＴＲのうちの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に単一ステムおよび単一ループを含む、パラグラフ１３またはパラグラフ１４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１６．少なくとも１つの非対称ＩＴＲが、図２６Ａまたは２６ＢのＩＴＲ、配列番号１０１〜４９９または５４５〜５４７、図２６Ａまたは２６ＢのＩＴＲに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＩＴＲ、ならびに配列番号１０１〜４９９および５４５〜５４７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＩＴＲから選択されるヌクレオチド配列を含む、修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲである、パラグラフ１〜１５のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１７．少なくとも１つの非対称ＩＴＲが、配列番号２、５２、６３、もしくは６４のヌクレオチド配列、または配列番号２、５２、６３、もしくは６４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲである、パラグラフ１〜１６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１８．５’ＩＴＲが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲであり、３’ＩＴＲが、配列番号２、６４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、４６９〜４８３、および５４６、ならびに図２６Ａに示されるＩＴＲ配列、ならびに配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、パラグラフ１〜１６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１９．３’ＩＴＲが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲであり、５’ＩＴＲが、配列番号５２、６３、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、４８４〜４９９、５４５、および５４７、ならびに図２６Ｂに示されるＩＴＲ配列、ならびに配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、パラグラフ１〜１６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２０．５’ＩＴＲが、配列番号５２、６３、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、４８４〜４９９、５４５、および５４７、ならびに図２６Ｂに示されるＩＴＲ配列、ならびに配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含み、３’ＩＴＲが、配列番号２、６４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、４６９〜４８３、および５４６、ならびに図２６Ａに示されるＩＴＲ配列、ならびに配列のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択される配列を含む、パラグラフ１〜１６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２１．（ａ）配列番号１および配列番号５２、ならびに（ｂ）配列番号２および配列番号５１から選択される少なくとも２つの非対称ＩＴＲを含む、パラグラフ１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２２．（ａ）配列番号１および配列番号５２、ならびに（ｂ）配列番号２および配列番号５１から選択される非対称ＩＴＲの対を含む、パラグラフ１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２３．一方または両方の非対称ＩＴＲが、配列番号２、５２、６３、６４、１１３、１１４、および５５７以外の配列を含む、パラグラフ１〜２０のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２４．異種ヌクレオチド配列の全部または一部が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、パラグラフ１〜２４のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２５．少なくとも１つの調節スイッチが、表１１または本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに列挙される調節スイッチのうちのいずれかまたは組み合わせから選択される、パラグラフ２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。単なる例として、調節スイッチは、異種ヌクレオチド配列、例えば導入遺伝子の発現を微調整するのに役立ち、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「オン／オフ」スイッチである。理論に制限されるものではないが、「オン／オフ」スイッチは、異種ヌクレオチド配列またはｃｅＤＮＡベクターから発現される導入遺伝子の発現を、制御可能かつ調節可能に開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計されている。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」である。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、バイナリスイッチ（例えば、誘導性プロモーター、共因子、もしくは転写を脱抑制する外因性薬剤）、小分子調節スイッチ（例えば、薬物誘導性薬物またはプロドラッグは、転写を活性化もしくは停止する）、「パスコード」調節スイッチ（例えば、導入遺伝子の発現および／もしくは抑制が生じるために条件の組み合わせが存在する必要がある）、核酸系調節スイッチ（例えば、発現および／もしくは抑制を制御する核酸系機序）、翻訳後および／または転写後調節スイッチ（例えば、翻訳後修飾が発生するまで機能的導入遺伝子を防止するシグナル反応エレメント（ＳＲＥ）もしくは不安定化ドメイン（ＤＤ）発現される導入遺伝子）、またはキルスイッチ（例えば、対象の系から導入されたｃｅＤＮＡベクターを永久に除去する手段としてプログラム化細胞死を誘導するスイッチ）のうちのいずれかから選択される。
２６．ベクターが、ナノ担体中に存在する、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２７．ナノ担体が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、パラグラフ２６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２８．ｃｅＤＮＡベクターが、（ａ）少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下、ｃｅＤＮＡ発現構築物を内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、ｃｅＤＮＡ発現構築物が、昆虫細胞内でｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、ｃｅＤＮＡベクターをコードする、ステップと、（ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを昆虫細胞から単離するステップと、を含むプロセスから取得される、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター。
２９．ｃｅＤＮＡ発現構築物が、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、およびｃｅＤＮＡバキュロウイルスから選択される、パラグラフ２８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３０．昆虫細胞が、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、パラグラフ２８またはパラグラフ２９に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３１．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、パラグラフ３０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３２．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ３１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３３．パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクターをコードする、ｃｅＤＮＡ発現構築物。
３４．ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、またはｃｅＤＮＡバキュロウイルスである、パラグラフ３３に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物。
３５．パラグラフ３３またはパラグラフ３４に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物を含む、宿主細胞。
３６．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、パラグラフ３５に記載の宿主細胞。
３７．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、パラグラフ３６に記載の宿主細胞。
３８．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ３７に記載の宿主細胞。
３９．昆虫細胞である、パラグラフ３５〜３８のいずれか１つに記載の宿主細胞。
４０．Ｓｆ９細胞である、パラグラフ３９に記載の宿主細胞。
４１．ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法であって、（ａ）ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、パラグラフ３５〜４０のいずれか１つに記載の宿主細胞をインキュベートすることと、（ｂ）ｃｅＤＮＡを宿主細胞から単離することと、を含む、方法。
４２．対象における疾患または障害を治療、予防、改善、監視、または診断するための方法であって、当該方法が、それを必要とする対象に、パラグラフ１〜２５のうちのいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を投与することを含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、疾患または障害を治療、予防、改善、診断、または監視するために選択される、方法。
４３．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されたときに、対象における内因性タンパク質の異常な量を補正する、パラグラフ４２に記載の方法。
４４．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されたときに、対象における内因性タンパク質または経路の異常な機能または活性を補正する、パラグラフ４２に記載の方法。
４５．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドから選択されるヌクレオチド分子をコードするか、または含む、パラグラフ４２〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ４２〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４７．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、マーカータンパク質（例えば、レポータータンパク質）をコードする、パラグラフ４２に記載の方法。
４８．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、疾患または障害に関連する内因性タンパク質または経路のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする、パラグラフ４２〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４９．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、抗体をコードする、パラグラフ４２〜４６のいずれか１つに記載の方法。
５０．疾患または障害が、代謝性疾患または障害、ＣＮＳ疾患または障害、眼疾患または障害、血液疾患または障害、肝疾患または障害、免疫疾患または障害、感染性疾患または障害、筋疾患または障害、癌、ならびに遺伝子産物の異常なレベルおよび／または機能に基づく疾患または障害から選択される、パラグラフ４２〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．代謝性疾患または障害が、糖尿病、リソソーム蓄積障害、ムコ多糖障害、尿素サイクル疾患または障害、およびグリコーゲン蓄積疾患または障害から選択される、パラグラフ５０に記載の方法。
５２．リソソーム蓄積障害が、ゴーシェ病、ポンペ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、およびファブリー病から選択される、パラグラフ５１に記載の方法。
５３．尿素サイクル疾患または障害が、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠乏である、パラグラフ５１に記載の方法。
５４．ムコ多糖障害が、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群、モルキオ症候群、およびマロトー・ラミー症候群から選択される、パラグラフ５１に記載の方法。
５５．ＣＮＳ疾患または障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスヴァンガー病、脊髄または頭部損傷に起因する外傷、テイ・サックス病、レッシュ・ナイアン病、癲癇、脳梗塞、精神障害、統合失調症、薬物依存、ノイローゼ、精神病、認知症、偏執病、注意欠陥障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食または体重障害、ならびに癌およびＣＮＳの腫瘍から選択される、パラグラフ５０に記載の方法。
５６．眼疾患または障害は、網膜、後視床路、および／または視神経から選択される、パラグラフ５０に記載の方法。
５７．網膜、後視床路、および／または視神経に関与する眼科障害が、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性を含む黄斑変性、地図状萎縮および血管または「滲出型」黄斑変性、緑内障、ブドウ膜炎、網膜色素変性、スタルガルド病、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、ならびに眼の癌および腫瘍から選択される、パラグラフ５５に記載の方法。
５８．血液疾患または障害が、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症、および血液癌から選択される、パラグラフ５０に記載の方法。
５９．肝疾患または障害が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）、ならびに肝臓癌および腫瘍から選択される、パラグラフ５０に記載の方法。
６０．疾患または障害が、嚢胞性繊維症である、パラグラフ４２に記載の方法。
６１．ｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、パラグラフ４２〜６０に記載の方法。
６２．治療タンパク質を対象に送達するための方法であって、当該方法が、パラグラフ１〜２５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、治療タンパク質をコードする、方法。
６３．治療タンパク質が、治療抗体である、パラグラフ６２に記載の方法。
６４．治療タンパク質が、酵素、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、サイトカイン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ペプチド増殖因子、およびホルモンから選択される、パラグラフ６２に記載の方法。
６５．パラグラフ１〜２５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターおよびナノ担体を含み、添付文書とともに容器にパッケージ化される、キット。
６６．ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、当該キットが、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列の挿入のための少なくとも１つの制限部位、または調節スイッチ、または両方を含む、発現構築物を含み、少なくとも１つの制限部位が、非対称逆位反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられており、非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、キット。
６７．パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクターを産生するために好適である、パラグラフ６６に記載のキット。
６８．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導し得る、ウイルスカプシドコード配列を欠いている昆虫細胞の集団をさらに含む、パラグラフ６６またはパラグラフ６７に記載のキット。
６９．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含み、当該ベクターが、昆虫細胞中の前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現するのに好適である、パラグラフ６６〜６８のいずれか１つに記載のキット。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、任意に異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシド中に存在しない。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記でさらに詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。
【図１Ｂ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有するｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲによって隣接される。
【図１Ｃ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子の挿入のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含有する発現カセットを有するｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。
【図２Ａ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定を有するＡＡＶ２（配列番号５３８）の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。さらに、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは変位型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。
【図２Ｂ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）、および末端分解部位（ｔｒｓ）の特定を有するＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型ＩＴＲ（配列番号５３９）中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよび結紮活性を示し、またいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域、および他の保存構造も示す。
【図３Ａ】野生型左ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４０）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）および二次構造（右）を提供する。
【図３Ｂ】左ＩＴＲの例示的な変位型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、左）（配列番号１１３）のＡ−Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。
【図３Ｃ】野生型右ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４１）のＡ−Ａ’ループ、ならびにＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および二次構造（右）を示す。
【図３Ｄ】例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、右）（配列番号１１４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。左ＩＴＲが非対称であるか、または右ＩＴＲとは異なる限り、左および右ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを使用することができる。図３Ａ〜３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ〜３Ｄの各々に含まれる。
【図４Ａ】図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。
【図４Ｂ】ｃｅＤＮＡ産生の例示的な方法の概略図である。
【図４Ｃ】ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。
【図４Ｄ】図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図４Ｅ】図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図５】エンドヌクレアーゼでの消化を有する（＋）または有しない（−）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル流動例の例示的な図である（ｃｅＤＮＡ構築物１および２の場合ＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３および４の場合ＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５および６の場合ＳｐｅＩ、ならびにｃｅＤＮＡベクター７および８の場合ＸｈｏＩ）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。
【図６Ａ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−１、構築物−３、構築物−５、構築物−７）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞中のルシフェラーゼ活性（ｙ軸、ＲＱ（Ｌｕｃ））を測定するインビトロタンパク質発現アッセイからの結果を示す（表１２）。
【図６Ｂ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−２、構築物−４、構築物−６、構築物−８）（表１２）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞中で測定されたルシフェラーゼ活性（ｙ軸、ＲＱ（Ｌｕｃ））を示す。いかなるプラスミドも含まないＦｕｇｅｎｅで処理したＨＥＫ２９３細胞中（「Ｆｕｇｅｎｅ」）または未処理のＨＥＫ２９３細胞中（「未処理」）で測定されたルシフェラーゼ活性もまた提供される。
【図７Ａ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−１、構築物−３、構築物−５、構築物−７）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞（ｙ軸）の生存能力を示す。
【図７Ｂ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−２、構築物−４、構築物−６、構築物−８）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞（ｙ軸）の生存能力を示す。
【図８Ａ】Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８の核酸配列を含むｐＦＢＤＬＳＲプラスミド中の例示的なＲｅｐ−バクミドである。この例示的なＲｅｐ−バクミドは、ＩＥ１プロモーター断片（配列番号６６）、Ｋｏｚａｋ配列を含むＲｅｐ７８ヌクレオチド配列（配列番号６７）、Ｒｅｐ５２（配列番号６８）およびＫｏｚａｋ配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃ）で始まるＲｅｐ５８ヌクレオチド配列（配列番号６９）のポリヘドロンプロモーター配列を含む。
【図８Ｂ】ｗｔ−Ｌ  ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ルシフェラーゼ導入遺伝子、ＷＰＲＥおよびポリアデニル化配列、ならびにｍｏｄ−Ｒ  ＩＴＲを有する、例示的なｃｅＤＮＡ−プラスミド−１の概略図である。
【図９Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−２（左）」配列番号１０１）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図９Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−２（右）」配列番号１０２）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。それらは、単一アーム（Ｃ−Ｃ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１０Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−３（左）」配列番号１０３）のＡ−Ａ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１０Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−３（右）」配列番号１０４）のＡ−Ａ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。それらは、単一アーム（Ｂ−Ｂ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１１Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−４（左）」配列番号１０５）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１１Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−４（右）」配列番号１０６）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。それらは、単一アーム（Ｃ−Ｃ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１２Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲのＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示し、Ｃ−Ｂ’およびＣ’−Ｂ部分（「ＩＴＲ−１０（左）」配列番号１０７）の相補的塩基対合を示す。
【図１２Ｂ】例示的な修飾型左ＩＴＲのＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示し、Ｂ−Ｃ’およびＢ’−Ｃ部分（「ＩＴＲ−１０（右）」配列番号１０８）の相補的塩基対合を示す。それらは、単一アーム（Ｃ’−ＢおよびＣ−Ｂ’の部分またはＢ’−ＣおよびＢ−Ｃ’の部分）ならびに単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１３Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１７（左）」配列番号１０９）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１３Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１７（右）」配列番号１１０）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１７（左）およびＩＴＲ−１７（右）の両方は、単一アーム（Ｂ−Ｂ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１４Ａ】例示的な修飾型ＩＴＲ（「ＩＴＲ−６（左）」配列番号１１１）のＡ−Ａ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１４Ｂ】例示的な修飾型ＩＴＲ（「ＩＴＲ−６（右）」配列番号１１２）のＡ−Ａ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−６（左）およびＩＴＲ−６（右）の両方は、単一アームを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１５Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１（左）」配列番号１１３）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣアームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１５Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１（右）」配列番号１１４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣアームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１（左）およびＩＴＲ−１（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７４．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１６Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−５（左）」配列番号５４５）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１６Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−５（右）」配列番号１１６）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−５（左）およびＩＴＲ−５（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７３．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１７Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−７（左）」配列番号１１７）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１７Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−７（右）」配列番号１１８）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１７（左）およびＩＴＲ−１７（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｂ−Ｂ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８９．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１８Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−８（左）」配列番号１１９）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１８Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−８（右）」配列番号１２０）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−８（左）およびＩＴＲ−８（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１９Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−９（左）」配列番号１２１）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図１９Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−９（右）」配列番号１２２）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−９（左）およびＩＴＲ−９（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２０Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１１（左）」配列番号１２３）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図２０Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１１（右）」配列番号１２４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１１（左）およびＩＴＲ−１１（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２１Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１２（左）」配列番号１２５）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図２１Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１２（右）」配列番号１２６）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１２（左）およびＩＴＲ−１２（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８６．２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２２Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１３（左）」配列番号１２７）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図２２Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１３（右）」配列番号１２８）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１３（左）およびＩＴＲ−１３（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つ（例えば、Ｃ−Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２３Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１４（左）」配列番号１２９）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図２３Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１４（右）」配列番号１３０）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１４（左）およびＩＴＲ−１４（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つ（例えば、Ｃ−Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−８０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２４Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１５（左）」配列番号１３１）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図２４Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１５（右）」配列番号１３２）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１５（左）およびＩＴＲ−１５（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つ（例えば、Ｃ−Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２５Ａ】例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１６（左）」配列番号１３３）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’アームおよびＢ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。
【図２５Ｂ】例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ−１６（右）」配列番号１３４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ−１６（左）およびＩＴＲ−１６（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つ（例えば、Ｃ−Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、−７３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図２６Ａ−１】表１０Ａに列挙される例示的な修飾型右ＩＴＲのＡ−Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｂ−Ｂ’アームおよび／または修飾型Ｃ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。
【図２６Ａ−２】同上。
【図２６Ａ−３】同上。
【図２６Ａ−４】同上。
【図２６Ａ−５】同上。
【図２６Ａ−６】同上。
【図２６Ａ−７】同上。
【図２６Ｂ−１】表１０Ｂに列挙される例示的な修飾型左ＩＴＲのＡ−Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｃ−Ｃ’アームおよび／または修飾型Ｂ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。示される構造は、予測された最低自由エネルギー構造である。カラーコード：赤色＝確率９９％超、橙色＝確率９９％〜９５％、ベージュ色＝確率９５〜９０％、濃緑色９０％〜８０％、明緑色＝８０％〜７０％、明青色＝７０％〜６０％、濃青色６０％〜５０％、およびピンク色＝５０％未満。
【図２６Ｂ−２】同上。
【図２６Ｂ−３】同上。
【図２６Ｂ−４】同上。
【図２６Ｂ−５】同上。
【図２６Ｂ−６】同上。
【図２６Ｂ−７】同上。
【図２６Ｂ−８】同上。
【図２７】表１０Ａおよび１０Ｂから選択される非対称ＩＴＲ突然変異体異形でトランスフェクトされたＳｆ９  ＧｌｙｃｏＢａｃ昆虫細胞のルシフェラーゼ活性を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、野生型ＩＴＲおよび表１０Ａまたは１０Ｂから選択される修飾型非対称ＩＴＲによって隣接されるルシフェラーゼ遺伝子を有していた。「ＩＴＲ−５０  Ｒ  ｎｏ  ｒｅｐ」は、Ｒｅｐ含有バキュロウイルスの共感染のない既知のレスキュー可能な突然変異体である。「模擬」条件は、ドナーＤＮＡのないトランスフェクション試薬のみである。
【図２８】表１０Ａに開示される様々な突然変異体右ＩＴＲから選択される他のＩＴＲとともに左ｗｔ−ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡ−プラスミドでトランスフェクトされたＳｆ９昆虫細胞培養物からの代表的な粗ｃｅＤＮＡ抽出物の未変性アガロースゲル（１％アガロース、１×ＴＡＥ緩衝液）を示す。レーンあたり２ｕｇの全抽出物を負荷した。左から右へ、レーン１）１ｋｂ＋ラダー、レーン２）ＩＴＲ−１８右、レーン３）ＩＴＲ−４９右、レーン４）ＩＴＲ−１９右、レーン５）ＩＴＲ−２０右、レーン６）ＩＴＲ−２１右、レーン７）ＩＴＲ−２２右、レーン８）ＩＴＲ−２３右、レーン９）ＩＴＲ−２４右、レーン１０）ＩＴＲ−２５右、レーン１１）ＩＴＲ−２６右、レーン１２）ＩＴＲ−２７右、レーン１３）ＩＴＲ−２８右、レーン１４）ＩＴＲ−５０右、レーン１５）１ｋｂ＋ラダー。
【図２９】ＩＴＲ突然変異体ライブラリーからの代表的な構築物の変性ゲル（０．８％アルカリアガロース）を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、表１０Ａに開示される様々な突然変異体右ＩＴＲから選択される他のＩＴＲとともに左ｗｔ−ＩＴＲを含むプラスミド構築物から産生される。左から右へ、レーン１）１ｋｂ＋ＤＮＡラダー、レーン２）ＩＴＲ−１８右  未切断、レーン３）ＩＴＲ−１８右  制限消化、レーン４）ＩＴＲ−１９右  未切断、レーン５）ＩＴＲ−１９右  制限消化、レーン６）ＩＴＲ−２１右  未切断、レーン７）ＩＴＲ−２１右  制限消化、レーン８）ＩＴＲ−２５右  未切断、レーン９）ＩＴＲ−２５右  制限消化。抽出物をＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した。各突然変異体ｃｅＤＮＡは、２つの特徴的な断片、約２，０００ｂｐおよび約３，０００ｂｐ（それぞれ変性条件下で約４，０００および約６，０００ｂｐに達する）を産生する単一ＥｃｏＲＩ認識部位を有することが予想される。未処理のｃｅＤＮＡ抽出物は、約５，０００ｂｐであり、変性条件下で約１１，０００ｂｐで移動すると予想される。
【図３０】ＩＴＲ突然変異体ＩＴＲ−１８右、ＩＴＲ−１９右、ＩＴＲ−２１右、およびＩＴＲ−２５右、およびＩＴＲ−４９のＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ活性を示し、ｃｅＤＮＡベクター中の左ＩＴＲは、ＷＴ  ＩＴＲである。「模擬」条件は、ドナーＤＮＡのないトランスフェクション試薬のみであり、負の対照は未処理である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における共通用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ  ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ  ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ  ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、それらの内容は、参照によりそれら全体がすべて本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。関心対象の導入遺伝子としては、ポリペプチドをコードする核酸、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸としては、治療的ＲＮＡに転写される核酸が挙げられる。本発明のｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために含まれる導入遺伝子としては、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、アプタマー、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを発現させる、またはコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補鎖であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、統合、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、２つより多くのＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科、および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科からなる。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖でない単一ｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、ヌクレオチド付加、欠失、切断、または点突然変異に起因し得る。一実施形態では、対の１つのＩＴＲは、野生型ＡＡＶ配列であり得、もう１つは非野生型または合成配列であり得る。別の実施形態では、対のいずれのＩＴＲも、野生型ＡＡＶ配列でなく、２つのＩＴＲは、互いに配列が異なる。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位等に便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒ等を挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ  Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実行できるようにする。ＲＢＳ配列およびその逆相補鎖は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ  ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’−（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）−３’（配列番号５３１）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質−ＤＮＡ複合体を安定させる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ  ｐｏｌ  δまたはＤＮＡ  ｐｏｌ  εを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン−ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替として、Ｒｅｐ−チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産生物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’−ＧＧＴＴＧＡ−３’（配列番号４５）を含む。他の既知のＡＡＶ  ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号４６）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号４７）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号４８）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号４９）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号５０）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ−ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」、「ｃｅＤＮＡベクター」、および「ｃｅＤＮＡ」は、交換可能に使用され、少なくとも１つの共有結合性閉端を有する非ウイルスカプシド不含ＤＮＡベクター（すなわち、分子間二重鎖）を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
【００４５】
本明細書で定義される場合、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用され得るタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生成する反応を触媒させ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産生物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
【００４７】
転写調節因子は、関心対象の遺伝子の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン−ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または非存在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつすべての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が挙げられる。薬学的活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
【００５１】
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現、または本明細書に記載される合成生物的回路の別のモジュール構成成分において使用される別のプロモーターの発現を調節する、転写因子の発現を駆動し得る。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０〜１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
【００５４】
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「操作可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された）、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
【００５５】
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と称され得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する突然変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照、各々が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
【００５７】
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方法で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の非存在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。追加として、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、スペイン人、中東人等であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない。「抗体断片」は、無傷抗体が結合する同じ抗原に結合する無傷抗体の部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。一実施形態では、抗体または抗体断片は、免疫グロブリン鎖または抗体断片、および少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。抗体およびその断片の例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖、軽鎖、重鎖および軽鎖、完全抗体（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、重鎖、系さ、可変領域等の各々を含む）、二重特異性抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体、細胞内抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、または多量体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体またはその断片は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含むが、これらに限定されない任意のクラス、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を含むが、これらに限定されない任意のサブクラスであり得る。追加として、抗体は、任意の哺乳類、例えば霊長類、ヒト、ラット、マウス、ウマ、ヤギ等に由来し得る。一実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化である。いくつかの実施形態では、抗体は、修飾抗体である。いくつかの実施形態では、抗体の構成成分は、抗体自体が、タンパク質構成成分の発現に続いて集成するように別々に発現され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトにおける免疫原性反応を低減するように「ヒト化」される。いくつかの実施形態では、抗体は、疾患または疾患の症状を治療する目的のために、所望の機能、例えば、所望のタンパク質の相互作用および阻害を有する。一実施形態では、抗体または抗体断片は、フレームワーク領域またはＦｃ領域を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、抗体分子の「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する抗体分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の一部を指す。実施形態では、抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の可変領域（Ｖ）のアミノ酸残基によって形成される。超可変領域と称される、重鎖および軽鎖の可変領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された隣接するストレッチの間に配設される。ＦＲは、免疫グロブリン中の超可変領域間およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列である。実施形態では、抗体分子中に、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間内に互いに対して配設され、抗原結合表面を形成し、これは結合した抗原の３次元表面に相補的である。重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７において定義され、説明されている。各可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端までアミノ酸順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで形成される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「全長抗体」という用語は、例えば、天然に存在し、正常な免疫グロブリン遺伝子断片リコンビナトリアルプロセスによって形成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「機能的抗体断片」という用語は、無傷（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する断片を指す。「抗体断片」または「機能的断片」という用語はまた、可変領域からなる単離された断片、例えば重鎖および軽鎖、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）によって接続されるリコンビナント単鎖ポリペプチド分子の可変領域からなる「Ｆｖ」断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆｃ断片または単一アミノ酸残基などの抗原結合活性のない抗体の部分を含まない。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得る、アミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含み得る。例えば、配列は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成に対応した他の変更を含んでもよい。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【００６６】
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらそれぞれの構成成分を指す。
【００６７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示等を読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【００６８】
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。「約」という用語は、パーセンテージに関して使用される場合、±１％を意味し得る。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されてはならない。
【００６９】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００７０】
ＩＩ．ｃｅＤＮＡベクター
本明細書では、共有結合性閉端を有する新規の非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）が提供される。これらの非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス、または統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得、ＩＴＲは、互いに関して異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位（ｔｒｓ）およびＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
【００７１】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子等の挿入を許可する。
【００７２】
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’〜３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、互いに関して非対称であり、すなわち、それらは互いに異なる。例示的な実施形態では、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、または異なる修飾を有するか、または同一の修飾型ＩＴＲではない。言い換えれば、ＩＴＲは、１つのＩＴＲの任意の変化が他のＩＴＲに反映されていない非対称であるか、あるいはＩＴＲは、互いに関して異なる。ｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ−プラスミドを生成するために使用するための例示的なＩＴＲは、「ＩＴＲ」と題するセクションで後述されている。
【００７３】
本明細書に提供される野生型または突然変異型または他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ−プラスミドまたは他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、調節配列、核酸をコードする配列（例えば、ｍｉＲまたはアンチセンス配列など）、またはポリペプチドをコードする配列（例えば、導入遺伝子など）であり得る。一実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を可能にする、または制御する１つ以上の調節配列（複数可）に操作可能に連結されてもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含み、関心対象のヌクレオチド配列は、第１および第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１および第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称である。
【００７５】
これらの態様の各々における一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、ならびにポリアデニル化および終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能−誘導可能または抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号０３）またはその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調節する配列、非限定例として、導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。
【００７６】
一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥ（例えば、配列番号０８）を含む。一実施形態では、ポリアデニル化および終結シグナルは、ＢＧＨポリＡ（例えば、配列番号０９）を含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、またはその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）または他の転写後処理エレメント（限定されないが、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む）が追加として使用され得る。一実施形態では、５’〜３’配向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、または５ｋｂ超、または６ｋｂ超、または７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。
【００７７】
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
【００７８】
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【００７９】
図１Ａ〜１Ｃは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、またはｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセットおよび第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され、第１および／または第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に関して突然変異される。発現可能な導入遺伝子カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順に含む。
【００８０】
発現カセットは、関心対象の任意の導入遺伝子を含み得る。関心対象の導入遺伝子としては、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲｓ等）、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、発現カセット中の導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、治療的遺伝子またはマーカータンパク質である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、抗体の模倣体、または抗体断片、またはその抗原結合断片、例えば、中和抗体または抗体断片等である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。
【００８１】
特に、導入遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異型および／または活性断片を含むが、これらに限定されない１種以上の治療剤（複数可）をコードすることができる。例示的な導入遺伝子は、「治療の方法」と題するセクションにおいて本明細書に記載されている。
【００８２】
プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合および末端分解部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ならびに細菌型ＤＮＡメチル化、または実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定例としてプロモーターまたはエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
【００８３】
本明細書に提供される方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて突然変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造は、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ−プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）およびこれらの異なる対象物（下記を参照）を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ−プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
【００８４】
プラスミド系発現ベクターを超える本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターのいくつかの利点としては、次のことが挙げられるが、これらに限定されない。１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核細胞特異的メチル化、例えば、６−メチルアデノシンおよび５−メチルシトシンメチル化に供されるが、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は、真核細胞起源であり、原核細胞特異的メチル化を受けず、結果として、カプシド不含ＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症および免疫反応を誘導する可能性が低い。２）プラスミドは、産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない。３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解をバイパスするために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与するウイルスシスエレメント、すなわちＩＴＲを含有し、核に対して標的化され、送達されるように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小定義エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号４８））に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列であると仮定する。４）ｃｅＤＮＡベクターは、報告によれば受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫反応を誘起する原核細胞由来のプラスミドにおいてしばしば見出されるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【００８５】
ＩＩＩ．ＩＴＲ
本明細書に開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、互いに関して異なる（すなわち、非対称ＩＴＲである）２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられる異種遺伝子を含有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、例えば、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号５３１）および機能的末端分解部位（ＴＲＳ、例えば５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号４６）を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。一実施形態では、異なるＩＴＲは、異なる血清型からの各野生型ＩＴＲではない。
【００８６】
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２  ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、または任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）に由来する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、パルボウイルス科のウイルスに由来し得、２つの亜科、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科、および昆虫に感染するデンソウイルス亜科を含む。パルボウイルス亜科（パルボウイルスと称される）は、ディペンドウイルス族を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ディペンドウイルス族は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に感染するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルス）を含む。パルボウイルスおよびパルボウイルス科ファミリーの他のメンバーは、一般に、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，″Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，″Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に記載されている。
【００８８】
熟練者であれば、ＩＴＲ配列は、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａ）、各ＩＴＲは、より大きなパリンドロームアーム（Ａ−Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成され（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ−プラスミドにおける使用のための、任意のＡＡＶ血清型からの対応する修飾型ＩＴＲ配列を容易に判定することができる。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６）からのＩＴＲの構造分析および配列比較を参照されたい。Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４−３７９、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２６１；８−１４に記載されている。
【００８９】
ＩＴＲにおける特定の変更および突然変異が本明細書に詳細に記載されているが、ＩＴＲの文脈において、「変更型」または「突然変異型」は、ヌクレオチドが、野生型配列、参照配列、または元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、および／または置換されており、２つの隣接するＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクター中の他の隣接するＩＴＲに対して変更され得ることを示す。変更型または突然変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、合成であり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶ系配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、突然変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。
【００９１】
ＩＴＲ配列は、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａ）、各ＩＴＲは、より大きなパリンドロームアーム（Ａ−Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ−プラスミドにおいて使用するための任意のＡＡＶ血清型からＩＴＲ配列または修飾型ＩＴＲ配列を容易に判定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９に記載される異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６、ならびにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）およびウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））からのＩＴＲの配列比較を参照されたい。これは、他の血清型からの左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの同一性％を示す。ＡＡＶ−１（８４％）、ＡＡＶ−３（８６％）、ＡＡＶ−４（７９％）、ＡＡＶ−５（５８％）、ＡＡＶ−６（左ＩＴＲ）（１００％）、およびＡＡＶ−６（右ＩＴＲ）（８２％）。
【００９２】
したがって、ＡＡＶ２  ＩＴＲは、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の例示的なＩＴＲとして使用されるが、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）を含む任意の既知のＡＡＶ血清型のＩＴＲで調製され得るか、またはそれに基づき得る。熟練者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、またはＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）または他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本発明は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからＩＴＲを含む集団および複数のｃｅＤＮＡベクターをさらに提供する。すなわち、１つのＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得る。
【００９３】
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、または塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロンおよび骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、および光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋および肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、および膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、および肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲに基づいている。例えば、それは、配列番号２および配列番号５２からなる群から選択される。これらの態様の各々の一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドは、配列番号１および配列番号５２、ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択されるＩＴＲの対を含む。これらの態様の各々の一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、配列番号１０１および配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４、配列番号１０５および配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号１０８、配列番号１０９および配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２、配列番号１１３および配列番号１１４、ならびに配列番号１１５および配列番号１１６からなる群から選択される異なるＩＴＲの対を含む。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、配列番号２、５２、６３、６４、１０１〜４９９、または５４５〜５４７のＩＴＲまたは部分ＩＴＲ配列のうちのいずれかから選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書において表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、および１０Ｂのうちのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列もしくはＩＴＲ部分配列、または図２６Ａもしくは２６Ｂに示される配列の修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲの修飾を有するＩＴＲを含み得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、分子内二重鎖二次構造を形成し得る。第１のＩＴＲおよび非対称の第２のＩＴＲの二次構造は、野生型ＩＴＲ（例えば、図２Ａ、３Ａ、および３Ｃを参照）ならびに修飾型ＩＴＲ構造（例えば、図２Ｂ、および図３Ｂ、３Ｄを参照）の文脈において例証されている。二次構造は、ｃｅＤＮＡベクターを産生するために使用されるプラスミドのＩＴＲ配列に基づいて推定または予測される。ステムループ構造の一部が欠失される修飾型ＩＴＲの例示的な二次構造は、図９Ａ〜２５Ｂおよび図２６Ａ〜２６Ｂに示され、また表１０Ａおよび１０Ｂにも示される。単一ステムおよび２つのループを含む修飾型ＩＴＲの例示的な二次構造は、図９Ａ〜１３Ｂに示される。単一ステムおよび単一ループを有する修飾型ＩＴＲの例示的な二次構造は、図１４に示される。いくつかの実施形態では、二次構造は、自由エネルギー変化を倍にすることによって定量化される構造の安定性を予測する最近傍規則に基づいて熱力学的方法を使用し、本明細書に示されるものとして推定され得る。例えば、構造は、最低自由エネルギー構造を見出すことによって予測され得る。いくつかの実施形態では、Ｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．Ｓ．，＆Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．（２０１０）ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１，１２９に開示され、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅソフトウェア（ワールド・ワイド・ウェブのアドレス：″ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ″において入手可能）において実装されるアルゴリズムを、ＩＴＲ構造の予測に使用することができる。このアルゴリズムはまた、３７℃での自由エネルギー変化パラメーター、および実験文献に由来するエンタルピー変化パラメーターの両方を含み、任意の温度での構造安定性の予測を可能にし得る。ＲＮＡ構造ソフトウェアを使用し、修飾型ＩＴＲ構造のうちのいくつかは、図３Ａ〜３Ｄに示される生理的条件下での推定Ｇｉｂｂｓ展開自由エネルギー（ΔＧ）を有する修飾型Ｔ形ステムループ構造として予測され得る。ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅソフトウェアを使用し、修飾型ＩＴＲの３つの型は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲ（−９２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりも高いＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーを有すると予測され、以下のとおりである。（ａ）本明細書に提供される単一アーム／単一不対ループ構造を有する修飾型ＩＴＲは、−８５〜−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーを有すると予測される。（ｂ）本明細書に提供される単一ヘアピン構造を有する修飾型ＩＴＲは、−７０〜−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーを有すると予測される。（ｃ）本明細書に提供される２つのアーム構造を有する修飾型ＩＴＲは、−９０〜−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーを有すると予測される。理論に束縛されるものではないが、より高いＧｉｂｂｓ自由エネルギーを有する構造は、Ｒｅｐ  ６８またはＲｅｐ  ７８複製タンパク質による複��のためにより容易に展開される。したがって、より高いＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーを有する修飾型ＩＴＲ、例えば、単一アーム／単一不対ループ構造、単一ヘアピン構造、切断構造は、野生型ＩＴＲよりも効率的に複製される傾向がある。
【００９６】
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの左ＩＴＲは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ  ＩＴＲ構造に関して修飾または突然変異され、右ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲである。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの右ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ構造に関して修飾され、左ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲである。そのような実施形態では、ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）の修飾は、ＡＡＶゲノムに由来する野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換によって生成され得る。
【００９７】
本明細書で使用されるＩＴＲは、分解可能および非分解可能であり得、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために選択され、好ましくはＡＡＶ配列であり、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、および９が好ましい。分解可能なＡＡＶ  ＩＴＲは、末端反復が所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、統合、および／またはプロウイルスレスキュー等を媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列を必要としない（例えば、内在性または野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、切断、および／またはミスセンス突然変異によって変更され得る）。典型的には、必須ではないが、ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型からのものであり、例えば、ｃｅＤＮＡベクターの両方のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２からのものである。ＩＴＲは、ＡＡＶ逆位末端反復として機能する合成配列、例えばＳａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「二重Ｄ配列」であってもよい。必須ではないが、ＩＴＲは、同じパルボウイルスからのものであり得、例えば、両方のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２からのものである。
【００９８】
一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、本明細書に開示される野生型ＩＴＲのうちの１つに関して突然変異されるＩＴＲ構造を含み得るが、突然変異体または修飾型ＩＴＲは、依然としてすべての操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持している。一実施形態では、突然変異体ｃｅＤＮＡ  ＩＴＲは、機能的複製タンパク質部位（ＲＰＳ−１）を含み、ＲＰＳ−１部位に結合する複製可能タンパク質が産生に使用される。
【００９９】
一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、Ｒｅｐ結合および／またはＲｅｐニッキングに関して欠陥のあるＩＴＲである。一実施形態では、欠陥は、野生型還元ＩＴＲに対して少なくとも３０％であり、他の実施形態では、少なくとも３５％…、５０％…、６５％…、７５％…、８５％…、９０％…、９５％…、９８％…であるか、またはその間の関数または任意の点を完全に欠いている。宿主細胞は、ウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、任意のウイルスカプシドコード配列を欠いている。一実施形態では、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠いたポリヌクレオチドベクターテンプレートおよび宿主細胞、ならびに得られるタンパク質もまた、他のウイルスのカプシド遺伝子をコードまたは発現しない。追加として、特定の実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ  ７８またはＲｅｐ  ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、または上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、ＡおよびＡ’アーム、ＢおよびＢ’アーム、ＣおよびＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、ならびに末端分解部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
【０１０１】
より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、およびｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲであり得、ＡもしくはＡ’アームまたはＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＣまたはＣ’アーム、ＲＢＥ、およびｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＢおよびＢ’アームは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ  ＢおよびＢ’アームで置き換えられる。
【０１０２】
単なる例として、表１は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対するそのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃおよび／またはＣ’および／またはＢおよび／またはＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ−Ｃ’アーム、もしくは単一Ｂ−Ｂ’アーム）、または修飾型Ｃ−Ｂ’アームもしくはＣ’−Ｂアーム、または少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／もしくは切断されたＢ−Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、または２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／または切断されたＢ−Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。
【表１】
2020532981.tif 000003
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、およびＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣまたはＣ’またはＢまたはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、依然としてステムループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替実施形態では、ＣとＣ’および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、および／またはＤから選択される領域のうちの１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡおよび／またはＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。
【０１０４】
一実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、ＩＴＲに対する特定の修飾は、本明細書において例示されている（例えば、配列番号２、５２、６３、６４、１０１〜４９９、または５４５〜５４７）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号４６９〜４９９もしくは５４５〜５４７の修飾型ＩＴＲ、または配列番号１０１〜１３４もしくは５４５〜５４７のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションのうちの１つと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ−Ａ’アームの全部もしくは一部、またはＢ−Ｂ’アームの全部もしくは一部、またはＣ−Ｃ’アームの全部もしくは一部の除去または欠失、あるいはステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去（例えば、ＩＴＲ−６を参照）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去、およびＢ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ−Ｃ’アームにおける６つの塩基対、およびＢ−Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図１３Ａ〜１３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ−Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分およびＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、ならびにＢ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。この実施例では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対欠失を含むため、アームＢ−Ｂ’もまた、ＷＴ  ＩＴＲに対して切断される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の相補的塩基対は、Ｃ−Ｃ’アームが切断されるように、Ｃ−Ｃ’アームのＣ部分およびＣ’部分の各々から除去される。つまり、塩基がＣ−Ｃ’アームのＣ部分において除去される場合、Ｃ’部分の相補的塩基対が除去され、それによってＣ−Ｃ’アームを切断する。そのような実施形態では、２、４、６、８、またはそれ以上の塩基対は、Ｃ−Ｃ’アームが切断されるように、Ｃ−Ｃ’アームから除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＣ’部分のみが残るように、Ｃ−Ｃ’アームのＣ部分から除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＣ部分のみが残るように、Ｃ−Ｃ’アームのＣ’部分から除去される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の相補的塩基対は、Ｂ−Ｂ’アームが切断されるように、Ｂ−Ｂ’アームのＢ部分およびＢ’部分の各々から除去される。つまり、塩基がＢ−Ｂ’アームのＢ部分において除去される場合、Ｂ’部分の相補的塩基対が除去され、それによってＢ−Ｂ’アームを切断する。そのような実施形態では、２、４、６、８、またはそれ以上の塩基対は、Ｂ−Ｂ’アームが切断されるように、Ｂ−Ｂ’アームから除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＢ’部分のみが残るように、Ｂ−Ｂ’アームのＢ部分から除去される。代替実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対は、アームのＢ部分のみが残るように、Ｂ−Ｂ’アームのＢ’部分から除去される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２〜２０ヌクレオチド欠失を有す。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、２つの対向する長さ方向に非対称のステムループを形成し、例えば、Ｃ−Ｃ’ループは、Ｂ−Ｂ’ループに対して異なる長さである。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲの対向する長さ方向の非対称ステムループのうちの１つは、長さが８〜１０塩基対の範囲のＣ−Ｃ’および／またはＢ−Ｂ’ステム部分、ならびに２〜５不対デオキシリボヌクレオチドを有するループ部分（例えば、ＣとＣ’の間もしくはＢとＢ’の間）を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲの１つの長さ方向の非対称ステムループは、長さが８未満または７、６、５、４、３、２、１塩基対未満のＣ−Ｃ’および／またはＢ−Ｂ’ステム部分、ならびに０〜５ヌクレオチドを有するループ部分（例えば、ＣとＣ’の間もしくはＢとＢ’の間）を有する。いくつかの実施形態では、長さ方向に非対称のステムループを持つ修飾型ＩＴＲは、長さが３塩基対未満のＣ−Ｃ’および／またはＢ−Ｂ’ステム部分を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、もしくは末端分解部位でのニッキング）に干渉しないように、ＡまたはＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、および／またはＣ領域に１つ以上の欠失を有する。修飾型ＩＴＲのいくつかの非限定例は、図９Ａ〜２６Ｂに示される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームが残るように、Ｂ−Ｂ’アームの欠失を含み得る。例えば、図９Ａ〜９Ｂに示される例示的なＩＴＲ−２（左）およびＩＴＲ−２（右）、ならびにＩＴＲ−４（左）およびＩＴＲ−４（右）（図１１Ａ〜１１Ｂ）を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームが残るように、Ｃ−Ｃ’アームの欠失を含み得る。例えば、図１０Ａ〜１０Ｂに示される例示的なＩＴＲ−３（左）およびＩＴＲ−３（右）を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、単一ステムループが残るように、Ｂ−Ｂ’アームおよびＣ−Ｃ’アームの欠失を含み得る。例えば、図１４Ａ〜１４Ｂに示される例示的なＩＴＲ−６（左）およびＩＴＲ−６（右）、ならびにＩＴＲ−２１およびＩＴＲ−３７を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、切断されたＣループおよびＢ−Ｂ’アームが残るように、Ｃ’領域の欠失を含み得る。例えば、図１５Ａ〜１５Ｂに示される例示的なＩＴＲ−１（左）およびＩＴＲ−１（右）を参照されたい。同様に、いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、切断されたＣ’ループおよびＢ−Ｂ’アームが残るように、Ｃ領域の欠失を含み得る。例えば、図１６Ａ〜１６Ｂに示される例示的なＩＴＲ−５（左）およびＩＴＲ−５（右）を参照されたい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ部分、Ｃ’部分、Ｂ部分、またはＢ’部分のうちのいずれか１つ以上における塩基対の欠失を含み得、それによりＣ−Ｂ’部分およびＣ’−Ｂ部分の間で相補的塩基対合が起こり、単一アームを産生する。例えば、ＩＴＲ−１０（右）およびＩＴＲ−１０（左）（図１２Ａ〜１２Ｂ）を参照されたい。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、および／またはＢ’領域中の１つ以上のヌクレオチドにおける修飾に加えて、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、Ａ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、Ｂ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１、２、３、４、５、６ヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、置換、もしくは付加）を含み得る。例えば、修飾型右ＩＴＲにおけるＢ’とＣとの間のヌクレオチドは、ｎＡからＧ、Ｃ、もしくはＡまで置換され得るか、または欠失され得るか、または１つ以上のヌクレオチドが付加され得る。修飾型左ＩＴＲにおけるＣ’とＢとの間のヌクレオチドは、ＴからＧ、Ｃ、もしくはＡに変更され得るか、または欠失され得るか、または１つ以上のヌクレオチドが付加され得る。
【０１１４】
本発明のある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０〜５５７のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなる修飾型ＩＴＲを有しない。本発明のある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０〜５５７のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む修飾型ＩＴＲを有しない。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される調節スイッチと、配列番号５５０〜５５７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された修飾型ＩＴＲと、を含む。．
【０１１６】
別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さおよび／またはループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステム高さは、約５ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施形態では、ステム高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施例では、ループは、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０１１７】
別の実施形態では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位またはＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加または減少され得る。一実施例では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、またはその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列またはＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
【０１１８】
別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥおよびヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加または減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０１１９】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号４６））を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型または修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、または非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に提供される、配列番号５００〜５２９からなる、または本質的になる任意の配列から選択される修飾型ＩＴＲを有しない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００〜５２９から選択される任意の配列から選択されるＩＴＲを有しない。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表２に列挙されている。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアームおよび切断アーム内に修飾を有する。ループアームおよび切断アーム内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表３に列挙されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアームおよびスペーサー内に修飾を有する。ループアームおよびスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表４に列挙されている。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、切断アームおよびスペーサー内に修飾を有する。切断アームおよびスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表５に列挙されている。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、およびスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、およびスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表６に列挙されている。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、それが最低展開エネルギー（「低エネルギー構造」）を含むように修飾される。低エネルギーは、野生型ＩＴＲと比較して、低減したＧｉｂｂｓ自由エネルギーを有するであろう。低い（すなわち、低減した）展開エネルギーに修飾されるＩＴＲの例示的な配列は、本明細書において表７〜９に提示される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、表２〜９、１０Ａもしくは１０Ｂに示されるものうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択される。
【表２−１】
2020532981.tif 000004
【表２−２】
2020532981.tif 000005
【表２−３】
2020532981.tif 000006
【表２−４】
2020532981.tif 000007
【表２−５】
2020532981.tif 000008
【表３−１】
2020532981.tif 000009
【表３−２】
2020532981.tif 000010
【表４−１】
2020532981.tif 000011
【表４−２】
2020532981.tif 000012
【表４−３】
2020532981.tif 000013
【表５−１】
2020532981.tif 000014
【表５−２】
2020532981.tif 000015
【表６−１】
2020532981.tif 000016
【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
2020532981.tif 000022
【０１２８】
本明細書に開示されるように、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来する野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含むように生成され得る。修飾型ＩＴＲは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中のプラスミドにおける増殖中の遺伝子修飾によって、またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中のバキュロウイルスゲノムとして、または例えば、インビトロでポリメラーゼ連鎖反応もしくは化学合成を使用する他の生物学的方法によって生成され得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２（左）の野生型ＩＴＲ（配列番号５１）またはＡＡＶ２（右）の野生型ＩＴＲ（配列番号１）からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含む。具体的には、１つ以上のヌクレオチドが、Ｔ形ステムループ構造のＢ−Ｃ’またはＣ−Ｃ’から欠失、挿入、または置換される。さらに、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲのＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）および末端分解部位（ｔｒｓ）に修飾を含まないが、ＲＢＥ’（ＴＴＴ）は、テンプレートが一巡の複製療法を受け、それによってＡＡＡ三重項を相補的ＲＢＥ’−ＴＴＴに変換したかどうかに依存して存在してもしなくてもよい。
【０１３０】
３つの修飾型ＩＴＲの種類が例示される。（１）単一アームおよび単一不対ループを含む最低エネルギー構造（「単一アーム／単一不対ループ構造」）を有する修飾型ＩＴＲ、（２）単一ヘアピンを持つ最低エネルギー構造（「単一ヘアピン構造」）を有する修飾型ＩＴＲ、ならびに（３）２つのアーム（１つが切断されている）を持つ最低エネルギー構造（「切断構造」）を有する修飾型ＩＴＲ。
【０１３１】
単一アーム／単一不対ループ構造を有する修飾型ＩＴＲ
野生型ＩＴＲは、単一アームおよび単一不対ループを含む二次構造（すなわち、「単一アーム／単一不対ループ構造」）を形成するように修飾され得る。構造のＧｉｂｂｓ展開自由エネルギー（ΔＧ）は、−８５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。修飾型ＩＴＲの例示的な構造が提供される。
【０１３２】
単一アームおよび単一不対ループ構造を形成すると予測される修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列中に、野生型ＩＴＲから１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。修飾型ＩＴＲは、遺伝子修飾または生合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
【０１３３】
例えば、図９Ａ〜９Ｂに提供されるＩＴＲ−２左および右（配列番号１０１および１０２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲ中のＣ−Ｃ’アームから２つのヌクレオチドの欠失、およびＢ−Ｂ’アームから１６ヌクレオチドの欠失を有するように生成される。修飾型ＩＴＲのＢ−Ｂ’アームに残る３つのヌクレオチドは、相補的対合を作製しない。したがって、ＩＴＲ−２左および右は、単一Ｃ−Ｃ’アームおよび単一不対ループを持つ最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−７２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０１３４】
図１０Ａおよび１０Ｂに提供されるＩＴＲ−３左および右（配列番号１０３および１０４）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＣ−Ｃ’アームに１９ヌクレオチド欠失を含むように生成される。修飾型ＩＴＲのＢ−Ｂ’アームに残る３つのヌクレオチドは、相補的対合を作製しない。したがって、ＩＴＲ−３左および右は、単一Ｂ−Ｂ’アームおよび単一不対ループを持つ最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−７４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０１３５】
図１１Ａおよび１１Ｂに提供されるＩＴＲ−４左および右（配列番号１０５および１０６）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ−Ｂ’アームに１９ヌクレオチド欠失を含むように生成される。修飾型ＩＴＲのＢ−Ｂ’アームに残る３つのヌクレオチドは、相補的対合を作製しない。したがって、ＩＴＲ−４左および右は、単一Ｃ−Ｃ’アームおよび単一不対ループを持つ最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−７６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０１３６】
図１２Ａおよび１２Ｂに提供されるＩＴＲ−１０左および右（配列番号１０７および１０８）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ−Ｂ’アームに８ヌクレオチド欠失を含むように生成される。Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームに残るヌクレオチドは、ＢモチーフとＣ’モチーフとの間（ＩＴＲ−１０左）またはＣモチーフとＢ’モチーフとの間（ＩＴＲ−１０右）に新たな相補的結合を作成する。したがって、ＩＴＲ−１０左および右は、単一Ｂ−Ｃ’アームまたはＣ−Ｂ’アームおよび単一不対ループを持つ最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−８３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０１３７】
図１３Ａおよび１３Ｂに提供されるＩＴＲ−１７左および右（配列番号１０９および１１０）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＣ−Ｃ’アームに１４ヌクレオチド欠失を含むように生成される。Ｃ−Ｃ’アームに残る８ヌクレオチドは、相補的結合を作成しない。結果として、ＩＴＲ−１７左および右は、単一Ｂ−Ｂ’アームおよび単一不対ループを持つ最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−７３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０１３８】
野生型ＩＴＲ左または右（上）、および単一アーム／単一不対ループ構造を形成すると予測される様々な修飾型ＩＴＲ左または右（下）の配列は整列され、下記の表７に提供される。
【表７−１】
2020532981.tif 000023
【表７−２】
2020532981.tif 000024
【表７−３】
2020532981.tif 000025
【０１３９】
単一ヘアピン構造を有する修飾型ＩＴＲ
野生型ＩＴＲは、単一ヘアピン構造を含む最低エネルギー構造を有するように修飾され得る。構造のＧｉｂｂｓ展開自由エネルギー（ΔＧ）は、−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。修飾型ＩＴＲの例示的な構造は、図１４Ａおよび１４Ｂに提供される。
【０１４０】
単一ヘアピン構造を形成すると予測される修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列中に、野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。修飾型ＩＴＲは、遺伝子修飾または生合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
【０１４１】
例えば、図１４Ａおよび１４Ｂに提供されるＩＴＲ−６左および右（配列番号１１１および１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームに４０ヌクレオチド欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残るヌクレオチドは、単一ヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
【０１４２】
野生型ＩＴＲおよびＩＴＲ−６（左および右の両方）の配列は整列され、下記の表８に提供される。
【表８】
2020532981.tif 000026
【０１４３】
切断構造を有する修飾型ＩＴＲ
野生型ＩＴＲは、１つが切断される２つのアームを含む最低エネルギー構造を有するように修飾され得る。それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギー（ΔＧ）は、−９０〜−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。したがって、それらのＧｉｂｂｓ展開自由エネルギーは、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲよりも低い。
【０１４４】
修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列中に、野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定ループ、例えば、Ａ−Ａ’ループ、Ｂ−Ｂ’ループ、もしくはＣ−Ｃ’ループのすべての除去、または代替として、ステムの最後の最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。修飾型ＩＴＲは、遺伝子修飾または生合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
【０１４５】
切断構造を有する修飾型ＩＴＲの例示的な構造は、図１５Ａ〜１５Ｂに提供される。
【０１４６】
切断構造を形成すると予測される様々な修飾型ＩＴＲの配列は、野生型ＩＴＲの配列と整列され、下記の表９に提供される。
【表９−１】
2020532981.tif 000027
【表９−２】
2020532981.tif 000028
【表９−３】
2020532981.tif 000029
【表９−４】
2020532981.tif 000030
【０１４７】
本明細書における使用のための上記クラスの各々の追加の例示的な修飾型ＩＴＲは、表１０Ａおよび１０Ｂに提供される。表１０Ａの右修飾型ＩＴＲの予測される二次構造は、図２６Ａに示され、表１０Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測される二次構造は、図２６Ｂに示される。
【０１４８】
表１０Ａおよび表１０Ｂは、例示的な右および左修飾型ＩＴＲを示す。
【表１０Ａ−１】
2020532981.tif 000031
【表１０Ａ−２】
2020532981.tif 000032
【表１０Ｂ−１】
2020532981.tif 000033
【表１０Ｂ−２】
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【０１４９】
本発明の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０、５５１、５５２、５５３、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７の群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する修飾型ＩＴＲを有しない。
【０１５０】
ｃｅＤＮＡベクターが修飾型ＩＴＲを有する範囲で、本出願の特許請求の範囲のうちのいずれか１つ以上において、または本出願において、もしくはそれから派生する任意の特許において今後提出され得る補正された特許請求の範囲において定義される任意の発明内で定義される、配列番号５５０〜５５７に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域に修飾のうちの１つを有し、またその特許請求の範囲（複数可）に対する任意の関連国（複数可）の法律が適用する範囲で、我々は、ここで当該開示を本出願の特許請求の範囲またはそれから派生する任意の特許から、本出願またはそれから派生する任意の特許の無効化を防ぐために必要な範囲で放棄する権利を留保する。
【０１５１】
例えば、無制限に、本出願の任意の特許請求の範囲（現在の、もしくは今後補正される）、またはそれから派生する任意の特許から、以下の主題のうちのいずれか１つを放棄する権利を留保する。
【０１５２】
Ａ．調節スイッチのないｃｅＤＮＡベクター中で使用される配列番号２、５２、６３、６４、１１３、１１４、５５０、５５１、５５２、５５３、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７からなる群のうちのいずれかから選択される修飾型ＩＴＲ
【０１５３】
Ｂ．調節配列のないｃｅＤＮＡベクター中の上記Ａ．において指定された修飾型ＩＴＲ。異種核酸は、ＡＢＣＡ４、ＵＳＡ２Ａ  ｖａｒ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＥＰ２９０、ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子、ｖＷＦ＿Ｈｉｓ、ｖＷＦ、レシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＨ、Ｇ６ＰＣ、またはＣＦＴＲをコードする。
【０１５４】
無制限に、上記の権利放棄の留保は、少なくとも本出願の特許請求の範囲１〜５７、ならびに[００２７]および[０３４０]に記載されるパラグラフを含むが、これらに限定されないすべてのパラグラフに適用されることを明言する。
【０１５５】
ＩＶ．調節エレメント
ｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。
【０１５６】
ｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）およびＢＧＨポリＡ（配列番号９）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。本発明の発現カセットは、全体発現レベルとともに細胞特異性に影響を及ぼし得るプロモーターを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫反応を低減するために組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。好ましい実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）などの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）ウサギβ−グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替として、発現カセットは、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（配列番号４もしくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（配列番号５もしくは配列番号１６）、またはヒト伸長因子−１α（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、配列番号６もしくは配列番号１５）を含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する、例えば、配列番号２２）を含む。代替として、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。
【０１５７】
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号１８（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１−抗チプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号２１）等が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
【０１５８】
プロモーターは、さらに発現を強化し、かつ／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れた位置にあり得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子構成成分の発現を、発現が起こる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に反応して、構成的にまたは示差的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ならびに下記に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサーは、関心対象（例えば、遺伝子編集分子、ドナー配列、治療タンパク質等）の任意の遺伝子の発現のために使用され得る。例えば、ベクターは、治療タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含み得る。治療タンパク質をコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒト遺伝子からのプロモーター、例えばヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオニンであり得る。プロモーターはまた、組織特異的プロモーター、例えば肝臓特異的プロモーター、例えばヒトα１抗チプシン（ＨＡＡＴ）（天然または合成）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介した肝細胞への、ｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
【０１５９】
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサー（例えば、配列番号２２および配列番号２３）をさらに含み得る。
【０１６０】
本発明に従う使用のための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号２１）、ヒトＥＦ１−αプロモーター（配列番号６）、またはＥＦ１ａプロモーター（配列番号１５）、ＩＥ２プロモーター（例えば、配列番号２０）、およびラットＥＦ１−αプロモーター（配列番号２４）の断片が挙げられる。
【０１６１】
ポリアデニル化配列：ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０〜５０ヌクレオチド、約４０〜５５ヌクレオチド、約４５〜５０ヌクレオチド、約３５〜５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
【０１６２】
発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号７４）もしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号１０）から単離された天然に存在する配列、または合成配列（例えば、配列番号２７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
【０１６３】
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ−０２およびＶＫ−Ａ２６配列、例えば、配列番号２５および配列番号２６に連結され得る。
【０１６４】
Ｖ．調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチを、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターの出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける関心対象の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。
【０１６５】
Ａ．バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、追加として、関心対象の遺伝子を操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサー等を含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子または外因性薬剤によって調節される。したがって、一実施形態では、１つ以上の共因子（複数可）または外因性薬剤が細胞中に存在する場合のみ、ｃｅＤＮＡベクターからの関心対象の遺伝子の転写および発現が起こる。別の実施形態では、１つ以上の共因子（複数可）または外因性薬剤を使用して、関心対象の遺伝子の転写および発現を脱抑制することができる。
【０１６６】
当業者によって既知の任意の核酸調節領域は、調節スイッチを含むように設計されたｃｅＤＮＡベクターにおいて用いられ得る。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２０３−１２０８（２０００））に開示されるものを含む、古典的なテトラサイクリン系または他の抗生物質系スイッチが使用のために包含される。
【０１６７】
Ｂ．小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異形／ＬＧ３３５およびＧＲＱＣＩＭＦＩ（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（２０１０）：１５に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに）；操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）には結合するＣ末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２−１４５１７）、またはＳａｎｄｏ  Ｒ  ３ｒｄ；Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５−８に開示される抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択され得る。
【０１６８】
熟練者に既知の他の小分子系調節スイッチもまた、ｃｅＤＮＡの導入遺伝子発現を制御するための使用が想定され、Ｂｕｓｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ；Ｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．，２００５；１２（２）；１５１−１６１に開示されているもの、Ｌｉａｎｇ，Ｆ．−Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ４（１６４）に開示されているものなどのアブシジン酸感受性オンスイッチ、Ｈａｒｔｅｎｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５（２０），２００７に開示されているものなどの外因性Ｌ−アルギニン感受性オンスイッチ、Ｒｏｓｓｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．２０１４，２１：８１−９０に開示されているものなどの合成胆汁酸感受性オンスイッチ、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２００９  Ｍａｒ；１１（２）：１１７−１２４に開示されるものなどのビオチン感受性オンスイッチ、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４；４２（１４）；ｅ１１６に開示されるものなどの二重入力食品添加物安息香酸塩／バニリン感受性調節スイッチ、Ｇｉｕｓｅｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６（５），６５３  −６６３に開示されるものなどの４−ヒドロキシタモキシフェン感受性スイッチ、およびＧｉｔｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００９  Ｊｕｎ  ３０；１０６（２６）：１０６３８−１０６４３に開示されているものなどのフラビノイド（フロレチン）感受性調節スイッチが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号および同第６，３３９，０７０号に開示されているものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
【０１７０】
ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例示的な調節スイッチは、表１１のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
Ｃ．「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および／または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件ＡおよびＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、またはそれ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣまたはＡ、Ｂ、およびＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、およびＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、およびＣは、以下のとおりであり得る。条件Ａは、病態または疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン反応であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する反応である。単なる例示的な実施例として、導入遺伝子がインスリンである場合、条件Ａは、対象が糖尿病を有する場合に条件Ａが起こり、条件Ｂは、血糖値が高い場合であり、条件Ｃは、必要な量で発現されていない内因性インスリン値である。一旦血糖値が低下するか、または所望のインスリン値に達すると、導入遺伝子（例えば、インスリン）は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。別の例示的な実施例では、導入遺伝子がＥＰＯである場合、条件Ａは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合であり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（ＥＰＣ）動員が不全であるか、または代替としてＨＩＦ−２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子（例えば、ＥＰＯ）は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
【０１７２】
パスコード調節スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を微調整するために有用である。例えば、パスコード調節スイッチは、それが複数のスイッチを含むことにおいてモジュールであり得、例えば、ある特定のレベルの代謝物の存在下でのみオンになる、組織特異的誘導性プロモーターであり得る。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現が起こるためには、所望の細胞型（条件Ｂ）に誘導性薬剤が存在しなければならず（条件Ａ）、代謝物は、ある特定の閾値であるか、またはそれ以上、またはそれ以下である（条件Ｃ）。代替実施形態では、パスコード調節スイッチは、導入遺伝子発現が、条件ＡおよびＢが存在するときにオンであるが、条件Ｃが存在するときにオフになるように設計され得る。そのような実施形態は、発現された導入遺伝子の直接の結果として条件Ｃが起こったときに有用である。すなわち、条件Ｃは、導入遺伝子が十分な量の所望の治療効果を有していたときに、ループへの正のフィードバックとして、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現をオフにするのに役立つ。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチは、ＷＯ２０１７／０５９２４５に開示されており、これはハイブリッド転写因子（ＴＦ）を使用して、細胞生存のための複雑な環境要件を構築する合成生体回路である、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」または「パスコードキルスイッチ」と称されるスイッチを説明している。ＷＯ２０１７／０５９２４５に記載されるパスコード調節スイッチは、それらがモジュールであり、回路の活性化を制御する環境条件および細胞運命を制御する出力モジュールの両方でカスタム可能であるため、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために特に有用である。さらに、パスコード回路は、適切な「パスコード」分子がなければ、必要な既定条件の存在下でしか導入遺伝子発現を可能にしないため、ｃｅＤＮＡベクターにおいて使用される特定の実用性を有する。何かが細胞とうまくいかないか、または何らかの理由でさらなる導入遺伝子発現が所望されない場合、関連キルスイッチ（すなわち、デッドマンスイッチ）がトリガーされ得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死をトリガーするデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存または導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現および／または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
【０１７５】
一態様では、細胞増殖を少なくとも２つの選択された薬剤の所定のセットの存在に制限する「パスコード」系は、ｉ）宿主細胞に対して毒性である毒素をコードする毒素発現モジュールであって、毒素をコードする配列が、第１のハイブリッドリプレッサータンパク質の結合によって抑制されるプロモーターＰ１に操作可能に連結されている、モジュールと、ｉｉ）第１のハイブリッドリプレッサータンパク質ｈＲＰ１をコードする第１のハイブリッドリプレッサータンパク質発現モジュールであって、ｈＲＰ１の発現が、２つのハイブリッド転写因子ｈＴＦ１およびｈＴＦ２（それらの結合または活性は、それぞれ薬剤Ａ１およびＡ２に反応性であり、それによりｈＲＰ１の発現のために薬剤Ａ１およびＡ２の両方が必要とされる）によって形成されたＡＮＤゲートによって制御され、Ａ１またはＡ２のいずれかの非存在下で、ｈＲＰ１発現は、毒素プロモーターモジュールＰ１および毒素産生を抑制し、それにより宿主細胞を殺滅するのに不十分である、モジュールと、を含む発現モジュールをコードする１つ以上の核酸構築物を含む。この系では、ハイブリッド因子ｈＴＦ１、ｈＴＦ２、およびｈＲＰ１は各々、１つの転写因子からの環境センシングモジュール、およびそれぞれのパスコード調節スイッチの結合を、それぞれのサブユニットが通常は自然界で結合するものとは異なる環境薬剤Ａ１またはＡ２の存在に対して感受性にする、異なる転写因子からのＤＮＡ認識モジュールを含む。
【０１７６】
したがって、ｃｅＤＮＡベクターは、出力モジュールを活性化するために特定分子の存在および／または非存在を必要とする「パスコード調節回路」を含み得る。細胞毒素をコードする遺伝子が出力モジュールに配置されるいくつかの実施形態では、このパスコード調節回路は、導入遺伝子発現を調節するために使用され得るだけでなく、細胞が望ましくない様式で動作する場合に回路が細胞を殺滅するキルスイッチ機序を作成するためにも使用され得る（例えば、センサードメインによって定義される特定の環境を残す、または異なる細胞型に分化する）。１つの非限定例では、ハイブリッド転写因子のモジュール性、回路アーキテクチャ、および出力モジュールは、当該技術分野において理解されるように、他の環境シグナルを感知し、他の方法で環境シグナルに反応し、誘導される細胞死に加えて細胞中の他の機能を制御するように、回路が再構成されるのを可能にする。
【０１７７】
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子−核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコード系における使用のための調節スイッチは、表１１のスイッチのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０１７８】
Ｄ．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡによって発現された導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、ＵＳ２００９／０３０５２５３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１８／０２６７６２Ａ１、米国特許第９，２２２，０９３号、および欧州特許出願第ＥＰ２８８０７１号に開示されるもの、またＶｉｌｌａ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８  Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。ＷＯ２０１８／０７５４８６およびＷＯ２０１７／１４７５８５に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。遺伝子発現を制御する、または調節スイッチとしてのＲＮＡｉ分子のそのような例は、ＵＳ２０１７／０１８３６６４に開示されている。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を遮断するリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、オン／オフスイッチは、小転写活性化ＲＮＡ（ＳＴＡＲ）系スイッチ、例えば、ＣｈａｐｐｅｌｌＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｍａｒ；１１（３）：２１４−２０、およびＣｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８  Ｍａｙ；６（３に開示されるものなどである。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、トーホールドスイッチ、例えばＵＳ２００９／０１９１５４６、ＵＳ２０１６／００７６０８３、ＷＯ２０１７／０８７５３０、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１７／０７５４８６、およびＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４；１５９（４）；９２５−９３９に開示されるものである。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２００２／００２２０１８に開示されている組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子発現を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２０１４／０１２７１６２および米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序および小分子調節系のハイブリッドである。そのような系は、当業者に周知であり、本明細書における使用が想定される。そのような調節スイッチの例としては、例えば、ＵＳ２０１０／０１７５１４１、ならびにＤｅａｎｓ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．，２００７，１３０（２）；３６３−３７２、ＷＯ２００８／０５１８５４、および米国特許第９，３８８，４２５号に開示される、ＬＴＲｉ系または「Ｌａｃ−Ｔｅｔ−ＲＮＡｉ」系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，３３８，１３８号に開示されるような円順列を必要とする。そのような実施形態では、分子スイッチは、多安定であり、すなわち、少なくとも２つの状態を切り替えることができるか、あるいは双安定であり、すなわち、状態は、「オン」または「オフ」のいずれか、例えば、光を放出することができるか否か、結合することができるか否か、触媒することができるか否か、電子を転送することができるか否か等である。別の態様では、分子スイッチは、融合分子を使用するため、スイッチは、２つより多くの状態を切り替えることができる。例えば、挿入配列またはアクセプター配列によって呈される特定の閾値状態に反応して、融合のそれぞれの他の配列は、状態の範囲（例えば、結合活性の範囲、酵素触媒の範囲等）を呈し得る。したがって、「オン」または「オフ」を切り替えるのではなく、融合分子は、刺激に対する段階的な反応を呈し得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、核酸系調節スイッチは、表１１のスイッチのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０１８３】
Ｅ．転写後および翻訳後調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、ＵＳ２０１８／０１１９１５６、ＧＢ２０１１／０７７６８、ＷＯ２００１／０６４９５６Ａ３、欧州特許第２７０７４８７号、およびＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ  ５２６−５３４、Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６  Ｎｏｖ  ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されている、テトラサイクリンまたはテオフィリンに対して感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、翻訳後修飾系である。代替実施形態では、関心対象の遺伝子またはタンパク質は、プロタンパク質もしくはプレプロタンパク質として発現されるか、またはシグナル反応エレメント（ＳＲＥ）もしくは発現されたタンパク質に結合した不安定化ドメイン（ＤＤ）を有し、それによって翻訳後修飾が起こるまで、正しいタンパク質フォールディングおよび／または活性を防ぐ。不安定化ドメイン（ＤＤ）またはＳＲＥの場合、不安定化ドメインは、外因性薬剤または小分子の存在下で翻訳後に切断される。当業者は、米国特許第８，１７３，７９２号およびＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／１８０５８７号に開示されるような制御方法を利用することができる。機能的導入遺伝子活性を制御するためにｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される他の転写後制御スイッチは、Ｒａｋｈｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１４；２１（９）：１２３８−５２  およびＮａｖａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１９；１１（８）：２１０１−２１０４Ａに開示されている。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための遺伝子調節スイッチは、翻訳後修飾系であり、それがリガンド感受性インテインを導入遺伝子コード配列に組み込み、それにより導入遺伝子または発現されたタンパク質は、スプライシング前に阻害される。例えば、これは、４−ヒドロキシタモキシフェンおよび甲状腺ホルモンの両方を使用して実証されている（例えば、米国特許第７，５４１，４５０号、同第９，２００，０４５号、同第７，１９２，７３９号、Ｂｕｓｋｉｒｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４  Ｊｕｌ  ２０；１０１（２９）：１０５０５−１０５１０、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｄｅｃ  １６；５（１２）：１４７５−１４８４、および２００５  Ｆｅｂ；１４（２）：５２３−５３２を参照）。いくつかの実施形態では、転写後系調節スイッチは、表１１のスイッチのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０１８６】
Ｆ．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することができる。追加の例としては、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン／オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｏｔｔ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００  Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１−５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、およびＷＯ１９９９／０２５３８５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、ＵＳ２００７／０１９００２８Ａ１に開示されている、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、１つ以上のエネルギー形態によって制御される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、ＷＯ１９９９／０６０１４２Ａ２、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、ＵＳ２０１５／０３２２４１０、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ９，Ｓ３６８に開示されるものなど、ならびにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、およびＮＲＳＥエレメント、および条件的に誘導可能なサイレンスエレメント（例えば、米国特許第９，３９４，５２６号に開示される、低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、炎症反応エレメント（ＩＲＥ）、および剪断応力活性化エレメント（ＳＳＡＥ）を含む）である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および／もしくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、光遺伝学的（例えば、光制御）調節スイッチ、例えば、Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８；１９（Ｓｕｐｐｌ  １）：１２においてレビューされたスイッチのうちの１つなどであり、それらもまた、本明細書における使用が想定される。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、光感受性である遺伝子エレメントを含み得、可視波長（例えば、青色、近赤外線）に反応して導入遺伝子を調節することができる。光遺伝学的調節スイッチを含むｃｅＤＮＡベクターは、そのような光源を受容し得る身体の場所、例えば、皮膚、眼、筋肉等において導入遺伝子を発現するときに有用であり、ｃｅＤＮＡベクターが内臓および組織中で導入遺伝子を発現しているときに使用することもでき、その場合、光源は、好適な手段（例えば、本明細書に開示される埋め込み可能なデバイス）によって提供され得る。そのような光遺伝学的調節スイッチは、光反応性エレメント、または光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）（例えば、２０１４／０２８７９３８に開示されている）、点灯系（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２  Ｆｅｂ  １２；９（３）：２６６−９に開示されており、インスリン導入遺伝子の発現のインビボ制御を可能にすることを報告している）、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１系（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；７，９７３−９７５（２０１０）に開示されている）、およびＦＫＦ１／ＧＩＧＡＮＴＥＡ系（例えば、Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９  Ｏｃｔ；２７（１０）：９４１−５に開示されている）の使用を含む。
【０１８９】
Ｇ．キルスイッチ
本発明の他の実施形態は、キルスイッチを含むｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、または導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。本発明のｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、癌細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結びつけられることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の非存在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書においてｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象からｃｅＤＮＡベクターを除去すること、またはコードされた導入遺伝子を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。したがって、キルスイッチは、環境シグナルを、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の条件的生存と結びつける、ｃｅＤＮＡベクターにおける合成生体回路である。いくつかの実施形態では、異なるｃｅＤＮＡベクターは、異なるキルスイッチを有するように設計され得る。これによって、ｃｅＤＮＡベクターのカクテルが使用される場合に、どの導入遺伝子発現細胞が殺滅されるかを制御することができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、モジュール生物学的封じ込め回路であるキルスイッチを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定されるキルスイッチは、ＷＯ２０１７／０５９２４５に開示されており、少なくとも２つの抑制可能な配列の相互に阻害性の配列を含み、それにより環境シグナルが構築物中の第２の分子の活性を抑制する（例えば、小分子結合転写因子を使用して、毒素産生の抑制に起因する「生存」状態をもたらす）「デッドマンキルスイッチ」と称されるスイッチを説明している。デッドマンキルスイッチを含むｃｅＤＮＡベクターを含む細胞において、環境シグナルを喪失すると、回路は永久に「死」状態に切り替え、ここで毒素は脱抑制され、細胞を殺滅する毒素産生をもたらす。別の実施形態では、細胞生存のための複雑な環境要件を構築するためにハイブリッド転写因子（ＴＦ）を使用する、「パスコード回路」または「パスコードキルスイッチ」と称される合成生体回路が提供される。ＷＯ２０１７／０５９２４５に記載されるデッドマンおよびパスコードキルスイッチは、それらがモジュールであり、回路の活性化を制御する環境条件および細胞運命を制御する出力モジュールの両方でカスタム可能であるため、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために特に有用である。エンドヌクレアーゼを含むが、これに限定されない毒素、例えば、ＥｃｏＲＩの適切な選択により、ｃｅＤＮＡベクターに存在するパスコード回路を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを含む宿主細胞を殺滅するだけでなく、そのゲノムおよび付随プラスミドを分解することができる。
【０１９１】
当業者に既知の他のキルスイッチは、本明細書に開示される、例えば、ＵＳ２０１０／０１７５１４１、ＵＳ２０１３／０００９７９９、ＵＳ２０１１／０１７２８２６、ＵＳ２０１３／０１０９５６８に開示されるｃｅＤＮＡベクター、ならびにＪｕｓｉａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１４；１−５６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４；１０１；８４１９−９、Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０１１；４３；３１０−３１９、およびＲｅｉｎｓｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，１１に開示されるキルスイッチにおける使用のために包含される。
【０１９２】
したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エフェクター毒素またはレポータータンパク質をコードする核酸を含む、キルスイッチ核酸構築物を含み得、エフェクター毒素（例えば、死タンパク質）またはレポータータンパク質の発現は、所定の条件によって制御される。例えば、所定の条件は、環境薬剤、例えば、外因性薬剤などの存在であり得、それがなければ細胞はデフォルトでエフェクター毒素（例えば、死タンパク質）を発現し、殺滅される。代替実施形態では、所定の条件は、２つ以上の環境薬剤の存在であり、例えば、細胞は、２つ以上の必須の外因性薬剤が供給されるときのみに生存し、それらのいずれかがなければ、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞は殺滅される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を破壊して、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、治療遺伝子、タンパク質、またはペプチド等）によって発現されている導入遺伝子のインビボ発現を効果的に終結させるために、キルスイッチを組み込むように修飾される。具体的に、ｃｅＤＮＡベクターは、正常な生理的条件下、哺乳類細胞中で機能性でないスイッチタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作される。このスイッチタンパク質を特異的に標的とする薬物または環境条件の投与時のみに、スイッチタンパク質を発現する細胞は破壊され、それによって治療タンパク質またはペプチドの発現を終結させる。例えば、ＨＳＶ−チミジンキナーゼを発現する細胞は、ガンシクロビルおよびシトシンデアミナーゼなどの薬物の投与時に殺滅され得ることが報告された。例えば、Ｄｅｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ−１  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ＴＫ），ｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｙｏｕ（２０１１）、およびＢｅｌｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１５）：８６９９−８７０４（１９９９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＩＳＥと称されるｓｉＲＮＡキルスイッチを含み得る（Ｄｅａｔｈ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｇｅｎｅ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）（Ｍｕｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８：８４６４３−８４６５８．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＩＳＥ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【０１９４】
いくつかの態様では、デッドマンキルスイッチは、細胞反応を、細胞増殖環境における薬剤、例えば、外因性薬剤の欠失などの所定の条件に対して感受性にする、生体回路または系である。そのような回路または系は、所定の条件に対して感受性であるデッドマン調節回路を形成する発現モジュールを含む、核酸構築物を含み得、当該構築物は、調節回路を形成する発現モジュールを含み、当該構築物は、
ｉ）第１のリプレッサータンパク質発現モジュールであって、第１のリプレッサータンパク質が、第１のリプレッサータンパク質核酸結合エレメントに結合し、第１のリプレッサータンパク質結合エレメントを含むコード配列からの転写を抑制し、第１のリプレッサータンパク質の抑制活性が、第１の外因性薬剤による阻害、所定の条件を確立する第１の外因性薬剤の存在または非存在に対して感受性である、第１のリプレッサータンパク質発現モジュールと、
ｉｉ）第２のリプレッサータンパク質発現モジュールであって、第２のリプレッサータンパク質が、第２のリプレッサータンパク質核酸結合エレメントに結合し、第２のリプレッサータンパク質結合エレメントを含むコード配列からの転写を抑制し、第２のリプレッサータンパク質は、第１のリプレッサータンパク質とは異なる、第２のリプレッサータンパク質発現モジュールと、
ｉｉｉ）第２のリプレッサータンパク質のための結合エレメントを含む遺伝子エレメントに操作可能に連結されたエフェクタータンパク質をコードする核酸配列を含み、それにより、第２のリプレッサータンパク質の発現が、エフェクター発現モジュールからのエフェクター発現の抑制を引き起こす、エフェクター発現モジュールであって、第２の発現モジュールは、エレメントが第１のリプレッサータンパク質によって結合されると、第２のリプレッサータンパク質の転写の抑制を許可する第１のリプレッサータンパク質核酸結合エレメントを含み、それぞれのモジュールは、第１の外因性薬剤の非存在下、第１のリプレッサータンパク質が第１のリプレッサータンパク質発現モジュールから産生され、第２のリプレッサータンパク質発現モジュールからの転写を抑制するように調節回路を形成し、それにより第２のリプレッサータンパク質によるエフェクター発現の抑制が緩和され、エフェクタータンパク質の発現をもたらすが、第１の外因性薬剤の存在下では、第１のリプレッサータンパク質の活性が阻害され、第２のリプレッサータンパク質の発現を許可し、これが「オフ」状態でのエフェクタータンパク質発現の発現を維持し、それにより第１の外因性薬剤は、「オフ」状態でのエフェクタータンパク質発現を維持するために回路により必要とされ、第１の外因性薬剤の除去または非存在は、エフェクタータンパク質の発現をデフォルトとする、エフェクター発現モジュールと、を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、エフェクターは、細胞死プログラムを誘導する毒素またはタンパク質である。宿主細胞に対して毒性である任意のタンパク質が使用され得る。いくつかの実施形態では、毒素は、それが発現される細胞を殺滅するに過ぎない。他の実施形態では、毒素は、同じ宿主生物の他の細胞を殺滅する。細胞死につながる多数の産生物のうちのいずれかを、デッドマンキルスイッチに用いることができる。ＤＮＡ複製を阻害する薬剤、タンパク質翻訳、または例えば宿主細胞の核酸を分解する他のプロセスが、特に有用である。回路の起動時に宿主細胞を殺滅するために効率的な機序を特定するために、宿主細胞のＤＮＡまたはＲＮＡを直接損傷するいくつかの毒素遺伝子を試験した。エンドヌクレアーゼｅｃｏＲＩ２１、ＤＮＡギラーゼ阻害剤ｃｃｄＢ２２、およびリボヌクレアーゼ型毒素ｍａｚＦ２３は、十分に特性化され、Ｅ．ｃｏｌｉに対して未変性であり、一連の殺滅機序を提供するため、それらを試験した。回路のロバスト性を高め、回路依存的細胞死の独立した方法を提供するため、この系は、例えば、「オフ」状態で死遺伝子を維持するリプレッサーにさらに干渉する標的化プロテアーゼまたはヌクレアーゼを発現するようにさらに適合され得る。生存シグナルの喪失または撤回時に、死遺伝子抑制は、例えば、リプレッサータンパク質またはそのメッセージの活発な分解によってさらにより効率的に除去される。非限定例として、ｍｆ−Ｌｏｎプロテアーゼを使用して、ＬａｃＩを分解するだけでなく、分解に必須のタンパク質を標的とした。ｍｆ−Ｌｏｎ分解タグｐｄｔ＃１を、５つの必須遺伝子（それらのタンパク質産生物は、ｍｆ−Ｌｏｎ分解に対して特に感受性である２０）の３’端に結合することができ、細胞生存性は、ＡＴｃの除去に続いて測定した。試験した必須遺伝子標的の中で、ペプチドグリカン生合成遺伝子ｍｕｒＣが、最強かつ最速の細胞死表現型をもたらした（生存率は６時間以内に１×１０−４未満）。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「所定の入力」は、既知の方法で転写因子ポリペプチドの活性に影響を及ぼす薬剤または病態を指す。一般に、そのような薬剤は、転写因子ポリペプチドの構造に結合し、かつ／またはそれを変化させることにより、転写因子ポリペプチドの活性を修飾することができる。所定の入力の例としては、所与の宿主生物の生存に必要とされない（すなわち、本明細書に記載される合成生体回路の非存在下での）環境入力剤が挙げられるが、これに限定されない。例えば、所定の入力を提供し得る条件としては、例えば、温度（例えば、１つ以上の因子の活性が温度感受性である場合）、光（所与の波長スペクトルの光を含む）の存在または非存在、およびガス、塩、金属、またはミネラルの濃度が挙げられる。環境入力剤としては、例えば、小分子、生物学的薬剤、例えばフェロモン、ホルモン、増殖因子、代謝産物、栄養素等、およびそれらの類似体；化学物質の濃縮物、環境副産物、金属イオン、および他のそのような分子もしくは薬剤；光レベル；温度；機械的応力もしくは圧力；または電流および電圧などの電気シグナルが挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、レポーターを使用して、本発明のモジュールまたはプログラム可能な合成生体回路によって受信されるシグナルの強度または活性を定量化する。いくつかの実施形態では、レポーターを他のタンパク質コード配列にインフレームで融合して、タンパク質が細胞または生物中のどこに位置しているかを特定することができる。細胞は、ルシフェラーゼの非存在下でバックグラウンド発光をほとんどまたは全く有しない経口があるため、ルシフェラーゼは、本明細書に記載される様々な実施形態のエフェクタータンパク質として使用することができ、例えば、低レベルの遺伝子発現を測定する。他の実施形態では、着色物質を産生する酵素は、分光光度計またはプレートリーダーを含む吸光度測定を行うことができる他の器具を使用して定量化され得る。ルシフェラーゼのように、β−ガラクトシダーゼのような酵素は、低シグナルを増幅させる傾向があるため、低レベルの遺伝子発現を測定するために、そのような酵素を使用することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、所与の毒素を分解または他の方法で破壊することができる酵素であり得る。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、物質を発臭産生物に変換する発臭酵素であり得る。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、小分子もしくは他のタンパク質のいずれかをリン酸化もしくは脱リン酸化する酵素、または他のタンパク質もしくはＤＮＡをメチル化もしくは脱メチル化する酵素であり得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、受容体、リガンド、または溶解性タンパク質であり得る。受容体は、３つのドメイン、タンパク質、ペプチド、または小分子などのリガンドに結合するための細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびリン酸化などのある種のシグナル伝達事象に頻繁に関与し得る細胞内または細胞質ドメインを有する傾向がある。いくつかの実施形態では、トランスポーター、チャネル、またはポンプ遺伝子配列が、エフェクタータンパク質として使用される。本明細書に記載されるキルスイッチとともに使用するためのエフェクタータンパク質の非限定例および配列は、ワールド・ワイド・ウェブ上ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇでのＲｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓにおいて見出され得る。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「モジュレータータンパク質」は、標的核酸配列からの発現を調節するタンパク質である。モジュレータータンパク質は、例えば、転写アクチベーターおよびリプレッサーを含む転写因子、とりわけ転写因子に結合するか、またはそれを修飾し、その活性に影響を及ぼすタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、モジュレータータンパク質は、例えば、標的核酸配列からの発現の調節に関与するタンパク質因子を分解するプロテアーゼを含む。好ましいモジュレータータンパク質としては、例えば、ＤＮＡ結合および入力剤結合または反応性エレメントまたはドメインが、分離可能かつ移動可能であり、それにより、例えば、第１のモジュレータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、第２のモジュレータータンパク質の入力剤反応性ドメインへの融合が、第１のタンパク質によって認識されるＤＮＡ配列に結合する新たなタンパク質をもたらすが、通常は第２のタンパク質が反応する入力剤に対して感受性である、モジュラータンパク質が挙げられる。したがって、本明細書で使用される場合、「モジュレーターポリペプチド」という用語、より具体的に「リプレッサーポリペプチド」は、指定のポリペプチドに加えて、例えば、「ＬａｃＩ（リプレッサー）ポリペプチド」、異なるか、または異形の入力剤に反応するそのようなポリペプチドの異形、または誘導体を含む。したがって、ＬａｃＩポリペプチドの場合、ラクトースまたはＩＰＴＧ以外の薬剤に結合するＬａｃＩ突然変異体または異形が含まれる。広範囲のそのような薬剤が当該技術分野において既知である。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【０２００】
ＶＩ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の詳細な方法
Ａ．一般的な産生
本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶまたは他のウイルス系ベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
【０２０１】
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【０２０２】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳類細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐおよびヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
【０２０３】
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば図４Ａ〜４Ｃおよび実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
【０２０４】
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存性、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ−ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ−ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
【０２０５】
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
【０２０６】
ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡの存在を確認することによって確認され得る。図４Ｃおよび４Ｅは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を特定するための一実施形態を示す。例えば、図５は、実施例に記載されるこれらのベクターを産生するための一実施形態を使用し、複数のプラスミド構築物からのｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。
【０２０７】
Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、転写の方向に操作可能に連結される構成成分として、少なくとも以下を提供するための既知の技法を使用して構築され得る。（１）５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサー等、および（３）３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよびｃａｐコード領域を置き換える。
【０２０８】
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、および突然変異型または修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と参照されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）野生型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’ＩＴＲは、互いに対して非対称である。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）突然変異型または修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’修飾型ＩＴＲは異なり、同じ修飾を有しない。
【０２０９】
さらなる実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。追加として、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドはまた、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、機能的ＡＡＶ  ｃａｐおよびＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ−３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
【０２１０】
本発明のｃｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されるＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記−ＵＲＬまたはデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬまたはデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’および３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
【０２１１】
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能または選択マーカーを任意に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシン等であり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。
【０２１２】
例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）は、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞およびプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を描いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。
【０２１３】
Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、（１）発現カセットおよび２つの非対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクションまたは感染のいずれかによって）前述の昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を採取し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。カプシド不含ＡＡＶベクターの産生のために上記の発現カセットおよび２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｆＡＡＶ−プラスミド、または下記のようにｃｆＡＡＶ−プラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、または当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
【０２１５】
Ｄ．細胞株：
ｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、もしくは哺乳類細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。熟練者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１  １８０、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＢＡ−プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
【０２１６】
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）または物理的手段（例えば、電気穿孔）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替として、ｃｅＤＮＡ−プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ−プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクトするために使用されるｃｅＤＮＡ−プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ−プラスミドでトランスフェクトされ、ｃｅＤＮＡ−プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈またはコロニー移動技法によって単離され、伝播され得る。
【０２１７】
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターを単離し、精製する
ｃｅＤＮＡベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図４Ａ〜４Ｅおよび下記の特定の実施例に記載されている。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡ−ベクターは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（複数可）を発現するプロデューサー細胞から取得され、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドとしては、図８Ａ（Ｒｅｐ  ＢＩＩＣ産生に有用な）、図８Ｂ（ｃｅＤＮＡベクターを取得するために使用されるプラスミド）に示されるプラスミドが挙げられる。
【０２１８】
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ−プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ−バクミド）、またはバキュロウイルス（Ｒｅｐ−バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達されたＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８もしくは６８）をコードする。Ｒｅｐ−プラスミド、Ｒｅｐ−バクミド、およびＲｅｐ−バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
【０２１９】
例示的なｃｅＤＮＡベクターである、ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法は、本明細書に記載されている。本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスおよびＲｅｐ−バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ−バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成する。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−プラスミド、Ｒｅｐ−バクミド、またはＲｅｐ−バキュロウイルス中で送達されるＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスは、細胞に一時的にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。
【０２２０】
バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、非対称ＩＴＲおよび発現カセットを含む配列を含む組み換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組み換えバキュロウイルスを取得することができる。任意に、このステップを一回または複数回繰り返して、より多い量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。
【０２２１】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存性、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  ＥＮＤＯ−ＦＲＥＥ  ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
【０２２２】
代替として、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ  Ｑ（登録商標））上に上澄を負荷し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９、ＥＰ１０３０６２２６．１）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）およびエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質およびＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞および／またはエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、またはｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
【０２２４】
微小胞は、培養培地を濾過、または２０，０００×ｇでの超遠心分離、および１００，０００×ｇでのエキソソームに供することによって、単離され得る。超遠心分離の最適期間は、実験的に判定され得、小胞が単離される特定の細胞型に依存する。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５〜２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞およびエキソソームは、微小胞およびエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介してさらに精製され得る。他の微小胞およびエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、および特定の抗体またはアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞またはエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（ＥＰ１０３０６２２６も参照）
【０２２５】
本明細書における本発明の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
【０２２６】
図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。ｃｅＤＮＡ産生プロセスおよび中間体の他の特徴は、実施例に記載されるように、図６Ａおよび６Ｂならびに図７Ａおよび７Ｂに要約される。
【０２２７】
ＶＩＩ．薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【０２２８】
本明細書に開示されるＤＮＡは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０２２９】
ｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達し、その中で導入遺伝子の治療的発現をもたらすために製剤化することができる。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
【０２３０】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊水内、髄腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管支、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝臓内、腎臓内、脳内）、髄腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、後眼窩、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、基質内、前房内、および硝子体内）、蝸牛内、および粘膜（例えば、経口、直腸、鼻腔）投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
【０２３１】
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０２３２】
核酸を細胞に送達するための様々な技法および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、ｃｅＤＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子中に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ−脂質複合体）、および任意にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
【０２３３】
ｃｅＤＮＡなどの核酸を細胞に送達するための別の方法は、細胞によって内在化されるリガンドと核酸を複合することによるものである。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載されている。
【０２３４】
ｃｅＤＮＡなどの核酸はまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ−１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
【０２３５】
インビボまたはエクスビボでの核酸の非ウイルス性送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション（米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、ならびにＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）などの市販試薬）、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号）、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、ならびにＤＮＡの薬剤により強化された取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達のために使用され得る。
【０２３６】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
【０２３７】
核酸ベクターの導入のための方法  本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば米国特許第５，９２８，６３８号に記載される方法によって、例えば造血幹細胞中に送達され得る。
【０２３８】
本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０２３９】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０２４０】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
【０２４１】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０２４２】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０２４３】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、エタノールアミン官能基、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０２４４】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０２４５】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０２４６】
いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多重ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０２４７】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０２４８】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。
【０２４９】
例えば、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、微小球、脂質粒子、小胞等の送達試薬は、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用され得る。特に核酸は、送達のために製剤化され得るか、または脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ粒子、金粒子等に封入され得る。そのような製剤は、本明細書に開示される核酸の薬学的に許容される製剤の導入のために好ましい場合がある。
【０２５０】
当該技術分野において既知の様々な送達方法またはそれらの修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターをインビトロまたはインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。
【０２５１】
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１〜３μｍ径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、電気穿孔を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを送達する。電気穿孔は、組織への電極対の挿入によって細胞膜標的細胞組織の一時的な不安定化を引き起こし、それにより不安定化した膜の周囲媒質中のＤＮＡ分子は、細胞の細胞質および核質中に貫通することができる。電気穿孔は、皮膚、肺、および筋肉などの多くの組織型にインビボで使用されている。
【０２５３】
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注入によって送達される。
【０２５４】
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、プラスミドＤＮＡのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用することによってマグネトフェクションにより送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞中に濃縮する。
【０２５５】
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに俗するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質−ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生したｓ細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ〜１μｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
【０２５７】
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ５（３）：４９８−５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール−ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約１０００ｎｍの間の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約３００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５〜約２００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ〜約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
【０２５９】
当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５−１０８３によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る（例えば、負荷−負荷相互作用によって結合される）。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子−核酸複合体は、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載されている方法を使用して産生される。
【０２６１】
Ｃ．リポソーム
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
【０２６２】
リポソームは、通常は他の手順によるトランスフェクションに対して耐性があるいくつかの細胞型とともに良好に使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長さの制約を含まない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターを、様々な培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を調べるいくつかの良好な臨床治験が完了している。
【０２６３】
リポソームは、水性媒質中に分散されるリン脂質から形成され、同時に多重ラメラ同心円二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの音波処理は、コアに水溶液を含有する、２００〜５００ＡＮＧの範囲の直径を有する小さい単一ラメラ小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、リポソームは、カチオン性脂質を含む。「カチオン性脂質」という用語は、極性ドメインおよび非極性ドメインの両方を有し、生理的ｐＨまたはその付近で正に電荷されることができ、核酸などのポリアニオンに結合し、細胞への核酸の送達を促進する脂質および合成脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、飽和および不飽和アルキル、およびアミンの脂環式エーテルおよびエステル、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、直鎖、分岐鎖アルキル、アルケニル基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１〜約２５個の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２５個より多くの炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケン基は、６個以上の炭素原子を有する。カチオン性脂質はまた、いくつかの実施形態では、１つ以上の脂環式基を含み得る。脂環式基の非限定例としては、コレステロールおよび他のステロイド基が挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１つ以上の対イオンで調製される。対イオン（アニオン）の例としては、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩、亜硝酸塩、および硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６５】
カチオン性脂質の非限定例としては、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星形デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）、ＤＯＰＥ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＥｕｆｅｃｔｉｎ（ＪＢＬ，Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、２，３，−ジオレイロキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、およびジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）から作製され得る。核酸（例えば、ＣＥＬｉＤ）はまた、例えばポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合され得、脂質は、この混合物、例えばステリル−ポリ（Ｌ−リジン）に含まれ得るか、または含まれない場合がある。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第８，１５８，６０１号に記載されるカチオン性脂質、または米国特許第８，０３４，３７６号に記載される脂質を使用して送達される。
【０２６７】
Ｄ．複合体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、複合される（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロール等）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂ等）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１−８０９に開示されている。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されているように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されているように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されているように、葉酸分子に複合される。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されているように、炭水化物に複合される。
【０２７０】
Ｅ．ナノカプセル
代替として、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
【０２７１】
ＶＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、様々な好適な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、単独で適用または注入され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなしに細胞に送達され得る。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬または他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔等を使用して送達され得る。
【０２７２】
対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【０２７３】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与される。ｃｅＤＮＡベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉、皮質、基底核、海馬、および偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、網膜、角膜、および／または視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、さらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。さらなる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。さらに追加の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療、改善、および／または予防することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
【０２７６】
ＶＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の使用
本明細書に提供される組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態または障害の治療、予防、または改善に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、または遺伝子の不適切な上方調節（導入遺伝子がその発現を抑制する、または他の方法でその発現を低減させる）に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る（例えば、発現され得る）。
【０２７７】
ＩＸ．使用方法
本発明のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞への関心対象のヌクレオチド配列の送達のための方法において使用することもできる。この方法は、特に関心対象の治療遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するための方法であり得る。本発明は、細胞中の治療的外因性ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドのインビボ発現を可能にし、それにより治療レベルのポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドが発現される。これらの結果は、ｃｅＤＮＡベクター送達のインビボおよびインビトロ両方の形態で見られる。
【０２７８】
対象の細胞中の関心対象の核酸の送達のための方法は、関心対象の当該核酸を含む本発明のｃｅＤＮＡベクターの当該対象への投与を含み得る。加えて、本発明は、当該関心対象の核酸を含む本発明のｃｅＤＮＡベクターの多回投与を含む、それを必要とする対象の細胞中の関心対象の核酸の送達のための方法を提供する。本発明のｃｅＤＮＡベクターは、免疫反応を誘導しないため、そのような多回投与戦略は、カプシド化ベクターで観察されるものとは対照的に、本発明のｃｅＤＮＡベクターに対して宿主免疫系反応によって障害されない。
【０２７９】
ｃｅＤＮＡベクター核酸（複数可）は、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、静脈内（例えば、リポソーム製剤）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、筋肉内、および他の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
【０２８０】
ＣｅＤＮＡベクター送達は、１つの種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なる外因性ＤＮＡ配列を含む複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略は、複数の遺伝子の発現を可能にし得る。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの非存在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
【０２８１】
本発明はまた、治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に結合された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０２８２】
Ｘ．治療の方法
本明細書に記載される技術はまた、開示されるｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、ならびにそれを様々な方法（例えば、原位置外、インビトロおよびインビボ適用、方法論、診断手順、ならびに／または遺伝子療法レジメン）で使用する方法を実証する。
【０２８３】
治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞もしくは組織、または他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患または障害を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に結合された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０２８４】
任意の導入遺伝子は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによって送達され得る。関心対象の導入遺伝子としては、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲｓ等）、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が挙げられる。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを発現またはコードする。
【０２８６】
特に、導入遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異型および／または活性断片、アゴニスト、アンタゴニスト、模倣体を含むが、これらに限定されない１種以上の治療剤（複数可）をコードすることができる。一態様では、疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害は、ヒト疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害である。
【０２８７】
本明細書に記載されるように、導入遺伝子は、治療タンパク質もしくはペプチド、または治療核酸配列、または治療剤をコードすることができ、治療剤としては、１種以上のアゴニスト、アンタゴニスト、抗アポトーシス因子、阻害剤、受容体、サイトカイン、細胞毒、エリスロポエチン剤、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、神経増殖因子、向神経活性ペプチド、向神経活性ペプチド受容体、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、酵素、受容体結合タンパク質、輸送タンパク質もしくはその１種以上の阻害剤、セロトニン受容体、またはその１種以上の取り込み阻害剤、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制剤、診断的分子、化学療法剤、細胞毒、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、またはｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒト（例えば、ヒト化）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）または別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対象の宿主細胞中で導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞、肝細胞、癌細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、または哺乳類起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、もしくは遺伝子療法が企図される対象の任意の１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
【０２９０】
本発明のｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、１種以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む、ｃｅＤＮＡベクター組成物および製剤が、本明細書に開示される。そのような組成物は、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための、１つ以上の診断的または治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全である。
【０２９１】
本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、または器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を対象に提供することを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０２９２】
本明細書に記載される技術の別の態様は、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも開示されるｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための量および時間にわたって投与するステップを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０２９３】
別の態様は、疾患または疾患状態の１つ以上の症状を治療または低減するためのツールとしての、ｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節または構造タンパク質に関与し得るが、典型的には常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ｃｅＤＮＡベクターを使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、いくつかの実施形態では、アンチセンス突然変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデルシステムにおいて病態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その病態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、病態は、疾患を引き起こす、またはそれをより重篤にする欠乏または不均衡を部分的または全体的に修繕することによって治療される。
【０２９４】
一般に、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、または改善することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症（および他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇および他の神経障害、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（および他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、および亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）および心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。．いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オミチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個体の治療において有利に使用され得る。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、遺伝子または遺伝子産生物中の突然変異によって引き起こされる疾患または障害を治療、改善、および／または予防することができる。ｃｅＤＮＡベクターで治療され得る例示的な疾患または障害としては、代謝疾患または障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積疾患）；尿素サイクル疾患または障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患または障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患または障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患または障害（例えば、血友病（ＡおよびＢ）、サラセミア、および貧血症）；癌および腫瘍、ならびに遺伝子疾患または障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９６】
なおもさらなる態様として、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモンまたは増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
【０２９７】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患または障害をもたらす遺伝子産生物の異常なレベルおよび／または機能（例えば、タンパク質中の非存在または欠損）を訂正することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を産生し、かつ／またはタンパク質のレベルを修正して、タンパク質中の非存在もしくは欠損によって引き起こされる特定の疾患もしくは障害から生じる症状を緩和もしくは低減するか、または利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病ＡおよびＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病またはゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的αガラクトシダーゼまたはβグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＬＤまたはＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡまたはイズロネート−２−スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節剤を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積疾患の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、またはＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
【０２９８】
代替実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸をインビトロまたはインビボで細胞に提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸またはＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞または組織培養系を最適化することもできる。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、タイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、またはハンター症候群／ＭＰＳ  ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ならびにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子−３および４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子−αおよび−β等）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、関心対象の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産生物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、および腫瘍壊死因子）、癌治療において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、および腫瘍抑制因子遺伝子産生物をコードする。
【０３００】
代表的な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における治療のために使用され得る。この方法は、治療、改善、または予防に有効な量の、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸をコードするジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性突然変異体、サルコスパン、ウトロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン−α２、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチンもしくはミオスタチンポリペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉを含む。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の別の場所に記載されるように、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与され得る。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、通常は血液中で循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮａｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のため、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＶＩＩＩ）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群等）またはリソソーム蓄積症（ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］）またはグリコーゲン蓄積疾患（ポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ）を治療、改善、および／または予防するための他の組織への全身送達のため、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、導入遺伝子を骨格筋、心筋、または横隔膜筋に送達することができる。代謝障害を治療、改善、および／または予防するための他の好適なタンパク質は、上に記載される。
【０３０２】
他の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、代謝障害の治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法において、導入遺伝子を送達することができる。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする導入遺伝子が、本明細書に記載される。任意に、ポリペプチドが分泌される（例えば、その未変性状態の分泌ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば、当該技術分野において既知のような分泌シグナル配列との操作可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。
【０３０３】
本発明の別の態様は、先天性心疾患またはＰＡＤの治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法に関し、その方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを哺乳類対象に投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターが、例えば、筋形質小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）、ホスホランバンなどのＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害剤または優性陰性分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ホスホランバン遺伝子を調節する亜鉛フィンガータンパク質、β２−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルシン、β−アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１、Ｓ１００Ａ１、パルバルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇ−タンパク質連結受容体キナーゼ２型ノックダウンに影響を及ぼす分子、例えば、切断された構成的活性型のβＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン−β４、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、および／またはｍｉｒ−２０８をコードする導入遺伝子を含む。
【０３０４】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを、任意の好適な手段によって、任意に、ｃｅＤＮＡベクターを含む呼吸域粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与することができ、これを対象が吸入する。呼吸域粒子は、液体または固体であり得る。ｃｅＤＮＡベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に既知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いるなど、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ｃｅＤＮＡベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において既知の技法によって、任意の固体粒子薬剤エアロゾル生成器を用いて同様に産生され得る。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子障害、神経変性障害、精神障害、および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療、改善、または予防するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋委縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊椎または頭部傷害に起因する外傷、タイ・サック病、リーシュ・ナイアン病、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、抑うつ、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存（例えば、アルコール依存および他の薬物依存）、ノイローゼ（例えば、不安症、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲痛、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、拒食症、および過食症）、ならびにＣＮＳの癌および腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０６】
本発明のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、または予防され得る眼障害としては、網膜、後視床路、および／または視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。多くの眼科疾患および障害は、３種類の適応症、（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性のうちの１つ以上に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを用いて、抗血管新生因子、抗炎症性因子、細胞変性を遅らせる、細胞節約を促進する、または細胞増殖を促進する因子、およびそれらの組み合わせを送達することができる。糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかで１つ以上の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つ以上の神経栄養因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲のいずれかに共送達することもできる。本発明のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、または予防され得る追加の眼疾患としては、地図状萎縮、血管性または「滲出型」黄斑変性、スタルガルト病、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、ならびに眼の癌および腫瘍が挙げられる。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、炎症性眼疾患または障害（例えば、ブドウ膜炎）は、本発明のｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の抗炎症性因子は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体または前眼房）投与によって発現され得る。他の実施形態では、網膜変性（例えば、網膜色素変性）によって特徴付けられる眼疾患または障害は、本発明のｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の神経栄養因子をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体）投与を使用して、そのような網膜変性に基づく疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、血管新生および網膜変性（例えば、加齢性黄斑変性）の両方に関与する疾患または障害は、本発明のｃｅＤＮＡベクターで治療され得る。加齢性黄斑変性は、眼内に１つ以上の神経栄養因子および／または眼内もしくは眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に１つ以上の抗血管新生因子をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを投与することによって治療され得る。緑内障は、増加した眼圧および網膜神経節細胞の喪失を特徴とする。緑内障の治療は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１種以上の神経保護剤の投与を含む。したがって、そのような薬剤としては、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、眼内、任意に硝子体内に送達され得る。
【０３０８】
他の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、発作を治療する、例えば、発作の徴候、発生率、または重症度を低減することができる。発作の治療的処置の有効性は動作的（例えば、揺動、眼もしくは口のチック）および／または電子記録的手段（ほとんどの発作は、顕著な電子記録的異常を有する）によって評価され得る。したがって、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、経時的に複数の発作によってマークされる癲癇を治療することもできる。代表的な一実施形態では、脳下垂体腫瘍を治療するために、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、ソマトスタチン（またはその活性断片）が脳に投与される。この実施形態に従い、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、脳下垂体への微小注入によって投与される。同様に、そのような治療を使用して、末端肥大症（脳下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６、処理された活性ペプチドソマトスタチン−２８およびソマトスタチン−１４を含有する）配列は、当該技術分野において既知のとおりである。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含む導入遺伝子をコードすることができる。
【０３０９】
本発明の別の態様は、インビボでの対象への全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生するための、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用に関する。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性トランススプライシングに影響を及ぼすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１を参照）または他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９２９、Ｙｕａｎらへの米国特許第５，８６９，２４８号）等をコードする導入遺伝子を含み得る。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはまた、レポーターポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質またはアルカリホスファターゼなどの酵素）をコードする導入遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、実験または診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、またはそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主染色体と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み替える、導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列を含み得る。このアプローチを利用して、宿主細胞中の遺伝子欠陥を訂正することができる。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対象における免疫原性ポリペプチドを発現するため、例えば、ワクチン接種のために使用され得る導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、当該技術分野において既知の関心対象の任意の免疫原をコードし得、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等からの免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１３】
ＸＩ．投与
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４回またはそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年等）、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
【０３１４】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内等、ならびに直接組織または器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
【０３１５】
ｃｅＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。ｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存する。追加として、ｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは２つ以上のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に複数の導入遺伝子を投与できるようにする。
【０３１６】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの、本発明に従う骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、および／または下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意に、脚および／もしくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：３４５８−３４６４を参照）ならびに／または直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内または動脈内投与による）によって投与される。実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、「流体力学的技法」を用いることなく投与され得る。
【０３１７】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの、心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与が挙げられる。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、および／またはその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患（例えば、ＰＡＤもしくはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するため）。
【０３１９】
Ａ．エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、ｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
【０３２０】
ｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは薬学的担体と組み合わせて、「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、望ましくはインビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞中で産生される任意のポリペプチドである、導入遺伝子（時には異種ヌクレオチド配列と呼ばれる）をコードすることができる。例えば、本明細書で論じられる治療方法におけるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、抗原またはワクチンの産生のために、培養した細胞、およびそれから単離された発現遺伝子産物中に導入されてもよい。
【０３２２】
ｃｅＤＮＡベクターは、獣医用途および医療用途の両方に使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ）および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、少年、および成人を含む。
【０３２３】
本明細書に記載される技術の一態様は、導入遺伝子を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビトロ方法の場合、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される方法ならびに当該技術分野において既知の他の方法を使用して導入され得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは生物学的有効量で細胞に投与される。ｃｅＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的有効量は、標的細胞における導入遺伝子の形質導入および発現をもたらすのに十分な量である。
【０３２４】
Ｂ．用量範囲
インビボおよび／またはインビトロアッセイを任意に用いて、使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路および病態の重症度に依存し、当業者の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
【０３２５】
ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されるもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
【０３２６】
特定の「治療効果」を達成するために必要なｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、および遺伝子（複数可）、ＲＮＡ産物（複数可）、または得られる発現タンパク質（複数可）の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患または障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
【０３２７】
最適な治療反応を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、いくつかの用量が毎日投与され得るか、または治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量およびスケジュールを容易に判定することができる。
【０３２８】
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注入は、多量を必要とする）。例えば、ヒト対象の骨格筋または心筋への直接インビボ注入の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ〜１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなる。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ〜約１００ｇのベクターを送達することが予想される。
【０３２９】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【０３３０】
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達されるｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１〜１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは１〜１５μｇまたは８〜１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とする。エキソソームまたは微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定されるが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
【０３３１】
治療は、単一用量または複数用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、複数の用量を対象に投与することができ、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの非存在に起因して、抗カプシド宿主免疫反応を誘起する誘起しないため、実際に、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１〜１００、好ましくは２〜２０用量であり得る。
【０３３２】
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の非存在）は、複数の場合にｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与できるようになる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２〜１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１０回より多く対象に送達される。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月あたり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）あたり１回だけ対象に投与される。
【０３３４】
Ｃ．単位剤形
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、蒸発器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
【０３３５】
ＸＩＩ．様々な適用
本明細書に提供される組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、上記のような様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療、改善、または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、診断およびスクリーニング方法における使用のために想定され、導入遺伝子は、細胞培養系または代替として形質導入動物モデルにおいて一時的または安定して発現される。
【０３３８】
本明細書に記載される技術の別の態様は、哺乳類細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示されるｃｅＤＮＡのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。
【０３３９】
追加として、本発明は、１つ以上の追加の成分で配合されるか、またはそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、開示されるｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ組成物の１つ以上を含む、組成物、ならびに治療および／または診断キットを提供する。
【０３４０】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターが投与される細胞は、任意のタイプのものであり得、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に脳細胞を含む）、肺細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、胃および呼吸器上皮細胞）、筋細胞、樹状細胞、膵細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。なおもさらなる代替として、細胞は、癌または腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上に示されるように、任意の種の起源に由来し得る。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１Ａ．ｃｅＤＮＡベクターであって、
シス調節エレメントを含む発現カセットであって、シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、を含み、
当該ＤＮＡベクターが、原核細胞特異的メチル化を欠いており、ＡＡＶカプシドタンパク質中でカプシド化されない、ｃｅＤＮＡベクター。
２Ａ．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ１Ａに記載のＤＮＡベクター。
３Ａ．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ１Ａ〜２Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
４Ａ．発現カセットは、クローニング部位をさらに含む、パラグラフ１Ａ〜３Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
５Ａ．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、パラグラフ１Ａ〜４Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
６Ａ．発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１Ａに記載のＤＮＡベクター。
７Ａ．発現カセットは、クローニング部位と、そのクローニング部位に挿入された外因性配列と、をさらに含む、パラグラフ１Ａ〜６Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
８Ａ．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ７Ａに記載のＤＮＡベクター。
９Ａ．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ７Ａに記載のＤＮＡベクター。
１０Ａ．外因性配列が、レポータータンパク質をコードする、パラグラフ７Ａに記載のＤＮＡベクター。
１１Ａ．パラグラフ１Ａ〜１０Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクターを含む細胞。
１２Ａ．ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８、ＡＡＶ  Ｒｅｐ６８、ＡＡＶ  Ｒｅｐ５２、およびＡＡＶ  Ｒｅｐ４０からなる群から選択される複製タンパク質をさらに含む、パラグラフ１１Ａに記載の細胞。
１３Ａ．当該複製タンパク質が、ヘルパーウイルスによってコードされる、パラグラフ１２Ａに記載の細胞。
１４Ａ．細胞が、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする遺伝子を描いている、パラグラフ１１Ａ〜１３Ａのいずれかに記載の細胞。
１５Ａ．パラグラフ１Ａ〜１０Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクターと、任意選択的に賦形剤と、を含む、薬学的活性成分。
１６Ａ．パラグラフ１Ａ〜１０Ａのいずれかに記載の当該ＤＮＡベクターを、当該細胞に導入するステップを含む、外因性配列を細胞に送達する方法。
１７Ａ．ＤＮＡベクターを導入する当該ステップが、流体力学的注入を含む、パラグラフ１６Ａに記載の方法。
１８Ａ．ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
細胞に、
シス調節エレメントを含む発現カセットであって、シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、を含む、核酸構築物またはウイルスを導入するステップであって、
当該細胞が、ＡＡＶカプシドタンパク質を欠いている、ステップと、
当該核酸構築物または当該ウイルスから産生された当該ＤＮＡベクターを収集するステップであって、
当該ＤＮＡベクターが、原核細胞特異的メチル化を欠いている、ステップと、を含む、方法。
１９Ａ．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ１８Ａに記載の方法。
２０Ａ．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ１８Ａ〜１９Ａのいずれかに記載の方法。
２１Ａ．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、パラグラフ１８Ａ〜２０Ａのいずれかに記載の方法。
２２Ａ．当該発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１８に記載の方法。
２３Ａ．当該発現カセットが、外因性配列をさらに含む、パラグラフ１８Ａ〜２２Ａのいずれかに記載の方法。
２４Ａ．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ２３Ａに記載の方法。
２５Ａ．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ２３Ａに記載の方法。
２６Ａ．外因性配列が、レポータータンパク質をコードする、パラグラフ２３Ａに記載の方法。
２７Ａ．当該細胞が、昆虫細胞である、パラグラフ１８Ａ〜２６Ａのいずれかに記載の方法。
２８Ａ．パラグラフ１８〜２７のいずれかに記載の方法によって生成されるＤＮＡベクター。
２９Ａ．ＤＮＡベクターを産生するための細胞であって、
シス調節エレメントを含む発現カセットであって、シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、を含む、第１のポリヌクレオチドと、
ＡＡＶ７８、ＡＡＶ５２、ＡＡＶ  Ｒｅｐ６８、およびＡＡＶ  Ｒｅｐ４０からなる群から選択される複製タンパク質をコードする、第２のポリヌクレオチドと、を含み、
当該細胞が、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする遺伝子を欠いている、細胞。
３０Ａ．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ２９Ａに記載の細胞。
３１Ａ．当該細胞が、昆虫細胞である、パラグラフ２９Ａ〜３０Ａのいずれかに記載の細胞。
３２Ａ．当該第１のポリヌクレオチドの複製によって、パラグラフ２９Ａ〜３１Ａのいずれかに記載の細胞から産生される、ＤＮＡベクター。
３３Ａ．ＤＮＡベクターを生成するためのポリヌクレオチドであって、
シス調節エレメントを含む発現カセットであって、シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、を含む、ポリヌクレオチド。
３４Ａ．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ３３Ａに記載のポリヌクレオチド。
３５Ａ．ポリヌクレオチドが、プラスミド、バクミド、またはバキュロウイルス中に存在する、パラグラフ３３Ａ〜３４Ａのいずれかに記載のポリヌクレオチド。
３６Ａ．外因性配列をさらに含む、パラグラフ３３Ａ〜３５Ａのいずれかに記載のポリヌクレオチド。
３７Ａ．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ３６Ａに記載のポリヌクレオチド。
３８Ａ．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ３６Ａに記載のポリヌクレオチド。
３９Ａ．外因性配列が、レポーターをコードする、パラグラフ３６Ａに記載のポリヌクレオチド。
４０Ａ．ＡＡＶ７８、ＡＡＶ５２、ＡＡＶ  Ｒｅｐ６８、およびＡＡＶ  Ｒｅｐ４０からなる群から選択される複製タンパク質による、パラグラフ３３Ａ〜３９Ａのいずれかに記載のポリヌクレオチドの複製によって産生されるＤＮＡベクターであって、直鎖状で連続的な構造を有し、原核細胞特異的メチル化を欠いており、ＡＡＶカプシドタンパク質中でカプシド化されない、ＤＮＡベクター。
４１Ａ．ＤＮＡベクターであって、
発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号５２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、を含み、
原核細胞特異的メチル化を欠いており、ＡＡＶカプシドタンパク質中でカプシド化されない、ＤＮＡベクター。
４２Ａ．発現カセットが、シス調節エレメントを含み、当該シス調節エレメントが、転写後反応エレメントおよびポリ−Ａシグナルからなる群から選択される、パラグラフ４１Ａに記載のＤＮＡベクター。
４３Ａ．転写後反応エレメントが、ＷＨＰ転写後反応エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ４２Ａに記載のＤＮＡベクター。
４４Ａ．ポリ−Ａシグナルが、ＢＧＨポリ−Ａシグナルを含み、パラグラフ４２Ａ〜４３Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
４５Ａ．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、パラグラフ４１Ａ〜４４Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
４６Ａ．発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ４１Ａに記載のＤＮＡベクター。
４７Ａ．発現カセットは、外因性配列を含む、パラグラフ４１Ａ〜４６Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクター。
４８Ａ．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ４７Ａに記載のＤＮＡベクター。
４９Ａ．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ４７Ａに記載のＤＮＡベクター。
５０Ａ．外因性配列が、レポータータンパク質をコードする、パラグラフ４７Ａに記載のＤＮＡベクター。
５１Ａ．パラグラフ４１Ａ〜５０Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクターを含む細胞。
５２Ａ．ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８、ＡＡＶ  Ｒｅｐ６８、ＡＡＶ  Ｒｅｐ５２、およびＡＡＶ  Ｒｅｐ４０からなる群から選択される複製タンパク質をさらに含む、パラグラフ５２Ａに記載の細胞。
５３Ａ．当該複製タンパク質が、ヘルパーウイルスによってコードされる、パラグラフ５１Ａに記載の細胞。
５４Ａ．細胞が、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする遺伝子を描いている、パラグラフ５１〜５３のいずれかに記載の細胞。
５５Ａ．パラグラフ１Ａ〜１０Ａのいずれかに記載のＤＮＡベクターと、任意選択的に賦形剤と、を含む、薬学的活性成分。
５６Ａ．パラグラフ１Ａ〜１０Ａのいずれかに記載の当該非カプシド化ＤＮＡベクターを、当該細胞に導入するステップを含む、外因性配列を細胞に送達する方法。
５７Ａ．ＤＮＡベクターを導入する当該ステップが、流体力学的注入を含む、パラグラフ１６Ａに記載の方法。
５８Ａ．ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
細胞に、
発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号５２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、を含む、核酸構築物またはウイルスを導入するステップであって、
当該細胞が、ＡＡＶカプシドタンパク質を欠いている、ステップと、
当該核酸構築物または当該ウイルスから産生された当該ＤＮＡベクターを収集するステップであって、
当該ＤＮＡベクターが、原核細胞特異的メチル化を欠いており、ＡＡＶカプシドタンパク質中でカプシド化されない、ステップと、を含む、方法。
５９Ａ．発現カセットが、シス調節エレメントを含み、当該シス調節エレメントが、転写後反応エレメントおよびポリ−Ａシグナルからなる群から選択される、パラグラフ１８Ａに記載の方法。
６０Ａ．転写後反応エレメントが、ＷＨＰ転写後反応エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ５９Ａに記載の方法。
６１Ａ．ポリ−Ａシグナルが、ＢＧＨポリ−Ａシグナルを含み、パラグラフ５９Ａ〜６０Ａのいずれかに記載の方法。
６２Ａ．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、パラグラフ１８Ａ〜６１Ａのいずれかに記載の方法。
６３Ａ．当該発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１８Ａに記載の方法。
６４Ａ．当該発現カセットが、外因性配列をさらに含む、パラグラフ１８Ａ〜６３Ａのいずれかに記載の方法。
６５Ａ．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ２３Ａに記載の方法。
６６Ａ．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ２３Ａに記載の方法。
６７Ａ．外因性配列が、レポータータンパク質をコードする、パラグラフ２３Ａに記載の方法。
６８Ａ．当該細胞が、昆虫細胞である、パラグラフ１８Ａ〜２６Ａのいずれかに記載の方法。
６９Ａ．パラグラフ１８Ａ〜２７Ａのいずれかに記載の方法によって生成されるＤＮＡベクター。
７０Ａ．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ６９Ａに記載のＤＮＡベクター。
７１Ａ．ＤＮＡベクターを産生するための細胞であって、
第１のポリヌクレオチドであって、
発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号５２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、を含む、第１のポリヌクレオチドと、
ＡＡＶ７８、ＡＡＶ５２、ＡＡＶ  Ｒｅｐ６８、およびＡＡＶ  Ｒｅｐ４０からなる群から選択される複製タンパク質をコードする、第２のポリヌクレオチドと、を含み、
当該細胞が、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする遺伝子を欠いている、細胞。
７２Ａ．当該細胞が、昆虫細胞である、パラグラフ７１Ａに記載の細胞。
７３Ａ．当該第１のポリヌクレオチドの複製によって、パラグラフ２９Ａ〜５０Ａのいずれかに記載の細胞から産生される、ＤＮＡベクター。
７４Ａ．ＤＮＡベクターを生成するためのポリヌクレオチドであって、
発現カセットと、
発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号５２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、を含む、ポリヌクレオチド。
７５Ａ．ポリヌクレオチドが、プラスミド、バクミド、またはバキュロウイルス中に存在する、パラグラフ７４Ａのいずれかに記載のポリヌクレオチド。
７６Ａ．外因性配列をさらに含む、パラグラフ７４Ａ〜７５Ａのいずれかに記載のポリヌクレオチド。
７７Ａ．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ７４Ａに記載のポリヌクレオチド。
７８Ａ．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ７４Ａに記載のポリヌクレオチド。
７９Ａ．外因性配列が、レポーターをコードする、パラグラフ７４Ａに記載のポリヌクレオチド。
８０Ａ．ＡＡＶ７８、ＡＡＶ５２、ＡＡＶ  Ｒｅｐ６８、およびＡＡＶ  Ｒｅｐ４０からなる群から選択される複製タンパク質による、パラグラフ３３〜３９のいずれかに記載のポリヌクレオチドの複製によって産生されるＤＮＡベクターであって、原核細胞特異的メチル化を欠いており、ＡＡＶカプシドタンパク質中でカプシド化されない、ＤＮＡベクター。
８１Ａ．ＤＮＡベクターが、昆虫細胞中で産生される、パラグラフ８０Ａに記載のＤＮＡベクター。
８２Ａ．表２〜６または表７〜１０Ａもしくは１０Ｂのいずれかにおける突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むプラスミドから取得される、ｃｅＤＮＡベクター。
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１Ｂ．ＤＮＡベクターであって、
（ａ）第１のＤＮＡプラスミド構築物をバキュロウイルス発現ベクター中に転置することによって取得された第１の組み換えバクミドで昆虫細胞の第１の集団をトランスフェクトすることであって、第１のＤＮＡプラスミド構築物は、第１の複製タンパク質部位（ＲＰＳ−１）、ＯＲＦレポーターポリペプチド配列に操作可能に連結されたプロモーター、翻訳後および終結シグナル、ならびに第２の複製タンパク質部位（ＲＰＳ−２）の順序で単一方向に連続的に進行し、ＲＰＳ−１およびＲＰＳ−２が、独立して、分子内で重複され、共役結合され、ＲＰＳ−１が、ＲＰＳ−２に対する１つ以上のポリヌクレオチド塩基対の欠失、置換、または切断を有し、次いでバキュロ注入した昆虫細胞の第１の集団（ＢＩＩＣ−１）をそこから採取する、トランスフェクトすることと、
（ｂ）第２のＤＮＡプラスミド構築物を第２のバキュロウイルス発現ベクター中に転置することによって取得された第２の組み換えバクミドで昆虫細胞の第２の集団をトランスフェクトすることであって、第２のＤＮＡプラスミド構築物が、ＲＰＳ−１およびＲＰＳ−２のうちの少なくとも１つに結合するタンパク質をコードし、次いでバキュロ注入した昆虫細胞の第２の集団（ＢＩＩＣ−２）をそこから採取する、トランスフェクトすることと、
（ｃ）ＢＩＩＣ−１およびＢＩＩＣ−２を昆虫細胞の第３の集団と、実質的に等しい感染多重度（ＭＯＩ）を提供する相対量で組み合わせ、次いで昆虫細胞の第３の集団、ＢＩＩＣ−１、およびＢＩＩＣ−２を、第２のＤＮＡプラスミド構築物によってコードされるタンパク質が、ＲＰＳ−１および／またはＲＰＳ−２部位と反応して、第１のＤＮＡプラスミドによってコードされたＤＮＡベクターの複製を誘導する細胞増殖条件下で、約１５〜２０マイクロメートルの昆虫細胞直径および約５０〜８０％の細胞生存性が観察されるまでインキュベートした後、遠心分離によって昆虫細胞ペレットからＤＮＡを採取することと、
（ｄ）昆虫細胞ペレットからＤＮＡを抽出して、昆虫細胞ペレットから産生されたＤＮＡを取得することと、
（ｅ）一次バンドの重量のおよそ２倍である第２のバンドを表す材料を示す、互いに対して相対距離で一次バンドおよび二次バンドの両方における未変性ゲル上の昆虫細胞ペレットから取得されたＤＮＡを同定することと、
（ｆ）ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化後にゲルのより低い重量領域に向かって上方に一次バンドおよび二次バンドを転換することによって、変性ゲル上の昆虫細胞ペレットから取得されたＤＮＡ中のＤＮＡベクターを確認することと、
（ｇ）昆虫細胞ペレットから取得された残りのＤＮＡベクターを単離して、高安定性ＤＮＡベクターを取得することと、を含プロセスによって取得される、ＤＮＡベクター。
２Ｂ．ＲＰＳ−１およびＲＰＳ−２が異なり、独立して、以下の配列番号のＤＮＡポリヌクレオチド配列対：
配列番号１および配列番号５２、または配列番号２および配列番号５１、または配列番号１０１および配列番号１０２、または配列番号１０３および配列番号１０４、または配列番号１０５および配列番号１０６、または配列番号１０７および配列番号１０８、または配列番号１０９および配列番号１１０、または配列番号１１１および配列番号１１２、または配列番号１１３もしくは配列番号１１４、および配列番号１１５もしくは配列番号１１６から選択される、パラグラフ１Ｂに記載のＤＮＡベクター。
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１Ｃ．カプシド不含ＡＡＶ（ｃｆＡＡＶ）ベクターであって、
シス調節エレメント、プロモーター、および外因性配列を含む、発現カセットと、
当該発現カセットに隣接する２つの自己相補的配列と、を含み、
ｃｆＡＡＶベクターが、カプシドタンパク質と関連せず、原核細胞特異的メチル化を欠いている、カプシド不含ＡＡＶ（ｃｆＡＡＶ）ベクター。
２Ｃ．シス調節エレメントが、リボスイッチ、絶縁体、ｍｉｒ−調節エレメント、および転写後調節エレメントからなる群から選択される、パラグラフ１Ｃに記載のｃｆＡＡＶベクター。
３Ｃ．ＤＮＡベクターが、ＣＥＬｉＤである、パラグラフ１Ｃ〜２Ｃに記載のｃｆＡＡＶベクター。
４Ｃ．２つの自己相補的配列が、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列である、パラグラフ１Ｃ〜３Ｃのいずれかに記載のｃｆＡＡＶベクター。
５Ｃ．外因性配列が、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および２Ａエレメントを含む、パラグラフ１Ｃ〜４Ｃのいずれかに記載のｃｆＡＡＶベクター。
６Ｃ．発現カセットが、２つ以上のタンパク質をコードする配列を含む、パラグラフ５Ｃに記載のｃｆＡＡＶベクター。
７Ｃ．発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、または２０，０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ１Ｃ〜６Ｃのいずれかに記載のｃｆＡＡＶベクター。
８Ｃ．パラグラフ１Ｃ〜７Ｃのいずれかに記載のｃｆＡＡＶベクターを含む薬学的組成物。
９Ｃ．発現構築物であって、
シス調節エレメント、プロモーター、および外因性配列を含む発現カセットと、当該発現カセットに隣接する２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、
発現構築物が、カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠いている、発現構築物。
１０Ｃ．シス調節エレメントが、リボスイッチ、絶縁体、ｍｉｒ−調節エレメント、および転写後調節エレメントからなる群から選択される、パラグラフ９Ｃに記載の発現構築物。
１１Ｃ．外因性配列が、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および２Ａエレメントを含む、パラグラフ９Ｃ〜１０Ｃのいずれかに記載の発現カセット。
１２Ｃ．発現カセットが、２つ以上のタンパク質をコードする配列を含む、パラグラフ１１に記載の発現カセット。
１３Ｃ．発現構築物が、プラスミド、バクミド、またはバキュロウイルス中に存在する、パラグラフ９Ｃ〜１２Ｃのいずれかに記載の発現構築物。
１４Ｃ．ｃｆＡＡＶベクターを生成するための方法であって、
パラグラフ９Ｃ〜１３Ｃのいずれかに記載の発現構築物を細胞中に導入することと、
発現構築物の複製によって生成されたｃｆＡＡＶベクターを収集することと、を含む、方法。
１５Ｃ．発現構築物を細胞中に導入する前に、発現構築物を複数回複製するステップをさらに含む、パラグラフ１４Ｃに記載の方法。
１６Ｃ．発現構築物が、プラスミド中に存在し、複製ステップが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で行われる、パラグラフ１５Ｃに記載の方法。
１７Ｃ．発現構築物を細胞中に導入する前に、発現構築物をプラスミドからバクミドに導入するステップをさらに含む、パラグラフ１６Ｃに記載の方法。
１８Ｃ．発現構築物を細胞中に導入する前に、発現構築物をバクミドからバキュロウイルスに導入するステップをさらに含む、パラグラフ１７Ｃに記載の方法。
１９Ｃ．Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入するステップをさらに含む、パラグラフ１４Ｃ〜１８Ｃのいずれかに記載の方法。
２０Ｃ．細胞が、昆虫細胞である、パラグラフ１４Ｃ〜１９Ｃのいずれかに記載の方法。
２１Ｃ．パラグラフ１４Ｃ〜２０Ｃのいずれかに記載の方法によって産生されるｃｆＡＡＶベクター。
２２Ｃ．ＤＮＡベクターが、ＣＥＬｉＤである、パラグラフ２１Ｃに記載のｃｆＡＡＶベクター。
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１Ｄ．ベクターポリヌクレオチドから取得されるカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターであって、当該ベクターポリヌクレオチドが、第１および第２のＡＡＶ２逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、配列番号１または配列番号５１の対応するＡＡＶ２野生型ＩＴＲに関して少なくとも１つのポリヌクレオチド欠失、挿入、および／または置換を有し、Ｒｅｐタンパク質の存在下で昆虫細胞中のＤＮＡベクターの複製を誘導し、ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、ステップと、
ｂ．カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
２Ｄ．突然変異型ＩＴＲが、配列番号２および配列番号５２からなる群から選択される、パラグラフ１に記載のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
３Ｄ．ベクターポリヌクレオチドが、配列番号１および配列番号５２、ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択されるＩＴＲの対を含む、パラグラフ１に記載のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
４Ｄ．ベクターポリヌクレオチドから取得されるカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターであって、ベクターポリヌクレオチドが、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む機能的ＩＴＲであり、ＩＴＲのうちの１つが、機能的ＩＴＲに対して欠失、挿入、および／または置換を含み、Ｒｅｐタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびＤＮＡベクターの産生を誘導し、ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
ｂ．カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１Ｅ．（ｉ）共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターを含むベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、ｃｅＤＮＡベクターが、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つが、もう１つのＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み（修飾型ＩＴＲ）、ベクターが、ウイルスカプシド中に存在しない、ベクター。
２Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターが、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析したときの直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を有する、パラグラフ１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３Ｅ．修飾型ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、パラグラフ１Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
４Ｅ．修飾型ＩＴＲが、野生型ＩＴＲではない、パラグラフ３Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５Ｅ．欠失、挿入、または置換が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、およびＤからなる群から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つに存在する、パラグラフ１Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６Ｅ．欠失、挿入、または置換が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるループのうちの１つの欠失をもたらす、パラグラフ５Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
７Ｅ．修飾が、配列番号１０１〜４９８および４９９または５４５〜５４７からなる群から選択されるＡＡＶ２修飾型ＩＴＲ中の変更に対応する、パラグラフ１Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
８Ｅ．修飾が、配列番号２、５２、６３、および６４からなる群から選択されるＡＡＶ２修飾型ＩＴＲ中の変更に対応する、パラグラフ１Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
９Ｅ．ベクターが、ナノ担体中に存在する、パラグラフ１Ｅ〜８Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１０Ｅ．ナノ担体が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、パラグラフ９Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１１Ｅ．
共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を、ベクターポリヌクレオチドを使用することによって産生することを含む方法であって、ベクターポリヌクレオチドが、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つが、もう１つのＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、Ｒｅｐタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびＤＮＡベクターの産生を誘導し、ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
ｂ．カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、方法。
１２Ｅ．ベクターポリヌクレオチドから取得されるカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターであって、当該ベクターが、第１および第２のＡＡＶ２逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種遺伝子をコードし、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、配列番号１または配列番号５１の対応するＡＡＶ２野生型ＩＴＲに関して少なくとも１つのポリヌクレオチド欠失、挿入、または置換を有し、Ｒｅｐタンパク質の存在下で昆虫細胞中のＤＮＡベクターの複製を誘導し、ＤＮＡベクターが、
（ａ）Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、ステップと、
（ｂ）カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
１３Ｅ．突然変異型ＩＴＲが、配列番号２および配列番号５２からなる群から選択される、パラグラフ１２Ｅに記載のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
１４Ｅ．ベクターポリヌクレオチドが、配列番号１および配列番号５２、ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択されるＩＴＲの対を含む、パラグラフ１２Ｅに記載のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
１５Ｅ．ベクターポリヌクレオチドから取得されるカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターであって、ベクターポリヌクレオチドが、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種遺伝子をコードし、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つが、欠失、挿入、または置換を含み、Ｒｅｐタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびＤＮＡベクターの産生を誘導し、ＤＮＡベクターが、
（ａ）Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
（ｂ）カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
１７Ｅ．１つのＩＴＲが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲである、パラグラフ１５Ｅに記載のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター。
１８Ｅ．対象における疾患を治療するための方法であって、
（ｉ）共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターを含むベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を含む組成物を、それを必要とする対象に共投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターが、２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つが、もう１つのＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む、方法。
１９Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、パラグラフ１７Ｅに記載の方法。
２０Ｅ．治療薬を対象に送達するための方法であって、
パラグラフ１Ｅ〜１０Ｅおよび１２Ｅ〜１６Ｅに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
【実施例】
【０３４２】
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。
【０３４３】
実施例１：ｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生について説明する。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つのＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（レスキュー）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
【０３４４】
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ−プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照して、ｃｅＤＮＡ−プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左ＩＴＲおよび右突然変異型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間に以下を有する。（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後反応エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、および（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１〜Ｒ６）（図１Ａおよび１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号７）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号５４２）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ  Ｂプラスミドにクローニングした。
【０３４５】
要するに、一連のｃｅＤＮＡベクターは、図４Ａ〜４Ｃに示されるプロセスを使用して、表１２に示されるｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物から取得した。表１２は、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターの各末端上の複製タンパク質部位（ＲＰＳ）として活性な配列を含む、各構成成分の対応するポリヌクレオチド配列の数を示す。表１２の番号は、各構成成分の配列に対応する、本文書中の配列番号を指す。
【表１２】
2020532981.tif 000041
【０３４６】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作成するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチ、例えば、誘導性プロモーターである、プロモーターを含む。ルシフェラーゼ導入遺伝子に操作可能に連結されたＭＮＤまたはＨＬＣＲプロモーターを含む、他の構築物、例えば、構築物１０、構築物１１、構築物１２、および構築物１３（例えば、表１４Ａを参照）を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを作製した。
【０３４７】
ｃｅＤＮＡ−バクミドの産生：
図４Ａを参照して、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）、正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
【０３４８】
組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着性Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、Ｔ２５フラスコ内の５０ｍＬの培地中２５℃で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
【０３４９】
任意に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０〜５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４〜１５ｎｍのナイーブ直径から）１８〜１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０３５０】
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的に、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈：１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５〜２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって、４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０３５１】
図４Ａを参照して、図８Ａによる「Ｒｅｐ−プラスミド」を、Ｒｅｐ７８（配列番号１３）またはＲｅｐ６８（配列番号１２）およびＲｅｐ５２（配列番号１４）またはＲｅｐ４０（配列番号１１）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）−二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏｒＦｉｓｈｅｒ）中で産生した。
【０３５２】
Ｒｅｐ−プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ−プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ−バクミド」）を生成した。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ−バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ−バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
【０３５３】
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ−バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意に、第１世代のＲｅｐ−バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０〜５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０３５４】
ｃｅＤＮＡベクター生成および特徴付け
図４Ｂを参照して、次に、（１）ｃｅＤＮＡ−バクミドを含有する試料またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス、および（２）上記のＲｅｐ−バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次に、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。共感染の４〜５日後、細胞直径および生存性を検出する。細胞直径が１８〜２０ｎｍに到達し、生存性が約７０〜８０％であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
【０３５５】
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。ＵＶ吸光度に基づいて判定された様々なｃｅＤＮＡベクターの収率を表１３に提供する。
【表１３】
2020532981.tif 000042
【０３５６】
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって特定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
【０３５７】
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載される）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが予想されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが予想される。
【０３５８】
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると特定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｄを参照）。
【０３５９】
図５は、エンドヌクレアーゼによる消化を伴う（＋）または伴わない（−）、次のようなｃｅＤＮＡベクター：構築物−１、構築物−２、構築物−３、構築物−４、構築物−５、構築物−６、構築物−７、および構築物−８（すべて上記の表１２に記載される）を有する変性ゲルの例示的な図を提供する。構築物−１〜構築物−８の各ｃｅＤＮＡベクターは、エンドヌクレアーゼ反応後に２つのバンド（＊）を産生した。サイズマーカーに基づいて判定されたそれら２つのバンドサイズは、図の下部に提供される。バンドサイズは、構築物−１〜構築物−８を含むプラスミドから産生されたｃｅＤＮＡベクターの各々が、連続的な構造を有することを確認する。
【０３６０】
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産生物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）  ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）  Ｇ−２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＯＨで以前にインキュベートされた０．８〜１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解すであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００Ｘ濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。
【０３６１】
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ−プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に負荷し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
【０３６２】
実施例２：ｃｅＤＮＡ細胞中のウイルス性ＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターはまた、表１４Ａに示される構築物１１、１２、１３、および１４から生成された。構築物１１〜１４を含むｃｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において周知の分子クローニング方法によって生成された。表１４Ａのプラスミドは、導入遺伝子と右側ＩＴＲとの間の３’未翻訳領域において、配列番号８を含むＷＰＲＥ、続いて配列番号９を含むＢＧＨｐＡにより構築された。
【表１４Ａ】
2020532981.tif 000043
【０３６３】
構築物１１〜１４の構築物の骨格ベクターは以下のとおりである。（ｉ）ｐＦＢ−ＨＴｂ（構築物１１）中のａｓｙｍＩＴＲ−ＭＮＤ−ルシフェラーゼ−ｗＰＲＥ−ＢＧＨ−ポリＡ−ＩＴＲ、（ｉｉ）ｐＦＢ−ＨＴｂ（構築物１２）中のＩＴＲ−ＭＮＤ−ルシフェラーゼ−ｗＰＲＥ−ＢＧＨ−ポリＡ−ａｓｙｍＩＴＲ、（ｉｉｉ）ｐＦＢ−ＨＴｂ（構築物１３）中のａｓｙｍＩＴＲ−ＨＬＣＲ−ＡＡＴ−ｌｕｃ−ｗＰＲＥ（Ｏ）−ＢＧＨ−ポリＡ−ＩＴＲ、およびｐＦＢ−ＨＴｂ（構築物１４）中のＩＴＲ−ＨＬＣＲ−ＡＡＴ−ｌｕｃ−ｗＰＲＥ（Ｏ）−ＢＧＨ−ポリＡ−ａｓｙｍＩＴＲ（各構築物が、互いに対して少なくとも１つの非対称ＩＴＲを有する）。これらの構築物はまた、以下の配列のうちの１つ以上を含む。ｗＰＲＥＯ（配列番号７２）およびＢＧＨ−ポリＡ配列（配列番号７３）、またはそれに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列。
【０３６４】
次に、ｃｅＤＮＡベクター産生は、図４Ａ〜４Ｃの手順、例えば、（ａ）組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドＤＮＡの生成および組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドＤＮＡによる昆虫細胞のトランスフェクション、（ｂ）Ｐ１ストック（低力価）、Ｐ２ストック（高力価）の生成および定量的ＰＣＲによるウイルス力価の判定に従って実施して、送達可能な５ｍＬ、＞１Ｅ＋７プラーク形成または感染単位「ｐｆｕ」／ｍＬ  ＢＶストック、ＢＶ  ストックＣＯＡを得た。ｃｅＤＮＡベクター単離は、以下の感染対のＢＶストックによる５０ｍＬの昆虫細胞の共感染によって実施した。本明細書に開示されるＲｅｐ−バクミドおよび以下の構築物、構築物１１、構築物１２、構築物１３、および構築物１４のうちの少なくとも１つ。ｃｅＤＮＡベクター単離は、ＱＩＡＧＥＮプラスミドＭｉｄｉキットを使用して実施し、さらなる分析のために精製されたＤＮＡ材料を取得した。表１４Ｂおよび表１４Ｃは、構築物１１〜１４から産生されたｃｅＤＮＡベクターの収率（ＯＤ検出によって検出された）を示す。
【表１４Ｂ】
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【表１４Ｃ】
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【０３６５】
表１４Ｃは、表１４Ｃからの構築物１２および１４を使用して取得された（ＯＤ検出によって検出された）ＤＮＡ材料の量を示す。全ＤＮＡ材料の収率は、上記の実施例１（表１３）のプロセスからの約３ｍｇ／ＬのＤＮＡ材料の典型的な収率と比較して、許容可能であった。
【０３６６】
実施例３：ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子をインビトロで発現する
構築物は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを、ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物：構築物−１、構築物−３、構築物−５、および構築物−７のクローニング部位に導入することによって生成された。ルシフェラーゼコーティング配列を含むｃｅＤＮＡ−プラスミド（表１２の上記を参照）は、それぞれプラスミド構築物１−Ｌｕｃ、ｃプラスミド構築物−３−Ｌｕｃ、プラスミド構築物−５−Ｌｕｃ、およびプラスミド構築物７−Ｌｕｃと呼ばれている。
【０３６７】
ＨＥＫ２９３細胞を培養し、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）をトランスフェクション剤として使用し、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または４００ｎｇのプラスミド構築物１、３、５、および７でトランスフェクトした。プラスミドの各々からのルシフェラーゼの発現を、各細胞培養物中のルシフェラーゼ活性に基づいて判定し、結果を図６Ａに提供する。ルシフェラーゼ活性は、未処理の対照細胞（「未処理」）またはＦｕｇｅｎｅ単独で処理した細胞（「Ｆｕｇｅｎｅ」）から検出されず、そのルシフェラーゼ活性がプラスミドからの遺伝子発現から生じたことを確認する。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ルシフェラーゼのロバストな発現は、構築物１および７から検出された。構築物−７からの発現は、ルシフェラーゼを発現し、ルシフェラーゼ活性の容量依存的増加が検出された。
【０３６８】
プラスミドの各々でトランスフェクトした細胞の増殖および生存性もまた判定し、図７Ａおよび７Ｂに提示した。トランスフェクト細胞の細胞増殖および生存性は、異なる構築物で処理された細胞の異なる群間で有意に異ならなかった。
【０３６９】
したがって、各群において測定され、細胞増殖および生存性に基づいて正規化されたルシフェラーゼ活性は、正規化なしにルシフェラーゼ活性とは異ならなかった。構築物１−Ｌｕｃを有するｃｅＤＮＡ−プラスミドは、正規化を伴う、または伴わないルシフェラーゼの最もロバストな発現を示した。
【０３７０】
したがって、図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂに提示されるデータは、５’〜３’−ＷＴ−ＩＴＲ（配列番号５１）、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、Ｒ３／Ｒ４クローニング部位（配列番号７）、ＷＰＲＥ（配列番号８）、ＢＧＨｐＡ（配列番号９）、および修飾ＩＴＲ（配列番号２）を含む構築物１が、ｃｅＤＮＡベクター内で導入遺伝子のタンパク質を発現し得るｃｅＤＮＡベクターを産生する際に有効であることを実証する。
【０３７１】
実施例４：ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ導入遺伝子のインビボタンパク質発現
上記の構築物１〜８から産生されるｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子のインビボタンパク質発現は、マウスにおいて評価される。ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物１から取得されたｃｅＤＮＡベクター（表１２に記載される）を試験し、外因性ホタルルシフェラーゼｃｅＤＮＡのリポソームを含まないｃｅＤＮＡ構築物の流体力学的注入後のマウスモデルにおける持続した耐性のあるルシフェラーゼ導入遺伝子発現、再投与（２８日目）、および体制（４２日目まで）を実証した。異なる実験では、選択されたｃｅＤＮＡベクターのルシフェラーゼ発現は、インビボで評価され、ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子、および表１０Ａ〜１０Ｂに示される任意のものから選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲ、または図２６Ａ〜２６Ｂに示される少なくとも１つの配列を含むＩＴＲを含む。
【０３７２】
インビボルシフェラーゼ発現：５〜７週齢の雄ＣＤ−１  ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０日目の尾静脈への静脈内流体力学的投与を介して１．２ｍＬ量のルシフェラーゼを発現する０．３５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを投与する。３、４、７、１４、２１、２８、３１、３５、および４２日目に、ルシフェラーゼ発現をＩＶＩＳ撮像によって評価する。手短に言えば、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内的に注入した後、全身発光をＩＶＩＳ（登録商標）撮像を介して評価する。
【０３７３】
ＩＶＩＳ撮像を、３日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、３５日目、および４２日目に実施し、収集した器官を４２日目の屠殺後にエクスビボで撮像する。
【０３７４】
研究の経過中、動物を計量し、健康全般および幸福について毎日監視する。屠殺後、終端心臓穿刺によって各動物から血液を収集し、および２つの部分に分割し、１）血漿および２）血清に処理し、血漿は急速冷凍し、血清は肝臓酵素パネルに使用した後に急速冷凍する。追加として、肝臓、脾臓、腎臓、および鼠径リンパ節（ＬＮ）を収集し、ＩＶＩＳによってエクスビボで撮像する。
【０３７５】
ルシフェラーゼ発現を、ＭＡＸＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）ルシフェラーゼＥＬＩＳＡアッセイ（ＢＩＯＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、肝臓試料のルシフェラーゼのためのｑＰＣＲ、肝臓試料の組織病理学、および／または血清肝臓酵素パネル（ＶｅｔＳｃａｎＶＳ２、Ａｂａｘｉｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｕｓ）によって、肝臓において評価する。
【０３７６】
実施例５：ＩＴＲ  Ｗａｌｋ突然変異体スクリーニング
ｃｅＤＮＡ形成にたいする対するＩＴＲ構造の関係のさらなる分析を実施した。一連の突然変異体を構築して、ｃｅＤＮＡ形成に対する特定の構造変化の衝撃およびｃｅＤＮＡでコードされた導入遺伝子を発現する能力を照会した。ヒト細胞培養物中の突然変異体構築、ｃｅＤＮＡ形成のアッセイ、およびｃｅＤＮＡ導入遺伝子発現の評価を、以下でさらに詳細に説明する。
【０３７７】
Ａ．突然変異体ＩＴＲ構築
固有の非対象ＡＡＶ  ＩＩ型ＩＴＲ突然変異体カセットを有する３１プラスミドのライブラリーをコンピューターで設計し、その後、Ｓｆ９昆虫細胞およびヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３）中で評価した。各ＩＴＲカセットは、昆虫細胞中の発現のための、ｐ１０プロモーター配列によって駆動されるルシフェラーゼ（ＬＵＣ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子のいずれか、および哺乳類細胞中の発現のためのＣＡＧプロモーター配列を含有していた。ＩＴＲ配列に対する突然変異は、右ＩＴＲ領域または左ＩＴＲ領域のいずれかで作成した。ライブラリーは、本明細書における表１０Ａおよび１０Ｂ、ならびに図２６Ａおよび２６Ｂに開示される１５右側（ＲＳ）および１６左側（ＬＳ）突然変異体を含有していた。
【０３７８】
Ｓｆ９懸濁培養物を、通気した２００ｍＬの組織培養フラスコ内のＳｆ９００ＩＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。培養物を４８時間毎に継代し、ＶｉＣｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し、各継代前に細胞カウントおよび増殖メトリクスを測定した。振とう条件（１″オービット、１３０ｒｐｍ）下２７℃で培養物を維持した。ＨＥＫ２９３の付着性培養物を、２５０ｍＬの培養フラスコ中の１％ウシ胎仔血清および１％  ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＧｌｕｔｉＭａｘ  ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）において３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。培養物をトリプシン化し、９６時間毎に継代した。９０〜１００％の合流フラスコの１：１０希釈を使用して、各継代を播種した。
【０３７９】
ｃｅＤＮＡベクターを、上記の実施例１に記載されるように精製し、構築した。要するに、図４Ｂを参照して、プラスミド構築物で形質導入されたＳｆ９細胞を、２７℃の静的条件下で２４時間、付着的に増殖させた。２４時間後、トランスフェクトしたＳｆ９細胞を、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を介してＲｅｐベクターに感染させた。ＢＩＩＣは、依然にアッセイされ、感染性について特徴付けられており、１：２０００の最終希釈で使用した。Ｓｆ９００昆虫細胞中１：１００で希釈したＢＩＩＣを、依然にトランスフェクトした細胞ウェルの各々に付加した。非ＲｅｐベクターＢＩＩＣを、負の対照としてウェルのサブセットに付加した。プレートロッカー上で２分間優しく揺らすことによってプレートを混合した。次いで、静的条件下２７℃で追加の４８時間にわたって細胞を増殖させた。すべての実験構築物および対照を三重にアッセイした。
【０３８０】
４８時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り除き、手短に室温に平衡させ、ルシフェラーゼ発現（ＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））についてアッセイした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ  Ｓｅｒｉｅｓマイクロプレートリーダーを使用して、全発光を測定した。複製を平均した。結果を図２７に示す。予想されるとおり、３つの負の対照（培地のみ、模擬トランスフェクション欠失ドナーＤＮＡ、およびＲｅｐ含有バキュロウイルス細胞の非存在下で処理された試料）は、著しいルシフェラーゼ発現を示さなかった。突然変異体試料の各々においてロバストルシフェラーゼ発現が観察され、各試料について、ｃｅＤＮＡをコードした導入遺伝子が、良好にトランスフェクトされ、突然変異にかかわらず発現されたことを示す。
【０３８１】
Ｂ．ｃｅＤＮＡ形成のアッセイ
先行研究において生成されたｃｅＤＮＡが、予想される閉端構造であることを保証するために、実験を実施して、十分な量の各ｃｅＤＮＡを産生し、それらは後に適切な構造について試験され得る。手短に言えば、Ｓｆ９懸濁培養物を、ライブラリーからの単一ＩＴＲ突然変異体プラスミドに属するＤＮＡでトランスフェクトした。培養物を、ガス交換が制限されたＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ培養フラスコ中で１．２５ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。ＤＮＡ：脂質トランスフェクション複合体を、製造元の指示に従い、ｆｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬を使用して調製した。複合体混合物を調製し、ルシフェラーゼプレートアッセイについて以前に記載されているものと同じ方法で、トランスフェクトされる細胞の数に比例して体積を増加させてインキュベートした。レポーター遺伝子アッセイと同様に、４．５：１（体積試薬／質量ＤＮＡ）を使用した。模擬（トランスフェクション試薬のみ）および未処理の増殖対照を、実験培養物と並行して調製した。トランスフェクション試薬の付加に続いて、優しく渦流させながら室温で１０〜１５分間にわたって培養物を回復させた後、２７℃の振とうインキュベーターに移した。振とう条件下で２４時間のインキュベーション後に、ＶｉＣｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、すべてのフラスコ（実験および対照）について細胞カウントおよび増殖メトリクスを測定した。すべてのフラスコ（増殖対照を除く）を、１：５，０００の最終希釈でＲｅｐベクターを含有するＢＩＩＣに感染させた。ｃｅＤＮＡ産生のための確立されたＢＩＩＣ二重感染手順を使用して、正の対照も調製した。二重感染培養物を、すべての実験培養物の平均生存細胞カウントに等しい細胞数で播種した。二重感染対照を、各構築物について１：５，０００の最終希釈でＲｅｐおよびレポーター遺伝子ＢＩＩＣにそれぞれ感染させた。感染後、培養物を前述の振とう条件下でインキュベーターに戻した。細胞カウント、増殖、および生存性メトリクスを、感染後３日間にわたってすべてのフラスコについて毎日測定した。Ｔ＝０時点の測定値は、新たに感染させた培養物を振とうインキュベーション条件下で約２時間にわたって回復させた後に取られた。３日後、１５分間の遠心分離によって細胞を採取した。上澄を破棄し、ペレットの質量を記録し、ペレットをＤＮＡ抽出まで−８０℃で冷凍した。
【０３８２】
推定の粗ｃｅＤＮＡを、製造元の「高収率」プロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｄｉ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、すべてのフラスコ（実験および対照）から抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＯｎｅＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から取得される光学密度測定を使用して、溶出液を定量化した。得られたｃｅＤＮＡ抽出物を４℃で保管した。
【０３８３】
前述のｃｅＤＮＡ抽出物を、ＴｒａｃｋＩｔ  １ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダーに沿って、１：１０，０００希釈のＳＹＢＲ  Ｓａｆｅゲル染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で調製された未変性アガロース（１％アガロース、１ｘＴＡＥ緩衝剤）ゲル上で走行させた。その後、ゲルをＵＶ／青色照明下でＧｂｏｘ  Ｍｉｎｉ  Ｉｍａｇｅｒを使用して可視化した。前述されるように、未変性ゲル上で走行させたｃｅＤＮＡ試料中で２つの一次バンドが予想され、約５，５００ｂｐバンドは、単量体種を表し、約１１，０００ｂｐバンドは、二量体種に対応する。すべての突然変異体試料を試験し、未変性アガロースゲル上の予想される単量体バンドおよび二量体バンドを示した。突然変異体の代表的な試料の結果を図２８に示す。小規模産生のための推定の粗ＩＴＲ−突然変異体ｃｅＤＮＡおよび対照抽出物を、連結された制限消化および変性アガロースゲルを使用してさらにアッセイして、ｃｅＤＮＡを診断する二本鎖ＤＮＡ構造を確認した。各突然変異体ｃｅＤＮＡは、単一ＥｃｏＲ１制限部位を有するため、適切に形成された場合、ＥｃｏＲ１消化時に２つの特徴的な断片を産生すると予想される。高忠実度制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、製造元の指示に従って推定のｃｅＤＮＡ抽出物を消化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ならびに未変性アガロースゲル分析を使用する分光測光定量が、溶出物中に検出可能なｃｅＤＮＡ／プラスミド様産生物が存在しないことを明らかにしているため、模擬および増殖対照からの抽出物はアッセイしなかった。精製された消化材料をＱｉａｇｅｎ溶出緩衝液の代わりにヌクレアーゼを含まない水中で溶出したことを除いて、製造元の指示に従ってＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、消化材料を精製した。アルカリアガロースゲル（８％アルカリアガロース）を、平衡緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＯＨ）中で一晩４℃で平衡させた。１０ｘ変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を精製されたｃｅＤＮＡ消化物および対応する未消化ｃｅＤＮＡ（合計１ｕｇ）の試料に添加し、試料を６５℃で１０分間加熱した。１０ｘローディングダイ（ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を各変性試料に添加し、混合した。ＴｒａｃｋＩｔ  １ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もまた、参考としてゲル上に載置した。ゲルを４℃で１８時間、定常電圧（２５Ｖ）で走行させた後、脱イオン化Ｈ２Ｏで洗い流し、１ｘＴＡＥ（トリス酢酸塩、ＥＤＴＡ）緩衝液（ｐＨ７．６）中で２０分間、優しく撹拌しながら中和させた。次いで、ゲルを１ｘＴＡＥ／１ｘＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ溶液中に約１時間、優しく撹拌しながら移した。次いで、ゲルをＵＶ／青色照明下でＧｂｏｘ  Ｍｉｎｉ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して可視化した。未切断の変性試料は、約１１，０００ｂｐで移動すると予想され、ＥｃｏＲＩ処理した試料は、２つのバンド（１つは約４，０００ｂｐおよび１つは約６，０００ｂｐ）を有すると予想された。
【０３８４】
この実験では、すべての突然変異体試料が同様の結果を有していた。ＥｃｏＲ１処理した試料中の各試料レーンにおいて２つの重要なバンドを見ることができ、予想される約１１，０００ｂｐサイズで移動した未消化の突然変異体試料とは明確に対照的に、予想されるサイズで変性ゲル上で移動する。図２７は、突然変異体の代表的な試料の結果を示し、未消化の突然変異体試料中で目に見える単一バンドと比較して、各消化突然変異体試料について２つのバンド背景上に見られる。したがって、突然変異体試料は、ｃｅＤＮＡを正しく形成すると思われる。
【０３８５】
Ｃ．ヒト細胞培養物中の機能的発現
小規模産生プロセスによって産生された突然変異体ＩＴＲ  ｃｅＤＮＡの機能性を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞をいくつかの代表的な突然変異体ｃｅＤＮＡ試料でトランスフェクトした。活発に分裂しているＨＥＫ２９３細胞を、３ｘ１０６細胞／ウェル（８０％集密度）で９６ウェルマイクロタイタープレート中に置き、付着性ＨＥＫ２９３培養物の前述の条件で２４時間インキュベートした。２４時間後、合計２００ｎｇの粗小規模ｃｅＤＮＡを、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｏｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してトランスフェクトした。製造元の指示に従ってトランスフェクション複合体を調製し、全量１０ｕＬのトランスフェクション複合体を使用して、以前に置かれたＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。すべての実験構築物および対照を三重にアッセイした。トランスフェクトした細胞を、前述の条件で７２時間インキュベートした。７２時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り除き、手短に室温に平衡させた。ＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイを実施した。オービタルシェーカー上で１０分後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍシリーズマイクロプレートリーダーを使用して、全発光を測定した。複製を平均した。結果を図３０に示す。試験した突然変異体試料の各々は、ヒト細胞培養物中でルシフェラーゼを発現し、ｃｅＤＮＡが、正しく形成され、ヒト細胞の設定において各試料に対して発現されたことを示す。
【０３８６】
参照文献
特許、特許出願、国際特許出願および公開を含む、明細書および実施例に列挙され、開示されるすべての参照文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ−１】
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【図２６Ａ−２】
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【図２６Ａ−３】
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【図２６Ａ−４】
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【図２６Ａ−５】
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【図２６Ａ−６】
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【図２６Ａ−７】
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【図２６Ｂ−１】
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【図２６Ｂ−２】
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【図２６Ｂ−３】
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【図２６Ｂ−４】
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【図２６Ｂ−５】
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【図２６Ｂ−６】
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【図２６Ｂ−７】
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【図２６Ｂ−８】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020532981.tif 000121
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