(57)【要約】  本発明は、被験体の血液由来試料における非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法であって、ａ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；ｂ）ａ）において決定した凝固時間関連パラメータの値を、少なくとも１つの参照試料において決定した前記凝固時間関連パラメータの値に対して比較し；そしてｃ）比較工程ｂ）の結果に基づいて、被験体の血液由来試料における前記非抗凝固剤干渉物質を決定する工程を含む、前記方法に関する。さらに、本発明は、不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法であって、前述の方法、ならびに該方法に関連するデバイス、キット、および使用にしたがって、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を決定する工程を含む、前記方法に関する。
2020513548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の血液由来試料におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定するための方法であって、
ａ）前記試料におけるトロンビン時間の値を決定し；
ｂ）ａ）において決定したトロンビン時間の値を、少なくとも１つの参照試料において決定したトロンビン時間の値に対して比較し；そして
ｃ）比較工程ｂ）の結果に基づいて、被験体の血液由来試料におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
工程ａ）が、フォトオプティカルアッセイで、１つの態様において比濁法によって、前記試料におけるトロンビン時間の値を決定する、請求項１の方法。
【請求項３】
工程ａ）が、
ａ１）前記試料をトロンビンと接触させ；
ａ２）試料をトロンビンと接触させた後、第一の時点で、前記試料における透過関連パラメータの第一の値を決定し；
ａ３）試料をトロンビンと接触させた後、第二の時点で、前記試料における透過関連パラメータの第二の値を決定し；そして
ａ４）下位工程ａ２）およびａ３）の結果に基づいて、トロンビン時間を決定する
下位工程を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
工程ｂ）が、
ｂ１）あらかじめ決定した非同一濃度のコンジュゲート化ビリルビンを有する、少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を提供し；
ｂ２）前記較正物質試料の各々に関して、１つの態様において工程ａ）の下位工程にしたがって、トロンビン時間の値を決定し；そして
ｂ３）下位工程ｂ２）において決定した値に基づいて、検量線を提供する
下位工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
前記試料が血液試料またはその誘導体であり、１つの態様においてクエン酸血漿試料である、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と前記試料のアリコットを接触させ、そして前記ビリルビンオキシダーゼ処理したアリコットにおける前記トロンビン時間の値を決定する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
総ビリルビンを決定し、そして総ビリルビンおよびコンジュゲート化ビリルビンに関して決定した値から、遊離ビリルビンを計算する工程をさらに含む、請求項６の方法。
【請求項８】
前記被験体が、ビリルビン脳症を発展させる増加したリスクを有する被験体である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
前記被験体が、抗凝固療法を投与されていない被験体である、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
前記決定が定量的決定である、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法であって、
Ａ）請求項１〜１０のいずれか一項記載のコンジュゲート化ビリルビンを決定し；
Ｂ）工程Ａ）の結果を品質参照に対して比較し；そして
Ｃ）比較工程Ｂ）の結果に基づいて、不十分な品質を有する試料を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、以下の条件の少なくとも１つを評価する工程を含み、そして以下の条件の少なくとも１つが満たされている場合、前記試料が不十分な品質を有すると同定する、前記方法：
ｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より低い；
ｉｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より高く、そしてビリルビンオキシダーゼおよび／またはベータ−グルクロニダーゼでの前記試料の処理後、凝固時間関連パラメータの値が有意により低い；および
ｉｉｉ）決定したコンジュゲート化ビリルビンの濃度が、１ｍｇ／ｄｌより高い、１つの態様において２．５ｍｇ／ｄＬより高い。
【請求項１３】
不十分な品質を有すると同定される試料が、臨床化学分析から排除される、請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
血液由来試料において、コンジュゲート化ビリルビンを決定するためのデバイスであって、分析装置および評価装置を含み、
（Ｉ）前記分析装置が、前記試料におけるトロンビン時間の値を決定するために適応しており、そして
（ＩＩ）前記評価装置が、コンジュゲート化ビリルビンに関する参照に、分析装置によって決定したトロンビン時間を比較するための触知可能に（ｔａｎｇｉｂｌｙ）組み込まれたアルゴリズムを含むメモリ装置を含む
前記デバイス。
【請求項１５】
ｉ）トロンビン；およびｉｉ）あらかじめ決定した濃度でコンジュゲート化ビリルビンを含む少なくとも１つの較正物質試料を含む、コンジュゲート化ビリルビンを決定するためのキット。
【請求項１６】
ビリルビンオキシダーゼおよび／またはベータ−グルクロニダーゼをさらに含む、請求項１５のキット。
【請求項１７】
血液由来試料分析の品質管理のための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法の使用、請求項１４記載のデバイスの使用、および／または請求項１５または１６記載のキットの使用。
【請求項１８】
被験体の血液由来試料における、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、
ａ）ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と前記試料を接触させ、
ｂ）工程ａ）の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして
ｃ）それによって、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、
ａ）前記被験体の第一の血液由来試料における凝固時間関連パラメータの第一の値を決定し；
ｂ）前記被験体の第二の血液由来試料を、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と接触させ、
ｃ）工程ｂ）の試料における凝固時間関連パラメータの第二の値を決定し、
ｄ）ａ）において決定した凝固時間関連パラメータの第一の値に由来するパラメータを参照に対して比較し；
ｅ）比較工程ｄ）の結果に基づいて、前記被験体におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定し、
ｆ）工程ｂ）の第二の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして、それによって
ｇ）前記被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記の第一および第二の血液由来試料が、被験体の同じ試料のアリコットである、請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体の血液由来試料における非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法であって、ａ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；ｂ）ａ）において決定した凝固時間関連パラメータの値を、少なくとも１つの参照試料において決定した前記凝固時間関連パラメータの値に対して比較し；そしてｃ）比較工程ｂ）の結果に基づいて、被験体の血液由来試料における前記非抗凝固剤干渉物質を決定する工程を含む、前記方法に関する。さらに、本発明は、不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法であって、前述の方法、ならびに該方法に関連するデバイス、キット、および使用にしたがって、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を決定する工程を含む、前記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床化学における血液試料の分析は、しばしば、試料において、用いるアッセイに干渉する化合物の存在によって混乱する。最も顕著な混乱要因は、大部分、溶血によって試料中に放出されるヘモグロビン；特に黄疸を患う患者の試料におけるビリルビン、および特に脂質症患者由来の試料における脂質濃度増加であり；これはまた、溶血、黄疸および脂質症（ＨＩＬ）干渉としても知られる。
【０００３】
ＨＩＬ干渉の検出および報告は、伝統的に、実験室職員による個々の標本の視覚的検査によって行われてきている；しかし、このプロセスは、非常に主観的であり、そして変動しやすい。近年、血清または血漿試料に関するＨＩＬ状態の自動化検出を提供する臨床化学分析装置が始動し、そしてＨＩＬ濁度指数値を報告してきている（例えば、Ｓｈｉｎら（２０１４），  Ａｎｎ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ３４：３０７；  Ｂｏｙｄら（２０１５），  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ４５０：３を参照されたい）。ＨＩＬ指数（閾値レベルとしてもまた知られる）は、分光光度測定および数学的補正を用いて、干渉レベルを決定する、ＨＩＬ干渉の半定量的概算である。臨床化学分析装置において、これらの指数は、通常、分析物と干渉するＨＩＬの最低濃度として定義され、＞１０％のバイアスを生じる。
【０００４】
ＨＩＬ指数は前分析アルゴリズムにおいて用いられ得て、これらのそれぞれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断キットまたは分析装置の製造者によって推奨され、明記される警戒指数を超えた場合に、分析用試料を拒絶する。あらかじめ定義されたＨＩＬ指数は、分析装置特異的であり、そして基本的に、いくつかの選択される波長での吸光度読み取りに基づく。ビリルビン、ヘモグロビン、および脂肪血症の吸光度スペクトルは、ある程度重複するため、ＨＩＬ指数の計算は、半定量的であるのみである。例えば、ヘモグロビンの吸光度スペクトルは、ビリルビンのスペクトルの大部分と重複し、したがって、溶血の存在下での黄疸の度合いまたはその逆の概算は、測光法を用いた際のＨＩＬ測定には困難な課題である。
【０００５】
ビリルビン定量化は、主に、ジアゾカップリング反応（ＵＳ  ６，３２６，２０８  Ｂ１）に基づいて行われる。ビリルビンおよびジアゾベンゼン−ｐ−スルホン酸は、中性溶液中では赤、そしてアルカリ溶液中では青の有色産物（アゾビリルビン）を生じる（バン−デン−ベルグ反応）。非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）は、生理学的ｐＨおよび温度では水に不溶性であるため、アゾ色素とゆっくりと反応する。グルクロン酸にコンジュゲート化されたビリルビン（ｂｉｌｉｃ）は、水溶性であり、そして迅速に反応する。ｂｉｌｉｕ反応は、いわゆる加速物質、例えばメタノールまたはカフェインによって加速されうる（ＷａｌｔｅｒｓおよびＧｅｒａｒｄｅ（１９７０），  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５：２３１；  Ｖａｌｄｅｓら（１９７９），  Ａｎｎａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９（３）：２５１）。反応は通常、アスコルビン酸の添加によって停止され、そして色素の消衰を５４０ｎｍで分光光度計で読み取る。典型的には、これらのアッセイは、有害化学化合物の使用を必要とする。例えば、ニホンウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ）筋肉由来のビリルビン誘導性蛍光タンパク質を用いることによって、こうした化合物を置き換えようと試みる努力がなされてきた（Ｉｗａｔａｎｉら（２０１６），  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｓｒｅｐ２８４８９）。ビリルビンオキシダーゼを使用する酵素法もまた知られる。ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンからビリベルジンへの酸化を触媒する際、４５０ｎｍの吸光度を減少させる。慣用的方法（ジアゾ法、ビリルビンオキシダーゼ法、または分光光度法）の主な不都合な点は、結果が、血清試料における濁度によって影響されることである。例えば、ビリルビンオキシダーゼ法は、４５０ｎｍの吸光度における変化を監視することによって、ビリルビンレベルを測定するが、この吸光度は、ヘモグロビンまたは脂質エマルジョンによる濁度によって影響される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ  ６，３２６，２０８  Ｂ１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎら（２０１４），  Ａｎｎ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ３４：３０７
【非特許文献２】Ｂｏｙｄら（２０１５），  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ４５０：３
【非特許文献３】ＷａｌｔｅｒｓおよびＧｅｒａｒｄｅ（１９７０），  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５：２３１
【非特許文献４】Ｖａｌｄｅｓら（１９７９），  Ａｎｎａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９（３）：２５１
【非特許文献５】Ｉｗａｔａｎｉら（２０１６），  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｓｒｅｐ２８４８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野に知られる方法の不都合な点、例えば毒性化学化合物の使用、および濁った試料によって引き起こされる問題を考慮すると、血液試料における干渉化合物、特に凝固および／または臨床化学アッセイに干渉する化合物の存在を検出し、先行技術の欠点を回避するための、改善された方法に関する必要性がある。この問題は、本明細書に開示する手段および方法によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、被験体の血液由来試料における非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法であって、
ａ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；
ｂ）ａ）において決定した凝固時間関連パラメータの値を、少なくとも１つの参照試料において決定した前記凝固時間関連パラメータの値に対して比較し；そして
ｃ）比較工程ｂ）の結果に基づいて、被験体の血液由来試料における前記非抗凝固剤干渉物質を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｒｏｃｈｅ  ｔ７１１凝固分析装置上における、ＡＰＴＴ試薬を用いたコンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の決定のための検量線。正常血漿プールに、増加する量のコンジュゲート化ビリルビンをスパイクした。
【図２】Ｒｏｃｈｅ  ｔ７１１凝固分析装置上における、ＡＰＴＴ試薬を用いたコンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の決定のための検量線。病的血漿プールに、増加する量のコンジュゲート化ビリルビンをスパイクした。
【図３】Ｒｏｃｈｅ  ｔ７１１凝固分析装置上における、ＡＰＴＴ試薬を用いた非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）の決定のための検量線。正常血漿プールに、増加する量の非コンジュゲート化ビリルビンをスパイクした。
【図４】Ｒｏｃｈｅ  ｔ７１１凝固分析装置上における、ＡＰＴＴ試薬を用いたヘモグロビンの決定のための検量線。正常血漿に、増加する量のヘモグロビンをスパイクし、そしてＲｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ試薬を用いて、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイに供した。
【図５】Ｒｏｃｈｅ  ｔ７１１凝固分析装置上における、ＡＰＴＴ試薬を用いたトリグリセリドの決定のための検量線。正常血漿に、増加する量のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）をスパイクし、そしてＲｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ試薬を用いて、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイに供した。
【図６】Ｒｏｃｈｅ  ｔ７１１凝固分析装置上における、ＡＰＴＴ試薬を用いたトリグリセリドの決定のための検量線。病的血漿プールに、増加する量のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）をスパイクし、そしてＲｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ試薬を用いて、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイに供した。
【図７】Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上における、トロンビン時間試薬を用いたコンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の決定のための検量線。正常血漿プールに、増加する量のコンジュゲート化ビリルビンをスパイクした。
【図８】Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上における、トロンビン時間試薬を用いたコンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の決定のための検量線。病的血漿プールに、増加する量のコンジュゲート化ビリルビンをスパイクした。
【図９】Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上における、トロンビン時間試薬を用いた非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）の決定のための検量線。正常血漿プールに、増加する量の非コンジュゲート化ビリルビンをスパイクした。
【図１０】Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上における、トロンビン時間試薬を用いたヘモグロビンの決定のための検量線。病的血漿に、増加する量のヘモグロビンをスパイクした。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。さらに、該方法は、上に明白に言及されるものに加えて、工程を含んでもよい。例えば、さらなる工程は、例えば、工程ａ）のための試料を提供するか、または工程ｂ）のための適切な参照試料を提供することに関してもよい。干渉物質を決定するための方法が含んでもよいさらなる工程は、本明細書で以下に明記される。さらに、前記工程の１またはそれより多くを自動化装置によって実行してもよい。
【００１２】
以下で用いるような用語「有する（ｈａｖｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」あるいはそのあらゆる任意の文法的変形は、非排他的な方式で用いられる。したがって、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴に加えて、この文脈で記載される実体に、さらなる特徴はまったく存在しない状況、および１またはそれより多いさらなる特徴が存在する状況の両方を指すことも可能である。例えば、表現「ＡはＢを有する」、「ＡはＢを含む」および「ＡにはＢが含まれる」は、Ｂに加えて、Ａに他の要素がまったく存在しない状況（すなわちＡはもっぱらそして排他的にＢからなる状況）、ならびにＢに加えて実体Ａに１またはそれより多いさらなる要素、例えば要素Ｃ、要素ＣおよびＤまたはさらにさらなる要素が存在する状況の両方を指してもよい。
【００１３】
さらに、以下で用いるような用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「具体的に」、「より具体的に」、「特に」、「より明確に」または類似の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意の特徴と組み合わせて用いられる。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、任意の特徴であり、そしていかなる意味でも、請求項の範囲を制限するとは意図されない。本発明は、当業者が認識するであろうように、別の特徴を用いることによって実行可能である。同様に、「本発明の態様において」または類似の表現によって導入される特徴は、本発明のさらなる態様に関するいかなる制限も伴わず、本発明の範囲に関するいかなる制限も伴わず、そしてこうした方式で導入される特徴と、本発明の他の任意のまたは任意でない特徴とを組み合わせる可能性に関するいかなる制限も伴わずに、任意の特徴であると意図される。さらに、別に示されていない限り、用語「約」は、関連分野において、一般的に認められる技術的精度を持つ、示す値に関し、好ましくは示す値±２０％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％に関する。
【００１４】
用語「非抗凝固剤干渉物質の決定」は、本明細書において、試料における、少なくとも１つの非抗凝固剤干渉物質の存在および／または量に関する指標を提供することに関する。１つの態様において、決定は定量的決定であり、さらなる態様において、試料中の非抗凝固剤干渉物質の濃度の絶対的定量化であり、該定量化は、例えば体積あたりの重量の値、体積あたりの活性等として提供されることも可能であり；そして／または決定は、例えば体積あたりの任意単位で、または参照値の割合として、例えばパーセントで提供されうる、参照値に対して比較した、非抗凝固剤干渉物質の濃度の相対的定量化である。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は定性的決定であり、すなわち１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質が、検出限界を超えた量または濃度で試料中に存在するかどうかの評価である。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は、半定量的決定であり、すなわちあらかじめ決定した閾値、例えば品質閾値、すなわち試料がさらなる分析のために十分な品質のものであるかどうかを、１つの態様において本明細書で以下に明記するように決定するために確立された閾値より高い量または濃度で、非抗凝固剤干渉物質が試料中に存在するかどうかの評価である。あらかじめ決定した閾値の値は、想定する方法の特定の適用に応じるであろう。当業者は、例えば本明細書で以下に明記するような１またはそれより多い参照試料における対応するパラメータの値を測定することによって、１またはそれより多い閾値をどのように確立するかを知っている。１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は、少なくとも１つの非抗凝固剤干渉物質が、少なくとも１つの閾値を超える濃度で試料中に存在するかどうかの評価である。当業者に理解されるであろうように、少なくとも１つの非抗凝固剤干渉物質が、少なくとも１つの閾値を超える濃度で試料中に存在するかどうかの評価は、関心対象の各非抗凝固剤干渉物質に関して、試料中のその濃度があらかじめ決定した閾値を超えるかどうかを決定する工程を含んでもよく；１つの態様において、少なくとも１つのあらかじめ決定した閾値は、各場合で、関心対象の非抗凝固剤干渉物質ごとに用いられる。さらなる態様において、少なくとも１つの非抗凝固剤干渉物質が少なくとも１つの閾値を超える濃度で試料中に存在するかどうかの評価は、１つの態様において、前記試料中に存在する非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）が、前記凝固時間関連パラメータの決定から、そして／または臨床化学から、該試料を排除すべき度合いまで、凝固時間関連パラメータを調節するかどうかの決定を含む。したがって、１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は、試料における非抗凝固剤干渉物質の同定を含まず；こうした決定は特に、試料中の非抗凝固剤干渉物質の決定が品質管理に用いられる場合、例えば本明細書で以下に明記するような血液由来試料の前分析品質管理において、想定される。１つの態様において、定量的および半定量的決定は、１より多い参照値に対して、試料において決定した値を比較する工程を含む。１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は、試料において決定した凝固時間関連パラメータの値を、少なくとも２つの参照値、例えば陰性対照および陽性対照に対して比較する工程を含む。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は、あらかじめ決定した、非同一濃度の非抗凝固剤干渉物質を有する、少なくとも３つ、１つの態様において少なくとも４つ、さらなる態様において少なくとも５つの参照試料から、検量線を確立する工程を含む。１つの態様において、少なくとも１つの参照試料の非抗凝固剤干渉物質の濃度は、検出限界未満である。
【００１５】
本明細書において、用語「参照値」は、参照試料において決定したパラメータ値に関する。１つの態様において、前記パラメータは、凝固時間関連パラメータである。１つの態様において、参照値は、以前の決定から入手可能であり、そして１つの態様において、例えばデータベース中に提供され；さらなる態様において、参照値は、関心対象の試料における少なくとも１つのパラメータの値を決定するのと同時に決定される。用語「対応するパラメータ」は、潜在的に標準的数学演算を含み、それが対応するパラメータと本質的に同じ情報を提供するパラメータに関する。例えば、試料の既知の体積中で決定した量の値は、濃度の値に対応する。１つの態様において、対応するパラメータは同じパラメータである。
【００１６】
「参照試料」は、本明細書において該用語が用いられた際、凝固反応が起こるために必要な化合物を、１つの態様において血液由来試料中でこれらの化合物が見られる濃度で含み、そして既知の量の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む試料である。１つの態様において、用語「既知の量の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）」は、半定量的に知られる非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の量に関する。前記の半定量的な量は、１つの態様において、例えば検出限界を超えるまたは検出限界未満の量、あるいは定性的閾値を超えるまたは定性的閾値未満の量であってもよい。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の量は、定量的に知られており、すなわち、相対的または絶対的な量または濃度として決定されている。参照試料は人工試料であってもよく；１つの態様において、参照試料は天然試料であるかまたは天然試料に基づき、１つの態様において血漿であり、さらなる態様において以下に明記するようなクエン酸血漿である。１つの態様において、参照試料は、１つの態様において半定量的に、試料が非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含むかどうかを決定することを可能にする試料である。したがって、本明細書において、参照試料中、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の絶対濃度は、必ずしも知られている必要はない。１つの態様において、参照試料は、試料中の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の定量的決定を可能にする試料である。こうした場合、１つの態様において、参照試料中の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の絶対濃度は知られている。
【００１７】
１つの態様において、参照試料は、検出可能な量で非抗凝固剤干渉物質を含まないことが知られており；こうした参照試料は、例えば、非抗凝固剤干渉物質が添加されていないか；または検出限界未満の濃度で非凝固剤干渉物質が添加されている、人工参照試料を提供することによって提供可能であるか；あるいはこうした参照試料は、本発明の方法とは異なる方法によって、血液由来試料における非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の量を決定することによって、そして非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の非存在が検出された試料を選択することによって；または非抗凝固剤干渉物質の濃度を、検出限界未満に調節することによって、提供可能である。１つの態様において、こうした試料はまた、非抗凝固剤干渉物質を含まないことが以前同定された参照試料を用いて、本発明の方法によって、そして非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の非存在が検出された試料を選択することによっても提供可能である。さらに、参照試料は、見かけ上健康な被験体由来、または見かけ上健康な被験体の集団由来の試料であってもよく、ここで用語「見かけ上健康な被験体」は、本明細書において、凝固欠損を患うと診断されていない被験体に関する。さらなる態様において、参照試料は、被験体集団における非抗凝固剤干渉物質を含む試料の出現率が、非凝固剤干渉物質（単数または複数）の濃度が健康な被験体の試料における非凝固剤干渉物質（単数または複数）の濃度から有意に逸脱しないことを統計的に確実にするために十分に低いならば、被験体集団由来の試料の混合物である。非抗凝固剤干渉物質を検出可能な量で含まないことが知られる参照試料は、例えば陰性対照試料として使用可能である。
【００１８】
あるいはまたはさらに、「参照試料」は、検出可能な量で非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含むことが知られる（さらなる）試料である。こうした参照試料は、例えば、人工参照試料を提供することによって、そして前記人工試料に既知の量の非抗凝固剤干渉物質を添加することによって、提供可能である。また、こうした試料は、血液由来試料に、１つの態様において、上に明記するように、非抗凝固剤干渉物質を含まないことが知られる試料に、既知の量の非抗凝固剤干渉物質を添加することによって、提供可能である。さらなる態様において、こうした参照試料は、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含むことが知られる被験体から得られた血液由来試料であり；１つの態様において、前記非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の存在および／または濃度は、本発明の方法とは異なる方法によって確立される。１つの態様において、こうした参照試料は、非抗凝固剤干渉物質を含むことが以前同定された参照試料を用いて、本発明の方法によって、そして非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含むと同定された試料を選択することによってもまた提供されうる。あらかじめ決定した検出可能な量で、非抗凝固剤干渉物質を含むことが知られる参照試料は、例えば陽性対照試料として使用可能であり；またはあらかじめ決定した検出可能な量で非抗凝固剤干渉物質を含むことが知られる参照試料は、品質管理試料として、例えば測定の正確さを決定するために使用可能である。
【００１９】
用語「較正物質試料」は、本明細書において、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の量または濃度が知られる参照試料に関する。１つの態様において、較正物質試料は、あらかじめ決定した量の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む血液由来試料である。１つの態様において、少なくとも２つ、さらなる態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも４つの較正物質試料を提供し、前記較正物質試料は、あらかじめ定義した非同一濃度の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む。１つの態様において、前記較正物質試料に、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を混合することによって、前記較正物質試料中の前記非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の濃度を調節することにより、前記較正物質試料が提供される。さらなる態様において、少なくとも２つ、さらなる態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも４つの較正物質試料は、１つの較正物質ストック溶液に由来する。さらなる態様において、少なくとも２つ、さらなる態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも４つの較正物質試料は、２つの較正物質ストック溶液、例えば抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含まないことが知られる１つの較正物質ストック溶液、および較正に用いる最高濃度で抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む１つの較正物質ストック溶液に由来する。当業者によって理解されるであろうように、１つの態様において、少なくとも１つの較正物質試料は、検出限界未満の濃度で、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含み、そして少なくとも１つの較正物質試料は、検出限界を超えるあらかじめ決定した濃度で、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む。
【００２０】
用語「干渉物質」は、本明細書において、被験体の血液由来試料における凝固時間関連パラメータを調節する剤に関する。当業者に知られるように、凝固時間は、試料中の抗凝固剤の存在によって修飾されうる。「抗凝固剤」は、該用語を本明細書において用いる際、被験体における凝固を調節するために、１つの態様において延長するために、療法適用において用いられる化学的化合物である。抗凝固剤は、当業者に知られ、そしてこれには、１つの態様において、ヘパリン、例えば未分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリン；因子Ｘａ阻害剤、例えば合成五糖または直接因子Ｘａ阻害剤；直接トロンビン阻害剤；またはビタミンＫアンタゴニストが含まれる。さらなる抗凝固剤は４−ヒドロキシクマリン、１つの態様においてアセノクマロール、ジクマロール、ビスクマ酢酸エチル、フェンプロクモン、ワルファリン、クマテトラリル、ジフェナコウム、フロクマフェン、ブロマジオロン、チオクロマロール、ブロディファコウム、および／またはフェンプロクモン（マルクマール（ｍａｒｃｕｍａｒ）、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−（１−フェニルプロピル）クマリン）；１つの態様においてワルファリン（（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−（３−オキソ―１−フェニルブチル）−２Ｈ−クロメン−２−オン）；さらなる態様において（−）−ワルファリン（（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−（３−オキソ−１−フェニルブチル）−２Ｈ−クロメン−２−オン）、さらなる態様において、フェンプロクモン（マルクマール、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−（１−フェニルプロピル）クマリン）である。さらなる抗凝固剤は、フェニンジオン、クロリンジオン、および／またはジフェナジオンである。
【００２１】
さらなる干渉物質は、「非抗凝固剤干渉物質」、すなわち上に明記するように、抗凝固剤でないが、試料において凝固時間関連パラメータを調節する活性を有する化合物である。１つの態様において、前記非抗凝固剤干渉物質は、被験体の体細胞によって産生される化合物である。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質はビリルビン、１つの態様においてコンジュゲート化ビリルビンである。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質はヘモグロビンである。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質は脂質、１つの態様においてトリグリセリドまたはトリグリセリド混合物である。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質は、コンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビンおよび／または脂質、１つの態様においてトリグリセリドまたはトリグリセリド混合物である。１つの態様において、干渉物質はイオン錯体化剤ではなく、特にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩の１つではなく、そしてクエン酸またはその塩の１つではない。
【００２２】
用語「凝固時間関連パラメータ」は、血液由来試料が凝固するために必要な時間を示すパラメータに関する。したがって、用語「凝固時間関連パラメータ」は、血液由来試料が凝固するために必要な時間を示すかまたはこれに相関するパラメータ、あるいはそれに由来するパラメータに関する。１つの態様において、凝固時間関連パラメータは、数学、物理および／または化学の標準演算によって、前述のパラメータから得られる。通常、凝固実験室において、例えば活性化プロトロンビン時間（ＡＰＴＴ）試薬およびトロンビン時間（ＴＴ）試薬を用いて、凝固異常に関してスクリーニングし、そして療法における抗凝固剤の治療効果を監視する。延長されたＡＰＴＴは、ヘパリンの使用（または試料の汚染）、抗リン脂質抗体（特にループス抗凝固剤）、凝固因子不全（例えば血友病）、凝固因子消費を含む敗血症、または凝固因子に対する抗体（因子阻害剤）の存在を示しうる。したがって、１つの態様において、凝固時間関連パラメータは、トロンビン時間または活性化部分トロンボプラスチン時間である。１つの態様において、凝固時間関連パラメータはトロンビン時間である。１つの態様において、凝固時間関連パラメータは活性化部分トロンボプラスチン時間である。凝固時間を決定するための方法は、当該技術分野に周知であり；１つの態様において、凝固時間関連パラメータは、発色アッセイにおいて、機械アッセイで、経時的な凝固塊質量を決定することによって、経時的な粘性関連パラメータ、例えば凝固反応において包埋された鉄ビーズのオシレーションを決定することによって（Ｈｕｂｂｕｃｈら（１９９６），  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  ４２：６３７−６４０）、あるいはフォトオプティカルアッセイで決定され、これらはすべて当業者に知られる。１つの態様において、凝固時間関連パラメータは、フォトオプティカルアッセイで、さらなる態様において測光法によって、さらなる態様において比濁分析によってまたは比濁法によって、さらなる態様において比濁法によって、決定される。したがって、１つの態様において、凝固時間関連パラメータは、本明細書の別の箇所に明記するように、経時的に、少なくとも１つの透過関連パラメータを決定することによって決定される。当業者によって理解されるように、透過関連パラメータは、１つの態様において、凝固を誘発した後、２つの非同一時点で、少なくとも２回決定される。
【００２３】
用語「血液由来試料」は、本明細書において、凝固に必要な、血液中に含まれる少なくとも凝固因子を含む、血液、または血液由来試料材料に関する。１つの態様において、血液由来試料は血漿であり、さらなる態様においてクエン酸血漿である。被験体から血液由来試料を得るための方法は、当業者に知られ、そして１つの態様において、これには動脈または静脈穿刺、および皮膚穿刺が含まれる。
【００２４】
用語「被験体」は、本明細書において、脊椎動物、１つの態様において哺乳動物、さらなる態様においてヒトに関する。１つの態様において、被験体は、見かけ上健康な被験体である。さらなる態様において、被験体は抗凝固剤療法を投与されていない被験体、すなわち本明細書で上に明記するような抗凝固剤で治療されていない被験体である。さらなる態様において、被験体は凝固障害を患っていないことが知られる。さらなる態様において、被験体はビリルビン脳症を発展させる増加したリスクを持つ被験体であり、特に被験体は新生児であり、１つの態様においてヒト新生児である。さらなる態様において、被験体は２ヶ月齢未満、１つの態様において１ヶ月齢未満、１つの態様において２週齢未満である。さらなる態様において、被験体は早産児、１つの態様において３７週妊娠期間未満で生まれたヒト乳児である。
【００２５】
１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、さらなる工程および／または下位工程を含む。当業者に知られるように、凝固は、カルシウムイオンの存在を必要とし；一方、凝固試験のための臨床試料は、通常、時期尚早の凝固を防止するため、カルシウムイオンキレーターを含有する。したがって、１つの態様において、工程ａ）すなわち試料中の凝固時間関連パラメータの値を決定する工程は、ａ０）カルシウムイオンを提供する剤と前記剤を、１つの態様において凝固を誘発する剤と前記試料を接触させる直前に、またはそれと同時に接触させる下位工程を含む。１つの態様において、工程ａ）、すなわち試料における凝固時間関連パラメータの値を決定する工程は、ａ１）凝固を誘発する剤と前記試料を接触させる下位工程を含む。凝固を誘発する剤は当該技術分野に知られ；１つの態様において、凝固を誘発する剤は、トロンビン、シリカ、セライト、カオリン、エラグ酸、リン脂質、バクストロキソビン、および／またはエカリンであり、１つの態様においてトロンビンである。さらなる態様において、工程ａ）は、ａ２）前記試料において、凝固を誘発した後、第一の時点で透過関連パラメータの第一の値を決定する下位工程、およびａ３）前記試料において、凝固を誘発した後、第二の時点で透過関連パラメータの第二の値を決定する下位工程を含む。本明細書で上に記載するように、第一の時点および第二の時点は同一でない。さらなる態様において、工程ａ）は、前記試料において、凝固を誘発した後、さらなる時点で、透過関連パラメータのさらなる値を決定するさらなる下位工程を含む。したがって、１つの態様において、工程ａ）は、前記試料において、凝固を誘発した後、多数の非同一時点で、透過関連パラメータの値を決定する多数の下位工程を含み、すなわち、１つの態様において、多数の間隔の後に、１つの態様において定期的な間隔で、透過関連パラメータの値を決定する工程を含む。したがって、１つの態様において、透過関連パラメータの値は、少なくとも１０秒（ｓ）ごと、さらなる態様において少なくとも８秒ごと、さらなる態様において少なくとも５秒ごと、さらなる態様において少なくとも３秒ごと、さらなる態様において少なくとも２秒ごと、さらなる態様において少なくとも１秒ごと、さらなる態様において少なくとも０．２秒ごとに決定される。さらなる態様において、工程ａ）は、透過関連パラメータの値を連続して決定する工程を含む。当業者に理解されるように、透過関連パラメータの決定は、１つの態様において、透過関連パラメータと相関するシグナル、および前記シグナルの実際の記録値を少なくとも確立する工程を含む。透過関連パラメータと相関するシグナルは、例えば測光計のフォトセル中で測定される電位として真に連続して提供されてもよいし、または例えばマルチウェルプレートのウェルを、測光計の光路に移動させることによって、別個の測定で提供されてもよく、前記シグナルの値の記録は、別個の工程において、所定の時点におけるものであろう。にもかかわらず、本明細書において、用語「透過関連パラメータの値を連続して決定する工程」は、少なくとも０．１秒ごとに透過関連パラメータの値を決定する工程に関する。したがって、該用語は、前述の頻度で、透過関連パラメータの値を記録する工程に関する。さらなる態様において、工程ａ）は、ａ４）下位工程ａ２）で決定した透過関連パラメータの第一の値、および下位工程ａ３）で決定した透過関連パラメータの第二の値に基づいて、前記試料において、凝固時間関連パラメータの値を決定する下位工程を含む。当業者に理解されるであろうように、透過関連パラメータの２より多い値を決定する場合、凝固時間関連パラメータの値の決定は、決定した透過関連パラメータの少なくとも２つの前記の値に基づき；１つの態様において、凝固時間関連パラメータの値の決定は、決定した透過関連パラメータの前記値のうちの２より多く、１つの態様において、３またはそれより多く、さらなる態様において、４またはそれより多くに基づき、さらなる態様において５またはそれより多くに基づき、さらなる態様において、決定した前記の透過関連パラメータのすべての値に基づく。したがって、１つの態様において、凝固時間関連パラメータの値の決定は、前記試料において決定した、凝固時間関連パラメータの値に基づく。したがって、１つの態様において、工程ａ）は、ａ１）凝固を誘発する剤、１つの態様においてトロンビンと、前記試料を接触させ；ａ２）前記試料において凝固を誘発した後、第一の時点で前記試料における透過関連パラメータの第一の値を決定し；ａ３）前記試料において凝固を誘発した後、第二の時点で前記試料における透過関連パラメータの第二の値を決定し；そしてａ４）下位工程ａ２）およびａ３）の結果に基づいて、凝固時間関連パラメータを決定する下位工程を含む。さらなる態様において、工程ａ）は、ａ１）凝固を誘発する剤、１つの態様においてトロンビンと、前記試料を接触させ；ａ２）前記試料において凝固を誘発した後、多数の非同一時点で前記試料における透過関連パラメータの多数の値を決定し；そしてａ３）下位工程ａ２）の結果に基づいて、凝固時間関連パラメータを決定する下位工程を含む。
【００２６】
用語「透過関連パラメータ」は、試料の透過光対入射光の比を示すかまたはこうした比に相関するパラメータ、あるいはそれに由来するパラメータに関する。１つの態様において、透過関連パラメータは、数学、物理および／または化学の標準演算によって、前述の比から得られる。したがって、１つの態様において、透過関連パラメータは、透過係数、吸光係数、透過率、吸光度、光散乱、または吸光である。さらに、１つの態様において、透過関連パラメータは、標準的数学演算によって、例えば試料に適用された希釈、較正係数等に関して補正するため、前述のパラメータの１つから得られる値である。血液試料における透過関連パラメータを決定するための手段および方法は、当業者に知られ、そして１つの態様において、透過測定、比濁分析、または比濁法である。試料は、透過関連パラメータを決定するため、マルチウェルプレートのウェルに含まれていてもよい。さらなる態様において、試料は、キュベットに含まれ；キュベットは単一キュベットとして、あるいは多数のキュベットの配置で、例えばキュベットローターまたはキュベットが充填されたラックに基づく系で用いられてもよい。１つの態様において、透過関連パラメータは、比濁法によって決定される。当業者によって、透過関連パラメータは、特定の波長で決定可能であることが理解され；したがって、１つの態様において、前記透過関連パラメータは、可視光の波長で、１つの態様において３００ｎｍ〜７００ｎｍの波長で、１つの態様において３００ｎｍ〜６００ｎｍまたは５００ｎｍから７００ｎｍの波長で決定される。１つの態様において、透過関連パラメータは、５５０〜６５０ｎｍの波長で、さらなる態様において６００ｎｍ〜６５０ｎｍの波長で、さらなる態様において６２５±１０ｎｍの波長で、さらなる態様において６２５ｎｍの波長で決定される。当業者には、前述の透過関連パラメータを用いて、例えば経時的な値のグラフ提示におけるプラトーを同定し、そしてそれに関してシグナルの高さのあらかじめ定義した割合を推定することによって、そして／または経時的な前記透過関連パラメータの値の変化を示すグラフの傾斜から外挿することによって、凝固時間関連パラメータを決定することも可能であることもまた知られる。
【００２７】
１つの態様において、工程ｂ）、すなわち本明細書で上に明記するように、工程ａ）で決定した凝固時間関連パラメータの値を、参照試料において決定した前記凝固時間関連パラメータの値に対して比較する工程は、ｂ１）あらかじめ決定した非同一濃度の単数または複数の前記非抗凝固剤干渉物質を有する、少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を提供する下位工程を含む。１つの態様において、工程ｂ）は、ｂ２）前記較正物質試料各々に関する前記凝固時間関連パラメータの値を、１つの態様において工程ａ）の下位工程にしたがって決定する下位工程を含む。さらなる態様において、工程ｂ）は、ｂ３）下位工程ｂ２）で決定した値に基づいて、検量線を提供する下位工程を含む。したがって、１つの態様において、工程ｂ）は、ｂ１）あらかじめ決定した非同一濃度の単数または複数の前記非抗凝固剤干渉物質を有する、少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を提供し；ｂ２）前記較正物質試料各々に関する前記凝固時間関連パラメータの値を、１つの態様において工程ａ）の下位工程にしたがって決定し；そしてｂ３）下位工程ｂ２）で決定した値に基づいて、検量線を提供する下位工程を含む。
【００２８】
１つの態様において、血液由来試料は、干渉物質、特に抗凝固剤を含まないと推測される被験体の試料、例えば本明細書で上に明記するような見かけ上健康な被験体由来の試料である。さらなる態様において、血液由来試料は、抗凝固剤で治療されたことが知られているかまたは治療されたと推測される被験体由来の試料である。こうした場合、１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、前記試料を、ヘキサジメトリンブロミド、プロタミンおよびヘパリナーゼより選択される化合物と接触させる工程を含む。あるいはまたはさらに、１つの態様において、方法は、前記試料を、抗線維素溶解剤、１つの態様において、トラネキサム酸またはその抗線維素溶解性誘導体、あるいはアプロチニンまたはその抗線維素溶解性誘導体と接触させる工程を含む。
【００２９】
１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、コンジュゲート化ビリルビンを決定する工程を含む方法である。こうした場合、１つの態様において、方法は、前記試料のアリコットをビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）と接触させ、そして前記ビリルビンオキシダーゼ処理したアリコットにおける前記凝固時間関連パラメータの値を、１つの態様において本発明の非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法にしたがって、決定する工程を含む。さらなる態様において、方法は、総ビリルビンを決定する工程をさらに含む。したがって、さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、総ビリルビンを決定する工程を含む方法である。総ビリルビンを決定するための方法は、例えば本明細書で上に引用する文献から、当該技術分野に知られる。さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、総ビリルビンを決定し、そして総ビリルビンおよびコンジュゲート化ビリルビンに関して決定した値から、遊離ビリルビンを計算する工程を含む方法である。
【００３０】
１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、前記試料のアリコットをベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と接触させ、そして前記ビリルビンオキシダーゼ処理したアリコットにおける凝固時間関連パラメータの値、１つの態様においてトロンビン時間の値を、１つの態様において本発明の非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法にしたがって、決定する工程を含む。１つの態様において、ベータ−グルクロニダーゼは、基質としてコンジュゲート化ビリルビンを用いるベータ−グルクロニダーゼであり；適切なベータ−グルクロニダーゼは当該技術分野に知られ、そしてこれには、細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含む腸細菌由来のもの；哺乳動物肝臓ベータ−グルクロニダーゼ、例えばヒトまたはウシ肝臓ベータ−グルクロニダーゼ；リンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ）ベータ−グルクロニダーゼ；およびアワビ（Ａｂａｌｏｎｅ）ベータ−グルクロニダーゼが含まれる。
【００３１】
１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、干渉物質の同一性確立を補助する、さらなる工程を含む。１つの態様において、方法は、凝固を誘発する前に、試料の濁度および／または吸収を決定する工程をさらに含む。当業者に理解されるであろうように、凝固を誘発する前に、増加した量の脂質を含まない参照に対して比較して濁度が増加していれば、１つの態様において、本明細書で上に明記するように、非抗凝固剤干渉物質が脂質である指標となり；そして１つの態様において４００ｎｍ〜６００ｎｍの波長を測定して、増加した量のヘモグロビンを含まない参照に対して比較して吸収が増加していれば、非抗凝固剤干渉物質がヘモグロビンである指標となる。上に示すように、試料のアリコットおよびビリルビンオキシダーゼで処理されている前記試料のさらなるアリコットの間における凝固時間関連パラメータの相違は、非抗凝固剤干渉物質がビリルビンである指標となる。１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法は、干渉物質の同一性の確立を補助するさらなるおよび／または追加の工程を含み、前記工程は、当業者に知られ、例えば酵素的方法、化学的検出反応、例えば親油性剤での染色法等である。
【００３２】
好適なことに、本発明の根底にある研究において、血液由来試料に天然に存在する化合物、特にビリルビン、ヘモグロビン、および脂質は、凝固に干渉可能であり、そしてこの干渉によって、凝固時間関連パラメータを決定することを通じて、干渉剤を定量化可能であることが見出された。さらに、干渉剤は、頻繁に観察される、凝固試験および臨床化学アッセイの混乱要因であるため、上昇した量のこれらの化合物を含む血液由来試料は、好ましくは、偽結果の生成を回避するため、こうした分析から排除される。
【００３３】
上で行う定義は、変更すべきを変更して以下に適用される。以下で行うさらなる定義および説明もまた、変更すべきを変更して、本明細書で記載するすべての態様に関して適用される。
【００３４】
本発明は、不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法であって、
Ａ）本発明にしたがって、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を決定し；
Ｂ）工程Ａ）の結果を品質参照に対して比較し；そして
Ｃ）比較工程Ｂ）の結果に基づいて、不十分な品質を有する試料を同定する
工程を含む、前記方法にさらに関する。
【００３５】
本明細書において、用語「不十分な品質を有する血液由来試料」は、臨床化学および／または凝固測定の少なくとも１つのアッセイに干渉する量で、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む、血液由来試料に関する。１つの態様において、該用語は、凝固測定に干渉する量で、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を含む試料に関する。１つの態様において、該用語は、標準プロトコルにしたがって分析した際、実際の値から有意に逸脱した、少なくとも１つの臨床化学値および／または凝固測定値が測定されるか、または測定されると予測される試料に関する。したがって、１つの態様において、不十分な品質を有する血液由来試料は、偽結果を回避するため、標準プロトコルにしたがって解析されるべきではないか、あるいは前記非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の量を減少させるかまたは除去するため、こうした分析の前に前処理すべきである。例えば、１つの態様において、試料が閾値を超える濃度のビリルビンを含むと同定される場合、前記試料を、さらなる分析前に、ビリルビンオキシダーゼで処理してもよい。また、１つの態様において、試料が閾値を超える濃度の脂質を含むと同定される場合、前記試料を、さらなる分析前に、適切な脂質分解酵素（ｌｉｐｉｄａｓｅ）で処理してもよいし、脂質小滴を除去するために遠心分離に供してもよいし、他の処理を行ってもよい。さらなる態様において、不十分な品質を有すると同定される試料を、臨床化学分析および／または凝固測定から排除する。
【００３６】
当業者に理解されるであろうように、本発明の不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法にしたがって、１つの態様において、試料中に存在する非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を同定する必要はないし；また値の偏差を実際に測定することを確実にする必要もない。したがって、１つの態様において、不十分な品質を有する血液由来試料は、１つの態様において、あらかじめ決定した閾値を超えて、少なくとも１つの非抗凝固剤干渉物質が前記試料中に存在することを決定することによって同定され、そして１つの態様において、前記の知見のみに基づいて、臨床化学分析および／または凝固分析から、試料を排除する。
【００３７】
本明細書で上に明記するように、閾値は、定義される閾値の値または閾値範囲であってもよい。しかし、１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の閾値量を含む参照試料を提供することによって、あらかじめ決定した閾値を提供し；例えば最高の許容されうる濃度の干渉物質（単数または複数）を含む参照試料を提供してもよいこともまた想定される。原則として、前記参照試料中の非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）の実際の濃度は知られる必要はなく、これは閾値濃度を含む試料はまた、実験的に同定可能であるためである。さらなる態様において、閾値は閾値の値であり、１つの態様において閾値濃度である。
【００３８】
本発明にしたがって、非抗凝固剤干渉物質（単数または複数）を決定する結果を品質参照に対して比較してもよい。本明細書において、用語「品質参照」は、所定の血液由来試料が、十分な品質のものであるかまたはそうでないかを決定することを可能にする参照試料または参照値に関する。１つの態様において、品質参照は、干渉物質（単数または複数）の最高の許容されうる濃度を含む参照試料であり、そして血液由来試料および品質参照試料の間で対応するパラメータの値を比較する。さらなる態様において、品質参照は、あらかじめ決定可能であるか、または例えば検量線から決定可能である、参照値である。したがって、１つの態様において、品質参照は品質参照範囲または品質参照曲線である。さらなる態様において、前記品質参照の下限は、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の−２０％、１つの態様において−１０％、さらなる態様において−７．５％である。さらなる態様において、前記品質参照の上限は、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の＋２０％、１つの態様において＋１０％、さらなる態様において＋７．５％である。さらなる態様において、品質参照は、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の±２０％、１つの態様において±１０％、さらなる態様において±７．５％の品質参照範囲である。さらなる態様において、品質参照の下限は、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の正常の下限である。さらなる態様において、前記品質参照の上限は、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の正常の上限である。
【００３９】
１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質はヘモグロビンであり；こうした場合、不十分な品質を有する血液由来試料は、１つの態様において、決定したヘモグロビン濃度が２０ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において５０ｍｇ／ｄＬより高い場合、同定される。
【００４０】
さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質はコンジュゲート化ビリルビンであり；こうした場合、不十分な品質を有する血液由来試料は、１つの態様において、決定したコンジュゲート化ビリルビンが１ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において２．５ｍｇ／ｄＬより高い場合、同定される。
【００４１】
さらなる態様において、非抗凝固剤干渉物質は、脂質であり、１つの態様においてトリグリセリドを含む混合物であり；こうした場合、不十分な品質を有する血液由来試料は、１つの態様において、決定した脂質濃度が１００ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において２５０ｍｇ／ｄＬより高い場合、同定される。当業者に理解されるように、血液由来試料中の脂質濃度増加は、濁りを導く可能性もあり；したがって、不十分な品質を有する血液由来試料は、１つの態様において、凝固前の前記試料における透過関連パラメータの値が透過参照より高い場合、同定される。用語「透過参照」は、本明細書において、脂質の最大に許容されうる濃度を含むことが知られる、本明細書で上に明記するような参照試料において決定される値、または脂質の前記の最大に許容されうる濃度に対応する参照値に関する。１つの態様において、透過参照値は、正常試料における透過関連パラメータの値の＋２０％、１つの態様において＋１０％、さらなる態様において＋７．５％である。さらなる態様において、透過参照値は、正常試料における透過関連パラメータの値の正常の上限である。
【００４２】
したがって、１つの態様において、不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法は、以下の条件の少なくとも１つを評価する工程を含み、そして以下の条件の少なくとも１つが満たされている場合、該試料が不十分な品質を有すると同定する：
ｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より低い；
ｉｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より高く、そしてビリルビンオキシダーゼでの前記試料の処理後、凝固時間関連パラメータの値が有意により低い；
ｉｉｉ）決定したヘモグロビン濃度が、２０ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において５０ｍｇ／ｄＬより高い；
ｉｖ）決定したコンジュゲート化ビリルビンの濃度が、１ｍｇ／ｄｌより高い、１つの態様において２．５ｍｇ／ｄＬより高い；
ｖ）決定した脂質濃度が、１００ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において２５０ｍｇ／ｄＬより高い；および
ｖｉ）凝固前の前記試料における透過関連パラメータの値が透過参照試料の値より高い。
【００４３】
本発明はまた、血液由来試料において、非抗凝固剤干渉物質を決定するためのデバイスであって、分析装置および評価装置を含み、
（Ｉ）前記分析装置が、前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定するために適応しており、そして
（ＩＩ）前記評価装置が、前記非抗凝固剤干渉物質に関する定量化参照に、分析装置によって決定した凝固時間関連パラメータを比較するための触知可能に（ｔａｎｇｉｂｌｙ）組み込まれたアルゴリズムを含むメモリ装置を含む
前記デバイスにも関する。
【００４４】
用語「デバイス」は、本明細書において、決定を可能にするように、互いに機能可能であるように連結された、記載された手段を少なくとも含む、手段の系に関する。凝固時間関連パラメータを決定するための典型的な手段は、当該技術分野に知られ、そして本発明の方法の背景において、本明細書に上に記載されてきている。１つの態様において、凝固時間関連パラメータを決定するための手段は、当該技術分野に知られ、そして例えばＨｕｂｂｕｃｈら（１９９６），  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  ４２：６３７−６４０に記載される、透過関連パラメータを決定するための手段である。機能可能な方式でデバイスの手段をどのように連結するかは、デバイスに含まれる手段のタイプに応じるであろう。１つの態様において、手段は、単一のデバイスに含まれる。しかし、本発明の手段が、１つの態様において、別個のデバイスとして現れてもよく、そしてさらなる態様において、キットとしてともにパッケージングされることもまた意図される。当業者は、さらなる面倒を伴わずに、手段をどのように連結するかを理解するであろう。好ましいデバイスは、特別な技術者の特定の知識を伴わずに適用されうるものである。１つの態様において、デバイスは本明細書に記載するようなさらなる特徴を含むように適応している。
【００４５】
１つの態様において、デバイスには、非抗凝固剤干渉物質の決定を提供するために、凝固時間関連パラメータを決定するための分析装置、ならびに分析装置から、そして／またはデータベースから受け取ったデータをプロセシングするための評価装置が含まれる。１つの態様において、非抗凝固剤干渉物質の決定は、本明細書の別の箇所に明記するような分析装置によって決定される透過関連パラメータに基づいて、凝固時間関連パラメータを決定する工程を含む。したがって、１つの態様において、分析装置は、ある時間間隔で、１つの態様において定期的な時間間隔で、さらなる態様において本明細書の別の箇所に明記するように、同じ試料の前記透過関連パラメータの多数の値を測定するよう適応している。１つの態様において、分析装置は、参照試料、１つの態様において較正物質試料における凝固時間関連パラメータの値を決定するために、さらに適応している。さらなる態様において、分析装置は、較正試料を自動的に提供するために、１つの態様において少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を、さらなる態様において１つまたは２つの較正物質ストック溶液（単数または複数）から自動的に提供するために、さらに適応している。さらなる態様において、分析装置は、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長、１つの態様において６００ｎｍ〜６５０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５±１０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５ｎｍの波長、さらなる態様において４００ｎｍ〜４５０ｎｍの波長で、透過関連パラメータを決定するために適応している光学装置を含む。さらなる態様において、分析装置は、もっぱら、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長、１つの態様において６００ｎｍ〜６５０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５±１０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５ｎｍの波長、さらなる態様において４００ｎｍ〜４５０ｎｍの波長で、透過関連パラメータを決定するために適応している光学装置を含む。
【００４６】
デバイスの評価装置は、決定した凝固時間関連パラメータを前記非抗凝固剤干渉物質に関する参照に対して比較するための触知可能に組み込まれたアルゴリズムを含むメモリ装置を含む。さらなる態様において、メモリ装置は、検量線、および／または凝固時間関連パラメータまたはそれに由来するパラメータに前記検量線を適用するための触知可能に組み込まれたアルゴリズムを含む。したがって、１つの態様において、触知可能に組み込まれたアルゴリズムは、本発明の方法にしたがった決定を実装する。１つの態様において、評価装置は、前記透過関連パラメータの前記の複数の値から、凝固関連パラメータの１つの値を決定するように適応している。
【００４７】
さらに、本発明は、
ｉ）トロンビン；および
ｉｉ）あらかじめ決定した濃度でコンジュゲート化ビリルビンを含む、またはあらかじめ決定した濃度でヘモグロビンを含む、少なくとも１つの較正物質試料
を含む、コンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビン濃度を決定するためのキットに関する。
【００４８】
さらに、本発明は、
ｉ）凝固を誘発する剤；および
ｉｉ）あらかじめ決定した検出可能な量で、非抗凝固剤干渉物質を含む、少なくとも１つの参照試料
を含む、不十分な品質を有する血液由来試料を同定するためのキットに関する。
【００４９】
さらに、本発明は、被験体の血液由来試料における非抗凝固剤干渉物質を決定するための、１つの態様においてコンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビンおよび／または脂質を決定するためのキットであって、
ｉ）凝固を誘発する剤；および
ｉｉ）あらかじめ決定した検出可能な量で、非抗凝固剤干渉物質を含む、少なくとも１つの参照試料
を含む、前記キットに関する。
【００５０】
用語「キット」は、本明細書において、ともにパッケージングされてもまたはされなくてもよい、本発明の前述の化合物、手段または試薬のコレクションを指す。キットの構成要素は、別個の筐体に含まれてもよいし（すなわち別個の部分のキットとして）、あるいは２またはそれより多い構成要素が単一の筐体中で提供されてもよい。さらに、本発明のキットは、１つの態様において、本明細書に上に言及する方法を実施するために用いられるべきものであることが理解されるものとする。１つの態様において、構成要素、１つの態様においてすべての構成要素が、上に言及する方法を実施するために、すぐに使用可能な方式で提供されることが想定される。１つの態様において、前記構成要素のすべてまたはいくつかが、乾燥した、例えば凍結乾燥型で提供され、ここで構成要素は、水性緩衝溶液などの液体を用いて再構成される。１つの態様において、前記構成要素のすべてまたはいくつかは、濃縮液体型で提供され、ここで濃縮構成要素は、水性緩衝溶液などの液体を用いて希釈される。１つの態様において、前記構成要素のすべてまたはいくつかは、すぐに使用可能な型、すなわち直接使用可能であり、そして１つの態様において希釈を必要としない状態で提供される。１つの態様において、前記構成要素、特に参照試料のすべてまたはいくつかは、凍結型で、例えば凍結溶液として提供される。さらに、キットは、１つの態様において、前記方法、および適用可能な場合、乾燥試薬の前記再構成を実行するための使用説明書を含有する。使用説明書は、紙または電子型のユーザーマニュアルによって提供されうる。さらに、マニュアルは、本発明のキットを用いて前述の方法を実行した際に得られる結果を解釈するための使用説明書を含んでもよい。
【００５１】
１つの態様において、キットはビリルビンオキシダーゼをさらに含む。さらなる態様において、キットは、少なくとも１つの較正物質試料および／または少なくとも１つの品質参照試料をさらに含む。さらなる態様において、キットは、ヘキサジメトリンブロミド、プロタミンおよびヘパリナーゼより選択される化合物をさらに含み；そして／または抗線維素溶解剤、１つの態様において、トラネキサム酸またはその抗線維素溶解性誘導体、あるいはアプロチニンまたはその抗線維素溶解性誘導体を含む。１つの態様において、キットは、カルシウムイオンを提供する剤、特に少なくとも０．０１Ｍ、１つの態様において少なくとも０．０２Ｍの濃度でカルシウムイオンを含む溶液を含む。１つの態様において、キットはさらにトロンビンを含む。
【００５２】
１つの態様において、キットは、少なくとも１つの接触活性化因子、１つの態様においてシリカ、セライト、カオリン、および／またはエラグ酸、特にシリカゲルまたはエラグ酸を含み、１つの態様においてリン脂質をさらに含み；１つの態様において、キットは、（ｉ）あらかじめ決定した濃度のコンジュゲート化ビリルビンを含む少なくとも１つの参照試料および／または（ｉｉ）あらかじめ決定した濃度のヘモグロビンを含む少なくとも１つの参照試料および／または（ｉｉｉ）あらかじめ決定した濃度の脂質を含む少なくとも１つの参照試料をさらに含む。したがって、１つの態様において、キットは、ＡＰＴＴ試薬、１つの態様において本明細書に言及するようなＡＰＴＴ試薬、および少なくとも１つの非抗凝固剤干渉物質較正物質試料を含むキットである。
【００５３】
さらなる態様において、コンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビン濃度を決定するためのキットは、少なくとも１ｍｇ／ｄＬ、１つの態様において少なくとも２．５ｍｇ／ｄＬ、さらなる態様において少なくとも５ｍｇ／ｄＬのあらかじめ決定した濃度でコンジュゲート化ビリルビンを含む較正物質試料を含む。さらなる態様において、コンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビン濃度を決定するためのキットは、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬ、１つの態様において少なくとも５０ｍｇ／ｄＬ、１つの態様において少なくとも１００ｍｇ／ｄＬのあらかじめ決定した濃度でヘモグロビンを含む較正物質試料を含む。
【００５４】
また、本発明は、血液由来試料分析の品質管理のための、本発明記載のデバイスおよび／または本発明記載のキットの、本発明記載の非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法の使用に関する。
【００５５】
１つの態様において、前記品質管理は、臨床化学分析および／または凝固分析から、不十分な品質である試料を排除する工程を含む。さらなる態様において、不十分な品質である試料は、本明細書で上に明記するような、不十分な品質である少なくとも１つの条件を満たす試料である。
【００５６】
また、本発明は、被験体の血液由来試料におけるビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、ａ）ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と前記試料を接触させ、ｂ）工程ａ）の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そしてｃ）それによって、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する工程を含む、前記方法に関する。
【００５７】
さらに、本発明は、被験体におけるコンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、ａ）前記被験体の第一の血液由来試料における凝固時間関連パラメータの第一の値を決定し；ｂ）前記被験体の第二の血液由来試料を、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と接触させ、ｃ）工程ｂ）の試料における凝固時間関連パラメータの第二の値を決定し、ｄ）ａ）で決定した凝固時間関連パラメータの第一の値に由来するパラメータを参照に対して比較し；ｅ）比較工程ｄ）の結果に基づいて、前記被験体におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定し、ｆ）工程ｂ）の第二の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして、それによってｇ）前記被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する工程を含む、前記方法に関する。１つの態様において、第一および第二の血液由来試料は、こうした場合、被験体の同じ試料のアリコットである。
【００５８】
本発明は、プログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行された際、本明細書に含まれる態様の１またはそれより多くで、本発明記載の方法を実行するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラムをさらに開示し、そして提唱する。特に、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能データキャリア上に保存可能である。したがって、特に、上に示すような、１つ、１より多くまたはさらにすべての方法工程ａ）〜ｄ）は、コンピュータまたはコンピュータネットワークを用いることによって、好ましくはコンピュータプログラムを用いることによって、実行可能である。
【００５９】
本発明は、プログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行された際、本明細書に含まれる態様の１またはそれより多くで、本発明記載の方法を実行するための、プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品をさらに開示し、そして提唱する。特に、プログラムコード手段は、コンピュータ読み取り可能データキャリア上に保存可能である。
【００６０】
さらに、本発明は、コンピュータまたはコンピュータネットワーク、例えばコンピュータまたはコンピュータネットワークの作業メモリまたは主メモリに装填した後、本明細書に開示する態様の１またはそれより多くにしたがって、方法を実行可能である、データ構造がその上に保存されている、データキャリアを開示し、そして提唱する。
【００６１】
本発明は、プログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行された際、本明細書に開示する態様の１またはそれより多くにしたがって、方法を実行するための、機械読み取り可能キャリア上に保存されたプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品をさらに提唱し、そして開示する。本明細書において、コンピュータプログラム製品は、取引可能な製品としてのプログラムを指す。製品は一般的に、任意の形式で、例えば紙の形式、またはコンピュータ読み取り可能データキャリア上に存在しうる。特に、コンピュータプログラム製品は、データネットワークを通じて配布可能である。
【００６２】
最後に、本発明は、本明細書に開示する態様の１またはそれより多くにしたがって方法を実行するための、コンピュータ系またはコンピュータネットワークによって読み取り可能な命令を含有する変調データシグナルを提唱し、そして開示する。
【００６３】
好ましくは、本発明のコンピュータ実装側面に関して、本明細書に開示する態様の１またはそれより多くにしたがった方法の方法工程の１またはそれより多く、あるいはさらに方法工程のすべては、コンピュータまたはコンピュータネットワークを用いることによって実行可能である。したがって、一般的に、データの提供および／または操作を含む方法工程のいずれかを、コンピュータまたはコンピュータネットワークを用いることによって実行可能である。一般的に、これらの方法工程には、典型的には手動の作業を必要とする方法工程、例えば試料を提供する工程および／または実際の測定を実行する特定の側面を除いて、任意の方法工程が含まれうる。
【００６４】
特に、本発明はさらに：
−少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータまたはコンピュータネットワークであって、該プロセッサが、本明細書に記載する態様の１つにしたがって方法を実行するよう適応している、前記コンピュータまたはコンピュータネットワーク、
−コンピュータ装填可能データ構造であって、該データ構造がコンピュータ上で実行されている間、本明細書に記載する態様の１つにしたがって方法を実行するよう適応している、前記データ構造、
−コンピュータプログラムであって、該プログラムがコンピュータ上で実行されている間、本明細書に記載する態様の１つにしたがって方法を実行するよう適応している、前記コンピュータプログラム、
−コンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行されている間、本明細書に記載する態様の１つにしたがって方法を実行するためのプログラム手段を含む、コンピュータプログラム、
−先行する態様記載のプログラム手段を含むコンピュータプログラムであって、コンピュータ読み取り可能ストレージ媒体上に保存されている、前記コンピュータプログラム、
−ストレージ媒体であって、データ構造が該ストレージ媒体上に保存されており、そして該データ構造が、コンピュータまたはコンピュータネットワークの主および／または作業ストレージ内に装填された後、本明細書に記載する態様の１つにしたがって方法を実行するよう適応している、前記ストレージ媒体、
−プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品であって、該プログラムコード手段がコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行される際、本明細書に記載する態様の１つにしたがった方法を実行するため、該プログラムコード手段がストレージ媒体上に保存されうるかまたは保存されている、前記コンピュータプログラム製品
を開示する。
【００６５】
上記を考慮して、以下の態様が特に想定される：
１．  被験体の血液由来試料における非抗凝固剤干渉物質を決定するための方法であって、
ａ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；
ｂ）ａ）において決定した凝固時間関連パラメータの値を、少なくとも１つの参照試料において決定した前記凝固時間関連パラメータの値に対して比較し；そして
ｃ）比較工程ｂ）の結果に基づいて、被験体の血液由来試料における前記非抗凝固剤干渉物質を決定する
工程を含む、前記方法。
【００６６】
２．  前記非抗凝固剤干渉物質が、脂質、コンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビンであり、１つの態様においてコンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビンであり、１つの態様においてコンジュゲート化ビリルビンである、態様１の方法。
【００６７】
３．  工程ａ）が、発色アッセイ、機械的アッセイ、またはフォトオプティカルアッセイで、１つの態様においてフォトオプティカルアッセイで、さらなる態様において測光法によって、さらなる態様において比濁分析によってまたは比濁法によって、さらなる態様において比濁法によって、前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定する工程である、態様１または２の方法。
【００６８】
４．  工程ａ）が、ａ１）凝固を誘発する剤と、１つの態様においてトロンビンと、前記試料を接触させる下位工程を含む、態様１〜３のいずれか１つの方法。
５．  工程ａ）が、ａ２）前記試料において凝固を誘発した後、第一の時点で、透過関連パラメータの第一の値を決定する下位工程、およびａ３）前記試料において凝固を誘発した後、第二の時点で、透過関連パラメータの第二の値を決定する下位工程を含む、態様１〜４のいずれか１つの方法。
【００６９】
６．  工程ａ）が、前記試料において凝固を誘発した後、さらなる時点で、透過関連パラメータのさらなる値を決定するさらなる下位工程を含む、態様１〜５のいずれか１つの方法。
【００７０】
７．  工程ａ）が、ａ４）下位工程ａ２）で決定した透過関連パラメータの第一の値および下位工程ａ３）で決定した透過関連パラメータの第二の値に基づいて、１つの態様において前記試料において決定した透過関連パラメータの値に基づいて、前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定する下位工程を含む、態様４〜６のいずれか１つの方法。
【００７１】
８．  工程ａ）が、
ａ１）前記試料を、凝固を誘発する剤、１つの態様においてトロンビンと接触させ；
ａ２）前記試料において凝固を誘発した後、第一の時点で、前記試料における透過関連パラメータの第一の値を決定し；
ａ３）前記試料において凝固を誘発した後、第二の時点で、前記試料における透過関連パラメータの第二の値を決定し；そして
ａ４）下位工程ａ２）およびａ３）の結果に基づいて、凝固時間関連パラメータを決定する
下位工程を含む、態様１〜７のいずれか１つの方法。
【００７２】
９．  工程ｂ）が、ｂ１）あらかじめ決定した非同一濃度の単数または複数の前記非抗凝固剤干渉物質を有する、少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を提供する下位工程を含む、態様１〜８のいずれか１つの方法。
【００７３】
１０．  工程ｂ）が、ｂ２）前記較正物質試料の各々に関して、１つの態様において工程ａ）の下位工程にしたがって、前記凝固時間関連パラメータの値を決定する下位工程を含む、態様１〜９のいずれか１つの方法。
【００７４】
１１．  工程ｂ）が、ｂ３）下位工程ｂ２）において決定した値に基づいて、検量線を提供する下位工程を含む、態様１０の方法。
１２．  工程ｂ）が、
ｂ１）あらかじめ決定した非同一濃度の単数または複数の前記非抗凝固剤干渉物質を有する、少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を提供し；
ｂ２）前記較正物質試料の各々に関して、１つの態様において工程ａ）の下位工程にしたがって、前記凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして
ｂ３）下位工程ｂ２）において決定した値に基づいて、検量線を提供する
下位工程を含む、態様１〜１１のいずれか１つの方法。
【００７５】
１３．  前記試料が血液試料またはその誘導体であり、１つの態様において血漿試料であり、さらなる態様においてクエン酸血漿試料である、態様１〜１２のいずれか１つの方法。
【００７６】
１４．  前記被験体が見かけ上健康な被験体である、態様１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．  前記被験体が、抗凝固療法を投与されていない被験体である、態様１〜１４のいずれか１つの方法。
【００７７】
１６．  前記被験体が凝固障害を患っていないことが知られる、態様１〜１５のいずれか１つの方法。
１７．  前記被験体が、ビリルビン脳症を発展させる増加したリスクを有する被験体である、態様１〜１６のいずれか１つの方法。
【００７８】
１８．  前記被験体が、新生児、１つの態様においてヒト新生児である、態様１〜１７のいずれか１つの方法。
１９．  前記被験体が、２ヶ月齢未満、１つの態様において１ヶ月齢未満、１つの態様において２週齢未満のヒト新生児である、態様１〜１９のいずれか１つの方法。
【００７９】
２０．  前記被験体が未熟児、１つの態様において３７週妊娠期間未満で生まれたヒト乳児である、態様１〜１９のいずれか１つの方法。
２１．  前記凝固時間関連パラメータが、活性化部分トロンボプラスチン時間またはトロンビン時間であり、１つの態様においてトロンビン時間である、態様１のいずれか１つの方法。
【００８０】
２２．  ヘキサジメトリンブロミド、プロタミンおよびヘパリナーゼより選択される化合物と、前記試料を接触させる工程を含む、態様１〜２１のいずれか１つの方法。
２３．  抗線維素溶解剤、１つの態様においてトラネキサム酸またはその抗線維素溶解性誘導体、あるいはアプロチニンまたはその抗線維素溶解性誘導体と、前記試料を接触させる工程を含む、態様１〜２２のいずれか１つの方法。
【００８１】
２４．  ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）と前記試料のアリコットを接触させ、そして前記ビリルビンオキシダーゼ処理したアリコットにおける前記凝固時間関連パラメータの値を決定する工程を含む、態様１〜２３のいずれか１つの方法。
【００８２】
２５．  総ビリルビンを決定する工程をさらに含む、態様１〜２４のいずれか１つの方法。
２６．  総ビリルビンを決定し、そして総ビリルビンおよびコンジュゲート化ビリルビンに関して決定した値から、遊離ビリルビンを計算する工程をさらに含む、態様１〜２５のいずれか１つの方法。
【００８３】
２７．  前記較正物質試料が１つの較正物質ストック溶液に由来する、態様９〜２６のいずれか１つの方法。
２８．  少なくとも１つの参照試料において決定した前記凝固時間関連パラメータの前記値が検量線である、態様１〜２７のいずれか１つの方法。
【００８４】
２９．  前記決定が、定量的決定であり、１つの態様において濃度を決定することである、態様１〜２８のいずれか１つの方法。
３０．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である、態様１〜２９のいずれか１つの方法。
【００８５】
３１．  前記試料が単離試料である、態様１〜３０のいずれか１つの方法。
３２．  不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法であって、
Ａ）態様１〜３１のいずれか１つ記載の非抗凝固剤干渉物質を決定し；
Ｂ）工程Ａ）の結果を品質参照に対して比較し；そして
Ｃ）比較工程Ｂ）の結果に基づいて、不十分な品質を有する試料を同定する
工程を含む、前記方法。
【００８６】
３３．  前記非抗凝固剤干渉物質がコンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビンであり、１つの態様においてコンジュゲート化ビリルビンである、態様３２の方法。
【００８７】
３４．  態様３２または３３の方法であって、以下の条件の少なくとも１つを評価する工程を含み、そして以下の条件の少なくとも１つが満たされている場合、前記試料が不十分な品質を有すると同定する、前記方法：
ｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より低い；
ｉｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より高く、そしてビリルビンオキシダーゼでの前記試料の処理後、凝固時間関連パラメータの値が有意により低い；
ｉｉｉ）決定したヘモグロビン濃度が、２０ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において５０ｍｇ／ｄＬより高い；
ｉｖ）決定したコンジュゲート化ビリルビンの濃度が、１ｍｇ／ｄｌより高い、１つの態様において２．５ｍｇ／ｄＬより高い；
ｖ）決定した脂質濃度が、１００ｍｇ／ｄＬより高い、１つの態様において２５０ｍｇ／ｄＬより高い；および
ｖｉ）凝固前の前記試料における透過関連パラメータの値が、透過参照の値よりも高い。
【００８８】
３５．  前記品質参照が、品質参照範囲または品質参照曲線である、態様３２〜３４のいずれか１つの方法。
３６．  前記品質参照の下限が、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の−２０％、１つの態様において−１０％、さらなる態様において−７．５％である、態様３２〜３５のいずれか１つの方法。
【００８９】
３７．  前記品質参照の上限が、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の＋２０％、１つの態様において＋１０％、さらなる態様において＋７．５％である、態様３２〜３６のいずれか１つの方法。
【００９０】
３８．  前記品質参照が、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の±２０％、１つの態様において±１０％、さらなる態様において±７．５％の品質参照範囲である、態様３２〜３７のいずれか１つの方法。
【００９１】
３９．  前記品質参照の下限が、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の正常の下限である、態様３２〜３５または３７のいずれか１つの方法。
４０．  前記品質参照の上限が、正常試料における凝固時間関連パラメータの値の正常の上限である、態様３２〜３６のいずれか１つの方法。
【００９２】
４１．  前記透過参照が、正常試料における透過関連パラメータの値の＋２０％、１つの態様において＋１０％、さらなる態様において＋７．５％である、態様３２〜４０のいずれか１つの方法。
【００９３】
４２．  前記透過参照が、正常試料における透過関連パラメータの値の正常の上限である、態様３２〜４１のいずれか１つの方法。
４３．  前記決定が半定量的決定であり、１つの態様において定量的決定であり、さらなる態様において濃度の決定である、態様３２〜４２のいずれか１つの方法。
【００９４】
４４．  不十分な品質を有すると同定される試料が、臨床化学分析から排除され、そして／またはさらなる分析前に、ビリルビンオキシダーゼで処理される、態様３２〜４３のいずれか１つの方法。
【００９５】
４５．  血液由来試料において、非抗凝固剤干渉物質を決定するためのデバイスであって、分析装置および評価装置を含み、
（Ｉ）前記分析装置が、前記試料における凝固時間関連パラメータの値を決定するよう適応しており、そして
（ＩＩ）前記評価装置が、前記非抗凝固剤干渉物質に関する参照に、分析装置によって決定した凝固時間関連パラメータを比較するための触知可能に組み込まれたアルゴリズムを含むメモリ装置を含む
前記デバイス。
【００９６】
４６．  前記分析装置が、較正物質試料における前記凝固時間関連パラメータの値を決定するようさらに適応している、態様４５のデバイス。
４７．  前記分析装置が、較正物質試料を自動的に提供する、１つの態様において少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を、さらなる態様において１つの較正物質ストック溶液から自動的に提供するようさらに適応している、態様４５または４６のデバイス。
【００９７】
４８．  前記分析装置が、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長、１つの態様において６００ｎｍ〜６５０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５±１０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５ｎｍの波長、さらなる態様において４００ｎｍ〜４５０ｎｍの波長で、透過関連パラメータを決定するよう適応している光学装置を含む、態様４５〜４７のいずれか１つのデバイス。
【００９８】
４９．  前記分析装置が、もっぱら、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長、１つの態様において６００ｎｍ〜６５０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５±１０ｎｍの波長、さらなる態様において６２５ｎｍの波長、さらなる態様において４００ｎｍ〜４５０ｎｍの波長で、透過関連パラメータを決定するよう適応している光学装置を含む、態様４５〜４８のいずれか１つのデバイス。
【００９９】
５０．  前記透過関連パラメータが、フォトオプティカル法によって、１つの態様において測光法によって、さらなる態様において比濁分析によってまたは比濁法によって、さらなる態様において比濁法によって、決定される、態様４５〜４９のいずれか１つのバイス。
【０１００】
５１．  前記分析装置が、比濁分析によってまたは比濁法によって、さらなる態様において比濁法によって、前記透過関連パラメータを決定するために適応している、態様４５〜５０のいずれか１つのデバイス。
【０１０１】
５２．  前記デバイスが、態様１〜４４のいずれか１つにさらなる特徴が含まれるよう適応している、態様４５〜５１のいずれか１つのデバイス。
５３．  ｉ）トロンビン；および
ｉｉ）あらかじめ決定した濃度のコンジュゲート化ビリルビンを含むか、またはあらかじめ決定した濃度のヘモグロビンを含む、少なくとも１つの較正物質試料
を含む、コンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビン濃度を決定するためのキット。
【０１０２】
５４．  前記のあらかじめ決定した濃度が、正常試料の濃度を、少なくとも２０％、１つの態様において少なくとも１０％超える、態様５３のキット。
５５．  少なくとも１ｍｇ／ｄＬ、１つの態様において少なくとも２．５ｍｇ／ｄＬ、さらなる態様において少なくとも５ｍｇ／ｄＬのあらかじめ決定した濃度のコンジュゲート化ビリルビンを含む較正物質試料を含む、態様５３または５４のキット。
【０１０３】
５６．  少なくとも２０ｍｇ／ｄＬ、１つの態様において少なくとも５０ｍｇ／ｄＬ、１つの態様において少なくとも１００ｍｇ／ｄＬのあらかじめ決定した濃度のヘモグロビンを含む較正物質試料を含む、態様５３〜５５のキット。
【０１０４】
５７．不十分な品質を有する血液由来試料を同定するためのキットであって
ｉ）凝固を誘発する剤；および
ｉｉ）あらかじめ決定した検出可能な量で非抗凝固剤干渉物質を含む、少なくとも１つの参照試料
を含む、前記キット。
【０１０５】
５８．  ビリルビンオキシダーゼをさらに含む、態様５３〜５７のいずれか１つのキット。
５９．  少なくとも１つの較正物質試料および／または少なくとも１つの品質参照試料をさらに含む、態様５３〜５８のいずれか１つのキット。
【０１０６】
６０．  ヘキサジメトリンブロミド、プロタミンおよびヘパリナーゼより選択される化合物をさらに含む、態様５３〜５９のいずれか１つのキット。
６１．  抗線維素溶解剤、１つの態様においてトラネキサム酸またはその抗線維素溶解性誘導体、あるいはアプロチニンまたはその抗線維素溶解性誘導体をさらに含む、態様５３〜６０のいずれか１つのキット。
【０１０７】
６２．  接触活性化剤、特にシリカゲルまたはエラグ酸をさらに含み、１つの態様においてリン脂質をさらに含む、態様５３〜６１のいずれか１つのキット。
６３．  トロンビンをさらに含む、態様５７〜６２のいずれか１つのキット。
【０１０８】
６４．  血液由来試料分析の品質管理のための、態様１〜４４のいずれか１つ記載の方法の使用、態様４５〜５２のいずれか１つに記載のデバイスの使用、および／または態様５３〜６３のいずれか１つに記載のキットの使用。
【０１０９】
６５．  前記品質管理が、臨床化学分析から、および／または凝固分析から、不十分な品質である試料を排除する工程を含む、態様６４の使用。
６６．  不十分な品質である試料が、態様３４記載の少なくとも１つの条件を満たす試料である、態様６４または６５の使用。
【０１１０】
６７．  被験体の血液由来試料における、非抗凝固剤干渉物質を決定するための、１つの態様においてコンジュゲート化ビリルビンおよび／またはヘモグロビンおよび／または脂質を決定するためのキットであって
ｉ）凝固を誘発する剤；および
ｉｉ）あらかじめ決定した検出可能な量で非抗凝固剤干渉物質を含む少なくとも１つの参照試料
を含む、前記キット。
【０１１１】
６８．  凝固を誘発する前記剤が接触活性化剤であり、１つの態様においてシリカ、セライト、カオリン、および／またはエラグ酸である、態様６７のキット。
６９．  カルシウムイオンを提供する剤をさらに含む、態様６７または６８のキット。
【０１１２】
７０．  前記の少なくとも１つの参照試料が、（ｉ）あらかじめ決定した検出可能な量のコンジュゲート化ビリルビンを含む少なくとも１つの参照試料および／または（ｉｉ）あらかじめ決定した検出可能な量のヘモグロビンを含む少なくとも１つの参照試料および／または（ｉｉｉ）あらかじめ決定した検出可能な量の脂質を含む少なくとも１つの参照試料である、態様６７〜６９のいずれか１つのキット。
【０１１３】
７１．  ビリルビンオキシダーゼをさらに含む、態様６７〜７０のいずれか１つのキット。
７２．  被験体の血液由来試料における、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、
ａ）ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と前記試料を接触させ、
ｂ）工程ａ）の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして
ｃ）それによって、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する
工程を含む、前記方法。
【０１１４】
７３．  被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、
ａ）前記被験体の第一の血液由来試料における凝固時間関連パラメータの第一の値を決定し；
ｂ）前記被験体の第二の血液由来試料を、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）および／またはベータ−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）と接触させ、
ｃ）工程ｂ）の試料における凝固時間関連パラメータの第二の値を決定し、
ｄ）ａ）で決定した凝固時間関連パラメータの第一の値に由来するパラメータを参照に対して比較し；
ｅ）比較工程ｄ）に基づいて、前記被験体におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定し、
ｆ）工程ｂ）の第二の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして、それによって
ｇ）前記被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する
工程を含む、前記方法。
【０１１５】
７４．  前記の第一および第二の血液由来試料が、被験体の同じ試料のアリコットである、態様７３の方法。
本明細書に引用するすべての参考文献は、その全開示内容および本明細書に特に言及する開示内容に関して、本明細書に援用される。
【０１１６】
以下の実施例は、本発明を単に例示するものとする。これらは、どんなものであれ、本発明の範囲を限定するとは見なされないものとする。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：試料におけるコンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の定量化（ＡＰＴＴアッセイ）
予期せぬことに、商業的に入手可能な活性化部分トロンボプラスチン時間試薬（Ｒｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ試薬、開発中）を用いて、自動化凝固分析装置（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｔ７１１）上で、コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）を定量化可能であることが見出された。増加する濃度のコンジュゲート化ビリルビンを正常血漿試料に添加すると、添加したコンジュゲート化ビリルビンの量および［秒］での生じる凝固時間の間に、線形の正の相関が示された。これは、ＡＰＴＴアッセイの凝固時間が、スパイクされたコンジュゲート化ビリルビンの量に、体系的に経時的に依存したことを意味する（表１）。
【０１１８】
表１：ＡＰＴＴ試薬を用いた、コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の定量化。コンジュゲート化ビリルビンを、増加する量で正常血漿にスパイクした。続いて、ＡＰＴＴ試薬を用いて、この血漿を活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイに供した。アッセイ：Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上のＲｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ、試料：正常血漿プール。
【０１１９】
【表１】
2020513548.tif 000003
【０１２０】
これは、正常血漿試料と組み合わせたＡＰＴＴアッセイを用いて、血漿試料中のコンジュゲート化ビリルビンの未知の量を決定可能であることを示す。表１に示すデータのグラフ提示は、ビリルビン決定アッセイのための検量線である（図１）。増加する濃度のコンジュゲート化ビリルビンをスパイクした病的血漿プールを用いた際に、同様の結果が得られた（図２）。
【０１２１】
検量線および図１由来のそれぞれの等式を用いて、未知の量のコンジュゲート化ビリルビン（≧２ｍｇ／ｄＬ）は、秒でのＡＰＴＴ結果から得られうる。例：
【０１２２】
【化１】
2020513548.tif 000004
【０１２３】
３１秒のＡＰＴＴ結果は、コンジュゲート化ビリルビン濃度ｘ＝１１．７４ｍｇ／ｄＬを生じるであろう。
上に示す検量線は、増加する量のｂｉｌｉｃを正常血漿試料にスパイクすることによって生成された。病的血漿試料に増加する量のｂｉｌｉｃをスパイクして、そしてＡＰＴＴアッセイに供した際も、同様の結果が得られた。これは、凝固時間およびビリルビン濃度の間に、用量依存性の体系があることを立証する。
【０１２４】
コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）で得た結果とは対照的に、非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）は、高濃度であっても、ＡＰＴＴ結果にわずかにしか影響を及ぼさないことを示すことが可能であった（表２および図３）。
【０１２５】
表２：ＡＰＴＴ試薬を用いた非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）の定量化。非コンジュゲート化ビリルビンを、増加する量で正常血漿にスパイクした。続いて、Ｒｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ試薬を用いて、この血漿をＡＰＴＴアッセイに供した。Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上でのＡＰＴＴ  ＬＳ；試料：正常血漿プール。
【０１２６】
【表２】
2020513548.tif 000005
【０１２７】
これは、ＡＰＴＴ試薬に基づくビリルビンアッセイを用いて、非コンジュゲート化ビリルビンによる実質的な干渉を伴わずに、コンジュゲート化ビリルビンを決定可能であることを示す。このアッセイは、コンジュゲート化および非コンジュゲート化ビリルビンの間の区別を可能にし、これは慣用法を用いる場合には些細な問題ではない。
【０１２８】
実施例２：試料におけるヘモグロビンの定量化（ＡＰＴＴアッセイ）
上述の方法および実施例と本質的に同様に、同じＡＰＴＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ）を用いて、自動化凝固分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置、現在開発中）上、クエン酸血漿試料におけるヘモグロビン濃度を定量化可能であることが見出された。病的血漿試料に増加する濃度のヘモグロビンを添加すると、添加したヘモグロビンの量および［秒］での生じる凝固時間の間に、線形の負の相関が示された。ｂｉｌｉｃ濃度の増加に伴い、用量依存性の凝固時間の延長を示したビリルビン定量化法と対照的に、ＡＰＴＴアッセイの凝固時間は、スパイクしたヘモグロビンの量に依存して、体系的に短くなった（表３）。
【０１２９】
表３：ＡＰＴＴ試薬を用いたヘモグロビンの定量化。ヘモグロビンを、増加する量で正常クエン酸血漿にスパイクした。続いて、ＡＰＴＴ試薬を用いて、この血漿を活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイに供した。アッセイ：Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上のＲｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ、試料：正常血漿プール。
【０１３０】
【表３】
2020513548.tif 000006
【０１３１】
これは、正常血漿試料と組み合わせたＡＰＴＴアッセイが、血漿試料中のヘモグロビンの未知の量を決定するために適していることを示す。表３に示すデータのグラフ提示は、ヘモグロビン決定アッセイのための検量線である（図４）。
【０１３２】
検量線および図４由来のそれぞれの等式を用いて、未知の量のヘモグロビンは、秒でのＡＰＴＴ結果から得られうる。例：
【０１３３】
【化２】
2020513548.tif 000007
【０１３４】
２７秒のＡＰＴＴ結果は、ヘモグロビン濃度ｘ＝７８５．７１ｍｇ／ｄＬを生じるであろう。
上述のビリルビン定量化法と同様、ヘパリン中和剤を添加し、そしてそれによってヘモグロビンの定量化のためのＡＰＴＴ結果の特異性を体系的に改善する方式で、用いるＡＰＴＴ試薬を修飾してもよい。
【０１３５】
実施例３：試料におけるトリグリセリドの定量化（ＡＰＴＴアッセイ）
上述の方法および実施例と本質的に同様に、同じＡＰＴＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ）を用いて、自動化凝固分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１）上、クエン酸血漿試料におけるトリグリセリド濃度を定量化可能であることが見出された。正常または病的血漿試料に、増加する濃度のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（精製タマゴ・リン脂質およびグリセリンによって乳化された（ｅｍｕｌｇａｔｅｄ）、ダイズ油（２０％（ｗ/ｖ））のエマルジョン）を添加すると、添加したＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の量および［秒］での生じる凝固時間の間に、線形の負の相関が示された。ｂｉｌｉｃ濃度の増加に伴い、用量依存性の凝固時間の延長を示したビリルビン定量化法と対照的に、ＡＰＴＴアッセイの凝固時間は、スパイクしたＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の量に依存して、体系的に短くなった（表４）。
【０１３６】
表４：ＡＰＴＴ試薬を用いたトリグリセリドの定量化。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）を、増加する量で正常クエン酸血漿にスパイクした。続いて、ＡＰＴＴ試薬を用いて、この血漿を活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイに供した。アッセイ：ｔ７１１凝固分析装置上のＲｏｃｈｅ  ＡＰＴＴ  ＬＳ、試料：正常血漿プール。
【０１３７】
【表４】
2020513548.tif 000008
【０１３８】
これは、正常血漿試料と組み合わせたＡＰＴＴアッセイが、血漿試料中のトリグリセリドの未知の量を決定するために適していることを示す。表４に示すデータのグラフ提示は、ヘモグロビン決定アッセイのための検量線である（図５）。
【０１３９】
検量線および図５由来のそれぞれの等式を用いて、未知の量のトリグリセリドは、秒でのＡＰＴＴ結果から得られうる。例：
【０１４０】
【化３】
2020513548.tif 000009
【０１４１】
２７．９秒のＡＰＴＴ結果は、ヘモグロビン濃度ｘ＝２８３．８８ｍｇ／ｄＬを生じるであろう。
病的血漿試料に増加する量のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）をスパイクして、そしてＡＰＴＴアッセイに供した際も、同様の結果が得られた。これは、凝固時間およびＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）濃度の間に、用量依存性の体系があることを立証する（図６）。
【０１４２】
上述のビリルビン定量化法と同様、ヘパリン中和剤を添加し、そしてそれによってヘモグロビンの定量化のためのＡＰＴＴ結果の特異性を体系的に改善する方式で、用いるＡＰＴＴ試薬を修飾してもよい。
【０１４３】
実施例４：試料におけるコンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の定量化（トロンビン時間アッセイ）
予期せぬことに、トロンビン試薬（Ｒｏｃｈｅトロンビン時間試薬、開発中）を用いて、自動化凝固分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置、現在開発中）上で、コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）を定量化可能であることが見出された。増加する濃度のコンジュゲート化ビリルビンを正常血漿試料に添加すると、添加したコンジュゲート化ビリルビンの量および［秒］での生じる凝固時間の間に、線形の正の相関が示された。これは、トロンビン時間（ＴＴ）アッセイの凝固時間が、スパイクされたコンジュゲート化ビリルビンの量に、体系的に経時的に依存したことを意味する（表５）。
【０１４４】
表５：トロンビン試薬を用いた、コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）の定量化。コンジュゲート化ビリルビンを、増加する量で正常血漿にスパイクした。続いて、商業的トロンビン試薬を用いて、この血漿をトロンビン時間アッセイに供した。アッセイ：Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置（現在開発中）上のトロンビン時間、試料：正常血漿プール。
【０１４５】
【表５】
2020513548.tif 000010
【０１４６】
これは、正常血漿試料と組み合わせたトロンビン時間アッセイ（ＴＴアッセイの活性成分は酵素トロンビンである）を用いて、血漿試料中のコンジュゲート化ビリルビンの未知の量を決定可能であることを示す。表５に示すデータのグラフ提示は、ビリルビン決定アッセイのための検量線である（図７）。
【０１４７】
検量線および図７由来のそれぞれの等式を用いて、未知の量のコンジュゲート化ビリルビン（≧１ｍｇ／ｄＬ）は、秒でのＴＴ結果から得られうる。例：
【０１４８】
【化４】
2020513548.tif 000011
【０１４９】
１９秒のＴＴ結果は、コンジュゲート化ビリルビン濃度ｘ＝４．９５ｍｇ／ｄＬを生じるであろう。
上に示す検量線は、増加する量のｂｉｌｉｃを正常血漿試料にスパイクすることによって生成された。病的血漿試料に増加する量のｂｉｌｉｃをスパイクして、そしてトロンビン時間アッセイに供した際も、同様の結果が得られた（図８）。これは、凝固時間およびビリルビン濃度の間に、用量依存性の体系があることを立証する。
【０１５０】
コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｃ）で得た結果とは対照的に、非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）は、高濃度であっても、トロンビン時間結果に影響を及ぼさないようであることを示すことが可能であった（表６および図９）。
【０１５１】
表６：トロンビン試薬を用いた非コンジュゲート化ビリルビン（ｂｉｌｉｕ）の定量化。非コンジュゲート化ビリルビンを、増加する量で正常血漿にスパイクした。続いて、商業的トロンビン試薬を用いて、この血漿をトロンビン時間アッセイに供した。アッセイ：Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上でのトロンビン時間、試料：正常血漿プール。
【０１５２】
【表６】
2020513548.tif 000012
【０１５３】
これは、トロンビン試薬に基づくビリルビンアッセイを用いて、非コンジュゲート化ビリルビンによる実質的な干渉を伴わずに、コンジュゲート化ビリルビンを決定可能であることを示す。このアッセイは、コンジュゲート化および非コンジュゲート化ビリルビンの間の区別を可能にし、これは慣用法を用いる場合には些細な問題ではない。
【０１５４】
実施例５：試料におけるヘモグロビンの定量化（ＴＴアッセイ）
上述の実施例４の方法および実施例と本質的に同様に、同じトロンビン試薬（Ｒｏｃｈｅトロンビン時間試薬）を用いて、自動化凝固分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置、現在開発中）上、クエン酸血漿試料におけるヘモグロビン濃度を定量化可能であることが見出された。病的血漿試料に増加する濃度のヘモグロビンを添加すると、添加したヘモグロビンの量および［秒］での生じる凝固時間の間に、線形の負の相関が示された。ｂｉｌｉｃ濃度の増加に伴い、用量依存性の凝固時間の延長を示したビリルビン定量化法と対照的に、トロンビン時間アッセイの凝固時間は、スパイクしたヘモグロビンの量に依存して、体系的に短くなった（表７）。
【０１５５】
表７：トロンビン試薬を用いたヘモグロビンの定量化。ヘモグロビンを、増加する量で正常クエン酸血漿にスパイクした。続いて、商業的トロンビン試薬を用いて、この血漿をトロンビン時間（ＴＴ）アッセイに供した。アッセイ：Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ｔ７１１凝固分析装置上のトロンビン時間、試料：病的血漿プール。
【０１５６】
【表７】
2020513548.tif 000013
【０１５７】
これは、病的血漿試料と組み合わせたトロンビン時間アッセイが、血漿試料中のヘモグロビンの未知の量を決定するために適していることを示す。表７に示すデータのグラフ提示は、ヘモグロビン決定アッセイのための検量線である（図１０）。
【０１５８】
検量線および図１０由来のそれぞれの等式を用いて、未知の量のヘモグロビンは、秒でのＴＴ結果から得られうる。例：
【０１５９】
【化５】
2020513548.tif 000014
【０１６０】
３５秒のＴＴ結果は、ヘモグロビン濃度ｘ＝９１９．５８ｍｇ／ｄＬを生じるであろう。
上述のビリルビン定量化法と同様、ヘパリン中和剤を添加し、そしてそれによってヘモグロビンの定量化のためのトロンビン時間結果の特異性を体系的に改善する方式で、用いるトロンビン試薬を修飾してもよい。
【図１】
2020513548.tif 000015
【図２】
2020513548.tif 000016
【図３】
2020513548.tif 000017
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月15日(2019.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の血液由来試料におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定するための方法であって、
ａ）前記試料におけるトロンビン時間の値を決定し；
ｂ）ａ）において決定したトロンビン時間の値を、少なくとも１つの参照試料において決定したトロンビン時間の値に対して比較し；そして
ｃ）比較工程ｂ）の結果に基づいて、被験体の血液由来試料におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定する
工程を含み、
ここで工程ａ）が、フォトオプティカルアッセイで、前記試料におけるトロンビン時間の値を決定する、前記方法。
【請求項２】
工程ａ）が、比濁法によって、前記試料におけるトロンビン時間の値を決定する、請求項１の方法。
【請求項３】
工程ａ）が、
ａ１）前記試料をトロンビンと接触させ；
ａ２）試料をトロンビンと接触させた後、第一の時点で、前記試料における透過関連パラメータの第一の値を決定し；
ａ３）試料をトロンビンと接触させた後、第二の時点で、前記試料における透過関連パラメータの第二の値を決定し；そして
ａ４）下位工程ａ２）およびａ３）の結果に基づいて、トロンビン時間の値を決定する
下位工程を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
工程ｂ）が、
ｂ１）あらかじめ決定した非同一濃度のコンジュゲート化ビリルビンを有する、少なくとも２つ、１つの態様において少なくとも３つ、さらなる態様において少なくとも５つの較正物質試料を提供し；
ｂ２）前記較正物質試料の各々に関して、１つの態様において工程ａ）の下位工程にしたがって、トロンビン時間の値を決定し；そして
ｂ３）下位工程ｂ２）において決定した値に基づいて、検量線を提供する
下位工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
前記試料が、クエン酸血漿試料である、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
ビリルビンオキシダーゼＥＣ  １．３．３．５および／またはベータ−グルクロニダーゼＥＣ  ３．２．１．３１と前記試料のアリコットを接触させ、そして前記処理したアリコットにおける前記トロンビン時間の値を決定する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
総ビリルビンの値を決定し、そして総ビリルビンおよびコンジュゲート化ビリルビンに関して決定した値から、遊離ビリルビンを計算する工程をさらに含む、請求項６の方法。
【請求項８】
前記被験体が、ビリルビン脳症を発展させる増加したリスクを有する被験体である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
前記被験体が、抗凝固療法を投与されていない被験体である、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
前記決定が定量的決定である、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
不十分な品質を有する血液由来試料を同定するための方法であって、
Ａ）請求項１〜１０のいずれか一項記載のコンジュゲート化ビリルビンを決定し；
Ｂ）工程Ａ）の結果を品質参照に対して比較し；そして
Ｃ）比較工程Ｂ）の結果に基づいて、不十分な品質を有する試料を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、以下の条件の少なくとも１つを評価する工程を含み、そして以下の条件の少なくとも１つが満たされている場合、前記試料が不十分な品質を有すると同定する、前記方法：
ｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より低い；
ｉｉ）前記試料における凝固時間関連パラメータの値が、品質参照より高く、そしてビリルビンオキシダーゼおよび／またはベータ−グルクロニダーゼでの前記試料の処理後、凝固時間関連パラメータの値が有意により低い；および
ｉｉｉ）決定したコンジュゲート化ビリルビンの濃度が、１ｍｇ／ｄｌより高い、１つの態様において２．５ｍｇ／ｄＬより高い。
【請求項１３】
不十分な品質を有すると同定される試料が、臨床化学分析から排除される、請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
血液由来試料において、コンジュゲート化ビリルビンを決定するためのデバイスであって、分析装置および評価装置を含み、
（Ｉ）前記分析装置が、前記試料におけるトロンビン時間の値を決定するために適応しており、ここで前記トロンビン時間の値が、フォトオプティカル法によって決定され、そして
（ＩＩ）前記評価装置が、コンジュゲート化ビリルビンに関する参照に、分析装置によって決定したトロンビン時間の値を比較するための触知可能に（ｔａｎｇｉｂｌｙ）組み込まれたアルゴリズムを含むメモリ装置を含む
前記デバイス。
【請求項１５】
ｉ）トロンビン；およびｉｉ）あらかじめ決定した濃度でコンジュゲート化ビリルビンを含む少なくとも１つの較正物質試料を含む、コンジュゲート化ビリルビンを決定するためのキット。
【請求項１６】
ビリルビンオキシダーゼＥＣ  １．３．３．５および／またはベータ−グルクロニダーゼＥＣ  ３．２．１．３１をさらに含む、請求項１５のキット。
【請求項１７】
フォトオプティカルアッセイでトロンビン時間の値を決定することを介してコンジュゲート化ビリルビンを決定することによる血液由来試料分析の品質管理のための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法の使用、請求項１４記載のデバイスの使用、および／または請求項１５または１６記載のキットの使用。
【請求項１８】
被験体の血液由来試料における、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、
ａ）ビリルビンオキシダーゼＥＣ  １．３．３．５および／またはベータ−グルクロニダーゼＥＣ  ３．２．１．３１と前記試料を接触させ、
ｂ）工程ａ）の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして
ｃ）それによって、ビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定するための方法であって、
ａ）前記被験体の第一の血液由来試料における凝固時間関連パラメータの第一の値を決定し；
ｂ）前記被験体の第二の血液由来試料を、ビリルビンオキシダーゼＥＣ  １．３．３．５および／またはベータ−グルクロニダーゼＥＣ  ３．２．１．３１と接触させ、
ｃ）工程ｂ）の試料における凝固時間関連パラメータの第二の値を決定し、
ｄ）ａ）において決定した凝固時間関連パラメータの第一の値に由来するパラメータを参照に対して比較し；
ｅ）比較工程ｄ）の結果に基づいて、前記被験体におけるコンジュゲート化ビリルビンを決定し、
ｆ）工程ｂ）の第二の試料における凝固時間関連パラメータの値を決定し；そして、それによって
ｇ）前記被験体における、コンジュゲート化ビリルビンおよびビリルビン補正凝固時間関連パラメータを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記の第一および第二の血液由来試料が、被験体の同じ試料のアリコットである、請求項１９の方法。
【国際調査報告】
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