(57)【要約】本発明は、細菌株を含む組成物、及び疾患の治療に、そのような組成物を使用することを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物であって、疾患を罹患していると診断された対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに使用するための前記組成物。
【請求項２】
微生物叢の多様性の向上及び／または安定化が、前記対象の腸または遠位消化管におけるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
疾患が、マイクロバイオームの多様性の低下によって特徴付けられる、請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物であって、炎症性腸疾患、体重減少、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される疾患を治療するための、前記組成物。
【請求項５】
（ａ）シクロホスファミドと、（ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物とを含む組合せであって、がん、炎症性障害または自己免疫障害を治療するための、前記組合せ。
【請求項６】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅではない、請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
シクロホスファミドが、１日当たり１０００ｍｇ以下、８００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下または２００ｍｇ以下の投与量で投与される、請求項５または６に記載の組合せ。
【請求項８】
シクロホスファミドが、１日当たり１０〜５００ｍｇ、５０〜２５０ｍｇまたは８０〜１５０ｍｇの間の投与量で投与される、請求項５または６に記載の組合せ。
【請求項９】
シクロホスファミドが、経口投与される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１０】
ａ）細菌株が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍもしくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓであり、及び／または
ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍもしくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を細菌株が有し、及び／または
ｃ）配列番号１、２もしくは５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を細菌株が有する、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物または組合せ。
【請求項１１】
（ａ）配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を細菌株が有するか、または、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を細菌株が有するか、あるいは、（ｂ）配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を細菌株が有するか、または配列番号５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を細菌株が有する、請求項１〜４、１０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１２】
前記細菌株が、
ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌及び／または
ｂ）受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌及び／または
ｃ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ細菌
である、請求項１〜４、１０〜１１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１３】
組成物が、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種のレベルを低下させ、及び／または
ｂ）ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａの細菌のレベルを低下させ、及び／または
ｃ）Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ種の細菌のレベルを上昇させ、及び／または
ｄ）Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ種の細菌のレベルを上昇させ、及び／または
ｅ）Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ種のレベルを上昇させ、及び／または
ｆ）ペントースリン酸経路と関連する少なくとも１つの代謝物のインビボでの形成を減少させる、
請求項１〜４、１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１２のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１４】
ペントースリン酸経路の代謝物が、リボース５−リン酸、エリトロース４−リン酸及びセドヘプツロース７−リン酸からなる群から選択される、請求項１３（ｆ）に記載の組成物または組合せ。
【請求項１５】
組成物が、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｈａｌｌｅｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶｂ、Ｖａｍｐｉｒｏｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ及び／またはＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａのうちの１または２以上のレベルを上昇させる、請求項１〜４、１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１４のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１６】
ａ）組成物が、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体を含み、及び／または
ｂ）細菌株が、凍結乾燥されており、及び／または
ｃ）細菌株が、生存可能であり、及び／または
ｄ）細菌株が、腸に部分的もしくは完全に定着できる、
請求項１〜４、１０〜１５のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１５のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１７】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの単一の株を含む、請求項１〜４、１０〜１６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１６のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１８】
組成物がＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓを含み、及び、いずれかの他の属の細菌を含まないか、またはそのような他の細菌をわずかな量で含むに過ぎない、請求項１〜４、１０〜１７のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１７のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１９】
組成物が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍを含み、及び、いずれかの他の種の細菌を含まないか、またはそのような他の細菌をわずかな量で含むに過ぎない、請求項１〜４、１０〜１８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１８のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項２０】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓを微生物コンソーシアムの一部として含む、請求項１〜４、１０〜１９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５〜１９のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項２１】
請求項１〜４、１０〜２０のいずれか１項に記載の組成物を含む食品またはワクチン。
【請求項２２】
対象における腸内微生物叢の多様性を向上させる方法であって、前記向上の必要な対象に、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物を投与することを含み、任意に、前記Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓである、前記方法。
【請求項２３】
炎症性腸疾患、体重減少、潰瘍性大腸炎またはクローン病の治療方法であって、前記治療の必要な対象に、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物を投与することを含み、任意に、前記Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓである、前記方法。
【請求項２４】
がん、炎症性障害または自己免疫疾患の治療方法であって、前記治療の必要な対象に、（ａ）シクロホスファミドと、（ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物との組合せを投与することを含み、任意に、前記Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌株を含む組成物の分野、及びそのような組成物を疾患の治療に使用する分野におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられるが、出生直後に、さまざまな種類の母体微生物及び環境微生物に暴露される。その後、微生物の定着及び遷移の動的期間が生じるが、この動的期間は、分娩様式、環境、食事及び宿主の遺伝子型のような要因による影響を受け、これらのすべての要因が、特に幼少期に、腸内微生物叢の組成に影響を及ぼす。その後、微生物叢は安定して、成人様になる［１］。ヒト腸内微生物叢には、５００〜１０００個超の異なるファイロタイプが含まれ、これらは本質的に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓという２つの主な細菌門に属する［２］。ヒト消化管への細菌定着に起因する良好な共生関係によって、多種多様な代謝的機能、構造的機能、保護的機能及びその他の有益な機能が得られている。定着した消化管の代謝活性が増強されると、増強されない場合には難消化性である食事成分が、副産物の放出を伴いながら分解され、重要な栄養源が宿主に供給される。同様に、腸内微生物叢の免疫学的な重要性は、充分に認識されており、免疫系が損なわれた無菌動物であって、共生細菌の導入あとに免疫系が機能的に再構成される無菌動物において例証されている［３〜５］。
【０００３】
微生物叢組成の急激な変化は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような消化器障害で立証されている。例えば、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａの細菌のレベルは、ＩＢＤ患者で低下する一方で、Ｅ．ｃｏｌｉの数は増加することから、消化管内の善玉菌と悪玉菌のバランスが変化することが示唆されている［６〜９］。興味深いことに、ＩＢＤの炎症状態と関連するこの微生物変化は、エフェクターＴ細胞集団のアンバランスによって特徴付けられる。
【０００４】
微生物叢の変化に関連する、ヒトの多くの疾患の特徴は、微生物叢の多様性の喪失であり、健常な対象における典型的な集団の微生物叢と比べて、単純に微生物叢組成が変化したものであるいわゆるディスバイオシスとは異なる。腸内微生物叢の多様性の変化は、がんを発現するリスクの調節に関連付けられている［１０］。健常な微生物叢の再構築は、困難であることがある。消化管内の細菌が、定着抵抗性を示すからである。これにより、不健康な対象の微生物叢の多様性を向上させることによって、不健康な対象の微生物叢を治療しようとするときに、難題が生じる［１１］。しかしながら、微生物叢の多様性とがんとの関連性に対する理解は、不充分である。
【０００５】
当該技術分野においては、微生物叢の多様性を向上させ、及び／または微生物叢の多様性の安定性を向上させると効果が得られる疾患の新規な治療方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者は、対象の腸内微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させることによって、疾患を治療及び／または予防するための新規療法を開発した。特には、本発明者は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株が、対象の遠位消化管内の腸内微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有効であり得ることを見出した。本発明者は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓからなるリストから選択した種の細菌株が、対象、特に、疾患を罹患していると診断された対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに特に有効であり得ることを確認した。
【０００７】
本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物であって、対象における微生物叢の多様性の向上及び／または安定化方法で用いる方法を提供する。同様に、本発明は、対象における微生物叢の多様性の向上及び／または安定化方法であって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物を対象に投与する工程を含む方法も提供する。好ましくは、そのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの種の細菌株である。
【０００８】
「微生物叢の多様性の向上」という表現は、本明細書では、対象の微生物叢における異なる種類の細菌の数を増加させ、及び／またはその異なる種類の均等度を向上させることを意味するものとして使用する。微生物叢の多様性は、対象における異なる細菌属、細菌種または細菌株の数の増加によって測定できる。微生物叢の多様性のこの向上は、対象の腸内または対象の遠位消化管内の向上であることができる。この向上または均等度は、本発明による組成物を投与する前の対象における多様性／均等度と比較して測定し得る。微生物叢における異なる種類の細菌の相対存在量は、本発明の組成物による治療後に、均等度が上昇する。
【０００９】
「微生物叢の多様性の安定化」とは、微生物叢における異なる属の相対数が、安定した状態を保つ（例えば、相対数の非変動度が、２回の測定間で７０％超、８０％超、９０％超、９５％超または９９％超である）ことを意味する。微生物叢の多様性の安定化は、対象の腸内または対象の遠位消化管内におけるものであることができる。相対的な安定性は、本発明による組成物を投与する前の安定性に比較して評価し得る。
【００１０】
対象の微生物叢の安定性は、２つの異なる時点における、対象のマイクロバイオームを比較することによって評価できる。その２つの異なる時点は、少なくとも３日以上離れた時点、例えば、少なくとも１週間、２週間、１カ月、３カ月、６カ月、１年または２年離れた時点であることができる。その２つの異なる時点は、３〜７日離れた時点、１〜２週間離れた時点、２〜４週間離れた時点、４〜８週間離れた時点、８〜２４週間離れた時点、２４〜４０週間離れた時点、４０〜５２週間離れた時点、または５２週間超離れた時点であり得る。３個以上の異なる時点、例えば、３個、４個、５個、または６個以上の時点を使用できる。例えば上で定めたような様々な時点の中で、好適な間隔を選択する。
【００１１】
微生物叢の多様性の向上または安定化は、試料において、配列ベースの細菌分類数、または典型的には、１６Ｓ  ｒＲＮＡアンプリコンシーケンシング法によって求めた操作的分類単位（ＯＴＵ）の数を測定することによって定量し得る。多様性の向上は、Ｓｈａｎｎｏｎ多様性指数またはＣｈａｏ指数の上昇によって測定し得る［１２］。
【００１２】
本発明者は、対象における微生物叢の多様性を向上させ、及び／または微生物叢の多様性を安定化させることによって、疾患を治療及び予防するための新規療法も開発した。例えば、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物であって、がんと診断された対象における微生物叢の多様性を向上させ、及び／または微生物叢の多様性を安定化させる方法で用いる組成物を提供する。当業者が認識するように、がん患者は、そのがん及び／またはがん治療の影響により、マイクロバイオームの多様性の低下をきたすことがあり、その低下は、二次疾患の発現または増悪に関連することがある。
【００１３】
その発現及び／または増悪が、マイクロバイオームの多様性の低下と関連するとされている疾患の数は増加している。これらの疾患としては、アルツハイマー病［１３］、パーキンソン病［１４］、自閉症［１５］及び多発性硬化症［１６、１７］のような神経学的状態、過敏性腸症候群［１８］及び炎症性腸疾患［１９、２０、２１］のような消化器障害、関節リウマチ［２２］及び乾癬性関節炎［２３］のような筋骨格障害、Ｉ型糖尿病［２４］を含む代謝障害、ならびにサルコペニア［２５］及び筋痛性脳脊髄炎［２６］を含む、るいそう／疲労状態が挙げられる。
【００１４】
したがって、対象（がん患者を含む）のマイクロバイオームの多様性を安定化または向上させることができる、すなわち、マイクロバイオームの多様性の低下によって特徴付けられる疾患を治療または予防できる本発明の組成物は望ましい。
【００１５】
本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物であって、対象における微生物叢の多様性を向上させ、及び／または微生物叢の多様性を安定化させる方法で用いる組成物を提供する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌は、生化学的な手段を用いることによって同定できる［２７］。本発明の組成物の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有してよい。したがって、本発明は、配列番号１、２または５と（その配列の１００％に対して）少なくとも９５％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含む組成物であって、対象における微生物叢の多様性及び／または微生物叢の安定性を向上させる方法で用いる組成物を提供する。
【００１６】
本発明の組成物中の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細胞株であってよい。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株のような近縁の株も用いてよい。好ましくは、その細菌株は、配列番号１、２または５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、本発明で用いる細菌株は、配列番号１、２または５によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。この方が好ましい。本発明者は、このような株が、微生物叢の多様性を特に大きく向上させることを見出したからである。
【００１７】
本発明の細菌株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌であってよい。その細菌株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌であってよい。本発明の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ細菌であってよい。
【００１８】
本発明の組成物は、経口投与に適することがある。本発明の組成物の株の経口投与は、対象における微生物叢の多様性を向上させるのに有効であり得る。また、経口投与は、患者及び医療従事者にとって利便的であり、腸への送達、及び／または部分もしくは完全定着を可能にする。
【００１９】
本発明の組成物は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含んでよい。本発明の組成物は、凍結乾燥した細菌株を含んでよい。凍結乾燥は、細菌の送達を可能にする安定な組成物を調製するための有効かつ利便的な技法である。
【００２０】
本発明は、上記のような組成物を含む食品を提供する。本発明は、上記のような組成物を含むワクチン組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属（好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種）の細菌株を含む組成物と、シクロホスファミドを組み合わせたものを療法で使用することも提供する。
【００２２】
加えて、本発明は、対象における微生物叢の多様性の向上方法であって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物をその対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１ａは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＭＲＸ５１８による処置後、０日目及び２２日目の時点に観察された多様性である。図１ｂは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＭＲＸ５１８による処置後、０日目及び２２日目の時点のＳｈａｎｎｏｎ多様性である。図１ｃは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＭＲＸ０５５４による処置後、０日目及び２２日目の時点に観察された多様性である。図１ｄは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＭＲＸ０５５４による処置後、０日目及び２２日目の時点のＳｈａｎｎｏｎ多様性である。図１ｅは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＭＲＸ０８５８による処置後、０日目及び２２日目の時点に観察された多様性である。図１ｆは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＭＲＸ０８５８による処置後、０日目及び２２日目の時点のＳｈａｎｎｏｎ多様性である。図１ｇは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＲＥＦ１０による処置後、０日目及び２２日目の時点に観察された多様性である。図１ｈは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目のＲＥＦ１０による処置後、０日目及び２２日目の時点のＳｈａｎｎｏｎ多様性である。図１ｉは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目の抗ＣＴＬＡ４による処置後、０日目及び２２日目の時点に観察された多様性である。図１ｊは、ＥＭＴ６マウスにおける、−１４日目の抗ＣＴＬＡ４による処置後、０日目及び２２日目の時点のＳｈａｎｎｏｎ多様性である。
【図２】ＬＬＣマウスにおいて、細菌株ＭＲＸ５１８（Ｇ２）、ＭＲＸ０５５４（Ｇ３）、ＭＲＸ０８５８（Ｇ４）、ＲＥＦ１０−ＤＳＭ１００１１０（Ｇ５）、抗ＣＴＬＡ４（Ｇ６）による処置後、及び未処置（Ｇ１）における１８日目のＳｈａｎｎｏｎ多様性である。
【図３ａ】Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ非類似度に基づく微生物叢プロファイルのＰＣｏＡ座標付けプロットである。データは、時点に従って群分けされており、全処置群を含む（ｐ値＝０．００１）。総数Ｎは２１０であり、各時点のｎは７０である。
【図３ｂ】Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ非類似度に基づく微生物叢プロファイルのＰＣｏＡ座標付けプロットである。データは、−１５日目の時点に、処置に従って群分けされている（ｐ値＝０．０７７）。総数Ｎは７０であり、各処置のｎは１０である。
【図３ｃ】Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ非類似度に基づく微生物叢プロファイルのＰＣｏＡ座標付けプロットである。データは、２２日目の時点に、処置に従って群分けされている（ｐ値＝０．００１）。総数Ｎは７０であり、各処置のｎは１０である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
細菌株
本発明による用途用の組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む。実施例によって、この属の細菌が、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有用であることが実証されている。この属の好ましい細菌種は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓである。受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８及び受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株が好ましい。本発明者は、これらの株で良好な結果を得たからである。本発明の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅではないことが好ましい。
【００２５】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．は、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析によって同定できる。ＲＡＰＤ解析には、標的生物のＤＮＡ配列の特定の知識はいずれも不要である。ＲＡＰＤマーカーは、任意のヌクレオチド配列の１つのプライマーによって、ゲノムＤＮＡのランダムなセグメントをＰＣＲ増幅して得られるＤＮＡ断片であるとともに、遺伝的に異なる個体を鑑別できるＤＮＡ断片である［２８］。
【００２６】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、大半はペアまたは短鎖で、球菌様細胞を形成する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、非運動性であり、血液寒天培地または普通寒天培地上のコロニーは、円状かつスムースである。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ  Ｄ群抗血清と反応する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの基準株は、Ｆ８７／２７６＝ＰＢ２１＝ＡＴＣＣ４９５７３＝ＣＣＵＧ１８６５８＝ＣＩＰ１０３０１３＝ＪＣＭ８７２８＝ＬＭＧ１３１２９＝ＮＢＲＣ１００６７５＝ＮＣＩＭＢ７０２３１３（以前はＮＣＤＯ２３１３）＝ＮＣＴＣ１２３５９［２９］である。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＦ０３９９００である（本明細書では、配列番号１として開示されている）。例示的なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株は、［２９］に記載されている。
【００２７】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株は、実施例で試験したものであり、本明細書では、ＭＲＸ５１８株とも称する。試験したＭＲＸ５１８株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、配列番号２に示されている。ＭＲＸ５１８株は、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ．ＡＢ２５  ２ＺＳ．Ｓｃｏｔｌａｎｄ）が２０１５年１１月１６日に、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ」として、国際寄託当局のＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に寄託したものであり、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８が割り当てられたものである。
【００２８】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株は、実施例で試験したものであり、本明細書では、ＭＲＸ５５４株とも称する。ＭＲＸ５５４及びＭＲｘ０５５４への言及は、同義的に使用する。ＭＲＸ５５４株は、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）が２０１７年５月２２日に、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ」として、国際寄託当局のＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ．Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に寄託したものであり、ＮＣＩＭＢ４２７６１の受託番号が割り当てられたものである。
【００２９】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲＸ５１８株のゲノムは、染色体及びプラスミドを含む。ＭＲＸ５１８株の染色体配列は、配列番号３に示されている。ＭＲＸ５１８株のプラスミド配列は、配列番号４に示されている。これらの配列は、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩのプラットフォームを用いて生成されたものである。
【００３０】
実施例で試験した株と近縁の細菌株も、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有効であることが予想される。したがって、本発明による組成物は、その組成物を投与する前の対象における微生物の多様性のレベルまたは安定性と比べて、対象における微生物の多様性を向上及び／または安定化させることができる株を含み得る。
【００３１】
本発明で用いる細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％、好ましくは、少なくとも９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有することができる。本発明で用いる細菌株は、配列番号１、２または５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有してもよい。好ましくは、本発明で用いる細菌株は、配列番号１、２または５によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【００３２】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌のバイオタイプである細菌株も、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有効であることが予想される。バイオタイプは、生理的及び生化学的特徴が同じであるか、または非常に似ている近縁の株であり、例えば、本発明の組成物を投与する前の対象における微生物の多様性と比べて、対象における微生物の多様性を、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌と同じまたは同程度のレベル（例えば、ｘ±２０％、ｘ±１０％、ｘ±５％またはｘ±１％）まで向上及び／または安定化させることができる。
【００３３】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌のバイオタイプであるとともに、本発明で用いるのに適する株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌に対して、他のヌクレオチド配列をシーケンシングすることによって同定し得る。例えば、実質的に全ゲノムをシーケンシングしてよく、本発明で用いるバイオタイプ株は、その全ゲノムの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％、またはその全ゲノム）にわたる配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％であってよい。例えば、バイオタイプ株は、そのゲノムの少なくとも９８％にわたる配列同一性が少なくとも９８％であるか、または、そのゲノムの９９％にわたる配列同一性が少なくとも９９％であることができる。バイオタイプ株を同定するのに用いるのに好適な他の配列としては、ｈｓｐ６０、またはＢＯＸ、ＥＲＩＣ、（ＧＴＧ）５もしくはＲＥＰのような繰り返し配列を挙げてよい［３０］。
【００３４】
バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託された細菌の対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列との配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有してよい。バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＭＲＸ５１８株の対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列との配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有することができ、配列番号２と少なくとも９９％同一である（例えば、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む。バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＭＲＸ５１８株の対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列との配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有することができ、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＭＲＸ５１８株の対応する配列と少なくとも９９％同一である（例えば少なくとも９９．５％同一であるか、または少なくとも９９．９％同一である）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【００３５】
バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌の対応する全ゲノム配列との配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である全ゲノム配列を有してよい。バイオタイプ株は、ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託されたＭＲＸ５５４株の対応する全ゲノム配列との配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である全ゲノム配列を有するとともに、さらに、配列番号５と少なくとも９９％同一である（例えば、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含むことができる。バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＭＲＸ５１８株の対応する配列との配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％である全ゲノム配列を有することができるとともに、配列番号５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託されたＭＲＸ５５４株の対応する配列と少なくとも９９％同一である（例えば、少なくとも９９．５％同一であるか、または少なくとも９９．９％同一である）全ゲノム配列を有する。
【００３６】
本発明のバイオタイプは、対象における腸内微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させる有効性が、上で定義したようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓと同程度となる。したがって、本発明のバイオタイプでは、上で定義したようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ株の細菌によって得られる向上度と比べて、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の向上度が得られることになる。この代わりに、またはこれに加えて、本発明のバイオタイプは、微生物叢の多様性を、上で定義したようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓと同様のレベルまで安定化させることができ、すなわち、対象の微生物叢内の異なる種類の細菌の数であって、上で定義したようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓによって安定化される、異なる種類の細菌の数の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である数を維持できる。微生物の多様性は、異なる種類の細菌の数を考察することによって評価できる。
【００３７】
本発明で用いる細菌株は、配列番号３と配列同一性を有する染色体を有してよい。本発明で用いる細菌株は、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）にわたって、少なくとも９０％である（例えば、配列同一性が少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である）染色体を有することができる。例えば、本発明で用いる細菌株は、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の７０％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の８０％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の９０％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の１００％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の７０％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の８０％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の９０％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の１００％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の７０％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の８０％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の９０％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号３との同一性が、配列番号３の９５％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の１００％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の９０％にわたって、少なくとも９９．５％であるか、配列番号３との同一性が、配列番号３の９５％にわたって、少なくとも９９．５％であるか、配列番号３との同一性が、配列番号３の９８％にわたって、少なくとも９９．５％であるか、または配列番号３との配列同一性が、配列番号３の１００％にわたって少なくとも９９．５％である染色体を有してよい。
【００３８】
本発明で用いる細菌株は、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドであることができる。本発明で用いる細菌株は、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）にわたって、少なくとも９０％である（例えば、配列同一性が少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である）プラスミドを有することができる。例えば、本発明で用いる細菌株は、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の７０％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の８０％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の９０％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の１００％にわたって、少なくとも９０％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の７０％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の８０％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の９０％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の１００％にわたって、少なくとも９５％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の７０％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の８０％にわたって、少なくとも９８％であるか、配列番号４との配列同一性が、配列番号４の９０％にわたって、少なくとも９８％であるか、または配列番号４との配列同一性が、配列番号４の１００％にわたって、少なくとも９８％であるプラスミドを有してよい。
【００３９】
本発明で用いる細菌株は、例えば上記のように、配列番号３と配列同一性を有する染色体と、例えば上記のように、配列番号１または２のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列、好ましくは、配列番号２と少なくとも９９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有してよく、より好ましくは、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含み、任意に、上記のように、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含む。
【００４０】
本発明で用いる細菌株は、例えば上記のように、配列番号３と配列同一性を有する染色体を有してよく、任意に、上記のように、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、対象における微生物叢の多様性を向上させるのに有効である。
【００４１】
本発明で用いる細菌株は、例えば上記のように、配列番号３と配列同一性を有する染色体と、例えば上記のように、配列番号１または２のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有することができ、任意に、上記のように、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、対象における微生物叢の多様性を向上させるのに有効である。
【００４２】
本発明で用いる細菌株は、配列番号２によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である（例えば、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の少なくとも９０％にわたって、少なくとも９５％である染色体を有してよく、任意に、上記のように、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、対象における微生物叢の多様性を向上させるのに有効である。
【００４３】
本発明で用いる細菌株は、配列番号２によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である（例えば、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）、少なくとも９８％である（例えば、配列同一性が少なくとも９９％または少なくとも９９．５％である）染色体を有することができ、任意に、上記のように、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、対象における微生物叢の多様性を向上させるのに有効である。
【００４４】
本発明で用いる細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであってよく、配列番号２によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である（例えば、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、配列番号３との配列同一性が、配列番号３の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）、少なくとも９８％である（例えば、配列同一性が少なくとも９９％または少なくとも９９．５％である）染色体を有してよく、任意に、上記のように、配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、対象における微生物叢の多様性を増大させるのに有効である。
【００４５】
２つのヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％）への言及は、その２つの配列をアラインメントして比較した際に同じであるヌクレオチドの割合（％）指す。このアラインメント及び相同性または配列同一性の割合（％）は、当該技術分野において知られているソフトウェアプログラム、例えば、参照文献［３１］の７．７．１８節に記載されているプログラムを用いて求めることができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティーが１２、ギャップエクステンションペナルティーが２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスが６２のアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムによって求める。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムは、参照文献［３２］に開示されている。
【００４６】
他の考え得るコンピュータープログラムは、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡであり、そのプログラムでは、各残基の最適な照合のために、（１つもしくは両方の配列の全長、または１つもしくは両方の配列の所定の部分のいずれかに沿って）２つの配列をアラインメントする。そのプログラムでは、デフォルトのオープニングペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティが提供されており、そのコンピュータープログラムと併せて、ＰＡＭ２５０［３３］のようなスコアリングマトリックスを使用できる。例えば、続いて、同一マッチの総数に１００を掛けてから、マッチ範囲内の長い方の配列の長さと、２つの配列をアラインメントするために、短い方の配列に導入したギャップの数の合計で除したものとして、同一性の割合（％）を算出できる。
【００４７】
あるいは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌のバイオタイプであるとともに、本発明で用いるのに適する株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１寄託株、ならびに制限断片解析及び／またはＰＣＲ解析を用いることによって、例えば、蛍光増幅断片長多型（ＦＡＦＬＰ）及び反復ＤＮＡエレメント（ｒｅｐ）−ＰＣＲフィンガープリンティング、タンパク質プロファイリング、または部分的な１６Ｓもしくは２３ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングを用いることによって同定し得る。これらの技法を用いて、他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ株を同定し得る。
【００４８】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌のバイオタイプであるとともに、本発明で用いるのに適する株は、増幅リボソームＤＮＡ制限解析（ＡＲＤＲＡ）によって解析したときに、例えばＳａｕ３ＡＩ制限酵素を用いたときに（例示的な方法及び手引きについては、例えば、参照文献３４を参照されたい）、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌と同じパターンを示す株であってよい。あるいは、バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌と同じ炭水化物発酵パターンを有する株として同定し得る。炭水化物発酵パターンは、ＡＰＩ５０  ＣＨＬパネル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて求めることができる。本発明で用いる細菌株は、好ましくは、ＡＰＩ  ５０ＣＨＬ解析によって（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０ＣＨＬパネルを用いて）求めた場合に、
（ｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース及びＤ−タガトースのうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個またはすべて）の発酵性が陽性であり、及び／または
（ｉｉ）Ｄ−マンニトール、メチル−αＤ−グリコピラノシド、Ｄ−ラクトース、デンプンのうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個、４個またはすべて）の発酵性が擬陽性であることができる。
【００４９】
好ましくは、本発明で用いるのに適するバイオタイプ株は、好ましくは、ＡＰＩ  ５０ＣＨＬ解析によって（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０ＣＨＬパネルを用いて）求めた場合に、
（ｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース及びＤ−タガトースの発酵性が陽性であり、及び／または
（ｉｉ）Ｄ−マンニトール、メチル−αＤ−グリコピラノシド、デンプンの発酵性が擬陽性である
炭水化物発酵パターンを有する株である。
【００５０】
好ましくは、本発明で用いるのに適するバイオタイプ株は、好ましくは、ＡＰＩ  ５０ＣＨＬ解析によって（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０ＣＨＬパネルを用いて）求めた場合に、
（ｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−サッカロース（スクロース）、Ｄ−トレハロース及びゲンチオビオースの発酵性が陽性であり、及び／または
（ｉｉ）メチル−αＤ−グリコピラノシド及びメリビオースの発酵性が擬陽性である
炭水化物発酵パターンを有する株である。受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌のバイオタイプのように、本発明の組成物及び方法で有用である他の株は、実施例に記載されているアッセイを含むいずれかの適切な方法または方策を用いて同定し得る。例えば、本発明で用いる株は、嫌気性ＹＣＦＡで培養し、及び／またはその細菌をＩＩ型コラーゲン誘導関節炎マウスモデルに投与してから、サイトカインレベルを評価することによって同定し得る。特には、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された細菌と同様の成長パターン、代謝種類及び／または表面抗原を有する細菌株が、本発明で有用であり得る。有用な株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８株に匹敵する免疫調節活性を有することになる。
【００５１】
本発明で用いる細菌株は、好ましくは、炭水化物、アミノ酸及び硝酸塩の代謝アッセイ、任意に、アルカリホスファターゼ活性のアッセイによって求めた場合、より好ましくは、Ｒａｐｉｄ  ＩＤ３２Ａ解析によって（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａシステムを用いて）求めた場合に、
（ｉ）マンノース発酵、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、アルギニンアリールアミダーゼ、フェニルアラニンアリールアミダーゼ、ピログルタミン酸アリールアミダーゼ、チロシンアリールアミダーゼ、ヒスチジンアリールアミダーゼ及びセリンアリールアミダーゼのうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個またはすべて）に対して陽性であり、及び／または
（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ−６−リン酸、β−グルコシダーゼ及びＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼのうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個またはすべて）に対して擬陽性であることができ、及び／または
（ｉｉｉ）ラフィノース発酵、プロリンアリールアミダーゼ、ロイシルグリシンアリールアミダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、アラニンアリールアミダーゼ、グリシンアリールアミダーゼ及びグルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼのうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個またはすべて）に対して陰性であることができる。
【００５２】
本発明で用いる細菌株は、
（ｉ）例えば、炭水化物、アミノ酸及び硝酸塩の代謝のアッセイによって求めた場合、好ましくは、Ｒａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ解析によって（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａシステムを用いて）求めた場合に、グリシンアリールアミダーゼ、ラフィノース発酵、プロリンアリールアミダーゼ及びロイシンアリールアミダーゼのうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個または４個すべて）に対して陰性であることができ、及び／または
（ｉｉ）好ましくは、ＡＰＩ  ５０ＣＨＬ解析によって（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ  ５０ＣＨＬパネルを用いて）求めた場合に、Ｌ−フコースの発酵性が擬陽性であることができる。
【００５３】
本発明で用いる細菌株は、細胞外ＡＴＰ産生菌、例えば、ＡＴＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＡＫ１９０）を用いて測定した場合に、ＡＴＰを６〜６．７ｎｇ／μｌ（例えば、６．１〜６．６ｎｇ／μｌもしくは６．２〜６．５ｎｇ／μｌ、または６．３３±０．１０ｎｇ／μｌ）産生する菌である。細菌の細胞外ＡＴＰは、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達の活性化［３５］、腸内Ｔｈ１７細胞の分化の活性化［３６］、及びＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化することによる、炎症誘発性メディエーターＩＬ−１βの分泌の誘導［３７］を含む多面的作用を有することができる。したがって、細胞外ＡＴＰ産生菌である細菌株は、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有用である。
【００５４】
本発明で用いる細菌株は、可動性エレメントタンパク質、キシロースＡＢＣトランスポーター（パーミアーゼ成分）及びＦＩＧ００６３２３３３（仮想タンパク質）という３つの遺伝子のうちの１または２以上を含むことができる。例えば、本発明で用いる細菌株は、可動性エレメントタンパク質及びキシロースＡＢＣトランスポーター（パーミアーゼ成分）、可動性エレメントタンパク質及びＦＩＧ００６３２３３３（仮想タンパク質）、キシロースＡＢＣトランスポーター（パーミアーゼ成分）及びＦＩＧ００６３２３３３（仮想タンパク質）、または可動性エレメントタンパク質、キシロースＡＢＣトランスポーター（パーミアーゼ成分）及びＦＩＧ００６３２３３３（仮想タンパク質）をコードする遺伝子を含む。
【００５５】
上で論じたように、本発明で用いるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された株と同じ安全性特性及び治療有効性特性を有する株であってよい。したがって、本発明の組成物は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された株ではないが、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７６１として寄託された株と同じ安全性特性及び治療有効性特性を有するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株を含むことができる。株の安全性特性は、例えば、その株の抗菌薬耐性を試験することによって、例えば、抗菌薬に対する内因性耐性と伝達耐性を区別することによって定めることができる。株の安全性特性は、インビトロでの株の病原特性、例えば、毒素の産生レベルを評価することによっても定めることができる。他の安全性試験としては、ラットモデル及びマウスモデルにおいて、細菌株の急性または慢性毒性を試験することが挙げられる。株の治療有効性は、関連するモデルを用いて、インビトロ及びインビボで細菌株の機能を特徴づけることによって定めることができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物中の細菌株は、生菌であり、腸に部分的または完全に定着できる。
【００５７】
治療的使用
本発明の組成物は、疾患を罹患していると診断された対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させる方法で用いるためのものである。本発明の組成物を投与すると、微生物叢の多様性が向上し得ることが実施例によって実証されている。実施例によってさらに、本発明の組成物が、対象における微生物叢の多様性の安定性を向上できることが示されている。
【００５８】
したがって、本発明の組成物を用いて治療または予防する疾患は好ましくは、健常な対象の微生物叢の多様性と比べて、微生物叢の多様性のレベルの低下と関連する疾患、及び／または微生物叢の安定性の低下と関連する疾患である。
【００５９】
本発明の組成物は、例えば、健常な対象または健常な対象の集団と比べると、微生物叢の多様性のレベルが低下しているか、または低下していると予想される対象で用いるためのものである。例えば、本発明の組成物は、１０１個未満の異なる細菌種（例えば、１００個未満、９９個未満、９８個未満、９７個未満、９６個未満、９５個未満、９３個未満、９０個未満、８５個未満、８０個未満、７５個未満もしくは７０個未満の細菌種）及び／または１９５個未満の異なる株（例えば、１９３個未満、１９０個未満、１８７個未満、１８５個未満、１８３個未満、１８０個未満、１７５個未満、１７０個未満、１６５個未満、１６０個未満、１５０個未満、１４０個未満の細菌株）をその微生物叢に有する対象の治療で用いるためのものであることができる。例えば、本発明の組成物は、健常な対象と比べて、または健常な対象の集団に比べて、少なくとも１個少ない細菌属（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個少ない細菌属）をその腸内微生物叢に有する対象の治療で用いるためのものであることができる。本発明の治療または予防は、微生物叢の多様性のレベルが低下している者として対象を診断する工程を含むことができ、そして、多様性のレベルの低下が見られることが明らかになった場合には、その対象を、本発明による組成物で治療する。
【００６０】
微生物叢の多様性の低下は、多くの病理学的疾患と関連しており、実施例によって、本発明の組成物が、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有効であり得ることが実証されている。当業者は、患者における微生物叢の多様性及び／または安定性を評価して、それを健常な対象の微生物叢の多様性及び／または安定性と比較することによって、本発明の組成物で微生物叢の多様性／安定性を向上させると恩恵を受ける好適な疾患を容易に特定できる。
【００６１】
その疾患の発症機序は、腸に影響を及ぼし得る。しかしながら、別のケースでは、その疾患の発症機序は、腸に影響を及ぼさないか、または腸に局在しない。その疾患の治療または予防は、腸で行うことも、遠位部位で行うこともできる。治療する疾患は、全身性であってもよい。
【００６２】
微生物叢の多様性の低下によって特徴付けられる疾患であって、本発明の組成物を用いて治療し得る疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症及び多発性硬化症のような神経学的状態、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患のような消化器障害、関節リウマチ及び乾癬性関節炎のような筋骨格障害、Ｉ型糖尿病を含む代謝障害、ならびにサルコペニア及び筋痛性脳脊髄炎を含む、るいそう／疲労状態が挙げられる。
【００６３】
実施例によって、本発明の組成物で治療すると、微生物叢の多様性及び／または微生物叢の安定性が向上することが示されている。したがって、上記のような組成物は、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させる方法において有用である。上で説明したように、マイクロバイオームの多様性の低下と関連する疾患は、かなりの数存在する。マイクロバイオームの多様性の低下は、特定の疾患（例えば、がん）またはそれらの疾患を治療するために使用する療法によって発生及び／または悪化し得る。
【００６４】
本発明の組成物は、がんと診断された対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに使用できる。消化管マイクロバイオームと、がんの数との関連性が、これまで示唆されてきている。例えば、結腸直腸癌患者から得た糞便試料の分類学的解析によって、健常な患者と比べて、微生物叢の多様性の低下が見られた。したがって、微生物叢の多様性の向上は、マイクロバイオームの多様性の低下によって特徴付けられる疾患を予防または治療し得るのみならず、有益なことに、結腸直腸癌のようながんの予防または治療にも寄与し得る。
【００６５】
本発明の組成物は、例えば、健常な対象または健常な対象の集団と比べると、微生物叢の多様性の安定性が低下しているか、または低下していると予想される対象で用いるためのものである。本発明の治療または予防は、微生物叢の安定性が低下している対象を診断する工程を含むことができ、そして、安定性の低下が見られることが明らかになった場合には、その対象を、本発明による組成物で治療する。
【００６６】
本明細書で定義されているようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物は、がん、炎症性障害または自己免疫疾患の治療に用いるシクロホスファミドと併用してもよい。
【００６７】
微生物叢中の細菌は、実施例で用いたｑＰＣＲ法のような標準的な技法を用いて、対象から得た糞便で検出してよい。
【００６８】
対象は、乳児（０〜１歳の対象）、小児（１〜１８歳の対象）または成人（１８歳超の対象）であることができる。対象は、健常な対象であることができ、その場合には、疾患を予防する目的で、本発明の組成物を使用でき、任意に、その健常な対象は、微生物叢の多様性の低下によって特徴付けられる疾患を発現するリスクのある者として同定された対象であってよい。
【００６９】
対象は、抗菌薬による治療を以前に受けたことがあるか、受けているか、または（例えば、本発明による組成物の投与から１週間または１カ月以内に）受けることになっている。本発明の治療は、抗菌薬による治療の後、抗菌薬による治療と同時、または抗菌薬による治療の前に、本発明の組成物を投与することを含むことができる。本発明の組成物及びその１または２以上の抗菌薬は、個別投与、同時投与または順次投与用であってよい。
【００７０】
本発明の組成物は、健常な対象と比べて、呼気中の水素レベルが上昇している対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させる方法で用いるためのものであることができる。本発明の組成物は、微生物叢の多様性及び／または安定性のレベルが低下しているか、または低下していると予想される対象の呼気中の水素レベルを低下させるのに用いることができる。本発明の対象は、がんであると診断された対象であってよい。本発明の組成物による治療は、水素呼気検査で検出される水素のレベルを低下させる。したがって、その水素レベルは好ましくは、水素呼気検査を用いて評価する。水素呼気検査は、当該技術分野において周知であるので、当業者は、その検査の実施方法を理解するであろうし、ラクツロースを対象に投与することを伴うことができる。
【００７１】
水素呼気検査は、本発明の組成物または併用療法を用いた治療の後に、微生物叢の多様性を向上または安定化させる有効性または有効性の可能性をモニタリングするのに有用なツールでもある。例えば、本発明の組成物または併用療法による治療の後に、対象の呼気で検出される水素のレベルが低下することは、その治療が、対象における微生物叢の多様性を向上させていることを示し得る。したがって、本発明の方法及び用途は、本発明の組成物による治療の最中及び／または後に、対象の呼気中の水素レベルをモニタリングし、それによって、その対象における微生物叢の多様性を向上させる有効性または有効性の可能性を評価することをさらに含む。例えば、水素レベルは、所望に応じて、治療前、治療開始時、治療の最中、治療終了時及び／または治療後を含め、１回以上（例えば、１回、２回、３回、４回、または５回以上）モニタリングしてよい。投与期間（その期間中、本発明の組成物を対象に投与する）の終了時及び／または後の対象の呼気中の水素のレベルを、投与期間の開始時及び／または前のレベルと比較し、そのレベルの低下によって、対象における微生物叢の多様性を向上させる有効性または有効性の可能性が示される。対象の呼気中の水素レベルは、複数回測定できる。例えば、投与期間が１６日である場合には、１日目及び１６日目、または例えば、１日目、２日目、１５日目及び１６日目に測定するのが望ましいことがある。複数回、測定を行って、それらの測定値の平均（例えば、１日目及び２日目の平均、１５日目及び１６日目の平均）を得ることができる。水素レベルのＣｍａｘが少なくとも４０ｐｐｍ低下することによって、組成物が、その対象における微生物叢の多様性を向上させるのに有効であるか、または有効である可能性の高いことが示される。水素呼気検査は、標準的なアッセイであるので、規定のレベルは、当該技術分野において知られている。
【００７２】
本発明者は、本明細書の実施例によって明らかなように、本明細書に定義されているようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物の投与後に、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓの存在量が増加したことを示した。その細菌は、免疫刺激作用を有することが示されている。より具体的には、その細菌は、がん病変におけるＩＦＮ産生Ｔ細胞の浸潤を通じて、シクロホスファミドの誘導による治療的免疫調節作用を促進することが示されている。さらに、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ特異的メモリーＴｈ１細胞免疫応答は選択的に、化学免疫療法で治療を行った進行性肺癌患者及び進行性卵巣癌患者の無増悪生存率を延長すると予測された［３８］。したがって、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物を用いることによって、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓのレベルを上昇させるので、シクロホスファミドの有効性を向上させる。したがって、本発明の併用療法は、シクロホスファミドによる治療から恩恵を受けることが知られている疾患を治療するのに特に有用である。併用することで、その治療の有効性が増強されるからである。シクロホスファミドで治療できる既知の疾患は、がん、炎症性障害及び自己免疫障害を含む。
【００７３】
本発明の組成物の投与を通じて、マイクロバイオームの多様性が安定化する（向上しない場合）のみならず、有益なことに、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓの存在量も増加する。したがって、本発明の組成物は、がん患者におけるマイクロバイオームの多様性を安定化または向上させるのに特に有用である。
【００７４】
したがって、本発明の組成物は、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ種のレベルを上昇し得る。当業者は、この上昇は、本発明の組成物の投与前のＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓ種のレベルに対する上昇であることを理解するであろう。
【００７５】
Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓは、シクロホスファミドの免疫調節作用を増強することが報告されている［３８］。したがって、実施例のデータによって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物と、シクロホスファミドを組み合わせたものが、特に有用であることが確認される。したがって、本発明の一態様によると、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物と、シクロホスファミドを組み合わせたものを療法で用いることを提供する。好ましくは、その細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の株である。
【００７６】
このような実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物を投与して、患者の消化管におけるＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓのレベルを上昇させて、シクロホスファミドの免疫調節作用を増強し得る。
【００７７】
本発明のこの態様の実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物と、シクロホスファミドを組み合わせたものを用いて、がんを治療し得る。例えば、その組み合わせは、がん治療において、腫瘍サイズを縮小するか、腫瘍の成長を減少させるか、または血管新生を減少させるのに用いるためのものであってよい。
【００７８】
特定の実施形態では、その組み合わせは、大腸癌のような結腸直腸癌、好ましくは結腸直腸腺癌を治療または予防するのに用いるためのものである。いくつかの実施形態では、そのがんは、腸のがんである。別の実施形態では、その組み合わせは、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、卵巣癌、乳癌（特には癌腫）、小細胞肺癌、神経芽腫、肉腫、網膜芽腫、腺癌（特には、卵巣の腺癌）または肝臓癌を治療または予防するのに用いるためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、癌腫を治療または予防するのに用いるためのものである。
【００７９】
実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物と、シクロホスファミドを組み合わせたものは、自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するのに有用である。その組み合わせで治療し得る疾患（シクロホスファミドによる治療に応答することが知られている疾患）の例としては、ネフローゼ症候群、全身性ループスエリテマトーデス、多発性血管炎性肉芽腫症、再生不良性貧血、顕微鏡的多発性血管炎、結節性多発動脈炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ・ストラウス症候群）、ベーチェット症候群、原発性中枢神経系血管炎、孤立性血管炎ニューロパチー、臓器移植後及び骨髄移植の準備中が挙げられる。概して、本発明の組成物とシクロホスファミドを組み合わせたものは、疾患に罹患している対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させると有益と予測される疾患に用いることになる。
【００８０】
本発明の組成物では、有益なことに、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｈｏｍｉｎｉｓレベルに対するプラスの作用（及びマイクロバイオームの多様性の向上）に加えて、実施例において、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属及びＲｏｓｅｂｕｒｉａ属の細菌を含む短鎖脂肪酸産生細菌の数のレベルを上昇させることが実証されている。それらの属に属する細菌は、炎症性腸疾患（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌の場合［３９］）及び体重減少（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属のメンバーの場合）を含むいくつかの疾患の治療と関連付けられている。
【００８１】
したがって、本発明の組成物は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ種及び／またはＲｏｓｅｂｕｒｉａ種のレベルを上昇し得る。当業者は、この上昇が、本発明の組成物の投与前のＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ種及び／またはＲｏｓｅｂｕｒｉａ種のレベルと（それぞれ）比較したものであることを理解するであろう。
【００８２】
実施例によって、本発明の組成物が、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属の細菌の存在量を増加できることが実証されている。ヒト微生物叢におけるＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属の細菌レベルの低下は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような消化器疾患に関連付けられている［４０］。シクロホスファミドによる治療は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属の細菌を含む多くの細菌種のレベルを低下させることが示されている［４１］。
【００８３】
したがって、いくつかの実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物と、シクロホスファミドを組みわせたものを用いて、消化管におけるＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属のレベルを上昇させることができる。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株と組みわせて、シクロホスファミドを投与すると、シクロホスファミドによる治療と関連する、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属の細菌の関連性の低下が阻止される。Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属のレベルの上昇によって、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような消化器疾患が予防または治療され得る。
【００８４】
本発明の組成物はさらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種のレベルに影響を及ぼすことが示されている。これらの細菌は、免疫系の調節、ならびに自己免疫疾患、感染症及びアレルギー疾患の予防及び治療の有効性と関連付けられている。
【００８５】
実施例によって、本発明の組成物が、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ属の細菌のレベルを上昇できることも示されている。ＩＢＤ患者は、その微生物叢の多様性が低下している。健常なコントロールと比べて優位に減少する分類群としては、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ属及びＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａ属の細菌が挙げられる［４２］。したがって、本発明の組成物は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような消化器疾患を治療または予防するのに有用であり得る。本発明の組成物は、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ属及び／またはＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａ属の細菌のレベルを上昇させることによって、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような消化器疾患を治療し得る。
【００８６】
本発明の組成物は、実施例において、リボース５−リン酸、エリトロース４−リン酸及びセドヘプツロース７−リン酸を含む代謝物の形成の低下によって特徴付けられるように、ペントースリン酸経路に対する制限作用を及ぼすことが実証されている。
【００８７】
本発明の組成物のこの特性も有益である。ペントースリン酸経路は、解糖作用を引き起こすがん細胞が、酸化ストレスに対抗するのを補助する際の保護作用を有するとして関連があるとされているので、腫瘍細胞を保護し得るからである。さらに、文献によって、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを欠損させると、がん、特には、乳癌、結腸直腸癌などから保護できること、及びペントースリン酸経路のメンバーの増加が、がん患者における不良転帰と関連することが示されている［４３、４４］。したがって、本発明の組成物を用いて、ペントースリン酸経路の低下から恩恵を受ける対象（例えば、がん患者）におけるマイクロバイオームの多様性を促進するときに、本発明の組成物は、上記に作用をさらに発揮し得る。
【００８８】
したがって、本発明のさらなる態様に従って、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株を含む組成物であって、上記のような治療が必要な対象、例えば、ペントースリン酸の正常な機能または機能の増進によって発症または悪化する疾患の罹患リスクがあるか、その疾患と診断された対象において、ペントースリン酸経路と関連する少なくとも１つの代謝物のインビボでの形成を軽減するのに用いるための組成物を提供する。例えば、その代謝物は、リボース５−リン酸、エリトロース４−リン酸及びセドヘプツロース７−リン酸であってよい。
【００８９】
本発明の組成物を用いて、以前に化学療法を受けたことのある患者における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させることができる。本発明の組成物を用いて、化学療法による治療に耐えられなかった患者における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させ得る。
【００９０】
本発明の組成物は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮体癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、小児視経路及び視床下部グリオーマ、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞新生物、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、肉腫、睾丸癌、甲状腺癌または子宮癌と診断された患者における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのにも有用であり得る。
【００９１】
本発明の組成物を用いて、さらなる治療剤で治療している患者における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させ得る。本発明の組成物は、抗がん剤と組み合わせてよい。好ましくは、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株及び抗がん剤を含む組成物を提供する。好ましくは、その抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤、標的化抗体免疫療法剤、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法剤、腫瘍溶解性ウイルスまたは細胞増殖抑制剤である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ、ＢＭＳ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ、Ｍｅｒｃｋ）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ、ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トレメリムマブ（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＣＴ−０１１（ピジリズマブ、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＢＭＳ−９８６０１５（リリルマブ、ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＰＦ−０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ）、ＢＭＳ−６６３５１３（ウレルマブ、ＢＭＳ）、ＩＭＰ３２１（Ｐｒｉｍａ  Ｂｉｏｍｅｄ）、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＲＧＸ−１１０（ａｒＧＥＮ−Ｘ）、ＰＦ−０５０８２４６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＤＸ−１１２７（バルリルマブ、ＣｅｌｌＤｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＴＲＸ−５１８（ＧＩＴＲ  Ｉｎｃ．）、ＭＫ−４１６６（Ｍｅｒｃｋ）、ＪＴＸ−２０１１（Ｊｏｕｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＲＧＸ−１１５（ａｒＧＥＮ−Ｘ）、ＮＬＧ−９１８９（インドキシモド、ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）、ＩＰＨ２２０１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＡＺ）、ＮＬＧ−９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、抗ＶＩＳＴＡ（ＪｎＪ）、エパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０、Ｉｎｃｙｔｅ）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ／ＢＭＳ）、ＣＰ８７０８９３（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｘ）、エマクツズマブ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ガルニセルチブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ウロクプルマブ（ＢＭＳ）、ＢＫＴ１４０／ＢＬ８０４０（Ｂｉｏｋｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、バビツキシマブ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＣ９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、８５２Ａ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＶＴＸ−２３３７（ＶｅｎｔｉＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＭＯ−２０５５（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ、Ｉｄｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＹ２１５７２９９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＥＷ−７１９７（Ｅｗｈａ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｏｒｅａ）、ベムラフェニブ（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ダブラフェニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＧＳＫ）、ＢＭＳ−７７７６０７（ＢＭＳ）、ＢＬＺ９４５（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（ブリナツモマブ、Ａｍｇｅｎ）、Ｃｙｒａｍｚａ（ラムシルマブ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｂｉｏｇｅｎ）、Ｋａｄｃｙｌａ（アド−トラスツズマブエムタンシン、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン、Ｔａｋｅｄａ／Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ、ＧＳＫ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ、Ａｍｇｅｎ）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ、ＢＭＳ／Ｍｅｒｃｋ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ−Ｉ１３１、ＧＳＫ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ、Ｂａｙｅｒ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ）、ボロシキシマブ（Ａｂｂｖｉｅ）、エナバツズマブ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＢＴ−４１４（Ａｂｂｖｉｅ）、エロツズマブ（Ａｂｂｖｉｅ／ＢＭＳ）、ＡＬＸ−０１４１（Ａｂｌｙｎｘ）、オゾラリズマブ（Ａｂｌｙｎｘ）、Ａｃｔｉｍａｂ−Ｃ（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、Ａｃｔｉｍａｂ−Ｐ（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、ミラツズマブ−ＤＯＸ（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、ナプツモマブエスタフェナトクス（Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＡＦＭ１３（Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＡＣＳ−１６Ｃ３Ｆ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＧＳ−１６Ｍ８Ｆ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＧＳ−２２ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＧＳ−１５ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＧＳ−６７Ｅ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＬＸＮ６０００（サマリズマブ、Ａｌｅｘｉｏｎ）、ＡＬＴ−８３６（Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＬＴ−８０１（Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＬＴ−８０３（Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＭＧ７８０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２２８（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ８２０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ１７２（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ５９５（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ１１０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２３２（アデカツムマブ、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２１１（Ａｍｇｅｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＢＡＹ２０−１０１１２（Ａｍｇｅｎ／Ｂａｙｅｒ）、リロツムマブ（Ａｍｇｅｎ）、デノスマブ（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＰ−５１４（Ａｍｇｅｎ）、ＭＥＤＩ５７５（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ３６１７（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ６３８３（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ５５１（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、モキセツモマブパスドトクス（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ５６５（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ０６３９（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ５６２（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＡＶ−３８０（ＡＶＥＯ）、ＡＶ２���３（ＡＶＥＯ）、ＡＶ２９９（ＡＶＥＯ）、ＢＡＹ７９−４６２０（Ｂａｙｅｒ）、アネツマブラブタンシン（Ｂａｙｅｒ）、バンチクツマブ（Ｂａｙｅｒ）、ＢＡＹ９４−９３４３（Ｂａｙｅｒ）、シブロツズマブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ）、ＢＩ−８３６８４５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ）、Ｂ−７０１（ＢｉｏＣｌｉｎ）、ＢＩＩＢ０１５（Ｂｉｏｇｅｎ）、オビヌツズマブ（Ｂｉｏｇｅｎ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＩ−５０５（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＢＩ−１２０６（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＴＢ−４０３（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＢＴ−０６２（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＢＩＬ−０１０ｔ（Ｂｉｏｓｃｅｐｔｒｅ）、ＭＤＸ−１２０３（ＢＭＳ）、ＭＤＸ−１２０４（ＢＭＳ）、ネシツムマブ（ＢＭＳ）、ＣＡＮ−４（Ｃａｎｔａｒｇｉａ  ＡＢ）、ＣＤＸ−０１１（Ｃｅｌｌｄｅｘ）、ＣＤＸ１４０１（Ｃｅｌｌｄｅｘ）、ＣＤＸ３０１（Ｃｅｌｌｄｅｘ）、Ｕ３−１５６５（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、パトリツマブ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、チガツズマブ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ニモツズマブ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＤＳ−８８９５（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＤＳ−８８７３（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＤＳ−５５７３（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＭＯＲａｂ−００４（Ｅｉｓａｉ）、ＭＯＲａｂ−００９（Ｅｉｓａｉ）、ＭＯＲａｂ−００３（Ｅｉｓａｉ）、ＭＯＲａｂ−０６６（Ｅｉｓａｉ）、ＬＹ３０１２２０７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２８７５３５８（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２８１２１７６（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３０１２２１７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２４９５６５５（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３０１２２１２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３０１２２１１（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３００９８０６（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、シクスツムマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、フランボツマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ラムシルマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、タバルマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ザノリムマブ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＦＧ−３０１９（ＦｉｂｒｏＧｅｎ）、ＦＰＡ００８（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＦＰ−１０３９（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＦＰＡ１４４（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カツマキソマブ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＭＡＢ３６２（Ｇａｎｙｍｅｄ）、ＩＭＡＢ０２７（Ｇａｎｙｍｅｄ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ７４（Ｇｅｎｍａｂ）、ＨｕＭａｘ−ＴＦＡＤＣ（Ｇｅｎｍａｂ）、ＧＳ−５７４５（Ｇｉｌｅａｄ）、ＧＳ−６６２４（Ｇｉｌｅａｄ）、ＯＭＰ−２１Ｍ１８（デムシズマブ、ＧＳＫ）、マパツムマブ（ＧＳＫ）、ＩＭＧＮ２８９（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ９０１（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ８５３（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ５２９（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＭＵ−１３０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ミラツズマブ−ＤＯＸ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１１５（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１３２（Ｉｍｍｕ��ｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１０６（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１０２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、エプラツズマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、クリバツズマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＰＨ４１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ダラツムマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ／Ｇｅｎｍａｂ）、ＣＮＴＯ−９５（インテツムマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＣＮＴＯ−３２８（シルツキシマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＫＢ００４（ＫａｌｏＢｉｏｓ）、モガムリズマブ（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｉｒｒｉｎ）、ＫＷ−２８７１（エクロメキシマブ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ソネプシズマブ（Ｌｐａｔｈ）、マルジェツキシマブ（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、エノブリツズマブ（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＧＤ００６（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＧＦ００７（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＫ−０６４６（ダロツズマブ、Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ）、Ｓｙｍ００４（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＤＩ１７Ｅ６（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＭＯＲ２０２（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、Ｘｍａｂ５５７４（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＢＰＣ−１Ｃ（エンシツキシマブ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＴＡＳ２６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＬＦＡ１０２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＨＱ８８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＱＧＥ０３１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＨＣＤ１２２（ルカツムマブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＬＪＭ７１６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＴ３５５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＯＭＰ−２１Ｍ１８（デムシズマブ、ＯｎｃｏＭｅｄ）、ＯＭＰ５２Ｍ５１（Ｏｎｃｏｍｅｄ／ＧＳＫ）、ＯＭＰ−５９Ｒ５（Ｏｎｃｏｍｅｄ／ＧＳＫ）、バンチクツマブ（Ｏｎｃｏｍｅｄ／Ｂａｙｅｒ）、ＣＭＣ−５４４（イノツズマブオゾガマイシン、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０３４４６９６２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０４８５６８８４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＳＭＡ−ＡＤＣ（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＲＥＧＮ１４００（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＲＥＧＮ９１０（ネスバクマブ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＲＥＧＮ４２１（エノチクマブ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＲＧ７２２１、ＲＧ７３５６、ＲＧ７１５５、ＲＧ７４４４、ＲＧ７１１６、ＲＧ７
４５８、ＲＧ７５９８、ＲＧ７５９９、ＲＧ７６００、ＲＧ７６３６、ＲＧ７４５０、ＲＧ７５９３、ＲＧ７５９６、ＤＣＤＳ３４１０Ａ、ＲＧ７４１４（パルサツズマブ）、ＲＧ７１６０（イムガツズマブ）、ＲＧ７１５９（オビヌツズマブ）、ＲＧ７６８６、ＲＧ３６３８（オナルツズマブ）、ＲＧ７５９７（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＳＡＲ３０７７４６（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ５６６６５８（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ６５０９８４（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ１５３１９２（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ３４１９（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ２５６２１２（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＧＮ−ＬＩＶ１Ａ（リンツズマブ、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−７５（ボルセツズマブマホドチン、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−１９Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−ＣＤ７０Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＥＡ−ＣＤ４０（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、ＭＬＮ０２６４（Ｔａｋｅｄａ）、ガニツマブ（Ｔａｋｅｄａ／Ａｍｇｅｎ）、ＣＥＰ−３７２５０（Ｔｅｖａ）、ＴＢ−４０３（Ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ）、ＶＢ４−８４５（Ｖｉｖｅｎｔｉａ）、Ｘｍａｂ２５１２（Ｘｅｎｃｏｒ）、Ｘｍａｂ５５７４（Ｘｅｎｃｏｒ）、ニモツズマブ（ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カルルマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲ（Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ）、ＭＡＧＥ−Ａ−１０  ＴＣＲ（Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ）、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＪＣＡＲ０１５（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＫＴＥ−Ｃ１９  ＣＡＲ（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）、ＢＰＸ−４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＰＸ−６０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＴＴＣＫ２０（Ｕｎｕｍ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＡＲ−ＮＫＧ２Ｄ（Ｃｅｌｙａｄ）、Ｏｎｙｘ−０１５（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｈ１０１（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙｂｉｏ）、ＤＮＸ−２４０１（ＤＮＡｔｒｉｘ）、ＶＣＮ−０１（ＶＣＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｏｌｏ−Ａｄ１（ＰｓｉＯｘｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰｒｏｓｔＡｔａｋ（Ａｄｖａｎｔａｇｅｎｅ）、Ｏｎｃｏｓ−１０２（Ｏｎｃｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）、Ｐｅｘａ−ｖａｃ（ＪＸ−５９４、Ｊｅｎｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＧＬ−ＯＮＣ１（Ｇｅｎｅｌｕｘ）、Ｔ−ＶＥＣ（Ａｍｇｅｎ）、Ｇ２０７（Ｍｅｄｉｇｅｎｅ）、ＨＦ１０（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）、ＳＥＰＲＥＨＶＩＲ（ＨＳＶ１７１６、Ｖｉｒｔｔｕ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）、ＯｒｉｅｎＸ０１０（ＯｒｉｅｎＧｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＳＶＶ−００１（Ｎｅｏｔｒｏｐｉｘ）、Ｃａｃａｔａｋ（ＣＶＡ２１、Ｖｉｒａｌｙｔｉｃｓ）、Ａｌｉｍｔａ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、シスプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、フォリン酸、メトトレキセート、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、Ｚｙｋａｄｉａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｔａｆｉｎｌａｒ（ＧＳＫ）、Ｘａｌｋｏｒｉ（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｉｒｅｓｓａ（ＡＺ）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｔａｒｃｅｖａ（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ）、Ｈａｌａｖｅｎ（Ｅｉｓａｉ  Ｐｈａｒｍａ）、ベリパリブ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＺＤ９２９１（ＡＺ）、アレクチニブ（Ｃｈｕｇａｉ）、ＬＤＫ３７８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ガネテスピブ（Ｓｙｎｔａ  Ｐｈａｒｍａ）、テルジェンプマツセル−Ｌ（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＧＶ１００１（Ｋａｅｌ−ＧｅｍＶａｘ）、チバンチニブ（ＡｒＱｕｌｅ）、Ｃｙｔｏｘａｎ（ＢＭＳ）、Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｇｅｍｚａｒ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ｘｅｌｏｄａ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｘｅｍｐｒａ（ＢＭＳ）、Ａｂｒａｘａｎｅ（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、Ｔｒｅｌｓｔａｒ（Ｄｅｂｉｏｐｈａｒｍ）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｓａｎｏｆｉ）、Ｎｅｘａｖａｒ（Ｂａｙｅｒ）、ＩＭＭＵ−１３２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、Ｅ７４４９（Ｅｉｓａｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｄｏｘ（Ｃｅｌｓｉｏｎ）、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（Ｅｘｅｌｌｘｉｓ）、Ｌｏｎｓｕｒｆ（Ｔａｉｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＵＦＴ（Ｔａｉｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＴＳ−１（Ｔａｉｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）からなる群から選択した抗がん剤を含む。
【００９２】
投与方法
好ましくは、本発明の組成物は、本発明の細菌株を腸に送達し、及び／または部分定着もしくは完全定着させることができるように、消化管に投与することになる。概して、本発明の組成物は、経口投与するが、直腸内投与、鼻腔内投与、または口腔内経路もしくは舌下経路を介した投与を行ってよい。
【００９３】
本発明の組成物は、泡、スプレーまたはゲルとして投与してよい。本発明の組成物は、肛門坐剤のような坐剤として、例えば、テオブロマ油（カカオ脂）、合成ハードファット（例えば、Ｓｕｐｐｏｃｉｒｅ、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、グリセロゼラチン、ポリエチレングリコールまたは石鹸グリセリン組成物の形態で投与し得る。
【００９４】
本発明の組成物は、経鼻胃管、経口胃管、胃管、空腸瘻管（Ｊ管）、経皮内視鏡的胃瘻造設術（ＰＥＧ）のような管、または胃、空腸に到達させる胸壁ポート及び他の好適なアクセスポートのようなポートを介して、消化管に投与し得る。
【００９５】
本発明の組成物は、静脈内投与、直腸内投与、舌下投与、皮下投与または経鼻投与用に調合してもよい。
【００９６】
本発明の組成物は、１回投与しても、または治療レジメンの一部として順次投与してもよい。例えば、本発明の組成物は、毎日投与できる。
【００９７】
本発明による治療は、患者の腸内微生物叢を評価することによって行うことができる場合もある。本発明の株の送達及び／または部分もしくは完全定着が行われず、その結果、有効性が観察されない場合には、治療を反復してよく、あるいは、送達及び／または部分もしくは完全定着がうまくいき、有効性が観察される場合には、治療を停止してよい。
【００９８】
本発明の組成物は、子供が生まれた後に、微生物叢の多様性及び／または微生物叢の安定性の向上を促すために、妊娠している動物、例えば、ヒトのような哺乳動物に投与し得る。
【００９９】
本発明の組成物は、腸内微生物叢が異常であると確認された患者に投与し得る。例えば、その患者は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの定着が低下しているかまたは見られない者であってよい。
【０１００】
本発明の組成物は、栄養補助サプリメントのような食品として投与し得る。
【０１０１】
好ましくは、本発明の組成物は、ヒトを治療するためのものであるが、本発明の組成物を用いて、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマまたはウサギのような単胃哺乳動物を含む動物を治療してもよい。本発明の組成物は、動物の成長及び出来栄えを高めるのに有用であり得る。動物に投与する場合には、強制経口を使用し得る。
【０１０２】
療法において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物をシクロホスファミドと併用する本発明の実施形態では、シクロホスファミドは、その組成物の一部として投与しても、別個に投与してもよい。シクロホスファミドを別個に投与する場合には、同時に（例えば、医療専門家への同じ回の診察時に）または順次に投与してよい。また、シクロホスファミドは、本発明の組成物と同じ経路で投与しても、異なる経路で投与してもよい。
【０１０３】
好ましくは、シクロホスファミドは、経口投与するか、または（任意に、注射または注入によって）静脈内投与する。シクロホスファミドを経口投与する場合には、１日当たりｌ０００ｍｇ以下、８００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下または２００ｍｇ以下の投与量で投与し得る。その１日当たりの投与量は、１０〜５００ｍｇ、５０〜２５０ｍｇまたは８０〜１５０ｍｇであってよい。シクロホスファミドを静脈内投与する場合には、１日当たり５００〜２０００ｍｇの投与量で投与し得る。
【０１０４】
組成物
概して、本発明の組成物は、細菌を含む。本発明の組成物は、凍結乾燥形態で調合できる。例えば、本発明の組成物は、上記のような細菌株を含む顆粒剤またはゼラチンカプセル剤、例えば、硬カプセル剤を含み得る。
【０１０５】
あるいは、本発明の組成物は、活性生菌培養物を含み得る。したがって、本発明の組成物中の細菌株は、例えば熱によって、不活化、殺傷及び／または弱毒化されていない。本発明の組成物中の細菌株は、生存可能であり、及び／または腸に部分的または完全に定着できる。本発明の組成物は、生菌株と、殺傷された細菌株の混合物を含むことができる。
【０１０６】
本発明の組成物は、細菌株を腸に送達可能にするために、カプセル化できる。カプセル化すると、例えば、圧力、酵素活性または物理的崩壊（ｐＨの変化によって誘発し得る）のような化学的または物理的な刺激によって破裂させることで、標的の位置に送達されるまで、組成物が分解から保護される。いずれかの適切なカプセル化法を使用し得る。例示的なカプセル化技法としては、多孔性マトリックス内への取り込み、固体担体表面上への結合または吸着、フロキュレーションまたは架橋剤による自己凝集、微多孔膜またはマイクロカプセルへの機械的封入が挙げられる。本発明の組成物の調製に有用であり得るカプセル化に関する手引きは、例えば参照文献［４５］及び［４６］に見ることができる。
【０１０７】
本発明の組成物は、経口投与してよく、錠剤、カプセル剤または散剤の形態であってよい。カプセル化した製品が好ましい。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは嫌気菌であるからである。送達及び／または部分もしくは完全定着、ならびにインビボでの生存性を高めるために、他の成分（例えばビタミンＣなど）を脱酸素剤及びプレバイオティクス基質として含めてもよい。あるいは、本発明のプレバイオティクス組成物は、乳もしくはホエイベースの発酵乳製品のような食品もしくは栄養製品、または医薬品として経口投与し得る。
【０１０８】
本発明の組成物は、プロバイオティクス製品として調合し得る。
【０１０９】
本発明の組成物は、本発明の細菌株を治療有効量含む。細菌株の治療有効量は、患者に有効な作用を及ぼすのに充分な量である。細菌株の治療有効量は、患者の腸に送達させ、及び／または部分定着もしくは完全定着させるのに充分な量であり得る。細菌株の治療有効量は、すでに説明したように、インビトロまたはインビボモデルにおいて、該当する細菌株が有意な当該治療作用を発揮できる能力を、未治療のコントロールと比較することによって定めることができる。
【０１１０】
例えば成人のヒトに対する１日当たりの好適な細菌投与量は、約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）、例えば、約１ｘ１０７〜約１×１０１０ＣＦＵ、別の例では、約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵであってよい。本発明の組成物は、その組成物の重量に対して、細菌株を約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、例えば約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量で含むことができる。その投与量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ及び１０ｇであってよい。
【０１１１】
典型的には、本発明の組成物のようなプロバイオティクス製品は任意に、少なくとも１つの好適なプロバイオティクス化合物と組み合わせる。プロバイオティクス化合物は通常、オリゴ糖もしくは多糖、または糖アルコールのような難消化性の炭水化物（上部消化管で分解または吸収されない）である。既知のプロバイオティクス製品としては、イヌリン及びトランスガラクトオリゴ糖のような市販品が挙げられる。
【０１１２】
本発明のプレバイオティクス組成物は、その組成物の総重量に対して、プロバイオティクス化合物を約１〜約３０重量％（例えば５〜２０重量％）の量で含み得る。炭水化物は、フルクトオリゴ糖（すなわちＦＯＳ）、短鎖フルクトオリゴ糖、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、ペクチン、キシロオリゴ糖（すなわちＸＯＳ）、キトサンオリゴ糖（すなわちＣＯＳ）、β−グルカン、アラビアガム、変性及び難消化性デンプン、ポリデキストロース、Ｄ−タガトース、アカシアファイバー、イナゴマメ、オート麦及びシトラスファイバーからなる群から選択し得る。一態様では、本発明のプレバイオティクス物質は、短鎖フルクトオリゴ糖（簡略化のために、以下ではＦＯＳｓ−ｃ．ｃとして示す）であり、前記ＦＯＳｓ−ｃ．ｃ．は、概してビート糖を変換することによって得られるとともに、３つのグルコース分子が結合しているサッカロース分子を含む難消化性の炭水化物である。
【０１１３】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体含み得る。このような好適な賦形剤の例は、参照文献［４７］で見ることができる。治療で用いる許容可能な担体または希釈剤は、製剤分野において周知であり、例えば、参照文献［４８］に記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール及び水が挙げられる。製剤用担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図されている投与経路及び標準的な製剤作業との関連で行うことができる。本発明の医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、または担体、賦形剤または希釈剤に加えて、いずれかの好適な結合剤（複数可）、潤沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含み得る。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、自由流動ラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味料のような天然の糖、アカシアガム、トラガカントガムまたはアルギン酸ナトリウムのような天然及び合成ガム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが挙げられる。好適な潤沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。保存剤、安定剤、色素及びさらには香味剤を本発明の医薬組成物に供給してもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁化剤も用いてよい。
【０１１４】
本発明の組成物は、食品として調合し得る。例えば、食品は、本発明の治療作用に加えて、栄養補助サプリメントにおけるような栄養的な効果をもたらし得る。同様に、本発明の組成物の味を高めたり、または医薬組成物よりもむしろ、一般的な食品に似せることによって、消費するものとしての組成物の魅力を高めたりするために、食品を調合してよい。本発明の組成物は、乳ベースの製品として調合する。「乳ベースの製品」という用語は、脂肪含有量が様々であるいずれかの液体または半固体の乳またはホエイベースの製品を意味する。乳ベースの製品は、例えば、牛乳、ヤギ乳、ヒツジ乳、脱脂粉乳、全乳、いずれの加工も行わずに、粉乳及びホエイから還元した乳、またはヨーグルト、凝乳、カード、酸乳、全酸乳、バターミルク及び他の酸乳製品のような加工製品であることができる。別の重要な群としては、ホエイ飲料、発酵乳、コンデンスミルク、乳幼児用ミルクのような乳飲料、フレーバーミルク、アイスクリーム、菓子のような乳含有食品が挙げられる。
【０１１５】
本発明の組成物は、単一の細菌株または種を含むことができ、いずれかの他の細菌株または種を含まないでよい。このような組成物は、他の細菌株または種をわずかに、または生物学的に無関係な量で含むに過ぎなくてよい。このような組成物は、実質的に他の種の細菌を含まない培養物であってよい。本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の株を１または２以上含む組成物であって、いずれかの他の種の細菌を含まないか、または治療で用いるための別の種の細菌をわずかに、もしくは生物学的に無関係な量で含むに過ぎない組成物を提供し得る。
【０１１６】
本発明の組成物は、１以上の細菌株または種を含むことができる。例えば、本発明の組成物は、同じ種の中の１以上の株（例えば、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上または４５個以上の株）を含み、任意に、いずれかの他の種の細菌を含まない。本発明の組成物は、同じ種の中の株を５０個未満（例えば、４５個未満、４０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１２個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満または３個未満）含むことができ、任意に、いずれかの他の種の細菌を含まない。本発明の組成物は、同じ種の中の株を１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、２〜５０個、２〜４０個、２〜３０個、２〜２０個、２〜１５個、２〜１０個、２〜５個、６〜３０個、６〜１５個、１６〜２５個または３１〜５０個含むことができ、任意に、いずれかの他の種の細菌を含まない。本発明の組成物は、同じ属の中の種を２個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１３個以上、１６個以上、１８個以上、２１個以上、２４個以上、２６個以上、３１個以上、３６個以上または４１個以上）を含むことができ、任意に、いずれかの他の属の細菌を含まない。本発明の組成物は、同じ属の中の種を５０個未満（例えば、５０個未満、４５個未満、４０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１２個未満、１０個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満または３個未満）含むことができ、任意に、いずれかの他の属の細菌を含まない。本発明の組成物は、同じ属の中の種を１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、２〜５０個、２〜４０個、２〜３０個、２〜２０個、２〜１５個、２〜１０個、２〜５個、６〜３０個、６〜１５個、１６〜２５個または３１〜５０個含み、任意に、いずれかの他の属の細菌を含まない。本発明は、上記をいずれかに組み合わせたものを含むことができる。
【０１１７】
本発明の組成物は、微生物コンソーシアムを含むことができる。例えば、本発明の組成物は、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株であって、例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである細胞株を微生物コンソーシアムの一部として含む。例えば、その細菌株は、インビボの腸内で共生的に生存できる、他の属の１個以上（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個または２０個）の他の細菌株とともに存在する。例えば、本発明の組成物は、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株であって、例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである細菌株を、異なる属の細菌株とともに含む。本発明の微生物コンソーシアムは、単一の生物、例えばヒトの糞便試料から得られる２個以上の細菌株を含むことができる。本発明の組成物中の微生物コンソーシアムは、天然においては、合わさった形では見ることができない。例えば、本発明の微生物コンソーシアムは、同じ種に由来し得る少なくとも２体の異なる生物、例えば、２人の異なるヒト、例えば、２人の異なるヒトの乳児、またはヒトの乳児及びヒトの成人の糞便試料から得た細菌株を含み得る。その２体の生物は、異なる種に由来することもでき、例えば、その２体の生物は、ヒト及びヒト以外の哺乳動物である。
【０１１８】
本発明の組成物が、２個以上の細菌株、細菌種または細菌属を含む場合には、個々の細菌株、細菌種または細菌属は、別個、同時または順次に投与し得る。例えば、２個以上の細菌株、細菌種または細菌属は、別個に保存されているが、使用前に混ぜ合わせる。
【０１１９】
本発明で用いる細菌株は、ヒトの乳児、青年または成人の糞便から得ることができる。本発明の組成物が、２個以上の細菌株を含む場合には、すべての細菌株をヒトの乳児、青年または成人の糞便から得ることができる。その細菌は、ヒトの乳児の糞便から得た後に培養して、本発明の組成物で使用し得る。
【０１２０】
本発明に従って用いるための組成物は、市販の認可を得る必要があることも、ないこともある。
【０１２１】
好ましくは、本発明の組成物は、凍結乾燥した細菌を含む。細菌の凍結乾燥は、充分に確立された手順であり、関連する手引きは、例えば参照文献［４９〜５１］で得ることができる。本発明は、上記の医薬組成物であって、前記細菌株が噴霧乾燥されていてよい医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明は、上記の医薬組成物であって、その細菌株が凍結乾燥または噴霧乾燥されており、その細菌が、生存しており、生存可能であり、及び／または腸に部分的または完全に定着できる医薬組成物である。
【０１２２】
いくつかのケースでは、凍結乾燥または噴霧乾燥されている細菌株を投与前に再構成する。いくつかのケースでは、その再構成は、本明細書に記載されている希釈剤を使用することによるものである。
【０１２３】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含むことができる。
【０１２４】
本発明による組成物は、本発明で用いるような細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含んでよく、その細菌株は、微生物叢の多様性を向上させる必要のある対象に投与したときに、対象における微生物叢の多様性を向上させるのに充分な量である。
【０１２５】
本発明は、本発明で用いるような細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供でき、その細菌株は、障害を治療する必要のある対象に投与したときに、障害を治療するのに充分な量であり、その障害は、脳腫瘍、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌または大腸癌と診断された対象における微生物叢の多様性及び／または微生物叢の安定性の低下である。
【０１２６】
本発明の組成物中の細菌株の量は、その組成物の重量に対して、１ｇ当たり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位であってよい。
【０１２７】
本発明の組成物は、１ｇ、３ｇ、５ｇまたは１０ｇの用量で投与し得る。
【０１２８】
本発明の組成物は、経口、直腸内、皮下、経鼻、口腔内及び舌下からなる群から選択した方法によって投与し得る。
【０１２９】
本発明の組成物は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択した担体を含み得る。
【０１３０】
本発明の組成物は、エタノール、グリセロール及び水からなる群から選択した希釈剤を含み得る。
【０１３１】
本発明の組成物は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、自由流動ラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムからなる群から選択した賦形剤を含み得る。
【０１３２】
本発明の組成物は、保存剤、抗酸化剤及び安定剤のうちの少なくとも１つをさらに含み得る。保存剤は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群から選択できる。
【０１３３】
本発明の組成物は、密閉容器に約４℃または約２５℃で保存し得る。その容器は、相対湿度が５０％である雰囲気中に置いてよく、コロニー形成単位で測定した場合に、少なくとも約１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、２．５年または３年の期間の後に、細菌株の少なくとも８０％が維持される。その密閉容器は、小袋またはボトルであってよい。本明細書に記載されているような本発明の組成物は、シリンジで提供することもできる。
【０１３４】
本発明の組成物は、医薬製剤として提供し得る。例えば、本発明の組成物は、錠剤またはカプセル剤として提供してよく、任意に、そのカプセル剤は、ゼラチンカプセル剤（「ジェルキャップ」）である。
【０１３５】
本発明の組成物は、経口投与できる。経口投与には、化合物が消化管に入る嚥下投与、及び／または化合物が口から直接、血流に入る口腔内投与、舌上投与または舌下投与が含まれてよい。経口投与に適する医薬製剤としては、固体プラグ剤、固体微粒子剤、錠剤のような半固体及び液体剤（複数の相または分散系を含む）、多粒子またはナノ粒子、液体（例えば水溶液）、乳濁液または粉末を含む軟カプセル剤及び硬カプセル剤、ロゼンジ剤（液体が充填されたものを含む）、咀嚼剤、ゲル剤、分散速度の速い剤形、フィルム剤、卵形剤、噴霧剤、ならびに口腔内／粘膜付着パッチが挙げられる。
【０１３６】
本発明の医薬製剤は、本発明の組成物を腸に経口投与によって送達するのに適する腸溶性製剤、すなわち、胃耐性製剤（例えば、胃のｐＨに対する耐性がある製剤）であることができる。腸溶性製剤は、本発明の組成物の細菌または別の成分が酸感受性であり、例えば、胃内条件下で分解しやすいときに、特に有用であり得る。本発明の腸溶性製剤は、腸溶性コーティングを含み、腸溶性被覆剤形であることができる。例えば、その製剤は、腸溶性被覆錠剤、腸溶性被覆カプセル剤などであってよい。本発明の腸溶性コーティングは、従来の腸溶性コーティング、例えば、経口送達用の錠剤、カプセル剤などのための従来のコーティングであってよい。本発明の製剤は、フィルムコーティング、例えば、腸溶性ポリマー、例えば酸不溶性ポリマーの薄膜層を含んでよい。
【０１３７】
本発明の腸溶性製剤は、本質的に腸溶性であることができ、例えば、腸溶性コーティングを必要とすることなく、胃耐性であることができる。したがって、その製剤は、腸溶性コーティングを含まない腸溶性製剤であり、カプセル製剤を熱ゲル化物質から作製できる。熱ゲル化物質は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）のようなセルロース物質であることができる。本発明のカプセル剤は、いずれのフィルム形成ポリマーも含まないシェルも含むことができる。そのシェルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むことができ、いずれのフィルム形成ポリマーも含まない（例えば、［５２］を参照）。本発明の製剤は、本質的に腸溶性であるカプセル剤（例えば、ＣａｐｓｕｇｅｌのＶｃａｐｓ（登録商標））であることができる。
【０１３８】
本発明の製剤は、軟カプセル剤であることができる。軟カプセル剤は、カプセル剤のシェル内に存在する軟化剤（例えば、グリセロール、ソルビトール、マルチトール及びポリエチレングリコールなど）を加えることにより、特定の弾性及び軟度を有し得るカプセル剤である。軟カプセル剤は、例えば、ゼラチンまたはデンプンをベースに作製できる。ゼラチンベースの軟カプセル剤は、様々な供給業者から市販されている。例えば経口投与または直腸内投与のような投与方法に応じて、軟カプセル剤は、様々な形状を有することができ、例えば、円形、卵状、横長または魚雷型の形であることができる。軟カプセル剤は、従来のプロセスによって、例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒプロセス、Ａｃｃｏｇｅｌプロセス、または滴下もしくはブロープロセスによるなどして作製できる。
【０１３９】
培養方法
本発明で用いる細菌株は、例えば、参照文献［５３〜５５］に詳述されているような標準的な微生物学的技法を用いて培養できる。
【０１４０】
培養に用いる固体培地または液体培地は、ＹＣＦＡ寒天またはＹＣＦＡ培地であってよい。ＹＣＦＡ培地は、カシトン（１．０ｇ）、酵母エキス（０．２５ｇ）、ＮａＨＣＯ３（０．４ｇ）、システイン（０．１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＮａＣｌ（０．０９ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．０９ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００９ｇ）、ＣａＣｌ２（０．００９ｇ）、レザズリン（０．１ｍｇ）、ヘミン（１ｍｇ）、ビオチン（１μｇ）、コバラミン（１μｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（３μｇ）、葉酸（５μｇ）及びピリドキサミン（１５μｇ）を含んでよい（カッコ内は１００ｍｌ当たりの概算値）。
【０１４１】
ワクチン組成物で用いる細菌株
本発明者は、本発明の細菌株が、対象における微生物叢の多様性を向上及び／または安定化させるのに有用であることを確認した。これは、本発明の細菌株が宿主の免疫系に及ぼす作用によるものである可能性が高い。したがって、本発明の組成物は有益なことに、対象の微生物叢の多様性を維持及び／または向上させるのに加えて、ワクチン組成物として投与すると、がんを治療または予防する作用も有し得る。本発明の細菌株は、生存可能であり、及び／または腸に部分的または完全に定着することができる。本発明の細菌株は、殺傷、不活化または弱毒化されたものであってよい。ワクチンに用いる本組成物は、ワクチンアジュバントを含んでよく、皮下注射のような注射を介して投与できる。
【０１４２】
一般
本発明の実施の際には、別段に示されていない限り、当該技術分野の技術の範囲内における、化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の従来の方法を使用することになる。このような技法は、文献で充分に説明されている。例えば、参照文献［５６］及び［５７〜６３］などを参照されたい。
【０１４３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語には、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「なる」が含まれ、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなっても、追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０１４４】
数値ｘに関連する「約」という用語は、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４５】
「実質的に」という語句は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合には、「実質的に」という語句は、本発明の定義から除外してもよい。
【０１４６】
具体的な記載のない限り、多くの工程を含むプロセスまたは方法は、その方法の最初または最後に追加の工程を含んでよく、あるいは、追加の中間工程を含んでもよい。また、適切な場合には、工程を組み合わせたり、除外したり、または別の順序で行ったりしてもよい。
【０１４７】
本発明の様々な実施形態が本明細書に記載されている。各実施形態に定められている特徴は、定められている他の特徴と組み合わせて、さらなる実施形態をもたらし得ることは明らかであろう。特には、本明細書で好適なもの、典型的なものまたは好ましいものとして明らかにされている実施形態を相互に組み合わせてもよい（ただし、互いに排他的である場合を除く）。
【実施例】
【０１４８】
手法
細菌株
ＭＲＸ５１８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株、ＮＣＩＭＢ４２４８８
ＭＲＸ０５５４−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株、ＮＣＩＭＢ４２７６１
ＭＲＸ０８５８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ株
ＲＥＦ１０−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株、ＤＳＭ１００１１０
【０１４９】
１６Ｓアンプリコンのシーケンシング
Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔをメーカの指示に従って使用して、−１４日目、０日目及び２２日目に、処置したＥＭＴ６マウスから得た０．２ｇの凍結糞便試料から、微生物ＤＮＡを抽出した。
【０１５０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の開発した１６Ｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｎｅｘｔｅｒａプロトコールを用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンの調製及びシーケンシングを行った。ＰＣＲ、及び１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３／Ｖ４可変領域を標的とするプライマーを用いて、５０ｎｇの各ＤＮＡ糞便抽出物を増幅した。その産物を精製し、フォーワードバーコード及びリバースバーコードを第２ラウンドのアダプターＰＣＲによって結合させた。得られたＰＣＲ産物を精製し、定量し、続いて、等モル量の各アンプリコンをプールしてから、シーケンシングのために、供給業者のＧＡＴＣ  ＧｍｂＨに、ＭｉＳｅｑ（２×２５０ｂｐの化学物質）またはＨｉＳｅｑ（２×３００ｂｐの化学物質）のプラットフォームのいずれかで送付した。
【０１５１】
マイクロバイオーム組成データ解析（ポストシーケンシング）
フラッシュ法を用いて、生の配列データをマージ及びトリミングした。これによって、リードペアからシングルリードが生成されて、質の低いリードが除去される。ＵＳＥＡＲＣＨパイプライン法（バージョン８．１．１８６１＿ｉ８６＿ｌｉｎｕｘ６４）を用いて、１つのリードによって表されるに過ぎないシングルトン配列を特定し、それらを、ＯＴＵ（操作的分類単位）生成工程から遮蔽した。それらのリードが、真の生物学的変動を表すものではなく、むしろ、技術的な変動によるものである可能性により、この遮蔽を行う。続いて、ＵＰＡＲＳＥアルゴリズムを使用して、それらの配列をＯＴＵに９７％の類似度でクラスタリングした。これにより、データセット内の配列変動を反映する代表的な配列のリストが生成される。門について、ＲＤＰクラシファイヤーを用いて、科のレベルまで、これらの代表的な配列を分類学的レベルに割り当て、属及び種レベルでは、ＡＰＣ関連のＳＰＩＮＧＯクラシファイヤーを用いた。
【０１５２】
キメラ配列は、生物学的に異なる２または３以上の転写物に由来する配列である。キメラ配列は、それらの配列の供給源が、系統学的に異なる供給源のものであっても、類似性のレベルが高い１６Ｓ配列がアニーリングすることにより、２つの配列を組み合わせて新たな配列を生成すると生じる。これらのキメラ配列は、Ｃｈｉｍｅｒａｓｌａｙｅｒ参照データベース（２０１６年９月９日にダウンロード）とともに、ＵＣＨＩＭＥキメラ除去アルゴリズムを用いて除去した。続いて、ＵＳＥＡＲＣＨグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、残りのＯＴＵ配列でのシングルトンを含め、すべてのリードをマッピングし、これにより、初期試料の真の分類学的変動が反映されている。個別の配列をＯＴＵに群分けして、マイクロバイオームの組成情報（存在量及び多様性）を得た。これらの工程によって、各試料における各分類群の存在量を推定可能になった。
【０１５３】
高レベルデータ解析
１）各試料内の分類群の数（豊富度）及びそれらの相対存在量（均等度）を表すＳｈａｎｎｏｎ多様性指数、ならびに２）ｐｈｙｌｏｓｅｑというライブラリーを用いて、各試料で観察された種の数（豊富度）を用いて、アルファ多様性を調べた。
【０１５４】
群間で、グローバルなマイクロバイオームプロファイルに有意差があるか明らかにするために、ＲのＡｄｏｎｉｓ関数を用いて、Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ＭＡＮＯＶＡを非類似度行列に対して行った。統計ソフトウェアＲのストリップチャート及びボックスプロット関数を用いて、ボックスプロットを構築した。
【０１５５】
負の二項統計法（ＤＥＳｅｑ２法）を用いて、選択した対照内で、存在量に有意差が見られた分類学的な変数を特定した。生成されたままの状態のＰ値は、複数の試験のために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ／Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて調整した。
【０１５６】
実施例１−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍによる治療後の微生物叢の変化
概要
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓが、微生物叢の多様性及び安定性に及ぼす作用をマウスモデルで試験した。
【０１５７】
試験デザイン
乳癌モデル（ＥＭＴ６）のマウス（ｎ＝４０）を２×１０８の濃度のＭＲＸ５１８、ＭＲＸ０５５４、ＭＲＸ０８５８またはＲＥＦ１０の細菌株、１０ｍＬ／ｋｇの濃度の抗ＣＴＬＡ４のいずれかで処置した。そのマウスは、−１４日目に各細菌株で処置し、０日目に腫瘍細胞を接種した。抗ＣＴＬＡ４は、試験の１３日目に投与した。試験中の３つの時点、すなわち、−１４日目、０日目及び２２日目（試験終了時）に、糞便試料を採取した。試験全体を通じて、１２０個の糞便試料を採取した。
【０１５８】
９個の試料で、データを得られなかった。プレシーケンシングを増幅できなかったか、またはシーケンシングから得られたリードの数が、解析するには非常に少なかったためである。合計で、ｎ＝１１１の試料について、データが得られた。表１に、処置群ごと、時点ごとに、成功して戻ってきた試料の数がまとめられている。
【０１５９】
【表１】
2020529431.tif 000002
【０１６０】
結果
微生物叢の多様性の変化
処置が微生物叢の多様性に及ぼした作用であって、−１４日目、０日目及び２２日目における作用は、図１ａ〜ｊに見ることができる。これらの図は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株による処置後に観察された、多様性の向上と整合している。例えば、図１ａ〜ｄ及び図１ｇ〜ｈには、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株で処置したマウスにおけるマイクロバイオームの多様性が向上したことが示されている。図１ｅ〜ｆには、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓによる処置も、マウスにおけるマイクロバイオームの多様性を向上できることが示されている。
【０１６１】
この多様性の向上は、試験全体にわたって維持され、このことは、これらの細菌株が、マイクロバイオームの安定性を維持できる能力と整合している。例えば、図１ａ〜ｄ及び図１ｅ〜ｆにおける、２２日目のマイクロバイオームの多様性は、０日目に観察された多様性と同程度である。これにより、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株が、マイクロバイオームの安定性を維持できることが示されている。
【０１６２】
分類群の変動
ＧＢ１７１２８５７．０に開示されているデータを再解析した。下記の表２に示されているように、３つのすべての時点（−１４日目、０日目及び２２日目）に、処置群において、コントロール群と比べて、存在量が有意に異なる分類群が観察された（ｐ値＜０．０５）。↑は、処置群における分類群の有意な増加を示しており、↓は、処置群における分類群の有意な減少を示している。言及した図では、存在量の変化（ｌｏｇ２倍率変化）が反映されている。表３には、各時点において、各処置群で見られた存在量の異なる分類群の数がまとめられている。
【０１６３】
【表２】
2020529431.tif 000003
2020529431.tif 000004
【０１６４】
【表３】
2020529431.tif 000005
【０１６５】
Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥ．ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株による処置後、微生物叢の多様性は向上し、この向上には、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ及びＲａｓｅｂｕｒｉａの存在量の増加が含まれる。存在量の減少が見られる細菌群の１つは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａ  Ｓｐｐ．である。
【０１６６】
データは、マイクロバイオームをさらに安定化させるＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥ．ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓによる処置と整合している。
【０１６７】
実施例２−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓで処置後の微生物叢の多様性の変化
概要
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓが、微生物叢の多様性及び安定性に及ぼす作用を試験した。
【０１６８】
試験デザイン
肺癌モデル（ＬＬＣ）のマウス（ｎ＝４８）を２×１０８の濃度のＭＲＸ５１８、ＭＲＸ０５５４、ＭＲＸ０８５８またはＲＥＦ１０の細菌株、１０ｍＬ／ｋｇの濃度の抗ＣＴＬＡ４のいずれかで処置するか、未処置にするかした。マウスは、−１４日目に各細菌株で処置し、０日目に腫瘍細胞を接種し、関連する抗ＣＴＬＡ４は、試験の１３日目に投与した。糞便試料は、１８日目の試験終了時に採取した。
【０１６９】
１１個の試料で、データが得られなかった。マウスが、データ収集の前に死亡したか、または試料で、プレシーケンシングを増幅できなかったからである。合計で、ｎ＝３７の試料について、データが得られた。表４に、治療群ごと、時点ごとに、成功して戻ってきた試料の数がまとめられている。
【０１７０】
【表４】
2020529431.tif 000006
【０１７１】
結果
微生物叢の多様性の変化
処置が微生物叢の多様性の変化に及ぼした１８日目における作用は、図２に見ることができる。Ｓｈａｎｎｏｎ多様性指数は、ＭＲＸ５１８及びＭＲＸ０８５８による処置後、未治療のコントロールと比べて上昇したが、これは、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥ．ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株が、微生物叢の多様性を向上させる能力と整合している。ＭＲＸ５５４による処置後には、多様性の低下が観察された。しかしながら、このデータは、実験誤差によるものである可能性が高い。図１ｃ〜ｄには、この細菌株が、マイクロバイオームの多様性を向上できることが示されているからである。
【０１７２】
分類群の変動
ＧＢ１７１２８５７．０に開示されているデータを再解析した。下記の表５に示されているように、コントロール群と比べた場合に、処置群における、存在量が有意に異なる分類群が明らかになった。↑は、処置群における分類群の有意な増加を示しており、↓は、処置群における分類群の有意な減少を示している。言及した図では、存在量の変化（ｌｏｇ２倍率変化）が反映されている。
【０１７３】
【表５】
2020529431.tif 000007
【０１７４】
Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥ．ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株による処置は、微生物叢の多様性、特には、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ及びＲｏｓｅｂｕｒｉａ（ＰＭＩＤ：２６４１６８１３）の割合を向上させることができる。
【０１７５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＸＩＶａ  ｓｐｐ．は、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍまたはＥ．ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓの細菌株による処置後に減少する。
【０１７６】
処置によってさらに、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｈｏｍｉｎｉｓが選択的に増加した。この株は以前に、腫瘍内で、ＩＦＮ−γ産生γδＴ細胞を増加させて、特異的メモリーＴｈ１細胞の免疫応答を誘導し、すなわち、追加の免疫刺激機序をもたらすことが示されている［３８］。したがって、本発明の組成物は、対象に投与すると、それらの対象の微生物叢の多様性を安定化及び／または向上させるように機能するのみならず、抗がん作用を持つものとして実証されている細菌の成長も促進し、それらの対象が、がん患者であるか、またはがんになるリスクがあると特定された対象である場合には、特に有益である。
【０１７７】
実施例３−安定性試験
本明細書に記載されている組成物であって、本明細書に記載されている細菌株を少なくとも１つ含む組成物を密閉容器に２５℃または４℃で保存し、その容器を、相対湿度が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％の雰囲気に置く。標準的なプロトコールによって求められるコロニー形成単位で測定した場合に、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後、１年後、１．５年後、２年後、２．５年後または３年後に、その細菌株の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が残存するものとする。
【０１７８】
実施例４−代謝解析
概要
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍが、マウスにおける微生物叢の代謝プロファイルに及ぼす作用を調べた。
【０１７９】
試験デザイン
乳癌モデル（ＥＭＴ６）のマウスを、２００μｌ中に２×１０８個の濃度のＭＲＸ５１８（ｎ＝９）、ＭＲｘ０５１８（ｎ＝８）、ＭＲｘ０５５４（ｎ＝８）、ＭＲｘ０８５８（ｎ＝８）またはＲＥＦ１０−ＤＳＭ１００１１０（ｎ＝８）で処置するか、ＥＭＴ６マウスに、１０ｍＬ／ｋｇの濃度の抗ＣＴＬＡ４（ｎ＝８）を投与するかした。細菌種の投与は、−１４日目に開始した。マウスには、０日目に腫瘍細胞を生着させた。抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｌ０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）による処置は、腫瘍が体積５０〜７０ｍｍ３に達したら開始した。腫瘍体積は、３〜４日おきに測定した。
【０１８０】
急速凍結した盲腸から、盲腸内容物を単離し、糞便スラリーから、短鎖脂肪酸代謝物、極性代謝物及び脂質代謝物を別々に抽出した。ＧＣ−ＭＳ（短鎖脂肪酸）、ならびにＨＩＬＩＣ（極性代謝物）及びＵＰＬＣ（脂質代謝物）を用いたＬＣ−ＭＳ解析によって、抽出物を解析した。未処置群を他のすべての群と比較するために、統計ｔ検定とともに、偽発見率１０％でベンジャミーニ−ホッホベルク法による補正を行うことを通じて、データを解析した。代謝物は、ｐ値が、各化合物に関して算出したベンジャミーニ−ホッホベルクの臨界値（（ｉ／ｍ）Ｑ）未満である場合に、統計的に有意とした。
【０１８１】
ＭＲＸ５１８で処置したマウスでは、代謝物プロファイルに有意差が見られた（表６）。これに対して、抗ＣＴＬＡ−４による処置は、代謝物産生のいずれの変化とも関連がなかった。さらに、ＭＲｘ０５１８及びＭＲｘ０５５４による処置の最中には、ペントースリン酸経路全体における代謝物が減少する。
【０１８２】
ＭＲｘ０５１８及びＭＲｘ０５５４で処置したマウスでは、リボース５−リン酸、エリトロース４−リン酸及びセドヘプツロース７−リン酸を含むペントースリン酸経路のメンバーの減少も見られた。上で論じたように、この経路のメンバーの高発現レベルは、がん患者の不良転帰と関連するので、この減少は有益であり、したがって、本発明の組成物を投与して、このような患者の微生物叢の安定性を安定化及び／または向上させると、これらの組成物はさらに、がんの予防または治療に寄与することになる。
【０１８３】
【表６】
2020529431.tif 000008
2020529431.tif 000009
【０１８４】
実施例５−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍによる処置後の微生物叢の変化
試験デザイン
健常な雌の５〜７週齢のＢａｌｂ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウス（ｎ＝２１０）をＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手し、ＥＭＴ−６腫瘍細胞を注射して、乳癌モデルを作製した。試験は、３つの時点（−１５日目、−１日目及び２２日目）に標本化した、群ごとに１０匹のマウスを含む７つの処置群で構成させた。処置群は、以下のとおりであった。
2020529431.tif 000010
【０１８５】
−１５日目に、マウスを強制経口投与によって、２×１０８個のＭＲＸ５１８で処置した。１日目（Ｄ−ｌ）に、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中の１×１０６個のＥＭＴ−６細胞を右側腹部に皮下注射することによって、マウスにＥＭＴ−６腫瘍細胞を生着させた。試験の１３日目に、マウスの腹膜腔に注射することによって、ｌ０ｍｌ／ｋｇの体積（マウスの直近の個々の体重に合わせて調整した）で、抗ＣＴＬＡ４（ＢＥ０１３１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）及びＰＤ−１を投与した。試験中の３つの時点（−１５日目、−１日目及び２２日目（試験終了時））に、糞便試料を採取した。
【０１８６】
マイクロバイオーム組成データの生成−１６Ｓアンプリコンシーケンシング
社内パイプラインの適応を用いて、データの前処理を行った。シーケンシングから戻ってきたリードの質は不良であったことから、厳格なクオリティフィルタリング工程を加えることになった。トリミング及びクオリティフィルタリングには、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃというツール（ｖ０．３６）を使用した。フォワードリードからは最初の１６個の塩基対、リバースリードからは最初の２０個の塩基対を除去して、プライマー配列を除去した。この後、Ｐｈｒｅｄクオリティスコア２５を下回るリーディング塩基対またはトレーリング塩基対をトリミングした。次に、データにスライディングウィンドウ４を適用し、ウィンドウ内のリードが、平均Ｐｈｒｅｄスコア２２を下回った場合には、そのリードの末端を除去した。前のクオリティトリミング工程後に、リードペアの１つまたは両方が１８０塩基対未満であった場合には、そのリードペアを除去した。クオリティフィルタリング後、次の工程は、ＦＬＡＳＨというツール（ｖ１．２．１１）を用いて、リードをマージするものであった。これによって、リードペアからシングルリードが生成される一方で、組み合わせないリードペアが除去される。
【０１８７】
マイクロバイオーム組成データの解析（ポストシーケンシング）
ＱＩＩＭＥ（ｖ１．９．１）及びＳＰＩＮＧＯ（ｖ１．３）を用いて、代表的なＯＴＵ配列の分類学的分類を行った。ＱＩＩＭＥのａｓｓｉｇｎ＿ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｐｙというスクリプトを用いて、ＲＤＰ１１．２というデータベースを参照することによって、分類を属レベルに割り当てた。ＳＰＩＮＧＯのツールを用いて、種レベルの分類を割り当てた。ブートストラップ信頼値が０．８未満の分類はいずれも、「未分類」というラベルを割り当てた。
【０１８８】
【表７】
2020529431.tif 000011
【０１８９】
８９７９４＿Ｄ＿１５という１つの試料は、配列深度が非常に低かった（１，０８６）。したがって、マウス８９７９４の全試料を多様性の算出から除去した。
【０１９０】
高レベルデータ解析
Ｒ  ｖ３．４．３という統計ソフトウェアを用いて、解析を行った。Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ非類似度行列を用いて、データセットの組成非類似度を調べた。ｖｅｇａｎパッケージのｖｅｇｄｉｓｔ関数を用いて、割合で正規化したデータで、Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ行列を算出した。主座標解析（ＰＣｏＡ）の座標付けプロットを作成して、異なる処置が分類群の組成に及ぼす作用を可視化した。ＰＣｏＡプロットは、ｍａｄｅ４及びｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いて作成した。ｖｅｇａｎパッケージのａｄｏｎｉｓ関数を用いて、Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ非類似度に対するＰｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ＭＡＮＯＶＡ統計試験を行った。
【０１９１】
結果
ＲパッケージのＤＥＳｅｑ２を用いて、分類群の存在量の差を試験した。処置の作用をＹＣＦＡコントロールと比較するような方法で、完全データセットをモデル化した。試験は、ＯＴＵレベルで、分類学的な分類の５つの各レベル（門、網、目、科及び属）で行った。分類群は、調整済みｐ値が０．０５未満である場合に有意とみなした。ｌｏｇ倍率変化が０．５超の分類群のみを、信頼性のあるものとみなした。各時点に、これを繰り返した。−１５日目には、有意な分類群は見られなかった。−１日目における有意な分類群は、表８に、２２日目における有意な分類群は、表９に示されている。正のｌｏｇ倍率変化によって、処置群において、ビヒクルと比べて、分類群が増加することが示されている。
【０１９２】
【表８】
2020529431.tif 000012
【０１９３】
【表９】
2020529431.tif 000013
【０１９４】
図３（ｃ）には、ＭＲｘ０５１８による処置と関連する分類群の傾向が示されている。座標プロットの上部では、ＭＲｘ０５１８で処置したマウスがクラスタリングされており、ＰＣ２値はプラスであるが、座標プロットの下部では、他の処置がクラスタリングされており、ＰＣ２値はマイナスである。これは、図３（ａ）にも示されている。図３（ｂ）には、処置前の分類群が示されている。このクラスタリングは、ＭＲｘ０５１８による処置後のみに見られることは明らかである。
【０１９５】
図３の座標付けプロットの第２軸で可視化されているように、相補解析を行って、ＭＲｘ０５１８応答と関連する分類群を同定した。この解析によって、２２日目に観察されたＭＲｘ０５１８応答と関連する分類群の差が示されている。
【０１９６】
この解析は、Ｒでｃｏｒ．ｔｅｓｔ関数を用いて行うようなスピアマンの相関解析から構成させた。有意な分類群のみ、プラスのρ（それらの分類群がその傾向と関連すること示す）及びマイナスのρ（それらの分類群が逆に関連することを示す）で示されている。
【０１９７】
表６には、２２日目の時点に、ビヒクルコントロール（ＹＦＣＡ）と比べて、有意に異なる分類群が示されている。これらのデータによって、ＭＲｘ０５１８によって処置すると、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ種の存在量が増加することが確認される。本発明の組成物は、シクロホスファミドの有効性に関連付けられているＢａｒｎｅｓｉｅｌｌａ種のレベルを向上させることができる。
【０１９８】
【表１０】
2020529431.tif 000014
【０１９９】
配列
配列番号１（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子−ＡＦ０３９９００）
2020529431.tif 000015
【０２００】
配列番号２（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株ＭＲＸ５１８のコンセンサス１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列）
2020529431.tif 000016
【０２０１】
配列番号３（ＭＲＸ５１８株の染色体配列）−電子的な配列表を参照。
【０２０２】
配列番号４（ＭＲＸ５１８株のプラスミド配列）−電子的な配列表を参照。
【０２０３】
配列番号５（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株ＭＲｘ０５５４のコンセンサス１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列）
2020529431.tif 000017
【０２０４】
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［３５］Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｌ  ａｌ（２０１１）Ｓｉｃ  Ｓｉｇｎａｌ，４，１６２
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［４２］Ｍｏｕｓｔａｆａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９．ｅ１３２
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［４４］Ｂｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．；８（６３）：１０６６９３−１０６７０６
［４５］Ｍｉｔｒｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ．（２０１３）７１６８６１．
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［４９］Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，９−２４．
［５０］Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｄａｙ  ａｎｄ  ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．
［５１］Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，３５９２−３５９７．
［５２］ＵＳ２０１６／００６７１８８
［５３］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）Ｒｏｎａｌｄ  Ａｔｌａｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．
［５４］Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（１９９６）Ｊｅｎｎｉｅ  Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ−Ｃｅｖｅｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
［５５］Ｓｔｒｏｂｅｌ（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５８１：２４７−６１．
［５６］Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２．
［５７］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）．
［５８］Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
［５９］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
［６０］Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）．
［６１］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｄｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）
［６２］Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）（２００２）Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）．
［６３］ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ  ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）
【図１−１】
2020529431.tif 000018
【図１−２】
2020529431.tif 000019
【図１−３】
2020529431.tif 000020
【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３ａ】
2020529431.tif 000024
【図３ｂ】
2020529431.tif 000025
【図３ｃ】
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【配列表】
2020529431000001.app
【国際調査報告】
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