(57)【要約】本明細書に記載されるのは、ＴＥＡＤと相互作用するか、ＨＩＰＰＯ経路を妨害するか、または細胞内のＴＥＡＤ相互作用の活性もしくは機能を調節できるペプチドならびにその変異型および変異体である。がん、腫瘍または調節不全のＨＩＰＰＯ経路もしくは無制御な細胞成長に関連する他の任意の疾患／病状を治療するためのペプチドの医薬組成物および使用、ならびにこのようなペプチドを設計および製造する方法も本明細書に記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＥＡＤに結合できる天然に存在しない、合成のもしくは操作されたペプチドまたはその変異型、相同体もしくは類似体を含む組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、かつＴＥＡＤ相互作用を妨害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＥＡＤ相互作用は、ＴＡＺ、ＹＡＰまたはそれらの任意の組み合わせとのＴＥＡＤ相互作用を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路の１つまたは複数の構成要素を妨害または阻害する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路の１つまたは複数の構成要素を調節する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路において発がん遺伝子を抑制する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドは、ＹＡＰペプチド由来の１〜１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記１〜１０個の連続したアミノ酸は、ＰＤＢ  ３ＫＹＳのＢ鎖のアミノ酸残基：５３〜５５、５５〜５７、６４〜６８、６４〜６９、８６〜８９または９４〜９６の１つまたは複数から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記１〜１０個の連続したアミノ酸は、３つのジスルフィド架橋剤を含むペプチド上にグラフトされる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
３つのジスルフィド架橋剤を含む前記ペプチドは、ノッチンである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記１〜１０個の連続したアミノ酸は、細胞浸透性ペプチド上にグラフトされる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞浸透性ペプチドは、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オピカルシン−１、オピカルシン−２、ミッドカイン（６２−１０４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩまたはクロロトキシンである、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞浸透性ペプチドは、配列番号１６８〜配列番号１７６のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号４２のいずれか１つの配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号４２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号４２のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドは、配列番号４３〜配列番号８４のいずれか１つの配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドは、配列番号４３〜配列番号８４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項１〜１３または１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドは、配列番号４３〜８４のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項１〜１３または１７もしくは１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドは、ノットペプチドであるか、またはノットペプチドに由来する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドは、ＴＥＡＤへの結合についてＹＡＰまたはＴＡＺと競合する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドは、ＴＥＡＤを隔離するか、または別のタンパク質がＴＥＡＤに結合することを妨げる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドは、ＹＡＰまたはＴＡＺのものと比較して等しいかまたはより大きいＴＥＡＤに対する親和性または特異性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドは、ＹＡＰまたはＴＡＺのものと比較して等しいかまたはより低いＴＥＡＤに対する解離定数を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ペプチドは、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満のＫＤを有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ペプチドは、標的細胞に浸透または局在化する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドは、細胞浸透性部分との配合、それへの融合またはそれへのコンジュゲーションによって標的細胞に浸透または局在化する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細胞浸透性部分は、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２−プロピルアクリル酸）、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｔａｔペプチド、Ａｒｇパッチ、ノットペプチド、ＣｙｓＴＡＴ、Ｓ１９−ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号１４６）、ｐＡｎｔｐ、Ｐａｓ−ＴＡＴ、Ｐａｓ−Ｒ８（配列番号１４９）、Ｐａｓ−ＦＨＶ、Ｐａｓ−ｐＡｎｔＰ、Ｆ２Ｒ４（配列番号１５２）、Ｂ５５、オーリン、ＩＭＴ−Ｐ８、ＢＲ２、ＯＭＯＴＡＧ１、ＯＭＯＴＡＧ２、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ３、ＤＰＶ１０４７、Ｃ１０５Ｙ、トランスポータン、ＭＴＳ、ｈＬＦ、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号１６６）、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン−１、オピカルシン−２、ミッドキン（６２−１０４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、クロロトキシン、ＤＲＩ−ＴＡＴ、ｃＦΦＲ４（配列番号２８１）、ミリステート、ｙＢＢＲまたはその断片もしくは変異型あるいはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記細胞浸透性部分は、配列番号１４３〜配列番号１７６のいずれかの配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を含む、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記細胞浸透性部分へのペプチド融合物は、配列番号８５〜配列番号１４２または配列番号２２２〜配列番号２７９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドは、標的細胞の核内に局在化し得る、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドは、核局在化シグナルペプチドまたは部分との配合、それへの融合またはそれへのコンジュゲーションによって前記標的細胞の核内に局在化する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ペプチドは、がん細胞を標的化するか、それにホーミングするか、またはそれに選択的に浸透する部分または第２のペプチドにさらにコンジュゲート、連結または融合される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記部分または第２のペプチドは、ノットペプチドまたはその変異型もしくは断片である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ノットペプチドは、血液脳関門を越えて前記ペプチドを標的化するかまたはそれにホーミングする、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ペプチドは、ＴＥＡＤ不活性化または分解を標的化する部分にコンジュゲート、連結または融合される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
ＴＥＡＤの不活性化または分解を標的化する前記部分は、ＴＥＡＤの翻訳後修飾をもたらす、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
ＴＥＡＤの前記翻訳後修飾は、ユビキチン化を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記標的細胞は、調節不全のＨＩＰＰＯ経路を有する細胞である、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記標的細胞は、無制御なまたは調節不全の細胞成長を有する細胞である、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記標的細胞は、がん性細胞または腫瘍細胞である、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記標的細胞は、膵臓細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞、脳細胞またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２６〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ペプチドは、ジスルフィドノットを介してジスルフィドを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ペプチドは、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つは、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されたループを通過する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ペプチドは、ジスルフィド結合またはジスルフィドノットを含まない、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｌ立体配置にあるか、または少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｄ立体配置にある、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０個の正荷電残基を含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０個の連続した正荷電残基を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記正荷電残基は、Ａｒｇ、Ｌｙｓまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ペプチドは、Ａｒｇパッチを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ペプチドは、Ｎ末端に２つ以上の連続したＡｒｇ残基を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ペプチドは、Ｔａｔペプチドまたはその断片を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記Ｔａｔペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９５）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４３）の配列またはその断片もしくは変異型を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記Ｔａｔペプチドは、（ＧＳ）ｘ（配列番号２８２）またはＧｘＳｙ（配列番号２８３）（式中、ｘおよびｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）の配列を有するリンカーを使用して、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記Ｔａｔペプチドは、前記ペプチドの任意の残基に付加される、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記Ｔａｔペプチドは、ＴＥＡＤ結合活性に干渉することなく前記ペプチドの任意の残基に付加される、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６個のシステイン残基を含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ペプチドは、１、２、３、４、５または６つのＣｙｓ残基を含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ペプチドは、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）（式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸である）を含むか、またはそれを含むように変異されるか、またはそれを含むようにグラフトされる、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）配列中のＸ１およびＸ２は、ＥＡ、ＩＣ、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣを含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ペプチドは、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ（式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸である）を含むか、またはそれを含むように変異されるか、またはそれを含むようにグラフトされる、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ中のＸ１およびＸ２は、ＥＡ、ＩＣ、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣを含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ペプチドは、Ｌ２３、Ｌ２６およびＦ２７位に変異を含む、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ペプチドは、Ｇ１５、Ｙ２３、Ｅ２５、Ｇ２８およびＰ４０位に変異を含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ペプチドは、Ｇ１５、Ｙ２３およびＰ４０位に変異を含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ペプチドは、Ｐ４０位に変異を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ペプチドは、Ｇ１５Ｑ、Ｙ２３Ｉ、Ｅ２５Ｄ、Ｇ２８ＫおよびＰ４０Ｗからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ペプチドは、Ｅ２５Ｄ、Ｇ２８ＫおよびＰ４０Ｗを含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ペプチドは、負荷電残基の１つまたは複数の領域を含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ペプチドは、正荷電残基の１つまたは複数の領域を含む、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ペプチド配列は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８個の残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０または少なくとも８１個の残基を含む、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ペプチドは、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、気泡タンパク質、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ｐＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシン阻害因子（ＣＴＩ）、ＥＧＦエピレギュリンコア、ハイナントキシン、セラホトキシン、ヘキサトキシン、オピカルシン、インペラトキシン、デフェンシンおよびインセクトトキシンからなる群を含むかまたはそれに由来する、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ペプチドは、ヒトタンパク質またはペプチドを含むかまたはそれに由来する、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記ペプチドは、少なくとも１つの他のペプチドを有する多量体構造に配置される、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記多量体構造は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ペプチドは、約３．０〜約１０．０の範囲内の等電点を含む、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ペプチドは、約４．５〜約８．９の範囲内の等電点を含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ペプチドは、不均一な電荷分布を含む、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記ペプチドは、生理学的または細胞内ｐＨ価で安定している、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記ペプチドは、約７または７．５のｐＨで安定している、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記ペプチドは、約６．５〜７．５のｐＨで安定している、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ペプチドは、約５．０以下、約３．０以下または約３．０〜約５．０の範囲内のｐＨ価で安定している、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ペプチドは、約５．０〜約７．０の範囲内のｐＨ価で安定している、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ペプチドは、疎水性コアを含む、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ペプチドは、プロテアーゼ分解に対して耐性である、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つである、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記ペプチドは、還元に対して耐性であるか、または還元性環境において安定している、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記還元または還元性環境は、ＤＴＴまたはＧＳＨを含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記ペプチドは、高温で安定している、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記ペプチドは、細胞膜に浸透できる、請求項１〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ペプチドは、抗がん効果を示す、請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記ペプチドは、１つまたは複数の化学修飾を含む、請求項１〜９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
前記化学修飾は、前記ペプチドの半減期を延長するかまたはその薬物動態を修飾する、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
前記化学修飾は、前記ペプチドのＮ末端をブロックしている、請求項９３〜９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
前記化学修飾は、メチル化、アセチル化またはアシル化である、請求項９３〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
前記化学修飾は、
１つもしくは複数のリジン残基またはその類似体のメチル化、
Ｎ末端のメチル化、または
１つもしくは複数のリジン残基またはその類似体のメチル化およびＮ末端のメチル化
である、請求項９３〜９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ペプチドは、アシル付加物に連結される、請求項１〜９７のいずれかー項に記載の組成物。
【請求項９９】
前記ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲート、連結または融合される、請求項１〜９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１００】
前記活性薬剤は、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端で前記ペプチドにコンジュゲート、連結または融合される、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記活性薬剤は、抗体、抗体断片、Ｆｃまたは一本鎖Ｆｖである、請求項９９または１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記ペプチドは、Ｆｃドメインにコンジュゲートされるか、連結されるか、融合されるか、または埋め込まれる、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の活性薬剤は、前記ペプチドに連結される、請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記ペプチドは、切断可能リンカーまたはｐＨ感受性リンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項９９〜１０３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記ペプチドは、リンカーにより、前記ペプチドのＮ末端、内部リジン残基のεアミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボン酸またはＣ末端で前記活性薬剤に連結される、請求項９９〜１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換である、請求項９９〜１０５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記ペプチドは、リンカーにより、前記非天然アミノ酸で前記活性薬剤に連結される、請求項１０６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、炭酸結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合または炭素−窒素結合を含む、請求項１０５〜１０７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記リンカーは、加水分解的に不安定なリンカーである、請求項１０５〜１０９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記ペプチドは、切断不能リンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記活性薬剤は、抗がん剤である、請求項９７〜１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記活性薬剤は、オーリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアマイシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ−３８、ＢＡＣＥ阻害剤、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、ＷＥＨＩ−５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ−１９９、ナビトクラクス、ＡＴ−１０１、オバトクラクス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体またはドラスタチンである、請求項９７〜１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記ペプチドに結合される半減期修飾剤をさらに含む、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記半減期修飾剤は、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニンおよびセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸およびセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸またはアルブミンに結合する分子を含む、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記ペプチドに結合される検出可能薬剤をさらに含む、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記検出可能薬剤は、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端で前記ペプチドにコンジュゲート、連結または融合される、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の検出可能薬剤は、前記ペプチドに連結される、請求項１１６または１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記ペプチドは、切断可能リンカーを介して前記検出可能薬剤に連結される、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記ペプチドは、リンカーにより、前記ペプチドのＮ末端、内部リジン残基のεアミンまたはＣ末端で前記検出可能薬剤に連結される、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２１】
非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換である、請求項１１６〜１２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記ペプチドは、リンカーにより、前記非天然アミノ酸で前記検出可能薬剤に連結される、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合または炭素−窒素結合を含む、請求項１１９〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む、請求項１１９〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記ペプチドは、切断不能リンカーを介して前記検出可能薬剤に連結される、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記検出可能薬剤は、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体または放射性核種キレート剤である、請求項１１６〜１２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記検出可能薬剤は、蛍光色素である、請求項１１６〜１２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２８】
請求項１〜１２５のいずれか一項に記載の組成物またはその塩と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項１２９】
対象への投与のために製剤化される、請求項１２８に記載の医薬組成物。
【請求項１３０】
経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与またはそれらの組み合わせのために製剤化される、請求項１２８または１２９に記載の医薬組成物。
【請求項１３１】
病状の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
請求項１〜１２７のいずれか一項に記載の組成物または請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップ
を含む方法。
【請求項１３２】
前記組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内投与、腹腔内、腫瘍内またはそれらの組み合わせによって投与される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記組成物は、ボーラス、注入または持続注入として静脈内投与される、請求項１３１または１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記組成物または医薬組成物は、ＴＥＡＤとのＹＡＰの相互作用を妨害する、請求項１３１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記組成物または医薬組成物は、ＹＡＰがＴＥＡＤに結合することを妨げる、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記組成物または医薬組成物は、ＴＥＡＤへの結合についてＹＡＰと競合する、請求項１３１〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記組成物または医薬組成物は、ＴＥＡＤに結合する、請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記組成物または医薬組成物は、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路において発がん遺伝子を阻害する、請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記組成物または医薬組成物は、細胞によって内在化される、請求項１３１〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記組成物または医薬組成物は、標的細胞の細胞膜に浸透する、請求項１３１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記病状は、糖尿病である、請求項１３１〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記病状は、がんまたは腫瘍である、請求項１３１〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記がんは、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、卵巣がん、脳がんまたは肺がんである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記がんは、前記ＨＩＰＰＯ経路における変異に関連する、請求項１４２または１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記病状は、無制御な細胞成長または調節不全のＨＩＰＰＯ経路を含む、請求項１４２〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記組成物または前記医薬組成物は、１日に複数回、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に１回、２週間に１回または１ヶ月に１回もしくは３ヶ月に１回投与される、請求項１３１〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記組成物は、１日に１回、１週間に１回または１ヶ月に１回皮下投与される、請求項１４１〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
ＴＥＡＤに結合できるペプチドを設計する方法であって、
ａ）コンピュータプログラムを使用して、最適化された安定性および折り畳みを有するペプチドをペプチドのライブラリーから同定するステップであって、前記ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも３つのジスルフィド架橋剤を含む、ステップと、
ｂ）コンピュータプログラムを使用してペプチド：ＴＥＡＤ複合体からの結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせて、前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトした後にＴＥＡＤに結合する安定なペプチドを判定するステップと、
ｃ）前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトして、前記安定なペプチドを製造するステップと
を含む方法。
【請求項１４９】
部位飽和変異誘発を実施して、前記安定なペプチドよりも高いＴＥＡＤに対する結合親和性を有する変異ペプチドを得るステップをさらに含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
ペプチドのライブラリーからの前記ペプチドは、２０〜５５アミノ酸残基長である、請求項１４８または１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
ｄ）コンピュータプログラムを使用して、最適化された安定性および折り畳みを有するペプチドをペプチドのライブラリーから同定するステップであって、前記ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、細胞浸透が可能である、ステップと、
ｅ）コンピュータプログラムを使用して変異ペプチド：ＴＥＡＤ複合体からの結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせて、前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトした後にＴＥＡＤに結合する新しいペプチドを判定するステップと、
ｆ）前記結合パッチを前記変異ペプチド上にグラフトして、前記新しいペプチドを製造するステップと
を含む、細胞浸透が可能であるペプチドを設計するステップをさらに含む、請求項１４８〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その開示全体が本明細書に援用される、２０１７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７，８６４号明細書および２０１７年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５１０，７１９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０１８年１月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、４４１８９−７１８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが１７７，０６７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
がんは、世界中で主な死因であり、全てのがん関連死の９０％超が転移によって引き起こされる。ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路は、細胞成長、細胞接触阻害および器官形成にとって重要である。ＨＩＰＰＯ経路が妨害されると、発がん遺伝子は、チェックされないまま、細胞増殖、腫瘍進行および転移を助長する下流遺伝子の過剰発現を引き起こし得る。したがって、未チェックの発がん遺伝子が抑制され得るように、高い親和性および特異性を有するＨＩＰＰＯ経路の阻害剤に対する必要性がある。阻害剤をはじめとするこのようなＨＩＰＰＯ経路修飾物質を使用して、がん、腫瘍進行、転移または調節不全のＨＩＰＰＯ経路に関連する他の疾患または病状が予防または治療され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、ＴＥＡＤ相互作用を妨害するための組成物および方法を提供する。
【０００５】
本概要は、詳細な説明において以下でさらに説明される概念の選択を簡略化された形式で紹介するために提供される。本概要は、特許請求される主題の重要な特徴を同定することを意図するものではなく、特許請求される主題の範囲を判定する際の補助として使用されることを意図するものでもない。
【０００６】
様々な態様において、本開示は、ＴＥＡＤに結合できる天然に存在しない、合成のもしくは操作されたペプチドまたはその変異型、相同体もしくは類似体を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、かつＴＥＡＤ相互作用を妨害する。いくつかの態様では、ＴＥＡＤ相互作用は、ＴＡＺ、ＹＡＰまたはそれらの任意の組み合わせとのＴＥＡＤ相互作用を含む。
【０００７】
いくつかの態様では、ペプチドは、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路の１つまたは複数の構成要素を妨害または阻害する。他の態様では、ペプチドは、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路の１つまたは複数の構成要素を調節する。いくつかの態様では、ペプチドは、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路において発がん遺伝子を抑制する。
【０００８】
いくつかの態様では、ペプチドは、ＹＡＰペプチド由来の１〜１０個の連続したアミノ酸を含む。さらなる態様では、１〜１０個の連続したアミノ酸は、ＰＤＢ  ３ＫＹＳのＢ鎖のアミノ酸残基：５３〜５５、５５〜５７、６４〜６８、６４〜６９、８６〜８９または９４〜９６の１つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、１〜１０個の連続したアミノ酸は、３つのジスルフィド架橋剤を含むペプチド上にグラフトされる。様々な態様において、３つのジスルフィド架橋剤を含むペプチドは、ノッチンである。いくつかの態様では、１〜１０個の連続したアミノ酸は、細胞浸透性ペプチド上にグラフトされる。さらなる態様では、細胞浸透性ペプチドは、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オピカルシン−１、オピカルシン−２、ミッドカイン（６２−１０４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩまたはクロロトキシンである。様々な態様において、細胞浸透性ペプチドは、配列番号１６８〜配列番号１７６のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を含む。
【０００９】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号４２のいずれか１つの配列またはその変異型もしくは断片を含む。さらなる態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号４２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む。なおもさらなる態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号４２のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む。
【００１０】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号４３〜配列番号８４のいずれか１つの配列またはその変異型もしくは断片を含む。さらなる態様では、ペプチドは、配列番号４５〜配列番号８４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む。なおもさらなる態様では、ペプチドは、配列番号４３〜配列番号８４のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、ノットペプチドであるか、またはノットペプチドに由来する。
【００１１】
他の態様では、ペプチドは、ＴＥＡＤへの結合についてＹＡＰまたはＴＡＺと競合する。いくつかの態様では、ペプチドは、ＴＥＡＤを隔離するか、または別のタンパク質がＴＥＡＤに結合することを妨げる。さらなる態様では、ペプチドは、ＹＡＰまたはＴＡＺのものと比較して等しいかまたは撚り大きいＴＥＡＤに対する親和性または特異性を有する。いくつかの態様では、ペプチドは、ＹＡＰまたはＴＡＺのものと比較して等しいかまたはより低いＴＥＡＤに対する解離定数を有する。さらなる態様では、ペプチドは、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満のＫＤを有する。
【００１２】
いくつかの態様では、ペプチドは、標的細胞に浸透または局在化し得る。他の態様では、ペプチドは、細胞浸透性部分との配合、それへの融合またはそれへのコンジュゲーションによって標的細胞に浸透または局在化する。いくつかの態様では、細胞浸透性部分は、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２−プロピルアクリル酸）、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｔａｔペプチド、Ａｒｇパッチ、ノットペプチド、ＣｙｓＴＡＴ、Ｓ１９−ＴＡＴ、Ｒ８（配列番号１４６）、ｐＡｎｔｐ、Ｐａｓ−ＴＡＴ、Ｐａｓ−Ｒ８（配列番号１４９）、Ｐａｓ−ＦＨＶ、Ｐａｓ−ｐＡｎｔＰ、Ｆ２Ｒ４（配列番号１５２）、Ｂ５５、オーリン、ＩＭＴ−Ｐ８、ＢＲ２、ＯＭＯＴＡＧ１、ＯＭＯＴＡＧ２、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ３、ＤＰＶ１０４７、Ｃ１０５Ｙ、トランスポータン、ＭＴＳ、ｈＬＦ、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号１６６）、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン−１、オピカルシン−２、ミッドキン（６２−１０４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、クロロトキシン、ＤＲＩ−ＴＡＴ、ｃＦΦＲ４（配列番号２８１）、ミリステート、ｙＢＢＲまたはその断片もしくは変異型あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。さらなる態様では、細胞浸透性部分は、配列番号１４３〜配列番号１７６のいずれかの配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を含む。他の態様では、細胞浸透性部分へのペプチド融合は、配列番号８５〜配列番号１４２または配列番号２２２〜配列番号２７９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を含む。
【００１３】
他の態様では、ペプチドは、標的細胞の核内に局在化し得る。さらなる態様では、ペプチドは、核局在化シグナルペプチドまたは部分との配合、それへの融合またはそれへのコンジュゲーションによって標的細胞の核内に局在化する。いくつかの態様では、ペプチドは、がん細胞を標的化するか、それにホーミングするか、または選択的に浸透する部分または第２のペプチドにさらにコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの態様では、部分または第２のペプチドは、ノットペプチドまたはその変異型もしくは断片である。さらなる態様では、ノットペプチドは、血液脳関門を越えてペプチドを標的化するかまたはそれにホーミングする。
【００１４】
いくつかの態様では、ペプチドは、ＴＥＡＤ不活性化または分解を標的化する部分にコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの態様では、ＴＥＡＤの不活性化または分解を標的化する部分は、ＴＥＡＤの翻訳後修飾をもたらす。いくつかの態様では、ＴＥＡＤの翻訳後修飾は、ユビキチン化を含む。
【００１５】
他の態様では、標的細胞は、調節不全のＨＩＰＰＯ経路を有する細胞である。いくつかの態様では、標的細胞は、無制御なまたは調節不全の細胞成長を有する細胞である。いくつかの態様では、標的細胞は、がん性細胞または腫瘍細胞である。他の態様では、標的細胞は、膵臓細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞、脳細胞またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１６】
いくつかの態様では、ペプチドは、ジスルフィドノットを介してジスルフィドを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋の１つは、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されたループを通過する。他の態様では、ペプチドは、ジスルフィド結合またはジスルフィドノットを含まない。
【００１７】
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｌ立体配置にあるか、または少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｄ立体配置にある。いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０個の正荷電残基を含む。
【００１８】
他の態様では、ペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０個の連続した正荷電残基を含む。いくつかの態様では、正荷電残基は、Ａｒｇ、Ｌｙｓまたはそれらの任意の組み合わせである。
【００１９】
なおも他の態様では、ペプチドは、Ａｒｇパッチを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｎ末端に２つ以上の連続したＡｒｇ残基を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｔａｔペプチドまたはその断片を含む。いくつかの態様では、Ｔａｔペプチドは、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９５）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４３）またはその断片もしくは変異型を含む。
【００２０】
いくつかの態様では、Ｔａｔペプチドは、（ＧＳ）ｘ（配列番号２８２）またはＧｘＳｙ（配列番号２８３）（式中、ｘおよびｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）の配列を有するリンカーを使用して、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される。他の態様では、Ｔａｔペプチドは、ペプチドの任意の残基に付加される。なおも他の態様では、Ｔａｔペプチドは、ＴＥＡＤ結合活性に干渉することなくペプチドの任意の残基に付加される。
【００２１】
いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６個のシステイン残基を含む。他の態様では、ペプチドは、１、２、３、４、５または６つのＣｙｓ残基を含む。
【００２２】
いくつかの態様では、ペプチドは、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）（式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸である）を含むか、それを含むように変異されるか、またはそれを含むようにグラフトされる。さらなる態様では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）中のＸ１およびＸ２は、ＥＡ、ＩＣ、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ（式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸である）を含むか、それを含むように変異されるか、またはそれを含むようにグラフトされる。さらなる態様では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ中のＸ１およびＸ２は、ＥＡ、ＩＣ、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｌ２３、Ｌ２６およびＦ２７位に変異を含む。他の態様では、ペプチドは、Ｇ１５、Ｙ２３、Ｅ２５、Ｇ２８およびＰ４０位に変異を含む。なおも他の態様では、ペプチドは、Ｇ１５、Ｙ２３およびＰ４０位に変異を含む。
【００２３】
なおも他の態様では、ペプチドは、Ｐ４０位に変異を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｇ１５Ｑ、Ｙ２３Ｉ、Ｅ２５Ｄ、Ｇ２８ＫおよびＰ４０Ｗからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｅ２５Ｄ、Ｇ２８ＫおよびＰ４０Ｗを含む。
【００２４】
いくつかの態様では、ペプチドは、負荷電残基の１つまたは複数の領域を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、正荷電残基の１つまたは複数の領域を含む。いくつかの態様では、ペプチド配列は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８個の残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０または少なくとも８１個の残基を含む。
【００２５】
いくつかの態様では、ペプチドは、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、気泡タンパク質、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ｐＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシン阻害因子（ＣＴＩ）、ＥＧＦエピレギュリンコア、ハイナントキシン、セラホトキシン、ヘキサトキシン、オピカルシン、インペラトキシン、デフェンシンおよびインセクトトキシンからなる群を含むかまたはそれに由来する。
【００２６】
いくつかの態様では、ペプチドは、ヒトタンパク質またはペプチドを含むかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも１つの他のペプチドを有する多量体構造に配置される。さらなる態様では、多量体構造は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を含む。
【００２７】
いくつかの態様では、ペプチドは、約３．０〜約１０．０の範囲内の等電点を含む。他の態様では、ペプチドは、約４．５〜約８．９の範囲内の等電点を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、不均一な電荷分布を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、生理学的または細胞内ｐＨ価で安定している。他の態様では、ペプチドは、約７または７．５のｐＨで安定している。なおも他の態様では、ペプチドは、約６．５〜７．５のｐＨで安定している。なおも他の態様では、ペプチドは、約５．０以下、約３．０以下または約３．０〜約５．０の範囲内のｐＨ価で安定している。他の態様では、ペプチドは、約５．０〜約７．０の範囲内のｐＨ価で安定している。いくつかの態様では、ペプチドは、疎水性コアを含む。
【００２８】
いくつかの態様では、ペプチドは、プロテアーゼ分解に対して耐性である。さらなる態様では、プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つである。他の態様では、ペプチドは、還元に対して耐性であるか、または還元性環境において安定している。
【００２９】
さらなる態様では、還元または還元性環境は、ＤＤＴまたはＧＳＨを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、高温で安定している。いくつかの態様では、ペプチドは、細胞膜に浸透できる。いくつかの態様では、ペプチドは、抗がん効果を示す。いくつかの態様では、ペプチドは、１つまたは複数の化学修飾を含む。さらなる態様では、化学修飾は、ペプチドの半減期を延長するかまたはその薬物動態を修飾する。いくつかの態様では、化学修飾は、ペプチドのＮ末端をブロックしている。いくつかの態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化またはアシル化である。
【００３０】
いくつかの態様では、化学修飾は、１つもしくは複数のリジン残基またはその類似体のメチル化、Ｎ末端のメチル化、または１つもしくは複数のリジン残基またはその類似体のメチル化およびＮ末端のメチル化である。他の態様では、ペプチドは、アシル付加物に連結される。
【００３１】
いくつかの態様では、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲート、連結または融合される。さらなる態様では、活性薬剤は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端でペプチドにコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの態様では、活性薬剤は、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃまたは一本鎖Ｆｖである。他の態様では、ペプチドは、Ｆｃドメインにコンジュゲートされるか、連結されるか、融合されるか、または埋め込まれる。いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の活性薬剤は、ペプチドに連結される。
【００３２】
さらなる態様では、ペプチドは、切断可能リンカーまたはｐＨ感受性リンカーを介して活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、リンカーにより、ペプチドのＮ末端、内部リジン残基のεアミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボン酸またはＣ末端で活性薬剤に連結される。他の態様では、組成物は、非天然アミノ酸をさらに含み、非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換である。
【００３３】
他の態様では、ペプチドは、リンカーにより、非天然アミノ酸で活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、炭酸結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合または炭素−窒素結合を含む。いくつかの態様では、切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む。他の態様では、リンカーは、加水分解的に不安定なリンカーである。
【００３４】
なおも他の態様では、ペプチドは、切断不能リンカーを介して活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、活性薬剤は、抗がん剤である。さらなる態様では、活性薬剤は、オーリスタチン、ＭＭＡＥ、メイタンシノイド、ＤＭ１、ＤＭ４、ドキソルビシン、カリケアマイシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＳＮ−３８、ＢＡＣＥ阻害剤、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、ＷＥＨＩ−５３９、ベネトクラクス、ＡＢＴ−１９９、ナビトクラクス、ＡＴ−１０１、オバトクラクス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体またはドラスタチンである。
【００３５】
他の態様では、組成物は、ペプチドに結合される半減期修飾剤をさらに含む。いくつかの態様では、半減期修飾剤は、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニンおよびセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸およびセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸またはアルブミンに結合する分子を含む。
【００３６】
いくつかの態様では、組成物は、ペプチドに結合される検出可能薬剤をさらに含む。一部の態様では、検出可能薬剤は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端でペプチドにコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の検出可能薬剤は、ペプチドに連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、切断可能リンカーを介して検出可能薬剤に連結される。他の態様では、ペプチドは、リンカーにより、ペプチドのＮ末端、内部リジン残基のεアミンまたはＣ末端で検出可能薬剤に連結される。いくつかの態様では、組成物は、非天然アミノ酸をさらに含み、非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換である。
【００３７】
他の態様では、ペプチドは、リンカーにより、非天然アミノ酸で検出可能薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合または炭素−窒素結合を含む。いくつかの態様では、切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む。
【００３８】
なおも他の態様では、ペプチドは、切断不能リンカーを介して検出可能薬剤に連結される。いくつかの態様では、検出可能薬剤は、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体または放射性核種キレート剤である。いくつかの態様では、検出可能薬剤は、蛍光色素である。
【００３９】
様々な態様において、本開示は、上述した組成物のいずれかまたはその塩と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、医薬組成物は、対象への投与のために製剤化される。いくつかの態様では、医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与またはそれらの組み合わせのために製剤化される。
【００４０】
様々な態様において、本開示は、病状の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、上述した組成物のいずれかまたは上述した医薬組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの態様では、組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内投与、腹腔内、腫瘍内またはそれらの組み合わせによって投与される。他の態様では、組成物は、ボーラス、注入または持続注入として静脈内投与される。
【００４１】
いくつかの態様では、組成物または医薬組成物は、ＴＥＡＤとのＹＡＰの相互作用を妨害する。いくつかの態様では、組成物または医薬組成物は、ＹＡＰがＴＥＡＤに結合することを妨げる。他の態様では、組成物または医薬組成物は、ＴＥＡＤへの結合についてＹＡＰと競合する。いくつかの態様では、組成物または医薬組成物は、ＴＥＡＤに結合する。いくつかの態様では、組成物または医薬組成物は、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路において発がん遺伝子を阻害する。
【００４２】
いくつかの態様では、組成物または医薬組成物は、細胞によって内在化される。他の態様では、組成物または医薬組成物は、標的細胞の細胞膜に浸透する。いくつかの態様では、病状は、糖尿病である。他の態様では、病状は、がんまたは腫瘍である。さらなる態様では、がんは、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、卵巣がん、脳がんまたは肺がんである。
【００４３】
いくつかの態様では、がんは、ＨＩＰＰＯ経路における変異に関連する。いくつかの態様では、病状は、無制御な細胞成長または調節不全のＨＩＰＰＯ経路を含む。いくつかの態様では、組成物または医薬組成物は、１日に複数回、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に１回、２週間に１回または１ヶ月に１回もしくは３ヶ月に１回投与される。他の態様では、組成物は、１日に１回、１週間に１回または１ヶ月に１回皮下投与される。
【００４４】
いくつかの態様では、ＴＥＡＤに結合できるペプチドを設計する方法は、ａ）コンピュータプログラムを使用して、最適化された安定性および折り畳みを有するペプチドをペプチドのライブラリーから同定するステップであって、ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも３つのジスルフィド架橋剤を含む、ステップと、ｂ）コンピュータプログラムを使用してペプチド：ＴＥＡＤ複合体からの結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせて、結合パッチをペプチド上にグラフトした後にＴＥＡＤに結合する安定なペプチドを判定するステップと、ｃ）結合パッチをペプチド上にグラフトして、安定なペプチドを製造するステップとを含む。いくつかの態様では、方法は、部位飽和変異誘発を実施して、安定なペプチドよりも高いＴＥＡＤに対する結合親和性を有する変異ペプチドを得るステップをさらに含む。他の態様では、ペプチドのライブラリーからのペプチドは、２０〜５５アミノ酸残基長である。追加的な態様では、方法は、ｅ）コンピュータプログラムを使用して、最適化された安定性および折り畳みを有するペプチドをペプチドのライブラリーから同定するステップであって、ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、細胞浸透が可能である、ステップと、ｆ）コンピュータプログラムを使用して変異ペプチド：ＴＥＡＤ複合体からの結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせて、結合パッチをペプチド上にグラフトした後にＴＥＡＤに結合する新しいペプチドを判定するステップと、ｇ）結合パッチを変異ペプチド上にグラフトして、新しいペプチドを製造するステップとを含む、細胞浸透が可能であるペプチドを設計するステップをさらに含む。
【００４５】
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願があたかも具体的かつ個別に参照により援用されているかのように参照により本明細書に援用される。
【００４６】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより、官庁によって提供されるであろう。本発明の新規特性は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、その中で本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明およびその添付図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】製造されたビオチン化ＴＥＡＤおよびシデロカリン融合ＹＡＰの検証および機能解析を図示する。図１Ａ：シデロカリン−ＹＡＰのサンプルに対応する５５ｋＤａ付近のバンドを有するＳＤＳ−ＰＡＧＥを図示する。図１Ｂ：シデロカリン融合ＹＡＰは、ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに５７０ｎＭの解離定数（ＫＤ）で結合することを示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データを図示する。図１Ｃ：表面係留ＹＡＰ（５０−１７１）を発現するＨＥＫ−２９３細胞は、右側のピークに対応する、ビオチン化ＴＥＡＤに結合したストレプトアビジンにコンジュゲートされたＡｌｅｘａフルオロフォア（ＡＦ）−６４７（ＡＦ６５７−ストレプトアビジン）によって染色されることを図示する。ヒトトランスフェリン受容体に対する特異的リガンドであるマチュポウイルス（ＭＡＣＶ）糖タンパク質を発現する細胞は、ＡＦ−６４７によって染色されず、これは、ＴＥＡＤが左のピークに対応するＭＡＣＶに結合しないことを示唆する。
【図２】表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターは、別の部分またはタンパク質へのペプチド−ＴＥＡＤ結合およびノットペプチド結合などのタンパク質−タンパク質相互作用を同定および評価するための有効な哺乳類提示法をどのように提供するかを図示する。図２Ａ：ＳＤＧＦベクターの概略図を示す。細胞質ゾルのＮ末端ＧＦＰは、ヒトＦａｓＬの膜貫通ドメインを介してペプチドの細胞外ドメインに連結される。ウシロドプシンＣ９タグおよび／または短いリンカーを使用して、ＦａｓＬ膜貫通ドメインおよびペプチドのＮ末端が連結され得る。ノッチンペプチドまたは任意の組換え、操作もしくは設計されたペプチドをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のペプチドまたはペプチドライブラリーが、目的のタンパク質への結合についてこの方法を用いてスクリーニングされ得る。ＧＦＰ−エラフィン融合ペプチドへのエラスターゼの結合が一例としてここに示される。例におけるエラスターゼなどの目的のタンパク質は、細胞に蛍光または検出可能なシグナルを付与してタンパク質結合またはタンパク質−ペプチド相互作用を示す蛍光標識などの検出可能な部分でタグ付けまたは染色され得る。図２Ｂ：ＳＤＧＦ−エラフィンを発現するＨＥＫ−２９３懸濁細胞は、ＡＦ６４７コンジュゲートエラスターゼによって染色されることを示すフローサイトメトリーヒストグラムを図示する（最も右側のピークによって示される）。ＳＤＧＦ−ＹＡＰ（５０〜１７１）またはＳＤＧＦ−ＭＡＣＶ糖タンパク質のいずれかを発現する細胞を用いた陰性対照実験は、ＡＦ６４７エラスターゼによって染色されない（最も左に重なるピークによって示される）。
【図３−１】設計または操作されたペプチドのライブラリーをＴＥＡＤ結合についてスクリーニングすることを図示する。図３Ａ：タンパク質結合についてＳＤＧＦペプチドライブラリーを評価するためのスクリーニングステップの概略図を示す。図３Ｂ：ｘ軸上にペプチドコンストラクト発現（例えば、ＧＦＰ融合ペプチドまたはペプチドライブラリー）の蛍光を示し、ｙ軸上にペプチドに結合した目的の標的タンパク質またはパートナータンパク質（例えば、ＡＦ６４７で染色されたＴＥＡＤ）を示すフローサイトメトリープロットを図示する。二重陽性細胞（右上四分円）は、ＴＥＡＤなどの標的タンパク質または目的のタンパク質に結合したペプチド発現細胞を示す。ＨＥＫ−２９３細胞は、ＳＤＧＦ  ＴＥＡＤバインダーペプチドライブラリーで形質導入され、２００ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジン−ＴＥＡＤで染色された。フローサイトメトリープロットは、未分類の細胞、１、２または３回の選別後に分類された細胞を示す。図３Ｃ：スクリーニングおよび選別（「入力」）前の各ライブラリーメンバーの存在量と対比した、１、２、３および４ラウンド後の各ライブラリーメンバーの存在量をプロットするＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定データを図示する。ｘ軸は、濃縮スコア（入力存在量と対比した相対存在量のｌｏｇ２比）を示し、ｙ軸は、ｌｏｇ２  Ｐ値（スチューデントのｔ検定を用いて判定された）を示す。データは、三重反復試験サンプルから示されている。読み取りが大量であったライブラリーメンバーは、より大きい円のデータ点として表される。所与のデータ点を表す円の面積は、サンプル中の読み取りの量に比例する。図３Ｄ：ｘ軸にコンストラクト発現（ＧＦＰ）を示し、ｙ軸にＴＥＡＤ（ＡＦ６４７）を示すフローサイトメトリープロットを図示する。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴＥＡＤに結合したペプチド発現細胞を示す。ＨＥＫ−２９３懸濁細胞は、ＳＤＧＦベクターにクローニングされたスクリーンからのヒットで形質移入され、２００ｎｍのＡＦ６４７−ストレプトアビジン−ＴＥＡＤで染色された。試験されたペプチドには、配列番号１、配列番号２および配列番号３のペプチドが含まれた。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【図４−１】配列番号１および配列番号２のペプチドの構造ならびに配列番号１および配列番号２のペプチドの構造と重ね合わせたＹＡＰと界面を接するモデル化ＴＥＡＤを図示する。図４Ａ：ＹＡＰならびに配列番号１および配列番号２のペプチドは、同一部位（部位２）でＴＥＡＤに結合すると予測されることを図示する。ＹＡＰ−ＴＥＡＤ構造（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ：３ＫＹＳ）は、構造バイオインフォマティクス研究共同体（ＲＣＳＢ）から入手可能である。配列番号１および配列番号２のペプチドの構造がＴＥＡＤ構造上にモデル化された。図４Ｂ：配列番号２のＳＤＧＦ−Ｌ２３Ａ変異型（配列番号２の２３位のリジンからアラニンへの変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｃ：配列番号２のＳＤＧＦ−Ｌ２６Ａ変異型（配列番号２の２６位のリジンからアラニンへの変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｄ：配列番号２のＳＤＧＦ−Ｆ２７Ａ変異型（配列番号２の２７位のフェニルアラニンからアラニンへの変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｅ：配列番号２のＳＤＧＦ−６ｘＣＳ変異型（６個全てのシステインがセリンに変異している配列番号２の変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｆ：配列番号４のペプチド（配列番号１の２５位のグルタミン酸からアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｅ２５Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｇ：配列番号６のペプチド（配列番号１の３３位のメチオニンからアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｍ３３Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｈ：配列番号５のペプチド（配列番号１の３７位のロイシンからアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｌ３７Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｉ：配列番号７のペプチド（配列番号１の３８位のフェニルアラニンからアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｆ３８Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図４Ｊ：配列番号１８４のペプチド（６個全てのシステインがセリンに変異している配列番号１の変異型である、配列列番号１のＳＤＧＦ−６ｘＣＳ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。
【図４−２】同上
【図４−３】同上
【図５−１】可溶性ＴＥＡＤ結合ペプチドおよびその変異型のＴＥＡＤへの結合を図示する。ゲルは、最終容積の１０分の１のＮｕＰＡＧＥ中で還元条件にあるペプチドを示し、ＤＴＴは、５０ｍＭである。ＨＰＬＣは、４０ｍＭの最終ＤＴＴ濃度を有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中の還元条件にあるペプチドを示す。非還元条件は、「ＮＲ」として示され、還元条件は、「Ｒ」として示される。図５Ａ：非還元条件または還元条件で処理された配列番号１のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示する。図５Ｂ：非還元（ＮＲ）条件下またはＤＴＴによる還元（Ｒ）条件における配列番号１のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図５Ｃ：３１ｎＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号１のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを図示する。図５Ｄ：非還元条件または還元条件で処理された配列番号５のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示する。図５Ｅ：非還元条件下またはＤＴＴによる還元条件における配列番号５のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図５Ｆ：２８０ｎＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号５のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを図示する。図５Ｇ：非還元条件または還元条件で処理された配列番号７のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示する。図５Ｈ：非還元条件下またはＤＴＴによる還元条件における配列番号７のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図５Ｉ：２３μＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号７のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを図示する。図５Ｊ：非還元条件または還元条件で処理された配列番号３のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示する。図５Ｋ：非還元条件下またはＤＴＴによる還元条件における配列番号３のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図５Ｌ：１２μＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号３のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを図示する。
【図５−２】同上
【図６】ＹＡＰ−ＴＥＡＤと配列番号１の可溶性ペプチドとの相互作用の妨害を評価する免疫共沈降アッセイの結果を図示する。図６Ａ：配列番号１または配列番号７のペプチドの存在下において、ＦＬＡＧ−ＹＡＰがＭｙｃ−ＴＥＡＤ樹脂またはビーズによって沈降しなかったことを示す銀染色（上側パネル）およびウエスタンブロット（下側パネル）を図示する。図６Ｂ：Ｍｙｃ−ＴＥＡＤ樹脂またはビーズへのＦＬＡＧ−ＹＡＰ結合の用量依存的阻害を例証する、配列番号１のペプチドの希釈系列を示すウエスタンブロットを図示する。図６Ｃ：図６Ｂからプロットされた定量化濃度測定データを示す。誤差棒は、１回の実験における１サンプル当たり４レーンのシグナルの定量化からの標準偏差を示す。Ｍｙｃ−ＴＥＡＤビーズによって沈降したＦＬＡＧ−ＹＡＰの量は、ウエスタンブロットにおける各サンプルのＭｙｃ−ＴＥＡＤシグナルに対して正規化された。
【図７】ＴＥＡＤに対する結合活性が改善されている配列番号１の変異型の部位飽和変異誘発スクリーニングの結果を図示する。フローサイトメトリープロットは、ｘ軸上のペプチドコンストラクト発現の蛍光（ＧＦＰ）およびｙ軸上のＴＥＡＤ（ＡＦ６４７）を示す。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴＥＡＤに結合したペプチド発現細胞を示す。「ＳＳＭ０１」と標識されたパネルは、ペプチド変異型の全ライブラリーで形質導入された細胞を示す。図７Ａ：配列番号１のペプチドを単独で発現するＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図７Ｂ：ビオチン化ＴＥＡＤの非存在下でＡＦ６４７−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号１のペプチドを発現するＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図７Ｃ：選別前における、ＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図７Ｄ：１回の選別後における、ＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図７Ｅ：２回の選別後における、ＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図７Ｆ：２回の選別後における、ビオチン化ＴＥＡＤの非存在下でＡＦ６４７−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。
【図８−１】部位飽和（ＳＳＭ）変異誘発スクリーニングにおいて生成された配列番号１の変異型の各位置における濃縮スコアおよびペプチドまたは変異型ペプチドとＴＥＡＤとの間の結合界面の構造モデルを図示する。図８Ａ：ＳＳＭスクリーニングにおいて生成された配列番号１のペプチドの変異型のマトリックスを図示する。ｘ軸は、２回の選別後における、ｙ軸上の全ての置換非システイン残基と対比した配列番号１のペプチドの配列を示す。濃縮スコア（入力量と対比した、２回の選別後の相対量のｌｏｇ２変化）をグレースケールで示す。陽性または高い濃縮スコア（より薄い灰色）は、置換に対してより耐性のある残基に対応する。陰性またはより低い濃縮スコア（より濃い灰色）は、結合に重要である残基などの置換に対して耐性がより低い残基に対応する。本明細書で開示されるように、アミノ酸残基位置カウントは、Ｎ末端ＧＳを含まない。図８Ｂ：グレースケール上の濃淡強度が各残基または位置における平均濃縮スコアと相関する、配列番号１−ＴＥＡＤ界面のモデルを図示する。陽性またはより高い濃縮スコア（より薄い灰色）は、置換に対してより耐性のある残基に対応する。陰性またはより低い濃縮スコア（より濃い灰色）は、結合に重要である残基などの置換に対して耐性がより低い残基に対応する。これらの残基は、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を遮断することが所望されるペプチド中に保持されることが最も重要であり、置換に対してより耐性のある残基は変動し得る。黒色は、システイン残基を指す。本明細書で開示されるように、アミノ酸残基位置カウントは、Ｎ末端ＧＳを含まない。
【図８−２】同上
【図８−３】同上
【図９】ＳＳＭによって配列番号１のペプチドにおいて同定された濃縮変異の組み合わせは、改善されたＴＥＡＤ結合をもたらしたことを示す。図９Ａ：ＴＥＡＤ結合を評価するために使用された染色プロトコルの概略図を示す。「通常」および「追加洗浄」プロトコルは、いずれも２０ｎＭのＴＥＡＤを使用した。図９Ｂ：ＳＤＧＦ−配列番号１、ＳＤＧＦ−配列番号９（配列番号１のＱＩＤＫＷ変異型）およびＹＡＰを発現するＨＥＫ−２９３懸濁細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。五文字コード（例えばＱＩＤＫＷ）は、残基１５（ＧまたはＱ）、２３（ＹまたはＩ）、２５（ＥまたはＤ）、２８（ＧまたはＫ）、４０（ＰまたはＷ）における配列番号１のペプチドの変異型に相当する。図９Ｃ：図９Ｂに示される「スライス」ゲートに入る細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量化を図示する。ｘ軸は、試験された変異型を示し、全てのＭＦＩ値は、配列番号１のペプチドに対するＭＦＩ値に対して正規化された。ｘ軸上の標識群の陰影付けは、例えば、ＸＸＤＫＷ（最も左側の群）、ＸＸＤＧＷ（中央の群）、ＸＸＤＫＰ（最も右側の群）など、変異型に見いだされる変異のクラスタ化を表す。
【図１０−１】可溶性ペプチドとしての配列番号１のペプチドの変異型によるＴＥＡＤへの結合を図示する。非還元条件は、「ＮＲ」として示され、還元条件は、「Ｒ」として示される。図１０Ａ：非還元（ＮＲ）または還元（Ｒ）条件における配列番号９の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図示する。図１０Ｂ：非還元または還元条件における配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図１０Ｃ：ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤへの配列番号９のペプチドの結合を示すＳＰＲデータを図示する。配列番号９のペプチドについてのＳＰＲ実験は、単一サイクル動態解析によって行われ、ＫＤは、３６８ｐＭであると判定された。図１０Ｄ：非還元（ＮＲ）または還元（Ｒ）条件における配列番号１０の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｅ：非還元または還元条件における配列番号１０のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図１０Ｆ：ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤへの配列番号１０のペプチドの結合を示すＳＰＲデータを図示する。配列番号１０のペプチドについてのＳＰＲ実験は、単一サイクル動態解析によって行われ、ＫＤは、３７２ｐＭであると判定された。図１０Ｇ：非還元（ＮＲ）または還元（Ｒ）条件下における配列番号１１の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｈ：非還元または還元条件における配列番号１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図１０Ｉ：ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤへの配列番号１１のペプチドの結合を示すＳＰＲデータを図示する。配列番号１１のペプチドについてのＳＰＲ実験は定常状態解析によって実施され、ＫＤは、３．８ｐＭであると判定された。
【図１０−２】同上
【図１１−１】配列番号１の可溶性ペプチドを用いたＹＡＰのＴＥＡＤへの結合の阻害と比較した、配列番号９の可溶性ペプチドを用いたＹＡＰのＴＥＡＤへの結合の阻害を図示する。図１１Ａ：ＳＤＧＦ−ＹＡＰで形質移入され、０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭの配列番号１のペプチドと共にインキュベートされ、５ｎＭのビオチン化ＴＥＡＤおよび５ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションがそれに続いたＨＥＫ−２９３懸濁液細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図１１Ｂ：ＳＤＧＦ−ＹＡＰで形質移入され、０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭの配列番号９のペプチドと共にインキュベートされ、５ｎＭのビオチン化ＴＥＡＤおよび５ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションがそれに続いたＨＥＫ−２９３懸濁液細胞を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図１１Ｃ：図１１Ａおよび図１１Ｂに示される「スライス」ゲート（ＹＡＰ−ＴＥＡＤ結合を表す）に入る細胞のＭＦＩを定量化する用量反応曲線を示す。細胞は、５ｎＭのＴＥＡＤで染色されたため、５ｎＭ未満のＴＥＡＤ染色の用量は、ＩＣ５０またはＫｉ判定に関連があるデータを提供しない。図１１Ｄ：５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。細胞は、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで即座に染色され、ＴＥＡＤに結合したＹＡＰ発現細胞について分析された。図１１Ｅ：５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。細胞は、氷上で１時間インキュベートされ、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色され、ＴＥＡＤと結合したＹＡＰ発現細胞について分析された。図１１Ｆ：５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。細胞は、１００ｎＭの配列番号１のペプチドと共に氷上で１時間インキュベートされ、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色され、ＴＥＡＤに結合したＹＡＰ発現細胞について分析された。図１１Ｇ：５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。細胞は、１００ｎＭの配列番号９のペプチドと共に氷上で９時間インキュベートされ、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色され、ＴＥＡＤに結合したＹＡＰ発現細胞について分析された。
【図１１−２】同上
【図１２】還元剤の存在下におけるＴＥＡＤ結合ペプチドの安定性を図示する。図１２Ａ：非還元条件または１０ｍＭ  ＤＴＴ還元条件における配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。ＨＰＬＣクロマトグラムの下に、ＤＴＴへの曝露後における配列番号９の様々なピークを示す全イオンクロマトグラムがある。代表的な質量分析ピークプロファイルは、全イオンクロマトグラムの下に示される。図１２Ｂ：１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中でのインキュベーションを伴うまたは伴わない配列番号１および配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。
【図１３】ＳＤＧＦ−配列番号９を発現する細胞を還元剤に曝露した後におけるＴＥＡＤへの結合を図示する。図１３Ａ：ＳＤＧＦ−配列番号１（ＧＦＰ）で形質移入され、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴまたは１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中で５分間インキュベートされてから、２０ｎＭビオチン化ＴＥＡＤで染色され、洗浄がそれに続き、次に２０ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンと共にインキュベートされたＨＥＫ−２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図１３Ｂ：ＳＤＧＦ−配列番号９（ＧＦＰ）で形質移入され、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴまたは１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中で５分間インキュベートされてから、２０ｎＭビオチン化ＴＥＡＤで染色され、洗浄がそれに続き、次に２０ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンと共にインキュベートされたＨＥＫ−２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを図示する。図１３Ｃ：図１３Ａおよび図１３Ｂに示される「スライス」ゲート内に入る細胞のＡＦ６４７  ＭＦＩの定量化を図示する。
【図１４】配列番号９のペプチドのプロテアーゼ耐性を図示する。図１４Ａ：５００Ｕトリプシン（Ｔ）と共にインキュベートされ、次にトリプシンインヒビター（Ｉ）でクエンチされ、非還元（ＮＲ）条件または１０ｍＭ  ＤＴＴによる還元（Ｒ）条件に置かれた後の配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。図１４Ｂ：図２Ａに示されるＳＤＧＦベクターの変異型であるが、柄内の全ての塩基性および芳香族残基が除去されてトリプシン／キモトリプシン切断が防止され、６×Ｈｉｓタグ（配列番号２８４）がペプチドのＣ末端に付加されているＳＤＰＲベクターの概略図を示す。説明の目的で一例として、エラフィンが示される。図１４Ｃ：プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドおよび０または４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間形質移入され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。図１４Ｄ：ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチドおよび０または４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間形質移入され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。図１４Ｅ：ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドおよび０または４０μｇ／ｍｌのキモトリプシンで２０分間形質移入され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。図１４Ｆ：プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチドおよび０または４０μｇ／ｍｌのキモトリプシンで２０分間形質移入され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを図示する。図１４Ｇ：いずれも様々な濃度のトリプシンと共にインキュベートされたＳＤＰＲ−ＳＫペプチド形質移入細胞と、ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチド形質移入細胞とを比較したフローサイトメトリーデータの定量化を図示する。図１４Ｈ：いずれも様々な濃度のキモトリプシンと共にインキュベートされたＳＤＰＲ−ＳＫペプチド形質移入細胞と、ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチド形質移入細胞とを比較したフローサイトメトリーデータの定量化を図示する。
【図１５】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験の結果を示す。図１５Ａ：様々な濃度における配列番号１の結合を図示する、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｂ：単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを図示する。図１５Ｃ：様々な濃度における配列番号５の結合を図示する、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｄ：単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを図示する。図１５Ｅ：様々な濃度における配列番号７の結合を図示する、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｆ：単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを図示する。図１５Ｇ：様々な濃度における配列番号８の結合を図示する、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｈ：単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを図示する。図１５Ｉ：様々な濃度における配列番号１１の結合を図示する、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｊ：単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを図示する。
【図１６】本開示のペプチドのＴＥＡＤへの結合を図示する、ＳＰＲ実験からのデータを図示する。図１６Ａ：単一サイクル動態プロトコルを用いた、ＴＥＡＤへの配列番号９の結合を図示する。図１６Ｂ：単一サイクル動態プロトコルを用いた、ＴＥＡＤへの配列番号１０の結合を図示する。図１６Ｃ：定常状態動態プロトコルを用いた、ＴＥＡＤへの配列番号１１の結合を図示する。
【図１７】ＴＥＡＤ結合ペプチドを同定するための哺乳類表面提示スクリーニングを図示する。図１７Ａ：表面提示ＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを用いたスクリーニングストラテジーのスキームを図示する。ベクター中において、ＦａｓＬ−ＴＭは、ＦａｓＬタンパク質の膜貫通ドメインである。この図は、スクリーニングストラテジーが例えば配列番号２８９〜配列番号３０４のいずれか１つなどのジスルフィド安定化ペプチドのライブラリーから開始できることを図示する図１７Ｂ：タンパク質データバンク（ＰＤＢＩＤ）３ＫＹＳからのＹＡＰ−ＴＥＡＤ構造についてのモデル化ＴＥＡＤ界面を図示する。図１７Ｃ：図１７ＡのＴＥＡＤ構造を用いてモデル化された配列番号１のモデル化ＴＥＡＤ界面を示す。図１７Ｄ：図１７ＡのＴＥＡＤ構造を用いてモデル化された配列番号２のモデル化ＴＥＡＤ界面を示す。図１７Ｅ：モデル化ＴＥＡＤ界面に見いだされる部位にアラニン置換変異体を提示する細胞（ＳＤＧＦ−配列番号４、ＳＤＧＦ−配列番号６、ＳＤＧＦ−配列番号５およびＳＤＧＦ−配列番号７）と比較して、表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）−配列番号１で形質移入された２９３Ｆ細胞のＴＥＡＤ結合能力を図示する。全てのＣｙｓがＳｅｒ（６ＣＳ）に変換されてジスルフィド結合が排除されている変異型（配列番号１８４）も試験された。結合は、フローサイトメトリーを用いて形質移入細胞中のＡｌｅｘａ６４７レベルを定量化することによって評価された。示されているのは、親ペプチドを提示している細胞について正規化された中央値±９５％信頼区間である。図１７Ｆ：モデル化ＴＥＡＤ界面に見いだされる部位にアラニン置換変異体を提示する細胞（ＳＤＧＦ−配列番号３９、ＳＤＧＦ−配列番号４０、ＳＤＧＦ−配列番号４１およびＳＤＧＦ−配列番号４２）と比較して、表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）−配列番号２で形質移入された２９３Ｆ細胞のＴＥＡＤ結合能力を図示する。全てのＣｙｓがＳｅｒ（６ＣＳ）に変換されてジスルフィド結合が排除されている変異型（配列番号１８５）も試験された。結合は、フローサイトメトリーを用いて形質移入細胞中のＡｌｅｘａ６４７レベルを定量化することによって評価された。示されているのは、親ペプチドを提示している細胞について正規化された中央値±９５％信頼区間である。
【図１８】配列番号９が核内のＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体を有意に減少させることを図示する。図１８Ａ：ＹＡＰおよび８×ＧＴＩＩＣ（ＴＥＡＤルシフェラーゼレポーター）で同時形質移入された、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチド融合コンストラクトの一部として細胞質ゾルに直接発現された配列番号１または配列番号９の相対発光単位を図示する。これは、２４ウェルプレートウェル内で実施され、２９３Ｔ細胞が５０ｎｇのＦＬＡＧ−ＹＡＰ、３００ｎｇの８×ＧＴＩＩＣおよび１００または２５０ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチドプラスミドで形質移入された。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．００５対ＹＡＰ単独。図１８Ｂ：ウエスタンブロットによる、ＤＴＴ還元時のｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチドコンストラクトＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル移動度シフト中のＦＬＡＧタグ付き配列番号７、ＦＬＡＧタグ付き配列番号１、ＦＬＡＧタグ付き配列番号９またはＦＬＡＧタグ付き配列番号１７７（抗ＦＲＡＧＭ２抗体）を図示する。未切断融合タンパク質のサイズに対応するバンドが示される。配列番号１７７は、その中で６つ全てのシステインがセリンに変異して非被酸化性スルフヒドリルを模倣する配列番号９−６ｘＣＳである。図１８Ｃ：エンドソーム漏出を誘導する５μＭのｄｆＴＡＴを用いてＨｅＬａ細胞の細胞質ゾル／核に導入された配列番号９−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８を図示する。配列番号９−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８は、ＦＩＴＣチャネルに見られた一方、ｄｆＴＡＴは、ＴＲＩＴＣチャネルに見られた（図１８Ｄ）。図１８Ｄ：エンドソーム漏出を誘導する５μＭのｄｆＴＡＴを用いてＨｅＬａ細胞の細胞質ゾル／核に導入された配列番号９−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８を図示する。ｄｆＴＡＴは、ＴＲＩＴＣチャネルに見られた一方、配列番号９−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８は、ＦＩＴＣチャネルに見られた（図１８Ｃ）。図１８Ｅ：ＨｅＬａ細胞における近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を図示する。ＹＡＰおよびＴＥＡＤに対する一次抗体を用いて、ＤＡＰＩ染色された核（ＵＶチャネル）と重なるスペックル（ＡＰＣチャネル）を生成した。５μＭのｄｆＴＡＴのみで処理された細胞の代表的な画像が示される。図１８Ｆ：ＨｅＬａ細胞における近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を図示する。ＹＡＰおよびＴＥＡＤに対する一次抗体を用いて、ＤＡＰＩ染色された核（ＵＶチャネル）と重なるスペックル（ＡＰＣチャネル）を生成した。５μＭのｄｆＴＡＴおよび５μＭの配列番号９で処理された細胞の代表的な画像が示される。図１８Ｇ：一部のスペックルがＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体に対して非特異的である、抗ＹＡＰ一次抗体が省略されている対照近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）反応の代表的な画像を示す。図１８Ｈ：一部のスペックルがＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体に対して非特異的である、抗ＴＥＡＤ一次抗体が省略されている対照近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）反応の代表的な画像を示す。図１８Ｉ：５μＭのｄｆＴＡＴおよび／または５μＭのＴＥＡＤ結合ペプチドで処理されたＨｅＬａ細胞の１つの核当たりＹＡＰ：ＴＥＡＤ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）スペックルの自動計数のドットグラフを図示する。各ドットは、単一の核を表し、バーは、中央値±９５％信頼区間を表す。非特異的スペックルに帰せられる近似値を表す、２つの抗体省略サンプルの平均スペックルカウントの合計に線が引かれた。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１対任意の他のサンプル。全てのＰは、両側Ｔ検定によって判定された。
【図１９】配列番号１の変異型の部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーを図示する。このライブラリーは、改善されたＴＥＡＤバインダーを含む。図１９Ａ：配列番号１の結合プロファイルを図示する。配列番号１の結合は、明らかであるが、２０ｎＭのＴＥＡＤ濃度および２段階染色結合条件下で弱かった。図１９Ｂ：ＴＥＡＤとそれに続くストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７とで染色された未分類部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーの結合プロファイルを図示する。図１９Ｃ：ＴＥＡＤとそれに続くストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７とで染色された１回選別部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーの結合プロファイルを図示する。図１９Ｄ：ＴＥＡＤとそれに続くストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７とで染色された２回選別部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーの結合プロファイルを図示する。図１９Ｅ：ＴＥＡＤなしでストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７のみで染色された図１９Ｄの集団の結合プロファイルを示す。
【図２０】配列番号９および配列番号９の変異型が極度な加熱に対して安定していることを図示する。図２０Ａ：構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証する配列番号９の円二色性スペクトルならびにこの二次構造シグネチャは、９５℃でのインキュベーション前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）で同一であることを図示する。挿入図：２０℃から９５℃への加熱間における２２０ｎｍでの相対楕円率。図２０Ｂ：構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証する配列番号１０の円二色性スペクトルならびにこの二次構造シグネチャは、９５℃でのインキュベーション前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）で同一であることを図示する。挿入図：２０℃から９５℃への加熱間における２２０ｎｍでの相対楕円率。図２０Ｃ：構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証する配列番号１１の円二色性スペクトルならびにこの二次構造シグネチャは、９５℃でのインキュベーション前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）で同一であることを図示する。挿入図：２０℃から９５℃への加熱中の２２０ｎｍでの相対楕円率。図２０Ｄ：ペプチドのＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ融解アッセイを図示する。２０℃から９５℃への加熱中の相対蛍光単位（ｄＲＦＵ／ｄｔｅｍｐ）の変化の勾配が示される。ヒトシデロカリン（ＨｕＳｃｎ）は、そのＲＦＵのピーク対温度勾配によって解釈されるように、７９℃の予想融解温度を実証した。逆に、試験された３つのペプチド（配列番号９、配列番号１０および配列番号１１）では、融解温度が判定され得なかった。
【図２１】表面提示されたＹＡＰを発現するストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７染色細胞を有するビオチン化ＴＥＡＤを図示する。図２１Ａ：Ｈｉ５昆虫細胞において産生されたＴＥＡＤを図示する。図２１Ｂ：ウシロドプシンＣ９タグおよびペプチドを含む表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターのカートゥーン図を示す。図２１Ｃ：抗Ｃ９−Ａｌｅｘａ６４７で染色された表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）対照ペプチドで形質移入されたＨＥＫ−２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（２９３Ｆ）細胞の懸濁液のフローサイトメトリープロファイルを図示する。図２１Ｄ：対照タンパク質（ビオチン化ＴｆＲ外部ドメイン）と同時インキュベートされた後と比較して、ビオチン化ＴＥＡＤと同時インキュベートされた後、ＳＤＧＦ−ＹＡＰで形質移入された２９３Ｆ細胞がストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７によって染色されることを図示する。
【図２２】配列番号２（ＴＢ２Ｇ１）の可溶性ペプチドが複数のジスルフィド結合パターンを有することを図示する。非還元型（ＮＲ）および１０ｍＭ  ＤＴＴ還元型（Ｒ）ＴＢ２Ｇ１ペプチドの逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）トレースは、還元前の複数の化学種を示唆する。それらは、ジスルフィド結合の除去時に同一移動度を有することから、１つのペプチド産物のみが存在し、異なる化学種は、異なるジスルフィド結合パターンで存在するペプチドである可能性が高い。
【図２３】図１８ＢのｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ＦＬＡＧ−ペプチドコンストラクト（ＦＬＡＧ−配列番号７、ＦＬＡＧ配列番号１、ＦＬＡＧ配列番号９またはＦＬＡＧ配列番号１８４）からの完全抗ＦＬＡＧ  Ｍ２ウエスタンブロットを図示する。２９３Ｔ細胞は、５００ｎｇのコンストラクトで形質移入された。ウエスタンブロットによって示されるように、無傷の融合物であるが、切断されていない可溶性ペプチドが２９３Ｔ細胞溶解産物中に見いだされた。顕著なバンドは、無傷のｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチドの予想サイズに対応する。ボックスは、可溶性タグ無しペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、Ｔ２ａ切断型のＦＬＡＧタグ付きペプチドが泳動すると予想される領域を示す。ＮＲ：非還元型。ＤＴＴ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填する直前に添加された５ｍＭ  ＤＴＴ。ＵＴＦ：非形質移入２９３Ｔ溶解産物。
【図２４】ＴＥＡＤ結合ＫＤ判定のための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡分析適合曲線を図示する。この分析法は、これらのペプチドの別個のオン速度およびオフ速度が、ＳＰＲ機器が解決できるよりも速かったために用いられた。図２４Ａ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡分析を用いた配列番号１のＫＤを図示する。図２４Ｂ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡分析を用いた配列番号５のＫＤを図示する。図２４Ｃ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡分析を用いた配列番号７のＫＤを図示する。
【図２５−１】非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）条件下におけるＴＥＡＤ結合細胞浸透性ペプチド融合物（ＣＰＰ融合物）およびタンデムシステイン高密度ペプチド（タンデムＣＤＰ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示する。試験されたＣＰＰ融合物は、配列番号９６、配列番号９５、配列番号８５、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１１、配列番号１００、配列番号９４、配列番号１０９、配列番号９８および配列番号１０８であった。試験されたタンデムＣＤＰは、配列番号１３４、配列番号１２４、配列番号１１７、配列番号１２５、配列番号１３２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１３０および配列番号１３８であった。ＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰを１ｍＬ培養物中で小規模に製造し、ＴＥＶ切断してペプチド（図２５の下のバンド）をシデロカリン担体（図２５の中央のバンド）から分離した。未切断融合タンパク質は、最上部のバンドとして出現する。この図は、配列番号１３４、配列番号１２５および配列番号１１９における配列ＧＧＧＳ（配列番号２０３）のスペーサーの使用を示す。
【図２５−２】同上
【図２６】左から右へハドルカルシン（配列番号１７０）、インペラトキシン（配列番号１６９）、オピカルシン−２（配列番号１７３）、クロロトキシン（配列番号１７６）、ＴＥＡＤバインダー（配列番号９）、配列番号９５および配列番号９６のＣＰＰ融合物および配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２４、配列番号１２５および配列番号１３４のタンデムＣＤＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示する。
【図２７】Ｈａｌｏアッセイを用いて細胞浸透性について評価されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡画像を示す。左上の画像は、１μＭのＨＴ（タンパク質なし）を含む試験溶液で処理された細胞の蛍光を示す。右上の画像は、緩衝液のみで処理された細胞の蛍光を示す。左下の画像は、１μＭのＨＴ配列番号９（左下）で処理された細胞の蛍光を示す。右下の画像は、１μＭのＨＴ配列番号１２４（右下）で処理された細胞の蛍光を示す。配列番号１２４のペプチド（右下）は、高い細胞浸透性を示した。
【図２８】ＨｅＬａ細胞の赤色チャネルにおける平均蛍光の細胞毎の定量化を図示する。細胞は、ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ）なしで（図示されない；０細胞浸透性スコア（ＣＰＳ）として較正に使用された）、１μＭのＨＴ（グラフには示されない；１ＣＰＳとして較正に使用された）、１μＭのＨＴ−配列番号９（対照ＴＥＡＤバインダー）、１μＭの配列番号９４、１μＭのＨＴ−配列番号９５、１μＭのＨＴ−配列番号９６、１μＭのＨＴ−配列番号１１９、１μＭのＨＴ−配列番号１２４、１μＭのＨＴ−配列番号１２５または１μＭのＨＴ−配列番号１３４と共にインキュベートされた。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路は、がん発生、腫瘍進行および転移において重要である接触阻害、細胞密度調節、細胞増殖、臓器のサイズおよび成長（器官形成）ならびに組織恒常性において重要な役割を果たす（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＹＡＰ  ａｎｄ  ＴＡＺ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｋｅｙ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｉｐｐｏ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｓｅｐ；２３（７）：７８５−９３、Ｓａｎｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｊｕｎ  ２５；５８（１２）：４８５７−７３．）。この経路は、多くのヒトがんならびに肝臓がん、膵臓がん、結腸がん、卵巣がん、乳がん、脳がんおよび肺がん、黒色腫、髄芽腫ならびに糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）をはじめとする、無制御な細胞成長に関連する他の疾患において多くの場合に調節不全であるが、それは、調節不全が細胞増殖の増加、アポトーシスおよび分化の減少、組織過成長ならびに腫瘍発生をもたらし得るためである。例えば、ＨＩＰＰＯ経路は、骨肉腫、肝細胞がん、悪性中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腎臓がん、胆管がん、胆管過誤腫、軟部組織がん、卵巣がん、結腸腺腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、消化器肥大、皮膚がん、線維肉腫、膵管異形成、扁平上皮がん、カポジ肉腫およびＨＩＶ誘発性非ホジキンリンパ腫において、調節不全であり得る。
【００４９】
ＨＩＰＰＯ経路の構成要素は、脊椎動物および哺乳類において進化的に保存されている。哺乳類では、ＨＩＰＰＯ経路は、Ｍｓｔ１またはＭｓｔ２が関与するコアキナーゼカスケードを伴い、それは、アダプタータンパク質ＷＷ４５と複合体を形成して、キナーゼＬＡＴＳ１およびＬＡＴＳ２ならびにアダプタータンパク質ＭＯＢをリン酸化する。ＬＡＴＳ／ＭＯＢ複合体は、次に、転写活性化補助因子Ｙｅｓ関連タンパク質（ＹＡＰ）およびＴＡＺをリン酸化し抑制し得る。ＹＡＰのリン酸化は、ＹＡＰユビキチン化と引き続く分解とを促進し得る。ＦＥＲＭドメインタンパク質Ｍｅｒｌｉｎ／ＮＦ２およびＦＲＭＤ６、結合接合部タンパク質ＺＯ−２およびＡＪＵＢ、極性複合体タンパク質Ｃｒｕｍｂｓ、アンギオモチン、ＳｃｒｉｂｂｌｅおよびＫＩＢＲＡならびにタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡおよびＡＳＰＰ１などの様々な他のタンパク質および複合体が複数の点でＹＡＰタンパク質レベルを調節する。ＹＡＰは、発がん遺伝子のように機能し、その過剰発現は、いくつかのヒトがんに関与するため、ＹＡＰの厳密な調節は、生理学的に重要である。ＹＡＰ発現および核局在化の増加は、腫瘍進行に関連する（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＹＡＰ  ａｎｄ  ＴＡＺ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｋｅｙ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｉｐｐｏ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｓｅｐ；２３（７）：７８５−９３、Ｓａｎｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｊｕｎ  ２５；５８（１２）：４８５７−７３）。
【００５０】
ＹＡＰは、転写活性化補助因子であり、ＨＩＰＰＯ経路における臓器成長および細胞増殖の重要な調節因子である。ＹＡＰは、ＥｒｂＢ４、Ｒｕｎｘ２、ＴＥＡＤおよびｐ７３など、細胞成長の促進においてＹＡＰの生物学的機能を媒介するいくつかの転写因子と相互作用する。ＹＡＰの下流の様々な遺伝子を活性化することにより、ＹＡＰが遺伝子発現および細胞成長を刺激するのに必要であることから、ＴＥＡＤは、ＹＡＰの最も強力な標的の１つである。ＹＡＰは、ＴＥＡＤに結合し、ＹＡＰ依存性遺伝子誘導を媒介する。例えば、ＹＡＰおよびＴＥＡＤ間の相互作用は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）を活性化し得る。ＹＡＰとＴＥＡＤとの間の相互作用を妨害し得る阻害剤は、がんまたは糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）などのＨＩＰＰＯ経路および／または細胞成長の調節異常に関連する他の疾患を予防および／または治療する強力なアプローチを提供する。（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＹＡＰ  ａｎｄ  ＴＡＺ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｋｅｙ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｉｐｐｏ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｓｅｐ；２３（７）：７８５−９３、Ｓａｎｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｊｕｎ  ２５；５８（１２）：４８５７−７３）。本明細書に記載されるように、ＴＥＡＤは、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４またはそれらの断片、組換えタンパク質、相同体もしくは変異型であり得る。
【００５１】
ＨＩＰＰＯ経路は、転写活性化補助因子ＹＡＰおよび転写因子ＴＥＡＤ（１〜４）の核内相互作用に依存する。この経路は、傷害からの回復でも重要な役割を果たし、例えば、その調節された抑制は、肝細胞が分裂して部分的な肝切除で失われた組織を置換することを可能にし、その後、その活性化は、細胞成長を抑制して組織過成長を予防する。タンパク質−タンパク質相互作用を介して細胞成長シグナル伝達を標的化する薬物を設計することは、困難であることが実証されているが、これは、タンパク質−タンパク質相互作用の標的化が効率的な細胞内送達およびときに核内送達を必要とするためである。抗体は、細胞外または細胞表面エピトープを標的化するのに有効であり得る一方、ＹＡＰと、ＴＥＡＤまたはＴＥＡＤと、他のタンパク質との間の相互作用などの細胞内および核内標的は、一般に抗体が細胞膜に侵入して細胞質ゾルおよび核標的タンパク質にアクセスできないため、抗体ベースの治療に適さない。
【００５２】
細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を妨害し得る治療剤を発見することは、難易度が高いことがあり得るが、これは、そのような方法が、高い特異性または標的化、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害し得る高親和性バインダー、標的化タンパク質に作用するために細胞または核に侵入する能力、オフターゲットへの低い有害作用を必要とするためである。いくつかの例外を除いて、小分子ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニング作戦は、ＹＡＰ−ＴＥＡＤなどのより大きいタンパク質−タンパク質界面を破壊できる特異的な高親和性バインダーを提供できなかった。
【００５３】
ＴＥＡＤなどの目的の標的タンパク質に結合し、したがってＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用または細胞内の他のタンパク質とのＴＥＡＤ相互作用を妨害し得るペプチドと、ペプチドをスクリーニングする方法とが本明細書に記載されている。ペプチド結合が目的の標的タンパク質とその天然のバインダーもしくは基質との間の結合の阻害または妨害をもたらすように、同じ方法を適用して、任意の他の標的タンパク質もしくは受容体または任意の目的のタンパク質に結合するペプチドも同定され得る。標的タンパク質の例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、レプチン受容体（ＯｂＲ）などの受容体およびアポリポタンパク質Ｅ３（ＡｐｏＥ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
本明細書に記載されているのは、タンパク質−タンパク質相互作用を妨害するのに十分大きいが、細胞質ゾルもしくは核のような細胞区画または固形腫瘍の中央などの一般にまたは多くの場合に抗体が到達できない組織にアクセスするのに十分小さい、設計または操作されたペプチド、組換えペプチドおよび小型ジスルフィド−ノットペプチド（ノッチンまたはノットペプチド）などであるが、これに限定されるものではないペプチドである。例としては、筋小胞体リアノジン受容体の活性化剤であるカルシンと、広範囲の腫瘍型に蓄積できるペプチド−フルオロフォアコンジュゲートまたは融合物であるＢＬＺ−１００とが挙げられる。ＹＡＰ−ＴＥＡＤ界面は、構造的に特徴が明確であるため（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ：３ＫＹＳ，  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＹＡＰ  ａｎｄ  ＴＥＡＤ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、本開示は、いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤに結合してＹＡＰが結合することを妨害できるペプチドを同定するための、３Ｄタンパク質複合体構造に基づくタンパク質設計アプローチを提供する。
【００５５】
本開示の追加的な態様および利点は、本開示の例示的な実施形態が示され記載される以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。理解されるであろうように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、いずれも本開示から逸脱することなく、そのいくつかの詳細は、様々な点で変更可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
【００５６】
本明細書の用法では、天然Ｌ−鏡像異性アミノ酸の略号は、従来通りであり、次のようである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。典型的に、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であり得る。
【００５７】
本開示は、配列中のアミノ酸残基およびアミノ酸残基の位置に言及する。本明細書で言及されるように、位置は、「Ｘ位」と称され得、Ｘは、存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えない配列中の位置番号である。例えば、配列番号１（ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＣＫＫＧＤＩＱＣＣＬＲＹＦＥＥＳＧＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＣＰ）の１５位は、配列中の１５位の「Ｇ」残基を指し、１位は、Ｎ末端「ＧＳ」を数えず、したがって、１位は、Ｐ残基である。別の例として、配列番号２（ＧＳＬＥＲＬＫＫＣＣＮＱＧＬＤＣＥＥＡＲＷＫＣＥＬＥＡＬＦＱＧＫＮＲＥＴＣＬＥＥＣ）の１０位は、配列中の１０位の「Ｑ」残基を指し、１位は、Ｎ末端の「ＧＳ」を数えず、したがって、１位は、Ｌ残基である。さらに別の例として、配列番号４３（ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＣＫＫＧＤＩＱＣＣＬＲＹＦＥＥＳＧＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＣＰ）の１０位は、配列中の１０位の「Ｅ」残基を指し、１位は、最初のＰ残基であり、Ｎ末端ＧＳは、存在しない。本明細書でも言及されるように、位置は、「ＸＹ」と称され得、Ｘは、アミノ酸の一文字略語であり、Ｙは、存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えない配列中の位置番号である。例えば、Ｇ１５は、存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えずに配列中の１５位の「Ｇ」残基を指す。別の例として、Ｙ２３は、存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えずに配列中の２３位の「Ｙ」残基を指す。さらに別の例として、Ｅ２５は、存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えずに配列中の２５位の「Ｅ」残基を指す。本明細書でも言及されるように、位置は、「ＸＹＺ」と称され得、ＸおよびＺは、アミノ酸の一文字略語であり、Ｙは、存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えない配列中の位置番号である。例えば、Ｌ２３Ａは、（存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えない）配列中の２３位の「Ａ」残基で置換されている「Ｌ」残基を指す。別の例として、Ｅ２５Ａは、（存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えない）配列中の２５位の「Ａ」残基で置換されている「Ｅ」残基を指す。さらに別の例として、Ｆ２７Ａは、（存在する場合、Ｎ末端ＧＳを数えない）配列中の２７位の「Ａ」残基で置換されている「Ｆ」残基を指す。
【００５８】
本開示のいくつかの実施形態は、任意の標準もしくは非標準アミノ酸またはその類似体のＤアミノ酸残基を考察する。アミノ酸配列が一連の三文字または一文字のアミノ酸略称として表される場合、標準的用法および慣例に従って左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方向である。
【００５９】
ペプチド
本明細書で開示されているのは、ＴＥＡＤに結合できるか、またはＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用、他のタンパク質とのＴＥＡＤ相互作用、ＹＡＰおよびＴＥＡＤの相同体、誘導体もしくは変異型間の相互作用を妨害できる、表１に列挙されるものなどのペプチド配列である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、がん性細胞もしくは腫瘍細胞、肝細胞、膵臓細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞および／もしくは肺細胞またはそれらの任意の組み合わせなどの標的細胞に浸透または侵入し得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞の核に侵入して遺伝子の転写活性を調節し得る。他の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ＴＥＡＤへの結合についてＹＡＰと競合するか、またはＴＥＡＤへの結合からＹＡＰを置換する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ＴＥＡＤまたはその変異型、相同体もしくは誘導体に結合する。他の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、ＴＥＡＤとＴＡＺなどの他のタンパク質または活性化補助因子との間の相互作用を妨害または阻害できる。本明細書に記載されるように、ＴＥＡＤまたは任意の目的タンパク質への結合に対する「競合」またはペプチド競合は、立体障害、ＴＥＡＤの結合部位の占有、塩橋または疎水性相互作用などの非共有相互作用、架橋、共有結合相互作用、ＴＥＡＤの隔離、核への局在化を妨げるＴＥＡＤへの結合およびそれらの任意の組み合わせを包含するが、これに限定されるものではない。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤへのＹＡＰの結合と比較して等しいか、類似しているか、またはより高い親和性（より低い解離定数ＫＤＤ）でＴＥＡＤに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ＹＡＰの解離定数と比較して類似しているか、同一であるか、もしくは等しいか、またはより低い解離定数でＴＥＡＤに結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または０．１ｎＭ未満のＫＤを有し得る。他の実施形態では、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ界面における１つまたは複数の保存残基も本明細書に記載のペプチド中に存在する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ界面に見られる残基でＴＥＡＤに結合する。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤに結合するペプチドは、ＴＥＡＤに結合することが知られているタンパク質または補因子の結合界面または配列において少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性または少なくとも９９％の相同性を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ＴＥＡＤと少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性または少なくとも９９％の相同性を含む目的のタンパク質、その断片、相同体または変異型に結合する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４またはそれらの任意の組み合わせをはじめとする４つのＴＥＡＤ相同体のいずれにも結合し得る。他の実施形態では、ペプチドは、１つ、１つ以上、２つ、２つ以上、３つ、３つ以上または４つ全てのＴＥＡＤ相同体に結合できる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ＴＥＡＤと、ＴＥＡＤとの相互作用が知られている任意の他のタンパク質または補因子との間の結合を防止または妨害し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ＴＥＡＤとＴＡＺとの間の結合を防止または妨害し得、それによって発がん効果または下流発がん遺伝子の転写を防止または低減し得る。ＹＡＰおよびＴＡＺは、２つの周知のＴＥＡＤ結合転写補助因子である。ＴＥＡＤへのＴＡＺ結合は、ＴＥＡＤへのＹＡＰ結合と類似しており、ＴＥＡＤと類似したタンパク質−タンパク質界面またはタンパク質結合相互作用を有し、それは、配列番号１およびその誘導体または変異型（例えば、配列番号９または配列番号１〜配列番号８４のいずれか）によって遮断され得、ロイシン−Ｘ１−Ｘ２−ロイシン−フェニルアラニン（ＬＸ１Ｘ２ＬＦ、配列番号２１７）を含有し、式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸であり得、またはロイシン−Ｘ１−Ｘ２−ロイシン−フェニルアラニン（ＬＸ１Ｘ２ＬＦ、配列番号２１７）モチーフを含有し得、式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）中のＸ１Ｘ２は、配列番号２に示されるようなＥＡまたは配列番号１に示されるようなＩＣであり得る。他の実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）中のＸ１Ｘ２は、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣでもあり得る。ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）は、ＴＡＺおよびＹＡＰの両方に存在し、それは、アミノ酸
【化１】
2020505326.tif 000003
を含むらせん中に見いだされる。いくつかの実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ中のＸ１Ｘ２は、配列番号２に示されるようなＥＡまたは配列番号１に示されるようなＩＣであり得る。他の実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ中のＸ１Ｘ２は、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣでもあり得る。ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフは、ＴＡＺおよびＹＡＰの両方に存在し、そのモチーフは、アミノ酸
【化２】
2020505326.tif 000004
を含むらせん中に見いだされる。ＴＡＺも、ＹＡＰと同じがんの多くに関与しているが、あまり良く研究されていない。（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＹＡＰ  ａｎｄ  ＴＡＺ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｋｅｙ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｉｐｐｏ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｓｅｐ；２３（７）：７８５−９３、Ｓａｎｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｊｕｎ  ２５；５８（１２）：４８５７−７３）。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ＴＥＡＤと任意のＴＥＡＤ結合相同体またはＴＥＡＤ結合部分との間の結合を防止または妨害し得る。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合または相互作用を妨害するペプチドは、ＬＸ１Ｘ２ＬＦの配列（配列番号２１７）またはその変異型を含む。他の実施形態では、核酸、ベクター、プラスミドまたはドナーＤＮＡは、本開示のペプチドまたはその変異型もしくは断片をコードする配列を含む。さらなる実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）は、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つの配列のペプチド上にグラフトされ得る。ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）は、ペプチドに沿った任意の位置でペプチド上にグラフトされ得る。この位置は、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）が結合に利用できるように最適化され得る。例えば、それは、折り畳まれたときにペプチドの表面にある二次構造中の位置でペプチド配列にグラフトされ得る。代わりに、位置は、ＴＥＡＤに対するより高い結合親和性および／またはより良好な拮抗性ＴＥＡＤ機能に従って最適化され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤとＹＡＰとの間またはＹＡＰと他の任意のタンパク質との間の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤがタンパク質−タンパク質相互作用をすることを妨げ、かつ／または細胞核へのＴＥＡＤの局在化を妨げる。場合により、ペプチドは、不活性化ＴＥＡＤである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤの分解を引き起こし、またはＴＥＡＤが細胞核に局在化することを妨げ、またはＴＥＡＤがＹＡＰもしくはＹＡＰ様タンパク質と相互作用することを妨げ得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤ中の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合することにより、ＴＥＡＤとＹＡＰの間またはＹＡＰと他の任意のタンパク質の間の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤ中の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合することにより、ＴＥＡＤがタンパク質−タンパク質間相互作用することを妨げ、かつ／または細胞核へのＴＥＡＤの局在化を妨げる。場合により、ペプチドは、ＴＥＡＤ中の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合することによってＴＥＡＤを不活性化する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＥＡＤ中の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合することによってＴＥＡＤの分解を引き起こし、またはＴＥＡＤが細胞核に局在化することを妨げ、またはＴＥＡＤがＹＡＰもしくはＹＡＰ様タンパク質と相互作用することを妨げ得る。さらに、ペプチドは、特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合するその能力に基づいて、さらなる試験または使用のために選択され得る。ＴＥＡＤ中の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフは、ＴＥＡＤのＹＡＰへの結合に関与するアミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列として同定され得る。特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフは、ＹＡＰ：ＴＥＡＤ複合体の結晶構造から同定され得る。例えば、ＴＥＡＤアミノ酸残基Ｆ３１４、Ｋ３１６、Ｖ３１８、Ｙ３４６、Ｆ３５０、Ｋ３５３、Ｖ３６６またはそれらの任意の組み合わせは、配列番号１に結合するようにモデル化されたＹＡＰ：ＴＥＡＤ結晶構造に基づいて、本明細書で開示されるようなペプチドに結合するＴＥＡＤの標的残基であり得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはペプチドのライブラリーは、天然のノッチンスキャフォールドからの誘導なしにコンピュータを用いて設計される。他の実施形態では、ペプチドまたはペプチドのライブラリーは、誘導、関連もしくは重要なタンパク質結合残基もしくは保存残基のタンパク質結合界面へのグラフト、または目的のタンパク質もしくは受容体に結合することが知られている天然のペプチドもしくはタンパク質に基づく構造モデル化により、コンピュータを用いて設計される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、配列番号１を有するペプチドは、付加、欠失またはアミノ酸置換をはじめとするさらなる修飾のためのスキャフォールドまたは塩基配列として使用される。いくつかの実施形態では、残基ＧＳがペプチドのＮ末端に付加される。場合により、ペプチドは、Ｎ末端にＧＳを欠いている。場合により、ペプチドは、１つまたは複数の翻訳後修飾を被る。
【００６８】
表１は、本開示による例示的ペプチド配列を列挙する。
【００６９】
【表１】
2020505326.tif 000005
【００７０】
【表２】
2020505326.tif 000006
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤに結合するペプチドは、８位にＡｌａ、１６位にＡｓｐ、１７位にＳｅｒ、２３位にＭｅｔ、３８位にＰｈｅまたはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的な重要な残基については、図８を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＬＸ１Ｘ２ＦＥＸＳ（配列番号２１８）、ＬＸ１Ｘ２ＦＥＸＳＸＤＰＮＶＭＬ（配列番号２１９）またはＬＸ１Ｘ２ＦＥＸＳＸＤＰＮＶＭＸ３Ｘ４ＬＦ（配列番号２２０）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、任意のアミノ酸であり得る）を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ロイシン−Ｘ１−Ｘ２−ロイシン−フェニルアラニン（「ＬＸ１Ｘ２ＬＦ」、配列番号２１７）（式中、Ｘ１およびＸ２は、配列番号１および配列番号２で示されるような任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）配列を有するペプチドは、完全なＴＥＡＤ結合を示す。いくつかの実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）配列中のＸ１Ｘ２は、配列番号２に示されるようなＥＡまたは配列番号１に示されるようなＩＣであり得る。他の実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）配列中のＸ１Ｘ２は、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣでもあり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ロイシン−Ｘ１−Ｘ２−ロイシン−フェニルアラニン（「ＬＸ１Ｘ２ＬＦ」、配列番号２１７）（式中、Ｘ１およびＸ２は、配列番号１および配列番号２で示されるような任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフを有するペプチドは、完全なＴＥＡＤ結合を示す。いくつかの実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ中のＸ１Ｘ２は、配列番号２に示されるようなＥＡまたは配列番号１に示されるようなＩＣであり得る。他の実施形態では、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフ中のＸ１Ｘ２は、ＥＣ、ＭＣ、ＶＣまたはＦＣでもあり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１１、１２、１３、１４、１９、２０、２１、２２、３６、３８、３９、４１位の１つまたは複数にシステイン残基を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１１、１２、１９、２０、３６、３９位またはそれらの任意の組み合わせにＣｙｓを含む。例えば、特定の実施形態では、ペプチドは、１１位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、１２位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、１３位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、１４位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、１９位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、２０位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、２１位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、２２位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、３６位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、３８位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、３９位にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、４１位にシステイン残基を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、配列中の第１のシステイン残基は、配列中の第４のシステイン残基とジスルフィド結合し得、配列中の第２のシステイン残基は配列中の第５のシステイン残基とジスルフィド結合し得、配列中の第３のシステイン残基は配列中の第６のシステイン残基とジスルフィド結合し得る。必要に応じて、ペプチドは、「ツーアンドスルー」構造系としても知られている、２つの別のジスルフィド架橋によって形成される環を通過する１つのジスルフィド架橋を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、セリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。例えば、配列番号９は、ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＳＫＫＱＤＩＱＳＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＳＷ（配列番号１７７）；ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＣＫＫＱＤＩＱＳＣＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＣＷ（配列番号１７８）；ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＳＫＫＱＤＩＱＣＣＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＳＷ（配列番号１７９）；ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＣＫＫＱＤＩＱＣＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＣＷ（配列番号１８０）；ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＳＫＫＱＤＩＱＳＣＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＳＷ（配列番号１８１）；ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＳＫＫＱＤＩＱＣＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＳＷ（配列番号１８２）；またはＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＣＫＫＱＤＩＱＳＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＣＷ（配列番号１８３）などのセリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。配列番号５１は、ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＳＫＫＱＤＩＱＳＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＳＷ（配列番号１８６）；ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＣＫＫＱＤＩＱＳＣＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＣＷ（配列番号１８７）；ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＳＫＫＱＤＩＱＣＣＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＳＷ（配列番号１８８）；ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＣＫＫＱＤＩＱＣＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＣＷ（配列番号１８９）；ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＳＫＫＱＤＩＱＳＣＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＣＬＦＳＷ（配列番号１９０）；ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＣＳＫＫＱＤＩＱＣＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＳＷ（配列番号１９１）；またはＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＣＫＫＱＤＩＱＳＳＬＲＩＦＤＥＳＫＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＣＷ（配列番号１９２）などのセリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。配列番号１は、ＧＳＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＳＫＫＧＤＩＱＳＳＬＲＹＦＥＥＳＧＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＳＰ（配列番号１８４）などのセリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。配列番号１は、ＰＤＥＹＩＥＲＡＫＥＳＳＫＫＧＤＩＱＳＳＬＲＹＦＥＥＳＧＤＰＮＶＭＬＩＳＬＦＳＰ（配列番号１９３）などのセリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。配列番号２は、ＧＳＬＥＲＬＫＫＳＳＮＱＧＬＤＳＥＥＡＲＷＫＳＥＬＥＡＬＦＱＧＫＮＲＥＴＳＬＥＥＳ（配列番号１８５）などのセリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。配列番号２は、ＬＥＲＬＫＫＳＳＮＱＧＬＤＳＥＥＡＲＷＫＳＥＬＥＡＬＦＱＧＫＮＲＥＴＳＬＥＥＳ（配列番号１９４）などのセリンに変異した１つまたは複数のシステインを有し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞浸透性を改善するために少なくとも１つまたは複数の標的ペプチド配列を含み得る。例えば、ペプチドは、細胞浸透性を改善するために少なくとも１つまたは複数のＡｒｇ残基またはＴａｔタンパク質由来残基を含み得る。追加的なタグペプチド配列としては、ＣｙｓＴａｔ（ＣＹＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１４４）、Ｓ１９−ＴＡＴ（ＰＦＶＩＧＡＧＶＬＧＡＬＧＴＧＩＧＧＩＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１４５）、Ｒ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号１４６）、ｐＡｎｔｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号１４７）、Ｐａｓ−ＴＡＴ（ＦＦＬＩＰＫＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１４８）、Ｐａｓ−Ｒ８（ＦＦＬＩＰＫＧＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号１４９）、ＰａｓＦＨＶ（ＦＦＬＩＰＫＧＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ；配列番号１５０）、Ｐａｓ−ｐＡｎｔＰ（ＦＦＬＩＰＫＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号１５１）、Ｆ２Ｒ４（ＦＦＲＲＲＲ；配列番号１５２）、Ｂ５５（ＫＡＶＬＧＡＴＫＩＤＬＰＶＤＩＮＤＰＹＤＬＧＬＬＬＲＨＬＲＨＨＳＮＬＬＡＮＩＧＤＰＡＶＲＥＱＶＬＳＡＭＱＥＥＥ；配列番号１５３）、ａｕｚｕｒｉｎ（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ；配列番号１５４）、ＩＭＴ−Ｐ８（ＲＲＷＲＲＷＮＲＦＮＲＲＲＣＲ；配列番号１５５）、ＢＲ２（ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＬＬＲＲＬＬＲ；配列番号１５６）、ＯＭＯＴＡＧ１（ＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲ；配列番号１５７）、ＯＭＯＴＡＧ２（ＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲＭ；配列番号１５８）、ｐＶＥＣ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ；配列番号１５９）、ＳｙｎＢ３（ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；配列番号１６０）、ＤＰＶ１０４７（ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ；配列番号１６１）、ＣＹ１０５Ｙ（ＣＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＹＬＩ；配列番号１６２）、トランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；配列番号１６３）、ＭＴＳ（ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ；配列番号１６４）、ｈＬＦ（ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ；配列番号１６５）、ＰＦＶＹＬＩ（ＰＦＶＹＬＩ；配列番号１６６）およびｙＢＢＲ（ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ、配列番号１６７）が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１４６）などのアルギニンパッチ（Ａｒｇパッチ）またはその変異型もしくは断片を含み得、配列はペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態では、Ａｒｇパッチは、２つ以上のＡｒｇ残基またはＡｒｇｎ（式中、ｎは、整数であり、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり得る）（配列番号２８６）を含む。他の実施形態では、ペプチドは、Ｔａｔペプチドを含み得る（Ｔａｔタンパク質は、Ｇｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．ＴＡＴ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００７  Ｏｃｔ；１３（１０）：４４３−８およびＨａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ���ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６；１３（１）：１６−２６で概説される）。Ｔａｔペプチドは、例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９５）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４３）の配列またはその任意の修飾、変異型または断片を有し得、本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。いくつかの実施形態では、Ｔａｔペプチド配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号１９６）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４３）またはその断片もしくは変異型であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔａｔペプチドは、Ｎ末端ＧＳジペプチドと、例えばＧＧＧＳ（配列番号２０３）などの先行するスペーサーとに続いて、本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端に付加され得る。いくつかの実施形態では、配列番号１４３〜配列番号１６７のいずれか１つなどの細胞浸透性タグペプチドは、ＧｘＳｙ（配列番号２８３）（式中、ｘおよびｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０などの任意の整数であり得る）ペプチドリンカーなどのペプチドリンカーを用いて、本明細書で開示される任意のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。他の実施形態では、ＴａｔペプチドまたはＡｒｇパッチまたは任意の他の部分などの細胞浸透性ペプチドは、ＧｘＳｙペプチドリンカー（式中、ｘおよびｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０などの任意の整数であり得る）などのペプチドリンカーを用いて、本明細書で開示される任意のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｘ（配列番号２８２）（式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０などの任意の整数であり得る）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号２０４）、ＧＧＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０６）、ＧＳＧＧ（配列番号２０７）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２０８）、ＧＧＧＳ（配列番号２０３）、ＧＧＳ（配列番号２０９）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１０）またはその変異型もしくは断片を含む。さらに、ＤｋＴｘ由来のＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号２１１）およびヒトＩｇＧ３由来のＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号２１２）がペプチドリンカーとして使用され得る。他の実施形態では、タグペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。さらなる実施形態では、タグペプチドは、ＴＥＡＤ結合活性に干渉することなく任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態では、タグペプチドは、コンジュゲーション、連結または融合技術によって付加される。他の実施形態では、Ｔａｔペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。さらなる実施形態では、Ｔａｔペプチドは、ＴＥＡＤ結合活性に干渉することなく任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態では、Ｔａｔペプチ��は、コンジュゲーション、連結または融合技術によって付加される。細胞浸透性を改善し得る追加的な例示的ＴＥＡＤバインダー−細胞浸透性ペプチド融合（ＣＰＰ融合）配列を表２に示す。
【００７５】
【表３】
2020505326.tif 000007
【００７６】
【表４】
2020505326.tif 000008
【００７７】
【表５】
2020505326.tif 000009
【００７８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質または高分子積荷の生体内送達のために、原形質膜または核に浸透できるアルギニン富化、両親媒性およびリジン富化ならびに疎水性残基またはペプチドなどの１つまたは複数の細胞浸透性ペプチドにコンジュゲート、連結または融合される。コンジュゲーションまたは融合は、直接的であるか、またはその間にスペーサーを有し得る（化学的またはペプチドベース）。スペーサーは、任意のペプチドリンカーであり得る。例えば、スペーサーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１０）、ＤｋＴｘ由来のＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号２１１）もしくはヒトＩｇＧ３由来のＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号２１２）またはその任意の変異型もしくは断片であり得る。細胞浸透性ペプチドとしては、陽性正味電荷を有し、細胞膜に浸透して、共有結合的または非共有結合的にペプチドに付着する分子または積荷を細胞に輸送できる短い両親媒性ペプチドまたはカチオン性の短いペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。このような細胞浸透性ペプチドは、ペネトラチン、Ｔａｔペプチド、ｐＶＥＣなどの既知のタンパク質；またはトランスポータン、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１’などのキメラペプチド；またはポリアルギニン、ＭＡＰおよびＲ６Ｗ３（配列番号２８７）などの合成ペプチドから合成または誘導され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞浸透性を改善するために少なくとも１つまたは複数の細胞浸透性ペプチド配列を含み得る。例えば、細胞浸透性ペプチドは、マウロカリン（ＧＤＣＬＰＨＬＫＬＣＫＥＮＫＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＩＥＫＲＣＲ；配列番号１６８）、インペラトキシン（ＧＤＣＬＰＨＬＫＲＣＫＡＤＮＤＣＣＧＫＫＣＫＲＲＧＴＮＡＥＫＲＣＲ；配列番号１６９）、ハドルカルシン（ＳＥＫＤＣＩＫＨＬＱＲＣＲＥＮＫＤＣＣＳＫＫＣＳＲＲＧＴＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１７０）、ヘミカルシン（ＧＤＣＬＰＨＬＫＬＣＫＡＤＫＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１７１）、オピカルシン−１（ＧＤＣＬＰＨＬＫＲＣＫＥＮＮＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１７２）、オピカルシン−２（ＧＤＣＬＰＨＬＫＲＣＫＥＮＮＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＡＮＰＥＫＲＣＲ；配列番号１７３）、ミッドカイン（６２−１０４）（ＣＫＹＫＦＥＮＷＧＡＣＤＧＧＴＧＴＫＶＲＱＧＴＬＫＫＡＲＹＮＡＱＣＱＥＴＩＲＶＴＫＰＣ；配列番号１７４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（ＳＧＳＤＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＣＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ；配列番号１７５）またはクロロトキシン（ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ；配列番号１７６）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、配列番号１６８〜配列番号１７６の任意の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞浸透性ペプチド配列は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、Ｎ末端ＧＳジペプチドと、例えばＧＧＧＳ（配列番号２０３）などの先行するスペーサーとに続いて、本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端に付加され得る。いくつかの実施形態では、配列番号１６８〜配列番号１７６のいずれか１つなどの細胞浸透性タグペプチドは、ＧｘＳｙ（配列番号２８３）（式中、ｘおよびｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０などの任意の整数であり得る）ペプチドリンカーなどのペプチドリンカーを用いて、本明細書で開示される任意のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳ（配列番号２０９）、ＧＧＳＳＧ（配列番号２０４）、ＧＧＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０６）、ＧＳＧＧ（配列番号２０７）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２０８）、ＧＧＧＳ（配列番号２０３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１０）またはその変異型もしくは断片を含む。さらに、ＤｋＴｘ由来のＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号２１１）およびヒトＩｇＧ３由来のＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号２１２）がペプチドリンカーとして使用され得る。他の実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。さらなる実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、ＴＥＡＤ結合活性に干渉することなく任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、コンジュゲーション、連結または融合技術によって付加される。他の実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加され得る。細胞浸透性を改善し得る追加的な例示的細胞浸透性タンデムシステイン高密度ペプチド（タンデム−ＣＤＰ）配列が表３に示される。
【００８０】
【表６】
2020505326.tif 000010
【００８１】
【表７】
2020505326.tif 000011
【００８２】
【表８】
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【００８３】
【表９】
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【００８４】
いくつかの実施形態では、核局在化シグナルが本明細書に記載のペプチドに共役、コンジュゲート、連結または融合されて、核局在化が促進され得る。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合ペプチドは、Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸またはその変異型であり得る）の四残基配列（配列番号２０２）などの核局在化シグナルにコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合ペプチドは、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１９７）またはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９８）などのＬａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７Ｆｅｂ  ２３；２８２（８）：５１０１−５に記載されるような核局在化シグナルにコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、ＫＫＲＲ（配列番号１９９）、ＫＫＫＲＲ（配列番号２００）またはＫＫＫＫ（配列番号２０１）などのＫｘＲｙ（式中、ｘおよびｙは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり得る）（配列番号２８８）を含む核局在化シグナルにコンジュゲート、連結または融合される。他の細胞浸透性部分も、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ（２−プロピルアクリル酸）、ポリ（２−エチルアクリル酸）またはそれらの任意の組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書に記載されるペプチドにコンジュゲート、連結または融合され得る。
【００８５】
他の実施形態では、ＴＡＴまたはｄｆＴＡＴは、本明細書に記載されるペプチドにコンジュゲート、連結または融合され得、連結、コンジュゲートもしくは融合ペプチドまたはタンパク質が生体内送達の経路または細胞または核に侵入する方法として、エンドサイトーシス経路を使用できるようにする。いくつかの実施形態では、ｄｆＴＡＴは、ＴＥＡＤ結合ペプチドの細胞質ゾル送達を容易にし得ると考えられる。ｄｆＴＡＴとＴＥＡＤ結合ペプチドとの共送達は、細胞内へのＴＥＡＤ結合ペプチドの細胞質ゾル取り込みを促進し得る。本明細書中に記載されるようなペプチドの効率的な細胞浸透性は、ＴＥＡＤと相互作用して、ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ転写活性化によって駆動される発がん遺伝子などの遺伝子を下方制御または抑制し得る。
【００８６】
他の実施形態では、細胞浸透性は、例えば、最大１０μＭまたは１０μＭ以上などの高用量の本明細書に記載されるペプチドを使用することによって増加され得る。場合により、Ａｒｇパッチは、ペプチドに融合、コンジュゲート、連結され得るか、またはそれと同時送達され得る。最大で１０μＭまたは１０μＭ以上のＡｒｇパッチがペプチドと同時送達されて、細胞浸透性が促進され得る。タンパク質形質移入因子も使用されて、ペプチドの細胞浸透性が増大され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの直接的細胞質ゾル発現が使用され得る。他の実施形態では、電気穿孔などの物理的破壊方法を用いて、ペプチドの細胞内への送達が改善され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドの細胞浸透性が改善され得る。例えば、本明細書に記載されるペプチドの結合界面は、カルシンなどの天然に細胞浸透性であるスキャフォールド上にグラフトされ得る。カルシンのいくつかの非限定的例は、インペラトキシンＡ、マウロカルシン、ヘミシン、オピクラシン１、オピカルシン２およびハドカルシンであり得る。スキャフォールドは、配列番号１６８〜配列番号１７６のいずれか１つの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞浸透性ペプチドは、細胞浸透性を高めるために使用され得るカルシン、修飾カルシン、カルシン誘導体またはそれらの断片であり得る。修飾カルシン、カルシン誘導体または断片は、筋小胞体リアノジン受容体の活性化、リアノジン感受性Ｃａ２＋チャネルＲｙＲ１、Ｒｙｒ２またはその両方に対する活性など、または前述の選択的作動薬としての細胞浸透活性についてスクリーニングされ得る。さらに、修飾カルシンは、活性を修飾して、このようなカルシンの細胞浸透活性またはＲｙＲ１またはＲｙＲ２受容体に対する活性を最適化するための、天然カルシン中のリジン残基または他の荷電残基の置換、付加または還元を含み得る。一例として、ＴＥＡＤに結合する配列番号９の主成分であり得るらせん３の６アミノ酸部分（ＭＬＩＣＬＦ；配列番号２２１）は、カルシンまたは修飾カルシンスキャフォールド上に移植されて、新規な配列番号９のＴＥＡＤ結合機能を有する、カルシンの細胞浸透性を保持する二機能性ペプチドが生成される。別の例として、本明細書に記載されるペプチドは、ＴＡＴまたはオクタ−アルギニン（配列番号１４６）のようなＫ／Ｒに富む配列の包含、らせん内アルギニンパッチまたはペネトラチンもしくはメリチンのような細胞浸透性スクリーニングにおいて同定されたタンパク質のより大きい断片への融合をはじめとするシス作用因子を用いて、細胞浸透能を改善させることができる。
【００８８】
場合により、ペプチドは、標的細胞または標的細胞の核に浸透し得る。標的細胞の例としては、がん性細胞、腫瘍およびＨＩＰＰＯ経路が調節不全になっている他の細胞型が挙げられる。標的細胞は、ヒト細胞、哺乳類細胞、ヒトまたは哺乳類細胞株、がん細胞株、生体内または生体外で対象から抽出された細胞であり得る。
【００８９】
場合により、ペプチドは、１つのリジン残基のみを含むか、またはリジン残基を含まないことができる。場合により、ペプチド中のリシン残基の一部または全部がアルギニン残基で置換される。場合により、ペプチド中のメチオニン残基の一部または全部がロイシンまたはイソロイシンによって置換される。ペプチド中のトリプトファン残基の一部または全部がフェニルアラニンまたはチロシンによって置換され得る。場合により、ペプチド中のアスパラギン残基の一部または全部がグルタミンによって置換される。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸残基の一部または全部がグルタミン酸残基によって置換され得る。場合により、ペプチドのＮ末端は、アセチル基などによってブロックされる。代わりにまたは組み合わせて、場合により、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによってブロックされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を通じて達成され得る。
【００９０】
場合により、ＧＳは、配列番号１〜配列番号４２に示されるように最初の２つのＮ末端アミノ酸として付加され得、またはこのようなＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は配列番号４３〜配列番号８４に示されるように非存在であり得、または任意の他の１つもしくは２つのアミノ酸によって置換され得る。いくつかの実施形態では、ＧＳは、リンカーとして使用され、またはタンパク質コンジュゲートもしくは融合物を作製するためにリンカーに共役させるために使用される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧｘＳｙ（配列番号２８３）ペプチド（式中、ｘおよびｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０などの任意の整数であり得る）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｘ（配列番号２８２）（式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０などの任意の整数であり得る）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号２０４）、ＧＧＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２０８）、ＧＧＧＳ（配列番号２０３）またはその変異型もしくは断片を含む。
【００９１】
場合により、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌなどの別の残基に修飾される。例えば、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、Ｉｌｅに修飾され得る。代わりに、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、任意の非天然アミノ酸に修飾され得る。この修飾は、重要な水素結合の維持をなおも可能にしながら、発現、合成、プロセシング、貯蔵中、生体外または治療中を含む生体内におけるＣ末端残基のクリッピングを防止し得る。重要な水素結合は、最初の折り畳み核形成中に形成される水素結合であり得、最初のヘアピンを形成するために重要である。
【００９２】
場合により、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つの配列を含む。ペプチドは、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６残基長、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０または少なくとも８１残基長である、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つの連続断片を含む断片であり得、ペプチド断片は、ペプチドの任意の部分から選択される。いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、追加的なアミノ酸で挟まれる。１つまたは複数の追加的なアミノ酸は、例えば、所望の生体内電荷、等電点、化学的コンジュゲーショ部位、安定性または生理学的な性質をペプチドにもたらし得る。
【００９３】
場合により、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害できるペプチドは、６０以下のアミノ酸長または５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下もしくは１０以下のアミノ酸長を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、主にβシートおよび／またはαらせん構造を含む。いくつかの実施形態では、本開示の設計または操作されたＴＥＡＤ結合ペプチドは、鎖内ジスルフィド結合（システインによって媒介される）および十分に充填された疎水性コアによって安定化された小型で緻密なミニタンパク質である。いくつかの実施形態では、操作されたＴＥＡＤ結合ペプチドは、各αらせん間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を有するらせんバンドルを含む構造を有し、それによってペプチドを安定化させる。他の実施形態では、操作されたＴＥＡＤ結合ペプチドは、バンドル中の３つの各αらせん間に３つのαらせんおよび３つの鎖内ジスルフィド結合が１つある構造を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのヘリックスターンを含む、バンドル中の１つのαらせんは、設計されたＴＥＡＤ結合ペプチドの折り畳み構造の表面にロイシン−Ｘ１−Ｘ２−ロイシン−フェニルアラニン（ＬＸ２Ｘ２ＬＦ、配列番号２１７）（式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸である）モチーフを提示し得る。ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）モチーフは、ＹＡＰ配列に見いだされる重要な結合モチーフであり、ＹＡＰとＹＡＰとの間の結合界面の中心にある。
【００９５】
他の実施形態では、ペプチドは、目的の細胞または標的細胞に対する標的化またはホーミング機能を有する担体または分子にコンジュゲート、連結または融合され得る。他の実施形態では、ペプチドは、ペプチドもしくはそれらの任意の組み合わせの半減期を延長し、またはその薬力学特性および／もしくは薬物動態特性を修飾する分子にコンジュゲート、連結または融合され得る。
【００９６】
場合により、ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０個のＡｒｇもしくはＬｙｓまたはそれらの任意の組み合わせなどの正荷電残基を含む。場合により、ペプチド中の１つまたは複数のリジン残基がアルギニン残基で置き換えられる。場合により、ペプチドは、１つまたは複数のＡｒｇパッチを含む。いくつかの実施形態では、Ａｒｇパッチは、ペプチドのＮ末端に位置する。他の態様では、Ａｒｇパッチは、ペプチドのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、Ａｒｇパッチは、８個の連続したＡｒｇ残基（配列番号１４６）を含む。場合により、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上または１０個以上のＡｒｇまたはＬｙｓ残基がペプチド上で溶媒にさらされている。いくつかの実施形態では、Ａｒｇパッチは、２つ以上の連続したＡｒｇ残基であり得る。いくつかの実施形態では、Ａｒｇパッチは、Ｌｙｓで置換された１つ以上のＡｒｇを含む。
【００９７】
本開示のペプチドは、中性アミノ酸残基をさらに含み得る。場合により、ペプチドは、３５個以下の中性アミノ酸残基を有する。他の事例では、ペプチドは、８１個以下の中性アミノ酸残基、７０個以下の中性アミノ酸残基、６０個以下の中性アミノ酸残基、５０個以下の中性アミノ酸残基、４０個以下の中性アミノ酸残基、３６個以下の中性アミノ酸残基、３３個以下の中性アミノ酸残基、３０個以下の中性アミノ酸残基、２５個以下の中性アミノ酸残基または１０個以下の中性アミノ酸残基を有する。
【００９８】
本開示のペプチドは、負のアミノ酸残基をさらに含み得る。場合により、ペプチドは、６個以下の負のアミノ酸残基、５個以下の負のアミノ酸残基、４個以下の負のアミノ酸残基、３個以下の負のアミノ酸残基、２個以下の負のアミノ酸残基または１個以下の負のアミノ酸残基を有する。負のアミノ酸残基は、任意の負荷電アミノ酸残基から選択され得るが、いくつかの実施形態では、負のアミノ酸残基は、ＥまたはＤのいずれかまたはＥおよびＤの両方の組み合わせである。
【００９９】
場合により、ペプチドは、Ｃｙｓまたはジスルフィドを含まない。場合により、ペプチドは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上または１５個以上のＣｙｓまたはジスルフィドを含む。他の実施形態では、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のＣｙｓ残基がＳｅｒ残基で置換されている。いくつかの実施形態では、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のＣｙｓ残基がＴｈｒ残基で置換されている。
【０１００】
場合により、ペプチド中のメチオニン残基の一部または全部がロイシンまたはイソロイシンによって置換される。場合により、ペプチド中のトリプトファン残基の一部または全部がフェニルアラニンまたはチロシンによって置換される。場合により、ペプチド中のアスパラギン残基の一部または全部がグルタミンによって置換される。場合により、ペプチドのＮ末端は、アセチル基などによってブロックされる。代わりにまたは組み合わせて、場合により、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによってブロックされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を通じて達成され得る。場合により、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌなどの別の残基に修飾される。例えば、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、Ｉｌｅに修飾され得る。代わりに、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、任意の非天然アミノ酸に修飾され得る。この修飾は、重要な水素結合の維持をなおも可能にしながら、発現、合成、プロセシング、貯蔵中、生体外または治療中を含む生体内におけるＣ末端残基のクリッピングを防止し得る。重要な水素結合は、最初の折り畳み核形成中に形成される水素結合であり得、最初のヘアピンを形成するために重要である。
【０１０１】
一般に、関連する構造相同体のＮＭＲ溶液構造を用いて、特定の生物学的機能を維持しながら、折り畳み、安定性、製造可能性を改善し得る変異ストラテジーの情報を提供し得る。それらを用いて、一群の構造的に相同的なスキャフォールドの３Ｄファーマコフォアが予測され、かつ関連タンパク質の可能なグラフト領域が予測されて、改善された特性を有するキメラが作製され得る。例えば、このストラテジーを用いて、改善された細胞浸透特性、ＴＥＡＤまたはＹＡＰのいずれかに対する高親和性、高度発現、生体内での高安定性またはそれらの任意の組み合わせを有するペプチドを設計するために使用され得る重要なアミノ酸位置およびループが同定される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害できるペプチドは、表１に列挙される例示的ペプチド配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列またはその断片を含む。２つ以上のペプチドがある程度の配列同一性または相同性を共有し得、生体内で類似した特性を共有し得る。例えば、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８４の任意の１つペプチドとある程度の配列同一性または相同性を共有し得る。場合により、本開示の１つまたは複数のペプチドは、最大約２０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約２５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約３０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約３５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約４０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約４５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約５０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約５５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約６０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約６５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約７０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約７５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約８０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約８５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９０％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９５％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９６％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９７％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９８％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９９％のペアワイズ配列同一性または相同性、最大約９９．５％のペアワイズ配列同一性または相同性または最大約９９．９％のペアワイズ配列同一性または相同性を有し得る。場合により、本開示の１つまたは複数のペプチドは、第２のペプチドとの少なくとも約２０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約２５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約３０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約３５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約４０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約４５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約５０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約５５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約６０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約６５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約７０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約７５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約８０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約８５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９６％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９７％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９８％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９．５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９．９％のペアワイズ配列同一性または相同性を有し得る。
【０１０３】
ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅなどの様々な方法およびソフトウエアプログラムまたは別の適切な方法またはアルゴリズムを用いて、２つ以上のペプチド間の相同性が判定され得る。ペアワイズ配列アライメントを用いて、２つの生物学的配列（タンパク質または核酸）間の機能的、構造的および／または進化的関係を示唆し得る類似性領域が同定される。対照的に、多重配列アラインメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアライメントである。ＭＳＡアプリケーションの結果から相同性が推定され、配列間の進化的関係が評価され得る。当業者は、本明細書の用法では、「配列相同性」、および「配列同一性」、および「パーセント（％）配列同一性」、および「パーセント（％）配列相同性」が同義的に使用されており、任意選択的に参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する配列の関連性または多様性を意味することを認識するであろう。
【０１０４】
場合により、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つまたはその機能的断片である。他の実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つと９９％、９５％、９０％、８５％または８０％の配列同一性または相同性を有するペプチドまたはその断片をさらに含む。
【０１０５】
他の場合、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つと相同的なペプチドまたはその機能的断片であり得る。「相同的」という用語は、本明細書では、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つの配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％を超える配列同一性または相同性を有するペプチドまたはその機能的断片を示すために使用される。
【０１０６】
なおも他の場合、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つのペプチドをコードする変異型核酸分子は、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つのアミノ酸配列と、コードされたペプチドアミノ酸配列との配列同一性または相同性の判定または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって同定され得る。配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つのこのようなペプチド変異型は、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣに相当する、高度にストリンジェントな洗浄条件下において、配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つのヌクレオチド配列（またはその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、（２）配列番号１〜配列番号８４のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％以上の配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする核酸分子として特徴付けられ得る。
【０１０７】
ノッチンペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＴＥＡＤ結合ペプチドは、ジスルフィドまたはＣｙｓを含有しない。他の実施形態では、ＴＥＡＤ結合ペプチドは、１つまたは複数のＣｙｓまたは１つまたは複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合ペプチドは、ノットペプチドまたはノッチンペプチドから誘導される。いくつかの実施形態では、このようなノットペプチドは、ＴＥＡＤと結合し得、それによってＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用などのＴＥＡＤ相互作用を妨げる。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合相互作用を妨害するペプチドは、安定性、タンパク質分解耐性、還元条件耐性および／または血液脳関門通過能力など、いくつかのノッチンペプチドの１つまたは複数の特性を含む。
【０１０８】
他の実施形態では、ノットペプチドは、表１に記載されるものなどのＴＥＡＤ結合ペプチドにコンジュゲート、連結または融合されて、がん細胞、膵臓細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞またはそれらの任意の組み合わせなどの標的細胞のホーミングまたは標的化機能が提供され得る。いくつかの実施形態では、このようなノットペプチドは、乳がん、肝臓がん、結腸がん、脳がんなどのがん細胞または腫瘍細胞を選択的に標的化またはホーミングする。いくつかの実施形態では、このようなノットペプチドは、血液脳関門を越えて、不健康なまたは罹患した細胞またはがん細胞にホーミングまたは標的化し得る。場合により、ノットペプチドは、ＴＥＡＤ結合ペプチドにコンジュゲート、連結または融合され、血液脳関門を越えてＴＥＡＤ結合ペプチドを局在化させ、ＴＥＡＤ結合ペプチドを中枢神経系内の標的細胞に送達できる。いくつかの実施形態では、このような標的化またはホーミングペプチドまたはノットペプチドを使用して、分解または不活性化のためにＴＥＡＤを標的化する、ユビキチン化または他の翻訳後修飾のためのＴＥＡＤの標的化など、分解または不活性化のために、細胞傷害性薬が標的細胞にまたは標的細胞中の標的ＴＥＡＤに送達され得る。
【０１０９】
ノッチンは、通常、約１１〜約８１アミノ酸長の範囲のペプチドのクラスであり、多くの場合に緻密型構造に折り畳まれる。ノッチンは、典型的には、いくつかの分子内ジスルフィド架橋によって特徴付けられ、β鎖、αへリックスおよび他の二次構造を含有し得る複合三次構造に組み立てられる。ジスルフィド結合の存在は、ノッチンに顕著な環境安定性を与え、それらが極端な温度およびｐＨに耐えて、血流のタンパク質分解酵素に抵抗できるようにする。ジスルフィドノットの存在は、還元剤による還元に対する耐性を提供し得る。ノッチンの剛性は、標的に結合する際に柔軟なペプチドが生じる「エントロピーのペナルティ」を支払うことなく標的に結合することも可能にする。例えば、結合は、ペプチドが標的に結合して複合体を形成する際に起こるエントロピーの損失によって悪影響を受ける。したがって、「エントロピーのペナルティ」は、結合に対する有害効果であり、この結合時に生じるエントロピーの損失が大きいほど、「エントロピーのペナルティ」もより大きくなる。さらに、可撓性の非結合分子は、複合体を形成した際に柔軟性が失われることから、堅固に構造化された分子よりも多くのエントロピーを失う。しかしながら、非結合分子の剛性は、分子が形成し得る複合体の数を制限することによって一般に特異性も増加させる。ノットペプチドは、抗体様の親和性またはナノモルもしくはピコモル親和性で標的に結合し得る。ノッチンの配列構造および配列同一性または相同性のより幅広い試験は、それらが全ての種類の動植物における収束進化によって生じたことを明らかにする。動物では、それらは、多くの場合、毒液、例えばクモおよびサソリの毒液に典型的に見いだされ、イオンチャネルの調節に関与するとされている。植物のノッチンタンパク質は、動物のタンパク質分解酵素を阻害するかまたは抗菌活性を有し得、ノッチンが植物の天然防御において機能し得ることが示唆される。
【０１１０】
本開示は、これらのノットペプチド（またはノッチン）を含み、またはそれらに由来するペプチドを提供する。本明細書の用法では、「ノットペプチド」という用語は、「ノッチン」および「ペプチド」という用語と同義であると見なされる。
【０１１１】
本開示のペプチドは、システインアミノ酸残基を含む。場合により、ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基を有する。場合により、ペプチドは、少なくとも８個のシステインアミノ酸残基を有する。他の事例では、ペプチドは、少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１２個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１４個のシステインアミノ酸残基または少なくとも１６個のシステインアミノ酸残基を有する。
【０１１２】
ノットペプチドは、ジスルフィド架橋を含み得る。ノットペプチドは、その中で残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインである、ペプチドであり得る。ジスルフィド結合ペプチドは、薬物スキャフォールドであり得る。いくつかの実施形態では、ジスルフィド架橋は、ノットを形成する。ジスルフィド架橋は、例えば、システイン１および４、２おｙび５または３および６間などのシステイン残基間で形成され得る。場合により、１つのジスルフィド架橋は、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過して例えばノットを形成する。他の場合、ジスルフィド架橋は、任意の２つのシステイン残基間に形成され得る。
【０１１３】
本開示は、ペプチドスキャフォールドをさらに含み、これは、例えば、追加的なペプチドを生成するための出発点として使用され得る。いくつかの実施形態では、これらのスキャフォールドは、様々なノットペプチド（またはノッチン）に由来し得る。特定の実施形態では、ノットペプチドは、複合三次構造に構築され、これは、いくつかの分子内ジスルフィド架橋によって特徴付けられ、必要に応じてβ鎖およびαらせんなどの他の二次構造を含有する。例えば、ノットペプチドは、いくつかの実施形態では、ジスルフィドノットを介するジスルフィドによって特徴付けられる、小さいジスルフィドに富むタンパク質を含む。このノットは、例えば、１つのジスルフィド架橋が、他の２つのジスルフィドと相互接続骨格とによって形成される大環状分子を通過する場合に得られる。いくつかの実施形態では、ノットペプチドとして成長因子システインノットまたはインヒビターシステインノットが挙げられる。他の可能なペプチド構造としては、βシートなしに２つのジスルフィド架橋によって連結される２つの平行らせんを有するペプチド（例えば、ヘプトキシン）が挙げられる。
【０１１４】
ノットペプチドは、Ｌ立体配置にある少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。ノットペプチドは、Ｄ立体配置にある少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ノットペプチドは、１５〜４０アミノ酸残基長である。他の実施形態では、ノットペプチドは、１１〜５７アミノ酸残基長である。なおも他の実施形態では、ノットペプチドは、１１〜８１アミノ酸残基長である。さらなる実施形態では、ノットペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基長である。
【０１１５】
ノットペプチドまたはペプチドは、毒素または毒液が存在するかまたはそれに関連することが知られているクラスのタンパク質に由来し得る。場合により、ペプチドは、サソリまたはクモに関連する毒素または毒液に由来し得る。ペプチドは、様々な属および種のクモおよびサソリの毒液および毒素に由来し得る。例えば、ペプチドは、レイウルス・キンクエストリアツス・ヘブラオイス（Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ）、ブツス・オシタヌス・ツネタヌス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｔｕｎｅｔａｎｕｓ）、ホッテントッタ・ジュダイクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｊｕｄａｉｃｕｓ）、メソブツス・オイポイス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｅｕｐｅｕｓ）、ブツス・オッシタヌス・イスラエリス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｉｓｒａｅｌｉｓ）、ハドルルス・ゲルトスキ（Ｈａｄｒｕｒｕｓ  ｇｅｒｔｓｃｈｉ）、アンドロクトヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、セントルロイデス・ノキシウス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ）、ヘテロメトルス・ラオチクス（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ  ｌａｏｔｉｃｕｓ）、オピストフタルムス・カリナツス（Ｏｐｉｓｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、ハプロペルマ・スクミドチ（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、イソメトルス・マクラツス（Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ハプロペルマ・フウェヌム（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｈｕｗｅｎｕｍ）、ハプロペルマ・ハイナヌム（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｈａｉｎａｎｕｍ）、ハプロペルマ・シュミドチ（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、ハイドロニク・ベルスタ（Ｈａｙｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ）、セレノコスミア・フウエナ（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａ  ｈｕｗｅｎａ）、ヘテロポダ・ベナトリア（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｄａ  ｖｅｎａｔｏｒｉａ）、グランモストラ・ロセア（Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａ）、オルニトクトヌス・フウエナ（Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓ  ｈｕｗｅｎａ）、ハドロニク・ベルスタ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ）、アトラキス・ロブスツス（Ａｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ）、アンゲレノプシス・アペルタ（Ａｎｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、サルモポオイス・カンブリドゲイ（Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ  ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ）、ハドロニク・インフェンサ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ）、パラコエロテス・ルクトスス（Ｐａｒａｃｏｅｌｏｔｅｓ  ｌｕｃｔｏｓｕｓ）およびキロブラキス・ジングズハオオル（Ｃｈｉｌｏｂｒａｃｈｙｓ  ｊｉｎｇｚｈａｏｏｒ）ならびに他の適切な属または種のサソリまたはクモに由来する毒液または毒素であり得る。場合により、ペプチドは、ブツス・マルテンシイ・カルシュ（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ  Ｋａｒｓｈ）（サソリ）毒素に由来し得る。
【０１１６】
配列同一性および相同性
配列同一性百分率または相同性は、従来法によって判定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい。簡潔に述べると、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」重み行列を用いて、２つのアミノ酸配列が整列され、アライメントスコアが最適化される。次に、配列同一性または相同性は、（［完全一致の総数］／［より長い配列長＋２つの配列を整列させるためにより長い配列に導入されたギャップ数］）（１００）として計算される。
【０１１７】
さらに、２つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在する。例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列と、ペプチド変異型のアミノ酸配列とによって共有される配列同一性または相同性のレベルを調べるのに適したタンパク質アライメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって説明されている。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、クエリー配列（例えば、配列番号１）と、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または対の同一性（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列とによって共有される領域を同定することにより、最初に配列類似性が特徴付けられる。次に、最高密度の同一性を有する１０個の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、全ての対合アミノ酸の類似性を比較することによって再スコアされ、領域の末端は、最も高いスコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」される。「カットオフ」値（配列長およびｋｔｕｐ値に基づく所定の式によって計算される）より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、トリミングされた初期領域を調べて、領域を結合させてギャップとの近似整列を形成させ得るかどうかが判定される。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコア領域が、アミノ酸の挿入および欠失を許容する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｓｉａｍ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の修正を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ分析のための例示的なパラメータは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップ延長ペナルティ＝１および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の補遺２で説明されるように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修正することにより、ＦＡＳＴＡプログラムに導入され得る。
【０１１８】
ＦＡＳＴＡを用いて、上で開示されるような比率を用いて核酸分子の配列同一性または相同性が判定され得る。ヌクレオチド配列の比較のために、ｋｔｕｐ値は、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３の範囲であり得、他のパラメータは、上記のように設定される。
【０１１９】
「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、以下の群のそれぞれにおけるアミノ酸間の置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸塩およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連タンパク質の５００を超えるグループの高度に保存された領域に相当する、タンパク質配列断片の約２，０００の局所的な多重アライメントからのアミノ酸置換マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換が定義され得る。（上で考察されるように）化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは、−１より大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、置換が０、１、２または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる場合、アミノ酸置換は、保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる一方、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２のＢＬＯＳＵＭ６２値（例えば、２または３）によって特徴付けられる。
【０１２０】
構造的完全性を維持するのに重要な領域またはドメイン内にあるアミノ酸残基の判定が決定され得る。これらの領域内では、程度の差はあるもの、変化に耐えて分子の全体的な三次構造を維持し得る特定の残基を判定し得る。配列構造を分析する方法としては、アミノ酸またはヌクレオチドの高い同一性または相同性を有する複数の配列の整列および利用可能なソフトウェア（例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ．ＲＴＭ．ｖｉｅｗｅｒ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ；ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンピュータ分析、二次構造の傾向、二成分パターン、相補的充填および埋没極性相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３７２−６（１９９５）およびＣｏｒｄｅｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３−１０（１９９６））。一般に、分子への修正を設計するかまたは特定の断片を同定する場合、構造の判定は、典型的には、修飾分子の活性を評価することを伴い得る。
【０１２１】
生理学的ｐＨでは、ペプチドは、例えば、−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４または＋５などの正味電荷を有し得る。正味電荷がゼロであれば、ペプチド非電荷または両性イオン性であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含有して、生理学的ｐＨで正の正味電荷を有し、正味電荷は、＋０．５以下、＋１以下、＋１．５以下、＋２以下、＋２．５以下、＋３以下、＋３．５以下、＋４以下、＋４．５以下、＋５以下、＋５．５以下、＋６以下、＋６．５以下、＋７以下、＋７．５以下、＋８以下、＋８．５以下、＋９以下、＋１０以下であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、生理学的ｐＨで負の正味電荷を有し、正味電荷は、−０．５以下、−１以下、−１．５以下、−２以下、−２．５以下、−３以下、−３．５以下、−４または以下、−４．５以下、−５以下、−５．５以下、−６以下、−６．５以下、−７以下、−７．５以下、−８以下、−８．５以下、−９以下、−１０以下であり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜１０の等電点（ｐＩ）値を有し得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、４．３〜８．９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜４のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜５のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３〜９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４〜５のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４〜６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４〜７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４〜８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４〜９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４〜１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５〜６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５〜７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５〜８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５〜９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５〜１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６〜７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６〜８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６〜９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６〜１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７〜８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７〜９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７〜１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、８〜９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、８〜１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、９〜１０のｐＩ値を有し得る。
【０１２３】
場合により、ペプチド内の１つまたは複数の変異の操作は、生理学的ｐＨで等電点、電荷、表面電荷またはレオロジーが変化したペプチドをもたらす。サソリまたはクモ由来のペプチドに対するこのような変異の操作は、例えば、正味電荷を１、２、３、４もしくは５低下させるか、または正味電荷を１、２、３、４もしくは５増加させることにより、複合体の正味電荷を変化させ得る。このような場合、遺伝子操作された変異は、ペプチドが細胞、エンドソームまたは核に浸透する能力を促進し得る。ペプチドのレオロジーおよび効力を改善するのに適したアミノ酸修飾は、保存的または非保存的変異を含み得る。
【０１２４】
ペプチドは、ペプチドがそれに由来する毒液または毒素構成成分の配列と比較して最大で１アミノ酸変異、最大で２アミノ酸変異、最大で３アミノ酸変異、最大で４アミノ酸変異、最大で５アミノ酸変異、最大で６アミノ酸変異、最大で７アミノ酸変異、最大で８アミノ酸変異、最大で９アミノ酸変異、最大で１０アミノ酸変異または別の適切な数の変異を含み得る。他の場合、ペプチドまたはその機能的断は、ペプチドがそれに由来する毒液または毒素構成成分の配列と比較して少なくとも１アミノ酸変異、少なくとも２アミノ酸変異、少なくとも３アミノ酸変異、少なくとも４アミノ酸変異、少なくとも５アミノ酸変異、少なくとも６アミノ酸変異、少なくとも７アミノ酸変異、少なくとも８アミノ酸変異、少なくとも９アミノ酸変異、少なくとも１０アミノ酸変異または別の適切な数の変異を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド内で変異を操作して、生理学的ｐＨにおいて所望の電荷または安定性を有するペプチドが提供され得る。
【０１２５】
一般に、ＮＭＲ溶液構造、Ｘ線結晶構造ならびに関連する構造同族体の一次構造配列アラインメントまたはコンピュータシミュレーションによる設計を用いて、特定の生物学的機能を維持しながら、折り畳み、安定性および／または製造可能性を改善し得る変異ストラテジーの情報を提供し得る。相同体またはコンピュータシミュレーションによる設計のペプチドまたはタンパク質を製造するための一般的なストラテジーは、荷電表面パッチまたはタンパク質の保存残基の同定、重要なアミノ酸位置とループの変異および配列の試験を含み得る。このストラテジーを用いて、改善された特性を有するペプチドが設計され、または折り畳みおよび製造可能性を複雑にする有害な変異が修正され得る。ペプチド配列中の他の残基が変異され、結合または細胞、もしくはエンドソーム、もしくは細胞核に浸透する能力、ホーミングまたはペプチドの別の活性などが改善、変更、除去または別の様式で修飾され得る一方、これらの重要なアミノ酸位置およびループが維持され得る。
【０１２６】
本開示は、本明細書に記載の様々なペプチドの多量体も包含する。多量体の例としては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同一サブユニットから形成されるホモマーまたは複数の異なるサブユニットから形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１つの他のペプチドまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれを超える他のペプチドを有する多量体構造に配置される。特定の実施形態では、多量体構造のペプチドは、それぞれ同一配列を有する。代替の実施形態では、多量体構造のペプチドの一部または全部が異なる配列を有する。
【０１２７】
本開示は、ペプチドスキャフォールドをさらに含み、これは、例えば、追加的なペプチドを生成するための出発点として使用され得る。いくつかの実施形態では、これらのスキャフォールドは、様々なノットペプチドまたはノッチンに由来し得る。スキャフォールドのためのいくつかの適切なペプチドとしては、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼインヒビター、バブルプロテイン、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ＰＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシンインヒビター（ＣＴＩ）およびＥＧＦエピレギュリンコアが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、追加的なアミノ酸で挟まれる。１つまたは複数の追加的なアミノ酸は、例えば、所望の生体内電荷、等電点、化学的コンジュゲーショ部位、安定性または生理学的な性質をペプチドにもたらし得る。
【０１２８】
化学修飾
ペプチドは、様々な方法の１つまたは複数で化学的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドが変異して、機能が付加されるか、機能が欠失されるか、または生体内挙動が変更され得る。例えば、本開示のペプチドは、ＴＥＡＤのプロテアソーム分解をもたらすであろう分子で化学的に修飾され得る（例えば、ユビキチンリガーゼ係合コンジュゲートもしくは融合物またはセレブロン結合分子）。ジスルフィド結合間の１つまたは複数のループを修飾または置換して、他のペプチドからの活性成分を含め得る（Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３−２５１，２０１２に記載されるように）。アミノ酸は、半減期を増加させ、生体内結合挙動を修飾、もしくは付加、もしくは欠失させ、新たな標的機能を追加し、表面電荷および疎水性を変更し、またはコンジュゲーション部位を可能にするなどのためにも変異され得る。Ｎ−メチル化は、本開示のペプチドにおいて生じ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を通じて達成され得る。
【０１２９】
化学修飾は、例えば、ペプチドの半減期を延長するか、または生体内分布もしくは薬物動態プロファイルを変化させ得る。化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、生体高分子、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミチン酸もしくはミリスチン酸などの単純飽和炭素鎖またはアルブミンを含み得る。ポリアミノ酸としては、例えば、反復される単一アミノ酸（例えば、ポリグリシン）を有するポリアミノ酸配列およびパターンに従っても従わなくてもよい混合ポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−ａｌａ）を有するポリアミノ酸配列または前述の任意の組み合わせが挙げられる。本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性および／または半減期を増加させるように修飾され得る。Ｎ末端、Ｃ末端または内部アミノ酸への疎水性部分の結合を使用して、本開示のペプチドの半減期を延長させ得る。ペプチドはまた、修飾されて、ペプチドの腸透過性または細胞透過性が増加または減少し得る。本開示のペプチドは、例えば、血清半減期に影響を及ぼし得る翻訳後修飾（例えば、メチル化、および／またはアミド化、および／またはグリコシル化）を含み得る。いくつかの実施形態では、単純炭素鎖（例えば、ミリストイル化および／またはパルミトイル化による）は、融合タンパク質またはペプチドにコンジュゲートされ、連結され得る。単純炭素鎖は、融合タンパク質またはペプチドが非コンジュゲート材料から容易に分離されるようにし得る。例えば、非コンジュゲート材料から融合タンパク質またはペプチドを分離するために用いられ得る方法としては、溶媒抽出および逆相クロマトグラフィーが挙げられるが、これに限定されるものではない。親油性部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延長させ得る。コンジュゲートされた部分は、例えば、血清アルブミンへの可逆的結合を通じてペプチドの半減期を延長させる親油性部分であり得る。いくつかの実施形態では、親油性部分は、コレステン、コレスタン、コレスタジエンおよびオキシステロールをはじめとするコレステロールまたはコレステロール誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体にコンジュゲートされ、連結され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、半減期修飾剤に結合（例えば、コンジュゲート、連結または融合）され得る。半減期修飾剤の例としては、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニンおよびセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸およびセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸またはアルブミンに結合する分子が挙げられ得るが、これに限定されるものではない。さらに、Ｃｙ５．５などの近赤外色素またはＡｌｂｕタグなどのアルブミンバインダーへのペプチドのコンジュゲーションは、本明細書中に記載されるような任意のペプチドの血清半減期を延長させ得る。いくつかの実施形態では、免疫原性は、最小限の非ヒトタンパク質配列を使用することによって低減され、ペプチドの血清半減期が延長される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜配列番号８４の最初の２つのＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子へのコンジュゲーションまたは融合を促進し、かつこのようなコンジュゲート、連結または融合された分子からの切断を容易にするためのスペーサーまたはリンカーの役割を果たす。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、例えば、ペプチドの特性を修飾するかまたは変化させ得る他の部分にコンジュゲート、連結または融合され得る。
【０１３１】
活性薬剤ペプチドコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド自体を使用してＴＥＡＤへのＹＡＰの結合が阻害され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドを使用して他の活性薬剤を送達することもできる。本開示に従ったペプチドは、腫瘍およびがんの治療で使用するための薬剤にコンジュゲート、連結または融合され得る。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、追加の機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に融合される。活性薬剤の配列とペプチドの配列とを含有するベクターの発現を通じて、ペプチドが活性薬剤と融合され得る。様々な実施形態において、ペプチドの配列および活性薬剤の配列は、同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現され得る。様々な実施形態において、ペプチドの配列および活性薬剤の配列は、連続配列を含み得る。ペプチドおよび活性薬剤は、融合ペプチドにおいて、それらの機能的能力が別々に発現された場合と比較して同様の機能的能力をそれぞれ維持し得る。特定の実施形態では、活性剤の例は、他のペプチドを含み得る。
【０１３２】
別の例として、特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に付着される。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合ペプチドは、活性薬剤を細胞内に誘導し得る。さらなる実施形態では、ＴＥＡＤ結合ペプチドは、活性薬剤を核内に誘導し得る。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、固有の腫瘍ホーミング特性を有し、または活性剤は、腫瘍ホーミング特性を有するように操作され得る。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の活性薬剤がペプチドに連結され得る。複数の活性薬剤は、複数のリジン残基および／またはＮ末端にコンジュゲートさせるなどの方法によって付着され得るか、または複数のポリマーもしくは活性薬剤をデンドリマーなどのスキャフォールドに連結させて、次に薬剤−スキャフォールドをペプチドに付着させることによって付着され得る（Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉ，Ａ．Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５（１６）：３３６５−７２（２０１５）に記載されるように）。活性薬剤の例としては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣剤、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、一本鎖変数断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、インターフェロン、ホルモン、酵素、増殖因子、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＣＤ抗原、ケモカイン、神経伝達物質、イオンチャネル阻害剤、イオンチャネル賦活剤、Ｇタンパク質共役型受容体阻害剤、Ｇタンパク質共役型受容体賦活剤、化学薬剤、放射線増感剤、放射線防護体、放射性核種、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、補体結合ペプチドもしくはタンパク質、腫瘍壊死因子阻害剤、腫瘍壊死因子賦活剤、腫瘍壊死因子受容体ファミリー作動薬、腫瘍壊死受容体拮抗薬、Ｔｉｍ−３阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞毒性分子、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、脂質、デンドリマー、脂肪酸もしくはＦｃ領域またはそれらの活性断片または修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、直接またはリンカーを介して活性薬剤に共有結合または非共有結合される。例えば、使用され得る細胞毒性分子としては、オーリスタチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ドロスタチン、オーリスタチンＦ、モノメチルオーリスタチンＤ、ＤＭ１、ＤＭ４、メイタンシノイド、メイタンシン、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ＰＢＤ二量体、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド（４−デアセチルビンブラスチン）、デュオカルマイシン、キノコアマトキシンの環状オクタペプチド類似体、エポチロンおよびアントラサイリン、ＣＣ−１０６５、タキサン、パクリタキセル、カバジタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、白金化合物、シスプラチン、メトトレキサートおよびＢＡＣＥ阻害剤が挙げられる。活性薬剤の追加的な例は、ＭｃＣｏｍｂｓ，Ｊ．Ｒ．，ＡＡＰＳ  Ｊ，１７（２）：３３９−５１（２０１５）、Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３）およびＳｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５４１−３５７１（２０１５）に記載されている。本明細書の実施形態で使用するのに適する例示的なリンカーは、以下でさらに詳細に考察される。
【０１３３】
抗体−薬物コンジュゲート（例えば、Ａｄｃｅｔｒｉｓ、Ｋａｄｃｙｌａ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ）と比較して、いくつかの態様では、本明細書に記載されるような活性薬剤にコンジュゲート、連結または融合されたペプチドは、そのより小さいサイズのために固形腫瘍のより良好な浸透を示し得る。特定の態様では、本明細書に記載されるような活性薬剤にコンジュゲート、連結または融合されたペプチドは、抗体−薬物コンジュゲートと比較して異なるまたはより高用量の活性薬剤を輸送できる。なおも別の態様では、本明細書に記載されるような活性薬剤にコンジュゲート、連結または融合されたペプチドは、抗体−薬物コンジュゲートと比較して、規定された薬物比のより良い部位特異的送達を有し得る。他の態様では、ペプチドは、（水の他に）有機溶媒中で溶媒和を受け入れやすいことができ、これは、薬物（低い水溶性を有することが多い）の溶媒和およびコンジュゲーションのためのより多くの合成経路およびより高いコンジュゲーション収量、ペプチドにコンジュゲート、連結または融合される薬物のより高い比率（抗体との対比で）、ならびに／またはコンジュゲーション中における凝集体／高分子量種の形成の減少を可能にする。さらに、さもなければ短い配列中に存在しない残基を通じてまたは非天然アミノ酸の包含を通じて、独特のアミノ酸残基がペプチドに導入されて、ペプチドの部位特異的コンジュゲーションができるようにし得る。
【０１３４】
本開示のペプチドまたは融合ペプチドは、組織または体液からペプチドを回収するための親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供するなどの他の役割を果たし得る、他の部分にコンジュゲート、連結または融合され得る。例えば、本開示のペプチドまたは融合ペプチドは、ビオチンにもコンジュゲート、連結または融合され得る。半減期の延長に加えて、ビオチンは、組織または他の部位からペプチドまたは融合ペプチドを回収するための親和性ハンドルとしても作用し得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識および親和性ハンドルの両方として作用し得る蛍光性ビオチンコンジュゲートを用い得る。市販の蛍光性ビオチンコンジュゲートの非限定的例としては、Ａｔｔｏ  ４２５−ビオチン、Ａｔｔｏ  ４８８−ビオチン、Ａｔｔｏ  ５２０−ビオチン、Ａｔｔｏ−５５０ビオチン、Ａｔｔｏ  ５６５−ビオチン、Ａｔｔｏ  ５９０−ビオチン、Ａｔｔｏ  ６１０−ビオチン、Ａｔｔｏ  ６２０−ビオチン、Ａｔｔｏ  ６５５−ビオチン、Ａｔｔｏ  ６８０−ビオチン、Ａｔｔｏ  ７００−ビオチン、Ａｔｔｏ  ７２５−ビオチン、Ａｔｔｏ  ７４０−ビオチン、フルオレセインビオチン、ビオチン−４−フルオレセイン、ビオチン−（５−フルオレセイン）コンジュゲートおよびビオチン−Ｂ−フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ビオシチン、ＡＬＥＸＡ  ｆｌｏｕｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミンおよびテトラメチルローダミンビオシチンが挙げられ得る。いくつかの他の例では、コンジュゲートは、化学発光化合物、コロイド金属、ルミネセンス化合物、酵素、放射性同位体および常磁性標識を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、別の分子にも付着され得る。例えば、ペプチド配列は、別の活性薬剤（例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、先行する薬剤のいずれかの活性断片または修飾、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、アシル付加物、化学リンカーまたは糖）にも付着され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲート、連結もしくは融合されるか、または共有結合もしくは非共有結合され得る。
【０１３５】
さらに、毒素または毒液ノッチンタンパク質から誘導された２つ以上のペプチド配列が特定のペプチド上に存在し得るか、または特定のペプチドにコンジュゲート、連結もしくは融合され得る。ペプチドは、様々な技術によって生体分子に組み込まれ得る。ペプチドは、アミド結合などの共有結合形成などの化学転換によって組み込まれ得る。ペプチドは、例えば、固相または溶液相ペプチド合成によって組み込まれ得る。ペプチドは、生体分子をコードする核酸配列を調製することによって組み込まれ得、核酸配列は、ペプチドをコードする部分配列を含む。部分配列は、生体分子をコードする配列に加えられ得るか、または生体分子をコードする配列の部分配列を置換し得る。
【０１３６】
検出可能薬剤ペプチドコンジュゲート
ペプチドは、イメージング、研究、治療学、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート療法、標的化薬物送達および放射線療法に使用される薬剤にコンジュゲート、連結または融合され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート剤またはイメージングで使用され得る別の適切な材料などの検出可能薬剤にコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の検出可能薬剤がペプチドに連結され得る。放射性同位体の非限定的例としては、α放射体、β放射体、陽電子放射体およびγ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウムおよびイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウムまたはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５または鉛−２１２である。いくつかの実施形態において、近赤外線色素は、生物学的組織および体液によって容易に消光されない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、６５０ｎｍ〜４０００ｎｍの波長の電磁放射を発する蛍光剤であり、このような放射は、薬剤を検出するために使用されている。本開示のコンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ−６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ−７５０、ＶｉｖｏＴａｇ−７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ−８００、ＩＲＤｙｅ−８００、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、Ｃｙ５．５またはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、近赤外線色素は、多くの場合、シアニン色素（例えば、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５およびＣｙ５）を含む。本開示のコンジュゲート分子として使用される蛍光色素の追加的な非限定的例としては、アクラジンオレンジまたはイエロー、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、７５０、７００、６８０、６６０および６４７）およびそのあらゆる誘導体、７−アクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、ＡＴＴＯ色素およびそのあらゆる誘導体、オーラミン−ローダミン染色およびそのあらゆる誘導体、ベンゾアントルホン、ビマン、９−１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナタタセン、ビスベンズイミド、ブレインボウ、カルセイン、カルボジフルオレセインおよびそのあらゆる誘導体、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセンおよびそのあらゆる誘導体、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓおよびそのあらゆる誘導体、エピコッコノン、臭化エチジウム、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２、Ｆｌｕｏ色素およびそのあらゆる誘導体、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅおよびそのあらゆる誘導体、フルオレセインおよびそのあらゆる誘導体、Ｆｕｒａおよびそのあらゆる誘導体、ＧｅｌＧｒｅｅｎおよびそのあらゆる誘導体、ＧｅｌＲｅｄおよびそのあらゆる誘導体、蛍光タンパク質およびそのあらゆる誘導体、例えばｍＣｈｅｒｒｙなどのｍイソ型タンパク質およびそのあらゆる誘導体、ヘタメチン色素およびそのあらゆる誘導体、ヘスキスト染色、イミノクマリン、インディアンイエロー、ｉｎｄｏ−１およびそのあらゆる誘導体、ラウルダン、ルシファーイエローおよびそのあらゆる誘導体、ルシフェリンおよびそのあらゆる誘導体、ルシフェラーゼおよびそのあらゆる誘導体、メルコシアニンおよびそのあらゆる誘導体、ナイル色素およびそのあらゆる誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素およびそのあらゆる誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミンおよびそのあらゆる誘導体、リボグリーン、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、スチルベンおよびそのあらゆる誘導体、スルホローダミンおよびそのあらゆる誘導体、ＳＹＢＲおよびそのあらゆる誘導体、ｓｙｎａｐｔｏ−ｐＨｌｕｏｒｉｎ、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス、テキサスレッド、チタンイエロー、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質およびＹＯＹＯ−１が挙げられる。他の適切な蛍光色素としては、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’、５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル−ローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、オレゴングリーン色素（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、など）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、スペクトラムレッド、スペクトラムグリーン、シアニン色素（例えば、ＣＹ−３、Ｃｙ−５、ＣＹ−３．５、ＣＹ−５．５など）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０��ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００など）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。追加的な適切な検出可能薬剤は、ＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／５６１７７号明細書に記載されている。放射性同位体の非限定的例としては、α放射体、β放射体、陽電子放射体およびγ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウムおよびイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウムまたはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５または鉛−２１２である。
【０１３７】
ペプチドは、放射線増感剤または光増感剤にコンジュゲート、連結または融合され得る。放射線増感剤の例としては、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＷＥＨＩ−５３９、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミンおよび核酸塩基誘導体（例えば、ハロゲン化プリンまたはピリミジン、例えば５−フルオロデオキシウリジン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。光増感剤の例としては、照射発熱蛍光性分子またはビーズ、ナノ粒子、ポルフィリンおよびポルフィリン誘導体（例えば、クロリン、バクテリオクロリン，イソバクテリオクロリン、フタロシアニンおよびナフタロシアニン）、金属ポルフィリン、金属フタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲンアピリリウム色素、クロロフィル、クマリン、フラビンとアロキサジンおよびリボフラビンなどの関連化合物、フラーレン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン（例えば、メロシアニン５４０）、フェオフィチン、サフィリン、テキサフィリン、プルプリン、ポルフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタルイミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリンおよびセルコスポリン）、ソラレン、キノン、レチノイド、ローダミン、チオフェン、ベルジン、キサンテン色素（例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル）、ポルフィリンの二量体およびオリゴマー形態および５−アミノレブリン酸などのプロドラッグが挙げられ得るが、これに限定されるものではない。有利には、このアプローチは、治療薬（例えば、薬物）および電磁エネルギー（例えば、放射線または光）の両方を同時に用いて、病的細胞（例えば、がん細胞）の高度に特異的な標的化を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、直接またはリンカーを介して薬剤にコンジュゲート、連結もしくは融合されるか、または共有結合もしくは非共有結合される。本明細書の実施形態で使用するのに適する例示的なリンカーは、以下でさらに詳細に考察される。
【０１３８】
リンカー
本開示に従ったペプチドは、リンカーを介してまたはリンカーの非存在下で直接、小分子、第２のペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、生体高分子、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカーもしくは糖または本明細書に記載の他の活性薬剤もしくは検出可能薬剤などの別の部分（例えば、活性薬剤または検出可能薬剤）に付着され得る。リンカーの非存在下では、例えば、活性薬剤または検出可能薬剤は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲート、連結または融合されて、活性薬剤または検出可能薬剤融合ペプチドが生成し得る。他の実施形態では、還元的アルキル化によるペプチド融合を通して連結が生成され得る。いくつかの実施形態では、細胞、エンドソームまたは核への侵入時、切断または分解され得るリンカーなどの切断可能リンカーがペプチドの生体内送達に使用される。いくつかの実施形態では、ペプチドの生体内送達は、細胞の浸透または細胞核への局在化に干渉しない小型リンカーを必要とする。リンカーを用いて、本明細書に記載のペプチドを、標的化、細胞傷害性、治療的、ホーミング、画像化または診断的機能などの別個の機能を有する別の部分または分子に共有結合的に付着させることもできる。
【０１３９】
ペプチドを別の分子の領域に共有結合的に付着させることを通して直接付着が可能である。例えば、活性薬剤または検出可能薬剤は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲート、連結または融合されて、活性薬剤または検出可能薬剤融合ペプチドが生成され得る。別の例として、ペプチドは、リンカーにより、Ｎ末端、内部リジン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基またはＣ末端において別の分子のアミノ酸配列の末端に付着され得る。付着が内部リジン残基にある場合、他の分子は、内部リジン残基のεアミンでペプチドに連結され得る。いくつかのさらなる例では、ペプチドは、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基またはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖によって別の分子に付着され得る。リンカーは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、炭酸結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素一重または二重または三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の二炭素架橋、２つのシステイン間の３つの炭素架橋またはチオエーテル結合であり得る。なおも他の実施形態では、ペプチドは、非天然アミノ酸を含み得、非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換であり得、ペプチドは、リンカーによって非天然アミノ酸で活性薬剤に連結され得る。いくつかの実施形態では、開示されるペプチド自体の類似領域（アミノ酸配列の末端、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基もしくはグルタミン酸残基側鎖などのアミノ酸側鎖、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合または本明細書に記載されるような他のリンカーを介するなど）を使用して、別の分子が連結され得る。
【０１４０】
リンカーを介する付着は、別の分子とペプチドとの間のリンカー部分の組み込みを伴う。ペプチドおよび別の分子は、いずれもリンカーに共有結合的に付着され得る。リンカーは切断可能、切断不能、自己犠牲、親水性または疎水性であり得る。リンカーは、１つが別の分子に結合し、１つがペプチドに結合する少なくとも２つの官能基と、２つの官能基間の連結部分とを有する。いくつかの例示的なリンカーは、Ｊａｉｎ，Ｎ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５２６−４０（２０１５）、Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．１９（１０）：１９６０−３（２００８）、Ｐｉｌｌｏｗ，Ｔ．Ｈ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５７（１９）：７８９０−９（２０１４）、Ｄｏｒｙｗａｌｋｓａ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．２６（４）：６５０−９（２０１５）、Ｋｅｌｌｏｇｇ，Ｂ．Ａ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．２２（４）：７１７−２７（２０１１）およびＺｈａｏ，Ｒ．Ｙ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５４（１０）：３６０６−２３（２０１１）に記載されている。
【０１４１】
付着のための官能基の非限定的例としては、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、炭酸結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素一重または二重または三重結合、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を形成できる官能基が挙げられ得る。このような結合を形成できる官能基の非限定的例としては、アミノ基；カルボキシル基；アルデヒド基；アジ化物基；アルキンおよびアルケン基；ケトン；ヒドラジド；ヒドラジン；酸フッ化物、塩化物、臭化物およびヨウ化物などの酸ハロゲン化物；対称性、混合および環式酸無水物をはじめとする酸無水物；炭酸塩；シアノ、スクシンイミジルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの離脱基に結合するカルボニル官能基；マレイミド；加水分解するように設計されたマレイミド基含有リンカー；マレイミドカプロイル；ＭＣＣ（［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）；Ｎ−エチルマレイミド；マレイミドアルカン；ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ；ＤＵＢＡ（デュオカルマイシンヒドロキシベンズアミド−アザインドールリンカー）；ＳＭＣＣスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＳＰＤＢＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート；スルホ−ＳＰＤＢ  Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート；ＳＰＰ  Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート；ジチオピリジルマレイミド（ＤＴＭ）；ヒドロキシルアミン、ビニル−ハロ基；ハロアセトアミド基；ブロモアセトアミド；ヒドロキシル基；スルフヒドリル基；ならびに例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、またはハロゲン化物、メシレート、トシレート、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硫酸エステルおよびベシレートなどのベンジル離脱基を有する分子が挙げられる。
【０１４２】
連結部分の非限定的例としては、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエーテル、ポリエステルなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリペプチド、切断可能ペプチド、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に記載の他のペプチドリンカー、βグルクロニダーゼによって切断可能リンカー、カテプシンによってまたはカテプシンＢ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、Ｏ、Ｆ、Ｖ、ＸまたはＷによって切断可能リンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル、グルクロニド−ＭＡＢＣ、アミノベンジルカルバメート、Ｄ−アミノ酸およびポリアミンが挙げられ得、これらのいずれも未置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキサルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、ハロアルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシド、荷電基、両性イオン基およびエステル基などの置換基の任意の数で置換される。分子を共に連結、融合またはコンジュゲートする反応の他の非限定的な例としては、クリックケミストリー、銅非含有クリックケミストリー、ＨＩＰＳライゲーション、シュタウディンガーライゲーションおよびヒドラジン−イソ−ピクテ・スペングラーが挙げられる。
【０１４３】
リンカーの非限定的な例としては、
【化３】
2020505326.tif 000014
が挙げられ、式中、各ｎは、独立して、０〜約１，０００；１〜約１，０００；０〜約５００；１〜約５００；０〜約２５０；１〜約２５０；０〜約２００；１〜約２００；０〜約１５０；１〜約１５０；０〜約１００；１〜約１００；０〜約５０；１〜約５０；０〜約４０；１〜約４０；０〜約３０；１〜約３０；０〜約２５；１〜約２５；０〜約２０；１〜約２０；０〜約１５；１〜約１５；０〜約１０；１〜約１０；０〜約５；または１〜約５である。いくつかの実施形態では、各ｎは、独立して、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９または約５０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜約１，０００；１〜約５００；１〜約２５０；１〜約２００；１〜約１５０；１〜約１００；１〜約５０；１〜約４０；１〜約３０；１〜約２５；１〜約２０；１〜約１５；１〜約１０；または１〜約５である。いくつかの実施形態では、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９もしくは約５０であり、またはＪａｉｎ，Ｎ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５２６−４０（２０１５）もしくはＤｕｃｒｙ，Ｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３）で開示されるような任意のリンカーである。
【０１４４】
場合により、リンカーは、コハク酸リンカーであり得、薬剤は、エステル結合または２つのメチレン炭素をその間に有するアミド結合を介してペプチドに付着され得る。他の場合、リンカーは、ヒドロキシヘキサン酸または乳酸などのヒドロキシル基およびカルボン酸の両方を有する任意のリンカーであり得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、未修飾形態で活性薬剤を遊離させ得る。他の実施形態では、活性薬剤は、化学修飾によって遊離され得る。なおも他の実施形態では、リンカーおよび／またはペプチドの一部になおも連結される活性薬剤は、異化作用によって遊離され得る。
【０１４６】
リンカーは、切断不能リンカーまたは切断可能リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、切断不能リンカーは、血清アルブミン上の遊離チオール上への結合部分の交換によって結合部分を緩慢に遊離させ得る。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーの使用は、例えば、それを必要とする対象への投与後、結合部分（例えば、治療薬）がペプチドから遊離できるようにし得る。他の実施形態では、切断可能リンカーの使用は、コンジュゲートされた治療薬がペプチドから遊離できるようにし得る。場合により、例えば、バリン−シトルリンリンカーなどのように、リンカーは、酵素切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、自己犠牲部分を含有する。他の実施形態では、リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、カテプシン、ペプチダーゼまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位など、特定のプロテアーゼのための１つまたは複数の切断部位を含む。代わりにまたは組み合わせて、リンカーは、ｐＨ、還元または加水分解などの他の機序によって切断可能である。
【０１４７】
リンカーの加水分解または還元の速度は、用途に応じて微調整または修正され得る。例えば、非障害エステルを有するリンカーの加水分解速度は、エステルカルボニルの隣に嵩高い基を有するリンカーの加水分解と比較してより迅速であり得る。嵩高い基は、メチル基、エチル基、フェニル基、環もしくはイソプロピル基または立体バルクを提供する任意の基であり得る。場合により、立体バルクは、ケトロラクによってなど、薬物自体により、そのカルボン酸を介してコンジュゲート、連結または融合された際に提供され得る。リンカーの加水分解速度は、標的位置におけるコンジュゲートまたは融合の滞留時間に応じて調節され得る。例えば、ペプチドが腫瘍または脳から比較的迅速に除去される場合、リンカーは、急速に加水分解するように調整され得る。ペプチドが標的位置においてより長い滞留時間を有する場合、より緩慢な加水分解速度は、活性薬剤の延長された送達ができるようにする。“Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ”Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１５，５，１２０２３  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，は、改変された加水分解速度の例を提供している。
【０１４８】
ペプチド安定性
本開示のペプチドは、細胞内、細胞質ゾル内、細胞核内またはエンドソーム内のｐＨまたは還元環境などの様々な生物学的または生理学的条件において安定であり得る。例えば、配列番号１〜配列番号８４のいずれのペプチドも還元剤、プロテアーゼ、酸化条件または酸性条件に対して耐性を示し得る。
【０１４９】
場合により、生物学的分子（ペプチドおよびタンパク質など）は、治療機能を提供し得るが、このような治療機能は、生体内環境によって引き起こされる不安定性によって減少されるかまたは妨げられる。（Ｍｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １０１：１０８−２１（２０１６）、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １３（９）：６５５−７２（２０１４）、Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ（１１）：１４４３−６７（２０１３）、Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２４（１）：６３−９２（２００７）、Ｈａｍｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９（３）：１６５−７７（２００５））。例えば、消化管は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ約１）領域、還元性環境またはペプチドおよびタンパク質を分解し得るプロテアーゼに富む環境を含有し得る。口、眼、肺、鼻腔内窩洞、関節、皮膚、膣鎖、粘膜および血清などの身体の他の領域におけるタンパク質分解活性も、機能的に活性なペプチドおよびポリペプチドの送達に対する障害であり得る。さらに、血清中のペプチドの半減期は、ある程度までプロテアーゼのために非常に短いことができ、その結果、ペプチドは、妥当な投与レジメンを投与した場合、持続的な治療効果を有するにはあまりにも迅速に分解され得る。同様に、リソソームなどの細胞区画内のタンパク質分解活性およびリソソームおよび細胞質ゾル内の還元活性は、ペプチドおよびタンパク質を分解し得、その結果、それらは、細胞内標的に対して治療機能を提供できないこともある。したがって、還元剤、プロテアーゼおよび低ｐＨに対して耐性のペプチドは、生体内において、共配合またはコンジュゲート、連結もしくは融合された活性薬剤に増強された治療効果を提供でき得るか、またはその治療有効性を増強でき得る。
【０１５０】
さらに、薬物の経口送達は、この投与方法によって提示される機能的に活性なペプチドおよびポリペプチドの送達に対する障害にもかかわらず、身体の特定の領域（例えば、結腸がん、過敏性腸疾患、感染症、代謝障害および便秘症などの消化管における疾患）を標的化するために望ましくあり得る。例えば、薬物の経口送達は、非経口送達と比較して、患者の服用により便利な剤形を提供することによって服薬遵守を高め得る。経口送達は、大きい治療濃度域を有する治療レジメンにおいて有用であり得る。したがって、還元剤、プロテアーゼおよび低ｐＨに対して耐性のペプチドは、それらの治療機能を無効にすることなくペプチドの経口送達を可能にすることができる。
【０１５１】
還元剤に対するペプチドの耐性。本開示のペプチドは、ペプチドの折り畳まれた状態を保持するために不可欠であり得るジスルフィド架橋に関与し得る１つまたは複数のシステインを含有し得る。還元剤がある生物学的環境へのペプチドの曝露は、ペプチドの展開および機能性と生物活性の喪失をもたらし得る。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）は、体内および細胞内の多くの領域に存在し得、ジスルフィド結合を還元し得る還元剤である。別の例として、ペプチドは、経口投与後の胃腸上皮を越えるペプチドの輸送中に還元され得る。ペプチドは、消化管の様々な部分に曝露されると還元され得る。胃腸管は還元性環境であり得、それは、ジスルフィド結合の還元のため、ジスルフィド結合のある治療分子が最適な治療有効性を有する能力を阻害し得る。ペプチドは、エンドソームもしくはリソソームによる内部移行、または細胞質ゾル、または他の細胞区画への内部移行後などの細胞への侵入時にも還元され得る。ジスルフィド結合の還元およびペプチドの展開は、機能性の喪失につながり、または生物学的利用能、ピーク血漿濃度、生物活性および半減期などの重要な薬物動態パラメータに影響を及ぼし得る。ジスルフィド結合の還元は、引き続くプロテアーゼによる分解に対するペプチドの感受性の増加に起因する機能性の喪失にもつながり、投与後に無傷のペプチドの急速な喪失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、還元耐性のペプチドは、無傷のままであり得、より容易に還元されるペプチドと比較して、身体の様々な区画および細胞においてより長期にわたって機能的活性を付与し得る。
【０１５２】
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、還元剤耐性の特徴について分析され、安定なペプチドが同定され得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、０．００００１Ｍ〜０．０００１Ｍ、０．０００１Ｍ〜０．００１Ｍ、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍ、０．０１Ｍ〜０．０５Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１Ｍなどの異なるモル濃度の還元剤に１５分以上曝露された後に無傷のままであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド安定性を判定するために使用される還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、（還元型）グルタチオン（ＧＳＨ）またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドが還元剤への曝露後に無傷のままである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＧＳＨ還元条件に対して完全に耐性があり、ＤＴＴ還元条件下における分解に対して部分的に耐性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、生理学的還元条件での分解に耐え得るかまたは分解に対して耐性があり得る。
【０１５３】
プロテアーゼに対するペプチドの耐性。本開示のペプチドの安定性は、プロテアーゼ分解耐性によって判定され得る。ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも称されるプロテアーゼは、隣接するアミノ酸間の結合を破壊することにより、ペプチドおよびタンパク質を分解し得る酵素である。特定のアミノ酸を標的化する特異性を有するプロテアーゼのファミリーとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよびアスパラギンプロテアーゼが挙げられる。さらに、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素およびカテプシンもペプチドおよびタンパク質を消化し得る。プロテアーゼは、血液、粘膜、肺、皮膚、胃腸管、口、鼻、眼および細胞の区画に高濃度で存在し得る。プロテアーゼの誤調節は、関節リウマチおよび他の免疫障害などの様々な疾患にも存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療分子の生物学的利用能、生体内分布、半減期および生物活性を低下させ得、その結果、それらは、治療機能を果たすことができない。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ耐性であるペプチドは、生体内で合理的に耐容される濃度で治療活性をより良好に提供し得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、任意のクラスのプロテアーゼによる分解に抵抗し得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ペプシン（胃に見いだされ得る）、トリプシン（十二指腸に見いだされ得る）、血清プロテアーゼまたはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗する。いくつかの実施形態では、ペプチド安定性を判定するのに使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ（例えば、セリン、システイニルおよびアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、α−１アンチトリプシン、分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤およびエラフィン）またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドがプロテアーゼへの曝露後に無傷のままである。
【０１５５】
酸性条件におけるペプチド安定性。本開示のペプチドは、酸性の生物学的環境に投与され得る。例えば、経口投与後、ペプチドは、胃の胃液および消化（ＧＩ）管中の酸性環境条件を経験し得る。胃のｐＨは、約１〜４の範囲であり得、消化管のｐＨは、酸性から正常生理学的ｐＨの範囲にわたり、上部消化管から結腸にかけて低下する。さらに、膣、後期エンドソームおよびリソソームもｐＨ７未満のような酸性ｐＨ値を有し得る。これらの酸性条件は、折り畳まれていない状態へのペプチドおよびタンパク質の変性をもたらし得る。ペプチドおよびタンパク質の展開は、他の酵素による引き続く消化に対する感受性の増加ならびにペプチドの生物学的活性の喪失をもたらし得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、酸性条件および酸性条件をシミュレートする緩衝液中で変性および分解に抵抗し得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ１未満、ｐＨ２未満、ｐＨ３未満、ｐＨ４未満、ｐＨ５未満、ｐＨ６未満、ｐＨ７未満またはｐＨ８未満の緩衝液中の変性または分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１〜３のｐＨで無傷のままである。特定の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、ｐＨ１未満、ｐＨ２未満、ｐＨ３未満、ｐＨ４未満、ｐＨ５未満、ｐＨ６未満、ｐＨ７未満またはｐＨ８未満の緩衝液への曝露後に無傷のままである。他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、ｐＨ１〜３の緩衝液への曝露後に無傷のままである。他の実施形態では、本開示のペプチドは、人工胃液（ｐＨ１〜２）中の変性または分解に対して耐性であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドが人工胃液への曝露後に無傷のままである。いくつかの実施形態では、人工胃液などの低ｐＨ溶液を使用してペプチド安定性が判定され得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、生体内、対象の血清中または細胞内での分解に対して耐性がある。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、約ｐＨ５〜７．５、約６．５〜７．５、約ｐＨ５〜８または約ｐＨ５〜７などの範囲の生理学的ｐＨで安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、約ｐＨ５以下、約ｐＨ３以下または約３〜約５の範囲内などの酸性条件において安定している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、エンドソームまたはリソソームの条件においてまたは核内部で安定している。
【０１５７】
高温におけるペプチド安定性。本開示のペプチドは、高温の生物学的環境において投与され得る。例えば、経口投与後、ペプチドは、体内で高温を経験し得る。体温は、３６℃〜４０℃の範囲であり得る。高温は、ペプチドおよびタンパク質の折り畳まれていない状態への変性をもたらし得る。ペプチドおよびタンパク質の展開は、他の酵素による引き続く消化に対する感受性の増加ならびにペプチドの生物学的活性の喪失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃〜１００℃の温度で無傷のままであり得る。高温は、ペプチドのより迅速な分解をもたらし得る。より高い温度での安定性は、熱帯環境または冷蔵へのアクセスが限られた地域におけるペプチドの貯蔵を可能にする。特定の実施形態では、５％〜１００％のペプチドは、６ヶ月間〜５年間にわたる２５℃への曝露後に無傷のままであり得る。５％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる７０℃への曝露後に無傷のままであり得る。５％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる１００℃への曝露後に無傷のままであり得る。他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、少なくとも６ヶ月間〜５年間にわたる２５℃への曝露後に無傷のままである。他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる７０℃への曝露後に無傷のままである。他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる１００℃への曝露後に無傷のままである。
【０１５８】
方法
ペプチドの製造および精製。いくつかの実施形態では、コンピュータによる設計から生成されたペプチドライブラリーからの配列は、発現ベクターまたは固相もしくは液相ペプチド合成法を用いて合成され得る。例えば、ＴＥＡＤ結合ペプチドまたはペプチドおよびシデロカリン−ＹＡＰは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に従って、分泌された可溶性タンパク質産生／発現ベクターにクローニングされ、精製され得る。精製法としては、親和性精製カラム、イオン交換（カチオンおよび／またはアニオンカラム）、逆相、疎水性相互作用およびサイズ交換カラムが挙げられるが、これに限定されるものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続くクマシー染色および逆相ＨＰＬＣを用いて、精製タンパク質のサンプルが分析され得る。タンパク質濃度は、ＵＶスペクトル吸収および／またはアミノ酸分析によって評価された。
【０１５９】
表面提示ベクター構築。様々な実施形態において、元のＤａｅｄａｌｕｓベクターに基づく、表面提示ベクターＳＤＧＦおよびＳＤＰＲ（ＳＤＧＦベクターの変異型であるが、柄内の全ての塩基性および芳香族残基が除去されてトリプシン／キモトリプシン切断が防止され、６×Ｈｉｓタグ（配列番号２８４）がペプチドのＣ末端に付加されている）（Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）が、本明細書に記載されるように組換えペプチドをクローン化および発現するために使用され得る。ペプチドは、修飾コード配列を用いて、かつＩＲＥＳ−ＧＦＰを用いることなくクローニングまたは発現され得る。場合により、ベクターのコード配列は、以下を含む：ＧＦＰ；単回通過ＩＩ型膜貫通タンパク質ＦＡＳＬＧ（ヒトＦａｓリガンド）の膜貫通ドメイン；ポリＧＧＧＳスペーサー（配列番号２０３）；９残基ウシロドプシン抗原；ポリＧＧＧＳスペーサー（配列番号２０３）；ＧＳリンカーなどのＴＥＶ切断部位；提示されたペプチド；およびＳＤＰＲに限って６×Ｈｉｓタグ（配列番号２８４）。元のＤａｅｄａｌｕｓベクターと同様に、いくつかの実施形態では、コンストラクト全体がレンチウイルスＬＴＲでクローニングされて、一過性形質移入または形質導入によって細胞に導入され得る。ペプチド配列は、ＳＤＧＦベクターでは固有のＢａｍＨＩとＮｏｔＩ切断部位との間またはＳＤＰＲでは固有のＢａｍＨＩとＡｇｅＩ切断部位との間に挿入され得る。ＳＤＧＦまたはＳＤＰＲコンストラクトのいずれにおいても、制限消化（ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ、ＮＥＢ；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはギブソンアセンブリをはじめとするいくつかの標準的なクローニングストラテジーを用いて所望のコード配列が挿入され得、全ての形質転換は、電気穿孔によって形質転換されたＳｔｅｌｌａｒ化学的コンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはエレクトロコンピテント細胞（ＮＥＢ１０−β細胞）を使用する。ＤＮＡは、ＳＤＧＦ順方向プライマー：ＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２１３）；ＳＤＧＦ逆方向プライマー：ＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣ（配列番号２１４）；ＳＤＰＲ順方向プライマー：ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＧ（配列番号２１５）；ＳＤＰＲ逆方向プライマー：ＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＣＴＣ（配列番号２１６）などの例示的プライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。
【０１６０】
哺乳類表面提示。ＴＥＡＤへの結合についてのペプチドまたは単一候補の検証は、ＨＥＫ−２９３細胞の懸濁液を使用して検証され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、２４ウェル懸濁組織培養皿内において、１ｍＬ培地中の２Ｅ６細胞に対して、推定上のまたは候補ペプチドを含む２．５μｇのＳＤＧＦベクターおよび３．５μｇのポリエチレンイミンで形質移入される。細胞のインキュベーション後、プールされた全てのスクリーニングは、レンチウイルスで形質導入された２９３Ｔ細胞（ＶＳＶ−Ｇ被覆、２９３Ｔ細胞において標準的な方法により生成）において実施され、約１または最大５のＭＯＩでＳＤＧＦコンストラクトが送達される。形質導入または形質移入された懸濁液ＨＥＫ−２９３細胞は、ペレット化され（５００×ｇ、５分間）、標的タンパク質に対して等モル量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ありまたはなしで、ＤＡＰＩおよび標的タンパク質を含む流動緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に最大８Ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁され得る。全ての染色インキュベーションは、穏やかに撹拌しながら４℃で３０分間実施された。低ストリンジェンシープロトコル（最初のアッセイ検証およびプールされたスクリーニング）では、２００ｎＭの標的タンパク質が使用され得、ストレプトアビジンを標的タンパク質と予備混合され得る。フローサイトメトリー前に、細胞は、インキュベートされ、流動緩衝液で１０倍に希釈され、ペレット化され（５００×ｇ、５分間）、新鮮な流動緩衝液に再懸濁され得る（最大６．５Ｅ６細胞／ｍＬ）。中ストリンジェンシープロトコル（ＳＳＭ成熟）では、２０ｎＭの標的タンパク質のみが使用され得、細胞は、標的タンパク質のみとインキュベートされ、流動緩衝液で１０倍に希釈され、ペレット化され、次に２０ｎＭストレプトアビジンで再懸濁され得る。フローサイトメトリー前に、細胞は、再度インキュベートされ、流動緩衝液で１０倍に希釈され、ペレット化され（５００×ｇ、５分間）、新鮮な流動緩衝液に再懸濁された（最大６．５Ｅ６細胞／ｍＬ）。高ストリンジェンシープロトコルは、標的タンパク質染色の直後に追加の流動緩衝液のみの洗浄工程が含まれること以外、中ストリンジェンシープロトコルと同一である。場合により、分析は、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ  ＬＳＲ  ＩＩとＡｃｅａ  ＮｏｖｏＣｙｔｅ流動血球計算器との組み合わせ上で実施される一方、流動選別は、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ａｒｉａ  ＩＩ上で実施される。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）およびＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）上で実施され得る。
【０１６１】
ＳＤＰＲプロテアーゼ耐性試験。いくつかの実施形態では、ＳＤＰＲプロテアーゼ耐性試験は、トリプシンおよびキモトリプシンをはじめとする配列決定グレードの酵素と共に使用され得る。トリプシンおよびトリプシンインヒビターは、ＨＰＬＣ分析で使用され得る。
【０１６２】
次世代配列決定法。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合に影響を及ぼす変異型の濃縮または枯渇についてのスクリーニングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定によって評価され得る。このような配列決定法は、５０μＬのＴｅｒｒａ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲＭｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの）に再懸濁されて、元のクローニングプライマーを使用して１６サイクルにわたり増幅された細胞ペレット（１．５Ｅ６、３つの技術的複製物）を収集することを伴う。最大４つのアリコートが、６０μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ反応液に１６倍希釈され、フローセル接着のためのアダプター配列を含む個別のＩｌｌｕｍｉｎａプライマーを使用して増幅され得る。順方向プライマーは、多重化のための６ｂｐバーコードを含み得る。急速モードのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００がサンプル分析に使用され得、そのＢｏｗｔｉｅ  ２ソフトウェアはマッピングに使用され得、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）がデータ分析に使用され得る。
【０１６３】
Ｈｉｓ−Ａｖｉ−ＴＥＡＤの製造、精製およびビオチン化。いくつかの実施形態では、生体外アッセイを使用して、候補ペプチドがＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を阻害または妨害する能力またはＴＥＡＤに結合し、それによってＴＥＡＤをＹＡＰとの相互作用から隔離する能力を分析する。場合により、ビオチン化されたＨｉｓ−Ａｖｉ−ＴＥＡＤ（１９４−４１１）は、ＢａｃＭａｇｉｃシステム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、Ｈｉ５昆虫細胞中で発現され得る。導入遺伝子は、ｐＩＥＸ−ＢＡＣ３ベクターにクローニングされ、次にカルフェクチンＩＩを使用してＢａｃＭａｇｉｃ−３ＤＮＡ（１００μｇベクター、１μＬのＢａｃＭａｇｉｃ−３）と共に１２ウェルシャーレ内のＳｆ９細胞に同時形質移入され得る。Ｈｉｓ−Ａｖｉ−ＴＥＡＤをコードするバキュロウイルスは、Ｓｆ９細胞内で増幅され得、ウイルス上清（５ｍＬ）を使用してＬ−グルタミンを補充した２５０ｍＬのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地中の２．５Ｅ８Ｈｉ５細胞に形質導入され得る。形質導入細胞は、分析のための細胞ペレットを収集する前に２７℃および１４０ＲＰＭで７２時間増殖され得る（５００ｍＬに増殖）。
【０１６４】
収集するために、細胞は、ペレット化され（２０００×ｇ、１０分間）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１：１０，０００のベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、０．５ｍのＭＴＣＥＰおよび２０ｍＭのイミダゾールを含有するＩ−ＰＥＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁され得る。ＧＳＴ−ＴＥＡＤを精製するためのニッケルＮＴＡ樹脂を使用して、溶解物を清澄化させ得る（１０，０００×ｇ、３０分間）。タンパク質は、トロンビン切断緩衝液（２５ｍＭのトリス  ｐＨ８．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ１００、１０％のグリセロール、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）に緩衝液交換され得る（Ｚｅｂａスピンカラム、５ｍＬ容量）。４ｍＬの溶出液の半分は、５μＬの制限等級トロンビン（ＥＭＤ）で室温において一晩処理され得る。ＴＥＡＤは、ニッケル樹脂上で、次にＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃｉｅｎｃｅｓ）上のＦＰＬＣによって再精製され得る。ＳＥＣ泳動用緩衝液は、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰを含有し得る。精製されたＴＥＡＤは、製造業者のプロトコルに従ってＢｉｒＡ−５００キット（Ａｖｉｄｉｔｙ）を使用してビオチン化され得、５％グリセロールを含有するＰＢＳへの最終緩衝液交換および−８０℃での小アリコートでの保存がそれに続く。
【０１６５】
フルオロフォアコンジュゲーション。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはペプチドライブラリーのスクリーニングは、フルオロフォアまたは検出可能部分からのシグナルの検出がペプチドへの結合の指標となるように、目的のタンパク質またはタンパク質パートナーをフルオロフォアまたは任意の他の検出可能部分で標識することを伴う。使用可能なフルオロフォアの一例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＮＨＳエステル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、これは、製造業者のプロトコルに従って使用され、目的のタンパク質またはＴＥＡＤもしくはＹＡＰなどのタンパク質パートナーが標識される。分光分析によって判定されるように、飽和は、１分子当たり約１個のフルオロフォアである。
【０１６６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）相互作用解析。いくつかの実施形態では、ＴＥＡＤ結合は、表面プラズモン共鳴を用いて評価され得る。ＹＡＰは、不安定であり、シデロカリンから切断されると沈殿し、その結果、それは、ＴＥＡＤ結合のＳＰＲ検証のための融合タンパク質として使用される。他の全てのペプチドは、ＴＥＶ切断可能であり、独立した可溶性タンパク質として分析され得る。
【０１６７】
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器を用いて実施され得る。場合により、ビオチン化ＴＥＡＤが特定の速度でフローセル上に注入され、約３００共鳴単位（ＲＵ）が捕捉される。参照表面は、モル当量のビオチン化ヒトトランスフェリン受容体外部ドメインを捕捉することによって生成される。定常状態に達し得る分析物では、連続２倍希釈液は、各ペプチドの解離定数（ＫＤ）の範囲をカバーする濃度範囲において泳動用緩衝液中で調製され得る。複数の緩衝液空試験がその中に散在する重複サンプルがさらなる試験のためにランダムに注入され得る。再生は、緩衝液流のみで達成され得る。二重参照データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０．４ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１の親和性または動態結合モデルのいずれかに適合され得る。Ｔ１００  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ２．０．４ソフトウェアの単一サイクル動態プロトコルを使用して、配列番号９および配列番号１０（Ｎ末端にＧＳを含む）または配列番号５１および配列番号５２（Ｎ末端にＧＳを含まない）の２つのサンプルが実施され得る。これらのペプチドの連続３倍希釈液（３．６ｎＭ〜０．０４４ｎＭ）が泳動用緩衝液中で調製され、７分間の注入時間および１５分間の解離で増加する濃度順に注入され得る。参照のための２回の緩衝液空試験サイクルを分析物注入に先立って実行し、１回の緩衝液空試験サイクルがそれに続き、これにより次の分析物注入前に分析物が完全に解離する時間が与えられた。二重参照データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０．４ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、単一サイクル動態についての１：１結合モデルに適合させた。図面は、Ｍａｃ  ＯＳＸのためのＰｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）バージョン７．０ａで作成された。
【０１６８】
ＹＡＰ−ＴＥＡＤ妨害および免疫共沈降。本明細書中に記載されるように、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害する能力についてペプチドをアッセイするために、ＴＥＡＤおよびＹＡＰの免疫共沈降の妨害が使用され得る。２９３Ｔ細胞は、Ｍｙｃタグ付きＴＥＡＤ発現プラスミドｐＲＫ５−Ｍｙｃ−ＴＥＡＤ１またはＦＬＡＧタグ付きＹＡＰ発現プラスミドｐＦＬＡＧ−ＹＡＰ１のいずれかで形質移入され得る。２日間の増殖後、細胞は、ＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で溶解され、溶解産物は、次のように使用される：抗Ｍｙｃアガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ）の１２５μＬのアリコートが調製され、Ｍｙｃ−ＴＥＡＤ形質移入細胞溶解産物からＭｙｃ−ＴＥＡＤを沈降させるために使用され得る。次に、ＴＥＡＤ結合ビーズは、競合ＴＥＡＤ結合ペプチドと予備混合された５０μＬのＦＬＡＧ−ＹＡＰ形質移入細胞溶解物と共に最終容量１００μＬで４℃において３０分間インキュベートされる。次に、樹脂は、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄され、次に２０μＬの２×ＬＤＳサンプル緩衝液に再懸濁される。次に、ビーズを煮沸してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｉｇｍａからの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２を１：２０００で、かつ／またはＡｂｃａｍからの抗Ｍｙｃタグ抗体を１：２０００で、ＬｉＣｏｒ二次抗体を１：１０，０００で使用する銀染色またはウエスタンブロットのいずれかを使用してサンプルが分析された。
【０１６９】
本明細書に記載されるのは、ペプチドまたはＴＥＡＤに対して様々な親和性を有するペプチドの様々な実施形態である。ＴＥＡＤに結合するペプチドは、ＴＥＡＤをＹＡＰへの結合に利用できないようにし、したがってＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を阻害する。
【０１７０】
ペプチドライブラリーのコンピュータによる設計：スキャフォールド構築。スキャフォールド構築に使用される入力トポロジーパラメータは、以下の通りであり得る：最小および最大配列長：それぞれ３０および４１残基；二次構造型：らせん、らせん、らせん；二次構造の長さ範囲：６〜１８残基；ターン長：２〜４残基；ジスルフィドの数：３；ジスルフィドトポロジー：Ｈ１−Ｈ２、Ｈ１−Ｈ３およびＨ２−Ｈ３。数十万の独立した設計シミュレーションを実施して、候補スキャフォールドの大規模なライブラリーが構築され得、次に、それは、配列−構造適合性、充填、極性基の満足度およびジスルフィドスコアによってフィルタリングされ得る。各設計シミュレーションの開始時、対応する長さの範囲から、らせんおよびターン長さがランダムにサンプリングされて設計の二次構造が固定され得、次にそれを使用して低解像度断片アセンブリーシミュレーションの主鎖断片が選択され得る。低解像度シミュレーションの終了時、タンパク質構造データベースのジスルフィド結合に由来するＮ−Ｃα−Ｃ主鎖変換のライブラリーを使用して、ジスルフィド結合によって連結され得る残基ペアについてタンパク質主鎖がスキャンされ得る。ジスルフィドトポロジー制約を満たす、一致残基対を有する主鎖を使用して、２サイクルの交互固定主鎖配列設計および固定配列構造緩和からなる全原子配列設計シミュレーションが開始され得る。最終設計は、充填（ｓａｓａｐａｃｋスコア＜０．５）、埋没極性基の満足度（１．０Ａのプローブ半径を使用）についてフィルタリングし、１残基当たりのエネルギーによって分類され得る。フィルタリングされた設計の上位１０％は、コンピュータを用いた再折り畳み検定によって配列−構造適合性について評価され得、設計配列を使用して３０００の独立した構造予測シミュレーションが開始され得る。成功は、設計モデルの２ÅＣα−ＲＭＳＤ内で低エネルギー構造予測モデルの割合を評価することによって評価され得る。
【０１７１】
ペプチドライブラリーのコンピュータによる設計：界面設計。ＹＡＰ−ＴＥＡＤ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＫＹＳ）の結晶構造を調べて、ＴＥＡＤ上の結合パッチおよびＹＡＰ上の対応する主鎖要素を同定し、界面設計のためのテンプレートとして機能させ得る。以下の主鎖残基セグメントは、設計スキャフォールドを方向付けるための重ね合わせ標的として選択され得る：３ＫＹＳ／Ｂ／５３−５５、３ＫＹＳ／Ｂ／５５−５７、３ＫＹＳ／Ｂ／６４−６８、３ＫＹＳ／Ｂ／６４−６９、３ＫＹＳ／Ｂ／８６−８９、３ＫＹＳ／Ｂ／９４−９６（ＰＤＢ  ＩＤ／鎖／残基番号として与えられる）。各ペプチドスキャフォールドについて、重ね合わせのために選択された各ＹＡＰ主鎖セグメントを標的化する設計シミュレーションが実施され得る。各設計シミュレーションは、以下のステップからなり得る：（１）適合する二次構造を有するスキャフォールド主鎖要素を使用して、スキャフォールド主鎖をＹＡＰ主鎖セグメントに重ね合わせるステップ、（２）多様性をもたらし、主鎖の衝突を軽減するためのランダムな小さい撹乱ステップ、（３）固定主鎖配列選択と固定配列構造緩和との間で交互する全原子配列設計ステップ。最終界面設計は、極性基の満足度（１．０Ａのプローブ半径を使用）、界面の表面相補性（ｓｃスコア＞０．５）および界面の品質（１００Åの１つの埋没ＳＡＳＡ当たりの予測結合エネルギー＜−１．１）を満たすようにフィルタリングされ、結合エネルギーの予測値で選別された。トップスコアのデザインは、コンピュータによる再ドッキング試験によって評価され得、再設計されたスキャフォールドペプチドがＴＥＡＤから除去され、ランダムに向きを変えてＴＥＡＤタンパク質構造上に再ドックされ得る。成功は、設計された界面コンフォメーションに近い最終状態に達した低エネルギー再ドッキングシミュレーションの割合として測定され得る。
【０１７２】
円二色性。タンパク質二次構造は、円二色性（ＣＤ）を用いて評価され得る。ＣＤスペクトルは、１．０ｍｍの光路長セルを使用してＪａｓｃｏ  Ｊ−７２０Ｗ分光偏光計で測定され得る。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中のタンパク質サンプルは、２５〜３０μＭのタンパク質濃度であり得る。サンプルは、２６０〜１９０ｎＭの波長範囲で分析され得る。データは、相対楕円率［θ］；（ｍｄｅｇ）で表され得る。タンパク質の熱安定性を判定するために、サンプルは、２℃／分の勾配で２０℃から９５℃に温度を徐々に上昇され得る。安定性およびタンパク質アンフォールディングは、αらせんおよびβシート二次構造についてそれぞれ２２０および２１５でモニターした。データは、ｍｄｅｇで報告される相対楕円率［θ］で表され得る。
【０１７３】
熱移動アッセイ。タンパク質融解温度（Ｔｍ）の測定は、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、タンパク質のアンフォールディングをモニターすることによって実施され得る。手短に述べると、全容積２０μＬのＰＢＳ緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬタンパク質サンプルが２μＬの１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ色素と混合され得る。タンパク質アンフォールディングに続く疎水性タンパク質コアへの色素のインターカレーションを、ＣＦＸ９６深型ウェルリアルタイムシステム（ＢｉｏＲａｄ）を備えたＣ１０００  Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラーを用いてアッセイした。サンプルを毎分０．５℃ずつ段階的に増加させながら２０℃から９５℃に加熱し、各点で５秒間保持して、蛍光読み取りがそれに続いた。Ｔｍは、相対発光単位（ＲＦＵ）の導関数を分析することによって計算された。
【０１７４】
細胞質ゾルペプチド発現。ＦＬＡＧタグ付けされているかどうかにかかわらず、ペプチドは、ＣＭＶプロモーター、次に単シストロン性ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチド配列からなる哺乳類発現ベクターにクローニングされ得る。これらは、（示されている場合）ｐＦＬＡＧ−ＹＡＰ１および８ｘＧＴＩＩＣ−ルシフェラーゼ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃３４６１５）と共に２９３Ｔ細胞に形質移入され得る。形質移入の２４時間後、細胞は、ルミネセンス（ＯＮＥ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）またはウエスタンブロット（抗ＦＬＡＧ  Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）のために収集され得る。
【０１７５】
ｄｆＴＡＴ試薬によるタンパク質形質移入。溶液は、培養ウェル内で５μＭの最終濃度になるように、１０×作業ストック用にＰＢＳ中で５０μＭに希釈された。本明細書に開示されるようなペプチドは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＡ２８０およびＡ４８８によって評価されるように、０．８〜１．４の最終色素：ペプチド標識比においてＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８  ＮＨＳ−エステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で蛍光化され得る。ペプチド細胞浸透性の確認のために、２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を含むＤＭＥＭ中で９６ウェルプレート内に播種され、約５０％のコンフルエンスまで一晩増殖され得る。細胞は、１ｍＭ  ＣａＣｌ２と０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２とを含有するＰＢＳで３回、次に無血清ＤＭＥＭで２回、穏やかに洗浄され得る。加湿組織培養インキュベーター内における３７℃および５％ＣＯ２で６０分間のインキュベーション前にウェル（合計５０μＬ）にＰＢＳ中５μＭ（最終）のペプチドまたはＰＢＳのみのいずれかが添加され、またはＰＢＳ中５μＭ（最終）のｄｆＴＡＴ試薬またはＰＢＳのみのいずれかが添加され得る。インキュベーション後、細胞は、ＰＢＳ中で３回穏やかに洗浄され、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを用いた４℃で１０分間の固定がそれに続き得る。固定サンプルは、冷ＰＢＳで３回洗浄され得、次にＰＢＳ中０．２５％トリトンＸ−１００で１０分間室温において透過処理され得、透過処理は、後時の近接連結アッセイとの一貫性のために実施された。サンプルは、２０倍の対物レンズを備えたＥｖｏｓ  ＦＬ顕微鏡（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたイメージングに先立ってＰＢＳでさらに３回すすぎ洗いされ得る。画像は、明るさ／コントラスト調節のためにＩｍａｇｅＪで処理された。
【０１７６】
近接ライゲーションアッセイ。ＴＥＡＤ結合ペプチドは、本明細書で開示されるような任意のペプチドを使用し得、上記のように、未改変ペプチドと、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８ＮＨＳ−エステルと反応させたペプチドとの１：１混合物であり得る。ＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳおよび１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ  Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ）内に播種され得、一晩増殖され得、約５０％コンフルエンスに達する。細胞は、１ｍＭ  ＣａＣｌ２と０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２とを含有するＰＢＳで３回、次に無血清ＤＭＥＭで２回、穏やかに洗浄され得る。加湿組織培養インキュベーター内における３７℃および５％ＣＯ２で９０分間のインキュベーション前にウェル（合計１２０μＬ）にＰＢＳ中５μＭ（最終）のペプチドまたはＰＢＳのみのいずれかが添加され、またはＰＢＳ中５μＭ（最終）のｄｆＴＡＴ試薬またはＰＢＳのみのいずれかが添加され得る。インキュベーション後、細胞は、ＰＢＳ中で３回穏やかに洗浄され、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを用いた４℃で１０分間の固定がそれに続き得る。固定サンプルは、冷ＰＢＳで３回洗浄され得、次にＰＢＳ中０．２５％トリトンＸ−１００で１０分間室温において透過処理され得る。サンプルは、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）に先立ってＰＢＳでさらに３回すすぎ洗いされ得る。
【０１７７】
ＰＬＡは、Ｄｕｏｌｉｎｋ原位置蛍光（Ｆａｒ  Ｒｅｄ）キットを製造会社の使用説明書に従って使用し、代用なしで供給された緩衝液を使用し、１ｃｍ２のサンプルについて推奨される容積で実施され得る。全てのインキュベーションは、３７℃の加湿チャンバー内で行われ得る。サンプルは、３０分間ブロックされ得、ヒトＹＡＰ（１：１００ウサギ抗−ＹＡＰ１、ＡｂＣａｍカタログ番号ａｂ５２７７１）および／またはヒトＴＥＡＤ（１：２００マウス抗−ＴＥＦ−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号６１０９２３）に対する一次抗体との１時間のインキュベートがそれに続き得る。サンプルは、２回洗浄され得（これらの洗浄後にウェル仕切りが除去され得、さらなる洗浄がコプリンジャー内で行われ得る）、次にライゲーションが３０分間実施され得る。ライゲーション後、サンプルは、１００分間の増幅反応に先立って２回洗浄され得る。次に、スライドは、洗浄され、短時間乾燥され、供給された封入剤およびカバーガラスを用いてマウントされ得る。画像化は、４０倍の対物レンズを用いてＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ  Ｅｌｉｔｅ（ＧＥ）上で行われ得、完全なＺスタックが取得され、デコンボリューションされ得る。ＩｍａｇｅＪにおける核スペックルの定量化のために、ＵＶおよびＣｙ５．５フィルター処理画像がＺ投影（最大強度）され得、カスタムマクロを使用して処理され核境界（ＵＶチャネル）およびスペックル（Ｃｙ５．５チャネル）が識別され得る。重複およびスペックルのカウントは、Ｂｉｏｖｏｘｘｅｌツールボックス（Ｂｒｏｃｈｅｒ，２０１５）およびスペックルインスペクターツールを使用して自動化され得る。プロット、信頼区間および有意性の計算は、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）において作成され得る。
【０１７８】
製造方法
様々な発現ベクター／宿主系が、本明細書に記載のペプチドの組換え発現に利用され得る。このようなシステムの非限定的例としては、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、前述の核酸配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、前述の核酸配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染されるか、または前述の核酸配列を含有する組換えプラスミド（例えば、Ｔｉプラスミド）発現ベクターで形質転換された植物細胞系または二重微小染色体において安定して増幅される（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンセターゼ）か、または不安定に増幅される（例えば、マウス型細胞株）かのいずれかである、遺伝子操作されて前述の核酸配列の複数コピーを含有する細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス）で感染された動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合の形成および折り畳みは、発現中もしくは発現後またはその両方で起こり得る。
【０１７９】
宿主細胞は、本明細書に記載の１つまたは複数のペプチドを発現するように適応され得る。宿主細胞は、原核、真核または昆虫細胞であり得る。場合により、宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節できるか、または所望の特定の様式で遺伝子もしくはタンパク質産物を修飾およびプロセシングできる。例えば、特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質（例えば、メタロチオニンプロモーターのための亜鉛およびカドミウムイオン）の存在下で増加され得る。場合により、ペプチド産物の修飾（例えば、リン酸化）およびプロセシング（例えば、切断）は、ペプチドの機能にとって重要であり得る。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機序を有し得る。場合により、ペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。
【０１８０】
細胞ベースまたはウイルスベースのサンプルの場合、生物を精製前に処理して標的ポリペプチドを保存および／または遊離させ得る。いくつかの実施形態では、細胞は、固定剤を用いて固定される。いくつかの実施形態では、細胞は、溶解される。細胞材料は、有意な割合の細胞を破壊することなく細胞物質の表面および／または細胞間の隙間からタンパク質を除去するように、処理され得る。例えば、細胞間空隙および／または植物細胞壁内に位置するタンパク質を除去するため、細胞材料は、液体緩衝液に浸漬され得るか、または植物材料の場合には真空に曝露され得る。細胞材料が微生物である場合、タンパク質は、微生物培養液から抽出され得る。代わりに、ペプチドは、封入体に充填され得る。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、破壊されない。細胞またはウイルス粒子の付着および／または精製のため、細胞またはウイルスによって提示される細胞またはウイルスペプチドが使用され得る。組換え系に加えて、ペプチドは、タンパク質およびペプチド合成に用いられる様々な既知の技術を用いた抽出前に無細胞系でも合成され得る。
【０１８１】
場合により、宿主細胞は、薬物の付着点を有するペプチドを産生する。結合点は、リジン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基、Ｃ末端または非天然アミノ酸を含み得る。ペプチドは、固相ペプチド合成または溶液相ペプチド合成などにより、合成的にも製造され得る。ペプチド合成は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学またはブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学によって実施され得る。ペプチドは、合成中もしくは合成後またはその両方において折り畳まれ得る（ジスルフィド結合の形成）。ペプチド断片は、合成的または組換え的に生成され得る。次に、ペプチド断片は、酵素的または合成的に共に連結され得る。
【０１８２】
他の態様では、本開示のペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法（“Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，”ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に従って従来の固相化学合成技術によって調製され得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、製造中により安定であり得る。例えば、本開示のペプチドは、組換え発現および精製中により安定であり得、製造プロセスに存在するプロテアーゼによるより低い分解速度、より高い純度のペプチド、より高い収率のペプチドまたはそれらの任意の組み合わせをもたらし得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、製造、貯蔵および流通中における高温および低温での分解に対してもより安定であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃で安定であり得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、７０℃または７０℃より高い温度で安定であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１００℃または１００℃より高い温度で安定であり得る。
【０１８４】
ペプチド医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるような任意のペプチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、抗酸化剤、溶解剤、緩衝液、オスモライト、塩類、界面活性剤、アミノ酸、封入剤、増量剤、抗凍結剤および／または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであり得る。医薬組成物は、本明細書に記載のペプチドの生物への投与を容易にする。場合により、医薬組成物は、ペプチドの半減期を延長し、かつ／またはペプチドが標的細胞に浸透することを促進する因子を含む。
【０１８５】
薬学的組成物は、医薬組成物として治療有効量で例えば静脈内、皮下、筋肉内、直腸内、煙霧剤、非経口、眼科用、肺、経皮、膣、眼、経鼻、口腔、舌下、吸入、皮膚、クモ膜下腔内、腫瘍内、鼻腔内および局所投与をはじめとする様々な形態および経路によって投与され得る。医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のペプチドを直接臓器に、必要に応じてデポーに注射することにより、局所的または全身的な様式で投与され得る。
【０１８６】
非経口注射は、ボーラス注射または持続注入のために製剤化され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての非経口注射に適した形態であり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化剤を含有し得る。非経口投与のための医薬製剤としては、水溶性形態の本明細書に記載のペプチドの水溶液が挙げられる。本明細書に記載のペプチド−抗体複合体の懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油もしくは合成脂肪酸エステルなどの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソームなどが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液は、本明細書に記載のこのようなペプチド−抗体複合体の溶解性を高めかつ／または凝集を減少させる、適切な安定剤または薬剤も含有して、高度に濃縮された溶液の調製ができるようにし得る。
【０１８７】
本明細書中に記載されるような細胞浸透性またはペプチドを増加させるための配合物またはアプローチとしては、本明細書に記載されるような例えば最大１０μＭなどの高用量のペプチドを使用すること；Ｔａｔペプチドもしくは細胞浸透性ペプチドまたはそれらの変異型もしくは誘導体をペプチドにコンジュゲートまたは融合させること；Ｔａｔペプチドもしくは細胞浸透性ペプチドまたはその変異型もしくは誘導体をペプチドと同時送達すること；Ａｒｇパッチをペプチドにコンジュゲートまたは融合させること；またはペプチドを例えば最大１０μＭなどのＡｒｇパッチペプチドと共送達することが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、タンパク質形質移入因子、ペプチドの直接的な細胞質ゾル発現またはペプチドの電気穿孔法を用いて、細胞浸透性を増大させ得る。いくつかの実施形態では、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｏｒａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，Ｓｈａｊｉ  ａｎｄ  Ｐａｔｏｌｅ，ｖ７０（３）２６９−２７７，２００８に記載されるアプローチなどの他の賦形剤がペプチドと共に配合されて、ペプチドの細胞浸透性を増加させ得る。これらの配合物またはアプローチの任意の組み合わせが使用されて、本明細書中に記載されるようなペプチドの細胞浸透性が増加され得る。
【０１８８】
代わりに、本明細書中に記載のペプチドは、例えば、滅菌発熱物質非含有水などの適切なビヒクルによる使用前の再構成のために凍結乾燥され得るか、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、精製ペプチドは、静脈内投与される。本明細書に記載のペプチドは、対象に投与されて、がん性細胞、腫瘍またはＨＩＰＰＯ経路が調節不全の細胞にホーミング、標的化、移動または誘導され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、中枢神経系内においてまたは血液脳関門を越えて特定の標的細胞型の標的化機能を提供する別のペプチドにコンジュゲート、連結または融合され得る。
【０１８９】
本開示のペプチドは、外科手術中、脳または脳組織もしくは細胞などの臓器または臓器組織もしくは細胞に直接適用され得る。本明細書に記載の組換えペプチドは、局所的に投与され得、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、香膏、クリームおよび軟膏などの様々な局所投与可能な組成物に調合され得る。このような医薬組成物は、溶解剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液および保存料を含有し得る。
【０１９０】
本明細書で提供される治療または使用方法の実施において、本明細書に記載のペプチドの治療有効量は、免疫系に影響を及ぼす病状に罹患している対象に医薬組成物中で投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたは霊長類などの哺乳類である。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の効力ならびに他の要素に応じて広範に変動し得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ウイルス性または非ウイルス性発現ベクターにクローニングされる。このような発現ベクターは、遺伝子治療の形態で患者に投与されるウイルス粒子、ビリオンまたは非ウイルス性担体もしくは送達機構中にパッケージされ得る。他の実施形態では、修飾細胞が患者に移植され戻されたらペプチドを発現するように、患者細胞が抽出されて生体外でＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を阻害できるペプチドを発現するように修飾されてから、細胞ベース治療法の形態で修飾細胞が患者に戻される。
【０１９２】
医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。処方は、選択された投与経路に応じて修正され得る。本明細書に記載のペプチドを含む医薬組成物は、例えば、ペプチドを組換え系において発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥し、混合し、溶解し、顆粒化し、糖衣丸を製造し、研和し、乳化し、カプセル化し、封入し、または圧縮加工することによって製造され得る。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤および本明細書に記載の化合物を遊離塩基または薬理的に許容可能な塩形態として含み得る。
【０１９３】
本明細書に記載の化合物を含む本明細書に記載のペプチドを調製する方法は、本明細書に記載のペプチドを１つまたは複数の不活性な薬学的に許容可能な賦形剤または担体と共に調合して、固体、半固体または液体組成物を形成するステップを含む。固体組成物としては、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤および坐薬が挙げられる。これらの組成物は、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤および他の薬理的に許容可能な添加剤などの微量の無毒の補助物質も含有し得る。
【０１９４】
薬理的に許容可能な賦形剤の非限定的例は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  １９９９）に見いだされ得る。
【０１９５】
医薬組成物は、浸透または吸収促進薬も含み得る（Ａｕｎｇｓｔ  ｅｔ  ａｌ．ＡＡＰＳＪ．１４（１）：１０−８．（２０１２）およびＭｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １０１：１０８−２１．（２０１６））。浸透促進剤は、消化管から体循環への分子の取り込みを促進し得る。浸透促進剤は、中鎖脂肪酸の塩、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（ＳＮＡＣ）、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸（５−ＣＮＡＣ）、フェノキシエタノール、ベンジルアルコールおよびフェニルアルコールなどの親水性芳香族アルコール、キトサン、アルキル配糖体、ドデシル−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピオン酸塩（ＤＤＡＩＰＰ）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびクエン酸などの二価カチオンのキレート剤、アルキル硫酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、デオキシコール酸などのレシチンベースまたは胆汁酸塩由来の薬剤を含み得る。
【０１９６】
組成物は、大豆トリプシンインヒビター、アプロチニン、グリココール酸ナトリウム、メシル酸カモスタット、バシトラシンまたはシクロペンタデカラクトンをはじめとする、プロテアーゼインヒビターも含み得る。
【０１９７】
治療におけるペプチドの使用
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の有効量のペプチドを、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【０１９８】
一実施形態では、方法は、本明細書に記載の有効量のペプチドを、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【０１９９】
「有効量」という用語は、本明細書の用法では、治療される疾患または病状の１つまたは複数の症状をある程度緩和する投与された薬剤または化合物の十分な量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状もしくは原因の減少および／もしくは緩和または生体系の任意の他の所望の改変であり得る。このような薬剤または化合物を含有する組成物は、予防、増強および／または治療処置のために投与され得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技術を用いて判定され得る。
【０２００】
本開示の方法、組成物およびキットは、病状の症状を予防し、治療し、阻止し、逆転させ、または改善する方法を含み得る。治療は、対象（例えば、個人、飼育動物、野生動物または疾患もしくは病状に罹患した実験動物）を本開示のペプチドで治療することを含み得る。疾患は、がんまたは腫瘍であり得る。疾患の治療において、ペプチドは、腫瘍またはがん性細胞と接触し得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、ヒト；チンパンジーなどの非ヒト霊長類および他の類人猿およびサル種；畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌおよびネコなどの飼育動物；ラット、マウスおよびモルモットなどの齧歯類をはじめとする実験動物などであり得る。対象は、あらゆる年齢であり得る。対象は、例えば、高齢者、成人、青年、前青年、小児、幼児、子宮内胎児であり得る。
【０２０１】
治療は、疾患の臨床的発症前に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、６ヶ月間、１２ヶ月間または２年間以上後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２年間以上にわたって対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間または２年間未満後に対象に提供され得る。治療は、臨床試験においてヒトを治療することも含み得る。治療は、本開示全体を通じて記載される医薬組成物の１つまたは複数などの医薬組成物を対象に投与するステップを含み得る。治療は、毎日１回の投与を含み得る。治療は、本開示のペプチドを静脈内、皮下、筋肉内、吸入により、皮膚に、局所的、関節内注射、経口、舌下、クモ膜下腔内、経皮、鼻腔内、腹膜経路経由、例えば直接腫瘍への注射など腫瘍に直接、例えば脳室内経路を介するなど脳内に直接または例えば関節内局所注射経路を介するなど関節に直接のいずれかで対象に送達することを含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入により、関節内注射により、皮膚に、局所的、経口的、クモ膜下腔内、経皮的、鼻腔内、非経口的、経口的、腹膜経路経由、経鼻、舌下またはがん組織に直接のいずれかでペプチド活性薬剤複合体を対象に投与することを含み得る。
【０２０２】
ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用の妨害は、調節不全の細胞成長、細胞増殖、血管新生、器官形成、腫瘍進行および／または転移に関連するいくつかの疾患、病状または障害に影響を及ぼし得る。ＴＥＡＤに結合するペプチドのいずれか１つまたはその医薬組成物を含む組成物は、がん、腫瘍進行および／または調節不全の細胞成長を治療する方法において使用され得る。例示的な疾患、障害または病状としては、多発性骨髄腫、不良性貧血、骨髄異形成および関連する骨髄不全症候群、骨髄増殖性疾患、急性および慢性骨髄性白血病、リンパ系細胞の悪性疾患、血液学的悪性疾患、形質細胞障害、骨格筋障害、ミオパチー、筋ジストロフィー（例えば、ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋緊張症および筋緊張性ジストロフィー）および慢性閉塞性肺障害が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組成物／ペプチドが使用されて、以下の細胞型、組織型または臓器型のいずれかに関連する、調節不全の細胞成長、がん、腫瘍および／または転移が治療される：脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口腔組織および骨髄。さらなる実施形態では、本明細書で開示される組成物／ペプチドが使用されて、以下のいずれかが治療される：骨肉腫、肝細胞がん、悪性中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腎臓がん、胆管がん、胆管過誤腫、軟部組織がん、卵巣がん、結腸腺腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、消化器肥大、線維肉腫、膵管異形成、扁平上皮がん、カポジ肉腫およびＨＩＶ誘発性非ホジキンリンパ腫。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（配列番号１〜配列番号８４）が使用されて、低ｐＨ、プロテアーゼに富む環境、酸性環境、還元環境または温度が変動する環境をはじめとする、様々な生物学的環境におけるそれらの増強された安定性のためにこれらの障害にアクセスして治療し得る。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で開示されるペプチドのいずれか１つを含み、ペプチドは、ＨＩＰＰＯ経路の１つまたは複数の因子を調節して、調節不全のＨＩＰＰＯ経路に関連する病状または疾患を治療するために使用される。
【０２０５】
ペプチドキット
一態様では、本明細書に記載のペプチドは、キットとして提供され得る。別の実施形態では、本明細書に記載のペプチドコンジュゲートは、キットとして提供され得る。別の実施形態では、キットは、本明細書に記載のペプチドをコードするアミノ酸、ベクター、宿主生物および取扱説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチドの使用または投与に関する書面による指示を含む。
【実施例】
【０２０６】
以下の実施例は、本開示のいくつかの態様をさらに説明するために含まれ、本発明の範囲を限定するために使用されないものとする。
【０２０７】
実施例１
ペプチドの製造
この実施例は、本明細書に記載のペプチドの製造を記載する。タンパク質由来のペプチドは、公表された方法論を用いて哺乳類細胞培養において生成した。（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１．Ｄａｅｄａｌｕｓ：ａ  ｒｏｂｕｓｔ，ｔｕｒｎｋｅｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｉｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。
【０２０８】
ペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し、合成して、標準的分子生物学技術を用いて、シデロカリンとインフレームでクローン化した（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．）。得られたコンストラクトをレンチウイルス内にパッケージし、ＨＥＫ−２９３細胞に形質導入して増殖させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって単離し、タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断して、逆相クロマトグラフィーによって均質性に精製した。精製に続いて、各ペプチドを凍結乾燥して凍結保存した。
【０２０９】
実施例２
哺乳類発現系を用いたペプチド発現
この実施例は、哺乳類発現系を用いたペプチドの発現を記載する。ペプチドは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４３に記載される方法に従って発現させた。ペプチドを、タバコエッチウイルスプロテアーゼを使用してシデロカリンから切断し、１×ＤＰＢＳ中で４カラム容量にわたって定組成溶離を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム上でＦＰＬＣにより精製した。次に、ペプチドを４℃で保存した。
【０２１０】
実施例３
ＴＥＡＤの製造および検証
この実施例は、ＴＥＡＤ結合ペプチドの製造を記載する。設計されたライブラリーからＴＥＡＤバインダーを同定するために、可溶性ＴＥＡＤ（１９４〜４１１）を２つのＣ末端タグ：６×Ｈｉｓ（配列番号２８４）およびＡｖｉＴａｇを用いて作製した。Ｈｉｓ−Ａｖｉ−ＴＥＡＤの安定性およびＹＡＰ結合能を確認するために、ＹＡＰ（５０−１７１）を可溶性シデロカリン融合物として作製した。図１は、製造されたビオチン化ＴＥＡＤおよびシデロカリン融合ＹＡＰの検証および機能解析を示す。図１Ａは、シデロカリン−ＹＡＰの存在を示唆する付近の５５ｋＤａのバンドを有するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１Ｂは、シデロカリン融合ＹＡＰがＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに５７０ｎＭの解離定数（ＫＤ）で結合することを示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データを示す。図１Ｃは、表面係留ＹＡＰ（５０−１７１）を発現するＨＥＫ−２９３細胞が、ビオチン化ＴＥＡＤに結合したストレプトアビジンにコンジュゲートされたＡｌｅｘａフルオロフォア（ＡＦ）−６４７（ＡＦ６５７−ストレプトアビジン）によって染色されることを示す。ヒトトランスフェリン受容体に対する特異的リガンドであるマチュポウイルス（ＭＡＣＶ）糖タンパク質を発現する細胞は、ＡＦ−６４７によって染色されず、これは、ＴＥＡＤがＭＡＣＶに結合しないことを示唆する。
【０２１１】
実施例４
ＴＥＡＤ結合ペプチドの哺乳類表面提示
この実施例は、本開示のＴＥＡＤ結合ペプチドの哺乳類表面提示を記載する。ＴＥＡＤバインダーのスクリーニングは、哺乳類細胞の提示候補ペプチドへの形質移入または形質導入と、それに続くＡｌｅｘａフルオロフォア６４７（ＡＦ６４７）にコンジュゲートしたビオチン化ＴＥＡＤでのスクリーニングによって実施した。哺乳類細胞は、ジスルフィド架橋タンパク質の折り畳みにおける改善された忠実度を有し、それらを本開示のペプチドの提示に適した細胞型にする。図２は、表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターがペプチド発現および別の部分へのノッチンペプチド結合の評価のための効果的な哺乳類提示ベクターであることを示す。図２Ａは、ＳＤＧＦベクターの概略図を示す。細胞質ゾルのＮ末端ＧＦＰは、ヒトＦａｓＬの膜貫通ドメインを介して細胞外ドメインに接続する。ウシロドプシンＣ９タグが続き、Ｃ末端ノッチンから短いリンカーで分離されている（エラフィンが代表例としてここに示されるが、任意のペプチドも使用され得る）。特異的結合パートナー（エラフィンに対するエラスターゼが代表例としてここに示されているが、任意のペプチドまたはペプチドのライブラリーも使用され得る）は、ノッチンに結合し、結合パートナーが蛍光でタグ付けされている場合、その蛍光を細胞に付与する。図２Ｂは、ＳＤＧＦ−エラフィンを発現するＨＥＫ−２９３懸濁細胞がＡＦ６４７コンジュゲートエラスターゼによって染色されることを示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＳＤＧＦ−ＹＡＰ（５０〜１７１）またはＳＤＧＦ−ＭＡＣＶ糖タンパク質のいずれかを発現する細胞による陰性対照実験は、ＡＦ６４７エラスターゼによって染色されない。
【０２１２】
図１７は、ＴＥＡＤ結合ペプチドを同定するために哺乳類表面提示クリーニングを使用する方法をさらに例示する。図１７Ａは、表面提示ＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを用いたスクリーニングストラテジーの詳細なスキームを示す。ベクター中において、ＦａｓＬ−ＴＭは、ＦａｓＬタンパク質の膜貫通ドメインである。より具体的には、設計されたペプチドをプールとしてＳＤＧＦにクローニングし、次にＳＤＧＦをレンチウイルスにする。２９３Ｆ細胞を約１の感染多重度でこのライブラリーで形質導入し、３日間の増殖後、形質導入細胞のプールをＡｌｅｘａ６４７標識ＴＥＡＤと共にインキュベートする。ＧＦＰおよびＡＰＣ二重陽性細胞由来の最も高く染色されたＡＰＣ陽性細胞の百分率を選別し、増殖させる。増殖毎に細胞の一部を収集し、最後に濃縮されたペプチドを配列決定によって同定する。
【０２１３】
実施例５
ＴＥＡＤ結合ペプチドのスクリーニング
この実施例は、実施例４の哺乳類表面提示システムを用いたＴＥＡＤ結合ペプチドのスクリーニングを記載する。潜在的なＴＥＡＤ結合ペプチドをＳＤＧＦにクローニングし、２００ｎＭのＴＥＡＤ−ストレプトアビジンを用いて有効なバインダーをスクリーニングした。図３は、ＴＥＡＤ結合ペプチドについて設計されたライブラリーをスクリーニングすることを示す。図３Ａは、ＳＤＧＦペプチドライブラリーのスクリーニング工程の概略図を示す。図３Ｂは、ｘ軸にペプチドコンストラクト発現（ＧＦＰ）の蛍光を示し、ｙ軸にＴＥＡＤ（ＡＦ６４７）を示すフローサイトメトリープロットを示す。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴＥＡＤに結合したペプチド発現細胞を示す。ＨＥＫ−２９３細胞をＳＤＧＦ  ＴＥＡＤバインダーライブラリーで形質導入し、２００ｎＭのＡＦ５４７−ストレプトアビジン−ＴＥＡＤで染色した。フローサイトメトリープロットは、未分類の細胞、１、２または３回のスクリーニング後に分類された細胞を示す。
【０２１４】
形質導入細胞からペプチド遺伝子配列をＰＣＲ増幅し、候補ＴＥＡＤバインダーを従来法のＳａｎｇｅｒ配列決定およびＩｌｌｕｍｉｎａディープ配列決定によって同定した。図３Ｃは、スクリーニングおよび選別前（「入力」）の各ライブラリーメンバーの存在量と対比した、１、２、３および４ラウンド後の各ライブラリーメンバーの存在量をプロットするＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定データを示す。ｘ軸は、濃縮スコア（入力存在量と対比した相対存在量のｌｏｇ２比）を示し、ｙ軸は、ｌｏｇ２  Ｐ値（スチューデントのｔ検定を用いて判定された）を示す。データは、三重反復試験サンプルから示されている。ＴＥＡＤ結合ペプチドは、＞５の濃縮スコアを選択し、存在量および統計的有意性フィルターを適用することによって同定した。２回の選別後、強化されたヒットが現れ始めた。３回の選別後、残りの細胞発現ペプチドの大多数は、ヒットしたと見なされた。３回目の選別後にヒットとして同定された全てのペプチドを再クローニングし、再試験した。配列番号１、配列番号２および配列番号３ペプチドをＴＥＡＤバインダーとして同定した。読み取りが大量であったライブラリーメンバーは、より大きい円のデータ点として表される。所与のデータ点を表す円の面積は、サンプル中の読み取りの量に比例する。図３Ｄは、ｘ軸にペプチドコンストラクト発現（ＧＦＰ）を示し、ｙ軸にＴＥＡＤ（ＡＦ６４７）を示すフローサイトメトリープロットを示す。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴＥＡＤに結合したペプチド発現細胞を示す。ＨＥＫ−２９３懸濁細胞は、ＳＤＧＦベクターにクローニングされたスクリーンからのヒットで形質移入され、２００ｎｍのＡＦ６４７−ストレプトアビジン−ＴＥＡＤで染色された。フローサイトメトリープロットのＧＦＰ＋ＡＦ６４７＋領域に入る細胞によって実証されるように、ＨＥＫ−２９３細胞によって発現された配列番号１、配列番号２および配列番号３のペプチドは、ＴＥＡＤへの結合を示した。
【０２１５】
図１７Ｅは、モデル化ＴＥＡＤ界面に見いだされる部位にアラニン置換変異体を提示する細胞（ＳＤＧＦ−配列番号４、ＳＤＧＦ−配列番号６、ＳＤＧＦ−配列番号５およびＳＤＧＦ−配列番号７）と比較して、表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）−配列番号１で形質移入された２９３Ｆ細胞のＴＥＡＤ結合能力を示す。全てのＣｙｓがＳｅｒ（６ＣＳ）に変換されてジスルフィド結合が排除された変異型（配列番号１８４）も試験した。結合は、フローサイトメトリーを用いて形質移入細胞中のＡｌｅｘａ６４７レベルを定量化することによって評価した。示されているのは、親ペプチドを提示している細胞について正規化された中央値±９５％信頼区間である。図１７Ｆは、モデル化ＴＥＡＤ界面に見いだされる部位にアラニン置換変異体を提示する細胞（ＳＤＧＦ−配列番号３９、ＳＤＧＦ−配列番号４０、ＳＤＧＦ−配列番号４１およびＳＤＧＦ−配列番号４２）と比較して、表面提示ＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）−配列番号２で形質移入された２９３Ｆ細胞のＴＥＡＤ結合能力を示す。全てのＣｙｓがＳｅｒ（６ＣＳ）に変換されてジスルフィド結合が排除された変異型（配列番号１８５）も試験した。結合は、フローサイトメトリーを用いて形質移入細胞中のＡｌｅｘａ６４７レベルを定量化することによって評価した。示されているのは、親ペプチドを提示している細胞について正規化された中央値±９５％信頼区間である。
【０２１６】
実施例６
細胞表面提示ＴＥＡＤ結合ペプチドおよび可溶性ＴＥＡＤ結合ペプチドの結合
この実施例は、ＴＥＡＤと、本開示のペプチドと、本開示のペプチド変異型との結合を記載する。ＹＡＰが結合するのと同じ一部位（部位２）でＴＥＡＤに結合するように配列番号１および配列番号２のペプチドを設計した。配列番号１および配列番号２の両方のペプチドは、ＹＡＰらせん２にも存在するＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番２１７）モチーフを含み、式中、Ｘ１およびＸ２は、任意のアミノ酸であり得る。図４は、配列番号１および配列番号２のペプチドならびにＹＡＰと界面を接するモデル化ＴＥＡＤおよび配列番号１変異型および配列番号２変異型へのＴＥＡＤの結合を示す。図４Ａは、ＹＡＰならびに配列番号１および配列番号２のペプチドが同一部位（部位２）でＴＥＡＤに結合すると予測されることを示す。ＹＡＰ−ＴＥＡＤ構造（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ：３ＫＹＳ）は、構造バイオインフォマティクス研究共同体（ＲＣＳＢ）からのものである。ＲＣＳＢ  ３ＫＹＳからのＴＥＡＤ構造に結合した配列番号１および配列番号２をモデル化した。図４Ｂは、配列番号２のＳＤＧＦ−Ｌ２３Ａ変異型（配列番号２の２３位のリジンからアラニンへの変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦー配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、ＹＡＰのＬ６５残基と類似した配列番号２のＬ２３位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｃは、配列番号２のＳＤＧＦ−Ｌ２６Ａ変異型（配列番号２の２６位のリジンからアラニンへの変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、ＹＡＰのＬ６８残基と類似した配列番号２のＬ２６位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｄは、配列番号２のＳＤＧＦ−Ｌ２７Ａ変異型（配列番号２の２７位のフェニルアラニンからアラニンへの変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、ＹＡＰのＦ６９残基と類似した配列番号２のＦ２７位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｅは、配列番号２のＳＤＧＦ−６ｘＣＳ変異型（６個全てのシステインがセリンに変異している配列番号２の変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号２で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。システインのセリンへの変異は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｆは、配列番号４のペプチド（配列番号１の２５位のグルタミン酸からアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｅ２５Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡ���結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、配列番号１のＥ２５位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｇは、配列番号６のペプチド（配列番号１の３３位のメチオニンからアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｍ３３Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、配列番号２のＭ３３位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｈは、配列番号５のペプチド（配列番号１の３７位のロイシンからアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｌ３７Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合との対比で、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、ＹＡＰのＬ６８残基と類似した配列番号１のＬ３７位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｉは、配列番号７のペプチド（配列番号１の３８位のフェニルアラニンからアラニンへの変異型である配列番号１のＳＤＧＦ−Ｆ３８Ａ変異型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、ＹＡＰのＦ６９残基と類似した配列番号１のＦ３８位は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。図４Ｊは、配列番号１８４のペプチド（６個全てのシステインがセリンに変異している配列番号１の変異型である、配列列番号１のＳＤＧＦ−６ｘＣＳ型）で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合と対比した、ＳＤＧＦ−配列番号１で形質移入されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞に対するＴＥＡＤ結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。システインのセリンへの変異は、ＴＥＡＤへの結合の喪失をもたらした。
【０２１７】
実施例１の方法を用いて可溶性ＴＥＡＤ結合ペプチドを作製し、次に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）実験のために、ＴＥＡＤ結合ペプチドの１５０μＭ〜４４ｐＭ（濃度範囲は試験されるＴＥＡＤ結合ペプチド次第で変動した）で変動する希釈系列を２μｇ／ｍＬのＴＥＡＤと共にインキュベーションし、約３００共鳴単位（ＲＵ）のタンパク質を捕捉することによって結合について評価した。図５は、可溶性ＴＥＡＤ結合ペプチドおよび変異型のＴＥＡＤへの結合を示す。ゲルは、最終容積の１０分の１のＮｕＰＡＧＥ中で還元条件にあるペプチドを示し、ＤＴＴは、５０ｍＭである。ＨＰＬＣは、４０ｍＭの最終ＤＴＴ濃度を有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中の還元条件にあるペプチドを示す。非還元条件は、「ＮＲ」として示され、還元条件は、「Ｒ」として示される。図５Ａは、非還元条件および還元条件における配列番号１のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５Ｂは、非還元条件およびＤＴＴによる還元条件における配列番号１のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５Ｃは、３１ｎＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号１のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを示す。図５Ｄは、非還元条件および還元条件における配列番号５のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５Ｅは、非還元条件およびＤＴＴによる還元条件における配列番号５のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５Ｆは、２８０ｎＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号５のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを示す。図５Ｇは、非還元条件および還元条件における配列番号７のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５Ｈは、非還元条件およびＤＴＴによる還元条件における配列番号７のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５Ｉは、２３μＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号７のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを示す。図５Ｊは、非還元条件および還元条件における配列番号３のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５Ｋは、非還元条件およびＤＴＴによる還元条件における配列番号３のペプチドを表すピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５Ｌは、１２μＭの解離定数（ＫＤ）でＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤに対する、配列番号３のペプチドのＳＰＲ結合アッセイデータを示す。配列番号５のペプチドは、配列番号１のペプチドと比較して低下したＴＥＡＤに対する親和性を有した。配列番号７のペプチドも、配列番号１のペプチドと比較して低下したＴＥＡＤに対する親和性を有した。配列番号５のペプチドは、配列番号１のペプチドと比較して低下したＴＥＡＤに対する結合を有した。配列番号３のペプチドも、配列番号１のペプチドと比較してより低いＴＥＡＤに対する結合を示した。配列番号３のペプチドは、ＴＥＡＤへの結合のために設計されていないため、ＴＥＡＤへの結合に対するより低い親和性は、ペプチドの不十分な折り畳みの結果である可能性がある。
【０２１８】
実施例７
ＹＡＰ−ＴＥＡＤ結合のペプチド妨害
この実施例は、本開示のペプチドによるＹＡＰ−ＴＥＡＤ結合の妨害を記載する。免疫共沈降により、配列番号１のペプチドをＴＥＡＤへのＹＡＰ結合の妨害について評価した。ＨＥＫ−２９３Ｔ懸濁細胞の２つの別々の集団にＭｙｃ−ＴＥＡＤまたはＦＬＡＧ−ＹＡＰのいずれかを形質移入し、細胞を溶解した。Ｍｙｃ−ＴＥＡＤ溶解物を抗Ｍｙｃ樹脂と共にインキュベートしてＴＥＡＤ結合樹脂を生成し、引き続いてこれをＹＡＰ溶解物および配列番号１または配列番号７のペプチドと共に３０分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、銀染色またはウエスタンブロットによって分析した。ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）配列を含む配列番号１のペプチドは、ＴＥＡＤに結合する能力を実証し、その結果、ＹＡＰがＴＥＡＤに結合しＴＥＡＤ結合樹脂によって沈降することを妨げた。図６Ａは、ＦＬＡＧ−ＹＡＰが配列番号１のペプチドの存在下でＭｙｃ−ＴＥＡＤ樹脂によって沈降しないが、配列番号７のペプチドの存在下でＭｙｃ−ＴＥＡＤ樹脂によって沈降したことを示す銀染色およびウエスタンブロットを示す。図６Ｂは、Ｍｙｃ−ＴＥＡＤ樹脂へのＦＬＡＧ−ＹＡＰ結合の用量依存的阻害を例証する、配列番号１のペプチドの希釈系列を示すウエスタンブロットを示す。図６Ｃは、図６Ｂからプロットされた定量化濃度測定データを示す。誤差棒は、１回の実験における１サンプル当たり４レーンのシグナルの定量化からの標準偏差を示す。ＴＥＡＤシグナルに対するＹＡＰシグナル（図示せず）の４つのブロットレーンのそれぞれの比率を取ることにより、ＦＬＡＧ−ＹＡＰシグナルをＭｙｃ−ＴＥＡＤシグナルに対して正規化した。
【０２１９】
実施例８
ペプチドの部位飽和変異誘発
この実施例は、有益なまたは有害な変異を同定するための本開示のペプチドの部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）を例示する。部位飽和変異誘発を配列番号１のペプチドに対して実施した。保存され置換されていないシステイン残基を除いて、配列番号１の全ての可能な単一アミノ酸置換をクローニングした。配列番号１のペプチドは、３４個の非システイン残基を有する（Ｎ末端「ＧＳ」は数えない）。所与の位置で可能な１８個の非システイン置換残基を用いて、ＳＳＭライブラリーは、配列番号１の６１２個の全変異型を含み、ライブラリーは、配列番号１の非変異ペプチドも含む。ＳＳＭライブラリーのペプチドを発現する哺乳類細胞のＴＥＡＤ結合は、実施例４および実施例５に記載されるように、しかし、より高ストリンジェンシーなプロトコルを用いて実施した。より高ストリンジェンシーなプロトコルは、より低濃度のＴＥＡＤ（２０ｎＭ）および最初のビオチン化ＴＥＡＤ染色と、それに続くＡＦ６４７−ストレプトアビジン染色の２つの別々のステップでの染色とを含んだ。４回の選別後、変異型を発現するほぼ全ての細胞集団がＴＥＡＤへの改善された結合を示した。図７は、ＴＥＡＤに対する結合活性が改善された配列番号１の変異型の部位飽和変異誘発スクリーニングの結果を示す。フローサイトメトリープロットは、ｘ軸上のペプチドコンストラクト発現の蛍光（ＧＦＰ）およびｙ軸上のＴＥＡＤ（ＡＦ６４７）を示す。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴＥＡＤに結合したペプチド発現細胞を示す。「ＳＳＭ０１」と標識されたパネルは、ペプチド変異型の全ライブラリーで形質導入された細胞を示す。図７Ａは、配列番号１のペプチドのみを発現するＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図７Ｂは、ビオチン化ＴＥＡＤの非存在下でＡＦ６４７−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号１のペプチドを発現するＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図７Ｃは、選別前にＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図７Ｄは、１回の選別後にＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図７Ｅは、２回の選別後にＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図７Ｆは、２回の選別後、ビオチン化ＴＥＡＤの非存在下でＡＦ６４７−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１および６１２変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ０１」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。結果は、２回の選別後、二重陽性細胞（右上の四分区間）が濃縮されたことを示し、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ結合の阻害の増強を示唆する。図１９は、ＴＥＡＤに対する結合活性が改善された配列番号１の変異型の部位飽和変異誘発スクリーニングの結果も示す。フローサイトメトリープロットは、ｘ軸上のペプチドコンストラクト発現の蛍光（ＧＦＰ）およびｙ軸上のＴＥＡＤ（ＡＦ６４７）を示す。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴＥＡＤに結合したペプチド発現細胞を示す。「ＳＳＭ」と標識されたパネルは、ペプチド変異型の全ライブラリーで形質導入された細胞を示す。図１９Ａは、配列番号１のペプチドのみを発現するＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。配列番号１の結合は、明らかであるが、２０ｎＭのＴＥＡＤ濃度および２段階染色結合条件下で弱かった。図１９Ｂは、選別前にＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリー（配列番号１変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「ＳＳＭ」ライブラリー）で形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１９Ｃは、１回の選別後にＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型ライブラリーで形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１９Ｄは、２回の選別後にＴＥＡＤと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型ライブラリーで形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１９Ｅは、２回の選別後、ビオチン化ＴＥＡＤの非存在下において、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号１の変異型のライブラリーで形質導入されたＨＥＫ−２９３細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。２回のスクリーニング終了後にＴＥＡＤ結合ペプチドの分布を評価した。図８は、部位飽和（ＳＳＭ）変異誘発スクリーニングにおいて生成された配列番号１の変異型の各位置における濃縮スコアおよびペプチドまたは変異型ペプチドとＴＥＡＤとの間の結合界面の構造モデルを示す。図８Ａは、ＳＳＭスクリーニングにおいて生成された配列番号１のペプチドの変異型のマトリックスを示す。ｘ軸は、配列番号１のペプチドの配列を示し、ｙ軸は、各位置で試験された各アミノ酸置換を示す（全て非システイン残基）。各単一点変異の濃縮度は、２回の選別後のマトリックス表に示される。濃縮スコア（入力量と対比した、２回の選別後の相対量のｌｏｇ２変化）をグレースケールでかつ数値として示す。陽性または高い濃縮スコア（より薄い灰色）は、置換に対してより耐性のある残基に対応する。置換に対してより寛容な残基の例としては、配列番号１の１５、２３および４０位に対応する残基が挙げられる。陰性またはより低い濃縮スコア（より濃い灰色）は、結合に重要である残基などの置換に対して耐性がより低い残基に対応する。
【０２２０】
以下の表４および表５は、ペプチドの各位置における構造および変異耐性に対する洞察を提供する、配列番号１の改善された変異型についてのＳＳＭスクリーニングを示す図８Ａの別の表現を示す。表４および表５のマトリックス中では、２回の選別後における配列番号１配列の各アミノ酸残基が行に示され、全ての置換された非Ｃｙｓ残基が列に示される。灰色の網掛け（または数字のないセル）は、その位置における天然アミノ酸または変化していないＣｙｓのいずれかを示す。各単一点変異についての濃縮度は、表４および表５において数値スコアとして示される。表４は、配列番号１の１〜２０位におけるアミノ酸残基を示す。表５は、配列番号１の２１〜４０位におけるアミノ酸残基を示す。
【０２２１】
【表１０】
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【０２２２】
【表１１】
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【０２２３】
全体的に、親水性アミノ酸残基に対するＧ１５およびＧ２８（らせん間ループ内に存在する）変異は、より高い濃縮スコアを示し、より良好な結合が示唆される。これは、おそらく、改善された折り畳み動態または改善された溶解度に起因する。Ｅ２５におけるアスパラギン酸への変異は、より良好な結合をもたらし、これは、４回のスクリーニング後に最も濃縮された変異型であった。Ｙ２３における変異は、芳香族残基への変異を除いて、結合を改善するために全体的に有益であった。これは、おそらく、Ｙ２３残基が溶媒から部分的に遮蔽され、溶媒に部分的に曝露されているという事実に起因し得る。したがって、より小型の脂肪族残基への置換は、らせん間相互作用を改善し得、親水性残基への置換は、溶解性を改善し得る。Ｐ４０残基における変異は、結合を改善し、これは、αらせん中のプロリン誘導捻れを除去することによる改善された安定性に起因し得る。図８Ｂは、グレースケール上の濃淡強度が各残基における平均濃縮スコアを示す配列番号１−ＴＥＡＤ界面のモデルを示す。陽性または高い濃縮スコア（より薄い灰色）は、置換に対してより耐性のある残基に対応する。陰性またはより低い濃縮スコア（より濃い灰色）は、結合に重要である残基などの置換に対して耐性がより低い残基に対応する。黒色は、システイン残基を指す。このモデルは、溶媒に曝露された残基が所与の位置における変異に対してより耐性があることを示したのに対し、ＴＥＡＤ結合領域の内部の残基またはペプチド−ＴＥＡＤ界面の残基は、所与の位置における変異に対して耐性が低かった。Ｇ１５、Ｙ２３およびＰ４０における配列番号１の変異は、全てゼロより大きい平均濃縮スコアをもたらした。
【０２２４】
実施例９
ＳＳＭ生成変異型ＴＥＡＤ結合ペプチドのＴＥＡＤ結合
この実施例は、実施例８で作製されたＳＳＭ生成変異型ＴＥＡＤ結合ペプチドのＴＥＡＤ結合を記載する。ＳＳＭスクリーニングは、多数の有益な変異を生じさせ、その中から、本発明者らは、配列番号１のペプチドに対する、Ｇ１５Ｑ、Ｙ２３Ｉ、Ｅ２５Ｄ、Ｇ２８ＫおよびＰ４０Ｗをはじめとする５つの特に有益な変異を選択した。これらの変異を有する配列番号１の変異型を作製し、上述した５つの変異のうちの３つが含まれる全ての組み合わせを含む１０の三重変異体、上述した５つの変異のうちの４つが含まれる全ての組み合わせを含む５つの四重変異体および五重変異体を作製した。実施例４および実施例５に記載されるＴＥＡＤ結合アッセイは、実施例８で使用されたのと同じストリンジェンシーで試験した。ビオチン化ＴＥＡＤとのインキュベーションと、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションとの間に追加の洗浄ステップが導入されるＴＥＡＤ結合アッセイについても記載した。追加の洗浄ステップによる結合の変化は、候補ペプチドのＴＥＡＤへの結合の動態、特にｋｏｆｆ値について本発明者らに情報を与えた。
【０２２５】
図９は、ＳＳＭによって配列番号１のペプチドにおいて同定された濃縮変異の組み合わせが改善されたＴＥＡＤ結合をもたらすことを示す。図９Ａは、ＴＥＡＤ結合を評価するために使用された染色プロトコルの概略図を示す。「通常」および「追加洗浄」プロトコルは、いずれも２０ｎＭのＴＥＡＤを使用する。図９Ｂは、ＳＤＧＦ−配列番号１、ＳＤＧＦ−配列番号９（配列番号１のＱＩＤＫＷ変異型）およびＹＡＰを発現するＨＥＫ−２９３懸濁細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。五文字コード（例えばＱＩＤＫＷ）は、残基１５（ＧまたはＱ）、２３（ＹまたはＩ）、２５（ＥまたはＤ）、２８（ＧまたはＫ）、４０（ＰまたはＷ）における配列番号１のペプチドの変異型に相当する。図９Ｃは、図９Ｂに示される「スライス」ゲートに入る細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量化を示す。ｘ軸は、試験された変異型を示し、全てのＭＦＩ値は、配列番号１のペプチドに対するＭＦＩ値に対して正規化される。網掛けされた群は、特定の変異、ＸＸＤＫＷ；ＸＸＤＧＷ；ＸＸＤＫＰの組み合わせを有するクラスタである。五重変異型「ＱＩＤＫＷ」は、最高の性能を発揮したが、３つまたは４つの変異がなされ、少なくともＥ２５Ｄ、Ｇ２８ＫおよびＰ４０Ｗを含む変異型よりわずかにのみ優れていた。Ｅ２５Ｄは、ＴＥＡＤ上のＫ１５２で形成されるようにモデル化された塩橋における保存的変異または換言すれば生化学的に類似した変異である（すなわち、グルタミン酸およびアスパラギン酸は、負に荷電した側鎖を有する残基である）。Ｋに変異しているかどうかにかかわらず、配列番号１のペプチドの残基Ｇ２８は、計算モデルによって予測されるようにＴＥＡＤに直接結合するように見えない。しかし、改善された結合は、ペプチドを安定化する変異Ｇ２８Ｋの結果であり得、それによって結合および二量体化からのいかなるエントロピーのペナルティも軽減される。その中にＥ２５ＤおよびＰ４０Ｗ変異があるが、Ｇ２８が保持されている（ＸＸＤＧＷボックス）全ての変異型は、３つ全ての変異を含む変異型よりもごくわずかに低い結合を有した。全ての変異型は、変異Ｅ２５ＤおよびＧ２８Ｋを有するが、Ｐ４０を保持することは、追加の洗浄ステップを伴うスクリーニングにおいてより低い結合をもたらした。これは、Ｐ４０Ｗ変異がより緩慢なオフ速度をもたらし得ることを示唆した。
【０２２６】
配列番号９（五重変異型、Ｇ１５Ｑ、Ｙ２３Ｉ、Ｅ２５Ｄ、Ｇ２８Ｋ、Ｐ４０Ｗ）、配列番号１０（Ｇ２８Ｋ変異なしの四重変異型）および配列番号１１（Ｐ４０Ｗなしの四重変異型）のペプチドをはじめとする３つの変異型を可溶性ペプチドとして試験した。これらのペプチドは、両親媒性であり得、ＨＰＬＣによって観察されるよりも長い滞留時間をもたらす。図１０は、可溶性ペプチドとしての配列番号１のペプチドの変異型によるＴＥＡＤへの結合を示す。非還元条件は、「ＮＲ」として示され、還元条件は、「Ｒ」として示される。図１０Ａは、非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）条件における配列番号９の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｂは、非還元または還元条件における配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈにおいて、還元（Ｒ）ペプチドＨＰＬＣクロマトグラムに見られる初期ピーク（＜３分）は、還元型および酸化型ＤＴＴ化学種である。図１０Ｃは、ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤへの配列番号９のペプチドの結合を示すＳＰＲデータを示す。配列番号９のペプチドについてのＳＰＲ実験は、単一サイクル動態解析によって行われ、ＫＤは、３６８ｐＭであると判定された。図１０Ｄは、非還元（ＮＲ）または還元（Ｒ）条件における配列番号１０の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｅは、非還元または還元条件における配列番号１０のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０Ｆは、ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤへの配列番号１０のペプチドの結合を示すＳＰＲデータを示す。配列番号１０のペプチドについてのＳＰＲ実験は、単一サイクル動態解析によって行われ、ＫＤは、３７２ｐＭであると判定された。図１０Ｇは、非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）条件における配列番号１１の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｈは、非還元または還元条件における配列番号１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０Ｉは、ＳＰＲチップ上に固定化されたビオチン化ＴＥＡＤへの配列番号１１のペプチドの結合を示すＳＰＲデータを示す。配列番号１１のペプチドについてのＳＰＲ実験は定常状態解析によって実施し、ＫＤは、３．８ｐＭであると判定された。全体的に、データは、３つの変異型が配列番号１の親ペプチドよりもＴＥＡＤへの結合がより良好であることも示す。さらに、配列番号９および配列番号１０について観察されたものとは対照的に、追加の洗浄ステップが配列番号１１のペプチドについて組み込まれた場合に観察された減少した結合は、配列番号１１のペプチドのより速いオフ速度によって駆動された。
【０２２７】
実施例１０
細胞表面提示ＹＡＰと対比したＴＥＡＤへのペプチドの競合的結合
この実施例は、本開示のペプチドのＴＥＡＤへの競合的結合または表面提示ＹＡＰへのＴＥＡＤ結合の妨害について記載する。ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現するＨＥＫ−２９３懸濁細胞を最初に配列番号１または配列番号９のペプチドのいずれかと共にインキュベートした。次に、細胞培養物を図１１に示すように５ｎＭのビオチン化ＴＥＡＤで染色した。
【０２２８】
図１１は、配列番号１の可溶性ペプチドを用いたＹＡＰのＴＥＡＤへの結合の阻害と比較した、配列番号９の可溶性ペプチドを用いたＹＡＰのＴＥＡＤへの結合の阻害を示す。図１１Ａは、ＳＤＧＦ−ＹＡＰで形質移入され、０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭの配列番号１のペプチドと共にインキュベートされ、５ｎＭのビオチン化ＴＥＡＤおよび５ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションがそれに続いたＨＥＫ−２９３懸濁液細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１１Ｂは、ＳＤＧＦ−ＹＡＰで形質移入され、０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭの配列番号９のペプチドと共にインキュベートされ、５ｎＭのビオチン化ＴＥＡＤおよび５ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションがそれに続いたＨＥＫ−２９３懸濁液細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１１Ｃは、図１１Ａおよび図１１Ｂに示される「スライス」ゲートに入る細胞のＭＦＩを定量化する用量反応曲線を示す。細胞は５ｎＭのＴＥＡＤで染色されたため、５ｎＭ未満のＴＥＡＤ染色の用量は、ＩＣ５０またはＫｉ判定に関連があるデータを提供しない。図１１Ｄは、５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞をＡＦ６４７−ストレプトアビジンで即座に染色し、ＴＥＡＤに結合したＹＡＰ発現細胞について分析した。図１１Ｅは、５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞を氷上で１時間インキュベートし、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色し、ＴＥＡＤと結合したＹＡＰ発現細胞について分析した。図１１Ｆは、５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞を１００ｎＭの配列番号１のペプチドと共に氷上で１時間インキュベートし、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色し、ＴＥＡＤに結合したＹＡＰ発現細胞について分析した。図１１Ｇは、５ｎＭのＴＥＡＤと共にインキュベートされ、次に洗浄された、ＳＤＧＦ−ＹＡＰを発現する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞を１００ｎＭの配列番号９のペプチドと共に氷上で１時間インキュベートし、ＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色し、ＴＥＡＤに結合したＹＡＰ発現細胞について分析した。
【０２２９】
競合的結合アッセイのフローサイトメトリー分析の結果は、約３０ｎＭの配列番号１のペプチドがＹＡＰへのＴＥＡＤ結合の最大半量阻害をもたらしたことを実証した。これにより、実施例６に示されるような先に得られた結果が確認され、配列番号１のペプチドは、３１ｎＭのＫＤを有すると判定された。競合的結合アッセイのフローサイトメトリー分析の結果は、ＹＡＰ提示細胞のＴＥＡＰ−ＡＦ６４７による染色の欠如によって示されるように、配列番号９のペプチドがＹＡＰへのＴＥＡＤ結合のほぼ完全な排除をもたらすことも実証した。ＹＡＰに対するＴＥＡＤ結合のほぼ完全な排除の同一結果が、配列番号９のペプチドの添加に先立ってＹＡＰ提示細胞を最初にＴＥＡＤとインキュベートした場合にも観察された。
【０２３０】
実施例１１
還元条件におけるペプチドの安定性
この実施例は、還元条件下におけるペプチドの安定性を記載する。核内のＴＥＡＤを標的化するペプチドは、細胞の細胞質ゾル区画内の還元条件に曝露される。したがって、本開示のペプチドが還元条件において安定性を示すことは有利である。本開示のペプチドの安定性を１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１０ｍＭ  ＧＳＨ中で試験した。ＧＳＨは、細胞内条件におけるペプチド安定性を試験するためのより生理学的に関連のある還元剤である。図１２Ｂに示されるように、細胞の細胞質ゾル区画内の還元性環境をより良く代表する還元剤であるＧＳＨ下の還元条件に配列番号１および配列番号９のペプチドを曝露させた場合、いずれのペプチドも、ＨＰＬＣによって観察されるように非還元ペプチドと比較して有意に移行したピークを示さなかったため、配列番号１および配列番号９は、ＧＳＨ還元条件に対して耐性であった。図１０Ｂに示されるように、１０ｍＭ  ＤＴＴなどのより強い還元条件では、配列番号９のペプチドは、ＤＴＴ還元に対してある程度耐性であった。ＤＴＴ還元条件における配列番号９のペプチドのインライン質量分析は、非還元ペプチドの約６Ｄａ以内の断片を明らかにし、したがって配列番号９のペプチドがＤＴＴの還元に対してある程度耐性であることを実証した。
【０２３１】
図１２は、還元剤に対するＴＥＡＤ結合ペプチドの安定性を示す。図１２Ａは、非還元条件および１０ｍＭ  ＤＴＴ還元条件における配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。代表的な質量分析ピークプロファイルが挿入図に示される。図１２Ｂは、１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中でのインキュベーションを伴うまたは伴わない配列番号１および配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０２３２】
本開示のペプチドは、還元条件へのペプチドの曝露により、ＴＥＡＤへの結合が影響を受けるかどうかを評価するためにも試験した。ＨＥＫ−２９３Ｔ懸濁液細胞をＳＤＧＦ−配列番号１またはＳＤＧＦ−配列番号９と共にインキュベートした。培養物を２日間増殖させ、１０ｍＭ  ＧＳＨまたは１０ｍＭ  ＤＴＴ中でのインキュベーションがそれに続いた。最後に、細胞をＴＥＡＤで染色した。図１３は、ＳＤＧＦ−配列番号９を発現する細胞を還元剤に曝露した後におけるＴＥＡＤへの結合を示す。図１３Ａは、ＳＤＧＦ−配列番号１（ＧＦＰ）で形質移入され、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴまたは１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中で５分間インキュベートされてから、２０ｎＭビオチン化ＴＥＡＤおよび２０ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１３Ｂは、ＳＤＧＦ−配列番号９（ＧＦＰ）で形質移入され、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴまたは１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）中で５分間インキュベートされてから、２０ｎＭビオチン化ＴＥＡＤおよび２０ｎＭのＡＦ６４７−ストレプトアビジンで染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１３Ｃは、図１３Ａおよび図１３Ｂに示される「スライス」ゲート内に入る細胞のＡＦ６４７  ＭＦＩの定量化を示す。結合アッセイの結果は、配列番号１のペプチドを提示する細胞がＤＴＴ処理後にＴＥＡＤへの結合の部分的喪失を示し、ＧＳＨ処理後にＴＥＡＤへの結合の喪失を示さないことを示唆した。結合アッセイの結果は、配列番号９のペプチドを提示する細胞が、ＤＴＴまたはＧＳＨのいずれを還元剤として使用したかどうかにかかわりなく、ＴＥＡＤへの結合の喪失を示さなかったことも示唆した。
【０２３３】
実施例１２
プロテアーゼに対するペプチド安定性
この実施例は、プロテアーゼに対する本開示のペプチドの安定性を例示する。腫瘍環境は、一般に大量のプロテアーゼを含有する。さらに、タンパク質分解（プロテアーゼによる分解または切断）に対する耐性は、ペプチドが分解され、次にＭＨＣによって免疫系に提示される可能性を減少させる。さらに、タンパク質分解に対する耐性は、腫瘍への輸送に先立つ投与後における血清中のペプチド半減期を増加させ得る。したがって、本開示のペプチドがプロテアーゼによる分解に対して耐性であることは有利である。
【０２３４】
可溶性ペプチドを５００Ｕ／ｍＬのブタトリプシンに曝露させ、ＨＰＬＣで分析した。プロテアーゼ耐性は、ＳＤＰＲ提示ペプチドを使用することによっても評価した。ＳＤＰＲベクターは、ＳＤＧＦベクターと同様であるが、Ｃ末端６ｘＨｉｓタグ（配列番号２８４）を含有し、柄上の全ての塩基性または芳香族アミノ酸残基が除去されている。次に、ペプチドを提示する細胞のトリプシンまたはキモトリプシンとのインキュベーションと、それに続く１０ｍＭ  ＤＴＴ中でのインキュベーションおよび抗６ｘＨｉｓフルオロフォア標識抗体での染色によってプロテアーゼ耐性を試験する。ペプチド未切断であれば、それらは、Ｈｉｓタグを保持し、抗体によって染色される。対照プロテアーゼ感受性ノッチンペプチド（ＳＫ）を陽性対照として使用した。ペプチドを提示する細胞を４０μｇ／ｍｌまでのトリプシンまたはキモトリプシンで処理した。
【０２３５】
図１４は、配列番号９のペプチドのプロテアーゼ耐性を示す。図１４Ａは、５００Ｕトリプシン（Ｔ）と共にインキュベートされ、次にトリプシンインヒビター（Ｉ）でクエンチされ、非還元（ＮＲ）条件または１０ｍＭ  ＤＴＴによる還元（Ｒ）条件に置かれた後の配列番号９のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。次に、生成物をＨＰＬＣ上で泳動した。クロマトグラムは、トリプシンを欠く実験で見られたものと（同一ではないが）類似しているように見える。図１４Ｂは、図２Ａに示されるＳＤＧＦベクターの変異型であるが、柄内の全ての塩基性または芳香族残基が除去されてトリプシン／キモトリプシン切断が防止され、６×Ｈｉｓ（配列番号２８４）タグがＣ末端に付加されているＳＤＰＲベクターの概略図を示す。図１４Ｂの概略図において、抗６ｘＨｉｓについて染色することで達成され得るプロテアーゼ耐性または耐還元性の評価ができるように修飾表面提示ベクターを設計した。様々な実施形態において、このコンストラクトが使用される実験では、コンストラクトを発現する細胞をトリプシンまたはキモトリプシンなどのプロテアーゼと共にインキュベートし得、還元剤での処理がそれに続く。プロテアーゼおよび還元剤での処理後、プロテアーゼ処理による還元および／またはタンパク質分解から生じた線状化ペプチド産物または分解産物を６×Ｈｉｓタグ（配列番号２８４）に対する染色によって検出または分析し得る。例えば、ペプチドは、還元剤の存在下で線状化され得、それは、タンパク質分解に対してより感受性になり得、または還元耐性ペプチドは、プロテアーゼによって切断され得る。ペプチド主鎖中の単一の切断事象の存在は、線状化提示ペプチドをもたらし得、それは、Ｃ末端上の６×Ｈｉｓタグ（配列番号２８４）を失い得、このようなペプチドを有する細胞に６×Ｈｉｓに対する染色を失わせる（配列番号２８４）。
【０２３６】
図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅおよび図１４Ｆは、ＳＤＰＲコンストラクトにクローニングされたプロテアーゼ感受性ノッチンペプチドＳＫ（ＳＤＰＲ−ＳＫ）またはＳＤＰＲコンストラクトにクローニングされた配列番号９のいずれかで形質移入され、０もしくは４０μｇ／ｍｌのトリプシンまたはキモトリプシンで２０分間処理され、次にＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁液細胞のフローサイトメトリー分析を示す。抗６×ＨＩＳシグナルの喪失は、ペプチドの不安定化または分解の指標となる。図１４Ｃは、プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドで形質移入され、次に０または４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間処理され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。図１４Ｃでは、プロテアーゼ感受性（ＳＫ）であるとして以前に特徴付けられたノッチンは、トリプシンまたはキモトリプシンによる処理後に染色の喪失が示される（細胞をＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗６ｘＨｉｓ抗体で染色した際のＡＰＣシグナルの減少として可視化する。図１４Ｄは、ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチドで形質移入され、次に０または４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間処理され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。図１４Ｅは、プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドで形質移入され、次に０または４０μｇ／ｍｌのキモトリプシンで２０分間処理され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。図１４Ｆは、ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチドで形質移入され、次に０または４０μｇ／ｍｌのキモトリプシンで２０分間処理され、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色されたＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。図１４Ｇは、いずれも様々な濃度のトリプシンと共に処理された、ＳＤＰＲ−ＳＫペプチド形質移入細胞と、ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチド形質移入細胞とを比較したフローサイトメトリーデータの定量化を示す。図１４Ｈは、いずれも様々な濃度のキモトリプシンと共に処理された、ＳＤＰＲ−ＳＫペプチド形質移入細胞と、ＳＤＰＲ−配列番号９ペプチド形質移入細胞とを比較したフローサイトメトリーデータの定量化を示す。プロテアーゼへの曝露の結果は、配列番号９のペプチドがプロテアーゼによる切断に対してある程度耐性であることを示唆した。
【０２３７】
実施例１３
ペプチド放射性標識
この実施例は、ペプチドの放射性標識を記載する。いくつかのペプチドを標準技術（Ｊｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５４（１１）：４３５９−６５．１９７９に記載のものなど）により、１４Ｃホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化によって放射性標識した。配列は、Ｎ末端にアミノ酸「Ｇ」および「Ｓ」を有するように操作した。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖ９１：１９８３ｐ．５７０およびＪＢＣ  ２５４（１１）：１９７９  ｐ．４３５９を参照されたい。過剰なホルムアルデヒドを使用して、完全なメチル化（全ての遊離アミンのジメチル化）を駆動した。標識されたペプチドは、Ｓｔｒａｔａ−Ｘカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ８Ｂ−Ｓ１００−ＡＡＫ）上での固相抽出によって単離し、５％メタノール添加水で洗浄して、２％ギ酸添加メタノール中に回収した。溶媒は、引き続いて穏やかな加熱および窒素ガス流を用いてブローダウン蒸発器内で除去した。
【０２３８】
実施例１４
ペプチド検出可能薬剤コンジュゲート
この実施例は、ペプチドの色素標識を記載する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、次にＤＣＣまたはＥＤＣを用いて、ペプチドのＮ末端を、ＮＨＳエステルを介して検出可能薬剤にコンジュゲート、連結または融合させ、ペプチド検出可能薬剤コンジュゲートを作製する。検出可能薬剤は、Ｃｙ５．５などのシアニン色素などのフルオロフォア色素またはＡｌｅｘａ６４７などのＡｌｅｘａフルオロフォアである。
【０２３９】
ペプチド検出可能薬剤コンジュゲートを対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ペプチド検出可能薬剤コンジュゲートは、腎臓にホーミングする。対象または対象から生検を画像化し、腎臓へのペプチド検出可能薬剤コンジュゲートの局在化を視覚化する。いくつかの態様では、腎障害の診断は、投与後の腎臓におけるペプチド検出可能能薬剤コンジュゲートの可視化に基づく。
【０２４０】
実施例１５
がんの治療
この実施例は、本開示のペプチドを使用したがんの治療を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、直接使用する。ペプチドを、それを必要とする対象にがんの治療薬として医薬組成物中で投与する。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。ペプチドは、配列番号９であり得る。１つまたは複数のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり得る。医薬組成物を、静脈内、皮下、筋肉内、経口的に投与するか、または腫瘍微小環境内に直接注射する。ペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、引き続くＹＡＰまたはＴＡＺによる結合を排除することにより、ＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用およびＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害する。ペプチドは、結合ＹＡＰまたはＴＡＺと競合することにより、ＹＡＰ−ＴＥＡＤおよびＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害し、ＴＥＡＤからのＹＡＰまたはＴＡＺの解離およびＴＥＡＤへのペプチド結合をもたらす。ＹＡＰ−ＴＥＡＤおよびＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害する投与されたペプチドは、対象のがんの病状を治療する。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
【０２４１】
同じ方法は、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を治療するために適合されるか、またはそれを治療するためにも使用され得る。
【０２４２】
実施例１６
遺伝子治療修飾細胞によるペプチド送達
この実施例は、遺伝子治療修飾細胞によるペプチド送達を例示する。本開示のペプチドは、遺伝子治療修飾細胞によって媒介される送達により、腫瘍微小環境（例えば、免疫浸潤物またはがん性細胞）に向けられ得る。がん細胞に選択的に感染または標的化するウイルスベクターを含み、本開示のペプチドをコードする遺伝子を保有する遺伝子治療組成物を対象に投与して、がん細胞または腫瘍においてペプチドを選択的に発現させ得る。代わりに、本開示のペプチドを発現する細胞を、遺伝子治療を用いて生体外で修飾し、修飾細胞の対象への移植がそれに続く。対象は、ヒトまたは動物である。移植後、修飾細胞は、腫瘍微小環境またはがん細胞に移動して生体内でＴＥＡＤ結合を妨害する。医薬組成物は、静脈内、皮下または経口投与される。
【０２４３】
図１８Ａおよび１８Ｂは、標的細胞における配列番号１および配列番号９の発現の一例を示す。図１８Ａは、ＹＡＰおよび８×ＧＴＩＩＣ（ＴＥＡＤルシフェラーゼレポーター）で同時形質移入された、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチド融合コンストラクトの一部として細胞質ゾルに直接発現された配列番号１または配列番号９の相対発光単位を示す。これは、２４ウェルプレートウェル内で実施し、２９３Ｆ細胞を５０ｎｇのＦＬＡＧ−ＹＡＰ、３００ｎｇの８×ＧＴＩＩＣおよび１００または２５０ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチドプラスミドで形質移入した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．００５対ＹＡＰ単独。配列番号１２が発現された場合、レポーター活性が低下した（Ｐ＝０．００３）。図１８Ｂは、ウエスタンブロットによる、ＤＴＴ還元時のｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２ａ−ペプチドコンストラクトＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル移動度シフト中のＦＬＡＧタグ付き配列番号７、ＦＬＡＧタグ付き配列番号１、ＦＬＡＧタグ付き配列番号９またはＦＬＡＧタグ付き配列番号１８４（抗ＦＲＡＧＭ２抗体）を示す。未切断融合タンパク質のサイズに対応するバンドが示される。配列番号１８４は、６つ全てのシステインがセリンに変異して非被酸化性スルフヒドリルを模倣する配列番号９−６ｘＣＳである。ＦＬＡＧタグ付きのｍＣｈｅｒｒｙ融合型は、ＤＴＴ還元時にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてわずかなシステイン依存性移動度シフトを示した一方、Ｔ２ａ切断された配列番号１変異型は、目に見えなかった（図２３）。これは、配列番号１のシステインおよびその変異型が細胞質ゾル中でシスチンに酸化され得るが、細胞質ゾル中で直接発現されたときのその安定性は、ｍＣｈｅｒｒｙのような融合パートナーなしでは損なわれ得ることを示唆する。
【０２４４】
ペプチドの発現に際して、ペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、引き続くＹＡＰまたはＴＡＺによる結合を排除することによってＴＥＡＤとＹＡＰ／ＴＡＺとの相互作用を妨害し、これは、発がん遺伝子を下方制御する。このペプチドは、結合したＹＡＰまたはＴＡＺと競合することによってＹＡＰ−ＴＥＡＤおよびＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害し、ＴＥＡＤからのＹＡＰ／ＴＡＺ解離がもたらされる。ＹＡＰ／ＴＡＺとＴＥＡＤとの相互作用を妨害するペプチドをコードする投与された遺伝子治療を使用して、対象におけるがんの病状を治療し得る。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
【０２４５】
遺伝子治療は、膵臓細胞を選択的に標的化する遺伝子治療ベクターを使用してＩ型およびＩＩ型糖尿病を治療するためにも使用され得る。
【０２４６】
実施例１７
ペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
この実施例は、ペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を例示する。本開示の様々なペプチドをＴＥＡＤへの結合親和性について分析した。簡潔に述べると、シリーズＳＳＡチップを有するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上において、２５℃で実施されたＳＰＲ実験によって結合親和性を分析した。０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した実験における泳動用緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２Ｏ）を使用した。ビオチン化ＴＥＡＤを２μｇ／ｍＬの濃度および１０μＬ／分の速度でフローセル上に注入し、ＳＰＲチップ上の約３００共鳴単位（ＲＵ）に対応するＴＥＡＤを捕捉した。参照表面は、モル当量のビオチン化ヒトトランスフェリン受容体外部ドメインを捕捉することによって作製した。定常状態に到達できたペプチドについては、ペプチドの連続２倍希釈物を、各ペプチドのＫＤを広くカバーする濃度範囲において上述の泳動用緩衝液中で調製した。複数の緩衝液空試験がその中に散在する二連のサンプルを２〜５分間の結合および２〜５分間の解離で５０μＬ／分でランダムに注入した。ＳＰＲチップ上に緩衝液のみを流すことによって再生を達成した。二重参照データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０．４ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１の親和性または動態結合モデルのいずれかに適合させた。２つのペプチドサンプル（配列番号９および配列番号１０）を、Ｔ１００  Ｃｏｎｔｒｏｌ２．０．４ソフトウェアの単一サイクル動態プロトコルを用いて泳動した。配列番号９および配列番号１０のペプチドの連続３倍希釈液（３．６ｎＭ〜０．０４４ｎＭ）を泳動用緩衝液中で調製し、７分間の注射時間および１５分間の解離時間を伴って濃度順に５０μＬ／分の速度で注射した。参照のための２回の緩衝液のみの空試験サイクルをペプチド注射に先立って実施し、１回の緩衝液のみの空試験サイクルがそれに続いて、これは、次のペプチドの注射に先立って完全なペプチド解離のための時間を与えた。二重参照データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０．４ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、単一サイクル動態についての１：１結合モデルに適合させた。表６は、捕捉されたビオチン化ＴＥＡＤへのペプチドの結合を評価するためのＳＰＲ法の条件を例示する。
【０２４７】
【表１２】
2020505326.tif 000017
【０２４８】
【表１３】
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【０２４９】
図１５は、ＳＰＲ実験の結果を示す。図１５Ａは、様々な濃度における配列番号１の結合を示す、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｂは、単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを示す。図１５Ｃは、様々な濃度における配列番号５の結合を示す、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｄは、単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを示す。図１５Ｅは、様々な濃度における配列番号７の結合を示す、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｆは、単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを示す。図１５Ｇは、様々な濃度における配列番号８の結合を示す、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｈは、単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを示す。図１５Ｉは、様々な濃度における配列番号１１の結合を示す、ＳＰＲ実験からの生データを示す。図１５Ｊは、単一サイクル動態の１：１結合モデルと適合する、ＳＰＲからのデータを示す。図１６は、本開示のペプチドのＴＥＡＤへの結合を示す、ＳＰＲ実験からのデータを示す。図１６Ａは、単一サイクル動態プロトコルを用いたＴＥＡＤへの配列番号９の結合を示す。図１６Ｂは、単一サイクル動態プロトコルを用いたＴＥＡＤへの配列番号１０の結合を示す。図１６Ｃは、定常状態動態プロトコルを用いたＴＥＡＤへの配列番号１１の結合を示す。
【０２５０】
表７は、結合（ｋａ））、解離（ｋｄ）および解離定数（ＫＤ）の定量化をはじめとする、試験された各ペプチドのＳＰＲ実験の結果を示す。より低いＫＤ値は、より高い親和性およびより良い結合を示唆する。
【０２５１】
【表１４】
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【０２５２】
実施例１８
細胞浸透性ペプチド融合物
この実施例は、細胞浸透性ペプチド融合物を記載する。本開示のＴＥＡＤ結合ペプチドを細胞浸透性ペプチド部分への融合物として組換え的に発現させる。ＴＥＡＤ結合ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。細胞浸透性ペプチド部分は、Ｎ末端にコンジュゲート、連結または融合されたＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１４６）配列などの１つまたは複数のＡｒｇ残基であり、または本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端にコンジュゲート、連結または融合された配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９５）を有するＴａｔペプチドである。代わりに、細胞浸透性ペプチド部分は、本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端に融合しているマウロカリン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オプリカリン−１、オピカルシン−２、ミッドカイン（６２−１０４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩまたはクロロトキシンから選択される。代わりに、細胞浸透性ペプチド部分は、本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端に融合しているＴＡＴ（配列番号１４３）、ＣｙｓＴＡＴ（配列番号１４４）、Ｓ１９−ＴＡＴ（配列番号１４５）、Ｒ８（配列番号１４６）、ｐＡｎｔｐ（配列番号１４７）、Ｐａｓ−ＴＡＴ（配列番号１４８）、Ｐａｓ−Ｒ８（配列番号１４９）、Ｐａｓ−ＦＨＶ（配列番号１５０）、Ｐａｓ−ｐＡｎｔＰ（配列番号１５１）、Ｆ２Ｒ４（配列番号１５２）、Ｂ５５（配列番号１５３）、アズリン（配列番号１５４）、ＩＭＴ−Ｐ８（配列番号１５５）、ＢＲ２（配列番号１５６）、ＯＭＯＴＡＧ１（配列番号１５７）、ＯＭＯＴＡＧ２（配列番号１５８）、ｐＶＥＣ（配列番号１５９）、ＳｙｎＢ３（配列番号１６０）、ＤＰＶ１０４７（配列番号１６１）、Ｃ１０５Ｙ（配列番号１６２）、トランスポータン（配列番号１６３）、ＭＴＳ（配列番号１６４）、ｈＬＦ（配列番号１６５）、ＰＦＶＹＬＩ（配列番号１６６）またはｙＢＢＲ（配列番号１６７）から選択される。代わりに、細胞浸透性ペプチド部分は、リンカーによって本開示の任意のＴＥＡＤ結合ペプチドのＮ末端に融合している。リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１０）、ＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号２１１）（ＤｋＴｘ由来のリンカー）もしくはＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号２１２）（ヒトＩｇＧ３由来のリンカー）または配列番号２０３〜配列番号２１２の任意のリンカーあるいは任意の他のリンカーから選択される。代わりに、ＴＥＡＤ結合ペプチド、細胞浸透性ペプチド部分および任意選択的にリンカーは、別の手段によって結合される。例えば、他の手段としては、任意の位置における化学的コンジュゲーション、細胞浸透性ペプチド部分および／またはリンカーのＴＥＡＤ結合ペプチドＣ末端への融合、リポソームとの共製剤化または他の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２５３】
細胞浸透性ペプチド融合物またはコンジュゲートは、それを必要とする対象に投与される。対象は、ヒトまたは動物であり、がんまたは糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）などの疾患を有する。投与に際して、細胞浸透性ペプチド融合物は、細胞膜を通過して細胞内区画にアクセスし、引き続いてＴＥＡＤと結合し、ＹＡＰのＴＥＡＤとの結合を妨げる。
【０２５４】
実施例１９
核局在化を促進するためのペプチド融合物
この実施例は、核局在化を促進するペプチド融合物を記載する。本開示のＴＥＡＤ−結合ペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成する。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。ＴＥＡＤ結合ペプチドは、四残基配列Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ（配列番号２０２）などの核局在化シグナルにコンジュゲート、連結、融合される（式中、Ｘは、任意のアミノ酸またはその変異型であり得る）（Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  Ｆｅｂ  ２３；２８２（８）：５１０１−５）。ペプチド融合物を、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、がんまたは糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）などの疾患を有する。投与に際して、ペプチド融合物は、核に移動し、そこで、それらは、ＹＡＰとＴＥＡＤとの結合を効率的に妨げる。
【０２５５】
実施例２０
ペプチドの細胞質ゾル送達の促進
この実施例は、ペプチドの細胞質ゾル送達または細胞浸透の促進を記載する。本開示のＴＥＡＤ−結合ペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成する。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。ＴＥＡＤ結合ペプチドは、ｄｆＴＡＴにコンジュゲート、連結または融合され、かつ／またはｄｆＴＡＴと同時送達される。四残基配列Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ（配列番号２０２）などの核局在化シグナル（式中、Ｘは、任意のアミノ酸またはその変異型であり得る）（Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  Ｆｅｂ  ２３；２８２（８）：５１０１−５）は、ＴＥＡＤ結合ペプチドにさらにコンジュゲート、結合または融合され得る。ペプチド融合物を、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、がんまたは糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）などの疾患を有する。投与に際して、ペプチド融合物は、細胞質ゾル中で発現され、細胞質ゾルおよび核内のＴＥＡＤと相互作用して、ＹＡＰまたはＴＡＺなどの転写活性化補助因子へのＴＥＡＤ結合を妨害する。
【０２５６】
例えば、配列番号９を、生存能力または遺伝子発現プロファイルに顕著な影響を与えることなく、最大１５０ｋＤａまでの積荷のエンドソーム漏出を促進する小型二量体ペプチドであるｄｆＴＡＴと同時投与した。可視化のためにＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８にコンジュゲートされた配列番号９を使用して、ＨｅＬａ細胞を配列番号９およびｄｆＴＡＴの両方と同時インキュベートすると、細胞内に分散パターンで配列番号９の蓄積が生じた。より具体的には、図１８〜１８Ｉは、配列番号９が核内のＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体を有意に減少させることを示す。エンドソーム漏出を誘導する５μＭのｄｆＴＡＴを使用して、配列番号９−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８をＨｅＬａ細胞の細胞質ゾル／核に導入した。配列番号９−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８は、ＦＩＴＣチャネルに見られた（図１８Ｄ）一方、ｄｆＴＡＴは、ＴＲＩＴＣチャネルに見られた（図１８Ｃ）。ＹＡＰおよびＴＥＡＤに対する一次抗体を使用して、ＨｅＬａ細胞における近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を実施し、ＤＡＰＩ染色核（ＵＶチャネル）と重なるスペックル（ＡＰＣチャネル）を生成した。図１８Ｅは、５μＭのｄｆＴＡＴのみで処理された細胞の代表的な画像を示す。図１８Ｆは、５μＭのｄｆＴＡＴおよび５μＭの配列番号９で処理された細胞の代表的な画像を示す。図１８Ｇは、一部のスペックルがＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体に対して非特異的である、抗ＹＡＰ一次抗体が省略されている対照近接ライゲーションアッセイＰＬＡ反応の代表的な画像を示す。図１８Ｈは、一部のスペックルがＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体に対して非特異的である、抗ＴＥＡＤ一次抗体が省略されている対照（ＰＬＡ）反応の代表的な画像を示す。図１８Ｉは、５μＭのｄｆＴＡＴおよび／または５μＭのＴＥＡＤ結合ペプチドで処理されたＨｅＬａ細胞の１つの核当たりのＹＡＰ：ＴＥＡＤ  ＰＬＡスペックルの自動計数のドットグラフを示す。各ドットは、単一の核を表し、バーは、中央値±９５％信頼区間を表す。非特異的スペックルに帰せられる近似値を表す２つの抗体省略サンプルの平均スペックルカウントの合計に線が引かれた。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１対任意の他のサンプル。全てのＰ値は、両側Ｔ検定によって判定した。１つの核当たりのスペックルは、ｄｆＴＡＴと組み合わせた配列番号９のペプチドで処理した細胞において有意に減少し、これは、処理が処理細胞の核におけるＹＡＰとＴＥＡＤとの相互作用を減少させた可能性があることを支持する。
【０２５７】
実施例２１
がんの併用治療
この実施例は、本開示のペプチドを使用したがんの併用療法を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、直接使用する。ペプチドを、それを必要とする対象にがんの治療薬として医薬組成物中で投与する。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。特に、シスプラチン、メトトレキサート、ドセタキセルおよびエトポシドなどの標準的な小分子または化学療法の治療レジメンと共に１つまたは複数のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物である。医薬組成物を静脈内、皮下、筋肉内、経口的に投与し、または腫瘍微小環境内に直接注射する。ペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、引き続くＹＡＰによる結合を排除することによってＹＡＰ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害する。標準的な小分子療法によって投与されたペプチドは、対象のがんの病状を治療する。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
【０２５８】
実施例２２
患者のがんの分析およびペプチドによる治療
この実施例は、患者のがんの分析およびペプチドによる治療を例示する。それを必要とする対象から生検を採取し、ＹＡＰ過剰発現をもたらす変異などのＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ経路における変異について分析する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、直接使用する。ペプチドを、それを必要とする対象にがんの治療薬として医薬組成物中で投与する。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。１つまたは複数のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトである。医薬組成物を静脈内、皮下、筋肉内、経口的に投与し、または腫瘍微小環境内に直接注射する。ペプチドは、ＴＥＡＤに結合し、引き続くＹＡＰまたはＴＡＺによる結合を排除することによってＹＡＰ／ＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用を妨害する。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
【０２５９】
実施例２３
結合親和性を改善させるペプチドの変異
この実施例は、オフ速度を減少させかつ／またはオン速度を増加させるペプチドの変異を例示する。本開示のペプチドは、部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）または任意のランダム変異誘発方法を用いて、オフ速度を減少させかつ／またはオン速度を増加させ、それによって結合親和性を増加または改善させる。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。代わりに、配列番号１〜配列番号８４の任意の１つのペプチドを変異させるかまたはグラフトし、ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）配列またはモチーフを含むようにしてＴＥＡＤに対する結合／拮抗活性を改善する。ＬＸ１Ｘ２ＬＦ（配列番号２１７）は、ＴＥＡＤに対する結合／拮抗活性を改善できるようにする配列に沿った任意の位置においてペプチド上で変異させるかまたはそれにグラフトする。
【０２６０】
実施例２４
ペプチドライブラリーのコンピュータによる設計
この実施例は、ＴＥＡＤに結合する３つのジスルフィド架橋を有するスキャフォールドペプチドのペプチドライブラリーのコンピュータによる設計のための方法を例示する。最初の候補は、特定のペプチド特性を検索することによるかまたはペプチド設計を通じてのいずれかで同定した。Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアパッケージをペプチド設計に使用して、新生スキャフォールド構造を同定し、３つのジスルフィド架橋を有する候補スキャフォールドペプチドは、結合機能性を考慮せずに折り畳みおよび安定性についてのみ最適化し、新規の折り畳み設計によって構築した。スキャフォールド構築に使用された入力トポロジーパラメータは以下の通りであった：最小および最大配列長：それぞれ３０および４１残基；二次構造型：らせん、らせん、らせん；二次構造の長さ範囲：６〜１８残基；ターン長：２〜４残基；ジスルフィドの数：３；ジスルフィドトポロジー：Ｈ１−Ｈ２、Ｈ１−Ｈ３およびＨ２−Ｈ３。数十万の独立した設計シミュレーションを実施して、候補スキャフォールドの大規模なライブラリーを構築し、次にそれを配列−構造適合性、充填、極性基の満足度およびジスルフィドスコアによってフィルタリングした。各設計シミュレーションの開始時、対応する長さの範囲から、らせんおよびターン長さをランダムにサンプリングして設計の二次構造を固定し、次にそれを使用して、低解像度断片アセンブリーシミュレーションの主鎖断片を選択した。低解像度シミュレーションの終了時、タンパク質のジスルフィド結合に由来するＮ−Ｃα−Ｃ主鎖変換のライブラリーを使用して、ジスルフィド結合によって連結され得る残基ペアについてタンパク質主鎖をスキャンした。ジスルフィドトポロジー制約を満たす、一致残基対を有する主鎖を使用して、２サイクルの交互固定主鎖配列設計および固定配列構造緩和からなる全原子配列設計シミュレーションを開始した。最終設計は、充填（ｓａｓａｐａｃｋスコア＜０．５）、埋没極性基の満足度（１．０Ａのプローブ半径を使用）についてフィルタリングし、１残基当たりのエネルギーによって分類した。フィルタリングされた設計の上位１０％を、コンピュータを用いた再折り畳み検定によって配列−構造適合性について評価し、設計配列を使用して３０００の独立した構造予測シミュレーションを開始した。成功は、設計モデルの２ÅＣα−ＲＭＳＤ内で低エネルギー構造予測モデルの割合を評価することによって評価した。次に、新規スキャフォールド構造によって同定される有望なペプチドならびに長さ３０〜５０残基のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの７５の天然ノッチン構造を、ＴＥＡＤ上のＹＡＰフットプリントを標的化する界面設計のためのスキャフォールドとして使用した。第２段階におけるスキャフォールド配列の再設計は、コアアミノ酸およびジスルフィド形成残基を保存する一方、界面側鎖を標的化した。さらにＹＡＰ−ＴＥＡＤ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＫＹＳ）の結晶構造を調べ、ＴＥＡＤ上の結合パッチを同定した。ＴＥＡＤへの結合を保持するために、ＹＡＰ上の対応する主鎖要素を観察して選択し、各有望なペプチドの界面設計のための鋳型としての役割を果たすようにした。より具体的には、以下の主鎖残基セグメン���を、設計スキャフォールドを方向付けるための重ね合わせ標的として選択した：３ＫＹＳ／Ｂ／５３−５５、３ＫＹＳ／Ｂ／５５−５７、３ＫＹＳ／Ｂ／６４−６８、３ＫＹＳ／Ｂ／６４−６９、３ＫＹＳ／Ｂ／８６−８９、３ＫＹＳ／Ｂ／９４−９６（ＰＤＢ  ＩＤ／鎖／残基番号として与えられる）。各ペプチドスキャフォールドについて、重ね合わせのために選択された各ＹＡＰ主鎖セグメントを標的化し、１５０の設計シミュレーションを実施した。各設計シミュレーションは、以下のステップで構成された：（１）適合する二次構造を有するスキャフォールド主鎖要素を使用して、スキャフォールド主鎖をＹＡＰ主鎖セグメントに重ね合わせるステップ、（２）多様性をもたらし、主鎖の衝突を軽減するためのランダムな小さい撹乱ステップ、および（３）固定主鎖配列選択と固定配列構造緩和との間で交互する全原子配列設計ステップ。最終界面設計は、極性基の満足度（１．０Ａのプローブ半径を使用）、界面の表面相補性（ｓｃスコア＞０．５）および界面の品質（１００Åの１つの埋没ＳＡＳＡ当たりの予測結合エネルギー＜−１．１）を満たすようにフィルタリングされ、結合エネルギーの予測値で選別された。トップスコアのデザインは、コンピュータによる再ドッキング試験によって評価され、再設計されたスキャフォールドペプチドがＴＥＡＤから除去され、ランダムに向きを変えてＴＥＡＤタンパク質構造上に再ドックされた。成功は、設計された界面コンフォメーションに近い最終状態に達した低エネルギー再ドッキングシミュレーションの割合として測定した。このプロセスは、ＴＥＡＤに結合する３つのジスルフィド架橋を有する潜在的な可溶性ペプチドとして配列番号１および配列番号２の両方を同定したが、配列番号１のみが単分散であり、安定していることが見いだされた。
【０２６１】
図１７Ｂは、タンパク質データバンク（ＰＤＢＩＤ）３ＫＹＳからのＹＡＰ−ＴＥＡＤ構造についてのモデル化ＴＥＡＤ界面を示す。図１７Ｃは、図１７ＡのＴＥＡＤ構造を用いてモデル化された配列番号１のモデル化ＴＥＡＤ界面を示す。図１７Ｄは、図１７ＡのＴＥＡＤ構造を用いてモデル化された配列番号２のモデル化ＴＥＡＤ界面を示す。
【０２６２】
実施例２５
ペプチドの細胞浸透度を改善する方法
この実施例は、ペプチドの細胞浸透度を改善する方法を例示する。その結合パートナーが細胞内に位置するペプチドは、その活性を発揮するために細胞に侵入／浸透する必要がある。
【０２６３】
これを克服する一方法は、実施例２４の方法によって同定された設計ペプチドの結合界面を細胞浸透性ペプチドスキャフォールド上にグラフトすることである。例えば、カルシンまたは修飾細胞浸透性ペプチド（修飾カルシンまたはカルシン誘導体など）などの天然の細胞浸透性ペプチドがスキャフォールドとして使用される。使用されるいくつかのペプチドとしては、インペラトキシン、マウロカルシン、ヘミカルシン、オピクラシン１、オピカルシン２、ミッドカイン（６２−１０４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ、クロロトキシンおよびハドルカルシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。使用されるこのようなスキャフォールドも、本明細書中に記載されるような前述のカルシンの修飾誘導体である。一例として、ＴＥＡＤに結合する配列番号９の主要構成要素である、らせん３（ＭＬＩＣＬＦ；配列番号２２１）の６個のアミノ酸部分をカルシンスキャフォールド上に移植し、新規の配列番号９のＴＥＡＤ結合機能を有するカルシンの細胞浸透性を保持する二機能性ペプチドを生成させる。この方法を用いて、配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つの細胞浸透性を改善する。
【０２６４】
代わりに、ＴＡＴまたはオクタ−アルギニン（配列番号１４６）のようなＫ／Ｒに富む配列の包含、らせん内アルギニンパッチまたはペネトラチンもしくはメリチンのような細胞浸透性スクリーニングで同定されたより大きいタンパク質断片への融合物をはじめとするシス作用性要素を使用してペプチドの細胞浸透性を改善する。この方法を用いて、配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つの細胞浸透性を改善する。
【０２６５】
代わりに、部位飽和変異誘発を用いてカルシンベースのＴＥＡＤ結合ペプチドの結合を改善する。代わりに、カルシンではないが、ＴＥＡＤ結合ファルマコフォアを含有するように、カルシンと類似の表面電荷分布を有するペプチドを設計する。さらなる代替形態として、ペプチド中の一部または全部のシステイン残基をセレノシステインで置換し、細胞質ゾル還元条件に対してジスルフィド結合よりも安定している架橋をもたらす。さらなる代替形態として、リアノライド受容体に対する活性をペプチド外で変異させる。
【０２６６】
実施例２６
細胞浸透性ペプチドライブラリーのコンピュータによる設計
この実施例は、スキャフォールド細胞浸透性ペプチドのペプチドライブラリーのコンピュータによる設計方法を例示する。最初の候補は、特定のペプチド特性（細胞浸透性など）について検索することによるかまたはペプチド設計を通じてのいずれかで同定した。Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアパッケージをペプチド設計に使用して、新生スキャフォールド構造を同定し、候補細胞浸透性スキャフォールドペプチドは、結合機能性を考慮せずに折り畳みおよび安定性についてのみ最適化して、新規の折り畳み設計によって構築される。次に、新規のスキャフォールド構築によって同定された有望なペプチドならびに長さ３０〜５０残基の既知の細胞浸透性ペプチドを、ＴＥＡＤ上の配列番号９のフットプリントを標的化する界面設計のためのスキャフォールドとして使用する。スキャフォールドペプチド再設計配列の界面側鎖を第２段階において標的化し、コアアミノ酸およびジスルフィド形成残基を保存する。さらに、配列番号９−ＴＥＡＤ複合体の結晶構造を調べ、ＴＥＡＤ上の結合パッチを同定する。配列番号９上の対応する主鎖要素を観察して選択し、ＴＥＡＤへの結合を保持するためにペプチドの界面設計のための鋳型としての役割を果たすようにした。これから、特定の主鎖残基セグメントを、設計スキャフォールドを方向付けるための重ね合わせ標的として選択した。各ペプチドスキャフォールドについて、重ね合わせのために選択された各配列番号９の主鎖セグメントを標的化して複数の設計シミュレーションを実施する。各設計シミュレーションでは、以下のステップに従う：（１）一致する二次構造を有する主鎖要素を使用して、スキャフォールド主鎖を配列番号９の主鎖セグメントに重ね合わせるステップ、（２）多様性をもたらし、主鎖の衝突を軽減するためのランダムな小さい撹乱ステップ、および（３）固定主鎖配列選択と固定配列構造緩和との間で交互する全原子配列設計ステップ。最終界面設計を、極性基の満足度（１．０Ａのプローブ半径を使用）、界面の表面相補性（ｓｃスコア＞０．５）および界面の品質（１００Åの１つの埋没ＳＡＳＡ当たりの予測結合エネルギー＜−１．１）を満たすようにフィルタリングして、結合エネルギーの予測値で選別する。トップスコアのデザインをコンピュータによる再ドッキング試験によって評価し、再設計されたスキャフォールドペプチドをＴＥＡＤから除去し、ランダムに向きを変えてＴＥＡＤタンパク質構造上に再ドックした。成功は、設計された界面コンフォメーションに近い最終状態に達した低エネルギー再ドッキングシミュレーションの割合として測定する。ＴＥＡＤに結合する細胞浸透性ペプチドが同定されている。
【０２６７】
実施例２７
高温におけるペプチド安定性
この実施例は、本開示のペプチドが極度の熱において安定していることを示す。タンパク質二次構造を、円二色性（ＣＤ）を用いて評価した。ＣＤスペクトルを、１．０ｍｍの光路長セルを使用してＪａｓｃｏ  Ｊ−７２０Ｗ分光偏光計で測定した。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中のタンパク質サンプルは、２５〜３０μＭのタンパク質濃度であった。サンプルを２６０〜１９０ｎＭの波長範囲で分析した。データは、相対楕円率［θ］；（ｍｄｅｇ）で表した。タンパク質の熱安定性を判定するために、タンパク質は、２℃／分の勾配で２０℃から９５℃に温度を徐々に上昇させた。安定性およびタンパク質アンフォールディングは、αらせんおよびβシート二次構造についてそれぞれ２２０および２１５でモニターした。データをｍｄｅｇで報告される相対楕円率［θ］で表す。配列番号９およびその点変異体変異型について、９５℃に至るまで加熱してもαらせん優勢構造の変化は観察されなかった。図２０Ａは、配列番号９のＣＤスペクトルが、構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証したこと、ならびにこの二次構造シグネチャが９５℃でのインキュベーション前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）に同一であることを示す。挿入図は、２０℃から９５℃への加熱間における２２０ｎｍでの相対楕円率を示す。図２０Ｂは、配列番号１０の円二色性スペクトルが、構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証したこと、ならびにこの二次構造シグネチャが９５℃でのインキュベーション前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）で同一であったことを示す。挿入図は、２０℃から９５℃への加熱間における２２０ｎｍでの相対楕円率を示す。図２０Ｃは、配列番号１１の円二色性スペクトルが、構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証したこと、ならびにこの二次構造シグネチャが９５℃でのインキュベーション前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）で同一であったことを示す。この場合にも、挿入図は、２０℃から９５℃への加熱間における２２０ｎｍでの相対楕円率を示す。さらに、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、タンパク質のアンフォールディングをモニターすることにより、タンパク質融解温度（Ｔｍ）の判定を実施した。手短に述べると、全容積２０μＬのＰＢＳ緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬタンパク質サンプルを２μＬの１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ色素と混合した。タンパク質アンフォールディングに続く疎水性タンパク質コアへの色素のインターカレーションを、ＣＦＸ９６深型ウェルリアルタイムシステム（ＢｉｏＲａｄ）を備えたＣ１０００  Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラーを用いてアッセイした。サンプルを毎分０．５℃ずつ段階的に増加させながら２０℃から９５℃に加熱し、各点で５秒間保持して、蛍光読み取りがそれに続いた。Ｔｍは、相対発光単位（ＲＦＵ）の導関数を分析することによって計算した。図２０Ｄは、ペプチドのこのＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ融解アッセイを示す。ヒトシデロカリン（ＨｕＳｃｎ）は、そのＲＦＵのピーク対温度勾配によって解釈されるように、７９℃の予想融解温度を実証した。逆に、試験された３つのペプチド（配列番号９、配列番号１０および配列番号１１）では、融解温度が判定され得なかった。このようにして、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ熱移動アッセイは、タンパク質アンフォールディングの証拠を示さず、したがって、配列番号９およびその点変異型は、高温で安定であることが示された。
【０２６８】
実施例２８
細胞浸透性を促進するペプチドコンジュゲート
この実施例は、ペプチドの細胞浸透性を促進するペプチドコンジュゲートを記載する。本開示のＴＥＡＤ−結合ペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成する。ペプチドを配列番号１〜配列番号８４のペプチドのいずれか１つから選択する。ＴＥＡＤ結合ペプチドは、マウロカリン（配列番号１６８）、インペラトキシン（配列番号１６９）、ハドルカルシン（配列番号１７０）、ヘミカルシン（配列番号１７１）、オピリカリン−１（配列番号１７２）、オピカルシン−２（配列番号１７３）、ミッドカイン（６２−１０４）（配列番号１７４）、ＭＣｏＴＩ−ＩＩ（配列番号１７５）、クロロトキシン（配列番号１７６）、ＤＲＩ−ＴＡＴ３１（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ；式中、小文字表記は、Ｄ−アミノ酸を示す；配列番号２８０）、環状ヘプタペプチドシクロ（ｃＦΦＲ４）（ＦΦＲＲＲＲＱ；式中、Φは、１−２−ナフチルアラニンであり、部分全体が環化され、Ｇｌｎは、コンジュゲーションハンドルの役割を果たし、Ｌｙｓ（アミンカップリング用）またはＣｙｓ（スルフヒドリルカップリング用）などの他の官能基で置換され得る；配列番号２８１）またはミリステートにコンジュゲートされる。場合により、ペプチドは、リンカーによって細胞浸透性部分に連結され、アミンカップリングが使用されて、リンカー／官能基を本開示のＴＥＡＤ結合ペプチド上のアミンに結合させる。本開示のＴＥＡＤ結合ペプチドのいずれかまたは全てのＬｙｓ残基は、化学的コンジュゲーションを均質化し、かつ／または細胞浸透性を増強するためにＡｒｇに変異され得る。
【０２６９】
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）により、ＹＡＰ：ＴＥＡＤシグナル伝達（８ｘＧＴＩＩＣ）に応答性のルシフェラーゼレポーターで形質移入された２９３Ｔ細胞におけるＴＥＡＤシグナル伝達の機能障害について、およびＨｅＬａ細胞におけるＹＡＰ：ＴＥＡＤ二量体化の阻害についてペプチドコンジュゲートの細胞浸透性を試験する。成功したペプチドコンジュゲートのリポソーム製剤を調べる。さらに、いくつかのペプチドコンジュゲートでは、ジスルフィド架橋、フューリン切断部位（ＲＸ［Ｋ／Ｒ］Ｒ）および／またはカテプシン切断部位をリンカーに導入する。
【０２７０】
ペプチドコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、がんまたは糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）などの疾患を有する。投与に際して、標的細胞は、ペプチドコンジュゲートによって浸透され、ＴＥＡＤと相互作用して、ＴＥＡＤとＹＡＰまたはＴＡＺなどの転写活性化補助因子との結合を妨害する。
【０２７１】
実施例２９
ペプチド血清半減期の延長
この実施例は、本明細書で開示されるようなペプチドの血清半減期を延長する方法を示す。その血清半減期を増加させるために、配列番号１〜配列番号１４２および配列番号２２２〜配列番号２７９のいずれか１つのペプチドを修飾する。Ｃｙ５．５などの近赤外色素へのペプチドのコンジュゲーションを使用して、ペプチドコンジュゲートの血清半減期を延長する。代わりに、Ａｌｂｕタグなどのアルブミンバインダーへのペプチドのコンジュゲーションを使用して、血清半減期を延長する。任意選択的に、最小の非ヒトタンパク質配列を使用することによって免疫原性が低下した結果として、血清半減期が延長される。
【０２７２】
実施例３０
ＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰの小規模および大規模生産
この実施例は、ＴＥＡＤ結合細胞浸透性ペプチド融合物（ＣＰＰ融合物）およびタンデムシステイン高密度ペプチド（タンデムＣＤＰ）の小規模および大規模生産を記載する。ＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰを、シデロカリンタグ付きタンパク質の分泌を駆動するレンチウイルスベクターであるＤａｅｄａｌｕｓベクターにクローニングした。このベクターによって産生されるシデロカリンは、６×Ｈｉｓタグ付き（配列番号２８４）であり、ＴＥＶ切断部位を有するリンカーを含み、切断後にペプチドのＮ末端に「ＧＳ」のみを残す。クローニングされたベクター配列を、サンガー配列決定法（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を用いて検証し、検証されたベクターを小規模で（９６ウェル深型ウェルブロック内の１ｍＬ）または大規模で（４００ｍＬ）で精製した。次に、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスを標準的な方法で作製した。懸濁２９３Ｆ細胞をＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスで形質導入し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）発現培地中で培養した。小規模生産では、次に、１×１０６個の細胞を、１００μＬのウイルス上清を含む１ｍＬ中に形質導入し、収集まで（約７日間）１，０００ｒｐｍで振盪した。５日後に３ｍＭのバルプロ酸を添加した。大規模生産では、１ｍＬのウイルス上清を含む１０ｍＬのＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスで１ｘ１０７個の細胞を形質導入し（標的感染多重度は約１０であった）、その後、培養物（１２５ｒｐｍで振盪された）を８〜１０日間かけて４００ｍＬの最終容積に拡大した。細胞をペレット化し、残骸を０．２２μｍで濾過した後、ＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰを培地から収集し、ニッケル樹脂精製およびＴＥＶプロテアーゼ切断がそれに続いた。大規模生産では、追加的なＳＥＣ精製を実施し、２０５、２１４および２８０ｎｍの波長でモニターした。小規模生産と大規模生産との両方で品質管理をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実施し、クマシー染色がそれに続いた。タンパク質濃度は、２１４または２８０ｎｍでのＵＶスペクトル吸収によって判定した。
【０２７３】
図２５は、非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）条件におけるＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。試験されたＣＰＰ融合物は、配列番号９６、配列番号９５、配列番号８５、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１１、配列番号１００、配列番号９４、配列番号１０９、配列番号９９および配列番号１０８であった。試験されたタンデムＣＤＰは、配列番号１３４、配列番号１２４、配列番号１１７、配列番号１２５、配列番号１３２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１３０および配列番号１３８であった。ＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰを１ｍＬ培養物中で小規模に製造し、ＴＥＶ切断してペプチド（図２５の下のバンド）をシデロカリン担体（図２５の中央のバンド）から分離した。未切断融合タンパク質は、最上部のバンドとして出現する。分子量マーカー（ＭＷＭ）は、各配列について（非還元）ＮＲおよび（還元）Ｒレーンのすぐ右側のレーンにキロダルトン（ｋＤａ）で示される。
【０２７４】
図２６は、ＣＰＰ融合物およびタンデムＣＤＰの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。左から右へ、図２６は、試験されたハドルカルシン（配列番号１７０）、インペラトキシン（配列番号１６９）、オピカルシン−２（配列番号１７３）およびクロロトキシン（配列番号１７６）を含めた４つの対照を示す。図２６は、（配列番号９）のＴＥＡＤバインダー、配列番号９５および配列番号９６のＣＰＰ融合物ならびに配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２４、配列番号１２５および配列番号１３４のタンデムＣＤＰをさらに示す。分子量マーカー（ＭＷＭ）は、一番左のレーンにキロダルトン（ｋＤａ）で表示される。
【０２７５】
実施例３１
クロロアルカン浸透アッセイ（ＣＡＰＡ）を用いた細胞浸透ペプチドの判定
この実施例は、配列番号１２４のタンデムＣＤＰの細胞浸透性および細胞質ゾルアクセスを判定するためのクロロアルカン浸透アッセイ（ＣＡＰＡ）の使用を示す。
【０２７６】
ＨａｌｏＥｎｚｙｍｅ（ミトコンドリア外膜の細胞質ゾル側を標的化するようにさらに修飾された修飾細菌ハロアルカンデハロゲナーゼ）を発現するＨｅＬａ細胞を２４ウェルシャーレ内で約６０％のコンフルエントになるまで培養した。細胞をＰＢＳですすぎ、次にＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清緩衝液中のＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ）なし、または１μＭのＨＴ、または１μＭのＨＴ−配列番号１７６、ＨＴ−配列番号９、ＨＴ−配列番号２３２、またはＨＴ−配列番号１２４を含む溶液と共に４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をすすぎ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと共に３０分間インキュベートし、次に５μＭのＨＴ−ＴＡＭＲＡリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ８２５１）と共に３０分間インキュベートした。ＨＴ−ＴＡＭＲＡを含まない追加的な対照を試験した。このインキュベーション後、細胞をＰＢＳですすぎ、次にＦＩＴＣ／緑色（全細胞）およびＴＲＩＴＣ／赤色（ＨＴ−ＴＡＭＲＡ蓄積）チャネルで蛍光顕微鏡上において画像化した。色のない細胞は、細胞内ＨａｌｏＥｎｚｙｍｅがＨＴによって占有されていることを示唆し、したがって、試験されたＨＴリガンド標識ペプチドは、細胞浸透性のペプチドを含む。色のついた細胞は、ＨａｌｏＥｎｚｙｍｅが占有されていないこと、およびＨＴ−ＴＡＭＲＡが細胞内に蓄積できたことを示唆し、したがって、試験されたＨＴリガンド標識ペプチドは、細胞浸透性でなかった。
【０２７７】
図２７は、Ｈａｌｏアッセイを用いて細胞浸透性について評価されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡画像を示す。左上の画像は、１μＭのＨＴ（タンパク質なし）を含む試験溶液で処理された細胞の蛍光を示す。右上の画像は、緩衝液のみで処理された細胞の蛍光を示す。左下の画像は、１μＭのＨＴ配列番号９（左下）で処理された細胞の蛍光を示す。右下の画像は、１μＭのＨＴ配列番号１２４（右下）で処理された細胞の蛍光を示す。配列番号１２４のペプチド（右下）は、高い細胞浸透性を示した。
【０２７８】
図２８は、ＣＡＰＡ中の細胞の赤色チャネルにおける平均蛍光の細胞毎の定量化を示す。細胞は、ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ）なしで（図示されない；０細胞浸透性スコア（ＣＰＳ）として較正に使用され、細胞浸透がないことを示唆する）、１μＭのＨＴ（グラフには示されない；１ＣＰＳとして較正に使用され、全細胞浸透を示唆する）、１μＭのＨＴ−配列番号９（対照ＴＥＡＤバインダー）、１μＭの配列番号９４、１μＭのＨＴ−配列番号９５、１μＭのＨＴ−配列番号９６、１μＭのＨＴ−配列番号１１９、１μＭのＨＴ−配列番号１２４、１μＭのＨＴ−配列番号１２５または１μＭのＨＴ−配列番号１３４と共にインキュベートした。高いＣＰＳ（細胞の蛍光の逆数、ＨＴなし（０ＣＰＳ）および１μＭのＨＴ（１ＣＰＳ）の対照に対して較正された）は、細胞内ＨａｌｏＥｎｚｙｍｅがＨＴによって占有されており、したがって試験されたＨＴリガンド標識ペプチドが細胞浸透性のペプチドを含むことを示唆した。低いＣＰＳは、細胞内でのＨＴ−ＴＡＭＲＡの蓄積を可能にする細胞内ＨａｌｏＥｎｚｙｍｅが占有されていないこと、したがって試験されたＨＴリガンド標識ペプチドが細胞浸透性ではないことを示唆した。元のＴＥＡＤバインダー（配列番号９）を上回るＣＰＳは、細胞浸透性の改善を示唆する。
【０２７９】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され説明されたが、このような実施形態は、単なる例示として提供されることが当業者に明らかであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、当業者に多数の変動形態、変更形態および置換形態が想至されるであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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