(57)【要約】  本発明は、長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子の新規な用途を開示し、前記長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子は脂糖素であり、前記新規な用途は、非アルコール性脂肪肝炎治療用医薬の調製における応用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝炎治療用医薬の調製における、長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子の応用。
【請求項２】
前記長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子は、脂糖素またはその薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項３】
前記応用は、血清中のアラニントランスアミナーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの低下、脂肪変性の程度の改善、肝小葉炎症の程度の改善、肝細胞風船様変性の程度の低下および肝損傷の程度の改善における脂糖素の応用から選ばれることを特徴とする請求項２に記載の応用。
【請求項４】
前記非アルコール性脂肪肝炎は、肝炎に起因する非アルコール性脂肪肝炎、肥満症に起因する非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病に起因する非アルコール性脂肪肝炎、インスリン抵抗性に起因する非アルコール性脂肪肝炎、高トリグリセリド血症に起因する非アルコール性脂肪肝炎、無βリポ蛋白血症に起因する非アルコール性脂肪肝炎、糖原病に起因する非アルコール性脂肪肝炎、ウェーバー・クリスチャン病に起因する非アルコール性脂肪肝炎、ウォルマン病に起因する非アルコール性脂肪肝炎または脂肪栄養不良に起因する非アルコール性脂肪肝炎から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項５】
前記医薬は、医薬活性成分として脂糖素またはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物であることを特徴とする請求項２に記載の応用。
【請求項６】
前記医薬組成物は、いずれか１種の薬学的に許容可能な剤形に調製されてもよいことを特徴とする請求項５に記載の応用。
【請求項７】
前記剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、ペースト剤、ペレット、注射剤、坐剤、噴霧剤、滴剤、貼布剤、滴丸剤より選ばれることを特徴とする請求項６に記載の応用。
【請求項８】
前記剤形は、粉末注射剤または液状注射剤から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の応用。
【請求項９】
前記液状注射剤は、水性注射剤、有機溶剤注射剤、懸濁性注射剤から選ばれることを特徴とする請求項８に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬分野に属し、具体的には、非アルコール性脂肪肝炎治療用医薬における、長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子−２１の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ）とも呼ばれる非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）は、様々な原因に起因するが、病変の主体は肝小葉での肝実質細胞の脂肪変性およびトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＴＧ）の蓄積（肝組織の脂質含量が肝湿量の５％以上を超えるか、または組織学的に１／３以上の肝細胞が脂肪化されている）を特徴とし、病理学的変化はアルコール性肝疾患（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＬＤ）と類似しているが、過度な飲酒歴（エタノール量換算で、男性＜１４０ｇ／週、女性＜７０ｇ／週）およびその他の明確な肝損傷要因のない臨床病理学的症候群である。
【０００３】
非アルコール性脂肪肝疾患の疾患スペクトラムには、非アルコール性単純脂肪肝（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ，ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝硬変（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ＮＡＣ）および肝細胞癌が含まれる。
【０００４】
ここ２０年にわたり、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、すでに西洋諸国の肝疾患の主要な病因となっている。非アルコール性脂肪肝疾患は、このときに適時の制御ができないと、脂肪が過度に累積して変性し続け、非アルコール性脂肪肝炎に進展しやすい。非アルコール性脂肪肝炎と非アルコール性脂肪肝疾患は、脂肪の過度な累積の他に、炎症性細胞浸潤、様々な程度の線維化および肝細胞の損傷が肝部に現われるという点で区別される。なお、非アルコール性脂肪肝炎が有効に制御されずに進展し続けると、肝線維化、肝硬変、ひいては肝癌が極めて容易に発生してしまう。
【０００５】
現在のところ、ＮＡＳＨ疾患の臨床に対し、長期的に応用でき、安全かつ有効な医薬は未だない。
【０００６】
線維芽細胞増殖因子−２１（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２１，ＦＧＦ−２１）は、近年発見されたｉｎ  ｖｉｖｏにおけるもう１つの代謝調節因子であり、線維芽細胞増殖因子ファミリーに属し、その特異性である肝臓、脂肪、膵島細胞に作用しかつインスリンに依存せずに有効かつ安全に血糖血脂を調節する能力が研究者に重視されており、線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導におけるＮＡＦＬＤを有効に予防治療できるということも報告されている（劉敏等、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導における非アルコール性脂肪肝細胞モデルの脂質代謝に対する線維芽細胞増殖因子−２１の影響、吉林大学学報、２０１２年５月、第３８卷第３期、４７７〜４８１）。
【０００７】
ＨＡＲＢＩＮ  ＢＯＡＯ  ＢＩＯ−ＭＥＤＩＣＡＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯＭＰＡＮＹによるＣＮ２０１３１０１１５２１００（公開番号ＣＮ１０３１９３８７８Ａ）には、新規な長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子およびポリエチレングリコールの架橋物が開示されているが、ポリエチレングリコール架橋物の蛋白質構造は配列３であり、その調製方法は該文献の実施例４を参照し、後日、この発明の発明者が脂糖素（英文名：ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ−ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２１、略称ＰＥＧ−ｈｍＦＧＦ２１）と命名した。
【０００８】
脂糖素は、血糖の調節、血液中のトリグリセリドの低下および総コレステロールの調節等の効果を有するが、脂糖素を使用した非アルコール性脂肪肝炎の治療に関しては、今のところ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎治療用医薬における、長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子の応用を提供する。
【００１０】
前記長期作用型の変異ヒト由来線維芽細胞増殖因子は、脂糖素またはその塩であり、その配列は、ＣＮ２０１３１０１１５２１００（公開番号ＣＮ１０３１９３８７８Ａ）の配列３を参照する。
【００１１】
本発明に係る応用には、脂糖素またはその塩が、血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを低下させ、脂肪変性の程度を改善し、肝小葉炎症の程度を改善し、肝細胞風船様変性の程度を低下させ、肝損傷の程度を改善することが可能であることが含まれる。
【００１２】
本発明に係る非アルコール性脂肪肝炎には、肝炎に起因する非アルコール性脂肪肝炎に限定されず、肥満症に起因する非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病に起因する非アルコール性脂肪肝炎、インスリン抵抗性に起因する非アルコール性脂肪肝炎、高トリグリセリド血症に起因する非アルコール性脂肪肝炎、無βリポ蛋白血症に起因する非アルコール性脂肪肝炎、糖原病に起因する非アルコール性脂肪肝炎、ウェーバー・クリスチャン病に起因する非アルコール性脂肪肝炎、ウォルマン病に起因する非アルコール性脂肪肝炎および脂肪栄養不良に起因する非アルコール性脂肪肝炎等が含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】
ここで、前記医薬は、医薬活性成分として本発明の脂糖素またはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物であり、前記医薬組成物は、いずれか１種の薬学的に許容可能な剤形に調製されてもよく、これらの剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、ペースト剤、ペレット、粉剤、溶液剤、注射剤、坐剤、噴霧剤、滴剤、貼布剤を含み、本発明の医薬は、粉末注射剤、または、水性注射剤、有機溶剤注射剤、懸濁性注射剤等のような液状注射剤に調製される注射用医薬であることが好ましい。
【００１４】
本発明の医薬組成物において、経口投与による製剤は、例えば、接着剤、充填剤、希釈剤、錠剤圧縮剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、調味剤および湿潤剤のような通常用いられる賦形剤を含有してもよい。適用される充填剤は、デンプン、スクロース、セルロース、マンニトール、ラクトースおよびその他の類似の充填剤を含む。好適な崩壊剤は、デンプン、ポリビニルピロリドンおよびデンプン誘導体を含み、例えば、デンプングリコール酸ナトリウムである。好適な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含む。混合、充填、打錠等の通常用いられる方法によって経口固形組成物を調製することができる。繰り返し混合することで、大量の充填剤を用いたこれらの組成物全体に活性物質を分布させることができる。通常用いられる補助材料の成分は、マンニトール、ソルビトール、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩酸システイン、メルカプト酢酸、メチオニン、ビタミンＣ、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡカルシウムナトリウム、一価アルカリ金属の炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩またはそれらの水溶液、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸、アミノ酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、乳酸ナトリウム、キシリトール、マルトース、グルコース、フルクトース、デキストラン、グリシン、デンプン、スクロース、ラクトース、マンニトール、ケイ素誘導体、セルロースおよびそれらの誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、ツイン８０、寒天、炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、リン脂質系材料、カオリン、タルカムパウダー、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等を含む。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、使用の際に、疾病の状態に応じて使用方法および使用量を決定し、各回１〜１０の用量単位で、１日につき１〜６回服用してもよく、各用量単位は、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇであってもよい。
【００１６】
本発明で提供される脂糖素の新規な用途は、以下の利点を有する。
【００１７】
脂糖素は、血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを顕著に低下させ、脂肪変性の程度を改善し、肝小葉炎症の程度を改善し、肝細胞風船様変性の程度を低下させ、肝損傷の程度の病理学的スコアを改善することができる。最終的な結果は、本発明が非アルコール性脂肪肝炎の治療に用いられることができ、かつ効果が従来技術より優れていることを証明している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
【００１９】
本発明に用いられる脂糖素の調製方法は、ＣＮ２０１３１０１１５２１００（公開番号ＣＮ１０３１９３８７８Ａ）の実施例４を参照することができる。
【００２０】
実施例１：水性注射剤の調製
【００２１】
１．組成：
脂糖素蛋白質（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）、ヒスチジン（薬用グレード、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム−クエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５±０．１）。
【００２２】
２．調製方法：
（１）濃度が１２．５ｍｇ／ｍＬである脂糖素蛋白質原液を、緩衝系がクエン酸−クエン酸ナトリウムである緩衝液で、ｐＨ５．５±０．１に調節して用意する。
【００２３】
（２）濃度が５０ｍｇ／ｍＬであるヒスチジン母液を、緩衝系がクエン酸−クエン酸ナトリウムである緩衝液で、ｐＨ５．５±０．１に調節して用意する。
【００２４】
（３）ステップ（１）の脂糖素蛋白質原液とステップ（２）のヒスチジン母液とを、体積比が４：１である配合比率に基づいて、５００μＬ／本の基準で２ｍＬのバイアルに充填する。
【００２５】
実験例１：有効用量範囲における、メチオニン・コリン欠乏飼料（ＭＣＤ  ｄｉｅｔ）により誘導される非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）マウスモデルに対する脂糖素の治療作用。
【００２６】
本実験では、メチオニン・コリン欠乏飼料（ＭＣＤ）により誘導されるマウスＮＡＳＨモデルを選択して使用する。その主な理由は、このような飼料の応用にはすでに４０年以上の歴史があり、その生産工程は発展を重ねて成熟しており、かつ誘発される特徴もすでに多方面から検証され、その迅速性（約４週間でＮＡＳＨ関連症状を誘発することができる）および有効性（誘発される症状とヒトＮＡＳＨとには大きな類似性がある）のためである。
【００２７】
１．実験方法：
８週齢のＣ５７ＢＬ雄性マウスを２週間適応するように餌付けた後、メチオニン・コリン欠乏（ＭＣＤ）飼料で飼育を開始し、ＭＣＤ飼料で２週間飼育した後、動物の体重に基づいて、溶剤群、ＦＧＦ−２１群、脂糖素低用量群、脂糖素高用量群の４つの群にランダムに分け、各群１０匹であり、投与方式は皮下注射で１日１回投与し、投与周期は２週間である。
【００２８】
動物群および投与状況における具体的な状況は、表１に示す通りである。
【００２９】
【表１】
2020511545.tif 000002
【００３０】
投与終了後にマウスを致死させ、関連組織を摘出して後続の分析を行う。
【００３１】
２．検出指標：
２．１  血清を分離して、血清中の各種生化学指標である血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の含有量を、臨床で常用される測定キット（Ｓｈｅｎｓｕｏ  ＵＮＦ）で測定して検出する。
【００３２】
２．２  マウス肝臓組織を形態学的に検出する。Ｈ＆Ｅ染色方法によりマウス肝臓の形態変化を観察する。その具体的なステップは次の通りである。新たに取り出された小塊の肝臓をホルマリン溶液中で一晩固定し、勾配による脱水後にさらに浸漬し、包埋して、５μｍに薄切りし、ヘマトキシリン−エオジン染液を用いて肝臓切片を染色し、最後に顕微鏡下で各マウス肝臓組織の形態を観察する。
【００３３】
２．３  マウス肝臓組織のコラーゲン線維を検出する。シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ，ＳＲ）染色法によりマウス肝臓のコラーゲン蓄積を観察する。その具体的なステップは次の通りである。パラフィンブロックから切り出したマウス肝臓切片をＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色キットを用いて染色し、最後に顕微鏡下で各マウス肝臓組織の線維化状況を観察する。
【００３４】
非アルコール性脂肪肝炎の深刻度に対するスコア基準（ＮＡＳＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｓｃｏｒｅｓ）を臨床的に設定する。主に、脂肪変性（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝小葉炎症（ｌｏｂｕｌａｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、肝細胞風船様変性（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）の３つの態様を含む。本実験では、各群から５匹のマウスをランダムに選択し、対応するマウス肝組織のＨ＆Ｅ染色切片において、５つの視野をランダムに選択して、上記の３つの態様からスコアを付け、各群のマウスの肝炎の病変の程度を客観的に評価する。
【００３５】
３．データの統計および分析は、ＳＰＳＳ１６．０統計学ソフトウェアで分析し、２つの群のデータ間はｔ検定を採用し、複数の群のデータ間はＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を採用し、多重線形回帰分析し、Ｐ＜０．０５で、統計学的有意差ありとする。
【００３６】
４．実験結果：
４．１  血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルに対する脂糖素の影響は、表２に示した通りである。
【００３７】
【表２】
2020511545.tif 000003
【００３８】
表２の結果は次の通りである。２週間の治療を経た後に次のことが見出された。ＦＧＦ−２１群の非アルコール性脂肪肝炎マウスのＡＬＴレベルが１００．２±２０．６Ｕ／Ｌに低下し、かつ溶剤群の１９９．８±３０．８Ｕ／Ｌに比べて顕著な差があり（Ｐ＜０．０５）、脂糖素低用量群および高用量群のＡＬＴレベルがそれぞれ５１．１±７．７Ｕ／Ｌおよび３９．９±４．１Ｕ／Ｌに低下し、かつ溶剤群とは極めて顕著な差があり（Ｐ＜０．００１）、ＦＧＦ−２１群に比べても顕著な差があり（Ｐ＜０．０５）、いずれも脂糖素はＡＬＴレベルを低下させる薬効を有するだけでなく、その薬効がＦＧＦ−２１群より優れていることを説明している。
【００３９】
４．２  血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルに対する脂糖素の影響は、表３に示した通りである。
【００４０】
【表３】
2020511545.tif 000004
【００４１】
表３の結果は次の通りである。２週間の治療を経た後に次のことが見出された。ＦＧＦ−２１群の非アルコール性脂肪肝炎マウスのＡＳＴレベルが１１５．７±１５．９Ｕ／Ｌに低下し、かつ溶剤群の１９６．９±２９．３Ｕ／Ｌに比べて顕著な差があり（Ｐ＜０．０５）、脂糖素低用量群および高用量群のＡＬＴレベルがそれぞれ７４．４±７．９Ｕ／Ｌおよび７３．７±７．８Ｕ／Ｌに低下し、かつ溶剤群とは極めて顕著な差があり（Ｐ＜０．０１）、ＦＧＦ−２１群に比べても顕著な差があり（Ｐ＜０．０５）、脂糖素はＡＬＴレベルを低下させる薬効を有するだけでなく、その薬効がＦＧＦ−２１群より優れていることを説明している。
【００４２】
４．３  ＮＡＳＨ臨床関連スコアに対する改善作用は、表４に示した通りである。
【００４３】
【表４】
2020511545.tif 000005
【００４４】
表４の結果は次の通りである。２週間の治療を経た後に、ＦＧＦ−２１群は、溶剤群に比べて肝細胞風船様変性およびＮＡＳＨの総スコアはいずれも顕著な改善があったが（Ｐ＜０．０５）、肝細胞炎症に対しては顕著な改善がなかった（Ｐ＞０．０５）。脂糖素低用量群および高用量群は、溶剤群に比べて肝小葉炎症、肝細胞風船様変性およびＮＡＳＨの総スコアにおいていずれも極めて顕著な改善があった。なお、脂糖素高用量群は、脂肪変性レベルにおいても溶剤群より顕著に優れていた。なお、脂糖素低用量群または／および脂糖素高用量群は、脂肪変性、肝小葉炎症、肝細胞風船様変性およびＮＡＳＨの総スコアにおいていずれもＦＧＦ−２１処理群より顕著に優れていた。以上の結果は、脂糖素が、肝小葉炎症、肝細胞風船様変性およびＮＡＳＨの総スコアを改善する薬効を有するだけでなく、その薬効がＦＧＦ−２１群より顕著に優れていることを説明している。
【００４５】
５．実験結果：
脂糖素を注射して検出することにより、次のことが見出された。脂糖素低用量群または／および脂糖素高用量群は、溶剤群およびＦＧＦ−２１群に比べて血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを顕著に低下させ、脂肪変性の程度を改善し、肝小葉炎症の程度を改善し、肝細胞風船様変性の程度を低下させ、肝損傷の程度の病理学的スコアを改善することができる。以上の結果は、脂糖素が非アルコール性脂肪肝炎の治療作用を有することを説明している。
【００４６】
６．結論：
脂糖素は、非アルコール性脂肪肝炎を治療する臨床的応用価値を有し、かつ従来技術より優れている。
【国際調査報告】
2020511545.tif 000006
2020511545.tif 000007
2020511545.tif 000008
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