(57)【要約】本発明は、IVD 変性及び／又は LDD の症状を有する対象における IVD 変性及び／又は LDD の治療方法を提供し、この治療方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。本発明の方法を使用した IVD 変性の減少及び IVD の再生も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における IVD 変性及び/又は LDD の治療に使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物。
【請求項２】
対象における老化した椎間板（IVD）の再生に使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物。
【請求項３】
対象の IVD において、髄核（NP）及び/又は線維輪（AF）及び/又は軟骨終板（EP）の総組織体積を増加させるのに使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物。
【請求項４】
対象の IVD において、NP 細胞のアポトーシスを減少させるのに使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物。
【請求項５】
対象の IVD のNP 細胞において、活性型 TGF-β のレベルを増加させるのに使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物。
【請求項６】
前記 PTH 又はその機能的断片若しくは類似体が、薬学的に許容される担体とともに投与される、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記 PTH 又はその機能的断片若しくは類似体が、PTH(1-28)、PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)、PTH(1-41)、及び組換え rPTH(1-34) からなる群から選択される、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記 PTH 又はその機能的断片若しくは類似体が、10 mg/kg/日から 500 mg/kg/日の間の用量で投与される、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記 PTH 又はその機能的断片若しくは類似体が、筋肉内、皮内、又は腹腔内に投与される、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2017 年 2 月 1 日に出願された米国仮特許出願第 62/453,044 号の利益を主張し、これは、本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる目的で参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
＜電子的に提出した物件の参照による取り込み＞
本出願は、EFS-Web を介して ASCII 形式で送信された配列リストを含んでおり、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。2018 年 2 月 1 日に作成された前記 ASCII コピーの名前は P13213-03_ST25.txt で、サイズは 6,378 バイトである。
【０００３】
＜政府の利益に関する表明＞
本発明は、米国国立衛生研究所からの助成金番号AR 063943 のもと、米国政府の援助を受けて成された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
腰椎椎間板疾患（Lumbar disc disease（LDD））は、椎間板（intervertebral disc（IVD））変性、又は変性椎間板疾患又は変性椎間板障害（degenerative disc disorder（DDD））としても知られ、老化の疾患として長い間報告されており、最も一般的な筋骨格障害の 1 つである。変性は早くも 10 歳代に検出され、重度の変性は 70 歳代の 60 % に検出される。腰痛を持つ人の数は世界中に蔓延しており、生涯を通じて最大 80 % の個人が罹患し、身体障害の主な原因となっている。LDD は、米国だけでも年間 1,000 億ドル以上の莫大な社会経済的な負担となっており、脳卒中、呼吸器感染症、糖尿病、冠動脈疾患、及びリウマチ性疾患の合計費用を上回る。
【０００５】
LDDの有病率と重要性にもかかわらず、その病態生理についてはほとんど理解されておらず、効果的な疾患修飾治療法も無い。椎間板（IVD）は巨視的には 2 つのコンポーネントに分離できる；即ち、中心部にある水和した髄核（nucleus pulposus（NP））とこれを囲む線維輪（annulus fibrosus（AF））と呼ばれるコラーゲン線維の外側のネットワーク、である。この NP は、細胞外マトリックス（extracellular matrix（ECM））を形成する豊富なプロテオグリカン（主にアグリカンとコラーゲン）に囲まれた脊索起源の細胞で構成されている。この NP は、脊椎に沿って伝達される軸方向の圧縮力を吸収するように機能する。前記 ECM は、椎間板の恒常性のために NP 細胞を支える重要な要素である。水結合能力を持つプロテオグリカンは、コラーゲンが引張強度を付与する一方で、圧縮に対する復元性を提供する。
【０００６】
ECM タンパク質であるタイプ II コラーゲンに変異がある個人は、重度の IVD 変性を有する。遺伝学的研究により、LDD と前記 ECM の成分（特に IX 型コラーゲン、アグリカン、及び軟骨中間層タンパク質（cartilage intermediate layer protein（CILP））をコードする遺伝子との関連が報告されている。CILP は TGF-β1 に直接結合し、TGF-β1 により誘導される軟骨 ECM タンパク質の合成を阻害する。NP 細胞は TGF-β を分泌し、結合組織成長因子（CTGF/CCN2）の転写を誘導して、軟骨及び椎間板の細胞外マトリックスの合成を増加させる。このように、TGF-β 活性は、椎間板細胞外タンパク質の発現と機能に重要である。
【０００７】
副甲状腺ホルモン（Parathyroid hormone（PTH））は、骨粗鬆症に対する FDA によって承認された同化療法で、骨のリモデリングを刺激する。PTH は、古典的には、1 型 PTH 受容体（PTH1R）に結合し、サイクリック・アデノシン1 リン酸（cyclic adenosine monophosphate（cAMP））を生成するためにアデニル酸シクラーゼを刺激する。増加した cAMP レベルは、プロテインキナーゼ A（PKA）を活性化し、PTH を介した遺伝子発現に関与する cAMP 応答結合タンパク質（CREB）転写因子のリン酸化を誘導する。PTH は又、代替経路を介した TGF-β 等を含む局所因子のシグナル伝達を調整することにより、骨格の恒常性も調節する。骨格組織の恒常性及びカルシウム代謝における PTH の関与は十分に証明されてきているにもかかわらず、椎間板変性におけるその役割に関するデータは不足している。
【０００８】
DDD の有病率と重要性にもかかわらず、現在のところ、変性の進行を止める、或いは、椎間板機能を回復させる効果的な治療法は無い。痛みの症状緩和、ゴールデン・スタンダードの脊椎固定等の手術は、これらの治療戦略にはいくつかの欠点と障害があるにも関わらず、現在 DDD の治療に広く採用されている。症状を緩和するために使用される方法の多くは、効果がはっきりしないか、或いは椎間板の健常性にとって破壊的である。近年、細胞又は生体材料を椎間板腔に注入することや、生体工学的に作られた椎間板で置換することによる、多大な努力が払われてきた。しかし、それにも拘らず、どれも脊柱が真に再構築されることを可能にするものはなく、これらの研究によって、椎間板組織の恒常性と若返りのメカニズムが明らかになることは無かった。
【０００９】
従って、患者において、DDD を治療及び回復させるためのより効果的な方法を開発する必要性が依然として存在し、満たされていない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の 1 つ以上の実施形態によれば、本発明者らは、断続的に投与する PTH （iPTH、例えば毎日の注射）の、LDD に対する潜在的な効果を検討した。iPTH は、マウスにおいて、加齢過程で、ECM 中の潜在型 TGF-β（latent TGF-β）を活性化することにより、椎間板変性を効果的に軽減させることがわかった。PTH はインテグリン αvβ6 の NP 細胞での発現を誘導し、TGF-β-CCN2-マトリックス・タンパク質のシグナル伝達カスケードを活性化する。従って、PTH は、加齢過程の椎間板の恒常性と機能に関する負の調節因子である。これらの発見は、同化活性を活性化する NP 細胞を介した PTH シグナル伝達の新規メカニズムと、これを LDD 及び関連障害を軽減するために使用することを提供する。
【００１１】
ある実施形態によれば、本発明は、IVD 変性及び／又は LDD の症状を有する対象における IVD 変性及び／又は LDD の治療方法を提供し、この治療方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００１２】
ある実施形態によれば、本発明は、IVD 変性及び／又は LDD の症状を有する対象における IVD 変性及び／又は LDD の治療方法を提供し、この治療方法は、PTH 又はその機能的断片若しくは類似体、並びに薬学的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【００１３】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における老化した IVD の再生方法を提供し、この再生方法は、有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００１４】
別の実施形態によれば、本発明は、対象における老化した IVD の再生方法を提供し、この再生方法は、副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体、並びに薬学的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【００１５】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における椎間板（IVD）変性の治療方法を提供し、この治療方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００１６】
別の実施形態によれば、本発明は、対象における椎間板（IVD）変性の治療方法を提供し、この治療方法は、副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体、並びに薬学的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【００１７】
ある実施形態によれば、本発明は、対象の IVD において、髄核（NP）及び/又は線維輪（AF）及び/又は軟骨終板（EP）の総組織体積を増加させるための方法を提供し、この方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００１８】
更に別の実施形態によれば、本発明は、対象の IVD において、NP 細胞のアポトーシスを減少させるための方法を提供し、この方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００１９】
更に別の実施形態によれば、本発明は、対象の IVD の NP 細胞において、活性型 TGF-β のレベルを増加させるための方法を提供し、この方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ-１Ｉは、加齢過程で IVD 体積と TGF-β 活性が減少したことを示す。（Ａ）2 か月齢及び 18 か月齢のマウスの IVD の 3D 伝播位相コントラスト・マイクロ‐トモグラフィー（3D propagation phase contrast micro-tomography（PPCT））画像。スケール・バー、500 μm。（Ｂ）IVD の高さと体積の定量解析。（Ｃ）2 か月齢及び 18 か月齢のマウスの IVDs の 5 つの領域間の厚さ分布を示す、3D 上面及び下面 PPCT 画像、及び（Ｄ）（Ｃ）の定量解析。スケール・バー、青（100μm）から赤（800μm）までの厚さの度合いを示すカラーコード。C：中央部、R：右部、A：前部、L：左部、P：後部。（Ｅ、Ｆ）：髄核（NP）領域を示す IVD 組織切片のソフラニン-O 染色画像（Ｅ）及び2 か月齢及び 18 か月齢のマウスの NP 領域の細胞数の定量解析と IVD 組織学的スコア（Ｆ）。スケール・バー、100μm。（Ｇ）NP 領域のアグリカン（ACAN）、CCN2、及び pSmad2/3 の発現陽性細胞を示す IVD 切片の免疫染色画像。スケール・バー、200μm。（Ｈ）NP 領域における、全 IVD 領域の割合としての ACAN- 及び CCN2- 陽性領域、及び pSmad2/3 陽性細胞の定量解析（Ar）。スケール・バー、50μm。（Ｉ）2 か月齢及び 18 か月齢のマウスの NP 組織における pSmad2 レベルを示すウェスタン・ブロット解析。全てのデータは平均値±s.d. として示す。*P<0.05、**P <0.01、1 群につき n=8。統計的有意性は、スチューデントの t 検定によって決定した。
【図２】図２Ａ-２Ｉは、NP 細胞において、PTH が cAMP の産生と CREB のリン酸化を直接的に誘導することを示す。（Ａ）NP 細胞での PTH1R（茶色）を示すマウス IVD 切片の免疫染色画像であり、陰性対照（NC）として IgG 抗体を使用した。スケール・バー、100μm。（Ｂ）陰性対照（NC）としての HEK293 細胞及び陽性対照（PC）としての UMR-106 骨芽細胞様細胞を使用して、NP 及び AF 細胞での PTH1R 発現を示すウエスタン・ブロット解析。（Ｃ）NotoCre; ROSA26-GFPマウスを使用した脊索起源（上黄色）の NP 細胞における PTH1R 発現の系列マッピング。スケール・バー、20μm（上）及び50μm（下）。脊索起源（緑色）及び PTH1R 受容体の存在（赤色）に関して、陽性に染色された NP 細胞。脊索起源の細胞（緑色）及び PTH1R 陽性細胞（赤色）は、椎間板組織の NP 領域で共局在している（黄色）として多く染色された。（Ｄ）PTH 処置をした NP 細胞における細胞 cAMP レベルの ELISA 解析。（Ｅ）PTH 処置をした、時点が異なる NP 領域における pCREB 陽性細胞を示す IVD 切片の免疫染色。スケール・バー、100μm。（Ｆ）PTH 処置をした全 NP 細胞に対する pCREB 陽性細胞の割合。（Ｇ）PTH 処置をした NP 細胞における pCREB レベルのウエスタン・ブロット解析。（Ｈ）異なる年齢のヒト NP 標本における PTH1R 発現のウエスタン・ブロット解析。（Ｉ）若年及び高齢患者由来の NP 組織における PTH1R mRNA レベルの qRTPCR を変化割合として示す。全てのデータは平均値±s.d. として示す。*P<0.05、**P <0.01、1 群につき n=8。統計的有意性は、スチューデントの t 検定によって決定した。
【図３】図３Ａ‐３Ｓは、TGF-β を活性化することでインテグリン αvβ6 の発現を誘導することにより、iPTH が椎間板変性を軽減させたことを示す。（Ａ）週 5 日、8 週間、毎日 40 μg/kg の iPTH(1-34) 又は媒体の注射を受けた、18 か月齢のマウスの IVD の3D PPCT 画像。スケール・バー、500μm。（Ｂ）マウス IVD の高さと IVD 体積の定量解析。（Ｃ、Ｄ）iPTH 又は媒体で処置した IVD の 5 つの領域の厚さ分布を示す 3D PPCT 画像と定量解析。青色（100 μm）から赤色（800 μm）までの厚さの度合いを示すカラー・コード。（Ｅ、Ｆ）2 か月齢のマウスの MRI スキャンと比較した、iPTH 又は媒体で処置した 18 か月齢のマウスの椎間板の信号強度（黄色の矢印）を示すマウス腰椎の MRI スキャン及びその椎間板の信号強度の定量的測定（Ｆ）。スケール・バー、1 mm。（Ｇ、Ｈ）iPTH 又は媒体で処置した 18 か月齢マウスの NP 領域を示す IVD 切片のソフラニン-O 染色画像（Ｇ）並びに NP 領域の細胞数の定量解析及び IVD 組織学的スコア（Ｈ）。スケール・バー、100μm。（Ｉ）NP 領域での ACAN、CCN2 及び pSmad2/3 の発現陽性細胞を示す IVD 切片の免疫染色画像。スケール・バー、200μm。（Ｊ）ACAN-、CCN2-陽性領域、及び pSmad2/3 陽性細胞の数の全 IVD 領域の割合としての定量解析（Ar）。（Ｋ、Ｌ）iPTH 又は媒体で処置した 18 か月齢のマウスの NP 組織に由来する総 TGF-β 及び活性型 TGF-β レベルに関する ELISA 分析。（Ｍ）PTH 又は媒体を注射した 18 か月齢のマウスの NP 組織の pSmad2 レベルを、2 か月齢の NP 組織のそれと比較して示す、ウエスタン・ブロット解析。（Ｎ）PTH 又は媒体を注射した 18 か月齢のマウスの IVD 組織における様々なインテグリンの発現を示す免疫染色画像と定量解析（Ｏ）。スケール・バー 50μm。（Ｐ）PTH 又は媒体を注射した 18 か月齢のマウスの NP 組織における様々なインテグリンの mRNA レベルに関する qRT-PCR 解析。変化割合として結果を記載した。（Ｑ）PTH 注射（PTH1-34、100nM）後の異なる時点での 18 か月齢マウスの NP 細胞におけるインテグリン β6 の発現に関するウエスタン・ブロット解析。（Ｒ、Ｓ）β6 インテグリン・プロモーター内の 4 つの異なる潜在的な pCREB 結合部位（プライマー1、2、3、及び 4）に関するクロマチン免疫沈降アッセイ。全てのデータは平均値±s.d. として記載した。*P<0.05、**P <0.01、1 群につき n=8。統計的有意性は、一元配置分散分析及びスチューデントの t 検定によって決定した。
【図４】図４Ａ‐４Ｍは、PTH1R ノックアウト・マウスにおいて、特に NP 細胞において、椎間板の変性が加速することを示す。（Ａ）PTH1R 欠損マウス（PTH1R-/-）の NP組織には、その野生型同腹仔（PTH1R+/+）と比較して、PTH1R の発現が無いことを示す免疫染色画像。IVDs（上）; NP（下）。スケール・バー 50μm。（Ｂ）PTH1R+/+ マウスと比較した、異なる月齢の PTH1R-/- マウスにおける IVD 厚さ分布に関する 3D PPCT画像。青（100 μm）から赤（800 μm）までの厚さの度合いを示すスケール・バー、カラーコード。（Ｃ）PTH1R+/+ マウスと比較した、異なる月齢の PTH1R-/- マウスにおける IVD 体積の定量解析。（Ｄ、Ｅ）6 か月齢及び 12 か月齢のマウスの PTH1R 欠損マウスの脊椎の柔軟性をテストするための 3D 有限要素解析モデルの画像。（Ｄ）柔軟性を測定するために、L3 の上面と L4 の底面を剛性バーで固定し、IVD への負荷を模倣した。（Ｅ）各モデルについて、4 つの異なる方向の運動をシミュレートするためにトルク負荷を加えた；即ち、背屈（dorsiflexion）、前屈（anteflexion）、左と右の側屈（left and right lateral flexion）の測定、である。（Ｆ）6 か月齢及び 12 か月齢の PTH1R 欠損マウスにおける脊椎の柔軟性の定量解析。（Ｇ）2 番目から 5 番目の腰椎までの棘上靭帯及び棘間靭帯に沿った、3 番目及び 4 番目の腰棘プロセスを切除することによって生じた不安定な脊椎モデルの概略図。（Ｈ）PTH1R+/+ マウスと比較した、手術後の異なる時点での PTH1R 欠損マウスにおける IVD 厚さ分布に関する 3D PPCT 画像。（Ｉ）（Ｈ）の IVD 体積の定量解析。（Ｊ）iPTH 又は媒体で処置した 12 か月齢の PTH1R 欠損マウス又は PTH1R+/+ マウスにおける IVD 厚さ分布を示す 3D PPCT 画像。（Ｋ）（Ｊ）の IVD 体積の定量解析。iPTH 又は媒体で処置した PTH1R 欠損マウスの NP 組織における pSmad2/3、CCN2 及び ACAN のウエスタン・ブロット解析。（Ｍ）iPTH 又は媒体で処置した PTH1R 欠損マウス又は PTH1R+/+ マウスの NP 組織における CCN2 及び ACAN の mRNA 発現レベルに関する qRT-PCR 解析。結果を変化割合として記載した。*P<0.05、**P<0.01、1 群につき n=8。統計的有意性は、一元配置分散分析及びスチューデントの t 検定によって決定した。全てのデータは平均値±s.d. として記載した。
【図５】図５Ａ‐５Ｎは、PTH 及び機械的ストレスで刺激した、PTH1R の NP 細胞の一次繊毛への輸送を示す。（Ａ）PTH1R 欠損マウス又は PTH1R+/+ マウス由来の NP 細胞の一次繊毛の長さを示すアセチル化 α-チューブリン（緑色）及び DAPI（青色）の免疫染色。（Ｂ）（Ａ）の一次繊毛の長さの定量的測定。（Ｃ）PTH が NP 細胞の一次繊毛への PTH1R の輸送を刺激したことを示す、アセチル化 α-チューブリン又は PTH1R の免疫染色。（Ｄ）（Ｃ）の繊毛の PTH1R 強度の定量解析。（Ｅ）PTH が NP 細胞の一次繊毛で CREB のリン酸化を刺激したことを示す DAPI、pCREB 又はアセチル化 α-チューブリンの免疫染色。（Ｆ）（Ｅ）の繊毛の pCREB 強度の定量解析。（Ｇ、Ｈ）PTH 又は媒体で処置した NP 細胞の細胞溶解物の共免疫沈降を、pCREB に対する抗体を使用し、PTH1R でブロットする（Ｇ）、又は PTH1R に対する抗体を使用し、pCREB でブロットする（Ｈ）、で行うと、アセチル化 α-チューブリンの抽出物における PTH1R と pCREB の相互作用が示される。（Ｉ）せん断応力によって NP 細胞の一次繊毛への PTH1R の輸送が刺激されたことを示すアセチル化 α-チューブリン又は PTH1R の免疫染色。（Ｊ）（Ｉ）の繊毛における PTH1R 強度の定量解析。（Ｋ）NP 細胞の一次繊毛への PTH1R の PTH 刺激による輸送が阻害されたことを示す、パリジン siRNA 又は対照 siRNA で処置した NP 細胞の、アセチル化 α-チューブリン又は PTH1R に関する免疫染色。スケール・バー= 10 μm。（Ｌ）（Ｋ）の繊毛における PTH1R 強度の定量解析。（Ｎ）パリジン siRNA 又は対照 siRNA で処置した NP 細胞における PTH 誘導 pCREB レベルのウエスタン・ブロット解析。*P<0.05、**P<0.01。1 群につき n=8。統計的有意性は、一元配置分散分析及びスチューデントの t 検定によって決定した。全てのデータは平均値±s.d. として記載した。
【図６】図６Ａ‐６Ｈは、一次繊毛が、椎間板の同化活性のために、NP 細胞における PTH シグナル伝達を調節することを示す。（Ａ）IVDs に対する PTH の効果が IFT88-/- マウスで減少したことを示す3D PPCT及び免疫染色画像。PPCT のスケール・バー、500 μm。Saf-o のスケール・バー、100 μm。（Ｂ）IVD 体積の定量解析及び（Ｃ）（Ａ）の IVD 組織学的スコア。（Ｄ）iPTH 又は媒体を注射したIFT88-/- 又は IFT88+/+ マウスから単離した NP 細胞において、せん断応力を加える、又は加えない条件での、pCREB のウェスタン・ブロット解析。（Ｅ）PTH 又は媒体で処置した 2 か月齢の IFT88-/- 又は IFT88+/+ マウスにおける、DAPI（青色）染色と共に示す、pSmad2/3（茶色）、CCN2 及び ACAN（赤色）の免疫染色。pSmad2/3 及び CCN2 のスケール・バー、50 μm；ACAN のスケール・バー、100 μm。（Ｆ、Ｇ、Ｈ）NP 領域における pSmad2/3 陽性細胞及び全 IVD 領域中での CCN2 及び ACAN 陽性領域の割合の定量解析。*P<0.05、**P<0.01。1 群につき n=8。統計的有意性は、一元配置分散分析及びスチューデントの t 検定によって決定した。全てのデータは平均値±s.d. として記載した。
【図７】図７Ａ‐７Ｄは、シンクロトン放射に基づいた伝播位相コントラスト・マイクロ‐トモグラフィー（PPCT）による椎間板の 3D 視覚化を示す。（Ａ）中国の上海シンクロトロン放射施設（the Shanghai Synchrotron Radiation Facility（SSRF））の BL13W1 生物医学ビームラインでの PPCT スキャンの概略図。サンプルは回転ステージに固定した。単色シンクロトロン放射の X 線ビームが前記サンプルを透過した後、サンプル・ステージに対して適切な距離にある画像検出器によって、サンプルの内部構造を記録した。（Ｂ）PPCT により、椎間板の冠状断面（coronal）、横断面（transverse）及び矢状断面（sagittal）の画像を検出した；椎間板のこれらの断面は、従来の μCT で描写するのは困難である。（Ｃ）（Ｂ）中でマークした対応線に関する強度分布。青色の線（I、II、III）はμCT、赤色の線（1,2,3）は PPCT を示す。（Ｄ）L3-4 セグメントの完全な 3D 画像。椎骨（VB）、終板（EP）、及び IVD を、別々に、又複数の視点から視覚化できる。3D 厚さ分布を、異なるカラー・コーディング使用して定義できる。スケール・バー= 500 μm。
【図８】図８Ａ‐８Ｆは、断続的に投与する PTH の、椎間板の形態に対する効果に関する用量のスクリーニングを示す。（Ａ）20μg/kg/d、40μg/kg/d 及び 80μg/kg/d のヒト PTH(1-34) で iPTH 処置をした後の IVD の 3D 厚さ分布。（Ｂ）iPTH 処置後の IVD 体積の定量解析。（Ｃ）PTH 処置有り、又は処置無しで、2 か月齢のマウスと 18 か月齢のマウスの L4 椎骨の 3D 画像であり、その微細構造が見える。（Ｄ）iPTH 処置後の骨梁骨体積率（BV/TV）、骨梁厚（Tb. Th）、骨梁数（Tb. N）及び骨梁分離（Tb. Sp）の定量解析。（Ｅ）前記 L4 椎骨の組織切片のベータ Gal 染色の画像。（Ｆ）加齢に伴い、ベータ Gal 陽性細胞が増加することを示す定量解析。この増加は、PTH を注射した後では軽減した。*P<0.05、**P<0.01。統計的有意性は、一元配置分散分析及びスチューデントの t 検定によって決定した。全てのデータは平均値±s.d. として記載した。
【図９】図９Ａ‐９Ｃは、IVD 柔軟性試験の 3D 有限要素解析モデルを示す。（Ａ）柔軟性を測定するために、L3 の上面と L4 の底面を剛性バーで固定し、IVD への負荷を模倣した。（Ｂ）各モデルについて、4 つの異なる方向の運動をシミュレートするためにトルク負荷を加えた；即ち、背屈（dorsiflexion）、前屈（anteflexion）、左と右の側屈（left and right lateral flexion）の測定、である。（Ｃ）サンプル 3D 有限要素モデル。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜発明の詳細な説明＞
前記 IVD を、巨視的に、少なくとも 3 つの別個のコンポーネントに分離可能な、統合された機能的関節ユニットと見なすことができる：即ち、1）脊索起源の髄核（nucleus pulposus（NP））、（幼若な椎間板中では）中心に位置するゼラチン状の均質な塊を表す；2）間葉起源の線維軟骨細胞様細胞が存在する線維輪（annulus fibrosus（AF））、コラーゲン線維の同心円状に組織化された層から成り、髄核を含む；3）軟骨終板（cartilaginous endplates（EP））、前記 NP と AF を隣接する椎骨から分離する。前記 3 つの構造の内の 1 つの健常性及び相互作用が乱れると、IVD ユニットの機能が損なわれてしまうことがある。椎間板の構造的な健常性が生じること、及び維持することに必要であると考えられていて、変性過程でまず最初に影響を受ける構造は、NP である。
【００２２】
前記脊索の祖先を純粋に起源としているので、前記 NP は、前記 AF によって包まれ、前記 EP によって挟まれている。NP の変性は、マトリックスの合成と分解との間における、細胞駆動型の不均衡によって特徴付けられる。幼若な椎間板では生理的に、NP 細胞はプロテオグリカン、アグリカン、及びバイグリカンを負に帯電した側鎖が付いた状態で合成し、EPからの圧縮応力と均衡を取って、大量の水を保持する。年齢の増加とともに、代謝異常の目に見える兆候であるピロリン酸カルシウム二水和物の結晶沈着物が、変性椎間板疾患である高齢患者の AF 及び軟骨 EP に頻繁に見られる。これにより、毛細血管芽を介した EP から NP へ栄養が拡散することが損なわれ、乳酸が蓄積することにより、ますます酸性となる微小環境がもたらされる。これにより、髄核細胞の ECM 産生能は低下するが、MMPs や ADAMTS 等の分解酵素の産生は阻害されない。アグリカンの分解は、NP 中の含水量の減少、椎間板腔の狭小化、及び EP の硬化の促進につながる最も重要な変化になる。これにより、ネガティブ・フィードバック回路が形成され、椎間板変性が悪化する。前記 NP は、最終的に椎体間の圧縮力を分散する能力を失い、それが前記 AF に不均一に伝達され、圧力及び微小外傷のリスクが増加した領域を生じる。この変化した力の分布と微小外傷によって、AF に沿った裂け目とひび割れが生じ、最終的に椎間板の高さが失われる。成人の椎間板において前記 NP マトリックスが維持されることは、軟骨 EP が機能的に健常であることに依存しており、ECM 産生細胞が失われることが IVD 変性の原因であると考えられている。
【００２３】
ある実施形態によれば、本発明は、IVD 変性及び／又は LDD の症状を有する対象における IVD 変性及び／又は LDD の治療方法を提供し、この治療方法は、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００２４】
ある実施形態によれば、本発明は、IVD 変性及び／又は LDD の症状を有する対象における IVD 変性及び／又は LDD の治療方法を提供し、この治療方法は、PTH 又はその機能的断片若しくは類似体、並びに薬学的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【００２５】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における IVD 変性及び/又は LDD の治療に使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物、を提供する。
【００２６】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における老化した椎間板（IVD）の再生に使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物、を提供する。
【００２７】
ある実施形態によれば、本発明は、対象の IVD において、髄核（NP）及び/又は線維輪（AF）及び/又は軟骨終板（EP）の総組織体積を増加させるのに使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物、を提供する。
【００２８】
ある実施形態によれば、本発明は、対象の IVD において、NP 細胞のアポトーシスを減少させるのに使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物、を提供する。
【００２９】
ある実施形態によれば、本発明は、対象の IVD の NP 細胞において、活性型 TGF-β のレベルを増加させるのに使用するための、有効量の副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体を含む組成物、を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、対象に投与される副甲状腺ホルモンは、組成物又は溶液の形態をとることがあり、これらは完全長（84 アミノ酸型の副甲状腺ホルモン）、特にヒト型の hPTH（1-84）を含むことがあり、組換え、ペプチド合成又はヒトの体液からの抽出のいずれかによって取得されることがある。例えば、米国特許第 5,208,041 号を参照。参照により本明細書に取り込まれる。hPTH（1-84）のアミノ酸配列は、Biochem. Biophys. Res. Comm., 114(2):493 で Kimura らによって報告されている。
【００３１】
別の実施形態では、PTH を含む組成物又は溶液は又、Kimmel et al., Endocrinology, 1993, 32(4):1577 によって報告されている骨粗鬆症の卵巣切除ラット・モデルで測定されるようなヒト PTH 活性を有する、ヒト PTH 又はラット、ブタ若しくはウシ PTH の、機能的断片又は部分若しくはバリアント（variants）の断片を、活性成分として含むこともある。
【００３２】
副甲状腺ホルモンの機能的断片又は部分には、PTH（1-28）、PTH（1-31）、PTH(1-34)、PTH（1-37）、PTH（1-38）及びPTH（1-41）等のように、少なくとも最初の 28 個の N 末端残基が取り込まれていることが望ましい。PTH バリアント（variants）である代替の PTH には、PTH の安定性と半減期を改善する 1 から 5 個のアミノ酸置換が取り込まれていて、そのような置換には、例えば、8 及び/又は 18 番目のメチオニン残基を、酸化に対する PTH の安定性を改善する、ロイシン又は他の疎水性アミノ酸に置換すること、及び 25-27 番目の領域のアミノ酸を、プロテアーゼに対する PTH の安定性を改善する、ヒスチジン又は他のアミノ酸等のトリプシン非感受性アミノ酸に置換すること等がある。PTH の他の適切な型には、PTHrP、PTHrP(1-34)、PTHrP(1-36)、及び PTH1 受容体を活性化する PTH 又は PTHrP の類似体が含まれる。これらの型の PTH は、本明細書で総称的に使用する「副甲状腺ホルモン」という用語に含まれる。これらのホルモンは、例えば、米国特許第 4,086,196 号及び第 5,556,940 号（参照により本明細書に取り込まれる）に記載されているような既知の組換え法又は合成法により得ることができる。
【００３３】
ある実施形態において、本発明の方法において、前記 PTH は、テリパラチド（teriparatide）としても知られるヒト PTH(1-34) である。例えば、組換えヒト PTH(1-34)(rhPTH(1-34))等のヒト PTH(1-34) の安定化溶液は、結晶形を含め、本方法で使用でき、米国特許 6,590,081 （参照により本明細書に取り込まれる）に記載されている。
【００３４】
用語「アミノ酸」には、D 型又は L 型の天然の α-アミノ酸の残基（例、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及びVal）、並びに β-アミノ酸、合成アミノ酸及び非天然アミノ酸、が含まれる。多くのタイプのアミノ酸残基がポリペプチドに有用であり、本発明は、天然の遺伝的にコードされたアミノ酸に限定されない。本明細書に記載のペプチドに利用できるアミノ酸の例は、例えば、Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc.及びそこに引用されている参考文献に見出すことができる。様々なアミノ酸残基の別の出所は、RSP Amino Acids LLC のウェブサイトで提供されている。
【００３５】
本明細書において、「誘導体（derivatives）」に言及するときは、PTH ペプチドの部分（parts）、断片、及び部分（portions）が含まれる。誘導体には、単一又は複数のアミノ酸の置換、削除、及び/又は付加も含まれる。ホモログには、天然に存在するペプチド又はタンパク質に由来する機能的、構造的、又は立体化学的に類似したペプチドが含まれる。そのようなホモログは全て、本発明によって企図される。
【００３６】
類似体（analogs）及び模倣体（mimetics）には、天然に存在しないアミノ酸を含む分子を含む分子、又はアミノ酸を含まないがそれでも機能的に PTH ペプチドと同じように振る舞う分子が含まれる。天然物のスクリーニングは、類似体及び模倣物を同定するための有用な戦略の 1 つである。
【００３７】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を取り込ませる例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン及び/又はアミノ酸の D-異性体を使用することが含まれる。本明細書で企図される既知の非天然アミノ酸の部分的なリストを表1に示す。
【００３８】
【表１−１】
2020506926.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
2020506926.tif 000005
【００３９】
本明細書で企図される対象ペプチドの類似体には、側鎖の修飾、ペプチド合成中の非天然アミノ酸及び/又はそれらの誘導体の取り込み、並びにペプチド分子又はそれらの類似体に立体構造上の制約を課す架橋剤の使用及び他の方法が含まれる。
【００４０】
本発明により企図される側鎖の修飾の例には、例えば、アルデヒドとの反応後に NaBH4 により還元をする還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼン・スルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸及びテトラヒドロ無水フタル酸によるアミノ基のアシル化；ピリドキサール-5-リン酸によるリジンのピリドキシル化とそれに続くNaBH4による還元、等のアミノ基の修飾が含まれる。
【００４１】
アルギニン残基のグアニジン基は、例えば、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、グリオキサール等の試薬との複素環縮合生成物の形成により修飾されることがある。
【００４２】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成を介したカルボジイミド活性化、続いて、例えば、対応するアミドへの誘導体化により修飾されることがある。
【００４３】
スルフヒドリル基は、例えば、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸の酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸又は他の置換マレイミドとの反応；4-クロロメルクリ安息香酸、4-クロロメルクリフェニルフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール及び他の水銀剤を使用した水銀誘導体の形成；アルカリ性 pH でのシアネートによるカルバモイル化、等の方法によって修飾されることがある。
【００４４】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化、又は2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジル・ブロミド又はスルフェニル・ハライドによるインドール環のアルキル化により修飾されることがある。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化による変化を受けて、3-ニトロチロシン誘導体を形成する場合がある。
【００４５】
ヒスチジン残基のイミダゾール環に関する修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化又はジエチルピロカルボネートによる N-カルボエトキシル化によって達成することがある。
【００４６】
架橋剤は、例えば、n=1 から n=6 の (CH2)n スペーサー基をもつ二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル等のホモ二官能性架橋剤、並びにN-ヒドロキシスクシンイミド等のアミノ反応性部分及びマレイミド又はジチオ部分（SH）又はカルボジイミド（COOH）等のもう一つ別の基特異的反応性部分を通常含むヘテロ二官能性試薬等を使用して、3 D コンフォメーションを安定化するために使用することがある。更に、ペプチドに、例えば、Cα 及び Nα-メチルアミノ酸を取り込ませること、アミノ酸の Cα 及び Cβ 原子間に二重結合を導入すること、並びに N 末端と C 末端の間、2 つの側鎖の間、又は 1 つの側鎖と N 末端若しくは C 末端の間に、アミド結合を形成させる等の共有結合を導入することによって、環状ペプチド又は類似体を形成させること、等によって、立体構造的な制約を課すことがある。
【００４７】
本発明は更に、天然の Pep 部分の小さな化学的類似体を企図する。化学的類似体は必ずしもペプチド自体に由来するわけではなく、ある特定の立体構造的な類似性を共有する場合がある。或いは、前記ペプチドのある特定の物理化学的特性を模倣するように化学的類似体を特別に設計してもよい。化学的類似体は化学的に合成されることもあり、又は、例えば、天然物をスクリーニングして見つけられることもある。
【００４８】
副甲状腺ホルモンは、骨粗鬆症に対する FDA が承認した同化療法であり、骨芽細胞を分泌する骨マトリックスに直接作用することができ、骨格の恒常性を調節する機能を有することがよく知られている。PTH の主な産生場所である副甲状腺は、両生類で進化し、水中での生活から陸上での生活への移行を表しており、水生脊椎動物を陸上運動に適応させる。PTH は、骨格の健常性及び、例えば、ライニング細胞を活性型骨芽細胞に変換する等のリモデリングのために、静止細胞を活性化することが示されてきており、TGFβ、Wnts、BMP 及び IGF-1（限定されるものではない）等の局所因子のシグナル伝達を調整する。従って、PTH は、微小環境内の−MSCs、T 細胞、及びその他の PTH 応答細胞の細胞活動を含む−細胞活動を調節して、組織の恒常性を全身的に制御することを統合する。更に、PTH-刺激の骨リモデリングの際、新骨形成部位の空間的より近くに、小血管が再配置される。血管がより近接していることにより、骨格組織のホメオスタシス、特に非血管系 IVD にとって必要な栄養を効率的に送達することが可能になる。
【００４９】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における老化した椎間板 IVD の再生方法を提供し、この再生方法は、有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００５０】
親 PTH ポリペプチドに関して、前記機能的部分は、例えば、前記 PTH ポリペプチドの約 90 %、95 %、又はそれ以上を含むことがある。
【００５１】
PTH の機能的部分は、その部分のアミノ又はカルボキシ末端、又は両方の末端に、追加のアミノ酸を含むことがあり、その追加のアミノ酸は PTH ポリペプチドのアミノ酸配列には見られない。望ましくは、前記追加のアミノ酸は機能部分の生物学的な機能を妨げない。
【００５２】
本発明の範囲には、本明細書に記載の、本発明のポリペプチド及びタンパク質の機能的バリアント、が含まれる。本明細書で使用される用語「機能的バリアント（functional variant）」は、PTH ポリペプチド、又はタンパク質と実質的又は有意な配列同一性又は類似性を有する、PTH ポリペプチド、又はタンパク質、を指し、その機能的バリアントは、元の PTH ポリペプチド、又はタンパク質の生物学的活性を保持する。親 PTH ポリペプチド又はタンパク質を見た場合、前記機能的バリアントは、例えば、PTH ポリペプチド又はタンパク質に対して、アミノ酸配列において、少なくとも約 30 % 、50 %、75 %、80 %、90 %、98 % 以上が同一であることがある。
【００５３】
機能的バリアントは、例えば、少なくとも 1 つの保存的なアミノ酸置換を有する PTH ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含むことがある。保存的なアミノ酸置換は、当技術分野で知られており、ある特定の物理的及び/又は化学的特性を有する 1 つのアミノ酸が同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、前記保存的なアミノ酸置換は、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸（例えば、Asp 又は Glu）に置換すること、非極性側鎖を有するアミノをが別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val 等）に置換すること、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸（Lys、Arg 等）に置換すること、極性側鎖を有するアミノ酸を別の極性側鎖を有する別のアミノ酸（Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr 等など）に置換すること、であることがある。
【００５４】
機能的バリアントには、PTH ポリペプチドの伸長を含むこともある。例えば、前記 PTH ポリペプチドの機能的バリアントには、前記 PTH ポリペプチドの N 末端又は C 末端のいずれかに、1、2、3、4 及び 5 個のアミノ酸が追加されることを含むことがある。
【００５５】
或いは又は更に、前記機能的バリアントは、少なくとも 1 つの非保存的なアミノ酸置換を有する PTH ポリペプチド、又はタンパク質、のアミノ酸配列を含むことがある。この場合、非保存的なアミノ酸置換は、前記機能的バリアントの生物学的活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、非保存的なアミノ酸置換は機能的バリアントの生物学的活性を増強し、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、PTH ポリペプチド、又はタンパク質と比較して増加する。
【００５６】
前記 PTH ポリペプチド、又はタンパク質は、前記機能的バリアントの他の成分（例えば他のアミノ酸）が前記機能的バリアントの生物学的活性を実質的に変化させないように、本質的に本明細書に記載の特定のアミノ酸配列（sequence or sequences）からなることがある。
【００５７】
本発明の方法で使用される、本発明のPTH ポリペプチド（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、1 種以上の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことがある。そのような合成アミノ酸は当技術分野で知られており、例えば、アミノシクロヘキサン・カルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリンβ-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペンタン・カルボン酸、α-アミノシクロヘキサン・カルボン酸、α-アミノシクロヘプタン・カルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα-tert-ブチルグリシン、が含まれる。
【００５８】
本発明の方法で使用される PTH ポリペプチド及びタンパク質（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化、又は酸付加塩に変換、及び/又は任意選択的に二量体化若しくは重合化、又は共役化、されることがある。
【００５９】
本発明での方法で使用される PTH ポリペプチド及びタンパク質（機能的部分及び機能的バリアントを含む）が塩の形態である場合、好ましくは、前記ポリペプチドは薬学的に許容される塩の形態である。適切な薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、硫酸等の鉱酸、及び酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、及びアリールスルホン酸、例えば、p-トルエンスルホン酸等の有機酸に由来するものが含まれる。
【００６０】
本発明の方法で使用される PTH ポリペプチド及び／又はタンパク質（その機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、当技術分野で公知の方法により得ることができる。ポリペプチド及びタンパク質を新規に合成する適切な方法は、参考文献（例えば、Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwoood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; 及び米国特許番号 5,449,752 号）の中に記載されている。又、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え方法を使用して、本明細書に記載の核酸を使用して組換え的に生産することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994 を参照のこと。更に、本発明の PTH ポリペプチド及びタンパク質のいくつか（その機能的部分及び機能的バリアントを含む）を、例えば植物、細菌、昆虫、哺乳動物（例えばラット、ヒト等）等の供給源から単離し、及び／又は精製することがある。単離する、及び精製する方法は当技術分野において周知である。或いは、本明細書に記載の PTH ポリペプチド、及び／又はタンパク質（その機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、企業（例えば、Synpep（ダブリン、カリフォルニア州）、Peptide Technologies Corp.（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）及び Multiple Peptide Systems （サンディエゴ、カリフォルニア州）等）によって、商業的に合成されることがある。これに関して、前記 PTH ポリペプチド及びタンパク質は、合成、組換え、単離、及び／又は精製されたものであることがある。
【００６１】
本発明の範囲には、PTH ポリペプチド又はタンパク質（任意のその機能的部分又はバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞の集団、又は抗体、又はそれらの抗原結合部位の何れかを含む共役体（例えばバイオ共役体）が含まれる。共役体、及び一般的な共役体の合成方法は、当技術分野において知られている（例えば、Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) 及び Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)、を参照のこと）。
【００６２】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における IVD 変性の治療方法を提供し、この治療方法は、有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「IVD 変性」又は「変性椎間板疾患（degenerative disk disease）」という用語は、IVD 空間の狭小化、又は NP 及び AF の何れか若しくは両方における細胞外マトリックス及び細胞数の減少を意味し、並びに、NP 及び EP におけるマトリックス産生の代謝不全を意味することもある。いくつかの実施形態では、変性は、NP 及び AF における pSmad2/3+ 細胞の数の減少を含むことがある。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「処置する、治療する（treat）」、及びそれに由来する語は、診断及び予防、並びに障害を緩和する治療を含む。更に、本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防する疾患の 1 つ以上の状態又は症状（例えば下痢）の治療又は予防を含むことがある。又、本明細書の目的のために、「予防（prevention）」は、疾患、又はその症状又は状態の発症を遅らせることを含むことがある。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「対象（subject）」は、任意の哺乳類（限定されるものではないが、ネズミ目の哺乳類、例えば、マウス及びハムスター、ウサギ目の哺乳類、例えばウサギ）をいう。前記哺乳動物は、食肉目（ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）等を含む）由来であることが好ましい。前記哺乳動物は、偶蹄目（ウシ属（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）等を含む）由来、又は奇蹄目（ウマ科（ウマ）等を含む）であることがより好ましい。前記哺乳動物は、霊長類、オマキザル上科（Ceboids）、又はシモイド（Simoids）（サル）又は類人猿（Anthropoids）（人類及び類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００６６】
ある実施形態によれば、本発明は、対象の IVD において、髄核（NP）及び/又は線維輪（AF）及び/又は軟骨終板（EP）の総組織体積を増加させるための方法を提供し、この方法は、有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００６７】
更に別の実施形態によれば、本発明は、対象の IVD において、NP 細胞のアポトーシスを減少させるための方法を提供し、この方法は、有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００６８】
更に別の実施形態によれば、本発明は、対象の IVD の NP 細胞において、活性型 TGF-β のレベルを増加させるための方法を提供し、この方法は、有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を前記対象に投与することを含む。
【００６９】
治療的に使用される有効量の PTH 又はその機能的断片若しくは類似体は、例えば、治療（therapeutic）及び治療（treatment）の目的、投与経路、年齢、状態、並びに治療（treatment）又は治療（therapy）を受けている対象の体重、並びに対象に提供されている補助的（auxiliary）又は補助的（adjuvant）な療法に依存するだろう。従って、最適な治療効果を得るために、施術者が必要に応じて用量の力価測定をし、必要に応じて投与経路を変更することは、必要かつ日常的であろう。PTH 又はその機能的断片若しくは類似体の典型的な 1 日用量は、上記の要因に応じて約 0.1 mg/kg から最大約 100 mg/kg 以上、好ましくは約 0.1 から約 10 mg/kg/日の範囲であることがある。典型的には、前記臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまで、PTH 又はその機能的断片若しくは類似体を投与する。この治療法の進捗は、従来のアッセイによって簡単にモニターされる。
【００７０】
PTH ペプチド又はその誘導体を投与するための用量範囲は、悪性疾患の症状が改善される所望の効果を生み出すのに十分なものである。前記用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほど大きくすべきではない。一般に、前記用量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度によって異なり、当業者によって決定され得る。合併症がある場合には、個々の医師が前記用量を調節することがある。
【００７１】
非限定的な例として、被験者の治療は、0.1 mg から 100 mg/kg （例えば 1 日当たり、0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、若しくは 100 mg/kg を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33 、34、35、36、37、38、39、若しくは 40 日目の少なくともどれか 1 日に、又はその代わりに若しくは追加的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、又は 52 週目の少なくともどれか 1 週に、又はその代わりに若しくは追加的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は 20 年の少なくともどれか、又はその組み合わせに、単回又は反復投与で）、PTH ペプチド又はその誘導体を 1 回又は定期的に投与することとして提供されることがある。
【００７２】
具体的には、前記 PTH ペプチド又はその誘導体を、数週間にわたって少なくとも 1 日 1 回投与することがある。ある実施形態では、前記医薬組成物を、数週間から数か月にわたって少なくとも 1 日 1 回投与する。別の実施形態では、前記医薬組成物を、4 から 8 週間にわたって週に数回（例えば週に 2、3、4、5 回等）投与する。更に別の実施形態では、前記医薬組成物は、4 週間以上にわたって週に 1 回投与する。
【００７３】
別の実施形態によれば、本発明は、対象における老化した IVD の再生方法を提供し、この再生方法は、副甲状腺ホルモン（PTH）又はその機能的断片若しくは類似体、並びに薬学的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【００７４】
ある実施形態によれば、本発明は、上記のペプチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００７５】
別の実施形態によれば、本発明は、上記のペプチド、もう一つ別の治療薬、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７６】
本明細書に記載のペプチド組成物に関して、薬学的に許容される担体は、従来使用されているものの何であって良く、溶解度及び活性化合物との反応性の欠如等の物理化学的なことを考慮して、及び投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載の担体、例えば、媒体、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。前記担体は、活性薬剤に対して化学的に不活性なもの、及び使用条件下で有害な副作用又は毒性をほとんど又は全く持たないものであることが好ましい。前記担体の例には、生理学的に許容され得る既知の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）等の可溶性担体、並びに固体担体又はラテックス・ビーズ等の固体組成物が含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される担体又は希釈剤は、固体製剤用の固体担体又は希釈剤、液体製剤用の液体担体又は希釈剤、又はそれらの混合物であることがある。
【００７８】
固体担体又は希釈剤には、限定されるものではないが、ガム、デンプン（例、コーンスターチ、アルファ化デンプン）、糖類（例、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース材料（例、微結晶セルロース）、アクリレート（例、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、又はそれらの混合物、が含まれる。
【００７９】
液体製剤の場合、薬学的に許容される担体は、例えば、水性又は非水性の溶液、又は懸濁液であることがある。非水性溶媒の例は、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体等を含む、水、アルコール/水溶液、シクロデキストリン、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。
【００８０】
（皮下、静脈内、動脈内、又は筋肉内注射用の）非経口媒体には、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液及び固定油が含まれる。非経口投与に適した製剤には、例えば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及びこの製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、を含むことがある水性及び非水性の等張滅菌注射溶液が含まれ、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことがある水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。
【００８１】
上記の医薬組成物に加えて、本発明を、シクロデキストリン包接複合体等の包接複合体、又はリポソームとして製剤化できることは、当業者には理解されよう。
【００８２】
更に、ある実施形態では、PTH 又はその誘導体を含む組成物は、結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチル・セルロース、グアー・ガム、ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシプロピル・メチル・セルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモ・デンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロース・ナトリウム、クロスポビドン、グアー・ガム、澱粉グリコール酸ナトリウム）、様々な pH 及びイオン強度の緩衝液（例えば、Tris-HCl、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、表面への吸収を防ぐアルブミン又はゼラチン等の添加剤、洗剤（detergents）（例、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（surfactants）（例、ラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例、クレモホール、グリセロール、ポリエチレン・グリセロール、塩化ベンザルコニウム、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、ソルビタン・エステル、ステアリン酸）、抗酸化剤（アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定化剤（ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシプロピルメチル・セルロース）、増粘剤（例、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチル・セルロース、グアー・ガム）、甘味料（例、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例、チメロサール、ベンジル・アルコール、パラベン）、潤滑剤（例、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレン・グリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、フロー‐エイド（flow-aids）（例、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例、カルボマー、ヒドロキシプロピル・セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム） 、ポリマー・コーティング（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）、コーティング及びフィルム形成剤（例えば、エチル・セルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）、及び/又はアジュバント、を更に含むことがある。
【００８３】
担体の選択は、部分的には、具体的なペプチド含有組成物によって、並びに前記組成物を投与するために使用する具体的な方法によって決まるだろう。従って、本発明の医薬組成物に関して、様々な適切な製剤が存在する。非経口、皮下、筋肉内、及び腹腔内投与のための以下の製剤は例示であり、決して限定的ではない。本発明の組成物を投与するために複数の経路を使用することができ、特定の場合において、ある特定の経路は、別の経路よりも迅速且つ効果的な応答を提供することができる。
【００８４】
注射可能な製剤は、本発明に沿うものである。注射可能な組成物のための有効な医薬担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, フィラデルフィア,ペンシルベニア州, Banker と Chalmers 編, 頁 238-250 (1982), 及び ASHP Handbook on Injectable Drugs, Trissel, 15th ed., 頁 622-630 (2009) を参照）。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に活性な化合物」又は「治療的に活性な化合物」は、疾患又は状態を患う対象の、疾患又は状態の治療又は調節に、有用な化合物を意味する。薬学的に活性な化合物の例には、疾患の徴候を治療するための、当該技術分野において既知の任意の薬物が含まれ得る。
【００８６】
一般に、前記 PTH ポリペプチド又はその誘導体を、追加の治療薬と一緒に投与する場合、より低い用量が使用されることがある。PTH 又はその誘導体は、注射又は時間をかけて徐々に灌流することにより、非経口的に投与することがある。PTH ポリペプチド又はその誘導体は、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、又は経皮的に、単独で又はエフェクター細胞（effector cells）と組み合わせて投与することがある。非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体等を含む、水、アルコール/水溶液、乳液又は懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が含まれる。防腐剤及び他の添加物が存在することもあり、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等である。
【実施例】
【００８７】
人間の被験者。
ジョンズ・ホプキンス大学の施設内審査委員会による承認後、腰椎椎間板変性を治療するために椎間板切除術を受けた、年齢の異なる 5 人の患者から、腰椎椎間板の標本を収集した。前記標本を、ウエスタン・ブロット試験のために処理した。
【００８８】
マウス。
老化によって誘発される IVD 変性のモデルのために、2 及び 16 か月齢の C57BL/6J WT オス・マウスをチャールス・リバーより購入した。ジャクソン・ラボラトリから（ROSA）26Sortm1Sor/J マウスを購入した。PTH1R（PTH1Rflox/flox）をフロックス化（floxed）したマウスは、Henry Kronenberg 博士の研究室から入手した。Cheryle A. Seguin 博士から NotoCre マウス系統を入手した。
【００８９】
loxP 部位を隣接させた PTH1R 遺伝子を持つマウス（PTH1Rflox/flox）を NotoCre マウスと交配させて、生殖系列に NotoCre 及びフロックス化した PTH1R 対立遺伝子を持つマウスを作成した。これらのマウスをホモ接合のフロックス化したマウスに戻し交配し（NotoCre/+/PTH1Rflox/+::PTH1Rflox/flox）、脊索由来細胞において、両方の対立遺伝子を不活性化したマウス（遺伝子型 NotoCre/+::PTH1Rflox/flox）を作成した。Noto 座のホモ接合破壊は、周産期において致死的がある；即ち、生存可能な子孫の遺伝子型は、NotoCre/+:: PTH1Rflox/flox（本文で、Noto 系統細胞において、PTH1R をコンディショナルに欠損するマウスを「PTH1R-/-」と呼ぶ）又はNoto+/+::PTH1Rflox/flox（以降、本文で、野生型の同腹仔を「PTH1R+/+」と呼ぶ）である。トランスジェニック・マウスの遺伝子型は、マウスの尾から単離したゲノム DNA の PCR 解析によって決定した。フロックス化された PTH1R 対立遺伝子は、プライマー lox1F（5-TGGACGCAGACGATGTCTTTACCA-3）（配列番号 1）及び lox1R（5-ACATGGCCATGCCTGGGTCTGAGA-3）（配列番号 2）で同定した。Cre 導入遺伝子のジェノタイピングは、プライマー Cre F（5-CAAATAGCCCTGGCAGAT-3）（配列番号 3）及び Cre R（5-TGATACAAGGGACATCTTCC-3）（配列番号 4）を用いた PCR によって行った。我々は、NotoCre マウスと loxP が隣接する DNA 停止配列をホモ接合で有するマウスを掛け合わることによって、下流の lacZ 遺伝子の発現が妨げられている、NotoCre/+::ROSA26-lacZflox/flox を作製した。記載する通り、IFT88flox/floxマウス・モデルを作製した。NotoCre マウスと IFT88flox/flox マウスを掛け合わせることで、NP 組織特異的な一次繊毛のノックアウト（KO）マウス系統が作製され、このマウス中では、NP 組織の一次繊毛が欠損していた。この loxP IFT88 対立遺伝子を、プライマー lox2F（5'-GACCACCTTTTTAGCCTCCTG-3 '）（配列番号 5）及び lox2R（5'-AGGGAAGGGACTTAGGAATGA-3'）（配列番号 6）を使用して同定した。
【００９０】
腰椎を不安定にしたマウス・モデル（LSI）の場合：この実験では、2か月齢の PTH1R+/+ 及び PTH1R-/- オス・マウスを使用した。ケタミンとキシラジンで麻酔をかけた後、腰椎を不安定にさせるために、棘上靭帯と棘間靭帯とともに第 3 腰椎-第 4 腰椎（L3-L4）の棘突起を切除する手術をマウスにした。マウスは、手術後 0、2、4、及び 8 週間で安楽死させた（1 群あたり n=8）。
【００９１】
用量スクリーニング実験では、17 か月齢のオスの C57BL/6J WT マウスを、異なる用量の PTH 又は媒体で処置する 4 つの群に割り当てた；即ち、20μg/kg/d、40μg/kg/d 及び 80μg/kg/d のヒト PTH(1-34)（Bachem California, Inc.、キング・オブ・ペルシア、ペンシルバニア州、米国）群又は溶媒群、である。残りの実験に対して、PTH(1-34) のその最適な用量を選択した。
【００９２】
11 か月齢の PTH1R+/+ 及び PTH1R-/- のオス・マウスをランダムに 4 つの群に分けた： PTH1R+/++PTH(1-34)、PTH1R+/++ 媒体、PTH1R-/-+PTH(1-34) 及び PTH1R-/-+媒体の群（1 群あたり n=8）。11か月齢の IFT88+/+及び IFT88-/-のオス・マウスをランダムに 4 つの群に分けた：IFT88+/++PTH(1-34)、IFT88+/++ 媒体、IFT88-/-+PTH(1-34)及び IFT88-/-+媒体の群（1 群あたり n=8）。マウスに PTH(1-34) 又は媒体（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に 1 mMの酢酸を加えたものを PTH と等量で）を毎日（週 5 日）皮下注射し、全てのマウスを、PTH(1-34)／媒体で処置した 4 週間後に屠殺した。
【００９３】
すべての動物は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の動物施設で飼育した。両種の実験プロトコルは、米国メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学の施設内動物管理使用委員会によってレビューされ及び承認された。
【００９４】
初代 NP 細胞の単離と培養。
緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識した脊索起源の NP 細胞を、前述のように 15 日齢の NotoCre/+::ROSA26-lacZflox/floxオス・マウスから単離した。15 日齢の PTH1R+/+ 及び PTH1R-/-、IFT88+/+ 及び IFT88-/- オス・マウスから NP 細胞を単離した。簡単に説明すると、胸部中部から腰部下部の脊柱にある IVDs の NP 領域から細胞を単離し、最初に TrypLE Express（Gibco）でシェーカーで 30 分間消化し、続いて 0.25 mg/ml Collagense-P（Roche）で 37°Cで更に 30 時間消化した。消化した細胞を PBS で 2 回洗浄し、10 % ウシ胎児血清（Atlanta Biologicals）及び 1 % ペニシリン-ストレプトマイシン（Mediatech）を添加した α-MEM（Gibco）中、37°C、5 % CO2 及び5 % O2 で、80-90 % コンフルエントになるまで培養した。
【００９５】
一次繊毛の視覚化と共局在解析。
NP 細胞内の PTH シグナル伝達成分の局在化を、48 時間の血清飢餓（DMEM、0.5 % FBS、1 % P/S）後の免疫細胞化学により検討した。細胞を PTH（組換えヒト PTH、100  nmol、Bachem California, Inc.、キング・オブ・ペルシア、ペンシルバニア州、米国）又はせん断応力（1 dyn/cm2）で 30 分間処置し、固定し、一次繊毛のアセチル化 α-チュブリン、PTH1R（Abcam、1:100）及び pCREB（Abcam、1:500）について染色した。カバーガラスを Fluoroshield-DAPI でマウントした。63x 対物レンズを取り付けた Zeiss LSM710 META 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、全ての細胞をイメージングした。目的とする領域は、ImageJ ソフトウェアを使用してマニュアルで選択した。繊毛に沿った強度プロファイルは、一次繊毛の長さを横切る線をトレースし、ImageJ ソフトウェアを使用しながら、この線に沿って強度を測定することにより、行った。繊毛領域の平均強度は、条件毎に少なくとも 30 個の繊毛細胞で測定した。
【００９６】
ウエスタン・ブロット解析及び共免疫沈降。
PTH(1-34) 処置後の特定の時点でのマウス由来の、及び腰椎椎間板変性を有する異なる年齢のヒト由来の、in vitro 培養 NP 細胞又は NP 組織のタンパク質溶解物について、ウェスタン・ブロット解析を実施した。前記タンパク質抽出物を遠心分離し、上清の濃度を DC タンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories）で評価した後、SDS-PAGE で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Bio-Rad Laboratories）にブロットした。特定の抗体とインキュベーションした後、高感度化された化学発光キット（enhanced chemiluminescence kit）（Amersham Biosciences）を使用してタンパク質を検出した。ウサギ CTGF（CCN2）（Abcam、1:1000）、アグリカン（ACAN）（Abcan、1:1000）、p-Smad2（Cell Signaling Technology Inc.、1:1000）、Smad2（Cell Signaling Technology Inc.、1:1000）、GAPDH（Cell Signaling Technology Inc.、1:1000）、CREB（Abcam、1:2500）、pCREB（Abcam、1:2500）、PTH1R PRB-635P（Covance、1:100）、PTH1R PRB-640P（Covance、1:500）及びヤギ・インテグリン β6（Santa Cruz、1:500）を認識する特異的な抗体を使用して、溶解物中の個々のタンパク質濃度を調べた。共免疫沈降の解析は、PTH(1-34) 又は媒体で処置した in vitro 培養の NP 細胞から、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit（Pierce Thermo Scientific、78833）を使用して抽出した核及び細胞質タンパク質で実施した。PTH1R 及び pCREB の発現は、抗 pCREB（Abcam、1:500）及び抗 PTH1R （Abcam、1:500）抗体を使用して明らかにした。
【００９７】
クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイ。
ChIP アッセイは、Thermo Fisher ChIP Kit（カタログ番号：26156）を使用して実施した。NP 細胞からの粗ホモジネートを室温で 10 分間、1 % ホルムアルデヒドで架橋した。グリシン（0.25 M）を添加してこの反応を停止させた。遠心分離後、前記ペレットを回収し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む SDS 溶解緩衝液に溶解した。この溶解物を、DNA が平均長 200-1,000 bp の断片に分解されるまで、超音波処理した。このサンプルは、まず最初にプロテイン G アガロースで前洗浄し、次に pCREB に対する 2 mgのウサギ抗体（CST、1:50）と 2 mgの正常ウサギ血清とで、4 ℃で一晩免疫沈降させた。免疫沈降用サンプルの 10-20 % をインプット（陽性対照）として使用した。精製後、表1に記載されている β6 プロモーターに対するプライマーによるリアルタイム PCR を使用して、前記 DNA断片を増幅した。
【００９８】
【表２】
2020506926.tif 000006
【００９９】
cAMP アッセイ及び ELISA 解析。
cAMP アッセイでは、35 mm 6ウェル・プレートで細胞をコンフルエントに増殖させ、37 ℃で、無血清 α-MEM で一晩、血清飢餓の状態においた。次に、この細胞を 100 nM のヒト PTH（1-34; Bachem California, Inc.）で 1 時間処置した。細胞の cAMP を抽出し、Biotrak 酵素免疫アッセイ・システム（GE Healthare、Inc.、プリンストン、HJ）を使ってその濃度を測定した。ELISA Development Kit（R＆D Systems）を、メーカーの指示に従いながら使用して、前記 NP 組織中の総 TGF-β 及び活性型 TGF-β の濃度を測定した。
【０１００】
定量 RT-PCR。
タンパク質抽出後、同じ群のマウスの標本を、TRIzol 試薬（Invitogen）を、製造者の指示に従いながら使って、RNA 抽出物を調整した。RNA の純度は、260 及び 280 nm での吸光度を測定することにより、試験した。qRT-PCR については、SuperScript ファースト・ストランド合成システム（SuperScript firststrand synthesis system）（Invitrogen）を使用して、2 マイクログラムの RNA を cDNA に逆転写し、SYBR Green-Master Mix（Qiagen）と各標的遺伝子に特異的な 2 組のプライマーを使用したサーマル・サイクラーで解析した。相対発現は、標準化のための GAPDH を使用して、2-△△CT 法によって各遺伝子について計算した。qRT-PCR に使用したプライマーを表2にリストする。
【０１０１】
【表３】
2020506926.tif 000007
【０１０２】
免疫細胞化学、免疫蛍光及び組織形態計測。
免疫細胞化学染色については、GFP で標識された NP 細胞を、ウサギ PTH1R PRB-635P（Covance、1:100）に対する一次抗体で 1 時間、インキュベートして共染色し、その後、室温で蛍光色素が結合した二次抗体で染色した。安楽死の時点で、解剖して、その腰椎を 10 % 緩衝ホルマリンで 48 時間固定し、10 % EDTA（pH 7.4）で 14-21 日間脱灰し、パラフィン又は最適切断温度（optimal cutting temperature（OCT））コンパウンド（Sakura Finetek）中に包埋した。L1-L6 脊椎の 4 マイクロメートル厚の冠状断面方向の切片を、サフラニン O 及びファスト・グリーン染色で処理した。標準プロトコルを使用して、切片の免疫染色を行い、ウサギ ACAN（Abcam、1:100）、CCN2（Abcam、1:100）、インテグリン β8（Abcam、1:200）、pCREB（Abcam、1: 100）及び PTH1R PRB-635P（Covance、1:100）、マウス pSmad2/3（Santa Cruz、1:100）、インテグリン αvβ6（Millipore、1:100）、インテグリン αvβ3（Bioss、1:100）、インテグリン αvβ5（Bioss、1:100）に対する一次抗体と、4°Cで一晩、インキュベートした。免疫組織化学染色については、その後、ホース・ラディッシュ・ペルオキシダーゼ-ストレプトアビジン検出システム（horse radish peroxidase-streptavidin detection system（Dako））を使用して免疫活性を検出し、続いてヘマトキシリン（Sigma-Aldrich）で対比染色を行った。免疫蛍光アッセイについては、スライドグラスを、蛍光色素が結合した二次抗体とともに室温で 1 時間、光を避けてインキュベートした。陰性対照として、同じ濃度及び条件下で、例えばポリクローナル・ウサギ IgG（R＆D Systems、AB-105-C）等のアイソタイプが一致した対照を使用した。切片の顕微鏡写真を撮影し、脊椎の L3-L4 の全領域で組織形態計測を行った（Olympus DP71）。
【０１０３】
定量的組織形態計測解析は、Image-Pro Plus Software バージョン6.0（Media Cybernetics Inc）を使用して盲検方式で実施した。IVD の組織学的スコアは、前述のように得た67。定量的組織形態計測分析のために、L3-L4 レベルで、各群のマウス当たりにランダムに選択した 5 枚の切片を選んだ。pSmad2/3 及び pCREB 陽性細胞の割合を、NP 領域内における総細胞数に対する陽性染色細胞数をカウントすることによって得た。CCN2 及び ACAN 陽性染色の面積の割合は、各群の L3-L4 の全面積に対する前記陽性染色の面積を測定することにより計算した。
【０１０４】
伝播位相コントラスト・マイクロ‐トモグラフィー・スキャニング（Propagation phase contrast micro-tomography scanning）。
中国の上海シンクロトロン放射施設（the Shanghai Synchrotron Radiation Facility（SSRF））の BL13W1 生物医学ビームラインで、シンクロトロン放射スキャニングに基づく伝搬位相コントラスト・マイクロ‐トモグラフィー（PPCT）を行った（図７Ａ）。高い X 線減衰コントラスト画像を得るために、単色の X 線エネルギーを 15 keV に調整し、スキャナーを 15 keV の電圧に設定し、露光時間を 2.5秒 に設定し、及びサンプルから検出器までの距離（sample-to-detector distance（SDD））を 30 cm に調整し、ピクセルあたり 3.7 μm の解像度とした。その画像は、GPU-CT-Reconstruction ソフトウェア（BL13W1 実験ステーションで適用）及び VG Studio Max 3D ソフトウェア（バージョン 2.1、Volume Graphics GmbH、ドイツ）をそれぞれ使用して再構築し、及び解析した。目的とする領域は、L3-L4 コンパートメント全体をカバーするように規定した。IVDs の 3D 定量解析は、市販の Image Pro Analyzer 3D ソフトウェア（バージョン7.0、Media Cybernetics, Inc.、米国）を使用して行った。IVDs の平均の高さと体積、及び厚さの分布について、3D 構造パラメーターを解析した。L4 の骨梁を骨髄から分けて、骨梁体積分率（BV/TV）、骨梁厚（Tb. Th）、骨梁数（Tb. N）、及び骨梁分離（Tb. Sp）を決定するために解析した。
【０１０５】
PPCT ベースの 3D 有限要素テスト。
各モデルについて、L3-L4 の 1 つのモーション・セグメント（motion segment）の PPCT 画像は、まず最初に、ノイズ除去に供し、判別解析によって得られた閾値を使用して 2 値化を行った。次に、図９Ａ、Ｃに示すように、骨組織（軟骨終板等を含む）と IVD の 3D ジオメトリ・モデル（geometry model）をセグメンテーション結果から再構築した。骨組織モデルでは、骨梁微細構造が大量にあるため、ジオメトリ・ソリッド・モデル（geometry solid model）を使用すると、いくつかのトポロジ・エラー（topology errors）と望ましくない幾何学的な特徴が生じる可能性がある。それ故に、幾何学的な修復と最適化の操作で前処理する必要がある。その後、有限要素メッシュ・モデルを、VG Studio Max 3D ソフトウェアのアダプティブ・メッシング・ツール（adaptive meshing tool）による、ジオメトリ・ソリッド・モデルの 10-ノードの二次四面体要素によって直接的に離散化する。組織の材料特性は、以前の研究に従って設定した。最後に、有限要素解析（finite element analysis（FEA））を ABAQUS（DassaultSystemesAmericas Corp、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で実施した。各モデルについて、L3 の上面と L4 の底面を、図９Ｂに示すオレンジ色の部分のような堅いバーで固定し、4 つの異なる方向への動きをシミュレートするトルク負荷を正確に加えることができるようにした（背屈、前屈、左と右の側屈を測定する）。最後に、各モーション・セグメントに関して、結果として生じるモーションの範囲（range of motion（ROM））を計算した。
【０１０６】
In vivo マイクロ-MRI。
In vivo 脊髄 IVD イメージングを、B0 磁場に直交して配置した、特注のシングル‐ターン・ボリューム・コイル（single-turn volume coil）を備えた水平 30 cm 内径 9.4T Bruker Biospec 前臨床スキャナーで行った。マウスの麻酔は 4 % イソフルランで開始し、2 % イソフルランと酸素の混合ガスで維持した。マウスを仰向けにトレイに置き、モーション・アーティファクト（motion artifacts）を最小限に抑えるためにテープで固定した。以下のパラメーター（15.17 ms/3,000 ms のエコー時間/繰り返し時間（echo time/repetition time（TE/TR））、0.35 mm の厚さの 35 スライス、1.75 cm×1.75 cm の視野（field of view（FOV））、256×128 のマトリックス・サイズ）にした緩和促進（relaxation enhancement（RARE））シーケンスを使用して、T2 強調画像を取得した。全ての T2 強調画像は、0.068 mm ピクセル-1 の等方性解像度で、256×256 の最終マトリックス・サイズに処理した。椎間板組織の水和の指標としての信号強度を定量化するために、各群の L3-L4 レベルにある目的の領域を選択し、Image-Pro Plus ソフトウェア・バージョン 6 を使用して測定した。
【０１０７】
統計。
データは、平均±s.d. として表す。2 つのグループ間の比較には、対応のない両側スチューデント t 検定を使用し、多重比較には一元配置分散分析（ANOVA）とボンフェローニ事後検定を使用した。全てのデータは、正規分布を示し、群間で同様なバラツキを示した。有意水準を P <0.05 に設定した。すべてのデータ解析は、SPSS 22.0 解析ソフトウェア（SPSS Inc.）を使用して実行した。
【０１０８】
＜実施例１＞
TGF-α 活性は、加齢過程の IVD 変性で減少する。
加齢過程の IVD の変化を体系的に調べた。IVD の3次元（3D）変化を、シンクロトロン放射に基づく伝播位相コントラスト・マイクロ‐トモグラフィ（PPCT）を使用して視覚化し、2 か月齢及び 18 か月齢のマウスで、脊椎骨に隣接する IVD（上）及び無傷の IVD （下）の3 D イメージを示す（図１Ａ及び図７）。IVD の高さと体積は、2 か月齢のマウスと比較して、18 か月齢のマウスで有意に減少した（図１Ｂ）。同様に、3D の 5 つの異なる IVD エリア内の厚さ分布は、特に後部エリアで、加齢とともに減少した（図１Ｃ、Ｄ、及び図７）。NP 細胞の数も、18 か月齢のマウスでの IVD 切片のサフラニン-O 染色によって視覚化されるように、変性の指標としての IVD スコアが増加するとともに、有意に減少した（図１Ｅ、Ｆ）。免疫組織化学染色により、IVD 内のアグリカン（ACAN）、結合組織成長因子（CTGF/CCN2）+、及び pSmad2/3+ 細胞のレベルは、2 か月齢のマウスと比較して、18 か月齢のマウスで有意に減少することが示された（図１Ｇ、Ｈ）。ウェスタン・ブロット解析により、18 か月齢のマウスで pSmad2/3 が減少することが検証された（図１Ｉ）。我々の結果は、加齢の IVD 変性の過程で、活性型 TGF-β の減少が、その下流の同化 CCN2-ECM カスケードに相関していることを示している。
【０１０９】
＜実施例２＞
NP 細胞において、PTH は、cAMP の生成と CREB のリン酸化を直接的に誘導する。
両生類で進化した PTH 腺は、陸上での脊椎動物が適応するために機能していることが示唆されているので、NP 細胞において、PTH がその下流シグナル伝達を直接的に活性化するかどうかを調べた。L3-L4 椎間板切片を免疫染色すると、PTH1R が NP 細胞で発現していることが示された（茶色の領域）（図２Ａ）。更に、ウエスタン・ブロット解析により、NP 及び AF において PTH1R が発現していることが示された（図２Ｂ）。NP 細胞での PTH1R 発現が脊索起源であることを検証するために、ROSA26-GFPflox/flox マウスと NotoCre マウスを交配させて、脊索細胞系列で GFP 蛍光を発するマウス（NotoCre::ROSA26-GFP）を作成した。NotoCre::ROSA26-GFP マウスから単離した GFP+ IVD 細胞は、PTH1R と共局在し（図２Ｃ、上パネル）、そして、IVD 切片の免疫蛍光染色によっても、PTH1R が NP 領域で GFP+ 細胞と共局在していることが示された（図２Ｃ、下のパネル）。これにより、PTH1R が脊索由来 NP 細胞で発現していることが確認された。
【０１１０】
PTH が下流の細胞内シグナル伝達を刺激するかどうかを解明するために、PTH によって誘導されるサイクリック・アデノシン 1 リン酸（cAMP）産生のレベルを、NP 細胞において測定した。NP 細胞の cAMP レベルは、PTH(1-34)（100 nmol）で処置した 30 分後にピークに達した（図２Ｄ）。pCREB+ 細胞の数は、NP領域で、処理後 30 分で増加していて、1 時間でピークに達した（図２Ｅ、Ｆ）。ウェスタン・ブロット解析によって、NP 細胞において、30 分後に、PTH が CREB のリン酸化を誘導していることも示された（図２Ｇ）。重要なことに、患者の腰部 IVD 標本のウエスタン・ブロット解析では、ヒト NP 及び AF 細胞の PTH1R タンパク質レベルは、若年及び成人で比較的低かったが、加齢過程で有意に増加した（図２Ｈ）。同様に、NP 組織における PTH1R mRNA 発現レベルは、若い成人では比較的低く、加齢とともに増加した。（図２Ｉ）。まとめると、これらの結果から、NP 細胞における PTH の直接的なシグナル伝達には、加齢過程の IVD を維持する際における潜在的な機能がある、ということが分かる。
【０１１１】
＜実施例３＞
iPTH は、TGF-α を活性化する際に、インテグリン αvβ6 の発現を誘導することにより、椎間板変性を軽減する。
断続的に投与する PTH（iPTH）が IVD 変性に及ぼす潜在的な影響を調べるために、加齢マウスに、ヒト PTH(1-34)の C 末端切断合成類似体である PTH を、異なる用量で 8 週間毎日注射した。iPTH 40 μg/kg 及び 80μg/kg は、IVD の形態を著しく改善したので、残りの研究に関しては、40μg/kg の用量を選択した（図８Ａ、Ｂ）。具体的には、IVD の高さと体積は、18 か月齢のマウスで、ビークル・マウスと比較して、iPTH 処置で増加し（図３Ａ、Ｂ）、骨体積（BV/TV）及び接続性（connectivity（Tb. Con））と共に増加した（図８Ｃ、Ｄ）。更に、iPTH で処置した 5 つの異なる領域で、特に IVD の中央領域で、3D 画像での IVD の厚さが大幅に増加した（図３Ｃ、Ｄ）。腰椎 IVDs のMRI信号強度は、iPTH を注射するのに伴って著しく増加した（図３Ｅ、Ｆ）。NP 細胞の数は IVD スコアが減少するとともに著しく増加し（図３Ｇ、Ｈ）、アグリカンと CCN2+ のレベルは iPTH 処置で増加した（図３Ｉ、Ｊ）。更に、iPTH 処置により、pSmad2/3+ NP 細胞の数が増加し（図３Ｉ、Ｊ）、IVD において、PTH が TGF-β の活性化を誘導することを示す。確かに、活性型 TGF-β のレベルは、iPTH の処置により、IVDs で増加したが、総 TGF-β レベルは、ELISA では変化しなかった（図３Ｈ、Ｌ）。ウエスタン・ブロット解析により、iPTH 処置で pSmad2 が増加することが確認された（図３Ｍ）。
【０１１２】
PTH が IVD において TGF-β の活性化を誘導するメカニズムを決定するために、PTH が αvβ インテグリンの発現を増加させ、それが潜在型 TGF-β の活性化を媒介するかどうかを調べた。iPTH 又は媒体で処置した 18 か月齢のマウスから調製した IVD 切片を、それぞれ αvβ3、αvβ5、αvβ6 及び β8 に対する個々の抗体で染色し、インテグリン・レベルを、2 か月齢のマウスのそれと比較した。この結果により、αvβ5 及び αvβ6 インテグリンの発現が、2 か月齢のマウスと比較して 18 か月齢のマウスで有意に減少したが、αvβ3 及び β8 の発現レベルは相対的に変化しないままであることが示された。重要なことは、PTH は、18か月齢のマウスで、αvβ6 のレベルだけを有意に増加させた、ということである（図３Ｎ、Ｏ）。iPTH による αvβ6 インテグリンの調節を検証するために、qRTPCR を行い、個々のインテグリン mRNA 発現に対する PTH 処置の効果を定量化した。先の結果と合致するように、PTH は、高齢マウスの NP 細胞で、β6 インテグリンの mRNA 発現を特異的に誘導した（図３Ｐ）。PTH は又、時間依存的に β6 インテグリンのタンパク質レベルを著しく刺激した（図３Ｑ）。従って、PTH は、NP 組織内の αvβ6 発現を増加させることにより潜在型 TGF-β を活性化し、腰部椎間板疾患に対する潜在的な治療標的を提供する。
【０１１３】
PTH によって誘導される β6 インテグリン遺伝子転写のメカニズムを決定するために、β6 インテグリン・プロモーター内の、pCREB が結合する可能性のある 4 つの異なる部位で、クロマチン免疫沈降アッセイを実施した（プライマー 1、2、3、及び 4）。免疫沈降の結果、pCREB は β6-インテグリン・プロモーター内の最も遠位の CREB 部位に特異的に結合することが明らかになった（プライマー1）（図３Ｒ、Ｓ）。まとめると、これらの結果から、PTH は、NP 細胞で、pCREB が β6 インテグリン・プロモーターに直接的に結合することを誘導することにより、β6 インテグリンの発現を活性化すること、が示される。
【０１１４】
＜実施例４＞
NP 細胞において、PTH1R をコンディショナル・ノックアウトすると、加齢過程の椎間板変性が加速される。
加齢過程の NP 細胞における PTH シグナル伝達の役割を検討するために、NotoCre マウスと PTH1Rflox/flox マウスを交配して、脊索由来の NP 細胞中で、PTH1R 遺伝子を特異的に欠損させた（NotoCre::PTH1Rflox/flox、以後「PTH1R KO マウス」と呼ぶ）。PTH1R KO マウスの椎間板切片内の NP 細胞では、PTH1R の発現は検出されなかった（図４Ａ）。異なる月齢の PTH1R KO マウス及び野生型同腹仔において、PPCT で IVD の変化を評価した。出生後及び成年期のIVD 体積は、PTH1R KO マウスでは正常なままであったのに対し、IVD 体積は、月齢が一致した野生型同腹仔（以後「PTH1R+/+ マウス」と呼ぶ）と比較して、6 か月齢から減少することがわかった（図４Ｂ、Ｃ）。これは、加齢過程で IVD の機能を維持する上で、PTH が重要な役割を果たしていることを示唆する。ヒトでは、高レベルの PTH1R の発現は、老化した IVDs でのみ観察された（図２Ｉ）。IVD 機能を評価するために、PPCT 画像取得に基づく 3D 有限要素解析モデルを使用して、背屈、前屈、左と右の側屈等の、IVD の柔軟性テストを行った（図４Ｄ、Ｅ）。全ての方向における IVDs の柔軟性は、PTH1R KO マウスで、進行的に、有意に減少し、これは 6 ヶ月齢の時点で始まっていた（図４Ｆ）。更に、機械的負荷が加わった不安定な環境下で、椎間板の機能を PTH が調節するかどうかを評価するために、隣接する腰椎の椎間靭帯を切除することにより、脊椎を不安定化したマウス・モデルを作製した（図４Ｇ）。IVD 体積は、2 か月齢の PTH1R-/- マウスの手術後 4 週間で減少した。これは、有意な減少が 6 か月齢で始まり、12 か月齢で顕著になる安定モデルでのそれよりもはるかに早かった（図４Ｈ、Ｉ）。
【０１１５】
次に、NP 細胞での PTH1R の欠損が、IVD に対する iPTH による同化作用効果に影響するかどうかを調べた。12 か月齢の PTH1R+/+ マウスでの、iPTH による IVD 体積の増加は、PTH1R KO マウスでは見られなくなった（図４Ｊ、Ｋ）。更に、ウェスタン・ブロット解析により、NP 組織で見られる、PTH 誘導による pSmad2、ACAN 及び CCN2 のレベルの増加が、PTH1R KO マウスで減少することが示された（図４Ｌ）。qRT-PCR によると、PTHは、野生型マウスの NP 細胞での ACAN 及び CCN2 の mRNA 発現を有意に増加させたが、これは、PTH1R KO マウスでは鈍化した（図４Ｍ）。従って、NP 細胞における PTH シグナル伝達は、椎間板の恒常性にとって、（特に加齢過程で）不可欠である。
【０１１６】
＜実施例５＞
PTH は、NP 細胞の繊毛へ PTH1R が輸送されることを刺激する。
機械的ストレスが NP 細胞の PTH シグナル伝達を調節するかどうかを理解するために、PTH1R が GPCR であり、一次繊毛で見られるので、NP 細胞の一次繊毛が PTH シグナル伝達を調節するかどうかを調べた。アセチル化チューブリンの免疫染色により、野生型マウスの NP 細胞に一次繊毛が存在し、PTH1R KO マウスでは、一次繊毛の長さが著しく減少していることが示された（図５Ａ、Ｂ）。重要なことに、PTH は、繊毛への PTH1R の移動を著しく刺激し、処置 10 分後には始まった（図５Ｃ、Ｄ）。アセチル化チューブリンと pCREB が共免疫染色されることは又、繊毛で pCREB が増加することも明らかにし（図５Ｅ、Ｆ）、繊毛で PTH シグナル伝達が調節されていることも示唆している。PTH1R と pCREB が複合体を形成するかどうかを調べるために、pCREB に対する抗体を使って共免疫沈降をし、PTH1R でブロットすることを行った。これにより PTH1R と pCREB の間の相互作用が、繊毛を含む細胞質のアセチル・チューブリン抽出物中のみにあることが示された（図５Ｇ）。同様に、PTH1R に対する抗体を使った共免疫沈降によって、前記相互作用が、細胞質のアセチル・チューブリン抽出物中のみに存在することが示された（図５Ｈ）。
【０１１７】
次に、機械的ストレスが繊毛を介して PTH シグナル伝達を調節するかどうかを調べた。NP 細胞にせん断応力を加えると、繊毛への PTH1R の移動がせん断応力によって有意に増強された（図５Ｉ、Ｊ）。パリジンは、繊毛へのタンパク質の輸送を仲介する。そこで、PTH によって増強される、繊毛への PTH1R の移動を検証するために、siRNA でパリジンをノックダウンした。パリジンをノックダウンすると、PTH によって増強される、繊毛への PTH1R の輸送及び CREB のリン酸化がブロックされた（図５Ｋ−Ｍ）。まとめると、PTH は一次繊毛への PTH1R の輸送を刺激し、せん断応力によって、前記輸送は促進される。
【０１１８】
＜実施例６＞
NP 細胞において、繊毛を破壊すると、IVD 体積、PTH シグナル伝達、及び TGF-β 活性が低下する。
IVD の機能を維持することにおける繊毛の役割を調べるため、IFT88flox/flox マウスとNotoCre/+ マウスを掛け合わせ、NP 細胞特異的に繊毛が破壊された IFT88::Noto-Cre マウス（IFT88-/-）を作成した。野生型マウスと比較して、IFT88-/- マウスでは、NP 細胞特異的に繊毛が破壊されると IVD 体積が大幅に減少し（図６Ａ、Ｂ）、結果として IVD スコアが増加した（図６Ａ、Ｃ）。更に、野生型マウスと比較して、IFT88-/- マウスでは、iPTH によって増加する IVD 体積は鈍化しており（図６Ａ、Ｂ）、iPTH による IVD スコアの改善も損なわれた（図６Ａ、Ｃ）。機械的ストレスが PTH1R の繊毛への輸送を介して PTH シグナル伝達を調節していることを検証するために、一次繊毛が破壊されている NP 細胞で、PTH が CREB のリン酸化を刺激するかどうかを調べた。ウェスタン・ブロット解析により、野生型マウスでは、PTH は CREB のリン酸化を有意に刺激し、及びせん断応力は前記リン酸化を促進するが（図６Ｄ）、一次繊毛を破壊すると、IFT88-/- 細胞における PTH 又はせん断応力による CREB のリン酸化レベルが有意に低下すること、が示された。重要なことに、免疫組織化学染色により、PTH が、媒体で処置したマウスと比較して、野生型マウスでの pSmad2/3+ NP 細胞の数と CCN2 及びアグリカンのレベルを有意に刺激し、その効果は、IFT88-/- マウスで、NP 細胞特異的に繊毛を破壊することによって小さくなることが示された（図６Ｅ−Ｈ）。これらのデータは、機械的ストレスが、一次繊毛を介して NP 細胞の PTH シグナル伝達を強化し、IVD の機能を維持することを示している。
【０１１９】
本明細書に引用される出版物、特許出願、及び特許等を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別に且つ具体的に参照により取り込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されるているのと同程度に、参照により取り込まれる。
【０１２０】
本発明を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲において）、用語「a」及び「an」並びに「the」並びに類似の指示物の使用は、本明細書で特に記載されている、又は文脈上、明らかに矛盾している、ということが無い限り、単数及び複数の両方をカバーするものと解釈する。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含む（containing）」は、特に断りのない限り、無制限（open-ended）の用語（つまり、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to,）」という意味）と解釈する。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で特に明記しない限り、範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略な方法として機能することを意図しているだけであり、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に取り込まれる。本明細書で記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供される、ありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「例えば‐‐‐等（such as）」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しており、特に特許請求の範囲に記載しない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言語は、特許請求の範囲に記載されていない要素が、本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１２１】
本発明を実施するのに、本発明者らが知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読めば、当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、及び本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法で許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題に関して、全ての修飾物及び均等物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に明記しない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【０１２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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