(57)【要約】  本発明は、プロパゲーター細胞並びにファージ及び形質導入粒子を増殖させるための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、前記方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
【請求項２】
ファージのコートタンパク質によってパッケージングされた核酸を含む形質導入粒子の集団を産生する方法であって、粒子が、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能であり、それによって、宿主細胞が核酸により形質導入され、前記方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものであり、前記核酸の複製を生成することが可能であるDNAを含む第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、第2の細菌細胞に含まれるレセプターにファージを結合させることによって、ファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させる行程であって、前記核酸の複製をパッケージングするファージのコートタンパク質が産生され、それによって、粒子の集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団の粒子を単離する工程
とを含む、方法。
【請求項３】
粒子が、非複製型形質導入粒子又はファージである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ファージ又は粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記宿主細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA(又はシングルガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記宿主細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA(又はgRNA)が宿主細胞のCasをガイドして標的配列を修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞集団の成長を低減する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ファージが感染した場合に、第2の細胞が前記活性CRISPR/Casシステムを含まない、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まない、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
(a)前記第2の細胞のCas(任意選択で、Cas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)が、前記crRNA(又はgRNA)とともに作動可能ではなく、
(b)前記第2の細胞のtracrRNAが、前記crRNAとともに作動可能ではなく、及び/又は
(c)前記第2の細胞が、前記crRNAをコードするヌクレオチド配列から前記crRNAを生成するのに作動可能ではない(又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列から前記gRNAを生成するのに作動可能ではない)、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
crRNA(又はgRNA)が、第2の細胞のCas(任意選択で、第2の細胞のCas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)とともに作動可能ではないリピート配列を含む、請求項4から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、前記宿主の種又は株の細菌におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのプロモーターであって、前記第2の種又は株におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのものではないプロモーターに作動可能に接続している、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
(a)ファージ又は粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記宿主細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA(又はシングルガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記宿主細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA(又はgRNA)が宿主細胞のCasをガイドして標的配列を修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞集団の成長を低減し、
(b)宿主細胞と第2の細胞が、同じ種(任意選択で、大腸菌株)のものであり、
(c)各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まず、第1及び第2の細胞が、同じ種の異なる株である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主の種又は株の細菌が、宿主細菌に感染する前記第1の型のファージ又は粒子を死滅させるか又はその増殖を低減する抗ファージ毒素又は機構を含み、第2の細菌が、前記毒素又は機構を含まない、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主の種又は株の細菌が、宿主細菌に感染する前記第1の型のファージ又は粒子を死滅させるか又はその増殖を低減するのに活性であるCRISPR/Casシステムを含み、第2の細菌が、前記システムを含まない、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第2の細菌細胞が、レセプターを生成するように遺伝子操作されており、前記第2の種又は株の野生型細菌が前記レセプターを生成しない、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ファージ又は粒子が、前記第2の細胞において及び前記第1の種又は株の細胞において作動可能である複製起点を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第2の細胞が、大腸菌細胞である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第1及び第2の細胞が、同じ種(任意選択で、大腸菌株)のものである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞の株がヒト病原性株であり、第2の細胞株がヒト病原性株ではない、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
第2の細胞が、宿主の種又は株(任意選択で、ハザードグループ3又は4)の細胞と比較して、より低いハザードカテゴリー(任意選択で、ハザードグループ1又は2)の細胞である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
レセプターが、リポ多糖、タイコ酸(任意選択で、ManNAc残基のC4ヒドロキシルに付着した1から3個のグリセロールホスフェートを有し、それにグリセロール-又はリビトールホスフェートリピートの長鎖が続くManNAc(β1→4)GlcNAc二糖)、タンパク質及び鞭毛から選択される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
レセプターが、宿主細胞のO-抗原を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ファージ又は粒子が、任意選択で、ファージ又は粒子が第2の細胞において複製する場合に、第2の細胞において、エンドリシン又はホリンを発現するのに作動可能である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ファージのコートタンパク質によってパッケージングされた核酸を含むファージ又は形質導入粒子を増殖させるための細胞(プロパゲーター細胞)であって、ファージ又は粒子が、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、プロパゲーター細胞が、その表面にレセプターを含み、第2の種又は株のものであり、第2の種又は株が、第1の種又は株と異なり、それによって、プロパゲーター細胞が、それにおけるファージ又は粒子のそれぞれの増殖のために前記第1の型のファージ又は前記粒子による感染を受けることが可能である、プロパゲーター細胞。
【請求項２３】
レセプターが、プロパゲーター細胞のゲノムに含まれる発現可能なヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、請求項22に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項２４】
レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物である糖部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、請求項22に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項２５】
レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物であるタイコ酸部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、請求項22に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項２６】
酵素が、TarO、TarA、TarB、TarF、TarK、及びTarL(又は宿主細胞及び/又は第2の細胞によって発現されたこれらの相同体)から選択される、請求項25に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項２７】
前記第1の型のファージ又は前記形質導入粒子と組み合わせた、請求項22から26のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項２８】
前記第1の型の1つ若しくは複数のプロファージ(任意選択で、プロパゲーター細胞の染色体に組み込まれた)、又は形質導入粒子の前記核酸の複製を生成することが可能であるDNA(任意選択で、プロパゲーター細胞の染色体に組み込まれた)を含む、請求項22から27のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項２９】
プロパゲーター細胞がグラム陰性細菌細胞であり、任意選択で、宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項22から28のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項３０】
プロパゲーター細胞がグラム陽性細菌細胞であり、任意選択で、宿主細胞がグラム陽性細菌細胞である、請求項22から28のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞。
【請求項３１】
任意選択で、プロパゲーター細胞を培養し、前記第1の型のファージ又は前記形質導入粒子を増殖させるための発酵容器に含まれる、請求項22から30のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞の集団。
【請求項３２】
各プロパゲーター細胞が、請求項1から21のいずれか一項に規定の第2の細胞である、請求項22から31のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞又は集団。
【請求項３３】
各宿主細胞が、請求項1から21のいずれか一項に規定の宿主細胞である、請求項22から31のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞又は集団。
【請求項３４】
ファージ又は粒子が、請求項1から21のいずれか一項に規定のファージ又は粒子である、請求項22から31のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞又は集団。
【請求項３５】
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防する方法であって、疾患又は状態が、対象に含まれる(任意選択で、対象の腸に含まれる)宿主細胞によって媒介され、前記方法が、プロパゲーター細胞を対象に(任意選択で、対象の腸に生息するために)投与する工程を含み、プロパゲーター細胞が請求項22から34のいずれか一項に記載されており、プロパゲーター細胞がファージ又は形質導入粒子を産生し、ファージ又は粒子が、それぞれ、患者の(任意選択で、その腸の)宿主細胞に感染し、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は対象の宿主細胞の成長若しくは増殖を阻害し、それによって、疾患又は状態が処置又は予防される、方法。
【請求項３６】
プロパゲーター細胞が、ラクトバチルス菌(任意選択で、ラクトバチルス・ロイテリ)の細胞である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
ファージが、宿主細胞においてCasをガイドし、宿主細胞のDNAを修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、前記死滅させるか又は阻害することを実行する、抗宿主細胞のcrRNA又はgRNAをコードする、請求項35又は36に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
バクテリオファージ(ファージ)は、バクテリアに影響を及ぼすウイルスの門であり、動物及び植物ウイルスとは異なる。ファージは、「溶菌性」ライフサイクル、潜在的に溶菌性になり得る「溶原性」ライフサイクル、又は「非溶菌性」ライフサイクルのいずれかを有し得る。溶菌性サイクルによって複製するファージは、それらのライフサイクルの正常な部分として、宿主標的バクテリア細胞の溶菌を引き起こす。溶原性サイクルによって複製するファージはテンペレートファージと呼ばれ、溶菌性ライフサイクルによって複製して宿主バクテリアの溶菌を引き起こすことができるか、又はそれらのDNAを宿主バクテリアDNAへと組み込み、非感染性プロファージとなることができるかのいずれかである。バクテリオファージは、それらの特定のバクテリア宿主に感染してその中で増殖するだけのバクテリアウイルスである。具体的には、宿主は、株レベル、種レベル、又はより稀には属レベルで一般的に見出される。具体的には、このことにより、ファージを使用して危険な細菌の指向標的化が可能となる。バクテリオファージの宿主細胞への吸着は、一部の場合を除いたすべての場合に、感染プロセスの開始にとっての必須条件である。
【０００２】
ファージと細菌の相互作用の特異性と共に、細菌に感染して死滅させるファージの天然の能力は、ファージ療法の概念の構築の土台となる基礎現象である。したがって、溶菌性ライフサイクルを有するファージは、ファージ療法に対する好適な候補である。近年、食品生産におけるファージの使用は、特に、生鮮食品及びインスタント食品の安全性を増進する、望ましくない病原体の生物的防除のための新規方法として、食品産業に関する選択肢となっている。
【０００３】
国際特許出願WO00/69269には、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)の耐性菌と同様に、バンコマイシン感受性によって引き起こされる感染を処置するためのある特定のファージの使用が開示され、国際特許出願WO01/93904には、クロストリジウム属(Clostridium)の種に関連する消化器疾患を予防又は処置するための、単独での又は他の抗微生物的手段と組み合わせた、バクテリオファージの使用が開示されている。
【０００４】
米国特許出願公開第2001/0026795号には、宿主防御システムによる不活性化を遅延させ、よって、ファージが細菌を死滅させるのに活性である期間を増加させるよう修飾されたバクテリオファージを生産するための方法が記載されている。
【０００５】
米国特許出願公開第2002/0001590号には、多剤耐性細菌、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に対するファージ療法の使用が開示され、国際特許出願WO02/07742には、複数の宿主範囲を有するバクテリオファージの開発が開示されている。
【０００６】
例えば、米国特許出願公開第2002/0044922号;同第2002/0058027号及び国際特許出願WO01/93904には、特定の細菌感染疾患の処置に対するファージ療法の使用が開示されている。
【０００７】
しかしながら、治療的使用のためのバクテリオファージ組成物の商業規模生産は、依然として限定されている。現在の技術では、ファージ組成物の力価は低く、通常、実験室規模で109〜1011pfu/ml、及び商業規模で107〜109の範囲であるが、一方、治療用途に典型的に必要とされる力価は、依然として限定されている。現在の技術では、ファージ組成物の力価は低く、通常、実験室規模で109〜1011pfu/ml、及び商業規模で107〜109の範囲であるが、一方、ファージ療法に典型的に必要とされる力価は、1012pfu/mlである。更に、望ましい力価に到達するために、非常に大きな体積の液体が必要とされる。
【０００８】
US20160333348には、ベクターとしてファージを使用する、宿主標的細菌細胞に送達されるCRISPR/Casシステムの使用が記載されている。原則として、ファージは、標準的細菌培養技法及び機器を使用して、同種の宿主細胞の容積で増殖することができる。しかしながら、標的宿主細胞におけるこのようなファージ又は溶菌性ファージの増殖は、溶菌による及び/若しくは宿主DNAのCRISPR/Cas標的化による又はファージ核酸によってコードされ宿主細胞において活性である任意の他の抗宿主機構若しくは因子による、常在性ファージによる宿主細胞の死滅によって妨害される場合がある。
【０００９】
産業用途でのバクテリオファージの使用が増大しているため、同定されたバクテリオファージの商業量に対する需要が存在する。したがって、良好な収率力価をもたらし、及び/又は製造体積を低減するファージの生産のための方法に対する需要が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際特許出願WO00/69269
【特許文献２】国際特許出願WO01/93904
【特許文献３】米国特許出願公開第2001/0026795号
【特許文献４】米国特許出願公開第2002/0001590号
【特許文献５】国際特許出願WO02/07742
【特許文献６】米国特許出願公開第2002/0044922号
【特許文献７】米国特許出願公開第2002/0058027号
【特許文献８】US20160333348
【特許文献９】WO2016205276
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hillら  J Bacteriol. 173(14):4363〜70頁(1991)
【非特許文献２】O'Loughlinら  PLoS One. 2015:e0118533頁
【非特許文献３】Roberts、R. J.ら  Nucleic Acids Res. 31、1805〜1812頁(2003)
【非特許文献４】Lobockaら  J. Bacteriol. 186、7032〜7068頁(2004)
【非特許文献５】Iidaら  Virology. 1 57(1):156〜66頁(1987)
【非特許文献６】McGrathら  Applied Environmental Microbiology. 65:1891〜1899頁(1999)
【非特許文献７】Robertsら  Nucleic Acids Res 43:D298〜D299頁。http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkul046
【非特許文献８】K. Terpe Appl. Microbiol、Biotechnol. 72:211〜222頁(2006)
【非特許文献９】Hannigら  Trends in Biotechnology 16:54〜60頁(1998)
【非特許文献１０】Srivastava Protein Expr Purif 40:221〜229頁(2005)
【非特許文献１１】Levskayaら  2005. Nature 438:441〜442頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ファージを増殖するためにプロパゲーター細胞を提供することによる解決策を提供する。この目的のために、本発明は、以下のものを提供する:
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第1の構成において
ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
【００１４】
第2の構成において
ファージを増殖させるための細胞(プロパゲーター細胞)であって、ファージは、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、プロパゲーター細胞が、その表面にレセプターを含み、第2の種又は株のものであり、第2の種又は株は、第1の種又は株と異なり、それによって、プロパゲーター細胞が、それにおけるファージの増殖のために前記第1の型のファージによる感染を受けることが可能である、プロパゲーター細胞。
【００１５】
第3の構成において
任意選択で、プロパゲーター細胞を培養し、前記第1の型のファージを増殖させるための発酵容器に含まれる、本発明によるプロパゲーター細胞の集団。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細菌生産株(1)を遺伝子操作して、ヘルパーファージによって認識されるレセプターを発現させ(2)(系列X)、一方、レセプターを含有しない細胞(系列Y)を対照とした。次いで、両方の系列をCGVで形質転換し、ヘルパーファージに感染させて、CGC-PLPを生成した(3)。ヘルパーファージレセプターを保有する系列Xにおいてのみ、CGV-PLPが生成され(4)、これを使用して、ファージレセプターを発現する標的細胞集団にDNAを送達することができる。
【図２】共に、CGV-PLPによって認識されるレセプターを発現する、標的細胞ATCC43888(ATCC社から得られた)又はEMG-2(Coli Genetic Stock Center社, CGSCから得られた)へのCGVの送達を示すグラフである。感染のために使用した溶菌液は、ヘルパーファージに対するレセプターを保有する産生株(塗りつぶしバー)又はレセプターを有さない対照株(白抜きバー)に関して生成した。ヘルパーファージが感染することができ、CGV-PLPを生成することができる、レセプターを有する産生株のみが、標的細胞集団に感染することが可能であるCGV-PLP溶菌液を生成することができた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明により、例えば、大規模に培養することができ、有用なファージ集団を大規模(例えば、商業規模)に増殖させ、成長させるのに有用な細胞の使用において、細菌細胞によって発現されるレセプターを人工的に変更すること(又は天然に発現したレセプターのプロファイルに従って細胞を選択すること)の利点が認識される。例えば、このようなファージは、US20160333348に記載されているHM-crRNA又はgRNAをコードする場合があり、このファージは、ヒト、動物、植物、食糧、飲料、化粧品、環境(例えば、土壌、水路、貯水器又は原油採収環境)、例えば、US20160333348(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているこれらの適用に含まれる宿主細菌細胞を死滅させるのに有用である。
【００１８】
タンパク質性レセプターは、主に、外膜タンパク質であり;糖部分は、細胞壁、ペリクル、タイコ酸及びLTAを構成するものを含む。例えば、本発明のレセプターは、これらのいずれかから選択される。
【００１９】
バクテリオファージの吸着によって感染プロセスが開始される。バクテリオファージ(ファージ)の結合タンパク質と細菌細胞表面のレセプターの間の一連の相互作用によって、ウイルスは、潜在的に感受性の宿主を認識、次いで、DNAが放出されるようにウイルス自身を位置させる。よって、ファージの吸着は、感染プロセスにおける極めて重要な工程であるだけでなく、ウイルスと宿主の間の接触の開始点を表し、宿主範囲を特異的に定めるものでもある。
【００２０】
バクテリオファージの吸着は、一般的に、3つの工程:最初の接触、可逆的結合及び不可逆的付着からなる(Duckworth 1987)。第1の工程は、ブラウン運動、分散、拡散又は流動によって引き起こされるファージと宿主の間のランダムな衝突に関与する(Kokjohn及びMiller 1992)。可逆的工程では、細菌表面の構成成分への結合は最終的なものではなく、ファージは宿主から脱着することができる。溶出後のファージの脱離を実験観察することによりGaren及びPuck(1951)により最初に同定されたこのプロセスは、ファージが特異的レセプターを探索するため、ファージを細胞表面の近くに保つ役割を果たすことができる(Kokjohn及びMiller 1992)。細菌のレセプターとファージの結合ドメインの間の特異的接続は、酵素的切断によって媒介される場合もある。この工程により、遺伝子材料の宿主への挿入を可能とする(更に詳細には、ファージゲノム放出の機構に関する、Molineux及びPanja(2013)による概説を参照のこと)他のファージ分子における立体構造再編成が誘発される。
【００２１】
多数のレビュー研究によって、バクテリオファージが吸着の間に標的とする広い範囲の宿主関連レセプター(タンパク質、糖及び細胞表面構造)が強調されてきた(Lindberg 1977;Schwartz 1980;Wright, McConnell及びKanegasaki 1980;Heller 1992;Frost 1993;Henning及びHashemolhosseini 1994;Vingaら  2006;Rakhubaら  2010;Chaturongakul及びOunjai 2014)。バクテリオファージによって認識される宿主細胞レセプターの性質及び位置は、ファージ及び宿主に応じて非常に様々である。これらは、ペプチド配列から多糖部分までの範囲に及ぶ。実際に、バクテリオファージは、グラム陽性(Xiaら  2011)とグラム陰性細菌(Martiら  2013)の両方の細胞壁、細菌の莢膜又は粘液層(Fehmelら  1975)、及び付属器官[例えば、線毛(Guerrero-Ferreiraら  2011)及び鞭毛(Shinら  2012)]に位置するレセプターに結合することが示されている。関与するレセプター及び構造におけるこの多様性は、これらのカウンターパートによって採用される進化戦略を克服するためにファージ及び宿主によって展開される機構の多様さに対する証しである。この惑星の様々な環境に生息すると推定されるファージの多様性及び驚異的な量を検討する非常に多くの可能性に遭遇することは意外なことではない(Clokieら  2011)。それにも関わらず、いずれの場合も、吸着には、細菌細胞壁の構成要素又は突起構造のいずれかが関与することがこれまで示されてきた。したがって、ある実施形態では、本発明におけるレセプターは、この段落又はこの開示の他の箇所で言及した任意のこのようなレセプターであり得る。
【００２２】
任意選択で、レセプターは、リポ多糖(LPS)、ヘプトース部分、宿主のグルコシル化細胞壁タイコ酸(WTA)、YueB、又はファージのテールファイバータンパク質若しくはファージのgp21によって認識されるレセプターを含む。
【００２３】
グラム陽性細菌細胞壁におけるレセプター
ペプチドグリカン、又はムレインは、細菌細胞壁の重要な構成成分であり、バクテリオファージの吸着に関与する場合が多い。これは、複数ユニットのアミノ酸及び糖誘導体  - N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルムラミン酸から構成されるポリマーである。これらの糖構成要素は、グリコシド結合を介して接続され、アミノ酸の架橋を介して一緒に接合されるグリカンテトラペプチドシートを形成する。架橋は、ジアミノピメリン酸(アミノ酸類似体)とD-アラニンの間のペプチド結合を介して、又は短鎖ペプチドインターブリッジを介して生じる。これらのペプチドインターブリッジは、グラム陽性細菌においてより多数であり、それらの特徴的なより厚みのある細胞壁をもたらす。
【００２４】
ファージの吸着に関与し得るグラム陽性細菌細胞壁の別の主要構成成分は、グリセロールホスフェート又はリビトールホスフェート及びアミノ酸から構成される多糖であるタイコ酸である。これらは、ペプチドグリカンのムラミン酸に結合される。タイコ酸が細胞膜の脂質に結合されると、これらはリポタイコ酸(LTA)と称される。細菌細胞壁の組成についてのさらなる詳細は、Tortora, Funke及びCase(2007)、Willey, Sherwood及びWoolverton(2008)、Pommerville(2010)及びMadiganら(2012)において見い出すことができる。
【００２５】
これまでに同定されたレセプターの大部分は、ペプチドグリカン又はタイコ酸の構造のいずれかに関連する(Table 1(表1))。Table 1(表1)で報告したグラム陽性細菌を標的とする30種のファージのうち、10種のみが吸着に他の構造を利用する。これらの10種のファージの中で9種が、可逆的結合のために、タイコ酸(ファージSPP1)又はペプチドグリカン(ファージ5、13、c2、h、ml3、kh、L及びp2)のいずれかの残基と相互作用する。このことは、これらの構造が、ファージのグラム陽性細菌への吸着において果たし得る重要な役割を強調する。
【００２６】
任意選択で、本発明のレセプターは、ペプチドグリカン、ムレイン、タイコ酸又はリポタイコ酸(LTA)である。任意選択で、ファージはTable 1(表1)に列挙したファミリーのファージである(任意選択で、宿主はTable 1(表1)に列挙したファージに対する宿主であり、及び/又はレセプターはTable 1(表1)に列挙したファージに対するレセプターである)。ある実施形態では、宿主及び第2の細胞は、グラム陽性細菌である。任意選択で、宿主及び/又は第2の細胞は、Table 1(表1)に列挙した種又は株のものである(宿主と第2の細胞の種又は株が異なる場合)。好ましくは、宿主がグラム陽性細菌である場合、レセプターはペプチドグリカンである。或いは、好ましくは、宿主がグラム陽性細菌である場合、レセプターはタイコ酸である。
【００２７】
【表１Ａ】
2020529853.tif 000002
【００２８】
【表１Ｂ】
2020529853.tif 000003
【００２９】
【表１Ｃ】
2020529853.tif 000004
【００３０】
【表１Ｄ】
2020529853.tif 000005
【００３１】
【表１Ｅ】
2020529853.tif 000006
【００３２】
グラム陰性細菌細胞壁におけるレセプター
グラム陰性細菌では、ペプチドグリカン層が比較的薄く、細胞壁の主要な構成成分である外膜の内部に位置する。これらの二層は、ブラウンのリポタンパク質によって接続される。外膜は、タンパク質、多糖及び脂質(後者の2つの分子はLPS層に由来する)で装飾された脂質二重層から構成される精巧な構造である。LPSは、3つの部分:脂質A、コア多糖及びO-多糖からなる複合体である。脂質Aは、一般的に、グルコサミンホスフェートジサッカライドに付着した脂肪酸から構成される。コア多糖は、ケトデオキシオクトネートリンカーを介して脂質Aに接続される。コア多糖及びO-多糖(O-鎖又はO-抗原)は、外膜に対して外部に広がる糖残基のいくつかのユニットを含有する。LPSの3つの構成成分のすべてを含有する細胞はスムース(S)型と命名され、O-多糖部分が欠如するものはラフ(R)型として識別される。一般的に、O-抗原を構成する糖類は非常に多様であり、コア多糖のものは、種の間でより保存される。このため、S型の株にのみ特異的であるファージは、O-多糖を標的とする傾向があり、よって、一般的に、R型の細胞に吸着することができるものと比較すると、より狭い宿主範囲を有する(Rakhubaら  2010)。
【００３３】
Table 2(表2)(a)は、ファージレセプター結合タンパク質(RBP)と相互作用する細胞壁に位置するグラム陰性細菌のレセプターを収集する。興味深いことに、大腸菌ファージでは、タンパク質性又は多糖性レセプターに対する優先性が存在せず:一部のファージは細胞壁タンパク質に吸着し、一部は糖部分に吸着し、他のものは吸着のために両方の構造を必要とする。サルモネラ(Salmonella)ファージの場合には、状況はそれほど相違せず:一部はタンパク質を使用し、一部は糖部分を使用し、一部は両方の型のレセプターを使用する。一方、シュードモナス(Pseudomonas)ファージは、通常、多糖レセプター上に吸着する。このような小さなサンプルサイズからは、決定的な結論を導きだすことはできないが、シュードモナスは、2つのLPS部分、すなわち、Aバンドと称される短鎖LPS及びより長いBバンドLPSを有し得ることが注目されるべきである(Beveridge及びGraham 1991)。
【００３４】
任意選択で、レセプターは、宿主細胞壁タンパク質である。任意選択で、レセプターは、糖類である。任意選択で、レセプターは、O-抗原、LPS脂質A又はLPSコア多糖である。ある例では、レセプターは、スムースLPS又はラフLPSである。任意選択で、宿主細胞は、S-型の細菌であり、レセプターは、宿主のO-抗原を含む。任意選択で、宿主細胞は、R-型の細菌であり、レセプターは、宿主のLPS脂質Aを含む。
【００３５】
任意選択で、レセプターは、宿主細胞壁タンパク質である。任意選択で、レセプターは、糖類である。任意選択で、レセプターは、O-抗原、LPS脂質A又はLPSコア多糖である。ある例では、レセプターは、スムースLPS又はラフLPSである。任意選択で、宿主細胞は、S-型の細菌であり、レセプターは、宿主のO-抗原を含む。任意選択で、宿主細胞は、R-型の細菌であり、レセプターは、宿主のLPS脂質Aを含む。
【００３６】
ある例では、宿主は、大腸菌(E coli)であり、ファージは、大腸菌ファージであり、レセプターは、多糖レセプター及び/又は宿主細胞壁タンパク質である。ある例では、第2の細胞は、大腸菌の多糖レセプター及び/又は大腸菌の細胞壁タンパク質レセプターを発現するように遺伝子操作されており、任意選択で、大腸菌は、宿主細胞と同じ株のものである。
【００３７】
ある例では、宿主は、サルモネラ属(Salmonella)であり、レセプターは、多糖レセプター及び/又は宿主細胞壁タンパク質である。ある例では、第2の細胞は、サルモネラ属の多糖レセプター及び/又はサルモネラ属の細胞壁タンパク質レセプターを発現するように遺伝子操作されており、任意選択で、サルモネラ属は、宿主細胞と同じ株のものである。
【００３８】
ある例では、宿主は、シュードモナス菌(Pseudomonas)であり、レセプターは、多糖レセプターである。ある例では、第2の細胞は、シュードモナス菌の多糖レセプターを発現するように遺伝子操作されており、任意選択で、シュードモナス菌は、宿主細胞と同じ株のものである。
【００３９】
任意選択で、ファージは、Table 2(表2)に列挙したファミリーのファージである(任意選択で、宿主は、Table 2(表2)に列挙したファミリーに対する宿主であり、及び/又はレセプターは、Table 2(表2)に列挙したファージに対するレセプターである)。任意選択で、ファージは、Table 2(表2)に列挙したファージである(任意選択で、宿主は、Table 2(表2)に列挙したファミリーに対する宿主であり、及び/又はレセプターは、Table 2(表2)に列挙したファージに対するレセプターである)。
【００４０】
ある実施形態では、宿主細胞及び第2の細胞は、グラム陰性細胞である。好ましくは、第2の細胞は、大腸菌の細胞である。任意選択で、宿主細胞及び/又は第2の細胞は、Table 2(表2)に列挙した種又は株のものである(宿主細胞及び第2の細胞の種又は株は異なる)。
【００４１】
ある例では、宿主は、大腸菌であり、ファージは、大腸菌ファージであり、レセプターは、多糖レセプターレセプター及び/又は宿主細胞壁タンパク質レセプターである。ある例では、第2の細胞は、大腸菌の多糖レセプター及び/又は大腸菌の細胞壁タンパク質レセプターを発現するように遺伝子操作されており、任意選択で、大腸菌は、宿主細胞と同じ株のものである。
【００４２】
ある例では、宿主は、サルモネラ属であり、レセプターは、多糖レセプター及び/又は宿主細胞壁タンパク質レセプターである。ある例では、第2の細胞は、サルモネラ属の多糖レセプター及び/又はサルモネラ属の細胞壁タンパク質レセプターを発現するように遺伝子操作されており、任意選択で、サルモネラ属は、宿主細胞と同じ株のものである。
【００４３】
ある例では、宿主は、シュードモナス菌であり、レセプターは、多糖レセプターである。ある例では、第2の細胞は、シュードモナス菌の多糖レセプターを発現するように遺伝子操作されており、任意選択で、シュードモナス菌は、宿主細胞と同じ株のものである。
【００４４】
任意選択で、ファージは、Table 2(表2)に列挙したファミリーのファージである(任意選択で、宿主は、Table 2(表2)に列挙したファミリーに対する宿主であり、及び/又はレセプターは、Table 2(表2)に列挙したファージに対するレセプターである)。任意選択で、ファージは、Table 2(表2)に列挙したファージである(任意選択で、宿主は、Table 2(表2)に列挙したファミリーに対する宿主であり、及び/又はレセプターは、Table 2(表2)に列挙したファージに対するレセプターである)。
【００４５】
ある実施形態では、宿主細胞及び第2の細胞は、グラム陰性細胞である。好ましくは、第2の細胞は、大腸菌の細胞である。任意選択で、宿主細胞及び/又は第2の細胞は、Table 2(表2)に列挙した種又は株のものである(宿主細胞及び第2の細胞の種又は株は異なる)。
【００４６】
Table 2(表2)(b)は、ファージが細菌表面へと吸着するだけでなく、O-鎖構造における糖部分を酵素的に分解する事例を報告する。これらのファージのすべてが、ポドウイルス科(Podoviridae)のファミリーに属することが留意されるべきである。
【００４７】
【表２Ａ】
2020529853.tif 000007
【００４８】
【表２Ｂ】
2020529853.tif 000008
【００４９】
【表２Ｃ】
2020529853.tif 000009
【００５０】
【表２Ｄ】
2020529853.tif 000010
【００５１】
【表２Ｅ】
2020529853.tif 000011
【００５２】
【表２Ｆ】
2020529853.tif 000012
【００５３】
【表２Ｇ】
2020529853.tif 000013
【００５４】
【表２Ｈ】
2020529853.tif 000014
【００５５】
【表２Ｉ】
2020529853.tif 000015
【００５６】
【表２Ｊ】
2020529853.tif 000016
【００５７】
【表２Ｋ】
2020529853.tif 000017
【００５８】
【表２Ｌ】
2020529853.tif 000018
【００５９】
【表２Ｍ】
2020529853.tif 000019
【００６０】
【表２Ｎ】
2020529853.tif 000020
【００６１】
グラム陰性細菌の他の構造におけるレセプター
この項では、ファージのレセプターとしても作用する、細胞壁部分以外の細菌構造について議論する。これらには、鞭毛、線毛及び莢膜のような構造が含まれる。これらは、グラム株の両方に由来する種において見られ得る。例えば、Table 3(表3)を参照のこと。
【００６２】
任意選択で、本発明のレセプターは、鞭毛、線毛又は莢膜構成成分(例えば、Table 3(表3)に列挙した種における又は列挙した種と異なる種のものである宿主において見られるような構成成分)。任意選択で、ファージは、Table 3(表3)に列挙したファミリーのファージである(任意選択で、宿主は、Table 3(表3)に列挙したファージに対する宿主であり、及び/又はレセプターは、Table 3(表3)に列挙したファージに対するレセプターである)。任意選択で、ファージは、Table 3(表3)に列挙したファージである(任意選択で、宿主は、Table 3(表3)に列挙したファージに対する宿主であり、及び/又はレセプターは、Table 3(表3)に列挙したファージに対するレセプターである)。
【００６３】
鞭毛は、細胞に運動性を与える、長くて薄いヘリカル構造である。これらは、基底小体、鞭毛フック及びフラジェリンタンパク質から構成される鞭毛フィラメントから構成される(Willey、Sherwood及びWoolverton 2008)。Table 3(表3)(a)は、鞭毛のタンパク質に付着するファージについて報告する。フィラメント構造へのファージの接着は、一般的に可逆的であり、鞭毛のらせん運動によって、ファージは、細菌細胞壁に到達するまでその表面に沿って移動する。次いで、鞭毛の基部付近の、細菌の表面に位置するレセプター上で、不可逆的吸着が起こる(Schade、Adler及びRis 1967;Lindberg 1973;Guerrero-Ferreiraら  2011)。興味深いことに、一部のファージ(φCbK及びφCb13)は、宿主の鞭毛への可逆的結合を担う、ファージのカプシドから突出するフィラメントを含有することが観察され;不可逆的吸着は、ファージのテールが細胞極における線毛の先端と相互作用する場合にのみ起こる(Guerrero-Ferreiraら2011)。これらのファージでは、ファージが鞭毛と相互作用するとしても、不可逆的吸着は線毛において起こるため、これらは、線毛及び交配対形成構造と相互作用するファージに焦点を当てて、Table 3(表3)(b)において報告された。
【００６４】
線毛は、細菌接合に使用される桿状の繊維状付属器官である(Lindberg 1973)。これらは、ドナー細胞から伸長し、受容細胞の細胞壁におけるレセプターに付着する。線毛の脱重合によって収縮が起こり、これは、両細胞を互いにより接近させる。更に、細胞の接着は、細胞表面における結合タンパク質を介して達成され;遺伝子材料はこの接合点から移入する(Madiganら  2012)。線毛構造への吸着は、これまで、カウドウイルス目(Caudovirales)と異なる目に属するファージに関連してきた(Table 3(表3)b)。実際に、Frost(1993)によれば、シストウイルス科(Cystoviridae)及びイノウイルス科(Inoviridae)のファミリーは、線毛構造へと吸着するファージの大多数を構成する。興味深いことに、ファージは、線毛のある特定の部分に対して選択的であり得る。吸着が線毛の先端でのみ起こるF型のファージの場合がそうである(Click及びWebster 1998)。φ6等の他のファージでは、付着は、構造の側面(シャフト)で起こる(Daugelaviciusら  2005)。
【００６５】
【表３Ａ】
2020529853.tif 000021
【００６６】
【表３Ｂ】
2020529853.tif 000022
【００６７】
【表３Ｃ】
2020529853.tif 000023
【００６８】
【表３Ｄ】
2020529853.tif 000024
【００６９】
莢膜は、細胞壁から放射状に伸長する可撓性のセメント物質である。これらは、細菌と基質の間の及び/又は細胞と基質の間の結合剤として作用する(Beveridge及びGraham 1991)。粘液層は、莢膜と類似するが、より容易に変形する。いずれも細菌によって放出される粘着物質から構成され、これらに共通する構成成分は多糖又はタンパク質である(Madiganら  2012)。莢膜又は粘液層へのファージの吸着は、層を構成する菌体外多糖の酵素的切断によって媒介される。層の加水分解は可逆的工程であるが、一方、不可逆的結合は、ファージの細胞壁におけるレセプターとの結合によって達成される(Rakhubaら  2010)。Table 3(表3)(c)に見ることができるように、菌体外多糖を認識するRBPを有することが同定されたいくつかのファージは、ほとんど、ポドウイルス科形態学のものである。
【００７０】
ある例では、宿主はサルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌(S enterica Serovar Typhimurium))であり、レセプターは、鞭毛、ビタミンB12取り込み外膜タンパク質、BtuB及びリポ多糖関連O-抗原から選択される。ある例では、レセプターは、鞭毛又はBtuBであり、ファージは、シホウイルス科(Siphoviridae)のファージである。ある例では、レセプターは、LPSのO-抗原であり、ファージは、ポドウイルス科のファージである。任意選択で、レセプターは、FliC宿主のレセプター又はFljBレセプターである。
【００７１】
任意選択で、宿主は、サルモネラ菌(S enterica)又は緑膿菌(P aeruginosa)である。任意選択で、レセプターは、Table 4(表4)に列挙したような宿主のレセプターである。
【００７２】
【表４】
2020529853.tif 000025
【００７３】
サルモネラ属O66のO-抗原構造は確立されており、これは、1つの連結(最も可能性が高いのは、O-ユニット間の連結)とO-アセチル化においてのみ、公知の大腸菌O166のO-抗原構造と異なることが報告されている。サルモネラ属O66と大腸菌O166のO-抗原遺伝子クラスターは、唯一サルモネラ属O66ではwzy遺伝子が非コード領域によって置き換えられていることを除いて、同様の構成を有することが見い出された。大腸菌O166のwzy遺伝子の機能は、欠失及びトランス補完突然変異体の構築及び解析によって確認された。サルモネラ血清群A、B及びD1において以前に報告されているように、O-抗原遺伝子クラスターの外側に位置する機能的wzy遺伝子は、サルモネラ属O66のO-抗原生合成に関与することが提案される。サルモネラ属O66と大腸菌O166のO-抗原遺伝子クラスター間で対応する遺伝子に対する配列相同性は、64から70%であり、これらが共通の祖先に由来することが示される。種の多様化後に、サルモネラ属O66が、O-抗原遺伝子クラスターに位置するwzy遺伝子の不活性化と、いずれもO-抗原遺伝子クラスターの外側に存在する2つの新たな遺伝子(wzy遺伝子とO-アセチル修飾のためのプロファージ遺伝子)の獲得によって、その特異的O-抗原形態を得たようである。
【００７４】
ある例では、第2の細胞は、発現可能な大腸菌(例えば、大腸菌O166)のwzy遺伝子を含むように遺伝子操作されている。ある例では、第2の細胞は、発現可能な大腸菌(例えば、大腸菌O166)のwzy遺伝子を含まない。任意選択で、宿主細胞は、大腸菌又はサルモネラ属(例えば、サルモネラ属O66)の細胞である。
【００７５】
ある例では、ファージ又は粒子は、ファージゲノム又はファージミドを含み、例えば、ゲノム又はファージミドは、目的の1つ又は複数のタンパク質又は核酸をコードするDNA、例えば、宿主細胞を死滅させるために、宿主細胞ゲノム又は抗生物質を標的とするためのcrRNAを含む。
【００７６】
代替例では、細菌の代わりに、宿主細胞及び第2の細胞(プロパゲーター細胞)は古細菌細胞であり、代わりに、細菌に関連する本明細書の開示は、古細菌に対する必要な変更を加えて読むことができる。
【００７７】
細菌の標的宿主の株又は種は、侵入する核酸を認識及び切断又はそれ以外の場合は破壊若しくは分解することができる、制限エンドヌクレアーゼを含むR-M等の、制限-修飾システム(R-Mシステム)を含んでもよい。宿主DNAは、宿主DNAをメチル化し、それをR-Mシステムから保護するメチルトランスフェラーゼの作用によって保護される。したがって、R-Mシステムを含まないか又はそのゲノムが宿主細胞によってコードされる1つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を欠く第2の細菌細胞(プロパゲーター細胞)を提供することが望ましい場合がある。更に又は代わりに、第2の細胞は、宿主細胞によってコードされる1つ又は複数のメチルトランスフェラーゼ、任意選択で、宿主細胞によってコードされるすべてのメチルトランスフェラーゼのうちのすべて又は実質的にすべて(例えば、少なくとも50、60、70 80又は90%)を含む。任意選択で、第2の細胞は、宿主細胞によってコードされる1、2、3 4、5、6、7、8、9又は10種(又は少なくとも1、2、3 4、5、6、7、8、9又は10種)のメチルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。
【００７８】
有利には、特異的な細菌宿主集団を標的とするファージ又は形質導入粒子を産生するために、標的宿主細胞に関連する細菌株においてファージ又は粒子を生産し、例えば、宿主細胞の防御機構、例えば、R-Mシステム又は制限エンドヌクレアーゼ作用を回避することができるファージ又は粒子の核酸(例えば、DNA)を生産するのが有益である場合がある。したがって、任意選択で、宿主細胞及び第2の細胞(プロパゲーター細胞)は、同じ種(又は第2の細胞が宿主細胞のゲノムに見られない1つ又は複数の遺伝子修飾を含むことを除いて同じ種の株;このような修飾は、1つ又は複数のプロトスペーサー配列の欠失であり得、例えば、宿主細胞はこのような配列を含み、ファージ又は粒子は宿主細胞における配列を認識するcrRNAを発現してCasをガイドしてプロトスペーサー配列を修飾する)。例えば、次に、ファージ又は粒子が標的宿主細胞に感染すると(後者は第2の細胞と共通のメチルトランスフェラーゼも含む)、第2の細菌のメチルトランスフェラーゼによるファージ又は粒子のDNAの修飾は、制限修飾に対してDNAを遮蔽するのに有用であり得る。宿主細胞にも呈される表面レセプターを呈する本発明の通りの第2の細胞を採用する(又は選択する)ことによって、本発明は、次に、標的宿主細菌による制限修飾に対する有益なDNA修飾を呈することができる株において、ファージ又は粒子の生産を可能とする。有益には、標的宿主細菌において、ファージ又は粒子によってコードされるcrRNAの標的とされるプロトスペーサー配列は、第2の細胞のゲノムにおいて欠失するか又は天然には存在しない場合があり、その結果、第2の細胞のゲノムのCasにより媒介される切断は、ファージ又は粒子の産生の間には起こらない。
【００７９】
異種メチルトランスフェラーゼ(MTase)を使用して、産生細菌(本明細書のプロパゲーター細菌又は第2の細胞)において、標的宿主細菌のものと同様のメチル化パターンを与えることができる。例えば、本発明において使用するための、所望のMTaseを含む生産株のゲノムを提供する方法の例証を与えるために、参照により本明細書に組み込まれるWO2016205276を参照のこと。細菌及び古細菌では、一部のDNAメチルトランスフェラーゼは、修飾の位置及びそれらが触媒する反応の種類に応じて、3つの別個のクラスに分離することができる。N6-メチルアデニン(m6A)とN4-メチルシトシン(m4C)は、それぞれ、アデニンとシトシンのアミノ部分のメチル化から得られ、一方、5-メチルシトシン(m5C)は、シトシンのC5位におけるメチル化の結果である。
【００８０】
本発明に関して有用なDNA MTaseの非限定例は、ラクトコッカスにおけるII型のR-Mシステムに対して保護するために導入することができるファージΦ50由来のLlaPIを含む(Hillら  J Bacteriol. 173(14):4363〜70頁(1991))。任意選択で、産生細菌は、例えば、N6-メチルアデニン(m6A)を生成するために、アデニンのメチル化を触媒する1つ又は複数のDNA修飾酵素をコード及び発現する。任意選択で、産生細菌は、例えば、N4-メチルシトシン(m4C)又は5-メチルシトシン(m5C)を生成するために、シトシンのメチル化を触媒する1つ又は複数のDNA修飾酵素をコード及び発現する。任意選択で、産生細菌は、アデニン残基のアセトイミド化を触媒する1つ又は複数のDNA修飾酵素をコード及び発現する。一部のR-Mシステムは、アデニンのメチル化に対して感受性である。ファージ又は粒子のDNAにおけるアデニン残基をアセトイミド化するポリペプチドは、このようなシステムに対してDNAを保護することになる。産生宿主細菌におけるアデニン残基をアセトイミド化することができるポリペプチドの非限定例として、アデニン残基をN(6)-メチルアデニンに変換し、それによって、アデニン感受性制限酵素に対して保護する、ファージMu及びMu様プロファージ配列由来のmom遺伝子が挙げられる(インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のRd(FluMu)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)A型株Z2491(Pnmel)及びコッホ・ウィークス菌(H.influenzae biotype aegyptius)ATCC 111 16を参照のこと)。個々のメチルトランスフェラーゼによって与えられるメチル化のパターンは、Pacbio SMRTシークエンシング等の確立したDNAシークエンシング技術(O'Loughlinら  PLoS One. 2015:e0118533)を使用して評価することができる。一旦生じると、産生株を使用して、標的株へのDNA送達のためのバクテリオファージ粒子を産生することができる。
【００８１】
細菌の「制限-修飾システム」(R-Mシステム)は、(1)特定の配列においてDNAをメチル化するメチルトランスフェラーゼ及び/又は(2)メチル化されていない(I、II、及びIII型)又はメチル化した(IV型)のDNAを切断する制限酵素を含む。R-Mシステムは、外来のメチル化パターンを有するDNAが、R-Mシステムの制限酵素によって複数の位置で切断される細菌の防御システムを構成する。ほとんどの細菌は、1つを超えるR-Mシステムを含む。Roberts、R. J.ら  Nucleic Acids Res. 31、1805〜1812頁(2003)。I型のメチルトランスフェラーゼは、機能性に関して一致する特異性タンパク質の存在を必要とする。II型及びIII型のメチルトランスフェラーゼは、機能するいずれの追加のタンパク質も必要としない。よって、この発明に関して有用なメチルトランスフェラーゼ及び制限酵素(修飾若しくは阻害に関する標的として、又は産生細菌において発現され、それによって産生細菌のR-Mシステムを修飾する異種ポリペプチドとしてのいずれか)は、細菌の制限-修飾システム(例えば、I、II、III、又はIV型)に含まれる任意のメチルトランスフェラーゼ又は制限酵素を含むことができる。よって、ある例では、産生細菌(第2の細胞又はプロパゲーター細胞)のゲノムは、宿主細菌によってもコードされるI型のメチルトランスフェラーゼをコードする。更に又は代わりに、ある例では、産生細菌(第2の細胞又はプロパゲーター細胞)のゲノムは、宿主細菌によってもコードされるII型のメチルトランスフェラーゼをコードする。更に又は代わりに、ある例では、産生細菌(第2の細胞又はプロパゲーター細胞)のゲノムは、宿主細菌によってもコードされるIII型のメチルトランスフェラーゼをコードする。更に又は代わりに、ある例では、産生細菌(第2の細胞又はプロパゲーター細胞)のゲノムは、宿主細菌によってもコードされるIV型のメチルトランスフェラーゼをコードする。
【００８２】
ある例では、産生細菌の内因性制限修飾システムの酵素をコードする2つ又はそれを超える(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の)核酸配列は、活性において破壊又は変更される(例えば、活性において低減又は排除される)。
【００８３】
産生細菌(すなわち、第2の細胞又はプロパゲーター細胞)は、グラム陽性又はグラム陰性の細菌であり得る。よって、例えば、産生細菌は、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enteria)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、リステリア菌(Listeria)、カンピロバクター属(Campylobacter)又は黄色ブドウ球菌細菌である。ある例では、産生細菌は、大腸菌の株MG1655、Nissle、BW25113、BL21、TOP10、又はMG1655  Δdam  Δdcm  ΔhsdRMSである。
【００８４】
内因性R-Mシステムの酵素活性は、当技術分野で周知の方法又はポリペプチドの機能及び活性を破壊するために後に開発された方法を使用して破壊され得る。このような方法として、これらに限定されないが、点突然変異(例えば、ミスセンス、若しくはナンセンス、又はフレームシフトを生じる単一の塩基対の挿入若しくは欠失)の発生、挿入、欠失、及び/又は切断が挙げられる。一部の実施形態では、ポリペプチドインヒビターを使用して、細菌の制限修飾システム(R-Mシステム)の酵素活性を破壊又は抑制することができる。このようなポリペプチドインヒビターは当技術分野で公知である。ポリペプチドインヒビターは、例えば、ファージ又は粒子のDNA内にコードされる、及び/又はファージ又は粒子においてタンパク質としてパッケージングされてもよい。例えば、P1ファージは、大腸菌に見られるI型制限酵素を阻害する2つのポリペプチドインヒビターをコードする(Lobockaら  J. Bacteriol. 186、7032〜7068頁(2004))。一部の実施形態では、内因性R-Mシステムは、ポリペプチドインヒビター、すなわち、送達されたDNAのメチル化及び保護を促進する宿主のメチル化酵素の活性を刺激するポリペプチドの導入によって阻害又は破壊される。
【００８５】
R-Mシステムの酵素のインヒビターとして、これらに限定されないが、REase(制限エンドヌクレアーゼ)を分解し、それによって、宿主のR-M酵素システムがファージ又は粒子のDNAを切断するのを妨げるタンパク質が挙げられる。内因性細菌のR-Mシステムの酵素活性を破壊又は修飾するこの発明に関して使用することができるR-M酵素インヒビターの非限定例として、(a)すべての主要なクラスのI型R-Mシステムを阻害するタンパク質ArdAを生成するフェカリス菌(Enterococcus faecalis)由来のorf18;及び(b)I型R-M酵素EcoKIを捕捉するタンパク質Ocrを生成するバクテリオファージT7由来のgp0.3が挙げられる。R-Mシステムの酵素活性を遮断するために使用することができるタンパク質の追加の非限定例として、マスキングタンパク質が挙げられる。マスキングタンパク質は、ファージのヘッド内にパッケージングされ、DNA注入の際に、ファージのDNAに結合し、それによって、R-M認識部位をマスキングする。この発明に関して有用なマスキングタンパク質の非限定例として、DarA及びDarBタンパク質が挙げられる(Iidaら  Virology. 1 57(1):156〜66頁(1987))。これらのタンパク質は、溶菌性サイクルの間にP1バクテリオファージによって発現され、ヘッド内にパッケージングされる。宿主細菌へのDNA注入の際に、これらは、I型R-Mの認識部位に結合し、これをマスキングする。
【００８６】
加えて又は代わりに、産生細菌の内因性R-Mシステムは、少なくとも1つの異種メチルトランスフェラーゼの発現により変更/修飾され得る。産生宿主細菌のメチル化パターンが標的宿主細菌のメチル化パターンと実質的に類似するように、産生宿主細菌の内因性メチル化パターンを変更する任意のメチルトランスフェラーゼを本発明に関して使用することができる。異種メチルトランスフェラーゼは、標的細菌株と実質的に類似するメチル化パターンを産生宿主細菌に与える限り、同じ又は異なる生物に由来してもよい。本発明に関して有用なDNA MTaseの非限定例として、ラクトコッカスのII型R-Mシステムに対して保護するために導入することができるファージΦ50由来のLlaPIが挙げられる(McGrathら  Applied Environmental Microbiology. 65:1891〜1899頁(1999))。次いで、個々のメチルトランスフェラーゼによって与えられるメチル化パターンを、Pacbio SMRT  シークエンシング等の確立されたDNAシークエンシング技術を使用して評価する(O'Loughlinら  Pl.oS One. 2015:e0118533)。一旦生じると、産生株を使用して、標的宿主株へのDNA送達のためのファージ又は粒子を産生する。
【００８７】
さらなる異種DNA修飾酵素は、産生細菌のR-Mシステムが、標的宿主細菌のR-Mシステムと実質的に類似したものとなるように、産生細菌において発現され得る。このために有用なこのようなDNA修飾酵素の例として、DNAにおけるアデニン残基をアセトアミドアデニンに変換するポリペプチドをコードするものが挙げられる。ファージ又は粒子のDNAにおけるアデニン残基をアセトアミドアデニンに変換するポリペプチドは、アデニンのメチル化に感受性である制限酵素に対してDNAを保護することになる。産生細菌において、DNAにおけるアデニン残基をアセトアミドアデニンに変換することができるポリペプチドの非限定例として、アデニン残基をN(6)-メチルアデニンに変換し、それによって、アデニン感受性制限酵素に対して保護する、ファージMu及びMu様プロファージ配列由来のmom遺伝子が挙げられる(インフルエンザ菌のRd(FluMu)、髄膜炎菌A型株Z2491(Pnmel)及びコッホ・ウィークス菌ATCC 111 16;(Drozdzら  Nucleic Acids Res. 40(5):2119〜30頁(2012))を参照のこと)。
【００８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドインヒビター及び他のDNA修飾酵素をコードするポリヌクレオチドを、送達されたDNAを標的宿主細菌のR-Mシステムから保護する際に使用するために、ファージ又は粒子のゲノムに直接的に導入することができる。
【００８９】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、目的の異種核酸を、バクテリオファージ又は形質導入粒子を介して標的宿主細菌に導入する効率を増加させる方法であって、目的の少なくとも1つの異種核酸を、産生細菌の導入前に、ファージ又は粒子のDNAに導入する工程であって、産生宿主細菌が、内因性R-Mシステムの少なくとも1つの酵素を破壊するように及び/又は少なくとも1つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むように修飾されており、それによって、前記ファージ又は粒子のDNAをメチル化し、修飾されたメチル化パターン(前記変更されたメチル化活性を有さない産生細菌において産生されたファージ又は粒子のDNAと比較して)を有する目的の少なくとも1つの異種核酸を含むファージ又は粒子のDNAを生成する工程と;目的の少なくとも1つの異種核酸を含む前記組換えDNAを含むファージ又は粒子を産生する工程と;前記バクテリオファージ又は粒子に標的宿主細菌を感染させる工程であって、標的宿主細菌は、酸性細菌のものと同一、それに類似する又はそれと実質的に類似するメチル化パターン(又はR-Mシステム)を有し、それによって、対照の産生細菌(対照の産生宿主細菌は、標的宿主細菌のものと同一、それに類似する又はそれと実質的に類似するように変更されたメチル化活性を有さなかった)において成長したバクテリオファージを使用して目的の前記異種核酸を導入することと比較して、目的の前記異種核酸を前記標的宿主細菌に導入する効率を増加させる、工程とを含む方法を提供する。一部の態様では、ファージ又は粒子による感染後に、産生細菌を修飾して、そのR-Mシステムを変更する(例えば、内因性R-Mシテムの少なくとも1つの酵素を破壊する及び/又は少なくとも1つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む)ことができる。
【００９０】
一部の実施形態では、目的の異種核酸を、ファージ又は形質導入粒子を介して標的宿主細菌に導入する効率を増加させる方法であって、内因性R-Mシステムの少なくとも1つの酵素の破壊及び/又は少なくとも1種の異種メチルトランスフェラーゼの発現によってメチル化活性が変更された産生細菌を、目的の少なくとも1つの異種核酸を含むDNAを含むバクテリオファージ又は粒子に感染させ、それによって、前記DNAをメチル化する工程と;修飾されたメチル化パターンを有するバクテリオファージ又は粒子のDNAを含み、目的の少なくとも1つの異種核酸を含む/コードするバクテリオファージを産生する工程と;産生宿主細菌のものと同一、それに類似する又はそれと実質的に類似するメチル化パターン(又はR-Mシステム)を有する標的宿主細菌を、前記バクテリオファージ又は粒子に感染させ、それによって、対照の産生細菌(対照の産生宿主細菌は、本明細書に記載される標的宿主細菌のものと同一、それに類似する又はそれと実質的に類似するように変更されたメチル化活性を有さなかった)において産生されたバクテリオファージ又は粒子を使用して目的の前記異種核酸を導入することと比較して、目的の前記異種核酸を前記標的宿主細菌に導入する効率を増加させる工程とを含む方法が提供される。一部の態様では、バクテリファージ又は粒子による感染後に、産生細菌を修飾して、そのR-Mシステムを変更する(例えば、内因性R-Mシテムの少なくとも1つの酵素を破壊する及び/又は少なくとも1つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む)ことができる。
【００９１】
ある例では、標的宿主細菌は、産生宿主細菌の制限-修飾システム(R-Mシステム)と実質的に類似するDNAメチル化パターンを有することに基づいて選択される。
【００９２】
メチル化パターンは、メチル化された特定の配列(例えば、GmATC)と同様に、細菌に存在するメチル化の型(例えば、m4C)によって決定される。よって、メチル化パターン間の類似性のレベル(それが天然であるか修飾の結果であるかにかかわらず)は、それによって、標的部位がメチル化の適切な型を有する頻度を指す。よって、実質的に類似するメチル化パターンとは、本明細書に記載の適切な型のメチル化を有する標的部位間に少なくとも約20%以上の類似性(例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくはそれを超えるか、又はその中の任意の範囲若しくは値)を有することを意味する。よって、一部の実施形態では、メチル化パターンは、宿主細菌と標的細菌の間で、約20%から99%の間若しくはそれを超えて類似する、約30%から99%若しくはそれを超えて類似する、約40%から99%若しくはそれを超えて類似する、約50%から99%若しくはそれを超えて類似する、約60%から99%若しくはそれを超えて類似する、約70%から99%若しくはそれを超えて類似する、約80%から99%若しくはそれを超えて類似する、約85%から99%若しくはそれを超えて類似する、約90%から99%若しくはそれを超えて類似する、又は約95%から99%若しくはそれを超えて類似する可能性がある。標的宿主細菌と導入されたDNA(修飾されたバクテリオファージ又は粒子のDNA)のメチル化パターンの間の実質的類似性とは、導入されたDNAが、標的宿主細菌と実質的に類似するメチル化パターンを共有しない導入されたDNAのものほど分解されていないことを意味する。一部の実施形態では、産生細菌と標的細菌のメチル化パターンは同一であり得る。
【００９３】
一部の実施形態では、本発明は、標的宿主細菌のR-Mシステムと同一、それに類似する又はそれと実質的に類似する、修飾されたDNAのメチル化パターンを含むDNAを含み、少なくとも1つの目的の異種核酸が、バクテリオファージ又は粒子のDNA(ゲノム)に組み込まれているバクテリオファージ又は粒子を提供する。よって、例えば、修飾されたメチル化パターン(標的宿主細菌のR-Mシステムと実質的に類似するメチル化パターン)を有するバクテリオファージ又は形質導入粒子のDNAは、(1)CRISPRアレイをコードするポリヌクレオチド又は(2)(a)Cas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;(b)CRISPRアレイをコードするポリヌクレオチド;及び/又は(c)tracr核酸を含むII型のCRISPR-Casシステムを含むことができる。一部の実施形態では、CRISPRアレイ(a)及びtracr核酸(c)をコードするポリヌクレオチドは、互いに融合することができる。追加の実施形態では、修飾されたメチル化パターン(標的宿主細菌のR-Mシステムと同一、それに類似する又はそれと実質的に類似するメチル化パターン)を有するバクテリオファージ又は粒子のDNAは、(1)CRISPRアレイをコードするポリヌクレオチド又は(2)(a)CRISPRアレイをコードするポリヌクレオチド;及び/又は(b)1つ又は複数のI型のCRISPRポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組換えI型のCRISPR-Casシステムを含むことができる。一部の実施形態では、目的の少なくとも1つの異種核酸を、組込みの不要部位又は組込みの補足部位で、バクテリオファージ又は粒子のDNA(例えば、ゲノム)に組み込むことができる。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「不要部位」とは、バクテリオファージ又は粒子のゲノムの維持、ファージ又は粒子の生成、及びパッケージングされたDNAの送達に必要ではないDNA又はゲノムの部位を意味する。よって、このような機能を実行するために必要とされないバクテリオファージ又は粒子のゲノムにおける任意の部位を、目的の核酸を組み込むための「ランディング」部位として使用することができる。一部の例示的な不要部位として、これらに限定されないが、(a)ファージにコードされた制限-修飾システム(例えば、P1ファージにおけるres/mod)、(b)重複感染を遮断する遺伝子(例えば、simABC)、(c)制限-修飾システムのインヒビター(例えば、P1ファージにおけるdarA)、(d)挿入配列エレメント(例えば、P1ファージにおけるIS1)、(e)付加システム(例えば、P1ファージにおけるphd/doc)又は(f)これらの任意の組合せが挙げられる。
【００９５】
「補足部位」又は「補足可能部位」とは、本明細書で使用する場合、バクテリオファージ又は粒子のゲノムの維持、ファージ又は粒子の生成、及びパッケージングされたDNAの送達に必要であるが、目的の核酸の組込み(組込みの補足部位)によって破壊される核酸をコードする補足ポリヌクレオチドによって補足することができるバクテリオファージ又は粒子のDNA若しくはゲノムにおける必要不可欠な部位を意味する。補足ポリヌクレオチドは、産生細菌のゲノムに組み込むことができ、又は産生細菌のプラスミド上に含まれ得る。したがって、目的の核酸がバクテリオファージ又は粒子のDNAの補足部位に組み込まれると、産生細菌は、バクテリオファージ又は粒子のDNAの補足部位に対する補足物をコードするポリヌクレオチドをプラスミド上又はそのゲノム内に含むことができる。例示的な補足部位として、これらに限定されないが、(a)溶菌性サイクルのアクチベーター(例えば、P1ファージにおけるcoi)、(b)溶菌性遺伝子(例えば、P1ファージにおけるkilA)、(c)tRNA(例えば、P1ファージにおけるtRNAl,2)、(d)粒子の構成成分(例えば、P1ファージにおけるcixL及びcixRテールファイバー遺伝子)、又は(e)これらの任意の組合せが挙げられる。
【００９６】
ある実施形態では、産生株、例えば、大腸菌MG1655又は枯草菌168のメチル化パターンは、以下のように、その内因性制限-修飾システムを欠失させ、異種メチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入することによって変更される。制限-修飾遺伝子は、当技術分野で公知の手段によって、例えば、オンラインREBASEデータベース(Robertsら  Nucleic Acids Res 43:D298〜D299頁。http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkul046)によって特定される。これらの制限-修飾システムは、当技術分野で公知の標準的リコンビニアリング戦略を使用して欠失され得る。一旦欠失すると、外来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子が、複製プラスミドに挿入され、構成型又は誘導型プロモーターの制御下で宿主ゲノムにリコンビニアリングされる。これらの遺伝子は、天然配列又は産生宿主に対してコドン最適化された配列を使用して、標的株から直接的に得られる。或いは、異種メチルトランスフェラーゼ遺伝子を使用して、標的株として類似するメチル化パターンを与えることができる。次いで、個々のメチルトランスフェラーゼによって与えられたメチル化パターンをPacBio SMRTシークエンシング等の確立したDNAシークエンシング技術(O'Loughlinら  PLoS One. 2015:e0118533)を使用して評価する。一旦生じると、産生株を使用して、標的宿主株へのDNA送達のためのバクテリオファージ又は形質導入粒子を産生する。
【００９７】
プロモーター:
プロモーターとして、例えば、組換え核酸構築物、ポリヌクレオチド、発現カセット及び本発明のポリヌクレオチド及び組換え核酸構築物を含むベクターの調製に使用するための、構成型、誘導型、時間制御型、発生制御型、化学制御型プロモーターが挙げられる。これらの様々な型のプロモーターは、当技術分野で公知である。
【００９８】
よって、一部の実施形態では、本発明に従って、目的の生物において機能的である適切なプロモーターである、構成型、誘導型、時間制御型、発生制御型、化学制御型プロモーターに作動可能に連結した本発明の組換え核酸構築物を使用して、本発明における発現がなされ得る。代表的実施形態では、例えば、目的の生物において機能的である誘導型プロモーターに作動可能に連結した本発明の組換え核酸構築物を使用して、抑制が可逆的になされ得る。
【００９９】
プロモーターの選択は、発現のための量的、時間的及び空間的要求に応じて、また、形質転換される宿主細胞に応じて変化する。多くの異なる生物に関するプロモーターが当技術分野で周知である。当技術分野に存在する広範な知識に基づき、目的の特定の宿主生物に対する適切なプロモーターが選択され得る。よって、例えば、モデル生物において高度に構成的に発現した遺伝子の上流のプロモーターについて多くが知られており、このような知識は、適宜、他のシステムにおいて容易に評価及び実施され得る。
【０１００】
この発明に関して有用な例示的プロモーターとして、細菌において機能的であるプロモーターが挙げられる。細菌に関して有用なプロモーターとして、これらに限定されないが、L-アラビノース誘導型(araBAD、PBAD)プロモーター、任意のlacプロモーター、L-ラムノース誘導型(rhaPBAD)プロモーター、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージプロモーター(PL、PL-9G-50)、アンヒドロテトラサイクリン-誘導型(tetA)プロモーター、trp、lpp、phoA、recA、proU、cst-1、cadA、nar、lpp-lac、cspA、T7-lacオペレーター、T3-lacオペレーター、T4遺伝子32、T5-lacオペレーター、nprM-lacオペレーター、Vhb、タンパク質A、コリネバクテリウム-大腸菌様プロモーター、thr、hom、ジフテリア毒素プロモーター、sig A、sig B、nusG、SoxS、katb、アルファ-アミラーゼ(Pamy)、Ptms、P43(2つの重複するRNAポリメラーゼσ因子認識部位、σA、σBから構成される)、Ptms、P43、rplK-rplA、フェロドキシンプロモーター、及び/又はキシロースプロモーターが挙げられる。(K. Terpe Appl. Microbiol、Biotechnol. 72:211〜222頁(2006);Hannigら  Trends in Biotechnology 16:54〜60頁(1998);及びSrivastava Protein Expr Purif 40:221〜229頁(2005)を参照のこと)。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態では、誘導型プロモーターを使用することができる。よって、例えば、化学制御型プロモーターを使用して、外因性化学調節剤の適用により、生物における遺伝子の発現をモジュレートすることができる。化学的に調節されるプロモーターを介した本発明のヌクレオチド配列の発現の調節により、例えば、生物が誘導性化学物質で処理された場合にのみ本発明のRNA及び/又はポリペプチドの合成が可能となる。目的に応じて、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導型プロモーター、又は化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制型プロモーターであってもよい。一部の態様では、プロモーターは、特定の光の波長の適用が遺伝子発現を誘導する光誘導型プロモーター(Levskayaら  2005. Nature 438:441〜442頁)も含んでもよい。
【０１０２】
記述
例証として、本発明は、以下の記述を提供する。
【０１０３】
1.ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
【０１０４】
好ましくは、第2の細胞は、細菌細胞である。或いは、第2の細胞は、古細菌細胞;真核細胞、酵母細胞、CHO細胞又はHEK293細胞である。
【０１０５】
ある実施形態では、レセプターは、発現可能な外因性ヌクレオチド配列(すなわち、第2の細菌の非野生型配列)によってコードされるタンパク質を含み、外因性配列は第2の細菌のゲノムに含まれる。例えば、ヌクレオチド配列は、宿主細胞に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか又は少なくとも85、90、95又は98%同一である。
【０１０６】
別の実施形態では、レセプターは、第2の細菌における1つ又は複数の酵素の作用によって生成される糖部分を含み、第2の細菌のゲノムは、1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能な外因性ヌクレオチド配列(すなわち、第2の細菌の非野生型配列)を含む。例えば、各ヌクレオチド配列は、宿主細胞に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか又は少なくとも85、90、95又は98%同一である。
【０１０７】
任意選択で、第2の種又は株は、レセプターを天然には発現しない。宿主及び/又は第2の細胞は、天然に存在しない細菌細胞であってもよい。宿主及び/又は第2の細胞は、非野生型細胞であってもよい。
【０１０８】
任意選択で、宿主細胞は、レセプターをコードする発現可能な外因性ヌクレオチド配列(例えば、染色体に組み込まれたもの)を含む。
【０１０９】
代わりには、工程(b)においてファージに第2の細胞を感染させる代わりに、ファージのコードするDNAが、他の手段、例えば、エレクトロポレーションによって、第2の細胞に導入される。ある例では、工程(c)は、例えば、鋼製発酵槽等の培養容器内で、第2の細胞を培養することを含む。
【０１１０】
第2の細胞は、ファージをコードするDNAを複製するのに作動可能な細胞装置を含む。
【０１１１】
ある例では、宿主細胞は、ヒトに対して病原性であり(例えば、宿主細胞は、クロストリジウム・ディフィシル(C difficile)の細胞である)及び/又は第2の細胞は、ヒトに対して非病原性であり、腸の共生種の細胞である(例えば、第2の細胞は、ラクトバチルスの細胞、例えば、ラクトバチルス・ラクティス(L lactis)又はラクトバチルス・ロイテリ(L reuteri)の細胞である)。例えば、第2の細胞は、例えば、US20160333348(この具体的開示は、参照により本明細書に組み込まれている)に記載されているキャリア細胞である。ある例では、本発明は、ヒト又は動物対象における宿主細胞感染(例えば、対象の腸の感染)を処置又は予防する方法であって、対象に、前記第2の細胞の集団を投与する工程を含み(対象の腸で生息させるために)、細胞が、第1の型の前記ファージ(例えば、プロファージ)を含むキャリア細胞であり、ファージが、対象に含まれる宿主細胞(例えば、対象の腸に含まれる宿主細胞)におけるプロトスペーサー配列を標的とするcRNA又はgRNAをコードし、第2の細胞が、対象の宿主細胞に感染するファージに対するキャリアであり、前記crRNA又はgRNAをコードするファージの核酸が宿主細胞において産生され、それによって、宿主細胞において活性CRISPR/Casシステムが形成され、それによって、Casが、crRNA又はgRNAによって、宿主細胞のゲノムに含まれるプロトスペーサー配列にガイドされ、宿主細胞のDNAを修飾し(例えば、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞の成長又は増殖を阻害し、それによって、感染が処置又は予防される、方法を提供する。ある実施形態では、このような方法は、対象の疾患又は状態を処置又は予防するためのものであり、疾患又は状態は、宿主細胞の感染に関連するか又はそれによって引き起こされ、それによって、疾患又は状態が処置又は予防される。宿主細胞及び/又は第2の細胞は、本明細書に開示されている任意のこのような細胞であり得る。
【０１１２】
2.ファージが、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記宿主細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA(又はシングルガイドRNA)(必要であれば、tracrRNA)をコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記宿主細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA(又はgRNA)が宿主細胞のCasをガイドして標的配列を修飾し(例えば、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞集団の成長を低減する、記述1の方法。
【０１１３】
ある例では、ファージは、その具体的開示が参照により本明細書に組み込まれるUS20160333348に開示されているHM-アレイ又はヌクレオチド配列をコードするgRNAを含む。
【０１１４】
3.ファージが感染した場合に、第2の細胞が前記活性CRISPR/Casシステムを含まない、記述2の方法。
【０１１５】
例えば、1つ又は複数のCasは、crRNA又はgRNAとともに作動可能ではない欠陥のあるCRISPR/Casシステムを含む第2の細胞において、抑制、不活性化又はノックアウトされる。
【０１１６】
ある例では、活性CRISPR/Casシステムは、その具体的開示が参照により本明細書に組み込まれるUS20160333348に開示されている通りである。
【０１１７】
4.各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まない、記述2又は3の方法。
【０１１８】
ある例では、標的配列は、その具体的開示が参照により本明細書に組み込まれるUS20160333348に開示されている通りである。
【０１１９】
5.
(a)前記第2の細胞のCas(例えば、Cas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)が、前記crRNA(又はgRNA)とともに作動可能ではなく、
(b)前記第2の細胞のtracrRNAが、前記crRNAとともに作動可能ではなく、及び/又は
(c)前記第2の細胞が、前記crRNAをコードするヌクレオチド配列から前記crRNAを生成するのに作動可能ではない(又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列から前記gRNAを生成するのに作動可能ではない)、記述2から4のいずれか1つの方法。
【０１２０】
6.crRNA(又はgRNA)が、第2の細胞のCas(例えば、第2の細胞のCas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)とともに作動可能ではないリピート配列を含む、記述2から5のいずれか1つの方法。
【０１２１】
ある例では、リピートは、その具体的開示が参照により本明細書に組み込まれるUS20160333348に開示されている通りである。
【０１２２】
7.前記ファージのヌクレオチド配列が、前記宿主の種又は株の細菌におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのプロモーターであって、前記第2の種又は株におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのものではないプロモーターに作動可能に接続している、記述2から6のいずれか1つの方法。
【０１２３】
ある例では、プロモーターは、第2の細胞において構成的に活性である。
【０１２４】
8.前記宿主の種又は株の細菌が、宿主細菌に感染する前記第1の型のファージを死滅させるか又はその増殖を低減する抗ファージ毒素又は機構を含み、第2の細菌が、前記毒素又は機構を含まない、記述1から7のいずれか1つの方法。
【０１２５】
9.前記宿主の種又は株の細菌が、宿主細菌に感染する前記第1の型のファージを死滅させるか又はその増殖を低減するのに活性であるCRISPR/Casシステムを含み、第2の細菌が、前記システムを含まない、記述1から8のいずれか1つの方法。
【０１２６】
10.第2の細菌細胞が、レセプターを生成するように遺伝子操作されており、前記第2の種又は株の野生型細菌が前記レセプターを生成しない、記述1から9のいずれか1つの方法。
【０１２７】
11.ファージが、前記第2の細胞において及び前記第1の種又は株の細胞において作動可能である複製起点を含む、記述1から10のいずれか1つの方法。
【０１２８】
12.第2の細胞が、大腸菌細胞である、記述1から11のいずれか1つの方法。
【０１２９】
例えば、第2の細胞は、ヒトに対して病原性ではない。例えば、第2の細胞は、ハザードグループ1又は2の細胞(例えば、本明細書の表においてグループ2として記載される種のもの等)である。
【０１３０】
13.第1及び第2の細胞が、同じ種(例えば、大腸菌株)のものである、記述1から12のいずれか1つの方法。
【０１３１】
例えば、第2の細胞は、宿主細胞の遺伝子操作されたバージョンであり、例えば、ここで、第2の細胞は、本明細書で言及した欠陥のあるCRISPR/Casシステムを含み、及び/又は前記プロトスペーサー配列を含まず、及び/又は宿主細胞によって発現される毒素を発現しない。
【０１３２】
14.宿主細胞の株がヒト病原性株(例えば、クロストリジウム・ディフィシル)であり、第2の細胞株がヒト病原性株ではない(例えば、ラクトバチルス・ロイテリ又はラクトバチルス・ラクティス等のラクトバチルス菌)、記述13の方法。
【０１３３】
15.第2の細胞が、宿主の種又は株(例えば、ハザードグループ3又は4)の細胞と比較して、より低いハザードカテゴリー(例えば、ハザードグループ1又は2)の細胞である、任意の先行する記述1から14のいずれか1つの方法。
【０１３４】
16.レセプターが、リポ多糖、タイコ酸(例えば、ManNAc残基のC4ヒドロキシルに付着した1から3個のグリセロールホスフェートを有し、それにグリセロール-又はリビトールホスフェートリピートの長鎖が続くManNAc(β1→4)GlcNAc二糖)、タンパク質及び鞭毛から選択される、記述1から15のいずれか1つの方法。
【０１３５】
17.レセプターが、宿主細胞のO-抗原を含む、記述1から16のいずれか1つの方法。
【０１３６】
18.ファージが、例えば、ファージが第2の細胞において複製する場合に、第2の細胞において、エンドリシン又はホリンを発現するのに作動可能である、記述1から17のいずれか1つの方法。
【０１３７】
19.ファージを増殖させるための細胞(プロパゲーター細胞)であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、プロパゲーター細胞が、その表面にレセプターを含み、第2の種又は株のものであり、第2の種又は株は、第1の種又は株と異なり、それによって、プロパゲーター細胞が、それにおけるファージの増殖のために前記第1の型のファージによる感染を受けることが可能である、プロパゲーター細胞。
【０１３８】
ある例では、プロパゲーター細胞(本発明の方法における第2の細胞)のゲノムは、レセプターをコードする外因性ヌクレオチド配列を含み、この細胞の種又は株の野生型細胞は前記ヌクレオチド配列を含まない。
【０１３９】
20.レセプターが、プロパゲーター細胞のゲノムに含まれる発現可能なヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、記述19のプロパゲーター細胞。
【０１４０】
21.レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物である糖部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、記述19のプロパゲーター細胞。
【０１４１】
22.レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物であるタイコ酸部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、記述19のプロパゲーター細胞。
【０１４２】
23.酵素が、TarO、TarA、TarB、TarF、TarK、及びTarL(又は宿主細胞及び/又は第2の細胞によって発現されたこれらの相同体)から選択される、記述22のプロパゲーター細胞。
【０１４３】
24.前記第1の型のファージと組み合わせた、記述19から23のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１４４】
25.前記第1の型の1つ又は複数のプロファージ(例えば、プロパゲーター細胞の染色体に組み込まれる)を含む、記述19から24のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１４５】
26.プロパゲーター細胞がグラム陰性細菌細胞であり、任意選択で、宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である、記述19から25のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１４６】
27.プロパゲーター細胞がグラム陽性細菌細胞であり、任意選択で、宿主細胞がグラム陽性細菌細胞である、記述19から25のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１４７】
28.任意選択で、プロパゲーター細胞を培養し、前記第1の型のファージを増殖させるための発酵容器に含まれる、記述19から27のいずれか1つに記述のプロパゲーター細胞の集団。
【０１４８】
29.各プロパゲーター細胞が、記述1から18のいずれか1つに規定の第2の細胞である、記述19から28のいずれか1つのプロパゲーター細胞又は集団。
【０１４９】
30.各宿主細胞が、記述1から18のいずれか1つに規定の宿主細胞である、記述19から28のいずれか1つのプロパゲーター細胞又は集団。
【０１５０】
31.ファージが、記述1から18のいずれか1つに規定のファージである、記述19から28のいずれか1つのプロパゲーター細胞又は集団。
【０１５１】
32.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防する方法であって、疾患又は状態が、対象に含まれる(例えば、対象の腸に含まれる)宿主細胞によって媒介され、方法が、プロパゲーター細胞を対象に(例えば、対象の腸に生息するために)投与する工程を含み、プロパゲーター細胞が記述19から31のいずれか1つに記載されており、プロパゲーター細胞がファージを産生し、ファージが患者の(例えば、その腸の)宿主細胞に感染し、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は対象の宿主細胞の成長若しくは増殖を阻害し、それによって、疾患又は状態を処置又は予防する、方法。
【０１５２】
33.プロパゲーター細胞が、ラクトバチルス菌(例えば、ラクトバチルス・ロイテリ)の細胞である、記述32の方法。
【０１５３】
34.ファージが、宿主細胞においてCasをガイドし、宿主細胞のDNAを修飾し(例えば、切断し)、それによって、前記死滅させるか又は阻害することを実行する、抗宿主細胞のcrRNA又はgRNAをコードする、記述32又は33の方法。
【０１５４】
概念
本発明は、以下の概念も提供する:
1.ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
【０１５５】
2.ファージのコートタンパク質によってパッケージングされた核酸を含む形質導入粒子の集団を産生する方法であって、粒子が、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能であり、それによって、宿主細胞が核酸により形質導入され、方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものであり、前記核酸の複製を生成することが可能であるDNAを含む第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、第2の細菌細胞に含まれるレセプターにファージを結合させることによって、ファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させる行程であって、前記核酸の複製をパッケージングするファージのコートタンパク質が産生され、それによって、粒子の集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団の粒子を単離する工程
とを含む、方法。
【０１５６】
ある例では、粒子に含まれる核酸は、DNAである。ある例では、核酸は、RNAである。ある例では、工程(b)において第2の細胞を感染させるために使用され、任意選択で、形質導入粒子とは異なる(形質導入粒子がファージである場合)ファージは、ヘルパーファージである。任意選択で、ヘルパーファージは、第2の細胞における自己複製に関して欠陥を有する。
【０１５７】
例えば、第2の細胞に含まれるDNAは、各第2の細胞の染色体DNAに含まれる。別の例では、DNAは、各第2の細胞に含まれる1つ又は複数のエピソーム(例えば、プラスミド)に含まれる。
【０１５８】
「形質導入粒子」は、ファージであるか又はファージより小さくてもよく、核酸(例えば、その抗生物質又はCRISPRアレイ等の構成成分をコードするもの)を宿主細菌細胞に形質導入することが可能である粒子である。
【０１５９】
粒子は、ファージコートタンパク質及び任意選択で、工程(b)において使用されるファージにコードされる他のファージ構造タンパク質を含む。構造タンパク質の例は、主要なヘッド及びテールタンパク質、ポータルタンパク質、テールファイバータンパク質、及び少数のテールタンパク質のうちの1つ、複数又はすべてから選択されるファージタンパク質である。
【０１６０】
粒子は、核酸(例えば、アレイ又は抗生物質をコードするDNA等のDNA)を含み、核酸は、核酸又はその複製を、宿主細胞を感染させることが可能である形質導入粒子にパッケージングするために、工程(b)のファージにコードされるタンパク質とともに作動可能なパッケージングシグナル配列を含む。
【０１６１】
ある例では、各形質導入粒子は、非自己複製形質導入粒子である。「非自己複製形質導入粒子」とは、細菌細胞に粒子の核酸分子(例えば、抗細菌剤又は構成成分をコードする)を送達することが可能であるが、それ自身の複製ゲノムを形質導入粒子中にパッケージングしない粒子(例えば、ファージ若しくはファージ様粒子;若しくはゲノムアイランド(例えば、黄色ブドウ球菌病原性アイランド(SaPI)から産生される粒子)又はその修飾バージョンを指す。
【０１６２】
任意選択で、各粒子の核酸は、修飾されたゲノムアイランドを含む。任意選択で、ゲノムアイランドは、宿主の種又は株の細菌細胞に天然に見られるアイランドである。ある例では、ゲノムアイランドは、SaPI、SaPI1、SaPI2、SaPIbov1及びSaPibov2ゲノムアイランドからなる群から選択される。任意選択で、各粒子の核酸は、修飾された病原性アイランドを含む。任意選択で、病原性アイランドは、第1の種又は株の細菌細胞に天然に見られるアイランド、例えば、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)のSaPI若しくはVibro PLE又は緑膿菌の病原性アイランド(例えば、PAPI又はPAGI、例えば、PAPI-1、PAGI-5、PAGI-6、PAGI-7、PAGI-8、PAGI-9又はPAGI-10)である。任意選択で、病原性アイランドは、SaPI(黄色ブドウ球菌の病原性アイランド)である。
【０１６３】
任意選択で、形質導入粒子の核酸の転写は、宿主細胞における抗細菌剤若しくは構成成分又はアレイの複製の転写のために、誘導型プロモーターの制御下にある。これは、例えば、標的細胞を含有する、環境(例えば、土壌又は水中)において又は工業的培養若しくは発酵容器において、例えば、標的細菌細胞に対して使用するための、抗菌活性のスイッチオン又は抗宿主細胞のcrRNA生成を制御するために有用である。例えば、宿主細胞は、工業的プロセス  において(例えば、醸造業又は酪農業における、例えば、発酵のために)有用である場合があり、導入により、宿主細菌に対する抗細菌剤又はcrRNAを使用することによって、プロセスを制御する(例えば、停止又は低減する)ことが可能となる。
【０１６４】
3.粒子が、非複製形質導入粒子又はファージである、概念2の方法。
【０１６５】
4.ファージ又は粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記宿主細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA(又はシングルガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記宿主細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA(又はgRNA)が宿主細胞のCasをガイドして標的配列を修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞集団の成長を低減する、任意の先行する概念1から3のいずれか1つの方法。
【０１６６】
5.ファージが感染した場合に、第2の細胞が前記活性CRISPR/Casシステムを含まない、概念4の方法。
【０１６７】
6.各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まない、概念4又は5の方法。
【０１６８】
7.
(a)前記第2の細胞のCas(任意選択で、Cas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)が、前記crRNA(又はgRNA)とともに作動可能ではなく、
(b)前記第2の細胞のtracrRNAが、前記crRNAとともに作動可能ではなく、及び/又は
(c)前記第2の細胞が、前記crRNAをコードするヌクレオチド配列から前記crRNAを生成するのに作動可能ではない(又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列から前記gRNAを生成するのに作動可能ではない)、概念4から6のいずれか1つの方法。
【０１６９】
8.crRNA(又はgRNA)が、第2の細胞のCas(任意選択で、第2の細胞のCas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)とともに作動可能ではないリピート配列を含む、概念4から7のいずれか1つの方法。
【０１７０】
9.前記ヌクレオチド配列が、前記宿主の種又は株の細菌におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのプロモーターであって、前記第2の種又は株におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのものではないプロモーターに作動可能に接続している、概念4から8のいずれか1つの方法。
【０１７１】
10.
(a)ファージ又は粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記宿主細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA(又はシングルガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記宿主細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA(又はgRNA)が宿主細胞のCasをガイドして標的配列を修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞集団の成長を低減し、
(b)宿主細胞と第2の細胞が、同じ種(任意選択で、大腸菌株)のものであり、
(c)各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まず、第1及び第2の細胞が、同じ種の異なる株である、概念1から9のいずれか1つの方法。
【０１７２】
11.前記宿主の種又は株の細菌が、宿主細菌に感染する前記第1の型のファージ又は粒子を死滅させるか又はその増殖を低減する抗ファージ毒素又は機構を含み、第2の細菌が、前記毒素又は機構を含まない、概念1から10のいずれか1つの方法。
【０１７３】
12.前記宿主の種又は株の細菌が、宿主細菌に感染する前記第1の型のファージ又は粒子を死滅させるか又はその増殖を低減するのに活性であるCRISPR/Casシステムを含み、第2の細菌が、前記システムを含まない、概念1から11のいずれか1つの方法。
【０１７４】
13.第2の細菌細胞が、レセプターを生成するように遺伝子操作されており、前記第2の種又は株の野生型細菌が前記レセプターを生成しない、概念1から12のいずれか1つの方法。
【０１７５】
14.ファージ又は粒子が、前記第2の細胞において及び前記第1の種又は株の細胞において作動可能である複製起点を含む、概念1から13のいずれか1つの方法。
【０１７６】
15.第2の細胞が、大腸菌細胞である、概念1から14のいずれか1つの方法。
【０１７７】
16.第1及び第2の細胞が、同じ種(任意選択で、大腸菌株)のものである、概念1から15のいずれか1つの方法。
【０１７８】
17.宿主細胞の株がヒト病原性株であり、第2の細胞株がヒト病原性株ではない、概念16の方法。
【０１７９】
18.第2の細胞が、宿主の種又は株(任意選択で、ハザードグループ3又は4)の細胞と比較して、より低いハザードカテゴリー(任意選択で、ハザードグループ1又は2)の細胞である、概念1から17のいずれか1つの方法。
【０１８０】
19.レセプターが、リポ多糖、タイコ酸(任意選択で、ManNAc残基のC4ヒドロキシルに付着した1から3個のグリセロールホスフェートを有し、それにグリセロール-又はリビトールホスフェートリピートの長鎖が続くManNAc(β1→4)GlcNAc二糖)、タンパク質及び鞭毛から選択される、概念1から18のいずれか1つの方法。
【０１８１】
20.レセプターが、宿主細胞のO-抗原を含む、概念1から19のいずれか1つの方法。
【０１８２】
21.ファージ又は粒子が、任意選択で、ファージ又は粒子が第2の細胞において複製する場合に、第2の細胞において、エンドリシン又はホリンを発現するのに作動可能である、概念1から20のいずれか1つの方法。
【０１８３】
22.ファージ又はファージコートタンパク質によってパッケージングされた核酸を含む形質導入粒子を増殖させるための細胞(プロパゲーター細胞)であって、ファージ又は粒子が、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、プロパゲーター細胞が、その表面にレセプターを含み、第2の種又は株のものであり、第2の種又は株は、第1の種又は株と異なり、それによって、プロパゲーター細胞が、それにおけるファージ又は粒子のそれぞれの増殖のために前記第1の型のファージ又は前記粒子による感染を受けることが可能である、プロパゲーター細胞。
【０１８４】
23.レセプターが、プロパゲーター細胞のゲノムに含まれる発現可能なヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、概念22のプロパゲーター細胞。
【０１８５】
24.レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物である糖部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、概念22のプロパゲーター細胞。
【０１８６】
25.レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物であるタイコ酸部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、概念22のプロパゲーター細胞。
【０１８７】
26.酵素が、TarO、TarA、TarB、TarF、TarK、及びTarL(又は宿主細胞及び/又は第2の細胞によって発現されたこれらの相同体)から選択される、概念25のプロパゲーター細胞。
【０１８８】
27.前記第1の型のファージ又は前記形質導入粒子と組み合わせた、概念22から26のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１８９】
28.前記第1の型の1つ又は複数のプロファージ(任意選択で、プロパゲーター細胞の染色体に組み込まれた)、又は形質導入粒子の前記核酸の複製を生成することが可能であるDNA(任意選択で、プロパゲーター細胞の染色体に組み込まれた)を含む、概念22から27のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１９０】
29.プロパゲーター細胞がグラム陰性細菌細胞であり、任意選択で、宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である、概念22から28のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１９１】
30.プロパゲーター細胞がグラム陽性細菌細胞であり、任意選択で、宿主細胞がグラム陽性細菌細胞である、概念22から28のいずれか1つのプロパゲーター細胞。
【０１９２】
31.任意選択で、プロパゲーター細胞を培養し、前記第1の型のファージ又は前記形質導入粒子を増殖させるための発酵容器に含まれる、概念22から30のいずれか1つに記載のプロパゲーター細胞の集団。
【０１９３】
32.各プロパゲーター細胞が、概念1から21のいずれか1つに規定の第2の細胞である、概念22から31のいずれか1つのプロパゲーター細胞又は集団。
【０１９４】
33.各宿主細胞が、概念1から21のいずれか1つに規定の宿主細胞である、概念22から31のいずれか1つのプロパゲーター細胞又は集団。
【０１９５】
34.ファージ又は粒子が、概念1から21のいずれか1つに規定のファージ又は粒子である、概念22から31のいずれか1つのプロパゲーター細胞又は集団。
【０１９６】
35.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防する方法であって、疾患又は状態が、対象に含まれる(任意選択で、対象の腸に含まれる)宿主細胞によって媒介され、方法が、プロパゲーター細胞を対象に(任意選択で、対象の腸に生息するために)投与する工程を含み、プロパゲーター細胞が概念22から34のいずれか1つに記載されており、プロパゲーター細胞がファージ又は形質導入粒子を産生し、ファージ又は粒子が患者の(任意選択で、その腸の)宿主細胞に感染し、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は対象の宿主細胞の成長若しくは増殖を阻害し、それによって、疾患又は状態が処置又は予防される、方法。
【０１９７】
36.プロパゲーター細胞が、ラクトバチルス菌(例えば、ラクトバチルス・ロイテリ)の細胞である、概念35の方法。
【０１９８】
37.ファージが、宿主細胞においてCasをガイドし、宿主細胞のDNAを修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、前記死滅させるか又は阻害することを実行する、抗宿主細胞のcrRNA又はgRNAをコードする、概念35又は36の方法。
【実施例１】
【０１９９】
ヘルパーファージに対して感受性となるための産生細胞の遺伝子操作
概要:
本発明者らは、細菌の産生株(この場合には、大腸菌産生細胞)を遺伝子操作し、ファージレセプターを発現させ、ヘルパーファージによる感染に感受性の株とした。産生細菌は、CRISPRアレイとファージパッケージング部位を含有するベクターを保有し、その結果、ベクターは、ヘルパーによって感染した細胞内においてパッケージングされ(感染していない細胞においてはパッケージングされない)、それによって、crRNAをコードするファージ様粒子に対する産生株としての細菌の使用が可能となった。本発明者らは、更に、このような産生株によって生成された溶菌液がファージ様粒子を含有し、これを使用して、他の関連する大腸菌標的集団にCRISPRアレイを送達することができることを示した。ここで、本発明者らは、このベクターをCRISPR Guided Vectors(CGV(商標))と称する。
【０２００】
有利には、特定の細菌集団を標的とするCGV-負荷ファージ様粒子(CGV-PLP)を産生するために、標的株に関連する株においてCGV-PLPを産生すること、例えば、標的株において宿主の防御機構を回避してCGV-PLPを産生することが有益であり得る。例えば、次いで、PLPが、産生細菌及び標的細菌の種又は株が同一であるか又は密接に関連する(又は任意の割合で共通のメチルトランスフェラーゼが含む)標的細胞に感染した際に、産生細菌におけるメチルトランスフェラーゼによるCGV-PLPのDNA修飾は、制限修飾に対してDNAを遮蔽するのに有用である場合がある。表面レセプターを呈する本発明の通りの産生株を採用することによって、本発明は、次に、標的宿主細菌による制限修飾に対する有益なDNA修飾を呈することができる株において、PLP生産を可能とする。有益には、標的細菌においてPLPのcrRNAの標的とされるプロトスペーサー配列は、産生細菌のゲノムにおいて欠失するか又は天然には存在しない場合があり、その結果、産生細菌のゲノムのCasにより媒介される切断は、PLPの産生の間には起こらない。
【０２０１】
方法及び結果:
産生株として、本発明者らは、ヘルパーファージM13KO7(図1_X)に対するレセプターを発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株MG1655を使用し、一方、レセプター(図1_Y)を受容しない株系列を対照とした。レセプターは、New England Biolabsから入手したプラスミドpCJ105から発現したF-pilusであった。両方の株をCGV(図1_3)で形質転換し、CGV-PLPの産生のためにヘルパーファージM13KO7に感染させた。
【０２０２】
系列Xでは、レセプターの存在によりCGV-PLP溶菌液が生成されたが、系列Yでは、溶菌液は生成されなかった(図1_4)。得られた溶菌液は、産生株に関連し、ファージレセプターを保有する異なる標的集団に、CGVを送達することができることを示した(図1_5及び図2)。対照株系列は、CGV-PLPを産生せず、標的集団にCGVを送達することができなかった(図2)。
【０２０３】
【表５】
2020529853.tif 000026
【０２０４】
【表６Ａ】
2020529853.tif 000027
【０２０５】
【表６Ｂ】
2020529853.tif 000028
【０２０６】
【表６Ｃ】
2020529853.tif 000029
【０２０７】
【表６Ｄ】
2020529853.tif 000030
【０２０８】
【表６Ｅ】
2020529853.tif 000031
【０２０９】
【表７−１】
2020529853.tif 000032
【表７−２】
2020529853.tif 000033
【表７−３】
2020529853.tif 000034
【表７−４】
2020529853.tif 000035
【表７−５】
2020529853.tif 000036
【表７−６】
2020529853.tif 000037
【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表７−２３】
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【表７−２４】
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【表７−２５】
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【表７−２６】
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【表７−２７】
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【０２１０】
[参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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