(57)【要約】  本発明は、組織特異的抗炎症性マクロファージのｅｘ  ｖｉｖｏで作製された集団ならびにこのようなマクロファージを作製および使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症性マクロファージを作製する方法であって、
ＣＤ１４+細胞が、抗炎症性マクロファージ表現型を獲得するまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１４+細胞を、組織特異的細胞または組織特異的細胞外因子とともに同時培養するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
組織特異的細胞が、心臓線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組織特異的細胞外因子が、心臓組織に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組織特異的細胞外因子が、エキソソーム、微小胞および細胞外マトリックスからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって製造された抗炎症性マクロファージの集団。
【請求項６】
ＣＤ１４+細胞が単球である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組織特異的細胞が、骨髄細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脳細胞、内分泌細胞および生殖器に由来する細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組織特異的細胞外因子が、エキソソーム、微小胞および細胞外マトリックスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法によって製造された抗炎症性マクロファージの集団であって、ＣＤ１６３低、ＣＤ２０６高、ＣＤ１６低、ＰＤ−Ｌ１高、ＰＤ−Ｌ２高、ＴＧＦ−β高、ＴＮＦ−α低、ＩＬ−６高、ＩＬ−１０高、ＩＬ−１ｂ高およびセルピン−１高の心臓線維芽細胞エキソソームによって教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＥＭ）を含む、集団。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によって製造された抗炎症性マクロファージの集団であって、ＣＤ１６３低、ＣＤ２０６高、ＣＤ１６低、ＰＤ−Ｌ１高、ＰＤ−Ｌ２高、ＴＧＦ−β高、ＴＮＦ−α低、ＩＬ−６高、ＩＬ−１ｂ高およびセルピン−１高の骨髄エキソソームによって教育されたマクロファージ（ＢＭ−ＥＥＭ）を含む、集団。
【請求項１１】
それを必要とする対象において状態を軽減するための治療の方法であって、対象に、請求項９に記載のマクロファージの集団を投与するステップを含み、状態が、心血管疾患である、方法。
【請求項１２】
マクロファージの集団を、注射によって投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
マクロファージの集団を、局所適用によって投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
状態が、虚血性心不全である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
マクロファージを、医薬上許容される担体とともに注射によって投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
担体が、注射用心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項９に記載のマクロファージの集団と
医薬上許容される担体と
を含む、組成物。
【請求項１８】
担体が、液体、オイル、ローション、軟膏、クリーム、フォーム、ゲル、ペースト、パウダー、フィルムおよびヒドロゲルからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
担体が、注射用心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
ＣＦ−ＥＣＭが、心臓線維芽細胞由来エキソソームをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月３１日に出願されたオランダ特許出願番号第２０１８６２８号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患は、米国および先進国における最も一般的な死亡の原因である。ヒト心臓は、心筋梗塞（ＭＩ）後に生存組織および収縮機能の喪失を被り、心不全、再発入院、不整脈および死亡につながる。虚血性心不全は、約５００万人の米国人に影響を及ぼし、米国における最も一般的な入院の理由である。これらの患者では、死亡率が高く、進行がんの死亡率と同様に高い。標準療法は、不適応性神経ホルモン経路をブロックする、βアドレナリン作動性およびアンジオテンシンＩＩ阻害性薬物療法を含むが、これらの薬物は、部分的に有効であるだけであり、普遍的に許容されるわけではない。左室補助装置および心臓移植が提供されることがあるが、装置故障、卒中、感染および臓器不足がこれらのアプローチを制限している。ＶＥＧＦまたは遺伝子転写因子などの個々の血管新生および心臓再生タンパク質の局所投与は、ヒト心血管疾患治験において、徹底的に失敗するか、または予期しない毒性を作り出し、これらのアプローチを使用するさらなる調査は事実上中断された。
【０００３】
残念ながら、心臓は、制限された潜在的再生力しか有していない。伝統的な心臓再生の努力は、成体心臓細胞を補充するために幹細胞を投与することに焦点が合わされてきた。心臓および血管細胞を補充するために、目が回るほどの幹／前駆体細胞候補のアレイが試験されてきたが、今日までに、ヒト治験は、陰性であったか、またはわずかに陽性の結果しか示さなかった。２０年間の調査にもかかわらず、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された細胞ベースの療法は、まだない。
ほとんどの炎症細胞が、心臓虚血性損傷の後期段階において有害な作用を有することは、広く理解されている。しかし、代替活性化（Ｍ２）マクロファージは、これらのＭ２応答は本来鈍らされているが、後期心臓修復において有益な役割を有することが最近示唆された。
【０００４】
分類の種々のカテゴリーが提案されているが、マクロファージは、通常、古典的活性化（Ｍ１）および代替活性化（Ｍ２）マクロファージに分けられる（Martinez et al., Annu. Rev. Immunol. 27:451-483 (2009)）。一般に、Ｍ１マクロファージは、感染および組織損傷時に活性であり、１型ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ１）応答を暗示する強力な抗微生物特性を示す炎症促進性スカベンジャー細胞である。Ｍ１マクロファージのマーカーとして、それだけには限らないが、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。対照的に、代替活性化マクロファージとも呼ばれるＭ２マクロファージは、２型ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ２）様応答を促進し、炎症性促進性の低いサイトカインを分泌し、栄養因子合成および食作用による炎症の消散を補助する、抗炎症性、血管新生促進性、および再生促進性「治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）」細胞である（Mosser et al., Nature Rev. 8:958-969 (2008)）。Ｍ２マクロファージのマーカーとして、それだけには限らないが、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６およびＰＤ−Ｌ１が挙げられる。
マクロファージを、炎症および治癒の異なる段階と関連する異なる表現型を想定するために、その微小環境によって極性化することができる（Stout et al., J. Immunol. 175:342-349 (2005)）。ある特定のマクロファージは、創傷治癒にとって不可欠である。それらは、細胞補充の、および組織防御の初期段階ならびに組織ホメオスタシスおよび修復の後期段階に関与している（Pollard, Nature Rev. 9:259-270 (2009)）。末梢血単球由来のマクロファージは、難治性潰瘍を治療するために使用されてきた（Danon et al., Exp. Gerontol. 32:633-641 (1997); Zuloff-Shani et al., Transfus. Apher. Sci. 30:163-167 (2004)）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、ＣＤ１６３低、ＣＤ２０６高、ＣＤ１６低、ＰＤ−Ｌ１高、ＰＤ−Ｌ２高、ＴＧＦ−β高、ＴＮＦ−α低、ＩＬ−６高、ＩＬ−１０高、ＩＬ−１ｂ高およびセルピン−１高の心臓線維芽細胞エキソソームによって教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＥＭ）の集団が、本明細書において提供される。
第２の態様において、ＣＤ１６３低、ＣＤ２０６高、ＣＤ１６低、ＰＤ−Ｌ１高、ＰＤ−Ｌ２高、ＴＧＦ−β高、ＴＮＦ−α低、ＩＬ−６高、ＩＬ−１ｂ高およびセルピン−１高の骨髄エキソソームによって教育されたマクロファージ（ＢＭ−ＥＥＭ）の集団が、本明細書において提供される。
【０００６】
第３の態様では、それを必要とする対象において状態を軽減するための治療の方法が本明細書において提供され、方法は、対象に、本明細書において記載されるようなマクロファージの集団を投与するステップを含み、状態は、本明細書において記載される疾患または損傷である。いくつかの実施形態では、マクロファージの集団を、注射によって投与する。いくつかの実施形態では、マクロファージの集団を、局所適用によって投与する。いくつかの実施形態では、状態は、心血管疾患である。いくつかの実施形態では、状態は、虚血性心不全である。
いくつかの実施形態では、マクロファージを、医薬上許容される担体とともに注射によって投与する。いくつかの実施形態では、担体は、注射用心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックスである。
第４の態様では、本明細書において記載されるようなマクロファージの集団と、医薬上許容される担体とを含む、組成物が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、担体は、液体、オイル、ローション、軟膏、クリーム、フォーム、ゲル、ペースト、パウダー、フィルムおよびヒドロゲルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、担体は、注射用心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）である。いくつかの実施形態では、ＣＦ−ＥＣＭは、心臓線維芽細胞由来エキソソームをさらに含む。
【０００７】
第５の態様では、抗炎症性マクロファージを作製する方法が本明細書において提供され、方法は、ＣＤ１４+細胞が、抗炎症性マクロファージ表現型を獲得するまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１４+細胞を組織特異的細胞または組織特異的細胞外因子とともに同時培養するステップを含む。
いくつかの実施形態では、組織特異的細胞は、心臓線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞外因子は、心臓組織に対して特異的である。
いくつかの実施形態では、細胞外因子は、エキソソーム、微小胞および細胞外マトリックスからなる群から選択される。
第６の態様では、本明細書において記載される方法によって製造された抗炎症性マクロファージの集団が本明細書において提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１４+細胞は、単球である。いくつかの実施形態では、組織特異的細胞は、骨髄細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脳細胞、内分泌細胞および生殖器に由来する細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組織特異的細胞外因子は、エキソソーム、微小胞および細胞外マトリックスからなる群から選択される。
本発明は、より良好に理解され、以下のそれらの詳述を考慮すると特徴、態様および上記のもの以外の利点が明らかとなろう。このような詳述は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、分泌細胞からレシピエント細胞への種々の種類の細胞外小胞（ＥＶ）の形成、放出および取り込みの図である。より大きな微小胞は、細胞膜から直接出芽するが、エキソソームは、細胞膜の内部移行から最初に形成され、エンドソームを生成する異なる大きさのより小さい小胞である。続いて、エンドソーム膜の部位の陥入によってエンドソームの内側に多数の小さい小胞が形成される。このようなエンドソームは、多小胞体（ＭＶＢ）と呼ばれる。最後に、ＭＶＢは、細胞膜と融合し、細胞外間隙中に内腔内エンドソーム小胞を放出してエキソソームになる。エキソソーム内腔において、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および他の非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含めて、タンパク質および種々の核酸が最近同定された。これらの内部構成成分は、隣接細胞または遠位細胞によって取り込まれ、レシピエント細胞表現型および活性を調節し得る。画像供給源：Lieff, J. 「Vesicle Transport Information」、Searching for the Mind, January 19, 2014, jonlieffmd.com.
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ＩＺＯＮナノ粒子システムを使用するエキソソーム大きさ分布特徴を示す図である。（Ａ）は、間葉系幹細胞エキソソームの特性決定を示し、２．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、６１．８ｎｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度、１２３ｎｍの平均粒径、９３ｎｍのモード粒径および６．０×１０11個粒子／ｍｌの濃度を有する。（Ｂ）は、心臓線維芽細胞エキソソームの特性決定を示し、２５μＬの容量、０．１７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、１３．６ｎｇ／μｌのＲＮＡ濃度、１．４５のＡ２６０／２８０、１６５．９ｎｍの平均粒径および３．２×１０11個粒子／ｍｌの濃度を有する。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、（Ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームおよび（Ｂ）心臓線維芽細胞（ＣＦ）エキソソームの透過型電子顕微鏡像を示す。各調製物の数マイクロリットルを、ＦｏｒｍｖａｒＥＭグリッド上にスポットし、乾燥させ、ＰＢＳで洗浄し、次いで、酢酸ウラニルを用いて染色した。大きさに基づいて、ＭＳＣまたはＣＦによって放出されたＥＶのほとんどは、エキソソームの大きさ範囲内である。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、間葉系幹細胞エキソソームによる内皮細胞への親油性色素移動によるエキソソーム機能性の試験を表す図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｊは、骨髄および心臓線維芽細胞由来のエキソソームで教育されたマクロファージの表面マーカープロファイルを示す図である。発現プロファイルマーカーのレベルは、マクロファージ（対照）を、単球の、ＢＭ−ＭＳＣとの（ＢＭ−ＭＥＭ）、骨髄由来のエキソソームとの（ＢＭ−ＥＥＭ）、または心臓線維芽細胞由来のエキソソームとの（ＣＦ−ＥＥＭ）同時培養によって生じた教育されたマクロファージと比較するフローサイトメトリーによって測定した。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、骨髄由来のエキソソーム（ＢＭ−ＥＥＭ）または心臓線維芽細胞由来のエキソソーム（ＣＦ−ＥＥＭ）を用いて教育されたマクロファージのＭ１表面マーカープロファイルを示す図である。Ｍ１発現プロファイルマーカーのレベルは、マクロファージ（対照）を、単球の、ＢＭ−ＭＳＣとの（ＢＭ−ＭＥＭ）、または骨髄由来のエキソソームとの（ＢＭ−ＥＥＭ）、または心臓線維芽細胞由来のエキソソームとの（ＣＦ−ＥＥＭ）同時培養によって教育されたマクロファージと比較するフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ８６平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＢＭ−ＥＥＭと比較してＣＦ−ＥＥＭにおいて統計的により低い。ＣＤ８６は、Ｔ細胞活性化の同時刺激性シグナルであり、ＨＬＡ−ＤＲは、Ｔ細胞受容体のリガンドである。
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、ＢＭ−ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＢＭ−ＥＥＭ）またはマクロファージ由来のエキソソーム（マクロファージ−ＥＥＭ）との同時培養によって教育されたマクロファージにおいて基準Ｍ２表面マーカー発現を比較する図である。マクロファージ由来のエキソソーム培養は、マクロファージにおいてＭ２表現型を誘導しない。
【図８】図８は、心臓線維芽細胞細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）によって教育されたマクロファージにおけるＣＤ２０６の発現を示す図である。
【図９】図９は、ｑＰＣＲによって測定される種々のサイトカインの遺伝子発現の相違を表す図である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、未刺激Ｔ細胞の、マクロファージまたはＢＭ−ＥＥＭのいずれかとの同時培養を表す図である。ＢＭ−ＥＥＭは、Ｔ細胞の活性化および増殖を引き起こさない。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＢＭ−ＥＥＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  機能アッセイを表す図である。Ｔ細胞活性化後、ＭＳＣは、Ｔ細胞増殖を抑制するとわかっている。ＢＭ−ＥＥＭは、未教育マクロファージよりも抑制性である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、心臓細胞外マトリックスとともに送達されたＣＦ−ＥＥＭが、心筋梗塞後の心臓機能を有意に改善することを示す図である。心筋梗塞後の偽およびＣＦ−ＥＥＭ／マトリックス処置ラット間の比較は、収縮期圧の有意な改善、有害なリモデリングの低減および心収縮性の増大（収縮終期圧容量関係、ＥＳＰＶＲとして測定される）を実証する。白色矢印によって示されたように、処置動物において梗塞領域（瘢痕）内で有意な血管新生が観察された。
【図１３】図１３は、種々の炎症促進性および抗炎症性マーカーのＢＭ−ＭＥＭ対ＢＭ−ＥＥＭにおけるｑＰＣＲ遺伝子発現を比較する図である。２セット間の相違比較倍数を実証するために、ＢＭ−ＭＥＭにおける発現レベルを、１の値に設定した。
【図１４】図１４は、種々の炎症促進性および抗炎症性マーカーのＢＭ−ＥＥＭ、ＣＦ−ＥＥＭおよび未教育マクロファージ（対照）におけるｑＰＣＲ遺伝子発現を比較する図である。３セットすべての間の相違比較倍数を実証するために、対照マクロファージにおける発現レベルを、１の値に設定した。
【図１５】図１５は、心臓線維芽細胞特性決定を示す図である。心臓線維芽細胞は、独特の表面マーカーおよび内部マーカー表現型を有する。ヒト心臓線維芽細胞は、ＭＳＣおよび皮膚線維芽細胞と比較して、フローサイトメトリー分析によってＣＤ９０、ＣＤ３４、ＳＵＳＤ２、ｗ６７ｃおよびＴＮＡＰを異なって発現する。さらに、心臓線維芽細胞はまた、ＧＡＴＡ４も発現し、これは、ＭＳＣまたは皮膚線維芽細胞では発現されない。
【図１６】図１６は、心臓線維芽細胞細胞外小胞の特性決定を示す図である。タンパク質決定および直接吸光度によるおよそのＲＮＡ濃度について、Ｔｈｅｒｍｏ  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して心臓線維芽細胞エキソソームを特性決定した。測定に先立って、エキソソームを溶解せず、染色せず、またはＲＮＡ抽出しなかった。粒径および濃度を、４７ｍｍストレッチのＮＰ１５０ナノポアメンブレンを使用する調整可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ；（ｑＮａｎｏ、Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ）によって評価した。１．１×１０13個粒子／ｍＬの濃度の１１０ｎｍカルボキシル化ポリスチレンビーズを用いるマルチ圧力較正を使用して、粒子の濃度を標準化した。
【図１７】図１７は、心臓線維芽細胞全ＲＮＡ単離を示す図である。心臓線維芽細胞由来のエキソソームを、ＳｅｒａＭｉｒ  ＥｘｏｓｏｍｅＲＮＡ  ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＣｏｌｕｍｎキット（カタログ番号ＲＡ８０８Ａ−１、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、パロアルト）を製造業者の使用説明書に従って使用して全ＲＮＡ単離のために処理した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００  Ｅｘｐｅｒｔ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙによる小ＲＮＡ濃度の測定のために、各サンプルについて、１μｌの最終ＲＮＡ溶出液を使用した。３人のドナーに由来する心臓線維芽細胞エキソソームを、類似性についてＲＮＡシーケンシングによって比較した。手短には、ＲＳＥＭを使用して、各サンプルにおいて遺伝子あたりの予測されたカウントを推定した。３種のサンプルすべてにおいて少なくとも１つの予測されたカウント（遺伝子あたり）を有していた遺伝子のみを維持しながら、カウントをフィルタリングした。次いで、ＴＭＭ（平均値のトリム法）をコンピュータで計算して、カウントを正規化した。３サンプルにわたって各遺伝子の、コンピュータで計算された１００万あたりのカウント（ＣＰＭ）、次いで、変動係数（ＣＶ＝標準偏差／平均）を算出した。最後に、経路濃縮分析を実施して、３サンプルにわたって高度に保存されている遺伝子が、エフェクター細胞に影響を及ぼすと予測される方法を決定した。結果は、心臓線維芽細胞エキソソームにおいて一般的であり、高度に発現される経路および遺伝子を実証する。
【図１８】図１８は、ＣＦ−ＥＥＭセクレトームサイトカイン分析特性決定を示す図である。ＣＦ−ＥＥＭは、非刺激マクロファージ（ＰＢＳ）および骨髄ＥＥＭ（ＢＭ−ＥＥＭ）と比較して独特のセクレトームを有する。ＣＦ−ＥＥＭは、対照マクロファージ（ＰＢＳ）またはＢＭ−ＥＥＭＳと比較してＥＧＦを分泌するが、ＢＭ−ＥＥＭは、ＣＦ−ＥＥＭおよび対照マクロファージと比較して有意により多いＧＲＯを分泌する。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭの特性決定を示す。ヒトマクロファージを、プラスチック、ゼラチンまたはＣＦ−ＥＣＭ上で３日間培養し、次いで、表面から回収し、フローサイトメトリーを使用して、表面マーカー発現を分析した。マクロファージは、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６およびＰＤＬの有意により高い発現を有していた（平均蛍光強度によって）（図１９Ｃ）。さらに、マクロファージは、炎症マーカーＣＤ６８およびＨＬＡ−ＤＲの有意により低い発現を有していた（図１９Ｂ）。心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）（またはＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭ）で培養されたマクロファージは、独特の抗炎症性表現型を有する。ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭは、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの有意により低い発現を有するが、ＰＤＬ−１発現は有意に増大される（図１９Ａおよび１９Ｃ）。ＰＤＬ−１は、免疫系の抑制において主要な役割を果たすと考えられる。
【図２０】図２０は、組織特異的マクロファージを作製および使用する橋渡し経路を表す。組織供給源を同定すると（Ａ）、線維芽細胞、組織前駆体細胞および他のものなどの細胞を、生検もしくは臓器調達を使用して回収するか、または多能性幹細胞から分化させる（Ｂ）。組織特異的細胞または組織特異的細胞由来の細胞外因子、例えば、エキソソーム、微小胞および細胞外マトリックス（Ｃ）を、単球またはマクロファージと同時培養して、修復促進性（pro-reparative）、血管新生性、抗炎症性および炎症調節性表現型を有する組織特異的な教育されたマクロファージ（Ｄ）を作製する。組織特異的な教育されたマクロファージは、独特のサイトカイン、ＲＮＡ、表面マーカーおよび機能的発現により、表現型的および機能的に独特であると予測される。これらの組織特異的な教育されたマクロファージを、治療を必要とする対象に、全身にまたは損傷を受けた組織中に直接的に送達することができる。送達方法として、静脈内注入、血管内注入、経皮注射、外科的注射、局所投与または本明細書において記載される任意のその他の送達方法を挙げることができる。組織特異的な教育されたマクロファージは、さまざまな動物モデル（Ｅ）および臨床適用（Ｆ）において実証されるように、組織特異的に損傷を受けた組織を回復させると予測される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、抗炎症性の組織特異的な教育されたマクロファージならびにこのようなマクロファージを作製および使用する方法に広く関する。
【００１１】
本発明の一態様では、ＣＤ１４+単球またはマクロファージを、組織特異的細胞または細胞外因子と同時培養して、組織特異的な教育されたマクロファージを生成する。教育されたマクロファージのそれを必要とする対象への投与によって疾患を治療または予防するために、本発明の方法によって作製された教育されたマクロファージを使用してもよい。
【００１２】
本明細書において、「教育されたマクロファージ（ｅｄｕｃａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）」とは、ＣＤ１４+単球またはマクロファージを、組織特異的細胞と、または細胞外因子と同時培養することによってｅｘ  ｖｉｖｏで作製された組織特異的抗炎症性および組織修復性マクロファージを指す。この種の同時培養によって作製された教育されたマクロファージは、一般に、教育されていないマクロファージと比較してＣＤ１６３低、ＣＤ２０６高、ＣＤ１６低、ＰＤ−Ｌ１高、ＰＤ−Ｌ２高、ＴＧＦ−β高、ＴＮＦ−α低およびＩＬ−１ｂ高と特性決定される。特徴的なマーカーのレベルは、フローサイトメトリー、遺伝子発現分析または当技術分野で公知の他の手段によって測定できる。一実施形態では、教育されたマクロファージは、心臓細胞に対して特異的であり、ＣＤ１４+単球またはマクロファージを、心臓特異的細胞または細胞外因子と同時培養することによって作製される。一実施形態では、教育されたマクロファージは、骨髄細胞に対して特異的であり、ＣＤ１４+単球またはマクロファージを、骨髄特異的細胞または細胞外因子と同時培養することによって作製される。
【００１３】
同時培養
ＣＤ１４+細胞を、特異的組織から得た細胞（「組織特異的細胞（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌｓ）」）と、または組織特異的細胞外因子と同時培養して、教育されたマクロファージを生成する。ＣＤ１４+細胞を、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と同時培養して、ＭＳＣによって教育されたマクロファージ（本明細書において、ＢＭ−ＭＥＭと呼ばれる）を作製する方法は記載されている。両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６４７，６７８号および米国特許公開番号第２０１６／００８２０４２号を参照のこと。
【００１４】
ＣＤ１４+細胞を、同時培養構成成分の生存および成長に適した当技術分野で公知の任意の培養培地で、組織特異的細胞または組織特異的細胞外因子とｅｘ  ｖｉｖｏで同時培養する。教育されたマクロファージを作製するために、同時培養を０〜２８日間維持してもよい。同時培養は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２３、２５日後または２６日より多くの後、所望の免疫表現型を有する教育されたマクロファージをもたらし得る。いくつかの実施形態では、同時培養は、１０日後に教育されたマクロファージを生成する。いくつかの実施形態では、同時培養は、５日後に教育されたマクロファージを生成する。一実施形態では、同時培養は、１日後に教育されたマクロファージを生成する。
いくつかの場合には、組織特異的細胞または組織特異的細胞外因子を、教育されたマクロファージを得るための同時培養において使用するのに先立ってさらなる精製ステップに付す。組織特異的細胞または細胞外因子は、教育されたマクロファージを作製するために、ＣＤ１４+培養物に単回用量で添加しても、反復用量で添加してもよい。
【００１５】
本発明の同時培養のために、単球またはマクロファージを、細胞が直接的物理的接触をするように組織特異的細胞または組織特異的細胞外因子と同時培養できる。あるいは、同時培養構成成分を、流体連結しているが、半透膜によってわけられているサブコンパートメント中に入れることができる。半透膜は、可溶性培地構成成分および細胞によって分泌された因子の交換を可能にするが、細胞自体は透過できない。半透膜内の孔は、細胞透過を予防するように十分に小さいが、可溶性培地構成成分が膜を通過するのを可能にするように十分に大きく、通常、０．１〜１．０μｍの間であるが、他の孔の大きさが適している場合もある。
細胞分離および単離の種々の方法が当技術分野で公知であり、単離された細胞集団の所望の純度などの因子に応じて、組織特異的細胞および組織特異的細胞外因子から教育されたマクロファージを分離するために使用できる。例えば、フローサイトメトリーまたは磁性ベースの選別を使用して、教育されたマクロファージを同時培養物から単離できる。教育されたマクロファージは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージを支持する任意の培地中の培養物で維持できる。また、それだけには限らないが、冷蔵、凍結保存、ガラス化、凍結乾燥および不死化を含む当技術分野で公知の方法を使用して、教育されたマクロファージを保存できる。
【００１６】
本明細書において、「ＣＤ１４+細胞」とは、単球またはマクロファージを指す。ＣＤ１４+細胞は、任意の適した供給源に由来し得る。当業者ならば、同時培養のために末梢血単球からマクロファージを作製する有利な効率を理解するであろう。あるいは、マクロファージは、個体から採取した組織サンプルの細胞増殖から単離することもできる。末梢血単球を、同時培養の前に種々の時間、および種々の条件下で培養してもよく、または同時培養物にエキソソームもしくは細胞外マトリックスを直接添加してもよい。一実施形態では、単球を、白血球除去によって対象から回収する。一実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を末梢血から単離する。一実施形態では、細胞を末梢血に動員するために、それだけには限らないが、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびモゾビル（商標）（プレリキサホル注射）などを含む薬剤を用いて最初に処置されている患者の末梢血から、ＣＤ１４＋細胞を単離する。一実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を、Ｇ−ＣＳＦ刺激を用いて末梢血から単離する。一実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を、骨髄吸引液から単離する。一実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を、組織または心臓などの臓器から単離する。一実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を、胚幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などの多能性幹細胞から誘導する。
本明細書において、「マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）」とは、ＣＤ１４の発現および樹状細胞または間葉系細胞マーカーの発現がないことを特徴とする単核食細胞を指す。
本明細書において、「単核白血球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）」または「単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）」は、組織に補充されるとマクロファージに分化でき、自然免疫系および適応免疫系両方に影響を及ぼすことができる白血球である。
【００１７】
本明細書において、「高（ｈｉｇｈ）」とは、細胞が、組織特異的細胞または細胞外因子を伴わずに培養された対照マクロファージと比較して、特定のサイトカインの高い発現を特徴とすることを意味する。例えば、「ＩＬ−６高（ＩＬ−６  ｈｉｇｈ）」は、組織特異的細胞または細胞外因子と同時培養されたマクロファージが、組織特異的細胞または細胞外因子と同時培養されていなかったマクロファージよりも高い量のＩＬ−６を発現することを示す。同様に「低（ｌｏｗ）」とは、細胞が特定のサイトカインのより低い発現を特徴とすることを意味する。例えば、「ＩＬ−１２低（ＩＬ−１２  ｌｏｗ）」は、組織特異的細胞または細胞外因子と同時培養されたマクロファージが、組織特異的細胞または細胞外因子と同時培養されていなかったマクロファージよりも低い量のＩＬ−１２を発現することを示す。「低（ｌｏｗ）」はまた、発現レベルが検出限界未満であることを意味し得る。
【００１８】
組織特異的細胞および細胞外因子
当業者ならば、本明細書において記載される方法において使用される単球、マクロファージ、組織特異的細胞および細胞外因子を、その生存および成長を支持する任意の培地で培養または同時培養できるということは理解されよう。一実施形態では、培地は、それだけには限らないが、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５およびＳＴＥＭＰＲＯ（商標）血清不含培地を含む血清不含培地である。一実施形態では、培地は、マクロファージ培地においてヒトＡＢ血清を置換するためにヒト血小板溶解物を使用する。同時培養は、サイトカインの添加を必要としない。組織特異的細胞、細胞外因子およびマクロファージは、互いに関して、自己、同系、同種異系または第三者サードパーティであり得る。
【００１９】
本明細書において、「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（ＭＳＣ）」とは、出生直後の個体の実質的にすべての組織内にある線維芽細胞様細胞を指す。当業者ならば、間葉系幹細胞またはＭＳＣと本明細書において呼ばれる細胞はまた、間葉系間質細胞、骨髄間質細胞、複能性間質細胞としても、おそらくは他の名称によっても当技術分野で公知であるということは理解するであろう。本開示の範囲内のＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化し得る任意の細胞である。本開示の範囲内のＭＳＣは、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子の発現を欠きながら、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０の発現について陽性である。（Dominici et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, (2006), Cytotherapy, 8(4):315-317）。これらのマーカーは、ほとんどの組織に由来するＭＳＣを特性決定すると知られているが、当技術分野では、いくつかの供給源に由来するＭＳＣが、細胞表面マーカー発現の相違を示し得ることが理解されている。骨髄内で、ＭＳＣは、造血幹細胞の間質支持組織を提供する。ＭＳＣは、間葉系系統の細胞に分化し得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣをＣＤ１４+細胞と同時培養して、ＭＳＣによって教育されたマクロファージを作製する（本明細書においてＭＥＭと呼ばれる）。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、組織特異的細胞は、骨髄間葉系幹細胞（本明細書においてＢＭ−ＭＳＣと呼ばれる）である。ＢＭ−ＭＳＣをＣＤ１４+細胞と同時培養して、骨髄特異的な教育されたマクロファージ（本明細書においてＢＭ−ＭＥＭと呼ばれる）を作製する。
本発明のいくつかの実施形態では、組織特異的細胞は、心臓線維芽細胞細胞（本明細書においてＣＦと呼ばれる）である。ＣＦを、ＣＤ１４+細胞と同時培養して、心臓線維芽細胞によって教育されたマクロファージ（本明細書においてＣＦ−ＥＭと呼ばれる）を作製する。
【００２１】
本発明の方法または組成物において使用するためのＣＦ、ＭＳＣ、ＢＭ−ＭＳＣおよび本明細書において記載される他の細胞は、任意の適した供給源から導くまたは単離することができる。一実施形態では、ＣＦを、ドナー心臓組織から単離する。一実施形態では、ＣＦを、本明細書において記載されるような疾患または損傷を有する患者から生検する。一実施形態では、ＣＦは、胚性または人工多能性幹細胞から分化する。一実施形態では、ＭＳＣを、心臓組織から単離する。一実施形態では、ＭＳＣを、骨髄および肺組織などの組織から単離する。一実施形態では、ＭＳＣは、胚性または人工多能性幹細胞から分化する。
【００２２】
本明細書において、「細胞外因子（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｃｔｏｒｓ）」とは、細胞外小胞、エキソソーム、微小胞、細胞外マトリックス組成物、単離された細胞外マトリックス構成成分およびそれらの断片または誘導体、細胞外マトリックスから精製されたエキソソームおよびそれらの組合せを指す。細胞外因子をＣＤ１４+細胞との同時培養において使用して、組織特異的にマクロファージを教育する。組織特異的細胞外因子は、対象の特定の組織に由来する細胞について由来するか、または単離される。本明細書において、「細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）」とは、エキソソームおよび微小胞の両方を指す。
【００２３】
本明細書において、「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」とは、さまざまな細胞型によって放出される小脂質小胞を指す。エキソソームは、内向き出芽または逆向き出芽によって生成し、結果として、サイトゾルおよび特定の膜結合性タンパク質の露出された細胞外ドメインを含有する粒子が得られる（Stoorvogel et al.,Traffic 3:321-330 (2002)）。細胞からエキソソームを調製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Raposo et al., J. Exp. Med. 183:1161 (1996)を参照のこと。一方法では、エキソソームを、馴化培養培地から遠心分離によって回収する。本発明のいくつかの実施形態では、エキソソームをマクロファージと同時培養して、エキソソームが由来する組織に対して特異性の増大した、組織特異的な教育されたマクロファージを作製する。本方法において使用するのに適したエキソソームは、新たに誘導されてもよく、または組成物として維持され、解凍され、かつ教育されたマクロファージを作製するためにＣＤ１４+培養物に単回用量もしくは反復用量で添加されるような、先に凍結されていたアリコートであってもよい。いくつかの実施形態では、エキソソーム調製物はまた、微小胞を含み得る。いずれか特定の理論に捉わることを望まないが、組織特異的エキソソームは、起源の組織にターゲッティングされる組織特異的な教育されたマクロファージをもたらし得るその起源の組織の表面マーカーを発現すると知られていることが理解される。対象の組織、例えば、修復のためにターゲッティングされる、損傷を受けた組織に由来するエキソソームは、対象の組織に対して特異的である、前記組織の修復のために優れている、組織特異的翻訳因子または翻訳後因子、内部核酸およびタンパク質を含有する可能性が高い。
【００２４】
エキソソームは、それだけには限らないが、約１０〜３００ｎｍの直径を有し得る。いくつかの実施形態では、エキソソームは、それだけには限らないが、２０〜２５０ｎｍ、３０〜２００ｎｍまたは約５０〜１５０ｎｍの間の直径を有し得る。エキソソームは、単離し、エキソソームの単離にとって適当な一定期間、培養できる対象の標的組織中にある任意の細胞型から単離または誘導してもよい。
【００２５】
一実施形態では、エキソソームを、骨髄間葉系幹細胞から誘導する。骨髄ＭＳＣから誘導されたエキソソームを、ＣＤ１４+細胞と同時培養して、骨髄エキソソームによって教育されたマクロファージを作製する（本明細書においてＢＭ−ＥＥＭと呼ばれる）。フローサイトメトリーによってＭＥＭの外表面マーカーをＢＭ−ＥＥＭに対して比較する場合に、ＢＭ−ＥＥＭは、ＣＤ１６３およびＣＤ１６低ならびにＣＤ２０６、ＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２高である。ｑＰＣＲによって遺伝子発現を比較する場合には、ＢＭ−ＥＥＭは、ＭＥＭと比較して、ＴＧＦ、ＴＮＦおよびＩＬ１ｂ高ならびにＩＬ６、セルピンおよびＶＥＧＦ低である。
一実施形態では、エキソソームは、心臓線維芽細胞に由来する（本明細書においてＣＦ−ＥＶと呼ばれる）。ＣＦ−ＥＶをＣＤ１４+細胞と同時培養して、心臓線維芽細胞エキソソームによって教育されたマクロファージを作製する（本明細書においてＣＦ−ＥＥＭと呼ばれる）。
【００２６】
フローサイトメトリーによってＭＥＭの外表面マーカーをＢＭ−ＥＥＭに対して比較する場合に、ＢＭ−ＥＥＭは、ＣＤ１６３およびＣＤ１６低ならびにＣＤ２０６、ＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２高である。ｑＰＣＲによって遺伝子発現を比較する場合には、ＢＭ−ＥＥＭは、ＭＥＭと比較して、ＴＧＦ、ＴＮＦおよびＩＬ１ｂ高ならびにＩＬ６、セルピンおよびＶＥＧＦ低である。さらに、ＢＭ−ＥＥＭとＣＦ−ＥＥＭの発現プロファイル間に差異がある。フローサイトメトリーによってＢＭ−ＥＥＭプロファイルをＣＦ−ＥＥＭプロファイルに対して比較すると、ＣＤ２０６は、ＣＦ−ＥＥＭにおけるＣＤ１６と同様に、わずかにより低いが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤＬ−２は両方とも、ＢＭ−ＥＥＭと比較してより高い。ｑＰＣＲによる遺伝子発現においてもわずかな相違が見られ、ＩＬ−６の発現において最も顕著である。
【００２７】
【表１】
2020511999.tif 000002
【００２８】
一実施形態では、ＣＤ１４+細胞とともの同時培養において使用するために、エキソソームを、心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）内に埋め込むことができる。一実施形態では、ＣＦ−エキソソームを用いてＣＦ−ＥＣＭを飽和させることおよび組合せ材料を真空乾燥し、その結果、ＣＦ−ＥＣＭにおけるエキソソームの沈着が得られることによって、埋め込まれたマトリックスを作り出す。別の実施形態では、ＣＤ１４+細胞を心臓線維芽細胞細胞外マトリックスと同時培養して、心臓線維芽細胞細胞外マトリックスによって教育されたマクロファージを作製する（本明細書においてＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭと呼ばれる）。別の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を、心臓線維芽細胞細胞外マトリックスから単離されたエキソソームと同時培養して、心臓線維芽細胞ＥＣＭエキソソーム教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭ）を作製する。
【００２９】
本明細書において、「心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）」とは、心筋疾患または損傷後に治癒する心臓組織に特有の心臓線維芽細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ３次元細胞外マトリックスと実質的に類似であるが、必ずしも同一ではない３次元マトリックスを指す。実質的類似性は、ＥＣＭ中に存在する構造タンパク質の種類および存在量に、ならびに増殖因子およびサイトカインなどの特徴的なマトリックス細胞タンパク質の存在に基づく。いくつかの実施形態では、ＣＦ−ＥＣＭは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８０２，１４４号および米国特許公開番号第ＵＳ２０１６／０３５４４４７号に記載されるような遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭである。
【００３０】
遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭは、構造タンパク質フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩＩ型およびエラスチンならびに他の構造タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭは、構造タンパク質コラーゲンＶ型を含む。好ましくは、フィブロネクチン分子は、遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭ中に存在する構造タンパク質分子の６０％〜９０％または７０％〜９０％または８０％〜９０％を構成する。
遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭは、断片化される、または凍結乾燥される前に、２０〜５００μｍの厚みを有する。いくつかの実施形態では、断片化されていないＣＦ−ＥＣＭは、３０〜２００μｍの、または５０〜１５０μｍの範囲の厚みを有する。いくつかの実施形態では、構造タンパク質分子の８０％超がフィブロネクチン分子である。
好ましくは、遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭの構造タンパク質は、化学的に架橋されない。
【００３１】
構造タンパク質に加えて、ＣＦ−ＥＣＭは、増殖因子およびサイトカインなどの１種または複数のマトリックス細胞タンパク質ならびに他の物質を含み得る。心臓ＥＣＭにおいて見ることができる他のタンパク質の限定されない例として、潜在型トランスフォーミング増殖因子β１（ＬＴＧＦβ−１）、潜在型トランスフォーミング増殖因子β２（ＬＴＧＦβ−２）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、酸性およびシステインが豊富な分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、バーシカンコアタンパク質（ＶＣＡＮ）、ガレクチン１、ガレクチン３、マトリックスｇｌａタンパク質（ＭＧＰ）、硫酸化糖タンパク質１、タンパク質−リシン６−オキシダーゼおよびバイグリカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ−１）、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦβ−３）、上皮成長因子様タンパク質８、成長／分化因子６、グラニュリン、ガレクチン３結合タンパク質、ナイドジェン１、ナイドジェン２、デコリン、プロラルギン、血管内皮細胞増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、フォンウィルブランド因子Ａ１、フォンウィルブランド因子Ａ５  Ａ、マトリックスメタロプロテアーゼ１４、マトリックスメタロプロテアーゼ２３、血小板因子４、プロトロンビン、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１およびグリア由来ネキシンのうち１種または複数を含んでもよい。
【００３２】
遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭは、脱細胞化され、無傷の心臓線維芽細胞細胞を実質的に欠いてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＦ−ＥＣＭを、心臓疾患または損傷にとって治療的である１種または複数の細胞とともに、当技術分野で公知である方法を使用して播種してもよい。ＣＦ−ＥＣＭバイオスキャフォールドを播種するために使用できる治療用細胞型の例として、制限するものではないが、ＣＦ、ＣＤ１４＋単球、マクロファージ、ＭＳＣ、ＣＦ−ＥＥＭ、ＢＭ−ＥＥＭ、ＢＭ−ＭＥＭ、ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭまたはそれらの組合せが挙げられる。
遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭを製造する方法およびその構造および組成に関する情報は、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８０２，１４４号および米国特許公開番号第ＵＳ２０１６／０３５４４４７号に開示されている。
【００３３】
治療
本発明の方法によれば、教育されたマクロファージをそれを必要とする対象に投与する。治療を必要とする対象として、本明細書において記載されるような疾患または損傷をすでに有しているものもしくは有すると診断されたものまたは本明細書において記載されるような疾患もしくは損傷を発生するリスクにあるものが挙げられる。
【００３４】
本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、異常な、制御されない、または不適当な炎症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と関連する状態ならびに成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）などのサイトカインストームと関連する他の障害を挙げることができる。ＣＲＳは、サイトカインの、血流への急速な大量の放出であり、これは、高熱および心臓機能障害につながることがあり、免疫療法薬の投与（例えば、治療用ｍＡｂ注入）後および養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞の投与）後に頻繁に観察される。免疫抑制は、サイトカインストームを逆転させ、サイトカインを正常レベルに戻す潜在的な可能性があるが、免疫療法の有効性を制限する可能性がある。本明細書において提供される方法は、ＣＲＳおよび他のサイトカイン関連毒性の命を脅かす合併症のリスクを最小にしながら、対象が免疫療法から治療的利益を受け取る機会を改善することが有利である。
心血管疾患は、それだけには限らないが、冠動脈心疾患、心不全関連状態（例えば、虚血性心筋症および浸潤性心筋症、炎症性心筋症、心筋炎、弁膜症性心筋症などの非虚血性心筋症）、駆出率が保たれた慢性虚血（例えば、アテローム性動脈硬化症による慢性狭心症）、急性冠動脈症候群などの亜急性心筋梗塞または亜急性心筋虚血、伝導障害および頻脈性不整脈などの不整脈関連状態を指し得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、および閉塞性細気管支炎などといった肺の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、末梢動脈疾患などといった脈管構造の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、移植片対宿主病、および骨髄不全などといった骨髄の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、火傷、外傷、虚血性潰瘍、および神経因性潰瘍などといった皮膚の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、糖尿病などの膵臓の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、硬変、および肝不全などといった肝臓の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、急性および慢性腎不全などの腎臓の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、卒中、神経変性、および神経発達疾患などといった脳の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、ホルモン欠乏症または内分泌器官炎症などの内分泌器官の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、それだけには限らないが、不妊症、ホルモン不均衡、閉経、および早期老化などといった生殖器の疾患または損傷が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の疾患または損傷として、正常ヒト老化プロセスと関連する老化または疾患または損傷が挙げられる。
【００３６】
本明細書において、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」および「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、治療的および防止的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）手段の両方を指すことができ、目的は、本明細書において記載されるような疾患または損傷に起因する望まれない生理学的変化または病理学的障害を予防する、または減速する（減らす）ことである。本発明の目的上、疾患または損傷を治療することは、制限するものではないが、１つまたは複数の臨床指標を軽減すること、炎症を減少させること、疾患または損傷の１つまたは複数の臨床指標の重症度を低減すること、状態の程度を減少させること、対象の疾患または損傷を安定化すること（すなわち、悪化しない）、疾患または損傷を遅延または減速、停止または逆転させることおよび疾患または損傷の部分または完全緩解を起こすことを含む。疾患または損傷を治療することはまた、教育されたマクロファージを用いる治療を組み込まない標準的な医療行為に従って治療された場合の予後と比較して、生存を数日、数週間、数ヶ月または数年延長することを含む。
【００３７】
治療を必要とする対象として、本明細書において記載されるような疾患または損傷をすでに有している、または有すると診断されたものならびに本明細書において記載されるような疾患または損傷の傾向がある、発生する可能性が高い、または有すると疑われるものを挙げることができる。本発明の方法に従って疾患または損傷を前処置することまたは予防することは、疾患もしくは損傷の出現もしくは存在の前の、または疾患もしくは損傷を誘導すると知られている因子に対する対象の曝露の前の時間で、治療薬（例えば、ヒトの教育されたマクロファージ）の投与を開始することを含む。障害を前処置することは、疾患損傷を有するまたは獲得するリスクにある対象に特に適用可能である。本明細書において、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、望まれない生理学的変化または疾患もしくは損傷をもたらす障害もしくは状態の発生を阻害するように意図される防止的または予防的手段を指す。例示的実施形態では、疾患または損傷を予防することは、疾患もしくは損傷またはその症状、病理学的特徴、結果もしくは有害作用が生じないように、疾患または損傷の出現または存在の前の時間で治療薬（例えば、教育されたマクロファージ）の投与を開始することを含む。このような場合には、疾患または損傷を予防するための本発明の方法は、疾患または損傷の発生に影響を及ぼす因子に対する対象の曝露の前に、教育されたマクロファージをそれを必要とする対象に投与することを含む。
【００３８】
本明細書において、用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、同義的に使用され、制限するものではないが、ヒト、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類を含む任意の脊椎動物を包含し得る。しかし、対象または患者は、ヒトなどの哺乳動物または飼い慣らされた哺乳動物などの哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、およびウマなど、または家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、およびブタなどであることが有利である。例示的実施形態では、対象はヒトである。本明細書において、語句「それを必要とする（ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、対象の状態を示し、治療的または予防的手段が望ましい。このような状態として、それだけには限らないが、本明細書において記載されるような疾患もしくは損傷または本明細書において記載されるような疾患もしくは損傷と関連している病理学的症状もしくは特徴を有する対象を挙げることができる。
【００３９】
いくつかの場合には、本明細書において記載されるような疾患または損傷を治療または予防する方法は、治療薬として（すなわち、治療的適用のために）治療上有効な量の教育されたマクロファージを含む医薬組成物を投与することを含む。本明細書において、用語「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、哺乳動物への投与に適した化学的または生物学的組成物を指す。このような治療的適用にとって適当な組成物の例として、非経口、皮下、経皮、皮内、筋肉内、冠状動脈内、心筋内、心膜内、腹腔内、静脈内（例えば、注射用）、実質内、くも膜下腔内または気管内投与のための調製物、例えば、滅菌懸濁液、エマルジョンおよびエアロゾルが挙げられる。気管内投与は、肺組織、例えば、肺胞を、治療上有効な量の教育されたマクロファージを、単独または組織特異的ＥＣＭもしくは細胞外小胞と組み合わせて含む医薬組成物に対して接触させることまたは曝露することを含み得る。いくつかの場合には、治療的適用にとって適当な医薬組成物は、１種または複数の医薬上許容される賦形剤、希釈剤または滅菌水、生理食塩水、もしくはグルコースなどといった担体との混合物中にある場合もある。例えば、本明細書において記載される教育されたマクロファージを、担体溶液を含む医薬組成物として対象に投与できる。
【００４０】
製剤は、経口、直腸、鼻腔、局所または経粘膜（頬側、舌下、眼内、経膣および経直腸を含む）および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球内、実質内、くも膜下腔内および硬膜外を含む）投与用に設計することができる、または意図することができる。一般に、水性および非水性液またはクリーム製剤は、非経口、経口または局所経路によって送達される。他の実施形態では、組成物は、任意の経路、例えば、経口、局所、頬側、舌下、非経口、エアロゾル、皮下デポーまたは腹腔内、実質内もしくは筋肉内デポーなどのデポーによる投与に適した水性もしくは非水性液体製剤または固体製剤として存在し得る。いくつかの場合には、医薬組成物を凍結乾燥する。他の場合には、本明細書において提供されるような医薬組成物は、投与の経路および所望の調製物に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加剤、保存料、香味剤、および着色料などといった補助物質を含有する。医薬組成物は、従来の薬務に従って製剤化できる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000, ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）。
【００４１】
好ましい経路は、例えば、対象の病状もしくは体重または療法に対する対象の応答または状況にとって適当であることによって変わり得る。製剤はまた、２つまたはそれより多い経路によって投与してもよく、送達方法は、組成物が対象に投与される時間において、本質的に同時であるか、またはわずかな時間的重複を有する、もしくは重複を有さず本質的に逐次であり得る。
初回投与およびさらなる用量の、または逐次投与の適したレジメンは可変であり、初回投与と、それに続くその後の投与を含み得るが、それにもかかわらず、熟練者によって本開示、本明細書において引用される文書および当技術分野における知識から確認することができる。
【００４２】
いくつかの場合には、教育されたマクロファージを、１種または複数のさらなる活性薬剤と組み合わせて投与してもよい。このような活性薬剤として、抗炎症性薬剤、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、解熱剤、抗生物質および抗ウイルス剤ならびに増殖因子およびアゴニスト、アンタゴニストおよび免疫調節剤のモジュレーター（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＨＲＧ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘプシジン、前記のもののいずれかに対して反応性の抗体およびそれらの受容体のいずれかに対して反応性の抗体を含む）が挙げられる。このような活性薬剤の任意の適した組合せも考慮される。１種または複数の活性薬剤と組み合わせて投与する場合には、教育されたマクロファージを、他の活性薬剤と同時にまたは逐次投与できる。例えば、虚血性心損傷の犠牲者は、一定時間の間、または虚血性心損傷の重症度の回復を支持する、および治療する、軽減するまたは減少させるのに十分な投与計画に従って、教育されたマクロファージおよびヘパリンなどの抗血栓剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤またはＰ２Ｙ１２阻害剤を同時に受け取ることができる。いくつかの実施形態では、本発明の教育されたマクロファージをまた、ステント、バイパス移植、補助装置または他の形態の細胞療法を同時に受け取っている患者に投与できる。いくつかの実施形態では、投与された細胞の生着、生存または機能を改善または増強するなどのために、教育されたマクロファージを、第２の細胞療法の投与に先立って、それと同時に、またはその後に投与する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、教育されたマクロファージを、注入、局所適用、外科的移植または留置を使用してそれを必要とする対象に投与する。例示的実施形態では、投与は全身である。このような場合には、教育されたマクロファージを、対象への静脈内投与に適応された医薬組成物でそれを必要とする対象に提供できる。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。このようなバッファーおよび希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。必要であれば、組成物はまた、注射部位の任意の疼痛を回復させるために局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、成分は、別個に、または単位投与形で、例えば、活性薬剤の量を指示するアンプルなどの密閉された容器中の低温保存濃縮物として一緒に混合されて供給される。組成物を注入によって投与する予定である場合には、滅菌医薬等級水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配できる。組成物を注射によって投与する場合には、投与に先立って成分を混合できるように、滅菌注射水または生理食塩水のアンプルを提供できる。いくつかの場合には、ヒトの教育されたマクロファージを含む組成物を、投与に先立って低温保存する。
【００４４】
治療上有効な量の教育されたマクロファージをそれを必要とする対象に投与する。有効な用量または量は、有益なまたは所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。本発明の方法に関して、１回または複数回の投与で投与できる有効な用量または量は、細胞が投与される対象において治療効果を引き出すのに十分なヒトの教育されたマクロファージの量である。いくつかの場合には、教育されたマクロファージの有効な用量は、約１×１０5個細胞／キログラム〜約１０×１０9個細胞／レシピエントの体重１キログラム（例えば、１×１０5個細胞／キログラム、５×１０5個細胞／キログラム、１×１０6個細胞／キログラム、５×１０6個細胞／キログラム、１×１０7個細胞／キログラム、５×１０7個細胞／キログラム、１×１０8個細胞／キログラム、５×１０8個細胞／キログラムまたは１×１０9個細胞／キログラム）である。有効量は、投与の際に細胞の作用および細胞に対する対象の生物学的応答を改変する種々の因子、例えば、虚血性心不全の重症度、損傷を受けた組織の種類、患者の年齢、性別および食事、炎症の重症度、投与の時間および他の臨床因子によって影響を受けるであろう。
【００４５】
ヒト対象への投与のための治療上有効な量は、動物試験および動物について有効であると決定された量をヒトへの投与に換算するための任意の技術分野で認容された方法において決定できる。例えば、動物モデルにおいて有効である（例えば、有益なまたは所望の臨床結果を達成する）量を最初に測定できる。当技術分野で公知の換算係数を使用することによって、動物モデルから得られた量をヒトのための有効量の処方において使用できる。例えば、体表面積係数などの適した換算係数を使用することによって、ある動物モデルにおいて得られた有効量を別の動物のために変換できる。
任意の個々の対象のために、個体の必要性および教育されたマクロファージの投与を管理または監督する専門家の判断に従って、特定の投与計画を経時的に調整しなければならないということは理解されるべきである。例えば、虚血性心不全の個々の対象のための教育されたマクロファージの投与量を、低用量が心機能において検出可能なまたは十分な改善を誘発しない場合には増大できる。逆に、虚血性心不全が治療または排除される場合には、投与量を減少させることができる。
【００４６】
いくつかの場合には、例えば、所望の徴候軽減レベルが達成されるまで投与量を徐々に増加させることによって、対象における治療薬の効果を測定することによって、教育されたマクロファージの治療上有効な量を決定できる。所望の結果を達成または維持するために、継続用法または反復用法も使用できる。有効量範囲の決定において、当技術分野で公知の任意のその他の技術も同様に使用できる。もちろん、特定の有効量は、治療されている個々の疾患状態、対象の健康状態、治療されている動物の種類、治療期間、投与経路および任意の併用療法の性質のような因子で変わる。
【００４７】
本明細書において記載される疾患または損傷に苦しめられる、傾向がある、または発生する可能性が高い個々の対象への教育されたマクロファージの投与後、疾患または損傷と関連する臨床症状または特徴を観察し、正または負の変化について評価する。例えば、対象において虚血性心不全を治療する方法について、治療の間または治療後の対象の心機能における正または負の変化を、制限するものではないが、収縮終期圧を測定すること、拡張終期血圧を測定すること、拡張終期容量を測定すること、収縮終期容量を測定すること、心臓駆出率を測定すること、心拍出量を測定すること、収縮性（収縮終期圧容量関係、一回仕事量または前負荷動員一回仕事量）を測定することおよび梗塞サイズを測定することを含む当業者に公知の任意の尺度によって決定できる。
いくつかの実施形態では、開示される注射用組成物は、遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭの１つまたは複数の断片および教育されたマクロファージの集団を、注射用の医薬上許容される担体とともに含んでもよく、ＣＦ−ＥＣＭの断片は、皮下針開口部を自由に通過できるように十分に小さい。遺伝子操作されたＣＦ−ＥＣＭを作製する方法および注射用組成物におけるその使用に関する情報は、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８０２，１４４号および米国特許公開番号第ＵＳ２０１６／０３５４４４７号に開示されている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、マクロファージ生着、維持および機能性のためのｉｎ  ｓｉｔｕニッチを提供するために、マクロファージ投与に先立ってＣＦ−ＥＣＭを投与する治療において、心臓特異的な教育されたマクロファージを注射用ＣＦ−ＥＣＭとともに投与する。いくつかの実施形態では、ＣＦ−ＥＣＭを、マクロファージとともに単一組成物で同時に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＦ−ＥＣＭを、教育されたマクロファージのための担体としての使用の前に組織特異的細胞外因子とともに注入または移植する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、心臓疾患または損傷、組織への血液供給の中断による虚血性四肢損傷または他の損傷を治療するために、注射用組成物を使用できる。いくつかの場合には、注射用組成物を、経心内膜送達のための任意の適当な手段を使用して心腔の心内膜壁中に送達する。例えば、送達カテーテルを使用して、心臓疾患または状態の治療のための注射用組成物を送達できる。他の送達デバイスを使用して、本明細書において記載されるような注射用組成物の治療的または診断的送達を達成できる。例えば、Ｍｙｏｓｔａｒ  （Ｂｉｏｓｅｎｓｅ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）、Ｈｅｌｉｘ（Ｂｉｏｃａｒｄｉａ）、Ｂｕｌｌｆｒｏｇ（Ｍｅｒｃａｔｏｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）またはＣ−Ｃａｔｈ  （Ｃａｒｄｉｏ３Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの心臓針先端注射カテーテルを使用して注射用組成物を送達できる。本明細書において記載される注射方法による注射用組成物の送達は、最小に侵襲性であり、全身麻酔、体外循環（例えば、人工心肺装置による循環）、循環支援または開胸を伴わずに達成できることが有利である。したがって、合併症の見込みおよび患者に対するリスクは実質的により低い。
いくつかの場合には、注射用組成物を、心外膜送達のための任意の適当な手段を使用して心臓外壁（心外膜）に送達する。例えば、本明細書において記載される注射用組成物の心外膜送達は、針および／またはシリンジを含む送達デバイスを使用して達成できる。一実施形態では、適した送達媒体は、心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックスであり得る。一実施形態では、適した送達媒体は、心臓線維芽細胞エキソソームが埋め込まれた心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックスであり得る。
【００５０】
本発明の方法のいずれかにおいて、教育されたマクロファージのドナーおよびレシピエントは、単一個体または異なる個体、例えば、同種異系または異種個体であり得る。本明細書において、用語「同種異系の（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」とは、遺伝的に異なるが、同一種に属する、または同一種から得られるもの（例えば、同種異系組織移植片または臓器移植片）を指す。「異種の（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）」とは、細胞が異なる種に由来する可能性があることを意味する。
本発明は、１つまたは複数の好ましい実施形態の点で記載されているが、当然のことではあるが、明確に記載されるものの他、多数の均等物、代替物、変法および改変があり得、本発明の範囲内であることが認識されよう。
本発明は、以下の限定されない例を考慮するとより十分に理解されよう。
【実施例】
【００５１】
（例１）
本明細書において記載される実施形態は、循環単球を心臓線維芽細胞由来エキソソームおよび心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックスを用いて馴化することによって、心臓特異的抗炎症性組織修復性マクロファージをバイオエンジニアリングできるという概念を実証する。本発明者らは、これらのマクロファージを、心臓線維芽細胞エキソソームによって教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＥＭ）と記載する。本明細書において記載される予備的研究において、本発明者らは、ＣＦ−ＥＥＭは、他のいかなる既知マクロファージ集団とも異なる独特の細胞表面免疫表現型を有するということを観察した。概念実証ｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、ＣＦ−ＥＥＭを免疫適格性ラット心筋梗塞モデルに注射した。本発明者らは、歴史的対照動物と比較して、ＣＦ−ＥＥＭ処置ラットにおいて、梗塞サイズの有意な低減と、心機能の有意な改善と、免疫拒絶の証拠がないこととを観察した。
【００５２】
本発明者らは、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）（Hematti et al.）、心臓線維芽細胞（ＣＦ）および心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス（ＣＦ−ＥＣＭ）は、単球を独特の教育されたマクロファージになるように教育できることを発見した。本発明者らの結果は、ヒトＣＦから単離されたエキソソームを使用する、およびヒトＣＦ由来細胞外マトリックスを使用する、相当な単球からマクロファージへの変換を示唆する。これらの心臓特異的抗炎症性組織修復性亜集団は、損傷を受けた心臓微小環境を修復するための新規免疫治療的アプローチを提供する。
【００５３】
本明細書において記載される例において、マクロファージを、心臓線維芽細胞由来エキソソームと同時培養することによってヒトＣＦ−ＥＥＭを作製し、続いて、大きなＭＩを誘導するように冠動脈連結を施しておいた免疫無防備状態のラットに投与する。駆出率、梗塞サイズ、圧−容量血行力学、血管新生反応、線維治癒反応およびＣＦ−ＥＥＭ保持を測定する。
【００５４】
方法
ＭＳＣ、マクロファージおよび心臓線維芽細胞（ＣＦ）の単離および培養
本発明者らは、ヒト血液および骨髄を使用して、それぞれ、単球およびＭＳＣを導き出した。すべてのプロトコールは、ウィスコンシン大学マディソン校医学および公衆衛生学の健康科学機関審査委員会によって承認されていた。単球は、磁性ビーズ分離法を製造業者のプロトコールに従って使用することによってヒト末梢血から単離した。手短には、末梢血単核細胞を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を使用する密度勾配分離によって健常ドナーの血液から集めた。赤血球を、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｌｏｎｚａ、メリーランド州、ウォーカーズビル）中で細胞を３分間インキュベートすることによって溶解し、単核細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。血小板混入を低減するために、細胞懸濁液を３００〜７００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットをａｕｔｏＭＡＣＳ（商標）ランニングバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９１−２２１）に再懸濁した。単球を単離するために、細胞を、抗ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国、カリフォルニア州、オーバーン）とともに４℃で１５分間インキュベートした。洗浄して結合していない抗体を除去した後、ａｕｔｏＭＡＣＳ（商標）Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して細胞分離を行った。単離されたＣＤ１４+細胞の純度は、フローサイトメトリーを用いて調べた場合に＞９５％であった。精製ＣＤ１４+単球を、フローサイトメトリーのために６ウェル細胞培養プレートまたはエキソソーム単離もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために７５ｃｍ2のフィルターキャップ細胞培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、米国、ノースカロライナ州、モンロー）のいずれかに、１０％ヒト血清血液型ＡＢ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国、バージニア州、ハーンドン）、１×非必須アミノ酸（Ｌｏｎｚａ、米国、メリーランド州、ウォーカーズビル）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）および４μｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給した、フェノールを含まないイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨーク州、グランドアイランド）中、ウェルまたはフラスコあたり０．５〜１×１０6個の濃度でプレーティングした。細胞を５％  ＣＯ2を用いて３７℃で７日間培養してマクロファージに分化させた。
【００５５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、正常な健常ドナーからの骨髄採取後に残された骨髄フィルターから単離した。手短には、フィルターに捕捉された残された骨髄細胞をＰＢＳで洗浄し、単核細胞をフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ  １．０７３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を製造業者のプロトコールに従って使用して分離した。赤血球をＡＣＫ溶解バッファー中での３分インキュベーションで溶解し、単核細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（米国起源、特性決定されていない；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、米国、ユタ州）、１×非必須アミノ酸および４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、カールスバッド）を補給したα−最小必須培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＧｒｏ、バージニア州、マナッサス）に懸濁した。細胞を７５ｃｍ2のフィルターキャップ細胞培養フラスコで培養した。培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、ＴｒｙｐＬＥ（商標）細胞解離酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して接着細胞を剥離することによって細胞（継代０）を回収し、次いで、新しいフラスコ中に再プレーティングした。
【００５６】
組織採取プロトコールは、ウィスコンシン大学医学および公衆衛生大学院治験審査委員会（ＵＷ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ  （ＩＲＢ））によって審査および承認されている。ＵＷ臓器調達機関（Ｏｒｇａｎ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＯＰＯ）によって無菌手術条件下でウィスコンシン州、マディソンのウィスコンシン大学病院＆診療所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃｓ  （ＵＷＨＣ））で最近死亡した脳死ドナーから死体心臓組織が回収され、心臓線維芽細胞単離のために研究者に送られた。
【００５７】
これまでに記載された改変プロトコールから心臓線維芽細胞を単離した。手短には、無菌技術を使用してＵＷＨＣ  ＯＰＯによって心臓を入手した。受け取りの際、新鮮臓器を輸送容器から回収し、生物学的安全キャビネットにおいて滅菌パッケージングを開けた。２０〜２００グラムの左心室を解剖して取り出した。次いで、解剖した組織を粗く刻み、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｃチューブ（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／１３０−０９３−２３５）中で５〜６グラムを処理した。次いで、組織をＭｉｌｔｅｎｙｉ  ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒで標準心臓分散プロトコールに通した。次いで、各Ｃチューブに１．２５ｇのＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ／  ０５４０１１１９００１）を加え、一定撹拌しながら３７℃で最大１２０分間インキュベートし、単細胞懸濁液を形成した。次いで、細胞懸濁液を２００μｍ  Ｐｌｕｒｉｓｔｒａｉｎｅｒ（ＰｌｕｒｉＢｅａｄ／４３−５０２００−０３）を通して篩にかけた。得られた細胞懸濁液を１０００×ｇで３０分間遠心分離した。次いで、細胞懸濁液を完全Ｌｏｎｚａ  ＦＧＦ−３培地（Ｌｏｎｚａ−ＣＣ−４５２６）に懸濁し、Ｔ７５組織培養処理フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）上に１２０分間プレーティングした。次いで、プレートを吸引し、フラスコに新鮮なＬｏｎｚａ  ＦＧＦ−３培地を添加した。標準条件（５％ＣＯ2、３７℃、１００％湿度）下で心臓線維芽細胞を培養し、心臓線維芽細胞が５０％〜９０％コンフルエンシーに達するまで培地を２〜３日毎に交換し、その時点で、それらをＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅ  ｓｅｌｅｃｔを使用して継代した。
【００５８】
エキソソームおよび微小胞を含有する細胞外小胞（ＥＶ）の単離
７５ｃｍ2フィルターキャップ細胞培養フラスコ中でコンフルエンスに増殖させた細胞を、次いで、ＰＢＳで１回洗浄し、培地をＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＭＳＣ血清不含培地（ＳＦＭ）ＣＴＳ（Ａ１０３３３２−０１、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置換した。細胞を１８〜２４時間インキュベートし、馴化培養培地を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ（登録商標）Ｘ−１５Ｒ遠心機を使用して、２０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して、任意の剥離した細胞、アポトーシス小体および細胞片を回収した。次いで、清澄化された上清培養培地を、ＳＷ  ２８ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ（商標）Ｌ−８０ＸＰ超遠心機で、１００，０００ｇ平均、４℃で２時間遠心分離して、エキソソームをペレットにした。上清を注意深く回収し、ＥＶ含有ペレットをＰＢＳに再懸濁し、プールした。通常、本発明者らは、１００μｌ  ＰＢＳ／１０ｍｌのＣＭでＥＶペレットを再懸濁した。
【００５９】
心臓線維芽細胞エキソソーム特性決定
心臓線維芽細胞エキソソームを、タンパク質決定および直接吸光度によるおよそのＲＮＡ濃度についてＴｈｅｒｍｏ  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して特性決定した。測定に先立って、エキソソームを溶解せず、染色せず、またはＲＮＡ抽出しなかった。粒径および濃度を、４７ｍｍストレッチのＮＰ１５０ナノポアメンブレンを使用する調整可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ；（ｑＮａｎｏ、Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ）によって評価した。１．１×１０13個粒子／ｍＬの濃度の１１０ｎｍカルボキシル化ポリスチレンビーズを用いるマルチ圧力較正を使用して、粒子の濃度を標準化した。ＣＦエキソソーム特性決定の結果は、図１６に示されている。
【００６０】
エキソソーム全ＲＮＡ単離
心臓線維芽細胞から得たエキソソームを、ＳｅｒａＭｉｒＥｘｏｓｏｍｅＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎキット（カタログ番号ＲＡ８０８Ａ−１、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、パロアルト）を製造業者の使用説明書に従って使用して全ＲＮＡ単離のために処理した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００  Ｅｘｐｅｒｔ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙによる小ＲＮＡ濃度の測定のために、各サンプルについて、１μｌの最終ＲＮＡ溶出液を使用した。
【００６１】
ＮＧＳライブラリー作製およびシーケンシング
エキソソームＲＮＡ単離物から、ＣｌｅａｎＴａｇ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（ＴｒｉＬｉｎｋ、カタログ番号Ｌ−３２０６）を製造業者のプロトコールに従って用いて、小ＲＮＡライブラリーを構築した。最終精製ライブラリーを、高感度ＤＮＡ試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＯ番号Ｇ２９３３−８５００４）および高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＯ番号５０６７−４６２６）を用いて定量化した。ライブラリーをプールし、１４０ｂｐ〜３００ｂｐの領域を、８％ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、参照番号ＥＣ６２１５）でサイズ選択した。サイズ選択したライブラリーを、高感度ＤＮＡ  １０００  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＯ番号５０６７−５５８４）、高感度Ｄ１０００試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＯ番号５０６７−５５８５）およびＴａｉｌｏｒＭｉｘ  ＨＴ１  ｑＰＣＲアッセイ（ＳｅｑＭａｔｉｃ、カタログ番号ＴＭ−５０５）を用いて定量化し、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｖ２キット（カタログ番号ＦＣ−４０４−２００５、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、ＳＲ７５でＮｅｘｔＳｅｑ  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔシングルエンドシーケンシングランを続けた。全ＲＮＡ単離物およびＮＧＳライブラリーでのデータ分析のために、ＲＳＥＭを使用して各サンプルにおける遺伝子あたりの予測カウントを推定した。３サンプルすべてにおいて少なくとも１つの予測されたカウント（遺伝子あたり）を有していた遺伝子のみを維持しながら、これらのカウントをフィルタリングした。次いで、ＴＭＭ（平均値のトリム法）をコンピュータで計算して、カウントを正規化した。最後に、３サンプルにわたって各遺伝子の、１００万あたりのカウント（ＣＰＭ）をコンピュータで計算し、変動係数（ＣＶ＝標準偏差／平均）を算出した。ＣＦエキソソーム全ＲＮＡ単離物から得られたＲＮＡ−Ｓｅｑの結果は、図１７に示されている。
【００６２】
ＭＳＣを用いる（ＭＥＭ）、ＭＳＣ、ＣＦまたはマクロファージ由来のＥＶ（ＥＥＭ）を使用するマクロファージの教育
ＭＳＣによって教育されたマクロファージ（ＭＥＭ）を生成するためのＭＳＣとの同時培養によるマクロファージの教育のために、７日目にマクロファージに、１０：１マクロファージ対ＭＳＣの比でＭＳＣを含有する新鮮マクロファージ培地を補給し、３日間培養した。ＥＶを使用する教育のために、７日目に、マクロファージに、ＭＳＣ、ＣＦまたはマクロファージ由来のＥＶを添加し、３日間培養した。通常、細胞は、６ウェルプレート（２ｍｌ）または７５ｃｍ2フィルターキャップ細胞培養フラスコ（１０ｍｌ）のいずれかにおいて、それぞれ、６０μｌまたは３００μｌのＥＶのいずれかを使用して教育した。培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、次いで、ＴｒｙｐＬＥ（商標）細胞解離酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および／またはセルスクレーパーを使用することによって細胞を回収した。
【００６３】
フローサイトメトリー
＋１０日の培養でマクロファージ、ＭＥＭまたはＥＶによって教育されたマクロファージ（ＥＥＭ）を採取し、カウントし、Ｆｃブロック（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５６４２２０）とともにインキュベートし、抗体希釈剤（２％  ＦＢＳを有するＰＢＳ）中で、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ９０（５Ｅ１０、カタログ番号３２８１２４）、ＦＩＴＣ−ＣＤ１６３（ＧＨＩ／６１、カタログ番号３３３６１８）、ＦＩＴＣ−ＣＤ３９（Ａ１、カタログ番号３２８２０６）、ＰＥ−ＣＤ２０６（１５−２、カタログ番号３２１１０６）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−ＣＤ１４（ＨＣＤ１４、カタログ番号３２５６２２、ＡＰＣ−ＰＤ−Ｌ１（２９Ｅ．２Ａ３、カタログ番号３２９７０８）、ＡＰＣ−ＰＤ−Ｌ２（２４Ｆ．１０Ｃ１２、カタログ番号３２９６０８）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−ＨＬＡ−ＤＲ／ＭＨＣ  ＩＩ（Ｌ２３４、カタログ番号３０７６３３）、ＢＶ４２１−ＣＤ１６（３Ｇ８、カタログ番号３０２０３８）およびＢＶ５１０−ＣＤ８６（ＩＴ２．２、カタログ番号３０５４３２）を含む抗ヒト抗体とともに４℃で２０分間染色した。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、サンノゼ）からのＢＶ５１０−ＣＤ７３（ＡＤ２、カタログ番号５６３１９８）を除いて、すべての抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入した。補償は、Ｕｌｔｒａｃｏｍｐ  ｅ−ビーズ（カタログ番号０１−２２２２−４２）ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して実施した。ＭＳＣおよびマクロファージのゲーティングは、ＭＳＣに特異的なＣＤ９０抗体およびマクロファージに特異的なＣＤ１４抗体を使用して達成した。フローサイトメトリーデータは、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６サイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）またはＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ、カリフォルニア州、サンディエゴ）で獲得した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙ（商標）ソフトウェアを使用してＭＡＣＳＱｕａｎｔファイルを．ｆｃｓファイルに変換した。ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータを分析した。
【００６４】
遺伝子発現分析
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、バレンシア）を使用してＲＮＡを細胞から単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）を使用して単離されたＲＮＡの質を調べた。Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、標準プロトコールを使用するＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）を使用して実施した。検証されたプライマーをＱｉａｇｅｎから購入した。各遺伝子の閾値サイクル（Ｃｔ）値を、一般的なハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の平均Ｃｔ数によって正規化した。
【００６５】
活性化されたＴ細胞抑制アッセイ
活性化Ｔ細胞抑制アッセイを、４８ウェル組織培養プレートで実施した。Ｔ細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の凍結ストックならびにＭＳＣ、マクロファージおよびＢＭ−ＥＥＭを、１０％熱不活化ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、バージニア州、マナッサス）、１×グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）、１×ピルビン酸Ｎａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１×ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，、ミズーリ州、セントルイス）を含有するＲＰＭＩ−１６４０からなる培地（ＩＰＡ培地）中で新たに培養した。増殖を測定するために、ＰＢＭＣを最初に、カルボキシフルオレセインコハク酸−エステル（ＣＦＳＥ）を１μＭの最終濃度で用い、３７℃暗所で１０分間標識し、均一標識を確実にするために５分の時点で混合した。等容量の冷ＦＢＳを１分間添加して、ＣＦＳＥ標識反応を停止した。次いで、ＰＢＭＣをＩＰＡ培地を用いて２回洗浄し、その後、４×１０6個／ｍｌで再構成した。１００マイクロリットル（４×１０5個）のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、ＭＳＣ、マクロファージおよびＢＭ−ＥＥＭを含有する各ウェルに添加した。このアッセイにおいて評価される、抗体活性化ＰＢＭＣ対ＭＳＣ、マクロファージおよびＢＭ−ＥＥＭの比は、１：０（陽性対照−抑制なし）、１：１、１：０．５、１：０．２、１：０．１および１：０．０５を含む。ＭＳＣは、ＰＢＭＣ増殖を強力に阻害するとわかっているので、陽性対照細胞群として働くように、このアッセイにＭＳＣを含めた。１：１（ＰＢＭＣ：ＭＳＣ）比のために、４×１０5個ＭＳＣ（１００μｌ）をプレーティングし、次いで、２×１０4個にさらに滴定して、１：０．０５（ＰＢＭＣ：ＭＳＣ）比を達成した。信頼できるゲーティング戦略を確立するために、活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）（陰性対照−Ｔ細胞活性化なし）を添加しない、１：０．０５  ＰＢＭＣ：ＭＳＣ細胞比からなる非活性化対照を使用した。種々の比の、各群（ＰＢＭＣ：ＭＳＣ）、（ＰＢＭＣ：マクロファージ）および（ＰＢＭＣ：ＢＭ−ＥＥＭ）からの細胞を、プレート中のウェルに添加し、次いで、細胞を３７℃で沈降させた。次いで、細胞混合物中のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（それぞれ、クローンＵＣＨＴ１および３７４０７）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、ミネソタ州、ミネアポリス）を用いて活性化した。具体的には、１００μｌの、４×濃縮抗ｈｕＣＤ３および抗ｈｕＣＤ２８抗体（それぞれ、１０μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬ）の混合物を、ウェルあたり４００μｌの総容量について１００μｌのＩＰＡ培地を受け取った１：０．０５（ＰＢＭＣ：ＭＳＣ）の非活性化対照を除いて、各ウェルに添加した。細胞混合物を３７℃で５％  ＣＯ２を用いて４日間培養した。混合するためにピペットで上下させることによって各ウェルからＰＢＭＣを回収し、５ｍｌフローチューブに添加した。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性細胞を、標準フローサイトメトリー方法論を使用して増殖について各々分析した。抗ヒトＡＰＣ−ＣＤ４またはＣＤ８−（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、Ｔ細胞型をゲーティングした。す���ての増殖分析を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、サンノゼ）を使用して実施し、ＣＦＳＥ分析のために関連Ｃ６  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用した。
【００６６】
本発明者らはまた、最高比でＰＢＭＣと混合された（１：１比）マクロファージまたはＢＭ−ＥＥＭのいずれかが、それ自体、抗ｈｕＣＤ３および抗ｈｕＣＤ２８抗体を用いる抗体活性化を必要とせずにＰＢＭＣの増殖を促進できるか否かを試験した。上記の非活性化群と同様に、１００μｌの、活性化性抗体を有さない培地を、細胞の混合物に添加した。上記のように、細胞混合物を３７℃で４日間培養し、回収し、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性細胞の両方を、標準フローサイトメトリー方法論を使用して増殖について分析した。抗ヒトＡＰＣ−ＣＤ４またはＣＤ８−（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を使用してＴ細胞型をゲーティングした。
【００６７】
虚血性心不全動物モデル
ｎ＝１０ラットのパイロットに、ＭＩの２日後に梗塞境界域に注射されるヒトＣＦ−ＥＥＭを用いる処置を施した。２８日後、ベースラインと比較して（図１２Ａ〜１２Ｅ）、およびこのモデルを用いる本発明者らの過去の経験における歴史的対照と比較して、収縮性、左室内径短縮率および梗塞サイズの低減において有意な改善があった。
【００６８】
免疫適格性ルイスラットは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。イソフラン麻酔（３％）の誘導後、ラットに挿管し、ラット人工呼吸器上に置き、２％イソフランで維持した。第４肋間腔を通る左側方切開を行って、心臓を露出させた。左前下行冠動脈を視覚化した後、７−０または８−０  Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸を心筋を通って前外側壁中に入れ、固定した。心室心尖部で遠位循環の分岐を観察することによって冠動脈捕捉を確認した。吸収性縫合糸を使用して、肋骨および筋肉層を閉じた。さらなる６−０ナイロンまたはシルク縫合糸によって覆っている皮膚を閉じ、その後ラットを回復させた。
心筋梗塞の２日後、生存ラットに麻酔し、挿管し、上記のように心臓を露出させた。１×１０6個のヒトＣＦ−ＥＥＭを梗塞の境界域に注射し、切開を上記のように閉じた。動物を追跡し、次いで、処置の２８日後に屠殺した。
【００６９】
ラットに、ベースラインで０日目（処置日）および２８日目に経胸壁心エコー検査法を施した。測定値は以下を含む：梗塞サイズ、左室内径短縮率、収縮終期容量、拡張終期容量および壁圧。屠殺に先立って、浸潤性圧力容量ループ評価を実施し、収縮終期圧、拡張終期血圧、収縮終期容量、拡張終期容量、前負荷独立性収縮性および圧力−容量関係を、下大静脈クランプを有するコンダクタンスカテーテルを使用して測定した。測定は、処置割り当てに対して盲検されたＵＷ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ研究室によって実施した。
屠殺の時点で、心臓を切り出し、切片にした。ＬＶ質量および梗塞サイズを測定した。切片を染色し、盲検された委員会認定のＵＷ  ＲＡＲＣ獣医学病理学者によって、血管密度、組織壊死および心筋線維症について定量的に等級付けられた。
【００７０】
結果
エキソソームをヒト骨髄間葉系幹細胞およびヒト心臓線維芽細胞から単離し、粒子サイズ（直径）、タンパク質およびＲＮＡ濃度およびエキソソーム濃度について特性決定した（図２Ａ〜２Ｂ、表２）。本発明者らは、ＭＳＣおよび心臓線維芽細胞由来のエキソソームは、直径およびタンパク質／ＲＮＡ濃度において異なっていることを見出した。一般に、心臓線維芽細胞由来エキソソームは、ＭＳＣ由来エキソソームよりも大きかったが、より少ないタンパク質およびＲＮＡを有していた。間葉系幹細胞（図３Ａ）および心臓線維芽細胞（図３Ｂ）由来のエキソソームのサンプル透過型電子顕微鏡像を撮った。さらに、ＭＳＣ由来エキソソーム（図４Ａ〜４Ｂ）の機能性試験は、エキソソームが機能性であり、内皮細胞に親油性色素移動させることができることを示す。
【００７１】
【表２】
2020511999.tif 000003
【００７２】
ヒト心臓線維芽細胞をフローサイトメトリーによって特性決定し、ＭＳＣおよび皮膚線維芽細胞と比較した。図１５に表されるように、ヒト心臓線維芽細胞は、ＢＭ−ＭＳＣまたは皮膚線維芽細胞のいずれかと比較して、ＣＤ９０、ＣＤ３４、ＳＵＳＤ２、ｗ６７ＣおよびＴＮＡＰを差次的に発現する。さらに、心臓線維芽細胞はまた、ＧＡＴＡ４を発現するが、これは、ＭＳＣまたは皮膚線維芽細胞においては発現されない。
【００７３】
マクロファージの骨髄−ＭＳＣエキソソームまたは心臓線維芽細胞エキソソームとの同時培養後、教育されたマクロファージの発現プロファイルおよび表現型を、図５Ａ〜５Ｊに表されるように分析した。基準Ｍ２マクロファージ表面マーカーを、フローサイトメトリーによって調べた。表面マーカーパーセンテージおよびマーカーの蛍光強度両方において有意差が見られた。具体的には、エキソソーム教育は、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＥＭ）、ＢＭ−ＥＥＭおよびＣＦ−ＥＥＭ群の間で有意差をもたらす。重要なことに、骨髄エキソソーム−および心臓線維芽細胞エキソソーム−によって教育されたマクロファージは、異なる表現型を示す。対照実験では、マクロファージ培養物から単離したエキソソームを、ＣＤ１４+細胞とともの同時培養において使用したが、教育されたマクロファージにおいて抗炎症性表現型を誘導できず、未処置対照マクロファージと同一の表面マーカー表現型を示し、したがって、抗炎症性表現型教育が、組織特異的（すなわち、ＭＳＣまたはＣＦ）エキソソームにとって独特であるということを示した（図７Ａ〜７Ｅ）。
【００７４】
また、教育されたマクロファージにおけるＭ１（炎症性）マクロファージ表面マーカーを、図６Ａ〜６Ｄに表されるようにフローサイトメトリーによって調べた。表面マーカーパーセンテージおよびマーカーの蛍光強度の両方において有意差が見られた。具体的には、エキソソーム教育は、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＥＭ）、ＢＭ−ＥＥＭおよびＣＦ−ＥＥＭ群の間で有意差をもたらす。骨髄および心臓線維芽細胞エキソソームによって教育された抗炎症性マクロファージは、骨髄ＭＳＣとの同時培養によって生成したマクロファージと比較して、低減されたＭ１マーカーを有する。
【００７５】
未教育マクロファージ（対照）においてフローサイトメトリー（図８）によってＣＤ２０６、Ｍ２マクロファージの特異的マーカーを評価し、細胞（ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ同時培養）または心臓線維芽細胞（心臓線維芽細胞同時培養））との、エキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣエキソソーム）またはＣＦ（ＣＦエキソソーム）のいずれかに由来する）との、またはＣＦ培養物から抽出されたＥＣＭ（ＣＦ−ＥＣＭ培養物）との同時培養によって教育されたマクロファージに対して比較した。細胞、エキソソームまたはＥＣＭを使用する教育は、対照マクロファージと比較して、細胞発現パーセントに基づいて決定されたようなマクロファージにおけるＣＤ２０６発現のレベルを増大した。予測されるように、極めて低い数の対照マクロファージしかＣＤ２０６を発現しなかった。しかし、この発現は、ＢＭ−ＭＳＣエキソソームまたはＣＦ由来のＥＣＭのいずれかを使用する教育後にマクロファージにおいて、およそ４〜１５倍増大した。結果は、教育の３つの方法（ＣＦ−エキソソーム、ＢＭ−エキソソームおよびＣＦ−ＥＣＭ）はすべて、マクロファージを抗炎症性表現型に成功裏に教育できたことを示す。興味深いことに、これらの条件下の結果は、いずれかの細胞供給源から得たＥＣＭまたはエキソソームとともの細胞外因子の使用が、マクロファージにおいて最強レベルの抗炎症性表現型変換を与えることを示した。
【００７６】
ｑＰＣＲによって決定されるような遺伝子発現（図９）は、ＢＭ−ＭＳＣとともの同時培養によって教育されたマクロファージ（ＢＭ−ＭＥＭ）を、未教育マクロファージ（対照）またはＢＭ−ＭＳＣもしくはＣＦに由来するエキソソーム（それぞれ、ＢＭ−ＥＥＭ、ＣＦ−ＥＥＭ）を使用して教育されたマクロファージのいずれかに対して比較する場合に、組織修復および免疫抑制に関与する関連遺伝子の発現プロファイルが異なっていることを示した。組織修復に関与する、ある特定の抗炎症性サイトカイン（ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０）、免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１ｂ）および免疫抑制分子（ＰＤ−Ｌ１）は、ＢＭ−ＭＥＭと比較してＢＭ−ＥＥＭおよびＣＦ−ＥＥＭの両方においておよそ２倍またはそれよりも高かった。対照的に、他の免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−６）および増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ、セルピン−１）は、ＢＭおよびＣＦ−ＥＥＭの両方において少なくとも２倍より低かった。ＢＭ−ＥＥＭおよびＣＦ−ＥＥＭ両方の全体的な発現プロファイルは、互いに同様であったが、対照マクロファージまたはＢＭ−ＭＥＭのいずれかに対して比較した場合には、異なっていた。
【００７７】
図１０Ａおよび１０Ｂに示される結果は、未教育マクロファージもＢＭ−ＥＥＭも、非活性化ＰＢＭＣ（活性化性抗体を有さないＰＢＭＣである）と混合された場合に、（Ａ）ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４）または（Ｂ）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）の両方において、それぞれの非活性化サブタイプ（非活性化Ｔ細胞）と比較してＴ細胞の増殖を自発的に誘導できないことを示した。免疫抑制についてのこの対照実験は、試験細胞自体が、誘導性抗体の不在下で増殖を刺激し得る可能性を除外すると最初に決定されることを必要とする。期待されたように、非活性化Ｔ細胞対照と比較して、マクロファージまたはＢＭ−ＥＥＭと同時培養された場合に、いずれかのＴ細胞サブタイプの増殖の増大は生じなかった。
【００７８】
ＢＭ−ＭＳＣから単離されたエキソソームを使用して教育されたＥＥＭは、未教育の対照マクロファージ（マクロファージ）と比較して、ヘルパーＴ細胞（Ａ）および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｂ）サブタイプ両方において抗体誘導性Ｔ細胞増殖を効率的に抑制できた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＭＳＣは、抑制についての陽性対照として働き、両サブタイプでＴ細胞増殖パーセントを効率的に抑制できた。１：１〜１：０．０５のＰＢＭＣ対ＭＳＣ比で用量応答が見られ、１：１で完全抑制および１：０．０５ほどの低い比でおよそ３０〜３５％増殖（または本質的に６５〜７０％成長抑制）である。未教育マクロファージを使用すると、両Ｔ細胞サブタイプのかなり弱い抑制がみられる。１：０．５のＰＢＭＣ対マクロファージの比を使用すると約５０％の増殖（または５０％の成長抑制）のみが生じ、これは次いで、より小さい数字のマクロファージ対ＰＢＭＣを使用する場合に増大する。対照的に、教育されたマクロファージ（ＥＥＭ）は、未教育マクロファージと比較して、活性化Ｔ細胞の増殖のより強力な抑制因子であった。マクロファージと同時培養されたＴ細胞の約８０％増殖があったが、ＥＥＭを用いた場合には、わずか１５〜２０％であった、１：０．１のＰＢＭＣ対マクロファージまたはＥＥＭの比を比較する場合に、両Ｔ細胞サブタイプにおいて最も明らかである。全体的な結果は、ＥＥＭは、両Ｔ細胞サブタイプにおいて増殖を用量依存的に効率的に抑制でき、未教育マクロファージと比較してＴ細胞抑制で、より良好であることを示す。
【００７９】
図１８で示されるように、ＣＦ−ＥＥＭは、非刺激マクロファージおよび骨髄−ＭＳＣ  ＥＥＭ（ＢＭ−ＥＥＭ）と比較して独特のセクレトームを有する。ＣＦ−ＥＥＭは、対照マクロファージ（ＰＢＳ）またはＢＭ−ＥＥＭＳと比較してＥＧＦを分泌するが、ＢＭ−ＥＥＭは、ＣＦ−ＥＥＭおよび対照マクロファージと比較して有意により多いＧＲＯを分泌する。これらの結果は、ＣＦ−ＥＥＭＳは、ＢＭ−ＥＥＭＳおよび対照マクロファージとは機能的に異なっていることを実証する。
【００８０】
心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックス上で培養されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭ）は、独特の抗炎症性表現型を有する。ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭは、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの有意により低い発現を有するが、ＰＤＬ−１発現は有意に増大されている。ＰＤＬ−１は、免疫系の抑制において主要な役割を果たすと考えられる。図１９で示されるように、ヒトマクロファージを、プラスチック、ゼラチンまたはＣＦ−ＥＣＭ上で３日間培養し、次いで、表面から回収し、フローサイトメトリーを使用して、表面マーカー発現を分析した。ＣＦ−ＥＣＭによって教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭ）は、プラスチックまたはゼラチン上で培養されたマクロファージと比較して、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６およびＰＤＬの有意により高い発現（平均蛍光強度によって）を有していた。さらに、ＣＦ−ＥＣＭ−ＥＭは、プラスチックまたはゼラチン上で培養されたマクロファージと比較して、炎症性マーカーＣＤ６８およびＨＬＡ−ＤＲの有意により低い発現を有していた。このデータは、ＣＤ１４+細胞のＣＦ−ＥＣＭ教育が、培養プレートをコーティングするための一般的に使用される方法を使用して成長したＣＤ１４+細胞とは表現型的に異なるマクロファージを生成することを示す。
【００８１】
心臓線維芽細胞エキソソームによって教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＥＭ）を、担体として注射用心臓線維芽細胞由来細胞外マトリックスを使用して梗塞性ラット心臓中に移植した。ＣＦ−ＥＥＭを用いて処置された動物は、心室拡張の有意な低減（収縮および拡張終期容量の低減）および収縮終期圧の増大への傾向を示した（図１２Ａ〜１２Ｅ）。ＣＦ−ＥＥＭ処置動物において、心収縮性のゴールドスタンダード測定である、収縮終期圧容量関係（ＥＳＰＶＲ）が有意に改善されたことが最も重要である。総合すると、ＣＦ−ＥＥＭ処置は、有害なＭＩ後心臓リモデリングを鈍らせ、心収縮性を改善する。
【００８２】
一実施形態では、心筋梗塞または虚血性心不全を患っている患者を以下のとおりに処置する：ｉ）病気の心不全患者から十分な心臓組織を生検し、培養でＣＦを多量に増やす、または患者自身からの生検試料の代わりに、心臓移植のために使用されなかった健常ドナー心臓からＣＦを単離する；（この細胞回収法は、「心臓球由来細胞」を導くために、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（ニュージャージー州、ニューブランズウィック）によって支援されるＣａｐｒｉｃｏｒ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ビバリーヒルズ）と呼ばれるバイオテクノロジー企業によって現在使用されている）、ｉｉ）ＣＦからＣＦ−エキソソーム単離する；ｉｉｉ）白血球除去を実施することによって、または当技術分野で公知の任意の適した方法によって、患者から単球を回収する；ｉｖ）同時培養法を使用して、ＣＦ−エキソソームを用いてこれらの単球を「教育して（ｅｄｕｃａｔｅ）」、心臓特異的抗炎症性マクロファージに変換する；かつ、ｖ）最小に侵襲性の画像によってガイドされる経カテーテル法または当技術分野で公知の他の適した方法を使用して心臓特異的抗炎症性マクロファージを患者に送達する。白血球除去は、単球を含む多量の単核細胞を得るための、高度に有効であり安全な手順であり、簡単に、各上肢静脈において２回のＩＶを使用する。白血球除去は、造血再構成のために細胞を回収するために数十年間使用されており、また、Raval et alによるものを含め、多数の進行心血管疾患治験のために安全に使用されてきた。本発明者らのアプローチを用いた場合の主要な利点として、十分に定義された用量のＣＦエキソソームによって教育されたマクロファージ（ＣＦ−ＥＥＭ）を患者に投与する能力が挙げられる。
【００８３】
（例２）
（予言的）
マクロファージは、虚血性、外傷性、炎症性損傷に応じた組織修復および正常老化プロセスにおいて重要な役割を有する。天然には、代替活性化、再生促進性マクロファージは、骨髄、循環および組織中にある単球から「スイッチが入れられる（ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｏｎ）」または「極性化される（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）」。しかし、ほとんどの場合、組織が莫大な規模の組織損傷によって圧倒され得るので、この自然修復応答は不適切である。本発明者らは、再生促進性マクロファージが多量に製造され、次いで、治療的に送達される新規治療的アプローチを提案する。図２０に表されるように、ひとたび組織供給源を同定すると（Ａ）、線維芽細胞、組織前駆体細胞および他のものなどの細胞を、吸引、生検もしくは臓器調達を使用して回収するか、または胚幹細胞もしくは人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞（Ｂ）から分化させる。組織特異的細胞または組織特異的細胞に由来する細胞外因子、例えば、エキソソーム、微小胞および細胞外マトリックス（Ｃ）を、単球またはマクロファージと同時培養して、それらの特定の組織に好都合な、修復促進性、血管新生性、抗炎症性および炎症調節性表現型を有する組織特異的な教育されたマクロファージ（Ｄ）を作製する。組織特異的な教育されたマクロファージは、独特のサイトカイン、ＲＮＡ、表面マーカーおよび機能的発現により表現型的および機能的に独特であると予測される。これらの組織特異的な教育されたマクロファージを、治療を必要とする対象に、全身にまたは損傷を受けた組織中に直接的に送達することができる。送達方法として、静脈内注入、血管内注入、経皮注射、外科的注射、局所投与または本明細書において記載される任意のその他の送達方法を挙げることができる。組織特異的な教育されたマクロファージは、さまざまな動物モデル（Ｅ）および臨床適用（Ｆ）において実証されるように、組織特異的に損傷を受けた組織を回復させると予測される。
【００８４】
（例３）
（予言的）
この予言的実施例において、肺線維芽細胞、肺細胞または塵埃細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。肺線維芽細胞、肺細胞または塵埃細胞またはその細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、肺特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの肺特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。肺特異的な教育されたマクロファージを、ラット炎症性肺損傷モデルにおいて、および煙吸入性肺損傷、ＣＯＰＤ、喘息、肺線維症または閉塞性細気管支炎を有するヒトにおいて肺機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００８５】
（例４）
（予言的）
この予言的実施例において、ケラチノサイトまたは皮膚線維芽細胞などの皮膚間質細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。皮膚細胞または皮膚細胞細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、皮膚特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの皮膚特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。皮膚特異的な教育されたマクロファージを、動物皮膚損傷モデルにおいて、および火傷、外傷、乾癬などの炎症性皮膚障害、皮膚ＧＶＨＤ、全身性強皮症、虚血性潰瘍または神経因性潰瘍を有するヒトにおいて、創傷または火傷を治癒するなどのために対象に投与する。
【００８６】
（例５）
（予言的）
この予言的実施例において、膵臓、膵臓間質におけるＭＳＣなどの膵臓間質細胞または線維芽細胞細胞または膵島細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。膵臓細胞または膵臓細胞細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、膵臓特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの膵臓特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。膵臓特異的な教育されたマクロファージを、遺伝子ノックアウトまたは過剰カロリー摂取モデルなどの動物膵臓疾患モデルにおいて、および糖尿病を有するヒトにおいて、膵臓機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００８７】
（例６）
（予言的）
この予言的実施例において、肝細胞、Ｋｕｐｐｆｅｒ細胞などの肝臓細胞、肝線維芽細胞またはＭＳＣは、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。肝臓細胞または肝臓細胞細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、肝臓特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの肝臓特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。肝臓特異的な教育されたマクロファージを、硬変の動物モデルにおいて、および硬変または肝不全を有するヒトにおいて肝臓機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００８８】
（例７）
（予言的）
この予言的実施例において、ＭＳＣなどの腎臓細胞、線維芽細胞、糸球体細胞、尿細管細胞、糸球体上皮細胞またはメサンギウム細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。腎臓細胞または腎臓細胞細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、腎臓特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの腎臓特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。腎臓特異的な教育されたマクロファージを、急性もしくは慢性腎不全の動物モデルにおいて、ならびに急性もしくは慢性腎不全、末期腎疾患、糸球体腎炎およびループス腎炎を有するヒトにおいて腎臓機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００８９】
（例８）
（予言的）
この予言的実施例において、グリア細胞などの脳細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。脳細胞または脳細胞細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、脳特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの脳特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。脳特異的な教育されたマクロファージを、ラットまたはマウス卒中モデルにおいて、および卒中、アルツハイマー病、ＡＬＳ、パーキンソン病または神経発達疾患などの神経変性性疾患を有するヒトにおいて脳機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００９０】
（例９）
（予言的）
この予言的実施例において、線維芽細胞または他の間質細胞などの内分泌器官に由来する細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。内分泌線維芽細胞または間質細胞またはその細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、内分泌特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの内分泌特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。内分泌特異的な教育されたマクロファージを、ホルモン欠乏症の動物モデルにおいて、およびホルモン欠乏症または内分泌器官の炎症を有するヒトにおいて内分泌機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００９１】
（例１０）
（予言的）
この予言的実施例において、ライディッヒ細胞、ＭＳＣおよびその他の間質細胞などの生殖器由来の細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。生殖器由来の細胞またはそれに由来する細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、生殖器特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの生殖器特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。生殖器特異的な教育されたマクロファージを、不妊症の動物モデルにおいて、および不妊症、ホルモン不均衡、生殖器の損傷、閉経または低テストステロンレベルなどの正常な老化生殖ホルモン欠乏症を有するヒトにおいて生殖器機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００９２】
（例１１）
（予言的）
この予言的実施例において、周皮細胞または内皮細胞などの血管細胞は、生検または多能性幹細胞の分化によって得る。周皮細胞、内皮細胞またはその細胞外因子を、白血球除去によって得られた循環単球とともに同時培養して、血管特異的な教育されたマクロファージを作製する。これらの血管特異的な教育されたマクロファージは、伝統的なＭ１もしくはＭ２マクロファージまたは他の組織特異的マクロファージと比較して、独特の差次的サイトカイン、増殖因子、タンパク質およびＲＮＡ発現プロファイルを有する。血管特異的な教育されたマクロファージを、静脈または動脈連結の動物モデルにおいて、および末梢動脈疾患を有するヒトにおいて血管機能を回復させるまたは修復するなどのために対象に投与する。
【００９３】
参考文献
2020511999.tif 000004
2020511999.tif 000005
2020511999.tif 000006
2020511999.tif 000007
【図１】
2020511999.tif 000008
【図２】
2020511999.tif 000009
【図３Ａ−３Ｂ】
2020511999.tif 000010
【図４】
2020511999.tif 000011
【図５】
2020511999.tif 000012
【図６】
2020511999.tif 000013
【図７】
2020511999.tif 000014
【図８】
2020511999.tif 000015
【図９】
2020511999.tif 000016
【図１０】
2020511999.tif 000017
【図１１】
2020511999.tif 000018
【図１２】
2020511999.tif 000019
【図１３】
2020511999.tif 000020
【図１４】
2020511999.tif 000021
【図１５−１】
2020511999.tif 000022
【図１５−２】
2020511999.tif 000023
【図１６】
2020511999.tif 000024
【図１７−１】
2020511999.tif 000025
【図１７−２】
2020511999.tif 000026
【図１７−３】
2020511999.tif 000027
【図１７−４】
2020511999.tif 000028
【図１７−５】
2020511999.tif 000029
【図１７−６】
2020511999.tif 000030
【図１８−１】
2020511999.tif 000031
【図１８−２】
2020511999.tif 000032
【図１９】
2020511999.tif 000033
【図２０】
2020511999.tif 000034
【国際調査報告】
2020511999.tif 000035
2020511999.tif 000036
2020511999.tif 000037