(57)【要約】  脳虚血を経験しつつある対象者の治療は、その治療が血栓溶解剤と血管内皮増殖因子受容体シグナル伝達（ＶＥＧＦ−ＲＳＴ）の阻害剤とを使用する場合に改善され、該阻害剤の用量は、癌患者の治療に使用される用量と比較して少ない、低用量である。その治療はまた、ポイント・オブ・ケア使用を可能にするために、室温での長期安定性を目的としてタンパク質薬物を製剤化し、その方法に適した用量を提供することによって、かつ該治療薬を血液脳関門の完全性についてのポイント・オブ・ケア診断と組み合わせることによって、改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者における、脳虚血性イベントによって引き起こされるニューロン損傷を軽減するための治療方法であって、該患者に、有効量の血栓溶解剤および有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体介在シグナル伝達（ＶＥＧＦ−ＲＳＴ）阻害剤を投与することを含み、
ここで、該阻害剤の有効量が急性期阻害をもたらすが、長期的には阻害しない方法。
【請求項２】
ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤が、ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦ−Ｒに特異的に結合し、かつそれに対してアンタゴニスティックである抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、あるいは、抗体ミミックであるか、あるいは、ＶＥＧＦ−Ｒシグナル伝達に関連するキナーゼの阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害剤の有効量が癌の治療に使用される用量の０．１〜５％の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体阻害剤の有効量が７０ｋｇの患者につき０．１〜２．５ｍｇの範囲内であり、
ここで、抗体フラグメントまたは抗体ミミックの値は、該フラグメントまたは該ミミックの分子量と完全抗体の分子量の比に応じて減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記虚血性イベントから生じる血液脳関門（ＢＢＢ）完全性の喪失について検査を実施することをさらに含む、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記検査が、血中の総Ｓ１００Ｂおよび／またはＳ１００ＢＢホモ二量体を測定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記血栓溶解剤が、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、デスモテプラーゼ、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）、または機械的血栓溶解を含む、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤が、ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦ−Ｒに特異的に結合し、かつそれに対してアンタゴニスティックである抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、あるいはチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記キナーゼ阻害剤が、チボザニブ（Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ）、アパチニブ（Ａｐａｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（Ａｘｉｔｉｎｉｂ）、イムチニブ（Ｉｍｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、フルキチニブ（Ｆｒｕｑｕｉｔｉｎｉｂ）、ブリバニブ（Ｂｒｉｖａｎｉｂ）、セジラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、スルファチニブ（Ｓｕｌｆａｔｉｎｉｂ）、およびスニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血栓溶解剤と前記ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤が、室温における長期安定性のため製剤化されかつ／またはパッケージングされている、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
血栓溶解剤およびＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤である成分を含むキットであって、
ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤が癌の治療に使用される用量の０．１％〜５％の範囲内の測定用量であるキット。
【請求項１２】
前記成分が、室温における長期安定性のため製剤化されかつ／またはパッケージングされている、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤が、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｒに特異的に結合しかつそれに対してアンタゴニスティックである抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、あるいはＶＥＧＦ−Ｒシグナル伝達に関連するキナーゼの阻害剤である、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記治療に対する患者の感受性を判定するために前記虚血性イベントから生じる血液脳関門（ＢＢＢ）完全性の喪失についての検査、および、血栓溶解剤とＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の併用治療に適切な患者を選択するのに適した判断ガイドをさらに含む、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記検査が血中の総Ｓ１００Ｂおよび／またはＳ１００ＢＢホモ二量体を測定することを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ヒト患者における脳虚血性イベントによって引き起こされるニューロン損傷を軽減するための治療方法であって、該虚血性イベントに関連する血塊を機械的に除去すること、およびその除去に伴い、ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤を、シグナル伝達の５０％超を２４時間にわたって阻害するのに有効な測定用量で投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】
ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤が、ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦ−Ｒに特異的に結合し、かつそれに対してアンタゴニスティックである抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、あるいはチロシンキナーゼ阻害剤であり、前記測定用量が癌の治療に使用される用量の０．１％〜５％の範囲内である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記機械的除去のためのカテーテルを含むデバイスによって行われ、前記阻害剤が前記機械的除去用のデバイスの一部であるカテーテルを用いて投与される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／４４２，８２６号および２０１７年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４７０，０８６号に対する優先権を主張するものであり、各出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、薬学的または機械的な血栓溶解後に出血性変化（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のリスクがある脳虚血経験患者を治療するための、生理学的状態の生物学的マーカーの分野およびその方法を実施するためのキットに関する。特に、本発明は、長期的な阻害ではなく一過性の阻害をもたらす、有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体介在シグナル伝達（ＶＥＧＦ−ＲＳＴ）の阻害剤に関する。本発明はまた、冷蔵保存を不要とするためのタンパク質薬物の安定化、ならびに酸素ラジカル損傷を低減させかつ注射による送達の際のタンパク質凝集を低減させるようにこれらの薬物をパッケージングすることに関する。本発明はまた、機械的な血栓溶解の改善に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＷＯ２０１１／０１３６６８として公開され、米国特許出願第１３／３５９，２８１号（現在米国特許第８，６５２，４７６号および第９，４３９，９６１８号）として米国で一部継続出願として出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６２６３１は、脳梗塞の発症後６時間以内であると考えられている脳虚血性イベントの急性期の間に、血栓溶解療法（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）とＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤とを組み合わせることによる、ヒトの脳梗塞または脳虚血の改善された治療方法を記載している。これにより、治療ウィンドウは３時間から６時間に延長された。
【０００４】
ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の添加により、このような治療において拡大した時間ウィンドウ内でおこる血栓溶解剤による出血性の影響が改善される。この治療によって、血栓溶解剤投与の利点がリスクを上回る時間ウィンドウが拡張されることもあり、血栓溶解療法が適用できる患者群が拡大される。しかし、これらの文献では、ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の投与量レベルが制限されておらず、抗ＶＥＧＦ抗体である阻害剤の高用量、すなわち癌の治療に使用される範囲内の用量が提案されている。
【０００５】
前記プロトコルに関する研究が発表されている。Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０００）１０６：８２９−８３８では、ＶＥＧＦに結合する抗体が、ラットモデルにおいて脳卒中を誘発した後早期（１時間）および後期（４８時間）に投与された。Ｈａｒｖａｒｄポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社；  Ｓｏｕｔｈ  Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，米国）を用いて、ｒｈＶＥＧＦ１６５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を１ｍｇ／ｋｇの用量で４時間間隔でラットに静注した。早期投与は有害であったが、後期投与は有益であった。ｔＰＡの毒性を改善するのに必要とされる、ＶＥＧＦに対する抗体の用量レベルは、ポリクローナル抗体ＲＢ−２２２に基づいていた：Ｋａｎａｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ（２０１１）３１：１４６１−７４。その後の研究もポリクローナル抗血清に基づいており、ＭＭＰの発現を調節することによる血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＢＢ）の破壊の減弱が示されている。Ｚｈａｎｇ，Ｈ−Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｐ．（２０１７）１５：５７−６４。
【０００６】
脳梗塞の発症時期は、対象者がその時に医学的監視下にないため、判定するのが通常困難である。さらに、塞栓性脳卒中の患者における破壊された血液脳関門（ＢＢＢ）の存在は、血栓溶解後の出血のリスク因子である。ＷＯ２０１５／１３８９７４において本発明者らにより記載されるように、ＢＢＢ完全性の乱れの深刻度とその期間の両方の決定は、血中に存在するＢＢＢ完全性についてのマーカーを使用することによって達成され得る。適切なマーカーは、Ｍａｒｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００２）２０：１−１３の論文、彼らの対応する特許である米国特許第７，１４４，７０８号および第６，８８４，５９１号、ならびにＷＯ２０１２／１５４８８９として公開された彼らのその後のＰＣＴ出願に記載されている。これらの文献は、血中のＳ１００Ｂまたはそのホモ二量体の総レベルを測定することを含む、対象者における血液脳関門透過性の診断方法を記載しており、その場合、Ｓ１００Ｂまたはそのホモ二量体のレベルの上昇がＢＢＢ透過性を表している。Ｚｈｏｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇ．Ｒｅｓ．（２０１６）３８：３２７−３３２も参照されたい。
【０００７】
様々な血栓溶解療法が文献に記載されており、様々なＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害方法も同様である。例えば、血栓溶解療法は、プラスミノーゲンアクチベータ、例えば、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼもしくはそれらの類似体、または他のプラスミノーゲンアクチベータ、例えば、吸血コウモリに由来するもの、もしくは真菌に由来するもの、例えばＳＭＴＰ−７、あるいは塞栓の機械的破壊または除去を含み得る。ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤は、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ−Ｒに対する特異的結合パートナー、または血小板からのＶＥＧＦの放出を阻害する化合物、または活性化されたＶＥＧＦ−Ｒからのシグナル伝達を妨害する化合物、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、であり得る。
【０００８】
最も重篤な脳卒中もまた、血栓溶解療法から最大の恩恵を受けている。しかしながら、重篤な脳卒中はＢＢＢ破壊のより高いリスクにもさらされており、ｔＰＡはその破壊を深刻なものにする。したがって、ｔＰＡのような血栓溶解剤は、脳卒中後３時間を超えて投与すると深刻になる出血のリスクのため、現在のところ脳卒中患者の数パーセントにしか使用されていない。ｔＰＡの毒性を下げるために利用可能な補助療法を用いると、そうした治療から恩恵を得ることができる患者集団はかなり増加する。一般に脳卒中は目覚める直前に起こることが最近の研究で分かっているので、これは「睡眠中発症」（ｗａｋｅｕｐ）脳卒中の患者にまで広がっている。Ｒｕｂｉｎ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓｔ（２０１５）５：１６１−１７２。
【０００９】
現在、ｔＰＡ使用の適切性を評価することは病院でのＣＴスキャン後に行われており、その結果、血栓溶解剤の最適な早期投与と比較して、治療の大幅な遅れが生じている。診断の遅れを減らすためにポータブルＣＴスキャナーを装備した救急車を使用する研究では、血栓溶解療法を選択するのに必要とされる時間の大幅な削減が、有害事象の増加なしに、標準的な治療により達成された；Ｗａｌｔｅｒ，Ｓ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０１２）１１：３９７−４０４；  Ｅｂｉｎｇｅｒ，Ｍ．，ＪＡＭＡ（２０１４）３１１：１６２２−１６３１。この研究は改良された診断技術に基づいて早期血栓溶解療法の有用性を確立したが、ＣＴスキャナーを全ての救急車に装備する費用は法外なものである。ｔＰＡの有益性についての同等の早期診断を提供する、ポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）に適した検査法の開発によって、病院に到着する前に、救急車内でかなりの割合の脳卒中患者を治療する機会がもたらされる。本発明は、救急車内で行う治療（ａｍｂｕｌａｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を容易にするものである。この改善された診断方法を用いると、患者において望ましい治療効果をもたらす血栓溶解剤の使用は、推定脳卒中患者の５％未満から２５％超にまで増加し得る。
【００１０】
上記の文献および本明細書に引用された他の全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１１】
発明の開示
一態様では、本発明は、ヒト患者における脳虚血性イベントによって引き起こされるニューロン損傷を軽減するための治療方法に関し、該方法は、該患者に、有効量の血栓溶解剤および有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体介在シグナル伝達（ＶＥＧＦ−ＲＳＴ）の阻害剤を投与することを含んでなり、この場合、該阻害剤の有効量は急性期阻害をもたらすが、長期的には阻害しない量である。典型的には、該阻害剤の有効量は癌の治療に使用される用量の０．１〜５％の範囲である。
【００１２】
脳卒中の状況においてＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤を適正な用量レベルで使用することは、ｔＰＡの毒性を低減させるための効率的な道筋を提供する。この状況での目標はＶＥＧＦ活性の急性遮断であるので、必要とされる用量は、癌の治療（そのためには長期の薬理活性が望まれる）に使用される用量よりも質的に少ない量である。低用量のＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の正常なクリアランスは、長期リモデリング期（この期間、ＶＥＧＦは有益な因子である）のかなり前に、該阻害剤が薬理学的に活性なレベル以下に減少することを確実にするであろう。
【００１３】
ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤に関して、ＶＥＧＦに対する抗体は、現在、癌の治療に使用されている；その場合には、ＶＥＧＦ活性の長期抑制が望まれており、その用量は数週間にわたって有効な血中レベルを達成することを基準としている。脳卒中患者における血栓溶解剤の毒性を改善するためには、短期抑制のみが必要とされる（理想的には４８時間）。同様に、他のＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤、例えばＳｕｔｅｎｔ（登録商標）を含むキナーゼ阻害剤などもまた、長期治療を必要とする癌の治療に使用されている。
【００１４】
別の態様では、本発明は、脳虚血を経験しつつある患者のポイント・オブ・ケア治療、例えば救急車による輸送中の治療、を可能にする一連の要因に関する。本発明によって提供される技術革新は、ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の用量を調整することに加えて、投与される薬物を適切なパッケージングおよび安定化技術によって安定化すること、ならびに血液脳関門（ＢＢＢ）破壊の徴候として血中のマーカーを評価することによって示唆される、治療に対する患者の適合性を判定することを含む。
【００１５】
貯蔵に関しては、前記治療のための組み合わせは、典型的には、２種の生物学的製剤、血栓溶解剤と、出血の発生率または重症度を軽減するためのＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤、例えば血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ）に対する抗体、またはチロシンキナーゼ（ＶＥＧＦ−Ｒによるシグナル伝達を媒介する）の阻害剤とを含む。それゆえに、安定化が必要とされる。血栓溶解剤の用量は標準的治療に基づいている。本発明によれば、ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤の投与量は癌治療に使用される投与量よりもはるかに少ない量である。
【００１６】
この組み合わせ治療（併用療法）は、好ましくは、上記のような予防薬、すなわちＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤が投与されるとしても出血を引き起こす可能性がある、血栓溶解剤による治療のリスクを正当化するのに脳卒中の重症度が十分である場合に、施されるべきである。したがって、別の態様では、本発明は、血中のＳ１００ＢまたはＳ１００ＢＢ二量体についてのポイント・オブ・ケア検査を使用して、治療に適した患者を識別する方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、ＢＢＢ破壊の１つ以上のバイオマーカーを測定するための試薬を含むキット、ならびにＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤と組み合わせて血栓溶解療法または血栓除去術を提供するための組成物中の治療薬または材料の容器に関する。そのようなキット中の薬物および試薬は、必要とされる投与量に相当する測定用量で提供され得る。
【００１８】
本発明はまた、虚血性イベントに関連する血塊を機械的に除去すること、およびその除去に際して、ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤を、シグナル伝達の５０％超を２４時間にわたって阻害するのに有効な測定用量で投与することに関し、特に、その場合、該阻害剤は機械的除去デバイスの一部であるカテーテルを用いて投与される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
上述したように、本発明の一態様では、脳虚血を有する患者に対する有効なポイント・オブ・ケア治療、例えば救急車での輸送中の治療、を可能にする３つの基本的側面が存在する。これらの側面は以下のとおりである：血栓溶解剤と併用されるＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤の用量を調整すること；この治療に使用される薬物を、薬物自体の適切な処理により、かつ／または適切なパッケージングにより安定化すること；ならびに患者の血中のＢＢＢ完全性または破壊のマーカーを測定することによって、ポイント・オブ・ケアでの治療を含めて、治療の妥当性を評価すること。
【００２０】
重要な特徴は、ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の投与量レベルである。多くのそのような阻害剤は当技術分野で公知であり、癌の治療に使用されている。ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤については、長期の阻害が生じないように急性の投薬が必要とされる。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｒに結合する抗体を含めて、抗体はもともと長期効果を示すものであるため、癌治療に使用される投与量と比較して、低減した投与量が必要とされる；キナーゼ阻害剤の場合も同様である。同じことが、ＶＥＧＦ−Ｒシグナル伝達に関連するキナーゼの阻害剤についても言える。任意のＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の場合、その投与量は、阻害が２４〜４８時間にわたってのみもたらされ、５０％超または６０％超のＶＥＧＦ−ＲＳＴを阻害し、かつその治療ウィンドウをかなり超えて長期にわたることがない、すなわち５日以上の期間に及ぶ癌治療とは相違する、ようなものであるべきである。抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはキナーゼ阻害剤については、これは、癌の治療に用いられる用量の５％未満または１％未満または０．１％未満の用量を用いることによって達成される；なぜなら、体内からの正常な排出が、示された期間内にその血清濃度を薬理学的に活性なレベル以下に低下させるからである。低用量の全身作用は、Ａｖｅｒｙ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（２０１４）９８（１２）：１６３６−４１に報告されたように、最小限である。
【００２１】
「抗体」は、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ構築物、および二重特異性構築物を包含し得る。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、組換え的に作製してもよい。抗体は、好ましくはヒトにおいて最小限に抗原性であり、それゆえに配列の点でヒト（ヒト抗体レパートリーを発現するトランスジェニック動物またはヒト抗体遺伝子の組換えライブラリー由来）であり得、ヒト化されてもよく、ヒトから単離されてもよく、またはキメラであってもよい。同様に、縮小サイズ（低分子量）の抗体（ナノボディ）、例えばラクダまたはサメに見られる抗体（天然に存在する変異体）なども使用可能である。抗体ミミックは、フィブロネクチン、トランスフェリン、グルタチオントランスフェラーゼ、水晶体クリスタリンなどの足場に基づくタンパク質のファミリーを含む。他のミミックには、小ペプチド、ペプチドミミック（例えば、βアミノ酸、もしくはＤアミノ酸、または立体配座安定性を高めるための化学的架橋剤を組み込んだもの）、ならびに核酸ベースのアプタマーなどの非ペプチド結合剤が含まれる。
【００２２】
抗ＶＥＧＦ抗体の例としては、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））およびベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。ヒト患者へのＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）の標準投与量は５０ｍｇの範囲である。多くのキナーゼ阻害剤が存在し、少なくとも２４０種類が一般的に使用されている。Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）６５８：１１４８を参照されたい。典型的なものは、チボザニブ、アパチニブ、レンバチニブ、アキシチニブ、イムチニブ、モテサニブ、フルキチニブ、ブリバニブ、セジラニブ、レゴラフェニブ、スルファチニブ、およびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））である。癌治療のためのＳｕｔｅｎｔ（登録商標）の典型的な投与量は、５０ｍｇを経口的に毎日４週間、その後２週間の休薬である。また、ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤として、キナーゼまたはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ−Ｒに結合するアプタマー、例えばペグ化抗ＶＥＧＦアプタマーであるペガプタニブなど、も含まれる。
【００２３】
血栓溶解剤および血栓溶解療法に関して、種々のプラスミノーゲンアクチベータを使用することができ、例えば、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）またはその誘導体、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）、デスモテプラーゼ（吸血コウモリプラスミノーゲンアクチベータ由来）、およびフィブリンに作用する他のプロテアーゼなどである。フィブリンを切断することが知られている他の薬剤ならびに機械的破壊も本発明において使用される。これらは単独でまたは組み合わせで使用することができる。
【００２４】
簡単に説明すると、しかしながら、本発明の改良方法によるこの薬物の組み合わせは、ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤の用量を、もっぱら急性的に作用する用量、すなわち薬物濃度が２４〜４８時間後に大幅に低下する用量に制限するものである。用量は、癌の治療において使用されるときのそうした阻害に使用される用量の５％未満である。このように有用な量は、ＶＥＧＦに対する抗体であるＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤によって用いられる量から推定することができる。それゆえに、抗ＶＥＧＦ抗体による血中濃度は、本明細書で定義されるように急性的にのみ作用するＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤の適切な用量を決定するために、これらの阻害剤の代替形態の血中濃度と比較され得る。治療で投与される薬物の組み合わせは、ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤の用量が癌の治療において所望の効果を得るために使用される用量の５％未満または１％未満または０．１％未満である組み合わせに特に限定される。小分子薬（ならびに抗体またはフラグメント）の場合、その用量は、２４時間にわたってＶＥＧＦ−ＲＳＴ活性の５０％超または６０％超を阻害するのに必要な量である。これは、本発明のプロトコルで使用されるモノクローナル抗体の投与量が、７０ｋｇの患者において０．１〜２．５ｍｇ、または７０ｋｇの患者において０．５〜２．０ｍｇ、または７０ｋｇの患者において１ｍｇ〜１．５ｍｇの範囲であり、異なる体重の患者については調整されることを意味している。
【００２５】
投与は経口または注射であり得る。静脈内注射が好ましいが、必須ではない。好ましい投与方法は、当然、使用される特定の治療薬に依存するであろう。経口投与用の典型的なビヒクルには、標準的な賦形剤を含む錠剤、カプセル剤、シロップ剤などが含まれる；注射剤用の賦形剤もまた、慣用のものであり、当技術分野において周知である。これらは、例えば、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）によって発行されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に見出すことができる。注射は、従来の方法またはＰｈａｒｍａｊｅｔ社（Ｇｏｌｄｅｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）から販売される空気圧システムにより行うことができる。
【００２６】
上記のＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤はまた、機械的血栓溶解と組み合わせて使用することができ、機械的血栓溶解は典型的には、カテーテルを挿入し、虚血に伴う血塊を機械的に除去することによって行われる。これらの阻害剤は個別に提供されてもよいし、機械的除去に使用されるカテーテルによって導入されてもよい。当技術分野では虚血に伴う血塊を機械的に除去するための多数のデバイスが知られており、これらは以下に記載される。ＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤を直接的に血塊に供給することは、血塊それ自体に特に関連する急性投薬の利点を有するが、カテーテルを介する投与の代わりに、またはそれに加えて、そのような阻害剤を全身的に追加投与することもできる。本発明のこの態様では、血塊の機械的除去が出血のリスクをそれほど高めないので、血液脳関門の状態の評価は必要とされない。
【００２７】
しかしながら、血栓溶解手段が医薬品である場合、出血が起こりそうもないことを保証することが望ましい。救急車内で投与され得る血栓溶解剤の迅速な方法での投与の望ましさとタイミングの両方の決定は、ＢＢＢ破壊の程度についての血中の１つ以上のバイオマーカーのポイント・オブ・ケア検査を用いて、達成することができる。この目的のために、好ましい実施形態は、血中のＳ１００Ｂおよび／またはそのホモ二量体を測定することである。Ｓ１００Ｂは、星状膠細胞から分泌されるカルシウム結合タンパク質であり、末梢血中のその正常レベルは極めて低い。血液脳関門破壊の他のマーカーが当技術分野で公知であり、それらは、Ｓ１００Ｂ検査の代わりにまたはそれと組み合わせて、使用することができる。例えば、末梢血中のＵＣＨＬ−１レベルの上昇はＢＢＢ破壊の診断に役立つ。Ｐｕｖｅｎｎａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１４）９（５）：ｅ９６２９６。
【００２８】
血液を用いた診断は、精巧な機器が頼りであったり、時間と労力がかかったり、また、サンプルを精製する必要があったりするため、これまで臨床検査室での使用に限定されてきた。バイオセンサーとマイクロ流体力学の複合分野での進歩によって、ポイント・オブ・ケア診断が可能になっている。Ｌｕｋａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ（２０１５）１５：３００１１−３００３１。バイオセンサーは、物理化学トランスデューサー上に固定化された、抗体などの、生物由来の認識エレメントを利用する。マイクロ流体システムは、流動条件を制御し、異なる試薬類の混合速度を上げ、サンプル体積を（ナノリットルスケールにまで）減らし、それによって検出感度を高める一方で、サンプル調製機能をも提供する。
【００２９】
ＢＢＢ破壊の深刻度についての血液由来マーカーなどのポイント・オブ・ケア検査は、迅速な血栓溶解療法を可能にし、それによって、より高い効果を達成するのに有用であり、また、ＶＥＧＦ活性を遮断するための薬剤との組み合わせによって有害な出血のリスクが低減される。
【００３０】
ＢＢＢ破壊についてのポイント・オブ・ケア検査の使用と、その結果としての、治療の望ましさおよびタイミングの評価は、参照により本明細書に組み込まれる上記ＷＯ２０１１／０１３６６８に記載された治療に関しての改善点をもたらす。
【００３１】
上記検査の実施に関して参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８４，５９１号および第７，１４４，７０８号は、脳虚血後のＢＢＢ完全性の状態についてのアッセイを記載している。‘５９１および‘７０８特許に概説されるように、血液（または血漿もしくは血清）中のＳ１００Ｂの測定は、そのレベルが通常血液中で非常に低いかまたは検出不可能であり、正常レベルが０．０５ｎｇ／ｍｌであり、ＢＢＢの損傷時には１０〜１００倍増加する、という利点を有する。様々なポイント・オブ・ケア検査プラットフォームで容易に検出できるＳ１００Ｂレベルの範囲は、１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｌである。したがって、正常レベルを超える増加は容易に測定され得る。
【００３２】
上記の方法では、この戦略の有用性を最大にするために、血栓溶解剤とＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤とが病院に到着する前に容易に利用可能であることが重要である。これらの不安定なタンパク質薬物のための冷蔵または他の低温貯蔵法は、救急車の閉鎖的空間内に提供することが難しいので、冷蔵保存の必要性を排除する方法でこれらの生物学的薬物を安定化することがさらに有利である。この目的のためにいくつかの戦略が利用可能である。当然のことながら、そのような安定化およびパッケージングされた薬物ならびに本発明の検査および治療レジメンを病院では使用できないとする理由はない。
【００３３】
冷蔵の必要性を排除するためのタンパク質の安定化は、特に熱帯諸国で使用するための、ワクチンとの関連において、強い関心を集めている。冷蔵せずに貯蔵寿命の延長をもたらす凍結乾燥条件が、無菌食塩水への容易な溶解と併せて、見出されている。米国特許第８，３１３，８９７号は、凍結乾燥形態でのポリエチレンイミンと組み合わせたある種の糖の有用性を開示している。米国特許第７，１５３，４７２号は、蒸発フォーム乾燥（ｖａｐｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏａｍ  ｄｒｙｉｎｇ）（従来の凍結乾燥よりも速く、かつタンパク質変性を起こしにくい）によって粉末ガラス（非晶質、半結晶性）組成物を得ることを開示している。フォーム乾燥のさらなる詳細は、米国特許第５，７６６，５２０号に開示されている。タンパク質の安定化に加えて、Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０３：１５２０−１５２８に記載されるように、シリンジの設計が微小凝集塊の形成に影響を及ぼす。適切なコーティング技術を用いると、タンパク質の微小凝集を促進し得るシリコーンオイルを使用せずに、滑らかな分配が可能である。
【００３４】
まとめると、本発明は、救急車内での虚血性患者の緊急治療を可能にする改善、ならびに通常病院で行われる医療手当の改善を提供する。かくして、血液脳関門の状態を評価しかつ適量のＶＥＧＦ−ＲＳＴ阻害剤を投与することによって出血のリスクを最小にしながら、血塊を溶解する治療薬による適切な緊急治療を評価するための材料および方法が提供された。本発明はまた、そのような阻害剤を同様の量で、特に機械的除去に使用したのと同じカテーテルを用いて、投与することによって、機械的血塊除去の結果を改善することにも向けられる。
【００３５】
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１
治療ウィンドウの関数としてのｔＰＡと抗ＶＥＧＦ抗体との併用投与を評価するためのアッセイ
脳梗塞ラットモデルは、上記のＷＯ２０１１／０１３６６８ならびに米国特許第８，６５２，４７６号および第９，４３９，９６１号に開示されている。簡単に説明すると、ポリエチレンチューブカテーテル内でラット由来の自己血およびトロンビンをゲルとして凝固させることによって、血栓を形成させる。これを一晩放置して、１ｍｍの長さに切断する。ハロタンによる麻酔下でラットモデルの外頸動脈から中大脳動脈に血栓を注入する。脳の血流を、血栓の注入前と注入３０分後または２４時間後に測定する。血栓の注入前に測定された脳血流の５０％よりも低下した脳血流を示す動物を、この実験におけるモデルとして使用する。
【００３７】
血栓の注入後、時間の関数としての血清Ｓ１００Ｂレベルを、血栓の注入前に測定されたＳ１００Ｂレベルと比較することによって、ＢＢＢの状態を評価する。抗ＶＥＧＦ処置は、脳卒中の誘発前の同じ個々のラットにおけるＳ１００Ｂレベルに対して正規化されたＳ１００Ｂレベルを著しく減少させる。その効果は両方の時点（脳卒中の誘発後３〜９時間および２４時間）で見られ、対照グループでのたった１匹に比べて、抗ＶＥＧＦグループでは５匹のうち４匹のラットがＳ１００Ｂの減少を示す。
【００３８】
実施例２
ヒト脳卒中血栓サンプル中のＶＥＧＦとＳ１００Ｂの測定
複数のＳ１００Ｂ研究のレビューは、Ｓ１００Ｂが一般的に脳卒中のマーカーとしては適さないが、脳損傷のための代理マーカーとして有用であると結論づけた（Ｄａｓｓａｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．（２００９）２７：２９５−３０２）。ＶＥＧＦシグナル伝達を遮断することによってｔＰＡの毒性を改善する薬剤と組み合わせたｔＰＡの使用は、より重度の脳損傷を有する患者に最適であり、そのためＳ１００Ｂはこの併用療法を受ける患者を選択するための有用なマーカーである。
【００３９】
現在、ｔＰＡは動脈内血塊を溶解するために広く使用されている唯一の薬理学的介入であり、脳血流を回復させるのに役立っている。他の介入戦略には、動脈内血栓を機械的に破壊・粉砕して取り除く機器の使用が含まれ、特に、ＭＥＲＣＩ（登録商標）またはＴｒｅｖｏ（登録商標）（Ｓｔｒｙｋｅｒ社；Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）；Ｓｏｌｉｔａｉｒｅ（商標）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；Ａｐｏｌｌｏ（商標）（Ｐｅｎｕｍｂｒａ社；Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）が挙げられる。ラットモデルで観察されたのと同じ局所的ＶＥＧＦ上昇が、塞栓性脳卒中イベント後にヒトの脳にも見られるかを試験するために、３９人の患者がこの研究に登録された。これらのうち、１８人が介入的血栓除去術を開始する前にｔＰＡの静脈内投与を受けた。全ての患者が血管内再開通術（ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を受け、臨床的および放射線学的基準によって２０例が出血性と分類された。ＭＲＩによる脳卒中の程度を、拡散強調イメージング（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ：ＤＷＩ）として測定し、改良したＡｌｂｅｒｔａ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅａｒｌｙ  ＣＴスコア（ＡＳＰＥＣＴＳ）によって定量化した。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｔｕｄｙ（ＥＣＡＳＳ）基準を用いて出血の性質を定義した。摘出された血栓および吸引物は通常廃棄されるが、この研究では分析のために保存した。完全な再開通は症例の５０％で達成され、部分的な成功は介入の２５％で達成された。Ｓ１００ＢおよびＶＥＧＦの値は、再開通の成功または程度と統計的に相関していなかった。末梢血サンプルも回収して、ＥＬＩＳＡアッセイでＶＥＧＦまたはＳ１００Ｂについて検査した。被検物質のレベルは脳卒中病因の機序（アテローム性動脈硬化、７％；心原性脳塞栓、５６％；大血管閉塞、１５％；原因不明、２２％）に左右されなかった。
【００４０】
循環ＶＥＧＦの値を血塊中のｔＰＡのレベルと比較したとき、ｔＰＡレベルとＶＥＧＦとの間に統計的に有意な相関が見られた（Ｐ＜０．００６）。患者をＶＥＧＦ血塊＞ＶＥＧＦ末梢として区分けした後、低ＶＥＧＦの患者は４２％のみに出血が認められた（ＣＴスキャンにより判定）のに対して、脳ＶＥＧＦが上昇した患者の７２％は出血の影響を受けたことが観察された（グループ間の差Ｐ＝０．０５）。末梢Ｓ１００Ｂと出血の存在の間の関係は有意であり（Ｐ＜０．０５）、採用した方法（ＣＴまたはＭＲＩ）には左右されなかった。全ての患者をまとめて分析したところ、Ｓ１００Ｂと血塊中のＶＥＧＦは放射線学的エンドポイントとよく相関していた；血塊ＶＥＧＦと末梢Ｓ１００Ｂは予後不良（退院時ＮＩＨストロークスケール（ＮＩＨＳＳ））と特に相関していた。
【００４１】
上記のヒトデータに基づいて、実験的に誘発された動脈内血栓のラットモデルでのさらなる実験を行って、ウサギポリクローナル抗ＶＥＧＦ抗体による処置後にＳ１００Ｂを調べた。未処置の動物では、８０％が虚血性脳卒中後８時間および２４時間で血清中のＳ１００Ｂの増加（前日のベースラインレベルに対して正規化した）を示した。対照的に、抗ＶＥＧＦ処置動物の８０％は両時点でＳ１００Ｂの顕著な減少を示した。
【００４２】
実施例３
ＶＥＧＦに対する抗体の用量調整
ＶＥＧＦ−ＲＳＴの阻害剤の有効量は、以下のような、入手可能な情報源から決定される：ｔＰＡの出血活性を改善するためのＶＥＧＦに対する抗体の有用性を確立する研究は、ＲＢ−２２２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）と命名されたポリクローナルウサギ血清を使用した：Ｋａｎａｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２０１１）３１：１４６１−１４７４。ラットに投与された用量は３０または１００μｇ／ラットであった；Ｚｈａｎｇ，Ｈ−Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｐ．（２０１７）１５：５７−６４では、１０μｇ／ラットのＲＢ−２２２の用量は５μｇ／ラットよりも有効であった。５００〜１０００ｇの体重では、これらの結果は、有効量が約７５μｇ／ｋｇであったことを意味する。平均体重７０ｋｇのヒトに適用すると、これはヒトに約５ｍｇ量を投与することに相当する。抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）の標準的な市販の単回量バイアルは１００ｍｇを含み、推奨される１０〜１５ｍｇ／ｋｇの総用量を達成するために複数のバイアルが使用される。この用量は癌治療に適しているが、前述のＫａｎａｚａｗａおよびＺｈａｎｇのデータは、脳卒中の治療で血栓溶解剤と組み合わせたときの有効用量が、ＲＢ−２２２のようなポリクローナル抗体を使用する場合、患者あたりわずか５ｍｇであることを実証する。本明細書に記載される脳卒中適応症では、この併用療法のための適切な用量は、癌に使用される用量の約１％である。
【００４３】
インビトロＥＬＩＳＡアッセイにおけるＶＥＧＦへのＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）結合のＥＣ５０は、０．１μｇ／ｍＬである。密接に関連した免疫組織化学アプリケーションのために業者が推奨するＲＢ−２２２の濃度は、１０μｇ／ｍＬである。すなわち、該モノクローナル抗体は、インビトロで該ポリクローナル血清よりも１００倍強力である。したがって、この比較による急性脳卒中適応症に対する等価のヒト用量は、癌に使用される用量の１％である。
【００４４】
実施例４
薬物動態に基づく用量調整
ＰＫ（薬物動態）モデルは、低用量Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）に関する既報のデータを用いて構築されたが、この低用量Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）は、黄斑変性症の治療のために眼内投与された該抗体からの全身循環への漏出から生じた；Ａｖｅｒｙ  Ｒ．Ｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（２０１４）９８：１６３６−４１。血栓除去術後に摘出された血塊中のＶＥＧＦのアッセイは、その部位でのピーク濃度が約１０ｎＭであることを示した。ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）の公表されているＫｄは２．２ｎＭであり、このモデルからは、約１ｎＭ（０．１５μｇ／ｍｌ）のＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）が血塊中のピークＶＥＧＦレベルを封鎖するのに十分であろうと予測される。
【００４５】
血液５Ｌ中のこの抗体濃度（約１ｎＭ）は、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量、または７０ｋｇのヒトに対しては０．７ｍｇの用量で達成される。これは標準的な癌用量の０．１％である。その用量で、正常なクリアランスは抗体濃度をそのＫｄの１０％未満に４８時間以内で減少させ、それ以後、該抗体は無視できるほどの薬理学的活性を有するであろう。
【００４６】
マウスモデルにおいて、これは証明されている。２．６７×１０−３ｍｇ／ｋｇ〜８．８×１０−３ｍｇ／ｋｇのＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）ＩＶの投与量範囲は、ピーク血中濃度１．５×１０−４〜４９×１０−４μｇ／ｍｌまたは６〜１８ｎＭをもたらした。これは、血清中のＶＥＧＦレベルを２２ｐｇ／ｍｌから１０ｐｇ／ｍｌにまで低下させるのに十分であった。
【国際調査報告】
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