(57)【要約】  オメガ−３脂肪酸について油を濃縮するための種々の酵素的方法、およびこれらの方法で使用するための特定のリパーゼ調製物が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）約５％〜約６０％ｗ／ｗのｎ−３ＰＵＦＡ部分含量を有する油であって、前記ｎ−３ＰＵＦＡ部分が前記油中に含有される遊離酸として、またはグリセリドおよび／もしくは極性脂質のアシル基として存在する油を用意するステップと；
（ｂ）前記油に、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で水またはアルカリ性水性緩衝液を添加して、ｐＨ約５〜約９の混合物を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記混合物にリパーゼを添加するステップであって、前記リパーゼが適切なポリマー支持体上に固定化され、前記リパーゼが飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸またはその脂肪酸アシル基に対して高い選択性を示し、前記油を同時または連続的にエステル交換、加水分解および／またはエステル化することができるステップと；
（ｄ）アルキルアルコールまたはアルコールドナー、特に短鎖アルキルアルコールまたはアルコールドナー、を用意し、前記アルコールまたはアルコールドナーを、ステップ（ｃ）で得られた前記油と前記酵素調製物の前記混合物に添加、特に段階的に添加、して、前記油、前記リパーゼ調製物、前記水またはアルカリ性水性緩衝液および前記アルコールを含む反応系を形成し（前記油は前記アルコールと反応する）、前記反応を、前記反応系に使用される油の、少なくとも４０重量％の前記油の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、１０重量％未満の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および約１５重量％〜約６０重量％のグリセリドへの転換率に到達させるステップと；
（ｅ）前記反応系から前記反応媒体を除去することによって前記反応を停止させ、引き続いて蒸発、特にフラッシュ蒸発、させて、過剰なアルコールおよび水を除去して、ＦＡＥＥ、ＦＦＡならびにモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドの混合物、ならびに場合により極性脂質を含む生成物を得るステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記生成物から前記脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸を留去することによって前記ＦＡＥＥおよびＦＦＡから前記グリセリドを単離して、ＦＡＥＥおよびＦＦＡを含む留出物ならびにグリセリド混合物および場合により極性脂質を含む残渣を得るステップであって、前記混合物が前記油と比較して高いオメガ−３脂肪酸含量を含有し、回収率が６０％より高いステップと
を含む、グリセリドとしてのｎ−３多価不飽和脂肪酸（ｎ−３ＰＵＦＡ）を濃縮するための酵素的方法。
【請求項２】
前記反応生成物から留去された脂肪酸アルキルエステルと遊離脂肪酸の前記混合物が、前記油中に存在する全ｎ−３脂肪酸のうちの４０％未満のｎ−３脂肪酸部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルコールがエタノールまたはメタノールのいずれか１つであり、前記短鎖アルキルアルコールドナーがアルコールドナーがジメチルまたはジエチルカーボナートのいずれか１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蒸留が分子蒸留、短行程または薄膜蒸留のうちのいずれか１つである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｎ−３脂肪酸部分がＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ部分のうちのいずれか１つ、ならびにそれらの少なくとも２つの任意の混合物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来し、特に前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種またはサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）のいずれか１つに由来する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リパーゼが、疎水性多孔質ポリマー樹脂支持体、特に疎水性脂肪族または芳香族樹脂支持体、上に固定化され、特に疎水性芳香族樹脂が架橋ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）またはスチレンまたは架橋スチレン−ＤＶＢである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｆ）で得られた前記グリセリド混合物を、真空下および温度３０〜８０℃で、反応混合物中適切なリパーゼ、特にその遊離形態のまたはポリマー樹脂支持体上に固定化されたカンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）由来のリパーゼ、の存在下で、（ｉ）ｎ−３ＦＦＡ濃縮物、または（ｉｉ）ｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル濃縮物の少なくとも１つとさらに反応させて、前記反応混合物からの過剰な脂肪酸エチルエステルおよび／または脂肪酸、ならびにアルコールおよび／または水副産物の蒸留後に６０％超の、６０％超のｎ−３脂肪酸を含有するトリグリセリドを含むグリセリド混合物を得る、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記油が食用油、特に魚油または藻油、真菌油、またはｎ−３脂肪酸を含有する適切な油性物質、である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）特に約５％〜約６０％ｗ／ｗの、ｎ−３多価不飽和脂肪酸を含む油を用意するステップであって、前記ｎ−３脂肪酸が前記油中のグリセリドもしくは極性脂質のグリセロール骨格に結合した脂肪酸アシル基として、および／または遊離脂肪酸として存在し、前記油が遊離またはエステル化飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸も含むステップと；
（ｂ）前記油に、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で水またはアルカリ性水性緩衝液を添加して、ｐＨ約５〜約９の混合物を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記混合物にリパーゼを添加するステップであって、前記リパーゼがポリマー樹脂支持体上に固定化され、前記樹脂が交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、特に疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメイン、を含み、前記リパーゼが飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸またはその脂肪酸アシル基に対して高い選択性を示し、前記油を同時または連続的にエステル交換、加水分解および／またはエステル化することができるステップと；
（ｄ）アルキルアルコールまたはアルコールドナー、特に短鎖アルキルアルコールまたはアルコールドナー、を用意し、前記アルコールまたはアルコールドナーを、ステップ（ｃ）で得られた前記油と前記酵素調製物の前記混合物に添加、特に段階的に添加、して、前記油、前記水または水性アルカリ性緩衝液、前記リパーゼ調製物および前記アルコールを含む反応系を形成し（前記油は前記アルコールと反応する）、前記反応を、前記反応系に使用される油の、少なくとも４０重量％の前記油の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、１０重量％未満の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および約１５重量％〜約６０重量％のグリセリドへの転換率に到達させるステップと；
（ｅ）前記反応系から前記反応媒体を除去することによって前記反応を停止させ、引き続いて前記反応物を蒸発、特にフラッシュ蒸発、させて過剰なアルコールおよび水を除去して、ＦＡＥＥ、ＦＦＡならびにモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドの混合物、ならびに場合により極性脂質を含む生成物を得るステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記生成物から前記脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸を留去することによって前記ＦＡＥＥおよびＦＦＡから前記グリセリド混合物を単離して、ＦＡＥＥおよびＦＦＡを含む留出物ならびにグリセリド混合物を含む残渣を得るステップであって、前記グリセリド混合物が場合により極性脂質をさらに含み、前記油と比較して高いオメガ−３脂肪酸含量を含有し、回収率が６０％より高いステップと
を含む、約３０％〜約８０％ｗ／ｗ、特に約５０％〜８０％ｗ／ｗ、より具体的には約５０％〜７０％ｗ／ｗ、のｎ−３多価不飽和脂肪酸部分を有するグリセリドの混合物を調製する方法。
【請求項１１】
前記油が食用油、特に魚油または藻油、真菌油、またはｎ−３脂肪酸、を含有する適切な油性物質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応生成物から留去された脂肪酸アルキルエステルと遊離脂肪酸の前記混合物が、供給原料中に存在する全ｎ−３脂肪酸のうちの４０％未満のｎ−３脂肪酸部分を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルコールがエタノールまたはメタノールのいずれか１つであり、前記短鎖アルキルアルコールドナーがアルコールドナーがジメチルまたはジエチルカーボナートのいずれか１つである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記蒸留が分子蒸留、短行程または薄膜蒸留のうちのいずれか１つである、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｎ−３脂肪酸部分がＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ部分のうちのいずれか１つ、ならびにそれらの少なくとも２つの任意の混合物である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来し、特に前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種またはサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）のいずれか１つに由来する、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎水性芳香族モノマーがジビニルベンゼン（ＤＶＢ）および／またはスチレンであり、場合により前記温和な親水性モノマーがアクリル酸もしくはメタクリル酸エステル、または組み合わせたアクリル／メタクリル酸エステルである、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記疎水性樹脂ドメインと前記温和な親水性ドメインとの間の重量比が、それぞれ約１０：０．１〜約１：１０である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｆ）で得られた前記グリセリド混合物を、反応混合物中適切なリパーゼ、特にその遊離形態のまたはポリマー樹脂支持体上に固定化されたカンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）由来のリパーゼ、の存在下で、（ｉ）ｎ−３遊離脂肪酸濃縮物、または（ｉｉ）ｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル濃縮物の少なくとも１つと反応させて、前記反応混合物からの過剰な脂肪酸エチルエステルおよび／または脂肪酸、ならびにエタノールおよび／または水副産物の蒸留後に６０％超の、６０％超のｎ−３脂肪酸を含有するトリグリセリドを含むグリセリド混合物を得る、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）特に約５％〜約６０％ｗ／ｗの、ｎ−３多価不飽和脂肪酸を含む油を用意するステップであって、前記ｎ−３脂肪酸が前記油中のグリセリドおよび場合により極性脂質のグリセロール骨格に結合した脂肪酸アシル基として、ならびに／または遊離脂肪酸として存在し、前記油が遊離またはエステル化飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸も含むステップと；
（ｂ）前記油に、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で水またはアルカリ性水性緩衝液を添加して、ｐＨ約５〜約９の混合物を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記混合物にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（ＰＳリパーゼ）調製物を添加するステップであって、前記ＰＳリパーゼが、特にポリマー支持体１ｇ当たり１００００ユニットより高い前記ＰＳリパーゼの、高充填量でポリマー樹脂支持体上に固定化され、前記樹脂が交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、特に疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメイン、を含み、前記リパーゼＰＳが、その遊離形態でまたはグリセロールもしくは極性脂質に結合している場合に飽和、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸に対して高い選択性を示し、前記脂肪酸を同時または連続的にエステル交換／エステル化することができるステップと；
（ｄ）短鎖アルキルアルコール、特にエタノール、を用意し、前記アルコールを、ステップ（ｃ）で得られた前記油、前記水またはアルカリ性水性緩衝液および前記酵素調製物の前記混合物に添加、特に段階的に添加、して、前記油、前記リパーゼ調製物、前記水または水性緩衝液および前記アルコールを含む反応系を形成し（前記油は前記アルコールと反応する）、前記反応を、約７０％の前記油の脂肪酸アルキルエステルへの転換率に到達させるステップと；
（ｅ）前記第１のリパーゼ調製物を除去することによって前記反応を停止させ、遊離脂肪酸副産物および過剰なアルコールに加えて、脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、モノ−、ジ−および残留トリ−グリセリドを含有する前記反応混合物の有機上相／画分を回収するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記有機相を、ポリマー樹脂支持体上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（ＴＬ）の存在下で、短鎖アルキルアルコール、特にエタノール、と反応させ（前記樹脂は交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、特に疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメイン、を含む）、前記反応を、前記油中少なくとも９７％ｗ／ｗ、特に９８％ｗ／ｗ、９９％ｗ／ｗおよび最大１００％の、脂肪酸アシル基がその低級アルキルエステル、特にエチルエステル、に転換されるまで継続させるステップと；
（ｇ）前記反応混合物から前記リパーゼ調製物を除去することによって前記反応を停止させ、引き続いて前記反応媒体を蒸発、特にフラッシュ蒸発、させて、過剰なアルコールおよび水を除去するステップと；
（ｈ）分別蒸留によって前記反応混合物から前記ｎ−３多価不飽和脂肪酸アルキルエステル濃縮物を単離するステップと
を含む、ｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル、特にｎ−３脂肪酸エチルエステル、を酵素的に調製する方法。
【請求項２１】
前記ＰＳリパーゼと前記ＴＬリパーゼの両方のための前記樹脂支持体が、交互の架橋ジビニルベンゼンモノマー、架橋スチレンモノマーまたは架橋スチレンおよびジビニルベンゼンモノマーで構成される疎水性ドメインとアクリル酸および／またはメタクリル酸エステルで構成される前記温和な親水性ドメインを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＳリパーゼを、前記支持体１ｇ当たり約５０００〜約５００００ユニット、特に前記支持体１ｇ当たり約１５０００〜３００００ユニット、より具体的には前記支持体１ｇ当たり約２００００〜２５０００、の充填量で前記ポリマー樹脂支持体上に固定化する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疎水性樹脂ドメインと前記温和な親水性ドメインとの間の重量比が、それぞれ約１０：０．１〜約１：１０である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＳリパーゼ調製物および前記ＴＬリパーゼ調製物が、同じバッチの各前記ＰＳリパーゼ調製物およびＴＬリパーゼ調製物を使用して少なくとも２０反応サイクルにわたってそれらの触媒活性の少なくとも７０％を維持する、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機上相／画分を、比重分離、遠心分離、またはグリセロール／水吸着樹脂を充填したカラムに前記反応混合物を通過させることのいずれかによって回収する、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｈ）で得られた前記単離された３−ｎ多価不飽和脂肪酸アルキルエステル、特にエチルエステル、を、前記アルキルエステルの前記ｎ−３脂肪酸アシル部分をグリセロールとエステル交換することができるリパーゼ、特にカンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）由来のリパーゼ、の存在下で、グリセロールとさらに反応させ（前記リパーゼは場合により適切なポリマー樹脂支持体上に固定化され、前記反応系は前記単離された３−ｎ多価不飽和脂肪酸アルキルエステル１重量当たり最大約１％の水を含む）、未反応グリセロールの除去および過剰な脂肪酸／脂肪酸アルキルエステル、および副産物としてのアルキルアルコール、特にエタノール、および／または水の蒸留後に、全形成グリセリドの５０％超のトリグリセリドを含むグリセリドの混合物が形成されるまで、前記反応を進行させる、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリマー樹脂支持体、前記樹脂が交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、特に疎水性脂肪族または芳香族モノマー、特にジビニルベンゼンおよび／またはスチレンで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメイン、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記油中前記ｎ−３脂肪酸部分がＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ部分のうちのいずれか１つ、ならびにそれらの少なくとも２つの任意の混合物である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｎ−３脂肪酸が遊離形態で、またはモノ−、ジ−もしくはトリグリセリドの脂肪酸部分として、または油、特に魚油および油性油、の極性脂質として存在する、請求項２０から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）リパーゼを適切な緩衝液に溶解してリパーゼ溶液を得るステップと；
（ｂ）適量の微孔性ポリマー樹脂を前記リパーゼ溶液に添加して混合物を得るステップであって、前記微孔性ポリマー樹脂は交互の疎水性モノマードメインと親水性、特に温和な親水性モノマーの、ドメインを含むステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記得られた混合物を、混合／振盪しながら適切な時間、適切な温度で維持し、それによって前記リパーゼを前記微孔性ポリマー樹脂上に固定化するステップと；
（ｄ）前記樹脂上に固定化された前記得られたリパーゼを濾別して固定化リパーゼ調製物を得るステップと；
（ｅ）場合により前記固定化リパーゼ調製物を適当な溶媒で洗浄するステップと；
（ｆ）前記洗浄した固定化リパーゼ調製物を５％ｗ／ｗ未満の水のレベルまで乾燥させるステップと
を含む、微孔性ポリマー樹脂上にリパーゼを固定化する方法。
【請求項３１】
前記樹脂が、交互の疎水性ドメインと親水性ドメイン、特に疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルまたはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメイン、を有する巨大網状多孔質ポリマー、例えばメタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疎水性ドメインと前記温和な親水性ドメインとの間の重量比が、それぞれ約１０：０．１〜約１：１０である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
交互の疎水性ドメインと親水性ドメインを有する前記巨大網状多孔質ポリマーが、メタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼンであり、ジビニルベンゼンドメインとメタクリル酸メチルドメインの比がそれぞれ１０−９９〜９０−１である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記リパーゼが、遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基の形態の飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する高い選択性、ならびに遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基としてのｎ−３脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する低い選択性を有する、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来するリパーゼである、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記適切な温度が１０〜５０℃であり、前記適切な時間が約０．５〜４８時間、特に約６時間であり、前記固定化リパーゼ調製物を洗浄するのに適した前記溶媒がアセトンまたは水であり、前記乾燥がデシケーターまたは凍結乾燥器中である、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記固定化リパーゼ調製物を、５％ｗ／ｗ未満、特に２％ｗ／ｗ未満、より具体的には１．５％ｗ／ｗ未満、とりわけ１％ｗ／ｗ未満、の含水量まで乾燥させる、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
エステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、エステル交換（ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、エステル化または加水分解反応のいずれにおいても、グリセリドまたはアルキルエステルのように遊離形態またはエステル化形態であり得るｎ−３脂肪酸に対する前記リパーゼの選択性が調節される、特に、前記リパーゼの触媒活性を維持しながら、前記活性が低下される、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｎ−３脂肪酸が、遊離形態で、またはモノ−、ジ−もしくはトリグリセリドの脂肪酸部分として、または油、特に食用油、より具体的には魚油、真菌油もしくはｎ−３脂肪酸を含有する食用油性物質の極性脂質として存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固定化リパーゼが、少なくとも１０回の反応サイクルにわたってその触媒活性の少なくとも７０％を保持する、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
微孔性ポリマー樹脂支持体上に固定化されたリパーゼを含む固定化リパーゼ調製物であって、前記巨大網状多孔質ポリマー樹脂は混合の疎水性ドメインと温和な親水性ドメインを含み、前記疎水性ドメインは疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成され、前記親水性ドメインは温和な親水性モノマー、特にアクリル酸もしくはメタクリル酸エステル、またはこれらの任意の組み合わせで構成される、固定化リパーゼ調製物。
【請求項４２】
交互の疎水性ドメインと親水性ドメインを有する前記巨大網状多孔質ポリマーが、メタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼンであり、ジビニルベンゼンドメインとメタクリル酸メチルドメインの比がそれぞれ１０−９９％〜９０−１％である、請求項４１に記載の固定化リパーゼ調製物。
【請求項４３】
前記リパーゼが、遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基の形態の飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する高い選択性、ならびに遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基としてのｎ−３脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する低い選択性を有する、請求項４１または４２に記載の固定化リパーゼ調製物。
【請求項４４】
前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来するリパーゼである、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の固定化リパーゼ調製物。
【請求項４５】
少なくとも１０回の反応サイクルにわたってその触媒活性の少なくとも７０％を保持する、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の固定化リパーゼ調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ｎ−３脂肪酸部分、特にＥＰＡおよびＤＨＡが濃縮されたグリセリドを含む組成物が開示される。ｎ−３多価不飽和脂肪酸濃縮グリセリドを製造するための、ワンポットまたはマルチステップ多酵素触媒反応であり得る、開示される組成物を調製するための酵素的方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
ここに開示される主題の背景として関連があると考えられる参考文献を以下に参照する。上に列挙される刊行物において参照されている刊行物もまたその全体が参照される。本明細書における上記の参考文献の承認は、これらがここに開示される主題の特許性に何らかの形で関連することを意味すると解釈されるべきではない。
【０００３】
背景
概要
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、２つ以上の二重結合を含む長鎖脂肪酸の群を表す。ＰＵＦＡは、ｎ−３（ω−３またはオメガ−３）脂肪酸およびｎ−６（ω−３またはオメガ−６）脂肪酸の２つの主要なグループに細分される。ｎ−３脂肪酸群には、必須脂肪酸α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）およびその長鎖代謝産物、すなわち、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）およびＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）が含まれる一方で、ｎ−６脂肪酸群には、とりわけ、アラキドン酸（ＡＲＡ）およびリノール酸が含まれる。
【０００４】
オメガ−３脂肪酸は動植物界の至る所に存在する。微生物、特に藻類、真菌および細菌は、この種の脂肪酸が最も豊富な種と考えられている。これらの脂肪酸は、典型的には貯蔵油トリグリセリド中に、またエステル、リン脂質、エーテル、糖脂質、スフィンゴ脂質およびリポタンパク質の脂肪酸アシル基の形態で膜脂質中に存在する。遊離脂肪酸および短鎖脂肪酸アルキルエステル、例えば脂肪酸エチルエステルは酸化および分解をより受けやすいので、ＰＵＦＡ部分のトリグリセリドへの組み込みがこれらの脂肪酸を貯蔵するための最も好ましい形態である。また、脂肪酸部分のトリグリセリドへの組み込みは、それらが遊離形態に容易に加水分解可能であり、それが食品、栄養補助食品および医薬品に使用されると消化系に容易に吸収されるために好ましい［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９５、６１：５６］。
ｎ−３脂肪酸の濃縮および分離方法
【０００５】
天然源からｎ−３脂肪酸およびその誘導体（メチルまたはエチルエステル、トリグリセリドおよびアミド）を濃縮、分離および回収するために、様々な方法が別々にまたは組み合わせて適用されてきた。これらの方法には、主として低温での分別結晶、分子蒸留、尿素付加物結晶化、静止層クロマトグラフィー、およびまたリパーゼの使用が含まれる。これらの濃縮方法は、通常、脂肪酸の不飽和度および炭素鎖長も利用し、これらは共に、様々な溶媒への溶解度、結晶化、融点および蒸発点、極性および化学反応性に関する種々の物理的および化学的特性を示すことにつながる。
リパーゼ触媒反応によるｎ−３脂肪酸の濃縮
リパーゼは、水性系中のトリアシルグリセロール分子中のエステル結合に作用して遊離脂肪酸、部分グリセリドおよびグリセロールを生じる加水分解酵素として定義される。微水性有機系では、この群の酵素は逆加水分解反応を触媒することができる［Ｍｅｄｉｎａ，Ａ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、７０：３７９；Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２００１、９１（６）：５２９］。一般に、リパーゼはそれらの位置特異性に従って２つのクラス、すなわちランダムリパーゼと１，３−位置特異的リパーゼに分類される。多くの場合、リパーゼは、脂肪酸の飽和度、脂肪酸アシル基の鎖長、脂肪酸の炭素鎖上の二重結合の位置、および炭素鎖上の二重結合の幾何学（シス／トランス）に関連して様々な基質活性を露出する。
【０００６】
ＰＵＦＡ含有油のリパーゼ触媒加水分解
一定のリパーゼは、トリグリセリド基質の脂肪酸残基の種類に対する選択性を発現する。例えば、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）およびカンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のリパーゼは、トリグリセリド中の飽和およびモノ不飽和脂肪酸残基に対してより高い選択性を有することが知られている酵素である。このような方法では、ある程度の油の加水分解を達成した後、有機層と水層を分離する。その後、有機相中の遊離脂肪酸を分子蒸留によって除去してグリセリドの形態におけるｎ−３脂肪酸の濃縮物を得る［米国特許出願公開第２００４／００３３５７１号明細書］。カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のリパーゼによるマグロ魚油の加水分解により、４４．１％のｎ−３脂肪酸（１８．５％のＥＰＡ、１７．３％のＤＨＡおよび３．６２％のＤＰＡ）を含有するグリセリド混合物が得られたことが報告されている。より高いｎ−３脂肪酸含量、例えば最大７０％のｎ−３脂肪酸を得るために、第１段階で得られた濃縮物に第２段階のリパーゼによる加水分解を適用することができる。また、複数の加水分解段階がｎ−３脂肪酸の回収率を低下させる可能性があることも報告されている。
【０００７】
遊離脂肪酸のリパーゼ触媒選択的エステル化
いくつかのリパーゼが、種々の遊離脂肪酸の混合物とアルコールのエステル化反応において、脂肪酸の種類に関して異なる特異性を有することが確認されている。このような方法は、遊離脂肪酸を得るために化学的に、例えば苛性ソーダを用いた、またはランダムで非選択的なリパーゼを用いた油の加水分解、および一定の種類の脂肪酸に対する選好性を有するリパーゼを使用した、短鎖アルコールによる第１の段階で得られた遊離脂肪酸の選択的エステル化の二段階で行われる［Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．ら、（２００１）同上；米国特許６１５９５２３号明細書］。
【０００８】
この種の二段階酵素法は、ｎ−３脂肪酸の濃縮ならびに個々の脂肪酸の濃縮に使用されてきた。例えば、ＥＰＡ（１４％）およびＤＨＡ（１５％）を含有する化学または酵素加水分解によって得られる遊離脂肪酸加水分解物をエタノールで直接エステル化してＥＰＡおよびＤＨＡエチルエステルを得た。反応は、典型的には、飽和、モノ−およびジ−不飽和脂肪酸、ならびにある程度ＥＰＡに対して高い選択性を有する、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（ＭＭＬ）などのリパーゼによって触媒される。例えば、遊離脂肪酸の脂肪酸エチルエステルへの転換率が約７０％に到達し、未エステル化脂肪酸が一般により高濃度のＤＨＡを含有していたら、反応を停止することができる。この方法に従って、それぞれ７３％および１０％の回収率で４９％のＤＨＡおよび６％のＥＰＡを含有するｎ−３脂肪酸濃縮物が得られた［Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１９９９、８８（６）：６２２；米国特許出願公開第２００６／０１４８０４７号明細書］。
【０００９】
ＰＵＦＡ含有油のリパーゼ触媒アルコール分解
一定のリパーゼは有機媒体中でアルコール分解活性を有する。この種の反応では、トリグリセリドまたはｎ−ヘキサノールなどの中鎖脂肪アルコールを有する脂肪酸のエステルを、エタノールまたは他の短鎖アルコールと直接反応させる。この種の反応において使用される可能性のあるリパーゼは、ある種の脂肪酸または脂肪酸アシル基に対する選択性を有するものである［Ｗａｔａｎａｂｅら、同上；米国特許出願公開第２００５／０２３３４２７号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１４８０４７号明細書；Ｓｈｉｍａｄａら、同上］。アルコール分解反応を通したｎ−３脂肪酸の濃縮には、通常２つの方法が使用される：
ａ．第１の段階で、魚油脂肪酸のエチルエステルを調製するためのアルカリ触媒または非特異的リパーゼによる魚油トリグリセリドの完全なアルコール分解が行われる二段階アルコール分解反応。この反応は、典型的には、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）由来のリパーゼによって触媒される。第２の段階で、得られた魚油脂肪酸エチルエステルを、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼなどのｎ−３脂肪酸に対して低い選択性を有するリパーゼを使用して、ｎ−ヘキサノールなどの長鎖アルコールでエステル交換して、低いｎ−３脂肪酸アシル基含量を有する脂肪酸ヘキシルエステルおよび高いｎ−３脂肪酸アシル基含量を有する未反応脂肪酸エチルエステルを形成する。反応混合物を、ｎ−３脂肪酸エチルエステルが濃縮された画分を得るために分別蒸留で処理することができる。真空下で触媒としてＮｏｖｏｚｙｍ  ４３５（固定化カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）を使用し、６５℃まで加熱することによって、ｎ−３脂肪酸が濃縮された脂肪酸エチルエステルの画分をグリセロールでエステル交換して、ｎ−３脂肪酸が濃縮されたトリグリセリドを形成することができる。
ｂ．ｎ−３脂肪酸が濃縮されたグリセリドおよびエステル交換反応の副産物としての低いｎ−３脂肪酸含量を有する脂肪酸アルキルエステルを形成するためのｎ−３脂肪酸アシル基に対して低い選択性を有するリパーゼを使用した魚油とエタノールなどの短鎖アルコールの一段階アルコール分解反応。この方法は、典型的には４０〜６０％のｎ−３脂肪酸を有するグリセリドをもたらし、ｎ−３脂肪酸の回収率は典型的には５０〜７０％の範囲であるが、ｎ−３脂肪酸の残りは副生成物中に現れる。
【００１０】
ＰＵＦＡ含有油のリパーゼ触媒アシドリシス反応
研究業績によって、植物油と大部分は遊離脂肪酸またはそのエチルエステルであるｎ−３脂肪酸の豊富な供給源のリパーゼ触媒エステル交換が記載されている。リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製のＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＲＭ  ＩＭ）が、これらの研究で使用される一般的な酵素である。この酵素は１，３−位置活性を示すので、達成され得る最終生成物中のＰＵＦＡの最高含量は６６％である［Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｂ．およびＡｋｏｈ，Ｃ．Ｃ．、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９、７６（１０）：１１３３］。
【００１１】
個々のｎ−３脂肪酸またはその混合物を含有する酵素的に調製された純粋なトリグリセリドもまた報告されている。この方法は、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５（いずれかの国における登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）を使用して、ｎ−３脂肪酸アシル基を含有するグリセロールまたは部分グリセリドを純粋なｎ−３脂肪酸またはその混合物と反応させることに基づいている。特に医薬用途のための、９０％超の含量でｎ−３脂肪酸を含有するトリグリセリドの様々な調製物がこの方法に従って調製されている［米国特許第５６０４１１９号明細書］。
【発明の概要】
【００１２】
第１の態様では、本開示は、（ａ）約５％〜約６０％ｗ／ｗのｎ−３ＰＵＦＡ部分含量を有する油であって、ｎ−３ＰＵＦＡ部分が前記油中に含有される遊離酸として、またはグリセリドおよび／もしくは極性脂質のアシル基として存在する油を用意するステップと；（ｂ）前記油に、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で水またはアルカリ性水性緩衝液を添加して、ｐＨ約５〜約９の混合物を得るステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた混合物にリパーゼを添加するステップであって、前記リパーゼが適切なポリマー支持体上に固定化され、前記リパーゼが飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸またはその脂肪酸アシル基に対して高い選択性を示し、前記油を同時または連続的にエステル交換、加水分解および／またはエステル化することができるステップと；（ｄ）アルキルアルコールまたはアルコールドナー、具体的には短鎖アルキルアルコールまたはアルコールドナーを用意し、前記アルコールまたはアルコールドナーを、ステップ（ｃ）で得られた前記油と前記酵素調製物の混合物に添加、具体的には段階的に添加して、前記油、前記リパーゼ調製物、前記水または水性アルカリ性緩衝液および前記アルコールを含む反応系を形成し（前記油は前記アルコールと反応する）、前記反応を、反応系に使用される油の、少なくとも４０重量％の前記油の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、１０重量％未満の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および約１５重量％〜約６０重量％のグリセリドへの転換率に到達させるステップと；（ｅ）前記反応系から前記反応媒体を除去することによって反応を停止させて、ＦＡＥＥ、ＦＦＡならびにモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドの混合物、ならびに場合により極性脂質を含む生成物を得るステップと；（ｆ）ステップ（ｆ）で得られた生成物から前記脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸を留去することによって前記ＦＡＥＥおよびＦＦＡから前記グリセリドを単離して、ＦＡＥＥおよびＦＦＡを含む留出物ならびにグリセリド混合物および場合により極性脂質を含む残渣を得るステップであって、前記混合物が前記油と比較して高いオメガ−３脂肪酸含量を含有し、回収率が６０％より高いステップとを含む、グリセリドとしてのｎ−３多価不飽和脂肪酸（ｎ−３ＰＵＦＡ）を濃縮するための酵素的方法を提供する。
【００１３】
前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で添加される前記水またはアルカリ性水性緩衝液は、具体的には前記油の最大０．２％、０．５％、０．７５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、６．０％、６．５％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％および最大１０％ｗ／ｗの量で添加することができる。
【００１４】
反応系のｐＨは、前記水または水性アルカリ性緩衝液を添加して約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０に調整することができる。
【００１５】
前記ステップ（ｄ）で、反応系に使用される油の、少なくとも４０重量％、具体的には少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％および最大７０重量％の前記油の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、１０重量％未満、具体的には２〜８重量％の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および約１５重量％〜約６０重量％、具体的には約１５重量％、２０重量％、２５重量％〜約３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％または６０重量％のグリセリドへの転換率を達成するまで、反応を進行させることができる。
【００１６】
本開示の前記第１の態様の方法のステップ（ｆ）で得られるグリセリド混合物を含み、場合により極性脂質を含む生成物は、前記油と比較して高いオメガ−３脂肪酸含量を含有し、回収率は６０％より高い、例えば、６２％、６５％、６８％、７０％、７５％またはそれより高い。
【００１７】
前記第１の態様の方法の具体的な実施形態では、ステップ（ｆ）で反応生成物から留去された脂肪酸アルキルエステルと遊離脂肪酸の混合物が、前記油中に存在する全ｎ−３脂肪酸のうちの４０％未満のｎ−３脂肪酸部分、具体的には４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満およびそれ未満を含む。
【００１８】
本開示の前記第１の態様の前記方法では、前記アルコールが、具体的にはエタノールまたはメタノールのいずれか１つであり得、前記短鎖アルキルアルコールドナーがジメチルまたはジエチルカーボナートのいずれか１つであり得る。
【００１９】
本開示の前記第１の態様の前記方法では、前記蒸留が分子蒸留、短行程または薄膜蒸留のうちのいずれか１つである。
【００２０】
本開示の前記第１の態様の前記方法では、前記ｎ−３脂肪酸部分がＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ部分のうちのいずれか１つ、ならびにそれらの少なくとも２つの任意の混合物である。
【００２１】
本開示の前記第１の態様の前記方法では、前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来し、具体的には前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種またはサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）のいずれか１つに由来する。
【００２２】
本開示の前記第１の態様の前記方法では、前記リパーゼが、疎水性多孔質ポリマー樹脂支持体、具体的には疎水性脂肪族または芳香族樹脂支持体上に固定化され、特に疎水性芳香族樹脂が架橋ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）またはスチレンまたは架橋スチレン−ＤＶＢである。
【００２３】
本開示の前記第１の態様の前記方法の実施形態では、ステップ（ｆ）で得られた前記グリセリド混合物を、真空下および温度３０〜８０℃で、反応混合物中適切なリパーゼ、具体的にはその遊離形態のまたはポリマー樹脂支持体上に固定化されたカンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）由来のリパーゼの存在下で、（ｉ）ｎ−３ＦＦＡ濃縮物、または（ｉｉ）ｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル濃縮物の少なくとも１つとさらに反応させて、反応混合物からの過剰な脂肪酸エチルエステルおよび／または脂肪酸、ならびにアルコールおよび／または水副産物の蒸留後に６０％超、具体的には約６５％超、約７０％超および最大約１００％の、６０％超のｎ−３脂肪酸を含有するトリグリセリドを含むグリセリド混合物を得ることができる。
【００２４】
本開示の前記第１の態様の前記方法では、前記油が食用油、具体的には魚油または藻油、真菌油、またはｎ−３脂肪酸を含有する適切な油性物質であり得る。
【００２５】
第２の態様では、本開示は、油源のエステル交換、エステル化および加水分解を含むリパーゼ触媒反応のグリセリド生成物中のｎ−３脂肪酸含量が有意に増加する一方で、反応の副産物（エタノール脂肪酸エチルエステルを使用した場合、主に遊離脂肪酸および脂肪酸アルキルエステル）中で減少するように、一定のｎ−３脂肪酸に対するリパーゼの選択性を低下させる方法を提供する。本発明によるリパーゼの選択性の変化は、以下に、具体的には本発明の第３の態様の説明に記載される、疎水性ドメインと親水性ドメインの両方を有する特定の「混合」支持体樹脂上にリパーゼを固定化することによって達成される。
【００２６】
第３の態様では、本開示は、（ａ）リパーゼを適切な緩衝液に溶解してリパーゼ溶液を得るステップと；（ｂ）適量の微孔性ポリマー樹脂を前記リパーゼ溶液に添加して混合物を得るステップであって、前記微孔性ポリマー樹脂は交互の疎水性モノマードメインと親水性、具体的には温和な親水性モノマードメインを含むステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の得られた混合物を、混合／振盪しながら適切な時間、適切な温度で維持し、それによって前記リパーゼを前記微孔性ポリマー樹脂上に固定化するステップと；（ｄ）前記樹脂上に固定化された得られたリパーゼを濾別して固定化リパーゼ調製物を得るステップと；（ｅ）場合により固定化リパーゼ調製物を適当な溶媒で洗浄するステップと；（ｆ）洗浄した固定化リパーゼ調製物を５％ｗ／ｗ未満の水のレベルまで乾燥させるステップとを含む、微孔性ポリマー樹脂上にリパーゼを固定化する方法を提供する。
【００２７】
前記リパーゼ固定化方法では、前記樹脂が、交互の疎水性ドメインと親水性ドメイン、具体的には疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリル酸またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメインを有する巨大網状多孔質ポリマー、例えばメタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼンであり得る。
【００２８】
前記リパーゼ固定化方法では、前記疎水性ドメインと前記温和な親水性ドメインとの間の重量比が、それぞれ約１０：０．１〜約１：１０、より具体的にはそれぞれ１０−９９％〜９０−１％である。
【００２９】
前記リパーゼ固定化方法では、交互の疎水性ドメインと親水性ドメインを有する前記巨大網状多孔質ポリマーが、メタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼンであり得、ジビニルベンゼンドメインとメタクリル酸メチルドメインの比率がそれぞれ１０−９９〜９０−１である。
【００３０】
前記リパーゼ固定化方法では、前記リパーゼが、遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基の形態の飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する高い選択性、ならびに遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基としてのｎ−３脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する低い選択性を有するリパーゼであり得る。具体的には、前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来するリパーゼであり得る。
【００３１】
前記リパーゼ固定化方法では、前記適切な温度が１０〜５０℃であり得、前記適切な時間が約０．５〜４８時間、具体的には約６時間であり得、固定化リパーゼ調製物を洗浄するのに適した前記溶媒がアセトンまたは水であり得、前記乾燥がデシケーターまたは凍結乾燥器中で行われ得る。
【００３２】
前記リパーゼ固定化方法では、得られた固定化リパーゼ調製物を、５％ｗ／ｗ未満、具体的には２％ｗ／ｗ未満、より具体的には１．５％ｗ／ｗ未満、特に１％ｗ／ｗ未満の含水量まで乾燥させることができる。
【００３３】
前記リパーゼ固定化方法では、エステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、エステル交換（ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、エステル化または加水分解反応のいずれにおいても、グリセリドまたはアルキルエステルのように遊離形態またはエステル化形態であり得るｎ−３脂肪酸に対する前記リパーゼの選択性が調節される、具体的には、前記リパーゼの触媒活性を維持しながら、前記活性が低下される。ｎ−３脂肪酸は、遊離形態で、またはモノ−、ジ−もしくはトリグリセリドの脂肪酸部分として、または油、具体的には食用油、より具体的には魚油、真菌油もしくはｎ−３脂肪酸を含有する食用油性物質の極性脂質として存在することができる。
【００３４】
前記固定化方法によって調製されたリパーゼは、同じバッチの固定化酵素を使用して、少なくとも１０回の反応サイクルにわたってその触媒活性の少なくとも７０％を保持することができる。
【００３５】
第４の態様では、本開示は、微孔性ポリマー樹脂支持体上に固定化されたリパーゼを含む固定化リパーゼ調製物であって、前記巨大網状多孔質ポリマー樹脂は混合の疎水性ドメインと温和な親水性ドメインを含み、前記疎水性ドメインは疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成され、前記親水性ドメインは温和な親水性モノマー、具体的にはアクリル酸もしくはメタクリル酸エステル、またはこれらの任意の組み合わせで構成される調製物を提供する。
【００３６】
本開示による固定化リパーゼ調製物では、交互の疎水性ドメインと親水性ドメインを有する前記巨大網状多孔質ポリマーが、メタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼンであり得、ジビニルベンゼンドメインとメタクリル酸メチルドメインの比がそれぞれ１０−９９％〜９０−１％、例えば、限定されないが、１０−９８％〜９０−２％である。
【００３７】
本開示による固定化リパーゼ調製物は、遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基の形態の飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する高い選択性、ならびに遊離脂肪酸としてまたは脂肪酸アシル基としてのｎ−３脂肪酸のエステル交換／エステル化／加水分解に対する低い選択性を有するリパーゼを示すことができる。
【００３８】
本開示による固定化リパーゼ調製物はカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来するリパーゼであり得る。
【００３９】
本開示による固定化リパーゼ調製物は、少なくとも１０回の反応サイクルにわたってその触媒活性の少なくとも７０％を保持することができる。
【００４０】
第５の態様では、本開示は、（ａ）具体的には約５％〜約６０％ｗ／ｗのｎ−３多価不飽和脂肪酸を含む油を用意するステップであって、前記ｎ−３脂肪酸が前記油中のグリセリドおよび／もしくは極性脂質のグリセロール骨格に結合した脂肪酸アシル基として、ならびに／または遊離脂肪酸として存在し、前記油が遊離またはエステル化飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸も含むステップと；（ｂ）前記油に、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で水またはアルカリ性水性緩衝液を添加して、ｐＨ約５〜約９の混合物を得るステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた混合物にリパーゼを添加するステップであって、前記リパーゼがポリマー樹脂支持体上に固定化され、前記樹脂が交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、具体的には疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメインを含み、前記リパーゼが飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸またはその脂肪酸アシル基に対して高い選択性を示し、前記油を同時または連続的にエステル交換、加水分解および／またはエステル化することができるステップと；（ｄ）アルキルアルコールまたはアルコールドナー、具体的には短鎖アルキルアルコールまたはアルコールドナーを用意し、前記アルコールまたはアルコールドナーを、ステップ（ｃ）で得られた前記油と前記酵素調製物の混合物に添加、具体的には段階的に添加して、前記油、前記リパーゼ調製物および前記アルコールを含む反応系を形成し（前記油は前記アルコールと反応する）、前記反応を、反応系に使用される油の、少なくとも４０重量％の前記油の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、１０重量％未満の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および約１５重量％〜約６０重量％のグリセリドへの転換率に到達させるステップと；（ｅ）前記反応系から前記反応媒体を除去することによって反応を停止させて、ＦＡＥＥ、ＦＦＡならびにモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドの混合物、ならびに場合により極性脂質を含む生成物を得るステップと；（ｆ）ステップ（ｆ）で得られた生成物から前記脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸を留去することによって前記ＦＡＥＥおよびＦＦＡから前記グリセリド混合物を単離して、ＦＡＥＥおよびＦＦＡを含む留出物ならびにグリセリド混合物を含む残渣を得るステップであって、前記グリセリド混合物が場合により極性脂質をさらに含み、前記油と比較して高いオメガ−３脂肪酸含量を含有し、オメガ−３脂肪酸の回収率が６０％より高いステップとを含む、約３０％〜約８０％ｗ／ｗ、具体的には約５０％〜８０％ｗ／ｗ、より具体的には約５０％〜７０％ｗ／ｗ、より具体的には約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％〜約７０％、７２％、７５％、７８％または８０％のｎ−３多価不飽和脂肪酸部分を有するグリセリドの混合物を調製する方法を提供する。
【００４１】
本開示の前記第５の態様の方法では、前記水またはアルカリ性水性緩衝液を、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で添加することができ、具体的には前記油の最大０．２％、０．５％、０．７５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、６．０％、６．５％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％および最大１０％ｗ／ｗの量で添加することができ、反応系のｐＨを、前記水またはアルカリ性水性緩衝液の添加によって約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０に調整することができる。
【００４２】
本開示の前記第５の態様の方法の前記ステップ（ｄ）で、反応系に使用される油の、少なくとも４０重量％、具体的には少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％および最大７０重量％の前記油の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、１０重量％未満、具体的には２〜８重量％の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および約１５重量％〜約６０重量％、具体的には約１５重量％、２０重量％、２５重量％〜約３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％または６０重量％のグリセリドへの転換率を達成するまで、反応を進行させることができる。
【００４３】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、ステップ（ｆ）で得られるグリセリド混合物を含み、場合により極性脂質を含む生成物が、前記油と比較して高いオメガ−３脂肪酸含量を含有し、回収率が６０％より高い、例えば、６２％、６５％、６８％、７０％、７５％またはそれより高い。
【００４４】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、ステップ（ｆ）で反応生成物から留去された脂肪酸アルキルエステルと遊離脂肪酸の混合物が、前記油中に存在する全ｎ−３脂肪酸のうちの４０％未満のｎ−３脂肪酸部分、具体的には４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満およびそれ未満を含む。
【００４５】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、前記油が食用油、具体的には魚油または藻油、真菌油、またはｎ−３脂肪酸を含有する適切な油性物質であり得る。
【００４６】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、前記アルコールが、具体的にはエタノールまたはメタノールのいずれか１つであり得、前記短鎖アルキルアルコールドナーがジメチルまたはジエチルカーボナートのいずれか１つであり得る。
【００４７】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、前記蒸留が分子蒸留、短行程または薄膜蒸留のうちのいずれか１つである。
【００４８】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、前記ｎ−３脂肪酸部分がＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ部分のうちのいずれか１つ、ならびにそれらの少なくとも２つの任意の混合物である。
【００４９】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれか１つに由来し、具体的には前記リパーゼがカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種またはサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）のいずれか１つに由来する。
【００５０】
本開示の前記第５の態様の前記方法では、前記疎水性芳香族モノマーがジビニルベンゼン（ＤＶＢ）および／またはスチレンであり、場合により前記温和な親水性モノマーがアクリル酸もしくはメタクリル酸エステル、または組み合わせたアクリル／メタクリル酸エステルである。前記疎水性モノマーと前記温和な親水性モノマーとの間の重量比は、それぞれ約１０：０．１〜約１：１０、より具体的にはそれぞれ１０−９９％〜９０−１％であり得る。
【００５１】
本開示の前記第５の態様の前記方法の実施形態では、ステップ（ｆ）で得られた前記グリセリド混合物を、真空下および温度３０〜８０℃で、反応混合物中適切なリパーゼ、具体的にはその遊離形態のまたはポリマー樹脂支持体上に固定化されたカンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）由来のリパーゼの存在下で、（ｉ）ｎ−３ＦＦＡ濃縮物、または（ｉｉ）ｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル濃縮物の少なくとも１つとさらに反応させて、反応混合物からの過剰な脂肪酸エチルエステルおよび／または脂肪酸、ならびにアルコールおよび／または水副産物の蒸留後に６０％超、具体的には約６５％超、約７０％超および最大約１００％の、６０％超のｎ−３脂肪酸を含有するトリグリセリドを含むグリセリド混合物を得ることができる。
【００５２】
第６の態様では、本開示は、（ａ）具体的には約５％〜約６０％ｗ／ｗのｎ−３多価不飽和脂肪酸を含む油を用意するステップであって、前記ｎ−３脂肪酸が前記油中のグリセリドおよび場合により極性脂質のグリセロール骨格に結合した脂肪酸アシル基として、ならびに／または遊離脂肪酸として存在し、前記油が遊離またはエステル化飽和脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸も含むステップと；（ｂ）前記油に、前記油の０．２〜１０％ｗ／ｗの量で水またはアルカリ性水性緩衝液を添加して、ｐＨ約５〜約９の混合物を得るステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた混合物にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（ＰＳリパーゼ）調製物を添加するステップであって、前記ＰＳリパーゼが、具体的にはポリマー支持体１ｇ当たり１００００ユニットより高い前記ＰＳリパーゼの高充填量でポリマー樹脂支持体上に固定化され、前記樹脂が交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、具体的には疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメインを含み、前記ＰＳリパーゼが、その遊離形態でまたはグリセロールもしくは極性脂質に結合している場合に飽和、モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸に対して高い選択性を示し、前記脂肪酸を同時または連続的にエステル交換／エステル化／加水分解することができるステップと；（ｄ）短鎖アルキルアルコール、具体的にはエタノールを用意し、前記アルコールを、ステップ（ｃ）で得られた前記油と前記酵素調製物の混合物に添加、具体的には段階的に添加して、前記油、前記リパーゼ調製物、前記水または水性緩衝液および前記アルコールを含む反応系を形成し（前記油は前記アルコールと反応する）、前記反応を、約７０％の前記油の脂肪酸アルキルエステルおよび１０％未満のＦＦＡへの転換率に到達させるステップと；（ｅ）前記第１のリパーゼ調製物を除去することによって反応を停止させ、遊離脂肪酸副産物および過剰なアルコールに加えて、脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、モノ−、ジ−および残留トリ−グリセリドを含有する反応混合物の有機上相／画分を回収するステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記有機相を、ポリマー樹脂支持体上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（ＴＬ）の存在下で、短鎖アルキルアルコール、具体的にはエタノールと反応させ（前記樹脂は交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、具体的には疎水性脂肪族または芳香族モノマーで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメインを含む）、反応を、前記油中少なくとも９７％の転換率、具体的には９８％、９９％および最大１００％の脂肪酸アシル基がその低級アルキルエステル、具体的にはエチルエステルに転換されるまで継続させるステップと；（ｇ）反応混合物から前記リパーゼ調製物を除去することによって反応を停止させるステップと；（ｈ）分別蒸留によって反応混合物から前記ｎ−３多価不飽和脂肪酸アルキルエステル濃縮物を単離するステップとを含む、ｎ−３脂���酸短鎖アルキルエステル、具体的にはｎ−３脂肪酸エチルエステルを酵素的に調製する方法を提供する。
【００５３】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記ＰＳリパーゼと前記ＴＬリパーゼの両方のための前記樹脂支持体が、交互の架橋ジビニルベンゼンモノマー、架橋スチレンモノマーまたは架橋スチレンおよびジビニルベンゼンモノマーで構成される疎水性ドメインとアクリル酸および／またはメタクリル酸エステルで構成される前記温和な親水性ドメインを含む。
【００５４】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記ＰＳリパーゼを、前記支持体１ｇ当たり約５０００〜約５００００ユニット、具体的には前記支持体１ｇ当たり約１５０００〜３００００ユニット、より具体的には前記支持体１ｇ当たり約２００００〜２５０００の充填量で前記ポリマー樹脂支持体上に固定化することができる。
【００５５】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記疎水性樹脂ドメインと前記温和な親水性ドメインとの間の重量比が、それぞれ約１０：０．１〜約１：１０であり得る。より具体的には、前記疎水性樹脂ドメインと前記温和な親水性ドメインとの間の重量比が、それぞれ１０−９９％〜９０−１％であり得る。
【００５６】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記ＰＳリパーゼ調製物および前記ＴＬリパーゼ調製物が、同じバッチの各前記ＰＳリパーゼ調製物およびＴＬリパーゼ調製物を使用して少なくとも２０反応サイクルにわたってそれらの触媒活性の少なくとも７０％を維持する。
【００５７】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記有機上相／画分を、比重分離、遠心分離、またはグリセロール／水吸着樹脂を充填したカラムに反応混合物を通過させることのいずれかによって回収することができる。
【００５８】
本開示の前記第６の態様の方法の実施形態では、ステップ（ｈ）で得られた単離された３−ｎ多価不飽和脂肪酸アルキルエステル濃縮物、具体的にはエチルエステルを、前記アルキルエステル濃縮物のｎ−３脂肪酸アシル部分をグリセロールとエステル交換することができるリパーゼ、具体的にはカンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）由来のリパーゼの存在下で、グリセロールとさらに反応させ（前記リパーゼは場合により適切なポリマー樹脂支持体上に固定化され、反応系は前記単離された３−ｎ多価不飽和脂肪酸アルキルエステル濃縮物１重量当たり最大約１％の水を含む）、未反応グリセロールの除去および過剰な脂肪酸／脂肪酸アルキルエステル、および副産物としてのアルキルアルコール、具体的にはエタノールおよび／または水の蒸留後に、全形成グリセリドの５０％超のトリグリセリドを含むグリセリドの混合物が形成されるまで、反応を進行させることができる。
【００５９】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記リパーゼが固定化されているポリマー樹脂支持体が、交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメイン、具体的には疎水性脂肪族または芳香族モノマー、具体的にはジビニルベンゼンおよび／またはスチレンで構成される疎水性ドメインとアクリルおよび／またはメタクリル酸エステルで構成される温和な親水性ドメインを含むことができる。
【００６０】
本開示の前記第６の態様の方法では、前記油中のｎ−３脂肪酸部分がＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ部分のうちのいずれか１つ、ならびにそれらの少なくとも２つの任意の混合物であり得る。前記ｎ−３脂肪酸は遊離形態で、またはモノ−、ジ−もしくはトリグリセリドの脂肪酸部分として、または油、具体的には魚油および油性油の極性脂質として存在することができる。
【００６１】
本明細書に開示される主題をよりよく理解し、それを実際にどのように行うことができるかを例示するために、添付の図面を参照しながら、単なる非限定的な例として実施形態をここで説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】同じバッチの固定化リパーゼ調製物を繰り返し使用した、４回目の反応サイクルにおける、精製魚油とエタノールのエステル交換における、固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）調製物（リパーゼはそれぞれジビニルベンゼン（ＤＶＢ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）を種々の比率で含む様々なポリマー樹脂に固定化されている）の触媒活性プロファイルを示す図である。リパーゼ調製物は粉末形態で使用した。反応条件は表１に詳述する。
【００６３】
【図２】３５回の連続反応サイクルで、同じバッチの固定化リパーゼ調製物を使用した、固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ）調製物（リパーゼはそれぞれ交互のＤＶＢドメインとＭＭＡドメインを種々の比率で含む様々なポリマー樹脂に固定化されている）を使用した６時間の反応後の精製魚油とエタノールのエステル交換／エステル化転換率を示す図である。リパーゼ調製物は粉末形態で使用した。反応条件は表１に詳述する。
【００６４】
【図３】３５回の連続反応サイクルで、同じバッチの固定化リパーゼ調製物を使用した、固定化されたシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ  Ａｍａｎｏ）調製物（リパーゼはそれぞれ交互のＤＶＢドメインとＭＭＡドメインを種々の比率で含む様々なポリマー樹脂に固定化されている）を使用した精製魚油とエタノールのエステル交換／エステル化転換率を示す図である。リパーゼ調製物は粉末形態で使用した。反応条件は表１に詳述する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、特にｎ−３多価不飽和脂肪酸（本明細書で互換的に使用される、ｎ−３ＰＵＦＡまたはｎ−３脂肪酸）、特にＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡについて油を濃縮するための新規な方法およびプロセスが本明細書で提供される。
【００６６】
その主成分がトリ−、ジ−またはモノ−グリセリドおよびそれらの少なくとも２つの任意の混合物であり、高レベルのｎ−３多価不飽和脂肪酸アシル部分がグリセロール骨格に結合している、ｎ−３多価不飽和脂肪酸が濃縮されたグリセリドの組成物、およびｎ−３多価不飽和脂肪酸濃縮物が本明細書でさらに提供される。
【００６７】
ここに開示される方法は、以下に詳述される、トリグリセリドまたは部分グリセリドの形態のｎ−３多価不飽和脂肪酸について油、具体的にはそれだけに限らないが、魚油を濃縮するために、固定化された形態のリパーゼを含む種々のリパーゼ調製物を使用する。ここに開示される方法は、上記の従来の方法と比較した代替案を提供する。
【００６８】
回収率が改善した、典型的には出発材料中のｎ−３脂肪酸の初期含量の６０％ｗ／ｗ超を有する、ｎ−３多価不飽和脂肪酸について油を濃縮するため、特にグリセリドの全脂肪酸部分のうちの４０％ｗ／ｗ超がｎ−３脂肪酸部分であるグリセリドの形態のｎ−３多価不飽和脂肪酸濃縮物を得るために、リパーゼ触媒反応と分子蒸留の種々の異なる組み合わせを使用するプロセスおよび方法が本明細書で提供される。
【００６９】
第１の態様では、本開示は、本明細書に開示される、基質特異性および選択性を有するリパーゼまたはリパーゼの混合物を含む固定化リパーゼ調製物を使用した、ｎ−３脂肪酸の供給源としての油と短鎖アルコールまたはアルコール供給源との間の反応を提供し、高いｎ−３多価不飽和脂肪酸含量のグリセリドの製造、ならびに反応の脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸副産物中の低いｎ−３多価不飽和脂肪酸含量を可能にし、それによってｎ−３ＰＵＦＡについて油源を濃縮する。
【００７０】
第２の態様では、本開示はまた、油源のエステル交換、エステル化および加水分解を含むリパーゼ触媒反応のグリセリド生成物中のｎ−３脂肪酸含量が有意に増加する一方で、反応の副産物（エタノール脂肪酸エチルエステルを使用した場合、主に遊離脂肪酸および脂肪酸アルキルエステル）中で減少するように、一定のｎ−３脂肪酸に対するリパーゼの選択性を低下させる方法を提供する。本発明によるリパーゼの選択性の変化は、以下に記載される、疎水性ドメインと親水性ドメインの両方を有する特定の「混合」支持体樹脂上にリパーゼを固定化することによって達成される。
【００７１】
したがって、第３の態様では、本開示は、疎水性ポリマー（本明細書を通して任意の数の連結モノマー）で構成される疎水性ドメインと親水性ポリマーで構成される温和な親水性ドメイン（本明細書を通して任意の数の連結モノマー）の両方を含む微孔性ポリマー樹脂上にリパーゼを固定化する方法を提供する。本明細書で使用される「温和な」という用語によって、形成された混合樹脂上で、隣接ポリマー鎖間に水素結合を生じさせることができないエステル基を有するモノマーを含む親水性ポリマー伸長またはセグメントが意味される。本明細書で提供されるこのような「混合」疎水性−親水性樹脂上に固定化されたリパーゼは、飽和脂肪酸、ならびにある程度遊離脂肪酸の形態またはグリセリドの脂肪酸アシル基の形態の一定のモノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸に対する増加したエステル交換／エステル化活性、ならびに遊離脂肪酸または脂肪酸アシル基の形態のｎ−３脂肪酸のエステル交換／エステル化に対する低い選択性をもたらし得る。このポリマー樹脂支持体の「ドメイン」はまた、本明細書では「セグメント」または「伸長」、すなわち疎水性ポリマーの伸長／セグメントとも呼ばれ、本質的に温和な親水性ポリマーの伸長／セグメントと交互である。本明細書で提供されるポリマー支持体は、交互の親水性ドメインと疎水性ドメインを含む（そして「混合支持体」または「混合樹脂」とも呼ばれることもある）。例えば、「混合」ポリマー支持体は、交互の疎水性脂肪族または芳香族ドメインで構成されるドメインとアクリル酸もしくはメタクリル酸エステルドメイン、またはこれらの任意の混合物などの温和な親水性ドメインで構成されるドメインを有する支持体であり得る。温和な親水性ドメインは、異なるまたは同一の長さ（異なる数のモノマー）であり得、疎水性ドメインも異なるまたは同一の長さ（異なる数のモノマー）であり得る。本開示では、アクリル酸またはメタクリル酸エステルと架橋したジビニルベンゼンを含む巨大網状多孔質ポリマー支持体の使用が、混合支持体の非限定的な例として提示される。上記のように、「温和な親水性ポリマーで構成されるドメイン」または「疎水性ポリマーで構成されるドメイン」に言及する場合、任意の長さ／数の連結した、具体的には架橋した温和な親水性モノマー、または疎水性モノマーを意味し、伸長が従来の「ポリマー」長である必要はなく、１つおよび／または少数のモノマー（例えば、オリゴマー中）から多数のモノマー（例えば、ポリマー中）までを含むことができることが理解される。
【００７２】
第４の態様では、リパーゼが微孔性ポリマー樹脂支持体上に固定化されているリパーゼ調製物であって、樹脂が上記の疎水性ドメインと温和な親水性ドメインを有する調製物が本明細書で提供される。このポリマー支持体は、交互の温和な親水性ドメインと疎水性ドメインを含む（そして「混合支持体」または「混合樹脂」とも呼ばれることもある）。
【００７３】
本開示の前記第３および第４の態様において、ならびに全体を通して、混合ポリマー支持体は、交互の疎水性脂肪族または芳香族連結モノマーのドメインと温和な親水性アクリル酸またはメタクリル酸エステル連結モノマーのドメインを有するポリマー樹脂であり得る。混合樹脂中の温和な親水性ドメインは、異なるまたは同一の長さ（異なる数のモノマー）であり得、混合樹脂中の疎水性ドメインも異なるまたは同一の長さ（異なる数のモノマー）であり得る。混合支持体上にリパーゼを固定化する方法の具体的な実施形態および混合支持体上に固定化されたリパーゼの具体的な実施形態では、リパーゼ固定化支持体が、アクリル酸またはメタクリル酸エステル（ＭＭＡ）と架橋したジビニルベンゼン（ＤＶＢ）（またはジビニルベンゼンとスチレンの異なる比率の混合物）の交互のドメインを含む巨大網状多孔質ポリマー支持体である。混合支持体上に固定化された開示されるリパーゼ調製物は、遊離リパーゼまたは親水性もしくは疎水性支持体などの他の支持体上に固定化されたリパーゼと比較して、飽和脂肪酸、ならびにある程度遊離脂肪酸の形態または脂肪酸アシル基の形態のモノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸に対する増加したエステル交換／エステル化活性、ならびに遊離脂肪酸または脂肪酸アシル基の形態のｎ−３脂肪酸のエステル交換／エステル化に対する低い選択性を示す。
【００７４】
「ポリマー支持体」、「ポリマーマトリックス」、「固定化支持体」、「ポリマー基板」、「樹脂支持体」、「樹脂マトリックス」、「固定化樹脂」、「樹脂基板」、「ポリマー担体」などの用語は、本明細書で互換的に使用され、酵素、具体的にはリパーゼを化学的または物理的に固定化することができる固体または半固体のポリマー／樹脂体を指す。
【００７５】
酵素、具体的にはリパーゼを固定化するためのポリマー支持体の成分として本明細書で使用される「ポリマードメイン」または「ポリマーセグメント」または「ポリマー断片」または「ポリマー伸長」などの用語は、このようなポリマー支持体の一部を意味すると解釈されるべきである。
【００７６】
第５の態様では、本開示は、出発油源と比較して高いｎ−３脂肪酸含量のグリセリド、および酵素反応の脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸副産物中の低下したｎ−３脂肪酸含量をもたらす、開示される「混合」疎水性−親水性支持体（樹脂）上に固定化されたリパーゼを使用した、ｎ−３脂肪酸の供給源としての油と短鎖アルコールまたはアルコールドナーとの間の反応を本質的に含む、ｎ−３ＰＵＦＡについて油を酵素的に濃縮する方法を提供する。
【００７７】
例えば、この態様によると、５％〜６０％ｗ／ｗ、具体的には１０％〜３０％ｗ／ｗ以上の多価不飽和脂肪酸、特にＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡを含有する油を濃縮する方法が以下のステップを含む：
（ａ）疎水性−親水性ドメインを有するポリマー樹脂上に固定化された、特に飽和、ならびにある程度モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸またはそれらのアシル部分に対して高い選択性のリパーゼを使用して、アルコールまたはアルコールドナーによりｎ−３脂肪酸を含有する油を同時または連続的にエステル交換／エステル化および加水分解するステップ；および
（ｂ）固定化リパーゼ調製物を除去し、出発材料中の全ｎ−３脂肪酸の５０％未満のｎ−３脂肪酸を含有する形成された脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸から、出発材料中全ｎ−３脂肪酸の５０％ｗ／ｗより高いｎ−３脂肪酸を含有する形成されたグリセリドを単離して、ｎ−３脂肪酸が濃縮されたグリセリド画分を得るステップ。
【００７８】
本開示の全ての態様において、前記エステル交換反応は、一段階直接エステル交換反応であり得る、または加水分解反応と引き続く形成された遊離脂肪酸のアルコールによる連続エステル化を通して達成され得ることに留意されたい。エステル化はまた、短鎖アルコールによる反応媒体中に存在する任意の遊離脂肪酸のエステル化でもあり得る。
【００７９】
第６の態様では、本開示は、上および以下の例に詳述される、脂肪酸アルキルエステル、具体的には脂肪酸エチルエステルを調製するための全酵素的二段階法を提供した。一般に、この方法は、ｎ−３多価不飽和脂肪酸を含む油を、ｐＨ約５〜９で、水またはアルカリ性水性緩衝液の存在下で、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（ＰＳリパーゼ）調製物の存在下で、短鎖アルキルアルコール、具体的にはエタノールと反応させる、ｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル、具体的にはｎ−３脂肪酸エチルエステルの酵素的調製であって、前記ＰＳリパーゼは、具体的にはポリマー支持体１ｇ当たり１００００ユニットより高い前記ＰＳリパーゼの高充填量でポリマー樹脂支持体上に固定化され、前記支持体は本開示による混合ポリマー支持体である調製を提供する。約７０％の前記油の脂肪酸アルキルエステルおよび１０％未満のＦＦＡへの転換率が達成されるまで反応を進行させ、次いで、前記ＰＳリパーゼ調製物を除去することによって停止させ、遊離脂肪酸副産物および過剰なアルコールに加えて、脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＥＥ）、モノ−、ジ−および残留トリ−グリセリドを含有する反応混合物の有機上相／画分を回収する。第２のステップで、前記有機相を、本開示による混合ポリマー樹脂支持体上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（ＴＬ）の存在下で、短鎖アルキルアルコール、具体的にはエタノールと反応させ、前記油中の脂肪酸アシル基の少なくとも９７％ｗ／ｗ、具体的には９８％ｗ／ｗ、９９％ｗ／ｗおよび最大１００％がその低級アルキルエステル、具体的にはエチルエステルに転換されるまで、反応を継続させる。次いで、反応混合物から前記リパーゼ調製物を除去することによって、反応を停止させ、得られたｎ−３多価不飽和脂肪酸アルキルエステル濃縮物を分別蒸留によって反応混合物から単離する。以下の例６に示されるように、この方法では、ＰＳリパーゼ調製物およびＴＬリパーゼ調製物が共に、同じバッチの各前記ＰＳリパーゼ調製物およびＴＬリパーゼ調製物を使用して少なくとも２０反応サイクルにわたってそれらの触媒活性の少なくとも７０％を維持した。
【００８０】
開示される方法／反応の全ての態様の実施形態で、ｎ−３ＰＵＦＡが濃縮されたグリセリド画分が、反応混合物を分子／薄膜蒸留で処理して、脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸に富む画分を除去することによって反応混合物から単離することができ、これにより、蒸留後、ｎ−３ＰＵＦＡが濃縮されたグリセリド画分は、ｎ−３ＰＵＦＡについて少なくとも６０％ｗ／ｗの回収率でモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドの混合物を含む。
【００８１】
開示される方法／反応の全ての態様の実施形態で、得られた単離された濃縮グリセリド画分を、場合により、例えば、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、または遊離脂肪酸中もしくは脂肪酸アシル基の不飽和度に対する選好性も炭素鎖長に対する選好性も有さない脂肪酸のエステル化を触媒する同様の活性の他の酵素調製物の存在下で、ｎ−３ＰＵＦＡ濃縮物（主に遊離脂肪酸の）、またはｎ−３ＰＵＦＡ短鎖アルキルエステルとさらに酵素反応させることができる。酵素を、その遊離形態でまたはポリマー樹脂上に固定化して使用して、それぞれ、主にｎ−３脂肪酸がさらに濃縮された、典型的には６０％ｗ／ｗ超のトリグリセリド、および反応の副産物としての水またはアルコールを含む混合物を得ることができる。反応混合物から酵素を除去し、その後水および／またはアルコールならびに任意の未反応脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルをそれぞれ蒸留した後、６０％ｗ／ｗ超のｎ−３脂肪族部分を含有する、主にトリグリセリドを含む、混合物を得る。
【００８２】
一定のリパーゼは、例えば使用される油の初期ｎ−３脂肪酸含量の７０％ｗ／ｗ未満のグリセリド画分中のｎ−３脂肪酸部分の回収率をもたらすことができ、ｎ−３脂肪酸部分の残りは副産物脂肪酸アルキルエステル混合物および加水分解副産物、すなわち遊離脂肪酸混合物にエステル交換される。このようなリパーゼを使用する場合、開示される方法／反応の全ての態様の実施形態では、反応混合物を以下のステップで処理することができる：
ａ．反応混合物から酵素を除去し、引き続いて反応混合物からアルコールおよび水副産物を除去するために、蒸発、具体的にはフラッシュ蒸発させるステップ；
ｂ．場合により、反応成分（グリセリド）と脂肪酸アルキルエステルまたは遊離脂肪酸の濃縮物との間のワンポット選択的エステル化、エステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびエステル交換（ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を触媒してトリグリセリドの形態のｎ−３脂肪酸含量が高いグリセリドを得るために、得られた反応混合物を、その遊離または固定化形態の第２のリパーゼで処理するステップ；
ｃ．酵素を除去し、過剰な脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸を除去するために、分子／薄膜蒸留で反応混合物を処理して、ｎ−３脂肪酸部分含量が６０％より高い、グリセリド混合物、主にトリグリセリドを含む残渣を得るステップ。
【００８３】
本開示の全ての態様および実施形態では、種々の反応および方法に使用される油が食用油、例えば魚油または藻油、真菌油、またはｎ−３脂肪酸を含有する任意の他の適切な油性物質であり得る。
【００８４】
本開示の全ての態様および実施形態では、アルコールがアルキルアルコール、例えば、それだけに限らないが、短鎖アルキルアルコールであり得る。本明細書で使用される「短鎖アルキルアルコール」とは、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルアルコール、具体的にはＣ１〜Ｃ４−アルキルアルコール、例えばメタノールおよびエタノールを意味する。本明細書で使用される「短鎖アルコールドナー」とは、モノ短鎖アルキルエステル、例えば、酢酸メチルもしくは酢酸エチル、またはジ−短鎖−アルキルカーボナート、例えばジメチル−もしくはジエチルカーボナートを意味する。
【００８５】
本明細書に開示される種々の反応および方法、または存在する場合はそれらの異なる段階で使用されるリパーゼは、例えばカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）、カンジダ・アンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂ）（ＣＡＬＢ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）またはクロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）のいずれかに由来し得る。酵素の混合物の使用が企図される。
【００８６】
「酵素選択性」、「酵素特異性」および「酵素選好性」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【００８７】
本開示の全ての態様および実施形態では、記載される反応および方法に使用されるリパーゼが遊離であり得る、またはこれが微孔性ポリマー樹脂上に固定化され得る。例えば、特に本開示の前記第１の態様では、微孔性ポリマー樹脂が、脂肪族または芳香族基を含む疎水性微孔性有機ポリマー樹脂、例えば架橋ジビニルベンゼンまたは架橋スチレンおよびジビニルベンゼンであり得る。いくつかの特定の態様および実施形態、例えば本開示の前記第２、第３、第４、第５または第６の態様では、リパーゼが、本明細書に開示される交互の疎水性−親水性ドメインを一般に有する「混合」微孔性ポリマー樹脂上に固定化される。メタクリル酸エステルが架橋したジビニルベンゼンでできた巨大網状多孔質ポリマー支持体が、本明細書に開示される方法の実施形態に使用することができる混合支持体の一例である。これらのポリマー支持体は、連結した脂肪族または芳香族モノマーの疎水性ドメインおよび連結した親水性アクリル酸またはメタクリル酸エステルモノマーの親水性ドメインなどの、その交互の疎水性ドメインと温和な親水性ドメインを特徴とする。「連結した」を指す場合、これは特に「架橋した」を意味する。温和な親水性モノマーにはアクリル酸アルキルエステルおよびメタクリル酸アルキルエステルが含まれる一方、疎水性モノマーにはジビニルベンゼン、スチレンおよびプロピレンが含まれる。本明細書に開示され、例示される具体的な組み合わせは、交互の伸長の、様々な比率のジビニルベンゼンとメタクリル酸メチルモノマーを含むポリマーである。
【００８８】
本開示の実験節に提示されるように、本明細書に開示される「混合」支持体上に固定化されたリパーゼを使用した、グリセリド生成物中の脂肪酸部分の形態のｎ−３脂肪酸の回収率は、有意に増加する。さらに、リパーゼを開示される混合支持体上に固定化する場合、これは、遊離形態または脂肪酸アシル部分（例えば、脂肪酸アルキルエステルならびにモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドならびに極性脂質）としての、種々の種類の脂肪酸、飽和、不飽和または多価不飽和脂肪酸に対する選好性に関する特有の触媒特性を示す。遊離の固定化されていない形態における、または他の支持体上に固定化された場合のその選択性と比較したリパーゼ調製物の選択性もまた有意に改善される。
【００８９】
本明細書に開示されるエステル交換／エステル化反応および方法に使用されるリパーゼは、ＤＨＡおよびＥＰＡに対する様々な選択性を有することができ、最終生成物中の遊離脂肪酸ならびに脂肪酸アルキルエステルおよびグリセリド（モノ−、ジーおよびトリ−グリセリド）中の脂肪酸アシル基の形態のＥＰＡ：ＤＨＡの比率を事前設計することができる。例えば、最終グリセリド生成物中の高いＤＨＡ濃度が望ましい場合には、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）［ＴＬ］リパーゼが選択される一方で、最終グリセリド生成物中の高いＥＰＡおよびＤＨＡ含量が望ましい場合には、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＱＬＭ（商標））またはカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）リパーゼ［ＣＡＬＡ］を使用することができる。したがって、本開示によると、ＥＰＡとＤＨＡとの間の一定の所定の比率を含む最終的な一貫したグリセリド生成物を得るために、一定の公知のＥＰＡ：ＤＨＡ比率を含む様々な酵素系を使用して得られたグリセリド混合物を最終グリセリド生成物に使用して、最終グリセリド生成物中特定の所望のＥＰＡ：ＤＨＡ比率を得ることができる。
【００９０】
なおさらに、様々なｎ−３脂肪酸間の比率が予め決定されている、ｎ−３脂肪酸が実質的にそれらのグリセリド形態の、すなわちモノ−、ジ−および／またはトリグリセリドの脂肪酸部分としてのＥＰＡ、ＤＨＡおよびＤＰＡであるｎ−３脂肪酸濃縮物が本明細書で開示される。これらの濃縮物は、食品および栄養補助食品中の栄養食品成分として、または食品添加物として、または医薬品製剤中の成分として有用である。このような添加剤または医薬組成物は、液体形態、または投与単位形態、例えばｎ−３脂肪酸濃縮グリセリド混合物を含有するゼラチンカプセルで提供することができる。
【００９１】
グリセリド混合物は、トリグリセリド、ジグリセリドおよび／またはモノグリセリドを含む任意の混合物である。グリセリド混合物中のトリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドの間の比率は予め設計することができる。
【００９２】
許容され、本明細書で使用される多価不飽和脂肪酸は、その炭素鎖中に４個以上の二重結合を有する脂肪酸である。
【００９３】
オメガ−３脂肪酸、ω−３脂肪酸、ｎ−３脂肪酸、オメガ−３ＰＵＦＡ、ω−３ＰＵＦＡおよびｎ−３ＰＵＦＡという用語は、本明細書で互換的に使用される。
【００９４】
脂肪酸アシル、または脂肪酸アシル基、または脂肪酸残基または脂肪酸部分という用語は、本明細書で互換的に使用され、一般に、例えばグリセリドおよび／もしくは極性脂質のグリセロール骨格に結合した、または脂肪酸アルキルエステルの酸部分としての結合脂肪酸部分を指す。
【００９５】
本開示を通して、特に指示しない限り、百分率でｎ−３脂肪酸または脂肪酸部分のレベルに言及する場合、これらは重量パーセントであり、脂肪酸の総重量のうちのｎ−３脂肪酸部分の重量分率を表す。このような百分率は、互換的にｘ％またはｘ％ｗ／ｗまたはｘ％ｗ／ｗとして示される。
【００９６】
本明細書に開示されるｎ−３濃縮法のいくつかの実施形態では、水および生体触媒、具体的には上記の疎水性ドメインと温和な親水性ドメインで構成されるポリマー樹脂（混合支持体）上に固定化されたリパーゼの存在下で、５％〜６０％、例えば１０％〜３５％のｎ−３脂肪酸を含む油と短鎖アルコールまたはアルコールドナーを反応させるステップを含む方法が提供される。以下により詳細に記載されるように、その固定化のために、生体触媒（リパーゼ）は、特に飽和脂肪酸、ならびにある程度モノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸の、同時または任意の順序で連続的に起こり得るエステル交換／エステル化反応に対する増加した活性、ならびにｎ−３脂肪酸に対する低下したエステル交換／エステル化活性を示す。反応を停止させたら、固定化リパーゼ調製物を除去し、引き続いて反応媒体を蒸発、具体的にはフラッシュ蒸発させて、水および過剰なアルコールを除去し、反応中に形成された脂肪酸アルキルエステルおよび遊離脂肪酸を含む画分の蒸留を介して、ｎ−３脂肪酸が濃縮されたグリセリドの画分を得る。蒸留は、例えば、分子蒸留または薄膜蒸留であり得る。単離されたグリセリド画分は、出発油材料中に存在するｎ−３多価不飽和脂肪酸の６０％超を含む。ｎ−３脂肪酸が濃縮されたこの単離されたグリセリド画分を、場合により、エステル交換／エステル化活性を有する遊離または固定化酵素、例えばカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢの存在下で、ｎ−３遊離脂肪酸濃縮物またはｎ−３脂肪酸短鎖アルキルエステル濃縮物でさらにエステル化／エステル交換して、主に６０％超のｎ−３脂肪酸を含むトリグリセリド混合物、ならびに副産物としての水および短鎖アルコールをそれぞれ形成することができる。ｎ−３脂肪酸がさらに濃縮されたこのトリグリセリド画分は、反応混合物から形成された水／アルコールならびに残留する過剰の遊離脂肪酸および／または脂肪酸アルキルエステルを蒸留することによって得ることができる。除去された酵素は再生利用可能であり、多数の反応サイクルにわたって再使用することができる。
【００９７】
酵素反応に言及する場合の「連続的に」および「順次」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【００９８】
本開示の方法および反応の全ての態様および実施形態では、固定化酵素を、複数のバッチで、または固定床、充填床、流動床および撹拌槽型反応器で連続的に使用することができる。
【００９９】
理論によって拘束されないが、上に詳述される交互の疎水性−親水性ドメインを含む、具体的な態様および実施形態におけるリパーゼが固定化される本明細書で定義される混合ポリマー樹脂支持体の性質により、酵素は、遊離形態の場合、または疎水性もしくは親水性の特性を有する他の種類のポリマー支持体樹脂上に固定化されている場合のその活性部位の空洞と比較して活性部位空洞が小さい新しいお気に入りの構造に適合することが示唆される。より小さな活性部位空洞は、遊離形態のまたは異なるポリマー樹脂上に固定化された場合のその活性と比較して、ラウリン酸、ミリスチン酸またはパルミチン酸アシル基などの短鎖脂肪酸、ならびにある程度オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などのモノ−、ジ−またはトリ−不飽和脂肪酸に対するリパーゼのエステル交換／エステル化活性速度の増加、ならびにその遊離脂肪酸形態のまたは脂肪酸アシル部分としてのＤＰＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡなどの長鎖脂肪酸アシル基に対する低下したエステル交換／エステル化活性をもたらし得る。したがって、本開示は、本明細書に開示される混合ポリマー支持体上にこのようなリパーゼを固定化することによって、リパーゼの様々な種類の脂肪酸アシル基に対する選択性を変化させる手段を提供することができる。
【０１００】
ここに開示される方法および組成物の全てで、グリセリド混合物またはグリセリド濃縮物中のｎ−３脂肪酸の最終濃度（レベル）を、出発ｎ−３脂肪酸濃縮物に応じて、また酵素供給源に応じて事前設計することもできる。
【０１０１】
さらに、言及されるように、本開示の方法を、ＥＰＡおよびＤＨＡに対して異なる特異性を示すリパーゼを使用することによって、最終濃縮物中に所定の比のＥＰＡ：ＤＨＡを生じるように適合させることができる。この特徴により、意図した用途に従って、食品および栄養補助食品業界用の種々のブレンドおよび混合物に使用することができる「コスチュームメード（ｃｏｓｔｕｍｅ−ｍａｄｅ）」ＥＰＡ／ＤＨＡ脂肪酸濃縮物の調製が可能になる。一般に、本開示に従って製造される濃縮物中のＥＰＡ：ＤＨＡ部分の重量比は、約０．０１：２〜５：１およびそれらの間の任意の下位値に及び得る。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、温度、圧力、濃度、収率、濃度等などのパラメータの具体的に言及される値から±１０％の偏差を包含することを意味する。
【０１０３】
数値範囲を本明細書で指示する場合はいつでも、これは指示される範囲内の任意の引用数字（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「間に及ぶ／間の範囲」および第１の指示数「から」第２の指示数「までに及ぶ／までの範囲」という句は本明細書で互換的に使用され、第１の指示数および第２の指示数ならびにそれらの間の全ての分数および整数を含むことを意図する。種々の実施形態を所与の範囲を使用することによって説明する場合、その範囲は単に便宜上および簡潔さのためにそのように与えられるものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことに留意すべきである。したがって、範囲の説明は、その範囲内の全ての可能な部分範囲ならびに個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「式（Ｉ）の化合物」という用語は、独立に、その混合物を含む式（Ｉ）の複数の化合物を含み得る。
【０１０５】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈上別段の意味を要しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、任意の整数もしくはステップまたは整数およびステップの群を除外することを意味しないことを意味するのではなく、明記される整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むことを意味することが理解される。
【０１０６】
明確にするために別々の実施形態の文脈で説明されている本発明の一定の特徴を、単一の実施形態で組み合わせて提供してもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の種々の特徴を、別々にもしくは任意の適切な部分的組み合わせで、または本発明の任意の他の記載される実施形態で適切に提供してもよい。種々の実施形態の文脈で記載される一定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは実施不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。
【０１０７】
以下の例は、本発明の態様を非限定的に実施する際に本発明者らによって使用された技術の代表例である。これらの技術は開示される方法および組成物を実施するための具体的な実施形態の例示であるが、当業者であれば、本開示に照らして、意図した本発明の範囲から逸脱することなく多数の修正を行うことができることを認識するだろう。
【０１０８】
例
例１−固定化リパーゼの調製
この研究におけるリパーゼは、遊離形態で、または微孔性シリカ、種々の程度の親水性および疎水性特性のポリマー吸着剤を含む様々な支持体上、ならびにイオン交換樹脂上に固定化して使用した。以下は、この研究で試験した様々なリパーゼの固定化に使用した支持体のリストである。
【０１０９】
酵素固定化手順は以下の通りであり得る：
指定される様々な適切な供給源に由来するリパーゼ（１００００ユニットのリパーゼ）を０．１ＭおよびｐＨ７のリン酸緩衝液（１０ｍｌ）に溶解した。１００〜１５００ミクロンの範囲の粒径分布を有するビーズ形態、または粉末形態（１００ミクロン未満）の酵素支持体（２ｇ）を酵素溶液に導入した。混合物を室温で４〜１２時間振盪した。支持体上に固定化された酵素を溶液から濾別した。場合により、濾過した酵素を冷アセトンで洗浄し、次いで、デシケーターまたは凍結乾燥器中で５％未満の固定化酵素調製物の含水量まで乾燥させた。
【０１１０】
この研究で使用したリパーゼは、様々な供給源：カンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）およびＢ（ＣＡＬＢ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種およびサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）に由来するリパーゼであった。
【０１１１】
一例として、ＣＡＬＡを、固定化リパーゼ調製物を形成するための様々な疎水性−親水性特性を有する以下に列挙される種々の支持体上に固定化した：
１．疎水性特性を有する活性炭（Ｓｉｇｍａ）
２．疎水性特性を有する架橋スチレン−ジビニルベンゼン（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（いずれかの国における登録商標）ＸＡＤ  １６００Ｎ、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ、またはＬｅｗａｔｉｔ（いずれかの国における登録商標）ＶＰ  ＯＣ  １０６４  ＭＤ  ＰＨ、Ｌａｎｘｅｓｓ、ドイツ）
３．別個の（交互の）疎水性ドメインと温和な親水性ドメインを含むメタクリル酸メチルと架橋したジビニルベンゼン
４．親水性特性を有する架橋フェノールホルムアルデヒド重縮合樹脂−弱塩基性陰イオン交換体（Ｄｕｏｌｉｔｅ（いずれかの国における登録商標）Ａ５６８、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ）
５．親水性特性を有するメタクリル酸ポリマー（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（いずれかの国における登録商標）ＸＡＤ７ＨＰ、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ）
６．親水性特性を有するシリカゲル６０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１１２９２６−００−８）
【０１１２】
例２
グリセリドの形態のｎ−３脂肪酸濃縮物の調製
遊離形態または例１による６種の異なる酵素支持体（１ｇ）（以下の表１において「遊離」または支持体番号により示される）の各々の上に固定化されたカンジダ・アンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ａ）（ＣＡＬＡ）由来のリパーゼ（１５０００ユニット、ＮｏｖｏＣｏｒ  ＡＤ  Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）を、混合または振盪することによって、精製魚油（１０ｇ）（ＦＦＡ含量０．３％未満、ｎ−３脂肪酸レベル３０％、ＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％ｗ／ｗ）と接触させ、エタノール（２ｇ）を、反応系（油−酵素混合物）に、それぞれ１時間間隔で３等量分ずつ添加した。反応混合物中の含水量を、反応媒体のｐＨが５〜９の範囲となるように必要量の水またはアルカリ性水性緩衝液を添加することによって、油の３重量％に調整した。反応を３０℃で行った。反応生成物を様々な時間間隔でガスクロマトグラフィーによって定量した。以下の表１、２および３は、様々な時間間隔で反応系中で生成されたエチルエステル画分中の脂肪酸エチルエステルの分布を示す。
【０１１３】
４８時間撹拌した後、固定化リパーゼ調製物を濾別し（遊離リパーゼを使用したこの例および以下の例の全てで、調製物は反応終了時に沈殿した）、反応混合物をフラッシュ蒸発させて過剰の水およびアルコールを除去し、次いで、分別分子蒸留（Ｌａｂ  ３（商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｙｅｒｓ（商標）、米国）によって１０ｍＴｏｒｒおよび１２０℃で留去して、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を除去して、出発材料中に存在する全ｎ−３脂肪酸のうち６０％超のｎ−３脂肪酸を含有する魚油グリセリドの画分を得た。最終グリセリド画分中のｎ−３脂肪酸の含量を、メタノール中１４％三フッ化ホウ素溶液（Ｓｉｇｍａ−ＢＦ３／ＣＨ３ＯＨの製品）の存在下でモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドについて完全メチル化し、形成された脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーによって分析することによって決定した。
【０１１４】
表１は、６時間の反応後の、ＣＡＬＡの様々な調製物を使用した、エステル交換／エステル化反応、精製魚油およびエタノールのＦＡＥＥへの転換の結果を提示している。
【０１１５】
反応条件：３％の水を含有する精製魚油（１０ｇ）および固定化リパーゼ調製物１ｇ（またはその粗形態の同等のリパーゼユニット）を、反応系（油−酵素混合物）にそれぞれ１時間間隔で３等量分ずつ添加したエタノール（２ｇ）と混合した。反応混合物を３０℃でインキュベートし、３００ｒｐｍで振盪した。
【表１】
2020513750.tif 000002
【０１１６】
表２は、２４時間の反応後の、ＣＡＬＡの様々な調製物を使用した、エステル交換／エステル化反応、精製魚油およびエタノールのＦＡＥＥへの転換の結果を提示している。反応条件は表１と同じであった。
【表２】
2020513750.tif 000003
【０１１７】
表３は、３０時間の反応後の、ＣＡＬＡの様々な調製物を使用した、エステル交換／エステル化反応、精製魚油およびエタノールのＦＡＥＥへの転換の結果を提示している。反応条件は表１と同じであった。
【表３】
2020513750.tif 000004
【０１１８】
表１〜３は、温和な疎水性ドメインと温和な親水性ドメインで構成されるポリマー樹脂上に固定化されたＣＡＬＡ（リパーゼ調製物番号３）が、その遊離形態または他の異なる支持体上に固定化された場合の同じリパーゼの活性と比較して、飽和ならびにモノ−、ジ−およびトリ−不飽和脂肪酸アシル基に対する選好性を増加させ、ｎ−３脂肪酸アシル基に対する選好性を低下させたことを明確に示している。例えば、表１に見られるように、反応を進行させた６時間後に、リパーゼ調製物番号３を使用すると、ＦＡＥＥの画分は、粗（固定化されていない）ＣＡＬＡの３９．６％と比較して４９．９％に増加した一方で、ＦＡＥＥ画分中のｎ−３脂肪酸部分のレベルは、粗ＣＡＬＡを使用した場合の１５．９％ｗ／ｗと比較して、７．３％ｗ／ｗであり、ｎ−３脂肪酸の大部分がグリセリド画分中に保持されており、ｎ−３脂肪酸部分が高度に濃縮された油が得られたことを示している。
【０１１９】
例３
グリセリドの形態のｎ−３脂肪酸濃縮物の調製
例１のように遊離形態または様々な酵素支持体（１ｇ）上に固定化されたアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種由来のリパーゼ（１００００ユニット、リパーゼＱＬＭ（商標）、Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ、日本）の様々な酵素調製物を、それぞれ、３０％ｎ−３脂肪酸を含有する０．３％（１０ｇ）未満のＦＦＡ含量の精製魚油と混合または振盪することによって接触させ、エタノール（２ｇ）を反応系（油と酵素）に、それぞれ１時間間隔で３等量分ずつ添加した。反応混合物中の含水量を、反応媒体のｐＨが５〜９の範囲となるように必要量の水またはアルカリ性水性緩衝液を添加することによって、油の２重量％に調整した。反応を３０℃で行った。反応生成物を様々な時間間隔でガスクロマトグラフィーによって定量した。
【０１２０】
６時間撹拌した後、固定化リパーゼ調製物を濾別し、反応混合物をフラッシュ蒸発させて過剰のアルコールおよび水を除去し、次いで、分別分子蒸留によって留去して、脂肪酸エチルエステルおよび遊離脂肪酸を除去して、出発材料中に存在する全ｎ−３脂肪酸に対して６０％超の回収率でｎ−３脂肪酸を含有する魚油グリセリドの画分を得た。以下の表４は、魚油グリセリドの脂肪酸エチルエステルへの転換率、および６時間の反応後のエチルエステル画分中のｎ−３含量も示す。
【表４】
2020513750.tif 000005
【０１２１】
表４に提示される結果は、親水性−疎水性ドメインを含むポリマー支持体上に固定化されたリパーゼが、エステル交換／エステル化反応系においてオメガ−３脂肪酸基に対して低下した選好性を示すという点で、表１〜３に提示されるのと同様の傾向を示している。６時間の反応後の転換率は比較的低かったので、リパーゼＱＬＭ／４についてのオメガ−３／ＦＡＥＥの低い比率は無視される。
【０１２２】
例４
グリセリドの形態のｎ−３脂肪酸濃縮物の調製
サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）由来のリパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種由来のリパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＱＬＭ（商標）、Ｍｉｅｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ、日本）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のリパーゼ［Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、日本］を、例１によりジビニルベンゼン（ＤＶＢ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）で構成されるポリマー支持体（それぞれ１０：１重量％の比率）上に別々に固定化した。リパーゼ調製物を、混合または振盪することによって、３０％ｎ−３脂肪酸を含有するＦＦＡ含量２４％（１０ｇ）の粗魚油の混合物と接触させ、エタノール（２ｇ）を反応系にそれぞれ１時間間隔で３等量分ずつ添加した。反応混合物中の含水量を、反応媒体のｐＨが５〜９の範囲となるように必要量の水またはアルカリ性溶液を添加することによって、油の３重量％に調整した。反応を３０℃で行った。反応生成物およびＦＦＡ値を様々な時間間隔でガスクロマトグラフィーによって定量した。
【０１２３】
以下の表５〜７は、様々な酵素調製物を使用した、魚油グリセリドおよびＦＦＡの脂肪酸エチルエステルへのエステル交換／エステル化および加水分解のプロファイルを示す。
【０１２４】
表５は、ＤＶＢ／ＭＭＡポリマー樹脂上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）リパーゼを使用した、魚油グリセリドおよびＦＦＡのＦＡＥＥへのエステル交換／エステル化および加水分解のプロファイルを提示する。
【表５】
2020513750.tif 000006
【０１２５】
表６は、ＤＶＢ／ＭＭＡポリマー樹脂上に固定化されたシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼを使用した、魚油グリセリドおよびＦＦＡのＦＡＥＥへのエステル交換／エステル化および加水分解のプロファイルを提示する。反応条件は上記の通りであった。
【表６】
2020513750.tif 000007
【０１２６】
表７は、ＤＶＢ／ＭＭＡポリマー樹脂上に固定化されたアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種リパーゼを使用した、魚油グリセリドおよびＦＦＡのＦＡＥＥへのエステル交換／エステル化および加水分解のプロファイルを提示する。反応条件は上記の通りであった。
【表７】
2020513750.tif 000008
【０１２７】
表５〜７に提示される結果は、固定化リパーゼが、油グリセリドと遊離脂肪酸のエステル交換／エステル化および加水分解反応を同時にまたは順次触媒して、２４時間の反応後に、主に脂肪酸エチルエステルおよび典型的には１０％より低い、低いＦＦＡ値をもたらすことを示している。
【０１２８】
例５
疎水性ドメインと温和な親水性ドメインを含むコポリマー上に固定化されたリパーゼ
この研究に使用されたポリマーおよびコポリマー支持体は、ＷａｎｇおよびＹａｎｇによって報告された方法（Ｗａｎｇ，Ｙ．およびＹａｎｇ，Ｗ．、２００４、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第２０巻、６２２５〜６２３１頁）に従って合成した。種々の比率のジビニルベンゼンとメタクリル酸メチルを有する様々な支持体を合成し、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して水および残留有機溶媒を除去した。例１に記載される酵素固定化手順を種々の支持体組成物上の様々なリパーゼの調製に使用した。最終生成物、固定化リパーゼ調製物は、５０ミクロン未満の粒径の不透明な粉末状物質であった。５０ミクロン未満の粒径に粉砕したＬｅｗａｔｉｔ  ＯＣ  １６００（ＬａｎＸｅｓｓ、ドイツ）を、製造業者によって指定されるようにＤＶＢおよびＭＭＡを含む対照樹脂支持体として使用した。
【０１２９】
図１は、同じバッチの生体触媒を繰り返し使用した、４回目の反応サイクルにおける、精製魚油とエタノールのエステル交換における、種々の比率のＤＶＢとＭＭＡの様々な樹脂上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の触媒活性プロファイルを示す。全てのリパーゼ調製物を粉末形態で使用した。反応条件については表１を参照されたい。
【０１３０】
図１に提示される結果は、温和な親水性モノマーの含量と比較して、疎水性モノマーの含量を増加させると（この例では、ＤＶＢ（疎水性）とＭＭＡ（温和な親水性））、リパーゼエステル交換活性が改善されたことを示している。ＤＶＢ／ＭＭＡ間の比率がそれぞれ１０：１の場合に、最高のリパーゼ活性が観察された。
【０１３１】
図２は、３５回の連続反応サイクルで、同じバッチの固定化酵素ビーズを繰り返し使用した、様々な比率のＤＶＢ／ＭＭＡで構成される様々なポリマー支持体上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ）を使用した６時間の反応後の精製魚油とエタノールのエステル交換／エステル化転換率を示している。反応条件については例１を参照されたい。
【０１３２】
図３は、３５回の連続反応サイクルで、同じバッチの固定化酵素ビーズを繰り返し使用した、様々な比率のＤＶＢ／ＭＭＡで構成される様々なポリマー支持体上に固定化されたシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ  Ａｍａｎｏ）を使用した精製魚油とエタノールのエステル交換／エステル化転換率を示している。
【０１３３】
例６
魚油の非選択的エステル交換／エステル化のための共にＤＶＢ−ＭＭＡ混合ポリマー支持体上に固定化されたシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ、およびその後のサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの使用による魚油の脂肪酸エチルエステルの調製
ポリマー支持体の単位重量当たり様々な量の酵素を含有する、魚油とエタノールとのエステル交換反応におけるオメガ−３脂肪酸アシル基に対するその低い選択性について先行技術で知られているリパーゼの様々な調製物を、この研究で、固定化形態で使用した。以下の表は、疎水性−温和な親水性の連続ポリマー支持体上に別々に固定化された様々な酵素濃度のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ  Ａｍａｎｏ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種リパーゼ（リパーゼＱＬＭ（商標）、Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ）およびサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ）による６時間および２４時間の反応後のエステル交換反応媒体の組成を示す。
【０１３４】
表８および９は、様々な酵素タンパク質充填量（酵素ユニット／１ｇポリマー支持体）でＤＶＢ−ＭＭＡポリマー支持体上に固定化されたシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ（リパーゼＰＳ  Ａｍａｎｏ）を使用した精製魚油とエタノールの６時間および２４時間のエステル交換反応後に生成されたＦＡＥＥ％の組成を提示する。
【表８】
2020513750.tif 000009
【表９】
2020513750.tif 000010
【０１３５】
表１０および１１は、様々な酵素タンパク質充填量（酵素ユニット／１ｇポリマー支持体）でＤＶＢ−ＭＭＡポリマー支持体上に固定化されたアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種リパーゼ（リパーゼＱＬＭ  Ａｍａｎｏ）を使用した精製魚油とエタノールの６時間および２４時間のエステル交換反応後に生成されたＦＡＥＥ％の組成を提示する。
【表１０】
2020513750.tif 000011
【表１１】
2020513750.tif 000012
【０１３６】
表１２および１３は、様々な酵素タンパク質充填量（酵素ユニット／１ｇポリマー支持体）でＤＶＢ−ＭＭＡポリマー支持体上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ）を使用した精製魚油とエタノールの６時間および２４時間のエステル交換反応後に生成されたＦＡＥＥ％の組成を示す。
【表１２】
2020513750.tif 000013
【表１３】
2020513750.tif 000014
【０１３７】
表８〜１３に提示される結果は、ポリマー支持体上の酵素タンパク質の濃度を増加させると、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼが、ＥＰＡおよびＤＨＡアシル基を含む全ての種類の脂肪酸アシル基をエステル交換し、２４時間後に約９５％の転換率に到達した一方、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（リパーゼＱＬＭ  Ａｍａｎｏ）およびサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＴＬ）は、ポリマー支持体上の酵素タンパク質充填量を増大させても、オメガ−３脂肪酸アシル基に対するその低い選択性を維持したことを示している。重要なことに、これらの結果は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種由来のリパーゼＰＳを、ポリマー支持体上高充填量のタンパク質で使用する場合に、オメガ−３脂肪酸アシル基含有油の非選択的エステル交換／エステル化に使用して、ほぼ完全な収率の脂肪酸アルキルエステル、特に脂肪酸エチルエステルを得ることができることを示している。驚くべきことに、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ、Ａｍａｎｏ）を魚油とエタノールのエステル交換／エステル化に使用して、７０％超の転換率に到達し、次いで、反応媒体の上部有機相を、反応混合物からグリセロールおよび水相を除去することによって回収し、ジビニルベンゼン／メタクリル酸メチルポリマー樹脂上に固定化されたサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）リパーゼの存在下でエタノールと再度反応させる二段階法を行うと、１００％に近い転換率が達成された。両酵素のリサイクル性も二段階酵素エステル交換法で試験し、両リパーゼ調製物が少なくとも２０回のサイクル後にその初期酵素活性の７０％超を維持することが実証された。これらの結果は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種由来のリパーゼの単独で、またはサーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼなどの高いエステル交換／エステル化触媒活性および安定性を特徴とする他の種類のリパーゼと組み合わせた使用が、エステル化可能な脂肪酸の脂肪酸エチルエステルへの１００％に近い転換率を得るために、オメガ−３油の従来の化学的エステル交換を全酵素的方法で置き換えるために工業的に極めて興味深いであろうことを示している。典型的には５０〜７０％の範囲のオメガ−３脂肪酸濃縮物を得るために、脂肪酸エチルエステルへの１００％転換を達成した後に、分別蒸留を方法の最後に使用することができる。
例７
多価不飽和脂肪酸濃縮トリグリセリドの調製
例２または３と同様にして得られた様々な比率のモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドを含有する混合物（エチルエステルおよび遊離脂肪酸画分を留去した後）を、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、または適切なポリマー樹脂上に固定化されたＣＡＬＢを使用して、遊離脂肪酸の形態またはＦＡＥＥの形態の８０％のｎ−３脂肪酸濃縮物と反応させた。反応を真空下６０℃で行って、反応系から形成した水またはエタノールを除去した。初期グリセリド画分中に存在していた部分グリセリドの７０％超のトリグリセリドへの高い転換率に到達した後、固定化生体触媒を濾別した。生成物は典型的には、出発脂肪酸組成に応じて、６０％超のレベルのｎ−３多価不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの全グリセリドの７０％超を含んでいた。
【図１】
2020513750.tif 000015
【図２】
2020513750.tif 000016
【図３】
2020513750.tif 000017
【国際調査報告】
2020513750.tif 000018
2020513750.tif 000019