(57)【要約】  α−シヌクレインに結合するモノクローナル抗体、タウ線維に結合するモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体の使用方法を提供する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマクローン２Ｆ１１である。また、モノクローナル抗体２Ｆ１１および薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤を含む組成物もまた提供する。それを必要とする対象において活性型α−シヌクレインを減少させる方法もまた記載されている。この方法は、ある量の２Ｆ１１を含む組成物を対象に投与することを含む。モノクローナル抗体２Ｆ１１を用いて、生物学的サンプルにおける、α−シヌクレインまたはタウ線維のレベルを決定することもできる。
2020529473.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１２４１７４として寄託されたモノクローナル抗体２Ｆ１１。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１を、薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤と共に含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１を、薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤と共に含む、ワクチン。
【請求項４】
それを必要とする対象において、活性型α−シヌクレインまたはタウ線維の形成を減少させる方法であって、一定量の請求項２に記載の組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項５】
それを必要とする対象において、活性型α−シヌクレインまたはタウ線維の形成を減少させる方法であって、一定量の請求項３に記載のワクチンを該対象に投与すること含む、方法。
【請求項６】
該組成物が対象に経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該ワクチンが対象に経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
投与工程の前に、該対象における活性型α−シヌクレインまたはタウ線維のレベルが決定され、投与工程の後、一定期間後に、活性型α−シヌクレインまたはタウ線維の第二のレベルが決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
投与工程の前に、該対象における活性型α−シヌクレインまたはタウ線維のレベルが決定され、投与工程の後、一定期間後に、活性型α−シヌクレインまたはタウ線維の第二のレベルが決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を決定する方法であって、
ｉ）サンプルの一部を対照抗体と予め混合し、次いで組換え活性型α−シヌクレインモノマーを添加して、対照処置群を作製し、
ｉｉ）サンプルの第２の部分を請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１と予め混合し、次いで組換え活性型α−シヌクレインモノマーを添加して、薬物処置群を作製し、
ｉｉｉ）チオフラビンアッセイを用いて対照処置群および薬物処置群の両方においてβシート構造形成の量が決定され、ここで、対照処置群と比較した薬物処置群におけるチオフラビン蛍光の減少が、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示す、方法。
【請求項１１】
サンプルを請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１に暴露し、該モノクローナル抗体２Ｆ１１がサンプル中のタンパク質に結合するかどうかを決定することを含む、該サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーまたはタウ線維の存在を決定する方法であって、ここで、結合が活性型α−シヌクレインオリゴマーまたはタウ線維の存在を示す、方法。
【請求項１２】
サンプルを、暴露工程の前に非変性電気泳動を用いて分離させ、該分離したタンパク質を、ウェスタン分析によりモノクローナル抗体２Ｆ１１を用いてプローブ化することを含み、ここで、１以上の高分子量タンパク質の結合が、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーまたはタウ線維の存在を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルのドットブロットをモノクローナル抗体２Ｆ１１を用いてプローブ化することを含み、ここで、サンプルへのモノクローナル抗体２Ｆ１１の結合が、活性型α−シヌクレインオリゴマーまたはタウ線維の存在を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病を有すると診断された対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１または該モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病を処置する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１または該モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーまたはタウ線維の存在、濃度または存在および濃度の両方を決定するための方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１を用いて調製された表面にサンプルを適用し、該モノクローナル抗体に結合する活性型α−シヌクレイン凝集またはタウ凝集の発生、量または発生および量の両方を決定し、それにより、該サンプルにおける、活性型α−シヌクレイン凝集またはタウ凝集の存在、濃度または存在および濃度の両方を決定することを含む、方法。
【請求項１７】
モノクローナル抗体のＣＤＲをコードする配列番号１４から１９で定義されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体。
【請求項１８】
該アミノ酸配列が、１以上の配列番号２０から２５で定義されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によりコード化される、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
該モノクローナル抗体が、活性型α−シヌクレイン凝集、タウ線維またはそれらの組合せに結合する、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
血液脳関門を通過するための、請求項１に記載のモノクローナル抗体に結合させた１または２以上の担体分子を含む多重特異性抗体。
【請求項２１】
該多重特異性抗体が二重特異性抗体であって、該二重特異性抗体が、一価または二価のの二重特異性抗体である、請求項２０に記載の多重特異性抗体。
【請求項２２】
二重特異性抗体の１以上の担体分子が、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合抗体またはインシュリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）結合抗体に由来する、請求項２１に記載の多重特異性抗体。
【請求項２３】
サンプル中のタウ凝集体の存在を決定する方法であって、
ｉ）サンプルの一部を対照抗体と予め混合し、次いでタウモノマーを添加して、対照処置群を作製すること、
ｉｉ）サンプルの第２の部分をモノクローナル抗体２Ｆ１１と予め混合し、次いでタウモノマーを添加して、薬物処置群を作製すること、および
ｉｉｉ）対照処置群および薬物処置群の両方におけるβシート構造形成の量を決定することを含み、ここで、対照処置群と比較して、薬物処置群におけるβシート構造形成の量の減少は、サンプル中のタウ凝集体の存在を示す、方法。
【請求項２４】
タウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、またはグリア細胞球状封入体タウオパチーと診断された対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１または該モノクローナル２Ｆ１１を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
タウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、またはグリア細胞球状封入体タウオパチーの処置方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体２Ｆ１１または該モノクローナル２Ｆ１１を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、α−シヌクレインに結合する抗体に関する。また、該抗体の使用方法も記載されている。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、世界中で約１０００万人が罹患している神経変性障害であり、それらの約１５％がレビー小体型認知症（ＤＬＢ）を患っている。これらは、該疾患に関与しているが、これまでに体内でのその主な機能がほとんど知られていないタンパク質であるα−シヌクレインが関与する中核病理を示す。疾患自体は、一次性運動時症状：安静時振戦、運動緩慢、硬直、姿勢反射障害（postural instability）、ならびに嗅覚喪失、便秘、レム期睡眠行動異常症、気分障害および物忘れなどの非運動症状、を含む広範な症状により特徴付けられる。近年、α−シヌクレインの凝集もまた、多系統萎縮症（ＭＳＡ）に関与することが示されている。レビー小体に加えて、タンパク質の蓄積により、軸索および樹状突起が伸長してジストロフィー性神経変性突起（dystrophic）になるレビー神経突起が生じ得る。レビー小体を形成する凝集体としてのα−シヌクレインの蓄積および最終的な沈着は、神経組織内の１０−２０μｍの封入体として可視化され得る。ＤＬＢにおいて、これらの形成が広くみられ、疾患に関連する症状を引き起こしている。
【０００３】
タウは、軸索輸送および神経の完全性を維持することに関与し、樹状突起における生理的役割を有する微小管関連タンパク質である。タウは、グリア細胞でも低レベルで発現している。成人脳において、ＭＡＰＴ遺伝子からの選択的スプライシングにより６つのイソ型のタウが発現される。ＭＡＰＴ遺伝子における変異は、病理的タウタンパク質の蓄積に関連する遺伝性疾患を引き起こす。タウオパチーは、脳内の異常なタウタンパク質の沈着を特徴とする神経変性疾患である。神経病理学的な表現形としては、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、以前は神経原線維変化優位型認知症として知られていた原発性加齢関連タウオパチー、グリア細胞球状封入体タウオパチー（globular glial tauopathy）が挙げられる（Kovacs, G.G, 2015, Neuropathol. App. Neurobiol., 41, 3-23）。アルツハイマー病は、タウタンパク質がもつれ（tangles）の主成分である、脳内のアミロイド斑および神経原線維変化によって特徴づけられる（Congdon, E.E., and Sigurdsson, E.M., Nat. Rev. Neurol., published on-line June 12, 2018, Nature.com/nrneurol）。
【０００４】
伝統的に、α−シヌクレイン含有レビー小体は、パーキンソン病、およびアルツハイマー病および種々の前頭側頭骨性認知症症候群を伴うタウ含有神経原線維変化に関連している。しかしながら、神経変性疾患のスペクトラムには、α−シヌクレインおよびタウには顕著な重複および共発現性がある。例えば、α−シヌクレイン凝集体（レビー小体）は、家族性および孤発性のアルツハイマー病に高い割合（６０％）で見いだされ、一方で、タウ凝集体（神経原線維変化、ＮＦＴ）は、パーキンソン病で観察された。加えて、レビー小体および神経原線維変化は、該タンパク質がインビボで互いの凝集体産生において見いだされたため、共局在性が観察された（Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304）。
【０００５】
α−シヌクレインは、タウに直接結合し、タウの線維化を誘発することが知られている（Benussi, L. et. el. 2005, Exp. Cell Res. 308:78-84; Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304）。結果として、α−シヌクレインおよびタウは、病理学的なミスフォールディングおよび凝集を起こしやすいタンパク質である。ミスフォールディングは、ホモオリゴマー化および凝集カスケードを開始し、複数の神経変性疾患における不溶性タンパク質封入体中の凝集したα-シヌクレインおよびタウの脳内蓄積に至る（Yan, X et. al., 2018 Seminars Cell Devel. Biol. available at URL: doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.05.005）。
【０００６】
α−シヌクレインタンパク質は、３つの主要なアイソフォームとして存在し、最長のものは１４０アミノ酸長である。小胞内に少量含まれているが、細胞質タンパク質であり、エキソサイトーシスを受け得る。このタンパク質は、血液および脳脊髄液で検出されている（Borghi et al., 2000; El-Agnaf et al., 2006; Kasuga et al., 2010）。細胞外α−シヌクレインは、脳全体に疾患を広めることに関与している可能性があり、神経細胞死および炎症を引き起こす可能性がある（Desplats et al., 2009）。
【０００７】
α−シヌクレインがプリオン様の特性を有する疾患形成実体（disease-forming entity）になるプロセスは十分に理解されていない。α−シヌクレインは、プリオン様活性を有しない単量体の可溶性タンパク質からプリオン様活性を有する不溶性凝集体までの、未知の中間体メンバーおよび／または中間体の集団を介して複雑な経路(path)を通り得る（例えば、図１参照：先行技術文献；Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305）。プリオン様活性を有する不溶性凝集体は、可溶性α-シヌクレインを動員し、膜および細胞質ゾルに見られるらせん構造からβシート構造への構造変化を含むプロセスにより凝集体に変化し得る（Bartels et al, 2011; Wang et al, 2011）。しかしながら、同じタンパク質の単量体を動員し、それらの線維化を促進することができるα−シヌクレイン凝集体を形成するプロセスは、未知のオリゴマー集団セットの形成から始まる。
【０００８】
ヒトα−シヌクレイン中の１２アミノ酸のペプチド配列（残基７１から８２；β−シヌクレインには存在しない）は、タンパク質の線維化に必要かつ十分であると思われる。このペプチドは、タンパク質分解に耐性があり、α−シヌクレインフィラメントのコアになる可能性がある。７１−８２アミノ酸配列に対応する合成ペプチドは、フィラメントの自己重合および共集合の両方を可能にし、インビトロでの完全長α−シヌクレイン集合を促進する（Giasson et al., 2001）。このペプチドは、分子間βシートを可逆的に形成し、モノマー（単量体）およびオリゴマー形態の間の平衡を実証する（Bedard et al., 2014）。陰イオン性小胞と接触すると、ペプチドは、主にβシート形成を特徴とする不可逆的な自己凝集を伴う立体構造変化を起こす。これは、天然のα−シヌクレインタンパク質の構造的および一般的特性を反映している。
【０００９】
陰イオン性の膜小胞は、α−シヌクレイン７１から８２ペプチドのみを有する凝集体の迅速な形成を示す。さらに、天然のα−シヌクレインは、膜（Jo et al, 2000, Lee et al., 2002）および多価不飽和脂肪酸（Perrin et al., 2001）と相互作用すると、ミスフォールディングまたはコンフォメーション変化を起こし、オリゴマー化が引き起こされる可能性がある。らせん状α−シヌクレインは、陰イオン性リン脂質膜上のフィブリルを含むβシートに直接変換され得る（Comellas et al., 2012）。同じタンパク質のモノマーを動員できるα−シヌクレイン凝集体を作製するプロトコル（Volpicelli-Daley et al., 2014）は、ローターの速度、バイアルのサイズおよび形状（α−シヌクレインを含む）のわずかな変動が、バイアル内に形成された気泡の大きさに影響を及ぼし、それ故に、線維化プロセスのために利用可能な表面積は、界面活性化工程を直接的に干渉するという欠点がある。ＵＳ２００４／０１４３０９３は、界面活性化に関連する問題に対処するために、特殊な装置および濃度依存的疎水性界面活性剤の使用を教示している。さらに、α−シヌクレインのカルボキシ末端変異体は、天然の野生型α−シヌクレインが存在しない条件下で線維化を示す（Murray et al., 2003）。
【００１０】
α−シヌクレインフィブリル（原線維）が本質的に毒性である程度は明らかではない。成熟したα−シヌクレインフィブリルは、フィブリルの会合（assembly）および解離（disassembly）によって生成されたオリゴマー集団と動的平衡の形態で存在する。生理的状態に近い条件下では、オリゴマーの（大規模および小規模の）不均一な混合物が形成されることがある（Cremades et al., 2012）。フィブリルが解離すると、生成物はモノマーの存在下で新しいフィブリルの成長を生じ(seed)させ得る。フィブリルの解離は、細胞培養（Desplats et al., 2009）およびシヌクレイノパシーモデル（Hansen et al, 2011）におけるα-シヌクレイン凝集体の伝達中にインビボで生じ得る。
【００１１】
プリオン様活性は、オリゴマー集団によって直接的に、またはフィブリル解離によって作製されたオリゴマー集団から生じ得て、例えば、原線維の崩壊は、α−シヌクレインの線維化を促進し（Shvadchak et al., 2015）、そして異なる構造を有するオリゴマー集団は、原線維形成を阻害したか、または原線維形成を活性化した（Horvath et al.,2013）。これらの結果は、オリゴマー集団が、“経路上(on the pathway)で”または“経路外(off the pathway)で”フィブリルアセンブリに向かい得ることを示す。１つまたは複数のオリゴマーが形成される経路（on-pathway）（Lashuel et al., (2002), Kostka et al., (2008), Zhang et al. (2013)）および経路外(off-pathway）（Lorenzen et al., (2014), Cherny et al. (2005)）の両方が同定されている。
【００１２】
レビー小体ベースの研究のためのα−シヌクレイン凝集体（予め形成されたフィブリルまたはＰＰＦとも称される）を製造する方法（Volpicelli-Daley et al., 2014に記載の方法を用いて）は、既存のα−シヌクレインのオリゴマー（Ariesandi et al., 2013）を減少させることができ、結果として、（毒性ではない他のオリゴマー集団または凝集体と比較して）α−シヌクレイン凝集体の調製において毒性レベルのオリゴマー集団または凝集体の不確実さをもたらす。
【００１３】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、組換えα−シヌクレインおよびその部分ペプチドに対して作製されている（Giasson, B. I. et al, 2000; Luk et al., 2009）。Masliah et al., 2005, 2011は、抗α−シヌクレイン抗体を用いたα−シヌクレインに対する能動および受動免疫が、シヌクレイノパチーのトランスジェニックモデルにおいてα−シヌクレインの蓄積およびシナプス損失を減少させたことを教示している。Bae et al (2012)は、細胞外α−シヌクレインの伝達が抗体で免疫することによって減少または停止し、この減少した伝達が主にミクログリア細胞によって行われ、タンパク質のクリアランスのメカニズムを提供することを示した。これらの研究では、（組換え単量体ヒトα−シヌクレインに対して産生された）抗体は、線形配列に特異的であり、変性したモノマーを同定した。該抗体は、α−シヌクレインオリゴマーの構造的な３次元立体構造に結合しなかった。例えば、モノクローナル抗体２７４（Bae et al, 2012）または９Ｅ４（および他のモノクローナル抗体；Masliah et al. 2011）は、凝集形態ならびに単量体において、α−シヌクレインの線形配列を同定し、故に、α−シヌクレインの凝集形態間またはモノマー形態間で区別されないことが観察された。
【００１４】
Lee et al. (2011)は、変性したα−シヌクレインに対して親和性が減少した（ウェスタンブロット法にて）２つのモノクローナル抗体クローン１６９および１７１を同定し、かつ完全長の変性した組換えα−シヌクレインを同定した。
【００１５】
米国特許第８,８０９５０６号は、化学的に変異させたα−シヌクレインプロトフィブリルおよびオリゴマー（４−オキソ−２−ノネナールおよび４−ヒドロキシ−２−ノネナールで化学修飾された）の混合物に対するモノクローナル抗体を作製した。モノクローナル抗体は、それらが、毒性であったα−シヌクレインの亜集団に結合したかどうか、またはそれらが、毒性である多量体α−シヌクレイン集団により生成された線形または３次元のエピトープに結合するかどうかを決定するための試験はされていない。
【００１６】
米国特許第８,９４０,２７６号は、α−シヌクレインに対する抗体の作製を教示している。抗体は、毒性または非毒性のα−シヌクレイン集団を区別することはできなかった。α−シヌクレインは、ウェスタンブロットにおけるモノマーとして同定され、このことは、該抗体が、毒性のオリゴマー（ＳＤＳには存在せず、還元され、煮沸されたサンプルをウェスタンブロットに用いた）により生成された３次元エピトープに結合しないことを示唆する。
【００１７】
米国特許第９,０８４,８３２号は、ＥＬＩＳＡ技術を用いてα−シヌクレインに対する抗体を特徴付け、これは、線維性集団前駆体の集団に対してより高い親和性を有するが、α−シヌクレイン集団がプリオン様であるかまたは毒性であるかどうかの示唆はないことを示す。さらに、該抗体は、（毒性）オリゴマーに特異的な３次元構造ではなく、特定の短い線形エピトープに結合する。
【００１８】
Ariesandi et al. (2013)は、ＰＰＦを作製するための熱処理を含む工程が既存のオリゴマー濃度を低下させることを教示している。この結果、上記の先行技術文献に記載の抗体が、“経路上”にあるα−シヌクレインオリゴマーの毒性集団を標的にするか、または“別の経路”にある非毒性オリゴマーを標的にするかに関してさらに疑問を投げかける。
【００１９】
α−シヌクレインタンパク質の生理学的機能は知られていない。タンパク質の毒性は、文献では十分に定義されていないα−シヌクレインオリゴマー（原繊維ではなく）の亜集団に関連すると考えられている。これらの亜集団のタイプおよび濃度は動的であり、インビボで会合および解離すると考えられている。毒性のプリオン様（毒性）型α−シヌクレインを結合できる抗体を作製する必要がある。
【発明の概要】
【００２０】
発明の概要
本発明は、α−シヌクレインに結合する抗体に関する。また、該抗体の使用方法も記載されている。
【００２１】
本発明により、受託番号ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−１２４１７４（ＡＴＣＣにより、２０１７年５月１１日に受理）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、活性型α−シヌクレインに結合するモノクローナル抗体または単離されたモノクローナル抗体２Ｆ１１が提供される。２０１７年５月１１日に受理された受託番号ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−１２４１７４のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の可変軽鎖、可変重鎖、または可変軽鎖および可変重鎖の両方をコードする単離されたポリヌクレオチドもまた本明細書に記載されている。薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤中にモノクローナル抗体２Ｆ１１を含む組成物またはワクチンもまた提供され、これも本明細書に記載されている。
【００２２】
ある量の上記の組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、それを必要とする対象において活性型α−シヌクレインまたはタウ線維を減少させる方法もまた提供される。該組成物またはワクチンは、対象に経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下に投与されてもよい。要すれば、投与工程の前に、対象における活性型α−シヌクレインまたはタウ線維のレベルが決定され、かつ投与工程の後の一定期間後に、１つまたは２以上の活性型α−シヌクレインまたはタウ線維の第２のレベルが決定され得る。
【００２３】
本明細書中、α−シヌクレイン、タウ線維、またはそれらの組合せに結合し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を定義する以下のアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体２Ｆ１１もまた記載されている：
重鎖：
ＤＹＹＭＦ  （配列番号１４）；
ＷＮＤＰＥＮＧＤＴＥＹＡＰＫＦＱＧ  （配列番号１５）；
ＮＡＷＤＧＮＹＶ  （配列番号１６）；
軽鎖：
ＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ  （配列番号１７）
ＳＴＳＮＬＡＳ  （配列番号１８）
ＨＱＹＨＲＳＰＰＭＹＴ  （配列番号１９）。
【００２４】
配列番号１４−１９で定義されるモノクローナル抗体２Ｆ１１のＣＤＲをコードする核酸配列もまた提供される。例えば、モノクローナル抗体２Ｆ１１のＣＤＲをコード化する核酸配列は以下のヌクレオチド配列を含み得る：
重鎖：
ＧＡＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＴＴＴ  （配列番号２０）
ＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣ  （配列番号２１）
ＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴ  （配列番号２２）
軽鎖：
ＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＣＴＴＧＣＡＣ  （配列番号２３）
ＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴ  （配列番号２４）
ＣＡＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣＧ  （配列番号２５）。
【００２５】
本明細書中、ヒトα−シヌクレインまたはタウ線維に結合し、配列番号１４−１６のそれぞれに記載のアミノ酸配列を含む３つの重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨおよび配列番号１７−１９のそれぞれに記載のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲを含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または単離されたモノクローナル抗体もまた記載されている。モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号２０−２５で定義される１以上のヌクレオチド配列を含む核酸配列によりコード化され得る。さらに、モノクローナル抗体は、活性型α−シヌクレイン凝集体、タウ凝集体またはそれらの組合せに結合することを特徴とする。薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤中に、本明細書に記載のモノクローナル抗体を含む組成物またはワクチンもまた、本明細書に記載されている。
【００２６】
本明細書中、配列番号１４−１６に定義されるアミノ酸配列を含む３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むモノクローナル抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲをコードする単離されたポリヌクレオチド配列もまた記載されている。ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターもまた記載されている。
【００２７】
血液脳関門の通過のための多重特異性抗体もまた本明細書に記載されている。多重特異性抗体は、受託番号ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−１２４１７４（ＡＴＣＣにより、２０１７年５月１１日に寄託）を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｆ１１に結合された１つまたは２以上の担体分子を含む。多重特異性抗体は、三重特異性抗体または二重特異性抗体であってよく、例えば一価−二重特異性抗体または二価−二重特異性抗体であり得る。さらに、多重特異性抗体または二重特異性抗体の１つまたは２以上の担体分子は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合抗体、またはインシュリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）結合抗体に由来し得る。薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤中に、本明細書に記載の多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体を含む組成物またはワクチンもまた本明細書中に記載されている。
【００２８】
それを必要とする対象において、活性型α−シヌクレインまたはタウ線維を減少させる方法であって、該対象にある量の上記の組成物またはワクチンを投与することを含む方法もまた提供される。組成物またはワクチンは、対象に経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下に投与され得る。要すれば、投与工程の前に、該対象における活性型α−シヌクレインまたはタウ線維のレベルが決定され、かつ投与工程の後、一定期間後に、１つまたは２以上の活性型α−シヌクレインまたはタウ線維の第２のレベルが決定され得る。
【００２９】
サンプルにおける活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を決定する方法もまた、本明細書中に記載される。該方法は、
ｉ）サンプルの一部を活性型α−シヌクレインモノマーと結合しない対照抗体と予め混合し、次いで組換え活性型α−シヌクレインモノマーを添加して、対照処置群（control treatment）を作製し、
ｉｉ）サンプルの第２の部分をモノクローナル抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４、２０１７年５月１１日寄託）と予め混合し、次いで組換え活性型α−シヌクレインモノマーを添加して、薬物処置群（active treatment）を作製し、
ｉｉｉ）チオフラビンアッセイを用いて対照処置群および薬物処置群の両方においてβシート構造形成の量を決定する、ここで、対照処置群と比較した薬物処置群におけるチオフラビン蛍光の減少は、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示す、
ことを含む。
【００３０】
サンプルにおけるタウ凝集体の存在を決定する方法が提供される。該方法は、
ｉ）サンプルの一部を対照抗体と予め混合し、次いでタウモノマーを添加して、対照処置群を作製すること、
ｉｉ）サンプルの第２の部分をモノクローナル抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４）と予め混合し、次いでタウモノマーを添加して、薬物処置群を作製すること、および
ｉｉｉ）対照処置群および薬物処置群の両方におけるβシート構造形成の量を決定することを含む。ここで、対照処置群と比較して、薬物処置群におけるβシート構造形成の量の減少は、該サンプルにおけるタウ凝集体の存在を示す。
【００３１】
サンプルにおける活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を決定する別の方法もまた記載されている。該方法は、サンプルをモノクローナル抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４、２０１７年５月１１日寄託）に暴露すること、およびモノクローナル抗体２Ｆ１１がサンプル中のタンパク質に結合するかどうかを決定することを含み、ここで、結合は、活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示している。サンプルは、暴露工程の前に非変性電気泳動を用いて分離されてよく、分離されたタンパク質は、ウェスタン分析によりモノクローナル抗体２Ｆ１１を用いてプローブ化され、ここで、１以上の高分子量タンパク質の結合は、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示す。あるいは、非変性サンプルのドットブロットを、モノクローナル抗体２Ｆ１１を用いてプローブ化することができ、モノクローナル抗体２Ｆ１１のサンプルへの結合は、活活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示している。
【００３２】
サンプル中のタウ凝集体の存在を決定する方法もまた記載されている。該方法は、サンプルをモノクローナル抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４、２０１７年５月１１日寄託）に暴露すること、およびモノクローナル抗体２Ｆ１１がサンプル中のタンパク質に結合するかどうかを決定することを含み、ここで、結合は、タウ凝集体の存在を示す。サンプルは、暴露工程の前に非変性電気泳動を用いて分離されてよく、分離されたタンパク質は、ウェスタン分析によりモノクローナル抗体２Ｆ１１を用いてプローブ化され、ここで、１以上の高分子量タンパク質の結合は、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示している。あるいは、非変性サンプルのドットブロットを、モノクローナル抗体２Ｆ１１を用いてプローブ化することができ、モノクローナル抗体２Ｆ１１のサンプルへの結合は、タウ凝集体の存在を示しいる。
【００３３】
サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在、濃度または存在および濃度の両方を決定するためのさらなる方法が提供される。該方法は、モノクローナル抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４）を用いて調製された表面にサンプルを適用し、該モノクローナル抗体に結合する活性型α−シヌクレイン凝集体の発生、量または発生および量の両方を決定し、それにより、サンプル中の活性型α−シヌクレイン凝集体の存在、濃度または存在および濃度の両方を決定することを含む。
【００３４】
サンプル中のタウ凝集体の存在、濃度または存在および濃度の両方を決定するための方法もまた提供される。該方法は、モノクローナル抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４）を用いて調製された表面にサンプルを適用し、該モノクローナル抗体に結合するタウ凝集体の発生、量または発生および量の両方を決定し、それにより、サンプル中のタウ凝集体の存在、濃度または存在および濃度の両方を決定することを含む。
【００３５】
シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病、タウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、グリア細胞球状封入体タウオパチーを有すると診断された対象における免疫応答を誘導する方法もまた記載されている。該方法は、上記のモノクローナル抗体２Ｆ１１、該モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物、または２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体もしくは二重特異性抗体を該対象に投与することを含む。
【００３６】
上記のモノクローナル抗体２Ｆ１１、該モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物、または２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体もしくは二重特異性抗体を対象に投与することを含む、シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病、タウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、グリア細胞球状封入体タウオパチーを処置する方法もまた本明細書中に記載されている。
【００３７】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を記載しているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照して以下の説明からより明確になり得る。
【００３９】
【図１】図１は、“経路上”の毒性α−シヌクレインモノマーからアミロイド原線維形成に至る経路を示す。先行技術文献（Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305；ＵＲＬ：mdpi.com/2218-273X/5/2/282でも利用可能）。
【図２】図２Ａは、種々の不活性型モノマー、不活性型凝集体、活性型モノマー、活性型凝集体、およびそれらの組合せのインキュベーション後の、α−シヌクレインβシート構造形成に関係するチオフラビンアッセイの結果を示す。左側のバー：（３７℃にて）１時間のインキュベーション時間後の蛍光定量；右側のバー：（３７℃にて；詳細は実施例参照のこと）２４時間のインキュベーション時間後の蛍光定量。図２Ｂは、不活性型凝集体（エンドトキシンの不存在下でα−シヌクレインモノマーで作製）、または活性型凝集体（エンドトキシンの存在下で作製）と共にインキュベートした初代皮質細胞の共焦点画像を示す。蛍光を、レビー小体病理の検出のためにセリン１２９リン酸化特異的抗体を用いて測定した。ヘキスト：ＤＡＰＩ染色；ｐｓｅｒ１２９：ＦＩＴＣ標識セリン１２９リン酸化特異的抗体。図２Ｃは、活性型ヒトα−シヌクレイン原線維（上パネル）および不活性型ヒトα−シヌクレイン原線維（下パネル）の電子顕微鏡画像を示す。バー：１００ｎｍ。
【図３】図３Ａは、クローン２Ｆ１１でプローブ化されたマウス脳溶解物のウェスタンブロット分析を示す。左レーン：マーカー（ｋＤａ）；右レーン：クローン２Ｆ１１。マウス脳溶解物中において高分子量バンドが、クローン２Ｆ１１を用いて同定された。図３Ｂは、クローン４Ｆ１でプローブ化されたマウス脳溶解物のウェスタンブロット分析を示す。左レーン：マーカー（ｋＤ）；右レーン：クローン４Ｆ１。マウス脳溶解物において低分子量バンドが、クローン４Ｆ１を用いて同定された。図３Ｃは、クローン３Ｆ８でプローブ化したマウス脳溶解物のウェスタンブロットを示す。左レーン：マーカー（ｋＤａ）；右レーン：クローン３Ｆ８。マウス脳溶解物における低分子量バンドが、クローン３Ｆ８を用いて同定された。図３Ｄは、クローン２Ｆ１１でプローブ化された、ＨｅＬａ溶解物（α−シヌクレインを産生することが知られている、ＵＲＬ：proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cellを参照）のウェスタンブロット分析を示す。左レーン：マーカー（ｋＤａ）；右レーン：クローン２Ｆ１１。マウス脳溶解物における高分子量バンドが、クローン２Ｆ１１を用いて同定された。
【００４０】
【図４】図４は、図３Ａ−３Ｃで用いたマウス脳溶解物のタンパク質染色を示す。左レーン：マーカー（ｋＤａ）、右レーン：マウス脳溶解物のポンソー（Ponceau）染色。
【図５】図５Ａは、クローン２Ｆ１１を用いてプローブ化された、免疫沈降されたマウス脳溶解物のウェスタンブロット分析を示す。約６０−７０ｋＤａのα−シヌクレインのオリゴマーバンドが示されている。左レーン：マーカー（ｋＤａ）；中間レーン：ブランク；右レーン：マウス脳溶解物。図５Ｂは、クローン２Ｆ１１を用いてプローブ化された、免疫沈殿されたマウス脳溶解物からの非結合画分（flow through）のウェスタンブロット分析を示す。約６０−７０ｋＤａのα−シヌクレインのオリゴマーバンド、α−シヌクレイン三量体のバンドおよびα−シヌクレイン単量体のバンドが示される。左レーン：マーカー（ｋＤａ）；右レーン：マウス脳溶解物。
【図６】図６は、マウスα−シヌクレイン（上の配列；０５５０４３；配列番号１）およびヒトα−シヌクレイン（下の配列；Ｐ３７８４０；配列番号２）の核酸配列アラインメントを示す。
【図７】図７は、クローン２Ｆ１１でプローブ化された、パーキンソン病ヒト脳、ヒト脳およびマウス脳から得られた変性サンプルのウェスタンブロット分析を示す。左から右へ：マーカーｋＤａ；パーキンソン病のヒト脳；ヒト対照；マウス脳。高分子量を含む種々の分子量範囲の複数のバンドが、パーキンソン病を有するおよび有しないヒト脳ならびにマウスサンプルに存在している。
【００４１】
【図８】図８Ａは、クローン２Ｆ１１を用いてプローブ化した、パーキンソン病ヒト脳、ヒト脳およびマウス脳から得られたサンプルのネイティブウェスタン分析を示す。左から右へ：マーカー：ｋＤａ；ヒト脳（対照）；パーキンソン病ヒト脳；マウス脳；ブランク；マーカーｋＤａ；マウス脳（サンプル２）；ブランク；α−シヌクレイン凝集体（活性型）；α−シヌクレイン単量体（活性型）。図８Ｂは、クローン４Ｆ１を用いてプローブ化した、パーキンソン病ヒト脳、ヒト脳およびマウス脳から得られたサンプルのネイティブウェスタン分析を示す。左から右へ：マーカーｋＤａ；ヒト脳（対照）；パーキンソン病ヒト脳；マウス脳；ブランク；マーカーｋＤａ；マウス脳（サンプル２）；ブランク；α−シヌクレイン凝集体（活性型）；α−シヌクレイン単量体（活性型）。マウス脳およびマウス脳２の溶解物は、異なる供給源からのものであって、同じ方法で調製された。図８Ｃは、２Ｆ１１（左側パネル）およびＳＰＣ−５０６（Ａ１１；右側パネル）に結合する、活性型および不活性型α−シヌクレイン凝集体（原線維）のドットブロット分析を示す。上ブロット：２μｇ 活性型α−シヌクレイン凝集体；２番目のブロット：０．５μｇ 活性型α−シヌクレイン凝集体；３番目のブロット：２μｇ 不活性型α−シヌクレイン凝集体；下ブロット：０．５μｇ 不活性型α−シヌクレイン凝集体。図８Ｄは、ヒト活性型α−シヌクレイン凝集体に結合した、２Ｆ１１金ナノ粒子複合体（nano-gold conjugated）（黒いドット）の電子顕微鏡分析を示す。バー：１００ｎｍ。
【００４２】
【図９】図９Ａは、チオフラビン活性アッセイの継時変化を示す。サンプル（上から下の順）：α-シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）；α−シヌクレイン活性型凝集体（１０ｎＭ）；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）；チオフラビン対照（２５μＭ）。図９Ｂは、抗体（２Ｆ１１；３Ｆ８；４Ｆ１；ＳＭＣ−１０４）の存在下におけるチオフラビン活性の継時変化アッセイを示す。反応が開始されたとき（０時）に抗体が反応に追加された。サンプル（上から下の順）：α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋ＳＭＣ−１０４；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋４Ｆ１；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋３Ｆ８；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋２Ｆ１１；活性型凝集体１０ｎＭ；活性型モノマー（１００μＭ）；チオフラビン対照（２５μＭ）。図９Ｃは、抗体（２Ｆ１１；３Ｆ８；４Ｆ１；ＳＭＣ−１０４）の存在下におけるチオフラビン活性の継時変化アッセイを示す。抗体は、反応の開始前にサンプルとともに予めインキュベートされた。サンプル（上から下の順）：α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋３Ｆ８；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋ＳＭＣ−１０４；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋４Ｆ１；活性型凝集体（１０ｎＭ）；α−シヌクレイン活性型モノマー（１００μＭ）＋活性型凝集体（１０ｎＭ）＋２Ｆ１１；活性型モノマー（１００μＭ）；チオフラビン対照（２５μＭ）。図９Ｄは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットからの初代脳細胞の共焦点画像を示す。左上パネル：対照、ＤＡＰＩおよびｐＳｅｒ１２９α−シヌクレイン抗体でプローブ化（ＤＡＰＩ染色核のみが識別される）；右上パネル：活性型α−シヌクレイン原線維を追加し、ＤＡＰＩおよびｐＳｅｒ１２９α−シヌクレイン抗体でプローブ化（α−シヌクレイン抗体への結合を示し、α−シヌクレインの病理を示唆する、ＤＡＰＩおよびｐＳｅｒ１２９染色を示す）；下パネル：活性型α−シヌクレイン原線維＋２Ｆ１１を追加し、ＤＡＰＩおよびｐＳｅｒ１２９α−シヌクレイン抗体でプローブ化（ＤＡＰＩ染色とバックグラウンドレベルのｐＳｅｒ１２９染色を示す）。２０ｘ倍率；バー：２５０μｍ。図９Ｅは、２Ｆ１１抗体の存在下および不存在下での、活性型α−シヌクレインオリゴマー、不活性型α−シヌクレインオリゴマー、活性型α−シヌクレインモノマーの存在における、ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞の細胞死を示す。細胞死（％）：死んだ細胞の数／総正常核数ｘ１００。
【００４３】
【図１０】図１０は、種々の抗体の、α−シヌクレインの重複ペプチドとの結合を示す。ペプチド：１−３０ａａ（配列番号３）；２１−５０ａａ（配列番号４）；４１−７０ａａ（配列番号５）；６１−９０ａａ（配列番号６）；８１−１００ａａ（配列番号７）；１０１−１３０ａａ（配列番号８）；１２１−１４０（配列番号９）。ＥＬＩＳＡ分析、ドットブロット（ＤＢ）分析および／またはウェスタンブロット（ＷＢ）分析を用いて結合を決定した。
【図１１】図１１Ａは、２Ｆ１１の可変領域（重鎖−ＩｇＧ１アイソタイプ）のコンセンサス配列の核酸配列（配列番号１０）およびアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。図１１Ｂは、２Ｆ１１の軽鎖可変領域（Ｋａｐｐａ）のコンセンサス配列の核酸配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）には下線が引かれている；リーダー配列は、イタリック体で示されている。
【００４４】
【図１２】図１２は、多重特異性抗体の例の概略図を示す。この限定されない例において、種々の担体分子を含む二重特異性抗体が、２Ｆ１１の概略図と共に示されている（左側パネル）。二重特異性抗体は、マウスＦｃ（分子の中央部分）およびα−シヌクレイン抗体（分子の上部分）を含むカーゴ分子に共有結合した、インスリン増殖因子１受容体の単一ドメイン（ｓｄ−ＩＦＧ１Ｒ−ＢＢ；分子の下部分）を、二価（中パネル）または一価(右パネル）の変異体として含む。
【図１３】図１３は、タウを用いたチオフラビン活性アッセイの継時変化を示す。抗体をタウ線維と予めインキュベートし、タウ単量体を添加して反応を開始させた。蛍光を、インキュベーションの１、２４または４８時間後に測定した。サンプル（左から右の順）：タウ単量体＋タウ線維＋２Ｆ１１；タウ単量体＋タウ線維＋ＳＭＣ−１０４；タウ単量体＋タウ線維；タウ単量体；および、タウ線維。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
以下の説明は好ましい態様のものである。
【００４６】
本明細書で用いる用語“含む（comprising）”、“有する（having）”、“含む（including）”および“含む（containing）”ならびにそれらの文法上の変形は、包括的であるか、または制限なく、かつ追加の、記載されていない要素および／または方法ステップを除外しない。用語“本質的に〜からなる”は、使用または方法に関連して本明細書で用いられるとき、追加の要素および／または方法ステップが存在し得ることが示されるが、これらの追加は、記載される方法または使用が機能する方法で重大な影響を及ぼさないことを意味する。使用または方法に関連して本明細書で用いられるとき、用語“〜からなる”は、追加の要素および／または方法ステップの存在を除外する。特定の要素および／またはステップを含むものとして本明細書に記載の使用または方法は、これらの態様が具体的に言及されているか否かにかかわらず、特定の態様において、本質的にこれらの要素および／またはステップからなり、他の態様において、それらの要素および／またはステップからなる。加えて、単数形の使用は複数形を含み、“または”は、他にこれと異なる記載がない限り、“および／または”を意味する。本明細書で用いる用語“複数の”は、２以上、例えば、２またはそれ以上、３またはそれ以上、４またはそれ以上などを意味する。本明細書中で他にこれと異なる記載がない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で用いる用語“約”は、所与の値から約±１０％の変動を意味する。そのような変動は、それが具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される所与の値に常に含まれることが理解されるべきである。本明細書において用語“含む（comprising）”と合わせていらされるとき、用語“ａ”または“ａｎ”は、“１つ”を意味し得るが、“１つ以上”、“少なくとも１つ”および“１つまたは２以上”もまた意味する。
【００４７】
本明細書で用いる“タンパク質レベル”または“活性型タンパク質のレベル”とは、サンプル、対象から得られたサンプルまたは対象中のタンパク質の量または相対量を意味する。タンパク質レベルを参照（reference）または対照(control)タンパク質レベルと比較して、サンプルの状態を決定することができる。対象のタンパク質レベルは、例えば、ｎｇ／ｍｌまたはμｇ／ｍｌなどの絶対量で表されるか、または対照レベルと比較して、例えばシグナルの相対強度などの相対量；対照タンパク質レベルと比較した場合、パーセントまたは“倍”もしくは“倍変化”の増加、として表され得る。
【００４８】
同様に、対象における転写産物の“発現レベル”とは、対象の診断されていない生体サンプル中の転写産物の量を意味する。発現レベルを対照発現レベルと比較して、サンプルの状態を判断することができる。対象の発現レベルは、絶対量（例えば、ｎｇ／ｍｌまたはμｇ／ｍｌ）あるいは相対量（例えば、シグナルの相対強度；パーセントまたは“倍”もしくは“倍変化”の増加）のいずれかであり得る。
【００４９】
図１に示すように、α−シヌクレインは、プリオン様活性を有しない単量体の可溶性タンパク質からプリオン様活性を有する不溶性凝集体へ、未知の数の中間体および／または中間体集団を介して複雑な経路をとり得る（例えば、図１参照：先行技術文献；Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305、引用により本明細書中に包含させる）。プリオン様活性を有する不溶性凝集体は、可溶性α−シヌクレインを動員し、α−シヌクレイン凝集プロセスを開始（seed）することができる。
【００５０】
α−シヌクレイン線維形成またはシヌクレイノパチーに関連する疾患または疾病の例としては、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、孤発性アルツハイマー病および家族性のアルツハイマー病などの、レビー小体により特徴付けられる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。タウ線維形成またはタウオパチーに関連する疾患または疾病の例としては、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、前頭側頭骨性認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症およびグリア細胞球状封入体タウオパチーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
“α−シヌクレイン単量体の種類”または“α−シヌクレイン単量体種”には、α−シヌクレイン単量体の群（非活性型または不活性型α−シヌクレイン単量体とも称される）、および活性型α−シヌクレイン単量体（毒性α−シヌクレイン単量体とも称される）が含まれる。
【００５２】
“α−シヌクレインオリゴマーの種類”または“α−シヌクレインオリゴマー種”には、非活性型α−シヌクレインオリゴマー（“経路外”オリゴマーとも称される）、活性型α−シヌクレインオリゴマー、または毒性α−シヌクレインオリゴマー（“経路上”α−シヌクレインオリゴマーとも称される）が含まれる。
【００５３】
“非活性型α−シヌクレインモノマー”または“不活性型α−シヌクレインモノマー”とは、α−シヌクレインの非毒性モノマーを意味する。α−シヌクレインモノマーの混合物は、結合して、活性なα−シヌクレインオリゴマーを形成しない。しかしながら、α−シヌクレインモノマー（不活性型）および活性型α−シヌクレインモノマーの混合物は、結合して、活性型α−シヌクレインオリゴマーを形成し得る。
【００５４】
“活性型α−シヌクレイン種”とは、１つまたは２以上の活性型α−シヌクレインモノマー、毒性α−シヌクレインモノマー、活性型α−シヌクレイン凝集体、毒性α−シヌクレイン凝集体、活性型α−シヌクレインオリゴマー、毒性α−シヌクレインオリゴマー、経路上のオリゴマー、α−シヌクレインを含むβシート構造、α−シヌクレイン原線維を意味する。
【００５５】
本明細書で用いる“活性型α−シヌクレインモノマー”または“毒性α−シヌクレインモノマー”は、他の活性型α−シヌクレインモノマーまたは活性型α−シヌクレイン凝集体と組み合わせたとき、活性型または毒性のα−シヌクレインオリゴマーの形成、α−シヌクレインを含むβシート構造の形成、活性型または毒性のα−シヌクレイン凝集体、またはα−シヌクレイン原線維の形成をもたらす、数種のα−シヌクレインモノマーを意味する。活性型α−シヌクレインモノマーは、他の活性型α−シヌクレインオリゴマー、活性型α−シヌクレイン凝集体またはそれらの組合せと結合することができ、アミロイド線維形成の経路に沿って進行する。
【００５６】
本明細書で用いる“活性型α−シヌクレインオリゴマー”、“毒性α−シヌクレインオリゴマー”または“経路上のα−シヌクレインオリゴマー”とは、活性型α−シヌクレインモノマーまたは活性型凝集体を動員してプロトフィブリルオリゴマーを産生する能力を有するα−シヌクレインモノマーの集団を意味し、それはα−シヌクレインフィブリル（アミロイド原線維；図１参照）を伸長し、産生することができる。
【００５７】
“活性型凝集体”または“活性型α−シヌクレイン凝集体”は、“予め形成された（pre-formed）フィブリル”（ＰＦＦ）と互換的に用いられ得る。ＰＦＦまたは活性型凝集体は、活性型α−シヌクレインオリゴマー、２つもしくはそれ以上の活性型α−シヌクレインオリゴマーを含むプレフィブリル、２つもしくはそれ以上の活性型α−シヌクレインオリゴマーを含むフィブリル、またはそれらの組合せの集合体を意味する。ＰＦＦまたは活性型凝集体は、反応を開始する（seed）ために用いられ得る（例えば、図２Ｂ、９Ｂ−９Ｄ参照）。活性型α−シヌクレイン凝集体は、“不活性型凝集体”よりも、β−シート含有量が多く、α−ヘリックス含有量が少ない（表１；実施例２参照）。
【００５８】
“不活性型凝集体”は、不活性型α−シヌクレインオリゴマー、不活性型α−シヌクレインオリゴマーを含むプレフィブリル、不活性型α−シヌクレインオリゴマーを含むフィブリル、またはそれらの組合せの集合体を意味するために用いられる。不活性型凝集体は、β−シートを形成せず（図２参照）、それらは、反応を開始（seed）させない（例えば、図２Ｂ、９Ｂ−９Ｄ参照）。
【００５９】
マウスおよびヒトのα−シヌクレインのアミノ酸間の同一性パーセント（または類似性パーセント）は、９５％である（図６参照）。
【００６０】
用語“類似性パーセント”、“配列類似性”、“同一性パーセント”または“配列同一性”は、特定の配列に言及するとき、例えば、ウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプログラムに設定されるか、または手動アライメントおよび目視検査により用いられる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement参照）。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Watermanのアルゴリズム（1981, Adv. Appl. Math. 2:482）を用いて、Needleman & Wunschのアライメントアルゴリズム（1970, J. Mol. Biol. 48:443）により、Pearson & Lipmanの類似性探索方法（1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444）により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装方式(implementation)（例えば：Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、実行することができる。
【００６１】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それらはAltschul et al., (1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402)およびAltschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０を、本明細書に記載のパラメーターと共に用いて、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いてよい。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）および１０の期待値（Ｅ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照）アライメント（Ｂ）および１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いてよい。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国の国立生物工学情報センターから公開されている（URL: ncbi.nlm.nih.gov/参照）。
【００６２】
本明細書で用いる“参照（reference）レベル”、“参照（reference）タンパク質レベル”または“対照（control）タンパク質レベル”は、正常な個体、または対象においてα−シヌクレイン線維形成に関連して疾患状態または病理学的状態、例えばレビー小体により特徴付けられる疾患、例えばこれに限定されないが、パーキンソン病を有するとの何らかの兆候のない個体の集団において測定された、α−シヌクレインの量またはα−シヌクレインタンパク質の量の範囲を意味する。例えば、１つまたは２以上の活性型α−シヌクレイン種、例えば活性型α−シヌクレインモノマーまたは活性型α−シヌクレインオリゴマーの参照レベルは、１つまたは２以上の正常個体から得られたサンプルにおいて同定されたα−シヌクレイン（活性型α−シヌクレインモノマーまたは活性型α−シヌクレインオリゴマー）のレベルまたは量に基づいて決定され得る。参照レベルは、絶対量（例えば、ｎｇ／ｍｌまたはμｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度；対照レベルまたは量と比較したとき、増加のパーセントまたは“倍”または“倍変化”）のいずれかであり得る。
【００６３】
本明細書で用いる“閾値レベル”、“閾値量”または“閾値発現レベル”は、例えば、対照サンプルまたは対照対象で同定されたα−シヌクレインのレベルまたは量と比較したとき、１つまたは２以上の活性型α−シヌクレイン種、活性型α−シヌクレインモノマーまたは性型α−シヌクレインオリゴマーの参照量またはレベルを超える、約１．５倍変化から約２０倍変化の間の生体サンプル中のα−シヌクレインの量またはレベル、あるいはその間の任意の量またはレベルを意味する。α−シヌクレインの閾値レベルは、α−シヌクレイン線維形成と関連する疾患、レビー小体、例えばこれに限定されないが、パーキンソン病により特徴付けられる病理学的状態を示し得る。
【００６４】
本明細書で用いる“基準（ベースライン）レベル”とは、何らかの処置前または何らかの処置中に決定される対象から得られた第１の生体サンプルにおけるα−シヌクレインの量またはレベルを意味し、第１の生体サンプルが得られた後に対象から得られた第２の生体サンプルから評価されるα−シヌクレインの第２の発現レベルと比較して用いられる。この基準レベルは、例えば、対象におけるα−シヌクレイン線維形成に関連する疾患または病的状態、例えばレビー小体、例えばこれに限定されないが、パーキンソン病により特徴付けられる病的状態の進行をモニタリングすること、α−シヌクレイン線維形成と関連する疾状または病的状態を有する対象における処理レジメンまたは処置モダリティをモニタリングすること、処置レジメンまたは処置モダリティが対象において考慮されるべきかどうかを決定すること、処置レジメンまたは処置モダリティが対象において中止されるべきかどうかを決定すること、または処置レジメンまたは処置モダリティが対象において変更されるべきかどうかを決定することに用いられ得る。
【００６５】
本明細書で用いる“正常個体”とは、本明細書に記載の１以上の診断方法（チオフラビンアッセイ、ウェスタン分析、ＥＬＩＳＡまたはドットブロット分析）の組合せを用いてα−シヌクレイン線維形成について試験され、活性型α−シヌクレインモノマーまたは活性型α−シヌクレインオリゴマーを有しないと判断された個体を意味する。
【００６６】
本明細書中互換的に用いられる用語“治療”および“処置”は、レシピエントの状態を改善する意図で行われる介入を意味する。改善とは、主観的または客観的であり、処置されている疾患、障害または病的状態に関連する疾患の改善、その発症の予防、あるいはその疾患の変化に関係している。したがって、治療および処置という用語は最も広い意味で用いられ、さまざまな段階での疾患、障害または病的状態の予防（防止）、緩和、軽減および治癒を含む。レシピエントの状態の悪化の予防もこの用語に含まれる。治療／処置を必要とする者には、すでに疾患、障害または疾患を有する者、ならびに疾患、障害または疾病を起こしやすい、もしくは発症するリスクがある者、および疾患、障害または病的状態が予防されるべき者が含まれる。本明細書中、疾患、障害または病的状態は以下に関連する：
パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、孤発性アルツハイマー病および家族性のアルツハイマー病などのレビー小体により特徴付けられる疾患を含むが、これに限定されない、α-シヌクレイン線維形成またはシヌクレイノパチー、
神経原線維変化、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症およびグリア細胞球状封入体タウオパチーを含むが、これらに限定されない、タウ原線維形成（凝集）またはタウパシー
あるいは、それらの組合せ。
【００６７】
本明細書で用いる用語“対象”または“患者”は、哺乳動物を意味し、例えば対象はヒトであり得る。あるいは、対象は、非ヒト霊長動物、家畜または農耕動物であり得る。
【００６８】
本明細書で用いる“有効量”とは、所望の効果を生じる化合物の量を意味する。例えば、細胞集団または細胞抽出物を有効量の化合物と接触させて、インビトロでのその効果を試験するか、または所望の治療効果をエクスビボまたはインビトロで生じさせることができる。有効量の化合物を用いて、標的状態を予防または処置する、該状態と関連する症状を緩和する、あるいは所望の生理的効果をもたらす等の、対象において治療効果をもたらすことができる。そのような場合、有効量の化合物は、“治療的有効量”、“治療的有効濃度”または“治療的有効用量”である。有効量または治療的有効量は、所定の対象における処置の有効性に関して最も効果的な結果をもたらし得る組成物の量である。この量は、化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学およびバイオアベイラビリティを含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類およびステージ、一般的な身体状態、所定の投与量に対する応答、および薬物の種類）または細胞、製剤中の薬学的に許容される担体（複数可）の性質、および投与経路を含むが、これらに限定されない、種々の要因によって変わり得る。適当な担体の非限定的な例としては、緩衝剤、安定化剤、塩、抗酸化剤、錯化剤、氷晶防止剤、凍結乾燥保護剤、懸濁化剤、乳化剤、抗菌剤、防腐剤、キレート剤、結合剤、界面活性剤、湿潤剤、油などの非水性ビークル、または持続もしくは制御放出用ポリマーが挙げられる。例えば、Berge et al. 1977 (J. Pharm Sci. 66:1-19)参照のこと。さらに、有効量または治療的有効量は、化合物が単独で投与されるか、あるいは別の化合物、薬物、療法剤または他の治療方法もしくはモダリティと組合せて投与されるかどうかによって変わり得る。臨床薬理分野の当業者は、例えば、通常の実験を通して、すなわち化合物の投与に対する細胞または対象の応答をモニタリングし、それに応じて投与量を調整することにより、有効量または治療的有効量を決定することができる。追加のガイダンスについては、例えば、本明細書中に完全に記載されているかのように引用により本明細書中に包含される、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2005を参照のこと。
【００６９】
“生体サンプル”または“サンプル”とは、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿および血清を含む）、脳脊髄液、組織抽出物、および細胞抽出物を含むが、これらに限定されない、対象から得られたまたは他の方法で対象に由来する任意の材料、体液、組織、または細胞を意味する。これには、上記のすべての実験的に分離された画分もまた含まれる。例えば、血液サンプルを、血清あるいは赤血球細胞または白血球細胞（白血球）などの特定の種類の血液細胞を含む画分に分画することができる。必要に応じて、サンプルは、組織および体液サンプルの組合せなど、個体由来のサンプルの組合せであってもよい。生体サンプルには、組織サンプルまたは組織生検などの均質化された固形材料を含む物質、あるいは組織培養物または細胞培養物に由来する物質も含まれる。組織は、正常組織または病変組織であってよい。
【００７０】
不活性型および活性型α−シヌクレインモノマーおよび凝集体を評価して、可溶性モノマーおよび不溶性凝集体が活性型（プリオン様）であり、α−シヌクレイン凝集プロセスを開始（seed）できるか、もしくはそれにより開始（seed）され得るかどうかを決定した（βシート構造形成により決定された）。図２（実施例２）に示すように、
ａ．不活性型α−シヌクレインモノマー、不活性型凝集体、または不活性型α−シヌクレインモノマーと活性型α−シヌクレイン凝集体との組合せは、凝集プロセスを開始（seed）することができず、βシート構造の形成は観察されなかった；
ｂ．活性型モノマー、または活性型モノマーと不活性型凝集体との組合せは、自己反応(self-seed)することができ、活性型モノマーおよび活性型凝集体（または事前に形成されたフィブリル；ＰＦＦ）は、プリオン様凝集反応を開始（seed）することができ、βシート構造形成の増加をもたらすことが観察された。
【００７１】
マウスモノクローナル抗体を、活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマーに対して調製した。α−シヌクレインモノマーの活性型に対する抗体であって、不活性型に対してのものではない抗体を分泌するハイブリドーマが選択された。ウェスタンブロット分析を用いて、１つの抗体２Ｆ１１（ＡＴＣＣ  ＃ＰＴＡ−１２４１７４、２０１７年５月１１日受託）が、マウス脳溶解物およびＨｅＬａ溶解物において高分子量のα−シヌクレイン凝集体を同定すること（＞１５０ｋＤａ；図３Ａおよび３Ｄ参照）が観察されたが、他のα−シヌクレインモノクローナル抗体（これも、α−シヌクレインモノマーの活性型に結合することにより選択された）は、１５ｋＤａのバンドのみを同定した（４Ｆ１、図３Ｂ；３Ｆ８、図３Ｃ）。
【００７２】
２Ｆ１１の重鎖（配列番号１０および１１）および軽鎖（配列番号１２および１３）の核酸配列およびアミノ酸配列は、図１１Ａおよび１１Ｂに記載されている。モノクローナル抗体２Ｆ１１は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を定義する以下のアミノ酸配列を含む：
重鎖：
ＤＹＹＭＦ  （配列番号１４）；
ＷＮＤＰＥＮＧＤＴＥＹＡＰＫＦＱＧ  （配列番号１５）；
ＮＡＷＤＧＮＹＶ  （配列番号１６）；
軽鎖：
ＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ  （配列番号１７）
ＳＴＳＮＬＡＳ  （配列番号１８）
ＨＱＹＨＲＳＰＰＭＹＴ  （配列番号１９）。
【００７３】
モノクローナル抗体２Ｆ１１のＣＤＲをコードする核酸配列は、以下のヌクレオチド配列を含む：
重鎖：
ＧＡＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＴＴＴ  （配列番号２０）
ＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣ  （配列番号２１）
ＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴ  （配列番号２２）
軽鎖
ＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＣＴＴＧＣＡＣ  （配列番号２３）
ＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴ  （配列番号２４）
ＣＡＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣＧ  （配列番号２５）。
【００７４】
モノクローナル抗体２Ｆ１１は、天然サンプルからの天然条件のゲル電気泳動下で、α−シヌクレインオリゴマーに結合するが、α−シヌクレインモノマー（活性型）に結合しない。脳溶解物（マウスから得られた）を、２Ｆ１１を用いて自然な条件下で免疫沈降させ、沈殿画分およびフロースルー画分を変性ウェスタンブロットを用いて分析した。２Ｆ１１抗体は、免疫沈降した天然の脳溶解物中のα−シヌクレインオリゴマー（一旦変性されると６０−７０ｋＤａに泳動される）に結合したが、α−シヌクレインモノマー（活性型）には結合せず、このことは、モノマーのバンドが天然サンプルから２Ｆ１１により免疫沈降されなかったことを証明した（図５Ａ）。しかしながら、この画分が変性条件下で分離されたとき、フロースルー画分の３つの画分：約１５ｋＤａのα−シヌクレインモノマー（活性型）；約４０ｋＤａの推定α−シヌクレイン三量体；および、６０−７０ｋＤａのα−シヌクレインオリゴマー（図５Ｂ）が２Ｆ１１に結合することが観察され、このことは、（ウェスタンブロット分析で用いられる）変性条件下で、２Ｆ１１が、安定化オリゴマーおよび単量体α−シヌクレインの両方に結合し得ることを証明した。２Ｆ１１はタウ凝集体に選択的に結合するため（図１３参照）、このアプローチを用いてタウ凝集体の存在を確認することもできる。
【００７５】
マウスモノクローナル抗体２Ｆ１１は、変性条件下（図７）または天然条件下（図８Ａおよび８Ｂ）で、ウェスタンブロット分析を用いて、ヒト脳由来の溶解物、パーキンソン病患者からのヒト脳由来の溶解物、およびマウス脳由来の溶解物においてヒトα−シヌクレインに結合することが観察された。例えば、２Ｆ１１は変性条件下で高分子量および中間分子量のヒトおよびマウスα−シヌクレインオリゴマーに結合した（図７）。天然の非還元条件下（図８Ａ）で、２Ｆ１１は、約６０ｋＤａから約２５０ｋＤａの、ヒト脳溶解物、パーキンソン脳溶解物、およびマウス脳溶解物由来の高分子量α−シヌクレインオリゴマーに結合した。従って、２Ｆ１１は、天然条件下でα−シヌクレインオリゴマーまたは凝集体を識別する。
【００７６】
４Ｆ１抗体は、天然条件下で高分子量オリゴマーに結合することも観察された（図８Ｂ）。しかしながら、４Ｆ１は、精製された病原性（活性型）α−シヌクレインモノマーまたは凝集体を認識しなかった。
【００７７】
従って、天然系では、２Ｆ１１は、ヒトおよびマウスα−シヌクレインの両方を識別するが、２Ｆ１１抗体は、α−シヌクレインモノマー（活性型）に結合しない。理論はともかく、これらの結果は、２Ｆ１１は、α−シヌクレイン凝集体に結合し、それがα−シヌクレインオリゴマーの病原性種またはレビー小体病の発症経路に直接関与するオリゴマーに結合することを可能にすることを示している。
【００７８】
２Ｆ１１は、ヒトおよびマウスα−シヌクレインの両方に結合することができ、かつマウスおよびヒトα−シヌクレインの間のアミノ酸の同一性パーセント（または類似性パーセント）が９５％（図６）であるため、２Ｆ１１は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と約９５〜約１００％の、またはその間の任意の値の配列類似性を有するα−シヌクレインを同定することができる。例えば、２Ｆ１１は、本明細書に記載の天然または変性条件下で決定されるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の値の配列類似性を有するα−シヌクレインを同定することができる。
【００７９】
モノクローナル抗体２Ｆ１１はまた、インビトロでβシート構造形成を阻止することも観察された。α−シヌクレイン反応の進行は、図９Ａに示すように決定され得る。このアッセイでは、活性型α−シヌクレイン凝集体の存在下で、活性型α−シヌクレインモノマーの反応が“開始(seed)され”、経時的にαヘリックス構造からβシートに変化する（すなわち、チオフラビン蛍光の増加が観察される；上の線）。活性型α−シヌクレイン凝集体は、βシート構造形成のわずかな増加をもたらした（上から２番目の線）が、この増加は、活性型α−シヌクレイン凝集体と活性型α−シヌクレインモノマーとの混合物の増加（上の線）より少ない。活性型α−シヌクレインモノマーは、経時的にゆっくりと自己反応する（self-seed）（上から３番目の線）。
【００８０】
α−シヌクレイン反応の進行は、反応の開始時に２Ｆ１１を添加したとき（図９Ｂ）、または反応の開始前に、２Ｆ１１を種々のα−シヌクレイン種と予めインキュベートしたとき（図９Ｃ）の両方で、モノクローナル抗体２Ｆ１１の存在下で遮断されることが観察された。モノクローナル抗体４Ｆ１または３Ｆ８は、２Ｆ１１の効果と比較したとき、α−シヌクレイン反応の進行を同程度には阻害しなかった。さらに、対照抗体ＳＭＣ−１０４（ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル）は、α−シヌクレイン反応にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった。
【００８１】
これらの結果は、２Ｆ１１抗体が、α−シヌクレイン凝集およびフィブリル化反応がβシート構造の形成に進行するために必要とされる成分または構造に結合することを明確に示す。従って、２Ｆ１１抗体は、この反応に対して中和効果を示す。
【００８２】
これらの結果は、天然サンプル由来のα−シヌクレインオリゴマーの毒性型への２Ｆ１１の結合を用いて、パーキンソン病脳 対 非パーキンソン病脳に由来するヒト脳溶解物中の毒性α−シヌクレインオリゴマーの量を決定できること、およびヒト脳溶解物中のより多量の毒性α−シヌクレインオリゴマーがパーキンソン病脳に由来するかどうかを識別できることを示している。
【００８３】
従って、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を判定するための方法が提供される。該方法は以下を含む：
ｉ）サンプルの一部を対照抗体と予め混合し、次いで組換え活性型α−シヌクレインモノマーを添加して、対照処置群を作製し、
ｉｉ）サンプルの第２の部分をモノクローナル抗体２Ｆ１１と予め混合し、次いで組換え活性型α−シヌクレインモノマーを添加して、薬物処置群を作製し、そして
ｉｉｉ）対照処置群および薬物処置群の両方においてβシート構造形成の量を決定すること。
ここで、対照処置群と比較した薬物処置群におけるβシート構造形成の量の減少は、サンプル中の活性型α−シヌクレインオリゴマーの存在を示す。
【００８４】
さらに、レビー小体（ＤＬＢ）疾患を伝達することができる天然のヒトサンプルから単離されたα−シヌクレインオリゴマーを用いて、活性型α−シヌクレインモノマーを誘導(seed)し、チオフラビンを用いてモニタリングされるβシート構造形成の反応動態を追跡することができる（実施例５に記載の方法を使用）。このアッセイを用いて、サンプル、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、ヒト脳溶解物、またはα−シヌクレインオリゴマーを含み得る他のサンプル中の、毒性α−シヌクレインオリゴマーの量を決定することができる。このアッセイは、パーキンソン病の疑いのある脳から得られたサンプル（試験サンプル）に用いることができ、パーキンソン病ではない脳から得られたサンプル（対照サンプル）から得られた結果と比較したとき、ヒト脳溶解物サンプル中の毒性シヌクレインオリゴマーの量の増加は、試験サンプル中のパーキンソン病の存在の指標となる。
【００８５】
タウとα−シヌクレインとの間の既知の相互作用により（Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304）、βシート構造形成を誘導するタウに対するモノクローナル抗体２Ｆ１１の効果もまた、チオフラビンアッセイを用いて試験した。図１３に示すように、２Ｆ１１は、タウ線維、βシート構造形成をインビトロで阻止することが観察された。タウ線維のみ、またはタウモノマーのみをアッセイしたとき、バックグラウンド蛍光シグナルが観察された。しかしながら、タウモノマーおよびタウ線維の混合物は、経時的なβシート構造形成を示す強い蛍光シグナルの発生をもたらす。２Ｆ１１を反応開始前にタウ線維と予めインキュベートすると、タウ反応の進行が、モノクローナル抗体２Ｆ１１の存在下で遮断されることが観察された。モノクローナル抗体ＳＭＣ−１０４（ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル）は、タウ反応にほとんどまたは全く影響を与えなかった。α−シヌクレインβシート構造形成をインビトロで阻止するための添加量と比べて、より多量の２Ｆ１１抗体が、インビトロでのタウ線維、βシート構造形成の阻止に必要であった。
【００８６】
従って、サンプル中のタウ凝集体の存在を判定する方法を提供する。該方法は以下を含む：
ｉ）サンプルの一部を対照抗体と予め混合し、次いでタウモノマーを添加して、対照処置群を作成すること、
ｉｉ）サンプルの第２の部分をモノクローナル抗体２Ｆ１１と予め混合し、次いでタウモノマーを添加して、薬物処置群を作成すること、および
ｉｉｉ）対照処置群および薬物処置群の両方におけるβシート構造形成の量を決定すること。
ここで、対照処置群と比較して、薬物処置群におけるβシート構造形成の量の減少は、サンプル中のタウ凝集体の存在を示す。
【００８７】
これらの結果は、２Ｆ１１抗体が、α−シヌクレイン凝集およびフィブリル化反応およびタウ反応がβシート構造を形成するために進行するために必要とされる成分または構造に結合することを明確に示す。従って、２Ｆ１１抗体は、この反応に対して中和効果を示す。
【００８８】
これらの結果は、天然サンプル由来のα−シヌクレインオリゴマーの毒性形態への２Ｆ１１の結合を用いて、パーキンソン病脳 対 非パーキンソン病脳に由来するヒト脳溶解物中の毒性α−シヌクレインオリゴマーの量を決定できること、およびヒト脳溶解物中のより多量の毒性α−シヌクレインオリゴマーがパーキンソン病脳に由来するかどうかを特定できることを示している。
【００８９】
これらの結果はまた、サンプルからのタウの線維形態への２Ｆ１１の結合を用いて、罹患していない脳と比較して、例えばアルツハイマー病に罹患した脳に由来するヒト脳溶解物中のタウ凝集体の有無または量を決定できること、およびヒト脳溶解物中のより多量のタウ凝集体が罹患した脳組織に存在するかどうかを特定できることを示している。
【００９０】
２Ｆ１１のエピトープ結合は、それぞれが約３０アミノ酸長の一連の重複するα−シヌクレインペプチドに特徴付けられた。２Ｆ１１クローンは、α−シヌクレインの活性型（例えば、４Ｆ１、３Ｆ８）に結合することも確認された他のモノクローナル抗体と比較した場合、エピトープ結合の特異なパターンを示した（図１０）。この分析では、２Ｆ１１は位置６１−９０および１０１−１３０で、α−シヌクレインの２つのＣ末端フラグメントに結合することが観察された。理論はともかく、２Ｆ１１のエピトープ結合特性により、α−シヌクレイン凝集および線維化反応のコア成分に結合し、これを中和できる。
【００９１】
２Ｆ１１抗体の線条体内注射はまた、ラット皮質細胞におけるレビー小体病態の発症を減少させることも観察された。皮質組織へのα−シヌクレイン線維の投与により、α−シヌクレイン特異的抗体ｐＳｅｒ１２９を用いて決定されるように、α−シヌクレイン反応が開始(seed)された。局在α−シヌクレイン凝集部位の数、および凝集体のサイズは、α−シヌクレイン原線維をモノクローナル抗体２Ｆ１１と予めインキュベートすることにより減少した。ＰＢＳ中のα−シヌクレイン線維で処理されたラットから得られた皮質組織の切片は、α−シヌクレイン抗体（ｐＳｅｒ１２９）のα−シヌクレイン線維への結合およびα−シヌクレイン凝集体形成（核周囲の凝集または封入体）を示す局在蛍光を明らかにした。対照（ＰＢＳ）処理ラットでは蛍光は観察されなかった（α−シヌクレイン凝集体の形成は示されなかった）。局在蛍光は、α−シヌクレイン線維および抗体３Ｄ１０で処理したラット皮質細胞でも観察され、抗体（ｐＳｅｒ１２９）のα−シヌクレイン線維への結合およびα−シヌクレイン凝集体形成が示された。α−シヌクレインフィブリルおよび抗体３Ｄ１０を投与された皮質細胞の局所結合の量は、α−シヌクレインフィブリルのみを投与したラットから得られた皮質組織のスライスにおいて観察された量と類似していた。α−シヌクレイン線維および抗体２Ｆ１１で処理したラット脳から得られた皮質細胞で局在蛍光が観察されたが、局在結合部位（核周囲の凝集）の数および局在結合部位のサイズの両方が、α−シヌクレイン線維のみ、またはα−シヌクレイン線維および抗体３Ｄ１０で処理した場合に皮質細胞で観察される結合部位の数およびサイズのいずれかと比較して減少し、このことは、２Ｆ１１抗体で脳組織を処理すると、インビボでラット皮質細胞のレビー小体病変の発症を減少させることを示している。従って、２Ｆ１１を用いた処置は、レビー小体様封入体の形成を妨害または遅延させ得る。理論はともかく、皮質細胞に投与される２Ｆ１１の量を増やすことは、インビボでのラット皮質細胞のレビー小体病理の発症をさらに妨害、減少および／または遅延させ得る。
【００９２】
モノクローナル抗体を用いて対象を免疫化し、インビボでα−シヌクレインオリゴマー化反応を減少または阻害することができる。例えば、α−ｓｙｎトランスジェニック（ｔｇ）マウス（ＰＤモデル; Masliah et al., 2011）および非−ｔｇマウスを、２Ｆ１１を用いて免疫化し、α−ｓｙｎトランスジェニック（ｔｇ）マウスおよび非−ｔｇマウスの両方の行動反応（記憶回復）を経時的に評価することができる。２Ｆ１１で免疫化したＴｇマウスは、より良好な記憶回復を示し、非−ｔｇマウスと同様の方法でタスクを完了することができ、従って、２Ｆ１１抗体処置が学習障害を元に戻すことが証明される。
【００９３】
結果として、本発明は、モノクローナル抗体２Ｆ１１、あるいは２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体（以下参照）を、薬学的に許容される担体、アジュバント、ビークルまたは賦形剤中に含む組成物またはワクチンを意図する。さらに、それを必要とする対象において活性型α−シヌクレインまたはタウ凝集体を減少させる方法も提供される。この方法は、ある量の組成物またはワクチンを該対象に投与することを含む。組成物またはワクチンは、該対象に、経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下に投与され得る。
【００９４】
本明細書に記載の抗体、例えば２Ｆ１１、または２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体もしくは二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体（以下に記載）、アジュバント、または賦形剤を含む医薬組成物もまた記載されている。治療薬、例えば２Ｆ１１、または２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体もしくは二重特異性抗体の投与は、そのままの投与を含む当技術分野で公知の種々のメカニズムを用いて行うことができるか、あるいは静脈内、腹腔内、皮下もしくは経口経路により、または直接注射により投与することができる。治療薬はまた、該治療薬の薬学的に使用可能な製剤への加工を促進する賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含む医薬組成物または製剤の一部として投与され得る。
【００９５】
本明細書では、シヌクレイノパチー、レビー小体により特徴付けられる病的状態、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病、タウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、およびグリア細胞球状封入体タウオパチーと診断された対象において免疫応答を誘導する方法であって、該対象に、モノクローナル抗体２Ｆ１１、２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体抗体、モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物、２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体を含む医薬組成物、モノクローナル２Ｆ１１を含むワクチン、あるいは２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体を含むワクチンを投与することを含む方法もまた提供する。
【００９６】
シヌクレイノパチー、レビー小体により特徴付けられる病的状態、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、孤発性アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、タウオパチー、神経原線維変化、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症およびグリア細胞球状封入体タウオパチーを有すると診断された対象における免疫応答を誘導するための、モノクローナル抗体２Ｆ１１、２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体抗体、２Ｆ１１を含む医薬組成物、あるいは２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体を含む医薬組成物の使用もまた記載されている。
【００９７】
また、シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする病的状態、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病、またはタウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、およびグリア細胞球状封入体タウオパチーを処置する方法もまた記載されている。該方法は、モノクローナル抗体２Ｆ１１、２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体、モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物、あるいは２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。対象において、シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病を処置するための、モノクローナル抗体２Ｆ１１、２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体、モノクローナル抗体２Ｆ１１を含む医薬組成物、あるいは２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体または二重特異性抗体を含む医薬組成物の使用もまた記載されている。
【００９８】
シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病を処置するための医薬の製造、またはタウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、およびグリア細胞球状封入体タウオパチーを処置するための医薬の製造における、モノクローナル抗体２Ｆ１１、または２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体もしくは二重特異性抗体の使用も記載されている。また、シヌクレイノパチー、レビー小体を特徴とする疾患、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病または家族性アルツハイマー病を処置するための医薬の製造、またはタウオパチー、神経原線維変化によって特徴付けられる疾患、アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭骨性認知症、嗜銀顆粒性認知症、原発性加齢関連タウオパチー、神経原線維変化型認知症、およびグリア細胞球状封入体タウオパチーを処置するための医薬の製造における使用のための、モノクローナル抗体２Ｆ１１、または２Ｆ１１を含む多重特異性抗体、三重特異性抗体もしくは二重特異性抗体の使用も記載されている。
【００９９】
抗体はモノクローナル抗体であり得る。抗体は、非ヒト抗体、霊長動物化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体をヒト化または霊長動物化する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、げっ歯動物の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくは他のアミノ酸配列またはヒト抗体のそれらの配列を置換することによる（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verho眼n et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)；各文献は引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）。本明細書で用いる用語“抗原結合ドメイン”は、抗原結合活性を有する任意の抗体誘導体または断片を意味する。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨドメイン）を含む。抗体断片および誘導体の限定されない例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（すなわち、単鎖Ｆｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、トリ（ア）ボディ、多重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。他の多くの抗体断片および誘導体が知られており、その多くの限定されない例が、Deyev and Lebedenko (2008, BioEssays 30:904-918、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）に記載されている。方法または使用のいくつかの態様において、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディまたはトリ（ア）ボディである。
【０１００】
受容体介在トランスサイトーシス経路を介して、１つまたは２以上の担体分子および１つまたは２以上の負荷分子を含む、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体または三重特異性抗体を用いて、血液脳関門を通過して治療抗体を輸送する方法が知られている。例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合抗体（およびその変異体）を担体として用いることができ、カーゴ分子（例えば、２Ｆ１１）に融合すると、血液脳関門を通過できる二重特異性抗体が作製される（例えば、Zuchero, Y. J, Y., et. Al., 2016, Neuron 89:70-82; Bien.Ly, N. et. al. 2014 J. Exp. Med. 211:233-244; US 2018/8002433; CA 3,000,560参照；これらは引用により本明細書に包含される）。あるいは、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）結合抗体を担体として用いて、カーゴ分子２Ｆ１１に融合させて、血液脳関門を通過する二重特異性抗体を作製することができる（例えば、ＷＯ２０１５／１３１２５６；ＷＯ２０１５／１３１２５７；ＷＯ２０１５／１３１２５８参照；これらは引用により本明細書に包含される）。血液脳関門を通過できる２Ｆ１１を含む一価または二価のＩＧＦ１Ｒ二重特異性抗体の例を、図１２に示す。Absolute antibody（URL：absoluteantibody.com/custom-services/antibody-engineering/を参照）は、多重特異性抗体の調製について記載している。
【０１０１】
従って、本発明は、血液脳関門を通過させるための多重特異性抗体、例えば三重特異性または二重特異性抗体も提供し、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体２Ｆ１１に結合した担体分子を含む。例えば、二重特異性抗体の担体分子は、一価−二重特異性抗体または二価−二重特異性抗体のいずれかであり得る。二重特異性抗体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合抗体、またはインシュリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）結合抗体のいずれかであり得る。
【０１０２】
本発明を以下の実施例でさらに説明する。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：材料および方法
α−シヌクレイン免疫原の作製：
不活性型ヒトα−シヌクレインモノマーおよび凝集体を、Volpicelli-Daley et al., 2014（引用により本明細書中に包含させる）に従い、軽微な改変を加えて、作製した。単量体形態のα−シヌクレインを含む画分を集め、Ｐｉｅｒｃｅの高容量エンドトキシン除去スピンカラム（Thermo Scientific, #88276）を製造元が提供するマニュアルに従って用いてエンドトキシン除去手順を行った。エンドトキシンレベルを、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（GenScript, #L00350）を用いて測定した。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッセイで測定された、１μｇのタンパク質当たり１ＥＵ未満であった。不活性型モノマーを用いて、不活性型凝集体を作製した。
【０１０４】
活性型マウスα−シヌクレイン凝集体（形成されたフィブリル−ＰＦＦ）および活性型α−シヌクレインモノマーを、Ｌｅｅ研究所（神経変性疾患研究のためのセンター, 3rd Floor, Maloney Building, 3600 Spruce Street, Philadelphia, PA 19104-4283, USA）から入手した。マウス脳溶解物は、ビクトリア大学（3800 Finnerty Rd, Victoria, BC V8P 5C2, Canada）より提供された。ヒト脳組織全体溶解物（５ｍｇ／ｍＬ）を、Novus Biologicals、＃ＮＢ８２０−５９１７７から入手した。パーキンソン病のヒト脳組織全体溶解物（５ｍｇ／ｍＬ）を、Novus Biologicals、＃ＮＢ８２０−５９４０７から入手した。ＨｅＬａ溶解物を、Rockland Immunochemicals Inc.、＃Ｗ０９−０００−３６４から入手した。
【０１０５】
チオフラビンアッセイ：
チオフラビンアッセイは、Murray et al., 2003（引用により本明細書中に包含させる）に基づいた。このアッセイは、β−シート含有量を経時的に測定する。蛍光の増加は、シーディング反応中の凝集フィブリルの増加によるβシート構造の増加を示している。
【０１０６】
チオフラビンＴストック（１ｍＭ）を、ＰＢＳで終濃度２５μＭ（１：４０希釈）に希釈した。９５μＬの希釈したチオフラビンＴを、３８４ウェルの各ウェルに添加し、サンプル（２．５μＬ）を各ウェルに添加し、そしてこの溶液を混合した。対照については、２．５μＬのＰＢＳのみを希釈したチオフラビンＴに添加し、２．５μＬの単量体α−シヌクレインを希釈したチオフラビンＴに添加した。混合物を室温にて２分から１時間インキュベートし、チオフラビンＴ蛍光を各ウェルにおいて測定した（励起４５０ｎｍ、発光５００ｎｍ）。上記のチオフラビンＴアッセイの変更点は以下の通りであった：チオフラビンＴ蛍光を、３７℃にて１時間から８８時間までインキュベートした後、各ウェル（励起４５０ｎｍ、発光４８５ｎｍ）において測定した。
【０１０７】
プレインキュベーション実験について、３０ｕｇの抗体を１０ｎＭのα−シヌクレイン凝集体と共に、振とうしながら、４℃にて１時間インキュベートした。混合物を１００００ｒｐｍで５分間遠心し、１ｍＬのＰＢＳで濯いだ。この工程をさらに４回繰り返した。上清を除き、α−シヌクレイン凝集体（結合した抗体を含む）を、１０μＬのＰＢＳに再懸濁させた。
【０１０８】
共インキュベーション実験について、チオフラビンＴの添加の直前に、３０ｕｇの抗体を単量体α−シヌクレインおよびα−シヌクレイン凝集体に添加した。
【０１０９】
マウスモノクローナル抗体作製：
マウスモノクローナル抗体を、カナダ（4464 Markham Street #3204, Victoria, BC V8Z 7X8, Canada）にあるImmunoPrecise Antibodies Ltd（ＩＰＡ）で独自のRapidPrime技術を用いて作製した。RapridPrime には、５匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫が含まれていた。
【０１１０】
間接ＥＬＩＳＡによるα−シヌクレイン線維抗原のハイブリドーマスクリーニング：
ＥＬＩＳＡ条件：コーニング・コスターＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて一晩、１００μｌ／ウェルのＣＣＢ（ｐＨ９．６）中０．１μｇ／ウェルで、活性型α−シヌクレイン凝集体または活性型α−シヌクレインモノマーでコーティングし、室温にて１時間、ＰＢＳ中３％スキムミルク粉末デブロッキングした。
【０１１１】
一次抗体：ハイブリドーマＴＣ上清ニート液（ＩＰＡで作製）を１００ｕＬ／ウェルで、３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした；二次抗体：１：１０,０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch, # 115-035-068）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルで、３７℃にて１時間、振とうした。全ての洗浄工程を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３０間行った。ＴＭＢ基質（BioFxt # TMBW-1000-01）を５０μＬ／ウェルで添加し、反応を、等量の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。発色時間：８．５分。プレートを４５０ｎｍで読みだした。
【０１１２】
アイソタイピング抗体捕捉ＥＬＩＳＡ条件：
ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中１：１０,０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ；Jackson ImmunoResearch, # 115-035-068）で、４℃にて一晩、ブロッキングなしにて、コーティングした。
【０１１３】
一次抗体：ハイブリドーマ組織培養上清（ニート（そのまま）；上記の間接ＥＬＳＩＡについて記載された同じ抗体）を、プレート上、１００ｕＬ／ウェルで、室温にて１時間、振とう。二次抗体  １：５０００ヤギ抗マウスＩｇＧγ−ＨＲＰ（５つのサブアイソタイプ特異的抗体の等量混合物、Jackson ImmunoResearch, # 115-035-205, 115-035-206, 115-035-207, 115-035-208, 115-035-209）または１：１０,０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ−ＨＲＰ（Thermo Scientific, # 31440）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルで、室温にて１時間、振とうした。全ての洗浄工程を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３０分間行った。ＴＭＢ基質を５０μＬ／ウェルで添加し、反応を等量の１Ｍ  ＨＣｌを用いて停止させた。発色時間：５．５分。プレートを４５０ｎｍで読みだした。
【０１１４】
間接ＥＬＩＳＡ法による、活性型α−シヌクレインモノマー、α−シヌクレイン活性型凝集体（または予め形成された原線維；ＰＦＦ）、不活性型α−シヌクレインモノマー、およびα−シヌクレイン不活性型凝集体抗原に対するマウス抗α−シヌクレインハイブリドーマの試験
ＥＬＩＳＡ条件：コーニングのCostar ELISAプレートを、以下：
ａ．１００μｌ／ウェルのＣＣＢ（炭酸塩コーティング緩衝液）（ｐＨ９．６）中、０．１μｇ／ウェルの活性型α−シヌクレインモノマーで、４℃にて一晩；
ｂ．１００μｌ／ウェルのＣＣＢ（ｐＨ９．６）中、０．１μｇ／ウェルのα−シヌクレイン活性型凝集体（ＰＦＦ）で、４℃にて一晩；
ｃ．１００μｌ／ウェルのＣＣＢ（ｐＨ９．６）中、０．１μｇ／ウェルの不活性型α−シヌクレインモノマーで、４℃にて一晩；または
ｄ．１００μｌ／ウェルのＣＣＢ（ｐＨ９．６）中、０．１μｇ／ウェルのα−シヌクレイン不活性型凝集体で、４℃にて一晩、でコーティングし、そして
ＰＢＳ中、３％スキムミルク粉末で、室温にて１時間ブロッキングした。
【０１１５】
一次抗体：ハイブリドーマ組織培養上清（そのまま）を、ＤＭＥＭ完全培地＋５％低ＩｇＧ ＦＢＳ中で死滅（＞９０％細胞死）まで増殖させた。培養物を採取し、４００ｘｇで遠心沈殿させて、上清を新しい滅菌チューブに移した。組織培養上清を添加し（１００μＬ／ウェル）、３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１００ｕＬ／ウェルの二次抗体  １：１０,０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰで、３７℃にて１時間振とうした。全ての洗浄工程を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３０分間行った。ＴＭＢ基質を５０μＬ／ウェルで添加し、反応を等量の１Ｍ  ＨＣｌを用いて停止させた。発色時間：１分。プレートを４５０ｎｍで読みだした。
【０１１６】
ウェスタンブロッティング：
種々の抗体を用いてブロッティングおよびプロービングする前に、以下の実施例に記載の変性（ＳＤＳ）および非変性（天然）条件下で、ゲルを泳動した。
【０１１７】
図３Ａ−３Ｄについて、一次抗体（前のセクションで定義された抗α−シヌクレイン上清）を、トリス−ホウ酸生理食塩水（ＴＢＳ）中、１：２希釈で用いた；インキュベーション温度：４℃、インキュベーション時間：１８時間。二次抗体は、ヤギ抗マウス：ＨＲＰ複合体、１：２０００希釈であった。ブロッキング緩衝液（５％スキムミルクＴＢＳＴ）、インキュベーション温度：室温；インキュベーション時間：１時間。発色溶液：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ基質（ＧＥ、＃  ＲＰＮ２２３２）、発色時間：６分。溶解物：１レーン当たり、２０μｇのマウス脳溶解物またはＨｅＬａ溶解物。５Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液をサンプルに添加し、Ｌｉｃｏｒ  Ｃ−ＤｉｇｉｔまたはＧＥ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００で可視化したゲルに負荷する前に、９０℃にて１０分間インキュベートした。
【０１１８】
図７（およびペプチドウエスタン）について、一次抗体は抗α−シヌクレインタンパク質Ｇ精製上清（GE, #29-0485-81）であった；ＴＢＳ中、１：１０００希釈；インキュベーション温度：室温；インキュベーション時間：１時間。二次抗体は、ヤギ抗マウス：ＨＲＰ複合体、１：２０００希釈であった。ブロッキング緩衝液（５％スキムミルクＴＢＳＴ）、インキュベーション温度：室温；インキュベーション時間：１時間。発色溶液：ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  化学発光基質（ThermoFisher Scientific, # 34080）、発色時間：６分。５Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  サンプル緩衝液をサンプルに添加し、ゲルに負荷する前に、９０℃にて１０分間インキュベートした。天然サンプルの場合、５Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  サンプル緩衝液の代わりに、ゲルに負荷する前に、５％グリセロールを添加した。ＧＥ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００で可視化した。
【０１１９】
ドットブロット分析について、５μｌ（０．１ｍｇ／ｍＬ）の各ペプチドを、ニトロセルロース（ＡＢＭ、＃Ｂ５００）に添加し、室温にて１５分間乾燥させた。その後、ドットブロットを、標準ウェスタンブロットとして行った（図７を参照して上記で概説）。
【０１２０】
初代細胞実験（図２Ａおよび９Ｄ）
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙの初代皮質細胞を、子ラットの脳を解剖することにより得た。解剖後、脳を外科用ハサミで機械的に切断し、０．２５％トリプシン溶液を用いて分離させた。トリプシン処理を４５分間行い、細胞懸濁液を得た。トリプシンを２回の遠心処理（７５０ｒｐｍで２０分）で洗浄し、細胞懸濁液を、ラミニンで予めインキュベートした６０ｍｍの細胞培養皿にプレーティングし、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを充填して、２４時間接着させた。翌日、６０ｍｍ細胞培養皿（ニューロンを含む）の上清を回収し、同じ増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中に再懸濁させて、遠心分離（５００ｒｐｍで２０分間）により２回洗浄した。懸濁したニューロンを、ラミニンで予めインキュベートした２２ｘ２２ｃｍのカバースリップ（ＮａＯＨおよび９５％エタノールで予め処理）に播種した。カバースリップを、６０ｍｍ細胞培養皿（１皿当たり、２つのカバースリップ）にペアで、または３５ｍｍ細胞培養皿に個別に配置し、これらにＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを充填した。ニューロンを２日間定着させて増殖させ、その後、それらの特定の実験条件を開始した。細胞の準備ができたら、細胞培養培地を馴化培地に交換した。図９Ｄを参照すると、馴化培地は以下の通りであった：
−対照実験：ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋等量の超音波処理したＤＰＢＳ＋等量のＤＰＢＳ；
−活性型α−シヌクレインのみ添加：ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋４μｇ／ｍｌの超音波処理した活性型α−Ｓｙｎフィブリル＋等量のＢＰＢＳ；
−２Ｆ１１処理したニューロン：ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋４μｇ／ｍｌの超音波処理した活性型α−Ｓｙｎフィブリル＋ＤＰＢＳで１：４００に希釈した１０μｌの２Ｆ１１抗体（２Ｆ１１抗体の量は１０μｇに相当）。
対照群はＤＰＢＳと共にインキュベートし、活性型α−シヌクレインのみの添加群は活性型α−シヌクレインフィブリルと共にインキュベートし、２Ｆ１１群は活性型α−シヌクレインフィブリルおよび２Ｆ１１抗体と共にインキュベートした。週に１回、培地の５０％を新しい培地（ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に交換した。
【０１２１】
馴化培地を用いてインキュベーションの１４日後、細胞を、２％ＰＦＡで４０分間固定し、０．０５％トライトン−Ｘ中で１０分間透過処理し、ＰＢＳ−２％  ＢＳＡを用いて２４時間ブロッキングした。細胞を、α−Ｓｙｎ−ｐＳｅｒ１２９に対するＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ製の一次ウサギポリクローナル抗体（ＳＰＣ−７４２）を１：１００で用いて、一晩染色させ、α−Ｓｙｎ−ｐＳｅｒ１２９に対するヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ−４８８（緑）である二次抗体を用いて、２時間インキュベーションした。全てのサンプルをＤＡＰＩで対比染色した。
【０１２２】
エピトープマッピングのためのペプチド合成（図１０）
以下のペプチド（Atlantic Peptides、USA）を、Ｆｍｏｃ化学およびアクティベーターとしてＨＣＴＵを用いて、ヒトα−シヌクレイン（Uni Prot P37840）の重複配列を反映させるRainin Symphony synthesizer（右側の残基番号）で作製した。Ｎ末端はＣ−６スペーサー（Ａｈｘ）に結合され、すなわちＣ−６スペーサーはＮ末端のシステイン残基に結合された。ペプチドは、Ｃ−１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。質量についてはエレクトロスプレーを用い、純度については分析ＬＣを用いて分析を行った。用いたＢＳＡはFishers Scientific製品７７１１０であり、用いた連結法（コンジュゲーション）は製品に付属のプロトコルに従った。
ＡＡ１−３０：ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ（配列番号３）；
ＡＡ２１−５０：ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ（配列番号４）；
ＡＡ４１−７０：ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ（配列番号５）；
ＡＡ６１−９０：ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ（配列番号６）；
ＡＡ８１−１１０：ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ（配列番号７）；
ＡＡ１０１−１３０：ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ（配列番号８）；
ＡＡ１２１−１４０：ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ  ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号９）．
【０１２３】
エピトープマッピングのためのＥＬＩＳＡ条件：Ｎｕｎｃ(登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ(商標）９８ウェルプレートＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌ／ウェル  ＣＣＢ（ｐＨ９．６）中、０．１μｇ／ウェルのＢＳＡに結合させたペプチドを用いて、４℃にて一晩コーティングした。その後、プレートを、ＰＢＳ中３％スキムミルク粉末で、室温にて３時間、ブロッキングした。１００μＬ／ウェル  抗体（１μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１００ｕＬ／ウェルの、二次抗体  １：１０,０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰで、室温にて１時間振とうした。全ての洗浄工程をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３０分間行った。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェルで添加し、反応を、等量の１Ｍ  ＨＣｌを用いて停止させた。発色時間：１５分。プレートを４５０ｎｍで読み出した。
【０１２４】
免疫沈降およびフロースルー分析（図５Ａおよび５Ｂ）
製造者のプロトコルを用いて、１．２ｍｇの２Ｆ１１を臭化シアン活性化セファロース（Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ９１４２−１Ｇ）に結合させた。２ｍｇのマウス脳溶解物を、振とうしながら、４℃にて４８時間、樹脂と共にインキュベートした。カラムをＰＢＳで洗浄し、その後、０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．７）で溶出させた。
【０１２５】
電子顕微鏡（図２Ｃ、８Ｃ）
超音波処理したα−Ｓｙｎフィブリルの１６０μｌアリコートを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁させて、最終容量を１ｍｌにした。次いで、再懸濁液を２つの微量遠心分離チューブに分けて、各チューブ内の元の再懸濁液０．５ｍｌの最終容量にし、１７，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。上清の８０％を捨て、残りの容量を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１：４００希釈した２Ｆ１１（１．２５μｇの抗体）またはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋等量のＤＰＢＳのいずれか０．５ｍｌの最終容量に再懸濁させた。一次抗体（または陰性対照の場合、ＤＰＢＳ）とのインキュベーションを２４時間行った。翌日、両チューブを１７,０００ｒｐｍで４０分間遠心し、上清の８０％を取り置き、残りの容量を０．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁させて、１７,０００ｒｐｍで４０分間、洗浄および遠心した。上清の８０％を取り置き、残りの容量を、両チューブ中、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１８ｎｍ金粒子と結合させたヤギ抗マウスＩｇＧに再懸濁させた。二次抗体のインキュベーションを２時間行い、次いでチューブを１７,０００ｒｐｍで４０分間遠心した。上清の８０％を取り置き、残りの容量をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁させた。再懸濁液を、１７,０００ｒｐｍで４０分間の遠心により洗浄した。最後に、容量の８０％を取り置き、残りの容量（約１００μｌ）のうち約４μｌを透過型電子顕微鏡の金属グリッドの上に置き、酢酸ウラニルで染色した。
【０１２６】
実施例２：不活性型および活性型α−シヌクレインモノマーおよび凝集体の作製
不活性型および活性型α−シヌクレインモノマーおよび凝集体を、実施例１に記載のように得た。可溶性モノマーおよび不溶性凝集体が活性（プリオン様）であり、α−シヌクレイン凝集プロセスを開始（seed）できるか、またはそれにより開始（seed）され得るかどうかを評価するために、モノマーおよび凝集体の両セットを、実施例１に記載のチオフラビンアッセイを用いて組み合わせて試験し、３７℃にて１時間または２４時間インキュベートした。活性型および不活性型凝集体の両方、ならびにモノマーをアッセイした。対照は、チオフラビンのみ、ＰＢＳのみおよび不活性型モノマーであった。結果を図２Ａに示す。このアッセイにおいて、α−シヌクレイン凝集の増加により、βシート構造形成が対応して増加している。チオフラビンはβシート構造に結合し、この構成では、４５０nmで励起されるとチオフラビンは（４８５ｎｍで）蛍光を発する。４８５ｎｍでの蛍光の量は、チオフラビン結合の量によって変わり、結合量は、βシート構造形成の量と相関している。結果として、チオフラビン蛍光の増加は、βシート構造形成の増加を示す。
【０１２７】
１時間または３７時間のインキュベーション後、βシート構造形成を示す蛍光の増加は、不活性型モノマーまたは不活性型凝集体では観察されなかった。しかしながら、活性型モノマーは、２４時間に亘って、自己伝達（seed）し、βシート構造を形成することができた。活性型凝集体（ＰＦＦ）もまた、１時間および２４時間後に蛍光の増加をもたらしたが、この増加は、βシート構造の作製に必要なモノマー構成要素の非存在下では横ばいになった。
【０１２８】
不活性型凝集体および不活性型モノマーの組合せは、蛍光の増加をもたらさず、不活性型凝集体が不活性型モノマーを形成(seed)できず、また不活性型モノマーによる自己伝達(seed）が生じ得ないことを示唆した。不活性型モノマーおよび活性型凝集体（ＰＦＦ）の組合せは、ＰＦＦ（活性型凝集体）のみを添加した場合と同様の蛍光レベルを発し、これは不活性型モノマーがβシート構造を作製する構成要素として機能できないためである。しかしながら、活性型モノマーが不活性型凝集体と組み合わされたとき、蛍光の大きな増加が２４時間に亘って観察された。これは、活性型モノマーが自己伝達(seed)できることを証明する結果と一致している。最後に、活性型モノマーおよび凝集体の両方を共に用いたとき、蛍光読み取り値が、１時間後および２４時間後の両方で大幅に増加し、このことにより、活性型モノマー上のＰＦＦ（活性型凝集体）による伝達(seed)プロセスによる凝集が示された。
【０１２９】
α−シヌクレインの円偏光二色性分析
円偏光二色性は、遠紫外線用のＪａｓｃｏ−Ｊ−１５００分光偏光計、０．１ｃｍセルを用いて、米国サンディエゴのAlliance Protein Laboratoriesによって行われた。二次構造を、ＣＤＮＮバージョン２．１、Ｇｕｉｄ２２３（Bohm, G., Muhr, G., and Jaenicke, R (1992) Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks. Protein Eng. 5, 191-195）に従って計算した。
【０１３０】
実施例１に記載されるように作製された非活性型または不活性型モノマーは、活性型モノマーと同様の二次構造を有するようである。一方、活性型α−シヌクレイン凝集体は、円二色性測定を用いて二次構造を測定することで決定されるように、不活性型凝集体よりもβシート含有量が多く、α−ヘリックスが少ないようである（表１）。
【０１３１】
【表１】
2020529473.tif 000003
【０１３２】
活性型凝集体はインビボでα−シヌクレイン凝集を開始(seed)させる
図２Ｂに示す通り、レビー小体病理の検出のためにセリン１２９リン酸化特異的抗体を用いると（実施例１に記載の方法）、エンドトキシンの不存在下で、α−シヌクレインモノマーで作製された不活性型凝集体は、ｐＳｅｒ１２９染色（不活性型凝集体−ｐＳｅｒ１２９）を示さず、このことは、不活性型凝集体がラット初代皮質細胞に内生α−シヌクレイン凝集を開始(seed)しないことを示す。しかしながら、エンドトキシンの存在下で作製された活性型凝集体は、活性型α−シヌクレイン凝集体で前処理された細胞のｐＳｅｒ１２９染色によって証明されるように、α−シヌクレイン凝集を開始(seed)する（活性型凝集体−ｐＳｅｒ１２９参照）。
【０１３３】
不活性型および活性型凝集体の間の相違をさらに確認するために、両タイプを電子顕微鏡で観察した。不活性型α−シヌクレインフィブリルは、活性型α−シヌクレインフィラメントよりも細いフィラメントを形成し、不活性型α−シヌクレインフィブリルはあまり詰まっていない。さらに、不活性型α−シヌクレイフィブリルはかなり長く、長さが数マイクロメートルに達した。一方、活性型α−シヌクレインフィブリルは、長さが約５５−７５ｎｍであり、幅が約６−８ｎｍであった（図２Ｃ参照）。
【０１３４】
これらの結果は、α−シヌクレインモノマーおよび凝集体の２つの集団：活性型α−シヌクレイン集団および不活性型α−シヌクレイン集団があることを証明している。
【０１３５】
実施例３：活性型α−シヌクレイン集団に対するモノクローナル抗体の作製
実施例１に記載のＲａｐｉｄＰｒｉｍｅ技術を用いて、活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマー（実施例１）に対するマウスモノクローナル抗体を調製した。最初のラウンドのクローンでの最初のスクリーニング実験を、間接ＥＬＩＳＡ（ここで、抗原をプレート上にコーティングし、スクリーニングされている抗体を結合させ、次いで、この結合を、マウスモノクローナルに特異的であり、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結させた二次抗体を添加することにより検出して、ＴＭＢによる発色反応の検出を触媒する；実施例１）を用いて活性型モノマーまたは活性型凝集体（ＰＦＦ）のいずれかで実行して、陽性クローンを同定した。選択された抗体分泌ハイブリドーマは、抗体価によって同定され、次いで、実施例１に記載のようにアイソタイプ化された。α−シヌクレインモノマーの活性型に対する抗体であるが、不活性型に対するものではない抗体を分泌するハイブリドーマが選択された。α−シヌクレインモノマーの活性型に結合する２０個を超えるモノクローナル抗体が同定された。
【０１３６】
選択されたモノクローナル抗体のさらなる特徴付けは、変性されたマウス脳サンプルおよびＨｅＬＡ溶解物のウェスタンブロット分析を用いることにより実施された。他の抗α−シヌクレイン抗体クローンと比較したとき、ユニークな結合パターンをもたらす１つの抗体（２Ｆ１１）が同定された。２Ｆ１１の配列は、配列番号１０−１３に提供されている（図１１ＡおよびＢ）。
【０１３７】
図３Ａに示すように、２Ｆ１１は、単量体α−シヌクレインに関連する１５ｋＤａバンドとは対照的に、高分子量バンド（＞１５０ｋＤａ）を同定した。４Ｆ１（図３Ｂ）および３Ｆ８（図３Ｃ）を含む他のα−シヌクレインモノクローナル抗が観察され、１５ｋＤａのバンドが同定された。クローン４Ｆ１および３Ｆ８は、すべて同じ特異性を示す約２０個のモノクローナル抗体のプールから無作為に選択された。さらに、２Ｆ１１は、ＨｅＬａ溶解物の高分子量バンド（＞１５０ｋＤａ）を同定した（図３Ｄ；α−シヌクレインを生じることが知られている、ＵＲＬ：proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cell参照）。
【０１３８】
タンパク質のレベルがポンソー染色またはクーマシーブルー染色を用いた検出レベルを下回っていたため、ウェスタンブロットで２Ｆ１１によって同定された強い陽性シグナルは、高レベルのタンパク質の結果ではないようであった。理論はともかく、この結果は、２Ｆ１１によって識別されたタンパク質が、多くのα−シヌクレイン分子（分子量は少なくとも１０merを示す）を含むオリゴマーであり、モノクローナル抗体に複数の結合部位を提供し、濃度が低いにもかかわらず、高いウェスタンブロット反応を生じることを示唆する。
【０１３９】
２Ｆ１１の重鎖および軽鎖の核酸およびアミノ酸配列を図１１に提供する。
【０１４０】
２Ｆ１１抗体のｐＩは、７．２３および７．２７の見かけのｐＩを有する２つのＩｇＧ１バンドを有すると決定された（Biorad ReadyStrip systemを用いて決定され、Focus Proteomics、USAで分析された）。
【０１４１】
２Ｆ１１抗体の質量分析は、それが質量２４,１３９の軽鎖および質量５０,１５５の重鎖を有することを示した（University of Victoria Proteomics Centre、Victoria、Canadaで分析を行った）。
【０１４２】
２Ｆ１１を用いた免疫沈降
２Ｆ１１は、ウェスタンブロットにおいて単量体α−シヌクレインタンパク質に対してほとんどまたは全く親和性を示さなかったという事実を考慮して、２Ｆ１１を用いて、実施例１に記載の天然条件下でマウス脳溶解物を免疫沈降させた。沈殿物およびフロースルー画分を得て、ウェスタンブロット分析を用いて再検査した（抗体は樹脂に共有結合させたまま、樹脂からタンパク質を溶出することにより、ウェスタンブロットを行う前に抗体から該タンパク質を除去した）。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。
【０１４３】
２Ｆ１１抗体が天然の溶解物中のα−シヌクレインオリゴマーにのみ結合した場合、免疫沈降物のウェスタン分析により安定化されたオリゴマーが明らかになり、モノマーはないことが予期され、これは観察された（図５Ａ）。図５Ａに示すように、２Ｆ１１は、免疫沈降したマウス脳溶解物中のα−シヌクレインの６０−７０ｋＤａオリゴマーを同定した。
【０１４４】
タンパク質の単量体種は、免疫沈降したオリゴマーから洗い流された物質（フロースルー画分）に存在することが観察された（図５Ｂ）。図５Ｂから、２Ｆ１１は３つの画分：α−シヌクレインモノマー（約１５ｋＤａ）、推定α−シヌクレイン三量体（約４０ｋＤａ）およびα−シヌクレインオリゴマー（６０−７０ｋＤａ）、に結合することが観察された。
【０１４５】
２Ｆ１１は、活性型α−シヌクレインモノマーに結合しない
インビボでの２Ｆ１１の結合を評価するために、ＢＶ−２ミクログリア細胞を、２Ｆ１１抗体と共に予めインキュベートした、活性型α−シヌクレインオリゴマーまたは活性型α−シヌクレインモノマーのいずれかで処理した。
【０１４６】
マウスミクログリアＢＶ−２細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたガラスカバースリップ上の２４ウェルディッシュに、２４時間、１００,０００細胞／ウェルで播種した。活性な５０μｇ／ｍｌのα−シヌクレインオリゴマーを、血清不含有ＤＭＥＭ中、５μｇ／ｍｌのモノクローナルα−シヌクレイン抗体（２Ｆ１１）または対照ＩｇＧと共に、ＲＴ（室温）にて１時間、シェーカー上で予めインキュベートした。活性な５０μｇ／ｍｌのα−シヌクレインモノマーを、血清不含有ＤＭＥＭ中、５μｇ／ｍｌのモノクローナルα−シヌクレイン抗体（２Ｆ１１）と共に、ＲＴ（室温）にて１時間、シェーカー上で予めインキュベートした。２５０μｌのα−シヌクレイン免疫複合体を含む培地を、示されたウェルに加え、３７℃にて１時間インキュベートした。処理後、細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、二重免疫細胞化学（ＩＣＣ）を行った。α−シヌクレイン免疫複合体中の２Ｆ１１抗体は、Ａｌｅｘａ  ４８８に結合した抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出された。内在化の経路は、ウサギポリクローナルＬＡＭＰ−１（ａｂ２４１７０、１：２００）を用いて検出された；ＬＡＭＰ−１の検出は、Ｃｙ５に結合させた抗ウサギＩｇＧを用いて達成された。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８を用いて、核を対比染色した。
【０１４７】
オリゴマー結合２Ｆ１１は容易に検出され、主に細胞表面に局在することが分かった。。しかしながら、２Ｆ１１は、α−シヌクレインモノマーと免疫複合体を形成しなかった（データは示さず）。
【０１４８】
これらの結果は、２Ｆ１１が、天然サンプルからの天然条件下および変性条件下（ウェスタンブロット分析において使用）で、α−シヌクレインオリゴマーに結合するが、モノマーに結合せず、安定化オリゴマーおよびモノマーα−シヌクレインの両方が２Ｆ１１により同定されることを示す。
【０１４９】
実施例４：マウスモノクローナル抗体はヒトα−シヌクレインに結合する
マウスおよびヒトのα−シヌクレインの類似性は９５％である（図６参照）。マウスの免疫化に用いられたα−シヌクレインはマウス起源であった。２Ｆ１１が、ヒトサンプルにおいて高分子量のα−シヌクレインオリゴマーを同定するかどうかを決定するために、ヒト脳由来の溶解物、パーキンソン病患者のヒト脳由来の溶解物、およびマウス脳由来の溶解物を、変性条件下（図７）および天然条件下（図８Ａおよび８Ｂ）で、ウェスタンブロット分析を用いて比較した。
【０１５０】
図７を参照して、２Ｆ１１抗体は、それがマウスおよびヒトの少なくとも二重の特異的結合高分子量および中分子量オリゴマーを有することを示した。１５０ｋＤのバンドは、ヒト脳溶解物よりもパーキンソンの病の脳溶解物においてわずかに多くみられたが、マウス脳溶解物ではより少なかった。同じ抗体は、ヒトおよびマウスの両方のサンプルで、変性条件下、単量体α−シヌクレインのバンドも同定した。
【０１５１】
図８Ａによって、天然（非還元）条件下での２Ｆ１１抗体の結合を調べた。天然ゲルをブロットし、２Ｆ１１抗体および４Ｆ１抗体（図８Ｂ）でプローブ化した。結果は、２Ｆ１１が、パーキンソン脳溶解物を含むヒト脳溶解物およびマウス脳溶解物で、サンプルに応じて約６０ｋＤから約２５０ｋＤの、高分子量オリゴマーに結合することを示した。２Ｆ１１は、天然条件下で、精製された活性病原性のα−シヌクレインモノマーまたは凝集体に結合することも観察された。４Ｆ１抗体は、天然条件下で高分子量オリゴマーに結合することも観察された。しかしながら、４Ｆ１は、精製された活性病原性のα−シヌクレインモノマーまたは凝集体を認識しなかった。
【０１５２】
この結果は、天然系において、２Ｆ１１がヒトおよびマウスサンプルの両方に結合できることを示す。さらに、２Ｆ１１抗体（および４Ｆ１抗体）は、天然条件下で、活性型α−シヌクレインモノマーに結合しなかった。理論はともかく、２Ｆ１１は、活性型α−シヌクレインオリゴマーの病原性種、またはレビー小体を構築する経路に直接関与する活性型オリゴマーに結合するのを可能にする、活性型α−シヌクレイン凝集体に対するユニークな結合パターンを有する。
【０１５３】
この結果は、パーキンソン脳溶解物にα−シヌクレインオリゴマーが存在することを示す。また、該抗体が、マウス特異的ではなく、その種の反応性をヒトに拡張することも示している。
【０１５４】
２Ｆ１１結合活性型ヒトα−シヌクレイン凝集体
活性型ヒトα−シヌクレイン凝集体および不活性型ヒトα−シヌクレイン凝集体に結合する２Ｆ１１抗体の特異性は、ドットブロットによって調べられた。このアッセイにおいて、活性型および不活性型シヌクレインタイプをニトロセルロース上に置き、２Ｆ１１を用いてプローブ化した。本発明者らは、活性型および不活性型α−シヌクレインオリゴマー／フィブリル種におけるプレフィブリルＡβオリゴマーに対する正の特異性を有する抗体Ａ１１の能力もまた試験した（Kayed. R, et. al. 2007. Molecular Neurodegeneration 2007, 2:18 doi:10.1186/1750-1326-2-18）。結果を図８Ｃに示し、２Ｆ１１抗体は活性型α−シヌクレイン凝集体にのみ結合することが示される。α−シヌクレインオリゴマーに結合することがKayed et. al. (2007)により示されたＡ１１抗体は、不活性型オリゴマー種／フィブリル種のみに結合する。
【０１５５】
２Ｆ１１抗体がα−シヌクレインオリゴマー原線維に結合したことをさらに証明するために、電子顕微鏡法が用いられた。２Ｆ１１抗体はナノ金粒子に連結され、活性型α−シヌクレイン凝集体に結合することができた。図８Ｄに示すように、２Ｆ１１抗体は活性なヒトα−シヌクレイン凝集体に結合した。
【０１５６】
まとめると、これらの結果は、２Ｆ１１抗体が活性型α−シヌクレイン凝集体に特異的であること、および２種の凝集体（すなわち、活性型および不活性型α−シヌクレイン凝集体）は類似していないことを示している。
【０１５７】
実施例５：２Ｆ１１は、インビトロにおいてβシート構造形成を阻止する
α−シヌクレインβシート構造形成
チオフラビンのインビトロアッセイを用いて、種々の抗体の存在下でのα−シヌクレイン反応の進行を測定した。一般的なα−シヌクレイン反応の動態特性を図９Ａに示す。活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマー（上ライン）の存在下、活性型α−シヌクレインモノマーは反応開始(seed)され、経時的にαヘリックス構造からβシートに変化し、対応してチオフラビン蛍光が増加する（図２Ａで観察される結果と同様；実施例２）。
【０１５８】
βシート構造形成およびチオフラビン蛍光の増加に、活性型α−シヌクレインモノマーおよびα−シヌクレイン凝集体の両方が存在する必要がある。活性型α−シヌクレイン凝集体は、経時的にチオフラビン蛍光がわずかに増加した（上から２番目のライン）が、βシート構造の形成量は活性型α−シヌクレイン凝集体＋活性型α−シヌクレインモノマーの混合物（上ライン）の形成量よりも少ない。図２に示した結果と同様に、活性型α−シヌクレインモノマーは、経時的にゆっくりと自己反応(self-seed)し得る（上から３番目のライン）。
【０１５９】
このアッセイを用いて、抗体２Ｆ１１、４Ｆ１および３Ｆ８、全て同じアイソタイプ抗体（ＩｇＧ１ｋａｐｐａ）、ならびにランダムアイソタイプ対照抗体（ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ、ｃａｔ  ｃｏｄｅ＃  ＳＭＣ−１０４）の、活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマーの存在下でのチオフラビン蛍光の反応速度に対する効果を決定した。結果を図９Ｂ（反応開始時に添加した抗体）および図９Ｃ（反応開始前に予めインキュベートした抗体）に示す。
【０１６０】
図９Ｂに示すアッセイに関して、３０μｇの抗体を、１０ｎＭの活性型α−シヌクレイン凝集体と共に１００μＭの活性型α−シヌクレインモノマーに添加した。抗体が添加されない場合、活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマー（上ライン）、活性型凝集体（上から３番目のライン）または活性型モノマー（上から２番目のライン）の存在下でのβシート構造形成の経時的動態は、図９Ａで観察されたものと似ている。ＳＭＣ−１０４（上から２番目のライン）、４Ｆ１（上から３番目のライン）または３Ｆ８（上から４番目のライン）を反応混合物に添加したとき、総チオフラビン蛍光の減少が観察されたが、βシート構造形成の顕著な増加が依然として観察された。チオフラビン蛍光は、２Ｆ１１抗体の存在下で大幅に減少し（下から４番目のライン）、このことは２Ｆ１１抗体の存在下でβシート構造形成が減少することを示した。
【０１６１】
２Ｆ１１抗体の添加は、遮断が強力であり、最初の１０００分（１６時間）に亘ってβシート構造形成の速度を低下させる。しかしながら、活性型α−シヌクレイン凝集体＋活性型α−シヌクレインモノマー（上ライン）で観察される反応速度は、４Ｆ１もしくは３Ｆ８、または対照抗体ＳＭＣ−１０４の存在下での活性基質の反応速度と同様であった。
【０１６２】
図９Ｃに示すアッセイでは、３０μｇの抗体を、１０ｎＭの活性型α−シヌクレイン凝集体に６０分間添加し、混合物を洗浄して、１００μＭの活性型α−シヌクレインモノマーを添加して反応を開始する前に、未結合抗体を取り除いた。抗体が添加されない場合、活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマー（上ライン）、活性型凝集体（下から４番目のライン）または活性型モノマー（下から２番目のライン）の存在下でのβシート構造形成の動態は、図９Ａで観察されたものと類似している。
【０１６３】
反応開始前の凝集体との抗体のプレインキュベーションにより、２Ｆ１１抗体は、活性型α−シヌクレインモノマーのみ（下から２番目のライン）またはα−シヌクレイン凝集体のみ（下から４番目のライン）のいずれかと同様の方法で、凝集活性を完全に阻害した（下から３番目のライン）。２Ｆ１１反応混合物の存在下での最初の１０００分間での蛍光の増加速度もまた、活性型α−シヌクレイン凝集体および活性型α−シヌクレインモノマー（上ライン）と比較して大幅に減少し、活性型α−シヌクレインモノマーまたはα−シヌクレイン凝集体のいずれかで観察された動態に近似していた。
【０１６４】
３Ｆ８および４Ｆ１との反応の開始前の活性型α−シヌクレイン凝集体のプレインキュベーションは、最初の１０００分に亘って蛍光の増加速度を変えず、結果として、アイソタイプ対照（ＳＭＣ−１０４）抗体とのプレインキュベーションと比較したとき、総蛍光のわずかな違いのみであった。
【０１６５】
これらの結果は、２Ｆ１１抗体が、α−シヌクレイン凝集およびフィブリル化反応が進行してβシート構造を形成するのに必要な構成成分または構造に結合することを明確に示している。従って、２Ｆ１１抗体は、この反応に対して中和効果を示す。
【０１６６】
タウβシート構造形成
タウとα−シヌクレインとの間の既知の相互作用のため（Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304）、タウ誘発βシート構造形成に対するモノクローナル抗体２Ｆ１１の効果を、チオフラビンアッセイを用いて調べた。Li W, Lee VM. (2006, Biochemistry. 45(51):15692-15701. doi: 10.1021/bi061422+）に記載されている方法を用いて、タウ線維をを調製した。
【０１６７】
抗体（２Ｆ１１またはＳＭＣ−１０４のいずれか６０ｕｇ）を、振とうしながら４℃にて１時間、１０ｎＭのタウ線維と共にインキュベートした。混合物を１００００ｒｐｍで５分間遠心し、１ｍＬのＰＢＳで濯いだ。この工程をさらに４回繰り返した。上清を除去し、タウ線維（結合抗体を含む）を、２５μＭのタウ単量体を添加して反応を開始させる前に、１０μＬのＰＢＳに再懸濁させた。チオフラビンＴストックを終濃度２５μＭ真で添加した。チオフラビンＴ蛍光を、振とうしながら３７℃にて１時間から４８時間までインキュベートした後、各ウェルにおいて決定した（励起４５０ｎｍ、発光４８５ｎｍ）。結果を図１３に示す。
【０１６８】
タウ線維のみ、またはタウ単量体のみがアッセイされたとき、バックグラウンド蛍光シグナルが観察された。しかしながら、タウ単量体およびタウ線維の混合物は、βシート構造形成を示す強い蛍光シグナルの生成をもたらす。タウ反応の進行は、モノクローナル抗体２Ｆ１１を、反応の開始前にタウ単量体およびタウ線維と共にプレインキュベートしたとき、遮断されることが観察された。モノクローナル抗体ＳＭＣ−１０４（ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル）は、タウ反応にほとんど影響を与えなかった。
【０１６９】
これらの結果は、モノクローナル抗体２Ｆ１１が、インビトロでタウ線維、βシート構造形成を阻止することを示している。
【０１７０】
実施例６：２Ｆ１１は、インビボで活性型α−シヌクレインフィブリル誘発性レビー小体病理を阻害する
実施例５に示すように、２Ｆ１１がインビトロでα−シヌクレインの凝集を阻害する能力を示したという事実を考慮して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胚の脳から採取された初代皮質細胞においてα−シヌクレイン凝集を阻害する２Ｆ１１抗体の能力を調べた。
【０１７１】
図９Ｄに示すように、ＤＡＰＩで処理され、ｐＳｅｒ１２９ α−シヌクレイン抗体でプローブ化された対照サンプル（左上パネル）は、ＤＡＰＩ染色された核のみを示す。ＤＡＰＩ染色およびｐＳｅｒ１２９ α−シヌクレイン抗体でのプローブ化の後、活性型α−シヌクレインフィブリルの初代脳細胞への添加は、ＤＡＰＩ染色された核およびｐＳｅｒ１２９抗体で染色された細胞の両方を示し（右上パネル）、ｐＳｅｒ１２９のα−シヌクレイン抗体への結合が示され、α−シヌクレインが脳細胞において病理を誘導したことが示される。活性型α−シヌクレインフィブリルおよび２Ｆ１１ｗを初代脳細胞に添加し、ＤＡＰＩに暴露し、ｐＳｅｒ１２９ α−シヌクレイン抗体でプローブ化したとき、バックグラウンドレベルの低いｐＳｅｒ１２９染色と共にＤＡＰＩ染色された核が観察された（下パネル）。従って、α−シヌクレイン凝集体の添加は、初代皮質細胞においてレビー体病変を誘発したが（右上パネル）、２Ｆ１１抗体がα−シヌクレイン凝集体と共に添加されたとき、レビー体病変は抑制された（下パネル）。
【０１７２】
これらの結果は、２Ｆ１１が、初代脳細胞における活性型α−シヌクレインフィブリル誘導性レビー小体病変を阻害することを証明している。
【０１７３】
２Ｆ１１抗体の線条体内注射は、初代ラット皮質細胞においてレビー小体病変の発症を減らす
インビボでのラット皮質細胞におけるレビー小体病変の発症を中和する２Ｆ１１抗体の能力も調べた。接種後３０日目（ｄｐｉ）にラットを安楽死させた。４月齢のオスのLong Evans ラットを無作為化し、４つの群に分けた。それらに、滅菌ＰＢＳ（対照、４μｌのＰＢＳ）、超音波処理した予め形成されたα−ｓｙｎフィブリル（ＰＦＦ；合計４．２ｕｇ）または適用可能なとき、ＰＦＦ＋抗体（２μｇ）のいずれかを１箇所の線条体内注射をした。２つの抗体（２μｇ  抗体）を、それらのレビー小体病変の形成を中和する能力について試験した：２Ｆ１１は、インビトロで病変を中和することが知られており、３Ｄ１０は、インビトロで病変の発生を中和できない別のα−シヌクレイン抗体である。
【０１７４】
線条体内注射の前に、−８０℃で保存されたＰＦＦを解凍し、Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  ｍｏｄｅｌ  １００（Fisher Scientific）を１０％出力で６０パルス（合計３０秒、０．５秒オン、０．５秒オフ）で用いて室温にて超音波処理した。麻酔したラット（イソフルラン吸入）を、定位固定装置に入れた。外科用メス刃を用いて正中切開を行うことにより頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨の表面が乾燥してブレグマを特定した。硬膜まで直径１ｍｍの孔を開ける。適切な場合、滅菌ＰＢＳ、ＰＦＦまたは抗体を含むＰＦＦのいずれかを、５μｌハミルトンシリンジを用いて、右背側線条体の１か所に合計量４μｌ（頭蓋骨から、ＡＰ＋１．６ｍｍ、ＭＬ＋２．４ｍｍ、ＤＶ−４．２ｍｍ）を毎分０．４μｌの速度で注射した。各注射後、シリンジを２分間置いておき、その後ゆっくりと引き抜いた。動物を、手術後に毎週モニタリングし、注射後３０日（ｄｐｉ）に屠殺した。
【０１７５】
動物に、２００ｍＬのヘパリン化０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて０．１Ｍ ＰＢＳで希釈した２００ｍＬの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心腔的に潅流（transcardially perfused）した。灌流後、脳を摘出し、同じ固定液（０．１Ｍ ＰＢＳ中、４％ＰＦＡ）に４℃で一晩浸漬して固定した。Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Leica VT1000S）を用いて、脳を冷ＰＢＳ中で５０マイクロメートルの切片にスライスした。６枚毎に１枚を同じウェルに入れた。動物ごとに１つのウェルを用いて、免疫蛍光染色を行った。切片を１２ウェルプレートのウェルに分け、３ｍＬの２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１Ｍ  ＰＢＳ中の０．２％トライトン−１００Ｘ中で、室温にて１時間インキュベートした。サンプルをブロッキングし透過処理した後、スライスを２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０分間洗浄し、合計３回洗浄した。ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ  ＳＰＣ−７４２（セリン１２９リン酸特異的α−シヌクレイン抗体）の１：５００希釈液を２％ＢＳＡ−ＰＢＳで調製し、各ウェルに添加した。スライスを、ウェルあたり合計容量３ｍＬで、４℃にて一晩、振とうしながらインキュベートした。サンプルを、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０分間洗浄し、合計３回洗浄した。２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８と結合させたヤギ抗ウサギ二次抗体の１：４００希釈液を調製し、各ウェルに添加した。スライスを、ウェルあたり合計容量３ｍＬで、室温にて２時間、振とうしながらインキュベートした。サンプル、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０分間、２回洗浄し、その後、ＤＡＰＩで１０分間対比染色し、ＰＢＳで１０分間洗浄した。スライスをマウントし、約４０分間乾燥させて、フルオロマウント（Fluoromont）−Ｇ（ThermoFisher Scientific, Catalog #00-4958-02）と共にカバースリップをのせた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１共焦点顕微鏡およびＦｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００ソフトウェアを用いて画像を撮影した。ＤＡＰＩは４０５ｎｍレーザーで励起され、Ａｌｅｘａ−４８８は４６１ｎｍレーザーで励起された。全ての取得パラメーター（例えば、レーザー出力、ＨＶ、ゲイン、Ｚステップなど）はサンプル間で一定に保たれた。
【０１７６】
ＰＢＳ中のα−シヌクレインフィブリルで処理したラットから得られた皮質組織の切片は、α−シヌクレイン抗体（ｐＳｅｒ１２９）のα−シヌクレインフィブリルへの結合およびα−シヌクレイン凝集体形成を示す局在蛍光を明らかにした。しかしながら、ＰＢＳ（対照）処理ラットにおいて、蛍光は観察されず、α−シヌクレイン凝集体が形成されないことが示された。局在蛍光はまた、α−シヌクレインフィブリルおよび抗体３Ｄ１０で処理されたラット皮質細胞でも観察され、抗体（ｐＳｅｒ１２９）のα−シヌクレインフィブリルへの結合およびα−シヌクレイン凝集体の形成が示された。α−シヌクレインフィブリルおよび抗体３Ｄ１０で処理された皮質細胞における局在結合の量は、α−シヌクレインフィブリルのみを投与されたラットから得られた皮質組織のスライスで観察された量と類似していた。α−シヌクレインフィブリルおよび抗体２Ｆ１１で処理したラット脳から得られた皮質細胞において局在蛍光が観察されたが、局在結合部位の数および局在結合部位のサイズの両方は、α−シヌクレインフィブリルのみ、またはα−シヌクレインフィブリルおよび抗体３Ｄ１０で処理したとき、皮質細胞において観察された結合部位の数およびサイズと比べて減少した。
【０１７７】
上記の結果は、脳組織の２Ｆ１１抗体での処置が、インビボでラット皮質細胞のレビー体病変の発生を低減することを証明している。
【０１７８】
２Ｆ１１はα−シヌクレインの細胞毒性効果を低下させる
α−シヌクレインは細胞毒性効果を有することが知られており、したがって、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞の細胞毒性を低下させる２Ｆ１１抗体の能力を調べた。
【０１７９】
ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに２０,０００細胞／ウェルで播種し、１０μＭのＲＡの存在下で５日間分化させた。細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、α−シヌクレインオリゴマーの毒性作用を中和するα−シヌクレイン抗体（２Ｆ１１）の能力を調べた。活性型α−シヌクレインオリゴマー、不活性型α−シヌクレインオリゴマーおよび活性型α−シヌクレインモノマー（２５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）を、血清不含有ＤＭＥＭ中、振盪機上で、ＲＴにて２時間、５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体２Ｆ１１と共にプレインキュベートした。培地を除去し、活性型α−シヌクレイン凝集体＋２Ｆ１１抗体を含む１００μｌの培地を関連するウェルに添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。処理後、細胞を直ちに１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、β−ＩＩＩチューブリン抗体を用いて免疫染色した（β−ＩＩＩチューブリンは神経細胞マーカーとして用いられる）。細胞死は、総細胞の割合またはβ−ＩＩＩ陽性ニューロンの割合として表された。結果を図９Ｅに示す。
【０１８０】
活性型α−シヌクレインオリゴマーをヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞に添加し、次いで活性型α−シヌクレイン凝集体を添加すると、対照（未処理）細胞、不活性型α−シヌクレインオリゴマーに曝露した細胞または活性型α−シヌクレインモノマーに暴露した細胞と比較して、より高い割合の細胞死をもたらした。この結果は、活性型α−シヌクレインオリゴマーが活性型α−シヌクレイン凝集体によって動員され、反応により、不活性型α−シヌクレインオリゴマーと比較して細胞死が増加することを示している。
【０１８１】
活性型α−シヌクレインオリゴマーをヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞に添加し、次いで活性型α−シヌクレイン凝集体＋２Ｆ１１抗体を添加すると、不活性型α−シヌクレインオリゴマーまたは活性型α−シヌクレインモノマーに暴露された細胞で観察されるレベルよりも細胞死が（約２．５倍）低下した。これらの結果は、２Ｆ１１が、インビボでα−シヌクレインオリゴマーの毒性作用を遮断または中和することを示している。
【０１８２】
実施例７：エピトープマッピング
２Ｆ１１、および４Ｆ１、３Ｆ８を含むいくつかの他の抗体（および、実施例３に記載のように調整された他のもの）のエピトープ結合を、約３０アミノ酸長のα−シヌクレインペプチドへの結合によって評価し、ここで、各α−シヌクレインペプチドは、隣接するアミノ配列の約１０アミノ酸残基で重複している（上記：“エピトープマッピングのためのペプチド合成”）。
【０１８３】
一連の重複ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット（ＤＢ）またはウェスタンブロット（ＷＢ）を用いた分析の前にＢＳＡに結合された。
【０１８４】
実施例３に記載のように、約２０抗体が活性型α−シヌクレインモノマーに結合するとして選択されたが、それらは天然または変性条件下で異なる結合を示した。従って、３つの方法を選択して、マッピング分析のために変性および天然結合条件の両方を含めた。これらの方法としては以下が挙げられる：ウェスタンブロット（変性条件下）、ドットブロット（非変性条件下（ウェスタンブロットと同様の出力システムを用いるが、サンプルをドデシル硫酸ナトリウム、還元剤および沸騰温度などのイオン性界面活性剤で変性しない））、およびＥＬＩＳＡ（非変性条件下）。実施例３で最初に選択された１５個の抗体の結合分析の結果を図１０に示す。
【０１８５】
図１０に示される結果から、２Ｆ１１クローンは、アミノ酸６１−９０およびアミノ酸１０１−１３０（ＥＬＩＳＡを用いて決定される）に特異的に結合するクローンのみである、ユニークなエピトープマップを示した。残りの抗体は、領域の異なる組み合わせに結合した。例えば、クローン３Ｆ８はまた、Ｃ末端部分への強い結合を示した（アミノ酸１０１−１３０および１２１−１４０；変性法および非変性法の両方を使用）。クローン３Ｆ８もまた、アミノ酸４１−７０に結合した。
【０１８６】
これらの結果は、２Ｆ１１抗体のユニークな性質をさらに示している。２Ｆ１１のユニークな結合能により、α−シヌクレイン凝集および線維化反応のコア構成成分を結合および中和することができる。
【０１８７】
実施例８：毒性α−シヌクレインオリゴマーを測定するためのＥＬＩＳＡ
サンドイッチベースのＥＬＩＳＡテストを、２Ｆ１１を用いて調製した。対照処置群には、４Ｆ１および３Ｆ８抗体を用い得る。組換えα−シヌクレインまたは活性型α−シヌクレイン凝集体を、標準として用い得る。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、毒性α−シヌクレインオリゴマーを選択的に測定できる。このアッセイでは不活性な単量体または不活性なα-シヌクレイン凝集体は同定されない。
【０１８８】
実施例９：マウス免疫化
α−ｓｙｎトランスジェニック（ｔｇ）マウス（ＰＤモデル；ＵＲＬ：jax.org/strain/004479; Masliah et al., 2011参照）および非ｔｇマウスを、２Ｆ１１、３Ｆ８および４Ｆ１抗体を用いて、Masliah et al. 2011で定義されるように、毎週の腹腔内注射を６月間行い、個々に免疫化する。
【０１８９】
行動的応答
α−ｓｙｎトランスジェニック（ｔｇ）マウスおよび非ｔｇマウスの両方の行動応答を、Masliah et al. 2011に記載のように、６カ月の毎週の腹腔内注射後、水迷路、ポール試験およびロータロッド試験を用いて評価する。結果は、免疫化されたｔｇマウスがより良好な記憶回復を有し、非ｔｇマウスと同様の方法でタスクを完了できたかどうか、および抗体処置が学習障害を逆転させるかどうかを決定し得る。
【０１９０】
血漿レベル
マウス血漿および脳せき髄液中の２Ｆ１１、３Ｆ８、４Ｆ１抗体の力価を、６カ月に亘って決定する。脳の力価が増加すると、抗体が血液脳関門を通過できることが示され得る。
【０１９１】
免疫組織化学
６月後、動物を屠殺し、それらの海馬および新皮質のサンプルを免疫組織化学的に分析する（Masliah et al. 2011に記載のように）。結果は、免疫化されたｔｇマウスの海馬および新皮質でα−シヌクレインのレベルが変化していることを示す。
【０１９２】
すべての引用文献は、引用により本明細書に包含される。
【０１９３】
本発明は、１以上の態様に関して記載されている。しかしながら、特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正が可能であることは当業者には明らかであり得る。
【０１９４】
文献
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【図１】
2020529473.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2020529473000001.app
【国際調査報告】
2020529473.tif 000026