(57)【要約】  薬物溶出性ステント（ＤＥＳ）中に現在使用されている抗細胞増殖薬のシロリムス又はシロリムス類縁体及びパクリタクセル又はパクリタクセル類縁体に比べて同じ又はより大きな程度で血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の選択的で有意に阻害できる、ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）−ｓｉＲＮＡ溶出性、カルポニン１（ＣＮＮ１）−ｓｉＲＮＡ溶出性、レイオモディン１（ＬＭＯＤ）−ｓｉＲＮＡ溶出性、スムーテリン（ＳＭＴＮ）−ｓｉＲＮＡ溶出性、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ溶出性、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ溶出性、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ溶出性、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡ溶出性、及びアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡ溶出性の医療デバイスであり、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡ溶出性、及びＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡ溶出性の医療デバイスは、シロリムス又はシロリムス類縁体及びパクリタクセル又はパクリタクセル類縁体等の抗細胞増殖薬を溶出する現在のＤＥＳと比べ、早期の医療デバイスストラットの被覆及び／又は血管再内皮化を促進する。
2020529267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）溶出性医療デバイスと、
ｂ）少なくとも１種の遺伝子サイレンサー（ｓｉＲＮＡ）と
を含む、迅速なストラットの被覆および血管内皮の被覆を促進するためのデバイスであって、
該溶出性医療デバイスが、少なくとも１種の遺伝子サイレンサーによってコーティングまたは充填されており、
該遺伝子サイレンサーが、ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）−ｓｉＲＮＡ、カルポニン１（ＣＮＮＩ）−ｓｉＲＮＡ、レイオモディン１（ＬＭＯＤ）−ｓｉＲＮＡ、スムーテリン（ＳＭＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡおよびアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡから選択され、
該遺伝子サイレンサーが、内皮細胞（ＥＣ）増殖の阻害を伴わない血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）過剰増殖に対して選択的な阻害を目的として血管内に局所的に送達されて、血管壁およびＶＳＭＣに進入する、デバイス。
【請求項２】
遺伝子サイレンサー媒体を含む、請求項１に記載のデバイスであって、該遺伝子サイレンサー媒体が、前記遺伝子サイレンサーの溶出を助長し、前記血管壁およびＶＳＭＣへの前記遺伝子サイレンサーの進入を可能にする、デバイス。
【請求項３】
前記溶出性医療デバイスが、任意の植込み型デバイスおよび非植込み型局所薬物送達デバイスから選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記植込み型デバイスが、金属ステントおよび生体吸収性血管スキャフォールド（ＢＶＳ）から選択される、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記非植込み型局所薬物送達デバイスが、薬物溶出性バルーン（ＤＥＢ）、局所薬物送達カテーテル、ならびに、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡを局所的に送達することが可能な任意の他の医療デバイスから選択される、請求項３に記載のデバイス。
【請求項６】
前記遺伝子サイレンサー媒体が、レンチウイルスおよびプラスミドと、ナノ粒子と、フルオロポリマーと、生体吸収性ポリマーと、非吸収性ポリマーとからなる群より選択され、またはポリマー不含であってもよい（いかなる種類のポリマーも含まないことが可能である）、請求項２に記載のデバイス。
【請求項７】
前記遺伝子サイレンサーが、単独で送達され、または別の遺伝子サイレンサーもしくは抗細胞増殖薬と組み合わせて送達される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
遺伝子サイレンサー濃度が、前記遺伝子サイレンサーを、非常に薄い単一の層から最大ではいくつかの厚い層までにわたる前記医療デバイスの表面に、局所的に送達すべき該遺伝子サイレンサーの所望の量に到達するように散在させることができるという理由で、幅広い濃度範囲の１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
血管の恒久的な開通性と、処置済みの血管区域の早期再内皮化との両方を促進する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
ａ）溶出性医療デバイスおよび少なくとも１種の遺伝子サイレンサーと、
ｂ）少なくとも１種の遺伝子サイレンサーによって溶出性医療デバイスをコーティングし、または少なくとも１種の遺伝子サイレンサーによって該溶出性医療デバイスを充填することと、
ｃ）該遺伝子サイレンサーを血管の標的区域に送達することと、
ｄ）該遺伝子サイレンサーを、次の遺伝子サイレンサー、すなわち、ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）−ｓｉＲＮＡ、カルポニン１（ＣＮＮ１）−ｓｉＲＮＡ、レイオモディン１（ＬＭＯＤ）−ｓｉＲＮＡ、スムーテリン（ＳＭＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡおよびアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡから選択することと
を含む、迅速なストラットの被覆および血管内皮の被覆を促進するための方法であって、
該遺伝子サイレンサーが、ＶＳＭＣ過剰増殖の選択的な阻害を目的として血管の標的区域に送達されて、血管壁およびＶＳＭＣに進入し、
該遺伝子サイレンサーが、ＥＣ生成に有意に干渉せず、またはＥＣ生成を活発化させることさえできる、方法。
【請求項１１】
前記遺伝子サイレンサーを遺伝子サイレンサー媒体に装入することをさらに含む、請求項１０に記載の方法であって、
該遺伝子サイレンサー媒体が、該遺伝子サイレンサーの溶出を助長し、
該遺伝子サイレンサー媒体が、標的の前記血管壁およびＶＳＭＣへの該遺伝子サイレンサーの進入を可能にする、方法。
【請求項１２】
前記溶出性医療デバイスが、任意の植込み型デバイスおよび非植込み型局所薬物送達デバイスから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記植込み型デバイスが、金属ステントおよびＢＶＳから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非植込み型局所薬物送達デバイスが、ＤＥＢ、局所薬物送達カテーテル、ならびに、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡを局所的に送達することが可能な任意の他の医療デバイスから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子サイレンサー媒体が、レンチウイルスおよびプラスミドと、ナノ粒子と、フルオロポリマーと、生体吸収性ポリマーと、非吸収性ポリマーとからなる群より選択され、またはポリマー不含であってもよい（いかなる種類のポリマーも含まないことが可能である）、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子サイレンサーが、単独で送達され、または別の遺伝子サイレンサーもしくは抗細胞増殖薬と組み合わせて送達される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子サイレンサー濃度が、前記遺伝子サイレンサーを、非常に薄い単一の層から最大ではいくつかの厚い層までにわたる前記医療デバイスの表面に、局所的に送達すべき該遺伝子サイレンサーの所望の量に到達するように散在させることができるという理由で、幅広い濃度範囲の１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
血管の恒久的な開通性と、処置済みの血管区域の早期再内皮化との両方を促進する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、医療デバイスの分野に関し、より特定すると、迅速なストラットの被覆および血管内皮の被覆を促進するためのデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物溶出性ステント（ＤＥＳ）は、ベアメタルステント（ＢＭＳ）に比較して再狭窄率を有意に低下させたが、ステントの再内皮化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）速度を有意に低下させ、ステント血栓症率を上昇させ、この結果、このような高い血栓症率を最小化するためには、長期間のわたる２剤併用抗血小板療法（ＤＡＰＴ：ｄｕａｌ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）の採用が必要になった。
【０００３】
したがって、ＤＡＰＴの持続期間は、ＢＭＳの場合における３０日間から、ＤＥＳを使用した場合における１２か月間まで延びた。長期にわたるＤＡＰＴの持続期間は、臨床学的および金銭的な影響を与えるものである。
【０００４】
このような臨床学的影響の中でも特に、ここ最近で消化管出血、出血性卒中、脊髄動静脈奇形、腫瘍等の既往歴がある患者等、出血しやすい傾向がある患者と、特に挙げれば、心房細動、心房粗動、人工心臓弁の存在、血栓形成傾向、および／または、ここ最近で深部静脈血栓症および／または肺塞栓の既往歴がある患者等、複数の経口抗凝血薬の併用を必要としている患者とにおいて特段に上昇する、出血の危険性である。
【０００５】
別の重要な臨床学的態様は、外科手術または歯科的措置の必要性である。ＤＡＰＴを受けている患者は、外科的措置または歯科的措置を受けることができない。したがって、可能ならば常に、１２か月間のＤＡＰＴが終了するまで外科的措置または歯科的措置を延期すべきであるが、このような延期は、大半の場合において実行可能ではなく、患者には、外科手術前に少なくとも５日間ＤＡＰＴを中断し、通常、中規模または大規模の外科手術から２日後にＤＡＰＴを再開することを要求するものであり、したがって、このＤＡＰＴの中断期間中にわたってステント血栓症率が上昇し、この結果、ステント閉塞症による急性心筋梗塞率が上昇する。
【０００６】
最後に、血腫は、主に長期間にわたってＤＡＰＴを受けている年配の患者から頻繁に訴えられるものである。場合によっては、毛細血管脆弱性は、患者が耐えることができず、推奨期間の経過前にＤＡＰＴを中断しなければならなくなるようなものである。
【０００７】
金銭的な観点においては、チエノピリジンおよびＰ２Ｙ１２受容体阻害剤は、高コストの薬物であり、したがって、ＤＡＰＴがＢＭＳのときの３０日間からＤＥＳのときの１２か月間まで引き延ばされた場合、個人と、特に公的医療制度への金銭的な影響は、著しいものになる。
【０００８】
現在利用可能なＤＥＳは、シロリムスまたはシロリムスアナログ、すなわち、エベロリムス、バイオリムスおよびゾタロリムス等として、抗増殖薬を局所的に送達する。パクリタクセルは、第１世代ＤＥＳにおいて使用されたが、後に中断されることになった別のクラスの抗増殖薬である。しかしながら、現時点において、この抗増殖薬は、現在利用可能な事実上すべてのＤＥＢ（薬物溶出性バルーン）に使用されている。
【０００９】
シロリムスおよびシロリムスアナログとパクリタクセルとは両方とも、ある特定の種類の細胞に対して非選択的な活性を有する抗増殖剤であり、すなわち、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）および内皮細胞（ＥＣ）等の任意の種類の細胞の増殖を、包括的で広範な様式で阻害する。シロリムスおよびシロリムスアナログは、細胞内受容体ＦＫ結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）に結合し、この結果として、ほ乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）経路を阻害することにより、Ｇ１−Ｓ細胞周期における細胞増殖を阻害することによって、作用する（非特許文献１）。ｍＴＯＲ経路は、細胞の間期を遮断して、Ｇ１期からＳ期への細胞周期の進行を妨害する。したがって、ＤＮＡ合成なしでも、細胞は、有糸分裂を実施できる状態にならない（非特許文献２；非特許文献３）。パクリタクセルもまた、細胞周期の遮断を促進するが、シロリムスとは異なる機構によって遮断する。パクリタクセルは、細胞周期のＧ２〜Ｍ期に作用して、細胞が、間期のＧ２期から有糸分裂の開始に移行できないようにする（非特許文献４）。そういうわけで、パクリタクセルは、細胞分裂のプロセス中における紡錘糸の形成およびクロモサムの配向のための基本要素である微小管の形成に作用する（非特許文献５）。
【００１０】
バルーンカテーテルを用いる冠動脈介入が始まったため、理想的な医療デバイスの探求が続行中である。９０年代には、アテロームアブレーション（ａｔｈｅｒｏａｂｌａｔｉｏｎ）デバイス（方向性アテレクトミーおよび回転性アテレクトミー、すなわち、ロータブレータ）および金属ステント等のいくつかの医療デバイスが評価されたが、バルーン、方向性アテレクトミーおよびロータブレータとの比較では、金属ステントが最良の臨床結果を示した。ＢＭＳの出現による措置成功率の上昇および再狭窄率の低下においてなされた出現にもかかわらず、患者の臨床学的特徴および血管造影法的な特徴によっては、ステント内再狭窄（ＩＳＲ）が依然として高いままであり、２０〜５０％にわたる。
【００１１】
２０００年代初め頃には、有意にＩＳＲを低下させるＤＥＳの進歩に伴って、新たな著しいブレークスルーが成し遂げられた。しかしながら、ＤＥＳは、有意にステント再内皮化を遅延させ、この結果、ステント血栓症率を上昇させ、この結果として、ＤＡＰＴの持続期間を延長した。したがって、血管の恒久的な開通性と処置済みの血管区域の早期再内皮化との両方を同時に確保する医療デバイス、すなわち、ＶＳＭＣ増殖を阻害し、ＥＣ生成および局所的な堆積に干渉せず、またはこれらを活発化することさえできる医療デバイスの探求は、必要とされ続けている。
【００１２】
シロリムスおよび／またはシロリムスアナログならびにパクリタクセル等の抗増殖薬は、ステント内側の表面における内皮の再確立を遅延させるため、このように血管壁の保護機構がないことにより、新生内膜過形成の進行が可能になる（非特許文献６）。研究により、早期再内皮化は再狭窄を防止することが示されている、したがって、ＶＳＭＣを阻害して迅速な再内皮化を促進することが可能な薬物を溶出するＤＥＳはおそらくは、さらなる有益性を提供するであろうが、このとき、現在のＤＥＳにおいて使用されている抗増殖薬に比べてＶＳＭＣの阻害における優越性がより高い可能性がある。内皮は、血管緊張の調節および心血管ホメオスタシスの維持において、重要な役割を担い、これにより、免疫系の活性化による血栓溶解、血管再構築および炎症反応の制御を左右するものである（非特許文献７）。
【００１３】
現在利用可能なＤＥＳは、ＶＳＭＣ過剰増殖の阻害によって制御された新生内膜形成により、わずか８％の平均ＩＳＲを示す。このような低いＩＳＲ率は主に、ステントの不完全密着、サイズが不十分なステントまたは展開が不十分なステント等、機械的な問題に帰せられる。したがって、現在のＤＥＳの改善に関する最も重要な課題は、上述の抗増殖薬がＶＳＭＣとＥＣとの両方を阻害することを理由にして、ステント再内皮化に左右される。したがって、このようなステント再内皮化の遅延は、上記においてすでに言及したように、臨床学的および金銭的な観点における著しい悪影響をもたらす。
【００１４】
したがって、迅速なストラットおよび／または血管内皮の被覆を促進する医療デバイスを作り出すという目的でＥＣの増殖に干渉することなくＶＳＭＣを阻害することが可能にする薬物が、現在必要とされている。ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）−ｓｉＲＮＡおよびカルポニン１（ＣＮＮＩ）−ｓｉＲＮＡという２種の遺伝子サイレンサーは、血管の閉塞を取り除くために使用される医療デバイス用として最も効果的な薬物であると特定されている。ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性またはＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスの主な利点は、このような遺伝子サイレンサー溶出性医療デバイスが、ＶＳＭＣ過剰増殖の効率的な阻害によって血管の再閉塞を防止するのと同時に、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡがＥＣの増殖を阻害しないため、早期再内皮化を促進するという点である。
追加実験において、遺伝子サイレンサーであるレイオモディン１（ＬＭＯＤ：ｌｅｉｏｍｏｄｉｎ１）−ｓｉＲＮＡ、スムーテリン（ＳＭＴＮ：ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）−ｓｉＲＮＡ、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡおよびアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡもまた、このような遺伝子サイレンサーがやはりＥＣの増殖を有意に阻害しないため、ＶＳＭＣ過剰増殖の阻害および早期再内皮化の促進を行うのに効果的であることが見出された。したがって、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性およびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスの他にも、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性およびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスも含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｂｅ  Ｍ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｔ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｆ，Ｎａｋａｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂａｌｌｏｏｎ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ  ｆｏｒ  Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｊ−Ｃｙｐｈｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２２：４２−５１
【非特許文献２】Ｙａｎｏ  Ｈ，  Ｈｏｒｉｎａｋａ  Ｓ，  Ｙａｇｉ  Ｈ，Ｉｓｈｉｍｉｔｓｕ  Ｔ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−ａｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｎ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ．Ｈｅａｒｔ  Ｖｅｓｓｅｌｓ．２０１２
【非特許文献３】Ｃｕｒｃｉｏ  Ａ，Ｔｏｒｅｌｌａ  Ｄ，Ｉｎｄｏｌｆｉ  Ｃ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｎｔｉｎｇ：ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｉｒｃ  Ｊ．２０１１；７５：１２８７−９６
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇ  Ｈ，Ａｎ  ＳＪ，Ｚｈａｎｇ  ＸＣ，Ｄｏｎｇ  Ｓ，Ｚｈａｎｇ  ＹＦ，Ｃｈｅｎ  ＺＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１；６７：６３７−４６
【非特許文献５】Ｐｉｒｅｓ  ＮＭ，Ｅｅｆｔｉｎｇ  Ｄ，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ＭＲ，Ｑｕａｘ  ＰＨ，Ｊｕｋｅｍａ  ＪＷ．Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ  ａｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｐｒｏｖｏｋｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｏｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ａｒｔｅｒｉｅｓ．Ｈｅａｒｔ．２００７；９３：９２２−７
【非特許文献６】Ｔａｒａｎｔｉｎｉ  Ｇ，Ｆａｃｃｈｉｎ  Ｍ，Ｃａｐｏｄａｎｎｏ  Ｄ，Ｍｕｓｕｍｅｃｉ  Ｇ，Ｓａｉａ  Ｆ，Ｍｅｎｏｚｚｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ  ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｄｏｅｓ  ｓｔｅｎｔ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ／ｏｒ  ｓｔｅｎｔ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｍａｔｔｅｒ？：ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ２，４２９−ｐａｔｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ．２０１３；８１：８０−９
【非特許文献７】Ｌｕｚ  ＰＬ．Ｅｎｄｏｔｅｌｉｏ  ｅ  ｄｏｅｎｇａｓ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｅｓ．Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ：Ａｔｅｎｅｕ；２００５．Ｇｌａｓｓｅｒ  ＳＰ，Ｓｅｌｗｙｎ  ＡＰ，Ｇａｎｚ  Ｐ．  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１９９６；１３１：３７９−８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、迅速なストラットの被覆および血管内皮の被覆を促進するためのデバイスおよび方法を導入することによって、上記問題を克服する。本発明は、ＶＳＭＣ過剰増殖を阻害し、血管の早期再内皮化を促進する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記事項を鑑みて、本明細書に含まれる一実施形態は、ＶＳＭＣ過剰増殖を阻害し、血管の早期再内皮化を促進するためのデバイスおよび方法を提供する。
【００１８】
本明細書に含まれる一実施形態は、迅速なストラットの被覆および血管内皮の被覆を促進するためのデバイスを提供する。本デバイスは、溶出性医療デバイスおよび少なくとも１種の遺伝子サイレンサーを含む。溶出性デバイスは、少なくとも１種の遺伝子サイレンサーによってコーティングまたは充填されている。遺伝子サイレンサーは、ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）−ｓｉＲＮＡ、カルポニン１（ＣＮＮＩ）−ｓｉＲＮＡ、レイオモディン１（ＬＭＯＤ）−ｓｉＲＮＡ、スムーテリン（ＳＭＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡおよびアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡから選択される。遺伝子サイレンサーは、ＥＣ増殖の阻害を伴わないＶＳＭＣ過剰増殖の選択的な阻害を目的として血管に局所的に送達されて、血管壁およびＶＳＭＣに進入する。
【００１９】
段落［００１８］において言及されたデバイスに関連付けられた実施形態において、本デバイスは、遺伝子サイレンサーの溶出を助長する遺伝子サイレンサー媒体を含む。遺伝子サイレンサー媒体は、血管壁および血管平滑筋細胞への遺伝子サイレンサーの進入を可能にする。同じ実施形態において、遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミドと、ナノ粒子と、フルオロポリマーと、生体吸収性ポリマーと、非吸収性ポリマーとからなる群より選択され、またはポリマー不含（いかなる種類のポリマーも含まない）であってもよい。
【００２０】
段落［００１８］において言及されたデバイスに関連付けられた実施形態において、溶出性医療デバイスは、任意の植込み型デバイスおよび非植込み型局所薬物送達デバイスから選択される。
【００２１】
段落［００１８］において言及されたデバイスに関連付けられた実施形態において、植込み型デバイスは、金属ステントおよび生体吸収性血管スキャフォールド（ＢＶＳ）から選択される。
【００２２】
段落［００１８］において言及されたデバイスに関連付けられた実施形態において、非植込み型局所薬物送達デバイスは、ＤＥＢ、局所薬物送達カテーテル、ならびに、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡを局所的に送達することが可能な任意の他の医療デバイスから選択される。
【００２３】
段落［００１８］において言及されたデバイスに関連付けられた実施形態において、遺伝子サイレンサーは、単独で送達され、または別のｓｉＲＮＡもしくは抗細胞増殖薬と組み合わせて送達される。
【００２４】
段落［００１８］において言及されたデバイスに関連付けられた実施形態において、遺伝子サイレンサー濃度は、遺伝子サイレンサーを、非常に薄い単一の層から最大ではいくつかの厚い層までにわたる医療デバイスの表面に、局所的に送達すべき遺伝子サイレンサーの所望の量に到達するように散在させることができるという理由で、幅広い濃度範囲の１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００２５】
本明細書に含まれる一実施形態は迅速なストラットの被覆および血管内皮の被覆を促進するための方法を記述する。本方法は、
ａ）溶出性医療デバイスおよび少なくとも１種の遺伝子サイレンサーと、
ｂ）少なくとも１種の遺伝子サイレンサーによってコーティングまたは充填された溶出性医療デバイスと、
ｃ）遺伝子サイレンサーが、ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）−ｓｉＲＮＡ、カルポニン１（ＣＮＮＩ）−ｓｉＲＮＡ、レイオモディン１（ＬＭＯＤ）−ｓｉＲＮＡ、スムーテリン（ＳＭＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡおよびアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡから選択されることと、
ｄ）遺伝子サイレンサーが、血管の早期再内皮化区域を促進し、ＶＳＭＣ過剰増殖のみを阻害し、この結果、遺伝子サイレンサーがＥＣ生成に有意に干渉せず、またはＥＣ生成を活発化することさえできることと、ｅ）遺伝子サイレンサーが、血管の標的区域に送達されることと、
ｆ）遺伝子サイレンサーを、遺伝子サイレンサー媒体に装入することができることと、
ｇ）遺伝子サイレンサー媒体が、遺伝子サイレンサーの溶出を助長することと、
ｈ）遺伝子サイレンサー媒体が、標的化された血管壁および血管平滑筋細胞への遺伝子サイレンサーの進入を可能にすることと、
ｉ）遺伝子サイレンサーを、本デバイスの表面に直接（媒体なしで）担持させることができ、または本デバイスに装入することができることと
を含む。
【００２６】
複数ある実施形態の一つにおいて、本方法は、血管の恒久的な開通性と、処置済みの血管区域の早期再内皮化との両方を助長する。
【００２７】
本明細書に含まれる実施形態に関する上記および他の態様は、下記の記述および添付の図面と組み合わせて検討すれば、より深く把握および理解されよう。しかしながら、好ましい実施形態およびこれらの好ましい実施形態に関する数多くの特定の詳細を示している下記の記述は、限定を加えるためではなく、説明のために与えられているものであることを理解すべきである。数多くの変更形態および修正形態が、本明細書に含まれる実施形態の範囲で、それらの形態の趣旨から逸脱することなくなされ得るが、本明細書に含まれる実施形態は、すべてのこのような修正形態を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】下記の処置群に応じた、ヒトＶＳＭＣを内包するボトル内でのＶＳＭＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミドである。
【図２】下記の処置群に応じた、ヒトＥＣを内包するボトル内でのＥＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミドである。
【図３】下記の処置群に応じた、ヒトＶＳＭＣを内包するボトル内でのＶＳＭＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミドである。
【図４】下記の処置群に応じた、ヒトＥＣを内包するボトル内でのＥＣ増殖を表す図であり、遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミドである。
【図５】下記の処置群に応じた、ヒトＶＳＭＣを内包するボトル内でのＶＳＭＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミドである。
【図６】下記の処置群に応じた、ヒトＶＳＭＣを内包するボトル内でのＶＳＭＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサーおよび抗細胞増殖薬の媒体は、ナノ粒子である。
【図７】下記の処置群に応じた、ヒトＥＣを内包するボトル内でのＥＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサーおよび抗細胞増殖薬の媒体は、ナノ粒子である。
【図８】下記の処置群に応じた、ヒトＶＳＭＣを内包するボトル内でのＶＳＭＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサーおよび抗細胞増殖薬の媒体は、ナノ粒子である。
【図９】下記の処置群に応じた、ヒトＥＣを内包するボトル内でのＥＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサーおよび抗細胞増殖薬の媒体は、ナノ粒子である。
【図１０】増大していく相異なる用量における下記の処置群に応じた、ヒトＶＳＭＣを内包するボトル内でのＶＳＭＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサーおよび抗細胞増殖薬の媒体は、ナノ粒子である。
【図１１】増大していく相異なる用量における下記の処置群に応じた、ヒトＥＣを内包するボトル内でのＥＣ増殖を表す、図であり、遺伝子サイレンサーおよび抗細胞増殖薬の媒体は、ナノ粒子である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
添付の図面に提示されており、下記の記載においても詳述されている、非限定的な実施形態を参照しながら、本明細書に含まれる実施形態ならびにこれらの実施形態に関する様々な特徴および利点の詳細を、より完全に説明する。周知の成分および処理法に関する記述は、本明細書に含まれる実施形態を不必要に不明瞭にしないように、省略されている。本明細書において使用されている例は単に、本明細書に含まれる実施形態が実施され得る態様に関する理解を容易にすることと、さらには、本明細書に含まれる実施形態を当業者が実施できるようにすることとを意図したものである。したがって、これらの例は、本明細書に含まれる実施形態の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。
【００３０】
本明細書に含まれる実施形態は、ＶＳＭＣ過剰増殖を阻害し、血管の早期再内皮化を促進するためのデバイスおよび方法を提供することによって、これを達成する。インターベンション心臓病学の出現を理由にして、血管の恒久的な開通性と、処置済みの血管区域の早期再内皮化との両方を提供する医療デバイス、すなわち、ＶＳＭＣ過剰増殖を阻害し、ＥＣ生成および局所的な堆積に干渉せず、またはこれらを活発化することさえできるデバイスを開発しようという試みが、これまでになされてきた。
【００３１】
現在のＤＥＳは、ＢＭＳとの比較で再狭窄率を有意に低下させた、抗増殖薬を溶出する。しかしながら、ＤＥＳの有益性は、著しく遅延させたステント再内皮化と、その結果としての、ステント血栓症率の上昇と、その結果としてのＤＡＰＴの持続期間の長期化とを引き換えにして、達成された。したがって、上記課題の一部のみは、現在利用可能なＤＥＳによって適切に解決された。
【００３２】
したがって、現在のＤＥＳが行うような恒久的な開通性と、現在のＤＥＳでは課題のままである、血管処置済み区域の早期再内皮化との両方を同時に確保する医療デバイスが、必要とされている。すなわち、血管管腔閉塞を引き起こすことになる、ＶＳＭＣの増殖および血管の内面に向かっての移動を阻害することと、ＥＣ生成および局所的な堆積に干渉せず、またはこれらを活発化さえすることとの両方が可能な医療デバイスの探求。
【００３３】
複数ある実施形態の一つにおいて、ＶＳＭＣ過剰増殖を有意に阻害しながらもＥＣ増殖に干渉しないことが可能な作用物質を特定するために、遺伝子標的を探求した。したがって、実験１の再狭窄プラークから得た組織断片について臨床研究を実施したが、この臨床研究により、可能性のある２種の遺伝子的が特定された。したがって、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）−ｓｉＲＮＡおよび好中球サイトゾル因子４（ＮＣＦ４）−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーを、インビトロ実験である実験２において査定したが、この実験２により、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーは、ＶＳＭＣ過剰増殖に対する阻害効果を有することと、文献において前もって記述されたＶＳＭＣおよびＥＣに対する阻害効果を有さず、またはＶＳＭＣ増殖およびＥＣ増殖を阻害するように作用する理論的根拠も有さない、遺伝子サイレンサー（平滑筋タンパク質２２ａ（ＳＭ２２ａ）−ｓｉＲＮＡおよびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ）を制御することが実証された、抗増殖薬（シロリムスおよびパクリタクセル）に対して比較された。
【００３４】
本明細書に含まれる実施形態は、実験２の結果を提供しているが、この実験２の結果では、２種の遺伝子サイレンサー、すなわち、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡは、
・予想された有益性を実証していないが、レンチウイルス媒体の対象として使用された遺伝子サイレンサーのうちの一方であるＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、
・ＶＳＭＣ増殖の有意な阻害を示している。次いで、実験２の結果を確認するために、実験３を実施した。最後に、ＶＳＭＣ構造タンパク質および機能性タンパク質に対するいくつかの他の遺伝子サイレンサーを、実験４において試験したが（ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ミオシン軽鎖９（ＭＹＬ９）−ｓｉＲＮＡ、ＴＲＩＯおよびＦ−アクチン結合タンパク質（ＴＲＩＯＢＰ）−ｓｉＲＮＡ、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＹＬＫ）−ｓｉＲＮＡおよびミオシンホスファターゼ−Ｒｈｏ相互作用タンパク質（ＭＰＲＩＰ）−ｓｉＲＮＡ）、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡおよびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、ＶＳＭＣ増殖の有意な阻害を示す唯一の遺伝子サイレンサーだった。
【００３５】
ＥＣに関しては、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーは、ＥＣの増殖の有意な阻害を起こさないが、このことは、これらの治療標的に関する目的が、ＥＣ増殖に干渉しないまたはＥＣ増殖に可能な限り少なく干渉することであるため、前もって予想されていた。対照として査定された他の遺伝子サイレンサー、とりわけ、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡもまた、ＥＣ増殖の有意な阻害を示さなかったが、このことは、これらの遺伝子サイレンサーが、文献から取得可能なデータによれば、ＶＳＭＣにもＥＣ増殖にも干渉しないという理由で、対照として選択されたため、前もって予想されていた。シロリムス群およびパクリタクセル群における有意なＥＣ阻害は周知であり、上記においてステント血栓症の課題を取り扱ったときにすでに述べたように、文献においても記述されている。
【００３６】
細胞内への遺伝子サイレンサーのトランスフェクションを目的としたレンチウイルスおよびプラスミドの使用は、実証可能なほどに効果的で一般的な方法である。しかしながら、この方法は、エチレンオキシド（ＥＴＯ）等、高温を伴うプロセスによって滅菌されることが多いＤＥＳ、ＢＶＳ、ＤＥＢおよび他のデバイスの製造に適用することが困難なこともある。したがって、実験５において、ナノ粒子を遺伝子サイレンサーキャリアとして査定すると、満足な結果を伴った。
【００３７】
実験６は、ステント内過形成の持続的な阻害（シロリムス溶出性ステントのようなもの）を促進し、さらには、医学文献において記述されていない作用機序によって迅速なステントストラットの再内皮化（ベアメタルステントのようなもの）も可能にするときの、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントとＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントとの両方に関する有効性を評価および証明する、最初のインビボ研究だった。
【００３８】
次いで、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡから得られた非常に有望な結果に基づいて、ヒトＶＳＭＣの構造タンパク質および機能性タンパク質に関連付けられたさらなる３２種の遺伝子サイレンサーを、インビトロ実験７において評価したが、このインビトロ実験７により、ヒトＥＣの増殖への干渉を伴わないヒトＶＳＭＣ増殖の有意な阻害における、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡの有効性が明らかになった。しかしながら、実験７により、識別された９種の効果的な遺伝子サイレンサーは、同じ用量を使用した場合でのヒトＶＳＭＣの阻害における相異なる効力または有効性を有することも示された。
【００３９】
最後に、遺伝子サイレンサー投与量と、ヒトＶＳＭＣの阻害における効力または有効性との関係を査定するために、実験８を実施したが、遺伝子サイレンサーには、遺伝子サイレンサーが効果的なものになる多種多様な用量があり、遺伝子サイレンサーの有効性は、用量依存性ではないことが示された。さらに、高い用量または非常に高い用量の遺伝子サイレンサーは、ヒトＥＣの増殖に干渉しない。
【００４０】
したがって、複数ある実施形態の一つにおいて、遺伝子サイレンサー濃度は、遺伝子サイレンサーを、非常に薄い単一の層から最大ではいくつかの厚い層までにわたる医療デバイスの表面に、局所的に送達すべき遺伝子サイレンサーの所望の量に到達するように散在させることができるという理由で、幅広い濃度範囲の１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００４１】
本明細書において記述された８種の実験により、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡのみが、議論の余地なくＶＳＭＣ増殖を阻害することができる遺伝子サイレンサーである証拠が示されたが、これは、これらの遺伝子サイレンサーのクラスに属する試験された他のすべての遺伝子サイレンサーは、ＶＳＭＣ増殖の阻害において同じ効果を示すことができないため、ＶＳＭＣ構造タンパク質および機能性タンパク質の遺伝子サイレンサーのクラスエフェクトではない。
【００４２】
したがって、９種すべての遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡは、ヒトＶＳＭＣ阻害に対する非常に特定的な効果を有するが、これは、これらの９種の遺伝子サイレンサーのクラスに属する他の遺伝子サイレンサーのすべてに拡張できるわけではない。ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡに関するこの特異的な効果は、９種すべてのタンパク質ＭＹＨ１１、ＣＮＮ１、ＬＭＯＤ、ＳＭＴＮ、ＴＰＭ、ＣＡＬＤ、ＡＣＴＮ、ＡＣＴＡおよびＡＣＴＢが成熟ＶＳＭＣに属するため、ＶＳＭＣ増殖プロセスにおける１種以上の肝要なタンパク質に対する活性、すなわち、若いＶＳＭＣの形成に必須な１種以上のタンパク質の阻害である。したがって、ＩＳＲを理解するためには、静止細胞によって発現される可能性のある可塑性は、以前胎芽期のときにのみ活性化されていた遺伝子が、再び発現し始め、高い増殖能力を生じさせることを可能にする、細胞の表現型の変化に起因し得る。可能性のある別の機構は、１種以上のタンパク質またはこれらのタンパク質の作用機序に対する、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡの活性である。
【００４３】
ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡによるＶＳＭＣ増殖の阻害に関する結果は、いくつかの疑問を生じさせているだけではなく、ＩＳＲ機構が、これまでに考えられたものより格段に複雑であること、および、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡによってサイレンシングされる１種以上の代謝経路が、ＶＳＭＣ過剰増殖に関して極めて重要なものであること等、いくつかの確かな事実ももたらしている。
【００４４】
別の実施形態において、医療デバイスは、
ａ）ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｂ）ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｃ）ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｄ）ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｅ）ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｆ）ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｇ）ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｈ）ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと、
ｉ）ＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスと
からなり、
これらの遺伝子サイレンサーのすべてが、ヒトＥＣの増殖に有意に干渉しない。したがって、ヒト血管ＥＣ増殖を阻害し、この結果として、早期におけるステント再内皮化を遅延させる、シロリムスまたはシロリムスアナログおよびパクリタクセル等の抗細胞増殖薬を溶出するＤＥＳとは異なり、次のＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスのすべてが、早期におけるステント、ＢＶＳまたは血管の再内皮化を促進することができる。
【００４５】
早期再内皮化に関連付けられた別の重要な態様は、ＩＳＲに関する早期再内皮化の潜在的な有益性を示す、研究である。したがって、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイス、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡ溶出性医療デバイスによって活発化される早期再内皮化は、現在利用可能な抗細胞増殖薬溶出性医療デバイスとの比較で、ＶＳＭＣ過剰増殖の阻害におけるさらなる有益性を促すことが可能である。シロリムスおよびシロリムスアナログおよびパクリタクセル等の抗細胞増殖薬は、ステント内面における内皮の再確立を遅延させるため、このように血管壁に保護機構がないことにより、新生内膜過形成の進行と、その結果としてのＩＳＲとが可能になる。
【００４６】
９種すべての遺伝子サイレンサーのいずれかの局所的な送達のために使用される遺伝子サイレンサー媒体は、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮＩ−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡがヒトＶＳＭＣに進入できるようにする、任意の媒体であり得る。したがって、このような遺伝子サイレンサー媒体は、レンチウイルスおよびプラスミド、ナノ粒子、フルオロポリマー、生体吸収性ポリマーおよび非吸収性ポリマーから、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡによってコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイス、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイスおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡコーティングされたポリマー不含の医療デバイスのいずれであってもよいし、または、最も重要なことは、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよび／またはＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡが血管壁およびＶＳＭＣに確実に進入することであるため、任意の他の医療デバイス媒体であってもよい。
【００４７】
溶出性医療デバイスは、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡまたはＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡと、必須ではないが好ましくは、好ましくは媒体とによってコーティングまたは充填されていなければならず、この溶出性医療デバイスは、両方とも、金属ステント、ＢＶＳおよび／もしくは他の植込み型デバイス等の任意の植込み型デバイスであり、または、ＤＥＢ、局所薬物送達カテーテル、および／もしくは、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮＩ−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡを局所的に送達することが可能な他の医療デバイス等の任意の非植込み型局所薬物送達デバイスである。
【００４８】
遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡは、ＥＣ増殖の有意な阻害を伴わないＶＳＭＣ過剰増殖の選択的で有意な阻害である主要な作用機序が、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡに基づくため単独で局所的に送達することもできるし、一緒にして局所的に送達することもできるし、または、別のｓｉＲＮＡおよび／もしくは抗細胞増殖薬および／または他の薬物と組み合わせて送達することもできる。
【実施例】
【００４９】
選択的で効率的なＶＳＭＣ阻害活性を有しながらもＥＣ増殖に干渉しない、新たな薬物の識別および評価を、臨床研究（実験１）、いくつかのインビトロ研究（実験２，３，４，５，７および８）ならびにインビボ研究（実験６）によって実施して、本発明を裏付けた。
【００５０】
実験１
【００５１】
Ｆｌｅｘｉｃｕｔ（Ｇｕｉｄａｎｔ、ＵＳＡ）カテーテルを用いて、ＩＳＲプラークおよびデノボ冠状動脈プラークのフラグメントを抜き出す、方向性アテレクトミーを受けた２７人の患者のうち、１２人の患者には、ＩＳＲがあり、１５人の患者には、症候性のデノボ冠状動脈病変があった。アテレクトミー試料（プラーク）を識別し、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ６０に入れ、２２，０００個超の遺伝子が遺伝子プロファイリング分析されるまで液体窒素中で保管した。ＲＮＡは、ＰｏｗｅｒＧｅｎ  ｍｏｄｅｌ１２５ホモジナイザ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって均一化した後、０．２倍容のクロロホルムによって抽出し、０．５倍容のイソプロパノールによって沈殿させ、７５％エタノール中で洗浄し、ＲＮＡｓｅ不含の水に懸濁させることによって単離した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して測定した。ＲＮＡの品質および純度は、ＲＮＡ６０００ピコアッセイまたはＲＮＡ６０００ナノアッセイにより、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して査定した。
【００５２】
試料は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐマイクロアレイシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）を使用して、遺伝子発現プロファイリング用に標識化した。標準的なＴ７ベース増幅プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、ＲＮＡをビオチン化ｃＲＮＡに変換した。フラグメント化したビオチン標識ｃＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標準プロトコルに従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイゼーションした。オペレータ、チップロットおよびスキャナー（ＧｅｎｅＡｒｒａｙ３０００、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）は、始めから終わりまで制御された。ＧｅｎｅＣＨＩｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇソフトウェアを使用したアレイに関する品質管理には、スケール因子および存在する遺伝子の百分率が含まれていた。
【００５３】
ＩＳＲプラークの遺伝子発現プロファイリングを、デノボ冠状動脈プラークの遺伝子発現プロファイリングと比較し、ＩＳＲプラークにおいて１５倍より多く発現した遺伝子のみを、有意なものとして考えた。
【００５４】
２種の遺伝子、すなわち、デノボ冠状動脈プラークとの比較でＩＳＲプラークにおいては１８倍より多く発現した腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）と、ＩＳＲプラークにおいては１６倍より多く発現した好中球サイトゾル因子４（ＮＣＦ４）とは、１５倍より多く発現することが見いだされた。
【００５５】
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子は、オステオプレテゲリンに対するリガンドであり、破骨細胞の分化および活性化のために肝要な因子として機能する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）サイトカインファミリーのメンバーをコードする。このタンパク質は、樹状細胞生存因子であることが示されたが、Ｔ細胞に応じる免疫反応の調節に関与するものである。Ｔ細胞の活性化は、この遺伝子の発現を誘導して、破骨細胞形成および骨粗しょうを増進することが報告された。このタンパク質は、ＳＲＣキナーゼおよび腫瘍壊死因子受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を包含するシグナル伝達複合体によって、抗アポトーシスキナーゼＡＫＴ／ＰＫＢを活性化することが示されており、このことは、このタンパク質が、細胞アポトーシスの調節において役割を担い得ることを示唆していた。
【００５６】
ＮＣＦ４は、宿主防御に関して重要な他成分型酵素系である、超酸化物を生成する食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの細胞質調節成分である、タンパク質をコードする。このタンパク質は、好適には、骨髄系統の細胞内で発現する。このタンパク質は主に、好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２／ｐ６７−ｐｈｏｘ）と相互作用して、好中球サイトゾル因子１（ＮＣＦ１／ｐ４７−ｐｈｏｘ）との複合体を形成するが、この複合体は、細胞が刺激を受けたときに、低分子量Ｇタンパク質ＲＡＣ１とさらに相互作用し、膜に移行する。
【００５７】
実験２
【００５８】
実験１においてはＩＳＲを引き起こした炎症反応を調節することになる可能性が高い２種の遺伝子を識別した後、特定の遺伝子のタンパク質翻訳、この場合においてはＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子およびＮＣＦ４遺伝子のタンパク質翻訳を遮断する特異的な干渉ＲＮＡ配列である遺伝子サイレンサーにより、ヒトＶＳＭＣまたはヒト血管ＥＣを内包するボトル内にある２種の遺伝子（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ＆ＮＣＦ４）を中和することによって、治療反応を査定した。
【００５９】
したがって、実験２は、次の群、すなわち、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡ、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ、完全対照（媒体なし、薬物なし）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡ＋グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（溶媒対照１）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ＋ＧＡＰＤＨ（溶媒対照２）、シロリムス（薬物対照１）およびパクリタクセル（薬物対照２）を用いて実施した。
【００６０】
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡは、それぞれＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子およびＮＣＦ４遺伝子の遺伝子サイレンサーである。遺伝子サイレンサーの送達システムは、レンチウイルスによって運搬されるプラスミドに各遺伝子サイレンサーを挿入することによって、開発した。レンチウイルス粒子は、遺伝子サイレンサーと一緒にしたプラスミドを含有する、細胞内への形質導入が可能な状態のウイルスである。形質導入の後、細胞は、遺伝子サイレンサーを恒久的に発現する。トランスフェクションの２４時間前における細胞培養密度は、培地中で、２×１０５細胞／１０ｃｍ２だった。この結果、１００μＬ／ｍＬのトランスフェクション培養物に取り込ませた１０〜１０００μＭのｓｉＲＮＡから得られた５μＬのアリコートが、採取された。
【００６１】
レンチウイルスおよび平滑筋タンパク質２２ａ（ＳＭ２２ａ）または平滑筋ミオシン重鎖（ＭＹＨ１１）の遺伝子サイレンサーを含有する２種の対照群を使用して、媒体を査定した。２種の遺伝子は、分化した（成熟した）ＶＳＭＣの存在に対するマーカーであると考えられていること、すなわち、静止状態であると考えられる分化の最終段階においてＶＳＭＣにのみ確認されることを理由にして、選択された。したがって、文献においては、これらの２種の遺伝子と、ＶＳＭＣ増殖調節機構との間には関連性がなく、これらの２種の遺伝子は、若いＶＳＭＣマーカーでもない。したがって、２種の遺伝子サイレンサーＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡおよびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、遺伝子サイレンサーがＶＳＭＣおよびＥＣに効果的に進入したことを蛍光顕微鏡法によって確定させるという目的で、バイオコンジュゲートと呼ばれるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）によって標識された。さらに、これらの２種の溶媒対照を使用して、ＶＳＭＣ増殖プロセスおよりＥＣ増殖プロセスに干渉しない媒体を示した。ＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡおよびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡの用量は、やはり、前述の遺伝子サイレンサーの用量と同様であり、すなわち、１００μＬ／ｍＬのトランスフェクション媒体に取り込ませた１０〜１０００μＭのｓｉＲＮＡから得られた５μＬアリコートが、採取された。
【００６２】
２種の薬物対照群は、それぞれシロリムスおよびパクリタクセルからなっていた。シロリムスおよびパクリタクセルは、エタノール（２０ｍｇ／ｄＬ）とのストック溶液として調製し、１０〜１０００マイクログラム／ｍＬの範囲の希釈標準溶液になるように培地中に希釈した。２種の薬物は、やはりＥＣ増殖を有意に阻害して、ステント再内皮化に悪影響を与えるＤＥＳによって臨床業務において実証されたＶＳＭＣ阻害効率を有する、わずか２つのクラスの薬物に属する。
【００６３】
完全対照群において、ＶＳＭＣは、平滑筋細胞成長培地（Ｇｉｂｃｏ、ｍｅｄｉｕｍ２３１）中で培養されたが、ＥＣは、内皮細胞培地（Ｇｉｂｃｏ、ｍｅｄｉｕｍ２００）中で培養された。これらの平滑筋細胞成長培地と内皮細胞培地との両方に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加した。したがって、媒体も薬物も使用しなかった。
【００６４】
ヒトＶＳＭＣを内包するボトルの結果が、図１に示されている。
【００６５】
ＶＳＭＣ培養に関するデータにより、完全対照群との比較では、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡ群、ＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ群およびＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡ群の細胞増殖には、統計学的に有意な差異が示されなかった。やはり、シロリムス群、パクリタクセル群およびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ群の細胞増殖には、完全対照群に対して統計学的に有意な阻害があったが、これらの３群どうしの間には、統計学的に有意な差異がなかった。シロリムス群およびパクリタクセル群と完全対照群との間に統計学的に有意な差異があること、および、ＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡ群と完全対照群との間に有意な差異がないことは、前もって予想されていた。しかしながら、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、統計学的に有意なＶＳＭＣ増殖の阻害を促進しており、すなわち、成熟または分化したＶＳＭＣにおいてのみ発現した遺伝子のサイレンシングは、若いＶＳＭＣの増殖に干渉して、シロリムスおよびパクリタクセルの阻害に類似した程度でこれらのＶＳＭＣの増殖を有意に阻害した。
【００６６】
ヒト血管ＥＣを内包するボトルの結果が、図２に示されている。ＥＣ培養物についてのデータに関しては、その結果により、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡ群、ＮＣＦ４ｓｉＲＮＡ群、ＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡ群およびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ群の細胞増殖には、完全対照群に対して統計学的に有意な差異が示されなかった。シロリムス群およびパクリタクセル群と、完全対照群との間にも、統計学的に有意な細胞増殖の阻害が存在しなかった。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡ群と、ＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ群とに統計学的な差異がないことは、これらの治療標的の目的が、ＥＣ増殖に干渉しないまたは可能な限り少ない干渉にすることだったため、前もって予想されていた。ＳＭ２２ａ−ｓｉＲＮＡ群と、ＭＹＨ１１ｓｉＲＮＡ群との間に有意な差がないことも、これらの２種の遺伝子サイレンサーが、文献において取得可能なデータによれば、推定では、ＶＳＭＣ細胞増殖とＥＣ細胞増殖との両方に干渉しないことを理由にして対照として選択されたため、やはり前もって予想されていた。シロリムス群およびパクリタクセル群における有意なＥＣ阻害は、すでに周知であり、上記においてステント血栓症の課題を取り扱ったときに述べたように、文献においても記述されている。
【００６７】
ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、完全対照との比較で、ＶＳＭＣ増殖を有意に阻害した。ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、数値的には、シロリムスおよびパクリタクセルより多くヒトＶＳＭＣを阻害したが、これら３種の群のすべての間には、有意な差異が存在しなかった。ヒト血管ＥＣのＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ阻害は、完全対照と同等であり、シロリムスおよびパクリタクセルに比べて極めて低かった。
【００６８】
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡは、完全対照との比較でＶＳＭＣ増殖を有意に阻害することができなかった。
【００６９】
実験３
【００７０】
実験２において、実験１において識別された２種の遺伝子サイレンサーであるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡは、予想された有益性を示さなかったが、レンチウイルス媒体の対照として使用された２種の遺伝子サイレンサーのうちの一方であるＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡから予想されていたもの、すなわち、ＶＳＭＣ増殖の有意な阻害およびＥＣ増殖の有意でない阻害を示した。
【００７１】
したがって、懸濁液を調製しながらボトルを識別し、または遺伝子サイレンサーを置きかえるときの誤り確率は、チームの慎重な作業および経験の結果として低かったが、この誤り確率は、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡに関して得られた結果を確認するという目的で、実験２を部分的に繰り返すために決定された。
【００７２】
したがって、実験３は、次の群、すなわち、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＴＮＦＲＳＦ１１ＢｓｉＲＮＡおよびレンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡからなっていた。
【００７３】
ヒトＶＳＭＣを内包するボトルおよびヒト血管ＥＣを内包するボトルの結果が、それぞれ図３および図４に示されている。
【００７４】
ヒトＶＳＭＣおよびヒト血管ＥＣを内包するボトルから得られた結果に関する分析により、実験２において得られた結果と同様の結果が示されており、したがって、先行して得られた結果と、ＥＣ増殖の有意な阻害を伴わないＶＳＭＣ増殖の阻害へのＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡが有する良くせぬ驚くべき効果とが確認された。
【００７５】
実験４
【００７６】
ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーに起因する有望な結果を識別および確認した後、本発明者らの次のステップは、可能性としてあり得るこの薬物のクラスエフェクトを査定すること、すなわち、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡによって得られた有望な結果が、ＶＭＳＣ構造タンパク質および機能性タンパク質に対する他の遺伝子サイレンサーに及び得るかどうかを査定することだった。この目的のために、次の群、すなわち、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーミオシン軽鎖９（ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーＴＲＩＯおよびＦ−アクチン結合タンパク質（ＴＲＩＯＢＰ−ｓｉＲＮＡ）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーカルポニン１（ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＹＬＫ−ｓｉＲＮＡ）、レンチウイルス＋遺伝子サイレンサーミオシンホスファターゼ−Ｒｈｏ相互作用タンパク質（ＭＰＲＩＰ−ｓｉＲＮＡ）および完全対照（媒体なし、遺伝子サイレンサーなし）からなるヒトＶＳＭＣ培地中において、実験４を実施した。
【００７７】
ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ、ＴＲＩＯＢＰ−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡは、ＶＳＭＣ構造タンパク質を対象とする遺伝子サイレンサーであるが、ＭＹＬＫ−ｓｉＲＮＡおよびＭＰＲＩＰ−ｓｉＲＮＡは、ＶＳＭＣ機能性タンパク質を対象とする遺伝子サイレンサーである。
【００７８】
ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ、ＴＲＩＯＢＰ−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＭＹＬＫ−ｓｉＲＮＡおよびＭＰＲＩＰ−ｓｉＲＮＡの用量は、１００μＬ／ｍＬのトランスフェクション媒体に取り込ませた１０〜１０００μＭのｓｉＲＮＡから得られた５μｌのアリコートだった。
【００７９】
ヒトＶＳＭＣを内包するボトルの結果が、図５に示されている。研究した構造タンパク質および機能性タンパク質に対する６種の特異的な遺伝子サイレンサーの中では、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡのみが、ＶＳＭＣ増殖を有意に阻害するものだった。
【００８０】
おそらくは、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーは、ＭＹＨ１１遺伝子およびＣＮＮ１遺伝子にのみ関連付けられた、何らかのブロッキング活性を発揮している。実験４の結果によれば、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡが、ＥＣ増殖への干渉を伴うことなくＶＳＭＣ増殖を有意に阻害することが可能な唯一の遺伝子サイレンサーであることには、反論の余地がない。したがって、このブロッキング活性は、ＶＳＭＣ構造タンパク質および機能性タンパク質に関連付けられたいくつかの他の遺伝子のサイレンシングが、ＶＳＭＣ増殖の同じ有意な阻害をもたらさないため、クラスエフェクトによるものではない。
【００８１】
したがって、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡとＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡとの両方が、互いに対して独立に、若いＶＳＭＣの形成および過剰増殖において肝要な役割を担う１種以上のタンパク質に対するブロッキング活性を発揮している。動脈血管の中膜において、若いＶＳＭＣの増殖が悪化および混乱し、続いて、これらの若いＶＳＭＣが、金属ステントストラットまたはＢＶＳストラットを介して血管管腔に向かって移動することにより、５０％超の場合にはＩＳＲと呼ばれるステントまたはＢＶＳの閉塞が起き得る。
【００８２】
実験５
【００８３】
遺伝子サイレンサーのトランスフェクションを目的としたレンチウイルスおよびプラスミドの使用は、エチレンオキシド（ＥＴＯ）等、高温を伴うプロセスによって滅菌されることが多いＤＥＳ、ＢＶＳ、ＤＥＢおよび他のデバイスの製造に応用することが困難である。したがって、実験において、ナノ粒子によって血管壁細胞内に遺伝子サイレンサーを運搬する別の方法を試験した。
【００８４】
実験５は、薬物である１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）と、前述の実験において使用されたレンチウイルスおよびプラスミドの代わりに媒体を運搬する遺伝子サイレンサーとからできたナノ粒子によって、実施された。そういうわけで、対照（ナノ粒子のみ）、ナノ粒子中のＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子中のＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子中のシロリムス、ナノ粒子中のパクリタクセル、ナノ粒子中のＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子中のＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡおよびナノ粒子中のＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ＋ＧＡＰＤＨという８種の群が、媒体であるナノ粒子の査定と、前述の結果の最終確認との両方のために含まれていた。
【００８５】
ナノ粒子中のシロリムスの群およびナノ粒子中のパクリタクセルの群は、ＶＳＭＣ増殖の阻害に関する有効性を比較するために含まれていた。ナノ粒子中のＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡの群およびナノ粒子中のＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡの群は、悪い結果について最終確認するという目的で、異なる媒体を用いて再度試験した。ナノ粒子中のＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ＋ＧＡＰＤＨの群を研究して、媒体有効性を評価し、すなわち、遺伝子サイレンサーが、媒体としてナノ粒子を使用したときにＶＳＭＣおよびＥＣに確実に進入するようにした。実験４において得られたデータによれば、ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーは、ＶＳＭＣ増殖およびＥＣ増殖との両方に対していかなる阻害効果も有さないため、ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーが、遺伝子サイレンサー対照として選択された。ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーは、蛍光顕微鏡法によって細胞内へのトランスフェクションを検証するために、ＧＡＰＤＨによって標識した。最後に、純粋なナノ粒子、すなわち、薬物も遺伝子サイレンサーも不含のナノ粒子を、媒体対照として使用した。
【００８６】
シロリムスを含有のナノ粒子およびパクリタクセルを含有のナノ粒子は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］を用いて調製された。シロリムスとパクリタクセルとの両方を、ＰＬＧＡポリマーと一緒にした１ｍＬのアセトン（有機相）に可溶化させた。水性相は、撹拌しながら４０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２からなっていた。次いで、有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら５分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で１０ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、薬物の最終濃度を調節した。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲のシロリムス濃度およびパクリタクセル濃度を、試験した。
【００８７】
遺伝子サイレンサー（ｓｉＲＮＡ）を担持させた脂質−ポリマーハイブリッド型ナノ粒子を、ナノ沈殿法によって調製した。水性相は、撹拌しながら３０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化させた遺伝子サイレンサーからなっていた。次いで、脂質カチオン性化合物ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］およびＰＬＧＡポリマーを含有する有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら５分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で１０ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、最終濃度を調節した。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の遺伝子サイレンサー濃度を、試験した。
【００８８】
ヒトＶＳＭＣを内包するボトルの結果が、図６に示されている。対照との比較では、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１  ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ならびに、シロリムス抗増殖薬およびパクリタクセル抗増殖薬によるＶＳＭＣ増殖の有意な阻害が存在したが、４種の群（２種の遺伝子サイレンサーおよび２種の抗増殖薬）そのものの間には、有意な差異が存在しなかった。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーは、対照との比較でＶＳＭＣ増殖の阻害における有意な差異を示さなかった。この実験において得られた１セットの結果は、ＶＳＭＣ過剰増殖の阻害におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡおよびＮＣＦ４−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーの無効果を実証したが、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーが、ＶＳＭＣ過剰増殖の阻害に効果的であることを明らかにした、上記前例のない実験に関する前述の結果を裏付けている。対照との比較でＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーによるＶＳＭＣ増殖の阻害に有意な差異がないことは、遺伝子サイレンサーが、遺伝子サイレンサー対照として使用されたため、前もって予想されていた。しかしながら、ＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡがＧＡＰＤＨによって標識され、この群のＶＳＭＣが光顕微鏡法によって検証された場合、ナノ粒子がＶＳＭＣ内に効果的に進入したことが見いだされた。
【００８９】
ヒト血管内皮細胞を内包するボトルの結果が、図７に示されている。
【００９０】
やはり、ヒトＥＣ培養の結果も、前述の実験の結果と同様だった。ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ−ｓｉＲＮＡ、ＮＣＦ４ｓｉＲＮＡおよびＭＹＬ９−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーと、対照群との間には、ＥＣ増殖における統計学的に有意な差異が存在しなかった。前もって予想されていたように、シロリムスおよびパクリタクセルは、試験された対照群とすべての遺伝子サイレンサーとの両方に比較して、統計学的に有意なＥＣ増殖の阻害を決定付けた。
【００９１】
実験６
【００９２】
実験６は、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントを、ベアメタルステントおよびシロリムス溶出性ステントと比較する、ブタにおけるインビボ研究だった。
【００９３】
血管の内面に局所的に遺伝子サイレンサーを送達するために、スプレーノズル機を使用して、ナノ粒子中のＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ（９個のステント）またはナノ粒子中のＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ（９個のステント）によって、２．７５×１５ｍｍ型の１８個の市販ベアメタルステントを被覆して、反内腔側の被覆材を生成した。
【００９４】
遺伝子サイレンサー（ｓｉＲＮＡ）を担持させた脂質−ポリマーハイブリッド型ナノ粒子を、ナノ沈殿法によって調製した。水性相は、撹拌しながら３０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化させた遺伝子サイレンサーからなっていた。次いで、脂質−カチオン性化合物ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］およびＰＬＧＡポリマーを含有する有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら５分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で１０ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、最終濃度を調節した。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲のＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ濃度を、試験した。
【００９５】
ナノ粒子中のＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ（９個のステント）またはナノ粒子中のＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ（９個のステント）によって、１８個のステントの反内腔側表面を被覆した後、ステントは、６０分間放置して乾燥させ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｔｙｖｅｋ（商標）に入れて包装し、次いで、エチレンオキシド（ＥｔＯ）によって５０℃で滅菌した。
【００９６】
９匹の大ヨークシャー種のブタを冠状動脈へのステント留置に供したが、１個のステントを左冠状動脈前下行枝（ＬＡＤ）に留置し、２個のステントを回旋枝（ＣＸ）に留置し、１個のステントを右冠状動脈（ＲＣＡ）に留置した。ステントは、ステント内再狭窄を引き起こす類似の炎症反応を活発化させて、インビボモデルにおけるステント内新生内膜過形成を制御する遺伝子サイレンサーの有効性を評価するという目的で、冠状動脈直径に対して１１の直径比で、すなわち、冠状動脈直径よりいくらかサイズが上回るようにして留置された。このサイズが過大なステント留置プロトコルは、以前に検証された（Ｌｏｗｅ  ＨＣ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＲＳ，Ｍａｃ  Ｎｅｉｌｌ  ＢＤ，Ｊａｎｇ  ＩＫ，Ｈａｙａｓｅ  Ｍ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎ−ｓｔｅｎｔ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔｓ．Ｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｌｎｔｅｒｖ．２００３：６０：５１５−２３．）
【００９７】
ステント再内皮化の時間を延長することは、現在の市販の薬物溶出性ステントに関して、決定的に重要な点である。したがって、シロリムスおよびシロリムスアナログならびにパクリタクセルは、血管平滑筋細胞の増殖を減少させて、ステント内新生内膜過形成を防止し、さらには、内皮細胞の増殖を抑制して、ステント再内皮化の時間を延長させる。シロリムスおよびシロリムスアナログならびにパクリタクセルとは異なり、遺伝子サイレンサーは、内皮細胞増殖への干渉を伴うことなく平滑筋細胞の増殖を減少させる、選択的な作用を及ぼす。したがって、ステント再内皮化の時間を評価するために、血管造影および血管内超音波による経過観察を、ステント留置から３０日後、９０日後および１８０日後にスケジュール設定した。
【００９８】
各ステントにつき３１のフレームを追跡する血管内超音波分析を実施したが、このとき、各フレームは、遠位のステント境界から近位のステント境界までで、０．５ｍｍ離れていた。ボンフェローニポストホックテストによる一元配置分散分析を用いて、データを分析した。
【００９９】
指標となる措置における血管内超音波のデータならびにステント留置から３０日後、９０日後および１８０日後におけるステント内新生内膜増殖に関するデータは、表１に示されており、ステント留置から３０日後、９０日後および１８０日後におけるステント再内皮化に関する血管内超音波の比較用データは、表２に示されている。
【表１】
2020529267.tif 000003
【０１００】
３種すべての薬物溶出性ステント、すなわち、シロリムス溶出性ステント、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントは、３０日目、９０日目および１８０日目において、ベアメタルステントに比べてより大きな最小内腔面積およびより少ない閉塞を示した。シロリムス溶出性ステント、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントの間には、統計学的に有意な差異がなかった。
【０１０１】
上記の発見は、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントと、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントとの両方が、ベアメタルステントより優れており、ステント内新生内膜過形成の阻害の促進においては、シロリムス溶出性ステントと同じくらい効果的であることを示している。したがって、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡは、ＶＳＭＣの増殖に関与する特異的で枢要な遺伝子を遮断する新規な作用機序によって、ＶＳＭＣの増殖を抑制し、この結果として、ステント内新生内膜過形成を抑制することが可能であり、この新規な作用機序は、細胞周期のチェックポイントにおいて作用するシロリムスおよびシロリムスアナログならびにパクリタクセル等の抗細胞増殖薬の作用機序とは全く異なるものである。したがって、シロリムスおよびシロリムスアナログは、細胞周期のＧ１〜Ｓ期に作用するが、パクリタクセルは、細胞周期のＧ２〜Ｍ期に作用するものであり、両方の薬物の群は、任意の種類の細胞（ＶＳＭＣおよびＥＣを含む）の細胞周期を停止させ、細胞分裂および後続する細胞増殖を阻害する。
【０１０２】
表２におけるステント再内皮化に関するデータは、重要な結果を示している。
【表２】
2020529267.tif 000004
【０１０３】
３０日目のとき、血管内超音波分析により、ベアメタルステント群、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群およびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群では、ステント１個当たりで分析された３１のステントフレームにおいて、類似するステントストラットの被覆の百分率が明らかにされたが、シロリムス溶出性ステント群は、ベアメタルステント群、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群およびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群との比較では、ステントストラットの被覆における統計学的に有意な差異を示した。
【０１０４】
９０日目の血管内超音波の結果により、ベアメタルステント、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群においては、ステントストラットの完全な被覆が示されたが、シロリムス溶出性ステント群は、ステントストラットの部分的な被覆のみを実証しており、ベアメタルステント群、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群およびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステント群との比較では、統計学的に有意な差異があった。
【０１０５】
１８０日目のとき、血管内超音波の結果により、４種の群のすべてにおいて、ステントストラットの完全な被覆が実証された。
【０１０６】
ステントストラットの被覆は、ステント血栓症に直接関係づけられており、したがって、２剤併用抗血小板療法の持続期間にも直接関係づけられているため、ステントストラットの完全被覆にかかる時間は、薬物溶出性ステントに関する現在の重荷である。したがって、シロリムス溶出性ステントとしてＶＳＭＣおよび新生内膜過形成を阻害し、さらには、ベアメタルステントとして迅速な再内皮化も促進する、薬物溶出性ステントが必要とされている。実験６により、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントとＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ溶出性ステントとの両方が、シロリムス溶出性ステントとして、ステント内過形成の持続的な阻害を促進可能であっただけではなく、ベアメタルステントとして、医学文献においてこれまでに記述されていなかった新規な作用機序による迅速な再内皮化を可能にしたことが示された。
【０１０７】
実験７
【０１０８】
実験７において、本発明者らは、これまでに試験されていなかった、または上記実験において言及さえされていなかった、ヒトＶＳＭＣの構造タンパク質および機能性タンパク質に関連付けられた他の３２種の遺伝子サイレンサーを評価した。
【０１０９】
遺伝子サイレンサーは、実験５と同じ方法の使用によって、遺伝子サイレンサーのための媒体である１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のナノ粒子に取り込ませた状態で調製された。
【０１１０】
（１）対照（ナノ粒子のみ）、（２）ナノ粒子中のシロリムス、（３）ナノ粒子中のＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよび（４）ナノ粒子中のＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡという４種の群を使用して、ＶＳＭＣ増殖の阻害における有効性を比較した。
【０１１１】
シロリムスを含有のナノ粒子は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］を用いて調製された。シロリムスを、ＰＬＧＡポリマーと一緒にして、１ｍＬのアセトン（有機相）に可溶化させた。水性相は、撹拌しながら４０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化させたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２からなっていた。次に、有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら５分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で１０ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、薬物の最終濃度を調節した。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲のシロリムス濃度を、試験した。
【０１１２】
遺伝子サイレンサー（ｓｉＲＮＡ）を担持させた脂質−ポリマーハイブリッド型ナノ粒子を、ナノ沈殿法によって調製した。水性相は、撹拌しながら３０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化させた遺伝子サイレンサーからなっていた。次いで、脂質−カチオン性化合物ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］およびＰＬＧＡポリマーを含有する有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら５分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で１０ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、最終濃度を調節する。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の遺伝子サイレンサー濃度を、試験した。
【０１１３】
ヒトＶＳＭＣの増殖を有意に阻害する有効性は、これらの特異的な細胞を内包するボトル内でのヒトＶＳＭＣ増殖が５０％未満であることだと規定されたが、ヒトＥＣの阻害への有意でない効果は、ヒトＥＣを内包するボトル内でのヒトＥＣ増殖が９０％超であることだと規定された。
【０１１４】
ヒトＶＳＭＣを内包するボトルの結果により、図８に提示のように、試験されたさらなる３２種の遺伝子サイレンサーのうち、レイオモディン１（ＬＭＯＤ）−ｓｉＲＮＡ、スムーテリン（ＳＭＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、トロポミオシン（ＴＰＭ）−ｓｉＲＮＡ、カルデスモン１（ＣＡＬＤ）−ｓｉＲＮＡ、アクチニン（ＡＣＴＮ）−ｓｉＲＮＡ、アクチンアルファ（ＡＣＴＡ）−ｓｉＲＮＡおよびアクチンベータ（ＡＣＴＢ）−ｓｉＲＮＡという７種の遺伝子サイレンサーのみが、上記において言及された判断基準に従ったヒトＶＳＭＣ増殖の有意な阻害、すなわち、これらの特異的な細胞を内包するボトル内での５０％未満のヒトＶＳＭＣ増殖を促進したことが明らかになった。
【０１１５】
遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮのみが、シロリムス（１９％のヒトＶＳＭＣ増殖）に類似する、８０％より高い阻害率（それぞれ１９％および１８％のヒトＶＳＭＣ増殖）を促したため、遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡは、最も強いヒトＶＳＭＣの阻害剤だった。ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡは、７０〜８０％の範囲のヒトＶＳＭＣ阻害率（２５％のヒトＶＳＭＣ増殖）を促した、唯一の遺伝子サイレンサーだったが、これは、シロリムス、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡに近いが、同じくらい強いわけではない。次に、６０〜７０％の範囲のヒトＶＳＭＣ阻害率においては、この実験により、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡおよびＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡが実証され、これらは、それぞれ３８％、３３％および３２％のヒトＶＳＭＣ増殖を示した。最後に、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡは、それぞれ４１％、４３％および４６％のヒトＶＳＭＣ増殖によって、５０〜６０％の範囲のヒトＶＳＭＣ阻害率を実証した。
【０１１６】
やはり、実験において得られたセットの結果によっても、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡおよびＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンサーが、ＶＳＭＣ過剰増殖の阻害においてシロリムスと同じくらい効果的であることを明らかにした、これらの一連の前例のない実験に関する前述の結果を支持している。さらに、これらの実験において得られたセットの結果により、ヒトＶＳＭＣ増殖の有意に阻害における、他の７遺伝子サイレンサー、すなわち、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡの有効性も実証した。したがって、合計で９種の遺伝子サイレンサーは、ヒトＶＳＭＣ過剰増殖を有意に阻害することができたが、異なる効力または効性を示した。
【０１１７】
実験７もまた、ヒトＥＣ増殖における９種の遺伝子サイレンサーＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡならびにナノ粒子のみ（対照）およびシロリムスの効果を評価した。ヒト血管内皮細胞を内包するボトルの結果が、図９に示されている。試験された９種すべての遺伝子サイレンサー（ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＴＰＭ−ｓｉＲＮＡ、ＣＡＬＤ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＮ−ｓｉＲＮＡ、ＡＣＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡ）そのものの間には、ＥＣ増殖における統計学的に有意な差異が存在しておらず、さらには、ナノ粒子のみ（薬物も遺伝子サイレンサーもない）から構成される対照群に比較しても、ＥＣ増殖における統計学的に有意な差異がなかった。文献においてすでに記述されており、上記実験においても観察されたとおり、シロリムスは、試験された対照群と、９種すべての遺伝子サイレンサーとの両方に比較して、統計学的に有意なＥＣ増殖の阻害を決定付けた。したがって、効果的に阻害されたヒトＶＳＭＣの増殖を効果的に阻害した９種すべての遺伝子サイレンサーは、ヒトＥＣの増殖に干渉しておらず、この結果、これらの遺伝子サイレンサーは、ヒトＥＣ増殖の抑制を伴わずにヒトＶＳＭＣ増殖することが可能であり、したがって、迅速な欠陥および／または医療デバイスの再内皮化を可能にするという理由で、遺伝子サイレンサー溶出性医療デバイスの有望な候補になった。
【０１１８】
実験８
【０１１９】
前述の７つの実験により、ヒトＥＣ増殖の抑制を伴わずヒトＶＳＭＣ増殖を制御することができる作用物質として、これまでに研究または試験されていなかったヒトＶＳＭＣの構造タンパク質および機能性タンパク質に関連付けられた９種の遺伝子サイレンサーを特定することができた。これらの実験によっても、前記９種の遺伝子サイレンサーは、同じ用量を使用したときに、ヒトＶＳＭＣの阻害における相異なる効力または有効性を有することが明らかにされた。
【０１２０】
したがって、遺伝子サイレンサー投与量と、ヒトＶＳＭＣの阻害における効力または有効性との関係を明確化するという目的で、本発明者らは、実験８を実施したが、この実験８では、実験７において試験された相異なる３種の用量の５種の遺伝子サイレンサーを評価した。そういうわけで、本発明者らは、最も効果的な遺伝子サイレンサーであるＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡおよびＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡと、７０〜８０％の範囲のヒトＶＳＭＣに対する阻害効果を促したＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡと、６０〜７０％の範囲であるヒトＶＳＭＣに対する阻害効果をもたらしたＳＭＴＮ−ｓｉＲＮＡと、効果的なものだと考えられた９種の遺伝子サイレンサーの中で最も弱いヒトＶＳＭＣ阻害における応答を示したＡＣＴＢ−ｓｉＲＮＡとを選択した。選択された５種の遺伝子サイレンサーを、ナノ粒子のみ（対照）およびシロリムスと比較した。
【０１２１】
一実施形態において、増大していく相異なる３種の用量の遺伝子サイレンサーを試験した。
ａ）標準的な用量。ウェル１個当たり８マイクロリットルの標準用遺伝子サイレンサー溶液濃度。
ｂ）高い用量。ウェル１個当たり２４マイクロリットルの標準用遺伝子サイレンサー溶液濃度。
ｃ）非常に高い用量。標準用遺伝子サイレンサー溶液との比較で２倍濃縮された状態である、ウェル１個当たり２４マイクロリットルの遺伝子サイレンサー溶液。
【０１２２】
標準用遺伝伝子サイレンサー溶液を、前述の実験と同じ方法を使用して、すなわち、ナノ沈殿法によって調製した。水性相は、撹拌しながら３０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化させた遺伝子サイレンサーからなっていた。次いで、脂質−カチオン性化合物ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］およびＰＬＧＡポリマーを含有する有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら５分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で１０ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、最終濃度を調節した。１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の遺伝子サイレンサー濃度を、試験した。
【０１２３】
２倍濃縮遺伝子サイレンサー溶液も、ナノ沈殿法を使用して調製した。水性相は、撹拌しながら３０℃の浴温で１０ｍＬの水Ｍｉｌｌｉ  Ｑに可溶化させた遺伝子サイレンサーからなっていた。次いで、脂質−カチオン性化合物ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］およびＰＬＧＡポリマーを含有する有機相を、２０Ｇニードルを使用して水性相に注入し、懸濁液を、適度に撹拌しながら１０分間保持し、次いで、ロータリーエバポレータ内で５ｍＬの最終体積に濃縮して、有機溶媒を除去し、最終濃度を調節した。２０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの範囲の遺伝子サイレンサー濃度を、試験した。
【０１２４】
ヒト血管内皮細胞を内包するボトルの結果が、図１０に示されている。
【０１２５】
評価された５種の遺伝子サイレンサーのそれぞれに関しては、試験された増大していく相異なる３種の用量どうしの間には、統計学的に有意な差異が存在しなかった。したがって、ヒトＶＳＭＣ増殖に対するシロリムスの効果と同様に、遺伝子サイレンサーにも、この遺伝子サイレンサーという作用物質が効果的になる多種多様な用量があり、遺伝子サイレンサーの有効性は、用量依存性ではない。そういうわけで、おそらくは、最大の効果に到達するこの幅広い範囲の用量には、しきい値が存在する（最小有効投与量）。さらに、一旦最小有効投与量に達したら、ＶＳＭＣ受容体は飽和し、この結果、効果は、最小有効投与量のしきい値からは、用量に応じたものではなくなる。
【０１２６】
評価された５種すべての遺伝子サイレンサーおよびシロリムスは、対照群との比較で、ここでの本特許出願の前述の実験の場合と同程度のヒトＶＳＭＣ阻害を示した。したがって、実験８は、ヒトＶＳＭＣ増殖の阻害における遺伝子サイレンサーの効果の安定性、ならびに実験のために使用された方法の再現性を裏付けている。
【０１２７】
さらに、用量が増大遺伝子サイレンサーの用量を増大させていったときの、ヒトＥＣに対する効果を評価するという目的で、本発明者らは、ヒトＥＣを内包するボトル内において、ナノ粒子のみ（対照）およびシロリムスとの比較で、増大していく相異なる３種の用量の５種の遺伝子サイレンサーＣＮＮ１−ｓｉＲＮＡ、ＭＹＨ１１−ｓｉＲＮＡ、ＬＭＯＤ−ｓｉＲＮＡ、ＳＭＴＮ−ｓｉＦｔＮＡおよびＡＣＴＢ−ｓｉＦｔＮＡを試験した。ヒトＥＣ細胞を内包するボトルの結果が、図１１に示されている。
【０１２８】
評価された５種の遺伝子サイレンサーのそれぞれ自体に関しては、試験された増大していく相異なる３種の用量どうしの間には、統計学的に有意な差異が存在しておらず、さらには、評価された５種の遺伝子サイレンサーのそれぞれに関しても、試験された増大していく相異なる３種の用量は、対照との比較で優位に相違しなかった。前もって予想されていたとおり、シロリムスは、評価された５種の遺伝子サイレンサーのそれぞれに関しては、対照との比較および試験されたすべての増大していく相異なる３種の用量との比較で、統計学的に有意な差異を示した。したがって、高い用量または非常に高い用量の遺伝子サイレンサーでさえ、ヒトＥＣの増殖には干渉しない。
【０１２９】
特定の実施形態に関する上記の記述は、他者が、現在の知識を適用することによって、包括的な概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を様々な用途のために容易に修正および／または改変することができるほどに、本明細書に含まれる実施形態の概略的な性質を明らかにし、したがって、このような適合および修正は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲。に包含されるべきであるし、包含されるように意図されてもいる。本明細書において利用された表現および用語は、記述を目的としたものであり、限定を目的としたものではないと理解すべきである。したがって、本明細書に含まれる実施形態は、好ましい実施形態との関連で記述されてきたが、当業者ならば、本明細書に含まれる実施形態は、添付した特許請求の範囲の趣旨および範囲で変更を加えて実施されてもよいことを認識されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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