(57)【要約】  ｃｆＲＮＡは、疾患関連遺伝子の発現レベルを特定及び定量化するために使用され、更に、このような遺伝子における変化の非侵襲的監視を可能にする。更に、疾患関連遺伝子の定量的分析は、処置が疾患関連遺伝子の存在に依存する場合、処置応答の予測を可能にする。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チェックポイント阻害剤による処置に対する、癌を有する個体の処置応答を予測する方法であって：
前記個体から血液を採取し、前記血液からｃｆＲＮＡを単離するステップであって、前記ｃｆＲＮＡはチェックポイント阻害遺伝子をコードする、ステップと；
定量的ＰＣＲ法を用いて前記ｃｆＲＮＡを定量化するステップと；
前記ｃｆＲＮＡの量が事前に決定された閾値レベルを超える場合、陽性の処置応答を予測するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１に対する抗体であり、前記ｃｆＲＮＡがＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃｆＲＮＡを単離するステップが、ＲＮＡ安定化及び細胞保存を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記定量的ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
定量化するステップが、内部標準としてβ−アクチンを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記閾値レベルが、β−アクチンに対するＰＤ−Ｌ１に関してΔΔＣＴ＞１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記定量的ＰＣＲ法を用いて少なくとも第２のｃｆＲＮＡを定量化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも第２のｃｆＲＮＡがＴＩＭ３又はＬＡＧ３をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも第２のｃｆＲＮＡを定量化するステップを更に含み、前記少なくとも第２のｃｆＲＮＡは、腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子、腫瘍関連遺伝子、又は癌特異的遺伝子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
癌を有する個体の処置の進行を監視する方法であって：
前記個体から血液を採取し、前記血液からｃｆＲＮＡを単離するステップであって、前記ｃｆＲＮＡがチェックポイント阻害遺伝子をコードするか、又は前記ｃｆＲＮＡが腫瘍関連遺伝子若しくは癌特異的遺伝子をコードするか、又は前記ｃｆＲＮＡが腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子をコードする、ステップと；
定量的ＰＣＲ法を用いて前記ｃｆＲＮＡを定量化するステップと；
前記ｃｆＲＮＡの量を用いて患者記録を更新するステップと、
を含む方法。
【請求項１１】
前記チェックポイント阻害遺伝子がＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、又はＬＡＧ３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍関連遺伝子又は癌特異的遺伝子が、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ブラキュリ、ＨＥＲ２、ＰＣＡ３、又はＡＲ−Ｖ７である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子が、ネオエピトープをコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｃｆＲＮＡを単離するステップが、ＲＮＡ安定化及び細胞保存を用いる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記定量的ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
定量化するステップが、内部標準としてβ−アクチンを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者記録が、前記ｃｆＲＮＡの量がβ−アクチンに対するＨＥＲ２に関してΔΔＣＴ＞５であるか又はβ−アクチンに対するＰＣＡ３に関してΔΔＣＴ＞１０である場合に更新される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前立腺癌を検出する方法であって：
個体から血液を採取し、前記血液からｃｆＲＮＡを単離するステップであって、前記ｃｆＲＮＡは、ＰＣＡ３又はアンドロゲン受容体のスプライスバリアント７をコードする、ステップと；
定量的ＰＣＲ法を用いて前記ｃｆＲＮＡを定量化するステップと；
前記ｃｆＲＮＡ量が事前に決定された閾値レベルを超える場合、前記個体が癌を有すると診断するステップと、
を含む方法。
【請求項１９】
ＰＣＡ３  ｃｆＲＮＡの量がβ−アクチンに対してΔΔＣＴ＞１０である場合に、前記個体が癌を有すると診断される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも第２のｃｆＲＮＡを定量化するステップを更に含み、前記少なくとも第２のｃｆＲＮＡは、腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子、腫瘍関連遺伝子、癌特異的遺伝子、又はチェックポイント阻害遺伝子をコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のｃｆＲＮＡが、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＡＲ−Ｖ７、ＰＳＡ、及びＰＳＭＡをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌を処置する方法であって：
ＰＤ−Ｌ１陰性癌と診断された個体に薬物を投与するステップと；
血液からｃｆＲＮＡを単離することにより前記個体の処置を監視するステップであって、前記ｃｆＲＮＡはＰＤ−Ｌ１をコードする、ステップと；
定量的ＰＣＲ法を用いて前記ｃｆＲＮＡを定量化するステップと；
前記ｃｆＲＮＡの検出後に、前記処置にチェックポイント阻害剤を含めるステップと、
を含む方法。
【請求項２３】
前記ＰＤ−Ｌ１陰性癌が固形癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固形癌が乳癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物がアフィニトールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ｃｆＲＮＡを定量化する前記ステップがリアルタイムＰＣＲを使用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記チェックポイント阻害剤は、前記ｃｆＲＮＡが検出され、経時的に増加する場合に含められる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｃｆＲＮＡが検出され、前記ｃｆＲＮＡレベルがβ−アクチンに対してΔΔＣＴ＞１０である場合に、前記チェックポイント阻害剤が含められる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
患者における免疫シグネチャーを決定する方法であって：
個体の血液中の異なるｃｆＲＮＡ分子の量を決定するステップであって、前記ｃｆＲＮＡ分子が異なるチェックポイント阻害遺伝子をコードする、ステップを含み；
前記決定するステップは、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、免疫療法薬、及び放射線処置のうちの少なくとも１つによる処置の前又は間に行われる、
方法。
【請求項３０】
前記異なるｃｆＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つがＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３をコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記量を決定するステップがリアルタイムＰＣＲを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
チェックポイント阻害剤による処置に対する、癌を有する個体の処置応答を予測するためのｃｆＲＮＡの使用であって、前記ｃｆＲＮＡがチェックポイント阻害遺伝子をコードし、前記ｃｆＲＮＡが閾値レベルを超える、使用。
【請求項３３】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１に対する抗体であり、前記ｃｆＲＮＡがＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記閾値レベルが、β−アクチンに対するＰＤ−Ｌ１に関してΔΔＣＴ＞１０である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
癌を有する個体の処置を監視するためのｃｆＲＮＡの使用であって、前記ｃｆＲＮＡがチェックポイント阻害遺伝子をコードするか、又は前記ｃｆＲＮＡが腫瘍関連遺伝子若しくは癌特異的遺伝子をコードするか、又は前記ｃｆＲＮＡが腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子をコードする、使用。
【請求項３６】
前記チェックポイント阻害遺伝子がＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、又はＬＡＧ３である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記腫瘍関連遺伝子又は癌特異的遺伝子が、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ブラキュリ、ＨＥＲ２、ＰＣＡ３、又はＡＲ−Ｖ７である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子が、ネオエピトープをコードする、請求項３５に記載の使用。
【請求項３９】
個体における前立腺癌の検出における、ＰＣＡ３又はアンドロゲン受容体のスプライスバリアント７をコードするｃｆＲＮＡの使用。
【請求項４０】
前記ｃｆＲＮＡの量が閾値レベルを超える場合に、前記個体が前立腺癌を有すると診断される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
ＰＣＡ３  ｃｆＲＮＡに関する前記閾値レベルが、β−アクチンに対してΔΔＣＴ＞１０である、請求項４０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年３月１７日に出願されたシリアル番号６２／４７３，２７３、２０１７年６月２０日に出願されたシリアル番号６２／５２２，５０９、及び２０１７年１２月１日に出願されたシリアル番号６２／５９３，５３４を有する本発明者らの同時係属米国仮特許出願に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、特に腫瘍細胞由来のｃｆＲＮＡに関する場合の循環遊離ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の検出及び定量化のシステム及び方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報が、先行技術であるか、若しくは現在特許請求されている発明に関連していること、又は具体的に若しくは暗黙に参照される刊行物が先行技術であることを容認するものではない。
【０００４】
全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の各刊行物又は特許出願が参照により組み込まれるように具体的に且つ個々に示されるかのように、それと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義又は使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と一致しないか、又は反対である場合、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【０００５】
過去１０年間にわたり、癌の治療は、手術及び放射線と組み合わせた一般的な化学療法に基づく治療から、患者全体にわたる腫瘍の遺伝的多様性を考慮に入れた、より個別化された処置へと変化してきた。従って、処置計画は、現在、より標的化された治療を可能にする分子マーカーの同定をしばしば必要とする。多くの場合、このような情報は、癌組織生検からの様々な核酸分子の分析によって得られる。しかしながら、組織生検はしばしば、最初の診断又は手術に限定され、後の生検は、患者に重大な危険性及び不快感をもたらす傾向がある。更に、腫瘍組織生検は、サンプリングの偏り、及び治療過程の間に患者の腫瘍マーカーとして核酸分子を監視する能力が限られているという点で問題となる傾向がある。
【０００６】
腫瘍細胞及び非腫瘍細胞由来の核酸分子は血液から得ることができることが知られていたが（例えば、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（１９９９）Ｖｏｌ  ５，１９６１−１９６５；Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ．（１９７７）３７：６４６−６５０参照）、これらの核酸がいずれかのキャリア又は他の構造と会合又は結合しているかどうかは明らかでなかった。実際には、より最近になって、ＲＮＡが循環腫瘍細胞（例えば、国際公開第２０１７／１８０４９９号参照）、エキソソーム（例えば、国際公開第２０１５／０８２３７２号参照）、及びキャリアタンパク質（例えば、国際公開第２０１０／０７９１１８号、又はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（１９８５）８２，３４５５参照）を含む様々な供給源に由来し得ることが発見された。
【０００７】
残念ながら、且つおそらく、ＲＮＡと様々なキャリア又は他の構造との異なる位置／会合に起因して、循環核酸の正確な定量化は、しばしば問題であった。例えば、無細胞ＲＮＡを使用する神経芽細胞腫における疾患状態検出は、全細胞ＲＮＡ分析に対する信頼できる代替物ではないことが示された（例えば、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０  Ｊｕｌ  １；５４（７）：８９７−９０３参照）。同様に、国際公開第２０１６／０７７７０９号に記載されているように、特定の関連にかかわらず、血液中の変異遺伝子又は不適切に融合した遺伝子から比較的少量のｃｆＲＮＡを検出することができるが、そのようなＲＮＡの検出量は有意に変化した。更に、検出された量のいずれかが、細胞内の生理学的現実の反映であり、又は問題の特定のＲＮＡの安定性の関数であるかは未知のままであった。例えば、‘７０９号公報のデータは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１をコードするｃｆＲＮＡの量がしばしば非常に可変であり、サンプル、患者の状態、及び他の因子に依存し得ることを示している。その結果、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法に対する癌患者の適格性を決定するための予後因子及び／又は指標としてＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡ発現レベルを使用する報告は今日まで存在しない。
【０００８】
従って、生物学的流体からの核酸分析の多数の方法が当該技術分野で既知ではあるが、それらの全て又は殆ど全ては、様々な欠点を被る。従って、ｃｆＲＮＡ分析のための改善されたシステム及び方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の主題は、処置応答を予測するため、処置を追跡するため、及び／又は癌を診断するための、様々な組成物、及び１つ以上のｃｆＲＮＡのｃｆＲＮＡレベルの使用方法に関する。特に好ましい態様において、本発明者らは、特定の癌に関する処置応答を予測できる、特定のｃｆＲＮＡ、特にＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２に関する発現閾値レベルを決定することができることを発見した。
【００１０】
本発明の主題の一態様において、個体から血液を採取し、血液からｃｆＲＮＡを単離するステップを含み、ここでｃｆＲＮＡはチェックポイント阻害遺伝子をコードし、且つ定量的ＰＣＲ法を用いてｃｆＲＮＡを定量化する更なるステップを含む、チェックポイント阻害剤による処置に対する、癌を有する個体の処置応答を予測する方法。次いで、ｃｆＲＮＡの量が閾値レベルを超える場合、陽性の処置応答が予測される。
【００１１】
好ましい実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１に対する抗体であり、ｃｆＲＮＡはＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡである。更に、ｃｆＲＮＡを単離するステップは、ＲＮＡ安定化及び細胞保存の少なくとも１つを用いることが一般に好ましい。最も典型的には、定量的ＰＣＲ法は、好ましくは内部標準としてβ−アクチンを使用するリアルタイムＰＣＲを含む。ＰＤ−Ｌ１が定量化される場合、閾値レベルは、β−アクチンに対するＰＤ−Ｌ１に関してΔΔＣＴ＞１０であり得る。加えて、所望される場合、少なくとも１つの第２のｃｆＲＮＡが、定量的ＰＣＲ法を用いて定量化され得る。本発明の主題を限定するものではないが、意図される第２のｃｆＲＮＡは、ＴＩＭ３又はＬＡＧ３、腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子、腫瘍関連遺伝子、又は癌特異的遺伝子をコードし得る。
【００１２】
本発明の主題の別の態様では、本発明者らはまた、個体から血液を採取し、血液からｃｆＲＮＡを単離するステップ（ここで、ｃｆＲＮＡはチェックポイント阻害遺伝子をコードし、又はｃｆＲＮＡは腫瘍関連遺伝子若しくは癌特異的遺伝子をコードし、又はｃｆＲＮＡは腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子をコードする）と；定量的ＰＣＲ法を用いてｃｆＲＮＡを定量化するステップと；ｃｆＲＮＡの量を使用して患者記録を更新するステップとを含む、癌を有する個体の処置を監視する方法を意図する。
【００１３】
例えば、好適なチェックポイント阻害遺伝子には、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３又はＬＡＧ３が含まれ、腫瘍関連又は癌特異的遺伝子には、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ブラキュリ、ＨＥＲ２、ＰＣＡ３又はＡＲ−Ｖ７が含まれ、腫瘍及び患者特異的変異を有する好適な遺伝子は、好ましくはネオエピトープをコードする。上記のように、ｃｆＲＮＡを単離するステップは、ＲＮＡ安定化及び細胞保存を用い、且つ定量的ＰＣＲ法はリアルタイムＰＣＲ（例えば、内部標準としてβ−アクチンを使用する）を含むことが一般に好ましい。患者記録は、ｃｆＲＮＡの量がβ−アクチンに対するＨＥＲ２に関してΔΔＣＴ＞５であり、又はβ−アクチンに対するＰＣＡ３に関してΔΔＣＴ＞１０である場合に更新され得る。
【００１４】
本発明の主題の更に別の態様では、本発明者らは、個体から血液を採取し、血液からｃｆＲＮＡを単離するステップ（ここで、ｃｆＲＮＡは、ＰＣＡ３又はアンドロゲン受容体のスプライスバリアント７をコードする）と；定量的ＰＣＲ法を用いてｃｆＲＮＡを定量化する更なるステップと；ｃｆＲＮＡ量が閾値レベルを超える場合、個体が癌を有すると診断する尚更なるステップとを含む、前立腺癌を検出する方法を意図する。最も典型的には、ＰＣＡ３  ｃｆＲＮＡの量がβ−アクチンに対してΔΔＣＴ＞１０である場合、個体は癌を有すると診断される。
【００１５】
所望であれば、腫瘍及び患者特異的変異を有する遺伝子、腫瘍関連遺伝子、癌特異的遺伝子、又はチェックポイント阻害遺伝子をコードする少なくとも第２のｃｆＲＮＡを定量化することができる。従って、このような第２の遺伝子には、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＡＲ−Ｖ７、ＰＳＡ及びＰＳＭＡが含まれる。
【００１６】
本発明の主題の更に別の態様では、本発明者らはまた、ＰＤ−Ｌ１陰性癌と診断された個体に薬物を投与するステップと；血液からｃｆＲＮＡを単離することにより個体の処置を監視するステップ（ｃｆＲＮＡはＰＤ−Ｌ１をコードする）と；定量的ＰＣＲ法を用いてｃｆＲＮＡを定量化するステップと；ｃｆＲＮＡの検出後に、処置にチェックポイント阻害剤を含めるステップとを含む、癌を処置する方法も意図する。
【００１７】
このような方法において、ＰＤ−Ｌ１陰性癌は固形癌（例えば、乳癌）であり、及び／又は薬物はアフィニトールであることが典型的に意図される。最も典型的には、ｃｆＲＮＡを定量化するステップはリアルタイムＰＣＲを使用し、ｃｆＲＮＡが検出され、経時的に増加する場合、チェックポイント阻害剤が含められる。このような方法の更なる好ましい態様では、チェックポイント阻害剤は、ｃｆＲＮＡが検出され、且つｃｆＲＮＡレベルがβ−アクチンに対してΔΔＣＴ＞１０である場合に含められる。
【００１８】
更に、本発明者らはまた、個体の血液中の異なるｃｆＲＮＡ分子の量を決定するステップを含む、患者における免疫シグネチャーを決定する方法を意図し、ここで、ｃｆＲＮＡ分子は異なるチェックポイント阻害遺伝子（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）をコードする。典型的には、決定するステップは、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、免疫療法薬、及び放射線処置のうちの少なくとも１つによる処置の前又は間に行われる。
【００１９】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、健康な対象及び癌と診断された対象に関してｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡの血漿濃度を比較するグラフを示す。
【図２−１】図２Ａは、様々な癌タイプにわたってＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの血漿濃度を比較するグラフを示す。
【図２−２】図２Ｂは、健康な対象に関するＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの血漿濃度を示すグラフを示す。図２Ｃは、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの血漿濃度の直線範囲を示すグラフを示す。
【図３】図３Ａは、臨床試験における肺癌患者に関するＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの相対発現を示すグラフを示す。図３Ｂは、臨床試験における肺癌患者に関してＩＨＣによって測定されたＰＤ−Ｌ１発現を示すデータを示す。
【図４】図４は、処置中のＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルと共に、ニボルマブに対する非応答者及び応答者のＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルを示すグラフと、肺腫瘍サンプルの対応するＩＨＣ染色を示す。
【図５】図５Ａは、ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣによって決定されたＰＤ−Ｌ１状態とＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルとを相関させるグラフを示す。図５Ｂは、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルとニボルマブ応答状態とを相関させるグラフを示し、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルに関する臨床的に関連する発現閾値を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、癌と診断され、処置を受けている対象のＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルに関する血漿濃度を比較するグラフを示す。
【図７】図７は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１組成物を用いた処置を示唆する、アフィニトールを用いた処置の関数としてのＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルを示すグラフを示す。
【図８】図８は、癌処置応答状態を全体的なｃｆＲＮＡ／β−アクチンｃｆＲＮＡと相関させるグラフを示す。
【図９】図９Ａは、ｃｆＲＮＡレベルによって測定したＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２の相対的な共発現を示すグラフを示す。図９Ｂは、ＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡレベルを、ＨＥＲ２  ＩＨＣ／ＦＩＳＨによって決定されたＨＥＲ２状態と相関させるグラフを示し、ＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡレベルに関する臨床的に関連する発現閾値を示す。
【図１０】図１０は、ｃｆＲＮＡレベルによって測定された胃癌におけるＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２の相対的な共発現を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ペルツズマブ及びトルスツズマブ（ｔｒｕｓｔｕｚｕｍａｂ）処置応答をＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡレベルと相関させるグラフを示す。
【図１２】図１２は、選択されたチェックポイント関連遺伝子に関するｃｆＲＮＡシグネチャーを示す。
【図１３】図１３は、ＡＲ−Ｖ７  ｃｆＲＮＡが好適なマーカーであることを示す、前立腺癌患者におけるＡＲ−Ｖ７  ｃｆＲＮＡレベル及びＡＲ  ｃｆＲＮＡレベルに関する例示的な結果を示す。
【図１４】図１４は、ＰＣＡ３  ｃｆＲＮＡが好適なマーカーであることを示す、非前立腺癌及び前立腺癌患者におけるＰＣＡ３  ｃｆＲＮＡレベルに関する例示的な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは、ｃｆＲＮＡが診断、処置の監視のための高感度、選択的、及び定量的マーカーとして、並びに患者の反復及び非侵襲的サンプリングを可能にする発見ツールとしてさえ使用できることを発見した。最も好ましい態様では、ｃｆＲＮＡは、細胞の完全性を保存し、ｃｆＲＮＡ及び／又はｃｔＤＮＡを安定化する条件下で処理される全血から単離される。特に、このような細胞保存条件下での全血処理の間に損傷した非腫瘍細胞から放出されたＲＮＡに対するｃｆＲＮＡの比は、臨床的に意味のある結果を提供し得る定量分析を実施するのに十分高い。非核酸成分から分離された後、循環核酸は、好ましくはリアルタイム定量的ＰＣＲを用いて定量化される。従って、本発明者らはまた、血液中のｃｆＲＮＡの単離、監視及び定量化のためのキット、試薬及び説明書、特に、以下により詳細に議論されるように、特定の遺伝子に関するｃｆＲＮＡの存在を定量的に決定するのに好適なプライマーのためのオリゴヌクレオチドを意図した。
【００２２】
勿論、以下により詳細に議論されるように、１つ以上の所望の核酸が、特定の疾患、疾患段階、特定の変異に関して、又は個人的な変異プロファイル若しくは発現されたネオエピトープの存在に基づいてさえ、選択され得ることを理解するべきである。あるいは、特定の遺伝子の新たな変異又は発現の変化に関する発見又はスキャニングが所望される場合、患者のｃｆＲＮＡトランスクリプトームの少なくとも一部をカバーするように、リアルタイム定量的ＰＣＲをＲＮＡｓｅｑによって置き換え、又は補充することができる。更に、分析は、静的に、又は腫瘍若しくは転移の生検を必要とせずに動的画像を得るために反復サンプリングを用いて経時的に行い得ることを理解するべきである。
【００２３】
異なる観点から見ると、本発明者らは一般に、発現を同定及び定量化し、且つ生検組織のタンパク質ベースの分析によってのみこれまで利用可能であった疾患の指標及び／又は駆動因子の変化の非侵襲的監視を可能にする、循環腫瘍ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の血液ベースのＲＮＡ発現試験のための様々な方法及び組成物を発見した。例えば、企図されるシステム及び方法は、疾患の指標及び／若しくは駆動因子の変化を監視すること、並びに／又は化学療法に対する新たな耐性に関連し得る薬物標的の変化を同定することを可能にする。有利には、企図されるシステム及び方法は、他のオミクス分析プラットフォーム、特にＧＰＳ  Ｃａｎｃｅｒ（全ゲノム又はエキソーム配列決定、ＲＮＡ配列及び発現分析、並びに定量的タンパク質分析を提供する）と統合して、オミクスプラットフォームによって同定される改変が本明細書に提示されるシステム及び方法によって非侵襲的に、分子的に監視される、強力な一次分析／監視組み合わせツールを確立する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明者らは、患者における（例えば、固形）癌の状態を決定する方法を意図し、この方法は、癌との遺伝子の既知の関連及び／又は患者における癌組織の事前のオミクス分析のうちの少なくとも１つに基づいて、癌関係遺伝子を選択するステップを含む。別のステップにおいて、癌関係遺伝子のｃｆＲＮＡが患者の体液（例えば、全血、血清又は血漿）中で定量化され、更なるステップにおいて、ｃｆＲＮＡの量が癌状態に関連付けられる。あるいは、又は癌関係遺伝子に加えて、他のｃｆＲＮＡもまた監視され得る。例えば、癌状態は、薬物による処置に対する癌の感受性、又は患者における癌の有無であり得る。最も典型的には、癌関係遺伝子は、癌関連遺伝子、癌特異的遺伝子、又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープをコードする遺伝子（ＧＰＳ  Ｃａｎｃｅｒオミクス分析を用いて決定され得る）である。更に企図される態様において、以下により詳細に記載されるように、定量化するステップは、ＲＮＡ安定化及び細胞保存下でのｃｆＲＮＡの単離を含み、及び／又は定量化するステップは、ｃｆＲＮＡから調製されたｃＤＮＡのリアルタイム定量的ＰＣＲを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本発明者らはまた、患者から体液を得るステップと、少なくとも１つのチェックポイント阻害関連遺伝子に関して体液中のｃｆＲＮＡを定量化するステップとを含み得る、チェックポイント阻害剤による処置のために患者を選択する方法を企図する。他の好適なｃｆＲＮＡの中でも、特に意図されるｃｆＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２をコードするｃｆＲＮＡを含む。勿論、ｃｆＲＮＡは、完全な遺伝子をコードする必要はなく、研究中の遺伝子の断片であり得ることを認識するべきである。次いで、ｃｆＲＮＡの量を、その量を可能性のある処置結果と関連付ける閾値と比較する。その結果、他の選択肢の中でも、処置結果は１つ以上のチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、及び／又はＬＡＧ３に対する抗体又は抗体断片）による処置、及び／又は様々な受容体を標的とする抗体（例えば、ＥＧＦＲ、ＥＲＣＣ１、ＩＧＦ１、ＨＥＲ２など）による処置に関連している可能性がある。
【００２６】
従って、本発明者らはまた、患者の血液サンプル中の第１及び第２のマーカーのｃｆＲＮＡ量を決定するステップを含む、癌を処置する様々な方法を意図し、ここで、第１のマーカーはチェックポイント阻害関連遺伝子であり、第２のマーカーは、癌関連遺伝子、癌特異的遺伝子、又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープをコードする遺伝子のうちの１つである。更に、このような方法における第１及び第２のマーカーの量は、（例えば、陽性に）関連することが意図される。次いで、第２のマーカーの量を使用して、チェックポイント阻害剤による処置を決定し得る。例えば、第１のマーカーはＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１（又は他のチェックポイント阻害関連マーカー）であり、第２のマーカーはＨＥＲ２である。同様に、第１のマーカーはＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１（又は他のチェックポイント阻害関連マーカー）であり、第２のマーカーはネオエピトープをコードするｃｆＲＮＡである。
【００２７】
更に別の実施形態において、本発明者らはまた、患者の血液サンプル中の複数のマーカーのｃｆＲＮＡ量を決定するステップを含む、患者における免疫シグネチャーを決定する方法を意図し、ここで、複数のマーカーは、チェックポイント阻害関連遺伝子を含む。最も典型的には、決定するステップは、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、免疫療法薬、及び放射線処置のうちの少なくとも１つによる処置の前又は間に行われる。更に、意図される方法は、少なくとも１つの共刺激マーカーのｃｆＲＮＡ量を決定するステップ、及び／又は決定された量に基づいて処置計画を生成又は更新するステップを更に含み得る。
【００２８】
一般に、ｃｆＲＮＡ分析は、ｃｆＲＮＡを含む任意の体液を使用して行われることが意図される。従って、好適な体液には、全血、血漿、血清、リンパ液唾液、腹水、脊髄液、尿などが含まれ、これらの各々は新鮮であり、又は保存／凍結され得る。しかしながら、ｃｆＲＮＡ分析は、生物学的サンプルとして全血を使用することが特に好ましい。全血は、重大な患者の不快感を伴わずに容易に得られ、単純且つ有効な様式で処理され得る。以下により詳細に記載されるように、本発明者らは、全血から細胞を除去するために使用されるプロトコルがＲＮＡの安定性及び収率に対して有意な影響を有することを発見した。特に、本発明者らは、細胞の完全性を維持する条件下で細胞を全血から除去した場合、定量的ｃｆＲＮＡ分析が有意に改善されることを発見した。いかなる理論又は仮説によっても束縛されることを望まないが、本発明者らは、血液中の非腫瘍細胞の細胞溶解が非ｃｆＲＮＡの放出における実質的な寄与因子であることを意図する。更に、特定のＲＮＡ安定化剤も、白血球及び赤血球に悪影響を及ぼし得、従って血漿中への非ｃｆＲＮＡの放出に寄与し得る。
【００２９】
例えば、本明細書に提示される分析のために、標本は、ＲＮＡ又はＤＮＡ安定化剤をそれぞれ含む、無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴ（登録商標）チューブ又は無細胞ＤＮＡ  ＢＣＴ（登録商標）チューブ（両方とも、Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．，７００２  Ｓ．１０９ｔｈ  Ｓｔ．，Ｌａ  Ｖｉｓｔａ  ＮＥ  ６８１２８から市販されている）中に採取された１０ｍＬの全血として許容された。有利には、ｃｆＲＮＡは、無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴチューブ中の全血中で７日間安定であり、一方、ｃｔＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ  ＢＣＴチューブ中の全血中で１４日間安定であり、ｃｆＲＮＡ又はｃｔＤＮＡの分解なしに、様々な位置からの患者サンプルの輸送のための時間を可能にする。しかしながら、ＲＮＡ安定化剤が実質的な細胞溶解（例えば、３％以下、１％以下、又は０．１％以下、又は０．０１％以下、又は０．００１％以下）白血球及び／又は赤血球を溶解しない限り、多数の代替の収集チューブ及び組成物も好適であると考えられることに留意するべきである。異なる観点から見ると、好適なＲＮＡ安定化試薬は、試薬が血液と組み合わされた後、血清又は血漿中のＲＮＡ量の実質的な増加（例えば、１０％以下、又は５％以下、又は２％以下、又は１％以下の総ＲＮＡの増加）をもたらさない。勿論、多数の他の又は追加の収集様式もまた適切であると考えられ、且つｃｆＲＮＡ及び／又はｃｔＤＮＡは更なる処理の前に安定性を増加させるために、少なくとも部分的に精製され、又は固相に一時的に吸着され得ることを認識するべきである。
【００３０】
容易に理解されるように、血漿の分画並びにｃｔＤＮＡ及びｃｆＲＮＡの抽出は、多数の様式で行われ得る。１つの例示的な好ましい態様では、１０ｍＬチューブ中の全血は、１６００ｒｃｆで２０分間、血漿を分画するために遠心分離される。適切な遠心分離速度は、既知の変換（例えば、ＲＣＦ＝１．１１１８×１０−５×ｒｐｍ２、ｒはロータ半径（ｃｍ））に従って、様々なロータに関して計算することができる。次いで、このようにして得られた血漿を、１６，０００ｒｃｆで１０分間更に遠心分離して、細胞残屑を除去する。勿論、遠心分離が血液細胞の実質的な細胞溶解をもたらさず／血液細胞の完全性を維持する限り（例えば、全細胞の３％以下、又は１％以下、又は０．１％以下、又は０．０１％以下、又は０．００１％以下の溶解）、様々な代替の遠心分離プロトコルもまた好適であると考えられる。次いで、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ又は他の市販の試薬を使用して、所望の体積（例えば、２ｍＬ）の血漿から抽出され得る。次いで、全ての単離されたｃｔＤＮＡ及び／又はｃｆＲＮＡを、好ましくはバーコードされたマトリックス貯蔵チューブ中に保持する（例えば、ＤＮＡは−４℃で貯蔵され、ＲＮＡは−８０℃で貯蔵され、又はｃＤＮＡに逆転写された後、−４℃で貯蔵される）。
【００３１】
ｃｆＲＮＡの定量化は多くの様式で実施することができ、企図される方法には、デジタルＰＣＲ法による定量化、外部標準を使用する絶対定量法、及び最も典型的には内部標準を使用する相対定量法（例えば、２ΔΔＣｔとして表される）が含まれる。例えば、リアルタイムｑＰＣＲ増幅は、２μＬのｃＤＮＡ、プライマー、及びプローブを含有する１０μＬの反応混合物中のアッセイを用いて行うことができる。β−アクチンは、ｃｔ−ｃＤＮＡの入力レベルの内部標準として用いることができる。既知濃度の各分析物を有するサンプルの標準曲線を、各ＰＣＲプレート並びに各遺伝子に関する陽性及び陰性対照に含めることができる。次いで、核酸を含むマトリックスチューブ上の２Ｄバーコードをスキャンすることによって、試験サンプルを同定する。ΔＣｔ（ｄＣＴ）は、各分析物に関する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅に由来するＣｔ値から、個々の患者のそれぞれの血液サンプルに関するβ−アクチンのＣｔ値を差し引いたものから計算した。患者標本の相対発現は、遺伝子発現値１０に設定したＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡの連続希釈のΔＣｔの標準曲線を用いて計算する（ΔＣＴを各分析物の対数濃度に対してプロットした場合）。ｃｔＤＮＡは、同様の様式で分析され得る。
【００３２】
ｃｔＤＮＡに関しては、診断試験におけるｃｔＤＮＡの正確性が、癌の診断ツールとして採用されて以来、問題となっていることに注意するべきである。異常に高い偽陽性率を伴う問題は、疾患の進行を監視する際にｃｔＤＮＡに頼る場合、特に疾患の存在の予測にｃｔＤＮＡの使用を考慮する場合に対処する必要がある。図１に示すように、健康な個体は癌患者と同様の量の総ｃｔＤＮＡを産生するが、総ｃｆＲＮＡのレベル（例えば、β−アクチンを使用する定量化によって決定されるような）は、健康な個体において有意に低い。更に、実質的な細胞溶解をもたらさない条件下でｃｆＲＮＡ単離プロトコルを実施した場合、総ｃｆＲＮＡのレベルは、癌患者と健康な個体との間で有意に異なった。実際に、健康な個体の群の間に重複はなく、それによって癌患者がそれらの総ｃｆＲＮＡレベルによって区別されることを可能にした。逆に、癌患者と健康な個体におけるｃｔＤＮＡのレベルの間には重複があった。従って、ｃｔＤＮＡは、これらの２つの群を区別することができなかった。更に意図される方法において、総ｃｆＲＮＡが単離される場合、ｃｆＤＮＡは適切なＤＮＡａｓｅを使用して（例えば、ＤＮＡのオンカラム消化を使用して）除去及び／又は分解され得ることを理解するべきである。同様に、ｃｔＤＮＡが単離される場合、ｃｆＲＮＡは、適切なＲＮＡｓｅを使用して除去及び／又は分解され得る。更に、ｃｆＲＮＡ（ここではＰＤ−Ｌ１）の線形検出範囲は、以下により詳細に示すように、実質的な細胞溶解をもたらさない条件下で単離プロトコルを行った場合に有意であった。
【００３３】
ｃｆＲＮＡという用語は、全長ＲＮＡ及び全長ＲＮＡの断片（５０〜１５０塩基、１５〜５００塩基、又は５００〜１，０００塩基以上の長さを有し得る）を含むことに留意するべきである。従って、ｃｆＲＮＡは、全長ＲＮＡ（典型的にはｍＲＮＡ）の１００〜８０％、又は８０〜６０％、又は６０〜４０％、又は４０〜２０％、又は更にそれ未満であり得るＲＮＡの一部を表し得る。更に、ｃｆＲＮＡという用語は、典型的には腫瘍由来ＲＮＡ（非腫瘍細胞由来のＲＮＡとは対照的に）を指し、従って、ｃｆＲＮＡは、固形腫瘍の腫瘍細胞、血液由来癌、循環腫瘍細胞、及びエキソソーム由来であり得ることを理解するべきである。しかしながら、最も典型的には、ｃｆＲＮＡは膜によって封入されない（従って、循環腫瘍細胞又はエキソソーム由来である）。更に、ｃｆＲＮＡは腫瘍において（例えば、薬物耐性の関数として、又は処置レジメンに応答して、スプライスバリアントとしてなど）、又は遺伝子の変異形態として（例えば、融合転写物として、単一又は多塩基変異を有する遺伝子の転写物としてなど）独特に発現され得ることを理解するべきである。従って、異なる観点から見ると、企図されるｃｆＲＮＡは特に、対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞に固有であり、又は対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において有意に過剰発現（例えば、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍）しており、又は対応する非腫瘍細胞と比較して変異（例えば、ネオエピトープを導くミスセンス又はナンセンス変異）を有する転写物を含む。
【００３４】
従って、好適な標的核酸に関して、適切な標的は特に、疾患及び／又は疾患の処置に関連する遺伝子を含むことを理解するべきである。例えば、疾患標的は、１つ以上の癌関連遺伝子、癌特異的遺伝子、患者及び腫瘍特異的変異を有する遺伝子（及び特にネオエピトープの形成を導くもの）、癌ドライバー遺伝子、並びに癌において過剰発現されることが知られている遺伝子を含む。結果として、好適な標的は、「機能的」タンパク質（例えば、酵素、受容体、転写因子など）をコードするもの、及び「非機能的」タンパク質（例えば、構造タンパク質、チューブリンなど）をコードするものを含む。異なる観点から見ると、好適な標的はまた、罹患した細胞又は器官（例えば、前立腺に関するＰＣＡ３、ＰＳＡなど）に特異的である標的、又はＫＲＡＳ（例えば、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃなど）若しくはＢＲＡＦ（例えば、Ｖ６００Ｅ）における様々な変異などの、異なる癌においてより一般的に見出される標的を含むことができる。本発明者らによって確認された例示的な標的には、ＡＫＴ１、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＡＲ−Ｖ７、ＡＬＫ、ＢＲＣＡ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＤＲ２、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ２、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＢＲＣＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＯＰＹＤ、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ３、ＫＯＲ、ＭＴＯＲ、ＰＤ−Ｕ、ＡＴＭ、ＣＣＮＤ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ３、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤ−１、ＢＩＭ、ＣＤＫ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＨＥＲ２、ＦＧＦ４、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＴＩＭ３、ＮＴＲＫ１、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＮＴＲＫ２、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＮＴＲＫ３、ＲＡＦ１、ＬＡＧ３、ＴＰ５３、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＥＴ、ＴＳＣ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＯ−Ｓ１、ＴＳＣ２及びＵＧＴ１Ａ１が含まれる。
【００３５】
従って、好適な処置標的は、特定の分子実体を標的とする特定の薬物による処置に対する疾患細胞の感受性を示す１つ以上のマーカーを含むことを理解するべきである。例えば、本明細書に提示されるシステム及び方法は、キナーゼ阻害剤によって標的化される特定のキナーゼの存在及び発現レベル、又は合成リガンドによって標的化される特定のシグナル伝達受容体の存在及び発現レベル、又は合成アンタゴニスト若しくは抗体などによって標的化される特定のチェックポイント受容体の存在及び発現レベルを同定するために有用であり得、且つ好適な標的はまた、下記の表１に示すように、適応によってグループ化され得る。
【００３６】
【表１】
2020511137.tif 000003
【００３７】
腫瘍関連抗原及び腫瘍特異的抗原のような既知のマーカーに加えて、患者の腫瘍の事前のオミクス分析は、１つ以上のネオエピトープの存在を明らかにし得ることも理解するべきである。例えば、以前の分析は、好ましくは米国特許第９７２１０６２号に記載されているような増分同期アラインメントを使用して、及び／又はＲＮＡｓｅｑを使用して、全ゲノム又はエキソームの腫瘍対一致正常比較によって行うことができる。加えて、最も好ましくは定量的質量分析法を用いて、プロテオミクス分析を行うことができる。従って、ｃｆＲＮＡはまた、ｃｆＲＮＡがそのような患者及び腫瘍特異的変異（例えば、ネオエピトープ）を含む場合、患者及び腫瘍特異的様式で腫瘍ＲＮＡを検出するために使用され得ることを理解するべきである。例えば、このような検出は、特に処置が患者及び腫瘍特異的変異（例えば、ネオエピトープ）を標的とする免疫療法である場合、処置効果を監視する際に有用であり得る。別の例において、患者及び腫瘍特異的変異の検出はまた、免疫又は化学療法で処置され得る（新たに生じた）処置標的を明らかにし得る。
【００３８】
従って、企図される組成物及び方法は、疾患関連マーカーの発見において、より典型的には好適な標的の定量化において使用されて、処置のための機構的標的の存在に関する情報を得、及び／又は癌細胞集団が処置に従うか、若しくは応答発生を予測するための定量的なプロキシベースラインを得ることができることを理解するべきである。例えば、意図される組成物及び方法は、標的がネオエピトープである場合、ネオエピトープの発現及び量を使用して、ネオエピトープを治療標的として検証し、ネオエピトープの発現及び量を処置進行のためのプロキシマーカーとして使用することができる免疫療法に特に好適である。従って、ｃｆＲＮＡは、処置の前、処置の間、及び処置の後に発現されたネオエピトープの存在を確認するために使用され得、従って個体レベルで処置効力を予測及び／又は定量化することを可能にすることに注目するべきである。
【００３９】
あるいは、及び他の好ましい使用の中でも、ｃｆＲＮＡを定量化して、チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１を標的とする）を用いた処置に好適な患者を同定し得る。これは、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１のレベルを確認するための便利且つ非侵襲的な方法が現在存在せず、患者がチェックポイント阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブなど）を用いた処置から利益を得るかどうかを臨床医に知らせるので、特に有用である。実際、プログラムされた死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）又はその受容体、プログラムされた死１（ＰＤ−１）のような免疫チェックポイントは、多数の腫瘍タイプに関するアキレス腱であるように思われる。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞に免疫逃避を提供するだけでなく、活性化Ｔ細胞のアポトーシススイッチをオンにする。この相互作用をブロックする処置は、いくつかの腫瘍タイプにおいて有望な臨床活性を示した。腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現状態は、黒色腫（ＭＥＬ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む多数の腫瘍タイプにおいて予後が示されている。加えて、腫瘍性ＰＤ−Ｌ１発現は、抗ＰＤ−１抗体に対する応答と密接に相関するように思われる。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１発現を定量化するための標準として一律に受け入れられる試験はない。更に、いくつかの抗ＰＤ−Ｌ１抗体が臨床試験段階にあり、２つがＮＳＣＬＣを処置するためにＦＤＡによって既に承認されている。従って、患者に抗ＰＤ−Ｌ１免疫療法を与える前に、ＰＤ−Ｌ１発現を測定することが重要である。本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１発現及び他の免疫療法に関連する癌マーカーが、以下により詳細に示すように、様々な癌タイプから単離されたｃｆＲＮＡにおけるＰＤ−Ｌ１（及び他のマーカー）発現の頻度及びレベルを分析することによって、ｃｆＲＮＡを使用して定量化され得ることを今回発見した。
【実施例】
【００４０】
全血からのｃｒＲＮＡの単離：全血を静脈穿刺によって得、１０ｍｌを、ＲＮＡ又はＤＮＡ安定剤をそれぞれ含む無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴ（登録商標）チューブ又は無細胞ＤＮＡ  ＢＣＴ（登録商標）チューブ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．，７００２  Ｓ．１０９ｔｈ  Ｓｔ．，Ｌａ  Ｖｉｓｔａ  ＮＥ  ６８１２８）に収集した。次いで、サンプルチューブを１，６００ｒｃｆで２０分間遠心分離し、血漿を取り出し、更に１６，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。血漿を使用して、市販のＲＮＡ単離キットを使用して製造業者のプロトコル（僅かに変更）に従ってｃｆＲＮＡを単離した。詳細には、オンカラムＤＮＡｓｅ消化でサンプルからＤＮＡを除去した。
【００４１】
代替的なアプローチでは、ｃｆＲＮＡは、ＱｉａＳｙｍｐｈｏｎｙ機器（Ｑｉａｇｅｎ，１９３００  Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ  Ｒｏａｄ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ  ２０８７４）上のロボット抽出法を用いて自動化された様式でも得られ、該方法は、所望される場合、ＤＮＡ除去に適応するように僅かに変更された。ロボット抽出は、ｃｆＲＮＡサンプル中の約１２％のＤＮＡ汚染を維持した。本発明者らは、同じ２１のＮＳＣＬＣサンプルにおける切除修復交差補完酵素（ＥＲＣＣ１）対βアクチンの相対発現を測定して、２つの抽出手順の間に有意差があるかどうかを決定した。特に、下記の表に示すように、自動化プロセス及び手動プロセスによって生成された相対発現に統計的差異はなかった。ｐ＝０．４１１１（対ｔ検定；この検定では統計的差異はｐ＜０．０５であった）。
【００４２】
【表２】
2020511137.tif 000004
【００４３】
Ｑｉａｇｅｎからのカスタムキット（ＱｉａＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔ  ＃１０７４５３６）は、１つのカスタムキット中に２つのウイルス抽出キットを含んでいた（ウイルスキットは、ＱｉａＳｙｍｐｈｏｎｙ  ＤＳＰ  Ｖｉｒｕｓ／Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １  ＃９３７０５５と呼ばれる）。分析は、Ｑｉａｇｅｎ機器（ＱｉａｇｅｎからのカスタムプログラムプロトコルＣＦ  ２０００Ｓ＿ＣＲ２１０４０＿ＩＤ９９３）上の単一の専用のプログラム内で行った。
【００４４】
ｃｆＲＮＡの定量化：特に断らない限り、内部対照としてβ−アクチンのプライマー対と共にｒｔＰＣＴ及び遺伝子特異的プライマー対による相対的な定量化を用いて定量化を行った。例えば、増幅は、２μＬのｃＤＮＡ、プライマー、及びプローブを含有する１０μＬの反応混合物中でのアッセイを用いて行った。β−アクチンは、ｃｔ−ｃＤＮＡの入力レベルの内部標準として用いることができる。既知の濃度の各分析物を有するサンプルの標準曲線を、各ＰＣＲプレート並びに各遺伝子に関する陽性及び陰性対照に含めた。核酸を含むマトリックスチューブ上の２Ｄバーコードをスキャンすることによって、試験サンプルを同定した。ΔＣｔ（ｄＣＴ）は、各分析物に関する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅に由来するＣｔ値から、個々の各患者の血液サンプルに関するβ−アクチンのＣｔ値を差し引いたものから計算した。患者標本の相対発現は、遺伝子発現値１０に設定したＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡの連続希釈のΔＣｔの標準曲線を用いて計算した（ΔＣＴを各分析物の対数濃度に対してプロットした場合）。ｃｔＤＮＡを同様の様式で分析した。
【００４５】
それぞれの遺伝子試験に関するΔＣｔ対ｌｏｇ１０相対遺伝子発現（標準曲線）を、反応（歴史的反応）の数百のＰＣＲプレートにわたって捕捉した。各アッセイに関して線形回帰分析を行い、これを用いて、先に進む元の標準曲線からの単一点から遺伝子発現を計算した。
【００４６】
特に、図１に示すように、ｃｔＤＮＡは、健康なドナー及び癌患者、非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）、１０人の癌及び９人の健康な個体から定量化された。統計的に有意な差は、２つの集団間の総ｃｔＤＮＡでは過剰には認められなかった。対照的に、総ｃｆＲＮＡ量（β−アクチンによって測定される）は、２つの集団間で有意に異なり、総ｃｆＲＮＡの測定が癌の存在に関する有効な指標であり得ることを示した。
【００４７】
次いで、本発明者らは、上記の結果が様々な他の癌タイプ及び選択された遺伝子（例えば、ＰＤ−Ｌ１）にわたって確認され得るかどうかを研究し、乳癌、結腸癌、胃癌、肺癌、及び前立腺癌と診断された選択された患者からの血液サンプルを分析した。この一連の試験では、ＰＤ−Ｌ１ｃｆＲＮＡの相対発現を定量化した。結果を図２Ａに示す。興味深いことに、全ての癌が図２Ａに示すようにＰＤ−Ｌ１を発現したわけではなく、様々な癌における陽性の頻度は、固形組織におけるＩＨＣを用いたＰＤ−Ｌ１の公表された発現と一致した。ＰＤ−Ｌ１ｃｆＲＮＡは、図２Ｂから分かるように、健康な患者では検出できなかった。
【００４８】
アッセイバリデーション−正確性：例示的なＰＤ−Ｌ１発現アッセイの正確性は、６１の臨床サンプルからの本ＰＤ−Ｌ１アッセイ（「ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ」）によって生成された結果をデジタルＰＣＲ  ＰＤ−Ｌ１アッセイ（実験室開発参照法、代替ＰＤ−Ｌ１検出アッセイ）と比較することによって決定した。結果を用いて、アッセイの臨床感度及び臨床特異性を決定した。本ＰＤ−Ｌ１アッセイ及びデジタルＰＣＲ  ＰＤ−Ｌ１アッセイからの正確性の結果を表２に要約する。
【００４９】
【表３】
2020511137.tif 000005
【００５０】
アッセイバリデーション−検出限界（ＬＯＤ）：本ＰＤ−Ｌ１アッセイ（「ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ」）の分析感度を、９５％検出率での２０回の反復により決定した。ｃｆＲＮＡを患者の血漿から抽出し、ランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに逆転写し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒの前増幅産物Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｐｒｅａｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘをＰＤ−Ｌ１及びβ−アクチンプライマーと共に使用して、製造業者の説明書に従って１０サイクル前増幅した。得られた前増幅ｃＤＮＡを、患者の血漿からのＰＤ−Ｌ１陰性のｃＤＮＡで２倍インクリメントで希釈した。全ての希釈サンプルを、増幅及び成功したＰＣＲに必要とされる最小量のＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡに関して、ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘによって試験した。次いで、推定ＬＯＤレベルでの２０回の反復を使用して、最終ＬＯＤを確認した。この研究における検出限界（ＬＯＤ）合格基準は、２０回の反復の全てで検出率が９５％を超える最低濃度として決定した。２０回の反復で検出率が９５％を超えることができなかった場合、次に高い濃度の希釈サンプルを推定ＬＯＤとして使用して、２０回の反復を用いて繰り返した。ＬＯＤ試験結果の要約を表３に示し、＊は最終ＬＯＤを示す。
【００５１】
【表４】
2020511137.tif 000006
【００５２】
アッセイバリデーション−検出限界（ＬＯＤ）：精密パネルは、低陽性ＰＤ−Ｌ１サンプル、中陽性ＰＤ−Ｌ１サンプル、高陰性ＰＤ−Ｌ１サンプル、陽性対照、及び鋳型なし対照を含んだ。全ての陽性サンプルは、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞株から作製した。各精密パネルを、３人の異なる操作者（Ｏｐ）によって、合計３日間（連続又は非連続）、１日当たり２つの機器に関して、１ラン当たり４連で、機器当たり２回試験した。精密パネルの各サンプルは、３日間にわたり合計４８のデータ点を生成した。試験デザインを表４に示す。
【００５３】
【表５】
2020511137.tif 000007
【００５４】
アッセイ内精度は、２つの機器、２人の操作者、１日、及びサンプル当たり４回の反復を使用して行った。全ての反復試験の結果一致率は９６％以上である。表５は、アッセイ内精度の例示的な要約である。
【００５５】
【表６】
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【００５６】
２つの機器、２人の操作者、３回のランを３日間にわたって行い、４連のランをアッセイ間精度に関して試験した。結果一致率は、独立したランにわたる全ての反復に関して９６％以上に達した。結果の要約を表６に示す。
【００５７】
【表７】
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【００５８】
アッセイバリデーション−線形範囲：本ＰＤ−Ｌ１アッセイ（「ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ」）の定量的線形範囲を、ｃｆＲＮＡ由来のＰＤ−Ｌ１陽性患者のｃＤＮＡをプールされた陰性マトリックス（ｃｆＲＮＡ由来のＰＤ−Ｌ１陰性ｃＤＮＡ）に希釈することによって決定した。ｃｔ  ＲＮＡを患者の血漿から抽出し、ランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに逆転写し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒの前増幅産物Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｐｒｅａｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘをＰＤ−Ｌ１及びβ−アクチンプライマーと共に使用して、製造業者の説明書に従って１０サイクル前増幅した。得られた前増幅ｃＤＮＡを、患者の血漿からのＰＤ−Ｌ１陰性のｃＤＮＡで２倍インクリメントで希釈した。全ての希釈サンプルをＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ  ＰＤ−Ｌ１によって試験して、その定量的直線範囲を決定した。図２Ｃは、最終的な線形範囲を示す。線の直線部分は、約３２．５のＣｔまで延在する。β−アクチン及びＰＤ−Ｌ１勾配も一致する。
【００５９】
アッセイバリデーション−特異性：試験サンプルを、ＴＥバッファーマトリックス中のヒトＰＤ−Ｌ１細胞株ｃＤＮＡの連続希釈によって調製した。中陽性サンプルに関する標的分析物の濃度は、ＬＯＤ濃度の４倍であった。各干渉物質を有する中陽性サンプル（各干渉物質を有する１つの分析物）及びベースラインサンプルを、本ＰＤ−Ｌ１アッセイ（「ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ」）によって３連で試験した。表７は、干渉物質及びそれらの試験濃度のリストである。異なる干渉物質の試験濃度を有する全てのサンプルは、依然として、ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ  ＰＤ−Ｌ１アッセイによって陽性であると決定された。
【００６０】
【表８】
2020511137.tif 000010
【００６１】
特に、異なる干渉物質の試験濃度を有する全てのサンプルは、依然として、ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ  ＰＤ−Ｌ１アッセイによって陽性であると決定された。
【００６２】
本ＰＤ−Ｌ１アッセイ（「ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｅＤｘ」）は、癌患者の血液中のＰＤ−Ｌ１遺伝子及び他の遺伝子の発現を検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイとして設計された。他の利点の中でも、そのような測定は、薬物療法の前及び間に、特定の薬物（例えば、抗ＰＤ−１抗体）を用いた可能性のある処置成功に関して臨床医に知らせることができる。
【００６３】
ｃｆＲＮＡが正確に定量化され得るという上記の知見に基づいて、本発明者らは、定量化されたｃｆＲＮＡレベルがまた、ＦＩＳＨ、質量分析などのような従来の方法によって測定される既知の分析物レベルと相関するかどうかを決定することを追求した。より詳細には、ＰＤ−Ｌ１発現の頻度及び強度を、ＬｉｑｕｉｄＧｅｎｏｍｉｃｓＤｘを使用して、３２０人の連続したＮＳＣＬＣ患者の血漿からのｃｆＲＮＡによって測定し、また組織ＩＨＣ試験を使用して、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）の登録試験であるＫｅｙｎｏｔｅ  Ｔｒｉａｌにおける陽性患者の頻度と比較した。特に、Ｋｅｙｎｏｔｅ試験におけるＮＳＣＬＣ患者の６６％（１，４７５／２，２２２）はＩＨＣによるＰＤ−Ｌ１の発現を有し（＞１％の細胞陽性）、一方、ＰＤ−Ｌ１の血液ベースｃｆＲＮＡ試験を有するＮＳＣＬＣ患者の６４％（２０４／３２０）は、図３Ａ及び３Ｂから分かるように陽性であった。注目すべきことに、２つの分析方法の間でＰＤ−Ｌ１状態に有意差はなかったが、ｃｆＲＮＡ試験は定量的データを与えた。
【００６４】
特に、２人の選択患者（Ｐｔ＃１及びＰｔ＃２）のＰＤ−Ｌ１状態の差異（即ち、ＰＤ−Ｌ１陽性又はＰＤ−Ｌ１陰性）も、図４から分かるように、ＩＨＣ分析及びニボルマブによる処置応答とよく相関していた。ここでは、２人の扁平上皮肺癌患者を抗ＰＤ−１抗体ニボルマブで処置した。患者１は、ｃｆＲＮＡ測定を用いて、組織又は血液中でＰＤ−Ｌ１の発現を有さなかった。患者１はニボルマブに応答しなかった。腫瘍増殖はＣＴスキャンによって証明され、患者は急速に死亡した。対照的に、患者２は、ｃｆＲＮＡ測定を用いて、ベースラインで組織及び血液中に高レベルのＰＤ−Ｌ１を有した。患者２は、薬剤の数サイクルにわたって持続的な応答でニボルマブに応答した。この応答は、劇的な腫瘍縮小を伴うＣＴスキャンによって実証された。興味深いことに、この患者の血液中の高レベルの遺伝子発現（ｃｆＲＮＡによって測定）は３週間半後に消失したが、患者は応答し続けた。
【００６５】
上記の観察された相関に基づいて、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの発現レベルがＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達を妨害するニボルマブ又は他の治療剤を用いた処置に対する応答予測に好適な閾値レベルを提供し得るか否かを研究することを開始した。そのために、ＰＤ−Ｌ１発現を、ｃｆＲＮＡを用いてＮＳＣＬＣ患者血漿中で測定し、ＩＨＣ状態と比較した。図５Ａは、ｃｆＲＮＡによる応答閾値を上回るＩＨＣ及びＰＤ−Ｌ１発現によって決定されるような、抗ＰＤ−Ｌ１治療剤を用いた処置応答状態とＰＤ−Ｌ１状態との間の相関を示す。処置応答者と判定された患者はＰＤ−Ｌ１陽性としてＩＨＣによっても判定されたが、処置に対する非応答者と判定された患者は全て、ＰＤ−Ｌ１陰性としてＩＨＣによって判定された。注目すべきことに、応答閾値をその後のデータに適用した場合、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルを使用して、応答者と非応答者との間の同じ分離を達成することができた。この例では、１０の相対発現閾値が応答者を非応答者から正確に分離した。図５Ｂは、β−アクチンに対するＰＤ−Ｌ１に関してΔΔＣＴ＞１０のｃｆＲＮＡ応答閾値がＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤（ここではニボルマブ）に対する陽性応答を予測することを示す。ニボルマブに対する全ての応答者は、処置前に閾値レベルを超えるＰＤ−Ｌ１を発現した。
【００６６】
本発明者らは更に、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡ発現レベルが、進行性疾患（ＰＤ）、安定疾患（ＳＤ）、及び／又は部分応答（ＰＲ）の指標として、他の癌処置において使用できるかどうかを研究した。その目的のために、ｃｆＲＮＡによって測定されたＰＤ−Ｌ１の動的変化が図６Ａ〜６Ｄに例示的に示すように、様々な処置レジメン下での処置過程の間に見出された。パネルＡは、進行性疾患を有する患者におけるアブラキサンを用いた乳癌の処置過程にわたるＰＤ−Ｌ１の相対発現レベルを示す。処置に対する応答の欠如は、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの上昇に反映され、ＣＤＸ−０１１（グレムバツムマブ・ベドチン）を用いた処置に有利なようにアブラキサン処置を中止した。図６Ａから分かるように、ＣＤＸ−０１１を用いた処置は疾患安定化をもたらし、これはまた、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの減少に反映される。同様に、図６Ｂから分かるように、肺癌患者は、カルボプラチン／アリムタ併用療法で安定した疾患で処置され、患者が部分応答を示すにつれて、最初は高レベルのＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡが劇的に減少した。結腸癌の場合、進行性疾患を有する患者は、カペシタビン及びベバシズマブで処置された。処置中、相対ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡ発現は有意に増加した。５−ＦＵ及びベバシズマブで癌を処置すると、図６Ｃから分かるように、患者は、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルの有意な低下を伴う部分応答を有した。従って、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの定量的レベルがまた、処置応答を監視するために正確に役立ち得ることを意図する。
【００６７】
更に別の例において、本発明者らは、図６Ｄに示すように、エキセメスタン／アフィニトールを用いた処置の際に、安定な疾患の乳癌を有する患者におけるＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡの急速な増加を観察した。特に、患者は、処置前に測定可能な量のＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡを有していなかった。この観察に基づいて、本発明者らはアフィニトール処置を受けた更なる乳癌患者サンプルを試験した。例示的な結果を図７に示す。容易に明らかなように、相対的なＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡは、第２の採血で、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤による処置に好適なレベルまで、処置後に有意に増加した。従って、本発明者らはまた、癌処置（特にＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤以外の薬物を使用するもの）に続いて、ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡ発現の出現を同定するためにＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡを少なくとも監視することができ、次いでＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤による処置の指標として役立つことができることを企図する。異なる観点から見ると、癌処置中の以前には検出できなかったＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡ発現の検出及び定量化は、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤で患者を（更に）処置するための指標として使用され得る。
【００６８】
興味深いことに、図８から分かるように、癌の疾患状態はまた、少なくともある程度β−アクチンｃｆＲＮＡに類似していた。血液はＣＴスキャンが行われるのと同時に、６〜８週間毎に様々な治療下の患者から採血された。転移性乳癌を有する４５人の患者の血漿からｃｆＲＮＡを抽出し、３０人の患者は最初の２サイクルの治療を完了した：ＰＲを有する６／６の患者は、β−アクチンｃｆＲＮＡレベルの変化を示さず（ＮＣ）又はレベルが減少し（ＤＥＣ）、ＳＤを有する１３／１６の患者は、ｃｆＲＮＡレベルのＮＣ又はＤＥＣを示し、ＰＤを有する６／８の患者は、ｃｆＲＮＡレベルの増加（ＩＮＣ）を受けた。ｃｆＲＮＡをランダムヘキサマーでｃＤＮＡに逆転写した。ｃｆＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで定量化し、ＣＴスキャンで測定して、患者の応答（ＰＲ／ＳＤ／ＰＤ）と相関させた。ｃｆＲＮＡ（ＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２を含む）における遺伝子発現のレベルを、採血中の患者において監視した。特に、進行性疾患を有する乳癌患者のβ−アクチンｃｆＲＮＡレベルは、安定疾患及び／又は部分応答を有する患者のβ−アクチンｃｆＲＮＡレベルより高かった。従って、β−アクチンｃｆＲＮＡレベルの増加は、疾患状態、特に癌と既に診断された患者における進行性疾患の主要な指標として役立ち得ることを理解するべきである。
【００６９】
乳癌サンプルの更なる研究に際して、本発明者らはまた、図９Ａに示すように、腫瘍におけるＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡがＰＤ−Ｌ１と共発現又は共調節されているように思われることを発見した。これに基づいて、本発明者らは、次いで、抗ＨＥＲ２抗体を使用する免疫組織化学分析（ＩＨＣ）によるＨＥＲ２状態分類を使用して、ＩＨＣ−ＨＥＲ２状態を、ｃｆＲＮＡレベルによって測定されるＨＥＲ２の定量的相対発現と相関させた。注目すべきことに、ＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡ発現レベルとＩＨＣ  ＨＥＲ２状態との間に有意な相関（８２％一致）があり、図９Ｂに例示的に示すように、β−アクチンに対するＨＥＲ２に関してΔΔＣＴ＞５を適用した。従って、ＨＥＲ２状態はまた、上記に提供されるような発現閾値を使用するＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡの検出及び定量化を用いて決定できることが意図される。
【００７０】
更なる実験において、本発明者らはまた、少なくともいくつかの胃腫瘍におけるＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡも、図１０に示すように、ＰＤ−Ｌ１と共発現又は共調節されているように見えることを発見した。このような発見は、全胃癌の約１５％がＨＥＲ２を発現することが知られていることから、特に注目に値する。結果として、本発明者らは、胃癌患者におけるＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡを検出又は定量化する方法を企図する。更に、本発明者らはまた、ｃｆＲＮＡによって測定される１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）が他の癌特異的マーカー又は腫瘍関連マーカー（例えば、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＭＵＣ１、ブラキュリなど）のためのプロキシマーカーとして使用され得ることを意図する。
【００７１】
容易に理解されるように、ＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡレベルの定量化はまた、処置に続いて、特に、抗ＨＥＲ２薬物を用いた処置が治療効果を有するか否かを評価するために使用され得る。例えば、転移性乳癌患者のコホートの例示的な２人の患者（それぞれ２５及び１２）における２つの抗ＨＥＲ２薬物（ペルツズマブ及びトルスツズマブ（ｔｒｕｓｔｕｚｕｍａｂ））に対する部分的処置応答は、図１１に示すように、陽性応答がｃｆＲＮＡの減少と直接相関することを示した。実際に、過去３ヶ月間の処置では、検出可能な量のＨＥＲ２  ｃｆＲＮＡは存在しなかった。
【００７２】
観察された共発現又は共調節に基づいて、本発明者らは、次いで、免疫チェックポイント関連遺伝子の他のｃｆＲＮＡレベルがＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡレベルと相関するかどうかを研究した。例示的な結果を図１２に示す。ここで、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のｃｆＲＮＡレベルを前立腺癌患者の血液サンプルから測定した。特に、１つを除く全てのサンプルにおいて、２つ以上のチェックポイント関連遺伝子が強く発現された。興味深いことに、また重要なことに、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３のレベルは、その前者がＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害のための逃避メカニズム又は耐性因子として働くことが示されており、しばしばＰＤ−Ｌ１発現を反映し、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１以外の全てのチェックポイントタンパク質に対処する必要性を強調している。従って、免疫チェックポイント関連遺伝子のｃｆＲＮＡレベルを癌患者に関して分析して、免疫シグネチャー又は患者を得ることができ、次いで、２つ以上のチェックポイント阻害薬を用いた適切な処置を勧めることができることを理解するべきである。理解されるように、遺伝子に関する好適な閾値は、上記のＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２に関して記載される方法に従って確立され得る。
【００７３】
本発明の主題の尚更なる態様において、様々な代替のｃｆＲＮＡ種は、健康な個体を癌に罹患した個体から定量的に区別すること、及び／又は処置応答を予測することが実証された。例えば、アンドロゲン受容体のスプライスバリアント７（ＡＲ−Ｖ７）の検出は、ホルモン療法による前立腺癌の処置のための重要な考慮事項であった。従って、本発明者らは、ホルモン療法耐性が前立腺癌腫瘍増殖と、ＡＲ−Ｖ７  ｃｆＲＮＡの検出及び定量化を介したＡＲ−Ｖ７の検出とに関連するか否かを研究した。図１３は、前立腺癌患者からの血漿を使用するｃｆＲＮＡ法によるＡＲ及びＡＲ−Ｖ７遺伝子発現に関する例示的な結果を示す。ＡＲ−Ｖ７も、同じ患者からのＣＴＣからのＩＨＣ技術を用いて測定した。特に、ＡＲ−Ｖ７のＣＴＣ及びｃｆＲＮＡの結果は一致していた（データは示されていない）。
【００７４】
更に、ＰＣＡ３は、ＰＣＡ３  ｃｆＲＮＡが前立腺癌患者からの血漿中で検出及び定量化され、非前立腺癌患者サンプルが比較的低レベルから非検出レベルを有していた試験において、前立腺癌のマーカーとして同定された。非前立腺癌患者は、ＮＳＣＬＣ及びＣＲＣ患者であった。図１４から分かるように、ＰＣＡ３は、ｃｆＲＮＡによって２つの群の間で差次的に発現されることが示され（前立腺癌患者と非前立腺癌患者との間の非重複中央値）、非侵襲的血液ベースｃｆＲＮＡ試験が前立腺癌を検出するために使用され得ることを示す。もう一度、試験された集団の先験的知識に基づいて、発現に関する閾値（ここでは、β−アクチンに対するＰＣＡ３に関してΔΔＣＴ＞１０）が図１４に例示的に示すように確立され得る。
【００７５】
尚更なる研究において、本発明者らは、遺伝子発現及びｃｆＲＮＡを含む核酸の総レベルにおける動的変化を測定するためのツールとして、癌患者（ｐｔ）の血漿から抽出された総無細胞循環腫瘍ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の分析を用いた。これらの分析は、疾患状態に関する洞察を更に再び提供し、抗腫瘍療法に対する転帰を予測することを可能にした。
【００７６】
より詳細には、ＣＴスキャンが行われたのと同時に、６〜８週毎に様々な処置（ｔｘ）の下でｐｔから血液を採取した。得られた血漿からＣｆＲＮＡを抽出し、ランダムヘキサマーを用いて上記のようにｃＤＮＡに逆転写した。総ｃｆＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで定量化し、ＣＴスキャンで測定したｐｔ応答（ＰＲ／ＳＤ／ＰＤ）と相関させた。この研究では、合計３０人の肺癌ｐｔが２年臨床試験に登録された。民族性は、白人７３％（２２／３０）、ヒスパニック２０％（６／３０）、その他７％（２／３０）であった。非ＳＱＣＣは全体の８７％（２６／３０）であった。２３ｐｔがｔｘの最初の２サイクルを完了した。これらのうち、進行性疾患（ＰＤ）を有する６／８のｐｔは、総ｃｆＲＮＡの増加した（ＩＮＣ）レベルを示し、安定疾患（ＳＤ）を有する８／１２のｐｔは変化なし（ＮＣ）又は減少した（ＤＥＣ）総ｃｆＲＮＡのいずれかを示し、また部分応答（ＰＲ）を有する３／３のｐｔはＤＥＣ総ｃｆＲＮＡを有し、これは、総ｃｆＲＮＡとｐｔ応答との間の７４％一致に対応する。血漿ｃｆＲＮＡにおいて測定されたＰＤ−Ｌ１発現は、７／１０のｐｔにおける組織のものと一致した。ＰＤ−Ｌ１が血中で陰性であり、組織中で陽性であった１ｐｔでは、ｐｔはペンブロリズマブに進んだ。免疫療法（ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ）で処置した７ｐｔのうち、ＰＤを有する３／３ｐｔがＩＮＣ  ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡ発現を示し、ＳＤを有する３／３ｐｔがＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡにおいてＮＣを有し、ＰＲを有する１ｐｔがＤＥＣ  ＰＤ−Ｌ１  ｃｆＲＮＡを示し、これは、ＰＤ−Ｌ１発現レベルとｐｔ応答との１００％相関に対応する。処置後、ＮＳＣＬＣｐｔにおける臨床応答と血漿ｃｆＲＮＡレベルの変化との間に有意な一致が観察された（７４％）。ｐｔ血漿中のＰＤ−Ｌ１発現の検出はまた、同じｐｔの組織から得られた結果と相関した（７０％）。標的療法を受けている間、７／７のｐｔにおいてＰＤ−Ｌ１発現のレベルは応答と相関した。従って、ｃｆＲＮＡレベルはｔｘ応答を示すことができ、血漿中のＰＤ−Ｌ１を使用して免疫療法に対する応答を監視できると結論付けることができる。
【００７７】
当業者には、本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に説明したもの以外にもっと多くの修正が可能であることが明らかであろう。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるべきではない。更に、明細書と特許請求の範囲の両方を解釈する際、全ての用語は文脈と矛盾することのない、最も幅広い可能な方法で解釈されるべきである。特に、「含む」及び「含んでいる」という用語は、参照される要素、構成要素、又はステップが、存在し得、利用され得、又は明示的に参照されない他の要素、構成要素、又はステップと組み合わされ得ることを示す、非排他的な方法で要素、構成要素、又はステップを参照するものとして解釈されるべきである。明細書の特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．及びＮからなる群から選択される何かのうちの少なくとも１つに言及する場合、本文は、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎなどではなく、群からの１つの要素のみを必要とするものとして解釈されるべきである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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