(57)【要約】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）、１つ以上のＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞、及びそれらを使用してがん等の疾患を治療する方法が、本明細書中に提供されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  ＴＣＲサブユニットを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の組み換え核酸分子であって、前記ＴＣＲサブユニットが、
（ｉ）  ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部と、
（ｉｉ）  ＣＤ３サブユニットの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを備えるＴＣＲ細胞内ドメインと、
（ｉｉｉ）  第１の標的結合ドメインであって、前記ＴＣＲサブユニット及び前記第１の標的結合ドメインが作動可能に連結され、且つ前記第１の融合タンパク質がＴ細胞内で発現したときにＴＣＲ内に組み込まれる、前記第１の標的結合ドメインと、
を含む前記第１の組み換え核酸分子と、
（ｂ）  第２の標的結合ドメインを有する第２の融合タンパク質をコードする第２の組み換え核酸分子であって、前記第２の標的結合ドメインがそのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されているＰＤ−１ポリペプチドを含み、前記ＰＤ−１ポリペプチドが前記細胞外ドメインとＰＤ−１の膜貫通ドメインとを含む、前記第２の組み換え核酸分子と、
を具備する組成物。
【請求項２】
前記第１の標的結合ドメインが、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）  ＴＣＲサブユニットを含む第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の組み換え核酸分子であって、前記ＴＣＲサブユニットが、
（ｉ）  ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部と、
（ｉｉ）  ＣＤ３サブユニットの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを備えるＴＣＲ細胞内ドメインと、
（ｉｉｉ）  第１の抗原結合ドメインを備える第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、任意に第２の抗原結合ドメインとを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインを有し、前記ＴＣＲサブユニット、前記第１の抗体ドメイン及び前記第２の抗体ドメインが作動可能に連結され、且つ前記第１のＴＦＰがＴ細胞内に発現したときにＴＣＲ内に組み込まれる、前記第１の組み換え核酸分子と、
（ｂ）  第２の標的結合ドメインを有する第２の融合タンパク質をコードする第２の組み換え核酸分子であって、前記第２の標的結合ドメインがそのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されているＰＤ−１ポリペプチドを含み、前記ＰＤ−１ポリペプチドが前記細胞外ドメインとＰＤ−１の膜貫通ドメインとを含む、前記第２の組み換え核酸分子と、
を具備する組成物。
【請求項４】
前記抗体ドメインが、ＲＯＲ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソセリン、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−１３Ｒα２、Ｌ１ＣＡＭ、及びＮＹ−ＥＳＯ−１、及びそれらの組み合わせを含むリストから選択される腫瘍関連抗原に特異的に結合し得る、請求項２または請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記共刺激ポリペプチドが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを含む群から選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の組み換え核酸分子が単離されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記第２の組み換え核酸分子が単離されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の第１及び第２の核酸分子を含むウイルスベクターを具備する組成物。
【請求項９】
前記第１の組み換え核酸分子及び前記第２の組み換え核酸分子が、単一のオペロン内に含有される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の組み換え核酸分子及び前記第２の組み換え核酸分子が、別々に転写された２つのオペロン内に含有される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オペロンがＥ１ａプロモーターを具備する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オペロンがそれぞれＥ１ａプロモーターを具備する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の第１の組み換え核酸分子を含むウイルスベクターを具備する組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の第２の組み換え核酸分子を含むウイルスベクターを具備する組成物。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターが単離されている、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１４及び／または１５に記載のウイルスベクターの混合物を具備する組成物。
【請求項１８】
請求項１〜５、８〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む形質導入Ｔ細胞を具備する、組成物。
【請求項１９】
形質導入Ｔ細胞を具備する組成物であって、前記形質導入Ｔ細胞が、請求項１４に記載のウイルスベクターと請求項１５に記載のウイルスベクターとを具備する、前記組成物。
【請求項２０】
前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質がそれぞれ前記Ｔ細胞の表面上で検出可能である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
第１のポリペプチドを含むＴ細胞を具備する組成物であって、前記第１のポリペプチドが、
（ａ）  ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）  ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部と、
（ｉｉ）  ＣＤ３εまたはＣＤ３γの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを備えるＴＣＲ細胞内ドメインと、
（ｉｉｉ）  第１の標的結合ドメインであって、前記ＴＣＲサブユニット及び前記第１の標的結合ドメインが作動可能に連結され、且つ前記第１の融合タンパク質が前記Ｔ細胞中のＴＣＲ内に組み込まれる、前記第１の標的結合ドメインと、
を含む前記ＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）  第２の標的結合ドメインを有する第２の融合タンパク質であって、前記第２の標的結合ドメインが、そのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されているＰＤ−１ポリペプチドを含み、前記ＰＤ−１ポリペプチドが前記細胞外ドメインと前記ＰＤ−１の膜貫通ドメインとを含む、前記第２の融合タンパク質と、
を具備する組成物。
【請求項２２】
前記第１の標的結合ドメインが、ＣＤ１６、ＢＣＭＡ、ＭＳＬＮ、ＮＫＧ２Ｄ、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及び前立腺特異的がん抗原（ＰＳＣＡ）を含む群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記共刺激ポリペプチドが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを含む群から選択される、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第２の融合タンパク質の共刺激ポリペプチドがＣＤ２８である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記コードされた第１の抗原結合ドメインが、第１のリンカー配列を介して前記第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに連接され、且つ前記コードされた第２の抗原結合ドメインが、第２のリンカー配列を介して前記第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに連接される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第１のリンカー配列及び前記第２のリンカー配列が（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を具備する、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットがＴＣＲ細胞外ドメインを具備する、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインを具備する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞内ドメインを具備する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメインと（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインとを含み、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが、前記同じＴＣＲサブユニットに由来する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットに、ＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δ、または少なくとも１つの修飾を施されたアミノ酸配列の細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメインを備える、ＴＣＲ細胞内ドメインが含まれる、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットに刺激ドメインを備える細胞内ドメインが含まれ、前記刺激ドメインが、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメイン、もしくは少なくとも１つの修飾を施されたアミノ酸配列の機能的シグナル伝達ドメインから選択される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、前記第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインまたは両方が抗体フラグメントを具備する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、前記第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方が、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを具備する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記コードされた第１のＴＦＰにＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインが含まれ、前記細胞外ドメインに、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の細胞外ドメインまたはその一部が含まれる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記コードされた第１のＴＦＰに膜貫通ドメインが含まれ、前記膜貫通ドメインに、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の膜貫通ドメインが含まれる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記コードされた第１のＴＦＰに膜貫通ドメインが含まれ、前記膜貫通ドメインに、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の膜貫通ドメインが含まれる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記第１及び／または第２の核酸分子が、共刺激ドメインをコードする、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質ならびにそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列から得られる、機能的シグナル伝達ドメインである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１及び／または第２の核酸分子が、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第１及び／または第２の核酸分子がリーダー配列をコードする、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記少なくとも１つ但し２０以下の修飾に、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または第１のＴＦＰに結合するリガンドに応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾が包含される、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第１及び／または第２の核酸分子がＲＮＡである、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記第１のＴＦＰが、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、ＴＣＲζ鎖、Ｆｃε受容体１鎖、Ｆｃε受容体２鎖、Ｆｃγ受容体１鎖、Ｆｃγ受容体２ａ鎖、Ｆｃγ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃγ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃγ受容体３ａ鎖、Ｆｃγ受容体３ｂ鎖、Ｆｃβ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄからなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを具備する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３εのＩＴＡＭを置換する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、且つＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物の第１及び第２の核酸分子を介してコードされる複数のポリペプチド分子。
【請求項４８】
前記ベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたベクターである、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ベクターが、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を更に含む、請求項８〜１７または請求項４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ベクターが、３’ＵＴＲをコードする配列を更に含む、請求項６〜１４または４８〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／４３７，５２４号の利益を主張するものであり、該文献はその全体が本明細書において参照により援用されている。
【背景技術】
【０００２】
後期固形腫瘍の患者のほとんどは、標準的な療法では治療不可能である。その上、従来の治療選択肢には、深刻な副作用が伴うことがしばしばであった。がん性細胞を拒絶するために患者の免疫系を関与させるための、がん免疫療法と総称される、多数の試みが為されてきた。しかしながら、幾多の障害によって、臨床的有効性の達成は極めて困難なものとなっている。これまでに同定されたいわゆる腫瘍抗原は数百種にも及ぶが、多くの場合は自己由来であることから、がん免疫療法を健常組織に対して指向してしまう可能性もあれば、あるいは免疫原性が低度であることもある。更になお、がん細胞は、複数の機序を用いて、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播を不可視または敵視する。
【０００３】
養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、進行期の転移性がんでさえ治療の対象とする強力なアプローチである（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ８（１０）（２０１１）。ＡＣＴでは、抗原特異的Ｔ細胞を、単離または操作し、且つｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた後、患者に再注入する（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６（５）（２００６）。臨床試験では、全身照射及びＡＣＴの併用によって、一部のがん患者において比類なき奏効率が達成されてきた反面、この治療は、患者の大多数には奏効していない（Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６（３２）（２００８）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７（１３）（２０１１）。全身照射では減弱されない腫瘍誘発性の免疫抑制は、この治療抵抗性に関与しているものとされてきた（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５（２００７）。つい最近になってから、阻害性受容体が活性化Ｔ細胞に対して上方制御され、且つそれらの各リガンドが腫瘍環境内に発現した場合、Ｔ細胞療法の不成功に寄与することが、明らかにされてきた（Ａｂａｔｅ−Ｄａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（８）（２０１３）。最近の研究によって、腫瘍内の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１が同定されてきたことを鑑みれば、阻害性受容体のなかでもとりわけ中心的な役割を果たしているのが、プログラム死受容体−１（ＰＤ−１）である（Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２０１４））。ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用によって、ＴＣＲシグナル伝達及びＴ細胞活性化が抑制され、ひいては標的認識時の有効な活性化が妨げられる（Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２０１４）；Ｙｏｋｏｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０９（６）（２０１２）；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１４）；Ｋａｒｙａｍｐｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１４））。これらの機序の臨床的重要性は、抗体ベースのＰＤ−１遮断とＡＣＴまたは遺伝子修飾Ｔ細胞とを併用し結果として抗腫瘍活性を著しく向上させる、療法研究によって強調されている（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（２０）（２０１３）；Ｇｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０（９）（２０１３）。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断抗体の全身的適用は、任意の反応性のＴ細胞を標的とする可能性があり、ひいては全身的副作用を誘発するという欠点を有する（Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６（２６）（２０１２）；Ｂｒａｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６（２６）（２０１２））。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１媒介Ｔ細胞阻害を鑑み、ＡＣＴの安全性及び有効性を向上させ、且つ上記の不利益を克服することが可能な、改良型の手段を提供することが、依然として必要とされている。
ＰＤ−１融合タンパク質とこのニーズに対応するように設計されている修飾Ｔ細胞受容体とを具備する操作されたＴ細胞が、本明細書中に記載されている。
【発明の概要】
【０００５】
Ｔ細胞操作用の融合タンパク質及びそれらの組み合わせ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）、ＰＤ−１と共刺激ドメインとを含む融合タンパク質、１つ以上のＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞、ＰＤ−１と共刺激ドメインとを含む融合タンパク質、ならびにそれらを疾患治療の目的に使用する方法が、本明細書中に提供されている。
【０００６】
一態様では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子が、本明細書中に提供されている。このＴＦＰには、ＴＣＲサブユニットと、ヒトまたはヒト化抗体ドメインとが含まれ、本ヒトまたはヒト化抗体ドメインには、ＰＤ−１ポリペプチドまたはそのフラグメントが含まれる。
【０００７】
一態様では、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部と、ＣＤ３サブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを備えるＴＣＲ細胞内ドメインと、第１の標的結合ドメインと、を具備するＴＣＲサブユニットにおいて、本ＴＣＲサブユニット及び第１の標的結合ドメインが作動可能に連結され、第１の融合タンパク質が、Ｔ細胞中で発現した際にＴＣＲに組み込まれ、第２の単離された組み換え核酸分子が、第２の標的結合ドメインを有する第２の融合タンパク質をコードし、第２の標的結合ドメインが、そのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されているＰＤ−１ポリペプチドを含み、ＰＤ−１ポリペプチドが、細胞外ドメインとＰＤ−１の膜貫通ドメインとを含む、本ＴＣＲサブユニットを具備する第１の融合タンパク質をコードする第１の単離された組み換え核酸分子を具備する組成物が、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインが、ヒトまたはヒト化抗体ドメインである。
【０００８】
一態様では、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の単離された組み換え核酸分子であって、本ＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部と、ＣＤ３サブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを備えるＴＣＲ細胞内ドメインと、第１の抗原結合ドメインを備える第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、及び任意に、第２の抗原結合ドメインを備える第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインを有するＴＣＲサブユニットを具備し、ＴＣＲサブユニット、第１の抗体ドメイン及び第２の抗体ドメインが作動可能に連結され、且つ第１のＴＦＰが、Ｔ細胞内に発現したときにＴＣＲ内に組み込まれ、第１の単離された組み換え核酸分子と、第２の標的結合ドメインを有する第２の融合タンパク質をコードする第２の単離された組み換え核酸分子であって、この第２の標的結合ドメインがそのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されているＰＤ−１ポリペプチドを含み、ＰＤ−１ポリペプチドが細胞外ドメインとＰＤ−１の膜貫通ドメインとを含む、第２の単離された組み換え核酸分子と、を具備する組成物が、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ＲＯＲ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソセリン、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｉｌ−１３Ｒα２、Ｌ１ＣＡＭ及びＮＹ−ＥＳＯ−１、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される腫瘍関連抗原に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、共刺激ポリペプチドは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される。
【０００９】
一態様では、本明細書に記載の第１及び第２の核酸分子を含むウイルスベクターが、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、第１の単離された組み換え核酸分子、及び第２の単離された組み換え核酸分子が、単一のオペロン内に収容されている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第１の単離された組み換え核酸分子、及び第２の単離された組み換え核酸分子が、別々に転写された２つのオペロン内に収容されている。
【００１１】
いくつかの実施形態では、オペロンは、Ｅ１ａプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、オペロンがそれぞれ、Ｅ１ａプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【００１２】
一態様では、本明細書中に記載の第１の単離された組み換え核酸分子を含むウイルスベクターが、本明細書中に提供されている。
【００１３】
一態様では、本明細書中に記載の第２の単離された組み換え核酸分子を含むウイルスベクターが、本明細書中に提供されている。
【００１４】
一態様では、本明細書中に記載のウイルスベクターを含む混合物が、本明細書中に提供されている。
【００１５】
一態様では、本明細書に記載の組成物もしくは本明細書に記載のウイルスベクター、または本明細書に記載の混合物を含む形質導入Ｔ細胞が、本明細書中に提供されている。
【００１６】
一態様では、本明細書に記載の１つ以上のウイルスベクターを含む形質導入Ｔ細胞が、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質がそれぞれＴ細胞の表面上で検出可能である。
【００１７】
一態様では、複数のポリペプチドを具備する単離されたＴ細胞であって、第１のポリペプチドはＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部と、ＣＤ３εまたはＣＤ３γの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを備えるＴＣＲ細胞内ドメインと、第１の標的結合ドメインを具備するＴＣＲサブユニットを具備し、ＴＣＲサブユニット及び第１の標的結合ドメインが作動可能に連結され且つ第１の融合タンパク質がＴ細胞内のＴＣＲに組み込まれ、第２の融合タンパク質は第２の標的結合ドメインを有し、第２の標的結合ドメインがそのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されているＰＤ−１ポリペプチドを含み、このＰＤ−１ポリペプチドが細胞外ドメインとＰＤ−１の膜貫通ドメインとを具備する、単離されたＴ細胞が、本明細書中に提供されている。
【００１８】
いくつかの実施形態において、第１の標的結合ドメインは、ＣＤ１６、ＢＣＭＡ、ＭＳＬＮ、ＮＫＧ２Ｄ、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及び前立腺特異的がん抗原（ＰＳＣＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、共刺激ポリペプチドは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の融合タンパク質の共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２８である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、コードされた第１の抗原結合ドメインが、第１のリンカー配列を介して第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに連接され、且つコードされた第２の抗原結合ドメインが、第２のリンカー配列を介して第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに連接される。いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列、及び第２のリンカー配列が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメインと（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインとを含み、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが、同じＴＣＲサブユニットに由来する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットに、ＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δ、または少なくとも１つの修飾を施されたアミノ酸配列の細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメインを備える、ＴＣＲ細胞内ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットに刺激ドメインを備える細胞内ドメインが含まれ、この刺激ドメインが、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメイン、もしくは少なくとも１つの修飾を施されたアミノ酸配列の機能的シグナル伝達ドメインから選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第２のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、または両方が、抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第２のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、またはその両方に、ｓｃＦｖドメインまたはＶＨドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、コードされた第１のＴＦＰにＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインが含まれ、この細胞外ドメインには、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の細胞外ドメインまたはその一部が含まれる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、コードされた第１のＴＦＰに膜貫通ドメインが含まれ、膜貫通ドメインに、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の膜貫通ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、コードされた第１のＴＦＰに膜貫通ドメインが含まれ、この膜貫通ドメインに、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の膜貫通ドメインが含まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質ならびにそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列から得られる、機能的シグナル伝達ドメインである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が更にリーダー配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つ但し２０以下の修飾に、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または第１のＴＦＰに結合するリガンドに応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾が包含される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ｍＲＮＡである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、第１のＴＦＰは、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、ＴＣＲζ鎖、Ｆｃε受容体１鎖、Ｆｃε受容体２鎖、Ｆｃγ受容体１鎖、Ｆｃγ受容体２ａ鎖、Ｆｃγ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃγ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃγ受容体３ａ鎖、Ｆｃγ受容体３ｂ鎖、Ｆｃβ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄからなる群から選択されるタンパク質、その機能的フラグメント、及びそのアミノ酸配列において少なくとも１個但し２０個以下の修飾を施されたアミノ酸配列のＩＴＡＭまたはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＡＭは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３εのＩＴＡＭを置換する。いくつかの実施形態において、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、且つＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、修飾２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホルアミダイトからなる群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、リーダー配列を更に含む。
【００３１】
一態様では、本明細書に記載の核酸分子を介してコードされる複数の単離されたポリペプチド分子が、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたベクターである。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列を介して、更にポリ（Ａ）尾部がコードされる。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列を介して、更に３’ＵＴＲがコードされる。
【００３２】
一態様において、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の混合物、または本明細書に記載のＴ細胞を含む、複数の核酸を具備する医薬組成物が、本明細書中に提供されている。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一態様では、養子Ｔ細胞療法用のＴ細胞を操作する目的に用いるための融合タンパク質の組み合わせが、本明細書中に記載されている。本明細書中に開示されている操作されたＴ細胞は、標的細胞に結合することができるポリペプチド、すなわち、腫瘍関連抗原などの抗原によって特徴付けられる細胞に対し特異的に結合できる細胞を有する修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現させることを含む。そのような修飾Ｔ細胞受容体については、例えば、同時係属中の非暫定的国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３３１４６号（２０１６年５月１８日出願）に詳述されており、該文献は、本明細書において参照により援用されている。
【００３４】
本明細書中に開示されている操作されたＴ細胞はまた、そのＣ末端を介して共刺激ポリペプチドの細胞内ドメインのＮ末端に作動可能に連結されたＰＤ−１の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを具備するＰＤ−１融合タンパク質を含む。共刺激ポリペプチドの好適な例については、後述する。一実施形態において、共刺激ポリペプチドはＣＤ２８ポリペプチドであり、それにより、「ＰＤ１ＣＤ２８融合タンパク質」または「ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体」を提供する。融合タンパク質の他の例としては、限定されるものではないが、ＰＤ１４１ＢＢスイッチ受容体、またはＰＤ１Ｘスイッチ受容体（ここで、Ｘは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、またはＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）である）が挙げられる。
【００３５】
一実施形態において、修飾ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍関連抗原（本明細書中で「ＴＡＡ」とも呼称される）を発現する腫瘍細胞に結合し得る。その例としては、限定されるものではないが、メソセリン（ＭＳＬＮ）、Ｂ細胞成熟ＭＵＣ１６抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、前立腺特異的がん抗原（ＰＳＣＡ）、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβθインテグリン、αｖβ６インテグリン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡ−１２５炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子、Ｅ−カドヘリン、ＥＭＡ（上皮膜抗原）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、上皮細胞糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）、上皮細胞糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥＧＦＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）、葉酸受容体−α、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ガングリオシド２（ＧＤ２）、ガングリオシド３（ＧＤ３）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒα２）、キナーゼインサートドメイン受容体（ＫＤＲ）、ｋ軽鎖、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ−Ａ１）、メソテリン、ムチン−１（ＭＵＣ１）、ムチン−１６（ＭＵＣ１６）、ムチン−１８（ＭＵＣ−１８）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺−特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体−チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ｍＡｂ  ＩｇＥを介して標的化されるＴＡＡ、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、チロシナーゼ、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体が挙げられる。そのようなＴ細胞には、腫瘍関連抗原に特異的に結合できるｓｃＦｖドメインまたはＶＨドメインを具備する修飾Ｔ細胞受容体が含まれるであろう。
【００３６】
別の実施形態において、ＴＣＲには、標的抗原に特異的なｓｃＦｖドメインまたはＶＨドメインが含まれる代わりに、ＣＤ１６ポリペプチドまたはそのＦｃ結合フラグメントが含まれる。そのようなＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞は、そのＣＤ１６残基がＩｇＧ１フォーマット抗体に結合できることから、前記抗原に対する抗体と組み合わせた際に表面抗原発現を有する多数の異なる種類の腫瘍細胞を標的とするうえで有用である。
【００３７】
別の実施形態において、ＴＣＲには、細胞表面抗原または腫瘍関連抗原に特異的な２つ以上のｓｃＦｖドメインまたはＶＨドメインを有するＴＦＰが含まれる。そのようなＴＦＰは「二重特異性」ＴＦＰと呼称されるもので、操作済みＴＣＲを発現するＴ細胞が、２種類以上のがん細胞、または単一がん細胞上の２種類以上の腫瘍関連抗原に結合するのを可能にしている。
【００３８】
別の実施形態において、ＴＣＲは、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＴＦＰに、Ｔ細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３εもしくはＣＤ３γからなる群より選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、あるいは少なくとも１個、２個もしくは３個但し２０個、１０個もしくは５個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインが含まれる。他の実施形態では、コードされたＴＦＰに膜貫通ドメインが含まれ、この膜貫通ドメインに、ＴＣＲのα鎖、β鎖、もしくはＴＣＲサブユニットＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δからなる群から選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、あるいは少なくとも１個、２個もしくは３個但し２０個、１０個もしくは５個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の膜貫通ドメインが含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、コードされたＴＦＰに膜貫通ドメインが含まれ、この膜貫通ドメインに、ＴＣＲのα鎖、β鎖もしくはζ鎖、またはＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δ  ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、あるいは少なくとも１個、２個もしくは３個但し２０個、１０個もしくは５個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の膜貫通ドメインが含まれる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、コードされた抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、またはＮＫＧ２Ｄドメインが、リンカー配列を介してＴＣＲ細胞外ドメインに連接されている。いくつかの実例において、コードされたリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの実例において、コードされたリンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの実例において、コードされた長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの実例において、コードされたリンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの実例において、コードされた短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実例において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質または少なくとも１個、２個もしくは３個但し２０個、１０個もしくは５個以下の修飾を施されたアミノ酸配列から得られる、機能的シグナル伝達ドメインである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、リーダー配列を更に含む。
【００４４】
また、前述の核酸分子のいずれかを介してコードされる単離されたポリペプチド分子が、本明細書中に提供されている。
【００４５】
いくつかの実施形態では、コードされた抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメインもしくはＮＫＧ２Ｄドメイン、またはそのフラグメントが、リンカー配列を介してＴＣＲ細胞外ドメインに連接されている。いくつかの実例において、コードされたリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの実例において、コードされたリンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの実例において、コードされた長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの実例において、コードされたリンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの実例において、コードされた短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、共刺激ドメイン及び／またはＤＮＡＸのようなアダプター分子をコードする配列を更に含む。いくつかの実例において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌ様受容体、ならびにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能的関連抗原−１（ＬＦＡ−１、別称：ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質または少なくとも１個、２個もしくは３個但し２０個、１０個もしくは５個以下の修飾を施されたアミノ酸配列から得られる、機能的シグナル伝達ドメインである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が、リーダー配列を更に含む。
【００４８】
また、前述の核酸分子のいずれかを介してコードされる単離されたポリペプチド分子が、本明細書中に提供されている。
【００４９】
いくつかの実施形態において、単離ＴＦＰ分子に、Ｔ細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、もしくはＣＤ３γからなる群より選択されるタンパク質または少なくとも１個、２個もしくは３個但し２０個、１０個もしくは５個以下の修飾を施されたアミノ酸配列の細胞外ドメインまたはその一部が含まれる、ＴＣＲ細胞外ドメインを具備する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメインもしくはＮＫＧ２Ｄドメイン、またはそのフラグメントが、リンカー配列を介してＴＣＲ細胞外ドメインに連接されている。いくつかの実例において、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの実例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの実例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの実例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの実例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、単離ＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。他の実施形態において、単離ＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。更に他の実施形態において、単離ＴＦＰ分子は、リーダー配列を更に含む。
【００５２】
また、前述のＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターが、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターが、プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたベクターである。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部を更に含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列によって、３’ＵＴＲを更に含む。
【００５３】
また、記載されているベクターのうちのいずれかを含む細胞も、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、阻害性分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む阻害性分子をコードする核酸を更に含む。いくつかの実例において、阻害性分子は、ＰＤ−１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチド、ならびに共刺激ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のポリペプチドを、具備する。
【００５４】
別の態様において、抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメインまたはＮＫＧ２Ｄドメインタンパク質もしくはそのフラグメント、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを具備し、内在性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用し得る、単離されたＴＦＰ分子が、本明細書中に提供されている。
【００５５】
別の態様において、抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメインまたはＮＫＧ２Ｄドメインタンパク質もしくはそのフラグメント、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを具備し、内在性ＴＣＲ複合体に機能的にインテグレートし得る、単離されたＴＦＰ分子が、本明細書中に提供されている。
【００５６】
別の態様では、ＴＦＰ分子が、腫瘍関連抗原ポリペプチドまたはそのフラグメントと、ＴＣＲ細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを具備し、本ＴＦＰ分子が、ヒトＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞の表面内、表面及び／または表面上で内在性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用し得るものである、少なくとも２つのＴＦＰ分子または１つのＴＦＰ分子及びＰＤ−１融合タンパク質を具備する、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、細胞母集団）が、本明細書中に提供されている。一実施形態において、１つ以上のＴＦＰ分子、及びＰＤ−１融合タンパク質は、同じ細胞内に存在する。別の実施形態において、１つ以上のＴＦＰ分子、及びＰＤ−１融合タンパク質は、同じ細胞母集団内に存在する。
【００５７】
別の態様において、ｉ）抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメインもしくはＮＫＧ２Ｄドメインポリペプチド、またはそのフラグメントと、ＴＣＲ細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むＴＦＰ分子、ならびにｉｉ）少なくとも１つの内在性ＴＣＲ複合体を具備するタンパク質複合体が、本明細書中に提供されている。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲに、Ｔ細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、もしくはＣＤ３γからなる群より選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部が含まれる。いくつかの実施形態では、抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメインもしくはＮＫＧ２Ｄドメインポリペプチドまたはそのフラグメントが、リンカー配列を介してＴＣＲ細胞外ドメインに連接されている。いくつかの実例において、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの実例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの実例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの実例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの実例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００５９】
別の態様では、母集団のＴ細胞が、個々にまたは集合的に少なくとも２つのＴＦＰ分子を含み、ＴＦＰ分子が、抗腫瘍抗原結合ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、またはＮＫＧ２Ｄドメインポリペプチドもしくはそのフラグメント、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメインを具備し、本ＴＦＰ分子が、ヒトＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞の表面内、表面及び／または表面上で内在性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用し得る、ヒトＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞の母集団が、本明細書中に提供されている。
【００６０】
別の態様では、母集団のＴ細胞が、個々にまたは集合的に、本明細書中に提供されている単離された核酸分子を介してコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の母集団が、本明細書中に提供されている。
【００６１】
別の態様では、記載のベクターまたはベクターの組み合わせのいずれかを用いてＴ細胞を形質導入することを含む、細胞を作製する方法が、本明細書中に提供されている。一実施形態では、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＴＦＰとＰＤ−１融合タンパク質とを含む単一のベクターで形質導入する。別の実施形態では、Ｔ細胞を、本明細書中に提供されているＴＦＰを発現する少なくとも１つのベクターと、本明細書中に提供されているＰＤ−１融合タンパク質を発現する少なくとも１つのベクターとを含む、２つ以上のベクターで形質導入する。
【００６２】
別の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ操作済み細胞母集団を生成する方法であって、ＲＮＡが記載のＴＦＰ分子及び／またはＰＤ−１融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を含む方法が、本明細書中に提供されている。
【００６３】
別の態様において、記載のＴＦＰ分子及びＰＤ−１融合タンパク質／スイッチ受容体のいずれかを発現する有効量の細胞を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法が、本明細書中に提供されている。いくつかの実施形態では、細胞は、自己由来Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物が増殖性疾患を有する。増殖性疾患は、血液がんまたは固形腫瘍のような、がんであり得る。一実施形態において、腫瘍細胞、または腫瘍微小環境内の細胞は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する。一実施形態において、哺乳動物は少なくとも１種の抗がん療法剤に対し耐性を有する。
【００６５】
それゆえ、別の態様では、本明細書中に開示されているＰＤ−１融合タンパク質とＴＦＰとを含む操作されたＴ細胞は、がん細胞が、ＰＤ−１のリガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２を発現する、がんもしくは悪性腫瘍、または前癌状態のような増殖性疾患の治療に有用である。例としては、限定されるものではないが、肺癌（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８（８）（２００２），７９３−８００）、卵巣癌（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８（８）（２００２），７９３−８００）、黒色腫（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８（８）（２００２），７９３−８００）、結腸癌（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８（８）（２００２），７９３−８００）、胃癌（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９（６）（２００３）、１３７０−１３７３）、腎細胞癌（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１０４（１０）（２００５）、２０８４−９１）、食道癌（Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１１（８）（２００５）、２９４７−２９５３）、神経膠腫（Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（２１）（２００３）、７４６２−７４６７）、尿路上皮癌（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６（８）（２００７）、１１７３−１１８２）、網膜芽細胞腫（Ｕｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４７（１０）（２００６）、４６０７−４６１３）、乳癌（Ｇｈｅｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８（３）（２００６）、１９０−１９８）、非ホジキンリンパ腫（Ｘｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．３９（７）（２００８）、１０５０−１０５８）、膵癌（Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１３４（９）（２００８）、１０２１−１０２７）、ホジキンリンパ腫（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１（６）（２００８）、３２２０−３２２４）、骨髄腫（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０（１）（２００７）、２９６−３０４）、肝細胞癌（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（３）（２００９）、９７１−９７９）、白血病（Ｋｏｚａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２３（２）（２００９）、３７５−３８２）、子宮頸癌（Ｋａｒｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（２０）（２００９）、６３４１−６３４７）、胆管癌（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．１００（６）（２００９）、５００−５０４）、口腔癌（Ｍａｌａｓｐｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６０（７）（２０１１）、９６５−９７４）、頭頸部癌（Ｂａｄｏｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（１）（２０１３）、１２８〜１３８）、及び中皮腫（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．９（７）（２０１４）、１０３６〜１０４０）のような、がんが挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、記載されたＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞を、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善させる薬剤と併用投与する。いくつかの実施形態では、記載のＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞を、ＰＤ−１関連の疾患を治療する薬剤と併用投与する。
【００６７】
また、医薬品として用いるための、記載の単離核酸分子の任意のもの、記載の単離ポリペプチド分子の任意のもの、記載の単離ＴＦＰの任意のもの、記載のタンパク質複合体の任意のもの、記載のベクターの任意のもの、または記載の細胞の任意のものが、本明細書中に提供されている。
【００６８】
定義
別途規定されていない限り、本明細書中に用いられている全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者に遍く理解されているのと意味が同じである。
【００６９】
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、当該項目の文法上の目的語のうちの１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「１つの要素」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００７０】
本明細書において、「約」は、当業者に知られているかまたは知られ得る状況に応じて、±１％未満または１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％もしくは３０％超）を意味し得る。
【００７１】
本明細書中に用いられている「対象（複数可）」または「個体」としては、限定されるものではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（飼育動物、農業動物もしくは野生動物など）のような哺乳動物類、ならびに鳥類、及び水産動物類を挙げることができる。「患者」は、疾患、障害もしくは病態に罹患しているかまたはそれらを発症するリスクに曝されている対象、あるいはさもなければ本明細書中に提供されている組成物及び方法を必要としている対象である。
【００７２】
本明細書において、「治療すること」または「治療」とは、疾患もしくは病態の治療または改善が成功する兆候を指す。治療することには、例えば、疾患もしくは病態の１つ以上の症状の重篤度を軽減、遅延もしくは緩和することが含まれる場合もあれば、あるいは患者が体験する疾患、欠陥、障害もしくは有害状態などの症状の頻度を低減することが含まれる場合もある。本明細書において、「治療または予防する」とは、疾患もしくは病態における或るレベルの治療または改善に帰結し、病態を完全に防止をすること含むがこれに限定されない、当該の目的を目指したある範囲の結果を想到する方法を指すために、本明細書中に時々用いられている。
【００７３】
本明細書において、「予防する」とは、患者における腫瘍形成のような疾患または病態の予防を指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクに曝されている個体を本発明の方法で治療し、後になって腫瘍もしくは他の形態のがんを発症せずに済んだ場合、その個体において疾患が少なくとも一定期間にわたって予防されたことになる。
【００７４】
本明細書において、「治療有効量」とは、本組成物の投与先となる個体に対し有益な効果をもたらすかあるいはさもなければ有害な非有益事象を低減するうえで十分な組成物またはその活性成分の量である。本明細書において「治療有効量」とは、そのような投与が所与の期間にわたって１回以上行われる場合に、投与により所望されるまたは望ましい（例えば、有益な）１つ以上の効果をもたらす用量を意味する。正確な用量は治療目的に応じて異なってくるものであり、当業者が公知の技法を用いて確証するであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照）。
【００７５】
本明細書において、「融合タンパク質」という用語は、異なる起源由来のポリペプチド部分からなるタンパク質に関する。したがって、この用語はまた、キメラタンパク質として理解される場合もある。本明細書中に記載されているＰＤ−１融合タンパク質との関連において、「融合タンパク質」という用語は、「スイッチ受容体」という用語と同義に用いられる。融合タンパク質は通常、もともと別々のタンパク質をコードした２つ以上の遺伝子（または好ましくはｃＤＮＡ）の結合によって作出されたタンパク質である。この融合遺伝子（または融合ｃＤＮＡ）が翻訳されると、結果として、好ましくは、各々の原タンパク質に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドが生成される。組み換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療において用いられる組み換えＤＮＡ技術を介して人工的に作出される。本発明の融合タンパク質の産生に関する更なる詳細は、本明細書において後述する。
【００７６】
本発明との関連において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が人工化学模倣物または対応する天然に存在するアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。したがって、本発明との関連において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド（アミド）結合を介して連結されたアミノ酸モノマー鎖を含むかまたはそのアミノ酸モノマー鎖からなる分子に関する。ペプチド結合は、或るアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ酸のアミノ基と反応したときに形成される、共有化学結合である。本明細書において、「ポリペプチド」は、規定の長さを有する分子に限定されない。それゆえ、本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合を介して連結されている、アミノ酸鎖を包含するペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはポリペプチドに関する。一方、本明細書において「ポリペプチド」という用語はまた、アミノ酸（複数可）及び／またはペプチド結合（複数可）が機能的類似体で置換されている、そのようなタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣物も包含する。また、ポリペプチドという用語は、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを指し、それらを除外しようとしないものである。そのような修飾は、当該技術分野において綿密に記載されている。
【００７７】
本明細書において、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」には、一般的に、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合する機能を有し、且つｉｉ）典型的にはＴ細胞の表面内または表面上の同じ場所にあるときに、無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用する機能を有する、ＴＣＲを含む種々のポリペプチドから誘導された組み換えポリペプチドが包含される。
【００７８】
本明細書において、「ＰＤ−１」という用語は、Ｔ細胞及びプロＢ細胞上に発現する阻害性細胞表面受容体であるＣＤ２７９（分化群２７９）としても公知であり、免疫寛容中にＴ細胞機能の調節に関与する、プログラム細胞死タンパク質１を指す。リガンドが結合した際、ＰＤ−１は、Ｔ細胞エフェクター機能を抗原特異的に阻害し、他の因子と関連して、考え得る細胞死誘発因子として機能する。ヒトにおいて、ＰＤ−１は、ＰＤＣＤ１遺伝子を介してコードされる。ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドに結合することで知られている。ＰＤ−１及びそのリガンドは、Ｔ細胞の活性化を妨げ、自己免疫を低下させ、自己寛容を促進することによって、免疫系の下方制御において重要な役割を果たす。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節内の抗原特異的Ｔ細胞においてアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）においてアポトーシスを低減するという二重機序を介して達成される。
【００７９】
ヒト及びネズミの、アミノ酸配列及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公共データベースに見出すことができる。例えば、ヒトＰＤ−１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０２２４２に対応し、且つ配列：ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶＶＧＶＶＧＧＬＬＧＳＬＶＬＬＶＷＶＬＡＶＩＣＳＲＡＡＲＧＴＩＧＡＲＲＴＧＱＰＬＫＥＤＰＳＡＶＰＶＦＳＶＤＹＧＥＬＤＦＱＷＲＥＫＴＰＥＰＰＶＰＣＶＰＥＱＴＥＹＡＴＩＶＦＰＳＧＭＧＴＳＳＰＡＲＲＧＳＡＤＧＰＲＳＡＱＰＬＲＰＥＤＧＨＣＳＷＰＬ（配列番号１４）を有する。
【００８０】
本明細書中に用いられている「ＰＤ−１融合タンパク質」または「ＰＤ−１」スイッチ受容体という用語は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に結合することによって阻害シグナルを受信し、融合タンパク質の共刺激ドメインを介してシグナルを活性化シグナルに変換する（すなわち「スイッチする」）、記載のＰＤ−１融合タンパク質を指す。
【００８１】
「抗腫瘍効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増大、腫瘍細胞増殖の低減、腫瘍細胞生存率の低下、またはがん性病態に関連する様々な生理学的症状の改善などを含むがこれらに限定されない様々な手段によって顕現化され得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体が初期段階で腫瘍の発生を防止する能力によっても顕現化される場合がある。
【００８２】
「自己由来」という用語は、後になってから再導入されるべき個体と同一の個体に由来する、任意の材料を指す。一実施形態において、本明細書中に開示されているＴＦＰ  Ｔ細胞及びＰＤ−１スイッチ細胞は、Ｔ細胞のレシピエントにとって自己由来である。
【００８３】
「同種異系」または「同種他家由来」という用語は、材料が導入された個体と同じ種の別の動物に由来するか、またはその個体とは別の患者に由来する任意の材料を指す。１つ以上の遺伝子座に位置する遺伝子が同一遺伝子ではないときに、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同一種の個体に由来する同種異系材料が、遺伝的には異なるが、抗原的に十分に相互作用し得る。一実施形態において、本明細書中に開示されているＴＦＰ  Ｔ細胞及びＰＤ−１スイッチ細胞は、Ｔ細胞のレシピエントにとって同種異系である。
【００８４】
「異種間」または「異種由来」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【００８５】
「がん」という用語は、異常細胞の増殖が急速且つ無制御であることを特徴とする疾患を指す。がん細胞は局所的な場合もあれば、あるいは血流及びリンパ系を通って身体の他の部分にまで及ぶ可能性もある。本明細書中に記載の多様ながんの例としては、限定されるものではないが、前立腺癌、乳癌、黒色腫、肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、腹部癌、胃癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胆管癌、扁平上皮癌、中皮腫、副腎皮質癌、食道癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、神経上皮癌、腺様嚢胞癌、胸腺腫、慢性リンパ性白血病、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病などが挙げられる。
【００８６】
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著な影響を及ぼしたりまたはその結合特性を改変したりすることのない、アミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸置換、付加及び欠失が包含される。修飾は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような、当該技術分野において公知の標準的な技法により、本発明の抗体または抗体フラグメントに導入することが可能である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されてきた。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が包含される。それゆえ、本発明のＴＦＰ内の１つ以上のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換してもよいし、改変されたＴＦＰを本明細書に記載の機能的アッセイを用いて試験してもよい。
【００８７】
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合を介して誘導され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を含むがこれに限定されないシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される、一次応答を指す。或る分子の発現の改変、及び／または細胞骨格構造の再編成などは、刺激により媒介される場合がある。
【００８８】
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供するＴ細胞によって発現し、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様に対して刺激的な方法でＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する、分子またはその一部を指す。一態様において、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを担持したＭＨＣ分子との結合を介して開始され、これにより、Ｔ細胞応答が媒介される（増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されない）に至る。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（別称：「一次シグナル伝達ドメイン」）には、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（略称「ＩＴＡＭ」）として知られるシグナル伝達モチーフが含まれる場合がある。本発明において特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、限定されるものではないが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（別称：「ＩＣＯＳ」）、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭが挙げられる。
【００８９】
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、その表面上に、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成した外来抗原を表示する補助細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。これらの複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いることで、Ｔ細胞に認識できる。ＡＰＣによって抗原が処理されてＴ細胞に対し提示される。
【００９０】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語が本明細書中に用いられている場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰ発現Ｔ細胞のようなＴＦＰ含有細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。ＴＦＰ発現Ｔ細胞などにおける免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びＴヘルパー細胞活性（例えば、サイトカインの分泌）が挙げられる。或る実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合がある。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するドメインが挙げられる。或る実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含む場合がある。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナルに関与する分子、または抗原非依存性刺激に由来するドメインが挙げられる。
【００９１】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」）を含む場合がある。一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、限定されるものではないが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ  ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するＩＴＡＭが挙げられる。
【００９２】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、限定されるものではないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされるのは、抗原受容体及びそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、限定されるものではないが、ＭＨＣクラス１分子ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１、別称：ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体に代表され得る。細胞内シグナル伝達ドメインには、その誘導元分子の細胞内部分全体もしくは天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的フラグメントが含まれる場合がある。「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、またはマウス、齧歯類、サル、類人猿などの非ヒト種由来の同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として定義される。
【００９３】
「コードする」という用語は、定義済みヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）または定義済みアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセス及びそれから得られた生物学的特性において他のポリマー及び高分子を合成するための鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの具体的な配列の固有の特性を指す。それゆえ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合にタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり通常なら配列表中に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方は、タンパク質もしくはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするものと呼称される場合がある。
【００９４】
別途指定されていない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互の縮重バージョンであり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が包含される。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、或るバージョンにおいてタンパク質をコードするヌクレオチド配列に１つ以上のイントロンが含有され得る限り、イントロンを含む場合がある。
【００９５】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書中で同義に用いられており、特定の生物学的または治療的結果を達成するのに有効な本明細書に記載の化合物、製剤、材料または組成物の量を指す。
【００９６】
「内在性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の物質を指す。
【００９７】
「外在性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその外部で産生される任意の物質を指す。
【００９８】
「発現」という用語は、プロモーターを介して駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
【００９９】
「トランスファーベクター」という用語は、単離された核酸を含み、この単離された核酸を、細胞内部に送達する目的に使用することができる物質の組成物を指す。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当該技術分野において公知である。それゆえ、「トランスファーベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリシン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移動を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物を更に含むものと解釈すべきである。ウイルス導入ベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
【０１００】
「発現ベクター」という用語は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現に十分なシス作用要素は発現ベクターに含まれており、他の発現のための要素は、宿主細胞を介して供給される場合もあればあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において供給される場合もある。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド類（例えば、裸プラスミド、またはリポソーム内に収容されたプラスミド）、ならびにウイルス類（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）をはじめとする、当該技術分野において公知の全ての発現ベクターが包含される。
【０１０１】
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも、非分裂細胞に感染し得るという点で独特であり、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡ内に送達できるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つとなっている。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはいずれもレンチウイルスの例である。
【０１０２】
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクター（特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に提供されているような自己不活性化レンチウイルスベクターなど）を指す。診療所で使用可能なレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されるものではないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（商標）遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが挙げられる。また、非臨床型レンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知である。
【０１０３】
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間（例えば、２つのＤＮＡ分子間もしくは２つのＲＮＡ分子間など、２つの核酸分子間）、または２つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が、同じ単量体サブユニットに占有されているとき（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンに占有されている場合）、それらの分子はその位置にて相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数値の直接的関数である。例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さ１０サブユニット中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば１０中９）が一致または相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【０１０４】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、ネズミ）抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）であり、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。大部分において、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望される特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体フラグメント）である。いくつかの実例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換されている。更になお、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体内にも見出されないし移入済みＣＤＲまたはフレームワーク配列内にも見出されない残基を含む場合がある。これらの修飾を施すことによって、抗体または抗体フラグメントの性能を更に洗練して最適化することが可能である。概して、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントには、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部が含まれており、このドメインでは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部またはかなりの部分が、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。また、ヒト化抗体または抗体フラグメントには、典型的にはヒト免疫グロブリン由来の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部が含まれる場合がある。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照のこと。
【０１０５】
「ヒト」または「完全にヒト」とは、全分子がヒト源であるか、あるいはヒト型の抗体もしくは免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンを指す。
【０１０６】
「単離された」という用語は、天然の状態に改変を施されたものまたは天然の状態から取り除かれたものであることを意味する。例えば、生存している動物内に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」のに対し、同じ核酸またはペプチドであっても、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離されるなら「単離されている」ことになる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在する場合もあれば、あるいは例えば宿主細胞のような非天然環境に存在する場合もある。
【０１０７】
本発明との関連において、一般的に存在する核酸塩基については、以下の略語が用いられる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、且つ「Ｕ」はウリジンを指す。
【０１０８】
「作動可能に連結された」または「転写制御」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、この連結の結果、後者が発現する。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれたときは、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されていることになる。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に対し作動可能に連結されていることになる。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は互いに隣接する場合があり、例えば２つのタンパク質コード領域を連結するのに必要な場合、同一のリーディングフレーム内にある。
【０１０９】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下注射（ｓ．ｃ．）、静脈内注射（ｉ．ｖ．）、筋肉内注射（ｉ．ｍ．）、胸骨内注射、腫瘍内または注入技法が包含される。
【０１１０】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。別途限定されていない限り、この用語には、基準核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。別途指示されていない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、ならびに明示的に指示されている配列も、暗黙的に包含する。具体的には、選択された１つ以上の（または全ての）コドンの３位が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、縮重コドン置換を達成することが可能である（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１１１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、同義に用いられており、ペプチド結合を介して共有結合されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質またはペプチドが少なくとも２つのアミノ酸を含有することは必須とされているが、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に対し制限は課されていない。ポリペプチドは、ペプチド結合を介して相互に結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を具備する。本明細書において、この用語は、例えば当該技術分野においてペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも通称されている短鎖と、当該技術分野においてタンパク質と通称されている長鎖との両方を指し、それらの種類は多岐にわたっている。「ポリペプチド」としては、数ある中でも、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの改変体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、またはそれらの組み合わせが包含される。
【０１１２】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の転写機構に認識されるＤＮＡ配列、または導入された合成機構を指す。
【０１１３】
「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。いくつかの実例において、この配列はコアプロモーター配列である場合もあれば、他の実例において、この配列はまた、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節要素を含む場合もある。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するプロモーター／調節配列であり得る。
【０１１４】
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているときに、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下で遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１１５】
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているときに、プロモーターに対応する誘発因子が細胞内に存在する場合に限り、実質的に細胞内に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１１６】
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子によってコードされるかまたはそれによって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているときに、その細胞が実質的にプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１１７】
ｓｃＦｖとの関連において用いられる「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」という用語は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを一体的に連結する目的に単独でもしくは組み合わせて使用されるグリシン及び／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、且つアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１つ以上の正の整数である）を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、及びｎ＝１０である。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーとしては、限定されるものではないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が挙げられる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の繰り返しを含む。また、ＷＯ第２０１２／１３８４７５号（本明細書において参照により援用されている）に記載のリンカーも、本発明の範囲内に含まれる。いくつかの実例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの実例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの実例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの実例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１１８】
本明細書において、５’キャップ（別称：ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップ）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前面」または５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第１の転写ヌクレオチドに連結されている末端基からなり、その５’キャップの存在は、リボソームに認識され、且つＲＮａｓｅから保護されるようにするうえで重大な意味を持つ。キャップ付加は、転写と連動して共転写的に起こり、各々が相互的に影響を及ぼし合う。転写開始の直後に、合成の対象となるｍＲＮＡの５’末端が、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップ合成複合体を介して結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は複数ステップからなる生化学反応として進行する。キャッピング残基は、その安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するように修飾できる。
【０１１９】
本明細書において、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターから生成される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成する目的に使用される鋳型を含む。
【０１２０】
本明細書において、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着された一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態において、ポリＡは、５０〜５０００、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００超または４００超である。局在化、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性が調節されるように、ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に修飾する場合がある。
【０１２１】
本明細書において、「ポリアデニル化」とは、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニル残基またはその修飾改変体の共有結合を指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素、ポリアデニレートポリメラーゼの作用を介したプレｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチド（しばしば数百）の長い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は特定の配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）尾部、及びそのポリ（Ａ）尾部に結合されたタンパク質は、ｍＲＮＡがエキソヌクレアーゼで分解されないように保護する助けをする。また、ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核外輸送、及び翻訳にとって重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡがＲＮＡに転写された直後に核内で起こるが、後になってから更に細胞質内でも起こる場合もある。転写の終了後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合されたエンドヌクレアーゼ複合体の作用によって開裂する。開裂部位は通常、その開裂部位の付近に塩基配列ＡＡＵＡＡＡが存在することを特徴とする。ｍＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基が開裂部位の遊離３’末端に付加される。
【０１２２】
本明細書において、「一過性」とは、非組み込み導入遺伝子がゲノム内に組み込まれたかあるいは宿主細胞内の安定なプラスミドレプリコン内部に収容された場合に、発現の期間が遺伝子の発現に必要な期間よりも短く、非組み込み型導入遺伝子が数時間、数日間または数週間だけ発現することを指す。
【０１２３】
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の或る部分から別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句には、細胞膜を横断してシグナルを受信しシグナルを伝達できる分子、及び分子複合体が包含される。
【０１２４】
「対象」という用語は、免疫応答を誘発できる生物（哺乳動物、ヒトなど）を包含することを意味する。
【０１２５】
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。また、実質的に精製された細胞は、その天然に存在する状態で通常関連している他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの実例において、実質的に精製された細胞の母集団は、均質な細胞母集団を指す。他の実例において、この用語は、単に、それらの天然の状態で天然に会合している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様では細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、他の態様では細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養しない。
【０１２６】
本明細書中に用いられている「治療的」という用語は、治療を意味する。病状を軽減、抑制、寛解、または根絶することにより、治療効果が得られる。
【０１２７】
本明細書中に用いられている「予防」という用語は、疾患もしくは病状の予防、または予防的治療を意味する。
【０１２８】
本発明との関連において、「ＰＤ−１リガンド」、「ＰＤ−Ｌ１」、及び「ＰＤ−Ｌ２」は、ＰＤ−１が結合親和性を有するタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１タンパク質もしくはその結合フラグメント（ＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインなど）は、ヒトＰＤ−１の天然リガンド、すなわちヒトＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７としても知られる）に結合する能力、及び／または天然のＰＤ−１タンパク質と比べて親和性が同じ（すなわち同等）であるか、増強もしくは低減（すなわち減弱）されたヒトＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＢＱ５１としても知られる）に結合する能力により特徴付けられる。
【０１２９】
或る態様において、本発明のＰＤ−１リガンドは、肺癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、胃癌、腎細胞癌、食道癌、神経膠腫、尿路上皮癌、網膜芽細胞腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、肝細胞癌、白血病、子宮頸癌、胆管癌、口腔癌、頭頸部癌、または中皮腫を含むがこれらに限定されないがんに由来する。
【０１３０】
「トランスフェクトされた」、「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外在性核酸が宿主細胞内に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外在性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞を言う。細胞には、初代対象細胞及びその子孫が包含される。
【０１３１】
「特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する同族結合パートナー（例えば、ＰＤ−１リガンド）を認識して結合するが、試料中の他の分子を必ずしも且つ実質的に認識したり結合したりしない抗体、抗体フラグメントまたは特異的リガンドを指す。
【０１３２】
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様を範囲形態で提示し得る。当然のことながら、範囲形式での説明は、あくまで便宜上及び簡略化を目的としたものであり、本発明の範囲に対する非柔軟な限定として解釈すべきではない。したがって、範囲の記載を、考え得る全ての部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なすべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜３のような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示したものと見なすべきである。別の例として、９５〜９９％の同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する任意の範囲を含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％及び９８〜９９％の同一性のような部分範囲を含む。これは範囲の幅とは関係なしに適用される。
【０１３３】
記載
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質を用いた、がんなどの疾患の治療に有用な物質及び方法の組成物が、本明細書中に提供されている。本明細書において、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」には、一般的に、ｉ）標的細胞上の腫瘍関連抗原などの表面抗原に結合する機能を有し、且つｉｉ）典型的にはＴ細胞の表面内または表面上の同じ場所にあるときに、無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用する機能を有する、ＴＣＲを含む種々のポリペプチドから誘導された組み換えポリペプチドが包含される。本明細書中に提供されているように、ＴＦＰはキメラ抗原受容体と比べて実質的な利益を提供する。「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、ｓｃＦｖの形態の細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義されるような刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む、細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む組み換えポリペプチドを指す。概して、ＣＡＲの中央細胞内シグナル伝達ドメインは、通常ＴＣＲ複合体に関連して見出されるＣＤ３ζ鎖に由来する。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／またはＣＤ２８などの少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合し得る。
【０１３４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
本発明には、ＴＦＰ及びＰＤ−１融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ構築物を包含される。このＴＦＰには、１つ以上の腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）、例えばヒトＴＡＡに特異的に結合する抗体フラグメントが含まれており、抗体フラグメントの配列は、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と連続しており、その酸配列と同じリーディングフレーム内にある。本明細書中に提供されているＴＦＰは、機能的ＴＣＲ複合体を形成するために、１つ以上の内在性（または代替的に、１つ以上の外在性、または内在性及び外在性の組み合わせ）ＴＣＲサブユニットと会合し得る。別の態様において、ＴＦＰには、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体のＴｃ領域に特異的に結合するＣＤ１６フラグメントが含まれる。
【０１３５】
一態様において、本発明のＴＦＰには、抗原結合ドメインとも呼ばれる標的特異的結合要素が含まれる。残基の選択は、標的細胞の表面を画定する標的抗原の種類及び数に依存する。例えば、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原が認識されるように、抗原結合ドメインを選択してもよい。それゆえ、本発明のＴＦＰにおいて、抗原結合ドメインに対する標的抗原として作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌及び寄生虫感染症に関連するもの、自己免疫疾患、ならびにがん性疾患（例えば悪性疾患）が挙げられる。
【０１３６】
一態様では、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをＴＦＰに操作することによって、ＴＦＰ媒介Ｔ細胞応答を目的の抗原に指向させる場合がある。
【０１３７】
一実施形態において、本発明のＴＦＰ構築物にはＤＮＡＸ発現カセットが更に含まれる。
【０１３８】
抗原結合ドメインは、限定されるものではないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの機能的フラグメントなどの抗原に結合する任意のドメインであり得る。例えば、限定されるものではないが、ラクダ科動物由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体が挙げられるほか、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＤＡＲＰＩＮ及びこれらに類するものなどの、当該技術分野において抗原結合ドメインとして機能することが公知である代替スキャフォルドも挙げられる。同様に、標的抗原を特異的に認識して結合する天然または合成のリガンドを、ＴＦＰ用の抗原結合ドメインとして使用してもよい。いくつかの実例では、抗原結合ドメインが、最終的にＴＦＰが用いられる種と同じ種に由来することが有益である。例えば、ＴＦＰの抗原結合ドメインをヒトにおいて使用するためには、このＴＦＰの抗原結合ドメインに、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメイン用のヒトまたはヒト化残基が含まれることが有益であり得る。
【０１３９】
それゆえ、一態様では、抗原結合ドメインに、ヒト化もしくはヒト抗体もしくは抗体フラグメント、またはネズミ抗体もしくは抗体フラグメントが含まれる。一実施形態において、ヒト化もしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書中に記載のヒト化もしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書中に記載のヒト化もしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、１つ以上の、例えば３つ全てのＬＣ  ＣＤＲ、及び１つ以上の、例えば３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含むヒト化もしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインなどを含む。一実施形態では、ヒト化もしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインに、本明細書中に記載のヒト化もしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）が含まれる。例えば、ヒト化もしくはヒト抗腫瘍関連の抗原結合ドメインは２つの可変重鎖領域を有し、各可変重鎖領域には、本明細書中に記載のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３が含まれる。一実施形態では、ヒト化もしくはヒト抗腫瘍関連の抗原結合ドメインに、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト軽鎖可変領域及び／または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト重鎖可変領域が含まれる。一実施形態では、ヒト化もしくはヒト抗腫瘍関連の抗原結合ドメインに、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域、例えば本明細書に記載の少なくとも２つのヒト化またはヒト重鎖可変領域が含まれる。一実施形態において、抗腫瘍関連の抗原結合ドメインは、本明細書中に提供されているアミノ酸配列の軽鎖と重鎖とを含むｓｃＦｖである。或る実施形態において、抗腫瘍関連の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ  ｎｂ）は、本明細書中に提供されている軽鎖可変領域のアミノ酸配列の修飾（例えば、置換）数が少なくとも１個、２個もしくは３個、但し３０個、２０個または１０個以下であるアミノ酸配列が含まれる軽鎖可変領域、または本明細書中に提供されているアミノ酸配列に対し９５〜９９％の同一性を有する配列、及び／または本明細書中に提供されている重鎖可変領域のアミノ酸配列の修飾（例えば、置換）数が少なくとも１個、２個もしくは３個、但し３０個、２０個または１０個以下であるアミノ酸配列が含まれる重鎖可変領域、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒト化もしくはヒト抗腫瘍関連の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、且つ本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載のリンカーなどのリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着されている。一実施形態において、ヒト化抗腫瘍関連の抗原結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６、好ましくは３または４である）を具備する。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域の配向のいずれかであり得る。いくつかの実例において、リンカー配列には、長いリンカー（ＬＬ）配列が含まれる。いくつかの実例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの実例において、リンカー配列には、短いリンカー（ＳＬ）配列が含まれる。いくつかの実例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１４０】
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然源または組み換え源のいずれかに由来し得る。ドメインは、天然源である場合、任意のタンパク質、特に膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来し得る。一態様において、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合し得る。本発明において特に有用な細胞外ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、またはＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δの少なくとも細胞外領域（複数可）が含まれる場合があり、あるいは代替の実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも細胞外領域（複数可）が含まれる場合がある。
【０１４１】
膜貫通ドメイン
概して、ＴＦＰ配列には、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインが含まれる。代替実施形態において、ＴＦＰは、ＴＦＰの細胞外ドメインに対して異種の膜貫通ドメインを含むように設計することが可能である。膜貫通ドメインには、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通タンパク質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）の誘導元となったタンパク質の細胞外領域と会合した１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくは最高１５個のアミノ酸）、及び／または膜貫通タンパク質の誘導元となるタンパク質の細胞内領域と会合した１つ以上の更なるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくは最高１５個のアミノ酸）が含まれる場合がある。一態様において、膜貫通ドメインは、使用されているＴＦＰの他のドメインのうちの１つと関連するものである。いくつかの実例では、膜貫通ドメインをアミノ酸置換によって選択または修飾することにより、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避し、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることを可能にしている。一態様において、膜貫通ドメインは、ＴＦＰ−Ｔ細胞表面上の他のＴＦＰとホモ二量体化する機能を有する。異なる態様では、同じＴＦＰ内に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用が最小限に抑えられるように、膜貫通ドメインのアミノ酸配列を修飾または置換する場合がある。
【０１４２】
膜貫通ドメインは、天然源または組み換え源のいずれかに由来し得る。ドメインは、天然源である場合、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来し得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＴＦＰが標的に結合した際にいつでも、細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域（複数可）が含まれる場合がある。
【０１４３】
いくつかの実例において、膜貫通ドメインは、ヒトタンパク質由来のヒンジなどのヒンジを介してＴＦＰの細胞外領域、例えばＴＦＰの抗原結合ドメインに付着し得る。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジなどのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジであり得る。
【０１４４】
リンカー
任意に、長さが２〜１０アミノ酸の間の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーを介して、膜貫通ドメインとＴＦＰの細胞質領域との間の結合を形成することが可能である。特に好適なリンカーはグリシン−セリンダブレットによって提供される。例えば、一態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヌクレオチド配列ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号３）によってコードされる。
【０１４５】
細胞質ドメイン
ＴＦＰにＣＤ３γ、δまたはεポリペプチドが含まれていて、ＴＣＲα及びＴＣＲβサブユニットが一般にシグナル伝達ドメインを欠いているときは、ＴＦＰの細胞質ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる場合がある。細胞内シグナル伝達ドメインは、概して、ＴＦＰが導入された免疫細胞の少なくとも１つの正常エフェクター機能の活性化に関与している。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性である場合もあれば、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性である場合もある。それゆえ、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊機能を果たすように指示するタンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用できるが、多くの事例では、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断型部分が使用される限りにおいて、そのような切断型部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用される場合がある。それゆえ、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
【０１４６】
本発明のＴＦＰにおいて用いられる細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列及び共受容体、これらの配列の任意の誘導体または改変体、ならびに同じ機能的能力を有する任意の組み換え配列が挙げられる。
【０１４７】
公知となっているように、ＴＣＲを介して生成されたシグナルだけではナイーブＴ細胞を完全に活性化するのには十分でないことから、二次的シグナル及び／または共刺激シグナルが要求される。それゆえ、ナイーブＴ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言える。ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するクラス（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び二次シグナルまたは共刺激シグナルを供給するために抗原非依存的に作用するクラス（二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン）、である。
【０１４８】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的にまたは阻害的にＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的に作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインには、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）として知られるシグナル伝達モチーフが含まれる場合がある。
【０１４９】
本発明において特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメインが含まれるＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄのＩＴＡＭが挙げられる。一実施形態において、本発明のＴＦＰには、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−εの一次シグナル伝達ドメインが含まれる。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインに、天然のＩＴＡＭドメインと比べて活性に改変が見られた（例えば増加または低減した）突然変異ＩＴＡＭドメインなどの、修飾ＩＴＡＭドメインが含まれる。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインには、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば最適化及び／または切断型ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。或る実施形態において、一次シグナル伝達ドメインには、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＩＴＡＭモチーフが含まれる。
【０１５０】
ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、それ自体でＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む場合もあれば、または本発明のＴＦＰとの関連において有用な他の任意の所望される細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と組み合わせられる場合もある。例えば、ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインには、ＣＤ３ε鎖部分、及び共刺激シグナル伝達ドメインが含まれる場合がある。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＴＦＰの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ならびにそれらに類するものが挙げられる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＴＦＰ−Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能及び生存を増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴ細胞の持続性及び抗腫瘍活性を増強することが実証されてきた（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。
【０１５１】
本発明のＴＦＰの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、無作為的な順序でまたは指定の順序で相互に連結させることができる。任意に、例えば長さが２〜１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸）の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の連鎖を形成し得る。
【０１５２】
一実施形態では、グリシン−セリンダブレットを好適なリンカーとして使用する場合がある。一実施形態では、アラニン、グリシンのような単一のアミノ酸を好適なリンカーとして使用する場合がある。
【０１５３】
一態様において、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞には、第２のＴＦＰ、例えば細胞表面標的（例えばＣＤ１２３）への抗原結合ドメインを含む第２のＴＦＰが更に含まれる場合がある。本明細書中に開示されているＰＤ−１  ＴＦＰと組み合わせることができる抗原結合ドメインを含むＴＦＰは、例えば同時係属中の国際出願（ＰＣＴ出願）第ＰＣＴ  ＵＳ２０１６／０３３１４６号に記載されており、該文献は、本明細書において参照により援用されている。
【０１５４】
別の態様において、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞または第２のＴＦＰ発現細胞は、別の薬剤、例えばＴＦＰ発現細胞の活性を増強する薬剤を更に発現し得る。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤であり得る。ＰＤ−１のような阻害性分子は、いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター応答開始能力を低下させてしまう可能性がある。阻害性分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４（また、ＣＴＬＡ４またはＣＤ１５２）、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲβが挙げられる。一実施形態において、阻害性分子を阻害する薬剤には、細胞に陽性シグナルを供給する第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）と会合した第１のポリペプチド（例えば、阻害性分子）が含まれる。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１０、２Ｂ４及びＴＧＦＲβなどのような阻害性分子の第１のポリペプチド、またはそれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）、ならびに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の４−１ＢＢ、ＣＤ２７もしくはＣＤ２８などの共刺激ドメインを含む）、及び／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１の第１のポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＰＤ−１の細胞外ドメインの少なくとも一部）、及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインの第２のポリペプチド（例えば、本明細書記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン）及び／または本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含むＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害因子メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄性細胞上に発現する（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２に対する２つのリガンドは、ＰＤ−１に結合した際にＴ細胞活性化を下方制御することが明らかにされてきた（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ヒトのがんにはＰＤ−Ｌ１が豊富に存在する（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって免疫抑制が逆転される場合がある。
【０１５５】
一実施形態において、薬剤には、阻害性分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が含まれる。例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）が、膜貫通ドメインに融合する場合もあれば、任意に、４１ＢＢ及びＣＤ３ζ（本明細書中でＰＤ−１スイッチとも呼ばれる）のような細胞内シグナル伝達ドメインに融合する場合もある。一実施形態では、ＰＤ−１スイッチを本明細書に記載の抗ＴＡＡ  ＴＦＰと併用した場合にＴ細胞の持続性が向上する。一実施形態において、ＴＦＰは、ＴＡＡの細胞外ドメインを含むＴＡＡ  ＴＦＰである。
【０１５６】
別の態様では、ＴＦＰ−Ｔ細胞などのＴＦＰ発現Ｔ細胞の母集団が、本明細書中に開示されている。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の母集団に、種々のＴＦＰを発現する細胞の混合物が含まれる。例えば、一実施形態において、ＴＦＰ−Ｔ細胞の母集団には、ＰＤ−１融合タンパク質を発現する細胞と、腫瘍細胞関連抗原に特異的なｓｃＦｖを有するＴＦＰとが含まれる場合がある。別の例として、ＴＦＰ発現細胞の母集団には、例えば本明細書に記載のように、ＰＤ−１ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質を発現する第１の細胞と、腫瘍関連抗原に対する抗原結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第２の細胞とが含まれる場合がある。
【０１５７】
別の態様において、本発明は、母集団中の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載のＰＤ−１リガンド結合ドメインを有する融合タンパク質を発現し、少なくとも１つの細胞が、抗ＴＡＡ  ＴＦＰを発現し、且つ第３の細胞が、ＴＦＰ発現細胞の活性を増強する薬剤などの別の薬剤を発現する、細胞母集団を提供する。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤であり得る。阻害性分子は、例えばいくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター応答開始能力を低下させてしまう可能性がある。阻害性分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲβが挙げられる。一実施形態において、阻害性分子を阻害する薬剤には、細胞に陽性シグナルを供給する第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）と会合した第１のポリペプチド（例えば、阻害性分子）が含まれる。
【０１５８】
別の実施形態では、ＴＦＰ構築物の１つ以上のドメイン（例えば、細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメイン）またはＴ細胞ゲノム（例えば、ＰＤ１をコードする遺伝子などの１つ以上の内在性遺伝子）を、クラスター化された規則的に散在した短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ（登録商標）、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、例えば米国特許第９，３９３，２５７号を参照）、メガヌクレアーゼ（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を含む大きな認識部位を有する天然に存在するエンドデオキシリボヌクレアーゼ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ法（ＺＦＮ、例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）ｖ１１，６３６−６４６を参照）のような遺伝子編集技法を用いて操作、改変または欠失させる。このようにして、キメラ構築物は、立体構造またはシグナル伝達能力のような各サブユニットの望ましい特徴が兼備されるように操作できる。また、Ｓａｎｄｅｒ  ＆  Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１４）  ｖ３２，３４７−５５、及びＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６を参照のこと。これらの各文献は本明細書において参照により援用されている。いくつかの実施形態では、ＴＦＰサブユニットまたはＰＤ−１スイッチの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインのうちの１つ以上は、２つ以上の天然ＴＣＲサブユニットドメインの態様を有する（すなわち、キメラである）ように操作される。
【０１５９】
ＴＦＰをコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを産生する方法が、本明細書中に開示されている。本発明はまた、直接的に細胞にトランスフェクトできるＴＦＰをコードするＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションに用いられるｍＲＮＡを生成する方法は、特別に設計されたプライマーを用いた鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）、その後のポリＡ付加を含み、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現すべき核酸、ならびに典型的には５０〜２０００塩基長であるポリＡ尾部を含む構築物を産生する。そのようにして産生されたＲＮＡは、様々な種類の細胞を効率的にトランスフェクトできる。一態様において、鋳型はＴＦＰの配列を含む。
【０１６０】
一態様において、ＰＤ−１融合タンパク質、及び／または抗ＴＡＡ  ＴＦＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様において、ＰＤ−１融合タンパク質及び／または抗ＴＡＡ  ＴＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＴＦＰ−Ｔ細胞産生用にＴ細胞に導入される。一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ  ＴＦＰは一過性トランスフェクションの一形態として細胞に導入することが可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成鋳型を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、ＲＮＡが産生される。任意の起源由来の目的ＤＮＡは、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍＲＮＡ合成用のＰＣＲにより、直接的に鋳型に変換できる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他の任意の適切なＤＮＡ源であり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の所望される鋳型は、本発明のＴＦＰである。一実施形態において、ＰＣＲ用に使用されるＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノム由来の天然に存在するＤＮＡ配列に由来する場合がある。一実施形態において、核酸は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を含む場合がある。核酸は、エクソンとイントロンとを含む場合がある。一実施形態において、ＰＣＲ用に使用されるＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲ用に使用されるＤＮＡは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを含むヒト核酸配列である。代替的に、ＤＮＡは、天然に存在する生物において通常は発現しない人工的なＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する、ともにライゲートされている遺伝子の部分を含むものである。ともにライゲートされているＤＮＡの部分は、単一の生物または２つ以上の生物に由来し得る。
【０１６１】
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに用いられるｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型を生成する。ＰＣＲを実施するための方法は、当該技術分野において周知である。ＰＣＲに用いられるプライマーは、ＰＣＲ用の鋳型として使用されるＤＮＡの領域に対し実質的に相補的な領域を有するように設計されている。本明細書中に使用される「実質的に相補的」とは、プライマー配列中の塩基の大部分もしくは全部が相補的であるか、あるいは１つ以上の塩基が非相補的であるかまたはミスマッチであるヌクレオチドの配列を指す。ＰＣＲ用に使用されるアニーリング条件下で、実質的に相補的な配列を意図されたＤＮＡ標的とアニーリングまたはハイブリダイズしてもよい。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に対し実質的に相補的となるように設計できる。例えば、プライマーは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを含む、細胞内で通常転写される核酸の部分（オープンリーディングフレーム）が増幅されるように設計できる。また、関心対象の特定のドメインをコードする核酸の一部が増幅されるように、プライマーを設計してもよい。一実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの全部または一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域が増幅されるように、プライマーを設計する。当該技術分野において周知の合成方法により、ＰＣＲに有用なプライマーを作製できる。「フォワードプライマー」は、増幅の対象となるＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに対し実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」が本明細書中に用いられている場合、コード鎖を基準とした増幅対象ＤＮＡ配列に対し５位にあることを指す。「リバースプライマー」とは、増幅対象ＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型に対し実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」が本明細書中に用いられている場合、コード鎖を基準とした増幅対象ＤＮＡ配列に対して３’位にあることを指す。
【０１６２】
本明細書中に開示されている方法では、ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼを使用できる。試薬及びポリメラーゼは多くの供給元から市販されている。
【０１６３】
また、安定性及び／または翻訳効率を促進できる化学構造を使用してもよい。ＲＮＡは好ましくは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは、１〜３，０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’ＵＴＲ配列及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲのプライマーの設計を含むがこれらに限定されない異なる方法により、改変することができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要とされる５’ＵＴＲ長及び３’ＵＴＲ長を修正することができる。
【０１６４】
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、天然に存在し得る、目的の核酸に対して内在性の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲであり得る。代替的に、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列は、フォワードプライマー及びリバースプライマー内にＵＴＲ配列を組み込むことによって、あるいは鋳型の他の任意の修飾によって付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を使用することは、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を改変するうえで有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵに富む要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させる可能性があることが公知である。ゆえに、当該技術分野において周知のＵＴＲの特性に基づき、転写ＲＮＡの安定性が増強されるように、３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
【０１６５】
一実施形態において、５’ＵＴＲには内在性核酸のコザック配列が含まれる場合がある。代替的に、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲにより付加されている場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによって、コンセンサスコザック配列を再設計できる。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳効率を増強し得るが、効率的な翻訳を可能にするうえで必ずしも全てのＲＮＡに必要とされるとは思われない。多くのｍＲＮＡにコザック配列が必要とされることは、当該技術分野において公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、そのＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態において、３’または５’ＵＴＲ内で様々なヌクレオチド類似体を用いて、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げる場合がある。
【０１６６】
遺伝子をクローニングする必要なしにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成できるようにするには、転写の対象となる配列の上流にあるＤＮＡ鋳型に、転写プロモーターを付着させる必要がある。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは転写の対象となるオープンリーディングフレームの上流にあるＰＣＲ産物に組み込まれるようになる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されているような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターに対するコンセンサスヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である。
【０１６７】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、５’末端及び３’ポリ（Ａ）尾部の両方にキャップを有し、細胞内のリボソーム結合、翻訳の開始及び安定性ｍＲＮＡを決定する。ＲＮＡポリメラーゼは、プラスミドＤＮＡのような環状ＤＮＡ鋳型上に、真核細胞内での発現には好適でない長いコンカテマー産物を生成する。３’ＵＴＲの末端にて線状化されたプラスミドＤＮＡが転写されると、結果として、転写後にポリアデニル化された場合でも、真核生物トランスフェクションに有効ではない通常サイズのｍＲＮＡを生ずる。
【０１６８】
直鎖状ＤＮＡ鋳型上では、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最終塩基を超えて転写産物の３’末端を伸長できる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３）。
【０１６９】
分子クローニングは、ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に組み込む従来の方法であるが、ポリＡ／Ｔ配列がプラスミドＤＮＡ内に組み込まれた際、プラスミドが不安定になる可能性があり、それが原因で、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型が欠失及び他の異常で非常に汚染されることもしばしばである。そのせいで、クローニング手順が、面倒で多大な時間がかかるようになるだけでなく、信頼性の問題が浮上することも多々ある。この理由から、クローン化することなくポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築を可能にする方法が、極めて所望される。
【０１７０】
ＰＣＲ中に、１００Ｔ尾部（サイズは５０〜５０００Ｔであり得る）のようなポリＴ尾部を含むリバースプライマーを使用することによって、あるいは、ＰＣＲ後に、ＤＮＡライゲーションまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えを含むがこれらに限定されない任意の他の方法で、転写されたＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントを生成することが可能である。また、ポリ（Ａ）尾部によりＲＮＡを安定化させ、ＲＮＡの分解を低減させる。ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関するのが、一般的である。一実施形態において、ポリ（Ａ）尾部は、１００〜５０００アデノシンである。
【０１７１】
ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後に、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）のようなポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して更に伸長させることが可能である。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドに増大すると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増加する。加えて、３’末端に異なる化学基を付着させることで、ｍＲＮＡ安定性を増強することが可能である。そのような付着には、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物が含まれる場合がある。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用い、ＡＴＰ類似体をポリ（Ａ）尾部に組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性を更に増強し得る。
【０１７２】
また、５’キャップを付けるとＲＮＡ分子が安定化される。好ましい実施形態では、本明細書中に開示されている方法により産生されたＲＮＡが、５’キャップを具備する。５’キャップは、当該技術分野において公知の、且つ本明細書中に記載の技法を用いて提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０１７３】
また、本明細書中に開示されている方法により産生されるＲＮＡには、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が含まれる場合がある。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を容易にする任意のウイルス、染色体または人工的に設計された配列であり得る。細胞エレクトロポレーションに好適な任意の溶質で、細胞透過性ならびに生存能力を促進する因子を含有し得るもの、例えば、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などを含めることができる。
【０１７４】
ＲＮＡは、いくつかの異なる方法、例えば市販の方法のいずれかを用いて標的細胞に導入できる。これらの方法としては、限定されるものではないが、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ）もしくはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ、（ＢｉｏＲａｄ，  Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏ）、マルチポレーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，  Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子送達システムが挙げられる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照のこと）。
【０１７５】
ＴＦＰまたはＰＤ−１融合タンパク質をコードする核酸構築物
本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上のＴＦＰ構築物及び／またはＰＤ−１融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一態様において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０１７６】
所望される分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、その遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導すること、または標準的な技法を用いてその遺伝子を含む細胞及び組織から直接的に単離することなどの、当該技術分野において公知の組み換え方法を使用して得ることができる。代替的に、目的の遺伝子をクローン化せずに、寧ろ合成的に生成してもよい。
【０１７７】
また、本発明には、本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供されている。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子が長期間安定して組み込まれ且つ娘細胞に増殖することを可能にすることから、長期間の遺伝子導入を達成するうえで好適なツールとされている。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞を形質導入できるという点で、ネズミ白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも更に有利であり、また、免疫原性が低いという更なる利点も有する。
【０１７８】
別の実施形態において、本発明の所望されるＴＦＰまたはスイッチをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＴＦＰをコードする核酸の発現を達成する目的に、スリーピングビューティ、クリスパー、ＣＡＳ９、及びジンクフィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンが使用される場合がある（本明細書において参照により援用されているＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６を参照）。
【０１７９】
また、本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子治療に使用される場合がある。遺伝子送達のための方法は、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。これらの文献はその全体が本明細書において参照により援用されている）。別の実施形態において、本発明は遺伝子治療ベクターを提供する。
【０１８０】
核酸をクローニングできるベクターには、多くの種類がある。例えば、核酸をクローニングできるベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドが挙げられるがこれらに限定されない。特に関心対象とされるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
【０１８１】
更に、発現ベクターがウイルスベクターの形態で細胞に提供される場合もある。ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。概して、好適なベクターには、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能マーカーが含まれる（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０１８２】
哺乳動物細胞への遺伝子導入用に、幾多のウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達システム用の便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子をベクター内に挿入し、当該技術分野において公知の技法を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージングすることができる。次いで、組み換えウイルスを単離し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。当該技術分野において公知のレトロウイルス系は、多岐にわたっている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用されている。当該技術分野において公知のアデノウイルスベクターは、幾多にも及んでいる。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用されている。
【０１８３】
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、多数のプロモーターが同様に開始部位の下流に機能要素を含むことが明らかにされている。プロモーター要素間の間隔は柔軟性のあることが多く、そのため、要素どうしが互いに反転または移動したとしても、プロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐ離れて増加できる。プロモーターに応じて、個々の要素が協調的にまたは独立に転写を活性化するように機能できるように思われる。
【０１８４】
哺乳動物Ｔ細胞においてＴＦＰ導入遺伝子を発現し得るプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターによって、伸長因子−１複合体のαサブユニットの発現が駆動され、このαサブユニットはアミノアシルｔＲＮＡをリボソームに酵素的に送達することに関与する。ＥＦ１ａプロモーターは哺乳動物発現プラスミドにおいて広く用いられており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からＴＦＰの発現を駆動するのに有効であることが明らかにされてきた（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。もう１つのプロモーター例は、即時型サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、このプロモーター配列に作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列が高レベルに発現するように駆動し得る、強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列もまた使用可能である。例えば、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即時型初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターが挙げられるほか、限定されるものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターも挙げられる。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。また、誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用することによって、そのような発現が所望される場合に、作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができ、また発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチが提供される。誘導性プロモーターの例としては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられる。
【０１８５】
ＴＦＰポリペプチドまたはその一部の発現を評価するため、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを通してトランスフェクトされるかまたは感染することが要求される細胞の母集団からの発現細胞の同定及び選択を促進するための、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、またはその両方を具備し得る。他の態様では、選択可能マーカーは、別のＤＮＡ片上に担持され、且つ同時トランスフェクション手順において使用できる。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子の両方は、適切な調節配列に隣接することによって、宿主細胞において発現を可能にし得る。有用な選択可能マーカーには、例えば、ｎｅｏ及びそれらに類するものの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【０１８６】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定し、調節配列の機能性を評価する目的に使用される。概して、レポーター遺伝子とは、レシピエント生物もしくは組織内に存在しない遺伝子、または受容体生物もしくは組織によって発現しない遺伝子において、酵素活性等のいくつかの容易に検出可能な特性によって発現が顕現化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が包含される場合がある（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。好適な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製可能であるかまたは商業的に入手可能である。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結されている可能性があり、プロモーター駆動転写の調節能力について薬剤を評価する目的に使用される。
【０１８７】
遺伝子を細胞内に導入して発現させる方法は、当該技術分野において公知である。発現ベクターとの関連において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞内に容易に導入することが可能である。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入できる。
【０１８８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びそれらに類するものが挙げられる。ベクター及び／または外在性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０１８９】
目的ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターを使用することを含む。ウイルスベクター、及びとりわけレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞内に遺伝子を挿入する目的に最も広く使用される方法となってきた。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照）。
【０１９０】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズのようなコロイド分散系、ならびに脂質系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む）が挙げられる。人工膜小胞などのリポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ送達媒体として用いられる例示的なコロイド系である。それ以外にも、最先端の核酸標的化送達方法としては、例えば、標的化ナノ粒子を用いたポリヌクレオチドの送達、または他の好適なサブミクロンサイズ送達系などが、利用可能である。
【０１９１】
非ウイルス送達系が利用されている事例において、例示的な送達媒体はリポソームである。核酸を宿主細胞内に（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）導入するために、脂質製剤の使用が想到されている。別の態様において、核酸は脂質と会合している可能性がある。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、連結分子を介してリポソームに付着している。この連結分子は、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合しているか、リポソームに捕捉されているか、リポソームと複合体を形成しているか、脂質を含む溶液中に分散されているか、脂質と混合しているか、脂質と結合しているか、脂質中に懸濁液として含有されているか、ミセルを含有するか、またはミセルと複合体を形成しているか、あるいは脂質と会合している。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連の組成物は、溶液中の如何なる特定の構造にも限定されず、例えば、ミセルとして存在する場合もあれば、または「崩壊」構造を有する二層構造中に存在する場合もあり、また、単に溶液中に散在して、大きさまたは形状が一様でない凝集体を形成する可能性もあり得る。脂質類は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質類には、細胞質において天然に存在する脂肪滴、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物のクラスが包含される。
【０１９２】
使用に好適な脂質は、商業的供給源から入手できる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手可能であり、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手可能であり、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手可能であり、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から入手可能である。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質ストック液は、約−２０℃で貯蔵できる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、クロロホルムは唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単一及び多重層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体とを有する小胞構造を具備するものとして特徴付けることができる。多層リポソームは、水性媒体を介して分離された複数の脂質層を有し、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると、自然発生的に形成される。脂質成分が自己転位を経た後、閉じた構造が形成され、脂質二重層どうしの間に水及び溶存溶質が閉じ込められる（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。一方、溶液中では、通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造を取る場合もあれば、または単に脂質分子からなる不均一な凝集体として存在す場合もある。また、リポフェクタミン−核酸複合体が、想到される。
【０１９３】
外在性核酸を宿主細胞に導入するか、さもなければ細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法とは関係なしに、宿主細胞中の組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するため、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）による特定のペプチドの存在もしくは非存在の検出などの「生化学的」アッセイ、または本発明の範囲内に含まれる薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９４】
本発明は更に、ＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。一態様では、ＴＦＰベクターを、Ｔ細胞などの細胞に直接的に形質導入する場合がある。一態様において、ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、例えば、限定されないが、１種以上のプラスミド（発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体など）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物をはじめとするベクターが挙げられる。一態様において、ベクターは、哺乳動物のＴ細胞においてＴＦＰ構築物を発現し得る。一態様において、哺乳動物のＴ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【０１９５】
Ｔ細胞源
増殖及び遺伝的修飾に先立って、対象からＴ細胞源を採取する。「対象」という用語は、免疫応答を誘発できる生物（例えば、哺乳動物）を包含することを意味する。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞の供給元としては、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍など、幾多の起源を挙げることができる。本発明の或る態様では、当該技術分野において利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用する場合がある。本発明の或る態様では、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離溶液のような、当業者に公知の任意の数の技法を使用して、対象から採取された血液の単位からＴ細胞を得る場合がある。好ましい一態様では、アフェレーシスによって、個体の循環血液由来の細胞を得る。アフェレーシス生成物には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板をはじめとするリンパ球が含有されるのが、一般的である。一態様では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄し、血漿画分を除去してから、後続の処理ステップ用に細胞を適切な緩衝液または培地に収容する場合がある。本発明の一態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替態様において、洗浄液は、カルシウムを欠き、且つマグネシウムを欠く場合もあれば、あるいは全部ではないにしても多くの二価陽イオンを欠く場合もある。初期活性化ステップでは、カルシウムの不在下にて、活性化が増強される可能性がある。当業者に容易に理解されるように、洗浄ステップは、製造業者の指示書に従い、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ（商標）、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５）を使用するなどの、当業者に公知の方法によって達成できる。洗浄後、細胞を、例えば、Ｃａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳ、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ、または緩衝液含有もしくは不含の他の生理食塩水などのような様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させてもよい。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を直接的に培地に再懸濁させてもよい。
【０１９６】
一態様では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離、または向流遠心エルトリエーションにより、赤血球を溶解させて単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球からＴ細胞を単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜母集団は、陽性または陰性選択技法によって更に単離できる。例えば、一態様では、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）共役ビーズと共に、所望されるＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたってインキュベートすることによって、単離させる。一態様において期間は約３０分である。更なる態様において、時間は３０分〜３６時間以上の範囲で、その間の全ての整数値である。更なる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間である。更に別の好ましい態様では、時間が１０〜２４時間である。一態様において、インキュベーション時間は２４時間である。腫瘍組織または免疫不全状態の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合などのように他の細胞型と比較してＴ細胞がほとんど存在しない任意の状況では、Ｔ細胞が単離されるように使用インキュベーション時間を延長する場合がある。更に、使用インキュベーション時間を延長することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を増強することが可能になる。それゆえ、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単に短くもしくは長くすることより、及び／または（本明細書中に更に記載されるように）ビーズのＴ細胞に対する比率を増加もしくは減少させることによって、培養開始時もしくはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞の亜母集団を優先的に選択対象もしくは選択対象外にできる。加えて、ビーズもしくは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加もしくは低下させることによって、培養開始時もしくは他の所望の時点でＴ細胞の亜母集団を優先的に選択対象もしくは選択対象外にできる。本発明との関連において、複数ラウンドの選択も使用することができることが、当業者に認識されるであろう。或る態様では、選択手順を実行して活性化及び増殖プロセスにおいて「選択対象外にされた」細胞を使用することが、望ましい場合もある。また、「選択対象外にされた」細胞を、更なる選択ラウンドに供してもよい。
【０１９７】
陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせによって、陰性選択によるＴ細胞母集団の富化を達成できる。負の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーにおいて、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカー用にモノクローナル抗体のカクテルを用い、細胞を選別及び／または選択するのも、１つの方法である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。或る態様では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を富化することが望ましい場合もあれば、または調節性Ｔ細胞を積極的に選択することが望ましい場合もある。代替的に、或る態様において、Ｔ調節細胞は、抗Ｃ２５共役ビーズまたは他の類似の選択方法によって枯渇される。
【０１９８】
一実施形態において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２グランザイムＢ、及びパーフォリン、または他の適切な分子、例えば他のサイトカインのうちの１つ以上を発現するＴ細胞母集団を選択できる。例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１３／１２６７１２に記載されている方法により、細胞発現に対するスクリーニング方法を特定することができる。
【０１９９】
陽性選択または陰性選択によって、所望される細胞母集団を単離する目的で、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変動させる場合がある。或る態様では、確実に細胞とビーズとの接触を最大限にするため、ビーズと細胞とがともに混合される体積を顕著に減少させる（例えば、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合もある。例えば、一態様では、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用されている。一態様では、１０億細胞／ｍＬの濃度が使用されている。更なる態様では、１億細胞／ｍＬ超が使用されている。更なる態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用されている。もう１つの態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍＬ超の細胞濃度が使用されている。更なる態様では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度が使用される場合がある。高濃度を用いると、結果として、細胞の収量、細胞の活性化、及び細胞の増殖を増強することが可能となる。更に、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞、あるいは（白血病性血液、腫瘍組織などのような）多くの腫瘍細胞が存在する試料由来の細胞を、高濃度を用いることによって、より効率的に捕捉することも可能になる。そのような細胞母集団は、治療的価値を有する場合があるので、入手することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を用いると、通常ＣＤ２８を弱く発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を、より効率的に選択できる。
【０２００】
関連する態様では、低濃度の細胞を使用することが所望される場合がある。Ｔ細胞と表面（例えばビーズのような粒子）との混合物を著しく希釈すると、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合する高量の所望される抗原を発現する細胞が、選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度にてＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一態様において、使用した細胞の濃度は５×１０６／ｍＬである。他の態様において、使用される濃度は約１×１０５／ｍＬ〜１×１０６／ｍＬ、及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様では、２〜１０℃または室温のいずれかで、様々な速度にて様々な時間にわたって細胞を回転子上でインキュベートする場合がある。
【０２０１】
洗浄ステップ後に、刺激用Ｔ細胞を凍結してもよい。理論に束縛されるものではないが、凍結ステップ及びその後の解凍ステップで、細胞母集団中の顆粒球及び或る程度は単球を除去することによって、生成物を均一化する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後に、細胞を凍結溶液中に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液及びパラメータが、当該技術分野において公知であり、この関連において有用となるであろうが、１つの方法は、２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と８％ヒト血清アルブミンとを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０と５％デキストロースとを含有する培地、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯ、例えばＨｅｓｐａｎ（登録商標）及びＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ−Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用し、次いで細胞を毎分１の速度で−８０℃に凍結して、液体窒素貯蔵タンクの気相で貯蔵することを含む。−２０℃または液体窒素中での即時の無制御凍結だけでなく、制御凍結の他の方法も使用できる。或る態様において、本発明の方法を用いて活性化する前に、凍結保存した細胞を本明細書に記載のように解凍及び洗浄し、室温で１時間静置する。
【０２０２】
また、本明細書中に記載されているような増殖細胞が必要になり得る前に、或る期間に対象から採取された血液試料またはアフェレーシス産物を収集することが、本発明との関連において想到される。したがって、増殖の対象となる細胞源を、必要な任意の時点で採取してもよいし、所望される細胞、例えばＴ細胞を単離し、任意の数の疾患または病態のためのＴ細胞療法におけるその後の使用に備えて凍結してもよい。そうすることで、本明細書に記載されているようなＴ細胞療法による恩恵が得られるであろう。一態様において、血液試料またはアフェレーシスは、概ね健常な対象から採取される。或る態様において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクに曝されているがまだ疾患を発症していない概ね健常な対象から採取され、且つ目的の細胞はその後の使用に備えて単離され凍結される。或る態様では、Ｔ細胞を増殖させ、凍結しておき、その後に使用する場合がある。或る態様では、本明細書に記載の特定の疾患が診断された直後、但し任意の処置に先立って、患者から試料を採取する。更なる態様では、対象から採取された血液試料またはアフェレーシスから細胞を単離した後、限定されるものではないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線療法、免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸及びタクロリムスなどの薬剤、抗体、またはアレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン、及び放射線照射による治療をはじめとする任意の数の関連する治療を行う。
【０２０３】
本発明の更なる態様では、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後に、Ｔ細胞を患者から直接的に採取する。これに関しては、或る種のがん治療（とりわけ、免疫系を損傷させる薬物を用いた治療）後、患者が治療により正常に回復しつつある期間中の治療直後に、得られたＴ細胞の品質をｅｘ  ｖｉｖｏ増殖能力に合わせて最適化または向上させることが可能であることが観察されてきた。同様に、本明細書に記載の方法を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ操作後、これらの細胞は、生着の増強及びｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に適した好ましい状態となり得る。それゆえ、この回復段階の間に、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系統の細胞をはじめとする血液細胞を採取することが、本発明との関連において想到される。更に、或る態様では、モビリゼーション（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを用いたモビリゼーション）及び条件付けレジメンを用いて、とりわけ治療後の定義済み時間枠中に、対象において特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増殖に有利に働く状態を生じさせ得る。例証的な細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が含まれる。
【０２０４】
Ｔ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞は概して、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び同第７，５７２，６３１号に記述されているような方法を用いて活性化し、且つ膨張させることができる。
【０２０５】
本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと、を付着させた表面への接触によって増殖させることが可能であるのが一般的である。とりわけ、Ｔ細胞母集団は、本明細書に記載されるようにして、例えば、抗ＣＤ３抗体、またはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、刺激できる。Ｔ細胞の表面上の補助分子を共刺激する目的に、補助分子を結合するリガンドが用いられる。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、Ｔ細胞母集団を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体に接触させる場合がある。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激させるには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（抗ＣＤ２８抗体の例として挙げられるのは９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）である）を、当該技術分野において一般に知られている他の方法と同様に使用できる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０２０６】
Ｔ細胞を様々な刺激時間に曝露させた場合、それぞれ異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液または付着末梢血単核球細胞産物は、細胞傷害性または抑制性Ｔ細胞母集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも大きいヘルパーＴ細胞母集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによりＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ増殖させた場合、約８〜９日前には主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞母集団を産生する一方、約８〜９日後にはＴ細胞母集団におけるＴＣ細胞母集団の占有率が増大する。したがって、治療の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞母集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをより高度な程度まで増殖することが有益であり得る。
【０２０７】
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーのほか、他の表現型マーカーも大きく変動するが、大部分は細胞増殖プロセスの過程で再現可能に変動する。それゆえ、そのような再現性は、活性化Ｔ細胞産物を特定の目的に合わせて調整する能力を実現するものである。
【０２０８】
一旦抗ＴＡＡ  ＴＦＰ及び／またはＰＤ−１融合タンパク質が構築されると、限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる機能、再刺激なしにＴ細胞の増殖を持続させる機能、ならびに適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び動物モデルにおける抗がん作用に関し、種々のアッセイを使用して、分子の活性を評価できる。抗ＴＡＡ  ＴＦＰ及び／またはＰＤ−１融合タンパク質の効果を評価するためのアッセイについて、以下に更に詳述する。
【０２０９】
一次Ｔ細胞におけるＴＦＰ発現のウエスタンブロット分析は、単量体及び二量体の存在を検出する目的に使用できる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。ごく簡単に説明すると、ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を１０日間以上ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた後、溶解させ、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。ＴＣＲ鎖に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、ＴＦＰが検出される。同じＴ細胞サブセットを非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に用いて、共有結合二量体形成の評価を可能にする。
【０２１０】
抗原刺激後のＴＦＰ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を、フローサイトメトリーにより測定することができる。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８及びＡＰＣで刺激し、続いて分析対象プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける培養６日目に、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ蛍光を評価する（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。代替的に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、１日目に２Ａリボソームスキッピング配列を用い、ＴＦＰのみを発現するバイシストロンレンチウイルスベクターとｅＧＦＰとを併用して、ＴＦＰを形質導入する。洗浄後、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）の存在下にて、培養物を、ＰＤ−１＋Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２−ＰＤ−１）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、またはＫ５６２細胞のいずれか、ｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現する細胞で再刺激する。１日おきに外在性ＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍＬにて培養物に加える。ビーズベースの計数を用いて、フローサイトメトリーによりＧＦＰ＋Ｔ細胞を計数する（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。
【０２１１】
また、再刺激の不在下で、ＴＦＰ＋Ｔ細胞増殖の持続に関する測定を行うことができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。概略説明すると、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、１日目に指示されたＴＦＰを形質導入した後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩ粒子カウンターを用いて平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を測定する。
【０２１２】
また、ＴＦＰ−Ｔ活性を測定するための動物モデルを使用してもよい。例えば、免疫不全マウスにおけるがんを治療するための、ヒトＴＡＡ特異的ＴＦＰ＋Ｔ細胞及び／またはＰＤ−１融合タンパク質＋Ｔ細胞（例えば、ＰＤ１ＣＤ２８＋Ｔ細胞）を用いた異種移植片モデルである（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。ごく簡単に説明すると、がんが確立された後、マウスを治療群に関して無作為化する。がんを有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスに対し、異なる数の操作済みＴ細胞を１：１の比で同時注入する。Ｔ細胞注射後の様々な時点で、マウス由来の脾臓ＤＮＡ中の各ベクターのコピー数を評価する。毎週間隔で、動物のがんに関する評価を行う。αＴＡＡ−ζＴＦＰ＋Ｔ細胞または偽形質導入Ｔ細胞を注射したマウスにおける、末梢血ＴＡＡ＋及び／またはＰＤ−１＋がん細胞数を測定する。ログランク検定を用い、群を対象とした生存曲線を比較する。それ以外にも、また、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスにおいてＴ細胞注射後４週間を経過した絶対末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数を分析してもよい。マウスにがん細胞を注射し、３週間後には、ｅＧＦＰに連結されたＴＦＰをコードするバイシストロン性レンチウイルスベクターを介してＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。注射に先立って、Ｔ細胞を偽形質導入細胞と混合することにより、４５〜５０％の入力ＧＦＰ＋Ｔ細胞に正規化し、フローサイトメトリーにより確証する。１週間間隔で、動物のがんに関する評価を行う。ログランク検定を用い、ＴＦＰ＋Ｔ細胞群を対象とした生存曲線を比較する。
【０２１３】
用量依存的ＴＦＰ治療反応を評価してもよい（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。例えば、２１日目にＴＦＰ  Ｔ細胞を注射されたマウス、同数の偽形質導入Ｔ細胞を注射されたマウス、またはＴ細胞を注射されなかったマウスにおけるがんの確立後３５〜７０日経過してから末梢血を採取する。各群からのマウスを、末梢血ＴＡＡ＋及び／またはＰＤ−１＋がん細胞数を算定する目的に無作為に採血し、次いで３５日及び４９日に殺傷する。５７日目及び７０日目に、残りの動物を評価する。
【０２１４】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に前述されている。概略説明すると、マイクロタイタープレートで、洗浄済みＴ細胞を、ＰＤ−１またはＣＤ３２及びＣＤ１３７を発現する細胞（ＫＴ３２−ＢＢＬ）と２：１の最終Ｔ細胞：ＰＤ−１を発現する細胞比で混合することによって、ＴＦＰ媒介増殖の評価を行う。ＰＤ−１細胞を発現する細胞に対し、使用に先立ってガンマ線を照射する。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体は、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞含有の培養物に加えることで、Ｔ細胞増殖を刺激するための陽性対照としての機能を果たす。これらのシグナルによって、ｅｘ  ｖｉｖｏでの長期的なＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が支持されるからである。Ｔ細胞は、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び製造業者によって記載されているように、フローサイトメトリーを使用して培養物中で計数される。ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ−２Ａを介して連結したＴＦＰ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を用いた、ＧＦＰ発現によって同定される。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋Ｔ細胞については、ビオチン化組み換えＰＤ−１タンパク質及び二次アビジン−ＰＥ共役体を用いて、ＴＦＰ＋Ｔ細胞を検出した。また、特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることで、Ｔ細胞上のＣＤ４＋及びＣＤ８＋の発現も同時的に検出される。メーカーの指示書に従い、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、再刺激の２４時間後に採取された上清に対してサイトカイン測定を行う。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターを用いて蛍光を評価し、メーカーの指示書に従ってデータを分析する。
【０２１５】
細胞傷害性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価できる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。概要説明すると、標的細胞に、頻繁に撹拌しながら３７℃で２時間、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を充填し、完全ＲＰＭＩ培地で２回洗浄して、マイクロタイタープレートに播種した。エフェクターＴ細胞を、様々な比率のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）にて、完全ＲＰＭＩ中のウェル内の標的細胞と混合する。また、培地のみ（自発的放出、ＳＲ）または１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００洗剤溶液（全放出、ＴＲ）を含有する追加的なウェルも調製する。３７℃にて４時間インキュベートした後、各ウェルから上清を回収する。その後、放出された５１Ｃｒを、ガンマ粒子カウンターを用いて測定する（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）。各条件を少なくとも３回連続して行う。溶解率は、式：溶解率（％）＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）を用いて計算する。式中、ＥＲは、各実験条件ごとの平均５１Ｃｒ放出量を表す。
【０２１６】
また、細胞傷害性を、ラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイで測定してもよい。ＬＤＨ比色アッセイキットは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）またはＰｉｅｒｃｅ（商標）から入手可能である。本キットを様々な細胞型に使用して、化合物によって媒介される細胞傷害性を測定することも、また細胞媒介性細胞傷害性をアッセイすることも可能である。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、多様な細胞型に存在する細胞質ゾル酵素である。原形質膜が損傷した場合、ＬＤＨが細胞培養液中に放出される。培地中の細胞外ＬＤＨは、共役酵素反応によって定量できる。この共役酵素反応において、ＬＤＨは、乳酸からＮＡＤ＋を経由してピルビン酸に変換してからＮＡＤＨに還元するのを触媒する。次いで、ジアホラーゼは、ＮＡＤＨを用いてテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を４９０ｎｍにて測定可能な赤色のホルマザン生成物に還元する。ホルマザン形成のレベルは、培地中に放出されたＬＤＨの量に正比例する。これは、細胞傷害性の指標である。培養細胞を、エフェクター細胞（例えば、本明細書に開示されている操作されたＴ細胞）と共にインキュベートすることで、細胞傷害性を誘発させ、その後にＬＤＨを放出させる。培地中に放出されたＬＤＨを新しいプレートに移し、キットに付属している反応混合物と混合させた。室温で３０分間インキュベートした後、反応停止液を加えて反応を停止させる。プレート読み取り分光光度計を使用して、４９０ｎｍ及び６８０ｎｍでの吸光度を測定し、ＬＤＨ活性を算定する。
【０２１７】
細胞傷害性はまた、以下の実施例に記載されているような、測定されたＦＡＣＳ及びＲＴＣＡであり得る。
【０２１８】
画像処理技術を用いて、担がん動物モデルにおけるＴＦＰの特異的なトラフィッキング及び増殖を評価できる。そのようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１５７５−１５８６（２０１１）に記載されている。概略説明すると、がん細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスに静脈内注射し、続いて７日後にＴＦＰ構築物を用いたエレクトロポレーションの４時間後にＴ細胞を注射した。Ｔ細胞をレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼを発現させ、生物発光用にマウスを撮像する。代替的に、がん異種移植モデルにおけるＴＦＰ＋Ｔ細胞の単回注射の治療効果及び特異性を測定するには、以下のような方法があり得る：ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたがん細胞を注射し、続いて７日後にＰＤ−１  ＴＦＰでエレクトロポレーションされたＴ細胞を単尾静脈注射する。動物を注射後の様々な時点で撮像する。例えば、５日目（処置の２日前）及び８日目（ＴＦＰ＋ＰＢＬの２４時間後）の代表的マウスにおける、ホタルルシフェラーゼ陽性がんの光子密度ヒートマップを作成できる。
【０２１９】
また、他のアッセイ（本明細書の実施例の節に記載されているアッセイ、及び当該技術分野において公知のアッセイなど）も、本発明のＰＤ−１  ＴＦＰ構築物を評価する目的に使用できる。
【０２２０】
併用療法
本明細書中に記載されているＴＦＰ発現細胞及び／またはＰＤ−１融合タンパク質発現細胞（例えば、ＰＤ１ＣＤ２８発現細胞）を、他の公知の薬剤及び治療剤と併用することができる。本明細書中に用いられている「併用」投与とは、対象が障害に罹患している間に、２種（もしくはそれ以上）の異なる治療薬を対象に施すこと、例えば、対象の障害が診断された後、その障害が治癒または排除される前、あるいは他の理由で治療が中断される前に、２種以上の治療を施すことを意味する。いくつかの実施形態では、或る治療薬が依然として送達されている途中に、第２の送達が開始された場合、投与に関して重複が存在する。これは、本明細書において、「同時送達」または「並行送達」と呼称されることがある。他の実施形態では、一方の治療薬の送達が終了した後で、他方の治療薬の送達が開始される。いずれかの症例のいくつかの実施形態では、併用投与によってより有効となる。例えば、第２の治療薬の方がより有効であり、例えば、第２の治療薬を減量したとしても同等の効果が認められる。すなわち、第２の治療薬が症状を軽減する度合いの方が、第１の治療薬の不在下で第２の治療薬を投与した場合に認められる度合いよりも大きく、あるいは第１の治療薬で類似の状況が見られた場合に認められる度合いよりも大きい。いくつかの実施形態では、症状軽減、または障害に関連する他のパラメータが、一方の治療薬が他方の治療薬の非存在下で送達された場合に観察されるよりも優れるように、送達が為される。２つの治療薬の効果は、幾分かは相加的である場合もあれば、全体的に相加的である場合もあれば、または相加的より優れる場合もある。第２の治療薬が送達された際に、第１の治療薬を送達した効果を依然として検出することが可能となるように、送達が為され得る。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加的な療法剤は、上記のＰＤ−１融合タンパク質、例えばＰＤ１ＣＤ２８融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＰＤ−１融合タンパク質は、ＴＦＰと同じＴ細胞母集団において発現させることが可能なため、患者に対し同時的に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１融合タンパク質を、第２のＴ細胞母集団において発現させる。ＴＦＰを具備するＴ細胞母集団、及びＰＤ−１融合タンパク質を具備するＴ細胞母集団は、同時投与または連続投与される場合がある。いくつかの実施形態では、細胞ベースの治療薬（例えば、ヒトＴ細胞治療薬）の組み合わせが同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの治療薬（例えば、ヒトＴ細胞治療薬）と非細胞ベースの治療薬（例えば、小分子化学療法薬、または抗体治療薬）との組み合わせが逐次投与される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、「少なくとも１つの追加的な療法剤」に、第２の腫瘍関連抗原を標的とする第２のＴＦＰ発現細胞母集団が含まれる。また、同じもしくは異なる標的抗原に結合するか、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する、複数のＴＦＰを発現するＴ細胞も提供されている。また、Ｔ細胞の第１のサブセットが第１のＴＦＰを発現し、Ｔ細胞の第２のサブセットが第２のＴＦＰを発現する、Ｔ細胞の母集団も提供されている。一実施形態において、追加的な療法剤は、ＩＬ−１２を発現するＴＦＰ発現細胞である。
【０２２３】
本明細書に記載されているＴＦＰ発現細胞及び少なくとも１つの追加的な療法剤は、同じもしくは別々の組成物にて同時投与、または逐次投与できる。逐次投与の場合、最初に本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞を投与することもできるし、２回目に追加的な薬剤を投与することもできるし、あるいは投与順序を逆にすることもできる。
【０２２４】
更なる態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞を、外科手術、化学療法、放射線療法、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩、及びタクロリムス（ＦＫ５０６）などの免疫抑制剤、またはアレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン（ＦＲ９０１２２８）、サイトカイン、及び照射のような他の免疫破壊剤と組み合わせて治療レジメンに使用できる。また、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、ペプチドワクチン（Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載のものなど）との併用も可能である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の投与に関連する副作用を軽減または改善する薬剤を、対象に投与する場合がある。ＴＦＰ発現細胞の投与に関連する副作用としては、限定されるものではないが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及び血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）が挙げられ、このＨＬＨは、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも呼ばれる。ＣＲＳの症状には、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素、及びそれらに類するものが包含される。したがって、本明細書中に記載されている方法には、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞を対象に投与し、更に薬剤を投与することによって、ＴＦＰ発現細胞で処置した結果として生ずる高レベルの可溶性因子に対処することを含めてもよい。一実施形態では、対象における高レベルの可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２及びＩＬ−６のうちの１つ以上である。ゆえに、この副作用を治療する目的に投与される薬剤は、これらの可溶性因子のうちの１つ以上を中和する薬剤であり得る。そのような薬剤としては、限定されるものではないが、ステロイド、ＴＮＦαの阻害剤、及びＩＬ−６の阻害剤が挙げられる。ＴＮＦα阻害剤の例は、エタネルセプトである。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ（ｔｏｃ）である。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞の活性を増強する薬剤を、対象に投与する場合がある。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤であり得る。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）のような阻害性分子は、いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る。阻害性分子の例としては、限定されるものではないが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲβが挙げられる。
【０２２７】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害などによる阻害性分子の阻害によって、ＴＦＰ発現細胞の性能を最適化することが可能である。実施形態において、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ）は、ＴＦＰ発現細胞における阻害性分子の発現を阻害する目的に使用される場合がある。或る実施形態において、阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。或る実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の内部で阻害性分子が阻害される。これらの実施形態において、阻害性分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＴＦＰの成分、例えば全ての成分をコードする核酸に連結されている。一実施形態において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害性分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ−４に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、イピリムマブ（別称：ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１、商標名：Ｙｅｒｖｏｙ（商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ならびにトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、旧称：チシリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６））であり得る。或る実施形態において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。或る実施形態において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第１のドメインが阻害性分子またはそのフラグメントであり、且つ第２のドメインが陽性シグナル関連のポリペプチド（本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドなど）である、第１ドメインと第２ドメインとを具備する融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、陽性シグナルと関連するポリペプチドに、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７及び／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または例えば本明細書に記載のＣＤ３ζなどの一次シグナル伝達ドメインが含まれる場合がある。一実施形態では、ＴＦＰを発現した細胞と同じ細胞によって、融合タンパク質が発現する。別の実施形態において、融合タンパク質は、抗ＴＡＡ  ＴＦＰを発現しないＴ細胞等の細胞を介して発現する。
【０２２９】
医薬組成物
本発明の医薬組成物には、本明細書に記載の複数のＴＦＰ発現細胞などのＴＦＰ発現細胞と、ＰＤ−１融合タンパク質発現細胞などのＰＤ−１融合タンパク質（例えばＰＤ１ＣＤ２８スイッチ）発現細胞とが組み合わせて含まれる場合もあれば、１種以上の医薬的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる場合もある。そのような組成物には、中性緩衝食塩水のような緩衝剤、リン酸緩衝食塩水など、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、マンニトール、タンパク質、グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、補助剤（水酸化アルミニウムなど）及び防腐剤が含まれる場合がある。本発明の組成物は、一態様において、静脈内投与用に製剤化されている。
【０２３０】
本発明の医薬組成物は、治療対象（または予防対象）の疾患に適した方法で投与され得る。投薬量及び投薬頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類及び重篤度などの要因に応じて特定される一方、適切な投薬量は臨床試験によって算定することが可能である。
【０２３１】
一実施形態において、医薬組成物は、汚染物質を実質的に含まない。例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される検出可能なレベルの汚染物質は存在しない。一実施形態において、細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及びＡ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからなる群から選択される細菌のうちの少なくとも１種である。
【０２３２】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が指示されている場合、投与対象となる本発明の組成物の正確な量を、医師が患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び病態における個人差を考慮して判定する場合がある。概説すると、本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重の投与量（いくつかの実例において、１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の範囲内の全ての整数値を含む）で投与できる。また、これらの投与量のＴ細胞組成物を、複数回投与できる。免疫療法において遍く知られている注入技法を用い、細胞を投与できる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。
【０２３３】
或る態様において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、引き続き、血液を再採血し（またはアフェレーシスを行い）、本発明に従い、このアフェレーシスによるＴ細胞を活性化して、これらの活性化及び増殖済みＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは２〜３週間ごとに複数回遂行できる。或る態様において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血により活性化することが可能である。或る態様において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血により活性化することが可能である。
【０２３４】
本組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、インプランテーションまたは移植によることを含む任意の好都合な方法で遂行できる。本明細書に記載の組成物は、患者に対し、経動脈的に、皮下的に、皮内的に、腫瘍内的に、結節内的に、骨髄内的に、筋肉内的に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与できる。一態様では、本発明のＴ細胞組成物を、患者に対し、皮内注射または皮下注射で投与する。一態様では、本発明のＴ細胞組成物を、静脈内注射で投与する。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接的に注射することが可能である。
【０２３５】
特定の例示的な態様では、対象に対し白血球除去療法を施す場合がある。この白血球除去療法では、白血球をｅｘ  ｖｉｖｏで収集、富化、または枯渇させ、Ｔ細胞などの目的の細胞の選択及び／または単離を行う。これらのＴ細胞単離物は、当該技術分野において公知の方法により増殖させることが可能であり、本発明の１つ以上のＴＦＰ構築物を導入し、それにより、本発明のＴＦＰ発現Ｔ細胞を作製できる。続いて、それを必要とする対象に、高用量化学療法による標準治療を施し、続いて、末梢血幹細胞移植を施してもよい。或る態様では、移植後または移植と同時に、対象に対し、本発明の増殖済みＴＦＰ  Ｔ細胞を注入する。追加的な態様では、手術の前後に、増殖した細胞を投与する。
【０２３６】
患者に対し投与すべき上記治療薬の投薬量は、治療対象となる病態の正確な性質、及び治療薬の服用者に応じて異なる場合がある。ヒトに対し投与される投薬量の増減は、当該技術分野において認められている慣例に従って実施できる。例えば、アレムツズマブの用量は、成人患者では概ね１〜約１００ｍｇの範囲内であり、通常１〜３０日間の期間にわたって毎日投与される。好ましい１日量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、いくつかの実例では、１日当たり４０ｍｇまで用量を漸増させて用いる場合もある（米国特許第６，１２０，７６６号に記載）。
【０２３７】
一実施形態では、抗ＴＡＡ  ＴＦＰ、及び／またはＰＤ−１融合タンパク質を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いてＴ細胞に導入し、対象（例えばヒト）に対し本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞を初期投与し、以後、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞を１回以上投与する。以後の１回以上の投与が為されるのは、１５日間未満、例えば、前回の投与の１４日後、１３日後、１２日後、１１日後、１０日後、９日後、８日後、７日後、６日後、５日後、４日後、３日後または２日後である。一実施形態では、対象（例えば、ヒト）に対し、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の１回を超える投与を週に１回実施する。例えば、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞を２回、３回または４回の投与を週に１回実施する。一実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）に対し、１週間に２回以上ＴＦＰ  Ｔ細胞の投与（例えば、１週間に２回、３回または４回の投与）（本明細書中ではサイクルとも呼ぶ）を施し、直後の１週間はＴＦＰ  Ｔ細胞を全く投与せず、次いで、対象に対し、ＴＦＰ  Ｔ細胞を１回以上更に投与（例えば、１週間に１回より多くＴＦＰ  Ｔ細胞を投与）する。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１サイクルを超えるＴＦＰ  Ｔ細胞を投与される。各サイクル間の期間は、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満である。一実施形態では、週３回の投与の場合、ＴＦＰ  Ｔ細胞を１日おきに投与する。一実施形態において、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞を、少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週以上にわたって投与する。
【０２３８】
一態様では、ＰＤ−１  ＴＦＰ  Ｔ細胞を、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイルスベクターを用いて作製する。そのようにして作製されたＴＦＰ−Ｔ細胞は、安定してＴＦＰを発現させることになる。
【０２３９】
一態様において、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、形質導入後の４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間にわたってＴＦＰベクターを過渡的に発現する。ＴＦＰの一過性発現は、ＲＮＡ  ＴＦＰベクター送達によって為され得る。一態様では、エレクトロポレーションにより、ＴＦＰ  ＲＮＡをＴ細胞に形質導入する。
【０２４０】
一過性に発現するＴＦＰ  Ｔ細胞を用いて（特にネズミｓｃＦｖ保有ＴＦＰ  Ｔ細胞を用いて）治療される患者に起こり得る可能性のある問題は、多数回にわたる治療後のアナフィラキシーである。
【０２４１】
この理論に束縛されるものではないが、そのようなアナフィラキシー応答は、体液性抗ＴＦＰ応答、すなわち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＴＦＰ抗体を生じている患者により引き起こされる可能性があると考えられる。抗原に対する曝露が１０〜１４日間にわたって中断された場合、患者の抗体産生細胞が、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを誘発しない）クラスからＩｇＥアイソタイプに切り替えられると考えられる。
【０２４２】
一過性のＴＦＰ療法過程にて抗ＴＦＰ抗体応答を生ずる（例えば、ＲＮＡ形質導入によって生ずる）ような高度なリスクに患者が曝されている場合、ＴＦＰ  Ｔ細胞注入の中断を１０〜１４日間を超えて持続させてはならない。
【実施例】
【０２４３】
本発明については、以下の実験例を参照して、更に詳細に説明する。これらの実施例は、もっぱら例証の目的に提供されたものであり、別途指定されていない限り、限定を意図したものではない。それゆえ、本発明は、如何なる様式においても下記実施例に限定されるものと解釈すべきではなく、寧ろ本明細書中に提供されている教示の結果として明らかになるありとあらゆるバリエーションを包含するものと解釈すべきである。これ以上説明しなくても、当業者であれば、先行する説明及び下記の例示的な実施例を用い、本発明の化合物の製造及び利用によって、特許請求の範囲に記載されている方法を実施できるものと考えられる。下記実施例は、本発明の様々な態様を具体的に指摘したものであって、如何なる様式においても本開示の残りの部分を限定するものと解釈すべきではない。
【０２４４】
材料及び方法
実施例１：細胞株及び細胞培養条件
別途注記のない限り、いずれの細胞株も、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入されたものである。本明細書中に開示されている方法において使用するのに適切な細胞株の代表例は、下掲の通りである。下記の腫瘍細胞株は、ＩＦＮγ曝露の非存在下で低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する。ゆえに、レンチウイルスを介してＰＤ−Ｌ１をこれらの細胞株に形質導入することによっても同様に、ＰＤ−Ｌ１の高安定発現バージョンを産生することが可能である。腫瘍関連抗原または対照抗原をこれらの細胞株に形質導入することによって、本明細書中に開示されている融合タンパク質を試験することができる。それら融合タンパク質の例としては、限定されるものではないが、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、前立腺特異的がん抗原（ＰＳＣＡ）、及びＲＯＲ−１が挙げられる。本明細書中に開示されている併用療法用の標的として使用できる表面発現腫瘍関連抗原はいずれも、置換可能である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ヒト中皮腫細胞株を使用することができる。例としては、限定されるものではないが、ＭＳＴＯ−２１１及びＯＶＣＡＲ３が挙げられる。また、細胞上でのメソセリンの自然発現率が低い場合、これらの細胞株にヒトメソセリンを形質導入することによって、メソセリンの表面発現を増加させることも可能である。レンチウイルスを介してホタルルシフェラーゼを系列内に形質導入することによって、ＭＳＴＯ−２１１ｆｆｌｕｃ及びＯＶＣＡＲ３ｆｆｌｕｃが産生される。
【０２４６】
Ｎａｌｍ６は、ＣＤ１９を高発現するＢ細胞白血病前駆細胞株である（Ｇｅｒｍａｎ  ＤＳＭＺ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログ番号：ＡＣＣ１２８）。レンチウイルスを介してクリックビートルレッド（「ＣＢＧ」）またはホタルルシフェラーゼをＮａｌｍ６内に形質導入すると、Ｎａｌｍ６−ＣＢＧまたはＮＡＬＭ−６ｆｆｌｕｃが産生される。
【０２４７】
Ｋ５６２は、慢性骨髄性白血病細胞株である（ＡＴＣＣ；カタログ番号：ＣＣＬ−２４３）。一実施形態では、レンチウイルスを介してＣＤ１９をＫ５６２内に形質導入すると、Ｋ５６２−ＣＤ１９が産生される。他の標的は、適宜に形質導入できる。
【０２４８】
他の例示的な腫瘍細胞株、例えば、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ８６（商標））、ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２１３（商標））、及びＮＣＩ−６０パネル内に見つかる腫瘍細胞株が使用される場合がある。その上、他の不死化実験用細胞株、例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３などは、本明細書中に開示されている融合タンパク質を試験するための目的タンパク質を発現するように操作される場合がある。
【０２４９】
腫瘍細胞及びＴ細胞は、１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、及び１％Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５−０８５）中で培養する。
【０２５０】
融合タンパク質の生成：Ｔ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）
本明細書中に開示されているように、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体と併用するためのＴＦＰの生成については、例えば、同時係属中の非暫定的国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３３１４６号（２０１６年５月１８日出願）、ならびに同時係属中の米国特許仮出願第６２／４０５，５５１号（２０１６年１０月７日出願）、同第６２／３５７，１８５号（２０１６年６月３０日出願）、同第６２／３７０，１８９号（２０１６年８月２日出願）、同第６２／４２５，６９７号（２０１６年１１月２３日出願）、同第６２／４２５，４０７号（２０１６年１１月２２日出願）、同第６２／４２５，５３５号（２０１６年１１月２２日出願）、及び同第６２／４２５，８８４号（２０１６年１１月２３日出願）に記載されている。これらの各文献は、本明細書において参照により援用されている。
【０２５１】
実施例２：融合タンパク質の生成：ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体
ＰＤ−１−ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）由来の切断型細胞外ＰＤ−１（アミノ酸１〜１５５）をＣＤ２８の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと融合させることによって、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体が構築される（アミノ酸１４１−２２０）。また、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体の変異型（ＰＤ１ＣＤ２８ｍ）も構築される。このＣＤ２８シグナル伝達の無効化については、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７６（６）に記載されているほか、同時係属中の非暫定的国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６４１９５号（２０１６年６月２０日出願）にも更に記載されており、これらの各文献は本明細書において参照により援用されている。
【０２５２】
実施例３：レンチウイルスの産生
下記手順または軽微な変更を加えた手順に従い、適切な構築物をコードするレンチウイルスを調製する。５×１０６ＨＥＫ−２９３ＦＴ細胞を１００ｍｍ皿に播種し、一晩で７０〜９０％コンフルエンシーに達するようにした。指示されたＤＮＡプラスミド２．５μｇ及びＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＶＰ１００）２０μＬを、血清を含まない０．５  ｍＬのＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地で希釈し、穏やかに混合する。別個のチューブで、ＮａｎｏＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＮＦ１００）３０μＬを、血清不含のＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地０．５ｍＬ中で希釈し、穏やかに混合する。次いで、ＮａｎｏＦｅｃｔ／ＤＭＥＭ及びＤＮＡ／ＤＭＥＭ溶液を混合し、１０〜１５秒間ボルテックスした後、ＤＭＥＭ−プラスミド−ＮａｎｏＦｅｃｔ混合物を室温で１５分間インキュベートする。前のステップからの完全なトランスフェクション複合体を細胞のプレートに滴下して加え、このプレートでトランスフェクション複合体を揺すって均一に分散させる。次いで、プレートを加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、上清を新鮮な培地１０ｍＬと交換し、ＶｉｒａｌＢｏｏｓｔ（商標）２０μＬを補給する（５００×、ＡＬＳＴＥＭ、カタロログ番号ＶＢ１００）。その後、プレートを３７℃で更に２４時間インキュベートする。続いて、レンチウイルス含有の上清を、５０ｍＬの無菌キャップ付きコニカル遠心チューブ内に採取して氷上に置く。４℃で１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した後、清澄な上清を低タンパク質結合０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過し、続いて４℃で１．５時間、２５，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、Ｌ８−７０Ｍ）で超遠心分離することによってウイルスを単離させる。ペレットを取り出し、ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させてから、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｑＲＴ−ＰＣＲ滴定キットを使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲによりレンチウイルス濃度／力価を確立する（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタロログ番号６３１２３５）。プラスミドＤＮＡが残留している場合、ＤＮａｓｅＩで処理することによって除去する。ウイルスストック調製物を、感染の目的に直ちに使用するか、または等分して、今後の使用に備えて−８０℃で貯蔵する。
【０２５３】
実施例４：ＰＢＭＣ単離株
全血またはバフィーコートから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製する。全血を１０ｍＬのヘパリンバキュテナーで採取し、直ちに処理するかまたは４℃で一晩保存する。全抗凝固血液約１０ｍＬを、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を入れた５０ｍＬコニカル遠心管中で総容量２０ｍＬになるように滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液と混合する。次いで、この血液／ＰＢＳ混合物２０ｍＬをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）１５ｍＬの表面上に静かに重層した後、室温で４０ｇにて３０〜４０分間ブレーキなしで遠心分離する。
【０２５４】
バフィーコートを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）などから購入する。ＬｅｕｃｏＳｅｐ（登録商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）を１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）を加えて調製し、１０００ｇで１分間遠心分離する。バフィーコートをＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋不含）で１：３に希釈する。希釈したバフィーコートをＬｅｕｃｏＳｅｐチューブに移し、ブレーキをかけずに１０００ｇで１５分間遠心する。希釈した血漿／Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）界面に見られるＰＢＭＣを含む細胞の層を、Ｆｉｃｏｌｌによる汚染が最小限に抑えられるように注意深く除去する。次いで、残留フィコール、血小板、及び血漿タンパク質を、室温で２００ｇで１０分間遠心分離することにより、ＰＢＭＣを４０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄して除去する。次いで、細胞を血球計で計数する。洗浄されたＰＢＭＣを、５％ＡＢ血清及び１．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）のＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）混液で１回洗浄する。代替的に、洗浄されたＰＢＭＣを断熱バイアルに移し、−８０℃で２４時間凍結した後、その後の使用に備えて液体窒素に保存する。
【０２５５】
実施例５：Ｔ細胞の活性化
全血またはバフィーコートのいずれかから調製したＰＢＭＣを、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体共役磁気ビーズで２４時間刺激した後、ウイルスによる形質導入を行う。新たに単離したＰＢＭＣを、５％ＡＢ血清及び１．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含有するが、但しｈｕＩＬ−２不含のＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１回洗浄した後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２（１０００×ストック；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有のＣＡＲ−Ｔ培地中に、最終濃度１×１０６細胞／ｍＬにて再懸濁させる。ＰＢＭＣが事前に凍結されていた場合は、解凍してから、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンの存在下、１×１０６細胞／ｍＬの濃度にて予備加温した（３７℃）ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）９ｍＬ中に１×１０７細胞／ｍＬ中に再懸濁させた後、ＣＡＲ−Ｔ培地で１回洗浄し、ＣＡＲ−Ｔ培地中に１×１０６細胞／ｍＬにて再懸濁させ、前述のＩＬ−２を加える。
【０２５６】
活性化に先立って、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体共役磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどから入手可能なもの）１ｍＬを、無菌１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、磁気ラックを使用して溶液からビーズを単離させた後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２含有のＣＡＲ−Ｔ培地中に再懸濁させて、最終濃度４×１０７ビーズ／ｍＬにする。次いで、２５μＬ（１×１０６ビーズ）のビーズを１ｍＬのＰＢＭＣに移し、ビーズと細胞が１：１の比率になるようにＰＢＭＣ及びビーズを混合する。次いで、所望の数のアリコートを、１２ウェルの低付着性または未処理細胞培養プレートの単一ウェルに分配し、３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、ウイルスによる形質導入を行う。
【０２５７】
実施例６：Ｔ細胞の形質導入／トランスフェクション及び増殖
ＰＢＭＣが活性化された後、細胞を３７℃にて５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。レンチウイルスを氷上で解凍し、培地１ｍＬ当たり２μＬのＴｒａｎｓＰｌｕｓ（商標）（Ａｌｓｔｅｍ）（最終希釈率１：５００）と共に、１×１０６細胞の各ウェルに加える。細胞を更に２４時間インキュベートした後、ウイルスの添加を繰り返す。代替的に、レンチウイルスを氷上で解凍し、５μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下、各々のウイルスを５ＭＯＩまたは５０ＭＯＩで加える。室温にて細胞を１００ｇで１００分間かけて回転培養する。その後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２を引き続き存在させて、細胞を６〜１４日間増殖させる（総インキュベーション時間は、最終的なＴＦＰ−Ｔ細胞の所要数に依存する）。細胞濃度を２〜３日ごとに分析し、その時点で培地を加えて、細胞懸濁液を１×１０６細胞／ｍＬに維持する。
【０２５８】
いくつかの実例では、活性化されたＰＢＭＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡでエレクトロポレーションする。一実施形態では、ヒトＰＢＭＣを、３００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下、ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で１：１の比率にて３日間刺激する（他の刺激試薬、例えばＭｏｌｔｅｎｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製のＴｒａｎｓＡｃｔ（登録商標）Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔなどを使用してもよい）。エレクトロポレーションに先立って、ビーズを除去する。細胞を洗浄して、２．５×１０７細胞／ｍＬの濃度でＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中に再懸濁させる。細胞懸濁液（５×１０６細胞）２００μＬを、２ｍｍギャップのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ）に移し、氷上で予備冷却する。１０μｇのＩＶＴ  ＴＦＰ  ｍＲＮＡを細胞懸濁液に加えて、次いで、ＥＣＭ８３０  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ）を使用して、ｍＲＮＡ／細胞混合物を２００Ｖにて２０ミリ秒間エレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの直後に、細胞を新鮮な細胞培養培地（ＡＩＭ  Ｖ  ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）無血清培地＋５％ヒトＡＢ血清＋３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２）に移して、３７℃でインキュベートする。
【０２５９】
実施例７：細胞染色によるＴＦＰ発現の検出
レンチウイルスによる形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、ＴＦＰ及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体の発現を、フローサイトメトリーにより確証する。Ｔ細胞受容体に対するＴＦＰの取り込みは、適切な抗標的抗体を使用することにより、検出することが可能である（例えば、ＣＤ１９特異的ＴＦＰの発現は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ抗体または抗マウスＦａｂ血清を用いた検出が可能である）。一方、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体の検出は、ヒトＰＤ−１検出用の抗ＰＤ−１抗体またはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを用いた検出が可能である。Ｔ細胞を、染色緩衝液（ＰＢＳ、４％ＢＳＡ）３ｍＬ中で３回洗浄し、１ウェル当たり１×１０６細胞にてＰＢＳ中に再懸濁させる。死細胞を排除するため、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、氷上で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、染色緩衝液５０μＬ中に再懸濁させる。Ｆｃ受容体を遮断するため、１：１００に希釈された正常ヤギＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１μＬを各チューブに加えて、氷中で１０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液１．０ｍＬを各チューブに加え、十分に混合して、細胞を３００ｇにて５分間遠心分離させてペレット化する。ｓｃＦｖ  ＴＦＰの表面発現が、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識ヒト抗腫瘍抗原ＩｇＧ１  Ｆｃまたは腫瘍抗原−Ｆｃによって検出される。抗体または可溶性腫瘍抗原１μｇを各々の試料に加えて、氷上で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製の抗ＣＤ３  ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８  ＡＰＣＣｙ７（クローンＳＫ１）を用いて、Ｔ細胞の表面マーカーを染色する。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーを実行し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを用いてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）で分析する（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０２６０】
一実施形態では、Ｔ細胞を、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入する。別の実施形態では、Ｔ細胞を、抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入する。他の標的抗原に対する抗体を有するＴＦＰは、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体と正常に組み合わせることが可能である。標的抗原の例としては、限定されるものではないが、標的抗原、例えばＢＣＭＡ（ゼノン（登録商標）Ｒ−フィコエリスリン標識ｈＢＣＭＡ  ＩｇＧ）、及びＰＤ−１（標識組み換えヒトＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−１）が挙げられる。例示的な結果に、ＣＤ８に対し染色された活性化ＰＢＭＣ細胞（抗ＣＤ８  ＡＰＣＣｙ７）の表面発現分析を示す。
【０２６１】
実施例８：フローサイトメトリーによる細胞毒性アッセイ
ＰＤ−１リガンド（すなわち、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２）ならびに標的腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＭＳＬＮなど）に対して陽性または陰性の標的細胞を、蛍光色素カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。これらの標的細胞を、エフェクターＴ細胞と混合させる。このエフェクターＴ細胞は、形質導入されていないか、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体単独で形質導入されているか、腫瘍関連抗原に特異的なＴＦＰ（例えばＣＤ１９に特異的なＴＦＰ）であるか、変異型ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入されているか、またはＴＦＰで形質導入され且つＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体または変異型ＰＤ１ＣＤ２８ｍスイッチ受容体の一方と組み合わせられているか、のいずれかである。指示されたインキュベーション期間の後、フローサイトメトリーによって各エフェクター／標的細胞培養物に対して、死滅から生存までのＣＦＳＥ標識標的細胞と陰性対照標的細胞との割合が決定される。各Ｔ細胞の陽性標的細胞培養物中の標的細胞の生存率を、標的細胞のみを含有するウェルを基準とした相対値として計算する。
【０２６２】
フローサイトメトリーを用い、エフェクター細胞及び標的細胞の共インキュベーション後に、エフェクターＴ細胞含有または不含の標的細胞中の生存標的細胞の数を比較することにより、エフェクターＴ細胞の細胞傷害活性を測定する。抗腫瘍抗原ＴＦＰ細胞と組み合わせたＰＤ−１スイッチ受容体を用いた実験において、標的細胞は、腫瘍抗原陽性細胞である。一方、陰性対照として使用される細胞は、腫瘍抗原陰性細胞またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２陰性細胞である。
【０２６３】
一実施形態において、標的細胞は細胞表面にＣＤ１９を発現し、併用療法は抗ＣＤ１９−ＴＦＰ及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体を含む。例示的な方法は以下の通りである。標的細胞を１回洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬでＰＢＳ中に再懸濁させる。蛍光色素カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を０．０３μＭの濃度で細胞懸濁液に加え、細胞を室温で２０分間インキュベートする。完全細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＨＩ−ＦＢＳ）を、反応体積の５倍の体積で細胞懸濁液中に加え、細胞を室温で更に２分間インキュベートして、標識化反応を停止させる。細胞を遠心分離によりペレット化し、細胞傷害性培地（フェノールレッドフリーＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に２×１０５細胞／ｍＬにて再懸濁させる。ＣＦＳＥ標識標的細胞懸濁液５０μｌ（１０，０００細胞に相当）を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに加える。
【０２６４】
ＴＦＰ構築物（例えば、抗ＣＤ１９  ＴＦＰ構築物）及びＰＤ１ＣＤ２８融合構築物（すなわち、両方の構築物を同時発現させる）で形質導入したエフェクターＴ細胞を、陰性対照としての非形質導入Ｔ細胞と共に、洗浄してから、細胞傷害性培地中に２×１０６細胞／ｍＬまたは１×１０６細胞／ｍＬにて懸濁させる。エフェクターＴ細胞懸濁液５０μｌ（１００，０００または５０，０００細胞に相当）を、総容量１００μＬにてエフェクターとターゲットとの比率がそれぞれ１０対１または５対１になるように、Ｎａｌｍ６及びＮａｌｍ６−ＰＤＬ１細胞などの播種済み標的細胞に加える。次いで、培養液を混合し、遠心して、３７℃にて５％ＣＯ２で８時間インキュベートする。このインキュベーションの直後に、７ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をメーカーの推奨事項に従って培養細胞に加え、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーを行う。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、フローサイトメトリーデータの分析を行う。
【０２６５】
腫瘍抗原（例えばＣＤ１９）を発現する標的細胞の生存率を計算するには、試料中の生存標的細胞（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−）の数をエフェクターＴ細胞及び標的細胞で除算、あるいは試料中の生存（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−）細胞の数を標的細胞単独で除算する。エフェクター細胞に対する細胞傷害性は、標的細胞に対する致死率＝１００％−細胞に対する生存率として計算される。
【０２６６】
形質導入されていないＴ細胞、または非腫瘍抗原特異的ＴＦＰ対照で形質導入されているＴ細胞と比較したときの、腫瘍抗原発現細胞（例えば、ＣＤ１９を発現するＮａｌｍ６細胞及び／またはＮａｌｍ６−ＰＤＬ１細胞）に対する細胞傷害性を、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体及び腫瘍抗原特異的ＴＦＰ構築物（例えば、抗ＣＤ１９−ＴＦＰ構築物）で形質導入されたＴ細胞によって、デモンストレーションする。
【０２６７】
例えば、ＣＤ１９を発現するＮａｌｍ６−ＰＤＬ１細胞に対して最高の細胞傷害性を、ＣＤ１９及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体に特異的なＴＦＰをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションされたＴ細胞によって、デモンストレーションする。ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞に見られる殺傷量は少なめであり、対照または本明細書に開示されている併用療法のいずれにもＣＤ１９陰性Ｎａｌｍ６細胞（ＰＤ−Ｌ１陰性）細胞の顕著な殺傷は見られないと考えられる一方、ＣＤ１９／ＰＤ−Ｌ１（またはＰＤ−Ｌ２）発現細胞のＣＤ１９特異的殺傷（例えばＰＤ−１−ＣＤ３εまたはＰＤ−１−ＣＤ３γＴＦＰのいずれかで形質導入されたＴ細胞によるもの）は観察される可能性がある。
【０２６８】
実施例９：リアルタイム細胞毒性アッセイによる、細胞毒性の判別方法
実施例１にデモンストレーションされているのと同様、抗腫瘍抗原ＴＦＰ＋ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入されたＴ細胞によってもまた、細胞毒性が秀逸であることをリアルタイム細胞毒性アッセイ（ＲＴＣＡ）フォーマットにてデモンストレーションできる。ＲＴＣＡアッセイは、専用の９６ウェルプレートの各ウェルにおける接着性標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定し、最終的な読み出し値を細胞指数と呼ばれる値として提示する。細胞指数の変化は、同時インキュベートされたＴ細胞エフェクターによって標的細胞が死滅した結果として、標的細胞単層が破壊されたことが示す。それゆえ、エフェクターＴ細胞の細胞傷害性を、標的細胞単独のウェルの細胞指数の変化と比較した、標的細胞及びエフェクターＴ細胞の両方を含むウェルの細胞指数の変化として評価することができる。
【０２６９】
１０％ＦＢＳ及び１％抗生物質−抗真菌剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充されたＤＭＥＭ中で、接着性標的細胞を培養する。ＲＴＣＡを調製するために、例えばＤＭＥＭ培地５０μＬをＥプレートの適切なウェルに加える（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号：ＪＬ−１０−１５６０１０−１Ａ）。次いで、プレートをＲＴＣＡ  ＭＰ装置（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に入れ、製造元のマニュアルに記載されているように適切なプレートレイアウト及びアッセイスケジュールをＲＴＣＡ  ２．０ソフトウェアに入力する。１００回の測定に対して１５分ごとに、ベースライン測定を行う。次いで、１００μＬ容量中の１×１０４標的細胞を各アッセイウェルに加えて、細胞を１５分間沈降させる。プレートをリーダーに戻し、読み取りを再開する。
【０２７０】
翌日、エフェクターＴ細胞を洗浄し、細胞傷害性培地（５％ＡＢ血清が補充されたフェノールレッドフリーＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００−３１８））中に再懸濁させる。次いで、器具からプレートを取り出し、細胞傷害性培地（フェノールレッドフリーＲＰＭＩ１６４０＋５％ＡＢ血清）中に懸濁させたエフェクターＴ細胞を、エフェクター対標的の比がそれぞれ１０対１または５対１に達するように、１００，０００細胞または５０，０００細胞にて各ウェルに加える。その後、プレートを器具に戻し、１００回の測定に対して２分ごとに測定を遂行してから、１，０００回の測定に対して１５分ごとに測定を遂行する。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、標的細胞の表面上に発現した腫瘍抗原は、例えばＭＳＬＮである。ＲＴＣＡアッセイでは、細胞指数の時間依存的減少によって実証されるように、エフェクター細胞の添加後、細胞単独または対照ＣＡＲ構築物で形質導入したＴ細胞と同時インキュベートされた細胞と比較して、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体＋抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞による、ＰＤ−Ｌ１及びＭＳＬＮ発現細胞の死滅が観察され得る。例えば、ＭＳＬＮ陽性のＰＤ−Ｌ１発現標的細胞の死滅が本質的に完了するのは、抗ＭＳＬＮ−ＣＤ３εＴＦＰで形質導入されたＴ細胞を加えてから４時間以内であり得る。他のＣＤ３とＴＣＲ構築物とを含むいくつかのＴＦＰ構築物が形質導入されたＴ細胞では、殺傷がほとんどまたは全く観察されない可能性がある。抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ−＋ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入されたＴ細胞の方が、ＴＦＰまたはスイッチ受容体のみのいずれかで形質導入されたＴ細胞よりも、ＭＳＬＮ／ＰＤ−Ｌ１発現標的細胞に対する細胞傷害性が大きい。その事例において、ＭＳＬＮ陽性細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性細胞に対する細胞傷害性は、ＴＦＰのみに依存することから低下することになる。
【０２７２】
抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ構築物は、リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号１）をコードするＤＮＡ配列を介してＣＤ３εＤＮＡフラグメントに連結されたＭＳＬＮ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位にて（ＳＢＩから）ｐ５２６ベクターにクローニングすることによって操作される。
【０２７３】
ＲＴＣＡに対する標的細胞は、例えばＭＳＬＮ陽性／ＰＤ−Ｌ１陽性細胞であり、以下の対照細胞母集団：ＭＳＬＮ−／ＰＤ−Ｌ１＋細胞、ＭＳＬＮ＋／ＰＤ−Ｌ１−細胞、及びＭＳＬＮ−／ＰＤ−Ｌ１−細胞をいずれも陰性対照として使用する。１０％ＦＢＳ及び１％抗生物質−抗真菌剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充されたＤＭＥＭ中で、接着性標的細胞を培養する。
【０２７４】
次いで、細胞傷害性を示す正規化細胞指数を算定する。活性化ＰＢＭＣは未処理であるか、形質導入されていないか、あるいは空のベクターで形質導入されているか、抗ＭＳＬＮ−ＴＦＰ単独で形質導入されているか、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体単独、または抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ＋ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体の組み合わせ、抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ単独、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体単独で形質導入されている。標的細胞はＰＤ−Ｌ１陽性であり、ＰＤ−Ｌ１陰性細胞は陰性対照として使用される。
【０２７５】
標的ＭＳＬＮ陽性細胞の方が、単独形質導入細胞または陰性対照と比べて、組み合わせ形質導入Ｔ細胞を介して殺傷される効率が高い。対照的に、ＭＳＬＮ陰性細胞は、いずれの構築物を介しても殺傷される効率が低い。
【０２７６】
実施例１０：ｉｎ  ｖｉｖｏ固形腫瘍異種移植マウスモデルにおけるヒトＴＦＰ  Ｔ細胞の治療
皮下固形腫瘍または播種性もしくは皮下血液腫瘍を担持する免疫不全マウスモデルにおいて、腫瘍抗原発現ヒトがん細胞株を使用することで、本明細書中に開示されている併用療法による治療の有効性を試験することができる。ヒトＴＦＰ  Ｔ細胞及びＰＤ−１融合受容体での処置に応答した腫瘍収縮は、腫瘍サイズのキャリパー測定によって、またはｆｆｌｕｃ発現腫瘍細胞によって放出されるルシフェラーゼタンパク質（ｆｆｌｕｃ）シグナルの強度を追跡することによって評価できる。
【０２７７】
原発性ヒト固形腫瘍細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する必要なしに、免疫不全状態のマウスにおいて増殖させる場合もある。例示的な固形がん細胞としては、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）及び／またはＢｒｏａｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａに提供されるような固形腫瘍細胞株が挙げられる（ＣＣＬＥ，Ｂａｒｒｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８３：６０３（２０１２）を参照）。例示的な固形がん細胞としては、肺癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、胃癌、腎細胞癌、食道癌、神経膠腫、尿路上皮癌、網膜芽細胞腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、肝細胞癌、白血病、子宮頸癌、胆管癌、口腔癌、頭頸部癌、または中皮腫から単離された原発腫瘍細胞が挙げられる。これらのマウスを使用して、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて操作されたＴ細胞受容体及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体を発現するＴ細胞の有効性を、試験することができる。１×１０５〜１×１０７の原発性細胞（ＥＣマトリックス材料中のコラゲナーゼ処理したバルク腫瘍懸濁液）もしくは腫瘍フラグメント（ＥＣマトリックス材料中の原発性腫瘍フラグメント）を皮下に移植または注射した後に、腫瘍を２００〜５００ｍｍ３まで増殖させてから、治療を開始する。
【０２７８】
実施例１１：ＥＬＩＳＡを用いたＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌
同族抗原を有する細胞の認識に関連するエフェクターＴ細胞活性化及び増殖のもう１つの尺度が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）などのエフェクターサイトカインの産生である。
【０２７９】
ヒトＩＬ−２（カタログ番号ＥＨ２ＩＬ２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））及びＩＦＮ−γカタログ番号ＫＨＣ４０１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに関するＥＬＩＳＡアッセイを、製品添付文書に記載されているようにして実施する。一実施例では、２連の再構成済み標準物質または試料５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、続いて５０μＬのビオチン化抗体試薬を加える。プレートを数回軽く叩いて、試料を混合する。次いで、標準希釈液５０μＬを、標準物質または試料を含有しない全てのウェルに加え、プレートを接着プレートカバーで慎重に密封した後、室温（２０〜２５℃）で３時間インキュベートする。続いて、プレートカバーを取り外し、プレートの内容物を空にしてから、各ウェルを洗浄用緩衝液で満たす。この洗浄手順を合計３回繰り返し、プレートをペーパータオルまたは他の吸収性材料で拭う。調製したストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液１００μＬを各ウェルに加え、新しいプレートカバーを取り付けてから室温で３０分間インキュベートする。再びプレートカバーを取り外し、プレートの内容物を捨て、ＴＭＢ基質溶液１００μＬを各ウェルに加える。反応液を室温で３０分間、暗所で発色させた後、停止液１００μＬを各ウェルに加える。プレートを評価する。反応停止後３０分以内に、４５０ｎｍ及び５５０ｎｍに設定されたＥＬＩＳＡプレートリーダーで、吸光度を測定する。５５０ｎｍ値を４５０ｎｍ値から差し引き、未知試料中のＩＬ−２量をＩＬ−２標準曲線から得られた値について計算を行う。
【０２８０】
代替的に、ヒトサイトカイン磁気緩衝剤試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＨＢ０００１Ｍ）、ヒトＩＬ−２磁気ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＨＣ００２１Ｍ）、及びヒトＩＦＮ−γ磁気ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＨＣ４０３１Ｍ）とを併用して、２−Ｐｌｅｘアッセイを実施する。概略説明すると、２５μＬのヒトＩＬ−２及びＩＦＮ−γ抗体ビーズを９６ウェルプレートの各ウェルに加える。洗浄の際に用いられるガイドラインは、以下の通りである：洗浄液２００μＬ１倍で２回洗浄し、プレートをＭａｇｎｅｔｉｃ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１４１７９）と接触させて置き、ビーズを１分間沈降させ、液体をデカントする。次いで、インキュベーション緩衝液５０μＬを、再構成標準物質１００μＬ含有のプレートの各ウェルに二連で加えるか、あるいは試料（細胞毒性アッセイから採取された上清）５０μＬ、及びアッセイ希釈剤５０μＬを三連で加えて、総容量を１５０μＬとする。室温にて、軌道半径３ｍｍの軌道シェーカーを用い、６００ｒｐｍで、試料を暗所で２時間かけて混合する。同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、１００μＬのヒトＩＬ−２及びＩＦＮ−γビオチン化検出抗体を、各ウェルに加える。室温にて、軌道半径３ｍｍの軌道シェーカーを用い、６００ｒｐｍで、試料を暗所で１時間かけて混合する。同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、１００μＬのストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリンを、各ウェルに加える。室温にて、軌道半径３ｍｍの軌道シェーカーを用い、６００ｒｐｍで、試料を暗所で３０分かけて混合する。同じ洗浄ガイドラインを用いてプレートを３回洗浄し、デカントした後、液体試料を１倍の洗浄液１５０μＬ中に再懸濁させる。軌道半径３ｍｍの軌道シェーカーを用い、６００ｒｐｍで、試料を暗所で３分かけて混合し、４℃で一晩保存する。その後、同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、試料を１倍の洗浄液１５０μＬ中に再懸濁させる。
【０２８１】
ＭＡＧＰＩＸシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）及びｘＰＯＮＥＮＴソフトウェアを使用して、プレートを読み取る。ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用してデータの分析を実施することにより、標準曲線及びサイトカイン濃度を得る。
【０２８２】
腫瘍抗原を、内因的に発現する細胞または腫瘍抗原形質導入細胞のいずれかと共培養した場合、腫瘍抗原特異的ＴＦＰ及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体単独で形質導入されたＴ細胞の方が、形質導入されていないＴ細胞または対照の単独形質導入Ｔ細胞（すなわち、ＴＦＰまたはスイッチ受容体のいずれかを単独で形質導入したＴ細胞）と比較して、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの両方をより高レベルにて産生することが可能である。対照的に、腫瘍抗原陰性細胞または非形質導入細胞との共培養の場合、ＴＦＰ形質導入Ｔ細胞からサイトカインがほとんど放出されない場合もあれば、または全く放出されない場合もある。
【０２８３】
抗腫瘍抗原ＣＤ３ε及び抗腫瘍抗原ＣＤ３γは、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γレベルが最高度のＴＦＰ構築物を産生し得る。一方、抗腫瘍抗原−ＣＤ３εまたは抗腫瘍抗原−ＣＤ３γＴＦＰ（例えば、抗ＣＤ１９−ＣＤ３εまたは抗ＣＤ１９−ＣＤ３γＴＦＰ）、及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入されたＴ細胞によるサイトカイン産生は、ＰＤ−Ｌ１陰性標的細胞を殺傷する能力が、ＴＦＰのみを発現するＴ細胞に匹敵し得る。
【０２８４】
５０ＭＯＩのレンチウイルスを、２日間連続で活性化ＰＢＭＣに形質導入して、増殖させる。形質導入後８日目に、ＰＢＭＣの共培養物を標的細胞（ＰＤ−Ｌ１及び抗腫瘍抗原（ＣＤ１９など）を発現するＫ５６２細胞、「Ｋ５６２−１９−ＰＤ−Ｌ１」、またはＰＤ−Ｌ１陰性Ｋ５６２−１９）もしくはＣＤ１９陰性Ｋ５６２−ＰＤ−Ｌ１）とＥ：Ｔを１：１の比（各細胞型０．２×１０６）にて、細胞傷害性培地（フェノールレッドフリーＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００−３１８）中にセットアップした。別の腫瘍関連抗原（例えばＢＣＭＡ）を過剰発現するＰＤ−Ｌ１発現Ｋ５６２細胞を、陰性対照として使用してもよい。２４時間後、上記のようにして、ＥＬＩＳＡにより、細胞のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２発現の分析を行う。一例では、ＰＤ１ＣＤ２８融合タンパク質及びＣＤ１９  ＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、Ｋ５６２−１９−Ｄ−Ｌ１と共培養することによって、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２産生の両方によって証明されるように、活性化される。ＰＤ−１発現細胞がＴ細胞を特異的に活性化する能力を更にデモンストレーションする。
【０２８５】
実施例１２：ｉｎ  ｖｉｖｏマウス有効性試験
抗腫瘍抗原ＴＦＰ、例えば抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰで形質導入されたエフェクターＴ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍応答を達成する能力を評価するため、１）抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ＋ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体、２）抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ単独、もしくは３）ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体単独のいずれかで形質導入されたエフェクターＴ細胞、または４）形質導入されていないエフェクターＴ細胞を、以前にＰＤ−Ｌ１＋またはＰＤ−Ｌ１−ヒトがん細胞株を接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ−／−（ＮＳＧ−ＪＡＸ）マウスに対し、養子的に導入する。
【０２８６】
試験開始前少なくとも６週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ−／−（ＮＳＧ−ＪＡＸ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、実験的に使用する前の３日間にわたって順応させる。接種用のヒトがん細胞株を対数増殖期培養で維持し、続いて回収し、トリパンブルーで計数して、生存細胞数を算定する。腫瘍攻撃の日に、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、０．５〜１×１０６細胞／１００μＬのいずれかで予備加温した滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させる。養子免疫伝達用のＴ細胞（非形質導入、ＴＦＰ単独で形質導入されているか、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ単独で形質導入されているか、またはＴＦＰ及びＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体の両方で同時形質導入されているか、のいずれか）を調製する。研究の０日目に、実験群あたり１０匹の動物を、静脈内投与により、０．５〜１×１０６個のがん細胞に曝露させる。３日後、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中に溶解した５×１０６個のエフェクターＴ細胞母集団を、各動物に静脈内移入する。動物に関する詳細な臨床観察を、動物が安楽死するまで毎日記録する。全ての動物を対象に、動物が死亡または安楽死するまで、毎週体重測定を行う。被験物質及び対照物質を養子移入された全ての動物を、その３５日後に安楽死させる。研究中に瀕死の状態にあることが認められた動物については、研究責任者が獣医師と協議のうえ自己の裁量で安楽死させることとする。
【０２８７】
予期される結果の要約を、表１に示す。組み合わせまたは抗腫瘍抗原ＴＦＰ構築物＋ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入されたＴ細胞を養子免疫伝達した方が、非形質導入Ｔ細胞または単独形質導入Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−Ｌ１＋またはＰＤ−Ｌ２＋担癌マウスの生存が長期間に及ぶ場合がる。総合すると、これらのデータが示すように、ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体及び抗腫瘍抗原ＴＦＰを含む併用療法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で秀逸な抗原特異的殺傷をデモンストレーションするキメラ受容体を操作するための代替プラットフォームに匹敵する。
【０２８８】
【表１】
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【０２８９】
実施例１３：ＰＤ−１スイッチ受容体とＴＦＰとを含む併用療法
いくつかの実施形態では、併用療法は、追加的な抗体を含む。一実施形態では、ＰＤ−１スイッチ受容体を、ＣＤ１６ポリペプチドと標的細胞の表面上の腫瘍抗原に対するＩｇＧ１抗体とを含むＴＦＰと併用して投与する。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ１６−ＣＤ３εＴＦＰ＋ＰＤ１ＣＤ２８スイッチ受容体で形質導入される。次いで、対象は、これらのＴ細胞を投与され、リツキシマブのようなＩｇＧ抗腫瘍抗体も投与される。
いくつかの実施形態において、併用療法におけるＴＦＰは、二重特異性ＴＦＰである。そのようなＴＦＰには２つのｓｃＦｖポリペプチドが含まれており、これらのｓｃＦｖポリペプチドは、単一ＴＣＲサブユニットに直列に付着して発現するか、またはそれぞれ異なるサブユニット上に発現する。例えば、ＴＦＰには、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ−ＣＤ３ε構築物及び抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−ＣＤ３γ構築物が含まれる場合がある。他の抗原結合対、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＭＳＬＮ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９などに対する抗体を含む抗原結合対を使用してもよい。二重特異性ＴＦＰは、上記のようにＰＤ−１スイッチ受容体と併用投与される。
【０２９０】
本発明の好ましい実施形態については、本明細書において図示及び記載してきたが、そのような実施形態がほんの一例としてのみ提供されていることが、当業者には明らかであろう。この時点で、当業者は、本発明から逸脱することなしに、多数の変形形態、変更形態、及び代替形態を想起するであろう。当然のことながら、本発明を実施する際には、本明細書中に記載されている本発明の実施形態に対する種々の代替物を使用できる。下記特許請求の範囲によって、本発明の範囲が規定され、これらの特許請求の範囲内にある方法及び構造、ならびにそれらの均等物が網羅されることが、意図されている。
【０２９１】
【表２】
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【０２９２】
【表３】
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【０２９３】
【表４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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