(57)【要約】  Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、患者に投与することを含む、該患者の免疫応答の活性化方法ならびに／またはがんの治療方法であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与する、方法を本明細書中で提供する。Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができるヒト化抗Ｇａｌ３抗体ならびに抗Ｇａｌ３抗体を使用してがんを治療する方法も提供する。Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に患者のがんが適しているかどうかの判定方法ならびにＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断し免疫応答の活性化および／またはがんの治療をすることができる化合物の選択方法も提供する。
2020529469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、患者に投与することを含む、前記患者の免疫応答の活性化方法であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与する、方法。
【請求項２】
前記ＴＩＭ−３は免疫細胞上で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者はがんの宿主であり、前記Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用は腫瘍微小環境中で起こり、前記免疫応答の活性化は前記患者の前記がん量を低減する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記がんは腫瘍微小環境中の細胞を含み、前記細胞は細胞表面上でＧａｌ３を過剰発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍微小環境中の細胞を含むがんの宿主である患者における免疫応答の活性化方法であって、前記細胞はその表面上でＧａｌ３を過剰発現し、前記方法は前記腫瘍微小環境中の前記免疫細胞上の前記Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を前記患者に投与することを含み、前記阻害剤を前記免疫応答の活性化によって前記患者の前記がん量を低減するのに充分な量で投与する、方法。
【請求項６】
免疫細胞はＴ細胞であり、前記免疫応答の活性化はＴ細胞の活性による、請求項２または５に記載の方法。
【請求項７】
前記がんは、転移がんまたは原発がんである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害剤は、ＴＩＭ−３と結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害剤は、Ｇａｌ３と結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体は、配列番号５〜８から成る群から選択される配列を含むペプチドを認識する、請求項５に記載の方法
【請求項１２】
前記抗体は、一本鎖抗体またはＦａｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の前記投与は、点滴静注による、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、１つ以上の他の治療と併用して投与する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の他の治療は、化学療法、放射線療法、チェックポイント阻害剤療法から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記チェックポイント阻害剤療法は、抗ＰＤ−１療法および抗ＣＴＬＡ４療法から成る群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害剤の前記投与を、隔週に１０μｇ／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇの投与量で投与する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
患者のがんがＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適しているかどうかの決定方法であって、前記方法は：
患者の公知の型のがんの腫瘍微小環境から得られた細胞を、Ｇａｌ３に対して特異的な抗体と組み合わせること；
前記細胞上のＧａｌ３レベルを決定すること；
前記細胞表面上の前記Ｇａｌ３レベルを、Ｇａｌ３の第一活性閾値と比較すること；及び
前記細胞表面上の前記Ｇａｌ３レベルが前記第一活性閾値より高い場合に、前記患者のがんは、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適していると判定すること、
を含む、方法。
【請求項２０】
Ｇａｌ３の前記第一活性閾値は、前記患者と同型のがんに罹患している少なくとも１００試験個体のコホートから誘導される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者のがんが治療ステップに適していると判定することは、腫瘍微小環境から得られる細胞表面上のＧａｌ３レベルがＧａｌ３の第二活性閾値と比較して２５％以上であるかどうかの判定をさらに含み、前記第二活性閾値は健常な患者由来の対応する細胞を含むサンプルから誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍微小環境から得られる前記細胞は、少なくともがん細胞および／または腫瘍関連マクロファージを含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者のがんが治療ステップに適していると判定することは、腫瘍微小環境から得られる細胞表面上のＧａｌ３レベルが前記第二活性閾値と比較して７５％以上であるかどうかの判定をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
がん患者のＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる滅菌液剤であって、前記溶液は１〜４時間にわたる静脈内送達に適した１００ｍｌの溶液中の患者体重キログラム当たり１０μｇ〜１００ｍｇの抗体を含み、前記抗体はＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる、滅菌液剤。
【請求項２５】
前記滅菌液剤は、１つ以上の他のチェックポイント阻害抗体をさらに含む、請求項２４に記載の滅菌液剤。
【請求項２６】
１つ以上の他のチェックポイント阻害抗体は、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体から成る群から選択される、請求項２４に記載の滅菌液剤。
【請求項２７】
前記滅菌液剤は、１０〜１００ｎｍの径を有する１つ以上のナノ粒子をさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の滅菌液剤。
【請求項２８】
前記抗体は、抗Ｇａｌ３抗体である、請求項２４に記載の滅菌液剤。
【請求項２９】
前記抗体は、抗ＴＩＭ−３抗体である、請求項２４に記載の滅菌液剤。
【請求項３０】
Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる抗Ｇａｌ３抗体の製造方法であって、前記方法は：配列番号５〜８から成る群から選択される配列を含むペプチドを動物に導入することを含み、前記動物は抗Ｇａｌ３抗体を産生する、方法。
【請求項３１】
ヒト化抗Ｇａｌ３抗体であって、前記抗体は、
（１）相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３を含む軽鎖可変領域ならびに（２）ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３を含む重鎖可変領域を含み、
前記ＣＤＲ  Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｌ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｌ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｈ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｈ２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、および
前記ＣＤＲ  Ｈ３は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、
ヒト化抗Ｇａｌ３抗体。
【請求項３２】
前記重鎖可変領域は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する、請求項３１に記載のヒト化抗Ｇａｌ３抗体。
【請求項３３】
前記軽鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する、請求項３１または３２に記載のヒト化抗Ｇａｌ３抗体。
【請求項３４】
Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断し、患者の免疫応答の活性化および／またはがん治療をすることができる化合物の選択方法であって、前記方法は：
（ａ）化合物のライブラリーを、Ｇａｌ３およびＴＩＭ−３と接触させること、ならびに 
（ｂ）前記Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができる前記ライブラリーから１つ以上の候補化合物を選択すること、
を含む、方法。
【請求項３５】
（ｃ）前記工程（ｂ）から選択された１つ以上の候補化合物を、Ｔ細胞を含む混合物、および同種抗原提示細胞と接触させて、Ｔ細胞を刺激することができる１つ以上の化合物を特定すること、ならびに／または
（ｄ）腫瘍の宿主である哺乳類に、前記（ｂ）から選択された１つ以上の候補化合物を投与し、前記哺乳類の腫瘍量を低減することができる１つ以上の化合物を特定すること、ならびに必要に応じて、
（ｅ）前記Ｔ細胞を刺激することができ、および／または前記哺乳類の腫瘍量を減らすことができる化合物の有効量を前記患者に投与し、それにより、前記患者の免疫応答を活性化および／またはがんを治療すること、
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物は、抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、患者に投与することを含む、前記患者の免疫応答の活性化方法であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与し、前記阻害剤は請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のヒト化抗体を含む、方法。
【請求項３８】
抗体を患者に投与することを含む前記患者の免疫応答の活性化方法であって、前記抗体はＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を阻害するための手段を含む、方法。
【請求項３９】
前記抗体は、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３と結合するための手段をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年７月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／５３６，８８６号の利益を主張する。前記特許仮出願は、全目的のため、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【背景技術】
【０００２】
ヒトがんは、免疫系により潜在的に認識可能なネオ抗原を生じる多数の遺伝子変化およびエピジェネティックな変化を抱える。がんに対する内在免疫応答は前臨床モデルおよび患者において観察されるが、応答は効果がなく、樹立されたがんは「自己」とみなされることが多く、免疫系に許容されている。加えて、腫瘍は、宿主の免疫応答を積極的に抑制するいくつかの異なる機序を利用し得る。これらの機序の中で、付帯的組織傷害を軽減する免疫応答を正常に止める免疫系の様々な負の制御因子を含む免疫チェックポイントは、免疫による破壊を逃れるために腫瘍によって使用され得る。
【０００３】
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）は、Ｔ細胞活性化のこのような負の制御因子の１つとして公知であるが、Ｔ細胞のＴＩＭ−３抑制の機序はほとんど知られていない。この調節におけるＴＩＭ−３のリガンドを特定するためにこれ以前に努力されてきたが、データは一貫性がなく信頼がなかった。例えば、２００５年に、ガレクチン９（Ｇａｌ９）はＴＩＭ−３と結合することができると報告された（Ｚｈｕ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，１２４５）；しかしながら、後の報告では、ＴＩＭ−３およびＧａｌ９の相互作用は本来非特異的であると示された（Ｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９（３）：ｅ１００３２５３）。ＣＥＡＣＡＭ１は、Ｔ細胞耐容能および消耗を調節するＴＩＭ−３リガンドとして報告された（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，３８６）。しかしながら、Ｈｕａｎｇの結果は、ＴＩＭ−３がＣＥＡＣＡＭ１と結合しないと示す本発明者ら自身のデータと一致しない（下記参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＴＩＭ−３が新規リガンドガレクチン−３（Ｇａｌ−３）と相互作用し、この相互作用は免疫応答、例えば、Ｔ細胞活性化を抑制する。本発明は新規組成物および相互作用を遮断し、免疫応答を活性化し、このようにしてがんを治癒する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態では、本開示は、患者におけるＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、患者に投与することを含む、患者の免疫応答の活性化方法であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者はがんの宿主であり、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用は腫瘍微小環境において起こる。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化は患者のがん量を低減する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３は免疫細胞上に存在する。いくつかの実施形態では、患者はがんの宿主であり、Ｇａｌ３は腫瘍微小環境で過剰発現され、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は患者のがん量を低減するのに充分な量で投与される。いくつかの実施形態では、がんは、その表面でＧａｌ３を過剰発現するがん細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３が発現される免疫細胞はＴ細胞および／またはＮＫ細胞である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞がＧａｌ３を過剰発現する腫瘍微小環境内で
細胞を含むがんを宿主とする患者のＴ細胞の活性化方法であって、該方法はＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を患者に投与することを含み、前記阻害剤はＴ細胞の活性化により患者のがん量を低減するのに充分な量で投与される、方法を提供する。
【０００７】
必要に応じて、腫瘍微小環境内の細胞はがん細胞を含んでよい。必要に応じて、腫瘍微小環境内の細胞は腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、例えば、Ｍ２  ＴＡＭを含んでよい。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤はＴＩＭ−３と結合する。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤はＧａｌ３と結合する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、患者のがんがＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適しているかどうかの決定方法であって、前記方法は：患者由来の既知の型の腫瘍微小環境から得られた細胞をＧａｌ３に対して特異的な抗体と結合すること；サンプル中の原発がん細胞表面上のＧａｌ３レベルを決定すること；細胞表面上のＧａｌ３レベルをＧａｌ３の第一活性閾値と比較すること；および原発がん細胞表面上のＧａｌ３レベルが第一活性閾値より高い場合に患者のがんがＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適していると判定することを含む、方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３の第一活性閾値は、患者サンプルと同型のがんに罹患している少なくとも１００の試験個体のコホートから誘導される。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３の第一活性閾値は、健常な個体由来の同様な組織型の細胞表面上のＧａｌ３レベルの平均値（average）、平均値（mean）、またはメジアンに基づく。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、がん患者のＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる滅菌液剤であって、該溶液は１〜４時間にわたる静脈内送達に適した１００ｍｌの溶液中の患者体重キログラム当たり１０μｇ〜１００ｍｇの抗体を含み、該抗体はＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる、滅菌液剤を提供する。いくつかの実施形態では、滅菌液剤は、１つ以上の他のチェックポイント阻害抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の他のチェックポイント阻害抗体は、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体から成る群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる抗Ｇａｌ３抗体の製造方法であって、該方法は：配列番号５〜８に記載の配列のいずれか１つを含むペプチドを動物に導入することを含み、該動物は抗Ｇａｌ３抗体を産生する、方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト化抗Ｇａｌ３抗体であって、該抗体は、（１）相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（２）ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２およびＣＤＲ  Ｈ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１１のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体の重鎖可変領域は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断し、それにより、免疫応答を活性化することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができる化合物の選択方法、（ａ）化合物のライブラリーをＧａｌ３およびＴＩＭ−３と接触させること、ならびに（ｂ）Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができるライブラリーから１つ以上の候補化合物を選択することを含む患者の免疫応答の活性化方法および／またはがんの治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、（ｃ）工程（ｂ）から選択された１つ以上の候補化合物を、Ｔ細胞を含む混合物、および同種抗原提示細胞と接触させて、Ｔ細胞を刺激することができる１つ以上の化合物を特定すること、ならびに／または（ｄ）腫瘍の宿主である哺乳類に（ｂ）から選択された１つ以上の候補化合物を投与し、該哺乳類の腫瘍量を低減することができる１つ以上の化合物を特定すること、ならびに必要に応じて、（ｅ）Ｔ細胞を刺激することができ、および／または哺乳類の腫瘍量を減らすことができる化合物の有効量を患者に投与し、それにより、患者の免疫応答を活性化および／またはがんを治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、化合物は抗体である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を患者に投与することを含む患者の免疫応答の活性化方法において使用するための、上記実施形態のいずれかで開示されたＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与する、阻害剤を提供する。必要に応じて、Ｇａｌ３：ＴＩＭ阻害剤は、上記のヒト化抗Ｇａｌ３抗体である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫応答の活性化および／またはがん治療のための薬物（すなわち、医薬組成物）の製造における上記実施形態のいずれかで開示されたＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の使用を提供する。必要に応じて、Ｇａｌ３：ＴＩＭ阻害剤は、上記のヒト化抗Ｇａｌ３抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はヒトＧａｌ３（ｈＧａｌ３）がヒトＴＩＭ−３（ｈＴＩＭ−３）を特異的にプルダウンすることを示す共免疫沈降アッセイの結果を示す。図１Ａは、ＨＡタグｈＴＩＭ−３をコードするプラスミドおよびｈＧａｌ３、ｈＧａｌ９、またはｈＣＥＡＣＡＭ１をコードするプラスミドでコトランスフェクトされた、２９３Ｔ細胞内のＴＩＭ−３発現を示す。図１Ｂは、ｈＧａｌ９、ｈＧａｌ３、またはｈＣＥＡＣＡＭ１の発現を示す。図１Ｃは、ｈＧａｌ３は、コトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞内のＨＡタグｈＴＩＭ−３をプルダウンしたが、ＣＥＡＣＡＭ１はしなかったことを示す。結果は、ヒトＧａｌ９（ｈＧａｌ９）がｈＴＩＭ−３をプルダウンしたが、このプルダウンはタンパク質アグリゲーションを伴い（図１Ｂ）、ｈＧａｌ９およびｈＴＩＭ−３間の結合は非特異的である可能性があることを示していることも示す。
【図２】ｈＩｇＧのＦｃ部分（ｈＴＩＭ−３  Ｆｃ）と融合されたｈＴＩＭ−３細胞外ドメインから成る融合タンパク質を使用したプルダウンアッセイの結果を示す。結果は、Ｇａｌ３およびＴＩＭ−３間の結合は特異的であることを示す。この図に示されているように、ｈＴＩＭ−３  Ｆｃは、２９３Ｔ細胞から過剰発現されたＦｌａｇタグｈＧａｌ３タンパク質をプルダウンしたが、ｈＦｃまたはｈＰＤ１はしなかった。
【図３】ｈＧａｌ３およびｈＴＩＭ−３間の特異的相互作用を示す細胞接着アッセイの結果を示す。図に示されているように、ｈＶＩＳＴＡ  ＦｃまたはｈＰＤ１  Ｆｃで被覆されたプレートより、ｈＧａｌ３を発現する著しく多数のＡ２０細胞（Ａ２０  Ｇａｌ３細胞）は、ｈＴＩＭ−３  Ｆｃで被覆されたプレートに接着することができた。結果は、ヒトＶＩＳＴＡ  Ｆｃ（ｈＶＩＳＴＡ  Ｆｃ）で被覆されたプレートまたはｈＴＩＭ−３  Ｆｃで被覆されたプレートより、多数のＡ２０  ＰＤＬ１細胞がｈＰＤ１  Ｆｃで被覆されたプレートに接着することができたことも示す。
【図４】図４Ａは、フローサイトメトリー分析による生Ａ２０細胞（左のピーク）および死Ａ２０細胞（右のピーク）を示す。図４Ｂおよび図４Ｃは、抗ｈＦｃ  ＡＰＣ抗体で染色された生細胞（図４Ｂ）および死細胞（図４Ｃ）のフローサイトメトリー分析結果を示す。群１では、Ａ２０  Ｇａｌ３細胞をコントロールとしてｍＴＩＭ−３  Ｆｃタンパク質なしでインキュベートし；群２では、Ａ２０  Ｇａｌ３細胞をｍＴＩＭ−３  Ｆｃタンパク質と共にインキュベートし；群３、４、５では、ｍＴＩＭ−３  Ｆｃタンパク質に加えて、抗マウスＴＩＭ−３ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社、米国ミネソタ州ミネアポリス）（群３）、モノクローナル抗体ＲＭＴ３−２３（Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）（群４）、モノクローナル抗体２１５０１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）（群５）も加えてこれらの抗体がＧａｌ３およびＴｉｍ３結合を遮断することができるかどうかを試験した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＴＩＭ−３に対するＧａｌ３の特異的結合を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。図５Ａでは、プレートを１０μｇ／ｍｌのｍＧａｌ３で被覆し、ｍＧａｌ３ポリクローナル抗体（ｍＧａｌ３  ｐＡｂ）およびモノクローナル抗体ＩＭＴ００１は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することが分かったが、モノクローナル抗体Ｍ３／３８は遮断しないことが分かった。図５Ｂは、ラクトースは、Ｇａｌ９がＴＩＭ−３と結合するのを遮断したが、Ｇａｌ３が結合するのを遮断せず、Ｇａｌ３とＴｉｍ３との結合は糖非依存性結合であることを示していることを示す。図５Ｃは、抗体ＲＭＴ３−２３は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）がＴＩＭ−３と結合するのを遮断したが、Ｇａｌ３が結合するのを遮断せず、Ｇａｌ３と結合するＴＩＭ−３上のエピトープはＰＳと結合するものと異なることを示していることを示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、過剰発現されたＧａｌ３はＴ細胞活性化を抑制したことを示す。図６Ａは、マウスＡ２０細胞クローン＃４１、＃３１、および＃１５がＧａｌ３を過剰発現することを示す。図６Ｂは、これらの細胞をマウスＤＯ１１．１０Ｔ細胞と混合した場合、親Ａ２０細胞と比較して、産生されるＩＬ−２はずっと少なかったことを示す（図６Ｂ）。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｅは、Ｇａｌ３抗体は肺転移モデルにおいて抗腫瘍作用を有することを示す。図７Ａは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞上のＧａｌ３の高発現を示す。図７Ｂは、３処置群由来の肺全体の代表的画像を示す。図７Ｃは、左肺葉表面上の多数の転移コロニーを示す（平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差））。図７Ｄおよび図７Ｅは、種々の処置群の肺重量および体重を示す（平均値±ＳＥＭ）。アイソタイプコントロールで処置された動物と比較して、モノクローナル抗ヒトＧａｌ３抗体で処置された動物は、腫瘍数の有意な減少（ｐ＜０．０１）（図７Ｂ）および肺重量によって示されたずっと少ない腫瘍負荷（ｐ＜０．０５）（図７Ｄ）を示した。しかしながら、ＰＤ１抗体で処置された動物は、この肺転移モデルにおいて腫瘍数でも腫瘍量でもその有意な減少は示さなかった（ｐ＞０．０５）。図７Ｅは、ＰＤ１抗体またはＧａｌ３抗体のいずれかで処置された動物がコントロール群と同様な体重であり、いずれもの抗体の投与に関連する有害作用はなかったことを示していることを示す。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、４Ｔ１同所腫瘍誘発肺転移におけるＧａｌ３抗体の抗腫瘍作用を示す。図８Ａは、４Ｔ１細胞を移植され、次いで、コントロール抗体（「アイソタイプ」）またはＩＭＴ００１で処置されたマウスの肺上の転移腫瘍コロニーの画像を示す。３０日の期間中の０、３、７、１０および１４日目に抗体を腹腔内投与した。マウスを犠牲にする場合、３０日目に画像を撮影した。図８Ｂは、同期間におけるこれらのマウスの体重測定を示す。図８Ｃは、３０日目のこれらのマウスの左葉表面上の転移腫瘍コロニー数を示す。
【図９】Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞を移植され、Ｇａｌ３抗体で処置されたマウスの腫瘍増殖を示す。Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞を移植され、アイソタイプコントロール抗体（「Ｉｓｏ」）で処置されたマウスと比較して、Ｇａｌ３抗体（「ＩＭＴ００１」）で処置されたマウスは非常に低減した腫瘍サイズ（ｐ＜０．０５）を示したが、抗マウスＰＤ−１抗体２９Ｆは効果がなかった（ｐ＞０．０５）。
【図１０】ＭＣ３８大腸がん細胞を移植され、抗Ｇａｌ３抗体で処置されたマウスの腫瘍増殖を示す。ＭＣ３８腫瘍細胞を移植され、アイソタイプコントロール抗体（「Ｉｓｏ」）で処置されたマウスと比較して、Ｇａｌ３抗体（「ＩＭＴ００１」）で処置されたマウスは非常に縮小した腫瘍サイズを示した（ｐ＜０．０５）。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｄは、エピトープマッピングの結果を示す。ｈＧａｌ３タンパク質配列から誘導されたペプチドアレイを合成し（図１１Ａ）、抗Ｇａｌ３抗体ＩＭＴ００１でドットブロットした（図１１Ｂ）。ペプチド５および６は良好なシグナルを示し、抗Ｇａｌ３モノクローナル抗体、ＩＭＴ００１、がこれらのペプチドと結合することができることを示した。これらのペプチドに対するＩＭＴ００１の結合エピトープをさらにマッピングするために、これらのペプチド配列から誘導された複数のより短いペプチドを合成し（図１１Ｃ）、ＩＭＴ００１に対するこれらの結合をＥＬＩＳＡによって測定した（図１１Ｄ）。配列ＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧ（配列番号８）を有するペプチドは最も高いシグナルを生じた。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】様々なリンパ球マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、またはＤＸ５を発現するＢ１６Ｆ１０細胞を移植されたマウス由来の免疫細胞数を集約している。これらのマウスを、アイソタイプコントロール抗体またはＩＭＴ００１で処置した。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイにおいてヒト肺がんの腫瘍関連マクロファージ上のＧａｌ３発現を示す。ＩＭＴ００１を使用して、ヒト肺がん凍結スライドを染色し、腫瘍関連マクロファージ上のＧａｌ３発現を検出した。図１３Ａは、扁平上皮がんの染色結果を示し、図１３Ｂは、腺がんの染色結果を示す。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｇａｌ３の発現がヒトＭ２マクロファージ上で検出された（図１４Ｃ）が、樹状細胞（ＤＣ）（図１４Ａ）上でも、Ｍ１マクロファージ（図１４Ｂ）上でも検出されなかったことを示す。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５】マウスマクロファージ／Ｔ細胞反応におけるＧａｌ３抗体（「ＩＭＴ００１」）の免疫作用を示す。図１５Ｂは、コントロール（図１５Ａ）と比較した、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７上のＩＨＣによるＧａｌ３発現の検出を示す。図１５Ｃは、ＩＭＴ００１で染色された細胞を使用したフローサイトメトリーによるマウスマクロファージ細胞株上のＧａｌ３発現を示す。抗Ｇａｌ３抗体ＩＭＴ００１は、ＲＡＷマクロファージ／ＤＯ１１．１０Ｔ細胞混合反応におけるＩＬ−２産生を促進したが、抗マウスＰＤ−１抗体２９Ｆは促進しなかった（図１５Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つのメンバーの態様を含むだけでなく、１つより多いメンバーの態様も包含する。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈａ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の参照を包含する。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」と言うのは、複数のかかる細胞を包含し、「ｔｈｅ  ａｇｅｎｔ（薬剤）」と言うのは当業者に公知の１つ以上の薬剤を言うこと、などを包含する。
【００２１】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」は、組成物が記載された要素を含むが、他のものを排除しない。したがって、含むは、組成物が記載された要素のみを含むことも意味する。例えば、軽鎖は配列番号２４を含むは、軽鎖は配列番号２４に示されている配列を有するというシナリオを含む。
【００２２】
用語「対象」、「患者」または「個体」は、本明細書において互換的に使用され、ヒトまたは動物を表す。例えば、動物対象は哺乳類、霊長類（例えば、サル）、家畜動物（例えば、雌ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヤギ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験用動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的重要性のある動物、または経済的重要性のある動物であってよい。
【００２３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基の重合体を包含する。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体だけでなく、対応する天然アミノ酸の人工的化学的模倣体であるアミノ酸重合体に当てはまる。本明細書で使用されるとき、用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって結合している、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含むいずれもの長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００２４】
用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を包含する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体としては、天然アミノ酸と同じ塩基性化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボン酸基、アミノ基、およびＲ基と結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」としては、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物が挙げられる。
【００２５】
アミノ酸は、本明細書中、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている１文字記号のいずれかによって表され得る。同様に、ヌクレオチドは、その一般に認められている１文字コードによって表され得る。
【００２６】
用語「治療有効量」または「有効量」は、投与量および必要な時間において、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量（ａｍｏｕｎｔ）または量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）を含む。
【００２７】
用語「投与すること」は、対象への、経口投与、局所接触、坐薬としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、くも膜下腔内、鼻内、もしくは皮下投与、または徐放デバイスの移植、例えば、ミニ浸透圧ポンプが挙げられる。投与は、非経口および経粘膜（例えば、口腔内、舌下、口蓋、歯肉、腟内、直腸、または経皮）を含むいずれもの経路による。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が挙げられる。他の送達方法としては、リポソーム製剤の使用、点滴静注、経皮パッチなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、患者のがん量を低減するためにＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げる本明細書に記載されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の治療有効量を投与する更なる方法について知っているだろう。「同時投与する」は、本明細書に記載されている第一化合物を、本明細書に記載されている第二化合物の投与と同時、直前、または直後に投与することを意味する。
【００２８】
用語「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」および用語「がん（ｃａｎｃｅｒ）」は互換的に使用され、どちらも過剰な細胞分裂をもたらす組織の異常な増殖を表す。
【００２９】
用語「腫瘍微小環境」は、腫瘍細胞および周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄誘
発炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックスを含む腫瘍が存在する細胞環境を表す。
【００３０】
用語「免疫細胞」は、抗原の特異的認識に関与する造血起源の細胞を表す。免疫細胞としては、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ならびに単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄系細胞が挙げられる。
【００３１】
用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介免疫応答および／またはＢ細胞媒介免疫応答を表す。例示的免疫応答としては、Ｂ細胞応答（例えば、抗体産生）、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン産生、および細胞傷害活性）およびサイトカイン応答細胞の活性化、例えば、マクロファージの活性化が挙げられる。用語「免疫応答の活性化」は、当業者に公知の方法を使用して、Ｔ細胞媒介免疫応答および／またはＢ細胞媒介免疫応答のレベルを増強することを表す。１つの実施形態では、増強レベルは少なくとも２０〜５０％であり、あるいは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％である。
【００３２】
用語「認識する」は、分子が第二分子と特異的および選択的に結合することができるという現象を表す。通常、特異的または選択的結合は、背景シグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より典型的には、背景の１０倍超〜１００倍であるだろう。
【００３３】
用語「Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤」は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を阻害する分子を表し、該阻害はＴ細胞活性化をもたらす。
【００３４】
用語「ＴＩＭ−３：Ｇａｌ３」または「Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３」経路は、ＴＩＭ−３がＧａｌ３と結合するシグナル経路を表し、相互作用はＴ細胞活性化を抑制する。
【００３５】
用語「Ｔ細胞の活性化」は、Ｔ細胞が活性化され、免疫応答を促進するシグナル伝達経路に関与する現象を表す。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン、例えば、インターフェロン−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、もしくはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの遊離を通常伴う。
【００３６】
用語「Ｇａｌ３を過剰発現するがん」は、コントロール細胞と比較して細胞表面上でより高レベルのＧａｌ３を発現するがんを表す。場合によっては、コントロール細胞は、健常な個体における同様な組織由来の細胞である。場合によっては、コントロール細胞は、がんの宿主である同じ個体由来の非がん性細胞である。
【００３７】
用語「がん量」、「腫瘍量」、または「腫瘍負荷」は、一般的に、いずれかの所与の時間における対象の体内のがん細胞数、腫瘍サイズ、またはがんの量を表す。腫瘍量は、例えば、下記本明細書に開示されている多くの周知な生化学またはイメージング法による腫瘍特異的遺伝子マーカーの発現の測定および腫瘍サイズの測定によって検出することができる。
【００３８】
用語「活性閾値」は、診断を行うことができるか、または治療を処方することができるかどうかを決定する助けとなり得る比較に使用する発現レベルまたは活性レベルを表す。いくつかの実施形態では、活性閾値は、治療中の患者として同型のがんを有する異種集団由来のがん細胞上のＧａｌ３発現レベルのメジアンである。いくつかの実施形態では、活性閾値は、がんの宿主である患者の非がん性組織上のＧａｌ３レベルである。いくつかの実施形態では、活性閾値は、健常な個体の同様な組織型の細胞上のＧａｌ３の発現レベル
または活性レベルである。
【００３９】
用語「抗体」は最も広義の意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、例えば、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全合成抗体および所望の生物作用、すなわち、結合特異性を示す限りにおいて抗体フラグメントを特に包含する。抗体は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む単量体または多量体タンパク質である。抗体は抗原と特異的に結合し、該抗原の生物作用の調節を可能とすることができる。用語「抗体」は、抗体フラグメントも包含する。特異的抗体フラグメントとしては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｉｖ）単一可変から成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２つの結合されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが抗原結合部位の形成に関与する２つのドメインを可能とするペプチドリンカーによって結合された、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ出願第ＵＳ９２／０９９６５号）ならびに（ｉｘ）「二重特異性抗体」または「三重特異性抗体」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性フラグメント（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ．  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９；国際公開第９４／１３８０４号；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６４４４−６４４８）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体を、組換えＤＮＡ技術によって製造する。抗体フォーマットおよびアーキテクチャーの他の例は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１２６−１１３６、およびＣａｒｔｅｒ  ２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：３４３−３５７およびその中の引用文献に記載されており、全文は参照により明示的に組み入れられる。追加の実施形態では、抗体を、天然抗体の酵素切断または化学切断によって製造する。
【００４０】
用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフト化された抗体を表す。フレームワーク領域修飾を、ヒトフレームワーク配列内で行ってよい。
【００４１】
用語「フレームワーク」は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を表す。異なる軽鎖または重鎖の「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、種内で比較的保存的である。可変ドメインのフレームワークは、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４から一般的には成り、フレームワーク領域修飾をヒトフレームワーク配列内で行ってよい。構成要素である軽鎖および重鎖の結合したフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを位置付け、配置する働きをする。フレームワーク配列を、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列を、ヒトおよびマウス配列の「ＶＢＡＳＥ２」生殖系列可変遺伝子配列データベースにおいて見出すことができる。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「可変領域」および「可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖および重鎖の部分を表す。ＣＤＲおよびＦＲと呼ばれるアミノ酸位置は、
Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、または国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）データベースしより定義され得る。抗体重鎖または軽鎖における可変領域は、生殖系列可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、またはジョイニング（Ｊ）遺伝子（コンスタント（ＣμおよびＣδ）遺伝子セグメント由来でない）から誘導され、抗原との結合に対するその特異性を抗体に与える。典型的には、抗体可変領域は、３つの超可変「相補性決定領域」が散在した４つの保存性「フレームワーク」領域を含む。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、構造的に画定されたループの配列および／または形態で超可変な抗体可変領域の領域を表す。ＣＤＲは、超可変領域としても公知である。軽鎖および重鎖可変領域は各々３つのＣＤＲを有する。軽鎖可変領域は、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３を含む。重鎖可変領域は、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３を含む。各ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ
Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、または国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）データベースにより定義された相補性決定領域由来のアミノ酸残基を含み得る。
【００４４】
用語「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源から誘導された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体を表す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
【００４５】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種由来であり、定常部配列が別の種由来である抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体由来であり、定常部配列がヒト抗体由来である抗体などを表す。
【００４６】
用語「チェックポイント阻害剤療法」は、チェックポイント経路を抑制する治療を表す。チェックポイント阻害剤療法の非限定的例としては、ＰＤ１シグナル伝達経路を阻害する治療およびＣＴＬＡ４シグナル伝達経路を阻害する治療が挙げられる。チェックポイント阻害剤療法は、ペプチド、ヌクレオシド類似体（例えば、アプタマー）、小分子化合物、またはその組合せであり得る。
【００４７】
用語「原発がん」は、特定のがんが開始する体または組織の位置にあるがんを表す。原発がんは、第一がんまたは元のがんと呼ばれることが多い。原発がんは転移の反対であり、元の腫瘍部位からがん細胞が遊走して他の組織にがんを産生することを言う。
【００４８】
用語「転移がん」は、元の部位（開始した場所）から体の異なる領域に広がったがんを表す。
【００４９】
用語「原発がん細胞」は、がん患者から単離され、例えば、がん生検、インビトロで培養されていないがん細胞を表す。
【００５０】
表現、がんは「Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の治療に適している」は、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤での治療に対して応答しそうであるがんを表し、例えば、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を受けている患者は全生存率、進行時間、無病生存率、無進行生存、腫瘍量低減、もしくは下記開示された他の有益な臨床転帰のいずれかまたはＲＥＣＩＳＴ基準に従
ったものなどの有益な臨床転帰を有しそうであることを言う。
【００５１】
概要
本発明は、ＴＩＭ−３がＧａｌ３タンパク質と特異的に結合し、該相互作用はＴ細胞活性化の抑制をもたらすという驚くべき発見に基づく。本開示は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げる阻害剤を投与することによってＴ細胞活性化を回復し、がん、特にＧａｌ３を過剰発現するがん型の宿主である患者を治療する方法を提供する。本開示は、加えて、腫瘍微小環境における細胞、例えば、がん細胞および腫瘍関連マクロファージの表面上のＧａｌ３レベルを決定し、Ｇａｌ３レベルを活性閾値と比較することによって、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３療法を使用した治療にがんが適しているかどうかの決定方法を提供する。
【００５２】
１．患者集団選択
ガレクチン３としても公知のＧａｌ３はいくつかの細胞型内で発現され、細胞接着、細胞活性化および化学誘引、細胞サイクル、アポトーシス、細胞増殖および分化、ならびに腫瘍進行および転移を含む生理学的および病理学的過程の広域に関与する。Ｇａｌ３は、下記のように、腫瘍細胞上および腫瘍微小環境中の細胞、例えば、腫瘍関連マクロファージ、特にＭ２マクロファージ上で発現される。
【００５３】
ＴＩＭ−３は、免疫細胞、特にＴ細胞上で発現される分子であり、Ｇａｌ３との相互作用により、免疫応答、例えば、Ｔ細胞シグナル伝達を抑制することができる。本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができ、免疫応答を活性化することができる。本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、免疫応答の活性化から利益を得ることができる可能性がある、がんまたは他の疾病の治療に使用することができる。
【００５４】
固形腫瘍中のがん細胞はその周辺に腫瘍微小環境を形成し、がん細胞の増殖および転移を支援することができる。腫瘍微小環境は、周囲の結果、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、および悪性形質転換を促進することができる機械的なきっかけを含んで腫瘍が存在する細胞環境であり、腫瘍増殖および浸潤を支援し、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療耐性を育成し、休止状態の転移が活力を呈するためのニッチを提供する。腫瘍およびその周囲の微小環境は密接にかかわり、常に相互作用している。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、周辺の免疫寛容を含むことによってその微小環境に影響を与えることができ、一方、微小環境中の免疫細胞はがん性細胞の増殖および進化に影響を与えることができる。Ｓｗａｒｔｓ
ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，頁２４７３−２４８０，２０１２参照。
【００５５】
腫瘍は、マクロファージに富む反応性間質の一部として、免疫浸潤としばしば関連する。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、血管新生およびマトリックス分解の促進によって腫瘍増殖促進において重要な役割を果たす。腫瘍と関連する場合、マクロファージは、２つの表現型の異なるサブセットのマクロファージ：Ｍ１マクロファージ（ＴＨ１としても公知）またはＭ２マクロファージ（ＴＨ２としても公知）の１つに向けた機能的分極化を示す。Ｍ１マクロファージは、炎症誘発性サイトカインを産生し、細胞破壊において積極的役割を果たすことが知られており、一方、Ｍ２マクロファージは、壊死組織片（ｄｅｂｒｉｓ）を主に捕捉し、血管新生を促進して修復する。結果として、多数のＴＡＭを有する多くの腫瘍は、腫瘍増殖速度増加、局所的増殖および遠隔転移を有する。Ｍ２マクロファージ集団は、腫瘍増殖および腫瘍成長を促進するＴＡＭ集団と表現型的に類似する。Ｇａｌ３の発現に加えて、Ｍ２マクロファージは、ＣＤ２０６、ＩＬ−４ｒ、ＩＬ−１ｒ
ａ、デコイＩＬ−１ｒｌｌ、ＩＬ−１０ｒ、ＣＤ２３、マクロファージ捕捉受容体ＡおよびＢ、Ｙｍ−１、Ｙｍ−２、低密度受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、ＩＬ−６ｒ、ＣＸＣＲ１／２、ＣＤ１３６、ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ９３、ＣＤ２２６、（ＦｃｙＲ）ならびにＰＤ−Ｌ１から成る群から選択される１つ以上の細胞表面マーカーも発現し得る。
【００５６】
本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を使用して、腫瘍微小環境中のＧａｌ３を過剰発現するがんを治療することができる。場合によっては、がんは、その表面でＧａｌ３を過剰発現するがん細胞を含む。場合によっては、がんは、腫瘍微小環境中に含まれる他の型の細胞、例えば、表面上でＧａｌ３を過剰発現する、腫瘍関連マクロファージ、血管、間質細胞、線維芽細胞を含む。場合によっては、がんは、Ｇａｌ３を過剰発現し、Ｇａｌ３は腫瘍微小環境に可溶なタンパク質として存在する。特に断りがない限り、用語「過剰発現する」は、コントロール、例えば、健常な個体の体の同様な細胞、組織、または領域における発現レベルより少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高いことを表す。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、コントロール細胞と比較して、腫瘍微小環境中の細胞、例えば、がん細胞または腫瘍関連マクロファージの表面上により高レベルのＧａｌ３を有する様々な型のがんを治療するのに有用である。細胞表面上のＧａｌ３の発現レベルは、これに限定されないが、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を含む当技術分野で周知の方法によって測定することができる。通常、腫瘍微小環境中のＧａｌ３の発現レベルの検出は、がん細胞および／または腫瘍関連マクロファージ（例えば、Ｍ２  ＴＡＭ）を含む腫瘍微小環境由来の細胞を含むサンプルを、抗Ｇａｌ３抗体と組み合わせることを含み、細胞表面上のＧａｌ３レベルを細胞表面と結合することができるＧａｌ３抗体量によって示す。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３レベルを、Ｇａｌ３抗体と結合した検出可能標識の測定によって決定する。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３抗体と結合する標識された二次抗体を使用し、Ｇａｌ３発現レベルを二次抗体の標識からのシグナルの測定によって決定する。あるいは、抗体をビオチンと結合することができ、検出可能に標識されたアビジン（ビオチンと結合するポリペプチド）を使用してビオチン化抗体の存在を検出することができる。使用することができる適切な検出可能標識としては、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光部分もしくはタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（米国カリフォルニア州パロアルト）によって供給されるＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、決定されたがんのＧａｌ３発現レベルを活性閾値と比較して、がんが本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適しているかどうかを判別する。いくつかの実施形態では、活性閾値は、がんの宿主である患者の非がん性組織の細胞内のＧａｌ３の発現レベルまたは活性レベルである。いくつかの実施形態では、活性閾値は、健常な個体の同様な組織型の細胞上のＧａｌ３の発現レベルまたは活性レベルである。いくつかの実施形態では、活性閾値は、同型のがんを罹患している患者のコホート上のＧａｌ３の発現レベルの個々のメジアンからであり、患者のコホートはＧａｌ３の発現レベルに関して異種集団である。試験コホートは、好ましくは、全値およびその範囲を含む少なくとも２５、５０、１００、２００、１０００個体またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態では、患者におけるＧａｌ３の発現レベルおよび活性閾値は比較前に正規化する。
【００５９】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、患者のがんがＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適しているかどうかを決定する方法を提供し、該方法は患者由来のがん細胞を含むサンプルを得ること、該サンプル中の細胞表面上のＧａｌ３レベルを決定すること、細胞上のＧａｌ３レベルを活性閾値と比較すること、および患者のがん細胞上のＧａｌ３表面発現が活性閾値より少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１００００倍高い場合に、患者のがんはＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適していると決定することを含む。いくつかの実施形態では、比較に使用される活性閾値は、少なくとも１００、２００、３００、５００がん患者由来の同じがん型のがん細胞表面上のＧａｌ３レベルの平均値（average）、平均値（mean）、またはメジアンに基づくことができる。いくつかの実施形態
では、活性閾値は、健常な個体由来の同様な組織型の細胞表面上のＧａｌ３レベルの平均値（average）、平均値（mean）、またはメジアンに基づく。いくつかの実施形態では、
がんがＧａｌ３：ＴＩＭ−３を用いた治療に適しているかどうかの決定に使用されたサンプル中のがん細胞は原発がん細胞である。
【００６０】
転移するものを含むいくつかのがん型は、表面上でＧａｌ３を過剰発現し、したがって、本明細書に開示されている方法を使用して治療するのに適しているだろう。これらのがん型としては、肺がん、肝がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、グリオーマ、腎がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、頭部／頚部がん、メラノーマ、肉腫、腎細胞腫瘍、幹細胞腫瘍、神経膠芽腫、神経内分泌腫瘍、膀胱がん、膵がん、胆嚢がん、胃がん、前立腺がん、子宮内膜がん、甲状腺がんおよび中皮腫が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、場合によっては、本明細書に開示されている方法を使用する治療に適しているがんは、上記腫瘍、例えば、転移性肺がん由来の転移がんである。
【００６１】
２．Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤
本開示は、少なくとも１つのＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の治療有効量を、患者に投与することによるがんの治療方法を提供する。Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を阻害するいずれもの分子であり得、前記阻害はＴ細胞の活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤はＴＩＭ−３タンパク質と結合し、かかる阻害剤は本開示においてＴＩＭ−３阻害剤と呼ぶ。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤はＧａｌ３タンパク質と結合し、かかる阻害剤はＧａｌ３阻害剤と呼ぶ。Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、タンパク質（例えば、抗体）または小分子であり得る。Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤である抗体は、本開示においてＧＩＡと呼ぶ。
【００６２】
ｉ．Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害抗体（「ＧＩＡ」）
１つの実施形態では、がんの治療方法は、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害抗体を投与することを含む。かかる抗体は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を阻害し、Ｔ細胞を活性化することができる。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害抗体は、Ｇａｌ３阻害抗体である。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害抗体は、ＴＩＭ−３阻害抗体である。
【００６３】
ＧＩＡの作製
当技術分野で周知の方法を使用してＧＩＡを発現させることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、およびＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ．１，頁２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）参照。抗原、例えば、Ｇａｌ３またはそのエピトー
プを含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出してＢリンパ球を得て、該Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマをクローン化し、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養液から抗体を単離することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３阻害抗体を産生するために使用されるＧａｌ３のエピトープは：配列番号５（ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧ）、配列番号６（ＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰ）、配列番号７（ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰ）、配列番号８（ＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧ）である。
【００６４】
産生されたモノクローナル抗体を単離し、様々な確立された既知の技術によってハイブリドーマ培養液から精製することができる。かかる単離技術としては、タンパク質Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  頁２．７．１−２．７．１２および頁２．９．１−２．９．３参照。Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ），”  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，頁７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も参照。目標タンパク質まで抗体を初期培養後、抗体をシークエンシングし、その後、組換え技術によって製造することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に周知である。例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４）；米国特許出願公開第２０１４／００９９２５４（Ａ１）号参照。
【００６５】
ヒト抗体を、標的タンパク質を使用して抗原投与に応じて特異的ヒト抗体を産生する、遺伝子操作されたトランスジェニックマウスを使用して製造することができる。Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）参照。標的タンパク質に対するヒト抗体を、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ファージディスプレイ技術、またはインビトロ活性化Ｂ細胞によって構築することもできる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３；米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号参照。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＧＩＡは、抗Ｇａｌ３抗体である。いくつかの実施形態では、ＧＩＡは、配列番号５、６、７または８の配列を有するペプチドと結合する。いくつかの実施形態では、ＧＩＡは、Ｇａｌ３と結合し、ＴＩＭ−３とＧａｌ３との相互作用を妨げることができる抗体である。いくつかの実施形態では、ＧＩＡは、配列番号５〜８のいずれかから選択される配列を含むペプチドと結合し、ＴＩＭ−３とＧａｌ３との相互作用を妨げることができる抗体である。いくつかの実施形態では、ＧＩＡは、公知のＧＩＡがＧａｌ３と結合するのを遮断し、ＴＩＭ−３とＧａｌ３との相互作用を妨げることができる抗体である。場合によっては、本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤、例えば、Ｇａｌ３阻害抗体の投与は、治療期間、例えば、３〜１２週の期間にわたって、マウスモデルにおいて少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも４６％腫瘍負荷を低減し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＧＩＡは、抗Ｇａｌ３抗体である。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体は、重鎖可変領域相補性決定領域ＣＤＲ１、２、および３（ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ
Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３）を含み、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ならびに／またはＣＤＲ  Ｈ３は
配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体の重鎖可変領域は、フレームワーク領域１〜４（ＦＲ  Ｈ１、ＦＲ  Ｈ２、ＦＲ  Ｈ３、およびＦＲ  Ｈ４）を含み、ＦＲ  Ｈ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＦＲ  Ｈ２は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＦＲ  Ｈ３は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ならびに／またはＦＲ  Ｈ４は配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体の重鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体は、軽鎖可変領域相補性決定領域ＣＤＲ１、２、および３（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３）を含み、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ならびに／またはＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体の重鎖可変領域は、フレーム領域１〜４（ＦＲ  Ｌ１、ＦＲ  Ｌ２、ＦＲ  Ｌ３、およびＦＲ  Ｌ４）を含み、ＦＲ  Ｌ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＦＲ  Ｌ２は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＦＲ  Ｌ３は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ならびに／またはＦＲ  Ｌ４は配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体の軽鎖は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｇａｌ３抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００７０】
ＧＩＡの修飾
現在あるＧＩＡに対して保存的修飾の導入によってＧＩＡを製造してもよい。例えば、修飾ＧＩＡは、上記製造された抗体の相当品と相同性である重鎖および軽鎖可変領域ならびに／またはＦｃ領域を含む。本明細書に開示されている方法に使用することができる修飾ＧＩＡは、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３シグナル伝達経路を遮断することができる所望の機能特性を保持しなければならない。
【００７１】
本明細書に記載されているＧＩＡを、別の機能性分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（アルブミン、別の抗体など）、トキシン、ラジオアイソトープ、細胞傷害性薬物または細胞分裂阻害剤と結合することができる。例えば、抗体を、化学的架橋または組換え法によって結合することができる。抗体を、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載されている方法で、様々な非タンパク質重合体、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つと結合してもよい。抗体を、重合体と共有結合によって化学的に修飾して、例えば、その循環半減期を増長させることができる。例示的重合体およびこれらと結合する方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号にも示されている。
【００７２】
ＧＩＡを、タンパク質修飾部位の改変によって製造してもよい。例えば、抗体のグリコシル化の部位を改変して、グリコシル化していない抗体を製造することができ、そのように修飾したＧＩＡは、通常、抗原に対する抗体の親和性を増大している。抗体を、１つ以上のＰＥＧ基が抗体と結合する条件下、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との反応によってＰＥＧ化することもできる。ＰＥＧ化は、抗体の生物学的半減期を増長することができる。かかる修飾をした抗体を使用して、ＴＩＭ−３−Ｇａｌ３経路を遮断する所望の機能特性を保持する限り、Ｇａｌ３過剰発現する腫瘍を治療することもできる。
【００７３】
抗体を、検出可能または機能的標識でタグ付けしてもよい。検出可能な標識としては、１３１Ｉまたは９９Ｔｃなどの放射標識が挙げられ、これを、従来化学を使用して抗体に結合してもよい。検出可能な標識としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素標識も挙げられる。検出可能な標識としては、ビオチンなどの化学部分も挙げられ、これを、特異的類似検出可能部分、例えば、標識されたアビジンとの結合によって検出してもよい。
【００７４】
別の態様では、本発明は、本発明の抗Ｇａｌ３抗体または抗ＴＩＭ−３抗体、またはそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体、またはその抗原結合性部分を、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のためのリガンド）に誘導または結合して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。実際に、本発明の抗体を、２つ以上の他の機能性分子に誘導または結合して、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を作製してもよく；かかる多重特異性分子も本明細書で使用されるとき、用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を作製するため、本発明の抗体を、二重特異性分子が生じるように、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合性模倣体などの１つ以上の他の結合性分子と（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合性会合または別様によって）機能的に結合することができる。１つの例証的実施形態では、二重特異性抗体を、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を使用して作製することができる。該技術は、通常、第一抗原、例えば、Ｇａｌ３を認識する抗体の第一の半分部分および第二抗原を認識する抗体の第二の半分部分を先ず作製して、それから２つの半分部分を結合して、二重特異性抗体を作製することを含む。
【００７５】
したがって、本発明は、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３に対する少なくとも１つの第一結合特異性および第二標的に対する第二結合特異性を備える二重特性分子を含む。いくつかの実施形態では、第二標的は、公知がん標的、例えば、ＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態では、第二標的エピトープはＴＩＭ−３またはＧａｌ３であり、二重特性分子はＴＩＭ−３およびＧａｌ３と同時に結合することができる。いくつかの実施形態では、第二標的は、Ｆｃ受容体、例えば、ヒトＦｃ．γ．ＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃ．α．受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本発明は、Ｆｃ．γ．ＲまたはＦｃ．α．Ｒを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮ））、ならびにＧａｌ３を発現する標的細胞と両方に結合することができる二重特性分子を含む。これらの二重特性分子は、エフェクター細胞に的を絞ってＧａｌ３発現細胞を標的とし、ＰＤ−１発現細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン遊離、またはスーパーオキシドアニオンの生成などのＦｃ受容体媒介エフェクター細胞作用を引き起こす。
【００７６】
ｉｉ．他のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤分子
別の実施形態では、本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、小分子であるＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げる非タンパク質化合物であり、したがって、ＴＩＭ−３の免疫抑制機能と拮抗する。これらの小分子は、通常、５０ダルトン〜２５００ダルトンの分子量を有する有機分子である。該化合物を、当技術分野で公知および、例えば、欧州特許出願公開第２３６０２５４号に開示されているコンビナトリアルライブラリーの方法における多数の手法のいずれかを使用して、同定することもできる。該コンビナトリアルライブラリーとしては、生物学ライブラリー；空間的アドレス可能な平行固相または液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボリューションを要する合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー方法；およびアフィニティークロ
マトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法が挙げられる。生物学ライブラリー
の手法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリー（Ｌａｍ，  Ｋ．  Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）に適用可能である。
【００７７】
ｉｉｉ．Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤候補の評価
いくつかの周知のアッセイを使用して、候補、例えば、Ｇａｌ３タンパク質またはコンビナトリアルライブラリーからの試験化合物を含む抗原で動物を免疫することにより生成された抗体がＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができるかどうかを評価することができる。通常、これは、次の種類のアッセイのうち１つ以上を使用して候補の評価を含む：ｉ）候補が標的タンパク質、すなわち、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３と結合するかどうかを試験する結合アッセイ；ｉｉ）候補がＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができるかどうかを試験する遮断アッセイ；ｉｉｉ）Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用の遮断によって、候補がＴ細胞を活性化することができるかどうかを試験する細胞ベース機能アッセイ；ならびにｉｖ）候補が腫瘍量を低減することができるかどうかを試験するインビボ有効性アッセイ。
【００７８】
結合アッセイ
２つの分子の相互作用を評価するために使用されるいずれものアッセイを使用して、候補が標的タンパク質と結合することができるかどうかを決定することができる。非限定的例示的アッセイとしては、−酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの−結合アッセイ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析が挙げられる。場合によっては、標的タンパク質および候補の結合を複合体中の標識化された標的タンパク質の検出によって決定することができるように、標的タンパク質、すなわち、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３タンパク質を放射性同位元素または酵素標識と結合することができる。例えば、標的タンパク質を直接的にまたは間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識化し、放射性同位元素を電波放射の直接的計数もしくはシンチレーション測定によって検出することができる。あるいは、標的タンパク質分子を、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識化することができ、候補と標的タンパク質との結合を適切な基質を生成物に変換することによって決定する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイを使用して、その標的タンパク質に対するＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤候補の結合特異性を評価することができる。いくつかの実施形態では、候補を含むサンプルを標的タンパク質で事前に被覆されているプレートに添加し、ある時間インキュベートする。候補を認識する標識された二次抗体を添加することができ、標識された二次抗体からのシグナルを検出する。場合によっては、二次抗体を酵素と結合し、該酵素に対して特異的な基質の添加によって該結合を評価し、製造者使用説明書に従って適切な波長において読み取る。使用することができる酵素の非限定的例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。ホースラディッシュペルオキシダーゼに関して、ＡＢＴＳ基質を使用することができ、４１５〜４９０ｎｍにおける読み取りを行いＧａｌ３またはＴＩＭ−３に対する候補の結合能を評価することができる。あるいは、プレート上に候補を被覆し、標的タンパク質をプレートに添加し、上記結合を検出することによってＥＬＩＳＡを行うこともできる。
【００８０】
候補の結合速度（例えば、結合親和性）を、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）など、当技術分野で公知の標準的アッセイによって評価することもできる。１つの例示的アッセイでは、標的タンパク質を、標準的アミンカップリング化学およびＢｉａｃｏｒｅにより提供されているキットを使用して、チップ、例えば、カルボキシメチルデキストラン被覆チップと共有結合する。製造者によっ
て推奨されている適切な濃度、流速において緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢにより提供されている）中に候補を流すことによって、結合を測定する。会合速度および解離速度を記録し、会合速度および解離曲線を、ＢＩＡ評価ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用して結合モデルにフィットする。相互作用のＫＤ値、Ｋｏｎ値およびＫｏｆｆ値を測定することができる。好ましいＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、１×１０−７Ｍ以下、例えば、５×１０−７Ｍ以下または１×１０−８Ｍ以下でその標的タンパク質と結合することができる。
【００８１】
遮断アッセイ
それから、標的タンパク質の結合能を示した候補を、遮断アッセイにおいてＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断するその能力について評価する。いくつかの実施形態では、遮断アッセイは、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡである。１つの実施形態では、候補がＴＩＭ−３とＧａｌ３との相互作用を遮断するかどうかの決定方法は、プレートを標的タンパク質、ＴＩＭ−３またはＧａｌ３のうち１つで被覆すること、ならびに候補および他の標的タンパク質、すなわち、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３の混合物を被覆されたプレートに添加して、ＴＩＭ−３とＧａｌ３との結合に対応するシグナルを検出することを含む。候補を添加しないコントロール反応と比較したシグナルの減少は、候補がＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができることを示す。
【００８２】
いくつかの実施形態では、遮断アッセイは、フローサイトメトリーアッセイである。概して、候補を標的タンパク質、ＴＩＭ−３またはＧａｌ３のうち１つと混合し、混合物を他の標的タンパク質、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３を過剰発現する細胞に添加する。細胞表面上のＴＩＭ−３とＧａｌ３との結合を、蛍光標識された抗体によって検出することができる。コントロールと比較した候補を含む反応におけるシグナルの減少は、候補がＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができることを示す。候補がＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができるかどうかを決定するために使用することができる例示的遮断アッセイは、実施例２に記載されている。
【００８３】
機能アッセイ
場合によっては、標的タンパク質との結合を示した候補を、混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、Ｔ細胞を活性化するその能力についてさらに評価する。１つの例示的アッセイは、米国特許第８，００８，４４９号に記載されており、関連する開示はその全文を参照することにより本明細書に組み入れられる。ＭＬＲアッセイを使用して、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの産生を測定することができる。１つの例示的アッセイでは、候補を、種々の濃度において抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に培養されたいくつかの精製Ｔ細胞に添加する。それから、３７℃において４〜７日の期間、候補の存在下で細胞を培養する。それから、特定の体積の培養培地を、サイトカイン測定のために採取する。ＩＦＮ−γおよび他のサイトカインのレベルを測定することができる。サイトカイン産生の測定方法は周知であり、市販キットを容易に入手することができ、例えば、ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）がある。いくつかの実施形態では、１２〜２４時間、例えば、１８時間の期間、３Ｈ−チミジンの存在下細胞を培養し、細胞増殖と正の相関性がある細胞内の３Ｈ−チミジンの取込み量について分析する。コントロールと比較して、候補を含む培養液はＴ細胞増殖の増加、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの産生増加を示すことを示している結果は、該候補はＴＩＭ−３およびＧａｌ３の相互作用の遮断によってＴ細胞の活性化に有効であることを示す。Ｔ細胞の活性化における候補の能力を評価するために使用することができるＭＬＲの１つの例示的アッセイは、実施例１１に開示されている。
【００８４】
インビボアッセイ
別の実施形態では、インビボアッセイを使用して、候補ががん治療に有効であるかどう
かを評価する。インビボアッセイを確立された既知の手順に従って、マウス腫瘍モデルなどの腫瘍モデルで行うことができる。手短に言えば、動物、例えば、マウスにヒト腫瘍細胞株を皮下に移植する。腫瘍が増殖し、特定のサイズ、例えば、１００〜３００ｍｍ３に達した場合、適切な投与量で、所定の頻度でマウスに候補を投与する。腹腔内注射または静脈内注射などのいくつかの経路によって候補を投与することができる。通常、４〜８週間継続し、腫瘍増殖について、毎週１回または２回動物をモニターする。腫瘍を、三次元的に（高さ×幅×長さ）測定し、腫瘍体積を算出する。マウスが腫瘍エンドポイント、例えば、１５００ｍｍ３に達した、またはマウスが著しく体重減少、例えば、１５％超、２０％超、もしくは２５％超の体重減少を示した場合、実験終了時に、マウスを通常安楽死させる。コントロールと比較して、候補治療群において腫瘍増殖がより遅い、または腫瘍エンドポイント体積に達する平均時間がより長いことを示す結果は、候補ががん増殖を阻害する作用を有することを表している。腫瘍治療における候補の能力を評価するために使用することができるインビボ有効性アッセイの１つの例示的アッセイは、実施例４に開示されている。
【００８５】
４．Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤療法の有効性評価
本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤療法は腫瘍量を低減し、有益な臨床転帰をがん患者、特にＧａｌ３を過剰発現するがんに罹患しているものに与えることができる。これらの応答の測定方法は、例えば、ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｄｏｃｓ／ｒｅｃｉｓｔ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．ｐｄｆで入手することができる固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（「ＲＥＣＩＳＴ）に記載されているように、がん治療分野において当業者に周知である。
【００８６】
１つの手法では、腫瘍特異的バイオマーカーの発現を評価することによって、腫瘍量を測定する。この手法は、転移腫瘍に特に有用である。腫瘍特異的バイオマーカーは、がん細胞に特有であるか、または非がん細胞と比較してその中にずっとより豊富に存在するタンパク質または他の分子である。様々ながんに対する有用なバイオマーカーは公知であり、腫瘍特異的遺伝子マーカーの非限定的例としては、肝がんのα−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、多発性骨髄腫に対するβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；絨毛がんおよび生殖細胞腫瘍に対するβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β−ｈＣＧ）；膵がん、胆嚢がん、胆管がん、および胃がんに対するＣＡ１９−９；卵巣がんに対するＣＡ−１２５およびＨＥ４；結腸直腸がんに対するがん胎児抗原（ＣＥＡ）；神経内分泌腫瘍に対するクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）；膀胱がんに対するフィブリン／フィブリノーゲン；前立腺がんに対する前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；ならびに甲状腺がんに対するサイログロブリンが挙げられる。ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ−ｃａｎｃｅｒ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ−ｓｔａｇｉｎｇ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ／ｔｕｍｏｒ−ｍａｒｋｅｒｓ−ｆａｃｔ−ｓｈｅｅｔ参照。
【００８７】
腫瘍特異的遺伝子マーカーの発現レベルの測定方法は周知である。いくつかの実施形態では、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、遺伝子マーカーのｍＲＮＡを血液サンプルまたは腫瘍組織から単離し、遺伝子マーカーの発現を定量化する。いくつかの実施形態では、ウェスタンブロット、免疫組織化学、またはフローサイトメトリー分析を行い、腫瘍特異的遺伝子マーカーのタンパク質発現を評価する。通常、本発明の治療の時間にわたって採取される複数のサンプルにおいて、腫瘍特異的遺伝子マーカーレベルを測定し、レベルの減少は腫瘍量の減少と相関する。
【００８８】
別の手法では、本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤療法による腫瘍量の減少は、体内の腫瘍サイズの減少またはがん量の減少によって示される。腫瘍サイズの測定を、イメージング技術によって通常行う。例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは、現在ある病変の増殖または新しい病変または腫瘍転移の発症のいずれかの特
定によって、腫瘍の縮小または増殖だけでなく、疾病の進行に関する正確かつ信頼性のある解剖学的情報を提供することができる。
【００８９】
さらに別の手法では、腫瘍量の減少を、機能的および代謝的イメージング技術によって評価することができる。これらの技術は、灌流、酸素添加および代謝の変化の観察によって治療応答の早期評価を提供することができる。例えば、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴは、放射標識されたグルコース類似体分子を使用して組織代謝を評価する。腫瘍は、通常、グルコース消費量を上昇させ、腫瘍組織代謝の減少に対応する値変化は腫瘍量の減少を示す。同様なイメージング技術は、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．（２０１２）１３（４）３７１−３９０に開示されている。
【００９０】
本明細書に開示されている治療を受ける患者は、様々な程度の腫瘍量減少を示す可能性がある。場合によっては、患者は、「無病生存状態（ＮＥＤ）」とも呼ばれる完全奏効（ＣＲ）を示し得る。ＣＲは、試験、身体検査およびスキャンによって示される検出可能な腫瘍は全て消失したことを意味する。場合によっては、本明細書に開示されている併用療法を受ける患者は、部分奏効（ＰＲ）し、これは、総腫瘍体積が少なくとも５０％減少したが、いくらかの残存疾患がまだ残っている証拠があることにおおよそ相当する。場合によっては、深い部分奏効における残存疾患は実際には死腫瘍または瘢痕である可能性があり、その結果、ＰＲであると分類された少数の患者は実際にはＣＲである可能性がある。治療中に縮小を示す多くの患者も治療を継続してさらに縮小を示し、ＣＲになる可能性がある。場合によっては、治療を受ける患者は、やや有効（ＭＲ）であり得、これは、総腫瘍体積の２５％超であるがＰＲとなる５０％より少ない少量の縮小をおおよそ意味する。場合によっては、治療を受ける患者は、病勢安定（ＳＤ）を示し得、これは、腫瘍がおおよそ同じサイズに留まっているが、少量の増殖（通常、２０％未満または２５％）または少量の縮小（やや有効にならない限りＰＲ未満である。もしそうであれば、ＳＤは通常２５％未満と定義される）のいずれかを含み得ることを意味する。
【００９１】
治療の所望の効果または所望の臨床結果は、例えば、周辺臓器へのがん細胞浸潤減少（すなわち、ある程度遅延および／または停止）；腫瘍転移阻止（すなわち、ある程度遅延および／または停止）；奏効率（ＲＲ）増大；奏効期間増長；がん関連症状の１つ以上をある程度緩和；病気治療に要する他の薬物の投与量低減；病気進行遅延；ならびに／または患者の生存期間延長および／もしくは生活品質向上も含み得る。これらの効果の評価方法は周知であり、ならびに／または、例えば、ｃａｎｃｅｒｇｕｉｄｅ．ｏｒｇ／ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．ｈｔｍｌおよび上記ＲＥＣＩＳＴガイドラインに開示されている。
【００９２】
場合によっては、本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の投与は、治療期間内で少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも４６％腫瘍負荷を低減し得る。
【００９３】
４．他の治療との併用
いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤および１つ以上の第二抗がん剤（「第二薬剤」）の併用を使用して、患者の腫瘍量を減らしてもよい。「併用療法」または「併用して」は、これらの送達方法は本明細書に記載されている範囲内であるが、治療薬を同時に投与および／または一緒に送達するために製剤化しなければならないことを暗示していないものとする。Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤および第二薬剤を同じ投与レジメンに従って投与してもよく、異なる投与レジメンに従って投与してもよい。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤および第二薬剤を、全治療期間中または治療期間の一部の間に、いずれもの順番で逐次投与する。いくつかの実施形態では、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤および第二抗がん薬剤を、同時にまたはほぼ同時（例えば、互いの約１、５、１０、１５、２０、または３０分以内）に投与する。併用療法の非限定的例は次の
ものである：例えば、Ｇａｌ３および第二抗がん剤の投与で、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は「Ａ」であり、第二抗がん剤または化合物は「Ｂ」である：
【００９４】
Ａ／Ｂ／ＡＢ／Ａ／ＢＢ／Ｂ／ＡＡ／Ａ／ＢＡ／Ｂ／ＢＢ／Ａ／ＡＡ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【００９５】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
【００９６】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【００９７】
患者への第二抗がん剤の投与は、もしあったにしても、治療の有害性を考慮して、かかる化合物の投与のための一般的プロトコールに従うだろう。次に、がん治療するためのＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用して使用することができるいくつかの好ましい第二薬剤を開示する。
【００９８】
ｉ．標的療法
いくつかの実施形態では、第二抗がん剤は標的治療薬であり、すなわち、受容体型チロシンキナーゼと関連するものなど、特定の分子標的または遺伝子標的に対する薬剤を含む。
【００９９】
ｉｉ．化学療法および放射線療法
本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用する用途に適した化学療法薬としては、がん細胞を殺しまたはがん細胞増殖を阻害する特性を有する薬剤が挙げられる。上記標的療法と比較して、化学療法は、非特異的に機能し、例えば、有糸分裂として知られる細胞分裂過程を阻害し、細胞外増殖シグナルをより選択的に遮断（すなわち、シグナル伝達遮断薬）する薬剤を概して排除する。これらの薬剤としては、微小管阻害薬（例えば、タキサン系薬剤およびビンカアルカロイド）、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗薬（例えば、ゲムシタビンのように作用するヌクレオシド類似体）、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、挿入剤、シグナル伝達経路を妨げることができる薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、およびプロテオソーム阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
アルキル化剤は、細胞の静止期において最も作用する。これらの種類の薬剤は、細胞周期非特異的である。本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用して使用することができる例示的アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼン類：ウラシルマスタード（アミノウラシルマスタード（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、 トリ
エチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓ
ｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスフォルアミン、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的アルキル化剤としては、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄとしても知られている、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭとしても知られている、Ｌ−サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても知られている、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても知られている、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても知られている、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣとしても知られている、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミ（ＨＭＭ）としても知られている、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌムスチン；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチンおよびメクロレタミン塩酸塩としても知られている、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても知られている、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；ならびにベンダムスチンＨＣｌ  （Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
抗腫瘍抗生物質は、土壌真菌ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種によって産生された天然産物から得られる化学薬剤である。これらの薬物は、細胞周期の複数の期中で作用し、細胞周期特異的であると考えられている。これに限定されないが、アントラサイクリン系薬剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、およびイダルビシン）、クロモマイシン系薬剤（例えば、ダクチノマイシンおよびプリカマイシン）、マイトマイシンおよびブレオマイシンを含む抗腫瘍抗生物質のいくつかの種類がある。
【０１０２】
代謝拮抗薬は、細胞周期特異的である化学療法治療のタイプである。細胞がこれらの代謝拮抗薬物質を細胞代謝中に取り込むと、細胞は分裂することができない。化学療法薬のこれらの分類としては、メトトレキサートなどの葉酸拮抗薬；５−フルオロウラシル、フロクスウリジン（Foxuridine）、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビンなどのピリミジン拮抗薬；６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンなどのプリン拮抗薬；クラドリビン、フルダラビン、ネララビンおよびペントスタチンなどのアデノシンデアミナーゼ阻害薬が挙げられる。
【０１０３】
本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用して使用することができる例示的アントラサイクリン系薬剤としては、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（Ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン，およびルビドマイシン塩酸
塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム製剤（ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム製剤、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン（Ｒａｖｉｄｏｍｙｃｉｎ）；およびデサセチルラビドマイシンが挙げられる。
【０１０４】
微小管阻害薬としては、ビンカアルカロイドおよびタキサン系薬剤がある。本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用して使用することができる例示的ビンカアルカロイドとしては、酒石酸ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチンとしても知られている、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標））；ならびにビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用して使用することができる例示的タキサン系薬剤としては、パクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられるが、これらに限定されない。パクリタキセル系薬剤の非限定的例としては、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ、Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより市販）、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル（ＤＨＡ−パクリタキセル、Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ、Ｐｒｏｔａｒｇａにより市販）、ポリグルタミン酸結合パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクス、ＣＴ−２１０３、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃにより市販されているＸＹＯＴＡＸ）、腫瘍活性プロドラッグ（ＴＡＰ）、ＡＮＧ１０５（パクリタキセル３分子と結合したＡｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎにより市販）、パクリタキセル−ＥＣ−１  （ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ−１と結合したパクリタキセル；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００７）８７：２２５−２３０参照）、ならびにグルコース結合パクリタキセル（例えば、２−グルコピラノシルコハク酸２’−パクリタキセルメチル、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００７）１７：６１７−６２０参照）が挙げられる。
【０１０５】
本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤と併用して使用することができる例示的プロテオソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ．ＲＴＭ．）；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（Ｓ）−４−メチル−Ｎ−−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）；イキサゾミブクエン酸エステル（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；およびＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（−２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、化学療法薬は、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、カルムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、マンノスルファン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、アルトレタミン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン
、イダルビシン、ＳＮ−３８、ＡＲＣ、ＮＰＣ、カンプトテシン（campothecin）、トポ
テカン、９−ニトロカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ルビフェン（rubifen
）、ギマテカン（gimatecan）、ジフロモテカン、ＢＮ８０９２７、ＤＸ−８９５Ｉｆ、
ＭＡＧ−ＣＰＴ、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、アッカチン（ａｃｃａｔｉｎ）ＩＩＩ、１０−デアセチルタキソール、７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール、セファロマンニン、１０−デアセチル−７−エピタキソール、７−エピタキソール、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルセファロマンニン、ゲムシタビン、イリノテカン、アルブミン結合パクリタキセル、オキサリプラチン、カペシタビン、シスプラチン、ドセタキセル、イリノテカンリポソーム製剤、およびエトポシド、ならびにこれらの組合せから成る群から選択される。
【０１０７】
特定の実施形態では、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または経験的な最適化に従った他の規制機関によって承認された投与量およびスケジュールにより導かれ得る投与量およびスケジュールで、化学療法薬を投与する。
【０１０８】
なお更なる実施形態では、２つ以上の化学療法薬を、同時に投与してもよく、治療期間全体または部分の間にいずれもの順番で逐次投与してもよい。２つの薬剤を、同じ投与レジメンに従って投与してもよく、異なる投与レジメンに従って投与してもよい。
【０１０９】
放射線療法は、正常な周辺組織を避けながら、患部組織への最大限の暴露を要する。放射性線源を含む針を腫瘍に埋め込む組織内治療は、重要な新規手法となった。この方法では、大線量の放射線を周囲の正常組織を避けながら局所的に送達することができる。手術中、正常構造部をビームから離して安全に動かしながらビームが腫瘍上に直接置かれる手術中放射線治療は、別の特殊放射線技術である。また、これは、周囲構造部への暴露を限定しながら腫瘍の有効な照射を達成する。照射の局所的制御に基づいた手法の明白な利点にもかかわらず、患者生存率はなお非常に低い。
【０１１０】
ｉｉｉ．他の治療
Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を含む本方法を、手術、放射線、および／またはホルモン療法などの他の治療手段と組み合わせることができる。ホルモン療法は、古典的内分泌性ホルモン由来の増殖促進シグナル、例えば、主として、乳がんのエストロゲンおよび前立腺がんのアンドロゲンを阻害することができる。
【０１１１】
５．医薬組成物
本明細書に開示されているＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は、上記炎症性疾患の治療のための医薬組成物または薬物の製造に有用である。本発明において使用するための医薬組成物または薬物を、１つ以上の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して標準的技術によって製剤化することができる。適切な医薬用担体は本明細書および、例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤ならびにその生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を、これに限定されないが、経口、局所、鼻内、直腸内、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、その他）、およびこれらの組合せを含むいずれかの適切な経路による投与用に製造することができる。いくつかの実施形態では、治療薬を、液体、例えば、水中に熔解する。
【０１１２】
経口投与のため、本明細書に開示されている医薬組成物または薬物は、例えば、従来の方法によって製剤化される錠剤またはカプセル剤の剤形にすることができる。（ａ）希釈剤または充填材、例えば、ラクトース、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース（例えば、エチルセルロース、結晶セルロース）、グリシン、ペクチ
ン、ポリアクリレートおよび／もしくはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（ｂ）潤滑剤、例えば、シリカ、無水コロイダルシリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム）、金属ステアリン酸塩、コロイド状二酸化ケイ素、硬化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび／もしくはポリエチレングリコール；錠剤用では、（ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、デンプンのり、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース；必要に応じて（ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプンナトリウム）、グリコール酸、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、もしくは発泡性混合物；（ｅ）湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムならびに／または（ｆ）吸収剤、直食料、香料および甘味料と共に有効成分を含む錠剤およびゼラチンカプセル剤が好ましい。いくつかの実施形態では、錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール６０００および二酸化チタンの混合物を含有する。錠剤は、当技術分野で公知の方法に従って被覆された薄膜または腸溶性のいずれかであってよい。
【０１１３】
経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の剤形であり得、または使用前に水もしくは他の適切な媒体で投与のための調製をするための乾燥製品として提供することもできる。かかる液体製剤を、薬剤的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または食用硬化脂；乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシア；非水性媒体、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画された植物油；および防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸と共に、従来方法によって製剤化することができる。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、光量、着色料、および／または甘味料を含有することもできる。必要に応じて、経口投与用製剤を適切に製剤化し、活性化合物を放出制御することができる。
【０１１４】
局所投与のため、本発明の組成物は、エマルジョン剤、ローション剤、ゲル剤、クリーム剤、ゼリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏剤、および経皮パッチ剤の剤形であり得る。吸入による送達のため、組成物を、乾燥粉末またはネブライザーによる液体として送達することができる。非経口投与のため、組成物は、滅菌注射液剤および滅菌パック粉末剤の剤形であり得る。好ましくは、注射液剤を、約４．５〜約７．５のＰＨで製剤化する。
【０１１５】
本発明の組成物を、凍結乾燥された剤形で提供することもできる。かかる組成物は、緩衝剤、例えば、投与前に調製するために重炭酸塩を含んでよく、例えば、水で投与のための調製をするための凍結乾燥組成物中に緩衝剤が含まれていてもよい。凍結乾燥組成物は、適切な血管収縮薬、例えば、エピネフリンをさらに含んでもよい。凍結乾燥組成物を、必要に応じて、投与のための調製がされた組成物を患者に直ぐに投与することができるように、投与のための調製用に緩衝剤と組み合わせてパッケージ化した注射器で提供することができる。
【０１１６】
圧調節送達カプセル剤（例えば、Ｔａｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，５０：１１１−１２２（１９９８）参照）、大腸標的送達システム、浸透圧調節薬剤送達システムおよび同様のものなどの制御された薬物送達システム内に化合物をカプセル化することができる。圧調節送達カプセル剤は、エチルセルロース膜を含むことができる。大腸標的送達システムは、酸性可溶物質、例えば、オイドラギットＥ（登録商標）をオーバーコートし、次いで、腸溶物質をオーバーコートした、ラクトースを含む錠剤コアを含むことができる。浸透圧調節薬剤送達システムは、硬質ゼラチンカプセル（例えば、カプセル浸透圧ポンプ；例えば、Ａｌｚｅｔ社、米国カリフォルニア州クパチーノから市販されている）でカプセル化された単一またはそれ以上の浸透圧ユニットであり得る
。典型的には、浸透圧ユニットは、その療法が半透膜により取り囲まれた浸透圧プッシュ層および薬物層を含む。
【０１１７】
６．投与量
医薬組成物または薬物を、本明細書に記載されているがんを治療するのに治療有効投与量で対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物または薬物を、対象において有効な治療応答を引き出すのに充分な量で対象に投与する。
【０１１８】
投与される用量は、これに限定されないが、対象の体重、年齢、個々の病態、治療しようとする表面積もしくは領域の体積、および／または投与形態を含むいくつかの因子に依存して変わるだろう。用量サイズは、特定の対象における特定の化合物の投与に伴う副作用の存在、性質、および程度によって決定されるだろう。好ましくは、所望の結果を得るのに要する最低用量および濃度を使用すべきである。投与量は、小児、高齢者、衰弱した患者および心疾患および／または肝疾患患者に対して適切に調節すべきである。さらにガイダンスを、投与量を評価するための実験動物モデルを使用する当技術分野で公知の試験から得ることができる。
【０１１９】
投与レジメンを調節して、最適な所望の応答、例えば、治療応答または最小の副作用を得る。Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害抗体の投与のため、投与量は、対象の体重に対して約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、通常、約０．００１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、より通常、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。好ましくは、投与量は、体重に対して、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。例えば、投与量は、体重に対して０．１、０．３、１、３、５または１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは体重に対して０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１２０】
投与スケジュールを、通常、Ａｂの典型的な薬物動態学的特性に基づいて持続的受容体占有（ＲＯ）をもたらす暴露を達成するように設計する。例示的治療形態は、毎週１回、隔週に１回、３週間毎に１回、４週間毎の１回、毎月１回、３ヶ月毎に１回または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。投与およびスケジュールは治療途中で変更してよい。例えば、投与スケジュールは：（ｉ）６週サイクルにおいて隔週に；（ｉｉ）４週間毎に６回の投与、次いで、３ヶ月毎；（ｉｉｉ）３週間毎；（ｉｖ）体重に対して３〜１０ｍｇ／ｋｇを１回、次いで、２〜３週間毎に体重に対して１ｍｇ／ｋｇ、Ａｂの投与を含んでよい。ＩｇＧ４  Ａｂは、通常、２〜３週間の半減期を有することを考慮して、本発明のＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤のための好ましい投与レジメンは、静脈内投与により、体重に対して０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは体重に対して３〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは体重に対して３ｍｇ／ｋｇを含み、Ａｂは無病生存状態になるかまたは増悪が確認されるまで、６週間または１２週間以下のサイクルにおいて１４日毎に与えられる。
【０１２１】
場合によっては、異なる結合特異性を有する２つ以上の抗体を同時に投与し、この場合、投与される各Ａｂの投与量は指定範囲内である。通常、抗体を何度も投与する。単一投与間の間隔は、例えば、毎週、隔週毎、３週間毎、毎月、３ヶ月毎または毎年であり得る。間隔は、患者の標的抗原に対するＡｂの血液レベルの測定によって示される通りに不規則であってもよい。いくつかの方法では、約１〜１０００ｍｇ／ｍｌの血漿Ａｂ濃度になるように、いくつかの方法では、約２５〜３００ｍｇ／ｍｌの血漿Ａｂ濃度になるように、投与量を調節する。
【０１２２】
場合によっては、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤が化合物であり、治療有効な毎日の用量で複数日の間投与してもよく、３日〜２週間以上の範囲の期間、治療を継続してもよい。継続的な毎日の用量は治療有効用量を達成するのに好ましい手段であるが、対象において薬剤の治療有効濃度を維持するのに充分な頻度で投与を反復する限り、たとえ薬剤を毎日
投与しなくとも、有益な治療効果を得ることができる。例えば、毎日、隔日に、または、より高い用量範囲を使用し、該対象による耐性がある場合、毎週２回、薬剤を投与することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、約５０〜７０ｋｇを個体に経口投与するための単位投与量は、約２０〜３００ｍｇの有効成分を含有してよいことを提供する。典型的には、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３の投与量は、所望の効果を得るのに充分な投与量である。最適投与スケジュールを、対象の体内の薬物蓄積の測定から算出することができる。概して、投与量を、毎日、毎週、または毎月１回以上与えてよい。当業者は、最適投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。
【０１２４】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、がん患者のＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる抗体を含む滅菌液剤であり、該液剤はある期間、例えば、１〜４時間の期間にわたって静脈内送達に適している１００ｍｌの液剤中に患者の体重のキログラム当たり１０μｇ〜１００ｍｇ、例えば、１０μｇ〜４０ｍｇ、１００μｇ〜４０ｍｇ、または１ｍｇ〜１０ｍｇの抗体を含む。滅菌液剤中の抗体は、抗Ｇａｌ３抗体または抗ＴＩＭ−３抗体であり得る。いくつかの実施形態では、滅菌液剤は、１つ以上の標的治療薬、例えば、上記１つ以上のチェックポイント阻害薬治療薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、滅菌液剤は、１０〜１００ｎｍ、例えば、４０〜１００ｎｍ、または５０〜８０ｎｍの径を有する１つ以上のナノ粒子をさらに含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を、１週間以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４週間以上投与する。さらに他の実施形態では、化合物を、１ヶ月以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月以上投与する。
【０１２６】
あるいは、徐放性製剤としてＡｂを投与することができ、この場合、余り頻繁に投与する必要がない。投与量および頻度は、患者のＡｂの半減期に依存して変わる。概して、ヒトＡｂは最長半減期を示し、次いで、ヒト化Ａｂ、キメラＡｂ、および非ヒトＡｂである。投与の投与量および頻度は、治療が予防かまたは治療であるかどうかに依って変わり得る。予防用途では、長期間にわたって比較的頻繁ではない間隔で、比較的低投与量を投与する。一部の患者は、その余生、治療を継続して受ける。治療用途では、病気の進行が減ずるかまたは止まるまで、好ましくは患者が病気の症状の部分寛解または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高投与量を必要とする。その後、患者は予防的形態で投与され得る。
【０１２７】
本発明の組成物の投与量をモニターし、症状の重症度、再発頻度、および／または治療レジメンに対する生理応答に応じて、治療全体にわたって調節することができる。当業者は、治療レジメンのかかる調節に通常従事する。
【０１２８】
非限定的例示的実施形態
本発明を、次の非限定的例示的実施形態によって例証する。
１．患者におけるＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、前記患者に投与することを含む、前記患者の免疫応答の活性化方法であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与する、方法。
２．前記ＴＩＭ−３は前記患者の免疫細胞上で発現される、実施形態１に記載の方法。
３．前記患者はがんの宿主であり、前記Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用は腫瘍微小環境中で起こり、前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を前記患者の前記がん量を低減するのに充分な量で投与する、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記がんは腫瘍微小環境中の細胞を含み、前記細胞はその表面上でＧａｌ３を過剰発現する、実施形態３に記載の方法。
５．腫瘍微小環境中の細胞を含むがんの宿主である患者における免疫応答の活性化方法であって、前記細胞はその表面上でＧａｌ３を過剰発現し、前記方法は前記腫瘍微小環境中の前記免疫細胞上の前記Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を前記患者に投与することを含み、前記阻害剤を前記免疫応答の活性化によって前記患者の前記がん量を低減するのに充分な量で投与する、方法。
６．免疫細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞である、実施形態２または５に記載の方法。
７．前記がんは、転移がんまたは原発がんである、実施形態３〜５のいずれか１つに記載の方法。
８．前記阻害剤は、ＴＩＭ−３と結合する、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記阻害剤は、Ｇａｌ３と結合する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤は抗体である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記抗体は、配列番号５〜８から成る群から選択される配列を含むペプチドを認識する、実施形態５に記載の方法。
１２．前記抗体は、一本鎖抗体またはＦａｂである、実施形態５に記載の方法。
１３．前記抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態５に記載の方法。
１４．前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の前記投与は、点滴静注による、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、１つ以上の他の治療と併用して投与する、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記１つ以上の他の治療は、化学療法、放射線療法、チェックポイント阻害剤療法から成る群から選択される、実施形態１５に記載の方法。
１７．前記チェックポイント阻害剤療法は、抗ＰＤ−１療法および抗ＣＴＬＡ４療法から成る群から選択される、実施形態１５または１６に記載の方法。
１８．前記阻害剤の前記投与を、隔週に１００μｇ／体重ｋｇ〜４０ｍｇ／体重ｋｇの投与量で投与する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．患者のがんがＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適しているかどうかの決定方法であって、前記方法は：
患者由来の公知の型の腫瘍微小環境から得られた細胞を、Ｇａｌ３に対して特異的な抗体と組み合わせること；
前記細胞上のＧａｌ３レベルを決定すること；
前記細胞表面上の前記Ｇａｌ３レベルを、Ｇａｌ３の第一活性閾値と比較すること；及び
前記細胞表面上の前記Ｇａｌ３レベルが前記第一活性閾値より高い場合に、前記患者のがんは、Ｇａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を用いた治療に適していると判定すること、
を含む、方法。
２０．Ｇａｌ３の前記第一活性閾値は、前記患者と同型のがんに罹患している少なくとも１００試験個体のコホートから誘導される、実施形態１９に記載の方法。
２１．前記患者のがんが治療ステップに適していると判定することは、腫瘍微小環境から得られる細胞表面上のＧａｌ３レベルがＧａｌ３の第二活性閾値と比較して２５％以上であるかどうかの判定をさらに含み、前記第二活性閾値は健常な患者由来の対応する細胞を含むサンプルから誘導される、実施形態２０に記載の方法。
２２．前記腫瘍微小環境から得られる前記細胞は、少なくともがん細胞および／または腫瘍関連マクロファージを含む、実施形態１９〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記患者のがんが治療ステップに適していると判定することは、前記腫瘍微小環
境から得られる細胞表面上のＧａｌ３レベルが前記第二活性閾値と比較して７５％以上であるかどうかの判定をさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
２４．がん患者のＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる滅菌液剤であって、前記溶液は１〜４時間にわたる静脈内送達に適した１００ｍｌの溶液中の患者体重キログラム当たり１０μｇ〜１００ｍｇの抗体を含み、前記抗体はＴ細胞上のＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる、滅菌液剤。
２５．前記滅菌液剤は、１つ以上の他のチェックポイント阻害抗体をさらに含む、実施形態２３に記載の滅菌液剤。
２６．１つ以上の他のチェックポイント阻害抗体は、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体から成る群から選択される、実施形態２３に記載の滅菌液剤。
２７．前記滅菌液剤は、１０〜１００ｎｍ径のナノ粒子をさらに含む、実施形態２３〜２５のいずれか１つに記載の滅菌液剤。
２８．前記抗体は、抗Ｇａｌ３抗体である、実施形態２３に記載の滅菌液剤。
２９．前記抗体は、抗ＴＩＭ−３抗体である、実施形態２３に記載の滅菌液剤。
３０．Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げることができる抗Ｇａｌ３抗体の製造方法であって、前記方法は：配列番号５〜８から成る群から選択される配列を含むペプチドを動物に導入することを含み、前記動物はＧａｌ３抗体を産生する、方法。
３１．ヒト化またはキメラ抗Ｇａｌ３抗体であって、前記抗体は、
（１）相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３を含む軽鎖可変領域ならびに（２）ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３を含む重鎖可変領域を含み、
前記ＣＤＲ  Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｌ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｌ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｈ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ  Ｈ２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、および
前記ＣＤＲ  Ｈ３は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、
ヒト化またはキメラ抗Ｇａｌ３抗体。
３２．前記重鎖可変領域は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する、実施形態３１に記載のヒト化またはキメラ抗Ｇａｌ３抗体。
３３．前記軽鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する、実施形態３１または３２に記載のヒト化またはキメラ抗Ｇａｌ３抗体。
３４．Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断し、患者の免疫応答の活性化および／またはがん治療をすることができる化合物の選択方法であって、前記方法は：
（ａ）化合物のライブラリーを、Ｇａｌ３およびＴＩＭ−３と接触させること、ならびに
（ｂ）前記Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断することができる前記ライブラリーから１つ以上の候補化合物を選択すること、
を含む、方法。
３５．（ｃ）前記工程（ｂ）から選択された１つ以上の候補化合物を、Ｔ細胞を含む混合物、および同種抗原提示細胞と接触させて、Ｔ細胞を刺激することができる１つ以上の化合物を特定すること、ならびに／または
（ｄ）腫瘍の宿主である哺乳類に、前記（ｂ）から選択された１つ以上の候補化合物を投与し、前記哺乳類の腫瘍量を低減することができる１つ以上の化合物を特定すること、ならびに必要に応じて、
（ｅ）前記Ｔ細胞を刺激することができ、および／または前記哺乳類の腫瘍量を減らすことができる化合物の有効量を前記患者に投与し、それにより、前記患者の免疫応答を活性化および／またはがんを治療すること、
をさらに含む、実施形態３４に記載の方法。
３６．前記化合物は、抗体である、実施形態３５に記載の方法。
３７．Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を妨げるＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤を、患者に投与することを含む、前記患者の免疫応答の活性化方法であって、前記阻害剤を、免疫応答を活性化するのに充分な量で投与し、前記阻害剤は実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載のヒト化抗体を含む、方法。
３８．抗体を患者に投与することを含む前記患者の免疫応答の活性化方法であって、前記抗体はＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を阻害するための手段を含む、方法。
３９．前記抗体は、Ｇａｌ３またはＴＩＭ−３と結合するための手段をさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
【実施例】
【０１２９】
本発明を次の実施例を例証によって提供される参照することにより説明するが、いかなる方法によっても本発明を限定するものではないものとする。特に断りがない限り、当技術分野において周知の標準的技術または以下に詳述された技術を使用した。
【０１３０】
実施例１．Ｇａｌ３過剰発現細胞株の作製
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス）から得られたＡ２０、マウスＢリンパ腫細胞株を、ＦｌａｇタグヒトＧａｌ３タンパク質またはＦｌａｇタグヒトＰＤＬ１タンパク質をコードする核酸構築物でトランスフェクトした。加えて、構築物は、抗生物質耐性マーカーを含む。形質転換された細胞を抗生物質耐性に基づいて選択し、ＦｌａｇタグヒトＧａｌ３タンパク質を安定して発現するＡ２０細胞（Ａ２０
Ｇａｌ３細胞）またはＦｌａｇタグヒトＰＤＬ１タンパク質を安定して発現するＡ２０細胞（Ａ２０  ｈＰＤＬ１細胞）を作製した。
【０１３１】
実施例２．Ｇａｌ３はＴＩＭ−３と特異的に結合する
本実施例は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用の評価を行った様々なアッセイを説明する。
【０１３２】
結合アッセイ−共免疫沈降
ＴＩＭ−３がＧａｌ３と特異的に相互作用するかどうかを試験するために、共免疫沈降実験を行った。２９３Ｔ細胞を、ＨＡタグＴＩＭ−３をコードするプラスミドおよびＦｌａｇタグＧａｌ３、ＦｌａｇタグＧａｌ９、またはＦｌａｇタグＣＥＡＣＡＭ１をコードするプラスミドでコトランスフェクトした。製造者プロトコールに従って、リポフェクタミン３０００（米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクトした細胞を一夜増殖させてから、洗浄し、１ｍｌ溶解バッファー中に溶解した。溶解細胞を遠心分離し、上澄み（ライセート）を回収した。ライセートを調製し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、それぞれ、抗ＨＡ（図１Ａ）および抗Ｆｌａｇ抗体（図１Ｂ）でプローブした。抗Ｆｌａｇおよび抗ＨＡ抗体の両方ともＳｉｇｍａ社から購入した。図１Ａおよび１Ｂの矢印は、様々なタンパク質の存在を示す。
【０１３３】
免疫沈降のため、抗Ｆｌａｇアガロースビーズ（Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）を上記で得られた上澄み（ライセート）に添加した。ビーズおよびライセートを４℃で一夜回転させながらインキュベートして、Ｆｌａｇタグタンパク質を結合させた。それから、ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、１×ＳＤＳ  ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、沸騰し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを抗ＨＡ抗体でプローブされた膜に移動した（図１Ｃ）。図１Ａ〜１Ｃでは、レーン１〜３は、それぞれ、ＨＡタグＴＩＭ−３をコードするプラスミドおよびＦｌａｇタグＧａｌ３をコードするプラスミドでコトランスフェクトされた細胞；ＨＡタグＴＩＭ−３をコードするプラスミドおよびＦｌａｇタグＧａｌ９をコードするプラスミドでコトランスフェクトされた細胞、またはＨＡタグＴＩＭ−３をコードするプラスミドおよびＦｌａｇタグＣ
ＥＡＣＡＭ１をコードするプラスミドでコトランスフェクトされた細胞から得られたライセートからの結果を示す。
【０１３４】
図１に示されているように、結果は、ヒトＧａｌ３はヒトＴＩＭ−３を特異的にプルダウンしたが、ヒトＣＥＡＣＡＭ１はＨＡタグヒトＴＩＭ−３をプルダウンすることができなかったことを示す。ヒトＧａｌ９もヒトＴＩＭ−３をプルダウンした（図１Ｃのレーン２）と思われたが、これは、Ｇａｌ９タンパク質アグリゲーションのせいで非特異的であると思われた−Ｇａｌ９の分子量は４０ｋＤであるその実際の大きさよりずっと大きいと思われる。Ｇａｌ９およびＴＩＭ−３間の相互作用が本来非特異的であるという結論は、下図５Ｂに示されている証拠によっても支持される。
【０１３５】
Ｇａｌ３がＴＩＭ−３と特異的に相互作用するかどうかを試験するために、更なる共免疫沈降実験を行った。ＦｌａｇヒトＧａｌ３プラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ社、米国メリーランド州ロックビル）を、８０％コンフルエントな２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上記リポフェクタミン３０００を使用して、１０ｃｍプレート中でトランスフェクションを行った。一夜のトランスフェクション後、ヒトＦｃ、ヒトＰＤ１−Ｆｃ、またはヒトＴＩＭ−３Ｆｃで被覆された１０ｃｍプレート上で、３時間、細胞を置換した。細胞を、１×ＰＢＳ中で１回洗浄し、それから、１ｍｌ溶解バッファー中に溶解した。細胞ライセートを回収し、遠心分離した。タンパク質Ｇビーズを、遠心分離後に生成した上澄みに添加し、４℃で４時間回転させながらインキュベートした。それから、ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、次いで、１×ＳＤＳ  ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。ビーズを含むサンプルを沸騰し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、膜上に移動した。それから、膜を、抗Ｆｌａｇ抗体でプローブした。図２に示されているように、ヒトＴＩＭ−３は、ＦｌａｇタグＧａｌ３を特異的にプルダウンした。対照的に、ヒトＦｃもヒトＰＤ１  ＦｃもＴＩＭ−３をプルダウンすることができなかった。これは、Ｇａｌ３がＰＤ１  Ｆｃと結合せず、Ｇａｌ３およびＴＩＭ−３間の結合は特異的であることを示している。
【０１３６】
結合アッセイ−細胞接着アッセイ
次に、細胞接着アッセイを行い、Ｇａｌ３およびＴＩＭ−３間の結合を確認した。この実験では、９６ウェルプレートを４℃一夜でヒトＦｃ、ヒトＰＤ１−Ｆｃ、ヒトＶＩＳＴＡ−Ｆｃ、ヒトＴＩＭ−３−Ｆｃで被覆し、それから、３７℃で２時間ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで遮断した。Ａ２０、ヒトＧａｌ３を過剰発現するＡ２０細胞（Ａ２０  Ｇａｌ３）、またはヒトＰＤＬ１を過剰発現するＡ２０細胞（Ａ２０  ＰＤＬ１）を上記様々なＦｃタンパク質で被覆されたウェル中に播種した。それから、プレートを７２０ｒｐｍで遠心分離してから、止めた。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、それから、ＰＢＳ中に浸した。プレートをゆっくりと１８０度ひっくり返し、３０分間ひっくり返した位置で保持した。プレートを反転から戻した後、ＰＢＳから取り出し、各ウェルから２００μｌの溶液を取り出して捨て、約１００μｌの残った溶液を９６ウェルプレート中に移動した。細胞をフローサイトメトリー分析によってカウントした。
【０１３７】
結果は、ヒトＴＩＭ−３  Ｆｃ被覆プレートに接着したヒトＧａｌ３を発現するＡ２０細胞（Ａ２０  Ｇａｌ３）数は、ヒトＶＩＳＴＡ  ＦｃまたはヒトＰＤ１  Ｆｃで被覆されたプレートに接着した細胞数より有意に大きかったことを示している。予想通りに、ＰＤＬ１はＰＤ１の公知のリガンドであるので、ｈＰＤ１  Ｆｃと接着すると分かっているＡ２０  ＰＤＬ１細胞の数は、ヒトＶＩＳＴＡ  ＦｃまたはヒトＴＩＭ−３  Ｆｃで被覆されたプレートに接着した数より有意に大きかった。これらの結果は、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用が特異的であることをさらに確認した。
【０１３８】
遮断アッセイ−フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析を行い、Ａ２０細胞を使用してＴＩＭ−３およびＧａｌ３間
の結合を評価した。Ａ２０  Ｇａｌ３細胞を、氷上２０分間、マウスＴＩＭ−３  Ｆｃを含むかまたは含まない１０％ＦＢＳ  ＨＢＳＳ溶液と共にインキュベートした。５つの実験群があった：群１では、Ａ２０  Ｇａｌ３細胞をコントロールとしてｍＴＩＭ−３  Ｆｃタンパク質なしでインキュベートし；群２では、Ａ２０  Ｇａｌ３細胞をｍＴＩＭ−３
Ｆｃタンパク質と共にインキュベートし；群３、４、５では、ｍＴＩＭ−３  Ｆｃタンパク質に加えて、抗マウスＴＩＭ−３ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社、米国ミネソタ州ミネアポリス）（群３）、モノクローナル抗体ＲＭＴ３−２３（Ｂｉｏ  Ｘ
ｃｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）（群４）、モノクローナル抗体２１５０１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）（群５）も加えてこれらの抗体がＧａｌ３およびＴｉｍ３結合を遮断することができるかどうかを試験した。遮断のため、細胞を指定された抗体を含む１０％ＦＢＳ  ＨＢＳＳと共にインキュベートし、それから、２０分間、ｍＴＩＭ−３  Ｆｃを含む１０％ＦＢＳ  ＨＢＳＳと共に添加した。サンプルを遠心分離し、２０分間、ＡＰＣ結合抗ｈＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）を含む１０％ＦＢＳ  ＨＢＳＳにペレットを添加した。遠心した後、生／死細胞をバイオレット死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で染色した。染色細胞をフロー分析に付した。
【０１３９】
図４は、ｍＴＩＭ−３が死細胞および生細胞上のＧａｌ３タンパク質と結合することができ、Ｇａｌ３および死細胞はＴＩＭ−３上の異なるエピトープと結合することを示している。このアッセイでは、ＴＩＭ−３  Ｆｃは死細胞（図４Ｃ、２列目）および生細胞上で発現されたＧａｌ３（図４Ｂ、２列目）の両方と結合する。しかしながら、ｍＴＩＭ−３モノクローナル抗体ＲＭＴ３−２３は、ＴＩＭ−３の死細胞との結合を遮断した（図４Ｃ、４列目）が、生細胞上で発現されたＧａｌ３との結合を遮断しなかった（図４Ｂ、４列目）。これは、Ｇａｌ３および死細胞はＴＩＭ−３上の異なるエピトープと結合することを示している。コントロールとして、ｍＴＩＭ−３ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体２１５０１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社、米国ミネソタ州ミネアポリス）も、それぞれ、Ｔｉｍ３のＧａｌ３（図４Ｂ、３および５列目）または死細胞（図４Ｃ、３および５列目））に対する効果を有していない。
【０１４０】
遮断アッセイ−ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡも行い、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を試験した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をＰＢＳ中のマウスＧａｌ３タンパク質（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）またはＰＢＳ中のヒトＧａｌ９タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）またはエタノール中のホスファチジルセリン（ＰＳ）（Ｓｉｇｍａ社）で被覆し、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、それから、室温で１時間２％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファーで遮断した。図５Ａでは、種々の抗Ｇａｌ３抗体、すなわち、ｍＧａｌ３ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）、ｍＡｂ  ＩＭＴ００１、ｍＡｂ  Ｍ３／３８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（図５Ａ）を、Ｇａｌ３で被覆されたウェルに添加した。それから、抗体を１０分間インキュベートしてから、ＴＩＭ−３  Ｆｃをプレートに添加し、更に１時間インキュベートした。それから、プレートを３回洗浄し、次いで、室温で１時間、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）と共にインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＴＭＢ基質（ＧｅｎｅＴｅｘ社、米国カリフォルニア州アーバイン）で発色し、反応を１Ｎ
ＨＣｌで停止した。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍにおいて読み取った。結果を、二重反復試験の平均ＯＤ±ＳＤとして表した。図５Ａでは、結果は、試験された全抗体の中で、マウスＧａｌ３ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ＩＭＴ００１がＧａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用を遮断したことを示した（図５Ａ）。
【０１４１】
図５Ｂでは、ＰＢＳ中のマウスＧａｌ３タンパク質（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）（群１お
よび２）またはエタノール中のＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス）（群３および４）をプレート上に被覆し、４℃で一夜インキュベートした。抗ｍＴＩＭ−３マウス抗体、ｍＡｂ  ＲＭＴ３−２３（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）を、群２および４の被覆プレートのみに添加した。二次抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体および基質を上記のように添加し、ｍＴＩＭ−３のｍＧａｌ３またはＰＳとの結合を検出した。結果は、群３と比較して群４におけるシグナルの著しい低下を示し、ＲＭＴ３−２３はＰＳがＴＩＭ−３と結合するのを遮断したことを示し；一方、結果は、群１と比較して群２における有意な低下は示されず、ＲＭＴ３−２３はＧａｌ３がＴＩＭ−３と結合するのを遮断しなかったことを示す。ＴＩＭ−３は死細胞表面上で外面化され暴露されたそのＰＳとの相互作用により死細胞と結合するので、これらの実験は、図４Ａ〜４Ｃにおいて、Ｇａｌ３およびＰＳがＴＩＭ−３の異なるエピトープと結合するという観察を実証した。
【０１４２】
糖依存アッセイのため、ＥＬＩＳＡプレートを、ｍＧａｌ３（群１および２）、またはｈＧａｌ９（群３および４）のいずれかで被覆した。マウスＴＩＭ−３  Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、室温で１時間、２５ｍＭのα−ラクトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む（群２および４）または含まない（群１および３）被覆ＥＬＩＳＡプレートに添加した。二次抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体および基質を上記のように添加し、ｍＴＩＭ−３−ＦｃのｍＧａｌ３またはｈＧａｌ９との結合を検出した。図５Ｃは、群３（ラクトースなし）と比較して、群４（ラクトースあり）におけるシグナルの著しい１０倍超の低下で示されるように、ラクトースはＧａｌ９のＴＩＭ−３との結合を遮断したことを示し、Ｇａｌ９およびＴＩＭ−３間の糖依存性結合であることを示す。対照的に、Ｇａｌ３のＴＩＭ−３との結合に対するラクトースの遮断効果は最小であるが−群２（ラクトースあり）および群１（ラクトースなし）間のＴＩＭ−３とＧａｌ３との結合から生じるシグナルの有意な差はなかった。これは、Ｇａｌ３とＴＩＭ−３との相互作用が糖の存在によって影響を受けなかった、すなわち、相互作用は糖非依存性であったことを示す。
【０１４３】
実施例３．過剰発現Ｇａｌ３はＴ細胞活性化を抑制する
この実施例は、Ａ２０細胞内のＧａｌ３の過剰発現の機能特性を評価するために行われた実験を説明する。
【０１４４】
ｈＧａｌ３を安定して過剰発現するＡ２０クローン、＃４１、＃３１、および＃１５を、上記のように作製した。図６Ａは、これらのクローンにおけるｈＧａｌ３発現レベルを示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。Ａ２０の細胞またはＡ２０  Ｇａｌ３クローンをマウスＤＯ１１．１０  Ｔ細胞と混合した。混合物をフラット型の９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、それから、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）をプレートに添加した。一夜インキュベーション後、上澄みを、ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によってＴ細胞のＩＬ−２産生を測定するために使用した。図６Ｂに示されているように、マウスＤＯ１１．１０  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生は、Ｔ細胞を親Ａ２０細胞と混合した場合と比較して、３つのマウスＡ２０細胞クローンのいずれかと混合した場合に有意に減少した（図６Ｂ）。
【０１４５】
実施例４．抗Ｇａｌ３抗体はマウス肺転移モデルにおいて抗腫瘍作用を示す
インビボでのＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の抗腫瘍効率を評価するために、この実施例における実験を行った。分子医学研究所動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って、動物実験を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、到着次第、実験動物管理公認協会公認の施設に入れた。３６匹の７週齢雌マウスを無作為に３つの群（ｎ＝１２）に割り当てた。０日目、Ｂ１６Ｆ１０細胞（０．１ｍＬのＰＢＳ中、２×１０５）を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した後、２７ゲージ針の注射器を使用してマウスの尾静脈内に注射した。
Ｂ１６Ｆ１０細胞の注射後、動物に、０、３、７および１０日目に１０ｍｇ／ＫｇのマウスＩｇＧ２ｂ（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を腹腔内投与し、０、３および７日目にｍＰＤ１抗体（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）または０、３、７、１０および１５日目にＧａｌ３抗体ＩＭＴ００１を腹腔内投与した。この実験で使用されたＧａｌ３抗体クローンＩＭＴ００１は、Ｇａｌ３上のエピトープ（配列番号５）を認識する。２１日目、動物を人道的に犠牲にし、肺組織を取り出し、１０％緩衝ホルムアルデヒド溶液中に固定した。肺の左葉の１つの表面上の黒色転移コロニー数をカウントした（図７Ｂ）。結果は、平均±ＳＥＭとして表した。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用してＩｇＧコントロール群と比較して統計解析を行った。
【０１４６】
図７Ａは、抗ｍＧＡＬ３抗体で染色されたＢ１６Ｆ１０細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、アイソタイプコントロール抗体で染色された細胞の平均蛍光強度よりほとんど１０倍高いことを示す。詳細には、Ｂ１６Ｆ１０細胞を、氷上で２０分間、コントロールラットＩｇＧ  ＰＥまたはラット抗マウスＧａｌ３  ＰＥ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を含有する１０％ＦＢＳ
ＨＢＳＳ溶液と共にインキュベートした。遠心した後、生／死細胞をバイオレット死細胞染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で染色した。染色細胞をフロー分析に付した。図７Ｂは、３処置群由来の肺全体の代表的画像を示す。図７Ｃは、左肺葉表面上の多数の転移コロニーを示す（平均値±ＳＥＭ）。図７Ｄおよび図７Ｅは、種々の処置群の肺重量および体重を示す（平均値±ＳＥＭ）。アイソタイプコントロール群と比較して、Ｇａｌ３抗体処置群は、黒色転移コロニー数によって示される腫瘍数の有意な（約４６％）減少（ｐ＜０．０１）を示した。しかしながら、アイソタイプコントロール群と比較して、抗マウスＰＤ１抗体２９Ｆは、この肺転移モデルにおいて有意な抗腫瘍作用を示さなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１４７】
実施例５．抗Ｇａｌ３抗体は４Ｔ１同所腫瘍性肺転移モデルにおいて抗腫瘍作用を示す
分子医学研究所動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った動物実験。７週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、到着次第、実験動物管理公認協会公認の施設に入れた。腫瘍移植の日に、４Ｔ１細胞を集め、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。吸入麻酔薬（医療用グレードの空気中３〜５％イソフルラン）によってマウスを麻酔した。０．１ｍＬ  ＰＢＳ中の２×１０５細胞を、２５ゲージ針の注射器により乳腺中に皮下注射した。マウスを無作為に２つの群（ｎ＝１０）に割り当てた。４Ｔ１細胞の注射後、マウスに、０、３および７日目に１０ｍｇ／ＫｇのマウスＩｇＧ２ｂ（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）または０、３、７、１０および１４日目にＧａｌ３抗体ＩＭＴ００１を腹腔内投与した。腫瘍体積および体重を毎週２回モニターした。３０日目、マウスを人道的に犠牲にし、肺組織を３０％ショ糖で膨張させ、取り出して、ボーインズ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中に固定した。肺の左葉の１つの表面上の転移コロニー数をカウントした。結果は、平均±ＳＥＭとして表した。対応のないｔ検定を使用してＩｇＧコントロール群と比較して統計解析を行った。
【０１４８】
図８Ａは、処置群由来の肺全体の代表的画像を示す。図８Ｂは、異なる処置群の体重を示す（平均±ＳＥＭ）。図８Ｃは、左肺葉の１つの表面上の多数の転移コロニーを示す（平均値±ＳＥＭ）。アイソタイプコントロール抗体で処置されたマウスと比較して、モノクローナル抗ヒトＧａｌ３抗体で処置された動物は、肺転移数の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１４９】
実施例６．抗Ｇａｌ３抗体は原発性マウスＲＥＮＣＡ腎腫瘍モデルにおいて抗腫瘍作用を示す
原発性腫瘍モデルにおいてＧａｌ３：ＴＩＭ−３阻害剤の抗腫瘍効率を評価するために
実験を行った（図９）。分子医学研究所動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って、動物実験を行った。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、到着次第、実験動物管理公認協会公認の施設に入れた。７週齢雌マウスを無作為に３つの群（ｎ＝１５）に割り当てた。腫瘍移植の日に、吸入麻酔薬（医療用グレードの空気中３〜５％イソフルラン）によってマウスを麻酔し、Ｒｅｎｃａ細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した後、２５ゲージ針の注射器を使用して０．１ｍＬのＰＢＳ中の２×１０５細胞を皮下注射した。Ｒｅｎｃａ細胞の注射後、マウスに、０、３および７日目に１０ｍｇ／ＫｇのマウスＩｇＧ２ｂ（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）または０、３および７日目にｍＰＤ１抗体（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）または０、３、７、１０および１４日目にＧａｌ３抗体ＩＭＴ００１抗体を腹腔内投与した。コントロール群における腫瘍体積が２０００〜２５００ｍｍ３に達した場合、動物を人道的に犠牲にした。結果は、平均±ＳＥＭとして表した。対応のないｔ検定を使用してＩｇＧ２ｂコントロール群と比較して統計解析を行った。
【０１５０】
結果は、腎がんモデルにおけるＧａｌ３抗体（ＩＭＴ００１）の抗腫瘍作用を示す。アイソタイプコントロール群と比較して、抗Ｇａｌ３抗体処置群は、腫瘍増殖の有意な（約３５％）減少（ｐ＜０．０５）を示したが、抗ＰＤ−１抗体は効果を有しなかった（図９）。
【０１５１】
実施例７．抗Ｇａｌ３抗体は原発性マウスＭＣ３８大腸がんモデルにおいて抗腫瘍作用を示す
分子医学研究所動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った動物実験。７週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、到着次第、実験動物管理公認協会公認の施設に入れた。腫瘍移植の日に、ＭＣ３８マウス大腸腺がん細胞を集め、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。吸入麻酔薬（医療用グレードの空気中３〜５％イソフルラン）によってマウスを麻酔した。０．１ｍＬのＰＢＳ中の５×１０５細胞を、２５ゲージ針の注射器によりマウスの右側に皮下注射した。７日目、腫瘍体積を測定し、マウスを無作為に２つの群（ｎ＝８）に割り当てた。マウスに、７、１０、１４、１７および２２日目に、１０ｍｇ／ＫｇのマウスＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）またはＧａｌ３抗体ＩＭＴ００１を腹腔内投与した。腫瘍体積および体重を毎週２回モニターした。腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達した場合、動物を人道的に犠牲にした。結果は、平均±ＳＥＭとして表した。対応のないｔ検定を使用してＩｇＧコントロール群と比較して統計解析を行った。
【０１５２】
図１０の結果は、ＩＭＴ００１抗体は、ＭＣ３８大腸がんモデルにおいて抗腫瘍作用を有することを示す。アイソタイプコントロール抗体で処置されたマウスと比較して、ＩＭＴ００１抗体処置マウスは、２４日目に腫瘍負荷の有意な減少（約３３％）を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１５３】
実施例８．Ｇａｌ３抗体クローンＩＭＴ００１のエピトープ結合
１０アミノ酸により重複し、全ヒトＧａｌ３タンパク質配列を包含する２４の２０アミノ酸ペプチドを含むペプチドアレイを合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）（図１１Ａ）。各ペプチド２０μｇを、膜上にドットブロットした。ＰＢＳ中の５％ミルクで遮断後、４℃で一夜、膜を、１μｇ／ｍｌのＩＭＴ００１抗体と共にインキュベートした。３回の洗浄後、膜を、１時間、１：８０００希釈抗ｍＩｇＧ  ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、  米国アラバマ州バーミンガム）と共にインキュベートした。３回の洗浄後、膜を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬブロッティング基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）と共にインキュベートし、反応させた（図１１Ｂ）。ペプチド５および６は良好なシグナルを示し、ＩＭＴ００１が結合するｈＧａｌ３上のエピトープはＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰ（配列番号７）であることを示した。
【０１５４】
上記ペプチド上のＩＭＴ００１の結合エピトープをさらに明らかにするために、これから誘導された８つのより短鎖のペプチドを合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）（図１１Ｃ）、ＩＭＴ００１によるこれらの結合をＥＬＩＳＡによって決定した（図１１Ｄ）。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をＰＢＳバッファー中のこれらのペプチドで被覆し、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、それから、室温で１時間２％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴバッファーで遮断した。１０μｇ／ｍＬのＩＭＴ００１を、室温で１時間、被覆ＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。プレートを３回洗浄し、次いで、室温で１時間、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰの１：８０００希釈液でインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄後、１００μＬのＴＭＢ基質（ＧｅｎｅＴｅｘ社）で発色し、５０μＬの１Ｎ  ＨＣｌにより停止した。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍにおいて読み取った。結果を、二重反復試験の平均ＯＤ±ＳＤとして表した。Ｐｅｐ−２は良好なシグナルを示し、ヒトＧａｌ３上のＩＭＴ００１の結合エピトープはＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧ（配列番号８）であることを示した。
【０１５５】
実施例９．Ｂ１６Ｆ１０肺転移マウス腫瘍における免疫プロファイリング
マウスに、百万個のＢ１６Ｆ１０細胞を静脈内に移植した。それから、マウスを、０、１、３および７日目にＩＭＴ００１またはアイソタイプコントロール（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で処置し、８日目に肺免疫細胞を単離するために犠牲にして、表現型を決定した。肺から細胞を単離し、それから、リンパ球マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＤＸ５に対する蛍光標識抗体で染色して、フローサイトメトリーによって分析した。図１２の結果は、アイソタイプコントロール抗体処置と比較して、抗Ｇａｌ３抗体ＩＭＴ００１処置は、腫瘍の宿主である肺におけるＣＤ３  Ｔリンパ球、ＣＤ４  Ｔヘルパー、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ１９  Ｂ細胞およびＤＸ５ナチュラルキラー細胞を含む様々な免疫エフェクター細胞数を増加させたことを示す。これは、抗Ｇａｌ３抗体は免疫細胞を活性化することができたことを示す。
【０１５６】
実施例１０．ヒト肺がん関連マクロファージ上で検出されたＧａｌ３発現
ヒト肺がんにおけるＧａｌ３発現を検出するために免疫組織化学（ＩＨＣ）実験を行った。ヒト肺がんの凍結組織スライド（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｉｎｃ．）を、室温で１０分間、１０％中性緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中に固定し、ＰＢＳ中で５分間２回洗浄した。内在過酸化酵素を、室温で１０分間、３％Ｈ２Ｏ２中にスライドを浸すことによって遮断した。ＰＢＳ中で５分間２回洗浄後、スライドを、室温で１５分間、ストレプトアビジン試薬（Ｍｏｌｅｃｕｋａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）中でインキュベートし、次いで、ＰＢＳで徹底的に洗浄し、１５分間ビオチン試薬（Ｍｏｌｅｃｕｋａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）中でインキュベートし、ＰＢＳ中で更に洗い流して、内在ビオチンバックグラウンドを遮断した。スライドを１０％ＦＢＳ、２００μｇ／ｍＬのｍＩｇＧおよび２００μｇ／ｍＬのｈＩｇＧで１時間遮断し、４℃で一夜、一次抗体ＩＭＴ００１−ビオチン（５μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、３回洗浄してから、１時間１：１００で二次抗体ＨＲＰアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）と共にインキュベートし、３回洗浄した。ＤＡＢ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共にインキュベートすることによって染色を行い、蒸留水中にスライドを浸すことにより停止した。そして、ヒト肺がんスライドをヘマトキシリンＱＳ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中で対比染色し、蒸留水中で洗浄し、段階的の濃度を変えた一連のエタノールおよびキシレン溶液中で脱水し、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（商標）封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で封入した。
【０１５７】
図１３の結果は、これらのヒト肺がんスライド（扁平上皮がんおよび腺がん）におけるキャノピー形状腫瘍関連マクロファージは、ＩＭＴ００１によるこれらの陽性染色によって証明されたように、Ｇａｌ３を発現することを示す。
【０１５８】
実施例１１．ヒトＭ２マクロファージ上のＧａｌ３発現
まずヒトＣＤ１４単球を、ＣＤ１４細胞ポジティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、米国カリフォルニア州オーバーン）を使用して末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、それぞれ、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、米国ニュージャージー州）の存在下、樹状細胞（ＤＣ）、またはＭ１マクロファージ、またはＭ２マクロファージに分化した。それから、ヒト樹状細胞（ＤＣ）、Ｍ１およびＭ２マクロファージ細胞上のＧａｌ３発現を検出するために、フローサイトメトリー分析を行った。詳細には、１００，０００のＤＣ、Ｍ１またはＭ２細胞を、氷上で２０分間、１０μｇ／ｍｌで、コントロールｍＩｇＧ−ビオチン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）またはＩＭＴ００１−ビオチンを含む１００μｌの１０％ＦＢＳ  ＨＢＳＳ溶液と共にインキュベートした。それから、細胞を洗浄し、氷上で２０分間、１：１０００でＰＥ−ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）と共にインキュベートした。遠心した後、生／死細胞をバイオレット死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で染色した。染色細胞をフロー分析に付した。図１４の結果は、ＩＭＴ００１で染色されたＭ２細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、アイソタイプコントロール抗体で染色された細胞の平均蛍光強度よりずっと高いことを示し、ＩＭＴ００１がＭ２細胞と特異的結合するが、樹状細胞（図１４Ａ）およびＭ１マクロファージ（図１４Ｂ）を染色することができなかったことを示す。
【０１５９】
実施例１２．抗Ｇａｌ３抗体はマクロファージ／Ｔ細胞反応においてマウスＴ細胞活性化を促進する
マウスマクロファージ上のＧａｌ３の発現を、ＩＨＣおよびフローサイトメトリー分析によって検出した。ＩＨＣの詳細では、ウェル当たり１００，０００細胞を一夜播種した。２日目、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、室温で１０分間、３％ホルムアルデヒドで固定し、それから、ＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間、１０％ＦＢＳおよび２００μｇ／ｍＬを含有するＰＢＳ中で遮断した。遮断後、細胞を、４０℃で一夜、１０μｇ／ｍＬの一次抗体ｍＩｇＧ−ビオチン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）またはＩＭＴ００１−ビオチンと共にインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１時間アビジン−ＨＲＰ（１：１０００）で染色し、それから、ＰＢＳＴで再度３回洗浄した。過酸化酵素基質を使用して染色を発色し、ヘマトキシリンＱＳ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で対比染色した。結果は、ｍＩｇＧコントロール（図１５Ａ）と比較して、ＩＭＴ００１はマクロファージ上のＧａｌ３発現を明白に検出したことを示す（図１５Ｂ）。
【０１６０】
フローサイトメトリーの実験では、１００，０００ＲＡＷ細胞を、氷上で２０分間、１０％ＦＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのｈＩｇＧで遮断し、それから、氷上で２０分間、１０μｇ／ｍｌでコントロールｍＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）またはＩＭＴ００１を含有する１００μｌの１０％ＦＢＳ  ＨＢＳＳ溶液と共にインキュベートした。それから、細胞を洗浄し、氷上で２０分間、１：１００でＡＰＣ結合抗ｍＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）と共にインキュベートした。遠心した後、生／死細胞をバイオレット死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で染色した。染色細胞をフロー分析に付した。図１５Ｃは、アイソタイプコントロール抗体で染色された細胞と比較して、ＩＭＴ００１で染色されたＲＡＷ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は１０倍超高いことを示す。
【０１６１】
ＩＭＴ００１がＴ細胞を活性化する能力を、混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）アッセイによって示した。ＲＡＷマウスマクロファージ細胞を、１：１の比でＤＯ１１マウスＴ細胞と混合し、ＯＶＡペプチドで処置し、３７℃で一夜、１０μｇ／ｍｌで、ｍＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ｍＰＤ１抗体２９Ｆ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）またはＩＭＴ００１の存在下培養した。培養培地５０μｌをｍＩＬ−２測定のために採取した。
ｍＩＬ−２産生を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から市販キットマウスＩＬ−２  Ｅｌｉｓａ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏに従って測定した。
【０１６２】
図１５Ｄは、ｍＩｇＧまたはｍＰＤ１抗体処置細胞と比較して、ＩＭＴ００１抗体はＩＬ−２の産生を促進したが、マウスＰＤ−１抗体２９Ｆは促進しなかったことを示し、マクロファージ誘発性Ｔ細胞不活性化の復帰を示す。
【０１６３】
前述の本発明を明確さと理解のために例証および実施例によって少し詳しく説明したが、本発明の要旨および範囲から必然的に逸脱することなく、特定の変化形、変更、修正および均等物の置換を行ってもよいことは、本発明の教示を踏まえると当業者には容易に明白であろう。結果として、本明細書に記載されている実施形態は様々な修正および変更などに受け、本発明の範囲は本明細書に添付されている実施形態の参照によってのみ決定される。本質的に同様な結果を得るように変更、変化または修正することができる様々な重要でないパラメーターを、当業者は容易に見分けるだろう。本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のためだけであると理解されるものとし、本発明の範囲は添付の実施形態によってのみ限定されるので、限定的ではないものとする。加えて、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が参照によって個々に組み入れられているのと同じ程度に、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。本願および本明細書で提供される参考文献間に矛盾がある場合、本願を優先する。
【０１６４】
配列リスト情報
配列番号１  マウスＧａｌ３核酸（ｃＤＮＡ）配列（下線部は開始コドンおよび終止コドンである。）
GGGAGGGCGG GCCCGGGGAA AAGAGTACTA GAAGCGGCCG AGCCACCGCC CAGCTCTGAC
AGCTAGCGGA GCGGCGGGTG GAGCACTAAT CAGGTGAGCG GCACAGAGAG CACTACCCAG
GAAAATGGCA GACAGCTTTT CGCTTAACGA TGCCTTAGCT GGCTCTGGAA ACCCAAACCC
TCAAGGATAT CCGGGTGCAT GGGGGAACCA GCCTGGGGCA GGGGGCTACC CAGGGGCTGC
TTATCCTGGG GCCTACCCAG GACAAGCTCC TCCAGGGGCC TACCCAGGAC AGGCTCCTCC
AGGGGCCTAC CCAGGACAGG CTCCTCCTAG TGCCTACCCC GGCCCAACTG CCCCTGGAGC
TTATCCTGGC CCAACTGCCC CTGGAGCTTA TCCTGGCTCA ACTGCCCCTG GAGCCTTCCC
AGGGCAACCT GGGGCACCTG GGGCCTACCC CAGTGCTCCT GGAGGCTATC CTGCTGCTGG
CCCTTATGGT GTCCCCGCTG GACCACTGAC GGTGCCCTAT GACCTGCCCT TGCCTGGAGG
AGTCATGCCC CGCATGCTGA TCACAATCAT GGGCACAGTG AAACCCAACG CAAACAGGAT
TGTTCTAGAT TTCAGGAGAG GGAATGATGT TGCCTTCCAC TTTAACCCCC GCTTCAATGA
GAACAACAGG AGAGTCATTG TGTGTAACAC GAAGCAGGAC AATAACTGGG GAAAGGAAGA
AAGACAGTCA GCCTTCCCCT TTGAGAGTGG CAAACCATTC AAAATACAAG TCCTGGTTGA
AGCTGACCAC TTCAAGGTTG CGGTCAACGA TGCTCACCTA CTGCAGTACA ACCATCGGAT
GAAGAACCTC CGGGAAATCA GCCAACTGGG GATCAGTGGT GACATAACCC TCACCAGCGC
TAACCACGCC ATGATCTAAG CCAGAAGGGG CGGCACCGAA ACCGGCCCTG TGTGCCTTAG
GAGTGGGAAA CTTTGCATTT CTCTCTCCTT ATCCTTCTTG TAAGACATCC ATTTAATAAA
GTCTCATGCT GAGAGATACC CATCGCTTTG GGGGTTTTTA TGATACTGGA TGTCAAATCT
TAGGACTGCT CGTGACTGCT AGGCAAGTGT TCTCTCACTG AGCTACACAT CCCTAGCCTT
TTAAACTTTG TGTGTTGTGT GTCTGTGCAC ATGGGTACAG GTGCCTGCTC ACTTGAGAGG
CACCAGGCCT CCTGGAGCTG GAGTTACAGG TGGTTGTAAG TAAGCTGTGT GACCAGGTTG
CTGGGAACCA GTCTCAGATC CTCCTGAGAC AGGTCAGGTC CACTGATGCC TCCAGCTGCC
TGTCTTTATA TGCCCTTTGA TTTGGTGCAG TTTTATATAA AGGGAACTAT GTAATTATCA
ATAAACCATC CTGATTTTTA CAAAGG
配列番号２：マウスＧａｌ３ポリペプチド配列
MADSFSLNDALAGSGNPNPQGYPGAWGNQPGAGGYPGAAYPGAY
PGQAPPGAYPGQAPPGAYPGQAPPSAYPGPTAPGAYPGPTAPGAYPGSTAPGAFPGQP
GAPGAYPSAPGGYPAAGPYGVPAGPLTVPYDLPLPGGVMPRMLITIMGTVKPNANRIV
LDFRRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKQDNNWGKEERQSAFPFESGKPFKIQVLV
EADHFKVAVNDAHLLQYNHRMKNLREISQLGISGDITLTSANHAMI
配列番号３  ヒトＧａｌ３核酸（ｃＤＮＡ）配列（下線部は開始コドンおよび終止コドンである。）
GAGTATTTGA GGCTCGGAGC CACCGCCCCG CCGGCGCCCG CAGCACCTCC TCGCCAGCAG
CCGTCCGGAG CCAGCCAACG AGCGGAAAAT GGCAGACAAT TTTTCGCTCC ATGATGCGTT
ATCTGGGTCT GGAAACCCAA ACCCTCAAGG ATGGCCTGGC GCATGGGGGA ACCAGCCTGC
TGGGGCAGGG GGCTACCCAG GGGCTTCCTA TCCTGGGGCC TACCCCGGGC AGGCACCCCC
AGGGGCTTAT CCTGGACAGG CACCTCCAGG CGCCTACCCT GGAGCACCTG GAGCTTATCC
CGGAGCACCT GCACCTGGAG TCTACCCAGG GCCACCCAGC GGCCCTGGGG CCTACCCATC
TTCTGGACAG CCAAGTGCCA CCGGAGCCTA CCCTGCCACT GGCCCCTATG GCGCCCCTGC
TGGGCCACTG ATTGTGCCTT ATAACCTGCC TTTGCCTGGG GGAGTGGTGC CTCGCATGCT
GATAACAATT CTGGGCACGG TGAAGCCCAA TGCAAACAGA ATTGCTTTAG ATTTCCAAAG
AGGGAATGAT GTTGCCTTCC ACTTTAACCC ACGCTTCAAT GAGAACAACA GGAGAGTCAT
TGTTTGCAAT ACAAAGCTGG ATAATAACTG GGGAAGGGAA GAAAGACAGT CGGTTTTCCC
ATTTGAAAGT GGGAAACCAT TCAAAATACA AGTACTGGTT GAACCTGACC ACTTCAAGGT
TGCAGTGAAT GATGCTCACT TGTTGCAGTA CAATCATCGG GTTAAAAAAC TCAATGAAAT
CAGCAAACTG GGAATTTCTG GTGACATAGA CCTCACCAGT GCTTCATATA CCATGATATA
ATCTGAAAGG GGCAGATTAA AAAAAAAAAA AGAATCTAAA CCTTACATGT GTAAAGGTTT
CATGTTCACT GTGAGTGAAA ATTTTTACAT TCATCAATAT CCCTCTTGTA AGTCATCTAC
TTAATAAATA TTACAGTGAA TTACCTGTCT CAATATGTCA AAAAAAAAAA AAAAAAA
配列番号４：ヒトＧａｌ３ポリペプチド配列
MADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGA
YPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYP
ATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFN
PRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHL
LQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI
配列番号５：ｈＧａｌ３エピトープ、図１１Ａ中のペプチド＿５に対応する
PGAYPGQAPPGAYPGQAPPG
配列番号６：ｈＧａｌ３エピトープ、図１１Ａ中のペプチド＿６に対応する
GAYPGQAPPGAYPGAPGAYP
配列番号７：ｈＧａｌ３エピトープ
PGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYP
配列番号８：ｈＧａｌ３エピトープ、図１１Ｃ中のＰｅｐ−２に対応する
GQAPPGAYPG
ｈＩｇＧ４アイソタイプ中のヒト化ＩＭＴ００１
配列番号９：重鎖ＣＤＲ１
GYTFTNY
配列番号１０：重鎖ＣＤＲ２
NTNTGE
配列番号１１：重鎖ＣＤＲ３
YDNFFAY
配列番号１２：重鎖ＦＲ１
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS
配列番号１３：重鎖ＦＲ２
GMNWVRQAPGQGLKWMGWI
配列番号１４：重鎖ＦＲ３
PTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCAP
配列番号１５：重鎖ＦＲ４
WGQGTTVTVS
配列番号１６：重鎖 
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGWINTNTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCAPYDNFFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG**
配列番号１７：軽鎖ＣＤＲ１
RSSKSLLYKDGKTYLN
配列番号１８：軽鎖ＣＤＲ２
LMSTHAS
配列番号１９：軽鎖ＣＤＲ３
QQLVDYPLT
配列番号２０：軽鎖ＦＲ１
DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISC
配列番号２１：軽鎖ＦＲ２
WFLQKPGQSPQLLIY
配列番号２２：軽鎖ＦＲ３
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
配列番号２３：軽鎖ＦＲ４
FGGGTKLEIK
配列番号２４：軽鎖 
DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQKPGQSPQLLIYLMSTHASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号２５：重鎖可変領域
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGWINTNTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCAPYDNFFAYWGQGTTVTVS
配列番号２６：軽鎖可変領域
DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQKPGQSPQLLIYLMSTHASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVDYPLTFGGGTKLEIK
配列番号２７：ペプチド＿１、図１１Ａ中に開示
ADNFSLHDALSGSGNPNPQG
配列番号２８：ペプチド＿２、図１１Ａ中に開示
SGSGNPNPQGWPGAWGNQPA
配列番号２９：ペプチド＿３、図１１Ａ中に開示 
WPGAWGNQPAGAGGYPGASY
配列番号３０：ペプチド＿４、図１１Ａ中に開示 
GAGGYPGASYPGAYPGQAPP
配列番号３１：ペプチド＿７、図１１Ａ中に開示 
AYPGAPGAYPGAPAPGVYPG
配列番号３２：ペプチド＿８、図１１Ａ中に開示 
GAPAPGVYPGPPSGPGAYPS
配列番号３３：ペプチド＿９、図１１Ａ中に開示 
PPSGPGAYPSSGQPSATGAY
配列番号３４：ペプチド＿１０、図１１Ａ中に開示 
SGQPSATGAYPATGPYGAPA
配列番号３５：ペプチド＿１１、図１１Ａ中に開示 
PATGPYGAPAGPLIVPYNLP
配列番号３６：ペプチド＿１２、図１１Ａ中に開示 
GPLIVPYNLPLPGGVVPRML
配列番号３７：ペプチド＿１３、図１１Ａ中に開示 
LPGGVVPRMLITILGTVKPN
配列番号３８：ペプチド＿１４、図１１Ａ中に開示 
ITILGTVKPNANRIALDFQR
配列番号３９：ペプチド＿１５、図１１Ａ中に開示 
ANRIALDFQRGNDVAFHFNP
配列番号４０：ペプチド＿１６、図１１Ａ中に開示 
GNDVAFHFNPRFNENNRRVI
配列番号４１：ペプチド＿１７、図１１Ａ中に開示 
RFNENNRRVIVCNTKLDNNW
配列番号４２：ペプチド＿１８、図１１Ａ中に開示 
VCNTKLDNNWGREERQSVFP
配列番号４３：ペプチド＿１９、図１１Ａ中に開示 
GREERQSVFPFESGKPFKIQ
配列番号４４：ペプチド＿２０、図１１Ａ中に開示 
FESGKPFKIQVLVEPDHFKV
配列番号４５：ペプチド＿２１、図１１Ａ中に開示 
VLVEPDHFKVAVNDAHLLQY
配列番号４６：ペプチド＿２２、図１１Ａ中に開示 
AVNDAHLLQYNHRVKKLNEI
配列番号４７：ペプチド＿２３、図１１Ａ中に開示 
NHRVKKLNEISKLGISGDID
配列番号４８：ペプチド＿２４、図１１Ａ中に開示 
SKLGISGDIDLTSASYTMI
配列番号４９：Ｐｅｐ−１、図１１Ｃ中に開示 
PGAYPGQAPP
配列番号５０：Ｐｅｐ−３、図１１Ｃ中に開示  
GAYPGQAPPGA
配列番号５１：Ｐｅｐ−４、図１１Ｃ中に開示  
APPGAYPGAP
配列番号５２：Ｐｅｐ−５、図１１Ｃ中に開示  
YPGAPGAYP
配列番号５３：Ｐｅｐ−６、図１１Ｃ中に開示  
APPGAY
配列番号５４：Ｐｅｐ−７、図１１Ｃ中に開示  
GAYPGQ
配列番号５５：Ｐｅｐ−８、図１１Ｃ中に開示  
PGQAPP
【図１】
2020529469.tif 000003
【図２】
2020529469.tif 000004
【図３】
2020529469.tif 000005
【図４】
2020529469.tif 000006
【図５】
2020529469.tif 000007
【図６】
2020529469.tif 000008
【図７−１】
2020529469.tif 000009
【図７−２】
2020529469.tif 000010
【図８】
2020529469.tif 000011
【図９】
2020529469.tif 000012
【図１０】
2020529469.tif 000013
【図１１−１】
2020529469.tif 000014
【図１１−２】
2020529469.tif 000015
【図１２】
2020529469.tif 000016
【図１３】
2020529469.tif 000017
【図１４−１】
2020529469.tif 000018
【図１４−２】
2020529469.tif 000019
【図１５】
2020529469.tif 000020
【国際調査報告】
2020529469.tif 000021
2020529469.tif 000022
2020529469.tif 000023
2020529469.tif 000024