(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼを含み、少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインと直接相互作用する人工分子複合体に関し、該修復鋳型ドッキングドメインは、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用する。人工複合体は、少なくとも１つの相互作用ドメインをさらに含みうる。人工分子複合体は、原核生物又は真核生物におけるＤＮＡ標的配列の修復を、標的方法で高精度で媒介するように構成され、したがって、原核又は真核の細胞又は生物におけるゲノム工学、又はウイルスゲノムの編集のために使用されうる。さらに、原核細胞又は真核細胞、又はウイルスゲノム中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を、例えば形質開発のために、又は疾患の治療のために改質する方法が提供される。さらに、少なくとも１つの人工分子複合体を含むか、又は少なくとも１つの人工分子複合体により編集された植物、植物細胞、植物材料、又は誘導体、又はそれらの子孫が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工分子複合体であって、
（ａ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）もしくはそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする核酸配列、及びそれらと直接相互作用するもの、
（ｂ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）、又はそれらをコードする核酸配列、ここで修復鋳型ドッキングドメインは、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）と直接相互作用するように設計されている
を含み、
（ｃ）任意に少なくとも１つの相互作用ドメイン（ＩＡ）、又はそれらをコードする核酸配列を含み、ここで少なくとも１つの相互作用ドメインは、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメントと直接相互作用し、かつ少なくとも１つの相互作用ドメインは、
（ｉ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインとの相互作用、及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との相互作用、及び／又は
（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡとの配列特異的相互作用
からなる群から選択される少なくとも１つの機能性を提供するように設計され、
ここで、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのゲノム相補性配列に相補的である少なくとも１つの部位を含み、かつ少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、ＤＮＡ標的配列の修復を媒介するように設計される、人工分子複合体。
【請求項２】
部位特異的ヌクレアーゼ、又はそれらをコードする核酸配列は、Ｃａｓ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそれらの多様体を含む制限エンドヌクレアーゼ、又は２つの部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、又はそれらの多様体もしくはそれらの触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の人工分子複合体。
【請求項３】
少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン、又はそれらをコードする核酸配列が、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はフルオレセインを含む蛍光体もしくはそれらの多様体、マレイミド又はテトラゾリウム（ＸＴＴ）を含むタンパク質染料、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に設計されたガイド核酸配列、ストレプトアビジン、又はそれらの多様体、好ましくは単量体ストレプトアビジン、アビジン、又はそれらの多様体、アフィニティタグ、好ましくはストレプトアビジンタグ、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボディ）、アンチカリン、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質又はそれらのドメイン、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ又はそれらのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ*タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質又はそれらのドメイン、又はジゴキシゲニンの少なくとも１つから選択される、請求項１又は２に記載の人工分子複合体。
【請求項４】
少なくとも１つの相互作用ドメイン、又はそれらをコードする核酸配列が、ＤＮＡ結合ドメイン、ストレプトアビジン、又はそれらの多様体、好ましくは単量体ストレプトアビジン、アビジン、又はそれらの多様体、アフィニティタグ、ビオチン化シグナル、ビオチン受容体部位、ストレプトアビジンタグ、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボティ）、アンチカリン、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はフルオレセインを含む蛍光体もしくはそれらの多様体、マレイミド又はテトラゾリウム（ＸＴＴ）を含むタンパク質染料、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に設計されたガイド核酸配列、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質又はそれらのドメイン、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ又はそれらのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ*タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質又はそれらのドメイン、又はジゴキシゲニンの少なくとも１つから選択される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項５】
少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つの相互作用ドメインが、少なくとも１つの核局在化配列、色素体局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項６】
少なくとも１つの修復鋳型核酸配列が、少なくとも１つの末端部位、好ましくは３’末端を含み、この末端部位が、人工分子複合体の任意の他の成分と相互作用せず、したがってＤＮＡ標的配列の修復を媒介するための少なくとも１つのゲノム相補性配列にハイブリッドするように設計され、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列がプラスミドとして提供される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項７】
少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする配列が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから、好ましくはＣａｓ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼ、又はＦｏｋＩヌクレアーゼ、又はそれらの触媒フラグメントから選択され、かつ少なくとも１つの相互作用ドメイン、又はそれらをコードする配列が、一本鎖可変フラグメント又は単量体ストレプトアビジンから選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項８】
前記複合体が、少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインを示す少なくとも１つのガイド核酸配列を含み、少なくとも１つのガイド核酸配列のそれぞれが、
（ｉ）認識ＤＮＡ標的配列に相補的である第一の配列部位と、
（ｉｉ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼと相互作用するように設計された第二の配列部位と
を含み、かつ
（ｉｉｉ）少なくとも１つのガイド核酸配列が、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と物理的に会合して、少なくとも１つのＲＮＡもしくはＤＮＡ及び少なくとも１つのさらなるＤＮＡ核酸配列を含むか又はそれらからなるハイブリッド核酸配列を形成し、及び
（ｉｖ）任意に少なくとも１つのガイド核酸配列と少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域を含むハイブリッド核酸配列を形成し、
好ましくは修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列の３’末端でガイド核酸配列と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列の５’末端で会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列内に位置している、請求項１から７までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項９】
少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つのガイド核酸配列が、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基修飾を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含み、ここで、ガイド核酸配列は、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項１０】
少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらをコードする配列、及び少なくとも１つの相互作用ドメイン又はそれらをコードする配列、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン又はそれらをコードする配列が、少なくとも１つのリンカードメインにより連結されている、請求項１から９までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項１１】
少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする配列が、Ｃａｓポリペプチドであって、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）を含むストレプトコッカス属（Streptococcus）種、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、又はナイセリア・メニンギチダス（Neisseria meningitides）を含むナイセリア属（Neisseria）種、コリネバクテリア属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifactor）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、バクテロイド属（Bacteroides）、フラビイボラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、スピロヘータ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリラム属（Azospirillum）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ロゼブリア属（Roseburia）、パルビバクラム属（Parvibaculum）、ニトラチフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、及びカンピロバクター属（Campylobacter）、カンジダタス・ミクラルケウム・アシジフィルム（Candidatus Micrarchaeum acidiphilum）ＡＲＭＡＮ−１、パルクバクテリア属（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰＧ８０６５６．１）、スルホロブス・アイランジカス（Sulfolobus islandicus）ＨＶＥ１０／４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８１７７０．１）又はＲＥＹ１５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８４８５２．１）を含むスルホロブス属（Sulfolobus）種からのＣａｓポリペプチド、Ｃｐｆ１ポリペプチドであって、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）種ＢＶ３Ｌ６を含むアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）種、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ＮＤ２００６、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ＭＣ２０１７、ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２を含むラクノスピラ科（Lachnospiraceae）種、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Butyrivibrio proteoclasticus）、カンジダタス属（Candidatus）種、メタノプラズマ・ターミツム（Methanoplasma termitum）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、モラクセラ・ボヴォクリ（Moraxella bovoculi）２３７、ペレグリニバクテリア属（Peregrinibacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア属（Parcubacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Smithella）種ＳＣＡＤＣ、スミセラ属種ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２を含むフランシセラ属（Francisella）種、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、プレポテラ属（Prevotella）種、又はポルフィロモナス属（Porphyromonas）種を含む古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチド、又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼであって、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Natronobacterium gregoryi）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＺ７３７４９．１）、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１２２６５２０９．１又はＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００２７４７７９５．１又はＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１２２６５２０９．１）、ハロゲオメトリカム・パリダム（Halogeometricum pallidum）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＬＺ２９０１７．１）、���トリアラバ・アジアティカ（Natrialaba asiatica）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６１１１０８５．１）、ナトロノルブラム・チベテンス（Natronorubrum tibetense）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６０９０８３２．１）、ナトリネマ・ペリルブラム（Natrinema pellirubrum）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６１８３３３５．１）、又はシネココッカス属（Synechococcus）種（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１１３７８０６９．１）からのＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ、又はニッカーゼもしくはヌクレアーゼ欠乏ヌクレオチド鎖切断活性を含む、それらの多様体及び／又は機能的フラグメント及び／又は組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項１２】
疾患の治療法において使用するための人工分子複合体であって、その際疾患が、少なくとも１つのゲノム変異により特徴付けられ、かつ人工分子複合体が、少なくとも１つのゲノム変異を標的とし、かつ修復するように設計されている、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の人工分子複合体。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載の人工分子複合体を使用する疾患の治療方法であって、その際疾患が、少なくとも１つのゲノム変異により特徴付けられ、かつ人工分子複合体が、少なくとも１つのゲノム変異を標的とし、かつ修復するように設計される、方法。
【請求項１４】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの人工分子複合体を含むか又は該人工分子複合体によって編集された、植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫。
【請求項１５】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改質するための方法であって、以下：
（ｉ）目的のゲノム領域における少なくとも１つのゲノム相補性配列及び少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを準備するステップ、
（ｉｉ）請求項１から１１までのいずれか１項において定義された少なくとも１つの人工分子複合体を準備するステップ、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの人工分子複合体と少なくとも１つのＤＮＡ標的配列とを適した条件下で接触させて、
（ａ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼと少なくとも１つのＤＮＡ標的配列との相互作用、及び
（ｂ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配と少なくとも１つのゲノム相補性配列との相補的塩基対を得て、少なくとも１つの相補性配列の認識及び少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼによる少なくとも１つのＤＮＡ切断の導入を得るステップ、ここで少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の部位で相同性により方向付けられた修復を指示する、並びに
（ｉｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改質を含む少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを得るステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
人工分子複合体の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインが、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼとは無関係に少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞に提供され、かつ少なくとも１つの人工分子複合体が、少なくとも１つの原核、真核又はウイルスの細胞及び／又はゲノム内で構築又は部分的に構築されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの人工分子複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏで構築された人工分子複合体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの真核細胞が、植物細胞、好ましくは、オオムギ（Hordeum vulgare）、ホルデウム・ブルブソム（Hordeum bulbusom）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarium）、トウモロコシ（Zea mays）を含むゼア属（Zea）種、アワ（Setaria italica）、オリザ・ミヌタ（Oryza minuta）、イネ（Oriza sativa）、オリザ・オーストラリエンシス（Oryza australiensis）、オリザ・アルタ（Oryza alta）、コムギ（Triticum aestivum）、マカロニコムギ（Triticum durum）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticale）、リンゴ（Malus domestica）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、ハマムギクサ（Hordeum marinum）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ゴウシュウヤブジラミ（Daucus glochidiatus）、サトウダイコン（Beta vulgaris）を含むベータ属（Beta）種、ダウクス・プシルス（Daucus pusillus）、ダウクス・ムリカツス（Daucus muricatus）、ノラニンジン（Daucus carota）、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、ブドウ（Vitis vinifera）、エリスランテ・グタタ（Erythrante guttata）、ゲンセリア・アウレア（Genlisea aurea）、キュウリ（Cucumis sativus）、マルバグワ（Marus notabilis）、アラビドプシス・アレノサ（Arabidopsis arenosa）、アラビドプシス・リラタ（Arabidopsis lyrata）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、クルシヒマラヤ・ヒマライカ（Crucihimalaya himalaica）、クルシヒマラヤ・ワリチイ（Crucihimalaya wallichii）、カルダミン・ネクスオサ（Cardamine nexuosa）、マメグンバイナズナ（Lepidium virginicum）、ナズナ（Capsella bursa pastoris）、オルマラビドプシス・プミラ（Olmarabidopsis pumila）、ヤマハタザオ（Arabis hirsute）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ダイコン（Raphanus sativus）、ブラシカ・ユンカセア（Brassica juncacea）、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ルッコラ（Eruca vesicaria subsp. sativa）、オレンジ（Citrus sinensis）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、シセル・ヤマシタ（Cicer yamashitae）、シセル・ビユグム（Cicer bijugum）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、シセル・レチクラツム（Cicer reticulatum）、シセル・ユダイクム（Cicer judaicum）、カヤヌス・カヤニフォリウス（Cajanus cajanifolius）、ビロードヒメクズ（Cajanus scarabaeoides）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ダイズ（Glycine max）、ワタ属種（Gossypium sp.）、ゲンゲ（Astragalus sinicus）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、ハナウリクサ（Torenia fournieri）、タマネギ（Allium cepa）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、及びニラ（Allium tuberosum）からなる群から選択される植物、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からの植物細胞である、請求項１５から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変が、収量改善、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、酸化ストレス、重金属ストレス、塩ストレスもしくは浸水を含む非生物的ストレスに対する耐性、昆虫に対する耐性、細菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、真菌に対する耐性もしくは線虫に対する耐性を含む生物的ストレスに対する耐性、グリホサート、グルホシネート、ＡＬＳ阻害剤及びジカンバを含む除草剤に対する耐性、倒伏抵抗性、開花期、脱粒抵抗性、種子の色、胚乳組成、栄養含有量、又は少なくとも１つの植物細胞における分子薬学アプローチを可能にするゲノム編集を含む代謝工学からなる群から選択される形質編集を生じる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、以下、
（ｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改質を含む、少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを同定及び／又は選択するステップ
を含む、請求項１５から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
以下、
（ｉ）請求項１５から２０までのいずれ１項に記載の方法を実施するステップ、ここで少なくとも１つの真核細胞は植物細胞である、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの少なくとも１つの植物細胞から少なくとも１つの植物又はそれらの子孫を得るステップ、
（ｉｉｉ）任意に、少なくとも１つの植物又はそれらの子孫の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を決定するステップ
を含む、植物又は植物細胞を製造するための方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物から選択され、好ましくは、植物が、トウモロコシ（Zea mays）を含むゼア属（Zea）種、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、又はサトウダイコン（Beta vulgaris）を含むベタ属（Beta）種、又はライムギ（Secale cereal）を含むセカレ属（Secale）種、又はコムギ（Triticum aestivum）を含むトリチカム属（Triticum）種からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノム及び／又は生物における、好ましくは植物細胞又は生物におけるゲノム工学のための請求項１から１１までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの人工分子複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼを含み、少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインと直接相互作用する人工分子複合体に関し、該修復鋳型ドッキングドメインは、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用する。人工複合体は、少なくとも１つの相互作用ドメインをさらに含みうる。人工分子複合体は、原核又は真核又はウイルス性の生物又はゲノムにおけるＤＮＡ標的配列の修復を、標的方法で高精度で媒介するように構成され、したがって、原核又は真核の細胞又は生物におけるゲノム工学、又はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの原核、真核、又はウイルスのゲノムを使用したゲノム工学のために使用されうる。さらに、原核細胞又は真核細胞、又はウイルスゲノム中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を、例えば形質開発（trait development）のために、又は疾患の治療のために改変する方法が提供される。さらに、少なくとも１つの人工分子複合体を含むか、又は少なくとも１つの人工分子複合体により編集された植物、植物細胞、植物材料、又は誘導体、又はそれらの子孫を作成するための方法が提供される。したがって、種々のゲノム工学アプローチの高い効率及び予測可能性を保証するために、誘導されるＤＮＡ二本鎖切断の部位でｉｎ ｓｉｔｕで修復鋳型をすぐに利用できるように改変されるべきＤＮＡ標的配列に物理的に近接して修復鋳型を導く、任意の部位特異的ヌクレアーゼに適した人工分子複合体が提供される。
【０００２】
背景技術
高精度の遺伝子編集又はゲノム工学は、目的のゲノムの標的化及び部位特異的操作を可能にする遺伝子工学の最も重要な分野の１つとして発展してきた。部位特異的ゲノム工学のために不可欠な必要条件は、定義された位置で目的の核酸を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）又は１つ以上の一本鎖切断のいずれかを誘発するために使用することができる、プログラム可能なヌクレアーゼである。代わりに、前記ヌクレアーゼは、もはやヌクレアーゼ機能を含まず、むしろ他の酵素と組み合わせて認識分子として作用するキメラ多様体又は変異多様体であってよい。したがって、これらのヌクレアーゼ又はそれらの多様体は、任意の遺伝子編集又はゲノム工学のアプローチの鍵となる。近年、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、例えばナトロノバクテリウム・グレゴリー（Natronobacterium gregoryi）に由来するＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ、及び例えばＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート：ＣＲＩＳＰＲ）システムの一部としてＣａｓ、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ又はＣａｓＹヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む、多くの適したヌクレアーゼ、特にテーラードエンドヌクレアーゼ（tailored endonucleases）が開発されている。
【０００３】
それらの自然環境において、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、元来、ＣＲＩＳＰＲシステムがウイルス攻撃に対する防御のための適応免疫システムの役割を果たす細菌中で進化した。ウイルスに暴露に対して、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ＲＮＡは、ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子剤の一部から転写される。ウイルスゲノムに対して相補的な配列を含む前記ＲＮＡは、ウイルスゲノム中の標的配列に対してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の標的化を媒介する。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は切断され、それによってウイルス標的の複製が妨げられる。ここ数年にわたって、ＣＲＩＳＰＲシステムは、真核細胞においても遺伝子編集又はゲノム工学にうまく適応されている。動物細胞における編集及び人類のための治療の適用は、現在、重要な研究の主眼点である。複雑な動物及び植物ゲノムの標的化された改変は、困難な課題である。
【０００４】
自然環境におけるＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼは他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば特異的なＤＮＡ二本鎖切断を生じうるＣｐｆ１ヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅら、"Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｓ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ"， Ｃｅｌｌ， １６３， ｐｐ． １−１３， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５）と組み合わせて、少なくとも１つの小さい個々の非コードＲＮＡを含む分子複合体を記載している。現在、ＣＲＩＳＰＲシステムは、５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステムを含む２つの分類、例えばエフェクターとしてＣａｓ９を使用するタイプＩＩシステム、及びエフェクター分子としてＣｐｆ１を使用するタイプＶシステムに識別されている（Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２０１５）。人工ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、合成非コードＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は任意に改変ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ニッカーゼとして作用するために改変させた、又はあらゆるヌクレアーゼ機能を欠いている）は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの機能を組み合わせた少なくとも１つの合成又は人工のガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡと組み合わせて使用されてよい（Ｍａｋａｒｏｖａら、２０１５、前述）。天然のシステムにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより媒介される免疫応答は、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を要求し、その際、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特異的活性を制御するこのガイドＲＮＡの成熟は、これまでに特徴付けられている種々のＣＲＩＳＰＲシステム間で著しく変動する。第一に、スペーサーとして公知でもある侵入ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端での２つの隣接する繰り返し領域間に組み込まれる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、干渉ステップのための鍵となる酵素としてＣａｓ９ヌクレアーゼをコードし、それは、ガイドモチーフとしてｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の双方を含むシステムである。これらは、ハイブリダイズされ、そしてＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって認識され、成熟ｃｒＲＮＡを形成するために切断されてよい二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成する。続いて、これらは、ヌクレアーゼを標的核酸領域に特異的に向けるためにＣａｓ分子と順に会合する。組換えｇＲＮＡ分子は、可変ＤＮＡ認識領域とＣａｓ相互作用領域の双方を含んでよく、特異的標的核酸及び所望のＣａｓヌクレアーゼとは無関係に、特異的に設計されてよい。さらに安全なメカニズムとして、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）が標的核酸領域に存在する必要があり、これらはＣａｓ９／ＲＮＡ複合体認識ＤＮＡから直接続くＤＮＡ配列である。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（化膿性連鎖球菌）からのＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」又は「ＮＡＧ」（Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）であると記載されている（Ｊｉｎｅｋら、"Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ"、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２、３３７：８１６−８２１）。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）からのＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」である。さらなる多様体ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが公知である。したがって、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）（髄膜炎菌）Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴで切断される。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷで切断される。近年、さらなるＰＡＭモチーフＮＮＮＮＲＹＡＣは、カンピロバクター属（Campylobacter）のＣＲＩＳＰＲシステムについて記載されている（国際公開第２０１６／０２１９７３号Ａ１（ＷＯ ２０１６／０２１９７３ Ａ１））。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９システムにより認識される通常のＧリッチＰＡＭとは対照的に短いＴリッチＰＡＭによって生じる標的ＤＮＡを効率的に切断することが記載されている（Ｚｅｔｓｃｈｅら、前述）。さらに、改変ＣＲＩＳＰＲポリペプチドを使用することにより、特異的な一本鎖切断が得られる。Ｃａｓニッカーゼと種々の組換えｇＲＮＡとを組み合わせた使用は、二本鎖ＤＮＡニッキングによって非常に特異的なＤＮＡ二本鎖切断も含んでもよい。２つのｇＲＮＡを使用することによって、さらに、ＤＮＡ結合及びしたがってＤＮＡ切断の特異性が最適化されうる。
【０００５】
目下、例えば、エンドヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９上にあるＩＩ型システム又はその多様体もしくは任意のキメラ型は、ゲノム工学のために改変されている。２つの成分、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも言われるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる合成ＣＲＩＳＰＲシステムは、エンドヌクレアーゼＣａｓ９と会合することができる標的とされる遺伝子に特異的なｇＲＮＡを同時発現することによってノックアウト細胞又は動物を生じるために使用されてよい。とりわけ、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ又は任意の他のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、又はその多様体もしくは触媒活性フラグメントと相互作用する１つのドメイン、及び目的の標的核酸と相互作用し、したがってｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合を示す他のドメインを含む人工分子である（「一本鎖ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）又は単に「ｇＲＮＡ」；Ｊｉｎｅｋら、２０１２、前述）。ゲノム標的は、任意の〜２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であってよいが、但し標的はＰＡＭのすぐ上流にある。ＰＡＭ配列は、標的結合のために非常に重要であり、正確な配列はＣａｓ９の種に依存し、そして例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９については５’ＮＧＧ３’又は５’ＮＡＧ３’を読む（Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）（Ｊｉｎｅｋら、２０１２、前述）。改変Ｃａｓヌクレアーゼを使用して、標的とされた一本鎖切断は、目的の標的配列に導入されてよい。かかるＣａｓニッカーゼと、異なる組換えｇＲＮＡの高い部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断との併用は、二本鎖ネッキングシステムを使用して導入されてよい。１つ以上のｇＲＮＡを使用することは、全体の特異性をさらに高め、かつオフターゲット効果を低減することができる。
【０００６】
一旦発現されると、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの「足場」ドメインとＣａｓ９上の表面に露出した正電荷を帯びた溝との間の相互作用を介してリボヌクレオタンパク質複合体を形成する。重要なことに、ｇＲＮＡの「スペーサー」配列は、標的ＤＮＡと相互作用するために自由なままである。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、任意のゲノム配列をＰＡＭと結合させるが、ｇＲＮＡスペーサーが標的ＤＮＡと一致する程度によってＣａｓ９が切断されるかどうか決定する。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が推定ＤＮＡ標的に結合すると、ｇＲＮＡ標的配列の３’末端にある「シード」配列が標的ＤＮＡにアニールし始める。シードＤＮＡ配列及び標的ＤＮＡ配列が一致する場合に、ｇＲＮＡは、（ｇＲＮＡの極性に対して）３’から５’の方向で標的ＤＮＡにアニールし続けるであろう。
【０００７】
近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに加えて、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが、標的ゲノム工学のためにますます重要となっている（Ｚｅｔｓｃｈｅら、前述、及び欧州公開特許第３ ００９ ５１１号Ａ２（ＥＰ ３ ００９ ５１１ Ａ２）を参照されたい）。Ｖ型システムは、ＩＩ型システムと共に、クラス２のＣＲＩＳＰＲシステムに属する（Ｍａｋａｒｏｖａ及びＫｏｏｎｉｎ法、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０１５， １３１１：４７−７５３）。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富んだクラスターの対応物に加えて、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む大きいタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、全てＣａｓ９タンパク質中に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入物を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列に近接している（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ， ２０１４； Ｍａｋａｒｏｖａ， ２０１５）。Ｃｐｆ１エフェクターは、Ｃａｓ９エフェクターとは確実な違いを有し、すなわちＣＲＩＳＰＲアレイ処理のために追加のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とせず、短いＴリッチＰＡＭにより標的ＤＮＡを効率的に切断し（Ｃａｓ９とは対照的に、ＰＡＭはＧリッチ配列に続く）、かつＣｐｆ１によるねじれＤＮＡ二本鎖切断を導入する。ごく最近、ＣａｓＸ及びＣａｓＹに基づく追加の新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが同定され、これは、比較的小さいエフェクタータンパク質のサイズにより、多くの遺伝子編集又はゲノム工学アプローチに対して特に興味深いものである（Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、"Ｎｅｗ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅｓ"， Ｎａｔｕｒｅ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１６）。ＣＲＩＳＰＲシステムの特異性は、ｇＲＮＡ標的配列がゲノムの残りの部分と比較してゲノム標的に対してどれくらい特異的であるかによって大部分が決定される。
【０００８】
植物界は、緑藻、コケ植物、シダ植物及び陸生植物のゲノム並びに表現型の違いをもたらす高い不均一性及び多様性の種を含む。植物ゲノム及びそれらの複雑さは、高精度の遺伝子編集又はゲノム工学にとって難題である。トウモロコシ（Zea mays）（ｍａｉｚｅ又はｃｏｒｎ）は、例えば、全穀物作物の中で、２０１２年には８億７５００万トンの収量である、世界で最も高い生産量を有する。それは１０の単数染色体数を有する約２．４ギガベース（Ｇｂ）の大きなゲノムを有する（Ｓｃｈｎａｂｌｅら、２００９；Ｚｈａｎｇら、２００９）。トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum）（パンコムギ）は、例えば、〜１７Ｇｂと推定されるゲノムサイズを有する六倍体である。ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）亜種ブルガリス（vulgaris）（サトウダイコン）は、約４７０メガベース（Ｍｂ）〜約５６９Ｍｂの範囲のゲノムサイズを有する。植物細胞の特定の構造及び組成、並びに植物の特有の発達は、植物細胞内の標的配列を改変するための使用を意図する場合に、ゲノム工学ツールについての特定の適応を要求する。したがって、動物、特に哺乳動物のシステムのために確立されたゲノム工学ツール及びそれに関連する原理は、必ずしも目的の植物細胞において機能するとは限らず、植物において広範な適用を達成するための技術を確立するための特定の戦略が必要である。
【０００９】
同様に、動物、及び特に哺乳動物のゲノムは複雑であり、例えば、ハツカネズミ（Mus musculus）のゲノムについて２．７Ｇｂ又はホモサピエンス（Homo sapiens）のゲノムについて３．２Ｇｂを含む。特に、ＣＲＩＳＰＲを基礎とする遺伝子編集又はゲノム工学のアプローチをヒトゲノム内の標的の正確な遺伝子編集又はゲノム工学のために使用することが意図される場合に、あらゆる種類のオフターゲット効果が非常に有害でありうるために、高い特異性を提供する緊急の必要性がある。
【００１０】
一般に二本鎖切断（ＤＳＢ）又はＤＮＡ損傷がゲノムの完全性にとって有害であるため、ゲノム工学に関して決定的に考慮されるべき他の態様は、目的のゲノム標的部位の切断後に必要な修復機構である。ゲノム材料中のＤＳＢは、複製中に電離放射線、化学物質、酸化、酵素、及び一本鎖切断によって生じてよく、遺伝子喪失、失速したＤＮＡ複製、及び細胞死をもたらしうる深刻な形態のＤＮＡ損傷を示す。したがって、細胞機構が二本鎖切断（ＤＳＢ）修復のメカニズムを提供することが非常に重要である。細胞は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ損傷のいずれかの修復を試みる固有のメカニズムを有する。ＤＳＢ修復メカニズムは、２つの主要な基本型、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）に分けられている。一般に、相同性を基礎とする修復メカニズムは、通常、相同組換え修復（ＨＯＲ）と言われる。
【００１１】
ＮＨＥＪは、相同配列を必要としないが、しばしば誤りがちであり、したがって潜在的に変異原性である動物及び植物において優位な核応答である（Ｗｙｍａｎ Ｃ， Ｋａｎａａｒ Ｒ． "ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ− ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ： ａｌｌ'ｓ ｗｅｌｌ ｔｈａｔ ｅｎｄｓ ｗｅｌｌ"， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２００６； ４０， ３６３−８３）。ＨＯＲによる修復は相同性を要求するが、破壊されたものを修復するために無傷の染色体を使用するＨＯＲ経路、すなわち二本鎖切断修復及び合成依存鎖アニーリング（synthesis-dependent strand annealing）は非常に正確である。古典的なＤＳＢ修復経路において、３’末端が無傷の相同鋳型に侵入し、そしてＤＮＡ修復合成のためのプライマーとして作用し、最終的に二重ホリデイジャンクション（ｄＨＪ）の形成をもたらす。ｄＨＪは、侵入鎖の伸長が第２のＤＳＢ末端からＤＮＡを「捕獲」及び合成する場合に形成される四本鎖分岐構造である。個々のＨＪは、２つの方法のうちの１つでの切断により分解される。合成依存鎖アニーリングは保存的であり、もっぱら非乗換え事象（non-crossover event）をもたらす。これは、全ての新たに合成された配列が同一の分子上に存在することを意味する。ＮＨＥＪ修復経路とは異なり、合成依存鎖アニーリングにおける鎖侵入及びＤループ形成に続いて、侵入鎖の新たに合成された部分を、鋳型から移動し、他のＤＳＢ末端での非侵入鎖の処理した末端に戻す。非侵入鎖の３’末端は、伸長され、連結されてギャップを満たす。ＨＯＲのさらなる経路があり、まだ完全に特徴付けられていない破壊誘発修復経路（break- induced repair pathway）と言われる。この経路の中心的な特徴は、修復のために使用されうるＤＳＢでの唯一の侵入末端の存在である。
【００１２】
さらなるＨＯＲ経路は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）である。ＳＳＡは、非保存性であり、３０ｂｐ超の直列反復配列間で生じ、欠失をもたらす。近年、マイクロホモロジー媒介末端連結（ＭＭＥＪ）は、真核生物におけるＤＳＢ修復の特徴的なタイプとして認識されている。相同性の非常に短い（２〜１４ｂｐ）領域のみが、この経路のために要求され、そしてそれは、典型的にＳＳＡのような欠失を放置する。それは、ＨＲ及びＮＨＥＪ経路と遺伝的に区別されており、哺乳動物細胞においてＮＨＥＪに対する補助として作用する（以下から公知である、Ｔ．， Ｈｕｑ， Ｅ．， & Ｈｅｒｒｉｎ， Ｄ． Ｌ． （２０１０）． "Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．" Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １０７（３１ ）， １３９５４−１３９５９）。要約すると、ＨＲ／ＨＯＲは、鋳型として姉妹染色分体上で相同な一続きのＤＮＡを使用する。したがって、高いフェデリティーが得られるが、しかしながら効率は低下する。対照的に、ＮＨＥＪは非常に効率的であり、有意な相同性とは無関係に両端を再結合することができる直接的な経路であるが、一方でこの効率は、このプロセスがエラーを生じやすく、かつ挿入又は欠失に関連しうるという欠点を伴う。
【００１３】
したがって、自然な修復経路に影響を与えようとする遺伝子編集又はゲノム工学的アプローチのために、重要なパラメータである修復鋳型（ＲＴ）の物理的設計が必要である。ｓｓＤＮＡ又は部分的ｄｓＤＮＡのいずれかとしてＲＴを提供することが可能であってよい。修復鋳型（ＲＴ）と組み合わせてゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲツールに依存する現在のプロトコルは、二本鎖又は一本鎖のいずれかの核酸ＲＴの個別の提供にもっぱら依存しており、それは、塩基対及びハイブリダイゼーションによってのみ修復されるＤＮＡにおける切断を順に認識する。しかしながら、ＤＮＡ切断が誘発される部位でのＲＴの物理的及び時間的な有効性は、それらの方法が区画での正しい配置、濃度、及びしたがって化学量論量におけるＲＴの正確な空間的及び時間的な供給を提供しないため、現在利用可能な方法により制御できず、修復を実施すべきである場合に、好ましくは標的ＤＮＡ切断の誘導直後に、切断だけでなく修復の事象も特異的に制御する。
【００１４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと同様に、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ（「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ」）は、核酸ガイドを使用して標的配列を特定し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質成分によって切断されることにより、外来核酸に対する防御に関与する。特に、Ａｒｇｏｎａｕｔｅは、設計された又は合成の核酸−ターゲティング核酸との複合体を形成することにより、標的核酸を結合及び切断することができ、標的核酸の切断は、標的核酸中に二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓ９システムも同様に、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ核酸ガイドは、エンドヌクレアーゼ配列特異性をプログラムするための容易な方法を提供している。しかしながら、短いｓｓＲＮＡ分子は、あらゆる第二の構造認識制限条件、例えばＣａｓ９−一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ）相互作用において存在するものを有さない、多くの真核性Ａｒｇｏｎａｕｔｅによりガイドとして使用される。したがって、大部分の真核細胞中の豊富なｓｓＲＮＡは、ＲＮＡ誘導真核性Ａｒｇｏｎａｕｔｅの特異的な標的化を潜在的な課題にする。対照的に、いくつかの原核性Ａｒｇｏｎａｕｔｅは、短い５’リン酸化ｓｓＤＮＡ分子により誘導され（Ｓｗａｒｔｓ， Ｄ．Ｃ．ら、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ａ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５０７， ２５８−２６１， ２０１４； Ｓｗａｒｔｓ， Ｄ．Ｃ．ら、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ｉｓ ａ ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ ｃｏｇｎａｔｅ ＤＮＡ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３， ５１２０−５１２９ ２０１５）、したがって、真核細胞に存在する短いｓｓＤＮＡ分子の不足により、宿主細胞由来の核酸による誤誘導の可能性が本質的に低い。したがってＤＮＡ誘導Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼは、真核性ゲノム編集における適用のための可能性を有する。しかしながら、植物におけるナトロノバクテリウム・グレゴリーのＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）システムの使用は、これまで証明されていない。
【００１５】
文献において、２つの配列間の相同組換えは、その配列が有意な量の分離を伴うよりもむしろ核内でごく接近している場合に、より頻繁に生じることが証明されている。例えば、染色体に位置するドナー分子及び標的の間で得られた遺伝子編集率のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）における分析は、ドナーが標的と同一染色体上に存在する両方の場合において、２つの遺伝子座が異なる染色体上に位置する他の場合よりも高かった（Ｆａｕｓｅｒら、２０１２）。しかしながら、これらの調査結果は、真核細胞における部位特異的エンドヌクレアーゼを基礎とする遺伝子編集又はゲノム工学のアプローチを最適化するために合理的な方法で決して利用されていない。
【００１６】
欧州公開特許第２ ９５８ ９９６号Ａ１（ＥＰ ２ ９５８ ９９６ Ａ１）は、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）又はヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）によって媒介される遺伝子破壊を増加させるために細胞内にＮＨＥＪメカニズムの阻害剤を提供することによって特異的ＤＳＢ修復の問題を克服することを試みている。ＤＮＡ依存型プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）及び／又はポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１／２）の小分子阻害剤を使用して、これらのＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路の重要な酵素活性を阻害することによって、ヌクレアーゼによる遺伝子破壊のレベルは、古典的なＮＨＥＪ、例えば代替的なＮＨＥＪ及び／又はマイクロホモロジー媒介末端連結よりもエラーを生じやすい修復経路を頼ることで細胞を強制することによって増加する。したがって、追加の化学物質がゲノム編集の過程で追加されるが、しかしこれはいくつかの細胞型及びアッセイについて不利である可能性がある。これは、処理した細胞のゲノムの完全性及び／又は再生能にも影響しうる。
【００１７】
Ｍａら（２０１６， ＪＣＢ， ２１４（５）：５２９， "ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ"）は、テロメア標的に対するＣａｓ９の動態及びｓｇＲＮＡ動態を研究するために、蛍光受容体のアプタマーベースの結合を可能にする３’−修飾したｓｇＲＮＡを使用した。特に、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内での改変は、ターゲティングに影響しなかった。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の続く短縮化のみが、アプタマー修飾とは無関係に不安定化させたｓｇＲＮＡをもたらした。
【００１８】
したがって、例えば、目的の細胞における標的部位のために最適化されたｇＲＮＡを提供し、かつ同時に高精度であり正確なＨＯＲを媒介する可能性及びしたがって遺伝子編集又はゲノム工学の介入を制御するために不可欠であるＤＳＢの標的修復を提供することにより、高精度ゲノム切断を組み合わせた、適したＣＲＩＳＰＲツール、具体的には、植物、特に主要作物植物の精密な編集のために最適化されたツールを提供することにおける継続的な必要性が存在する。
【００１９】
したがって、酵母、動物及び植物細胞を含む真核細胞に特に適しているが原核細胞にも適している高精度のゲノム編集のため、例えば代謝工学及び種々の他の目的のための修復鋳型、又はウイルスゲノムの改変のため、例えばウイルスを弱毒化するため、もしくはウイルスの毒性を低減するための修復鋳型を提供するための新規の戦略を提供することが目的である。バイオテクノロジーにおける、例えば標的とした形質開発のための治療的アプローチ、遺伝子治療又は植物もしくは微生物ゲノム工学のための、ゲノム編集のとてつもない進歩にもかかわらず、導入されるべき標的ゲノムの改変の特異性又はオフターゲット効果に関して依然として大きな問題及び懸念がある。この問題は、とりわけ、目的のゲノム標的核酸の切断及び関連する修復を誘発する場合に得られる精度の程度に関係する。
【００２０】
ＤＳＢを誘発するあらゆる種類の遺伝子編集又はゲノム工学アプローチは、望ましくない核酸交換を引き起す、潜在的に有害なＤＮＡ切断及びおそらく所望されていないＤＮＡ修復メカニズムを導入するため、標的ＤＮＡ修復鋳型（ＲＴ）の使用も含意する高精度で制御された遺伝子編集又はゲノム工学を達成するためのより効率的な方法及びツールを開発することが継続的に必要とされている。
【００２１】
オフターゲット効果を媒介することなく成功したゲノム工学を提供することにしばしば関連する別の問題は、厳密に、切断が起き、したがって修復されなければならない時点でＤＳＢの部位での修復鋳型の物理的有効性である。通常、所望の編集の事象は、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）経路を介するか又は前述した内因性相同配列での組換えを介する修復によって打ち負かされる。改変される標的生物に依存して、これは、目的の修復鋳型と一緒に遺伝子編集又はゲノム工学のツールを導入するための一致した戦略を要求し、その結果、全てのツールが、適切なタイミングで、ゲノムを含む細胞内の区画、すなわち好ましくは核、又は任意の他のゲノム保有区画、例えばミトコンドリアに到達すことができる。この制限を部分的に克服するための方法の１つは、修復鋳型を増幅し、それにより核内の鋳型の存在量を増加させ、そしておそらくジェミニウイルスベクターの助けによるＤＳＢの修復のために使用することをより有効にすることによる方法である（例えば、Ｍａｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． ２０１４， ｄｏｉ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１１４．１２２６０６；及びＢａｌｔｅｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． ２０１４， ｄｏｉ： １０．１ １０５／ｔｐｃ．１１３．１１９７９２を参照されたい）。しかしながら、修復鋳型は別個の物理的実体として送達され、したがって、ＤＳＢがエンドヌクレアーゼにより導入される時点で、ＤＮＡ修復が正確に必要とされる場所で、修復鋳型が実際に存在することを確認することを制御するメカニズムはない。
【００２２】
ＣＲＩＳＰＲ適用に関して、遊離ｓｓＤＮＡヌクレオチドを修復鋳型又はプラスミド由来の修復鋳型として使用することが頻繁に提案されているが、まだ戦略は開示又は示唆されておらず、これは、ＤＳＢが生じた場合に、修復鋳型が実際にｉｎ ｓｉｔｕで修復されるべきＤＳＢと物理的に接触することを保証する。
【００２３】
ビオチン−ストレプトアビジン及びビオチン−アビジンの相互作用は、１０-15Ｍの解離定数Ｋdで本質的に最も安定している。この関連性は、アビジン又はストレプトアビジンのタンパク質（それぞれ１サブユニットあたり〜１６．５ｋＤａ及び１３．２ｋＤａ）と、普遍的に存在するが存在量の少ないビタミンビオチンとの間のホモ四量体構造に基づく。ホモ四量体のストレプトアビジン又はアビジン複合体は、自然発生的に形成され、かつ低い解離定数を有する４つのビオチン分子を結合することができる。少なくとも２つの試みにおいて、自然発生的四量体化は、結合親和性の低下により克服できた（Ｌａｉｔｉｎｅｎら、２００３， "Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ａｖｉｄｉｎ Ｍｏｎｏｍｅｒ．" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８（６）： ４０１０−４０１４； Ｍａｎｎら、２０１６， "Ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．" ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ４（３）： １−７）。同様に、ヌクレアーゼのビオチン化は、配列中にビオチン化シグナルを含むことにより可能であることが証明された（Ｋａｙら、２００９， "Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．" Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．） ４９８： １８５−１９６）。ＢｉｒＡは、細菌タンパク質発現のための可能なビオチン化酵素であるが、ビオチン化は高等植物においても生じる（Ｔｉｓｓｏｔら、１９９６， "Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ： ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎ ｈｏｌｏｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｐｅａ （Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ） ｌｅａｖｅｓ．"， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３１４（Ｐｔ ２）： ３９１−３９５）。
【００２４】
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと連結したイムノグロブリンの重鎖（ＶH）及び軽鎖（ＶL）の可変領域の融合タンパク質を示し、かつ可変性の高親和性結合分子として公知である。二価の一本鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することにより操作されてよい。これは、タンデムｓｃＦｖをもたらす、２つのＶH領域及び２つのＶL領域を有するシングルペプチド鎖を生じることにより達せられうる（Ｋｕｆｅｒら、２００４， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２２（５）， ２３８−２４４； Ｘｉｏｎｇら， ２００６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， １９（８），  ３５９−３６７）。
【００２５】
これまで、ビオチン化分子及びそれらの同族結合パートナーの能力について、又は例えば抗体又は一本鎖可変フラグメント及びそれらの同族パートナーのような他の高親和性分子結合対についてのこれらの発見は、しかしながら、部位特異的ヌクレアーゼ及び修復鋳型を使用して標的化したゲノム工学のために未だ活用されていなかった。
【００２６】
この点で、異なる標的細胞に必要な遺伝子編集又はゲノム工学及び／又は修復鋳型ツールの導入の特有の差異が明らかになる。これに関して、植物細胞は、細胞壁を含む特定の顕著な特徴を有し、植物細胞における遺伝子編集又はゲノム工学を、動物／哺乳動物細胞について確立された遺伝子編集又はゲノム工学とは完全に異なる作業課題にしている。それというのも、ゲノム編集及び／又は修復ツールの導入は、他の真核細胞とは異なる形質転換、形質移入及び／又は形質導入の方法によって媒介されるからである。しかしながら、これらの特性は、非常に正確な植物ゲノム編集を達成するために考慮されなければならない。したがって、本発明の目的は、植物細胞を含む真核細胞における高精度のゲノム編集に適した新たなツール及び方法を提供することにおける顕著な必要性を克服すること、特にＣＲＩＳＰＲ及びＡｒｇｏｎａｕｔｅ媒介ゲノム編集の分野において、ＤＳＢが修復される部位及びその時点での修復鋳型の物理的有効性に関する遺伝子編集の分野における進行中の制限、及びしたがって非相同末端連結経路（ＮＨＥＪ）を介した又は（内因性）相同配列（ＨＲ／ＨＯＲ）での組換えを介したＤＮＡ修復メカニズムによる競合を克服することである。本発明の他の目的は、ＤＮＡ認識、切断及び修復鋳型特性を一様にする分子又は分子複合体を提供することにより、真核細胞又は原核細胞における、又は任意の原核性、真核性又はウイルス性ゲノムに対する部位特異的ゲノム編集のために利用されることができ、同時に、標的部位、すなわち原核細胞、真核又はウイルス性ゲノム、特に動物細胞、特に哺乳動物細胞、又は植物細胞のゲノムに容易に導入することができる、任意の部位特異的ヌクレアーゼに適し、かつ核酸誘導ＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼに制限されない単純化された部位指向ヌクレアーゼツールキットを提供することであり、それというのも、動物又は植物細胞のゲノム編集中に達せられる精度の程度は、医学及び食品管理当局によって設定される必然的に高い規制要件を満たすために依然として改善されなければならないからである。本明細書において開示される人工分子複合体のオフターゲット組み込みの危険性は、遊離分子として細胞に導入されるｓｓ−ＤＮＡ又はｄｓ−ＤＮＡ修復鋳型よりも低い。さらに、植物特異的導入方法を助ける植物特異的ゲノム編集構築物を形質移入するために特に最適化された導入ツールを提供することが目的であった。さらに、生産プロセスにおける中間体として外来ＤＮＡを統合するあらゆる形態の遺伝子改変に対する特定の権限における感応性の理由で、必要に応じて、一時的に提供されるＲＮＡ及び部位特異的ヌクレアーゼを使用して一時的な編集活性に依存できるアプローチを提供することが目的であった。最終的に、本発明の目的は、面倒なクローニング及び予備試験を必要としないため、新たな標的の試験に関して時間節約であるという点で最近の方法より優れている遺伝子編集又はゲノム工学の方法を提供することであった。
【００２７】
発明の要約
前記目的は、本発明に従って、修復鋳型をヌクレアーゼ複合体に対する「カーゴ」として直接利用することによってＤＳＢの部位に導入することにより、修復鋳型の有効性の問題を解決することによって達せられる一方で、このアプローチに適したヌクレアーゼのスペクトルは、目的の任意の部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）に依存して、人工分子複合体を提供することにより劇的に増加されている。少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）を少なくとも１つのＳＳＮと一緒に提供することにより、ｉｎ ｓｉｔｕでの切断時に修復鋳型を二本鎖切断させ、その際、修復鋳型ドッキングドメインは、切断の修復における活用のための修復鋳型（ＲＴ）の局所利用能を増加する少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）と直接相互作用するように設計される。それによって、本発明による人工分子複合体は、特注の修復鋳型を提供することを補助するだけでなく、さらに遺伝子編集の事象の頻度及び／又は特異性を増加させるのを助けることができる。したがって、このアイデアは、ゲノム編集ツール及び／又は修復鋳型を標的細胞内の目的の区画に導入するための特定の導入ツール及び方法と組み合わせた、同時のゲノム切断及び標的修復のために、部位特異的ヌクレアーゼ及び修復鋳型の機能性と単一の分子複合体とを組み合わせる。したがって、このシステムは、大型動物、特に哺乳動物、又は時にはさらにより複雑な植物ゲノムにおけるオフターゲット分裂を最小限にするために必要である、本編集アプローチのより高い特異性、及びしたがってオフターゲット効果の低減を可能にする。
【００２８】
特に、前記目的は、第一の態様において、（ａ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）もしくはそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする核酸配列、及びそれらと直接相互作用するもの、（ｂ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）、又はそれらをコードする核酸配列、ここで修復鋳型ドッキングドメインは、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）と直接相互作用するように設計されている、を含み、（ｃ）任意に少なくとも１つの相互作用ドメイン（ＩＡ）、又はそれらをコードする核酸配列を含む人工分子複合体を提供することによって達成され、その際、少なくとも１つの相互作用ドメインは、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメントと直接相互作用し、かつ少なくとも１つの相互作用ドメインは、（ｉ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインとの相互作用、及び／又は（ｉｉ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との相互作用、及び／又は（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡとの配列特異的相互作用からなる群から選択される機能性の少なくとも１つを提供するように設計され、ここで、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのゲノム相補性配列に相補的である少なくとも１つの部位を含み、かつ少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、ＤＮＡ標的配列の修復を媒介するように設計される。
【００２９】
本発明の種々の態様に従った一実施形態において、人工分子複合体であって、部位特異的ヌクレアーゼ、又はそれらをコードする核酸配列が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、ＦｏｋＬ又はそれらの多様体を含むＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ、又は２つの部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、又はそれらの多様体もしくはそれらの触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される人工分子複合体が提供される。
【００３０】
他の実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン、又はそれらをコードする核酸配列が、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質染料、例えば蛍光体、例えばフルオレセイン、又はそれらの多様体、マレイミド、又はテトラゾリウム（ＸＴＴ）、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に設計されたガイド核酸配列、ストレプトアビジン、又はそれらの多様体、好ましくは単量体ストレプトアビジン、アビジン、又はそれらの多様体、アフィニティタグ、好ましくはストレプトアビジンタグ、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボディ）、アンチカリン、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質又はそれらのドメイン、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ又はそれらのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ*タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質又はそれらのドメイン、又はジゴキシゲニンの少なくとも１つから選択される人工分子複合体が提供される。相互作用についての他の周知のシステムは、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ． （ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）により提案されたようなｄＣａｓ９に融合されるＳＮＡＰタグである。ＳＮＡＰタグは、蛍光体、ビオチン、及び他のコンジュゲートの系列を結合することができる。主な目的は、視覚化を可能にすることであるが、修復鋳型の連結にも有用である。
【００３１】
本発明に従った前記第一の態様のさらなる他の実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの相互作用ドメイン、又はそれらをコードする核酸配列が、ＤＮＡ結合ドメイン、ストレプトアビジン、又はそれらの多様体、好ましくは単量体ストレプトアビジン、アビジン、又はそれらの多様体、アフィニティタグ、ビオチン化シグナル、ビオチン受容体部位、ストレプトアビジンタグ、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボティ）、アンチカリン、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質染料、例えば蛍光体、例えばフルオレセイン、又はそれらの多様体、マレイミド、又はテトラゾリウム（ＸＴＴ）、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に設計されたガイド核酸配列、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質又はそれらのドメイン、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ又はそれらのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ*タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質又はそれらのドメイン、又はジゴキシゲニンの少なくとも１つから選択される人工分子複合体が提供される。
【００３２】
さらに他の実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つの相互作用ドメインが、少なくとも１つの核局在化配列、色素体局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含む人工分子複合体が提供される。
【００３３】
本発明の種々の態様に従った他の実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列が、少なくとも１つの末端部位、好ましくは３’末端を含み、この末端部位が、人工分子複合体の任意の他の成分と相互作用せず、したがってＤＮＡ標的配列の修復を媒介するための少なくとも１つのゲノム相補性配列にハイブリッドするように設計され、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列がプラスミドとして提供される、人工分子複合体が提供される。
【００３４】
さらに他の実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする配列が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから、好ましくはＣａｓ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼ、又はＦｏｋＩヌクレアーゼ、又はそれらの触媒フラグメントから選択され、かつ少なくとも１つの相互作用ドメイン、又はそれらをコードする配列が、一本鎖可変フラグメント又は単量体ストレプトアビジンから選択される人工分子複合体が提供される。
【００３５】
さらに、他の実施形態において、人工分子複合体であって、該複合体が、少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインを示す少なくとも１つのガイド核酸配列を含み、少なくとも１つのガイド核酸配列のそれぞれが、（ｉ）認識ＤＮＡ標的配列に相補的である第一の配列部位と（ｉｉ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼと相互作用するように設計された第二の配列部位とを含み、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１つのガイド核酸配列が、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と物理的に会合して、少なくとも１つのＲＮＡもしくはＤＮＡ及び少なくとも１つのさらなるＤＮＡ核酸配列を含むか又はそれらからなるハイブリッド核酸を形成し、及び（ｉｖ）任意に少なくとも１つのガイド核酸配列と少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域を含むハイブリッド核酸配列を形成し、好ましくは修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列の３’末端でガイド核酸配列と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列の５’末端で会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列内に位置している、人工分子複合体が提供される。
【００３６】
他の実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つのガイド核酸配列が、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基修飾を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここで、ガイド核酸配列は、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む、人工分子複合体が提供される。
【００３７】
さらに本発明の種々の態様に従ったさらなる実施形態において、人工分子複合体であって、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらをコードする配列、及び少なくとも１つの相互作用ドメイン又はそれらをコードする配列、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン又はそれらをコードする配列が、少なくとも１つのリンカードメインにより連結されている人工分子複合体が提供される。
【００３８】
提供される実施形態の１つにおいて、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする配列は、Ｃａｓポリペプチドであって、ストレプトコッカス属（Streptococcus）種、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、又はナイセリア属（Neisseria）種、例えばナイセリア・メニンギチダス（Neisseria meningitides）、コリネバクテリア属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifactor）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、バクテロイド属（Bacteroides）、フラビイボラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、スピロヘータ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリラム属（Azospirillum）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ロゼブリア属（Roseburia）、パルビバクラム属（Parvibaculum）、ニトラチフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カンジダタス・ミクラルケウム・アシジフィルム（Candidatus Micrarchaeum acidiphilum）ＡＲＭＡＮ−１、パルクバクテリア属（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰＧ８０６５６．１）、スルホロブス属（Sulfolobus）種、例えばスルホロブス・アイランジカス（Sulfolobus islandicus）ＨＶＥ１０／４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８１７７０．１）又はＲＥＹ１５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８４８５２．１）、及びカンジダタス・パルバルケウム・アシジフィルム（Candidatus Parvarchaeum acidiphilum）ＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓポリペプチド、Ｃｐｆ１ポリペプチドであって、古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチド、例えばアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）種、例えばアシダミノコッカス属種ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）種、例えばラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６、ラクノスピラ科細菌ＭＣ２０１７、ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Butyrivibrio proteoclasticus）、カンジダタス属（Candidatus）種、メタノプラズマ・ターミツム（Methanoplasma termitum）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、モラクセラ・ボヴォクリ（Moraxella bovoculi）２３７、ペレグリニバクテリア属（Peregrinibacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア属（Parcubacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Smithella）種ＳＣＡＤＣ、スミセラ属種ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７、フランシセラ属（Francisella）種、例えばフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、プレポテラ属（Prevotella）種、又はポルフィロモナス属（Porphyromonas）種のＣｐｆ１ポリペプチド、又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼであって、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Natronobacterium gregoryi）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＺ７３７４９．１）、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１２２６５２０９．１又はＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００２７４７７９５．１又はＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ��０１２２６５２０９．１）、ハロゲオメトリカム・パリダム（Halogeometricum pallidum）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＬＺ２９０１７．１）、ナトリアラバ・アジアティカ（Natrialaba asiatica）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６１１１０８５．１）、ナトロノルブラム・チベテンス（Natronorubrum tibetense）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６０９０８３２．１）、ナトリネマ・ペリルブラム（Natrinema pellirubrum）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６１８３３３５．１）、又はシネココッカス属（Synechococcus）種（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１１３７８０６９．１）からのＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ、又はそれらの多様体及び／又は機能的フラグメント及び／又は組み合わせ、例えばニッカーゼ、又はヌクレアーゼ欠乏ヌクレオチド鎖切断活性からなる群から独立して選択される。
【００３９】
本発明に従った第二の態様において、疾患の治療方法において使用するための前記実施形態のいずれか１つに従った人工分子複合体が提供され、その際疾患は、少なくとも１つのゲノム変異により特徴付けられ、かつ人工分子複合体は、少なくとも１つのゲノム変異を標的とし、かつ修復するように設計される。したがって、前記実施形態のいずれか１つに従った人工分子複合体を使用する疾患の治療方法が提供され、その際疾患は、少なくとも１つのゲノム変異により特徴付けられ、かつ人工分子複合体は、少なくとも１つのゲノム変異を標的とし、かつ修復するように設計される。
【００４０】
さらなる態様において、前記態様及び／又は実施形態のいずれか１つに従った少なくとも１つの人工分子複合体を含むか又は該人工分子複合体によって編集された、植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫が提供される。
【００４１】
さらに他の態様において、以下のステップ：（ｉ）目的のゲノム領域における少なくとも１つのゲノム相補性配列及び少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを準備するステップ、（ｉｉ）前記態様及び／又は実施形態のいずれか１つにおいて定義された少なくとも１つの人工分子複合体を準備するステップ、（ｉｉｉ）少なくとも１つの人工分子複合体と少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を適した条件下で接触させて、（ａ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼと少なくとも１つのＤＮＡ標的配列との相互作用、及び（ｂ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と少なくとも１つのゲノム相補性配列との相補的塩基対を得て、少なくとも１つの相補性配列の認識及び少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼによる少なくとも１つのＤＮＡ切断の導入を得るステップ、ここで少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の部位で相同性により方向付けられた修復を指示する、並びに（ｉｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を含む少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを得るステップを含む、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法が提供される。
【００４２】
前記態様の一実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法であって、人工分子複合体の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインが、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼとは無関係に少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムに提供され、かつ少なくとも１つの人工分子複合体が、少なくとも１つの原核又は真核又はウイルスのゲノム及び／又は細胞内で構築又は部分的に構築されている、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法が提供される。
【００４３】
前記態様のさらなる実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法であって、少なくとも１つの人工分子複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏで構築された人工分子複合体である、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法が提供される。
【００４４】
前記態様のさらなる実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法であって、少なくとも１つの真核細胞が、植物細胞、好ましくは、オオムギ（Hordeum vulgare）、ホルデウム・ブルブソム（Hordeum bulbusom）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarium）、ゼア属（Zea）種、例えばトウモロコシ（Zea mays）、アワ（Setaria italica）、オリザ・ミヌタ（Oryza minuta）、イネ（Oryza sativa）、オリザ・オーストラリエンシス（Oryza australiensis）、オリザ・アルタ（Oryza alta）、コムギ（Triticum aestivum）、マカロニコムギ（Triticum durum）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticale）、リンゴ（Malus domestica）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、ハマムギクサ（Hordeum marinum）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ゴウシュウヤブジラミ（Daucus glochidiatus）、ベータ属（Beta）種、例えばサトウダイコン（Beta vulgaris）、ダウクス・プシルス（Daucus pusillus）、ダウクス・ムリカツス（Daucus muricatus）、ノラニンジン（Daucus carota）、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、ブドウ（Vitis vinifera）、エリスランテ・グタタ（Erythrante guttata）、ゲンセリア・アウレア（Genlisea aurea）、キュウリ（Cucumis sativus）、マルバグワ（Marus notabilis）、アラビドプシス・アレノサ（Arabidopsis arenosa）、アラビドプシス・リラタ（Arabidopsis lyrata）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、クルシヒマラヤ・ヒマライカ（Crucihimalaya himalaica）、クルシヒマラヤ・ワリチイ（Crucihimalaya wallichii）、カルダミン・ネクスオサ（Cardamine nexuosa）、マメグンバイナズナ（Lepidium virginicum）、ナズナ（Capsella bursa pastoris）、オルマラビドプシス・プミラ（Olmarabidopsis pumila）、ヤマハタザオ（Arabis hirsute）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ダイコン（Raphanus sativus）、ブラシカ・ユンカセア（Brassica juncacea）、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ルッコラ（Eruca vesicaria subsp. sativa）、オレンジ（Citrus sinensis）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、シセル・ヤマシタ（Cicer yamashitae）、シセル・ビユグム（Cicer bijugum）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、シセル・レチクラツム（Cicer reticulatum）、シセル・ユダイクム（Cicer judaicum）、カヤヌス・カヤニフォリウス（Cajanus cajanifolius）、ビロードヒメクズ（Cajanus scarabaeoides）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ダイズ（Glycine max）、ワタ属（Gossypium）種、ゲンゲ（Astragalus sinicus）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、ハナウリクサ（Torenia fournieri）、タマネギ（Allium cepa）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、及びニラ（Allium tuberosum）からなる群から選択される植物、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からの植物細胞である、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法が提供される。
【００４５】
さらなる実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法であって、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変が、収量改善、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、酸化ストレス、重金属ストレス、塩ストレスもしくは浸水を含む非生物的ストレスに対する耐性、昆虫に対する耐性、細菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、真菌に対する耐性もしくは線虫に対する耐性を含む生物的ストレスに対する耐性、グリホサート、グルホシネート、ＡＬＳ阻害剤及びジカンバを含む除草剤に対する耐性、倒伏抵抗性、開花期、脱粒抵抗性、種子の色、胚乳組成、栄養含有量、又は少なくとも１つの植物細胞における分子薬学アプローチを可能にするゲノム編集を含む代謝工学からなる群から選択される形質編集を生じる、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法が提供される。
【００４６】
さらに次のステップ：（ｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を含む、少なくとも１つの原核、真核又はウイルスのゲノム及び／又は細胞を同定及び／又は選択するステップを含む、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法がさらに提供される。
【００４７】
さらに他の態様において、次のステップ：（ｉ）前記態様及び／又は実施形態のいずれか１つに従った方法を実施するステップ、ここで少なくとも１つの真核細胞は植物細胞である、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの少なくとも１つの植物細胞から少なくとも１つの植物又はそれらの子孫を得るステップ、（ｉｉｉ）任意に、少なくとも１つの植物又はそれらの子孫の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を決定するステップを含む、植物又は植物細胞を作製するための方法が提供される。
【００４８】
一実施形態において、植物又は植物細胞を作製するための方法であって、少なくとも１つの植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物から選択され、好ましくは、植物が、オオムギ（Hordeum vulgare）、ホルデウム・ブルブソム（Hordeum bulbusom）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarium）、ゼア属（Zea）種、例えばトウモロコシ（Zea mays）、アワ（Setaria italica）、オリザ・ミヌタ（Oryza minuta）、イネ（Oryza sativa）、オリザ・オーストラリエンシス（Oryza australiensis）、オリザ・アルタ（Oryza alta）、コムギ（Triticum aestivum）、マカロニコムギ（Triticum durum）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticale）、リンゴ（Malus domestica）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、ハマムギクサ（Hordeum marinum）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ゴウシュウヤブジラミ（Daucus glochidiatus）、ベータ属（Beta）種、例えばサトウダイコン（Beta vulgaris）、ダウクス・プシルス（Daucus pusillus）、ダウクス・ムリカツス（Daucus muricatus）、ノラニンジン（Daucus carota）、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、ブドウ（Vitis vinifera）、エリスランテ・グタタ（Erythrante guttata）、ゲンセリア・アウレア（Genlisea aurea）、キュウリ（Cucumis sativus）、マルバグワ（Marus notabilis）、アラビドプシス・アレノサ（Arabidopsis arenosa）、アラビドプシス・リラタ（Arabidopsis lyrata）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、クルシヒマラヤ・ヒマライカ（Crucihimalaya himalaica）、クルシヒマラヤ・ワリチイ（Crucihimalaya wallichii）、カルダミン・ネクスオサ（Cardamine nexuosa）、マメグンバイナズナ（Lepidium virginicum）、ナズナ（Capsella bursa pastoris）、オルマラビドプシス・プミラ（Olmarabidopsis pumila）、ヤマハタザオ（Arabis hirsute）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ダイコン（Raphanus sativus）、ブラシカ・ユンカセア（Brassica juncacea）、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ルッコラ（Eruca vesicaria subsp. sativa）、オレンジ（Citrus sinensis）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、シセル・ヤマシタ（Cicer yamashitae）、シセル・ビユグム（Cicer bijugum）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、シセル・レチクラツム（Cicer reticulatum）、シセル・ユダイクム（Cicer judaicum）、カヤヌス・カヤニフォリウス（Cajanus cajanifolius）、ビロードヒメクズ（Cajanus scarabaeoides）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ダイズ（Glycine max）、ワタ属（Gossypium）種、ゲンゲ（Astragalus sinicus）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、ハナウリクサ（Torenia fournieri）、タマネギ（Allium cepa）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、及びニラ（Allium tuberosum）、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からなる群から選択される、植物又は植物細胞を作製するための方法が提供される。
【００４９】
さらなる態様において、原核、真核、又はウイルスの細胞、ゲノム又は生物において、好ましくは植物細胞又は生物においてゲノム操作するための前記態様及び／又は実施形態のいずれか１つに従った少なくとも１つの人工分子複合体の使用が提供される。
【００５０】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、続く詳細な説明、図面、配列表、並びに付属の特許請求の範囲から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、異なるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ−ＤＮＡ核酸配列のための、本発明による少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）及び／又は少なくとも１つの相互作用ドメイン（ＩＡ）を繰り返すガイド核酸部位の可能な配置、及び該ガイド核酸部位の異なる会合の方法の制限のない例を示す。（Ａ）一本鎖修復鋳型（ＲＴ）（ｓｓＤＮＡ）のワトソンクリック塩基対による、ｓｇＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡとして又はｇＤＮＡとして機能する配列を含むガイド核酸分子への非共有会合。（Ｂ）ガイド核酸分子への一本鎖ＲＴ（ｓｓＤＮＡ）の共有会合。この形は、単分子としてのＲＴＤＤガイド核酸分子とＲＴ部分の配列合成により、又は別個の部分をライゲーションして単分子を形成することにより作製されうる。（Ｃ）ガイド核酸分子への二本鎖ＲＴ（ｄｓＤＮＡ）の非共有会合。（Ｄ）ガイド核酸分子への二本鎖ＲＴ（ｄｓＤＮＡ）の共有会合。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、本発明による少なくとも１つのＲＴＤＤ及び／又は少なくとも１つのＩＡとしてガイド核酸分子にＲＴを付着又は会合させることができる可能な位置の限定されない例を示す。（Ａ）ガイド核酸分子の３’末端への一本鎖又は二本鎖ＲＴの共有又は非共有会合。（Ｂ）ガイド核酸分子の５’末端への一本鎖又は二本鎖ＲＴの共有又は非共有会合。（Ｄ）ガイド核酸分子への一本鎖又は二本鎖ＲＴの内部の共有又は非共有会合。修復鋳型（ＲＴ）の一部はこの図及び全ての他の図において白色で示される。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、ＲＴと、ガイド核酸分子の３’領域との共有会合の一実施形態を使用する、本明細書において開示された部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）であるヌクレアーゼ複合体での目的のゲノム配列への編集を段階的に導入するための制限のない例を示す。（Ａ）ＳＳＮ、例えばＮｇＡｇｏ、Ｃａｓ（Ｃａｓ９、ＣａｓＸもしくはＣａｓＹを含む）、又はＣｐｆ１との複合体におけるガイド核酸分子の概略図。（Ｂ）標的ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ））に結合した複合体の概略図及び切断部位の表示（黒い三角）。（Ｃ）切断された標的ＤＮＡの概略図。（Ｄ）ＳＳＮによって離された切断された標的ＤＮＡ及び相補的ワトソン・クリック塩基対による修復鋳型（ＲＴ）との相互作用の概略図。（Ｅ）相同組換え中にＲＴからコピーされた編集を含む修復された標的部位（ｇＤＮＡ）の概略図。修復鋳型（ＲＴ）の一部は全ての図において白色で示される。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、修復鋳型（ＲＴ）を直接又は間接的に結合する能力を有する、ＳＳＮとしての核酸ガイドエンドヌクレアーゼと相互作用ドメイン（ＩＡ）としてのタンパク質又はタンパク質ドメインとの融合タンパク質の設計のための制限のない例を示す。（Ａ）標的ＤＮＡとの複合体としての前記融合タンパク質の概略図。（Ｂ）二本鎖切断を導入した後の複合体の概略図。核酸ガイドエンドヌクレアーゼは標的ＤＮＡから離れる。融合核酸修復鋳型は、相同性を基礎とする方法で標的領域で複合体を形成する。（Ｃ）相同性指向修復が生じた後の標的ＤＮＡの概略図。特に、示されたアプローチは、ゲノム操作する複合体により正確に付加するために１超のＲＴＤＤを使用する。
【図５】図５は、左のパネルにおいてＲＴＤＤ１に融合させて大腸菌（E. coli）中で発現させた精製したヌクレアーゼ（この場合ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）を示す。これは、変性連続勾配（４〜１０％）ＳＤＳゲルで実行し、タンパク質の量及び純度を示す。タンパク質をこのゲルで染色した。右のパネルは連結を示す。これは、４％非変性アクリルアミドゲル（Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）であり、ここでＤＮＡはＧｅｌＲｅｄを使用して染色される。ＦＡＭ標識した（ＲＴＤＤ２−）修復鋳型を、左側に示すヌクレアーゼ−ＲＴＤＤ１を用いずに又は用いてヌクレアーゼ緩衝液中でインキュベートした。タンパク質が存在した場合に、ＤＮＡにより見られる生じた連結は、高分子の質量レベルで検出される（矢印）。
【図６】図６は、１行目において標的部位の野生型配列の一部（全長配列を配列番号４７に示す）、２行目及び３行目においてＩＮＤＥＬ発生の例（全長配列を配列番号４８及び４９に示す）、４行目において正確なＨＤＲ事象（全長配列を配列番号５０に示す）、並びに５行目において修復鋳型（全長配列を配列番号５１）を示す。
【図７】図７は、修復鋳型がない場合（左列）及び修復鋳型がヌクレアーゼに連結している場合（右列）の標準化ＨＤＲ効率の比較を示す。
【００５２】
定義
本明細書において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に本明細書において明らかに示されない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなけらばならない。例えば、成分（a component）に関しては、複数の成分の組成を含むことも意図される。構成成分（"a" constituent）を含む組成に関しては、指定された１つに加えて他の構成成分を含むことが意図される。言い換えれば、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語は、量の制限を示すものではなく、むしろ参照される項目の「少なくとも１つ」の存在を示すものである。それぞれの用語は、当業者によって理解されるようなその最も広い意味を検討し、同様の目的を達成するために同様の方法で操作する全ての技術的同等物を含むことが意図される。
【００５３】
範囲は、「約」又は「およそ」又は「実質的に」ある特定の値から、及び／又は「約」又は「およそ」又は「実質的に」別の特定の値までとして本明細書において表現されてよい。かかる範囲を表現する場合に、他の例示的な実施形態は、ある特定の範囲から及び／又は他の特定の値までを含む。さらに、「約」という用語は、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの限界に一部依存する、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲の範囲内を意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例により、許容できる標準偏差内を意味しうる。代わりに、「約」は、所与の値の±２０％まで、好ましくは±１０％まで、より好ましくは±５％、及びより好ましくはさらに±１％までの範囲を意味しうる。代わりに、特に生物学的システム又はプロセスに関して、前記用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味しうる。本明細書及び特許請求の範囲において特定の値が記載されている場合に、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、本記載内容では特定の値についての許容誤差範囲の範囲内を意味する。
【００５４】
「含む（comprising）」又は「含有する（containing）」又は「包含する（including）」に関しては、少なくとも指定された化合物、要素、粒子、又は方法ステップが、組成物又は物品又は方法に存在するが、他の化合物、材料、粒子、方法ステップの存在を、他のかかる化合物、材料、粒子、方法ステップが指定されたものと同一の機能を有する場合であっても排除しない。
【００５５】
本明細書において使用されるように、「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを含む。核酸は、フラグメント及び改変されたヌクレオチドも含んでよい。したがって、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸フラグメント」という用語は、互換的に使用でき、一本鎖又は二本鎖であり、任意に合成、非天然又は変更したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ及び／又はＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、それらの５’一リン酸の形で見出される）は、以下のようにそれらの一文字表記によって示される：アデノシン又はデオキシアデノシンについて（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡについて）「Ａ」、シトシン又はデオキシシトシンについて「Ｃ」、グアノシン又はデオキシグアノシンについて「Ｇ」、ウリジンについて「Ｕ」、デオキシチミジンについて「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）について「Ｙ」、Ｇ又はＴについて「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドについて「Ｎ」。核酸はヌクレオチドを含んでよい。核酸は、細胞に対して外因性又は内因性であってよい。核酸は、無細胞環境で存在してよい。核酸は、遺伝子又はそれらのフラグメントであってよいが、しかし核酸は遺伝子をコードする必要はない。核酸はＤＮＡであってよく、核酸はＲＮＡであってよい。核酸は、１つ以上の類似体（例えば改変した骨格、糖、又はヌクレオ塩基）を含んでよい。類似体のいくつかの制限のない例は、以下を含む：５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、キセノ核酸、モルホリノ類、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド類、コーディセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア類（例えば、糖に結合したローダミン又はフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光性塩基類似体、ＣｐＧアイランド、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、２０プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、及びワイオシン。本発明による核酸は、例えば天然に生じるホスホジエステル結合により、又はホスホロチオエート結合により、又はその混合により連結されうる。
【００５６】
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」又は「一本鎖ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」の用語は、本明細書において互換的に使用され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との合成融合物を示すか、又はｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡのみからなる単一のＲＮＡ分子を示すか、又は個々にｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むｇＲＮＡを示す。したがって、ｔｒａｃｒ及びｃｒＲＮＡ部分は、必ずしも１つの共有的に付着したＲＮＡ分子上に存在する必要はないが、非共有又は共有相互作用によって会合して又は会合されて、本開示によりｇＲＮＡを提供できる２つの個々のＲＮＡ分子によって構成することもできる。「ｇＤＮＡ」又は「ｓｇＤＮＡ」又は「ガイドＤＮＡ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、Ａｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼと相互作用する核酸分子をいう。本明細書において開示される双方のｇＲＮＡ及びｇＤＮＡは、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用するそれらの能力及びゲノム標的部位への該部位特的ヌクレアーゼのターゲティングを補助するそれらの能力により、「ガイディング核酸」又は「ガイド核酸」と言われる。
【００５７】
「遺伝子編集」、「ゲノム編集」及び「ゲノム工学」の用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の生きている生物の遺伝情報又はゲノムの標的とした特異的な改変のための戦略及び技術を示す。それ自体、前記用語は遺伝子編集を含むが、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も含む。さらに、核（存在するならば）及び細胞の他の遺伝子情報の編集又は操作を含む。さらに、「ゲノム編集」及び「ゲノム工学」の用語は、エピジェネティック編集又は操作、すなわち、例えば遺伝子発現における遺伝的変化を引き起こす可能性があるメチル化、ヒストン修飾、又は非コードＲＮＡの標的修飾も含む。
【００５８】
配列又は分子に関連する「ヌクレオチド」及び「核酸」の用語は、本明細書において互換的に使用され、天然源又は合成源の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを示す。したがって、ヌクレオチド配列の用語は、その長さに独立して任意のＤＮＡ又はＲＮＡ配列のために使用され、該用語は、少なくとも１つのヌクレオチドを含む任意のヌクレオチド配列を含むが、任意の種類のより大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも含む。したがって、該用語は、天然及び／又は合成のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）配列を示し、これらは任意に合成核酸類似体を含んでいてよい。本開示による核酸は、任意に最適化されたコドンであってよい。コドン最適化は、ＤＮＡ又はＲＮＡのコドン使用頻度が、目的の細胞又は生物における前記組換え核酸の転写速度を改善するために、目的の細胞又は生物のコドン使用頻度に適合されることを意味する。標的核酸が、コドン縮重により１つの位置で改変されてよい一方で、この改変が、標的細胞又は生物の種特異的コドン使用頻度を考慮に入れるためのコドン最適化によって達せられ、翻訳後にその位置で同一のアミノ酸配列をもたらすであろう事実を当業者は十分に認識している。本明細書による核酸配列は、以下の制限のない生物のリストについて特異的コドン最適化を実施できる：オオムギ、モロコシ、ライムギ、ライコムギ、サトウキビ、トウモロコシ、アワ、イネ、オリザ・ミヌタ、オリザ・オーストラリエンシス・アルタ、コムギ、マカロニコムギ、ライコムギ、ホルデウム・バルボーサム、ミナトカモジグサ、ハマムギクサ、タルホコムギ、リンゴ、サトウダイコン、ヒマワリ、ゴウシュウヤブジラミ、ダウクス・プルシス、ダウクス・ムリカツス、ノラニンジン、ユーカリプタス・グランディス、エリスランテ・グタタ、ゲンセリア・アウレア、ニコチアナ・シルベストリス、タバコ、ニコチアナ・トメントシフォルミス）、トメントシフォルミス、ベンサミアナタバコ、トマト、ジャガイモ、ロブスタコーヒーノキ、ブドウ、キュウリ、マルバグワ、アラビドプシス・サリアナ、アラビドプシス・リラタ、アラビドプシス・アレノサ、クルシヒマラヤ・ヒマライカ、クルシヒマラヤ・ワリチイ、タネツケバナ、マメグンバイナズナ、ナズナ、オルマラビドプシス・プミラ、ヤマハタザオ、セイヨウアブラナ、ブラッシカ・オレラセア、ブラッシカ・ラパ、ブラッシカ・イウンカセア、ブラッシカ・ニグラ、ルッコラ、オレンジ、ナンヨウアブラギリ、ダイズ、ワタ属種、ブラックコットンウッド、ハツカネズミ（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicu）又はホモサピエンス（Homo sapiens）。
【００５９】
本明細書において使用されるように、「非天然」又は「天然に生じない」又は「人工」は、核酸もしくはポリペプチド配列、又は天然の核酸又はタンパク質において見出されないビオチン又はフルオレセインのような任意の他の生体分子を示してよい。非天然は、アフィニティタグを示してよい。非天然は、融合を示してよい。非天然は、変異、挿入及び／又は欠失を含む天然に生じる核酸又はポリペプチド配列を示してよい。非天然配列は、非天然配列に融合する核酸及び／又はポリペプチド配列により示されていてもよい活性（例えば酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）について示してよく、及び／又は該活性をコードしてよい。非天然核酸又はポリペプチド配列は、遺伝子操作して、キメラ核酸及び／又はポリペプチド配列をコードするキメラ核酸及び／又はポリペプチドを生じることにより、天然に生じる核酸又はポリペプチド配列（又はそれらの多様体）に連結してよい。非天然配列は、３’にハイブリダイズした伸長配列を示してよい。
【００６０】
本明細書において使用されるように、「ヌクレオチド」は、一般的に、塩基−糖−リン酸の組み合わせを示してよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似体を含んでよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ））のモノマー単位であってよい。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はそれらの誘導体を含んでよい。かかる誘導体は、例えば、限定されるものではないが、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ及び７−デアザ−ｄＡＴＰ、並びにそれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を含んでよい。本明細書において使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びそれらの誘導体を示してよい。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰを含んでよいが、これらに制限されない。ヌクレオチドは、標識付けされていないか、又は周知の技術により検出可能に標識付けされうる。標識付けは、量子ドットで実施されてもよい。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識及び酵素標識を含んでよい。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−５ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙａｎｉｎｅ及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含みうるが、これらに制限されない。
【００６１】
本明細書において使用されるように、「融合物」は、１つ以上の非天然配列（例えば一部）を含むタンパク質及び／又は核酸を示してよい。融合物は、改変タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、又はその双方に、又は分離ドメインとしての分子内にあってよい。核酸分子について、融合物分子は、５’末端又は３’末端に又はその間の任意の適した位置に付着してよい。融合物は、転写融合物及び／又は翻訳融合物であってよい。融合物は、１つ以上の同一の非天然配列を含んでよい。融合物は、１つ以上の異なるの非天然配列を含んでよい。融合物はキメラであってよい。融合物は核酸アフィニティタグを含んでよい。融合物はバーコードを含んでよい。融合物はペプチドアフィニティタグを含んでよい。融合物は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅの細胞内局在のために提供されてよい（例えば、核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア標的シグナル、葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル、１５小胞体（ＥＲ）保留シグナル等）。融合物は、追跡又は精製のために使用されてよい非天然配列（例えばアフィニティタグ）を提供してよい。融合物は、小分子、例えばビオチン又は染料、例えばＡｌｅｘａ蛍光染料、Ｃｙａｎｉｎｅ３染料、Ｃｙａｎｉｎｅ５染料であってよい。融合物は、安定性を増加させる又は減少させるために提供されてよい。いくつかの実施形態において、融合物は、検出可能なシグナルを提供しうる成分を含む検出可能な標識を含んでよい。検出可能なシグナルを提供しうる適した検出可能な標識及び／又は成分は、それらに制限されることはないが、酵素、放射性同位体、特異的結合対のメンバー、蛍光体、蛍光受容体又は蛍光タンパク質、量子ドット等を含んでよい。融合物は、ＦＲＥＴ対のメンバー、又は蛍光体／量子ドット  ドナー／アクセプタ対を含んでよい。融合物は酵素を含んでよい。適した酵素は、それらに制限されることはないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−２５ガラクトシダーゼ等を含んでよい。融合物は蛍光タンパク質を含んでよい。適した蛍光タンパク質は、これらに制限されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（例えば、オワンクラゲ（Aequoria victoria）からのＧＦＰ、ニホンウナギ（Anguilla japonica）からの蛍光タンパク質、又はそれらの変異体もしくは誘導体）、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、黄緑色蛍光タンパク質（例えば、頭索類ニシナメクジウオ（cephalochordate Branchiostoma lanceolatum）からの四量体蛍光タンパク質由来のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、任意の種々の蛍光タンパク質及び着色タンパク質を含んでよい。融合物はナノ粒子を含んでよい。適したナノ粒子は、蛍光ナノ粒子又は発光ナノ粒子、及び磁気ナノ粒子、又はナノダイアモンド、任意にナノ粒子に連結したナノダイアモンドを含んでよい。ナノ粒子の任意の光学又は磁性の特徴又は特性を検出することができる。融合物は、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ（例えば５’−エキソヌクレアーゼ及び／又は３’−エキソヌクレアーゼ）、リガーゼ、ニッカーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（例えばＣａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラ���ゼ（例えばＤａｍ）又はＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ（例えばこれに制限されないがヒストンアセチラーゼを含む）、デアセチラーゼ（例えばこれに制限されないがヒストンデアセチラーゼを含む）、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ−）アクチベーター、転写（コ−）ファクター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写抑制因子、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造タンパク質、長鎖非コードＲＮＡ、ＤＮＡ修復タンパク質（例えば、一本鎖及び／又は二本鎖切断の修復に含まれるタンパク質、例えば塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、ＮＨＥＪ、ＨＲ、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、及び／又は代替非相同末端結合（ＡＮＨＥＪ）、例えばこれに制限されないがＨＲ調節因子、及びＨＲ複合体構造シグナルに含まれるタンパク質）、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えばｍＣｈｅｒｒｙ又は重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えばＴａｔ−シグナル配列）、標的タンパク質又は標的ペプチド、細胞内局在化配列（例えば、核局在化配列、葉緑体局在化配列）、及び／又は抗体エピトープ、又はそれらの任意の組み合わせを含んでよい。
【００６２】
アミノ酸配列に関して本明細書において使用される「触媒活性フラグメント」という用語は、鋳型配列の活性部位の全て又は一部を含む、所与の鋳型アミノ酸配列に由来するコア配列、又はそれらをコードする核酸配列を示すが、但し、得られる触媒活性フラグメントは、鋳型配列の活性化の特徴を未だ呈しており、それは、天然酵素又はそれらの多様体の活性部位が原因である。前記改変は、触媒活性フラグメントを立体的に要求の少ないより多用途の又はより安定なツールにする鋳型配列と同一の活性を未だ有するより嵩の低いアミノ酸配列を生じるのに適している。
【００６３】
本明細書において開示される任意の部位特異的ヌクレアーゼの「多様体」は、天然に生じる野生型ヌクレアーゼの活性を変化させるための、野生型の部位特異的ヌクレアーゼと比較して少なくとも１つの変異、欠失又は挿入を含む分子を示す。「多様体」は、これらの例に制限されないが、ニッカーゼとしての機能を改質されている触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）又は部位特的ヌクレアーゼであってよい。
【００６４】
本明細書において使用される「導入構築物」又は「導入ベクター」という用語は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むハイブリッド核酸及び／又は目的のアミノ酸配列を含む核酸を標的細胞、好ましくは真核細胞に運搬するためのカーゴとして使用される任意の生物学的又は化学的手段を示す。したがって、本明細書において使用される導入構築物又はベクターの用語は、本開示による遺伝子又は組換え構築物を、標的細胞、組織、器官又は生物に導入するための輸送手段を示す。したがって、ベクターは、直接又は間接的に、目的の標的細胞に又は植物の所望の細胞区画中の植物標的構造に導入するための配列、例えば調節配列又は局在化配列を任意に含む核酸配列を含んでよい。ベクターは、アミノ酸配位列又はリボヌクレオ分子複合体を標的細胞又は標的構造に導入するために使用されてもよい。通常、本明細書において使用されるベクターは、プラスミドベクターであってよい。さらに、本発明によるある好ましい実施形態に従って、目的の構築物又は配列又は複合体の直接導入が実施される。直接導入の用語は、本開示により改質されるＤＮＡ標的配列を含む所望の標的細胞又は標的構造が、導入ベクターと共に導入された材料がその効果を発揮する目的の特定の標的細胞に直接形質転換又は形質導入又は形質移入されることを意味する。間接導入の用語は、それ自体が形質転換されるべき目的の実際の標的細胞又は構造を示すものではないが、しかし、それらの構造は、実際の標的構造、例えば分裂組織細胞もしくは組織、又は幹細胞もしくは組織への、好ましくは本開示による遺伝子構築物を含むベクターの全身拡散及び転移の基礎として役立つ構造、例えば葉の細胞又は器官もしくは組織の細胞への導入が達せられることを意味する。ベクターの用語が、アミノ酸配列及び／又はハイブリッド核酸配列を含む核酸配列を標的細胞に形質移入する記載内容において使用される場合に、ベクターの用語は、ペプチド又はタンパク質移入に適した作用剤、例えばイオン性脂質混合物、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、又は微粒子銃を意味する。核酸材料の導入の記載内容において、ベクターの用語は、プラスミドベクターを意味するだけでなく、例えば微粒子銃によって目的の標的細胞への核酸の導入及び／又はアミノ酸配列導入の基礎として役立ってよい適切な担体材料も意味する。前記担体材料は、とりわけ、金粒子又はタングステン粒子を含む。最終的に、ベクターの用語は、例えば、以下のウイルス株に由来する改質されたウイルスのような、本開示による少なくとも１つの遺伝子構築物の導入のためのウイルスベクターの使用も含む：アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、ワクシニアウイルス、センダイウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メイズストリークウイルス（ＭＳＶ）、オオムギストライプモザイクウイルス（ＢＳＭＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ、アクセッション番号：ＲＮＡ１：Ｘ５８４５６；ＲＮＡ２：Ｘ５８４５７；ＲＮＡ３：Ｘ５８４５８）、メイズストライプウイルス（ＭＳｐＶ）、メイズラヤドフィノウイルス（Maize rayado fino virus）（���ＹＤＶ）、メイズ萎縮モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）、ベニーウイルス（Benyviridae）科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばビート壊死性萎黄ウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３５１４；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３５１５；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３５１６；ＲＮＡ４：ＮＣ＿００３５１７）又はブロモウイルス（Bromoviridae）科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばアルファモザイクウイルス属のウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：  ＮＣ＿００１４９５；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００２０２４；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００２０２５）、又はブロモウイルス（Bromovirus）属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＢＭＶ（前述）、又はククモウイルス（Cucumovirus）属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばキュウリモザイクウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００２０３４；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００２０３５；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００１４４０）、オレアウイルス（Oleavirus）属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、カリモウイルス科（Caulimoviridae）の、特にバドナウイルス（Badnavirus）属又はカリモウイルス属のｄｓＤＮＡウイルス、例えば種々のバナナストリークウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００７００２、ＮＣ＿０１５５０７、ＮＣ＿００６９５５又はＮＣ＿００３３８１）又はカリフラワーモザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００１４９７）、又はカベモウイルス属（Cavemovirus）、ペチュウイルス属（Petuvirus）、ロサドナウイルス属（Rosadnavirus）、ソレンドウイルス属（Solendovirus）、ソイモウイルス属（Soymovirus）又はツングロウイルス属（Tungrovirus）のウイルス、クロステロウイルス科（Closteroviridae）、例えばアンペロウイルス属（Ampelovirus）、クリニウイルス属（Crinivirus）のプラスストランドＲＮＡウイルス、例えばレタス伝染性黄斑ウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３６１７；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３６１８）又はトマト萎黄ウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００７３４０；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００７３４１）、クロステロウイルス属（Vlosterovirus）のプラスストランドＲＮＡウイルス、例えばビート萎黄ウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００１５９８）、又はベラリウイルス属（Velarivirus）のプラスストランドＲＮＡウイルス、ジェミニウイルス科（Geminiviridae）、例えばベクトルウイルス属（Becurtovirus）、ベグモウイルス属（Begomovirus）の一本鎖ＤＮＡ（±）ウイルス、例えばビーンゴールデン黄化モザイクウイルス、タバコカーリーシュートウイルス、タバコモトルリーフカーリーウイルス、トマトクロロティックモトルウイルス、トマト萎縮リーフウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、トマトリーフカーリーウイルス、トマトモルトウイルスもしくはトマト黄斑ウイルス、又はクルトウイルス属（Curtovirus）のジェミニウイルス科一本鎖ＤＮＡ（±）ウイルス、例えばビートカーリートップウイルス、又はトポクウイルス属（Topocuvirus）、ツルンクルトウイルス属（Turncurtvirus）、又はマストレウイルス属（Mastrevirus）のジェミニウイルス科一本鎖ＤＮＡ（±）ウイルス、例えばマイゼストリークウイルス（前述）、タバコ黄化萎縮ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、ルテオウイルス科（Luteoviridae）、例えばルテオウイルス属（Luteovirus）のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオオムギ黄化萎縮ウイルス−ＰＡ  Ｖ（アクセッション番号：ＮＣ＿００４７５０）、ポレロウイルス属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばポテトリーフロールウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００１７４７）、ナノウイルス属（Nanovirus）又はバブウイルス属（Babuvirus）を含むナノウイルス科（Nanoviridae）の一本鎖ＤＮＡウイルス、アルファパルティティウイルス属（Alphapartitivirus）、ベータパルティティウイルス属（Betapartitivirus）又はデルタパルティティウイルス属（Deltapartitivirus）を特に含むパルティティウイルス科（Partiviridae）の二本鎖ＲＮＡウイルス、ポスピウイリド科（Pospiviroidae）のウイロイド、ブランビウイルス属（Brambyvirus）、バイモウイルス属（Bymovirus）、イポモウイルス属（Ipomovirus）、マクルラウイルス属（Macluravirus）、ポアセウイルス属（Poacevirus）を例えば含むポティウイルス科（Potyviridae）のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばコムギモザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿０１２７９９）、又はポティウイルス属（Potyvirus）のポティウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばビートモザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００５３０４）、マイゼ萎縮モザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００３３７７）、ポテトウイルスＹ（アクセッション番号：ＮＣ＿００１６１６）又はゼアモザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿０１８８３３）、又はトリティモウイルス属（Tritimovirus）のポティウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばブロムストリークモザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００３５０１）又はコムギストリークモザイクウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００１８８）、シュードウイルス科（Pseudoviridae）、例えばシュードウイルス属（Pseudovirus）又はサイアウイルス属（Sirevirus）の一本鎖ＲＮＡウイルス、レオウイルス科（Reoviridae）の二本鎖ＲＮＡウイルス、例えばイネ萎縮ウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３７７３；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３７７４；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３７７２；ＲＮＡ４：ＮＣ＿００３７６１；ＲＮＡＳ：ＮＣ＿００３７６２；ＲＮＡ６：ＮＣ＿００３７６３；ＲＮＡ７：ＮＣ＿００３７６０；ＲＮＡＢ：ＮＣ＿００３７６４；ＲＮＡ９：ＮＣ＿００３７６５；ＲＮＡ１０：ＮＣ＿００３７６６；ＲＮＡ１１：ＮＣ＿００３７６７；ＲＮＡ１２：ＮＣ＿００３７６８）、例えばアルファネクロウイルス属（Alphanecrovirus）、アウレウスウイルス属（Aureusvirus）、ベータネクロウイルス属（Betanecrovirus）、カルモウイルス属（Carmovirus）、ダイアンソウイルス属（Dianthovirus）、ギャランティウイルス属（Gallantivirus）、マカナウイルス属（Macanavirus）、マクロモウイルス属（Machlomovirus）、パニコウイルス属（Panicovirus）、トンブスウイルス属（Tombusvirus）、ウンブラウイルス属（Umbravirus）もしくはゼアウイルス属（Zeavirus）を含むトンブスウイルス科（Tombusviridae）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばマイゼ壊死性ストリークウイルス（アクセッション番号：ＮＣ＿００７７２９）、又はビルガウイルス科（Virgaviridae）のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばフロウイルス属（Furovirus）、ホルデイウイルス属（Hordeivirus）のウイルス、例えばオオムギストライプモザイクウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３４６９；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３４８１；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３４７８）又はペクルウイルス属（Pecluvirus）、ポモウイルス属（Pomovirus）、トバモウイルス属（Tobamovirus）もしくはトブラウイルス属（Tobravirus）のウイルス、例えばタバコラットルウイルス（アクセッション番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３８０５；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３８１１）、並びにモノネガウイルス目（Mononegavirales）、特にラブドウイルス科（Rhabdoviridae）のマイナス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばオオムギ黄化縞モザイクウイルス（アクセッション番号：ＫＭ２１３８６５）又はレタス壊死性黄化ウイルス（アクセッション番号／標本：ＮＣ＿００７６４２／ＡＪ８６７５８４）、ピコルナウイルス目（Picornavirales）、特にセコウイルス科（Secoviridae）、例えばコモウイルス属（Comovirus）、ファバウイルス属（Fabavirus）、ネポウイルス属（Nepovirus）、チェラウイルス属（Cheravirus）、サドワウイルス属（Sadwavirus）、セクイウイルス属（Sequivirus）、トラドウイルス属（Torradovirus）もしくはワイカウイルス属（Waikavirus）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、ティモウイルス目（Tymovirales）、特にアルファウレキシウイルス科（Alphaflexiviridae）、例えばアレキシウイルス属（Allexivirus）、ロラウイルス属（Lolavirus）、マンダリウイルス属（Mandarivirus）もしくはポテックスウイルス属（Potexvirus）、ティモウイルス目、特にベータフレキシウイルス科（Betaflexiviridae）、例えばキャピロウイルス属（Capillovirus）、カルラウイルス属（Carlavirus）、シトリウイルス属（Citrivirus）、フォベアウイルス属（Foveavirus）、テポウイルス属（Tepovirus）もしくはビティウイルス属（Vitivirus）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、ティモウイルス目、特にティモウイルス科（Tymoviridae）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばマクラウイルス属（Maculavirus）、マラフィウイルス属（Marafivirus）もしくはティモウイルス属（Tymovirus）のウイルス、並びに細菌ベクター、例えばアグロ
バクテリウム属種、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の細菌ベクター。最終的に、ベクターの用語は、ポリマー又は脂質を基礎とする導入構築物を含む、物理的導入法と組み合わせて直鎖状核酸配列（一本鎖又は二本鎖）を標的細胞に導入するための適した化学輸送作用剤も含む。
【００６５】
したがって、適した導入構築物又はベクターは、ウイルスベクター、アグロバクテリウム種属、又はナノ粒子、例えばメソ孔シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）ポリマーを基礎とするアプローチもしくはＤＥＡＥデキストラン等のポリマーを含むカチオンポリマー、又はカチオン表面を生じるためのＰＥＩの非共有表面アタッチメント、脂質もしくはポリマー小胞、又はそれらの組合せを含む化学導入構築物を含む、ヌクレオチド配列を標的細胞に導入するための生物学的手段を含む。脂質又はポリマー小胞は、例えば、脂質、リポソーム、脂質カプセル化系、ナノ粒子、小核酸−脂質粒子配合物、ポリマー、及びポリマーソームから選択されうる。
【００６６】
「遺伝子構築物」又は「組換え構築物」の用語は、本開示による植物、植物の細胞、組織、器官又は材料を含む任意の原核標的細胞又は真核標的細胞に導入又は形質転換、形質移入又は形質導入するための、とりわけ、プラスミドもしくはプラスミドベクター、コスミド、人工酵母染色体もしくは細菌人工染色体（ＹＡＣ及びＢＡＣ）、ファージミド、細菌ファージを基礎とするベクター、発現カセット、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む単離した一本鎖もしくは二本鎖核酸配列、又はアミノ酸配列、改質したウイルスを含むウイルスベクター、並びにそれらの組み合わせ又は混合物を含む構築物を意味するために本明細書において使用される。本開示による組換え構築物は、核酸又はアミノ酸配列の形のいずれかでのエフェクタードメインを含んでよく、ここでエフェクタードメインは、標的細胞中で効果を発揮することができ、トランスジーン、ガイドＲＮＡ（（ｓ）ｇＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡを含む一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子、又はとりわけ酵素又はそれらの触媒活性フラグメントを含むアミノ酸配列、結合タンパク質、抗体、転写ファクター、ヌクレアーゼ、好ましくは部位特異性ヌクレアーゼ等を含む分子を示す。さらに、組換え構築物は、制御配列及び／又は局在化配列を含んでよい。組換え構築物は、プラスミドベクターを含むベクターに組み込まれてよく、及び／又は組換え構築物は、ベクター構築物から単離されて、例えばポリペプチド配列の形で又はベクターに連結されていない一本鎖もしくは二本鎖核酸として存在してよい。例えば形質転換による導入後に、遺伝子構築物は、例えば、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡの形で又はアミノ酸配列として、染色体外に残っていてよい、すなわち、標的細胞のゲノム中に組み込まれていなくてよい。代わりに、本開示による遺伝子構築物又はそれらの一部は、核酸ゲノムを含む標的細胞のゲノム、又はミトコンドリアもしくは葉緑体等の色素体のゲノムを含む他の標的細胞のさらなる遺伝子エレメントに安定して組み込まれてよい。この関連において使用されるプラスミドベクターの用語は、プラスミドから独自に得られる遺伝子構築物をいう。プラスミドは、通常、二本鎖核酸配列の形での環状自己複製染色体外エレメントをいう。遺伝子工学の分野において、これらのプラスミドは、例えば抗生物質又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、標的核酸配列をコードする遺伝子、局在化配列、制御配列、タグ配列、抗生物質マーカーもしくは蛍光マーカーを含むマーカー遺伝子等を挿入することにより、日常的に標的の改変を受ける。元のプラスミドの構造成分、例えば複製起点は、維持されている。本発明の特定の実施形態に従って、局在化配列は、核局在化配列、色素体局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含んでよい。前記局在化配列は、植物バイオテクノロジーの分野における当業者に利用可能である。目的の種々の標的細胞において使用するための種々のプラスミドベクターが市販されており、それらの改質は、それぞれの分野における当業者に公知である。
【００６７】
「遺伝子（遺伝的に）改変した」又は「遺伝子操作」又は「遺伝子（遺伝的に）操作した」の用語は、本明細書では広義に使用され、人間の介入によって、直接的又は間接的に、標的細胞、組織、器官又は生物の内因性遺伝物質又はトランスクリプトーム又はプロテオームに影響を及ぼして、目的の方法でそれを改変し、その結果、人間の介入なしに見出されるその状態と異なるようにすることにより達成される核酸配列又はアミノ酸配列、標的細胞、組織、器官又は生物の任意の改変を意味し、一方で、ゲノム編集という用語は、標的細胞のゲノムの標的操作を具体的に示す。人間の介入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもしくはｉｎ ｖｉｖｏで、又はその双方で実施されてよい。さらなる改変は、例えば、１つ以上の点変異、例えば標的タンパク質工学のためのもしくはコドン最適化のための点変異、欠失、及び少なくとも１つの核酸もしくはアミノ酸分子の１つ以上の挿入又は欠失（相同組換えも含む）、核酸又はアミノ酸配列の改質、又はそれらの組合せを含んでよい。この用語は、天然に生じるものと同等の配列、生物又は材料に類似しているが、目的の操作の少なくとも１つのステップにより構築されている、植物又はその植物材料を含む核酸分子又はアミノ酸分子又は宿主細胞又は生物体も含む。
【００６８】
したがって、本明細書において使用される「標的遺伝子操作」、又は「標的化」もしくは「部位特異的」遺伝子編集又はゲノム編集は、標的化された方法、すなわち少なくとも１つの操作されるべき細胞、好ましくは植物細胞において所望の効果を達成するための標的細胞における少なくとも１つの特定の位置で及び特定の適した状況下で実施される、「遺伝子操作」の結果である。
【００６９】
本開示に従って使用される「トランスジェニック」という用語は、自然法によって又は遺伝子工学技術によって他の生物から植物、植物の細胞、組織、器官又は材料に導入される導入遺伝子を含む、遺伝子又は遺伝子構築物を含む動物、動物の細胞、組織又は器官、植物、植物の細胞、組織、器官又は材料をいう。「導入遺伝子」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ又はそれらの組合せもしくはそれらの混合物を含む核酸配列を含む。したがって、「導入遺伝子」という用語は、一般に遺伝子と同定される配列、すなわちタンパク質をコードする配列に制限されない。例えば、非タンパク質コードＤＮＡ又はＲＮＡ配列も示してよい。したがって、トランスジェニックという用語は、一般に、目的の細胞に導入されるそれぞれの核酸が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、動物又は動物細胞、植物、植物の細胞、組織、器官又は材料を含むそれぞれの標的の原核細胞又は真核細胞に天然に存在しないことを含む。したがって、本明細書において使用される導入遺伝子又はトランスジェニックという用語は、ある生物のゲノムから取られる、又は合成的に生成される、及び一過的な又は安定な方法で、分子生物学、遺伝学等の人工的な技術によって他の生物に導入される、核酸配列又はアミノ酸配列をいう。
【００７０】
本明細書において使用される「植物」又は「植物細胞」の用語は、植物生物、植物器官、分化及び未分化植物組織、植物細胞、種子、並びにそれらの誘導体及び子孫を示す。植物細胞は、例えば、種子、成熟胚、未成熟胚、分裂組織、実生、異なる分化状態のカルス組織、葉、花、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、花粉管及び小胞子、プロトプラスト、大型藻類及び微細藻類からの細胞を含むが、これらに制限されない。種々の植物細胞は、一倍体、二倍体、四倍体、六倍体又は多数体のいずれかであってよい。
【００７１】
本明細書において使用される「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを意味しうる。前記用語は、哺乳動物（例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウス及びラット又はハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、及びヤギ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、対象は、ヒトである。
【００７２】
本明細書において使用される「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。前記効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防する点で予防的であってよく、並びに／又は疾患及び／又はその疾患に起因する有害作用について部分的又は完全に治癒する点で治療的であってよい。本明細書において使用される「治療」は、哺乳動物における疾患又は症状の任意の治療を含み、かつ以下を含む：（ａ）疾患又は症状を獲得する素因があってよいが、疾患又は症状を有していると未だ診断されていない対象における疾患又は症状の発生を予防すること、（ｂ）疾患又は症状を抑制すること、すなわちその発症を阻止すること、又は（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を生じること。治療薬は、疾患もしくは損傷の発症前、発症中又は発症後に投与されうる。治療が患者の望ましくない臨床的症状を安定化又は軽減する進行中の疾患の治療が、特に目的とされる。かかる治療は、冒された組織における機能の完全な喪失の前に実施されることが望ましい。対象の療法は、望ましくは、疾患の症候性のステージ中に、及びいくつかの場合には、疾患の症候性のステージ後に投与されるであろう。
【００７３】
本明細書において使用される「植物材料」は、任意の発達段階中の植物から得られてよい任意の材料を示す。植物材料は、植物体中で、又は植物又はそれらの植物組織もしくは器官のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物から得られる。したがって、前記用語は、植物細胞、組織及び器官、並びに発達した植物構造物、並びに細胞内区画、例えば核酸、ポリペプチド、及び植物細胞もしくは区画内に見いだされ、及び／又は植物によって生成され、又は任意の発生段階における任意の植物細胞、組織又は植物の抽出物から得られる全ての化学的植物物質又は代謝産物を含む。前記用語は、植物材料により含まれる少なくとも１つの植物細胞に由来する植物材料の誘導体、例えばプロトプラストも含む。したがって、前記用語は、植物の分裂組織的細胞又は分裂組織も含む。
【００７４】
本明細書において使用される「変異」及び「改変」の用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、核酸操作の記載内容における、欠失、挿入、付加、置換、編集、鎖切断、及び／又は付加物の導入を示すために互換的に使用される。欠失は、１つ以上のヌクレオチドが存在しない核酸配列における変化として定義される。挿入又は付加は、１つ以上のヌクレオチドの付加でもたらされる核酸配列における変化である。「置換」又は編集は、置き換えられた１つ以上のヌクレオチドからの異なる分子である分子による１つ以上のヌクレオチドの置き換えに起因する。例えば、核酸は、チミンをシトシン、アデニン、グアニン又はウリジンに置き換えることによって例示されるように、異なる核酸により置き換えられうる。ピリミジンからピリミジン（例えば、ＣからＴ又はＴからＣへのヌクレオチド置換）又はプリンからプリン（例えば、ＧからＡ又はＡからＧへのヌクレオチド置換）を転移といい、一方で、ピリミジンからプリン又はプリンからピリミジン（例えば、ＧからＴ又はＧからＣ又はＡからＴ又はＡからＣ）を塩基転換という。代わりに、核酸は、チミンをチミングリコールに置き換えることにより例示されるように、改質した核酸により置き換えられうる。変異は、ミスマッチをもたらしうる。ミスマッチの用語は、２つの核酸間の非共有相互作用を示し、それぞれの核酸は、異なるヌクレオチド配列又は核酸分子上に存在し、それは塩基対合則に従わない。例えば、部分的相補配列５’−ＡＧＴ−３’及び５’−ＡＡＴ−３’について、Ｇ−Ａミスマッチ（転移）が存在する。
【００７５】
「鎖切断」の用語は、二本鎖核酸配列、例えばＤＮＡ標的配列としてゲノム配列に関する場合に、一本鎖切断及び／又は二本鎖切断を含む。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の２つの鎖の１つにおける中断を示す。これは、二本鎖核酸配列の双方の鎖における中断を示す二本鎖切断と対照的である。本開示による鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ又はその多様体を含む、適したエンドヌクレアーゼを使用して、目的の核酸塩基位置での酵素的切断により二本鎖核酸配列に導入されてよく、ここで、多様体は、野生型タンパク質の酵素機能をまだ発揮することができる野生型タンパク質又はエンドヌクレアーゼの変異した又は短縮された型であってよい。
【００７６】
本明細書において使用される「相補的」又は「相補性」は、２つのＤＮＡ間、２つのＲＮＡ間、又は本発明によるハイブリッド配列に関してＲＮＡとＤＮＡ核酸領域との間の相互作用を意味する。ＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオ塩基により定義された、２つの核酸領域は、互いに鍵と鍵穴モデルに従ってハイブリダイズすることができる。この目的のために、ワトソン−クリック塩基対合の原理は、相補的塩基が適用されるため、それぞれアデニン及びチミン／ウラシル並びにグアニン及びシトシンの主成分を有する。さらに、非ワトソン−クリック対、例えば逆ワトソン−クリック対、フーグスティーン対、逆フーグスティーン対及びゆらぎ対も、それぞれの塩基対が互いに水素結合を構築することができる限り、すなわち２つの異なる核酸鎖が前記相補性に基づいて互いにハイブリダイズすることができる限り、本明細書において使用される用語「相補的」に含まれる。当業者は、核酸ハイブリダイゼーションが、核酸間の相補性の程度及び長さ、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、並びに核酸内のＧ：Ｃ比等の要因によって影響を受ける事実を認識しているため、所与の長さにわたって互いに１００％整列する２つの配列伸長という意味での完全な相補性を要求しない。さらに、立体要因は、互いに１００％相補的ではない場合であっても２つの配列がハイブリダイズするかどうかに影響しうる。したがって、本発明による２つの相補的な核酸配列は、互いに、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相同性又は相補性を有してよく、およそ中程度のストリンジェンシー条件で互いになおハイブリダイズしてよい。「中程度の」ストリンジェンシー条件は、２０〜２９℃の温度範囲でＴｍ未満でＮａＣｌ０．１６５〜０．３３０Ｍをいい、ここで、Ｔｍは、ＤＮＡ配列について一般に使用される計算式：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ10（［Ｎａ＋］／１．０＋０．７［Ｎａ＋］）＋０．４１（％［Ｇ＋Ｃ］）−（５００／ｎ）−Ｐ−Ｆ
［式中、Ｔｍ＝℃での溶融温度、［Ｎａ+］＝ナトリウムイオンのモル濃度、％［Ｇ＋Ｃ］＝ＤＮＡ配列におけるＧ＋Ｃ塩基の割合、ｎ＝塩基におけるＤＮＡ配列の長さ、Ｐ＝％ミスマッチ塩基対についての温度補正（１％のミスマッチあたり〜１℃）、及びＦ＝ホルムアミド濃度についての補正（＝１％のホルムアミドあたり０．６３℃）］によって推定できると定義される。
【００７７】
本明細書において使用される「一過性導入」の用語は、好ましくは導入ベクターの助けを借りて又は導入ベクターを使用せずに導入ベクターに又は組換え構築物に組み込まれる本開示による少なくとも１つの核酸配列の、標的構造、例えば植物細胞への一過性導入を示し、ここで、少なくとも１つの核酸配列は、標的構造の内因性核酸材料に少なくとも１つの核酸配列を組み込まない適した反応条件下で導入され、ゲノム全体は、少なくとも１つの核酸配列が標的細胞の内因性ＤＮＡに組み込まれないように生じる。結果として、一過性導入の場合に、導入された遺伝子構築物は、標的構造の子孫、例えば原核生物、動物又は植物細胞の子孫に遺伝しないであろう。少なくとも１つの核酸配列又はその転写もしくは翻訳から生じる産物は、一時的に、すなわち一過性に、構成的又は誘導可能な形でのみ存在し、したがって制限された時間でそれらの効果を発揮するために標的細胞内でのみ活性化されてよい。したがって、一過性導入により導入された少なくとも１つの核酸配列は、細胞の子孫に対して遺伝性ではないであろう。しかしながら、核酸配列が一過性に導入される効果は、潜在的に標的細胞の子孫に受け継がれてよい。
【００７８】
本明細書において使用される「安定な組み込み」又は「安定して組み込まれる」の用語は、好ましくは導入ベクター又は組換え構築物に組み込まれた、本開示による少なくとも１つの核酸配列の安定な組み込みを示す。組み込みは、標的細胞の核ゲノム、又は目的の真核細胞区画内の任意の他のゲノムの核外物質、例えばミトコンドリア又は植物細胞色素体のいずれかで起こってよい。したがって、安定して組み込まれた少なくとも１つの組換え構築物は、改変された標的細胞の子孫に対して遺伝性があるだろう。遺伝子構築物の性質に依存して、遺伝子構築物の全て又は一部は、遺伝子構築物が、安定的に統合される標的領域を含むいくつかの目的の領域、並びにとりわけ植物細胞内での遺伝子構築物の輸送、送達、維持、及び正確な局在化のために要求されるさらなる領域（しかしながらその領域は、それ自体は統合されないであろうが、当業者に公知である安定して統合されるための目的の領域のためのカーゴとしての役割を果たす）を含みうるため、安定的に統合される。少なくとも１つの造血細胞もしくは組織又は分裂組織細胞もしくは組織への本開示による少なくとも１つの遺伝子構築物の安定な組み込みは、結果として、アプローチのために有利であってよい前記少なくとも１つの造血細胞又は分裂細胞の全ての発生段階を通して改変された細胞の子孫に対する、このように改変された標的構造のゲノム領域、すなわちＤＮＡ標的領域の遺伝をもたらし、少なくとも１つの造血分裂組織細胞の分化及び発生から生じる最終的な細胞型における標的とされた遺伝子改変、及び該細胞型の収量が所望される。例えば、植物の成熟していない花序の少なくとも１つの分裂組織細胞への安定した組み込みを達成することは、成熟していない花序の少なくとも１つの分裂組織細胞から発生的に得られる花粉又は胚珠の配偶子への導入された遺伝的特徴の安定な遺伝をもたらし得る。少なくとも１つの多能性造血細胞又は任意の多能性もしくは多分化能性細胞への安定な組み込みは、導入された遺伝的特徴の安定した遺伝を同様に導くであろう。
【００７９】
本明細書において使用される「微粒子銃」の用語は、微粒子銃形質移入又は微粒子媒介遺伝子移入とも言われ、目的の核酸又は遺伝子構築物を含む被覆微粒子又はナノ粒子を標的細胞又は組織に形質移入するための物理的導入方法を示す。マイクロ粒子又はナノ粒子は、発射体として機能し、しばしば「遺伝子銃」と呼ばれる適した装置を使用して高圧下で目的の標的構造上で発射される。微粒子銃による形質転換は、目的の遺伝子で覆われた金属の微小発射体を使用し、そして、「遺伝子銃」として公知の装置（Ｓａｎｄｆｏｒｄら、１９８７年）を使用して標的細胞上に標的組織の細胞壁を貫通するために十分に速いが細胞死を引き起こすのに十分厳しくはない速度で発射する。細胞壁が完全に除去されているプロトプラストの場合に、前記条件は論理的に異なる。少なくとも１つの微小発射体上で沈着した核酸又は遺伝子構築物は、照射後に細胞内に放出され、そして前記定義に従ってゲノムに組み込まれるか又は一過性に発現される。微小発射体の加速は、高電圧放電又は圧縮ガス（ヘリウム）により達せられる。使用される金属粒子に関しては、金属粒子が非毒性、非反応性であり、標的細胞よりも小さい直径を有することが必須である。最も一般的に使用されるものは、金又はタングステンである。一般的な使用に関して、遺伝子銃及び関連するシステムの製造元及び提供者から公的に入手可能な多くの情報がある。
【００８０】
本開示による原核細胞又は真核細胞、好ましくは動物細胞、及びより好ましくは植物又は植物細胞又は植物材料の記載内容において本明細書において使用される「誘導体」又は「子孫」又は「後代」の用語は、性的及び無性的繁殖を含む自然生殖的繁殖から生じるかかる細胞又は物質の子孫を示す。前記繁殖が、親生物又は親細胞とはゲノム的に異なる子孫又は後代をもたらす自然現象から生じる生物のゲノムへの変異の導入を導くことができるが、しかしながら、同一の属／種にまだ属し、かつ親の組換え宿主細胞とほぼ同一の特徴を有することは当業者に周知である。したがって、生殖又は再生中の自然現象から生じるかかる誘導体又は子孫又は後代は、本開示の用語に含まれる。さらに、「誘導体」の用語は、物質又は分子の記載内容において、細胞又は生物を示すよりむしろ、直接的に、又は他から間接的に得られる改変によって意味することができる。これは、細胞又は材料から得られる細胞又は植物代謝産物に由来する核酸配列を意味してよい。したがって、これらの用語は、任意の誘導体、子孫又は祖先を指すのではなく、むしろ親の細胞又はウイルス又はその分子に系統発生的に関連する、すなわちそれらに基づく誘導体、又は子孫又は祖先を示す一方で、誘導体、子孫又は祖先と「親」とのこの関係は、当業者によって明らかに推測可能である。
【００８１】
さらに、生物学的配列（核酸もしくはアミノ酸）又は分子又は複合体の記載内容における本明細書において使用される「由来」、「に由来する」又は「誘導体」という用語は、それぞれの配列が、配列、例えば配列表からの基準配列、又はデータベースアクセッション番号、又はそれぞれの骨格構造、すなわち該配列の起源に基づくことを意味する一方で、基準配列は、ウイルスのより多くの配列、例えば全ゲノム又は完全ポリタンパク質コード配列を含んでよく、天然配列「に由来する」配列は、それらの１つの単離されたフラグメント、又はそれらの干渉性フラグメントをのみを含みうる。本記載内容において、ｃＤＮＡ分子又はＲＮＡは、分子鋳型として作用するＤＮＡ配列「に由来する」と言える。したがって、当業者は、ＤＮＡ又はアミノ酸レベルに対する配列アライメントによってそれぞれの基準配列に対する高い同一性を有し、かつそれぞれの参照配列と共通してＤＮＡ／アミノ酸の干渉性伸長を有するであろう基準配列「に由来する」配列を容易に定義できる（整列した分子の所与の長さについて＞７５％のクエリ同一性、但し、由来する配列はクエリであり、かつ基準配列は配列アライメント中の対象を示す）。したがって、当業者は、本明細書において提供される開示に基づくそれぞれの配列を、ポリメラーゼ連鎖反応等によって、適した目的のベクター系にクローニングしてよく、又はベクター足場として配列を使用してよい。したがって、「に由来する」という用語は、任意の配列ではないが、それが由来する基準配列に対応する配列であり、一方である特定の差異、例えば宿主細胞内での組換え構築物の複製中に天然に生じるある特定の変異を除外することができず、したがって「に由来する」という用語により含まれる。さらに、親配列からのいくつかの配列伸長は、植物に由来する配列において連鎖状であってよい。種々の伸長は、親配列に対する相同性が高い（好ましくは９０％より高い）か又は１００％ですらあってよい。当業者は、本発明による人工分子複合体の配列が、核酸配列として提供又は部分的に提供される場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで転写及び任意に翻訳され、おそらくさらに宿主細胞内で消化及び／又は処理される（シグナルペプチドの切断、内因性ビオチン化等）という事実を十分に認識しており、そのため「に由来する」という用語は、本発明の開示に従って本来使用される配列との相関を示す。
【００８２】
本明細書において使用される「標的領域」、「標的部位」、「標的構造」、「標的構築物」、「標的核酸」又は「標的細胞／組織／生物」、又は「ＤＮＡ標的領域」の用語は、標的細胞の任意の区画内の任意のゲノム領域であってよい標的を示す。
【００８３】
本明細書において使用される「制御配列」の用語は、目的の核酸配列の転写及び／又は翻訳及び／又は修飾を指示することができる核酸配列又はアミノ酸配列を示す。
【００８４】
「タンパク質」、「アミノ酸」又は「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、触媒酵素機能又は構造的もしくは機能的効果を有するアミノ酸配列を示す。「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」又は「アミノ酸分子」という用語は、任意の天然の又は化学合成したタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び酵素、又は改質したタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び酵素を含み、ここで「改質した」という用語は、野生型配列を短く切断したが、まだ活性部分を含むタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び酵素の任意の化学的又は酵素的改質を含む。
【００８５】
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、及び当該技術分野の範囲内の組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。かかる技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ｈｅｒｅｉｎ "Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９"）； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ & ＳＪ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４）； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （ＲＩ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）；等を参照されたい。
【００８６】
本開示が核酸又はアミノ酸配列の相同性又は同一性の割合に関する場合はいつでも、これらの値は、核酸についてＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ヌクレオチド）プログラム（www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html）又はアミノ酸配列についてＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（タンパク質）プログラム（www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/）を使用することによって得られるものを定義する。局所配列アライメントについてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ） Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）により提供されるそれらのツールは、改良したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する（www.ebi.ac.uk/Tools/psa/及びＳｍｉｔｈ， Ｔ．Ｆ． & Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ｍ．Ｓ． "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８１ １４７ （１）：１９５−１９７を参照されたい）。アライメントを実施する場合に、ＥＭＢＬ−ＥＢＩにより定義されたデフォルトパラメータを使用する。それらのパラメータは、（ｉ）アミノ酸について：Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ＝１０及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５、又は（ｉｉ）核酸配列について：Ｍａｔｒｉｘ＝ＤＮＡｆｕｌｌ、ギャップオープンペナルティ＝１０及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。
【００８７】
詳細な説明
本発明の第一の態様に従って、本発明は、（ａ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）もしくはそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする核酸配列、及びそれらと直接相互作用するもの、（ｂ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）、又はそれらをコードする核酸配列、ここで修復鋳型ドッキングドメインは、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）と直接相互作用するように設計されている、を含み、（ｃ）任意に少なくとも１つの相互作用ドメイン（ＩＡ）、又はそれらによる核酸配列を含む人工分子複合体を提供し、その際、少なくとも１つの相互作用ドメインは、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメントと直接相互作用し、かつ少なくとも１つの相互作用ドメインは、（ｉ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインとの相互作用、及び／又は（ｉｉ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との相互作用、及び／又は（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡとの配列特異的相互作用からなる群から選択される少なくとも１つの機能性を提供するように設計され、ここで、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのゲノム相補性配列に相補的である少なくとも１つの部位を含み、かつ少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、ＤＮＡ標的配列の修復を媒介するように設計される。
【００８８】
したがって、本発明は、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）による。このヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能及びＤＮＡ認識機能を有することで特徴付けられる。ＤＮＡ認識機能は、ドメイン媒介ＤＮＡ認識又は結合の形でヌクレアーゼに固有であってよく、又は、例えば核酸ガイドＣＲＩＳＰＲ（ＲＮＡガイド）又はＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＤＮＡガイド）ヌクレアーゼのための追加のガイド分子によって補助されてよいが、しかし本発明は、前記核酸ガイドヌクレアーゼの使用に制限されず、かつ任意の非ＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅ部位特異的ヌクレアーゼに対する標的ゲノム操作の用途の範囲を拡大する。本発明による人工システムの他の部分は、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）であり、本開示の生成物及び方法は、主にＳＳＮによって誘導される二本鎖切断の部位でＲＴを物理的に利用可能にすることに焦点を合わせている。さらに、本発明は、最適化分子系の一部としての修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）による。このＲＴＤＤは、直接又は間接的にＳＳＮ及び少なくとも１つのＲＴを密接に結び付けて、効率的に標的とするゲノム操作を可能にする機能を果たす。
【００８９】
したがって、ＲＴＤＤは、ＲＴと共有又は非共有的に会合し、すなわち分子レベルでＲＴと直接相互作用する。同時に、ＲＴＤＤは、少なくとも１つのＳＳＮと直接相互作用し、したがってＳＳＮとＲＴとの間の連結分子又はドメインを示す。ＲＴＤＤについて、いくつかの可能な配置がある。一実施形態において、ＲＴＤＤはＳＳＮと直接会合している。例えば、ＳＳＮがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである場合に、ＲＴＤＤはｇＲＮＡであってよく、又はＳＳＮがＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼである場合には、ＲＴＤＤはｇＤＮＡであってよい。他の実施形態において、ＲＴＤＤは、ＳＳＮ自体の一部であってよく、又はＲＴの一部であってよく、その際ＲＴＤＤはＲＴ又はＳＳＮの特定の部分を示す。これらの実施形態において、ＳＳＮは、ＲＴを保有するアプタマーと相互作用できるそのアミノ酸配列の一部としてドメインを含んでよい。したがって、ある実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼ自体がＲＴＤＤとの相互作用のためのドメインを含むため、別々の相互作用ドメインがない。したがって、ＲＴＤＤは、ＲＴ核酸配列と会合したアプタマーであってよく、その際アプタマーが認識され、かつしたがって、ＳＳＮ及び／又は追加の相互作用ドメインと特異的に相互作用できる。
【００９０】
さらに、人工分子複合体の成分間の共有及び非共有的な相互作用が、本発明に従って予測される。
【００９１】
さらなる実施形態において、人工分子複合体は、追加の相互作用ドメイン（ＩＡ）を含む。この配置において、ＲＴＤＤは、ある実施形態についての追加の相互作用ドメインと会合しうる。相互作用ドメインは、融合タンパク質として共有的に、又は非共有的に、ＳＳＮと直接相互作用、すなわち物理的に会合しており、分子複合体にさらなる機能を提供する。相互作用ドメインは、ＤＮＡ認識／結合機能を含むタンパク質ドメインであってよく、すなわち、ゲノムＤＮＡ標的部位と部位特異的な方法で相互作用できるドメインであってよく、又は相互作用ドメインは、ＲＴＤＤ及び／又はＲＴと相互作用するために特異的に配置されていてよい。例えば、相互作用ドメインは、ゲノムＤＮＡと特異的に相互作用するためにヌクレアーゼ機能自体を有さない固有のＤＮＡ認識及び結合機能を含みうる。他の実施形態において、相互作用ドメインは、さらに以下で詳述するようなＲＴと会合したＲＴＤＤについてより高い特異的相互作用パートナーとして機能しうる。この追加のＤＮＡ認識又はＲＴＤＤ相互作用機能を相互作用ドメインを付加することによって分子複合体に付加することにより、ＳＳＮのみの単なる機能性に加えてゲノム操作に特異的な他のレベルを提供する。
【００９２】
最終的に、特にＲＴと直接相互作用するＲＴＤＤ及び本明細書に以下で詳述されるさらなる相互作用ドメインは、（ｉ）ＲＴを目的のＳＳＮと密接に接触させ、少なくとも１つのＳＳＮにより誘発された二本鎖切断に近接させて、（ｉｉ）ゲノム工学、代謝工学、植物における形質開発のため及び治療用途のために最適な結果を得るための真核生物及び原核生物において種々のカスタムメイドのゲノムアプローチに適したより有意な標的範囲及びより高い正確さを有する人工分子複合体の形での分子系を提供するために多用途のツールキットを提供する。
【００９３】
したがって、本発明の種々の態様及び実施形態は、全て、適した二本鎖切断を誘発する酵素、又は２つのニッカーゼ、ＳＳＮ、及び適切に設計された修復鋳型核酸配列（ＲＴ）の提供に依存しており、その際本発明の要点は、ＳＳＮ及びＲＴが、密接に近接して、標的とした方法でゲノム工学事象を示すことである。
【００９４】
一実施形態において、少なくとも１つのＲＴＤＤは、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡであり、修復鋳型と直接相互作用又は会合して、ＲＮＡ−ＤＮＡの又はＲＴＤＤからのＤＮＡとＲＴからのＤＮＡとのハイブリッド核酸配列を構築する。
【００９５】
したがって、本発明による「人工分子複合体」は、少なくとも１つのアミノ酸成分、すなわちＳＳＮ、及び任意に相互作用ドメイン、ＲＴＤＤ及び核酸−塩基修復鋳型（ＲＴ）を含む複合体を示す。組織化状態で、複合体は、通常、少なくとも１つのアミノ酸（タンパク質）を含む成分、すなわち少なくとも１つのＳＳＮと、核酸を含む成分、すなわちＲＴとを含むであろう。少なくとも１つのＲＴＤＤ及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、構成要素としてアミノ酸及び／又は核酸も含んでよく、さらに分子複合体内の該成分の機能によって、合成構成要素又は異なる生体分子及び／又は合成分子の組み合わせを含む分子のより大きいスペクトルが可能である。
【００９６】
したがって、本発明による人工分子複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで自己組織化できず、それによって、少なくとも１つのさらなる相互作用媒介ドメイン、すなわちＲＴＤＤ、及び任意にＲＴ及びＳＳＮの緊密な会合を保証するＩＡを付加することによりｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集のためのそれらの有用性、並びにｉｎ ｖｉｖｏでの、又は改変されるべき目的のゲノム標的ＤＮＡ（核、色素体及びエピソーム標的ＤＮＡ及びエピジェネティック標的部位を含むコード領域及び非コード領域を含むゲノム）を保有する少なくとも１つの未処理の細胞で作用する場合に一般に生理学的条件下で、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの分子複合体の完全な組織化を著しく制限するオリゴヌクレオチド（ＲＴ）−酵素（ＳＳＮ）抱合体の欠点を克服する。
【００９７】
一実施形態において、人工分子複合体が提供され、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば合成のために必要な構築物を準備し、続いて宿主細胞内で複合体を構築することによって、完全に構築される。他の実施形態において、人工分子複合体は、ｅｘ ｖｉｖｏで構築された分子複合体として提供されてよく、該分子複合体は、続いて、ｉｎ ｖｉｖｏで目的の宿主細胞に導入されるか、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで目的のゲノム標的分子と接触される。さらなる実施形態において、人工分子複合体の一部は、ｅｘ ｖｉｖｏで生成されてよく、例えば人工分子複合体の構成成分の転写及び／又は発現のためのプラスミドを保有する適した導入ベクターの導入後にｉｎ ｖｉｖｏで生成されてよく、そしてその機能を発揮する最終的な人工分子複合体は、ＲＴＤＤにより媒介される固有の認識機能に基づいてｉｎ ｖｉｖｏで構築される。
【００９８】
したがって、本発明による人工分子複合体の任意の構成成分間の「相互作用」又は「直接相互作用」は、人工分子複合体の２つの構成成分間の任意の共有又は非共有的な相互作用又は結合を意味する。したがって、核酸レベルでの共有結合は、核酸分子のヌクレオチド間のホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を意味しうる。さらに、共有結合は、アミノ酸と他のアミノ酸及び／又は改変した核酸分子とのジスルフィド架橋であってよく、さらに任意の天然に生じるか又は人工的な共有結合が、本発明によって予測されてよい。非共有相互作用は、イオン結合、水素結合又はハロゲン結合を含む静電相互作用、双極子−双極子、双極子−誘起双極子を含むファンデルワールス力、Ｌｏｎｄｏｎ分散力、π効果及び疎水性効果を含む。特に、１超の相互作用のタイプが、本発明による人工分子複合体の成分内に存在してよい。例えば、ＳＳＮ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＲＴＤＤとしてｇＲＮＡと、非共有相互作用により相互作用してよい。ＲＴＤＤは、修復鋳型ＲＴに共有結合してよい。他の実施形態において、ＳＳＮとしてのＡｒｇｏｎａｕｔｅ融合タンパク質は、相互作用ドメイン（ＩＡ）として一本鎖可変抗体フラグメントに共有的に融合してよい。ＩＡは、とりわけ、フルオレセインに特異的であり、したがってＲＴＤＤフルオレセインと非共有的に相互作用しうる。フルオレセイン及びかかる標識付けした修復鋳型核酸ＲＴは、合成共有融合として提供されてよい。他の実施形態において、異なる構成成分の会合は、非共有相互作用により、例えばＳＳＮ又はＩＡのいずれかと相互作用するＤＮＡ標的配列及び／又はアプタマー（核酸又はアミノ酸塩基）のロイシンジッパー認識によって媒介される。一実施形態において、ＲＴＤＤは、アプタマー、例えば修復鋳型においてアプタマー機能を提供する配列であってよい。他の実施形態において、修復鋳型とのハイブリダイゼーションを可能にするガイド核酸の伸長は、少なくとも１つのＲＴＤＤとして機能してよい。例えばＲＴＤＤとしてガイド核酸を定義する場合、そのような実施形態は、１超のＲＴＤＤを使用する。さらなる実施形態において、修復鋳型とのライゲーションのために使用されるガイド核酸の３’末端又は５’末端は、ＲＴＤＤとしての機能に特異的に構成されていてよい。
【００９９】
本発明に従って、人工分子複合体の異なる構成成分は、天然に生じる構成要素及び／又は合成の人工的な構成要素を含みうる。
【０１００】
したがって、本発明の種々の実施形態による部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）、又はそれらをコードする核酸配列は、部位特異的な方法でＤＮＡを認識及び切断できる任意の天然に生じるヌクレアーゼ又は操作されたヌクレアーゼであってよい。多くのＳＳＮが生物又はウイルスのゲノム内で多数の潜在的な切断部位を有するため、定義された切断パターンを有するかかるＳＳＮ、又はカスタムメイドの切断パートナーを有するデザイナーＳＳＮが好ましい。したがって、ＳＳＮは、ゲノム編集技術のための部位特異的ヌクレアーゼ、例えばデザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、（ホーミング）メガヌクレアーゼ、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲシステム由来ヌクレアーゼ、又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ並びに低頻度切断エンドヌクレアーゼ、又はＦｏｋＩもしくはその多様体を含むＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含む２つの部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、又は２つの部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、又はその多様体もしくは触媒活性フラグメント、又は前記ＳＳＮの任意の多様体もしくは触媒活性フラグメントを含む。したがって、本発明に従って、１超のＳＳＮ又はそれらをコードする核酸配列が存在する一方で、全ての分子は、標的となるＤＮＡ二本鎖切断、又はＤＮＡ標的核酸での２つの連続一本鎖切断を誘発することができる。
【０１０１】
本発明による「ＤＮＡ標的配列」は、二本鎖ＤＮＡ、ゲノム又はプラスミド塩基内での任意の領域であってよく、そこで標的となるＤＮＡ切断が誘発され、続いて本発明による修復鋳型（ＲＴ）の助けにより修復される。「ＤＮＡ標的配列」は内因性配列から生じるが、該配列の編集又は操作は、ゲノムＤＮＡを含む分子、好ましくはプラスミド上で関連配列を提示することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されてよい。かかる実施形態において、目的の標的遺伝子座は、細胞内でＤＮＡ分子中で含まれていてよい。細胞は、原核細胞もしくは真核細胞、又はウイルスの増殖のために使用される原核細胞もしくは真核宿主細胞内のプラスミド上のウイルスゲノムであってよい。細胞は哺乳動物細胞であってよい。哺乳動物細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、齧歯類又はマウスの細胞であってよい。細胞は、非哺乳動物の真核細胞、例えば家禽、魚類又はエビであってよい。細胞は植物細胞であってもよい。植物細胞は、作物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、大豆、綿、テンサイ又は米の細胞であってよい。植物細胞は、藻類、木又は野菜の細胞であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、細胞及び細胞の子孫が、生物学的生成物、例えば抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物の改善された生成のために変更されるようなものであってよい。本発明によって細胞に導入される改変は、細胞及び細胞の子孫が、生成された生物学的生成物を変化させる変更を含むようなものであってよい。他の実施形態において、「ＤＮＡ標的配列」は目的のエピゲノム遺伝子座であってよい。
【０１０２】
本発明による「ゲノム相補性配列」は、本発明によるＲＴの配列の一部を相補的塩基対により整列することができるものをいう。したがって、「ＤＮＡ標的配列」及び「ゲノム相補性配列」は、オーバーラップしているか又は同一であってよいが、しかしある実施形態について、例えば少なくとも１つのＳＳＮがＲＴの「ゲノム相補性配列」部位の上流又は下流に切断部位を有する場合に、該配列は異なってよい。
【０１０３】
任意の記載された実施態様において、鎖切断は、二本鎖切断であってよく、又は２つの一本鎖切断であってよい。
【０１０４】
ある実施形態において、人工分子複合体のＳＳＮ成分及び任意のＩＡ成分は、一実施形態においてＲＴＤＤを標的とするか又は会合する修復鋳型オリゴヌクレオチドでタンパク質同時送達により、又は他の実施態様において、融合タンパク質のプラスミドベースの発現及び続くＲＴＤＤ標的修復鋳型への曝露により改変されるべき目的のゲノム領域を含む宿主細胞又はアッセイシステムに送達されてよい。追加のＲＴＤＤが、１超のＲＴＤＤが予測される場合に同時送達されてよく、例えばあるＲＴＤＤがガイド核酸分子であり、かつ他のＲＴＤＤがＲＴに会合される分子、例えばビオチン又はマーカー、例えばフルオレセインである。本発明によるプラスミドベース又はベクターベースのアプローチは、ＳＳＮ及び／又はＩＡ及び／又はそれらの融合タンパク質の安定な発現系列のものも含む。
【０１０５】
一実施形態において、人工分子複合体は２つのＳＳＮ分子を含み、その際１つのＳＳＮは活性ヌクレアーゼであり、他のＳＳＮは触媒不活性ヌクレアーゼ欠損分子であり、ここで不活性ＳＳＮは、ＲＴＤＤ／ＲＴについての相互作用パートナーとして機能するであろう。人工分子複合体の該配置は、目的のあるＤＮＡ標的配列についての特異性を高めうる。
【０１０６】
他の実施形態において、融合タンパク質又は非共有会合活性Ｃｐｆ１及び相互作用ドメインとして不活性ｄＣａｓ９がＳＳＮとして提供されうる。ＲＴＤＤとしてＣａｓ９のためのｇＲＮＡは、修復鋳型又はそれらの伸長部を標的として、Ｃｐｆ１−ｄＣａｓ９−ＲＴ複合体を形成しうる。ｃｒＲＮＡ（Ｃｐｆ１）は、ＨＤＲを開始するための二本鎖切断について定義されたゲノム遺伝子座を標的とする。
【０１０７】
同様に、より高い活性のジンクフィンガータンパク質、メガＴＡＬ又は不活性メガヌクレアーゼが、相互作用ドメインとして使用されうる。
【０１０８】
本発明の種々の態様による一実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン（ＲＴＤＤ）、又はそれらをコードする核酸配列、又は少なくとも１つの人工分子複合体は、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質染料、例えば蛍光体、例えばフルオレセイン、又はそれらの多様体、マレイミド、又はテトラゾリウム（ＸＴＴ）、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に設計されたガイド核酸配列、ストレプトアビジン、又はそれらの多様体、好ましくは単量体ストレプトアビジン、アビジン、又はそれらの多様体、アフィニティタグ、好ましくはストレプトアビジンタグ、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボディ）、アンチカリン、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質又はそれらのドメイン（例えば配列番号３３を参照されたい）、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ又はそれらのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ*タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質又はそれらのドメイン、又はジゴキシゲニンの少なくとも１つから選択される。したがって、ＲＴＤＤは、天然に生じる分子又は合成分子であってよく、核酸又はアミノ酸分子に制限されない。したがって、ＲＴＤＤは、むしろ本発明の人工分子複合体の特異的相互作用媒介物であり、それは、少なくとも１つの目的のＳＳＮ及び目的のゲノム相補性領域に特異的な少なくとも１つの修復鋳型を連結するための可変性の方法で設計されてよく、及び任意に少なくとも１つのＳＳＮにより切断される目的のＤＮＡ標的配列で導入されるべき目的の装入物を運搬する。ＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅベースのＳＳＮを使用する実施形態について、ＲＴＤＤはガイド核酸配列であってよい。したがって、本開示に従ったＲＴＤＤは、種々の種類の人工分子又は天然分子に属する分子であってよい。したがって、ＲＴＤＤは、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）と直接相互作用するその能力によって、及びさらに少なくとも１つのＳＳＮとの直接相互作用によって定義される。したがって、ＲＴＤＤは、ＲＴ及びＳＳＮの物理的な近接を提供し、かつＲＴ及びＳＳＮとの二重相互作用によって、高次の特異的分子相互作用によってｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで人工分子複合体の会合を保証する、人工分子複合体内の分子リンカーである。ある実施形態について、１超のＲＴを保有する１超のＲＴＤＤが存在してよい。
【０１０９】
他の実施形態において、人工分子複合体は相互作用ドメインを含み、ここで、少なくとも１つの相互作用ドメイン、又はそれらをコードする核酸配列が、ＤＮＡ結合ドメイン、ストレプトアビジン、又はそれらの多様体、好ましくは単量体ストレプトアビジン、アビジン、又はそれらの多様体、アフィニティタグ、ビオチン化シグナル、ビオチン受容体部位、ストレプトアビジンタグ、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボティ）、アンチカリン、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質染料、例えば蛍光体、例えばフルオレセイン、又はそれらの多様体、マレイミド、又はテトラゾリウム（ＸＴＴ）、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に設計されたガイド核酸配列、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質又はそれらのドメイン、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼ又はそれらのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ*タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質又はそれらのドメイン、又はジゴキシゲニンの少なくとも１つから選択される。
【０１１０】
特に、ＲＴＤＤ及び相互作用ドメインは、相互作用ドメインが本発明による人工分子複合体の特異性又は効率をさらに最適化できる任意の成分である事実により、比較可能な重複する分類の分子から選択できる。相互作用ドメインの存在は、人工分子複合体を使用する実施形態に重要であってよく、その際核酸ガイドヌクレアーゼはＳＳＮとして使用されず、又はＳＳＮは、ＳＳＮの固有のＤＮＡ認識、結合又は切断活性を改変する１つ以上の変異を有する。さらなる他の実施形態において、人工分子複合体内のさらなる成分としての相互作用ドメインが、該複合体に拡張機能を付加でき、したがってその適用範囲を広げることができるため、相互作用ドメインの存在は、標的範囲、結合及び／又は切断の効率、切断率、又は目的のＤＮＡ標的配列に対する標的の精度をさらに増大させるために任意の種類のＳＳＮと組み合わせて使用するために有利であってよい。したがって、特に複合体ゲノムを含む高次真核生物におけるゲノム操作のために、追加の成分、すなわち相互作用ドメインの存在は、ＤＮＡ切断及び（本発明によるＲＴにより媒介される）標的とされる修復の改善された精度を達成するために極めて重要であってよい。ある実施形態において、ＩＡは、それ自体ゲノム操作中に含まれない分子パートナーのための高い特異性の結合パートナーを示してよく、その際分子パートナー又は同族の結合パートナーは、ＲＴと会合するＲＴＤＤを示す。したがって、ＩＡドメイン及び同族のパートナーＲＴＤＤを付加することで、人工分子複合体に対する結合特異性及びＲＴ有用性が著しく向上し、標的とされるゲノム工学アプローチの結果を改善する。
【０１１１】
本発明による相互作用ドメイン（ＩＡ）は、（ｉ）少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインとの相互作用、及び／又は（ｉｉ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との相互作用、及び／又は（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡとの配列特異的相互作用からなる群から選択されるいくつかの機能性を有する。これらの機能性の１つより多くが、１つの特異的ＩＡ内に一様にあってよい。
【０１１２】
アプタマー又は抗原／エピトープのための同族のリガンド、例えばビオチン又はジゴキシゲニン及びその多様体を含む生体分子のためのフルオレセインを含む合成リガンドについての固有の高い特異性及び高い親和性結合能力を有するタンパク質又はポリペプチドを表すＩＡを使用することが好ましいだろう。本明細書において使用され、かつ免疫学の分野において通常使用される「抗原」という用語は、「抗体を生じる」分子、すなわち適応免疫応答を誘発できる物質をいう。したがって、抗原は、抗原特異性受容体、Ｔ細胞もしくはＢ細胞受容体又はそれらの多様体に結合する分子、例えばナノボディ又は一本鎖可変フラグメント抗体、二重特異性抗体タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ（三価）又は三重特異性抗体（三価）である。抗体は、通常（ポリ）ペプチドであるが、多糖類又は脂質であってもよく、タンパク質又は多糖類キャリヤー分子と組み合わされている可能性もある。ＩＡのこの固有の結合／認識特性によって媒介され、非常に特異的な方法でＲＴＤＤを特異的に認識する目的のＩＡを選択でき、ＩＡを共有又は非共有的にＳＳＮに連結又は融合できる。したがって、かかるＩＡの包含は、本発明の人工分子複合体にさらなるレベルの特異性を追加し、ＲＴＤＤと直接相互作用するＲＴが、非常に特異的なＩＡ−ＲＴＤＤ会合によって媒介されるＳＳＮ−ＩＡ複合体と特異的に会合することを保証する。最も好ましくは、ＩＡ及び同族のＲＴＤＤは、生理学的条件下で互いに高い親和定数又は結合親和性、及びしたがって低い解離定数（Ｋd）、すなわち、低いμＭ、又は好ましくはｎＭ範囲、好ましくはそれ以下のＫd値を有する。ＩＡは、それぞれ１つ以上の特異性（三価抗体由来のフラグメント）を有する、又は１超の結合部位（四量体ストレプトアビジン）を有する一価、二価、三価又は多価の分子であってよい。この実施形態において、１超のＲＴＤＤ及び／又はＲＴが存在し、人工分子複合体と一緒に少なくとも１つのＳＳＮに提示されうる。低い解離定数（Ｋd）を持つＩＡ、すなわち、同族のリガンドに対して高い親和性を有するＩＡが好ましい。通常、２つの分子間の非共有結合性相互作用、すなわちタンパク質とリガンド間の典型的な相互作用形態の結果として、ピコモル以下の解離定数はまれである。それにもかかわらず、いくつかの重要な例外がある。ビオチン及び天然に生じるアビジンは、およそ１０-15Ｍの解離定数で結合し、これは、可逆結合が意図されている用途には適さないほど高い親和性を表す。市販の抗体又はｓｃＦｖは、１０-14Ｍ〜１０-6Ｍの範囲のＫd値を有しうる。したがって、本発明の目的のために、ＩＡ−ＲＴＤＤ対は、低い解離定数、すなわち高い親和性を有するべきである。
【０１１３】
さらに、ある実施形態において、ＩＡはＲＴと直接相互作用ができる。ＲＴ核酸配列が伸長部、例えば核酸ベースのアプタマーを含む場合に、この配列は、同族の結合パートナーであるＩＡによって認識されてよく、そして非常に特異的な方法でＲＴと相互作用することができる。さらに、ＩＡは、１超の結合特異性を有する二価又は三価又は多価の分子であってよい。ＩＡの一部は、ＲＴＤＤと相互作用するように構成されてよく、一部はＲＴと相互作用するように構成されてよく、一方でＩＡは、ＳＳＮと会合して、ゲノム操作中にＲＴ及びＳＳＮのさらにより緊密な会合が達せられる。
【０１１４】
他の実施形態において、ＩＡは、ゲノムＤＮＡとの配列特異的相互作用の能力を有する結合分子であってよい。ＤＮＡ標的配列への人工分子複合体のターゲティング中に、より高い特異性が追加される。さらに、これは、改変されたＳＳＮの使用を可能にし、最適化された切断活性を有するＳＳＮが提供されるが、ＩＡは、高精度でＤＮＡ標的配列に人工分子複合体をターゲティングする機能を媒介し、ＳＳＮ及び／又はＩＡは、二本鎖切断が誘導される部位と相互作用し、したがってＲＴを該部位に提示するＲＴＤＤと相互作用できる。したがって、一実施形態において、ＩＡは、少なくとも１つのＳＳＮヌクレアーゼ又はその多様体のＮ末端上又はＣ末端上で融合タンパク質の一部となるように設計されたＤＮＡ結合ドメイン又はＤＮＡ結合モチーフであってよい。アミノ酸ベースのリンカーは、柔軟性を可能にし、ＤＮＡ結合又はヌクレアーゼ活性の立体障害を回避する。潜在的なＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（Ｒｏｙら、２０１２）、例えばＣｙｓ2／Ｈｉｓ2  Ｚｎフィンガー（Ｋｕｂｏら、１９９８）、ＴＡＬＥＮ（Ｈｕｂｂａｒｄら、２０１５）、又は不活性化Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、又は非常に特異的にＤＮＡ結合できるＣａｓ９タンパク質であってもよい。これらのＤＮＡ結合ドメインのいずれかは、理想的には、相互作用の立体障害を回避する目的の相同性アーム隣接配列外の配列を標的とし、したがって、本発明の人工分子複合体に別のレベルの特異性を付加できる。
【０１１５】
さらなる実施形態において、１超のＩＡドメインは、人工分子複合体内で、すなわちＲＴＤＤのための高い特異性及び親和性バインダーとして使用される１つのＩＡ、及び追加のＤＮＡ結合ドメインとして使用される１つのＩＡを使用でき、その際双方のＩＡは、直接、人工分子複合体の少なくとも１つのＳＳＮと相互作用し、すなわち共有又は非共有的に会合される。
【０１１６】
一実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び／又は少なくとも１つのＩＡは、ビオチン化シグナル又はビオチン化アクセプター部位又はｓｔｒｅｐ−タグを含む。関連するシグナル／部位は、内因性（ＢｉｒＡ）又は外因性のビオチン化酵素／薬剤によってｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのビオチン化ステップでビオチン化でき、ビオチン化シグナル／部位及び／又はｓｔｒｅｐ−タグは、ストレプトアビジン又はアビジン、又は好ましくはその改変多様体、最も好ましくはその単量体多様体によって認識及び結合されてよく、その際ストレプトアビジン又はアビジン又はその多様体は目的のＲＴに会合される。アビジンは、ＤＮＡと非特異的に相互作用することが公知であり（Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、２００４）、アビジンの改変された多様体又はより好ましくはストレプトアビジン又はその多様体が好ましい場合がある。
【０１１７】
特に、ＲＮＡ／ＤＮＡの誘導に依存しないＳＳＮについて、追加の結合能力、及びしたがって所与の結合特異性を有する単量体ストレプトアビジン又はｓｃＦｖのＲＴターゲティング機能は、本発明によるＲＴＤＤ及び／又はＩＡと組み合わせて使用する場合に、ゲノム操作に適したＳＳＮの範囲を劇的に増加することができる。
【０１１８】
一実施形態において、ビオチンは、市販のキットによって、又はＲＴＤＤとしてのサードパーティ合成プロセスの一部として、修復鋳型ＤＮＡに融合することができる。改変したストレプトアビジン又はアビジン配列を使用することは、タンパク質間複合体化が生じず、タンパク質ごとに１つのビオチン化修復鋳型ＤＮＡが結合することを確実にする。そして、修復鋳型は、相互作用ドメインとしてストレプトアビジン又はその任意の多様体に連結され（Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、１９９９、"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｖａｌｅｎｔ ＤＮＡ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．"、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １０（５）：７０８−７１９）、ここで、相互作用ドメインは、例えば融合分子としてＳＳＮ及びストレプトアビジンを提供することにより、ＳＳＮと直接相互作用する。他の実施形態において、ＳＳＮは、ビオチン化シグナル又はペプチドを含んでよく、ビオチン化は、宿主細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで進行するであろう。この実施形態において、ストレプトアビジン又はアビジン、又はその多様体は、ＲＴに連結されているＲＴＤＤ自体として機能することができる。本発明による相互作用ドメイン又はＲＴＤＤとして適した単量体ストレプトアビジンをコードする例示的な配列（ｍＳＡ）を配列番号３４に示す。したがって、ＳＳＮに融合したｍＳＡは、本発明によるＲＴＤＤとして又は相互作用ドメインとして解される。他の実施形態において、ＳＳＮは、それぞれ、相互作用ドメインとして又はＲＴＤＤとして機能するストレプトアビジン多様体によって認識されるｓｔｒｅｐタグを保有してよい。 適したストレプトアビジン又はアビジン酵素、又はその多様体、又はそれらをコードするベクターは、当業者に、ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）、Ｉｎｔｒｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ， ＵＳＡ）、又はＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ； Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）から入手できる。本発明によるＩＡ又はＲＴＤＤとして適したｍＳＡをコードする単量体ストレプトアビジン構築物の他の例示的な配列は、配列番号４２に示されている。
【０１１９】
したがって、いくつかの実施形態において、ＲＴＤＤとＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインと間の相互作用又は付着又は会合は、これらに制限されないが、ビオチン−アビジン；ビオチン−ストレプトアビジン；ビオチン−アビジンの改変型；タンパク質−タンパク質；タンパク質−核酸相互作用；リガンド−受容体相互作用；リガンド−基質相互作用；抗体−抗原；一本鎖抗体−抗原；抗体又は一本鎖抗体−ハプテン；ホルモン−ホルモン結合タンパク質；受容体−アゴニスト；受容体−受容体アンタゴニスト；ＩｇＧ−タンパク質Ａ；酵素−酵素コファクター；酵素−酵素阻害剤；一本鎖ＤＮＡ−ＶｉｒＥ２；ＳｔｉｃｋｙＣ−ｄｓＤＮＡ；ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体）−ＲＮＡ；ウイルスコートタンパク質−核酸；抗フルオロセイン一本鎖可変フラグメント抗体（ａｎｔｉ−ＦＡＭ ｓｃＦＶ）−フルオレセイン；抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）イムノグロビン（ＤＩＧ−ｓｃＦｖ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、及びアグロバクテリウムＶｉｒＤ２結合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせもしくは異形から選択される結合対の非共有相互作用から選択される結合対の相互作用に起因する。特に、ｓｃＦｖ、ナノボディ又はカスタムメイドの特異性及び高い親和性（ｐＭ又はｆＭの範囲内）を有する二重特異性抗体のような抗体及び抗体フラグメント又は誘導体は市販されており、特にかかる抗体又はそのフラグメントもしくは多様体は、古典的な染料、例えばフルオレセイン、又はその誘導体を結合する。
【０１２０】
一実施形態において、本発明による相互作用ドメインは、ロイシンジッパー、アプタマー配列、ｄＣａｓ９、ｄＣＰＦ１、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、又はＴＡＬＥ構築物から選択される。この実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及びＲＴ  ＤＮＡは、ＳＳＮのＮ末端上及び／又はＣ末端上の融合タンパク質の一部であるように設計された中間体ＤＮＡ結合ドメイン又はＤＮＡ結合モチーフを介して直接相互作用させることができる。アミノ酸ベースのリンカーは、柔軟性を可能にし、ＤＮＡ結合又はヌクレアーゼ活性の立体障害を回避する。潜在的なＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（Ｒｏｙら、２０１２， "Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．" Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ ３７（３）： ４８３−４９１）、例えばＣｙｓ2／Ｈｉｓ2 Ｚｎフィンガー（Ｋｕｂｏら、１９９８， "Ｃｙｓ２／Ｈｉｓ２ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｅｔｕｎｉａ： ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．" Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６（２）： ６０８−６１５）、ＴＡＬＥＮ（Ｈｕｂｂａｒｄら、２０１５， "Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ＴＡＬＥＮ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．" Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２（１０）： ９３９−９４２）、又は不活性化Ａｒｇｏｎａｕｔｅ又は非常に特異的にＤＮＡ結合できるＣａｓ９タンパク質であってよい。相互作用ドメインとしてのこれらのＤＮＡ結合ドメインのいずれかは、さらに、相互作用の立体障害を回避するために目的の相同性アーム隣接配列の外側の配列を標的とするのに役立つ。該相互作用ドメインは、本発明の人工分子複合体のＤＮＡ結合を増加させる機能を果たし、かつ／又はＲＴＤＤ／ＲＴ結合のための追加のドッキング部位の提供を可能にして、ゲノム操作に適した非常に特異的な複合体を提供できる。
【０１２１】
ある実施形態に従って、本発明による少なくとも１つのＳＳＮは、これらに制限されないがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合を含む、ＤＮＡ分子を結合する又は他の細胞分子を結合するＤＮＡ結合ドメイン、すなわちタンパク質もしくはそのフラグメント、又は該タンパク質もしくはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合しうる。
【０１２２】
ある実施形態において、１超のＲＴＤＤがあってよい。第一のＲＴＤＤは、ｍＳＡ又は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、第二のＲＴＤＤは、ビオチン又はｓｃＦｖの同族リガンドであってよい。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅベースのＳＳＮシステムを使用する場合には、第一のＲＴＤＤは、ガイド核酸配列であり、第二のＲＴＤＤは、ビオチン又はフルオレセイン、又はＲＴに連結した他の高親和性結合パートナー部分であり、その際単量体ストレプトアビジン又はｓｃＦｖ、又は他の同族タンパク質結合パートナーは、第二のＲＴＤＤを認識するＩＡを表し、高い親和性でそれに結合する。本発明による人工分子複合体のこの設計は、ＲＴＤＤがＲＴ及びＳＳＮとの強力かつ信頼できる相互作用を提供して、高精度のゲノム操作事象を達成するため、高いＲＴ有用性及びＲＴを消失しないことを同時に提供することにより、ＲＴをエフェクターＳＳＮと密接に接触させる最大の柔軟性を可能にする。
【０１２３】
一実施形態において、ＳＳＮへの修復鋳型結合は、染料フルオレセインに対する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体によって達成される。
フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体に特異的に結合するｓｃＦｖは、ハイブリッドタンパク質法でＳＳＮに融合される（Ｓｃｈｅｎｋら、２００７、"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ．"、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ８９（１１）：１３０４−１３１１）。他の実施形態において、ＳＳＮは、それと相互作用するフルオレセイン分子を含むことができ、同族フルオレセイン特異的ｓｃＦｖは、ＲＴとの融合物として提供することができ、かつＳＳＮに会合するフルオレセインに結合することができる。したがって、ｓｃＦｖは、本発明によるＲＴＤＤ又は相互作用ドメインとして機能することができる。
【０１２４】
本発明の他の実施形態において、異なる結合特異性を有する任意のｓｃＦｖが使用されてよい。
【０１２５】
適したｓｃＦｖリガンド対は、ｓｃＦｖとフルオレセイン（ＦＡＭ）又は任意のＦＡＭ誘導体もしくは多様体、ジゴキシゲニンを認識するｓｃＦｖ（ＤＩＧ）、目的のＳＳＮ上のエピトープ／抗原を認識するカスタムメイドのｓｃＦｖ等からなる群から選択される。フルオレセインに対する結合能力を有するｓｃＦｖコード配列をコードする１つの例示的な配列は、配列番号４３に示されている。
【０１２６】
他の実施形態において、アプタマー配列は、少なくとも１つのＳＳＮと特異的に相互作用するように設計されている。この実施形態において、アプタマー配列は、目的の修復鋳型配列に共有又は非共有結合されて、融合タンパク質を作成せずに及び／又は追加の相互作用ドメインを利用せずに、ＲＴＤＤとしてのＳＳＮとアプタマーの間の直接会合を可能にしうる。別個の相互作用ドメインが使用されない実施形態において、ＲＴと相互作用するＲＴＤＤは、少なくとも１つのＳＳＮタンパク質のドメイン又はＲＴＤＤと相互作用するように構成されたその特異的ドメインに、特異的に相互作用、すなわち付着又は結合できるヌクレオチドモチーフを含む：いくつかの実施形態において、相互作用は以下から選択されるが、これらに限定されない：ジンクフィンガータンパク質−ジンクフィンガーモチーフ；制限酵素認識ドメイン−制限酵素認識配列；転写因子のＤＮＡ結合ドメイン−ＤＮＡモチーフ；リプレッサー−オペレーター；ロイシンジッパー−プロモーター；ヘリックスループヘリックス−Ｅボックスドメイン；アルギニンリッチモチーフドメイン、αβタンパク質ドメイン、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）ドメイン、Ｋ−ホモロジードメイン、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ、ＲＮＡ結合ジンクフィンガー、及びＲＮＡターゲティング酵素を含むＲＮＡ結合モチーフ−同族特異的ＲＮＡ配列；ＨＩＶ ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）のＨＩＶ−ｒｅｖタンパク質−Ｓｔｅｍ ＩＩＢ；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）Ｔａｔメイン結合ドメイン−ＢＩＶトランス作用性応答エレメント（ＴＡＲ）配列のループ１；ファージラムダ、ｐｈｉ２１、及びＰ２２ Ｎタンパク質、そのそれぞれのＲＮＡのＮ利用（ｎｕｔ）部位のｂｏｘＢループヘアピン。
【０１２７】
本発明が部位特異的ヌクレアーゼとしてＡｒｇｏｎａｕｔｅの使用に関する限り、ガイドＤＮＡ分子の利点に加えて、ＮｇＡｇｏエンドヌクレアーゼの送達は、その小さなサイズによって促進される。野生型（ＷＴ）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＺ７３７４９）は、８８７アミノ酸であり、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９の約２／３のサイズである。これにより、クローニング及びベクターの組織化を単純化し、細胞内のヌクレアーゼの発現レベルを増加させることができ、ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスを含むウイルスなどのサイズ感受性プラットフォームからタンパク質を発現する際の課題が軽減される。他の核酸誘導エンドヌクレアーゼのように、ＮｇＡｇｏ ＳＳＮは、通常、植物細胞における標的とされた変異誘発のために最低２つの成分：５’−リン酸化一本鎖ガイドＤＮＡ及びＮｇＡｇｏエンドヌクレアーゼタンパク質を必要とする。標的とする編集、挿入、又は配列置換について、所望の配列変更をコードするＤＮＡ鋳型が植物細胞に提供されて、ＮＨＥＪ又はＨＲ修復経路を介して変更を導入することができる。編集事象の成功は、表現型の変化（例えばノックアウト又は可視表現型となる遺伝子の導入）によって、ＰＣＲベースの方法（例えば濃縮ＰＣＲ、ＰＣＲ消化、又はＴ７ＥＩもしくはＳｕｒｖｅｙｏｒエンドヌクレアーゼアッセイ）によって、又は標的とする次世代シーケンス（ＮＧＳ；ディープシーケンスとしても公知である）によって、最も一般的に検出される。特定の一実施形態において、改変Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼは、約２０℃〜約３５℃の温度で活性がある。特定の一実施形態において、改変Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼは、約２３℃〜約３２℃の温度で活性がある。エンドヌクレアーゼとして機能できるＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、３つの重要な機能ドメイン：ＰＩＷＩエンドヌクレアーゼドメイン、ＰＡＺドメイン、及びＭＩＤドメインを含みうる。ＰＩＷＩドメインはヌクレアーゼに似ている場合がある。ヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ Ｈ又はＤＮＡ誘導リボヌクレアーゼであってよい。ＰＩＷＩドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡを切断できる他のヌクレアーゼにより示される触媒作用のために、二価カチオン結合モチーフを共有していてよい。二価カチオン結合モチーフは、４つの負に帯電した進化的保存アミノ酸を含んでよい。４つの負に帯電した進化的保存アミノ酸は、アスパラギン酸−グルタミン酸−アスパラギン酸−アスパラギン酸（ＤＥＤＤ）であってよい。４つの負に帯電した進化的保存アミノ酸は、２つのＭｇ2+イオンに結合し、標的核酸を３’ヒドロキシル及び５’リン酸基を持つ生成物に切断する触媒四分子を形成しうる。ＰＩＷＩドメインは、塩基性残基から選択される１つ以上のアミノ酸をさらに含んでもよい。ＰＩＷＩドメインは、ヒスチジン、アルギニン、リジン、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸をさらに含んでもよい。ヒスチジン、アルギニン、及び／又はリジンは、触媒作用及び／又は切断において重要な役割を果たしてよい。Ａｒｇｏｎａｕｔｅによる標的核酸の切断は、単一のホスホジエステル結合で生じうる。場合により、１つ以上のマグネシ��ム及び／又はマンガンカチオンは、標的核酸の切断を促進でき、その際、最初のカチオンは、水分子を求核的に攻撃及び活性化でき、２番目のカチオンは、遷移状態及び脱離基を安定化できる。特定のＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼについて、ｇＤＮＡの長さが、ＡｒｇｏｎａｕｔｅとガイドｇＤＮＡ間の親和性を提供する。
【０１２８】
本発明による適したＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、配列番号１９及び２０で示され、又は該配列に対して少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有する配列を含んでよいが、但し、相同配列は、それに由来する、すなわちその起源のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の機能を未だ満たしている。さらに適したＡｒｇｏｎａｕｔｅ配列は、米国仮特許出願番号第６２／３４５，４４８号（provisional U.S. application No. 62/345,448）において開示されており、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。さらに、適したＡｒｇｏｎａｕｔｅ配列は、配列番号２１〜２９に従った配列、又は該配列に対して少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有する配列に由来しうる。
【０１２９】
Ａｒｇｏｎａｕｔｅは、核酸結合ドメインを含みうる。核酸結合ドメインは、核酸と接触する領域を含みうる。核酸結合ドメインは核酸を含みうる。核酸結合ドメインは、タンパク質性物質を含みうる。核酸結合ドメインは、核酸及びタンパク質性物質を含みうる。核酸結合ドメインはＤＮＡを含みうる。核酸結合ドメインは、一本鎖ＤＮＡを含みうる。核酸結合ドメインの例には、これらに限定されないが、ヘリックス−ターン−ヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメイン、ウィングドヘリックスドメイン、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックスドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン、ＨＭＧ−ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、免疫グロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン、又はＴＡＬＥドメインが含まれる。核酸結合ドメインは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のドメインであってよい。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、真核生物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ又は原核生物のＡｒｇｏｎａｕｔｅであってよい。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの双方に結合しうる。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、ＲＮＡ、又はＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの双方を切断しうる。場合により、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する。場合により、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、二本鎖ＤＮＡに連結し、二本鎖ＤＮＡを切断する。場合により、２つ以上の核酸結合ドメインを一緒に連結することができる。複数の核酸結合ドメインを一緒に結合することは、ポリヌクレオチドを標的とする特異性の増大を提供しうる。２つ以上の核酸結合ドメインは、１つ以上のリンカーを介して連結されうる。リンカーは柔軟なリンカーであってよい。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０以上のアミノ酸の長さを含みうる。リンカードメインは、グリシン及び／又はセリンを含んでよく、いくつかの実施形態において、グリシン及び／又はセリンからなってよく、又は実質的にグリシン及び／又はセリンからなってよい。リンカーは、ヌクレオチドを含むことができる核酸リンカーであってよい。核酸リンカーは、２つのＤＮＡ結合ドメインを一緒に連結できる。核酸リンカーは、最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０以上のヌクレオチド長であってよい。核酸リンカーは、少なくとも５、１０、１５、３０、３５、４０、４５、又は５０以上のヌクレオチド長であってよい。核酸結合ドメインは核酸配列に結合できる。核酸結合ドメインは、ハイブリダイゼーションにより核酸に結合できる。核酸結合ドメインを設計することができる（例えば、ゲノム中の配列にハイブリダイズするように設計される）。核酸結合ドメインは、分子クローニング技術（例えば、定向進化、部位特異的変異、及び合理的変異誘発）によって設計されてよい。
【０１３０】
ある実施形態において、本発明によるＳＳＮは、Ｃａｓ又はＣｐｆ１を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ、又はその多様体もしくは触媒活性フラグメントである。適したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ配列は、配列番号１９〜２９もしくは３５〜４１、又は該配列に対して少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有する配列からなる群から選択される。他の適したＣａｓ又はＣｐｆ１エフェクターは、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カンジダタス・ミクラルケウム・アシジフィルム（Candidatus Micrarchaeum acidiphilum）ＡＲＭＡＮ−１、パルクバクテリア属（Parcubacteria）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰＧ８０６５６．１）、スルホロブス属（Sulfolobus）種、例えばスルホロブス・アイランジカス（Sulfolobus islandicus）ＨＶＥ１０／４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８１７７０．１）又はＲＥＹ１５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８４８５２．１）、ニトラチフラクター属（Nitratifractor）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、パルビバクラム属（Parvibaculum）、ロゼブリア属（Roseburia）、ナイセリア属（Neisseria）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、アゾスピリラム属（Azospirillum）、スピロヘータ属（Sphaerochaeta）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、コリネバクテリア属（Corynebacter）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、ロドバクター属（Rhodobacter）、リステリア属（Listeria）、パルジバクター属（Paludibacter）、クロストリジウム属（Clostridium）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、クロストリジアリジウム属（Clostridiaridium）、レプトトリキア属（Leptotrichia）、フランシセラ属（Francisella）、レジオネラ属（Legionella）、アリシクロバシルス属（Alicyclobacillus）、メタノメチオフィルス属（Methanomethyophilus）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、プレボテラ属（Prevotella）、バクテロイデテス属（Bacteroidetes）、ヘルココッカス属（Helcococcus）、レトスピラ属（Letospira）、デスルホビブリオ属（Desulfovibrio）、デスルホナトロナム属（Desulfonatronum）、オピトゥトゥス科（Opitutaceae）、ツベリバシルス属（Tuberibacillus）、バシルス属（Bacillus）、ブレビバシリス属（Brevibacilus）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）又はアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）を含む群からの生物、例えばＳ．ミュータンス（S. mutans）、Ｓ．アガラチエ（S. agalactiae）、Ｓ．エクイシミリス（S. equisimilis）、Ｓ．サングイニス（S. sanguinis）、Ｓ．ニューモニア（S. pneumonia）；Ｃ．ジェジュニ（C. jejuni）、Ｃ．コリ（C. coli）；Ｎ．サルスギニス（N. salsuginis）、Ｎ．テルガルカス（N. tergarcus）；Ｓ．アウリクラリス（S. auricularis）、Ｓ．カルノサス（S. carnosus）；Ｎ．メニンギチデス（N. meningitides）、Ｎ．ゴノルホーエ（N. gonorrhoeae）；Ｌ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、Ｌ．イバノビイ（L. ivanovii）；Ｃ．ボツリナム（C. botulinum）、Ｃ．ジフィシル（C. difficile）、Ｃ．テタニ（C. tetani）、Ｃ．ソルデリイ（C. sordellii）に由来してよい。
【０１３１】
一実施形態において、本発明の人工分子複合体の一部としての少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらの触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする配列は、Ｃａｓポリペプチドであって、ストレプトコッカス属（Streptococcus）種、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、又はナイセリア属（Neisseria）種、例えばナイセリア・メニンギチダス（Neisseria meningitides）、コリネバクテリア属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifactor）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、バクテロイド属（Bacteroides）、フラビイボラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、スピロヘータ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリラム属（Azospirillum）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ロゼブリア属（Roseburia）、パルビバクラム属（Parvibaculum）、ニトラチフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、及びカンピロバクター属（Campylobacter）、カンジダタス・ミクラルケウム・アシジフィルム（Candidatus Micrarchaeum acidiphilum）ＡＲＭＡＮ−１、パルクバクテリア属（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰＧ８０６５６．１）、スルホロブス属（Sulfolobus）種、例えばスルホロブス・アイランジカス（Sulfolobus islandicus）ＨＶＥ１０／４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８１７７０．１）又はＲＥＹ１５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８４８５２．１）からのＣａｓポリペプチド、Ｃｐｆ１ポリペプチドであって、古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチド、例えばアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）種、例えばアシダミノコッカス属種ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）種、例えばラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６、ラクノスピラ科細菌ＭＣ２０１７、ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Butyrivibrio proteoclasticus）、カンジダタス属（Candidatus）種、メタノプラズマ・ターミツム（Methanoplasma termitum）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、モラクセラ・ボヴォクリ（Moraxella bovoculi）２３７、ペレグリニバクテリア属（Peregrinibacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア・バクテリウム属（Parcubacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Smithella）種ＳＣＡＤＣ、スミセラ属種ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７、フランシセラ属（Francisella）種、例えばフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、プレポテラ属（Prevotella）種、又はポルフィロモナス属（Porphyromonas）種のＣｐｆ１ポリペプチド、又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼであって、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Natronobacterium gregoryi）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＺ７３７４９．１）、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１２２６５２０９．１又はＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００２７４７７９５．１又はＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１２２６５２０９．１）、ハロゲオメトリカム・パリ���ム（Halogeometricum pallidum）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＬＺ２９０１７．１）、ナトリアラバ・アジアティカ（Natrialaba asiatica）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６１１１０８５．１）、ナトロノルブラム・チベテンス（Natronorubrum tibetense）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６０９０８３２．１）、ナトリネマ・ペリルブラム（Natrinema pellirubrum）（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００６１８３３３５．１）、又はシネココッカス属（Synechococcus）種（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１１３７８０６９．１）からのＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼ、又はそれらの多様体及び／又は機能的フラグメント及び／又は組み合わせ、例えばニッカーゼ、又はヌクレアーゼ欠乏ヌクレオチド鎖切断活性からなる群から独立して選択される。
【０１３２】
ＳＳＮとして少なくとも１つのＣｐｆ１エフェクターを使用する本発明のさらなる実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフは、目的の標的遺伝子座へのエフェクタータンパク質複合体の結合を指示する。ＳＳＮとして少なくとも１つのＣｐｆ１エフェクターを使用する実施形態において、ＰＡＭは５’ＴＴＮであり、その際ＮはＡ／Ｃ／Ｇ又はＴである。本発明の他の好ましい実施形態において、ＰＡＭは、５’ＴＴＴＶであり、その際ＶはＡ／Ｃ又はＧである。ある実施形態において、ＰＡＭは、５’ＴＴＮであり、その際ＮはＡ／Ｃ／Ｇ又はＴであり、ＰＡＭはプロトスペーサーの５’末端の上流に位置する。本発明のある実施形態において、ＰＡＭは、５’ＣＴＡであり、ＰＡＭはプロトスペーサー又は標的遺伝子座の５’末端の上流に位置する。ある実施形態において、ＲＮＡ誘導ゲノム編集ヌクレアーゼの拡大されたターゲティング範囲が提供され、その際、Ｃｐｆ１ファミリーのＴリッチＰＡＭは、ＡＴリッチゲノムのターゲティング及び編集を可能にする。
【０１３３】
ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素が操作され、ヌクレアーゼ活性を低減又は排除する１つ以上の変異を含みうる。同様に、本発明は、２つ以上のニッカーゼを使用する方法、特に標的ＤＮＡ二本鎖切断を生じるための二重又はダブルニッカーゼアプローチを検討する。
【０１３４】
本発明による人工分子複合体内でＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を使用する実施形態において、１つ以上の非天然に生じる又は操作又は改変又は最適化された核酸成分、又はコードされたタンパク質を有するＣｐｆ１エフェクターが使用されうる。好ましい実施形態において、複合体の核酸成分は、直接反復配列に連結されたガイド配列を含んでよく、その際、直接反復配列は、１超のステムループ又は最適化された二次構造を含む。好ましい実施形態において、直接反復は、最小長さ１６ヌクレオチド及び単一のステムループを有する。さらなる実施形態において、直接反復は、１６ヌクレオチドよりも長い、好ましくは１７ヌクレオチドよりも長い長さを有し、複数のステムループ又は最適化された二次構造を有する。好ましい実施形態において、直接反復は、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変されてよい。好ましい実施形態において、１つ以上のアプタマー、例えば最適化された二次構造の一部が含まれてよい。かかるアプタマーは、バクテリオファージコートタンパク質に結合できてよい。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択されてよい。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。
【０１３５】
特定の実施形態において、本発明は、ＲｕｖＣドメインを含む少なくとも１つのＳＳＮエフェクタータンパク質の触媒活性フラグメントにある１つ以上の変異又は２つ以上の変異も提供する。いくつかの実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩもしくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン、又はＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩもしくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン等又は本明細書に記載された方法のいずれかに記載されている任意の関連ドメインに相同である触媒活性ドメインを含んでよい。エフェクタータンパク質ＳＳＮは、１つ以上の異種機能ドメインを含んでよい。人工分子複合体の１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含んでよい。１つ以上の異種機能的ドメインは、少なくとも２つ以上のＮＬＳドメインを含んでよい。１つ以上のＮＬＳドメインは、エフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）の末端の近くに又は近接して配置されてよく、かつ２つ以上のＮＬＳの場合には、２つはそれぞれ、エフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）の末端の近くに又は近接して配置されてよい。１つ以上の異種機能性ドメインは、１つ以上の転写活性化ドメインを含んでよい。好ましい実施形態において、転写活性化ドメインはＶＰ６４を含んでよい。１つ以上の異種機能的ドメインは、１つ以上の転写抑制ドメインを含んでよい。好ましい実施形態において、転写抑制ドメインは、ＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメイン（例えばＳＩＤ４Ｘ）を含む。１つ以上の異種機能ドメインは、ＳＳＮとして１つ以上のヌクレアーゼドメインを含んでよい。一実施形態において、ＳＳＮは、ＦｏｋＩ又はその触媒活性フラグメントもしくはその多様体を含みうる。
【０１３６】
好ましい一実施形態において、本発明による人工分子複合体の少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はその多様体もしくはその触媒活性フラグメント、又はそれらをコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから、好ましくはＣａｓ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼ、又はＦｏｋＩヌクレアーゼ、又はそれらの触媒フラグメントから選択され、かつ少なくとも１つの相互作用ドメイン、又はそれらをコードする配列が、一本鎖可変フラグメント又は単量体ストレプトアビジンから選択される。
【０１３７】
一実施形態において、本発明による人工分子複合体は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅ由来のＳＳＮ、又はその多様体もしくはその触媒活性フラグメント、及び少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインを示す少なくとも１つのガイド核酸配列を含み、その際、少なくとも１つのガイド核酸配列のそれぞれが、（ｉ）認識ＤＮＡ標的配列に相補的である第一の配列部位と（ｉｉ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼと相互作用するように設計された第二の配列部位とを含み、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１つのガイド核酸配列が、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と物理的に会合して、少なくとも１つのＲＮＡもしくはＤＮＡ又は少なくとも１つのさらなるＤＮＡ核酸配列を含むか又はそれらからなるハイブリッド核酸を形成し、及び（ｉｖ）任意に少なくとも１つのガイド核酸配列と少なくとも１つの修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域を含むハイブリッド核酸配列を形成し、好ましくは修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列の３’末端でガイド核酸配列と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列の５’末端で会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ガイド核酸配列内に位置している。
【０１３８】
本発明の種々の態様及び実施形態に従った少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つのガイド核酸配列は、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基修飾を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含み、ここで、ガイド核酸配列は、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
ある実施形態において、本発明による人工分子複合体の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）は、少なくとも１つの末端部位、好ましくは３’末端を含み、この末端部位が、人工分子複合体の任意の他の成分と相互作用せず、したがってＤＮＡ標的配列の修復を媒介するための少なくとも１つのゲノム相補性配列にハイブリッドするように設計され、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列がプラスミドとして提供される。したがって、少なくとも１つのゲノム相補配列にアクセスできるようにするためには、少なくとも１つのゲノム相補配列との最適な塩基対合を可能にする構成でＲＴを提供する必要がある。この構成は、ＲＴの性質に依存して、及びＲＴの提供方法に依存して変化する。ある実施形態において、ＲＴＤＤに共有結合又は非共有結合できる少なくとも１つのＲＴ、例えばｇＲＮＡ又はｇＤＮＡが使用される。
【０１４０】
ＲＴＤＤとして少なくとも１つのＲＮＡ伸長部を含む分子を使用する、又は目的のタンパク質をコードするＲＮＡを使用するある実施形態において、ＲＮＡは、保護分子又はプロテクター分子もしくは鎖と一緒に提示されてよく、プロテクター分子は、ＲＮＡエフェクター分子を細胞内での分解から保護するための人工分子複合体の実際のエフェクター分子を表すＲＮＡに少なくとも部分的にアニールする。
【０１４１】
本発明による人工分子複合体の適した構成を図１〜４に示す。本発明によるＲＴＤＤ及びＲＴとして「ハイブリッド核酸配列」を使用する人工分子複合体は、図１Ａ〜Ｄ、及び図２Ａ〜Ｃに示されるが、これらに限定されない。ＳＳＮに依存して、修復鋳型（ＲＴ）は、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの形であってよく、ＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をＳＳＮとして使用する場合に、少なくとも１つのガイド核酸（ｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ又はｇＤＮＡ）に共有又は非共有的方法で、３’末端、５’末端で付着してよく、又は例えば定義したサイズ及び形状のヘアピン二次構造を形成するｇＲＮＡ内にあってよい。この設計は、ｇＲＮＡ及びＲＴ部分の双方が、少なくとも１つの目的のｇＲＮＡと目的のＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼとの相互作用を妨げることなく、かつ同時に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ／ｇＲＮＡ対によって誘発されるＤＮＡ切断の部位に近接してＲＴを配置することなく、双方の機能を果たすことができることを可能にする。
【０１４２】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用するある実施形態において、人工分子複合体は、したがって、本発明による少なくとも１つのＲＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡ核酸配列、又は単にハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列を含むか又はそれらからなるハイブリッド核酸配列を含み、２つの機能性を含むキメラＲＮＡ及びＤＮＡ含有分子を示す。第一に、それは、リボ核酸を含むＣガイド核酸（ｇＲＮＡ）部分を含む。このｇＲＮＡは、２つのヌクレオチド配列部分を含み、その際、１つのヌクレオチド配列は、目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの相互作用に必要であり、もう１つのヌクレオチド配列は標的ドメインを含み、ここで標的ドメインは、逆ストランドにおけるＰＡＭ配列に隣接する目的の相補的ＤＮＡ標的配列に塩基対によりハイブリダイズすることができ、したがってこの相補的ＤＮＡ標的配列は、本発明による第１のＤＮＡ標的配列を示す。第二に、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、目的のＤＮＡ標的配列に導入されるべき所望の編集を含むことができる修復鋳型核酸配列部分を含む。さらに、修復鋳型核酸配列は、ＤＮＡ標的配列のすぐ上流及びすぐ下流の追加の相同配列、すなわち左右の相同性アームを含んでよい。それぞれの相同性アームの長さ及び結合位置は、導入される変化のサイズに依存し、かつ最適な効率のために調節されてよい。例えば、Ｃａｓ９（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１６、ｄｏｉ：１０．１０３８ ／ ｎｂｔ．３４８１において記載されている）によって最初に放出された切断されたＤＮＡ鎖に特異的な相補性を有する修復鋳型が最も効率的な修復をもたらしてよいだろう。修復鋳型は、特定の適用に依存する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列であってよい。
【０１４３】
修復鋳型は、ヌクレアーゼによる結合を破壊するためにゲノムＤＮＡと比較して多型を含んでよく、そうでなければ、修復鋳型は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド切断のために適した標的となる。例えば、ＰＡＭは、もはや存在しないように変異させることができるが、コードされるアミノ酸配列を変化しないサイレント変異に対応する遺伝子のコード領域は影響を受けない。ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲポリペプチドがＳＳＮとして人工分子複合体内で使用される他の実施形態において、修復鋳型配列内でＰＡＭ配列の存在が可能である。一実施形態において、ＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、少なくとも１つのガイド核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含むが、ハイブリッドは、以下にさらに詳述するように、ゲノム編集に適したそれに付着するさらなる部分も含んでよい。他の実施形態において、ハイブリッドＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、少なくとも１つのガイド核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列からなる。
【０１４４】
最適なＲＴサイズが、ＨＲ媒介ＤＳＢ修復の効率化のために相同性アームサイズとのヌクレアーゼ効率の均衡状態を提供する使用されるＳＳＮに依存して存在してよいことが見出された。
【０１４５】
一実施形態において、ガイド核酸配列又はｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ要素を一体化する１つのＲＮＡ核酸配列として提供される。他の実施形態において、例えばＣｐｆ１ポリペプチド又はその多様体もしくは触媒活性フラグメントを使用してＶ型ＣＲＩＳＰＲ系と共に作用する場合に、ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡエレメントを含む。さらにさらなる実施形態において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、双方が必要とされる場合に、２つの別々のＲＮＡ分子上で提供される、多くのＣＲＩＳＰＲ系における自然の状況を模倣する１超のＲＮＡ核酸配列として提供されてよい。したがって、ある実施形態において、この配置は、自然に別々のＲＮＡ鎖において２つのエレメント（ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ）を有する可能性を可能にする。一実施形態において、ＣｒＲＮＡを提供する別々のＲＮＡ核酸分子が提供され、かつ別々の核酸分子が提供され、すなわち１超のＲＴＤＤを提示する。ｃｒＲＮＡ部分又はｔｒａｃｒＲＮＡ部分のいずれかは、修復鋳型（ＲＴ）核酸配列と会合されてよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＲＴハイブリッド又はｃｒＲＮＡ：ＲＴを提供することは、ｇＲＮＡ：ＲＴハイブリッドと比較してそれぞれの分子の長さがより短いために、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＲＴ又はｃｒＲＮＡ：ＲＴのｅｘ ｖｉｖｏ化学合成が選択される場合に好ましく、ここで、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの機能を一様にした単一のＲＮＡ分子からなる。
【０１４６】
したがって、本発明によるＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、原核細胞並びに真菌、動物及び植物細胞を含む真核細胞を含む、任意の目的の細胞型、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ設定での目的の任意のゲノムにおける精密なゲノム編集に適しており、同時にゲノム編集中の修復鋳型及びＳＳＮの時空間的利用可能性を可能にする適切な物理的連結ツールを示す。
【０１４７】
本発明の全ての態様及び実施形態に従って、少なくとも１つのＲＴＤＤ及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、互いに会合している。本開示による「〜と会合する」又は「会合する」という用語は、広く解釈されるべきであり、したがって本発明に従って、ＲＴＤＤ、例えばｇＲＮＡ又はビオチン分子、ＦＡＭ又はジゴキシゲニンが、ＤＮＡ修復鋳型物理的に会合して提供されることを意味し、その際、会合は、共有又は非共有結合のいずれかであり、相同組換えのための修復鋳型の利用可能性を本質的に高める。修復鋳型の無差別な増幅、又は物理的にＲＴＤＤに連結していない過剰な修復鋳型の提供の代わりに、修復鋳型ヌクレオチド配列は、人工分子複合体のＳＳＮと共にＤＳＢに提示され、これにより、ゲノム編集アプローチの予測可能性及び特異性が著しく改善する。
【０１４８】
本発明によるさらなる実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、双方の共有及び／又は非共有的な結合又は付着によって少なくとも１つのＲＴＤＤ配列に付着される。この実施形態に従って、ハイブリッドＲＴＤＤ及びＲＴ複合体は、目的の標的細胞中でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、又は目的のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ内で、目的の少なくとも１つのＳＳＮと会合されてよい、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した分子として提供されてよい。好ましくは、細胞は、真菌、動物又は植物細胞を含む真核細胞である。細胞は原核細胞であってもよい。さらに、細胞は、プラスミド上に又はゲノムに組み込んで他の生物又はウイルスの異種標的配列を有する原核生物又は真核生物の宿主細胞であってよい。この実施形態において、細胞は、該宿主細胞内で提供される異種配列に対してゲノム操作を実施するための宿主として機能する。
【０１４９】
本発明の種々の態様による一実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）は、少なくとも１つのＲＴＤＤに共有的に付着される。共有的な付着又は共有結合は、互いに共有的に付着した分子又は配列の原子間での電子対の共有を含む化学結合である。
【０１５０】
本発明の種々の態様による他の実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのＲＴＤＤに非共有的に付着される。非共有的な相互作用は、電子の共有を含まず、むしろ分子／配列間の又は分子／配列内での電磁相互作用のより分散した変化を含むという点で共有結合とは異なる。したがって、非共有的な相互作用又は付着は、静電相互作用、ファンデルワールス力、π効果及び疎水性効果を含む。核酸分子に関して特に重要なのは、静電相互作用としての水素結合である。水素結合（Ｈ結合）は、部分的に正の水素原子と、該水素原子に共有結合していない極めて電気陰性の、部分的に負の酸素、窒素、硫黄、又はフッ素原子との間の相互作用を含む、特定のタイプの双極子相互作用である。
【０１５１】
本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が、塩基対合によって相補鎖と連結してハイブリダイズした複合体を形成する任意のプロセスを使用する、相補的核酸、すなわちＤＮＡ及び／又はＲＮＡの対合を示す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度及び長さ、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、並びに核酸内のＧ：Ｃ比といった要因によって影響を受ける。ハイブリダイズした複合体という用語は、相補的なＧ塩基及びＣ塩基間並びに相補的なＡ塩基及びＴ／Ｕ塩基間での水素結合の形成によって２つの核酸配列間で形成された複合体を示す。ハイブリダイズした複合体又は対応するハイブリッド構築物は、２つのＤＮＡ核酸分子間、２つのＲＮＡ核酸分子間、又はＤＮＡ核酸分子とＲＮＡ核酸分子との間で形成されうる。全ての群について、核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで生成された天然に生じる核酸分子、及び／又は人工又は合成の核酸分子であってよい。上述したハイブリダイゼーション、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ配列の間で形成することができるワトソン−クリック塩基対は、特定の水素結合パターンによって決定され、それは本発明による非共有的な付着形態を表す。
【０１５２】
本発明による非共有的な会合に関して、本発明の人工分子複合体の少なくとも１つのＲＴＤＤ及び本発明の少なくとも１つの修復鋳型配列は、ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合によって互いに会合してよい。
【０１５３】
非共有相互作用の他の形態は、電荷によって、少なくとも１つの修復鋳型配列と少なくとも１つの成分、又はＲＴＤＤもしくはＳＮＮにより含まれるＲＴＤＤのいずれかとの会合である。
【０１５４】
共有結合又は付着に関して、少なくとも１つのＲＴＤＤ及び少なくとも１つの修復鋳型配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで生成される隣接した分子と連結される。共有的及び／又は非共有的な付着は、例えば、共有的に付着したＲＴＤＤ／修復鋳型配列に非共有的に付着したさらなる修復鋳型核酸配列をさらに含んでよい、共有的に付着したＲＴＤＤ／修復鋳型配列を提供することによって組み合わされてもよい。このアプローチは、共有的に付着したＲＴＤＤ／修復鋳型配列が、少なくとも部分的にｉｎ ｖｉｖｏで生成され、かつｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで生成されるさらなる修復鋳型が、既存のＲＴＤＤ／修復鋳型複合体に付加されるべきである場合に、特に適している。
【０１５５】
前述のＮｉｓｈｉｍａｓｕらからも明らかであるように、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが通常ヘテロ二本鎖構造を構造を含む少なくとも１つの部分を含む場合に本発明の開示に従ってＣＲＩＳＰＲポリペプチド又はその多様体もしくはその触媒活性フラグメントと相互作用するように構成され、配列に依存した方法で、すなわちＡ、Ｕ、Ｇ及びＣを含むＲＮＡの塩基との相互作用を介して、又は配列に依存しない方法で、すなわちｇＲＮＡヌクレオチド配列のリン酸骨格とＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの相互作用を介して認識される。
【０１５６】
本発明の第一の態様及びさらなる態様の特定の実施形態に従って、ＤＮＡ標的配列は、細胞、好ましくは原核細胞もしくは真核細胞、より好ましくは真菌、動物又は植物細胞のゲノム内に位置し、その際ゲノムは、核ゲノム、及び色素体のゲノムを含む他のゲノム部分を含む。
【０１５７】
「ＤＮＡ標的配列」は、標的としたゲノム編集が実施されるべきゲノム領域を定義する。ＲＴＤＤ及び修復鋳型核酸配列が本質的に異なる機能を有するという事実によって、本発明の人工分子複合体の異なる成分について異なってよい１超のＤＮＡ標的領域があってよい。したがって、１つのＤＮＡ標的配列は、ＲＴＤＤ（ＲＴＤＤはｇＲＮＡである）の配列部分が相補的である目的のＤＮＡ標的領域の領域を定義してよく、一方で他のＤＮＡ標的配列は、ＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインに結合する目的のＤＮＡ標的領域の領域を定義する。修復鋳型核酸配列の少なくとも一部は、相補的なゲノム相補配列として定義され、該配列は、さらなるＤＮＡ標的配列も示す。ＤＮＡ標的領域は、目的のＤＮＡ標的配列内で、同一であるか、又は好ましくは異なるが、おそらくは重複する領域であってよい。
【０１５８】
ＲＴＤＤ及び／又はＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインに対する標的部位と修復鋳型核酸配列（ＲＴ）に対する相同性の部位との間の空間的関係は変動してよい。ＣＲＩＳＰＲ核酸配列に対する標的部位と修復鋳型核酸配列（ＲＴ）に対する相同性の部位との間の空間的関係は変動してよい。２つの部位は、同一であってよく、完全にもしくは部分的に重複してよく、又は目的のゲノム内の任意の数のヌクレオチドによって分離されてよい。ＲＴは、ゲノムＤＮＡの双方の鎖に対して相同性を有してよく、任意に、二本鎖構築物、例えばプラスミドとして提示されるか、又はどちらの鎖が、個々に、その鎖と無関係に標的とされる。効率的な修復鋳型は、ＳＳＮ、例えばＣａｓ９（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４８１において記載されている）によって最初に放出された切断されたＤＮＡ鎖に対して特異的な相補性を有するように配置されうる。
【０１５９】
ＲＴＤＤ及びＲＴとの相互作用、及びしたがって本発明の人工分子複合体によるＳＳＮ及びＲＴの近接近は、一般的に低い効率の相同組換え修復（ＨＤＲ）／相同組換え（ＨＲ）を克服すると予測される。それというのも、ｉｎ ｓｉｔｕで少なくともＳＳＮに関して化学量論的に存在する修復鋳型ヌクレオチド配列の物理的利用可能性を保証し、その場所で標的とされたゲノム鎖は、ＤＮＡ標的配列中の少なくとも１つのＳＳＮポリペプチドによって導入されるからである。
【０１６０】
したがって、本発明による人工分子複合体の一部としての修復鋳型核酸配列（ＲＴ）という用語は、ＤＮＡ切断の改変及び／又は修復のための型を提供することができる一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列であってよいヌクレオチド配列を意味する。
【０１６１】
本発明による一実施形態において人工分子複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで事前に構築されていてよく、その際ＳＳＮ、ＲＴＤＤ及びＲＴ及び任意に相互作用ドメイン成分もしくはその一部は、互いに共有的に付着されているか、又は非共有的に付着されているかのいずれかである。一実施形態において、ＲＴＤＤ／ＲＴ配列は事前に構築され、かつＳＳＮ及び任意に相互作用ドメインは、転写可能なＤＮＡもしくは翻訳可能なＲＮＡ構築物として、又は直接アミノ酸配列として、別々に標的細胞に送達され、かつＲＴＤＤ／ＲＴ配列並びにＳＳＮ及び任意に相互作用ドメインは、標的細胞内で複合体を形成する。他の実施形態において、ＲＴＤＤ／ＲＴ配列並びにＳＳＮ及び任意に相互作用ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築され、そして任意にさらなる分子、例えばビオチン又はＦＮＡ、又はジゴキシゲニンを含む核タンパク質複合体が、改変されるべき少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的ヌクレオチド配列を含む目的の標的細胞に又はｉｎ ｖｉｔｒｏでのシステムに導入される。
【０１６２】
機能的な事前に構築した人工分子複合体を標的細胞に導入することは、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）の活性が、本発明によるＤＮＡ標的配列の部位でＲＴＤＤに連結したＤＮＡ修復鋳型核酸配列と相同組換えを直ちに伴う事実により、標的とした二本鎖切断並びに同時に修復及び部位特異的改変をもたらし、その際ＲＴＤＤはＳＳＮと直接相互作用もする。したがって、ＲＴの利用可能性の乏しさ又は極めて特異的であり制御可能なゲノム編集事象を阻害する非特異的ＮＨＥＪ事象（上述の発明の背景を参照されたい）の欠点は、同時に低減されることであり、それというのも、人工分子複合体が、修復鋳型及びヌクレアーゼの適切な化学量論的組成で同等に標的部位に達することができるからである。さらなる利点は、修復鋳型の標的外への組み込みの可能性が、タンパク質及び複合体のＲＴＤＤとの物理的会合のために減少することであり、その際ＳＳＮ及び／又はＲＴＤＤはそれ自体ゲノムに組み込むことができない。
【０１６３】
本開示における「標的化された相同組換え修復」という用語は、独立して、配列挿入、少なくとも１つの配列位置の編集、欠失又は再編成を含んでよい、本出願による修復鋳型配列によって導入されてよい任意のタイプの変更を含み、ここで、高等真核生物におけるゲノム編集アプローチのための好ましい戦略は、現在挿入、欠失又は編集であり、それというのもこれらの戦略は、ＤＮＡ標的配列内の目的の配列の標的化したノックインもしくはノックアウト又は少なくとも１つの配列の部位特異的改変を可能にするからである。
【０１６４】
本発明によるハイブリッド核酸配列と協同してｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで形成されたＳＳＮとしてのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して人工分子複合体によって媒介されるような標的化された相同組換え修復の例は、例示的なＳＳＮ／ガイド核酸（ＲＴＤＤ）／修復鋳型（ＲＴ）複合体について及び所与の内因性ＤＮＡ標的配列についてのＤＮＡ認識結合、切断及び続く修復の時系列を示す図３Ａ〜Ｅに見出すことができる。
【０１６５】
本発明の種々の態様による一実施形態において、修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つのＲＴＤＤ配列は、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基修飾を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含み、ここで、ガイド核酸配列は、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む。
【０１６６】
任意のＣＲＩＳＰＲゲノム編集アプローチに対する挑戦は、ＳＳＮとしてｇＲＮＡ及び機能的ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、核、又はゲノムＤＮＡを含む任意の他の区画、すなわちＤＮＡ標的配列に、機能的な（劣化していない）方法で輸送されなければならないという事実である。ＲＮＡが、ポリペプチド又は二本鎖ＤＮＡよりも安定性が低く、かつより高いターンオーバーを有し、特に容易にヌクレアーゼにより分解されるため、特に本発明の第一の態様によるある実施形態において、ＲＴＤＤとしてｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つの天然に生じないヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の安定性を増大させる本発明による好ましい骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ロックド核酸修飾、２’Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾、ジ−ホスホロチオエート修飾、及びペプチド核酸修飾からなる群から選択される。特に、全ての前記骨格修飾は、２つの核酸鎖間の相補的塩基対合の形成をさらに可能にするが、それでも内因性ヌクレアーゼによる切断に対してより耐性がある。本発明によって利用されるヌクレアーゼに依存して、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの配列に依存しない相互作用に含まれる、ｇＲＮＡのそれらのヌクレオチド位置を改変しないことが必要であってよい。前記情報は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体について入手可能なものとして入手可能な構造情報に由来してよい。
【０１６７】
本発明の第一の態様によるある特定の実施形態において、ＲＴＤＤ及び／又はＤＮＡ修復鋳型ＲＴ核酸配列及び／又は相互作用ドメインは、ヌクレオチド及び／又は塩基修飾、好ましくは全部ではなく選択されたヌクレオチド配列位置を含むことが想定される。これらの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｄａｂｏｙｌ、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、リン酸ソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ”、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）の付加からなる群から選択される。好ましくは、前記付加は、本発明の人工分子複合体の一部としてのＲＴ及び／又はＲＴＤＤ及び／又は相互作用ドメインとして使用される核酸配列の３’末端又は５’末端で導入される。この修飾は、細胞内のＲＴＤＤ及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の細胞局在化を視覚化して、それぞれの配列の分布、濃度及び／又は利用可能性を研究することができるという有利な効果を有する。さらに、本発明の人工分子複合体と内因性分子との相互作用を研究することができる。かかる相互作用を研究する方法、又は前述したように修飾又はタグ付けされたヌクレオチド配列を視覚化するための方法は、それぞれの分野の当業者に利用可能である。
【０１６８】
本発明の種々の態様に従った任意の実施形態について、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つの相互作用ドメイン及び／又は少なくとも１つのＲＴＤＤは、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）、色素体局在化配列（ＰＬＳ）、好ましくはミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含む。したがって、人工分子複合体の成分の少なくとも１つは、複合体を核ゲノムの標的とする配列を含む。ある実施形態において、ＲＴＤＤは、少なくとも１つの局在化配列を保有することもできる。好ましくは、人工分子複合体のＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインは、少なくとも１つのＮＬＳ又は少なくとも１つのＰＬＳを含むか、又は少なくとも１つのＮＬＳと少なくとも１つのＰＬＳ配列の双方を含む。この少なくとも１つのＮＬＳ又はＰＬＳ配列は、人工分子複合体全体を核に輸送する。ＮＬＳタグ又はＰＬＳタグ付きタンパク質は、ＮＬＳタグ又はＰＬＳタグ付き融合分子として生じてよい。
【０１６９】
本発明による人工分子複合体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ目的のために、例えばゲノム又はゲノムの一部を、プラスミド又は任意の他のベクター上でｉｎ ｖｉｔｒｏで改変するために使用される実施形態について、局在化配列は必要ではないかもしれない。局在化配列は、目的の標的細胞内の関連する区画中で少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的配列に人工分子複合体を標的化するのに役立つ。本発明の特定の実施形態に従って、局在化配列は、核局在化配列、色素体局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列又はクロロプラスト局在化配列を含んでよい。したがって、少なくとも１つのＳＳＮ及び／又は少なくとも１つのＲＴＤＤ及び／又は少なくとも１つの相互作用ドメインは、少なくとも１つの対応する局在化配列、好ましくは細胞の核ゲノムに複合体を向けるための核局在化配列（ＮＬＳ）を含むだろう。いくつかの実施形態において、ＳＳＮ及び／又はＲＴ及び／又は少なくとも１つの相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤは、アミノ末端（ペプチド及びタンパク質について）で又はその付近で約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のＮＬＳ、又はカルボキシ末端（ペプチド及びタンパク質について）で又はその付近で約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のＮＬＳ、又はこれらの組み合わせ（例えば、ペプチド及びタンパク質についてアミノ末端で１つ以上のＮＬＳ及びカルボキシ末端で１つ以上のＮＬＳ）を含んでよい。人工分子複合体の非アミノ酸ベースの成分は、核酸配列の場合のように、例えば５’末端及び／又は３’末端上で局在化配列を保有する。さらに、局在化配列、好ましくは合成局在化配列を分子内の任意の位置に追加してもよいが、但し、分子複合体内の相互作用及び／又は本発明の人工分子複合体の結合、切断及び修復能力を妨げない。１超のＮＬＳが存在する場合に、それぞれは他から独立して選択されてよく、単一のＮＬＳが１超のコピー中に存在してもよく、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在してもよい。
【０１７０】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインは、局在化配列を含み、かつ最大で６つのＮＬＳを含みうる。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個又はそれ以上のアミノ酸の範囲内である場合に、人工分子複合体のアミノ酸成分のＮ末端又はＣ末端の近くにあると見なされる。ＮＬＳの制限のない例は、以下に由来するＮＬＳ配列を含む：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２）を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４）を有するｃ−ｍｙｃＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチンαからの１８８ドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号８）；ヒトｐ５３の配列ＰＸＰＫＫＫＰＬ（配列番号９）（ここで、配列番号９の８位での「Ｌ」は任意である）；マウスｃａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１１）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１２）；デルタ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）；ヒト  ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）。いくつかの実施形態において、局在化シグナルは、色素体局在化シグナル、例えば色素体又はミトコンドリア局在化シグナルであってよい。適した色素体局在化シグナルは、葉緑体輸送ペプチド又はミトコンドリア標的化ペプチドからなる群から選択される。さらに、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質に由来するペプチド又はそれをコードする配列は、目的の構築物又は分子を目的の細胞及び／又は細胞内区画に標的化するために適していてよい。適したＴａｔペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１７）に由来するか、又はモチーフＧＲＫＫＲ（配列番号１８）を含む。他の例示的な実施形態において、酵母ミトコンドリアＣｏｘ４ｐに由来する配列（配列番号３０）又はヒトリンゴ酸デヒドロゲナーゼミトコンドリアリーダー配列（ＭＬＳ）に由来する配列（配列番号３１）又はアラビドプシス属（Arabidopsis）のリポ酸シンターゼに由来する配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ 配列番号：ＮＰ １７９６８２．１、本明細書において配列番号３２として示す）を使用して、本発明による人工分子複合体をミトコンドリアマトリックスに局在化���せて、ミトコンドリアＤＮＡを改変してよい。
【０１７１】
特定の実施形態において、葉緑体に対して人工分子複合体を標的とすることが興味深い。多くの場合に、このターゲティングは、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又は色素体輸送ペプチドと呼ばれるＮ末端の伸長部の存在によって達せられる。細菌由来の染色体導入遺伝子は、発現させたポリペプチドが植物色素体（例えば葉緑体）に区分される場合に、発現させたポリペプチドをコードする配列に融合させたＣＴＰ配列をコードする配列を有するべきである。したがって、葉緑体への外因性ポリペプチドの局在化は、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’領域、すなわち本発明による少なくとも１つのＳＳＮに操作可能に連結することによりしばしば達せられる。ＣＴＰは、色素体への転座中の処理ステップにおいて除去される。しかしながら、処理効率は、ＣＴＰのアミノ酸配列及びペプチドのＮＨ２末端の近くの配列の影響を受けてよい。葉緑体を標的とする他の選択肢は、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（米国特許番号第７，０２２，８９６号（U.S. Patent 7,022,896）、国際公開番号第９７／４１２２８号（WO 97/41228））、エンドウグルタチオンレダクターゼシグナル配列（国際公開番号第９７／４１２２８号（WO 97/41228））、及び米国特許公開番号第２００９／０２９８６１号Ａ１（US 2009/029861 A1）に記載されているＣＴＰである。
【０１７２】
本発明による種々の局在化配列は、少なくとも１つの局在化配列をコードするプラスミド又は発現カセット上にコードして、局在化配列をそれぞれの分子に操作可能に連結することができ、又は局在化配列をタンパク質、核酸又は本発明の人工分子複合体を形成する他の生体分子に合成方法で付着させることができる。
【０１７３】
さらなる実施形態において、少なくとも１つの局在化配列に加えて又はその代わりに、少なくとも１つの核外輸送シグナルを使用することができる。
【０１７４】
人工分子複合体が核酸配列の形で少なくとも１つの導入ベクターの助けを借りて細胞に送達される実施形態において、局在化シグナルは、局在化シグナルをコードする核酸配列として、共有結合により、少なくとも１つのＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインをコードする配列に共有的に付着されてよい。
【０１７５】
一実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び／又はポリペプチド相互作用ドメインは、蛍光レポーター遺伝子又はタンパク質と共有的に又は非共有的に会合されてよい。このレポーターは、ＤＮＡとして、ｍＲＮＡとして、独立したタンパク質として、又は少なくとも１つのＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインポリペプチドに連結した融合タンパク質として送達されてよい。
【０１７６】
本発明によるＲＴＤＤ／ＲＴ分子は、いくつかの方法で生成されうる。これは、合成プロセスにおいて過程において適切な場合にはＲＮＡ塩基を、及び合成プロセスにおいて適切な場合にはＤＮＡ塩基を付加する化学合成によって製造されてよい。代わりに、ＲＴＤＤ及び／又はＲＴは、互いに独立して合成されてよく、次いでその分子が、前記したように互いに会合されてよい。他の選択肢は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、又はＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＲＮＡに核酸を連結することができる他の酵素を使用することである。ここで、ＲＮＡ及びＤＮＡ成分は、任意の方法によって独立して生じ、混合され、製造者のプロトコルに従って酵素にさらされ、そしてライゲーションによって共有結合的に連結され、すなわち共有結合を生じる。ＲＴＤＤのＲＴへの共有結合のための他の戦略は、それらの各々を他の連結化学基又は複合体、例えばペプチドに連結することを含む。このタイプのアプローチは、ハイブリッドＲＴＤＤ／ＲＴ配列が後に細胞内で検出されなければならない場合に、又はさらなる機能がハイブリッド核酸配列にあるべき場合に特に適している。ＲＴＤＤ及び／又はＲＴ核酸配列のいずれかの化学修飾は、ＲＴＤＤ／ＲＴ配列を安定化させるため、及び細胞酵素による分解を回避して目的のＤＮＡ標的部位でのＲＴＤＤ／ＲＴ配列及び少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼの高い同時利用可能性を得るために、非常に重要であってよい。
【０１７７】
ＲＴＤＤがｇＲＮＡであり、ＳＳＮがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼである実施形態において、１超のＲＴＤＤが存在してよい。複数のｇＲＮＡを同時に使用することは、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子活性化又は抑制を増大させ、遺伝子駆動に耐性のある対立遺伝子の出現を著しく減少させることができることが見出されている。したがって、ＲＴＤＤとしてのｇＲＮＡは、単一の未処理の転写物として提示され、次いでｇＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写により核中の前駆体から切除され、同時に細胞質へのｇＲＮＡの輸送を回避できる（Ｐｏｒｔ ａｎｄ Ｂｕｌｌｏｃｋ， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１６， ｖｏｌ． １３， ｎｏ．１０， ８５２−８５４）。それらの実施形態において、ｇＲＮＡをｔＲＮＡ−ｇＲＮＡプラスミドとして提示して、内因性ｔＲＮＡプロセシング機構を複数の機能的ｇＲＮＡを開放することができる。
【０１７８】
本発明の種々のある実施形態に従って、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ又はそれらをコードする配列、及び少なくとも１つの相互作用ドメイン又はそれらをコードする配列、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメイン又はそれらをコードする配列は、少なくとも１つのリンカードメインにより連結されている。このリンカー配列は、人工分子複合体のＲＴＤＤ配列及び修復鋳型核酸配列並びにＳＳＮ及び任意に相互作用ドメイン成分の最適な幾何学形状を達するための分子スペーサーとして提供されてよく、その結果、個々の成分がそれらの機能を十分に発揮することができる。リンカー又はテザー領域の長さ及び組成は、例えば特定のＲＴＤＤ及びＲＴ対のための重要な設計面でありうる。一実施形態において、特にＲＴの左相同性アームの５’末端は、リンカー領域を含んでよい。テザー又はリンカーは、種々の形をとってよい。ＲＴの左側又は右側の相同性アームから出発して、ＲＴのこの部分が染色体標的へのＲＴの移動を可能にするためのテザー又は柔軟なリンカーとして及びＨＲ反応を媒介する相同性として作用することを可能にすることは、本開示に基づき、ゲノム編集のために現在広く使用されている修復鋳型の通常の設計パラメータの知識を有する当業者によって、実施されてよい。
【０１７９】
人工分子複合体が少なくとも１つのＳＳＮ及び少なくとも１つの相互作用ドメイン（ＩＡ）を含む実施形態において、ＳＳＮ及びＩＡは、適したリンカーにより連結されていてよい。
【０１８０】
考慮されるべき設計パラメータは、ＳＳＮとしてＣＲＩＳＰＲポリペプチドの切断部位に関する修復鋳型相同性の幾何学形状、修復鋳型が相同である目的のＤＮＡ標的部位内の鎖、影響を及ぼしうる修復鋳型のサイズ、リンカーが導入されるかどうか、及びどの長さのリンカーが導入されるかを含む。リンカー配列は、ｇＲＮＡ及び修復鋳型の共有的な及び非共有的な会合の双方に使用されてよい。したがって、本開示に基づいて、及びＮｉｓｈｉｍａｓｕ（前述）、Ｔｓａｉ ｅｔら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３２， ５６９−５７６， （２０１４））、又はＳｈｅｃｈｎｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２（７）， ６６４−６７０ （２０１５）， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３４３３）において提供された情報に基づいて、当業者は、ｇＲＮＡ列及びＲＴ部分の双方があらゆる立体的制約なしにそれらの機能を十分に発揮できるようにいくつかのハイブリッド核酸が使用される場合に、ハイブリッド核酸配列に適したリンカー領域を定義し、ＲＴＤＤ／ＲＴとしてｇＲＮＡとＲＴとの間又は異なるｇＲＮＡ及び／又はＲＴの間の特定の配列を定義することができる。少なくとも１つのリンカー領域は、ＲＴから少なくとも１つのｇＲＮＡを適切に分離するか、又はｇＲＮＡ及び／又はＲＴの位置を最適化するために、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個までの追加のヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態において、リンカー配列は、ｇＲＮＡ及び／又はＲＴのより良好な位置決めを達成するために、最大１５０個、２００個、２５０個、５００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個まで、又は少なくとも４７００個もしくは５０００個のヌクレオチドを含んでよい。
【０１８１】
核酸配列を含む任意のＲＴＤＤ及びＲＴの非共有的な会合のために、１つのアプローチは、ＲＴＤＤ及びＲＴにおいて部分的に相補的な配列を提供して、２つの分子を核酸塩基対合によって自然に会合させることである。
【０１８２】
非共有的な会合の他の方法が考えられ、例えば分子の電荷を使用してＲＴと人工分子編集複合体のいくつかの成分との十分な会合を生じることである。他の実施形態において、人工分子複合体の少なくとも１つの成分は、それぞれ、タグ及び結合パートナー、すなわちＲＴＤＤ及びＳＳＮ、又はＲＴＤＤ及び相互作用ドメイン、及び／又はそのＲＴ部分を含んでよく、タグの対応する結合パートナーを含み、その結果、任意に、ＲＴＤＤ又は相互作用ドメインとＲＴとの間の塩基対合及びＲＴＤＤとＳＳＮポリペプチドとの間の会合に加えて非共有相互作用が生じて、相互作用が増大し、したがって人工分子複合体の安定性が増大するように、タグの対応する結合パートナーを含む。
【０１８３】
ヒト細胞において、３’末端上で２８ｂｐの追加の配列を有するｇＲＮＡと、会合した１８７アミノ酸（２１．４ｋＤ）Ｃｓｙ４タンパク質とを有するＣａｓ９が、標準ｇＲＮＡ対照と比較して、ＤＳＢ誘発において少なくとも９０％の活性を維持していた（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ３２， ２０１４）。これは、ｓｇＲＮＡの３’末端に連結されたカーゴのための、及び伸長ｓｇＲＮＡ分子のための適した構造−機能潜在性の、ＳＳＮとしてＣａｓ９によるかなり十分な耐性を示唆している。Ｃａｓ９耐性は、標準的なｇＲＮＡにおいて、Ｃａｓ９タンパク質の構造の外側で及び活性部位を保持表面にほぼ垂直な表面上で保持されるヘアピンで停止させる核酸配列の遊離３’末端の順応性によって部分的に可能である（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕら、２０１４；Ａｎｄｅｒｓら、２０１４）。さらに、Ｓｈｅｃｈｎｅｒら（"Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ， ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｉｓｐｌａｙ"， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２（７）， ６６４−６７０ （２０１５）， ｄｏｉ ： １０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３４３３）は、長い非コードｓｓＲＮＡ分子が、ｓｇＲＮＡの５’末端又は３’末端に、又はヒト細胞ゲノム中のｄＣａｓ９タンパク質による配列−特異的標的化活性の損失なしに、ｓｇＲＮＡの内部ループ内に、転写的に付着されてよいことを示す。４．８ｋｂまでのｓｓＲＮＡは、配列−特異的標的化活性を維持しながら、リボ核タンパク質複合体によって順応された。
【０１８４】
本発明の種々の態様による一実施形態において、修復鋳型核酸配列は、ＲＴＤＤ、例えばガイド核酸配列とガイド核酸配列の３’末端で会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列は、ＲＴＤＤ、例えばガイド核酸の５’末端と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列は、ＲＴＤＤ内に位置し、したがってＲＴＤＤの別々の機能的部位を形成する。
【０１８５】
驚くべきことに、本発明の発明者によって、一本鎖又は二本鎖ＲＴのいずれかである３’に位置するＤＮＡ修復鋳型配列（ＲＴ）を有するＲＴＤＤとしてｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からのＣａｓ９、又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ形からのＣｐｆ１、又は他のＣＲＩＳＰＲポリペプチドエフェクターによって標的に送達されるため、相同配列と自由に相互作用することが見出された。５’に位置するＤＮＡ修復鋳型配列、又は一本鎖もしくは二本鎖ＲＴ、又はその双方のいずれかの３’及び５’に位置するＲＴを有するＲＴＤＤとしてｇＲＮＡを使用した場合にも同様の観察がなされた。したがって、３’又は５’に位置することは、ＲＴがｇＲＮＡの３’末端又は５’末端に共有的に付着していることを意味し、又はＲＴがｇＲＮＡの３’及び／又は５’領域に付着した配列に対応する領域にハイブリダイズされる、すなわち該領域と非共有的に会合されることを意味してよい。さらに、ＲＴは、ｇＲＮＡのステムループに共有結合的に導入されてよく、又は機能的ハイブリッド核酸構築物を得るために前記ｇＲＮＡのステムループと非共有的に会合されてよく、その際、ＲＴＤＤ及びＲＴは直接相互作用する。したがって、前記したｇＲＮＡの種々の位置でｇＲＮＡと会合したＤＮＡが十分に許容され、したがってこの新たな形のハイブリッド複合体が、遺伝子編集の原理の２つの側面：（１）ＲＴＤＤ／ｇＲＮＡによって媒介される標的化の正確さ、及び（２）ＲＴによって媒介されるような効率的かつ部位特異的修復、をまとめるのに適していることが見出された。さらに、ｇＲＮＡとＲＴとを近接させて、目的のＤＮＡ標的部位で目的のＳＳＮとしてＣＲＩＳＰＲポリペプチドと共にハイブリッド構築物の安定性及び利用可能性を増大させる相乗効果がある。
【０１８６】
ＲＴが核酸ベースのＲＴＤＤ、例えばｇＲＮＡ又はｇＤＮＡの３’末端又は５’末端に結合している場合に、本発明による人工分子複合体の一部として送達されるこの伸長された修復鋳型ヌクレオチド配列の長さに対する制限はほとんどない。ＲＴＤＤの種類に依存せずに、ＲＴの長さは、むしろ導入されるべき標的とされた改変によって決まる。典型的なＲＴ配列は、少なくとも１つのＳＳＮの切断頻度の有意な損失を観察することなく、約２０〜８０００ｂｐ又はそれ以上の、例えば２０〜５０００ｂｐの、３０〜８０００ｂｐの、３０〜５０００ｂｐの、４０〜８０００ｂｐの、４０〜５０００ｂｐの、５０〜８０００ｂｐの、５０〜５０００ｂｐの、６０〜８０００ｂｐの、６０〜５０００ｂｐの、７０〜８０００ｂｐの、７０〜５０００ｂｐの、８０〜８０００ｂｐの、８０〜５０００ｂｐの、９０〜８０００ｂｐの、９０〜５０００ｂｐの、１００〜８０００ｂｐの、１００〜５０００ｂｐの長さの一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡを有してよい。当業者に公知であるように、ＲＴ鋳型の長さは、実施／導入されるべき改変／挿入の種類によって強く決定される。目的のタンパク質をコードするより長い核酸配列のノックインが意図される場合に、ＲＴ配列の長さは以下の長さを有する：目的のタンパク質をコードする核酸構築物の長さ＋配列の左側及び右側に位置する２つの十分に長い相同性アーム。したがって、原則として１５００ｂｐの上限はないが、ＲＴは最大５０００又はさらにそれ以上の塩基対（ｂｐ）を有してよい。例えば、修復鋳型としてプラスミドＤＮＡを使用し、標的部位内に修復鋳型を作製することにより現在導入されているより長いインサートは、修復鋳型の全長が数１０００ｂｐを有することができるように８００ｂｐ以上の左右相同性アームを使用する。核酸インサートの長さは、事前実験で決定されてよい目的の部位特異的ヌクレアーゼを阻害しないように設計されるべきである。
【０１８７】
本発明の分子複合体の異なる成分、すなわち少なくとも１つのＳＳＮ、少なくとも１つのＲＴＤＤ及び少なくとも１つのＲＴ、及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、機能的に会合している。
【０１８８】
「機能的に会合している」という用語は、ＳＳＮとＲＴＤＤとが前記したように好ましくは非共有的な会合の形によって互いに相互作用できるように、人工複合体の成分を接触させることを意味する。少なくとも１つのＲＴ配列と相互作用する少なくとも１つのＲＴＤＤは、少なくともＲＴＤＤ配列と目的の少なくとも１つの対応するＳＳＮ又はその多様体もしくは触媒活性フラグメントとを接触させる前、後又は同時に独立して構築される。一実施形態において、任意に少なくとも１つの相互作用ドメインを含む複合体全体は、編集されるべき少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的領域を含む標的細胞に導入される前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで会合される。他の実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び任意に相互作用ドメインは、少なくとも１つの相互作用するＲＴＤＤ／ＲＴ配列の前又は後ろの少なくとも１つの標的細胞に導入される。ＳＳＮポリペプチドは、ポリペプチド配列を形質移入することによって、又は少なくとも１つのポリペプチドをコードするＲＮＡで少なくとも１つの標的細胞を形質移入もしくは形質転換することによって、又は標的細胞内で転写及び翻訳されてよい少なくとも１つのＳＳＮポリペプチドをコードする導入構築物を導入することによって、標的細胞に導入されてよい。同様に、ある特定の実施形態において、ＲＴＤＤ配列及び修復鋳型核酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで提供された構築された構築物と同時に提供されてよい。代わりに、ＲＴＤＤ配列及び／又は修復鋳型核酸配列のいずれかは、適切な導入ベクターの助けを借りて標的細胞に形質移入又は形質転換されてよい。好ましい実施形態において、全人工分子複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築され、次いで目的の標的細胞に導入されてゲノム編集構築物の最良の空間的及び化学量論的制御を可能にする。他の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び任意に相互作用ドメインは、ＲＴＤＤ／ＲＴ配列の前の標的細胞に導入され、その後少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴ配列が、目的の標的細胞に導入される。導入されたｇＲＮＡがＳＳＮ、例えばある実施形態について既に細胞に存在するＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって即座に結合されそして安定化されるように、ポリペプチドと比較してＲＮＡの本質的に低い安定性によって、連続した順序は、例えばＲＴＤＤとしてｇＲＮＡを使用するある特定のアプローチに好ましくてよい。理論に縛られることを望むものではないが、ガイド核酸配列及び修復鋳型核酸配列のｅｘ ｖｉｖｏでの構築は、ガイドＲＮＡ単独と比較して、構築物の安定性を高めてもよい。
【０１８９】
現在、遺伝子構築物の形で遺伝物質を目的の植物細胞に導入するための、植物バイオテクノロジーの分野で当業者に公知である生物学的及び物理的手段を含む種々の植物形質転換方法が存在する。一般的な生物学的手段は、何十年もの間、種々の植物材料に使用されてきた、アグロバクテリウム属種での形質転換である。ウイルスベクターを媒介した植物形質転換は、遺伝物質を目的の細胞に導入するためのさらなる戦略を示す。植物生物学における適用を見出す物理的手段は、微粒子銃形質移入又は微粒子媒介遺伝子移入とも言われる微粒子銃であり、それは目的の核酸又は遺伝子構築物を含む被覆微粒子又はナノ粒子を標的細胞又は組織に形質移入するための物理的導入方法を指す。物理的導入方法は、核酸、すなわちＲＮＡ及び／又はＤＮＡ、並びにタンパク質を導入するために適している。同様に、特に、特異的な形質転換法又は形質移入法は、目的の核酸又はアミノ酸構築物を植物細胞に導入するために存在し、それはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子、及び細胞膜透過性ペプチドを含む。さらに、とりわけリン酸カルシウムでの形質移入、リポソーム、例えばカチオン性リポソームを使用する形質移入、又はＤＥＡＤ−デキストランもしくはポリエチレンイミンを含むカチオンポリマーでの形質移入、又はそれらの組合せを含む、遺伝子構築物及び／又は核酸及び／又はタンパク質を導入する、化学物質に基づく形質移入法が存在する。したがって、前記導入法及び導入媒体又はカーゴは、動物及び哺乳動物細胞を含む他の真核細胞のために使用される導入ツールとは本質的に異なり、全ての導入方法は、特に微調整及び最適化されなければならず、その結果、ゲノム編集を仲介するための目的の構築物が十分に機能的で能動的な方法で、目的の標的細胞の特定の区画に導入されることができる。前記送達技術は、単独で又は組み合わせて、少なくとも１つの人工分子複合体又は少なくとも１つのその小成分、すなわち少なくとも１つのＳＳＮ、少なくとも１つのＲＴＤＤ、少なくとも１つのＲＴ、及び任意に少なくとも１つのＩＡ、又は本発明による前述した小成分をコードする配列を、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞に挿入するために使用できる。
【０１９０】
ある実施形態において、本発明の人工分子複合体の送達の形式は、ＳＳＮ−（ＩＡ）−ＲＴＤＤ−ＲＴ複合体のＰＥＧ媒介送達、ＳＳＮ−（ＩＡ）−ＲＴＤＤをコードするプラスミドのＰＥＧ媒介送達（ここでＲＴＤＤは例えばｇＲＮＡ又はｇＤＮＡである）及びＲＴの並行送達、ＳＳＮ−（ＩＡ）−ＲＴＤＤ−ＲＴ複合体の照射、タンパク質（ＳＳＮ及び任意にＩＡ）−ＲＴＤＤ、例えばｇＲＮＡ／ｇＤＮＡをコードするプラスミドの照射及びＲＴの並行送達、ＳＳＮ−（ＩＡ）−ＲＴＤＤ−ＲＴ複合体の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）媒介送達、ＳＳＮ−（ＩＡ）−ＲＴＤＤ−ＲＴ複合体のリポフェクション、タンパク質（ＳＳＮ及び任意にＩＡ）−ＲＴＤＤ、例えばｇＲＮＡ／ｇＤＮＡをコードするプラスミドのリポフェクション及びＲＴの並行送達、又はタンパク質（ＳＳＮ及び任意にＩＡ）の安定な発現及びＲＴＤＤ又はあるＲＴＤＤについてＲＴＤＤをコードするプラスミドの一過性送達及びｒｔＤＮＡの並行送達から選択されうる。
【０１９１】
ある実施形態において、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、ステムループ又は最適化されたステムループ構造又は最適化された二次構造を含む。他の実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、直接反復配列中にステムループ又は最適化されたステムループ構造を含み、その際、ステムループ又は最適化されたステムループ構造は、切断活性に重要である。ある実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、好ましくは単一のステムループを含む。ある実施形態において、直接反復配列は、好ましくは単一のステムループを含む。ある実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重鎖構造に影響を及ぼす変異を導入することにより改変される。好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を維持する変異を導入してよく、それにより、エフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を破壊する変異を導入してよく、それにより、エフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に消滅する。
【０１９２】
本発明による人工分子複合体の一部としての本発明による少なくとも１つの修復鋳型核酸配列のサイズは変動してよい。改変されるべきＤＮＡ標的配列に依存して、該サイズは約２０ｂｐ〜約５０００ｂｐ又はさらに８０００ｂｐの範囲であってよい。
【０１９３】
目的のＤＮＡ標的領域への特異的な変異又は挿入を生じるために使用されるＨＯＲ鋳型は、改変される標的配列を囲んで一定量の相同性を要求する。改変の挿入部位が、ヌクレアーゼ欠損ＳＳＮ、例えばＣＲＩＳＰＲポリペプチドの場合に、ＳＳＮ又は融合パートナー、すなわち相互作用ドメインにより影響を受けるため、ＤＳＢから１００ｂｐ以下、理想的には可能であれば１０ｂｐ未満である場合に最良であり、相同性アームの全長は、これらを設計する場合に考慮される重要な要素である。より長い距離でも機能するであろうが、効率はおそらくより低くなり、目的のＤＮＡ標的配列に導入されるべき所望の改変が存在することを確実にするために選択マーカーの導入が必要になるであろう。
【０１９４】
本発明の種々の態様に従って、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ核酸分子であってよい。少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、１つ以上の直鎖の、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ分子の形で提供されてよい。しかしながら、ゲノム編集アプローチの特異性を高めるために、全ての成分が正しい化学量論で同時に導入されてよいため、特に機能的なＳＳＮ−ＲＴＤＤ−ＲＴ複合体の利用可能性を高めるために適している、分子複合体がｅｘ ｖｉｖｏで組み立てられる場合に、ｅｘ ｖｉｖｏで生じる、少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖の修復鋳型核酸配列を使用することが適切であってよい。
【０１９５】
一本鎖又は二本鎖のいずれかであるより大きい核酸配列の合成は、通常の先行技術の方法を使用して達せられる。ある特定の実施形態について、部分的に一本鎖及び／又は部分的に二本鎖の修復鋳型核酸配列も適切であってよいことに留意されたい。一本鎖及び／又は二本鎖核酸配列と任意の種類の導入との任意の組み合わせは、人工分子複合体のポリペプチド成分の導入と同時、又は導入の前又は後に可能である。一実施形態において、１超の修復鋳型核酸配列の使用が特定のゲノム編集アプローチに有益であるため、第二の態様による分子複合体を標的細胞に導入することが想定され、ここで標的細胞は、修復鋳型又は追加の修復鋳型配列をコードする追加のプラスミドベクターを含み、人工分子複合体が異なる成分が提供された後にｉｎ ｖｉｖｏで構築できる。一般に、ＤＮＡ標的領域が位置する標的細胞内のその部位での修復鋳型核酸配列の高い物理的利用可能性は、非常に正確なゲノム編集事象を可能にするために非常に重要である。ある特定の実施形態において、特に一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ修復鋳型は、相同性相互作用が最適な相同組換え修復を得るために十分な長さを提供しながら、できるだけ低い分子量を保ちながら正しいバランスをとるために適している。
【０１９６】
本発明の任意の態様に従った一実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドであり、かつストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）を含むストレプトコッカス属（Streptococcus）種、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、又はナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）を含むナイセリア属（Neisseria）種、コリネバクター属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifactor）、ユーバクテリム属（Eubacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、バクテロイデス属（Bacteroides）、フラビボーラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、スフェロケタ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリルム属（Azospirillum）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、ロゼブリア属（Roseburia）、パービバキュラム属（Parvibaculum）、ニトラティフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）及びカンピロバクター属（Campylobacter）、カンジダタス・ミクラルケウム・アシジフィルム（Candidatus Micrarchaeum acidiphilum）ＡＲＭＡＮ−１、パルクバクテリア属（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰＧ８０６５６．１）、スルホロブス・アイランジカス（Sulfolobus islandicus）ＨＶＥ１０／４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８１７７０．１）又はＲＥＹ１５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＸ８４８５２．１）を含むスルホロブス属（Sulfolobus）種のＣａｓポリペプチドからなる群から独立して選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、アシダミノコッカスＢＶ３Ｌ６種（Acidaminococcus sp. BV3L6）を含むアシダミノコッカス属種、ラクノスピラ細菌ＮＤ２００６（Lachnospiraceae bacterium ND2006）を含むラクノスピラ属種、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１ １２を含むフランシセラ属種、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、プレボテラ属（Prevotella）種、又はポーフィロモナス属（Porphyromonas）種のＣｐｆ１ポリペプチドを含む、古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチド、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドニッカーゼ又はＣＲＩＳＰＲポリペプチド欠失エンドヌクレアーゼ活性を含むそれらの多様体及び／又は機能的フラグメント及び／又は組合せ物から選択される。
【０１９７】
本発明による一実施形態において、本発明によるＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、ＳＳＮニッカーゼ、例えば、オフターゲット変異を最小にするための変異体であるＣａｓ９ニッカーゼと共に使用されてよく、ここで、それぞれＣａｓ９由来のニッカーゼ変異体に特異的である対のガイドＲＮＡが使用される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され、翻訳され、又は合成されたポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする導入ベクターが使用され、ここで導入ベクターは、さらに調節配列又は局在化シグナルを含んでよい。変異したＳＳＮ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は双方の鎖を切断する能力を欠くように対応する野生型酵素に関して変異させたＳＳＮポリペプチドも、本開示による種々の実施形態に含まれる。例えば、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）を使用することができ、これは、Ｃａｓ９を目的のＤＮＡ標的領域の双方の鎖を切断するエンドヌクレアーゼから一本鎖を切断するニッカーゼに変換する。Ｃａｓ９ポリペプチドをニッカーゼにする変異の他の例に、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉドメイン、ＲｕｖＣ ＩＩドメイン、及びＲｕｖＣ ＩＩＩドメイン、又はＨＮＨドメイン）を変異させて、実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠く変異Ｃａｓ９を生成してよい。いくつかの実施形態において、Ｄ１０Ａ変異を、１つ以上のＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ変異と組み合わせて、実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠くＣａｓ９酵素を生成する。いくつかの実施形態において、変異型酵素のＤＮＡ切断活性が変異させていない形の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下である場合に（一例として、変異型のＤＮＡ切断活性が変異させていない野生型と比較して無効又は無視できる場合であってよい）、ＳＳＮ酵素は実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠いていると見なされる。酵素がＳ．ピオゲネスからのＣａｓ９ではない場合に、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で突然変異を生じさせることができる（これは例えば標準的な配列比較ツールによって突き止められる）。特に、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９において、以下：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａの変異のいずれか又は全てが好ましく、任意の置換アミノ酸のための保存的置換も、本開示に従って想定される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの変異の同一又は保存的置換は、ある特定の実施形態、特にＳ．ピオゲネスからのＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０についても可能である。しかしながら、他のＣａｓ９において、Ｓ．ピオゲネスからのＤ１０及びＨ８４０のＣａｓ９に対応する残基も可能である。所与のＣＲＩＳＰＲタンパク質の「オルソログ」又は「オルソロガス」も、本発明の実施において使用されてもよい。オルソログは、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オルソログは、進化の過程で同一の機能を保持する。最も好ましくは、ＳＳＮとしてＣａｓ９酵素は、Ｓ．ピ���ゲネスＣａｓ９、又はＳ．アウレウスＣａｓ９、又はＳ．サーモフィルスからの野生型Ｃａｓ９に由来し、そのタンパク質配列は、アクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１でのスイスプロットデータベースにおいて提供されている。同様に、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９、又はＳ．アウレウスＣａｓ９は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２でのスイスプロットに含まれる。
【０１９９】
一実施形態において、本発明によるＲＴＤＤ配列としてガイドＲＮＡは、選択されたＳＳＮ酵素又は特定の長さのポリペプチドに対して最適な活性、すなわち認識特性を有するために設計され、したがって、ＳＳＮ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで転写又は翻訳されてよいＳＳＮ酵素をコードする核酸分子を切断することにより、又は合成ＳＳＮポリペプチドを提供することにより、対応する野生型酵素よりも短い長さになる野生型ＳＳＮの触媒活性フラグメントに切断されてよい。酵素の異なる部分が異なるオルソログ間で取り替え又は交換されて、目的に合わせた特異性を有するキメラ酵素を得る、キメラＳＳＮ酵素の生成も可能である。
【０２００】
したがって、本開示による「多様体」又は「機能的フラグメント」は、野生型ＳＳＮ及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤタンパク質に由来する、すなわち野生型酵素とある程度の配列相同性を有するが本明細書において記載されたいくつかの方法で変異（改変）されている、任意のＳＳＮ及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤタンパク質又はそれらの短縮型を含む。例えば、Ｃａｓ９由来のヌクレアーゼによる酵素活性は、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズし、標的配列の２０ヌクレオチドに続いて本明細書に記載したように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の例を有する、標的部位配列で二本鎖切断を生じる。この酵素機能は、ニッカーゼ活性を有するＳＳＮ多様体又はヌクレアーゼ失活多様体を生成することによって変えられる。さらに、本開示によるＳＳＮ及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤポリペプチド多様体をコドン最適化して、ＳＳＮ及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤポリペプチドを標的細胞、好ましくは真核細胞、好ましくは動物又は植物細胞のコドン使用頻度に適合させることができる。
【０２０１】
本発明の好ましい実施形態において、人工分子複合体の成分、特にＳＳＮもしくはＩＡ成分、又は野生型ポリペプチドの触媒機能を依然として発揮するその触媒活性フラグメント、及び／又はさらなる成分をコドン最適化でき、かつ／又はＳＳＮポリペプチド及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤ及び／又はＲＴをタグ配列に連結して、標的配列及び／又は人工分子複合体の位置を同定することができる。タグは、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、チオレドキシンタグ、ＦＬＡＧタグ、蛍光特性を有するタグ、例えば（Ｅ）ＧＦＰ（（強化）緑色蛍光タンパク質）タグ、ＤｓＲｅｄタグ、ｍＣｈｅｒｒｙタグ、（ｔ）ｄｔｏｍａｔｏタグ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタグ等から選択されるタグ、又はストレプトアビジンもしくはｓｔｒｅｐタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ミトコンドリアもしくは核を含む細胞内区画へのターゲティングを可能にする輸送ペプチド、スナップタグ及び／又はそれに付着したアミノ酸配列の分泌を可能にする分泌タグ、自然界では通常発生しない非天然アミノ酸、又は前記タグの組み合わせからなる群から選択されてよい。人工分子複合体のタンパク質成分、例えばＳＳＮ及び／又は相互作用ドメインは、追加のタンパク質配列、及び任意に２つのドメイン間のリンカー配列を含んでよい。少なくとも１つの人工分子複合体の任意の成分に融合されてよいタンパク質ドメインの例は、これらに制限されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、並びに次の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが含まれる。エピトープタグの非限定的な例は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例は、これらに制限されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、これらに制限されないがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合を含む、ＤＮＡ分子に結合する又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合してよい。
【０２０２】
一実施形態では、人工分子複合体の少なくとも１つの成分は、ＤＮＡニッカーゼとして機能する改変された機能であってよく、及び／又はＳＳＮポリペプチド、又はその触媒活性フラグメントは、他の機能的部分、好ましくは酵素機能を有する機能的ポリペプチド部分、好ましくはクロマチンモデリング機能、及び／又は相同組換えの刺激、及び／又は転写の改変を有する機能的部分との融合分子の形態で存在してよい。多細胞生物の組織内の少なくとも１つの改変細胞を分析する場合に、かかるタグ及びマーカータンパク質、特に蛍光タンパク質タグは、それらが複雑な組織のより深い層においてでさえも決定できるように明るい蛍光を有することが好ましい。適した蛍光タンパク質は市販されており、当業者によって特定の目的のために容易に選択されてよい。
【０２０３】
本発明の種々の実施形態にしがたって、ＳＳＮ及び／又は相互作用ドメイン及び／又はＲＴＤＤポリペプチド及び／又はＲＴＤＤ及び／又はＲＴ配列のいずれかは、改変されるべき目的のゲノムＤＮＡ配列を含む細胞区画へのＳＳＮポリペプチドの効率的な標的化のための少なくとも１つの核局在化配列及び／又は色素体局在化配列、例えばミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含む。かかる局在化配列のための配列要求は、分子生物学の分野における当業者に公知である。ＳＳＮポリペプチド又はＲＴヌクレオチド配列の機能を妨げずに、局在化配列は、Ｎ末端もしくはＣ末端部分、又はそれぞれの分子の対応する５’末端もしくは３’末端に融合、すなわち共有結合される。
【０２０４】
一実施形態において、ポリペプチド配列を示す場合に、ＳＳＮポリペプチド及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、タンパク質生成のための組換え技術を使用するか、又は対応するアミノ酸配列の合成によって、ｅｘ ｖｉｖｏで生成されるポリペプチド配列として提供される。他の実施形態において、ＳＳＮポリペプチド及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、目的の標的細胞の導入時に対応するアミノ酸配列に翻訳されてよいＲＮＡ配列として提示される。さらにさらなる実施形態において、ＳＳＮポリペプチド及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインポリペプチドは、目的の細胞において安定な発現のため又は一過性の発現のために構成されたＤＮＡ構築物として挿入され、その結果、少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインポリペプチドは、構成的又は誘導的な方法で目的の標的細胞において転写及び翻訳される。本発明による少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインポリペプチドを標的細胞に導入するための適切なＤＮＡ構築物及び会合方法は、当業者に公知であるが、植物細胞における適用に特に適している本発明のある特定の実施形態による少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインポリペプチドを導入する特定の方法を、以下にさらに詳細に記載する。
【０２０５】
人工分子複合体、又はそれらの一部、すなわち少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド、少なくとも１つのＲＴＤＤ及び少なくとも１つのＲＴ、及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、適した導入構築物を使用して目的の標的細胞に導入されなければならない。当然、分子複合体がｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に構築され、その後標的細胞に導入されるかどうか、又は分子複合体の異なる成分が別々に細胞に導入され、その複合体が目的の標的細胞内で非共有的相互作用によって構築されるかどうかの事実に依存して、導入構築物のタイプは変動する。導入は、通常、適した導入構築物を使用することによって実施される。
【０２０６】
本発明の異なる態様の種々の実施形態に従って本明細書において使用される「導入構築物」又は「（導入）ベクター」という用語は、目的のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を標的真核細胞に輸送するためのカーゴとして使用される任意の生物学的又は化学的又は非化学的又は粒子ベースの手段及び／又は方法を示す。適した導入構築物は、ウイルスベクター、アグロバクテリウム種、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、又はナノ粒子、脂質もしくはポリマー小胞、リン酸カルシウム又はそれらの組み合わせを含む化学導入構築物を含む、標的細胞にヌクレオチド配列を送達するための生物学的手段を含む。脂質又はポリマー小胞は、例えば、脂質、リポソーム、脂質カプセル化系、ナノ粒子、例えばメソ孔シリカナノ粒子、小核酸−脂質粒子配合物、ポリマー、例えばＤＥＡＥデキストラン又はポリエチレンイミンのようなカチオンポリマー、及びポリマーソームから選択されうる。一実施形態において、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー（高分岐有機化合物）、及び多糖からなる群から選択される。他の実施形態において、脂質カプセル化系は、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、及び粒子を標的組織に送達する親油性化合物の１つ以上を含む。さらなる実施形態において、導入構築物は、メソ孔シリカナノ粒子であってよい。
【０２０７】
本明細書において使用され、本発明による少なくとも１つの分子複合体又は少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列を提供するために適している物理的導入方法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、又はプラスミドＤＮＡで機能化される細長いナノ構造及びかかるナノ構造のアレイ、例えばカーボンナノファイバー又はシリコンナノワイヤを使用するインペールフェクション（impalefection）、及び化学的方法を示し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むマイクロもしくはナノ粒子又は化学物質の使用に依存してよい。本明細書において使用され、本発明による少なくとも１つの分子複合体又は少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列を提供するために適している物理的導入方法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、又はプラスミドＤＮＡで機能化される細長いナノ構造及びかかるナノ構造のアレイ、例えばカーボンナノファイバー又はシリコンナノワイヤを使用するインペールフェクション（impalefection）、及び化学的方法を示し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むマイクロもしくはナノ粒子又は化学物質の使用に依存してよい。
【０２０８】
例えば、人工分子複合体の成分がｅｘ ｖｉｖｏで会合している実施形態について、導入ベクターは、脂質ベースの又はポリマーのベクターであってよい。脂質ベースの又はポリマーのベクターは、例えば、脂質、リポソーム、脂質カプセル化系、マイクロ粒子、ウィスカー、ナノ粒子、小核酸−脂質粒子、ポリマー、及びポリマーソームから選択されうる。いくつかの実施形態において、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー、及び多糖からなる群から選択されてよい。他の実施形態において、脂質カプセル化系は、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、及び粒子を標的細胞に送達する親油性化合物の１つ以上を含む。
【０２０９】
哺乳動物細胞について、種々の治療目的のための免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏ改変は、特異的に改変されたリンパ球、好ましくはＴ細胞を養子移入することによっていくつかの腫瘍疾患と戦うために過去１０年間で多くの関心を集めている。特にＣＤ８+Ｔ細胞リンパ球は、この点に関して興味深い標的である。単一のナイーブＴ細胞、単一の一次及び単一の二次中央記憶Ｔ細胞に由来する免疫応答が、同様のサイズ及び表現型の多様性に達し、匹敵する確率的変動を受け、かつ最終的に、３世代の連続的な単一細胞養子移入及び感染による再増殖によって、ＣＤ８+Ｔ細胞及びそれらの子孫のｉｎ ｖｉｖｏでの運命マッピングによって測定された細菌性病原体での他の致命的な感染に対する免疫能を再構築してよい（Ｇｒａｅｆら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ４１ ， １１６−１２６， ２０１４）。造血細胞からのｄｅ ｎｏｖａの胸腺Ｔ細胞が完全に成熟した後に、抗原特異的Ｔ細胞は、長期間にわたって維持されてよく、ここで抗原は、異種抗原、例えばウイルス又は癌細胞で発現された抗原であってよい。したがって、そのようなエフェクターＴ細胞又はその前駆体の標的改変は、免疫療法に適したＴ細胞を提供するための重要な戦略を示す。ナイーブＴ細胞は、中央メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、そして最終的にエフェクターＴ細胞を生じる、幹細胞メモリーＴ細胞と言われる段階を通して分化し、ここで、エフェクターＴ細胞は、最終的に標的細胞を認識し破壊する高分化細胞を示す。エフェクターメモリー及びエフェクターＴ細胞は、末梢組織へ輸送するための能力を有するＴ細胞のサブセットである。他のサブセットである、組織常在性メモリーＴ細胞が現在示唆されており、これはこれ以上循環しない（例えば、Ｆａｒｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １４， ２４−３５， ２０１４を参照されたい）。
【０２１０】
さらに、癌の免疫療法は、組換え型の腫瘍反応性受容体を発現するＴ細胞の養子移入が、他の方法で治療抵抗性の悪性腫瘍を治療でき（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１３；Ｇｒｕｐｐら、２０１３；Ｐｏｒｔｅｒら、２０１１）、かつ養子移入療法における操作されたＴ細胞の使用が、癌、特に血液癌の治療において著しい望みを示していることを示す、いくつかの最初のめざましい臨床事例を提供している。ますます、定義されたサブセットの遺伝的に改変されたＴ細胞及び表現型の組成は、癌免疫療法の成功を増やすために使用される（Ｒｉｄｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．， ２０（２）， １４１−１４４， ２０１４を参照されたい）。血液悪性腫瘍及び固形腫瘍のための治療法としてのキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞の使用は、より広く普及してきている。この目的のために、Ｔ細胞は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために改変される（例えば、Ａｎｕｒａｔｈａｐａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２２， ６２３−６３３， ２０１４を参照されたい）。また、いわゆる抗腫瘍効果を増強するためにＴ細胞を再標的化及び再プログラミングするための第二世代のＣＡＲ、例えばＣＤ２Ｂ又は４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを組み込んだＣＤ１９標的化ＣＡＲがますます重要になっている（例えば、Ｓｊｏｕｋｊｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， １４， ４９９−５０９， ２０１５を参照されたい）。
【０２１１】
したがって、本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、好ましくは疾患の治療のために、１つ以上の哺乳動物細胞をｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで改変するための重要なツールを示す。例えば、リンパ球細胞、より好ましくは任意の発生段階のＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の発現遺伝子を改変してＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖に高精度で影響を及し、改変細胞又は細胞集団の治療的適用のために有害であってよいオフターゲット効果を回避する。
【０２１２】
したがって、ある実施形態において、本発明による人工分子複合体は、疾患の治療法において使用するために適しており、その際疾患は、少なくとも１つのゲノム変異により特徴付けられ、かつ人工分子複合体は、少なくとも１つのゲノム変異を標的とし、改変するために設計される。したがって、前記実施形態のいずれか１つに従った人工分子複合体を使用する疾患の治療方法が提供され、その際疾患は、少なくとも１つのゲノム変異により特徴付けられ、かつ人工分子複合体は、少なくとも１つのゲノム変異を標的とし、改変するために設計される。治療のための治療学的方法は、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子治療を含みうる。
【０２１３】
適した細胞、特に治療学的アプローチに、又はウイルスゲノムを改変するために適した細胞は、真核性（例えば動物）及び原核性の細胞及び／又は細胞株を含む。かかる細胞又はかかる細胞から生じた細胞株の制限のない例は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えばＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えばＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、及びｐｅｒＣ６細胞、並びに昆虫細胞、例えばツマジロクサヨトウ（Spodopterafugiperda）（Ｓｆ）、又は真菌細胞、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）及びシゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）を含む。ある実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞株である。適した細胞は、幹細胞、例えば非ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞及び間葉系幹細胞も含む。
【０２１４】
一態様において、本発明は、本明細書で議論される人工分子複合体の成分又は本明細書で議論される任意のベクターで対象を形質転換／形質移入することにより遺伝子編集を誘導し、対象に誘導エネルギー源を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。本発明は、薬剤の製造におけるそのようなポリヌクレオチド又はベクター、例えば対象を治療するためのかかる薬剤、又は対象を治療するかかる方法の使用を包含する。本発明は、遺伝子編集を誘導することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法において使用するための本明細書で議論されるポリヌクレオチド又は本明細書で議論される任意のベクターを含み、その際この方法は誘導エネルギー源を対象に投与することをさらに含む。一態様において、この方法では、例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達される修復鋳型も提供される。
【０２１５】
一実施形態において、特に本発明の人工分子複合体を使用する遺伝子治療のために、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小の非霊長類レンチウイルスベクターも考慮される（例えばＢａｌａｇａａｎ， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５を参照されたい）。他の実施形態において、加齢性黄斑変性のウェブ形態の治療のために網膜下注射を介して送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）も考慮され（例えばＢｉｎｌｅｙら、ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（２０１２年９月）を参照されたい）、このベクターは、本発明のＳＳＮ−ＲＴＤＤ−ＲＴシステム用に改変することができる。目下、パーキンソン病のための治療のためのレンチウイルスベクターが開示されている（例えば米国特許出願番号第２０１２／０２９５９６０号（U.S. Patent Application No. 2012/0295960 A1）及び米国特許番号第７，３０３，９１０号（U.S. Patent No. 7,303,910 B2）を参照されたい）。眼球の疾患の治療のためのレンチウイルスベクターも開示されている（例えば、米国特許出願番号第２００６／０２８１１８０号（U.S. Patent Application Nos. 2006/0281180）、第２００９／０００７２８４号、第２０１１／０１１７１８９号、第２００９／００１７５４３号、第２００７／００５４９６１号及び第２０１０／０３１７１０９号を参照されたい）。脳への送達のためのレンチウイルスベクターも開示されている（例えば、米国特許出願番号第２０１１／０２９３５７１号（U.S. Patent Application Nos. 2011/0293571）、第２０１１／０２９３５７１号、第２００４／００１３６４８号、第２００７／００２５９７０号、第２００９／０１１１１０６号及び米国特許番号第７，２５９，０１５号（U.S. Patent No. 7,259,015）を参照されたい）。
【０２１６】
他の実施形態において、人工分子複合体又はそれらの成分は、リポソーム、例えば安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）中に投与されてよい（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２３， Ｎｏ． ８， ２００５年８月を参照されたい）。ＳＮＡＬＰを標的とする特異的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの約１ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈注射が考えられる。毎日の治療は約３日間にわたり、その後は毎週を約５週間であってよい。他の実施形態において、約１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量まで静脈内注射により投与することができる特定のカプセル化されたＳＮＡＬＰも考慮される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． ４４１， ２００６年５月４日を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ調製物は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセントの割合で含んでよい（例えばＺｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． ４４１， ２００６）を参照されたい。他の実施形態において、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来の肝臓腫瘍ではなく高度に血管新生されたＨｅｐＧ２由来の肝臓腫瘍への効果的な送達分子であることが証明されている（例えばＬｉ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （２０１２） １９， ７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡで、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡモル比を使用して調製することによって製造されてよい。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０〜１００ｎｍのサイズである。
【０２１７】
さらに他の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含んでよい（例えばＧｅｉｓｂｅｒｔら、Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば静脈内大量投与として投与される１投与量あたり約２ｍｇ／ｋｇの合計ＳＳＮ／ＲＴＤＤ／ＲＴの投与が考慮される。
【０２１８】
同様に、本発明による人工分子複合体は、家畜又は他の動物細胞における遺伝物質の改変のための有用なツールを示してよい。例えば、遺伝子疾患の編集又は有利な特徴、例えば肉、牛乳のための編集、例えば乳糖の含有量を減らした牛乳、又は家畜もしくは家禽の産卵。
【０２１９】
したがって、一実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで、少なくとも１つの目的の免疫細胞に本発明によるハイブリッド核酸構築物を導入して、疾患、好ましくは自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病もしくは慢性関節リウマチ、又は増殖性疾患、例えば癌、例えば神経膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、多剤耐性癌、及び変異ｐ５３遺伝子に関連する癌を治療することを含む、動物の免疫細胞の集団を生成する方法が提供される。
【０２２０】
ゲノム編集のための標的を形成するほとんどの植物種の好ましい組織は、未熟胚、胚形成カルス、無傷植物の分裂組織、花粉、花粉管もしくは卵細胞、懸濁細胞、又は再生能を有する他の細胞型である。いくつかの植物について、好ましい組織は、プロトプラスト又は葉であってよい。処理され、次いで植物全体に再生されてよい任意の細胞は、好ましい組織又は細胞と考えられてよい。組織の調製、再生、及びＤＮＡ送達のためのプロトコルは、種、組織の種類、送達方法及び他の要因に依存して異なる。一般的な送達方法は、ＤＮＡ又はタンパク質で被覆された金又はタングステン粒子での細胞の微粒子銃である。他の送達方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介形質転換、エレクトロポレーション、ウイルス感染、細胞への直接注射、及びアグロバクテリウム媒介形質転換である。いくつかの植物において、受精直後に花柱を通してスライスし、編集試薬を含む液体を切断した花粉管に適用することによって受精卵細胞に送達することができる。動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞について、エレクトロポレーション、すなわち電気パルスを適用することによる細胞膜中の小孔の瞬間的な形成に基づく形質移入技術は、本発明による少なくとも１つの分子複合体を導入するために適したアプローチを示してよい。哺乳動物の初代細胞、幹細胞及び形質移入しにくい細胞株を含む、多数の異なる細胞型を用いた直接形質移入の成功のためのいくつかの細胞型特異的プロトコルが当業者に利用可能であり、それらは少なくとも１つの本発明による分子複合体のための送達ツールとして適している。送達に適した２つ以上の方法又は作用剤の組み合わせは、そのゲノムが編集されなければならない細胞タイプに依存して優れた結果を提供してよく、したがって本発明の範囲内に含まれることに留意することが重要である。
【０２２１】
一実施形態において、本発明に従って、人工分子複合体又はその成分を送達するために過荷電タンパク質を使用することができる。過荷電タンパク質は、異常に高い正又は負の正味理論電荷を有する操作した又は天然に生じるタンパク質の分類であり、人工分子複合体又はその成分又はそれをコードする核酸分子の送達に使用されうる。過度に正及び過度に負に荷電したタンパク質は、熱的又は化学的に誘発された凝集に耐える顕著な能力を示す。過度に正に帯電したタンパク質は、哺乳動物細胞に浸透することもできる。カーゴをこれらのタンパク質、例えばプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質と会合することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの双方でこれらの高分子を哺乳類細胞に機能的に送達できる。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、２００７年に過荷電タンパク質の作成及び特性化を報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９， １０１１０−１０１１２）。
【０２２２】
ＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、人工分子複合体を哺乳動物細胞に移入するのに特に関心があり、研究及び治療適用の双方に価値がある（Ａｋｉｎｃら、２０１０， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２６， ５６１−５６９）。精製した＋３６ＧＦＰタンパク質（又は他の過度に正に帯電したタンパク質、例えば＋４８ＧＦＰ）を、適切な無血清培地中でＲＮＡと混合し、細胞に添加する前に複合体化させる。この段階で血清を包含させると、過荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが、種々の細胞株に効果的であることが見出されている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎら、２００９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６， ６１１１−６１１６）（しかしながら、タンパク質及びＲＮＡの用量を変動させる前実験を特定の細胞株の手順を最適化するために実行すべきである）：（１）処理の１日前に、４８ウェルプレート中で１ウェルあたり１×１０5個の細胞（例：ＨＥＫ２９３、細胞タイプに応じた数）を蒔く。（２）治療当日に、精製した＋３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地中で最終濃度２００ｎＭに希釈する。ＲＮＡを最終濃度５０ｎＭまで添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。（３）インキュベート中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）＋３６ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベートに続いて、タンパク質−ＲＮＡ複合体を細胞に添加する。（５）細胞を複合体と３７°Ｃで４時間インキュベートする。（６）インキュベート後に、培地を吸引し、ヘパリンＰＢＳ  ２０Ｕ／ｍＬで３回洗浄する。活性化のためのアッセイに応じて、さらに４８時間以上、血清含有培地で細胞をインキュベートする。（７）イムノブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法により細胞を分析する。
【０２２３】
人工分子複合体のための他の好ましい送達方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＴＤＤ−ＲＴハイブリッド核酸を構築し、そしてそれを目的の標的細胞に適用する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され、任意に精製されたＳＳＮポリペプチドに導入することである。しかしながら、他の有用な送達方法は、ＳＳＮポリペプチド送達と同時、その前又は特にその後に、ハイブリッド核酸の適用と共に、ｉｎ ｖｉｖｏでの転写及び／又は発現のために、少なくとも１つの標的細胞への、任意にさらなる調節エレメントを含むｍＲＮＡとして又は遺伝的ＤＮＡ構築物としての、ＳＳＮポリペプチド及び任意に相互作用ドメイン、例えば単量体ストレプトアビジン、所与の特異性を有するｓｃＦｖ、又はＤＮＡ結合ドメイン、又は追加のヌクレアーゼドメインの送達であってよい。ＲＴＤＤとＲＴ成分との非共有的な会合の場合に、これらの分子は別々に送達されてもよく、ＲＴＤＤがｇＲＮＡである場合に、ｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、又はｉｎ ｖｉｖｏで転写されてよいＤＮＡ発現カセットとして送達されてよい。少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド又は少なくとも１つのｇＲＮＡが発現カセットとして送達される場合に、特に標的細胞が植物細胞である場合にＲＮＡ又はＤＮＡのウイルスレプリコン又はウイルスベクターから発現させることが好ましくてよい。
【０２２４】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの人工分子複合体は、ｅｘ ｖｉｖｏで会合しており、複合体の異なる成分、すなわち任意に少なくとも１つの相互作用ドメインを含む少なくとも１つのＳＳＮ、少なくとも１つのＲＴＤＤ及び少なくとも１つのＲＴ修復鋳型核酸を、ｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的又は組換えして合成し、そしてその異なる成分を、好ましくは構築前に精製する。本発明による少なくとも１つの人工分子複合体の構築後に追加の精製ステップを実施してよい。ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、又はポリペプチド、又はリボヌクレオ−及びリボヌクレオタンパク質−複合体を精製する方法は、当業者には容易に利用可能である。任意にｉｎ ｖｉｔｒｏで分析されてよい高純度の及び化学量論的な分子複合体の提供は、高効率で正確なゲノム編集ツールを提供することが可能である。
【０２２５】
ＲＴＤＤ又は相互作用ドメインとしての非核酸又は非アミノ酸ベースの分子、例えばビオチン（ビタミンＨ）又はその誘導体、フルオレセイン、又はジゴキシゲニン、又はＳＳＮ−ＲＴＤＤのための他の同族結合パートナー、又はＲＴＤＤ相互作用ドメイン相互作用、又はＳＳＮ相互作用ドメイン相互作用に依存する実施形態について、ＲＴをｅｘ ｖｉｖｏで合成し、次いでＲＴをそれぞれの分子に化学的に結合させることが好ましい。
【０２２６】
本発明による種々の態様によるさらなる実施形態において、従来の修復鋳型核酸配列が、プラスミドの形で又は核酸オリゴヌクレオチドの形で、ＲＴＤＤ／ＲＴに加えて、標的ゲノム編集事象の効率をさらに高めるために使用されてよい。通常、プラスミド又は他の二本鎖ＤＮＡ修復鋳型を適用するかどうか、又は一本鎖オリゴヌクレオチドを修復鋳型として使用するかどうかの決定的要因は、導入されるべき意図する改変のサイズに依存する。当業者は、本発明によるハイブリッド核酸構築物に加えて使用することができるさらなる従来の修復鋳型を容易に定義することができる。これらの従来の修復鋳型は、標的細胞が植物細胞である場合に導入ベクター、例えばジェミニウイルスベクターによって、又は本発明によるＲＴＤＤ／ＲＴ配列の導入について本明細書においても詳述されている直接形質移入もしくは導入によって、少なくとも１つの目的の標的細胞に導入されてよい。
【０２２７】
一態様において、本発明は、本明細書に開示された要素の任意の１つ以上を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書において教示されるベクターシステム及びキットを使用するための指示書を含む。要素は、個々に又は組み合わせて提供されてよく、かつ任意の適した容器、例えばバイアル、瓶又は管で提供されてよい。キットは、ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡを安定化させるための未結合の保護鎖を含んでよい。キットは、目的のＲＴと、及び任意に少なくとも部分的にガイド配列に結合するさらなる保護鎖と直接相互作用するＲＴＤＤとしてｇＲＮＡを含んでよい。したがって、キットは、部分的に二本鎖のヌクレオチド配列の形でｇＲＮＡを含んでよい。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の言語で、例えば１超の言語で指示書を含む。指示書は、本明細書に記載された適用及び方法に特定されてよい。
【０２２８】
本発明によるさらなる態様において、本発明の少なくとも１つの人工分子複合体の少なくとも１つの成分及び好ましくは全ての成分を含むキットが提供され、ここで、少なくとも１つの分子複合体は、予め構築された複合体として提供されてよく、又は好ましくはその別個の構成要素の形で提供されてよく、少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド、又はそれらをコードする発現可能な配列、少なくとも１つのＲＴＤＤ配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含む。好ましくは核酸配列用の乾燥粉末又は凍結乾燥粉末の形での分子複合体の異なる構成要素を別々に提供することは、特にポリペプチドよりも安定性が非常に低いＲＮＡ配列がキット内で提供される場合に、特にＲＴＤＤ／ＲＴ構築物の核酸配列のより高い安定性を保証する。少なくとも１つのＳＳＮタンパク質及び任意にそれらと相互作用するか又はそれらに連結する少なくとも１つの相互作用ドメインは、適した貯蔵緩衝液、例えばＣａｓ９ポリペプチドについて３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＯＴＴ、５０％グリセロールを含む貯蔵緩衝液（２５℃でｐＨ７．４）中で送達されてよい。前記キットは、さらに、それぞれのＣＲＩＳＰＲポリペプチドの活性に要求される適したイオン、例えばＣａｓ９酵素についてのＭｇ2+を含む適切な反応緩衝液を含んでよい。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載された要素の１つ以上を使用する方法で使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適した容器に提供されてよい。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は貯蔵緩衝液を提供してよい。試薬は、特定のアッセイで使用可能である形で、又は使用前に１つ以上の他の成分の添加を要求する形で（例えば濃縮又は凍結乾燥させた形で）提供されてよい。緩衝液は、これらに制限されないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びそれらの組合せを含む任意の緩衝液であってよい。いくつかの実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。いくつかの実施形態において、緩衝液は約７〜約１０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、キットは、ガイド配列及び調節要素を機能的に連結するために、ベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載された１つ以上のベクター及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含む。キットは、有利には、本発明のシステムの全ての要素を提供することが可能であってよい。
【０２３０】
代わりに、前記キットは、それぞれ凍結乾燥したｍＲＮＡ又は凍結乾燥したタンパク質としてＳＳＮ成分を含んでよい。この態様によるさらなる態様において、前記キットは、分子複合体としてＳＳＮ成分を含む成分に加えて、適した送達媒介物又は送達システムを提供するさらなる成分を含んでよい。この態様によるさらなる実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド及び少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、少なくとも２つの成分して提示され、その際１超のＳＳＮ及び／又はＲＴＤＤ／ＲＴは相互に親和性がある。少なくとも１つのＳＳＮポリペプチドは、目的の細胞に形質転換又は形質移入されるベクターとして提示されてよいが、一方で少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、別個の成分として提示されてよい。したがって、本開示によるキットは、１超の成分が存在する場合に異なる成分の同時又は続けた使用に適していてよい。任意に、この態様によるキットは、使用説明書、特に編集される標的細胞に特異的な使用説明書を含んでよい。本発明のこの態様によるさらなる好ましい実施形態において、キットは、所望の形質の改変を得るための特定のツールを含む、目的の特定の植物のための形質開発キットを提供するために特別に開発される。この実施形態によって、前記キットは、細胞、好ましくは動物細胞又は植物細胞内で、目的の形質を移入するために、又は目的の疾患を治療するために、又は目的のＤＮＡ標的配列を改変するために構成された修復鋳型を含む。さらに、前記キットは、少なくとも１つのＲＴＤＤとの分子複合体として会合した、適したＳＳＮ酵素又は２つのＳＳＮニッカーゼを含み、ここで、ＲＴＤＤは、少なくとも１つのＳＳＮと直接相互作用する少なくとも１つの第一の配列部分、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）と直接相互作用するように構成された第二の配列部分を含み、かつ少なくとも１つのＲＴＤＤは、目的の特定の形質を保有する修復鋳型と会合されているか、又は会合できるように構成されている。
【０２３１】
一実施形態によるキットは、植物細胞及び形質特異的の双方であり、前記キットの使用は、形質の発達が達せられる目的のゲノムＤＮＡ遺伝子座の急速な標的化及び改変が可能である。一実施形態において、ＲＴＤＤはｇＲＮＡであり、ｇＲＮＡ成分は、ＰＡＭモチーフ及び目的のＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用するように既に設計され、かつ提供された修復鋳型が便利な方法で挿入又は改変されるべき配列を提示する。
【０２３２】
本発明による一態様において、したがって、本発明の少なくとも１つの人工分子複合体を含むか又は該人工分子複合体により編集された、植物、植物細胞、植物材料、又は誘導体、又はそれらの子孫が提供される。本発明による他の態様において、少なくとも１つの人工分子複合体で改変されている、植物、植物細胞、植物材料、又は誘導体、又はそれらの子孫が提供される。
【０２３３】
本明細書によるさらに他の態様において、以下のステップ：（ｉ）目的のゲノム領域における少なくとも１つのゲノム相補性配列及び少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを準備するステップ、（ｉｉ）本明細書において定義された少なくとも１つの人工分子複合体を準備するステップ、（ｉｉｉ）少なくとも１つの人工分子複合体と少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を適した条件下で接触させて、（ａ）少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼと少なくとも１つのＤＮＡ標的配列との相互作用、及び（ｂ）少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と少なくとも１つのゲノム相補性配列との相補的塩基対を得て、少なくとも１つの相補性配列の認識及び少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼによる少なくとも１つのＤＮＡ切断の導入を得るステップ、ここで少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の部位で相同性により方向付けられた修復を指示する、並びに（ｉｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における形質を含む少なくとも１つの原核、真核、又はウイルスの細胞及び／又はゲノムを得るステップを含む、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変方法が提供される。
【０２３４】
人工分子複合体を目的の任意の細胞タイプ内で使用できるという事実により、原核生物、真核生物もしくはウイルスのＤＮＡ標的配列又は目的のエピジェネティック配列を含む、目的の生物のエピソーム又はエピジェネティック領域を含む任意のゲノムの改変のためのＳＳＮ／ＲＴＤＤ／ＲＴ対を設計することが可能である。ウイルスのゲノムを改変する実施形態について、ウイルスゲノム又はその関連部分を目的のベクターに導入して、ウイルスゲノム又はその関連部分を含むベクターを保有する適した宿主細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）内でウイルスゲノムを増殖及び改変することが適切である。
【０２３５】
本明細書において使用される「原核」細胞は、膜結合型核（カリオン）、ミトコンドリア、又は任意の他の膜結合型オルガネラを欠いており、かつ古細菌及び細菌を含む単細胞生物をいう。
【０２３６】
ウイルスゲノムは、ＲＮＡ又はＤＮＡをコードするゲノムを含む任意のウイルスに由来してよい。
【０２３７】
一実施形態において、人工分子複合体の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列及び／又は少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインが、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼとは無関係に少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞に提供され、かつ少なくとも１つの人工分子複合体が、少なくとも１つの原核、真核又はウイルスの細胞及び／又はゲノム内で構築又は部分的に構築されている。
【０２３８】
一実施形態において、人工分子複合体の少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴ配列は、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つのＳＳＮポリペプチドとは無関係に少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞に提供されてよく、少なくとも１つの人工分子複合体は、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞内で構築又は部分的に構築されている。
【０２３９】
前述したように、少なくとも１つの人工分子複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築した複合体として提供し、次いでこれを少なくとも１つの目的の標的細胞に導入してよい。代わりに、少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド及び／又は少なくとも１つのＲＴＤＤ配列及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列のいくつか又は全部を、遺伝子ＲＮＡ又はＤＮＡ構築物として挿入してよく、ｉｎ ｖｉｖｏで生成し、その結果、少なくとも１つの分子複合体の最終的な構築がｉｎ ｖｉｖｏで起こってよい。好ましい実施形態において、少なくとも１つの分子複合体はｅｘ ｖｉｖｏで結合され、そして少なくとも１つのＳＳＮポリペプチド、少なくとも１つのガイド核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含む少なくとも１つの分子複合体が、少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの標的細胞への少なくとも１つの分子複合体の機能的導入を可能にする適切な導入ベクターによって少なくとも１つの細胞に同時に提供される。
【０２４０】
他の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＳＳＮ及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインは、改変されるべきＤＮＡ標的配列を含む細胞内で生成されるプラスミド上の融合タンパク質として提供される。そして、人工分子複合体のさらなる成分をｅｘ ｖｉｖｏで生成できる。例えば、誘導可能なベクター系を使用して、少なくとも１つのＳＳＮ及び任意に少なくとも１つの相互作用ドメインを生成できる。十分な発現レベルが達成されるとすぐに、ＲＴＤＤ／ＲＴ複合体を標的細胞に導入し、本発明による人工分子複合体をｉｎ ｓｉｔｕで構築することができる。
【０２４１】
他の実施形態において、完全な少なくとも１つの人工分子複合体は、ｅｘ ｖｉｖｏで構築された人工分子複合体である。
【０２４２】
本開示による方法の記載内容において本明細書において言及される「適切な条件」又は「適切な反応条件」は、原核細胞又は真核細胞を含む形質転換又は製造される細胞又は生物の成長及び発生の双方を可能にする条件、及び目的の少なくとも１つの細胞又は生物に目的の遺伝子構築物を安定的に組み込むか又は一時的に導入するために必要な条件を示す。原核生物又は細菌の増殖及び／又は形質転換を促進するための条件は、当業者に公知である（Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２０１２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓも参照されたい）。動物細胞の増殖を促進するための及び／又は動物、特に哺乳動物細胞への遺伝物質の導入のための条件は、種々の異なる細胞株について当業者に利用可能である（前述のＧｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。とりわけ温度、光、水、酸素、鉱物栄養素及び土壌支持体を含む、植物又は植物細胞の成長及び発生を促進するための条件は、植物種によって異なり、本明細書において提供される開示の知識において当業者によって容易に決定されてよい。目的の少なくとも１つの分子複合体の安定な組み込み又は一過性導入を達成するためのさらなる適切な条件は、少なくとも１つの目的の分子複合体の導入のために選択される形質転換方法、形質転換される植物材料又は植物細胞の発生段階、及び導入されるべき少なくとも１つの目的の分子複合体に依存する。前記適切な条件は、本明細書において開示され特許請求される、例示的な分子複合体及び適切な導入ベクター及び送達技術と組み合わせて、前記方法に適した条件を定義する本開示に照らして当業者によって定義されてよい。
【０２４３】
本発明の前記方法による一実施形態において、少なくとも１つの細胞は、植物細胞、好ましくは、オオムギ（Hordeum vulgare）、ホルデウム・ブルブソム（Hordeum bulbusom）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarium）、トウモロコシ（Zea mays）を含むゼア属（Zea）種、アワ（Setaria italica）、オリザ・ミヌタ（Oryza minuta）、イネ（Oryza sativa）、オリザ・オーストラリエンシス（Oryza australiensis）、オリザ・アルタ（Oryza alta）、コムギ（Triticum aestivum）、マカロニコムギ（Triticum durum）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticale）、リンゴ（Malus domestica）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、ハマムギクサ（Hordeum marinum）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ゴウシュウヤブジラミ（Daucus glochidiatus）、サトウダイコン（Beta vulgaris）を含むベータ属（Beta）種、ダウクス・プシルス（Daucus pusillus）、ダウクス・ムリカツス（Daucus muricatus）、ノラニンジン（Daucus carota）、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、ブドウ（Vitis vinifera）、エリスランテ・グタタ（Erythrante guttata）、ゲンセリア・アウレア（Genlisea aurea）、キュウリ（Cucumis sativus）、マルバグワ（Marus notabilis）、アラビドプシス・アレノサ（Arabidopsis arenosa）、アラビドプシス・リラタ（Arabidopsis lyrata）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、クルシヒマラヤ・ヒマライカ（Crucihimalaya himalaica）、クルシヒマラヤ・ワリチイ（Crucihimalaya wallichii）、カルダミン・ネクスオサ（Cardamine nexuosa）、マメグンバイナズナ（Lepidium virginicum）、ナズナ（Capsella bursa pastoris）、オルマラビドプシス・プミラ（Olmarabidopsis pumila）、ヤマハタザオ（Arabis hirsute）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ダイコン（Raphanus sativus）、ブラシカ・ユンカセア（Brassica juncacea）、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ルッコラ（Eruca vesicaria subsp. sativa）、オレンジ（Citrus sinensis）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、シセル・ヤマシタ（Cicer yamashitae）、シセル・ビユグム（Cicer bijugum）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、シセル・レチクラツム（Cicer reticulatum）、シセル・ユダイクム（Cicer judaicum）、カヤヌス・カヤニフォリウス（Cajanus cajanifolius）、ビロードヒメクズ（Cajanus scarabaeoides）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ダイズ（Glycine max）、ワタ属種（Gossypium sp.）、ゲンゲ（Astragalus sinicus）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、ハナウリクサ（Torenia fournieri）、タマネギ（Allium cepa）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、及びニラ（Allium tuberosum）からなる群から選択される植物、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からの植物細胞である。
【０２４４】
標的としての植物細胞に関して、例えば、種々の形質転換法及び／又は形質移入法が、当業者に利用可能である。トウモロコシのプロトプラストについて、例えば、適切な方法が、Ｓｈｅｅｎ、Ｊ． ２００２（"Ａ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ"）において開示されている。アラビドプシス属のプロトプラストについて、適したプロトコルはdoi.org/10.1038/ngrot.2007.199から入手でき、又はhttp://www.nature.com/nprot/journal/v2/n7/full/nprot.2007.199.htmlから検索できる。タバコ及び他の双子葉植物のプロトプラストについて、適したプロトコルは、www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.112.205179から入手できる。したがって、本開示の知識を有し、引用されたプロトコルを知っている当業者は、本発明による分子複合体を単子葉植物又は双子葉植物に由来する植物プロトプラストに導入するために適した方法を定義することができる。
【０２４５】
プロトプラストは、遺伝子編集の技術及び試薬を試験するために非常に有用であるが、遺伝子編集した植物の再生のためにそれらは常に好ましい細胞型であるとは限らず、プロトプラストから効率的に再生する植物種は非常に少ない。この場合に、ほとんどの植物種のための好ましい組織は、未熟胚、胚形成カルス、受精した胚、無傷植物の分裂組織、花粉、花粉管もしくは卵細胞、胚形成懸濁細胞、又は再生能を有する他の細胞型である。一般的な物理的送達方法は、ＤＮＡ又はタンパク質で被覆された金又はタングステン粒子での細胞の微粒子銃であり、一方で一般的な生物学的会合方法は、本明細書において開示されたアグロバクテリウム属又は（改変）ウイルスベクターを使用する。
【０２４６】
本開示により言及される「分裂組織的細胞」は、分裂組織又は形成層又は形成組織とも言われる植物内の組織タイプに属する。動物生物の幹細胞と同様に、未分化細胞を代表する植物の分裂組織的細胞は、遺伝的素因並びにさらなる環境的及び発生的要因に依存して、特殊化した細胞型に発達及び分化する固有の能力を有する。植物生物において、分裂組織は、胚発生の間に存在するだけでなく、植物の全生活環の間にも見出すことができ、その結果、本開示による分裂組織細胞又は分裂組織の標的化された遺伝子改変は、植物の胚又は実生に限定されないが、むしろ、例えば、生殖性植物器官、例えばトウモロコシの房又は穂の基礎を築く分裂組織を標的とする場合に、より大きな実生及びより成熟した植物においても実施することができる。
【０２４７】
本開示による種々の態様による一実施形態に従って、分裂組織的細胞は、少なくとも１つの分裂組織的細胞又は分裂組織を含む植物胚の成熟もしくは未熟植物細胞又は植物の実生であってよい。
【０２４８】
ある特定のゲノム編集アプローチのために、目的の所望の構築物又はその一部を有するトランスジェニック生物が、最初に形質転換又は形質移入された目的の植物細胞の子孫に安定して挿入された構築物を受け継ぐことができる場合に、分子複合体をコードする発現カセットの安定な組み込みが望ましい。前記安定な組み込みは、核ゲノムと色素体のゲノムを含む核外ゲノムとを含む生物、好ましくは真核生物の任意のゲノム領域に起きてよい。
【０２４９】
一過性の導入は、目的の分子複合体又はその一部の導入によって特定の効果が望まれる場合に望ましいかもしれないが、構築物自体は、最初に細胞の子孫に受け継がれるべきではない。規制上の理由から、かかるアプローチは、特に植物細胞、組織、器官又は改変されるべきＤＮＡ標的配列を含む構造物としての材料を用いた特定の用途に特に適していてよい。
【０２５０】
本明細書において使用される「標的組み込み」又は「機能的組み込み」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む他の核酸分子への核酸分子の結合、又は少なくとも１つの細胞内の標的構造へのタンパク質の結合を含む、転写及び／又は翻訳及び／又は触媒活性及び／又は結合活性を可能にする、少なくとも１つの細胞への目的の遺伝子構築物の組み込みを示す。適切な場合、機能的組み込みは、核、サイトゾル、ミトコンドリア、葉緑体、液胞、膜、細胞壁等を含む、少なくとも１つの細胞の特定の細胞区画内で起こる。したがって、「機能的組み込み」という用語は、前述した「安定した組み込み」という用語とは対照的に、目的の分子複合体は、アグロバクテリウム属による形質転換を含む生物学的方法又は微粒子銃を含む物理的方法に及び続く工程よる形質転換、形質移入又は形質導入によって少なくとも１つの細胞に導入され、該分子複合体が導入された少なくとも１つの細胞内で又は細胞上にその効果を発揮することを意味する。導入されるべき遺伝子構築物の性質に依存して、前記効果は、当然変化してよく、そして単独で又は組み合わせて、とりわけリボ核酸への遺伝子構築物によってコードされるＤＮＡの転写、アミノ酸配列へのＲＮＡの翻訳、ガイドＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ、又はＲＮＡ干渉に使用するためのｓｉＲＮＡの活性を含む細胞内のＲＮＡ分子の活性、及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡを含む他の核酸分子への核酸分子の結合、又は少なくとも１つの細胞内の標的構造へのタンパク質の結合、又は一過的に又は安定した方法でベクターもしくは遺伝子構築物を介して送達される配列の組み込みを含む結合活性を含む。前記効果は、また、少なくとも１つの細胞等内で酵素又はその触媒活性部分を示すアミノ酸配列の触媒活性も含んでよい。本開示による分子複合体の機能的組み込み後に得られる前記効果は、当業者に公知であるように、目的の遺伝子構築物に含まれる制御配列又は局在化配列の存在に依存してよい。
【０２５１】
前述したように、多能性又は多分化能性の細胞を標的とする本発明による方法は、形質転換及び形質転換された少なくとも１つの細胞、特に分裂組織的細胞のさらなる発達の双方は、植物又はそれからの植物材料の再生のための面倒なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程の必要性を排除できるという利点をもたらす。しかしながら、特定の実施形態において、特定の必要性に応じて、さらなる培養、スクリーニング又は試験のために植物細胞、組織、器官又は材料を外植又は解剖することが適切であってよい。植物細胞、組織、器官又は材料のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養のためのいくつかの方法が当業者に利用可能である。
【０２５２】
したがって、目的の所望の構築物又はその一部を保有するトランスジェニック植物が安定して挿入され、かつ挿入された構築物又はその一部が最初に形質転換された目的の植物細胞の子孫に遺伝する場合に、安定な組み込みが望ましい。前記安定な組み込みは、核ゲノムと植物細胞の色素体のゲノムを含む核外ゲノムとを含む植物の任意のゲノム領域に起きてよい。さらに、本発明による人工分子複合体は、エピジェネティック修飾を生じるために使用されてよい。他の態様において、本発明は、遺伝子の機能評価及びスクリーニングの方法を提供する。したがって、本発明の人工分子複合体を使用して、機能的ドメインを正確に送達し、遺伝子を活性化又は抑制するか、又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変えることによりエピジェネティック状態を変えることができる。本発明の方法を使用して、例えば目的の変異の型又は疾患型により、目的の遺伝状態又はエピジェネティック状態をモデル化及び／又は研究するために使用されてよい植物、動物又は細胞が作成されうる。本明細書で使用される「疾患」は、被験体における疾患、障害、又は兆候をいう。例えば、本発明の方法を使用して、疾患に関連する１つ以上の核酸配列において改変を含む動物又は細胞、又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現を変更させた植物、動物又は細胞が作成されうる。かかる核酸配列は、疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。したがって、本発明の実施形態において、植物、被験体、患者、生物又は細胞が、非ヒトの被験体、患者、生物又は細胞であってよいことが理解される。したがって、本発明は、本発明の方法によって生成された植物、動物もしくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、生産された植物又は動物のクローンであるか、又は同種の他の個体と交配して子にさらに望ましい形質を遺伝子移入することによって有性生殖から生じてよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合に、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで提供されてよい。細胞が培養されている場合に、細胞株は、適切な培養条件が満たされている場合に、好ましくは細胞がこの目的に適切に適合している場合（例えば幹細胞）に確立されうる。本発明によって生成される細菌細胞株も想定される。したがって、細胞株も想定される。
【０２５３】
一過性の導入は、目的遺伝子構築物又はその一部の導入によってある特定の効果、例えばサイレンシング効果、ノックイン又はノックアウトを含む標的操作が望まれる場合に望ましいかもしれないが、構築物自体は、最初に形質転換された細胞の子孫に受け継がれるべきではない。
【０２５４】
本発明による前記態様のさらに他の実施形態において、ｇＲＮＡ及び／又はＲＴを含む少なくとも１つの目的の分子複合体又はその一部の導入は、ハンドヘルド遺伝子銃（例えば、Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）又は固定遺伝子銃を含む遺伝子銃を含む微粒子銃、アグロバクテリウム属種を使用した又はウイルスベクターを使用した形質転換を含む形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、炭化ケイ素ウイスカー技術並びに化学種、例えばリン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム又はカチオン性ポリマー及び非化学種の使用を含むウイスカー技術、例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、レーザーを使用する光学的形質移入、プロトプラスト融合、インペールフェクション、導入構築物を動物、好ましくはげっ歯類動物の臓器、好ましくは肝臓に注入することによるＤＮＡの流体力学的遺伝子送達、又はそれらの組合せからなる群から選択される方法を使用して実施される。
【０２５５】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの真核細胞は、分裂組織的植物細胞であり、該植物細胞は、本発明による人工分子複合体の導入後に、花序の成熟の発達段階が達成されるまで、植物細胞は適切な条件下でさらに培養されて、本発明による少なくとも１つの分子複合体によって媒介される目的の改変を含む植物又は植物材料を得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたトウモロコシの房から発芽可能で生存可能な花粉を製造するためのいくつかのプロトコルが、例えばＰａｒｅｄｄｙ ＤＲら１９９２） Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｐｏｌｌｅｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １１ （１０）：５３５−５３９． ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ００２３６２７３、Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ＡＥら（１９９２） Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｍａｉｚｅ ｓｐｉｋｅｌｅｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｏｌｌｅｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １１ （５−６）：２４８−２５２、又はＰａｒｅｄｄｙ ＤＲら （１９８９） Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ， ｇｅｒｍｉｎａｂｌｅ ａｎｄ ｖｉａｂｌｅ ｐｏｌｌｅｎ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｉｚｅ ｔａｓｓｅｌｓ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ７７ （４）：５２１−５２６において当業者に利用可能である。これらのプロトコルは、とりわけ、雄穂の成長及び成熟を促進するために、雄穂の切除、表面滅菌及びカイネチンを含む培地中での培養に基づく。小穂が形成された後に、葯の継続的な収穫を行うことができる。放出後、葯は花粉が出るまで乾燥される。代わりに、葯を解剖し、花粉を液体媒体中に流し込み、続いてそれを使用して穂を受粉させてよい。
【０２５６】
本明細書において使用される「花序の成熟」とは、少なくとも１つの分裂組織的細胞を含む植物の未成熟の花序が発生段階に達し、成熟花序、すなわち雄花序（雄）又は雌花序（雌）が得られ、したがって花粉（雄）又は胚珠（雌）又はその双方の配偶子が存在する状態を示す。植物の生殖相の前記段階は、得られた植物材料が、さらなる植物の受粉のため又は他の植物の花粉による受精のために直接使用することができるため、特に重要である。
【０２５７】
本発明による前記方法によるさらなる実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変は、収量改善、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、酸化ストレス、重金属ストレス、塩ストレスもしくは浸水を含む非生物的ストレスに対する耐性、昆虫に対する耐性、細菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、真菌に対する耐性もしくは線虫に対する耐性を含む生物的ストレスに対する耐性、グリホサート、グルホシネート、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤及びジカンバを含む除草剤に対する耐性、倒伏抵抗性、開花期、脱粒抵抗性、種子の色、胚乳組成、栄養含有量、表現型マーカーの改変又は少なくとも１つの植物細胞における分子薬学アプローチを可能にするゲノム編集を含む代謝工学からなる群から選択されるゲノム編集アプローチである。表現型マーカーは、例えば編集効率を監視するために、同時編集アプローチのための好ましい標的であってよい。
【０２５８】
他の実施形態において、例えば目的の産物を生成するために適切に改変された代謝経路を原核細胞に提供するために、又は弱毒化ウイルスゲノムを提供するために、原核細胞又はウイルスゲノムに対して形質開発が実施される。
【０２５９】
本発明の前記方法による他の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変は、少なくとも１つの真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、好ましくは哺乳動物白血球中の免疫細胞をウイルス性疾患の治療もしくは免疫療法、特に癌免疫療法に適した改変細胞を得るためにｅｘ ｖｉｖｏで改変するためのゲノム編集アプローチである。
【０２６０】
好ましい一実施形態において、本発明による前記方法は、真核細胞、好ましくは少なくとも１つの植物細胞を標的化した方法で改変して、遺伝子改変した植物、好ましくはトランスジェニックでない植物を提供する方法であり、その際、該方法は、とりわけ形質開発のための方法であってよい。例えば、植物遺伝子のコード配列中の１つ、２つ、３つ又はそれ以上のヌクレオチドの高度な部位特異的な置換を導入して、少なくとも１つの除草剤、例えばグリホサート、グルホシネート、ジカンバ又はアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害除草剤に対する耐性を付与する１つ以上のアミノ酸の置換を生じさせることができる。さらに、他の実施形態において、ヌクレオチド結合部位−ロイシンリッチリピート（ＮＢＳ−ＬＲＲ）植物遺伝子のコード配列における１つ以上のアミノ酸の置換は、植物の病害抵抗性を最適化するためにタンパク質の病原体認識スペクトルを変化させるだろう。さらにさらなる実施形態において、小さなエンハンサー配列又は転写因子結合部位は、植物遺伝子の内因性プロモーター中で改変されるか、又は植物遺伝子のプロモーターに導入されて、プロモーターによって制御された植物遺伝子の発現プロファイル又は強度を変えてよい。発現プロファイルは、他の領域、例えばイントロン、３’非翻訳領域、シス−又はトランス−エンハンサー配列における種々の改変、導入又は欠失によって変化させてよい。さらにさらなる実施形態において、植物細胞、好ましくは分裂組織的植物細胞のゲノムは、改変した分裂組織的細胞から生じる植物が農学的又は薬学的に関心のある化学物質又は化合物、例えば、インスリンもしくはインスリン類似体、抗体、目的の酵素機能を有するタンパク質、又は医薬として、栄養補助食品として、もしくはヘルスケア製品として適切な他の任意の薬学的に関連のある化合物を生成することができる方法で改変されてよい。
【０２６１】
さらなる態様において、本発明の方法による形質編集は、前述の方法のいずれかを使用することによる前記植物の染色体又は染色体外の遺伝物質を改変することを含む、植物における疾患及び／又は状態の治療、及び／又は昆虫感染／寄生の防止を達成するための形質編集の方法を提供する。本発明の方法により治療可能な疾患及び／又は状態の制限のない例は、炭疽性柄腐れ病（Anthracnose Stalk Rot）、アスペルギルス属穂腐れ病（Aspergillus Ear Rot）、一般的なトウモロコシの穂腐れ病（Common Corn Ear Rots）、トウモロコシの穂腐れ病（Corn Ear Rots）、一般的なコーンのサビ病病（Common Rust of Corn）、ジプロジア属穂腐れ病（Diplodia Ear Rot）、ジプロジア属条斑（Diplodia Leaf Streak）、ジプロジア属柄腐れ病（Diplodia Stalk Rot）、ベト病（Downy Mildew）、眼状斑点病（Eyespot）、フサリウム属穂腐れ病（Fusarium Ear Rot）、フサリウム属柄腐れ病（Fusarium Stalk Rot）、ジベレラ属穂腐れ病（Gibberella Ear Rot）、ジベレラ属柄腐れ病（Gibberella Stalk Rot）、Ｇｏｓｓの立枯れ病及び黒葉枯れ病（Goss's Wilt and Leaf Blight）、灰色斑点病（Gray Leaf Spot）、糸黒穂病（Head Smut）、トウモロコシ黒葉枯れ病（Northern Corn Leaf Blight）、フィソデルマ属褐斑病（Physoderma Brown Spot）、フハイカビ（Pythium）、南方葉枯れ病（Southern Leaf Blight）、南方サビ病（Southern Rust）、及びＳｔｅｗａｒｔの細菌立枯れ病及び胴枯れ病（Stewart's Bacterial Wilt and Blight）、並びにそれらの組合せを含む。
【０２６２】
直接又は間接的に、本発明によって治療できる疾患及び／又は状態を引き起こす昆虫の制限のない例は、アーミーワーム（Armyworm）、アカビロウドコガネ（Asiatic Garden Beetle）、タマナヤガ（Black Cutworm）、クサギカメムシ（Brown Marmorated Stink Bug）、茶色カメムシ（Brown Stink Bug）、軸くい虫（Common Stalk Borer）、トウモロコシゾウムシ（Corn Billbugs）、トウモロコシイヤーワーム（Corn Earworm）、トウモロコシアブラムシ（Corn Leaf Aphid）、トウモロコシルートワーム（Corn Rootworm）、シルク採食トウモロコシルートワーム（Corn Rootworm Silk Feeding）、ヨーロッパアワノメイガ（European Corn Borer）、ツマジロクサヨトウ（Fall Armyworm）、グレープコラスピス（Grape Colaspis）、ホップバインボーラー（Hop Vine Borer）、マメコガネ（Japanese Beetle）、スカウティングフォーフォールアーミーワーム（Scouting for Fall Armyworm）、シードコーンビートル（Seedcorn Beetle）、シードコーンウジ（Seedcorn Maggot）、南方トウモロコシハムシ（Southern Corn Leaf Beetle）、南西マツマダラメイガ（Southwestern Corn Borer）、クモダニ（Spider Mite）、サトウキビビートル（Sugarcane Beetle）、ウェスタンビーンカットワーム（Western Bean Cutworm）、地虫（White Grub）、及びハリガネムシ（Wireworms）、並びにそれらの組合せを含む。本発明の方法は、任意のかかる昆虫による植物の感染及び／又は寄生を妨げるためにも適している。
【０２６３】
この方法によって導入することができる形質の制限のない例は、害虫、例えばルートワーム、テッポウムシ、ヨトウムシ、カブトムシ、アブラムシ、ヨコバイ、ゾウムシ、ダニ及びカメムシに対する抵抗性又は耐性である。これらは、例えば、害虫に対する植物の固有の抵抗性を増大させるため、又は該害虫に対するその誘引性を低下させるために、植物遺伝子の改変によって作製されてよい。他の形質は、線虫、細菌、真菌又はウイルス性の病原体又はそれらのベクターに対する抵抗性又は耐性であってよい。さらに他の形質は、より効率的な栄養使用、例えば高められた窒素使用、窒素固定における効率の改善又は導入、高められた光合成効率、例えばＣ３植物のＣ４への変換であってよい。さらに他の形質は、非生物的ストレス、例えば温度、給水、塩分、ｐＨに対する耐性、日光曝露、窒素使用効率、リン使用効率、水使用効率、作物又はバイオマス収率における極値に対する耐性を高めてよい。追加の形質は、植物の食用部分又は摂食可能部分の味、外観、栄養素又はビタミンプロファイルに関連する特徴であってよく、又はこれらの部分の貯蔵寿命又は品質に関連してよい。最終的に、形質は、農学的品質、例えば倒伏、花振るい、開花時期、成熟、出芽、収穫、植物構造、生育量、サイズ、収量、及び他の特性に対する耐性に関連してよい。前記形質改変を達成するために、本発明による方法は、前述の方法のいずれかを使用することにより植物又は植物細胞の染色体又は染色体外の遺伝物質を改変することを含む。
【０２６４】
本発明による前記方法による一実施形態において、標的細胞は、原核細胞であり、改変は、少なくとも１つの原核細胞の目的のゲノム標的領域の少なくとも１つの改変を含み、ここで、該改変は、抗生物質に対する耐性を含む、生物的又は非生物的ストレスに対する細菌の耐性を調節又は増加させるために適しており、かつ該改変は、少なくとも１つの原核細胞のファージ耐性を改善するために適している。他の実施形態において、前記改変は、少なくとも１つの目的の原核細胞のＤＮＡ標的部位に目的の遺伝子を挿入すること、例えば蛍光マーカータンパク質又は他の選択マーカーをコードする配列を少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的部位に挿入することを含む。他の実施形態において、前記改変は、ノックアウト、すなわち少なくとも１つの原核細胞における少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的部位の削除を含む。原核細胞はさらに分化することはないが、直接それらの子孫に目的の改変を導入することができ、かつ原核細胞は通常真核細胞と比較して非常に短い生成時間を有するため、本発明による少なくとも１つの人工分子複合体の形での少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴによって導入される改変を急速に得ることができ、そして得られた改編された細胞の集団を、非常に短時間で得て、分析することができる。
【０２６５】
ある特定の実施形態に対して、本発明による前記方法は、さらに、（ｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改質を含む、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を同定及び／又は選択するステップ、又は原核細胞又は真核細胞虫で増殖させたウイルスゲノムに対する改変を同定するステップを含む。
【０２６６】
少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞のゲノム、又はウイルスゲノムにおいて実施される本開示による改変を分析又は同定するための方法は、当業者に公知であり、かつポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、とりわけリアルタイム定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、分析的ＰＣＲ等を含むポリメラーゼ連鎖反応、明視野及び暗視野顕微鏡を含む顕微鏡、分散染色、位相差、蛍光、共焦点、微分干渉コントラスト、逆重畳積分、電子顕微鏡、ＵＶ顕微鏡、ＩＲ顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、細胞の代謝産物の分析、改変した細胞の変更された抵抗スペクトルの分析、ＲＮＡ分析、プロテオーム分析、例えば目的のマーカー遺伝子もしくは導入遺伝子の機能的組み込みを決定するための機能的アッセイ、又はノックアウト、サザンブロット解析、ディープシークエンシングを含むシークエンシング、並びにそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない。次いで、所望の改変を含む細胞は、さらなる培養又は任意の他の下流の操作工程について選択されてよい。
【０２６７】
本発明によるさらなる態様において、（ｉ）前記した真核細胞中で少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改質する方法を実施するステップ、ここで少なくとも１つの真核細胞は植物細胞である、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの少なくとも１つの植物細胞から少なくとも１つの植物又はそれらの子孫を得るステップ、（ｉｉｉ）任意に、少なくとも１つの植物又はそれらの子孫の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を決定するステップを含む、植物又は植物細胞を作製するための方法が提供される。この態様を実施するために適した植物細胞、組織、器官及び材料は、上述されている。本開示による「製造」という用語は広く解釈されるべきであり、植物又は植物細胞の遺伝物質に対して実施される任意の形態の遺伝子操作を含む。少なくとも１つの修復鋳型ドッキングドメインと少なくとも１つの修復鋳型核酸と少なくとも１つのＳＳＮポリペプチドとを含み、任意に相互作用ドメインを含む少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴ配列を含む少なくとも１つの分子複合体の提供は、上述した異なる成分の一過性の作用又は安定な組み込み、又はそれらの組合せを可能にする方法で実施されてよい。好ましくは、少なくとも１つの人工分子複合体、又はそれらの異なる成分は、ガイド核酸ＲＮＡをコードする配列、修復鋳型核酸ＤＮＡをコードする配列、及びＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする配列を含むこれらのエフェクター成分のいずれかを目的の標的細胞のゲノムへ組み込まない一過性の方法で提供される。
【０２６８】
本発明による前前記製造方法による一実施形態において、少なくとも１つの植物又は植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物から選択され、好ましくは、植物は、トウモロコシを含むゼア属種、ベンサミアナタバコ、又はサトウダイコンを含むベータ属種、又はライムギを含むセカレ属種、又はコムギを含むトリチカム属種からなる群から選択される。
【０２６９】
本開示を通して詳述されるように、本発明による方法は適切であり、ＲＴＤＤと相互作用する適した部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて機能的に会合されたＲＴＤＤ／ＲＴ構築物を使用することの要点が種であるため、すべての生命界に属する標的細胞に適合されてよいが、但し、少なくとも１つのｇＲＮＡと少なくとも１つのＲＴとの共有的又は非共有的な相互作用によって決定される細胞内でのＤＮＡ修復のための相同組換え機構が存在する。それぞれの標的細胞及びそれぞれの標的について個々に決定する必要があるものは、（ｉ）部位特異的ヌクレアーゼ又はその触媒活性フラグメント、及び相互作用ドメインの使用、例えば融合タンパク質としての使用が適切かどうか；（ｉｉ）同種の結合パートナーの認識により当該成分の直接的な相互作用を可能にする適したＲＴＤＤ−ＳＳＮ又はＲＴＤＤ−相互作用ドメイン対；（ｉｉｉ）適したＲＴ及びＲＴＤＤとＲＴとの接続、その際ＲＴの設計は、人工分子複合体の少なくとも１つのＳＳＮによって切断された目的のＤＮＡ標的配列にカスタムメイドの修復を導入することに関連する；、並びに任意に（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの場合に）（ｉｖ）前記したように適合性であるべきであるｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲポリペプチド；（ｖ）目的のｇＲＮＡと、目的のＤＮＡ標的領域内のＰＡＭ部位とのマッチング；並びに（ｖｉ）ＤＮＡ標的配列及び導入されるべき標的改変である。公的に入手可能な任意の配列決定されたゲノムについて、したがって、適切な核酸配列の設計は、本発明の開示に基づいてｉｎ ｓｉｌｉｃｏでなされてよい。
【０２７０】
本発明によるさらに他の態様において、本発明による少なくとも１つのＲＴＤＤ／ＲＴ配列の使用、又は原核細胞もしくは真核細胞におけるゲノム編集のための本発明による人工分子複合体の使用が提供される。この態様の一実施形態において、前記使用は、真核細胞、好ましくは真菌、動物又は植物細胞又は生物、又は原核細胞もしくは真核細胞中で増殖させたウイルスゲノムについての使用である。
【０２７１】
本発明による種々の態様及び実施形態に従って、真核細胞、又は真核細胞（幹細胞を含む）を改変するための方法もしくは使用は、明らかに、ヒトをクローニングする任意のプロセス、ヒトの生殖系の遺伝的同一性もしくはヒトの胚の使用を改変するためのプロセス、又はそれから細胞を得るためにヒトの胚の破壊を必要とする方法を含まない。したがって、特にヒト生殖系列細胞又はヒト胚は、人工分子複合体で又は本発明による方法によって改変される標的の細胞又は生物として特に除外される。
【０２７２】
次の非限定的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【０２７３】
実施例
次の非限定的な実施例に従って本発明をさらに説明する。
【０２７４】
実施例１：Ｃａｓ又はＣｐｆ１又はＡｒｇｏｎａｕｔｅポリペプチドとの組み合わせに適したＲＴＤＤ／ＲＴ対としてのハイブリッド核酸配列
一実施例において、ｔａｉｌｅｄ ｓｇＲＮＡ又はｓｇＤＮＡを、双方の相補的塩基対及び一本鎖修復鋳型を有するＲＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＤＮＡライゲーションによりハイブリダイズする。共有的な会合のために、合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ｓｓＲＮＡリガーゼの製造者のプロトコルを使用してＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に共有的に連結する。非共有的な会合のために、部分的に相補的な配列を有するＲＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドを混合し、ワトソン−クリック塩基対によって複合体にする。ハイブリダイゼーションの成功は、ゲルシフトアッセイで確認することができる。ゲルシフトアッセイ前のＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅでのハイブリッド核酸のアリコートの処理は、いくつかのハイブリッド核酸が、ｓｇＲＮＡを使用するこれらの実施例についてＲＮＡ及びいくつかのＤＮＡから構成されていたことを示す。そして核酸ハイブリッドを、組換えＣａｓ９タンパク質又は他のＣＲＩＳＰＲもしくはＡｒｇｏｎａｕｔｅ由来のヌクレアーゼと複合体化する。複合体化の成功を、プロテイナーゼＫ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅでの処理及びモック処理によって検証し、そして関連するゲルシフトパターンを観察できる。組換えＣａｓポリペプチドを製造し、続いて外部の商業的実体を通して又は内部の能力により精製した。ＲＴＤＤとしてのガイド核酸配列と試験した修復鋳型（ＲＴ）核酸配列との間のハイブリッド核酸配列の異なる構築物を図１及び２に示す。
【０２７５】
実施例２：Ｃａｓ９タンパク質とハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸との複合体によるＤＮＡ標的のｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断
一実施例において、部位特異性エンドヌクレアーゼとしてのＣａｓタンパク質の機能性を、使用した時に記載された核酸ハイブリッド技術で試験した。ｓｇＲＮＡのための少なくとも１つの標的部位を含む線状にしたプラスミドを、本発明において記載されたＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＲＴ複合体と混合した。種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びそれらの多様体について当業者に公知である正しいＲＴ、温度及びコファクター等を含むヌクレアーゼ活性に適した条件下でインキュベートした後に、ＤＮＡ標的プラスミドを、アガロースゲル上で操作し、そして予期した標的部位を切断したことを示すバンドサイズについて観察した。標的ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断は、「カーゴ」としてｓｇＲＮＡが、部位特異的エンドヌクレアーゼとしてのＣａｓ９複合体の通常の機能を妨げなかったことを示した。
【０２７６】
実施例３：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質によるｉｎ ｖｉｖｏでの編集
Ｃａｓ９タンパク質及びハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸を含む提供された複合体によって標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで編集できたことを証明するために、形質転換したプラスミド内で含まれる非機能的ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子を、シグナルヌクレオチドを変更することにより修復してｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子からの蛍光シグナルを復活した。標的鎖又は標的でない鎖に対する相補性を有するｓｓＤＮＡ修復鋳型の提供によって編集するために最適な使用を決定するために、双方の鎖の修復鋳型を有する複合体を比較した。
【０２７７】
実施例１において得られたハイブリッド核酸ＲＮＡ／ＤＮＡ−Ｃａｓポリペプチド複合体を使用して、コドン位置５１で早期に停止シグナルを生じるＡからｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子へのシグナル点変異を有するｔｄＴｏｍａｔｏをコードするエピソームプラスミド標的を修復した。このプラスミドを、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを媒介する送達によってＣａｓ９タンパク質及びハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸を含む編集複合体と一緒にトウモロコシのプロトプラストに導入した。そして、一本鎖修復鋳型をｓｇＲＮＡに、相補塩基対を介して連結する。修復鋳型は、切断部位の８０塩基対下流及び〜４０塩基対上流の領域に対して相補性がある。編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって早期に評価できる。
【０２７８】
実施例４：相補的塩基対による共有的な付着又は会合によってＲＮＡに付着したＲＴと複合体化したＣａｓ９タンパク質によるｉｎ ｖｉｖｏでの編集
種々の方法で製造したハイブリッド核酸分子での編集を証明するために、実施例３において同定した最適条件を使用して、ｓｇＲＮＡへの修復鋳型のハイブリッド核酸共有結合又は非共有塩基対合による同一のエピソームプラスミド標的の修復を評価した。
【０２７９】
マーカー、特に蛍光マーカーを使用した場合に、編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおける蛍光コード遺伝子、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２８０】
実施例５：ｇＲＮＡの５’末端又は３’末端にＲＴを連結することにより形成された核酸ハイブリッドと複合体化したＣａｓ９タンパク質によるｉｎ ｖｉｖｏでの編集
一実施例において、実施例３において記載した方法を使用して、ｓｇＲＮＡの５’末端又は３’末端にハイブリダイズ又は連結した修復鋳型についての性能を同定することができる。実施例４において決定された共有的な好ましい連結をここで使用してよい。Ｔｓａｉら（"Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｆｏｋｌ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ"， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３２， ５６９−５７６ （２０１４）， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９０８）、及びさらに、Ｓｈｅｃｈｎｅｒら（"Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ， ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｉｓｐｌａｙ"， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２（７）， ６６４−６７０ （２０１５）， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３４３３）において示される結果に基づいて、３’融合が好ましいと予想される。
【０２８１】
編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって蛍光表現型、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２８２】
実施例６：ハイブリッド核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質によるｉｎ ｖｉｖｏ編集のためのｓｇＲＮＡと修復鋳型との間の最適なリンカーの長さの決定
一実施例において、ｓｇＲＮＡと修復鋳型との間で５００塩基対の長さまで５０塩基対ずつ増加するリンカーの長さを使用して、実施例３において記載される標的を修復するための相同組換えのための最適な条件を同定した。リンカー長のセットを使用することは、タンパク質標的鎖の幾何学的形態を克服するためにハイブリッド内で要求される必須の柔軟性を決定するのに役立つ。これは、分子複合体の相互作用を調整し、かつＲＴの存在下でもＣＲＩＳＰＲ複合体がその効果を発揮できることを保証するために、異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びしたがって特定のｇＲＮＡ及び個々の修復鋳型（ＲＴ）で操作する場合に特に必要である。実施例３の条件を、実施例３〜５で決定した最適なパラメータと共に使用した。リンカーは、標的遺伝子の近くの配列に対して相補性を有するＤＮＡであった。
【０２８３】
編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカーを使用した場合に、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらすだろう。したがって、異なるリンカー長で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。同様に、任目的の細胞型、抗生マーカー、タグ配列、制御配列等のために適した任意の蛍光マーカーを含む意の他の選択可能な目的のマーカーを使用できる。
【０２８４】
実施例７：ハイブリッド核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質によるｉｎ ｖｉｖｏ編集のための修復鋳型の最適な配置の決定
一本鎖又は二本鎖の修復鋳型での編集を証明するために、実施例３において記載したｉｎ ｖｉｖｏアッセイを、２つの配置の相対的な比較のために使用した。一本鎖修復鋳型は、より低い分子量に基づいて良好であると予想され、短いｄｓＤＮＡオリゴよりも短いｓｓＤＮＡオリゴを使用した編集の高い割合が公表されている。しかしながら、二本鎖の修復鋳型を使用することは、大きい配列が編集又は挿入される必要がある場合に必須であってよい。実施例４及び６の最適条件をこの実施例において使用できる。
【０２８５】
成功した編集事象は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって蛍光表現型、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２８６】
実施例８：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質による標的の染色体のｉｎ ｖｉｖｏでの編集
一実施例において、実施例３〜７によって最適化された方法を使用して、染色体標的遺伝子を編集した。ここで、早期の終止コドンｔｄＴｏｍａｔｏカセットの安定した挿入を有するトランスジェニックのトウモロコシ植物を使用して、標的の染色体のための本発明の有用性を証明した。編集の成功は、ゲノムＤＮＡにおいて組み込まれたｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらした。編集の効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２８７】
実施例９：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質による標的の染色体への遺伝子カセットのｉｎ ｖｉｖｏでの挿入
標的の染色体への完全長遺伝子の挿入のための本発明の有用性を証明するために、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光受容体遺伝子及びターミネーターをトウモロコシのｈｍｇ１３遺伝子に組み込み、ｈｍｇ１３の内因性プロモーターによって駆動する発現によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光シグナルをもたらした。その結果は、長い挿入物が、本発明の方法を使用して製造でき、かつ前記挿入のための条件を最適化するのに役立つことを証明できた。
【０２８８】
編集の成功は、標的のｈｍｇ１３へのｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の挿入によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらされ、続いてｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の発現が確認できた。したがって、試験したそれぞれの細胞型についての対応する編集の効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２８９】
実施例１０：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質を植物細胞に送達するための細胞透過性ペプチドの使用
実施例８又は９において同定された最適な系をこの実施例において使用して、ＰＥＧに基づく形質転換と細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）での形質転換の有効性を試験した。以前の刊行物及び出願は、送達のためのＣＰＰの使用が、細胞壁を有する細胞へのハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化されたＣａｓ９タンパク質の導入を可能にすることを示唆している。したがって、ＣＰＰを、Ｃａｓ融合タンパク質内で使用し、又はＣａｓタンパク質のＮ末端のシステインとＣＰＰ上のＮ末端のシステインとの間で形成されたジスルフィド結合によってＣａｓに連結した。遊離ＣＰＰは、核酸鎖上での一過性の結合を介したＣａｓ核酸複合体の移入を助けるためにも使用できる。初期のＣＰＰは、ＨＩＶ ＴＡＴペプチド（例えば配列番号１７及び１８を参照されたい）、又はそれらに由来する配列及び／又は（Ａｒｇ）9配列を含みうる。その有効性を、プロトプラスト系における成功したｔｄＴｏｍａｔｏ発現による実施例３〜９の最適な方法を使用して試験できる。
【０２９０】
実施例１１：さらなるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
前述したように、本発明によるハイブリッド核酸配列は、異なるＣＲＩＳＰＲ系の種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに適している。任意のエフェクターヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１について、ｇＲＮＡ及びＲＴの最適な条件及び長さは、前記実施例１〜１０において詳述したように評価され、それぞれの目的の細胞型のための目的のゲノム編集事象のための最適な結果を得るであろう。さらに、Ｃａｓ９ニッカーゼでの最初の実験を、１超のｇＲＮＡ、及びｇＲＮＡの少なくとも１つと会合した１つ又は２つの個々のＲＴを使用して、前述した方法と同一の方法を実施した。最初の結果は、これが、真核細胞における精密なゲノム編集のための有望なアプローチであると思われることを証明している。
【０２９１】
実施例１２：動物細胞の構築物
本発明の方法を、相同組換えすることができる条件で真核細胞において使用することができる。第一の一実施例において、マウスＴ細胞又はＴ細胞前駆体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで改変して、癌免疫療法に適しているようにそれらを調節させる。本発明によるハイブリッド核酸構築物は、動物系に対して特異的に最適化（コドン最適化）及び設計（ＰＡＭ、標的部位）された場合に、目的の真核動物細胞型における高精度のゲノム編集に使用できることを実証することができた。したがって、本発明において記載される方法を使用してＴ細胞の増殖又は機能を制御する発現遺伝子の改変は、特に哺乳動物における治療に使用することができ、より具体的には本発明による構築物で目的の細胞型を改変することによって対象における疾患又は障害を治療することができる。
【０２９２】
実施例１３：露出した未成熟な雄穂組織の形質転換／形質移入
前述したように、植物又は植物の標的構造に遺伝物質を導入するための、植物細胞、組織、器官又は植物全体又はその一部を形質転換するための種々の物理的／機械的並びに生物学的手段が記載されている。前記方法は、同様に、本発明による、少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＭＡ核酸配列及び／又は少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型、及び／又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを導入するために適している。分裂組織的細胞、例えば雄のトウモロコシ植物からの雄穂組織を露出させ、そして得た後に、この組織を形質転換するために以下の方法を適用することができる。
【０２９３】
生物学的手段に関して、植物組織又はその細胞を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を媒介した形質転換を含むアグロバクテリウム属で形質転換することができる。この種類の形質転換は、当業者に公知である（Ｊｏｎｅｓ， Ｈ．Ｄ．ら、"Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｌｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ"， ｐｌａｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００５；又はＦｒａｍｅ， Ｂ．Ｒ．ら、"Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ"， Ｐｌａｎｔ， ２００２を参照されたい）。このために、目的の構築物を含むアグロバクテリウム属の培養物を、例えば、適した抗生物質、１０ｍＭ  ＭＥＳ及び２００ｍＭ  ＡＣＥを含むＬＢ培地中で２８℃で一晩培養した。翌日、一晩培養物を１５分間４４０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。そしてそのペレットを、再度１５分間４４００ｒｐｍで２分間遠心分離し、そして残りの上清を捨てた。そのペレットを再懸濁した（５ｍｌ  Ｈ2Ｏ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2＋２０μΜ  ＡＣＥ）。６００ｎｍでの光学密度を１．５に調整する。そしておそらく希釈した懸濁液をさらに使用できる。
【０２９４】
生物学的手段によって植物の分裂組織細胞又は組織を形質転換するための他の可能性は、ウイルスベクターの使用である。ウイルスベクターは、ＤＮＡとして又はＲＮＡとして及び目的の植物標的構造に導入することができる利点を有する。さらに、ウイルスベクター又は植物ウイルスは、異なる細胞及び組織に伝播する能力を有する。
【０２９５】
本発明の目的のために、ウイルス粒子、ウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、又はウイルスを保有するアグロバクテリアをコードするＴ−ＤＮＡを、濾過（真空及び非真空）により目的の植物標的構造に導入することができる。代わりに、植物液を使用して実験を実施できる。この目的のために、タバコ又はホウレンソウを目的のウイルスに感染させ、続いて目的の前記ウイルスを植物液から単離して種々の植物からの他の植物標的構造、特に分裂組織細胞又は組織をウイルスを含有する植物液で感染させることができる。
【０２９６】
目的の雄穂構造を形質転換する生物学的手段にもかかわらず、粒微子銃に加えて、形質転換のためのさらなる物理的／機械的手段を使用することができる。
【０２９７】
適した１つの方法はマイクロインジェクションである。好ましくはマイクロマニピュレーターを使用して試験される任意の種類の分裂組織構造のために、マイクロインジェクションを使用できる。特定の分裂組織構造、例えば雄穂又は雌穂分裂組織のサイズによって、マイクロインジェクションを、顕微鏡の制御下で、又は標的構造が十分に大きい場合には顕微鏡の補助なしで実施することができる。溶液中で二本鎖プラズマＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質、並びにウイルス粒子を含む目的の植物標的構造に導入されるべき種々の異なる標的分子のための種々の方法を使用して、注入を実施できる。これらの異なる分子を、目的の分裂組織細胞又は構造に標的分子を注入することを補助するマイクロニードル又はナノニードルの助けを借りて適用することができる。標的分子を、最初に針上に被覆し、そして目的の分裂組織細胞又は構造に挿入する。
【０２９８】
他の適した方法は、微粒子銃、例えば粒子送達系を使用した微粒子銃であり、この方法はさらに前記で開示されている。
【０２９９】
この技術のさらなる発達は、炭化ケイ素（ＳｉＣ）ウイスカー（例えばＳｉｌａｒ（登録商標） Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｗｈｉｓｋｅｒ）とマイクロインジェクションの組合せの使用である。この目的のために、本発明による二本鎖（場合によりプラスミド）ＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、もしくは分子リボヌクレオ複合体、又はウイルス粒子を、炭化ケイ素ウイスカー上に沈殿させて、目的の分裂組織構造又は細胞にマイクロインジェクションの針を介して注入する。この技術は、単一細胞を形質移入できるだけでなく、ウイスカーの拡散により並行して異なる細胞を貫通することができるという利点を有する。さらに、針を細胞内に侵入させる必要がなく、ウィスカーのサイズが非常に小さいため、細胞の破壊が少なくなる。
【０３００】
実施例１４：改変を検出するための方法
本発明による少なくとも１つのＤＮＡ標的配列に導入されるような任意の一過性又は安定な改変を、蛍光レポーターを使用する場合に、蛍光検出手段を使用して検出できる。雄穂組織、例えば葯及び乾燥花粉は強い自発蛍光を有するため、これらの細胞及び組織については他の手段を使用すべきある。したがって、検出を、さらなる分子方法、例えば濃縮ＰＣＲ、ＰＣＲ消化、濃縮ＰＣＲとＰＣＲ消化との組み合わせ、定量的ＰＣＲ、又はディープシークエンシングもしくは次世代シークエンシングを含むシークエンシング、又はＲＴ−ＰＣＲ、又はサザンもしくはノーザンブロット分析によって、達成及び確認できる。タンパク質のレベルを、ウエスタンブロッティング等によって分析できる。表現型的に検出可能な形質を少なくとも１つの目的の細胞に導入した場合に、アッセイを実施して、前記形質、例えば抵抗性、蛍光性、形態的変異表現型、又は任意のさらなる形質が少なくとも１つの改変した細胞又はその子孫又はその誘導体に存在するかどうかを検出することも可能である。前記検出方法は当業者に公知である。
【０３０１】
異なる標的植物及びその細胞における安定な組み込み事象を分析するための通常の設定は、以下のように実施されてよい：最初に、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、蛍光タンパク質、例えば赤色蛍光タンパク質をコードする異なる構築物で形質転換された例えば雄穂、葯又は花粉組織／細胞を含む異なる材料から抽出する。要するに、試料を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって分析することができる前記試料から、いくつかの試料は、陽性の事象を示し、その後に選択されてよい、明らかな、すなわち非常に強い、（赤色の）蛍光シグナルを示すであろう。これらの試料から、後の結果が未消化ＤＮＡと関連していないことを排除するために逆転写酵素を含まない対照を含めて、ｃＤＮＡを作製する。転写測定のために使用されたポジティブＤＮＡシグナルを有する試料のうち、いくつかの試料は明らかな転写を示すことができ、他の試料は、潜在的な転写を示すことができた（明らかに測定できたものの境界で）。
【０３０２】
実施例１５：Ｃａｓ９とｓｃＦｖの融合タンパク質
一実施例において、ＳＳＮとしてＣａｓ９ヌクレアーゼと相互作用ドメインとしてフルオロセインに対する一本鎖抗体との融合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現させて、ＦＡＭ標識したオリゴヌクレオチドに曝し、修復鋳型として作用させることができた。ＲＴを合成し、そして修復鋳型ドッキングドメインとしてＦＡＭに共有結合させた。編集効率を、修復を示す蛍光シグナル、又は前記した修復頻度の配列に基づく測定により測定した。したがって、選択されたリガンド、例えばＦＡＭについて特異的な親和性を有するＣａｓ９とｓｃＦｖのＳＳＮ−相互作用ドメイン対を生成でき、別々に生成して、架橋又は連結でき、又はＳＳＮ及び相互作用ドメイン（ＩＡ）を、融合分子として生成できる。アッセイに依存して、ＳＳＮ−ＩＡ分子を、細胞に形質移入又はタンパク質としてアッセイに添加でき、又はその構築物を、ｉｎ ｖｉｖｏで転写及び翻訳されるべき（構成的方法で誘導可能な又は活性のある）ベクター上の標的細胞に導入できる。さらに、ＳＳＮ−ＩＡをコードする配列を、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されるべきＲＮＡ構築物として改変されるべき目的のＤＮＡ標的配列を含む標的細胞に導入できる。ＣＲＩＳＰＲ由来のＳＳＮの機能性と、その同族パートナーに対して特殊化したタンパク質の非常に高い結合親和性とを組み合わせた本発明による例示的なＳＳＮ−ＩＡ融合分子を、配列番号４４（Ｃａｓ／ｍＳＡ融合構築物）及び配列番号４５（Ｃａｓ／ｓｃＦｖ（ＦＡＭ）融合構築物）で示す。図４Ａ〜Ｃは、ＳＳＮと単量体ストレプトアビジン又はＩＡとしてｓｃＦｖの融合を使用するゲノム工学的アプローチを模式的に示す。特に、単量体ストレプトアビジン又はｓｃＦｖ又は任意の他のＩＡもしくはＲＴＤＤの使用は、ＣＲＩＳＰＲ又はＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼの使用に限定されない。
【０３０３】
実施例１６：ｓｃＦｖ結合Ｃａｓ９融合タンパク質による核酸結合
一本鎖又は二本鎖修復鋳型を結合する実施例１５の融合タンパク質の能力を証明するために、記載された結合アッセイをフルオレセイン（ＦＡＭ）標識オリゴヌクレオチドで繰り返す。市販用のＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドを得ることができる。相互作用の成功は、タンパク質、ＤＮＡ、及び蛍光色素の同時移動、並びに対応する分子量の増加によって試験できる。融合タンパク質のヌクレアーゼ部分の機能性を、特異的なガイドＲＮＡ及び対応する標的を保有する直線化されたプラスミドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して試験する。種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びそれらの多様体について当業者に公知である正しいＲＴ、温度及びコファクター等を含むヌクレアーゼ活性に適した条件下でインキュベートした後に、ＤＮＡ標的プラスミドを、アガロースゲル上で操作し、そして予期した標的部位で切断したことを示すバンドサイズについて観察した。標的ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断は、ヌクレアーゼが、部位特異的エンドヌクレアーゼとしてのＣａｓ９複合体の通常の機能を妨げなかったことを示した。
【０３０４】
実施例１７：Ｃａｓ９とｍＳＡ２の融合タンパク質
一実施例において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び改変したストレプトアビジンタグ（配列番号３４に基づく）の融合タンパク質を発現させ、修復鋳型として作用するビオチン標識オリゴヌクレオチド、ＲＴＤＤとして作用するビオチン及びＲＴを表すオリゴヌクレオチドに曝した。編集効率を、修復を示す蛍光シグナル、又は修復頻度の配列に基づく測定により測定した。
【０３０５】
実施例１８：ｍＳＡ２結合Ｃａｓ９融合タンパク質による核酸結合
一本鎖又は二本鎖修復鋳型を結合する実施例１７の融合タンパク質の能力を証明するために、記載した結合アッセイをビオチン標識オリゴヌクレオチドで繰り返した。ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、市販されているか、又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して生成できる。相互作用の成功は、タンパク質及びＤＮＡの同時移動、並びに対応する分子量の増加によって試験できる。融合タンパク質のヌクレアーゼ部分の機能性を、特異的なガイドＲＮＡ及び対応する標的を保有する直線化されたプラスミドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して試験する。種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びそれらの多様体について当業者に公知である正しいＲＴ、温度及びコファクター等を含むヌクレアーゼ活性に適した条件下でインキュベートした後に、ＤＮＡ標的プラスミドを、アガロースゲル上で操作し、そして予期した標的部位で切断したことを示すバンドサイズについて観察した。標的ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断は、ヌクレアーゼが、部位特異的エンドヌクレアーゼとしてのＣａｓ９複合体の通常の機能を妨げなかったことを示した。
【０３０６】
実施例１９：遺伝子機能を回復するためのＦＡＭ又はビオチン標識修復鋳型核酸と複合体化したＣａｓ９融合タンパク質によるエピソーム標的のｉｎ ｖｉｖｏでの編集
Ｃａｓ９タンパク質及びＦＡＭ又はビオチン標識核酸を含む提供された複合体によって標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで編集できたことを証明するために、形質転換したプラスミド内で含まれる非機能的ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子を、シグナルヌクレオチドを変更することにより修復してｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子からの蛍光シグナルを復活した。標的鎖又は標的でない鎖に対する相補性を有するｓｓＤＮＡ修復鋳型の提供によって編集するために最適な使用を決定するために、双方の鎖の修復鋳型を有する複合体を比較する。
【０３０７】
それぞれ実施例１６又は１８の核酸複合体化融合タンパク質を使用して、コドン位置５１で早期に停止シグナルを生じるＡからｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子へのシグナル点変異を有するｔｄＴｏｍａｔｏをコードするエピソームプラスミド標的を修復した。このプラスミドを、ＰＥＧ媒介送達によってＣａｓ９−ＳｃＦＶ又はＣａｓ９−ｍＳＡ２タンパク質及びＦＡＭ又はビオチン標識核酸を含む編集複合体と一緒にトウモロコシのプロトプラストに導入した。編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって早期に評価できる。
【０３０８】
実施例２０：特定の遺伝子座にＤＮＡを組み込むためのＦＡＭ又はビオチン標識修復鋳型核酸と複合体化したＣａｓ９融合タンパク質による染色体標的のｉｎ ｖｉｖｏでの編集
Ｃａｓ９タンパク質及びＦＡＭ又はビオチン標識核酸を含む提供された複合体によって標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで編集できたことを証明するために、特異的な公知のＤＮＡ配列を、ゲノムＤＮＡ内で特定の部位に組み込む。Ｃａｓ９とフルオレセインに親和性を有する一本鎖可変フラグメントとの融合タンパク質（実施例１６）又はＣａｓ９と改変ストレプトアビジンとの融合タンパク質（実施例１８）を発現させ、そしてタグ付けした修復鋳型ＤＮＡに曝し、それを使用してゲノム遺伝子座における公知のＤＮＡ配列を組み込んだ。編集の成功は、標的部位での蛍光シグナル表示修復又は分子アッセイによって分析される。
【０３０９】
実施例２１：ｓｃＦｖ結合Ａｒｇｏｎａｕｔｅ融合タンパク質による核酸結合
修復鋳型核酸を非ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する能力を証明するために、結合アッセイを実施し、ＦＡＭ標識修復核酸オリゴ及びＡｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼの融合タンパク質（配列番号４６を参照されたい）及びＦＡＭに対する親和性を有する一本鎖可変フラグメント（配列番号４３及び４５を参照されたい）を使用した同時移動試験において質量増加を示した。同様に、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ＳＳＮを、ＲＴのための結合複合体として単量体ストレプトアビジン（配列番号４２及び４４を参照されたい）に連結することができた。融合タンパク質のヌクレアーゼ部分の機能性を、特異的なガイド核酸及び対応する標的を保有する直線化されたプラスミドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して試験した。種々の非ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びそれらの多様体について当業者に公知である正しいＲＴ、温度及びコファクター等を含むヌクレアーゼ活性に適した条件下でインキュベートした後に、ＤＮＡ標的プラスミドを、アガロースゲル上で操作し、そして予期した標的部位で切断したことを示すバンドサイズについて観察した。標的ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断は、ヌクレアーゼが、部位特異的エンドヌクレアーゼとしてのＡｒｇｏｎａｕｔｅ複合体の通常の機能を妨げなかったことを示した。
【０３１０】
実施例２２：特定の遺伝子座にＤＮＡを組み込むためのＦＡＭ標識修復鋳型核酸と複合体化したＡｒｇｏｎａｕｔｅ融合タンパク質による染色体標的のｉｎ ｖｉｖｏでの編集
非ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質及びＦＡＭ又はビオチン標識核酸を含む提供された複合体によって標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで編集できたことを証明するために、特異的な公知のＤＮＡ配列を、ゲノムＤＮＡ内で特定の部位に組み込む。
【０３１１】
Ａｒｇｏｎａｕｔｅヌクレアーゼとフルオレセインに親和性を有する一本鎖可変フラグメントとの融合タンパク質（実施例２１を参照されたい）を発現させ、そしてタグ付けした修復鋳型ＤＮＡに曝し、それを使用してゲノム遺伝子座における公知のＤＮＡ配列を組み込んだ。編集の成功は、標的部位での蛍光シグナル表示修復又は分子アッセイによって分析される。
【０３１２】
実施例２３：ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１）とＲＴＤＤ１との融合タンパク質
連結計画が作用していることを証明するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９及びＣｐｆ１を、ＲＴＤＤ１と融合した。この場合、一本鎖可変フラグメント（配列番号５４）に連結し、大腸菌中で発現させた。これを、変性連続勾配（４〜１０％）ＳＤＳゲルで実行し、タンパク質の量及び純度を示す。タンパク質をこのゲルで染色した。図５の右のパネルは連結を示す。これは、４％非変性アクリルアミドゲル（Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）であり、ここでＤＮＡをＧｅｌＲｅｄを使用して染色する。ＦＡＭ標識した（ＲＴＤＤ２−）修復鋳型を、図５の左側に示すヌクレアーゼ−ＲＴＤＤ１を用いずに又は用いてヌクレアーゼ緩衝液中でインキュベートした。タンパク質が存在した場合に、ＤＮＡにより見られる生じた連結は、高分子の質量レベル（図５における矢印）で検出される。
【０３１３】
実施例２４：ＨＤＲ事象の検出
次世代シーケンシング、より具体的にはアンプリコンディープシーケンシングが標的部位でＨＤＲ事象を検出できることを証明するために、ストレプトアビジン多様体に融合させたコードさせたヌクレアーゼ（この場合はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）を、修復鋳型と一緒にプラスミド上で形質転換させた。修復鋳型は、５’ビオチンタグを有し、かつ一本鎖オリゴヌクレオチドとして提供された。形質転換した２４時間後に、プロトプラストを採取し、ＤＮＡを抽出した。修復鋳型の相同性アームと重複しないように設計されたプライマーのセットを使用して、標的部位を増幅させた。図６の４行目は正しいＨＤＲ事象を示す。この事象は、配列ＡＡＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣ（配列番号５２；アミノ酸配列ＫＶＬＧＰＥＬをコードする）をＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＡＧＣＴＣ（配列番号５３；アミノ酸配列ＫＷＳＳＡＡＴ−Ｌをコードする）に置き換える。配列番号５１は、完全な修復鋳型であり、相同性アームがアンプリコンを超えて伸長しないことを証明しており、修復鋳型が残っているＰＣＲ人工産物はないであろうことを意味する。
【０３１４】
実施例２５：修復鋳型の連結がＨＤＲ効率を改善する
この実施例について、実施例２４の成分をトウモロコシの葉のプロトプラストに形質転換させた。連結の場合に、ヌクレアーゼ（この場合ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであった）を、野生型ストレプトアビジン配列に融合させた。いずれの場合も、ヌクレアーゼをプラスミドの形で提供した。修復鋳型ＤＮＡを５’ビオチンタグを有するオリゴヌクレオチドとして提供した。形質転換した２４時間後に、プロトプラストを採取し、ＤＮＡを抽出した。修復鋳型の相同性アームと重複しないように設計されたプライマーのセットを使用して、標的部位を増幅させた。アンプリコンのディープシーケンス（実施例２４を参照されたい）及び続くコンピュータ解析は、標的部位でのＩＮＤＥＬ及びＨＤＲ事象の定量化を可能にする。二本鎖切断の発生の尺度として、ＨＤＲ頻度をＩＮＤＥＬ頻度に規準化した。平均ＨＤＲ頻度は、連結なしで０．９２％（±０．０６％）から、修復鋳型をヌクレアーゼに連結させた場合に、１．２６％（±０．０６％）まで増加した（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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