(57)【要約】本開示は、変更されたＮＡＤＰＨ利用能を有し、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の産生の増大を可能にする宿主細胞およびそれを使用する方法に関する。ＮＡＤＰＨ利用能は、宿主細胞において、変更されたＧＡＰＤＨを発現させること、バリアントグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）を発現させること、新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させること、新規スレオニンアルドラーゼを発現させることおよびピルビン酸カルボキシラーゼを発現させることまたはその発現をモジュレートすることのうち１つまたは複数によって変更される。
2020520645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する微生物細胞の能力を改善する方法であって、細胞の利用可能なＮＡＤＰＨを変更することを含む方法。
【請求項２】
前記利用可能なＮＡＤＰＨが、前記細胞において改変グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を発現させることによって変更され、前記改変ＧＡＰＤＨが、その補酵素特異性が拡大するように改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の利用可能なＮＡＤＰＨが、前記微生物細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることによって変更され、前記バリアント酵素が補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物細胞が細菌細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．からなる群から選択される細菌に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物細胞が、酵母細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．に由来する細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記天然に存在するＧＡＰＤＨがｇａｐＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｇａｐＡが、配列番号５８のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号５８のアミノ酸３６に対応する位置のロイシンが、スレオニンによって置換されており、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号５８のアミノ酸１７２に対応する位置のプロリンが、セリンによって置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号５８のアミノ酸２２４に対応する位置のロイシンが、セリンによって置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号５８のアミノ酸１１０に対応する位置のヒスチジンが、アスパラギン酸によって置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号５８のアミノ酸１４０に対応する位置のチロシンが、グリシンによって置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、表２から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む微生物細胞であって、前記改変ＧＡＰＤＨを欠く対応する微生物細胞と比較して、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の改善された産生を有する微生物細胞。
【請求項２７】
前記改変ＧＡＰＤＨが、前記天然に存在するＧＡＰＤＨと比較してＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、請求項２６に記載の微生物細胞。
【請求項２８】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の微生物細胞。
【請求項２９】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の微生物細胞。
【請求項３０】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８の位置３６、３７または両方のアミノ酸の置換を含む、請求項２７に記載の微生物細胞。
【請求項３１】
前記改変ＧＡＰＤＨが、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択される、請求項２７に記載の微生物細胞。
【請求項３２】
前記化合物が、表２から選択される、請求項２６に記載の微生物細胞。
【請求項３３】
前記化合物が、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンである、請求項３２に記載の微生物細胞。
【請求項３４】
細菌由来である、請求項２６に記載の微生物細胞。
【請求項３５】
前記細菌が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．である、請求項３４に記載の微生物細胞。
【請求項３６】
前記細菌が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項３５に記載の微生物細胞。
【請求項３７】
前記微生物細胞が、酵母細胞である、請求項３３に記載の微生物細胞。
【請求項３８】
ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含む、方法。
【請求項３９】
前記改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤよりもＮＡＤＰをより効率的に使用する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、前記バリアント酵素が、配列番号４２または４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、前記バリアント酵素が、配列番号３０または４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、ｄａｐＢのバリアント酵素を発現させることを含み、前記バリアント酵素が、配列番号４６または４８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、ｄｄｈを発現させることを含み、前記ｄｄｈ酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、前記バリアント酵素が、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、前記バリアント酵素が、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４７】
４種の酵素すべてのバリアントが、前記微生物細胞において同時に発現される、請求項３に記載の方法。
【請求項４８】
酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのうち１種または複数のバリアントを含む微生物細胞であって、前記バリアントが、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、微生物細胞。
【請求項４９】
前記ｇｄｈのバリアント酵素が、配列番号１４４、１５０、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ａｓｄのバリアント酵素が、配列番号１０８および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記微生物細胞において、スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素を発現させることをさらに含み、前記スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉスレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）とは異なる基質選好性または酵素動態を示す、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
バリアントスレオニンアルドラーゼが、グリシン産生を上回るスレオニン産生を好む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
バリアントスレオニンアルドラーゼが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記バリアントスレオニンアルドラーゼが、配列番号１９６、２０６、２２０、２２４および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物が、Ｌ−スレオニンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉであり、前記方法が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてｐｙｃを発現させることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項５７】
ｐｙｃのバリアント酵素を発現させることを含み、前記ｐｙｃのバリアント酵素が、配列番号２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７および２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
各々、１種または複数の合成プロモーターに作動可能に連結されたｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子およびｔｈｒＣ遺伝子を含むマルチコピー複製プラスミドを含む微生物細胞。
【請求項５９】
ｔｄｈ欠失（Δｔｄｈ）細胞である、請求項５８に記載の微生物細胞。
【請求項６０】
前記マルチコピー複製プラスミドが、配列番号７７のｔｈｒＡＢＣオペロン配列に対して少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項５８に記載の微生物細胞。
【請求項６１】
微生物細胞による化合物の産生の効率を改善する方法であって、
（１）酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること、（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する細菌においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること、（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること、（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすること、（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすることおよび（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させること
のうち２つまたはそれより多くを含む、方法。
【請求項６２】
前記化合物が、表２から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物がＬ−スレオニンである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記酵素が、ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するように、前記内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによって、ＮＡＤＰＨを産生するように前記解糖系を遺伝子操作することが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすることが、
ｉ）配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇｄｈのバリアント酵素を発現させること、
ｉｉ）配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むａｓｄのバリアント酵素を発現させること、
ｉｉｉ）配列番号４６および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｄａｐＢのバリアント酵素を発現させること、および
ｉｖ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｄｄｈのバリアント酵素を発現させること
のうち１つまたは複数を含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすることが、
ｉ）配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇｄｈのバリアント酵素を発現させること、
ｉｉ）配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むａｓｄのバリアント酵素を発現させること
のうち１つまたは複数を含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすることが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｌｔＡのバリアント酵素を発現させることを含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させることが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７および２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｐｙｃのバリアント酵素を発現させることを含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
短縮型グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）遺伝子をコードする人工ポリヌクレオチドであって、配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％同一である配列を含む、人工ポリヌクレオチド。
【請求項７０】
配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項６９に記載の人工ポリヌクレオチド。
【請求項７１】
プロモーターに作動可能に連結された請求項６９または７０に記載の人工ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７２】
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の組換えタンパク質断片であって、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一の配列を含む、組換えタンパク質断片。
【請求項７３】
配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の組換えタンパク質断片。
【請求項７４】
ｇａｐＡ活性を欠く、請求項７２または７３に記載の組換えタンパク質断片。
【請求項７５】
微生物細胞がｇａｐＡ活性を有する別のタンパク質を含む場合に、前記組換えタンパク質断片が、前記微生物細胞による表２から選択される化合物の生産性を増強する、請求項７４に記載の組換えタンパク質断片。
【請求項７６】
バリアントスレオニンアルドラーゼ、ｐｙｃタンパク質または両方をさらに含む、請求項２６から３６のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１７年５月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／５０８，５８９号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願と関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿０１１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、９５０ＫＢであり、２０１８年５月１８日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
分野
本開示は、一般に、微生物細胞におけるＮＡＤＰＨ利用能を増大する微生物工学の方法を対象とする。
【０００４】
特に、本開示は、宿主細胞において、変更されたＧＡＰＤＨ、バリアントグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）、スレオニンアルドラーゼ（threonine  aldohase）（ｌｔａＥ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）および新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼのうち１種または複数を発現させることによってＮＡＤＰＨ利用能を増大するように宿主細胞を遺伝子操作することに関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
還元当量としてのＮＡＤＰＨは、糖ならびにＬ−リシンおよびＬ−スレオニンなどのアミノ酸といった工業的に重要な化合物の合成のための多数の重要なバイオプロセスに関与している。しかし、ＮＡＤＰＨの正常な細胞性供給が、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造において制限因子であり得るということがわかっている。例えば、ＮＡＤＰＨは、Ｌ−リシンをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて工業規模で製造する場合に制限因子であり得る（Beckerら（２００５年）、Appl.  Environ.  Microbiol.、７１巻（１２号）：８５８７〜８５９６頁）。
したがって、ＮＡＤＰＨを使用して作製される化合物を製造するために使用される細胞、例えば、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンを製造するために使用される細胞におけるＮＡＤＰＨの利用能に関する制限を克服するために工業微生物を遺伝子操作する新規方法が当技術分野で大いに必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Beckerら（２００５年）、Appl.  Environ.  Microbiol.、７１巻（１２号）：８５８７〜８５９６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の概要
本開示は、Ｌ−リシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−グリシン産生の増大につながる、宿主細胞におけるＮＡＤＰＨ利用能に関する制限を克服するための少なくとも６種の戦略：（１）酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによって、ＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること、（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する宿主細胞においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること、（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること、（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすること、（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすること、および（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させることに関する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、細胞の利用可能なＮＡＤＰＨを変更することを含む方法が提供される。
【０００９】
ある特定の実施形態では、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素特異性が拡大した改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨを欠く対応する宿主細胞と比較して、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の改善された産生を有する宿主細胞が提供される。
【００１０】
ある特定の実施形態では、Ｌ−リシンを製造する方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株を培養することと、培養されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株または培養液からＬ−リシンを回収することとを含み、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株が、補酵素としてＮＡＤＰを使用する改変ＧＡＰＤＨを発現し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株が、Ｌ−リシンの改善された生産性を有する、方法が提供される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含む方法が提供される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、方法が提供される。
【００１３】
ある特定の実施形態では、酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのうち１種または複数のバリアントを含む宿主細胞であって、バリアントが、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、宿主細胞が提供される。
【００１４】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させることを含む方法が提供される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によるＬ−リシン製造の効率を改善する方法であって、
【００１６】
改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有するように内因性ＧＡＰＤＨを改変することと、
【００１７】
宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることであって、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、発現させることと、
【００１８】
宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させることと
のうち２つまたはそれより多くを含む方法が提供される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）のうち一方または両方のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、方法が提供される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によるＬ−スレオニンの製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞においてスレオニンアルドラーゼのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉスレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）とは異なる基質選好性または酵素動態を示す、方法が提供される。
【００２１】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によるＬ−スレオニン製造を増大する方法であって、宿主細胞において、酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、スレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含む方法が提供される。
【００２２】
ある特定の実施形態では、各々、１種または複数の合成プロモーターに作動可能に連結されたｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子およびｔｈｒＣ遺伝子を含むマルチコピー複製プラスミドを含む宿主細胞が提供される。
【００２３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞による化合物の製造の効率を改善する方法であって、（１）酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること、（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する宿主細胞においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること、（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること、（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすること、（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすること、および（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させることのうち２つまたはそれより多くを含む方法が提供される。
【００２４】
ある特定の実施形態では、短縮型グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）遺伝子をコードする人工ポリヌクレオチドであって、配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同一である配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００２５】
ある特定の実施形態では、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の組換えタンパク質断片であって、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一である配列を含む組換えタンパク質断片が提供される。
【００２６】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によるＬ−リシンまたはＬ−スレオニン製造の効率を改善する方法であって、ＮＡＤＰＨを製造する宿主細胞の能力を増大することを含む方法が提供される。一部の態様では、方法は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、その補酵素特異性が拡大するように改変することを含む。特定の場合には、改変ＧＡＰＤＨは、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対する増大した特異性を有する。ある特定の態様では、宿主細胞は原核細胞である。ある特定の態様では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．である。一部の態様では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。一部の実施形態では、天然に存在するＧＡＰＤＨは、配列番号５８のアミノ酸配列を有する。一部の態様では、改変ＧＡＰＤＨは、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＡＰＤＨは、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、改変ＧＡＰＤＨは、配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む。ある特定の態様では、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンは、リシンによって置換されている。他の態様では、配列番号５８のアミノ酸３６に対応する位置のロイシンは、スレオニンによって置換されており、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンは、リシンによって置換されている。
【００２７】
ある特定の実施形態では、宿主細胞によるＬ−リシン製造の効率を改善する方法であって、ＮＡＤＰＨを利用する宿主細胞の能力を減少させることを含み、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、方法が提供される。ある特定の態様では、４種の酵素のすべてが、宿主細胞において同時に発現される。ある特定の実施形態では、宿主細胞によるＬ−スレオニン製造の効率を改善する方法であって、ＮＡＤＰＨを利用する宿主細胞の能力を減少させることを含み、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）のいずれかまたは両方のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、方法が提供される。一部の実施形態では、バリアント酵素は、ＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する。ある特定の実施形態では、方法は、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４２のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、方法は、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、方法は、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、方法は、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。さらに他の態様では、方法は、ｄａｐＢのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。なお他の態様では、方法は、ｄｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、ｄｄｈ酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ｇｄｈのバリアント酵素は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ａｓｄのバリアント酵素は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ｄａｐＢのバリアント酵素は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
他の実施形態では、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンを製造する方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を培養することと、培養されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株または培養液からＬ−リシンまたはＬ−スレオニンを回収することとを含み、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株が、補酵素としてＮＡＤＰを使用する改変ＧＡＰＤＨを発現し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株が、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンの改善された生産性を有する、方法が提供される。
【００２９】
さらに他の実施形態では、ＧＡＰＤＨを改変することによってＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変ＧＡＰＤＨが、補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有する、方法が提供される。ある特定の態様では、改変ＧＡＰＤＨは、ＮＡＤと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する。他の態様では、改変ＧＡＰＤＨは、ＮＡＤよりもＮＡＤＰをより効率的に使用する。
【００３０】
一部の実施形態では、改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、宿主細胞が提供される。ある特定の態様では、宿主細胞は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００３１】
他の実施形態では、改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号５８のアミノ酸３６に対応する位置のロイシンが、スレオニンによって置換されており、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、宿主細胞が提供される。ある特定の態様では、宿主細胞は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００３２】
さらなる実施形態では、酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのうち１種または複数のバリアントを含む宿主細胞であって、バリアントが、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、宿主細胞が提供される。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、細胞の利用可能なＮＡＤＰＨを変更することを含む方法を教示する。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、を使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、細胞において利用可能なＮＡＤＰＨが、改変グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を発現させることによって変更され、改変ＧＡＰＤＨが、その補酵素特異性が拡大するように改変される、方法を教示する。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、方法を教示する。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．である、方法を教示する。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、方法を教示する。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞のＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する能力を改善する方法であって、天然に存在するＧＡＰＤＨがｇａｐＡである、方法を教示する。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、ｇａｐＡが配列番号５８のアミノ酸配列を有する、方法を教示する。
【００４０】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、方法を教示する。
【００４１】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、方法を教示する。
【００４２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞のＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、方法を教示する。
【００４３】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、方法を教示する。
【００４４】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、配列番号５８のアミノ酸３６に対応する位置のロイシンがスレオニンによって置換されており、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンがリシンによって置換されている、方法を教示する。
【００４５】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、化合物が、ポリケタイド（ピクロマイシン、エリスロマイシンＡ、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エバーメクチン、イベルメクチン、スピノサド、ゲルダナマイシン、マクベシン（ｍａｃｂｅｃｉｎ）、リファマイシン、アンホテリシン、ナイスタチン、ピマリシン、モネンシン、ドキシサイクリン、ブラタシン、スクアモシン、モルビザリン（ｍｏｌｖｉｚａｒｉｎ）、ウバリシン（ｕｖａｒｉｃｉｎ）、アンノナシン（ａｎｎｏｎａｃｉｎ）、タクロリムス、シロリムス、ラディシコール、ロバスタチン、ディスコデルモリド、アフラトキシン、ウスニン酸（ｕｓｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびアントラマイシンなど）、カテキン（エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、エピアフゼレキン（ｅｐｉａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、フィセチニドール（ｆｉｓｅｔｉｎｉｄｏｌ）、グイブルチニドール（ｇｕｉｂｏｕｒｔｉｎｉｄｏｌ）、メスキトール（ｍｅｓｑｕｉｔｏｌ）およびロビネチニドール（ｒｏｂｉｎｅｔｉｎｉｄｏｌ）など）、テルペン（プレノール（ｐｒｅｎｏｌ）、イソ吉草酸、ゲラニオール、テルピネオール（ｔｅｒｐｉｎｅｏｌ）、リモネン、ミルセン、リナロール、ピネン、フムレン（ｈｕｍｕｌｅｎｅ）、ファルネセン（ｆａｒｎｅｓｅｎｅ）、ファルネソール、カフェストール（ｃａｆｅｓｔｏｌ）、カーウェオール（ｋａｈｗｅｏｌ）、センブレン（ｃｅｍｂｒｅｎｅ）、タキサジエン（ｔａｘａｄｉｅｎｅ）、レチノール、レチナール、フィトール、ゲラニルファルネソール、スクアレン、ラノステロール、シクロアルテノール、コレステロール、フェルジカジオール（ｆｅｒｒｕｇｉｃａｄｉｏｌ）、テトラプレニルクルクメン（ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌｃｕｒｃｕｍｅｎｅ）、リコピン、ガンマ−カロテン、アルファおよびベータ−カロテン、３−オキソ−α−イオノール（ｉｏｎｏｌ）、７，８−ジヒドロイオノン（ｄｉｈｙｄｒｏｉｏｎｏｎｅ）、メガスチグマン（ｍｅｇａｓｔｉｇｍａｎｅ）−３，９−ジオールおよび３−オキソ−７，８−ジヒドロ−α−イオノール（ｉｏｎｏｌ）など）、脂肪酸（ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸など）、アミノ酸またはその誘導体（Ｓ−アデノシルメチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、スレオニン、リシン、グルタメート、トリプトファン、チロシン、Ｌ−リシンおよびフェニルアラニンなど）、コリスミ酸経路由来の化合物（インドール、コリスミ酸、シキミ酸、サリチル酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、パラ−アミノ安息香酸、ビタミンｋおよび葉酸など）およびアルカロイド（エフェドリン、ホモハリントニン、ガランタミン、ビンカミン、キニジン、モルヒネ、チェレリスリン、ピペリン、カフェイ���、ニコチン、テオブロミンおよびキニーネなど）からなる群から選択される、方法を教示する。
【００４６】
一部の実施形態では、本開示は、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、化合物が表２から選択される、方法を教示する。
【００４７】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨを欠く対応する宿主細胞と比較して、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の改善された産生を有する宿主細胞を教示する。
【００４８】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨが、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較してＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、宿主細胞を教示する。
【００４９】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、宿主細胞を教示する。
【００５０】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８の位置３６、３７または両方のアミノ酸について置換を含む、宿主細胞を教示する。
【００５１】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、化合物が、ポリケタイド（ピクロマイシン、エリスロマイシンＡ、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エバーメクチン、イベルメクチン、スピノサド、ゲルダナマイシン、マクベシン、リファマイシン、アンホテリシン、ナイスタチン、ピマリシン、モネンシン、ドキシサイクリン、ブラタシン、スクアモシン、モルビザリン、ウバリシン、アンノナシン、タクロリムス、シロリムス、ラディシコール、ロバスタチン、ディスコデルモリド、アフラトキシン、ウスニン酸およびアントラマイシンなど）、カテキン（エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、エピアフゼレキン、フィセチニドール、グイブルチニドール、メスキトールおよびロビネチニドールなど）、テルペン（プレノール、イソ吉草酸、ゲラニオール、テルピネオール、リモネン、ミルセン、リナロール、ピネン、フムレン、ファルネセン、ファルネソール、カフェストール、カーウェオール、センブレン、タキサジエン、レチノール、レチナール、フィトール、ゲラニルファルネソール、スクアレン、ラノステロール、シクロアルテノール、コレステロール、フェルジカジオール、テトラプレニルクルクメン、リコピン、ガンマ−カロテン、アルファおよびベータ−カロテン、３−オキソ−α−イオノール、７，８−ジヒドロイオノン、メガスチグマン−３，９−ジオールおよび３−オキソ−７，８−ジヒドロ−α−イオノールなど）、脂肪酸（ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸など）、アミノ酸またはその誘導体（Ｓ−アデノシルメチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、スレオニン、リシン、グルタメート、トリプトファン、チロシン、Ｌ−リシンおよびフェニルアラニンなど）、コリスミ酸経路由来の化合物（インドール、コリスミ酸、シキミ酸、サリチル酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、パラ−アミノ安息香酸、ビタミンｋおよび葉酸など）およびアルカロイド（エフェドリン、ホモハリントニン、ガランタミン、ビンカミン、キニジン、モルヒネ、チェレリスリン、ピペリン、カフェイン、ニコチン、テオブロミンおよびキニーネなど）からなる群から選択される、宿主細胞を教示する。
【００５２】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、化合物が表２から選択される、宿主細胞を教示する。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変が、配列番号５８のアミノ酸３６に対応する位置のロイシンのスレオニンによる置換および配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンのリシンによる置換を含む、宿主細胞を教示する。
【００５４】
一部の実施形態では、本開示は、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである宿主細胞を教示する。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示は、Ｌ−リシンを製造する方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株を培養することと、培養されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株または培養液からＬ−リシンを回収することとを含み、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株が、補酵素としてＮＡＤＰを使用する改変ＧＡＰＤＨを発現し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の株が、Ｌ−リシンの改善された生産性を有する、方法を教示する。
【００５６】
一部の実施形態では、本開示は、ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含む方法を教示する。
【００５７】
一部の実施形態では、本開示は、ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含み、改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、方法を教示する。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示は、ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含み、改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤよりもＮＡＤＰをより効率的に使用する、方法を教示する。
【００５９】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、方法を教示する。
【００６０】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、化合物が、ポリケタイド（ピクロマイシン、エリスロマイシンＡ、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エバーメクチン、イベルメクチン、スピノサド、ゲルダナマイシン、マクベシン、リファマイシン、アンホテリシン、ナイスタチン、ピマリシン、モネンシン、ドキシサイクリン、ブラタシン、スクアモシン、モルビザリン、ウバリシン、アンノナシン、タクロリムス、シロリムス、ラディシコール、ロバスタチン、ディスコデルモリド、アフラトキシン、ウスニン酸およびアントラマイシンなど）、カテキン（エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、エピアフゼレキン、フィセチニドール、グイブルチニドール、メスキトールおよびロビネチニドールなど）、テルペン（プレノール、イソ吉草酸、ゲラニオール、テルピネオール、リモネン、ミルセン、リナロール、ピネン、フムレン、ファルネセン、ファルネソール、カフェストール、カーウェオール、センブレン、タキサジエン、レチノール、レチナール、フィトール、ゲラニルファルネソール、スクアレン、ラノステロール、シクロアルテノール、コレステロール、フェルジカジオール、テトラプレニルクルクメン、リコピン、ガンマ−カロテン、アルファおよびベータ−カロテン、３−オキソ−α−イオノール、７，８−ジヒドロイオノン、メガスチグマン−３，９−ジオールおよび３−オキソ−７，８−ジヒドロ−α−イオノールなど）、脂肪酸（ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸など）、アミノ酸またはその誘導体（Ｓ−アデノシルメチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、スレオニン、リシン、グルタメート、トリプトファン、チロシン、Ｌ−リシンおよびフェニルアラニンなど）、コリスミ酸経路由来の化合物（インドール、コリスミ酸、シキミ酸、サリチル酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、パラ−アミノ安息香酸、ビタミンｋおよび葉酸など）およびアルカロイド（エフェドリン、ホモハリントニン、ガランタミン、ビンカミン、キニジン、モルヒネ、チェレリスリン、ピペリン、カフェイン、ニコチン、テオブロミンおよびキニーネなど）から選択される、方法を教示する。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、化合物が表２から選択される、方法を教示する。
【００６２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、バリアント酵素が、ＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、方法を教示する。
【００６３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、方法が、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、方法を教示する。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含む方法を教示し、バリアント酵素は、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、方法は、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含む方法を教示し、バリアント酵素は、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、方法は、ｄａｐＢのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素は、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、方法が、ｄｄｈを発現させることを含み、ｄｄｈ酵素が配列番号４のアミノ酸配列を含む、方法を教示する。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、ｇｄｈのバリアント酵素が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、方法を教示する。
【００６８】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含む方法を教示し、バリアント酵素は、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、ａｓｄのバリアント酵素は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含む方法を教示し、バリアント酵素は、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、ｄａｐＢのバリアント酵素は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、４種の酵素すべてのバリアントが、宿主細胞において同時に発現される、方法を教示する。
【００７１】
一部の実施形態では、本開示は、酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのうち１種または複数のバリアントを含む宿主細胞であって、バリアントが、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、宿主細胞を教示する。
【００７２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によるＬ−リシン製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させることを含む方法を教示する。
【００７３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞によるＬ−リシン製造の効率を改善する方法であって、
（１）改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有するように内因性ＧＡＰＤＨを改変することと、
（２）宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることであって、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、発現させることと、
（３）宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させることと
のうち２つまたはそれより多くを含む方法を教示する。
【００７４】
一部の実施形態では、本開示は、（１）酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること、（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する宿主細胞においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること、（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること、（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすること、（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌＴＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすること、および（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させることのうち２つまたはそれより多くによって、Ｌ−リシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−グリシン製造を増大する方法を教示する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、細菌リシン生合成経路を図示し、細菌におけるＬ−リシンの収率および生産性を改善するために本出願で用いた戦略を概説する。宿主細胞によるＬ−リシン製造の効率は、（１）改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有し、ＮＡＤＰＨの産生をもたらすように内因性ＧＡＰＤＨを改変すること；（２）宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることであって、バリアント酵素が補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示し、ＮＡＤＰＨの利用の減少をもたらすこと；ならびに（３）宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させ、ＮＡＤＨからのＮＡＤＰＨの産生をもたらすことのうち１つまたは複数によって改善することができる。
【００７６】
【図２】図２は、実施例１に記載の改変グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を発現するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株におけるＬ−リシン生産性を示す。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのいくつかの株を生成し、各々は、以下の突然変異の１つまたは複数を有するｇａｐＡ酵素を発現していた：Ｄ３５Ｇ、Ｌ３６Ｔ、Ｔ３７ＫおよびＰ１９２Ｓ。これらの株は、天然のｇａｐＡを有する親株と比較してＬ−リシンを産生するそれらの能力について次に試験した。ＮＡＤＰへの変更された補酵素特異性を付与するある特定の突然変異を有するＧＡＰＤＨの導入は、Ｌ−リシンの生産性を有意に改善した。Ｔ３７Ｋ単独およびＬ３６Ｔと一緒のＴ３７Ｋは、２つのバックグラウンドにおいて生産性を有意に増加させる。株７０００１８２９９４および７０００１８４３４８は各々Ｔ３７Ｋを含有し、それらのそれぞれの親である親＿１および親＿２より優れた性能を発揮する。株７０００１８２９９９および７０００１８４３５２は各々Ｔ３７ＫおよびＬ３６Ｔを含有し、それらのそれぞれの親である親＿１および親＿２より優れた性能を発揮する。
【００７７】
【図３】図３は、ＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用するバリアントｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素を発現させることによって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるリシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングするための戦略を図示する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素ｇｄｈおよびｄａｐＢは、ＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける公知の相同体をそれぞれ有する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのａｄｈおよびｄｄｈのバリアントを見出すために、宿主細胞においてゲノムワイドの相同性検索を実行した。相同性検索により、各酵素について９つのバリアントが得られた。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｄｈおよびｄａｐＢの公知の相同体ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのａｓｄおよびｄｄｈの９つのバリアントをコドン最適化し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける発現のためにプラスミドにクローニングした。
【００７８】
【図４】図４は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてバリアントｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の様々な組合せを発現させるための戦略を図示する。ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の異なるバージョンの各々の１コピーを、カナマイシン耐性マーカー遺伝子を含有するプラスミドの中に様々な組合せでクローニングした。各プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの中に次に導入し、酵素遺伝子は標準の相同組換え技術によってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体に組み込んだ。カナマイシン含有培地での培養によって、それらのゲノムの中に酵素遺伝子を組み込むのに成功したクローンを選択した。４つの全酵素が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて同時に発現された。
【００７９】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の異なるバージョンの様々な組合せの発現の効果を示す。図５Ａは２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ組換え株、７０００１８６９６０および７０００１８６９９２のためのデータを示し、各々は、ｄｄｈの天然の酵素ならびにそれらのそれぞれの親である親＿３および親＿４と比較してＬ−リシンの有意に改善された生産性を示したｇｄｈ、ａｓｄおよびｄａｐＢのための同じ３つの異種酵素を含有する（ＮＡＤＨを使用するｇｄｈおよびｄａｐＢの公知のバージョンならびにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓからのａｓｄのバリアント）。７０００１８６９６０および７０００１８６９９２の各々は、ｇｄｈ、ａｓｄおよびｄａｐＢのための同じ３つの異種酵素ならびにｄｄｈの天然の酵素を含有する。図５Ｂは、試験した３つのバックグラウンドのうちの２つにおいて、ｇｄｈおよびｄａｐＢの異種酵素が収率をわずかに増加させることも示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の異なるバージョンの様々な組合せの発現の効果を示す。図５Ａは２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ組換え株、７０００１８６９６０および７０００１８６９９２のためのデータを示し、各々は、ｄｄｈの天然の酵素ならびにそれらのそれぞれの親である親＿３および親＿４と比較してＬ−リシンの有意に改善された生産性を示したｇｄｈ、ａｓｄおよびｄａｐＢのための同じ３つの異種酵素を含有する（ＮＡＤＨを使用するｇｄｈおよびｄａｐＢの公知のバージョンならびにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓからのａｓｄのバリアント）。７０００１８６９６０および７０００１８６９９２の各々は、ｇｄｈ、ａｓｄおよびｄａｐＢのための同じ３つの異種酵素ならびにｄｄｈの天然の酵素を含有する。図５Ｂは、試験した３つのバックグラウンドのうちの２つにおいて、ｇｄｈおよびｄａｐＢの異種酵素が収率をわずかに増加させることも示す。
【００８０】
【図６】図６は、本開示の形質転換プラスミドのアセンブリーおよび宿主生物へのそれらの組込みを示す。挿入ＤＮＡは、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴを合わせることによって生成される。所望の配列を含有するＤＮＡ挿入には、ゲノムの標的化領域に相同的なＤＮＡ領域が隣接する。これらの相同的領域はゲノム組込みを容易にし、組み込まれると、以降のステップにおいてベクター骨格ＤＮＡをループアウトするように設計される直列反復領域を形成する。アセンブルされたプラスミドは、挿入ＤＮＡ、および必要に応じて、１つまたは複数の選択マーカーを含有する。
【００８１】
【図７】図７は、宿主株からＤＮＡの選択された領域をループアウトする手順を示す。挿入されたＤＮＡおよび宿主微生物ゲノムの直列反復領域は、組換え事象において「ループアウト」することができる。選択マーカーのために対抗選択される細胞は、直列反復領域が隣接したループＤＮＡの欠失を含有する。
【００８２】
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、Ｗ３１１０においてｔｈｒＬＡＢＣレギュロン（図８Ａ）またはｔｈｒＡＢＣオペロン（図８Ｂ）を使用したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０スレオニン基準株構築のステップ１のために使用したプラスミド設計を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、Ｗ３１１０においてｔｈｒＬＡＢＣレギュロン（図８Ａ）またはｔｈｒＡＢＣオペロン（図８Ｂ）を使用したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０スレオニン基準株構築のステップ１のために使用したプラスミド設計を示す。
【００８３】
【図９】図９は、リシンおよびスレオニンの細菌生合成経路を図示し、細菌におけるＬ−リシンまたはＬ−スレオニンの収率および生産性を改善するために本出願で用いた戦略を概説する。（１）その酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作することは、ＮＡＤＰＨの産生をもたらす。（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する宿主細胞においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させることは、ＮＡＤＰＨの産生をもたらす。（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによってリシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすることは、ＮＡＤＰＨ利用の減少をもたらす。（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性のｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによってスレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすることは、ＮＡＤＰＨ利用の減少をもたらす。（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすることは、消費されるＮＡＤＰＨの１単位あたりのスレオニン産生の増加をもたらす。（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させるまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させる。
【００８４】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｃは、異種スレオニンアルドラーゼライブラリー（ＴＡｌｉｂ）の発現によって実現される可能なシナリオを示す、スレオニン生合成の代謝経路地図を示す。図１０Ａは、天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｌｔａＥによってより好まれる反応（スレオニンからアセトアルデヒドおよびグリシンへの変換）を示す、スレオニン生合成の代謝経路地図を示す。図１０Ｂは、スレオニンとアセトアルデヒドおよびグリシンの間の変換が異種ＴＡ酵素の発現とより平衡している、改善されたシナリオを示す部分的経路を示す。図１０Ｃは、アセトアルデヒドおよびグリシンからスレオニンへの変換が異種ＴＡ酵素の発現でより好まれる方向である、好ましいシナリオを示す部分的経路を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｃは、異種スレオニンアルドラーゼライブラリー（ＴＡｌｉｂ）の発現によって実現される可能なシナリオを示す、スレオニン生合成の代謝経路地図を示す。図１０Ａは、天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｌｔａＥによってより好まれる反応（スレオニンからアセトアルデヒドおよびグリシンへの変換）を示す、スレオニン生合成の代謝経路地図を示す。図１０Ｂは、スレオニンとアセトアルデヒドおよびグリシンの間の変換が異種ＴＡ酵素の発現とより平衡している、改善されたシナリオを示す部分的経路を示す。図１０Ｃは、アセトアルデヒドおよびグリシンからスレオニンへの変換が異種ＴＡ酵素の発現でより好まれる方向である、好ましいシナリオを示す部分的経路を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｃは、異種スレオニンアルドラーゼライブラリー（ＴＡｌｉｂ）の発現によって実現される可能なシナリオを示す、スレオニン生合成の代謝経路地図を示す。図１０Ａは、天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｌｔａＥによってより好まれる反応（スレオニンからアセトアルデヒドおよびグリシンへの変換）を示す、スレオニン生合成の代謝経路地図を示す。図１０Ｂは、スレオニンとアセトアルデヒドおよびグリシンの間の変換が異種ＴＡ酵素の発現とより平衡している、改善されたシナリオを示す部分的経路を示す。図１０Ｃは、アセトアルデヒドおよびグリシンからスレオニンへの変換が異種ＴＡ酵素の発現でより好まれる方向である、好ましいシナリオを示す部分的経路を示す。
【００８５】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃは、Ｃｏｒｙｎｅにおいても試験されたｇａｐＡ、ｇｓｄ、ａｓｄ、ｌｔａＥの天然のものまたはバリアントの個々の遺伝子または組合せを発現するときの、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｈｒＡＢＣバックグラウンド株によって産生されるＬ−スレオニン（Ｗ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ；ｔｈｒＡＢＣ）の力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  Ｗ３１１０、ｔｄｈが欠失したＷ３１１０（ｔｄｈ＿ｄｅｌ）およびＷ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＬＡＢＣΔｔｄｈ（ｔｈｒＬＡＢＣ）株の力価も比較のために示す。図１１Ａは、ｇａｐＡの結果を示す。我々が試験した３つのｇａｐＡバリアント（ｇａｐＡｖ５、ｇａｐＡｖ７およびｇａｐＡｖ８）のすべては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡ（Ｅｃ＿ｇａｐＡ）の余分のコピーを発現する株を含めて、対照と比較して有意により高いＬ−スレオニン力価をもたらした。図１１Ｂは、ａｓｄの結果を示す。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ  ａｓｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｓｄの第２のコピーを発現する同じ基準株より有意に高い力価をもたらした。図１１Ｃは、ｇｄｈの結果を示す。この場合には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｄｈ（Ｃｓｙ＿ｇｄｈ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｄｈの第２のコピーを発現する同じ基準株とは有意に異ならなかったが、他の株は親株（ｔｈｒＡＢＣ）より良い性能を発揮した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃは、Ｃｏｒｙｎｅにおいても試験されたｇａｐＡ、ｇｓｄ、ａｓｄ、ｌｔａＥの天然のものまたはバリアントの個々の遺伝子または組合せを発現するときの、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｈｒＡＢＣバックグラウンド株によって産生されるＬ−スレオニン（Ｗ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ；ｔｈｒＡＢＣ）の力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  Ｗ３１１０、ｔｄｈが欠失したＷ３１１０（ｔｄｈ＿ｄｅｌ）およびＷ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＬＡＢＣΔｔｄｈ（ｔｈｒＬＡＢＣ）株の力価も比較のために示す。図１１Ａは、ｇａｐＡの結果を示す。我々が試験した３つのｇａｐＡバリアント（ｇａｐＡｖ５、ｇａｐＡｖ７およびｇａｐＡｖ８）のすべては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡ（Ｅｃ＿ｇａｐＡ）の余分のコピーを発現する株を含めて、対照と比較して有意により高いＬ−スレオニン力価をもたらした。図１１Ｂは、ａｓｄの結果を示す。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ  ａｓｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｓｄの第２のコピーを発現する同じ基準株より有意に高い力価をもたらした。図１１Ｃは、ｇｄｈの結果を示す。この場合には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｄｈ（Ｃｓｙ＿ｇｄｈ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｄｈの第２のコピーを発現する同じ基準株とは有意に異ならなかったが、他の株は親株（ｔｈｒＡＢＣ）より良い性能を発揮した。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、Ｃｏｒｙｎｅにおいても試験されたｇａｐＡ、ｇｓｄ、ａｓｄ、ｌｔａＥの天然のものまたはバリアントの個々の遺伝子または組合せを発現するときの、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｈｒＡＢＣバックグラウンド株によって産生されるＬ−スレオニン（Ｗ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ；ｔｈｒＡＢＣ）の力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  Ｗ３１１０、ｔｄｈが欠失したＷ３１１０（ｔｄｈ＿ｄｅｌ）およびＷ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＬＡＢＣΔｔｄｈ（ｔｈｒＬＡＢＣ）株の力価も比較のために示す。図１１Ａは、ｇａｐＡの結果を示す。我々が試験した３つのｇａｐＡバリアント（ｇａｐＡｖ５、ｇａｐＡｖ７およびｇａｐＡｖ８）のすべては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡ（Ｅｃ＿ｇａｐＡ）の余分のコピーを発現する株を含めて、対照と比較して有意により高いＬ−スレオニン力価をもたらした。図１１Ｂは、ａｓｄの結果を示す。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ  ａｓｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｓｄの第２のコピーを発現する同じ基準株より有意に高い力価をもたらした。図１１Ｃは、ｇｄｈの結果を示す。この場合には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｄｈ（Ｃｓｙ＿ｇｄｈ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｄｈの第２のコピーを発現する同じ基準株とは有意に異ならなかったが、他の株は親株（ｔｈｒＡＢＣ）より良い性能を発揮した。
【００８６】
【図１２】図１２は、ａｓｄ、ｇｄｈおよびｌｔａＥライブラリーバリアントの発現のために使用したプラスミドを構築するために使用した、調節エレメント（ｐＭＢ０３８プロモーター（配列番号２３７）およびｔｈｒＬターミネーター（配列番号２３８））および骨格（ｐ１５Ａ）（配列番号２３９）の設計を示す。
【００８７】
【図１３】図１３は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  Ｗ３１１０および親対照株−ｐ１５Ａの空のベクター（ｐＭＢ０３８プロモーター（配列番号２３７）とターミネーター（配列番号２３８）の間にクローニングしたライブラリーバリアントなしの環化ｐ１５Ａプラスミド（配列番号２３９）；対照プラスミド）で形質転換したスレオニン基準株ＴＨＲ０２（Ｗ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ）と比較してＬ−スレオニンの改善された力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。ａｓｄ＿１３（配列番号１０８）およびａｓｄ＿１８（配列番号１１８）を発現する株は改善された力価を有していたが、対照株と有意に異ならなかった。７つのｇｄｈバリアント：ｇｄｈ＿１（配列番号１３６）ｇｄｈ＿８（配列番号１５０）、ｇｄｈ＿１４（配列番号１６２）、ｇｄｈ＿１６（配列番号１６６）、ｇｄｈ＿１８（配列番号１７０）、ｇｄｈ＿２０（配列番号１７４）およびｇｄｈ＿２２（配列番号１７８）のすべては、平均のスチューデントＴ比較による判定で有意により高いＬ−スレオニン力価をもたらした。灰色の円および表示は、対照株より有意に良い性能を発揮した試料を示す。
【００８８】
【図１４】図１４は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  Ｗ３１１０および親対照株−ｐ１５Ａの空のベクター（ｐＭＢ０３８プロモーター（配列番号２３７）とターミネーター（配列番号２３８）の間にクローニングしたライブラリーバリアントなしの環化ｐ１５Ａプラスミド（配列番号２３９）；対照プラスミド）で形質転換したスレオニン基準株ＴＨＲ０２（Ｗ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ）と比較して、スレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）ライブラリーバリアントを発現する株からもたらされた、改善されたＬ−スレオニン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。ｌｔａＥ＿６（配列番号１９６）、ｌｔａＥ＿１１（配列番号２０６）、ｌｔａＥ＿１８（配列番号２２０）、ｌｔａＥ＿２０（配列番号２２４）、ｌｔａ＿２４（配列番号２３２）のすべては、平均のスチューデントＴ比較による判定で有意により高いＬ−スレオニン力価をもたらした。灰色の円および表示は、対照株より有意に良い性能を発揮した試料を示す。
【００８９】
【図１５】図１５は、個々に発現させたときに力価を各々改善した単一のａｓｄ、ｇｄｈまたはｌｔａＥライブラリーバリアントとの、Ｃｓｙ＿ｇｄｈ、ｇａｐＡｖ５またはｇａｐＡｖ７の組合せを発現する株からもたらされた、改善されたスレオニン力価を示す。Ｗ３１１０以外の示したすべての株は、ｐＭＢ０８５−ｔｈｒＡＢＣｔｄｈ欠失バックグラウンドの中にある。これらの実験では、最も重要な対照は、空のｐ１５Ａ対照プラスミドで形質転換した親株（Ｃｓｙ＿ｇｄｈ、ｇａｐＡｖ５およびｇａｐＡｖ７）である（それぞれ７０００３４９８８６、７０００３４９８８７および７０００３４９８８５；Ｃｓｙ＿ｇｄｈ＋ｐ１５Ａ（−）、ｇａｐＡｖ５＋ｐ１５Ａ（−）およびｇａｐＡｖ７＋ｐ１５Ａ（−））。
【００９０】
【図１６】図１６は、ＮＮＫライブラリーから外因性ｇａｐＡ対立遺伝子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるリシンの産生についての、２つのプレートモデルにおけるライブラリー性能を示す。各モデルにおける平均的性能がプロットされる。ほとんどの要素（灰色の円）は、親（黒色のひし形）と同等のまたはそれより劣る性能を発揮する。ある特定のｇａｐＡ対立遺伝子は、両方のプレートモデルでリシンの高い力価をもたらす（黒色の円）。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
詳細な説明
定義
以下の用語は当業者には十分に理解されると考えられるが、本開示の主題の説明を容易にするために以下の定義を示す。
【００９２】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」とは、１つまたは複数のその実態を指す、すなわち、複数の指示対象を指すこともある。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、本明細書において同義的に使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による「要素」への言及は、１つのおよび１つだけの要素があることを文脈が明確に必要としない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。
【００９３】
文脈が別のことを必要としない限り、本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、「含むが、それに限定されない」のように、限定されない、包括的な意味で解釈されるべきである。
【００９４】
本明細書を通じて「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、関連して記載される個々の特性、構造または特徴は、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれ得るということを意味する。したがって、本明細書を通じて、語句「一実施形態において（ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態において（ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」の出現は、必ずしもすべてが同一実施形態を指すわけではない。明確にするために、別個の実施形態に関連して記載される本開示のある特定の特性は、単一実施形態において組み合わせて提供されてもよいということは理解される。逆に、簡潔性のために、単一実施形態に関連して記載される本開示の種々の特性はまた、別個にまたは任意の適した小さい組合せで提供されてもよい。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「細胞性生物」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、広く解釈されなければならない。これらの用語は、同義的に使用され、それだけには限らないが、２つの原核生物のドメイン、細菌および古細菌ならびにある特定の真核生物真菌および原生生物を含むことができる。一部の実施形態では、本開示は、本開示中に存在する一覧／表および図の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」または「細胞性生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）」を指す。この特性決定は、表および図の同定された分類学的属だけでなく、同定された分類学的種ならびに前記表または図中の任意の生物の種々の新規株および新たに同定もしくは設計された株も指すことができる。同一特性決定は、本明細書のその他の部分における、例えば、実施例におけるこれらの用語の記述に当てはまる。
【００９６】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核またはその他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は、一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌のうちの一方に分類される。古細菌および細菌のドメインの生物間の決定的相違は、１６ＳリボソームＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基配列の基本的な相違に基づいている。
【００９７】
用語「古細菌」とは、通常、普通でない環境において見られ、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含むいくつかの基準によって原核生物の残りから区別されるメンドシキュート（Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ）門の生物の分類を指す。ｓｓｒＲＮＡ解析に基づいて、古細菌は、２つの系統的に別個の群：クレンアーキオータ門（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）およびユリアーキオータ門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる。その生理学に基づいて、古細菌は、３つの種類に分けることができる：メタン生成菌（メタンを生成する原核生物）；高度好塩菌（極めて高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生存する原核生物；および高度（超）好熱菌（極めて高温で生存する原核生物）。細菌からそれらを区別する統一古細菌特性（すなわち、細胞壁中のムレイン、エステルが連結した膜脂質などがないなど）に加えて、これらの原核生物は、その個々の生息地にそれらを適合させる独特の構造および生化学的特質を示す。クレンアーキオータ門は、主に、超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、ユリアーキオータ門は、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【００９８】
「細菌」または「真正細菌」とは、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下のような少なくとも１１の別個の群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、そのうち２つの主要な細区画がある：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓなど）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）、（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（ほとんどの「一般的な」グラム陰性細菌を含む）、（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生光合成生物、（４）Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ属および関連種、（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ属、（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ属、（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、（８）緑色硫黄細菌、（９）緑色非硫黄細菌（また、嫌気性光合成生物）、（１０）Ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉおよび関連物、（１１）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【００９９】
「真核生物」は、細胞が核および膜内に封入されたその他の小器官を含有する任意の生物である。真核生物は、分類群真核生物（Ｅｕｋａｒｙａ）または真核生物（Ｅｕｋａｒｙｏｔａ）に属する。真核細胞を原核細胞（上記の細菌および古細菌）と分離する決定的な特性は、それらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核エンベロープによって封入される核を有することである。
【０１００】
用語「遺伝子改変された宿主細胞」、「遺伝子改変された微生物」、「組換え微生物」、「組換え宿主細胞」および「組換え株」は、本明細書において同義的に使用されることができ、遺伝子改変されている微生物を指し得る。したがって、この用語は、由来する天然に存在する微生物と比較して、変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響を及ぼす場合）を示すように、遺伝的に変更されている、改変されている、または遺伝子操作されている微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞など）を含む。この用語が、問題の個々の組換え微生物だけでなく、このような微生物の後代または潜在的後代も指すことは理解される。
【０１０１】
用語「野生型微生物」とは、天然に生じる細胞、すなわち、遺伝子改変されていない細胞を説明できる。
【０１０２】
用語「遺伝子操作された」とは、微生物のゲノムの任意の操作（例えば、核酸の挿入または欠失）を指し得る。
【０１０３】
用語「対照」または「対照宿主細胞」とは、遺伝子改変または実験的処置の効果を調べるための適当な比較基準宿主細胞を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を区別する遺伝子改変（複数可）を除いて、遺伝子改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株の使用（例えば、株改善プログラムの基準として使用されたＳ１株）を教示する。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子（複数可）」とは、その対立遺伝子のすべてが、少なくとも１つの形質または特徴に関する、遺伝子の１つまたは複数の代替形態を意味し得る。２倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子が、相同染色体対上の対応する遺伝子座を占有し得る。本開示は、実施形態において、ＱＴＬ、すなわち、１種または複数の遺伝子または調節配列を含み得る遺伝子領域に関するので、いくつかの場合には、「対立遺伝子」の代わりに、「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）を指すことがより正確であるが、それらの場合には、用語「対立遺伝子」は、用語「ハプロタイプ」を含むと理解されなければならない。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形（ｌｏｃｉ））は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見られる染色体上の１つまたは複数の特定の場所または部位を意味し得る。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」とは、育種の際に高率で同時に遺伝され、その結果、交雑によって分離することが困難である２つまたはそれより多い形質を指し得る。
【０１０７】
「組換え」または「組換え事象」とは、本明細書で使用される場合、染色体の交差または独立アソートメントを指し得る。用語「組換え」とは、組換え事象の結果として生じる新規遺伝子構成を有する生物を指し得る。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」とは、個体の遺伝子構成（すなわち、遺伝子型）と環境の間の相互作用に起因する、個々の細胞、細胞培養物、生物または生物の群の観察可能な特徴を指し得る。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」または「組換え」とは、核酸配列またはタンパク質配列を説明する場合に、少なくとも２種の異種ポリヌクレオチドまたは２種の異種ポリペプチドを、単一高分子に連結する、または少なくとも１つの天然核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成できる核酸またはタンパク質配列を指し得る。例えば、用語「組換え」とは、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離されたセグメントの操作による２つのそうでなければ分離している配列のセグメントの人工組合せを指し得る。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に生じることがわかっていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列であり得る。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意のその他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較すると少なくとも１つのヌクレオチド相違を含む。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれか、またはそのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し得る。この用語は、分子の一次構造を指すこともでき、したがって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。また、メチル化および／またはキャップド核酸、改変された塩基、骨格改変などを含有する核酸などの改変された核酸も含み得る。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、同義的に使用され得る。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」とは、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントを指し得る。したがって、遺伝子は、それに限定されないが、コード配列および／またはその発現に必要な調節配列を含み得る。遺伝子はまた、例えば、その他のタンパク質のための認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニングまたは既知もしくは予測配列情報から合成することを含め、種々の供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「相同」または「相同体」または「オーソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先もしくはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指し得る。用語「相同性」、「相同な」、「実質的に同様の」および「実質的に対応する」は、本明細書において同義的に使用され得る。それらは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片の、遺伝子発現を媒介する能力またはある特定の表現型をもたらす能力に影響を及ぼさない核酸断片を指し得る。これらの用語はまた、得られる核酸断片の機能特性を最初の非改変断片と比較して実質的に変更しない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの本開示の核酸断片の改変を指し得る。したがって、当業者ならば理解するであろうが、本開示は、特定の例示的配列より多くを包含し得るということは理解される。これらの用語は、ある種、亜種、変種、栽培品種または株において見られる遺伝子と、別の種、亜種、変種、栽培品種または株における対応するまたは相当する遺伝子間の関係を説明できる。本開示の目的上、相同配列を比較できる。「相同配列」または「相同体」または「オーソログ」は、機能的に関連していると考えられる、信じられる、またはわかっている。機能的関係は、それに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同一もしくは同様の生物学的機能を含め、いくつかの方法のうちいずれか１つで示されることができる。（ａ）および（ｂ）の両方が示されることが好ましい。相同性は、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.Ausubelら編、１９８７年）補足３０、７．７１８節、表６．７１において論じられるものなどの、当技術分野で容易に入手可能なソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。いくつかのアラインメントプログラムとして、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）がある。別のアラインメントプログラムとして、デフォルトパラメーターを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）がある。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント酵素」または「バリアント」とは、バリアントが発現される生物における天然酵素と比較して異なるアミノ酸配列を有するが、天然酵素によって触媒されるものと同一または同様に反応を触媒する能力を有する酵素を指す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「内因性」または「内因性遺伝子」とは、宿主細胞ゲノム内のそれが天然に見られる位置における天然に存在する遺伝子を指す。本開示に関連して、異種プロモーターを内因性遺伝子に作動可能に連結することは、異種プロモーター配列を既存の遺伝子の前に、遺伝子が天然に存在する位置に遺伝的に挿入することを意味する。本明細書において記載されるような内因性遺伝子は、本開示の方法のいずれかに従って突然変異されている天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含み得る。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、用語「異種」と同義的に使用され、その天然供給源以外のいくつかの供給源に起因する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」とは、非天然供給源または位置に由来する、および生物システムに人工的に供給されているタンパク質または遺伝子を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」とは、当技術分野で十分に理解されるように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を指し得る。例えば、突然変異は、サイレント置換、付加または欠失をもたらすが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質改変」は、当技術分野で十分に理解されるように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失および／または挿入を指し得る。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドの用語「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小サイズの特徴と有する一部または完全長分子の任意のより大きな、最大で完全長分子であり、完全長分子を含む断片を意味し得る。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物学的に活性な部分をコードし得る。遺伝子調節エレメントの生物学的に活性な部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１種の一部を単離することおよび本明細書において記載されるような活性を評価することによって調製できる。同様に、ポリペプチドの一部は、完全長ポリペプチドに向かう、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得る。使用されるべき一部の長さは、個々の適用に応じて変わり得る。ハイブリダイゼーションプローブとして有用である核酸の一部は、１２ヌクレオチド程度の短いものであってよく、一部の実施形態では、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用であるポリペプチドの一部は、４アミノ酸程度の短いものであってよい。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの一部は、一般に、４アミノ酸より長いものであり得る。
【０１２０】
バリアントポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡシャッフリングなどの突然変異誘発および組換え誘導手順に由来し得る配列を包含する。このようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer（１９９４年）PNAS  ９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Stemmer（１９９４年）Nature  ３７０巻：３８９〜３９１頁；Crameriら（１９９７年）Nature  Biotech．１５巻：４３６〜４３８頁；Mooreら（１９９７年）J.  Mol.  Biol．２７２巻：３３６〜３４７頁；Zhangら（１９９７年）PNAS  ９４巻：４５０４〜４５０９頁；Crameriら（１９９８年）Nature  ３９１巻：２８８〜２９１頁および米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照のこと。
【０１２１】
本明細書において開示されるポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応において使用するために設計して、目的の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅できる。ＰＣＲプライマーを設計する方法およびＰＣＲクローニングのための方法は、全般的に当技術分野で公知であり、Sambrookら（２００１年）Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。また、Innisら編（１９９０年）PCR  Protocols:A  Guide  to  Methods  and  Applications  (Academic  Press、New  York)；InnisおよびGelfand編（１９９５年）PCR  Strategies(Academic  Press、New  York)；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual  (Academic  Press、New  York)も参照のこと。ＰＣＲの既知方法は、それに限定されないが、ペアードプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法を含み得る。
【０１２２】
用語「プライマー」とは、本明細書で使用される場合、増幅標的に対してアニーリング可能であり、ＤＮＡポリメラーゼが付着することを可能にし、それによって、プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、適した温度およびｐＨで、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための物質の存在下に置かれた場合に、ＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドを指し得る。（増幅）プライマーは、増幅における最大効率のためには、一本鎖であることが好ましい。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、重合のための物質の存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分に長いものでなくてはならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）を含め、多数の因子に応じて変わる。二方向プライマー対は、ＰＣＲ増幅においてなどＤＮＡ増幅の技術分野でよく使用されるような、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーからなる。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーターポリヌクレオチド」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を指し得る。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれ得ることも多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であることがあり、プロモーターの生得的エレメントである場合も、プロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントである場合もある。プロモーターは、天然遺伝子からその全体が誘導される場合も、天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合もあり、さらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合もある。当業者ならば、異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞種において、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示し得るということは理解される。ほとんどの場合には、調節配列の正確な境界は、完全に定義されておらず、いくつかの変動のＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有することがあるということはさらに認識される。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、語句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書において同義的に使用され得る。組換え構築物は、核酸断片、例えば、天然では一緒に見られない調節配列およびコード配列の人工組合せを含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同一供給源に由来するが、天然に見られるものとは異なる方法で配置している調節配列およびコード配列を含み得る。いくつかの場合には、キメラ構築物は、複数の調節配列（例えば、プロモーター）およびコード配列（例えば、ｇａｐＡ／トランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子）を含む組換え構築物であり得る。複数のコード配列を含むキメラ構築物中の各コード配列は、別個の調節配列によって制御されてもよい、または別個の調節配列に機能的に連結されてもよい。本明細書において記載されるこのような構築物は、それ自体によって使用してもよく、またはベクターとともに使用してもよい。次いで、ベクターを使用する場合には、ベクターの選択は、当業者に周知であるような宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存し得る。例えば、プラスミドベクターを使用できる。当業者ならば、本開示の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクターに存在しなくてはならない遺伝子エレメントを十分に承知している。当業者ならば、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすであろう（Jonesら、（１９８５年）EMBO  J.  ４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら、（１９８９年）Mol.  Gen.  Genetics  ２１８巻：７８〜８６頁）、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す道筋を得るために複数の事象をスクリーニングしなくてはならないということも認識するであろう。このようなスクリーニングは、中でも、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析または表現型解析によって達成できる。ベクターは、自己複製する、または宿主細胞の染色体中に組み込まれ得るプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自己複製しない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内でＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなるポリヌクレオチド、ポリ−リシンがコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドがコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームがコンジュゲートされたＤＮＡなどであり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、機能的最終生成物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟した）の生成を指す。
【０１２５】
「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」は、この文脈では、本開示のプロモーターポリヌクレオチドと、さらなるオリゴまたはポリヌクレオチド（例えば、ｇａｐＡ／トランスヒドロラーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子）とが連続して配置し、さらなるポリヌクレオチド（例えば、ｇａｐＡ／トランスヒドロラーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ）の転写をもたらすことを意味し得る。言い換えれば、「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」は、プロモーターが、前記プロモーターに隣接する、またはその下流のもしくはその３’の遺伝子（例えば、ｇａｐＡ／トランスヒドロラーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子）の転写を制御することを意味し得る。
【０１２６】
用語「目的の生成物」または「生体分子」とは、本明細書で使用される場合、供給原料から微生物によって産生される任意の生成物を指す。いくつかの場合には、目的の生成物は、小分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の生成物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、スレオニン、トリプトファンおよびその他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬物、グリセオフルビンのような殺真菌剤などであり得る。目的の生成物または生体分子はまた、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼおよび多数のその他のものを含む微生物酵素などの微生物によって産生される任意の細胞内成分であり得る。細胞内成分はまた、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなどといった組換えタンパク質も含み得る。
【０１２７】
用語「炭素供給源」とは、一般に、細胞成長のための炭素の供給源として使用されるのに適した物質を指し得る。炭素供給源として、それに限定されないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロースおよびリグニンならびにこれらの基質の単量体構成成分が挙げられる。炭素供給源は、それに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含む種々の形態の種々の有機化合物を含み得る。これらとして、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、マルトースなどの種々の単糖、オリゴ糖、多糖、飽和または不飽和脂肪酸、コハク酸、乳酸、酢酸、エタノールなどまたはそれらの混合物を挙げることができる。光合成生物は、光合成の生成物として炭素供給源をさらに産生できる。一部の実施形態では、炭素供給源をバイオマス加水分解物およびグルコースから選択してもよい。
【０１２８】
用語「供給原料」は、その他の生成物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原材料または原材料の混合物として定義できる。例えば、バイオマスまたはバイオマス由来の炭素化合物などの炭素供給源は、発酵プロセスにおいて目的の生成物（例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物のための供給原料であり得る。しかし、供給原料は、炭素供給源以外の栄養素を含有し得る。
【０１２９】
用語「容積生産性」または「生産速度」は、時間の単位あたり培地の容積あたりに形成される生成物の量として定義できる。容積生産性は、時間あたりのリットルあたりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告できる。
【０１３０】
用語「比生産性」は、生成物の形成の速度として定義できる。発酵プロセスのではない、微生物の固有のパラメーターとして生産性を説明するために、本明細書において生産性を、時間あたりの細胞乾重（ＣＤＷ）のグラムあたりの生成物グラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）で比生産性としてさらに定義できる。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性をまた、時間あたりの６００ｎｍでの培養液の光学濃度（ＯＤ）あたりの培養培地リットルあたりの生成物グラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表すことができる。
【０１３１】
用語「収率」は、原材料の単位重量あたりの得られた生成物の量として定義でき、基質ｇあたりの生成物ｇ（ｇ／ｇ）として表してもよい。収率は、理論上の収率のパーセンテージとして表してもよい。「理論上の収率」は、生成物を作製するために使用される代謝経路の化学量論によって決定されるような、所与の量の基質あたりの生成され得る生成物の最大量として定義される。
【０１３２】
用語「力価（ｔｉｔｒｅ）」または「力価（ｔｉｔｅｒ）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義できる。例えば、発酵培養液中の目的の生成物（例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価（ｔｉｔｒｅ）は、発酵培養液のリットルあたりの溶液中の目的の生成物のｇ（ｇ／Ｌ）として記載できる。
【０１３３】
用語「総力価（ｔｉｔｅｒ）」は、それに限定されないが、溶液中の目的の生成物、妥当な場合にはガス相中の目的の生成物ならびにプロセスから除去されるおよびプロセスにおける初期容積または作動容積に対して回収される任意の目的の生成物を含む、プロセスにおいて産生されたすべての目的の生成物の合計として定義できる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」とは、本開示による遺伝子撹乱の収集物を指す。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ｉ）データベースまたはその他のコンピュータファイルにおける配列情報の収集物、ｉｉ）前記の遺伝子エレメントのシリーズをコードする遺伝子構築物の収集物またはｉｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として現れ得る。
【０１３５】
ＮＡＤＰＨを増大するための遺伝子設計＆ＨＴＰ微生物工学プラットフォームにおいて利用するための遺伝的多様性プールの作製
一部の実施形態では、本開示の方法を遺伝子設計として特性決定する。本明細書で使用される場合、用語遺伝子設計とは、新規の優れた宿主細胞を設計および作出するための個々の遺伝子、遺伝子の部分、プロモーター、停止コドン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはその他のＤＮＡ配列の最適バリアントの同定および選択による、宿主生物のゲノムの再構築または変更を指す。
【０１３６】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計法における第１のステップは、新規宿主ゲノムが再構築され得る複数の配列変動を有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることである。
【０１３７】
既存の野生型株に由来する多様性プールの利用
一部の実施形態では、本開示は、所与の野生型集団の微生物の間に存在する配列多様性を同定するための方法を教示する。したがって、多様性プールは、解析のために利用される所与の数ｎの野生型微生物である場合があり、前記微生物のゲノムは「多様性プール」を示す。
【０１３８】
一部の実施形態では、多様性プールは、前記野生型微生物の間の天然遺伝子変異において存在する既存の多様性の結果であり得る。この変動は、所与の宿主細胞の株変異体に起因し得るか、または完全に異なる種である微生物の結果であり得る。遺伝子変異は、天然に存在するか否かに関わらず、株の遺伝子配列における任意の相違を含み得る。態様では、本開示は、新規スレオニンアルドラーゼを導き出すために専売の微生物のライブラリーを利用する。見られるように、本適用は、この価値あるアミノ酸の株産生を最適化するためにスレオニンアルドラーゼのこのライブラリーを利用する方法を教示する。
【０１３９】
既存の工業的株変異体に由来する多様性プールの利用
本開示の他の実施形態では、多様性プールは、伝統的な株改善プロセスの際に作出された株変異体（例えば、ランダム突然変異によって作製され、数年にわたって改善された収率について選択された１種または複数の宿主生物株）である。したがって、一部の実施形態では、多様性プールまたは宿主生物は、歴史的生産株の収集物を含み得る。
【０１４０】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点で「ベースライン」遺伝子配列を有する（Ｓ１Ｇｅｎ１）元の親微生物菌株（Ｓ１）および前記Ｓ１株から導かれた／開発され、Ｓ１のベースラインゲノムと関連して異なるゲノム（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）を有するその他の任意の数のその後の子孫株（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５など、Ｓ２−ｎまで作製可能）であり得る。
【０１４１】
突然変異誘発による多様性プールの作出
一部の実施形態では、細胞の所与の多様性プール集団における目的の突然変異は、変異原性化学物質または放射線照射を含む株を突然変異させるための任意の手段によって人工的に作製できる。用語「突然変異誘発すること」は、細胞性核酸材料において１つまたは複数の遺伝子改変を誘導する方法を指すように本明細書において使用される。
【０１４２】
用語「遺伝子改変」とは、ＤＮＡの任意の変更を指す。代表的な遺伝子改変は、ヌクレオチド挿入、欠失、置換およびそれらの組合せを含み、単一塩基ほど小さいものまたは数万塩基ほど大きいものであり得る。したがって、用語「遺伝子改変」は、ヌクレオチド配列の反転および染色体の領域を含むＤＮＡの位置または配向が変更されるその他の染色体再編成を包含する。染色体再編成は、染色体内再編成または染色体間再編成を含み得る。
【０１４３】
一実施形態では、ここで特許請求される主題において使用される突然変異誘発法は、遺伝子改変が、突然変異誘発されるべき核酸材料内の任意の利用可能なヌクレオチド位置で起こり得るように実質的にランダムである。別の言い方をすれば、一実施形態において、突然変異誘発することは、特定のヌクレオチド配列での出現の優先または頻度の増大を示さない。
【０１４４】
本開示の方法は、それに限定されないが、紫外線、Ｘ線照射、ガンマ照射、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、メチルニトロソ尿素（methyinitrosourea）（ＭＮＵ）、プロカルバジン（ＰＲＣ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、アクリルアミドモノマー（ＡＡ）、クロラムブシル（ＣＨＬ）、メルファラン（ＭＬＰ）、シクロホスファミド（ＣＰＰ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、マイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、３Ｈ２Ｏおよびウレタン（ＵＲ）（例えば、Rinchik、１９９１年；Markerら、１９９７年；およびRussell、１９９０年を参照のこと）を含む任意の変異原性物質を使用し得る。さらなる変異原性物質は、当業者には周知であり、http://www.iephb.nw.ru/~spirov/hazard/mutagen_lst.htmlに記載されるものを含む。
【０１４５】
用語「突然変異誘発すること」はまた、細胞機能を変更（例えば、ターゲッティングされた突然変異により）またはモジュレートし、それによって、突然変異誘発の速度、品質または程度を増強する方法を包含する。例えば、細胞を、それによってＤＮＡ修復、変異原代謝、変異原感受性、ゲノム安定性またはそれらの組合せにおいて機能障害または欠損であるように変更またはモジュレートできる。したがって、普通、ゲノム安定性を維持する遺伝子機能の破壊を使用して、突然変異誘発を増強できる。破壊の代表的な標的として、それに限定されないが、ＤＮＡリガーゼＩ（Bentleyら、２００２年）およびカゼインキナーゼＩ（米国特許第６，０６０，２９６号）が挙げられる。
【０１４６】
一部の実施形態では、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販のキットを使用するプライマーによって指示される突然変異誘発）を使用して、核酸配列を通じて複数の変化をもたらし、本開示の切断酵素をコードする核酸を作製する。
【０１４７】
１種または複数の変異原性物質に対する曝露の際の遺伝子改変の頻度は、処置の用量および／または反復を変更することによって調節することができ、特定の適用のために合わせることができる。
【０１４８】
したがって、一部の実施形態では、「突然変異誘発」とは、本明細書で使用される場合、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、オリゴヌクレオチドによって指示される突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発および本明細書において記載される技術のいずれかによる反復性配列組換えを含む突然変異を誘導するための当技術分野で公知のすべての技術を含む。
【０１４９】
ＮＡＤＰＨを増大するための遺伝子設計の概要
本開示は、生体分子または目的の生成物の増大された産生が可能である微生物（例えば、細菌）を作製する方法を提供する。一般に、本明細書において提供されるような任意の生体分子の製造において使用するための微生物を作製する方法は、１つまたは複数の標的遺伝子を宿主微生物中に導入して前記宿主微生物を遺伝子改変して、前記微生物の遺伝子操作された株を作製すること、前記操作された株を生体分子または目的の生成物を産生するのに適した条件下で培養すること、前記操作された株が生体分子または目的の生成物の増大した量をもたらす場合に前記操作された株を選択することを必要とし得る。増大された量は、宿主微生物の野生型株と比較したものであり得る。増大された量は、標的遺伝子のライブラリーのメンバーを含有しない宿主微生物の株と比較してであり得る。標的遺伝子は、ベクター中の単一標的遺伝子または同一ベクター上の複数の標的遺伝子を含み得る。
【０１５０】
本開示の実施形態の１つの例示的ワークフローは、標的遺伝子を同定することと、標的遺伝子の核酸（例えば、ＤＮＡ）を獲得または合成することと、前記の獲得または合成された標的遺伝子を適したベクターにクローニングすることとを必要とする。標的遺伝子（複数可）を適したベクター中にアセンブルまたはクローニングするために、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意の方法を使用できる。ベクターは、利用されるべき宿主微生物と適合する、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意のベクターであり得る。標的遺伝子（複数可）を含むベクターをアセンブルすると、それを宿主微生物に導入できる。ベクターの導入は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意の方法を使用してであり得る。宿主微生物は、本明細書において提供される任意の宿主微生物であり得る。宿主微生物へ導入すると、遺伝子改変された宿主を選択でき、標的遺伝子（複数可）の挿入を評価できる。標的遺伝子（複数可）を、宿主微生物のゲノムの特定の位置に挿入されるように遺伝子操作できる。いくつかの場合には、標的遺伝子（複数可）を、宿主微生物内の意図しない経路／プロセスを撹乱することなく、標的遺伝子（複数可）の発現を促進するゲノムの中立部位に挿入する。いくつかの場合には、標的遺伝子（複数可）は、宿主微生物内の特定の遺伝子（複数可）を置換する。特定の遺伝子は、普通、宿主微生物中に存在する相同標的遺伝子であり得る。例えば、中立組込み部位などの組込み部位は、種々の部位を試験できるように経験的に決定でき、宿主細胞にとって有害ではない、組み込まれた標的遺伝子（複数可）の発現を可能にする部位を選択できる。所望の部位（例えば、中立部位）への組込みは、標的遺伝子（複数可）を、所望の組込み部位（すなわち、相同アーム）に相同な配列の部分を含むベクターにクローニングすること、続いて、宿主細胞において組換え事象を実施することによって容易にすることができる。標的遺伝子（複数可）を相同配列の部分の間に挿入できる。ある特定の実施形態では、ベクターは、所望の組込み部位に相同な約２ｋｂの配列を含む。所望の部位に相同な配列は、配列の第１の部分が、遺伝子挿入の上流（すなわち、５’）であり、配列の第２の部分が、遺伝子挿入の下流（すなわち、３’）であるように、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）および／またはｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）遺伝子挿入部分の両端に位置してもよい。他の実施形態では、ベクターは、所望の組込み部位に相同な約４ｋｂの配列を含む。この実施形態では、ベクターは、ｇａｐＡ、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子挿入に対して上流（すなわち、５’）の所望の組込み部位に対して相同な約２ｋｂの配列ならびにｇａｐＡ、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子挿入に対して下流（すなわち、３’）の所望の組込み部位に対して相同な約２ｋｂの配列を含む。一部の実施形態では、単回クロスオーバー組込みおよびベクター骨格中に存在するマーカーでの対抗選択によって促進される、その後のプラスミド骨格のループアウトによって組込みを実施する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意のｇａｐＡ遺伝子である。他の実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ酵素遺伝子である。さらに他の実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のおよび／もしくは本明細書において提供される任意のｇａｐＡ遺伝子ならびに／または当技術分野で公知のおよび／もしくは本明細書において提供される任意のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ酵素遺伝子ならびに／または当技術分野で公知のおよび／もしくは本明細書において提供される任意のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ遺伝子である。さらに他の実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意のｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣおよび／またはｌｔａＥ遺伝子である。さらに他の実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において提供される任意のｐｙｃ遺伝子である。
【０１５１】
挿入の評価は、例えば、遺伝子改変された微生物のゲノムまたはその部分を増幅および／またはシーケンシングすることなど、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施できる。いくつかの場合には、本明細書において提供される方法はまた、本明細書において記載されるような対抗選択による選択マーカーの除去またはループアウトを必要とする。ループアウトは、本明細書において提供される方法のいずれかを使用して実施できる。
【０１５２】
標的遺伝子（複数可）の挿入の評価および必要に応じた選択マーカーの除去後、遺伝子改変された株を、生体分子または目的の生成物を産生するその能力について評価できる。評価の前に、必要に応じたステップは、株を増殖することであり得る。増殖は、増殖に適した成長培地中、プレート上またはマルチウェルプレート中のウェル中で遺伝子改変された株を培養することを必要とし得る。評価ステップは、生体分子または目的の生成物の産生のための成長培地／実際の状態を模倣するように設計された条件を含むプレート上またはマルチウェルプレート中のウェル中で、遺伝子改変された株を培養することを必要とし得る。いくつかの場合には、このステップにおける成長培地は、グルコースの代謝的プロセシングに由来する生体分子または目的の生成物の産生に適している。遺伝子改変された株が、評価ステップから決定されるように、生体分子または目的の生成物の製造または収率の所望の速度または閾値速度を有する、またはもたらすと予測される場合には、株を選択し、冷貯蔵に置くことができる。予測は、株の培養の間の種々の時点で形成された目的の生成物およびバイオマスの量を測定することおよび前記測定を使用して、前記株が、拡大されたまたはより大きな規模条件（例えば、発酵条件）下でどのように実施するかを予測することに基づき得る。一実施形態において、予測は、評価法の間の株の実施の線形回帰分析に基づく。
【０１５３】
いくつかの場合には、生体分子または目的の生成物の製造または収率の所望の速度または閾値速度を有する、またはもたらすと予測される遺伝子改変された株を、生体分子または目的の生成物を産生する条件（例えば、発酵条件）下で、より大きな培養に移す、またはそこで成長させる。このステップを使用して、生体分子または目的の生成物の製造のための実際の条件下で、選択された株が予測されたように実施できるか否かを決定することができる。いくつかの場合には、本明細書において提供されるものなどの標的遺伝子のライブラリーに由来する各標的遺伝子の導入および評価のための本明細書において提供されるステップを、ライブラリーに由来する各標的遺伝子について反復して、生体分子または目的の生成物の所望の収率もしくは閾値収率および／または生産性速度をもたらす遺伝子改変された微生物の１種または複数の株を選択する。
【０１５４】
一部の実施形態では、生体分子または目的の生成物は、グルコースおよび微生物によるその代謝的プロセシングに由来し、その結果、本明細書において提供される方法は、１つまたは複数の株によるグルコースの代謝的プロセシングに由来する生体分子または目的の生成物の増大した量を産生する微生物の１つまたは複数の株を作製することを必要とする。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、リシン生合成に関与する１種または複数の標的遺伝子の導入を必要とする。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、宿主細胞におけるＮＡＤＰＨ産生に関与する１種または複数の標的遺伝子の導入を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、宿主細胞によるＮＡＤＰＨ利用の低減に関与する１種または複数の標的遺伝子の導入を必要とする。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ｇａｐＡ遺伝子であり、その結果、本明細書において提供される方法においてｇａｐＡ遺伝子が宿主微生物に導入される。ｇａｐＡ遺伝子は、宿主微生物において異種遺伝子であり得る。
【０１５５】
他の実施形態では、標的遺伝子は、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子であり、その結果、本明細書において提供される方法においてニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子が、宿主微生物に導入される。
【０１５６】
多数の生物において、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル中間体は、ピルベートから直接再生され得る。例えば、いくつかの細菌において見られ、Ｅ．ｃｏｌｉでは見られないピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）は、カルボキシビオチンを利用するピルベートのカルボキシル化によるオキサロアセテートの形成を媒介する。
【０１５７】
他の実施形態では、標的遺伝子は、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子であり、その結果、本明細書において提供される方法においてピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）遺伝子が、宿主微生物に導入される。ｐｙｃ遺伝子は、宿主微生物にとって異種であり得る。ある特定の実施形態では、ｐｙｃ遺伝子は、米国特許第６，１７１，８３３号および同第６，１７１，８３３号に開示される配列から選択される。一実施形態において、ｐｙｃ遺伝子は、Ｒ．ｅｔｌｉに由来する。一実施形態において、ｐｙｃ遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する。一実施形態において、標的生物はＥ．ｃｏｌｉである。一実施形態において、標的生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．である。一実施形態において、ｐｙｃの異種バリアントを、内因性ｐｙｃを欠く宿主細胞において発現させる。一実施形態において、ｐｙｃの異種バリアントを、内因性ｐｙｃを有する宿主細胞において発現させる。一実施形態において、ｐｙｃに作動可能に連結された強力なプロモーターを含むように、ｐｙｃを含む遺伝子座を遺伝子改変することによって内因性ｐｙｃの発現を増大させる。一部の実施形態では、プロモーターラダーからプロモーターを選択することによってｐｙｃの発現をモジュレートする。一実施形態において、天然ｐｙｃ遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターエレメントを挿入することによって天然ＰＹＣの発現を増大する。一実施形態において、各々天然ｐｙｃ遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターラダーからのいくつかのプロモーターエレメントを挿入することによって天然ＰＹＣの発現を調整する。一実施形態において、異種ｐｙｃ遺伝子の過剰発現によってＰＹＣの発現を増大する。一実施形態において、異種ｐｙｃ遺伝子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｙｃ遺伝子である。一実施形態において、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｙｃを、強力なプロモーターに作動可能に連結する。一実施形態において、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｙｃを、プロモーターラダーからのいくつかのプロモーターエレメントの各々に作動可能に連結し、最大量の目的生成物、例えば、スレオニンをもたらすプロモーターエレメントの選択によってＰＹＣの発現を調整する。
【０１５８】
さらに他の実施形態では、標的遺伝子は、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子のうち１種または複数であり、その結果、本明細書において提供される方法においてｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子が、宿主微生物に導入される。ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子のうち１種または複数は、宿主微生物にとって異種遺伝子であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において４種の遺伝子すべてｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈが、宿主微生物に導入される。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ｇａｐＡ遺伝子およびニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の両方が、本明細書において提供される方法において宿主微生物に導入される。
【０１６０】
他の実施形態では、ｇａｐＡ遺伝子ならびにｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種または複数の遺伝子が、本明細書において提供される方法において宿主微生物に導入される。さらに他の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびにｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種または複数の遺伝子が、本明細書において提供される方法において宿主微生物に導入される。
【０１６１】
さらに他の実施形態では、ｇａｐＡ、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子およびｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種または複数の遺伝子が、本明細書において提供される方法において宿主微生物に同時に導入される。
【０１６２】
一実施形態において、宿主微生物へのｇａｐＡ遺伝子ならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種または複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子の導入は、宿主微生物においてＮＡＤＰＨの量を増大する。ある特定の態様では、ＮＡＤＰＨの産生は、宿主微生物において増大される。他の態様では、ＮＡＤＰＨの利用は、宿主微生物において低減される。ある特定の実施形態では、宿主微生物におけるＮＡＤＰＨの量の増大は、生体分子または目的の生成物の合成を増大するように働く。本明細書において提供される方法によって産生される生体分子または目的の生成物は、グルコースから産生される任意の市販の生成物であり得る。いくつかの場合には、生体分子または目的の生成物は、小分子、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。特定の実施形態では、生体分子または目的の生成物は、アミノ酸である。特定の態様では、アミノ酸はリシンである。ある特定の態様では、リシンはＬ−リシンである。特定の態様では、アミノ酸はスレオニンである。ある特定の態様では、スレオニンはＬ−スレオニンである。
【０１６３】
一実施形態において、宿主株は、ｔｈｒＬＡＢＣレギュロン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｗ３１１０のｔｈｒＬＡＢＣレギュロン（配列番号７６））の挿入によって改変されている細菌株である。一実施形態において、宿主株は、ｔｈｒＡＢＣレギュロン（例えば、ｔｈｒＬリーダー配列の欠失によって改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｗ３１１０のｔｈｒＬＡＢＣレギュロン（配列番号７７））の挿入によって改変されている細菌株である。一実施形態において、宿主株は、Ｌ−スレオニン３−デヒドロゲナーゼ（ｔｄｈ）またはその相同体をコードする細菌ゲノムの領域の欠失によって改変されている細菌株である。
【０１６４】
ＮＡＤＰＨを増大するためのライブラリーを利用する微生物遺伝子工学
一実施形態において、開示された微生物ゲノム工学は、ｇａｐＡ遺伝子ならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子のライブラリーを利用する。ｇａｐＡ遺伝子は、補因子としてＮＡＤを使用するその能力に基づいて選択できる。ある特定の実施形態では、ｇａｐＡの補酵素特異性が広げられる。したがって、一部の態様では、ｇａｐＡは、ＮＡＤおよびＮＡＤＨに対して二重特異性を有する。一部の態様では、ｇａｐＡは、ＮＡＤよりもＮＡＤＨをより優先的に使用する。他の態様では、ｇａｐＡは、ＮＡＤおよびＮＡＤＨに対して同等の選好性を有する。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するその能力に基づいて選択できる。ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈを、補因子としてＮＡＤＰＨを使用するその能力に基づいて選択できる。ある特定の実施形態では、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈの補酵素特異性が広げられる。したがって、一部の態様では、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈは、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰに対して二重特異性を有する。一部の態様では、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈは、ＮＡＤＰよりもＮＡＤＰＨをより優先的に使用する。他の態様では、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈは、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰに対して同等の選好性を有する。ＴＡ遺伝子は、スレオニンをよりゆっくりと代謝する、またはスレオニンを生成する能力に基づいて選択できる。ある特定の実施形態では、ＴＡの基質特異性が広げられる。したがって、一部の態様では、ＴＡは、グリシンおよびセリンに対して二重特異性を有する。一部の態様では、ＴＡは、グリシン（glcyine）よりもセリンをより優先的に使用する。他の態様では、ＴＡは、セリンおよびグリシンに対して同等の選好性を有する。ｐｙｃは、ピルベートをオキサロアセテート（oxaloacete）に変換するその能力に基づいて選択できる。
【０１６５】
いくつかの場合には、微生物は、ｇａｐＡライブラリー、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼライブラリー、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／もしくはｄｄｈならびに／またはＴＡライブラリーならびに／またはｐｙｃライブラリーまたはこれらのライブラリーの任意の組合せを利用して遺伝子操作される。一部の実施形態では、ライブラリーは、複数のキメラ構築物挿入を含有し、その結果、ライブラリー中の各挿入が、ｇａｐＡ遺伝子、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびにｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種または複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子を含む。遺伝子操作後、微生物を、得られた成果、例えば、本明細書において提供されるようなグルコースからの生成物の産生について効率的にスクリーニングまたは評価できる。特定のゲノム変更を規定するために本明細書において提供されるライブラリーを利用することおよび次いで、変更を有する宿主微生物ゲノムを試験／スクリーニングすることというこのプロセスは、効率的な、反復性の方法で実行でき、宿主細胞におけるその発現が、グルコースからの所望のレベルまたは閾値レベルの生体分子または目的の生成物をもたらす、ｇａｐＡならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子の特定の組合せを同定するために使用できる。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において使用するための、本明細書において提供されるような、ｇａｐＡ遺伝子またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子は各々、天然プロモーターまたは本明細書において提供されるプロモーターポリヌクレオチドのいずれかの制御下にある、またはそれに機能的に連結されている。「プロモーターポリヌクレオチド」または「プロモーター」または「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、転写されるべきポリヌクレオチドに機能的に連結された場合に、コーディングポリヌクレオチド（例えば、ｇａｐＡ遺伝子またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子）の転写開始点および転写開始頻度を決定し、それによって、制御されたポリヌクレオチドの発現の強度が影響を受けることを可能にする、ポリヌクレオチド、好ましくは、デオキシリボポリヌクレオチドまたは核酸、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味し得る。一部の実施形態では、ｇａｐＡ遺伝子ならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｇａｐＡ遺伝子を含むライブラリー中のｐｙｃ遺伝子ならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子は各々、同様または同一プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、ｇａｐＡ遺伝子ならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはグルコースｇａｐＡ遺伝子を含むライブラリー中のｐｙｃ遺伝子ならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子は各々、別個のまたは異なるプロモーターの制御下にある。さらに他の実施形態では、標的遺伝子を含むキメラ構築物ライブラリー中のキメラ構築物中の各標的遺伝子は、同様または同一プロモーターの制御下にある。さらなる実施形態では、標的遺伝子を含むキメラ構築物ライブラリー中のキメラ構築物中の各標的遺伝子は、別個のまたは異なるプロモーターの制御下にある。
【０１６７】
プロモーターラダー
一部の実施形態では、本開示は、宿主微生物において１種または複数の酵素の発現をモジュレートし、全体的な宿主株生産性に対して有益な効果をもたらす最適発現特性を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【０１６８】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、種々の方法で転写に影響を及ぼすことができる。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部細胞条件に関わらず、一定速度でその関連遺伝子の転写を指示するのに対し、調節可能プロモーターは、内部および／または外部細胞条件、例えば、成長速度、温度、特定の環境化学物質に対する応答などに応じて、遺伝子が転写される速度を増大または減少する。プロモーターは、その正常な細胞関係から単離することができ、実質的に任意の遺伝子の発現を調節するように遺伝子操作し、細胞成長、生成物収率および／またはその他の目的の表現型の効率的な改変を可能にすることができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、本開示は、下流遺伝子設計法において使用するためのプロモーターラダーライブラリーを製造する方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、１種または複数のプロモーターを同定する方法および／または宿主細胞でさまざまな発現強度または優れた調節特性を示す１種または複数のプロモーターのバリアントを作製する方法を教示する。これらの同定されたおよび／または作製されたプロモーターの特定の組合せを、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができ、これを以下により詳細に説明する。
【０１７０】
一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダーの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続した範囲の発現プロファイルを示すプロモーターを含む。例えば、一部の実施形態では、刺激に応じて、または構成的発現によってさまざまな発現強度を示す自然の、天然または野生型プロモーターを同定することによってプロモーターラダーを作出する。これらの同定されたプロモーターをプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１７１】
他の実施形態では、本開示は、種々の条件にわたってさまざまな発現プロファイルを示すプロモーターラダーの作出を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、発酵の種々の段階に広がる発現ピークを有するプロモーターのラダーを作出することを教示する。他の実施形態では、本開示は、特定の刺激に応じて異なる発現ピーク動態を有するプロモーターのラダーを作出することを教示する。当業者ならば、本開示の調節プロモーターラダーは、任意の１種または複数の調節プロファイルの代表であり得るということを認識するであろう。
【０１７２】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続する範囲の応答にわたって予測可能な方法で遺伝子発現を撹乱するように設計される。一部の実施形態では、連続する性質のプロモーターラダーは、株改善プログラムにさらなる予測力を付与する。例えば、一部の実施形態では、選択された代謝経路のプロモーターまたは終結配列を交換することは、宿主細胞性能曲線をもたらし、これによって、最適な発現割合またはプロファイルが同定され、不適当な状況下での不必要な過剰発現または異所性発現も避けながら、ターゲッティングされた遺伝子がもはや、特定の反応または遺伝子カスケードの制限因子ではない株を製造することができる。一部の実施形態では、所望のプロファイルを示す自然の、天然または野生型プロモーターを同定することによってプロモーターラダーを作出する。他の実施形態では、天然に存在するプロモーターを突然変異させて、複数の突然変異プロモーター配列を導くことによってプロモーターラダーを作出する。これらの突然変異プロモーターの各々を、標的遺伝子発現に対する効果について試験する。一部の実施形態では、編集されたプロモーターを、さまざまな条件にわたる発現活性について試験し、その結果、各プロモーターバリアントの活性が文書化され／特性決定され／注釈づけされ、データベースに保存される。得られた編集されたプロモーターバリアントを続いて、その発現の強度に基づいて配置されたプロモーターラダーに組織する（例えば、高度に発現するバリアントを頂部付近に、減弱された発現を底の付近に、したがって、用語「ラダー」につながる）。
【０１７３】
一部の実施形態では、本開示は、同定された天然に存在するプロモーターおよび突然変異バリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【０１７４】
一部の実施形態では、本開示は、以下の基準の両方を満たした自然の、天然または野生型プロモーターを同定する方法を教示する：１）構成プロモーターのラダーを表した、２）短いＤＮＡ配列、理想的には、１００塩基対未満によってコードされ得る。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（通常、工業的培養の際に経験される条件の間で比較される）にわたって一定の遺伝子発現を示す。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび２６から４０塩基対の間の長さの５’ＵＴＲからなるであろう。
【０１７５】
一部の実施形態では、前記の同定された天然に存在するプロモーター配列のうち１種または複数を、遺伝子編集のために選択する。一部の実施形態では、自然のプロモーターを、前記の突然変異法のいずれかによって編集する。他の実施形態では、所望の配列を有する新規プロモーターバリアントを合成することによって本開示のプロモーターを編集する。
【０１７６】
以下の出願の全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許出願第１５／３９６，２３０号（米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１５９０４５Ａ１号）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５（ＷＯ２０１７／１００３７７Ａ１）、米国特許出願第１５／１４０，２９６号（米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０３１６３５３Ａ１号）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２９７２５（ＷＯ２０１７／１８９７８４Ａ１）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６４（ＷＯ２０１７／１００３７６Ａ２）、米国特許仮出願第６２／４３１，４０９号、米国特許仮出願第６２／２６４，２３２号および米国特許仮出願第６２／３６８，７８６号。
【０１７７】
本開示のプロモーターの包括的でない一覧を以下の表１に提供する。プロモーター配列の各々は、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ばれることもある。
【表１】
2020520645.tif 000003
【０１７８】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、上記の表に由来するプロモーターと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を示す。
【０１７９】
いくつかの場合には、プロモーターラダーは、ｇａｐＡライブラリー、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼライブラリー、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／もしくはｄｄｈならびに／またはＴＡライブラリーならびに／またはｐｙｃライブラリーまたはこれらのライブラリーの任意の組合せから選択される遺伝子の前に利用できる。一部の実施形態では、プロモーターラダーの使用は、ｇａｐＡライブラリー、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼライブラリー、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／もしくはｄｄｈならびに／またはＴＡライブラリーならびに／またはｐｙｃライブラリーまたはこれらのライブラリーの任意の組合せから選択される遺伝子の発現をモジュレートすることを含む。一部の実施形態では、プロモーターラダーの使用は、ｇａｐＡライブラリー、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼライブラリー、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／もしくはｄｄｈならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子またはこれらのライブラリーの任意の組合せから選択される遺伝子の発現を微調整することを含む。遺伝子操作後、微生物を、得られた成果、例えば、本明細書において提供されるようなグルコースからの生成物の産生について効率的にスクリーニングまたは評価できる。遺伝子が特定の発現レベルを達成する宿主を作製するために本明細書において提供されるプロモーターラダーを利用し、次いで、変更を有する宿主微生物ゲノムを試験／スクリーニングするこのプロセスは、効率的に反復して実行することができ、ｇａｐＡならびに／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子ならびに／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈから選択される１種もしくは複数の遺伝子ならびに／またはＴＡ遺伝子ならびに／またはｐｙｃ遺伝子に最適な特定の遺伝子発現レベルであって、宿主細胞におけるその遺伝子発現レベルでの発現がグルコースからの所望のまたは閾値レベルの生体分子または目的の生成物をもたらす、遺伝子発現レベルを同定するために使用することができる。
【０１８０】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼライブラリー
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において使用するためのｇａｐＡ遺伝子のライブラリーが本明細書において提供される。ｇａｐＡ遺伝子のライブラリーは、１種または複数のｇａｐＡ遺伝子を含み得る。ライブラリー中の各ｇａｐＡ遺伝子は、ｇａｐＡ遺伝子の天然形態または突然変異形態であり得る。突然変異形態は、挿入、欠失、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１つまたは複数の突然変異を含み得る。ライブラリー中の各ｇａｐＡ遺伝子は、ｇａｐＡ遺伝子であり得る。ｇａｐＡ遺伝子は、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）に由来する任意のｇａｐＡ遺伝子であり得る。ｇａｐＡ遺伝子は、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）に由来する任意のｇａｐＡ遺伝子であり得る。ｇａｐＡは、ＮＡＤ−および／またはＮＡＤＨ−依存性ＧＡＰＤＨ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのｇａｐＡは、グリセルアルデヒド−３−リン酸をグリセリン酸−１，３−ビスホスフェートに変換する任意の酵素であり得る。宿主細胞は、本明細書において提供される任意の宿主細胞であり得る。一部の実施形態では、ｇａｐＡ遺伝子のライブラリーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任意の株／種／亜種に由来するｇａｐＡ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本開示のｇａｐＡ酵素は、本明細書において提供されるｇａｐＡ酵素と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を示す。
【０１８２】
ライブラリー中の各ｇａｐＡ遺伝子は、その天然プロモーターもしくはその天然プロモーターの突然変異形態に機能的に連結できる、またはその制御下にあり得る。ライブラリー中の各ｇａｐＡ遺伝子は、本明細書において提供される任意のプロモーターに機能的に連結できる、またはそれによって制御され得る。ｇａｐＡ遺伝子のライブラリー中の各ｇａｐＡ遺伝子は、遺伝子が、１つまたは複数の調節配列および／または宿主細胞のゲノム中に存在する配列に相同な配列によって隣接され得るようなキメラ構築物中に存在することもある。宿主細胞中に存在する配列に相同な配列は、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのｇａｐＡ遺伝子の組込みを容易にできる。組込みは、組換え事象によってであり得る。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書において提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝子機構によって使用されるプロモーター、開始、停止、シグナル、分泌および／または終結配列などであり得る。
【０１８３】
ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼライブラリー
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において使用するためのニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーが本明細書において提供される。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーは、１種または複数のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含み得る。ライブラリー中の各ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子の天然形態または突然変異形態であり得る。突然変異形態は、挿入、欠失、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１つまたは複数の突然変異を含み得る。ライブラリー中の各ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子であり得る。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）に由来する任意のトランスヒドロゲナーゼ遺伝子であり得る。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）に由来する任意のトランスヒドロゲナーゼ遺伝子であり得る。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換する任意の酵素であり得る。宿主細胞は、本明細書において提供される任意の宿主細胞であり得る。一部の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任意の株／種／亜種に由来するトランスヒドロゲナーゼ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本開示のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ酵素は、本明細書において提供されるトランスヒドロゲナーゼ酵素と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を示す。
【０１８５】
ライブラリー中の各ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、その天然プロモーターもしくはその天然プロモーターの突然変異形態に機能的に連結できる、またはその制御下にあり得る。ライブラリー中の各ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、本明細書において提供される任意のプロモーターに機能的に連結できる、またはそれによって制御され得る。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリー中の各ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、遺伝子が、１つまたは複数の調節配列および／または宿主細胞のゲノム中に存在する配列に相同な配列によって隣接され得るようなキメラ構築物中に存在することもある。宿主細胞中に存在する配列に相同な配列は、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の組込みを容易にできる。組込みは、組換え事象によってであり得る。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書において提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝子機構によって使用されるプロモーター、開始、停止、シグナル、分泌および／または終結配列などであり得る。
【０１８６】
ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈライブラリー
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において使用するためのｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ遺伝子のライブラリーが本明細書において提供される。ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ遺伝子のライブラリーは、１種または複数のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ遺伝子を含み得る。ライブラリー中の各ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、それぞれ、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子の天然形態または突然変異形態であり得る。突然変異形態は、挿入、欠失、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１つまたは複数の突然変異を含み得る。ライブラリー中の各ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、それぞれ、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子であり得る。ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、それぞれ、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）に由来する任意のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子であり得る。ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、それぞれ、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）に由来する任意のａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子であり得る。ｇｄｈは、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのｇｄｈは、オキサロアセテートをアスパルテートに変換する任意の酵素であり得る。ａｓｄは、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのａｓｄは、アスパルチルリン酸をアスパラギン酸セミアルデヒドに変換する任意の酵素であり得る。ｄａｐＢは、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性ジヒドロピコリン酸レダクターゼ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのｄａｐＢは、ジヒドロピコリネートをテトラヒドロピコリネートに変換する任意の酵素であり得る。ｄｄｈは、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのｄｄｈは、テトラヒドロピコリネートをｍｅｓｏ−ジアミノピメレートの直接変換を触媒する任意の酵素であり得る。
【０１８７】
宿主細胞は、本明細書において提供される任意の宿主細胞であり得る。一部の実施形態では、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子のライブラリーは、それぞれ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任意の株／種／亜種に由来するａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、本開示のａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ酵素は、それぞれ、本明細書において提供されるａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ酵素と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を示す。
【０１８９】
ライブラリー中の各ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、その天然プロモーターもしくはその天然プロモーターの突然変異形態に機能的に連結できる、またはその制御下にあり得る。ライブラリー中の各ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、本明細書において提供される任意のプロモーターに機能的に連結できる、またはそれによって制御され得る。ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子のライブラリー中の各ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子は、遺伝子が、１つまたは複数の調節配列および／または宿主細胞のゲノム中に存在する配列に相同な配列によって隣接され得るようなキメラ構築物中に存在することもある。宿主細胞中に存在する配列に相同な配列は、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子の組込みを容易にできる。組込みは、組換え事象によってであり得る。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書において提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝子機構によって使用されるプロモーター、開始、停止、シグナル、分泌および／または終結配列などであり得る。
【０１９０】
ＴＡライブラリー
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において使用するためのＴＡ遺伝子のライブラリーが本明細書において提供される。ＴＡ遺伝子のライブラリーは、１種または複数のＴＡ遺伝子を含み得る。ライブラリー中の各ＴＡ遺伝子は、それぞれ、ＴＡ遺伝子の天然形態または突然変異形態であり得る。突然変異形態は、挿入、欠失、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１つまたは複数の突然変異を含み得る。ライブラリー中の各ＴＡ遺伝子は、それぞれ、ＴＡ遺伝子であり得る。ＴＡ遺伝子は、それぞれ、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）に由来する任意のＴＡ遺伝子であり得る。ＴＡ遺伝子は、それぞれ、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）に由来する任意のＴＡ遺伝子であり得る。ＴＡは、スレオニンアルドラーゼ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのＴＡは、スレオニンをアセトアルデヒドおよびグリシンに変換する任意の酵素であり得る。一実施形態において、ＴＡ遺伝子は、内因性ＴＡよりもゆっくりした速度でスレオニンをアセトアルデヒドおよびグリシンに変換する。一実施形態において、ＴＡ遺伝子は、アセトアルデヒドおよびグリシンをスレオニンに変換する。
【０１９１】
宿主細胞は、本明細書において提供される任意の宿主細胞であり得る。一部の実施形態では、ＴＡ遺伝子のライブラリーは、それぞれ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任意の株／種／亜種に由来するＴＡ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、本開示のＴＡ酵素は、それぞれ、本明細書において提供されるＴＡ酵素と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を示す。
【０１９３】
ライブラリー中の各ＴＡ遺伝子は、その天然プロモーターもしくはその天然プロモーターの突然変異形態に機能的に連結できる、またはその制御下にあり得る。ライブラリー中の各ＴＡ遺伝子は、本明細書において提供される任意のプロモーターに機能的に連結できる、またはそれによって制御され得る。ＴＡ遺伝子のライブラリー中の各ＴＡ遺伝子は、遺伝子が、１つまたは複数の調節配列および／または宿主細胞のゲノム中に存在する配列に相同な配列によって隣接され得るようなキメラ構築物中に存在することもある。宿主細胞中に存在する配列に相同な配列は、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのＴＡ遺伝子の組込みを容易にできる。組込みは、組換え事象によってであり得る。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書において提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝子機構によって使用されるプロモーター、開始、停止、シグナル、分泌および／または終結配列などであり得る。
【０１９４】
ｐｙｃライブラリー
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法において使用するためのｐｙｃ遺伝子のライブラリーが本明細書において提供される。ｐｙｃ遺伝子のライブラリーは、１種または複数のｐｙｃ遺伝子を含み得る。ライブラリー中の各ｐｙｃ遺伝子は、それぞれ、ｐｙｃ遺伝子の天然形態または突然変異形態であり得る。突然変異形態は、挿入、欠失、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１つまたは複数の突然変異を含み得る。ライブラリー中の各ｐｙｃ遺伝子は、それぞれ、ｐｙｃ遺伝子であり得る。ｐｙｃ遺伝子は、それぞれ、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）に由来する任意のｐｙｃ遺伝子であり得る。ｐｙｃ遺伝子は、それぞれ、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）に由来する任意のｐｙｃ遺伝子であり得る。ｐｙｃは、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を含む任意のタンパク質と考えることができる。例えば、本明細書において使用するためのｐｙｃは、ピルベートをオキサロアセテートに変換する任意の酵素であり得る。
【０１９５】
宿主細胞は、本明細書において提供される任意の宿主細胞であり得る。一部の実施形態では、ｐｙｃ遺伝子のライブラリーは、それぞれ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任意の株／種／亜種に由来するｐｙｃ遺伝子またはそれらの組合せを含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、本開示のｐｙｃ酵素は、それぞれ、本明細書において提供されるｐｙｃ酵素と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を示す。
【０１９７】
ライブラリー中の各ｐｙｃ遺伝子は、その天然プロモーターもしくはその天然プロモーターの突然変異形態に機能的に連結できる、またはその制御下にあり得る。ライブラリー中の各ｐｙｃ遺伝子は、本明細書において提供される任意のプロモーターに機能的に連結できる、またはその制御下にあり得る。ｐｙｃ遺伝子のライブラリー中の各ｐｙｃ遺伝子は、遺伝子が、１つまたは複数の調節配列および／または宿主細胞のゲノム中に存在する配列に相同な配列によって隣接され得るようなキメラ構築物中に存在することもある。宿主細胞中に存在する配列に相同な配列は、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのｐｙｃ遺伝子の組込みを容易にできる。組込みは、組換え事象によってであり得る。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書において提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝子機構によって使用されるプロモーター、開始、停止、シグナル、分泌および／または終結配列などであり得る。
【０１９８】
ｇａｐＡ遺伝子の突然変異形態の作製
本明細書において提供されるように、本明細書において提供される方法において使用するためのｇａｐＡ遺伝子は、由来する遺伝子の突然変異形態であり得る。突然変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書において提供される任意の方法で突然変異され得る。
【０１９９】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入、欠失または置換することによって細胞集団を突然変異することを教示する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、突然変異を特定の遺伝子座（例えば、ｇａｐＡ）にターゲッティングする方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術の使用を教示する。細胞集団の突然変異後、細胞からターゲッティングされた突然変異を単離し、その後、ｇａｐＡ遺伝子のライブラリーを作製するために使用することができる。
【０２００】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外側の選択されたＤＮＡ領域（例えば、ｇａｐＡ遺伝子）を突然変異することを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然ｇａｐＡ遺伝子を突然変異することを教示する。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然のバリアントの遺伝子シャッフリングまたは合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換えまたはウイルス−ウイルス組換えによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する。他の実施形態では、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発によってゲノム領域を製造する。
【０２０２】
一部の実施形態では、ｇａｐＡ遺伝子を含有する選択された遺伝子領域において突然変異を作製することは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成する。手短には、オリゴヌクレオチドの配列が２つのセグメントの接合部を重複するように、目的の核酸配列（例えば、ｇａｐＡ遺伝子）のセグメントのＰＣＲ増幅のためにオリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ）を合成する。重複領域は、通常、約１０〜１００ヌクレオチド長である。各セグメントをこのようなプライマーのセットを用いて増幅する。次いで、ＰＣＲ産物を、アセンブリープロトコールに従って「リアセンブル」する。手短には、アセンブリープロトコールでは、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＰＣＲ産物をプライマーから離してまず精製する。精製生成物を一緒に混合し、さらなるプライマーの不在下（「自己プライミング」）でのポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）および適当なバッファー塩の存在下での約１〜１０サイクルの変性、再アニーリングおよび伸長に付す。遺伝子に隣接するプライマーを用いるその後のＰＣＲを使用して、完全にリアセンブルされた、シャッフルされた遺伝子の収率を増幅する。
【０２０３】
本開示の一部の実施形態では、複数の突然変異体範囲、すなわち、突然変異のあり得る組合せがより効率的にサンプリングされるように、上記で論じられたものなどの突然変異されたｇａｐＡ  ＤＮＡ領域を、突然変異体配列について濃縮する。一部の実施形態では、突然変異配列を、アセンブリー反応に先立つ親和性精製材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する好ましいステップを有するｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスによって同定する（Wagnerら、Nucleic  Acids  Res.  ２３巻（１９号）：３９４４〜３９４８頁（１９９５年）；Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  (U.S.A.)、８３巻：５０５７〜５０６１頁（１９８６年））。次いで、この増幅された材料をアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応に入れる。
【０２０４】
一部の実施形態では、突然変異ｇａｐＡ  ＤＮＡ領域は、天然に見られる。
【０２０５】
ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の突然変異形態の作製
本明細書において提供されるように、本明細書において提供される方法において使用するためのニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、由来する遺伝子の突然変異形態であり得る。突然変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書において提供される任意の方法で突然変異され得る。
【０２０６】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入、欠失または置換することによって細胞集団を突然変異することを教示する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、突然変異を特定の遺伝子座（例えば、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ）にターゲッティングする方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術の使用を教示する。細胞集団の突然変異後、細胞からターゲッティングされた突然変異を単離し、その後、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーを作製するために使用することができる。
【０２０７】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外側の選択されたＤＮＡ領域（例えば、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子）を突然変異することを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を突然変異することを教示する。
【０２０８】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然のバリアントの遺伝子シャッフリングまたは合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換えまたはウイルス−ウイルス組換えによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する。他の実施形態では、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発によってゲノム領域を製造する。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する選択された遺伝子領域において突然変異を作製することは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成する。
【０２１０】
一部の実施形態では、複数の突然変異体範囲、すなわち、突然変異のあり得る組合せがより効率的にサンプリングされるように、上記で論じられたものなどの突然変異されたニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＤＮＡ領域を、突然変異体配列について濃縮する。一部の実施形態では、突然変異配列を、アセンブリー反応に先立つ親和性精製材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する好ましいステップを有するｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスによって同定する。次いで、この増幅された材料をアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応に入れる。
【０２１１】
一部の実施形態では、突然変異ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＤＮＡ領域は、天然に見られる。
【０２１２】
ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子の突然変異形態の作製
本明細書において提供されるように、本明細書において提供される方法において使用するためのｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子は、由来する遺伝子の突然変異形態であり得る。突然変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書において提供される任意の方法で突然変異され得る。
【０２１３】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入、欠失または置換することによって細胞集団を突然変異することを教示する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、突然変異を特定の遺伝子座（例えば、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ）にターゲッティングする方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術の使用を教示する。細胞集団の突然変異後、細胞からターゲッティングされた突然変異を単離し、その後、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーを作製するために使用することができる。
【０２１４】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外側の選択されたＤＮＡ領域（例えば、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子）を突然変異することを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈ遺伝子を突然変異することを教示する。
【０２１５】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然のバリアントの遺伝子シャッフリングまたは合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換えまたはウイルス−ウイルス組換えによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する。他の実施形態では、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発によってゲノム領域を製造する。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する選択された遺伝子領域において突然変異を作製することは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成する。
【０２１７】
一部の実施形態では、複数の突然変異体範囲、すなわち、突然変異のあり得る組合せがより効率的にサンプリングされるように、上記で論じられたものなどの突然変異されたｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ  ＤＮＡ領域を、突然変異体配列について濃縮する。一部の実施形態では、突然変異配列を、アセンブリー反応に先立つ親和性精製材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する好ましいステップを有するｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスによって同定する。次いで、この増幅された材料をアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応に入れる。
【０２１８】
一部の実施形態では、突然変異されたまたはバリアントｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ  ＤＮＡ領域は、天然に見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｄｄｈの天然に存在するバリアントは、それに限定されないが、Ａ．ｏｒｉｓ、Ｈ．ａｒｃｈａｅｏｎ、ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍ．ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ、Ｂ．ｆａｅｃｉｕｍおよびｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む細菌において見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ａｓｄの天然に存在するバリアントは、それに限定されないが、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｓ．ｕｓｉｔａｔｕｓ、Ｎ．ｉｎｎｅｒｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｌ．ａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｂ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍ．ｈａｎｓｕｐｕｓおよびＰ．ｓａｂｉｎａｅを含む細菌において見られる。一部の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇｄｈの天然に存在するバリアントは、それに限定されないが、Ｃ．ｓｙｍｂｉｏｓｕｍを含む細菌において見られる。一部の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｄａｐＢの天然に存在するバリアントは、それに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉを含む細菌において見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈの天然に存在するバリアントは、生物（例えば、細菌）においてゲノムワイド相同性検索を実施することによって見られる。
【０２１９】
ＴＡ遺伝子の突然変異形態の作製
本明細書において提供されるように、本明細書において提供される方法において使用するためのＴＡ遺伝子は、由来する遺伝子の突然変異形態であり得る。突然変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書において提供される任意の方法で突然変異され得る。
【０２２０】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入、欠失または置換することによって細胞集団を突然変異することを教示する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、突然変異を特定の遺伝子座（例えば、ＴＡ）にターゲッティングする方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術の使用を教示する。細胞集団の突然変異後、細胞からターゲッティングされた突然変異を単離し、その後、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーを作製するために使用することができる。
【０２２１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外側の選択されたＤＮＡ領域（例えば、ＴＡ遺伝子）を突然変異することを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然ＴＡ遺伝子を突然変異することを教示する。
【０２２２】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然のバリアントの遺伝子シャッフリングまたは合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換えまたはウイルス−ウイルス組換えによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する。他の実施形態では、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発によってゲノム領域を製造する。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する選択された遺伝子領域において突然変異を作製することは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成する。
【０２２４】
一部の実施形態では、複数の突然変異体範囲、すなわち、突然変異のあり得る組合せがより効率的にサンプリングされるように、上記で論じられたものなどの突然変異されたＴＡ  ＤＮＡ領域を、突然変異体配列について濃縮する。一部の実施形態では、突然変異配列を、アセンブリー反応に先立つ親和性精製材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する好ましいステップを有するｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスによって同定する。次いで、この増幅された材料をアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応に入れる。
【０２２５】
一部の実施形態では、突然変異されたまたはバリアントＴＡ  ＤＮＡ領域は、天然に見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＴＡの天然に存在するバリアントは、それに限定されないが、Ａ．ｏｒｉｓ、Ｈ．ａｒｃｈａｅｏｎ、ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍ．ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ、Ｂ．ｆａｅｃｉｕｍおよびｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む細菌において見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＴＡの天然に存在するバリアントは、生物（例えば、細菌）においてゲノムワイド相同性検索を実施することによって見られる。
【０２２６】
ｐｙｃ遺伝子の突然変異形態の作製
本明細書において提供されるように、本明細書において提供される方法において使用するためのｐｙｃ遺伝子は、由来する遺伝子の突然変異形態であり得る。突然変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書において提供される任意の方法で突然変異され得る。
【０２２７】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入、欠失または置換することによって細胞集団を突然変異することを教示する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、突然変異を特定の遺伝子座（例えば、ｐｙｃ）にターゲッティングする方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術の使用を教示する。細胞集団の突然変異後、細胞からターゲッティングされた突然変異を単離し、その後、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子のライブラリーを作製するために使用することができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外側の選択されたＤＮＡ領域（例えば、ｐｙｃ遺伝子）を突然変異することを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然ｐｙｃ遺伝子を突然変異することを教示する。
【０２２９】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然のバリアントの遺伝子シャッフリングまたは合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換えまたはウイルス−ウイルス組換えによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する。他の実施形態では、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発によってゲノム領域を製造する。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する選択された遺伝子領域において突然変異を作製することは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成する。
【０２３１】
一部の実施形態では、複数の突然変異体範囲、すなわち、突然変異のあり得る組合せがより効率的にサンプリングされるように、上記で論じられたものなどの突然変異されたｐｙｃ  ＤＮＡ領域を、突然変異体配列について濃縮する。一部の実施形態では、突然変異配列を、アセンブリー反応に先立つ親和性精製材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する好ましいステップを有するｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスによって同定する。次いで、この増幅された材料をアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応に入れる。
【０２３２】
一部の実施形態では、突然変異されたまたはバリアントｐｙｃ  ＤＮＡ領域は、天然に見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｙｃの天然に存在するバリアントは、それに限定されないが、Ａ．ｏｒｉｓ、Ｈ．ａｒｃｈａｅｏｎ、ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍ．ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ、Ｂ．ｆａｅｃｉｕｍおよびｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む細菌において見られる。ある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｙｃの天然に存在するバリアントは、生物（例えば、細菌）においてゲノムワイド相同性検索を実施することによって見られる。
【０２３３】
ｇａｐＡ遺伝子を含むライブラリーの作製
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のｇａｐＡ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入および／または置換および／または欠失することを教示する。一部の態様では、本明細書において教示される方法は、目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、ｇａｐＡセグメント）を構築することを含み、これを宿主生物のゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本開示のｇａｐＡ  ＤＮＡセグメントは、既知鋳型からコピーすることもしくは切断すること、突然変異またはＤＮＡ合成を含む当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を製造するための市販の遺伝子合成製品（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．またはＱｉａｇｅｎ（商標））と適合する。
【０２３４】
一部の実施形態では、ｇａｐＡ  ＤＮＡセグメントを、グルコースｇａｐＡ  ＤＮＡセグメントを、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域に組み込む（例えば、有用なＧＡＰＤＨ活性を付加する）ように設計する。ある特定の実施形態では、選択されたＤＮＡ領域は、中立組込み部位である。他の実施形態では、ｇａｐＡ  ＤＮＡセグメントを、宿主生物のＤＮＡから天然ｇａｐＡ遺伝子を除去する（例えば、天然ＧＡＰＤＨ活性を除去する）ように設計する。
【０２３５】
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるｇａｐＡ遺伝子は、当技術分野で公知の酵素的または化学的合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成できる。オリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズまたはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜などの固相支持体上で合成してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、アレイで、マイクロフルイディクスを使用して（Tianら、Mol.  BioSyst.、５巻、７１４〜７２２頁（２００９年））平行マイクロスケールで、または両方の組合せを提供する既知技術（Jacobsenら、米国特許出願第２０１１／０１７２１２７号を参照のこと）を使用して合成してもよい。
【０２３６】
アレイでの、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より少ない試薬使用によって経費を削減することによって、従来の固相支持体合成を上回る利点を提供する。遺伝子合成に必要な規模は小さく、そのため、アレイから、またはマイクロフルイディクスによって合成されるオリゴヌクレオチド生成物の規模は容認できる。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固相支持体合成を使用する場合よりも低い品質のものである（Tian下記を参照のこと；Staehlerら、米国特許出願第２０１０／０２１６６４８号も参照のこと）。
【０２３７】
伝統的な４ステップホスホルアミダイト化学では、１９８０年代にそれが最初に記載されてから多数の進歩が達成されてきた（例えば、ペルオキシアニオン脱保護を使用するSierzchalaらJ.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替保護基についてのHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてのAzhayevら、Tetrahedron  ５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；ラージポアＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてのKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてのDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照のこと）。
【０２３８】
合成の種類に関わらず、次いで、結果として生じたオリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（すなわち、ｇａｐＡ遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト合成（ＴＢＩＯ）などの当技術分野で公知のプロトコールを使用して、より小さいオリゴヌクレオチドを一緒につなぐことができる（Czarら  Trends  in  Biotechnology、２７巻、６３〜７１頁（２００９年）を参照のこと）。ＰＣＡでは、所望のより長い生成物の全長にわたるオリゴヌクレオチドをアニーリングし、複数のサイクル（通常、約５５サイクル）において延長して完全長生成物を最終的に達成する。ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して、両方とも第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングされる２つのオリゴヌクレオチドをつなぐ。ＴＢＩＯ合成は、目的生成物の中心で始まり、遺伝子の５’末端でフォワード鎖に対して、および遺伝子の３’末端でリバース鎖に対して相同である重複するオリゴヌクレオチドを使用することによって両方向に漸進的に延長される。
【０２３９】
より長い二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によって、より小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。この方法では、複数のオリゴヌクレオチドが、目的生成物の全長に広がり、隣接オリゴヌクレオチド（複数可）に対して重複する領域を含有する。増幅は、ユニバーサルフォワードおよびリバースプライマーを用い、複数サイクルの増幅によって実施でき、完全長二本鎖ＤＮＡ生成物が形成される。次いで、この生成物は、必要に応じたエラー補正および所望の二本鎖ＤＮＡ断片最終生成物をもたらすさらなる増幅を経ることができる。
【０２４０】
ＴＳＰの一方法では、組み合わされて完全長目的生成物を形成するであろう、より小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基長の間であり、少なくとも約１５〜２０塩基だけ、互いに重複する。実際的目的上、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするのに十分な最小の長さであり、使用される反応温度でアニーリングするように十分に高い融点（Ｔｍ）を有さなくてはならない。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接オリゴヌクレオチドによって完全に重複される点に広げることができる。重複の量は、最終生成物の品質に対して何ら効果を有さないと思われる。アセンブリーにおける第１および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、フォワードおよびリバース増幅プライマーに対する結合部位を含有しなくてはならない。一実施形態では、第１および最後のオリゴヌクレオチドの末端配列は、ユニバーサルプライマーの使用を可能にする相補的な同一配列を含有する。
【０２４１】
ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むライブラリーの作製
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入および／または置換および／または欠失することを教示する。一部の態様では、本明細書において教示される方法は、目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼセグメント）を構築することを含み、これを宿主生物のゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本開示のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＤＮＡセグメントは、既知鋳型からコピーすることもしくは切断すること、突然変異またはＤＮＡ合成を含む当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を製造するための市販の遺伝子合成製品（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．またはＱｉａｇｅｎ（商標））と適合する。
【０２４２】
一部の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＤＮＡセグメントを、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＤＮＡセグメントを、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域に組み込む（例えば、有用なトランスヒドロゲナーゼ活性を付加する）ように設計する。ある特定の実施形態では、選択されたＤＮＡ領域は、中立組込み部位である。他の実施形態では、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＤＮＡセグメントを、宿主生物のＤＮＡから天然ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を除去する（例えば、天然トランスヒドロゲナーゼ活性を除去する）ように設計する。
【０２４３】
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の酵素的または化学的合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成できる。オリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズまたはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜などの固相支持体上で合成してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、アレイで、マイクロフルイディクスを使用して平行マイクロスケールで、または両方の組合せを提供する既知技術を使用して合成してもよい。
【０２４４】
アレイでの、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より少ない試薬使用によって経費を削減することによって、従来の固相支持体合成を上回る利点を提供する。遺伝子合成に必要な規模は小さく、そのため、アレイから、またはマイクロフルイディクスによって合成されるオリゴヌクレオチド生成物の規模は容認できる。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固相支持体合成を使用する場合よりも低い品質のものである。
【０２４５】
伝統的な４ステップホスホルアミダイト化学では、１９８０年代にそれが最初に記載されてから多数の進歩が達成されてきた（例えば、ペルオキシアニオン脱保護を使用するSierzchalaらJ.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替保護基についてのHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてのAzhayevら、Tetrahedron  ５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；ラージポアＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてのKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてのDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照のこと）。
【０２４６】
合成の種類に関わらず、次いで、結果として生じたオリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（すなわち、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト合成（ＴＢＩＯ）などの当技術分野で公知のプロトコールを使用して、より小さいオリゴヌクレオチドを一緒につなぐことができる。
【０２４７】
より長い二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によって、より小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。ＴＳＰの一方法では、組み合わされて完全長目的生成物を形成するであろう、より小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基長の間であり、少なくとも約１５〜２０塩基だけ、互いに重複する。実際的目的上、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするのに十分な最小の長さであり、使用される反応温度でアニーリングするように十分に高い融点（Ｔｍ）を有さなくてはならない。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接オリゴヌクレオチドによって完全に重複される点に広げることができる。重複の量は、最終生成物の品質に対して何ら効果を有さないと思われる。アセンブリーにおける第１および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、フォワードおよびリバース増幅プライマーに対する結合部位を含有しなくてはならない。一実施形態では、第１および最後のオリゴヌクレオチドの末端配列は、ユニバーサルプライマーの使用を可能にする相補的な同一配列を含有する。
【０２４８】
ピルビン酸カルボキシラーゼの調節
ピルビン酸カルボキシラーゼは、宿主細胞において、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸断片を含有する発現ベクターから発現させることができる。あるいは、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸断片は、宿主の染色体に組み込むことができる。核酸配列は、宿主細胞に関して異種であろうと、内因性であろうと、例えば、相同組換えを使用して細菌染色体に導入することができる。第１に、目的の遺伝子および薬物耐性マーカーをコードする遺伝子を、目的の遺伝子が挿入されるべき染色体の領域に対して相同であるＤＮＡの小片を含有するプラスミドに挿入する。次いで、この組換えＤＮＡを細菌に導入し、目的の遺伝子および薬物耐性マーカーを含有するＤＮＡ断片が、所望の位置で染色体に組み換えられているクローンを選択する。遺伝子および薬物耐性マーカーは、任意のクローニングベクターから調製されているＤＮＡの線形化小片として、または細菌宿主において複製できない特殊化された組換え自殺ベクターの一部として形質転換によって細菌に導入できる。線形化されたＤＮＡの場合には、所望の組換え体が得られる頻度を増大するためにｒｅｃＤ−宿主を使用できる。次いで、ＰＣＲおよび挿入の領域にわたってＤＮＡを増幅するプライマーを使用してクローンを検証する。非組換えクローンに由来するＰＣＲ産物は、より小さいサイズとなり、挿入事象が起こるべき染色体の領域のみを含有するが、組換えクローンに由来するＰＣＲ産物は、より大きいサイズとなり、染色体の領域ならびに挿入された遺伝子および薬物耐性を含有する。
【０２４９】
好ましい実施形態では、宿主細胞、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂ．ｆｌａｖｕｍまたはＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍを、遺伝子が、宿主細胞において転写および発現され、同等の野生型細胞と比較して、オキサロアセテートの増大された産生、結果として、目的の下流代謝産物の増大された産生を引き起こすように、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、好ましくは、Ｒ．ｅｔｌｉまたはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓから単離される遺伝子、より好ましくは、Ｒ．ｅｔｌｉ由来のｐｙｃ遺伝子を含む核酸断片を用いて形質転換する。
【０２５０】
本開示の代謝的に遺伝子操作された細胞は、ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現する。言い換えれば、代謝的に遺伝子操作された細胞は、同等の野生型細胞において発現されるピルビン酸カルボキシラーゼのレベルよりも高いレベルでピルビン酸カルボキシラーゼを発現する。この比較は、当業者によっていくつもの方法で行うことができ、同等の成長条件下で行う。例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、PayneおよびMorrisの方法（J.  Gen.  Microbiol.、５９巻、９７〜１０１頁（１９６９年））を使用して定量化し、比較できる。ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現する代謝的に遺伝子操作された細胞は、このアッセイにおいて野生型細胞よりも大きな活性をもたらす。さらに、またはあるいは、細胞からタンパク質抽出物を調製すること、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付すこと、それらをウエスタンブロットに移すこと、次いで、ウエスタンブロットでビオチン化タンパク質を可視化するために、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）から商業的に入手可能である検出キットを使用してビオチン化ピルビン酸カルボキシラーゼタンパク質を検出することによって、ピルビン酸カルボキシラーゼの量を定量化し、比較できる。いくつかの適した宿主細胞では、遺伝子操作されていない野生型細胞におけるピルビン酸カルボキシラーゼ発現は、検出可能レベルを下回る場合もある。
【０２５１】
ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子を含むライブラリーの作製
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入および／または置換および／または欠失することを教示する。一部の態様では、本明細書において教示される方法は、目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈセグメント）を構築することを含み、これを宿主生物のゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本開示のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ  ＤＮＡセグメントは、既知鋳型からコピーすることもしくは切断すること、突然変異またはＤＮＡ合成を含む当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を製造するための市販の遺伝子合成製品（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．またはＱｉａｇｅｎ（商標））と適合する。
【０２５２】
一部の実施形態では、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ  ＤＮＡセグメントを、１種または複数のグルコースｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ  ＤＮＡセグメントを、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域に組み込む（例えば、１種または複数の有用なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロピコリン酸レダクターゼおよび／またはｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を付加する）ように設計する。ある特定の実施形態では、選択されたＤＮＡ領域は、中立組込み部位である。他の実施形態では、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ  ＤＮＡセグメントを、１種または複数の天然ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子を宿主生物のＤＮＡから除去する（例えば、１種または複数の天然グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロピコリン酸レダクターゼおよび／またはｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を除去する）ように設計する。
【０２５３】
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子は、当技術分野で公知の酵素的または化学的合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成できる。オリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズまたはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜などの固相支持体上で合成してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、アレイで、マイクロフルイディクスを使用して平行マイクロスケールで、または両方の組合せを提供する既知技術を使用して合成してもよい。
【０２５４】
アレイでの、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より少ない試薬使用によって経費を削減することによって、従来の固相支持体合成を上回る利点を提供する。遺伝子合成に必要な規模は小さく、そのため、アレイから、またはマイクロフルイディクスによって合成されるオリゴヌクレオチド生成物の規模は容認できる。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固相支持体合成を使用する場合よりも低い品質のものである。
【０２５５】
伝統的な４ステップホスホルアミダイト化学では、１９８０年代にそれが最初に記載されてから多数の進歩が達成されてきた（例えば、ペルオキシアニオン脱保護を使用するSierzchalaらJ.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替保護基についてのHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてのAzhayevら、Tetrahedron  ５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；ラージポアＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてのKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてのDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照のこと）。
【０２５６】
合成の種類に関わらず、次いで、結果として生じたオリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（すなわち、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト合成（ＴＢＩＯ）などの当技術分野で公知のプロトコールを使用して、より小さいオリゴヌクレオチドを一緒につなぐことができる。
【０２５７】
より長い二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によって、より小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。ＴＳＰの一方法では、組み合わされて完全長目的生成物を形成するであろう、より小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基長の間であり、少なくとも約１５〜２０塩基だけ、互いに重複する。実際的目的上、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするのに十分な最小の長さであり、使用される反応温度でアニーリングするように十分に高い融点（Ｔｍ）を有さなくてはならない。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接オリゴヌクレオチドによって完全に重複される点に広げることができる。重複の量は、最終生成物の品質に対して何ら効果を有さないと思われる。アセンブリーにおける第１および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、フォワードおよびリバース増幅プライマーに対する結合部位を含有しなくてはならない。一実施形態では、第１および最後のオリゴヌクレオチドの末端配列は、ユニバーサルプライマーの使用を可能にする相補的な同一配列を含有する。
【０２５８】
スレオニンアルドラーゼ（ＴＡ）遺伝子を含むライブラリーの作製
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のＴＡ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入および／または置換および／または欠失することを教示する。一部の態様では、本明細書において教示される方法は、目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、ＴＡセグメント）を構築することを含み、これを宿主生物のゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本開示のＴＡ  ＤＮＡセグメントは、既知鋳型からコピーすることもしくは切断すること、突然変異またはＤＮＡ合成を含む当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を製造するための市販の遺伝子合成製品（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．またはＱｉａｇｅｎ（商標））と適合する。
【０２５９】
一部の実施形態では、ＴＡ  ＤＮＡセグメントを、１種または複数のＴＡ  ＤＮＡセグメントを、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域に組み込む（例えば、スレオニンアルドラーゼ活性を有する１種または複数の有用な遺伝子を付加する）ように設計する。ある特定の実施形態では、選択されたＤＮＡ領域は、中立組込み部位である。他の実施形態では、ＴＡ  ＤＮＡセグメントを、１種または複数の天然ＴＡ遺伝子を、宿主生物のＤＮＡから除去する（例えば、スレオニンアルドラーゼ活性を有する１種または複数の遺伝子を除去する）ように設計する。
【０２６０】
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるＴＡ遺伝子は、当技術分野で公知の酵素的または化学的合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成できる。オリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズまたはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜などの固相支持体上で合成してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、アレイで、マイクロフルイディクスを使用して平行マイクロスケールで、または両方の組合せを提供する既知技術を使用して合成してもよい。
【０２６１】
アレイでの、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より少ない試薬使用によって経費を削減することによって、従来の固相支持体合成を上回る利点を提供する。遺伝子合成に必要な規模は小さく、そのため、アレイから、またはマイクロフルイディクスによって合成されるオリゴヌクレオチド生成物の規模は容認できる。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固相支持体合成を使用する場合よりも低い品質のものである。
【０２６２】
伝統的な４ステップホスホルアミダイト化学では、１９８０年代にそれが最初に記載されてから多数の進歩が達成されてきた（例えば、ペルオキシアニオン脱保護を使用するSierzchalaらJ.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替保護基についてのHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてのAzhayevら、Tetrahedron  ５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；ラージポアＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてのKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてのDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照のこと）。
【０２６３】
合成の種類に関わらず、次いで、結果として生じたオリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（すなわち、ＴＡ遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト合成（ＴＢＩＯ）などの当技術分野で公知のプロトコールを使用して、より小さいオリゴヌクレオチドを一緒につなぐことができる。
【０２６４】
より長い二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によって、より小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。ＴＳＰの一方法では、組み合わされて完全長目的生成物を形成するであろう、より小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基長の間であり、少なくとも約１５〜２０塩基だけ、互いに重複する。実際的目的上、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするのに十分な最小の長さであり、使用される反応温度でアニーリングするように十分に高い融点（Ｔｍ）を有さなくてはならない。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接オリゴヌクレオチドによって完全に重複される点に広げることができる。重複の量は、最終生成物の品質に対して何ら効果を有さないと思われる。アセンブリーにおける第１および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、フォワードおよびリバース増幅プライマーに対する結合部位を含有しなくてはならない。一実施形態では、第１および最後のオリゴヌクレオチドの末端配列は、ユニバーサルプライマーの使用を可能にする相補的な同一配列を含有する。
【０２６５】
ｐｙｃ遺伝子を含むライブラリーの作製
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のｐｙｃ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入および／または置換および／または欠失することを教示する。一部の態様では、本明細書において教示される方法は、目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、ｐｙｃセグメント）を構築することを含み、これを宿主生物のゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本開示のｐｙｃ  ＤＮＡセグメントは、既知鋳型からコピーすることもしくは切断すること、突然変異またはＤＮＡ合成を含む当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を製造するための市販の遺伝子合成製品（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．またはＱｉａｇｅｎ（商標））と適合する。
【０２６６】
一部の実施形態では、ｐｙｃ  ＤＮＡセグメントを、１種または複数のグルコースｐｙｃ  ＤＮＡセグメントを、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域に組み込む（例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する１種または複数の有用な遺伝子を付加する）ように設計する。ある特定の実施形態では、選択されたＤＮＡ領域は、中立組込み部位である。他の実施形態では、ｐｙｃ  ＤＮＡセグメントを、１種または複数の天然ｐｙｃ遺伝子を宿主生物のＤＮＡから除去する（例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する１種または複数の天然遺伝子を除去する）ように設計する。
【０２６７】
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるｐｙｃ遺伝子は、当技術分野で公知の酵素的または化学的合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成できる。オリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズまたはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜などの固相支持体上で合成してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、アレイで、マイクロフルイディクスを使用して平行マイクロスケールで、または両方の組合せを提供する既知技術を使用して合成してもよい。
【０２６８】
アレイでの、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より少ない試薬使用によって経費を削減することによって、従来の固相支持体合成を上回る利点を提供する。遺伝子合成に必要な規模は小さく、そのため、アレイから、またはマイクロフルイディクスによって合成されるオリゴヌクレオチド生成物の規模は容認できる。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固相支持体合成を使用する場合よりも低い品質のものである。
【０２６９】
伝統的な４ステップホスホルアミダイト化学では、１９８０年代にそれが最初に記載されてから多数の進歩が達成されてきた（例えば、ペルオキシアニオン脱保護を使用するSierzchalaらJ.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替保護基についてのHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてのAzhayevら、Tetrahedron  ５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；ラージポアＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてのKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてのDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照のこと）。
【０２７０】
合成の種類に関わらず、次いで、結果として生じたオリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（すなわち、ｐｙｃ遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト合成（ＴＢＩＯ）などの当技術分野で公知のプロトコールを使用して、より小さいオリゴヌクレオチドを一緒につなぐことができる。
【０２７１】
より長い二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によって、より小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。ＴＳＰの一方法では、組み合わされて完全長目的生成物を形成するであろう、より小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基長の間であり、少なくとも約１５〜２０塩基だけ、互いに重複する。実際的目的上、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするのに十分な最小の長さであり、使用される反応温度でアニーリングするように十分に高い融点（Ｔｍ）を有さなくてはならない。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接オリゴヌクレオチドによって完全に重複される点に広げることができる。重複の量は、最終生成物の品質に対して何ら効果を有さないと思われる。アセンブリーにおける第１および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、フォワードおよびリバース増幅プライマーに対する結合部位を含有しなくてはならない。一実施形態では、第１および最後のオリゴヌクレオチドの末端配列は、ユニバーサルプライマーの使用を可能にする相補的な同一配列を含有する。
【０２７２】
プラスミドのアセンブリング／クローニング
一部の実施形態では、本開示は、所望のｇａｐＡ遺伝子、および／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、および／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢ、および／もしくはｄｄｈ遺伝子、および／またはＴＡ遺伝子、および／またはｐｙｃ遺伝子ＤＮＡの部分を、宿主生物のゲノムに挿入することが可能なベクターを構築するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、挿入ＤＮＡ（例えば、ｇａｐＡ遺伝子、および／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、および／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢ、および／もしくはｄｄｈ遺伝子、および／またはＴＡ遺伝子および／またはｐｙｃ遺伝子）、相同性の腕および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターのクローニング方法を教示する。（図６を参照のこと）。
【０２７３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物への形質転換に適している任意のベクターに適合する。一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞に適合するシャトルベクターの使用を教示する。一実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するためのシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞に適合するシャトルベクターである。本明細書で提供される方法で使用するためのシャトルベクターは、本明細書に記載される選択および／または対抗選択のためのマーカーを含むことができる。マーカーは、当技術分野で公知である、および／または本明細書で提供される任意のマーカーであってよい。シャトルベクターは、当技術分野で公知である、任意の調節配列（複数可）および／または前記シャトルベクターのアセンブリーにおいて有益である配列をさらに含むことができる。シャトルベクターは、本明細書で提供される宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける増殖のために必要とされるかもしれない任意の複製開始点をさらに含むことができる。調節配列は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書で提供される任意の調節配列、例えば宿主細胞の遺伝機構によって使用されるプロモーター、開始、中止、シグナル、分泌および／または終結配列であってよい。ある特定の場合には、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手できるベクター、構築物またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０カスタムまたはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照のこと）に挿入することができる。
【０２７４】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリー戦略の少なくとも１つを用いることができる：ｉ）タイプＩＩ従来のクローニング、ｉｉ）タイプＩＩＳ媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler,  C.、R.  KandziaおよびS.  Marillonnet、２００８年「A  one  pot,  one  step,  precision  cloning  method  with  high  throughput  capability」、PLos  One３巻：ｅ３６４７頁；Kotera,  I.およびT.  Nagai、２００８年「A  high-throughput  and  single-tube  recombination  of  crude  PCR  products  using  a  DNA  polymerase  inhibitor  and  type  IIS  restriction  enzyme」、J  Biotechnol１３７巻：１〜７頁；Weber,  E.、R.  Gruetzner、S.  Werner,  C.  EnglerおよびS.  Marillonnet、２０１１年Assembly  of  Designer  TAL  Effectors  by  Golden  Gate  Cloning、PloS  One６巻：ｅ１９７２２頁を参照のこと）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde  Jong１９９０年、「Ligation-independent  cloning  of  PCR  products  (LIC-PCR)」、Nucleic  Acids  Research、第１８巻、２０号６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同的末端連結、またはその組合せ。モジュール式のタイプＩＩＳベースのアセンブリー戦略は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示され、その開示は参照により本明細書に含まれる。
【０２７５】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するクローニングベクターを教示する。選択圧の下での原核生物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対して）または真核生物の細胞（例えば、ジェネティシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）における選択のための抗生物質耐性機能をしばしばコードする、様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。首尾よく形質導入された宿主細胞において発現される緑色または赤色の蛍光性タンパク質などのＸ−ｇａｌまたは蛍光性レポーターの存在下で陽性クローンを選択するために細菌において使用される周知の青色／白色スクリーニングシステムなどの他のマーカーシステムは、望ましいかまたは望ましくない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどは原核生物系だけで機能的である選択マーカーの別のクラスは、生産細胞を死滅させる有毒遺伝子生成物を発現する「死亡遺伝子」ともしばしば呼ばれる対抗選択マーカー遺伝子に関する。そのような遺伝子の例には、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１またはｃｃｄＢが含まれ、その機能は、（Reyratら、１９９８年「Counterselectable  Markers:  Untapped  Tools  for  Bacterial  Genetics  and  Pathogenesis」、Infect  Immun.６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載される。
【０２７６】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡセグメントがクローニングされるベクターは、プロモーターポリヌクレオチドを含む。プロモーターポリヌクレオチドは、ｇａｐＡ、および／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、および／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢ、および／もしくはｄｄｈ、および／またはＴＡ、および／またはｐｙｃを宿主微生物の中で過剰発現または過少発現させるために使用することができる。
【０２７７】
一部の実施形態では、異種ｇａｐＡ遺伝子、および／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子、および／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ遺伝子の１つまたは複数、および／またはＴＡ遺伝子および／またはｐｙｃ遺伝子を含む生成された株の各々を培養し、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、生体分子または目的の生成物の生産性）の下で分析する。分析した宿主株の各々からのデータは、特定のｇａｐＡ遺伝子、またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子、またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢ、および／もしくはｄｄｈ遺伝子、および／またはＴＡ遺伝子、および／またはｐｙｃ遺伝子、または、ｇａｐＡ／ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／もしくはｄｄｈ遺伝子／ＴＡ／ｐｙｃの組合せと関連付け／相関させ、将来の使用のために記録する。したがって、本開示は、任意数の目的の遺伝的または表現型形質に及ぼす、ｇａｐＡ遺伝子、またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子、またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢ、および／もしくはｄｄｈ遺伝子、および／またはＴＡ遺伝子、および／またはｐｙｃ遺伝子、または、ｇａｐＡ／ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／もしくはｄｄｈ／ＴＡ／ｐｙｃ遺伝子の組合せの影響を同定する大きな高度に注釈付けされた遺伝的多様性ライブラリー／保管所の作出を可能にする。
【０２７８】
一部の実施形態では、多様性プールの中の株は、「参照株」を参照して判定される。一部の実施形態では、参照株は、野生型株である。他の実施形態では、参照株は、いかなるゲノム遺伝子操作にも付される前の元の工業用株である。参照株は開業医が規定することができ、元の野生型株でもまたは元の工業用株でもある必要がない。基準株は、前記参照株に由来するかまたはそれから生じた以降の株が比較される、「基準」、「参照」または元の遺伝子バックグラウンドと考えられるものを単に代表するだけである。
【０２７９】
記憶にとどめるべき概念は、親株および参照株の間の差のそれである。親株は、ゲノム遺伝子操作の現在のラウンドのために使用したバックグラウンドである。参照株は、特にプレートの間での比較を容易にするためのあらゆるプレートにおいて実行される対照株であり、一般的に、上で参照される「基準株」である。しかし、基準株（例えば、全体の性能をベンチマーク試験するために使用されている野生型または工業用株）は、株改善の所与のラウンドにおける突然変異誘発標的であるという意味で必ずしも「基準」であるとは限らないので、より記述的な用語は「参照株」である。
【０２８０】
要約すると、一般的に基準／参照株は構築された株の性能をベンチマーク試験するために使用され、親株は関連する遺伝子バックグラウンドにおける特異的遺伝子変化の性能をベンチマーク試験するために使用される。
【０２８１】
一部の実施形態では、本開示は、クローン遺伝子が開始および／または停止コドンバリアントを利用するように、ｇａｐＡ遺伝子、および／またはニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、および／またはｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢ、および／もしくはｄｄｈ遺伝子、および／またはＴＡ遺伝子、および／またはｐｙｃ遺伝子を開始および／または停止コドンバリアントと一緒にクローニングするためのベクターの使用を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物のための一般的な停止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物のための一般的な停止コドンはＵＧＡであるが、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは停止コドンとしてＵＡＡを一般的に使用する（Dalphinら（１９９６年）Nucl.  Acids  Res.２４巻：２１６〜２１８頁）。
【０２８２】
コドン最適化
一実施形態では、提供される開示の方法は、宿主生物によって発現される１つまたは複数の遺伝子を最適化するコドンを含む。様々な宿主において発現を改善するためにコドンを最適化する方法は当技術分野で公知であり、文献に記載されている（参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号を参照のこと）。例えば、翻訳率を増加させるために、または、非最適化配列から産生された転写物と比較して望ましい特性、例えばより長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために、特定の原核生物または真核生物の宿主にとって好ましいコドンを含有する最適化コード配列（Murrayら（１９８９年）Nucl.  Acids  Res.１７巻：４７７〜５０８頁も参照する）を調製することができる。
【０２８３】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇａｐＡ／ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子／ＴＡ遺伝子／ｐｙｃ遺伝子またはポリヌクレオチドは、本明細書で提供される宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける翻訳のためにコドン最適化される分子を含む。遺伝子またはポリヌクレオチドは、単離されるか、合成であるかまたは組換えの核酸であってよい。コドン最適化ｇａｐＡ／ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ／ＴＡ／ｐｙｃ遺伝子またはポリヌクレオチドは、配列番号１〜５０、６７〜７４、７９〜２３１および２３２から選択することができる。本明細書で提供されるコドン最適化ｇａｐＡ／ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ／ＴＡ遺伝子／ｐｙｃ遺伝子またはポリヌクレオチドは、コドン最適化ポリヌクレオチドを生成するための当技術分野で公知の方法、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ’ｓ  ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）遺伝子設計システムまたはＤＮＡ２．０  ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）発現最適化技術を使用して生成することができる。
【０２８４】
タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡプロセシングならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含む多くの因子によって支配される。したがって、最適化は任意の特定の遺伝子のいくつかの配列特性のいずれにも対処することができる。具体例として、稀なコドン誘導翻訳中止は、タンパク質発現の低減をもたらすことができる。稀なコドン誘導翻訳中止は、宿主生物において稀に使用され、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるそれらの稀少性のためにタンパク質翻訳に負の影響を及ぼす可能性のある、目的のポリヌクレオチドの中のコドンの存在を含む。
【０２８５】
代わりの翻訳開始も、異種タンパク質発現の低減をもたらすことができる。代わりの翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することが可能なモチーフを偶然に含有する合成ポリヌクレオチド配列を含むことができる。これらの部位は、遺伝子内部部位からの短縮型タンパク質の翻訳の開始をもたらすことができる。精製中に取り除くのが困難であるかもしれない短縮型タンパク質を産生する可能性を低減する１つの方法は、最適化されたポリヌクレオチド配列から推定上の内部ＲＢＳ配列を排除することを含む。
【０２８６】
反復配列によって誘導されたポリメラーゼのずれは、異種タンパク質発現の低減をもたらすことができる。反復配列によって誘導されたポリメラーゼのずれは、フレームシフト突然変異をもたらすことができるＤＮＡポリメラーゼのずれまたはつかえを引き起こすことが示されたヌクレオチド配列の反復配列を含む。そのような反復配列は、ＲＮＡポリメラーゼのずれを引き起こすこともできる。高Ｇ＋Ｃ含量への偏りを有する生物では、ＧまたはＣヌクレオチドの反復配列で構成される、より高い程度の反復配列がある可能性がある。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのずれを誘導する可能性を低減する１つの方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの伸長した反復配列を変更することを含む。
【０２８７】
二次構造に干渉することも、異種タンパク質発現の低減をもたらすことができる。二次構造はＲＢＳ配列または開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の低減と関連付けられた。ステムループ構造は、転写の中止および減弱に関与することもできる。最適化されたポリヌクレオチド配列は、改善された転写および翻訳を可能にするために、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域に最小限の二次構造を含有することができる。
【０２８８】
例えば、最適化プロセスは、宿主によって発現されるべき所望のアミノ酸配列を同定することから開始することができる。アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計の間、コドン利用の頻度を宿主発現生物のコドン利用と比較することができ、稀な宿主コドンを合成配列から取り除くことができる。さらに、望ましくない酵素制限部位を取り除き、任意の所望のシグナル配列、リンカーまたは非翻訳領域を加えるかまたは取り除くために、合成候補ＤＮＡ配列を改変することができる。合成ＤＮＡ配列は、翻訳過程に干渉することができる二次構造、例えばＧ／Ｃ反復配列およびステムループ構造の存在について分析することができる。
【０２８９】
宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ媒介遺伝子導入を含む様々な技術のいずれかを使用して宿主細胞の中に導入することができる。特定の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔が含まれる（Davis,  L.、Dibner,  M.、Battey,  I.、１９８６年「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」）。形質転換の他の方法には、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が含まれる、例えば、Gietzら、Nucleic  Acids  Res.２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J.  Bacterol.１５３巻：１６３〜１６８頁（１９８３年）；およびBeckerおよびGuarente、Methods  in  Enzymology１９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照のこと。一部の実施形態では、形質転換された宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０２９０】
一部の実施形態では、本開示は、９６ウェルプレートロボティックスプラットフォームおよび当技術分野で公知の液体処理機を使用した細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０２９１】
一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の選択マーカーを有する形質転換細胞のスクリーニングを教示する。そのような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換した細胞を、カナマイシン抗生物質の有効量を含有する培地で平板培養する。カナマイシン入りの培地の上で可視的であるコロニー形成単位は、ベクターカセットをそれらのゲノムに組み込んでいると推定される。所望の配列の挿入は、ＰＣＲ、制限酵素分析および／または関連する挿入部位の配列決定を通して確認することができる。
【０２９２】
選択された配列のループアウト
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からのＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。ループアウトする方法は、Nakashimaら２０１４年「Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing」、Int.  J.  Mol.  Sci.１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁に記載の通りであってよい。一部の実施形態では、本開示は、陽性の形質転換体からの選択マーカーのループアウトを教示する。ループアウト欠失技術は当技術分野で公知であり、（Tearら２０１４年「Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli」、Appl.  Biochem.  Biotech.１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載される。本明細書で提供される方法において使用されるループアウト方法は、単一交差相同組換えまたは二重交差相同組換えを使用して実行することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される選択された領域のループアウトは、本明細書に記載される単一交差相同組換えの使用を内包することができる。
【０２９３】
先ず、ループアウトベクターは、宿主生物のゲノムの中の選択された標的領域に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲまたは他の遺伝子編集技術を通して）。一実施形態では、図６に示すように環状プラスミドまたはベクターをループインするために、環状プラスミドまたはベクターと宿主細胞ゲノムの間で単一交差相同組換えが使用される。挿入されるベクターは、その直列反復がルーピングおよび欠失に予定されるＤＮＡの領域に隣接するように、既存のまたは導入される近くの宿主配列の直列反復である配列で設計することができる。挿入されると、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞は、選択領域の欠失について対抗選択することができる（例えば、図７を参照のこと；選択遺伝子への耐性の欠如）。
【０２９４】
宿主微生物
本明細書で提供されるゲノム遺伝子操作方法は、工業微生物細胞培養で例示されるが、遺伝子突然変異体の集団において所望の形質を同定することができる任意の生物に適用可能である。
【０２９５】
したがって、本明細書で用いるように、用語「微生物」は、広義にとるべきである。それには、２つの原核生物の領域である細菌および古細菌、ならびにある特定の真核生物の真菌および原生生物が限定されずに含まれる。しかし、ある特定の態様では、昆虫、植物および動物などの「高等な」真核生物の生物を、本明細書に教示される方法で利用することができる。
【０２９６】
適する宿主細胞には、限定されずに、細菌細胞、藻類の細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物の細胞が含まれる。例示的な一実施形態では、適する宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．にあるＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手可能なＳＨｕｆｆｌｅ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ）がある。
【０２９７】
本開示の他の適する宿主生物には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が含まれる。一部の実施形態では、好ましいＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種には、Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ（寄託された基準株はＤＳＭ４４５４９である）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（寄託された基準株はＡＴＣＣ１３０３２である）、およびＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（寄託された基準株はＡＴＣＣ６８７１である）が含まれる。一部の実施形態では、本開示の好ましい宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉを含むＳｈｉｇｅｌｌａの宿主細胞を教示する。
【０２９８】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、特に種Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの適する宿主株が、特に公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびに、それから調製されたＬアミノ酸産生性の突然変異体または株、例えばＬ−リシン産生性の株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６である。
【０２９９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのために「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」という用語も使用されている。種Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓの一部の代表は、先行技術ではＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、例えばＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９株とも呼ばれている。
【０３００】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、真核細胞である。適する真核生物の宿主細胞には、限定されずに、真菌細胞、藻類の細胞、昆虫細胞、動物細胞および植物細胞が含まれる。適する真菌宿主細胞には、限定されずに、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、不完全菌類が含まれる。ある特定の好ましい真菌宿主細胞には、酵母細胞および糸状菌細胞が含まれる。適する糸状菌宿主細胞には、例えば、亜門ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａの任意の糸状形態が含まれる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hawksworthら、In  Ainsworth  and  Bisby's  Dictionary  of  The  Fungi、第８版、１９９５年、CAB  International、University  Press、Cambridge、UK、を参照のこと）。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に異なる。
【０３０１】
ある特定の例示的であるが非限定的な実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、または、そのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムまたは分類学的同等物の細胞であってよい。
【０３０２】
適する酵母宿主細胞には、限定されずに、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｒｒｏｗｉａが含まれる。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、藻類、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０３０４】
他の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。適する原核細胞には、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定細菌細胞が含まれる。宿主細胞は、限定されずに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの種であってよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０３０５】
一部の実施形態では、宿主株は、細菌宿主株である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本明細書に記載される方法および組成物に適する。
【０３０６】
一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを限定されずに含む、工業用のＢａｃｉｌｌｕｓ株になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＥｒｗｉｎｉａ属種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＰａｎｔｏｅａ属種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖ���ｄａｎｓ）になる。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用のＺｙｍｏｍｏｎａｓ属種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）になる、などである。
【０３０７】
様々な実施形態では、原核生物および真核生物の両方の株を含む、本開示の実施において使用することができる株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの微生物株保存機関から一般人に容易にアクセス可能である。
【０３０８】
一部の実施形態では、本開示の方法は、多細胞生物にも適用可能である。例えば、作物の性能を改善するために、プラットフォームを使用することができる。生物は、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、ＣｏｍｐｏｓｉｔａｅまたはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅなどの複数の植物を含むことができる。例えば、植物は、コーン、イネ、ダイズ、ワタ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、エンドウ、豆、レンチル、ピーナッツ、ヤムイモ豆、カウピー豆、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルペン、ソラマメ類、ハス、スイートクローバ、フジ、スイートピー、ソルガム、アワ類、ヒマワリ、キャノーラなどであってよい。同様に、生物は、非ヒト哺乳動物、魚類、昆虫などの複数の動物を含むことができる。
【０３０９】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞
前述のように、本開示の実施形態においてＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を利用することができる。
【０３１０】
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ種の適する宿主株は、腸毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管組織侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、ベロ毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＣ１０１を含む。一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｃのゲノム遺伝子操作を教示する。
【０３１１】
一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＮＣＴＣ  １２７５７、ＮＣＴＣ  １２７７９、ＮＣＴＣ  １２７９０、ＮＣＴＣ  １２７９６、ＮＣＴＣ  １２８１１、ＡＴＣＣ  １１２２９、ＡＴＣＣ  ２５９２２、ＡＴＣＣ  ８７３９、ＤＳＭ  ３００８３、ＢＣ  ５８４９、ＢＣ  ８２６５、ＢＣ  ８２６７、ＢＣ  ８２６８、ＢＣ  ８２７０、ＢＣ  ８２７１、ＢＣ  ８２７２、ＢＣ  ８２７３、ＢＣ  ８２７６、ＢＣ  ８２７７、ＢＣ  ８２７８、ＢＣ  ８２７９、ＢＣ  ８３１２、ＢＣ  ８３１７、ＢＣ  ８３１９、ＢＣ  ８３２０、ＢＣ  ８３２１、ＢＣ  ８３２２、ＢＣ  ８３２６、ＢＣ  ８３２７、ＢＣ  ８３３１、ＢＣ  ８３３５、ＢＣ  ８３３８、ＢＣ  ８３４１、ＢＣ  ８３４４、ＢＣ  ８３４５、ＢＣ  ８３４６、ＢＣ  ８３４７、ＢＣ  ８３４８、ＢＣ  ８８６３およびＢＣ  ８８６４のゲノム遺伝子操作を教示する。
【０３１２】
一部の実施形態では、本開示はベロ細胞毒素産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＶＴＥＣ）、例えば株ＢＣ  ４７３４（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ４７３５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ４７３６、ＢＣ  ４７３７（ｎ．ｄ．）、ＢＣ  ４７３８（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ４９４５（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ４９４６（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ４９４７（Ｏ１１１：Ｈ−）、ＢＣ  ４９４８（Ｏ１５７：Ｈ）、ＢＣ  ４９４９（Ｏ５）、ＢＣ  ５５７９（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５５８０（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５５８２（Ｏ３：Ｈ）、ＢＣ  ５６４３（Ｏ２：Ｈ５）、ＢＣ  ５６４４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ５６４５（Ｏ５５：Ｈ−）、ＢＣ  ５６４６（Ｏ６９：Ｈ−）、ＢＣ  ５６４７（Ｏ１０１：Ｈ９）、ＢＣ  ５６４８（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ５８５０（Ｏ２２：Ｈ８）、ＢＣ  ５８５１（Ｏ５５：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５２（Ｏ４８：Ｈ２１）、ＢＣ  ５８５３（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ５８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５８５５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５７（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ５８５８（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ７８３２、ＢＣ  ７８３３（Ｏ原形：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３４（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３５（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８３６（Ｏ５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３７（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３８、ＢＣ  ７８３９（Ｏ１２８：Ｈ２）、ＢＣ  ７８４０（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４１（Ｏ２３：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４２（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４３、ＢＣ  ７８４４（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４５（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８４６（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ７８４７（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４８（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４９（Ｏ１５６：Ｈ４７）、ＢＣ  ７８５０、ＢＣ  ７８５１（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５２（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５３（Ｏ５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ７８５５（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ７８５６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５７、ＢＣ  ７８５８、ＢＣ  ７８５９（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６０（Ｏ１２９：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６１、ＢＣ  ７８６２（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８６３、ＢＣ  ７８６４（Ｏ原形：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６５、ＢＣ  ７８６６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６７（Ｏ原形：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６８、ＢＣ  ７８６９（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７０（Ｏ１１３：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７１（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７２（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７３、ＢＣ  ７８７４（Ｏ原形：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７６（Ｏ１１１：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７７（Ｏ１４６：Ｈ２１）、ＢＣ  ７８７８（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７９（Ｏ２２：Ｈ８）、ＢＣ  ７８８０（Ｏ原形：Ｈ−）、ＢＣ  ７８８１（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ８２７５（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ８３１８（Ｏ５５：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８３２５（Ｏ１５７：Ｈ７）およびＢＣ  ８３３２（ＯＮＴ）、ＢＣ  ８３３３を教示する。
【０３１３】
一部の実施形態では、本開示は、腸管組織侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、例えば、株ＢＣ  ８２４６（Ｏ１５２：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８２４７（Ｏ１２４：Ｋ（７２）：Ｈ３）、ＢＣ  ８２４８（Ｏ１２４）、ＢＣ  ８２４９（Ｏ１１２）、ＢＣ  ８２５０（Ｏ１３６：Ｋ（７８）：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５１（Ｏ１２４：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５２（Ｏ１４４：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５３（Ｏ１４３：Ｋ：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５４（Ｏ１４３）、ＢＣ  ８２５５（Ｏ１１２）、ＢＣ  ８２５６（Ｏ２８ａ．ｅ）、ＢＣ  ８２５７（Ｏ１２４：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５８（Ｏ１４３）、ＢＣ  ８２５９（Ｏ１６７：Ｋ−：Ｈ５）、ＢＣ  ８２６０（Ｏ１２８ａ．ｃ．：Ｈ３５）、ＢＣ  ８２６１（Ｏ１６４）、ＢＣ  ８２６２（Ｏ１６４：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８２６３（Ｏ１６４）、およびＢＣ  ８２６４（Ｏ１２４）を教示する。
【０３１４】
一部の実施形態では、本開示は、腸毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、例えば、株ＢＣ  ５５８１（Ｏ７８：Ｈ１１）、ＢＣ  ５５８３（Ｏ２：Ｋ１）、ＢＣ  ８２２１（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２２２（Ｏ１４８：Ｈ−）、ＢＣ  ８２２３（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８２２４（Ｏ１１０：Ｈ−）、ＢＣ  ８２２５（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２２６（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２２７（Ｏ２５：Ｈ４２）、ＢＣ  ８２２９（Ｏ６）、ＢＣ  ８２３１（Ｏ１５３：Ｈ４５）、ＢＣ  ８２３２（Ｏ９）、ＢＣ  ８２３３（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２３４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８２３５（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２３７（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８２３８（Ｏ１１０：Ｈ１７）、ＢＣ  ８２４０（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２４１（Ｏ６Ｈ１６）、ＢＣ  ８２４３（Ｏ１５３）、ＢＣ  ８２４４（Ｏ１５：Ｈ−）、ＢＣ  ８２４５（Ｏ２０）、ＢＣ  ８２６９（Ｏ１２５ａ．ｃ：Ｈ−）、ＢＣ  ８３１３（Ｏ６：Ｈ６）、ＢＣ  ８３１５（Ｏ１５３：Ｈ−）、ＢＣ  ８３２９、ＢＣ  ８３３４（Ｏ１１８：Ｈ１２）、およびＢＣ  ８３３９を教示する。
【０３１５】
一部の実施形態では、本開示は、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、例えば、株ＢＣ  ７５６７（Ｏ８６）、ＢＣ  ７５６８（Ｏ１２８）、ＢＣ  ７５７１（Ｏ１１４）、ＢＣ  ７５７２（Ｏ１１９）、ＢＣ  ７５７３（Ｏ１２５）、ＢＣ  ７５７４（Ｏ１２４）、ＢＣ  ７５７６（Ｏ１２７ａ）、ＢＣ  ７５７７（Ｏ１２６）、ＢＣ  ７５７８（Ｏ１４２）、ＢＣ  ７５７９（Ｏ２６）、ＢＣ  ７５８０（ＯＫ２６）、ＢＣ  ７５８１（Ｏ１４２）、ＢＣ  ７５８２（Ｏ５５）、ＢＣ  ７５８３（Ｏ１５８）、ＢＣ  ７５８４（Ｏ−）、ＢＣ  ７５８５（Ｏ−）、ＢＣ  ７５８６（Ｏ−）、ＢＣ  ８３３０、ＢＣ  ８５５０（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５５１（Ｏ５５）、ＢＣ  ８５５２（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５５３（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５５４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５５５（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５５６（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５５７（ＯＫ２６）、ＢＣ  ８５５８（Ｏ５５）、ＢＣ  ８５６０（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６１（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６２（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５６３（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５６４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５６５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６８（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８５６９（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７０（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５７１（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７２（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７３（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７８（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８１（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８３（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５８４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８５（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５８６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８８（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５８９（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５９０（Ｏ１２７）、ＢＣ  ８５９１（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５９２（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９３（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９４（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９５（Ｏ１２５）、ＢＣ  ８５９６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５９７（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５９８（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５９９（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０８（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８６０９（Ｏ５５）、ＢＣ  ８６１０（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８６１５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６１６（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８６１７（Ｏ２６）、ＢＣ  ８６１８（Ｏ８６）、ＢＣ  ８６１９、ＢＣ  ８６２０、ＢＣ  ８６２１、ＢＣ  ８６２２、ＢＣ  ８６２３、ＢＣ  ８６２４（Ｏ１５８）、およびＢＣ  ８６２５（Ｏ１５８）を教示する。
【０３１６】
細胞の発酵および培養
本明細書に記載される遺伝子操作されたものを含む本開示の微生物は、任意の所望の生合成反応または選択のために適宜改変された従来の栄養培地で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための培地の誘導における培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体（例えば、抗生物質）または阻害条件（例えば、高エタノール条件）の下での成長に適している生物の選択の選択薬剤を含む、選択薬剤を含有する培地を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞成長のために最適化した培地で細胞培養を成長させることを教示する。他の実施形態では、本開示は、例えば、グルコースの代謝的プロセシングに由来する目的の生成物または生体分子などの生成物の収率のために最適化した培地において、細胞培養を成長させることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞成長を誘導することが可能であり、最終生成物の産生のために必要な前駆体（例えば、エタノール生産のための高レベルの糖）も含有する培地において培養を成長させることを教示する。
【０３１７】
本明細書で提供される方法によって産生される目的の生体分子または生成物は、グルコースから産生される任意の市販の生成物であってよい。一部の場合には、目的の生体分子または生成物は、小分子、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、限定されずに、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであってよい。具体的な実施形態では、アミノ酸はリシンである。ある特定の態様では、リシンは、Ｌ−リシンである。有機酸は、限定されずに、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであってよい。アルコールは、限定されずに、エタノールまたはイソブタノールであってよい。
【０３１８】
培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択される宿主細胞で使用するのに適するものであり、当業者にとって明らかになる。記されるように、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）および古細菌起源の細胞を含む、多くの細胞の培養および産生のために多くの参考文献が利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology第１５２巻Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；および、Freshney（１９９４年）Culture  of  Animal  Cells,  a  Manual  of  Basic  Technique、第３版、Wiley-Liss、New  Yorkおよびその中の引用文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）Mammalian  Cell  Culture:  Essential  Techniques  John  Wiley  and  Sons、NY；Humason（１９７９年）Animal  Tissue  Techniques、第４版、W.H.  Freeman  and  Company；および、Ricciardelleら、（１９８９年）In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照のこと、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。植物細胞の培養および再生については、Payneら（１９９２年）Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems  John  Wiley  &  Sons,  Inc.、  New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編、（１９８４年）Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J.およびPlant  Molecular  Biology（１９９３年）R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.、ＩＳＢＮ０１２１９８３７０６、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に一般に示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。細胞培養のためのさらなる情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）および、例えば、同じくSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant  Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な民間の文献に見出され、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１９】
使用する培養培地または発酵培地は、それぞれの株の要求量を満足させる、適する様式にしなければならない。様々な微生物のための培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriology（Washington  D.C.、USA、１９８１年）の「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」に存在する。培養培地および発酵培地という用語は、同義的である。
【０３２０】
一部の実施形態では、本開示は、所望の有機化学化合物を製造する目的で、製造される微生物は、例えば、国際公開第０５／０２１７７２号に記載される通り連続的に、または、回分法（回分培養）において、または流加もしくは反復流加プロセスにおいて断続的に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての一般的性質の要約は、Chmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuhrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書の中で、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書の中で見出すことが可能である。
【０３２１】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、回分または連続発酵条件で成長させる。古典的回分発酵は閉鎖系であり、そこでは培地の組成は発酵の初めに設定され、発酵の間の人工的な交替を受けない。回分システムの変形形態は、本開示においても有用である流加発酵である。この変形形態では、発酵の進行につれて基質が徐々に加えられる。異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性があるとき、および培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合、流加システムは有益である。回分および流加発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。連続発酵は、規定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに加えられ、所望のタンパク質の処理および採収のために等量の馴化培地が同時に取り除かれるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は、細胞が主に対数成長期にある、恒常的な高い密度で培養を一般的に維持する。一部の実施形態では、連続発酵は、培養を静止期または後期対数／静止期の成長で一般的に維持する。連続発酵システムは、定常状態の成長条件を維持するよう努める。
【０３２２】
連続発酵プロセスのための栄養および増殖因子をモジュレートする方法、ならびに生成物形成速度を最大にする技術は、工業微生物学分野で周知である。
【０３２３】
例えば、本開示の培養のための炭素源の非限定的なリストには、糖および炭水化物、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、テンサイまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物およびセルロース；油脂、例えばダイズ油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油脂；脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸；アルコール、例えばグリセロール、メタノールおよびエタノール；ならびに有機酸、例えば酢酸または乳酸が含まれる。
【０３２４】
本開示の培養のための窒素源の非限定的なリストには、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆粉および尿素；または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源は、個々に、または混合物として使用することができる。
【０３２５】
本開示の培養のための可能なリン源の非限定的なリストには、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩が含まれる。培養培地は、成長のために必要である、例えば金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよび鉄の塩化物または硫酸塩の形の塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄をさらに含むことができる。最後に、上述の物質に加えて、必須の増殖因子、例えばアミノ酸、例えばホモセリンおよびビタミン、例えばチアミン、ビオチンまたはパントテン酸を用いることができる。
【０３２６】
一部の実施形態では、培養のｐＨは、任意の酸または塩基または緩衝塩、例えば、限定されずに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水；または酸性化合物、例えばリン酸または硫酸によって適する様式で制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは６．０から８．５、好ましくは６．５から８の値に一般的に調整される。
【０３２７】
一部の実施形態では、本開示の培養は、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを含むことができる。一部の実施形態では、本開示の培養は、適する選択的物質、例えば抗生物質を加えることによって培養のプラスミドを安定化するように改変される。
【０３２８】
一部の実施形態では、培養は、好気的条件の下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素、または例えば空気などの酸素含有ガス混合物が培養に導入される。過酸化水素で濃縮した液体を使用することも同様に可能である。発酵は、適切な場合には高い圧で、例えば０．０３から０．２ＭＰａの高い圧で実行される。培養温度は、通常２０℃から４５℃、好ましくは２５℃から４０℃、特に好ましくは３０℃から３７℃である。回分または流加法では、目的の所望の生成物（例えば、有機化学化合物）の回収に十分な量が形成されるまで、培養は好ましくは継続される。この目的は、１０時間から１６０時間以内に通常は達成することができる。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活動は、発酵培地におけるおよび／または前記微生物の細胞における目的の生成物の濃縮（蓄積）をもたらす。
【０３２９】
一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件の下で実行される。
【０３３０】
スクリーニング
一部の実施形態では、本開示は、ハイスループット初期スクリーニングを教示する。他の実施形態では、本開示は、性能データの頑強なタンクベースの検証も教示する。
【０３３１】
一部の実施形態では、ハイスループットスクリーニングプロセスは、バイオリアクター内の株の性能を予測するように設計される。前述の通り、培養条件は、生物に適し、バイオリアクター条件を反映するように選択される。個々のコロニーを選び出し、９６ウェルプレートに移し、適する時間インキュベートする。細胞は、さらなる種子培養のための新しい９６ウェルプレートに、または生産培養にその後移される。培養は様々な長さの時間インキュベートされ、そこでは、複数の測定が可能である。これらには、生成物、バイオマス、またはバイオリアクター内の株の性能を予測する他の特性の測定を含めることができる。ハイスループット培養結果は、バイオリアクター性能を予測するために使用される。
【０３３２】
一部の実施形態では、タンクベースの性能検証は、ハイスループットスクリーニングによって単離される株の性能を確認するために使用される。発酵プロセス／条件は、商業リアクター条件を再現するように設計される。候補株は、生産性または収率などの関連する株性能特性のためのベンチスケール発酵リアクターを使用してスクリーニングされる。
【０３３３】
生成物回収および定量化
目的の生成物の産生についてスクリーニングする方法は当業者に公知であり、本明細書全体で議論される。そのような方法は、本開示の株をスクリーニングするときに用いることができる。本明細書で提供される方法によって産生される目的の生体分子または生成物は、グルコースから産生される任意の市販の生成物であってよい。一部の場合には、目的の生体分子または生成物は、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、限定されずに、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであってよい。具体的な実施形態では、アミノ酸は、リシンである。ある特定の態様では、リシンは、Ｌ−リシンである。有機酸は、限定されずに、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであってよい。アルコールは、限定されずに、エタノールまたはイソブタノールであってよい。
【０３３４】
一部の実施形態では、本開示は、分泌されない細胞内生成物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬品、または他の価値ある小分子もしくはペプチドを産生する細胞培養の頑健性、収率、効率または全体の望ましさを改善する方法を教示する。分泌されない細胞内生成物の回収または単離は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で周知である溶解および回収技術によって達成することができる。
【０３３５】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈澱または他の方法によって採収することができる。採収された細胞は、凍結融解循環、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解薬剤の使用、または当業者に周知である他の方法を含む、任意の便利な方法によって次に破壊される。
【０３３６】
結果として生じる目的の生成物、例えばポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離すること、および必要に応じて精製することができる。例えば、生成物ポリペプチドは、限定されずに、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマトフォーカシングおよびサイズ除外）または沈殿を含む従来の手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップにおいて用いることができる。（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Parryら、２００１年、Biochem.  J.３５３巻：１１７頁およびHongら、２００７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.７３巻：１３３１頁に記載される細胞内タンパク質の精製を参照のこと）。
【０３３７】
上記の参考文献に加えて、例えば以下に示すものを含めて、様々な精製方法が当技術分野で周知である：Sandana（１９９７年）Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）Protein  Methods、第２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）The  Protein  Protocols  Handbook  Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）Protein  Purification:  Principles  and  Practice、第３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods  and  Applications、第２版、Wiley-VCH、NY；およびWalker（１９９８年）Protein  Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJ、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３８】
一部の実施形態では、本開示は、分泌生成物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、価値ある小分子またはペプチドを産生する細胞培養の頑健性、収率、効率または全体の望ましさを改善する方法を教示する。
【０３３９】
一部の実施形態では、本開示の細胞によって産生される分泌されるかまたは分泌されない生成物を検出および／または精製するために、免疫学的方法を使用することができる。アプローチの１例では、従来の方法を使用して作製される、生成物分子に対する（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対する）抗体がビーズの上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合して沈殿する条件の下で細胞培養培地と混合される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０３４０】
他の関連した実施形態では、その各々は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年に開示される通り、イムノクロマトグラフィーが使用される。一般的なイムノクロマトグラフィーは、２つの抗体を使用して検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液の中に、または、試験溶液が滴下される、多孔膜から作製される概ね長方形の試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド状粒子で標識される（この抗体は、以降標識抗体と呼ばれる）。滴下させる試験溶液が検出する検体を含むとき、標識抗体は検体に結合するように検体を認識する。検体および標識抗体の複合体は、濾紙から作製され、標識抗体を含んでいる末端と反対側の末端に付着している吸収体の方へ、毛管現象によって流れる。流れる間、検体および標識抗体の複合体は、多孔膜の中央に存在する第２の抗体（それは、以降タッピング抗体と呼ばれる）によって認識、捕捉され、この結果、複合体は多孔膜の上の検出部に可視シグナルとして出現し、検出される。
【０３４１】
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、光度測定検出技術（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどの蛍光団検出部の存在に基づくことができる。他の実施形態では、光度測定検出は、細胞培養からの所望の生成物の上での蓄積に基づくことができる。一部の実施形態では、生成物は、培養または前記培養からの抽出物のＵＶを通して検出可能であってよい。
【０３４２】
一部の実施形態では、生成物回収方法は、各候補ｇａｐＡ／トランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子の性能に及ぼす影響の定量判定を可能にする。一部の実施形態では、生成物回収方法は、各候補ｇａｐＡ／トランスヒドロゲナーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ遺伝子組合せの性能に及ぼす影響の定量判定を可能にし、最適な組合せの各々の比較および選択を可能にする。
【０３４３】
本開示の方法および生物を通して産生、回収される生成物の非限定的なリストは、表２に提供する。
【表２−１】
2020520645.tif 000004
【表２−２】
2020520645.tif 000005
【０３４４】
当業者は、本開示の方法が、任意の望ましい目的の生体分子生成物を産生する宿主細胞に適合することを認める。
【０３４５】
選択判定基準および目標
異種ｇａｐＡ／ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ／スレオニンアルドラーゼ／ピルビン酸カルボキシラーゼ／ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよび／またはｄｄｈを発現する宿主細胞の特定株の選択は、特異的目標に基づくことができる。例えば、一部の実施形態では、プログラムの目標は、即時的時間制限のない反応の単一のバッチ収率を最大にすることであってよい。他の実施形態では、プログラムの目標は、特異的生成物を産生するために、または特定の比の生成物を産生するために、生合成収率を再均衡させることであってよい。一部の実施形態では、プログラムの目標は、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセス回遊への耐性、最適な成長温度および成長率などの性能特性を改善することであってよい。一部の実施形態では、プログラムの目標は、微生物によって産生される目的の生成物の体積測定生産性、比生産性、収率または力価によって測定したときの改善された宿主性能である。
【０３４６】
他の実施形態では、プログラムの目標は、投入量あたりの最終生成物収率（例えば、スクロース１ポンドあたりの産生されるエタノールの総量）の点からの市販株の合成効率を最適化することであってよい。他の実施形態では、プログラムの目標は、例えば連続培養システムにおけるバッチ完了率または収率に関して測定したときの合成速度を最適化することであってよい。一実施形態では、プログラムの目標は、目的の生体分子または生成物の最終生成物の収率および／または生産速度を最適化することである。本明細書で提供される方法によって産生される目的の生体分子または生成物は、グルコースから産生される任意の市販の生成物であってよい。一部の場合には、目的の生体分子または生成物は、小分子、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、限定されずに、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであってよい。具体的な実施形態では、アミノ酸は、リシンである。ある特定の態様では、リシンは、Ｌ−リシンである。ある特定の態様では、スレオニンは、Ｌ−スレオニンである。有機酸は、限定されずに、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであってよい。アルコールは、限定されずに、エタノールまたはイソブタノールであってよい。
【０３４７】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株選択基準を調整する方法を認める。例えば、反応飽和時の株の単一バッチの最大収率の選択は、高い単一バッチ収率を有する株の同定のために適当である可能性がある。一定範囲の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、頑健性および信頼性が増加した株の同定のために適当である可能性がある。
【０３４８】
一部の実施形態では、初期の相およびタンクベースの検証のための選択基準は同一になる。他の実施形態では、タンクベースの選択は、さらなるおよび／または異なる選択基準の下で操作することができる。
【０３４９】
配列決定
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される生物の全ゲノム配列決定を教示する。他の実施形態では、本開示はまた、本開示の方法への品質管理として、プラスミド、ＰＣＲ産物および他のオリゴの配列決定を教示する。大きいおよび小さいプロジェクトのための配列決定方法は、当業者に周知である。
【０３５０】
一部の実施形態では、核酸配列決定のための任意のハイスループット技術を本開示の方法で使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、全ゲノム配列決定を教示する。他の実施形態では、本開示は、遺伝的変異を同定するためのアンプリコン配列決定ウルトラディープシークエンシングを教示する。一部の実施形態では、本開示は、タグメンテーション（ＷＯ／２０１６／０７３６９０を参照のこと）を含むライブラリー調製のための新規方法も教示する。ＤＮＡ配列決定技術には、標識ターミネーターまたはプライマーおよびスラブまたは毛細管におけるゲル分離を使用した古典的なジデオキシ配列決定反応（サンガー法）；可逆的終止標識ヌクレオチドを使用した合成による配列決定、ピロシークエンシング；４５４配列決定；標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション；ライゲーションが続く標識クローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用した合成による配列決定；重合ステップの間の標識ヌクレオチドの組込みのリアルタイムモニタリング；ポロニー配列決定；およびＳＯＬｉＤ配列決定が含まれる。
【０３５１】
本開示の１つの態様では、それらが並行して配列決定される固体表面の個々の分子を空間的に単離するステップを含む、配列決定のハイスループット方法が用いられる。そのような固体表面は、非多孔性表面（例えば、Ｓｏｌｅｘａ配列決定、例えばBentleyら、Nature、４５６巻：５３〜５９頁（２００８年）または全ゲノム配列決定、例えばDrmanacら、Science、３２７巻：７８〜８１頁（２０１０年）におけるように）、ウェルのアレイ、これはビーズまたは粒子結合鋳型を含むことができる（例えば、４５４、例えばMarguliesら、Nature、４３７巻：３７６〜３８０頁（２００５年）またはイオントレント配列決定、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号または第２０１０／０３０４９８２号による）、微加工メンブラン（例えば、ＳＭＲＴ配列決定、例えばEidら、Science、３２３巻：１３３〜１３８頁（２００９年）による）、またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤ配列決定またはポロニー配列決定、例えばKimら、Science、３１６巻：１４８１〜１４１４頁（２００７年）による）を含むことができる。
【０３５２】
別の実施形態では、本開示の方法は、それらが固体表面の上で空間的に単離される前後に、単離された分子を増幅することを含む。前での増幅は、乳濁液ＰＣＲまたはローリングサークル増幅などの乳濁液ベースの増幅を含むことができる。参照により組み込まれる、Bentleyら（上で引用した）に、および製造業者の使用説明書（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）試料調製キットおよびデータシート、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、２０１０年）に；ならびに以下の参考文献：米国特許第６，０９０，５９２号；第６，３００，０７０号；第７，１１５，４００号；および欧州特許第０９７２０８１Ｂ１号にさらに記載の通りに、個々の鋳型分子が固体表面で空間的に単離され、その後それらはブリッジＰＣＲによって並行して増幅され、別個のクローン集団またはクラスタを形成し、次に配列決定される、Ｓｏｌｅｘａベースの配列決定も教示される。
【０３５３】
一実施形態では、固体表面に置かれ、増幅される個々の分子は、１ｃｍ２あたり少なくとも１０５個のクラスタの密度、または１ｃｍ２あたり少なくとも５×１０５の密度；または１ｃｍ２あたり少なくとも１０６個のクラスタの密度でクラスタを形成する。一実施形態では、比較的高い誤り率を有する配列決定化学が用いられる。そのような実施形態では、そのような化学によって生成される平均品質スコアは、配列読み取りデータの長さの単調な下降関数である。一実施形態では、そのような下降は、配列読み取りデータの０．５パーセントが１〜７５位に少なくとも１つの誤りを有すること；配列読み取りデータの１パーセントが７６〜１００位に少なくとも１つの誤りを有すること；および配列読み取りデータの２パーセントが１０１〜１２５位に少なくとも１つの誤りを有することに対応する。
配列バリアント
【０３５４】
一部の実施形態では、改変ＧＡＰＤＨは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変ＧＡＰＤＨは、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｇｄｈ酵素のバリアントは、配列番号４２または４４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ａｓｄのバリアント酵素は、配列番号３０または４０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｄａｐＢのバリアント酵素は、配列番号４６または４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｄｄｈのバリアント酵素は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
【０３５５】
一部の実施形態では、ｇｄｈのバリアント酵素は、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ａｓｄのバリアント酵素は、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素は、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
【０３５６】
一部の実施形態では、マルチコピー複製プラスミドは、配列番号７７のｔｈｒＡＢＣオペロン配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性である配列を含む。一部の実施形態では、ｇａｐＡの組換えタンパク質断片は、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性である配列を含む。
【実施例】
【０３５７】
以下の実施例は本開示の様々な実施形態を図示するために与えられ、決して本開示を限定するものでない。請求項の範囲によって規定される本開示の精神の範囲内に包含されるその中の変更および他の使用は、当業者に認められる。
【０３５８】
これらの実施例は、ＮＡＤＰＨの利用能によって制限される、宿主細胞における目的の生成物の産生を増加させる方法を実証する。本開示の教示される方法は、その代謝経路においてＮＡＤＰＨの利用能に依存する目的の任意の生成物の産生を増加させるために利用することができる。例えば、本開示は、その産生が細胞内のＮＡＤＰＨの利用能によって制限される２つの目的の生成物である、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンなどのアミノ酸の産生を増加させる方法を提供する。
【０３５９】
ＮＡＤＰＨは、細菌におけるＬ−リシンおよびＬ−スレオニン生産の制限因子であることが公知である。したがって、これらの実施例は、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニン産生の増加につながる、宿主細胞におけるＮＡＤＰＨ利用能に対する制限を克服するための６つの戦略を例示する。これらの戦略は以下の通りである：（１）その酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること；（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する宿主細胞においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること；（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよび／またはａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、リシン、スレオニン、イソロイシンおよびメチオニンの前駆体であるアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）の合成を再プログラミングすること；（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性のｄａｐＢおよび／またはｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによってリシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること；（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性ＩｔＡの相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすること；および（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰｙＣ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ＰｙＣの発現を増大させること。一実施形態では、標的生物は、Ｅ．ｃｏｌｉである。一実施形態では、標的生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．である。
【０３６０】
読者を支援する目的のためだけに、下に簡単な目次を提供する。この目次の中身は、本出願の実施例の範囲も開示の範囲も制限するものでない。
【表３−１】
2020520645.tif 000006
【表３−２】
2020520645.tif 000007
【０３６１】
（実施例１）
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の補酵素特異性を拡大する−リシン
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、中心炭素代謝経路に関与する酵素である。ＧＡＰＤＨの最も一般的な形は、これまでに研究されたすべての生物において見出されるＮＡＤ依存性の酵素ｇａｐＡである。この酵素はｇａｐＡ遺伝子によってコードされ、グリセルアルデヒド−３−リン酸をグリセリン酸−１，３−二リン酸に変換する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのｇａｐＡ酵素のアミノ酸配列は、以下の通りである：
【化１】
2020520645.tif 000008
【０３６２】
図１に示すように、グリセルアルデヒド−３−リン酸をグリセリン酸−１，３−二リン酸に変換する補酵素として、ｇａｐＡ酵素はＮＡＤを使用する。この過程で、ＮＡＤはＮＡＤＨに変換される。さらに図１に示すように、解糖系は、細菌におけるＬ−リシン産生に導く生合成経路に原料を供給する。しかし、上記のように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるＬ−リシンの生物工学的生産における重要な因子は、ＮＡＤＰＨの十分な供給である。このように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてＮＡＤＰＨ産生を増加させることは、Ｌ−リシンの産生の増加につながるはずである。この目標を達成する１つの方法は、改変される酵素がＮＡＤＰを補因子として使用し、その結果としてＮＡＤＰＨのより多くの量が細胞において生成されるように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇａｐＡの補酵素特異性を変更することであろう。このように、この実験の目的は、ＮＡＤＰを含むようにｇａｐＡの補酵素特異性を拡大することによって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるリシン生産性を改善することであった。
【０３６３】
以前の研究は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇａｐＡにおけるＤ３５Ｇ、Ｌ３６Ｔ、Ｔ３７ＫおよびＰ１９２Ｓ突然変異が、その酵素の補酵素特異性（ＮＡＤからＮＡＤＰに）の変更をもたらすことを示している（Bomareddy  R.R.ら（２０１４年）、Metab.  Eng.、２５巻：３０〜３７頁）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのいくつかの株を生成し、各々は、下の表４に示すように、上の突然変異の１つまたは複数を有するｇａｐＡ酵素を発現していた。
【０３６４】
これらの株は、天然のｇａｐＡを有する参照株と比較してＬ−リシンを産生するそれらの能力について試験した。Ｔ３７Ｋ突然変異が、単独でまたはＬ３６Ｔ突然変異と組み合わせて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇａｐＡの補酵素特異性の広幅化につながり、そのため、改変された酵素がＮＡＤおよびＮＡＤＰへの選好性を示し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける改変された酵素の発現はリシンの生産性の有意な改善をもたらしたことを見出した（図２）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇａｐＡ突然変異株（Ｔ３７ＫおよびＬ３６Ｔ／Ｔ３７Ｋ）の構築を、下に記載する。
【０３６５】
ｇａｐＡ遺伝子は、市販のオリゴを使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）の染色体ＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ断片をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍクローニングベクターにアセンブルし、標準の部位特異的突然変異誘発技術を使用して突然変異誘発した。正しくアセンブルされたクローンを同定するために、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換のためにベクターＤＮＡを増幅するために、最初に標準のヒートショック形質転換技術を使用してベクターをＥ．ｃｏｌｉに形質転換させた。
【０３６６】
検証されたクローンは、電気穿孔を通してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞に形質転換させた。各形質転換のために、ＤＮＡ  １μｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を挿入サイズの関数として判定した。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムの組込みも相同性の腕の長さの関数として分析し、結果は、より短い腕がより低い効率を有することを示した。
【０３６７】
カナマイシン耐性選択遺伝子のループアウトについて対抗選択するために、挿入カセットの組込みが成功したと同定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養をカナマイシン含有培地で培養した。
【０３６８】
ループアウト事象をさらに検証するために、カナマイシン耐性を示すコロニーを培養し、配列決定を通して分析した。
【０３６９】
２つの異なるリシン産生性バックグラウンド株親＿２および親＿１において、上記のプロセスによっていくつかの突然変異株を生成した。表４は、各親株に導入された特異的突然変異を記載する。
【表４】
2020520645.tif 000009
【０３７０】
新たに作出された各株およびその親株は、産物力価性能を評価するように設計された小規模培養（例えば、９６ウェルプレート）においてリシン収率について試験した。小規模培養は、工業規模の培養からの培地を使用して実行した。産物力価は、標準の比色アッセイによって炭素消耗時（すなわち、単一バッチ収率に相当する）に光学的に測定した。簡潔には、試薬の最終濃度が１６０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、０．２ｍＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．２Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼおよび０．００５Ｕ／ｍＬのリシンオキシダーゼであるように濃縮アッセイ混合物を調製して、発酵試料に加えた。反応をエンドポイントまで進行させ、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光計を５６０ｎｍの波長で使用して光学密度を測定した。実験の結果は、図２に要約する。
【０３７１】
ＮＡＤＰへの変更された補酵素特異性を付与するある特定の突然変異を有するＧＡＰＤＨの導入は、リシンの生産性を有意に改善した（図２）。株７０００１８２９９４および７０００１８４３４８は各々Ｔ３７Ｋを含有し、それらのそれぞれの親である親＿１および親＿２より優れた性能を発揮する。株７０００１８２９９９および７０００１８４３５２は各々Ｔ３７ＫおよびＬ３６Ｔを含有し、それらのそれぞれの親である親＿１および親＿２より優れた性能を発揮する。株７０００１８２９９７および７０００１８４３４９は、各々Ｐ１９２Ｓを含有する。株７０００１８２９９８および７０００１８４３４７は、各々Ｌ３６Ｔを含有する。
【０３７２】
（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株、Ｗ３１１０のスレオニン産生性基準株の構築
リシン（ならびに、メチオニン、イソロイシンおよびグリシン）と同様に、スレオニン合成経路に導く初期のステップはオキサロアセテートからアスパルテートへの変換を含み、それは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ｇｄｈ）によって２−オキソグルタレートから再生されるグルタメートを使用する。アスパルテートはアスパルチルリン酸に次に変換され、引き続き、酵素アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）によるアスパルチルリン酸からアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）への還元が起こる。これらのステップは、リシン、スレオニン、イソロイシンおよびメチオニン生合成に共通する。スレオニン形成は、ａｓｄによるアスパルチルリン酸からＡＳＡへの変換の他に、３つのさらなるステップを必要とする：（１）二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）によるホモセリンへのＡＳＡの変換、（２）ホモセリンキナーゼ（ｔｈｒＢ）によるホモセリンからＬ−ホモセリンリン酸へ、最後に、（３）スレオニンシンターゼ（ｔｈｒＣ）によるスレオニンへのＬ−ホモセリンリン酸の変換。これらの最後の３ステップは、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＨとは無関係に機能する。
【０３７３】
先ず、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株、Ｗ３１１０を使用してスレオニン産生性基準株を生成した。このスレオニン基準株は、２つのステップで作出した：先ず、以下からなった天然のＥ．ｃｏｌｉ、ｔｈｒＬＡＢＣレギュロン（配列番号７６）を過剰発現させた：ｔｈｒＬ（スレオニンおよびイソロイシンコドンに富むリーダー配列、および直後にオペロンにおける酵素コード遺伝子の転写を阻止する働きをする機能的転写ターミネーターが続く）；ｔｈｒＡ（二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１）；ｔｈｒＢ（ホモセリンキナーゼ）およびｔｈｒＣ（スレオニンシンターゼ）。このポリヌクレオチドは、市販のオリゴヌクレオチドを使用してＷ３１１０ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ｔｈｒＬＡＢＣオペロンを、合成プロモーターｐＭＢ０８５（図８Ａ；配列番号７５）の制御下のマルチコピー複製プラスミド（改変ｐＵＣ１９ベクター；配列番号：７８）に挿入した。発現の減弱を緩和するために、ｔｈｒＬリーダー配列が除去された、このプラスミドのバリアントを構築した（図８Ｂ；配列番号７７）。第２に、２−アミノ−３−ケト酪酸へのＬ−スレオニンの酸化を触媒することによってスレオニン産生の反対に作用する酵素、Ｌ−スレオニン３−デヒドロゲナーゼ（ｔｄｈ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０染色体の領域を削除した。
【０３７４】
結果として生じるＷ３１１０スレオニン基準株Ｗ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＬＡＢＣΔｔｄｈ（ＴＨＲ０１；７０００３３６１１３）およびＷ３１１０  ｐＭＢ０８５ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ（ＴＨＲ０２；７０００３４１２８２）におけるスレオニン産生を評価するために、産物力価性能を評価するように設計された小規模培養（例えば、９６ウェルプレート）において各株、およびその親（Ｗ３１１０；７０００２８４１５５）をスレオニン収率について試験した。小規模（３００μｌ）培養を、ＴＰＭ１培地で成長させた。ＴＰＭ１培地は、１リットルあたり、グルコース、５０ｇ；酵母エキス、２ｇ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、４ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４ｇ；ベタイン、１ｇ；Ｌ−メチオニン、０．１４９ｇ；Ｌ−リシン、０．１６４ｇ；希少金属溶液、５ｍｌおよびＣａＣＯ３、３０ｇを含有する。希少金属溶液は、１リットルあたり、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１０ｇ；ＣａＣｌ２、１．３５ｇ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ；ＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、１ｇ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇ；Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ；３５％ＨＣｌ、１０ｍｌを含有する。最終ｐＨは、４Ｎ  ＫＯＨを加えることによって７．２に調整した。クロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を必要に応じて培地に加えた。１０００ｒｐｍで恒常的に撹拌させた加湿（８０％湿度）ＩＮＦＯＲＳ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏインキュベーター振盪機の中で、培養を３７℃で概ね３６時間成長させた。
【０３７５】
ペプチドおよびタンパク質加水分解物アミノ酸のためのＡｃｃＱ・Ｔａｇ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）プレカラム誘導体化および分析技術を使用して、無細胞培地の試料においてスレオニン力価を判定した。試料中に存在するアミノ酸の誘導体化のために、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ・Ｆｌｕｏｒ試薬を使用した。これらの誘導体は、次に逆相ＨＰＬＣによって分離し、蛍光検出によって定量化した。６６０ｎｍの波長でＴｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光計を使用して光学密度（ＯＤ）を測定することによってバイオマス推定値を各試料について判定し、標準の比色アッセイによって最終グルコース濃度を判定した。簡潔には、濃縮アッセイ混合物は、以下の通りの試薬の最終濃度で調製した：１７５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０；０．２ｍＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（Ｃｈｅｍｏｄｅｘ  ＣＤＸ−Ａ００２２）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒからの１６Ｕ／ｍＬグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７１４１）および０．２Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＶＷＲ０４１７−２５０００）。暗所の中で反応を室温で３０分間進行させ、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光計を５６０ｎｍの波長で使用して光学密度を測定した。以下の実施例に記載される株の力価を計算し、収率および生産性を推定するために、上記の培養条件および測定値を使用した。
【０３７６】
（実施例３）
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の補酵素特異性を拡大する−スレオニン
以下の実施例の実験のために、実施例２に記載される基準株を使用した。
【０３７７】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、中心炭素代謝経路に関与する酵素である。ＧＡＰＤＨの最も一般的な形は、これまでに研究されたすべての生物において見出されるＮＡＤ依存性の酵素ｇａｐＡである。この酵素はｇａｐＡ遺伝子によってコードされ、グリセルアルデヒド−３−リン酸をグリセリン酸−１，３−二リン酸に変換する。
【０３７８】
図９に示すように、グリセルアルデヒド−３−リン酸をグリセリン酸−１，３−二リン酸に変換する補酵素として、ｇａｐＡ酵素はＮＡＤを使用する。この過程で、ＮＡＤはＮＡＤＨに変換される。さらに図９および図１０Ａ〜Ｃに示すように、解糖系は、細菌におけるＬ−スレオニン産生に導く生合成経路に原料を供給する。しかし、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉによるＬ−スレオニンの生物工学的生産における重要な因子は、ＮＡＤＰＨの十分な供給である。このように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＮＡＤＰＨ産生を増加させることは、Ｌ−スレオニンの産生の増加につながるはずである。この目標を達成する１つの方法は、改変される酵素がＮＡＤＰを補因子として使用し、その結果としてＮＡＤＰＨのより多くの量が細胞において生成されるように、ｇａｐＡの補酵素特異性を変更することであろう。このように、この実験の目的は、ＮＡＤＰを含むようにｇａｐＡの補酵素特異性を拡大することによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるスレオニン生産性を改善することであった。
【０３７９】
以前の研究は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇａｐＡにおけるＤ３５Ｇ、Ｌ３６Ｔ、Ｔ３７ＫおよびＰ１９２Ｓ突然変異が、その酵素の補酵素特異性の変更（ＮＡＤからＮＡＤＰに）をもたらすことを示している（Bomareddy  R.R.ら（２０１４年）、Metab.  Eng.、２５巻：３０〜３７頁）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのｇａｐＡ酵素のアミノ酸配列は、以下の通りである：
【化２】
2020520645.tif 000010
ここで、異種（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｇａｐＡ酵素のバリアントを各々発現するＥ．ｃｏｌｉのいくつかの株を生成した：下の表５に示すように、上記の突然変異の１つを有するｇａｐＡｖ５（配列番号６９）、ｇａｐＡｖ７（配列番号７１）またはｇａｐＡｖ８（配列番号７３）。
【表５】
2020520645.tif 000011
【０３８０】
これらの株を、天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡ（配列番号６７）を有する参照株（Ｗ３１１０ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈ）と比較してＬ−スレオニンを産生するそれらの能力について試験した。すべての３つのバリアント−ｇａｐＡｖ５（配列番号６９）、ｇａｐＡｖ７（配列番号７１）およびｇａｐＡｖ８（配列番号７３）−の発現が、有意に改善されたスレオニン力価を独立してもたらすことを見出した（図１１Ａ）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡ突然変異株の構築を、下に記載する。
【０３８１】
市販のオリゴを使用してＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍクローニングベクターからＰＣＲによってｇａｐＡバリアント（ｇａｐＡｖ５（配列番号６９）、ｇａｐＡｖ７（配列番号７１）またはｇａｐＡｖ８（配列番号７３））を増幅した。天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡは、Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ断片をＥ．ｃｏｌｉクローニングベクター改変ｐＵＣ１９ベクター（配列番号７０、７２および７４として提供されるコードポリヌクレオチド配列）にアセンブルし、最初に、正しくアセンブルされたクローンを同定するために、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０スレオニン基準株ＴＨＲ０１およびＴＨＲ０２への形質転換のためにベクターＤＮＡを増幅するために、標準のヒートショック形質転換技術を使用してＮＥＢ１０−ベータＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換させた。
【０３８２】
新たに作出された各株およびその親株は、上記の小規模培養（例えば、９６ウェルプレート）においてスレオニン産生について試験した。
【０３８３】
ＮＡＤＰへの変更された補酵素特異性を付与するある特定の突然変異を有するＧＡＰＤＨの導入は、スレオニン力価を有意に改善した（図１１Ａ）。株７０００３４２７２６（ｇａｐＡｖ５）、７０００３４２７２０（ｇａｐＡｖ７）および７０００３４２７２７（ｇａｐＡｖ８）は、すべてそれらの親株（７０００３４１２８２）およびＥ．ｃｏｌｉ  ｇａｐＡの第２のコピーを発現する親（７０００３４２７２３）より高い性能を発揮する。
【表６】
2020520645.tif 000012
【０３８４】
（実施例４）
ＮＡＤＨへの補因子特異性を有するバリアント酵素を利用することによってリシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングする
細菌におけるＬ−リシン産生につながる生合成経路は、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）経路として公知である（図１）。ＤＡＰ経路に向かう初期のステップはオキサロアセテートからアスパルテートへの変換を含み、それは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ｇｄｈ）によって２−オキソグルタレートら再生されるグルタメートを使用する。アスパルテートはアスパルチルリン酸に次に変換され、引き続き、酵素アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）によるアスパルチルリン酸からアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）への還元が起こる。これらのステップは、リシン、スレオニン、イソロイシンおよびメチオニン生合成に共通する。リシン生合成への第１の専任ステップはＡＳＡからジヒドロピコリネート（ＤＨＤＰ）への変換であり、ジヒドロピコリン酸シンターゼによって触媒される。ＤＨＤＰは、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）によってテトラヒドロピコリネート（ＴＨＤＰＡ）に次に還元される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含むいくつかの細菌は、酵素メゾ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）を有し、それは、ＴＨＤＰＡからメゾ−ジアミノピメレート（ｍＤＡＰ）への直接的変換を触媒し、これはジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼによってＬ−リシンに次に変換される。
【０３８５】
図１に示すように、天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈの各々は、それらのそれぞれの作用のために補酵素としてＮＡＤＰＨを必要とする。しかし、ＮＡＤＰＨは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける工業規模でのグルコースからのＬ−リシン生産における制限因子の１つである（Beckerら（２００５年）、Appl.  Environ.  Microbiol.、７１巻（１２号）：８５８７〜８５９６頁）。このように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてＮＡＤＰＨ産生を増加させることは、Ｌ−リシン産生の増加につながるはずである。この目標を達成する１つの方法は、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈの天然に存在する相同体を利用することによって、ＮＡＤＰＨの利用を減少させることであろう。したがって、この実験の目的は、ＮＡＤＰＨと共にＮＡＤＨを含むように、ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈの補酵素依存性を拡大することであった。
【０３８６】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素ｇｄｈおよびｄａｐＢは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ（Lilley  K.S.ら（１９９１年）、Biochim  Biophys  Acta、１０８０巻（３号）：１９１〜１９７頁）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Reddy  S.G.ら（１９９５年）、Biochemistry、３４巻（１１号）：３４９２〜３５０１頁）のそれぞれにおいて、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する公知の相同体を有する。そのような相同体は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素ａｓｄおよびｄｄｈでは公知ではない。このように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素ａｓｄおよびｄｄｈのアミノ酸配列バリアントを見出すために、細菌においてゲノムワイドの相同性検索を実行した。相同性検索は、ａｓｄおよびｄｄｈの各々について９つのバリアントを与えた。バリアントの供給源およびそれらの配列を、表７に要約する。ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのＤＮＡ配列は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに最適化されたコドンである。
【表７】
2020520645.tif 000013
【０３８７】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｄｈおよびｄａｐＢの公知の相同体ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのａｓｄおよびｄｄｈの９つのバリアントをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける発現のためにコドン最適化した。図４に示すように、ｇｄｈおよびｄａｐＢの２つのバージョンの各々の１コピーならびにａｓｄおよびｄｄｈの１０個のバージョンの各々の１コピーを、カナマイシン耐性マーカー遺伝子を含有するプラスミドの中に様々な組合せでクローニングした。この実施例で試験した酵素の組合せは、表７に要約する。
【０３８８】
各ａｓｄ−ｇｄｈ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ組合せを、プラスミド（配列番号５１）にクローニングした。図４は、１つの例示的なａｓｄ−ｇｄｈ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ試験組合せのためのカセット配置を図示する。調節配列は、配列番号５２〜５７であった。各試験組合せの最終カセットは、以下の通りに５’から３’末端にかけて表すことができる：
【表Ａ】
2020520645.tif 000014
ｄａｐＢおよびｄｄｈ対立遺伝子の逆相補体の配向は発現カセット配置の帰結であり、前記対立遺伝子のサイレンシングを誘発する意図を表すものでないことに注意する。
【表８−１】
2020520645.tif 000015
【表８−２】
2020520645.tif 000016
【０３８９】
正しくアセンブルされたクローンを同定するために、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換のためにベクターＤＮＡを増幅するために、最初に標準のヒートショック形質転換技術を使用して各プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換させた。
【０３９０】
検証されたクローンは、電気穿孔を通してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞に形質転換させた。各形質転換のために、ＤＮＡ  １μｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を挿入サイズの関数として判定した。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムの組込みも相同性の腕の長さの関数として分析し、結果は、より短い腕がより低い効率を有することを示した。
【０３９１】
カナマイシン耐性選択遺伝子のループアウトについて対抗選択するために、挿入カセットの組込みが成功したと同定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養をカナマイシン含有培地で培養した。
【０３９２】
ループアウト事象をさらに検証するために、カナマイシン耐性を示すコロニーを培養し、配列決定を通して分析した。
【０３９３】
４つの全酵素が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて同時に発現された。
【０３９４】
各酵素の異種バージョンを含有する組換え株を３つの異なる親株から作製し、そのすべては遺伝的に異なるリシン生産株である。新たに作出された各株およびその親株は、産物力価性能を評価するように設計された小規模培養（例えば、９６ウェルプレート）においてリシン収率について試験した。小規模培養は、工業規模の培養からの培地を使用して実行した。産物力価は、標準の比色アッセイによって炭素消耗時（すなわち、単一バッチ収率に相当する）に光学的に測定した。簡潔には、試薬の最終濃度が１６０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、０．２ｍＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．２Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼおよび０．００５Ｕ／ｍＬのリシンオキシダーゼであるように濃縮アッセイ混合物を調製して、発酵試料に加えた。反応をエンドポイントまで進行させ、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光計を５６０ｎｍの波長で使用して光学密度を測定した。実験の結果は表９に提供し、図５Ａおよび図５Ｂに要約する。
【０３９５】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｄｄｈの天然の酵素ならびにｇｄｈ、ａｓｄおよびｄａｐＢのための同じ３つの異種酵素（ＮＡＤＨを使用するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ  ｇｄｈおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄａｐＢの公知のバージョン、ならびにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓからのａｓｄのバリアント）を各々含有する２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ組換え株、７０００１８６９６０および７０００１８６９９２は、それらのそれぞれの親である親＿３および親＿４と比較してＬ−リシンの有意に改善された生産性を示した（図５Ａ）。異なる酵素の組合せの作用に関するデータは表９に提供し、親と比較した有意な改善につながる酵素組合せは太字で強調されている。
【表９−１】
2020520645.tif 000017
【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【０３９６】
４遺伝子カセットの２つのバージョンをＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの親＿６に導入し、リシンの産生をモニタリングした。ＮＡＤＰＨではなく代替の補因子ＮＡＤＨのそれらの使用に基づいて、４つの遺伝子を選択した。４遺伝子カセットｖ１（株２６３２５４）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのアスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（配列番号３９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍからのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）（配列番号４３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）（配列番号４７）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのメゾ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）（配列番号３）を含有する。したがって、４遺伝子カセットｖ１（株２６３２５４）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのアスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（配列番号４０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍからのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）（配列番号４４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）（配列番号４８）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのメゾ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）（配列番号４）をコードする。
【０３９７】
４遺伝子カセットｖ２（株２６３２６４）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓからのアスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（配列番号２９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍからのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）（配列番号４３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）（配列番号４７）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのメゾ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）（配列番号３）を含有する。したがって、４遺伝子カセットｖ２（株２６３２６４）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓからのアスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（配列番号３０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍからのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）（配列番号４４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）（配列番号４８）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのメゾ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）（配列番号４）をコードする。
【０３９８】
４遺伝子カセットは、プレートモデル９においてリシン産生を有意に改善した。データは、表１０に要約する。
【表１０】
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【０３９９】
（実施例５）
ＮＡＤＨへの補因子特異性を有するバリアント酵素を利用することによってスレオニン生合成経路を再プログラミングする
実施例２に記載される基準株を、以下の実施例の実験のために使用した。
【０４００】
細菌におけるＬ−スレオニン産生につながる生合成経路は、ｔｈｒＡＢＣ経路として公知である（図９）。リシン（ならびに、メチオニン、イソロイシンおよびグリシン）と同様に、スレオニン合成経路に導く初期のステップはオキサロアセテートからアスパルテートへの変換を含み、それは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ｇｄｈ）によって２−オキソグルタレートから再生されるグルタメートを使用する。アスパルテートはアスパルチルリン酸に次に変換され、引き続き、酵素アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）によるアスパルチルリン酸からアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）への還元が起こる。これらのステップは、リシン、スレオニン、イソロイシンおよびメチオニン生合成に共通する。スレオニン形成は、ａｓｄによるアスパルチルリン酸からＡＳＡへの変換の他に、３つのさらなるステップとして、二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）によるＡＳＡからホモセリンへの変換、ホモセリンキナーゼ（ｔｈｒＢ）によるホモセリンからＬ−ホモセリンリン酸、および最後にスレオニンシンターゼ（ｔｈｒＣ）によるＬ−ホモセリンリン酸からスレオニンへの変換を必要とするが、これらの最後の３ステップはＮＡＤＰ／ＮＡＤＨとは無関係に機能し、この経路におけるいかなる可能なボトルネックもｔｈｒＡＢＣオペロンの過剰発現によってスレオニン基準株において脱リスクされる。
【０４０１】
図９に示すように、天然のＥ．ｃｏｌｉ酵素ｇｄｈおよびａｓｄの各々は、それらのそれぞれの作用のために補酵素としてＮＡＤＰＨを必要とする。しかし、ＮＡＤＰＨは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける工業規模でのグルコースからのＬ−スレオニン生産における制限因子の１つである（Beckerら（２００５年）、Appl.  Environ.  Microbiol.、７１巻（１２号）：８５８７〜８５９６頁）。このように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＮＡＤＰＨ産生を増加させることは、Ｌ−スレオニンの産生の増加につながるはずである。この目標を達成する１つの方法は、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用するＥ．ｃｏｌｉ酵素ｇｄｈおよびａｓｄの天然に存在する相同体を利用することによって、ＮＡＤＰＨの利用を減少させることであろう。したがって、この実験の目的は、ＮＡＤＰＨと共にＮＡＤＨを含むように、ｇｄｈおよびａｓｄの補酵素依存性を拡大することであった。
【０４０２】
Ｅ．ｃｏｌｉ酵素ｇｄｈは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍにおいて、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する公知の相同体を有する（Lilley  K.S.ら（１９９１年）、Biochim  Biophys  Acta、１０８０巻（３号）：１９１〜１９７頁）。そのような相同体は、Ｅ．ｃｏｌｉのａｓｄでは公知ではない。より強力なＮＡＤＨ選好性を有するさらなるｇｄｈ相同体およびＮＡＤＨ選好性を有するａｓｄの新規相同体を同定することができるかどうか調査するために、環境試料から作成した自家製のメタゲノミクスライブラリーのゲノムワイド相同性検索を実行した。検索は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓのａｓｄ（ａｓｄ＿ｌａｇ；配列番号３０）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓのｇｄｈ（ｇｄｈ＿ｃｓｙ；配列番号４４）のタンパク質配列を使用した前記ライブラリーのＢｌａｓｔＰ分析からなった。相同性検索は数百の配列を取り出したが、各酵素のために２４個の配列のライブラリーに到達するためにさらなるフィルタリングおよび選択基準を適用した。クエリー配列に対して７０％未満の同一性の結果のフィルタ処理したサブセットから、各酵素の概ね１２個の配列を選択した。クエリー配列に対して７０％を超える同一性を有する配列のサブセットから、概ね１２個の別の配列を選択した。
【表１１】
2020520645.tif 000024
【表１２−１】
2020520645.tif 000025
【表１２−２】
2020520645.tif 000026
【表１２−３】
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【０４０３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｄｈの公知の相同体（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓのｇｄｈ；配列番号１３４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓのａｓｄ（配列番号８０）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ならびに、市販のオリゴを使用してＰＣＲによって増幅し、図１２に示すように調節配列、プロモーターｐＭＢ０３８（配列番号２３７）および転写ターミネーター（配列番号２３８）を含有するマルチコピープラスミドｐ１５Ａベースの配列（配列番号２３９）にクローニングした酵素の２４個のバリアント。ａｓｄのバージョン２６およびｇｄｈのバージョン２６の各々の１コピーを、ｐ１５Ａに基づくマルチコピープラスミド骨格（配列番号２３９）の中に二シストロン性カセットとして様々な組合せによってクローニングした。
【０４０４】
正しくアセンブルされたクローンを同定するために、およびスレオニン基準株（ＴＨＲ０１−０２）の形質転換のためにベクターＤＮＡを増幅するために、最初に標準のヒートショック形質転換技術を使用して各プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換させた。
【０４０５】
検証されたクローンは、電気穿孔を通してＥ．ｃｏｌｉ基準株細胞に形質転換させた。新たに作出された各株およびその親株は、上記の通りに小規模培養においてスレオニン収率について試験した。実験の結果は、表１３に提供する。対立遺伝子ａｓｄ＿１３（配列番号１０８）およびａｓｄ＿１８（配列番号１１８）はより優れた性能を発揮したが、対照と有意に異ならなかった。対立遺伝子ｇｄｈ＿１（配列番号１３６）、ｇｈｄ＿８（配列番号１５０）、ｇｄｈ＿１４（配列番号１６２）、ｇｄｈ＿１６（配列番号１６６）、ｇｄｈ＿１８（配列番号１７０）、ｇｄｈ＿２０（配列番号１７４）およびｇｄｈ＿２２（配列番号１７８）の各々は、Ｗ３１１０および対照株と比較してスレオニンが増加した（図１３）。すべての株の構築および試験が成功したというわけではなかった。劣る／無成長および統計的外れ値を提示した複製試料は、図１３に示さないが表１３に表す。
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【０４０６】
（実施例６）
異なる基質選好性および酵素動態を有するバリアントスレオニンアルドラーゼ酵素を利用することによってスレオニン力価を改善する
実施例２に記載される基準株を、以下の実施例の実験のために使用した。
【０４０７】
この実施例は、異種スレオニンアルドラーゼ遺伝子を使用して細菌宿主細胞においてＬ−スレオニン製造を増大する方法を実証する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、スレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）は、Ｌ−スレオニンをアセトアルデヒドおよびグリシンに変換することによってスレオニン蓄積の反対に作用する。しかし、スレオニンアルドラーゼ酵素（ＴＡ）のより広い分類学的ファミリーの中に、多様な基質特異性および酵素動態が存在する。この実施例は、異なる基質選好性または酵素動態を有する異種ＴＡを加えるかまたは天然のｌｔａＥ遺伝子と置換することを可能にすることによってスレオニンの収率を改善するために、ＴＡの間で見出される多様な基質選好性を活用する戦略を例示する。しかし、上記の実施形態と同様に、この実施例は例示的であり、本開示の範囲を限定するものと決してみなすべきでないことに留意すべきである。
【０４０８】
アルドラーゼは、アクセプター構成成分へのドナー構成成分（求核体）の可逆的アルドール付加を触媒する。Ｅ．ｃｏｌｉのスレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）は、グリシンおよびアセトアルデヒドへのＬ−アロ−スレオニンおよびＬ−スレオニンの切断を触媒する（図１０Ａ）。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｌｔａＥは、Ｌ−スレオニンをグリシンに変換することによってスレオニン蓄積の反対に作用する。しかし、スレオニンアルドラーゼ遺伝子（ＴＡ）のより広い分類学的ファミリーの中に、多様な基質特異性が存在する。Ｌ−スレオニンの形成のために好ましい基質選好性（例えば、セリン、アラニン）および動態学を有するＴＡが記載されている（Feskoら、２０１５年）。
【０４０９】
スレオニン産生を好む基質選好性または酵素動態を有するＥ．ｃｏｌｉのｌｔａＥの相同体を同定することができるかどうか調査するために、環境試料から作成した自家製のメタゲノミクスライブラリーのゲノムワイド相同性検索を実行した。検索は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｏｒ  ｓａｋａｚａｋａｉｉのスレオニンアルドラーゼ（Ｃｓａ＿ｌｔａＥ；配列番号１８３）、グリシンへの選好性が報告されている酵素、からのタンパク質配列を使用した前記ライブラリーのＢｌａｓｔＰ分析からなった（Feskoら、２０１５年）。ｌｔａＥ検索は数百の配列を取り出したが、２４個の配列のライブラリーに到達するためにさらなるフィルタリングおよび選択基準を適用した。クエリー配列に対して７０％未満の同一性の結果のフィルタ処理したサブセットから、概ね１２個の配列を選択した。クエリー配列に対して７０％を超える同一性を有する配列のサブセットから、概ね１２個の別の配列を選択した。
【０４１０】
Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｏｒ  ｓａｋａｚａｋａｉｉのスレオニンアルドラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＥ．ｃｏｌｉのためにコドン最適化し（配列番号１８３）、ｇＢｌｏｃｋ遺伝子断片（ＩＤＴ）として合成した。２４個のｌｔａＥバリアントは市販のオリゴを使用してＰＣＲによって増幅し、図１２に示すようにプロモーターｐＭＢ０３８（配列番号２３７）および天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｔｈｒＬの転写ターミネーター（配列番号２３８）を含有するマルチコピープラスミドｐ１５Ａベースの配列（配列番号２３９）にクローニングした。
【０４１１】
正しくアセンブルされたクローンを同定するために、およびＥ．ｃｏｌｉスレオニン基準株への形質転換のためにベクターＤＮＡを増幅するために、最初に標準のヒートショック形質転換技術を使用して各プラスミドを化学的にコンピテントであるＮＥＢ  １０ベータＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換させた。
【０４１２】
検証されたクローンは、電気穿孔を通してＥ．ｃｏｌｉ基準株細胞に形質転換させた。新たに作出された各株およびその親株は、上記の通りに小規模培養においてスレオニン収率について試験した。実験の結果は、表１４に提供する。対立遺伝子ｌｔａＥ＿６（配列番号１９６）、ｌｔａＥ＿１１（配列番号２０６）、ｌｔａＥ＿１８（配列番号２２０）、ｌｔａＥ＿２０（配列番号２２４）、ｌｔａ＿２４（配列番号２３２）の各々は、ｔｈｒＡＢＣ＋ｐ１５Ａの空のベクター対照（対照プラスミド）およびＷ３３１０株と比較してスレオニン力価が増加した（図１４）。
【表１４】
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【０４１３】
（実施例７）
Ｌ−スレオニン産生を増加させるためにＥ．ｃｏｌｉにおいて改変またはバリアントのｇａｐＡ、ｇｄｈ、ａｓｄおよびｌｔａＥ酵素の組合せを発現させる
実施例２に記載される基準株を、以下の実施例の実験のために使用した。
【０４１４】
ＮＡＤＰＨ産生をさらに増加させ、したがってＥ．ｃｏｌｉにおけるＬ−スレオニンの収率を増加させるために、上記の戦略の１つまたは複数を組み合わせて使用することができる。ｇａｐＡ、ｇｓｄ、ａｓｄ、ｌｔａＥの様々な組合せを、実施例２に記載されるＥ．ｃｏｌｉ  ｔｈｒＡＢＣΔｔｄｈバックグラウンドに導入した。一部の場合には、上記の通り、市販されているオリゴヌクレオチドを使用して、ｔｈｒＡＢＣオペロンの下流のポリシストロン性付加としてｐＭＢ０８５−ｔｈｒＡＢＣを含有し、ｐＭＢ０８５プロモーターによって促進される、同じ改変ｐＵＣ１９ベクターにこれらの組合せをクローニングし、その上で形質転換させた。複数の遺伝子が縦列で加えられたとき、以下のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）リンカーが含まれた：ＲＢＳ１（ａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｔａｔ（配列番号３０６）；ｔｈｒＣの後）、ＲＢＳ２（ａｇｇａｇｇｔｔｇｔ（配列番号３０７）；遺伝子１と２の間）およびＲＢＳ３（ｔｇａｃａｃｃｔａｔｔｇ（配列番号３０８）；遺伝子２と３の間）。これらのリンカー配列はオリゴヌクレオチドテールに含まれ、遺伝子のＰＣＲ増幅の間に導入された。ｇａｐＡ、ｇｓｄ、ａｓｄ、ｌｔａＥの組合せがｔｈｒＡＢＣを有するポリシストロン性オペロンとして発現されたとき、１５ｍｇ／Ｌのスレオニンまでのおよびそれより高い力価が特定の組合せ（図１１Ａ〜Ｃ）および表１５で観察された。
【表１５】
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【０４１５】
ｐＵＣ１９プラスミドの上でポリシストロン的に発現させた上の遺伝子組合せに加えて、上記の株の３つ（７０００３４２７２１、７０００３４２７２６および７０００３４２７２０；それぞれ、Ｃｓｙ＿ｇｄｈ（配列番号４４）、ｇａｐＡｖ５（配列番号６９）およびｇａｐＡｖ７（配列番号７１））を、ａｓｄ、ｇｄｈおよびｌｔａＥの個々のライブラリーバリアントを発現するｐ１５Ａプラスミド（配列番号２３９）（上で記載され、試験された）または空のｐ１５Ａベクター対照（例えば、Ｃｓｙ＿ｇｄｈ＋ｐ１５Ａ（−））で形質転換させた。これらの株およびそれらの性能（スレオニン力価）の要約を、表１６に示す。Ｗ３１１０以外のこれらの株のすべては、ｐＭＢ０８５−ｔｈｒＡＢＣ  ｔｄｈ欠失バックグラウンドの中にある。これらの実験では、最も重要な対照は、空のｐ１５Ａ対照プラスミドで形質転換した親株（Ｃｓｙ＿ｇｄｈ、ｇａｐＡｖ５およびｇａｐＡｖ７）である（それぞれ７０００３４９８８６、７０００３４９８８７および７０００３４９８８５；Ｃｓｙ＿ｇｄｈ＋ｐ１５Ａ（−）、ｇａｐＡｖ５＋ｐ１５Ａ（−）およびｇａｐＡｖ７＋ｐ１５Ａ（−））。Ｃｓｙ＿ｇｄｈ、ｇａｐＡｖ５またはｇａｐＡｖ７とａｓｄ、ｇｄｈまたはｌｔａＥバリアントのある特定の組合せは、スレオニン力価を改善した。ａｓｄ、ｇｄｈまたはｌｔａＥライブラリーバリアントを発現する株の多くで、少なくとも１つの生物学的複製が重要な対照株より優れた性能を発揮した（図１５）。改善されたスレオニン力価をもたらした個々の生物学的複製は、これらの組合せからもたらされる改善を示すと思われる。高い変動性（スレオニンを産生しない多数の複製からもたらされる大きな標準偏差）は、おそらく株が２つのプラスミドを維持しているときのプラスミドの不安定性または高率の突然変異の結果であるが、これらの遺伝子の染色体組込みによって緩和されるかもしれない。クロラムフェニコールにおけるさらなるｐ１５Ａプラスミドの維持および成長も、親と比較して２つのプラスミドを維持している株（例えば、親と比較した−ｐ１５Ａ（−）プラスミド）において観察されたより低い力価をもたらした。
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【０４１６】
（実施例８）
ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを作出するためにトランスヒドロゲナーゼを発現させる
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＬ−リシンの生物工学的生産における重要な因子は、ＮＡＤＰＨの十分な供給である。図１に示すように、メンブランと一体化されたニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ酵素は、ＮＡＤＨの酸化を通してＮＡＤＰ＋の還元を促進することができ、それによってＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する。したがって、トランスヒドロゲナーゼの発現は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける細胞内ＮＡＤＰＨ産生を、したがってＬ−リシン産生を増加させる有効な戦略である。
【０４１７】
（実施例９）
ピルビン酸カルボキシラーゼを発現させる
ピルビン酸カルボキシラーゼ（Pyruvate  carboxylate）は、成長の間、または工業生産発酵におけるリシンおよびグルタミン酸生産の間に生合成のために消費されるオキサロアセテートを補充する重要な補充酵素である。
【０４１８】
ピルビン酸カルボキシラーゼ（Pruvate  carboxylase）遺伝子をクローニングし、以下から配列決定をした：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ（Dunn,  F.  F.ら、J.  Bacteriol.１７８巻：５９６０〜５９７０頁（１９９６年））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Kondo,  H.ら、Gene１９１巻：４７〜５０頁（１９９７年）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ９７０２５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ８３０１８）およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Mukhopadhyay,  B.、J.  Biol.  Chem.２７３巻：５１５５〜５１６６頁（１９９８年）。ピルビン酸カルボキシラーゼ活性は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（Tosaka,  O.ら、Agric.  Biol.  Chem.４３巻：１５１３〜１５１９頁（１９７９年））およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Peters-Wendisch,  P.  G.ら、Microbiology１４３巻：１０９５〜１１０３頁（１９９７年）において以前に測定されている。
【０４１９】
研究は、アミノ酸のアスパラギン酸ファミリーの収率および生産性が、補充経路を通して炭素フラックスに決定的に依存することを示した（Vallino,  J.  J.およびStephanopoulos,  G.、Biotechnol.  Bioeng.４１巻：６３３〜６４６頁（１９９３年））。代謝産物平衡に基づいて、リシン産生速度が補充経路を通したオキサロアセテートの合成速度未満またはそれと同じであることを示すことができる。
【０４２０】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は突然変異体またはバリアントと置換することができ、それによって好ましくはピルビン酸カルボキシラーゼはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株におけるその発現より２〜２０倍高く発現される。
【０４２１】
Ｅ．ｃｏｌｉは、内因性ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が欠けていると考えられる。異種ピルビン酸カルボキシラーゼを提供することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは別の微生物からの異種ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、任意のＥ．ｃｏｌｉ株、例えば、実施例２に記載される基準株に導入することができる。一部の適用では、突然変異体またはバリアントのｐｙｃ遺伝子の発現レベルまたは活性レベルのために不十分なピルビン酸カルボキシラーゼ活性または過剰なピルビン酸カルボキシラーゼ活性のいずれかにより最適未満の結果しか達成することができないという点で、内因性または異種のピルビン酸カルボキシラーゼの発現レベルの精密なモジュレーションまたは微調整が望ましいかもしれない。そのような場合、発現をモジュレートまたは微調整するために、プロモーターラダーを使用することができる。様々な強度のプロモーターエレメントを様々なｐｙｃバリアントまたは突然変異体と組み合わせて試験することによって、最適な遺伝子活性をもたらすプロモーターおよびｐｙｃ遺伝子の組合せを判定することができ、所望の化合物、例えばＬ−スレオニンの産生の増加をもたらす。
【０４２２】
（実施例１０）
Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニン産生を増加させるために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉにおいて改変ｇａｐＡ、トランスヒドロゲナーゼと改変ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の組合せを発現させる
ＮＡＤＰＨ産生をさらに増加させ、したがってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉにおけるＬ−リシンまたはＬ−スレオニンの収率を増加させるために、上記の戦略の１つまたは複数を組み合わせて使用することができる。
【０４２３】
（実施例１１）
新規グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）対立遺伝子の同定
出発配列としてｇａｐＡｖ９（Ｄ３５Ｇ、Ｌ３６Ｔ、Ｔ３７Ｋ、Ｐ１９２Ｓ）（配列番号３０３）を使用して、ｇａｐＡ遺伝子のＮＮＫライブラリーを生成した。内因性ｇａｐＡ対立遺伝子を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、天然のｇａｐＡプロモーターの調節下の中立の組込み遺伝子座（ｃｇ１５０４とｃｇ１５０５の間）に、ｇａｐＡの第２のコピーとして各突然変異誘発された遺伝子を個々に導入した。リシン力価が改善された対立遺伝子を同定するために、２つの異なるプレートアッセイにおいて１２００を超えるｇａｐＡ要素をスクリーニングした。ある特定の要素は、親株（黒色のひし形）と比較してリシンの発現の増加を示した（黒色の円）（図１４）。
【０４２４】
いくつかの短縮型ｇａｐＡ配列は、リシン発現の増加をもたらした。天然のｇａｐＡ配列は、下線を引かれている。残りのアミノ酸は、フレームシフト突然変異のアーチファクトである。
【表１７】
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【表１８】
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【表Ｂ−１】
2020520645.tif 000036
【表Ｂ−２】
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【表Ｂ−３】
2020520645.tif 000038
【表Ｂ−４】
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【表Ｂ−５】
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【表Ｂ−６】
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【表Ｂ−７】
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【表Ｂ−８】
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【０４２５】
本開示の番号付けされた実施形態
添付の項（ｃｌａｕｓｅ）にもかかわらず、本開示は以下の番号付けされた実施形態を示す。
【０４２６】
ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の産生を改善する
１．ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する宿主細胞の能力を改善する方法であって、細胞の利用可能なＮＡＤＰＨを変更することを含む方法。
２．利用可能なＮＡＤＰＨが、細胞において改変グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を発現させることによって変更され、改変ＧＡＰＤＨがその補酵素特異性が拡大するように改変される、項１の方法。
３．改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、項２の方法。
４．天然に存在するＧＡＰＤＨがｇａｐＡである、項３の方法。
５．ｇａｐＡが配列番号５８のアミノ酸配列を有する、項４の方法。
６．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項２〜５のいずれか一項の方法。
７．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項２〜５のいずれか一項の方法。
８．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項２〜７のいずれか一項の方法。
９．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項２〜８のいずれか一項の方法。
１０．配列番号５８のアミノ酸３７に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がリシンである、項８または９の方法。
１１．配列番号５８のアミノ酸３６に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がスレオニンであり、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がリシンである、項９の方法。
１２．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項２〜１１のいずれか一項の方法。
１３．配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がセリンである、項１２の方法。
１４．配列番号５８のアミノ酸２２４に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がセリンである、項２〜１３のいずれか一項の方法。
１５．配列番号５８のアミノ酸１１０に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がアスパラギン酸である、項２〜１４のいずれか一項の方法。
１６．配列番号５８のアミノ酸１４０に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がグリシンである、項２〜１５のいずれか一項の方法。
１７．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、項２〜５のいずれか一項の方法。
１８．化合物が表２から選択される、項１〜１７のいずれか一項の方法。
１９．化合物がリシンである、項１８の方法。
２０．化合物がスレオニンである、項１８の方法。
２１．宿主細胞が原核細胞である、項１〜２０のいずれか一項の方法。
２２．宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、項２１の方法。
２３．宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項２２の方法。
２４．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項２２の方法。
２５．宿主細胞が真核細胞である、項１〜２０のいずれか一項の方法。
２６．宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａからなる群から選択される属に由来する、項２５の方法。
【０４２７】
改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞
２７．天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む宿主細胞であって、改変ＧＡＰＤＨを欠く対応する宿主細胞と比較して、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の改善された産生を有する、宿主細胞。
２８．細胞において改変グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を発現させることによって利用可能なＮＡＤＰＨが変更され、改変ＧＡＰＤＨがその補酵素特異性が拡大するように改変される、項２７の宿主細胞。
２９．改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、項２７または２８の宿主細胞。
３０．天然に存在するＧＡＰＤＨがｇａｐＡである、項２９の宿主細胞。
３１．ｇａｐＡが配列番号５８のアミノ酸配列を有する、項３０の宿主細胞。
３２．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項２７〜３１のいずれか一項の宿主細胞。
３３．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項２７〜３１のいずれか一項の宿主細胞。
３４．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項２７〜３３のいずれか一項の宿主細胞。
３５．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項２７〜３４のいずれか一項の宿主細胞。
３６．配列番号５８のアミノ酸３７に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がリシンである、項３４または３５の宿主細胞。
３７．配列番号５８のアミノ酸３６に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がスレオニンであり、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がリシンである、項３５の宿主細胞。
３８．改変ＧＡＰＤＨが配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項２７〜３７のいずれか一項の宿主細胞。
３９．配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がセリンである、項３８の宿主細胞。
４０．配列番号５８のアミノ酸２２４に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がセリンである、項２７〜３９のいずれか一項の宿主細胞。
４１．配列番号５８のアミノ酸１１０に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がアスパラギン酸である、項２７〜４０のいずれか一項の宿主細胞。
４２．配列番号５８のアミノ酸１４０に対応する改変ＧＡＰＤＨの位置における残基がグリシンである、項２７〜４１のいずれか一項の宿主細胞。
４３．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、項２７〜３１のいずれか一項の宿主細胞。
４４．化合物が表２から選択される、項２７〜４３のいずれか一項の宿主細胞。
４５．化合物がリシンである、項４４の宿主細胞。
４６．化合物がスレオニンである、項４４の宿主細胞。
４７．原核細胞である、項２７〜４６のいずれか一項の宿主細胞。
４８．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、項４７の宿主細胞。
４９．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項４８の宿主細胞。
５０．Ｅ．ｃｏｌｉである、項４８の宿主細胞。
５１．真核細胞である、項２７〜４６のいずれか一項の宿主細胞。
５２．Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａからなる群から選択される属に由来する、項５１の宿主細胞。
【０４２８】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．においてＬ−リシンを製造する方法
５３．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株を培養することおよび培養されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株または培養液からＬ−リシンを回収することを含む、Ｌ−リシンを製造する方法であって、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株が補酵素としてＮＡＤＰを使用する改変ＧＡＰＤＨを発現し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株が改善されたＬ−リシン生産性を有する方法。
【０４２９】
ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法
５４．ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含む、方法。
５５．改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、項５４の方法。
５６．改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤよりもＮＡＤＰをより効率的に使用する、項５４または５５の方法。
【０４３０】
ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法
５７．宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含み、
バリアント酵素が補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す方法。
５８．化合物が表２から選択される、項５７の方法。
５９．バリアント酵素がＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、項５７または５８の方法。
６０．ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が配列番号４２または４４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項５７〜５９のいずれか一項の方法。
６１．ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が配列番号３０または４０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項５７〜６０のいずれか一項の方法。
６２．ｄａｐＢのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が配列番号４６または４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項５７〜６１のいずれか一項の方法。
６３．ｄｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項５７〜６２のいずれか一項の方法。
６４．ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項５７〜６３のいずれか一項の方法。
６５．ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項５７〜６３のいずれか一項の方法。
６６．ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、およびａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、ｄａｐＢのバリアント酵素を発現させることを含み、ｄｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、ｄｄｈのバリアント酵素を発現させることを含む、項５７〜６３のいずれか一項の方法。
６７．化合物が表２から選択される、項５７〜６６のいずれか一項の方法。
６８．化合物がリシンである、項６８の方法。
６９．化合物がスレオニンである、項６８の方法。
７０．宿主細胞が原核細胞である、項５７〜６９のいずれか一項の方法。
７１．宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、項７０の方法。
７２．宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項７１の方法。
７３．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項７１の方法。
７４．宿主細胞が真核細胞である、項５７〜６９のいずれか一項の方法。
７５．宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａからなる群から選択される属に由来する、項７４の方法。
【０４３１】
ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢまたはｄｄｈのバリアントを含む宿主細胞
７６．酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのうち１種または複数のバリアントを含み、バリアントが補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、宿主細胞。
【０４３２】
新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを使用した方法
７７．宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させることを含む方法。
【０４３３】
戦略によってＬ−リシン製造の効率を改善する方法
７８．宿主細胞によるＬ−リシン製造の効率を改善する方法であって、
（１）改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有するように内因性ＧＡＰＤＨを改変すること；
（２）宿主細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることであって、バリアント酵素が補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示すこと；および
（３）宿主細胞において新規ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを発現させること
のうち２つまたはそれより多くを含む方法。
【０４３４】
ｇｄｈおよび／またはａｓｄを使用した方法
７９．宿主細胞によってＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞において酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）のうち一方または両方のバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す方法。
８０．バリアント酵素がＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、項７９の方法。
８１．ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項７９または８０の方法。
８２．ｇｄｈのバリアント酵素が、配列番号１４４、１５０、１６２、１６６、１７０、１７４および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項８１の方法。
８３．ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項７９〜８２のいずれか一項の方法。
８４．ａｓｄのバリアント酵素が、配列番号１０８および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項８３の方法。
【０４３５】
スレオニンアルドラーゼによってＬ−スレオニンの製造の効率を改善する方法
８５．宿主細胞によるＬ−スレオニンの製造の効率を改善する方法であって、宿主細胞においてスレオニンアルドラーゼのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素がＥ．ｃｏｌｉのスレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）とは異なる基質選好性または酵素動態を示す方法。
８６．バリアント酵素がグリシン産生を上回るスレオニン産生を好む、項８５の方法。
８７．スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項８５または８６の方法。
８８．バリアント酵素が、配列番号１９６、２０６、２２０、２２４および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項８７の方法。
８９．宿主細胞が原核細胞である、項８５〜８８のいずれか一項の方法。
９０．宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、項８９の方法。
９１．宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項９０の方法。
９２．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項９０の方法。
９３．宿主細胞が真核細胞である、項８５〜８８のいずれか一項の方法。
９４．宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａからなる群から選択される属に由来する、項９３の方法。
【０４３６】
バリアント酵素によりＬ−スレオニンの製造の効率を改善する方法
９５．宿主細胞によるＬ−スレオニンの製造を増大する方法であって、宿主細胞において、酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、スレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることを含む方法。
９６．ｇｄｈのバリアント酵素またはａｓｄのバリアント酵素が補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、項９５の方法。
９７．ｇａｐＡのバリアント酵素、ｇｄｈのバリアント酵素またはａｓｄのバリアント酵素がＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、項９５の方法。
９８．スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素がグリシン産生を上回るスレオニン産生を好む、項９５〜９７のいずれか一項の方法。
９９．ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項９５〜９８のいずれか一項の方法。
１００．ｇｄｈのバリアント酵素が、配列番号１４４、１５０、１６２、１６６、１７０、１７４および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項９９の方法。
１０１．ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項９５〜１００のいずれか一項の方法。
１０２．ａｓｄのバリアント酵素が、配列番号１０８および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項１０１の方法。
１０３．スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項９５〜１０２のいずれか一項の方法。
１０４．スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素が、配列番号１９６、２０６、２２０、２２４および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項１０３の方法。
１０５．ｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含み、ｇａｐＡのバリアント酵素が、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項９５〜１０４のいずれか一項の方法。
１０６．ｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含み、ｇａｐＡのバリアント酵素が配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項９５〜１０５のいずれか一項の方法。
１０７．ｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含み、ｇａｐＡのバリアント酵素が、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、項９５〜１０５のいずれか一項の方法。
１０８．ｇａｐＡのバリアント酵素が配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項１０６または１０７の方法。
１０９．ｇａｐＡのバリアント酵素が配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項１０６または１０７の方法。
１１０．配列番号５８のアミノ酸３７に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がリシンである、項１０８または１０９の方法。
１１１．配列番号５８のアミノ酸３６に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がスレオニンであり、配列番号５８のアミノ酸３７に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がリシンである、項１０９の方法。
１１２．ｇａｐＡのバリアント酵素が配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む、項１０６〜１１１のいずれか一項の方法。
１１３．配列番号５８のアミノ酸１９２に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がセリンである、項１１２の方法。
１１４．配列番号５８のアミノ酸２２４に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がセリンである、項１０６〜１１３のいずれか一項の方法。
１１５．配列番号５８のアミノ酸１１０に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がアスパラギン酸である、項１０６〜１１４のいずれか一項の方法。
１１６．配列番号５８のアミノ酸１４０に対応するｇａｐＡのバリアント酵素の位置における残基がグリシンである、項１０６〜１１５のいずれか一項の方法。
１１７．ｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含み、ｇａｐＡのバリアント酵素が、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、項９５〜１０５のいずれか一項の方法。
【０４３７】
スレオニン基準株
１１８．各々、１種または複数の合成プロモーターに作動可能に連結されたｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子およびｔｈｒＣ遺伝子を含む、マルチコピー複製プラスミドを含む宿主細胞。
１１９．ｔｄｈ欠失（Δｔｄｈ）細胞である、項１１８の宿主細胞。
１２０．マルチコピー複製プラスミドが、配列番号７７のｔｈｒＡＢＣオペロン配列に対して少なくとも７０％同一である配列を含む、項１１８または１１９の宿主細胞。
【０４３８】
スレオニンアルドラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼを含む戦略によって化合物の製造の効率を改善する方法
１２１．宿主細胞による化合物の産生の効率を改善する方法であって、
（１）酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること、（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する宿主細胞においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること、（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること、（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすること、（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすること、および（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させること
のうち２つまたはそれより多くを含む、方法。
１２２．その酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作することが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含む、項１２１の方法。
１２３．補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性のｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすることが、
ｉ）配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇｄｈのバリアント酵素を発現させること；
ｉｉ）配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むａｓｄのバリアント酵素を発現させること；
ｉｉｉ）配列番号４６および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｄａｐＢのバリアント酵素を発現させること；および
ｉｖ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｄｄｈのバリアント酵素を発現させること
のうち１つまたは複数を含む、項１２１または１２２の方法。
１２４．補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性のｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすることが、
ｉ）配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇｄｈのバリアント酵素を発現させること；および
ｉｉ）配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むａｓｄのバリアント酵素を発現させること
のうち１つまたは複数を含む、項１２１〜１２３のいずれかの方法。
１２５．スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすることが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｌｔＡのバリアント酵素を発現させることを含む、項１２１〜１２４のいずれかの方法。
１２６．異種のピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させることが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、および２３２、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７および２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｐｙｃのバリアント酵素を発現させることを含む、項１２１〜１２５のいずれかの方法。
【０４３９】
新規ｇａｐＡバリアント−ポリヌクレオチド
１２７．短縮型グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）遺伝子をコードする人工ポリヌクレオチドであって、配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同一である配列を含む人工ポリヌクレオチド。
１２８．配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、項１２７の人工ポリヌクレオチド。
１２９．プロモーターに作動可能に連結された項１２７または１２８の人工ポリヌクレオチドを含むベクター。
【０４４０】
新規ｇａｐＡバリアント−タンパク質
１３０．グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の組換えタンパク質断片であって、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一である配列を含む、組換えタンパク質断片。
１３１．配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項１３０の組換えタンパク質断片。
１３２．ｇａｐＡ活性を欠いている、項１３０または１３１の組換えタンパク質断片。
１３３．宿主細胞がｇａｐＡ活性を有する別のタンパク質を含む場合に、宿主細胞による表２から選択される化合物の生産性を増強する、項１３０〜１３３のいずれか一項の組換えタンパク質断片。
【０４４１】
他の実施形態
１３４．ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物を産生する微生物細胞の能力を改善する方法であって、細胞の利用可能なＮＡＤＰＨを変更することを含む方法。
１３５．利用可能なＮＡＤＰＨが、細胞において改変グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を発現させることによって変更され、改変ＧＡＰＤＨがその補酵素特異性が拡大するように改変される、請求項１３４の方法。
１３６．細胞の利用可能なＮＡＤＰＨが、微生物細胞において、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）およびｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）のうち１種または複数のバリアント酵素を発現させることによって変更され、バリアント酵素が補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、請求項１３４の方法。
１３７．改変ＧＡＰＤＨが、対応する天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、請求項１３５の方法。
１３８．微生物細胞が細菌細胞である、請求項１３４から１３７のいずれか一項の方法。
１３９．細菌細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．からなる群から選択される細菌である、請求項１３８の方法。
１４０．細菌が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１３８の方法。
１４１．微生物細胞が、酵母細胞である、請求項１３４から１３７のいずれか一項の方法。
１４２．酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．に由来する細胞である、請求項１４１の方法。
１４３．天然に存在するＧＡＰＤＨがｇａｐＡである、請求項１３７の方法。
１４４．ｇａｐＡが、配列番号５８のアミノ酸配列を有する、請求項１４３の方法。
１４５．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３４の方法。
１４６．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３４の方法。
１４７．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１４５または１４６の方法。
１４８．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸３６および３７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１４７の方法。
１４９．配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、請求項１４７の方法。
１５０．配列番号５８のアミノ酸３６に対応する位置のロイシンが、スレオニンによって置換されており、配列番号５８のアミノ酸３７に対応する位置のスレオニンが、リシンによって置換されている、請求項１４８の方法。
１５１．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８のアミノ酸１９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１３５の方法。
１５２．配列番号５８のアミノ酸１７２に対応する位置のプロリンが、セリンによって置換されている、請求項１３５の方法。
１５３．配列番号５８のアミノ酸２２４に対応する位置のロイシンが、セリンによって置換されている、請求項１３５の方法。
１５４．配列番号５８のアミノ酸１１０に対応する位置のヒスチジンが、アスパラギン酸によって置換されている、請求項１３５の方法。
１５５．配列番号５８のアミノ酸１４０に対応する位置のチロシンが、グリシンによって置換されている、請求項１３５の方法。
１５６．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択される、請求項１４６の方法。
１５７．化合物が、表２から選択される、請求項１３４から１３７のいずれか一項の方法。
１５８．化合物が、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンである、請求項１５７の方法。
１５９．天然に存在するＧＡＰＤＨと比較して拡大した補酵素特異性を有する改変ＧＡＰＤＨを含む微生物細胞であって、改変ＧＡＰＤＨを欠く対応する微生物細胞と比較して、ＮＡＤＰＨを使用して産生される化合物の改善された産生を有する微生物細胞。
１６０．改変ＧＡＰＤＨが、天然に存在するＧＡＰＤＨと比較してＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、請求項１５９の微生物細胞。
１６１．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６０の微生物細胞。
１６２．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６０の微生物細胞。
１６３．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、改変ＧＡＰＤＨが、配列番号５８の位置３６、３７または両方のアミノ酸の置換を含む、請求項１６０の微生物細胞。
１６４．改変ＧＡＰＤＨが、配列番号６９、７１、７３、３０３、２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択される、請求項１６０の微生物細胞。
１６５．化合物が、表２から選択される、請求項１５９の微生物細胞。
１６６．化合物が、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニンである、請求項１６５の微生物細胞。
１６７．細菌由来である、請求項１５９の微生物細胞。
１６８．細菌が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．である、請求項１６７の微生物細胞。
１６９．細菌が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１６８の微生物細胞。
１７０．微生物細胞が、酵母細胞である、請求項１６５の微生物細胞。
１７１．ＧＡＰＤＨの補酵素特異性を拡大する方法であって、改変されたＧＡＰＤＨが補酵素ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するようにＧＡＰＤＨを改変することを含む、方法。
１７２．改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤと比較して、補酵素ＮＡＤＰに対して増大した特異性を有する、請求項１７１の方法。
１７３．改変ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤよりもＮＡＤＰをより効率的に使用する、請求項１７２の方法。
１７４．方法が、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号４２または４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３６の方法。
１７５．方法が、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号３０または４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３６の方法。
１７６．方法が、ｄａｐＢのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号４６または４８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３６の方法。
１７７．方法が、ｄｄｈを発現させることを含み、ｄｄｈ酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１３６の方法。
１７８．方法が、ｇｄｈのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３６の方法。
１７９．方法が、ａｓｄのバリアント酵素を発現させることを含み、バリアント酵素が、配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３６の方法。
１８０．４種の酵素すべてのバリアントが、微生物細胞において同時に発現される、請求項１３６の方法。
１８１．酵素ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈのうち１種または複数のバリアントを含む微生物細胞であって、バリアントが、補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して二重特異性を示す、微生物細胞。
１８２．ｇｄｈのバリアント酵素が、配列番号１４４、１５０、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７８の方法。
１８３．ａｓｄのバリアント酵素が、配列番号１０８および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７９の方法。
１８４．微生物細胞において、スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素を発現させることをさらに含み、スレオニンアルドラーゼのバリアント酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉスレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥ）とは異なる基質選好性または酵素動態を示す、請求項１３４から１３７のいずれか一項の方法。
１８５．バリアントスレオニンアルドラーゼが、グリシン産生を上回るスレオニン産生を好む、請求項１８４の方法。
１８６．バリアントスレオニンアルドラーゼが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８４の方法。
１８７．バリアントスレオニンアルドラーゼが、配列番号１９６、２０６、２２０、２２４および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８６の方法。
１８８．化合物が、Ｌ−スレオニンである、請求項１８４の方法。
１８９．細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉであり、方法が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてｐｙｃを発現させることをさらに含む、請求項１４０の方法。
１９０．ｐｙｃのバリアント酵素を発現させることを含み、ｐｙｃのバリアント酵素が、配列番号２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７および２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８９の方法。
１９１．各々、１種または複数の合成プロモーターに作動可能に連結されたｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子およびｔｈｒＣ遺伝子を含むマルチコピー複製プラスミドを含む微生物細胞。
１９２．ｔｄｈ欠失（Δｔｄｈ）細胞である、請求項１９１の微生物細胞。
１９３．マルチコピー複製プラスミドが、配列番号７７のｔｈｒＡＢＣオペロン配列に対して少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項１９１の微生物細胞。
１９４．微生物細胞による化合物の産生の効率を改善する方法であって、
（１）酵素がＮＡＤＰおよびＮＡＤに対する二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによってＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作すること、（２）ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する細菌においてトランスヒドロゲナーゼ酵素を発現させること、（３）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすること、（４）補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすること、（５）スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすることおよび（６）異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させること
のうち２つまたはそれより多くを含む方法。
１９５．化合物が、表２から選択される、請求項１９４の方法。
１９６．化合物がＬ−スレオニンである、請求項１９５の方法。
１９７．酵素が、ＮＡＤＰおよびＮＡＤに対して二重特異性を有するように、内因性解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の補酵素特異性を拡大することによって、ＮＡＤＰＨを産生するように解糖系を遺伝子操作することが、配列番号２９４、２９６、２３３、２３４、２３５、２３６、２９８および３００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇａｐＡのバリアント酵素を発現させることを含む、請求項１９４から１９６のいずれかの方法。
１９８．補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈ、ａｓｄ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ酵素の相同体を発現させることによって、リシン合成のためのＤＡＰ経路を再プログラミングすることが、
ｉ）配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇｄｈのバリアント酵素を発現させること、
ｉｉ）配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むａｓｄのバリアント酵素を発現させること、
ｉｉｉ）配列番号４６および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｄａｐＢのバリアント酵素を発現させること、および
ｉｖ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｄｄｈのバリアント酵素を発現させること
のうち１つまたは複数を含む、請求項１９４から１９６のいずれかの方法。
１９９．補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨをより効率的に使用する、内因性ｇｄｈおよびａｓｄ酵素の相同体を発現させることによって、スレオニン合成のためのｔｈｒＡＢＣ経路を再プログラミングすることが、
ｉ）配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｇｄｈのバリアント酵素を発現させること、
ｉｉ）配列番号８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むａｓｄのバリアント酵素を発現させること
のうち１つまたは複数を含む、請求項１９４から１９６のいずれかの方法。
２００．スレオニンのグリシンへの分解を減少または逆転させる内因性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（ｌｔＡ）の相同体を発現させることによってスレオニン合成を再プログラミングすることが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｌｔＡのバリアント酵素を発現させることを含む、請求項１９４から１９６のいずれかの方法。
２０１．異種ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）またはその相同体を発現させて、オキサロアセテートの合成を増大させることまたは内因性ｐｙｃの発現を増大させることが、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０および２３２、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７および２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｐｙｃのバリアント酵素を発現させることを含む、請求項１９４から１９６のいずれかの方法。
２０２．短縮型グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）遺伝子をコードする人工ポリヌクレオチドであって、配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％同一である配列を含む、人工ポリヌクレオチド。
２０３．配列番号２９０、２９１、２９２および２９３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０２の人工ポリヌクレオチド。
２０４．プロモーターに作動可能に連結された請求項２０２または２０３の人工ポリヌクレオチドを含むベクター。
２０５．グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）の組換えタンパク質断片であって、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一の配列を含む、組換えタンパク質断片。
２０６．配列番号２３３、２３４、２３５、２３６および２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０５の組換えタンパク質断片。
２０７．ｇａｐＡ活性を欠く、請求項２０５または２０６の組換えタンパク質断片。
２０８．微生物細胞がｇａｐＡ活性を有する別のタンパク質を含む場合に、組換えタンパク質断片が、微生物細胞による表２から選択される化合物の生産性を増強する、請求項２０７の組換えタンパク質断片。
２０９．バリアントスレオニンアルドラーゼ、ｐｙｃタンパク質または両方をさらに含む、請求項１５９から１６９のいずれか一項の微生物細胞。
【０４４２】
参照による組込み
本明細書で引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、公開特許および特許出願は、すべての目的のために参照により完全に組み込まれる。
【０４４３】
しかし、本明細書で引用されるいかなる参考文献、論文、刊行物、特許、公開特許および特許出願への言及も、それらが世界のいかなる国においても正当な先行技術を構成するとの、または普通の一般的な知識の一部をなすということの承認でもいかなる形の示唆でもなく、およびそれととるべきでない。特に、以下の出願がこれにより参照により完全に組み込まれる：２０１６年１２月３０日に出願の米国特許出願番号第１５／３９６，２３０号；２０１６年１２月７日に出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５；２０１６年４月２７日に出願の米国特許出願番号第１５／１４０，２９６号；２０１６年７月２９日に出願の米国特許仮出願第６２／３６８，７８６号；および２０１５年１２月７日に出願の米国特許仮出願第６２／２６４，２３２号。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2020520645.tif 000050
【図７】
2020520645.tif 000051
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020520645.tif 000053
【図９】
2020520645.tif 000054
【図１０Ａ】
2020520645.tif 000055
【図１０Ｂ】
2020520645.tif 000056
【図１０Ｃ】
2020520645.tif 000057
【図１１Ａ】
2020520645.tif 000058
【図１１Ｂ】
2020520645.tif 000059
【図１１Ｃ】
2020520645.tif 000060
【図１２】
2020520645.tif 000061
【図１３】
2020520645.tif 000062
【図１４】
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【図１５】
2020520645.tif 000064
【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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