(57)【要約】  封入された抗有糸分裂剤が、リポソームが600mMスクロース中に懸濁されている場合、12時間で0.6%未満または8時間で5%未満である遅い速度で放出される、内部環境に封入された抗有糸分裂剤、1つ以上のアニオンおよび1つ以上のカチオンを含む超安定リポソーム。これらのリポソームは癌の治療に有用である。特に、HEPC：Chol：DSPE-PEG2000(50：45：5)リポソームは、BI 2536、および1：3の比のクエン酸塩：リン酸塩を含む。
2020505451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入された抗有糸分裂剤が、リポソームが600mMスクロース中に懸濁されている場合、12時間で0.6%未満または8日間で5%未満である遅い速度で放出される、内部環境に封入された抗有糸分裂剤、1つ以上のアニオンおよび1つ以上のカチオンを含む、膜によって外部環境から分離された内部環境を含む超安定リポソーム。
【請求項２】
1つ以上のアニオンが、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、塩化物、クエン酸塩と酢酸塩、クエン酸塩と2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、クエン酸塩と塩化物、酢酸塩とリン酸塩、酢酸塩と2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、酢酸塩と塩化物、リン酸塩と2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、リン酸塩と塩化物、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩と塩化物である、請求項１に記載の超安定リポソーム。
【請求項３】
2つのアニオンが、約1：7〜約7：1の比で存在する、請求項１または２に記載の超安定リポソーム。
【請求項４】
1つ以上のアニオンが、クエン酸塩とリン酸塩またはクエン酸塩と酢酸塩または酢酸塩とリン酸塩である、請求項３に記載の超安定リポソーム。
【請求項５】
1つ以上のカチオンが、ナトリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、銅、マグネシウム、亜鉛または鉄である、請求項１〜４のいずれか1つに記載の超安定リポソーム。
【請求項６】
抗有糸分裂剤が、BI 2536、ON01910、GSK 461364、HMN 214またはBI 6727などのポロ様キナーゼ阻害剤；イスピネシブ(SB 715992)、SB 743921、MK 0731またはARRY 520などのキネシンスピンドル阻害剤；またはMK 0457 (VX 680)、AZD 1152、PHA 680632、PHA 739358、MLN8054、MLN8237、R763、AT9283、SNS 314、SU 6668、ENMD 2076、BI 811283、CYC116、ENMD 981693またはMKC 1693などのオーロラキナーゼ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか1つに記載の超安定リポソーム。
【請求項７】
抗有糸分裂剤が、BI 2536またはイスピネシブである、請求項６に記載の超安定リポソーム。
【請求項８】
膜が、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000)、水素化卵L-α-ホスファチジルコリン(HEPC)およびコレステロール(Chol)を含む、請求項１〜７のいずれか1つに記載の超安定リポソーム。
【請求項９】
膜が、50：45：5のモル比でHEPC：Chol：DSPE-PEG2000を含む、請求項８に記載の超安定リポソーム。
【請求項１０】
水性媒体中に、請求項１〜９のいずれかに記載の超安定リポソームを含む、リポソーム組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか1つに記載の超安定リポソームを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
組成物が、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤および/または担体をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
治療有効量の請求項１〜９のいずれか1つに記載の超安定リポソーム、または請求項１０に記載のリポソーム組成物、または請求項１１もしくは１２に記載の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、対象の癌を治療する方法。
【請求項１４】
対象における癌を治療するための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか1つに記載の超安定リポソームの使用。
【請求項１５】
対象における癌を治療するための、治療有効量の請求項１〜９のいずれか1つに記載の超安定リポソーム、または請求項１０に記載のリポソーム組成物、または請求項１１もしくは１２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
対象における癌を治療するための医薬の製造における使用のための、請求項１〜９のいずれか1つに記載の超安定リポソーム。
【請求項１７】
対象における癌の治療における使用のための請求項１〜９のいずれか1つに記載の超安定リポソーム、または請求項１０に記載のリポソーム組成物、または請求項１１もしくは１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、癌の治療に有用な超安定リポソーム、および超安定リポソームを用いる癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を明らかにするため、または実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で使用される刊行物および他の資料は、参照により組み込まれ、便宜上それぞれ文献目録にまとめられている。
【０００３】
癌が根本的に過剰な細胞分裂の状態であるならば、有糸分裂調節酵素は、大きな抗癌薬標的を作るべきである。確かに、それは、有糸分裂を阻害し、それによって微小管標的化剤(MTA)に関連する末梢神経障害を回避する、より具体的な方法の探求を動機付けた薬物クラスとしてのMTAの成功であった[1-3]。Polo様キナーゼ(PLK)[4,5]、キネシンスピンドルタンパク質(KSP)[6,7]、オーロラキナーゼ[8,9]など、有糸分裂に中心的な役割を果たしている酵素調節剤は、すぐに優先度の高い薬物標的になった。しかしながら、25種類の有糸分裂特異的薬剤の開発に100億ドル以上が費やされたにもかかわらず、臨床的有効性は報告されておらず、実績は悲惨であった[10、11]。
【０００４】
しかしながら、ある時点では限られた割合の腫瘍細胞しか実際に分裂していないので、有糸分裂調節酵素は、本質的に不利な薬物標的である可能性がある。Komlodi-Pasztorら[10]が簡潔に述べたように、「標的療法が効果的であるためには、標的が存在しなければならない」。しかしながら、この議論は、腫瘍のバイオアベイラビリティが一時的に持続することができれば、有糸分裂調節酵素がおそらく依然として有効でありうることを意味する。PLK阻害剤であるBI 2536の前臨床試験が隔週投与で腫瘍縮小を示しただけであるという事実[4]は、持続的なバイオアベイラビリティが細胞分裂の行為において腫瘍細胞を捕らえる可能性を高めるという考えを支持する。
【０００５】
リポソームは、薬物送達に使用されてきた周知のコロイド粒子である。薬物を含む小分子は、リポソームの内部環境と外部環境との間に物理化学的差異を生じさせることによって、リポソームに「リモートローディング」され得ることがよく知られている[16-18]。薬物が、外部環境では膜透過性であるが、帯電するようになるので内部環境へ拡散して封入されるべきであることが重要である。薬物が弱塩基である場合、この差異を生じさせるための１つの方法は、外部に対して低いpHを生じる緩衝アニオンの、リポソームの内部への封入である。
【０００６】
リポソームは、腫瘍内皮の開窓部を利用して腫瘍組織にアクセスし、そこで持続することが知られている[12、13]。この現象は、増強された透過性および保持(EPR)効果と呼ばれ、最初にドキソルビシンで実証され、リポソーム癌治療薬ドキシル(商標)をもたらした[14、15]。Doxil(商標)によって実証されたように、リポソーム封入の安定性は両刃の刀であることが判明した。一方では、健康な組織への薬剤曝露は低減化される。他方では、ほとんどの抗癌剤が効果的であるためには高い腫瘍濃度を必要とするので、リポソームからのドキソルビシンのゆっくりとした漏出は、効力にブレーキをかける。
【０００７】
ドキソルビシンとは対照的に、BI 2536はドキソルビシンの濃度の1000分の1で有効であり、このことは、最大濃度ではなくて、持続的な曝露が有効性を大いに高めるはずであることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
有糸分裂阻害剤によって標的とされうる分裂癌細胞の割合を増加させるために、有糸分裂阻害剤の時間的曝露を最大にするシステムを開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概略
本発明は、癌治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、癌の治療に有用な超安定リポソーム、および超安定リポソームを用いる癌の治療方法に関する。
【００１０】
したがって、1つの態様では、本発明は、抗有糸分裂剤を封入した超安定リポソームを提供する。いくつかの実施態様では、抗有糸分裂剤は、BI 2536、イスピネシブ(SB 715992)、MK 0457 (VX 680)、AZD 1152、PHA 680632、PHA 739358、MLN8054、MLN8237、R763、AT9283、SNS 314、SU 6668、ENMD 2076、BI 811283、CYC116、ENMD 981693、MKC 1693、ON01910、GSK 461364、HMN 214、BI 6727、SB 743921、MK 0731またはARRY 520である。いくつかの実施態様では、超安定リポソームを調製するために、任意の適切なリポソーム構成成分を使用することができる。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは立体的に安定化されている。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、50：45：5のモル比で、HEPC：Chol：DSPE-PEG2000 (HEPC：水素化卵L-α-ホスファチジルコリン；Chol：コレステロール；DSPE-PEG-2000：1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000])を含む脂質混合物から調製される。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、1つ以上のアニオン、好ましくは2つ以上のアニオンを有する内部環境を含み、そのことによって、超安定リポソームからの抗有糸分裂剤の遅い放出がもたらされる。いくつかの実施態様では、1つ以上のアニオン、または好ましくは2つ以上のアニオンは、本明細書に記載のとおりでありうる。いくつかの実施態様では、内部環境は、1つ以上のカチオンを含む。いくつかの実施態様では、1つ以上のカチオンは、本明細書に記載のとおりでありうる。アニオンとカチオンの最良の組み合わせは、本明細書に記載の技術を使用することによって、所定の抗有糸分裂剤について容易に決定することができる。
【００１１】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の超安定リポソームを少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤および/または担体と、一緒にまたは無しで、含む医薬組成物が提供される。適切な薬学的に許容される賦形剤および担体は、当該技術分野において周知である。
【００１２】
第二の態様では、本発明は、本明細書に記載の超安定リポソームを用いる癌の治療方法を提供する。この方法によれば、たとえば、治療を必要とする、ヒトなどの患者に、治療有効量の超安定リポソームが投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】さまざまな塩溶液からヘキサノールへのBI 2536の分配能力を研究するための手順を示す。
【図２】図1に記載の方法を用いてさまざまな単一アニオン塩溶液からヘキサノールに抽出されたBI 2536の相対蛍光を示す。ヘキサノールおよび塩溶液へのBI 2536の分配は、塩アニオンの特性および濃度によって影響を受ける。使用した略語は、クエン酸塩(C)、酢酸塩(A)、リン酸塩(P)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩(M)および塩酸(H)である。すべての塩溶液は0.8Mであり、カチオンとしてナトリウムを用いてpH3に調整した。エラーバーは標準誤差を表す。
【図３】図1に記載の方法論を用いてさまざまなペアアニオンの組み合わせからヘキサノール中に抽出されたBI 2536の相対蛍光を示す。ペアアニオンの組み合わせのモル比を調整することは、BI 2536のヘキサノールへの分配に影響を及ぼしうる。すべての塩は0.8Mであり、カチオンとしてナトリウムを用いてpH3に調整した。単一塩は、0.8Mの濃度を有する。略号前の数字は、0.8Mの全塩濃度のうちの濃度割合を表す。
【図４】ではなくリポソームBI 2536についての放出速度は、EC50と相関するが、リポソームドキソルビシンでは相関しないことを示す。勾配ローディングを行うために、以下のアニオンの単一および対の組み合わせを使用して、一連の薬物放出速度を作成した：クエン酸塩(C)、酢酸塩(A)、リン酸塩(P)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩(M)および塩酸(H)。二文字略語は、それぞれ全濃度の半分にて対を成すアニオンの組み合わせを表す。低張(水)および高張(スクロース)条件の両方について、「細胞傷害性(EC50)」対「BI 2536(上部)およびドキソルビシン(下部)の放出速度」の散布図を示す。棒グラフは、同じデータについて「EC50」対「放出速度によってランク付けした製剤」を示す。すべてのグラフ上の点線は、封入されていない薬剤のEC50を示す。放出速度は12時間のインキュベーション後に放出された薬剤の量に基づいた。スピアマンのランク相関(rs)および関連するp値を記録する。
【図５Ａ−Ｂ】リポソームBI 2536の有効性が、クエン酸塩：リン酸塩比を調整することによって調節されることを示す。図5A：さまざまなクエン酸塩：リン酸塩(C：P)比について第3日および第8日に測定された「EC50」対「放出速度」の散布図を示す。図5B：HCT116結腸直腸癌細胞を異種移植したマウスを、さまざまなC：P比で配合した単回用量のリポソームBI 2536で処置した。各実験群に3匹のマウスを使用した。腫瘍の体積と重量を記録する。エラーバーは標準誤差を示す。
【図６Ａ−Ｂ】図6Aおよび6Bは、HCT116異種移植マウスに対するリポソームBI 2536のインビボでの有効性および毒性を示す。第0日における単回投与(図6A)または第0日および第7日における2回投与(図6B)による処置について、腫瘍体積および重量ならびにカプラン-マイヤー生存曲線を示す。リポソームBI 2536によるすべての治療は、記載されたようにさまざまなクエン酸塩：リン酸塩(C：P)比で配合され、封入効率を考慮した後、340mg/kgで投与された。非封入BI 2536を最大許容用量である100mg/kgで投与した。エラーバーは標準誤差を表す。超安定リポソーム(C：P=1：3)と他の群との間で、腫瘍体積は、単回投与処置について第9日以降、および二回投与処置について第14日で有意に異なる(p<0.05)。C：P(1：3)で処置したマウスは他の群よりも有意に長く生存した(p<0.05)。経時的な生存率を示すカプラン-マイヤー曲線。ティック(tichs)は死亡イベントを表す。BI-L2C6Pと他のすべての処置の違いは有意であり、生存曲線については、C：P(1：3)で処置したマウスが、単回(p=0.0164)および二回(p=0.0349)投与処置の両方について有意に長く生存したことを示すマンテル-コックス・ログランクp値を記録する。
【図７Ａ−Ｄ】図7A-7Dは、超安定リポソームBI 2536で処理した後のBI 2536の薬物動態分布およびバイオアベイラビリティを示す。(図7A)：HCT116異種移植片を有するマウスを、さまざまなクエン酸塩：リン酸塩比を用いて封入したBI 2536で処置した。各データポイントは、3匹のマウスを含む。BI 2536６は、さまざまな時点で組織から抽出され、蛍光光度法によって定量化された。データ点およびエラーバーは、それぞれ平均および標準誤差を表す。超安定リポソーム(C：P=1：3)と他の群との間の有意差(p<0.05)をアスタリスクで示す。(図7B)：曲線下面積で測定したBI 2536への組織曝露を示す。(図7C)：処理後1.5日および5.5日における有糸分裂停止細胞のパーセンテージを示す。各バーは、2つの隣接していないH&E染色切片の6つの別々の視野から誘導される。エラーバーは標準誤差を表す。(図7D)：さまざまな処置の典型的なH&E画像を示す。矢印は有糸分裂停止細胞の例を示す。スケールバー、10μm。
【図８Ａ−Ｂ】図8Aおよび8Bは、HCT116異種移植マウスに対するリポソームBI 2536のインビボでの有効性を示す。さまざまな比のクエン酸塩：酢酸塩と配合されたリポソーム(図8A)、およびナトリウムカチオンがアンモニウムで置換された、さまざまな比のクエン酸塩：酢酸塩と配合されたリポソーム(図8B)による、第0日の単回投与処置についての腫瘍体積を示す。すべての製剤を、340mg/kgのBI 2536にて投与した。エラーバーは標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な記載
本発明は癌治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、癌の治療に有用な超安定リポソーム、および超安定リポソームを用いた癌の治療方法に関する。超安定リポソームからの有糸分裂阻害剤放出の極度の延長が、標的化可能な癌細胞の割合を増加させることによって癌の治療における有効性を改善することが発見された。超安定リポソームからの有糸分裂阻害剤の遅い放出は、インビトロおよびインビボでの癌細胞の死滅と相関する。1つの例では、単回投与の超安定リポソームBI 2536で処置した異種移植マウスは、処置マウスの20%において、12日間持続する腫瘍体積の減少および完全寛解を経験した。1週間に2回の投与で処置すると、治療率は処置されたマウスの75%に増加した。
【００１５】
他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１６】
用語「約」または「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を意味する。そのような範囲は、所定の値または範囲の一桁以内、好ましくは50%以内、より好ましくは20%以内、さらにより好ましくは10%以内、さらにより好ましくは５%以内でありうる。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容される変動は、研究中の特定のシステムに依存し、かつ、当業者によって容易に理解されうる。
【００１７】
本明細書中で使用される「癌」は、身体の他の部分に侵入するかまたは他の部分に広がる可能性を有する、異常な細胞増殖を含む一群の疾患をいう。癌として、神経膠腫、頭頸部、腎臓、肺、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、神経芽細胞腫、食道、卵巣、膵臓、前立腺、胃、精巣、甲状腺などの癌；急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、リンパ芽球性T細胞白血病、T細胞白血病、B細胞白血病などの白血病；未分化大細胞型リンパ腫、B細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫；および骨髄腫が挙げられる。
【００１８】
「有糸分裂阻害剤」という用語は、微小管調節酵素、ポロ様キナーゼ(PLK)、キネシン-スピンドルタンパク質(KSP)、オーロラキナーゼなどの有糸分裂調節酵素を標的とする薬剤を意味する。用語「抗有糸分裂(anti-mitotic)剤」または「抗有糸分裂(anti-mitosis)剤」は、「有糸分裂阻害剤」と互換的に使用されうる。
【００１９】
本明細書中で使用される「超安定リポソーム」は、部分的にはリポソームの内部環境に存在するアニオンおよびカチオンに起因して薬剤の放出が遅いリポソーム封入薬剤を示す。超安定リポソームの最も遅い放出速度は、癌細胞の死滅と高度に相関する。
【００２０】
「薬剤の遅い放出」という用語は、リポソームが600mMスクロースに懸濁されている場合、12時間で0.6%未満、または8日間で5%未満である、リポソーム封入薬剤からの薬剤の定量的放出を示す。
【００２１】
1つの態様では、本発明は、抗有糸分裂剤を封入した超安定リポソームを提供する。いくつかの実施態様では、抗有糸分裂剤は、BI 2536、ON01910、GSK 461364、HMN 214またはBI 6727などのポロ様キナーゼ阻害剤である。他の実施態様では、抗有糸分裂剤は、イスピネシブ(SB 715992)、SB 743921、MK 0731またはARRY 520などのキネシンスピンドル阻害剤である。いくつかの実施態様では、抗有糸分裂剤は、MK 0457 (VX 680)、AZD 1152、PHA 680632、PHA 739358、MLN8054、MLN8237、R763、AT9283、SNS 314、SU 6668、ENMD 2076、BI 811283、CYC116、ENMD 981693またはMKC 1693などのオーロラキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施態様では、抗有糸分裂剤は、BI 2536またはイスピネシブである。
【００２２】
いくつかの実施態様では、超安定リポソームを調製するために、任意の適切なリポソーム構成成分を使用することができる。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは立体的に安定化されている。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、50：45：5のモル比で、HEPC：Chol：DSPE-PEG2000 (HEPC：水素化卵L-α-ホスファチジルコリン；Chol：コレステロール；DSPE-PEG-2000：1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000])を含む脂質混合物から調製される。
【００２３】
いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、1つ以上のアニオン、好ましくは2つ以上のアニオンを有する内部環境を含み、そのことによって、超安定リポソームからの抗有糸分裂剤の遅い放出がもたらされる。いくつかの実施態様では、1つ以上のアニオン、または好ましくは2つ以上のアニオンは、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、塩化物、クエン酸塩と酢酸塩、クエン酸塩と2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、クエン酸塩と塩化物、酢酸塩とリン酸塩、酢酸塩と2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、酢酸塩と塩化物、リン酸塩と2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩、リン酸塩と塩化物、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸塩と塩化物でありうる。いくつかの実施態様では、塩化物は、HCLの形態である。いくつかの実施態様では、2つのアニオンの比は、約1：7〜約7：1である。他の実施態様では、2つのアニオンの比は、約1：3〜約3：1である。いくつかの実施態様では、アニオンは、約1：3〜約1：7、好ましくは、約1：3の比のクエン酸塩：リン酸塩である。いくつかの実施態様では、アニオンは、約1：3〜約3：1、好ましくは、約1：3の比のクエン酸塩：酢酸塩である。いくつかの実施態様では、内部環境は、1つ以上のカチオンを含む。いくつかの実施態様では、1つ以上のカチオンは、ナトリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、銅、マグネシウム、亜鉛または鉄でありうる。アニオンとカチオンの最良の組み合わせは、たとえば、本明細書に記載の技術を使用することによって、所定の抗有糸分裂剤について容易に決定することができる。
【００２４】
いくつかの実施態様では、本発明の超安定リポソームは、任意の適切な形態で、たとえば、酸またはポリアニオンおよびカチオンを含む塩の形態で、好ましくは、塩の形態で、本発明の1つ以上のアニオンを含有することができる。アニオンの量は、化学量論的にカチオンの量と同じであっても、異なっていてもよい。いくつかの実施態様では、本発明の超安定リポソームは、カチオンの1つ以上のアニオン塩を含み、リポソーム膜を横切ってカチオン濃度勾配またはpH勾配が存在する。もう1つの実施態様では、本発明の超安定リポソームは、本発明の1つ以上のアンモニウムアニオン塩を含有する。さらにもう1つの実施態様では、本発明の超安定リポソームは、超安定リポソームの内部にアニオンを含有し、一方、超安定リポソームを含有する媒体中のアニオンは、希釈、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、限外ろ過、吸収、沈殿などの当業者に公知の任意の適切な手段によって部分的または実質的に除去される。いくつかの実施態様では、封入されたアニオンを有する超安定リポソームはまた、超安定リポソーム内に物質を保持するのに有効な膜貫通勾配を有する。このような膜貫通勾配の例は、pH勾配、電気化学ポテンシャル勾配、カチオンイオン勾配、または溶解度勾配である。膜貫通勾配を作り出す方法は、リポソームの分野においてルーチンである。
【００２５】
いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、腫瘍内皮の開窓を利用して、標的細胞に侵入する。他の実施態様では、本発明の超安定リポソームはまた、標的化リポソーム、たとえば、リポソームの表面上に1つ以上の標的化部分または生体内分布調節因子を含むリポソームでありうる。標的化部分は、所望の標的と特異的に結合または相互作用することができる任意の作用剤でありうる。いくつかの実施態様では、標的化部分は、リガンドである。いくつかの実施態様では、リガンドは、リポソーム封入体がその所望の効果を発揮する細胞(標的細胞)に優先的に結合し、および/またはその中に内在化する。リガンドは通常、結合ペアのメンバーであり、ここで第二のメンバーは、標的細胞の上または中に、または標的細胞を含む組織の中に存在する。たとえば、参照により本願に組み込まれる、米国特許第8,922,970号を参照。
【００２６】
本発明のリポソームは、当業者に既知であるか、または当業者によって後に発見された任意の適当な方法によって調製されうる。たとえば、Gregoriadis[25]、米国特許第8,992,970号および米国特許第9,023,384号をご参照ください。これらの文献は、参照により本願に組み込まれる。リポソームは、典型的には、水溶性(親水性)材料が、水和液としてこれらの材料の水溶液を使用することによって、またはリポソームの調製中のある段階で薬剤/薬剤溶液を添加することによって封入されるさまざまな手順を使用して調製される。脂溶性(親油性)材料は、構成脂質の有機溶液に可溶化され、次いで、蒸発させて、脂質フィルムを含有する乾燥薬剤にされ、続いて、水和される。これらの方法は、調製手順の前または最中に、封入された薬剤をローディングすること(パッシブローディング)を含む。しかしながら、イオン化可能基を有するある種の化合物、および脂質と水溶性の両方を示すものは、無傷の小胞の形成後にリポソームに導入することができる(リモートまたはアクティブローディング)。
【００２７】
混合脂質組成を有するリポソームを調製する場合、脂質を最初に有機溶媒に溶解および混合して、脂質の均質混合物を確実にする。いくつかの実施態様では、有機溶媒はクロロホルムまたはクロロホルム：メタノール混合物である。脂質が有機溶媒中で十分に混合されたら、溶媒を除去して脂質フィルムを得る。いくつかの実施態様では、有機溶媒を減圧下で回転蒸発により除去し、丸底フラスコの側面に薄い脂質フィルムを得る。脂質フィルムを、典型的には、高真空下で一晩徹底的に乾燥させて、残留有機溶媒を除去する。乾燥脂質フィルムの水和は、乾燥脂質の容器に緩衝水溶液を添加し、脂質転移温度より高い温度で撹拌することによって簡単に達成される。この方法は、大きさおよび形状の両方が不均一(たとえば、直径1〜5μm)の多層リポソーム(MLV)の集団を生じる。単一の単層ベシクル(SUV)形成のための超音波処理または大きな単層ベシクル(LUV)を形成するポリカーボネートフィルターを通しての押出しなどのリポソームサイズ縮小技術。封入された薬剤を用いてリポソームを調製するためのさらなる詳細およびさらなる方法は、Fritzeら[16]、Duaら[20]、Laouiniら[21]、米国特許第8,992,970号および米国特許第9,023,384号に見出すことができる。これらの文献は、参照により本願に組み込まれる。
【００２８】
いくつかの実施態様では、本発明の超安定リポソームは、膜透過性を低下させるために、高コレステロール含量と結合した飽和ホスファチジルコリンを使用してナノスケールで製剤される。いくつかの実施態様では、超安定リポソームはさらに、立体安定化のためにPEG化または他の複合を使用して製剤される。他の実施態様では、飽和ホスファチジルコリンを他の膜形成性リン脂質で置き換えることができる。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、慣例の技術または本明細書に記載の技術を用いて調製される。いくつかの実施態様では、膜形成性リン脂質は、飽和ホスファチジルコリン(PC)、飽和脂肪酸末端を有する任意の合成ホスファチジルコリン(PC)、または膜形成性脂質である。いくつかの実施態様では、合成PCは、ジミリストイル-ホスファチジルコリン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、またはジステアロイル-ホスファチジルコリンでありうる。いくつかの実施態様では、飽和ホスファチジルコリン(PC)は、水素化卵黄ホスファチジルコリン(HEPC)である。他の実施態様では、膜形成脂質は、飽和スフィンゴミエリン、飽和ホスファチジルエタノールアミン、飽和ホスファチジルグリセロール、飽和ホスファチジルイノシトールまたは飽和ホスファチジルセリンでありうる。
【００２９】
いくつかの実施態様では、複合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン-無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル-無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチンまたはカラギーナンでありうる。いくつかの実施態様では、ポリエチレングリコール(PEG)がコンジュゲート(C-PEG)として使用される。いくつかの実施態様では、PEGの分子量は、約500〜約10,000、好ましくは、約1,000〜約5,000、より好ましくは、約2,000である。
【００３０】
いくつかの実施態様では、PEGまたは他の複合体は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイルグリセロール(DSG)、ジミリストイルグリセロール(DMG)、コレステリル化複合体、ステアリル(STR)複合体、またはC8セラミド複合体またはC16セラミド複合体と複合する。いくつかの実施態様では、複合体は、PEG2000であり、複合体は、DSPE-PEG2000、DPPE-PEG2000、DMPE-PEG2000、DSG-PEG2000、DMG-PEG2000、cholesterylated-PEG2000、STR-PEG2000、C8セラミド-PEG2000またはC16セラミド-PEG2000である。
【００３１】
いくつかの実施態様では、立体安定化リポソームは、PC：コレステロール：C-PEGの調製混合物から調製され、ここで、PC：コレステロールのモル比は、典型的には、2：1〜1：1の範囲であり、C-PEGは、5%(mol/mol)で存在する。いくつかの実施態様では、PC：コレステロール：C-PEGの調製混合物は、50：45：5のモル比を有する。いくつかの実施態様では、調製混合物は、HEPC：コレステロール：DSPE-PEG2000である。いくつかの実施態様では、HEPC：コレステロール：DSPE-PEG2000の調製混合物は、50：45：5のモル比を有する。
【００３２】
いくつかの実施態様では、リポソームは、本明細書に記載の調製混合物をクロロホルムに溶解することによって調製される。この溶液を回転蒸発下、次いで、真空下で一晩乾燥して薄膜にする。フィルムは、リポソームの内部環境として、本明細書に記載されるような所望の塩溶液を含む水和緩衝液で水和され、次いで、ウォーターバスソニケーターに浸される。リポソーム混合物を最初に超音波処理し、続いて、押出してSUVを形成する。いくつかの実施態様では、SUVはスクロースに対して透析されて、リポソームの外部環境を変更する。
【００３３】
いくつかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、当業界ではよく知られているpH勾配法を介してリポソームに活発にローディングされる。いくつかの実施態様では、まず有糸分裂抑制剤を適当な容器内に薄膜としてコーティングし、次いで、乾燥させる。いくつかの実施態様では、リポソームは、3：1の脂質：薬剤濃度でローディングされ、水でこの所望の濃度に希釈される。次いで、ローディングを容易にするために、混合物を高温ウォーターバス中でインキュベートし、続いて、スクロース中で透析して、封入されていない薬剤を除去した。
【００３４】
いくつかの実施態様では、本発明の超安定リポソームは、次のようにして調製される。HEPC：Chol：DSPE-PEG2000のモル比50：45：5の脂質混合物をクロロホルムに溶解する。混合物を回転蒸発下、丸底フラスコ中で薄い脂質フィルムに乾燥させ、さらに一晩高真空下で乾燥させた後、リポソームの内部環境として所望の塩溶液で水和する。得られた100mM脂質懸濁液をバスソニケーターで１時間超音波処理し、続いて、Lipex Thermobarrel Extruderを用いて二重に積層した100nm Nucleporeフィルターを通して10回押し出して、単一の単層ベシクル(SUV)を形成する。これらのSUVを、24時間以内に新鮮なスクロース溶液を3回交換しながら4℃で300mMのスクロース中で透析して、リポソームの外部環境を交換する。意図した使用までリポソームをガラス管内で4℃にて保存する。
【００３５】
1つの例では、有糸分裂阻害剤BI 2536は、pH勾配法を介してリポソームに能動的にローディングされる。BI 2536をシンチレーションバイアル中でエタノール中に溶解し、続いて、回転蒸発下で乾燥することにより、最初に薄膜としてコーティングする。BI 2536薄膜をさらに、少なくとも24時間真空乾燥する。リポソームは、3：1の脂質：薬剤濃度でローディングされ、最終濃度約50〜約70mMの脂質になるように水で希釈される。次いで、ローディングを容易にするために、混合物を70℃のウォーターバス中でインキュベートし、続いて、300mMのスクロース中で少なくとも36時間透析して封入されていないBI 2536を除去する。透析後、リポソームは、使用するまでガラス管内に保存される。
【００３６】
いくつかの実施態様では、本発明の超安定リポソーム内部の実体の初期ローディングから一定期間後、本発明の超安定リポソームは、たとえば、超安定リポソームの外側で放出されたか、または依然として超安定リポソームの内側で維持されている封入された実体の百分率によって測定されるように、保存中非常に安定である。たとえば、本発明の超安定リポソーム組成物は、4℃で少なくとも6か月間安定である。
【００３７】
超安定リポソームがその意図された作用の部位、たとえば、患者に投与されるリポソーム抗有糸分裂剤の場合、腫瘍に達するまで、リポソームに封入された抗有糸分裂剤がリポソーム中にカプセル化されたままであることは、該抗有糸分裂剤にとって有利である。本発明の超安定リポソームは、インビボ条件下、たとえば、哺乳動物の血液中で、封入された抗有糸分裂剤の放出(漏出)に対して驚くべき安定性を示した。驚くべきことに、本発明の超安定リポソームは、血液循環中でのそのような低いインビボ薬剤放出速度を有する一方で、実質的なインビトロ抗腫瘍活性を示した。本発明の超安定リポソームは、封入された抗有糸分裂剤の高い効率と低い毒性の予想外の組み合わせを提供した。
【００３８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の超安定リポソームを水性媒体中に含むリポソーム組成物が提供される。いくつかの実施態様では、超安定リポソームは、膜によって水性媒体から分離された内部水性空間を有する。いくつかの実施態様では、膜は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]、水素添加卵L-α-ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含む。いくつかの実施態様では、超安定リポソームの内部に封入されたものは、抗有糸分裂剤、アニオンおよびカチオンであるり、ここで、超安定リポソームの内部に封入された抗有糸分裂剤の濃度は、水性媒体中の抗有糸分裂剤の濃度を超える濃度である。
【００３９】
いくつかの実施態様では、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤および/または担体を含むか、または含まない、本明細書に記載の超安定リポソームを含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施態様では、薬学的に許容される担体は、通常の生理食塩水、等張デキストロース、等張スクロース、リンガー液、およびハンクス液である。保存安定性に最適なpHを提供するために緩衝物質を添加することができる。たとえば、pH約6.0〜約7.5、より好ましくはpH約6.5は、リポソーム膜脂質の安定性にとって最適であり、そして、封入された実体の優れた保持を提供する。典型的には2-20mM濃度のヒスチジン、ヒドロキシエチルピペラジン-エチルスルホネート(HEPES)、モルホリポ-エチルスルホネート(MES)、コハク酸塩、酒石酸塩、およびクエン酸塩が、例示的な緩衝物質である。他の適切な担体として、たとえば、水、緩衝水溶液、0.4%NaCl、0.3%グリシンなどが挙げられる。タンパク質、炭水化物、またはポリマー安定剤および等張化剤、たとえば、ゼラチン、アルブミン、デキストラン、またはポリビニルピロリドンを添加することができる。組成物の張度は、グルコース、またはラクトース、スクロース、マンニトールもしくはデキストリンなどのより不活性な化合物を用いて、0.25-0.35 mol/kgの生理学的レベルに調整することができる。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術、たとえば、ろ過によって滅菌することができる。得られた水溶液を、使用のために包装するか、または無菌条件下でろ過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水性媒体と混合される。
【００４０】
いくつかの実施態様では、薬学的に許容される賦形剤を、生理学的条件に近づけるために必要に応じて、たとえば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのpH調整剤および緩衝剤、等張化剤などを使用することができる。さらに、超安定リポソーム懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸化的損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含みうる。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャーおよびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤が適切である。
【００４１】
医薬組成物中の本発明の超安定リポソームの濃度は広く変化し、すなわち通常約0.05%未満から、または少なくとも2-10重量%〜最大30-50重量%までの範囲で変化し、選択された特定の投与様式に従って、主に流体体積、粘度などにより、選択することができる。たとえば、濃度は、治療に伴う流体ロードを低下させるために増加させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症関連鬱血性心不全または重症高血圧症を患っている患者において特に望ましい可能性がある。あるいは、刺激性脂質からなる医薬組成物は、投与部位での炎症を軽減するために低濃度に希釈することができる。
【００４２】
第二の態様では、本発明は、本明細書に記載の超安定リポソームを用いて癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様では、投与される超安定リポソーム医薬組成物の量は、超安定リポソームの内部に封入された特定の抗有糸分裂剤、治療される癌、使用される超安定リポソームの種類、および臨床医の判断に応じて変わる。一般に、投与される超安定リポソーム医薬組成物の量は、治療上有効量の特定の抗有糸分裂剤を送達するのに十分であろう。
【００４３】
治療有効量を送達するのに必要な超安定リポソーム医薬組成物の量は、薬物検査の分野で一般的な通常のインビトロおよびインビボ方法によって決定することができる。たとえば、Budmanら[22]をご参照ください。さまざまな抗有糸分裂剤についての治療有効投薬量は、当業者に周知であり；そして、本発明によれば、本発明の医薬組成物を介して送達される抗有糸分裂剤は、通常の非リポソーム製剤中に同量の抗有糸分裂剤を投与することによって得られる活性と少なくとも同じか、またはそれよりも2倍、4倍、または10倍高い活性を提供する。典型的には、本発明の超安定リポソーム医薬組成物の投与量は、体重1キログラム当たり約0.005〜約500mgの治療物質、最も多くの場合、約0.1〜約100mgの治療物質/体重kgの範囲である。
【００４４】
典型的には、本発明の医薬組成物は、局所用または注射用として、溶液または懸濁液のいずれかとして調製される。しかしながら、注射前に液体ビヒクルに溶解するか、または液体ビヒクルに懸濁するのに適した固体形態も、調製されうる。該組成物はまた、当該技術分野で公知の方法に従って、腸溶性錠剤またはゲルカプセルに製剤されうる。
【００４５】
本発明の超安定リポソーム組成物は、治療されている癌に応じて異なる医学的に許容される任意の方法で投与することができる。可能な投与経路として、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、硬膜内、髄腔内などの非経口経路による注射、ならびに経口、経鼻、眼内、直腸内、膣内、局所または吸入による肺などが挙げられる。中枢神経系の腫瘍に、本発明に従って製剤された抗有糸分裂剤をリポソーム的に送達するために、腫瘍内への直接の、リポソームのゆっくりとした持続的な頭蓋内注入(対流強化送達、またはCED)が特に有利である。Saitoら[23]およびMamotら[24]をご参照ください。組成物はまた、組織表面に直接適用されてもよい。持続放出、pH依存型放出、または他の特定の化学的もしくは環境条件媒介性放出投与もまた、たとえば、デポー注射、または侵食性インプラントなどの手段によって、本発明に特に含まれる。
【００４６】
以下の実施例に示されるように、徐放性超安定リポソーム製剤を特定するために、コンビナトリアルアニオン多様性を使用するアプローチが記載されている。実施例では、クエン酸塩：リン酸塩アニオンペアに注目したが、スクリーン(図４)に見られる他の超安定アニオンペアもまた、BI 2536について同様の結果をもたらすであろう。クエン酸塩：リン酸塩ペアをクエン酸塩：酢酸塩で置き換えた場合、この代替のリポソームバージョンの単回投与で処置されたマウスは、クエン酸塩：酢酸塩比1：3で同様の効力を示し、最大の腫瘍減少を生じた(図8A)。さらに多様性を追加する自然な手段は、陽イオンの同一性を変えることである。たとえば、クエン酸塩：酢酸塩ペアについて、ナトリウムカチオンをアンモニウムに置き換えると、腫瘍退縮の速度が劇的に向上する(図8B)。
【００４７】
超安定リポソームは、2つの概念的問題を解決する。長期的な利用可能性は、複製作用において抗有糸分裂剤がより多くの腫瘍細胞を捕獲することを可能にする。さらに、超安定リポソームによって達成される低い残存薬物濃度は、有糸分裂スリップを引き起こす可能性が低い[19]。これは、より少ない腫瘍細胞しか、薬剤の意図された効果から逃れないことを意味する。このアプローチは、BI 2536のみならず、あらゆる抗有糸分裂剤に適用することができる。超安定カプセル化は、このクラスに含まれる24種類の薬剤の臨床的有用性を復活させる可能性がある。超安定リポソームの1つの利点は、1回の投与で2週間のタイムスケールでバイオアベイラビリティを延長できることであり、これにより、臨床医は、より少ない頻度でより高い有効性を達成することができる。もう1つの利点は、毒性の観点からの有糸分裂阻害剤の魅力的な特徴である、他の薬剤類と比較した場合の、超安定リポソームによる治療後の不可逆的神経障害の欠如である。失敗した有糸分裂阻害剤を再活性化するための一般的な方法の記載は、多くの可能性への扉を開き、欠陥があるのは有糸分裂を阻害するという考えではない；重要であるのは送達であるということを実証する。
【００４８】
実施例
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は説明のために提供され、決して本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野において周知の標準的な技術または以下に具体的に記載される技術を利用した。
【実施例１】
【００４９】
材料および方法
リポソーム調製：
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-２０００](DSPE-PEG2000)および水素添加卵L-α-ホスファチジルコリン(HEPC)は、Lipoidから購入し、Cholesterol(Chol)は、Sigma-Aldrichから購入した。モル比50：45：5のHEPC：Chol：DSPE-PEG2000の脂質混合物をクロロホルム(Takara)に溶解した。混合物を回転蒸発下(Eyela NVC-2200/N-1100)、丸底フラスコ中で薄い脂質膜になるまで乾燥し、さらに、高真空下で一晩乾燥した後、リポソームの内部環境として所望の塩溶液で水和した。得られた100mM脂質懸濁液をバスソニケーター(S30H Elmasonic)で1時間超音波処理し、続いて、Lipex Thermobarrel Extruder(Northern Lipids)を用いて二重積層100nm Nucleporeフィルター(Whatman)を通して10回押し出して、単一の単層ベシクル(SUV)を形成した。
これらのSUVを、24時間以内に新鮮なスクロース溶液を3回交換しながら4℃で300mMのスクロース(Sigma)中で透析して、リポソームの外部環境を交換した。意図した使用までリポソームをガラス管内で4℃にて保存する。
【００５０】
リポソームへのBI 2536のローディング：
pH勾配法を介してBI 2536(Axon)をリポソームに能動的にローディングした。必要なBI 2536を最初にエタノール中に溶解し、続いて回転蒸発下で乾燥することによりシンチレーションバイアル中で薄膜としてコーティングした。BI 2536薄膜をさらに、少なくとも24時間真空乾燥した。リポソームを、3：1の脂質：薬剤濃度でローディングし、最終濃度約50〜約70mMの脂質になるように水で希釈した。次いで、ローディングを容易にするために、混合物を70℃のウォーターバス中でインキュベートし、続いて、300mMのスクロース中で少なくとも36時間透析して封入されていないBI 2536を除去した。透析後、リポソームを、使用するまでガラス管内に保存し、スクロース透析液の一部を下流の封入効率測定のために4℃で保存した。
【００５１】
BI 2536封入の決定：
リポソームにローディングされたBI 2536の量を、直接計算(インビトロ研究)または逆算(動物研究について)によって決定した。直接計算のために、1μlのリポソームを20μlのエタノールで希釈し、360nm励起および470nm発光を用いる蛍光測定により読み取った(Tecan Infinite M200)。BI 2536の量を、標準曲線との比較により決定した。逆算のために、100μlの1-ノナノール(Merck)を使用して、1時間ボルテックスすることによって、1.5mlの透析液から未封入BI 2536を抽出した。ノナノールおよびスクロースを短時間の遠心分離によって相分離させ、20nmのノナノール層を330nmの励起および370nmの発光を用いる蛍光強度を測定した(Tecan Infinite M200)。透析液中のBI 2536の濃度を標準曲線と比較することによって決定し、封入効率を式：(A-B)/A × [BI 2536]初期
[式中、A=[透析液中のBI 2536]薬剤ローディングなしおよびB=[透析液中のBI 2536]サンプル]
によって計算した。
【００５２】
細胞培養：
HCT116(CCL-247、ヒト大腸癌腫)をAmerican Type Culture Collection(ATCC)から購入し、10%ウシ胎児血清(Thermo Scientific)を添加したMcCoyの5A培地(Life Technology)を用いて培養した。細胞を37℃、5%CO2でインキュベートし、コンフルエンスが〜80%に達したときに2〜3日ごとに継代した。
【００５３】
EC50決定：
約7x103個のHCT116細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、〜50%のコンフルエンスに達した。ウェル内の培地を、遊離BI 2536またはリポソームBI 2536のいずれかを補足した新鮮な培地と交換した。使用したBI 2536の濃度は、1μMのBI 2536を連続的に希釈することによって生成された。培地のみを含むウェルをブランク対照として使用した。製剤化のためにそれぞれ少なくとも3回反復を実施した。細胞生存の尺度としてSYBR Green I(Life Technologies)を使用してDNAを定量した。これは、最初に細胞を50μlの0.2%ドデシル硫酸ナトリウムと共に37℃で2時間インキュベートして、細胞を溶解させることによって行った。次いで、150μLのSYBRグリーン溶液(水中1：750希釈)を各ウェルに添加し、Tecanプレートリーダーを使用して蛍光強度(Ex：497nm/Em：520nm)を測定した。蛍光強度値をGraphPad Prism V5に入力した。ロジスティックス回帰曲線およびEC50を、最高蛍光値を100%生存として、そして最低蛍光値を0%生存として設定することによって決定した。
【００５４】
動物実験：
すべての動物実験は、Temasek Life Sciences Laboratoryの動物実験委員会およびシンガポール国立大学(NUS)によって承認された。雌性NCrヌードマウス(5〜8週齢)を(Singapore/InVivos)から購入し、HCT116細胞を用いて皮下異種移植した。HCT116細胞を600cm2の皿(Corning)中で上記のように増殖させ、コンフルエンスが、〜80%に達したときに各皿を使用して5匹のマウスに移植した。
【００５５】
有効性実験：
遊離BI 2536(0.1N HCl、生理食塩水に溶解)または指示されたリポソームBI 2536製剤を、HCT116を移植した7日後に緩徐な尾静脈注射により投与した。腫瘍体積は、少なくとも150mm3であり、長さ×幅2×0.5を用いて計算された。すべての測定は、ノギスを用いて行われ、マウスの体重は、一日おきに測定された。マウスが完全に水分補給されることを確実にするために、治療後5日間、毎日マウスに1mlのハートマン溶液で皮下的に水分補給した。
【００５６】
薬物動態研究：
HCT116異種移植片を有するマウスを、指示された遊離BI 2536またはリポソームBI 2536製剤で処置し、処置後の指示された時点で安楽死させて、心臓、腫瘍、筋肉、腎臓、肝臓および脾臓を採取した。臓器を秤量し、組織処理の前に-80℃で保存した。組織を、カオトロピック8M尿素(Vivantis)中に浸漬し、そして直径0.5mmのジルコニアビーズ(Biospec)を使用してBertin Homogenizer中で均質化することによって処理した。均質化した組織をベンチトップ遠心分離機にて最高速度で1時間回転させ、100μlのノナノールを用いて1時間穏やかに回転させて、BI 2536の抽出のために800μlの上清を回収した。ノナノールおよびスクロースを短時間の遠心分離によって相分離させ、20μlのノナノール層を、Tecanプレートリーダーを用いて、蛍光測定(Ex：330nm/Em：370nm)によって読み取った。標準曲線と比較することによってBI 2536を定量し、次いで、組織の重量に対して正規化した。
【００５７】
組織学：
処置後の指示された日に、腫瘍組織収集のためにマウスを屠殺した。腫瘍組織をOCT培地(Sakura Finetek)中で凍結し、切片化の前に-80℃で保存した。CM3050Sクライオスタット(Leica)を用いて、10μmの腫瘍組織切片を得た。切片化した組織をメタノール中で固定し、そして、直ちにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。H&E染色を行うために、最初に腫瘍切片をろ過したハリス溶液(Sigma)で過剰染色し、流水(水道水)で洗浄し、酸-アルコール(1%塩酸、70%エタノール)に浸し、さらに水道水で洗浄した。次いで、組織切片を、青味が出るまで0.2%アンモニア水(Sigma)に浸した。水道水で10分間洗浄した後、組織切片をエオシン-フロキシン(それぞれSigmaおよびMerck)で染色し、95％エタノールに浸して過剰の染色を洗い流した。組織切片を一晩乾燥させた後、Permount(Fisher)でマウントした。すべてのH&E染色切片を観察し、DXM 1200Fカメラ(Nikon)および63倍対物レンズと組み合わせたAxioplan 2顕微鏡(Carl Zeiss、Inc)を使用して明視野画像を取得した。
【００５８】
緩衝液中のBI 2536の調製：
最初にBI 2536をエタノールに溶解し、次いで、スピン乾燥により1.5mlの微量遠心管上にコーティングした。次に、BI 2636でコーティングしたチューブを高真空下で一晩さらに乾燥させた後、指示された塩溶液に再懸濁して、最終濃度500μMを達成した。コーティングされたBI 2636の完全な溶解を確実にするために、チューブを短時間ボルテックスし、特徴決定に使用する前に1分間浴超音波処理に付した。
【００５９】
ヘキサノール抽出：
1mlの指示された緩衝液から、100μlの1-ヘキサノール(Merck)で、1時間の短時間の振盪によりBI 2536を抽出した。ヘキサノールおよび緩衝液を短時間の遠心分離によって分離させ、20μlのヘキサノール層を、Tecanプレートリーダーを用いて、蛍光測定(Ex：330nm/Em：370nm)ついて分析した。
【００６０】
リポソーム安定性アッセイ：
漏出したBI 2536の蛍光の脱消光を、リポソーム不安定性の尺度として使用した。すべての蛍光読み取りは、Tecanプレートリーダー(Ex：280nm、Em：385nm)を用いて行った。リポソームからBI 2536を完全に放出させて、0.2%の最終濃度を達成するために、Triton-X100(シグマ)を添加し、蛍光の読み取りを再度行った。放出されたBI 2536の割合を計算するために、トリトン添加前の蛍光測定値をトリトン添加後の蛍光測定値で割った。安定性測定を行うために、リポソーム製剤を水または600mMスクロース溶液のいずれかで50倍希釈し、37℃でのインキュベートの開始時および12時間後に、Tecanプレートリーダーを用いて蛍光を測定した。長期安定性を決定するために、リポソームを水または600mMのスクロースで希釈した後に、37℃のインキュベーター内に保存し、指示された日に同様の方法で蛍光測定を行った。
【実施例２】
【００６１】
リポソームBI 2536の放出速度は、腫瘍細胞死滅と逆相関する
アニオンの同一性および濃度がBI 2536の物理化学的性質に影響を与える範囲は、pH3に調整された以下の溶液を用いて研究された：クエン酸ナトリウム(C)、酢酸ナトリウム(A)、リン酸ナトリウム(P)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(M)および塩酸(H)。これらの溶液からBI 2536がヘキサノールに分配する傾向を、さまざまな濃度で測定した(図1)。アニオンの同一性がヘキサノール抽出の効率に影響を及ぼし、そして、この効率がアニオン濃度依存的に増加(P、A)または減少(M、C、H)することも観察された(図2)。さらに、これらのアニオンのペアにした組み合わせを使用することによって、これらのヘキサノール-抽出効率曲線の多様性をさらに高めることができることが観察された(図3)。これらの結果から、これらのアニオンを組み合わせて使用して、放出速度が異なるリポソーム製剤のライブラリーを作製することができると推論された。
【００６２】
超安定かつ徐放性形態のリポソームBI 2536を特定するために、アニオンの15種類の単一および二重の組み合わせすべてのリポソーム封入バージョンを作製し、BI 2536をそれらの内部にリモート的にローディングした。リポソーム中に高濃度で封入されると、BI 2536の蛍光は消光する。したがって、リポソームからのBI 2536の放出は、脱消光による蛍光の増加によって測定することができる。この方法を用いて、各製剤についてのBI 2536の漏出を、高張(600mMスクロース)および低張(純水)条件下で、時間に関して測定した(図4)。予想されたように、速い(A、H、AH)から遅い(クエン酸塩とのすべての組み合わせ)までの放出速度の範囲が観察された。これらの放出速度のランク順は、高張環境と低張環境との間でそれほど差がなく、リポソームBI 2536の薬剤放出速度を決定するのはリポソーム内部環境であり、外部浸透圧ではないことを示す。超安定徐放性リポソームが癌細胞死滅と相関しているかどうかを調べるために、HCT116結腸直腸癌細胞をさまざまなリポソーム製剤の段階希釈物と共にインキュベートし、それらのEC50値を有効性の尺度として計算した。超安定性が細胞毒性と相関しているという仮説と一致して、放出速度とEC50との間に高い相関が見られた。対照的に、ドキソルビシンを用いて同じ実験を行った場合、同様の相関関係はないことがわかった(図4)。この知見は、有糸分裂阻害剤は超安定性から利益を得る可能性があるが、徐放が利点ではないであろう他のクラスの薬剤には逆のことが当てはまるという考えと一致する。
【実施例３】
【００６３】
アニオン比は、放出速度とインビボ有効性を調整する
放出速度が最も遅い2つのアニオンは、クエン酸塩単独とクエン酸塩とリン酸塩の組み合わせであるため(図4)、クエン酸塩：リン酸塩比を変化させることを研究して、それが有効性において実質的効果を有するかどうかを決定した。0：1、1：3、1：1、3：1および1：0の比を包含する製剤を、放出速度およびEC50について以前と同じ方法で試験した。これらの変数が細胞傷害性アッセイの第3日または第8日のどちらで測定されたかにかかわらず、放出速度およびEC50に関して同じ傾向が一貫して観察された(図5A)。興味深いことに、最も遅い放出は、クエン酸塩：リン酸塩比1：3で達成され、この組み合わせ比は、相乗的であって、単なるクエン酸塩単独とリン酸塩単独の平均された結果ではないことを明らかにすることが注目された。この結果はさらに、実際の固形腫瘍におけるインビボでの有効性を最大にするために、最適なクエン酸塩：リン酸塩比を特定することが重要であることを示唆した。この比を特定するために、確立されたヒト大腸癌異種移植片を有するマウスを、クエン酸塩：リン酸塩比1：7、1：4、1：3、1：2および1：0.5の範囲を網羅するリポソームで処理した。以前に観察された1：3の比と一致して、1：3および1：4のクエン酸塩：リン酸塩比で最良のインビボ有効性が観察された(図5B)。重要なことには、これらの比に対する腫瘍体積の減少は、2週間にわたって持続し、この観察はこれらの超安定リポソームからの予想される遅い放出と一致する。1：4の比は、1：3より大きい抗腫瘍効果をもたらしたが、それはまた、より多い重量減少をもたらした。したがって、1：3が、その後の実験のための最適比として採用された。このように封入されたBI 2536は「超安定」と呼ばれる。
【実施例４】
【００６４】
超安定リポソームBI 2536は、マウスにおける反応を完了させる
HCT116異種移植腫瘍を有するヌードマウスを、超安定リポソームBI 2536、またはアニオンとしてクエン酸塩もしくはリン酸塩のみのいずれかを含むリポソームBI 2536の単回静脈内注射で処置した。遊離のカプセル化されていないBI 2536を対照として使用した。超安定リポソームで処置された異種移植片は、12日間にわたって体積が減少し、我々の以前の動物実験で観察された長期の治療効果を再現した(図6A)。比較すると、クエン酸塩またはリン酸塩のみを使用するリポソームは、遊離の薬剤と区別することができず、アニオンの組み合わせが、どちらのアニオンだけでは説明されない相乗効果をもたらすことを実証した。超安定BI 2536で処置されたマウスは、処置後の体重が重い傾向にあり、これは薬剤放出の延長と共に予想される毒性よりも毒性が低いことと一致する傾向である。重要なことには、超安定BI 2536は、マウスの生存を有意に改善し、10匹中2匹のマウスで完全寛解が観察された(表1)。他の実験群では、完全寛解は観察されなかった。
【００６５】
表1
さまざまな処置に対する完全寛解の作表
【表１】
2020505451.tif 000003
【００６６】
超安定リポソームの単回投与の代わりに、7日間隔で2回の処置用量で同じ実験を繰り返した場合、治療効果はさらに長期間にわたって延長され(図6B)、75％のマウスにおいて完全寛解を生じた(表1)。対照的に、他の実験群では完全寛解は観察されなかった。超安定リポソームは、より有効であるのみならず、忍容性も良好であったが、他のすべての実験群は、処置後毒性を示した。
【実施例５】
【００６７】
超安定リポソームは、BI 2536の腫瘍存在性と有効性を延長する
超安定リポソームで観察された改善された有効性についての合理的な説明は、通常のペグ化リポソームと比較して薬剤の半減期が改善されることである。超安定リポソームの単回投与で処置されたヌードマウスは、クエン酸塩またはリン酸塩単独のいずれかを含有する対照リポソームと比較して、BI 2536の腫瘍中濃度が有意に高かった(図7A；表2)。この傾向は、腫瘍体積の減少が組織加工を非実用的にした後、測定の9.5日間全体にわたって持続した。超安定リポソームBI 2536への腫瘍曝露(曲線下面積で測定)は、クエン酸塩リポソームと比較して5倍高く、リン酸塩リポソームと比較して3倍高かった。健康な組織(脾臓、筋肉、腎臓、心臓、肝臓)中の薬剤濃度は、超安定リポソームについても同様に上昇したが、この傾向は10時間後には統計的に有意ではなかった(図7A；表2)。これらのより高い組織濃度にもかかわらず、超安定リポソームは、対照リポソームよりも毒性が低く、これは、健康な組織を循環している間、超安定リポソーム中のBI 2536の大部分が安全に封入されたままであることを示唆する。曲線下面積の一般的な増加と合わせて考慮すると、データから、超安定カプセル化は、BI 2536の循環半減期を増加させ、結果として、腫瘍区画内でのBI 2536の灌流および保持を増強させることが示唆される(図7B)。BI 2536(または任意の抗有糸分裂化学療法)の特徴は、腫瘍における有糸分裂を阻害するその能力にある。BI 2536の、より高いバイオアベイラビリティが超安定リポソームと対照との間の差異を説明することができるかどうかという問題を調べるために、単回投与の1.5および5.5日後の異種移植片上の腫瘍サンプルの組織学的分析を行った(図7Cおよび7D)。第1.5日では、封入されたBI 2536のすべてのリポソーム製剤および遊離BI 2536が、組織学的切片中の約25％の腫瘍核において観察される有糸分裂像と関連があった。しかしながら、第5.5日では、超安定リポソームBI 2536が、対照リポソームおよび遊離薬剤と比較して、有糸分裂停止細胞の有意に高い割合と関連があった。この延長された一時的なバイオアベイラビリティは、超安定的に封入されたBI 2536の改善された有効性を説明すると考えられる。
【００６８】
表2
超安定リポソーム(C：P=1：3)による治療からもたらされるBI 2536の組織濃度と他の治療(C：P=1：0およびC：P=0：1)を比較するp値(両側不等分散t検定)
【表２】
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【００６９】
本発明を説明する文脈における(特に以下の特許請求の範囲の文脈における)用語「a」、「an」、および「the」および類似の指示対象の使用は、他に本明細書別段の指定がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、および「含有する(containing)」は、特に断りのない限り、変更可能な用語として解釈されるべきである(すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」を意味する)。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指定がない限り、単にその範囲内に含まれる各個別の値を個々に示す簡潔な方法として機能することを意図している。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に別段に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語(たとえば、「など」)の使用は、単に本発明をよりよく解明することを意図しており、特に断りがない限り本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須のものとして特許請求の範囲に記載されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００７０】
本発明を実施するための、本発明者らが知っている最良の形態を含む本発明の実施態様を本明細書に記載する。これらの実施態様の変形は、前述の記載を読めば当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待しており、そして本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許容されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の主題のすべての修正形態および均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形形態における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【００７１】
参考文献一覧
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2020505451.tif 000009
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2020505451.tif 000011
【図６Ｂ】
2020505451.tif 000012
【図７Ａ】
2020505451.tif 000013
【図７Ｂ】
2020505451.tif 000014
【図７Ｃ】
2020505451.tif 000015
【図７Ｄ】
2020505451.tif 000016
【図８Ａ】
2020505451.tif 000017
【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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