(57)【要約】抗ＰＤ−１抗体及びその抗原結合断片が提供される。抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子、関連する発現ベクター、及び宿主細胞も提供される。抗ＰＤ−１抗体及びその抗原結合断片を作製する方法が提供される。関連する医薬組成物及び対象を治療するためのその使用方法も提供される。
2020501598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、
（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と
を含む抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号１７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、
（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と
を含む親和性成熟型抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項３】
（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、
（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン配列と
を含む親和性成熟型抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項４】
（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、
（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と
を含む親和性成熟型抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体。ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む、実施形態１〜９のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ、及び直線状の抗体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
抗体が、多重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
治療剤にコンジュゲートされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
標識にコンジュゲートされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
標識が、放射性同位体、蛍光色素、及び酵素からなる群から選択される、請求項８に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞を培養することと、細胞培養物から抗体を回収することとを含む、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を製造する方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を、患者から得たサンプルと接触させること、及びＰＤ−１タンパク質に結合した抗ＰＤ−１抗体を検出することにより、サンプル中のＰＤ−１タンパク質を検出する方法。
【請求項１６】
抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片が、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイで使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有効量の請求項１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象内のがんを治療する方法。
【請求項１８】
がんが、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、乳がん、子宮頸がん、甲状腺がん、及び唾液腺がんからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、及び細胞毒性剤からなる群から選択される治療剤を更に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、放射線療法を更に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、又はＥＧＦＲに対する治療用抗体を更に投与される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
このＰＣＴ国際出願は、２０１６年９月１６日出願の米国仮特許出願第６２／３９５，８３２号の利益及び優先権を主張する。このＰＣＴ国際出願は、２０１７年６月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５１９，５９０号の利益及び優先権についても主張する。これら出願の各記載内容は、本明細書により参照として組み込まれている。
【０００３】
本発明は、抗ＰＤ−１抗体、及びヒトがんの治療におけるその使用方法と一般的に関連する。
【背景技術】
【０００４】
プログラム死−１（ＰＤ−１）は、活性化Ｔ及びＢ細胞により発現される重要な免疫チェックポイント受容体であり、また免疫抑制を媒介する。ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、及びＢＴＬＡを含むＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１に対する２つの細胞表面糖タンパク質リガンド、プログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）及びプログラム死リガンド−２（ＰＤ−Ｌ２）が同定されているが、これらは抗原提示細胞並びに多くのヒトがんにおいて発現しており、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞の活性化及びサイトカイン分泌を下方制御することが明らかにされている（Freeman et al., 2000; Latchman et al., 2001）。ＣＴＬＡ−４とは異なり、ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞が、腫瘍及び／又は間質細胞により発現される免疫抑制的なＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）リガンドに遭遇する可能性がある周辺組織において主に機能する（Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012a）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害すると、前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を引き起こし（米国特許第８，００８，４４９号及び同第７，９４３，７４３号）、そしてがん治療を目的としたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に対するＡｂ阻害剤の使用について臨床トライアルが開始された（Brahmer et al., 2010; Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012）。
【０００５】
ＰＤ−１を標的とする抗がん治療薬の開発に対する必要性が存在する。本発明はこれ及びこれ以外の必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００６】
抗ＰＤ−１抗体及び／又はその抗原結合断片が本発明により提供される。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含むキメラ抗ＰＤ−１抗体であるｃ１Ｇ４及び／又はヒト化抗ＰＤ−１であるｈ１Ｇ４である。
【０００７】
本発明は、ヒト化抗ＰＤ−１抗体であるｈ１Ｇ４に対する親和性成熟型抗体を更に提供する。特定の実施形態では、本発明の成熟型抗ＰＤ−１抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、３３Ｂ）は、（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号１７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【０００８】
その他の実施形態では、本発明の成熟型抗ＰＤ−１抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、６６Ｅ）は、（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明の成熟型抗ＰＤ−１抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、７１１Ｄ）は、（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【００１０】
本明細書に記載するＣＤＲの配列を、下記の表１に提示する。
【００１１】
【表１】
2020501598.tif 000003
【００１２】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、（１）配列番号９、２１、及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号１０又は１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；（３）配列番号１１、１７、２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）配列番号１２又は１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号１３又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）配列番号１４、２０、２３、及び２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【００１３】
（配列番号４）に定めるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列と、（配列番号２）に定めるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列とを含む抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片も本発明により提供される。
【００１４】
（配列番号８）に定めるアミノ酸配列と、（配列番号６）に定めるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列とを含むヒト化抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片も本発明により提供される。
【００１５】
上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ、及び直線状の抗体からなる群から選択される。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。
【００１６】
上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片は、治療剤にコンジュゲートされている。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片は、標識にコンジュゲートされている。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、標識は、放射性同位体、蛍光色素、及び酵素からなる群から選択される。
【００１７】
本発明は、上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）核酸分子をコードする発現ベクターも提供される。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）発現ベクターを含む細胞も提供される。本発明は、上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）細胞を培養することと、細胞培養物から抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む、抗体を製造する方法も提供する。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は安定な哺乳動物細胞株である。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、安定な哺乳動物細胞株はＣＨＯ細胞株である。
【００１８】
本発明は、上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を含む組成物及び薬学的に許容される担体を提供する。
【００１９】
本発明は、上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を患者から得たサンプルと接触させること、及びＰＤ−１タンパク質に結合した抗ＰＤ−１抗体を検出することにより、そのサンプル中のＰＤ−１タンパク質を検出する方法を提供する。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片は、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される。
【００２０】
有効量の上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法も提供される。がんの治療で使用される、上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を含む組成物も提供される。がんを治療するための医薬の製造における上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片の使用が提供される。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、がんは、メラノーマ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞性肺がん及び非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん、及び唾液腺がんから選択される。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、対象は、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、及び細胞毒性剤からなる群から選択される治療剤が更に投与される。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、対象は、放射線療法が更に投与される。上記実施形態のいずれかに基づく（又はそれに適用される）いくつかの実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、又はＥＧＦＲに対する治療用抗体が更に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図１Ａ〜１Ｂ。ｃ１Ｇ４のＰＤ−１組換えタンパク質に対する結合。図１Ａは、抗ＰＤ−１抗体であるｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１のＰＤ−１−Ｈｉｓに対する結合を比較するために実施したＥＬＩＳＡの結果を示す。図１Ｂは、抗ＰＤ−１抗体であるｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１のＰＤ−１−ＡＰに対する結合を比較するために実施した第２セットのＥＬＩＳＡの結果を示す。ｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１はＰＤ−１−Ｈｉｓ及びＰＤ−１−ＡＰのいずれにも結合することができことをデータは示唆する。
【００２２】
図２Ａ〜２Ｂ。ＰＤ−１リガンドに対する結合におけるｃ１Ｇ４のブロッキング及び競合。図２Ａは、抗ＰＤ−１抗体であるｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合をブロックする能力を比較するために実施したＥＬＩＳＡの結果を示す。ｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１のいずれも、ＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１の結合をブロックすることが見出された。図２Ｂは、抗ＰＤ−１抗体であるｃ１Ｇ４が、ＰＤ−１−Ｈｉｓとの結合において、参照抗ＰＤ−１と競合する能力を確認するために実施したＥＬＩＳＡの結果を示す。ｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１のいずれも、ＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１の結合をブロックすることができること、及びｃ１Ｇ４はＰＤ−１−Ｈｉｓとの結合において、抗ＰＤ−１（参照）と競合することができることをデータは示唆する。
【００２３】
図３Ａ〜３Ｂ。ｃ１Ｇ４のＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞に対する結合。ｃ１Ｇ４抗体のＣＨＯ−Ｓ細胞（図３Ａ）、及びＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞（図３Ｂ）に対する結合をフローサイトメトリーにより試験した。参照抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。ｃ１Ｇ４は、ヒトＰＤ−１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合したが、しかし非トランスフェクトＣＨＯ細胞には結合しなかったことをデータは示唆する。
【００２４】
図４。リガンドのＰＤ−１に対する結合の、選択されたｃ１Ｇ４抗体によるブロッキング。フローサイトメトリーアッセイを使用して、リガンドＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞に結合するのをブロックする能力について、抗ＰＤ−１であるｃ１Ｇ４を試験した。参照抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定されるように、抗ＰＤ−１モノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞に対する結合をブロックした。抗ＰＤ−１であるｃ１Ｇ４はＰＤ−Ｌ１リガンドの細胞表面ＰＤ−１に対する結合をブロックすることをこのデータは実証する。
【００２５】
図５Ａ〜５Ｂ。混合白血球反応（ＭＬＲ）において、抗ＰＤ−１であるｃ１Ｇ４がサイトカイン産生に及ぼす効果。ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４は、混合白血球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌及びＩＬ−２分泌を促進する。参照抗ＰＤ−１及びアバスチン（Avastin）（抗ＶＥＧＦ）を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。図５Ａは、濃度依存性ＩＬ−２分泌を示す棒グラフについて説明する；図５Ｂは、濃度依存性ＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフについて説明する。
【００２６】
図６。混合白血球反応（ＭＬＲ）において、抗ＰＤ−１であるｃ１Ｇ４がＴ細胞増殖に及ぼす効果。ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４は、混合白血球反応アッセイにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する。参照抗ＰＤ−１及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。図６Ａは、様々な抗体濃度におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフについて説明する；図６Ｂは、様々な抗体濃度におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフについて説明する。
【００２７】
図７。ｃ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性。ヒト結腸がん細胞株ＨＴ２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝２：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１抗体を、１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図７Ａに示した。２８日目における個々の腫瘍容量を図７Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００２８】
図８。ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４に関する配列アラインメント。図８Ａは、ｃ１Ｇ４、ヒト化ｈ１Ｇ４の軽鎖、ヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域ＩＧＫＶ１−３９＊０１、及びニボルマブ（ＮＩＶ）の軽鎖のアミノ酸配列アライメントを示す。図８Ｂは、ｃ１Ｇ４、ヒト化ｈ１Ｇ４の重鎖、ヒト生殖細胞系列重鎖可変領域ＩＧＨＶ３−１１＊０４、及びニボルマブ（ＮＩＶ）の重鎖のアミノ酸配列アライメントを示す。ヒト化のためにｃ１Ｇ４からグラフティングしたＣＤＲ（相補性決定領域）を太字及び下線付きの文字で表わす。
【００２９】
図９。ヒト化抗ＰＤ−１抗体のＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞に対する結合。ヒト化ｈ１Ｇ４及びオリジナルのｃ１Ｇ４抗体について、それらと細胞表面上のＰＤ−１との結合をフローサイトメトリーにより試験した。参照抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。
【００３０】
図１０。ヒト化ｈ１Ｇ４抗体による、リガンドのＰＤ−１に対する結合のブロッキング。フローサイトメトリーアッセイを使用して、リガンドのＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞に結合するのをブロックする能力について、ヒト化抗ＰＤ−１であるｈ１Ｇ４を試験した。参照抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定されるように、ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４のいずれも、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞に対する結合をブロックした。
【００３１】
図１１Ａ〜１１Ｄは、ヒト（図１１Ａ）、カニクイザル（図１１Ｂ）、マウス（図１１Ｃ）、及びラット（図１１Ｄ）のＰＤ−１タンパク質に対するｈ１Ｇ４の種交差反応性を示す。すべてのデータポイントは三重測定の平均値±ＳＤである。
【００３２】
図１２。ヒト化抗ＰＤ−１抗体の活性化ヒトＴ細胞に対する結合。ヒト化ｈ１Ｇ４のヒトＴ細胞に対する結合をフローサイトメトリーにより試験した。参照抗ＰＤ−１抗体及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。
【００３３】
図１３。混合白血球反応（ＭＬＲ）において、ｈ１Ｇ４がサイトカイン産生に及ぼす効果。ヒトＰＤ−１に対するヒト化抗体であるｈ１Ｇ４は、混合白血球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌及びＩＬ−２分泌を促進する。参照抗ＰＤ−１抗体及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。図１３Ａは、濃度依存性ＩＬ−２分泌を示す棒グラフについて説明する；図１４Ｂは、濃度依存性ＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフについて説明する。
【００３４】
図１４。混合白血球反応（ＭＬＲ）において、ｈ１Ｇ４がＴ細胞の増殖に及ぼす効果。ヒトＰＤ−１に対するヒト化抗体であるｈ１Ｇ４は、混合白血球反応アッセイにおいてＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する。参照抗ＰＤ−１抗体及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。図１４Ａは、様々な抗体濃度におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフについて説明する；図１４Ｂは、様々な抗体濃度におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフについて説明する。
【００３５】
図１５。ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおけるｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性。ヒト結腸がん細胞株ＨＴ２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１抗体を、１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図１５Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図１５Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００３６】
図１６。ＮＣＩ−Ｈ２９２／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおけるｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性。ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１抗体を、１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図１６Ａに示した。２５日目における個々の腫瘍容量を図１６Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００３７】
図１７。ｈＰＤ１  ＫＩマウスにおけるｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性。ＭＣ３８−ｈｕＰＤ−Ｌ１（ヒトＰＤ−Ｌ１をトランスフェクトしたＭＣ３８）細胞を、ヒトＰＤ−１ノックイン（ｈＰＤ１  ＫＩ）マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。腫瘍容量が約７５ｍｍ３に達したときに、抗体治療を開始した。抗ＰＤ−１抗体を、１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＤである。
【００３８】
図１８。ヒト化ＮＳＧマウスを対象とする三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株異種移植モデルにおけるｈ１Ｇ４の有効性試験。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ヒト化ＮＳＧマウス（ｎ＝９匹／群）の皮下にイノキュレーションした。腫瘍容量が約６０〜１５０ｍｍ３に達したときに、抗体治療を開始した。投与日を矢印で示す。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００３９】
図１９。混合白血球反応（ＭＬＲ）において、ヒト抗ＰＤ−１抗体がサイトカイン産生に及ぼす効果。ヒトＰＤ−１に対するヒトモノクロナール抗体は、混合白血球反応アッセイにおいて、ＩＦＮ−γ分泌及びＩＬ−２分泌を促進する。参照抗ＰＤ−１抗体及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。図１９Ａは、濃度依存性ＩＬ−２分泌を示す棒グラフについて説明する；図１９Ｂは、濃度依存性ＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフについて説明する。
【００４０】
図２０。ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおけるヒト抗ＰＤ−１抗体の腫瘍増殖阻害活性。ヒト結腸がん細胞株ＨＴ２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１抗体を、１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍容量を１週間に２回測定した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００４１】
図２１。ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおける抗ＰＤ−１と抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体の併用。ヒト結腸がん細胞株ＨＴ２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１ｍＡｂ、抗ＶＥＧＦｍＡｂ（ＨＬＸ０４）、又は抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＶＥＧＦｍＡｂを、マウスの腹腔内に注射した。投与日を矢印で示す。腫瘍容量を１週間に２回測定した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００４２】
図２２。ＮＳＣＬＣ異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＶＥＧＦｍＡｂの腫瘍増殖阻害活性。ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１（ｈ１Ｇ４）及び抗ＶＥＧＦ（ＨＬＸ０４）抗体を、１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２２Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２２Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００４３】
図２３。ＮＳＣＬＣ異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＶＥＧＦＲ２ｍＡｂの腫瘍増殖阻害活性。ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１（ｈ１Ｇ４）及び抗ＶＥＧＦＲ２（ＨＬＸ０６）抗体を、第１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２３Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２３Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００４４】
図２４。ＮＳＣＬＣ異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＥＧＦＲｍＡｂの腫瘍増殖阻害活性。ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１（ＨＬＸ１０）及び抗ＥＧＦＲ（ＨＬＸ０７）抗体を、第１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２４Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２４Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【００４５】
図２５。ＨＴ−２９（ＫＲＡＳＷＴ、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＥＧＦＲｍＡｂの腫瘍増殖阻害活性。ヒト結腸がん細胞ＨＴ−２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣとの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を、マウス（ｎ＝５匹／群）の皮下に移植した。抗ＰＤ−１（ＨＬＸ１０）及び抗ＥＧＦＲ（ＨＬＸ０７）抗体を、第１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２５Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２５Ｂに示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、新規の抗ＰＤ−１抗体及び／又はその抗原結合断片を提供する。本発明者らは、抗ＰＤ−１抗体、例えば、本明細書に記載するキメラｃ１Ｇ４及びヒト化ｈ１Ｇ４抗体の他、その親和性成熟型抗体、例えば、３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１Ｄは、Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮγ分泌、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増強することを驚くべきことに見出した。本明細書に記載する抗ＰＤ−１抗体は、がんを治療するのに使用され、ＦＤＡより認可済みのヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクロナール抗体であるＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）と比較して、それよりも強化された有効性及び／又は抗腫瘍活性も示す。
【００４７】
イムノコンジュゲート、本明細書に記載する新規の抗ＰＤ−１抗体をコードする核酸、及び組成物（例えば、医薬組成物等）も提供される。本発明は、サンプル（例えば、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）又はエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でのサンプル等）中のＰＤ−１を検出するために、新規の抗ＰＤ−１抗体を使用する方法、がんの治療で使用されるそのような抗体を含む組成物、及びがんを治療するための医薬の製造におけるそのような抗体の使用も提供する。
【００４８】
定義
本明細書で使用する場合、「治療」又は「治療すること」とは、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を取得するアプローチである。本発明の目的に照らせば、有益な又は所望の臨床結果として、下記事項のうちの１つ又は複数が挙げられるが、但しこれらに限定されない：疾患に起因する１つ又は複数の症状を緩和すること、疾患の範囲を縮減すること、疾患を安定化させること（例えば、疾患の悪化を予防又は遅延させること）、疾患の拡散（例えば、転移）を予防又は遅延させること、疾患の再発を予防又は遅延させること、疾患の進行を遅延又は低速化させること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解（部分的又は完全）を実現すること、疾患を治療するのに必要とされる１つ又は複数のその他の薬物の投与量を減らすこと、疾患の進行を遅延させること、生活の質を高める又は改善すること、体重増加を増やすこと、及び／又は寿命を延ばすこと。がんの病理学的な結果（例えば、腫瘍容量等）の抑制もまた「治療」に含まれる。本明細書に提示する方法は、治療のこのような側面のうちの１つ又は複数のいずれかについて検討する。
【００４９】
用語「再発（recurrence）」、「再発（relapse）」、又は「再発した（relapsed）」とは、疾患が消失したという臨床評価の後のがん又は疾患のぶり返しを意味する。遠隔転移又は局所的再発（local recurrence）の診断は、再発（relapse）と考えることができる。
【００５０】
用語「難治性」又は「抵抗性」とは、治療に反応しなかったがん又は疾患を意味する。
【００５１】
用語「補助療法」とは、一次治療、通常手術後に行われる治療を意味する。がん又は疾患に対する補助療法として、免疫療法、化学療法、放射線療法、又はホルモン療法を挙げることができる。
【００５２】
用語「維持療法」とは、これまでの治療の効果を維持するのに役立つように行われるスケジュール化された再治療を意味する。維持療法は、寛解状態にあるがんを維持するのに役立つように、又は疾患進行を問わず、特定の療法に対する応答を引き延ばすために多くの場合行われる。
【００５３】
用語「浸潤がん」とは、それが発現した組織の層を超えて正常な周辺組織に拡散するがんを意味する。浸潤がんは、転移性の場合もあれば、またそうでない場合もある。
【００５４】
用語「非浸潤がん」とは、非常に初期のがん又は原発組織を超えて拡散していないがんを意味する。
【００５５】
腫瘍学における用語「無増悪生存率」とは、がんが増殖しない治療中及び後の時間の長さを意味する。無増悪生存率には、患者が完全な応答又は部分的な応答を経験した時間の量、並びに患者が安定な疾患を経験した時間の量が含まれる。
【００５６】
腫瘍学における用語「進行性疾患」とは、腫瘤の増加又は腫瘍の拡散に起因する、治療開始以降、２０パーセントを超える腫瘍の増殖を意味し得る。
【００５７】
「障害」は、抗体による治療から利益を得るあらゆる状態である。例えば、ＰＤ−１活性異常に罹患している、又はそれを予防する必要のある哺乳動物。これには、哺乳動物を問題とする障害に罹患させる病理学的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。本明細書において治療される障害の非限定的な例として、がん（例えば、頭頸部がん、咽頭がん、結腸直腸がん、肺がん等）が挙げられる。
【００５８】
「腫瘍」とは、本明細書で使用する場合、悪性又は良性を問わず、あらゆる新生細胞の成長及び増殖並びにあらゆる前がん性及びがん性の細胞及び組織を意味する。
【００５９】
用語「抗体」は広い意味で使用され、天然のポリペプチドに特異的に結合し、及び／又は本発明の生物学的活性若しくは免疫学的活性を示す限り、例えば、単一のモノクロナール抗体（作動薬、拮抗薬、及び中和抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクロナール抗体、単鎖抗−抗体、及び抗体の断片（下記参照）を特に包含する。１つの実施形態によれば、抗体は、標的タンパク質のオリゴマー形態、例えば、三量体の形態と結合する。別の実施形態によれば、抗体はタンパク質に特異的に結合し、その結合は、本発明のモノクロナール抗体により阻害され得る（例えば、本発明の預託抗体等）。抗体の「機能的断片又は類似体」という慣用句は、その参照先の抗体に共通する定性的な生物学的活性を有する化合物である。例えば、本発明の抗体の機能的断片又は類似体は、ＰＤ−１に特異的に結合することができるものであり得る。１つの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１が細胞の増殖を誘発する能力を阻止する、又は実質的に低下させることができる。
【００６０】
「単離された抗体」とは、その天然環境の成分から同定及び分離、及び／又は回収されたものである。その天然環境の汚染成分とは、診断上又は治療上の抗体使用を妨害し、また酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含み得る物質である。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法により決定した場合、抗体の９５重量％を上回り、及び最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により、Ｎ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー、又は好ましくは銀染色を使用して、還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質度まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないであろうから、単離された抗体は、組換え細胞内にインサイチュでの抗体を含む。通常、しかし、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６１】
基本的な４本鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に５つの基本的なヘテロ四量体ユニットから構成され、したがって１０個の抗原結合部位を備える一方、分泌型ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２〜５個の基本的な４本鎖ユニットを含む多価集合体を形成することができる）。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖と連結しているが、一方、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により相互に連結している。各Ｈ及びＬ鎖は、規則的間隔が置かれた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続くα鎖及びγ鎖のそれぞれに対応する３つの定常ドメイン（ＣＨ）、並びにμ及びεアイソタイプに対応する４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、それに続きその他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと一致した位置に配列し、またＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と一致した位置に配列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬが一対となって１つの抗原結合部位を共に形成する。抗体の異なるクラスの構造及び特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton &#38; Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6を参照。
【００６２】
任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づきκ及びλと呼ばれる明確に異なる２タイプのうちの一方に割り振ることができる。その重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス又はアイソタイプに割り振ることができる。α、δ、γ、ε、及びμとそれぞれ命名された重鎖を有する免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在する。γ及びαクラスは、ＣＨの配列及び機能における比較的マイナーな相違に基づいてサブクラスに更に分割され、例えば、ヒトは下記のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２。
【００６３】
用語「可変」とは、抗体間の配列において、可変ドメインの特定のセグメントが広範に異なるという事実を意味する。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、そして特定の抗体がその特定の抗原に対して有する特異性を定義する。但し、可変性は、可変ドメインのアミノ酸１１０個からなるスパンにおいて均等に分布しているわけではない。むしろ、Ｖ領域は、長さがそれぞれ９〜１２個のアミノ酸である「高度可変領域」と呼ばれる極めて可変性のより短い領域により分離した、１５〜３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから構成される。天然型の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲを含み、概ね３つの高度可変領域により結びつけられたβシート形状を採るが、該高度可変領域は、βシート構造を結びつけ、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の高度可変領域は、各ＦＲにより接近した状態で共に保持され、そして他方の鎖に由来する高度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常ドメインは、抗体が抗原に結合する際に直接関係しないが、しかし様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与等を示す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」とは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続的な抗原結合部位（antigen combining site）を意味するように意図されている。このような特別な領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 及びMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記載されているが、これらの定義には、相互に比較した場合、アミノ酸残基のオーバーラッピング又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はグラフティングされた抗体又はその変異体のＣＤＲを指すためにいずれかの定義を適用するにしても、その適用は本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であるように意図されている。上記で引用した参考文献のそれぞれにより定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基を、比較として下記の表２に記載する。
【００６５】
【表２】
2020501598.tif 000004
【００６６】
用語「モノクロナール抗体」とは、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る自然発生的な突然変異の可能性を除き同一である。モノクロナール抗体は、特異性が高く、単一の抗原性部位を標的とする。更に、異なる決定要素（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクロナール抗体調製物とは対照的に、各モノクロナール抗体は、抗原上の単一の決定要素を標的とする。その特異性に付加して、モノクロナール抗体は、その他の抗体により汚染されていない状態で合成可能であるという点において有利である。修飾語「モノクロナール」は、任意の特別な方法による抗体産生を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明で有用なモノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Nature. 256:495 (1975)）により最初に記載されたハイブリドーマ方法により調製可能である、又は細菌細胞、真核動物細胞又は植物細胞において組換えＤＮＡ方法を使用して作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクロナール抗体」は、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)、及び下記の実施例に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離可能である。
【００６７】
本明細書のモノクロナール抗体には、それが本発明の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列、並びにそのような抗体の断片と同一又は相同である「キメラ」抗体が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照）。本明細書の目的とするキメラ抗体には、ヒト以外の霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変ドメインの抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【００６８】
「インタクト」抗体は、抗原結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメインのＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然の配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）、又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクト抗体は、１つ又は複数のエフェクター機能を有する。
【００６９】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直線状の抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]を参照）；単鎖抗体分子；並びに複数の抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。表現「直線状の抗体」とは、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)において記載されている抗体を一般的に意味する。手短に述べると、このような抗体は、一対のタンデムなＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する。直線状の抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。
【００７０】
抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片が生成する。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体と共にＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び一方の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）から構成される。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシン処理すると、概略的には、二価の抗原結合活性を有し、及び抗原を架橋する能力をなおも有する２つのジスルフィドで連結したＦａｂ断片に対応する単一の大型のＦ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含め、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有することから、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）がフリーのチオール基を担持しているＦａｂ’に対する本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’断片として当初生成した。抗体断片のその他の化学カップリングも公知である。
【００７１】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより共に保持されたＨ鎖の両方のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域内の配列により決定され、同領域は、特定の種類の細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００７２】
「Ｆｃ領域変異体」は、本明細書において定義される少なくとも１つの「アミノ酸修飾」により、天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、Ｆｃ領域変異体は、天然配列のＦｃ領域、又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較したとき、天然配列のＦｃ領域内又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１〜約１０個のアミノ酸置換、及び好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。１つの実施形態では、本明細書におけるＦｃ領域変異体は、天然配列のＦｃ領域と、少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。別の実施形態によれば、本明細書におけるＦｃ領域変異体は、親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。
【００７３】
用語「Ｆｃ領域を含むポリペプチド」とは、Ｆｃ領域を含むポリペプチド、例えば抗体又はイムノアドヘシン等（本明細書に別途記載する定義を参照）を意味する。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムに基づく残基４４７）は、例えば、ポリペプチドの精製期間中に、又はポリペプチドをコードする核酸の組換えエンジニアリングにより除去され得る。したがって、抗体も含め、本発明に基づきＦｃ領域を有するポリペプチドを含む組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去されたポリペプチド集団、Ｋ４４７残基のいずれも除去されていないポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドと有さないポリペプチドとの混合物を有するポリペプチド集団を含み得る。
【００７４】
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し、及び抗体アイソタイプによって変化する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介式の細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体の下方制御；及びＢ細胞活性化が挙げられる。「天然配列のＦｃ領域」は、天然において見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。Ｆｃ配列の例は、例えばKabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))に記載されているが、但しこれらに限定されない。
【００７５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を備える最小の抗体断片である。この断片は、緊密に非共有結合的に会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体から構成される。これら２つのドメインが折り畳まれると、抗原に結合するためのアミノ酸残基に関係し、そして抗体に抗原結合特異性を付与する６つの高度可変ループ（Ｈ及びＬ鎖から各３ループ）が生み出される。
【００７６】
但し、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低くなるものの、抗原を認識しそれと結合する能力を有する。
【００７７】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」としても省略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結びつけられたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメインの間に、ｓＦｖが抗原に結合するための望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖのレビューについては、下記のPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995を参照。
【００７８】
用語「ダイアボディ」とは、鎖内ではなく鎖間でＶドメインの対形成を実現して、２価の断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすように、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（前段を参照）を構築することにより調製される小さい抗体断片を意味する。二重特異的なダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片からなるヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90:6444-6448 (1993)においてより十分に記載されている。
【００７９】
ヒト以外（例えば、齧歯類）の抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の抗体に由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高度可変領域に由来する残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有する、ヒト以外の種、例えばマウス、ラット、ウサギ、又はヒト以外の霊長類等の高度可変領域に由来する残基（ドナー抗体）と置き換わっているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応するヒト以外の残基と置き換わっている。
【００８０】
更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見出されない残基を含み得る。このような改変は、抗体の性能を更に精緻化するために実施される。一般的に、ヒト化抗体は、高度可変ループのすべて又は実質的にすべてが、ヒト以外の免疫グロブリンの高度可変ループに対応し、またＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ及び一般的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含む。ヒト化抗体は、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部分、一般的にはヒト免疫グロブリンのＦｃも適宜含む。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
【００８１】
本明細書において識別されたポリペプチド及び抗体配列における「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」又は「相同性」は、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮しながら配列をアライメントした後に、比較の対象となるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一の候補配列内のアミノ酸残基の割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一性の割合（％）を決定するためのアライメントは、当業者の手の内にある様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等を使用して達成され得る。比較の対象となる配列の全長にわたり、最大のアライメントを実現するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、当業者は、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書の目的に照らせば、％アミノ酸配列同一性の数値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生み出される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．社によって作成され、そしてソースコードは、ユーザー文書と共にワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９の米国著作権局にファイルされており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．社、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄ上で使用するためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、不変である。
【００８２】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」が、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するのに使用される。１つの実施形態では、本発明のＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むが、これには対立遺伝子変異体、及びこのような受容体のオルタナティブスプライシング型が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似したアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）をその細胞質ドメイン内に含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）をその細胞質ドメイン内に含有する（M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)のレビューを参照）。該用語には、アロタイプ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｐｈｅ１５８、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｖａｌ１５８、ＦｃγＲＩＩＡ−Ｒ１３１、及び／又はＦｃγＲＩＩＡ−Ｈ１３１等が含まれる。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);及び de Haas et al.,J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)においてレビューされている。その他のＦｃＲも、将来的に同定されるものを含め、本明細書の用語「ＦｃＲ」に包含される。該用語には、母体ＩｇＧの胎児への移行に関わっている新生児型受容体、ＦｃＲｎも含まれる（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００８３】
用語「ＦｃＲｎ」とは、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を指す。ＦｃＲｎは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と構造的に類似しており、またβ２−ミクログロブリンに非共有結合したα鎖から構成される。新生児型Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの複数の機能について、Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766においてレビューされている。ＦｃＲｎは、免疫グロブリンＩｇＧの母親から子供への受動的デリバリー及び血清ＩｇＧレベルの制御において役割を演じている。ＦｃＲｎはサルベージ受容体として作用することができ、細胞内及び細胞間の両方において、天然の形態のピノサイトースされたＩｇＧに結合し、それを輸送し、そしてそれをデフォルト分解経路から救済する。
【００８４】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも呼ばれる）は、アミノ酸１１８当たりからアミノ酸２１５当たり（ＥＵナンバリングシステム）まで通常延在する。
【００８５】
「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までのストレッチングとして一般的に定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)）。その他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同一位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列とアライメントすることができる。
【００８６】
Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、ヒンジ領域に対してＣ末端側直近のストレッチ、すなわちＦｃ領域の残基２３３〜２３９として通常定義される。これまでの報告では、ＦｃＲの結合は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域内のアミノ酸残基に一般的に起因した。
【００８７】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも呼ばれる）は、アミノ酸２３１当たりからアミノ酸３４０当たりまで通常延在する。ＣＨ２ドメインは、他方のドメインと緊密な対が形成されないという点で特有である。むしろ、インタクト天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に２本のＮ連結型分岐炭化水素鎖が挿入されている。炭化水素がドメイン間対形成に対する代替手段を提供し得ること、及びＣＨ２ドメインの安定化に役立ち得ることが推測されている。Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)。
【００８８】
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」又は「Ｈ３」ドメインとも呼ばれる）は、Ｆｃ領域内のＣ末端からＣＨ２ドメインにかけての一連の残基（すなわち、抗体配列の３４１アミノ酸残基当たりからＣ末端まで一般的にＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７に）を含む。
【００８９】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御等が挙げられる。そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせるのにＦｃ領域を一般的に必要とし、また例えば本明細書に開示する様々なアッセイを使用して評価可能である。
【００９０】
「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）経路の第１の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えば、Ｑｕｉｄｅｌ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから商業的に購入可能である。
【００９１】
用語「結合ドメイン」とは、別の分子と結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域との結合に関わるそのポリペプチド鎖（例えば、そのα鎖）の一部分を含み得る。１つの有用な結合ドメインは、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
【００９２】
ＦｃＲ結合親和力又はＡＤＣＣ活性が「変化した」ＩｇＧ  Ｆｃ変異体を含む抗体は、親ポリペプチド又は天然配列Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、ＦｃＲ結合活性（例えば、ＦｃγＲ又はＦｃＲｎ）及び／又はＡＤＣＣ活性が増強又は減少している抗体である。ＦｃＲに対する「結合の増強を示す」Ｆｃ変異体は、親ポリペプチド又は天然配列のＩｇＧ  Ｆｃよりも高い親和性を伴い（例えば、見かけのＫｄ又はＩＣ５０値が低め）、少なくとも１つのＦｃＲと結合する。いくつかの実施形態によれば、親ポリペプチドと比較したときの結合の改善は、約３倍、好ましくは約５〜、１０〜、２５〜、５０〜、６０〜、１００〜、１５０〜、２００〜、最大５００倍、又は約２５％〜１０００％の結合の改善である。ＦｃＲに対する「結合の低下を示す」ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも低い親和性を伴い（例えば、見かけのＫｄが高め又はＩＣ５０値が高め）、少なくとも１つのＦｃＲと結合する。親ポリペプチドと比較したときの結合の低下は、約４０％又はそれを超える結合の低下であり得る。
【００９３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」とは、特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型のＩｇによって、この細胞毒性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞と特異的に結合することが可能となり、そしてその後、細胞毒によって標的細胞が殺傷される細胞毒性の形態を意味する。抗体は「細胞毒性細胞を「武装させ」、またそのような殺傷にとって絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現が、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁、表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号、若しくは同第５，８２１，３３７号、又は下記の実施例に記載されているようなインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのＡＤＣＣアッセイが実施され得る。そのようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは又は加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性が、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいてインビボで評価され得る。
【００９４】
ヒトエフェクター細胞の存在下で、野生型ＩｇＧ  Ｆｃを有するポリペプチド又は親ポリペプチドよりも効果的に「ＡＤＣＣの増加を示す」、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するＦｃ領域変異体を含むポリペプチドは、アッセイ内のＦｃ領域変異体を含むポリペプチドと野生型Ｆｃ領域を含むポリペプチド（又は親ポリペプチド）の量が実質的に同一であるとき、ＡＤＣＣの媒介においてインビトロ又はインビボで実質的により有効であるポリペプチドである。一般的に、そのような変異体は、例えば、動物モデル等において、ＡＤＣＣ活性を決定するアッセイ又は方法等の、当技術分野において公知の任意のインビトロＡＤＣＣアッセイを使用して同定される。１つの実施形態では、好ましい変異体は、ＡＤＣＣの媒介において、野生型Ｆｃ（又は親ポリペプチド）よりも約５倍〜約１００倍、例えば、約２５〜約５０倍効果的である。
【００９５】
「補体依存性細胞毒性」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的細胞が溶解することを意味する。古典的補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１成分とその同種抗原に結合した抗体（該当するサブクラスの）の結合により開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)の記載に従い実施され得る。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変化し、及びＣ１ｑ結合能力が増加又は減少したポリペプチド変異体が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。それら特許公開の記載内容は参照として本明細書に特に組み込まれている。Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照。
【００９６】
本明細書に開示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の「有効量」とは、特に記載された目的を実現するのに十分な量である。「有効量」は、実験的に、及び記載された目的に関係する公知の方法により決定可能である。用語「治療有効量」とは、哺乳動物（ａｋａ患者）における疾患又は障害「を治療する」のに有効な、本明細書に開示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の量を意味する。がんの場合は、本明細書に開示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の治療有効量は、がん細胞の数を低下させる；腫瘍のサイズ若しくは重量を低下させる；がん細胞の末梢臓器への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度低速化させ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度低速化させ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害する；及び／又はがんと関連した症状のうちの１つ又は複数をある程度緩和することができる。本明細書に開示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物は、それが増殖を阻止し、及び／又は既存のがん細胞を殺傷することが可能となる範囲で、細胞増殖抑制的及び／又は細胞毒性的であり得る。１つの実施形態では、治療有効量は、増殖阻害量である。別の実施形態では、治療有効量は、患者の生存を延ばす量である。別の実施形態では、治療有効量は、患者の無増悪生存率を改善する量である。
【００９７】
本明細書に開示する本発明の抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の「増殖阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えばがん細胞の増殖を、インビトロ又はインビボで阻害する能力を有する量である。新生細胞増殖の阻害を目的とする本発明のポリペプチド、抗体、拮抗薬、又は組成物の「増殖阻害量」は、実験的に、また公知の方法により、又は本明細書に提示する実施例により決定可能である。
【００９８】
本発明の抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の「細胞毒性量」は、インビトロ又はインビボで、細胞、特に腫瘍、例えばがん細胞の破壊を引き起こす能力を有する量である。新生細胞増殖の阻害を目的とする本発明の抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の「細胞毒性量」は、実験的に、また当技術分野において公知の方法により決定可能である。
【００９９】
本発明の抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の「増殖阻害量」は、インビトロ又はインビボで、細胞、特に腫瘍、例えばがん細胞の増殖を阻害する能力を有する量である。新生細胞増殖の阻害を目的とする本発明の抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）又は組成物の「増殖阻害量」は、実験的に、また公知の方法により、又は本明細書に提示する実施例により決定可能である。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」又は「薬理学的に適合する」とは、生物学的に、又はそれ以外の形で忌避されない物質を意味し、例えば、該物質は、何らかの顕著な忌避すべき生物学的効果を引き起こさずに、又は該物質を含む組成物のその他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用を起こさないで患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、好ましくは毒性学試験及び製造試験の必要標準に適合し、並びに／又は米国食品医薬品局により作製された不活性成分指針に掲載されている。
【０１０１】
用語「検出すること」には、物質の有無を判断すること、又は物質（例えば、ＰＤ−１等）の量を定量することが含まれるように意図されている。該用語は、したがって、定性的及び定量的な決定を目的とする本発明の物質、組成物、及び方法の使用を意味する。一般的に、検出で使用される具体的な技術は、本発明の実践において重要でない。
【０１０２】
例えば、本発明に基づき「検出すること」には、ＰＤ−１遺伝子産物、ｍＲＮＡ分子、又はＰＤ−１ポリペプチドの有無；ＰＤ−１ポリペプチドのレベル又は標的に結合した量の変化；ＰＤ−１ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化を観察することが含まれ得る。いくつかの実施形態では、「検出すること」には、野生型ＰＤ−１レベル（例えば、ｍＲＮＡ又はポリペプチドレベル）を検出することが含まれ得る。検出することには、コントロールと比較したとき、１０％〜９０％の間の任意の数値、又は３０％〜６０％の間の任意の数値、又は１００％超の変化（増加又は減少）を定量することが含まれ得る。検出することには、２倍と１０倍を含むその間の任意の数値、又はそれを超える、例えば１００倍の変化を定量することが含まれ得る。
【０１０３】
単語「標識」とは、本明細書で使用されるとき、抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識そのものが、それ自体検出可能（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）となり得るが、酵素標識の場合、標識は検出可能である基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒し得る。
【０１０４】
本明細書における数値又はパラメーターの「約」とは、この技術分野における当業者にとってよく知られている各数値に関する通常の誤差範囲を意味する。本明細書における数値又はパラメーターの「約」は、当該数値又はパラメーターとそれ自体関連する側面を含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【０１０５】
本明細書に記載する本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、「からなる（consisting）」、及び「から実質的になる（consisting essentially of）」ことを含むものと理解されよう。
【０１０６】
特許出願及び公開資料を含む、本明細書で引用されたすべての参考資料は、本明細書により参考としてそのまま援用されている。
【０１０７】
抗ＰＤ−１抗体
本発明は、ＰＤ−１受容体（ＰＤ−１）に結合する新規抗体の同定に基づく。抗ＰＤ−１抗体は、様々な治療及び診断方法で使用可能である。例えば、抗ＰＤ−１抗体は、例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がんを含む、ＰＤ−１発現異常又はＰＤ−１活性異常により特徴付けられる疾患を治療する際に、単独又はその他の薬剤と組み合わせて使用可能である。本明細書に提示する抗体は、抗ＰＤ−１抗体を患者に投与し、そして患者から得られたサンプル中のＰＤ−１タンパク質に結合した抗ＰＤ−１抗体を検出する（例えば、インビボ又はエクスビボで）ことにより、或いは抗ＰＤ−１抗体を患者から得られたサンプルと接触させ、そしてＰＤ−１タンパク質に結合した抗ＰＤ−１抗体を定性的又は定量的に検出することにより、患者又は患者サンプル内のＰＤ−１タンパク質を検出するのにも使用可能である。
【０１０８】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１及びＣＤ２７９（分化抗原群２７９）としても知られている）は、ヒトではＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体であり、またＴ細胞及びプロＢ細胞上で発現している。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と結合する。ＰＤ−１は免疫チェックポイントとして機能し、Ｔ細胞の活性化を阻止することにより免疫系を下方制御し、次に自己免疫を低下させ、そして自己寛容を促進する際に重要な役割を演ずる。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節内の抗原特異的Ｔ細胞においてアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを低下させる二重機構を通じて達成される。
【０１０９】
抗ＰＤ−１抗体は、十分な親和性及び特異性を伴いＰＤ−１と結合する抗体である。好ましくは、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合断片）は、ＰＤ−１活性が関係する疾患又は状態を標的とし、またそれを妨害する際の治療剤として使用可能である。抗ＰＤ−１抗体は、その他の免疫グロブリンスーパーファミリーに通常結合しない。好ましくは、抗ＰＤ−１抗体は組換えヒト化抗ＰＤ−１モノクロナール抗体である。
【０１１０】
１つの実施形態によれば、抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に開示する抗体の任意の１つのＣＤＲ、可変性重鎖領域、及び／又は可変性軽鎖領域を含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含むキメラ抗ＰＤ−１抗体のｃ１Ｇ４、及び／又はヒト化抗ＰＤ−１のｈ１Ｇ４である。いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号９〜１４のうちの１つ又は複数において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸置換を含む。
【０１１２】
ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４の軽鎖及び重鎖の完全長アミノ酸配列及びヌクレオチド配列、並びにそのＣＤＲ配列を下記の配列リストに提示する。
【０１１３】
（配列番号４）に定めるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列と、（配列番号２）に定めるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列とを含む抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片も、本発明により提供される。
【０１１４】
（配列番号８）に定めるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列と、（配列番号６）に定めるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列とを含むヒト化抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片も本発明により提供される。
【０１１５】
本発明は、ヒト化ｈ１Ｇ４抗ＰＤ−１抗体に対する親和性成熟型抗体を更に提供する。特定の実施形態では、本発明の成熟型抗ＰＤ−１抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、３３Ｂ）は、（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号１７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【０１１６】
その他の実施形態では、本発明の成熟型抗ＰＤ−１抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、６６Ｅ）は、（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明の成熟型抗ＰＤ−１抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、７１１Ｄ）は、（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列とを含む。
【０１１８】
重鎖及び軽鎖可変ドメイン、並びにＣＤＲを、考え得るすべてのペアワイズコンビネーションで組み合わせると、いくつかの抗ＰＤ−１抗体が生成する。
【０１１９】
特定の実施形態では、アミノ酸置換（複数可）は、保存的なアミノ酸置換（複数可）である。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、抗体が抗原と結合する能力を実質的に低下させない。例えば、ＰＤ−１結合親和力を実質的に低下させない保存的な変更（例えば、本明細書に提示する保存的置換）を加えることができる。抗ＰＤ−１抗体変異体の結合親和力は、下記の実施例に記載する方法を使用して評価可能である。
【０１２０】
保存的置換を、「保存的置換」と題して表３に示す。より実質的な変化は、「代表的な置換」と題して表３に提示し、そしてアミノ酸側鎖クラスと関連して以下に更に記載する。アミノ酸置換は目的とする抗体に導入され得るが、また生成物は所望の活性、例えばＰＤ−１結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【０１２１】
【表３】
2020501598.tif 000005
【０１２２】
非保存的置換は、このクラスのちの１つのメンバーを別のクラスと交換する必要がある。代表的な置換変異体は、親和性成熟型抗体であり、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技法、例えば本明細書に記載する技法等を使用して好都合に生成され得る。手短に述べると、１つ又は複数のＣＤＲ残基が突然変異し、抗体の変異体がファージ上に提示され、そして特定の生物学的活性（例えば、結合親和力）についてスクリーニングされる。変更（例えば、置換）は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ内になし得る。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセス期間中に高頻度で突然変異が生ずるコドンによりコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）においてなし得るが、得られたＶＨ又はＶＬ変異体は結合親和力について試験される。二次ライブラリーからの構築及び再選択による親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。
【０１２３】
親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェインシャフリング（chain shuffling）、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかにより、成熟を目的として選択された可変遺伝子に多様性が導入される。二次ライブラリーが次に構築される。ライブラリーは、次に所望の親和性を有するあらゆる抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチと関係する。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して特異的に識別され得る。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、多くの場合標的の対象とされる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、（１）配列番号９、２１、及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号１０又は１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；（３）配列番号１１、１７、２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、（１）配列番号１２又は１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号１３又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）配列番号１４、２０、２３、及び２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）とを含む。
【０１２５】
重鎖及び軽鎖可変ドメインを、考え得るすべてのペアワイズコンビネーションで組み合わせると、いくつかの抗ＰＤ−１抗体が生成する。
【０１２６】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、重鎖又は軽鎖可変領域内のＮ−グリコシル化モチーフを欠いている場合があり、それは抗体バッチにおいて相違をもたらす原因となり得、その結果、機能、免疫原性、又は安定性に変化を引き起こす。抗体のグリコシル化を分析する方法として、例えば、クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又は液体クロマトグラフィー等）、マススペクトロメトリー（エレクトロスプレーイオン化質量分析等）、及びキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられるが、但しこれらに限定されない。そのような方法は、例えば、Jung et al. (2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67; Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47; Leymarie, et al. (2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048; Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review. pp 106-110;及びRaju, T. (2013) Methods Mol Biol. 988: 169-180に記載されている。
【０１２７】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対して、当該ＰＤ−１の相同体に対して有する結合親和力よりも強い結合親和力を有する。通常、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１と「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、及び最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和力（Ｋｄ）値を有する）が、しかしＰＤ−１ファミリーメンバーに対しては、そのＰＤ−１に対する結合親和力の少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い結合親和力を有する。ＰＤ−１と特異的に結合する抗ＰＤ−１抗体は、上記で定義したような様々な種類の抗体のうちのいずれかであり得るが、しかし好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、非標的タンパク質に対する抗ＰＤ−１抗体の結合の程度は、当技術分野において公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析、又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）等により決定したとき、該抗体のＰＤ−１に対する結合の約１０％未満である。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定可能であるが、該コントロール分子は、結合活性を有さない類似した構造の分子であるのが一般的である。例えば、標的と類似したコントロール分子、例えば、過剰の非標識標的との競合により、特異的結合は決定可能である。この場合、標識標的のプローブに対する結合が過剰の未標識標的により競合的に阻害される場合、特異的結合が示唆される。用語「特異的結合」、又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」若しくは「それに対して特異的な」とは、本明細書で使用する場合、例えば、標的に対して少なくとも約１０−４Ｍ、或いは少なくとも約１０−５Ｍ、或いは少なくとも約１０−６Ｍ、或いは少なくとも約１０−７Ｍ、或いは少なくとも約１０−８Ｍ、或いは少なくとも約１０−９Ｍ、或いは少なくとも約１０−１０Ｍ、或いは少なくとも約１０−１１Ｍ、或いは少なくとも約１０−１２Ｍ又はそれを超えるＫｄを有する分子により示され得る。１つの実施形態では、用語「特異的結合」とは、分子が、任意のその他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合しないで、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープと結合するような結合を意味する。
【０１２９】
抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、腫瘍細胞に対する治療抗体の作用機序である。ＡＤＣＣは細胞媒介性免疫防御であり、それによって免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原に特異抗体（例えば、本明細書に記載する抗ＰＤ−１抗体等）が結合した標的細胞（例えば、がん細胞）を活発に溶解する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、例えば、実施例に記載するアッセイにより実証されるように、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）又はニボルマブに類似した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。
【０１３０】
例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載する抗ＰＤ−１抗体のＡＤＣＣエフェクター機能活性は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）のＡＤＣＣエフェクター機能活性の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は１００％超（例えば、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、又は約１３０％）であるが、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含まれる。
【０１３１】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対してＯＰＤＩＶＯ（登録商標）と類似した結合親和力を示す。特定の実施形態では、ＰＤ−１に対する結合は、実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＡにより実証される。例えば、ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１の結合親和力は、ＰＤ−１に対するＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）の結合親和力よりも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％高い、又は１００％より高い（例えば、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、又は約１２５％超）。
【０１３２】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約０．１ｐＭ〜２００ｐＭ（０．２ｎＭ）の間、例えば、約０．１ｐＭ、約０．２５ｐＭ、約０．５ｐＭ、約０．７５ｐＭ、約１ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１１０ｐＭ、約１２０ｐＭ、約１３０ｐＭ、約１４０ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１６０ｐＭ、約１７０ｐＭ、約１８０ｐＭ、約１９０ｐＭの、又は約１９０ｐＭより大きいＫｄ、但しこれらの数値の間の任意の範囲を含むＫｄでヒトＰＤ−１と結合する。特定の実施形態では、ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１抗体の結合親和力は、ＰＤ−１に対するＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）の結合親和力よりも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％高い、又は約１００％よりも高い（例えば、約１０５％、約１１０％、約１２０％、又は約１３０％）。特定の実施形態では、ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１の結合親和力は、ＰＤ−１に対するＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）の結合親和力よりも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３倍、約３．２５倍、約３．５倍、約３．７５倍、約４倍、約４．２５倍、約４．５倍、約４．７５倍高い、又は約４．７５倍よりも高いが、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含まれる。
【０１３３】
特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）と比較してそれより延長したインビボ半減期を有する。特定の実施形態では、抗本明細書に記載するＰＤ−１抗体のインビボ半減期は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）のインビボ半減期よりも短くない。
【０１３４】
特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）又はその後発生物製剤と類似した薬物動態特性を示す。特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）又はその後発生物製剤の血清濃度−時間プロファイルの約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％である、又は９５％を上回る（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超等）ＡＵＣ（曲線下面積（ＡＵＣ））を示すが、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含まれる。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ配列を含む。特定の実施形態では、Ｆｃ配列は、多くの場合そのＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合と関連する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を欠くように変更され、さもなければ変化している。エフェクター機能を変え得るような、Ｆｃ配列に対する変化又は突然変異の例が多く存在する。例えば、国際公開第００／４２０７２号、及びShieldsら（J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)）は、ＦｃＲとの結合が改善した又は減少した抗体変異体について記載する。これらの公開資料の記載内容は、参照として本明細書に特に組み込まれている。抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片；ダイアボディ、及び直線状の抗体であり得る。また、抗体は、ＰＤ−１と結合するが、しかし１つ又は複数のその他の標的とも結合し、その機能を阻害する多重特異性抗体であり得る。抗体は、治療剤（例えば、細胞毒性剤、放射性同位体、及び化学療法剤）又は画像化法により患者サンプル中、若しくはインビボでＰＤ−１を検出するための標識（例えば、放射性同位体、蛍光色素、及び酵素）にコンジュゲートし得る。その他の改変には、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体に対する毒素のコンジュゲーションが含まれる。
【０１３６】
抗ＰＤ−１抗体をコードする核酸分子、ＣＤＲ及び／又は本明細書に記載する重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子を含む発現ベクター、並びに該核酸分子を含む細胞についても検討される。このような抗体は、本明細書に記載する療法において、患者サンプル中（例えば、ＦＡＣＳ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡアッセイにより）、又は患者内のＰＤ−１タンパク質を検出するのに使用可能である。
【０１３７】
モノクロナール抗体
モノクロナール抗体は、例えば、ハイブリドーマ方法、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature, 256:495 (1975)）により記載される方法等を使用して調製可能である、又は組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製可能、又は下記実施例内の本明細書に記載する方法により製造可能である。ハイブリドーマ方法では、ハムスター、マウス、又はその他のふさわしい宿主動物が免疫剤を用いて一般的に免疫化され、該免疫剤と特異的に結合する抗体を産生する又は産生する能力を有するリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球がインビトロで免疫化され得る。
【０１３８】
免疫剤は、ポリペプチド、又は目的とするタンパク質の融合タンパク質、又はタンパク質を含む組成物を一般的に含む。一般的に、ヒト起源の細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、又はヒト以外の哺乳動物供給源が望ましい場合には、脾臓細胞若しくはリンパ節細胞が使用される。次にポリエチレングリコール等の適する融合剤を使用してリンパ球を不死化細胞株と融合させると、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLESAND PRACTICE, New York: Academic Press, 1986, pp. 59-103）。不死化細胞株は、通常、哺乳動物形質転換細胞、特に齧歯類、ウシ、及びヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスのミエローマ細胞株が採用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合の不死化細胞が増殖又は生存するのを阻害する１つ又は複数の物質を含有する適する培養培地内で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（「ＨＡＴ培地」）を一般的に含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を阻止する。
【０１３９】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、そしてＨＡＴ培地等の培地に対して感受性を有する細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ系統であり、例えば、カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、及びバージニア州、マナッサスのアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から取得可能である。ヒトミエローマ及びマウスヒトヘテロミエローマ細胞株は、ヒトモノクロナール抗体の製造に関しても記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES ANDAPPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987, pp. 51-63）。
【０１４０】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地は、次にポリペプチドを標的とするモノクロナール抗体の存在についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクロナール抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等、若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定可能である。そのような技術及びアッセイは当技術分野において公知である。モノクロナール抗体の結合親和力は、例えば、Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)により決定可能である。
【０１４１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローン化され、そして標準方法により増殖させ得る。Goding、前出。これを目的とする適する培養培地として、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。或いは、ハイブリドーマ細胞は、腹水のように哺乳動物においてインビボで増殖し得る。
【０１４２】
サブクローンにより分泌されたモノクロナール抗体は、従来式の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等により、培養培地又は腹水液から単離又は精製され得る。
【０１４３】
モノクロナール抗体は、組換えＤＮＡ方法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法等によっても作製可能である。本明細書に提示するモノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定され得る。本明細書に提示するハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役に立つ。単離されたら、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得るが、該発現ベクターは次に例えば、免疫グロブリンタンパク質を別途生成しないｓｉｍｉａｎ  ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞等の宿主細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中でモノクロナール抗体の合成が取得される。ＤＮＡもまた、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに関するコーディング配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al.、前出）、又は免疫グロブリンコーディング配列を非免疫グロブリンポリペプチドに関するコーディング配列の全部又は一部と共有結合的に連結することにより改変され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ２価抗体を作製するために、本明細書に提示する抗体の定常ドメインに関して置換され得る、又は本明細書に提示する抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに関して置換され得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明により提供される抗ＰＤ−１抗体は、安定な哺乳動物細胞株により発現される。特定の実施形態では、本発明により提供される抗ＰＤ−１抗体は、約２．０グラム／リットル、約２．５グラム／リットル、約３．０グラム／リットル、約３．５グラム／リットル、約４．０グラム／リットル、約４．５グラム／リットル、約５．０グラム／リットル、約５．５グラム／リットル、約６グラム／リットル、約６．５グラム／リットル、約７．０グラム／リットルの、又は約７．０グラム／リットルより高い力価で安定な哺乳動物細胞株から発現されるが、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含まれる。特定の実施形態では、本発明により提供される抗ＰＤ−１抗体が発現している安定な哺乳動物細胞株はＣＨＯ細胞株である。
【０１４５】
特定の実施形態では、抗体は一価の抗体である。一価の抗体の調製方法は当技術分野において公知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び改変された重鎖の組換え発現と関係する。重鎖は、重鎖の架橋を防止するために、Ｆｃ領域内の任意のポイントにおいて一般的にトランケーションされている。或いは、関連するシステイン残基が、架橋を防止するために別のアミノ酸残基と置換される、又は削除される。
【０１４６】
インビトロ方法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体を消化してその断片、特にＦａｂ断片を生成させることは、当技術分野において公知の技術を使用して実現可能であるが、但しこれに限定されない。
【０１４７】
ヒト及びヒト化抗体
抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。ヒト以外（例えば、マウス）の抗体のヒト化形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最低限の配列を一般的に含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体のその他の抗原結合サブシーケンス等）である。ヒト化抗体として、レシピエントのＣＤＲに由来する残基が、ヒト以外の種（ドナー抗体）、例えば所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギ等のＣＤＲに由来する残基に置き換わっているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基に置き換わっている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも、また移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列内にも見出されない残基も含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み得るが、この場合、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
【０１４８】
一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源からそれに導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。このようなヒト以外のアミノ酸残基は、多くの場合「移入」残基と呼ばれ、「移入」可変ドメインから一般的に獲得される。１つの実施形態によれば、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者の方法（Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536 (1988)）に基づき、齧歯類ＣＤＲ又はヒト抗体の対応する配列に相当するＣＤＲ配列に置換することにより実質的に実施され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変ドメインのうちの実質的にそれより少ない部分がヒト以外の種に由来する対応する配列により置換された抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、一般的に、いくつかのＣＤＲ残基、及びおそらくはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体内の類似した部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【０１４９】
ヒト化に対する代替案として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化した際に、内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生する能力を有する遺伝子導入動物（例えば、マウス）を製造することが今日可能である。例えば、生殖細胞系列突然変異体キメラマウスにおいて抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子がホモ接合的に欠損すると、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような生殖細胞系列突然変異体マウスに移すと、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits et al. PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al.Year in Immunol., 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号；同第５，５４５，８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照。
【０１５０】
或いは、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化された遺伝子導入動物、例えばマウスに導入することにより作製可能である。チャレンジの際にヒト抗体産生が認められるが、それは、遺伝子再配列、アセンブリー、及び抗体レパートリーを含むすべての観点において、ヒトにおいて認められるものと密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号、及びMarks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)に記載されている。
【０１５１】
或いは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990）が、非免疫ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を製造するのに使用可能である。この技術の１つの実施形態によれば、抗体Ｖドメイン配列がＭ１３又はｆｄ等の糸状バクテリオファージのメジャー又はマイナーな外被タンパク質遺伝子にインフレームでクローン化され、そしてファージ粒子表面上に機能的抗体断片として提示される。ファージディスプレイは、例えば、下記の実施例のセクションにおいて記載するように、又は例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)でレビューされているように、様々なフォーマットで実施可能である。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイ用として使用可能である。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Nature, 352:624-628 (1991)）は、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから多種多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。非免疫ヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーが構築可能であり、また多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体が、Ｍａｒｋｓら（J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈら（EMBO J. 12:725-734 (1993)）により記載される技術に従い、実質的に単離可能である。米国特許第５，５６５，３３２号、及び同第５，５７３，９０５号を参照。
【０１５２】
上記で議論したように、ヒト抗体は、インビトロで活性化したＢ細胞によっても生成され得る（米国特許第５，５６７，６１０号、及び同第５，２２９，２７５号を参照）。
【０１５３】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野において公知の様々な技術を使用してやはり製造可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術もヒトモノクロナール抗体の調製に利用可能である。Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 及びBoerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)。
【０１５４】
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、２つ又はそれよりも多くの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクロナール抗体、好ましくはヒト又はヒト化抗体である（例えば、二重特異性抗体は、少なくとも２つの抗原に対して結合特異性を有する）。例えば、結合特異性の一方は、ａ５〜１タンパク質に対する特異性であり、他方は任意のその他の抗原に対する特異性であり得る。１つの好ましい実施形態によれば、その他の抗原は、細胞表面タンパク質、又は受容体、又は受容体サブユニットである。例えば、細胞表面タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体であり得る。したがって、１つの実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ−１、及び例えば第２の細胞の表面受容体の両方と結合することができる。
【０１５５】
二重特異性抗体を作製するための適する方法は、当技術分野において周知されている。例えば、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、その場合、２本の重鎖は、異なる特異性を有する。Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組合せであることから、このようなハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子からなる潜在的混合物を産生し、そのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により実現される。類似した手順は、国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991) に開示されている。
【０１５６】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合可能である。融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であり、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合体の少なくとも一方に存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは別の発現ベクターに挿入され、そして適する宿主生物に同時トランスフェクトされる。二重特異性抗体の生成に関する更なる詳細については、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照。
【０１５７】
二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接作製及び単離するための様々な技術についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成されてきた。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体をヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次に再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の製造にも利用可能である。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機構を提供した。断片はリンカーによりＶＬと繋がったＶＨを含むが、該リンカーは、同一鎖上にある２つのドメイン間で対形成を可能とするには短すぎる。したがって、一方の断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対を形成せざるを得ず、これにより２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照。
【０１５８】
２つを超える結合価を有する抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１５９】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞が望ましくない細胞を標的とするように（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療用として提案されている。国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；欧州特許第０３０８９号。抗体は、架橋剤と関係する方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を使用してインビトロで調製され得るものと考えられる。例えば、免疫毒素複合体は、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成することにより構築可能である。これを目的とする好適な試薬の例として、イミノチオレート（iminothiolate）及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示される試薬が挙げられる。
【０１６０】
エフェクター機能エンジニアリング
例えば、がんを治療する際の抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して、本明細書に提示する抗体を改変することが望ましい場合もある。例えば、システイン残基（複数可）がＦｃ領域に導入可能であり、これによりこの領域において鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。そのように生成されたホモ二量体の抗体は、内部移行能力を改善し、並びに／又は補体媒介式の細胞殺傷及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を高めることができる。Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191- 1195 (1992)及びShapes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体は、Wolff eta!., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993) の記載に従い、ヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製することも可能である。或いは、デュアルＦｃ領域を有し、これにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力が強化された抗体が工学的に作出され得る。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989)を参照。
【０１６１】
Ｆｃ領域配列内の突然変異又は変更が、ＦｃＲ結合（例えば、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ）を改善するために実施され得る。１つの実施形態によれば、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣからなる群から選択されるエフェクター機能について、その少なくとも１つが変化しており、また天然のＩｇＧ又は親抗体と比較してＦｃＲｎ結合が改善している。いくつかの有用な特異的突然変異の例は、例えば、Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490；及び国際公開第００／４２０７２号に記載されている。
【０１６２】
１つの実施形態によれば、Ｆｃ受容体突然変異は、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９からなる群から選択される少なくとも１つの位置における置換であるが、この場合、Ｆｃ領域内の残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムに基づく。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体突然変異はＤ２６５Ａ置換である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体突然変異はＮ２９７Ａ置換である。追加の適する突然変異が、米国特許第７，３３２，５８１号に記載されている。
【０１６３】
イムノコンジュゲート
本発明は、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、若しくはその断片）、又は放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート（radioconjugate））等にコンジュゲートした抗体を含むイムノコンジュゲートとも関係する。
【０１６４】
使用可能である酵素的に活性な毒素及びその断片として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリン（abrin）Ａ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、α−サルシン（sarcin）、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii）タンパク質、ダイアンシン（dianthin）タンパク質、フィトラッカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サポナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコセセンス（tricothecenes）が挙げられる。様々な放射性核種が、ラジオコンジュゲート抗体の製造用として利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。そのようなイムノコンジュゲートの生成において有用な代表的な化学療法剤として、本明細書に別途記載されている化学療法剤が挙げられる。
【０１６５】
特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体は、マイタンシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンにコンジュゲートされている。特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体は、マイタンシノイドＤＭ１にコンジュゲートされている。
【０１６６】
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは、例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性の誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性なエステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（tolyene）２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の様々な二官能性のタンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素複合体は、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)の記載に従い調製可能である。炭素１４標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（triaminepentaacetic acid）（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための代表的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。
【０１６７】
別の実施形態では、腫瘍のプレターゲティングにおいて利用するために、抗体は「受容体」（例えば、ストレプトアビジン等）にコンジュゲートし得るが、その場合、抗体−受容体コンジュゲートが患者に投与され、その後、排除剤を使用して未結合のコンジュゲートが循環から除去され、次に細胞毒性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートした「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１６８】
共有結合による改変
共有結合による改変
抗ＰＤ−１抗体及びその断片の共有結合による改変は、本発明の範囲に含まれる。１つの種類の共有結合による改変には、ポリペプチドの標的対象となるアミノ酸残基を、ポリペプチドの選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応する能力を有する有機の誘導化剤と反応させることが含まれる。二官能性薬剤による誘導体化は、例えばポリペプチドと抗体の精製方法で使用される水不溶性支持マトリックス又は表面との架橋において有用であり、またその逆も成り立つ。一般的に使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、ジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシニミジル−プロピオン酸塩）等を含むホモ二官能性イミドエステル、二官能性のマレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミデート（propioimidate）等の薬剤が含まれる。
【０１６９】
その他の改変には、対応するグルタミル及びアスパルチル残基のそれぞれに対するグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman &#38; Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１７０】
ポリペプチドの別の種類の共有結合による改変は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、又は同第４，１７９，３３７号に定める方式で、ポリペプチドを様々な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンと連結することを含む。
【０１７１】
キメラ分子
本発明の抗ＰＤ−１抗体、及び／又はその断片は、好都合な場合には、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子（例えば、イムノアドヘシン又はペプチボディ）を形成する方式でやはり改変可能である。
【０１７２】
１つの実施形態では、そのようなキメラ分子は、ポリペプチドとタンパク質形質導入ドメインとの融合体を含み、該ドメインは、デリバリー用の該ポリペプチドを様々な組織に仕向け、より具体的には、例えばヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメインを使用して、脳血液関門を通過させる（Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569- 72）。
【０１７３】
別の実施形態では、そのようなキメラ分子は、ポリペプチドと抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合体を含む。該エピトープタグは、ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に一般的に配置される。ポリペプチドのそのようなエピトープタグ化された形態が存在すると、該タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出可能となる。また、エピトープタグが提供されれば、抗タグ抗体又は該エピトープタグと結合する別の種類の親和性マトリックスを使用する親和性精製法により、ポリペプチドが容易に精製可能になる。様々なタグポリペプチド及びその各抗体は当技術分野において公知である。例として、ポリ−ヒスチジン（ポリ−Ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−Ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、及び９Ｅ１０抗体（Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が挙げられる。その他のタグポリペプチドとして、Ｆｌａｇ−ペプチド（Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin et al.（Martinet al.）, Science, 255:192-194 (1992)］；α−チューブリンエピトープペプチド（Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163- 15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が挙げられる。
【０１７４】
代替的実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の２価の形態（例えば、「イムノアドヘシン」）の場合、そのような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対する融合体であり得る。本発明のＩｇ融合体は、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ヒトの残基９４〜２４３、残基３３〜５３、又は残基３３〜５２の辺り又はそれのみを含むポリペプチドを含む。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号も参照。
【０１７５】
イムノリポソーム
本明細書に開示する抗体は、イムノリポソームとして製剤化することも可能である。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980)；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号等に記載されているような当技術分野において公知の方法により調製される。循環時間が増強されたリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１７６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法により生成可能である。リポソームを、定義されたポアサイズのフィルターを通じて押し出すと、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら（J. Biol. Chem., 257: 286- 288 (1982)）の記載に従い、ジスルフィド交換反応によりリポソームにコンジュゲートし得る。抗悪性腫瘍剤、増殖阻害剤、又は化学療法剤（例えば、ドキソルビシン等）がリポソームに含まれていてもよい。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照。
【０１７７】
抗ＰＤ−１抗体を使用する治療
本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体及び／又はその断片、及び／又は組成物は、例えば、がん（頭頸部がん、咽頭がん、結腸直腸がん、肺がん等）を含む、ＰＤ−１活性異常を伴う疾患及び障害を治療するために、対象（例えば、哺乳動物、例えばヒト等）に投与され得る。特定の実施形態では、本発明は、対象におけるがん（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん等）を治療するための医薬の製造で使用されるように、本明細書に記載する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）を提供する。特定の実施形態では、本発明は、対象におけるがん（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん等）の治療で使用されるように、本明細書に記載する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）を提供する。
【０１７８】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるがん（メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん）の治療で使用されるように、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、治療される対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等）である。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は、臨床患者、臨床トライアル志願者、実験動物等である。特定の実施形態では、対象は、がん（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん等）を有するリスクを有する、若しくは有するリスクに曝されていると疑われている、又はＰＤ−１の発現又は活性が異常ながん若しくは任意のその他の疾患を有すると診断されている。
【０１７９】
がん（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん等）、又はＰＤ−１活性異常を示す任意のその他の疾患及びそのような疾患の臨床的概要に対する多くの診断方法が、当技術分野において公知である。そのような方法として、例えば、免疫組織化学、ＰＣＲ、蛍光インサイチュでのハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が挙げられるが、但しこれらに限定されない。ＰＤ−１の活性又は発現異常に対する診断方法に関する追加の詳細情報は、例えば、Gupta et al. (2009) Mod Pathol. 22(1): 128-133; Lopez-Rios et al. (2013) J Clin Pathol. 66(5): 381-385; Ellison et al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89;及びGuha et al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782に記載されている。
【０１８０】
投与は、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下を含む任意の適する経路により実施可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）及び／又は組成物は、ＰＤ−１活性異常を伴う疾患又は障害を治療するために、第２、第３、又は第４の薬剤（例えば、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、細胞毒性剤、又は化学療法剤を含む）と組み合わせて投与される。そのような薬剤として、例えば、ドセタキセル、ゲフィチニブ、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５−フルオロウラシル、及びロイコボリン）、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）、ＦＯＬＦＯＸ−４、輸液用のフルオロウラシル、ロイコボリン、及びオキサリプラチン、アファチニブ、ゲムシタビン、カペシタビン、ペメトレキセド、チバンチニブ、エベロリムス、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ラパマイシン、レナリドマイド、ベムラフェニブ、エンドスタチン、ラパチニブ、ＰＸ−８６６、インプライム（Imprime）ＰＧＧ、及びイルロチニブ（irlotinibm）が含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）は、追加の薬剤にコンジュゲートされている。
【０１８１】
特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）、及び／又は組成物は、１つ又は複数の追加の療法、例えば放射線療法、手術、化学療法、及び／又は標的治療等と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）、及び／又は組成物は、放射線療法と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（若しくはその断片）及び／又は組成物と放射線療法との組合せが、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、及び甲状腺がんからなる群から選択されるがんを治療するのに用いられる。
【０１８２】
治療の対象となる兆候、及び当分野における熟練医師が精通する投与関連因子に応じて、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体又はその断片は、毒性及び副作用を最低限に抑えつつ、当該兆候の治療に対して有効な用量で投与される。がん（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん等）の治療の場合、典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲であり得るが、しかしこの代表的な範囲よりも少ない、又は多い用量も本発明の範囲内にある。１日用量は、全体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００ｍｇ（例えば、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、又は上記数値のうちの任意の２つにより定義される範囲）、好ましくは全体重１ｋｇ当たり約０．３μｇ〜約１０ｍｇ（例えば、約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、又は上記数値のうちの任意の２つにより定義される範囲）、より好ましくは、全体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜１ｍｇ（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、又は上記数値のうちの任意の２つにより定義される範囲）、及びなおもより好ましくは１日に体重１ｋｇ当たり約０．５〜１０ｍｇ（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は上記数値間の任意の範囲を含む、上記数値のうちの任意の２つにより定義される範囲）であり得る。上記のように、治療上又は予防上の有効性は、治療対象の患者の定期的評価によりモニタリング可能である。数日間又はそれより長い期間にわたり反復投与する場合、状態に応じて、疾患症状において所望の抑制が生ずるまで治療は反復される。しかし、その他の投与レジメンも有用であり得、また本発明の範囲内にある。所望の投与量が、組成物の単回ボーラス投与により、組成物の複数ボーラス投与により、又は組成物の連続輸液投与によりデリバリー可能である。
【０１８３】
抗ＰＤ−１抗体又はその断片を含む医薬組成物は、１日に１、２、３、又は４回投与可能である。組成物は、１日１回よりも低頻度で、例えば１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、又は６カ月毎に１回投与することも可能である。組成物は、徐放性製剤、例えばある期間にわたり使用に供されるように組成物を徐放し、また組成物がより低頻度で、例えば、１カ月に１回、２〜６カ月毎に１回、１年毎に１回等、又は単回投与のような低頻度で投与されることを可能にするインプラント等の状態で投与される場合もある。持続放出型デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、微粒子、ナノ球体、ミクロスフェア等）は注射により投与され得る。
【０１８４】
抗体（又はその断片）は１日１回の用量で投与され得る、又は１日の全用量は、１日に２、３、若しくは４回の分割用量で投与され得る。組成物は、１日１回より低頻度で、例えば１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、又は６カ月毎に１回投与することも可能である。抗体（又はその断片）は、徐放性製剤、例えばある期間にわたり使用に供されるように組成物を徐放し、また組成物がより低頻度で、例えば、１カ月に１回、２〜６カ月毎に１回、１年毎に１回等、又は単回投与のような低頻度で投与されることを可能にするインプラント等の状態で投与される場合もある。持続放出型デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、微粒子、ナノ球体、ミクロスフェア等）は注射により投与され得る、又は様々な場所に外科的に移植され得る。
【０１８５】
がん治療は、例えば、腫瘍退縮、腫瘍重量又はサイズの縮小、進行までの時間、生存期間、無増悪生存率、全体的な応答率、応答期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性により評価可能であるが、但しこれらに限定されない。例えば、放射線画像化法による応答測定を含む、療法の有効性を判断するアプローチが採用可能である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、治療の有効性は、腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）として測定され、式１００−（Ｔ／Ｃ×１００）を使用して計算されるが、式中、Ｔは治療対象とされる腫瘍の相対的な平均腫瘍容量であり、またＣは非治療腫瘍の相対的な平均腫瘍容量である。特定の実施形態では、％ＴＧＩは、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％である、又は９５％よりも大きい。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１の％ＴＧＩは、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）の％ＴＧＩと同一又はそれを上回り、例えば約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．１倍、約２．２倍、約２．３倍、約２．４倍、約２．５倍、約２．６倍、約２．７倍等であり、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含まれ、又はＯＰＤＩＶＯ（登録商標）の％ＴＧＩよりも約２．７倍を上回る。
【０１８７】
医薬製剤
抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）は、その投与に適するように、適する担体又は賦形剤と共に製剤化され得る。抗体の適する製剤は、所望の純度を有する抗体（又はその断片）と、随意の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）とを、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で混合することにより取得される。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、採用された用量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、またバッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸等；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン等；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン（olyvinylpyrrolidone）等；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他の炭化水素；キレート剤、例えばＥＤＴＡ等；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール等；造塩性の対イオン、例えばナトリウム等；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／或いは非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を含む。代表的な抗体製剤は、Ｗ０９８／５６４１８に記載されており、参照として本明細書に明示的に組み込まれている。皮下投与用として考案された凍結乾燥製剤は、Ｗ０９７／０４８０１に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適する希釈剤を用いて高タンパク質濃度に復元され得るが、また復元された製剤は、本明細書において治療される哺乳動物の皮下に投与され得る。
【０１８８】
本明細書の製剤は、治療される特定の兆候について、必要に応じて、２つ以上の活性化合物も含み得るが、同活性化合物は相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有することが好ましい。例えば、抗悪性腫瘍剤、増殖阻害剤、細胞毒性剤、又は化学療法剤を更に提供するのが望ましい場合もある。そのような分子は、併用物中に、意図した目的にとって有効な量で好適に存在する。そのようなその他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は障害又は治療の種類、及び上記で議論したその他の因子に依存する。これらは、本明細書に記載する用量及び投与経路と同一の用量、投与経路で、又は上記で採用された用量の約１〜９９％で一般的に使用される。有効成分は、コロイド薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）において、又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中にそれぞれ封入される場合もある。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。持続放出型の調製物が調製され得る。適する持続放出型の調製物の例として、拮抗薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成形品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態である。持続放出型マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレンビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及びロイプロリドアセテートから構成される注射用ミクロスフェア）等、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１８９】
リポフェクチン又はリポソームが、本発明のポリペプチド及び抗体（若しくはその断片）又は組成物を細胞にデリバリーするのに使用可能である。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列と結合する能力を保持するペプチド分子が設計可能である。そのようなペプチドは、化学的に合成され得る、及び／又は組換えＤＮＡ技術により製造され得る。例えば、Marasco et al., PNAS USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照。
【０１９０】
有効成分は、コロイド薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）において、又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中にそれぞれ封入可能である。そのような技術は、Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES、前出、に開示されている。
【０１９１】
持続放出型の調製物が調製可能である。適する持続放出型の調製物の例として、抗体（又はその断片）を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成形品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態である。持続放出型マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及びロイプロリドアセテートから構成される注射用ミクロスフェア）等、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日間にわたり分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルはタンパク質をより短い期間放出する。カプセル化された抗体が長時間身体内に留まると、抗体は、３７℃で湿気に曝露された結果として変性又は凝集するおそれがあり、生物学的活性の喪失及び免疫原性が変化する可能性を引き起こす。関係する機構に応じて安定化させるために、合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換（thio-disulfide interchange）が介在する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが判明すれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含水量を管理すること、適切な添加物を使用すること、及び特別なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成され得る。
【０１９２】
特定の実施形態では、製剤は、約０．５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約２ｍｇ／ｍｌを上回る、約３ｍｇ／ｍｌを上回る、約４ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約６ｍｇ／ｍｌを上回る、約７ｍｇ／ｍｌを上回る、約８ｍｇ／ｍｌを上回る、約９ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１１ｍｇ／ｍｌを上回る、約１２ｍｇ／ｍｌを上回る、約１３ｍｇ／ｍｌを上回る、約１４ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１６ｍｇ／ｍｌを上回る、約１７ｍｇ／ｍｌを上回る、約１８ｍｇ／ｍｌを上回る、約１９ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、約２１ｍｇ／ｍｌを上回る、約２２ｍｇ／ｍｌを上回る、約２３ｍｇ／ｍｌを上回る、約２４ｍｇ／ｍｌを上回る、約２５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２６ｍｇ／ｍｌを上回る、約２７ｍｇ／ｍｌを上回る、約２８ｍｇ／ｍｌを上回る、約２９ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約３０ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含むが、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含まれる。
【０１９３】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、クエン酸塩、ＮａＣｌ、アセテート、コハク酸塩、グリシン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、又は上記任意の組合せを含むバッファー中において（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約２５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め）製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭのグリシンを含むバッファー中において（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約２５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め）製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー中において製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのアセテートを含むバッファー中において（例えば、約ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約２５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め）製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのコハク酸塩を含むバッファー中で製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約０．００５％〜約０．０２％のポリソルベート８０を含むバッファー中において（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約２５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め）製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約５．１〜５．６の間のｐＨを有するバッファー中において製剤化される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、１０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％のポリソルベート８０を含むバッファー中において製剤化され、その場合、製剤のｐＨは５．５である。
【０１９４】
特定の実施形態では、本明細書に記載するＰＤ−１抗体を（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約２５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め）含む製剤（例えば、１０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％のポリソルベート８０を含むバッファーを含む製剤等、但し製剤のｐＨは５．５である）は、室温（例えば、約２０〜２５℃等）において、約０．５週間、１．０週間、１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．５週間、４．０週間、４．５週間、又は５．０週間、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め安定である。特定の実施形態では、本明細書に記載するＰＤ−１抗体を（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１ｍｇ／ｍｌを上回る、約５ｍｇ／ｍｌを上回る、約１０ｍｇ／ｍｌを上回る、約１５ｍｇ／ｍｌを上回る、約２０ｍｇ／ｍｌを上回る、又は約２５ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め）含む製剤（例えば、１０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％のポリソルベート８０を含むバッファーを含む製剤等、但し製剤のｐＨは＝５．５である）は、加速状態下（例えば、約３７℃での保管等）において約０．５週間、１．０週間、１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．５週間、４．０週間、４．５週間、又は５．０週間、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め安定である。
【０１９５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は幅広く使用されている周知の方法であり、物理的及び化学的不安定性に対応する断片化及び凝集化の可能性を検出するために、タンパク質安定性試験で使用されている。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で１週間後、高分子量種の初期％と比較して、約１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それらよりも小さい高分子量種（ＨＭＷＳ）の増加を示す。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、高分子量種の初期％と比較して、約２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それらよりも小さい高分子量種の増加を示す。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載する抗ＥＦＧＲ抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で４週間後、高分子量種の初期％と比較して、約３．３％、３．２％、３．１％、３．０％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．２％、２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それらよりも小さい高分子量種の増加を示す。
【０１９６】
特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で１週間後、低分子量種の初期％と比較して、約１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それらよりも小さい低分子量種（ＬＭＷＳ）の増加を示す。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、低分子量種の初期％と比較して、約２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、％、０．４％、０．２％、又は０．１％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それらよりも小さい低分子量種の増加を示す。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で４週間後、低分子量種の初期％と比較して、約２．４％、２．２％、２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それらよりも小さい低分子量種の増加を示す。
【０１９７】
特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で１週間後、モノマーの初期％と比較して、約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、又は３．５％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下のモノマーの減少を示す。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、モノマーの初期％と比較して、約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、又は３．５％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下のモノマーの減少を示す。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体を含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、モノマーの初期％と比較して、約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、又は３．５％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下のモノマーの減少を示す。
【０１９８】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、タンパク質分解イベント、例えば脱アミド又は酸化等を検出するための幅広く使用されている周知のツールである（Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603）。分解生成物は、より高い見かけのｐＩを有するｇｎｔｓとの比較において酸性種又は塩基性種と一般的に呼ばれる。酸性種はメインピークよりも早くＣＥＸから溶出する変異体であるが、一方、塩基性種はメインピークよりも後にＣＥＸから溶出する変異体である。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の酸性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で１週間後、総タンパク質の約７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下を占める。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の酸性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、総タンパク質の約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、又は１８％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下を占める。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体を含む製剤の酸性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、総タンパク質の約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、又は２７％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下を占める。
【０１９９】
特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の塩基性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で１週間後、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下を占める。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の塩基性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下を占める。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の塩基性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で４週間後、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以下を占める。
【０２００】
特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤のメインピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で１週間後、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以上を占める。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の塩基性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で２週間後、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以上を占める。特定の実施形態では、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤の塩基性ピーク分画は、ＣＥＸを使用して測定したとき、３７℃で４週間後、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％、但しこれらの数値の間の任意の範囲も含め、それ以上を占める。
【０２０１】
インビボでの投与で使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過により容易に実現される。
【０２０２】
抗ＰＤ−１抗体を使用する診断方法及び画像化方法
ＰＤ−１ポリペプチドに特異的に結合する標識抗ＰＤ−１抗体、その断片、並びにその誘導体及び類似体は、診断目的で使用して、ＰＤ−１の発現、発現及び／又は活性異常と関連した疾患及び／又は障害を検出、診断、又はモニタリングすることができる。例えば、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）は、インサイチュ、インビボ、エクスビボ、及びインビトロでの診断アッセイ又は画像アッセイで使用可能である。ＰＤ−１ポリペプチドの発現を検出する方法は、（ａ）本発明の１つ又は複数の抗体を使用して個体の細胞（例えば、組織）又は体液中のポリペプチドの発現をアッセイすること、及び（ｂ）遺伝子発現レベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較することを含み、それによって標準的な発現レベルと比較したとき、アッセイ対象遺伝子の発現レベルが増加又は減少していれば、それは異常な発現を示唆する。
【０２０３】
本明細書に提示する追加の実施形態は、動物（例えば、ヒト等の哺乳動物）におけるＰＤ−１の発現又は発現異常と関連した疾患又は障害を診断する方法を含む。方法は、哺乳動物内のＰＤ−１分子を検出することを含む。特定の実施形態では、診断は、（ａ）有効量の標識抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）を哺乳動物に投与することと、（ｂ）標識抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）が、ＰＤ−１分子が発現している対象内の部位において優先的に濃縮可能になる（及び未結合の標識分子がバックグラウンドレベルまで排出可能になる）まで、投与後のある期間待機することと、（ｃ）バックグラウンドレベルを決定することと；（ｄ）標識分子がバックグラウンドレベルより高く検出されると、それが対象はＰＤ−１の発現又は発現異常と関連した特定の疾患又は障害を有することを示唆するように、対象内の標識分子を検出することとを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を特定の系についてこれまでに決定された標準値と比較することを含む、様々な方法により決定可能である。
【０２０４】
本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）は、当業者にとって公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生体サンプル中のタンパク質レベルをアッセイするのに使用可能である（例えば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照）。タンパク質遺伝子発現を検出するのに役立つその他の抗体に基づく方法として、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。適する抗体アッセイ標識は当技術分野において公知であり、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ等；放射性同位体、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）（sulfur 35S)）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクニチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）（thallium 201Ti)）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ等；ルミノール；及び蛍光標識、例えばフルオレセインやローダミン等、及びビオチンが挙げられる。
【０２０５】
当技術分野において公知の技術は、本明細書に提示する標識化抗体（又はその断片）に適用され得る。そのような技術として、二官能性コンジュゲーティング剤の使用が挙げられるが、但しこれに限定されない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５；５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；及び同第５，８０８，００３号を参照）。
【０２０６】
或いは又は更に、細胞内のＰＤ−１ポリペプチドコーディング核酸又はｍＲＮＡのレベルを、例えば、ＰＤ−１コーディング核酸又はその相補体に対応する核酸ベースのプローブを使用する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開のＷ０９８／４５４  ７９を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等により測定することができる。例えば、抗体に基づくアッセイを使用して血清等の生体液中の脱落抗原（shed antigen）を測定することにより、ＰＤ−１の過剰発現について試験することも可能である（例えば、１９９０年６月１２日発行の米国特許第４，９３３，２９４号、；１９９１年４月１８日公開のＷ０９１／０５２６４；１９９５年３月２８日発行の米国特許第５，４０１，６３８号；及びSias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)も参照）。上記アッセイとは別に、様々なインビボ及びエクスビボでのアッセイが、熟練した開業医にとって利用可能である。例えば、哺乳動物の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で適宜標識された抗体に曝露させることができ、そして細胞に対する抗体の結合が、例えば、放射能の外部スキャニングにより、又は抗体にこれまでに曝露された哺乳動物から採取されたサンプル（例えば、生検若しくはその他の生体サンプル）を分析することにより評価され得る。
【０２０７】
製造用の物品及びキット
本明細書に提示する別の実施形態は、がん、例えばメラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん（head and neck）、尿路上皮がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん、ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、甲状腺がん、及び唾液腺がん等の治療に役立つ物質を含有する製造用の物品である。製造用の物品は、容器とラベル、又は容器上若しくは容器関連の添付文書を含み得る。適する容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、様々な物質、例えばガラス又はプラスチック等から形成され得る。一般的に、容器は、状態を治療するのに有効な組成物を保持し、また無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内輸液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物内の少なくとも１つの活性な薬剤は、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）である。ラベル又は添付文書は、組成物は特定の状態を治療するのに使用されることを表示する。ラベル又は添付文書は、抗体組成物を患者に投与するための指示書を更に含む。本明細書に記載するコンビナトリアル療法を含む製造用の物品及びキットについても検討される。
【０２０８】
添付文書とは、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる指示書を意味し、適応、用途、用量、投与、禁忌、及び／又はそのような治療用製品の使用における警告についての情報を含む。１つの実施形態では、添付文書は、組成物はがん（例えば、頭頸部がん、肺がん、又は結腸直腸がん等）を治療するのに使用されることを表示する。
【０２０９】
更に、製造用の物品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば抑菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等を含む第２の容器を更に含み得る。製造用の物品は、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及びユーザー上の立場から望ましいその他の物質を更に含み得る。
【０２１０】
様々な目的において、例えば、製造用の物品と適宜組み合わせて、患者内のＰＤ−１を単離又は検出するのに有用なキットも提供される。ＰＤ−１を単離及び精製する場合、キットは、ビーズ（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ビーズ）と結びついた、本明細書に提示する抗ＰＤ−１抗体（又はその断片）を含み得る。ＰＤ−１をインビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいて検出及び定量するための抗体（又はその断片）を含むキットが提供可能である。製造用の物品と同様に、キットは、容器とラベル、又は容器上若しくは容器関連の添付文書を含む。例えば、容器は、本明細書に提示する少なくとも１つの抗ＰＤ−１抗体を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤、及びバッファー、コントロール抗体を含む追加の容器も含まれ得る。ラベル又は添付文書は、組成物の説明書、並びに意図したインビトロでの使用又は診断上の使用に関する指示書を提供し得る。
【０２１１】
実施例
実施例１
抗ＰＤ−１抗体の開発
抗ＰＤ−１抗体の開発を以下に要約する。ハイブリドーマをＰＤ−１（精製済みの組換え６ｘＨｉｓタグ付化ＰＤ−１＿ＥＣＤ抗原）免疫化マウスから構築し、そのハイブリドーマから生成したＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることにより、陽性抗ＰＤ−１抗体クローンを同定した。インビトロでの機能的アッセイは、以下で更に詳細に記載されるが、これをクローンの特徴づけのために実施した。
【０２１２】
手短に述べると、ハイブリドーマクローンの連続希釈物を、ＰＤ１−Ｈｉｓタンパク質コーティングプレートと共に、室温で１時間インキュベートし、そしてＰＤ１結合活性を４５０ｎｍでモニタリングした。プレートを、５％のミルクを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、室温で１時間ブロックし、そしてＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、ハイブリドーマ希釈物を添加した。ハイブリドーマクローンと共にインキュベーとした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：４０００の抗マウスＩＧＧ−ＨＲＰと共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて発色させ、最終的にＨ２ＳＯ４を使用して反応を停止させ、そして４５０ｎｍにおける吸収を測定した。
【０２１３】
フローサイトメトリーにより、クローンＩＤ番号１１、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２７、及び２８が、ＰＤ−１に結合可能であったことが明らかとなった。ＰＤ−１結合を評価するためのフローサイトメトリー条件には以下の各工程が含まれる：１）４Ｅ＋０５個のＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞をＰＢＳ（２％のＦＢＳ）で２回洗浄した；２）ハイブリドーマ上清を添加し、４℃で３０分間インキュベートした；３）細胞を５００×ｇで５分間遠心分離した；４）ＰＢＳ（２％のＦＢＳ）で２回洗浄した；５）１：１５０に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを添加して４℃で３０分間インキュベートした；６）細胞をＰＢＳ（２％のＦＢＳ）で２回洗浄した；及び７）細胞を５０μｌの１×ＰＢＳ中で懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２１４】
フローサイトメトリーを、ハイブリドーマ上清がＰＤ−Ｌ１とＰＤ１の間の結合をブロックする能力を評価するのに使用した。結果より、クローン＃１１が、参照抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブと同等に結合をブロックすることが判明した。実施したフローサイトメトリー結合アッセイには以下の各工程が含まれる：１）１サンプル当たり４Ｅ＋０５個の細胞をＰＢＳ（２％のＦＢＳ）で２回洗浄した；２）８μｇ／ｍＬのビオチン−ＰＤＬ１とハイブリドーマ上清を混合した、但し容量比は１：１であった；３）工程２からの混合物６０μＬを細胞に添加し、そして４℃で３０分間インキュベートした；４）細胞をＰＢＳ（２％のＦＢＳ）で２回洗浄した；５）細胞をアビジン−ＦＩＴＣ（１：６５希釈）と共に４℃で３０分間インキュベートした；及び６）細胞をＰＢＳ（２％のＦＢＳ）で２回洗浄した。
【０２１５】
１つの陽性ＰＤ−１コロニー（ｃ１Ｇ４）がＳＳ３２０コンピテント細胞において同定された。ｃ１Ｇ４クローンの特徴及び配列を以下に提示する。
【０２１６】
実施例２
ヒト化抗ＰＤ−１抗体である１Ｇ４（ｈ１Ｇ４）の生成
ヒト化抗ＰＤ−１抗体である１Ｇ４（ｈ１Ｇ４）を、ヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域ＩＧＫＶ１−３９＊０１及びヒト生殖細胞系列重鎖可変領域ＩＧＨＶ３−１１＊０４を使用して生成した。手短に述べると、ヒト化を、キメラｃ１Ｇ４の軽鎖及び重鎖に由来するＣＤＲ残基を、ヒト免疫グロブリンの類似した軽鎖及び重鎖フレームワークにグラフティングすることにより実施した。インビトロでのファージディスプレイに基づく親和性成熟を更に行って、該ヒト化抗体の抗原に対する親和性を増強するために、ＣＤＲがグラフティングされたヒト化抗体のライブラリーを生成することが可能である。
【０２１７】
ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４に関する配列アラインメントを図８Ａ及び８Ｂ図に示す。図８Ａは、キメラｃ１Ｇ４、ヒト化ｈ１Ｇ４の軽鎖、ヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域ＩＧＫＶ１−３９＊０１、及びニボルマブ（ＮＩＶ）の軽鎖のアミノ酸配列アライメントを示す。図８Ｂは、キメラｃ１Ｇ４、ヒト化ｈ１Ｇ４の重鎖、ヒト生殖細胞系列重鎖可変領域ＩＧＨＶ３−１１＊０４、及びニボルマブ（ＮＩＶ）の重鎖のアミノ酸配列アライメントを示す。ヒト化のためにｃ１Ｇ４からグラフティングされたＣＤＲ（相補性決定領域）を、太字及び下線付きの文字で表わした。
【０２１８】
実施例３
ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４の平衡解離定数（ＫＤ）の決定
結合親和力及び反応速度論を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用して測定した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃをセンサーチップ上に最初に固定し、次に参照抗ＰＤ−１抗体、ｃ１Ｇ４、及びｈ１Ｇ４をＲｍａｘ約１５０ＲＵで捕捉した。実験を２５℃で実施し、そしてＰＤ−１−Ｈｉｓを５８．８ｎＭから７．３５ｎＭまで連続希釈して、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡが補充されたＨＢＳ−Ｐ＋バッファー中において捕捉された抗体上を通過させることにより測定を行った。すべてのデータを、評価ソフトウェアを用いて分析し、そして曲線を１：１ラングミュア結合モデルに近似させた。
【０２１９】
会合解離の反応速度論を、計算後の親和性（ＫＤ）と共に、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定した。ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４に関する親和性の改善について、抗ＰＤ−１（参照）と対比させて下記の表４に示す。データは、２回繰り返し実施した２つの独立した実験を代表する。
【０２２０】
【表４】
2020501598.tif 000006
【０２２１】
実施例４
キメラｃ１Ｇ４及びヒト化ｈ１Ｇ４抗体の結合特性
ｃ１Ｇ４のＰＤ−１組換えタンパク質に対する結合
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体のＰＤ−１に対する結合を評価した。キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１の連続希釈物を、マイクロタイターディッシュのウェル内でＰＤ−１−Ｈｉｓを用いて捕捉した。各ウェル内の捕捉された抗体の量を、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体を使用し数値化した。ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体をウェルに添加し、そしてインキュベーション後、過剰の二次抗体を洗い流した。ＴＭＢをウェルに添加し、インキュベーション後、反応を中止し、そしてＨＲＰ活性を４５０ｎｍにおける吸収の増加をモニタリングすることにより測定した。抗ＰＤ−１抗体であるキメラｃ１Ｇ４と参照抗ＰＤ−１抗体のＰＤ−１−Ｈｉｓに対する結合を比較するために実施したＥＬＩＳＡの結果を図１Ａに示す。
【０２２２】
図１Ｂは、抗ＰＤ−１抗体であるキメラｃ１Ｇ４と参照抗ＰＤ−１抗体のＰＤ−１−ＡＰに対する結合を比較するために実施した第２セットのＥＬＩＳＡの結果を示す。キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体の連続希釈物を、マイクロタイターディッシュのウェル内で、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いて捕捉した。各ウェル内の捕捉された抗体の量を、ＡＰ−コンジュゲートＰＤ−１を使用して定量した。インキュベーション後、過剰のＰＤ−１−ＡＰを洗い流した。アルカリホスファターゼ基質を、ウェルに添加し、インキュベーション後、反応を中止し、そしてＡＰ活性を４０５ｎｍにおける吸収の増加をモニタリングすることにより測定した。
【０２２３】
結果は、キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１−Ｈｉｓ及びＰＤ−１−ＡＰのいずれにも結合することができることを示唆する。
ｃ１Ｇ４のＰＤ−１リガンドに対する結合のブロッキング及び競合
【０２２４】
キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体の連続希釈物を、ＲＴで２時間、ＰＤ−Ｌ１−ＡＰと共にインキュベートした。各抗体：抗原の混合物を、マイクロタイターディッシュのＰＤ−１−Ｈｉｓ−コーティングウェルに添加した。インキュベーション及び洗浄の後、ｐＮＰＰをウェルに添加し、そして結合したＰＤ−Ｌ１−ＡＰを検出するために１時間インキュベートした。ＡＰ活性を４０５ｎｍにおける吸収の増加をモニタリングすることにより測定した。図２Ａは、抗ＰＤ−１抗体であるキメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体がＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合をブロックする能力を比較するために実施したＥＬＩＳＡの結果を示す。キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体は、いずれもＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１に対する結合をブロックすることが見出された。
【０２２５】
図２Ｂは、ＰＤ−１−Ｈｉｓとの結合について、抗ＰＤ−１抗体であるキメラｃ１Ｇ４が参照抗ＰＤ−１抗体と競合する能力を確認するために実施したＥＬＩＳＡの結果を示す。キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体の連続希釈物を一定濃度のＰＤ−１−Ｈｉｓ（０．１μｇ／ｍｌ）と室温で２時間事前混合し、次に一定濃度の参照抗ＰＤ−１（４μｇ／ｍｌ）コーティングプレートに結合させた。各ウェル中の結合ＰＤ−１−Ｈｉｓの量を、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体を使用して定量した。インキュベーション後、過剰の二次抗体を洗い流した。ＴＭＢをウェルに添加し、インキュベーション後、反応を停止させ、そしてＨＲＰ活性を４５０ｎｍにおける吸収の増加をモニタリングすることにより測定した。一定濃度のＰＤ−１−Ｈｉｓ（０．１μｇ／ｍｌ）を、一定濃度のＮＩＶ（４μｇ／ｍｌ）コーティングプレートに添加し、そして室温で１時間インキュベートし、次にキメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体の連続希釈物をウェルに添加した。インキュベーション及び洗浄後、各ウェル中の結合したＰＤ−１−Ｈｉｓの量を、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体を使用して定量した。
【０２２６】
これらのデータは、キメラｃ１Ｇ４及び参照抗ＰＤ−１抗体のいずれも、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１に対する結合をブロックすることができ、またキメラｃ１Ｇ４は、ＰＤ−１−Ｈｉｓとの結合について抗ＰＤ−１（参照）と競合することができることを示唆する。
ＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞に対するｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４の結合
【０２２７】
細胞表面において組換えヒトＰＤ−１を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を開発し、そしてフローサイトメトリーによりＰＤ−１ヒトモノクロナール抗体の特異性を決定するのに使用した。ＣＨＯ細胞に、膜貫通型ＰＤ−１をコードする完全長ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドをトランスフェクトした。ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４抗ＰＤ−１モノクロナール抗体の結合を、トランスフェクト細胞を連続希釈した抗ＰＤ−１モノクロナール抗体と共に、ＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中でインキュベートすることにより評価した。細胞をフローバッファーで洗い流し、そしてビオチン標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  ＦｃγＡｂ及びストレプトアビジン−ＰＥを用いて結合を検出した。フローサイトメトリー分析を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．社）を使用して実施した。
【０２２８】
図３Ａ及び３Ｂは、フローサイトメトリーによるＣＨＯ−Ｓ細胞（図３Ａ）、及びＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞（図３Ｂ）に対するｃ１Ｇ４抗体の結合について提示する。参照抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。結果は、ｃ１Ｇ４はＰＤ−１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合したが、しかしヒトＰＤ−１をトランスフェクトしなかったＣＨＯ細胞には結合しなかったことを示唆する。
【０２２９】
細胞表面上のＰＤ−１に対するヒト化ｈ１Ｇ４及びオリジナルのｃ１Ｇ４抗体の結合特性を図９に示す。
選択されたｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４抗体による、ＰＤ−１に対するリガンド結合のブロッキング
【０２３０】
抗ＰＤ−１であるｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４を、リガンドであるＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞に結合するのをブロックする能力について、フローサイトメトリーアッセイを使用して試験した。抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。ＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ＦＡＣＳバッファー（１％のＦＢＳを含むＰＢＳ）に懸濁した。様々な濃度のｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４抗ＰＤ−１抗体、参照抗ＰＤ−１、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を細胞懸濁物に添加し、そして４℃で３０分間インキュベートした。未結合の抗体を洗い流し、そしてビオチン標識ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質を添加し、そして４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次にストレプトアビジン−ＰＥにより４℃で３０分間染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．社）を使用して実施した。
【０２３１】
染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定されるように、抗ＰＤ−１モノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞に対する結合をブロックした。このデータは、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定されるように、ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４のいずれも、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞に対する結合をブロックしたことを示唆する（図４及び図１０）。
【０２３２】
ヒト化抗ＰＤ−１抗体の活性化ヒトＴ細胞に対する結合
ヒトＴ細胞を、ＭａｇｎｉＳｏｒｔ（商標）ヒトＴ細胞富化キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用してＰＢＭＣから単離した。単離したＴ細胞を、５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により３日間活性化させて、ＰＤ−１発現を刺激した。活性化Ｔ細胞を収集し、そしてヒトＦｃ遮断薬（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と共に、ＦＡＣＳバッファー（２％のＦＢＳを含むＰＢＳ）中、４℃で２０分間インキュベートした。
【０２３３】
抗ＰＤ−１モノクロナール抗体の結合を、ＦＡＣＳバッファー中で、活性化Ｔ細胞を連続希釈した抗ＰＤ−１モノクロナール抗体と共にインキュベートすることにより評価した。細胞をフローバッファーで洗浄し、そして結合をＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  ＦｃγＡｂを用いて検出した。フローサイトメトリー分析を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．社）を使用して実施した。参照抗ＰＤ−１抗体及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。
【０２３４】
ヒト化抗ＰＤ−１抗体であるｈ１Ｇ４の活性化ヒトＴ細胞に対する結合の結果を図１２に示す。
【０２３５】
実施例５
混合白血球反応（ＭＬＲ）において、抗ＰＤ−１であるｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４がサイトカイン産生に及ぼす効果
リンパ球エフェクター細胞に至るＰＤ−１経路をブロッキングしたときの効果を実証するのに、混合白血球反応を採用した。抗ＰＤ−１抗体が存在する又はしないときの増殖、ＩＦＮ−γ分泌、及びＩＬ−２分泌についてアッセイ内Ｔ細胞を試験した。
【０２３６】
ヒトＴ細胞を、Ｌｙｍｐｈｏ−ｋｗｉｋ  Ｔ（Ｏｎｅ  Ｌａｍｄａ，Ｉｎｃ．社）を使用してＰＢＭＣから精製した。単離したＴ細胞をＰＢＳに懸濁し、そして１μＭのＣＦＳＥを用いて室温で１０分間標識した。完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）で細胞を洗浄した後、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を１Ｅ６／細胞の濃度で完全培地中に懸濁した。
【０２３７】
同種異系樹状細胞をＰＢＭＣから生成した。単離したＰＢＭＣを、２００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）共に終夜インキュベートし、単球／マクロファージ集団をプレートに付着させた。非接着細胞を除去し、プレートを完全培地で２回洗浄した。プレート上の細胞を、次に２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び２００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する完全培地中で６日間培養した。６日目に、ＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍｌ）を培養物に添加することにより、単球由来の樹状細胞を成熟させ、そして終夜インキュベートした。成熟したＤＣをトリプシン処理、採取し、そして１Ｅ５／細胞の濃度で完全培地中に懸濁した。
【０２３８】
各反応では、２００μｌの総容量中に、１０５個のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞、及び１０４個の同種異系樹状細胞が含まれた。抗ＰＤ−１モノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４又はｈ１Ｇ４を、異なる抗体濃度で各培養物に添加した。抗体無し又は抗ＶＥＧＦ抗体（アバスチン）のいずれかを陰性コントロールとして使用した。参照抗ＰＤ−１抗体を陽性コントロールとして使用した。細胞を３７℃で５日間培養した。５日目以降、１００μｌの培地をサイトカイン測定用として各培養物から採取した。サイトカインのレベルを、ヒトＩＦＮ−γ又はＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して測定した。細胞を収集し、そしてＴ細胞増殖についてフローサイトメトリーにより分析した。
【０２３９】
図５Ａは、ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４により促進された濃度依存性ＩＬ−２分泌を説明し、また図５Ｂは、ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４による濃度依存性ＩＦＮ−γ分泌を説明する。
【０２４０】
図１３Ａは、ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｈ１Ｇ４により促進された濃度依存性ＩＬ−２分泌を説明し、また図１３Ｂは、ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｈ１Ｇ４により促進される濃度依存性ＩＦＮ−γ分泌を説明する。
【０２４１】
ヒトＰＤ−１に対するモノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４は、混合白血球反応アッセイにおいてＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する。図６Ａは、ｃ１Ｇ４抗体が様々な濃度で存在するときのＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を説明し、また図６Ｂは、ｃ１Ｇ４抗体が様々な濃度で存在するときのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を説明する。図１４Ａは、ｈ１Ｇ４抗体が様々な濃度で存在するときのＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を説明し、また図１４Ｂは、ｈ１Ｇ４抗体が様々な濃度で存在するときのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を説明する。
【０２４２】
まとめると、これらの結果は、抗ＰＤ−１モノクロナール抗体であるｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４はＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γ分泌、及びＩＬ−２分泌を促進することを示唆する。対照的に、陰性コントロール抗体を含有する培養物は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２分泌の増加を示さなかった。
【０２４３】
実施例６
ｃ１Ｇ４及びｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性
抗ヒトＰＤ−１抗体のインビボでの活性を、免疫不全状態のＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満性糖尿病／重度複合型免疫欠損）マウスを使用して、異種移植マウスモデルにおいて調査した。がん細胞及び単離したヒトＰＢＭＣを、表示のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比で皮下投与直前に混合した。各マウスに、がん細胞とヒトＰＢＭＣの混合物を両側にイノキュレーションした。マウス４匹を各実験群に割り振った。第１用量の試験品を、がん／エフェクター細胞の移植から１日後に腹腔内投与した。マウスに、試験品の投与を１週間に２回、３〜４週間施した。腫瘍の形成を、１週間に２回、各動物において観察した。腫瘍をカリパスにより測定し、そして腫瘍容量（Ｖ）を、式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５×（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）を使用して計算した。
【０２４４】
ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおいてｃ１Ｇ４又はｈ１Ｇ４抗体を用いたときの腫瘍増殖曲線を、図７Ａ及び図１５Ａにそれぞれ示す。ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおいて、ｃ１Ｇ４又はｈ１Ｇ４抗体を用いたとき、その２８日目又は２１日目における個々の腫瘍容量を図７Ｂ及び図１５Ｂにそれぞれ提示した。更に、ＮＣＩ−Ｈ２９２／ＰＢＭＣにおいてｈ１Ｇ４抗体を用いたときの腫瘍増殖曲線を図１６Ａに示す。ｈ１Ｇ４抗体を用いたときの２５日目の個々の腫瘍容量を図１６Ｂに提示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【０２４５】
更に、ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおける抗ＰＤ−１及び抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体の併用療法についても試験した。抗ＰＤ−１と抗ＶＥＧＦを併用したときの腫瘍阻害の増強を示すデータを図２１に示す。
【０２４６】
実施例７
ｈ１Ｇ４の種交差反応性
組換えヒト、ラット、マウス、及びカニクイザルのＰＤ−１融合タンパク質は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．社からを購入した。ＰＤ−１／Ｆｃ（１ウェル当たり９ｎｇ）を、４℃、終夜インキュベートすることにより、９６ウェルアッセイプレート上に固定した。非特異的結合部位を、５％のスキムミルクを含むＰＢＳを使用して、室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、表示の濃度のｈ１Ｇ４、参照抗ＰＤ−１（陽性コントロール）、及びＨＬＸ０１（陰性コントロール）を、固定したタンパク質と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次にＰＢＳ中で１／１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）’２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して発色させた。吸収を、Ｖｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により４５０ｎｍの波長で読み取った。
【０２４７】
図１１Ａ〜１１Ｄは、ヒト（図１１Ａ）、カニクイザル（図１１Ｂ）、マウス（図１１Ｃ）、及びラット（図１１Ｄ）ＰＤ−１タンパク質に対するｈ１Ｇ４の種交差反応性を示す。
【０２４８】
実施例８
ｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性
ｈＰＤ１  ＫＩマウスにおけるｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性
抗ヒトＰＤ−１抗体のインビボでの活性を、ヒトＰＤ−１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウス（ｈＰＤ１  ＫＩマウス）において調査した。ヒトＰＤ−Ｌ１トランスフェクトマウス結腸がん細胞をマウスの皮下にイノキュレーションした（マウス１匹当たり細胞１Ｅ６個）。腫瘍容量がほぼ７５ｍｍ３に達したら（９日目）、抗体治療を開始した。動物４匹を、治療前に各実験群に割り振った。抗ＰＤ−１抗体の投与を、１週間に２回、３〜４週間、動物に施した。腫瘍の形成を、１週間に２回、各動物において観察した。腫瘍をカリパスにより測定し、そして腫瘍容量（Ｖ）を、式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５×（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）を使用して計算した。ｈＰＤ１  ＫＩマウスにおけるｈ１Ｇ４抗体の腫瘍増殖阻害活性を図１７に示す。
ヒト化ＮＳＧマウスを対象とした三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株異種移植モデルにおけるｈ１Ｇ４の有効性試験
【０２４９】
ヒト化ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）の皮下に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト三重陰性乳がん細胞株）をイノキュレーションした。腫瘍容量が約６０〜１５０ｍｍ３に達したとき、表に基づく腫瘍容量を基準としてマウスを３群（ｎ＝９匹／群）にランダム化した。マウスの腹腔内にｈ１Ｇ４を７日に１回、試験０、７、１４、２１、及び２８日目に投与した。キイトルーダ（Keytruda）（抗ＰＤ−１）を、５日に１回、試験０、５、１０、１５、及び２０日目に腹腔内注射した。腫瘍の形成を、各動物において３〜４日毎に観察した。腫瘍をカリパスにより測定し、そして腫瘍容量（Ｖ）を、式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５×（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）を使用して計算した。図１８は、ヒト化のＮＳＧマウスを対象とした三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株異種移植モデルにおけるｈ１Ｇ４の有効性試験について説明する。
【０２５０】
実施例９
親和性成熟型抗ＰＤ−１抗体３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１Ｄの平衡解離定数（ＫＤ）の決定
ヒト化抗ＰＤ−１抗体であるｈ１Ｇ４を、インビトロでのファージディスプレイに基づく親和性成熟実験で使用して、結合性能が改善したクローンを生成した。ｈ１Ｇ４のＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ３（３つのＣＤＲに着目）及びＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ２／ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ１／ＣＤＲ−Ｈ２／ＣＤＲ−Ｈ３（６つのＣＤＲに着目）核酸ライブラリーの両方をＰＣＲにより生成し、ファージディスプレイベクターにクローン化し、そしてイーコリ（E.coli）ＴＧ１又はＳＳ３２０細胞に形質転換してファージのライブラリーを生成した。両ライブラリーについて、ストレプトアビジンコーティングマグネットＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃１１２０５Ｄ）と結びついたビオチン化ＰＤ−１−Ｈｉｓを用いて３ラウンドのパニングを行った後、３つのＦａｂクローン、すなわち、３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１ＤをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。更なる反応速度論的特徴を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（図９において上記した同一のＳＰＲ法を参照）により、３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１Ｄの完全長ＩｇＧを使用して測定し、そして参照抗ＰＤ−１抗体と同等又はそれより良好である結合性能を有することが見出された。
【０２５１】
表５は、ファージ−ディスプレイに基づく親和性成熟からスクリーニングした３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１ＤのＣＤＲのアミノ酸配列を、ｈ１Ｇ４と比較して示す。
【０２５２】
【表５】
2020501598.tif 000007
【０２５３】
表６は、会合解離の反応速度論を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定した３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１Ｄの計算後の親和性（ＫＤ）と共に示す。参照抗ＰＤ−１抗体と対比した抗ＰＤ−１抗体の親和性の改善についても表６に示した。データは、２回繰り返し実施した２つの独立した実験を代表する。
【０２５４】
【表６】
2020501598.tif 000008
【０２５５】
実施例１０
親和性成熟型抗体の機能
混合白血球反応（ＭＬＲ）において、ヒト抗ＰＤ−１抗体（３３Ｂ、６６Ｅ、及び７１１Ｄ）がサイトカイン産生に及ぼす効果
上記方法と同じ方法に従い、この試験は、ヒトＰＤ−１に対するヒトモノクロナール抗体、例えば６６Ｅ及び７１１Ｄ等は、混合白血球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌及びＩＬ−２分泌を促進することを示す。参照抗ＰＤ−１抗体及びアバスチン（抗ＶＥＧＦ）を陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。図１９Ａは、親和性成熟型抗体による濃度依存性ＩＬ−２分泌を説明し、また図１９Ｂは、親和性成熟型抗体による濃度依存性ＩＦＮ−γ分泌を説明する。
ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおけるヒト抗ＰＤ−１抗体の腫瘍増殖阻害活性
【０２５６】
上記方法と同じ方法に従い、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に、ヒト結腸がん細胞株ＨＴ２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を移植した。第１日目から１週間に２回、抗ＰＤ−１抗体をマウスの腹腔内に注射した。腫瘍容量を１週間に２回測定した。ＨＴ２９／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおけるヒト親和性成熟型抗ＰＤ−１抗体の腫瘍増殖阻害活性を図２０に示す。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【０２５７】
実施例１１
ＰＤ−１併用療法
抗ＰＤ−１とその他の治療用抗体を用いた併用療法のインビボでの活性を、免疫不全状態のＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満性糖尿病／重度複合型免疫欠損）マウスを使用して、異種移植マウスモデルにおいて調査した。がん細胞及び単離したヒトＰＢＭＣを、表示のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比で、皮下投与直前に混合した。各マウスに、がん細胞とヒトＰＢＭＣの混合物を両側にイノキュレーションした。動物４匹又は５匹を各実験群に割り振った。第１用量の試験品を、がん／エフェクター細胞の移植から１日後に腹腔内投与した。マウスに、試験品の投与を１週間に２回、３〜４週間施した。腫瘍の形成を、１週間に２回、各動物において観察した。腫瘍をカリパスにより測定し、そして腫瘍容量（Ｖ）を、式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５×（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）を使用して計算した。
【０２５８】
ＮＳＣＬＣ異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＶＥＧＦｍＡｂの腫瘍増殖阻害活性
この試験では、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を移植した。抗ＰＤ−１（ｈ１Ｇ４）、及び抗ＶＥＧＦ（ＨＬＸ０４）抗体を、第１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２２Ａに示す。２１日目における個々の腫瘍容量を図２２Ｂに提示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。これらのデータは、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、ｈ１Ｇ４は、抗ＶＥＧＦｍＡｂ（ＨＬＸ０４）と併用すると、いずれの薬剤においても、その単独使用よりも有効にＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植片の腫瘍増殖を抑制することを説明する。
【０２５９】
その他の試験では、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を移植した。抗ＰＤ−１（ｈ１Ｇ４）、及び抗ＶＥＧＦＲ２（ＨＬＸ０６）抗体を、第１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２３Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２３Ｂに提示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。これらのデータは、抗ＰＤ−１ｍＡｂ（ｈ１Ｇ４）は、抗ＶＥＧＦＲ２ｍＡｂ（ＨＬＸ０６）と併用すると、いずれの薬剤においても、その単独使用より有効にＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植片の腫瘍増殖を抑制することを説明する。
ＮＳＣＬＣ異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−１ｍＡｂ＋抗ＥＧＦＲｍＡｂの腫瘍増殖阻害活性
【０２６０】
上記方法と同じ方法に従い、マウス（ｎ＝４匹／群）の皮下に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２と新鮮分離したヒトＰＢＭＣの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を移植した。第１日目から１週間に２回、抗ＰＤ−１（ＨＬＸ１０）、及び抗ＥＧＦＲ（ＨＬＸ０７）抗体をマウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２４Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２４Ｂに提示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。これらのデータは、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、ＨＬＸ１０（ｈ１Ｇ４）は、抗ＥＧＦＲｍＡｂ（ＨＬＸ０７）と併用すると、いずれの薬剤においても、その単独使用よりも有効にＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植片の腫瘍増殖を抑制することを示唆する。
【０２６１】
更に、マウス（ｎ＝５匹／群）の皮下に、ヒト結腸がん細胞ＨＴ−２９と新鮮分離したヒトＰＢＭＣの混合物（がん細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を移植した。抗ＰＤ−１（ＨＬＸ１０）、及び抗ＥＧＦＲ（ＨＬＸ０７）抗体を、第１日目から１週間に２回、マウスの腹腔内に注射した。腫瘍増殖曲線を図２５Ａに示した。２１日目における個々の腫瘍容量を図２５Ｂに提示した。すべてのデータポイントは、平均値±ＳＥＭである。
【０２６２】
これらのデータは、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、ＨＬＸ１０（ｈ１Ｇ４）は、抗ＥＧＦＲｍＡｂ（ＨＬＸ０７）と併用すると、単独使用したＨＬＸ１０よりも有効にＢＲＡＦ突然変異体ＨＴ−２９異種移植片の腫瘍増殖を抑制することを示唆する。ＨＬＸ１０＋ＨＬＸ０７治療は、ＨＬＸ０７治療単独よりも若干大きな腫瘍増殖阻害を生成する。ＨＬＸ１０＋ＨＬＸ０７治療及びＨＬＸ０７治療単独の平均腫瘍増殖阻害率は、それぞれ４７％及び２８％であった。
【０２６３】
上記実施例は、説明目的に限定して提示され、またいかなる場合においても、本発明の範囲を限定するように意図されない。本明細書に示され、記載される改変に付加して、本発明の様々な改変が上記記載から当業者にとって明白となるが、それも添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０２６４】
実施形態のリスト
本発明により提示される実施形態として、非限定的に下記事項が挙げられる：
【０２６５】
１．（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２６６】
２．（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号１７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１８）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む成熟型抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２６７】
３．（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン配列とを含む成熟型抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２６８】
４．（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号１２）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号１３）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む成熟型抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む、実施形態１〜９のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２６９】
５．抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ、及び直線状の抗体からなる群から選択される、実施形態１〜４のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体の抗原結合断片。
【０２７０】
６．多重特異性抗体である、実施形態１〜５のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２７１】
７．治療剤にコンジュゲートされている、実施形態１〜６のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２７２】
８．標識にコンジュゲートされている、実施形態１〜７のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２７３】
９．標識が、放射性同位体、蛍光色素、及び酵素からなる群から選択される、実施形態８に記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片。
【０２７４】
１０．実施形態１〜４のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【０２７５】
１１．実施形態１０に記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
【０２７６】
１２．実施形態１１に記載の発現ベクターを含む細胞。
【０２７７】
１３．実施形態１２に記載の細胞を培養することと、細胞培養物から抗体を回収することとを含む、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を製造する方法。
【０２７８】
１４．実施形態１〜９のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【０２７９】
１５．実施形態１〜９のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を、患者から得たサンプルと接触させること、及びＰＤ−１タンパク質に結合した抗ＰＤ−１抗体を検出することにより、サンプル中のＰＤ−１タンパク質を検出する方法。
【０２８０】
１６．抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片が、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイで使用される、実施形態１５に記載の方法。
【０２８１】
１７．有効量の実施形態１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象内のがんを治療する方法。
【０２８２】
１８．がんが、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、尿路上皮がん、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）、胃がん、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫である原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＮＨＬ  ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣がん、肺がん、食道がん、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道がん、結腸直腸がん、乳がん、子宮頸がん、甲状腺がん、及び唾液腺がんからなる群から選択される、実施形態１７に記載の方法。
【０２８３】
１９．対象が、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、及び細胞毒性剤からなる群から選択される治療剤を更に投与される、実施形態１８に記載の方法。
【０２８４】
２０．対象が、放射線療法を更に投与される、実施形態１９に記載の方法。
【０２８５】
２１．対象が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、又はＥＧＦＲに対する治療用抗体を更に投与される、実施形態１８に記載の方法。
【０２８６】
配列リスト
配列番号１（ｃ１Ｇ４＿ＬＣヌクレオチド配列）
【表７】
2020501598.tif 000009
配列番号２（ｃ１Ｇ４＿ＬＣアミノ酸配列，Ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅ：Ｋａｂａｔが定義したＣＤＲ，図８Ａを参照）
【表８】
2020501598.tif 000010
配列番号３（ｃ１Ｇ４＿ＨＣヌクレオチド配列）
【表９】
2020501598.tif 000011
配列番号４（ｃ１Ｇ４＿ＨＣアミノ酸配列，Ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅ：Ｋａｂａｔが定義したＣＤＲ，図８Ｂを参照）
【表１０】
2020501598.tif 000012
配列番号５（ｈ１Ｇ４＿ＬＣヌクレオチド配列）
【表１１】
2020501598.tif 000013
配列番号６（ｈ１Ｇ４＿ＬＣアミノ酸配列，Ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅ：Ｋａｂａｔが定義したＣＤＲ，図８Ａを参照）
【表１２】
2020501598.tif 000014
配列番号７（ｈ１Ｇ４＿ＨＣヌクレオチド配列）
【表１３】
2020501598.tif 000015
配列番号８（ｈ１Ｇ４＿ＨＣアミノ酸配列，Ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅ：Ｋａｂａｔが定義したＣＤＲ，図８Ｂを参照）
【表１４】
2020501598.tif 000016
配列番号：９（ｃ１Ｇ４およびｈ１Ｇ４  ＣＤＲ−Ｌ１）：ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ
配列番号：１０（ｃ１Ｇ４およびｈ１Ｇ４  ＣＤＲ−Ｌ２）：ＷＡＳＴＲＨＴ
配列番号：１１（ｃ１Ｇ４およびｈ１Ｇ４  ＣＤＲ−Ｌ３）：ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ
配列番号：１２（ｃ１Ｇ４およびｈ１Ｇ４  ＣＤＲ−Ｈ１）：ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ
配列番号：１３（ｃ１Ｇ４およびｈ１Ｇ４  ＣＤＲ−Ｈ２）：ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ
配列番号：１４（ｃ１Ｇ４およびｈ１Ｇ４  ＣＤＲ−Ｈ３）：ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ
配列番号：１５（３３Ｂ  ＣＤＲ−Ｌ１）：ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ
配列番号：１６（３３Ｂ  ＣＤＲ−Ｌ２）：ＷＡＳＬＲＨＴ：
配列番号：１７（３３Ｂ  ＣＤＲ−Ｌ３）：ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ
配列番号：１８（３３Ｂ  ＣＤＲ−Ｈ１）：ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ
配列番号：１９（３３Ｂ  ＣＤＲ−Ｈ２）：ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ
配列番号：２０（３３Ｂ  ＣＤＲ−Ｈ３）：ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ
配列番号：２１（６６Ｅ  ＣＤＲ−Ｌ１）：ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ
配列番号：２２（６６Ｅ  ＣＤＲ−Ｌ３）：ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ
配列番号：２３（６６Ｅ  ＣＤＲ−Ｈ３）：ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ
配列番号：２４（７１１Ｄ  ＣＤＲ−Ｌ１）：ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ
配列番号：２５（７１１Ｄ  ＣＤＲ−Ｈ３）：ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ
【図１】
2020501598.tif 000017
【図２】
2020501598.tif 000018
【図３】
2020501598.tif 000019
【図４】
2020501598.tif 000020
【図５】
2020501598.tif 000021
【図６】
2020501598.tif 000022
【図７】
2020501598.tif 000023
【図８Ａ】
2020501598.tif 000024
【図８Ｂ】
2020501598.tif 000025
【図９】
2020501598.tif 000026
【図１０】
2020501598.tif 000027
【図１１−１】
2020501598.tif 000028
【図１１−２】
2020501598.tif 000029
【図１２】
2020501598.tif 000030
【図１３】
2020501598.tif 000031
【図１４】
2020501598.tif 000032
【図１５】
2020501598.tif 000033
【図１６】
2020501598.tif 000034
【図１７】
2020501598.tif 000035
【図１８】
2020501598.tif 000036
【図１９】
2020501598.tif 000037
【図２０】
2020501598.tif 000038
【図２１】
2020501598.tif 000039
【図２２】
2020501598.tif 000040
【図２３】
2020501598.tif 000041
【図２４】
2020501598.tif 000042
【図２５】
2020501598.tif 000043
【配列表】
2020501598000001.app
【国際調査報告】
2020501598.tif 000044
2020501598.tif 000045
2020501598.tif 000046