(57)【要約】  本発明は、ヒトイディオタイプを有する機能性免疫グロブリンの最適な産生に有用なトランスジェニック動物に関する。【選択図】図１Ａ
2020505037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物のゲノムの異なる染色体部位に組み込まれた、少なくとも１つの不活性化内在性Ｉｇ遺伝子座及び複数の人工トランスジェニックＩｇ重鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記複数の人工Ｉｇ重鎖遺伝子座が、（ｉ）生殖細胞系列または超変異ヒトＶ領域アミノ酸配列をコードする少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを有するＶ領域と、（ｉｉ）１つ以上のＪ遺伝子セグメントと、（ｉｉｉ）１つ以上の定常領域遺伝子セグメントと、を含み、前記人工Ｉｇ重鎖遺伝子座が機能的であり、遺伝子再編成を受けることができ、人工免疫グロブリンのレパートリーを産生するために協調的に作用する、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記少なくとも２つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座が、それらの間にヒト可変重鎖領域の完全相補体を含む、請求項２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記人工重鎖遺伝子座が、重複重鎖遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記トランスジェニック動物が、機能的内在性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠く、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記トランスジェニック動物が、機能的内在性Ｉｇ重鎖遺伝子座を欠く、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記トランスジェニック動物が、異なる染色体部位に位置するトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座のＶ遺伝子によってコードされる抗体の多様なレパートリーを発現する、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記トランスジェニック動物が、機能的Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、重鎖のみの抗体を産生することができる、請求項７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記人工Ｉｇ重鎖遺伝子座の少なくとも１つが、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）連結（Ｊ）領域遺伝子、Ｉｇ定常領域遺伝子、及びラット３’エンハンサーを含む、請求項２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記ラット３’エンハンサーが、配列番号１として記載される配列を含む、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
少なくとも１つのヒトＩｇ可変（Ｖ）領域遺伝子及び／またはヒトＩｇ多様性（Ｄ）領域遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記定常領域遺伝子が、ヒト定常領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子からなる群より選択される、請求項２または９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記定常領域遺伝子が、ラット定常領域遺伝子を含む、請求項１２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記定常領域遺伝子が、Ｃμ及びＣγからなる群より選択される定常領域遺伝子を含む、請求項２または９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌと実質的に相同な核酸配列、またはその一部を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記ヒトＩｇ  Ｖ領域が、ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／またはＢＡＣ３から単離可能な少なくとも１つのヒトＶ領域遺伝子を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
５’から３’の順序で核酸配列（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／またはＢＡＣ３から単離可能な天然の構成にヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、
（ｂ）前記細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌから単離可能な天然の構成にヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、
を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記ヒト免疫グロブリン可変領域、前記ヒト免疫グロブリン多様性領域、前記ヒト免疫グロブリン連結領域、前記免疫グロブリン定常領域、及び前記ラット３’エンハンサーのそれぞれが、図１ａに示す相対位置にある、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
配列番号２として記載される核酸配列と実質的に相同な核酸配列を含む、請求項１８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
配列番号１１として記載される核酸配列と実質的に相同な核酸配列を含む、請求項１８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２１】
前記Ｖ−Ｄ−Ｊ領域が再編成され、重鎖可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記ヒトＩｇ  Ｖ領域が、ＢＡＣ９−ＶＨ３−５３及び／またはＢＡＣ１４／５から単離可能な少なくとも１つのヒトＶ領域遺伝子を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
５’から３’の順序で核酸配列（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）ＢＡＣ９−ＶＨ３−５３及び／またはＢＡＣ１４／５から単離可能な天然の構成にヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、
（ｂ）前記細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌから単離可能な天然の構成にヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、
を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２４】
前記ヒト免疫グロブリン可変領域、前記ヒト免疫グロブリン多様性領域、前記ヒト免疫グロブリン連結領域、前記免疫グロブリン定常領域、及び前記ラット３’エンハンサーのそれぞれが、図１ｂに示す相対位置にある、請求項２２または２３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２５】
図６に記載の核酸配列と実質的に相同な核酸配列を含む、請求項２４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２６】
図７に記載の核酸配列と実質的に相同な核酸配列を含む、請求項２４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２７】
先行請求項のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することを含む、抗体産生方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によって産生されたポリクローナル抗血清組成物であって、前記抗血清が、異なる染色体部位に位置するトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座によってコードされるＶ遺伝子によってコードされる抗原特異的抗体を含む、前記ポリクローナル抗血清組成物。
【請求項２９】
（ｉ）請求項１〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することと、（ｉｉ）前記トランスジェニック動物から、前記免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を単離することと、（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体産生細胞を用いて前記免疫原に特異的に結合する前記モノクローナル抗体を産生するか、または前記モノクローナル抗体産生細胞を用いて前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を産生し、そして前記ハイブリドーマ細胞を用いて前記モノクローナル抗体を産生することと、を含む、モノクローナル抗体の産生方法。
【請求項３０】
（ｉ）請求項１〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することと、（ｉｉ）前記トランスジェニック動物から、前記免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を単離することと、（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体産生細胞から、前記免疫原に特異的に結合する前記モノクローナル抗体をコードするモノクローナル抗体核酸を単離することと、（ｉｖ）前記モノクローナル抗体核酸を用いて前記免疫原に特異的に結合する前記モノクローナル抗体を産生することと、を含む、モノクローナル抗体の産生方法。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体が、ヒトイディオタイプを有する、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）請求項１〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することと、（ｉｉ）前記トランスジェニック動物から、前記免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を単離することと、（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体産生細胞から、前記免疫原に特異的に結合する前記モノクローナル抗体をコードするモノクローナル抗体核酸を単離することと、（ｉｖ）前記モノクローナル抗体核酸を改変して、完全ヒトモノクローナル抗体をコードする組換え核酸を産生することと、（ｖ）完全ヒトモノクローナル抗体をコードする前記組換え核酸を用いて前記コードされた完全ヒトモノクローナル抗体を産生することと、を含む、完全ヒトモノクローナル抗体の産生方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項３４】
ヒト身体成分中の抗原性要素を中和するための方法であって、前記方法が、前記身体成分を、前記抗原性要素に特異的に結合する、かつそれを中和する免疫グロブリン分子を含む請求項２８に記載のポリクローナル抗血清組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３５】
ヒト身体成分中の抗原性要素を中和するための方法であって、前記方法が、前記身体成分を、前記抗原性要素に特異的に結合する、かつそれを中和する請求項３３に記載のモノクローナル抗体と接触させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、げっ歯類においてヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンの産生に有用なトランスジェニック動物、及びその作製方法に関する。本発明はさらに、細菌人工染色体上の改変された広領域、及びそれらの組み合わせたタンデム組み込みに由来するポリヌクレオチドを使用してヒト化抗体及び完全ヒト抗体を産生するための組成物及び方法に関する。独立して得られたトランスジェニック動物の異種交配は、多くの異なる、場合により全てのヒトＶＨ、Ｄ及びＪＨセグメントを使用して非常に多様なヒト抗体レパートリーの発現を可能にした。発現は、ＶＨ遺伝子の多様性及び選択を干渉せずに得るように、一斉に別々の組み込み部位を調節することによりｉｎ  ｖｉｖｏで管理される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトモノクローナル抗体は、通常のサイズ、一本鎖、またはドメインモジュールのＩｇＧのいずれかとして治療用途に有益であることが証明されている（Ｃｈａｎ＆Ｃａｒｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，３０１−３１６（２０１０）；Ｅｎｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４０５−４１１（２００９））。この成功にも関わらず、それらの産生には依然として大きな欠点があり、これは、利用可能なヒト材料の特異性選択及びその後の個々の産物の改変、または利用可能性が限られたトランスジェニック動物の免疫化のいずれかに依存する（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｈａｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ＩＩＩ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄ．Ｄｕｂｅｌ，Ｓ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＨＣ，６９−９３（２００７））。
【０００３】
生殖細胞系構成に重鎖遺伝子を安定的に挿入することによる、トランスジェニック動物におけるヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子のＤＮＡ再編成及び発現は２０年以上前に開発された（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８６，６７０９−６７１３（１９８９））。非ヒト免疫グロブリンの治療用途に関連する１つの問題は、ヒト患者におけるその免疫原性の可能性である。そのような製剤の免疫原性を低減するために、キメラ抗体、部分ヒト（ヒト化）抗体、及び完全ヒト抗体を産生するための様々な戦略が開発されてきた。キメラ抗体は、ヒト定常領域、及び非ヒトＶ遺伝子によってコードされる結合領域を含む。非ヒト動物においてヒトイディオタイプを有するトランスジェニック抗体を産生することができることは、抗原結合決定基がイディオタイプ領域内にあり、非ヒトイディオタイプは、現在の抗体治療薬の免疫原性の要因となると考えられているため特に望ましい。ヒトイディオタイプは、ポリクローナル抗体混合物によって低濃度で送達される多様なイディオタイプとは対照的に、比較的高濃度で送達される単一のイディオタイプからなるモノクローナル抗体治療薬に関して特に重要な問題である。
【０００４】
２つの新たな戦略：胚性幹（ＥＳ）細胞における遺伝子ノックアウト（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５０，４２３−４２６（１９９１））及び人工染色体上の遺伝子座伸長（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１，７６７−７６８（１９９３））を組み合わせて大きな改善、より高い発現レベルかつ独占的なヒトＩｇの産生がもたらされている。ＥＳ細胞における遺伝子ターゲッティングによる内在性Ｉｇ遺伝子のサイレンシングは、それらのＩｇＨ及びＩｇＬ遺伝子座を再編成する能力なしに、または完全に機能的なＩｇＨ、ＩｇＫまたはＩｇＬ産物を産生することなく、いくつかの不活性マウス系統を産生した。最近では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が、Ｉｇ遺伝子に部位特異的な二本鎖切断を起こすように設計されており、これは欠失及び非相同ＤＮＡ修復による遺伝子破壊を可能にした。受精卵へのＺＦＮプラスミドの注入により、ＩｇＨ及びＩｇＬが破壊されたＩｇサイレンシングラット及びウサギが作製された（Ｇｅｕｒｔｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４３３（２００９）；Ｍｅｎｏｒｅｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２９３２−２９４１（２０１０）；Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６，ｅ２１０４５（２０１１））。
【０００５】
非ヒト動物においてヒト化トランスジェニック抗体を産生するための多くの従来技術のアプローチで遭遇する重要な技術的課題は、同じ動物における二重Ｉｇ遺伝子座、例えば、トランスジェニック動物に導入された既存のまたは内在性のＩｇ遺伝子座及び外因性または人工の遺伝子座間の見かけの競合に関する。歴史的に、効果的なノックアウトがない場合、内在性遺伝子座は抗体産生に関して外因性遺伝子座に勝るため、重複遺伝子座が効果的にサイレンシングされる（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏ，２３，１１１７，２００５；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３，６８９８，１９９９；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＴＥ  ６３，１０１，２０１５）。したがって、これに関して、先行技術は、異なる染色体部位に組み込まれた二重Ｉｇ遺伝子座が同じ宿主動物におけるトランスジェニック抗体の産生において協調的に作用し得るかどうかについて対処も解決もしておらず、実際、その逆が真実であることが当業者に合理的に示唆されるであろう。
【０００６】
非ヒト動物におけるヒトイディオタイプを有するトランスジェニック抗体の産生に関して遭遇する別の技術的課題は、ヒト抗体を作製するために使用されるヒト免疫グロブリンＶＤＪまたはＶＪ遺伝子セグメントの完全相補体を提供することの困難さである。ヒト重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座からメガ塩基サイズのフラグメントを導入することによって問題に取り組むことを試みる者もいた。しかしながら、このアプローチは、生殖細胞系列構成に含まれるヒト免疫グロブリン遺伝子のおよそ８０％で成功したことが証明されているだけであり、酵母人工染色体（ＹＡＣ）システムによる関連染色体の大きなフラグメントを送達するためのプロトプラストの使用に頼ってきた（米国特許第５，９３９，５９８号）。
【０００７】
抗体の多様性を最大化するために、ＩｇＨ遺伝子座の全機能性を維持し、かつＤＮＡ再編成に不可欠であるような、広範な重複ＶＨＤＪＨ領域の組み込みがトランスジェニック動物において利用されているが、重複組み込みは、はるかに小さい領域（１００ｋｂ未満）（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５，４０５−４１４（１９９６）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２１，１３２３−１３２６（１９９１））または、大きな領域ではあるが、依然として単一の組み込み部位で限られたレパートリーを有する（ＷＯ２０１４／０９３９０８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら）と主に報告されてきた。出願時には、当該技術分野における共通の理解は、ＢＡＣまたはＹＡＣ混合物の拡散または複数組み込みは稀であり、ホモ接合にする交配にとって不利であり得ることであった。さらに、幹細胞への大型ＹＡＣの困難な組み込み、及びそれに続く該幹細胞からの動物の誘導が一般的に実施された（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，１４６−１５６（１９９７）；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１，９１１−９１４（１９９３））。
【０００８】
ヒトＶ遺伝子の完全相補体を有するトランスジェニック動物を使用したヒトイディオタイプを有する抗体の多様性を最大化する免疫グロブリンまたは抗体の最適な産生は、広範囲の疾患領域における治療用途のための新規な特異性を生み出すための課題のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、異なる染色体部位に組み込まれた二重／重複ヒト免疫グロブリンＶＤＪまたはＶＪ遺伝子セグメントを含む複数の人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含む、かつ内在性免疫グロブリンを産生する能力が欠如したトランスジェニック動物を提供することにより、当該分野における前述の不確実性を解決する。２つの異なる染色体上の２つの異なる位置に２つの異なる遺伝子座を挿入することを含むこれらのトランスジェニック動物作製に使用される方法は、驚くべきことに、トランスジェニック動物のゲノムに組み込まれたヒト免疫グロブリンＶＤＪ重鎖遺伝子セグメントの完全相補体により、対立遺伝子排除を有利に回避し、抗体多様性の増加をもたらす機能的Ｂ細胞を産生した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様では、キメラ免疫グロブリン鎖、特に、トランスジェニック動物作製に使用するためのキメラ重鎖をコードする核酸配列を含む新規なポリヌクレオチドが開示される。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも部分的に、３’エンハンサーの包含により最適発現を有利にもたらす、これは、この３’エンハンサーを欠くトランス遺伝子座がアイソタイプスイッチングの低下及び低ＩｇＧ発現をもたらすためである。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ラット３’エンハンサー配列、Ｉｇ定常領域遺伝子、及び少なくとも１つのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）連結（Ｊ）領域遺伝子を含むキメラポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態では、ラット３’エンハンサー配列は、配列番号１として記載される配列、またはその一部を含む。
【００１１】
一実施形態では、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒト可変（Ｖ）遺伝子、少なくとも１つの多様性（Ｄ）遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの定常領域遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子からなる群より選択される。好ましい実施形態では、定常領域遺伝子は、ラット定常領域遺伝子を含む。別の好適な実施形態では、定常領域遺伝子は、Ｃμ及びＣγからなる群より選択される。
【００１２】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、本明細書に開示される、細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌと実質的に相同な核酸配列（例えば、配列番号１０、またはその一部）を含み、任意でＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及びＢＡＣ３構築物及び／またはＢＡＣ９及びＢＡＣ１４／５構築物から単離可能な少なくとも１つのヒト可変Ｉｇ遺伝子をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、本明細書で企図されるキメラポリヌクレオチドは、５’から３’の順序で核酸配列（ａ）及び（ｂ）：（ａ）ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及びＢＡＣ３構築物及び／またはＢＡＣ９及びＢＡＣ１４／５構築物から単離可能な天然の構成にヒトＶ遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）ＢＡＣ  Ａｎｎａｂｅｌから単離可能な天然の構成にヒトＪ遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリヌクレオチドのヒトＩｇ可変領域、ヒトＩｇ多様性領域、ヒトＩｇ連結領域、Ｉｇ定常領域、及びラット３’エンハンサー領域のそれぞれは、図１ａに示す相対位置にある。別の実施形態では、開示されるキメラポリヌクレオチドは、配列番号２として記載される配列またはその一部を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有する。別の実施形態では、開示されるキメラポリヌクレオチドは、配列番号１１として記載される配列またはその一部を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有する。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリヌクレオチドは、重鎖可変ドメインエキソンをコードする再編成Ｖ−Ｄ−Ｊ領域を含む。
【００１３】
一実施形態では、トランスジェニック動物は、該ヒトＩｇ  Ｖ領域が、ＢＡＣ９及び／またはＢＡＣ１４／５から単離可能な少なくとも１つのヒトＶ領域遺伝子を含むキメラポリヌクレオチドをさらに含む。好ましい実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、５’から３’の順序で核酸配列（ａ）及び（ｂ）：（ａ）ＢＡＣ９及び／またはＢＡＣ１４／５から使用された（または再編成された）天然の構成にヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌから使用された（または再編成された）天然の構成にヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を含む。別の実施形態では、ヒト免疫グロブリン可変領域（遺伝子）、ヒト免疫グロブリン多様性領域（セグメント）、ヒト免疫グロブリン連結領域（セグメント）、免疫グロブリン定常領域遺伝子、及びラット３’エンハンサーのそれぞれは、図１ｂに示す位置にある。別の実施形態では、開示されるキメラポリヌクレオチドは、図６に記載の配列を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有する。別の実施形態では、開示されるキメラポリヌクレオチドは、図７に記載の配列またはその一部を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有する。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリヌクレオチドは再編成Ｖ−Ｄ−Ｊを含み得、該再編成遺伝子セグメントは上記の配列番号及び図に由来する。
【００１４】
ヒトカッパ軽鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチドもまた本明細書に開示される。一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＲＰ１１−１１５６Ｄ９（配列番号３として記載）及びＲＰ１１−１１３４Ｅ２４（配列番号４として記載）からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはそれと実質的に相同な核酸配列を有する。別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、５’から３’の順序で核酸配列（ａ）及び（ｂ）：（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１−１５６Ｄ９及び／またはＲＰ１１−１１３４Ｅ２４から単離可能な天然の構成にヒトＶ遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１−１１３４Ｅ２４及び／またはＲＰ１１−３４４Ｆ１７（配列番号５として記載）から単離可能な天然の構成にヒトＪ遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を含む。好ましい実施形態では、ヒトＩｇ可変領域、ヒトＩｇ連結領域、及びヒトＩｇ定常領域のそれぞれは、図２に示す相対位置にある。別の実施形態では、開示されるキメラポリヌクレオチドは、配列番号６として記載される配列またはその一部分を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有する。
【００１５】
本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含むげっ歯類細胞もまた本明細書に提供される。例えば、本明細書に開示のポリヌクレオチドであって、好ましくは、キメラ重鎖をコードする核酸配列（例えば、ラット３’エンハンサー配列、Ｉｇ定常領域遺伝子、及び少なくとも１つのヒトＪ領域遺伝子をコードする核酸配列）を含み、ならびに任意でＲＰ１１−１１５６Ｄ９、ＲＰ１１−１１３４Ｅ２４及びそれらの一部分からなる群より選択される核酸配列と実質的に相同な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、げっ歯類細胞が本明細書に提供される。本明細書で企図されるげっ歯類細胞は、機能的軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、例えば、図２ａに示す配列（配列番号６として記載）、図２ｂに示す配列（配列番号７として記載）、及びその一部分からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有するポリヌクレオチドをさらに含み得る。一実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、げっ歯類細胞ゲノムに組み込まれる。
【００１６】
本発明の別の態様では、動物のゲノムの異なる染色体部位に組み込まれた、少なくとも１つの不活性化内在性Ｉｇ遺伝子座及び複数の人工トランスジェニックＩｇ重鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物が提供される。一実施形態では、複数の人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を有するトランスジェニック動物は、（ｉ）生殖細胞系列または超変異ヒトＶ領域アミノ酸配列をコードする少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを有するＶ領域と、（ｉｉ）１つ以上のＪ遺伝子セグメントと、（ｉｉｉ）１つ以上の定常領域遺伝子セグメントと、を含み、該人工Ｉｇ重鎖遺伝子座は機能的であり、遺伝子再編成を受けることができ、人工免疫グロブリンのレパートリーを産生するために協調的に作用する。別の実施形態では、トランスジェニック動物は、ヒト可変重鎖領域の完全相補体を含む。他の各種実施形態では、トランスジェニック動物は、ｉ）重複する重鎖遺伝子セグメントを含む人工重鎖遺伝子座を有する、ｉｉ）機能的内在性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠く、及び／またはｉｉｉ）機能的内在性Ｉｇ重鎖遺伝子座を欠く。さらに別の実施形態では、トランスジェニック動物は、異なる染色体部位に位置するトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座のＶ遺伝子によってコードされる抗体の多様なレパートリーを発現する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、機能的Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、重鎖のみの抗体を産生することができる。
【００１８】
別の実施形態では、少なくとも２つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を有するトランスジェニック動物は、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）連結（Ｊ）領域遺伝子、Ｉｇ定常領域遺伝子、及びラット３’エンハンサーを含む少なくとも１つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を有する。これらのトランスジェニック動物では、ラット３’エンハンサーが、配列番号１として記載される配列を含み得る。上記実施形態に記載のトランスジェニック動物は、少なくとも１つのヒトＩｇ可変（Ｖ）領域遺伝子及び／またはヒトＩｇ多様性（Ｄ）領域遺伝子をさらに含み得る。本発明の他の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、定常領域遺伝子は、Ｃμ及びＣγからなる群より選択される定常領域遺伝子を含む。各種実施形態では、トランスジェニック動物は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌ、またはその一部分と実質的に相同な核酸配列を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、トランスジェニック動物のヒトＩｇ  Ｖ領域は、ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／またはＢＡＣ３から単離可能な少なくとも１つのヒトＶ領域遺伝子を含む。特定の実施形態では、トランスジェニック動物は、５’から３’の順序で、（ａ）ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／またはＢＡＣ３から単離可能な天然の構成にヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌから単離可能な天然の構成にヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を有する核酸を含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリン可変領域、ヒト免疫グロブリン多様性領域、ヒト免疫グロブリン連結領域、免疫グロブリン定常領域、及びラット３’エンハンサーのそれぞれは、図１ａに示す相対位置にある。別の実施形態では、トランスジェニック動物は、配列番号２として記載される核酸配列と実質的に相同な核酸配列を有する。さらに別の実施形態では、トランスジェニック動物は、配列番号１１として記載される核酸配列と実質的に相同な核酸配列を有する。ある実施形態では、トランスジェニック動物は、再編成されるＶ−Ｄ−Ｊ領域を有し、重鎖可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成する。
【００２０】
他のある特定の実施形態では、トランスジェニック動物は、ＢＡＣ９−ＶＨ３−５３及び／またはＢＡＣ１４／５から単離可能な少なくとも１つのヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ  Ｖ領域を有する。特定の実施形態では、これらのトランスジェニック動物は、５’から３’の順序で、（ａ）ＢＡＣ９−ＶＨ３−５３及び／またはＢＡＣ１４／５から単離可能な天然の構成にヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）Ａｎｎａｂｅｌから単離可能な天然の構成にヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を有する核酸を含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリン可変領域、ヒト免疫グロブリン多様性領域、ヒト免疫グロブリン連結領域、免疫グロブリン定常領域、及びラット３’エンハンサーのそれぞれは、図１ｂに示す相対位置にある。別の実施形態では、トランスジェニック動物は、図６に記載の核酸配列と実質的に相同な核酸配列を有する。さらに別の実施形態では、トランスジェニック動物は、図７に記載の核酸配列と実質的に相同な核酸配列を有する。
【００２１】
本発明の別の態様では、上記のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することを含む、抗体の産生方法が提供される。一実施形態では、ポリクローナル抗血清組成物が産生され、該抗血清は、異なる染色体部位に位置するトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座によってコードされるＶ遺伝子によってコードされる抗原特異的抗体を含む。別の実施形態では、モノクローナル抗体の産生方法は、（ｉ）上記のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することと、（ｉｉ）該トランスジェニック動物から、該免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を単離することと、（ｉｉｉ）該モノクローナル抗体産生細胞を用いて該免疫原に特異的に結合する該モノクローナル抗体を産生するか、または該モノクローナル抗体産生細胞を用いて該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を産生し、そして該ハイブリドーマ細胞を用いて該モノクローナル抗体を産生することと、を含む。
【００２２】
別の実施形態では、モノクローナル抗体の産生方法は、（ｉ）上記のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することと、（ｉｉ）該トランスジェニック動物から、該免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を単離することと、（ｉｉｉ）該モノクローナル抗体産生細胞から、該免疫原に特異的に結合する該モノクローナル抗体をコードするモノクローナル抗体核酸を単離することと、（ｉｖ）該モノクローナル抗体核酸を用いて該免疫原に特異的に結合する該モノクローナル抗体を産生することと、を含む。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒトイディオタイプを有する。
【００２３】
さらに別の実施形態では、完全ヒトモノクローナル抗体の産生方法は、（ｉ）上記のトランスジェニック動物を免疫原で免疫化することと、（ｉｉ）該トランスジェニック動物から、該免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を単離することと、（ｉｉｉ）該モノクローナル抗体産生細胞から、該免疫原に特異的に結合する該モノクローナル抗体をコードするモノクローナル抗体核酸を単離することと、（ｉｖ）該モノクローナル抗体核酸を改変して、完全ヒトモノクローナル抗体をコードする組換え核酸を産生することと、（ｖ）完全ヒトモノクローナル抗体をコードする該組換え核酸を用いて、該コードされた完全ヒトモノクローナル抗体を産生することと、を含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、上記の方法によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００２５】
さらに別の態様では、身体成分を、抗原性要素に特異的に結合する、かつそれを中和する免疫グロブリン分子を含む上記のポリクローナル抗血清組成物と接触させることを含む、ヒト身体成分中の抗原性要素を中和する方法が提供される。一実施形態では、ヒト身体成分中の抗原性要素の中和方法は、身体成分を、該抗原性要素に特異的に結合し、中和する上記のモノクローナル抗体と接触させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】組み込まれたキメラ（ヒト、ラット）及び完全ヒトＩｇ遺伝子座の概要である。２つのキメラヒト−ラットＩｇＨ領域（ＨＣ１４及びＨＣ３０）は、２２以上の異なるかつ潜在的に機能的なヒトＶＨセグメントを有する各３つの重複するＢＡＣを含む。ＨＣ１４では、ＢＡＣ６−３がＶＨ３−１１で伸長してＢＡＣ３に対して１０．６ｋｂの重複をもたらし、該ＢＡＣ３は、ＶＨ６−１を介してＣ領域ＢＡＣ  Ｈｕ−ラットＡｎｎａｂｅｌと１１．３ｋｂ重複する（Ａ）、そして、ＨＣ３０では、ＢＡＣ９がＢＡＣ１４／５に対して４．６ｋｂの重複をもたらし、該ＢＡＣ１４／５は、ＶＨ３−４３に続いてＢＡＣ５の一部を付加することによって伸長し、Ｈｕ−ラットＡｎｎａｂｅｌに対して６．１ｋｂの重複を備えていた（Ｂ）。後者はキメラであり、完全なエンハンサー配列を有するラットＣ領域が後に続く全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む。矢印は、ＨＣ１４、ＨＣ３０及びＨＣ１４／ＨＣ３０を組み合わせた場合のＶＨ遺伝子の使用を示す。より薄いバンドは、あまり頻繁には発現されないＶＨ遺伝子を示す。配列は、非バイアスＲＴ−ＰＣＲ及びＮＧＳによって得た。
【図１Ｂ】組み込まれたキメラ（ヒト、ラット）及び完全ヒトＩｇ遺伝子座の概要である。２つのキメラヒト−ラットＩｇＨ領域（ＨＣ１４及びＨＣ３０）は、２２以上の異なるかつ潜在的に機能的なヒトＶＨセグメントを有する各３つの重複するＢＡＣを含む。ＨＣ１４では、ＢＡＣ６−３がＶＨ３−１１で伸長してＢＡＣ３に対して１０．６ｋｂの重複をもたらし、該ＢＡＣ３は、ＶＨ６−１を介してＣ領域ＢＡＣ  Ｈｕ−ラットＡｎｎａｂｅｌと１１．３ｋｂ重複する（Ａ）、そして、ＨＣ３０では、ＢＡＣ９がＢＡＣ１４／５に対して４．６ｋｂの重複をもたらし、該ＢＡＣ１４／５は、ＶＨ３−４３に続いてＢＡＣ５の一部を付加することによって伸長し、Ｈｕ−ラットＡｎｎａｂｅｌに対して６．１ｋｂの重複を備えていた（Ｂ）。後者はキメラであり、完全なエンハンサー配列を有するラットＣ領域が後に続く全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む。矢印は、ＨＣ１４、ＨＣ３０及びＨＣ１４／ＨＣ３０を組み合わせた場合のＶＨ遺伝子の使用を示す。より薄いバンドは、あまり頻繁には発現されないＶＨ遺伝子を示す。配列は、非バイアスＲＴ−ＰＣＲ及びＮＧＳによって得た。
【図２】（Ａ）１２のＶｋ及び全てのＪｋを有するヒトＩｇｋ  ＢＡＣは、Ｖｋ領域において約１４ｋｂの重複、及びＣｋにおいて約４０ｋｂの重複をもたらし、ＫＤＥを含む。（Ｂ）１７のＶｌ及び３’エンハンサーを含む全てのＪ−Ｃｌを有するヒトＩｇｌ領域は、ＹＡＣ由来である（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｂｅｒｔ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１６，１８９５−１８９８（２０１０））。
【図３】第６染色体へのＨＣ１４遺伝子座の組み込み及び第１５染色体へのＨＣ３０遺伝子座の組み込みを示す。
【図４】ＨＣ３０及びＨＣ１４／ＨＣ３０動物の血清中のＩｇＭ及びＩｇＧ濃度のＥＬＩＳＡによる分析である。各点（ＨＣ３０）または四角（ＨＣ１４／ＨＣ３０）は１匹の動物の力価（μｇ／ｍｌ）を表す。ＩｇＧをＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂの含有量についてさらに分析する。
【図５】ＨＣ３０及びＨＣ１４／ＨＣ３０由来の抗β−ｇａｌ特異的抗体のＥＬＩＳＡによる分析である。各点（ＨＣ３０）または四角（ＨＣ１４／ＨＣ３０）は、１匹の動物の血清力価（比較希釈）を表す。
【図６−１】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３】ＢＡＣ９配列である。
【図６−４】ＢＡＣ９配列である。
【図６−５】ＢＡＣ９配列である。
【図６−６】ＢＡＣ９配列である。
【図６−７】ＢＡＣ９配列である。
【図６−８】ＢＡＣ９配列である。
【図６−９】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１０】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１１】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１２】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１３】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１４】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１５】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１６】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１７】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１８】ＢＡＣ９配列である。
【図６−１９】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２０】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２１】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２２】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２３】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２４】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２５】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２６】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２７】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２８】ＢＡＣ９配列である。
【図６−２９】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３０】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３１】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３２】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３３】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３４】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３５】ＢＡＣ９配列である。
【図６−３６】ＢＡＣ９配列である。
【図７−１】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−４】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−５】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−６】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−７】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−８】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−９】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１０】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１１】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１２】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１３】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１４】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１５】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１６】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１７】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１８】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−１９】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２０】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２１】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２２】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２３】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２４】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２５】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２６】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２７】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２８】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−２９】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３０】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３１】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３２】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３３】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３４】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３５】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３６】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３７】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３８】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−３９】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−４０】ＢＡＣ１４／５配列である。
【図７−４１】ＢＡＣ１４／５配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
組換えまたは人工免疫グロブリン鎖または遺伝子座をコードするキメラポリヌクレオチドが本明細書において提供される。上述のように、本明細書に開示されるキメラポリヌクレオチドは、ヒトＩｇ遺伝子を含むようにげっ歯類を形質転換する、及びそのようなげっ歯類を使用してヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンまたは抗体を産生するのに有用である。本明細書でさらに提供されるように、トランスジェニック動物のゲノムにタンデムに組み込まれたヒト免疫グロブリンＶＤＪ重鎖遺伝子セグメントの完全相補体を有する少なくとも３つの異なるトランスジーン構築物を含むトランスジェニック動物が作製され、これにより、内在性免疫グロブリン遺伝子または遺伝子座を完全に不活性化する状態での生殖細胞系列構成における完全ヒト免疫グロブリン遺伝子の利用可能性を確かなものにする。意外なことに、本明細書で初めて実証されたように、異なるＶ遺伝子を含む複数のトランスジェニック遺伝子座は、ヒト化トランスジェニック抗体及び完全ヒトトランスジェニック抗体の発現において協調的に作用し得る。
【００２８】
定義
免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄ、または２１４アミノ酸）は、一般的に、ＮＨ２末端に１つ以上の可変領域遺伝子（複数可）及び１つ以上の連結領域遺伝子（複数可）を含むエクソンによってコードされた可変ドメイン（約１１０アミノ酸）、ならびにＣＯＯＨ末端でカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされた定常ドメインを含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄ、または４４６アミノ酸）は、同様に、（１）１つ以上の可変領域遺伝子、１つ以上の多様性領域遺伝子、及び１つ以上の連結領域遺伝子を含むエクソンによってコードされた可変ドメイン（約１１６アミノ酸）、ならびに（２）例えば、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、またはミューなどの１つ以上の定常領域遺伝子を含む前述の定常ドメインのうちの１つ（約３３０アミノ酸をコードする）を含む。免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、抗体クラス、すなわちアイソタイプ（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）をコードする。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つの、及び好ましくは２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン（本明細書ではＶＨと省略）、ならびに少なくとも１つの、及び好ましくは２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン（本明細書ではＶＬと省略）を含むタンパク質を指す。当業者は、免疫鎖の可変ドメインが、可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成するために、まず体細胞組換えを受けなくてはならない遺伝子セグメントにおいてコードされることを認識するであろう。可変ドメインを形成するための再編成を受ける３つの型の領域または遺伝子セグメントは、可変遺伝子を含む可変領域、多様性遺伝子を含む多様性領域（免疫グロブリン重鎖の場合）、及び連結遺伝子を含む連結領域、がある。ＶＨ及びＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域が散在した「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分され得る。ＦＲ及びＣＤＲの程度は、正確に定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７を参照のこと）。各ＶＨ及びＶＬドメインは、一般的に、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。抗体の抗原結合フラグメント（または単に「抗体部分」または「フラグメント」）は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する完全長の抗体の１つ以上のフラグメントを指す（例えば、ＣＤ３）。
【００３０】
抗体の「抗原結合フラグメント」という用語内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結した２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−４６）、及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、それらがＶＬ及びＶＨ領域対が１価の分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来技術を使用して得られ、該フラグメントは、インタクト抗体がされるのと同様に、実用性についてスクリーニングされる。
【００３１】
抗体は、重鎖及び／または軽鎖定常ドメインをさらに含み得、これによりそれぞれ免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を形成する。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互結合される。重鎖定常ドメインは、３つの遺伝子セグメント、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。軽鎖定常ドメインは、１つの遺伝子、ＣＬで構成される。重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常ドメインは、典型的に、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的相補系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する抗体の結合を媒介する。
【００３２】
人工免疫グロブリン遺伝子座または人工免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドは、複数の免疫グロブリン領域を含む組換えポリヌクレオチド、例えば、Ｖ遺伝子を含む可変（Ｖ）領域または遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子を含む連結（Ｊ）遺伝子領域または遺伝子セグメント、重鎖遺伝子座の場合にＤ遺伝子を含む多様性（Ｄ）領域または遺伝子セグメント、及び／または少なくとも１つのＣ遺伝子を含む少なくとも１つの定常（Ｃ）領域を意味する。好ましくは、可変ドメインの各領域、例えば、Ｖ、Ｄ、またはＪ領域は、同一の型の少なくとも２つの遺伝子を含む、またはそれらに及ぶ。例えば、可変領域は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの可変遺伝子、少なくとも２つの連結遺伝子を含む連結領域、及び２つの多様性遺伝子を含む多様性領域を含む。定常領域は、たった１つの定常遺伝子、例えば、κ遺伝子またはλ遺伝子、または複数の遺伝子、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み得る。
【００３３】
「エンハンサー配列」または「エンハンサー」は、本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼ消化及び分解に対する過敏性によって、多くの活性遺伝子の近くで同定されている配列を指す。過敏部位は、プロモーター配列に先行し得、それらの活性の強度は、ＤＮＡ配列と相関した。レポーター遺伝子への連結は、エンハンサー機能が存在する場合に転写の上昇を示した（Ｍｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６，３３１５［２００１］）。ＩｇＨ遺伝子座では、２つの重要な転写または発現レギュレーター、Ｅμ及び３’Ｅが遺伝子座の末端で同定されている（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，１６５［１９９０］）。マウスでは、３’制御領域全体（ｈｓ３ａ、ｈｓ１，２、ｈｓ３ｂ、及びｈｓ４を含む）の除去は、正常な初期Ｂ細胞発達を可能にするが、クラススイッチ組換えを無効にし（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６，１８９５［２０１０］）、体細胞超変異の最適化を妨げる可能性がある（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１，［２０１１］）。最適なアイソタイプ発現を達成する制御機能は、トランスジェニックヒトＩｇＨ遺伝子が使用されている際に特に望ましい。通常ｈｓ１，２エレメントのみを提供する不完全な３’Ｅ領域を有するトランスジーン構築物は、内在性ＩｇＨ遺伝子座をノックアウトした場合であってもトランスジェニックマウスにおいて期待はずれの発現レベルをもたらした。結果として、過去２０年間に産生された構築物から単離されている抗原特異的完全ヒトＩｇＧは、ほんのわずかである（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６［１９９４］；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３，６８９８［１９９９］；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１８，４２１［１９９９］；Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１，［２０１１］）。ラットＩｇＨ遺伝子座では、３’Ｅ領域は、十分に分析されていない。マウス及びラット配列の比較では、ｈｓ４、すなわち、追加の重要な制御配列をさらに下流に有する非常に重要な第４のエレメントの同定ができなかった（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６，２９３０３［２０１１］）。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも部分的に、ラット３’エンハンサーの包含により最適発現を有利にもたらす、これは、この３’エンハンサーを欠くキメラポリヌクレオチドがアイソタイプスイッチングの低下及び低ＩｇＧ発現をもたらすためである。一実施形態では、ラット３’エンハンサーは、配列番号１として記載される配列、またはその一部分を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、第２の配列（例えば、配列番号１、配列番号２など）の一部分、例えば全体より少ない部分を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を有するポリヌクレオチドは、好ましくは第２の配列の生物学的活性を保持する（例えば、３’エンハンサーの生物学的活性を保持して免疫グロブリンの最適な発現及び／またはアイソタイプスイッチングを提供する、再編成してヒト化キメラ重鎖を提供することができる、など）。一実施形態では、配列番号１の一部分を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を含む核酸は、少なくとも８ｋＢ、好ましくは少なくとも１０ｋＢの、配列番号１と実質的に相同な連続核酸を含む。別の実施形態では、配列番号５９または６０の一部分を含むか、またはそれと実質的に相同な配列を含む第２の核酸は、少なくとも８ｋＢ、好ましくは少なくとも１０ｋＢの、配列番号５９または６０と実質的に相同な連続核酸を含む。
【００３５】
「人工Ｉｇ遺伝子座」は、本明細書で使用される場合、非再編成の、部分的に再編成された、または再編成されたポリヌクレオチド（例えば、重鎖の場合にＶ、Ｄ、及び／またはＪ領域、または軽鎖の場合にＶ及び／またはＪ領域、ならびに任意で重鎖及び軽鎖のいずれか、または両方の定常領域を含む配列）を指し得る。人工Ｉｇ遺伝子座は、人工Ｉｇ軽鎖遺伝子座及び人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含む。一実施形態では、本発明の人工免疫グロブリン遺伝子座は機能性であり、再編成及び免疫グロブリン鎖のレパートリーの産生が可能である。好ましい実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの可変ドメインまたはその部分は、天然の構成、すなわちヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然配列、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然配列の縮重形態、及びヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然配列によってコードされたポリペプチドに実質的に同一なポリペプチド配列をコードする合成配列の遺伝子を含む。別の好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトにおいて見られる天然の構成の可変ドメインまたはその部分を含む。例えば、本明細書に開示される人工Ｉｇ重鎖をコードするポリヌクレオチドは、天然の構成に、少なくとも２つのヒトＶ遺伝子、少なくとも２つのＤ遺伝子、少なくとも２つのＪ遺伝子、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００３６】
好ましい実施形態では、人工Ｉｇ遺伝子座は非ヒトＣ領域遺伝子を含み、非ヒトＣ領域を有するキメラ免疫グロブリンを含む免疫グロブリンのレパートリーを作製可能である。一実施形態では、人工Ｉｇ遺伝子座はヒトＣ領域遺伝子を含み、ヒトＣ領域を有する免疫グロブリンを含む免疫グロブリンのレパートリーを作製可能である。一実施形態では、人工Ｉｇ遺伝子座は「人工定常領域遺伝子」を含み、これにより、ヒト及び非ヒト定常領域遺伝子由来のヌクレオチド配列を含む定常領域遺伝子を意味する。例えば、例示的な人工Ｃ定常領域遺伝子は、ヒトＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン、ならびにラットＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする定常領域遺伝子である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、人工Ｉｇ重鎖遺伝子座は、得られる免疫グロブリンが典型的な免疫グロブリン：シャペロン会合を回避することを可能にするＣＨ１または同等の配列を欠く。そのような人工遺伝子座は、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠くために、機能性Ｉｇ軽鎖を発現しないトランスジェニック動物において重鎖のみの抗体の産生をもたらす。そのような人工Ｉｇ重鎖遺伝子座は、本明細書で企図される方法において、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含み、重鎖のみの抗体を産生することができる、トランスジェニック動物を産生するために使用される。あるいは、人工Ｉｇ遺伝子座は、ＣＨ１または同等の領域を破壊し、重鎖のみの抗体の産生をもたらす人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を生成するように、ｉｎ  ｓｉｔｕで操作され得る。軽鎖欠損マウスにおける重鎖のみの抗体産生に関しては、例えば、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ，２０４：３２７１−３２８３，２００７を参照されたい。
【００３８】
「ヒトイディオタイプ」は、免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントによってコードされたヒト抗体上に存在する、ポリペプチド配列を意味する。「ヒトイディオタイプ」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト抗体の天然配列、及び天然ヒト抗体に見られるポリペプチドに実質的に同一な合成配列の両方を含む。「実質的に」は、アミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％であることを意味する。好ましくは、アミノ酸配列同一性の程度は、９０％より大きい、または好ましくは９５％より大きい。
【００３９】
「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」は、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（またはヒトＩｇ遺伝子セグメントによってコードされたポリペプチド配列）の一部、及び非ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列の一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のキメラ免疫グロブリン分子は、非ヒトＦｃ領域または人工Ｆｃ領域、及びヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンである。そのような免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン分子を産生するように操作されている本発明の動物から単離され得る。
【００４０】
「人工Ｆｃ領域」は、人工定常領域遺伝子によってコードされたＦｃ領域を意味する。
【００４１】
「Ｉｇ遺伝子セグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト動物及びヒトの生殖細胞系列内に存在し、再編成されたＩｇ遺伝子を形成するためにＢ細胞内に集められる、Ｉｇ分子の様々な部分をコードするＤＮＡの領域を指す。したがって、Ｉｇ遺伝子セグメントは、本明細書で使用される場合、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、及びＣ遺伝子セグメントを含む。
【００４２】
「ヒトＩｇ遺伝子セグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然配列、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然配列の縮重形態、及びヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然配列によってコードされたポリペプチドに実質的に同一なポリペプチド配列をコードする合成配列のいずれをも含む。「実質的に」は、アミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％であることを意味する。好ましくは、アミノ酸配列同一性の程度は、９０％より大きく、より好ましくは９５％より大きい。
【００４３】
本発明に関するポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、完全にまたは部分的に合成であり得る。本明細書に明記されるヌクレオチド配列への言及は、別段文脈が要求しない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＵがＴに置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【００４４】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は、本明細書で互換的に使用される）の計算は、以下のように実施される。配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップが、最適なアラインメントの第１及び第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方の中に導入され得、非相同配列は比較目的で無視され得る）。好ましい実施形態では、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、及びさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置において、アミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される際、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適な整列のために導入される必要がある、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮する。
【００４５】
２つの配列間の配列の比較、及び配列同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍでオンラインから入手可能）内のＧＡＰプログラム内に組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け及び１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して、決定される。さらに別の好適な実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、６０、７０、または８０のギャップ重み付け、及び１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して、決定される。特に好ましい一連のパラメータ（及び、実践者が、分子が本発明の配列同一性または相同性の限界内にあるかどうかを決定するために、どのパラメータが適用されるべきか不確かである場合に使用されるべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティを有するＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスである。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長さペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定され得る。
【００４６】
人工Ｉｇ遺伝子座
本発明はさらに、人工Ｉｇ遺伝子座、及びヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンを産生することができるトランスジェニック動物作製におけるそれらの使用に関する。各人工Ｉｇ遺伝子座は、少なくとも１つのＶ領域遺伝子セグメント、１つ以上のＪ遺伝子セグメント、重鎖遺伝子座の場合に１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上の定常領域遺伝子を含む、複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。本発明では、Ｖ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、生殖細胞系列または超変異ヒトＶ領域アミノ酸配列をコードする。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプを有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリーを産生する能力を有する。重鎖遺伝子座では、ヒトまたは非ヒト由来Ｄ遺伝子セグメントが人工Ｉｇ遺伝子座に含まれ得る。そのような遺伝子座における遺伝子セグメントは、非再編成の構成（または「生殖細胞系列構成」）において、または部分的にもしくは完全に再編成された構成において、互いに対して並置される。人工Ｉｇ遺伝子座は、対象動物において遺伝子再編成を受ける能力を有し（遺伝子セグメントが完全に再編成されていない場合）、これによりヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンの多様化されたレパートリーを産生する。
【００４７】
プロモーター、エンハンサー、スイッチ領域、組換えシグナル、及び同様物などの制御エレメントは、ヒトまたは非ヒト起源であり得る。該エレメントは、人工遺伝子座を機能的にするために、関係する動物種において作動可能であることが求められる。好適な制御エレメントは、本明細書により詳細に記載される。
【００４８】
一態様では、本発明は、宿主動物において遺伝子再編成を受けることができ、それによりヒトイディオタイプを有する重鎖の多様化されたレパートリーを産生することができる人工重鎖遺伝子座を含むトランスジェニック構築物を提供する。トランスジーンの人工重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを有するＶ領域を含む。好ましくは、Ｖ領域は、少なくとも約５〜１００のヒト重鎖Ｖ（または「ＶＨ」）遺伝子セグメントを含む。好ましい実施形態では、Ｖ領域は、２０を超える、２５を超える、３０を超える、３５を超える、または４０を超えるＶＨ遺伝子セグメントを含む。上述のように、ヒトＶＨセグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの天然配列、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの天然配列の縮重形態、及びヒト重鎖Ｖドメインポリペプチドに実質的に（すなわち、少なくとも約８５％〜９５％）同一のポリペプチド配列をコードする合成配列を包含する。
【００４９】
好ましい実施形態では、人工重鎖遺伝子座は、少なくとも１つの、またはいくつかのラット定常領域遺伝子、例えば、Ｃδ、Ｃμ、及びＣγ（任意のＣγサブクラスを含む）を含む。
【００５０】
別の好適な実施形態では、人工重鎖遺伝子座は、人工定常領域遺伝子を含む。好ましい実施形態では、そのような人工定常領域遺伝子は、ヒトＣＨ１ドメイン及びラットＣＨ２ＣＨ３ドメイン、またはヒトＣＨ１及びラットＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインをコードする。ヒトＣＨ１ドメインを有するハイブリッド重鎖は、完全なヒト軽鎖と効果的に対合する。
【００５１】
好ましい実施形態では、人工Ｉｇ遺伝子座は、ｈｓ１，２、ｈｓ３ａ、ｈｓ３ｂ、及びラットＣアルファと３’ｈｓ３ｂとの間の配列を含む３’エンハンサー配列を含む。
【００５２】
別の好適な実施形態では、人工重鎖遺伝子座は、ＣＨ１ドメインを欠く人工定常領域遺伝子を含む。好ましい実施形態では、そのような人工定常領域遺伝子は、ＣＨ１ドメインを欠くがＣＨ２及びＣＨ３、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインを含む、切断型ＩｇＭ、及び／またはＩｇＧをコードする。ＣＨ１ドメインを欠く重鎖は、Ｉｇ軽鎖と効果的に対合することができず、重鎖のみの抗体を形成する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、宿主動物において遺伝子再編成を受けることができ、それによりヒトイディオタイプを有する軽鎖の多様化されたレパートリーを産生することができる人工軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック構築物を提供する。トランスジーンの人工軽鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを有するＶ領域、例えば少なくとも１つのヒトＶＬ遺伝子及び／または少なくとも１つの再編成されたヒトＶＪセグメントを有するＶ領域を含む。好ましくは、Ｖ領域は、少なくとも約５〜１００のヒト軽鎖Ｖ（または「ＶＬ」）遺伝子セグメントを含む。一貫して、ヒトＶＬセグメントは、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの天然配列、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの天然配列の縮重形態、及びヒト軽鎖Ｖドメインポリペプチドに実質的に（すなわち、少なくとも約８５％〜９５％）同一のポリペプチド配列をコードする合成配列を包含する。一実施形態では、人工軽鎖Ｉｇ遺伝子座は、少なくとも１つのラットＣ遺伝子（例えば、ラットＣλまたはＣκ）を有するＣ領域を有する。
【００５４】
本発明の別の態様は、人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作製する方法に関する。そのような方法は、Ｉｇ遺伝子座またはそのフラグメントを単離することと、それをヒトＶ領域エレメントをコードする配列を含む１つまたはいくつかのＤＮＡフラグメントと結合させることとを伴う。Ｉｇ遺伝子セグメント（複数可）は、対象動物において効果的な遺伝子再編成を受ける遺伝子座の能力を保持するような方法でライゲーションまたは相同組換えによって、人工Ｉｇ遺伝子座またはその一部分に挿入される。
【００５５】
好ましくは、非ヒトＩｇ遺伝子座は、そのゲノムＤＮＡから調製された、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、またはＢＡＣ、及び同様物のライブラリーをスクリーニングすることによって単離される。ＹＡＣクローンは、最大２メガ塩基対のＤＮＡフラグメントを保持することができるため、動物重鎖遺伝子座の全体またはその大部分は、１つのＹＡＣクローン内で単離され得るか、または１つのＹＡＣクローン内に含まれるように再構築され得る。ＢＡＣクローンは、より小さいサイズ（約５０〜５００ｋｂ）のＤＮＡフラグメントを保持することができる。しかしながら、Ｉｇ遺伝子座の重複フラグメントを含む複数のＢＡＣクローンは、別個に改変され得、その後、動物レシピエント細胞内に共に注入され得、該重複フラグメントはレシピエント動物細胞内で再結合して、連続Ｉｇ遺伝子座を生成する。
【００５６】
ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、ＤＮＡフラグメントのライゲーション、または相同組換えによるＤＮＡフラグメントの挿入を含む様々な方法によって、ベクター（例えば、ＢＡＣクローン）のＩｇ遺伝子座内に組み込まれ得る。ヒトＩｇ遺伝子セグメントの組み込みは、ヒトＩｇ遺伝子セグメントが、トランスジーン内の宿主動物配列に作動可能に連結して、機能性ヒト化Ｉｇ遺伝子座、すなわちヒトイディオタイプを有する抗体の多様化されたレパートリーの産生をもたらす遺伝子再編成を可能にするＩｇ遺伝子座を産生するような方法で行われる。相同組換えは、細菌、酵母、及び高頻度の相同組換え事象を有する他の細胞内で実施され得る。操作されたＹＡＣ及びＢＡＣは、該細胞から容易に単離され得、トランスジェニック動物の作製において使用され得る。
【００５７】
人工Ｉｇ遺伝子座を含む、かつヒトイディオタイプを有する抗体を産生することができる、トランスジェニック動物
一態様では、本発明は、ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンを産生することができるトランスジェニック動物、及びそれを作製する方法を提供する。使用されるトランスジェニック動物は、げっ歯類（例えば、ラット、ハムスター、マウス、及びモルモット）から選択される。
【００５８】
本発明におけるヒト化抗体産生のために使用されるトランスジェニック動物は、内在性Ｉｇ遺伝子座における生殖細胞系列突然変異を保持する。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、変異した内在性Ｉｇ重鎖及び／または内在性Ｉｇ軽鎖遺伝子についてホモ接合性である。さらに、これらの動物は、機能性である、かつ該トランスジェニック動物において免疫グロブリン分子のレパートリーを産生することができる、少なくとも２つの人工重鎖遺伝子座Ｉｇ遺伝子座を保持する。本明細書で使用される人工Ｉｇ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを含む。
【００５９】
好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、それぞれが機能性である、かつ該トランスジェニック動物においてヒトイディオタイプを有する抗体を含む免疫グロブリン分子のレパートリーを産生することができる、少なくとも２つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座、及び少なくとも１つの人工Ｉｇ軽鎖遺伝子座を保持する。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒトＣ遺伝子を含む人工遺伝子座が使用され、ヒトイディオタイプ及び非ヒト定常領域を有するキメラ抗体を産生することができる動物が提供される。一実施形態では、少なくとも１つのヒトＣ遺伝子を含む人工遺伝子座が使用され、ヒトイディオタイプ及びヒト定常領域を有する抗体を産生することができる動物が提供される。
【００６０】
別の好適な実施形態では、トランスジェニック動物は、少なくとも２つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を保持し、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠く。そのような動物は、重鎖のみの抗体の産生に用途を見出す。
【００６１】
そのようなトランスジェニック動物の産生は、少なくとも２つの人工重鎖Ｉｇ遺伝子座及び１つ以上の人工軽鎖Ｉｇ遺伝子座を、１つ以上のメガヌクレアーゼの作用によって非活性化されている、またはされるであろう、少なくとも１つの内在性Ｉｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物のゲノムへの組み込みを伴う。好ましくは、トランスジェニック動物は、内在性Ｉｇ重鎖及び／または内在性Ｉｇ軽鎖についてヌル接合性であるため、内在性免疫グロブリンを産生することができない。染色体位置に関わらず、本発明の人工Ｉｇ遺伝子座は遺伝子再編成を受け、それにより免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリーを産生する能力を有する。遺伝子再編成を受ける能力を有するＩｇ遺伝子座はまた、本明細書において「機能性」Ｉｇ遺伝子座として言及され、機能性Ｉｇ遺伝子座によって生成される多様性を有する抗体はまた、本明細書において「機能性」抗体または抗体の「機能性」レパートリーとして言及される。
【００６２】
そのようなトランスジェニック動物を生成するために使用される人工遺伝子座は、それぞれ、少なくとも１つのＶ領域遺伝子セグメント、１つ以上のＪ遺伝子セグメント、重鎖遺伝子座の場合に１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上の定常領域遺伝子を含む、複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。本発明では、Ｖ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、生殖細胞系列または超変異ヒトＶ領域アミノ酸配列をコードする。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプを有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリーを産生する能力を有する。
【００６３】
一実施形態では、使用される人工遺伝子座は、少なくとも１つの非ヒトＣ領域遺伝子セグメントを含む。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプを有するキメラ抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリーを産生する能力を有する。
【００６４】
一実施形態では、使用される人工遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＣ領域遺伝子セグメントを含む。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプ及びヒト定常領域を有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリーを産生する能力を有する。
【００６５】
一実施形態では、使用される人工遺伝子座は、少なくとも１つの人工定常領域遺伝子を含む。例えば、例示的な人工Ｃ定常領域遺伝子は、ヒトＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン、ならびにラットＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする定常領域遺伝子である。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプ、ならびにヒト及び非ヒト成分の両方を含む人工定常領域を有する抗体を含む免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリーを産生する能力を有する。
【００６６】
人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターが、レシピエント細胞（複数可）内に導入され、その後、ランダム組み込みまたはターゲット組み込みによってレシピエント細胞（複数可）のゲノムに組み込まれる。
【００６７】
ランダム組み込みの場合、人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターが、標準トランスジェニック技術によってレシピエント細胞内に導入され得る。例えば、トランスジェニックベクターは、受精卵母細胞の前核に直接注入され得る。トランスジェニックベクターは、卵母細胞の受精前に精子をトランスジェニックベクターと共インキュベーションすることによってもまた導入することができる。トランスジェニック動物は、受精卵母細胞から発達し得る。トランスジェニックベクターを導入するための別の方法は、胚性幹細胞または他の多能性細胞（例えば始原生殖細胞）をトランスフェクトし、その後、遺伝子組換え細胞を発達する胚に注入することによってである。あるいは、トランスジェニックベクター（そのまま、または促進試薬との組み合わせ）は、発達する胚に直接注入され得る。最終的に、キメラトランスジェニック動物が、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの体細胞のゲノム内に組み込まれた人工Ｉｇトランスジーンを含む胚から作製される。別の実施形態では、トランスジェニックベクターが細胞のゲノム内に導入され、動物が核移植クローニングによるトランスフェクト細胞から得られる。
【００６８】
好ましい実施形態では、人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジーンは、レシピエント細胞（受精卵母細胞または発達中の胚など）のゲノム内にランダムに組み込まれる。好ましい実施形態では、内在性Ｉｇ重鎖及び／またはＩｇ軽鎖についてヌル接合性であり、したがって内在性免疫グロブリンを産生することができず、トランスジェニック免疫グロブリンを産生することができる子孫が得られる。
【００６９】
ターゲット組み込みの場合、トランスジェニックベクターが、胚性幹細胞、他の多能性細胞、または既に分化した体細胞などの適切なレシピエント細胞内に導入され得る。その後、トランスジーンが動物ゲノム内に組み込まれている細胞が、標準的な方法によって選択され得る。その後、選択された細胞は、除核された核移植ユニット細胞、例えば卵母細胞または胚性幹細胞（全能性であり、機能性新生仔を形成することができる細胞）と融合され得る。融合は、十分に確立された従来技術にしたがって実施される。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８０：１２５６；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：１１７９を参照されたい。卵母細胞の除核及び核移植はまた、注入ピペットを使用して顕微手術によって実施することもできる。（例えば、Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９４：３６９を参照されたい）。その後、得られた細胞は適切な培地で培養され、トランスジェニック動物を作製するために同調したレシピエントに移入される。あるいは、選択された遺伝子組換え細胞は、その後キメラ動物に発達する、発達する胚内に注入され得る。
【００７０】
一実施形態では、メガヌクレアーゼを使用して、二本鎖ＤＮＡ開裂中の標的部位での相同組換えの頻度を増加させる。特異的部位内への組み込みの場合、部位特異的メガヌクレアーゼが使用され得る。一実施形態では、内在性Ｉｇ遺伝子座を標的化するメガヌクレアーゼを使用して、相同組換えの、及び人工Ｉｇ遺伝子座またはその一部分と内在性Ｉｇ遺伝子座またはその一部分の置換の頻度を増加させる。一実施形態では、トランスジェニック動物は、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含む。
【００７１】
ＹＡＣ及びＢＡＣを用いたヒトＩｇ遺伝子セグメントの組み込み、ならびに両者間での相互交換のための好ましい実施形態は、重複相同性により大きな領域の構築物を作製する際の速度及び完全性を確認する能力の両方の利点を有する。重複領域を有する構築物のタンデム組み込みは、完全な機能性を維持するような組み込み能力を有し、これはＤＮＡの再編成に不可欠である。本発明の好ましい実施形態は、相同性による所望の組み込みを有するだけでなく、頻度の高い事象としてタンデム組み込みをももたらす。これは、幹細胞への大きなＹＡＣの困難な組み込み、及びそれに続く該幹細胞からの動物の誘導を行う必要がないため、実質的にトランスジェニック技術を容易にする。加えて、同様にＤＮＡ注入を介して実施されるＺＦＮ技術（Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４３３（２００９）；Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２９３２−２９４１（２０１０））は、Ｉｇ  ＫＯ系統の産生が容易であり、遺伝子破壊及び置換のために選択される将来の技術となり得る。ヒト−ラットＩｇＨ及びヒトＩｇＬ遺伝子座を含むＯｍｎｉＲａｔ（商標）における内在性Ｉｇ遺伝子発現のサイレンシングは、混合産物に、干渉する、または望ましくないラットＩｇが生じ得ないという利点を有する。
【００７２】
マウスでは、Ｃαの下流のエンハンサー領域は、クラススイッチ組換えにおいて不可欠な役割を果たし（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１６，１８９５−１８９８（２０１０））、その領域内のエレメントは超変異を促進し得る可能性がある（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１））。これは、高頻度の免疫応答及び多様なハイブリドーマの生成が、大きな完全ヒト遺伝子座を保持するマウスにおいてでさえも困難であり得る理由であり得る（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ１８，４２１−４２５（１９９９）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，４５０−４５９（２００８））。キメラヒト−ラットＩｇＨ遺伝子座が、ＯｍｎｉＲａｔにおいて野生型に近い分化及び発現レベルを促進するため、内在性ラットＣ領域、及び実際にはＣαの約３０ｋｂエンハンサー配列３’が、ヒトＶＨ遺伝子を発現及び成熟させるための最適な遺伝子座制御を提供していることが結論付けられ得る。別の領域である、その３’制御モチーフクラスターを有するＣδ（Ｍｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６，３３１５−３３２３（２００１））は、ＩｇＤのサイレンシングまたは欠如が免疫作用を低減するようではなかったため（Ｃｈｅｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２３７，１６０−１７９（２０１０））、キメラＣ領域ＢＡＣから除去されている。通常、成熟ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞は、抗原接触時にＩｇＤを下方制御し、これがクラススイッチ組換えを開始する（Ｉｄ）。したがって、スイッチングは、ＩｇＤ制御なしで増加し得る、これは、Ｃδ領域がトランスジェニック構築物内に保持される際に、ＩｇＧ転写物及び血清レベルが著しく低いという本発明者らの発見によって裏付けられる（データは図示せず）。
【００７３】
本発明者らは、様々な免疫化において、野生型対照において産生されたものに相当する、配列及びエピトープにおける多様性を有するｍＡｂが、脾臓及びリンパ節融合を介して単離され得ることが見出されたため、ＯｍｎｉＲａｔ（商標）における特異的ＩｇＧの産生は特に有望である。Ｖ遺伝子、Ｄ及びＪ多様性は期待された通りであり、ほぼ全てのセグメントが予期された通り生産的に使用されることが判明した（Ｌｅｆｒａｎｃ＆Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆａｃｔｓｂｏｏｋ．ＦａｃｔｓＢｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＧＢ，４５−６８（２００１））。これは、少しの前駆Ｂ細胞からのクローン増殖が多様性をほとんどもたらさなかった完全ヒトトランス遺伝子座を持つマウスに対して著しく対照的であった（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１））。移植されたＶ遺伝子の数は、ヒトにおいて使用されるもののたったの約半分であるため、本発明者らは、ＯｍｎｉＲａｔを野生型動物と比較する際に、制限された免疫応答及び限定された多様性が見出されることを予測した。しかしながら、これはその限りではなく、１０００を超えるクローン（配列は提供され得る）におけるＣＤＲ３多様性の比較により、ＯｍｎｉＲａｔにおいて、野生型動物におけるのと同様に広範な接合差が明らかとなった。少数の同一の遺伝子セグメントの組み合わせは、ＶＨからＤ及び／またはＤからＪＨ接合でのＮ配列の付加または欠失によって、ならびに同様に超変異によって、さらに多様化された。したがって、ラットＣ領域配列は、ヒトＶＨＤＪＨのＤＮＡ再編成及び発現の制御において非常に効率的であることが明らかである。広範な多様性はまた、マウスにおいて既に示されているものに類似して、導入されたヒトＩｇκ及びＩｇλ遺伝子座についても見られた（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３，６８９８−６９０６（１９９９）；Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１）；Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８９，１６１１−１６２０（１９９９））。それゆえ、マウスからのヒト抗体の産生において大幅に低下した効率（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１１１７−１１２５（２００５））は、ＯｍｎｉＲａｔ（商標）において克服されており、これはクラススイッチ及び超変異によって、再編成されたＨ鎖を確実かつ広範に多様化し、高親和性抗体を時折ではなくむしろ大量に産出する。抗原特異的ｍＡｂにおいて印象的に利用される、トランスジェニックＩｇＧの収率及び超変異のレベルは、クローン多様化及び産生レベルがＯｍｎｉＲａｔ（商標）と野生型動物との間で類似することを示した。ナノモル以下の範囲における高親和性特異性の定期的な生成は、異なる単一免疫化によってでさえも達成され、ここでもまた、野生型動物と比較して好適である（もっぱらヒト遺伝子座から���ト抗体レパートリーを産生するトランスジェニックマウスにおいては結果は示されていない）（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，１４６−１５６（１９９７））。
【００７４】
要約すると、ヒト抗体産生を最大化するために、抗体特異性のためにヒト遺伝子を使用するが、分化及び高発現の制御のためにげっ歯類遺伝子を使用するＩｇＨ遺伝子座は、必須であると見なされるべきである。Ｌ鎖の柔軟性は、野生型Ｉｇが存在するときでさえも高効率なヒトＩｇＨ／ＩｇＬのアセンブリを可能にするため、追加の利点となる。治療用途にとって、キメラＨ鎖は、特異性を損なうことなく、Ｃ遺伝子置換によって完全ヒトＡｂに容易に変換され得る。
【００７５】
ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリン
ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンを産生することができるトランスジェニック動物が作製されると、抗原に対する免疫グロブリン及び抗体製剤を、その抗原で動物を免疫化することによって、容易に得ることができる。「ポリクローナル抗血清組成物」は、本明細書で使用される場合、親和性精製ポリクローナル抗体製剤を含む。
【００７６】
様々な抗原が、トランスジェニック動物を免疫化するために使用され得る。そのような抗原は、微生物、例えば、ウイルス及び単細胞生物（細菌及び真菌類など）、生きた、弱毒化した、もしくは死んだ微生物のフラグメント、または微生物から単離された抗原性分子を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
動物の免疫化における使用のために好適な細菌性抗原は、莢膜多糖体５型及び８型などのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからの精製抗原、アルファ毒素などの病原因子の組換え体、接着結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、及びフィブロネクチン結合タンパク質を含む。好適な細菌性抗原はまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの弱毒体、またはこれらの細菌細胞からの培養上清を含む。免疫化において使用され得る他の細菌性抗原は、精製リポ多糖（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖、及び／または外膜タンパク質の組換え体、フィブロネクチン結合タンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの内毒素及び外毒素を含む。
【００７８】
真菌類に対する抗体の生成のための好ましい抗原は、真菌類またはそれらの外膜タンパク質の弱毒体を含み、真菌類にはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含むが、これに限定されない。
【００７９】
ウイルスに対する抗体を生成するための免疫化における使用のための好ましい抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（特にＦタンパク質）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、及びＨＳＶを含むが、これらに限定されない、ウイルスのエンベロープタンパク質及び弱毒体を含む。
【００８０】
がんに特異的な抗体は、単離された腫瘍細胞または腫瘍細胞株、ならびにＨｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（乳癌の治療のために有用な抗体）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及びＣＤ５３抗原（Ｂ細胞リンパ腫の治療のために有用な抗体）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）（前立腺癌の治療のために有用な抗体）、ならびに１７−１Ａ分子（結腸癌の治療のために有用な抗体）を含むが、これに限定されない腫瘍関連抗原でトランスジェニック動物を免疫化することによって生成され得る。
【００８１】
抗原は、アジュバン卜の有無に関わらず、任意の従来の方法でトランスジェニック動物に投与され得、所定の計画にしたがって投与され得る。
【００８２】
モノクローナル抗体を作製するために、脾臓細胞を免疫化トランスジェニック動物から単離し、ハイブリドーマの産生のための形質転換細胞株との細胞融合において使用するか、または抗体をコードするｃＤＮＡを標準的な分子生物学技術によってクローン化してトランスフェクト細胞において発現するかのいずれかである。モノクローナル抗体の作製手順は、当該技術分野において十分に確立されている。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許出願第０  ５８３  ９８０  Ａ１号（「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｂｂｉｔｓ」）、米国特許第４，９７７，０８１号（「Ｓｔａｂｌｅ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、ＷＯ９７／１６５３７（「Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、及び欧州特許第０  ４９１  ０５７  Ｂ１号（「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｗｈｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ａｖｉａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ」）を参照されたい。クローンｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９（２０００）によって、及びＢｕｒｔｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７（１９９５）によって記載されている。
【００８３】
ヒトイディオタイプを有するキメラモノクローナル抗体が生成されると、そのようなキメラ抗体は標準的な分子生物学技術を使用して完全ヒト抗体に容易に変換され得る。完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒトにおいて免疫原性ではなく、ヒト対象の治療的処置における使用のために適切である。
【００８４】
本発明の抗体は、重鎖のみの抗体を含む。
一実施形態では、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、少なくとも２つの人工重鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物を、抗原で免疫化し、抗原に特異的に結合する重鎖のみの抗体を産生する。
【００８５】
一実施形態では、本発明は、そのような動物由来のモノクローナル抗体産生細胞、及びそれから得られる核酸を提供する。それに由来するハイブリドーマもまた提供される。完全ヒト重鎖のみの抗体、及びそれに由来するコーディング核酸もまた、提供される。
【００８６】
重鎖のみの抗体についての教示は、当該技術分野に見出される。例えば、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０２０８５９４４、ＷＯ０２０８５９４５、ＷＯ２００６００８５４８、及びＷＯ２００７０９６７７９を参照されたい。米国特許第５，８４０，５２６号、米国特許第５，８７４，５４１号、米国特許第６，００５，０７９号、米国特許第６，７６５，０８７号、米国特許第５，８００，９８８号、欧州特許第１５８９１０７号、ＷＯ９７３４１０３、及び米国特許第６，０１５，６９５号もまた参照されたい。
【００８７】
薬学的組成物
本発明のさらなる実施形態では、精製モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、薬学的組成物を提供するために、患者への投与に好適な適切な医薬担体と混合される。
【００８８】
本発明の薬学的組成物で治療される患者は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトであるが、獣医学的使用もまた企図される。
【００８９】
本薬学的組成物において用いられ得る、薬学的に許容可能な担体は、任意の及びあらゆる溶媒、分散媒体、等張剤、及び同様物であり得る。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤、または担体が、レシピエントまたはその中に含まれる抗体の治療的有効性にとって有害である場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用は適切である。
【００９０】
担体は、液体、半固体、例えば、ペーストまたは固体担体であり得る。担体の例は、油、水、生理食塩水、アルコール、糖、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリックス、結合剤、充填剤、コーティング剤、防腐剤、及び同様物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００９１】
治療方法
本発明のさらなる態様では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくは霊長類（ヒト対象が特に好適な実施形態である）における疾患を、そのような疾患の治療に望ましい本発明の精製抗体組成物を投与することによって治療するための方法が提供される。
【００９２】
抗体組成物は、ヒト体組織において、疾患を引き起こす、もしくはその要因となる、または不所望もしくは異常な免疫応答を誘発する抗原性要素に結合し、中和または調節するために使用され得る。「抗原性要素」は、本明細書において、少なくとも抗体に結合することができ、好ましくは免疫応答を刺激することもできる、タンパク質を含む任意の可溶性または細胞表面結合分子及び細胞または感染症を引き起こす生物または作用物質を包含するように定義される。
【００９３】
単独療法として、または化学療法との組み合わせでの、感染因子に対する抗体組成物の投与は、感染粒子の除去につながる。抗体の単回投与は、感染粒子の数を一般に１０〜１００倍、より一般的には１０００倍超、減少させる。同様に、単独療法として、または化学療法との組み合わせで用いられる、悪性疾患に罹患した患者における抗体療法は、悪性細胞の数を一般に１０〜１００倍、または１０００倍超、減少させる。治療法は、感染粒子、悪性細胞などの完全な除去を確実にするために長時間反復され得る。いくつかの例では、抗体製剤による治療法は、検出可能な量の感染粒子または不所望の細胞の不存在下で長期間継続され得る。
【００９４】
同様に、免疫応答の調節のための抗体療法の使用は、治療用抗体の単回または複数投与からなり得る。治療法は、任意の疾患症状がない状態で長期間継続され得る。
【００９５】
対象治療は、感染症または悪性腫瘍を抑制するのに十分な用量での化学療法と共に用いられ得る。自己免疫疾患患者または移植レシピエントにおいて、抗体療法は、免疫応答を抑制するのに十分な用量での免疫抑制治療法と共に用いられ得る。
【実施例】
【００９６】
ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座についてトランスジェニックであるマウスでは、完全ヒト抗体の送達における最適ではない効率は、ヒト膜ＩｇＨ鎖の定常領域とマウス細胞シグナル伝達機構との間の不完全な相互作用が原因とされている。この問題を未然に防ぐために、本発明者らは、本明細書において、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座［２２のヒトＶＨ、生殖細胞系列遺伝子スペースを有するがラットＣＨ遺伝子座に連結する全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む］と共に完全ヒト軽鎖遺伝子座［Ｊκ−Ｃκに連結する１２のＶκ及びＪλ−Ｃλに連結する１６のＶλ］を保持するヒト化ラット系統（ＯｍｎｉＲａｔ（商標））について説明する。内在性ラットＩｇ遺伝子座は、デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼによってサイレンシングした。免疫化後、ＯｍｎｉＲａｔは、高親和性血清ＩｇＧの産出において、正常なラットと同程度に効率的に機能する。正常なラットからの従来の抗体の産出と同様に、ナノモル以下の抗原親和性を有する完全ヒト可変領域を含み、広範な体細胞突然変異を保持するモノクローナル抗体を容易に得ることができる。
【００９７】
材料及び方法
ＹＡＣ及びＢＡＣ上での改変ヒトＩｇ遺伝子座の構築
ａ）ＩｇＨ遺伝子座
ヒトＩｇＨ  Ｖ遺伝子は２つのＢＡＣ：ＶＨ４−３９からＶＨ３−２３に続いてＶＨ３−１１まで広がる真正領域を含むＢＡＣ６−ＶＨ３−１１（商業的に入手可能なＢＡＣクローン３０５４Ｍ１７  ＣＩＴＢから改変）及びＶＨ３−１１からＶＨ６−１まで広がる真正領域を含むＢＡＣ３（８１１Ｌ１６  ＲＰＣＩ−１１）によって網羅された。Ａｎｎａｂｅｌと呼ばれるＢＡＣを、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ領域の直下流にラットＣＨ領域遺伝子を連結することによって構築した（図１）。ヒトまたはラットＩｇＨ遺伝子座の部分を含む全てのＢＡＣクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【００９８】
ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及びＡｎｎａｂｅｌの両方を、まずＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）として構築し、さらにＥ．ｃｏｌｉ内でＢＡＣとして確認し維持した。
【００９９】
ＹＡＣとは異なり、ＢＡＣプラスミド調製物は、大量の所望のＤＮＡを産出する。線状ＹＡＣをｃＹＡＣに変換するため、または重複する末端を有するＤＮＡフラグメントをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で単一のｃＹＡＣにアセンブルする（これはＥ．ｃｏｌｉ内でＢＡＣとしてもまた維持され得る）ために、２つの自己複製Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ／Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターである、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡ及びｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを構築した。簡潔には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ４をＡｖｒＩＩフラグメントとしてｐＹＡＣ−ＲＣから切り取り（Ｍａｒｃｈｕｋ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，７７４３（１９８８））、ＳｐｅＩ−線状化ｐＡＰ５９９にライゲーションした（Ｋａｕｒ＆Ｃｏｒｍａｃｋ  ＰＮＡＳ  １０４，７６２８−７６３３（２００７））。得られたプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３とハイグロマイシン耐性発現カセット（ＨｙｇＲ）との間の中でクローン化したＣＥＮ４を含む。このプラスミドから、ＵＲＡ３を含むＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、続いてＣＥＮ４またはＣＥＮ４を含むＰｍｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、続いてＨｙｇＲを切り取り、ＡｐａＬＩ及びＢａｍＨＩ、またはＨｐａＩ及びＳｐｈＩで二重消化されたｐＢＡＣＢｅｌｏ１１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にライゲーションして、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡ及びｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを産出する。
【０１００】
ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１を構築するために、まず２つのフラグメント、１１５ｋｂのＮｏｔＩ−ＰｍｅＩ及び１１０ｋｂのＲｓｒＩＩ−ＳｇｒＡＩを、ＢＡＣクローン３０５４Ｍ１７  ＣＩＴＢから切り取った。前者のフラグメントの３’末端は、後者の５’末端と２２ｋｂ重複する。ＮｏｔＩ−ＰｍｅＩフラグメントを、ｐＹＡＣ−ＲＣからのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ４及びＴＲＰ１／ＡＲＳ１を含むＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  ＹＡＣアームにライゲーションし、ＲｓｒＩＩ−ＳｇｒＡＩフラグメントを、同様にｐＹＡＣ−ＲＣからのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３を含むＳｇｒＡＩ−ＢａｍＨＩ  ＹＡＣアームにライゲーションした。続いて、ライゲーション混合物を、スフェロプラスト形質転換４１を介してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＢ１３８０細胞に形質転換し、ＵＲＡ＋ＴＲＰ＋酵母クローンを選択した。ヒトＶＨ４−３９からＶＨ３−２３までの線状領域を含むＹＡＣ６と呼ばれるクローンを、サザンブロット分析によって確認した。ＹＡＣ６を１０．６ｋｂのＶＨ３−２３フラグメントの３’の付加によってさらに伸長させ、ｃＹＡＣへ変換した。１０．６ｋｂの伸長はヒトＶＨ３−１１を含み、それはまたＢＡＣ３の５’末端で生じる。ＹＡＣ６の改変のために、ｐＢｅｌｏＨＹＧ−ＹＡＣ６＋ＢＡＣ３（５’）を構築した。簡潔には、重複する末端を有する３つのフラグメントを、ＰＣＲによって調製した：１）ＹＡＣ６において、ＶＨ４−３９の上流の配列と一致する５’末端及びＶＨ３−２３の下流と一致する３’末端を有するＨｐａＩ部位に隣接するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＲＰ１−ＡＲＳ１を含む「スタッフ（ｓｔｕｆｆ）」フラグメント（長鎖オリゴ５６１及び５６２、ならびに鋳型としてｐＹＡＣ−ＲＣを使用）、２）上述のように、ＶＨ３−２３の下流の配列と一致する５’末端を有する１０．６ｋｂの伸長フラグメント、及びその３’末端の固有ＡｓｃＩ部位（長鎖オリゴ５７０及び４１２、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用）、３）上述のように、１０．６伸長フラグメントの３’末端と一致する相同末端と下流で連結したＣＥＮ４を有するｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧベクター、及びＶＨ４−３９の上流の配列と一致する末端と上流で連結したＨｙｇＲ（長鎖オリゴ４１４及び５６６、ならびに鋳型としてｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを使用）。続いて、３つのＰＣＲフラグメントを、スフェロプラスト形質転換に関連する相同組換えを介して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＨＹＧＲ及びＴＲＰ＋を付与する小さいｃＹＡＣへとアセンブリし、このｃＹＡＣを、さらにＢＡＣｐＢｅｌｏＨＹＧ−ＹＡＣ６＋ＢＡＣ３（５’）に変換した。最後に、ＨｐａＩ消化ｐＢｅｌｏＨＹＧ−ＹＡＣ６＋ＢＡＣ３（５’）を使用して、ＹＡＣ６を保持する酵母細胞を形質転換し、相同組換えを通して、ＨＹＧＲのみを付与するｃＹＡＣ  ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１を生成した。形質転換を介して（下記を参照）、このｃＹＡＣをＢＡＣとしてＥ．ｃｏｌｉ内に導入した。ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１内のヒトＶＨ遺伝子を、約１８２ｋｂのＡｓｉＳＩ（ＨｙｇＲ内で自然発生）−ＡｓｃＩフラグメントとして切り取り、ＢＡＣ３内のＶＨ遺伝子を約１７３ｋｂのＮｏｔＩフ��グメントとして切り取った（図１上部）。
【０１０１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＥ．ｃｏｌｉの両方において効率的に作用する、ｐＣＡＵと呼ばれる自己複製シャトルベクターを、以前に公開されたｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡに基づいて構築した。（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；１９０：１４８１−１４９０）。簡潔には、ＡＲＳＨ４を、プライマー８７８及び８７９（全てのプライマー配列を以下に列挙する）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅し、ＡｐａＬＩ部位に続いてＡｓｉＳＩ及びＳｅｘＡｌを両端に導入した。フラグメントをＡｐａＬＩ及びＳｅｘＡＩによって消化し、同じ制限酵素によって消化したｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡとライゲートしてｐＣＡＵを得た。このベクターは、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１バックボーン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）中にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ４、ＵＲＡ３及びＡＲＳＨ４を含む。
【０１０２】
ヒト染色体１４に由来する３つのＢＡＣ、ＣＴＤ−２０１１Ａ５（ＢＡＣ９）、ＣＴＤ−３１４８Ｃ６（ＢＡＣ１４）、ＣＴＤ−２５４８Ｂ８（ＢＡＣ５）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから購入した。ＢＡＣ９中のＩｇＨＶ３−７４からＩｇＨＶ１−５８を包含するヒトゲノム領域を１８５ｋｂのＮｏｔＩ−フラグメントとして単離した。ＢＡＣ（１４＋５）は、ＢＡＣ１４及びＢＡＣ５から構築した。２１０ｋｂのＢｓｉｗＩ−フラグメントとして、５’から３’までに：ＢＡＣ９由来のＮｏｔＩフラグメントの３’と重複する４．６ｋｂの配列を含むＢＡＣ１４由来の９０．６ｋｂの領域と、それに続いてＩｇＨＶ５−５１からＩｇＨＶ１−４５を包含する８６ｋｂの領域と、中心に位置するＩｇＨＶ３−４３とＢＡＣ１４及びＢＡＣ５を連結する１．７ｋｂの合成領域と、ＩｇＨＶ３−２１からＩｇＨＶ３−１３を包含するＢＡＣ５由来の１１１．７ｋｂの領域と、Ａｎａｂｅｌの５’（ヒトＩｇ定常領域を保持するＢＡＣ）と重複する６．１ｋｂの領域と、を含むこのＢＡＣの組み合わされたゲノム領域を単離した。
【０１０３】
ＢＡＣ（１４＋５、１４／５とも呼ばれる）は、全て、前述のような酵母内での相同組換えによる環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）の生成及びｃＹＡＣのＢＡＣへの変換を含む３段階で構築された。第１に、ＢＡＣベクター−ｐＣＡＵ＋ＧＡＰ−ＢＡＣ１４，５は、酵母において以下の３つの重複フラグメントをアセンブリすることによって生成された：５’から３’までに：中央に固有のＲｓｒＩＩ部位を有するＢＡＣ１４の所望の領域の５’及び３’末端と重複する１１６ｂｐの配列と、１．６ｋｂのＩｇＨＶ３−４３遺伝子［１．０ｋｂの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び０．２ｋｂの３’ＵＴＲを含む］と、中央に固有のＰｍｅＩ部位を有するＢＡＣ５の所望の領域の５’及び３’末端と重複する１０６ｂｐの配列と、Ａｎａｂｅｌの５’末端と重複する３８ｂｐの配列とを含む１．９ｋｂの合成ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから注文）、プライマー３８３及び３８４を用いたＡｎａｂｅｌの５’に対応する６．１ｋｂのＰＣＲフラグメント、ならびにプライマー１０６６及び１０８８を用いて増幅したｐＣＡＵベクター。第２に、ｐＣＡＵ＋ＧＡＰ−ＢＡＣ１４，５ベクターをＰｍｅＩによって線状化し、ＢＡＣ５から単離された１５４ｋｂのＮｏｔＩ−フラグメントと、酵母株ＡＢ１３８０へと同時形質転換した。得られたＢＡＣ（長さ約１２８ｋｂ）は、ＰｍｅＩ線状化ベクターにおいて露出したＢＡＣ５への相同性末端により媒介される相同組換えを介してＢＡＣベクターに組み込まれたＢＡＣ５の所望の領域を有していた。第３に、第２段階のＢＡＣ５を保持するＢＡＣをＲｓｒＩＩによって線状化し、相同性末端をＢＡＣ１４の所望の領域に露出させ、ＢＡＣ１４から単離された１１４ｋｂのＳｎａＢＩ−フラグメントと同時形質転換してＢＡＣ（１４＋５）を得た。
【０１０４】
ＶＨ重複を有するＣ領域のアセンブリの場合、ｃＹＡＣ／ＢＡＣを得るために、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ領域を最後のＪＨの直下流のラットゲノム配列、続いてラットＣと連結しなければならなかった。これを達成するために、５つの重複する制限及びＰＣＲフラグメント；ヒトＶＨ６−１の６．１ｋｂのフラグメント５’（オリゴ３８３及び３８４、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用）と、ＢＡＣ１（ＲＰ１１６４５Ｅ６）から切り取ったヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ領域を含む約７８ｋｂのＰｖｕＩ−ＰａｃＩフラグメントと、最後のＪＨの直下流のラットゲノム配列でヒトＪＨ６に連結し、ラットμコード配列の一部を含む８．７ｋｂのフラグメント（オリゴ４８８及び３４６、ならびに鋳型としてラットゲノムＤＮＡを使用）と、ＢＡＣ  Ｍ５（ＣＨ２３０−４０８Ｍ５）から切り取った真正ラットμ、δ、及びγ２ｃ領域を含む約５２ｋｂのＮｏｔＩ−ＰｍｅＩフラグメントと、上述のように、ラットγ２ｃ領域の３’末端と一致する相同末端と下流で連結したＵＲＡ３、及びヒトＶＨ６−１の５’領域と一致する末端と上流で連結したＣＥＮ４を有するｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡベクター（長鎖オリゴ３８５及び５５０、ならびに鋳型としてｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡを使用）と、を調製した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での相同組換えを介した正確なアセンブリをＰＣＲによって分析し、正確なクローンからの精製ｃＹＡＣをＥ．ｃｏｌｉ中でＢＡＣに変換した。
【０１０５】
上記のＡｎｎａｂｅｌ部分のアセンブリには、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ、続いて真正ラットμ、δ及びγ２ｃ領域を含有するｃＹＡＣ／ＢＡＣ、ならびにＰＣＲフラグメントを使用した。５つの重複フラグメントは、上述のようにヒトＶＨ６−１の５’末端での６．１ｋｂのフラグメントと、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ、その直後に最後のＪＨの下流にあるラットゲノム配列を含み、そしてラットＣμの一部を含む約８３ｋｂのＳｐｅＩフラグメントと、ラットγ１の５’末端でラットμの３’末端に連結する５．２ｋｂのフラグメント（オリゴ４９０及び５３４、ならびに鋳型としてラットゲノムＤＮＡを使用）と、ＢＡＣ  Ｉ８（ＣＨ２３０−１６２Ｉ０８）から切り取った真正ラットγ１、γ２ｂ、ε、α、及び３’Ｅ  ＩｇＨエンハンサー領域を含む約１１８ｋｂのＮｏｔＩ−ＳｇｒＡＩフラグメントと、上述のようにラット３’Ｅの３’末端と一致する相同末端と下流で連結したＵＲＡ３、及びヒトＶＨ６−１の５’末端と一致する末端と上流で連結したＣＥＮ４を有するｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡベクターと、を含んだ。ＢＡＣ３及びＡｎｎａｂｅｌの両方におけるヒトＶＨ６−１領域間に１０．３ｋｂの重複がある。ＡｎｎａｂｅｌにおいてラットＣＨ領域と共にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３が続くヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨを、単一の約１８３ｋｂのＮｏｔＩ−フラグメントとして切り取ることができる（図１を参照されたい）。
【０１０６】
ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１、ＢＡＣ３、ＢＡＣ９、及びＢＡＣ（１４＋５）、及びＡｎｎａｂｅｌを、それらの真正性について制限分析及び部分配列によって詳しく確認した。
【０１０７】
ｂ）ＩｇＬ遺伝子座
約４１０ｋｂのＹＡＣ上のヒトＩｇλ遺伝子座を、コスミドを含む３ＣλとＶλ  ＹＡＣの組換えアセンブリによって得た（Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １７７，１９５−２０１（１９９６））。再編成及び発現を、完全ヒトＩｇλ  ＹＡＣの１つのコピーを含むＥＳ細胞由来のトランスジェニックマウスにおいて検証した（Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８９，１６１１−１６２０（１９９９））。このＩｇλ  ＹＡＣを、Ｖλ３−２７の領域５’のうちの約１００ｋｂを除去する環状ＹＡＣの生成によって短縮した。ベクターｐＹＡＣ−ＲＣを、ＣｌａＩ及びＢｓｐＥＩで消化して、ＵＲＡ３を除去し、ＨＹＧを含むｐＡＰ５９９からのＣｌａＩ／ＮｇｏＭＩＶフラグメントとライゲーションした。新たなベクター（ｐＹＡＣ−ＲＣ−ＨＹＧ）からの酵母セントロメア及びハイグロマイシンマーカー遺伝子を含む領域のＰＣＲを、Ｖλ３−２７の領域５’に相同な５’末端を有するプライマー（プライマー２７６）及びＹＡＣアーム内のＡＤＥ２マーカー遺伝子内のプライマー（プライマー２７５）で実施した。ＰＣＲフラグメント（３．８ｋｂ）を、高効率酢酸リチウム形質転換法（Ｇｉｅｔｚ＆Ｗｏｏｄｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２６，５３−６６（１９９８））及びＹＰＤプレートを含むハイグロマイシンの選択を使用して、Ｉｇλ  ＹＡＣ内に組み込んだ。ＤＮＡを、クローンから調製し（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ酵母ＤＮＡ精製キット）、以下のオリゴ：２４３＋２７８及びＨｙｇ末端Ｒ＋２３８を使用して、ＰＣＲにより正確な接合について分析した。プラグを作製し（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，３００９−３０１５（２００７））、酵母染色体をＰＦＧＥ（０．８％アガロース（ＰＦＣ）（Ｂｉｏｒａｄ）ゲル［６Ｖ／ｃｍ、１０時間に６０秒及び１０時間に１０秒のパルス時間、８℃）によって除去し、環状酵母人工染色体をアガロースブロック内に捕捉させた（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，９２５−９３９（１９８８））。ブロックを除去し、ＮｒｕＩで消化した。簡潔には、ブロックを、１×の最終濃度で過剰の制限酵素バッファーと共に、１時間氷上でプレインキュベートした。過剰なバッファーを、プラグを覆うのに十分なだけ残して除去し、制限酵素を１００Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、チューブを３７℃で４〜５時間インキュベートした。線状化ＹＡＣがＰＦＧＥによってブロックから溶出し、ゲルから細片として切り取られ、以下に記載するように精製した。
【０１０８】
ヒトＩｇκ遺伝子座のために、３つのＢＡＣ（ＲＰ１１−３４４Ｆ１７、ＲＰ１１−１１３４Ｅ２４、及びＲＰ１１−１５６Ｄ９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択し、これらは５’Ｖκ１−１７から３’ＫＤＥまで３００ｋｂ超の領域を網羅した（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１，１０１７−１０２８（２００１））。消化及び配列分析において、３つの重複フラグメント：Ｖκ１−１７からＶκ３−７まで（約１４ｋｂの重複を有する１５０ｋｂのＮｏｔＩ）、Ｖκ３−７からＣκの３’まで（約４０ｋｂの重複を有する１５８ｋｂのＮｏｔＩ）、及びＣκからＫＤＥの３’まで（４０ｋｂの重複を有する５５ｋｂのＰａｃＩ）を同定した。重複領域は、卵母細胞に共注入される際に、一般的に連結組み込みが好まれ得る（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５，４０５−４１４（１９９６））。
【０１０９】
ゲル分析及びＤＮＡ精製
精製ＹＡＣ及びＢＡＣ  ＤＮＡを、従来の０．７％アガロースゲル上で制限消化及び分離によって分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１））。５０〜２００ｋｂのより大きいフラグメントを、ＰＦＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｃｈｅｆ  Ｍａｐｐｅｒ（商標））によって８０℃で、０．５％のＴＢＥ中の０．８％のＰＦＣアガロースを使用して、１６時間に２〜２０秒のスイッチ時間で、６Ｖ／ｃｍ、１０ｍＡで分離した。精製により、得られるフラグメントの、配列分析から得られた予期されるサイズとの直接比較が可能となった。改変をＰＣＲ及びシーケンシングによって分析した。
【０１１０】
消化後の線状ＹＡＣ、環状ＹＡＣ、及びＢＡＣフラグメントを、Ｅｌｕｔｒａｐ（商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を使用する電気溶出によって、従来通りの０．８％アガロースゲル泳動から、またはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）から切断された切片から精製した（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４，４５−５０（１９９２））。ＤＮＡ濃度は、約１００μｌの量において、通常、数ｎｇ／μｌであった。最大約２００ｋｂのフラグメントについて、ＤＮＡを析出し、マイクロインジェクションバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８、及び１００ｍＭのＮａＣｌ、しかしスペルミン／スペルミジンは含まず）内で所望の濃度に再溶解させた。
【０１１１】
酵母からの環状ＹＡＣの精製を、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸシリカ系アニオン交換樹脂（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。簡潔には、ザイモリアーゼまたはリティカーゼを使用してスフェロプラストを作製し、ペレット化した（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＹＡＣｓ．．ＩＲＬ  Ｏｘｆｏｒｄ，５９−７６（１９９６））。次いで、細胞をアルカリ溶解させ、ＡＸ１００カラムに結合させ、低コピープラスミドに対するＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ法に記載されているように溶出させる。混入した酵母染色体ＤＮＡは、Ｐｌａｍｉｄ−Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて加水分解し、続いてＳｕｒｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて最終の浄化工程を行った。その後、ＤＨ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のアリコートを環状ＹＡＣで形質転換して、ＢＡＣコロニーを得た。マイクロインジェクションのために、挿入ＤＮＡ（１５０〜２００ｋｂ）を、セファロース４Ｂ−ＣＬを伴う濾過段階を使用して、ＢＡＣベクターＤＮＡ（約１０ｋｂ）から分離した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，８５９−８６５（１９９７））。
【０１１２】
ラット及び交配の誘導
組換え免疫グロブリン遺伝子座をコードする精製ＤＮＡを、マイクロインジェクションバッファー内で１０ｍＭのスペルミン及び１０ｍＭのスペミジンと共に再懸濁した。ＤＮＡを、０．５〜３ｎｇ／μｌの様々な濃度で受精卵母細胞に注入した。
【０１１３】
ラット免疫グロブリン遺伝子に特異的なＺＦＮをコードするプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡを、０．５〜１０ｎｇ／μｌの様々な濃度で受精卵母細胞内に注入した。
【０１１４】
マイクロインジェクションを、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ施設で実施した。非近交系ＳＤ／Ｈｓｄ（野生型）系統動物を、国際実験動物管理公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって認証された動物施設内で、承認済動物ケアプロトコルの下、標準的なマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。ラットは１４〜１０時間の明／暗周期で飼料及び水を自由に摂取させながら維持した。非近交系ＳＤ／Ｈｓｄ雄との交配前に、４〜５週齢のＳＤ／Ｈｓｄ雌ラットに、２０〜２５ＩＵのＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、続けて４８時間後に２０〜２５ＩＵのｈＣＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注入した。単細胞期の受精胚を、後続のマイクロインジェクションのために回収した。操作された胚を偽妊娠したＳＤ／Ｈｓｄ雌ラットに移し、分娩させた。
【０１１５】
複数特性のヒトＩｇラット（ラットＪ  ＫＯ、κＫＯ、及びλＫＯと組み合わされるヒトＩｇＨ、Ｉｇκ、及びＩｇλ）、ならびに対照としての野生型を、１０〜１８週齢の時点で分析した。該動物を、特定病原体除去条件下で、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒで交配した。
【０１１６】
別々の遺伝子座に複数の異なるＶＨ領域を導入する手順は、上記の実施例に記載されるように、これらの異なる遺伝子座を別々のトランスジェニックラット（好ましくは欠損ラットＩｇＨ遺伝子座を有する）に挿入することによって実施することができる。これらの別々の遺伝子座を用いて別々のトランスジェニックラット系統を作製し、続いてそれらを交配して、使用した全てのＶＨ領域を組換えプロセスに利用可能にさせ得る二重トランスジェニックラットを得る。これらのラットを両方の遺伝子座についてホモ接合となるように交配すると、組換えに利用可能なＶＨ領域の数が２倍となり得る（１つの遺伝子座が第６染色体上に組み込まれ、１つの遺伝子座が第１５染色体上にある図３の核型を参照されたい）。複数コピーの組み込まれた遺伝子座を持つことは、この数をさらに加えて増加させ得る。
【０１１７】
１つの定常領域アレイと共に複数の異なるＶＨ領域を移入することによって異なる遺伝子座を別々に導入する手順は、非連結及び複数のトランス遺伝子座の組み込みを可能にした。これに続いて交配し、両方の別々に組み込まれた遺伝子座から抗体を発現する動物を作製した。
【０１１８】
軽鎖にも同じ手順を適用した。ある系統の動物はカッパ遺伝子座で作られ、別の系統はラムダ遺伝子座で作られた。この遺伝子座は、異種交配によって動物内で組み合わされる。
【０１１９】
ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ
トランスジェニックラットを、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｄ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、尾または耳クリップＤＮＡからのＰＣＲによって同定した。ＩｇＨ  ＰＣＲについて、１ｋｂ未満のＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を以下の条件下で使用した：９４℃で２分間、３２×（９４℃で３０秒間、５４〜６７℃（プライマー及び特定のアニーリング温度については表１を参照されたい）で３０秒間、７２℃で１分間）、７２℃で２分間。ＩｇＨ  ＰＣＲについて、１ｋｂ超のＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を以下の条件下で使用した：９５℃で２分間、３２×（９５℃で２０秒間、５６〜６２℃、表１）で２０秒間、７０℃で９０秒間）、７０℃で２分間。Ｉｇκ及びＩｇλ  ＰＣＲについては、全て１ｋｂ未満で、７２℃で５０秒間の延長を除いては、上記の条件を使用した。
【０１２０】
ＲＮＡを、ＲｉｂｏＰｕｒｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して血液から抽出し、脾臓、骨髄、またはリンパ節からのＲＮＡの抽出は、ＲＮＡＳｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。オリゴｄＴ及びＰｒｏｍｅｇａ逆転写酵素を４２℃で１時間使用して、ｃＤＮＡを作製した。ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲ反応（オリゴ４２９〜４３０）によって濃度を決定した。
【０１２１】
ラットμＣＨ２またはラットγＣＨ２プライマーを有するＶＨリーダープライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを設定した（表２）。ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘでの増幅は、９４℃で２分間、３４×（９４℃で３０秒間、５５〜６５℃で３０秒間、７２℃で５０〜６０秒間）、７２℃で２分間であった。期待されたサイズのＰＣＲ産物を、ゲルまたはＱｕｉｃｋＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）のいずれかによって精製し、直接シーケンスするか、またはｐＧｅｍＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。
【０１２２】
ヒトＩｇＨ及びＩｇＬの組み込み及び発現を検出するためのＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用されるプライマーの配列は表３に提供される。
【０１２３】
次世代シーケンシングによる免疫化ＯｍｎｉＲａｔ動物における抗体の特性決定
合計６匹のＯｍｎｉＲａｔ２動物をβ−ｇａｌで免疫化し、Ｂ細胞を流入領域リンパ節から単離した。Ｂ細胞をペレット化し、上清を除去した後、全ＲＮＡがリンパ節由来のＢ細胞から調製された。ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを鋳型として用いて、Ｉｇ重鎖再編成遺伝子座の全可変領域（ＶＨ領域）を増幅した。次いで、この増幅産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製し、各動物の完全ＶＨレパートリーをＮＧＳによって決定した。
【０１２４】
生のＮＧＳリードの後処理及び品質管理の後、各動物のＶ遺伝子使用頻度は、各固有のＶＨ配列を生殖細胞系列Ｖ遺伝子参照配列と整列させることによって決定した。特定のＶ遺伝子を使用したＶＨ配列の数をその動物のＶＨ配列の総数で割ったものとして、Ｖ遺伝子の使用率を計算した。
【０１２５】
タンパク質精製
ＩｇＭを、プロトコルに記載される通り、抗ＩｇＭ親和性マトリックス（ＢＡＣ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ＃２８９０．０５）上で精製した。同様に、ヒトＩｇκ及びＩｇλを、プロトコルにしたがって抗Ｌ鎖親和性マトリックス（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ抗Ｉｇκ＃０８３３及び抗Ｉｇλ＃０８４９）上で精製した。
【０１２６】
ラットＩｇＧ精製の場合（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４２，３１４５−３１５０（１９８９））、プロテインＡ及びプロテインＧアガロースを使用した（Ｉｎｎｏｖａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，＃８５１−００２４及び＃８９５−００２４）。血清を樹脂とインキュベートし、０．１Ｍのリン酸ナトリウムをプロテインＧに対してｐＨ７で、プロテインＡに対してｐＨ８で、緩やかな混合下、結合を促進させた。ポリプレップカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を混合物で充填し、ｐＨ７．４のＰＢＳで十分に洗浄した。溶出バッファーはｐＨ２．５の０．１Ｍのクエン酸ナトリウムで、中和バッファーはｐＨ９の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌであった。
【０１２７】
電気泳動を４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実施し、クマシーブリリアントブルーを染色に使用した。ＭＷ標準は、ＨｙｐｅｒＰａｇｅ染色済みタンパク質マーカー（＃ＢＩＯ−３３０６６，Ｂｉｏｌｉｎｅ）であった。
【０１２８】
フローサイトメトリー分析及びＦＩＳＨ
細胞懸濁液を洗浄し、ＰＢＳ−１％  ＢＳＡ−０．１％アジド中５×１０５細胞／１００μｌに調整した。抗Ｂ細胞ＣＤ４５Ｒ（ラットＢ２２０）−ＰＥ−コンジュゲートｍＡｂ（Ｈｉｓ２４，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または抗ＩｇＤ−ＰＥ−コンジュゲートｍＡｂ（ＭＡＲＤ−３，Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に、マウス抗ラットＩｇＭ  ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ（ＭＡＲＭ４，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、異なるＢ細胞サブセットを同定した。ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を分析のために使用した。
【０１２９】
記載されるように、精製したＩｇＨ及びＩｇＬ  Ｃ領域ＢＡＣを使用して、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを固定した血液リンパ球上で実施した。（Ｍｅｉｓｎｅｒ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４５，１３３−１４１（２００８））
【０１３０】
免疫化、細胞融合、及び親和性測定
免疫化を、ＣＦＡ中１２５μｇのＰＧ、ＣＦＡ中１５０μｇのｈＧＨＲ、ＣＦＡ中２００μｇのＴａｕ／ＫＬＨ、ＣＦＡ中１５０μｇのＨＥＬ、ＣＦＡ中１５０μｇのＯＶＡで尾根部で実施し、記載されるように、２２日後に内側腸骨リンパ節細胞をマウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と融合した（Ｋｉｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ２０，１５１−１５６（１９９５））。複数の免疫化のために、タンパク質、１２５μｇのＰＧもしくはＨＥＬ、またはＧＥＲＢＵアジュバント（ｗｗｗ．Ｇｅｒｂｕ．ｃｏｍ）中１００μｇのｈＧＨＲもしくはＣＤ１４を、以下のように腹腔内に投与した：アジュバントなしで０日目、１４日目、２８日目、及び４１日目、続いて４日後にＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞との脾臓細胞融合（Ｍｅｉｓｎｅｒ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４５，１３３−１４１（２００８））。
【０１３１】
記載されるように、抗原が直接固定化された状態で、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００を使用して、表面プラズモン共鳴によって、結合キネティクスを分析した。（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１））。
【０１３２】
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体の検出
ラット血清試料を、抗原コート、抗ＩｇＧまたはＩｇＭレポーターＥＬＩＳＡを使用してＢ−Ｇａｌ  ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体及び抗原力価について分析した。９６ウェルプレートを２〜６℃で一晩Ｂ−Ｇａｌでコーティングし、ＰＢＳカゼインブロッカー／希釈剤１×でブロッキングし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄し、血清とインキュベートし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄し、ヤギ抗ラットＩｇＧ１−ＨＲＰ、ヤギ抗ラットＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ、及びヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＨＲＰの混合物（それぞれ１／５，０００希釈）またはヤギ抗ラットＩｇＭ（１／５，０００希釈）のいずれかとインキュベートし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄し、ＴＭＢ基質溶液と３０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ停止液をウェルに加えた。プレートウェル中の吸光度を４５０ｎｍで測定した。上記以外の場合、インキュベーションは周囲温度で１．５〜２時間であった。
【０１３３】
ラット血清中のＩｇＭ及びＩｇＧ濃度の測定
二重抗体ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイフォーマットを用いてラット血清試料を、総ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２ｂ、及びラットＩｇＭ濃度についても分析した。総ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２ｂ、及びラットＩｇＭ濃度を、各アイソタイプについて個別に作成した標準曲線を使用して算出した。９６ウェルプレートを、それぞれのアイソタイプ特異的捕捉抗体（マウス抗ラットＩｇＧ１、マウス抗ラットＩｇＧ２ｂ、またはヤギ抗ラットＩｇＭのいずれか）で２〜６℃で一晩コーティングし、ＰＢＳカゼインブロッカー／希釈剤１×でブロッキングし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄し、血清とインキュベートし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄し、それぞれの検出抗体（マウス抗ラットＩｇＧまたはヤギ抗ラットＩｇＭのいずれか）とインキュベートし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄し、ＴＭＢ基質溶液と３０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ停止液をウェルに加えた。プレートウェル中の吸光度を４５０ｎｍで測定した。上記以外の場合、インキュベーションは周囲温度で１．５〜２時間であった。
【表１】
2020505037.tif 000003
【表２】
2020505037.tif 000004
【表３−１】
2020505037.tif 000005
【表３−２】
2020505037.tif 000006
【表３−３】
2020505037.tif 000007
【０１３４】
結果
ヒトＩｇＨ及びＩｇＬ遺伝子座
ヒトＩｇ遺伝子座の構築は、ＹＡＣ及びＢＡＣを使用して大きいＤＮＡセグメントをアセンブリするための確立した技術を用いた（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，２６９３−２６９８（１９９２）；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）１１，９１１−９１４（１９９３）；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５，４０５−４１４（１９９６）；Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １７７，１９５−２０１（１９９６）；Ｍｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６，３３１５−３３２３（２００１））。Ｅ．ｃｏｌｉにおける複数のＢＡＣ改変は、スイッチ配列及びエンハンサーなどの反復領域を高頻度で欠失させたため、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内に環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）として重複する末端を有する配列をアセンブリし、その後そのようなｃＹＡＣをＢＡＣに変換するための方法を開発した。ＹＡＣの利点には、それらの大きなサイズ、酵母宿主における相同改変の容易さ、及び配列安定性が挙げられると同時にＥ．ｃｏｌｉ内で増殖するＢＡＣは、容易な調製及び高い収率という利点を提供する。加えて、詳細な制限マッピング及び配列分析は、ＹＡＣにおいてよりもＢＡＣにおいてより良好に達成され得る。
【０１３５】
配列分析及び消化は、対象の遺伝子クラスターを同定し、図１に示すような広領域にわたるＤＮＡ再編成及びスイッチングを安定にするための遺伝子座の完全性及び機能性を確保した。既に示したように、重複領域は、卵母細胞に共注入される際に、一般的に連結組み込みが好まれ得る（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５，４０５−４１４（１９９６））。これにより、１７３ｋｂのＮｏｔＩフラグメントであるＢＡＣ３及び１９３ｋｂのＮｏｔＩフラグメントであるＢＡＣ３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８（Ｈｕ−ラットＡｎｎａｂｅｌ）と、１８２ｋｂのＡｓｉＳＩ−ＡｓｃＩフラグメントであるＢＡＣ６−ＶＨ３−１１の挿入は、ラットゲノムにおける完全機能性トランスジェニックＩｇＨ遺伝子座（ＨＣ１４）の再構成をもたらした。同様に、ＢＡＣ９、ＢＡＣ（１４＋５）及びＢＡＣ３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８の注入は、ラットゲノムにおける完全機能性トランスジェニックＩｇＨ遺伝子座（ＨＣ３０）の再構成をもたらした。
【０１３６】
同様に、ヒトＩｇκ遺伝子座を、相同重複によって組み込んだ。ヒトＩｇλ遺伝子座を、約３００ｋｂのＹＡＣとしてインタクトに単離し、さらにラット染色体内に完全に挿入した。組み込みの成功は転写解析によって確認され、注入された遺伝子座の５’最末端から３’最末端にＶ（Ｄ）Ｊ−Ｃ組換えが示された。複数のコピーはｑＰＣＲ（図示せず）によって同定し、頭部から尾部の組み込みが生じたと考えられる。全ての場合において、単一部位の組み込みを有するトランスジェニック動物を交配によって作製した。
【０１３７】
ホモ接合にする交配
卵母細胞内へのＤＮＡマイクロインジェクションによるトランスジェニックラットの誘導、それらの交配、及び免疫化は、マウスと同等である。しかしながら、遺伝子ノックアウトをもたらすＺＦＮ技術は、近年ようやく報告されてきた（Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４３３（２００９）；Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６，ｅ２１０４５（２０１１））。ＺＦＮ  ＫＯ技術を使用したＪＨ欠失によるラットＩｇＨ遺伝子座のサイレンシングは、説明されており（Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２９３２−２９４１（２０１０））、ラットＩｇＬ遺伝子座のサイレンシング、Ｃκの標的化、及びＪ−Ｃλ遺伝子の欠失を説明する文書は準備中である。本発明者らは、ヒトＩｇ遺伝子座が組み込まれ、及び内在性Ｉｇの産生がサイレンシングされた複数のファウンダーを導出し、選択及び異種交配された完全なトランス遺伝子座を組み込んでＰＣＲ及びＦＩＳＨによって全てを分析した（表４）。いくつかのファウンダーラットは低トランス遺伝子座コピー数を保持し、ＯｍｎｉＲａｔ（商標）におけるラットＣ遺伝子ＢＡＣが、Ｃμ及びＣα産物のｑＰＣＲによって決定されるように、５つのコピー内に完全に組み込まれると考えられる（図示せず）。多くの系列における単一位置挿入のＦＩＳＨによる同定により、ＢＡＣ混合物の拡散または複数の組み込みは稀であり、ホモ接合にする交配の利点が達成されたことを確認した。
【表４】
2020505037.tif 000008
【０１３８】
個々のヒトトランス遺伝子座、ＩｇＨ、Ｉｇκ、及びＩｇλを保持するラットは、Ｉｇ遺伝子座ＫＯラットとホモ接合となる異種交配に成功した。これは、２２の機能性ＶＨを含む４００ｋｂ以上のヒトＶＨ−Ｄ−ＪＨ領域、及び約１１６ｋｂのラットＣ領域を有する高効率な新たな複数特性系列（ＯｍｎｉＲａｔ（商標））を産生した。ＤＮＡ再編成、発現レベル、クラススイッチング、及び超変異は、異なるファウンダー間で非常に類似し、野生型ラットと同等であった。これはおそらく、いくつかのＣを収容する関連するラット定常領域と、３’Ｅ（エンハンサー制御）領域が真正構成になっていることによる。ＨＣ１４重鎖遺伝子座を保持するＯｍｎｉＲａｔ動物を、ＨＣ３０遺伝子座を保持するＯｍｎｉＲａｔ動物と交配させて、ＯｍｎｉＲａｔ２を作製した。ＯｍｎｉＲａｔ２動物は、４３の機能性ＶＨを含む２つの重鎖遺伝子座を含む。
【０１３９】
ノックアウトバックグラウンドにおけるＢ細胞発達
導入されたヒトＩｇ遺伝子座が、正常なＢ細胞発達を再構成することができるかどうかを評価するために、フローサイトメトリー分析を実施した。脾臓及び骨髄リンパ球において特定の分化段階を分析したが（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；１９０：１４８１−１４９０）、既にＪＫＯ／ＪＫＯラットにおけるＢ細胞発達の欠如（Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２９３２−２９４１（２０１０））、ならびにκＫＯ／κＫＯ及びλＫＯ／λＫＯ動物において対応するＩｇＬ発現がないことは示された（データ図示せず）。最も顕著であったのは、骨髄及び脾臓において類似した数のＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）＋リンパ球を有する、野生型動物と比較してＯｍｎｉＲａｔにおいてＢ細胞発達が完全に回復したことであった。ＣＤ４５Ｒ＋Ｂ細胞の大部分におけるＩｇＭ発現は、完全に再構成された免疫系を示した。脾臓細胞のサイズ及び形状分離は、ＯｍｎｉＲａｔ（商標）と野生型動物との間で区別不可能であったため、ヒトイディオタイプとラットＣ領域を発現するトランスジェニックラットにおいて、復元が成功した。さらに、小さなｓＩｇＧ＋リンパ球集団がＯｍｎｉＲａｔ内に存在した（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；１９０：１４８１−１４９０）。
【０１４０】
他のＯｍｎｉＲａｔリンパ球組織の分析は、それらが野生型対照から区別不可能であり、例えば、Ｔ細胞サブセットが完全に保持される（データ図示せず）ことを示し、これはさらに最適な免疫作用が完全に復元されているという見解を裏付ける。
【０１４１】
血清中のＩｇレベル
抗体産生についての明確な情報を獲得するために、本発明者らは、ＨＣ３０及びＨＣ１４／ＨＣ３０動物からの血清Ｉｇの質及び量を比較した（図４）。結果は、２つの重鎖遺伝子座（ＨＣ１４及びＨＣ３０）を有する動物と比較して１つのＩｇ遺伝子座（ＨＣ３０）を有する動物が血清中で同量のＩｇＭ及びＩｇＧを発現することを実証した。
【０１４２】
１つのＨＣ遺伝子座（ＨＣ３０）または２つのＨＣ遺伝子座（ＨＣ１４及びＨＣ３０）を有する免疫化ＯｍｎｉＲａｔ動物の血清のＥＬＩＳＡ分析は、そのような動物において類似した力価の抗β−ｇａｌ  ＩｇＭ及びＩｇＧを明らかにした（図５）。
【０１４３】
多様なヒトＨ鎖及びＬ鎖転写物
機能性内在性Ｉｇ遺伝子座を有するトランスジェニックラットの血液リンパ球または脾臓細胞を使用して、広範な転写分析を実施した。ＣμまたはＣγリバースプライマーに対して前にある特異的ヒトＶＨ群からのＲＴ−ＰＣＲは、ヒトＶＨＤＪＨ使用頻度を示した。Ｌ鎖分析群には、特異的ヒトＶκまたはＶλフォワードプライマーをＣκまたはＣγリバースプライマーと共に使用した。
【０１４４】
加えて、動物のＢ細胞を収集し、ＲＮＡを調製し、逆転写し、得られたｃＤＮＡを鋳型として用いて、Ｉｇ重鎖再編成遺伝子座の全可変領域（ＶＨ領域）を増幅した。次いで、この増幅産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製し、各動物の完全ＶＨレパートリーをＮＧＳによって決定した。生のＮＧＳリードの後処理及び品質管理の後、各動物のＶ遺伝子使用頻度は、各固有のＶＨ配列を生殖細胞系列Ｖ遺伝子参照配列と整列させることによって決定した。特定のＶ遺伝子を使用したＶＨ配列の数をその動物のＶＨ配列の総数で割ったものとして、Ｖ遺伝子の使用率を計算した。ＯｍｎｉＲａｔ２のトランス遺伝子に導入された４３の全ヒトＶ遺伝子のうち、本発明者らは、再編成されたＩｇＧ転写産物において０．１％超のレベルで発現された３３のＶ遺伝子を検出する。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲ  ＶＨ遺伝子発現分析及びＮＧＳレパートリー分析の結果を図１にまとめた。これらの結果は、Ｄセグメント及び全てのＪＨセグメントの多様な使用と組み合わされて機能的であると見なされる全ての組み込まれたヒトＶＨ遺伝子の使用を示した（Ｌｅｆｒａｎｃ＆Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆａｃｔｓｂｏｏｋ．ＦａｃｔｓＢｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＧＢ，４５−６８（２００１））。
【０１４６】
結果は、２つの遺伝子座（ＨＣ１４＋ＨＣ３０）によって提供されるより多くの可変領域の付加がさらに広い抗体レパートリーをもたらすことを明確に実証する。結論として、本発明者らは、潜在的に任意のクラスの抗原特異的高親和性Ａｂが、１つまたは２つのＩｇ重鎖遺伝子座を有するトランスジェニック動物において産生され得ることを実証した。この技術は、ヒトにおける治療薬または診断薬としての使用のための抗原投与に応答して、任意のクラスの完全ヒトＡｂまたはそのフラグメントの産生を可能にするであろう。異なる遺伝子座を使用することによって、本発明者らの技術はまた試薬、診断薬としての使用、またはヒトの処置のための使用のためにげっ歯類から高親和性成熟抗体の産生を可能にする。
【０１４７】
考察
新規なＩｇＨ遺伝子座を組み立てるためのヒト及びラット遺伝子の組み合わせは、ヒトイディオタイプを有する抗体の、非常に効率的な正常に近い発現をもたらした。さらに、ヒトＩｇκ及びＩｇγ遺伝子座の組み込みは、完全ヒト特異性を有するキメラＩｇが容易に産生されること、ならびにヒトＬ鎖とラットＣ領域の会合が有害ではないことを明らかにした。ラットＩｇＨ遺伝子座の一部を使用することの利点は、本質的には多様なヒトＶＨＤＪＨ領域のみが移植されて、種特異的Ｃ領域及びエンハンサー制御エレメントがそれらの天然の構成で保持されることである。さらに、ラットＦｃ領域を有する抗体の発現は、正常Ｂ細胞受容体のアセンブリ、及び非常に効率的な免疫応答の開始のために必須である下流シグナル伝達経路の最適な活性化を可能にする。特に、抗原投与に対する免疫応答の質は、多くの受容体関連シグナル伝達及び改変構成成分の結合作用に依存する（ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍ／ｐａｔｈｆｉｌｅｓ／ｈ  ｂｃｒｐａｔｈｗａｙ．ａｓｐを参照されたい）。
【０１４８】
ＹＡＣ及びＢＡＣ、ならびに両者間での相互交換を使用するアプローチは、重複相同性により大きな領域の構築物を作製する際の速度及び完全性を確認する能力の両方の利点を有する。いくつかのファウンダーラットは低トランス遺伝子座コピー数を保持し、ＯｍｎｉＲａｔにおけるラットＣ遺伝子ＢＡＣが、Ｃμ及びＣα産物のｑＰＣＲによって決定されるように、５つのコピー内に完全に組み込まれると考えられる（図示せず）。多くの系列における単一位置挿入のＦＩＳＨによる同定により、ＢＡＣ混合物の拡散または複数の組み込みは稀であり、ホモ接合にする交配の利点が達成されたことを確認した。ＤＮＡ再編成のために必須である完全機能性を維持するように広範な重複領域が組み込まれ得るのかどうかについては、ほとんど知られていなかった。従来は、重複する組み込みは報告されていたが、はるかにより小さな領域（１００ｋｂ未満）についてであり（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５，４０５−４１４（１９９６）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２１，１３２３−１３２６（１９９１））、本発明者らの結果は、相同性による、またはタンデムでの所望の組み込みが頻繁な事象であることを示す。これは、幹細胞への大きなＹＡＣの困難な組み込み、及びそれに続く該幹細胞からの動物の誘導を行う必要がないため、実質的にトランスジェニック技術を容易にする。（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，１４６−１５６（１９９７）；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１，９１１−９１４（１９９３））に加えて、同様にＤＮＡ注入を介して実施されるＺＦＮ技術（Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４３３（２００９）；Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２９３２−２９４１（２０１０））は、容易にＩｇ  ＫＯ系統を産生し、遺伝子破壊及び置換のために選択される将来の技術となり得る。ヒト−ラットＩｇＨ及びヒトＩｇＬ遺伝子座を含むＯｍｎｉＲａｔにおける内在性Ｉｇ遺伝子発現のサイレンシングは、混合産物に、干渉する、または望ましくないラットＩｇが生じ得ないという利点を有する。興味深いことに、依然として野生型Ｉｇを産生するＯｍｎｉＲａｔにおける免疫化及びハイブリドーマ生成は、不完全なＩｇ  ＫＯにも関わらず、多くの産物が完全ヒト、ヒト−ラットＩｇＨ及びヒトＩｇＬであることを明らかにした。この場合、多数の野生型Ｖ遺伝子にも関わらず、導入されたヒト遺伝子が容易に増幅し、これにより効率的な発現競合因子となることが示されたことは注目に値した。これは、内在性遺伝子座と好ましくは競合する全ての本発明者らの組み込まれたトランスジーンの一般的に良好な発現レベルについての見解と一致する。従来は、ヒト抗体レパートリーを発現するマウスでは、野生型Ｉｇが放出された際にヒト産物の発現がほとんど見られなかったため、Ｉｇ  ＫＯは必須であった（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８６，６７０９−６７１３（１９８９）；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉ��ｓ  １５，１４６−１５６（１９９７））。
【０１４９】
系統特異的シス作用配列が高レベル発現に必要とされるため、Ｉｇ  ＫＯマウス内でさえ、完全ヒトＩｇ遺伝子座の産生が最適ではない可能性がある。マウスでは、Ｃαの下流のエンハンサー領域は、クラススイッチ組換えにおいて不可欠な役割を果たし（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１６，１８９５−１８９８（２０１０））その領域内のエレメントは超変異を促進し得る可能性がある（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１））。これは、高頻度の免疫応答及び多様なハイブリドーマの生成が、マウスにおいて、さらに大きな完全ヒト遺伝子座を保持することが困難であり得る理由であり得る（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ１８，４２１−４２５（１９９９）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，４５０−４５９（２００８））。キメラヒト−ラットＩｇＨ遺伝子座が、ＯｍｎｉＲａｔにおいて野生型に近い分化及び発現レベルを促進するため、内在性ラットＣ領域、及び実際には３０ｋｂのＣαのエンハンサー配列の３’が、ヒトＶＨ遺伝子を発現及び成熟させるための最適な遺伝子座制御を提供していることが結論付けられ得る。別の領域である、その３’制御モチーフクラスターを有するＣδ（Ｍｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６，３３１５−３３２３（２００１））は、ＩｇＤのサイレンシングまたは欠如が免疫機能を低減するようではなかったため、キメラＣ領域ＢＡＣから除去されている３７。通常、成熟ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞は、抗原接触時にＩｇＤを下方制御し、これがクラススイッチ組換えを開始する（Ｃｈｅｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２３７，１６０−１７９（２０１０））。したがって、スイッチングは、ＩｇＤ制御なしで増加し得、これは、Ｃδ領域がトランスジェニック構築物内に保持される際に、ＩｇＧ転写物及び血清レベルが著しく低いという本発明者らの発見によって裏付けられる（データは図示せず）。
【０１５０】
本発明者らは、様々な免疫化において、野生型対照において産生されたものに相当する、配列及びエピトープにおける多様性を有するｍＡｂが、脾臓及びリンパ節融合を介して単離され得ることを見出したため、ＯｍｎｉＲａｔにおける特異的ＩｇＧの産生は特に有望である。Ｖ遺伝子、Ｄ及びＪ多様性は期待された通りであり、ほぼ全てのセグメントが予期された通り生産的に使用されることが判明した（Ｌｅｆｒａｎｃ＆Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆａｃｔｓｂｏｏｋ．ＦａｃｔｓＢｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＧＢ，４５−６８（２００１））。これは、少しの前駆Ｂ細胞からのクローン増殖が多様性をほとんどもたらさなかった完全ヒトトランス遺伝子座を持つマウスに対して著しく対照的であった（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１））。移植されたＶ遺伝子の数は、ヒトにおいて使用されるもののたったの約半分であるため、本発明者らは、ＯｍｎｉＲａｔを野生型動物と比較する際に、制限された免疫応答及び限定された多様性が見出されることを予測した。しかしながら、これはその限りではなく、１０００を超えるクローンにおけるＣＤＲ３多様性の比較により、ＯｍｎｉＲａｔにおいて、野生型動物におけるのと同様に広範な接合差が明らかとなった。少数の同一の遺伝子セグメントの組み合わせは、ＶＨからＤ及び／またはＤからＪＨ接合でのＮ配列の付加または欠失によって、ならびに同様に超変異によって、さらに多様化された。したがって、ラットＣ領域配列は、ヒトＶＨＤＪＨのＤＮＡ再編成及び発現を制御することにおいて非常に効率的であることが明らかである。広範な多様性はまた、マウスにおいて既に示されているものに類似して、導入されたヒトＩｇκ及びＩｇλ遺伝子座について見られた（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３，６８９８−６９０６（１９９９）；Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ  ２４，７９１−７９９（２０１１）；Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８９，１６１１−１６２０（１９９９））。それゆえ、マウスからのヒト抗体の産生において大幅に低下した効率（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１１１７−１１２５（２００５））は、ＯｍｎｉＲａｔにおいて克服されており、これはクラススイッチ及び超変異によって、再編成されたＨ鎖を確実かつ広範に多様化し、高親和性抗体を時折ではなくむしろ大量に産出する。抗原特異的ｍＡｂにおいて印象的に利用される、トランスジェニックＩｇＧの収率及び超変異のレベルは、クローン多様化及び産生レベルがＯｍｎｉＲａｔと野生型動物との間で類似することを示した。ナノモル以下の範囲における高親和性特異性の定期的な生成は、異なる単一免疫化によってでさえも達成され、ここでもまた、野生型動物と比較して好適である（もっぱらヒト遺伝子座からヒト抗体レパートリーを産生するトランスジェニッ��マウスにおいては結果は示されていない）。（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，１４６−１５６（１９９７））
【０１５１】
要約すると、ヒト抗体産生を最大化するためには、抗体特異性のためにヒト遺伝子を使用するが、分化及び高発現の制御のためにげっ歯類遺伝子を使用するＩｇＨ遺伝子座は、必須であると見なされるべきである。Ｌ鎖の柔軟性は、それが野生型Ｉｇが存在するときでさえも高効率なヒトＩｇＨ／ＩｇＬアセンブリを可能にするため、追加の利点である。治療用途にとって、キメラＨ鎖は、特異性を損なうことなく、Ｃ遺伝子置換によって完全ヒトＡｂに容易に変換され得る。
【０１５２】
本明細書で言及される全ての特許及び特許公報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
前述の説明を読むと、当業者には特定の修正及び改良が思い浮かぶであろう。簡潔さ及び可読性のために、そのような全ての修正形態及び改良が本明細書で削除されているが、適切に以下の特許請求の範囲内にあることを理解されたい。
【図１Ａ】
2020505037.tif 000009
【図１Ｂ】
2020505037.tif 000010
【図２】
2020505037.tif 000011
【図３】
2020505037.tif 000012
【図４】
2020505037.tif 000013
【図５】
2020505037.tif 000014
【図６−１】
2020505037.tif 000015
【図６−２】
2020505037.tif 000016
【図６−３】
2020505037.tif 000017
【図６−４】
2020505037.tif 000018
【図６−５】
2020505037.tif 000019
【図６−６】
2020505037.tif 000020
【図６−７】
2020505037.tif 000021
【図６−８】
2020505037.tif 000022
【図６−９】
2020505037.tif 000023
【図６−１０】
2020505037.tif 000024
【図６−１１】
2020505037.tif 000025
【図６−１２】
2020505037.tif 000026
【図６−１３】
2020505037.tif 000027
【図６−１４】
2020505037.tif 000028
【図６−１５】
2020505037.tif 000029
【図６−１６】
2020505037.tif 000030
【図６−１７】
2020505037.tif 000031
【図６−１８】
2020505037.tif 000032
【図６−１９】
2020505037.tif 000033
【図６−２０】
2020505037.tif 000034
【図６−２１】
2020505037.tif 000035
【図６−２２】
2020505037.tif 000036
【図６−２３】
2020505037.tif 000037
【図６−２４】
2020505037.tif 000038
【図６−２５】
2020505037.tif 000039
【図６−２６】
2020505037.tif 000040
【図６−２７】
2020505037.tif 000041
【図６−２８】
2020505037.tif 000042
【図６−２９】
2020505037.tif 000043
【図６−３０】
2020505037.tif 000044
【図６−３１】
2020505037.tif 000045
【図６−３２】
2020505037.tif 000046
【図６−３３】
2020505037.tif 000047
【図６−３４】
2020505037.tif 000048
【図６−３５】
2020505037.tif 000049
【図６−３６】
2020505037.tif 000050
【図７−１】
2020505037.tif 000051
【図７−２】
2020505037.tif 000052
【図７−３】
2020505037.tif 000053
【図７−４】
2020505037.tif 000054
【図７−５】
2020505037.tif 000055
【図７−６】
2020505037.tif 000056
【図７−７】
2020505037.tif 000057
【図７−８】
2020505037.tif 000058
【図７−９】
2020505037.tif 000059
【図７−１０】
2020505037.tif 000060
【図７−１１】
2020505037.tif 000061
【図７−１２】
2020505037.tif 000062
【図７−１３】
2020505037.tif 000063
【図７−１４】
2020505037.tif 000064
【図７−１５】
2020505037.tif 000065
【図７−１６】
2020505037.tif 000066
【図７−１７】
2020505037.tif 000067
【図７−１８】
2020505037.tif 000068
【図７−１９】
2020505037.tif 000069
【図７−２０】
2020505037.tif 000070
【図７−２１】
2020505037.tif 000071
【図７−２２】
2020505037.tif 000072
【図７−２３】
2020505037.tif 000073
【図７−２４】
2020505037.tif 000074
【図７−２５】
2020505037.tif 000075
【図７−２６】
2020505037.tif 000076
【図７−２７】
2020505037.tif 000077
【図７−２８】
2020505037.tif 000078
【図７−２９】
2020505037.tif 000079
【図７−３０】
2020505037.tif 000080
【図７−３１】
2020505037.tif 000081
【図７−３２】
2020505037.tif 000082
【図７−３３】
2020505037.tif 000083
【図７−３４】
2020505037.tif 000084
【図７−３５】
2020505037.tif 000085
【図７−３６】
2020505037.tif 000086
【図７−３７】
2020505037.tif 000087
【図７−３８】
2020505037.tif 000088
【図７−３９】
2020505037.tif 000089
【図７−４０】
2020505037.tif 000090
【図７−４１】
2020505037.tif 000091
【配列表】
2020505037000001.app
【国際調査報告】
2020505037.tif 000092
2020505037.tif 000093
2020505037.tif 000094