(57)【要約】脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的血液網膜関門（BRB）を製造するための方法が開示されている。本方法はバイオプリントの使用を含む。三次元工学的BRBおよびその使用も開示されている。例えば、対象における網膜変性の処置のため、またはスクリーニングのために、該三次元工学的BRBを使用する方法も開示されている。プリント用フレーム内にしっかりと保持されかつ該プリント用フレームを通じて露出している培養基材シート上にバイオプリントするのに適合した三次元プリント用インサートも開示されている。2020504625.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 内皮細胞を含むヒドロゲルが生体適合性スキャホールドの第1の表面に付着するように、該ヒドロゲルと第1の培地とを含む第1のバイオインクを、互いに反対側にある第1の表面および第2の表面を含む該生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 該内皮細胞が血管を形成することができるように、該生体適合性スキャホールドの該第1の表面上に堆積した該第1のバイオインクを、第2の培地中で少なくとも4日間成熟させる工程；
c. 該生体適合性スキャホールドが該内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、該生体適合性スキャホールドの該第2の表面上に単一細胞層を形成するために第3の培地中に該網膜色素上皮細胞を堆積させる工程；ならびに
d. 堆積した該網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、該生体適合性スキャホールド上において該網膜色素上皮細胞を該第3の培地中で培養する工程
を含み、
それによって、該第1の表面上に人工脈絡膜を有しかつ該第2の表面上に人工網膜色素上皮を有する三次元工学的（three-dimensional engineered）血液網膜関門（BRB）を形成する、
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む該三次元工学的BRBを製造する方法。
【請求項２】
前記生体適合性スキャホールドが、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記生体適合性スキャホールドがポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記生体適合性スキャホールドが、架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、前記第1のバイオインクを堆積させる工程の前に酸素プラズマで処理される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、前記第1のバイオインクを堆積させる工程の前に1日未満の間、前記酸素プラズマで処理される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記第1のバイオインクが線維芽細胞および／または周皮細胞をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞、および1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：2：0.5の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記第1のバイオインクがバイオプリントにより堆積され、該バイオプリントが、前記生体適合性スキャホールド上への該バイオインクの押し出しを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第1のバイオインク中の前記ヒドロゲルが、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第1のバイオインク中の前記ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第1の培地および前記第2の培地が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、アンギオポエチン1、IGF、EGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン、およびアプロチニンを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1の培地が、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体適合性マトリクスの前記第2の表面上に前記網膜色素上皮細胞を堆積させる前に、該生体適合性マトリクスの該第2の表面を細胞外マトリクスでコーティングする工程をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、および／もしくはフィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記網膜色素上皮細胞を堆積させる工程が、網膜色素上皮細胞の懸濁物を前記生体適合性マトリクスの前記第2の表面に添加することを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および／または前記周皮細胞が、誘導多能性幹細胞から生成されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
単層が形成されるまで前記網膜色素細胞が前記第3の培地中で培養される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第1のバイオインクを前記生体適合性スキャホールドの前記第1の表面上にバイオプリントしてから5日後またはそれ以降に、前記網膜色素上皮細胞が該生体適合性マトリクスの前記第2の表面上に堆積される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体適合性マトリクスの表面1センチメートルあたり100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞を堆積させる工程を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記網膜色素上皮細胞を堆積させる工程が、網膜色素上皮細胞と前記第3の培地とを含む第2のバイオインクを堆積させることを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第2のバイオインクがヒドロゲルを含み、かつ該第2のバイオインク中の該ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、またはゼラチンメタクリロイルヒドロゲルを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記内皮細胞および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、前記周皮細胞、および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、請求項7〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記脈絡膜を網膜色素上皮細胞と共に対象の眼に移植する工程をさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が急性黄斑変性を有する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法によって製造された、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的BRBを、試験作用物質と接触させる工程、ならびに
網膜色素上皮細胞を伴う該脈絡膜内の細胞の表現型を評価し、かつ／または網膜色素上皮細胞を伴う該脈絡膜の三次元構造を評価する工程
を含む、試験作用物質の効果を判定する方法であって、
該細胞の表現型の変化または三次元構造の変化によって、該作用物質が効果を有することが示される、方法。
【請求項３０】
a. 内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞が生体適合性の酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）PDGLAスキャホールドの第1の表面に付着するように、コラーゲンヒドロゲル中およびフィブリノゲンヒドロゲル中の該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞と、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含む第1の培地とを含む第1のバイオインクを、該生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 該内皮細胞が血管を形成することができるように、堆積させた該第1のバイオインクを、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、ならびにアンギオポエチン-1およびアプロチニンの有効量を含む第2の培地中で少なくとも4日間、トロンビンの非存在下で成熟させる工程；
c. 該生体適合性スキャホールドが該内皮細胞と該網膜色素上皮細胞の間に存在するように、該生体適合性スキャホールドの第2の表面上に層を形成するために第3の培地中に網膜色素上皮細胞を堆積させる工程であって、該生体適合性スキャホールドの該第1の表面および該第2の表面が互いに反対側にある表面であり、かつ該第2の表面がビトロネクチンでコーティングされ、かつ該第3の培地がタウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む、工程；
d. 堆積した該網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む該第3の培地中で、堆積した該網膜色素上皮細胞を培養する工程；ならびに
e. 有効量の血管内皮成長因子を含む第4の培地中で、該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞を培養する工程であって、該第4の培地がトロンビンおよびアンギオポエチン-1を含まない、工程；
f. 有効量の血管内皮細胞を任意で含む第5の培地中で、該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞を培養する工程であって、該第5の培地がトロンビン、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含まない、工程；ならびに
g. 該第3の培地に添加された有効量のプロスタグランジンE2を含む第6の培地中で、該網膜色素上皮細胞を培養する工程
を含み、
それによって三次元工学的血液網膜関門（BRB）を形成する、
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む該三次元工学的BRBを製造する方法。
【請求項３１】
三次元工学的外側血液網膜関門
を含み、
該三次元工学的外側血液網膜関門が、
第1のバイオインクを含む脈絡膜を含み、該第1のバイオインクが複数の内皮細胞を含む、第1の層；ならびに
複数の網膜色素上皮細胞を含み、該第1の層および第2の層が該三次元工学的外側血液網膜関門を形成する、該第2の層
を含む、
三次元工学的眼組織モデル。
【請求項３２】
生体適合性スキャホールドをさらに含み、該生体適合性スキャホールドが前記第1の層と前記第2の層の間に存在する、請求項31に記載の眼組織モデル。
【請求項３３】
前記生体適合性スキャホールドが、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項32に記載の眼組織モデル。
【請求項３４】
前記生体適合性スキャホールドがポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む、請求項32に記載の眼組織モデル。
【請求項３５】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である、請求項34に記載の眼組織モデル。
【請求項３６】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である、請求項44または45に記載の眼組織モデル。
【請求項３７】
前記第1のバイオインクが複数の線維芽細胞をさらに含む、請求項31〜36のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３８】
前記第1のバイオインクが複数の周皮細胞をさらに含む、請求項31〜37のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３９】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞を含む、請求項31、37、または38のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４０】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞を含む、請求項37〜39のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４１】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む、請求項38〜40のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４２】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項38〜41のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４３】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：2：0.5の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項38〜41のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４４】
前記第1のバイオインクがヒドロゲルをさらに含む、請求項31〜43のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４５】
前記ヒドロゲルが、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む、請求項44に記載の眼組織モデル。
【請求項４６】
前記ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項44に記載の眼組織モデル。
【請求項４７】
前記バイオインクが第1の培地をさらに含む、請求項31〜46のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４８】
前記第1の層および／または前記第2の層が前記第1の培地中で培養される、請求項31〜46のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４９】
前記第1の培地が、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項47または48に記載の眼組織モデル。
【請求項５０】
前記第1の培地が、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む、請求項49に記載の眼組織モデル。
【請求項５１】
前記第1の層および／または前記第2の層が第2の培地中で培養される、請求項31〜50のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５２】
前記第2の培地が、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、およびアンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項51に記載の眼組織モデル。
【請求項５３】
前記第1の層および／または前記第2の層が第3の培地中で培養される、請求項31〜51のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５４】
前記第3の培地が、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清、またはそれらの組み合わせを含む、請求項53に記載の眼組織モデル。
【請求項５５】
前記生体適合性スキャホールドが、該生体適合性スキャホールドの表面をコーティングしている細胞外マトリクスをさらに含む、請求項32〜54のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５６】
前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項55に記載の眼組織モデル。
【請求項５７】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が、誘導多能性幹細胞から生成されている、請求項31〜56のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５８】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が有病細胞である、請求項31〜57のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５９】
前記生体適合性スキャホールドの表面1センチメートルあたり約100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞を含む、請求項32〜58のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６０】
前記第1の層がバイオプリントによって堆積される、請求項31〜59のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６１】
前記バイオプリントが、前記生体適合性スキャホールドの第1の表面上への前記第1のバイオインクの押し出しを含む、請求項60に記載の眼組織モデル。
【請求項６２】
前記内皮細胞および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、請求項31〜61のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６３】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、前記周皮細胞、および／または前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、請求項37〜62のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６４】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が、有病ヒトドナー由来の有病細胞である、請求項31〜63のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６５】
神経支配されていない、請求項31〜64のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６６】
ヒト対象の眼への移植に使用するための、請求項31〜65のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６７】
創薬、薬物試験、前臨床研究、毒性試験、吸収、分布、代謝、および排出試験（ADME）、薬物代謝および薬理試験（DMPK）、疾患モデリング、感染病モデリング、宿主疾患モデル、三次元生物学研究、細胞ベースのスクリーニング、遺伝子療法試験、ならびに／またはバイオマーカー発見の1つまたは複数に使用するための、請求項31〜66のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６８】
使用時に前記生体適合性スキャホールドを実質的に含まない、請求項66または67に記載の眼組織モデル。
【請求項６９】
培養チャンバーにちょうど収まるよう、かつ露出しているプリント用フレーム内でプリント用基材を提示するための該プリント用フレームを形成するように適合されたインサート
を含む、
スキャホールドにバイオプリントするためおよび既定の幅を有する該培養チャンバーの壁に対して該スキャホールドを挿入するためのバイオプリント用インサート。
【請求項７０】
前記インサートが、前記培養チャンバーと実質的に同じ外側寸法を有し、該インサートが該培養チャンバー内にちょうど収まってしっかりと保持され、かつ該インサートの外壁が、該インサートがちょうど収まる該チャンバーの壁に対して形状に関して相補的であり、
該インサートが、前記プリント用フレームを取り囲む中央開放部を有し、かつ該インサートが、該中央開放部に対して該スキャホールドを把持するようかつ該プリント用フレーム内で該スキャホールドを露出させるように、該中央開放部内に保持可能なホルダと係合可能である、
請求項69に記載のインサート。
【請求項７１】
前記インサートが、前記プリント用フレームを含むより小さい開口部を取り囲むカラー、および前記チャンバーの壁に対して配置するのに十分な距離だけ該カラーから半径方向に延びている複数のスペーサーアームを含み、かつ該アームが、該壁の形状に合致する表面で終結する、請求項69または70に記載のインサート。
【請求項７２】
前記チャンバーの壁が湾曲しており、かつ前記アームが、該壁の湾曲に対して相補的な湾曲した表面で終結する、請求項71に記載のインサート。
【請求項７３】
前記チャンバーが培養皿であり、かつ前記アームが、ウェルを該培養皿内の中心に配置するのに十分な距離だけ前記カラーから実質的に対称的に延びている、請求項71または72に記載のインサート。
【請求項７４】
前記培養皿が、マルチウェルプレート内の培養ウェルである、請求項69〜73のいずれか一項に記載のインサート。
【請求項７５】
前記開口部が、多角形であり、かつ前記カラーによって取り囲まれるのに十分なサイズであり、かつ、該カラーが、該開口部よりも大きい前記スキャホールドを保持するのに十分なサイズである、請求項71〜74のいずれか一項に記載のインサート。
【請求項７６】
前記カラーが円柱状であり、かつ前記プリント用フレームが、長方形であり、かつ該カラーによって取り囲まれている、請求項71〜75のいずれか一項に記載のインサート。
【請求項７７】
入口ポートおよび出口ポートをさらに含み、該入口ポートおよび出口ポートが、前記インサートを通ってフレーム開口部を通りそしてインサートボディ部の外側へと培養用培地を流し込むために該インサートを通って延びている、請求項69〜76のいずれか一項に記載のインサート。
【請求項７８】
前記カラーの内壁に対してちょうど収まるような形状にされたシートである前記スキャホールドをさらに含む、請求項71〜77のいずれか一項に記載のインサート。
【請求項７９】
前記プリント用フレームの前記開口部に対して前記スキャホールドをしっかりと保持するように前記カラー内に挿入された前記ホルダをさらに含む、請求項71〜78のいずれか一項に記載のインサート。
【請求項８０】
前記ホルダが、漏斗形状であり、かつ円錐台状ボディ部および円柱状ステム部を含み、該円柱状ステム部が、前記開口部に対して前記基材を保持するように前記カラー内にちょうど収まる、請求項79に記載のインサート。
【請求項８１】
前記スキャホールドを、前記カラー内に配置し、かつ前記プリント用フレームの開口部を通じて露出させ、かつ、プリント用スキャホールドを該フレームに対してしっかりと保持するように前記ホルダを前記インサートボディ部に挿入する、請求項71〜80のいずれか一項に記載のインサートを使用する方法。
【請求項８２】
前記インサートボディ部の前記カラーに合致して該カラー内にちょうど収まるようなサイズにされた前記スキャホールドが、前記プリント用フレームの前記開口部に向かって該カラー内に設置され、かつ、前記ホルダの円柱状係合部分が、該プリント用フレーム内で露出している該スキャホールドを保持するように該スキャホールドの上部において該カラー内に挿入される、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
前記プリント用フレームを通じて前記スキャホールド上にバイオプリントする工程をさらに含む、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
前記フレームを通じて露出していない前記スキャホールドの反対側の面に播種またはバイオプリントする工程をさらに含む、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
前記反対側の面に播種またはバイオプリントする工程が、前記ホルダを通じて播種またはバイオプリントすることを含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
前記プリント用フレームを通じて前記培養チャンバーの底側に前記スキャホールドが露出している状態で、前記インサートを該培養チャンバーに挿入する工程をさらに含む、請求項81〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ポートを通じて前記プリント用フレーム内に培養用培地を流し込む工程をさらに含む、請求項80〜86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記基材上にバイオプリントする工程が、前記プリント用フレームをバイオプリンタに露出させた状態で前記ホルダを支持表面上に設置し、かつ該プリント用フレームの前記開口部を通じて該基材上にバイオプリントすることを含む、請求項81〜87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記培養チャンバーが培養ウェルであり、該培養ウェルに対して前記インサートが円周方向に合致する、請求項86に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府による支援に関する宣言
本発明は、National Institutes of Health, the National Eye Instituteにより授与されたプロジェクト番号Z01#:EY000532-04の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有している。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2016年11月9日に出願された米国特許仮出願第62/419,835号の恩典を主張する。
【０００３】
本開示の分野
本開示は、人工器官の分野に関し、特に、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的（three-dimensional engineered）外側血液網膜関門（BRB）を製造するための三次元（3D）バイオプリントの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
網膜は、脊椎動物の眼の内表面に位置する分化した光感受性の神経組織の層である。角膜、水晶体、および硝子体液を通過した後に網膜に達した光は、化学的および電気的イベントに変換され、それが神経インパルスを誘起する。光をこれらの神経インパルスに変換するプロセスであるトランスダクションを担う細胞は、光受容体細胞と呼ばれる分化した神経細胞である。
【０００５】
多くの眼病、例えば（加齢性）黄斑変性、黄斑ジストロフィー、例えばスタルガルトおよびスタルガルト様病、ベスト病（卵黄状黄斑ジストロフィー）および成人卵黄状ジストロフィー、または網膜色素変性の亜型は、網膜自体の変性または悪化に関連する。網膜色素上皮細胞の網膜下移植によって光受容体の救済および視覚機能の保護を達成できることが、動物モデルにおいて実証されている（Coffey et al. Nat. Neurosci. 2002:5, 53-56（非特許文献1）; Lin et al. Curr. Eye Res. 1996: 15, 1069-1077（非特許文献2）; Little et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996: 37, 204-211（非特許文献3）; Sauve et al. Neuroscience 2002: 114, 389-401（非特許文献4））。治療剤候補の評価のためならびに網膜変性疾患および損傷の処置のために使用することができる、移植用の工学的（engineered）血管化外側血液網膜関門（BRB）を製造するための方法を見出す必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Coffey et al. Nat. Neurosci. 2002:5, 53-56
【非特許文献２】Lin et al. Curr. Eye Res. 1996: 15, 1069-1077
【非特許文献３】Little et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996: 37, 204-211
【非特許文献４】Sauve et al. Neuroscience 2002: 114, 389-401
【発明の概要】
【０００７】
本開示の概要
いくつかの態様において、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的血液網膜関門（BRB）を製造するための方法が開示される。この方法は、
a. 内皮細胞を含むヒドロゲルが生体適合性スキャホールドの第1の表面に付着するように、内皮細胞とヒドロゲルと第1の培地とを含む第1のバイオインクを、第1の表面および第2の表面を有する生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 内皮細胞が血管を形成することができるように、第1の表面上に堆積した第1のバイオインクを、第2の培地中で少なくとも4日間成熟させる工程；
c. 生体適合性スキャホールドが内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、生体適合性スキャホールドの第2の表面上に単一細胞層を形成するために第3の培地中に網膜色素上皮細胞を堆積させる工程；ならびに
d. 堆積した網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、この網膜色素上皮細胞を第3の培地中で培養する工程
を含む。
【０００８】
任意で、第1のバイオインクはまた、線維芽細胞および周皮細胞を含み得る。
【０００９】
本方法により製造される三次元工学的BRBは、その第1の表面上に人工脈絡膜を、その第2の表面上に人工網膜色素上皮を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む工学的BRBを対象の眼に移植することにより、急性黄斑変性または網膜変性を有する対象を処置するための方法が開示される。
【００１１】
いくつかの態様において、三次元工学的眼組織モデルが開示される。この三次元工学的眼組織モデルは、三次元工学的外側血液網膜関門（BRB）を含み、工学的外側網膜関門は、脈絡膜血管を含む第1の層と複数の網膜色素上皮細胞を含む第2の層とを含む。脈絡膜血管は、第1のバイオインクを含み、第1のバイオインクは、複数の内皮細胞、ならびに任意で、線維芽細胞および／または周皮細胞を含む。三次元工学的眼組織モデルは、野生型眼組織のモデルとして使用され得るか、または、眼病もしくは組織療法候補のモデルであり得るまたは遺伝子療法候補を試験するために使用され得る。
【００１２】
さらなる態様において、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む開示される三次元工学的BRBを用いて試験作用物質の効果を判定するための方法が提供される。この方法は、三次元工学的BRBを試験作用物質と接触させる工程、ならびに網膜色素上皮細胞を伴う脈絡膜内での細胞の表現型を評価し、かつ／または網膜色素上皮細胞を伴う脈絡膜の三次元構造を評価する工程を含む。細胞の表現型の変化または三次元構造の変化によって、この作用物質が生物学的効果、例えば生物学的試験活性を有することが示される。試験作用物質は、眼病の処置のために使用され得、またインサイチュー遺伝子療法において使用され得る。
【００１３】
三次元BRBを製造するための方法のより具体的で非限定的な例が開示されている。いくつかの具体的で非限定的な例において、この方法は、
a. コラーゲンヒドロゲル中またはフィブリノゲンヒドロゲル中の内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞と、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含む第1の培地とを含む第1のバイオインクを提供し、かつ、内皮細胞と線維芽細胞と周皮細胞とを含むヒドロゲルが生体適合性スキャホールドの第1の表面に付着するように、第1のバイオインクを、生体適合性の酸素プラズマ処理されたポリラクチド／グリコリドポリマー上に、例えばポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）PDGLAスキャホールド上に堆積させる工程；
b. 内皮細胞が血管を形成することができるように、堆積させた第1のバイオインクを、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、ならびにアンギオポエチン-1およびアプロチニンの有効量を含む第2の培地中で少なくとも4日間、第1の表面においてトロンビンの非存在下で成熟させる工程；
c. 生体適合性スキャホールドが内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、生体適合性スキャホールドの第2の表面上に層を形成するために第3の培地中に網膜色素上皮細胞を堆積させる工程であって、生体適合性スキャホールドの第1の表面および第2の表面が互いに反対側にある表面であり、第2の表面がビトロネクチンでコーティングされ、かつ第3の培地が、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む、工程；
d. 堆積した網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、第2の表面上において、堆積した網膜色素上皮細胞を、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む第3の培地中で培養する工程；
e. 血管内皮成長因子ならびに任意で上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、およびアプロチニンの1つ、複数、またはすべての有効量を含む第4の培地中で、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞を培養する工程であって、第4の培地がトロンビンおよびアンギオポエチン-1を含まない、工程；
f. 血管内皮細胞ならびに任意でEGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、およびヘパリン硫酸の1つ、複数、またはすべての有効量を含む第5の培地中で、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞を培養する工程であって、第5の培地がトロンビン、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含まない、工程；ならびに
g. 第3の培地に添加された有効量のプロスタグランジンE2を含む第6の培地中で、網膜色素上皮細胞を培養する工程
を含み、培養された内皮細胞が工学的BRBの人工脈絡膜を形成し、培養された網膜色素上皮細胞が人工網膜色素上皮を形成する。
【００１４】
本発明の上記および他の特徴および利点は、添付図面を参照しつつ進められる以下の様々な態様の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1Aは、ヒトiPSC由来内皮細胞およびRPE細胞を用いた血液網膜関門（BRB）の三次元（3D）バイオプリントの概要である。（A)ドライ型およびウェット型の加齢性黄斑変性（AMD）をモデル化するための3D工学的組織の概要図。フィブリンベースのゲル中の誘導多能性幹細胞（iPSC）由来内皮細胞、周皮細胞、および線維芽細胞の混合物を、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）電解紡糸（またはその他）スキャホールド上にプリントする。iPSC由来網膜色素上皮（RPE）細胞単層は、スキャホールドの他方の側に形成する。このRPE-スキャホールド-「脈絡膜」が、疾患モデルまたは組織療法を開発する原型となる。定義されたプリント幾何学形状は、血管新生と血管発生を区別し、血管新生の定量を容易にする。工学的BRBの原型は、網膜色素上皮細胞（RPE）細胞単層とプリントされた脈絡膜の間に生分解性ポリマースキャホールドを含む。図1B〜1Hは、スキャホールドをインサート内に設置し（図1E）、このインサートを漏斗形状のホルダに取り付け（図1F）、これらをバイオプリントのために逆さにし（図1G）、次いでこれを、インサートが培養チャンバーに入るように再度逆さにし（図1H）、インサートを培養チャンバーの縁からホルダによって吊り下げる、バイオプリント法の例における工程を図示している。
【図２】2つの異なる固有粘度（IV 0.6および1.0）のポリ（D,L-ラクチド-コ-グリコリド）（PDLGA）スキャホールド調製物の顕微鏡写真である。PDLGA（50：50、それぞれ1.0および0.6 I.V.）は、Polysciences（Warminster, PA）から入手した。A. 1.0 I.V.の10％(w:v)PDLGA溶液および0.6 I.V.の15％PDLGA溶液。電解紡糸スキャホールドを、Ames Thickness Gaugeを用いて（9つの異なる位置／シートにおける）厚みについて測定した。原料は、出荷前にAnprolene Sterilizerを用いて滅菌（12時間サイクル、25℃、72時間真空（99％）曝露）されたエチレンオキシドであった。電解紡糸PDLGA原料を、個々のスタブにマウントし、金（Denton Vacuum Desk II）を用いてスパッタコーティングし、JEOL JSM 5900LV SEMを用いて観察した。繊維径は、熱処理前スキャホールドにおいておよそ500 nmである。
【図３】図3A〜3Hは、開示されるバイオプリントのためのデバイスおよび方法を示す。図3Aは、6ウェルおよび12ウェルマイクロ流体アプローチを用いるマルチウェルプラットフォームに基づく三次元（3D）プリントされたトランズウェルの設計を示す。インサートが収縮するのを最小限に抑え、生体適合性を向上させるために、ガラス／カーボンと混合されたPLAを使用する。プリントされたウェルを酸素プラズマにより滅菌し、70％エチルアルコールに浸漬する。図3Bは、30分間酸素プラズマ処理されたテフロン上での水滴落下（矢印）試験を示しており、処理されたスキャホールド表面が、その上にバイオインクをプリントできるように疎水性から親水性に変更されることを示している。図3Cは、逆さにされたインサートのフレーム内に保持されたPDLGAスキャホールドの表面上でのバイオプリントを示す。図3D〜3Fは、インサートの異なる態様の拡大図であり、図3Gは、インサートが培養ウェル内でどのように使用されるかを図示している。図3Hは、図3Gの3H-3H横断線にそって切り取られた拡大断面図である。図3Hは、培養ウェルの底に押し込まれたプリント用インサート組立体を示す。スキャホールドシートは、インサートの中央カラーの内側に配置され、スキャホールドシートは、インサートボディ部の底壁上の凹部によって形成される正方形プリント用フレームを通じて露出する。漏斗形状の培養ウェルホルダの円柱状部分は、スキャホールドシートをプリント用フレーム内で固定するように、インサートの中央円柱状凹部に挿入される。ホルダが、漏斗の末端リップ部により培養ウェルの壁から吊り下げられていることが示されている。
【図４】内皮細胞に対するフィブリンゲル分解の効果を示す顕微鏡写真を示す（2.5 mg/ml）。内皮細胞（細胞400万個/ml）を24マルチウェルプレートに播種した。各画像は、ウェル全体を示している。
【図５】図5A〜5Cは、3つのタイプの内皮細胞：GFP陽性内皮細胞、非蛍光内皮細胞、およびiPSC由来内皮細胞を用いた培地成分の最適化を示す。A.管形成に対する内皮成長因子（EGF）およびアンギオポエチン（ANG）-1の効果。スケールバーは500μmを示す。B.培地成分交換のタイムフレーム。C.管形成は、グループ1培地で確認される（第9日）。
【図６】図6A〜6Dは、血管内皮成長因子（VEGF）処理に対するプリントされた組織の応答を示す。VEGF処理の3日（A、C）、7日（B、D）の、（A、B)GFP内皮細胞および（C、D）ヒトiPSC由来内皮細胞を含むプリントされた組織。緑色は、GFP/CD31を示し、青色は核を示す。スケールバーは200μmである。
【図７】バイオプリント後の組織培養のタイムフレームを図示している。フィブリンゲル（2.5 mg/ml）中の内皮細胞（細胞5.5×106個/ml）、線維芽細胞（細胞107個/ml）、および周皮細胞（細胞5×10５個/ml）を、スキャホールド上にプリントする。トロンビンの24時間処理によりフィブリノゲンを重合させる。VEGFは管形成に重要であり、ANG-1は血管の安定性を向上させる。アプロチニンは、フィブリンゲルの分解を最小化する。
【図８】I.V. 0.6およびI.V. 1.0のPDLGAスキャホールド上での脈絡膜のバイオプリントおよびiPSC由来RPE細胞の播種を示す顕微鏡写真である。プリントされた組織を、プリント後7〜8週で、4％パラホルムアルデヒドにより固定した。組織を、ZO-1（密着結合、赤色）、CD31（内皮細胞/血管マーカー、緑色）およびHoescht（核、青色）で免疫染色した。画像は、共焦点顕微鏡（Zeiss 710）により撮影した。
【図９】スキャホールドの表面1上で観察される3Dバイオプリントされた微小血管を示す顕微鏡写真である。微小血管は、バイオプリントされた血管の間で成長している。
【図１０】スキャホールドの表面2上のiPSC-RPEを示す顕微鏡写真である。
【図１１】図11A〜11Bは、（A)表面1上で観察される3Dバイオプリントされた微小血管およびスキャホールドの反対側のiPSC由来RPEの別の例；ならびに（B)表面2における3Dプリントされた組織上のiPSC-RPEを示す顕微鏡写真である。
【図１２】BRBを作製する例示的な培養法を示すフローチャートである。
【図１３】図13A〜13Cは、GFP陽性初代内皮細胞、周皮細胞、および線維芽細胞を含む3D血管化組織において得られた結果を示すデジタル画像（AおよびC）ならびにグラフ集（B）である。（A)プリントされたGFP内皮細胞（白色）の8ビット画像を定量化した。プリント幾何学形状のストライプ間の各ギャップに5本の線状プローブを配置した。各線状プローブは、しきい値を超えるGFP強度のピーク（中空の円）を検出する。線1および6、2および5、3および4は、それぞれ、各ギャップの縁、中間、および中心を示す。（B)2つの実験グループを比較する。グループ1（G1）は、1週の85 ng/mlのVEGF処理を示し、グループ2（G2）は、最初の3日間の85 ng/mlのVEGF処理およびその後の基本培地レベルのVEGF（1.7 ng/ml）を示す。血管新生を、各線状プローブにおけるGFPピークの数として定量化した。血管新生の定量を、グループ間とG1のタイムフレーム間で行った（n=5；プリント回数）。エラーバーは、標準誤差および平均を示す。二元ANOVAおよびボンフェローニ事後対比較。†は、グループ間（左図）および第5〜6日と第7〜8日の間（右図）の統計的有意性（p＜0.05）を示す。＃および＊は、それぞれ第3〜4日対第5〜6日および第3〜4日対第7〜8日の統計的有意性（p＜0.05）を示す。（C)第7日のiPSC由来内皮細胞を含む組織を、VibrotomeおよびMicrotomeを用いて100および5マイクロメートル厚で断面切断した。100μm厚の組織切片を、CD31（内皮細胞）およびNG2（周皮細胞）で染色した。10μm厚組織スライスを、H&E染色した。「v」は、微小血管の断面を示す。
【図１４】ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）を用いて外側血液網膜関門を工学的に作製する概要である。純度は、RPE特異的遺伝子のGFP発現と共にレポーターiPSC株を用いて試験することができる。GFPはまた、3D RPE/脈絡膜組織におけるRPEの成熟およびRPEの上皮表現型の観察を可能にする。
【図１５】図15A〜15Cは、0.6の固有粘度を有するPLGAスキャホールド上にバイオプリントされた外側血液網膜関門（BRB）のデジタル画像である。プリントされた組織を、プリント後6週間で固定した。iPSC由来RPE細胞を、（AおよびC)エズリン（細胞質に局在する、細胞質表在性膜タンパク質）およびE-カドヘリン（結合タンパク質、細胞境界）で染色した。（B)微小血管を、有窓性内皮連結構造（fenestrated endothelial-linked structure; FELS）タンパク質で染色した。（C、パネル1、2）RPE極性の証拠であるエズリンの発現（矢じり）は、RPEの頂端領域に局在化される。（C、パネル3）共焦点画像の3D再構築。画像は、Leica DMi8によって撮影した。
【図１６】図16A〜16Jは、「脈絡毛細管枝」の開窓の発生に対するRPEの効果を示すデジタル画像である。（A、B）RPEを含むおよび含まない工学的組織の3D再構築。6〜7週間の培養後、プリントされた組織を、「脈絡膜」において、有窓内皮連結構造（FELS：開窓マーカー、「F」）およびCD31（内皮細胞マーカー、「C」）で、ならびにRPEのE-カドヘリン（結合タンパク質、矢じり）で染色した。（D〜G）局所（D、F）および全（E、G）「脈絡膜」組織の微小血管網。（D〜G）画像を、FELS染色とCD31染色に分けた。（H)頂端突起（矢印）を有するRPEの透過型電子顕微鏡。（I)「脈絡毛細管枝」は、「v」としてラベル表示されている。（J)黒色矢じりとしてラベル表示された、脈絡毛細管枝の特別な特徴である「脈絡毛細管枝」の開窓。
【図１７】図17A〜17Iは、「脈絡毛細管枝」に対するRPE細胞におけるSTAT3発現の効果を示すデジタル画像である。健常、STAT3過剰発現およびSTAT3変異iPSC由来RPE細胞単層を、健常な「脈絡膜」上で形成させた。6週後、組織を4％PFA中で固定した。Zスタック共焦点画像を、RPE（A〜C）、サブRPE／スキャホールド（D〜F）および「脈絡膜」（G〜I）の3つのセクションに分けた。RPE領域は、エズリン（細胞質）およびE-カドヘリン（細胞境界）で染色した。脈絡膜領域は、FELSおよびCD31で染色した。スケールバー = 100μm。STAT3の過剰発現は、サブRPE領域の血管化を誘導した。
【図１８】図18A〜18Iは、「脈絡毛細管枝」に対する低酸素の効果を示すデジタル画像である。RPE-「脈絡膜」組織を、プリントから4週間後に、DMOG（100μM)で処理した。DMOGは、プロリル-4-ヒドロキシラーゼを阻害し、低酸素誘導因子を誘導する。DMOGは、RPEの頂端領域のみにおいてまたはRPEの頂端領域と「脈絡膜」側の両方において処理した。DMOG処理の2週間後、組織を4％PFA中で固定した。Zスタック共焦点画像を、RPE（A〜C）、サブRPE／スキャホールド（D〜F）および「脈絡膜」（G〜I）の3つのセクションに分けた。RPEは、Hoescht（核）によって確認した。脈絡膜は、CD31で染色した。スケールバー = 100μm。DMOG処理RPEは、サブRPE領域において血管化を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
様々な態様の詳細な説明
複数の細胞型を含む複雑な三次元構造物を構築するためにバイオプリント技術を使用することができる。それは、2つの開示される特徴を使用する：（1）分解性生体材料と混合された数百から数千個の細胞を含む「バイオインク」として大粒の滴の形態で播種される細胞；（2）細胞が、空間的および時間的に制御され使用者により定義された様式で正確に移動させることができるニードルを用いて播種されること。バイオプリントされた組織の三次元構造は、すべての異なる細胞型が同時に成熟することを可能にし、それによってそれらが天然組織と同様に協働する可能性を高める。極性RPE単層および微小血管を形成する内皮細胞を含む三次元工学的BRBが、本明細書に開示されており；この三次元工学的BRBは、生体適合性スキャホールド上に細胞をバイオプリントすることによって製造される。この三次元工学的BRBは、野生型細胞または1つもしくは複数の変異細胞から製造され得る。この三次元工学的BRBは、疾患のモデルとして製造され得る。いくつかの態様において、疾患をモデル化するために、この三次元工学的BRBは、化学剤で処理され得、および／または三次元工学的BRBは、遺伝的変異を含む1つまたは複数の細胞型を含み得る。この工学的BRBにおいて、内皮細胞から生成された三次元微小血管は、網膜色素上皮（RPE）細胞下に位置する脈絡膜線維芽細胞と周皮細胞とを含む組織内に並んでいる。この工学的BRBは、BRBの疾患における分子経路を解明するため、BRBに影響する薬物を発見および試験するためのモデルとして、ならびに細胞ベースの療法として使用され得る。いくつかの態様において、RPE、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞は、同じ誘導多能性幹細胞（iPSC）、例えばヒトiPSC細胞由来であり得る。
【００１７】
用語
それ以外のことが示されていない限り、技術用語は、従来的用法にしたがい使用される。分子生物学分野の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版, 1994（ISBN 0-19-854287-9）；Kendrewら（編）, The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994（ISBN 0-632-02182-9）；およびRobert A. Meyers（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers.出版, 1995（ISBN 1-56081-569-8）において見いだされ得る。本開示の様々な態様のレビューを容易にするために以下の特定の用語の説明が提供される。
【００１８】
加齢性黄斑変性（AMD）：米国およびその他の先進工業国において失明の主因となっている疾患（Evans J, Wormald R., Britis Journal Ophthalmology 80: 9-14, 1996; Klein R, Klein B E K, Linton K L P, Ophthalmology 99: 933-943, 1992; Vingerling J R, Ophthalmology 102: 205-210, 1995）。初期のAMDは、臨床的に、網膜色素上皮（RPE）下の位置でのタンパク質、脂質、および細胞残屑の細胞外沈着であるドルーゼン（Hageman G S, Mullins R F, Mol Vis 5: 28, 1999）を特徴とする。RPEは、それが覆っている光受容体に栄養、代謝および貪食機能を提供する。重度の視力喪失は、AMDの後期段階に関連する黄斑における光受容体の機能障害または死（網膜色素上皮細胞の地図状委縮および網膜下新血管新生）により引き起こされる。
【００１９】
バイオインク：バイオプリントに使用する液体、半固体または固体組成物。いくつかの態様において、バイオインクは、細胞、細胞溶液、細胞凝集物、細胞含有ゲル、多細胞体または組織を含む。いくつかの態様において、バイオインクは、固体または半固体であり得る。いくつかの態様において、バイオインクはさらに、バイオプリントを可能にする特定の生化学的特性を提供する非細胞物質を含む。いくつかの態様において、バイオインクは、押し出し化合物を含む。いくつかの例において、押し出し化合物は、バイオプリントプロセス後に除去され得る。他の態様において、押し出し化合物の少なくとも一部は、プリント後も細胞と共に残存し、除去されない。
【００２０】
バイオプリント：自動化または半自動化、コンピュータ支援三次元プリント用デバイス（例えば、バイオプリンタ）に適合する方法を用いた細胞（例えば、バイオインク、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁物、細胞ペースト、細胞濃縮物、多細胞凝集物、多細胞体等）の精密な堆積。バイオプリントは、生きた細胞をプリントするのに適合する方法、例えば連続および／または不連続様式での押し出しを含む。この文脈での押し出しは、半固体または固体のバイオインクに穴を強制的に通過させることを意味し、バイオインクは穴を強制的に通された後も一定程度および一定期間その形状を維持する。バイオプリントはまた、霧状物、噴霧物または小滴中の実質的に低粘性の液体を表面に射出することによって細胞を適用するエアゾール噴霧法を含む。適切なバイオプリンタは、Organovo, Inc. (San Diego, Calif.)製のNOVOGEN BIOPRINTERS（登録商標）およびRegenHU Ltd, (Switzerland)製の3D DISCOVERY（登録商標）を含む。バイオプリンタは、例えば、基材上に細胞を複数層でプリントすることによって、基材シートの一方表面上もしくは両方の表面上に細胞をプリントすることによって、および／または基材シートの一方の表面上にもしくは互いに反対側にある両方の表面上に複数の層をプリントすることによって、三次元工学的組織を製造するために使用され得る。
【００２１】
生体適合性：哺乳動物対象に移植した場合に、その哺乳動物において有害な反応を誘発しない任意の物質。生体適合性物質は、個体に導入された場合、その個体に対して毒性または有害ではなく、その対象においてその物質の免疫学的拒絶を誘導しない。
【００２２】
血液網膜関門（BRB）：インビボで、外側BRBは、神経網膜を脈絡膜毛細血管から隔離している。内側BRBは、微小血管内で形成されたタイトジャンクションおよび内側網膜内の硝子体側の近くに位置する網膜ミクログリアを含む。外側BRBは、上皮（RPE）細胞層により形成されるタイトジャンクションによって神経網膜を脈絡膜毛細血管から隔離している。眼のRPE細胞層において形成される外側関門は、一部、脈絡膜から網膜下空間への溶質および栄養分の移動を調節するように機能する。これらの細胞の間に位置するタイトジャンクションは、血液から網膜への分子の高度に選択的な拡散を媒介し、この関門は網膜のホメオスタシスの維持を助ける。
【００２３】
毛細管網：内皮細胞によって形成される微細な枝分かれした血管群。
【００２４】
細胞：独立して複製することができ、膜によって包まれており、生体分子および遺伝的物質を含む生物の構造上の機能的単位。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人為的に修飾された細胞（例えば、融合細胞、遺伝的に修飾された細胞等）であり得る。「細胞集団」という用語は、本明細書において、典型的には共通の（同じ）タイプの、一群の細胞を表すために使用される。細胞集団は、共通の前駆体由来であり得、または2つ以上の細胞型を含み得る。「濃縮された」細胞集団は、出発細胞集団（例えば、分画されていない、異種細胞集団）から得られる、特定の細胞型の比率がその出発集団におけるその細胞型の比率よりも高い細胞集団を表す。細胞集団は、1つもしくは複数の細胞型について濃縮され得、および／または1つもしくは複数の細胞型を除去され得る。
【００２５】
細胞培養表面：細胞および培養用培地を物理的に支持することができる固体基材、例えば、非限定的に、ポリスチレン。細胞培養表面は、細胞接着性を向上させる物質、例えば細胞外マトリクスでコーティングされ得る。
【００２６】
定義されたまたは十分に定義された：培地、細胞外マトリクス、または培養条件に関連して使用される場合、ほぼすべての成分の化学組成および量が分かっている培地、細胞外マトリクスまたは培養条件を表す。例えば、定義された培地は、例えばウシ胎仔血清中、ウシ血清アルブミ中ン、またはヒト血清アルブミン中に、定義されていない因子を含まない。一般に、定義された培地は、組換えアルブミン、化学的に定義された脂質および組換えインスリンが補充された、基本培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝液、抗酸化物質およびエネルギー源を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、F12またはロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）1640）を含む。例示的な十分に定義された培地は、ESSENTIAL 8（商標）培地である。
【００２７】
分化：特化していない細胞が構造的および／または機能的特性を変化させつつより特化したタイプに変わるプロセス。成熟細胞は、典型的に、変化した細胞構造および組織特異的タンパク質を有する。より詳細に、本発明の方法との関係で、そのRPE細胞が成熟し、最終分化した細胞であることを示す特徴を有する網膜色素上皮（RPE）細胞の細胞型を獲得するヒト幹細胞のプロセスを示す。本明細書で使用される場合、「未分化」は、胚または成体起源の最終分化した細胞から明確に区別される、非特化細胞の特徴的マーカーおよび形態学的特徴を提示する細胞を表す。
【００２８】
疾患：特有の兆候もしくは症状を生じるまたはその細胞、組織もしくは器官のそれぞれに負の影響を及ぼす、単なる物理的傷害の直接的結果ではない、細胞、組織、器官の構造または機能の障害。疾患の例は、網膜疾患である。網膜色素変性および加齢性黄斑変性は両方とも、網膜疾患の非限定的な例である。「有病細胞」は、関心対象の疾患を有する対象由来の細胞である。いくつかの態様において、有病細胞は、関心対象の疾患に特有の遺伝的変異を含む。いくつかの態様において、有病細胞は、病的表現型をもたらす後成的なおよび／またはプロテオミクス的な変化を有する。
【００２９】
胚性幹（ES）細胞：早期段階の胚、例えば胚盤胞段階の内部細胞塊から得られるまたは人工的手段（例えば、核移植）によって作製される、生殖細胞（例えば、精子および卵子）を含む、胚または成体のあらゆる分化した細胞型を生じることができる未分化の多能性細胞。
【００３０】
本質的に含まない：指定された成分、例えば細胞に関して、この用語は、本明細書において、その指定された成分が組成物中に意図的に配合されなかったことおよび／または混入物質としてのみもしくは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の任意の意図しない混入に起因する指定された成分の総量は、0.05％を十分下回り、好ましくは0.01％を下回る。指定された成分の量が標準的な分析法を用いて検出できない組成物が最も好ましい。
【００３１】
細胞外マトリクス（ECM）：それが取り囲む細胞に物理的および生物学的支援を提供する細胞外タンパク質の混合物。ECMタンパク質は、多くの場合、構造細胞によって分泌される。RPEおよび毛細血管を支える細胞外タンパク質の層状組織である基底膜はECMの1つのタイプである。
【００３２】
フィーダー非含有またはフィーダー非依存：フィーダー細胞層の代替物としてサイトカインおよび成長因子（例えば、TGFβ、bFGF、LIF）を補充された培養物。したがって、「フィーダー非含有」またはフィーダー非依存培養システムおよび培地は、多能性細胞を未分化かつ増殖性の状態で培養および維持するのに使用され得る。いくつかの例において、フィーダー非含有培養物は、動物ベースのマトリクス（例えば、MATRIGEL（商標））を用いるか、または基材物質上、例えばフィブロネクチン、コラーゲン、もしくはビトロネクチン上で成長させられる。これらのアプローチは、ヒト幹細胞を、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とせずに本質的に未分化の状態で維持することを可能にする。
【００３３】
線維芽細胞：細胞外マトリクスタンパク質を合成し、軟組織構築物を提供するタイプの細胞。線維芽細胞は、結合組織の最も一般的な細胞である。インビボで、線維芽細胞は、動物組織のために構造上のフレームワーク（間質）を形成し、創傷治癒において役割を果たす。線維芽細胞はまた、それらの中胚葉起源を識別するマーカーとして使用される特徴である、中間フィラメントタンパク質ビメンチンを発現する。
【００３４】
成長因子：細胞の成長、生存および／または分化を促進する物質。成長因子は、成長刺激物質として機能する分子（マイトジェン）、細胞の遊走を刺激する因子、走化性物質として機能するもしくは細胞の遊走もしくは腫瘍細胞の浸潤を阻害する因子、細胞の分化した機能を調整する因子、アポトーシスに関与する因子、または成長および分化に影響を与えずに細胞の生存を促進する因子を含む。成長因子の例は、線維芽細胞成長因子（FGF）、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）および血管内皮成長因子（VEGF）である。
【００３５】
増殖培地または増加培地：特定の細胞集団の成長（細胞の増殖／増加）を支援するのに必要な栄養分を含む培養条件の人工的組み合わせ。1つの態様において、細胞は、幹細胞である。他の態様において、細胞は、内皮細胞または網膜色素上皮細胞である。増殖培地は、一般に、炭素源、窒素源、およびpHを維持するための緩衝液を含む。1つの態様において、増殖培地は、幹細胞の成長を促進する様々な栄養分を補充された最小必須培地、例えばDMEMを含む。さらに、最小必須培地は、添加物、例えばウマ、ヒト、仔ウシ、またはウシの胎仔血清を補充され得る。
【００３６】
ヒドロゲル：静止状態にある場合に流動性を示さない制御された架橋構造を有する固形、ゼリー様の物質。ヒドロゲルは、弾力性のあるゲルを形成するように相当量の水を吸収することができる水膨潤性ポリマーマトリクスであり得、ここで「マトリクス」は共有結合または非共有結合架橋によってひとかたまりになった高分子の三次元網である。水性環境下におかれると、乾燥ヒドロゲルは、架橋度により許容される程度まで膨潤する。
【００３７】
誘導多能性幹細胞（iPSC）：因子（本明細書で再プログラム因子と称される）の組み合わせを発現させるまたはその発現を誘導することにより体細胞を再プログラムすることによって生成される細胞。iPSCは、胎児、出生後、新生児、幼児または成体の体細胞を用いて作製され得る。特定の態様において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用され得る因子は、例えば、Oct4（しばしばOct 3/4と称される）、Sox2、c-MycおよびKlf4、Nanog、ならびにLin28を含む。いくつかの態様において、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするように少なくとも2つの再プログラム因子、少なくとも3つの再プログラム因子または少なくとも4つの再プログラム因子を発現させることによって再プログラムされる。
【００３８】
単離された：その成分が本来存在する環境（例えば、細胞）内の他の生物学的成分、すなわち、染色体および染色体外DNAおよびRNA、タンパク質、ならびに他の細胞から実質的に隔離または精製された「単離された」生物学的成分、例えば核酸、タンパク質または細胞。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質を包含する。同様に、「単離された」細胞は、その細胞が本来存在する生物の他の細胞から実質的に隔離された、実質的に別個に生成された、または実質的に精製されたものである。単離された細胞は、例えば、少なくとも99％、少なくとも98％、少なくとも97％、少なくとも96％、95％、少なくとも94％、少なくとも93％、少なくとも92％、または少なくとも90％純粋であり得る。
【００３９】
標識：例えばELISA、分光光度法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、顕微鏡、ノーザン分析、またはサザン分析により検出することができる物質。例えば、核酸分子またはタンパク質にマーカーを付加し、それによってその核酸分子またはタンパク質の検出を可能にすることができる。標識の例は、放射性同位体、ニトロイミダゾール、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光物質、フルオロフォア、ハプテン、酵素、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。標識方法または様々な目的に適したマーカーの選択の手引きは、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)およびAusubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998内)で議論されている。
【００４０】
いくつかの態様において、標識は、フルオロフォア（「蛍光標識」）である。フルオロフォアは、特定波長の光への曝露により励起された場合に、例えば異なる波長の光（すなわち、蛍光）を発する化合物である。フルオロフォアは、それらの発光プロファイルまたは「色」により説明され得る。緑色フルオロフォア、例えばCy3、FITC、およびオレゴングリーンは、概ね515〜540λの範囲の波長でのそれらの発光を特徴とする。赤色フルオロフォア、例えばテキサスレッド、Cy5、およびテトラメチルローダミンは、概ね590〜690λの範囲の波長でのそれらの発光を特徴とする。他の態様において、マーカーは、抗体によって認識されるタンパク質タグ、例えばヒスチジン（His)タグ、ヘマグルチニン（HA）タグ、またはc-Mycタグである。
【００４１】
層：通常、複数細胞分の厚さである、少なくとも2つの次元における細胞、細胞外マトリクス成分、または生体適合性スキャホールドの集合。層は、細胞および／または細胞外マトリクス成分の連続的、実質的に連続的、または非連続的なシートを形成し得る。通常、本明細書に記載される工学的網膜組織の各層は、3つの次元において複数の細胞を含む。
【００４２】
レーバー先天黒内障（LCA）：出生時にまたは生涯の最初の数か月で現れ、主に網膜に影響する稀な遺伝性眼病。その症状は、複数の遺伝子が関与するため、様々であり得る。しかし、それは、眼振、羞明、どう孔反射の鈍さまたは欠如、および重度の視力喪失または失明を特徴とする。
【００４３】
哺乳動物：この用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。哺乳動物の例は、ヒトおよび脊椎動物および実験動物、例えばブタ、雌ウシ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギ、およびマウスを含むがこれらに限定されない。
【００４４】
マーカーまたは標識：例えばELISA、分光光度法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、顕微鏡、ノーザン分析またはサザン分析により検出することができる物質。例えば、核酸分子またはタンパク質にマーカーを付加し、それによってその核酸分子またはタンパク質の検出を可能にすることができる。マーカーの例は、放射性同位体、ニトロイミダゾール、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光物質、フルオロフォア、ハプテン、酵素、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。標識方法または様々な目的に適したマーカーの選択の手引きは、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)およびAusubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998内)で議論されている。
【００４５】
周皮細胞：身体を通じて毛細血管および細静脈の内皮細胞を包んでいる収縮性細胞であり、ルジェ細胞または壁細胞としても公知である。周皮細胞は、基底膜に埋め込まれており、そこでそれらは直接的な物理的接触とパラ分泌シグナル伝達の両方を用いて、内皮細胞と連絡する。周皮細胞は、特徴的な丸みのある核を有し、この細胞が毛細血管の血液の流れをインビボで調節することを可能にする毛細血管壁を包むフィンガー様伸長部を突出させている。
【００４６】
多能性：胚体外または胎盤細胞を除く、ある生物のすべての他の細胞型に分化する細胞の特性。多能性幹細胞は、長期間の培養の後でさえも、全3つの胚葉の細胞型（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞型）に分化することができる。
【００４７】
多能性幹細胞：（a）免疫不全（SCID）マウスに移植すると奇形腫に分化し得；（b）全3つの胚葉の細胞型に分化することができ（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞型に分化することができ）；ならびに（c）胚性幹細胞の1つまたは複数のマーカー（例えば、Oct 4、アルカリホスファターゼ、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等）を発現するが、その胚体外膜と共に胚を形成することができない（全能性でない）幹細胞。
【００４８】
例示的な多能性幹細胞は、（任意で胚の残りの部分を破壊せずに）胚盤胞段階の胚の内部細胞塊（ICM）から得られる胚性幹細胞、および分割段階または桑実胚段階の胚の1つまたは複数の割球から得られる胚性幹細胞を含む。これらの胚性幹細胞は、受精によりまたは体細胞核移植（SCNT）、単為生殖および雄性生殖を含む無性的手段により生成される胚物質から生成され得る。PSCは、すべての胚体外組織（例えば、インビボでの胎盤またはインビトロでのトロホブラスト）に寄与する能力は有していないので、子宮内移植された場合に、単独では胎児または成体動物に発生することができない。
【００４９】
多能性幹細胞は、因子（本明細書で再プログラム因子と称される）の組み合わせを発現させるまたはその発現を誘導することにより体細胞を再プログラムすることによって生成されるiPSCを含む。
【００５０】
精製された：完全な純粋さを必要としない用語である単離された；そうではなく、それは、相対的な用語であることが意図されている。したがって、精製された細胞集団は、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％を超えるもしくは100％の純度を有し、または最も好ましくは他の細胞型を本質的に含まない。
【００５１】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するまたは2つのそうでなければ隔離されていた配列のセグメントの人為的組み合わせにより得られる配列を有するものである。この人為的組み合わせは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般的には単離された核酸セグメントの人為的操作によって、例えば遺伝子操作技術によって達成される。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によりコードされるものである。
【００５２】
長方形：4つの直角からなる四辺形。正方形は、長方形の一種である。それらは、少なくとも3つの直線の辺および角を有する平面図形である多角形の一例である。本明細書に開示されるデバイスのいくつかの態様において、フレームは、任意の形状、例えば卵形、円形、多角形、四辺形、長方形、または正方形であり得る。
【００５３】
網膜：眼の内表面に並ぶ感光性の組織層。
【００５４】
網膜色素上皮：血管で満たされた層である脈絡膜と網膜の間の色素細胞の単層。
【００５５】
網膜色素上皮（RPE）細胞：RPE細胞は、色素沈着、上皮形態および頂端・基底極性細胞に基づき認識することができる。分化したRPE細胞はまた、それらの丸石形態および色素の最初の出現により視覚的に認識することができる。「RPE細胞」および「分化したRPE細胞」および「iPSC由来RPE細胞」および「ヒトRPE細胞」という用語は、一般に、分化したRPE細胞を表すために使用される用語である。
【００５６】
網膜色素変性（RP）：網膜において桿体光受容細胞が徐々に変性していくことにより重度の視力低下を引き起こす遺伝性、変性性眼病。この形態の網膜ジストロフィーは、年齢に非依存的に初期症状を発生させる。網膜色素変性の初期の網膜変性症状は、夜間視力の低下（夜盲症）および中間〜周辺視野の喪失を特徴とする。微光視力を担い、網膜周辺部に向けられている桿体光受容細胞は、この疾患の無症候群形態の間に最初に影響を受ける網膜プロセスである。視力低下は、比較的素早く最周辺視野に進行し、視野狭窄を進行させつつ最終的に中心視野におよぶ。視力および色覚は、色覚、視力および中心視野の視界を担う錐体光受容細胞における付随する異常により損なわれ得る。疾患症状の進行は、対称的様式で起こり、左眼と右眼の両方が同程度の症状を経験する。変異した場合に網膜色素変性表現型を引き起こし得る遺伝子は複数存在する。RPの遺伝パターンは、常染色体優性、常染色体劣性、X連鎖性および母方（ミトコンドリア）獲得として特定され、その親世代に存在する特定のRP遺伝子変異に依存する。
【００５７】
スキャホールド：組織支持体、例えば合成性スキャホールド、例えばポリマースキャホールドおよび非合成性スキャホールド、例えば既製細胞外マトリクスまたは脱細胞化器官スキャホールド。スキャホールドは、増殖性細胞の集団により想定される三次元形状または形態に影響を与えるまたはその範囲を区切るように特定の形状または形態を有し得る。この用語はまた、工学的組織の物理的構造に不可欠であり、その組織に損傷を与える／その組織を破壊することなく組織から除去することができない、任意のタイプの既製スキャホールドを表す。いくつかの例において、スキャホールドは、細胞を用いて別々にバイオプリントまたは播種され得る互いに反対側にある側の面を有する薄い三次元基材である。例えば、互いに反対側にある表面は、相互に平行であり得、上から見た場合のスキャホールドの輪郭は、任意の形状、例えば円形、楕円形、卵形または多角形（例えば、正方形などの長方形）であり得る。
【００５８】
したがって、「スキャホールドなし」という用語は、既製のスキャホールドが使用時点で工学的組織の不可欠な部分ではなく、除去されているかまたは工学的組織の不要成分として残っているかのいずれかであることを暗示することが意図されている。「スキャホールドなし」は、「スキャホールド非含有」および「既製スキャホールドを含まない」と言い換え可能に使用される。
【００５９】
幹細胞：適切な条件下で幅広い範囲の特化した細胞型に分化することができ、他方、他の適切な条件下では自己再生し本質的に未分化の多能性状態を維持することができる細胞。「幹細胞」という用語はまた、多能性細胞、多分化能細胞、前駆細胞、および前駆体細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血もしくは間葉幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖組織から得られる胚性生殖細胞から得られるものであり得る。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連する特定の転写因子の発現により多能性状態に再プログラムすることによって体細胞から作製され得；これらの細胞は、「誘導多能性幹細胞」または「iPSC」と呼ばれる。
【００６０】
対象：処置、観察、または実験に供される動物またはヒト。
【００６１】
処置：診断された病理学的状態または障害を治癒する、遅延させる、その症状を減らす、および／またはその進行を停止させる治療的手段。特定の態様において、網膜変性を有する対象の処置は、網膜の悪化の抑制、RPE細胞の数の増加、視力の改善、またはいくつかの効果の組み合わせをもたらす。
【００６２】
野生型：非典型的な変異型と異なり、自然状態の個体間で普及している系統、遺伝子または特徴。一般に、野生型対立遺伝子を有する個体は、その対立遺伝子内の変異に関連する特定の疾患状態を有さない。
【００６３】
それ以外の説明がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって広く理解されているのと同じ意味を有する。単数形の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。同様に、「または/もしくは」という単語は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、「および/ならびに」を含むことが意図されている。さらに、核酸またはポリペプチドについて使用される、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよびすべての分子量（molecular weight）または分子量（molecular mass）値は、近似値であり、説明のために提供されるものであることが理解されるべきである。本開示の実施または試験には、本明細書に記載されているのと同様のまたは同等の方法および材料が使用され得るが、以下には適切な方法および材料が記載されている。「含む（comprise）」という用語は、「含む（include）」を意味する。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。相反する場合、用語の説明を含めて、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
【００６４】
生体適合性スキャホールド
生体適合性スキャホールドが、本明細書に開示される方法において使用される。生体適合性スキャホールドは、合成性生体適合性スキャホールドまたは天然生体適合性スキャホールド、例えば脱細胞化器官スキャホールドを含む。生体適合性スキャホールドは、ポリマー、例えば合成ポリマーを含み得る。
【００６５】
いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドを製造するために使用されるポリマーは、生分解性物質、例えばラクチド／グリコリドポリマーまたはコポリマー、例えば、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化または組換え）である。使用され得るさらなる合成生分解性ポリマーは、ポリ（D-ラクチド）（PDLA）、ポリ（D,L-ラクチド）（PDLLA）、ポリ-p-ジオキサノン（PDO）およびポリトリメチレンカーボネート（PTMC）、ならびにそれらのコポリマー、ならびにポリ無水物、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、「疑似」ポリアミノ酸（例えば、（ポリアリレートおよびポリカーボネート）、ポリエステルアミド（PEA）、ポリホスファゼン、ポリプロピレンフマレート、ならびにポリオルトエステルならびにこれらと相互のコポリマーまたはマルチポリマーならびに1つまたは複数の生分解性成分とそのコポリマーを生分解性にする非再吸収可能成分（例えば、ポリ（ラクチド-コ-エチレンオキシド））を組み合わせた再吸収可能マルチまたはコポリマーを含む。
【００６６】
前記スキャホールドはまた、ポリマーのブレンドを用いて製造され得る。天然（例えば、コラーゲン、エラスチン、ポリ（アミノ酸）および多糖、例えばヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース）ならびに／または合成ポリマーの両方が、スキャホールドを製造するために使用され得る。生体適合性スキャホールドの製造は、例えば、米国特許出願公開第2007/0187857号およびPCT公報番号2014152906に開示されており、両方とも参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
前記生体適合性スキャホールドの吸収率もまた、選択的に制御され得る。例えば、スキャホールドは、望まれる用途によって異なる速度で分解するように製造され得る。治療剤、成長因子、または細胞外マトリクス等の物質が、例えばそれらの物質の水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にスキャホールドを浸漬することによって、スキャホールドの表面上にコーティングされ、その物質がスキャホールド表面に沈着され得る、または物質は、複合材上もしくはスキャホールド上に噴霧、共有結合により架橋または適用され得る。
【００６８】
いくつかの態様において、バイオスキャホールドは、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む。バイオスキャホールドは、PDGLA、PLGA、PLA、PLLA、PGA、PCL、PEG、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、またはコラーゲン（ガラス化もしくは組換え）からなり得る。特定の非限定的な例において、生体適合性スキャホールドは、PDGLAを含むかまたはPDGLAからなる。PDGLAは、架橋型または非架橋型であり得る。具体的で非限定的な例において、PDGLAは、0.6〜1.0の固有粘度を有する。
【００６９】
いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドの半減期は、インビボで移植される場合、約2〜6週間、例えば約2、3、4、5、もしくは6週間、または約4〜約6週間である。いくつかの態様において、RPE細胞および線維芽細胞がインビボで細胞外マトリクス（ECM）を生成するまで障壁構造を維持するために、インタクトな生体適合性スキャホールドが少なくとも2週間、または少なくとも約3週間、または少なくとも約4週間維持される。具体的で非限定的な例において、インタクトな生体適合性スキャホールドは、約2週間維持され、生体適合性スキャホールドの半減期は約4〜約6週間である。
【００７０】
生体適合性スキャホールドは、ポリマー、例えば合成ポリマーを含み得る。ポリマーは、例えば約20〜500 nm径の、ナノメートルスケールの繊維に成形され得るが、繊維はより薄いものであり得る。1つの態様において、繊維は、約20〜約50 nm径である。別の態様において、繊維は、約50〜約100 nm径である。さらなる態様において、繊維は、約100〜約200 nm径である。さらに別の態様において、繊維は、約200〜約300 nm径である。1つの態様において、繊維は、約300〜約400 nm径である。別の態様において、繊維は、約400〜約500 nm径である。さらなる態様において、繊維は、約500〜約700 nm径である。さらに別の態様において、繊維は、約700〜約1000 nm径である。さらなる態様において、繊維は、約1〜約20μm径である。1つの態様において、繊維は、約20〜約40μm径である。別の態様において、繊維は、約40〜約60μm径である。さらなる態様において、繊維は、約60〜約80μm径である。別の態様において、繊維は、約80〜約100μm径である。さらに別の態様において、繊維は、100μm径またはそれ以上である。1つの態様において、スキャホールドは、電解紡糸プロセスを用いたポリマーの押し出しにより形成される。ナノ繊維を製造する他の方法は、当技術分野で使用可能であり周知であり、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2014/0341965号を参照のこと。
【００７１】
前記生体適合性スキャホールドは、少なくとも0.1 MPa〜約500 MPaのヤング係数を有し得、約2μm〜約6μmの範囲の厚みを有し得る、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2014/0234381号を参照のこと。
【００７２】
いくつかの実施において、スキャホールドの厚みは、約2μ〜約45μm、例えば約2μm〜約25μm、例えば2μm〜約10μm、約2μm〜約9μm、約2μm〜約4μM、または約6μm〜約9μmであり得る。しかし、いくつかの実施において、厚みは最大25μmであり得る。具体的で非限定的な例において、生体適合性スキャホールドは、約2〜約3μm厚であり、例えばより高分子量のPDGLA（固有粘度（I.V.）1.0）から製造される。他の態様において、生体適合性スキャホールドは、約6μm〜約9μm厚であり、例えばより低分子量のPDGLA（I.V. 0.6）から製造される。
【００７３】
前記生体適合性スキャホールドは、1日あたり約200μg/mm2〜1日あたり約300μg/mm2の範囲、例えば天然ブルッフ膜の推定拡散率である1日あたり250μg/mm2の拡散率を特徴とし得る。
【００７４】
前記生体適合性スキャホールドは、表面上に分布している孔を有し得る。学説により拘束されないが、孔は、RPE、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞の増殖および分化を支援するために、栄養分が膜を横切って拡散することを可能にし、かつ細胞が膜を横切った細胞外シグナル伝達を通じて連絡することを可能にする。同時に、孔は、好ましくは、細胞が膜を通って遊走または浸潤するのに十分な大きさを有さない。
【００７５】
適切な孔は、約1μm未満の直径を有し得る、例えば、孔は、約0.1〜約1.0μm、例えば0.5〜1μmの範囲のサイズであり得る。いくつかの実施において、孔は、約300〜500 nmの直径の範囲である、例えば、孔は、約250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、または約500 nmであり得る。いくつかの実施において、孔は、約100、200、300、400、500、600、700、800、900 nm径である。いくつかの実施において、孔は、約0.1μm〜2.0μm、約0.3μm〜約1.7μm、約0.5μm〜約1.5μm、または約0.8μm〜約1.0μmである。いくつかの実施において、孔は、約0.5〜約1.0μmまたはそれ未満である。生体適合性スキャホールド内の孔はすべて同じサイズであり得る、または孔は異なるサイズを有し得る。これらの孔サイズは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2011/0004304号に開示されている。
【００７６】
学説により拘束されないが、孔のサイズおよび／または孔の間隔の均一性は、RPE細胞が膜上の均一な層において成長すること、そして重要なことであるが、相互とのタイトジャンクションを形成することを可能にする。いくつかの態様において、孔のサイズおよび間隔は、生体適合性マトリクスの表面上のRPE細胞および内皮細胞の形態を維持する。RPE細胞の1つの機能は、網膜を横断する分子を調節することである。加えて、RPE細胞間のタイトジャンクションは、連続的な障壁を形成する。
【００７７】
したがって、いくつかの実施において、孔は、スキャホールドの表面上に実質的に均等に分布している。孔は、規則的パターンで配列され得る。例えば、孔は、他の孔から約1.0μmの間隔をあけられ得る。いくつかの実施において、孔は、他の孔から少なくとも1.0μmの間隔をあけられ得る。いくつかの実施において、孔は、実質的に円形である。参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2011/0004304号は、孔が、交互に六角形形状または六角形の直線の辺が湾曲した凸形もしくは凹形の辺で置き換えられている変形六角形形状を有し得ることを開示している。孔のクラスタが六角形状に配列されることもある、例えば、6つまたはそれ以上の円形の孔が、それらの重複により凸状の辺を有する変形六角形形状が形成されるように六角形状に配列され得る。より大きな孔サイズは、それにより複数の隣接する細胞が直接相互作用することができその上孔の溝に沿った細胞の整列のための接触誘導を提供する点で有利であり得る。
【００７８】
いくつかの実施において、生体適合性スキャホールドの少なくとも1つの表面は、表面への細胞の接着を助ける1つまたは複数の化合物で処理される。限定ではなく一例として、いくつかの実施において、酸素プラズマ処理が使用される。学説により拘束されないが、これは、生体適合性スキャホールドの表面を親水性表面に変化させる。したがって、バイオインクは、この表面上にプリントされ得る。いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドの1つの表面は、表面への細胞の接着を助ける1つまたは複数の化合物または作用物質、例えば酸素プラズマおよび／またはECMタンパク質で処理される。他の態様において、生体適合性スキャホールドの2つの表面が、表面への細胞の接着を助ける1つまたは複数の化合物、例えば酸素プラズマ処理またはECMタンパク質を用いて処理される。
【００７９】
さらなる態様において、生体適合性スキャホールドの少なくとも1つの表面は、アンカー構造、例えば、非限定的に、細胞外マトリクス、例えばコラーゲン、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、および／もしくはフィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含むよう処理される。
【００８０】
いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドの少なくとも1つの表面は、平滑である（すなわち、数ナノメートルを超えるスケールで幾何学形状を有さない）。平滑な膜上でRPE細胞がタイトジャンクションマーカーの途切れのない膜局在化を伴う特徴的な蜂の巣パターンを形成することが、米国特許出願公開第2014/0234381号に開示されている。細胞の形態は、画像分析によって評価され得る。
【００８１】
細胞
本明細書に開示される方法は、網膜色素上皮（RPE）細胞および内皮細胞、ならびに任意で線維芽細胞および周皮細胞を用いる。細胞は、任意の哺乳動物由来であり得る。細胞は、ヒト、非ヒト霊長類または任意の他の哺乳動物対象、例えばイヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウマ、またはげっ歯類対象由来であり得る。通常、同じ種由来の細胞が用いられる。具体的で非限定的な例において、RPE細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞を含む、本明細書に開示される方法において使用される細胞は、ヒトである。
【００８２】
内皮細胞は、任意の組織、例えば血管から生成され得る。線維芽細胞は、皮膚、脂肪、骨、脈絡膜、および軟骨を含むがこれらに限定されない任意の結合組織に由来し得るか、または幹細胞に由来し得るもしくは任意の他の細胞型から分化転換され得る。周皮細胞は、骨格筋、血管、脳、網膜、および骨髄に由来し得るか、または幹細胞に由来し得るもしくは任意の他の細胞型から分化転換され得る。細胞は、細胞株由来であり得る。
【００８３】
網膜色素上皮（RPE）細胞は、色素沈着、上皮形態、および頂端・基底極性に基づき特徴づけられ得る。分化したRPE細胞は、それらの丸石形態および色素の最初の出現により視覚的に認識することができる。加えて、分化したRPE細胞は、その単層を横切る経上皮抵抗/TERおよび経上皮電位/TEP（TER＞100 ohms.cm2；TEP＞2 mV）を有し、頂端側から基底側に流体およびCO2を輸送し、サイトカインの極性分泌を調節する。RPE特異的マーカーは、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（CRALBP）、小眼球症関連転写因子（MITF）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TYRP-1）、網膜色素上皮特異的65 kDaタンパク質（RPE65）、プレメラノソームタンパク質（PMEL17）、ベストロフィン1（BEST1）、およびc-マープロトオンコジーンチロシンキナーゼ（MERTK）を含み得る。RPE細胞は、胚性幹細胞マーカーOct-4、nanog、またはRex-2を（検出可能なレベルで）発現しない。詳細に、これらの遺伝子の発現は、定量RT-PCRによって評価した場合、ES細胞またはiPSC細胞におけるよりも、RPE細胞においておよそ100〜1000倍低い。
【００８４】
いくつかの態様において、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的血液網膜関門（BRB）を作製するために用いられる細胞はすべて、同じ対象由来である。他の態様において、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的血液網膜関門（BRB）を作製するために用いられる細胞は、異なる対象由来である。いくつかの非限定的な例において、細胞は、HLA一致対象由来または（HLA対立遺伝子を有さない）共通ドナー幹細胞由来である。
【００８５】
細胞供給源としての哺乳動物個体の選択は、特に限定されない。同種異系細胞が使用され得る。
【００８６】
したがって、いくつかの態様において、細胞は、MHC（例えば、HLA）が一致しない。いくつかの態様において、得られた細胞がヒトにおける再生医療のために使用される場合、細胞は、処置される対象または処置される対象と同じまたは実質的に同じHLA型を有する別の対象の体細胞から収集され得る。
【００８７】
「実質的に同じHLA型」は、ドナーの体細胞由来のiPSCの分化を誘導することによって得られる移植細胞が、患者に移植された場合に生着することができる程度に、ドナーのHLA型が患者のそれと一致することを示す。患者は、任意で、免疫抑制剤で処置され得る。1つの例において、それは、主要HLA（例えば、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRの3つの主要遺伝子座、HLA-Cwをさらに含む4つの主要遺伝子座）が同一であるHLA型を含む。これらの細胞は直接使用され得、例えば、RPE細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞が対象から単離され直接使用され得る、または体細胞が、RPE、線維芽細胞、周皮細胞、および／もしくは内皮細胞の生成のためにiPSCもしくはES細胞を生成するために使用され得る。
【００８８】
いくつかの態様において、RPE細胞および内皮細胞、ならびに任意で線維芽細胞および／または周皮細胞は、幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞（iPSC）もしくは別のタイプの幹細胞、例えば胚性幹細胞から生成され得るか、または任意の体細胞から直接的に分化転換され得る。例示的な幹細胞は、胚性、胎盤、臍帯、間葉幹細胞から選択され得る。幹細胞は、当技術分野で公知の方法により、例えば幹細胞を分化培地中で培養することにより、RPE細胞、内皮細胞、線維芽細胞、または周皮細胞に分化するように誘導され得る。
【００８９】
iPSCの作製のための、出発体細胞は、関心対象の任意の細胞であり得る。哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）起源の生殖細胞以外の任意の細胞が、iPSCの作製のための出発物質として使用され得る。例は、特に、角化上皮細胞、粘膜上皮細胞、外分泌腺上皮細胞、内分泌細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、血液および免疫系の細胞、神経細胞およびグリア細胞を含む神経系の細胞、色素細胞、ならびに造血幹細胞を含む前駆体細胞を含む。細胞の分化度、細胞を収集する動物の年齢等に制限はなく、未分化の前駆体細胞（体性幹細胞を含む）および最終分化した成熟細胞さえも、本発明における体細胞の供給源として同様に使用され得る。1つの態様において、体細胞は、それ自体がRPE細胞、例えばヒトRPE細胞である。RPE細胞は、成体または胎児RPE細胞であり得る。したがって、いくつかの態様において、体細胞は、妊娠約9週〜約38週、例えば妊娠約9週〜約16週、妊娠約17週〜約25週、約16〜約19週、または妊娠約26週〜約38週のヒト胎児から得られる胎児性ヒトRPE細胞である。この文脈において「約」は、2日以内を意味する。
【００９０】
哺乳動物から単離された体細胞は、核再プログラムの工程に供される前に、細胞の選択にしたがいそれらの培養に適していることが分かっている培地を用いてプレ培養され得る。そのような培地の具体的で非限定的な例は、約5〜20％仔ウシ胎仔血清（FCS）を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地等を含むがこれらに限定されない。当業者は、哺乳動物、例えばヒト由来の特定の細胞型を増殖させるのに適した組織培養条件を容易に特定することができる。いくつかの態様において、完全異種フリーのヒトiPSCを得るために、培地は、非ヒト動物由来の成分、例えばFCSを排除し得る。様々な体細胞の培養に適したヒト由来成分（特に、組換えヒトタンパク質、例えば成長因子）、非必須アミノ酸、ビタミン等を補充された基本培地を含む培地が市販されており、当業者は体細胞の供給源にしたがい適切な異種フリー培地を選択することができる。異種フリー培地を用いてプレ培養された体細胞は、適切な異種フリー細胞分離溶液を用いて培養容器から分離および回収され、その後にそれらは核再プログラム物質と接触させられる。
【００９１】
一般に、細胞は、以下にそれ以外のことが具体的に示されていない限り、約4〜6％CO2中、一般に5％CO2の下で、約35〜38℃で、通常37℃で培養される。
【００９２】
体細胞は、当業者に公知の方法を用いて、誘導多能性幹細胞（iPSC）を生成するように再プログラムされ得る。当業者は、誘導多能性幹細胞を容易に作製することができる、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20090246875号、米国特許出願公開第2010/0210014号、米国特許出願公開第20120276636号、米国特許第8,058,065号、米国特許第8,129,187号、米国特許第8,278,620号、PCT公報番号WO2007/069666A1、および米国特許第8,268,620号を参照のこと。一般に、核再プログラム因子は、体細胞から多能性細胞を生成するために使用される。いくつかの態様において、Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog、およびLin28の少なくとも3つ、または少なくとも4つが用いられる。他の態様において、Oct3/4、Sox2、c-Myc、およびKlf4が用いられる。
【００９３】
iPSCの作製のために、細胞は、一般に体細胞からiPSCを誘導することができる1つまたは複数の因子である核再プログラム物質またはこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）で処理される。核再プログラム物質は、一般に、少なくともOct3/4、Klf4、およびSox2またはこれらの分子をコードする核酸を含む。p53の機能的阻害因子であるL-mycまたはL-mycをコードする核酸、ならびにLin28もしくはLin28bまたはLin28もしくはLin28bをコードする核酸が、さらなる核再プログラム物質として用いられ得る。Nanogもまた、核再プログラムに用いられ得る。米国特許出願公開第20120196360号に開示されるように、iPSCの作製のための例示的な再プログラム因子は、（1）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc（Sox2はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、もしくはSox18で置き換え可能；Klf4はKlf1、Klf2、もしくはKlf5で置き換え可能）；（2）Oct3/4、Klf4、Sox2、L- Myc、TERT、SV40ラージT抗原（SV40LT）；（3）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、ヒトパピローマウイルス（HPV）16 E6；（4）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16 E7  （5）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7；（6）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、Bmi1；（7）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28；（8）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28、SV40LT；（9）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28、TERT、SV40LT；（10）Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、SV40LT；（11）Oct3/4、Esrrb、Sox2、L-Myc（EsrrbはEsrrgで置き換え可能）；（12）Oct3/4、Klf4、Sox2；（13）Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、SV40LT；（14）Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E6；（15）Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E7；（16）Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7；（17）Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、Bmi1；（18）Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28  （19）Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、SV40LT；（20）Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、TERT、SV40LT；（21）Oct3/4、Klf4、Sox2、SV40LT；または（22）Oct3/4、Esrrb、Sox2（EsrrbはEsrrgで置き換え可能）を含む。1つの非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、Sox2、およびc-Mycが用いられる。他の態様において、Oct4、Nanog、およびSox2が用いられる、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,682,828号を参照のこと。これらの因子は、Oct3/4、Klf4、およびSox2を含むがこれらに限定されない。他の例において、これらの因子は、Oct 3/4、Klf4、およびMycを含むがこれらに限定されない。いくつかの非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、c-Myc、およびSox2が用いられる。他の非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、Sox2、およびSal 4が用いられる。
【００９４】
これらの核再プログラム物質のマウスおよびヒトcDNA配列は、参照により本明細書に組み入れられるPCT公報番号WO 2007/069666で言及されているNCBIアクセッション番号を参照して入手可能である。1つまたは複数の再プログラム物質またはこれらの再プログラム物質をコードする核酸を導入するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2012/0196360号および米国特許第8,071,369号に開示されている。
【００９５】
核再プログラム物質と共に培養された後、細胞は、例えば、ES細胞を培養するのに適した条件下で培養され得る。マウス細胞の場合、培養は、分化抑制因子として白血病抑制因子（LIF）を一般的な培地に添加して行われる。ヒト細胞の場合、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を添加するのが望ましい。
【００９６】
iPSCは、その後、分化するように、例えば、関心対象の特定の細胞型を形成するように誘導され得る。iPSCからRPEを生成するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられるPCT出願番号PCT/US2016/050543および公開されたPCT出願番号WO2014/121077を参照のこと。iPSCおよび胚性幹細胞から線維芽細胞、内皮細胞、および周皮細胞を生成するための方法は、例えば、すべて参照により本明細書に組み入れられる、Orlova et al. (2014) Nature protocols, 9(6), 1514-1531; Kusuma and Gerecht (2016) Human Embryonic Stem Cell Protocols, 213-222. Patsch et al., (2015) Nature Cell Biology, 17(8), 994; Hewitt et al., PLoS One_2011 Feb 28;6(2):e17128. doi: 10.1371/journal.pone.0017128に開示されている。
【００９７】
いくつかの態様において、RPE、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、ES細胞から生成され得る。ES細胞からRPE、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞を生成するための方法は、例えば、すべて参照により本明細書に組み入れられる、Levenberg et al. (2002) Proceedings of the National Academy of Sciences 99(7), 4391-4396; Wang et al., (2007) Nature Biotechnology 25(3), 317-318; Idelson et al. (2009) Cell Stem Cell 5(4), 396-408; Klimanskaya et al. (2004) Cloning and Stem Cells 6(3), 217-245; Togo et al., In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011 Feb;47(2):114-24. doi: 10.1007/s11626-010-9367-2. Epub 2010 Nov 25に開示されている。
【００９８】
他の態様においては、細胞株が用いられる。細胞株の例は、BEST-4、82-6、AMD-CD、およびAS10細胞である。
【００９９】
いくつかの態様において、IPSCは、健常対象から生成される、他の態様において、iPSCは、特定の疾患、例えばAMD、ベスト病、L-ORD病、高IgE症候群、nemo欠損症候群、またはソースビー眼底ジストロフィーを有する対象から生成され得る。これらのiPSCが、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、およびRPE細胞を生成するために使用され得る。
【０１００】
ヒドロゲル
ヒドロゲルと、細胞、例えば内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、およびRPE細胞とを含む、バイオインクが、本明細書に開示される。いくつかの態様において、バイオインクは、ヒドロゲルおよび内皮細胞を含む。他の態様において、バイオインクは、ヒドロゲルおよび内皮細胞、ならびに周皮細胞および／または線維芽細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、ヒドロゲルおよびRPE細胞を含む。
【０１０１】
前記ヒドロゲルは、天然ポリマーまたは合成（非天然）ポリマーを含み得る。ヒドロゲルは、非生分解性ヒドロゲル、天然生分解性ヒドロゲルおよび／または合成生分解性ヒドロゲルであり得る。ヒドロゲルは、一般に、液体を吸収することができ、平衡状態で、典型的に、60〜90％の液体および10〜30％のみのポリマーから構成される。1つの態様において、ヒドロゲルの含水量は、約70〜80％である。一般に、ヒドロゲルは、生体適合性である。
【０１０２】
分子量、ブロック構造、分解可能な連結、および架橋様式を変更することで、ヒドロゲルの強度、弾力性および分解特性に影響を及ぼすことができる（Nguyen and West, 2002, Biomaterials 23(22):4307-14; Ifkovits and Burkick, 2007, Tissue Eng.13(10):2369-85）。ヒドロゲルはまた、様々なタンパク質（例えば、コラーゲン）または化合物、例えば治療剤の共有結合付加のための官能基により修飾され得る。ヒドロゲルに組み込まれ得る分子は、糖タンパク質、フィブロネクチン；ペプチドおよびタンパク質；炭水化物（単純および／または複合の両方）；プロテオグリカン；抗原；オリゴヌクレオチド（センスおよび／またはアンチセンスDNAおよび／またはRNA）；抗体および成長因子を含むがこれらに限定されない。1つの態様において、ヒドロゲルは、そのヒドロゲル中またはヒドロゲル上で培養される場合に細胞、例えば内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、または網膜色素上皮細胞の成長および増殖を助ける分子を含む。そのような分子の非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、サプリメント、低分子阻害剤、グリコサミノグリカン、成長因子、核酸配列、およびそれらの組み合わせを含み得る。これらの分子は、成長因子であり得る。
【０１０３】
前記ヒドロゲルは、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせであり得る。具体的で非限定的な例において、ヒドロゲルは、コラーゲンベースのヒドロゲルである。他の態様において、ヒドロゲルは、インビボまたはインビトロで細胞が増殖できるように十分に遅い速度で分解する生分解性物質から製造される。市販のヒドロゲルは、MATRIGEL（登録商標）およびNOVOGEL2（登録商標）を含むがこれらに限定されない。
【０１０４】
特定の態様において、ヒドロゲルは、自己集合ペプチド、フィブリン、アルギネート、アガロース、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、キトサン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレンオキシド（PEO）、ポリ（エチレングリコール）（PEG）、I型コラーゲン、II型コラーゲンヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる態様において、ヒドロゲル組成物は、以下から選択されるヒドロゲルを含む：自己集合ペプチド、フィブリン、アルギネート、アガロース、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、キトサン、コンドロイチン硫酸、I型コラーゲン、II型コラーゲン、およびそれらの組み合わせ。さらなる態様において、ヒドロゲルは、ゼラチン、アルギン酸、キチン、キトサン、デキストラン、ポリアミノ酸、ポリリジン、およびこれらの物質のコポリマーから選択される生体吸収性物質を含む。
【０１０５】
前記ヒドロゲルは、αヒドロキシルポリエステルから作製され得る。例示的なヒドロゲルは、米国特許出願公開第2007/0098675号および米国特許出願公開第2010/0179659号に開示されており、両方とも参照により本明細書に組み入れられる。1つの態様において、ヒドロゲルは、ゼラチンを含む。ゼラチンヒドロゲルは、例えば、参照により本明細書に組み入れられるLin et al., Tissue Engineering Part A, DOI: 10.1089/ten.tea.2013.0642, 2014に開示されている。さらなる態様において、ヒドロゲルは、ヒアルロナンを含む。ヒドロゲルは、ゼラチンおよびヒアルロナンを含み得る。
【０１０６】
ヒドロゲルは、親水性バイオポリマーまたは合成ポリマーを架橋することによって調製され得る（参照により本明細書に組み入れられるPCT出願番号WO 2013/040559を参照のこと）。親水性バイオポリマーの物理的または化学的架橋により形成されるヒドロゲルの例は、ヒアルロナン、キトサン、アルギネート、コラーゲン、デキストラン、ペクチン、カラゲナン、ポリリジン、ゼラチン、および／またはアガロースを含むがこれらに限定されない（W. E. Hennink and C. F. van Nostrum, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 54, 13-36 and A. S. Hoffman, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 43, 3-12を参照のこと）。これらの物質は、直鎖状または分枝状の多糖またはポリペプチドから生成される高分子量骨格鎖からなる。
【０１０７】
合成ポリマーの化学的または物理的架橋に基づくヒドロゲルの例は、（メタ）アクリレート-オリゴラクチド-PEO-オリゴラクチド-（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）（PEO）、ポリ（プロピレングリコール）（PPO）、PEO-PPO-PEOコポリマー（プルロニクス）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（N-ビニルピロリドン）、PL(G)A-PEO-PL(G)Aコポリマー、ポリエチレンイミン）等を含むがこれらに限定されない（A. S Hoffman, Adv. Drug Del. Rev, 43, 3-12, 2002を参照のこと）。これらのヒドロゲルは、フィブロネクチン、ラミニン、またはビトロネクチンにより修飾され得る。
【０１０８】
特定の態様において、1つまたは複数の多官能性架橋剤が、バイオポリマーまたは合成ポリマーを共有結合により連結する反応性部分として用いられ得る。そのような二官能性架橋剤は、グルタルアルデヒド、エポキシド（例えば、ビス-オキシラン）、酸化型デキストラン、p-アジドベンゾイルヒドラジド、N-[a.-マレイミドアセトキシ]スクシンイミドエステル、p-アジドフェニルグリオキサル一水和物、ビス-[-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド、ビス[スルホスクシンイミジル]スベレート、ジチオビス[スクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、および当業者に公知の他の二官能性架橋試薬を含み得る。
【０１０９】
無水メタクリル酸、塩化メタクリロイル、およびメタクリル酸グリシジルは、ポリマーの1つまたは複数の単量体にメタクリレート基を付加するために使用され得る。メタクリル酸グリシジルは、例えば反応効率化のために使用され得る。
【０１１０】
重合開始因子は、電気化学的照射を含む。重合の開始は、例えば380〜740 nm、例えば約350〜約700 nm、例えば約514 nm〜約365 nmの間、例えば約380 nmの可視光の照射により達成され得る。いくつかの態様において、光の強度は、約10 mW/cm3である。いくつかの態様において、重合はまた、紫外線光、例えばUVA、UVBおよび／またはUVC光による架橋を含み得る。
【０１１１】
架橋されたポリマーマトリクス、例えばヒドロゲルの機械的特性は、孔構造にも関連し得る。望まれる臨床用途に依存して異なる機械的特性を有するヒドロゲルが望まれ得る。
【０１１２】
架橋剤を用いる1つの態様において、ポリアクリル化物質、例えばエトキシ化（20）トリメチルプロパントリアクリレートが、光活性化架橋剤として使用され得る。例示的な反応混合物の成分は、39℃で維持された熱可逆性ヒドロゲル、ポリアクリレート単量体、例えばエトキシ化（20）トリメチルプロパントリアクリレート、光開始因子、例えばエオシンY、触媒剤、例えば1-ビニル-2-ピロリドンおよびトリエタノールアミンを含み得る。この反応混合物を長波長光（＞498 nm）に曝露することにより、架橋されたヒドロゲルが生成される。
【０１１３】
いくつかの態様において、ヒドロゲルは、メタクリル化ゼラチンヒドロゲル、例えばメタクリル化ヒアルロナン（ヒアルロン酸）ヒドロゲルである。ヒドロゲルは、メタクリル化ゼラチンおよびメタクリル化ヒアルロナンの混合物であり得る。ヒドロゲルは、ゼラチンヒドロゲル、例えばメタクリル化ゼラチン、および／または可視光により光架橋されたメタクリル化ヒドロゲルであり得る。
【０１１４】
光架橋ゼラチンは、可視光を用いて架橋され得る。適切なヒドロゲルは、例えば、Lin et al., Application of visible light-based projection stereolithography for live cell scaffold fabrication with designed architecture, Biomaterials. 2013 Jan; 34(2): 331-9. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.09.048. Epub 2012 Oct 22およびLin et al., Cartilage Tissue Engineering Application of Injectable Gelatin Hydrogel with In Situ Visible-Light-Activated Gelation Capability in both Air and Aqueous Solution, Tissue Eng Part A. 2014 Apr 9に開示されており、両方とも参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
ヒドロゲルは、1つまたは複数の増強剤の添加によってさらに安定化および増強され得る。増強剤は、高分子量成分に加えて、ヒドロゲルマトリクスに添加される、さらなる安定性または機能的優位性を提供することによってヒドロゲルマトリクスを増強する任意の化合物を含む。これらは、例えば、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、天然コラーゲンおよび二価カチオンキレーター、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはそれらの塩を含む。極性アミノ酸は、チロシン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含むことが意図される。具体的で非限定的な例において、L-システイン、L-グルタミン酸、L-リジン、および／またはL-アルギニンの1つまたは複数が用いられる。増強剤は、高分子量成分の架橋前または架橋中にヒドロゲル組成物に添加され得る。
【０１１６】
当技術分野で公知の安定化剤が、組成物に加えられ得る。緩衝液、酸、および塩基は、それらのpHを調節するために組成物に加えられ得る。組成物から放出される作用物質の拡散距離を増大させる作用物質も加えられ得る。
【０１１７】
ヒドロゲルに含めるために、細胞、例えば線維芽細胞、周皮細胞、および内皮細胞、または網膜色素上皮（RPE）細胞は、増加し得る。例えば、ヒドロゲルに含めるために、関心対象の細胞は、トリプシン-EDTAで処理することによって培養容器の表面から剥離され、次いで収集される。細胞懸濁物を生成するために、培養溶液が収集された細胞に添加される。高い細胞密度の細胞を提供するため、細胞を収集する際または収集した後に遠心分離が行われ得る。遠心分離の一般的な条件は、30g〜500gおよび1〜10分間を含む。いくつかの態様において、クローニングリングまたはクローニングシリンダを使用して細胞懸濁物をヒドロゲル上で維持し、播種の間に細胞懸濁物がヒドロゲルから流れ落ちないようにする。
【０１１８】
バイオインク
本明細書に記載される組織、アレイ、および方法は、三次元工学的BRB構造体を生成するためにバイオインク配合物およびバイオプリント法を用いる。特定の態様において、バイオプリントは、生体適合性スキャホールドの表面への1つまたは複数のバイオインクの適用を含む。バイオインクは、培地およびヒドロゲルを含み得る。いくつかの態様において、バイオインクはまた、フィブリノゲンを含む。いくつかの態様において、バイオインクは、内皮細胞、ならびに任意で周皮細胞および／または線維芽細胞を含む。いくつかの態様において、バイオインクは、網膜色素上皮細胞を含み得る。
【０１１９】
前記プリント法は、網膜の天然BRBを模倣する層またはコンパートメントを形成する幾何学形状を生成するためにバイオインクを用いる。様々な態様において、バイオインクは、一定比率の内皮細胞、ならびに任意で周皮細胞および線維芽細胞の細胞混合物を含み、かつヒドロゲルを含む（上記参照）。他の態様において、バイオインクは、RPE細胞を含み、かつヒドロゲルを含む。特定の態様において、バイオインクは、特定の細胞型、例えば内皮細胞またはRPE細胞のいずれかから本質的になり、かつ培地およびヒドロゲルを含む。この文脈において「本質的になる」は、指定された細胞型が、存在する唯一の細胞型であるが、そのバイオインクは、押し出し化合物、ヒドロゲル、細胞外マトリクス成分、栄養および培地成分、無機および有機塩、酸および塩基、緩衝化合物、ならびに細胞の生存、接着、成長を促進するまたはプリント工程を容易にする他の非細胞成分を含むがこれらに限定されない他の非細胞物質を含み得ることを意味する。
【０１２０】
いくつかの態様において、バイオインクは、粘性の液体である。他の態様において、バイオインクは、半固体である。さらなる態様において、バイオインクは、半固体または固体である。具体的で非限定的な例において、バイオインクの粘度は、100センチポアズ超、200センチポアズ超、500センチポアズ超、1,000センチポアズ超、2,000センチポアズ超、5,000センチポアズ超、10,000センチポアズ超、20,000センチポアズ超、50,000センチポアズ超、または100,000センチポアズ超である。他の非限定的な例において、バイオインクの粘度は、100センチポアズ未満、200センチポアズ未満、500センチポアズ未満、1,000センチポアズ未満、2,000センチポアズ未満、5,000センチポアズ未満、10,000センチポアズ未満、20,000センチポアズ未満、50,000センチポアズ未満、または100,000センチポアズ未満であり、バイオインクおよびヒドロゲルの詳細について、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2016/0122723号を参照のこと。
【０１２１】
いくつかの態様において、バイオインクは、容量で50％超の生細胞を含む。他の態様において、バイオインクは、容量で60％超の生細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、容量で70％超の生細胞を含む。さらに他の態様において、バイオインクは、容量で80％超の生細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、容量で90％超の生細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、容量で95％超の生細胞を含む。
【０１２２】
いくつかの態様において、バイオインクは、エアゾール噴霧法により生体適合性スキャホールド上の層として適用され得る。他の態様において、バイオインクは、押し出し法により層または個別のコンパートメントとして適用され得る。
【０１２３】
他の態様において、バイオインクは、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞、例えば、1ミリリットルあたり約500万〜約2000万個の内皮細胞、1ミリリットルあたり約500万〜約1500万個の内皮細胞、1ミリリットルあたり約500万〜約1000万個の内皮細胞、または1ミリリットルあたり約500万〜約600万個の内皮細胞を含む。1つの非限定的な例において、1ミリリットルあたり約550万の内皮細胞が、バイオインクに含められる。他の非限定的な例において、バイオインクは、1ミリリットルあたり約500万、550万、600万、650万、700万、750万、800万、900万、1000万、1500万、2000万、2500万、または3000万個の内皮細胞を含む。
【０１２４】
さらなる態様において、線維芽細胞および／または周皮細胞が、バイオインクに含まれる。いくつかの態様において、バイオインクは、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞、例えば、1ミリリットルあたり約1000万〜約4000万個の線維芽細胞、1ミリリットルあたり約1000万〜約3000万個の線維芽細胞、1ミリリットルあたり約1000万〜約2000万個の線維芽細胞、または1ミリリットルあたり約1000万〜約1500万個の線維芽細胞を含む。1つの非限定的な例において、1ミリリットルあたり約1000万個の線維芽細胞が、バイオインクに含まれる。他の非限定的な例において、バイオインクは、1ミリリットルあたり約1500万、2000万、2500万、3000万、4000万、4500万、または5000万個の線維芽細胞を含む。さらに他の態様において、バイオインクは、約50万個〜約300万個の周皮細胞、例えば、1ミリリットルあたり約50万個〜約250万個の周皮細胞、1ミリリットルあたり約50万個〜約200万個の周皮細胞、1ミリリットルあたり約50万個〜約100万個の周皮細胞、または1ミリリットルあたり約50万個〜約75万個の周皮細胞を含む。具体的で非限定的な例において、バイオインクは、1ミリリットルあたり約50万個、60万個、70万個、80万個、90万個、100万個、200万個、または300万個の周皮細胞を含む。
【０１２５】
他の態様において、バイオインクは、1ミリリットルあたり約500万個〜約3000万個の内皮細胞、1ミリリットルあたり約1000万個〜約5000万個の線維芽細胞、および1ミリリットルあたり約50万個〜約300万個の周皮細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞をそれぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で含む。具体的で非限定的な例において、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、それぞれ1：2：0.5または1.1：2：0.5の比でバイオインク中に存在する。
【０１２６】
例えば1ミリリットルあたり約50万個〜約5000万個のRPE細胞を含む、RPE細胞を含むバイオインクもまた作製され得る。いくつかの態様において、バイオインクは、1ミリリットルあたり100万個〜約4000万個のRPE細胞、例えば、1ミリリットルあたり約200万個〜約3000万個のRPE細胞、または1ミリリットルあたり約500万個〜約2000万個のRPE細胞を含む。バイオインクは、1ミリリットルあたり50万個、75万個、100万個、125万個、150万個、175万個、200万個、300万個、400万個、500万個、600万個、700万個、800万個、900万個、1000万個、1500万個、2000万個、2500万個、3000万個、3500万個、4000万個、4500万個、または5000万個のRPE細胞を含み得る。
【０１２７】
非細胞性バイオインクもまた、本明細書に開示される方法において使用され得る。これらのバイオインクは、生細胞を、例えば内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、およびRPE細胞を含まない。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、細胞外マトリクスタンパク質またはペプチド、例えばコラーゲンもしくはフィブリノゲン、ヒアルロネート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギネート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、多糖、フィブリノゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ゴム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドゲン、糖タンパク質、例えばコンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ケラチン硫酸、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、デコリン、アグリカン、ペルレカンまたはそれらの任意の組み合わせを含み得るグリコサミノグリカン（GAG)およびプロテオグリカンを含む。他の態様において、バイオインクは、適切なヒドロゲル、例えば合成ポリマーである。適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせ由来のものを含むがこれらに限定されない。様々な具体的態様において、閉じ込め材（confinement material）は、ヒドロゲル、NOVOGEL（登録商標）アガロース、アルギネート、ゼラチン、MATRIGEL（登録商標）、ヒアルロナン、ポリキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピル n-ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート（PEG-DA）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルクまたはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、ヒドロゲルまたは他の支持材、クッション材または閉じ込め材を含む。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、無機または合成ポリマーを含まない。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、死細胞残屑を含まない。
【０１２８】
製造方法
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的血液網膜関門（BRB)を製造するための方法が、本明細書に開示される。一般に、この方法は、生体適合性マトリクスの1つの表面上に、内皮細胞を含むバイオインクを堆積させる工程、およびそのマトリクスが内皮細胞とRPE細胞の間に存在するように、生体適合性マトリクスのシートの第2の（例えば、反対側の）表面上に、任意でバイオインク中の、RPE細胞を堆積させる工程を含む。例えば生体適合性スキャホールドの表面上において、バイオプリントされたまたはそうでなければ堆積された細胞に対してさらなる培養用培地を提供するように、非細胞性バイオインクが任意で、該表面に堆積され得る。
【０１２９】
前記細胞および前記生体適合性マトリクスは、生体適合性マトリクスが内皮細胞とRPE細胞の間に存在するように積層表面を形成し、それによって積層構造を形成する。したがって、三次元工学的血液網膜関門（BRB)は、各平面に細胞が存在するようにx、y、およびz平面に延びている独立した構造体であり、かつ、内皮細胞およびRPE細胞の両方を含む。この三次元構造体は、任意の適切な形状であり得、組織が任意の適切な形状、例えば長方形（例えば、正方形）、卵形、楕円形、円形、台形、ひし形、球形、立方形等であり得ることを含む。
【０１３０】
バイオプリントされた組織は、三次元送達デバイス（例えば、バイオプリンタ）による生体適合性支持体への細胞溶液、細胞懸濁物、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体（例えば、円柱、球体、リボン等）、および任意で閉じ込め材を含む細胞の二次元または三次元自動コンピュータ支援堆積に基づく高速プロトタイピング技術を用いる方法を用いて作製される。開示されるBRBは、それらが、コンピュータスクリプトにしたがいコンピュータ支援デバイス（例えば、バイオプリンタ）により三次元構造体を形成するように細胞、細胞溶液、細胞懸濁物、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞凝集物、およびそれらの層が配置された組織である点で、「工学的」である。さらなる態様において、コンピュータスクリプトは、例えば、1つまたは複数のコンピュータプログラム、コンピュータアプリケーションまたはコンピュータモジュールである。なおさらなる態様において、場合によっては初期形態形成における自己集合現象に類似している、細胞のプリント後接着によって、三次元組織構造体が形成される。
【０１３１】
生体適合性スキャホールド上に細胞および／またはその層を配置して三次元構造体を生成するために、手作業による配置を含む多くの方法が使用可能であるが、自動コンピュータ支援機器、例えばバイオプリンタによる配置が有利である。例えば、開示される方法は、細胞、多細胞凝集物および／または層の計画的または既定の配向またはパターンを示す構築物を作製するための細胞の高速で正確でありかつ再現性のある設置を提供し得る。いくつかの態様において、この方法は、細胞の損傷を最小化しつつ高い細胞密度を提供する。
【０１３２】
バイオプリントは、例えば、本開示と相反しない程度まで参照により本明細書に組み入れられる米国公開出願番号2016/0122723に開示される。いくつかの態様において、バイオプリンタは、連続的および／または実質的に連続的である。連続バイオプリント法の非限定的な例は、バイオインクのリザーバに接続された射出口（例えば、シリンジ、ニードル、毛細管等）を通じてバイオプリンタからバイオインク（すなわち、細胞、賦形剤もしくは押し出し化合物と組み合わされた細胞、または細胞の凝集物）を射出するものである。さらなる非限定的な態様において、連続バイオプリント法は、機能的単位の繰り返しパターンで細胞を射出するものである。様々な態様において、繰り返される機能単位は、例えば円形、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則幾何学形状を含む任意の適切な幾何学形状を有し、それによって別個のバイオインクおよび／または間隙の空間的パターン配置によって達成される平面的な幾何学形状を有する1つまたは複数の組織層を生成する。さらなる態様において、バイオプリントされる機能単位の繰り返しパターンは、層状の幾何学形状を有する工学的組織または器官を形成するように隣接して（積み重ねられて）バイオプリントされる層および複数の層を含む。様々な態様において、少なくとも2つの層が、工学的組織を形成するようにバイオプリントされる。さらなる態様において、組織の1つまたは複数の層は、層状の幾何学形状および平面的な幾何学形状を有するように形成される。層は、互いに接していてもよいもしくは基材の互いに反対側にある面上に存在してもよいか、または複数層として基材の一方もしくは両方の面上に存在してもよい。
【０１３３】
いくつかの態様において、バイオプリント法は、不連続的である。不連続バイオプリントの非限定的な例は、バイオインクまたは細胞が射出されると、バイオインクまたは細胞の流れが一定期間停止、中断され、その後再度開始される。これは、細胞のバイオプリントにおいて、異なるバイオインクもしくは細胞、または同じバイオインクもしくは細胞を、遅延をはさんで積層することを可能にし得る。いくつかの態様において、不連続バイオプリントは、エアゾール噴霧技術を用いて細胞を既存の組織層または表面に適用するエアゾール噴霧型のバイオプリントを用いて達成される。いくつかの態様において、バイオインクは、内皮細胞、ならびに任意で線維芽細胞および／または周皮細胞を含み得る。他の態様において、バイオインクは、RPE細胞を含み得る。いくつかの態様において、細胞またはバイオインクの単一層または複数層が堆積され、その後に細胞またはバイオインクの単一層または複数層の堆積に一時的遅延が加えられる。任意のバイオインクが、押し出し（連続もしくは不連続）または噴霧（インクジェットもしくはエアゾール噴霧）により堆積され得る。
【０１３４】
特定の態様において、内皮細胞ならびに任意で線維芽細胞および周皮細胞を含む、第1のバイオインクは、押し出しにより生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される。他の態様において、第1のバイオインクは、噴霧により生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される。特定の態様において、RPE細胞を含む第2のバイオインクが、噴霧により生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される。さらなる態様において、RPE細胞を含む第2のバイオインクは、押し出しにより生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される。特定の態様において、非細胞性マトリクスバイオインクを含む第3のバイオインクが、噴霧により表面、例えば生体適合性マトリクスの同じ表面上に堆積される。他の態様において、非細胞性マトリクスバイオインクを含む第3のバイオインクは、押し出しにより表面、例えば生体適合性マトリクスの同じ表面上に堆積される。
【０１３５】
第3のバイオインクは、任意で、第1のバイオインクが適用されていないまたは第2のバイオインクが適用されていない生体適合性スキャホールドの表面上の空隙部に堆積され得る。いくつかの態様において、内皮細胞ならびに任意で線維芽細胞および周皮細胞を含む、バイオインクが、生体適合性スキャホールドの1つの表面上に堆積される。任意で、第3の非細胞性バイオインクは、堆積された第1のバイオインクの間に生じる空間に堆積される。
【０１３６】
本明細書に開示される任意のバイオインクは、上記の任意のヒドロゲルを含み得る。例示的なヒドロゲルは、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、ラミニンヒドロゲルまたはゼラチンメタクリロイルヒドロゲルを含むがこれらに限定されない。1つの態様において、ヒドロゲルは、フィブリンを含む。いくつかの態様において、複数のタイプのヒドロゲルおよび複数のバイオプリント用ヘッドを用いて、バイオプリント後に、プリントされた組織内にプリメイドチャネルが作製され得る。例えば、特定温度以上で溶解するヒドロゲルがバイオプリントされ得、その後にその温度で溶解しない別のヒドロゲルが、その前にプリントされた構造体を取り囲むように、バイオプリントされる。プリントされた組織が、例えば、非限定的に、37℃等の温度で、インキュベートされる場合、温度感受性ヒドロゲルは溶解し、溶解した空間が、かん流を補助する「チャネル」になる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Kolesky et al. PNAS 2016 113(12) 3179-3184 (March 7, 2016, doi: 10.1073/pnas.1521342113)参照のこと）。
【０１３７】
いくつかの態様において、この方法は、a. ヒドロゲルが生体適合性スキャホールドの第1の表面に付着するように、内皮細胞を含むヒドロゲルと第1の培地とを含む第1のバイオインクを生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；b. 内皮細胞が血管を形成することができるように、堆積した第1のバイオインクを、第2の培地中で少なくとも4日間（例えば、5日間または1週間）成熟させる工程；c. 生体適合性スキャホールドが内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、生体適合性スキャホールドの第2の表面上に単一細胞層を形成するために第3の培地中に網膜色素上皮細胞を堆積させる工程であって、生体適合性スキャホールドの第1の表面および第2の表面が互いに反対側にある表面である、工程；ならびにd. 堆積した網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように該網膜色素上皮細胞を第3の培地中で培養する工程を含む。
【０１３８】
三次元工学的BRBを製造する例示的な方法を示すフローチャートが、図12に示されている。いくつかの態様において、バイオインクの1つまたは複数、例えば第1のバイオインクは、フィブリノゲンを含む。したがって、フィブリノゲン鎖を不溶性の鎖に変換する有効量のトロンビンを含む第1の培地が、細胞のためのバイオインクで用いられ得る。堆積される内皮細胞、ならびに任意で線維芽細胞および周皮細胞（バイオインクに含められる場合）は、その後、有効量のトロンビンを含まない増殖培地中で培養される。
【０１３９】
いくつかの態様において、第1の培地および／または第2の培地は、血管内皮成長因子（VEGF）、アンギオポエチン-1（ANG-1）、アプロチニン、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）および線維芽細胞成長因子（FGF）の1つまたは複数の有効量を含む。したがって、第1の培地および第2の培地は、これらの因子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべてを含み得る。具体的で非限定的な例において、第1および第2の培地は、これらの因子のすべてを含む。EGFの例示的な濃度は、1〜50 ng/mlである。FGFの例示的な濃度は、1〜1,000 ng/mlであり、IGF-1の例示的な濃度は、1〜500 ng/mlである。これらの因子を含む例示的な培地は、以下に開示されている。いくつかの態様において、第1および第2の培地は、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、アンギオポエチン1、IGF、EGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン、およびアプロチニンを含む。具体的で非限定的な例において、第1の培地および／または第2の培地は、1〜1,000 ng/mlのVEGF、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む。他の具体的で非限定的な例において、第1の培地および／または第2の培地は、100 ng/ml ANG-1、0.075 U/mlアプロチニンを含む。さらなる態様において、培地は、EFG、IGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、およびヘパリン硫酸の有効量を含む。さらなる態様において、第1の培地および／または第2の培地は、トロンビン、例えば0.5 U/ml〜10 U/ml、例えば0.5 U/mlまたは1 U/mlを含む。
【０１４０】
上記に開示される生体適合性スキャホールドのいずれかが、開示される方法において使用され得る。具体的で非限定的な例において、第1のバイオインクは、PDGLA、PLGA、PLA、PLLA、PGA、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む生体適合性スキャホールド上に堆積される。生体適合性スキャホールドは、PDGLAを含み得るかまたはPDGLAからなり得る。任意で、PDGLAは、架橋され得る。
【０１４１】
さらなる態様において、生体適合性スキャホールドは、少なくとも1つの表面の疎水性を増加させるように処理される。いくつかの例において、生体適合性スキャホールドの1つの表面が、疎水性を増加させるように処理される。他の態様において、生体適合性スキャホールドの2つの表面が、疎水性を増加させるように処理される。いくつかの例において、生体適合性スキャホールドは、酸素プラズマを用いて処理され、その後に第1のバイオインクが、処理された表面上に堆積される。生体適合性スキャホールドは、第1のバイオインクを堆積させる前に約1日未満、例えば第1のバイオインクを堆積させる前に約18時間未満、約12時間未満、または約6時間未満、酸素プラズマで処理され得る。いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドは、第1のバイオインクを堆積させる前に約24時間、18時間、12時間、6時間、3時間、または1時間の間、酸素プラズマで処理される。
【０１４２】
第1のバイオインク中の細胞が、生体適合性スキャホールド上に堆積され、任意で、非細胞性バイオインクが、生体適合性スキャホールドの同じ表面上の、第1のバイオインクが堆積されていない領域に堆積される。この非細胞性バイオインクは、例えば、第1のバイオインクに含まれるのと同じヒドロゲルを含み得る。任意で、フィブリノゲンもまた、非細胞性バイオインクに含まれる。
【０１４３】
内皮細胞ならびに任意で線維芽細胞および周皮細胞を含む、第1のバイオインクは、少なくとも4日間、例えば少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14日間、第2の培地中、生体適合性スキャホールド上で培養される。いくつかの態様において、少なくとも5日間、または少なくとも1週間、細胞を成熟させる。第1のバイオインクおよび任意で非細胞性バイオインクがフィブリノゲンを含む場合、第2の培地は、有効量のトロンビンを含まない。第2の培地はさらに上述されている。第2の培地中での培養は、内皮細胞がプリントされた生体適合性スキャホールドの表面上で行われる。第2の培地中での培養は、例えば、内皮細胞がバイオプリントされた基材の面が第2の培地と接触するように、基材を第2の培地に対して配置することによって行われ得る。あるいは、第2の培地が基材の表面上の内皮細胞と接触するように、第2の培地がバイオプリントされた組織の表面上に堆積され得る。
【０１４４】
RPE細胞は、生体適合性スキャホールドが内皮細胞とRPE細胞の間に存在するように、生体適合性スキャホールドの第2の表面上に播種される。したがって、内皮細胞およびRPE細胞は、互いに反対側にある表面上に存在する。RPE細胞は、上記のように、第2のバイオインクで用いられ得る。あるいは、RPE細胞は、バイオプリントするのではなく、生体適合性スキャホールドの第2の表面に直接添加され得る。いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドの第2の表面は、網膜色素上皮細胞を生体適合性マトリクスの第2の表面上に堆積させる前に、細胞接着のための成分、例えば細胞外マトリクスでコーティングされる。細胞外マトリクスは、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチンおよび／もしくはフィブロネクチンの1つまたは複数を含み得る。いくつかの態様において、この方法は、細胞外マトリクスを含む生体適合性スキャホールドの第2の表面にRPE細胞の懸濁物を添加する工程を含む。1つの非限定的な例において、細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む。
【０１４５】
いくつかの態様において、1センチメートルあたり約100,000〜400,000個のRPE細胞が、生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される。様々な態様において、1センチメートルあたり約100,000〜約300,000個のRPE細胞が、生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される、または1センチメートルあたり約100,000〜約200,000個のRPE細胞が、生体適合性スキャホールドの表面上に堆積される。
【０１４６】
あるいは、網膜色素上皮細胞の堆積は、網膜色素上皮細胞、培地および第2の培地を含む第2のバイオインクの堆積を含み得る。第2のバイオインクは、ヒドロゲルを含み得、第2のバイオインク中のヒドロゲルは、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、またはゼラチンメタクリロイルヒドロゲルを含む。バイオインクおよびヒドロゲルについては上述されている。
【０１４７】
前記RPE細胞は、生体適合性マトリクスの第2の表面において、培地中で培養される。いくつかの態様において、この培地は、VEGFおよびANG-1を含まない。したがって、RPE細胞は、有効量のANG-1およびVEGFを含まない第3の培地中に播種され得る。例示的な培地は、実施例の節に開示される。さらなる態様において、培地は、VEGFおよびANG-1を含み得る。いくつかの態様において、RPE細胞は、RPE細胞の単層が形成されるまで培養される。細胞は、例えば、少なくとも1週間、例えば約7、8、9、10、11、または12、13、14、15、16日間培養され得る。
【０１４８】
いくつかの態様において、RPEの単層は、プロスタグランジンE2と、例えばそれを培養用培地中に含めることによって、接触させられる。いくつかの態様において、培地は、約1〜400μMプロスタグランジンE2を含む。RPE細胞は、プロスタグランジンE2を含む培地中で、播種後約1〜3週間、例えば播種後約2週間培養され得る。適切な濃度は、約1、10、12、50、75、100、200、300、または400μMプロスタグランジンE2を含む。具体的で非限定的な例において、RPEは、50μMプロスタグランジンE2と接触させられる。他の具体的で非限定的な例において、RPE細胞は、RPE細胞を生体適合性マトリクスの第2の表面上に播種した後約2週間、約50μMプロスタグランジンE2中で培養される。
【０１４９】
いくつかの態様において、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的血液網膜関門（BRB)を製造する方法が提供される。これらの方法は、以下の工程：
a. 内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞のバイオインクが生体適合性の酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）PDGLAスキャホールドの第1の表面に付着するように、コラーゲンヒドロゲル中およびフィブリノゲンヒドロゲル中の内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞とトロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含む第1の培地とを含む第1のバイオインクを、この生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 内皮細胞が血管を形成することができるように、第1の表面上に堆積させた第1のバイオインクを、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、ならびにアンギオポエチン-1およびアプロチニンの有効量を含む第2の培地中で少なくとも4日間、トロンビンの非存在下で成熟させる工程；
c. 生体適合性スキャホールドが内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、生体適合性スキャホールドの第2の表面上に層を形成するために第3の培地中に網膜色素上皮細胞を堆積させる工程であって、生体適合性スキャホールの第1の表面および第2の表面が互いに反対側にある表面であり、かつ第2の表面がビトロネクチンでコーティングされ、かつ第3の培地がタウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む、工程；ならびに
d. 堆積した網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む第3の培地中で、堆積した網膜色素上皮細胞を培養する工程；
e. 有効量の血管内皮成長因子を含む第4の培地中で、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞を培養する工程であって、第4の培地がトロンビンおよびアンギオポエチン-1を含まない、工程；
f. 任意で有効量の血管内皮成長因子を含む第5の培地中で、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞を培養する工程であって、第5の培地がトロンビン、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含まない、工程；ならびに
g. 第3の培地に添加された有効量のプロスタグランジンE2を含む第6の培地中で、網膜色素上皮細胞を培養する工程
を含み、それによって、培養された内皮細胞が人工脈絡膜を形成し、かつ培養された網膜色素上皮細胞が人工網膜色素上皮を形成する三次元工学的BRBが形成される。
【０１５０】
一般に、細胞またはRPE細胞および／もしくは内皮細胞などの細胞を含む、生体適合性スキャホールドは、約4〜6％CO2、一般に5％CO2の下、約35〜38℃、通常37℃で培養される。いくつかの態様において、血清、例えば約2〜10％血清、例えば5％血清が、本明細書に開示される任意の培地に含められる。いくつかの例において、血清は、ウシ胎仔血清である。
【０１５１】
三次元工学的眼組織
本明細書に開示される方法は、三次元工学的眼組織モデルを製造するために使用され得る、例えば、図1Aおよび図14を参照のこと。上記の任意の材料および方法が、三次元工学的眼組織を製造するために用いられ得る。
【０１５２】
いくつかの態様において、このモデルは、三次元工学的外側血液網膜関門（BRB）を含み、このBRBは三次元構造を形成する第1の層および第2の層を含む。第1の層は、複数の内皮細胞を含む第1のバイオインクを含む脈絡膜（または脈絡膜血管）を含む。いくつかの非限定的な例において、第1のバイオインクは、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞を含む。第2の層は、複数の網膜色素上皮細胞を含む。任意で、生体適合性スキャホールドは、第1の層と第2の層の間に存在する。
【０１５３】
いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドは、PDGLA、PLGA、PLA、PLLA、PGA、PCL、PEG、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含み得るまたはそれらからなり得る。具体的で非限定的な例において、生体適合性スキャホールドは、PDGLA、例えば架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む。別の具体的で非限定的な例において、PDGLAは、酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である。
【０１５４】
いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドはまた、例えば生体適合性スキャホールドの表面上にコーティングされた細胞外マトリクスを含み得る。細胞外マトリクスは、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドの表面1センチメートルあたり約100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞が存在する。
【０１５５】
いくつかの態様において、生体適合性スキャホールドは、使用前に除去され得る。例えば、生体適合性スキャホールドは、例えば約24時間〜約24週間、例えば約48時間〜約20週間、約72時間〜約10週間、インビトロで分解され得る。例示的な分解期間は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、1、11、12、13、または12日間を含むがこれらに限定されない。例示的な分解期間はまた、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24週間を含む。例示的な分解期間はまた、1、2、3、4、5、または6ヵ月間であり得る。分解は、培養下で起こり得る。他の態様において、生体適合性スキャホールドは、酵素により、熱、pHの変化または生体適合性スキャホールドを分解する他の化合物により処理され得る。当業者は、使用するプロセスを容易に特定することができる。いくつかの態様において、分解は、三次元モデルが使用時に生体適合性スキャホールドを実質的に含まないよう行われる。したがって、生体適合性スキャホールドは、当技術分野で公知の手順を用いて検出することができない。
【０１５６】
前記生体適合性スキャホールドは、少なくとも0.1 MPa〜約500 MPaのヤング係数を有し得、約2μm〜約6μmの範囲の厚みを有し得る、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2014/0234381号を参照のこと。
【０１５７】
いくつかの実施において、スキャホールドの厚みは、約2μ〜約45μm、例えば約2μm〜約25μm、例えば2μm〜約10μm、約2μm〜約9μm、約2μm〜約4μM、または約6μm〜約9μmであり得る。しかし、いくつかの実施において、厚みは最大25μmであり得る。具体的で非限定的な例において、生体適合性スキャホールドは、約2〜約3μm厚であり、例えばより高分子量のPDGLA（固有粘度（I.V.）1.0）から製造される。他の態様において、生体適合性スキャホールドは、約6μm〜約9μm厚であり、例えばより低分子量のPDGLA（I.V. 0.6）から製造される。
【０１５８】
前記生体適合性スキャホールドは、1日あたり約200μg/mm2〜1日あたり約300μg/mm2の範囲、例えば天然ブルッフ膜の推定拡散率である1日あたり250μg/mm2の拡散率を特徴とし得る。
【０１５９】
前記生体適合性スキャホールドは、表面上に分布している孔を有し得る。学説により拘束されないが、孔は、RPE、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞の増殖および分化を支援するために、栄養分が膜を横切って拡散することを可能にし、かつ細胞が膜を横切った細胞外シグナル伝達を通じて連絡することを可能にする。同時に、孔は、好ましくは、細胞が膜を通って遊走または浸潤するほど十分大きくない。使用される孔サイズは、上記に明記されている。
【０１６０】
さらなる態様において、第1のバイオインクは、複数の線維芽細胞および複数の周皮細胞を含み得る。いくつかの非限定的な例において、第1のバイオインクは、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞を含む。さらなる非限定的な例において、第1のバイオインクは、1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む。
【０１６１】
内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、任意の比で第1のバイオインクに含まれ得る。いくつかの態様において、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で第1のバイオインク中に存在する。さらなる態様において、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、それぞれ1：2：0.5の比で第1のバイオインク中に存在する。
【０１６２】
三次元工学的眼組織モデル内の細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、および脊椎動物対象を含む、任意のヒト種由来であり得る。いくつかの態様において、三次元工学的眼組織モデル内の細胞はすべて、同じ種由来である。
【０１６３】
網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞の1つまたは複数は、ヒト細胞であり得る。いくつかの態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞のすべてが、ヒト細胞である。他の態様において、内皮細胞および網膜色素上皮細胞が、ヒト細胞である。
【０１６４】
これらの網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、同じ供給源由来または異なる供給源由来であり得る。いくつかの態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、同じ対象由来である、または同じ対象由来の細胞由来である。上記のように、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞は、MHCハロタイプ一致、患者特異的、または同種異系であり得る。
【０１６５】
いくつかの態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞は、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、または多分化能幹細胞から生成される。
【０１６６】
任意の細胞が、iPSCの出発点として使用され得る。例えば、細胞型は、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、または胃細胞であり得る。T細胞もまた、再プログラムのための体細胞の供給源として使用され得る（米国特許第8,741,648号）。細胞の分化度または細胞を収集する動物の年齢に制限はなく、未分化の前駆体細胞（体性幹細胞を含む）および最終分化した成熟細胞でさえも、本明細書に開示される方法における体細胞の供給源として使用され得る。1つの態様において、体細胞は、それ自体がRPE細胞、例えばヒトRPE細胞である。RPE細胞は、成体または胎児RPE細胞であり得る。iPSCは、ヒトES細胞を特定の細胞型に分化させ、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、およびTRA-1-81を含むヒトES細胞マーカーを発現させることが分かっている条件下で成長させられ得る。
【０１６７】
体細胞は、当業者に公知の方法を用いて、誘導多能性幹細胞（iPSC）を生成するように再プログラムされ得る。当業者は、誘導多能性幹細胞を容易に作製することができる、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20090246875号、公米国特許出願公開第2010/021001号4、米国特許出願公開第20120276636号、米国特許第8,058,065号、米国特許第8,129,187号、米国特許第8,278,620号、PCT公報番号WO2007/069666 A1、および米国特許第8,268,620号を参照のこと。一般に、核再プログラム因子が、体細胞から多能性幹細胞を生成するために使用される。いくつかの態様において、Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、NanogおよびLin28の少なくとも3つ、または少なくとも4つが用いられる。他の態様において、Oct3/4、Sox2、c-Myc、およびKlf4が用いられる。
【０１６８】
上記のように、これらの核再プログラム物質のマウスおよびヒトcDNA配列は、参照により本明細書に組み入れられるWO 2007/069666で言及されているNCBIアクセッション番号を参照して入手可能である。1つまたは複数の再プログラム物質またはこれらの再プログラム物質をコードする核酸を導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2012/0196360号および米国特許第8,071,369号に開示されている。
【０１６９】
前記細胞は、一般に体細胞からiPSCを誘導することができる1つまたは複数の因子である核再プログラム物質またはこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）で処理され得る。核再プログラム物質は、一般に、少なくともOct3/4、Klf4、およびSox2、またはこれらの分子をコードする核酸を含む。p53の機能的阻害因子であるL-mycまたはL-mycをコードする核酸、ならびにLin28もしくはLin28bまたはLin28もしくはLin28bをコードする核酸が、さらなる核再プログラム物質として用いられ得る。Nanogもまた、核の再プログラムに用いられ得る。さらなる22の例が、上記に示されている。1つの非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、Sox2、およびc-Mycが用いられる。他の態様において、Oct4、Nanog、およびSox2が用いられる、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,682,828号を参照のこと。これらの因子は、Oct3/4、Klf4、およびSox2を含むがこれらに限定されない。他の態様において、これらの因子は、Oct 3/4、Klf4、およびMycを含むがこれらに限定されない。いくつかの非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、c-Myc、およびSox2が用いられる。他の非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、Sox2、およびSal 4が用いられる。Nanog、Lin28、Klf4、またはc-Myc等の因子は、再プログラム効率を向上させ得、これらは様々な異なる発現ベクターから発現され得る。例えば、組み込みベクター、例えばEBVエレメントベースのシステムが使用され得る（米国特許第8,546,140号）。さらなる局面において、再プログラムタンパク質は、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入され得る。上記のように、再プログラム工程はさらに、細胞を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK-3）阻害因子、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（MEK）阻害因子、形質転換成長因子β（TGF-β）受容体阻害因子またはシグナル伝達阻害因子、白血病抑制因子（LIF）、p53阻害因子、NF-カッパB阻害因子またはそれらの組み合わせを含む1つまたは複数のシグナル伝達受容体と接触させることを含む。これらの調節因子は、低分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセットまたはタンパク質因子を含み得る。実質的にあらゆるiPS細胞または細胞株が使用され得ることが理解されている。
【０１７０】
いくつかの態様において、iPSCは、外因性核酸を発現するように、例えば、プロモーターおよび第1のマーカーをコードする核酸配列に機能的に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含むよう、修飾され得る。チロシナーゼ遺伝子は、例えば、2013年1月1日に使用可能となった、GENBANK（登録商標）アクセッション番号22173に開示されている。この配列は、マウス系統C57BL/6の第7染色体の位置5286971〜5291691に整列する（逆位方向）。RPE細胞における発現には、4721塩基対の配列で十分である、参照により本明細書に組み入れられるMurisier et al., Dev. Biol. 303: 838-847, 2007を参照のこと。この構築物は、網膜色素上皮細胞において発現される。他のエンハンサーも用いられ得る。他のRPE特異的エンハンサーは、D-MITF、DCT、TYRP1、RPE65、VMD2、MERTK、MYRIP、およびRAB27Aを含み得る。適切なプロモーターは、チロシナーゼプロモーターを含む、網膜色素上皮細胞において発現される任意のプロモーターを含むがこれらに限定されない。この構築物はまた、他の要素、例えば、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）および転写／翻訳ターミネーターを含み得る。一般に、この構築物を細胞にトランスフェクトするのが有利である。安定なトランスフェクションのための適切なベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびセンダイウイルスを含むがこれらに限定されない。
【０１７１】
多くの目標、例えば、制御された高コピー数の達成および細菌内でのプラスミドの不安定化の潜在的原因の回避、ならびにヒト細胞を含む哺乳動物細胞内での使用に適合したプラスミド選択のための手段の提供を念頭において、プラスミドを設計した。ヒト細胞内での使用に関するプラスミドの二つの要件に特に注意を払った。1つ目は、それらが、多量のDNAを生成および精製することができるように、大腸菌（E.coli)内での維持および発酵に適することである。2つ目は、それらがヒト患者および動物内での使用に関して安全であり適することである。1つ目の要件は、選択可能であり、かつ細菌発酵の間に比較的容易に安定的に維持することができる高コピー数のプラスミドを必要とする。2つ目の要件は、選択マーカーおよび他のコード配列などの要素への注意を必要とする。いくつかの態様において、マーカーをコードするプラスミドは、（1）高コピー数の複製起点、（2）選択マーカー、例えば、非限定的に、カナマイシンを用いた抗生物質選択のためのneo遺伝子、（3）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、および（4）様々な核酸カセットの組み込みのためのマルチクローニング部位、ならびに（5）チロシナーゼプロモーターに機能的に連結されたマーカーをコードする核酸配列、から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための多くのプラスミドベクターが、当技術分野で公知である。これらは、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,103,470号；米国特許第7,598,364号；米国特許第7,989,425号；および米国特許第6,416,998号に開示されるベクターを含むがこれらに限定されない。
【０１７２】
ウイルス遺伝子送達システムは、RNAベースまたはDNAベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達システムは、プラスミド、エプスタインバーウイルス（EBV）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、シミアンウイルス40（SV40）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（BPV）ベースのベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。
【０１７３】
マーカーは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質もしくは赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼもしくはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼもしくはnanoluc）、または他のタンパク質を含むがこれらに限定されない。マーカーは、タンパク質（分泌、細胞表面、もしくは内部タンパク質を含む；細胞により合成されたものか取り込まれたもののいずれか）；核酸（例えば、mRNA、もしくは酵素活性を有する核酸分子）または多糖であり得る。関心対象の細胞型のマーカーに特異的な抗体、レクチン、プローブ、または核酸増幅反応により検出可能な任意のそのような細胞成分の決定因子が含まれる。マーカーはまた、生化学的もしくは酵素的アッセイまたは遺伝子産物の機能に依存する生物学的反応により同定され得る。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに機能的に連結され得る。加えて、他の遺伝子、例えば、幹細胞からRPEへの分化、またはRPEの機能、または生理学、または病理学に影響し得る遺伝子が含まれ得る。したがって、いくつかの態様において、MITF、PAX6、TFEC、OTX2、LHX2、VMD2、CFTR、RPE65、MFRP、CTRP5、CFH、C3、C2B、APOE、APOB、mTOR、FOXO、AMPK、SIRT1-6、HTRP1、ABCA4、TIMP3、VEGFA、CFI、TLR3、TLR4、APP、CD46、BACE1、ELOLV4、ADAM 10、CD55、CD59、およびARMS2の1つまたは複数をコードする核酸が含まれる。
【０１７４】
iPSCを異なる細胞型、例えば網膜色素上皮細胞に分化させる方法は、当技術分野で公知である、例えば、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 2017/044483を参照のこと。網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、当技術分野で公知の方法を用いてiPSCから生成され得る。
【０１７５】
いくつかの態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞は、例えば健常（野生型）対象由来の、健常（野生型）細胞であり得る。細胞は、細胞株から直接単離され得、または健常（野生型）対象の体細胞由来のiPSCから生成され得る。他の態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞の1つまたは複数は、有病細胞である。これらの細胞は、細胞株から直接単離され得、またはiPSC、例えば、有病対象の体細胞由来のiPSCから生成され得る。細胞株もまた用いられ得る。
【０１７６】
いくつかの態様において、有病細胞は、関心対象の疾患、例えば眼病、例えば網膜疾患を有する対象由来である。網膜疾患は、急性黄斑変性、網膜色素変性およびレーバー先天黒内障（LCA）、「ドライ」型黄斑変性、「ウェット」型黄斑変性、後期発症網膜変性、ソースビー眼底ジストロフィー、スタルガルト病、ベスト卵黄様黄斑変性、無虹彩、小眼症、ジュベール症候群、アッシャー症候群、桿体錐体ジストロフィー、夜盲症、小口病、マラチアレベンチネーゼ（Malattia Leventinese）、錐体桿体ジストロフィー、コロイデレミア、青錐体全色覚異常またはバルデー・ビードル症候群を含むがこれらに限定されない。
【０１７７】
いくつかの態様において、細胞は、疾患を模倣するように、作用物質、例えば化学剤で処理され得る。いくつかの態様において、細胞および／または三次元眼組織それ自体が、例えば低酸素症、炎症、酸化ストレスおよび／またはタンパク質毒性ストレスを誘導するように、化学剤で処理される。
【０１７８】
他の態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞は、疾患プロセスに特異的な1つまたは複数の変異を含み得る。変異は、天然に存在し得、または分子的方法、例えばノックアウト、ノックインおよびCRISPR/Cas9遺伝子標的化を用いて導入され得る。したがって、組換え核酸を含む細胞が用いられ得る。
【０１７９】
いくつかの態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および／または周皮細胞は、A2AR、A2BR、A3R、AC010973、AGT、AGTR1、AKT、APRIL、ASCC1、ATF6B、ATG、ATM、ATR、AZI2、BAD、BAFF、BCR、BCR、BECN1、BTRC、C1、C2、C2B、C3、C4、C5、CAPN6、CAPN7、CARD10、CARD6、CARD8、CAT、CCDC50、CCR3、CCR5、CCR5、CD137、CD16、CD19、CD21、CD22、CD28、CD45、CD79、CDC42、CDH13、CFTR、CFTR、CNGA、CNGB、CNTFR、CRLF2、CXCR4、CYGB、DCD、DRAM、DUSP1、EDNRB、EGF、EGFR、EIF4F、ENC1、EPO、ERBB、ERK、ESR、ESR1、ESR2、FAK、FAK2、FGF、FGFR、FYCO1、GASTA2、GCAP2、GDNF、GLRX2、GRK1、GSTM1、GSTM2、GSTM3、GSTM4、GSTM5、HERPUD、HGF、HGFR、HPX、IAP、IAP、ICOS、IFN、IGFR、IL-1、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-17、IL-19、IL-20、IL21R、IL-23、IL-23、IL-23、IL23R、IL31RA、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-9、IRGM、JAB、JAK1、JAK3、JNK1、JUN、LTD4、LXR、MASP、MEF2、MEK、MGST1、MIF、MPL、MTOR、NDUFA13、NFAT、NFKB、NGF、NKAP、NKAPL、NKRF、NOD2、NOTCH1、NOX1、OSGIN1、OSGIN2、OXSR1、P38、PARK7、PDE6G、PDGF、PDGFR、PDK、PI3K、PKA、PKC、PKR、PON2、PPAR、PPM1D、PRKD1、PRLR、PTPN21、RAC、RAC、RAF、RB1CC1、RDH13、REL、RETGC、RNF25、S1P1、SCARA3、SENP6、SESN1、SHP-2、SLC24A1、SLC24A2、SNIP1、SOCS3、SOD3、SQSTM1、SRC、SREBP、STAT3、STK39、STX5、SUMO、SUMO、TANK、TBK1、TBKBP1、TCR、TGF、TGFR、TICAM、TIE2、TLR、TNF、TNFR、TNFRSF11A、TP53、TP53I3、TRPM2、TXNRD、TXNRD1、TYK2、UBE2L3、UCP3、USP2、UVRAG、VEGF、VEGFR、VNN、WDFY3、WNT、XDH、および／またはZNF382の1つまたは複数内に変異を含む。変異は、例えばiPSC内で、分子的技術を用いて生成され得、または分子的技術を用いて網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、または周皮細胞に直接導入され得る。
【０１８０】
いくつかの態様において、網膜色素上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞の１つまたは複数は、有病ヒトドナー由来の有病細胞である。疾患は、例えば、急性黄斑変性、網膜色素変性またはLCAであり得る。いくつかの態様において、ヒトドナーは、A2AR、A2BR、A3R、AC010973、AGT、AGTR1、AKT、APRIL、ASCC1、ATF6B、ATG、ATM、ATR、AZI2、BAD、BAFF、BCR、BCR、BECN1、BTRC、C1、C2、C2B、C3、C4、C5、CAPN6、CAPN7、CARD10、CARD6、CARD8、CAT、CCDC50、CCR3、CCR5、CCR5、CD137、CD16、CD19、CD21、CD22、CD28、CD45、CD79、CDC42、CDH13、CFTR、CFTR、CNGA、CNGB、CNTFR、CRLF2、CXCR4、CYGB、DCD、DRAM、DUSP1、EDNRB、EGF、EGFR、EIF4F、ENC1、EPO、ERBB、ERK、ESR、ESR1、ESR2、FAK、FAK2、FGF、FGFR、FYCO1、GASTA2、GCAP2、GDNF、GLRX2、GRK1、GSTM1、GSTM2、GSTM3、GSTM4、GSTM5、HERPUD、HGF、HGFR、HPX、IAP、IAP、ICOS、IFN、IGFR、IL-1、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-17、IL-19、IL-20、IL21R、IL-23、IL-23、IL-23、IL23R、IL31RA、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-9、IRGM、JAB、JAK1、JAK3、JNK1、JUN、LTD4、LXR、MASP、MEF2、MEK、MGST1、MIF、MPL、MTOR、NDUFA13、NFAT、NFKB、NGF、NKAP、NKAPL、NKRF、NOD2、NOTCH1、NOX1、OSGIN1、OSGIN2、OXSR1、P38、PARK7、PDE6G、PDGF、PDGFR、PDK、PI3K、PKA、PKC、PKR、PON2、PPAR、PPM1D、PRKD1、PRLR、PTPN21、RAC、RAC、RAF、RB1CC1、RDH13、REL、RETGC、RNF25、S1P1、SCARA3、SENP6、SESN1、SHP-2、SLC24A1、SLC24A2、SNIP1、SOCS3、SOD3、SQSTM1、SRC、SREBP、STAT3、STK39、STX5、SUMO、SUMO、TANK、TBK1、TBKBP1、TCR、TGF、TGFR、TICAM、TIE2、TLR、TNF、TNFR、TNFRSF11A、TP53、TP53I3、TRPM2、TXNRD、TXNRD1、TYK2、UBE2L3、UCP3、USP2、UVRAG、VEGF、VEGFR、VNN、WDFY3、WNT、XDHおよび／またはZNF382の1つまたは複数内に自然発生変異を有し得る。
【０１８１】
いくつかの態様において、三次元眼組織は、神経支配されていない。他の態様においては、神経細胞が添加され、三次元眼組織が神経支配されている。
【０１８２】
任意で、第1バイオインクはさらに、ヒドロゲルを含み得る。ヒドロゲルは、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルまたはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの非限定的な態様において、ヒドロゲルは、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む。
【０１８３】
さらなる態様において、第1のバイオインクはさらに、第1の培地を含む。任意で、第1の培地は、1つまたは複数の活性剤を含み得る。バイオプリントされた（第1のバイオインクによって形成された）構造体は、第1の培地中で培養され得る。いくつかの態様において、第1の培地は、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる作用物質については、上記に開示されている。
【０１８４】
第1の培地は、血管内皮成長因子（VEGF）、アンギオポエチン-1（ANG-1）、アプロチニン、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、および線維芽細胞成長因子（FGF）の1つまたは複数の有効量を含み得る。したがって、第1の培地は、これらの因子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべてを含み得る。EGFの例示的な濃度は、1〜50 ng/mlである。FGFの例示的な濃度は、1〜1,000 ng/mlであり、IGF-1の例示的な濃度は、1〜500 ng/mlである。いくつかの態様において、第1の培地は、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、アンギオポエチン1、IGF、EGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン、およびアプロチニンを含む。具体的で非限定的な例において、第1の培地は、1〜1,000 ng/mlのVEGF、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む。他の具体的で非限定的な例において、第1の培地は、100 ng/ml ANG-1、0.075 U/mlアプロチニンを含む。さらなる態様において、第1の培地は、EFG、IGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、およびヘパリン硫酸の有効量を含む。さらなる態様において、第1の培地は、トロンビン、例えば0.5 U/ml〜10 U/ml、例えば0.5 U/mlまたは1 U/mlを含む。具体的で非限定的な例において、第1の培地は、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含み得る。
【０１８５】
バイオプリントされた（第1のバイオインクにより形成された）構造体は、第2の培地中で培養され得る。いくつかの態様において、三次元工学的外側BRBの第1の層および／または第2の層が、第2の培地中で培養される。第2の培地は、血管内皮成長因子（VEGF）、アンギオポエチン-1（ANG-1）、アプロチニン、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、および線維芽細胞成長因子（FGF）の1つまたは複数の有効量を含み得る。したがって、第2の培地は、これらの因子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべてを含み得る。具体的で非限定的な例において、第2の培地は、これらの因子のすべてを含む。EGFの例示的な濃度は、1〜50 ng/mlである。FGFの例示的な濃度は、1〜1,000 ng/mlであり、IGF-1の例示的な濃度は、1〜500 ng/mlである。これらの因子を含む例示的な培地については、以下に開示される。いくつかの態様において、第2の培地は、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、アンギオポエチン1、IGF、EGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン、およびアプロチニンを含む。具体的で非限定的な例において、第2の培地は、1〜1,000 ng/mlのVEGF、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む。他の具体的で非限定的な例において、第2の培地は、100 ng/ml ANG-1、0.075 U/mlアプロチニンを含む。さらなる態様において、第2の培地は、EFG、IGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、およびヘパリン硫酸の有効量を含む。さらなる態様において、第1の培地および／または第2の培地は、トロンビン、例えば0.5 U/ml〜10 U/ml、例えば0.5 U/mlまたは1 U/mlを含む。いくつかの態様において、第2の培地は、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１８６】
バイオプリントされた（第1のバイオインクにより形成された）構造体は、第3の培地中で培養され得る。いくつかの態様において、三次元工学的外側BRBの第1の層および／または第2の層が、第3の培地中で培養される。第3の培地は、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、バイオプリントされた構造体は、第1の培地、第2の培地、および／または第3の培地中で連続的に培養される。
【０１８７】
眼組織モデルは、バイオプリントにより堆積された第1の層を含み得る。バイオプリント工程は、生体適合性スキャホールドの第1の表面上への第1のバイオインクの押し出しを含み得る。
【０１８８】
いくつかの態様において、眼組織モデルは、創薬、薬物試験、前臨床研究、毒性試験、吸収、分布、代謝、および排出試験（ADME）、薬物代謝および薬理試験（DMPK）、疾患モデリング、感染病モデリング、宿主疾患モデル、三次元生物学研究、細胞ベースのスクリーニング、遺伝子療法試験、ならびに／またはバイオマーカー発見の1つまたは複数において使用され得る。他の態様において、眼組織モデルは、ヒト対象の眼への移植において使用される、以下を参照のこと。さらなる態様において、眼組織モデルは、使用時点で生体適合性スキャホールドを実質的に含まない。
【０１８９】
いくつかの態様において、キットが提供される。キットは、例えば、1つまたは複数の培地、および三次元工学的眼組織モデルを作製するための成分を含み得る。試薬システムは、適宜、水性培地中または凍結乾燥形態のいずれかで梱包され得る。他の態様において、三次元工学的眼組織モデル自体を含むキットが提供される。
【０１９０】
キットの収容手段は、一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはその他の収容手段を含み、その中に成分が入れられ得、好ましくは適切当に分割され得る。キットに2つ以上の成分が含まれる場合、キットはまた、一般に、追加の成分が別々に入れられ得る第2の、第3の、またはその他のさらなる容器を含む。しかし、様々な成分の組み合わせが、1つのバイアル中に含められ得る。
【０１９１】
キットの1つまたは複数の成分、例えば培地は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により再構成され得る。溶媒はまた、別の収容手段により提供され得ることが想定されている。
【０１９２】
キットはまた、典型的に、販売のために厳重な隔離下でキット成分を収容するための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルを保持する射出またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。キットはまた、例えば印刷または電子形式、例えばデジタル形式の、使用説明書を含み得る。
【０１９３】
処置方法
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む開示される三次元工学的BRBは、黄斑変性、例えば加齢性黄斑変性、黄斑ジストロフィー、例えばスタルガルドおよびスタルガルド様病、ソースビー眼底ジストロフィー、RPE裂傷、脈絡膜新血管新生、ベスト病（卵黄状黄斑ジストロフィー）および成人卵黄状ジストロフィーまたは網膜色素変性の亜型、網膜自体の変性もしくは劣化、または網膜、脈絡膜もしくはRPE細胞に対する物理的損傷もしくは外傷を処置するために使用され得る。加齢性黄斑変性（AMD）は、55歳以上の人々における失明の一番の原因であり；この疾患は、遺伝的および環境的要因によって引き起こされる。AMDは、網膜色素上皮（RPE）細胞の機能障害および死から光受容体の喪失および鮮明な視界の欠如に進行する。網膜色素上皮単層を置き換えるために、機能的なRPE細胞の移植が使用され得る。しかし、細胞懸濁物の注入は、移植された細胞が2週間以内に死滅し、RPE機能に必須の単層構造が形成されないという理由で成功しなかったことが、研究により示されている。したがって、RPEの単一細胞懸濁物の注入は効果的でない。本明細書に開示される方法は、眼に移植され、内在構造を復元することができる脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む工学的BRBを提供する。
【０１９４】
例えば、片方または両方の眼に、本明細書に開示される脈絡膜と網膜色素細胞とを含む工学的BRBを移植することによって、患者において網膜変性の症状を処置するための方法が、本明細書に開示されている。1つの態様において、AMDの症状は、例えば、脈絡膜新血管成長（CNV）、中心窩の萎縮、中心窩下網膜色素上皮の萎縮、脈絡膜の萎縮、および／または中心視の喪失を含む。AMDの初期段階においては、例えば本明細書に開示される工学的BRBを移植することによって、RPE細胞のみを置き換えることで十分であり得る。学説により拘束されないが、移植されたRPE細胞は、RPE細胞のさらなる喪失および／またはブルッフ膜の変性を予防し得る。AMDの進行段階においては、患者は、RPE細胞および光受容体細胞の両方の喪失を経験し得る。したがって、いくつかの態様において、この方法はさらに、光受容体細胞を含む組成物を移植する工程を含み得る。スキャホールドおよびRPE細胞を移植する方法は、例えば、PCT公開番号WO 2012177968およびPCT公開番号2016/007852に開示されており、その両方が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９５】
移植される組成物のサイズは、一般に、個々の患者に存在する網膜病変領域のサイズの臨床的評価を、特定サイズのインプラントを送達する外科的可能性により課される制約と比較することによって決定され得る。例えば、中心網膜に関連する変性（例えば、加齢性黄斑変性）において、解剖学的中心窩に近い約1.0〜2.5 mm径の（例えば、約1.5 mm径の）円形インプラントが、多くの場合、適切であり得る。いくつかの例において、最大で、中心窩を中心とするまたは中心外領域に位置するおよそ6.0 mm（縦）×7.5 mm（横）の卵形領域である側頭血管アーケード（組織学的黄斑、臨床的後極）の間に存在する後方網膜の領域に対応する、より大きなインプラントが適切であり得る。いくつかの例において、取り囲まれている病変領域に設置するための約0.5 mm程度のより小さい寸法のポリマースキャホールドを作製することも適切であり得る。加えて、例えば病変領域をカバーしつつそれ以外の高視力領域を避けるためにその患者に適する不規則形状のインプラントを特注生産することも、関心対象となり得る。
【０１９６】
いくつかの態様において、この方法は、例えば炎症細胞の応答を下方調節することによってまたは炎症細胞のアポトーシスを誘導することによって、免疫応答を減少させる免疫抑制剤を投与する工程を含む。他の態様において、この方法は、網膜神経細胞の生存を促進するおよび／または変性を減少させる治療有効量の神経保護剤を投与する工程を含む。さらに他の態様において、この方法は、例えば、AMD患者における中心窩下の脈絡膜新血管（CNV）成長に対処するために望まれない血管新生を阻害する治療有効量の作用物質を投与する工程を含み得る。例示的な治療剤は、例えば、活性型のVEGFの受容体部位に結合し、VEGFとその受容体の相互作用を妨げることによって、血管内皮成長因子（VEGF）の活性を低下させ得る。その治療有効量およびそれは、VEGF分泌を担う経路、例えばSTAT3、NF-kB、HIF-1αを阻害することによってVEGFの発現を抑制する。他の薬物は、補体経路、自食作用、またはNF-kB経路を標的化することによってRPE細胞の萎縮を防止し得る。
【０１９７】
さらなる態様において、この方法は、例えば神経細胞、例えば光受容体細胞の発生または機能を促進するために使用され得る毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、または色素上皮由来因子（PEDF）の治療有効量を対象に投与する工程を含む。他の例示的で非限定的な態様は、トロンボスポンジン1、抗炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン（IL）-lra、IL-6、Fasリガンドまたは腫瘍成長因子（TGF）-β、神経栄養／神経保護性成長因子、例えば、非限定的に、グリア細胞株由来成長因子、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン-3、-4/5、-6、およびビタミンEの治療有効量を対象に投与することを含む。そのような作用物質は、単独でまたは組み合わせて提供され得る。
【０１９８】
スクリーニング方法
試験作用物質の効果を判定する方法が、本明細書に提供される。この方法は、本明細書に開示される方法により製造される脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的BRBを試験作用物質と接触させる工程を含む。その後、脈絡膜内での細胞の表現型が評価される。例えば、RPE細胞または内皮細胞によって形成される毛細管の表現型が評価され得る。さらなる態様において、網膜色素上皮細胞を有する脈絡膜の三次元構造が評価される。細胞の表現型の変化および／または三次元構造の変化によって、その作用物質が効果を有することが示される。正の効果は、例えば、RPE細胞の障壁機能の維持、または1つもしくは複数の細胞型の生存率の向上であり得る。試験作用物質の負の効果は、RPE細胞の死、障壁機能の低下、毛細管の断絶、毛細管の過剰成長またはRPE層への毛細管の侵入であり得る。脈絡膜はまた、例えばそれが断絶されているかどうかを判定するように、評価され得る。加えて、周皮細胞は、それらが血管を覆っているかどうかを判定するように評価され得る。
【０１９９】
試験化合物は、化学的化合物、低分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカインまたは他の生物学的物質（例えば、抗体）を含む、関心対象の任意の化合物であり得る。様々な態様において、神経栄養物質候補のパネルがスクリーニングされる。他の態様において、ポリペプチド変種のパネルがスクリーニングされる。
【０２００】
所望の活性について試験され得る分子のコンビナトリアルライブラリを調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、拘束されたペプチドであり得る、ペプチドのファージディスプレイライブラリ（例えば、米国特許第5,622,699号；米国特許第5,206,347号；Scott and Smith, Science 249:386-390, 1992；Markland et al., Gene 109:13-19, 1991を参照のこと）、ペプチドライブラリ（米国特許第5,264,563号）；FDA承認薬物ライブラリ（例えば、Huang, E; Southall, N; Wang, Y et al., Science Translational Medicine 3: 1-12を参照のこと）、ペプチド模倣ライブラリ（Blondelle et al., Trends Anal Chem.14:83-92, 1995）；核酸ライブラリ（O'Connell et al., Proc. Natl Acad. Sci., USA 93:5883-5887, 1996; Tuerk and Gold, Science 249:505-510, 1990; Gold et al., Ann. Rev. Biochem.64:763-797, 1995）；オリゴ糖ライブラリ（York et al., Carb. Res.285:99-128, 1996; Liang et al., Science 274:1520-1522, 1996; Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol.376:261-269, 1995）；リポタンパク質ライブラリ（de Kruif et al., FEBS Lett.399:232-236, 1996）；糖タンパク質もしくは糖脂質ライブラリ（Karaoglu et al., J Cell Biol.130.567-577, 1995）；または、例えば薬物もしくはその他の医薬物質を含む、化学ライブラリ（Gordon et al., J Med. Chem.37.1385-1401, 1994; Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351-360, 1995）を作製する方法を含む。ポリヌクレオチドは、細胞内ポリペプチドを含む細胞内標的に対する結合特異性を有する核酸分子が自然界に存在するという理由で、ならびにそのような特異性を有する合成分子を容易に調製および同定することができるという理由で、細胞（例えば、非限定的に、内皮細胞および線維芽細胞およびRPE細胞）の機能を変化させることができる作用物質として特に有用であり得る（例えば、米国特許第5,750,342号を参照のこと）。
【０２０１】
1つの態様において、高スループット形式のために、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的BRBを、マルチウェルプレートまたはガラススライドもしくはマイクロチップのウェルに導入することができ、そして試験作用物質と接触させることができる。一般に、BRBは、溶液を操作するためにおよび特に試験される機能に関してBRB内の細胞を観察するために適宜ロボットを使用することができるように、アレイ、特にアドレス可能なアレイとして編成される。高スループット形式を使用する利点は、多数の試験作用物質を並行して試験することができること、および必要に応じて、試験条件と同一の条件下で対照反応も実行できることである。
【０２０２】
したがって、本明細書に開示される方法は、細胞の機能を変化させることができる作用物質、例えば、その細胞が所望の細胞型に分化するように誘導する、または分化、生存および／もしくは細胞増殖に影響する作用物質を同定するために、1つ、いくつかまたは多数の試験作用物質をスクリーニングする手段を提供する。表現型および生存を評価するために、高スループットスクリーニングが使用され得る。これらのスクリーニングは、RPEの表現型および生存、または内皮細胞の増殖および生存に影響し得る薬物を同定するために使用され得る。BRBの構造も試験され得る。
【０２０３】
工学的BRBはまた、画像ベースのアッセイ、分泌されたタンパク質の測定、マーカーの発現、および脂質、タンパク質またはmRNAの産生のために使用され得る。様々なさらなる態様において、工学的BRBは、障壁機能、分子の結合（放射性リガンドの結合を含む）、分子の取り込み、活性（例えば、酵素活性および受容体活性等）、遺伝子の発現、タンパク質の発現、タンパク質の修飾（非限定的な例は、リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、グリコシル化、脂質化等を含む）、受容体のアゴニスト活性、受容体のアンタゴニスト活性、細胞シグナル、アポトーシス、DNA損傷、ストレス応答、凝集性、透過性、炎症、色素沈着、化学的感受性、トランスフェクション、細胞の遊走、走化性、細胞の生存率、細胞の増殖、安全性、効能、代謝、毒性、感染性、および乱用傾向の1つまたは複数を検出または測定するアッセイにおいて使用される。様々な態様において、工学的BRBは、毒性学、薬学的または美容試験のために使用され得る。
【０２０４】
3Dプリント用インサート
スキャホールドのバイオプリントを容易にする3Dプリント用インサートもまた、いくつかの態様において提供される。この特注のインサートは、改良版TRANSWELL（登録商標）透過性支持体に代えて使用され得る、実施例2を参照のこと。インサートは、インサート内に収容される基材を枠組みする露出しているプリント用フレーム（例えば、直線的なフレーム開放部、例えば正方形または長方形のフレーム開放部）を提供しつつ、培養ウェル（例えば、円柱状培養ウェル）にちょうど収まるように適合される。インサートは、インサートが培養ウェル内にちょうど収まってしっかりと保持されることができるように、培養ウェルの内径と実質的に同じ長さを有する。インサートの外壁は、それを入れるウェルの壁に対して形状および／またはサイズにおいて相補的であるように湾曲している。インサートボディ部はまた、プリント用基材を着座させる中央カラーを有し、支持構造体（例えば、ホルダの円柱状端部）は、フレーム支持構造体に対して基材を適所でしっかりと保持するように、基材に向かって押し込まれ得る。インサートボディ部の壁を通って液体培地を導入するために、複数のポートが、円形の凹部とインサートボディ部の外部の間の流体連通を構築にするようにインサートのボディ部を通って延びている。
【０２０５】
例えば、インサートは、プリント用フレームを取り囲む任意の形状（例えば、円形または正方形）の中央カラーを有し、インサートは、プリント用フレーム内の定位置でスキャホールドをしっかりと維持するようにスキャホールドを中央カラー内で把持するために、中央カラー内に保持可能なホルダとはめ合わせすることができる。インサートは、チャンバーの壁に対する設置のために、カラーから半径方向に十分な距離延びている複数のスペーサーアーム、例えば2つのアームを有し得、アームはチャンバーの壁の形状に合致する表面で終結する。チャンバーの壁が湾曲している場合、アームは、壁の湾曲に対して相補的な湾曲した表面で終結する。いくつかの態様において、チャンバーは、培養皿であり、アームは、ウェルを培養皿の中心に配置させるのに十分な距離だけ、カラーから実質的に対称的に延びている。いくつかの例において、培養ウェルは、マルチウェルプレート内に存在する。
【０２０６】
いくつかの開示される態様において、プリント用フレームを形成する開口部は、多角形であり、カラーによって取り囲まれるのに十分なサイズであり、カラーは、スキャホールドが開口部よりも大きい場合にスキャホールドを保持するのに十分なサイズのものである。例えば、カラーが円柱状である場合、プリント用フレームは、長方形であり、カラーによって囲まれ得る。特定の例において、入口ポートおよび出口ポートは、培養用培地を、インサート内にそしてインサートを通って、次いでフレーム開口部を通って、そしてインサートボディ部の外側へと流し込んで、基材上で成長する細胞に栄養を供給するように基材を通ってフレーム開口部へと培養用培地を循環させるために、インサートを通って延びている。スキャホールドは、例えば、組織培地が基材に供給されたときに細胞がシートの両面（上面および下面）で成長し得るようにカラーの内壁にちょうど収まるような形状にされたシートであり得る。
【０２０７】
特定の態様において、ホルダは、スキャホールドをプリント用フレームの開口部に対してしっかりと保持するようにカラー内に挿入される。いくつかの開示される例において、ホルダは、漏斗形状であり、円錐台形のボディ部およびより細い円柱状ステム部を含む。基材がフレーム開口部に対して配置された場合に、円柱状ステム部は、基材を開口部に対して保持するようにインサートのカラー内にちょうど収まる。漏斗のボディ部は、基材を操作するためおよび／または開口部を通じて基材を露出させるバイオプリントの向きに基材を配置するために使用され得る。いくつかの態様において、インサートを使用する方法は、スキャホールドがプリント用フレームの開口部に隣接し、それを通じて露出するように、スキャホールドをインサートのカラー内に配置する工程を含む。ホルダは、基材の表面上の三次元空間に細胞層を慎重に配置するバイオプリントの間に動かないようそれを拘束するために、プリント用スキャホールドをフレームに対してしっかりと保持するように、インサートのボディ部のカラー内におよびスキャホールドに向かって挿入される。スキャホールドは、望ましくは、インサートボディ部のカラーに合致してこのカラー内にちょうど収まる、サイズである。例えば、スキャホールドは、シートがカラー内にしっかりと収まって、スキャホールドシートの一方の面を露出させるプリント用フレームの開口部に対して静止位置で保持されることを可能にするように、インサートの円柱状カラーの内径よりもわずかに小さい外径を有する薄い円形のシートである。次いで、ホルダの円柱状ステム部が、プリント用フレームの開口部に向かってカラー内に挿入され、ホルダの円柱状ステム部は、固定位置においてプリント用フレーム内で露出されたスキャホールドを保持するためにステム部の先端がスキャホールドに接触するまでカラー内に挿入される。
【０２０８】
次いで、ホルダは、インサートを培養ウェルから引き抜くために、バイオプリント用フレームがプリンタヘッドに向かって露出するようにインサートを方向づけるために、およびプリント用フレームを通じてスキャホールド上にバイオプリントするために、使用される。例えば、ホルダは、インサートを培養ウェルから引き抜くために把持され、漏斗が三次元(3D）バイオプリンタヘッド下の支持表面上に置かれる。ホルダは、基材を形成するシートの表面に対する細胞のバイオプリント、その後のプリント用フレームの開口部を通じた基材上でのバイオプリントのために、基材がバイオプリンタヘッド下の適所に（例えば、水平方向に）正確に整列されるように、支持表面上に配置され得る。いくつかの例において、この方法はまた、多層人工組織を構築するために、フレームを通じて露出していないスキャホールドの反対側の面に播種またはバイオプリントする工程を含む。基材の反対側の面は、ホルダを通して、例えば、ホルダの漏斗を通して播種またはバイオプリントされ得る。細胞が基材の一方または両方の面に存在すると、インサートは培養ウェル内に戻され、インサートのポートを通じてプリント用フレームに培養用培地が注入され、バイオプリントされた細胞に栄養分が供給される。あるいは、注入ポートは存在せず、培養用培地は、培養ウェルにおよび／またはホルダの漏斗を通じて添加される。
【０２０９】
インサートは、プリントされた組織をインサートが保持することができる限り、任意の形状であり得、任意の生体適合性材料から作製され得る。インサートの周辺表面は、任意の所望の形状、例えば、湾曲、正方形または不規則形状を有し得る。プリント用フレームは、正方形または長方形として図示されているが、任意の形状、例えば、多角形（例えば、五角形もしくは六角形）または丸みのある形状（例えば、円形もしくは卵形形状）であり得る。プリント用フレームを取り囲むカラーもまた、任意の様々な形状および断面、例えば、多角形（例えば、長方形、五角形、もしくは六角形）断面または円形もしくは卵形断面を有し得る。インサートはまた、任意の数のプリメイド注入チャネルを有し得る、またはひとつも有さない場合がある。
【０２１０】
インサートの具体例が図3A〜3Gに示されている。インサートは、一般に薄く、中央支持ボディ部およびインサートを入れるウェル内の中心位置でインサートを保持するように成形された周囲部分を有する。インサートボディ部は、インサートボディ部の上側に円柱状凹部を有し、その中に、インサートをホルダとしっかりと係合させるように相補的な形状の係合部分を有するホルダが挿入される。円柱状凹部は、例えばプリントされるスキャホールドの面の周囲に長方形のプリント用フレームを提供するインサートの底面の立方形または他の形状の下層凹部を取り囲み、かつそれとつながっている。
【０２１１】
プリント用基材として機能するスキャホールドは、スキャホールドシートの一方の面が、プリントされるスキャホールドの面を囲むプリント用フレームを形成するその下側にある正方形の凹部によりかかり、その凹部を通じて露出するように、円柱状凹部に配置される。次いで、ホルダの湾曲した（例えば、円柱状の）係合部分が、ホルダの縁部が円柱状凹部の壁に接し、ホルダの円柱状部分の先端がスキャホールドに接し、スキャホールドをその場でしっかりと保持するように、インサートの円柱状凹部に配置される。図1Gに示されるように、インサートは次いで、プリント用フレームが、長方形のフレームを通じて露出しているスキャホールドシートの一方の面と共に上を向くように逆さにされる。1つまたは複数のプリント用ニードルが、所望のパターンで、例えば基材上に間隔をあけた平行な列として、基材上にバイオインクを堆積させる間、ホルダは作業表面上でスキャホールドを支持する。
【０２１２】
図3Dに示されるスペーサーの態様において、インサート30は、円柱状ウェルの壁、例えば6ウェル培養プレートのウェルの壁（図示せず）にぴったりと収まる形状を有する。インサートは、培養ウェルの壁の間に延びることができる長さを有するように、細長である。インサート30は、その各々が滑らかに湾曲する外表面、例えば弓形表面38を有する末端アーム34、36を形成するように幅が広がっていく中央長方形ボディ部32を有する。アーム36は、同様の滑らかな湾曲した外面を有する。インサート30（中央ボディ部およびアーム）の長さは、インサート30がちょうど収まるウェルの直径と実質的に同じであり、アーム34、36の弓形表面の湾曲は、インサートがそれに入れるように設計されたウェルの壁の湾曲に対して相補的である。ボディ部32の上面の中央開放部は、一部、インサート30の全高の一部のみを通って延びているカラーを形成する円柱状凹部40により形成される。円柱状凹部40は、凹部40、42が協働してボディ部32を完全に通って延びている中心開放部を形成し、凹部42が基材にバイオプリントするためのフレームを形成するように、ボディ部32の底面の立方形凹部42を取り囲み、これとつながっている。複数のポート44、46、および48は、ボディ部32の露出している縦軸上の縁部から凹部42の上方にボディ部32を通って延びており、円柱状凹部40につながっている。これらのポートの各々は、インサート30の側壁に入り、凹部42の縁部から出て、次いで凹部42の反対側の縁部にある左右対称のポートを通って続き、インサートボディ部32の外に出る。このようにして、基材がインサート内に配置された場合に基材上で培養される細胞に栄養分を供給するためのインサート内へかつ開口部を通って培養用培地を任意で注入するための連続的な流路が形成される。
【０２１３】
立方形状の凹部42は、立方形以外、例えば任意の平行六面体または直方体、半球、四面体または凹部40内に設置される基材を囲むフレーム縁部を提供する任意のその他の形状であり得る。同様に、円柱状凹部40は、ホルダをインサートに取り付けるのを助けるようにホルダの一部に対して相補的であり、ホルダの一部と対になることができる任意の形状であり得る。
【０２１４】
使用時、プリント用基材（図示せず）は、円柱状凹部40と同等の直径を有するが、それより低い高さを有するように調製される。基材は、円柱状凹部40内に隙間なく配置され、そしてホルダがインサートに接続されフレーム42の内側に対して基材をしっかりと押し込むよう、ホルダの円柱状係合部分が基材の上部において凹部40内に挿入される。次いで、インサート30は、それがホルダにより作業表面上で支持されるように、図3Dに示される方向から逆さにされ、凹部42により形成される長方形のフレームを通じて露出している基材の表面がバイオプリントされる。露出している表面のバイオプリントが完了した後、インサートは、バイオプリントされた基材の表面がウェルの底を向くよう、その上方にあるホルダによって培養ウェルに入れられる。次いで、バイオプリントされた表面上の細胞がウェルの底に向かって成長するように、培養用培地がポート44、46、48を通じて注入される。鏡像ポートが、正方形の凹部42の反対側の縁部に存在し、これにより培養用培地は、凹部42の第1の縁部に沿う1つのポートセットから流入し、凹部42の反対側の縁部の対応するポートセットから流出することが可能となる。
【０２１５】
図3Eに示される第2の態様において、インサート50は、正方形のフレーム境界部を形成する中央立方形凹部58が位置する下面56を有する内部円柱状凹部54を形成する円柱状カラー52を含む中央ボディ部を有する。第1および第2のスペーサーアーム60、62は、小口装着喉部（narrow attachment throat）としてのカラー52からアームの周囲方向に拡大する外表面、例えば表面64まで半径方向に延びているくさび部を形成する。アームの周囲方向に拡大する表面は、培養ウェルの湾曲に対して相補的な湾曲形状を有する。一対のポート66、68は、カラー52の外壁から円柱状凹部54の底部を通ってフレーム58の第1の縁部の出口ポートにつながるように延びている。鏡像の出口ポートセットは、正方形凹部58の反対側の縁部に位置し、中央ボディ部の表面56の下を通ってカラーの外壁から出るように延びている。
【０２１６】
インサート50の使用は、図3Gおよびインサート50が培養ウェル84の底部に押し込まれている3Hに図示されている。培養ウェル84は、円柱状であり、輪状の上唇部87および平らな底壁88と共に連続的な側壁86を有する。インサート50の平らな底面は、ウェル84の底壁88上に着座しており、インサート50のアーム60、62は、カラーをウェル84内の中心に配置するように、カラー52から半径方向外側に延びている。環状のプリント用基材90のシートは、カラー52の底部にある下面56上に配置され、円柱状ステム部96およびその上端がウェル84の輪状の上唇部87に着座する屈曲末端フランジ100で終結する上方円錐台形漏斗部98を有する漏斗形状のホルダ94によってその場に保持されている。ホルダ94の円柱状部分96は、正方形凹部58により形成されるプリント用フレームに対して基材90をしっかりと押し付けるように、カラー52の内壁に隙間なく密着する。
【０２１７】
ホルダ94およびそれを取り付けられたインサートは、次いで、図3Hに示される方向から（図1Gのように）バイオプリントのために上側を向いたプリント用フレームおよびプリント用基材90を提示するように、逆さにされ得る。例えば、漏斗形状のホルダが自身を支持表面の方にしっかりと向けるように、漏斗部分98の末端フランジ100を平らな支持表面上に着座させる。ホルダ94は、それによって、バイオプリントのために、フレーム内の基材９０を、支持表面上に空間をあけて支持する。プリントが完了したら、ホルダ94は、再度逆さにされ得、培養ウェル84内で図3Hに示される培養方向に戻される。培養用培地は、プリントされたバイオ組織が培養プレートの底壁88に向かって正方形凹部58内へと成長するように、さらなる栄養分を提供するために、ポート66、68を通じておよび正方形凹部58を通じて注入され得る。ホルダ94が図3Gに示される方向にされている間に、さらなる細胞が、カラー52内で露出されている基材90の表面上に播種され得る。具体的な開示される例において、基材の一方の面に脈絡膜を含みかつ他方の面に網膜色素上皮細胞を含む三次元工学的血液網膜関門（BRB）を製造するために、血管細胞がプリント用フレーム凹部58を通じて基材90上にプリントされ、かつRPE細胞がホルダ94を通じて基材90の反対側の表面上に播種される。
【０２１８】
図3Fに示される第3の態様において、インサート70は、それを使用する培養ウェルに隙間なく収まるサイズおよび形状の円柱状カラー72である。カラー72は、平らな上表面および平行な平らな下表面を有する底壁74を有する。正方形のプリント用フレーム76が、底壁72を通って延びており、カラー72によって取り囲まれている。一連のポート78、82は、カラー72の外側のあたりに配置され、培養用培地がポートを通じてプリント用フレーム76へとおよびプリント用フレーム76を通って注入されることが可能になるようにフレーム76の内側のあたりのポート80、84とつながっている。ポートのいくつかは、細胞培地をフレーム76内に導入するために使用され、他のポートは、培養用培地をフレーム76から流出させるために使用される。
【実施例】
【０２１９】
ヒトiPS細胞技術とインビトロ発生および組織工学的アプローチの組み合わせは、重篤な変性疾患または傷害に起因する重篤な損傷を有する患者のための可能性のある細胞組織療法を開発する可能性を実現する。さらに、iPS細胞は、患者特異的な様式で入手することができ、免疫拒絶を回避する可能性が高い自己組織に発達させるために使用され得る。バイオプリント技術は、複数の細胞型を含む複雑な3D構造体を構築するために使用され得る。それは、2つの特徴を使用する：（1）分解性の生体材料と混合された数百〜数千の細胞（例えば、細胞200〜2000個）を含む「バイオインク」としての大きな滴の形態で播種される細胞；（2）細胞は、空間的かつ時間的に制御された使用者により定義された様式で動かすことができる、20μmの精度を有するニードルを用いて播種される。
【０２２０】
バイオプリントされた組織内の3D構造は、すべての異なる細胞型が同時に成熟することを可能にし、したがってそれらが天然組織のように協働する可能性を高める。工学的血液網膜関門は、極性RPE単層、および同じiPS細胞株由来の内皮細胞を含む。内皮細胞由来の3D微小血管は、RPE細胞の下に位置する脈絡膜線維芽細胞および周皮細胞を含む、組織内に並ぶ。このインビトロ組織は、BRBの疾患における分子経路を同定するため、BRBに影響を及ぼす薬物を発見および試験するためのヒトモデルとして、ならびに細胞ベースの治療法として使用され得る。
【０２２１】
実施例1
概要
バイオプリントされた脈絡膜組織の設計は、その（1）構造の設計（組織のタイプ、形状、厚み）の決定；（2）バイオインクの決定；（3）細胞濃度の決定；（4）バイオインクの細胞組成の決定；（5）プリント用基材の決定；（6）培地組成の決定；（7）培地量の決定；（8）培地交換頻度の決定；（9）総培養時間の決定；（10）プリント工程の決定；（11）視覚的、組織学的、および生化学的分析の決定に関して説明する。これらの要素は、図1〜14に例示されている。
【０２２２】
（1）構造の設計：3D工学的血管化組織は、電界紡糸ポリ（乳酸−グリコール酸）（PLGA）スキャホールド上にプリントする。プリントされる幾何学形状を、血管新生の定性的／定量的分析を容易にするように決定した。初期のプリントされた組織の直径は、およそ10 mmであり、これは容易に変更することが可能である。0.5〜25μm厚のPLGAスキャホールドは、線維芽細胞がブルッフ膜を模倣する細胞外マトリクス（ECM）構造を生成する空間およびプリントされた3D血管化組織の機械的支持を提供する。RPE細胞は、スキャホールドのもう一方の側に、単層として播種される。
【０２２３】
（2）バイオインク：バイオインクの一例を、Organovo製の市販のヒドロゲル（NOVOGEL（登録商標）＃2）と混合された天然ヒドロゲルであるフィブリンを用いて作製した。NOVOGEL（登録商標）＃2は、コラーゲン由来のゲルであり、ゼラチンと類似の特徴を有し、あらゆる類似のゲルで置き換えることができる。NOVOGEL（登録商標）＃2は、4℃で重合し、37℃で溶解し、この特性から、埋め込まれた内皮細胞の血管発生に適さない。NOVOGEL（登録商標）＃2とフィブリンゲルを組み合わせることによって、混合ヒドロゲルを生成し、これを3D血管発生に使用することに成功した。フィブリンゲルを、フィブリノゲンおよびトロンビンの混合によって生成し、アプロチニンの添加は、酵素反応を阻害することによってゲルの分解を減少させる。フィブリンゲル自体は、繊維性の特徴およびプリント用ゲル内での埋め込まれた細胞の均等な分布を妨げるタイミングでの重合のために、バイオプリントに適さなかった。
【０２２４】
フィブリノゲンは、トロンビンを添加するまでNOVOGEL（登録商標）＃2の重合に影響しないため、D-PBS（0.075 Uのアプロチニン/ml）中（2.5 mg/ml）溶液を使用した。ゲル混合物にカプセル化された細胞をプリントした後、トロンビン（0.5 U/ml）を含む増殖培地を添加し、プリントされたサンプルを室温で2時間、培地と共にインキュベートし、フィブリノゲンの重合のための時間を提供した。NOVOGEL（登録商標）＃2は、37℃で分解し、重合したフィブリンは、埋め込まれた内皮細胞からの血管発生に適した環境を提供する。
【０２２５】
（3）および（4）細胞濃度：組織の密度、融着および健康は、濃度の違いにより異なり得る。球状共培養システム実験は、線維芽細胞と内皮細胞の最適な比が10：1であることを示した。例示的なプロトコールは、500万細胞/mlの範囲の内皮細胞濃度、1000万細胞/mlの広範囲の線維芽細胞濃度および約50万細胞/mlの周皮細胞濃度を使用した。
【０２２６】
（5）プリント用基材：細胞を、マルチトランスウェルプラットフォームにおいて構築された電解紡糸PLGAスキャホールド上にプリントした。TRANSWELLは、底部および上部の両方の表面において分子を取り込み、分子を分泌することを可能にする細孔膜を有する透過性支持体に関するCorningの登録商標である。これらのデバイスは、TRANSWELL（登録商標）Permeable Supports Selection and Use Guide from Corningで詳細に説明されている。PLGAスキャホールドは、市販のTRANSWELL（登録商標）の従前の透過性支持体に置き換わり、数百ナノメートルの直径を有する繊維からなる生体適合性かつ生分解性のスキャホールドを提供する。バイオプリントの前に、プリントされる細胞・ゲル構造の接着性を向上させるために、PLGAスキャホールドの表面に対して酸素プラズマ処理を30分間適用した。酸素プラズマコーティングは、その表面を疎水性から親水性に変化させることによって表面条件を改善し、かつ滅菌性を提供する。本明細書に開示される3Dインサート、図3を参照、もまた、バイオプリントに使用することができる。
【０２２７】
（6）、（7）、（8）培地の組成、交換頻度、および量：各細胞型は、多くの場合、最大5％のウシ胎仔血清を必要とする。微小血管内皮細胞のために、FGF、VEGF、IGF-1、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸を含む内皮細胞用培地（Lifeline cell technology, MD）を使用した。iPSC由来内皮細胞（Cellular dynamics international, WI）の場合、補充物が必要であった。線維芽細胞の培養においても、5％ウシ胎仔血清含有RPE培地を使用した。プリント後、培地を、プリントされたフィブリンゲル内で成長した細胞と1：2比で混合する。培地は、24時間後に、次いで残りの培養期間の間、48時間ごとにトロンビン非含有培地と交換した。
【０２２８】
（9）培養時間およびRPEの播種：血管発生は、プリントから5日後までに観察された。プリントされた組織は、少なくとも9週間の期間生存可能であった。内皮細胞をプリントしてから7日後に、RPE細胞を、ポリマースキャホールドの反対側の面に播種した。RPEの播種から2週間後に、RPE単層の成熟のためにプロスタグランジンを添加した。プリントされた組織を維持するために、4〜9週の培養時間を使用した。この組織は、少なくとも9週間生存可能であった。
【０２２９】
（10）可視化：生きた組織の可視化のために、GFPを発現する初代内皮細胞を使用し、iPSC由来RPE/内皮細胞および周皮細胞を可視化するために、免疫染色技術を使用した。BRB組織の断面を可視化するために組織切片化技術を使用し、その後に免疫組織化学を行った。蛍光は、共焦点顕微鏡（Carl Zeiss, Germany）により捕捉される。
【０２３０】
バイオ工学的BRBを製造する方法の概要が、多能性幹細胞（iPSC）を内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞に分化させた図1Aに示されている。これらの細胞を、ヒドロゲルバイオインク中に懸濁し、PLGAスキャホールドの第1の面上にバイオプリントした。スキャホールドの第1の面上の細胞をウェル内で培養し、基材の第1の面上にバイオプリントされた脈絡膜が生成されるように、バイオプリントされた面をウェルの底に向けて、スキャホールドをTranswellホルダから吊り下げた。バイオプリントから7日後に、RPE細胞を、ホルダを通じて基材の反対側の面上に堆積させ、このRPE細胞を、基材を吊り下げているTranswellホルダ上のウェル内で培養した。最終生成物が、図1Aに、示される層が明確さのために分離されている分解図で図示されている。RPE単層は、中間生分解性スキャホールド層の上面に存在しかつその上面に付着しており、バイオプリントされた脈絡膜の底層は、生分解性スキャホールドの底面に付着していることが示されている。
【０２３１】
実施例2
例示的なプロトコール
例示的な方法の工程を示すフローチャートが、図12に提供される。この方法の個々の工程は、図1B〜1Hに図示されている。このプロトコールのこの態様は、以下の工程を含む。
【０２３２】
プリントの前日に、スキャホールドをプリントのために組み立てる。所望のプリント用フレーム（例えば、corning 3407 Snapwellプレートもしくはcorning 3470 Transwell（登録商標）プレート、または特注の3Dプリントされたフレーム等）を選択する。SNAPWELL（登録商標）/Transwell（登録商標）メンブレン（図1Bの影付き領域10）は、スナップウェルの底側半分を解体した後にフレームから取り除かれる。メンブレンの除去により、プリント用フレーム12を形成する開放端を有するトランスウェルの円柱状底部が残る（図1C）。あるいは、3Dインサートを使用することができる、図3を参照のこと。
【０２３３】
PLGA（または他の生体適合性材料）スキャホールドを、薄いPLGAシートに対して生検パンチを用いて正確なサイズで得、抜き取ったスキャホールドを、プリント用フレームにはめる。シリコーン接着剤を使用して、スキャホールドをプリント用フレームに取り付ける。混合接着剤をペトリ皿の蓋に塗り、プリント用フレーム12の底部を、接着性リング14を形成するように接着剤でコーティングする（図1D）。スキャホールド16（図1E）を、接着剤コーティングしたフレームの底部に取り付け、5分間乾燥させる。接着剤を塗った後、Snapwellの底側半分を、図1Fに示されるようにホルダの円錐台形漏斗ボディ部18に再付加する（この工程は、Transwellを使用する場合必要ない）。Snapwellを使用する場合、Teflon（またはそれと同等の代替物）製の滅菌性Oリングに接着剤を塗り、それを洗い流してスキャホールドと共に水密状態にできるように、スナップウェルの底面開放部内にOリングを取り付ける。
【０２３４】
図示されているスキャホールド16は、互いに反対側にある平行な第1の表面および第2の表面を有する薄い、実質的に平らな基材である。細胞は、スキャホールドの両面にまたは片面のみにプリントすることができる。説明を簡単にするために、ウェルの底面に露出している表面を底表面と称し、プリント用フレームを取り付ける反対側の表面を基材の上表面と称する。開示される態様においては、スキャホールドの一方の表面（底表面）のみを、プリントに使用し、他の表面（上表面）は、細胞、例えば上皮細胞の播種に使用する。基材16の非プリント表面または上表面を、ECM溶液、例えばビトロネクチン、フィブロネクチンまたは任意の他の細胞接着因子でコーティングする。基材16を、一晩（室温で1時間、および薄いスキャホールドからしわを取り除くためにインキュベーター内で1〜12時間）インキュベートする。水をプリント用装置から取り除き、次いでこれをプリントする時点まで滅菌条件下で保管する。
【０２３５】
プリント当日、すべての必要となる培地およびトリプシンを解凍し、プリント用スキャホールドに亀裂がないことを確認するために検査する。バイオインク（細胞＋ヒドロゲル）のバイアルおよびトロンビンのアリコートを調製する。比較的低濃度のフィブリノゲンの溶液（2.5〜20 mg/mＬ）を調製し、フィブリノゲンが溶解するまで水浴下で保管する。別のより高濃度のフィブリノゲン溶液を調製する（例えば、低濃度溶液と比較して少なくとも2倍の濃度；コラーゲン等の他のECMもこの低濃度フィブリノゲンに混合され得る）。両方のフィブリノゲン溶液を完全に懸濁状態にしたら、アプロチニン／トラネキサム酸／アミノカプロン酸を両方のチューブに添加し、十分に混合し、ろ過し、そして水浴下で保管する。アプロチニン濃度は、0.05〜0.3 U/mlである。Novogel#2（Organovo, CA）またはGelatin（60 mg〜200 mg/ml）の1本のチューブを低濃度フィブリノゲン溶液に添加し、さらに30分間インキュベートする。プリントの準備ができるまで、4℃で保管する。
【０２３６】
トロンビン（0.5 U〜10 U/ml）を含む増殖培地（30〜50 mＬ）を調製する。プリント用スキャホールド16を完全に乾燥させ、20〜60分間酸素プラズマ処理に供する。プラズマ処理は、スキャホールドを滅菌し、かつバイオインクが表面により付着できるようにスキャホールドを親水性にする。
【０２３７】
細胞を継代および計数して、複数の細胞型を使用する場合は比率（例えば、内皮細胞：500万〜3000万細胞/ml、線維芽細胞：1000万〜5000万細胞/ml、周皮細胞：50万〜300万細胞/ml等の範囲）を決定することによって、細胞混合物を調製する。細胞混合物を、バイオインク用に指定されたチューブに入れ、500Gで4分間遠心分離して沈殿させる。上清を除去した後、フィブリンゲルを添加し、ペレットを攪拌する。懸濁化したら、プランジャーに気泡が浮いていないことを確認しつつバイオインクを直ちにプリント用シリンジに入れ、4℃で10〜15分間保管する。
【０２３８】
次いで、基材16のプリント表面（「底表面」）が上向きになりプリントのために露出するよう漏斗を支持体上に着座させるように、漏斗18を逆さにする（図1G）ことによってプリント用フレームに取り付けられた基材16をプリンタにさらす。フードパワーをオンにし、リセットボタンを押し、電源スイッチを反転させ、次いでキーボードを電源オンにすることによってプリンタを起動する。作業領域にスプレーをした後、シリンジを装着し、気泡を除去するようにプランジャーを押し、そして分配位置を固定する。これは、案内矢印を使用してバイオプリンタニードルのx、y、およびz座標を操作することによって達成される。xおよびy座標が設定されたら、プリント用ニードルが、スキャホールドにわずかに触れるまで下げる。スクリプト（スクリプトは別々に記述され、それはプリント用シリンジの動作を命令する）を選択した後、バイオプリンタがプリントを開始する。プリントが完了したら、3〜5分間待つ。次いで、細胞を含むまたは含まない360μLの高密度フィブリン／コラーゲンゲル／マトリゲルをプリント物の上層に添加し、20分間重合させる。次いで、4 mLの調製済み培地を各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートし、その後にゲルを37℃のインキュベーターに入れる。
【０２３９】
RPE播種プロトコール
漏斗18を、図1Hに示されるように再度向きを変え、漏斗18がウェル20の上側になるようにマルチウェルプレートの壁20から吊り下げ、基材16を、そのすでにプリントされている表面が下になり、プリントされた表面がウェル20の底表面に隣接するまたは接するように配置する。すでにプリントされた脈絡膜は、基材16のバイオプリント（底）面にある。
【０２４０】
プリント工程から数日後に、3 mlの溶解試薬（TrypLEまたは0.25％トリプシン）を各ウェルに添加することによってRPE細胞をトリプシン処理し、37℃で30〜40分間インキュベートする。必要に応じて、細胞スクレイパーを使用して剥離しなかった任意の細胞を穏やかに取り除く。インキュベート後、2〜3 mLのRPE培地をウェルに添加し、内容物を50 mLチューブに移す。このチューブを1000 rpmで5分間遠心分離し、ペレットを回収する。RPE単層はすぐに塊になるので、シリンジおよび長いニードルを用いて混合し、細胞ストレイナーは、塊になった細胞の分解を促進し得る。
【０２４１】
RPE細胞の懸濁物を、漏斗18を通ってスキャホールドの非プリント面へとスキャホールド16の上面に添加する。播種後、500 uLのRPE培地をウェル（Transwell）の上面に、3〜5 mLをTranswellの底側に添加する。培地を一日おきに交換する。この手順を、単層が形成されるまで繰り返す。すでにプリントされている脈絡膜は、図1Hにおいて、基材16の底面にとどまり、基材16の上面の1 cm径の円形領域あたり200〜400KのRPE細胞が存在する。
【０２４２】
実施例3
例示的な試薬
ヒドロゲル（バイオインク）
2020504625.tif 000003
【０２４３】
スキャホールド（バイオプリント用基材）
2020504625.tif 000004
【０２４４】
5％ FBSを含むRPE培地
MEM-α改変培地（Sigma-Aldrich）を基本培地として使用し、RPE細胞培養用の5％血清含有培地を調製する（RPE培地：以下の表1）。
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*THTは、培地を作製する前に1 PBS 1.5 mL中にタウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニンを溶解させることによって作製する。培養用培地の培養調製を簡単にするために、複数のアリコートを作製して-80℃で保管する。培地の調製で使用するウシ胎仔血清は、Atlanta Biologicals（Norcross, GA）から入手する。使用前に、血清の各ボトルを熱不活性化する（56℃で1時間）。
【０２４５】
初代/iPSC由来内皮細胞培地（10％ FBS）
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*細胞補充物はFBSを含み、最終FBS濃度は10％である。
【０２４６】
プリント後のプリントされた脈絡膜のための組織培養用培地
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*組織培養のフェーズに依存するが、濃度は時間と共に減少する。
**組織培養のフェーズに依存するが、濃度は時間と共に減少する。
***組織培養のフェーズに依存するが、濃度は時間と共に減少する。
【０２４７】
実施例4
眼組織モデルの結果
図13A〜13Bに示される結果は、XY面におけるバイオプリントの再定義された幾何学形状が、血管新生優性（ギャップ部）および血管発生優性（プリントされた領域）領域への血管発生の分離を実現することを示している。ギャップ部における血管新生の定量は、血管新生が血管内皮成長因子（VEGF）の濃度に有意に依存したことを示すことによって、プリントされた微小血管網を検証した。一週間のVEGF処理は、微小血管網の成長および生存を有意に向上させた。この組織の断面の組織学的切断は、インビボと類似する、周皮細胞によって取り囲まれた内皮細胞の中空管形成（2つのマーカーの共局在化）を示している。このシステムは、疾患モデルとして使用することができる、図17、18を参照のこと。1つの例において、細胞はiPSC由来である。
【０２４８】
図15A〜15Cは、工学的外側血液網膜関門のプロトタイプを示している。図15Aは、PLGAスキャホールドの一方の側でのRPE単層の完全な形成を示している。図15Bは、スキャホールドの他方の側にプリントされた、完全に血管化された組織である脈絡膜を示している。図15Cのパネル1および15Cのパネル2は、RPEの頂端領域におけるエズリン発現によりRPEの極性が確認されることを示しており、15Cのパネル3は、共焦点画像から再構築された全体3D像を示している。図15A〜15Cに示される結果により、工学的組織の3D構造が天然の脈絡膜を模倣することが確認される。
【０２４９】
図16は、スキャホールド上のRPEを含む組織とそれを含まない組織の間の比較研究を示す。RPEを含む組織は、RPEを含まない組織よりも薄い直径の微小血管（図16D対図16F；CD31）ならびに強い開窓マーカーの発現（図16D対図16Fおよび図16E対図16G；FELS）を示している。RPEの含有はまた、有意な量の血管成長を誘導し、血管の生存率を維持した（図16E対図16G；CD31）。TEMデータ（図16H）は、強い色素沈着および頂端突起（矢印）を示している。微小血管のTEMデータにより、脈絡毛細管の特別な特徴である開窓の超微細構造（矢じり）が確認された。したがって、この結果により、インビボの脈絡膜に類似する、脈絡膜の生存および機能に関するRPEの有意な役割が確認された。
【０２５０】
STAT3の過剰発現は、ウェット型AMDに関して以前に報告されている。RPEにおけるSTAT3の発現が「脈絡膜」新血管新生において役割を果たすかどうかを、本発明の方法およびモデルシステムを用いて試験した（図17を参照のこと）。STAT3を過剰発現するiPSC由来RPEおよびSTAT3遺伝子変異特異的iPSC由来RPEを有する患者を、「健常脈絡膜」において使用した。RPE単層は、検知可能な変化を示さなかったが、RPEのSTAT3過剰発現はサブRPE領域において血管化を有意に誘導した（図17D対図17F）。RPEのSTAT3変異は、血管構造を不安定化させると考えられた（図17G対図17H）。したがって、図17は、遺伝子修飾iPSCおよび患者特異的iPSCを用いる疾患モデルの例を提供する。
【０２５１】
RPEまたはRPE-「脈絡膜」の低酸素状態が「脈絡膜」新血管新生において役割を果たすかどうかを試験した。低酸素は、ウェット型AMDを誘導する重要な要因であることが報告されている。化学的化合物DMOGを使用して、RPEまたは組織内のあらゆる細胞型において低酸素誘導因子を誘導した。RPE単層は、検知可能な変化を示さなかったが、RPEのみまたはRPEおよび「脈絡膜」の両方のいずれかのDMOG処理は、サブRPE領域において血管化を有意に誘導した（図18D〜図18F）。このように、図18は、分子標的の化学的誘導因子を用いて作製される疾患モデルの例を示している。
【０２５２】
本発明の原理が適用され得る多くの可能性のある態様に鑑みて、示されている態様は本発明の一例にすぎず、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきでないことが理解されるべきである。そうではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲およびその精神の範囲内にあるすべてを本発明者らの発明として主張する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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