(57)【要約】  本発明は、リラキシン融合ポリペプチド、特にリラキシン２融合ポリペプチドおよびその使用に関する。したがって、本発明は、リラキシン融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、ならびに医薬組成物を含むキットおよび治療の方法を含む医薬組成物の使用を提供する。本発明のポリペプチドおよび組成物は、特に、心臓血管系疾患の治療において、たとえば心不全の治療に有用であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ−Ｌ−ＢまたはＢ−Ｌ−Ａを含む融合ポリペプチドであって、
Ａは、リラキシンＡ鎖ポリペプチドまたはその変異体であり；
Ｂは、リラキシンＢ鎖ポリペプチドまたはその変異体であり；かつ
Ｌは、少なくとも１５のアミノ酸を含むリンカーポリペプチドであり；
前記融合ポリペプチドは、リラキシン活性を有し、かつ半減期を延長する成分をさらに含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記リラキシンＡ鎖は、リラキシン２  Ａ鎖であり、前記リラキシンＢ鎖は、リラキシン２  Ｂ鎖である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記リンカーポリペプチドＬは、長さが１５〜２０アミノ酸である、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記リンカーポリペプチドＬは、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）の３つ以上のリピートを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記リンカーポリペプチドＬは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記リンカーポリペプチドＬは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記半減期を延長する成分は、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｆｃ領域は、アミノ酸修飾の以下の組み合わせ：
（ｉ）  Ｆｃ−ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ）；
（ｉｉ）  Ｆｃ−ＦＱＱ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｑ，Ｋ３２２Ｑ）；
（ｉｉｉ）  Ｆｃ−ＴＭ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ）；
（ｉｖ）  Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｑ，Ｋ３２２Ｑ）；
（ｖ）  Ｆｃ−ＹＴＥ−ＴＭ（（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ），
（ｖｉ）  Ｆｃ−ＴＭ−ΔＴＨＴ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ，Ｄ２２１Ｇ，Ｋ２２２Ｇ，Ｔ２２３Ｇ，Ｈ２２４Ｓ，Ｔ２２５Ａ），
（ｖｉｉ）  Ｆｃ−ＴＭ−ΔＴＨＴΔＫ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ，Ｄ２２１Ｇ，Ｋ２２２Ｇ，Ｔ２２３Ｇ，Ｈ２２４Ｓ，Ｔ２２５Ａ，ΔＫ４４７），
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有し、
アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、請求項７または８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記半減期を延長する成分は、融合ポリペプチドのＮ−末端に付けられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記半減期を延長する成分は、コネクターポリペプチドを介して前記融合ポリペプチドに付けられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記コネクターポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＳＰ（配列番号５６）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）を含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記コネクターポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号６９）、ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号７０）を含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
リラキシン活性を有する融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のいずれか１つにおいて示される配列を有する、融合ポリペプチド。
【請求項１５】
基準となるリラキシンタンパク質のリラキシン活性に対する前記融合ポリペプチドのリラキシン活性の比は、約１０−５および約１０５の間である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターまたは請求項１６に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を培養するステップおよび前記融合ポリペプチドを収集するステップを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
療法における使用のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、前記対象に投与される、心不全を有する対象の治療における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、皮下注射によって前記対象に投与される、請求項２１もしくは２２に記載の使用のための融合ポリペプチドまたは請求項２１もしくは２２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２４】
前記融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、自己投与によって投与される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用のための融合ポリペプチドまたは請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２０の医薬組成物を含むキット。
【請求項２６】
疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項２０に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
心不全を有する対象を治療するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項２０に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、皮下注射によって前記対象に投与される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、自己投与によって投与される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リラキシン融合ポリペプチドに関する。特に、本発明は、リラキシン２融合ポリペプチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リラキシンは、インスリンスーパーファミリーに属するペプチドホルモンである。ヒトでは、リラキシンペプチドファミリーは、構造の類似性が高いが配列類似性が低い、７つのペプチドを含む：リラキシン１、２、および３ならびにインスリン様ペプチドＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５、およびＩＮＳＬ６。リラキシン遺伝子のコード領域は、シグナルペプチドで始まり、Ｂポリペプチド鎖、Ｃペプチド、およびＡポリペプチド鎖が続く。シグナルペプチドおよびＣペプチドは、タンパク質分解によって除去され、成熟リラキシンタンパク質が産生され、これは、２つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で連結されたＡ鎖およびＢ鎖からなる。Ａ鎖は、さらなる鎖内ジスルフィド結合を有する。成熟リラキシンタンパク質は、およそ６０００Ｄａの分子量を有する。
【０００３】
リラキシンは、妊娠の間に全身性の血行動態のおよび腎臓の適応変化を媒介することが知られている多面的なホルモンである。リラキシンはまた、抗線維性の特性を有し、かつ心不全において有益な効果を有することも示された。心不全は、深刻な罹患率および死亡率に関連する。心不全は、心筋細胞死の増加および間質性線維症を伴う複雑な組織リモデリングによって特徴付けられる（Ｂａｔｈｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｆｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｉｅｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。リラキシンは、虚血再灌流および心不全といった状況において有益であることが示された多くのシグナル伝達カスケードを活性化する（Ｂａｔｈｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これらのシグナル伝達経路は、ホスホイノシチド３−キナーゼ経路の活性化および一酸化窒素シグナル伝達経路の活性化を含む（Ｂａｔｈｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００４】
臨床試験が、未修飾組換えヒトリラキシン２、セレラキシンを使用して行われた。セレラキシンは、現在、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）についての第ＩＩＩ相臨床試験中である。この研究において、セレラキシンは、入院心不全患者に対して４８時間、連続静脈内注入によって投薬された（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２０６４８６８）。
【０００５】
以前に終了した臨床試験では、セレラキシンの静脈内投与は、心臓、腎臓、および肝臓の損傷ならびにうっ血のマーカーを改善した（Ｆｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔｅｅｒｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍｅｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかしながら、患者の血液循環からのセレラキシンの急速な排除のために、治療効果は、入院患者にとって限られたものであり、一旦静脈内注射を止めたら、正の効果は、急速に消滅した。そのうえ、およそ３分の１の患者は、セレラキシンを静脈内に受けた後に、深刻な血圧低下（＞４０ｍｍ  Ｈｇ）を経験し、半分またはさらにもっと用量を低下させなければならなかったという結論に達した。
【０００６】
国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットは、リラキシンＡ鎖ポリペプチドがリンカー配列によりリラキシンＢ鎖ポリペプチドに融合されている組換え単鎖リラキシン融合ポリペプチドを記載する。発明者らは、少なくとも５つのアミノ酸および１５未満のアミノ酸のリンカー長がリラキシン活性に必要とされることを見出した。国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットは、さらに、抗体のＦｃドメインに融合された組換え単鎖リラキシン２融合ポリペプチドを記載し、これは、野生型リラキシン２に対して半減期の改善を呈した。
【０００７】
未修飾組換えリラキシンによりこれまでに行われた有望な臨床研究を考慮すれば、リラキシン生物学的活性を保持し、長期にわたる半減期および好都合な投薬などのような利点を提供する、さらなる組換えリラキシン融合ポリペプチドの必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、リンカーポリペプチドによって連結されるリラキシンＡ鎖およびリラキシンＢ鎖を含み、リンカーポリペプチドは、少なくとも１５のアミノ酸を含むリラキシン融合ポリペプチドに関する。それと関連して、本発明は、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、および医薬組成物を含むキットならびに治療の方法を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【０００９】
本発明の態様および実施形態は、添付の請求項において述べられる。本発明のこれらのおよび他の態様および実施形態はまた、本明細書においても記載される。
【００１０】
図面の簡単な説明および配列表
本発明は、ここで、添付の図面に関してより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明のいくつかの実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチドの略図および略称を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。
【図３】図３は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＴＭ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＴＭ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図４】図４は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＦＱＱ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＦＱＱ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図５】図５は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＹＴＥ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＹＴＥ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図６】図６は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＹＴＥ−ＴＭ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＹＴＥ−ＴＭ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図７】図７は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＹＴＥ−ＦＱＱ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図８】図８は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−Ｇ４Ｐ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。
【図９】図９は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＴＭ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＴＭ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１１】図１１は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＦＱＱ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＦＱＱ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＹＴＥ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＹＴＥ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＹＴＥ−ＴＭ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＹＴＥ−ＴＭ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く；Ｆｃ部におけるＹＴＥ−ＦＱＱ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１５】図１５は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−Ｇ４Ｐ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。
【図１６】図１６は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿ｈＲＬＸ２＿２１−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。Ｆｃ部におけるＴＭΔＴＨＴΔＫ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿ｈＲＬＸ２（ＢＡ）＿２１−１５ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。Ｆｃ部におけるＴＭΔＴＨＴΔＫ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１８】図１８は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（ｈＲＬＸ２＿Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿１５−２４ＡＡ）のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。Ｆｃ部におけるＴＭΔＴＨＴΔＫ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図１９】図１９は、本発明の実施形態によるリラキシン２融合ポリペプチド（ｈＲＬＸ２（ＢＡ）＿Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿１５−２４ＡＡ）  のヌクレオチド（上）配列およびアミノ酸（下）配列を示す図である（それぞれ、コネクター（一重の下線）配列およびリンカー（二重の下線）配列に下線を引く）。Ｆｃ部におけるＴＭΔＴＨＴΔＫ突然変異に下線を引き、太字にする）。
【図２０】図２０は、ＲＸＦＰ１発現細胞における本発明のいくつかのリラキシン２融合ポリペプチドのインビトロにおける活性を示す図である。相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）は、ｃＡＭＰ産生の刺激に相当する。
【図２１】図２１は、ＲＸＦＰ１発現細胞における本発明のいくつかのリラキシン２融合ポリペプチドのインビトロにおける活性（ｃＡＭＰ産生の刺激）を示す図である。
【図２２】図２２は、リラキシン−２受容体に対する本発明のいくつかのリラキシン２融合ポリペプチドの特異性を示す図である。
【図２３】図２３は、本発明のいくつかのリラキシン２融合ポリペプチドによるＶＥＧＦ発現の誘発を示す図である。この図において、「ゼロ＝１」は、偽「治療なし」コントロールで測定された活性（すなわち、アッセイにおいてＲＬＸ２またはＲＬＸ２融合ポリペプチドの追加なし）をベースラインとして採用したことを意味する（すなわち、「治療なし」コントロールの倍数変化の値は１である）。
【図２４】図２４は、静脈内に（上）または皮下に（下）投与された融合ポリペプチドＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡ（４ｍｇ／ｋｇ）のラットＰＫプロファイルを示す図である。
【図２５】図２５は、静脈内に（上）または皮下に（下）投与された融合ポリペプチドＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ（４ｍｇ／ｋｇ）のラットＰＫプロファイルを示す図である。
【図２６】図２６は、静脈内に（「ＩＶ」、丸）または皮下に（「ＳＣ」、三角）投与された融合ポリペプチドＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ（６ｍｇ／ｋｇ）のマウスＰＫプロファイルを示す図である。「ＣＬ」は、ＩＶ投与後のＦｃ−リラキシンの全身クリアランスを示し、「ＣＬ／Ｆ」は、ＳＣ投与後のＦｃ−リラキシンの見かけの全身クリアランスを示す。
【図２７】図２７は、皮下に投与された融合ポリペプチドＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ（１ｍｇ／ｋｇ（丸）、６ｍｇ／ｋｇ（四角）、および３０ｍｇ／ｋｇ（三角））のマウスＰＫプロファイルを示す図である。「ＣＬ」は、ＩＶ投与後のＦｃ−リラキシンの全身クリアランスを示し、「ＣＬ／Ｆ」は、ＳＣ投与後のＦｃ−リラキシンの見かけの全身クリアランスを示す。
【図２８】図２８は、細胞ベースのｃＡＭＰアッセイにおける、ヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）細胞株における本発明のいくつかのＦｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドのインビトロにおける活性ならびにＲＸＦＰ２選択性（Ｃ）を示す図である。
【図２９】図２９は、Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡにより治療されたマウスにおけるイソプロテレノール誘発性の心肥大の予防を示す図である。（Ａ）は、心臓重量（ＨＷ）／下腿長（Ｔｉｂｉａ  Ｌｅｎｇｔｈ）（ＴＬ）（ｍｇ／ｍｍ）の比を示し、（Ｂ）は、コラーゲン含有量（μｇ／組織１ｍｇ）を示し、６グループを試験した：（１）ビヒクル、（２）Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ、（３）イソプロテレノール、（４）イソプロテレノール＋エナラプリル、（５）イソプロテレノール＋ｒｈＲＬＸ２、（６）イソプロテレノール＋Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列番号表
【００１３】
【表１】
2020505029.tif 000002
【００１４】
【表２】
2020505029.tif 000003
【００１５】
【表３】
2020505029.tif 000004
【００１６】
【表４】
2020505029.tif 000005
【００１７】
詳細な説明
本発明は、構造Ａ−Ｌ−ＢまたはＢ−Ｌ−Ａを有するリラキシン融合ポリペプチドであって、リラキシンＡ鎖（Ａ）は、リンカーポリペプチド（Ｌ）を介してリラキシンＢ鎖に連結され、リンカーポリペプチドＬは、長さが少なくとも１５のアミノ酸である、リラキシン融合ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、リラキシン融合ポリペプチドは、リラキシン２融合ポリペプチドである。リラキシン２融合ポリペプチドは、リラキシン２  Ａ鎖およびリラキシン２  Ｂ鎖を含む。
【００１８】
本発明は、リンカーポリペプチドＬが少なくとも１５のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが、リラキシン活性を有するという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明者らは、１５アミノ酸のリンカーによりＡ鎖のＣ末端がＢ鎖のＮ−末端につながれているリラキシン２融合ポリペプチドが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ０４０９０．１のリラキシン２ポリペプチドなどのような成熟リラキシン２ポリペプチドのＡ鎖およびＢ鎖のアレイを有するリラキシン２タンパク質（すなわちＡ鎖およびＢ鎖の間にリンカーを有していない）と同等の生物学的活性を呈することを見出した。同様に、本発明者らは、１５アミノ酸のリンカーによりＢ鎖のＣ末端がＡ鎖のＮ−末端につながれているリラキシン２融合ポリペプチドが、成熟リラキシン２ポリペプチドのＡ鎖およびＢ鎖のアレイを有するリラキシン２タンパク質と同等の生物学的活性を呈することを見出した。これらの発見は、１５未満のアミノ酸のリンカー長が生物学的活性に必要であることが見出された国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットにおける教示を考慮して特に驚くべきことである。
【００１９】
天然に存在するリラキシンは、構造Ｂ−Ｃ−Ａを有するプロホルモンとして発現され（ここで、「Ｂ」はリラキシンのＢ鎖であり、「Ｃ」はリラキシンのＣペプチドであり、「Ａ」はリラキシンのＡ鎖である）、成熟タンパク質は、プロホルモンコンバターゼ１（ＰＣ１）およびプロホルモンコンバターゼ２（ＰＣ２）の酵素によるプロホルモンのエンド型タンパク質分解性の（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断により、Ｃペプチドを除去することによって産生される。本発明の融合ポリペプチドは、ＰＣ１およびＰＣ２によるそのようなエンド型タンパク質分解性の切断を受けないことが理解されるであろう。
【００２０】
本発明の融合ポリペプチドは、リラキシンＡ鎖ポリペプチドまたはその変異体およびリラキシンＢ鎖ポリペプチドまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、リラキシンＢ鎖ポリペプチドは、そのＣ−末端にいかなる付属物も有していない。言いかえれば、リラキシンＢ鎖ポリペプチドは、遊離Ｃ−末端を有する。他の実施形態では、リラキシンＡ鎖ポリペプチドは、そのＣ−末端にいかなる付属物も有していない。言いかえれば、リラキシンＡ鎖ポリペプチドは、遊離Ｃ−末端を有する。
【００２１】
融合ポリペプチドは、リラキシン１、リラキシン２、およびリラキシン３から選択されるリラキシンのグループ由来のリラキシンＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、リラキシン２またはリラキシン３由来のリラキシンＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドを含む。したがって、融合ポリペプチドは、リラキシン２  Ａ鎖またはリラキシン３  Ａ鎖ポリペプチドまたはその変異体およびリラキシン２  Ｂまたはリラキシン３  Ｂ鎖ポリペプチドまたはその変異体を含んでいてもよい。いくつかの他の実施形態では、融合ポリペプチドは、リラキシン３  Ａ鎖ポリペプチドまたはその変異体およびリラキシン３  Ｂ鎖ポリペプチドまたはその変異体を含む。特に、融合ポリペプチドは、ヒトリラキシンＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドを含んでいてもよい。
【００２２】
融合ポリペプチドは、リラキシン２  Ａ鎖ポリペプチドまたはその変異体およびリラキシン２  Ｂ鎖ポリペプチドまたはその変異体を含んでいてもよい。特定の実施形態では、リラキシンＡ鎖ポリペプチドは、ヒトリラキシン２  Ａ鎖ポリペプチドまたはその変異体およびヒトリラキシン２  Ｂ鎖ポリペプチドまたはその変異体を含む。ヒトリラキシン２  Ａ鎖ポリペプチドは、配列番号４２において示される配列またはその変異体を有していてもよく、ヒトリラキシン２  Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号４４もしくは配列番号４６において示される配列またはその変異体を有していてもよい。さらなる実施形態では、ヒトリラキシン２  Ａ鎖ポリペプチドは、配列番号４２において示される配列を有し、ヒトリラキシン２  Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号４６において示される配列を有する。
【００２３】
リラキシンＡ鎖およびＢ鎖の変異体は、当技術分野において知られている。そのうえ、リラキシンＡ鎖およびＢ鎖の変異体の設計の手引きは、当業者に入手可能である。たとえば、変異体が、リラキシン機能に必要とされるアミノ酸を保持してもよいことは理解されるであろう。たとえば、リラキシン２  Ｂ鎖変異体は、保存モチーフＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｉｌｅ（配列番号５５）（Ｃｌａａｓｚ  ｅｔ  ａｌ，２００２、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）またはＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｖａｌ（配列番号６０）（Ｂａｔｈｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）を含んでいてもよい。変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含んでいてもよい。たとえば、リラキシン２  Ｂ鎖変異体は、配列番号４４と比較して、Ｖａｌ２３、Ａｌａ２４、Ｌｙｓ５４、Ａｒｇ５５、およびＮ−末端Ｍｅｔから選択される１つ以上のさらなるアミノ酸を有していてもよい。その代わりにまたはそのうえ、変異体は、１つ以上のアミノ酸誘導体を含んでいてもよい。たとえば、リラキシン２  Ｂ鎖変異体の第１のアミノ酸は、ピログルタミン酸であってもよい。
【００２４】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、ペプチド結合を通して連結された２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために本明細書において区別なく使用されてもよい。
【００２５】
本発明の融合ポリペプチドは、組換え融合ポリペプチドであってもよい、すなわち、それは、組換えＤＮＡ技術によって作られたものであってもよい。野生型リラキシンタンパク質と異なり、本発明の融合ポリペプチドは、生物学的活性のためにエンド型タンパク質分解性のプロセシングを必要としない。
【００２６】
リラキシンファミリーペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化およびそれぞれＧｓまたはＧｉタンパク質サブユニットによるｃＡＭＰシグナル伝達経路の続く刺激または阻害を通して、少なくとも部分的に、それらの生物学的効果を伝達する。リラキシン２は、ＧＰＣＲ  ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７としても知られている）および程度はより低いが、ＧＰＣＲ  ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８としても知られている）を活性化して、したがって、Ｇｓ−ｃＡＭＰ依存性のシグナル伝達経路を刺激し、セカンドメッセンジャー分子ｃＡＭＰの増加に至ることが知られている。
【００２７】
本明細書において使用されるように、用語「リラキシン活性」は、リラキシン分子が、リラキシン受容体に結合するおよび／または前記リラキシン受容体を活性化するおよび／または細胞の内部でシグナル伝達カスケードを開始する能力を指す。リラキシン活性がリラキシン２活性である実施形態では、リラキシン活性は、受容体ＲＸＦＰ１および／またはＲＸＦＰ２に結合するおよび／またはそれを活性化する能力を指してもよい。リラキシン活性がリラキシン３活性である実施形態では、リラキシン活性は、受容体ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ３、および／またはＲＸＦＰ４に結合するおよび／またはそれを活性化する能力を指してもよい（Ｂａｔｈｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。用語「リラキシン活性」は、「生物学的活性」と区別なく使用されてもよい。
【００２８】
リラキシン活性は、リラキシン受容体へのリラキシン分子の結合を測定することによっておよび／またはリラキシン受容体への結合の下流のイベントを測定することによって決定されてもよい。
【００２９】
リラキシン活性は、インビトロにおいておよび／またはインビボにおいて決定されてもよい。いくつかの実施形態では、リラキシン活性は、インビトロにおいて決定される。
【００３０】
リラキシン活性は、受容体のリラキシンによる活性化の下流の分子の量および／または存在を測定することによって決定されてもよい。たとえば、リラキシン活性は、受容体のリラキシンによる活性化後のｃＡＭＰ産生を測定することによって決定されてもよい。リラキシン誘発性のｃＡＭＰ生成の検出のための方法は、当技術分野において知られている。そのような方法は、ｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡおよびＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイを含む。リラキシン活性はまた、受容体のリラキシンによる活性化後の一酸化窒素（ＮＯ）産生を測定することによって決定されてもよい。リラキシン活性はまた、受容体のリラキシンによる活性化の下流の分子の活性化を測定することによって決定されてもよい。たとえば、リラキシン活性は、ｐ４２／４４  ＭＡＰＫの活性化を測定することによって決定されてもよい。
【００３１】
その代わりにまたはそのうえ、リラキシン活性は、既知のリラキシン標的遺伝子の活性化を測定することによって決定されてもよい。たとえば、リラキシン活性は、ＴＨＰ−１細胞における既知のリラキシン標的遺伝子、ＶＥＧＦの転写の活性化を測定することによって決定されてもよい。遺伝子の転写の活性化を決定する方法は、当技術分野において知られており、ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ分析を含む。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの相対的な発現は、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）において記載されるように、リラキシンとのＴＨＰ−１細胞のインキュベーション後にＶＥＧＦ転写物の定量リアルタイムＰＣＲ誘発によって測定することができる。
【００３２】
その代わりにまたはそのうえ、リラキシン活性は、リラキシンの１つ以上の下流の効果を測定することによって決定されてもよい。たとえば、心肥大の低下は、心エコー法、標準的な方法による体重および／または下腿長に比べた左心室重量によって測定することができる。別の実施例では、リラキシン活性は、マッソン三色染色法によって線維症低下を測定することによって決定されてもよい。別の実施例では、リラキシン活性は、線維化促進性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）因子（ＴＧＦ−ベータなど）の阻害、線維芽細胞増殖および分化の阻害、ならびに／またはＭＭＰ媒介性の細胞外マトリックス分解の活性化などのような結合組織代謝の変化を測定することによって決定されてもよい（Ｂａｔｈｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００３３】
本発明のリラキシン融合ポリペプチドの活性は、基準となるリラキシンタンパク質と比較して決定されてもよい。いくつかの実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質は、組換えタンパク質である。リラキシン融合ポリペプチドの活性は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ０４０９０．１のリラキシン２ポリペプチドなどのような成熟リラキシンポリペプチドのリラキシンＡ鎖およびリラキシンＢ鎖のアレイを有する基準となるリラキシンタンパク質（すなわちＡ鎖およびＢ鎖の間にリンカーを有していない）と比較して決定されてもよい。そのようなリラキシンは、市販で入手可能である。たとえば、成熟ヒトリラキシン２のリラキシン２鎖Ａおよびリラキシン２鎖Ｂのアレイを有する組換えヒトリラキシン２は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号６５８６−ＲＮ−０２５）から入手可能である。いくつかの実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質は、本発明の融合ポリペプチドのＡおよびＢリラキシン鎖と同じＡおよびＢリラキシン鎖を有するまたは１０以下のアミノ酸、たとえば１つもしくは２つのアミノ酸が、本発明の融合ポリペプチドのＡおよびＢリラキシン鎖と異なる。他の実施形態では、基準となるリラキシン２のＢ鎖の第１のアミノ酸は、Ｄであり、このアミノ酸は、本発明の融合ポリペプチドのＢ鎖において欠失している。さらなる実施形態では、融合ポリペプチドが配列番号４２のリラキシン２  Ａ鎖ポリペプチドおよび配列番号４４または４６のリラキシン２  Ｂ鎖ポリペプチドを含む場合、基準となるリラキシンは、成熟ヒトリラキシン２の鎖Ａおよび鎖Ｂのアレイを有し、かつＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ０４０９０．１の下で開示されるアミノ酸配列を有する組換えリラキシン２である。
【００３４】
本発明の融合ポリペプチドは、それらが、基準となるリラキシンタンパク質の活性の少なくとも一部を示す場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。たとえば、融合ポリペプチドは、それが、基準となるリラキシンタンパク質の活性の少なくとも約半分を有する場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。その代わりに、本発明の融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質の活性に対する前記融合ポリペプチドの活性の比が、１および約１０５の間、１および約１０４の間、約１および約１０３の間、約１および約１００の間、約１および約５０の間、約１および約２０の間、約１および約１５の間、約１および約１０の間、または約１および約５の間にある場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。その代わりに、本発明の融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質の活性に対する前記融合ポリペプチドの活性の比が、約１０−５および約１の間、約１０−４および約１の間、約１０−３および約１の間、約１０−２および約１の間、約１／５０および約１の間、約１／２０および約１の間、約１／１５および約１の間、約１／１０および約１の間、約１／５および約１の間である場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。
【００３５】
ある実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質のリラキシン活性に対する本発明の融合ポリペプチドのリラキシン活性の比は、約１０−５および約１０５の間である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質の活性に対する本発明の融合ポリペプチドの活性の比は、約１および約１００の間、たとえば約１および約５０の間、約１および約２０の間または約１および約１５の間または約１および約１０の間または約１および約５の間である。
【００３７】
他の実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質の活性に対する本発明の融合ポリペプチドの活性の比は、約１０−２および約１の間または約１／５０および約１の間、たとえば約１／２０および約１の間、約１／１５および約１の間、約１／１０および約１の間、もしくは約１／５および約１の間である。
【００３８】
さらに他の実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質の活性に対する本発明の融合ポリペプチドの活性の比は、約１である。
【００３９】
リラキシン活性は、ＥＣ５０値として決定されてもよい。本明細書において使用されるように、用語「ＥＣ５０」（半有効濃度）は、ベースラインおよび特定の暴露時間の後の最大値の間の中間の応答を誘発する治療用化合物の有効な濃度を指す。
【００４０】
発明者らは、本発明の融合ポリペプチドが、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓの組換えリラキシンタンパク質（カタログ番号６５８６−ＲＮ−０２５）などのような成熟リラキシン２ポリペプチドのリラキシン２  Ａ鎖およびリラキシン２  Ｂ鎖のアレイを有するリラキシンタンパク質（すなわちＡ鎖およびＢ鎖の間にリンカーを有していない）のように、リラキシン活性を有することを示した。実験の部で示されるように、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓの組換えリラキシンタンパク質（カタログ番号６５８６−ＲＮ−０２５）について決定された平均ＥＣ５０値に対する本発明のいくつかの融合ポリペプチドについて決定された平均ＥＣ５０値の比は、約１および約１００の間である。したがって、本発明の融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質のＥＣ５０値と同じまたは実質的に同じであるＥＣ５０値を有していてもよい。その代わりに、融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質のＥＣ５０値よりも高いＥＣ５０値を有していてもよい。その代わりに、融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質のＥＣ５０値未満であるＥＣ５０値を有していてもよい。
【００４１】
本発明の融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質のＥＣ５０に対する前記融合ポリペプチドのＥＣ５０の比が、１および約１０５の間、１および約１０４の間、約１および約１０３の間、約１および約１００の間、約１および約５０の間、約１および約２０の間、約１および約１５の間、約１および約１０の間、または約１および約５の間であるＥＣ５０値を有していてもよい。その代わりに、本発明の融合ポリペプチドは、基準となるリラキシンタンパク質のＥＣ５０に対する前記融合ポリペプチドのＥＣ５０の比が、約１０−５および約１の間、約１０−４および約１の間、約１０−３および約１の間、約１／１００および約１の間、約１／５０および約１の間、約１／２０および約１の間、約１／１５および約１の間、約１／１０および約１の間、約１／５および約１の間であるＥＣ５０値を有していてもよい。ある実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質のＥＣ５０値に対する本発明の融合ポリペプチドのＥＣ５０値の比は、約１０−５および約１０５の間である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、リラキシン融合ポリペプチドは、約１．１０−１１および約１．１０−７Ｍの間、たとえば約１．１０−１０および約１．１０−８Ｍの間または約１．１０−１０および約８．１０−９Ｍの間または約１．１０−１０および約５．１０−９Ｍの間または約１．１０−１０および約１．１０−９Ｍの間のＥＣ５０値を有する。
【００４３】
融合ポリペプチドのリンカーポリペプチドＬは、長さが少なくとも１５のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドＬは、長さが少なくとも１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸残基である。リンカーポリペプチドＬは、長さが１５〜３０のアミノ酸残基とすることができる、たとえば、リンカーポリペプチドＬは、長さが１５〜２５のアミノ酸残基または長さが１５〜２０のアミノ酸残基とすることができる。特定の実施形態では、リンカーポリペプチドＬは、１０２アミノ酸のアミノ酸配列長を有していない。別の実施形態では、前記リンカーポリペプチドＬは、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、または５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列長を有する。
【００４４】
リンカーポリペプチドＬは、任意のアミノ酸から構成することができる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドＬは、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３において記載されるものなどのように、グリシン残基およびセリン残基を含む。さらなる実施形態では、リンカーポリペプチドＬは、モチーフ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５８のリピート）を含み、ｎは、１および５の間であってもよい、たとえば、ｎは、４である。他の実施形態では、リンカーポリペプチドＬは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）を含むまたはそれからなる。代わりとなる実施形態では、リンカーポリペプチドＬは、配列Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号５９）を含みまたはそれからなり、ｎは、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３において記載されるように、５である。
【００４５】
リンカーポリペプチドＬは、リラキシンＣペプチドと、特に、アミノ酸配列  配列番号４８のヒトリラキシン２  Ｃペプチドと異なるアミノ酸配列を有していてもよい。特に、リンカーポリペプチドＬは、アミノ酸配列  配列番号４８のヒトリラキシン２  ＣペプチドなどのようなリラキシンＣペプチドと８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満の同一性を有していてもよい。
【００４６】
リンカーポリペプチドＬは、人工ポリペプチド、たとえば、化学的ペプチド合成によって合成されるポリペプチドであってもよい。
【００４７】
本発明の融合ポリペプチドはまた、半減期を延長する成分をも含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、対応する基準となるリラキシンと比較して、長期の半減期を有する。長期の半減期は、安全で好都合な投薬スケジュールに従って治療用タンパク質が投与されるのを可能にするので、たとえば、より少ない用量をより低い頻度で投与することができるので、有利であることが認識されるであろう。さらに、より少ない用量の達成は、改善された安全性プロファイルの提供および／またはインビボにおける多数の作用メカニズムの活性化などのような、さらなる利点をもたらしてもよい。
【００４８】
本発明者らは、半減期を延長する成分を有する本発明の融合ポリペプチドが、リラキシン活性を持ち、それと同時に、基準となるリラキシンと比較して、長期の半減期を有することを示した。たとえば、本発明者らは、本発明のいくつかの実施形態による半減期を延長する成分を有する融合ポリペプチドが、ラットおよびマウスのモデルにおいて少なくとも２日間の半減期を有することを示した（実施例５および６を参照）。比較すると、ＩＶ投与後のヒトリラキシン２の半減期は、約０．０９＋／−０．０４時間、すなわちヒトでは５．４＋／−２．４分間である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
【００４９】
本明細書において使用されるように、用語「半減期」は、血漿中の融合ポリペプチドの濃度がその最初のレベルの５０％まで下がるのにかかる時間を指すために使用される。血漿中のポリペプチドの「半減期」は、ポリペプチドのサイズ、その安定性、そのクリアランス速度、代謝回転速度、インビボにおけるタンパク質分解、身体または特定の組織による吸収速度などのような様々な因子に依存してもよい。タンパク質の半減期を決定する方法は、当技術分野において知られており、下記の実施例において記載される。
【００５０】
半減期を延長する成分は、融合ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に付けられてもよい。いくつかの実施形態では、半減期を延長する成分は、融合ポリペプチドのＮ−末端に付けられる。他の実施形態では、半減期を延長する成分は、融合ポリペプチドのＣ−末端に付けられる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、半減期を延長する成分は、タンパク質性の半減期を延長する成分である。タンパク質性の半減期の延長する成分は、免疫グロブリンのＦｃ領域、アルブミン結合ドメイン、血清アルブミン、およびトランスフェリンからなる群から選択されてもよい。他の実施形態では、半減期を延長する成分は、Ｆｃ領域である。
【００５２】
さらなる実施形態では、半減期を延長する成分は、残りの本発明の融合ポリペプチドに共有結合でまたは非共有結合で付けられてもよいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖などのような、タンパク質でもペプチドでもない化学成分である。ペグ化は、前記ＰＥＧポリマー鎖を分子に付けるプロセスであり、当技術分野においてよく知られている方法に従って実行することができる。
【００５３】
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義し、これは、完全な抗体のパパイン消化によって生成されてもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、任意選択でＣＨ４ドメインを含む。
【００５４】
Ｆｃ領域は、任意の種の免疫グロブリンに由来してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。さらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、天然のＦｃ配列、すなわち、自然界で見つけられるアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。代わりとなる実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｆｃ配列、すなわち、少なくとも１つのアミノ酸修飾によってそのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。Ｆｃ領域は、たとえば、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ分子の親和性を増加させるために修飾されてもよい。国際公開第０２／０６０９１９号パンフレットは、１つ以上のアミノ酸修飾を有するＦｃ領域を含む修飾免疫グロブリンを開示し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＦｃ領域については、Ｆｃ領域はまた、たとえば、ＩｇＧ４アミノ酸配列中にＳ２２８Ｐ修飾を導入することによって、Ｆａｂアーム交換（ＩｇＧ４抗体が分子の半分を交換することができるダイナミックなプロセス）を低下させるために修飾されてもよく、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。１つ以上のアミノ酸修飾を有するＦｃ領域を作製する方法は、当技術分野において知られている。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１配列、特に、以下のアミノ酸修飾の組み合わせ：
（ｉ）  Ｆｃ−ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ）；
（ｉｉ）  Ｆｃ−ＦＱＱ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｑ，Ｋ３２２Ｑ）；
（ｉｉｉ）  Ｆｃ−ＴＭ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ）；
（ｉｖ）  Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｑ，Ｋ３２２Ｑ）；
（ｖ）  Ｆｃ−ＹＴＥ−ＴＭ（（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ），
（ｖｉ）  Ｆｃ−ＴＭ−ΔＴＨＴ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ，Ｄ２２１Ｇ，Ｋ２２２Ｇ，Ｔ２２３Ｇ，Ｈ２２４Ｓ，Ｔ２２５Ａ），
（ｖｉｉ）  Ｆｃ−ＴＭ−ΔＴＨＴΔＫ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ，Ｄ２２１Ｇ，Ｋ２２２Ｇ，Ｔ２２３Ｇ，Ｈ２２４Ｓ，Ｔ２２５Ａ，ΔＫ４４７），
の少なくとも１つを含むヒトＩｇＧ配列を含み、
アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００５７】
さらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４配列を含む。特に、Ｆｃ領域は、セリンが２２８位でプロリンに修飾されている（「Ｓ２２８Ｐ」）ヒトＩｇＧ４配列を含み、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものであり、前記修飾Ｆｃ領域は、これによって「Ｆｃ−Ｇ４Ｐ」と略される。さらなる実施形態では、ＩｇＧ４に由来するＦｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ修飾および以下のアミノ酸修飾の組み合わせ：
（ｉ）  Ｆｃ−ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ）；
（ｉｉ）  Ｆｃ−ＦＱＱ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｑ，Ｋ３２２Ｑ）；
（ｉｉｉ）  Ｆｃ−ＴＭ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ）；
（ｉｖ）  Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｑ，Ｋ３２２Ｑ）；
（ｖ）  Ｆｃ−ＹＴＥ−ＴＭ（（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ），
（ｖｉ）  Ｆｃ−ＴＭ−ΔＴＨＴ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ，Ｄ２２１Ｇ，Ｋ２２２Ｇ，Ｔ２２３Ｇ，Ｈ２２４Ｓ，Ｔ２２５Ａ），
（ｖｉｉ）  Ｆｃ−ＴＭ−ΔＴＨＴΔＫ（Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５Ｅ，Ｐ３３１Ｓ，Ｄ２２１Ｇ，Ｋ２２２Ｇ，Ｔ２２３Ｇ，Ｈ２２４Ｓ，Ｔ２２５Ａ，ΔＫ４４７），
の少なくとも１つを含み、
アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００５８】
用語「ＫａｂａｔのＥＵのインデックス」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）において記載されるヒトＩｇＧｌ  ＥＵ抗体のナンバリング方式を指す。本出願で参照されるアミノ酸の位置はすべて、ＥＵインデックスの位置を指す。たとえば、「Ｌ２３４」および「ＥＵ  Ｌ２３４」は共に、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従って２３４位のアミノ酸ロイシンを指す。
【００５９】
本発明の一態様によれば、野生型免疫グロブリン定常ドメインに比べて１つ以上のアミノ酸修飾を含む免疫グロブリン定常ドメインを含む修飾免疫グロブリンであって、１つ以上のアミノ酸修飾は、２３４、２３５、および３３１位の１つ以上のところにあり、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、修飾免疫グロブリンが提供される。別の一態様によれば、野生型免疫グロブリン定常ドメインに比べて１つ以上のアミノ酸修飾を含む免疫グロブリン定常ドメインを含む修飾免疫グロブリンであって、１つ以上のアミノ酸修飾は、２３４、２３５、および３２２位の１つ以上のところにあり、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、修飾免疫グロブリンが提供される。本発明の別の態様によれば、野生型免疫グロブリン定常ドメインに比べて１つ以上のアミノ酸修飾を含む免疫グロブリン定常ドメインを含む修飾免疫グロブリンであって、１つ以上のアミノ酸修飾は、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、および４４７位の１つ以上のところにあり、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、修飾免疫グロブリンが提供される。本発明のさらなる態様によれば、野生型免疫グロブリン定常ドメインに比べて１つ以上のアミノ酸修飾を含む免疫グロブリン定常ドメインを含む修飾免疫グロブリンであって、１つ以上のアミノ酸修飾は、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２３４、２３５、３３１、および４４７位の１つ以上のところにあり、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、修飾免疫グロブリンが提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を消失させるならびに／または細胞傷害、たとえば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低下させるもしくは回避する。
【００６０】
本発明の一態様によれば、野生型免疫グロブリン定常ドメインに比べて１つ以上のアミノ酸修飾を含む免疫グロブリン定常ドメインを含む修飾免疫グロブリンであって、１つ以上のアミノ酸修飾は、２５２、２５４、および２５６位の１つ以上のところにあり、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、修飾免疫グロブリンが提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、融合ポリペプチドの半減期を増加させる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。
【００６２】
他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、アミノ酸欠失である。
【００６３】
さらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、２３４位でのフェニルアラニンとの置換、２３５位でのグルタミン酸との置換、および／または３３１位でのセリンとの置換の１つ以上を含む。特定の実施形態では、修飾免疫グロブリンは、２３４位でのフェニルアラニン、２３５位でのグルタミン酸、および３３１位でのセリンのアミノ酸置換を含む。ここで言及されるアミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００６４】
さらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、２３４位でのフェニルアラニンとの置換、２３５位でのグルタミンとの置換、および／または３２２位でのグルタミンとの置換の１つ以上を含む。特定の実施形態では、修飾免疫グロブリンは、２３４位でのフェニルアラニン、２３５位でのグルタミン、および３２２位でのグルタミンのアミノ酸置換を含む。ここで言及されるアミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００６５】
他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、２５２位でのチロシンとの置換、２５４位でのトレオニンとの置換、および／または２５６位でのグルタミン酸との置換の１つ以上を含む。特定の実施形態では、修飾免疫グロブリンは、２５２位でのチロシン、２５４位でのトレオニン、および２５６位でのグルタミン酸のアミノ酸置換を含む。ここで言及されるアミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００６６】
さらに他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、２２１位でのグリシンとの置換、２２２位でのグリシンとの置換、２２３位でのグリシンとの置換、２２４位でのセリンとの置換、２２５位でのアラニンとの置換、および／または４４７位でのリシンの欠失の１つ以上を含み、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００６７】
さらに他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、２２１位でのグリシンとの置換、２２２位でのグリシンとの置換、２２３位でのグリシンとの置換、２２４位でのセリンとの置換、２２５位でのアラニンとの置換、２３４位でのフェニルアラニンとの置換、２３５位でのグルタミン酸との置換、３３１位でのセリンとの置換、および／または４４７位でのリシンの欠失の１つ以上を含み、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。
【００６８】
修飾免疫グロブリンが、本明細書において詳述される他のアミノ酸修飾などのような他のアミノ酸修飾またはその任意の組み合わせをさらに含んでいてもよいことが理解されるであろう。
【００６９】
融合ポリペプチドに半減期を延長する成分を付ける方法は、当技術分野において知られている。たとえば、半減期を延長する成分は、化学的コンジュゲーションまたは組換え技術によって付けられてもよい。半減期を延長する成分は、融合ポリペプチドに直接またはコネクターポリペプチドを通して付けられてもよい。コネクターポリペプチドの使用は、融合ポリペプチドが、Ｆｃ領域などのようなタンパク質性の半減期を延長する成分を含む場合、特に適切であってもよい。
【００７０】
コネクターポリペプチドは、任意の適した長さをしていてもよい。たとえば、長さが約１および１００アミノ酸の間、長さが約１および５０アミノ酸の間、長さが約１および２５アミノ酸の間、長さが約１および１５アミノ酸の間、または長さが約４および１５アミノ酸の間であってもよい。いくつかの実施形態では、コネクターは、長さが４および１５アミノ酸の間である。たとえば、コネクターは、長さが４、５、または１５アミノ酸とすることができる。他の実施形態では、コネクターは、長さが１５および２５アミノ酸の間である、たとえば、コネクターは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸とすることができる。
【００７１】
コネクターポリペプチドは、任意のアミノ酸を含んでいてもよい。本発明に適したコネクターポリペプチドは、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３において記載されるもののいずれかを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、コネクターは、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３において記載されるものなどのように、グリシン残基およびセリン残基を含む。さらなる実施形態では、コネクターポリペプチドは、モチーフＧＧＧＧＳ（配列番号５８）の１つ以上のリピートを含む。たとえば、コネクターポリペプチドは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、コネクターポリペプチドは、Ｃ−および／またはＮ−末端部にプロリン残基を有する。他の実施形態では、コネクターポリペプチドは、Ｃ−および／またはＮ−末端部に１つ以上の、たとえば１〜３のアラニン残基を有する。いくつかの実施形態では、コネクターポリペプチドは、融合ポリペプチドのリンカーポリペプチドＬと同じ配列を含むまたはそれからなる。
【００７２】
コネクターの例は、ＧＧＳＰ（配列番号５６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号６９）、ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号７０）を含む。
【００７３】
本発明の融合ポリペプチドは、単鎖リラキシン融合ポリペプチドであってもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、構造
Ｆｃ  −  Ｃｎ  −  Ａ  −  Ｌ  −  ＢまたはＦｃ  −  Ｃｎ  −  Ｂ  −  Ｌ  −  Ａ
を有し、
Ａは、リラキシンＡ鎖ポリペプチドまたはその変異体であり；Ｂは、リラキシンＢ鎖ポリペプチドまたはその変異体であり；Ｌは、少なくとも１５のアミノ酸を含むリンカーポリペプチドであり；Ｃｎは、コネクターポリペプチドであり；Ｆｃは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、構造
Ａ  −  Ｌ  −  Ｂ  −  Ｃｎ  −  ＦｃまたはＢ  −  Ｌ  −  Ａ  −  Ｃｎ  −  Ｆｃ
を有し、
Ａは、リラキシンＡ鎖ポリペプチドまたはその変異体であり；Ｂは、リラキシンＢ鎖ポリペプチドまたはその変異体であり；Ｌは、少なくとも１５のアミノ酸を含むリンカーポリペプチドであり；Ｃｎは、コネクターポリペプチドであり；Ｆｃは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域である。
【００７６】
さらなる実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、表１および図１〜１９において示される１つ以上の融合ポリペプチドである。図２〜１９において、リンカーＬは、二重の下線によって示され、コネクターＣｎは、一重の下線によって示され、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換は、太字および太線の下線によって示される。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
本発明の融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている任意の方法によって生成されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、宿主細胞における、融合ポリペプチドをコードする核酸分子の組換え発現によって生成される。
【００７９】
したがって、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子、たとえばＤＮＡ分子ならびに本発明の核酸分子を含むベクターならびにそのような核酸分子およびベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００８０】
いくつかの実施形態による本発明の核酸分子の配列は、図２〜１９および表１において述べられる。
【００８１】
当業者らに知られている方法は、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。適したベクターは、たとえばプラスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクターを含む。
【００８２】
本発明の核酸分子を含有するベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移されてもよい。適した宿主細胞は、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞などのような哺乳動物細胞である。
【００８３】
トランスフェクトされた細胞は、本発明の融合ポリペプチドを産生するために、従来の技術によって培養されてもよい。
【００８４】
一旦、本発明の融合ポリペプチドが、たとえば組換え発現によって産生されたら、それは、当技術分野において知られている任意の方法によって精製されてもよい。例示的なタンパク質精製技術は、クロマトグラフィー（たとえばイオン交換、アフィニティー、および／またはサイジングカラムクロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））、遠心分離法、ならびに溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を含む。本発明は、任意選択で少なくとも１つの精製ステップによって、細胞培養物から分離された単離融合ポリペプチドを提供する。
【００８５】
本発明の融合ポリペプチドは、医薬組成物において提供されてもよい。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の賦形剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において知られており、たとえば、その全体が本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｂｙ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｐ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照されたい。
【００８７】
本発明は、疾患、障害、または感染に関連する症状を予防する、治療する、または寛解させるために、動物、特に哺乳動物、たとえばヒトに本発明の融合ポリペプチドを投与するステップを含む療法を包含する。
【００８８】
したがって、本発明の融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、たとえば、疾患または障害を治療するために、療法において使用されてもよい。対象またはその必要がある患者に治療有効量の本発明の融合ポリペプチドを投与するステップを含む、疾患または障害を治療するための方法もまた、提供される。使用または方法は、野生型リラキシン分子の治療的に有効な投薬スケジュールよりも、本発明の融合ポリペプチドの服用の頻度が低い治療的に有効なスケジュールを行うステップを含んでいてもよい。
【００８９】
本発明の融合ポリペプチドは、心臓血管系疾患の治療において、たとえば心不全の治療に使用されてもよいことが理解されるであろう。
【００９０】
本明細書において使用されるように、用語「心不全」は、急性心不全、慢性心不全（ＣＨＦ）、および急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）を含む。用語「心不全」はまた、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が軽度低下した心不全、または駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）などのような、より詳細な診断を含んでいてもよい。
【００９１】
本発明の融合ポリペプチドはまた、腎疾患、肺疾患、ならびに線維性の障害、たとえば、腎臓、心臓、肺、および肝臓の線維性の障害の治療においてならびに創傷治癒において使用されてもよい（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，２００４）。本発明の融合ポリペプチドはまた、糖尿病患者におけるインスリン抵抗性の回復において使用されてもよい（Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００９２】
本発明の融合ポリペプチドおよび／または医薬組成物は、対象または患者への非経口投与に適している。いくつかの実施形態では、対象または患者は、哺乳動物、特にヒトである。
【００９３】
野生型ヒトリラキシン２は、インビボにおいて数分間の半減期を有する。結果として、それは、入院患者において連続静脈内注入によって投与されなければならず、血圧低下を含む重度の副作用を引き起こす。対照的に、本発明の融合ポリペプチドおよび／または医薬組成物の実施形態は、対象または患者に、静脈内、皮下、または筋肉内注射によってなどのように、注射によって投与されてもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドおよび／または医薬組成物は、皮下注射によって投与される。皮下注射によってなどのような注射による投与は、対象または患者にとってより快適であるという長所および病院の外で対象または患者に投与する自由度を提供する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドまたは医薬組成物は、自己投与によって投与される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、野生型リラキシンと比較して、半減期の増加を有し、これは、モル濃度に基づいて、より低い全体的な暴露を可能にする。たとえば、本発明の融合ポリペプチドは、野生型リラキシンよりも低い頻度で投与されてもよく、したがって、より好都合な投薬スケジュールを提供する。
【００９５】
本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、本発明の医薬組成物および説明書を含有するパッケージを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、単一用量バイアルまたは容器施栓系（たとえば、あらかじめ充填されたシリンジ）において製剤される。任意選択で、そのような容器に、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する、政府機関によって指示された形態をした通知を添えることができ、この通知は、ヒト投与に対する、製造、使用、または販売についての機関による承認を表わす。
【００９６】
本明細書において使用されるように、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つのまたは１つを超える（たとえば少なくとも１つの）、冠詞の文法上の目的語を指してもよい。
【００９７】
「約」は、一般に、測定法の性質または精度を考慮すれば、測定される数量について許容される程度の誤差を意味してもよい。誤差の例示的な程度は、与えられた値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【００９８】
１つ以上の特徴を「含む」として本明細書において記載される実施形態はまた、そのような特徴「からなる」対応する実施形態の開示と考えられてもよい。
【００９９】
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、動物における、より詳細にはヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているまたは米国の薬局方、欧州の薬局方、もしくは他の一般に認識されている薬局方に載っていることを意味する。
【０１００】
濃度、量、容量、パーセンテージ、および他の数値は、範囲形式で本明細書において示されてもよい。そのような範囲形式は、単に便宜および簡潔さのために使用され、範囲の限界として明示的に詳述される数値だけでなく、あたかもそれぞれの数値および部分範囲が明示的に詳述されるかのように、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲のすべてを含むことが柔軟に解釈されるべきであることもまた、理解されるべきである。
【０１０１】
上記の実施形態は、例証となる実施例として理解されるべきである。さらなる実施形態が、想定される。任意の１つの実施形態に関して記載されるいかなる特徴も、単独でまたは記載される他の特徴と組み合わせて使用されてもよく、また、任意の他の実施形態または任意の他の実施形態の任意の組み合わせの１つ以上の特徴と組み合わせて使用されてもよいことが理解されるべきである。さらに、上記に記載されない等価物および変更もまた、添付の請求項において定義される本発明の範囲から逸脱することなく用いられてもよい。
【０１０２】
本開示に関連して、本明細書において記載される融合ポリペプチドおよび方法の他の例および変形は、当業者に明らかになるであろう。他の例および変形は、添付の請求項において述べられるように、本開示の範囲内にある。
【０１０３】
本明細書において引用されるすべての文献は、引用される文献において示されるデータ、表、図、および原文をすべて含め、それぞれ、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：構築物
いくつかのＤＮＡ構築物を、様々なＩｇＧ１−Ｆｃ／コネクター／リラキシン２  Ａ鎖／リンカー／リラキシン２  Ｂ鎖融合ポリペプチドを発現させるために作った。これらの構築物において、コネクターは、長さを４アミノ酸（ＧＧＳＰ）または１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のいずれかとし、リンカーは、長さを１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）とした。Ｆｃ成分は、天然の野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ成分（「ｈＦｃ−Ｇ１」と略される）または以下の突然変異の１つまたは数個の組み合わせを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ成分の突然変異形態とした：
（ｉ）  Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」と略される）。ＹＴＥ突然変異を含むＦｃ成分は、「ｈＦｃ−Ｇ１−ＹＴＥ」と略される。
（ｉｉ）  Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｑ、Ｋ３２２Ｑ（「ＦＱＱ」と略される）。ＦＱＱ突然変異を含むＦｃ成分は、「ｈＦｃ−Ｇ１−ＦＱＱ」と略される。ＹＴＥおよびＦＱＱ突然変異の両方を含むＦｃ成分は、「ｈＦｃ−Ｇ１−ＹＴＥ−ＦＱＱ」と略される。
（ｉｉｉ）  Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」と略される）。ＴＭ突然変異を含むＦｃ成分は、「ｈＦｃ−Ｇ１−ＴＭ」と略される。ＹＴＥおよびＴＭ突然変異の両方を含むＦｃ成分は、「ｈＦｃ−Ｇ１−ＹＴＥ−ＴＭ」と略される。
【０１０５】
これらの構築物において、Ａ鎖は、ヒトリラキシン２の天然の野生型Ａ鎖（配列番号４２）とし、Ｂ鎖は、第１のアミノ酸（Ｄ）を欠くヒトリラキシン２の天然の野生型Ｂ鎖（配列番号４４）に対応するＢ鎖変異体（配列番号４６）とした。
【０１０６】
天然のヒトＩｇＧ−１  Ｆｃ配列を有する融合ポリペプチドについてのＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成し、プラスミドＤＮＡとして供給した。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子配列を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩによる制限酵素消化によってＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）プラスミドから取り出し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩによる同じ制限消化を使用して、ｐＨＯＥベクターの中にクローニングした。ｐＨＯＥベクターは、ヒト抗体ＩｇＧ１の重鎖を発現するように設計した。このクローニング戦略により、ベクター抗体配列はすべて除去したが、シグナルペプチドおよびＦｃ配列の間の介在配列は保存した。
【０１０７】
必要とされるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ突然変異（ＹＴＥ、ＦＱＱ、およびＴＭ）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ内に位置する３００ｂｐ  ＫａｓＩ制限断片内に存在する。適切な突然変異を有するＫａｓＩ断片は、ＧｅｎｅＢｌｏｃｋとしてＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。天然のＦｃ融合物を有するヒトリラキシン−２プラスミドをＫａｓＩにより消化し、ＫａｓＩ  ＧｅｎｅＢｌｏｃｋを、シームレスクローニングのためにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ＃  Ｅ２６２１Ｓ）を使用してｐＨＯＥベクターにクローニングした。
【０１０８】
Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡおよびＦｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ
Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡおよびＦｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ遺伝子配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成し、プラスミドＤＮＡとして供給した。遺伝子配列を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩによる制限酵素消化によってＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）プラスミドから取り出し、同じ制限消化部位を使用して、ｐＨＯＥベクターの中に別々にクローニングし、それぞれｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡプラスミドおよびｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡプラスミドがもたらされた。ｐＨＯＥベクターは、ヒトＩｇＧ１の重鎖部分を発現するように使用する。このクローニング戦略により、ベクター抗体配列はすべて除去したが、シグナルペプチドおよびＦｃ配列の間の介在配列は保存した。
【０１０９】
Ｆｃ−ＹＴＥ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡおよびＦｃ−ＹＴＥ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ
ＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ中に位置する３００ｂｐ  ＫａｓＩ断片内に存在する。適切な突然変異を有するＫａｓＩ断片は、ＧｅｎｅＢｌｏｃｋとしてＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。ｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡプラスミドおよびｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡプラスミドをＫａｓＩにより別々に消化し、ＫａｓＩ  ＧｅｎｅＢｌｏｃｋを、シームレスクローニングのためにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ＃  Ｅ２６２１Ｓ）を使用して上記のプラスミドの中にクローニングした。
【０１１０】
Ｆｃ−ＹＴＥ−ＴＭ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡおよびＦｃ−ＹＴＥ−ＴＭ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ
ＹＴＥ−ＴＭ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ中に位置する３００ｂｐ  ＫａｓＩ断片内に存在する。適切な突然変異を有するＫａｓＩ断片は、ＧｅｎｅＢｌｏｃｋとしてＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。ｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡプラスミドおよびｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡプラスミドをＫａｓＩにより別々に消化し、ＫａｓＩ  ＧｅｎｅＢｌｏｃｋを、シームレスクローニングのためにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ＃  Ｅ２６２１Ｓ）を使用して空のベクターの中にクローニングした。３’ＫａｓＩ部位は、これらのプラスミドにおいて破壊される。
【０１１１】
Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡおよびＦｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ
ＹＴＥ−ＦＱＱ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｑ／Ｋ３２２Ｑ）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ中に位置する３００ｂｐ  ＫａｓＩ断片内に存在する。適切な突然変異を有するＫａｓＩ断片は、ＧｅｎｅＢｌｏｃｋとしてＩＤＴ（登録商標）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。ｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡプラスミドおよびｐＯＥ−Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡプラスミドをＫａｓＩにより別々に消化し、ＫａｓＩ  ＧｅｎｅＢｌｏｃｋを、シームレスクローニングのためにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ＃  Ｅ２６２１Ｓ）を使用して空のベクターの中にクローニングした。
【０１１２】
他のいくつかのＤＮＡ構築物は、長さが１５アミノ酸よりも長いコネクターを有するＦｃ融合ポリペプチドおよび融合タンパク質のＮ−またはＣ−末端のいずれかに位置するＦｃ部を含み、かつリラキシン鎖について考え得る２つの方向（Ａ−Ｌ−ＢまたはＢ−Ｌ−Ａ）を有するリラキシン２融合タンパク質としてリラキシン２を発現するために作った。
【０１１３】
これらの他の構築物において、コネクターは、２１アミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）または２４アミノ酸（ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ）のいずれかとし、リンカーは、長さを１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）とした。
【０１１４】
Ｆｃ成分は、以下の突然変異を含む、「ｈＦｃ−Ｇ１−ＴＭ−ΔＴＨＴ−ΔＫ」と略されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ成分の突然変異形態とした：
（ｉ）  Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」と略される）、
（ｉｉ）  Ｄ２２１Ｇ、Ｋ２２２Ｇ、Ｔ２２３Ｇ、Ｈ２２４Ｓ、Ｔ２２５Ａ（「ΔＴＨＴ」と略される）、
（ｉｉｉ）  Ｋ４４７の欠失（「ΔＫ」と略される）。
【０１１５】
これらの他の構築物において、Ａ鎖は、ヒトリラキシン２の天然の野生型Ａ鎖（配列番号４２）とし、Ｂ鎖は、第１のアミノ酸（Ｄ）を欠くヒトリラキシン２の天然の野生型Ｂ鎖（配列番号４４）に対応するＢ鎖変異体（配列番号４６）とした。
【０１１６】
構築物Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿ｈＲＬＸ２＿２１−１５ＡＡ（図１の構築物１５）およびｈＲＬＸ２−Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿１５−２４ＡＡ（図１の構築物１７）についてのＤＮＡ挿入物は、図１の構築物８（Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ）のＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅によって生成した。構築物（Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿ｈＲＬＸ２（ＢＡ）＿２１−１５ＡＡ（図１の構築物１６）およびｈＲＬＸ２（ＢＡ）−Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿１５−２４ＡＡ（図１の構築物１８）についてのＤＮＡ挿入物は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）によって合成し、次いで、制限酵素による消化の前にＰＣＲによって増幅した。構築物１５および１６についてのＰＣＲアンプリコンは、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによって消化した。構築物１７および１８についてのＰＣＲアンプリコンは、制限酵素ＮｇｏＭＩＶおよびＮｏｔＩによって消化した。消化した挿入物は、プラスミドｐｅｐＦｃ（ｐＯＥに由来）の中にライゲーションした。プラスミドは、ＦｃのＣ−末端での融合のためにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによりまたはＮ−末端での融合のためにＮｇｏＭＩＶおよびＮｏｔＩにより消化した。Ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＮＥＢ）は、プラスミドの中にＤＮＡ挿入物をライゲーションするために使用した。
【０１１７】
リラキシンＦｃ融合物は、Ｄａｒａｍｏｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４において記載されるように、標準的な方法によってＣＨＯ細胞において発現させた。融合タンパク質は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムを有するアフィニティークロマトグラフィーによってＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステムを使用して上清から精製した。カラムは、１×ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｔ  Ｎｏ：１４１９０−０９４））において平衡化した。上清をロードした後、カラムに特異的に結合しない分子を除去するために、カラムを１×ＤＰＢＳにより洗浄した。Ｆｃ融合物の溶出は、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシンの溶液を使用して実現した。精製タンパク質は、１×ＤＰＢＳにバッファー交換した。タンパク濃度は、２８０ｎｍの吸収を使用して決定した。次いで、精製タンパク質は、純度および単量体含有量を判断するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム）によって分析した。
【０１１８】
図１は、本発明のＦｃヒトリラキシン２融合ポリペプチドのうちのいくつかについての略図および略称を提供する。
【０１１９】
実施例２：Ｆｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドのインビトロにおける活性（インビトロにおけるｃＡＭＰアッセイ）
インビトロにおける細胞ベースのアッセイは、実施例１において生成したリラキシン２融合ポリペプチドの活性を測定するために使用した。アッセイにより、融合ポリペプチド（Ｆｃ−ｈＲＬＸ２−４−１５ＡＡおよびＦｃ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ）がｃＡＭＰ産生を刺激する能力を測定した。
【０１２０】
ＤｉｓｃｏｖｅｒＸのＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイ（カタログ番号９０−００７５、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）は、リラキシン２融合ポリペプチドによるリガンド刺激の後に産生されるｃＡＭＰを測定するために使用した。アッセイは、メーカーのプロトコールに基づいて実行した。手短に言えば、ＲＸＦＰ１発現細胞株、ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＸＦＰ１  Ｇｓ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸカタログ番号９５−０１２７Ｃ２、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）由来の細胞を、ＭｕｌｔｉＤｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して１％抗生物質、０．８ｍｇ／ｍｌジェネテシン、および１０％ウシ胎児血清を補足した１００μＬ／ウェルのＦ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃２１１２７０２２）中に２０，０００細胞／ウェルで接種し、５％  ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で一晩付着させた。インキュベーション後、プレートを１００μＬ／ウェルのＦ１２Ｋ無血清培地により洗浄した。洗浄培地を除去し、プレートに２０μＬ／Ｆ１２Ｋ無血清培地を追加して、いつでもアッセイができるようにした。サンプル調製物を試験するために、別々の９６Ｕ字底プレートにおいて、３倍希釈液のリラキシン２融合ポリペプチドおよびポジティブコントロールとしての組換えヒトリラキシン−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６５８６−ＲＮ−０２５）を、反復実験において作製した。希釈し、滴定したサンプルプレートから、それぞれのウェルの１０μＬをアッセイプレートの中に移し、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、１０μＬ／ウェルの抗体試薬（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）キットの）を追加し、続いて、４０μＬ／ウェルのｃＡＭＰ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）キットにおいて指示されるように作製）を直ちに追加し、１時間、暗中、室温でインキュベートした。次に、４０μＬのｃＡＭＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）キットの）を追加した。アッセイプレートを暗中、室温で、さらに３時間インキュベートした。アッセイプレートは、０．１〜１秒／ウェルで標準的な発光プレート読み取り装置（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。データ分析は、統計分析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、Ｖ６）を使用して実行した。
【０１２１】
結果および結論
試験した構築物の生物学的活性を、表２および図１６（１回の実験）および１７（繰り返しの実験）において提供する。
【０１２２】
数回のアッセイの組換えヒトリラキシン−２および融合ポリペプチドの両方についての平均ＥＣ５０を表２に要約した。
【０１２３】
【表６】
2020505029.tif 000007
【０１２４】
これらの結果は、本発明のリラキシン２融合ポリペプチドが、インビトロにおける細胞ベースのアッセイを使用するとわかるように、生物学的に活性であることを示す。
【０１２５】
インビトロにおける細胞ベースのｃＡＭＰ刺激アッセイのばらつきのために、組換えヒトリラキシン−２を、ポジティブコントロールとしてそれぞれのアッセイにおいて常に使用する。さらなる注釈として、活性比の計算は、融合物ペプチドおよび組換えヒトリラキシン−２の両方が含まれたそれぞれのアッセイについてのみ意味がある。融合ポリペプチド（ＥＣ５０）の活性は、比を導き出すために、組換えヒトリラキシン−２（ＥＣ５０）の活性と比較し、これは、数回の独立した繰り返しから得られる平均ＥＣ５０値を前記比を決定するために使用する場合、約１０または約５０となる。対照的に、同じアッセイ（１回の繰り返し）内で得られるＥＣ５０値に基づいて計算すると、比は、より低く、典型的に、約１０および２０の間または約１５となる（たとえば図２０を参照）。
【０１２６】
実施例３：リラキシン−２受容体に対するＦｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドの特異性
リラキシンファミリーペプチドは、４つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のグループを活性化することによって、それらの生理学的効果をもたらし、これらは、それらのリガンドによって刺激する（Ｇｓ）または阻害する（Ｇｉ）ことができる。リラキシン２は、受容体ＲＸＦＰ１に特異的に結合する。
【０１２７】
ＲＸＦＰ１受容体に対するリラキシン２融合ポリペプチドの結合性および活性化特異性を確認するために、以下の細胞株：
・ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＸＦＰ２  Ｇｓ細胞株（カタログ番号９５−０１４０Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、リガンドは、ＩＮＳＬ３（カタログ番号４５４４−ＮＳ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）である
・ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＸＦＰ３  Ｇｉ細胞株（カタログ番号９５−０１０２Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、リガンドは、リラキシン−３（カタログ番号ＴＰ７２３３７７、Ｏｒｉｇｅｎｅ）である
・ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＸＦＰ４  Ｇｉ細胞株（カタログ番号９５−０１３４Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、リガンドは、ＩＮＳＬ５（カタログ番号ＴＰ７２３２５１、Ｏｒｉｇｅｎｅ）である
・ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１  Ｇｓ／Ｇｑ細胞株（カタログ番号９５−００６４Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、リガンドは、ＰＡＣＡＰ１−２７（カタログ番号１１８３、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）である
をＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（Ｆｅｒｍｏｎｔ、ＣＡ）から購入した。
【０１２８】
ＲＸＦＰ２細胞株は、Ｇｓ野生型ＧＰＣＲ  ＲＸＦＰ２を自然に過剰発現し、アゴニスト刺激に応じた細胞内ｃＡＭＰレベルの増加を検出するために設計されている。ＲＸＦＰ３細胞株およびＲＸＦＰ４細胞株は、それぞれＧｉ野生型ＧＰＣＲ  ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４を自然に過剰発現し、アンタゴニスト刺激に応じた細胞内ｃＡＭＰレベルの減少を検出するために設計されている。ＣＨＯ−Ｋ１  ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１は、無関係なＧＰＣＲ過剰発現細胞株で、アッセイコントロールとして使用する。
【０１２９】
これらの細胞株は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸのＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）  ｃＡＭＰ  ＸＳ＋ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（カタログ番号９０−００７５、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）によりＩｇＧ１−Ｆｃヒトリラキシン融合ポリペプチドの活性を測定するために使用した。ｃＡＭＰアッセイは、実施例２において記載されるように実行したが、細胞株ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４は例外とし、それぞれ２５μＭまたは２０μＭ  フォルスコリン（カタログ番号１０９９、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、アッセイにおいて使用するリガンドがｃＡＭＰ産生を阻害するので、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させるために、希釈プレートおよび無血清培地に追加した。実験は、少なくとも２回実行した。
【０１３０】
結果および結論
結果を図２２に示す。試験したリラキシン２融合ポリペプチドは、ＲＸＦＰ２発現細胞株において最少の活性しか有しておらず、他の関係のあるＲＸＦＰ発現細胞株（ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４）において活性でない。予想通り、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１  Ｇｓ／Ｇｑ細胞株において活性は観察されなかった。
【０１３１】
実施例４．Ｆｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドはＴＨＰ−１細胞においてＶＥＧＦ発現を誘発する
リラキシン２融合ポリペプチドが、リラキシン２の既知の下流の標的であるＶＥＧＦの発現を誘発する能力について（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、アッセイした。ＴＨＰ−１細胞（カタログ番号ＴＩＢ−２０２、ＡＴＣＣ）におけるＶＥＧＦ  ＲＮＡの発現は、定量リアルタイムＰＣＲによって分析した。合計１０６細胞／ｍｌを、４００μｌ試験培地（フェノールレッド、０．５％  ＦＢＳ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールなしのＲＰＭＩ−１６４０）において２４ウェル平底プレート（カタログ番号３５３２２６、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種した。３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後に、ヒトリラキシン−２（カタログ番号３９５６−ＲＮ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＦｃ−ｈリラキシン−２融合ポリペプチドを３７℃で２．５時間、プレート中の細胞に追加した。ＴＨＰ−１細胞からのＲＮＡ単離および精製は、メーカーのプロトコールに従って、ＱｉａｇｅｎのＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（カタログ番号７９６５６、Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮＡ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１３４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実行した。ｍＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって測定し、サンプルは、同一の出発濃度（ＲＴ−ＰＣＲ設定；５０〜２０ｎｇ／μｌの間の範囲）に対して標準化した。ＲＴ−ＰＣＲサンプルは、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（カタログ番号１１７９１−２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製し、プライマー／プローブセットは以下のとおりとした：ＶＥＧＦＡヒト（Ｈｓ００９０００５５＿ｍ１、カタログ番号４３３１１８２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＧＡＰＤＨヒト（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１、カタログ番号４３３１１８２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅを使用して実行し、サイクルの設定は以下のとおりとした：ｃＤＮＡ合成のための１５分間５０℃での１サイクル、Ｔａｑ活性化における２０秒間９５℃での１サイクル、ならびにｑＰＣＲのための１秒間９５℃および２０秒間６０℃の２つの温度での４０サイクル。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルの相対的倍数変化は、ＧＡＰＤＨ発現を標準化に使用して、比較Ｃｔ法によって計算した。結果は、治療なしコントロールに対する倍数変化として計算した。実験は、ｎ＞２で三通り実行した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｖ６を用い、対応のある両側ｔ検定によって分析した。
【０１３２】
結果および結論
図２３（上）に示されるように、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ、および８０ｎｇ／ｍｌの濃度で、偽「治療なし」コントロールと比較して、試験したリラキシン２融合ポリペプチドは、ＴＨＰ−１細胞においてＶＥＧＦ転写物を有意に刺激する。同様に、市販で入手可能な組換えヒトリラキシン２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）もまた、０．０１、０．０６、および１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、「治療なし」コントロール細胞と比較して、ＴＨＰ−１細胞においてＶＥＧＦ転写物を有意に増加させた。ヒトリラキシン２と比較するために、Ｆｃリラキシン２融合ポリペプチド濃度は、分子量の差（６×）およびｃＡＭＰアッセイにおいて見られた活性の低下（１０〜１５倍）に基づいて調整した。
【０１３３】
図２３（下）は、試験したリラキシン２融合ポリペプチドが、偽「治療なし」コントロールと比較して、ＴＨＰ−１細胞において、ＶＥＧＦ転写物を有意に刺激することを示す。
【０１３４】
実施例５：いくつかのＦｃ−リラキシン２融合ポリペプチドのＰＫプロファイル
本発明のいくつかのリラキシン２融合ポリペプチドの薬物動態学的（ＰＫ）プロファイルをリラキシンＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。ラットインビボＰＫプロファイルを以下の融合ポリペプチドについて決定した：Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡおよびＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ。
【０１３５】
ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、５２−００−０１．Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）およびＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ、５０−８５−０５）は、アッセイを現像するために使用した。Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡおよびＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ融合ポリペプチドは、４ｍｇ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）ルートによって８週齢のウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に投与した。血液サンプルは、ＩＶルートについては薬剤の投与の５分後、３０分後、３時間後、８時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、７日後、９日後、１４日後、および２１日後にならびにＳＣルートについては薬剤の投与の８時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、７日後、９日後、１４日後、および２１日後に収集した。サンプルは、ＥＤＴＡを含有するチューブの中に収集し、直ちに氷上に置いた。サンプルは、収集の３０分以内に１０００ｘｇで１５分間遠心分離した。小分けしたサンプルを、≦−２０℃で保存し、その後ＥＬＩＳＡによって試験した。半減期は、Ｆｃ捕捉およびリラキシン検出ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判断した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｌａｘｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、カタログ番号ＤＲＬ２００のポリクローナル抗体を使用）。
【０１３６】
結果および結論
図２４は、ラットにおける皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）投与後のＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿４−１５ＡＡのインビボにおけるＰＫプロファイルを示す。ＳＣ投与後、ピーク血漿濃度は、８〜２４時間以内に実現した。ノンコンパートメント解析から推測した平均終末相半減期は、ＩＶ用量グループについては２．４６日であり、ＳＣ用量グループについては３．２１日であった。
【０１３７】
図２５は、ラットにおけるＳＣまたはＩＶ投与後のＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡのインビボにおけるＰＫプロファイルを示す。ＳＣ投与後、ピーク血漿濃度は、８〜２４時間以内に実現した。ノンコンパートメント解析から推測した平均終末相半減期は、ＩＶ用量グループについては３．５９日であり、ＳＣ用量グループについては３．７５日であった。
【０１３８】
比較すると、ＩＶ投与後のヒトリラキシン２の半減期は、約０．０９＋／−０．０４時間、すなわちヒトでは５．４＋／−２．４分間である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
【０１３９】
実施例６：ＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＰＫ研究
Ｆｃ融合ポリペプチド中に存在するＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）によって与えられる長期の半減期を、社内で生成したＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて６ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内にまたは皮下に投与するＦｃ−ＹＴＥ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ、Ｆｃ−ＹＴＥ−ＦＱＱ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ、およびＦｃ−ＹＴＥ−ＴＭ−ｈＲＬＸ２−１５−１５ＡＡ融合ポリペプチドについて実行するＰＫプロファイル研究によって確認する。長期の半減期は、Ｆｃ捕捉およびリラキシン検出ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判断した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｌａｘｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、カタログ番号ＤＲＬ２００のポリクローナル抗体を使用）。
【０１４０】
図２６は、ＳＣまたはＩＶ投与後のＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡのマウスインビボＰＫプロファイルを示す。ＳＣ用量グループにおける平均終末相半減期は、ＩＶ用量グループと比較して、およそ２６．５％長かった。
【０１４１】
図２７は、１ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＣ投与後のＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡのマウスインビボＰＫプロファイルを示す。ピーク血清濃度は、ＳＣ投与後２４〜７２時間の間に達した。平均終末相半減期は、４．５９〜７．０６日の範囲にわたった。用量に対して標準化したＣｍａｘは、用量の増加と共に減少した。
【０１４２】
実施例７：ヒトおよびマウス細胞株におけるいくつかのＦｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドのインビトロにおける活性ならびにＲＸＦＰ２選択性（細胞ベースのｃＡＭＰ活性アッセイにおいて）
実施例１において記載されるように産生した本発明のＦｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドのいくつか（Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ，  Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿ｈＲＬＸ２＿２１−１５ＡＡ，  Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿ｈＲＬＸ２（ＢＡ）＿２１−１５ＡＡ，  ｈＲＬＸ２−Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿１５−２４ＡＡ，  ｈＲＬＸ２（ＢＡ）−Ｆｃ−ＴＭΔＴＨＴΔＫ＿１５−２４ＡＡ）を以下の方法によって、生物学的活性、たとえば、１つ以上の細胞の受容体応答の刺激について試験した。
【０１４３】
ヒトもしくはマウスＲＸＦＰ１受容体またはヒトＲＸＦＰ２を発現する安定したＣＨＯ細胞株を、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸから購入し、受容体特異性を試験するために使用した。使用した細胞株は、以下のとおりであった：ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）  ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＸＦＰ１  Ｇｓ細胞株（カタログ番号９５−０１２７Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）  ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＸＦＰ２  Ｇｓ細胞株（カタログ番号９５−０１４０Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）  ＣＨＯ−Ｋ１  ｍＲＸＦＰ１  Ｇｓ細胞株（カタログ番号９５−０１８０Ｃ２、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）。これらの受容体の活性化は、機能活性アッセイにおいて測定することができるｃＡＭＰセカンドメッセンジャーの下流の産生をもたらす。
【０１４４】
通常のｃＡＭＰアッセイを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ベースのアッセイバッファー：０．１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ９４１８）および０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ７０１８）を補足し、１Ｍ  ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整したハンクス液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｈ８２６４）を使用して実行した。関心のある受容体を発現する細胞の冷凍クライオバイアルを、ウォーターバスにおいて速やかに解凍し、あらかじめ温めた細胞培地に移し、５分間２４０ｘｇで回転させた。細胞を、最適化濃度（たとえば３．３３×１０４細胞／ｍｌのｈＲＸＦＰ１）で細胞培地中に再懸濁した。
【０１４５】
３０μＬ細胞懸濁液を、ポリ−Ｄ−リシンコーティング３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＃７８１９４６）に追加し、一晩接着させた。翌日、培地をプレートから軽く払い落とし、５μＬアッセイバッファーと交換した。試験組換えペプチド／Ｆｃ融合サンプルの１１段階連続希釈液を非接触液体ディスペンサー（ＥＣＨＯ（商標）、Ｌａｂｃｙｔｅ）を使用して細胞に追加した。サンプル希釈液はすべて、二通り作製した。さらなる５μＬアッセイバッファーを、それぞれのウェルに追加し、プレートを３０分間室温でインキュベートした。
【０１４６】
ｃＡＭＰレベルは、メーカーの推奨どおり２段階のプロトコールに従って市販で入手可能なｃＡＭＰ  ｄｙｎａｍｉｃ  ２  ＨＴＲＦ  ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｃａｔ  ＃６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用して測定した。手短に言えば、抗ｃＡＭＰクリプタート（ドナーフルオロフォア）およびｃＡＭＰ−ｄ２（アクセプターフルオロフォア）を、キットにおいて提供されるコンジュゲート＆溶解バッファー中でそれぞれ１／２０に希釈することによって別々に用意した。５μＬ抗ｃＡＭＰクリプタートをアッセイプレートのすべてのウェルに追加し、５μＬ  ｃＡＭＰ−ｄ２を、非特異的結合（ＮＳＢ）ウェル以外のすべてのウェルに追加し、これらにはコンジュゲートおよび溶解バッファーを追加した。プレートを１時間室温でインキュベートし、次いで、３２０ｎｍの励起波長および６２０ｎｍ＆６６５ｎｍの放射波長を使用してＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。データは、メーカーのガイドラインにおいて記載されるように、％Ｄｅｌｔａ  Ｆに変換し、次いで、最大天然アゴニスト応答に対する活性化パーセントに変換し、ＥＣ５０値を決定するために４パラメーターロジスティックフィットによって分析した。
【０１４７】
結果を、ｈＲＸＦＰ１細胞の場合は組換えヒトリラキシン−２（カタログ番号６５８６−ＲＮ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍＲＸＦＰ１細胞ではｍリラキシン−１（カタログ番号６６３７−ＲＮ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはｈＲＸＦＰ２細胞ではＩＮＳＬ−３（カタログ番号４５４４−ＮＳ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）についての対応する結果と比較する。発明者らは、ＥＣ５０を決定するために、データの非拘束４パラメーターロジスティックフィット、曲線の中間点を使用した。
【０１４８】
結果および結論
試験した融合ポリペプチドの生物学的活性を表３に提供し、それぞれのポリペプチドについての１つの代表的なアッセイの結果を図２８に示す。
インビトロにおける細胞ベースのｃＡＭＰ刺激アッセイのばらつきのために、組換えヒトリラキシン−２を、ポジティブコントロールとしてそれぞれのアッセイにおいて常に使用する。
【０１４９】
数回のアッセイの組換えヒトリラキシン−２および融合ポリペプチドの両方についての平均ＥＣ５０を表３に要約した。
【０１５０】
【表７】
2020505029.tif 000008
【０１５１】
これらの結果は、以下のことを示す：
−リラキシン融合ポリペプチドのＮ−末端にまたはリラキシン融合ポリペプチドのＣ−末端に付けられたＦｃ成分を含む試験したリラキシン−２融合ポリペプチドは、生物学的に活性である。
−試験したリラキシン−２融合ポリペプチドは、どちらの鎖方向（Ｂ−ＡまたはＡ−Ｂ）を含んでいても、生物学的に活性である。
−ＲＸＦＰ１およびＲＸＦＰ２の間の選択性は、試験したすべてのＦｃ−リラキシン−２融合ポリペプチドについて保持される。
【０１５２】
結果はまた、試験したリラキシン−２融合ポリペプチドが、ヒトリラキシン−２よりも、ヒトおよびマウスの間で類似する種交差反応性を有することを示す。特に、結果は、Ｆｃドメインへの融合がヒトリラキシン−２の種交差反応性に影響を与えないことを示す。
【０１５３】
実施例８：Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡはマウスにおいてイソプロテレノール誘発性の心肥大を予防する
グループ当たりｎ＝８のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのオスのマウス）を有する合計６つの研究グループについて実行した。グループは以下のとおりとした：ビヒクル、Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ、イソプロテレノール、イソプロテレノール＋エナラプリル、イソプロテレノール＋組換えヒトリラキシン２、およびイソプロテレノール＋Ｆｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡ。薬剤およびビヒクルは、Ａｌｚｅｔミニポンプ（モデル１００２；速度：０．２５μｌ／時間（±０．０５）、１日に６μｌ＠３７℃）またはＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡについては皮下注射によって送達した。
【０１５４】
イソプロテレノールは以下のとおりに作製した：５００ｍＭ溶液（１２３．９ｍｇ／ｍｌ）を０．０００２％  Ｎａ−Ａｓｃ食塩水、０．２２μＭろ過中に新たに入れる）。ミニポンプ中の最終［Ｉｓｏ］濃度：１５ｍｇ／ｋｇ／日＝体重（ＢＷ）１グラム当たり１５ｍｇ／２４７．７２／６μｌ／１０００ｇ＝１０．１ｍＭ。ビヒクルは、０．０００２％  アスコルビン酸Ｎａ（Ｓｉｇｍａ  カタログ＃  Ａ７６３１）とした。
【０１５５】
エナラプリルは以下のとおりに作製した：エナラプリルはマレイン酸塩、ＭＷ４９２．５２、Ｓｉｇｍａ  カタログ＃  Ｅ６８８８として使用する。２００ｍＭストック溶液（９８．５ｍｇ／ｍｌ）をメタノール、０．２２μＭろ過中に新たに入れる。ミニポンプ中の最終濃度：２．５ｍｇ／ｋｇ／日＝体重（ＢＷ）１グラム当たり２．５ｍｇ／４９２．５２／６μｌ／１０００ｇ＝０．８４６ｍＭ、すなわち、３０グラムのマウスについての１回のミニポンプは１９．０μｌの２００ｍＭ  Ｅｎａ（１５０μｌ×０．８４６／２００ｍＭ×３０ｇ  ＢＷ）を必要とするであろう。
【０１５６】
イソプロテレノール＋エナラプリル：上記に記載されるように作製したイソプロテレノールおよびエナラプリルをポンプ中に含めた。
【０１５７】
６つのグループおよび投薬について表４に示す。
【０１５８】
【表８】
2020505029.tif 000009
【０１５９】
研究の終わりに、体重、心臓重量、肺重量、および下腿長を測定した。そのうえ、組織学的検査およびコラーゲンアッセイを心臓サンプルを使用して実行した。
【０１６０】
線維症は、ヒドロキシプロリンの検出に基づいて測定した（Ｔｏｔａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓｓａｙ、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。組織学的検査（Ｈ＆Ｅおよびマッソン三色染色）もまた、治療の２週間後にホルマリン処理した心臓組織に対して実行した。
【０１６１】
結果および結論
図２９Ａは、下腿長（ＴＬ）に対する心臓重量（ＨＷ）の比を示し、図２９Ｂは、コラーゲン含有量を示す。
【０１６２】
イソプロテレノールによる治療は、ＨＷ／ＴＬおよびコラーゲン含有量の増加によって示されるように、ビヒクルまたはＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡのみと比較して、心肥大および線維症の有意な増加をもたらした（図２９Ａ、Ｂ）。
【０１６３】
イソプロテレノールで観察された心肥大および線維症の増加は、イソプロテレノールをエナラプリル、ｒｈＲＬＸ２、またはＦｃ＿ｈＲＬＸ２＿１５−１５ＡＡと同時に投与した場合に、有意に減じた（図２９Ａ、Ｂ）。
【０１６４】
組織学的検査研究のデータは、コラーゲンおよび肥大の測定値と一貫した（データ示さず）。
【０１６５】
参考文献
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【図１】
2020505029.tif 000010
【図２】
2020505029.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020505029.tif 000015
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020505029.tif 000020
【図１２】
2020505029.tif 000021
【図１３】
2020505029.tif 000022
【図１４】
2020505029.tif 000023
【図１５】
2020505029.tif 000024
【図１６】
2020505029.tif 000025
【図１７】
2020505029.tif 000026
【図１８】
2020505029.tif 000027
【図１９】
2020505029.tif 000028
【図２０】
2020505029.tif 000029
【図２１】
2020505029.tif 000030
【図２２】
2020505029.tif 000031
【図２３】
2020505029.tif 000032
【図２４】
2020505029.tif 000033
【図２５】
2020505029.tif 000034
【図２６】
2020505029.tif 000035
【図２７】
2020505029.tif 000036
【図２８−１】
2020505029.tif 000037
【図２８−２】
2020505029.tif 000038
【図２９】
2020505029.tif 000039
【配列表】
2020505029000001.app
【国際調査報告】
2020505029.tif 000040
2020505029.tif 000041
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