(57)【要約】  本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシン；（ｂ）（ｉ）ヒト化抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの可変ドメイン、および（ｉｉ）Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含むＢＣＭＡ結合部分；ならびに（ｃ）前記アマトキシンおよび前記標的結合部分を結合するプロテアーゼ開裂性リンカーを含むコンジュゲートに関する。本発明はさらに、特に多発性骨髄腫の治療における使用のための、そのようなコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
2020504736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシン；（ｂ）（ｉ）抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖の可変ドメイン、および（ｉｉ）Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含むＢＣＭＡ結合部分；ならびに（ｃ）プロテアーゼ開裂性リンカーを含む式Ｉに記載のコンジュゲートであって、前記ＢＣＭＡ結合部分が、前記抗体重鎖中の位置２６５におけるシステイン残基のチオール基を介して前記リンカーに付着していることを特徴とするコンジュゲート。
【化１】
2020504736.tif 000026
【請求項２】
前記ＢＣＭＡ結合部分が、配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ＢＣＭＡ結合部分が、ＩｇＧ１である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項５】
患者における癌の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項４に記載の医薬組成物であって、特に、前記癌が、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、特に多発性骨髄腫からなる群から選択されるコンジュゲートまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシン；（ｂ）（ｉ）ヒト化抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの可変ドメイン、および（ｉｉ）Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含むＢＣＭＡ結合部分；ならびに（ｃ）前記アマトキシンおよび前記標的結合部分を結合するプロテアーゼ開裂性リンカーを含むコンジュゲートに関する。本発明はさらに、特に多発性骨髄腫の治療における使用のための、そのようなコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄中のＢ細胞に由来する形質細胞の単一クローンの増殖を特徴とする２番目に多く蔓延している血液悪性腫瘍である。ＭＭは、米国における１５番目に一般的な癌のタイプとして位置付けられており、依然として治癒不能とみなされており、生存率の中央値は約３０〜６０ヵ月間である。慣用および新規の治療薬の単独または組合せを使用するＭＭの治療における進歩が改善された奏効率およびしたがって、数年間の生存期間の中央値の延長をもたらしても、ＭＭは依然として治癒不能な疾患とみなされている。ＭＭは、世界中の全ての癌の約０．８〜１％に相当し、全ての血液癌の約１０％に相当し、推定される全世界での発生率は１年間に１００，０００超の新規症例であり、全世界での死亡率は、年間７０，０００超の症例である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＳＥＥＲデータベース）。
【０００３】
ＭＭにおける形質細胞の無秩序な増殖はモノクローナル免疫グロブリン（Ｍタンパク質としても公知）の異常な産生をもたらし、それは免疫グロブリン軽鎖により引き起こされる腎不全またはＭタンパク質の過剰量からの過粘稠をもたらし得る。まとめると、臨床症状を示すＭＭは、血清および／または尿中のＭタンパク質の存在ならびに末端器官損傷を特徴とし、一般に、高カルシウム血症、腎不全、貧血および骨髄病変（ＣＲＡＢ特徴）に関与する（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒａｊｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【０００４】
いくつかの治療選択にもかかわらず、ＭＭは治癒不能な疾患であり、ほぼ全ての患者が最終的に耐性または難治性疾患を発症する。再発性ＭＭは、サルベージ療法のファーストライン治療後に少なくとも部分奏功が既に達成された進行性疾患を指す。難治性ＭＭは、患者が初期または最後の治療後６０日以内で非応答である進行性疾患を示す（Ｄｉｍｉｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００５】
いかなる治療も行わない場合、骨髄腫患者の診断後の生存期間の中央値は、約３年間である（Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒａｊｋｕｍａｒ，２００４）。目下、骨髄腫の治療において使用されるいくつかのクラスの薬物：免疫調節薬（サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）および幹細胞移植が存在する。これらのクラスの注目に値する薬物の多くは、過去１０〜１５年間にわたり承認された。これらの新規薬物および高用量化学療法を自己または同種造血幹細胞移植（ＳＣＴ）との組合せで使用する治療は５年生存率の中央値を改善することが示されており、それにより現在の標準治療法となっている。しかしながら、多くの患者は治療耐性の再発または発症に罹患し、寛解の持続期間を延長し、生存期間を改善する安全で有効な治療を開発することが依然として必要とされている。
【０００６】
ＭＭ患者の約３０％は疾患の過程にわたり腎機能障害を発症し、２０％は軽鎖の蓄積および沈着により引き起こされる腎不全を呈する。腎疾病は、ＭＭ患者にかなりの負荷であり、ＭＭに起因する末期腎疾患のための腎代替療法を伴う。新規薬剤、例えば、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブは、かなりの比率の患者において腎機能を良好に回復させ得、腎不全に起因する合併症を、早期に検出および治療した場合に回避することができる（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００７】
薬剤、例えば、プロテアソーム阻害剤および／または免疫調節薬が患者についてのアウトカムを改善しても、それらの薬剤は疾患を治癒しない。したがって、新規作用方式を有する新たな薬剤が必要とされ続けている。骨髄腫細胞の表面上で発現される分子の知識は、新たな治療法のための現在開発中の多数の新たなモノクローナル抗体をもたらした。しかしながら、これらの分子のほとんどはＭＭ細胞上でのみ発現されるわけではなく、ＭＭを治療するそれらの潜在性の実証が必要とされている。
【０００８】
多数の薬物および治療法が現在、臨床段階にある：抗体、例えば、ＣＤ３８を標的化するダラツブマブおよびＳＬＡＭＦ７（シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバー７（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  ７））を標的化するエロツズマブ（両方とも単独または他の薬物との組合せで使用される）；パナビノスタット（ｐａｎａｂｉｎｏｓｔａｔ）、すなわち、組合せ療法で使用することができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ）；ＭＭ細胞の特異的標的化を可能とする抗ＢＣＭＡ単鎖可変断片を発現するキメラ抗原受容体遺伝子操作Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞。
【０００９】
ＭＭは、形質細胞、すなわち、通常状況下で免疫グロブリンの大量産生を担う最終分化Ｂ細胞の悪性増殖を特徴とする。悪性骨髄腫細胞への形質細胞のこの進行は、複数の遺伝子および癌遺伝子イベント、例として、サイクリンＤ１およびｃ−Ｍｙｃの調節不全、ならびに突然変異、例えば、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ３（線維芽細胞成長因子受容体３）およびＴＰ５３を伴う（Ｓｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｕｅｈｌ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，２０１２；Ｃｈｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，２０１５）。
【００１０】
これらの遺伝子変更にかかわらず、悪性形質細胞は、骨髄（ＢＭ）環境に大幅に依存し続ける。ＢＭ中のＭＭ細胞の結合後、シグナリングカスケード、例として、アクセサリー成長因子およびＢＭアクセサリー細胞により分泌されるそのリガンドが活性化される。これらのアクセサリー細胞により放出される構成成分はＭＭにおける重要な役割を担い、両方とも疾患を促進し、免疫サーベイランスから逃れる。
【００１１】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体の特異性を利用して強力な細胞毒性薬を抗原提示腫瘍細胞に選択的に送達することを目的とする。
【００１２】
抗体は、十分特徴付けされた抗原を腫瘍部位において高い特異的発現で、正常組織上では低い発現または発現なしで標的化し、したがって、ＡＤＣの効力を最大化する一方、毒性を制限するべきである。
【００１３】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーおよびそれらのリガンドは、Ｂ細胞の増殖、分化およびアポトーシスの制御における重要な役割を担う。特に、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）リガンド−受容体ネットワークは、Ｂ細胞成熟および悪性形質細胞への分化の調節における中心的な役割を担う。機能的に関連するＢＡＦＦ受容体ＢＡＦＦ−Ｒ、シクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）およびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、シグナルペプチドを欠き、システインリッチ細胞外ドメインを含有するＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。
【００１４】
これらの受容体は、区別される発生段階におけるＢ細胞の生存率を促進し、したがって、Ｂ細胞上のそれらの発現パターンは、Ｂ細胞のタイプならびにそれらの成熟および活性化の段階に応じて異なる。ＢＡＦＦ−Ｒ発現は、Ｂ細胞前駆体上で検出可能でないが、成熟Ｂ細胞上で発現される優位な受容体である。ＢＡＦＦ−ＲはＢ細胞の生存を媒介し、胚中心反応の寿命を持続し、免疫グロブリンクラススイッチ組換えを促進する。ＴＡＣＩはＢ細胞および活性化Ｔ細胞上で発現され、クラススイッチ組換えにおいて重要であり、Ｔ細胞依存性抗体応答を支持する。ＢＣＭＡは、ほぼ形質細胞上でのみ発現されるが、ナイーブおよびメモリーＢ細胞では不存在であり、形質細胞へのＢ細胞分化を促進し、したがって、体液性免疫応答の維持を促進する。可溶性ＢＣＭＡはＭＭ患者の血清中で上昇し、良好なドナーリンパ球注入はＢＣＭＡに対する抗体の形成を伴う。ＭＭ患者に見出される血清ＢＣＭＡのレベルは、臨床状態および全生存率に関連がある（Ｂｅｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００１５】
ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）およびＢＣＭＡは、Ｂ細胞から形質およびＭＭ細胞への決定プロセスにおける重要な役割を実行する。Ｂ細胞は骨髄から流出するため、辺縁帯Ｂ細胞（ＭＺ  Ｂ）へのさらなる成熟はＢＡＦＦに依存的である。ＢＡＦＦは、ナイーブ再循環Ｂ細胞およびＭＺ  Ｂ細胞のホメオスタシスにも不可欠である。形質細胞上のＢＡＦＦ−Ｒの下方調節は、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬに結合し得るＢＣＭＡの上方調節と一致する。転写因子ＮＦκＢは、調節、Ｂ細胞増殖、生存および分化の経路における重要な役割を果たす。ＮＦκＢ活性は、κＢ（ＩκＢ）タンパク質のインヒビターによりモジュレートされる。これらのうち、ＩκＢαは、細胞質中で不活性なＮＦκＢ二量体を保持し、分解された場合に結合ＮＦκＢ二量体を放出して核にトランスロケートし、遺伝子発現をドライブする。分解を介するＩκＢ活性の調節は、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）によるセリンリン酸化に依存する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００１６】
種々の抗ＢＣＭＡ抗体、例として、ネズミ抗体Ｊ２２．９（国際公開第２０１４／０６８０７９号パンフレット）およびそのヒト化バージョン（国際公開第２０１５／１６６０７３号パンフレット）がこれまで生成されてきた。
【００１７】
抗体−薬物コンジュゲートを得るため、この両方の抗体についての付着部位を有する二官能性リンカーおよび薬物を使用して２つの構成成分を結合させる。
【００１８】
抗体へのコンジュゲーションに関して、リンカー付着方針は、典型的には、抗体上のシステインまたはリジン残基に依存する。理想的に、リンカーは、副作用または毒性効果を最小化するために全身循環中で安定であり続けなければならない。抗原認識および結合時、得られるＡＤＣ受容体複合体は受容体媒介エンドサイトーシスを介して内在化される。非コンジュゲート毒素は、ＡＤＣからの放出時に効率的な殺傷を可能とする高い効力を実証するはずである。毒性ペイロードの放出は標的細胞内側でのみ生じるべきであり、ＡＤＣは血漿中で安定的であるべきである。細胞内側での抗体からの毒素の放出のため、リンカーは、開裂性（リソソームプロテアーゼにより開裂され、リソソームコンパートメント中で低ｐＨにおいて加水分解され、または細胞内グルタチオンによりジスルフィド結合から放出される）または非開裂性（ＡＤＣの内在化後の抗体の完全分解に依存する）のいずれかであり得る。
【００１９】
最後に、抗体−薬物コンジュゲートの毒性ペイロードに関して、細胞毒性剤の２つの主なクラス：微小管重合を破壊する薬物またはＤＮＡの副溝に結合し、二本鎖分解を引き起こす化合物が臨床評価において現在使用されている。
【００２０】
アマトキシンは、タマゴテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ  ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）キノコに見出される８つのアミノ酸から構成される環状ペプチドである（図１参照）。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより罹患細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。細胞中の転写の阻害は、成長および増殖の停止を引き起こす。アマニチンおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ間の複合体は共有結合していないが、極めてタイトである（ＫD＝３ｎＭ）。この酵素からのアマニチンの解離は極めて緩慢なプロセスであり、したがってそれにより罹患細胞の回復の可能性が低くなる。転写の阻害が長時間続く場合、細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を受ける。
【００２１】
腫瘍療法のための細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用が１９８１年に既に探索されており、それは抗Ｔｈｙ１．２抗体をα−アマニチンに、ジアゾ化を介してＴｒｐ（アミノ酸４；図１参照）のインドール環に付着しているリンカーを使用してカップリングすることによるものである（Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３（１９８１）１３８５−１３８８）。ＤａｖｉｓおよびＰｒｅｓｔｏｎは、付着の部位を７’位と同定した。ＭｏｒｒｉｓおよびＶｅｎｔｏｎも、７’位における置換が細胞毒性活性を維持する誘導体をもたらすことを実証した（Ｍｏｒｒｉｓ  ＆  Ｖｅｎｔｏｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２１（１９８３）４１９−４３０）。
【００２２】
特許出願の欧州特許出願第１８５９８１１Ａ１号明細書（２００７年１１月２８日公開）は、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ原子がアルブミンに、またはモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、もしくはＰＡ−１に直接、すなわち、リンカー構造なしでカップリングしているコンジュゲートを記載した。さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）およびＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対するこれらのコンジュゲートの阻害効果が示された。リンカー、例として、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などのような要素を含むリンカーの使用が示唆されたが、そのような構築物は実際には示されておらず、さらなる詳細、例えば、アマトキシン上の付着部位は提供されなかった。
【００２３】
特許出願の国際公開第２０１０／１１５６２９号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１１５６３０号パンフレット（両方とも２０１０年１０月１４日公開）は、抗体、例えば、抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば、ヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５がアマトキシンに、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子、（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ原子、または（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子を介して（それぞれの場合、直接または抗体とアマトキシンとの間のリンカーを介して）カップリングしているコンジュゲートを記載している。示唆されているリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などのような要素を含む。さらに、乳癌細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、膵臓癌腫（細胞株Ｃａｐａｎ−１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、および胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対するこれらのコンジュゲートの阻害効果が示された。
【００２４】
アマトキシンは、大型生体分子担体、例えば、抗体分子にカップリングした場合に比較的非毒性であること、および生体分子担体が開裂除外された後にのみ、それらがそれらの細胞毒性活性を付与することが公知である。アマトキシンの毒性に照らして、特に肝細胞について、標的腫瘍療法のためのアマトキシンコンジュゲートが血漿中の投与後に高度に安定であり続けること、およびアマトキシンの放出が標的細胞中の内在化後に生じることがとりわけ重要である。これに関して、コンジュゲート安定性のわずかな改善は、治療アプローチのためのアマトキシンコンジュゲートの治療ウインドウおよび安全性についての劇的な結果を有し得る。
【００２５】
特許出願の国際公開第２０１６／１４２０４９号パンフレットは、アマニチンペイロードが抗体重鎖定常領域中の特異的遺伝子操作システイン残基を介して抗体に付着している抗体−アマニチンコンジュゲートを記載している。突然変異残基の性質に応じて、野生型アミノ酸残基の置き換えが活性に影響し得る。
【００２６】
ＣＤ２６９において指向されるアマトキシンベース抗体コンジュゲートが、腫瘍患者の治療における利点を提供し得ることが既に報告されている（Ｐａｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．：“Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２６９  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ６９  （２０１６），Ｓ２１  ＆  ２８th  ＥＯＲＴＣ−ＮＣＩ−ＡＡＣＲ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｍｕｎｉｃｈ  （Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２９−Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２，２０１６；Ｐａｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．：“ＣＤ２６９−Ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｍａｎｉｔｉｎ  ｂａｓｅｄ  ＡＤＣｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７６（Ｎｏ．１４  ｓｕｐｐｌ）（２０１６）２９７３  ＆  １０７th  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ａｐｒｉｌ  １６−Ａｐｒｉｌ  ２０，２０１６参照）。しかしながら、使用されるアマトキシン誘導体の、およびアマトキシン誘導体と抗ＣＤ２６９抗体との間の特異的結合の具体的な性質についての詳細は提供されなかった。
【００２７】
したがって、治療的使用のためのアマトキシンベースコンジュゲートの開発は既に顕著に前進している。しかしながら、本発明者らは、α−およびβ−アマトキシンをベースとする構築物が血漿中のストレス条件下で完全に安定ではなく、かなりの程度の架橋産物をもたらすことを見出した（図２参照）。この効果は、完全に予測外であり、そのような不安定性および架橋についての理由は不明確であった。図２において、アマトキシンベース抗体コンジュゲートから形成される架橋産物の量をシステインの添加により低減させることができることがさらに示され、図３および４において、α−アマニチンがシステインと反応することが示される。しかしながら、高度に毒性のアマトキシンを含むコンジュゲートの安定性はヒトへの投与のための治療分子としての想定される使用に最も重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、標的細胞中で高い効力を有し、同時に高い安定性を有するアマトキシンベース抗体−薬物コンジュゲートが依然として非常に必要とされていた。この課題に対する解決策、すなわち、（ａ）適切な親抗ＢＣＭＡ抗体、（ｂ）毒性ペイロードを抗体にリンカーを介して付着させるための適切な方針、（ｃ）適切なリンカーおよび（ｄ）適切なアマトキシンバリアントの同定は、従来技術によっては提供も示唆もされていない。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、抗体およびアマトキシンが開裂性リンカーにより結合している、抗体Ｊ２２．９をベースとする抗ＢＣＭＡ抗体にコンジュゲートしているアマトキシンのバリアント形態が、ストレス条件下で、特にヒト血漿中で増加した安定性、および改善された治療指数を示すという予測外の観察に基づく。
【００３０】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシン；（ｂ）（ｉ）抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖の可変ドメイン、および（ｉｉ）Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含むＢＣＭＡ結合部分；ならびに（ｃ）プロテアーゼ開裂性リンカーを含む式Ｉに記載のコンジュゲートであって、前記ＢＣＭＡ結合部分が、抗体重鎖中の位置２６５における遺伝子操作システイン残基のチオール基を介して前記リンカーに付着しているコンジュゲートに関する。
【化１】
2020504736.tif 000003
【００３１】
第２の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【００３２】
第３の態様において、本発明は、患者における癌の治療における使用のための、本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬組成物であって、特に、癌が、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、特に多発性骨髄腫からなる群から選択されるコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】様々なアマトキシンの構造式を示す。太字の数字（１〜８）は、アマトキシンを形成する８つのアミノ酸の標準的番号付与を指定する。アミノ酸１、３および４中の原子の標準的指定も示される（それぞれ、ギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、および１’〜７’の数字）。
【図２】抗アマニチンウエスタンブロットにおけるストレス試験実験の結果を示す。トラスツズマブ−アマニチンコンジュゲート（Ｈｅｒ−３０．０６４３；６’−ＯＨを介するリジンコンジュゲーション；安定性リンカー）を３７℃においてＰＢＳ、ｐＨ７．４中で５日間インキュベートし、それは十分な鎖間および鎖内架橋をもたらし；抗体鎖の架橋をフリーシステインの添加により低減させることができた。
【図３】α−アマニチンがＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中でシステインとの強力な反応性を示すことを示す。１ｍｇ／ｍＬのα−アマニチン１０ｍｇ／ｍＬのシステインの、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３７℃における２４時間、４８時間および６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８。
【図４】β−アマニチンがＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中でシステインとの強力な反応性を示すことを示す。１ｍｇ／ｍＬのβ−アマニチン１０ｍｇ／ｍＬのシステインの、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３７℃における２４時間、４８時間および６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８。
【図５】アミノ酸４における６’−デオキシバリアント（「アマニン」）がシステインとの低減した反応を示すことを示す。１ｍｇ／ｍＬのアマニン  １０ｍｇ／ｍＬのシステインの、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３７℃における２４時間、４８時間および６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８。
【図６】二重デオキシバリアントＨＤＰ３０．２１０５（アミノ酸４における６’−デオキシおよびアミノ酸８におけるＳ−デオキシ；式Ｉ、Ｒ3＝−ＯＲ5、それぞれのＲ5＝Ｈ）が、システインとの反応性の完全な不存在を示すことを示す。１ｍｇ／ｍＬのＨＤＰ３０．２１０５、１０ｍｇ／ｍＬのシステインの、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３７℃における２４時間、４８時間および６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８；*不純物。
【図７】図３〜６からの結果をまとめる；ｘ軸：反応時間（時間）：ｙ軸：残りのアマトキシンバリアントの量（％）。
【図８】ＡＡ４−６−ＯＨ部分における開裂性リンカーを有するアルファ−アマニチン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９、ＡＡ１γ位における開裂性リンカーを有するアルファ−アマニチン誘導体ＨＤＰ３０．２０６０およびＡＡ１γ位における開裂性リンカーを有する二重デオキシアマトキシンバリアントＨＤＰ３０．２１１５を示す。
【図９】０、４および１０日間のヒト血漿、マウス血漿およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３７℃におけるインキュベーション後の、Ｄ２６５Ｃ突然変異を有する参照チオｍａｂ（Ｔｈｉｏｍａｂ）抗体にコンジュゲートしているアマトキシン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９、ＨＤＰ３０．２０６０およびＨＤＰ３０．２１１５のウエスタンブロット分析を示す。検出は、ウサギからのポリクローナル抗アマニチン抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしている抗ウサギ抗体を用いて行った。ＨＤＰ３０．１６９９およびＨＤＰ３０．２０６０は、かなりの架橋およびアマトキシン部分の損失を示した。二重デオキシアマニチンバリアントＨＤＰ３０．２１１５は、高い安定性および有意に低減した架橋を示す。
【図１０】Ｄ２６５Ｃ突然変異を有する参照チオｍａｂ抗体にコンジュゲートしているアマトキシン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９、ＨＤＰ３０．２０６０およびＨＤＰ３０．２１１５の細胞毒性を示す。試験物をヒト血漿中で３７℃において０および４日間インキュベートした。細胞毒性アッセイをＳＫＢＲ−３細胞に対して９６時間実施した。ＨＤＰ３０．１６９９およびＨＤＰ３０．２０６０ベースＡＤＣは、４日間の血漿ストレス付与後に顕著な細胞毒性の損失を示す一方、脱酸素誘導体ＨＤＰ３０．２１１５は依然としてピコモル濃度活性を示す。
【図１１】Ｄ２６５Ｃ突然変異を有する参照チオｍａｂ抗体にコンジュゲートしているアマトキシン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９、ＨＤＰ３０．２０６０およびＨＤＰ３０．２１１５の細胞毒性を示す。試験物をマウス血漿中で３７℃において０および４日間インキュベートした。細胞毒性アッセイを、ＳＫＢＲ−３細胞に対して９６時間実施した。ＨＤＰ３０．１６９９およびＨＤＰ３０．２０６０ベースＡＤＣは、血漿ストレス付与後に顕著な細胞毒性の損失を示す一方、脱酸素誘導体ＨＤＰ３０．２１１５はほぼ不変のままである。
【図１２】Ｄ２６５Ｃ突然変異を有する参照チオｍａｂ抗体にコンジュゲートしているアマトキシン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９、ＨＤＰ３０．２０６０およびＨＤＰ３０．２１１５の細胞毒性を示す。試験物をＰＢＳ中で３７℃において０および４日間インキュベートした。細胞毒性アッセイをＳＫＢＲ−３細胞に対して９６時間実施した。全てのＡＤＣは、非酵素環境に対する適切な安定性を示す。
【図１３】ゼノグラフトモデル−単一用量実験における腫瘍標的化参照抗体（ＨＤＰref）をベースとする様々なアマトキシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を比較する。リンカーおよび毒素構造に応じて、抗腫瘍活性の有意差が観察された。デオキシ−アマニンバリアントＨＤＰref−３０．２１１５（アミノ酸４における６’−デオキシおよびアミノ酸８におけるＳ−デオキシ）は、全てのアマトキシンＡＤＣの最良の抗腫瘍活性を示し、対応する開裂性リンカーＡＤＣ  ＨＤＰref−３０．１６９９（６’−ＯＨを介するリジンコンジュゲーション；アミノ酸８におけるＳ＝Ｏ）よりも治療指数が有意に良好であった。
【図１４】全身腫瘍モデル−参照抗体を用いる単一用量実験におけるカプランマイヤー生存分析を示す。簡潔に述べると、２００μＬのＰＢＳ中２．５×１０6個の腫瘍細胞／マウスを、０日目に静脈内接種した。治療法（単一用量、ｉｖ）を、腫瘍細胞接種３日後に開始した。デオキシ−アマニンバリアントＨＤＰref−３０．２１１５（アミノ酸４における６’−デオキシおよびアミノ酸８におけるＳ−デオキシ）は、α−アマニチン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９、ＨＤＰ３０．０８８０およびＨＤＰ３０．０６４３を有する、ならびに対応するＭＭＡＥ誘導体を有するＨＤＰrefベースコンジュゲートよりも優れた生存数を示した。
【図１５】Ｊ２２．９−ＩＳＹおよびチオｍａｂ  Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５ＣがＢＣＭＡ陽性細胞への同等の結合特性を有することを示す。抗体バリアントＪ２２．９−ＩＳＹおよびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃのフローサイトメトリー結合アッセイの結果により、ＢＣＭＡ発現ＭＭ．１Ｓ  ＬｕｃおよびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞への同等の結合特性が明らかになった。
【図１６Ａ】（Ａ）Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５、および（Ｂ）Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９の産生のＱＡ結果を示す。
【図１６Ｂ】（Ａ）Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５、および（Ｂ）Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９の産生のＱＡ結果を示す。
【図１７】安定性実験の結果を示す：Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５（Ａ）およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９（Ｂ）を、ヒト、カニクイザル、もしくはマウス血漿または対照用ＰＢＳ中で３７℃において０、４、および１０日間インキュベートし、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび後続の抗アマニチンウエスタンブロットにおいて分析した。
【図１８】血漿安定性および細胞毒性潜在性を分析する実験からの結果を示す。Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５（Ａ）およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９（Ｂ）を、対照用ＰＢＳ、またはヒト、カニクイザルもしくはマウス血漿中で３７℃において０、４、および１０日間インキュベートし、ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を使用して残りの細胞毒性潜在性について分析した。
【図１９】細胞毒性アッセイに使用される様々な細胞株上のＢＣＭＡ発現レベルを示す。ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＲＮＡポリメラーゼ２Ａ（ＰＯＬＲ２Ａ）、ｐ５３およびＧＡＰＤＨ（対照）に対する抗体を使用したウエスタンブロット分析。全ての細胞株は、ＢＣＭＡ陰性細胞株を使用したＣＣＲＦ−ＣＥＭを除きＢＣＭＡを発現する。最大ＢＣＭＡレベルはＮＣＩ−Ｈ９２９細胞中で検出され、最低レベルはＲＰＭＩ−８２２６細胞中で検出される。
【図２０】細胞毒性実験からの結果を示す：Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５との９６時間のインキュベーション後のＢＣＭＡ陽性（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ、Ｕ２６６Ｂ１、ＯＰＭ−２）およびＢＣＭＡ陰性（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）細胞の生存率をモニタリングした。細胞毒性を最大有効濃度の半数（ＥＣ50）として計算した。
【図２１】単一用量適用におけるマウスＮＣＩ−Ｈ９２９皮下ゼノグラフトにおける抗腫瘍活性を示す：雌ＣＢ−１７Ｓｃｉｄマウスに、５×１０6個のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を皮下接種した。腫瘍容積が８０ｍｍ3に達したら、マウス（１群当たり８匹の動物）を、単一用量（２または４ｍｇ／ｋｇ）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５もしくはＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９により静脈内処理し、または対照としてのＰＢＳにより処理した。腫瘍容積を週２回モニタリングした。
【図２２】反復用量適用におけるマウスＮＣＩ−Ｈ９２９皮下ゼノグラフトにおける抗腫瘍活性を示す：雌ＣＢ−１７Ｓｃｉｄマウスに、５×１０6個のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を皮下接種した。腫瘍容積が８０ｍｍ3に達したら、マウス（１群当たり９匹の動物）を、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５（用量０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）により週１回（１×／週）、２週間に１回（１×／２週間）もしくは３週間に１回（１×／３週間）のいずれかで静脈内処理し、または対照としてのＰＢＳにより処理した。さらに、２ｍｇ／ｋｇの用量を週２回（２×／週）適用した。腫瘍容積を週２回モニタリングした。
【図２３Ａ】播種ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍活性を示す：（Ａ）雌ＳＣＩＤベージュマウスに、１×１０7個のＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞を静脈内注射した。１．５×１０6〜１×１０7の平均発光量（ｆｌｕｘ）（移植１０〜１４日後）に達した場合、１群当たり８〜１０匹のマウスを単一用量（２および４ｍｇ／ｋｇ）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５または対照としてのＰＢＳにより処理した。ルシフェラーゼ活性を、非侵襲性生体イメージングにより週２回、ルシフェリンの投与（１０μｌ／１ｇの体重）１０分後にモニタリングした。（Ｂ）それぞれの動物についての個々の腫瘍成長曲線を示す。個々の成長曲線を、２ｍｇ／ｋｇ（実線）および４ｍｇ／ｋｇ（点線）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５により処理された群について示す。データは、それぞれの示される群からの１匹の動物のみがバックグラウンドレベルを有意に超えて上昇した腫瘍シグナルを示すことを示す。
【図２３Ｂ】播種ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍活性を示す：（Ａ）雌ＳＣＩＤベージュマウスに、１×１０7個のＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞を静脈内注射した。１．５×１０6〜１×１０7の平均発光量（ｆｌｕｘ）（移植１０〜１４日後）に達した場合、１群当たり８〜１０匹のマウスを単一用量（２および４ｍｇ／ｋｇ）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５または対照としてのＰＢＳにより処理した。ルシフェラーゼ活性を、非侵襲性生体イメージングにより週２回、ルシフェリンの投与（１０μｌ／１ｇの体重）１０分後にモニタリングした。（Ｂ）それぞれの動物についての個々の腫瘍成長曲線を示す。個々の成長曲線を、２ｍｇ／ｋｇ（実線）および４ｍｇ／ｋｇ（点線）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５により処理された群について示す。データは、それぞれの示される群からの１匹の動物のみがバックグラウンドレベルを有意に超えて上昇した腫瘍シグナルを示すことを示す。
【図２４Ａ】播種ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデル：減量における抗腫瘍活性を示す：（Ａ）雌ＳＣＩＤベージュマウスに、１×１０7個のＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞を静脈内注射した。１．５×１０6〜１×１０7の平均発光量に達した場合（移植１０〜１４日後）、１群当たり８〜１０匹のマウスを単一用量（０．１、０．３、１および２ｍｇ／ｋｇ）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５または対照としてのＰＢＳにより処理した。ルシフェラーゼ活性を、非侵襲性生体イメージングにより週２回、ルシフェリンの投与（１０μｌ／１ｇの体重）１０分後にモニタリングした。（Ｂ）それぞれの動物についての個々の腫瘍成長曲線を示す。成長曲線を、１ｍｇ／ｋｇ（実線）および２ｍｇ／ｋｇ（点線）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５により処理された群について示す。データは、それぞれの示される群からの１匹の動物のみがバックグラウンドレベルを有意に超えて上昇した腫瘍シグナルを示すことを示す。
【図２４Ｂ】播種ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデル：減量における抗腫瘍活性を示す：（Ａ）雌ＳＣＩＤベージュマウスに、１×１０7個のＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞を静脈内注射した。１．５×１０6〜１×１０7の平均発光量に達した場合（移植１０〜１４日後）、１群当たり８〜１０匹のマウスを単一用量（０．１、０．３、１および２ｍｇ／ｋｇ）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５または対照としてのＰＢＳにより処理した。ルシフェラーゼ活性を、非侵襲性生体イメージングにより週２回、ルシフェリンの投与（１０μｌ／１ｇの体重）１０分後にモニタリングした。（Ｂ）それぞれの動物についての個々の腫瘍成長曲線を示す。成長曲線を、１ｍｇ／ｋｇ（実線）および２ｍｇ／ｋｇ（点線）のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５により処理された群について示す。データは、それぞれの示される群からの１匹の動物のみがバックグラウンドレベルを有意に超えて上昇した腫瘍シグナルを示すことを示す。
【図２５】カニクイザルにおける忍容性試験からの結果を示す：３匹の動物の群に、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５またはＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９を漸増用量（０．３、１および３ｍｇ／ｋｇ）とそれに続く３ｍｇ／ｋｇを使用する反復投与で注射した。ＡＬＴ：アラニントランスアミナーゼ；ＡＳＴ：アスパラギン酸トランスアミナーゼ；ＬＤＨ：乳酸デヒドロゲナーゼ。
【図２６Ａ】ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ（左側パネル）およびＫＭＳ−１１細胞（右側パネル）に対する、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５（●）と、モノメチルアウリスタチンＦ誘導体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ（■）との細胞毒性潜在性の比較を示す：（Ａ）９６時間の時点における比較、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５のＥＣ50：ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対して５．５７５  １０-10Ｍ；ＫＭＳ．−１１細胞に対して１．７１６  １０-9Ｍ；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦのＥＣ50：ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対して４．８１２  １０-10Ｍ；ＫＭＳ−１１細胞に対して６．２６１  １０-10Ｍ；（Ｂ）ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対する細胞毒性潜在性の２４時間〜１２０時間のタイムコース（Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５：●；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ：■）；（Ｃ）ＫＭＳ−１１細胞に対する細胞毒性潜在性の２４時間〜１２０時間のタイムコース（Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５：●；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ：■）。
【図２６Ｂ】ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ（左側パネル）およびＫＭＳ−１１細胞（右側パネル）に対する、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５（●）と、モノメチルアウリスタチンＦ誘導体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ（■）との細胞毒性潜在性の比較を示す：（Ａ）９６時間の時点における比較、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５のＥＣ50：ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対して５．５７５  １０-10Ｍ；ＫＭＳ．−１１細胞に対して１．７１６  １０-9Ｍ；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦのＥＣ50：ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対して４．８１２  １０-10Ｍ；ＫＭＳ−１１細胞に対して６．２６１  １０-10Ｍ；（Ｂ）ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対する細胞毒性潜在性の２４時間〜１２０時間のタイムコース（Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５：●；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ：■）；（Ｃ）ＫＭＳ−１１細胞に対する細胞毒性潜在性の２４時間〜１２０時間のタイムコース（Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５：●；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ：■）。
【図２６Ｃ】ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ（左側パネル）およびＫＭＳ−１１細胞（右側パネル）に対する、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５（●）と、モノメチルアウリスタチンＦ誘導体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ（■）との細胞毒性潜在性の比較を示す：（Ａ）９６時間の時点における比較、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５のＥＣ50：ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対して５．５７５  １０-10Ｍ；ＫＭＳ．−１１細胞に対して１．７１６  １０-9Ｍ；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦのＥＣ50：ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対して４．８１２  １０-10Ｍ；ＫＭＳ−１１細胞に対して６．２６１  １０-10Ｍ；（Ｂ）ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ細胞に対する細胞毒性潜在性の２４時間〜１２０時間のタイムコース（Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５：●；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ：■）；（Ｃ）ＫＭＳ−１１細胞に対する細胞毒性潜在性の２４時間〜１２０時間のタイムコース（Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５：●；Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦ：■）。
【図２７】播種ゼノグラフトモデル（ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ）におけるモノメチルアウリスタチンＦ誘導体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦおよびカルフィルゾミブと比較したＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の効力の試験からの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明を以下に詳述する前に、本発明は本明細書に記載の特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解すべきである。それというのも、それらは変動し得るためである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではなく、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【００３５】
特に、本明細書において使用される用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｅｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において記載のとおり定義される。
【００３６】
以下の本明細書および特許請求の範囲全体にわたり、特に文脈が要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｌｉｓｉｎｇ）」は、記述される整数、組成物もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味する一方、任意の追加の整数、組成物もしくはステップまたは整数、組成物もしくはステップの群も場合により存在し得、追加の整数、組成物もしくはステップまたは整数、組成物もしくはステップの群が存在しない実施態様も含むことが理解される。このような後者の実施態様において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる」と同一範囲で使用される。
【００３７】
いくつかの文献が本明細書の本文全体にわたり引用される。本明細書に引用される文献（例として、全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の説明書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号配列寄託など）のそれぞれは、前掲か後掲かにかかわらず、各特許法の下で可能な程度で参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００３８】
目下、本発明はさらに記載される。以下の節において、本発明の様々な態様がより詳細に定義される。このように定義されるそれぞれの態様は、矛盾することが明確に示されない限り、任意の他の１つまたは複数の態様と組み合わせることができる。特に、関連性があるまたは有利であると示される任意の特徴は、特に関連性があるまたは有利であると示される任意の他の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００３９】
本発明は、様々な有利な要素および特徴の組合せに、特に、抗体およびアマトキシンが開裂性リンカーにより結合している、抗体Ｊ２２．９をベースとする抗ＢＣＭＡ抗体にコンジュゲートしているアマトキシンのバリアント形態がストレス条件下で、特にヒト血漿中で増加した安定性、および改善された治療指数を示すという予測外の観察に基づく。
【００４０】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシン；（ｂ）抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖の可変ドメインを含むＢＣＭＡ結合部分、ならびに（ｃ）プロテアーゼ開裂性リンカーを含むコンジュゲートであって、前記ＢＣＭＡ結合部分が、抗体重鎖中の位置２６５におけるシステイン残基のチオール基を介して前記リンカーに付着しているコンジュゲートに関する。
【００４１】
特定の実施形態において、ＢＣＭＡ結合部分は、Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含む。
【００４２】
特定の実施形態において、前記プロテアーゼ開裂性リンカーは、自己崩壊リンカーである。
【００４３】
特定の実施形態において、コンジュゲートは、式Ｉに記載のコンジュゲートである。
【化２】
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【００４４】
本発明に関して、用語「アマトキシン」は、テングタケ（Ａｍａｎｉｔａ）属から単離され、ならびにＷｉｅｌａｎｄ，Ｔ．およびＦａｕｌｓｔｉｃｈ  Ｈ．（１９７８）に記載の８つのアミノ酸から構成される全ての環状ペプチドを含み、これらは、（ｉ）（すなわち、アミノ酸残基トリプトファンのインドール部分は、特に６’位が水素原子を担持する場合、６’位における酸素含有置換基を有さない）および（ｉｉ）（すなわち、天然存在のアマトキシンのチオエーテルスルホキシド部分は、スルフィドにより置き換えられている）に従う規定の位置を含み、さらにそれらの全ての化学誘導体；さらにそれらの全ての半合成アナログ；天然化合物のマスター構造（環状、８つのアミノ酸）に従うビルディングブロックから構成されるさらにそれらの全ての合成アナログ；さらにヒドロキシル化アミノ酸に代えて非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する全ての合成または半合成アナログ、さらに全ての合成または半合成アナログを含み、それぞれの場合において、任意のそのような誘導体またはアナログは、少なくとも上記の（ｉ）および（ｉｉ）位を担持し、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩの阻害により機能的に活性である。
【００４５】
機能的に、アマトキシンは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチドまたはデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、上記定義のリンカー分子または標的結合部分と反応させることができる官能基（例えば、カルボン酸基またはカルボン酸誘導体、例えば、カルボキサミドまたはヒドロキサム酸、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールもしくはチオール捕捉基）を有するものである。本発明のコンジュゲートに特に好適なアマトキシンは、図１に示されるα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマヌリン、もしくはアマヌリン酸のジ−デオキシバリアント、またはアマニン、アマニンアミド、γ−アマニン、もしくはγ−アマニンアミドのモノ−デオキシバリアントならびにそれらの塩、化学誘導体、半合成アナログ、および合成アナログである。
【００４６】
（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシンバリアントは、最初にＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １６（２０１５）１４２０−１４２５においてアマトキシンのための全合成アプローチにおいて得られる４つのジアステレオマーの１つとして挙げられた。しかしながら、このようなバリアントが血漿中でストレス条件下でより安定的であり、低減した程度の架橋産物（図２に示される）をもたらすという事実は、２０１６年１２月の本出願の有効出願日において公知でなかった（２０１７年９月８日に公開された特許出願の国際公開第２０１７／１４９０７７号パンフレット参照）。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、９０％超、特に９５％超の純度を有する。
【００４８】
モノクローナルネズミ抗体Ｊ２２．９は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）にＮ末端融合している精製ヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン（残基１〜５４）により免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスから標準的ハイブリドーマ技術を使用して得られた。ハイブリドーマの不安定性に起因して、軽鎖および重鎖の可変領域が、それぞれヒトカッパおよびＩｇＧ１定常ドメイン上流で増幅およびクローニングされ、キメラＪ２２．９−ｘｉ抗体がもたらされた（Ｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００４９】
抗体Ｊ２２．９−ｘｉは、配列アラインメントおよび結晶構造から得られたデータに基づきヒト化されてＢＣＭＡへの結合を潜在的に破壊する突然変異が同定された。簡潔に述べると、全長抗体からＪ２２．９−ｘｉ  Ｆａｂ断片がペプシンとのインキュベーションにより生成され、精製５４アミノ酸残基ＢＣＭＡ細胞外ドメインと組み合わせられた。単離複合体が結晶化試験に使用され、Ｊ２２．９−ｘｉ  ＢＣＭＡ結合エピトープが詳細に分析された（国際公開第２０１４／０６８０７９号パンフレット、国際公開第２０１５／１６６０７３号パンフレット、Ｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００５０】
これらの分析に基づき、完全ヒト化遺伝子カセットの種々の組合せが同定され、全長抗体として発現された。Ｊ２２．９−Ｈは、Ｊ２２．９−ｘｉの完全ヒト化バージョンである。Ｊ２２．９−ＩＳＹおよびＪ２２．９−ＦＳＹは、潜在的に有害な翻訳後修飾（ＰＴＭ）モチーフを除去することを意図される追加の突然変異を含有する完全ヒト化バージョンである。
【００５１】
Ｊ２２．９−ｘｉは精製ＢＣＭＡに結合し、ヒトＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＰＭ−２およびＲＰＭＩ−８２２６上のＢＣＭＡも検出する。結合は、ＢＣＭＡ陰性細胞上では検出されなかった。さらに、フローサイトメトリー分析により、Ｊ２２．９−ｘｉを使用してＭＭ患者の骨髄からの細胞が検出可能であることが明らかになった。ＢＣＭＡに対するＪ２２．９−ｘｉの親和性は極めて高く、平均Ｋｄはプラズモン共鳴を使用して決定して５４ｐＭである（Ｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００５２】
ＢＣＭＡは核因子κＢ（ＮＦκＢ）経路を活性化させ、ＡＰＲＩＬおよび／またはＢＡＦＦとの相互作用を介してＭＭおよび形質細胞の生存に重要なシグナルをトリガーする。ＢＣＭＡに対するＪ２２．９の親和性は極めて高いことが示され、Ａｐｒｉｌの親和性を３００倍だけ、およびＢＡＦＦの親和性を３０，０００倍だけ超過する（Ｂｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２００６）。Ｊ２２．９−ｘｉは、ＢＣＭＡへのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの結合を効率的に遮断する。さらに、Ｊ２２．９−ｘｉは、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）のリン酸化および後続のＩκＢα分解を遮断することによりＡＰＲＩＬ誘導ＮＦκＢ活性化を妨害し、ＮＦκＢの低減したＤＮＡ結合活性をもたらす。まとめると、Ｊ２２．９−ｘｉは、ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞中でＡＰＲＩＬ誘導ＮＦκＢ活性化を妨害する（Ｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００５３】
ＩｇＧ１抗体の細胞毒性活性は、ＩｇＧ１と、エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との、または補体カスケードのＣ１ｑタンパク質との相互作用を介して達成される。この相互作用は、重鎖定常領域中のＡｓｎ２９７位における抗体のグリコシル化に依存的である。ＩｇＧ１上のグリカンはいくらかの不均一性を示すが、コア構造は、通常、アンテナにおける変動レベルのシアル酸を有するフコシル化二分岐構造である。多数の調査は、グリコシル化が結合親和性に影響し、グリコシル化の損失が結合を最終的に完全に停止させることを示している。グリコシル化の不存在は、Ｆｃγ受容体への最適な結合に要求されるＦｃ領域の構造的統合性を破壊する（概要についてはＨａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４参照）。しかしながら、ＩｇＧのコアフコースの不存在は、Ｆｃγ受容体への改善された結合および向上した抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をもたらす。
【００５４】
エフェクター細胞または補体への抗体の結合は、ナチュラルキラー細胞により媒介されるＡＤＣＣまたは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす。Ｊ２２．９−ｘｉは、健常ドナーからの単離Ｆｃ担持エフェクター末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と混合した場合、ＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｓ細胞に対する強力なＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導し得る。
【００５５】
ヒト化およびキメラ抗体バリアントは、ＢＣＭＡ発現細胞株に結合する。Ｊ２２．９−ＩＳＹおよびＪ２２．９−ＦＳＹについて結合特徴の差は観察されなかった一方、ヒト化バリアントＪ２２．９−Ｈの結合親和性はかなり低かった。
【００５６】
本発明に関して、用語「純度」は、存在するコンジュゲートの総量を指す。例えば、９０％超の純度は、本発明のコンジュゲートを含む１ｍｇの組成物中に、９０％超、すなわち、９００μｇ超のそのようなコンジュゲートが存在することを意味する。残りの部分、すなわち、不純物としては、未反応出発材料ならびに他の反応物質、溶媒、開裂産物および／または副生物を挙げることができる。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートを含む組成物は、１００ｍｇ超のそのようなコンジュゲートを含む。したがって、従来技術のコンジュゲートの複雑な調製において、例えば、天然存在のスルホキシドの部分的還元からほぼ必ず存在し得る微量の本発明のコンジュゲートは、明示的に除外される。
【００５８】
本明細書において使用される第１の化合物（例えば、抗体）は第２の化合物（例えば、抗原、例えば、標的タンパク質）に、それが１００μＭ以下、特定すると５０μＭ以下、特定すると３０μＭ以下、特定すると２０μＭ以下、特定すると１０μＭ以下、特定すると５μＭ以下、より特定すると１μＭ以下、より特定すると９００ｎＭ以下、より特定すると８００ｎＭ以下、より特定すると７００ｎＭ以下、より特定すると６００ｎＭ以下、より特定すると５００ｎＭ以下、より特定すると４００ｎＭ以下、より特定すると３００ｎＭ以下、より特定すると２００ｎＭ以下、いっそうより特定すると１００ｎＭ以下、いっそうより特定すると９０ｎＭ以下、いっそうより特定すると８０ｎＭ以下、いっそうより特定すると７０ｎＭ以下、いっそうより特定すると６０ｎＭ以下、いっそうより特定すると５０ｎＭ以下、いっそうより特定すると４０ｎＭ以下、いっそうより特定すると３０ｎＭ以下、いっそうより特定すると２０ｎＭ以下、いっそうより特定すると１０ｎＭ以下の前記第２の化合物に対する解離定数ＫDを有する場合、「特異的に結合する」とみなされる。
【００５９】
本明細書において使用される用語「抗体またはその抗原結合断片」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原ＢＳＭＡへ免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。したがって、用語「その抗原結合断片」は、少なくとも機能的抗原結合ドメインを含む抗体の断片を指す。特定の実施形態において、機能的抗原結合ドメインは、抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖の可変ドメインを含む。技術、例として、例えば、抗原ＢＳＭＡに特異的に結合するファージディスプレイを介して選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。本発明における使用に好適な「抗体およびその抗原結合断片」としては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異的、ヘテロコンジュゲート、多重特異的、ヒト、ヒト化（特にＣＤＲグラフト化）、脱免疫化、またはキメラ抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、ダイアボディまたはテトラボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０（１９９３）６４４４−８）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例として、例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。
【００６０】
一部の実施態様において、抗原結合断片は、本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、それとしては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片が挙げられる。抗原結合抗体断片、例として、単鎖抗体は、可変ドメインを単独で、または以下：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部もしくは一部との組合せで含み得る。可変ドメインとヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組合せも含む抗原結合断片も本発明に含まれる。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含む。
【００６１】
本発明において使用可能な抗体は、任意の動物起源、例として、鳥類および哺乳動物からのものであり得る。特に抗体は、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、またはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、またはイヌ起源からのものである。抗体は、ヒトまたはネズミ起源であることが特に好ましい。本明細書において使用される「ヒト抗体」としては、例えば、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓの米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載のとおり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、ヒト免疫グロブリンライブラリーからもしくは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体および内在性免疫グロブリンを発現しない抗体が挙げられる。
【００６２】
第２の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【００６３】
第３の態様において、本発明は、患者における癌の治療における使用のための、本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬組成物であって、特に、癌が、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、特に多発性骨髄腫からなる群から選択されるコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。
【００６４】
本明細書において使用される、疾患または障害を「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」またはその「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、以下の１つ以上を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度を軽減すること；（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発症を制限または予防すること；（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）障害に既に罹患した患者における障害の再発を制限または予防すること；および（ｅ）障害の症状を既に示した患者における症状の再発を制限または予防すること。
【００６５】
本明細書において使用される治療は、本発明によるコンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与することを含み得、「投与すること」としては、インビボ投与、およびエクスビボでの、例えば、静脈移植片での組織への直接的投与が挙げられる。
【００６６】
特定の実施形態において、治療有効量の本発明のコンジュゲートが使用される。
【００６７】
「治療有効量」は、意図される目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、要因、例えば、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受容する動物のサイズおよび種、ならびに投与目的により変動する。それぞれの個々の症例における有効量は、当分野において確立された方法に従って当業者が経験的に決定することができる。
【００６８】
別の態様において、本発明は、本発明によるアマトキシン、またはアマトキシンと標的結合部分との本発明のコンジュゲートを含み、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、および／または保存剤をさらに含む医薬組成物に関する。
【００６９】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されていること、または米国薬局方、もしくは動物、より特定するとヒトにおける使用のための他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【００７０】
特定の実施態様において、医薬組成物は、全身投与される医薬品の形態で使用される。これとしては、とりわけ注射剤および注入剤を含む非経口剤が挙げられる。注射剤は、アンプルの形態で、またはいわゆる調製済み注射剤、例えば、調製済み注射器または使い捨ての注射器として、およびこれに加えて複数回の抜取りのための穿刺用フラスコ中で配合される。注射剤の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態であり得る。特に、それぞれ好適な注射配合物を、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子またはコロイド分散系、例えば、ヒドロゾルとして製造することが可能である。
【００７１】
注射用配合物はさらに、水性等張希釈剤により溶解または分散させることができる濃縮物として製造することができる。注入剤は、等張溶液、脂肪エマルション、リポソーム配合物およびマイクロエマルションの形態で調製することもできる。注射剤と同様、注入配合物は、希釈用濃縮物の形態で調製することもできる。注射用配合物は、例えば、ミニポンプによる入院療法および通院療法の両方における持続性注入剤の形態で適用することもできる。
【００７２】
非経口薬物配合物に、例えば、アルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調節物質、錯体形成物質もしくはポリマー物質を、特にタンパク質もしくはポリマーへの本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの吸着に影響を与えるための物質として添加することが可能であり、または材料、例えば、注射機器もしくは包装用材料、例えば、プラスチックもしくはガラスへの本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの吸着を低減させる目的で、それらを添加することもできる。
【００７３】
標的結合部分を含む本発明のアマトキシンは、非経口剤におけるマイクロ担体またはナノ粒子に、例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸またはポリエーテルウレタンベースの微細分散粒子などに結合させることができる。非経口配合物は、例えば、本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートをそれぞれ微細分散、分散および懸濁形態で、もしくは医薬品中の結晶の懸濁液として導入する場合には「複数単位原理（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｕｎｉｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」に基づき、または本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートを続いて植込される配合物中に、例えば、錠剤もしくはロッド剤（ｒｏｄ）中に封入する場合には「単一単位原理（ｓｉｎｇｌｅ  ｕｎｉｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」に基づき、デポー製剤として改変することもできる。単一単位および複数単位配合物のこれらの植込剤またはデポー医薬品は、いわゆる生分解性ポリマー、例えば、乳酸およびグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレートまたは多糖などからなることが多い。
【００７４】
非経口剤として配合される本発明の医薬組成物の製造の間に添加される補助剤および担体は、特に、滅菌水（Ａｑｕａ  ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ）、ｐＨ値調節物質、例えば、有機または無機の酸または塩基およびそれらの塩など、ｐＨ値調整用の緩衝物質、等張化用物質、例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなど、それぞれテンシド（ｔｅｎｓｉｄｅ）および界面活性剤、ならびに乳化剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、もしくは例えば、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））など、脂肪油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油もしくはヒマシ油など、脂肪酸の合成エステル、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび中性油（例えば、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））など、ならびにポリマー補助剤、例えば、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンなど、有機溶媒の溶解度を増加させる添加剤、例えば、プロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど、または錯体形成物質、例えば、シトレートおよび尿素など、保存剤、例えば、安息香酸ヒドロキシプロピルエステルおよびメチルエステル、ベンジルアルコールなど、酸化防止剤、例えば、亜硫酸ナトリウムなど、ならびに安定剤、例えば、ＥＤＴＡなどである。
【００７５】
好ましい実施態様において懸濁液として本発明の医薬組成物を配合する場合、本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの状況を防止するための増粘剤、または堆積物の再懸濁性を確保するためのテンシドおよび多価電解質ならびに／または錯体形成剤、例えば、ＥＤＴＡなどを添加する。活性成分と種々のポリマーとの複合体を得ることも可能である。このようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）またはポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルである。本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートは、包接化合物の形態で、例えば、シクロデキストリンとともに液体配合物中に取り込むこともできる。特定の実施態様において、分散剤を追加の補助剤として添加することができる。凍結乾燥物の製造のため、足場剤、例えば、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰまたは種々のゼラチンを使用することができる。
【実施例】
【００７６】
以下において、非限定的な実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００７７】
実施例１：アマトキシン−リンカーＨＤＰ３０．２１１５の合成
毒素への抗体の結合は、抗体のシステインまたはリジン残基、特異的タグまたは非天然アミノ酸のいずれかに対して生じ得る。２の規定のＤＡＲを有する均一なＡＤＣ産物を得るため、遺伝子操作チオｍａｂとの組合せのシステインへの部位特異的コンジュゲーションが好ましい。リンカーの重要な性質としては、循環中への毒性ペイロードの無秩序な放出を防止するために血漿中で安定である要求が挙げられ、他方では、毒素は、標的結合時にＡＤＣの内在化後に細胞内で放出されることを必要とする。標的細胞内側での毒素の放出は、開裂性または非開裂性リンカーのいずれかを介して生じ得る。開裂性リンカーは、種々の機序、例として、循環と比較して細胞内側の低いｐＨの結果としての酸性分解およびプロテアーゼカテプシンＢによるプロテアーゼ開裂またはより還元性の細胞内環境に起因するチオール−ジスルフィド交換を介してペイロードから開裂させることができる。非開裂性リンカーは、抗体からの荷電リジンまたはシステイン残基を有するペイロードを生成する完全なリソソームタンパク質分解を要求する。
【００７８】
開裂性リンカーと比較した非開裂性リンカーの主な利点は、その増加した血漿安定性である。非開裂性リンカーを含有するＡＤＣの活性が予測しにくいことが明らかである一方、開裂性リンカーは非特異的細胞毒性の懸念を生じさせる。
【００７９】
しかしながら、多数の様々なリンカーを用いた事前の実験において、特にインビトロ実験において、非開裂性リンカーを含有するＡＤＣは、開裂性リンカーを有するＡＤＣよりも毒性が低く、開裂性リンカーをベースとするアマニチンベースＡＤＣの大多数が、非開裂性リンカー構築物と比較して有効であったことが示されている。したがって、カテプシンＢ開裂性リンカーを薬物物質に選択した。
【００８０】
α−アマニンアミド−リンカー−毒素ＨＤＰ３０．２１１５を、固相ペプチド合成を使用する多ステップアプローチにより合成する一方、最初に二環式オクタペプチドを直鎖状に構築する。出発点は、ヒドロキシプロリン樹脂固定化と、それに続くジヒドロキシイソロイシンのＣ末端カップリングである（ＨＤＰ３０．０４７７）。残りの６つのアミノ酸をＦｍｏｃ方針によりカップリングさせる。最初の環化（右側の環）は、「Ｓａｖｉｇｅ−Ｆｏｎｔａｎａ」機序の後に樹脂からの酸性開裂時に生じる。これを起こすため、トリプトファンをその酸化形態「ＨＰＩ」（ＨＤＰ３０．００７９）中に最後のアミノ酸として取り込む。第２の環は、中程度から高程度の希釈を使用してマクロラクタム化により形成する。リンカー化合物（ＨＤＰ３０．２１０９）は、６つのリニアステップで合成し、最後に標準的カップリング条件下で脱保護後に導入する。
【００８１】
１．合成ジデオキシ前駆体分子Ｋの合成
ジデオキシ前駆体分子Ｋの合成は、国際公開第２０１４／００９０２５号パンフレットの実施例５．５に記載されている。
【化３】
2020504736.tif 000005
【００８２】
化合物Ｋは、７Ｎのメタノール性ＮＨ3溶液（３．０ｍｌ）による処理および一晩の撹拌により脱保護することができる。
【００８３】
２．合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ３０．２１０５の合成
アミノ酸１におけるカルボキサミド基に代えて−ＣＯＯＨ基を含む代替ジデオキシ前駆体分子を合成し（ＨＤＰ３０．１８９５）、脱保護してＨＤＰ３０．２１０５をもたらすことができる。
【化４】
2020504736.tif 000006
【００８４】
ステップ１：４−ヒドロキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（ＨＤＰ３０．００１３）
【化５】
2020504736.tif 000007
ＦｍｏｃＨｙｐＯＨ（１０．０ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの８０％のＭｅＯＨ中で懸濁させ、Ｃｓ２ＣＯ３（４．６ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を完全に溶解するまで５０℃において３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮乾固させ、１００ｍｌのＤＭＦ中で溶解させた。臭化アリル（１．６ｍｌ、３．６ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）を滴加し、反応物をＲＴにおいて一晩撹拌した。ＤＭＦを留去し、残留物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中で溶解させた。沈殿物を濾過し、澄明溶液をカラムクロマトグラフィー前にＣｅｌｉｔｅ上で吸収させた。化合物を、２２０ｇのシリカゲル上でｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配を用いて精製した。
収量：１１．５ｇ、１００％
【００８５】
ステップ２：樹脂負荷（ＨＤＰ３０．０４００）
【化６】
2020504736.tif 000008
ＨＤＰ３０．００１３（５．０ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）、ピリジニウム４−トルエンスルホネート（１．３３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−メトキシメチル樹脂（５．０ｇ、１．０ｍｍｏｌ／ｇのＴＨＰ樹脂）の４０ｍｌのジクロロエタン中懸濁液に添加した。反応物を８０℃において一晩撹拌した。冷却後、樹脂を濾過し、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにより十分に洗浄した。
【００８６】
負荷は、０．６２ｍｍｏｌ／ｇであった（脱保護後のフルオレンメチル基のＵＶ分光分析により決定）。
【００８７】
ステップ３：固相前駆体合成（ＨＤＰ３０．１８９４）
【化７】
2020504736.tif 000009
【００８８】
樹脂前処理：
ＨＤＰ３０．０４００（０．５ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸（４８３ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（６９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）により処理した。樹脂をＲＴにおいて一晩振盪させた。その後、樹脂をジクロロメタン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにより十分に洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【００８９】
カップリング手順：
全ての反応物質および試薬を、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有するジクロロメタン／Ｎ−メチル−２−ピロリドン（溶媒Ａ）中で溶解させた。
【００９０】
ＨＤＰ３０．０４７７（２５７ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を３．０ｍｌの溶媒Ａ中で溶解させ、３．０ｍｌの０．２Ｎ溶液ＰｙＢＯＰ（３３３ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．０当量）、３．０ｍｌの０．２Ｎ溶液ＨＯＢｔ（１３０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．０当量）および４３９μｌのＤＩＥＡ（４．０当量）により処理した。反応物をマイクロ波照射（２０Ｗ、ＣＥＭマイクロ波反応器）により５０℃において８分間加熱し、カップリング後にＮ−メチル−２−ピロリドンにより洗浄した。
【００９１】
脱保護：
脱保護は、６．０ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドン中２０％のピペリジンを５０℃において８分間添加することにより実施した。樹脂をＮ−メチル−２−ピロリドンにより洗浄した（注：最後のアミノ酸のカップリング後の脱保護なし）。
【００９２】
全ての他のアミノ酸を上記プロトコル後にカップリングさせ、重量を以下に示す：
０．６３ｍｍｏｌ、４９８ｍｇのＦｍｏｃ  Ａｓｐ（ＯＡｌｌ）ＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、７３８ｍｇのＦｍｏｃ  Ｃｙｓ（Ｔｒｉ）ＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、３７５ｍｇのＦｍｏｃ  ＧｌｙＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、４４５ｍｇのＦｍｏｃ  ＩｌｅＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、３７５ｍｇのＦｍｏｃ  ＧｌｙＯＨ
０．３８ｍｍｏｌ、２４２ｍｇのＮ−Ｂｏｃ−ＨＰＩＯＨ（ＨＤＰ３０．００７９）
【００９３】
４，５−ジアセトキシ−２−アミノ−３−メチル−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；塩酸塩（ＨＤＰ３０．０４７７）を、国際公開第２０１４／００９０２５号パンフレットに記載のとおり合成した。
【００９４】
Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＰＩＯＨ（ＨＤＰ３０．００７９）を、Ｚａｎｏｔｔｉ，Ｇｉａｎｃａｒｌｏ；Ｂｉｒｒ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ；Ｗｉｅｌａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（１９８１）１６２−８に従って調製した。
【００９５】
ステップ４：ＨＤＰ３０．１８９５
【化８】
2020504736.tif 000010
【００９６】
樹脂からの脱離およびＢ環形成
樹脂を、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン５０：５０（ｖ／ｖ）と１０％のメタノールと３０分間振盪させ、最後に５０ｍｌのフラスコ中に溶出させた。樹脂をメタノールにより２回洗浄した（それぞれ１０ｍｌ）。合わせた溶出物を真空中で濃縮し、２〜４ｍｌのメタノール中で再懸濁させた。ペプチド沈殿のためにメタノール性溶液を５０ｍｌの冷ジエチルエーテル中に２回滴下させた。遠心分離後、沈殿物をジエチルエーテルにより洗浄し（２回）、減圧下で乾燥させた。白色沈殿物を約４〜５ｍｌのメタノール（１００ｍｇ当たり０．５ｍｌ）中で溶解させ、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。１ラン当たり約１００ｍｇの粗製沈殿物を精製した。分画を質量分析により分析し、合わせ、メタノールを減圧下で留去した。水相を冷凍乾燥させた。
収量：２４．４ｍｇ、２３．７μｍｏｌ
質量分析：［Ｍ＋Ｈ］+，１０３０．５
【００９７】
Ａ環形成
上記の冷凍乾燥中間体を２５ｍｌのジメチルホルムアミド中で溶解させ、ジフェニルホスホリルアジド（６３μｌ、１１８５μｍｏｌ、５当量）およびジイソプロピルエチルアミン（２０１μｌ、１１８５μｍｏｌ、５当量）により処理した。反応物を一晩撹拌した（２０時間）。変換率を逆相クロマトグラフィーによりモニタリングし、最後に１００μｌの水によりクエンチした。混合物を減圧により濃縮し、１〜２ｍｌのメタノール中で再溶解させた。生成物の沈殿を、２０ｍｌのジエチルエーテルへの滴加により実施した。沈殿物をジエチルエーテルにより２回洗浄し、減圧下で乾燥させた。次の段階をさらに精製せずに実施した。
質量分析：［Ｍ＋Ｎａ］+，１０３４．６
【００９８】
エステル脱保護：
粗製環化生成物に、２．５ｍｌのジクロロメタン、ジエチルバルビツール酸（２２．３ｍｇ、１１８．５μｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ3）4（２７ｍｇ、２３．７μｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴにおいて一晩撹拌した。反応物はＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングすることができる。完全変換後、混合物を２０ｍｌの冷却ジエチルエーテルに滴加し、沈殿物をジエチルエーテルにより２回洗浄した。減圧における乾燥後、沈殿物をメタノール（１．０ｍｌ）中で溶解させ、分取逆相クロマトグラフィーにより精製した。
収量：１５．０ｍｇ
質量分析：［Ｍ＋Ｈ］+，９７２，３；［Ｍ＋Ｎａ］+，９９４．５
【００９９】
ステップ５：ＨＤＰ３０．２１０５
【化９】
2020504736.tif 000011
ＨＤＰ３０．１８９５（１５．０ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）を７Ｎのメタノール性ＮＨ3溶液（３．０ｍｌ）中で溶解させ、一晩撹拌した。変換率を質量分析により確認した。完全変換後、反応物を真空中で濃縮し、８０％のｔｅｒｔ−ブタノール中で懸濁させ、凍結乾燥させた。生成物を分取ＨＰＬＣにより精製した。
収量：１２．１ｍｇ
質量分析：［Ｍ＋Ｈ］+，８８８，０；［Ｍ＋Ｎａ］+，９１０．２
【０１００】
３．合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ３０．２１１５の合成
【化１０】
2020504736.tif 000012
開裂性リンカーを有するチオール反応基を含むジデオキシ前駆体分子は、実施例２生成物から以下の７つのステップで合成することができる。
【０１０１】
ステップ１：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（ＨＤＰ３０．１３４３）
【化１１】
2020504736.tif 000013
この化合物をＲ．Ａ．Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅらの米国特許第６，２１４，３４５号明細書に従って調製する。０℃におけるテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（２０．２４ｇ；５９．６４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．８６ｇ＝１．０当量）を、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１２．３０ｇ；１．０当量）により処理した。混合物をＲＴにおいてアルゴン雰囲気下で６時間撹拌し、次いで固体ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）副生物を濾別し、ＴＨＦにより洗浄し、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去した。残留物を３００ｍｌのジクロロメタン中で溶解させ、氷浴中で１時間冷却し、再度濾過して追加のＤＣＵを除去した。ジクロロメタンを蒸発させ、固体泡状物（２６．５１ｇ）を次のステップにおいてさらに精製せずに使用した。
【０１０２】
ステップ２：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ（ＨＤＰ３０．１４１４）
【化１２】
2020504736.tif 000014
ステップ２生成物を、Ｐ．Ｗ．Ｈｏｗａｒｄらの米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書と同様に調製する。Ｌ−アラニン（５．５８ｇ；１．０５当量）および炭酸水素ナトリウム（５．５１ｇ；１．１当量）の１５０ｍｌの水中溶液を調製し、ＨＤＰ３０．１３４３（２６．５１ｇ；最大５９．６ｍｍｏｌ）の２２５ｍｌのテトラヒドロフラン中溶液に添加した。混合物をＲＴにおいて５０時間撹拌した。出発材料の消費後、溶液を２４０ｍｌの０．２Ｍのクエン酸および２００ｍｌの酢酸エチル間で分別した。水層を分離し、酢酸エチル（３×２００ｍｌ）により抽出した。合わせた有機層を水およびブライン（それぞれ３００ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、溶媒を約２００ｍｌに蒸発させた。この時に純粋生成物が沈殿し、それを濾別した。母液を蒸発乾固させ、残留物を１００ｍｌのＭＴＢＥと１時間撹拌して追加の結晶性材料をもたらした。２つの生成物の収穫物を、１８．０１ｇ（７４％）の白色粉末（ｍ．ｐ．：２０３〜２０７℃）に合わせた。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）［Ｍ＋Ｎａ］+実測値：４１０．９４；計算値：４１１．１９（Ｃ23Ｈ27Ｎ2Ｏ5）
［Ｍ＋Ｎａ］+実測値：４３３．１４；計算値：４３３．１７（Ｃ23Ｈ27Ｎ2Ｏ5）
［２Ｍ＋Ｈ］+実測値：８４２．７０；計算値：８４３．３６（Ｃ46Ｈ52Ｎ4ＮａＯ10）
【０１０３】
ステップ３：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨＢｏｃ（ＨＤＰ３０．１７１３）
【化１３】
2020504736.tif 000015
ステップ２生成物ＨＤＰ３０．１４１４（１．７６ｇ；４．２８ｍｍｏｌ）および４−［（Ｎ−Ｂｏｃ）アミノメチル］アニリン（１．００ｇ；１．０５当量）を、２６ｍｌの無水テトラヒドロフラン中で溶解させた。２−エトキシ−Ｎ−（エトキシカルボニル）−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ１．１１ｇ；１．０５当量）を添加し、混合物をＲＴにおいて撹拌し、光から保護した。反応の進行とともに、最初に澄明な溶液からゼラチン状物質が形成される。４０時間後、反応混合物を２５ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）により希釈し、１時間撹拌した。続いて、沈殿物を吸引により濾別し、ＭＴＢＥにより洗浄し、真空中で２．３０ｇ（８５％の収率）の白色固体に乾燥させた。
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ９．８７（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７４（ｑ，Ｊ＝８．４，７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．２３（ｍ，７Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．４４（ｐ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．１７（ｍ，３Ｈ），３．９６−３．８９（ｍ，１Ｈ），２．０１（ｈｅｐｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １７０．８４，１７０．７６，１５６．０４，１５５．６３，１４３．７７，１４３．６９，１４０．６０，１３７．４１，１３４．９９，１２７．５０，１２７．２６，１２６．９３，１２５．２２，１１９．９５，１１８．９７，７７．６０，６５．６２，５９．９５，４８．８６，４６．６２，４２．９３，３０．２８，２８．１６，１９．０６，１８．１０，１８．０３．
【０１０４】
ステップ４：Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨＢｏｃ（ＨＤＰ３０．１７４７）
【化１４】
2020504736.tif 000016
ステップ３化合物ＨＤＰ３０．１７１３（１．２３０ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌのフラスコ中に装入し、４０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で溶解させた。ジエチルアミン（７．５ｍｌ）を添加し、混合物をＲＴにおいて撹拌した。反応物をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／ＨＯＡｃ９０：８：２）によりモニタリングした。出発材料の消費（３０分）後、揮発物を蒸発させ、残留物を４０ｍｌの新鮮ＤＭＦと同時蒸発させて微量のジエチルアミンを除去した。粗製生成物を次のステップにさらに精製せずに使用した。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）［ＭＨ］+実測値：３９３．２６；計算値：３９３．２５（Ｃ20Ｈ33Ｎ4Ｏ4）
［Ｍ＋Ｎａ］+実測値：４１５．３５；計算値：４１５．２３（Ｃ20Ｈ32Ｎ4ＮａＯ4）
［２Ｍ＋Ｈ］+実測値：７８５．３７；計算値：７８５．４９（Ｃ40Ｈ65Ｎ8Ｏ8）
【０１０５】
ステップ５：ＢＭＰ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨＢｏｃ（ＨＤＰ３０．２１０８）
【化１５】
2020504736.tif 000017
粗製ステップ４生成物ＨＤＰ３０．１７４７（最大２．００ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦ中で溶解させ、３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ５３２ｍｇ；１．０当量）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（５１０μｌ、１．５当量）を添加し、混合物をＲＴにおいて３時間撹拌した。出発材料ＨＤＰ３０．１７４７（ＴＬＣ：クロロホルム／メタノール／ＨＯＡｃ９０：８：２）の消費後、揮発物を蒸発させ、残留物を微細懸濁液が形成されるまで（１時間）５０ｍｌのＭＴＢＥと撹拌する。沈殿物を吸引により濾別し、ＭＴＢＥにより洗浄し、乾燥させた。粗製生成物（１．１０ｇ）を２０ｍｌのジクロロメタン／メタノール１：１中で溶解させ、珪藻土（１５ｇ）を添加し、溶媒をストリッピング除去した。固体材料を８０ｇのシリカゲルカラムの頂部上に装入し、ジクロロメタン中０〜１０％のメタノールの線形勾配により溶出させた。生成物分画を合わせ、７９３ｍｇ（２つのステップにわたり７３％）のアモルファス固体に蒸発させた。
ＭＳ（ＥＳＩ+）［Ｍ＋Ｎａ］+実測値：５６６．２４；計算値：５６６．２６（Ｃ27Ｈ37Ｎ5ＮａＯ7）
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ９．７５（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２９−７．２３（ｍ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），４．３９（ｐ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝８．４，６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６７−３．５６（ｍ，２Ｈ），２．４９−２．４１（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １７０．８０，１７０．６３，１７０．６０，１６９．７２，１５５．６５，１３７．４５，１３４．９４，１３４．４４，１２７．２６，１１８．９５，７７．６２，５７．７１，４８．９２，４２．９５，３３．９６，３３．６４，３０．１７，２８．１７，１９．０２，１８．０６，１７．８２．
【０１０６】
ステップ６：ＢＭＰ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨ2（ＨＤＰ３０．２１０９）
【化１６】
2020504736.tif 000018
ステップ５生成物ＨＤＰ３０．２１０８（４００ｍｇ、７３６μｍｏｌ）を４，０００μｌのトリフルオロ酢酸中で溶解させ、２分間撹拌した。続いて、揮発物をＲＴにおいて蒸発させ、残部を４，０００μｌのトルエンと２回同時蒸発させた。残留物を５，０００μｌの１，４−ジオキサン／水４：１中で溶解させ、液体窒素中で凝固させ、冷凍乾燥させた：４１０ｍｇ（定量的）の無色粉末。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）［Ｍ＋Ｎａ］+実測値：４１５．３５；計算値：４６６．２１（Ｃ22Ｈ29Ｎ5ＮａＯ5）
［２Ｍ＋Ｈ］+実測値：８８７．１３；計算値：８８７．４４（Ｃ44Ｈ59Ｎ10Ｏ10）
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ９．８９（ｓ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６６−７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．３４（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），４．３９（ｐ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝８．２，６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６９−３．５８（ｍ，２Ｈ），２．４９−２．４０（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）．
13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １７１．２４，１７０．７８，１７０．７２，１６９．８５，１５８．１２（ｑ，Ｊ＝３３．２Ｈｚ，ＴＦＡ），１５８．２５，１５７．９９，１５７．７３，１３９．１９，１３４．５３，１２９．４５，１２８．５２，１１９．０２，１１６．５７（ｑ，Ｊ＝２９６．７Ｈｚ，ＴＦＡ），５７．７８，４９．０８，４１．９０，３４．００，３３．６８，３０．２１，１９．０７，１８．１６，１７．７６．
【０１０７】
ステップ６：ＨＤＰ３０．２１１５
【化１７】
2020504736.tif 000019
ＨＤＰ３０．２１０５（１５．０ｍｇ、１６．５μｍｏｌ）を、４２９μｌのＨＤＰ３０．２１０９の０．１Ｍ溶液（２５．２μｍｏｌ、１．５当量）、４９２μｌの０．１ＭのＴＢＴＵ（２５．２μｍｏｌ、１．５当量）および４９２μｌの０．２ＭのＤＩＥＡ（４９．１μｍｏｌ、３．０当量）によりＲＴにおいて処理した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングした。完了後、反応物を１００μｌのＨ2Ｏによりクエンチし、１５分間撹拌し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ上にインジェクトした。
収量：１２．２ｍｇ、５６％
質量分析：１３１３．２［Ｍ＋Ｈ］+、１３３５．５［Ｍ＋Ｎａ］+
【０１０８】
実施例２：ＨＤＰ３０．２１０５ベースとする構築物の特性
種々の実験を実施してジ−デオキシアマニチン誘導体ＨＤＰ３０．２１０５をベースとする構築物の特性と、他のアマニチンバリアントの特性とを比較した。これらの実験の結果を図２〜１４に示す。
【０１０９】
実施例３：チオｍａｂ抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃの生成および発現
抗体とリンカーおよび毒素とのコンジュゲーションはリジンまたはシステイン残基に対して生じ、高度に変動性の薬物−抗体比（ＤＡＲ）をもたらし得る。効力および毒性はＤＡＲにより強力に影響を受けるため、予測可能なＤＡＲを有するＡＤＣの均一性およびコンパラビリティが有利である。遺伝子操作反応性システイン残基を有する抗体（チオｍａｂ）は部位特異的コンジュゲーションを可能とし、したがって、位置２６５におけるアミノ酸アスパラギン酸がシステインに交換された（Ｄ２６５Ｃ）。したがって、得られる抗体バリアントは、毒素−リンカー化合物についてのカップリング部位として機能し、ＤＡＲ＝２を有するＡＤＣの産生を可能とするＦｃ領域のそれぞれの鎖における２つの導入システインを含有する。
【０１１０】
抗体のＦｃ領域中の配列改変は、抗体媒介免疫応答と細胞エフェクター機能との結びつきにおける劇的な影響を有し得る。それというのも、Ｆｃ領域中の残基がＩｇＧ  Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を担うためである。ＩｇＧとＦｃγＲとの相互作用は、細胞エフェクター機能、例として、炎症メディエーターの放出、免疫複合体のエンドサイトーシス、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）における重要な役割を果たす。ＡＤＣにおけるこれらのエフェクター機能の保存は、ＡＤＣの抗腫瘍活性に寄与し得た。しかしながら、この仮定は不正確と証明され得た。それというのも、これらのエフェクター機能が一般に弱く、重要なことに、ＡＤＣ内在化と競合し、それらの特異的毒素関連活性を低減または停止させ、Ｆｃ受容体を介する抗原陰性細胞中のＡＤＣ取り込みに起因するオフターゲット毒性を増加させ得たためである。現在、前臨床および臨床開発中のいくつかのＡＤＣは、それらのエフェクター機能において極めて非効率であるＩｇＧ２およびＩｇＧ４をベースとする（Ｔｒａｉｌ，２０１３；Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，２０１５）。
【０１１１】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩへの、および新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのヒトＩｇＧ１上の結合部位の詳細なマッピングにより、位置２６５におけるアスパラギン酸の重要な役割が明らかになった。ＩｇＧ２およびＩｇＧ１中のアスパラギン酸の置き換えにより、ＦｃγＲとの相互作用は完全に停止した（Ｂａｕｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１１２】
トラスツズマブ（商標Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））および位置２６５（Ｄ２６５Ｃ）または対照のための位置１１８（Ｔ１１８Ｃ）におけるアミノ酸交換を有する対応するチオｍａｂ抗体における抗体誘導エフェクター機能の効率を、マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１に対して試験した。この単球細胞株は複数のＦｃγＲを発現し、抗体媒介食作用の試験を可能とする（Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。ＴＨＰ−１細胞に対する細胞毒性は、エフェクター機能を低減させない位置Ａ１１８におけるシステイン突然変異を含有するチオｍａｂ  Ａ１１８Ｃ、および非遺伝子操作抗体と比較してチオｍａｂ  Ｄ２６５Ｃについて少なくとも２桁だけ低減された。アミノ酸２６５において遺伝子操作されたチオｍａｂによる低減された細胞毒性のこの効果は、遺伝子操作システインへの毒素のコンジュゲーションに起因しない。それというのも、遺伝子操作システインにコンジュゲートしている開裂性リンカーを含有するＴ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９とは対照的に、Ｔ−Ｄ２６５Ｃ−３０．０６４３の場合、安定性リンカーが抗体のリジン残基にコンジュゲートしているためである。したがって、驚くべきことに、抗体依存性エフェクター機能がチオｍａｂ中のＤ２６５Ｃ交換に起因して高度に低減された（表１参照）。
【０１１３】
【表１】
2020504736.tif 000020
【０１１４】
Ｊ２２．９のキメラおよび配列最適化バリアントの特徴付けからの結果により、Ｊ２２．９−Ｈと比較してＢＣＭＡへの配列最適化バリアントＪ２２．９−ＩＳＹおよびＪ２２．９−ＦＳＹの改善された結合特性が明らかになり、ＩＳＹ−またはＦＳＹ−バリアントについて明確な差はなかった。Ｊ２２．９−ＩＳＹ抗体バリアントを発現するプラスミドの使用は、細胞培養物中で一過的に発現された場合に改善された力価をもたらしたため、コンジュゲーションおよびさらなる評価のためにバリアントＪ２２．９−ＩＳＹを選択した。
【０１１５】
モノクローナル抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃの重鎖についての核酸コード配列を、国際公開第２０１６／１４２０４９号パンフレットに記載のとおり、ヒト化抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹ（国際公開第２０１４／０６８０７９号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１６６０７３号パンフレット参照）の重鎖配列から得た。Ｄ２６５Ｃの交換に加え、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃは、突然変異Ｒ２１４Ｋ（配列番号１参照）をさらに含有する。
【０１１６】
アマニチン−コンジュゲートＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５を産生するため、抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃを、重鎖および軽鎖についてのプラスミドが同時形質移入されたＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で一過的に発現させた。追加のアプローチにおいて、抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃを、重鎖および軽鎖を発現するプラスミドが安定的に形質移入されたＣＨＯ細胞中で産生した。プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くゲル濾過を使用して抗体を細胞培養物上清から精製した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）から、または安定性ＣＨＯ細胞から一過的に産生された抗体は、ＢＣＭＡへの結合およびＢＣＭＡ発現細胞に対する細胞毒性においてペイロードに対して同等のコンジュゲーションである。
【０１１７】
チオｍａｂ  Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ中のアミノ酸交換が、ＢＣＭＡへの結合を妨害しなかったか否かを試験するため、ＢＣＭＡ発現細胞へのＪ２２．９−ＩＳＹおよびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃの結合を比較した。ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＭＭ．１Ｓ−Ｌｕｃ細胞への遺伝子操作チオｍａｂ  Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃの結合特性は、Ｊ２２．９−ＩＳＹ抗体と同一であった（図１５参照）。
【０１１８】
実施例４：コンジュゲートＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の合成
１０ｍｇのＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５ＣへのＨＤＰ３０．２１１５のコンジュゲーション
ＰＢＳ緩衝液中の１０ｍｇのチオｍａｂ  Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃを、ＨＤＰ３０．２１１５へのコンジュゲーションに使用する。
抗体溶液を１ｍＭのＥＤＴＡに調整する：
２ｍｌの抗体溶液（１０．０ｍｇ）＋２０μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
抗体量：１０ｍｇ＝６．８×１０-8ｍｏｌ
【０１１９】
抗体と４０当量のＴＣＥＰとの反応によるシステインのアンキャッピング：
−  ２ｍｌの抗体溶液（６．８×１０-8ｍｏｌ）＋５４．５μｌの５０ｍＭのＴＣＥＰ溶液（２．７２×１０-6ｍｏｌ）
−  シェーカー上で３７℃において３時間インキュベートする。
−  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット２０’０００ＭＷＣＯ中の２．０ｌの１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中の４℃における２回の連続透析、１回目の透析、約４時間、２回目の透析、一晩
−  Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター５０’０００ＭＷＣＯを使用して約４．０ｍｌに濃縮する。
【０１２０】
抗体と２０当量のジヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）との反応による酸化：
−  約２ｍｌの抗体溶液（６．８×１０-8ｍｏｌ）＋２７．２μｌの５０ｍＭの新鮮ｄｈＡＡ溶液（１．３６×１０-6ｍｏｌ）
−  シェーカー上でＲＴにおいて３時間インキュベートする。
【０１２１】
４当量のＨＤＰ３０．２１１５を使用するアマニチンとのコンジュゲーションおよび２５当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインによるクエンチング：
０．７ｍｇのＨＤＰ３０．２１１５を７０μｌのＤＭＳＯ中で溶解させる＝１０μｇ／μｌ
−  約２ｍｌの抗体溶液（＝９．５ｍｇ；６．５４×１０-8ｍｏｌ）＋３４．４μｌのＨＤＰ３０．２１１５（＝３４４μｇ；２．６２×１０-7ｍｏｌ）。
−  ＲＴにおいて１時間インキュベートする。
−  １６．４μｌの１００ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（１．６４×１０-6ｍｏｌ）の添加によりクエンチする。
−  ＲＴにおいて１５分間（または４℃において一晩）インキュベートする。
−  １×ＰＢＳ、ｐＨ７．４により平衡化した１×ＰＤ−１０カラムにより反応混合物を精製する。パラフィルム上でブラッドフォード試薬によりタンパク質含有分画を同定し、タンパク質含有分画を合わせる。
−  ２．０ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４およびＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット２０’０００ＭＷＣＯ中の４℃における一晩の抗体溶液の透析。
【０１２２】
ＵＶスペクトル（２８０ｎｍにおける吸収）によるタンパク質濃度の測定。
【０１２３】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−分析によるＤＡＲの測定。
【０１２４】
タンパク質濃度を５．０ｍｇ／ｍｌ（３．４×１０−５Ｍ）に調整し、濾過により滅菌条件に供する。４℃において貯蔵する。
【０１２５】
実施例５：薬物物質Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の特徴付け
１．産生および放出試験
ＨＤＰ３０．２１１５をベースとするＡＤＣバリアントを特徴付けするため、それをＨＤＰ３０．１６９９（表１参照）をベースとするバリアントと比較した。
【化１８】
2020504736.tif 000021
【０１２６】
ＨＤＰ３０．１６９９は、完全合成アマニチン誘導体ＨＤＰ３０．２１１５と対照的に天然資源からのアマニチンを含有する。化学合成に起因して、２つの化合物間に以下の差が存在する：ＨＤＰ３０．２１１５はチオエーテル架橋およびコアトリプトファン部分を含有する一方、ＨＤＰ３０．１６９９はスルホキシド架橋および６−ヒドロキシトリプトファン部分を含有する。６−ヒドロキシトリプトファンが結合に使用されるＨＤＰ３０．１６９９とは対照的に、ＨＤＰ３０．２１１５中の６−ヒドロキシトリプトファンの不存在はアスパラギン酸への抗体の結合を要求する。両方の化合物において、カテプシンＢ開裂性リンカーを使用した。
【０１２７】
抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃを、化合物ＨＤＰ３０．１６９９およびＨＤＰ３０．２１１５に上記のマレイミド化学反応を使用してコンジュゲートさせ、分析ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにおいて凝集物、ＤＡＲおよび産物品質について試験した。
【０１２８】
Ｂ１６−００４０およびＢ１６−００４９からの試験結果を図１６に例示的に提示する。
【０１２９】
Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９の安定性を、ＰＢＳ、ヒト、カニクイザルまたはマウス血漿中の３７℃における０、４、および１０日間のインキュベーション後に試験した。Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９とは対照的に、ウエスタンブロット分析により、驚くべきことに、ＰＢＳまたは血漿中のＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５についての実験のタイムコース全体にわたり特に高い安定性が明らかになった（図１７参照）。したがって、合成アマニチン誘導体を含有するＡＤＣは、天然資源からのアマニチンを有するＡＤＣと比較して優れた安定性を示した。
【０１３０】
両方のＡＤＣバリアントの血漿安定性を、ＰＢＳ、ヒト、カニクイザルまたはマウス血漿中の０、４および１０日間のインキュベーション後にＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（表２参照）に対して細胞ベース細胞毒性アッセイにおいて確認した。最大１０日間にわたるＰＢＳまたは血漿中のインキュベーションは、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の細胞毒性潜在性に対する影響をほぼ有さない。対照的に、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９の細胞毒性およびしたがって安定性は、ウエスタンブロット分析において既に観察されたとおり、ヒト、カニクイザルまたはマウス血漿中のインキュベーション後に明らかに低減された（図１８参照）。
【０１３１】
【表２】
2020504736.tif 000022
【０１３２】
両方のＡＤＣの細胞毒性潜在性を、５つのＢＣＭＡ陽性ＭＭ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ、ＭＭ．１Ｓ、Ｕ２６６Ｂ１、およびＯＰＭ−２）および１つのＢＣＭＡ陰性対照細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）に対して試験した。両方のＡＤＣは、ピコモル濃度範囲内の高い細胞毒性活性を示し、一部の細胞株に対してＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９の毒性がわずかに優れている。Ｊ２２．９−ＡＤＣの細胞毒性は、細胞表面上のＢＣＭＡ発現レベルに強力に依存的であり、非ＢＣＭＡ発現対照細胞中で毒性は観察されない。さらに、両方のアマニチン−ＡＤＣを用いると、ＯＰＭ−２細胞に対する低いＥＣ50値は、不十分なＢＣＭＡ発現と相関する（表３／図１９および表４／図２０参照）。
【０１３３】
【表３】
2020504736.tif 000023
【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
実施例６：多発性骨髄腫ゼノグラフトモデルにおけるインビボ薬理学的活性
１．皮下ゼノグラフトモデル
単一投与
Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９の抗腫瘍活性を、皮下ＮＣＩ−Ｈ９２９（細胞株の詳細については表３参照）マウスゼノグラフトモデルにおいて試験した。
【０１３６】
２ｍｇ／ｋｇの用量による単一処理は、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９について８匹中７匹のマウスおよびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５についての８匹中６匹のマウスの初期応答とそれに続く腫瘍の再成長をもたらした。４ｍｇ／ｋｇの用量において、完全な腫瘍寛解は、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９について８匹中８匹のマウスおよびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５について８匹中７匹のマウスで達成され、マウスは、１００日間超、無腫瘍のままであった（実験のタイムコース）。２ｍｇ／ｋｇの用量において、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５は、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９と比較してわずかに優れた抗腫瘍効力を示した。４ｍｇ／ｋｇの用量におけるＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９を除き統計的に有意な体重低減は、観察されなかった（図２１参照）。
【０１３７】
反復投与
薬物物質Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の効力を、皮下ＮＣＩ−Ｈ９２９ゼノグラフトモデルにおける反復用量設定においてさらに評価した。上記の単一用量適用と比較して、用量を１、０．５および０．２５ｍｇ／ｋｇに低減させ、週１回（１×／週）、２週間に１回（１×／２週間）または３週間に１回（１×／３週間）のいずれかで適用した。１ｍｇ／ｋｇの反復適用用量が既に腫瘍退縮をもたらし、反復２ｍｇ／ｋｇ投与を用いると完全な腫瘍寛解を観察することができた（図２２参照）。
【０１３８】
２．静脈内ゼノグラフトモデル
単一投与
Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の抗腫瘍活性を、２および４ｍｇ／ｋｇの用量における播種静脈内ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデルにおいてさらに試験した。両方の化合物は、極めて有効で同等の抗腫瘍活性を示し、完全な腫瘍寛解は１００日間超であった（図２３Ａ参照）。両方の化合物について１０匹中１匹のマウスのみが、９０日間超の初期応答後の腫瘍のわずかな再成長を示した（図２３Ｂ参照）。
【０１３９】
播種ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデルにおいて、薬物物質Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の用量を１、０．３および０．１ｍｇ／ｋｇの単一用量適用にさらに低減させた。既に０．３ｍｇ／ｋｇの単一用量適用が完全な腫瘍根絶をもたらした（図２４参照）。
【０１４０】
実施例７：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）忍容性試験
Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５およびＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９を、カニクイザルにおける用量漸増忍容性試験について評価した。３匹の動物の群に、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．１６９９を１日目（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２２日目（１ｍｇ／ｋｇ）、および４４日目（３ｍｇ／ｋｇ）に、またはＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５を１日目（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２１日目（１ｍｇ／ｋｇ）、および４２、６４、８４、１０６日目（それぞれの時点で３ｍｇ／ｋｇ）に注射した。動物を、生化学的および血液学的血液パラメータ（図２５参照）、尿分析、体重、摂餌量、臨床兆候ならびに死亡率について経時的にモニタリングした。さらに、薬物動態試験のために血液試料を回収した。実験の終了時、組織試料を組織病理学的試験に使用する。
【０１４１】
両方の化合物の最大３ｍｇ／ｋｇの用量は十分に忍容され、血清パラメータによる腎損傷の兆候はなく、体重および摂餌量に影響はなかった。３ｍｇ／ｋｇの用量は、増加するが一過的なレベルの肝酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）および非特異的炎症マーカーＬＤＨをもたらした。３ｍｇ／ｋｇのＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の反復投与は、肝酵素のさらなる増加もＬＤＨのさらなる増加ももたらさなかった。
【０１４２】
実施例７：モノメチルアウリスタチンＦ誘導体と比較したＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の細胞毒性潜在性
Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の細胞毒性潜在性を、２つのＢＣＭＡ陽性ＭＭ細胞株（ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃ、およびＫＭＳ−１１）に対して鎖間コンジュゲートＪ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦと比較した。両方のＡＤＣは９６時間後にピコモル濃度範囲の高い細胞毒性活性を示し、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦの毒性がわずかに優れていた（図２６Ａ参照）。両方の化合物の効力を、時系列実験において２つの細胞株に対して比較した。細胞毒性を２４、４６、７２、９６、および１２０時間後に計測した（図２６Ｂ＋２６Ｃ参照）。Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５は９６および１２０時間後に十分な細胞毒性を展開した一方、ＭＭＡＦコンジュゲートは既に４８および７２時間後に十分に膨らんだ細胞毒性潜在性を示した。これは、アマニチン誘導体がその作用方式に起因してその細胞毒性潜在性を展開するため、および細胞をアポトーシスにドライブするためにＭＭＡＦよりも長い時間を必要とすることを示す。
【０１４３】
実施例８：播種ゼノグラフトモデルにおけるＪ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の効力
Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の抗腫瘍活性を、１および４ｍｇ／ｋｇの用量において播種静脈内ＭＭ．１Ｓ  Ｌｕｃゼノグラフトモデルにおいて鎖間コンジュゲートＪ２２．９−ＩＳＹ−ＭＭＡＦと比較した。ＭＭＡＦコンジュゲートは、両方の用量において５日後に極めて速い初期応答ならびに２０および５０日後に腫瘍の再成長をそれぞれ示した。対照的に、Ｊ２２．９−ＩＳＹ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５は両方の用量において１０日後により緩慢な初期応答を示したが、５０および１００日後の腫瘍の再成長までより長い時間をそれぞれ示した（図２７参照）。したがって、アマトキシンコンジュゲートは、そのより緩慢な作用開始にかかわらず無腫瘍生存率に関してより良好な効力を示した（図２６（Ａ）〜（Ｃ）参照）。
【０１４４】
参考文献
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【０１４５】
配列：
2020504736.tif 000025
【図１】
2020504736.tif 000027
【図２】
2020504736.tif 000028
【図３】
2020504736.tif 000029
【図４】
2020504736.tif 000030
【図５】
2020504736.tif 000031
【図６】
2020504736.tif 000032
【図７】
2020504736.tif 000033
【図８】
2020504736.tif 000034
【図９】
2020504736.tif 000035
【図１０】
2020504736.tif 000036
【図１１】
2020504736.tif 000037
【図１２】
2020504736.tif 000038
【図１３】
2020504736.tif 000039
【図１４】
2020504736.tif 000040
【図１５】
2020504736.tif 000041
【図１６Ａ】
2020504736.tif 000042
【図１６Ｂ】
2020504736.tif 000043
【図１７】
2020504736.tif 000044
【図１８】
2020504736.tif 000045
【図１９】
2020504736.tif 000046
【図２０】
2020504736.tif 000047
【図２１】
2020504736.tif 000048
【図２２】
2020504736.tif 000049
【図２３Ａ】
2020504736.tif 000050
【図２３Ｂ】
2020504736.tif 000051
【図２４Ａ】
2020504736.tif 000052
【図２４Ｂ】
2020504736.tif 000053
【図２５】
2020504736.tif 000054
【図２６Ａ】
2020504736.tif 000055
【図２６Ｂ】
2020504736.tif 000056
【図２６Ｃ】
2020504736.tif 000057
【図２７】
2020504736.tif 000058
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月23日(2018.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アマトキシン；（ｂ）（ｉ）抗体Ｊ２２．９−ＩＳＹの配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖の可変ドメイン、および（ｉｉ）Ｄ２６５Ｃ突然変異を含む重鎖定常領域を含むＢＣＭＡ結合部分；ならびに（ｃ）プロテアーゼ開裂性リンカーを含む式Ｉに記載のコンジュゲートであって、前記ＢＣＭＡ結合部分が、前記抗体重鎖中の位置２６５におけるシステイン残基のチオール基を介して前記リンカーに付着しており、
前記アマトキシンが、（ｉ）６’−デオキシ位を有するアミノ酸４；および（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位を有するアミノ酸８を含むことを特徴とするコンジュゲート。
【化１】
2020504736.tif 000059
【請求項２】
前記ＢＣＭＡ結合部分が、配列番号１に記載の重鎖および配列番号２に記載の軽鎖を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ＢＣＭＡ結合部分が、ＩｇＧ１である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項５】
患者における癌の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項４に記載の医薬組成物であって、特に、前記癌が、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、特に多発性骨髄腫からなる群から選択されるコンジュゲートまたは医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020504736000001.app
【国際調査報告】
2020504736.tif 000060
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