(57)【要約】  配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）、前記ネオエピトープがローディングされた抗原提示細胞、および前記抗原提示細胞によって癌治療のためのＴ細胞を活性化する方法に関する。本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞、すなわち、樹状細胞を介して癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化および増殖を迅速で効果的に誘導することができ、このように活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けて癌または腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行または転移を予防することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープ。
【請求項２】
前記癌特異的ネオエピトープは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、β２−マイクログロブリン、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、およびＨＬＡ−ＤＯＢ遺伝子座のうちの少なくとも１つと結合親和性を示すものである、請求項１に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項３】
前記癌特異的ネオエピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２およびＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１のうちの少なくとも１つと結合親和性を示すものである、請求項１に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項４】
前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陰性癌である、請求項１に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項５】
前記癌は、配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープを発現するものである、請求項４に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項６】
前記癌は、大腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肺癌、非小細胞性肺癌、前立腺癌、胆嚢癌、胆道癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血液癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭部癌、子宮癌、直腸癌、脳腫瘍、肛門付近癌、卵管癌、子宮内膜癌腫、膣癌、陰門癌腫、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫、または脳下垂体腺腫である、請求項５に記載のＥＢＶ陰性胃癌特異的ネオエピトープ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌特異的ネオエピトープをコーディングする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターが形質感染した宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープを含む、Ｔ細胞の活性化用組成物。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞は、癌の予防または治療のためのものである、請求項１０に記載のＴ細胞の活性化用組成物。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびメモリーＴ細胞からなる群より選択された１種以上を含む、請求項１０に記載のＴ細胞の活性化用組成物。
【請求項１３】
配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープがローディングされた抗原提示細胞。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージのうちの１種以上を含む、請求項１３に記載の抗原提示細胞。
【請求項１５】
前記抗原提示細胞は、Ｔ細胞の増殖または分化を促進する、請求項１３に記載の抗原提示細胞。
【請求項１６】
配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープ；および樹状細胞特異的抗体またはその断片を含む融合タンパク質。
【請求項１７】
前記樹状細胞特異的抗体は、樹状細胞のＤＣＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、Ｃｌｅｃ９Ａ、３３Ｄ１、マンノース受容体、ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、またはＡＳＰＧＲに特異的な抗体である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープがローディングされた抗原提示細胞を製造する方法。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージのうちの１種以上を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原提示細胞は、目的の個体の末梢血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ローディングは、前記抗原提示細胞を前記癌特異的ネオエピトープと接触させて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ローディングは、前記抗原提示細胞に前記癌特異的ネオエピトープをパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）して行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ローディングは、前記癌特異的ネオエピトープをコーディングする核酸分子が挿入された発現ベクターを前記抗原提示細胞にヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）させて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ローディングは、前記癌特異的ネオエピトープ；および樹状細胞特異的抗体またはその断片を含む融合タンパク質を用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗原提示細胞によって活性化された、Ｔ細胞。
【請求項２６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗原提示細胞によってＴ細胞を活性化する方法。
【請求項２７】
前記方法は、前記Ｔ細胞を前記抗原提示細胞と共培養して行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞は、目的の個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびメモリーＴ細胞からなる群より選択された１種以上を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記共培養時、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはこれらの組み合わせを添加して行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記共培養時、サイトカインおよび兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加して行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記サイトカインは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記共培養時、ＣＤ２７、ＣＸＣＲ３、またはＣＤ６２Ｌのリガンド；および兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加して行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３５】
前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陰性癌である、請求項３４に記載の薬学組成物。
【請求項３６】
請求項２５に記載の活性化されたＴ細胞を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３７】
前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陰性癌である、請求項３６に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）、前記ネオエピトープがローディングされた抗原提示細胞、および前記抗原提示細胞によって癌治療のためのＴ細胞を活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌の発病は全世界的に、特にアジアで高い発病率を示す悪性腫瘍として知られている。胃癌の発病原因としては種々知られてきているが、代表的に、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）の感染によって現れるＥＢＶ関連性胃癌と、胃腸細胞の遺伝子変異の蓄積によって発生する胃癌細胞抗原関連性胃癌とに分類することができる。現在、胃癌に対する治療策は、長い時間の間癌組織の切開手術が最も効果的であると知られてきており、化学的療法および放射線治療も行われているが、胃癌を初期に発見できなかった場合は完治が難しい疾病とされている。また、様々な生物学的製剤（抗体、小分子）により臨床試験を進行させてきているが、まだ良い臨床的効果を示す治療剤は現れていない。
【０００３】
最近、患者由来の自己Ｔ細胞を用いた癌細胞特異的ターゲット治療方法が様々な機関で研究されてきており、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いたリンパ腫に対して様々な機関で臨床試験を進行させた結果、良好な臨床的効果と低い副作用から、抗癌治療への新たな分野として注目されてきている。
【０００４】
患者由来Ｔ細胞を用いると、細胞治療剤の最も大きな副作用である免疫反応の誘導が少なく、供与者のＨＬＡタイプに対する制限が無くなるので、効果的で副作用のない治療剤とされてきた。今のところ、抗癌治療分野で最も多く使用されている細胞治療剤の種類には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞が知られている。ＮＫ細胞の場合、細胞死滅効能を有しているが、抗原特異性がないため、様々な副作用があり、樹状細胞の場合には、直接的に細胞を死滅する機能がないのに対し、患者体内のＴ細胞に抗原特異性を伝達して高い効率でＴ細胞の癌細胞特異性を付与できるワクチン概念の治療剤である。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原特異性により他の細胞に対して補助する役割を有しており、ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、抗原特異性および細胞死滅効果が最も良い細胞として知られている。
【０００５】
しかし、今のところ使用または開発されている細胞治療剤はほとんど限界があり、臨床的な効果が現れていないのが現状である。その限界をみると、癌細胞は、人体内の免疫反応を抑制する物質を自ら分泌するか、癌細胞に対する抗体の生成に必須な抗原を提示できないため、適切な免疫反応を起こせないようにする。
【０００６】
一方、樹状細胞は、人体の外部から入ってくるか、内部で発生する抗原を検知する監視者の役割を果たすだけでなく、このように認知し吸収した抗原をもって免疫器官（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎ）に迅速に移動して抗原と反応するＴ細胞を含む免疫細胞に抗原を提示する専門的な抗原提示細胞の役割を果たす。樹状細胞を用いた抗癌免疫治療ワクチンの場合、様々な方法により開発されてきており、大きく、生体外で発生した（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）樹状細胞ワクチンと、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）樹状細胞ワクチンとに分けられる。生体内樹状細胞ワクチンの場合、体内に存在する樹状細胞に抗原を直接的に伝達する方式である。また、生体外で発生した樹状細胞ワクチン方法の場合、患者のＰＢＭＣから樹状細胞を分離し、分離された樹状細胞に提示する抗原を伝達し、これによって樹状細胞が活性化された後、さらに患者に注入し、注入された樹状細胞からＴ細胞へ抗原を伝達する方法である。この方式の場合には、生体外で樹状細胞の培養方法および抗原伝達方式が重要であり、現在使用される抗原提示方法としては、提示する抗原のＤＮＡをウイルスやヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてトランスフェクションさせるか、樹状細胞をターゲットする抗体に抗原を結合させて、樹状細胞をターゲットとする抗原を伝達することが用いられている。
【０００７】
現在、樹状細胞ワクチンの最も大きな問題点としては、体内の激しい慢性炎症現象、ワールブルク効果（Ｗａｒｂｕｒｇ  ｅｆｆｅｃｔ）、免疫抑制サイトカイン、免疫抑制Ｔ細胞および樹状細胞などが存在する癌の微細環境中で効果的な抗癌兔疫細胞の活性化が極めて困難とされているという点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの目的は、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陰性癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）とこれを含むＴ細胞活性化用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、本発明のネオエピトープがローディングされたもので、癌治療のためのＴ細胞を活性化させることができる抗原提示細胞を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、本発明のネオエピトープがローディングされた抗原提示細胞によって活性化されたＴ細胞を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、癌治療のためにＴ細胞を活性化する方法を提供することである。
【００１２】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は以上に述べた課題に制限されず、述べていないさらに他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一実施形態によれば、癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に関する。
【００１４】
本発明において、前記「癌特異的エピトープ」は、癌細胞にのみ存在し、正常細胞には存在しない突然変異タンパク質抗原に由来するものである。本発明において、前記癌特異的エピトープは、Ｔ細胞受容体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含むもので、好ましくは、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陰性癌で癌遺伝子の変異によって現れる自己癌抗原のネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）であってもよい。
【００１５】
本発明において、前記「ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、正常な非癌細胞または生殖細胞のようなレファレンスでは存在しないが、癌細胞では発見されるエピトープを指す。ここでは特に、正常な非癌細胞または生殖細胞では対応するエピトープが発見されるが、癌細胞での１以上の突然変異によって、エピトープの配列が変化してネオエピトープが生じる状況も含まれる。ネオエピトープに関連して、ネオエピトープは、固有の腫瘍特異的抗原を生成する腫瘍細胞においてランダム突然変異を発現すると見られる。したがって、他の観点から見ると、ネオエピトープは、サイレントおよび他の非関連突然変異を除去させる第１の内容物フィルタとして作用できる突然変異の類型（例えば、欠失、挿入、転換、転移、転座）および影響（例えば、ナンセンス（ｎｏｎ−ｓｅｎｓｅ）、ミスセンス、フレーム移動など）を考慮して同定することができる。また、ネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、７〜１１ｍｅｒ）の配列伸長と定義され、ここで、このような伸長はアミノ酸配列の変化を含むことを理解しなければならない。最も典型的に、変化したアミノ酸は、中央アミノ酸位置またはその近傍にあるはずである。例えば、典型的なネオエピトープは、Ａ４−Ｎ−Ａ４、またはＡ３−Ｎ−Ａ５、またはＡ２−Ｎ−Ａ７、またはＡ５−Ｎ−Ａ３、またはＡ７−Ｎ−Ａ２の構造を有することができ、ここで、Ａは、タンパク質生成アミノ酸であり、Ｎは、変化したアミノ酸（野生型またはマッチングされた正常群に対して）である。例えば、本願で考慮されるネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、５〜３０ｍｅｒ、より典型的に７〜１１ｍｅｒまたは１２〜２５ｍｅｒ）の配列伸長を含み、ここで、このような伸長はアミノ酸配列の変化を含む。したがって、単一アミノ酸の変化が、変化したアミノ酸の位置によって、変化したアミノ酸を含む多数のネオエピトープ配列に提示できることを理解しなければならない。有利には、このような配列可変性は、ネオエピトープの多重選択を可能にして、１つ以上の好ましい形質（例えば、患者ＨＬＡ−類型に対する最も高い親和度、最も高い構造的安定性など）に基づいて選択可能な潜在的に有用な標的の数を増加させる。最も典型的に、このようなネオエピトープは、２〜５０個のアミノ酸、より典型的には５〜３０個のアミノ酸、最も典型的には９〜１５個のアミノ酸の長さを有するように計算され、変化したアミノ酸は、好ましくは、中央に位置するか、そうでなければ、ＭＨＣとの結合を向上させる方式で位置する。例えば、エピトープがＭＨＣ−Ｉ複合体によって提供される場合、典型的なネオエピトープの長さは、約８〜１１個のアミノ酸であり、ＭＨＣ−ＩＩ複合体を介して提示された典型的なネオエピトープの長さは、約１３〜１７個のアミノ酸を有するはずである。簡単に理解されるように、ネオエピトープでの変化したアミノ酸の位置は中心ではないため、実際にペプチド配列およびネオエピトープの実際の位相は大きく異なり得る。
【００１６】
本発明において、前記ネオエピトープとしては、ヒトの血液から抽出されたＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）が効能を有し得るように、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、β２−マイクログロブリン、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、およびＨＬＡ−ＤＯＢ遺伝子座のうちの少なくとも１つと結合親和性を示すことができる。なかでも、韓国人にとって最も多く発現しているＨＬＡタイプとして、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８０１、およびＨＬＡ−Ｂ＊３５０１のうちの少なくとも１つ、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１と高い結合親和性を示すものであってもよい。
【００１７】
好ましくは、本発明において、前記ネオエピトープとしては、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に対して高い結合親和性を有するもので、配列番号１〜４９のうちのいずれか１つで表されるネオエピトープであってもよく；またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対して高い結合親和性を有するもので、配列番号５０〜２１４のうちのいずれか１つで表されるネオエピトープであってもよい。
【００１８】
ただし、本発明において、前記ネオエピトープ−ＨＬＡ親和度を測定する方法としては、ネオエピトープが特定のＨＬＡ対立形質に結合するかを予測するためにＮｅｔＭＨＣ３．４（URL:www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.4/）を用いることができるが、これに制限されるわけではない。
【００１９】
本発明において、前記「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」は、免疫系の調節の原因になる細胞の表面上でＭＨＣ（主組織適合性複合体）タンパク質を暗号化するヒト遺伝子を表す。「ＨＬＡ−Ｉ」または「ＨＬＡクラスＩ」は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびβ２−マイクログロブリン遺伝子座を含むヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子を表す。「ＨＬＡ−ＩＩ」または「ＨＬＡクラスＩＩ」は、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、およびＨＬＡ−ＤＯＢ遺伝子座を含むヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を表す。
【００２０】
本発明において、前記癌としては、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陰性癌で、本発明の配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表されるネオエピトープを発現する癌腫であれば制限なく含まれ、その種類を特に制限しないが、例えば、大腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肺癌、非小細胞性肺癌、前立腺癌、胆嚢癌、胆道癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血液癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭部癌、子宮癌、直腸癌、脳腫瘍、肛門付近癌、ラッパ管癌腫、子宮内膜癌腫、膣癌、陰門癌腫、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫、または脳下垂体腺腫であってもよく、好ましくは、胃癌であってもよい。
【００２１】
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）で、好ましくは、配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表されるエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陰性癌抗原のネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）をコードする核酸分子に関する。
【００２２】
本発明の核酸分子は、本発明で提供するポリペプチドのアミノ酸配列を、当業者に知られているように、ポリヌクレオチド配列に翻訳した、核酸分子のすべてを含む。そのため、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）による多様なポリヌクレオチド配列が製造可能であり、これもすべて本発明の核酸分子に含まれる。
【００２３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
【００２４】
本発明において、前記「ベクター」は、ある核酸分子が連結された他の核酸を輸送できる前記核酸分子である。ベクターの一つの類型は、追加的なＤＮＡセグメントが結紮され得る円形の二重鎖ＤＮＡを指す「プラスミド」である。他の類型のベクターは、ファージベクターである。さらに他の類型のベクターは、ウイルス性ベクターで、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。あるベクターは、それらが流入した宿主細胞で自律的な複製を行うことができる（例えば、バクテリア性ベクターはバクテリア性複製起源を有するエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に流入しながら宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。それだけでなく、あるベクターは、これらが作動レベルで連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と名付けられる。一般的に、組換えＤＮＡ手法で有用な発現ベクターは、たびたびプラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターのうち最も通常使用される形態であるため、相互交換して使用できる。
【００２５】
本発明において、前記発現ベクターの具体的な例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムドイド（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１  Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択されるが、これに制限されるわけではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する際には、目的の宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、または電気穿孔法によって行われるが、これに限定されるものではなく、当業者は使用する発現ベクターおよび宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含有するが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物の生産有無によって選別が可能である。選別マーカーの選択は、目的の宿主細胞によって選別され、これは、すでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに制限を置かない。
【００２６】
本発明の核酸分子を精製を容易にするためにタグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、またはｆｌａｇタグを含むが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
【００２７】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記発現ベクターがトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【００２８】
本発明において、前記「宿主細胞」には、ポリペプチド挿入物の組込みのためのベクターの受取者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）であるか、受取者であった個別的な細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、前記子孫は、自然的な、偶発的なまたは故意の突然変異のため、必ずしも元の母細胞と完全に同一（形態学上またはゲノムＤＮＡ補完体において）でないことがある。宿主細胞には本願のポリペプチドで体内に形質注入された細胞が含まれる。
【００２９】
本発明において、前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類、または細胞性起源の細胞を含むことができ、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞、ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ショウジョウバエ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ＢＯＷメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、またはＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）の動物細胞；または植物細胞であってもよいが、これに制限されるわけではなく、当業者に知られた宿主細胞として使用可能な細胞はすべて利用可能である。
【００３０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、これをコーディングする核酸分子、前記核酸分子が挿入された発現ベクターまたは前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を含むＴ細胞の活性化用組成物に関する。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「Ｔ細胞の活性化」は、少なくとも１つの腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を有する、単クローン（例えば、同一のＴＣＲを暗号化する）または多クローン（例えば、相異なるＴＣＲを暗号化するクローンを有する）Ｔ細胞集団を称する。活性化されたＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびメモリーＴ細胞からなる群より選択された１種以上を含むが、これに限定されないＴ細胞の１つ以上の亜型を含有することができるが、好ましくは、メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）であってもよい。
【００３２】
本発明において、前記活性化されたＴ細胞は、癌細胞の防御機構を避けて癌または腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行または転移を予防することができる。
【００３３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣ）であってもよい。
【００３４】
本発明において、前記抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）、Ｂ細胞、およびマクロファージのうちの１種以上を含むことができるが、好ましくは、樹状細胞であってもよい。
【００３５】
本発明において、前記「樹状細胞」は、リンパ性または非リンパ性組織で発見される形態学的に類似する細胞類型の多様な集団の構成員である。このような細胞は、これらの独特の形態、および抗原ペプチドをＴ細胞に提示するタンパク質である表面クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の高い発現水準を特徴とする。ＤＣ、他のＡＰＣおよびＴ細胞は、末梢血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のように、都合的には末梢血液から、そして多数の組織供給源から単離されるか、由来（例えば、分化）できる。
【００３６】
本発明において、前記抗原提示細胞は、癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化および増殖を誘導することで癌細胞の防御機序を避けて癌または腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行または転移を予防することができる。
【００３７】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）；および樹状細胞特異的抗体またはその断片を含む融合タンパク質に関する。
【００３８】
本発明で提供する融合タンパク質は、樹状細胞に本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングできるようにする。
【００３９】
本発明において、前記樹状細胞特異的抗体としては、樹状細胞のＤＣＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、Ｃｌｅｃ９Ａ、３３Ｄ１、マンノース受容体（ｍａｎｎｏｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、またはＡＳＰＧＲに特異的な抗体であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００４０】
本発明の融合タンパク質において、前記癌特異的エピトープは、前記樹状細胞特異的抗体またはその断片にコンジュゲートされたものであってもよい。ここで、前記「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、２つの部分を一緒に結合させて形成された任意の物質をいう。本発明に係る代表的な接合体は、抗原と抗体およびＴＬＲ効能剤を一緒に結合させて形成されたものを含む。用語「コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」は、接合体を形成する工程をいい、一般的に、物理的カップリング、例えば、共有結合、同時−配位共有結合、または第２結合力、例えば、ファンデルワールス結合力（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）をいう。抗原を抗体に連結させる工程はさらに、ドックリン−コヘシン会合（ｄｏｃｋｅｒｉｎ−ｃｏｈｅｓｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のような非共有結合性会合［（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）らの米国特許公報第２０１００１３５９９４号、本願に参照として引用された部分に関連する］により、またはペプチドまたは化学的結合を形成することで直接的な化学的連結によって行われる。
【００４１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）がローディングされた抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣ）を製造する方法に関する。
【００４２】
本発明において、前記抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージのうちの１種以上を含むことができるが、好ましくは、樹状細胞であってもよい。
【００４３】
本発明において、前記樹状細胞（例えば、未成熟樹状細胞）は、自己供給源、すなわち、目的の個体由来を含む多様な供給源から得ることができ、好ましくは、末梢血液由来の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）から得られ、より好ましくは、個体由来ＰＢＭＣから単核球を分離して複数のサイトカインと接触させることで得られる。ここで、前記単核球の樹状細胞への分化を誘導するサイトカインの種類は特に制限しないが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のうちの１種以上を含むことができる。
【００４４】
本発明において、前記「目的の個体」とは、癌が発病したか、発病の可能性が高い個体を意味する。
【００４５】
本発明において、前記のように抗原提示細胞が用意されると、前記抗原提示細胞に本発明の癌特異的エピトープをローディングすることができる。一般的に、未成熟樹状細胞は、食作用や受容体を介した細胞内取込み（エンドサイトーシス）により抗原を捕獲して、細胞内の一連の過程により抗原を加工後、ＭＨＣに抗原ペプチドを積載してＴリンパ球に提示する。抗原を加工する過程とともに、樹状細胞は次第に成熟して食作用と細胞内取込みに使用される受容体を失い、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩ、補助刺激分子、細胞癒着分子の発現が増加し、新たなケモカイン受容体を発現して周辺リンパ節のＴリンパ球が豊かな地域に移動してＴリンパ球に抗原を提示することにより、Ｔリンパ球免疫反応を起こす。
【００４６】
本発明の一例として、前記癌特異的エピトープを前記抗原提示細胞にローディングするためには、前記抗原提示細胞を本発明の癌特異的エピトープと接触させることができ、好ましくは、前記抗原提示細胞として、例えば、未成熟樹状細胞、またはＰＢＭＣに含まれるか、これに由来する（例えば、分化した）抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）に本発明の前記癌特異的エピトープをパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）するステップを行うことができる。本技術分野で知られているように、パルシングは、細胞、例えば、樹状細胞を、抗原ペプチドを含有する溶液と混合し、次いで、任意に混合物から抗原ペプチドを除去する工程を称する。本発明では、前記未成熟樹状細胞を癌特異的エピトープと接触させる時、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体作用剤を処理して未成熟樹状細胞の集団の成熟を追加的に誘導することができる。この時、例示的なＴＬＲ作用剤には、Ｐｏｌｙ  ＩＣ、ＭＡＬＰ、およびＲ８４８が含まれるが、これに限定されない。
【００４７】
本発明の他の例として、前記癌特異的エピトープを前記抗原提示細胞にローディングするためには、前記癌特異的エピトープをコードする核酸分子が挿入された発現ベクター、好ましくは、プラスミドで前記抗原提示細胞をヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）させることができる。ここで、前記ヌクレオフェクションの際、例えば、Ａｍａｘａ（登録商標）ヌクレオフェクションシステムまたはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ヌクレオフェクションシステムを含む、本分野における何らかの有用な手段によって発生することができる。
【００４８】
本発明のさらに他の例示として、前記癌特異的エピトープを前記抗原提示細胞にローディングするためには、本発明で提供する前記癌特異的エピトープ；および樹状細胞特異的抗体またはその断片を含む融合タンパク質を用いて行われる。
【００４９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗原提示細胞によって活性化されたＴ細胞に関する。
【００５０】
本発明において、前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を有する、単クローン（例えば、同一のＴＣＲを暗号化する）または多クローン（例えば、相異なるＴＣＲを暗号化するクローンを有する）Ｔ細胞集団を称するもので、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびメモリーＴ細胞からなる群より選択された１種以上を含むことができ、これに限定されないＴ細胞の１つ以上の亜型を含有することができるが、好ましくは、メモリーＴ細胞であってもよい。
【００５１】
本発明において、前記「メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」は、これらの特異的抗原と前に遭遇して反応したＴ細胞または活性化されたＴ細胞から分化したＴ細胞である。腫瘍特異的メモリーＴ細胞は、Ｔ細胞総量の小さい部分を構成するが、これらは、個人の全体寿命の間に腫瘍細胞の監視に重要な機能を行う。腫瘍特異的メモリーＴ細胞がこれらの特定腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に遭遇すれば、メモリーＴ細胞は直ちに活性化されてクローン拡張（ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ）する。活性化され増殖されたＴ細胞は、エフェクターＴ細胞に分化して、高効率で腫瘍細胞を殺す。メモリーＴ細胞は、Ｔ細胞の臓器腫瘍抗原特異的反応を確立し維持するのに重要である。本発明において、活性化されたＴ細胞、好ましくは、活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の抗原を特異的に認識して、癌細胞の防御機序を避けて癌または腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行または転移を予防することができる。
【００５２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗原提示細胞によってＴ細胞を活性化する方法に関する。
【００５３】
本発明では、前記Ｔ細胞の活性化のためには、前記Ｔ細胞を本発明の癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞と共培養することができる。
【００５４】
本発明において、前記Ｔ細胞は、自己供給源、すなわち、目的の個体由来を含む多様な供給源から得ることができ、好ましくは、末梢血液由来の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）から得られ、より好ましくは、前記末梢血単核細胞の非付着性部分から得ることができる。本発明の一例として、前記ＰＢＭＣの非付着性部分を末梢血液サンプルの密度勾配遠心分離によって得ることができ、これを抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）があるかなしで、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と一緒に培養して得ることができる。
【００５５】
本発明において、前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を有する、単クローン（例えば、同一のＴＣＲを暗号化する）または多クローン（例えば、相異なるＴＣＲを暗号化するクローンを有する）Ｔ細胞集団を称するもので、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、およびメモリーＴ細胞からなる群より選択された１種以上を含むことができ、これに限定されないＴ細胞の１つ以上の亜型を含有することができるが、好ましくは、メモリーＴ細胞であってもよい。
【００５６】
また、本発明において、前記Ｔ細胞および前記抗原提示細胞は、同一の個体、例えば、癌に苦しめられている個体（例えば、低等級から中間等級の癌）に由来できるが、これに制限されるわけではない。
【００５７】
本発明において、前記Ｔ細胞の活性化のために、前記Ｔ細胞は、本発明の抗原提示細胞と１、２、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０日間のうちのいずれか１つ以上の間に共培養され、好ましくは、１日〜２１日、１日〜１４日、２日〜１０日、２日〜５日、２日〜５日、３日、５日、７日、１０日、１４日、１６日、１８日、または２１日間共同培養されるが、これに制限されるわけではない。
【００５８】
本発明において、前記Ｔ細胞と本発明の抗原提示細胞の共培養時、１種以上のサイトカインを添加してＴ細胞の活性化、成熟および／または増殖を促進し、後のメモリーＴ細胞への分化のためにＴ細胞をプライミングすることができる。このようなステップで使用できる例示的なサイトカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはこれらの組み合わせなどが含まれるが、これに限定されない。
【００５９】
また、本発明では、前記Ｔ細胞と本発明の抗原提示細胞の共培養時、サイトカインおよび兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加してＴ細胞の活性化、成熟および／または増殖を促進し、後のメモリーＴ細胞への分化のためにＴ細胞をプライミングすることができる。ここで、前記サイトカインとしては、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。また、前記兔疫グロブリン重鎖不変部は、兔疫グロブリンヒンジ部、および任意にＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメインまたはその配合物から構成された群より選択された兔疫グロブリン重鎖不変部領域であってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに、前記兔疫グロブリン重鎖不変部は、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、ＩｇＧ（Ｉｇγ）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）で、当業界で呼ばれる任意の５つの兔疫グロブリンクラスに属する兔疫グロブリンに由来できるが、好ましくは、ＩｇＧクラスに由来する兔疫グロブリン重鎖不変部であってもよい。
【００６０】
また、本発明では、前記Ｔ細胞と本発明の抗原提示細胞の共培養時、メモリーＴ細胞で高く発現する細胞表面タンパク質と結合するリガンド；および兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加してＴ細胞の活性化、成熟および／または増殖を促進し、後のメモリーＴ細胞への分化のためにＴ細胞をプライミングすることができる。ここで、前記メモリーＴ細胞で高く発現する細胞表面タンパク質としては、ＣＤ２７、ＣＸＣＲ３、またはＣＤ６２Ｌであってもよい。前記ＣＤ２７に結合可能なリガンドとしては、ＣＤ７０であってもよく、ＣＸＣＲ３に結合可能なリガンドは、ＣＸＣＲ９またはＣＸＣＲ１０であってもよいし、前記ＣＤ６２Ｌに結合可能なリガンドは、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、ＭａｄＣＡＭ−１、またはＰＳＧＬ−１であってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに、前記兔疫グロブリン重鎖不変部は、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、ＩｇＧ（Ｉｇγ）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）で、当業界で呼ばれる任意の５つの兔疫グロブリンクラスに属する兔疫グロブリンに由来できるが、好ましくは、ＩｇＧクラスに由来する兔疫グロブリン重鎖不変部であってもよい。
【００６１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞を有効成分として含む免疫治療剤に関する。本発明に係る免疫治療剤は、免疫反応を増加させるか、特定疾病で、例えば、癌の治療または予防に好ましい免疫反応の一部を選択的に上昇させることができる。
【００６２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞；および／または活性化されたＴ細胞を有効成分として含む抗癌ワクチン、癌の予防または治療用薬学組成物に関する。
【００６３】
本発明で提供する前記抗原提示細胞は、癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化および増殖を誘導することができ、このように活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けて癌または腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行または転移を予防することができる。
【００６４】
本発明において、前記「癌」は、哺乳類で典型的に調節されない細胞成長で特徴づけられた生理的状態を示すか、指す。本発明において、予防、改善または治療の対象になる癌は、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陰性癌で、本発明の配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表されるネオエピトープを発現する癌腫であれば制限なく含まれ、その種類を特に制限しないが、例えば、大腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非咽頭癌、肺癌、非小細胞性肺癌、前立腺癌、胆嚢癌、胆道癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血液癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭部癌、子宮癌、直腸癌、脳腫瘍、肛門付近癌、卵管癌、子宮内膜癌腫、膣癌、陰門癌腫、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫、または脳下垂体腺腫などであってもよいし、好ましくは、胃癌であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００６５】
本発明において、「予防」は、本発明の薬学組成物を用いて癌の症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させるあらゆる行為であれば制限なく含むことができる。
【００６６】
また、本発明において、「治療」は、本発明の薬学組成物を用いて癌の症状が好転するか、有利になるあらゆる行為であれば制限なく含むことができる。
【００６７】
本発明において、前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末、または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。
【００６８】
本発明において、前記薬学組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【００６９】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、または鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。
【００７０】
本発明において、前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。
【００７１】
本発明において、前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内、および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与される。
【００７２】
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合、および予防または治療される特定疾患の重度を含む様々な要因によって多様に変化することができ、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択可能であり、１日０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化される。
【００７３】
本発明の他の実施形態によれば、癌を予防または治療するために、目的の個体に本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞；および／または活性化されたＴ細胞を投与するステップを含む、癌の予防または治療方法に関する。
【００７４】
本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞または活性化されたＴ細胞の投与量、スケジュール、および投与経路は、個体の大きさおよび条件によって、そして標準薬学的慣行によって決定可能である。例示的な投与経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、血管内、筋肉内、器官内、皮下、眼内、脊髄腔内、または経皮を含む。
【００７５】
個体に投与される細胞の用量は、例えば、投与される細胞の特定類型、投与経路、および治療される癌の特定類型と病期によって異なる。前記量は、激しい毒性または有害な事例なしに、癌に対する治療反応のような所望の反応をもたらすのに十分でなければならない。一部の実施形態において、投与される活性化されたＴ細胞または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の量は、治療的有効量である。一部の実施形態において、細胞（例えば、癌特異的エピトープがローディングされた樹状細胞または活性化されたＴ細胞）の量は、治療前の同一の個体での相応する腫瘍の大きさ、癌細胞の数または腫瘍の成長速度と比較して、または治療を受けていない他の個体での相応する活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％のうちのいずれか１つの分だけ腫瘍の大きさを減少させるか、癌細胞の数を減少させるか、腫瘍の成長速度を減少させるのに十分な量である。精製された酵素を用いた試験管内検定、細胞ベース検定、動物モデル、または人体実験のような標準方法を用いて効果の規模を測定することができる。
【００７６】
本発明の一実施形態において、本発明の癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜２×１０６、２×１０６〜３×１０６、３×１０６〜４×１０６、４×１０６〜５×１０６、５×１０６〜６×１０６、６×１０６〜７×１０６、７×１０６〜８×１０６、８×１０６〜１×１０８、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜７×１０６、２×１０６〜４×１０６、１×１０６〜５×１０６、または５×１０６〜１×１０７個のうちのいずれか１つの細胞／個体の投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００７７】
本発明の他の実施形態において、本発明の癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は、１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜２×１０５、２×１０５〜４×１０５、４×１０５〜６×１０５、６×１０５〜８×１０５、８×１０５〜１×１０６、１×１０６〜２×１０６、２×１０６〜１×１０７、１×１０４〜１×１０５、１×１０５〜１×１０６、１×１０６〜１×１０７、１×１０４〜１×１０６、または１×１０５〜１×１０７個のうちのいずれか１つの細胞／ｋｇの投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００７８】
また、本発明の一実施形態において、本発明の活性化されたＴ細胞は、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜９×１０８、９×１０８〜１×１０９、１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜３×１０９、３×１０９〜４×１０９、４×１０９〜５×１０９、５×１０９〜６×１０９、６×１０９〜１×１０１０、１×１０９〜３×１０９、３×１０９〜５×１０９、５×１０９〜７×１０９、７×１０９〜１×１０１０、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、３×１０９〜７×１０９、１×１０１０〜１．５×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、または１×１０９〜１×１０１０個のうちのいずれか１つの細胞／個体の投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００７９】
本発明の他の実施形態において、本発明の活性化されたＴ細胞は、１×１０７〜１×１０８、１×１０８〜２×１０８、２×１０８〜４×１０８、４×１０８〜６×１０８、６×１０８〜８×１０８、８×１０８〜１×１０９、１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜４×１０９、４×１０９〜１×１０１０、２×１０８〜６×１０８、６×１０８〜１×１０９、１×１０８〜２×１０８、２×１０８〜２×１０９、１×１０７〜１×１０８、１×１０８〜１×１０９、１×１０９〜１×１０１０、または１×１０７〜１×１０９個のうちのいずれか１つの細胞／ｋｇの投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００８０】
本発明において、前記癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）および／または活性化されたＴ細胞の投与時、ヒトアルブミンのような安定化剤または賦形剤がともに使用できる。
【００８１】
本発明において、前記癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）および／または活性化されたＴ細胞の投与量および投与スケジュールは、投与する医師の判断に基づいて治療過程にわたって調整可能である。一部の実施形態において、活性化されたＴ細胞は、前記癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞が投与され、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、または１ヶ月後に投与されるか、前記抗原提示細胞と同時に投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００８２】
本発明において、前記癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）および／または活性化されたＴ細胞の投与時、単独でまたは他の療法、例えば、手術、放射線治療、遺伝子治療、免疫治療、骨髄移植、幹細胞移植、ホルモン療法、標的治療、冷凍療法、超音波治療、光線力学療法、化学療法などとともに行われる。追加的に、増殖性疾患が発病する危険がより大きい人は疾患の発病を抑制および／または遅延するための治療を受けることができる。
【発明の効果】
【００８３】
本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞、すなわち、樹状細胞を介して癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化および増殖を迅速で効果的に誘導することができ、このように活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けて癌または腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行または転移を予防することができる。
【００８４】
かつて養子（ａｄｏｐｔｉｖｅ）Ｔ細胞治療において、癌患者治療のために多数のＴ細胞を生産するために３〜６ヶ月の長時間がかかり、免疫細胞治療における細胞生産工程で大きな問題点があった。しかし、本発明による場合、患者の治療に使用しなければならない１０９の自己メモリーＴ細胞を３週以内に生産することができ、費用節減および外部汚染源に対する感染危険要素を最小化することができる。したがって、本発明による場合、より多くの固形癌患者に迅速な治療的接近が可能で、末期癌患者にも適用可能な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の一実施例により作製されたＥＢＶ陰性胃癌特異的自己メモリーＴ細胞（ＨＬＡ−Ａ２４０２）の抗原特異性を確認するために、ＩＦＮｒ  ＥＬＩＳＰＯＴによりＥＢＶ陰性胃癌抗原のネオエピトープ（１０ｍｅｒ）がローディングされた樹状細胞で刺激したＴ細胞、刺激のない対照群細胞のうちＩＦＮｒを分泌する細胞の比率を確認した結果を示すものである。
【図２】本発明の一実施例により作製されたＥＢＶ陰性胃癌特異的自己メモリーＴ細胞（ＨＬＡ−Ａ２４０２）の抗原特異性を確認するために、ＩＦＮｒ  ＥＬＩＳＰＯＴによりＥＢＶ陰性胃癌抗原のネオエピトープ（１０ｍｅｒ）がローディングされた樹状細胞で刺激したＴ細胞、刺激のない対照群細胞のうちＩＦＮｒを分泌する細胞の比率を確認した結果を示すものである。
【図３】本発明の一実施例により作製されたＥＢＶ陰性胃癌特異的自己メモリーＴ細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１）の抗原特異性を確認するために、ＩＦＮｒ  ＥＬＩＳＰＯＴによりＥＢＶ陰性胃癌抗原のネオエピトープ（１０ｍｅｒ）がローディングされた樹状細胞で刺激したＴ細胞、刺激のない対照群細胞のうちＩＦＮｒを分泌する細胞の比率を確認した結果を示すものである。
【図４】本発明の一実施例により作製されたＥＢＶ陰性胃癌特異的自己メモリーＴ細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１）の抗原特異性を確認するために、ＩＦＮｒ  ＥＬＩＳＰＯＴによりＥＢＶ陰性胃癌抗原のネオエピトープ（１０ｍｅｒ）がローディングされた樹状細胞で刺激したＴ細胞、刺激のない対照群細胞のうちＩＦＮｒを分泌する細胞の比率を確認した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明の一実施形態によれば、配列番号１〜２１４のうちのいずれか１つで表されるエプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陰性癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）に関する。
【００８７】
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する前記癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣ）に関する。
【００８８】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）によって活性化されたＴ細胞に関する。
【００８９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープがローディングされた抗原提示細胞；および／または活性化されたＴ細胞を有効成分として含む抗癌ワクチン、または癌の予防または治療用薬学組成物に関する。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００９１】
［実施例１］ＥＢＶ陰性胃癌細胞に特異的な自己メモリーＴ細胞の作製方法および臨床的適用
１．ＥＢＶ陰性胃癌細胞抗原ネオエピトープの選別
胃癌細胞で遺伝子変異が蓄積された最も主なシーケンスを予測し、このシーケンスがＴ細胞のＨＬＡに結合するエピトープを予測するアルゴリズムは、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅを利用して開発した。この時、ネオエピトープ予測アルゴリズムには、韓国人にとって最も多く発現しているＨＬＡタイプ（ＨＬＡ−Ａ２４０２、Ａ０２０１）と結合親和性が高いと予想されるペプチドシーケンスを発掘した。このために、現在、ＴＣＧＡに存在するすべてのＥＢＶ陰性胃癌患者の全エキソームシーケンシングとＲＮＡｓｅｑデータ分析によりｍＲＮＡに発現するミスセンス変異を予測した。各ＨＬＡタイプと発掘されたネオエピトープとの結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣから得られたＩＣ５０値（ｎＭ）と、ＮｅｔＣＴＬｐａｎから得られたＭＨＣ−ペプチド結合の順位ベース予測値（ｒａｎｋ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）をすべて考慮し、追加的に、タンパク質切断、ＴＣＲ接触残基でアミノ酸の疎水性、アミノ酸の極性および荷電値と、分子サイズおよびペプチドのエントロピーをすべて考慮してＮｅｏｐｅｐｓｅｅの最終スコアが算定され、これによって、最終的に癌特異的ネオ−抗原の可能性を予測してネオエピトープを発掘した。
【００９２】
下記表１〜６は、韓国人にとって最も多く発現すると知られたＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する患者のＲＮＡｓｅｑデータを分析して、ネオエピトープと予想されるシーケンスとシーケンスを発現する当該遺伝子、そして正常シーケンスを示し、本シーケンスとＨＬＡとの結合親和性を予測して、実際に細胞治療剤を作製する時に使用可能なネオエピトープの種類を予測する表である。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
【表２】
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【００９５】
【表３】
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【００９６】
【表４】
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【００９７】
【表５】
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【００９８】
【表６】
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【００９９】
前記表１〜３から明らかなように、インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測により、ＨＬＡ−Ａ２４０２に対して高い結合親和性を有するネオエピトープとして、ＡＹＮＳＩＳＳＥＶＩ（配列番号４５）（ＩＣ５０＝２７４ｎＭ）、ＴＹＱＮＤＮＫＰＥＦ（配列番号４２）（ＩＣ５０＝１８７ｎＭ）、ＦＦＹＰＣＨＰＤＶＦ（配列番号４９）（ＩＣ５０＝４３６ｎＭ）、ＶＹＮＭＰＳＴＰＳＦ（配列番号３２）（ＩＣ５０＝３８ｎＭ）、ＲＹＬＧＰＴＤＷＱＬ（配列番号４１）（ＩＣ５０＝１５９ｎＭ）、ＬＭＶＩＧＩＰＦＦＦ（配列番号４８）（ＩＣ５０＝４０４ｎＭ）を選定した。
【０１００】
また、表４〜６から明らかなように、ＨＬＡ−Ａ０２０１に対して高い結合親和性を有するネオエピトープとしては、ＭＬＩＤＶＬＬＩＧＶ（配列番号１２２）（ＩＣ５０＝４ｎＭ）、ＭＭＤＲＱＭＬＰＰＶ（配列番号１２３）（ＩＣ５０＝６ｎＭ）、ＬＭＷＶＣＡＬＧＨＬ（配列番号１７３）（ＩＣ５０＝１２０ｎＭ）、ＧＩＶＤＩＦＬＳＦＬ（配列番号１７４）（ＩＣ５０＝１２５ｎＭ）、ＡＶＦＶＩＣＷＴＰＩ（配列番号２１３）（ＩＣ５０＝４４８ｎＭ）、ＴＬＲＶＬＬＩＶＧＶ（配列番号２１４）（ＩＣ５０＝４５７ｎＭ）を選定した。
【０１０１】
以下の実験のために前記のように選別したネオエピトープを、作製されたＭＨＣ−ペプチドマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）（８、９、１０ｍｅｒ）で合成した。これを用いて患者由来のＴ細胞のうちこれを認知できる細胞を抽出し、この後、ＥＢＶ陰性胃癌細胞抗原特異的自己メモリーＴ細胞を作製した。
【０１０２】
２．選別されたネオエピトープがローディングされた樹状細胞で活性化されたＴ細胞のＥＬＩＳＰＯＴ結果
健康なヒトの血液から抽出したＰＢＭＣをフローサイトメトリーにより単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）と白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）に分離して、単核球は樹状細胞に分化させるために、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４サイトカインを培養液に入れて、２日間培養した。また、白血球の場合、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８抗体とともに３日間培養し、この後、ＩＬ−２サイトカインをともに入れた培養液で培養した。樹状細胞に分化した単核球に、前記のように選別したネオエピトープペプチドをエレクトロポレーション法で樹状細胞に導入した。この後、５日間培養して、樹状細胞の表面で前記ネオエピトープが発現することを確認した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体が含まれた培養液で培養している白血球とともに１：２０（樹状細胞：白血球）の比率で共培養した。共培養時、培養液には樹状細胞の抗原提示機能の効能を増加させるサイトカインであるＩＬ−４と、Ｔ細胞のメモリー細胞への転換を補助する機能をするサイトカインであるＩＬ−２とＩＬ−７をともに入れたサイトカインカクテルを混ぜて培養した。１６時間後、このように活性化されたＴ細胞のＩＦＮ−γの発現程度をＥＬＩＳＰＯＴで測定して、その結果を図１〜４に示した。７２時間共同培養した後、樹状細胞を介して抗原が提示されたメモリーＴ細胞を選び出すために、ＩＦＮｒサイトカインを分泌するＴ細胞を抽出できる磁石を用いた細胞抽出機（ＭＡＣＳ）を用いてＥＢＶ抗原特異的メモリーＴ細胞を抽出した。抽出されたメモリーＴ細胞は、メモリー機能を維持し、細胞の数を増加させるために、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５サイトカインが混合された培養液で培養して、マウスに注入可能な細胞数に到達するまで培養した。ただし、対照群としては、刺激のないＥＢＶ陽性胃癌ペプチド（ＨＬＡ−Ａ３１０１）を導入した細胞を使用した。
【０１０３】
その結果、Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅにより予測されたネオエピトープペプチドがローディングされた樹状細胞とともに培養されたＴ細胞において、前記ペプチドのＨＬＡに対する結合親和性と関係なく、対照群に比べてＩＦＮｒの分泌がはるかに多いことを確認することができた。
【０１０４】
これによって、本発明において、前記表１〜６で、ＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−Ａ０２０１に対して高い結合親和性を有するネオエピトープがローディングされた樹状細胞によって細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＣＴＬｓ）を活性化させることができ、このように活性化されたＴ細胞は、新抗原であるネオエピトープを認知できる抗原特異性を有することが分かった。
【０１０５】
以上、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、そのため、本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義されるというべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、癌特異的ネオエピトープ、前記ネオエピトープがローディングされた抗原提示細胞、および前記抗原提示細胞によって癌治療のためのＴ細胞を活性化する方法に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020532957.tif 000049
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