(57)【要約】  生物学的製品製造におけるタンパク質配列変異体を検出するため及びタンパク質配列変異体を生成する確率を評価するための方法が開示される。
2020505931.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞を分析する方法であって、
ａ）複数の細胞を培養して、生成物を含む馴化培地(conditioned media)を作製するステップであって、該複数の細胞の少なくとも１つの細胞が、該生成物をコードする核酸配列を含み、該生成物が、第１のアミノ酸配列を含む、該ステップと；
ｂ）該生成物を含む該馴化培地からのポリペプチドの第１の試料を、第１の配列ベースの反応に供して、第１の反応生成物を提供するステップと；
ｃ）該第１の反応生成物に対する値を参照値と比較し、該比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｄ）該生成物を含む該馴化培地からのポリペプチドの第２の試料を、第２の配列ベースの反応に供して、第２の反応生成物を提供するステップと；
ｅ）該第２の反応生成物に対する値を参照値と比較し、該比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｆ）場合により、生成物を含む該馴化培地からのポリペプチドの第３の試料を、第３の配列ベースの反応に供して、第３の反応生成物を提供するステップと；
ｇ）場合により、該第３の反応生成物に対する値を参照値と比較し、該比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと、
ｈ）ｃ）の結果並びに場合によりｅ）及びｇ）の結果に応じて、該第１のアミノ酸配列以外の配列が該複数の細胞に存在するか否かを決定するステップと
を含み、
それによって、複数の細胞を分析する、該方法。
【請求項２】
前記複数の細胞を培養して、生成物を含む第２の馴化培地を作製するステップと；該第２の馴化培地でステップｂ〜ｈを実施するステップとをさらに含み；
場合により、該複数の細胞を培養して、生成物を含む第３の馴化培地を作製するステップと；該第３の馴化培地でステップｂ〜ｈを実施するステップとをさらに含み；
場合により、該複数の細胞を培養して、生成物を含む後続の馴化培地、例えば、第Ｎ［ここでＮ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である］の馴化培地を作製するステップと；該後続の馴化培地、例えば、第Ｎの馴化培地において、ステップｂ〜ｈを実施するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料がアリコートである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記複数の馴化培養培地、前記馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地が、前記生成物の産生の異なる段階で産生され；又は
（ｉｉ）前記複数の馴化培養培地、前記馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地が、前記複数の細胞の培養における異なる時点で産生される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｉ）ｈ）において馴化培養培地、該馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地の１つに対して為された前記決定と
ｉｉ）ｈ）において馴化培養培地、該馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地の別の１つに関して為された前記決定と
を比較するステップを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第２の複数の細胞にステップａ〜ｈを実施するステップを含む、該第２の複数の細胞を分析するステップをさらに含み、
場合により、第３の複数の細胞にステップａ〜ｈを実施するステップを含む、該第３の複数の細胞を分析するステップをさらに含み、
場合により、後続の複数の細胞、例えば、第Ｎ［ここでＮ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である］の複数の細胞にステップａ〜ｈを実施するステップを含む、該後続の複数の細胞、例えば、第Ｎの複数の細胞を分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｉ）ｈ）において前記複数の細胞、前記第２、第３、又は後続の複数の細胞、例えば、第Ｎの複数の細胞の１つに関して為された前記決定と、
ｉｉ）ｈ）において該複数の細胞、第２、第３、又は後続の複数の細胞、例えば、第Ｎの複数の細胞の別の１つに関して為された前記決定と
を比較するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各複数の細胞が、同じタイプの細胞を含むか、該複数の細胞の１つ又は複数、例えばそれぞれが、異なるタイプの細胞を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記比較に応じて、前記第１のアミノ酸配列を含む生成物を産生するために複数の細胞を選択するステップを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列が、表１〜４から選択されるタンパク質生成物に対応する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｂ）、ｄ）、及び場合によりｆ）が、前記ポリペプチドの試料を変性させるステップを含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記精製されたタンパク質を変性させるステップが、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下及び酸性ｐＨにおいて該精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含み；又は
（ｉｉ）前記精製されたタンパク質を変性させるステップが、尿素及びデオキシコラートの存在下において該精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含み、場合により、精製されたタンパク質生成物の消化の前に、デオキシコラートを溶液から沈殿させ、場合により、（１）ｂ）の前、ｄ）の前、及び／又は場合によりｆ）の前に、該デオキシコラートを溶液から沈殿させ、又は（２）場合により前記反応生成物に分離ステップに供する前に、該デオキシコラートを溶液から沈殿させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記デオキシコラートを、酸の添加によって沈殿させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｂ）、ｄ）、及び／又は場合によりｆ）が、ＴＣＥＰによって前記精製されたタンパク質を還元するステップを含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記配列ベースの反応が、タンパク質分解酵素による消化である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、及びＡｓｐＮから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１つ又は複数のステップが、ハイスループット試料処理にとって好適な機器において実施され；場合により、１つ又は複数のステップが、９６ウェルプレートにおいて実施される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ｂ）、ｄ）、及び／又は場合によりｆ）が、場合により、ＬＣ／ＭＳを使用して前記反応生成物を分析することを含む分離ステップを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ｃ）、ｅ）、及び／又は場合によりｇ）が、前記比較によって識別された前記反応生成物の成分の前記アミノ酸配列を識別するステップを含み；場合により、該アミノ酸配列を識別するステップが、該反応生成物の前記成分にＭＳ／ＭＳを使用するステップを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
自動化されている、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ロボット設備を用いる、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
マイクロフルイディクスシステムを用いる、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ｂ）、ｄ）、及び／又は場合によりｆ）の前に、生成物を含有する前記馴化培地から該生成物を精製するステップをさらに含み、場合により、該生成物を精製するステップが、クロマトグラフィーを使用するステップを含む、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
設備からの残存する汚染を除去するための洗浄プロトコールを含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記洗浄プロトコールが、ＬＣ／ＭＳを使用してブランク試料を分析するステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記洗浄プロトコールが、酸性溶液及び高有機溶液の交互の洗浄を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記洗浄プロトコールが、複数の細胞を分析する前記方法、該複数の細胞又は該複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法と並行して実施することができる、請求項２４又は２６のどちらかに記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）前記洗浄プロトコールが、複数の細胞を分析する前記方法、該複数の細胞又は該複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法の経過時間を増加させないか；
（ｉｉ）前記洗浄プロトコールを、複数の細胞を分析する前記方法、該複数の細胞又は該複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法と並行して実施するステップが、前記方法の経過時間を少なくとも約５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮するか；又は
（ｉｉｉ）前記洗浄プロトコールを、複数の細胞を分析する前記方法、該複数の細胞又は該複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法と並行して実施するステップが、洗浄ステップに費やされた追加の時間を少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
パートｈ）において検出された前記第１のアミノ酸配列以外の配列の免疫原性を評価するステップをさらに含む、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫原性を評価するステップが、パートｈ）において検出された前記第１のアミノ酸配列以外の前記配列を、インシリコ免疫原性ツールを使用して評価するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質配列変異体を検出する方法であって、
ａ）細胞集団、例えば、複数の細胞を含む培養培地からの精製されたタンパク質生成物を提供するステップであって、該細胞が、タンパク質生成物を産生する、該ステップと；
ｂ）該精製されたタンパク質生成物を質量分析法によって分析するステップと；
ここでａ）〜ｂ）は、同じ細胞集団又は異なる細胞集団内の複数の試料に対して、同時に又は逐次的に繰り返され；並びに
ｃ）該複数の試料からの質量分析データと、質量分析データのデータベースとを比較することによって、該複数の試料内におけるタンパク質配列変異体を検出するステップと
を含み、
それによって、該タンパク質配列変異体を検出する、該方法。
【請求項３２】
（ｉ）前記複数の細胞集団が、前記生成物の産生の異なる段階で産生されるか；
（ｉｉ）前記複数の細胞集団が、前記複数の細胞の培養における異なる時点で産生されるか；
（ｉｉｉ）各細胞集団が、同じタイプの細胞を含むか；又は
（ｉｖ）前記細胞集団の１つ又は複数、例えばそれぞれが、異なるタイプの細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｃ）に応じて、前記生成物を産生するために細胞集団を選択するステップを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質生成物が、表１〜４から選択される遺伝子組換え又は治療用タンパク質である、請求項３１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
質量分析による分析のために前記精製されたタンパク質生成物を調製するステップが、前記精製されたタンパク質を変性させるステップを含む、請求項３１から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記精製されたタンパク質を変性させるステップが、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下及び酸性ｐＨにおいて前記精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記精製されたタンパク質を変性させるステップが、尿素及びデオキシコラートの存在下において前記精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記精製されたタンパク質生成物の消化の前に、前記デオキシコラートを溶液から沈殿させるか；又はｂ）の前に、前記デオキシコラートを溶液から沈殿させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記デオキシコラートを、酸の添加によって沈殿させる、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
質量分析による分析のために前記精製されたタンパク質生成物を調製するステップが、ＴＣＥＰによって前記精製されたタンパク質を還元するステップを含む、請求項３１から３９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
質量分析による分析のために前記精製されたタンパク質生成物を調製するステップが、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｓｐＮによって前記精製されたタンパク質を消化するステップを含む、請求項３１から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
質量分析による分析のために前記精製されたタンパク質生成物を調製するステップが、前記精製されたタンパク質の複数のアリコートを形成するステップと、複数のプロテアーゼによって該アリコートを消化するステップとを含み、この場合、各アリコートが、異なるプロテアーゼによって消化され、該プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｓｐＮから選択され；場合により、消化の後に、該複数のアリコートが一緒に混合される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
質量分析による分析のために前記精製されたタンパク質生成物を調製するステップが、ハイスループット試料処理にとって好適な機器において実施され；場合により、ｃ）が、９６ウェルプレートにおいて実施される、請求項３１から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ｂ）が、前記調製された精製されたタンパク質生成物をＬＣ／ＭＳを使用して分析するステップを含む、請求項３１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ｃ）が、前記複数の細胞集団のデータと質量分析データベースとの比較分析によって、存在量の変化を示すペプチドを識別するステップを含む、請求項３１から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ｃ）が、存在量の変化を示すペプチドをＭＳ／ＭＳによって分析するステップと、該ＭＳ／ＭＳのデータをＭＳ／ＭＳのデータベースと比較することによって配列変化を識別するステップとをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
自動化されている、請求項３１から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ロボット設備を用いる、請求項３１から４７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
マイクロフルイディクスシステムを用いる、請求項３１から４８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記精製されたタンパク質生成物を産生するために前記細胞集団からタンパク質生成物を精製するステップが、クロマトグラフィーを使用して該タンパク質生成物を精製するステップを含む、請求項３１から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ｂ）が、残存する汚染を除去するための洗浄プロトコールを含む、請求項３１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記洗浄プロトコールが、ＬＣ／ＭＳを使用してブランク試料を分析するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記洗浄プロトコールが、酸性溶液及び高有機溶液の交互の洗浄を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記洗浄プロトコールが、タンパク質配列変異体を検出する方法と並行して実施することができる、請求項５１又は５３のどちらかに記載の方法。
【請求項５５】
（ｉ）前記洗浄プロトコールが、タンパク質配列変異体を検出する前記方法の経過時間を増加させないか；
（ｉｉ）前記洗浄プロトコールを、タンパク質配列変異体を検出する前記方法と並行して実施することにより、前記方法の経過時間を少なくとも約５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮するか；又は
（ｉｉｉ）前記洗浄プロトコールを、タンパク質配列変異体を検出する該方法と並行して実施することにより、洗浄ステップに費やされた追加の時間を少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
検出されたタンパク質配列変異体の前記免疫原性を評価するステップをさらに含み、場合により、検出されたタンパク質配列変異体の該免疫原性を評価するステップが、インシリコ免疫原性ツールを使用して該タンパク質配列変異体を評価するステップを含む、請求項３１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
（ｉ）以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数を識別、評価、又は予測するために、ポリペプチドの前記第１、第２、及び／又は第３の試料に追加の分析に供するステップをさらに含むか；又は
（ｉｉ）前記複数の細胞中に前記第１アミノ酸配列以外の配列が存在する場合、以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数を識別、評価、又は予測するために、該第１アミノ酸配列以外の該配列を追加の分析に供するステップを含む、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ｄ）以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数を識別、検出、評価、又は予測するために、前記検出されたタンパク質配列変異体（単数及び複数）を分析するステップをさらに含む、請求項３１から５６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
請求項３１から５６までのいずれか一項において検出されるタンパク質配列変異体を分析する方法であって、以下：免疫原性を評価して、タンパク質凝集、例えば、タンパク質凝集の性向を予測するステップ；脱アミド処理を評価するステップ；アスパラギン酸異性化及び断片化を検出するステップ；Ｃ末端リシンのプロセシングを検出するステップ；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ反応、半減期、及びプロテインＡ精製を予測／評価するステップ；遊離システインチオール基を検出するステップ；等電点を評価して、リシングリケート化を検出するステップ；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化を識別するステップ；Ｎ末端環化を検出するステップ；酸化を検出するステップ；又はピログルタマート形成を検出するステップの１つ又は複数をさらに含む、該方法。
【請求項６０】
請求項１から５９までのいずれか一項に記載の方法の前記複数の細胞によって作製されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年２月３日に出願された米国特許出願第６２／４５４，５６７号、２０１７年２月２８日に出願された米国特許出願第６２／４６４，７７５号、及び２０１７年５月２４日に出願された米国特許出願第６２／５１０，５５９号の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、生物学的製品製造の様々な段階におけるタンパク質配列変異体の発生を評価するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質配列変異体（ＰＳＶ）は、ゲノムヌクレオチド変化又は翻訳誤取込みの結果として生じ得る意図されないアミノ酸配列変化として定義される。低レベルの配列変異体が、製品の有効性及び免疫原性に影響を与え得る製品の不均一性の原因となる。安定な細胞系開発プロセスへの、配列変異体の系統的スクリーニングのための方法の組み入れは、生物製剤の良好な製造のために重要である。
【０００４】
アミノ酸配列変異体がどのように生じ得るかについて、ゲノムＤＮＡの変異、特定のコドンにおける誤訳、及び栄養枯渇など、いくつかの潜在的メカニズムが報告されている。配列変異体の系統的スクリーニングは、生物製剤の良好な製造のための細胞系構築プロセスにおける不可欠な分析構成要素として台頭しつつある。アプローチの１つは、核酸における変異を識別するために使用される感度の高い方法である、アンプリコン配列決定法を使用することである。しかしながら、正しいＤＮＡ又はＲＮＡの配列は、正しいタンパク質配列を保証するわけではなく、翻訳プロセスの誤り率は、はるかに高いことが知られている。翻訳における誤り率（１０−４〜１０−３）は、一般的に、転写における誤り率（１０−５〜１０−４）より約１桁高いと考えられる。上記の理由から、配列変異体の分析をタンパク質レベルにおいて実施することは重要であり得る。ＬＣ−ＭＳによるペプチドマッピング分析は、タンパク質配列の徹底的な特徴付けに対して、素晴らしい特異性及び感度を提供する。配列変異体は、ＭＳ２データのデ・ノボ解析によって検出することができる。本方法の感度は、少ない存在量の種に対して生じる断片化データの非常に高い品質に依拠する。この方法の欠点は、誤陽性のレベルが高いことである。
【０００５】
したがって、生物製剤学的製造の様々な段階におけるタンパク質生成物変異体の、改良された系統的評価が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、複数の細胞を分析する方法、該複数の細胞を使用する方法、又は該複数の細胞によって作製されたポリペプチドであって、
ａ）複数の細胞を培養して、生成物を含む馴化培地を作製するステップであって、複数の細胞の少なくとも１つの細胞が、第１のアミノ酸配列、例えば、産生配列を含む生成物をコードする核酸配列を含む、ステップと；
ｂ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第１の試料を、第１の配列ベースの反応、例えば、タンパク質分解酵素による消化に供して（及び場合により、反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供して）、第１の反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を提供するステップと；
ｃ）第１の反応生成物に対する値、例えば、存在、移動度（例えば、飛行時間など）、又は分子量を、参照値、例えば、参照配列、例えば、第１のアミノ酸配列などに対する第１の配列ベースの反応の適用によって産生された反応生成物に対する値などと比較し、比較に応じて、さらなる分析、例えば、配列決定などのための反応生成物成分を選択するステップと；
ｄ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第２の試料を、第２の配列ベースの反応、例えば、第２のタンパク質分解酵素による消化に供して（及び場合により、反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供して）、第２の反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を提供するステップと；
ｅ）第２の反応生成物に対する値、例えば、存在、移動度（例えば、飛行時間など）、又は分子量を、参照値、例えば、参照配列、例えば、第１のアミノ酸配列などに対する第２の配列ベースの反応の適用によって産生された反応生成物に対する値などと比較し、比較に応じて、さらなる分析、例えば、配列決定などのための反応生成物成分を選択するステップと；
ｆ）場合により、生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第３の試料を、第３の配列ベースの反応、例えば、タンパク質分解酵素による消化に供して（及び場合により、反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供して）、第３の反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を提供するステップと、
ｇ）場合により、第３の反応生成物に対する値、例えば、存在、移動度（例えば、飛行時間など）、又は分子量を、参照値、例えば、参照配列、例えば、第１の配列などに対する第３の配列ベースの反応の適用によって産生された反応生成物に対する値などと比較し、比較に応じて、さらなる分析、例えば、配列決定などのための反応生成物成分を選択するステップと、
ｈ）場合により、ｃ）の結果並びに場合によりｅ）及び／又はｇ）の結果に応じて、第１のアミノ酸配列以外の配列が複数の細胞に存在するか否かを特定するステップと
を含み、
それによって、複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法を特徴とする。
【０００７】
別の態様において、本発明は、タンパク質配列変異体を検出する方法であって、
ａ）細胞集団を提供するステップであって、細胞がタンパク質生成物を産生する、ステップと；
ｂ）細胞集団からのタンパク質生成物を精製するステップと；
ｃ）質量分析による分析のために精製されたタンパク質生成物を調製するステップと；
ｄ）調製された精製されたタンパク質生成物を質量分析法によって分析するステップと；
ここでａ）〜ｄ）は、複数の（例えば、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、又はそれ以上）の細胞集団に対して、同時に又は逐次的に繰り返され；並びに、
ｅ）複数の細胞集団からの質量分析データと、質量分析データのデータベースとを比較するステップ
を含み、それにより、タンパク質配列変異体を検出する方法を特徴とする。
【０００８】
別の態様において、本発明は、複数の細胞を分析する方法であって、
ａ）複数の細胞を培養して、生成物を含む馴化培地を作製するステップであって、複数の細胞の少なくとも１つの細胞が、生成物をコードする核酸配列を含み、生成物が、第１のアミノ酸配列を含む、ステップと；
ｂ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第１の試料を、第１の配列ベースの反応に供して、第１の反応生成物を提供するステップと、
ｃ）第１の反応生成物に対する値を参照値と比較し、比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｄ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第２の試料を、第２の配列ベースの反応に供して、第２の反応生成物を提供するステップと；
ｅ）第２の反応生成物に対する値を参照値と比較し、比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｆ）場合により、生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第３の試料を、第３の配列ベースの反応に供して、第３の反応生成物を提供するステップと；
ｇ）場合により、第３の反応生成物に対する値を参照値と比較し、比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｈ）ｃ）の結果並びに場合によりｅ）及びｇ）の結果に応じて、第１のアミノ酸配列以外の配列が複数の細胞に存在するか否かを特定するステップと
を含み、それによって、複数の細胞を分析する方法を特徴とする。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
ａ）細胞集団、例えば、複数の細胞を含む培養培地からの精製されたタンパク質生成物を提供するステップであって、細胞が、タンパク質生成物を産生する、ステップと；
ｂ）精製されたタンパク質生成物を質量分析法によって分析するステップと；
ここでａ）〜ｂ）は、同じ細胞集団又は異なる細胞集団内の複数の試料に対して、同時に又は逐次的に繰り返され；並びに
ｃ）複数の試料からの質量分析データと、質量分析データのデータベースとを比較することによって、複数の試料内におけるタンパク質配列変異体を検出するステップと
を含み、それにより、タンパク質配列変異体を検出する方法を特徴とする。
【００１０】
いくつかの実施形態において、試料はアリコートである。
【００１１】
別の態様において、本発明は、例えば、本明細書において説明されるいずれかの方法によって、又は本明細書において説明されるいずれかの方法の複数の細胞又は細胞集団によって作製されるポリペプチドを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】タンパク質配列変異体分析のワークフロー。
【図２】リツキシマブの消化のトリプシン効率に対する尿素モル濃度の効果を示す。
【図３Ａ】トラスツズマブの未切断ペプチドの数に関するトリプシン効率に対する尿素モル濃度及び温度の効果を示す。
【図３Ｂ】表形式において同じデータを示す。
【図４】ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫペプチドの消化効率に対する尿素モル濃度及び温度の効果を示す。
【図５】リツキシマブの消化のキモトリプシンの活性に対する尿素モル濃度及び温度の効果を示す。
【図６Ａ】キモトリプシンを使用したトラスツズマブの不完全な消化に対する尿素モル濃度及び温度の効果を示す。
【図６Ｂ】６Ａのデータを示す表。
【図７】３７℃における２Ｍの尿素及び２５℃における０．５Ｍの尿素での、トラスツズマブのキモトリプシン消化の効率に対する尿素モル濃度及び温度の効果を示す。
【図８】リツキシマブの消化のＡｓｐＮ効率に対する尿素モル濃度の効果を示す。
【図９】ｃＢ７２．３の消化のＡｓｐＮ効率に対する尿素モル濃度の効果を示す。
【図１０】Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＦｕｓｉｏｎによるナノＬＣ−ＭＳ２分析での、トラスツズマブのＨＣ領域の複合トリプシン／キモトリプシン消化に対するカバー率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）プロット。１つのトリペプチド及び１つの単一の残基ペプチドは重鎖（赤い円）において検出されなかった。
【図１１】Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＦｕｓｉｏｎによるナノＬＣ−ＭＳ２分析での、トラスツズマブのＨＣ領域の複合トリプシン／キモトリプシン／ｌｙｓＣ消化に対するカバー率プロット。
【図１２】モデルタンパク質リツキシマブのタンパク質配列変異体分析のワークフロー。
【図１３】晩期世代クローン４Ｂ０４において検出された潜在的配列変異体に対する存在量プロファイルを示す。
【図１４】潜在的配列変異体に対するＭＳプロファイルを示す。
【図１５】潜在的配列変異体におけるターゲットＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図１６】本明細書において説明される洗浄手順に適合する実例ＬＣシステムを示す。
【図１７】洗浄プロトコールでの使用のための分析勾配及びクリーニング勾配に対する実例プロトコールを示す。矢印は、どの色がどのポンプに対応するかを示している。
【図１８】緩衝液安定性スクリーンでの使用のためのプレートのダイアグラムを示す。
【図１９】１日目（アルギニンなし）、１日目（アルギニンあり）、３日目（アルギニンなし）、及び３日目（アルギニンあり）での緩衝液ｐＨに対する凝集のグラフを示す。
【図２０】タンパク質配列変異体分析のワークフロー。
【図２１】識別された配列変異体のＭＳプロファイルを示す。
【図２２】上側において配列変異体におけるターゲットＭＳ／ＭＳ分析を、及び下側において配列変異体の存在量プロファイルを示す。
【図２３】上側においてＳ１６０Ｃ変異体のＭＳ／ＭＳのデータの３Ｄスペクトルを、及び下側においてトラスツズマブ変異体配列及びそのトリプシン切断断片配列を示す。
【図２４】添加された配列変異体のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法的対象を意味するために本明細書において使用される。一例として、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、１つの細胞又は２つ以上の細胞を意味し得る。
【００１４】
本明細書において使用される場合、用語「アリコート」は、例えば、精製されたタンパク質、調製された精製されたタンパク質、培養培地、又は馴化培養培地などの、所定量の溶液を意味する。実施形態において、各アリコートは、量に関する条件を満たし、例えば、各アリコートは、最小量、例えば、事前設定された最小値を有し；最小値と最大値との間、例えば、事前設定された最小値及び／又は最大値との間の範囲内に収まり；およそ等しい値、例えば、事前設定された値；又は同じ量、例えば、事前設定された値を有する。液体、例えば、比較的多くの量の馴化培養培地が複数のアリコートに分割される場合、複数のアリコートは、その比較的多くの量の全体に等しいか、又はその比較的多くの量の全体より少なくてもよい。
【００１５】
測定可能な値、例えば、量、一時的な持続時間などについて言及する場合の用語「約」は、特定の値からの変動が、開示される方法を実施するために適切である場合、特定の値から±２０％、又は場合により±１０％、又は場合により±５％、又は場合により±１％、又は場合により±０．１％の変動を包含することが意図される。
【００１６】
本明細書において使用される場合、用語「複数のアリコート」は、２つ以上（例えば、２つ又はそれ以上）のアリコートを意味する。
【００１７】
本明細書において使用される場合、用語「内因性」は、有機体、細胞、組織、又は器官からの任意の物質、又はそれらの内側で自然に産生される任意の物質を意味する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、用語「外因性」は、有機体、細胞、組織、又は器官に導入された任意の物質、又はそれらの外側で産生される任意の物質を意味する。したがって、「外因性核酸」は、有機体、細胞、組織、又は器官に導入された核酸又はそれらの外側において産生された核酸を意味する。ある実施形態において、外因性核酸の配列は、天然には産生されないか、又は外因性核酸が導入される有機体、細胞、組織、又は器官の内側において天然には見出すことができない。同様に、「外因性ポリペプチド」は、天然には産生されないポリペプチド又は、例えば、外因性核酸配列からの発現によって、外因性ポリペプチドが導入される有機体、細胞、組織、又は器官の内側において天然には見出すことができないポリペプチドを意味する。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「異種」は、異なる種から有機体、細胞、組織、又は器官に導入された場合の、１つの種からの任意の物質を意味する。
【００２０】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は「核酸分子」は、相互互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらのＤＮＡ若しくはＲＮＡの組み合わせ、並びに一本鎖又は二本鎖のどちらかの形態のそれらのポリマーを意味する。用語「核酸」は、これらに限定されるわけではないが、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを包含する。一実施形態において、核酸分子は、合成物（例えば、化学的に合成されたもの、又は人工物）又は遺伝子組換え物である。特に制限されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然由来又は非天然由来のヌクレオチドを同様の方式において代謝される、天然のヌクレオチドの類似物又は誘導体を含む分子を包含する。特に明記されない限り、特定の核酸配列は、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、相補的配列、並びに明確に示された配列も暗に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの三番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８頁（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８頁（１９９４））。
【００２１】
本明細書において使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、相互互換的に使用され、並びに、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合したアミノ酸残基を含む化合物を意味する。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含んでいなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。一実施形態において、タンパク質は、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のポリペプチドを含み得、この場合、各ポリペプチドは、共有結合又は非共有結合／相互作用のどちらかによって別のポリペプチドに会合する。ポリペプチドは、ペプチド結合によって又はペプチド結合以外の手段によってお互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野において一般的にタンパク質と呼ばれ、多くのタイプが存在する、長鎖の両方を意味する。「ポリペプチド」は、例えば、中でも特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を包含する。
【００２２】
「生成物」は、本明細書において使用される場合、細胞、例えば、生成物を産生するように修飾又は設計された細胞によって産生される、例えば発現される分子、例えば、ポリペプチド、例えば、タンパク質、例えば、糖タンパク質、核酸、脂質、糖、多糖、又はそれらの任意のハイブリッドを意味する。ある実施形態において、生成物は、タンパク質又はポリペプチド生成物である。一実施形態において、生成物は、天然に存在する生成物を含む。ある実施形態において、生成物は、天然に存在しない生成物を含む。一実施形態において、生成物の一部は、天然に存在し、その一方で、生成物の別の一部は、天然に存在しない。一実施形態において、生成物は、ポリペプチド、例えば、遺伝子組換えポリペプチドである。一実施形態において、生成物は、診断用途又はプレ臨床用途にとって好適である。別の実施形態において、生成物は、治療用途、例えば、疾患の治療にとって好適である。いくつかの実施形態において、生成物は、タンパク質生成物である。いくつかの実施形態において、生成物は、例えば、表１〜４において、本明細書で説明される遺伝子組換えタンパク質又は治療用タンパク質である。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「配列変異体」、「タンパク質配列変異体」、「タンパク質産生配列変異体」、又は同様の用語は、参照タンパク質生成物と異なるタンパク質生成物の種を意味する。例えば、参照アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質である。典型的には、配列変異体は、ゲノムヌクレオチド変化又は翻訳誤取込みの結果として生じる。例えば、タンパク質の配列変異体は、以下のアミノ酸配列変化：置換、欠失、及び挿入のそれぞれを含み得ないか、１つ又は複数を含み得る。
【００２４】
本明細書において使用される場合、用語「複数の配列変異体」、「複数のタンパク質配列変異体」、及び同様の用語は、２つ以上（例えば、２つ又はそれ以上）の配列変異体、タンパク質配列変異体などを意味する。
【００２５】
本明細書において使用される場合、複数の細胞又は細胞集団（相互互換的に使用される）は、２つ以上（例えば、２つ又はそれ以上）の細胞を意味する。ある実施形態において、複数の細胞は、細胞系の細胞、例えば、クローン細胞を含み得る。ある実施形態において、複数の細胞は、細胞系の混合物の細胞、例えば、異なるクローン系統からの細胞を含み得る。ある実施形態において、複数の細胞は、主に、細胞系の細胞、例えば、クローン細胞を含み得る（例えば、複数の細胞は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％超の細胞系の細胞を含む）。いくつかの実施形態において、複数の細胞の少なくとも１つの細胞は、第１の配列、例えば、産生配列、例えば、遺伝子組換えタンパク質生成物をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の細胞の大部分の細胞は、第１の配列、例えば、産生配列、例えば、遺伝子組換えタンパク質生成物をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の細胞の各細胞は、第１の配列、例えば、産生配列、例えば、遺伝子組換えタンパク質生成物をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の細胞の少なくとも１つの細胞は、第１の配列によってコードされるポリペプチド、例えば、産生配列によってコードされるポリペプチド、例えば、遺伝子組換えタンパク質生成物を産生することができる。いくつかの実施形態において、複数の細胞集団は、２つ以上（例えば、２つ又はそれ以上）の細胞集団を意味する。
【００２６】
本明細書において使用される場合、配列ベースの反応は、ポリペプチドにおいて実施される反応であり、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてポリペプチドを処理し、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ・・・、１００、又はそれ以上）の反応生成物を産生する。いくつかの実施形態において、配列ベースの反応は、プロテアーゼ又はタンパク質分解酵素による消化である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ又はタンパク質分解酵素は、アミノ酸の特定の配列を認識し、アミノ酸の特定の配列の中の部位、又は隣接する部位、又はある距離にある部位を切断する。本明細書において使用される場合、反応生成物は、配列ベースの反応の生成物である。いくつかの実施形態において、反応生成物は、ポリペプチドの１つ又は複数の一部、例えば、１つ又は複数の断片、例えば、１つ又は複数のタンパク質分解断片である。いくつかの実施形態において、反応生成物は、さらなる分析、例えば、質量分析、例えば、ＬＣ／ＭＳ又はＭＳ／ＭＳによる分析にとって好適な分子量の生成物である。いくつかの実施形態において、反応生成物の成分又は反応生成物成分は、配列ベースの反応によって産生されるポリペプチドの単一の一部、例えば、単一の断片、例えば、単一のタンパク質分解断片である。
【００２７】
本明細書において使用される場合、反応生成物に対する値は、反応生成物に関連するパラメータの値を意味する。いくつかの実施形態において、反応生成物に関連するパラメータは、存在、移動度（例えば、飛行時間、例えば、質量分析計における飛行時間、又はクロマトグラフ技術における移動速度）、分子量、電荷、イオン化能、又は標識の存在を含む。
【００２８】
タンパク質配列変異体の検出
一態様において、本開示の発明は、複数の細胞、例えば、タンパク質生成物を産生するように設計された細胞系においてタンパク質配列変異体を検出する方法に関する。
【００２９】
Ｌｏｎｚａ（ＬＣ−ＭＳＭＳ、ＵＫＳＬ−８０９２、によるトリプシン性ペプチドマッピング）におけるタンパク質の一次構造の特徴付けのための現在の手法は、理論上の産生配列を確認するために設計されている。意図されないタンパク質変異体の検出感度は、クロマトグラフ法の分解能によって制限される。タンパク質配列変異体分析（ＰＳＶＡ）の範囲は、複数のアミノ酸置換、Ｎ末端及びＣ末端の拡張及び先端切断の検出及び識別である。
【００３０】
配列変異体は、多変量解析の応用によるペプチドマップＭＳ１データの比較スクリーニングにおいて検出され、ＭＳ２データは、著しく異なる種の識別のために使用した。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、インシリコ免疫原性評価ツールを使用して、さらに分析される。可能なタンパク質配列変異体の免疫原性は、川下の治療効率及び製品信頼性に対して効果を有し得る。インシリコツールは、免疫系の要素への配列変異体又はそれらの断片の結合並びに免疫反応を引き起こすそれらの性向を評価するために使用することができる。タンパク質配列変異体の免疫原性のインシリコ評価及び本発明の方法に適合する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，７０２，４６５号及び欧州特許１５１６２７５号において、並びに商業的に（例えば、Ｌｏｎｚａ製のＥｐｉｂａｓｅ）、見出すことができる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、タンパク質凝集、例えば、タンパク質凝集の性向／可能性を予測するために、さらに分析される。タンパク質凝集は、生物薬剤学的開発の際に一般的に直面する問題である。それは、発酵、精製、製剤化、及び貯蔵などの製造プロセスのいくつかの異なるステップにおいて潜在的に生じ得る。凝集の影響は、製造プロセスだけでなく、目的の製品プロファイル、送達、及び重要なことに、患者の安全にまで至る（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｒｅｙ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ．（２０１１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８．１４９４〜５０８頁）。凝集生成物は、製造コストを増加させ、開発タイプラインを延ばし、製剤化及び送達の選択肢を限定し得る。凝集は、タンパク質の固有特性（固有凝集性向）及び環境因子、例えば、ｐＨ、濃度、緩衝液、賦形剤、及びせん断力などの両方に依存する。しかしながら、ある抗体がプロセス工程又は製造の間に凝集し、他の抗体が凝集しない理由に関する基本的な違いは、それらのアミノ酸配列及び固有凝集性向においてコードされる。予測法：Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ＡＰＡＲＴ（商標）は、ディスクリプターとして抗体の配列及び構造特徴に基づく機械学習アルゴリズムを使用して開発された（Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａら（２０１５）．ＭＡｂｓ．７．３５２〜３６３頁）。このモデルは、広い物理化学のディスクリプター空間を網羅するように、並びに低発現性及び高発現性の、凝集性及び非凝集性の抗体を含むように設計された、配列多様抗体のセットに対してトレーニングされ試験された。このセットにおける全ての抗体の特性は、Ｌｏｎｚａにおいて実験的に特定された。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、脱アミド化を検出するために分析される。（アスパラギン）脱アミド化は、時間経過と共に、影響を受ける位置において、アスパラギン、イソアスパラタート、又はアスパルタート（アスパラギン酸）と分子の不均質混合物を産生する非酵素反応である。脱アミド化は、アスパラギン及びグルタミンの側鎖のアミド基の加水分解によって引き起こされる。３つの主な要因：ｐＨ、高温、及び一次配列、がペプチドの脱アミド化の速度に影響を及ぼす。タンパク質の二次構造及び三次構造も、脱アミド化の速度を著しく変えることができる。（アスパラギン及びグルタミンの両方は、脱アミド化の影響を受けやすい。実際には、発明者らは、次の残基が小さく親水性であるアスパラギン部位のサブセットのみに興味を持っている。それがアスパラギン及びグルタミンの両方に当てはまるように、このセクションを書き直すことは可能である）。電荷不均一性を生じることに加えて、（アスパラギン）脱アミド化は、抗体ＣＤＲなどの結合界面において生じる場合、タンパク質の機能に影響を及ぼし得る（Ｈａｒｒｉｓら（２００１）．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．７５２．２３３〜２４５頁）。脱アミド化は、断片化、凝集、及び免疫原性に関連する後続の問題を引き起こし得る（Ｖｌａｓａｋ  ａｎｄ  Ｉｏｎｅｓｃｕ．（２０１１）．ＭＡｂｓ．３．２５３〜２６３頁；Ｄｏｙｌｅら（２００７）．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．４０．１３１〜１３７頁；Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒ．（２０１２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４．１２６５８〜１２６６７頁）。一次構造解析（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ，２００１；Ｌｉｕ，Ｈｕｉ  Ｆ．，ら  「モノクローナル抗体産生のための回収及び精製プロセス開発（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」  ＭＡｂｓ．Ｖｏｌ．２．Ｎｏ．５．Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１０）及び三次構造解析の組み合わせによって特定されるような、脱アミド化の傾向のあるアスパラギン残基は、障害であると予想される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、アスパラギン酸の異性化及び断片化を検出するために分析される。アスパラギン酸の異性化は、アスパラギン酸及びイソアスパラギン酸残基の非酵素相互変換である。アスパラギン酸へのペプチド結合Ｃ末端は、酸性条件下において断片化を受けやすくあり得る。これらの反応は、アスパラギン脱アミド化反応と同様の中間体を介して進行する。アスパラギン酸の異性化及び断片化の速度は、ｐＨ、温度、及び一次配列によって影響される。タンパク質の二次構造及び三次構造も、速度を変えることができる。アスパラギン酸の異性化は、抗体ＣＤＲなどの結合界面で生じる場合、タンパク質の機能に影響を及ぼし得る（Ｈａｒｒｉｓら（２００１））。異性化は、電荷不均一性も引き起こし、結果として、ペプチド骨格の切断によって引き起こされる断片化も生じ得る。断片化反応は、主に、低ｐＨにおいて生じ、Ａｓｐ−Ｐｒｏペプチド結合は、他のペプチド結合より不安定である（Ｖｌａｓａｋ  ａｎｄ  Ｉｏｎｅｓｃｕ．（２０１１））。アスパラギン酸の異性化は、免疫原性を増加させる可能性を有し（Ｄｏｙｌｅら（２００７））、断片化は凝集体形成に有利に働くため、そのリスクはさらに増加する。異性化及び／又は断片化のリスクのあるアスパラギン酸残基は、一次及び三次構造解析の組み合わせを使用して検出される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、Ｃ末端リシンのプロセシングを検出するために分析される。Ｃ末端リシンのプロセシングは、抗体及び、塩基性カルボキシペプチダーゼの作用によってバイオプロセシングの際に生じ得る他のタンパク質における、一般的な修飾である（Ｃａｉら（２０１１）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８．４０４〜４１２頁）。Ｃ末端リシンのプロセシングは、２つ又は１つのリシンを有するか又はリシンを有しない種としての抗体生成物における電荷及び質量の不均一性の主な原因である。Ｃ末端リシンのプロセシングは、質量及び電荷の不均一性の原因であるが、抗体力価又は安全性プロファイルに影響を及ぼさないことが知られている。Ｃ末端リシンは検出される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される方法によって検出される配列変異体は、さらに、Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ反応、半減期、及びプロテインＡの精製を予測するために分析される。抗体の結晶形成断片（Ｆｃ）は、抗体エフェクタ機能及び半減期の原因となる領域を含む。抗体エフェクタ機能、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、より低いヒンジ及び近くの領域におけるＦｃ残基によって媒介される。抗体半減期は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することによる再生に依存する。ＦｃＲｎ結合領域は、精製の際に、プロテインＡによっても結合される。Ｆｃ受容体領域又はその近くにおける変異又は置換は、生成物の有効性及び／又は半減期に影響を及ぼすことに加えて、Ｆｃ含有生成物の精製の見込みを変更し得る。Ｆｃにおける置換は、精製及び製造に対するそれらの潜在的影響について評価される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、遊離システインチオール基を検出するために分析される。溶媒に露出した遊離システインチオール基は、タンパク質のミスフォールディング、凝集、非特異的組織結合、ジスルフィドスクランブリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）による免疫原性の増加、又は溶液中の他の分子との意図されない反応などの問題を引き起こし得る。関連配列の場所を見つけ出し、結果として、保存されたジスルフィド結合を見つけ出すために、内部データベースに対する配列検索が実施される。これらの保存された部位に合わないシステイン残基は、障害であると見なされる。ジスルフィド形成並びにフォールディング及び安定性への影響に対するこれらの残基の可能性について、これらの残基の構造解析も実施される。ジスルフィド結合に関連する既知の問題を有するタンパク質、ドメイン、又はリンカも検出される。例えば、ヒト天然ＩｇＧ４及びＩｇＧ２抗体は、それぞれ、解離及びヒンジ領域のジスルフィドスクランブリングを受けやすい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、等電点を評価するために分析される。タンパク質の等電点（ｐＩ）は、タンパク質が正味のゼロ電荷を有するｐＨである。タンパク質溶液が、タンパク質のｐＩに等しいｐＨである場合、タンパク質分子上の電荷の間の反発的静電力は最小である。不適切な反発は、凝集ホットスポットになる疎水性表面パッチのリスクを増加させ得る。分子表面上の局所電荷分布も、製剤設計に影響を及ぼす。生成物が標準的（抗体）精製プロセスに適合するかどうかを特定するために、生成物のｐＩを評価する（Ｌｉｕら  ２０１０  ＭＡｂｓ）。ｐＩが標準的範囲を大きく外れる場合には、より複雑な精製戦略を追求するべきである。等電点は、ＥＭＢＯＳＳ  ｐＫａ値を使用して、一次アミノ酸配列における荷電された残基の数に基づいて計算される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、リシン糖化を検出するために分析される。糖化は、主にリシンの側鎖状εアミノ基に影響を及ぼす非酵素修飾である。修飾は、一般的に、グルコースの濃度が高い場合に細胞培養の際に生じる。産生された遺伝子組換えタンパク質の５〜２０％が糖化されたリシンを有するであろうと推定される（Ｓａｌｅｅｍら（２０１５）．ＭＡｂｓ．７．７１９〜７３１頁）。溶媒に露出した全てのリシンは、潜在的に、影響されやすいが、負電荷及びヒスチジンイミダゾール基は、修飾に対して触媒作用を及ぼし、影響されやすい部位におけるリシンの糖化の富化を生じ得る。リシンの側鎖状εアミノ基の触媒作用距離内のヒスチジン又は酸性残基側鎖を有するクリティカル領域におけるリシン残基が検出される。この触媒作用距離は、例えば、５Å、１０Å、又は２０Åであり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、Ｎ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化を検出するために分析される。グリコシル化は、抗体、血液因子、ＥＰＯ、ホルモン、インターフェロンなどの治療用タンパク質に現れる一般的な翻訳後修飾である（Ｗａｌｓｈ．（２０１０）．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．１５．７７３〜７８０頁）。適切なグリコシル化は、フォールディングにとってだけでなく、安定性、溶解性、力価、薬物動態、及び免疫原性にとっても重要である。結合界面又はその付近における意図されないグリカン構造は、結合を立体的に妨げ、親和性に影響を及ぼす。Ｎ−グリコシル化の場合、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフ［式中、Ｘはプロリン以外の任意の残基である］は、一般的に部位を検出するのに役立つ。しかしながら、そのようなモチーフの全てがＮ−グリコシル化されるわけではなく、このモチーフに適合しない千を超える他の特異部位が知られている。セリン及びトレオニンのＯ−グリコシル化は、いかなるシンプルなパターンにも従わず、Ｏ−グリコシル化を予測するために、ブースティング決定木アンサンブルアルゴリズム（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を、実験的に決定されたグリコシル化部位について訓練した。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、Ｎ末端環化を検出するために分析される。タンパク質のＮ末端環化は、骨格の第２のカルボニル基上のＮ末端アミンの求核攻撃により生じ得、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）を生じ得る（Ｌｉｕら（２０１１）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６．１１２１１〜１１２１７頁）。Ｎ末端環化は、制御及び監視しなければならない質量及び電荷の不均一性を生じる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、酸化を検出するために分析される。いくつかのアミノ酸は、反応性酸素種（ＲＯＳ）によって引き起こされる酸化による損傷を受けやすい。中でも、ヒスチジン、メチオニン、システイン、チロシン、及びトリプトファンが挙げられる。酸化は、概して、２つのカテゴリ：部位特異的金属触媒酸化及び非特異的酸化に分けられる。メチオニン及び比較的程度は低いがトリプトファンは、非部位特異的酸化をより受けやすい。メチオニンは、主に、遊離ＲＯＳに対して感応性である。トリプトファンは、光誘起酸化に対してより感応性である。感応性の度合いは、部分的に、側鎖の溶媒接近性によって決定され、埋もれた残基は、感応性が低いか、又は反応するために時間がかかる。危険性のある残基を特定するために、構造解析が使用される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、ピログルタマート形成を検出するために分析される。ピログルタマート形成は、Ｎ末端グルタミン又はグルタミン酸残基を有するタンパク質において生じる修飾であり、側鎖がＮ末端アミン基によって環化して、５員環構造を形成する。Ｎ末端環化は、制御し監視しなければならない質量及び電荷の不均一性を生じる（Ｌｉｕら（２００８）．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７．２４２６〜２４４７頁）。ピログルタマート形成は、一般的に、Ｎ末端グルタミンを有する抗体において見出される。Ｎ末端グルタミン酸からのピログルタマート形成は、製造の際に生じ得、インビボにおいて見出された（Ｃａｉら（２０１１）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８．４０４〜４１２頁）。Ｎ末端グルタミン又はグルタミン酸残基が検出される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法によって検出される配列変異体は、さらに、以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、１１つ、１２つ、又は全て）を検出、予測、及び／又は評価するために分析される。
【００４５】
変性方法
いくつかの実施形態において、本開示の方法及びシステムは、精製されたタンパク質生成物を変性させるステップを含む。変性方法としては、加熱、カオトロピック剤（例えば、グアニジンＨＣｌ又は尿素を単独において）、又は洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）の添加が挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本開示の方法及びシステムは、デオキシコラートを使用して精製されたタンパク質生成物を変性させるステップを含む。デオキシコラートは、尿素の存在によって（及び存在する尿素が、かなりのレベルの塩を含む溶液から沈殿することなく）、水溶液中において安定化される。これらの物資の両方は、分析物タンパク質を変性させるように作用し、代替の試料調製方法と比較して、試料調製ステップにおいて使用される温度及びインキュベーション時間を減じることを可能にする。この方法によって可能となる穏やかな試料調製条件は、他の調製方法によって誘起され得るタンパク質に対する修飾を最小限に抑える。この手順の終了時に、デオキシコラートを、酸の添加によって溶液から沈殿させることができ、その一方、分析物ペプチド（消化の生成物）は、尿素によって溶液中において安定化され、結果として、（洗浄剤分子の使用を含むほとんどの方法と異なって）質量分析法による分析に適合する方法を生じる。
【００４７】
同じ試料調製手順内でのこれらの物質の両方の組み合わせは、精製されたタンパク質調製手順の有効性にとって重要である。具体的には、酸沈降によるデオキシコラートの除去の際の、高塩溶液中での尿素とデオキシコラートとの相互作用の安定化、及び尿素と分析物タンパク質／ペプチド、例えば、精製されたタンパク質生成物、との相互作用の安定化は、本明細書において開示される方法に重要である。
【００４８】
産生への応用
本明細書において開示される、生成物、例えば、生成物変異体の調製の方法は、様々な生成物を産生するため、又は様々な細胞系を評価するため、或いはバイオリアクター又は処理用容器若しくはタンク、より一般的には任意の供給源を伴う容器若しくはタンクでの使用のための様々な細胞系の産生を評価するために使用することができる。本明細書において説明される装置、施設、及び方法は、原核細胞系及び／又は真核細胞系を含む任意の所望の細胞系を培養するために好適である。さらに、実施形態において、装置、施設、及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（付着性）細胞を培養するために好適であり、並びに、製薬製品及び生物製剤製品、例えば、ポリペプチド生成物、核酸生成物（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は細胞及び／又はウイルス、例えば、細胞治療及び／又はウイルス治療において使用されるものなどの産生のために構成される産生操作にとって好適である。
【００４９】
実施形態において、細胞は、生成物、例えば、遺伝子組換え治療用又は診断用生成物などを発現又は産生する。以下においてより詳細に説明されるように、細胞によって産生される生成物の例としては、これらに限定されるわけではないが、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異抗体）、抗体模倣物（抗原に特異的に結合するが構造的に抗体に関連しないポリペプチド分子、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、又はＩｇＮＡＲなど）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の遺伝子組換えタンパク質（例えば、グリコシル化されたタンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療（例えば、抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法及びウイルス性免疫療法のためのウイルスベクター）、細胞治療法（例えば、多能性幹細胞、間充織幹細胞、及び成人幹細胞）、ワクチン又は脂質カプセル化粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）又はＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質又はアミノ酸、が挙げられる。実施形態において、装置、施設、及び方法は、バイオシミラーを産生するために使用することができる。
【００５０】
言及したように、実施形態において、装置、施設、及び方法は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞又は下等真核生物細胞、例えば、酵母細胞又は糸状菌細胞など、或いは、原核細胞、例えば、グラム陽性細胞又はグラム陰性細胞など、並びに／或いは、真核細胞又は原核細胞の生成物、例えば、大規模な方法において真核細胞によって合成された、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）などの産生を可能にする。本明細書において特に明記されない限り、装置、施設、及び方法は、任意の所望の容積又は生産能力、例えば、これらに限定されるわけではないが、ベンチスケール、パイロットスケール、又はフル生産スケールの能力などを含み得る。
【００５１】
さらに、本明細書において明記されない限り、装置、施設、及び方法は、これらに限定されるわけではないが、撹拌槽、エアリフト式、ファイバ式、マイクロファイバ式、ホローファイバ式、セラミックマトリックス式、流動床式、固定床式、及び／又は噴流床式のバイオリアクターなどの任意の好適な反応器（単数又は複数）を含み得る。本明細書において使用される場合、「反応器」は、発酵槽又は発酵ユニット、或いは任意の他の反応槽を包含し得、用語「反応器」は、「発酵槽」と相互互換的に使用される。例えば、いくつかの態様において、バイオリアクターユニットは、以下：栄養素及び／又は炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の入口流及び出口流、気相及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、アジテーション（例えば、撹拌）、及び／又はクリーニング／殺菌の１つ又は複数或いは全てを実施することができる。実施例の反応器ユニット、例えば、発酵ユニットなどは、ユニット内に複数の反応器を収容し得、例えば、ユニットは、各ユニットに、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、又はそれ以上のバイオリアクターを有することができ、並びに／或いは、設備は、設備内に、単一又は複数の反応器を有する複数のユニットを収容し得る。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ式プロセス、半フェドバッチ式プロセス、フェドバッチ式プロセス、灌流式プロセス、及び／又は連続発酵式プロセスにとって好適であり得る。任意の好適な反応器直径を使用することができる。実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬから約５０，０００Ｌの間の容積を有することができる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、及び／又は５０，０００リットルの容積が挙げられる。さらに、好適な反応器は、マルチユース、シングルユース、使い捨て、又は非使い捨てであり得、並びに合金、例えば、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレス鋼）及びインコネルなど、プラスチック、及び／又はガラスなどの任意の好適な材料で形成することができる。いくつかの実施形態において、好適な反応器は、円形、例えば、円筒形であり得る。いくつかの実施形態において、好適な反応器は、方形、例えば、長方形であり得る。方形反応器は、場合により、円形反応器に勝る利点、例えば、使いやすさ（例えば、技術者による装入及び設定）、反応器の内容物のより一層の混合及び均一性、及びより少ない床面積などを提供する。
【００５２】
実施形態において、及び本明細書において明記されない限り、調製物を作製する方法による使用のための、本明細書において説明される装置、設備、及び方法は、言及されない任意の好適なユニットの操作及び／又は設備、例えば、そのような生成物の分離、精製、及び単離のための操作及び／又は設備など、も含むことができる。任意の好適な設備及び環境、例えば、従来の現場施工型（ｓｔｉｃｋ−ｂｕｉｌｔ）設備、モジュール式設備、モバイル式設備、及び一時的設備など、或いは任意の他の好適な建築物、設備、及び／又はレイアウトを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、モジュール式クリーンルームを使用することができる。さらに、特に明記されない限り、本明細書において説明される装置、システム、及び方法は、一つの場所又は施設において収容及び／又は実施することができ、或いは、別々の又は複数の場所及び／又は設備において収容及び／又は実施することができる。
【００５３】
非限定的な例は、これらに限定されるわけではないが、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号、同第２０１２／００７７４２９号、同第２０１１／０２８０７９７号、同第２００９／０３０５６２６号、及び米国特許第８，２９８，０５４号、同第７，６２９，１６７号、及び同第５，６５６，４９１号であり、なお、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられ、好適であり得る例示的な施設、設備、及び／又はシステムを説明する。
【００５４】
本明細書において説明される調製物を作製するための方法は、広範囲の細胞を使用することができる。実施形態において、細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト又は齧歯動物又はウシ科の細胞系又は細胞株であり得る。そのような細胞、細胞系、又は細胞株の例は、例えば、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫジャーカット、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１〜３，ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性細胞系又はハイブリドーマ細胞系である。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞系である。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞は、トリの細胞、細胞系、又は細胞株、例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、又はＥＢｖｌ３でもあり得る。
【００５５】
一実施形態において、真核細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成人の幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）、及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）などの多能性幹細胞であり得る。
【００５６】
一実施形態において、細胞は、本明細書において説明されるいずれかの細胞の分化形態である。一実施形態において、細胞は、任意の初代培養細胞から誘導された細胞である。
【００５７】
実施形態において、細胞は、肝細胞、例えば、ヒトの肝細胞、動物の肝細胞、又は非実質細胞などである。例えば、細胞は、プレート培養可能な代謝試験用ヒト肝細胞、プレート培養可能な誘導試験用ヒト肝細胞、プレート培養可能なＱｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁試験用ヒト肝細胞（ドナー１０人及びドナー２０人のプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールしたビーグル犬肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７Ｂｌ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ、及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（国内短毛種の肝細胞を含む）、及びウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイトの肝細胞を含む）であり得る。実例肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，ＬＬＣ，６  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ  ２７７０９から市販されている。
【００５８】
一実施形態において、真核細胞は、下等真核細胞、例えば、酵母細胞（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、及びピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属（例えば、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）、又はコマガタエラ・ファフィー（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えば、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（例えば、ゲオトリクム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などである。好ましいのは、ピキア・パストリス種である。ピキア・パストリス株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、及びＣＢＳ７４３５である。
【００５９】
一実施形態において、真核細胞は、真菌細胞（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ）、Ａ．ニジュラ（Ａ．ｎｉｄｕｌａ）など）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）（Ａ．サーモフィルム（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）（例えば、Ｃ．サーモフィルム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．サーモフィル（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、コルジセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）（例えば、Ｃ．ミリタリス（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）など）、コリナスクス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クテノミセス（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（例えば、Ｆ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）など）、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）（例えば、Ｇ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）など）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）（例えば、Ｈ．ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）など）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）（例えば、Ｍ．オリザエ（Ｍ．ｏｒｚｙａｅ）など）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（例えば、Ｍ．サーモフィル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）（例えば、Ｎ．ヘマトコッカ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ）など）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（例えば、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）など）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）（例えば、Ｓ．サーモフィル（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）（例えば、Ｔ．テレストリス（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ｔ．ヘテロタリカ（Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）など）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）など）、又はバーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）（例えば、Ｖ．ダリア（Ｖ．ｄａｈｌｉａなど））である。
【００６０】
一実施形態において、真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）、又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えば、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ダナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、藍藻（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、又はオクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ））、又は植物細胞（例えば、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、又はセタリア）の細胞、又は双子葉植物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、大豆、トマト、タバコ、アルファルファ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の細胞）である。
【００６１】
一実施形態において、細胞は細菌又は原核細胞である。
【００６２】
実施形態において、原核細胞は、グラム陽性細胞、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）などである。使用することができるバチルスは、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、納豆菌（Ｂ．ｎａｔｔｏ）、又はＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。実施形態において、細胞は、枯草菌、例えば、枯草菌３ＮＡ及び枯草菌１６８である。バチルスは、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６、４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０−１２１４から得ることができる。
【００６３】
一実施形態において、原核細胞は、グラム陰性細胞、例えば、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、例えば、ＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ  １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、及びＯｒｉｇａｍｉ、並びに大腸菌Ｂ株由来の細胞、例えば、ＢＬ−２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）などであり、これらの全ては市販されている。
【００６４】
好適な宿主細胞は、例えば、微生物株保存機関、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，ブラウンシュバイク、ドイツ）又はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）など、から市販されている。
【００６５】
実施形態において、培養細胞は、治療用途のために、タンパク質、例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体など、及び／又は遺伝子組換えタンパク質を産生するために使用される。実施形態において、培養細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸、或いは他の有用な生化学中間体又は代謝物を産生する。例えば、実施形態において、約４０００ダルトンから約１４０，０００ダルトン超の分子量を有する分子を産生することができる。実施形態において、これらの分子は、様々な複雑度を有することができ、グリコシル化を含む翻訳後修飾を含むことができる。
【００６６】
実施形態において、ポリペプチドは、例えば、ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（又はボツリヌス菌神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンディフティトックス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射剤）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、サイモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド、カルシトニン、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、遺伝子組換えヒト上皮増殖因子、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン、エプタコグアルファ（活性型）、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（遺伝子組換え体）、アルファナート（Ａｌｐｈａｎａｔｅ）、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、サーモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イニグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ）、モルグラモスチム、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド（アトリゲル（ＡＴＲＩＧＥＬ））、ロイプロリド（デュロス（ＤＵＲＯＳ））、ゴセレリン、ユーロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）、ソマトロピン、メカセルミン、エンフルビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリシン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート、アナキンラ、セルモロイキン、９９  ｍＴｃ−アプシチド、ミエロイド、ベタセロン、酢酸グラチラマー、ゲポン（Ｇｅｐｏｎ）、サラグラモスティム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ）、インスリン（遺伝子組換え体）、遺伝子組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセニン、ロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン（Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ）、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）遺伝子組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タ���チレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Ｚｅｍａｉｒａ）、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン（Ｔｒｉｃｏｍｉｎ）、遺伝子組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトラーゼ、遺伝子組換えインスリン、インターフェロンアルファ、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、遺伝子組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト遺伝子組換えＣ１エラスターゼ阻害剤、ラノテプラーゼ、遺伝子組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル、イカチバント、エカランチド、オミガナン、オーログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデリンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎ  ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、ディアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン、遺伝子組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン、インスリン（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−ｎ３、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト（Ｘｅｒｅｃｅｐｔ）、オペバカン、エイズバックス（ＡＩＤＳＶＡＸ）、ＧＶ−１００１、リンフォスキャン（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ）、ルスプルチド、ＭＰ５２、シプロイセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Ｉｎｓｅｇｉａ）、ビテスペン、ヒトトロンビン、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ）、テルリプレシン、ＥＵＲ−１００８Ｍ、遺伝子組換えＦＧＦ−Ｉ、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマンバーク阻害剤、ＸＭＰ−６２９、９９  ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、アルブフェロン（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）、ビファジックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ネミフィチド、ｒＡＡＴ、ＣＧＲＰ、ペグスネルセプト、サイモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（エリジェン（ｅｌｉｇｅｎ））、エキサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、ｒＮＡＰｃ２、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化遺伝子組換えスタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ  Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン、ＡＣＭ−９６０４、酢酸リナクロチド、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン（Ｈｅｍｏｓｐａｎ）、ＶＡＬ、速効性インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、インスリン（エリジェン）、遺伝子組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ、マルチカイン（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０、タラクトフェリン、ｒＥＶ−１３１、ｒＥＶ−１３１、遺伝子組換えヒトインスリン、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−ｌｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン（Ｔａｕｆｅｒｏｎ）、胆汁酸刺激リパーゼ、メリスパーゼ（Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ）、アラニン（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、遺伝子組換えヒトミクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、ＡＬＴＵ−１３５、遺伝子組換えノイラミニダーゼ、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、オスタボリン（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ）−Ｃ、ＰＴＨアナログ、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆ、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａ、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、遺伝子組換えペストＦ１Ｖ、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶｌ、Ｄｅｒ−ｐｌ／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７、ＰＲ１ペプチド抗原、変異型ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）、ＷＴ１−ペプチド、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン���ルピントリビル、レティキュロース、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的イムノトキシン、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７、Ｌ−１９ベースのＲａ、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨ、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、ＣＢＰ−５０１、遺伝子組換えヒトラクトフェリン、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ、ＯＧＰ−Ｉ、シフュビルタイド、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、サイモペンチン、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択性インスリン、スバリン、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経生長因子アンタゴニスト、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、テリパラチド（エリジェン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合、ＥＰ−１０４３、ｇｐＥ１、ｇｐＥ２、ＭＦ−５９、
ｈＰＴＨ（１−３４）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ−２３１９０、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、エンカスチム、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ、デスモプレシン、オネルセプト、及びＴＰ−９２０１である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ  ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、又はバイオシミラー及びバイオベターを含む他の任意の好適なポリペプチドである。
【００６８】
他の好適なポリペプチドは、以下及びＵＳ２０１６／００９７０７４の表１に一覧されるものである。
【００６９】
【表１−１】
2020505931.tif 000003
【表１−２】
2020505931.tif 000004
【表１−３】
2020505931.tif 000005
【００７０】
実施形態において、ポリペプチドは、表２に示されるような、ホルモン、凝血／凝固因子、サイトカイン／増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン、又はペプチドである。
【００７１】
【表２−１】
2020505931.tif 000006
【表２−２】
2020505931.tif 000007
【表２−３】
2020505931.tif 000008
【００７２】
実施形態において、タンパク質は、多重特異性タンパク質、例えば、表３に示されるような二重特異性抗体である。
【００７３】
【表３−１】
2020505931.tif 000009
【表３−２】
2020505931.tif 000010
【表３−３】
2020505931.tif 000011
【表３−４】
2020505931.tif 000012
【表３−５】
2020505931.tif 000013
【表３−６】
2020505931.tif 000014
【００７４】
【表４−１】
2020505931.tif 000015
【表４−２】
2020505931.tif 000016
【表４−３】
2020505931.tif 000017
【表４−４】
2020505931.tif 000018
【表４−５】
2020505931.tif 000019
【表４−６】
2020505931.tif 000020
【００７５】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、がん細胞によって発現される抗原である。いくつかの実施形態において、遺伝子組換え又は治療用ポリペプチドは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。いくつかの実施形態において、遺伝子組換え又は治療用ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９−Ｏアセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレティキュリン、カルボアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、癌種胚性抗原（ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）Ａ２（ＥｐｈＡ２）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングリオシドＧＤ３、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、糖タンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様増殖因子受容器１、ルイス−Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ−６、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソセリン、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）受容器ＩＩ型、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原、ＴＮＦ−アルファ前駆体、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、活性化受容体であり、並びに、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α４β１インテグリン、β２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤｌＯＯ、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭｌ（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳｌ（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＫＩＲの活性化型、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、１つ又は複数の天然細胞傷害性受容体、ＮＴＢ−Ａ、ＰＥＮ−５、及びそれらの組み合わせ、から選択され、場合により、β２インテグリンは、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８、又はＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８を含み、場合により、ＫＩＲの活性化型は、ＫｌＲ２ＤＳｌ、ＫＩＲ２ＤＳ４、又はＫＩＲ−Ｓを含み、並びに、場合により、天然細胞傷害性受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、又はＮＫｐ８０を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、阻害受容体であり、並びに、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−ｌ／ＣＤ８５ｊ、ＫＩＲの阻害型、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９、及びそれらの組み合わせから選択され、場合により、ＫＩＲの阻害型は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、又はＫＩＲ−Ｌを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、活性化受容体であり、並びにＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌイル−０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、阻害受容体であり、並びにＰＤ−１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈｌ（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００８０】
他の例示的タンパク質としては、これらに限定されるわけではないが、Ｌｅａｄｅｒら，「タンパク質治療：概要及び薬理学的分類（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００８，７：２１−３９（参照により本明細書に組み入れられる）の表１〜１０に記載される任意のタンパク質；又は任意のコンジュゲート、変異体、類似体、又は本明細書において説明される遺伝子組換えポリペプチドの機能的断片が挙げられる。
【００８１】
他の遺伝子組換えタンパク質生成物としては、非抗体スカホールド又は代替のタンパク質スカホールド、例えば、これらに限定されるわけではないが、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、及びアドネクチンなど、が挙げられる。そのような非抗体スカホールド又は代替のタンパク質スカホールドは、１つ又は２つ、又はそれ以上、例えば、１、２、３、４、又は５以上の異なる標的又は抗原を認識又は結合するように設計することができる。
【００８２】
一実施形態において、本明細書において説明される生成物、例えば、ポリペプチド、例えば、遺伝子組換えタンパク質などをコードする核酸配列を含むベクターは、さらに、選択マーカーをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、選択可能マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する耐性を付与する酵素；プロリン、又は抗生物質マーカー、例えば、抗生物質に対する耐性を付与する酵素、例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオシン、ピューロマイシン、又はブラストサイジンなどを含む。別の実施形態において、選択マーカーは、Ｓｅｌｅｘｉｓ選択系（例えば、Ｓｅｌｅｘｉｓ  ＳＡから市販されている、ＳＵＲＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）及びＳｅｌｅｘｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（商標））又はＣａｔａｌａｎｔ選択系を含むか、又はそれらと適合性である。
【００８３】
一実施形態において、本明細書において説明される遺伝子組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、本明細書において説明される遺伝子組換え生成物をコードする核酸を含む細胞の識別において有用な選択マーカーを含む。別の実施形態において、選択マーカーは、本明細書において説明されるように、ゲノムへの、遺伝子組換え生成物をコードする核酸配列の組込みを含む、細胞の識別において有用である。遺伝子組換えタンパク質をコードする核酸配列を統合した細胞の識別は、生成物を安定して発現する細胞又は細胞系の選択及び設計にとって有用であり得る。
付番された実施形態
【００８４】
本発明は、以下の付番されたパラグラフのいずれかにおいて定義され得る。
【００８５】
１．複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法であって、
ａ）複数の細胞を培養して、生成物を含む馴化培地を作製するステップであって、複数の細胞の少なくとも１つの細胞が、第１のアミノ酸配列、例えば、産生配列を含む生成物をコードする核酸配列を含む、ステップと；
ｂ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第１の試料を、第１の配列ベースの反応、例えば、タンパク質分解酵素による消化に供して（及び場合により、反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供して）、第１の反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を提供するステップと；
ｃ）第１の反応生成物に対する値、例えば、存在、移動度（例えば、飛行時間など）、又は分子量を、参照値、例えば、参照配列、例えば、第１のアミノ酸配列などに対する第１の配列ベースの反応の適用によって産生された反応生成物に対する値などと比較し、比較に応じて、さらなる分析、例えば、配列決定などのための反応生成物成分を選択するステップと；
ｄ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第２の試料を、第２の配列ベースの反応、例えば、第２のタンパク質分解酵素による消化に供して（及び場合により、反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供して）、第２の反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を提供するステップと；
ｅ）第２の反応生成物に対する値、例えば、存在、移動度（例えば、飛行時間など）、又は分子量を、参照値、例えば、参照配列、例えば、第１のアミノ酸配列などに対する第２の配列ベースの反応の適用によって産生された反応生成物に対する値などと比較し、比較に応じて、さらなる分析、例えば、配列決定などのための反応生成物成分を選択するステップと；
ｆ）場合により、生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第３の試料を、第３の配列ベースの反応、例えば、タンパク質分解酵素による消化に供して（及び場合により、反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供して）、第３の反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を提供するステップと；
ｇ）場合により、第３の反応生成物に対する値、例えば、存在、移動度（例えば、飛行時間など）、又は分子量を、参照値、例えば、参照配列、例えば、第１の配列などに対する第３の配列ベースの反応の適用によって産生された反応生成物に対する値などと比較し、比較に応じて、さらなる分析、例えば、配列決定などのための反応生成物成分を選択するステップと、
ｈ）場合により、ｃ）の結果並びに場合によりｅ）及び／又はｇ）の結果に応じて、第１のアミノ酸配列以外の配列が複数の細胞に存在するか否かを特定するステップと
を含み、それによって、複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法。
【００８６】
２．複数の細胞を培養して、生成物を含む第２の馴化培地を作製するステップと；第２の馴化培地でステップｂ〜ｈを実施するステップとをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【００８７】
３．複数の細胞を培養して、生成物を含む第３の馴化培地を作製するステップと；第３の馴化培地でステップｂ〜ｈを実施するステップとをさらに含む、パラグラフ２に記載の方法。
【００８８】
４．複数の細胞を培養して、生成物を含む後続の馴化培地、例えば、第Ｎ［ここでＮ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である］の馴化培地を作製するステップと；後続の馴化培地、例えば、第Ｎの馴化培地において、ステップｂ〜ｈを実施するステップとをさらに含む、パラグラフ３に記載の方法。
【００８９】
５．複数の馴化培養培地、馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地が、生成物の産生の異なる段階、例えば、生成物を産生する培養物の増殖の初期、中期、後期で、又は異なる細胞系産生段階で産生される、パラグラフ１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００９０】
６．複数の馴化培養培地、馴化培養培地、又は第２の馴化培養培地、第３の馴化培養培地、又は後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地が、複数の細胞の培養の異なる時点（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間の時点、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日の時点）で産生される、パラグラフ１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００９１】
７．
ｉ）ｈ）において馴化培養培地、馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地の１つに対して為された特定と、
ｉｉ）ｈ）において馴化培養培地、馴化培養培地、又は第２、第３若しくは後続の馴化培養培地、例えば、第Ｎの馴化培養培地の別の１つに関して為された特定と
を比較するステップを含む、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
８．第２の複数の細胞にステップａ〜ｈを実施するステップを含む、第２の複数の細胞を分析するステップをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【００９３】
９．第３の複数の細胞にステップａ〜ｈを実施するステップを含む、第３の複数の細胞を分析するステップをさらに含む、パラグラフ８に記載の方法。
【００９４】
１０．後続の複数の細胞、例えば、第Ｎ［ここでＮ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である］の複数の細胞にステップａ〜ｈを実施するステップを含む、後続の複数の細胞、例えば、第Ｎの複数の細胞を分析するステップをさらに含む、パラグラフ９に記載の方法。
【００９５】
１１．
ｉ）ｈ）において複数の細胞、第２、第３、又は後続の複数の細胞、例えば、第Ｎの複数の細胞の１つに対して為された特定と
ｉｉ）ｈ）において複数の細胞、第２、第３、又は後続の複数の細胞、例えば、第Ｎの複数の細胞の別の１つに関して為された特定と
を比較するステップを含む、パラグラフ８〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【００９６】
１２．各複数の細胞が、同じタイプの細胞、例えば、同じ種、同じ細胞系（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ）、又は細胞系における同じ分離株（例えば、ＣＨＯ細胞系における同じ分離株）を含む、パラグラフ８〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【００９７】
１３．複数の細胞の１つ又は複数、例えばそれぞれが、異なるタイプの細胞、例えば、異なる種、異なる細胞系（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ）、又は細胞系における異なる分離株（例えば、ＣＨＯ細胞系における異なる分離株）を含む、パラグラフ８〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【００９８】
１４．比較に応じて、例えば、第１のアミノ酸配列を含む生成物を産生するために、複数の細胞、例えば、第１のアミノ酸配列以外の配列を含む生成物を含まない複数の細胞を選択するステップを含む、パラグラフ１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【００９９】
１５．アミノ酸配列が、表１〜４から選択されるタンパク質生成物に対応する、パラグラフ１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
１６．ｂ）、ｄ）、及び場合によりｆ）が、ポリペプチドの試料を変性させるステップを含む、パラグラフ１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
１７．精製されたタンパク質を変性させるステップが、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下及び酸性ｐＨ（例えば、６．８、６．５、６．３、６、５．８、又は５．５のｐＨ）において精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含む、パラグラフ１６に記載の方法。
【０１０２】
１８．精製されたタンパク質を変性させるステップが、尿素及びデオキシコラートの存在下において精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含む、パラグラフ１６に記載の方法。
【０１０３】
１９．精製されたタンパク質生成物の消化の前に、デオキシコラートを溶液から沈殿させる、パラグラフ１８に記載の方法。
【０１０４】
２０．ｂ）の前、ｄ）の前、及び／又は場合によりｆ）の前に、デオキシコラートを溶液から沈殿させる、パラグラフ１９に記載の方法。
【０１０５】
２１．場合により反応生成物を、例えば質量分析などによる分離ステップに供する前に、デオキシコラートを溶液から沈殿させる、パラグラフ１９に記載の方法。
【０１０６】
２２．デオキシコラートを、酸の添加によって沈殿させる、パラグラフ１９〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１０７】
２３．ｂ）、ｄ）、及び／又は場合によりｆ）が、ＴＣＥＰによって精製されたタンパク質を還元するステップを含む、パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
２４．配列ベースの反応が、タンパク質分解酵素による消化である、パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１０９】
２５．タンパク質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、及びＡｓｐＮから選択される、パラグラフ２４に記載の方法。
【０１１０】
２６．１つ又は複数のステップが、ハイスループット試料処理にとって好適な機器において実施される、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
２７．１つ又は複数のステップが、９６ウェルプレートにおいて実施される、パラグラフ２６に記載の方法。
【０１１２】
２８．ｂ）、ｄ）、及び／又は場合によりｆ）が、場合により、ＬＣ／ＭＳを使用して、反応生成物、例えば、タンパク質分解断片を分析することを含む分離ステップを含む、パラグラフ１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０１１３】
２９．ｃ）、ｅ）、及び／又は場合によりｇ）が、比較によって識別された反応生成物、例えば、タンパク質分解断片の成分のアミノ酸配列を識別するステップを含む、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１１４】
３０．アミノ酸配列を識別するステップが、比較によって識別された反応生成物、例えば、タンパク質分解断片の成分にＭＳ／ＭＳを使用するステップを含む、パラグラフ２９に記載の方法。
【０１１５】
３１．自動化されている、パラグラフ１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
３２．ロボット設備を用いる、パラグラフ１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
３３．マイクロフルイディクスシステムを用いる、パラグラフ１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
３４．ｂ）、ｄ）、及び／又は場合によりｆ）の前に、生成物を含有する馴化培地から生成物を精製するステップをさらに含む、パラグラフ１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１１９】
３５．生成物を精製するステップが、クロマトグラフィーを使用するステップを含む、パラグラフ３４に記載の方法。
【０１２０】
３６．設備からの残存する汚染を除去するための洗浄プロトコールを含む、パラグラフ１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
３７．洗浄プロトコールが、ＬＣ／ＭＳを使用してブランク試料を分析するステップを含む、パラグラフ３６に記載の方法。
【０１２２】
３８．洗浄プロトコールが、酸性溶液及び高有機溶液の交互の洗浄を含む、パラグラフ３６に記載の方法。
【０１２３】
３９．洗浄プロトコールが、複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法と並行して実施することができる、パラグラフ３６又は３８のどちらかに記載の方法。
【０１２４】
４０．洗浄プロトコールが、複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法の経過時間を増加させない、パラグラフ３９に記載の方法。
【０１２５】
４１．洗浄プロトコールを、複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法と並行して実施することにより、方法の経過時間を少なくとも約５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮する、パラグラフ３９に記載の方法。
【０１２６】
４２．洗浄プロトコールを、複数の細胞を分析する方法、複数の細胞又は複数の細胞によって作製されたポリペプチドを使用する方法と並行して実施することにより、洗浄ステップに費やされた追加の時間を少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮する、パラグラフ３９に記載の方法。
【０１２７】
４３．パートｈ）において検出された第１のアミノ酸配列以外の配列の免疫原性を評価するステップをさらに含む、パラグラフ１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
４４．免疫原性を評価するステップが、パートｈ）において検出された第１のアミノ酸配列以外の配列を、インシリコ免疫原性ツール、例えば、Ｅｐｉｂａｓｅを使用して評価するステップを含む、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１２９】
４５．タンパク質配列変異体を検出する方法であって、
ａ）細胞集団を提供するステップであって、細胞がタンパク質生成物を産生する、ステップと；
ｂ）細胞集団からのタンパク質生成物を精製するステップと；
ｃ）質量分析による分析のために精製されたタンパク質生成物を調製するステップと；
ｄ）調製された精製されたタンパク質生成物を質量分析法によって分析するステップと；
ここでａ）〜ｄ）は、複数の（例えば、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、又はそれ以上）の細胞集団に対して、同時に又は逐次的に繰り返され；
ｅ）複数の細胞集団からの質量分析データと、質量分析データのデータベースとを比較するステップ
を含み、それにより、タンパク質配列変異体を検出する方法。
【０１３０】
４６．複数の細胞集団が、生成物の産生における異なる段階、例えば、生成物を産生する培養物の増殖の初期、中期、後期で、又は異なる細胞系製造段階で産生される、パラグラフ４５に記載の方法。
【０１３１】
４７．複数の細胞集団が、複数の細胞の培養の異なる時点（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間の時点、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日の時点）で産生される、パラグラフ４５に記載の方法。
【０１３２】
４８．各細胞集団が、同じタイプの細胞、例えば、同じ種、同じ細胞系（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ）、又は細胞系における同じ分離株（例えば、ＣＨＯ細胞系における同じ分離株）を含む、パラグラフ４５に記載の方法。
【０１３３】
４９．細胞集団の１つ又は複数、例えばそれぞれが、異なるタイプの細胞、例えば、異なる種、異なる細胞系（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ）、又は細胞系における異なる分離株（例えば、ＣＨＯ細胞系における異なる分離株）を含む、パラグラフ４５に記載の方法。
【０１３４】
５０．ｅ）に応じて、例えば、生成物を産生するために、細胞集団、例えば、タンパク質配列変異体を含まない細胞集団を選択するステップを含む、パラグラフ４５〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
５１．タンパク質生成物が、表１〜４から選択される遺伝子組換え又は治療用タンパク質である、パラグラフ４５〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
５２．ｃ）が、精製されたタンパク質を変性させるステップを含む、パラグラフ４５〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
５３．精製されたタンパク質を変性させるステップが、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下及び酸性ｐＨ（例えば、６．８、６．５、６．３、６、５．８、又は５．５のｐＨ）において精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含む、パラグラフ５２に記載の方法。
【０１３８】
５４．精製されたタンパク質を変性させるステップが、尿素及びデオキシコラートの存在下において精製されたタンパク質をインキュベートするステップを含む、パラグラフ５２に記載の方法。
【０１３９】
５５．精製されたタンパク質生成物の消化の前に、デオキシコラートを溶液から沈殿させる、パラグラフ５４に記載の方法。
【０１４０】
５６．ｄ）の前に、デオキシコラートを溶液から沈殿させる、パラグラフ５４に記載の方法。
【０１４１】
５７．デオキシコラートを、酸の添加によって沈殿させる、パラグラフ５４〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
５８．ｃ）が、ＴＣＥＰによって精製されたタンパク質を還元するステップを含む、パラグラフ４５〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
５９．ｃ）が、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｓｐＮによって精製されたタンパク質を消化するステップを含む、パラグラフ４５〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
６０．ｃ）が、精製されたタンパク質の複数のアリコートを形成するステップと、複数のプロテアーゼによってアリコートを消化するステップとを含み、この場合、各アリコートが、異なるプロテアーゼによって消化され、プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｓｐＮから選択される、パラグラフ５９に記載の方法。
【０１４５】
６１．消化の後に、複数のアリコートが一緒に混合される、パラグラフ６０に記載の方法。
【０１４６】
６２．ｃ）が、ハイスループット試料処理にとって好適な機器において実施される、パラグラフ４５〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
６３．ｃ）が、９６ウェルプレートにおいて実施される、パラグラフ６２に記載の方法。
【０１４８】
６４．ｄ）が、調製された精製されたタンパク質生成物をＬＣ／ＭＳを使用して分析するステップを含む、パラグラフ４５〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４９】
６５．ｅ）が、複数の細胞集団のデータと質量分析データベースとの比較分析によって、存在量の変化を示すペプチドを識別するステップを含む、パラグラフ４５〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
６６．ｅ）が、存在量の変化を示すペプチドをＭＳ／ＭＳによって分析するステップと、ＭＳ／ＭＳのデータをＭＳ／ＭＳのデータベースと比較することによって配列変化を識別するステップとをさらに含む、パラグラフ６５に記載の方法。
【０１５１】
６７．自動化されている、パラグラフ４５〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
６８．ロボット設備を用いる、パラグラフ４５〜６７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
６９．マイクロフルイディクスシステムを用いる、パラグラフ４５〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
７０．ｂ）が、クロマトグラフィーを使用してタンパク質生成物を精製するステップを含む、パラグラフ４５〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
７１．ｄ）が、残存する汚染を除去するための洗浄プロトコールを含む、パラグラフ４５〜７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
７２．洗浄プロトコールが、ＬＣ／ＭＳを使用してブランク試料を分析するステップを含む、パラグラフ７１に記載の方法。
【０１５７】
７３．洗浄プロトコールが、酸性溶液及び高有機溶液の交互の洗浄を含む、パラグラフ７１に記載の方法。
【０１５８】
７４．洗浄プロトコールが、タンパク質配列変異体を検出する方法と並行して実施することができる、パラグラフ７１又は７３のどちらかに記載の方法。
【０１５９】
７５．洗浄プロトコールが、タンパク質配列変異体を検出する方法の経過時間を増加させない、パラグラフ７４に記載の方法。
【０１６０】
７６．洗浄プロトコールを、タンパク質配列変異体を検出する方法と並行して実施することにより、方法の経過時間を少なくとも約５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮する、パラグラフ７４に記載の方法。
【０１６１】
７７．洗浄プロトコールを、タンパク質配列変異体を検出する方法と並行して実施することにより、洗浄ステップに費やされた追加の時間を少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％短縮する、パラグラフ７４に記載の方法。
【０１６２】
７８．検出されたタンパク質配列変異体の免疫原性を評価するステップをさらに含む、パラグラフ４５〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
７９．検出されたタンパク質配列変異体の免疫原性を評価するステップが、インシリコ免疫原性ツール、例えば、Ｅｐｉｂａｓｅなどを使用してタンパク質配列変異体を評価するステップを含む、パラグラフ７８に記載の方法。
【０１６４】
８０．以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数を識別、評価、又は予測するために、ポリペプチドの第１、第２、及び／又は第３の試料を追加の分析に供するステップをさらに含む、パラグラフ１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
８１．複数の細胞中に第１アミノ酸配列以外の配列が存在する場合、以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数を識別、評価、又は予測するために、第１アミノ酸配列以外の配列を追加の分析に供する、パラグラフ１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
８２．
ｆ）以下：免疫原性；タンパク質凝集；脱アミド化；アスパラギン酸の異性化及び断片化；Ｃ末端リシンのプロセシング；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ応答、半減期、及びプロテインＡ精製；遊離システインチオール基；等電点；リシンの糖化；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化；Ｎ末端環化；酸化；又はピログルタマート形成の１つ又は複数を識別、検出、評価、又は予測するために、検出されたタンパク質配列変異体（単数及び複数）を分析するステップ
をさらに含む、パラグラフ４５〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
８３．パラグラフ４５〜７９のいずれか１つにおいて検出されるタンパク質配列変異体を分析する方法であって、以下：免疫原性を評価して、タンパク質凝集、例えば、タンパク質凝集の性向を予測するステップ；脱アミド処理を評価するステップ；アスパラギン酸異性化及び断片化を検出するステップ；Ｃ末端リシンのプロセシングを検出するステップ；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ反応、半減期、及びプロテインＡ精製を予測／評価するステップ；遊離システインチオール基を検出するステップ；等電点を評価して、リシングリケート化を検出するステップ；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化を識別するステップ；Ｎ末端環化を検出するステップ；酸化を検出するステップ；又はピログルタマート形成を検出するステップの１つ又は複数を含む、方法。
【０１６８】
８４．配列、例えば、パラグラフ１〜４４において識別されるような第１配列以外の配列を分析する方法であって、以下：免疫原性を評価して、タンパク質凝集、例えば、タンパク質凝集の性向を予測するステップ；脱アミド処理を評価するステップ；アスパラギン酸異性化及び断片化を検出するステップ；Ｃ末端リシンのプロセシングを検出するステップ；Ｆｃ  ＡＤＣＣ／ＣＤＣ反応、半減期、及びプロテインＡ精製を予測／評価するステップ；遊離システインチオール基を検出するステップ；等電点を評価して、リシングリケート化を検出するステップ；Ｎ−グリコシル化及び／又はＯ−グリコシル化を識別するステップ；Ｎ末端環化を検出するステップ；酸化を検出するステップ；又はピログルタマート形成を検出するステップの１つ又は複数を含む、方法。
【０１６９】
８５．複数の細胞を分析する方法であって、
ａ）複数の細胞を培養して、生成物を含む馴化培地を作製するステップであって、複数の細胞の少なくとも１つの細胞が、生成物をコードする核酸配列を含み、生成物が、第１のアミノ酸配列を含む、ステップと；
ｂ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第１の試料を、第１の配列ベースの反応に供して、第１の反応生成物を提供するステップと；
ｃ）第１の反応生成物に対する値を参照値と比較し、比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｄ）生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第２の試料を、第２の配列ベースの反応に供して、第２の反応生成物を提供するステップと；
ｅ）第２の反応生成物に対する値を参照値と比較し、比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと；
ｆ）場合により、生成物を含む馴化培地からのポリペプチドの第３の試料を、第３の配列ベースの反応に供して、第３の反応生成物を提供するステップと；
ｇ）場合により、第３の反応生成物に対する値を参照値と比較し、比較に応じて、さらなる分析のための反応生成物成分を選択するステップと、
ｈ）ｃ）の結果並びに場合によりｅ）及びｇ）の結果に応じて、第１のアミノ酸配列以外の配列が複数の細胞に存在するか否かを特定するステップと
を含み、
それによって、複数の細胞を分析する、方法。
【０１７０】
８６．タンパク質配列変異体を検出する方法であって、
ａ）細胞集団、例えば、複数の細胞を含む培養培地からの精製されたタンパク質生成物を提供するステップであって、細胞が、タンパク質生成物を産生する、ステップと；
ｂ）精製されたタンパク質生成物を質量分析法によって分析するステップと；
ここでａ）〜ｂ）は、同じ細胞集団又は異なる細胞集団内の複数の試料に対して、同時に又は逐次的に繰り返され；並びに
ｃ）複数の試料からの質量分析データと、質量分析データのデータベースとを比較することによって、複数の試料内におけるタンパク質配列変異体を検出するステップと
を含み、
それによって、タンパク質配列変異体を検出する、方法。
【０１７１】
８７．試料がアリコートである、パラグラフ１〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０１７２】
８８．パラグラフ１〜８７のいずれか１つの方法の複数の細胞によって作製されたポリペプチド。
【０１７３】
例示
例１：序論、定義、パラメータ、材料、及び方法
タンパク質配列変異体は、ゲノムヌクレオチド変化又は翻訳誤取込みの結果として生じ得る、意図されないアミノ酸配列変化である。系統的スクリーニングは、生物製剤の良好な製造のための細胞系構築プロセスの必須の分析構成要素として台頭しつつある。
【０１７４】
配列変異体を生成させるための発現システムの性向を理解することは、効果的なリスク緩和戦略を可能にする。暫定的な誤取込み率を、ＧＳ−ＣＨＯ  Ｘｃｅｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）に対して調べた。誤取込みのメカニズム並びに初期及び後期世代番号における細胞系安定性との相関を調査した。方法の能力を、抗体生成物内の異なる位置における配列変異体に対する検出限界の変動性に関して検討した。
【０１７５】
【表５】
2020505931.tif 000021
【０１７６】
定義：
ＰＳＶＡ−タンパク質配列変異体分析
ＲＰ−ＬＣ−ＭＳ−逆相液体クロマトグラフィー質量分析法
ＬＯＤ−検出限界
ＤＤＡ−データ依存型取得
ＭＶＡ−多変量解析
ＰＳＭ−ペプチドスペクトルマッチ
ＦＤＲ−偽発見率
ＡＣＮ−アセトニトリル
ＦＡ−ギ酸
ＴＦＡ−トリフルオロ酢酸
ＮＬ−正規化された強度レベル
ＭＳ１−質量分析データ（ペプチドマスフィンガープリンティング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎ）のために使用される）
ＭＳ２−タンデム質量分析データ（質量分析計によるペプチドのデータ依存型断片化）
ＬＣ−ＭＳＥ−データ非依存型断片化による液体クロマトグラフィー質量分析法
ＴＩＣ−全イオンクロマトグラム
ＥＩＣ−抽出イオンクロマトグラム
ｍ／ｚ−質量電荷比
ｚ−電荷
ＲＣＦ−相対遠心力
【０１７７】
設備：
Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴＯＦ質量分析計システム（メンテナンスＮｏ．２７０４２０及び２７１５５０）
Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計システム（メンテナンスＮｏ．３０９２０２及び３０９２０３）
【０１７８】
ソフトウェア：
ＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ４．１
ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ  １．２
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ６．８
Ｔｕｎｅ  ２．０
Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ
ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）
【０１７９】
材料
リツキシマブ  バッチＢ６０２６Ｂ０１、１０ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
リツキシマブ  バッチＨ００１７Ｂ０１、１０ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
ハーセプチン  バッチ８２２６０１、２１ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
トラスツズマブのバイオシミラー候補  バッチＰ２０５０４００６、４．７ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
ｃＢ７２．３  バッチＬ２２６６１／Ｂ１０、１０．５ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
細胞系２Ａ６のためのｃＢ７２．３細胞培養上清（初期フェーズ及び後期フェーズ）、１Ａ１２、３Ｃ１０、３Ｃ１２、２Ｆ７、Ｅ２２、−２０℃で保存
リツキシマブのバイオシミラー候補  バッチ２１３９７６ＡＲＳ、４９．３ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
部位特異的抗体コンジュゲートコンストラクトトラスツズマブＬＣ  Ｔ１８０Ｃ、ＨＣ  Ｓ１６０Ｃ及びＫ２１７Ｒ、０．５７ｍｇ／ｍｌ、５±３℃で保存
部位特異的抗体コンジュゲートコンストラクトトラスツズマブＬＣ  Ｔ１８０Ｃ、ＨＣ  Ｓ１６０Ｃ、及びＫ２１７Ｒ、１８．７ｍｇ／ｍｌ、−６５℃以下で保存
【０１８０】
方法：
方法の概要は、以下の通りである：
・タンパク質試料を水中での≦１０ｍｇ／ｍｌに希釈する。
・Ｓｐｅｅｄｖａｃ０．１２ｍｇの試料アリコートを乾固させる。
・各試料を９０μｌの変性緩衝液（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に再溶解させる。
・試料をインキュベートする。
・試料当たり１つのＺｅｂａ回転脱塩処理カラムを用意する。
○１５００ｇにおいて１分間の遠心分離によって保存液を除去する。
○樹脂床の上部に３００μｌの消化緩衝液を加え、１５００ｇにおいて１分間遠心分離する。
○カラム平衡を２回繰り返す。
○各試料の総量をコンパクトな樹脂床の中央に適用する。１５００ｇにおいて２分間遠心分離し、カラム溶離液を保持する。
・各試料７５μｌに、試料あたり２５μｌのトリプシン消化液及びブランクを加え、ボルテックスによって混合する。試料を、３０±２℃において１９５±１０分間インキュベートする。
・各試料に２μｌのＴＦＡを加え、ボルテックスする。
・試料をｂｅｎｃｈｔｏｐ遠心分離機において、１４，０００ｒｃｆにおいて１０分間遠心分離する。
・分析のために上清を取り除く。
・ＬＣ−ＭＳによって分析する。
【０１８１】
例２：試料調製
複数の酵素による非依存性タンパク質消化を含み、並びに分析の前に、不活性化された消化物を組み合わせる、ワークフローを、タンパク質配列変異体分析のために選択した。別々の多酵素消化物を利用する有益性としては、
・所定のタンパク質のための最小限の方法最適化において冗長タンパク質配列カバー率を得る。
・各消化物からのペプチド配列のオーバーラップを使用する、配列変異体の非依存性の確認及び定量化。
・断片化選択性の差を利用するペプチド断片化からの最大化された配列確認。
が挙げられる。
この検討において評価されるプロテアーゼは：トリプシン、ｌｙｓＣ、キモトリプシン、及びａｓｐＮであった。トリプシン、キモトリプシン、及びａｓｐＮは、酵素の相補特異度により、初期評価のために選択した。消化条件の最適化を、選択されたプロテアーゼに対して実施した。試料を、ＭｉｌｌｉＱ水で≦１０ｍｇ／ｍｌに希釈する。希釈した各タンパク質試料のレプリケート０．１２ｍｇのアリコートを、ランダマイズされた順番において９６ウェルプレートに位置する。試料をＳｐｅｅｄＶａｃにおいて乾固するまで濃縮する。９０μｌの変性緩衝液を各試料に加え、プレートをインキュベートする。Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅｓ、９６ウェル、７Ｋを、製造元の取扱説明書に従って、尿素ベースの消化緩衝液で平衡させる。各変性された試料の全量を脱塩プレートに移し、１０００ｇにおいて２分間回転させる。各試料のアリコートを、特異的消化（例えば、トリプシン性、キモトリプシン性、ａｓｐＮ、ＬｙｓＣ）のために、別々のプレートに移す。制御された時間及び温度において、プロテアーゼ比に対して特異的酵素において消化を実施する。反応を、２％のＴＦＡを加えることによってクエンチする。
【０１８２】
消化の最適化
ＰＳＶＡに対する消化の適性を評価するために、以下の消化属性を特定した：
・完了（４つ以上の未切断を有する残留未消化ペプチドなし）
不完全消化は、分析の定量的能力に影響を及ぼす。
・再現性
ペプチドマップにおける変動は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩソフトウェアによる配列変異体の比較分析及び有効な識別に影響を及ぼし得る。
・１００％の配列カバー率の提供
不完全な消化、配列カバー率、及びペプチドの溶解度を評価することによって、消化に対する尿素モル濃度及び温度の効果を評価した。消化効率に影響を及ぼす尿素の低濃度（可能なペプチド溶解度の問題に並んで）では、抗体の再フォールディングが生じ得る。
【０１８３】
３つの異なる分子、リツキシマブ、トラスツズマブ、及びｃＢ７２．３を使用して、消化条件の最適化を実施した。
【０１８４】
０．１Ｍのトリスヒドロクロリド、尿素、並びに還元されたシステインを維持するための１ｍＭのＴＣＥＰを含有する消化緩衝液を使用して、一晩かけて消化を実施した。緩衝液のｐＨは、８であり、これは、それぞれの評価された酵素の最適活性に対してｐＨ範囲に収まる。以下の条件を、最適化プロセスの一部として評価した：
・尿素モル濃度：０．５Ｍ、１Ｍ、及び２Ｍ
・インキュベーション温度：２５℃、３０℃、及び３７℃
【０１８５】
トリプシン
尿素モル濃度（０．５Ｍ、１Ｍ、及び２Ｍ）及び温度（２５℃、３０℃、及び３７℃）を変量して、トリプトシン性消化を実施した。一晩かけてインキュベーションを実施し、酵素とタンパク質の比は１：２０であった。
【０１８６】
クロマトグラムの目視検査において、未消化のタンパク質の証拠のないことが観察された（図２）。単一の未切断に対して達成された≧９７％の配列カバー率は、自動化された検索によって検出されなかったジペプチドのみによって可能であった。
【０１８７】
不完全な消化によって生成されたペプチド（１つ以上の未切断を有するペプチド）の数を比較することによって、消化の効率も評価した。０．５Ｍの尿素における２５℃での消化に対して、未切断の最小集団が観察された（図３）。
【０１８８】
さらに、抗体再フォールディングの場合に影響を受けることが知られている重鎖ペプチドＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫを使用して、消化に対する尿素モル濃度の効果を評価した。ペプチドの正規化された強度を、全ての条件に対して比較した（図４）。
【０１８９】
クロマトグラムのプロットの目視検査によって、各条件に対する消化の再現性を評価した。各条件に対して、匹敵するクロマトグラムが観察された。
【０１９０】
キモトリプシン
尿素モル濃度（０．５Ｍ、１Ｍ、及び２Ｍ）及び温度（２５℃、３０℃、及び３７℃）を変量して、キモトリプシン性消化を実施した。一晩かけてインキュベーションを実施し、酵素とタンパク質の比は１：２０であった。
【０１９１】
全ての評価条件に対して、満足できる消化効率が達成された。クロマトグラムの目視検査において、未消化のタンパク質の証拠のないことが観察された（図５）。単一の未切断に対して達成された≧９５％の配列カバー率は、自動化された検索によって網羅されなかったジペプチドのみによって可能であった。
【０１９２】
トラスツズマブの不完全な消化から生成される大きい重鎖ペプチド：
Ｙ１９−２８  ＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷ
の強度を比較することによって、消化効率も評価した。
【０１９３】
検出されなかったため、０．５Ｍの尿素における２５℃での条件に対して、この誤切断ペプチドの最小の存在量（より効率的な消化を示す）が観察された（図６及び図７）。
【０１９４】
ＡｓｐＮ
尿素モル濃度（０．５Ｍ、１Ｍ、及び２Ｍ）を変量して、ＡｓｐＮ消化を実施した。１：４０の酵素とタンパク質の比を使用して、３７℃で一晩かけてインキュベーションを実施した。温度上昇及び長いインキュベーション時間により、試料のいくらかの蒸発が観察され、これは、消化緩衝液の組成に影響を及ぼしたであろう。未消化タンパク質を表す大きなピークが検出され、これは、消化プロセスの効率が悪いことを示している。２Ｍの尿素における未消化物質の存在量は、１Ｍ又は０．５Ｍの尿素より高かった（図８及び図９）。ＰＳＶＡ試料調製のための消化酵素の１つとしてＡｓｐＮを組み入れる前に、手順を最適化しなければならない。１Ｍ未満の尿素濃度を使用し、Ａｓｐ−Ｎの活性を増加させるための酢酸亜鉛の添加の効果を評価することにより、さらなる最適化を実施することができた。この時、消化手順の一部としてこれを進めないことを決定し、したがって、試料調製手順の一部として含めなかった。
【０１９５】
複合消化物
０．５Ｍの尿素におけるトリプシン及びキモトリプシンによる非依存性タンパク質分解によって、トラスツズマブ試料のトリプシン性／キモトリプシン性複合消化物を調製した。１：２０の酵素とタンパク質の比において、２５℃で一晩かけてインキュベーションを実施した。２％のＴＦＡによって消化をクエンチし、消化物を組み合わせた。標準及びナノフロー構成の両方を用いる２つのＬＣ−ＭＣシステムを使用して試料を分析した。
【０１９６】
Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏＦによるＲＰ−ＬＣ−ＭＳ１分析に対する複合トリプシン性及びキモトリプシン性消化物に対して、完全配列カバー率が達成された。
【０１９７】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＦｕｓｉｏｎによるｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２分析により、複合トリプシン性及びキモトリプシン性消化物に対して、不完全な配列カバー率が得られた。ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏによるトラスツズマブ消化物の分析は、結果として、軽鎖に対して１００％のＭＳ２カバー率及び重鎖に対して９９％のカバー率をもたらした。１つのトリペプチド及び１つの単一の残基ペプチドが、重鎖において検出されなかった（図１０）。
【０１９８】
ナノフローＬＣの適用は、分析カラムの前に、Ｃ１８トラッピングカラムにおいて分析物を捕獲するステップを伴う。小さいペプチド（通常、５アミノ酸残基未満）はこのカラムに保持されない。同様に、適切なペプチドのサイズが、ＭＳ２データによる配列確認に必要である。
【０１９９】
トリプシン及びキモトリプシンによる一晩の消化は、小さいペプチドを生成させ、これは、結果として、タンパク質配列のいくつかの領域に対して不完全なカバー率を生じる。さらに、キモトリプシンの幅広い活性は、部位Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｓｐ、及びＧｌｕにおいて高い切断率と、並びに、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＬｅｕにおいて予想される消化に加えていくつかの非特異的消化をもたらした。現在の消化ワークフローは、ｎａｎｏＬＣの適用にとって不適切であると特定された。
【０２００】
ナノフロー構成にとって適切なペプチドの集団を生成させるために、消化ワークフローを変更した。トリプシン及びキモトリプシンに加えて、ＬｙｓＣプロテアーゼを導入した。非特異的消化を最小限に抑えるために、消化時間を１９５分に短縮した。新しい消化手順により、トラスツズマブ配列の１００％が、ＰＥＡＫＳ  ｓｔｕｄｉｏによって検出された（図１１）。
【０２０１】
例３：ＬＣ−ＭＳ分析
タンパク質配列変異体分析（ＰＳＶＡ）の原理は、多変量解析の応用及びＭＳ２分析による有意に異なる種の識別による、タンパク質ペプチドマップの比較スクリーニングである。
【０２０２】
良好な方法を作り出すためには、様々な要因を考察する必要がある。ＰＳＶＡは、細胞系構築段階に対して行われ、そのため、ロバストなハイスループット法であることが必要である。再現可能なクロマトグラフィー、各クロマトグラフピークに対する包括的なＭＳ１特徴付け、及び最小限の試料の残存は、統計的分析にとって重要である。ＰＳＶＡは、低レベルでの変異体の検出に依拠し、したがって、感度及び広いダイナミックスキャンレンジも重要である。ＭＳ２による配列カバー率は、推定上の変異体の識別にとって必要な場合には、さらなる標的化された断片化を伴う正確で迅速な検出に依存する。
【０２０３】
ナノフローＬＣに対して、通常の低ミリリットル／分フローのＵＨＰＬＣは、高い再現性の有益性を有し、残存の傾向があまりない。
【０２０４】
モデルは、ＬＣパラメータのセットに関連する、ピーク容量、ピーク形状、及び感度を記述する出力方程式を使用するアプリケーションに依存する分離技術の適応を可能にする。モデルは、ハイスループットタンパク質配列変異体分析にとって好適な短いＬＣ法を開発するために使用した。定義された品質パラメータを満たすために必要な最小限の勾配長に対して、この方法を再計算した。
【０２０５】
例４：方法概要
試料調製
・タンパク質試料を水中における≦１０ｍｇ／ｍｌに希釈する。
・各試料の複製アリコートを、ランダマイズされた順番において９６ウェルプレート上に位置する。
・試料をＳｐｅｅｄＶａｃにおいて乾固するまで濃縮する。
・９０μｌの変性緩衝液を各試料に加える。
・試料をインキュベートする。
・Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅｓ、９６ウェル、７Ｋを、製造元の取扱説明書に従って調製する。
○保存緩衝液を除去するために、１０００×ｇにおいて２分間、プレートを遠心分離する。通過画分を捨てる。
○２５０μｌの消化緩衝液を樹脂床の上部に加える。１０００×ｇにおいて２分間、遠心分離を実施し、通過画分を捨てる。ステップを合計で４回実施する。
○各試料の総量をコンパクトな樹脂床の中央に加える。
○処理された試料を収集するために、プレートアセンブリを１０００×ｇにおいて２分間遠心分離する。
・トリプシン性及びキモトリプシン性消化のために、２つの２５μｌのアリコートを取る。
・全ての消化を、１：２０の酵素とタンパク質の比において実施する。特異的タンパク質分解のために、０．２ｍｇ／ｍｌの酵素の８．３μｌをアリコートの各セットに加える。
・試料をインキュベートする。
・全ての消化を、３つの希釈のＴＦＡのうちの１つの２μｌによって別々にクエンチする。
【０２０６】
ＬＣ−ＭＳ分析
・Ｃ１８トラッピングカラム及びｅａｓｙ−ｓｐｒａｙ用ＰｅｐＭａｐカラム、Ｃ１８、２μｌ、１００Ａ、７５ｃｍ×７５ｃｍによるナノフロー構成においてＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎを使用して試料を分析する。
・移動相Ａ及び５〜４０％の勾配の溶媒Ｂを使用して、溶解を実施する。
・データ取得を実施する。
・８０％のＡＣＮ及び１０％のＦＡの交互の洗浄を使用するクリーニング手順を方法に統合し、結果として、各試料注入後に実施する。
【０２０７】
変異体識別及びターゲットＭＳ２分析
洗練されたＭＶＡデータは、各特徴の発現プロファイルの調査により手作業で評価されるであろう。特徴のリストは、利用可能であれば、Ｐｅａｋｓ  Ｓｔｕｄｉｏ  ＭＳ２データのインポートによって識別され得る。ターゲットＭＳ２分析が必要な場合、保持時間窓を伴うｍ／ｚ値のリストがエクスポートされる。識別された変異体は、評価され、報告されるであろう。
【０２０８】
例５：インターアッセイコントロール及びシステム適性試験
低レベルの配列変異体を効果的に検出するため、各分析の際に適切な計器感度が達成されるのを確保するために制御手段が適所にあるべきである。提案されるインターアッセイコントロールは、方法のＬＯＤに一致する１％のレベルでの配列変異体と共に添加された消化Ｂ７２．３  ＩｇＧ４分子からなるであろう。
【０２０９】
ＣＨＯ細胞において発現される遺伝子組換え抗体において生じることが報告される変異に対して、文献調査を実施した。結果に基づいて、Ｂ７２．３消化物に対して予想される２つのトリプトシン性ペプチド及び１つのキモトリプシン性ペプチドを選択し、ケンブリッジペプチド（ＧＰＲ（ｓｕｂＳ）ＶＦＰＬＡＰＣＳＲ、ＶＤＮＡＬＱＳＧＳ（ｓｕｂＮ）ＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ，ＴＡＤＫＳＳＲ（ｓｕｂＳ）ＴＡＹ）によって、アミノ酸誤取込みを含む対応するペプチドを合成した。このペプチドを使用して、ＩＡＣ試料を調製することができる。
【０２１０】
以下のタンパク質変異が文献において報告されている：
・Ｐｈｅ→Ｌｅｕ  １１ｒｅｓ  Ｆ１１Ｌ
Ｚｅｃｋ  Ａ，Ｒｅｇｕｌａ  ＪＴ，Ｌａｒｒａｉｌｌｅｔ  Ｖ，Ｍａｕｔｚ  Ｂ，Ｐｏｐｐ  Ｏ，Ｇｏｐｆｅｒｔ  Ｕ，ら（２０１２）  「遺伝子組換えタンパク質の低レベル配列変異体分析：最適化された手法（Ｌｏｗ  Ｌｅｖｅｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ａｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（７）：  ｅ４０３２８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４０３２８
Ｄｏｒａｉ  Ｈ，Ｓａｕｅｒｗａｌｄ  Ｔ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ａ，Ｋｙｕｎｇ  ＹＳ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｊ，ら（２００７）  「生成物の微小不均一性の調査（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）」Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ  ５：６６〜７２頁
・Ｇｌｙ→Ａｌａ  ＬＣ  Ｇ４０Ａ
「ＴＬ０１１軽鎖変異体の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＬ０１１  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔ）」，Ｌｏｎｚａ  ｒｅｐｏｒｔ  Ｒ０４７６０
・Ｔｙｒ→Ｇｌｎ  ＨＣ  Ｙ３７６Ｑ
Ｈａｒｒｉｓ  ＲＪ，Ｍｕｒｎａｎｅ  ＡＡ，Ｕｔｔｅｒ  ＳＬ，Ｗａｇｎｅｒ  ＫＬ，Ｃｏｘ  ＥＴ，ら（１９９３）  「産生細胞系における遺伝的異種性の評価：遺伝子組換え抗体におけるＧｌｎ配列変異体への低レベルのＴｙｒのペプチドマッピングによる検出（Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｌｏｗ  ｌｅｖｅｌ  Ｔｙｒ  ｔｏ  Ｇｌｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２９３〜１２９７頁
・Ｓｅｒ→Ａｒｇ  ＬＣ  Ｓ１６７Ｒ
・Ｓｅｒ→Ａｓｎ  ＨＣ  Ｓ６３Ｎ
Ｇｕｏ  Ｄ，Ｇａｏ  Ａ，Ｍｉｃｈｅｌｓ  ＤＡ，Ｆｅｅｎｅｙ  Ｌ，Ｅｎｇ  Ｍ，ら（２０１０）  「チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現される遺伝子組換えモノクローナル抗体における意図されないアミノ酸配列変化のメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｕｎｉｎｔｅｎｄｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）  ｃｅｌｌｓ）」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０７：１６３〜１７１頁
・Ａｓｎ→Ｓｅｒ  複数の部位
Ｋｈｅｔａｎ  Ａ，Ｈｕａｎｇ  ＹＭ，Ｄｏｌｎｉｋｏｖａ  Ｊ，Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  ＮＥ，Ｗｅｎ  Ｄ，ら（２０１０）    「ＣＨＯ細胞を使用する抗体製造の際のアスパラギンに対するセリンの誤取込みの制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆ ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｆｏｒ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ）」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０７：１１６〜１２３頁
Ｗｅｎ  Ｄ，Ｖｅｃｃｈｉ  ＭＭ，Ｇｕ  Ｓ，Ｓｕ  Ｌ，Ｄｏｌｎｉｋｏｖａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  「チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現される遺伝子組換えタンパク質におけるアスパラギン位置でのセリンの誤取込みの発見及び調査（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ａｔ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）」  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３２６８６〜３２６９４頁
・Ｓｅｒ→Ａｓｎ  複数の部位
Ｙｕ  ＸＣ，Ｂｏｒｉｓｏｖ  ＯＶ，Ａｌｖａｒｅｚ  Ｍ，Ｍｉｃｈｅｌｓ  ＤＡ，Ｗａｎｇ  ＹＪ，Ｌｉｎｇ  Ｖ（２００９）  「高解像度質量分析法による遺伝子組換えモノクローナル抗体におけるアスパラギン誤訳へのコドン特異的セリンの識別（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ  ｔｏ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｍｉｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８１：９２８２〜９２９０頁
【０２１１】
システム適性試験
方法開発の際に、ＬＣ−ＭＳシステムの性能においていくらかの変動が観察された。毛細管先端の位置、スプレー安定性、ＬＣシステムの性能、及びｅａｓｙ−ｓｐｒａｙ用カラムの平衡におけるいくらかの微妙な変化の結果として、アッセイ間において感度及びクロマトグラム再現性に差が生じ得る。ＰＳＶＡの前の適切なシステム性能を確保するために、信号強度、カラム圧力などのパラメータを監視するべきである。カラムをコンディショニングするために、約３０のブランク注入の実行によってカラムを平衡させることは賢明である。好適な感度が達成されることを確保するために、試料分析の前に、インターアッセイコントロール試料を分析するべきである。
【０２１２】
例６：リツキシマブの配列変異体を識別するケーススタディ
ＧＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）を使用する代表的Ｌｏｎｚａ細胞系構築プロセスにおいて生成される配列変異体の性向を調査するために、モデルタンパク質としてリツキシマブを使用するケーススタディを提示する。典型的な生物学的生産シナリオを代表して、初期及び後期世代番号における培養物からの試料を分析した。
【０２１３】
初期（１６）又は後期（８６）世代番号において８つのクローン細胞系からａｍｂｒ（登録商標）スケールにおいて産生されたリツキシマブモデル抗体は、精製されたプロテインＡであった。後期世代培養のために、複製系列を生成させた。各試料の技術的複製をグアニジンＨＣｌを使用して変性させ、ＴＣＥＰで還元させた。別々の反応において試料をトリプシン、ｌｙｓＣ、及びキモトリプシンによって消化させ、各試料の消化物を組み合わせた。Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ及びＸｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴＯＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を実施した。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩソフトウェアによるＭＳデータの比較分析によって、分析間での存在量プロファイルにおける差を示すペプチドの識別を実施した。ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア内でのＳＰＩＤＥＲアルゴリズムの使用による識別を伴うＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎを使用して、推定上の変異ペプチドのターゲットＭＳ／ＭＳ配列決定を実施した。
【０２１４】
試料処理及び評価は、図１２のスキームに従った。
【０２１５】
リツキシマブモデル抗体を発現する初期世代リサーチ細胞バンクのいずれにおいても、配列変異体の存在を示す存在量プロファイルにおける変化は検出されなかった（図１３）。この観察は、ＧＳ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）が、比較的高い発現率が報告されているいくつかの代替の発現系よりも、これらの変異体を発生させる傾向が少ないことを示唆している。ＧＳ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）をベースとする産生細胞系は、典型的には、低いコピー数を有し、高い厳密性において選択され、それにより、開いたクロマチンの領域への遺伝子挿入の可能性を高める。これらの因子は、細胞系構築の際のＤＮＡ変異によるアミノ酸配列変異体取込みのリスク全体を低減し得る。
【０２１６】
４Ｂ０４細胞系の両方の後期世代系列のみに存在している単一の種を特定した（ｐ＜０．０１）（図１４）。比較ワークフローを使用せずに、この種は、共溶出及びより多いイオンの１３Ｃ同位体に対する同重体質量（ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｍａｓｓ）により、検出及び識別するのが非常に困難であろう。この種は、ＭＳデータの比較評価を含まない代替のＤＤＡ  ＭＳ／ＭＳベースの配列変異体分析アプローチを使用するＭＳ／ＭＳ分析ために選択されず、並びに１２０，０００ＦＷＨＭ解像度での後続の分析におけるｍ／ｚ寸法において分離されなかった。ターゲットＭＳ／ＭＳ分析は、これらの測定の両方に対して≦２％ＣＶの精度による各後期世代培養に対する１．０％及び１．７％の存在量においてプロリン＞トレオニン置換（Ｐ１７５Ｔ）を確認した（図１５及び表６）。
【０２１７】
【表６】
2020505931.tif 000022
【０２１８】
アミノ酸配列変異体がどのように生じ得るかについて、ゲノムＤＮＡ変異、特異的コドンにおける誤訳、及び栄養素欠乏など、いくつかの潜在的メカニズムが報告されている。結果について、初期及び後期世代細胞系の核酸分析によって、さらに調査した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（２Ｘ３００ｂｐ）を使用して、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡにおいて、分子バーコードによるアンプリコン配列決定を実施した。ＤＮＡ及びＲＮＡからの結果を組み合わせ、推定上の変異体は、高い信頼性としてランク付けするために両方のサブセットからのデータを必要とした。２つの高い信頼性の単一のポイントでの変異が識別され、これは、クローン４Ｂ０４後期世代（両方の系列）においてのみ検出された。１つの変異は、タンパク質レベルにおいて以前に検出されたＨＣ  Ｐ１７５Ｔ変異体であることが確認され、他方は、Ｒ１７８におけるサイレント変異であることが見出された。変異は、同じ変異アレルに関連し、それに由来することが見出された。変異アレルは、ＤＮＡレベルにおいて、４Ｂ０４系列Ａにおいて１．１％、系列Ｂにおいて２．３％生じた。ＲＮＡに関して、頻度は、それぞれ、２．９％及び５．６％であった。これらの観察は、アミノ酸変異体種が、細胞系の安定性の関数として産生細胞系において蓄積し得ること、及びこの蓄積が、バイオプロセスの前に被ったクローンにおける潜在的な遺伝的不安定性を反映し得ることを示している。
【０２１９】
アミノ酸配列変異体が、初期世代番号において検出されず、後期世代培養物において１．７％の存在量において生じ得るという観察結果は、細胞系発育プログラムにとって意味がある。細胞系安定性の研究におけるこの分析タイプの日常的な使用は、プロセス開発におけるプロジェクトリスク全体を最小限に抑えるために推奨される。ＭＳデータの比較分析は、特定のアミノ酸変異体の検出にとって重要なステップであることが見出され、それは、ＤＤＡ  ＭＳ／ＭＳ法に排他的に依拠するワークフローに「ブラインドスポット」が存在し得ることを示している。細胞系開発を支援するために開発された分析ワークフローは、低レベルの変異体を効果的に検出及び識別することが可能であり、生きた細胞系構築プロジェクトにおけるクローン選択プロセスからの除去を可能にする。
【０２２０】
例７：方法のキャパシティ
本方法は、細胞系構築試験の際に＜０．１％のレベルにおいて変異体を検出することができた。
【０２２１】
添加回収アプローチ（ｓｐｉｋｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用して、方法のキャパシティをさらに調査した。いくつかの変異体は、＜０．１％において報告されているが、この方法タイプの検出限界は、配列によって変わり得る。トラスツズマブ及び３つの既知の残基変化（ＨＣ  Ｓ１６０Ｃ、ＨＣ  Ｋ２１７Ｒ、及び軽鎖（ＬＣ）Ｔ１８０Ｃ）を伴う変異体の試料を同時に調製した（図２２）。消化された変異体を、１％及び５％においてトラスツズマブに添加し、非添加の試料と並行して分析した。添加した試料の分析は、３つ全ての変異体に対して、１％及び５％レベルの両方において、ＭＳ１データ比較分析における検出を実証した（図２３）。
【０２２２】
ＭＳ２分析は、５％の添加において、検出された変異体の全てを識別し、１％においてＨＣ  Ｓ１６０Ｃ及びＬＣ  Ｔ１８０Ｃを識別した（図２４）。ＨＣ  Ｋ２１７Ｒ変異体は、比較的低いレベルの冗長配列カバー率において、配列のリシンリッチなエリアに位置していた。理論上のペプチドは、非常に小さいか又は非常に大きいかのどちらかであり、小さいペプチドはカラムシステムに保持されなかったため、カバー率に影響を及ぼした。これらのエリアは、例えば代替の酵素又はターゲットＭＳ２法などの分析への適応を必要とし得る。
【０２２３】
ＧＳ−ＣＨＯ  Ｘｃｅｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）に対する＞０．２％における誤取込み率は、６％で特定された。核酸分析は、結果として後期世代に≧１％において変異体を生じるゲノム変異が、初期世代において検出可能でないことを確認した。そのような分析の検出限界は、配列にわたり一様でない。この配列のエリアは、より高い検出限界を示し得る。
【０２２４】
例８：トラスツズマブの配列変異体の試験検出のケーススタディ
Ｘｃｅｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）内での意図されないアミノ酸変異体取込み率全体を特定するために実験を行った。誤取込みのメカニズム並びに大規模バイオマニュファクチャリングを代表する世代番号における細胞系安定性との相関を調査した。最後に、抗体生成物内の異なる位置での配列変異体に対する検出限界の変動を調査した。
【０２２５】
プラットフォーム細胞培養プロセスを使用するＡＭＢｒ小型バイオリアクターにおいて、Ｘｃｅｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）を使用して抗体を発現させた。プロテインＡの親和性によって、培養上清を精製した。試料を変性させ、還元し、別々の消化物においてトリプシン及びキモトリプシンを使用して消化させた。結果として得られるペプチドを、ナノフロースケールにおいて逆相クロマトグラフィーによって分離し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｑ−ＯＴ−ＬＩＴ質量分析計並びにＨＣＤ及びＥＴｈｃＤ断片化によるデータ依存型決定木ワークフローを使用して同定した。プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）のためのＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ及びＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏ  ７．０を使用して、データ分析を実施した。
【０２２６】
いくつかの稼働中の開発プロジェクトからのデータを評価することに加えて、添加回収アプローチを使用して、方法のキャパシティを特定した。モデルとしてトラスツズマブを使用して、単一の同一タンパク質内において３つのアミノ酸変異体を発現させ、規定された相対濃度においてトラスツズマブに添加した。これらの変異体のそれぞれを検出する方法の能力を評価した。多くの変異体が、０．０１％未満のレベルにおいて確信を持って検出することができることを、開発プロフェクトから特定した。添加回収アプローチは、アミノ酸配列がこの方法に挑戦した、可能性のある「ブラインドスポット」において変異体を識別する方法の能力を試験した。これは、検出限界を１％まで実質的に増加させることがわかった。この観察は、変異体に対してこれらの領域を評価する場合にさらなる注意を払うことを可能にし、方法全体のロバストネスを高める。
【０２２７】
初期及び後期細胞系世代を使用して、細胞系安定性の関数としての変異体取込みを調査した。３つの変異体が、初期及び後期世代において差次的に発現したいくつかの細胞系構築において検出された。以前に報告された変異体のさらなる分析の際、この不安定性が、それ自体が後期世代培養物においてのみ検出される、ゲノムＤＮＡにおける変異に起因することが特定された。
【０２２８】
暫定的変異体率を特定するために、４つの異なる生成物に対して５つの細胞系構築を試験した。これは、結果として、６％の誤取込み率を生じ、これは、Ｘｃｅｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）に対する初期又は後期世代のどちらかにおいて０．２％を超える変異体を示す細胞系の割合を表している。
【０２２９】
例９：誤取込み率を調査するケーススタディ
方法
ａｍｂｒ（登録商標）スケールにおける５つの細胞系構築研究からの細胞培養上清は、精製されたプロテインＡであった。研究は、典型的には、初期（約２０）及び／又は後期（約９０）世代番号における８つのクローン細胞系からなる（図２０）。グアニジンＨＣｌを使用して複製を変性させ、ＴＣＥＰによって還元し、次いで、別々の反応において最低２つの消化酵素（トリプシン、キモトリプシン、又はＬｙｓＣ）によって消化させた。
【０２３０】
ＬＣ−ＭＳ分析を実施し、分析にわたって存在量プロファイルの違いを示すペプチドを検出するためにＭＳ１データを使用した。この比較分析は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩソフトウェアを使用して実施した。ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏにおいて分析したＭＳ２データを使用して、推定上の配列変異体を識別した。
【０２３１】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（２Ｘ３００ｂｐ）を使用して、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡに対して核酸配列決定を実施した。ＤＮＡ及びＲＮＡからの結果を組み合わせ、推定上の変異体は、高い信頼性としてランク付けするために両方のサブセットからのデータを必要とした。
【０２３２】
結果
ＧＳ−ＣＨＯ  Ｘｃｅｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）に対して、暫定的な変異体率を特定するために、４つのモノクローナル抗体生成物に対して５つの細胞系構築の分析からのデータを使用した（例えば、図２１）。合計３４の細胞系を試験し、初期又は後期世代のどちらかにおいて＞０．２％のレベルにおいて２つの異なる変異体が識別された。これは、６％の暫定的な変異体率を表した。
【０２３３】
ＧＳ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）は、いくつかの代替の発現系よりもこれらの変異体に対する傾向が低くあり得る。この発現系をベースとする産生細胞系は、典型的には、低いコピー数を有し、高い厳密性において選択され、開いたクロマチンの領域への遺伝子挿入の可能性を高める。これは、細胞系構築の際のＤＮＡ変異による誤取込みのリスクを減じ得る。
【０２３４】
例１０：洗浄手順
同時に試料勾配を実行しつつ、注入機器及び／又はトラッピングカラムのクリーニングのためのＬＣシステム洗浄手順を実践するために、実験を行った。クリーニング手順は、試料勾配に影響を与えてはならず、複数のポンプを独立して実行することができるＬＣシステムを必要とする。そのようなクリーニング手順は、前の実施例の方法及び本発明によって教示される方法において実施するのに有用である。
【０２３５】
この実施例において、提供されるＬＣシステムは、ポンプシステム、流路のクロスオーバーを防ぐ構成によってポンプシステムが同時に作動するのを可能にするスイッチングバルブ、及び別々のポンプの独立したプログラミング／制御を含む。本実施例は、別々のナノポンプ及びローディングポンプ（図１６）を備えるＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣ  Ｎａｎｏ（Ｄｉｏｎｅｘ）使用するが、本方法は、特定の設備設定に限定されない。
【０２３６】
洗浄シーケンスは、交互の酸性洗浄剤、例えばギ酸、及び高有機洗浄剤、例えば、アセトニトリルであることが特定された（図１７）。これらは、ローディングポンプのラインＢ及びＣから利用した。実施される分析的分離に従って、ナノポンプのラインＡ及びＢに対して標準的溶媒を使用した。実施される分析的分離に従って、ローディングポンプのラインＡに対して標準的試料ローディングバッファを使用した。
【０２３７】
ナノフローを使用する分析的分離を実施するために、ナノポンプからのラインＡ及びＢを使用した。次いで、ローディングポンプからのラインＢ及びＣを使用して注入機器及びトラップカラムの並行クリーニングを実施するように、標準的分析法を修正した。
【０２３８】
試料を分析カラムにロードした後に、ＬＣ法にバルブスイッチを追加することにより、注入バルブを注入位置のまま、分析カラムを備えるラインからトラッピングカラムを取り外した。ローディングポンプのラインＢ及びＣからの交互の洗浄（酸性洗浄剤及び高有機洗浄剤）によって注入システム及びトラッピングカラムを洗浄するために、ローディングポンプを使用した。これらの洗浄剤に対して、流量を１２μｌ／分から２０μｌ／分に増加させた。トラッピングカラムの後に消耗するために、バルブ位置をローディングポンプから逸らしたので、洗浄を分析勾配の際に実施することができ、これは、別々のナノポンプを使用して実施した。したがって、酸性／高有機洗浄ステップをメインの方法に並行して実施し、そのため、その後とは対照的に、方法の経過時間を増加させなかった。この並行なクリーニングプロトコールは、分析方法の経過時間を約９２分から約５０分へと約４６％短縮した。クリーニングに費やす延長時間（すなわち、追加洗浄時間）は、約８４％短縮した。
【０２３９】
分析カラムの洗浄ステップを、分析方法の終わりに追加し（ナノポンプを使用）、それにより、全ての必要な構成部品を洗浄した。勾配情報については、表７及び８を参照されたい。
【０２４０】
【表７】
2020505931.tif 000023
【０２４１】
【表８】
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【配列表フリーテキスト】
【０２４２】
配列番号１〜１８：＜２２３＞／注釈＝「人工配列の記載：合成ペプチド」
【図１】
2020505931.tif 000025
【図２】
2020505931.tif 000026
【図３Ａ】
2020505931.tif 000027
【図３Ｂ】
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【図４】
2020505931.tif 000029
【図５】
2020505931.tif 000030
【図６Ａ】
2020505931.tif 000031
【図６Ｂ】
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【図７】
2020505931.tif 000033
【図８】
2020505931.tif 000034
【図９】
2020505931.tif 000035
【図１０】
2020505931.tif 000036
【図１１】
2020505931.tif 000037
【図１２】
2020505931.tif 000038
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020505931.tif 000052
2020505931.tif 000053
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