(57)【要約】  本発明は、血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドに関し、該処置又は予防は、組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を、血液凝固障害を有する被験体に血管外投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そして投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドであって、該処置又は予防は、血液凝固障害を有する被験体に組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を血管外投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい、上記使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２】
血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドであって、該処置又は予防は、血液凝固障害を有する被験体に血管外に組み換えポリペプチドを、及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい、上記使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項３】
上記ポリペプチドは、半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含む、請求項１又は２に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項４】
被験体はヒト被験体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドはダイマーとして存在するか、又は高比率のダイマーを少なくとも有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための組み合えポリペプチド。
【請求項６】
ダイマーポリペプチドは、１ｎＭ未満、好ましくは５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満又は８０ｐＭ未満の解離定数ＫＤにより特徴づけられるＦＶＩＩＩ結合親和性を有する、請求項５に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドは、皮下、皮内又は筋肉内のいずれかに投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項８】
切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６〜８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項９】
切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２、（ｂ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｃ）  （ａ）若しくは（ｂ）のフラグメントのいずれかからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１０】
ＨＬＥＭは、切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１１】
上記異種アミノ酸配列は、アルブミン又はそのフラグメント、トランスフェリン又はそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモ−アミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アルブミン又は免疫グロブリン定常領域に生理条件下で結合することができるポリペプチド、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に免疫グロブリン定常領域及びその部分、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又は該ポリペプチドからなる、請求項１０に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１２】
ＨＬＥＭが組み換えポリペプチドに結合されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１３】
上記ＨＬＥＭは、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１４】
投与されたＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は、組み換えポリペプチドの同時投与により、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０未満であること以外は、上記処置と同じである、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１５】
投与された組み換えポリペプチドの平均滞留時間（ＭＲＴ）は、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０未満であること以外は、上記処置と同じである、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１６】
投与されたＦＶＩＩＩの終末期半減期は、組み換えポリペプチドの同時投与により、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍又は少なくとも３倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０未満であること以外は、上記処置と同じである、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１７】
ＨＬＥＭを有する上記ポリペプチドと同時投与されたＦＶＩＩＩの１％トラフレベルに達する期間は、参照処置と比較して延長されており、ここで該参照処置は、ＦＶＩＩＩが該ＨＬＥＭを有していない組み換えポリペプチドとともに投与されること以外は上記処置と同じである、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの血漿半減期と比較して、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの血漿半減期と比較して増加しており、ここでポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦよりも、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの血漿半減期と比較して、好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％又は好ましくは４００％高い、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項１９】
血液凝固障害が血友病Ａ又はフォン・ヴィルブランド病である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２０】
組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質の同時投与は、（ｉ）組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質を含む単一の組成物で一緒に投与することにより、又は（ｉｉ）それぞれ別々の組成物で提供される組み換えポリペプチド（第一の化合物）及びＦＶＩＩＩタンパク質（第二の化合物）を投与すること［ここで第一の化合物は第二の化合物の前に、後に、又は同時に投与される］のいずれかにより達成される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２１】
ＦＶＩＩＩは血漿由来のタンパク質又は組み換えＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２２】
ＦＶＩＩＩは血管外に投与され、そしてここで組み換えポリペプチドと同時投与された後の投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティは、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、好ましくは少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２３】
組み換えポリペプチドのバイオアベイラビリティは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２４】
同時投与されたＦＶＩＩＩタンパク質の投薬量は、２５００ＩＵ／ｋｇ、１５００ＩＵ／ｋｇ、１０００ＩＵ／ｋｇ、６００ＩＵ／ｋｇ、５００ＩＵ／ｋｇ又は４００ＩＵ／ｋｇを超えない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２５】
上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、ＦＶＩＩＩについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、少なくとも１０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも５０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００ｍＩＵ／ｍＬ又は少なくとも４００ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性、好ましくは発色ＦＶＩＩＩ活性である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２６】
上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについてのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０未満であること以外は、上記処置と同じである、請求項３〜２５のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２７】
上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して、好ましくは少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７．５分の１又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０未満であること以外は上記処置と同じである、請求項３〜２６のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２８】
組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００又は少なくとも１０００である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項において定義された血液凝固障害の処置又は予防における使用のための医薬組成物であって、該組成物は、
（ｉ）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチド、及び
（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）
を含み；
ここで医薬組成物内のＦＶＩＩＩタンパク質に対する組み換えポリペプチドのモル比は５０より大きく、そして該組み換えポリペプチドは、該ＦＶＩＩＩに結合することができ、
該処置は、血液凝固障害に罹患している被験体に医薬組成物を血管外に投与することを含み、そして
該医薬組成物は血管外同時投与用に処方される、上記医薬組成物。
【請求項３０】
（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を含む第一の組成物、及び（ｉｉ）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用のために提供される切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドを含む第二の組成物を含む、血液凝固障害の処置又は予防における使用のための医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液凝固障害の処置を改善するための製品及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液凝固因子の欠乏により引き起こされる様々な出血障害がある。最も一般的な障害は、それぞれ第ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）及び第ＩＸ血液凝固因子の欠乏により生じる血友病Ａ及びＢである。別の公知の出血障害はフォン・ヴィルブランド病（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＶＷＤ）である。
【０００３】
血漿中で、ＦＶＩＩＩは大部分はフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）との非共有結合複合体として存在し、そしてその凝固機能は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への第ＩＸａ因子依存性変換を加速することである。
【０００４】
古典的血友病又は血友病Ａは遺伝性の出血性障害である。これは染色体Ｘ連鎖性血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠損から生じ、そして１０，０００人あたり１人と２人との間の発生率でほとんど男性のみに影響を及ぼす。Ｘ染色体欠損は、それら自体血友病ではない女性キャリアにより伝達される。血友病Ａの臨床症状は増加した出血傾向である。
【０００５】
予防的処置を受けている重篤な血友病Ａ患者において、ＦＶＩＩＩは、約１２〜１４時間というＦＶＩＩＩの短い血漿半減期のために週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与されなければならない。各ｉ．ｖ．投与は煩雑であり、痛みを伴い、そして特に大部分は家庭で患者自身により、又は血友病Ａと診断された児童の両親により行われるので、感染のリスクを伴う。
【０００６】
従って、このようなＦＶＩＩＩを含有する医薬組成物がより少ない頻度で投与されなければならないように、ＦＶＩＩＩの半減期を増加させることは非常に望ましいだろう。
【０００７】
細胞受容体との相互作用を減少させることにより（特許文献１、特許文献２）、ポリマーをＦＶＩＩＩに共有結合で結合することにより（特許文献３、特許文献４及び特許文献５）、ＦＶＩＩＩの封入により（特許文献６）、新しい金属結合部位の導入により（特許文献７）、ペプチド連結（特許文献８及び特許文献９）若しくはジスルフィド連結（特許文献１０）のいずれかによりＡ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合で結合することにより、又はＡ１ドメインをＡ２ドメインに共有結合で結合すること（特許文献１１）のいずれかにより、非活性化ＦＶＩＩＩの半減期を延長させるための幾つかの試みがなされた。
【０００８】
ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの機能的半減期を増強するための別のアプローチは、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）又はＶＷＦのＰＥＧ化（特許文献１５）によるものである。ペグ化ＶＷＦの増加された半減期は、血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期も間接的に増強するだろう。また、ＦＶＩＩＩの融合タンパク質も記載されている（特許文献１６、特許文献１７及び特許文献１８）。
【０００９】
フォン・ビルブラント病（ＶＷＤ）の様々な形態において、欠失しているか、機能不全であるか又は減少した量でしか利用可能でないＶＷＦは、哺乳動物の血漿中に存在するマルチマーの接着性糖タンパク質であり、多数の生理学的機能を有する。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンのような細胞外マトリックスの成分との間のメディエーターとして作用する。さらに、ＶＷＦは、プロコアグラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）ＦＶＩＩＩのための担体及び安定化タンパク質として役立つ。ＶＷＦは、内皮細胞及び巨核球において２８１３アミノ酸の前駆体分子として合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、非特許文献１に開示される。前駆体ポリペプチドのプレ−プロ−ＶＷＦは、Ｎ末端２２残基のシグナルペプチド、続いて７４１残基のプロペプチド及び成熟血漿ＶＷＦにおいて見出される２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献２）。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後に、Ｃ末端ジスルフィド架橋が、ＶＷＦの２つのモノマー間に形成される。分泌経路を通るさらなる輸送の間に、１２のＮ連結及び１０のＯ連結炭水化物側鎖が付加される。より重要なことには、ＶＷＦダイマーは、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、そして７４１アミノ酸長のプロペプチドは、後期（ｌａｔｅ）ゴルジ体において酵素ＰＡＣＥ／フューリンにより開裂される。
【００１０】
血漿中に分泌されると、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１ドメイン内で高分子量ＶＷＦマルチマーを切断することができる。従って、血漿ＶＷＦは、５００ｋＤａの単一のダイマーから、１０，０００ｋＤａを超える分子量の２０まで又は２０より多くのダイマーからなるマルチマーまでの全範囲からなる。これによってＶＷＦ−ＨＭＷＭは最も強い止血活性を有し、これはリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）で測定され得る。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比が高くなるほど、高分子量マルチマーの相対的な量が高くなる。
【００１１】
血漿中で、ＦＶＩＩＩは高い親和性でＶＷＦに結合し、これはそれを早期排出から保護し、従って、一次止血におけるその役割に加えてＦＶＩＩＩを安定化するための重大な役割を果たし、ＦＶＩＩＩの血漿レベルを調節し、そして結果として、二次止血を制御する中心的因子でもある。ＶＷＦに結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は血漿中で約１２〜１４時間である。ＶＷＦが全く又はほとんど存在しない３型フォン・ヴィルブランド病において、ＦＶＩＩＩの半減期は約２〜６時間しかなく、このような患者ではＦＶＩＩＩの減少した濃度に起因して軽度から中程度の血友病Ａの症状を生じる。ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの安定化効果はまた、ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩの組み換え発現を補助するために使用されてきた（非特許文献３）。２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病は、ＦＶＩＩＩのＶＷＦに対する結合に影響を及ぼすＶＷＦにおける変異に起因する低いＦＶＩＩＩレベルに特徴づけられる。２Ｎ型ＶＷＤ患者におけるＦＶＩＩＩレベルは、ＶＷＦ中の特定の変異に依存して約３ＩＵ／ｄＬと３０ＩＵ／ｄＬとの間の範囲、典型的には２０ＩＵ／ｄＬ未満である。１型フォン・ヴィルブランド病は、正常ヒト血漿における内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルと比較して減少した内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる（非特許文献４）。
【００１２】
ＶＷＦ由来ポリペプチド、特にＶＷＦフラグメントは、インビトロ及びインビボでＦＶＩＩＩを安定化すると記載されている。特許文献１９は、特定のＶＷＦタンパク質及びＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質に関する。ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦフラグメントのこれらのキメラヘテロダイマーは、１：１のＶＷＦ対ＦＶＩＩＩの固定モル比を有する。
【００１３】
特許文献２０及び特許文献２１は、ＶＷＦフラグメント及び血友病の処置のおけるそれらの使用を記載する。ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティが、同様のモル量のＶＷＦフラグメントの血管外同時投与で有意に改善され得るということが見出された。ＦＶＩＩＩに対する高モル過剰のＶＷＦは望ましくないと言われ、そしてＦＶＩＩＩと皮下当時投与されるＶＷＦを用いた実験において、ＶＷＦ用量はＦＶＩＩＩバイオアベイラビリティに関して決定的ではないということが見出された。従って、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦフラグメントのモル比さらにはＶＷＦ用量は、ＦＶＩＩＩバイオアベイラビリティに重要ではないとみなされた。
特許文献２２は、特定のＶＷＦフラグメント及び抗体Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドを開示し、１０：１までのＦＶＩＩＩに対するＶＷＦフラグメントの特定のモル比を提案する。さらに、上記Ｆｃ融合構築物に関してインビボデータは提示されていない。
非特許文献５は、免疫グロブリンＧ１のＦｃ部分に融合されたＤ’Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦフラグメントが、ＶＷＦ欠損マウスにおいて内在性第ＶＩＩＩ因子を安定化するために十分であるということを見出した。しかし、ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩ欠損マウスに輸液された場合に顕著に長期の残存を示したが、ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ融合タンパク質は、同時輸液されたＦＶＩＩＩの残存を延長しなかった。
【００１４】
今までの血友病Ａの標準的な処置は、ヒトドナーの血漿由来の濃縮物として、又は組み換えＦＶＩＩＩに基づく医薬製剤のいずれかとして、頻繁なＦＶＩＩＩの静脈内注入を含む。これらの補充療法は一般的に有効であるが、例えば予防的処置を受けている重症血友病Ａ患者において、上述のように第ＶＩＩＩ因子は、約１２時間という第ＶＩＩＩ因子の血漿半減期のためにＶＩＩＩは週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与されなければならない。すでに、例えば０．０１Ｕ／ｍＬより高いＦＶＩＩＩレベルの上昇により健常非血友病（ｎｏｎ−ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ）におけるＦＶＩＩＩ活性の１％より高いレベルに達する場合、重症血友病Ａは中程度血友病Ａに変わる。予防的治療において、投薬レジメンはＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルが健常非血友病におけるＦＶＩＩＩ活性の２〜３％のレベルを下回らないように設計される。各ｉ．ｖ．投与は煩雑であり、痛みを伴い、そして特に大部分は在宅治療で患者自身により、又は血友病Ａと診断された児童の両親により行われるので、感染のリスクを伴う。さらに、頻繁なｉ．ｖ．注射は、必然的に瘢痕形成を生じ、将来の注入を妨げる。重症血友病における予防的処置は若年期に、しばしば２歳未満の児童で開始されるので、そのような小さい患者の静脈に週３回ＦＶＩＩＩを注射することはなおさら困難である。限定された期間の間、ポートシステムの移植が代替を提供し得る。繰り返される感染が発生し得、そしてポートが体育の間の不便を引き起こし得るという事実にもかかわらず、これらは典型的には静脈内注射と比較して好ましいとみなされる。
【００１５】
したがって、ＦＶＩＩＩを静脈内注入する必要を取り除く大きな医学的必要性がなお存在する。
【００１６】
ＦＶＩＩＩは非常に大きく不安定な分子であるため、皮下、筋肉内又は皮内に、すなわち血管外に投与された場合、不十分な吸収及び重度の分解に起因して非常に低いバイオアベイラビリティを示す。
【００１７】
特許文献２３は、１０００ＩＵ／ｍＬより高い濃度のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ製剤が皮下投与に適しており、サルにおいて皮下（ｓ．ｃ．）投与した後、活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線下面積を測定して５〜１０％のバイオアベイラビリティを生じるということを開示する。
【００１８】
特許文献２４は、有機添加剤と一緒になった少なくとも５００ＩＵ／ｍＬの濃度のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ製剤が、皮下投与された場合に、６時間より長い間、正常ＦＶＩＩＩレベルの少なくとも１．５％のＦＶＩＩＩ血漿レベルを生じ得るということを開示する。加水分解ゼラチン又は大豆油エマルションを有機添加剤として、及び１１００ＩＵ／ｍＬの濃度のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ及び１００００ＩＵ／ｋｇの用量を使用して、活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線下面積として測定して５０％より高いバイオアベイラビリティがカニクイザルにおいて見られた。しかしこれは、血液凝固障害を有する患者の処置には適切な臨床シナリオではない。
【００１９】
特許文献２５は、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（特異的活性１５０００ＩＵ／ｍｇ；用量２５００ＩＵ／ｋｇ）が皮下投与された場合に５．３％のバイオアベイラビリティを開示するが、ＦＶＩＩＩのｍＰＥＧ化結合体は、カニクイザルにおいて２２％又は１９％のバイオアベイラビリティを達成した。
【００２０】
特許文献２６によれば、第ＶＩＩＩ因子と１つ又はそれ以上のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドとの非共有結合複合体を含む組成物が示され、ここでフォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、少なくともアミノ酸７６４〜１０３５及び１６９１〜１９０５を含む。ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのモル比は１：１〜１：２０の間である。特許文献２６において、血友病Ａイヌは単独、又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテアーゼを用いたｐｄＶＷＦの消化により得られたＶＷＦフラグメント５倍モル過剰と組み合わせた、組み換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩの皮下注射及びその後の静脈内注射を受けた。サンプルは全血凝固時間（ＷＢＣＴ）及び発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにおける活性について分析された。ＦＶＩＩＩと複合体化したＶＷＦフラグメントの皮下投与は、ＦＶＩＩＩ単独の皮下投与と比較して正常イヌについての凝固時間を超えるために必要な時間の１．４倍の増加を生じた。ＦＶＩＩＩとのＶＷＦフラグメントの投与はまた、ＦＶＩＩＩ単独の投与と比較して、皮下及び静脈内適用の両方について、イヌ血漿における時間にわたる増加したＦＶＩＩＩ活性及びほぼ２倍の曲線下面積（ＡＵＣ）値を生じた。
【００２１】
特許文献２７において、ＶＷＦは、免疫応答の増加したリスクを伴い得るいずれの安定化共有結合修飾もなく、血管外投与された場合に血流中に取り込まれ得、そしてＶＷＦは、非静脈内でＦＶＩＩＩと同時投与された場合にＦＶＩＩＩの取り込みを増強するために使用することができるということが示された。ＶＷＦは半減期延長修飾をせずに適用された。ＦＶＩＩＩ活性に対するＶＷＦ抗原の比は２：１より大きかった。全長ＶＷＦを含むマルチマー及びモノマー製品のみが考慮された。しかし全長ＶＷＦを適用することにより、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの高い比が、上昇した血栓形成性リスクを生じ得る。さらに、全長ＶＷＦを使用する場合、比を増加させるために必要なタンパク質の量は、投与に受け入れられないだろう。さらに、マルチマー及びモノマー。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０９３３１３Ａ２
【特許文献２】ＷＯ  ０２／０６０９５１Ａ２
【特許文献３】ＷＯ  ９４／１５６２５Ａ１
【特許文献４】ＷＯ  ９７／１１９５７Ａ１
【特許文献５】ＵＳ  ４９７０３００
【特許文献６】ＷＯ  ９９／５５３０６Ａ１
【特許文献７】ＷＯ  ９７／０３１９３Ａ１
【特許文献８】ＷＯ  ９７／４０１４５Ａ１
【特許文献９】ＷＯ  ０３／０８７３５５Ａ１
【特許文献１０】ＷＯ  ０２／１０３０２４Ａ２
【特許文献１１】ＷＯ２００６／１０８５９０Ａ１
【特許文献１２】ＷＯ  ２００７／１２６８０８Ａ１
【特許文献１３】ＷＯ  ２００６／０５３２９９Ａ２
【特許文献１４】ＷＯ  ２００４／０７５９２３Ａ２
【特許文献１５】ＷＯ  ２００６／０７１８０１Ａ２
【特許文献１６】ＷＯ  ２００４／１０１７４０Ａ２
【特許文献１７】ＷＯ２００８／０７７６１６Ａ１
【特許文献１８】ＷＯ  ２００９／１５６１３７Ａ１
【特許文献１９】ＷＯ  ２０１３／１０６７８７Ａ１
【特許文献２０】ＷＯ  ２０１４／１９８６９９Ａ２
【特許文献２１】ＷＯ  ２０１３／０８３８５８Ａ２
【特許文献２２】ＷＯ２０１１／０６０２４２Ａ２
【特許文献２３】ＥＰ  ０７１０１１４Ａ１
【特許文献２４】ＥＰ  ０７７２４５２
【特許文献２５】ＷＯ  １９９７／１１９５７Ａ１
【特許文献２６】ＷＯ  ２０１５／１８５７５８Ａ２
【特許文献２７】ＷＯ  ２００８／１５１８１７Ａ１
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４３９３-４３９７
【非特許文献２】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：３４５−３４８，１９９４
【非特許文献３】Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１２３３−１２４２
【非特許文献４】Ｓａｄｌｅｒ  Ｊ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｂｌｉｎｄｅｒ  Ｍ．，Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｉｎ：Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ｅｄｓ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｍａｒｄｅｒ，Ｃｌｏｗｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ，Ａｉｒｄ，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｈａｂｅｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００６，ｐｐ  ９０５−９２１
【非特許文献５】Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｂｌｏｏｄ  １２４（３）：４４５−４５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
患者へのＦＶＩＩＩの静脈内投与に対する代替の医学的必要性が存在する。さらに、血管外投与された場合に第ＶＩＩＩ因子吸収を提供する方法、さらにはこのような方法に適した化合物又は組成物の継続した必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の要旨  
本発明の第一の目的は、血液凝固障害の改善された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質ベースの処置又は予防を提供することであった。
【００２６】
第二の目的によれば、上記処置は、それを必要とする被験体へのＦＶＩＩＩ投与の代替経路を可能にするはずである。特に、ＦＶＩＩＩの皮下投与が可能になるはずである。
【００２７】
第三の目的によれば、上記処置は、少なくとも血液凝固障害を有する被験体を処置するために十分な投与されたＦＶＩＩＩの薬物動態パラメーターに関して提供するはずである。
【００２８】
第四の目的によれば、上記処置は、特に、容認できるか又は改善された投与頻度を可能にするために十分高いＦＶＩＩＩの半減期を提供するはずである。
【００２９】
驚くべきことに、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質は、血液凝固障害の処置又は予防のために血管外経路を介して首尾良く投与され得るが、ただしＦＶＩＩＩは、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドと同時投与されるということが本発明者らにより見出された。該組み換えポリペプチドは、該同時投与されたＦＶＩＩＩに結合することができる。投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、好ましくは５０より高い。切断型ＶＷＦを含む組み換えポリペプチドは、好ましくは半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含む。いずれの理論に束縛されることも望まないが、切断型ＶＷＦと比較してより大きな分子構造を有し、おそらく増加した異化作用をもたらす内在性ＶＷＦへの同時投与されたＦＶＩＩＩの結合を最少にするために、投与された切断型ＶＷＦを含む組み換えポリペプチドの高過剰を達成することが重要であると考えられる。本明細書に提示されるＦＶＩＩＩと上記組み換えポリペプチドとの同時投与の使用により、ＦＶＩＩＩの適用のための血管外経路が可能であるだけでなく、循環へのＦＶＩＩＩの臨床的に関連する量も達成するということが初めて実証される。
【００３０】
本発明はさらに、組み換えポリペプチドの血管外投与が同時投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティの増加を提供するということを実証する。さらに、組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩと一緒の皮下投与が、血流へのＦＶＩＩＩの関連する吸収を伴うＦＶＩＩＩの血管外投与を可能にし、検出限界より十分に高いだけでなく、さらに治療適用に適したＦＶＩＩＩ活性レベルを生じる。ＦＶＩＩＩと同時投与された場合の組み換えポリペプチドは、十分に長い半減期を有し、このコンパートメントに達すると血漿中のＦＶＩＩＩの維持を増加させるだけでなく、治療適用に適したＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティも提供する。
【００３１】
さらに、本発明はさらに、組み換えポリペプチドの血管外投与が、組み換えポリペプチドに使用した投与経路と異なる投与経路を介したＦＶＩＩＩ投与を含む処置選択肢を可能にし得るということを実証する。特に、静脈内投与されたＦＶＩＩＩ及び皮下投与された組み換えポリペプチドの組み合わせから生じる利益が実証される。
【００３２】
したがって本発明は、特に以下の実施態様［１］〜［７３］に関する：
［１］  血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドであって、該処置又は予防は、組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を、血液凝固障害を有する被験体に血管外に投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そして投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい、上記使用のための組み換えポリペプチド。
【００３３】
［２］  血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドであって、該処置又は予防は、血液凝固障害を有する被験体に血管外に組み換えポリペプチドを、及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい、上記使用のための組み換えポリペプチド。
【００３４】
［３］  上記ポリペプチドは半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含む、実施態様［１］又は［２］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００３５】
［４］  被験体はヒト被験体である、実施態様［１］〜［３］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００３６】
［５］  切断型ＶＷＦはヒト切断型ＶＷＦである、実施態様［１］〜［４］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド
［６］  上記ポリペプチドは、皮下、皮内又は筋肉内のいずれかに投与される、実施態様［１］〜［５］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００３７】
［７］  ＦＶＩＩＩは、皮下、皮内又は筋肉内のいずれかに投与される、実施態様［１］〜［６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。好ましくは、ＦＶＩＩＩ及び該ポリペプチドの両方が皮下投与される。
【００３８】
［８］  実施態様［２］〜［６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。ＦＶＩＩＩは、組み換えポリペプチドの投与経路と異なる投与経路を介して投与され、好ましくはＦＶＩＩＩは静脈内投与され；より好ましくは組み換えポリペプチドは皮下投与され、そしてＦＶＩＩＩは静脈内投与される。
【００３９】
［９］  切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６〜８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様［１］〜［８］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４０】
［１０］  切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸１２４３〜２８１３を欠いている、実施態様［１］〜［９］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４１】
［１１］  切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２、（ｂ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｃ）  （ａ）若しくは（ｂ）のフラグメントのいずれかからなる、実施態様［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４２】
［１２］  ＨＬＥＭは、切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、実施態様［３］〜［１１］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４３】
［１３］  上記異種アミノ酸配列は、トランスフェリン又はそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモ−アミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アルブミン又は免疫グロブリン定常領域に生理条件下で結合することができるポリペプチド、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に免疫グロブリン定常領域及びその部分、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又は該ポリペプチドからなる、実施態様［１２］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。免疫グロブリン定常領域又はその部分は、好ましくは免疫グロブリンＧ１のＦｃフラグメント、免疫グロブリンＧ２のＦｃフラグメント又は免疫グロブリンＡのＦｃフラグメントである。
【００４４】
［１４］  ＨＬＥＭは組み換えポリペプチドに結合されている、実施態様［３］〜［１１］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４５】
［１５］  上記ＨＬＥＭは、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施態様［１４］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４６】
［１６］  組み換えポリペプチドは、組み換えポリペプチドに結合されたいずれのＨＬＥＭも含まない、実施態様［３］〜［１３］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４７】
［１７］  上記ポリペプチドはＮ−グリカンを含む糖タンパク質であり、そしてここで好ましくは該Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、実施態様［１］〜［１６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４８】
［１８］  上記組み換えポリペプチドはダイマーとして存在するか、又は高比率のダイマーを少なくとも有する、実施態様［１］〜［１７］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００４９】
［１９］  上記組み換えポリペプチドは、本明細書において開示される実施態様において定義される２つのポリペプチドを好ましくは含むホモダイマーであり、そしてダイマーを形成する２つのモノマーは、切断型ＶＷＦ内のシステイン残基により形成された少なくとも１つ又はそれ以上のジスルフィド架橋を介して互いに共有結合で連結されている、実施態様［１８］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５０】
［２０］  １つ又はそれ以上のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、Ｃｙｓ−１０９９、Ｃｙｓ−１１４２、Ｃｙｓ−１２２２、Ｃｙｓ−１２２５、Ｃｙｓ−１２２７及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして好ましくはＣｙｓ−１０９９及びＣｙｓ−１１４２であり、ここでアミノ酸番号付けは配列番号４を参照する、実施態様［１９］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５１】
［２１］  上記ダイマーのＦＶＩＩＩに対する親和性は、モノマーポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する親和性より高く、該モノマーポリペプチドは、ダイマーポリペプチドのモノマーサブユニットと同じアミノ酸配列を有する、実施態様［１８］〜［２０］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５２】
［２２］  本発明のポリペプチドの比ダイマー：モノマーは、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５又は少なくとも３である、実施態様［１８］〜［２１］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。好ましくは、本発明の組み換えポリペプチドは、ポリペプチドのモノマー及び／若しくはマルチマー形態を含まないか、又は少なくともポリペプチドのモノマー及び／若しくはマルチマー形態を本質的に含まない。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは全てダイマーとして存在する。
【００５３】
［２３］  ダイマーポリペプチドは、１ｎＭ未満、好ましくは５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満又は８０ｐＭ未満の解離定数ＫＤにより特徴づけられるＦＶＩＩＩ結合親和性を有する、実施態様［１８］〜［２２］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５４】
［２４］  ＫＤは０．１ｐＭ〜５００ｐＭ、０．５ｐＭ〜２００ｐＭ、０．７５ｐＭ〜１００ｐＭ又は最も好ましくは１ｐＭ〜８０ｐＭの範囲に及ぶ、実施態様［２３］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５５】
［２５］  ポリペプチドは、解離定数ＫＤにより特徴づけられるＦＶＩＩＩ結合親和性を有し、そしてダイマーポリペプチドの該解離定数ＫＤは、モノマーポリペプチドの解離定数ＫＤと比較して、少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも５００分の１又は少なくとも１０００分の１に減少している、実施態様［１８］〜［２４］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５６】
［２６］  上記ポリペプチドは、野生型ＶＷＦのアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでこのように改変されたポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する結合親和性は、好ましくは該改変以外は同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、該少なくとも１つの置換の導入によりさらに増加する、実施態様［１］〜［２５］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５７】
［２７］  切断型ＶＷＦ内の上記置換は、投与後に同時投与されたＦＶＩＩＩの半減期を増加する能力を有する、実施態様［２６］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。それにより、処置はまた、特にＦＶＩＩＩのインビボ半減期も提供し、これはさらに増加されて、容認できるか又は改善された投与頻度を可能にする。
【００５８】
［２８］  置換は、アミノ酸番号付けに関しては配列番号４の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、及びＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａからなる群より選択される、実施態様［２６］又は［２７］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００５９】
［２９］  上記置換は組み合わせＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ又はＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａのいずれかである、実施態様［２８］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６０】
［３０］  投与されたＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は、組み換えポリペプチドの同時投与により、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より小さいこと以外は、かつ／又は組み換えポリペプチドが全く投与されなかったこと以外は、上記処置と同じである、実施態様［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６１】
［３１］  投与されたＦＶＩＩＩのＭＲＴは、少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも１５時間、少なくとも２０時間又は少なくとも２５時間である、実施態様［１］〜［３０］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６２】
［３２］  投与された組み換えポリペプチドのＭＲＴは、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より小さい、特に５０未満であること以外は、上記処置と同じである、実施態様［１］〜［３１］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６３】
［３３］  投与されたＦＶＩＩＩの終末期半減期は、組み換えポリペプチドの同時投与により、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍又は少なくとも３倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より小さいこと以外は、かつ／又は組み換えポリペプチドが投与されなかったこと以外は、上記処置と同じである、実施態様［１］〜［３２］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。それにより、処置は特に、容認できるか又は改善された投与頻度を可能にするために十分なインビボ半減期を提供し得る。
【００６４】
［３４］  ＨＬＥＭを有する上記ポリペプチドと同時投与されたＦＶＩＩＩの１％トラフレベルに達する期間は、参照処置と比較して延長されており、ここで該参照処置は、該ＨＬＥＭを有していない組み換えポリペプチドとともにＦＶＩＩＩが投与されること以外は、かつ／又は組み換えポリペプチドが投与されなかったこと以外は上記処置と同じである、実施態様［１］〜［３３］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６５】
［３５］  （ｉ）  該ポリペプチドと同時投与されたＦＶＩＩＩの１％トラフレベルに達する期間は、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、もしくは少なくとも約５０時間であるか；又は
（ｉｉ）  該ポリペプチドと同時投与されたＦＶＩＩＩの５％トラフレベルに達する期間は、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３４時間、もしくは少なくとも約４３時間であるか；又は
（ｉｉｉ）  該ポリペプチドと同時投与されたＦＶＩＩＩの１０％トラフレベルに達する期間は、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１８時間、もしくは少なくとも約２０時間である、
実施態様［１］〜［３４］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６６】
［３６］  ポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの血漿半減期と比較して、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの血漿半減期と比較して増加しており、ここでポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦよりも、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの血漿半減期と比較して、好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％又は好ましくは４００％高い、実施態様［１］〜［３５］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６７】
［３７］  血液凝固障害は、血友病Ａ又はフォン・ヴィルブランド病である、実施態様［１］〜［３６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６８】
［３８］  血液凝固障害は血友病Ａであり、そして正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの５％〜４０％である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを典型的に伴う軽度血友病Ａ、又はＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの１％〜５％である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを典型的に伴う中程度血友病Ａ、又はＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性の１％未満である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを典型的に伴う重症血友病Ａのいずれかである、実施態様［３７］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００６９】
［３９］  ポリペプチドは、（ｉ）注文対応の処置及び出血事象の制御、（ｉｉ）特に出血事象の頻度を減少させるための日常的予防、又は（ｉｉｉ）出血の周術期管理のために使用される、実施態様［１］〜［３８］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７０】
［４０］  ポリペプチドは、血友病Ａを有する患者の出血事象の頻度を減少させるための日常的予防のために使用される、実施態様［３９］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７１】
［４１］  組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質の同時投与は、
−  （ｉ）組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質を含む単一の組成物で一緒に投与することにより、又は
−  （ｉｉ）それぞれ別々の組成物で提供される組み換えポリペプチド（第一の化合物）及びＦＶＩＩＩタンパク質（第二の化合物）を、場合により組み合わせ治療の一部として投与すること［ここで第一の化合物は第二の化合物の前に、後に、又は同時に投与される］
のいずれかにより達成される、実施態様［１］〜［４０］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。第一の化合物が第二の化合物の前又は後に投与される場合に、いずれかの適切なタイミング間隔が第一の化合物及び第二の化合物の投与に適用され得る。特に、日常的予防の目的のために、第一の化合物の投与及び第二の化合物の投与は、独立した又は協調した投薬スケジュールに従って提供され得る。
【００７２】
［４２］  （ｉ）の場合に、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質の同時投与は、
単一の組成物中に組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩを混合して含む組み合わせ製剤を提供することにより、又は
第一の製品が組み換えポリペプチドを含みそして第二の製品がＦＶＩＩＩを含む、投与前に混合されるように準備された少なくとも２つの別個の製品のセット若しくはキットを提供すること
のいずれかにより達成される、実施態様［４１］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７３】
［４３］  （ｉｉ）の場合に、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質は、特に同時に投与される場合、及び／又は特に両方共血管外に投与される場合、すぐ近くに投与され、好ましくは注射部位は５０ｍｍより多く離されず、４０ｍｍより多く離されず、３０ｍｍより多く離されず、特に２０ｍｍより多く離されない、実施態様［４１］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７４】
［４４］  （ｉｉ）の場合に、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質は、１ヶ月以内、３週間以内、２週間以内、１週間以内、１日以内、約１時間以内、３０分以内、１５分以内又は５分以内に同時投与され得る、実施態様［４１］又は［４３］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７５】
［４５］  （ｉｉ）の場合に、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質は、１ヶ月以下、３週間以下、２週間以下、１週間以下、１日以下、約１時間以下、好ましくは３０分以内、より好ましくは１５分以内、そして最も好ましくは５分以内のタイミング間隔内で同時投与され得る、実施態様［４１］、［４３］又は［４４］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７６】
［４６］  組み換えポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質を含まず、かつ／又はＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドを含まない、実施態様［１］〜［４５］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７７】
［４７］  ＦＶＩＩＩは血漿由来のＦＶＩＩＩタンパク質又は組み換えＦＶＩＩＩタンパク質、好ましくはヒトＦＶＩＩＩタンパク質である、実施態様［１］〜［４６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７８】
［４８］  ＦＶＩＩＩは組み換えＦＶＩＩＩタンパク質である、実施態様［１］〜［４７］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００７９】
［４９］  組み換えＦＶＩＩＩはインタクトな天然Ｂドメインを有するか、又は欠失、切断、若しくは修飾されたＢドメインを有する、実施態様［４８］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。場合により、組み換えＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つの半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含み得る。適切なＨＬＥＭは本明細書に開示される。
【００８０】
［５０］  ＦＶＩＩＩタンパク質は、好ましくはアミノ酸配列配列番号５又はそのフラグメントを含むか又はそれらからなる組み換え単鎖第ＶＩＩＩ因子であり、ただしこのようなフラグメントはＦＶＩＩＩ活性を有する、実施態様［４８］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８１】
［５１］  組み換えＦＶＩＩＩは欠失又は切断されたＢドメインを有し、ただし該欠失又は切断されたＢドメインは、少なくとも１つのリンカーペプチド及び／又は半減期増強ポリペプチドの異種挿入を含む、実施態様［４８］に記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８２】
［５２］  ＦＶＩＩＩが血管外に投与される場合、組み換えポリペプチドと同時投与された後の投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティは、参照処置と比較した場合組み換えポリペプチドにより増加し、ここで該参照処置は、ＦＶＩＩＩが該組み換えポリペプチドなしで投与される事以外は、上記処置と同じである、実施態様［１］〜［５１］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。それにより、組み換えポリペプチドの血管外投与は、投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティを提供するか又は増加させる。好ましくは、組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩと一緒の皮下同時投与は、ＦＶＩＩＩの血流への関連する吸収を伴うＦＶＩＩＩの血管外投与を可能にし、検出限界より有意に高いだけでなく、さらに治療適用に適したＦＶＩＩＩ活性レベルを生じる。好ましくは、ＦＶＩＩＩと同時投与された場合の組み換えポリペプチドは、十分に長い半減期を有し、それがこのコンパートメントに達すると血漿中のＦＶＩＩＩの維持を増加させるだけでなく、治療適用に適したＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティも提供する。
【００８３】
［５３］  組み換えポリペプチドと同時投与された後の血管外投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティは、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、好ましくは少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％である、実施態様［１］〜［５２］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８４】
［５４］  組み換えポリペプチドのバイオアベイラビリティは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％である、実施態様［１］〜［５３］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８５】
［５５］  同時投与されたＦＶＩＩＩタンパク質の投薬量は、２５００ＩＵ／ｋｇを超えず、好ましくは２０００ＩＵ／ｋｇを超えず、１５００ＩＵ／ｋｇを超えず、１０００ＩＵ／ｋｇを超えず、６００ＩＵ／ｋｇを超えず、５００ＩＵ／ｋｇを超えず、又は４００ＩＵ／ｋｇを超えない、実施態様［１］〜［５４］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８６】
［５６］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与の後に、ＦＶＩＩＩについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、１０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも５０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００ｍＩＵ／ｍＬ又は少なくとも４００ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性、好ましくは発色ＦＶＩＩＩ活性である、実施態様［１］〜［５５］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８７】
［５７］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、少なくとも２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも４０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも６０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも８０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は少なくとも１６０ｎｍｏｌ／ｋｇである、実施態様［１］〜［５６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。好ましくは、該組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、少なくとも５μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬ、又は少なくとも２０μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬであり、それにより値はＨＬＥＭについての計算に基づき、好ましくは、値は、好ましくはヒトアルブミンに対して特異的な、イムノアッセイのようなＨＬＥＭ特異的アッセイを使用した定量化に基づく。さらに好ましい実施態様は、実施態様［１］〜［５６］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチドに関し、ここで上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、参照処置と比較して少なくとも３倍高く、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より低いこと以外は、上記処置と同じである。
【００８８】
［５８］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与されたＦＶＩＩＩについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、少なくとも１，０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも２，０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも３，０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも５，０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ又は少なくとも２０，０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性、好ましくは発色ＦＶＩＩＩ活性である、実施態様［１］〜［５７］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００８９】
［５９］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与された組み換えポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、少なくとも２ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも３ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも４ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、又は少なくとも８０ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬである、実施態様［１］〜［５８］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。好ましくは、上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与された組み換えポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、少なくとも５００μｇ  ＨＬＥＭ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも７５０μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも１，０００μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍＬ  少なくとも５，０００μｇ  ＨＬＥＭ＊ｈ／ｍＬ、又は少なくとも１０，０００μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍＬであり、それにより値はＨＬＥＭについての計算に基づき、好ましくは値は、好ましくはヒトアルブミンに特異的なイムノアッセイのようなＨＬＥＭ特異的アッセイを使用した定量化に基づく。さらに好ましい実施態様は、実施態様［１］〜［５８］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチドに関し、ここで上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与された組み換えポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、参照処置と比較して、少なくとも５、少なくとも１０又は少なくとも１５倍高く、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より低いこと以外は上記処置と同じである。
【００９０】
［６０］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドのクリアランス（ＣＬ）値は、１．０〜２．５ｍＬ／ｋｇ／ｈの間、又は１．１〜２．２ｍＬ／ｋｇ／ｈの間、又は１．２〜２．１ｍＬ／ｋｇ／ｈの間の範囲に達する、実施態様［１］〜［５９］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００９１】
［６１］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より低いこと以外は上記処置と同じである、実施態様［１］〜［６０］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００９２】
［６２］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して、好ましくは少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７．５分の１又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より低いこと以外は上記処置と同じである、実施態様［１］〜［６１］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００９３】
［６３］  上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、１３５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、８０ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、４５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、４０ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、３５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、３０ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満又は２５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満である、実施態様［１］〜［６２］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、好ましくは参照処置のクリアランス値より低く、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より低いこと以外は上記処置と同じである。
【００９４】
［６４］  投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００又は少なくとも１０００である、実施態様［１］〜［６３］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００９５】
［６５］  組み換えポリペプチドは、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも３ｍｇ／ｋｇの組み換えポリペプチドの量で投与される、実施態様［１］〜［６４］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００９６】
［６６］  組み換えポリペプチドは、２０ｍｇ／ｋｇを超えない、１５ｍｇ／ｋｇを超えない、１０ｍｇ／ｋｇを超えない、又は５ｍｇ／ｋｇを超えない組み換えポリペプチドの量で投与される、実施態様［１］〜［６５］のいずれか１つに記載の使用のための組み換えポリペプチド。
【００９７】
［６７］  実施態様［１］〜［６６］のいずれか１つにおいて定義される血液凝固障害の処置又は予防における使用のための医薬組成物であって、該組成物は、
（ｉ）  実施態様［１］〜［７］のいずれか１つ又は実施態様［９］〜［６６］のいずれか１つに記載の切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチド［ただし、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩは同じ投与経路を介して投与しようとするものである］、及び
（ｉｉ）  第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）
を含み、
ここで組成物内の組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい、上記医薬組成物。
【００９８】
［６８］  上記処置は、血液凝固障害を有する被験体に組成物を血管外に投与することを含み、そして
該医薬組成物は、血管外同時投与に適するように処方される、実施態様［６７］に記載の使用のための医薬組成物。好ましくは、上記組み換えポリペプチドの少なくとも一部はＦＶＩＩＩに結合している。医薬組成物のさらに好ましい実施態様によれば、上記組み換えポリペプチドはＦＶＩＩＩに非共有結合で結合している。好ましくは、医薬組成物は高比率の上記ポリペプチドのダイマーを含む。医薬組成物がポリペプチドのモノマー形態及び／若しくはマルチマー形態を含まず、又は少なくともポリペプチドのモノマー形態及び／若しくはマルチマー形態を本質的に含まないことがさらに好ましい。
【００９９】
［６９］  実施態様［１］〜［６６］のいずれか１つに記載の使用のための、血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を含む第一の組成物、及び（ｉｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドを含む第二の組成物を含む医薬キットであって、該処置は、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質を、血液凝固障害を有する被験体に、好ましくは血管外に投与することを含み、ここで該ＦＶＩＩＩ及び該組み換えポリペプチドは、キット内で提供される、上記医薬キット。好ましくは、該ＦＶＩＩＩ及び該組み換えポリペプチドは、投与前に該組み換えポリペプチドの少なくとも一部が該ＦＶＩＩＩに結合することを可能にするためにキット内で提供され、ただし投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。好ましくは、第二の組成物は、高比率の該ポリペプチドのダイマーを含む。第二の組成物がポリペプチドのモノマー形態及び／若しくはマルチマー形態を含まず、又は少なくともポリペプチドのモノマー形態及び／若しくはマルチマー形態を本質的に含まないことがさらに好ましい。
【０１００】
［７０］  血液凝固障害の処置又は予防の方法であって、該方法は、有効量の、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を、血液凝固障害を有する被験体に同時投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい、上記方法。この方法内の組み換えポリペプチドは、好ましくは実施態様［１］〜［６６］のいずれか１つにしたがって提供され得る。該ポリペプチドは、皮下、皮内又は筋肉内に投与され得る。ＦＶＩＩＩもまた、皮下、皮内又は筋肉内に投与され得る。好ましくは、ＦＶＩＩＩ及び該ポリペプチドは両方共皮下投与される。該方法の別の変形によれば、ＦＶＩＩＩは組み換えポリペプチドと異なる投与経路を介して投与され、次いで好ましくはＦＶＩＩＩは静脈内投与され、より詳細には組み換えポリペプチドは皮下投与され、そしてＦＶＩＩＩは静脈内投与される。
【０１０１】
［７１］  血液凝固障害の処置又は予防の方法であって、該方法は、有効量の、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を異なる投与経路を介して、血液凝固障害を有する被験体に投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドはＦＶＩＩＩに結合することができる、上記方法。この方法内の組み換えポリペプチドは、実施態様［２］〜［６６］のいずれか１つにしたがって提供され得る。この実施態様内で、組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩに対するモル比の決定は、組み換えポリペプチドの投与前である義務はない。好ましくは、ＦＶＩＩＩは静脈内投与され、より好ましくは組み換えポリペプチドは皮下投与され、そしてＦＶＩＩＩは静脈内投与される。
【０１０２】
［７２］  血液凝固障害の処置又は予防のための、実施態様［１］〜［６６］のいずれか１つにおいて定義される組み換えポリペプチドの使用であって、該組み換えポリペプチドは切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、該処置又は予防は、ポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を被験体に、好ましくは血管外に投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができる。投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、好ましくは５０より大きい、上記使用。
【０１０３】
［７３］  切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドの、血液凝固障害の処置又は予防のための薬剤の製造のための使用であって、該処置又は予防は、組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を被験体に、好ましくは血管外に投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きく、ただし該組み換えポリペプチドは実施態様［１］〜［６６］のいずれか１つにしたがって定義される、上記使用。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩとともに又は組み換えＦＶＩＩＩなしでｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓを皮下又は静脈内投与した後の、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチド（本明細書以後では：組み換えポリペプチドとも）のレベルを示す。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをそのアルブミン成分を介して定量し、そしてｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓデータを等モル濃度に計算した。データを時点あたりｎ＝１〜４匹のマウスの平均±ＳＤとして示す。実線は皮下（ｓ．ｃ．）処置を表し、そして点線は静脈内（ｉ．ｖ．）処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；
【図２】図２は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩとともに又は組み換えＦＶＩＩＩなしでｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓを皮下投与した後の組み換えポリペプチド血漿レベルの最大濃度及びＡＵＣを示す。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをそのアルブミン成分を介して定量し、そしてｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓデータを等モル濃度で計算した。データを時点あたりｎ＝１〜４匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりを２コンパートメント吸収モデリングにより行った；
【図３】図３は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩとともに又は組み換えＦＶＩＩＩなしでｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓを皮下投与した後のｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓのバイオアベイラビリティを示す。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをそのアルブミン成分を介して定量し、そしてｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓデータを等モル濃度に計算した。データを時点あたりｎ＝１〜４匹のマウスから計算された平均ＡＵＣ０−ｉｎｆから計算した。ＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりを２コンパートメント吸収モデリングにより行った。ｒＦＶＩＩＩを用いるか又は用いずに様々な用量でｒＤ’Ｄ３−ＦＰを使用した３つの異なるｉ．ｖ．群についてｒＤ’Ｄ３−ＦＰの場合、バイオアベイラビリティを、ｉ．ｖ．投与と比較してｓ．ｃ．投与後のＡＵＣ０−ｉｎｆのパーセンテージとして計算した；
【図４】図４は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いるか又は用いないｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓの皮下又は静脈内投与後のＦＶＩＩＩ活性血漿レベルを示す。ＦＶＩＩＩを発色ＦＶＩＩＩ活性として定量した。データを時点あたりｎ＝２〜３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す；略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；
【図５】図５は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いるか又は用いないｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓの皮下投与後のＦＶＩＩＩ活性血漿レベルの最大濃度及びＡＵＣを示す。ＦＶＩＩＩを発色ＦＶＩＩＩ活性として定量した。データを時点あたりｎ＝２〜３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりを２コンパートメント−吸収モデリングにより行った；
【図６】図６は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓの皮下投与後の発色ＦＶＩＩＩ活性のバイオアベイラビリティを示す。時点あたりｎ＝２〜３匹のマウスから計算された平均ＡＵＣ０−ｉｎｆからデータを計算した。ＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりを２コンパートメント−吸収モデリングにより行った。バイオアベイラビリティを、ｒＦＶＩＩＩを用いるか又は用いずに異なる用量でｒＤ’Ｄ３−ＦＰを使用して２つの異なるｉ．ｖ．群についてｒＤ’Ｄ３−ＦＰの場合に、ｉ．ｖ．投与と比較してｓ．ｃ．投与後のＡＵＣ０−ｉｎｆのパーセンテージとして計算した。ＦＶＩＩＩ用量及び選択されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ用量をグラフに数値として示す；
【図７】図７は、ブタにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いるか又は用いないｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下又は静脈内投与後の組み換えポリペプチド血漿レベルを示す。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをそのアルブミン成分を介して定量した。データを時点あたりｎ＝１〜３匹のブタについての平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；
【図８】図８は、ブタにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いるか用いないｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下又は静脈内投与後のＦＶＩＩＩ活性血漿レベルを示す。ＦＶＩＩＩを発色ＦＶＩＩＩ活性として定量した。データを時点あたりｎ＝１〜３匹のブタについての平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；
【図９】図９は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける様々な組み換えＦＶＩＩＩ又は血漿由来のＦＶＩＩＩを用いるか又は用いないｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下又は静脈内投与後の組み換えポリペプチド血漿レベルを示す。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをそのアルブミン成分を介して定量した。データを時点あたりｎ＝２〜３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；
【図１０−１】図１０は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける様々な組み換えＦＶＩＩＩ又は血漿由来のＦＶＩＩＩを用いるか又は用いないｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下又は静脈内投与後のＦＶＩＩＩ活性血漿レベルを示す（図８Ａ  Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ）、図８Ｂ  Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）及び図８Ｃ  ＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ））。ＦＶＩＩＩを発色ＦＶＩＩＩ活性として定量した。データを時点あたりｎ＝２〜３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１】図１１は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ又はｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰの皮下又は静脈内投与後の組み換えポリペプチド血漿レベルを示す。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡをそのアルブミン成分を介して定量し、そしてｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰをそのＤ’Ｄ３成分を介して定量した。データを時点あたりｎ＝３匹のマウスの平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内；及び
【図１２】図１２は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおける組み換えＦＶＩＩＩを用いたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ又はｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰの皮下又は静脈内投与後のＦＶＩＩＩ活性血漿レベルを示す。ＦＶＩＩＩを発色ＦＶＩＩＩ活性として定量した。データを時点あたりｎ＝３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。実線はｓ．ｃ．処置を表し、そして点線はｉ．ｖ．処置を表す。略語：ｓ．ｃ．：皮下；ｉ．ｖ．：静脈内。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
詳細な説明
第一の局面において、本発明は、血液凝固障害の処置又は予防における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドに関し、該処置は、血液凝固障害を有する被験体に、組み換えポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を血管外投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。
【０１０６】
第二の局面において、本発明は、血液凝固障害の処置又は予防における使用のための医薬組成物に関し、該組成物は
（ｉ）本発明の切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチド、及び
（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）
を含み、
ここで医薬組成物内の組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩタンパク質に対するモル比は５０より大きく、そして該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、該処置は、血液凝固障害を有する被験体に医薬組成物を血管外に投与することを含み、そして該医薬組成物は血管外同時投与用に処方される。
【０１０７】
第三の局面において、本発明は、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を含む第一の組成物、及び（ｉｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む本発明の組み換えポリペプチドを含む第二の組成物を含む、本明細書において提示される血液凝固障害の処置又は予防における使用のための医薬キットに関し、該処置は、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質を被験体に血管外に投与することを含み、ここで該ＦＶＩＩＩ及び該組み換えポリペプチドは、投与の前に該組み換えポリペプチドの少なくとも一部が該ＦＶＩＩＩに結合することを可能にするためにキット内に提供され、ただし投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。
【０１０８】
第四の局面によれば、本発明は、血液凝固障害の処置又は予防の方法に関し、該方法は、有効量の、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む本発明の組み換えポリペプチド、及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を被験体に血管外同時投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてここで投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。
【０１０９】
第五の局面において、本発明は、血液凝固障害の処置又は予防のための本発明に従う組み換えポリペプチドの使用に関し、該組み換えポリペプチドは切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、該処置はポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を被験体に血管外投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そして投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。
【０１１０】
さらなる局面において、本発明は血液凝固障害の処置又は予防のための薬剤の製造のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組み換えポリペプチドの使用に関し、該処置は、ポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を被験体に血管外投与することを含み、ここで該組み換えポリペプチドは該ＦＶＩＩＩに結合することができ、そして投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きい。
【０１１１】
切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドは、本明細書において「本発明のポリペプチド」又は「組み換えポリペプチド」と呼ばれる。本発明のポリペプチドは好ましくは半減期延長部分（ＨＥＬＭ）を含む。
【０１１２】
比
以下により詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、モノマーであっても、ダイマーであっても、又はそれらの混合物であってもよい。本発明に従うモル比は、実際にモノマーとして存在してもダイマーとして存在しても、本発明のポリペプチドのモノマーサブユニットのモル濃度の比を指す。比は、同時投与されるＦＶＩＩＩのモル濃度に対して形成される。別の指示がなければ、本出願におけるＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドの比は、投与しようとする本発明のポリペプチド（好ましくはダイマーとして存在する）に含まれるモノマーの量（モル）を、投与しようとするＦＶＩＩＩの量（モル）で割ったものを指す。非限定的な例として、本発明のモノマーポリペプチド１００μＭのＦＶＩＩＩ  １μＭとの同時投与は、比１００を意味する。本発明のダイマーポリペプチド５０μＭがＦＶＩＩＩ  １μＭと同時投与される場合に同じ比１００が得られる。
【０１１３】
投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は５０より大きく、より好ましくは比は６０より大きく、又は少なくとも７５、少なくとも１００、又は１００より大きく、又は少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも３００、又は少なくとも４００、又は少なくとも５００、又は少なくとも６００、又は少なくとも７００、又は少なくとも８００、又は少なくとも９００、又は少なくとも１，０００、又は少なくとも１，１００、又は少なくとも１，２００、又は少なくとも１，３００、又は少なくとも１，４００、又は少なくとも１，５００、又は少なくとも１，６００、又は少なくとも１，７００、又は少なくとも１，８００、又は少なくとも１，９００、又は少なくとも２，０００、又は少なくとも２，５００、又は少なくとも３，０００又は少なくとも５，０００、又は少なくとも８，０００又は１０，０００までである。投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、特定の実施態様によれば、比１０，０００、比５，０００、比２，５００又は比２，０００を超えない。
【０１１４】
投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、５０より大きく１０，０００まで、または５０より大きく５，０００まで、または５０より大きく４，０００まで、または５０より大きく３，０００まで、または５０より大きく２，０００まで、または５０より大きく１，０００までの範囲に及び得る。好ましくは、投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、６０〜２，５００、または１１０〜２，０００、または１５０〜１，５００、または２００〜１，０００の範囲に及ぶ。
【０１１５】
正常ヒト血漿（ＮＨＰ）は、定義により１Ｕ／ｍＬ又は１００％の濃度でＶＷＦを含有する。これは、約１０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に相当する（Ｈａｂｅｒｉｃｈｔｅｒ  Ｓ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｒ．Ｒ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ；Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、ｅｄｓ．  Ｍａｒｄｅｒ、Ａｉｒｄ、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｓｃｈｕｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２０１３、ｐｐ１９７−２０７）。ＮＨＰ中のこのＶＷＦ濃度及び１８〜１９％のグリコシル化を含む約２６７，５００Ｄａの成熟ＶＷＦモノマーの分子量に基づいて、約３７ｘ１０−９Ｍｏｌ／ＬのＶＷＦモノマー単位の血漿モル濃度がＮＨＰについて算出され得る。ヒト血漿における内在性ＶＷＦの半減期は約１６時間である（Ｌｅｎｔｉｎｇ  ＰＪ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ  ＯＤ、Ｄｅｎｉｓ  ＣＶ．  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、ａｎｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆａｒ  ｅｎｄｓ．  Ｂｌｏｏｄ．２０１５．１２５（１３）：２０１９−２８）。
【０１１６】
本発明に従う処置のさらなる詳細は以下に更に記載される。
【０１１７】
切断型ＶＷＦ
本明細書で使用される用語「フォン・ヴィルブランド因子」（ＶＷＦ）は、天然に存在する（天然）ＶＷＦを含むが、天然に存在するＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を少なくとも保持するその変異体、例えば１つ又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換されている配列変異体も含む。ＦＶＩＩＩ結合活性は、実施例２に記載されるＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ結合アッセイにより決定される。
【０１１８】
本発明に従う好ましいＶＷＦは、配列番号４に示されるアミノ酸配列により表されるヒトＶＷＦである。配列番号４をコードするｃＤＮＡは配列番号３で示される。
【０１１９】
ヒト天然ＶＷＦをコードする遺伝子は、９ｋｂ  ｍＲＮＡに転写され、これが３１０，０００Ｄａの推定分子量を有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチド（ｐｒｅ−ｐｒｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）に翻訳される。プレプロポリペプチドは、Ｎ末端２２アミノ酸シグナルペプチド、続いて７４１アミノ酸プロポリペプチド（配列番号４のアミノ酸２３〜７６３）及び成熟サブユニット（配列番号４のアミノ酸７６４〜２８１３）を含有する。７４１アミノ酸プロポリペプチドのＮ末端からの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦを生じる。ヒト天然ＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す。別の指示がなければ、ＶＷＦ分子、特に切断型ＶＷＦが配列番号４の全ての残基を含むのではない場合でも、本出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸番号付けは配列番号４を参照する。
【０１２０】
天然ＶＷＦのプロポリペプチドは多数のドメインを含む。様々なドメインアノテーションを文献に見ることができる（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｂｌｏｏｄ  １２０（２）：４４９−４５８を参照のこと）。ＶＷＦの天然プレプロポリペプチドの以下のドメインアノテーションが本出願において適用される：
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ
配列番号４に関して、Ｄ’ドメインは、アミノ酸７６４〜８６５からなり；そしてＤ３ドメインはアミノ酸８６６〜１２４２からなる。
【０１２１】
特徴「切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」は、成熟ＶＷＦのアミノ酸配列全体（配列番号４のアミノ酸７６４〜２８１３）を含むのではないということを意味する。典型的には、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４〜２８１３全てを含むのではなく、そのフラグメントだけ含む。切断型ＶＷＦはまた、ＶＷＦフラグメントと呼ばれても、複数形でＶＷＦフラグメントと呼ばれてもよい。
【０１２２】
典型的には、切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。好ましくは、切断型ＶＷＦは、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子の成熟形態に結合することができる。別の実施態様において、切断型ＶＷＦは組み換えＦＶＩＩＩに、好ましくは本明細書に記載されるようにＦＶＩＩＩに結合するこができ、さらに好ましくは配列番号５のアミノ酸配列からなる単鎖第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。切断型ＶＷＦの第ＶＩＩＩ因子への結合は、実施例２に記載されるように、ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ結合アッセイにより決定することができる。
【０１２３】
本発明の切断型ＶＷＦは、好ましくは配列番号４のアミノ酸７７６〜８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６〜８０５に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは配列番号４のアミノ酸７７６〜８０５を含むかこれらからなる。本明細書において別の指示がなければ、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号４のアミノ酸７７６〜８０５）の全長にわたって決定される。
【０１２４】
本発明の切断型ＶＷＦは、好ましくは、配列番号４のアミノ酸７６６〜８６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６６〜８６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６６〜８６４を含むか又はこれらからなるものである。
【０１２５】
別の好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントからなるが、ただし、切断型ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。より好ましくは、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントからなるが、ただし、切断型ＶＷＦは、なおＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４〜１２４２、又は（ｂ）そのフラグメントからなるが、ただし、切断型ＶＷＦは、なおＦＶＩＩＩに結合することができる。
【０１２６】
以下により詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、切断型ＶＷＦを含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を使用する方法により製造され得る。核酸は、それ自体公知の技術により適切な宿主細胞に導入される。
【０１２７】
好ましい実施態様において、宿主細胞中の核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型成熟ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。より好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１〜１２４２に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。もっとも好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１〜１２４２、又は（ｂ）そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。特に本発明のポリペプチドがダイマーである場合、たとえポリペプチドにおける切断型ＶＷＦがＶＷＦ（例えば配列番号４）のアミノ酸１〜７６３を含まなくても、核酸はＶＷＦ（例えば配列番号４）のアミノ酸１〜７６３をコードする配列を含む。
【０１２８】
好ましい実施態様に従う本発明の組み換えポリペプチドの切断型ＶＷＦは配列番号４のＶＷＦのアミノ酸配列１〜７６３を含まないかもしれない。
【０１２９】
さらなる好ましい実施態様によれば、切断型ＶＷＦは、それぞれ配列番号４して、以下のアミノ酸配列の１つを含むかまたはそれからなる：
７７６−８０５；７６６−８０５；７６４−８０５；７７６−８１０；７６６−８１０；７６４−８１０；７７６−８１５；７６６−８１５；７６４−８１５；
７７６−８２０；７６６−８２０；７６４−８２０；７７６−８２５；７６６−８２５；７６４−８２５；７７６−８３０；７６６−８３０；７６４−８３０；
７７６−８３５；７６６−８３５；７６４−８３５；７７６−８４０；７６６−８４０；７６４−８４０；７７６−８４５；７６６−８４５；７６４−８４５；
７７６−８５０；７６６−８５０；７６４−８５０；７７６−８５５；７６６−８５５；７６４−８５５；７７６−８６０；７６６−８６０；７６４−８６０；
７７６−８６４；７６６−８６４；７６４−８６４；７７６−８６５；７６６−８６５；７６４−８６５；７７６−８７０；７６６−８７０；７６４−８７０；
７７６−８７５；７６６−８７５；７６４−８７５；７７６−８８０；７６６−８８０；７６４−８８０；７７６−８８５；７６６−８８５；７６４−８８５；
７７６−８９０；７６６−８９０；７６４−８９０；７７６−８９５；７６６−８９５；７６４−８９５；７７６−９００；７６６−９００；７６４−９００；
７７６−９０５；７６６−９０５；７６４−９０５；７７６−９１０；７６６−９１０；７６４−９１０；７７６−９１５；７６６−９１５；７６４−９１５；
７７６−９２０；７６６−９２０；７６４−９２０；７７６−９２５；７６６−９２５；７６４−９２５；７７６−９３０；７６６−９３０；７６４−９３０；
７７６−９３５；７６６−９３５；７６４−９３５；７７６−９４０；７６６−９４０；７６４−９４０；７７６−９４５；７６６−９４５；７６４−９４５；
７７６−９５０；７６６−９５０；７６４−９５０；７７６−９５５；７６６−９５５；７６４−９５５；７７６−９６０；７６６−９６０；７６４−９６０；
７７６−９６５；７６６−９６５；７６４−９６５；７７６−９７０；７６６−９７０；７６４−９７０；７７６−９７５；７６６−９７５；７６４−９７５；
７７６−９８０；７６６−９８０；７６４−９８０；７７６−９８５；７６６−９８５；７６４−９８５；７７６−９９０；７６６−９９０；７６４−９９０；
７７６−９９５；７６６−９９５；７６４−９９５；７７６−１０００；７６６−１０００；７６４−１０００；７７６−１００５；７６６−１００５；７６４−１００５；
７７６−１０１０；７６６−１０１０；７６４−１０１０；７７６−１０１５；７６６−１０１５；７６４−１０１５；７７６−１０２０；７６６−１０２０；７６４−１０２０；
７７６−１０２５；７６６−１０２５；７６４−１０２５；７７６−１０３０；７６６−１０３０；７６４−１０３０；７７６−１０３５；７６６−１０３５；７６４−１０３５；
７７６−１０４０；７６６−１０４０；７６４−１０４０；７７６−１０４５；７６６−１０４５；７６４−１０４５；７７６−１０５０；７６６−１０５０；７６４−１０５０；
７７６−１０５５；７６６−１０５５；７６４−１０５５；７７６−１０６０；７６６−１０６０；７６４−１０６０；７７６−１０６５；７６６−１０６５；７６４−１０６５；
７７６−１０７０；７６６−１０７０；７６４−１０７０；７７６−１０７５；７６６−１０７５；７６４−１０７５；７７６−１０８０；７６６−１０８０；７６４−１０８０；
７７６−１０８５；７６６−１０８５；７６４−１０８５；７７６−１０９０；７６６−１０９０；７６４−１０９０；７７６−１０９５；７６６−１０９５；７６４−１０９５；
７７６−１１００；７６６−１１００；７６４−１１００；７７６−１１０５；７６６−１１０５；７６４−１１０５；７７６−１１１０；７６６−１１１０；７６４−１１１０；
７７６−１１１５；７６６−１１１５；７６４−１１１５；７７６−１１２０；７６６−１１２０；７６４−１１２０；７７６−１１２５；７６６−１１２５；７６４−１１２５；
７７６−１１３０；７６６−１１３０；７６４−１１３０；７７６−１１３５；７６６−１１３５；７６４−１１３５；７７６−１１４０；７６６−１１４０；７６４−１１４０；
７７６−１１４５；７６６−１１４５；７６４−１１４５；７７６−１１５０；７６６−１１５０；７６４−１１５０；７７６−１１５５；７６６−１１５５；７６４−１１５５；
７７６−１１６０；７６６−１１６０；７６４−１１６０；７７６−１１６５；７６６−１１６５；７６４−１１６５；７７６−１１７０；７６６−１１７０；７６４−１１７０；
７７６−１１７５；７６６−１１７５；７６４−１１７５；７７６−１１８０；７６６−１１８０；７６４−１１８０；７７６−１１８５；７６６−１１８５；７６４−１１８５；
７７６−１１９０；７６６−１１９０；７６４−１１９０；７７６−１１９５；７６６−１１９５；７６４−１１９５；７７６−１２００；７６６−１２００；７６４−１２００；
７７６−１２０５；７６６−１２０５；７６４−１２０５；７７６−１２１０；７６６−１２１０；７６４−１２１０；７７６−１２１５；７６６−１２１５；７６４−１２１５；
７７６−１２２０；７６６−１２２０；７６４−１２２０；７７６−１２２５；７６６−１２２５；７６４−１２２５；７７６−１２３０；７６６−１２３０；７６４−１２３０；
７７６−１２３５；７６６−１２３５；７６４−１２３５；７７６−１２４０；７６６−１２４０；７６４−１２４０；７７６−１２４２；７６６−１２４２；７６４−１２４２；
７６４−１４６４；７６４−１２５０；７６４−１０４１；７６４−８２８；７６４−８６５；７６４−１０４５；７６４−１０３５；７６４−１１２８；７６４−１１９８；
７６４−１２６８；７６４−１２６１；７６４−１２６４；７６４−１４５９；７６４−１４６３；７６４−１４６４；７６４−１６８３；７６４−１８７３；７６４−１４８２；
７６４−１４７９；７６４−１６７２；及び７６４−１８７４。
【０１３０】
特定の実施態様において、切断型ＶＷＦは、成熟野生型ＶＷＦと比較して内部欠失を有する。例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、ＣＫドメイン又はそれらの組み合わせが欠失され得、そしてＤ’ドメイン及び／又はＤ３ドメインが保持される。さらなる実施態様によれば、切断型ＶＷＦはドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６またはＣＫの１つまたはそれ以上を欠いている。さらなる実施態様によれば、切断型ＶＷＦは配列番号４のアミノ酸１２４３〜２８１３、すなわちドメインＡ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫを欠いている。
【０１３１】
さらなる実施態様において、切断型ＶＷＦは、血小板糖タンパク質Ｉｂα（ＧＰＩｂα）、コラーゲン及び／又はインテグリンαＩＩｂβＩＩＩ（Ｃ１ドメイン内のＲＧＤＳ配列）についての結合部位を含まない。他の実施態様において、切断型ＶＷＦは、ＶＷＦの中央Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３についての切断部位（Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６）を含まない。さらに別の実施態様において、切断型ＶＷＦはＧＰＩｂαについての結合部位を含まず、かつ／又はコラーゲンについての結合部位を含まず、かつ／又はインテグリンαＩＩｂβＩＩＩについての結合部位を含まず、かつ／又はＶＷＦの中央Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３についての切断部位（Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６）を含まない。
【０１３２】
他の実施態様において、切断型ＶＷＦは、前の段落において列挙されるアミノ酸配列のうちの１つに対して、少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかそれからなるものであり、ただし切断型ＶＷＦはＦＶＩＩＩに結合することができる。
【０１３３】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの２つのモノマーが共有結合で連結されている場合、本発明において「ダイマー」と称される。好ましくは、共有結合は本発明のポリペプチドの切断型ＶＷＦ部分内に位置する。好ましくは、２つのモノマーサブユニットは、少なくとも１つのジスルフィド架橋により、例えば１つ、２つ、３つ又は４つのジスルフィド架橋を介して共有結合により連結される。少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、好ましくは本発明のポリペプチドの切断型ＶＷＦ部分内に位置する。一実施態様において、これらのシステイン残基は、Ｃｙｓ−１０９９、Ｃｙｓ−１１４２、Ｃｙｓ−１２２２、Ｃｙｓ−１２２５、若しくはＣｙｓ−１２２７又はそれらの組み合わせである。好ましくは、本発明のダイマーポリペプチドは、ポリペプチドの切断型ＶＷＦ部分内に位置する該共有結合に加えてモノマーを連結するさらなる共有結合連結を含まず、特にポリペプチドのＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ部分内に位置するいずれのさらなる共有結合も含まない。しかし代替の実施態様によれば、本発明のダイマーポリペプチドは、モノマーを連結するポリペプチドのＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ部分に位置する共有結合を含み得る。
【０１３４】
ダイマーは好ましくはホモダイマーであり、それにより各モノマーは好ましくは本明細書に開示される半減期延長部分を含む。本発明のポリペプチドがダイマーである場合、切断型ＶＷＦは、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４〜１０９９、アミノ酸７６４〜１１４２、アミノ酸７６４〜１２２２、アミノ酸７６４〜１２２５、又はアミノ酸７６４〜１２２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含むか又はそれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４〜１０９９、アミノ酸７６４〜１１４２、アミノ酸７６４〜１２２２、アミノ酸７６４〜１２２５、又はアミノ酸７６４〜１２２７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４〜１０９９、アミノ酸７６４〜１１４２、アミノ酸７６４〜１２２２、アミノ酸７６４〜１２２５、アミノ酸７６４〜１２２７又はアミノ酸７６４〜１２４２を含むか又はそれらからなる。
【０１３５】
切断型ＶＷＦは、ＷＯ２０１３／１０６７８７Ａ１、ＷＯ２０１４／１９８６９９Ａ２、ＷＯ２０１１／０６０２４２Ａ２又はＷＯ２０１３／０９３７６０  Ａ２（その開示は本明細書に参照により加入される）において開示されるＶＷＦフラグメントのいずれか１つであってもよい。
【０１３６】
さらなる好ましい実施態様によれば、上で開示される切断型ＶＷＦは、ＷＯ２０１６／００００３９Ａ１に開示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み得る。切断型ＶＷＦのそれらの改変バージョンは、配列番号４に従う野生型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列と比較して、そのＤ’ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。切断型ＶＷＦの改変バージョンのアミノ酸配列は、それぞれの野生型配列と比べて１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有し得る。改変された切断型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは配列番号４のＤ’ドメインと比べて１つ又は２つのアミノ酸置換を有する。配列番号４の位置７６４（配列番号２の位置１に対応する）におけるＳが、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群より選択されるアミノ酸で置換されていることが好ましい。配列番号４の位置７６６（配列番号２の位置３に対応する）におけるＳが、Ｙ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群より選択されるアミノ酸で置換されていることも好ましい。置換の好ましい組み合わせとしては、配列番号４の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ及びＳ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌが挙げられる。本発明のポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する結合親和性は、上記修飾を除いて同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドをの結合親和性と比較して、上記置換の導入によりさらに増加し得る。切断型ＶＷＦ内の上記置換は、内在性ＦＶＩＩＩの半減期若しくは同時投与されるＦＶＩＩＩの半減期をさらに増加するように寄与し得、かつ／又は投与しようとする本発明の組み換えポリペプチドの用量の減少を可能にし得る。
【０１３７】
本明細書で使用される用語「内在性ＶＷＦ」は、その多量体化の程度に関係なく、ＶＷＦのモノマーサブユニットを指す。
【０１３８】
半減期延長部分（ＨＬＥＭ）
切断型ＶＷＦに加えて、本発明のポリペプチドは、特定の好ましい実施態様において、半減期延長部分をさらに含み得る。半減期延長部分は、切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列であり得る。あるいは、半減期延長部分は、ペプチド結合と異なる共有結合により切断型ＶＷＦを含むポリペプチドに化学的に結合され得る。
【０１３９】
本発明の特定の実施態様において、本発明のポリペプチドの半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により延長される。別の実施態様において、本発明のポリペプチドは、アルブミンのようなＨＬＥＰに化学リンカーを介して結合される。この結合技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ  ＬＬＣにより例となる方法で記載されている（例えば、米国特許第７，２５６，２５３号）。
【０１４０】
他の実施態様において、半減期延長部分は半減期増強タンパク質（ＨＬＥＰ）である。好ましくは、ＨＬＥＰはアルブミン又はそのフラグメントである。アルブミンのＮ末端は、切断型ＶＷＦのＣ末端に融合され得る。あるいは、アルブミンのＣ末端は、切断型ＶＷＦのＮ末端に融合され得る。１つ又はそれ以上のＨＬＥＰは、ＶＷＦのＮ末端又はＣ末端部分に融合され得るが、ただしそれらは切断型ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合能を妨げず、消失もしない。
【０１４１】
組み換えポリペプチドは、好ましくは切断型ＶＷＦとＨＬＥＭとの間に位置づけられた化学結合又はリンカー配列を更に含む。
【０１４２】
上記リンカー配列は、互いに等しくても異なっていてもよい１つ若しくはそれ以上のアミノ酸、例えば１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５若しくは１〜３（例えば、１、２又は３つ）のアミノ酸からなるペプチドリンカーであり得る。好ましくは、リンカー配列は野生型ＶＷＦにおける対応する位置には存在しない。上記リンカー配列に存在する好ましいアミノ酸としてはＧｌｙ及びＳｅｒが挙げられる。リンカー配列は非免疫原性であるべきである。好ましいリンカーは、交互のグリシン及びセリン残基から構成され得る。適切なリンカーは例えばＷＯ２００７／０９０５８４に記載される。
【０１４３】
本発明の別の実施態様において、切断型ＶＷＦ部分とＨＬＥＭとの間のペプチドリンカーはペプチド配列からなり、これはヒトたんぱく質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然環境におけるこのようなペプチド配列は、タンパク質表面の付近に位置し、そしてこの配列に対する天然の寛容性を仮定することができるように免疫系にアクセス可能である。例はＷＯ２００７／０９０５８４に示される。切断可能なリンカー配列は、例えばＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に記載される。
【０１４４】
組み換えポリペプチドの好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦとＨＬＥＭとの間のリンカーは、配列番号２のアミノ酸配列４８０〜５１０を有するか又はこれらからなるグリシン／セリンペプチドリンカーである。
【０１４５】
一実施態様において、ポリペプチドは以下の構造を有する：
ｔＶＷＦ−Ｌ１−Ｈ、［式１］
式中、ｔＶＷＦは切断型ＶＷＦであり、Ｌ１は化学結合又はリンカー配列であり、そしてＨはＨＬＥＰである。
【０１４６】
Ｌ１は、化学結合、又は互いに等しくても異なっていてもよい１つ若しくはそれ以上のアミノ酸、例えば１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５若しくは１〜３（例えば、１、２又は３つ）のアミノ酸からなるリンカー配列であり得る。通常は、リンカー配列は野生型ＶＷＦにおける対応する位置には存在しない。Ｌ１に存在する適切なアミノ酸の例としてはＧｌｙ及びＳｅｒが挙げられる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、そして切断不可リンカーでも切断可能リンカーでもよい。切断不可リンカーは、ＷＯ２００７／０９０５８４Ａ１において例示されるように交互のグリシン及びセリンから構成されていてもよい。本発明の別の実施態様において、切断型ＶＷＦとアルブミン部分との間のペプチドリンカーはペプチド配列からなり、これがヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然の環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する天然の耐性を仮定することができるように、タンパク質表面の近くに位置し、そして免疫系に対してアクセス可能である。例はＷＯ２００７／０９０５８４に示される。切断可能なリンカー配列は、例えばＷＯ２０１３／１２０９３９  Ａ１に記載される。
【０１４７】
好ましいＨＬＥＰ配列は以下に記載される。それぞれのＨＬＥＰの正確な「Ｎ末端アミノ酸」若しくは正確な「Ｃ末端アミノ酸」への融合、又はそれぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」若しくは「Ｃ末端部分」への融合が本発明により同様に包含され、これはＨＬＥＰの１つ又はそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠失を含む。ポリペプチドは、１つより多くのＨＬＥＰ配列、例えば、２つ又は３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの多数のＨＬＥＰ配列は、例えば連続的な繰り返しとして縦一列にＶＷＦのＣ末端部分に融合され得る。
【０１４８】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）であり、より好ましくはＨＬＥＰは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー又はそのフラグメント、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖（例えばＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）又はプロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ））、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理的条件下で新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に免疫グロブリン定常領域およびその部分、例えばＦｃフラグメントに結合することができるポリペプチド、生理条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバーもしくはそのフラグメントまたは免疫グロブリン定常領域もしくはその部分に結合することができるポリペプチドまたは脂質から選択される。免疫グロブリン定常領域又はその部分は、好ましくは、免疫グロブリンＧ１のＦｃフラグメント、免疫グロブリンＧ２のＦｃフラグメント又は免疫グロブリンＡのＦｃフラグメントである。
【０１４９】
本明細書において使用される半減期増強ポリペプチドは、本明細書に記載される全長半減期増強タンパク質でも、凝固因子の治療活性又は生物学的活性を安定化又は延長することができる、特に本発明のポリペプチドのインビボ半減期を増加させることができるその１つ又はそれ以上のフラグメントでもよい。このようなフラグメントは、ＨＬＥＰフラグメントがＨＬＥＰを含まないそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも２５％の機能的半減期延長をもたらす限り、１０若しくはそれ以上のアミノ酸長のフラグメントであってもよく、又はＨＬＥＰ配列からの少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいてもよく、又はそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部若しくは全てを含んでいてもよい。
【０１５０】
本発明のポリペプチドのＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＬＥＰの変異体であってもよい。用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」は、保存的又は非保存的のいずれかの、挿入、欠失及び置換を含み、ここでこのような変化は切断型ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を実質的に変更しない。
【０１５１】
特に、本発明の提案されたＶＷＦ  ＨＬＥＰ融合構築物は、ＨＬＥＰ及びＨＬＥＰのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。ＨＬＥＰは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物ＨＬＥＰとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケが挙げられる。
【０１５２】
本開示の特定の実施態様によれば、本発明のポリペプチドのＨＬＥＭ部分、特にＨＬＥＰは、代替の用語「ＦＰ」で特定され得る。好ましくは、用語「ＦＰ」は別の指示がなければヒトアルブミンを表す。
【０１５３】
特定の好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは融合タンパク質である。本発明については融合タンパク質は、切断型ＶＷＦ、さらにはＨＬＥＰをコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列のインフレーム連結により生成されたタンパク質である。当業者は、融合タンパク質ＤＮＡ配列の翻訳が単一のタンパク質配列を生じることを理解する。さらなる好ましい実施態様に従うペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列のインフレーム挿入の結果として、切断型ＶＷＦ、適切なリンカー及びＨＬＥＰを含む融合タンパク質が得られ得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様によれば、同時投与されたＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されるＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ構造のいずれも含まない。特定の他の実施態様によれば、同時投与されたＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されるＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ構造の少なくとも１つを含み得る。
【０１５５】
ＨＬＥＰとしてのアルブミン
用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）及び「ヒトアルブミン」（ＨＡ）及び「アルブミン」（ＡＬＢ）は、本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、かつヒト血清アルブミン（並びにそのフラグメント及び変異体）、さらには他の種由来のアルブミン（並びにそのフラグメント及び変異体）を包含する。
【０１５６】
本明細書で使用される「アルブミン」は、集合的に、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンフラグメント若しくは変異体を指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン若しくはそのフラグメント、特に本明細書において配列番号６で示されるヒトアルブミンの成熟形態又は他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはそのフラグメント、又はこれらの分子若しくはそのフラグメントのアナログ若しくは変異体を指す。
【０１５７】
本開示の特定の実施態様によれば、代替の用語「ＦＰ」はＨＬＥＰを識別するため、特にアルブミンをＨＬＥＰとして定義するために使用される。
【０１５８】
特に、本発明の提案されたポリペプチドは、ヒトアルブミン及びヒトアルブミンのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは７０より多いアミノ酸長である。
【０１５９】
本発明の好ましい実施態様は、ＦｃＲｎ受容体への増強された結合を有する本発明のポリペプチドのＨＬＥＰとして使用されるアルブミン変異体を含む。このようなアルブミン変異体は、野生型アルブミンとの切断型ＶＷＦ融合物と比較して、切断型ＶＷＦアルブミン変異体融合タンパク質のより長い血漿半減期をもたらし得る。
【０１６０】
本発明のポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン又はそれらの保存的改変を含み得る。
【０１６１】
ＨＬＥＰとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療的タンパク質の半減期を増加させることが当該分野で公知である（Ｄｕｍｏｎｔ  Ｊ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．２００６．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０：１５１−１６０）。重鎖のＩｇＧ定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）及びヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、いずれかの哺乳動物由来、又はそれぞれサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４由来であり得る。抗原結合ドメインを含まないＩｇＧ及びＩｇＧフラグメントもまた、ＨＬＥＰとして使用され得る。治療的ポリペプチド部分は、好ましくは、切断可能であってもよい、抗体又はペプチドリンカーのヒンジ領域を介してＩｇＧ又はＩｇＧフラグメントに接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療的タンパク質のインビボ半減期を増強するために免疫グロブリン定常領域に治療的タンパク質を融合させることを記載する。ＵＳ  ２００４／００８７７７８及びＷＯ２００５／００１０２５は、Ｆｃドメイン又は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部の、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これは他の方法ではインビボで急速に排出される。Ｆｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質は、増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより大きな溶解度を達成したと記載された（ＷＯ  ２００６／０００４４８Ａ２）。長い血清半減期及び増加したインビボ効力を有するＦｃ−ＥＰＯタンパク質が開示され（ＷＯ  ２００５／０６３８０８Ａ１）、さらに全て半減期増強特性を有する、Ｇ−ＣＳＦ（ＷＯ  ２００３／０７６５６７Ａ２）、グルカゴン様ペプチド−１（ＷＯ  ２００５／０００８９２Ａ２）、凝固因子（ＷＯ  ２００４／１０１７４０Ａ２）及びインターロイキン−１０（米国特許第６，４０３，０７７号）とのＦｃ融合物も開示された。
【０１６２】
本発明に従って使用することができる様々なＨＬＥＰは、ＷＯ  ２０１３／１２０９３９  Ａ１において詳細に記載される。
【０１６３】
本発明のポリペプチドのＮ−グリカン及びシアリル化
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ−グリカンを含み、そして該Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。好ましい実施態様において、該Ｎ−グリカンの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。本発明者らは、高度にシアリル化されたＶＷＦフラグメントを含むポリペプチドが、延長された半減期自体を有するだけでなく、同時投与されるＦＶＩＩＩの半減期も延長することができるということを見出した。換言すれば、本発明のポリペプチドの投与は、同時投与されたＦＶＩＩＩの延長された半減期及び／又は減少したクリアランスをもたらす。
【０１６４】
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ−グリカンを含み、そして糖タンパク質のＮ−グリカンのシアリル基の少なくとも５０％は、α−２，６−連結シアリル基である。一般に、末端シアリル基は、α−２，３−又はα−２，６−連結を介してガラクトース基に結合され得る。典型的に、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンは、α−２，３−連結シアリル基よりもα−２，６−シアリル基を多く含む。好ましくは、Ｎ−グリカンのシアリル基の少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％は、α−２，６−連結シアリル基である。これらの実施態様は、例えば、ヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの哺乳動物細胞における同時発現により得ることができる。
【０１６５】
このような糖タンパク質を製造する適切な方法は、係属中のＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６１４４０に記載される。従って、増加したシアリル化を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法がそこで記載され、この方法は、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を供給すること、及び（ｉｉ）該細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む。さらに、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む糖タンパク質のダイマーを製造するか、又は該糖タンパク質の二量体化を増加するための方法が記載され、この方法は、（ｉ）糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を供給すること、及び（ｉｉ）該細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む。さらに、増加したシアリル化を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法がそこで記載され、この方法は、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸を含む細胞を供給すること、及び（ｉｉ）糖タンパク質及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。
【０１６６】
一実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。
【０１６７】
別の実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満又は１％未満は、アシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちこれらはシアル酸基を欠いたＮ−グリカンである。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満又は１％未満はアシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちこれらはシアル酸基を有していない。
【０１６８】
本発明の他の実施態様は切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、ここで該切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができ、そしてここで上記糖タンパク質はＮ−グリカンを含み、ここで該Ｎ−グリカンの３５％未満、好ましくは３４％未満、好ましくは３３％未満、好ましくは３２％未満、好ましくは３１％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２９％未満、好ましくは２８％未満、好ましくは２７％未満、好ましくは２６％未満、好ましくは２５％未満、好ましくは２４％未満、好ましくは２３％未満、好ましくは２２％未満、好ましくは２１％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１９％未満、好ましくは１８％未満、好ましくは１７％未満、好ましくは１６％未満、好ましくは１５％未満、好ましくは１４％未満、好ましくは１３％未満、好ましくは１２％未満、好ましくは１１％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは９％未満、好ましくは８％未満、好ましくは７％未満、好ましくは６％、そして好ましくは５％未満は、平均して、２つ又はそれ以上の末端かつ非シアリル化ガラクトース残基を含む。
【０１６９】
本発明のさらに他の実施態様は切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、ここで該切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができ、そしてここで該切断型ＶＷＦはＮ−グリカンを含み、ここで該Ｎ−グリカンの６％未満、好ましくは５％未満、好ましくは４％未満、好ましくは３％未満、好ましくは２％未満、そして好ましくは１％未満は、平均して、３つ又はそれ以上の末端非シアリル化ガラクトース残基を含む。
【０１７０】
上記の実施態様は互いに組み合わされ得る。上述のＮ−グリカンのいずれのパーセンテージ、又はシアリル化度のいずれの指示も、平均のパーセンテージ又はシアリル化度と理解されるべきであり、すなわち、それらは単一の分子ではなく分子の集団を指す。糖タンパク質の集団内の個々の糖タンパク質分子のグリコシル化又はシアリル化がいくらかの不均質性を示すことは明らかである。
【０１７１】
ダイマー
本発明のポリペプチドは好ましくは高い比率のダイマーを有する。従って、本発明のポリペプチドは好ましくはダイマーとして存在する。従って、本発明のポリペプチドは好ましくはダイマーとして存在する。一実施態様において、ポリペプチドの少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％、又は約１００％はダイマーとして存在する。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのダイマー：モノマー比は、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５又は少なくとも３である。最も好ましくは、本発明の全てのポリペプチドはダイマーとして存在する。本発明のポリペプチドがマルチマー形態を含まないことがさらに好ましい。ダイマーがモノマーと比較して第ＶＩＩＩ因子に対する改善された親和性を有するので、ダイマーの使用は有利である。本発明のポリペプチドのダイマー含有量、及びモノマーに対するダイマーの比は、実施例２に記載されるように決定することができる。
【０１７２】
一実施態様において、第ＶＩＩＩ因子に対する本発明のポリペプチドの親和性は、同じ第ＶＩＩＩ因子分子に対するヒト天然ＶＷＦの親和性よりも高い。ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子親和性は、ヒト天然、血漿由来若しくは組み換えの第ＶＩＩＩ因子、特に切断型欠失Ｂドメインを有する組み換え第ＶＩＩＩ因子分子、好ましくは配列番号５により特徴づけられる第ＶＩＩＩ因子分子を参照してもよい。
【０１７３】
高い比率のダイマーを有する本発明のポリペプチドの調製物は、第ＶＩＩＩ因子に対して増加した親和性を有することが見出されている。このような第ＶＩＩＩ因子に対する増加した親和性は、本発明のポリペプチドによる第ＶＩＩＩ因子の増強された安定化をもたらす。あるいは、又は増加したダイマー比率と組み合わせても、第ＶＩＩＩ因子に対する親和性を増加させる第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン内の変異を有する本発明に従うポリペプチドは、本発明の好ましい実施態様である。適切な変異は、例えばＷＯ  ２０１３／１２０９３９  Ａ１に記載される。
【０１７４】
ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の方法に従って製造され得る。ヒト天然ＶＷＦのプレ−プロ形態のｃＤＮＡ配列（配列番号３）に基いて、上述の切断型ＶＷＦ構築物又は本発明のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを設計し生成することができる。
【０１７５】
たとえ宿主細胞により分泌されるポリペプチドがヒト天然ＶＷＦのプレ−プロ形態のアミノ酸１〜７６３を含んでいなくても、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）が配列番号４のアミノ酸２３〜７６３に対して、又は好ましくはアミノ酸１〜７６３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。最も好ましくは、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号４のアミノ酸２３〜７６３、又は配列番号４のアミノ酸１〜７６３をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１７６】
ＤＮＡが正確な方向で発現プラスミド中に挿入されたオープンリーディングフレーム全体を含有する構築物が、タンパク質発現のために使用され得る。典型的な発現ベクターは、プラスミド保有細胞において挿入された核酸に対応する大量のｍＲＮＡの合成を方向づけるプロモーターを含有する。これらはまた、宿主生物内でのそれらの自律増殖を可能にする複製起点配列、及び合成されたｍＲＮＡが翻訳される効率を増加させる配列を含み得る。安定な長期ベクターは、例えば、ウイルス（例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のＯｒｉＰ配列）の調節エレメントを使用することにより自由に複製する実体として維持され得る。ゲノムＤＮＡ中にベクターを組み込まれた細胞株もまた製造され得、そしてこの方法では、遺伝子産物は連続して産生される。
【０１７７】
典型的に、供給しようとする細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物宿主細胞に導入することにより得られる。
【０１７８】
細胞培養しやすく、かつ糖タンパク質を発現しやすいいずれかの宿主細胞が、本発明に従って利用され得る。特定の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物である。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｓ）（ＰＥＲ．Ｃ６  （ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養用にサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３  ２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；水牛ラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４−６８、１９８２）；ＭＲＣ  ５細胞；ＰＳ４細胞；ヒト羊膜細胞（ＣＡＰ）；及びヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。好ましくは、細胞株は、齧歯動物細胞株、特にハムスター細胞株、例えばＣＨＯ又はＢＨＫである。
【０１７９】
目的の糖タンパク質の発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するために適した方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０−６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０−４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＰ  １１７，０６０；及びＥＰ  １１７，０５８を参照のこと。哺乳動物細胞については、遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入する一般的方法としては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂのリン酸カルシウム沈降法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４５７、１９７８）又はＨａｗｌｅｙ−ＮｅｌｓｏｎのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）法（Ｆｏｃｕｓ  １５：７３、１９９３）が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的局面は、米国特許第４，３９９，２１６号においてＡｘｅｌにより記載されている。遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入するための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７−５３７、１９９０、及びＭａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８−３５２、１９８８を参照のこと。
【０１８０】
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養する。ポリペプチドは、当業者に公知の方法を使用して回収そして精製され得る
最大濃度、時間−濃度曲線下面積、終末期半減期、ＭＲＴ、クリアランス及びバイオアベイラビリティ
本発明の別の局面は、血管外投与後のＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティを提供するか又は増加させるための、本明細書の上で定義された切断型ＶＷＦを含むポリペプチドの使用である。さらに、本発明の局面は、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、終末期半減期及び／若しくは平均滞留時間（ＭＲＴ）を増加させるため、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含んでいないこと以外は、かつ／若しくは投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比より小さい、特に５０未満、６０未満、７５未満、１００未満、２００未満、３００未満、４００又は１０００未満のモル比であること以外は上記処置と同じである参照処置と比較して、第ＶＩＩＩ因子のクリアランスを減少させるためのその使用である。
【０１８１】
薬物動態データの評価のために、２コンパートメントモデル（二相薬物動態プロフィール）を適用した。
【０１８２】
最大濃度（Ｃｍａｘ）はモデルにより得られた最も高い血漿濃度である。上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、ＦＶＩＩＩについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、少なくとも１０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも５０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００ｍＩＵ／ｍＬ又は少なくとも４００ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性、好ましくは発色ＦＶＩＩＩ活性であり得る。
【０１８３】
組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、特定の実施態様によれば、少なくとも２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも４０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも６０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも８０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は少なくとも１６０ｎｍｏｌ／ｋｇである。好ましくは、該組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、少なくとも５μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬ、１０μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ  ＨＬＥＭ／ｍＬ、又は少なくとも２０μｇ  ＨＬＥＭ  ／ｍＬであり、それによる値はＨＬＥＭについての値は、好ましくはヒトアルブミンに特異的な、イムノアッセイにようなＨＬＥＭ特異的アッセイを使用した定量化に基づく。組み換えポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、参照処置と比較して少なくとも３倍高いものであり得るが、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１８４】
ＡＵＣ０−ｉｎｆは、ゼロから無限大までの血漿濃度−時間曲線下面積である。組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与されたＦＶＩＩＩについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、少なくとも１０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも２０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも３０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも５０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも１００００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ又は少なくとも２００００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性、好ましくは発色ＦＶＩＩＩ活性であり得る。
【０１８５】
組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与された組み換えポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、少なくとも２ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも３ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも４ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬ又は少なくとも８０ｎｍｏｌ＊ｈ／ｍＬである。好ましくは、組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与された組み換えポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、少なくとも５００μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも７５０μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも１０００μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも５０００μｇ  ＨＬＥＭ＊ｈ／ｍＬ、又は少なくとも１００００μｇ  ＨＬＥＭ  ＊ｈ／ｍであり得、それにより値はＨＬＥＭについての計算に基づき、好ましくは、値は好ましくはヒトアルブミンに特異的な、イムノアッセイのようなＨＬＥＭ特異的アッセイを使用した定量化に基づく。
【０１８６】
組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、同時投与された組み換えポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）は、参照処置と比較して、少なくとも５倍高いものであり得、少なくとも１０倍高く、又は少なくとも１５倍高く、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１８７】
特定の時間ｔにおける「半減期」Ｔ１／２（ｔ）は、時間ｔに存在する血漿濃度Ｃ（ｔ）が半分になるためにかかる時間である。「終末期半減期」（以後の文章ではｔ１／２と略される）は、ｔが無限大になる場合のＴ１／２（ｔ）の極限である。これは２の自然対数を最終消失定数（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）で割ることにより計算される。
【０１８８】
投与されたＦＶＩＩＩの終末期半減期は、組み換えポリペプチドの同時投与により、参照処置比較して好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、又は少なくとも３倍増加し得、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。好ましくは、同時投与されるＦＶＩＩＩの終末期半減期は、参照処置と比較して増加しており、ここで該参照処置は、投与しようとする  組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１８９】
その後組み換えポリペプチドを同時投与される投与されたＦＶＩＩＩの終末期半減期は、少なくとも５時間（ｈ）、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間又は少なくとも１５時間に達し得る。
【０１９０】
本発明のポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの血漿半減期と比較して増加し得、ここでポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの血漿半減期より好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％又は好ましくは少なくとも４００％高い。
【０１９１】
その後ＦＶＩＩＩと同時投与される組み換えポリペプチドの終末期半減期は、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間又は少なくとも３５時間に達し得る。組み換えポリペプチドの終末期半減期は参照処置と比較して増加し得、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置同じである。
【０１９２】
本明細書で使用される用語「ＭＲＴ」は、薬物分子（例えば、本発明のポリペプチド又はＦＶＩＩＩ）が体内に滞留する平均時間を意味する。一定のクリアランスを有する薬物動態系では、ＭＲＴは一次モーメント曲線下面積（ＡＵＭＣ０−ｉｎｆ）をＡＵＣ０−ｉｎｆで割ったものとして計算され得る。一次モーメント曲線は、その時間における血漿濃度を掛けた時間である。ＡＵＭＣ０−ｉｎｆをＡＵＣ０−ｉｎｆと同様に計算した。
【０１９３】
投与されたＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は、組み換えポリペプチドの同時投与により、参照処置と比較して好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍増加し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１９４】
投与されたＦＶＩＩＩのＭＲＴは、少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも１５時間、少なくとも２０時間又は少なくとも２５時間に達し得る。
【０１９５】
投与された組み換えポリペプチドのＭＲＴは、参照処置と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍に増加し得、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１９６】
本明細書で使用される用語「クリアランス」は、血漿から薬物が除去される速度を指す。詳細には、薬物の現在の排出速度をその現在の血漿濃度で割ったものである。単回静脈内投与後の薬物動態系において、クリアランスはＡＵＣ０−ｉｎｆに対する用量の比として計算することができ、ただしクリアランスは一定である。クリアランスが低いほど、血漿から薬物が除去されるまでの時間が長くなる。
【０１９７】
組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して、好ましくは少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７．５分の１又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対する比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１９８】
好ましくは、組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの投与後に、投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、１３５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、８０ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、４５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、４０ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、３５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満、３０ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満又は２５ｍＬ／ｋｇ／ｈ未満である。投与されたＦＶＩＩＩのクリアランス（ＣＬ）値は、好ましくは参照処置のクリアランス値より低く、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０１９９】
組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドのクリアランス（ＣＬ）値は、１．０〜２．５ｍＬ／ｋｇ／ｈの間、又は１．１〜２．２ｍＬ／ｋｇ／ｈの間又は１．２〜２．１ｍＬ／ｋｇ／ｈの間の範囲に達し得る。
【０２００】
上記組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩとの同時投与後に、組み換えポリペプチドについてのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０２０１】
本明細書で使用される用語バイオアベイラビリティは、皮下投与後の本発明のポリペプチド、例えばｒＤ’Ｄ３−ＦＰのＡＵＣ０−ｉｎｆの、静脈内投与後の本発明のポリペプチド、例えばｒＤ’Ｄ３−ＦＰのＡＵＣ０−ｉｎｆに関するパーセンテージとして定義される。
【０２０２】
本発明はさらに、皮下ＦＶＩＩＩ投与を可能にするための、本明細書の上で定義されたポリペプチド、例えば限定されないが上記の実施態様［１］〜［６６］の使用に関する。本発明は特に、ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティを提供するか又は増加させるための、本明細書の上で定義されるポリペプチドの使用にさらに関する。
【０２０３】
投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティは、組み換えポリペプチドとの同時投与後に、参照処置と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍増加し得、ここで該参照処置は、投与しようとする組み換えポリペプチドがＨＬＥＭを含まないこと以外は、かつ／又は投与しようとする組み換えポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が本発明に従うモル比未満であること以外は、本発明に従う処置と同じである。
【０２０４】
投与されたＦＶＩＩＩの組み換えポリペプチドとの同時投与後のバイオアベイラビリティは、好ましくは少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、好ましくは少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％である。組み換えポリペプチドとの同時投与後の投与されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティ更に好ましい範囲は、５〜８０％、５〜７０％、５〜６０％、５〜５０％、５〜４０％、５〜３０％、５〜２５％、１０〜２５％、１０〜１５％、又は５〜１５％である。
【０２０５】
ＦＶＩＩＩとの同時投与後の組み換えポリペプチドのバイオアベイラビリティは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも８０％である。
【０２０６】
本発明のさらなる局面は、有効量の本明細書の上で定義されるポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法である。
【０２０７】
さらなる局面は、血友病Ａの処置においてＦＶＩＩＩ投与の頻度を減少させるための、本明細書の上で定義されるポリペプチドの、例えば限定されないが上の実施態様［１］〜［６６］のいずれかによる使用である。ＦＶＩＩＩの皮下投与の頻度は週あたり２回に減少され得る。あるいは、ＦＶＩＩＩの皮下投与の頻度は、週あたり１回、またはさらにより低く、例えば１０日に１回、又は１４日に１回に減少され得る。ＦＶＩＩＩは、週に２回、５日ごと、週に１回、１０日ごと、２週ごと、３週ごと、４週ごと又は月に１回、又は前述の値のうちいずれか２つの間の範囲、例えば４日ごとから毎月、１０日ごとから２週ごとなどで投与され得る。
【０２０８】
本明細書で使用される用語「トラフレベル」は、予防的設定でＦＶＩＩＩの次の用量が適用されるであろう血漿ＦＶＩＩＩ濃度を指す。現在では、重症血友病Ａを有する患者について、推奨されるトレフレベル（すなわち、体内に存在する凝固因子の最も低いレベル）は１％に設定される。１、５及び１０％トラフレベルまでの時間は、０．０１、０．０５又は０．１ＩＵ／ｍＬに等しいモデル式を設定し、時間について解くことにより計算される。
【０２０９】
好ましくは、ＨＬＥＭを有するポリペプチドと一緒に同時投与されたＦＶＩＩＩの１％、５％又は１０％トラフレベルに達するための期間は、参照処置と比較して延長され、ここで参照処置は、ＦＶＩＩＩが該ＨＬＥＭを有していない組み換えポリペプチドとともに投与されること以外は本発明に従う処置と同じである。
【０２１０】
ポリペプチドと一緒に同時投与されたＦＶＩＩＩの１％トラフレベルに達するための期間は、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、若しくは少なくとも約５０時間であり；又は該ポリペプチドと一緒に同時投与されたＦＶＩＩＩの５％トラフレベルに達するための期間は、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３４時間、若しくは少なくとも約４３時間であり；又は該ポリペプチドと一緒に同時投与されたＦＶＩＩＩの１０％トラフレベルに達するための時間は、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１８時間、若しくは少なくとも約２０時間である。
【０２１１】
凝固障害の処置
本発明のポリペプチドは、血友病Ａ及びフォン・ヴィルブランド病を含む血液凝固障害を処置するために有用である。用語「血友病Ａ」は、機能的凝固ＦＶＩＩＩの欠乏を指し、これは通常は遺伝性である。いくつかの好ましい実施態様に従うフォン・ヴィルブランド病は、２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病、３型フォン・ヴィルブランド病、及び１型フォン・ヴィルブランド病からなる群より選択される。
【０２１２】
一実施態様において、血液凝固障害は中程度血友病Ａである。中程度血友病Ａは、好ましくはＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約１％〜約５％である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。典型的に、中程度血友病Ａを有する被験体は、血漿中０．０１〜０．０５ＩＵ／ｍＬの内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
【０２１３】
別の実施態様において、血液凝固障害は軽度血友病Ａである。軽度血友病Ａは、好ましくはＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約５％〜約４０％である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。典型的には、軽度血友病Ａを有する被験体は、血漿中０．０５〜０．４ＩＵ／ｍＬの内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
【０２１４】
別の実施態様において、血液凝固障害は、好ましくはＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性の１％未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを伴う重症血友病Ａである。
【０２１５】
別の実施態様において、血液凝固障害は２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病である。２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病は、好ましくは、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約３％〜約３０％に対応する、約３ＩＵ／ｄＬと約３０ＩＵ／ｄＬ  ＦＶＩＩＩ活性レベルとの間の範囲である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。患者の大部分は、２０ＩＵ／ｄＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル、従ってＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの２０％未満のレベルを有する。従って、２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病を有する被験体は、血漿中０．０３ＩＵ／ｍＬ〜０．３ＩＵ／ｍＬ、典型的には０．２ＩＵ／ｍＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
【０２１６】
別の実施態様において、血液凝固障害は、好ましくは、通常は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約１％〜約２０％に対応する約１ＩＵ／ｄＬと約２０ＩＵ／ｄＬとの間のＦＶＩＩＩ活性レベル範囲である処置前の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる３型フォン・ヴィルブランド病である。患者の大部分は、１０ＩＵ／ｄＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル、従ってＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの１０％未満のレベルを有する。
【０２１７】
別の実施態様によれば、血液凝固障害は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルと比較して減少した処置前の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる１型フォン・ヴィルブランド病である。
【０２１８】
疾患の処置は、いずれかの臨床病期であるか又は顕性化した疾患のいずれかの形態を有すると既に診断された患者の処置；疾患の症状若しくは徴候の開始若しくは発展若しくは増悪若しくは悪化を遅延させること；並びに／又は疾患の重症度を防止及び／若しくは低減させることを包含する。
【０２１９】
本発明のポリペプチドが投与される「被験体」又は「患者」は、好ましくはヒトである。特定の局面において、ヒトは小児患者である。他の局面において、ヒトは成人患者である。
【０２２０】
本発明のポリペプチド及び、場合によりＦＶＩＩＩを含む組成物が本明細書に記載される。組成物は、典型的には薬学的に許容しうる担体を含む無菌医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者にそれを投与する所望の方法に依存して）任意の適切な形態であり得る。
【０２２１】
用語「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」又は「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、そして血漿由来のＦＶＩＩＩ及び組み換えＦＶＩＩＩの両方を包含する。組み換えＦＶＩＩＩは、限定することなく、全長ＦＶＩＩＩ、さらには二本鎖Ｂドメイン欠失又は切断型変異体、さらには単鎖Ｂドメイン欠失又は切断変異体、例えばＷＯ  ２００４／０６７５６６Ａ１に記載されるもの及びＢドメインの外側に変異を有するがＦＶＩＩＩの生物学的活性を有する他のＦＶＩＩＩ変異体を包含する。
【０２２２】
本発明のポリペプチドは、皮下、皮内又は筋肉内のような様々な血管外経路により患者に投与され得る。いずれかの所定の症例における投与に最も適切な経路は、特定のポリペプチド、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度並びに被験体の身体状態に依存する。好ましくは、本発明のポリペプチドは皮下投与される。
【０２２３】
ポリペプチド及びＦＶＩＩＩは好ましくは皮下に同時投与される。
【０２２４】
本発明のポリペプチド及びＦＶＩＩＩを用いた処置の総投薬数、及び長さの決定は、当業者の能力の十分範囲内である。投与しようとする本発明のポリペプチドさらにＦＶＩＩＩの投薬量は、投与しようとするＦＶＩＩＩの濃度、処置しようとする患者における内在性ＶＷＦの濃度、又はその両方に依存し得る。本出願の発明者らにより定義される比に基づく有効投薬量は、本発明のポリペプチドの分子量さらには投与しようとするＦＶＩＩＩの分子量を考慮して、当業者により決定され得る。血液凝固障害の重症度も、本発明のポリペプチドの適切な投薬量さらには投与しようとするＦＶＩＩＩの適切な投薬量を決定するために考慮され得る。ＦＶＩＩＩについての典型的な投薬量は、約２０ＩＵ／ｋｇ体重〜約１０００ＩＵ／ｋｇ体重、好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重〜約５００ＩＵ／ｋｇ体重、更に好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重〜約４００ＩＵ／ｋｇ体重、より好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重〜約３００ＩＵ／ｋｇ体重の範囲に及び得る。
【０２２５】
本発明によれば、本発明のポリペプチドを用いて処置される患者はまた、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を用いて処置される。本発明のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子は、好ましくは同時に、すなわち一緒に投与され得るが、逐次的な投与も原理的に行うことができ、両方の投与様式が用語「組み合わせ治療」及び「同時投与」により包含される。本発明のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子は、混合物として、すなわち同じ組成物内で投与されても、別々に、すなわち別個の組成物として投与されてもよい。組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質の同時投与は、好ましくは組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質を含む単一の組成物で一緒に投与されることにより達成される。更に好ましい実施態様によれば、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質の同時投与は、単一の組成物中で混合されている組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩを含む組み合わせ製剤を提供することにより、又は第一の製品は組み換えポリペプチドを含み、そして第二の製品はＦＶＩＩＩを含む少なくとも２つの別個の製品のセット若しくはキットを提供することにより達成される。
【０２２６】
特に、組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩタンパク質が同時投与前に混合されるように別個の組成物又は製品で提供される場合、この混合物は、投与前に該組み換えポリペプチドの少なくとも一部が該ＦＶＩＩＩに結合することを可能にするようなやり方で投与前に処理され得る。例えば、混合物は特定の時間インキュベートされ得る。このようなインキュベーションは、周囲温度又は適切な場合は高温で、しかし好ましくは４０℃未満の温度のいずれかで１分未満、又は５分未満行われ得る。このような迅速なインキュベーション工程はまた、単一の組成物中に混合された組み換えポリペプチド及びＦＶＩＩＩを含む組み合わせ製品のための再構成の間適切であり得る。
【０２２７】
使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、典型的には１０〜１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲である。異なる実施態様において、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩの濃度は、本明細書において定義される本発明のＶＷＦポリペプチドに対する比に関する要件が満たされることを条件として、１０〜８，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１０〜５，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２０〜３，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは５０〜１，５００ＩＵ／ｍｌの範囲、又は３，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２，５００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１，５００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１，２００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは８００ＩＵ／ｍｌ、若しくは７５０ＩＵ／ｍｌ、若しくは６００ＩＵ／ｍｌ、若しくは５００ＩＵ／ｍｌ、若しくは４００ＩＵ／ｍｌ、若しくは３００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２５０ＩＵ／ｍｌ、若しくは２００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１５０ＩＵ／ｍｌ、若しくは１２５ＩＵ／ｍｌ、若しくは１００ＩＵ／ｍｌ、若しくは６２．５ＩＵ／ｍｌ、若しくは５０ＩＵ／ｍｌであるが、ただし本明細書において定義される本発明のＶＷＦポリペプチドに対する比に関する要件は満たされる。
【０２２８】
「国際単位」又は「ＩＵ」は、「ＩＵ」で較正された国際標準品に対して較正された標準を使用して一段階凝固アッセイ又は発色性基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより測定されたＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の尺度の単位である。一段階凝固アッセイは、Ｎ  Ｌｅｅ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）３０、５１１  ５１９（１９８３）に記載されるように、当該分野で公知である。一段階アッセイの原理：この試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）−アッセイの改変バージョンとして行われる：リン脂質及び表面活性剤とともに血漿をインキュベートすることにより、内在凝固系の因子が活性化される。カルシウムイオンの添加が凝固カスケードを誘発する。測定可能なフィブリン血栓の形成までの時間が決定される。アッセイは、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の存在下で行われる。欠乏血漿の凝固能は、試験しようとするサンプル中に含まれる凝固第ＶＩＩＩ因子により回復される。凝固時間の短縮は、サンプル中に存在する第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、国際単位で第ＶＩＩＩ因子の既知の活性を有する標準品との直接比較により定量化される。
【０２２９】
別の標準的なアッセイは、発色基質アッセイである。発色基質アッセイは、市販で購入され得る、例えばＣｏａｍａｔｉｃ（Ｒ）ＦＶＩＩＩ試験キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ  Ｖ．  ｌｅ  Ｍｏｎｚａ  ３３８−２０１２８  Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）。発色性アッセイの原理：カルシウム及びリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を第ＩＸａ因子により第Ｘａ因子へと活性化させる。この反応は、補因子としての第ＶＩＩＩａ因子により刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定しようとするサンプル中のＦＶＩＩＩ由来の混合物中の少量のトロンビンにより形成される。最適濃度のＣａ２＋、リン脂質及び第ＩＸａ因子並びに過剰量の第Ｘ因子を使用する場合、第Ｘ因子の活性化は、第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化第Ｘ因子は、発色性基質Ｓ−２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。従って、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡの放出は、形成されたＦＸａの量に比例し、従って、サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。
【０２３０】
医薬組成物
本明細書に記載される方法において適した本発明のポリペプチドの治療用製剤は、当該分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は安定剤（これらは全て本明細書で「担体」と呼ばれる）、すなわち、緩衝化剤、安定剤、保存料、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒｓ）、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の種種雑多な添加物と、所望の程度の純度を有するポリペプチドを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての貯蔵のために製造され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ、ｅｄ．  １９８０）を参照のこと。このような添加物は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。
【０２３１】
緩衝化剤は、生理条件に近い範囲にｐＨを維持するために役立つ。これらは約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲に及ぶ濃度で存在し得る。適切な緩衝化剤としては、有機及び無機の両方のその酸及び塩、例えばクエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びＴｒｉｓのようなトリメチルアミン塩が使用され得る。
【０２３２】
保存料は微生物増殖を妨害するために添加され得、そして０．２％〜１％（質量／体積）の範囲に及ぶ量で添加され得る。適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールが挙げられる。「安定剤」としても知られる等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするために加えられ得、そしてこれらとしては多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。安定剤は、増量剤から、治療剤を可溶化するか又は変性もしくは容器壁への付着を防止する添加剤に及ぶ機能を有し得る広義の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上で列挙された）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、（イノシトールのようなシクリトール類を含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基又はそれ以下のペプチド）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン  単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えばラクトース、マルトース、スクロース及び三糖、例えばラフィノース；及び多糖、例えばデキストランであり得る。安定剤は、活性タンパク質１質量部あたり０．１〜１０，０００質量部の範囲で存在し得る。
【０２３３】
非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）又は洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を促進するため、さらには撹拌誘導凝集に対して治療用タンパク質を保護するために加えられ得、これはまた、タンパク質の変性を引き起こすことなく圧力を加えられたせん断面に製剤が曝露されることを可能にする。適切な界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（Ｒ）−２０、ＴＷＥＥＮ（Ｒ）−８０など）の非イオン界面活性剤が挙げられる。界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る
さらなる様々な賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。
【０２３４】
本明細書における製剤は、本発明のポリペプチドに加えて第二の治療剤も含んでいてもよい。適切な第二の治療剤の例は以下に示される。
【０２３５】
投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重篤度、及び本発明のポリペプチドに対する患者の感受性を含む、多数の臨床因子に依存して月に１回から毎日まで変化し得る。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、週に２回、５日ごと、週に１回、１０日ごと、２週間毎、３週間ごと、４週間ごと、又は月に１回、又は前述の値のいずれか２つの間の任意の範囲で、例えば、４週ごとから毎月、１０日ごとから２週ごとなどで投与される。
【０２３６】
投与しようとする本発明のポリペプチドの投薬量は、特定のポリペプチド、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度、被験体の身体状態、治療計画（例えば、第二の治療剤が使用されるかどうか）、及び選択された投与経路によって変わる；適切な投薬量は、当業者により容易に決定され得る。
【０２３７】
本発明のポリペプチドの最適な量及び個々の投薬の間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路、及び部位、並びに処置される特定の被験体の年齢及び状態により決定されること、そして医師が、使用されるべき適切な投薬量を最終的に決定するということは、当業者により認識されるだろう。この投薬は、必要なだけ頻繁に繰り返され得る。副作用が発生する場合、投薬の量及び／又は頻度が、通常の臨床診療に従って変更されるか又は減少され得る。
【０２３８】
医薬組成物は、好ましくは血管外に投与されるように、好ましくは皮下投与されるように処方される。
【０２３９】
当業者には当然のことながら、本明細書に記載される発明は、具体的に記載されるもの以外の変形及び改変を受けやすい。当然のことながら、本発明は、精神及び範囲内であるこのような変形及び改変をすべて含む。本発明はまた、本明細書において個々に又は集合的に言及されるか又は示された特徴、組成物、工程及び化合物の全て、並びに上記特徴、組成物、工程及び化合物のいずれか２つ又はそれ以上の全ての組み合わせを含む。
【０２４０】
配列表に示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を表１にまとめる。
【０２４１】
【表１】
2020504082.tif 000002
【０２４２】
本発明の特定の実施態様は、ここで以下の実施例を参照して記載されるが、これらは説明の目的のみを意図されるものであり、本明細書において前記された普遍概念の範囲を限定することはいとされない。
【実施例】
【０２４３】
材料及び方法
Ｄ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質（Ｄ’Ｄ３−ＦＰ）の生成：
ＶＷＦアミノ酸１〜１２４２をコードするｃＤＮＡ、グリシン／セリンリンカー及びヒトアルブミンのｃＤＮＡからなるＤ’Ｄ３−ＦＰの発現カセットを、カスタム遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により製造した。隣接する制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ）を介して発現カセットを供給されたクローニングベクターから切除し、そしてＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて線状化したｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に挿入した。得られた発現プラスミドは、ＶＷＦプロペプチド、ＣＭＶプロモーター制御下にある短いリンカーコード配列を介してアルブミンコード配列に融合されたＤ’及びＤ３（配列番号４のＶＷＦアミノ酸１〜１２４２）をコードするヌクレオチド配列を含有していた。コード配列のヌクレオチド配列は配列番号１として表示され、成熟Ｄ’Ｄ３−ＦＰのアミノ酸配列を配列番号２として示す。発現の間のＤ１Ｄ２  ＶＷＦプロペプチド（７４１アミノ酸）の存在は、合成されたポリペプチドの二量体化に不可欠である。
【０２４４】
同様のアプローチを使用して、Ｈｉｓタグ化Ｄ’Ｄ３タンパク質（グリシン／セリンリンカーにより連結されたＤ’Ｄ３及びＨｉｓ８）、及びグリシン／セリンリンカーを介して連結され、そして融合タンパク質のＣ末端で８つのヒスチジンによりタグ化された、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのＣ末端ペプチドへのＤ’Ｄ３融合タンパク質のための発現プラスミドを生成した。成熟Ｄ’Ｄ３−Ｈｉｓのアミノ酸配列を配列番号７として示し、そして成熟Ｄ’Ｄ３−ＣＴＰのアミノ酸配列を配列番号８として示す。
【０２４５】
上記の発現プラスミドをＸＬ１０  Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、そして標準的プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。
【０２４６】
ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトし、そして無血清培地（ＣＤ−ＣＨＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５００〜１０００μｇ／ｍｌジェネテシンの存在下にて増殖させた。ＷＯ２００７／１４４１７３Ａ１に記載されるようにＰＡＣＥ／フリン（ｐＦｕ−７９７）をコードする発現プラスミドを、プロペプチド切断効率を最大にするために同時トランスフェクトした。単細胞由来クローンを増殖させ、そしてアルブミン特異的酵素イムノアッセイ（以下を参照のこと）により定量したそれらのＤ’Ｄ３−ＦＰ発現収率に従って選択した。Ｄ’Ｄ３−ＦＰ発酵のために最終的に選択した細胞株をＴ２０５０−ＣＬ３と呼んだ。
【０２４７】
発酵プロセスを灌流モードで適用してｒＤ’Ｄ３−ＦＰの製造をバイオリアクターで行った。ｒＤ’Ｄ３含有ポリペプチドの製造のための発酵プロセスは、細胞株Ｔ２０５０−ＣＬ３の解凍から開始し、続いて振盪フラスコで細胞増殖させ、そして最終的に発酵プロセスを灌流モードでＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢｉｏＳｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵ  ５Ｌバイオリアクター及びＢｉｏＳｔａｔ  ＳＴＲ  ５０Ｌ単回使用バイオリアクターを使用して行った。それぞれＢｉｏＳｅｐｓ  １０Ｌ又は２００Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）を細胞保持デバイスとして使用した。細胞培地は８ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１μＭ  ＣｕＳＯ４を含むＰｏｗｅｒＣＨＯ３  （Ｌｏｎｚａ  ＢＥＳＰ１２０４）又は１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１μＭ  ＣｕＳＯ４を含むＰｒｏＣＨＯ５（Ｌｏｎｚａ  ＢＥＳＰ１０７２）のいずれかであった。
【０２４８】
振盪フラスコ中のシードトレインを３７℃、７．５％ＣＯ２で振盪速度１６０ｒｐｍにて行った。
【０２４９】
５Ｌバイオリアクターに２．５ｘ１０５細胞／ｍＬの標的ＶＣＤを播種した。８ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１μＭ  ＣｕＳＯ４を含むＰｏｗｅｒＣＨＯ３中で＋３７．０℃の温度、ｐＨ７．００、及び３０％酸素飽和にて細胞を培養した。＋３７℃でのバイオリアクター実行からの初期収穫を採取した後に＋３４．０℃への温度シフト（評価範囲＋３１℃〜＋３５℃）を行った。酸として散布されたＣＯ２及び塩基としてＮａＨＣＯ３を使用してｐＨを制御した。オーバーレイ空気流量を０．５Ｌ／分に設定した。リングスパージャーを散布ユニットとして使用した。撹拌速度は、２倍ピッチ羽根を用いてダウンプルモードで１５０ｒｐｍだった。
【０２５０】
５０Ｌバイオリアクターに標的ＶＣＤ  ３．０ｘ１０５細胞／ｍＬを播種した。１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１μＭ  ＣｕＳＯ４を含むＰｒｏＣＨＯ５培地で＋３７．０℃の温度、ｐＨ６．９０、及び３０％酸素飽和で細胞を培養した。＋３４．０℃への温度シフトを初期の１又は２回の収穫後に行った。上記のＰＨ制御、オーバーレイ空気流量を２Ｌ／分に設定した。マイクロスパージャーを散布ユニットとして使用した。撹拌速度は２倍ピッチ羽根を用いてダウンプルモードで９０ｒｐｍだった。
【０２５１】
バイオリアクター中のＶＣＤが≧１．０ｘ１０６細胞／ｍＬになった場合に灌流を開始した。灌流速度を１．０体積／体積／日に設定した。ＢｉｏＳｅｐをバックラッシュモードで５（１０）分ランタイム及び１０秒バックラッシュで７（３０）Ｗの電源入力で操作した（カッコ内の数字は５０Ｌバイオリアクターを指す）。灌流液及びブリード（ｂｌｅｅｄ）をインラインろ過し、そして４８時間にわたって＋２〜＋８℃にてバッグに集めた。能動的ブリードにより濁度プローブを使用して２ｇ／Ｌグルコースの標的とともにパラメーターとしてグルコース消費を使用してＶＣＤを制御した。収穫及びブリードをインラインろ過し、使い捨てフィルター及び使い捨てバッグからなる収穫システムを２日ごとに変更した。
【０２５２】
以下に記載されるＰＫ分析のための材料を製造するために、Ｄ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質収穫物をアフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。手短には、バイオリアクターからの無細胞収穫物をＴＦＦシステム（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  ５００  Ｓ）を使用して３０ｋＤ膜（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  ＯＳ０３０Ｔ１２）を用いて３０倍濃縮した。その濃縮物をＮａＣｌ及びＥＤＴＡを用いて最終濃度０．７５Ｍ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡまでスパイクし、そして終夜、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．４で予め平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトアルブミンカラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。カラムを平衡緩衝液で洗浄した後、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。次いで溶出液を１０倍濃縮し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して３０ｋＤカットオフを有する超遠心フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ．  ＵＦＣ９０３０２４）を用いて透析した。モノマー部分からｒＤ’Ｄ３−ＦＰダイマーを分離するために、その材料を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  コード：１７−１０６９−０１）にロードし、そしてＤ’Ｄ３−ＦＰダイマーを含有するピークフラクションをプールした。ダイマー及びモノマーピークフラクションについての曲線下面積を使用して、ダイマー対モノマー比を計算した。上記Ｄ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質のダイマー調製物を、薬物動態実験に使用した。このようなダイマー調製物は、別の指示がなければ、以下においてＤ’Ｄ３−ＦＰと呼ばれる。
【０２５３】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ変異体を同等の方法工程により生成した。
【０２５４】
Ｈｉｓタグ化Ｄ’Ｄ３タンパク質を、Ｎｉ−キレートアフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。手短には、ＴＦＦ濃縮無細胞バイオリアクター収穫物（詳細については上を参照のこと）を、予め平衡化した（２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）Ｎｉ−セファロースカラム（ＨｉｓＴｒａｐＴＭ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に終夜ロードした。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄した後、タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出した。次いで溶出液を濃縮し、そしてＡｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター（上記を参照のこと）を使用して透析した（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）。次いで最終生成物をＳＥＣカラム（上を参照のこと）上にロードし、ダイマーを含有するピークフラクションをプールし、そして約７ｍｇ／ｍＬ  ＯＤ２８０−３２０に濃縮した。Ｈｉｓタグ化Ｄ’Ｄ３タンパク質のダイマー調製物を薬物動態実験のために使用した。このようなダイマー調製物は、別の指示がなければ、以下においてｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓと呼ばれる。
【０２５５】
実施例１：ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はその変異体の存在下での組み換えＦＶＩＩＩの皮下バイオアベイラビリティ
血管外注射がＦＶＩＩＩを用いた改善された治療のための選択肢となり得るかどうかを評価するために、血管外治療の典型的代表、すなわち皮下（ｓ．ｃ．）注射を選択した。我々の目的は、様々なアプローチで切断型ＶＷＦを含む組み換えポリペプチドのＦＶＩＩＩの皮下バイオアベイラビリティに対する影響を特徴づけることであった：
・  実施例１．１：血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスでにおいて両方共皮下投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＶＩＩＩ−単鎖の調査
・  実施例１．２：生理的内在性ＦＶＩＩＩを有するモデル、すなわちブタにおいて両方共皮下投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＶＩＩＩ−単鎖の調査
・  実施例１．３：血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおいてそれぞれ皮下投与された様々なＦＶＩＩＩ製品に対するｒＤ’Ｄ３−ＦＰの効果の調査
・  実施例１．４：マウス血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおいて両方共皮下投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ親和性変異体、非アルブミンＨＥＬＰを有するｒＤ’Ｄ３分子及びｒＶＩＩＩ−単鎖の効果の調査
したがって、我々は、リンカーペプチドを介してアルブミンに融合されたＶＷＦのＤ’及びＤ３ドメインを含む組み換えポリペプチドの、組み換えＦＶＩＩＩと皮下に同時投与された場合の影響を調査した。
【０２５６】
この実施例のために、配列番号２において定義されるアミノ酸配列を有する切断型ＶＷＦを含むポリペプチドを使用した。この特定の融合タンパク質は、ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３領域を表すＮ末端アミノ酸配列１〜４７９（ヒト天然ＶＷＦのアミノ酸７６４〜１２４２）、続いて３１アミノ酸グリシン／セリンリンカーペプチド及びＣ末端ヒトアルブミンアミノ酸配列５１１〜１０９５からなる。配列番号２において定義される配列を有するこの融合タンパク質は、以下においてｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＷＴと呼ばれる。
【０２５７】
実施例の目的のために、配列番号５において定義されるアミノ酸配列を有する組み換えＢドメイン欠失単鎖ＦＶＩＩＩ、すなわちｒＶＩＩＩ−単鎖を使用した。実施例１．３において、様々な組み換えＦＶＩＩＩ製品を試験した。
【０２５８】
さらに、我々は、ｒＶＩＩＩ−単鎖に対する異なる様々な比のｒＤ’Ｄ３−ＦＰの影響を調べた。
【０２５９】
皮下アベイラビリティについての可能性のあるメディエータとしてのアルブミン融合の影響を、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰのバイオアベイラビリティをＨｉｓタグ化ｒＤ’Ｄ３（ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ）のバイオアベイラビリティと比較することにより調べた。成熟Ｄ’Ｄ３−Ｈｉｓのアミノ酸配列を配列番号７として示し、これによりＤ’Ｄ３及びＨｉｓ８はグリシン／セリンリンカーで接続されている。
【０２６０】
半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）としてのアルブミンの代替として、いくつかの実施例において、アルブミンの代わりに、グリシン／セリンリンカーを介してｒＤ’Ｄ３に融合されたＣＴＰ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのＣ末端ペプチド）を有するｒＤ’Ｄ３−ＦＰ変異体を使用し、これは本明細書以後でｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰと呼ばれる。融合タンパク質ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰは配列番号８において定義される配列を有する。
【０２６１】
特定の実施例において、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの高親和性変異体を使用した。この特定の変異融合タンパク質は、ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３  領域を表すＮ末端アミノ酸１〜４７９（ヒト天然ＶＷＦのアミノ酸７６４〜１２４２）、続いて３１アミノ酸グリシン／セリンリンカーペプチド及びＣ末端ヒトアルブミンアミノ酸配列５１１〜１０９５からなるが、ただし該ポリペプチドのＤ’Ｄ３内には３つのアミノ酸置換、すなわちＳ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙ及びＶ１０８３Ａが存在する。この融合タンパク質は、Ｄ’Ｄ３領域内に上記３つの置換Ｓ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙ、及びＶ１０８３Ａを有する配列番号２において定義される配列からなる。この変異体は本明細書以後でｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡと呼ばれる。
【０２６２】
材料及び方法
背景情報
様々なｒＤ‘Ｄ３−ＦＰ：ｒＶＩＩＩ−単鎖組み合わせの比を計算するために、以下の仮説を立てた：
・  薬物はそれらの投与後に体重１ｋｇあたり４０ｍＬの血漿で希釈される
・  使用された本発明のポリペプチドの分子量：モノマーサブユニットのｒＤ’Ｄ３−ＦＰ分子量（グリコシル化を含む）：１２７，０００Ｄａ（ＨＬＥＭ＝ヒトアルブミン）；モノマー分子量を計算した比において使用した
・  ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓの分子量：モノマーサブユニットのｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ分子量（グリコシル化を含む）：６４，０００Ｄａ；モノマー分子量を計算された比に使用した
・  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ変異体の分子量：モノマーサブユニットのｒＤ’Ｄ３−ＦＰ分子量（グリコシル化を含む）：１２７，０００Ｄａ；モノマー分子量を計算された比において使用した
・  ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰの分子量：モノマーサブユニットのｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰ分子量（グリコシル化を含む）：６９，８００Ｄａ；モノマー分子量を計算された比に使用した
・  使用したＦＶＩＩＩの分子量：ｒＶＩＩＩ−単鎖分子量（グリコシル化を含む）：１８０，０００Ｄａ及び特異的活性：１１，０００ＩＵ／ｍｇ
・  使用した他のＦＶＩＩＩ製品の分子量：
○Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ）：分子量：２８５，０００Ｄａ及び特異的活性：５，０００ＩＵ／ｍｇ
○Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）：分子量：２８０，０００Ｄａ及び特異的活性：７，０００ＩＵ／ｍｇ
○ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（Ｒ）：分子量：１７０，０００Ｄａ及び特異的活性：１０，７００ＩＵ／ｍｇ
Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ）はＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇからの血漿由来ヒトＦＶＩＩＩ製品である。
Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）はＢａｘｔｅｒ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａから購入した組み換え全長第ＶＩＩＩ因子調製物である。
ＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）はＰｆｉｚｅｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｋｅｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから購入したＢドメイン欠失組み換え第ＶＩＩＩ因子調製物である。
【０２６３】
分析
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ（野生型、さらにはＥＹＡ変異体）をヒトアルブミンＥＬＩＳＡにより定量した用量レベルで適用し、それによりタンパク質のアルブミン部分を測定した。このｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＬＩＳＡを血漿サンプルにも使用した。
【０２６４】
ヒトアルブミンＥＬＩＳＡは、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．  （Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＵＳＡ）からのポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン捕捉抗体を使用した。検出溶液は、ポリクローナルペルオキシダーゼ標識抗ヒトアルブミン検出抗体調製物（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＵＳＡ）からなる。発色読み出し、すなわちＳｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＴＭＢを、終止直後にマイクロプレートリーダーで４５０／６５０ｎｍ（ＥＬｘ８０８、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）にて定量するために使用した。標準として、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを含有する薬物製剤を使用した。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの量をｍｇアルブミンで示し、すなわち分子のＤ’Ｄ３部分について調節を行わなかった。
【０２６５】
ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ及びｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰ構築物の用量レベルをＯＤ２８０で測定し、そしてタンパク質の量をｒＤ’Ｄ３−ＨｉｓについてｒＤ’Ｄ３−ＦＰの量に対して当モル濃度に調節した。それにより、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓについての単位はｒＤ’Ｄ３−ＦＰと同じであり、すなわち、これはグラフにおいて理論的ｍｇアルブミンとしてプロットされる。ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰをｒＤ’Ｄ３−ＦＰ（ＥＹＡ変異体）と同様のモル比で投薬し、そして単位はアルブミンに変換しなかったが、ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰとして示す。ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ及びｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰを含有するＰＫの血漿サンプルを抗Ｄ’Ｄ３  ＥＬＩＳＡで測定した。このＤ’Ｄ３  ＥＬＩＳＡは、モノクローナル抗ヒトＤ’Ｄ３捕捉抗体（社内研究調製物）を使用した。検出溶液は、別のモノクローナルペルオキシダーゼ標識抗ヒトＤ’Ｄ３検出抗体（社内研究調製物）からなる。発色読み出し、すなわちＳｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＴＭＢを、終止直後にマイクロプレートリーダーにおける４５０／６５０ｎｍ（ＥＬｘ８０８、ＢｉｏＴｅｋ、Ｖｅｒｍｏｎｔ、ＵＳＡ）での定量のための使用した。標準として、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ及びｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰを含有する薬物製剤を使用し、そして前のようにｒＤ’Ｄ３−ＨｉｓをｒＤ’Ｄ３−ＦＰと比較して当モル濃度に計算し、すなわち再び量を理論的ｍｇアルブミンとして示す。ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰの量をｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰ濃度として示す。
【０２６６】
ＦＶＩＩＩ発色活性血漿レベルを、製造者の試験取扱説明書に従ってＣＯＡＭＡＴＩＣ（Ｒ）  ＦＶＩＩＩアッセイ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ  発色アッセイ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）により検出した。ＦＶＩＩＩ発色活性をＦＶＩＩＩ：Ｃと略す。
【０２６７】
ヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇ血漿レベルを、Ｓｔａｇｏ、Ｓ．Ａ．Ｓ．、ＦｒａｎｃｅからのＦＶＩＩＩ  Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＥＬＩＳＡ試験キットを用いて試験取扱説明書に従って決定した。Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  試験キットは、終止液を除いて全ての試薬を含んでおり、終止液はＳｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。標準として、ｒＶＩＩＩ−単鎖を含有する薬物製剤を使用した。
【０２６８】
動物
ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウス
ＦＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１６及び１７を欠失し、したがって血漿第ＶＩＩＩ因子活性を有していないので（Ｂｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９５、Ｖｏｌ  １０（１）、１１９−１２１；Ｂｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ、Ｂｌｏｏｄ、１９９６、Ｖｏｌ  ８８（９）、３４４６−３４５０）、（血友病Ａ表現型を表す）ＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスを選択した。これは、これらのマウスの血漿におけるＦＶＩＩＩ活性を定量することによりＦＶＩＩＩを用いた処置後のＦＶＩＩＩ活性レベルの分析を可能にする。
【０２６９】
１７〜３５ｇの体重範囲の  雄性及び雌性ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。社内でこれらの動物を標準的飼育条件、すなわち２０〜２４℃にて１２時間／１２時間明−暗サイクル下に維持した。動物に自由に標準的ラット食餌を与えた（Ｓｓｎｉｆｆ−Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
【０２７０】
群サイズはｎ＝１２であり、３又は４つのコホートに分けた。したがって時点あたりｎ＝３〜４匹の動物を使用した。
【０２７１】
ブタ
ヒトについてのその予測因子に関して皮下バイオアベイラビリティの良好なモデルを表すのでブタを選択した
２３〜２７ｋｇの体重範囲の雄性ブタをＳｃｈｌｏｓｓｅｒ（Ｓｃｈｗａｌｍｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。社内では、動物を家畜小屋でわら上にて１８〜２１℃に維持した。動物に損傷した穀物（ｂｒｕｉｓｅｄ  ｇｒａｉｎ）を与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
【０２７２】
群サイズは２（静脈内）又は３（皮下）であった。
【０２７３】
実施例１．１：血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおいて両方共皮下投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＶＩＩＩ−単鎖の調査。
【０２７４】
実験詳細
試験品を単回注射で総体積５ｍＬ／ｋｇにて頸部に皮下（ｓ．ｃ．）投与又は外側尾静脈（ｌａｔｅｒａｌ  ｔａｉｌ  ｖｅｉｎ）中に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。投与された用量レベル及び経路を表２に示す。
【０２７５】
【表２】
2020504082.tif 000003
【０２７６】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをヒトアルブミン値に基づいて０．３〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で適用し、ｒＶＩＩＩ−単鎖用量は５０〜４００ＩＵ／ｋｇ  発色ＦＶＩＩＩ活性の範囲に及んだ。ｒＶＩＩＩ−単鎖を注射用水で再構成し、そしてｒＤ’Ｄ３−ＦＰさらにはｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓを水浴で解凍した。同時投与のために、化合物を一緒に約３０分間＋３７℃でインキュベートした。全ての場合に、用量体積５ｍＬ／ｋｇを投与し、必要な場合はＦＶＩＩＩについて希釈緩衝液を化合物の溶解のために使用した。
【０２７７】
血液サンプルを短期間麻酔下で交互サンプリングスキームを使用して球後で採取した。ｓ．ｃ．群における時点は投与後（ｐ．ａ．）３、８、１６、２４、４８、７２、及び９６時間（ｈ）（４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖及び１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ＋４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖群を除く）であり、そしてｉ．ｖ．群において投与後５分、３、８、２４、４８、７２、及び９６時間であった。ＰＫプロフィールを群あたりマウスの３又は４つのコホートから、そして時点あたりｎ＝３〜４匹の動物から取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性、ＦＶＩＩＩ抗原、アルブミン及び／又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓの決定のために−７０℃で保存した。
【０２７８】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分を測定することにより決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色活性及び選択された群においてＦＶＩＩＩ抗原を測定した。
【０２７９】
生物統計学
最大濃度（Ｃｍａｘ）、ｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（ＣＬ）及び終末期半減期（ｔ１／２）の推定を、静脈内計算における２コンパートメントモデル、及び皮下計算における２コンパートメント吸収モデルにより行った。パラメーター推定のために、重み付き最小２乗コスト関数を適用した。バイオアベイラビリティを、静脈内投与と比較した皮下投与後のＡＵＣ０−ｉｎｆのパーセンテージとして計算した。１、５及び１０％トラフレベルまでの時間を、０．０１、０．０５又は０．１ＩＵ／ｍＬに等しいモデル等式を設定し、時間について解くことにより計算した。
【０２８０】
結果
Ｄ’Ｄ３データの評価
Ｄ’Ｄ３の両方の構築物（ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ、それぞれアルブミン融合有り及び無し）は皮下投与後に吸収された。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを、９６時間の観察期全体にわたって、最低用量０．３  ｍｇ／ｋｇでも定量することができた；すなわち、これは２３．４ｎｇ／ｍＬの検出限界より高いままであった（図１）。しかし、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを、特により後の時点において、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓと比較して有意に高いレベルで検出することができた。
【０２８１】
いくつかの曲線が最後の２つの測定点において高い類似性を示し、これが終末期における血漿濃度曲線の「横ばい」に至ったことに言及する必要がある。それによりクリアランス、ＭＲＴ、ｔ１／２及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりは、最終点を含めて非常に長く見積もられた。第二の計算を、バイオアベイラビリティの過大評価を避けるために最後の時点を含めずに行った；データの比較を表３に示し、そして最後の時点を含めないデータの他のデータとの良好な一致を示す。従って、表及びグラフにおいて（図１を除く）、９６時間のデータ点を含まない第二のデータ・セットを使用し、これはｒＤ’Ｄ３−ＦＰバイオアベイラビリティを過小評価するかもしれない。
【０２８２】
Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆは、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及び０〜４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖の試験範囲において、加えられたｒＦＶＩＩＩとは独立して、用量依存性を示した（表３、図２）。より低い曝露に関連して、ｒＤ’Ｄ３−ＨｉｓのＣｍａｘさらにはＡＵＣ０−ｉｎｆの両方が、同程度のｒＤ’Ｄ３−ＦＰ用量について関連してより低かった。詳細には、ｓ．ｃ．投与について、Ｃｍａｘは＞３分の１、そしてＡＵＣ０−ｉｎｆは＞１６分の１に低くなった。
【０２８３】
クリアランス、ＭＲＴ及びｔ１／２はｒＤ’Ｄ３−ＦＰの用量依存性を示さなかった。ｓ．ｃ．見積もりの高い変動性は、平坦な曝露対時間曲線に対して正確な曲線をフィッティングすることを困難にする傾向がある。クリアランス値はｓ．ｃ．後１．２〜２．１ｍＬ／ｋｇ／ｈの範囲にあり、そしてｉ．ｖ．投与後はわずかに低かった（０．８〜０．９ｍＬ／ｋｇ／ｈ）。これと一致して、ＭＲＴ（ｔ１／２）範囲はｓ．ｃ．投与について４１〜１１７時間（１５〜９０時間）、そしてｉ．ｖ．投与について５５〜８３時間（３９〜６９時間）であった。対照的に、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓの排出はかなり速く、すなわち、クリアランスはｓ．ｃ．投与後に３４．８ｍＬ／ｋｇ／ｈであり、そしてｉ．ｖ．投与後に１１．８ｍＬ／ｋｇ／ｈであり（＞１３倍の差）、ＭＲＴはｓ．ｃ．投与後１１時間、そしてｉ．ｖ．投与後５時間であり（＞３倍の差）そしてｔ１／２はｓ．ｃ．投与後７時間、そしてｉ．ｖ．投与後に６時間であった（＞２倍の差）。
【０２８４】
重要なことには、皮下投与後のｒＤ’Ｄ３−ＦＰのバイオアベイラビリティは４０〜７９％の範囲に及び、実験内の異なる群の非常に高い変動性であった（表４、図３）。それにもかかわらず、このバイオアベイラビリティは、この実験において使用されたｒＶＩＩＩ−単鎖又はｒＤ’Ｄ３−ＦＰの用量と独立していた。ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓは３４％というより低いバイオアベイラビリティを示した。
【０２８５】
【表３】
2020504082.tif 000004
【０２８６】
【表４】
2020504082.tif 000005
【０２８７】
ＦＶＩＩＩデータの評価
本発明のポリペプチドをいずれも伴わずに、すなわちＤ’Ｄ３−ＦＰ構築物なしで投与されたｒＶＩＩＩ−単鎖は、ｓ．ｃ．投与された場合関連して吸収されず、少なくとも検出限界より高いＦＶＩＩＩ活性は測定されなかった。しかし驚くべきことに、２つのＤ’Ｄ３構築物（ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ、それぞれアルブミン融合有り及び無し）のいずれかとともに皮下同時投与された場合にはＦＶＩＩＩは吸収され；そしてＦＶＩＩＩ活性は吸収プロセスに耐えた（図３）。
【０２８８】
ＦＶＩＩＩ活性についても、１つの曲線は最後の２つの測定点において高い類似性を示し、これは終末期における血漿濃度曲線の「横ばい」に至ったことに言及する必要がある。それにより、クリアランス、ＭＲＴ、ｔ１／２及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりは、最終点を含む場合非常に長く見積もられた。第二の計算は、バイオアベイラビリティの過大評価を避けるために最後の時点を含まずに行われた；データの比較を表５に示す。従って、表及びグラフにおいて（図４を除く）、最終データ点を含まない第二のデータセットが使用され、これはｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓのバイオアベイラビリティを過小評価するかもしれない。
【０２８９】
ＦＶＩＩＩ用量に依存して、ＦＶＩＩＩ活性を少なくとも３２時間（１ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  及び５０  ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖）及び最後の時点９６時間まで（例えば、４００  ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖及び１〜１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰのいずれかの用量）定量した；すなわち、これは３又は１０ｍＩＵ／ｍＬの検出限界を超えたままであった（図４）。例として、図４は、２００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖を用いた３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓと比較して、１００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖を用いた１又は３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰのｓ．ｃ．又はｉ．ｖ．投与後のＦＶＩＩＩ血漿曝露を表す（曝露をモニタリングできるようにより高い用量を投与した）。Ｄ’Ｄ３構築物が投与されなかった場合、ｒＶＩＩＩ−単鎖は、４００ＩＵ／ｋｇのｓ．ｃ．用量でさえ検出限界未満のままであった（データは示されていない）。
【０２９０】
Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆは、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及び０〜４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖の試験した範囲において、同時投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰと独立して用量依存性を示したが、曝露はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓが投与された場合かなり低かった（表５、図５）。
【０２９１】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＶＩＩＩ−単鎖がモル比＞５０で投与された場合、ｒＶＩＩＩ−単鎖についてのＣＬは７．５〜２３．７ｍＬ／ｋｇ／ｈの範囲に及び、従って０．３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及び２００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖  ｓ．ｃ．（比４５）又はｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ同時投与より低かった。これと一致して、ｒＶＩＩＩ−単鎖についてのＭＲＴ及びｔ１／２は、５０ＩＵ／ｋｇというｒＶＩＩＩ−単鎖の低い用量を除いて、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓと比較して比＞５０で投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及びｒＶＩＩＩ−単鎖について高かった（ＭＲＴ：２４〜３７時間の範囲、ｔ１／２：８〜２０ｈの範囲）。比較のために、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを用いずにｉ．ｖ．投与されたｒＶＩＩＩ−単鎖は、ＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおいて約２〜３ｍＬ／ｋｇ／ｈのＣＬ、１８時間のＭＲＴ及び１５時間のｔ１／２、並びにヒトにおいて約２〜３ｍＬ／ｋｇ／ｈのＣＬ、ＭＲＴ  ｏｆ約２０時間のＭＲＴ及び約１４時間のｔ１／２を有することが示された（データは本明細書中に提示される）。従って、ｓ．ｃ．投与後の薬物動態パラメーターは変動性であったが、ｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメーターとおおよそ同程度であった。
【０２９２】
これらをもとに、ｒＶＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティは、用量≧３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰで投与された場合１１〜２５％、１ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの用量で投与された場合６〜１４％の間、そして０．３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの用量で≦４％の範囲に及んだ（表６、図６）。このバイオアベイラビリティは、潜在的飽和が４００ＩＵ／ｋｇの試験された最も高い用量で観察されたという意味で、ｒＶＩＩＩ−単鎖の用量に依存し、これは利用可能な吸収面積に関連し得る。さらに、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ用量はｒＶＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティを制限し、すなわち、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ用量が高いほど、良好なｒＶＩＩＩ−単鎖有効性となり得る。これは、関連するｒＤ’Ｄ３−ＦＰ対ｒＶＩＩＩ−単鎖の、少なくとも４４７の試験された比（≧３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ；飽和を伴う４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖用量を除外する）、７４〜５９６の試験された範囲の許容し得る比（１ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ）及び望ましくない試験された比４５（０．３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ）に変換され得る。従って、比＜５０はＦＶＩＩＩの望ましくないバイオアベイラビリティを示したが５０より高い比が好ましいということが結論付けられた。。
【０２９３】
ｒＶＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティは、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓと同時投与された場合に比例せずより低く、すなわち３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓ及び２００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖の用量で１％であり、ｒＶＩＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティに対するｒＤ’Ｄ３のアルブミン融合の利点を示唆する。
【０２９４】
さらに、トラフまでの時間をｓ．ｃ．及びｉ．ｖ．投与について計算した（表７）。バイオアベイラビリティについては、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及び／又はＦＶＩＩＩのより高い用量は良好なトラフレベルを示し、そして一定のＦＶＩＩＩ又はｒＤ’Ｄ３−ＦＰ用量内では、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ：ｒＶＩＩＩ−単鎖比の増加は、より好ましいトラフレベルまでの時間を生じた。
【０２９５】
【表５】
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【０２９６】
【表６】
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【０２９７】
【表７】
2020504082.tif 000008
【０２９８】
実施例１．２：ブタにおけるｒＤ’Ｄ３−ＦＰの存在下での組み換えＦＶＩＩＩ、ｒＶＩＩＩ−単鎖の皮下バイオアベイラビリティ
実験詳細  
試験品を、０．２１１〜０．７５１ｍＬ／ｋｇの範囲に及ぶ総体積で単回注射により、側腹部にｓ．ｃ．投与又は耳静脈にｉ．ｖ．投与した。投与された用量レベル及び経路を表８に示す。
【０２９９】
【表８】
2020504082.tif 000009
【０３００】
ヒトアルブミン値に基づいてｒＤ’Ｄ３−ＦＰを３〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で適用し、ｒＶＩＩＩ−単鎖用量は１００〜４００ＩＵ／ｋｇ発色ＦＶＩＩＩ活性の範囲に及んだ。ｒＶＩＩＩ−単鎖を注射用水で再構成し、そしてｒＤ’Ｄ３−ＦＰを水浴で解凍した。
【０３０１】
血液サンプルを耳又は伏在静脈から採取した。１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ｓ．ｃ．群における時点は、投薬前（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）、投与の３、１２、２４、３２、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後であり、そしてｉ．ｖ．群では、投薬前、投与の５分、３、１２、２４、３２、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後であった。３  ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ｓ．ｃ．群における時点は、投薬前、投与の１、３、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０及び２６４時間後であった。
【０３０２】
ＰＫプロフィールを個々の動物から取った。血液サンプルを、クエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ抗原及びアルブミンの決定のために−７０℃で保存した。
【０３０３】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用してタンパク質のアルブミン部分を測定することにより決定した。ヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇ血漿レベルをＦＶＩＩＩ  Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【０３０４】
生物統計学
最大濃度（Ｃｍａｘ）、ｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（ＣＬ）及び終末期半減期（ｔ１／２）の推定を、静脈内計算における２コンパートメントモデル、及び皮下計算における２コンパートメント吸収モデルにより行った。パラメーター推定のために、重み付き最小２乗コスト関数を適用した。バイオアベイラビリティを、静脈内投与と比較した皮下投与後のＡＵＣ０−ｉｎｆのパーセンテージとして計算した。１、５及び１０％トラフレベルまでの時間を、０．０１、０．０５又は０．１ＩＵ／ｍＬに等しいモデル等式を設定し、時間について解くことにより計算した。
【０３０５】
結果
Ｄ’Ｄ３データの評価
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰはｓ．ｃ．投与後に吸収され、そして１６８時間までの観察期間全体にわたって３及び１０ｍｇ／ｋｇで定量された；すなわち、２３．４ｎｇ／ｍＬの検出限界より高いままであった（図７）。
【０３０６】
Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆは、３〜１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの試験された範囲において用量依存性であった（表９）。Ｃｍａｘは、０〜４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖の範囲で加えられたｒＦＶＩＩＩとは独立していたが、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰのＡＵＣ０−ｉｎｆは加えられたｒＶＩＩＩ−単鎖の用量とともに増加した。クリアランス、ＭＲＴ及びｔ１／２は、単独で投与された１００ＩＵ／ｋｇ又はｒＶＩＩＩ−単鎖と比較して、２００又は４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖で処置された動物についてｒＤ’Ｄ３−ＦＰについてより長いＰＫプロフィールを示し（表９）、すなわちＦＶＩＩＩとともにロードされたｒＤ’Ｄ３−ＦＰは、関連する量のＦＶＩＩＩを用いなかった系よりも系中により長く滞留した。
【０３０７】
これと一致して、皮下投与後のｒＤ’Ｄ３−ＦＰのバイオアベイラビリティは、５９〜１８７％の範囲に及び（表１０）、最も高い同時投与されたＦＶＩＩＩ用量でより高い値に達した。結論として、ｒＶＩＩＩ−単鎖はｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下吸収を支持する。
【０３０８】
【表９】
2020504082.tif 000010
【０３０９】
【表１０】
2020504082.tif 000011
【０３１０】
ＦＶＩＩＩデータの評価
ＦＶＩＩＩは驚くべきことに、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰとｓ．ｃ．同時投与された場合に吸収され、そしてＦＶＩＩＩ活性は吸収プロセスを耐えた（図８）。ＦＶＩＩＩ用量に依存して、ＦＶＩＩＩ活性を少なくとも４８時間（３ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ及び１００  ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖）、そして１６８時間まで（例えば、４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖とともにいずれかの用量及び３又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ）定量した；すなわち、これは１１７ｍＩＵ／ｍＬの検出限界より高いままであった。
【０３１１】
Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆは、１００〜４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖の試験された範囲において用量依存性を示した。値は予期されたように、薬物のｉ．ｖ．投与後により高かった(図１０）。ＦＶＩＩＩ活性のクリアランスは、ｉ．ｖ．（１．２ｍＬ／ｋｇ／ｈ）投与よりも、ｓ．ｃ．の後に高かった（２．９〜４．１ｍＬ／ｋｇ／ｈ）。それにもかかわず、ＭＲＴ及びｔ１／２は、より高いｒＶＩＩＩ−単鎖用量２００又は４００ＩＵ／ｋｇを用いたｓ．ｃ．及びｉ．ｖ．投与後に同程度であった（それぞれ８２及び８５時間対７７時間並びに５２及び５９時間対５４時間）。より低い用量の１００ＩＵ／ｋｇでは、ＭＲＴ及びｔ１／２は、ｒＶＩＩＩ−単鎖についてより長かった（それぞれ１３０及び８３時間）。従って、ｓ．ｃ．投与後の薬物動態は、より高い用量のｒＶＩＩＩ−単鎖を用いたｉ．ｖ．投与後のものとおおよそ同程度であり、そして１００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖の用量では優れていた。
【０３１２】
ｒＶＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティは２９〜４０％の範囲に及び、ｒＶＩＩＩ−単鎖及び／又はｒＤ’Ｄ３−ＦＰの用量とともに増加した（表１２）。
【０３１３】
さらに、トラフまでの時間をｓ．ｃ．及びｉ．ｖ．投与について計算した（表１３）。１％トラフレベルまでの時間は全てのｓ．ｃ．用量について同程度であったが、５％又は１０％トラフまでの時間は、２００及び４００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖＋３又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰについて同程度、そして１００ＩＵ／ｋｇ  ｒＶＩＩＩ−単鎖＋３  ｍｇ／ｋｇ  ｒＤ’Ｄ３−ＦＰについては優れていた。
【０３１４】
【表１１】
2020504082.tif 000012
【０３１５】
【表１２】
2020504082.tif 000013
【０３１６】
【表１３】
2020504082.tif 000014
【０３１７】
実施例１．３：マウス血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおいてそれぞれ皮下投与された様々なＦＶＩＩＩ製品に対するｒＤ’Ｄ３−ＦＰの効果の調査
実験詳細
試験品を、単回注射により５ｍＬ／ｋｇの総体積で、頸部にｓ．ｃ．投与又は外側尾静脈にｉ．ｖ．投与した。投与された用量レベル及び経路を表１４に示す。
【０３１８】
【表１４】
2020504082.tif 000015
【０３１９】
ヒトアルブミン値に基づいてｒＤ’Ｄ３−ＦＰを３ｍｇ／ｋｇの用量で適用し、そしてＦＶＩＩＩ製品を２００ＩＵ／ｋｇ  発色ＦＶＩＩＩ活性の用量で適用した（名称：Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）及びＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）、Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ））。Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）及びＲｅＦａｃｔｏ（Ｒ）ＡＦを添付文書に従って再構成した。Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ）を注射用水を用いてピペットを使用して再構成した。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを水浴で解凍し、そしてそれぞれのＦＶＩＩＩ製品と混合した。全ての場合において、５ｍＬ／ｋｇの用量体積を投与し、ＦＶＩＩＩのための希釈緩衝液全ての製品に使用した。
【０３２０】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ：ｒＦＶＩＩＩの比は、それらの異なる分子量及び特異的活性に基づいて、４つの異なる製品について３２２〜４４２の比較的高い範囲であったことに言及するべきだろう。
【０３２１】
血液サンプルを、短期間麻酔下で交互サンプリングスキームを使用して眼球後方で採取した。ｓ．ｃ．群における時点は、投与の３、８、１６、２４、３２、４８、７２、及び９６ｈ後、そしてｉ．ｖ．群において投与の５分、３、８、１６、２４、４８、７２、及び９６ｈ後であった。ＰＫプロフィールを群あたりマウスの４つのコホート、及び時点あたりｎ＝３匹から取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして発色ＦＶＩＩＩ活性及びアルブミンの決定のために−７℃で保存した。
【０３２２】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色活性を測定した。
【０３２３】
生物統計学
最大濃度（Ｃｍａｘ）、ｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（ＣＬ）及び終末期半減期（ｔ１／２）の推定を、静脈内計算における２コンパートメントモデル、及び皮下計算における２コンパートメント吸収モデルにより行った。パラメーター推定のために、重み付き最小２乗コスト関数を適用した。バイオアベイラビリティを、静脈内投与と比較した皮下投与後のＡＵＣ０−ｉｎｆのパーセンテージとして計算した。１、５及び１０％トラフレベルまでの時間を、０．０１、０．０５又は０．１ＩＵ／ｍＬに等しいモデル等式を設定し、時間について解くことにより計算した。
【０３２４】
結果
Ｄ’Ｄ３データの評価
同時投与されたＦＶＩＩＩ製品とは独立して、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰはｓ．ｃ．投与後に吸収された。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰは９６時間の観察期間全体にわたって定量することができ、２３．４ｎｇ／ｍＬの検出限界より高いままであった（図９）。
【０３２５】
同時投与されたＦＶＩＩＩに基づいて、それぞれｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．投与後のｒＤ’Ｄ３−ＦＰのＰＫプロフィールにおいて視覚的に差異はなかった。これと一致して、クリアランス、ＭＲＴ、ｔ１／２及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりは、それぞれ全てのｓ．ｃ．又はｉ．ｖ．処置についてデータの良好な一致を示す（表１５）。詳細には、クリアランスはｉ．ｖ．について０．９〜１．１ｍＬ／ｋｇ／ｈの範囲であり、そしてｓ．ｃ．投与後にわずかに高かった（１．０〜１．５ｍＬ／ｋｇ／ｈ）。これと一致して、ＭＲＴ及びｔ１／２はそれぞれｉ．ｖについて４０〜５６時間及び３１〜４０時間の間の範囲であり、そしてｓ．ｃ．処置について６１〜１１７時間及び３５〜８９時間の間の範囲であった；すなわち、クリアランスはｉ．ｖ．について低かったが、それにもかかわらず典型的にはＭＲＴ及びｔ１／２はｉ．ｖ．処置について短かった。
【０３２６】
重要なことには、皮下投与後のｒＤ’Ｄ３−ＦＰのバイオアベイラビリティは５６〜８７％の範囲に及び（表１６）、そして様々な同時投与されたＦＶＩＩＩ製品間で関連して異なっていなかった。これはｒＶＩＩＩ−単鎖と非常に類似している（表４、範囲４０〜７９％）。
【０３２７】
【表１５】
2020504082.tif 000016
【０３２８】
【表１６】
2020504082.tif 000017
【０３２９】
ＦＶＩＩＩデータの評価
全てのＦＶＩＩＩ製品は、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰとｓ．ｃ．同時投与された場合に吸収され、そしてＦＶＩＩＩ活性は吸収プロセスを耐えた（図１０）。対照的に、単独で投与された場合、どの製品も関連するｓ．ｃ．バイオアベイラビリティを示さなかった。
【０３３０】
Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−ｉｎｆ、クリアランス、ＭＲＴ及びｔ１／２の見積もりからのデータを表１７に示す。様々なＦＶＩＩＩ製品は単独で投与された場合様々なＰＫプロフィールを示したが、クリアランスは常にｉ．ｖ．投与と比較してｓ．ｃ．投与後に増加し、すなわちＢｅｒｉａｔｅ（Ｒ）について３．１〜５１．５ｍＬ／ｋｇ／ｈ、Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）について４．４〜７８．５ｍＬ／ｋｇ／ｈ、そしてＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）について１．７〜１６．２ｍＬ／ｋｇ／ｈであった。ＭＲＴはｓ．ｃ．投与とｉ．ｖ．投与との間でおおよそ同程度であり（Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ）及びＡｄｖａｔｅ（Ｒ）：範囲１７〜１９時間；ＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）：範囲２１〜２８時間）、ｒＶＩＩＩ−単鎖の同時投与からの結果と一致した（表１１を参照のこと）。これらの他のＦＶＩＩＩ製品について、ｔ１／２はｓ．ｃ．投与と比較してｉ．ｖ．投与後により長い傾向があった（Ｂｅｒｉａｔｅ：１３時間ｉ．ｖ．に対して８時間ｓ．ｃ．；Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）：１４時間ｉ．ｖ．に対して１２時間ｓ．ｃ．；ＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）：１５時間ｉ．ｖ．に対して１１時間ｓ．ｃ．）。
【０３３１】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰと同時投与された様々なＦＶＩＩＩ製品の皮下バイオアベイラビリティは６〜１１％の範囲に及び、ＦＶＩＩＩ製品間で関連する差異がないことを示唆した（表１８）。これはｒＤ’Ｄ３−ＦＰをｒＶＩＩＩ−単鎖と同時投与した場合に観察された２０％と比較してわずかに低かった（表１２を参照のこと）；それにもかかわず、ＦＶＩＩＩ製品の全てのバイオアベイラビリティは許容しうる範囲内であった。このことは、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰが皮下投与後のＦＶＩＩＩ吸収に鍵となる役割を果たすということを示す。しかし、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰのｒＶＩＩＩ−単鎖との組み合わせは、ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティを更に改善し得る。
【０３３２】
さらに、トラフまでの時間をｓ．ｃ．投与及びｉ．ｖ．投与について計算した（表１９）。１％トラフレベルについて、データはｉ．ｖ．投与及びｓ．ｃ．投与後におおよそ同程度であった（Ｂｅｒｉａｔｅ（Ｒ）  ６０及び７９  時間、Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）  ６６及び６８時間、ＲｅＦａｃｔｏ（Ｒ）  ＡＦ  ９８及び１０４時間）。５％又は１０％レベルについてのトラフまでの時間は、ｉ．ｖ．投与と比較してｓ．ｃ．投与後に優れていた：それぞれＢｅｒｉａｔｅはｉ．ｖ．に対してｓ．ｃ．の優位性を４％（５％トラフ）及び１７％（１０％トラフ）示し、Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）は２９％（５％トラフ）及び５０％（１０％トラフ）示し、そしてＲｅＦａｃｔｏ（Ｒ）  ＡＦは５０％（５％トラフ）及び２８％（１０％トラフ）示した。
【０３３３】
【表１７】
2020504082.tif 000018
【０３３４】
【表１８】
2020504082.tif 000019
【０３３５】
【表１９】
2020504082.tif 000020
【０３３６】
実施例１．４：マウス血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおいて両方とも皮下投与されたｒＤ’Ｄ３−ＦＰ親和性変異体、非アルブミンＨＥＬＰを有するｒＤ’Ｄ３分子及びｒＶＩＩＩ−単鎖の効果の調査
実験詳細
試験品を、単回注射により総体積５ｍＬ／ｋｇで頸部において皮下投与又は外側尾静脈に静脈内投与した。投与された用量レベル及び経路を表２０に示す。
【０３３７】
【表２０】
2020504082.tif 000021
【０３３８】
ヒトアルブミン値に基づいてｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡを３ｍｇ／ｋｇの用量で、ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰをタンパク質含有量に基づいて４．２９ｍｇ／ｋｇの用量で（両方とも高いｒＤ’Ｄ３変異体：ｒＶＩＩＩ−単鎖用量をもたらす、表２０）、そしてＦＶＩＩＩ製品を２００ＩＵ／ｋｇ  発色ＦＶＩＩＩ活性の用量で適用した。ｒＶＩＩＩ−単鎖を注射用水で再構成し、そしてｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡさらにはｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰを水浴で解凍した。全ての場合に、希釈のためにＦＶＩＩＩに希釈緩衝液を使用して用量体積５ｍＬ／ｋｇを投与した。
【０３３９】
血液サンプルを短期間麻酔下で交互サンプリングスキームを使用して眼球後で採取した。ｓ．ｃ．群における時点は、投与の３、８、１６、２４、３２、４８、７２、及び９６時間後であり、ｉ．ｖ．群では投与の５分、３、８、１６、２４、４８、７２、及び９６時間後であった。ＰＫプロフィールを群あたりマウスの４つのコホート、及び時点あたりｎ＝３匹から取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム（１分クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を用いて抗凝固処理し、処置して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性、アルブミン及び／又はｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰの決定のために−７０℃で保存した。
【０３４０】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分を測定することにより決定した。ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰをＥＬＩＳＡ技術により抗ヒトＤ’Ｄ３に対する抗体を使用して測定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色活性を測定した。
【０３４１】
生物統計学
最大濃度（Ｃｍａｘ）、ｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（ＣＬ）及び終末期半減期（ｔ１／２）の推定を、静脈内計算における２コンパートメントモデル、及び皮下計算における２コンパートメント吸収モデルにより行った。パラメーター推定のために、重み付き最小２乗コスト関数を適用した。バイオアベイラビリティを、静脈内投与と比較した皮下投与後のＡＵＣ０−ｉｎｆのパーセンテージとして計算した。１、５及び１０％トラフレベルまでの時間を、０．０１、０．０５又は０．１ＩＵ／ｍＬに等しいモデル等式を設定し、時間について解くことにより計算した。
【０３４２】
結果
Ｄ’Ｄ３データの評価
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ及びｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰの両方がｓ．ｃ．投与の後吸収され、そして両方共９６時間の観察期間全体にわたって定量することができ、すなわち、２３．４ｎｇ／ｍＬの検出限界より高いままであった（図１１）。
【０３４３】
クリアランス、ＭＲＴ、ｔ１／２及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりを表２１に示し、これはｉ．ｖ．投与後さらにはｓ．ｃ．投与後にｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰと比較してｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡについてより長いｔ１／２及びＭＲＴを示した（ｔ１／２：ＣＴＰについての２２時間より長いＥＹＡについての３０時間  ｉ．ｖ．及び３２時間  ｓ．ｃ．；ＭＲＴ：ＣＴＰについての２７時間ｉ．ｖ．及び４０時間ｓ．ｃ．より長いＥＹＡについての４２時間ｉ．ｖ．及び５７時間ｓ．ｃ．）。これらのデータはまた、ｓ．ｃ投与が両方のｒＤ’Ｄ３−ＦＰ変異体についてｉ．ｖ．投与と等しいか又はｉ．ｖ．投与より優れていたということを示す。Ｃｍａｘは、特にｉ．ｖ．投与後に、ｒＤ’Ｄ３−ＥＹＡと比較してｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰについてより高かった。ＡＵＣ０−ｉｎｆは、ｓ．ｃ．投与後にｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰと比較してｒＤ’Ｄ３−ＥＹＡについてわずかに高かったが（１０９４及び８２５μｇ＊ｈ／ｍＬ）、ｉ．ｖ．投与後に主要な差異はなかった（１６６９及び１７８３μｇ＊ｈ／ｍＬ）。これらのデータは、大部分は高い初期値に起因して、ＡＵＣ０−ｉｎｆがｉ．ｖ．投与後により高いということを示す。
【０３４４】
皮下投与後のｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡのバイオアベイラビリティは６６％であり、そしてｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰのバイオアベイラビリティは４７％であり（表２２）、従ってＦＶＩＩＩ  ｋｏマウスにおけるｒＤ’Ｄ３−ＦＰの範囲であった（範囲４０〜７９％、表４）。
【０３４５】
【表２１】
2020504082.tif 000022
【０３４６】
【表２２】
2020504082.tif 000023
【０３４７】
ＦＶＩＩＩデータの評価
ＦＶＩＩＩはｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ又はｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰとｓ．ｃ．同時投与された場合吸収され、そしてＦＶＩＩＩ活性は吸収プロセスを耐えた（図１２）。ＦＶＩＩＩ活性は９６時間の観察期間全体にわたって定量された。
【０３４８】
クリアランス、ＭＲＴ、ｔ１／２及びＡＵＣ０−ｉｎｆの見積もりを表２３に示し、これはｓ．ｃ．投与後にｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰと比較してｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡについて同程度のＭＲＴ及びｔ１／２（ＭＲＴ：２７及び２９時間、ｔ１／２  １３及び１２時間）、並びにｉ．ｖ．投与後にｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡについてわずかに高いＭＲＴ及びｔ１／２（ＭＲＴ：３０及び２５時間、ｔ１／２  ２１及び１８  ｈ）を示す。投与経路ごとに２つの変異体についてＡＵＣ０−ｉｎｆについての差異は観察されなかった（ｓ．ｃ．について１６及び１８ＩＵ＊ｈ／ｍＬ並びにｉ．ｖ．について１１１及び１１０ＩＵ＊ｈ／ｍＬ）。Ｃｍａｘは、ｉ．ｖ．投与後及びｓ．ｃ．投与後の両方でｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰと比較してｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡについて低かった（ｓ．ｃ．後０．４６対０．５１ＩＵ／ｍＬ及びｉ．ｖ後４．６３対５．４９）。
【０３４９】
ｒＶＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティは、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡについて１４％、そしてｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰについて１６％であった（表２４）。
【０３５０】
さらに、トラフまでの時間をｓ．ｃ．投与について計算し、これは１％（１０５及び１０４時間）及び５％（７６及び７８時間）トラフでｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡ及びｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰについて同程度の結果、並びに１０％（６４対５２時間）トラフレベルでｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰよりもｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡについて非常にわずかな優位を示した（表２５）。総合して、これらのデータは、ｒＤ’Ｄ３変異体がＦＶＩＩＩの改善された薬物動態の原因であり、ｒＤ’Ｄ３変異体に結合された半減延長原理の種類は主原因ではないということを実証する。しかし、いずれのＨＥＬＰも含有しないｒＤ’Ｄ３ポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの薬物動態を改善することができないか又は少なくとも不十分な有効性しか有していない（表５及び７を参照のこと）。
【０３５１】
【表２３】
2020504082.tif 000024
【０３５２】
【表２４】
2020504082.tif 000025
【０３５３】
【表２５】
2020504082.tif 000026
【０３５４】
インビボ実験からの結論
本発明は、異なる種におけるｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下バイオアベイラビリティ（表２６）、及びｒＤ’Ｄ３−ＦＰと皮下同時投与された場合の、組み換えＦＶＩＩＩ製品、すなわちｒＶＩＩＩ−単鎖、Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）、ＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）又はＢｅｒｉａｔｅ（Ｒ）の関連するバイオアベイラビリティを実証する（表２７）。
【０３５５】
【表２６】
2020504082.tif 000027
【０３５６】
【表２７】
2020504082.tif 000028
【０３５７】
実際に、この結果は、ＦＶＩＩＩと一緒のｒＤ’Ｄ３−ＦＰの皮下投与が、ＦＶＩＩＩの血流への前例のない吸収を伴う（ｒＶＩＩＩ−単鎖で３〜４０％のバイオアベイラビリティ範囲）、組み換えＦＶＩＩＩ製品、すなわちｒＶＩＩＩ−単鎖又は他のＦＶＩＩＩ製品、例えばＢｅｒｉａｔｅ（Ｒ）、Ａｄｖａｔｅ（Ｒ）又はＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ（Ｒ）の血管外投与を可能にし、検出限界より有意に高いＦＶＩＩＩ活性レベルを生じるということを実証する。ｒＤ’Ｄ３−ＣＴＰ及びｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ＥＹＡはｒＤ’Ｄ３−ＦＰとおおよそ同程度のデータを示した。上記の生じたＦＶＩＩＩ活性レベルは、治療適用に適している。
【０３５８】
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はその変異体は、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰのより長い半減期が、このコンパートメントに達した場合の血漿痛のＦＶＩＩＩの維持を増加させるだけでなく、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ又はその変異体とともに同時投与された場合に、ｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓと比較して、ｒＶＩＩＩ−単鎖のバイオアベイラビリティを不比例的に高く増加させるのでｒＤ’Ｄ３−Ｈｉｓよりも有利である。このことは、アルブミン又は他のＨＬＥＰを使用した半減期延長が有益なアプローチであることを支持する。
【０３５９】
実施例２：ＶＷＦフラグメントダイマー及びモノマーに対するＦＶＩＩＩ親和性の決定
ＶＷＦフラグメント（１〜１２４２）アルブミン融合物（Ｄ’Ｄ３−ＦＰ）をバイオリアクターで発現させた；上記のように精製してモノマー及びダイマーを単離した後、これらの調製物に対するＦＶＩＩＩの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（Ｔ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により表面プラズモン共鳴により評価した。
【０３６０】
抗アルブミン抗体（ＭＡ１−２０１２４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＮＨＳ  （Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ  （エタノールアミン塩酸塩）（両方共ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのアミンカップリングキットに含まれる（ＢＲ１０００−５０））によりそのＮ末端を介して活性化ＣＭ  ３チップに共有結合でカップリングした。固定のために、抗体３μｇ／ｍＬを酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．０）で希釈し、そして抗体溶液をチップ上に１０μＬ／分の流量で７分間流した。固定化手順の後に、未カップリングデキストランフィラメントを、エタノールアミン溶液（１Ｍ、ｐＨ８．３）をチップ上に５分間流すことにより（流量１０μＬ／分）飽和させた。フローセルを飽和させる目的は、チップへの検体の非特異的結合を最小にするためであった。参照フローセルを、空のフローセルを上記と同じ手順を使用することによりエタノールアミンで飽和させることにより設定した。
【０３６１】
それぞれダイマー及びモノマーＤ’Ｄ３−ＦＰタンパク質を、チップ上にＤ’Ｄ３−ＦＰタンパク質（５μｇ／ｍＬ）を３分間（流量１０μＬ／分）流すことにより抗アルブミン抗体に共有結合でカップリングして固定した。
【０３６２】
ＦＶＩＩＩについての結合曲線を作成するために、各Ｄ’Ｄ３−ＦＰタンパク質調製物をランニングバッファ（ＨＢＳ−Ｐ＋：０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５％体積／体積Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４；製品コードＢＲ１００６７１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ及び４ｎＭに希釈した。単一サイクル動力学（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ）を行うために、上昇する濃度の各希釈を有するサンプルを、チップ上に２分間流し（流量３０μＬ／分）、ランニングバッファＨＢＳ−Ｐ＋を用いた１０分間の解離時間がそれに続いた。全ての測定を２回行った。測定手順についての温度を＋２５℃に調節した。
【０３６３】
結合パラメーターをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して計算した。曲線フィッティング方法はラングミュアの式に基づくものであった。計算用の入力データは、検体ＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ−単鎖）のモル質量１７０ｋＤａであり、ｍａｘ．ＲＵ及び勾配のような他のパラメーターは、フィッティングされた結合及び解離曲線から自動的に抽出された。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの出力は結合速度定数及び解離速度定数であり、これらから親和性定数が計算される。結果を表２８に示す。
【０３６４】
【表２８】
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【０３６５】
ダイマーＤ’Ｄ３−ＦＰは、Ｄ’Ｄ３−ＦＰモノマー（ＫＤ＝３０ｎＭ）と比較して有意に（ＫＤ＝３４ｐＭ）増加したＦＶＩＩＩに対する親和性を示し、これはｒＶＩＩＩ−単鎖のより速い結合及びより遅い解離の両方から生じた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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