(57)【要約】本開示は、がんの治療及び予防のための組み換えウイルスベクターに関する。腫瘍溶解性ウイルスベクターは、１つ以上の以下の特徴を組み込む：マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列をウイルスゲノムに挿入することによるウイルス複製の制限、発がん性ｍｉＲＮＡの機能の妨害、がんの微小環境リモデリング、及びプロテアーゼ活性化抗体をウイルス粒子に組み込むことによるがん細胞の標的化。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列を、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されて含む、組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、前記１つ以上のウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、及びＵＬ４２からなる群から選択され、
前記組み換えＨＳＶの複製は、非がん性細胞では、同じ細胞型のがん性細胞における前記組み換えＨＳＶの複製と比較して低減される、前記組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス。
【請求項２】
前記１つ以上のウイルス遺伝子が、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、及びＵＬ４２からなる群から選択される、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
前記１つ以上のウイルス遺伝子が、ＵＬ８、ＩＣＰ８、及びＵＬ３０からなる群から選択される、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
前記１つ以上のウイルス遺伝子が、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ４からなる群から選択される、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
前記１つ以上のウイルス遺伝子が、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＵＬ８、ＵＬ４２、及びＩＣＰ３４．５からなる群から選択される、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
前記細胞が、神経細胞、心臓細胞、筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
前記神経細胞が、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、脳細胞、または脊髄細胞である、請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
前記筋細胞が、横紋筋細胞または平滑筋細胞である、請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
前記非がん性細胞及び前記がん性細胞が脳細胞であり、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４８７ｂ、及びｍｉＲ−１２８からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２４、及びｍｉＲ−１２８からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
前記非がん性細胞及び前記がん性細胞が、心臓細胞または横紋筋細胞であり、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−４９９ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３７８ｉ、ｍｉＲ−３０ｂ、及びｍｉＲ−３７８からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−１、及びｍｉＲ−２０８ａからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
前記非がん性細胞及び前記がん性細胞が、脊髄細胞であり、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−５７７、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１３２、及びｍｉＲ−１３５からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−９、及びｍｉＲ−２０４からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
前記非がん性及び前記がん性細胞が、末梢神経系細胞であり、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−５７４からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記非がん性細胞及び前記がん性細胞が、肝細胞であり、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２６からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
前記非がん性細胞及び前記がん性細胞が、平滑筋細胞であり、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列が、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
前記２つ以上のｍｉＲの標的配列が、前記１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに挿入されるｍｉＲ−Ｔカセットに組み込まれる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
前記ｍｉＲ−Ｔカセットが、長さ１０００未満のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２０】
前記ｍｉＲ−Ｔカセットが、長さ約２５〜約５００のヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２１】
前記ｍｉＲ−Ｔカセットが、長さ約１００〜約５００のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２２】
以下を含む組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）：
（ｉ）第一のウイルス遺伝子に挿入された第一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列カセット（ｍｉＲ−ＴＳカセット）であって、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、及びｍｉＲ−１４３の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含む前記カセット、
（ｉｉ）第二のウイルス遺伝子に挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセットであって、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９ａ、及びｍｉＲ−１２２の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含む前記カセット、ならびに
（ｉｉｉ）第三のウイルス遺伝子に挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセットであって、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−２０４、及びｍｉＲ−１２８の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含む前記カセット。
【請求項２３】
さらに、第三のウイルス遺伝子に挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含む、請求項２２に記載の組み換えＨＳＶであって、前記第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、
（ａ）ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６の各々に対して少なくとも２つの標的配列、または
（ｂ）ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、及びｍｉＲ−１２６の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含む、前記組み換えＨＳＶ。
【請求項２４】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットの各々が、ｍｉＲＮＡの各々に対して４つの標的配列をそれぞれ含む、請求項２２または２３に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項２５】
前記第一のウイルス遺伝子がＩＣＰ４である、請求項２２〜２３のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項２６】
前記第二のウイルス遺伝子がＩＣＰ２７である、請求項２２〜２３のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項２７】
前記第三のウイルス遺伝子がＩＣＰ３４．５である、請求項２２〜２３のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項２８】
前記第四のウイルス遺伝子がＵＬ８である、請求項２３に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項２９】
前記組み換えＨＳＶの複製が、非がん性細胞において、同じ細胞型のがん性細胞における前記組み換えＨＳＶの複製と比較して低減され、前記細胞が、神経細胞、心臓細胞、筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３０】
前記第一のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５２と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３１】
前記第一のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５２の核酸配列を含むまたは配列番号８５２の核酸配列からなる、請求項３０に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３２】
前記第二のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５３と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３３】
前記第二のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５３の核酸配列を含むまたは配列番号８５３の核酸配列からなる、請求項３２に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３４】
前記第三のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５４と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３５】
前記第三のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５４の核酸配列を含むまたは配列番号８５４の核酸配列からなる、請求項３４に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３６】
前記第四のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５５と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３７】
前記第四のｍｉＲ−ＴＳカセットが、配列番号８５５の核酸配列を含むまたは配列番号８５５の核酸配列からなる、請求項３６に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３８】
さらに、１つ以上のペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項３９】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０からなる群から選択されるペイロードをコードする、請求項３８に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項４０】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０からなる群から選択される２つ以上のペイロードをコードする、請求項３８に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項４１】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０を含む３つのペイロードをコードする、請求項３８に記載の組み換えＨＳＶ。
【請求項４２】
１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列をウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されて含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり、前記１つ以上のウイルス遺伝子は、ＵＬ８、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ４２、ＵＬ１９、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２７からなる群から選択される、前記組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４３】
前記１つ以上のｍｉＲの標的配列が、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、請求項４２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４４】
前記ｍｉＲの標的配列が、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４−３ｐ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３１−５ｐ、及びｍｉＲ−２０５ｐからなる群から選択されるｍｉＲの標的配列である、請求項４２または４３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４５】
前記１つ以上のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４６】
前記１つ以上のｍｉＲの標的配列の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項４５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４７】
前記ウイルス複製が、第一の細胞において、第二の細胞における前記ウイルス複製と比較して、低減または減弱され、前記第一の細胞は、前記１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現が、前記第二の細胞における前記ｍｉＲの発現と比較して増加している、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４８】
前記第一の細胞における前記ｍｉＲの発現レベルが、前記第二の細胞における前記ｍｉＲの発現レベルより少なくとも５％高い、請求項４７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４９】
前記第一の細胞が非がん性細胞である、請求項４７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５０】
前記第二の細胞は、前記１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現が、前記第一の細胞における前記ｍｉＲの発現と比較して低下している、請求項４７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５１】
前記第二の細胞における前記ｍｉＲの発現レベルが、前記第一の細胞における前記ｍｉＲの発現レベルより少なくとも５％低い、請求項５０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５２】
前記第二の細胞ががん性細胞である、請求項４７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５３】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項４２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５４】
前記ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項５３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５５】
前記１つ以上のウイルス遺伝子がＩＣＰ２７である、請求項５３または５４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５６】
さらに、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されて含む、請求項５３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５７】
前記ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項５６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５８】
前記１つ以上のウイルス遺伝子がＵＬ４２である、請求項５６または５８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５９】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項４２〜５２のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６０】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項４２〜５２のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６１】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項４２〜５２のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６２】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項４２〜５２のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６３】
組み換え腫瘍溶解性ウイルスであって、
（ａ）ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列、及び
（ｂ）（ｉ）１つ以上のタンパク質またはオリゴヌクレオチドであって、ｍｉＲ、遺伝子、または組織性メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）の発現を低減するもしくはその機能を阻害する前記タンパク質またはオリゴヌクレオチド、あるいは
（ｉｉ）プロテアーゼ活性化抗体
をコードする１つ以上のポリヌクレオチド
を含み、前記ウイルスはＨＳＶであり、前記１つ以上のウイルス遺伝子は、ＵＬ４２、ＵＬ１９、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２７からなる群から選択される、前記組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６４】
前記ｍｉＲが、発がん性ｍｉＲまたは微小環境リモデリングｍｉＲである、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６５】
前記発がん性ｍｉＲが、表４に記載するｍｉＲから選択される、請求項６４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６６】
前記遺伝子が発がん遺伝子である、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６７】
前記発がん遺伝子が、表７に記載の遺伝子から選択される、請求項６６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６８】
前記微小環境リモデリングｍｉＲが、表５に記載のｍｉＲから選択される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６９】
前記１つ以上のｍｉＲの標的配列が、ウイルス複製に必要な前記１つ以上のウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる、請求項２２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７０】
前記ｍｉＲの標的配列が、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４−３ｐ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３１−５ｐ、及びｍｉＲ−２０５ｐからなる群から選択されるｍｉＲの標的配列である、請求項６９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７１】
前記１つ以上のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７２】
前記１つ以上のｍｉＲの標的配列の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項７１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７３】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項６３〜７２のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７４】
前記ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項７３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７５】
前記１つ以上のウイルス遺伝子がＩＣＰ２７である、請求項７３または７４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７６】
さらに、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されて含む、請求項７３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７７】
前記ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される、請求項７６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７８】
前記１つ以上のウイルス遺伝子がＵＬ４２である、請求項７６または７７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７９】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８０】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８１】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８２】
ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８３】
前記ＴＩＭＰが、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３及びＴＩＭＰ４から選択される、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８４】
前記オリゴヌクレオチドが、ｓｈＲＮＡまたはデコイオリゴヌクレオチドである、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８５】
前記タンパク質が、ヌクレアーゼ、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）、抗免疫抑制タンパク質、または免疫原性抗原である、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８６】
前記ヌクレアーゼが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される、請求項８５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８７】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４から選択される、請求項８６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８８】
さらに、ｔｒａｃｒ−ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）及びｃｒｉｓｐｒ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、前記ｃｒＲＮＡは、ｍｉＲまたはＴＩＭＰをコードするゲノムＤＮＡ配列を標的とし、前記ｔｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの結合及び活性化を促進する、請求項８７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８９】
前記抗免疫抑制タンパク質が、抗制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）タンパク質または抗骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）タンパク質である、請求項８５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９０】
前記抗免疫抑制タンパク質が、ＶＨＨ由来ブロッカーまたはＶＨＨ由来ＢｉＴＥである、請求項８５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９１】
前記タンパク質が、抗腫瘍免疫応答を誘導する、請求項６３〜９０のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９２】
前記タンパク質が、細胞表面で発現する抗原と結合し、前記抗原は、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ／ＦＧＦＲ２ｂ、エンドセリンＢ受容体、及びＳＥＭＡ４Ｄからなる群から選択される、請求項９１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９３】
前記タンパク質が、葉酸、ＩＦＮβ、Ａ２Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ１３７、ＣＤ２００、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＩＳＲＥ７、ＬＦＡ−１、ＮＧ２（ＳＰＥＧ４としても知られる）、ＳＭＡＤタンパク質、ＳＴＩＮＧ、ＴＧＦβ、及びＶＣＡＭ１から選択される、請求項９１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９４】
前記少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体が、ウイルスの糖タンパク質エンベロープに組み込まれる、請求項６３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９５】
前記プロテアーゼ活性化抗体が、システインカテプシン、アスパラギン酸カテプシン、カリクレイン（ｈＫ）、セリンプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、及びディスインテグリンメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）から選択されるプロテアーゼによって活性化される、請求項６３または９４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９６】
前記プロテアーゼが、カテプシンＫ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、カテプシンＥ、カテプシンＤ、ｈＫ１、ＰＳＡ（ｈＫ３）、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＭＭＰ−２１、ＭＭＰ−２３Ａ、ＭＭＰ−２３Ｂ、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−２５、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−２７、ＭＭＰ−２８、または表６に記載のプロテアーゼから選択される、請求項９５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９７】
前記プロテアーゼ活性化抗体が、がん細胞によって、またはがん微小環境において、非がん細胞によって、または非がん微小環境においてよりも高度に発現するタンパク質に結合する、請求項６３または９４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９８】
前記プロテアーゼ活性化抗体が、ＮＫＧ２Ｄ、ｃ−ｍｅｔ、ＨＧＦＲ、ＣＤ８、ヘパラン硫酸、ＶＳＰＧ４（ＮＧ２としても知られる）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＬＣ−３、アネキシンＩＩ、ヒトトランスフェリン受容体、またはＥｐＣＡＭに結合する、請求項９７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９９】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記ウイルスゲノムの遺伝子座に挿入されるか、または前記ウイルスゲノムの２つの遺伝子座間に挿入される、請求項６３〜９８のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１００】
前記ウイルスの遺伝子座が、内部リピートジョイント領域（二倍体遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ４７プロモーターの各１つのコピーを含む）、ＩＣＰ０、ＬＡＴ、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及びＵＳ１２からなる群から選択される、請求項９９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０１】
先行請求項のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸分子。
【請求項１０２】
請求項１〜１００のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスを含むウイルスのストック。
【請求項１０３】
請求項４２〜１００のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス及び医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１０４】
がん性細胞の殺傷方法であって、前記がん性細胞を、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物に、前記腫瘍溶解性ウイルスが前記がん性細胞に感染し、前記がん性細胞内で複製するのに十分な条件下で曝露することを含み、前記がん性細胞内での前記腫瘍溶解性ウイルスの複製が細胞死をもたらす、前記方法。
【請求項１０５】
前記がん性細胞は、１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現が、非がん性細胞における前記ｍｉＲの発現と比較して低下している、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記がん性細胞における前記ｍｉＲの発現レベルが、前記非がん性細胞における前記ｍｉＲの発現レベルより少なくとも５％低い、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記腫瘍溶解性ウイルスの複製が、前記１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能な前記ｍｉＲの発現が低下したがん性細胞において増加するまたは維持される、請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ウイルス複製が、前記がん性細胞において、前記非がん性細胞における前記ウイルス複製と比較して、少なくとも５％高い、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞がインビボである、請求項１０４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞が腫瘍内にある、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
がんの治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であって、請求項１〜１００のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１１２】
前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物が、静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、または鼻腔内に投与される、請求項１１１または１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記がんが、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、膠芽腫、黒色腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記肺癌が、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記肝臓癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ペイロード分子またはタンパク質が、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導である、請求項３８に記載の組み換えＨＳＶまたは請求項６３〜９０のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１８】
前記ペイロード分子またはタンパク質が、抗ＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬタンパク質である、請求項３８に記載の組み換えＨＳＶまたは請求項６３〜９０のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月２６日に出願された米国仮出願第６２／５３７，３５９号、及び２０１８年６月１９日に出願された米国仮出願第６２／６８６，８０２号の優先権を主張する。当該仮出願の開示は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙面による複写の代替としてテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。当該配列表を含むテキストファイルの名称は、ＯＮＣＲ＿０１０＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。該テキストファイルは５００ＫＢであり、２０１８年７月２６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【０００３】
本開示は、がんの治療及び予防のための組み換えウイルスベクターに関する。とりわけ、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
現行の標的化がん治療は、腫瘍タンパク質の発現プロファイルの不均一性のために狭い範囲のがんにのみ有効である。さらに、既存のウイルスベクター、化学療法、放射線、及び外科手術を含めた多くのがん治療は、正常な非がん性細胞の健康と生存能力を維持しながら、がん性細胞を選択的に治療するための特異性に欠け、望ましくないオフターゲット効果を生み出す可能性がある。従って、複数のがんで広く有効であり、がん性細胞を選択的に排除することが可能ながん治療が当技術分野で必要とされる。
【０００５】
腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染するウイルスであり、がん治療に対する複数の前臨床及び臨床研究に使用されてきた。腫瘍溶解性ウイルスの使用は、健康な細胞の非特異的なウイルス感染のリスクを伴い、非がん性細胞及び組織の死につながる。しかしながら、正常な組織とがん性組織で差次的に発現する経路、タンパク質、及び遺伝子を利用するための該ウイルスの遺伝子操作は、これらウイルスの特異性を高め、オフターゲット感染及び細胞死を制限する可能性がある。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、低分子非コード内因性ＲＮＡであり、それらの標的メッセンジャーＲＮＡを分解または翻訳抑制に向けることで遺伝子発現を調節する。ｍｉＲは、正常な細胞過程と密接に関連しているため、ｍｉＲＮＡの脱調節は、がんを含めた幅広い疾患に寄与する。多くのｍｉＲ遺伝子は、がん関連のゲノム領域、または、染色体不安定部に位置し、ｍｉＲががんにおいて極めて重要な役割を果たすという証拠をさらに強固にしている。ｍｉＲは、正常な組織と比較してがん細胞で差次的に発現し、腫瘍形成と因果関係を有する可能性がある。多様な腫瘍型におけるこの差別的なｍｉＲ発現を利用することにより、腫瘍溶解性ウイルス複製が特定のｍｉＲまたはｍｉＲ群の発現に基づいて調節される本明細書に記載のがん治療は、広範囲の安全性及び有効性プロファイルを有する。さらに、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスはまた、腫瘍全体のウイルスの拡散を促進するタンパク質、例えば、遺伝子の発現を変更するもの、及び細胞外マトリックスを調節するタンパク質も発現する場合があり、それにより、治療効果が高まる。
【０００７】
当技術分野では、改善された腫瘍溶解性ウイルスベクターに対する必要性が残る。本開示は、かかる改善された腫瘍溶解性ウイルスベクター、その他を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、先行技術と比較して改善された技術的効果を示す腫瘍溶解性ウイルスベクターを提供する。本発明者らは、様々な腫瘍溶解性ウイルスベクターを設計し、本明細書に記載の広範囲に及ぶ実験を行い、がんの治療で臨床的に用いるための優れた特性を備えた腫瘍溶解性ウイルスベクターを特定した。
【０００９】
本発明は、がんの治療及び予防に有用な組み換えウイルスベクターに関する。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスベクターは、該ウイルスのゲノムに挿入されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列により、ウイルスベクターの複製をがんまたは腫瘍細胞に限定することが可能である。本明細書に記載の特定の実施形態では、該ウイルスベクターは、ｍｉＲの標的配列の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーを、１つ以上の必須ウイルス遺伝子に組み込まれて含む。さらなる実施形態では、該ウイルスベクターは、ウイルスゲノム内への１つ以上のポリヌクレオチド配列の組み込みを含み、その産物（複数可）が発がん性ｍｉＲの機能を妨害する、及び／または細胞外マトリックスを変更する。さらなる実施形態では、該ウイルスベクターは、プロテアーゼ活性化抗体を当該ウイルス粒子に組み込まれて含み、それにより、ベクターのがん／腫瘍細胞への高度に選択的な標的化を可能にする。該ウイルスベクターの組成物ならびにがん性細胞の殺傷及びがんの治療における使用方法をさらに本明細書に提供する。
【００１０】
実施形態では、本開示は、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列を含む、組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を提供し、ここで、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、及びＵＬ４２からなる群から選択される。実施形態では、該組み換えＨＳＶの複製は、非がん性細胞では、同じ細胞型のがん性細胞における組み換えＨＳＶの複製と比較して低減される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、及びＵＬ４２からなる群から選択される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＵＬ８、ＩＣＰ８、及びＵＬ３０からなる群から選択される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ４からなる群から選択される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＵＬ８、ＵＬ４２、及びＩＣＰ３４．５からなる群から選択される。
【００１１】
実施形態では、該細胞は、神経細胞、心臓細胞、筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される。実施形態では、該神経細胞は、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、脳細胞、または脊髄細胞である。実施形態では、該筋細胞は、横紋筋細胞または平滑筋細胞である。実施形態では、該非がん性細胞及びがん性細胞は脳細胞であり、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４８７ｂ、及びｍｉＲ−１２８からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２４、及びｍｉＲ−１２８からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該非がん性細胞及びがん性細胞は、心臓細胞または横紋筋細胞であり、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−４９９ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３７８ｉ、ｍｉＲ−３０ｂ、及びｍｉＲ−３７８からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−１、及びｍｉＲ−２０８ａからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該非がん性細胞及びがん性細胞は、脊髄細胞であり、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−５７７、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１３２、及びｍｉＲ−１３５からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−９、及びｍｉＲ−２０４からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該非がん性細胞及びがん性細胞は、末梢神経系細胞であり、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−５７４からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該非がん性細胞及びがん性細胞は、肝細胞であり、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２６からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。実施形態では、該非がん性細胞及びがん性細胞は、平滑筋細胞であり、該少なくとも２つのｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの標的配列である。
【００１２】
実施形態では、該２つ以上のｍｉＲの標的配列は、該１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに挿入されるｍｉＲ−Ｔカセットに組み込まれる。実施形態では、該ｍｉＲ−Ｔカセットは、長さ１０００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、該ｍｉＲ−Ｔカセットは、長さ約２５〜約５００のヌクレオチドを含む。実施形態では、該ｍｉＲ−Ｔカセットは、長さ約１００〜約５００のヌクレオチドを含む。
【００１３】
実施形態では、本開示は、以下を含む組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を提供する：（ｉ）第一のウイルス遺伝子に挿入された第一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列カセット（ｍｉＲ−ＴＳカセット）であって、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、及びｍｉＲ−１４３の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含むカセット、（ｉｉ）第二のウイルス遺伝子に挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセットであって、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９ａ、及びｍｉＲ−１２２の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含むカセット、ならびに（ｉｉｉ）第三のウイルス遺伝子に挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセットであって、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−２０４、及びｍｉＲ−１２８の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含むカセット。実施形態では、該組み換えＨＳＶは、さらに、第四のウイルス遺伝子に挿入された第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含み、該第四のｍｉＲ−ＴＳカセットは、（ａ）ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６の各々に対して少なくとも２つの標的配列、または（ｂ）ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、及びｍｉＲ−１２６の各々に対して少なくとも２つの標的配列を含む。
【００１４】
実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットの各々は、ｍｉＲＮＡの各々に対して４つの標的配列をそれぞれ含む。実施形態では、該第一のウイルス遺伝子はＩＣＰ４である。実施形態では、該第二のウイルス遺伝子はＩＣＰ２７である。実施形態では、該第三のウイルス遺伝子はＩＣＰ３４．５である。実施形態では、該第四のウイルス遺伝子はＵＬ８である。実施形態では、該組み換えＨＳＶの複製は、非がん性細胞において、同じ細胞型のがん性細胞における組み換えＨＳＶの複製と比較して低減され、該細胞は、神経細胞、心臓細胞、筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される。
【００１５】
実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５２と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５２の核酸配列を含むまたはそれからなる。実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５３と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５３の核酸配列を含むまたはそれからなる。実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５４と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５４の核酸配列を含むまたはそれからなる。実施形態では、該第四のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５５と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。実施形態では、該第四のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号８５５の核酸配列を含むまたはそれからなる。
【００１６】
実施形態では、該組み換えＨＳＶはさらに、１つ以上のペイロード分子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該異種ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０からなる群から選択されるペイロードをコードする。実施形態では、該異種ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０からなる群から選択される２つ以上のペイロードをコードする。実施形態では、該異種ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０を含む３つのペイロードをコードする。
【００１７】
実施形態では、本開示は、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供し、該ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＵＬ８、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ４２、ＵＬ１９、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２７からなる群から選択される。実施形態では、該１つ以上のｍｉＲの標的配列は、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる。実施形態では、該ｍｉＲの標的配列は、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４−３ｐ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３１−５ｐ、及びｍｉＲ−２０５ｐからなる群から選択されるｍｉＲの標的配列である。
【００１８】
実施形態では、該１つ以上のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該１つ以上のｍｉＲの標的配列の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該ウイルス複製は、第一の細胞において、第二の細胞における該ウイルス複製と比較して、低減または減弱され、該第一の細胞は、１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現が、該第二の細胞における該ｍｉＲの発現と比較して増加している。実施形態では、該第一の細胞における該ｍｉＲの発現レベルは、該第二の細胞における該ｍｉＲの発現レベルより少なくとも５％高い。実施形態では、該第一の細胞は非がん性細胞である。実施形態では、該第二の細胞は、該１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現が、該第一の細胞における該ｍｉＲの発現と比較して低下している。実施形態では、該第二の細胞における該ｍｉＲの発現レベルは、該第一の細胞における該ｍｉＲの発現レベルより少なくとも５％低い。実施形態では、該第二の細胞はがん性細胞である。
【００１９】
実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子はＩＣＰ２７である。実施形態では、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子はＵＬ４２である。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。
【００２０】
実施形態では、本開示は、以下を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する：（ａ）ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列、及び（ｂ）（ｉ）１つ以上のタンパク質またはオリゴヌクレオチドであって、ｍｉＲ、遺伝子、または組織性メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）の発現を低減するもしくはその機能を阻害する該タンパク質またはオリゴヌクレオチド、あるいは（ｉｉ）プロテアーゼ活性化抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド。ただし、該ウイルスはＨＳＶであり、該１つ以上のウイルス遺伝子は、ＵＬ４２、ＵＬ１９、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２７からなる群から選択される。実施形態では、該ｍｉＲは、発がん性ｍｉＲまたは微小環境リモデリングｍｉＲである。実施形態では、発がん性ｍｉＲは、表４に記載するｍｉＲから選択される。実施形態では、該遺伝子は、発がん遺伝子である。実施形態では、該発がん遺伝子は、表７に記載の遺伝子から選択される。実施形態では、該微小環境リモデリングｍｉＲは、表５に記載のｍｉＲから選択される。実施形態では、該１つ以上のｍｉＲの標的配列は、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに組み込まれる。実施形態では、該ｍｉＲの標的配列は、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４−３ｐ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３１−５ｐ、及びｍｉＲ−２０５ｐからなる群から選択されるｍｉＲの標的配列である。
【００２１】
実施形態では、該１つ以上のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該１つ以上のｍｉＲの標的配列の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーが、１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子はＩＣＰ２７である。実施形態では、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーが、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。実施形態では、該１つ以上のウイルス遺伝子はＵＬ４２である。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座に挿入される。
【００２２】
実施形態では、該ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３及びＴＩＭＰ４から選択される。実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡまたはデコイオリゴヌクレオチドである。実施形態では、該タンパク質は、ヌクレアーゼ、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）、抗免疫抑制タンパク質、または免疫原性抗原である。実施形態では、該ヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される。実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４から選択される。実施形態では、該組み換えウイルスはさらに、ｔｒａｃｒ−ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）及びｃｒｉｓｐｒ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、該ｃｒＲＮＡは、ｍｉＲまたはＴＩＭＰをコードするゲノムＤＮＡ配列を標的とし、該ｔｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの結合及び活性化を促進する。
【００２３】
実施形態では、該抗免疫抑制タンパク質は、抗制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）タンパク質または抗骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）タンパク質である。実施形態では、該抗免疫抑制タンパク質は、ＶＨＨ由来ブロッカーまたはＶＨＨ由来ＢｉＴＥである。実施形態では、該タンパク質は、抗腫瘍免疫応答を誘導する。実施形態では、該タンパク質は、細胞表面で発現する抗原と結合し、該抗原は、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ／ＦＧＦＲ２ｂ、エンドセリンＢ受容体、及びＳＥＭＡ４Ｄからなる群から選択される。実施形態では、該タンパク質は、葉酸、ＩＦＮβ、Ａ２Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ１３７、ＣＤ２００、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＩＳＲＥ７、ＬＦＡ−１、ＮＧ２（ＳＰＥＧ４としても知られる）、ＳＭＡＤタンパク質、ＳＴＩＮＧ、ＴＧＦβ、及びＶＣＡＭ１から選択される。実施形態では、該少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体は、ウイルスの糖タンパク質エンベロープに組み込まれる。実施形態では、該プロテアーゼ活性化抗体は、システインカテプシン、アスパラギン酸カテプシン、カリクレイン（ｈＫ）、セリンプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、及びディスインテグリンメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）から選択されるプロテアーゼによって活性化される。実施形態では、該プロテアーゼは、カテプシンＫ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、カテプシンＥ、カテプシンＤ、ｈＫ１、ＰＳＡ（ｈＫ３）、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＭＭＰ−２１、ＭＭＰ−２３Ａ、ＭＭＰ−２３Ｂ、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−２５、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−２７、ＭＭＰ−２８、または表６に記載のプロテアーゼから選択される。実施形態では、該プロテアーゼ活性化抗体は、がん細胞によって、またはがん微小環境において、非がん細胞によって、または非がん微小環境においてよりも高度に発現するタンパク質に結合する。実施形態では、該プロテアーゼ活性化抗体は、ＮＫＧ２Ｄ、ｃ−ｍｅｔ、ＨＧＦＲ、ＣＤ８、ヘパラン硫酸、ＶＳＰＧ４（ＮＧ２としても知られる）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＬＣ−３、アネキシンＩＩ、ヒトトランスフェリン受容体、またはＥｐＣＡＭに結合する。
【００２４】
実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドが、ウイルスゲノムの遺伝子座に挿入されるか、または該ウイルスゲノムの２つの遺伝子座間に挿入される。実施形態では、該ウイルスの遺伝子座は、内部リピートジョイント領域（二倍体遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ４７プロモーターの各１つのコピーを含む）、ＩＣＰ０、ＬＡＴ、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及びＵＳ１２からなる群から選択される。
【００２５】
実施形態では、本開示は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸分子を提供する。実施形態では、本開示は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含むウイルスのストックを提供する。実施形態では、本開示は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス及び医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２６】
実施形態では、本開示は、がん性細胞の殺傷方法を提供し、該方法は、該がん性細胞を、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物に、該腫瘍溶解性ウイルスが該がん性細胞に感染し、その中で複製するのに十分な条件下で曝露することを含み、この場合、該がん性細胞内での該腫瘍溶解性ウイルスの複製が細胞死をもたらす。実施形態では、該がん性細胞は、１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現が、非がん性細胞における該ｍｉＲ発現と比較して低下している。実施形態では、該がん性細胞における該ｍｉＲの発現レベルは、該非がん性細胞における該ｍｉＲの発現レベルより少なくとも５％低い。実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスの複製は、該１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能な該ｍｉＲの発現が低下したがん性細胞において増加するまたは維持される。実施形態では、該ウイルス複製は、該がん性細胞において、該非がん性細胞における該ウイルス複製と比較して、少なくとも５％高い。実施形態では、該細胞はインビボである。実施形態では、該細胞は腫瘍内にある。
【００２７】
実施形態では、本開示は、がんの治療方法を、それを必要とする対象において提供し、該方法は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。実施形態では、該対象は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである。実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、または鼻腔内に投与される。実施形態では、該がんは、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、膠芽腫、黒色腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される。実施形態では、該肺癌は、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である。実施形態では、該肝臓癌は、肝細胞癌（ＨＣＣ）である。
【００２８】
実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ペイロード分子を含み、この場合、該ペイロード分子またはタンパク質は、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導である。実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ペイロード分子を含み、この場合、該ペイロード分子またはタンパク質は、抗ＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性脳組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図２】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性膀胱組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図３】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性乳房組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図４】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性結腸組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図５】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応する膠芽腫及び非がん性脳組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図６】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性頭頸部組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図７】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性肺組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図８】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応するがん性及び非がん性膵臓組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図９】２５個の選択されたｍｉＲＮＡに対応する神経鞘腫及び非神経鞘腫組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃは、実施例２に記載のｍｉＲＮＡ発現及び減弱レポーター遺伝子系を示す。図１０Ａは、ｍｉＲＮＡ発現プラスミドの発現を誘導するｐＴｅｔＲ  ｔｅｔリプレッサープラスミドの概略図を示す。図１０Ｂは、ｔｅｔ誘導性ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｉＲＮＡ発現カセットを含むｐＴＦ−００２ｍｉＲＮＡ発現プラスミドの概略図を示す。図１０Ｃは、不安定化ＧＦＰ（ｄｓＧＦＰ）の読み出しを可能にするｐＴＦ−００４ｍｉＲＮＡ減弱レポーターの概略図を示す。
【図１１】図１０に示す実施例２に記載のレポーター系を用いたｍｉＲ−１２２の発現及び減弱を示す。
【図１２】図１０に示す実施例２に記載のレポーター系を用いたｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、及びＬｅｔ７ａが媒介するＧＦＰの減弱を示す。丸で囲んだウェルは、ＧＦＰの発現レベルの低下を示す。
【図１３】図１０に示す実施例２に記載のレポーター系を用いたｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、及びＬｅｔ７ａのｍＣｈｅｒｒｙ発現によって示される発現を示す。
【図１４】図１０に示す実施例２に記載のレポーター系を用いたｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９、及びｍｉＲ−４５１が媒介するＧＦＰの減弱を示す。丸で囲んだウェルは、ＧＦＰの発現レベルの低下を示す。
【図１５】図１０に示す実施例２に記載のレポーター系を用いたｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９、及びｍｉＲ−４５１のｍＣｈｅｒｒｙ発現によって示される発現を示す。
【図１６】ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１８４によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図１７】ｍｉＲ−３４ａ及びｍｉＲ−１８４によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図１８】Ｌｅｔ７ａ及びｍｉＲ−１８４によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図１９】ｍｉＲ−１２４及びｍｉＲ−１８４によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２０】ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−１８４によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２１】ｍｉＲ−１９９及びｍｉＲ−４５１によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２２】ｍｉＲ−１２５及びｍｉＲ−４５１によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２３】ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−４５１によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２４】ｍｉＲ−１２７及びｍｉＲ−４５１によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２５】ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−４５１によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２６】ｍｉＲ−２２３及びｍｉＲ−４５１によって減弱されたＧＦＰ蛍光の定量化を示す。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｄは、非がん性の有糸分裂後の肺細胞及びがん性Ａ２５３細胞における、ｍｉＲ−１２５によるＨＳＶ減弱の蛍光ベースの定量化を示す。図２７Ａは、有糸分裂後の肺細胞におけるＨＳＶ減弱の蛍光ベースの定量化を示す。図２７Ｂは、Ａ２５３細胞におけるＨＳＶ減弱の蛍光ベースの定量化を示す。図２７Ｃは、有糸分裂後の肺細胞におけるＨＳＶ減弱のｑＰＣＲベースの定量化を示す。図２７Ｄは、Ａ２５３細胞におけるＨＳＶ減弱のｑＰＣＲベースの定量化を示す。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｂは、ＨＣＣ１３９５及びＡ２５３細胞におけるｍｉＲ−１４５によるＨＳＶ減弱の蛍光ベースの（図２８Ａ）ならびにｑＰＣＲベースの（図２８Ｂ）定量化を示す。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｂは、正常肺細胞におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｍｉＲ−１４３−３ｐによるＨＳＶ減弱の蛍光ベースの（図２９Ａ）ならびにｑＰＣＲベースの（図２９Ｂ）定量化を示す。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃは、Ａ２５３、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐ３Ｂ細胞株におけるｍｉＲＮＡ−１２５ａ（図３０Ａ）及びｍｉＲＮＡ−１２２（図３０Ｂ）の発現ならびにウイルス複製への影響（図３０Ｃ）を示す。
【図３１Ｃ】図３０Ａ〜図３０Ｃは、Ａ２５３、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐ３Ｂ細胞株におけるｍｉＲＮＡ−１２５ａ（図３０Ａ）及びｍｉＲＮＡ−１２２（図３０Ｂ）の発現ならびにウイルス複製への影響（図３０Ｃ）を示す。
【図３１】ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５ａを発現する細胞において、ｍｉＲ−Ｔ１２２及び／またはｍｉＲ−Ｔ１２５ａを含むＨＳＶによる感染後に低減したウイルス拡散及びタンパク質発現を示すウェスタンブロットを示す。
【図３２−１】図３２Ａ〜図３２Ｄは、ｍｉＲによって減弱されたＨＳＶの複製に対するｍｉＲＮＡ発現の影響を示す。図３２Ａ〜図３２Ｂは、ｍｉＲ−１２５ａ模倣体（図３２Ａ）またはｍｉＲ−１２２模倣体（図３２Ｂ）によるトランスフェクション後のｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉｒ−１２２の細胞内発現の増加を示す。図３２Ｃは、蛍光画像によって示される別個の遺伝子座における同種ｍｉＲの標的配列での腫瘍溶解性ＨＳＶベクターの複製の減弱、及びＧＦＰ蛍光の定量化（図３２Ｄ）を示す。
【図３２−２】図３２Ａ〜図３２Ｄは、ｍｉＲによって減弱されたＨＳＶの複製に対するｍｉＲＮＡ発現の影響を示す。図３２Ａ〜図３２Ｂは、ｍｉＲ−１２５ａ模倣体（図３２Ａ）またはｍｉＲ−１２２模倣体（図３２Ｂ）によるトランスフェクション後のｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉｒ−１２２の細胞内発現の増加を示す。図３２Ｃは、蛍光画像によって示される別個の遺伝子座における同種ｍｉＲの標的配列での腫瘍溶解性ＨＳＶベクターの複製の減弱、及びＧＦＰ蛍光の定量化（図３２Ｄ）を示す。
【図３３】がんまたは良性過剰増殖性疾患の治療用のＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：残余のＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５等）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図３４】がんまたは良性過剰増殖性疾患の治療用のＩＣＰ２７−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ２７：ＴｍｉＲＮＡ：ＩＣＰ２７遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５等）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図３５】がんまたは良性過剰増殖性疾患の治療用のＵＬ１９−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＵＬ１９：ＴｍｉＲＮＡ：ＵＬ１９遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５等）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図３６】がんまたは良性過剰増殖性疾患の治療用のＵＬ１９−ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ２７−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＵＬ１９：ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ２７：ＴｍｉＲＮＡ：ＵＬ１９及びＩＣＰ２７遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５等）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図３７】がんまたは良性過剰増殖性疾患の治療用のＵＬ１９−ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＵＬ１９：ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：ＵＬ１９及びＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５等）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図３８】がんまたは良性過剰増殖性疾患の治療用のＵＬ１９−ＴｍｉＲＮＡ、ＩＣＰ２７−ＴｍｉＲＮＡ、及びＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＵＬ１９：ＴｍｉＲＮＡ、ＩＣＰ２７：ＴｍｉＲＮＡ、及びＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：ＵＬ１９、ＩＣＰ２７、及びＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５等）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図３９】がんの治療用のＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ減弱、ゲノム編集ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：残余のＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター：構成的（ＣＡＧ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ）または細胞特異的（例えば、ＴＲＰＶ１、Ｎａｖ１．７、ｈＳＹＮ）、エンドヌクレアーゼ：ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ１、ＦｎＣａｓ９等）、ポリ（Ａ）：ポリアデニル化シグナル（例えば、ｂＧＨ）、ｇＲＮＡ：単一のｃｒＲＮＡ−ｔｒＲＮＡ融合（ＤＲ−ｃｒＲＮＡ−ＤＲ−ｔｒＲＮＡ）、発がん性マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５）を標的とするｃｒＲＮＡ、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター：例えば、Ｕ６、Ｈ１、７ＳＫ。
【図４０】がんの治療用のＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ減弱、ゲノム編集、微小環境リモデリングＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：残余のＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの標的配列（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５）の挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター：構成的（ＣＡＧ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ）または細胞特異的（例えば、ＴＲＰＶ１、Ｎａｖ１．７、ｈＳＹＮ）、エンドヌクレアーゼ：ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ１、ＦｎＣａｓ９等）、ポリ（Ａ）：ポリアデニル化シグナル（例えば、ｂＧＨ）、ｇＲＮＡ２：微小環境リモデリングｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８）またはＴＩＭＰ（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２）を標的とするｃｒＲＮＡ、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター：例えば、Ｕ６、Ｈ１、７ＳＫ。
【図４１】膵臓癌、肺癌、及び結腸癌の治療用のＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ２７−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：残余のＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲ−１２４の標的配列カセットの挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）、ＩＣＰ２７：ＴｍｉＲＮＡ：ＩＣＰ−２７遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、及びｍｉＲ−５５９の標的配列カセットの挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図４２】複数のがん型の治療用のＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ２７−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：残余のＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲ−１２４の標的配列カセットの挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）、ＩＣＰ２７：ＴｍｉＲＮＡ：ＩＣＰ−２７遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、及びｍｉＲ−５５９の標的配列カセットの挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図４３】神経鞘腫の治療用のＩＣＰ４−ＴｍｉＲＮＡ及びＩＣＰ２７−ＴｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶベクターの概略図を示す。ｇＢ：ＮＴ：ｇＢ遺伝子におけるウイルスの侵入を促進する二重突然変異、ＢＡＣ：ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列、Δジョイント：ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた完全な内部リピート領域の欠失、ＩＣＰ４：ＴｍｉＲＮＡ：残余のＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲ−１２４の標的配列カセットの挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）、ＩＣＰ２７：ＴｍｉＲＮＡ：ＩＣＰ−２７遺伝子の３’ＵＴＲへのｍｉＲ−２０５ｐ、ｍｉＲ−１４１−５ｐ、及びｍｉＲ−３１−５ｐの標的配列カセットの挿入（５’ＵＴＲに配置してもよい）。
【図４４】ｍｉＲ減弱ＨＳＶウイルスの概略図を示し、ここでは、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、及び／またはｍｉＲ−１２４の標的部位の複数のコピーがＩＣＰ２７、ＵＬ４２、及び／またはＩＣＰ４に挿入される。
【図４５】ｍｉＲ減弱ＨＳＶウイルス（ＯＮＣＲ−１５７）の概略図を示し、ここでは、ｍｉＲの標的部位のカセットがＵＬ８、ＩＣＰ１２、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ３４．５に挿入される。
【図４６】ｍｉＲ減弱ＨＳＶウイルス（ＯＮＣＲ−１５９）の概略図を示し、ここでは、ｍｉＲの標的部位のカセットがＵＬ８、ＩＣＰ１２、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ３４．５に挿入される。
【図４７】図４７Ａは、様々なウイルス遺伝子に対してプールされたｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＧＦＰを発現するように操作したレポーターウイルスによって生じたＧＦＰ強度を示す。図４７Ｂは、個々のｓｉＲＮＡに対する同じアッセイの結果を示す。
【図４８】図４８Ａ及び４８Ｂは、ＨＳＶベクターＯＮＣＲ−００３（左）またはＯＮＣＲ−０１０（右）を用いて、様々なウイルス遺伝子に対してプールされたｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＧＦＰを発現するように操作したレポーターウイルスによって生じたＧＦＰ強度を示す。
【図４９】ＨＳＶベクターに感染し、示されたウイルス遺伝子に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞における、ウイルスタンパク質の発現を検出するためのウェスタンブロットを示す。ベータ−アクチンは、このウェスタンブロットの陽性対照である。
【図５０】図５０Ａ及び５０Ｂは、悪性組織と比較した、正常脳組織のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイデータをｍｉＲＮＡ発現比（図５０Ａ）及び正規化カウント（図５０Ｂ）として示す。
【図５１】図５１Ａ及び５１Ｂは、悪性組織と比較した、正常心臓組織のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイデータをｍｉＲＮＡ発現比（図５１Ａ）及び正規化カウント（図５１Ｂ）として示す。
【図５２】図５２Ａは、悪性組織と比較した、正常脊髄組織のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイデータをｍｉＲＮＡ発現比として示す。図５２Ａ及び５２Ｂは、悪性組織と比較した、正常神経または神経節組織のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイデータをｍｉＲＮＡ発現比（図５２Ａ）及び正規化カウント（図５２Ｃ）として示す。
【図５３】図５３Ａ及び５３Ｂは、ｍｉＲ−ＴＳカセットのルシフェラーゼアッセイ試験をカセット１（図５３Ａ）またはカセット２（図５３Ｂ）について示す。
【図５４−１】図５４Ａ〜図５４Ｇは、腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスベクターＯＮＣＲ−１２５、ＯＮＣＲ−１３１、ＯＮＣＲ−１４２、及びＯＮＣＲ−１５７のがん細胞株ＳＷ８３７（図５４Ａ）、ＳＫＭＥＬ２８（図５４Ｂ）、ＣＯＬＯ２０５（図５４Ｃ）、Ａ３７５（図５４Ｄ）、Ｈ４４６（図５４Ｅ）、ＢＸＰＣ３（図５４Ｆ）、及びＢＴ５４９（図５４Ｇ）における細胞毒性を示す。
【図５４−２】図５４Ａ〜図５４Ｇは、腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスベクターＯＮＣＲ−１２５、ＯＮＣＲ−１３１、ＯＮＣＲ−１４２、及びＯＮＣＲ−１５７のがん細胞株ＳＷ８３７（図５４Ａ）、ＳＫＭＥＬ２８（図５４Ｂ）、ＣＯＬＯ２０５（図５４Ｃ）、Ａ３７５（図５４Ｄ）、Ｈ４４６（図５４Ｅ）、ＢＸＰＣ３（図５４Ｆ）、及びＢＴ５４９（図５４Ｇ）における細胞毒性を示す。
【図５５】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。ＯＮＣＲ−１３３は、注入された腫瘍の腫瘍増殖を、媒体処理対照と比較して有意に抑制した（ｐ＜０．０００１）。ＯＮＣＲ−１３３処理はまた、非注入腫瘍の腫瘍増殖を有意に抑制し（ｐ＜０．００５）、遠達効果の向上を示した。
【図５６】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。ＯＮＣＲ−１３３＋ＯＮＣＲ−００７（ＵＬＢＰ３を発現するＨＳＶ構築物）またはＯＮＣＲ−１３３＋ＯＮＣＲ−００２（さらなるペイロード分子を発現しないＨＳＶ構築物）で処理したマウスは両方とも、媒体処理対照と比較して腫瘍増殖の有意な抑制を示した。
【図５７】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。ＯＮＣＲ−１０６＋ＯＮＣＲ−１１３処理群におけるＣＸＣＬ１０のさらなる発現は、腫瘍増殖の抑制を、ＯＮＣＲ−０３１＋ＯＮＣＲ−１１３で処理したマウスと比較して、注入された腫瘍または非注入腫瘍のいずれにおいても向上しなかった。
【図５８】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。ＯＮＣＲ−１０６＋ＯＮＣＲ−１１３処理群におけるＣＸＣＬ１０のさらなる発現は、腫瘍増殖の抑制を、ＯＮＣＲ−０３１＋ＯＮＣＲ−１１３で処理したマウスと比較して、注入された腫瘍または非注入腫瘍のいずれにおいても向上しなかった。
【図５９】図５９Ａ〜図５９Ｂは、注入されたウイルスの複製が、注入された腫瘍においてのみ生じ、非注入腫瘍では生じず、該非注入腫瘍で認められる抗腫瘍効果が免疫介在性であることを示唆することを示す。データは、マイクログラムのＤＮＡあたりの未加工のゲノムのコピーとして（図５９Ａ）または正規化発現として（図５９Ｂ）プロットする。ＨＳＶは、注入された腫瘍において検出され、非注入腫瘍では検出されず、非注入腫瘍で認められる腫瘍増殖抑制が、ウイルスの拡散によるものではなく、ウイルス投与の遠達効果によるものであることを示す。
【図６０】図６０Ａ〜図６０Ｃは、処理の２４時間後に注入された腫瘍においてピークに達し、その後減少するペイロード発現を示す。
【図６１】図６１Ａ〜図６１Ｃは、ＯＮＣＲ−１５３で処理したマウス血清のペイロードのレベルを示し、ここでは、ＣＸＣＬ１０の発現のみが認められた。
【図６２】図６２Ａは、注入された腫瘍及び非注入腫瘍におけるインターフェロンガンマの発現レベルを示す。ＯＮＣＲ−１５３によるマウスの処理が、注入された腫瘍及び非注入腫瘍の両方において腫瘍内のＩＦＮγ応答を誘導した。図６２Ｂは、宿主動物の血漿中のインターフェロンガンマの発現レベルを示す。
【図６３】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。
【図６４】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。
【図６５】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。
【図６６】図６６Ａは、マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。図６６Ｂは、肺への転移の事例の減少を示す。図６６Ｃは、媒体（ＰＢＳ）対照またはベクター処理動物由来の肺組織の画像を示す。
【図６７】マウス異種移植実験において、媒体の腫瘍増殖抑制効果をウイルスと比較して（凡例に示す通り）示す。注入された腫瘍の腫瘍体積の増加を非注入腫瘍の腫瘍体積の増加と比較する。ＯＮＣＲ−１５２及び−１３９での処理は、ＯＮＣＲ−１３９単独での処理と比較して腫瘍増殖抑制効果の向上を示した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、差次的ｍｉＲ発現プロファイルを利用し、ｍｉＲの標的配列をウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子に組み込むことによって、効果的にウイルスベクターの複製を腫瘍細胞に限定する。特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲの標的配列の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーを、１つ以上のウイルス遺伝子に組み込まれて含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターはまた、腫瘍増殖、転移、及び／またはウイルスの拡散の増強を可能にするための腫瘍の微小環境のリモデリングの減少のために、特異的なｍｉＲＮＡの発現を妨害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、腫瘍細胞への標的化を促進するためにウイルスベクターの表面分子を使用することを包含する。これらの態様を個々に、または組み合わせて適用し、幅広いがん型を単一のウイルスベクターで治療することが潜在的に可能なウイルスベクターを開発することができる。従って、本発明はさらに、疾患及び障害（例えば、がん）の治療ならびに予防に用いる組み換え腫瘍溶解性ウイルスベクターを包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）発現を利用し、広範囲のがんの治療に適切な安全かつ有効な組み換えウイルスベクターを可能にする。
【００３１】
本明細書で使用する節の見出しは、構成の目的のみのためであり、記載する主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含むがこれらに限定されない本明細書で引用するすべての文書、または文書の一部は、あらゆる目的のため、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれた文書または文書の一部の１つ以上が、本出願における用語の定義と矛盾する用語を定義する場合、本出願に現れる定義が統制する。しかしながら、本明細書に引用する任意の参考文献、記事、出版物、特許、特許公開、及び特許出願に関する言及は、それらが有効な先行技術を構成する、もしくは世界のどこの国においても共通の一般的な知識の一部を形成するという承認または何らかの暗示ではなく、また、そのように見なされるべきではない。
【００３２】
定義
本説明では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に指定のない限り、列挙された範囲内の任意の整数値及び、適切な場合、その分数（例えば、ある整数の１０分の１及び１００分の１等）を含むと理解される。本明細書で使用される、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、特に指定のない限り、「１つ以上の」列挙成分を指すと理解されたい。選択肢（例えば、「または」）の使用は、当該選択肢の１つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されたい。本明細書で使用される、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同意語として使用される。本明細書で使用される、「複数」は、１つ以上の成分（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列）を指す場合がある。
【００３３】
本出願で使用される、「約」及び「およそ」という用語は、同等に使用される。約／およその有無にかかわらず、本出願で使用される任意の数字は、当業者によって認識される任意の正常変動を含めることを意味する。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、表示された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲に入る値の範囲を指す（かかる数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００３４】
「減少する」または「低下する」とは、参照値と比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９もしくは１００％の特定の値の減少または低下を指す。特定の値の減少または低下はまた、参照値と比較した値の倍数変化、例えば、参照値と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍、またはそれ以上の減少として表してもよい。
【００３５】
「増加する」とは、参照値と比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００、２００、３００、４００、５００％、またはそれ以上の特定の値の増加を指す。特定の値の増加はまた、参照値と比較した値の倍数変化、例えば、参照値のレベルと比較して、少なくとも１倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍、またはそれ以上の増加として表してもよい。
【００３６】
「配列同一性」という用語は、同じであり、同じ相対位置にある２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列間の塩基またはアミノ酸のパーセンテージを指す。従って、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して、ある特定のパーセンテージの配列同一性を有する。配列比較では、通常は１つの配列が参照配列として機能し、これに対して試験配列が比較される。「参照配列」という用語は、試験配列が比較される分子を指す。
【００３７】
「相補的」とは、塩基スタッキング及び特定の水素結合を介して、自然発生もしくは非自然発生（例えば、上記の通り修飾された）の塩基（ヌクレオシド）またはその類似体を含む２つの配列間での対合能力を指す。例えば、１つの位置の核酸における塩基が、標的の対応する位置における塩基との水素結合が可能な場合、これらの塩基は、その位置において互いに相補的であると見なされる。核酸は、普遍的塩基を含むことも、水素結合にプラスの寄与もマイナスの寄与もしない不活性な脱塩基スペーサーを含むこともできる。塩基対合は、標準的なワトソン・クリック塩基対合及び非ワトソン・クリック塩基対合（例えば、揺らぎ塩基対合及びフーグスティーン型塩基対合）を含み得る。相補的塩基対合の場合、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）はグアノシン型塩基（Ｇ）に相補的であり、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドール等の普遍的塩基は、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴにハイブリダイズすることができ、これと相補的であると理解される。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４、３６９：４９２−４９３及びＬｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９４、２２：４０３９−４０４３．イノシン（Ｉ）もまた、当技術分野では普遍的塩基であると見なされており、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、またはＴと相補的であると見なされる。Ｗａｔｋｉｎｓ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５、３３（１９）：６２５８−６２６７を参照されたい。
【００３８】
「動作可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらが意図的に機能することを許可する関係である並列を指す。例えば、プロモーターは、該プロモーターが当該ポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を与える場合、ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されている。
【００３９】
「対象」という用語は、動物、例えば、哺乳類を含む。いくつかの実施形態では、該哺乳類は霊長類である。いくつかの実施形態では、該哺乳類はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、家畜、例えば、畜牛、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタ等であるか、または、飼いならされた動物、例えば、イヌ及びネコである。いくつかの実施形態では（例えば、特に研究の状況において）、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、またはブタ、例えば、近交系ブタ等である。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義で用いられる。
【００４０】
「有効量」という用語は、特定の生理作用をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量（例えば、特定の生理作用を増加させる、活性化する、及び／または増強するために必要な量）を指す。特定の薬剤の有効量は、該薬剤の特性に基づいた様々な方法、例えば、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）で表され得る。特定の薬剤の有効量はまた、半数効果濃度（ＥＣ５０）としても表してもよく、これは、参照レベルと最高反応レベルの中間である特定の生理反応の大きさをもたらす薬剤の濃度を指す。
【００４１】
「医薬的に許容される」という表現は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な損益比に見合った、人間及び動物の組織と接触する用途に適切な化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために使用される。
【００４２】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」には、米国食品医薬品局によってヒト及び／または家畜での使用に許容されるとして承認された任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存料、染料／色素、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤、界面活性剤、及び／または乳化剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞に優先的に感染するように変性された、または自然にがん細胞に優先的に感染するウイルスを指す。
【００４４】
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」という用語は、本明細書では同義で用いられ、約２１〜２５ヌクレオチド長の低分子非コード内因性ＲＮＡを指し、これは、それらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解または翻訳抑制に向けることで遺伝子発現を調節する。
【００４５】
本明細書で使用される、「必須ウイルス遺伝子」とは、１つ以上の必須なウイルス機能、例えば、ウイルス複製、ウイルスパッケージング、またはウイルス感染性に必要なウイルス遺伝子を指す。
【００４６】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行または輸送することが可能な核酸分子を指す。移行される核酸は、一般に当該ベクターの核酸分子に連結、例えば、その中に挿入される。ベクターは、細胞内で自己複製をするように指示する配列を含む場合もあれば、宿主細胞ＤＮＡへの統合を可能にするのに十分は配列を含む場合もある。
【００４７】
分子及び細胞生化学の一般的方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）等の標準的なテキストに見出すことができる。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの実施形態では、本発明は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供し、ここで、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列の１つ以上のコピーは、ウイルス複製に必要な１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。腫瘍溶解性ウイルスの例は、当技術分野で既知であり、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、マラバウイルスまたはコクサッキーウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、組み換えウイルスベクターまたは腫瘍溶解性ベクターと呼ばれる。
【００４９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２））、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、マラバウイルスまたはコクサッキーウイルスである。特定の実施形態では、該組み換えウイルスベクターは、参照によりその全体が組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０６６０４２号に記載の腫瘍選択的ベクター複製が可能なＨＳＶである。
【００５０】
ＨＳＶ系ベクター及びそれらの構築方法は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７８，０２９号、第６，２６１，５５２号、第５，９９８，１７４号、第５，８７９，９３４号、第５，８４９，５７２号、第５，８４９，５７１号、第５，８３７，５３２号、第５，８０４，４１３号、及び第５，６５８，７２４号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、第ＷＯ９６／０４３９４号、第ＷＯ９８／１５６３７号、及び第ＷＯ９９／０６５８３号に記載されている。ＨＳＶの配列は公開されており（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１８０６、ＭｃＧｏｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，６９（ＰＴ  ７），１５３１−１５７４（１９８８）も参照のこと）、これが本発明のＨＳＶ系ベクターの設計を容易にし得る。場合によっては、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり、二倍体遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ、及びＩＣＰ４の各１つのコピーをＩＣＰ４７遺伝子に対するプロモーターとともに含む内部リピート（ジョイント）領域の欠失を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスベクターは、直接の感染及び／または水平拡散のいずれかを介した細胞内への侵入の増強を示すＨＳＶである。１つの態様では、本発明のＨＳＶベクターは、通常のＨＳＶ感染のメディエーター以外（例えば、ネクチン−１、ＨＶＥＭ、またはヘパラン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン以外）の細胞タンパク質との相互作用を介して細胞に直接感染することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスベクターは、ＨＳＶであり、さらに、非標準受容体を介したベクター侵入を促進するｇＢまたはｇＨ遺伝子の変異を含む。別の態様では、本発明は、通常はＨＳＶの水平拡散に耐性がある細胞、例えば、ｇＤ受容体を欠損する細胞において水平拡散を示す変異ｇＨ糖タンパク質をさらに含むＨＳＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＨＳＶベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３／００９６１８６号に記載の１つ以上の変異ｇＢまたはｇＨタンパク質を含む。ある特定の態様では、ＨＳＶベクター内の変異侵入タンパク質は、ウイルス侵入に関わる糖タンパク質、例えば、ｇＢ、ｇＨであり、該変異ＨＳＶベクターは、両方の変異型を含むことができる。しかしながら、該変異侵入タンパク質は、細胞内への該ＨＳＶベクターの侵入をもたらす任意のタンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、該変異侵入タンパク質は、ｇＤ以外であるが、該ＨＳＶベクターは、例えば、リガンドまたは他の所望の変異を含む変異ｇＤをさらに含むことができる。本発明のＨＳＶベクターで用いるｇＢまたはｇＨ糖タンパク質の非限定的な変異は、以下の残基の１つ以上で生じる：ｇＢ：Ｄ２８５、ｇＢ：Ａ５４９、ｇＢ：Ｓ６６８、ｇＨ：Ｎ７５３、及びｇＨ：Ａ７７８。いくつかの実施形態では、本発明のＨＳＶベクターは、ｇＢ：Ｄ２８５及びｇＢ：Ａ５４９の両方、ｇＨ：Ｎ７５３及びｇＨ：Ａ７７８の両方、及び／またはｇＢ：Ｓ６６８、ｇＨ：Ｎ７５３、及びｇＨ：Ａ７７８の各々で変異を含む。ある特定の実施形態では、該ＨＳＶベクターは、かかる変異の２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上）を含み、該ＨＳＶベクターは、これら残基の５つすべてに変異を含むことができる。１つの実施形態では、ＨＳＶベクターは、ｇＢ：２８５、ｇＢ；５４９、ｇＨ：７５３、及びｇＨ：７７８で変異を有する。該変異は、本明細書では、ＨＳＶ−１株のＫＯＳ誘導体Ｋ２６ＧＦＰのｇＤ、ｇＢ、及びｇＨ遺伝子のコドン（アミノ酸）付番に対して言及される。Ｋ２６ＧＦＰのｇＢ及びｇＨの配列は、以下の表９に反映されるように、ＧｅｎＢａｎｋに開示されるｇＢの配列（＃ＡＦ３１１７４０（参照により本明細書に組み込まれる））及びｇＨの配列（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ０３８９６（参照により本明細書に組み込まれる））とは異なる。
【表９】
2020532951.tif 000003
【００５２】
しかしながら、Ｋ２６ＧＦＰは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ０３８９６のヌクレオチド２，０７９〜２，１０２に対応する遺伝子の領域にさらなる相違を含んでもよい。従って、ＫＯＳ誘導体Ｋ２６ＧＦＰまたはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３１１７４０のいずれかの配列は、本明細書で論じるｇＢ変異の参照配列の役割を果たすことができることが理解されよう。同様に、ＫＯＳ誘導体Ｋ２６ＧＦＰまたはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３８９６のいずれかの配列は、本明細書で論じるｇＨ変異の参照配列の役割を果たすことができる。しかしながら、本発明のＨＳＶベクターは、任意のＨＳＶ株のｇＢ及びｇＨにおいて同種の変異を含み得る。
【００５３】
いくつかの態様では、ＨＳＶベクターへの封入のための侵入タンパク質の変異は、置換変異であるが、変異は置換変異体に限定されない。ある特定の実施形態では、ＨＳＶベクターに用いるための変異ｇＢまたはｇＨ糖タンパク質は、ｇＢ：Ｄ２８５Ｎ、ｇＢ：Ａ５４９Ｔ、ｇＢ：Ｓ６６８Ｎ、ｇＨ：Ｎ７５３Ｋ、ｇＨ：Ａ７７８Ｖからなる置換変異群から選択される。ある特定の態様では、ＨＳＶベクターは、これらの置換の組み合わせ（例えば、２つ以上のかかる置換（例えば、３つ以上、４つ以上、またはすべて））を含み、ｇＢ：Ｄ２８５Ｎ／ｇＢ：Ａ５４９Ｔ二重変異体、ｇＨ：Ｎ７５３Ｋ／ｇＨ：Ａ７７８Ｖ二重変異体、及びｇＢ：Ｓ６６８Ｎ／ｇＨ：Ｎ７５３Ｋ／ｇＨ：Ａ７７８Ｖ三重変異体が実施形態の例である。１つの実施形態では、ＨＳＶベクターは、ｇＢ：Ｄ２８５Ｎ／ｇＢ：Ａ５４９Ｔ／ｇＨ：Ｎ７５３Ｋ／ｇＨ：Ａ７７８Ｖを含む。
【００５４】
ある特定の態様では、ＨＳＶベクターは、変異ｇＢ及び／または変異ｇＨ糖タンパク質を含み、該糖タンパク質における変異は、少なくとも２つの残基での置換変異であり、ベクターがＨＳＶ−１  Ｋ２６ＧＦＰの場合、該少なくとも２つの残基は、ｇＢ：Ｄ２８５、ｇＢ：Ａ５４９、ｇＢ：Ｓ６６８、ｇＨ：Ｎ７５３、及びｇＨ：Ａ７７８からなる群から選択されるか、または、該ベクターが同種ＨＳＶの場合、該少なくとも２つの残基は、ｇＢ：Ｄ２８５、ｇＢ：Ａ５４９、ｇＢ：Ｓ６６８、ｇＨ：Ｎ７５３、及びｇＨ：Ａ７７８と相関するアミノ酸から選択され、ここで、該ｇＢ：Ｄ２８５残基は、ＶＹＰＹＸＥＦＶＬ（配列番号８３８）のＸに相関し、該ｇＢ：Ａ５４９残基は、ＫＬＮＰＮＸＩＡＳ（配列番号８３９）のＸに相関し、該ｇＢ：Ｓ６６８残基は、ＩＴＴＶＸＴＦＩＤ（配列番号８４０）のＸに相関し、該ｇＨ：Ｎ７５３残基は、ＶＤＴＤＸＴＱＱＱ（配列番号８４１）のＸに相関し、該ｇＨ：Ａ７７８残基は、ＶＰＳＴＸＬＬＬＦ（配列番号８４２）のＸに相関し、該ＨＳＶベクターは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ベクターである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスは、神経細胞のＨＳＶ感染を低下させる１つ以上の変異、例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３２０号及びＲｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２０１７，１３（１２），ｅ１００６７４１に記載のものをＵＬ３７遺伝子に含む。
【００５６】
ｍｉＲＮＡ減弱腫瘍溶解性ウイルス
ｍｉＲは、複数のがん型を含めた広範囲の病状において差次的に発現される。重要なことには、ｍｉＲＮＡは、正常組織と比較して、がん組織で差次的に発現されるため、それらが幅広いがんにおいて標的化機構として機能することが可能になる。発がん、悪性転換、または転移と（正にまたは負に）関連するｍｉＲＮＡは、「ｏｎｃｏｍｉＲ」として知られている。
【００５７】
いくつかの態様では、特定のｏｎｃｏｍｉＲの発現レベルは、特定のがんの発生または維持と正に関連している。かかるｍｉＲは、本明細書では「発がん性ｍｉＲ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、発がん性ｍｉＲの発現は、がん性細胞または組織において、非がん性対照細胞（すなわち、正常または健康対照）で認められる発現レベルと比較して増加しているか、または、異なるがん型由来のがん性細胞で認められる発現レベルと比較して増加している。いくつかの実施形態では、発がん性ｍｉＲの発現は、非がん性対照細胞または異なるがん型由来のがん性細胞における該発がん性ｍｉＲの発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、またはそれ以上増加している。いくつかの態様では、がん性細胞または組織は、非がん性対照細胞または組織で発現されない発がん性ｍｉＲを発現し得る。がん組織でしばしば過剰発現される発がん性ｍｉＲＮＡの例としては、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−１７−９２が挙げられるがこれらに限定されない。発がん性ｍｉＲのさらなる例は、表４に記載される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、特定のｏｎｃｏｍｉＲの発現は、特定のがんの発生もしくは維持及び／または転移と負に関連している。かかるｏｎｃｏｍｉＲは、本明細書では、それらの発現ががんの発生を予防または抑制することから、「腫瘍抑制（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）ｍｉＲ」または「腫瘍抑制（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）ｍｉＲ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現は、がん性細胞または組織において、非がん性対照細胞（すなわち、正常または健康対照）で認められる発現レベルと比較して減少しているか、または、異なるがん型由来のがん性細胞で認められる該腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して減少している。例えば、がん性細胞における腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞または異なるがん型由来のがん性細胞における該腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少している場合がある。いくつかの態様では、非がん性対照細胞は、がん性細胞で発現されない腫瘍抑制ｍｉＲＮＡを発現し得る。腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの例としては、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４−３ｐ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−２０５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−３４、及びｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。腫瘍抑制ｍｉＲのさらなる例は、表３及び表８に記載される。
【００５９】
がんの発症は、不均一かつ多重遺伝子過程である。従って、特定の経路の活性化及び特定の遺伝子の発現がある状況においてはがんの発生をもたらす可能性があり、また、異なる状況において活性化または発現された場合には、異なるまたは正反対の結果をもたらす可能性がある。従って、特定の遺伝子またはｍｉＲを「がん遺伝子」もしくは「発がん性ｍｉＲ」として、または「腫瘍抑制因子」もしくは「腫瘍抑制ｍｉＲ」として特徴づけることは２つの区別ではなく、がん型によって異なる。例えば、あるｍｉＲＮＡの発現は、特定のがんでは増加し、そのがんの発生と関連している可能性がある一方で、同じｍｉＲＮＡの発現は、異なるがんでは減少し、そのがんの発生の抑制に関連している可能性がある。しかしながら、いくつかのｍｉＲＮＡは、がん型とは無関係に発がん性ｍｉＲＮＡとして機能し得る。例えば、いくつかのｍｉＲＮＡは、分解のための腫瘍抑制遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を標的とするため、当該腫瘍抑制タンパク質の発現を低下させる。例えば、ｍｉＲ−１５２ｂは、血液悪性腫瘍の大部分で発がん性ｍｉＲとして機能するが、多くの固形腫瘍では腫瘍抑制ｍｉＲとして機能する。さらに、特定のｍｉＲは、がん性及び非がん性の両細胞で高度に発現し得る。例えば、ｍｉＲ−１５５は、正常細胞で高度に発現し、マクロファージの分極化に必要な役割を果たし、がん細胞においても高度に発現する。従って、本明細書に記載のｍｉＲ減弱、ゲノム編集、及び微小環境リモデリング腫瘍溶解性ウイルスの開発は、ある細胞集団または組織における特定のｍｉＲまたはｍｉＲの群の別の細胞集団または組織と比較した差次的発現に基づいている。当業者には、腫瘍抑制ｍｉＲという用語が一般に非がん性細胞または組織で、がん性細胞または組織と比較して高度に発現するｍｉＲを指すこと、及び発がん性ｍｉＲという用語が一般にがん性細胞または組織で、非がん性細胞または組織と比較して高度に発現するｍｉＲを指すことが理解されよう。当業者には、さらに、あるがん型において腫瘍抑制ｍｉＲと特徴づけられるｍｉＲが、異なるがん型において腫瘍抑制ｍｉＲとして機能する場合もしない場合もあること、及びあるがん型において発がん性ｍｉＲと特徴づけられるｍｉＲが、異なるがん型において発がん性ｍｉＲとして機能する場合もしない場合もあることが理解されよう。
【００６０】
表１は、１２個の選定したｏｎｃｏｍｉＲ（９つの腫瘍抑制因子及び３つの発がん性ｍｉＲＮＡ）と多数のがんの関係を示す。３，４１０のｏｎｃｏｍｉＲとがんの関係のリストを表２に示す。ｍｉＲＮＡは、細胞の増殖及びアポトーシスの制御に関与するタンパク質の多くの転写産物を調節する。調節されるタンパク質としては、従来のプロトオンコプロテインならびに腫瘍抑制因子、例えば、Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、ＰＴＥＮ及びｐ５３が挙げられる。ｍｉＲＮＡの異常な発現はそれ故、しばしばがんの発生に関与し、発がん性ｍｉＲＮＡを抑制することまたは枯渇した腫瘍抑制ｍｉＲＮＡを置換することのいずれかによって治療的に修正することができる。さらに、がん性及び非がん性細胞での特定のｏｎｃｏｍｉＲの差次的発現を、がん治療をがん細胞に特異的に標的化する手段として利用することができる。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスベクターは、以下の特性を個々にまたは組み合わせて含むことができる：ｍｉＲＮＡの標的配列の当該ウイルスゲノムへの挿入により、ウイルスベクター複製をがんまたは腫瘍細胞に限定すること、その産物（複数可）が発がん性ｍｉＲＮＡの機能を妨害する、がんの細胞外マトリックスを調節する、及び／または抗がん免疫応答を向上させるもしくは活性化する、１つ以上のポリヌクレオチドが当該ウイルスゲノムに組み込まれていること、及び／またはプロテアーゼ活性化抗体が、当該ベクターをがん及び／または腫瘍細胞に選択的に標的化するため、当該ウイルス粒子に組み込まれていること。
【００６１】
本発明の１つの態様は、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス（またはウイルスベクター）を含む。ある特定の実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されたｍｉＲＮＡの標的配列を含み得る。正常（非がん性）細胞で発現するｍｉＲＮＡは、かかる標的配列に結合することができ、該ｍｉＲＮＡの標的配列を含むウイルス遺伝子の発現を抑制することができるため、健康な非がん性細胞でのウイルス複製を制限する。かかる組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書では、それらが、組み込まれたｍｉＲの標的配列に結合することが可能な１つ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞において、該ｍｉＲを発現しない、またはその発現が低下した細胞と比較して、ウイルス複製の低下または減弱を示すことから、「ｍｉＲ減弱」または「複製制限」と呼ばれる。ウイルス複製は、ウイルス複製に必要な鍵遺伝子にｍｉＲＮＡの標的配列を組み込むことで、当該ｍｉＲＮＡを発現する正常二倍体細胞で条件的に抑制され得るとともに、当該ｍｉＲＮＡを発現しない細胞において正常に進行することができる。かかる実施形態では、健康な非がん性細胞は、正常細胞から、組み換えウイルスベクターによる感染の溶解効果から保護される。
【００６２】
ある特定の実施形態では、該１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列は、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり、ウイルス複製に必要なウイルス遺伝子は、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及び／またはＵＳ１２のいずれかを含む。ある特定の実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶであり、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’または３’ＵＴＲに組み込まれた１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶであり、該１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＵＬ８、ＵＬ４２、ＵＬ１９、及びＩＣＰ３４．５の１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶであり、該１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＵＬ８、ＵＬ４２、ＵＬ１９、及びＩＣＰ３４．５の１つ以上の５’または３’ＵＴＲに組み込まれる。
【００６３】
ｍｉＲＮＡの標的配列カセット
動物では、ｍｉＲＮＡの遺伝子は、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に転写され、これがその後ドローシャ、すなわち、クラス２ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素によって核内でプロセシングされ、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）ヘアピンを形成する。該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンは、細胞質に輸送され、そこでＲＮａｓｅＩＩＩ酵素ダイサーによって切断される。このエンドリボヌクレアーゼは、該ヘアピンの５’及び３’末端と相互作用し、該３’及び５’アームをつなぐループを切断し、約２２ヌクレオチド長の二重鎖ＲＮＡ分子を生成する。該二重鎖のいずれかの鎖が潜在的に機能ｍｉＲＮＡとして作用する可能性があるが、通常、該ｍｉＲＮＡの１本の鎖は分解され、１本の鎖のみがアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質にロードされ、該ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的が相互作用するエフェクターＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を産生する（Ｗａｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１８０３：１１，  ２０１０，  １２３１−１２４３）。
【００６４】
本明細書では、特定のｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、「ＭＩＲ」とそれに続くｍｉＲＮＡ番号として参照される。中間体のヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子は、「ｍｉｒ」とそれに続くｍｉＲＮＡ番号として参照され、成熟した一本鎖ｍｉＲＮＡ分子は、「ｍｉＲ−」とそれに続くｍｉＲＮＡ番号として参照される。例えば、「ＭＩＲ１２２」は、その後成熟ｍｉＲ−１２２分子にプロセシングされるヘアピンｍｉｒ−１２２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子をコードする遺伝子を指す。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造のため、２つの成熟マイクロＲＮＡが同じｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来し得ることが考えられる。ある場合には、発現データにより、一方の鎖が主に発現されたｍｉＲＮＡとして、他方が微量生成物として明確に識別される。かかる場合では、該成熟ｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲ−＃＃（主生成物）及びｍｉＲ−＃＃＊（当該前駆体の反対のアーム由来の微量生成物）の形態の名称を割り当てられる。例えば、ｍｉｒ−５６の主及び微量生成物は、それぞれ、ｍｉＲ−５６及びｍｉＲ−５６＊と示される。既存のデータがどちらの配列が主なものであるかを判断するのに十分でない場合、またはそれらがほぼ同じ量で見出される場合、それら２つの成熟ｍｉＲＮＡ産物は、ｍｉＲ−＃＃−５ｐ（該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの５’アーム由来）及びｍｉＲ−＃＃−３ｐ（該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの３’アーム由来）として示される。例えばｍｉｒ−１４２の２つの成熟ｍｉＲＮＡ産物は、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１４２−３ｐとして示される。それらはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの対向する末端由来であるため、特定のｍｉＲＮＡの−３ｐ及び−５ｐ産物は、異なるＲＮＡ配列を含み、それ故異なる標的配列を認識する。
【００６５】
本明細書では、ｍｉＲＮＡの標的配列は、「ｍｉＲの標的配列カセット」または「ｍｉＲ−ＴＳカセット」の形態で、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入される。ｍｉＲ−ＴＳカセットは、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列を含みかつウイルス遺伝子の特定の遺伝子座に挿入され得るポリヌクレオチド配列を指す。転写されると、ｍｉＲ−ＴＳカセットを含むウイルス遺伝子のｍＲＮＡ転写産物は、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡの標的配列を含む。該ｍｉＲ−ＴＳカセットが２つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列を含むかかる実施形態では、該２つ以上の標的配列は、該ｍｉＲ−ＴＳカセットの合計長さ（ｍ）が、該ｍｉＲＮＡの標的配列の平均長さ（ｎ）に該カセット内のｍｉＲＮＡの標的配列の総数（ｙ）を乗じ、リンカー配列の平均長さ（ｌ）に該カセット内のｍｉＲＮＡの標的配列の総数プラス１（ｙ＋１）を乗じたものを加えたもの以下であるように配列される。従って、ｍｉＲ−ＴＳカセットの長さ（ｍ）は、式：ｍ≦（ｎ＊ｙ）＋（ｌ＊（ｙ＋１））、ただし、ｎ＝ｍｉＲＮＡの標的配列の平均長さ、ｌ＝リンカー配列の平均長さ、及びｙ＝ｍｉＲ−ＴＳカセット内の標的配列の総数、で表すことができる。説明に役立つ実例として、ｍｉＲ−ＴＳカセットが、平均長さが２１ｎｔ（ｎ）の４つ（ｙ）のｍｉＲＮＡの標的配列を含み、リンカー配列の平均長さが４〜２５ｎｔ（ｌ）である場合、ｍｉＲ−ＴＳカセットの長さ（ｍ）は、約１０４ｎｔ〜約２０５ｎｔである。
【００６６】
本明細書で使用される、ｍｉＲ−ＴＳカセットの「長さ」は、任意の介在配列を含め、当該ポリヌクレオチドの最初のｍｉＲ−ＴＳの５’ヌクレオチドから最後のｍｉＲ−ＴＳの３’ヌクレオチドまでのヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチドの塩基対）の総数として定義される。非重複ｍｉＲ−ＴＳの場合、ｍｉＲ−ＴＳカセットの最小長は、ｍｉＲ−ＴＳの長さの合計になる。スペーサーは長さを延長する。スペーサー長の選択がカセット内のさらなるヌクレオチドの数を決定する。長いスペーサーは短いスペーサーよりカセットの長さを長くする。より短いスペーサー（０、１、２、３、４、５、または６ｎｔ）は、ｍｉＲ−ＴＳが交互配置される（互いに隣接する同じｍｉＲＮＡのためｍｉ−ＴＳの数を最小にして）、すなわち、他のｍｉＲ−ＴＳ間のスペースを広げる役割をする交互的ｍｉＲ−ＴＳの場合に使用することができることを認識することにより、本発明者らは、同じｍｉＲＮＡに対するｍｉＲ−ＴＳがタンデムに、例えば、１つの型の４つに続いて次の型の４つが配列されているｍｉＲ−ＴＳカセットにおいて可能であるよりも短いｍｉＲ−ＴＳカセットを生成することが可能であると判断した。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットの長さは、１０００ｎｔ未満である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットの長さは、９００ｎｔ未満、８００ｎｔ未満、７００ｎｔ未満、６００ｎｔ未満、５００ｎｔ未満、４００ｎｔ未満、３００ｎｔ未満、２００ｎｔ未満、１００ｎｔ未満、または５０ｎｔ未満である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットの長さは、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ｎｔ×ｍｉＲ−ＴＳ部位の数未満、約３０ｎｔ×ｍｉＲ−ＴＳ部位の数未満、約３５ｎｔ×ｍｉＲ−ＴＳ部位の数未満、または約４０ｎｔ×ｍｉＲ−ＴＳ部位の数未満である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含み、該複数の中の各ｍｉＲＮＡの標的配列は、同じｍｉＲＮＡの標的配列である。例えば、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、同じｍｉＲの標的配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、同じｍｉＲの標的配列の２つ〜６つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、同じｍｉＲの標的配列の３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、同じｍｉＲの標的配列の４つのコピーを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含み、該複数は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲＮＡの標的配列の１つ以上のコピー及び第二のｍｉＲＮＡの標的配列の１つ以上のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピー及び第二のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピー及び第二のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピー、第二のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピー、及び第三のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピー、第二のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピー、及び第三のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピー、第二のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピー、及び第三のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピー、第二のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピー、第三のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピー、及び第四のｍｉＲの標的配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピー、第二のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピー、第三のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピー、及び第四のｍｉＲの標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、第一のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピー、第二のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピー、第三のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピー、及び第四のｍｉＲの標的配列の３つまたは４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む。
【００６９】
該ｍｉＲ−ＴＳカセットが複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含むいくつかの態様では、該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、介在核酸配列なしでタンデムに配列され得る。いくつかの態様では、該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、リンカー配列によって区切られてもよい。いくつかの実施形態では、該リンカー配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該リンカー配列は、約４〜約２０個のヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、該リンカー配列は、約４〜約１６個のヌクレオチドを含む。説明に役立つ実施形態として、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、以下のサブユニットの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上を含み得る：（ａ）第一のｍｉＲＮＡの標的配列−リンカー−第二のｍｉＲＮＡの標的配列、ここでは、隣接するサブユニットはさらなるリンカー配列で区切られる。いくつかの実施形態では、該第一及び第二のｍｉＲＮＡの標的配列は、同じｍｉＲＮＡの標的である。いくつかの実施形態では、該第一及び該第二のｍｉＲＮＡの標的配列は、異なるｍｉＲＮＡの標的である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号１〜８０３から選択される配列の逆相補体と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のｍｉＲＮＡの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、配列番号１〜８０３から選択される配列の逆相補体を含むか、またはそれからなるｍｉＲＮＡの標的配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列は、配列番号８０４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列は、配列番号８０４を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２４−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２４−３ｐの標的配列は、配列番号８０５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２４−３ｐの標的配列は、配列番号８０５を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８０６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８０６を含むか、またはそれからなる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２６−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６−３ｐの標的配列は、配列番号８０７または配列番号８０８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６−３ｐの標的配列は、配列番号８０７もしくは配列番号８０８を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２７ａ−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐの標的配列は、配列番号８０９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２７ａ−３ｐの標的配列は、配列番号８０９を含むか、またはそれからなる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２８−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２８−３ｐの標的配列は、配列番号８１０または配列番号８１１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２８−３ｐの標的配列は、配列番号８１０もしくは配列番号８１１を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２９−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２９−３ｐの標的配列は、配列番号８１２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２９−３ｐの標的配列は、配列番号８１２を含むか、またはそれからなる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１２９−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２９−５ｐの標的配列は、配列番号８１３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２９−５ｐの標的配列は、配列番号８１３を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐの標的配列は、配列番号８１４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐの標的配列は、配列番号８１４を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐの標的配列は、配列番号８１５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐの標的配列は、配列番号８１５を含むか、またはそれからなる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１３３ａ−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐの標的配列は、配列番号８１６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐの標的配列は、配列番号８１６を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１３３ｂ−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３３ｂ−３ｐの標的配列は、配列番号８１７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３３ｂ−３ｐの標的配列は、配列番号８１７を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１３４−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３４−３ｐの標的配列は、配列番号８１８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３４−３ｐの標的配列は、配列番号８１８を含むか、またはそれからなる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列は、配列番号８１９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列は、配列番号８１９を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１−３ｐの標的配列は、配列番号８２０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１−３ｐの標的配列は、配列番号８２０を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１４３−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４３−３ｐの標的配列は、配列番号８２１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４３−３ｐの標的配列は、配列番号８２１を含むか、またはそれからなる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１４５−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４５−３ｐの標的配列は、配列番号８２２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４５−３ｐの標的配列は、配列番号８２２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１４５−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４５−５ｐの標的配列は、配列番号８２３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４５−５ｐの標的配列は、配列番号８２３を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１８４−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１８４−３ｐの標的配列は、配列番号８２４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１８４−３ｐの標的配列は、配列番号８２４を含むか、またはそれからなる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１９９ａ−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐの標的配列は、配列番号８２５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐの標的配列は、配列番号８２５を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８２６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８２６を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−２０４−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２０４−５ｐの標的配列は、配列番号８２７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２０４−５ｐの標的配列は、配列番号８２７を含むか、またはそれからなる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐの標的配列は、配列番号８２８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐの標的配列は、配列番号８２８を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−２１４−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２１４−３ｐの標的配列は、配列番号８２９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２１４−３ｐの標的配列は、配列番号８２９を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列は、配列番号８３０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列は、配列番号８３０を含むか、またはそれからなる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８３１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８３１を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−２２３−３ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２２３−３ｐの標的配列は、配列番号８３２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−２２３−３ｐの標的配列は、配列番号８３２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−３４ａ−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−３４ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８３３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−３４ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８３３を含むか、またはそれからなる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−４５１ａの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−４５１ａの標的配列は、配列番号８３４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−４５１ａの標的配列は、配列番号８３４を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−５５９−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−５５９−５ｐの標的配列は、配列番号８３５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−５５９−５ｐの標的配列は、配列番号８３５を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８３６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの標的配列は、配列番号８３６を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−ＴＳカセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲ−９−５ｐの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−９−５ｐの標的配列は、配列番号８３７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−９−５ｐの標的配列は、配列番号８３７を含むか、またはそれからなる。
【００８２】
以下の表１０は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスのｍｉＲＮＡの標的配列に結合することができる例示的なｍｉＲＮＡの配列を提供する。さらなるｍｉＲＮＡ配列は、配列番号３３〜８０３に提供される。
【表１０】
2020532951.tif 000004
【００８３】
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、該カセットをウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入することを可能にする１つ以上のさらなるポリヌクレオチド配列を含む。例えば、ｍｉＲ−ＴＳカセットはさらに、当該ウイルスゲノムの所望の位置の核酸配列に相補的な５’及び３’末端に短いポリヌクレオチド配列を含み得る。かかる配列は、本明細書では「ホモロジーアーム」と呼ばれ、ウイルスゲノムの特定の位置へのｍｉＲ−ＴＳカセットの挿入を促進する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示のｍｉＲ−ＴＳカセットは、各々異なるｍｉＲＮＡに対応する２つ以上の複数のｍｉＲ−ＴＳを含み、該ｍｉＲ−ＴＳは、腫瘍溶解性ウイルスから多様な細胞型または器官を保護するように選択される。いくつかの実施形態では、該複数のｍｉＲ−ＴＳは、互いにタンデムではなく交互配置される。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、短い（例えば、４〜１５ｎｔ長）スペーサーを有し、よりコンパクトなカセットをもたらす。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、該ｍｉＲ−ＴＳの活性を阻害するＲＮＡの二次構造を含まない（またはこれが少ない）。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、発がん、悪性転換、または転移と関連するｍｉＲＮＡのシード配列（すなわち、「ｏｎｃｏｍｉＲ」）を含まない（またはこれが少ない）。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ポリアデニル化部位を含まない（またはこれが少ない）。
【００８５】
ｍｉＲ−ＴＳカセットを含む腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、１つのｍｉＲ−ＴＳカセットを、１つの必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれて含む場合があり、ここでは、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含み、その結果、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を、１つの必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれて含む。いくつかの態様では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む場合があり、ここでは、該複数のうちの各ｍｉＲＮＡの標的配列は、同じｍｉＲＮＡの標的であり、その結果、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、同じｍｉＲＮＡの標的配列の複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のコピーを、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれて含む。例えば、いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、２、３、４、５、６、またはそれ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、２、３、４、またはそれ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、２、３、４、５、６またはそれ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。
【００８６】
いくつかの態様では、該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含み、その結果、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列の１つ以上のコピーを、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれて含む。例えば、いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１８４−３ｐ、及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１８４−３ｐ、及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１８４−３ｐ、及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２２−５ｐ及びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−５９９−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−５９９−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−５９９−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに、挿入されて含み得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１２４−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１２４−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１２４−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２１７−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２１７−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２１７−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２のうちの１つに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの１つ以上の標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９のうちの１つに挿入されて含み得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、１つのｍｉＲ−ＴＳカセットを、当該ウイルスゲノムの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に組み込まれて含んでもよい。かかる実施形態では、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスが、ｍｉＲＮＡの標的配列の１つのコピーを、当該ウイルスゲノムの３’または５’ＵＴＲに組み込まれて含むように、ｍｉＲＮＡの標的配列の１つのコピーを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、組み換えポリオウイルス、ＳＶＶ、またはコクサッキーウイルスは、表１０に示すｍｉＲＮＡの標的配列を含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、当該ウイルスゲノムの３’または５’ＵＴＲに挿入されて含み得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、１つのｍｉＲ−ＴＳカセットを、当該ウイルスゲノムの３’または５’ＵＴＲに組み込まれて含む場合があり、ここで、該ｍｉＲ−ＴＳカセットは、表１０に示す複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含み、その結果、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を、当該ウイルスゲノムの３’または５’ＵＴＲに組み込まれて含む。
【００９２】
いくつかの態様では、該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含み、その結果、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列の１つ以上のコピーを、当該ウイルスゲノムの３’または５’ＵＴＲに組み込まれて含む。例えば、いくつかの実施形態では、組み換えポリオウイルス、ＳＶＶ、またはコクサッキーウイルスは、表１０から選択される少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列の１つ以上のコピーを含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、当該ウイルスゲノムの３’または５’ＵＴＲに挿入されて含み得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−ＴＳカセットを、２つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれて含み得る。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶウイルスであり、該２つ以上の必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶウイルスであり、該２つ以上の必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ３０、ＵＬ３９／４０、またはＵＬ４２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶウイルスであり、該２つ以上の必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、またはＵＬ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶウイルスであり、該２つ以上の必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ８、及びＵＬ４２からなる群から選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット及びＩＣＰ２７の遺伝子座の中に、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、ｍｉＲ−１−３ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）、
（ｂ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）。
【００９５】
いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１−３ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、ｍｉＲ−１４５−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、ｍｉＲ−１９９−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、及びｍｉＲ−５５９の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピー、及びｍｉＲ−１２８の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２４の標的配列の４つのコピーを含み、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、１−３ｐ、１４５−５ｐ、１９９ａ−５ｐ、及び５５９の各々の標的配列の２つ、３つ、またはそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２４の標的配列の４つのコピーを含み、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、２１９ａ−５ｐ、１２２−５ｐ、及び１２８Ｔの各々の標的配列の４つのコピーを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）。
【００９８】
いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ４２の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、ｍｉＲ−１２４の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入された、ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列の３つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のうちの１つに従って配列される：
（ａ）（１２２−５ｐ）、
（ｂ）（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）、
（ｃ）（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ４２の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のうちの１つに従って配列される：
（ａ）（１２２−５ｐ）、
（ｂ）（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）、
（ｃ）（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２２−５ｐ）。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４−３ｐの標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５−５ｐの標的配列の４つのコピーを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５−５ｐの標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲＮＡ−１２４の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２２−３ｐの標的配列の４つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５−５ｐの標的配列の４つのコピーを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４−３ｐの標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２２−３ｐの標的配列の３つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉｉ）ＵＬ４２の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２５−５ｐの標的配列の４つのコピーを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（２０８ｂ−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７の標的配列の４つのコピー、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐの標的配列の４つのコピー、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの標的配列の４つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（２１９ａ−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１２２−５ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１２２−５ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ａ、及びｍｉＲ−１２６の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（２０８ｂ−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの標的配列の４つのコピー、ｍｉＲ−１２２−５ｐの標的配列の４つのコピー、及びｍｉＲ−１２８の標的配列の４つのコピーを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７の標的配列の４つのコピー、ｍｉＲ−２０８ａの標的配列の４つのコピー、及びｍｉＲ−１２６の標的配列の４つのコピーを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、及び（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入された、複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第一のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１２４−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）−（１−３ｐ）−（１４３−３ｐ）。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲＮＡ  ２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ  １２２−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ  １２８の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第二のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（２１９ａ−５ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１２２−５ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１２２−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１２２−５ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ａ、及びｍｉＲ−１２６の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（２０８ｂ−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２０８ｂ−３ｐ）。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ１３７、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１２６の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２６−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２６−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１２７の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１３７−３ｐ）−（１２７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２７−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１３７−３ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１２９の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１３７−３ｐ）−（１２９−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２９−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２９−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１２９−３ｐ）−（２１９−５ｐ）−（１３７−３ｐ）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１３０の各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第三のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１３７−３ｐ）−（１３０−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３０−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３０−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１２７−３ｐ）−（１３７−３ｐ）−（１３０−３ｐ）−（２１７−５ｐ）−（１３７−３ｐ）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、該第四のｍｉＲ−ＴＳカセットは、ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲＮＡ  １２８Ｍ、ｍｉＲＮＡ  ２０４、及びｍｉＲＮＡ  ２１９−３ｐの各々の標的配列の１つ、２つ、３つ、または４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該第四のｍｉＲ−ＴＳカセットにおける該複数のｍｉＲＮＡの標的配列は、以下のように配列される：
（ａ）（１２８−３ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（２０４−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（２０４−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（２０４−５ｐ）−（１２８−３ｐ）−（２１９ａ−５ｐ）−（２０４−５ｐ）。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６の各々の標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２８の標的配列の４つ、ｍｉＲ−２０４の標的配列の４つのコピー、及びｍｉＲ−２１９−３ｐの標的配列の４つのコピーを含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２０８ａ、及びｍｉＲ−１２６の各々の標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列の４つ、ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列の４つ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２８の標的配列の４つ、ｍｉＲ−２０４の標的配列の４つのコピー、及びｍｉＲ−２１９−３ｐの標的配列の４つのコピーを含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列の４つ、ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列の４つ、及びｍｉＲ−１２７の標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２８の標的配列の４つ、ｍｉＲ−２０４の標的配列の３つのコピー、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの標的配列の３つのコピーを含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列の４つ、ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列の４つ、及びｍｉＲ−１２８の標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２８の標的配列の４つ、ｍｉＲ−２０４の標的配列の３つのコピー、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの標的配列の３つのコピーを含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列の４つ、ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列の４つ、及びｍｉＲ−１２９の標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２８の標的配列の４つ、ｍｉＲ−２０４の標的配列の３つのコピー、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの標的配列の３つのコピーを含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、（ｉ）ＩＣＰ４の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４の各々の標的配列の４つのコピーを含む第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉ）ＩＣＰ２７の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ−１２８の各々の標的配列の４つを含む第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、（ｉｉｉ）ＵＬ８の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１３７−３ｐの標的配列の４つ、ｍｉＲ−２１７−５ｐの標的配列の４つ、及びｍｉＲ−１３０の標的配列の４つを含む第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびに（ｉｖ）ＩＣＰ３４．５の遺伝子座に挿入され、ｍｉＲ−１２８の標的配列の４つ、ｍｉＲ−２０４の標的配列の３つのコピー、及びｍｉＲ−２１９−５ｐの標的配列の３つのコピーを含む第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーを、１つの必須ウイルス遺伝子に組み込まれて含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーを、ＵＬ４２の遺伝子座に組み込まれて含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーを、１つの必須ウイルス遺伝子に組み込まれて含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーを、ＩＣＰ２７の遺伝子座に組み込まれて含む（例えば、ＯＮＣＲ−０３６）。
【０１２５】
さらなる実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーを、ウイルス複製に必要なウイルス遺伝子に組み込まれて含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーを、ＵＬ４２の遺伝子座に組み込まれて含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲの標的配列の４つのコピーが必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。さらなる実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーを必須ウイルス遺伝子に組み込まれて含み得る。さらなる実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーを、ＵＬ４２の遺伝子座に組み込まれて含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーを、必須ウイルス遺伝子に組み込まれて含み得る。さらなる実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーを、ＩＣＰ２７の遺伝子座に組み込まれて含み得る（例えば、ＯＮＣＲ−０６３）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーが第一の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーが第二の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれる（例えば、ＯＮＣＲ−０９４）。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーが第一の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーが第二の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の１つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の３つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれる（例えば、ＯＮＣＲ−０９５）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、第一のｍｉＲの標的配列の４つのコピーが第一の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれ、第二のｍｉＲの標的配列の１つのコピーが第二の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーが第一の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーが第二の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれる（例えば、ＯＮＣＲ−０９３）。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、第一のｍｉＲの標的配列の４つのコピーが第一の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれ、第二のｍｉＲの標的配列の４つのコピーが第二の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーが第一の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーが第二の必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２の標的配列の４つのコピーがＩＣＰ２７の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれ、ｍｉＲ−１２５ａの標的配列の４つのコピーがＵＬ４２の遺伝子座の３’ＵＴＲに組み込まれる（例えば、ＯＮＣＲ−０９６）。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ減弱腫瘍溶解性ウイルスは、組み込まれたｍｉＲの標的配列の１つ以上に結合することが可能なｍｉＲを発現する細胞でのウイルス複製を低下させる。「ウイルス複製」とは、一定期間内に特定の細胞または細胞集団で生じるウイルス複製のサイクル数の合計を指す。いくつかの実施形態では、ウイルス複製は、該一定期間にわたって示されるウイルス価の合計を評価することにより、または示されるウイルスゲノムのコピー数を評価することによって（例えば、シーケンシングによって）直接測定することができる。いくつかの実施形態では、該ウイルスベクターは、さらに、検出可能なラベル、例えば、蛍光レポーターを含み得る。かかる実施形態では、ウイルス複製は、該レポーターの蛍光強度、または該レポーターを発現する細胞数を測定することにより、評価され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス複製は、該一定時間にわたる生存細胞数を評価することにより間接的に測定することができる。例えば、ウイルス複製のレベルは、経時的に生存細胞数と逆相関することが見込まれる。
【０１３１】
本明細書で使用される、「ウイルス複製の低下」とは、第一の細胞または第一の細胞集団で、第二の細胞または第二の細胞集団と比較して低いウイルス複製のレベルを指す。いくつかの実施形態では、該第一の細胞または第一の細胞集団におけるウイルス複製のレベルは、該第二の細胞または細胞集団におけるウイルス複製のレベルと比較して、少なくとも５％低い。いくつかの実施形態では、該第一の細胞または第一の細胞集団におけるウイルス複製のレベルは、該第二の細胞または細胞集団におけるウイルス複製のレベルと比較して、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低い。いくつかの実施形態では、該第一の細胞または第一の細胞集団におけるウイルス複製は、該第二の細胞または細胞集団におけるウイルス複製と比較して、完全に抑制されている。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、該第一の細胞または第一の細胞集団におけるウイルス複製の低下は、複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子に組み込まれた１つ以上のｍｉＲの標的配列に結合することが可能なｍｉＲの発現と相関する。いくつかの実施形態では、組み込まれたｍｉＲの標的配列に対応するｍｉＲの発現は、それ故、複製遺伝子の発現を抑制または低減し、それにより、ウイルス複製を抑制または低減する。いくつかの実施形態では、該第二の細胞または第二の細胞集団は、ｔ  ｍｉＲを発現しない、またはその発現レベルが低下している。いくつかの実施形態では、組み込まれたｍｉＲの標的配列に対応するｍｉＲ（例えば、がん細胞における）の発現の欠如または低下が、ウイルス複製を進行させる。いくつかの実施形態では、該第二の細胞または細胞集団におけるｍｉＲの発現レベルは、該第一の細胞または集団におけるｍｉＲの発現レベルより、少なくとも５％低い。いくつかの実施形態では、該第二の細胞または細胞集団におけるｍｉＲの発現レベルは、該第一の細胞または集団におけるｍｉＲの発現レベルと比較して、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上低い。いくつかの実施形態では、該第二の細胞は、該ｍｉＲを発現しない。特定の実施形態では、該第一の細胞は、非がん性細胞であり、該第二の細胞は、がん性細胞である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、複製制限ウイルスベクター（例えば、ｍｉＲ減弱ウイルスベクター）は、少なくとも１つのｌｅｔ−７の標的配列を含み、肺癌を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−１５ａ及び／または少なくとも１つのｍｉＲ−１６Ａの標的配列を含み、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２５ｂ、少なくとも１つのｍｉＲ−１４５、少なくとも１つのｍｉＲ−２１、及び／または少なくとも１つのｍｉＲ−１５５の標的配列を含み、乳癌を治療するために使用される。他の実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４３及び／または少なくとも１つのｍｉＲ−１４５の標的配列を含み、結腸直腸癌を治療するために使用される。ある特定の実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−１８１ａ、少なくとも１つのｍｉＲ−１８１ｂ、及び／または少なくとも１つのｍｉＲ−１８１ｃの標的配列を含み、膠芽腫を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−１９９ａ＊、少なくとも１つのｍｉＲ−１９５、少なくとも１つのｍｉＲ−１９９ａ、少なくとも１つのｍｉＲ−２００ａ、及び／または少なくとも１つのｍｉＲ−１２５ａの標的配列を含み、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）を治療するために使用される。
【０１３４】
特定の実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−４５１ａの標的配列、少なくとも１つのｍｉＲ−１４３−３ｐの標的配列、少なくとも１つのｍｉＲ−５５９の標的配列、及び少なくとも１つのｍｉＲ−１２４の標的配列を含み、膵臓癌、肺癌、及び／または結腸癌の治療に使用される。かかる実施形態では、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５５９、及びｍｉＲ−１２４の標的配列が、ウイルス複製に必要な２つ以上の遺伝子（例えば、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２７）に組み込まれる。さらなる特定の実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−４５１ａの標的配列、少なくとも１つのｍｉＲ−１４５−５ｐの標的配列、少なくとも１つのｍｉＲ−５５９の標的配列、及び少なくとも１つのｍｉＲ−１２４の標的配列を含み、本明細書に記載の任意のがん型の治療に使用される。かかる実施形態では、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−５５９、及びｍｉＲ−１２４の標的配列が、ウイルス複製に必要な２つ以上の遺伝子（例えば、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２７）に組み込まれる。さらなる特定の実施形態では、複製制限ウイルスベクターは、少なくとも１つのｍｉＲ−２０５ｐの標的配列、少なくとも１つのｍｉＲ−１４１−５ｐの標的配列、少なくとも１つのｍｉＲ−３１−５ｐの標的配列、及び少なくとも１つのｍｉＲ−１２４の標的配列を含み、神経鞘腫の治療に使用される。かかる実施形態では、ｍｉＲ−２０５ｐ、ｍｉＲ−１４１−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、及びｍｉＲ−１２４の標的配列が、ウイルス複製に必要な２つ以上の遺伝子（例えば、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２７）に組み込まれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｍｉＲ−４３２−５ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−１３６−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４８７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３７０−３ｐ、ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｍｉＲ−４３１−３ｐ、ｍｉＲ−４４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−７５８−３ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１１８０、ｍｉＲ−１２３６、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２８０、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３２０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−５７６−３ｐ、及び／またはｍｉＲ−９９ａの１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、膀胱癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２５１−５ｐ、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１９ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｍｉＲ−１２９−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２６４、ｍｉＲ−３９４３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−３８３−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２９−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−２−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−７１５８−３ｐ、ｍｉＲ−７７０−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３１８９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１−３ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５７７、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８７３、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ａ−１、ｍｉＲ−１８１ａ−２、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−５８４、ｍｉＲ−６２２、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、及び／またはｍｉＲ−３１８９−３ｐの１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、脳癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。ある特定の実施形態では、該脳癌は、星状細胞腫、膠芽腫、または神経膠腫である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５６８３、ｍｉＲ−３１９５、ｍｉＲ−３１８２、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−１３６−５ｐ、ｍｉＲ−５１４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−６０８０、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６１３０、ｍｉＲ−６０８９、ｍｉＲ−２０３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４２６６、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−５６９４、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８２６、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３００、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３３ｂ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−８７３、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９０−３ｐ、及び／またはｍｍｕ−ｍｉＲ−２９０−５ｐの１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、乳癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−８８６−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−２９ａ、及び／またはｍｉＲ−３７５の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、子宮頸癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６５５−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−４３２−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６２７、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４４８７、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９８、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−６２５、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−２０２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ、及び／またはｍｉＲ−４５１の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、結腸癌または結腸直腸癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−５４３、及び／またはｍｉＲ−３４ｂの１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、子宮内膜癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２２７８、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−２７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１３７、及び／またはｍｉＲ−１９７の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、血液癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。いくつかの実施形態では、該血液癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８２６、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｍｉＲ−５０９−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１０６ａ＊、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２８５、ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｍｉＲ−１２９１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３７７、及び／またはｍｉＲ−５０６の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、腎臓癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２３６、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２７１、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４４５８、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４５０ａ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０６、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｍｉＲ−６１０、ｍｉＲ−６１２、ｍｉＲ−６２５、ｍｉＲ−６３７、ｍｉＲ−６７５、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−８７７、ｍｉＲ−９４０、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１３２、及び／またはｍｉＲ−３１の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、肝臓癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。いくつかの実施形態では、該肝臓癌は、肝細胞癌である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２６６−３ｐ、ｍｉＲ−６１３０、ｍｉＲ−６０８０、ｍｉＲ−５１１−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１２９７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６９、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３３ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４５、ｍｉＲ−６１０、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６３０、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−７５１５、ｍｉＲ−９５００、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−１、ｍｉＲ−１８１ａ−２、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−４５００、ｍｉＲ−４７８２−３ｐ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５２６ｂ、ｍｉＲ−６２５＊、及び／またはｍｉＲ−９６の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、肺癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８０、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３３ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−５７３、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−９、及び／またはｍｉＲ−９８の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、黒色腫を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７１、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２２０ａ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０６、ｍｉＲ−６３２、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７７、及び／またはｍｉＲ−９の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、口腔癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９８、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−６５５、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３ａ、及び／またはｍｉＲ−７の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、卵巣癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４３２−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３６−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−１２９−２−３ｐ、ｍｉＲ−４５０７、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１１８１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０＊、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１６ａ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−６１５−５ｐ、ｍｉＲ−６３０、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１３２、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−４９４、及び／またはｍｉＲ−９８の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、膵臓癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２９６、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−１３３ａ−２、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−３０ｃ−２、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３７４ｂ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４７２３−５ｐ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−６２８−５ｐ、ｍｉＲ−６４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７６５、及び／またはｍｉＲ−９４０の１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、前立腺癌を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３６５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４８６−３ｐ、及び／またはｍｉＲ−５３２−５ｐの１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピーを、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されて含む。この腫瘍溶解性ウイルスは、網膜芽細胞腫を治療するための方法及び組成物に使用され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子は、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及びＵＳ１２からなる群から選択される。
【０１５２】
ペイロード分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ペイロード分子をコードする核酸配列を含む。本明細書で使用される、「ペイロード分子」とは、ウイルスの治療効果をさらに高めることが可能な分子を指す。本開示での使用に適したペイロード分子としては、抗原結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、双節型ペプチド、酵素、及び核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、アパタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、デコイオリゴヌクレオチド、またはアンタゴｍｉｒ）が挙げられる。ペイロード分子の性質は、疾患の種類及び所望の治療結果によって異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列が、ペイロード分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’または５’ＵＴＲに組み込まれる。かかる実施形態では、対応するｍｉＲＮＡが発現する細胞において、翻訳とそれに続くペイロードの発現が起こらないか、または実質的に低減される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列は、治療的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の３’及び／または５’ＵＴＲに挿入される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、内因性ｍｉＲＮＡ、遺伝子、または組織性メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）の発現を低減するもしくはその機能を阻害するペイロード分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。かかる組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書では、「ゲノム編集」または「微小環境リモデリング」ウイルスもしくはベクターと呼ばれる。コードされたタンパク質またはオリゴヌクレオチドは、タンパク質（例えば、ＴＩＭＰ）を分解（例えば、ユビキチン化及びプロテオソーム分解またはリソソーム分解の標的化による）の標的とすること、同族受容体との相互作用のブロッキング（例えば、抗体もしくその抗原結合断片またはペプチド阻害剤のブロッキング）、メッセンジャーＲＮＡ転写産物（例えば、低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡ）を分解すること、及び／または特定のｍｉＲＮＡ、遺伝子、またはタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列を変更すること（例えば、エンドヌクレアーゼによる）を含めたいくつもの方法で、ｍｉＲＮＡ、遺伝子、またはＴＩＭＰの発現を低減するもしくはその機能を阻害し得る。
【０１５４】
特定の実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、発がんまたは転移に関与するｍｉＲまたは遺伝子（例えば、発がん性ｍｉＲまたはがん遺伝子）の発現を低減する。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、発がん性ｍｉＲＮＡ（例えば、表４に記載のｍｉＲＮＡの１つ以上）であるｍｉＲＮＡの発現または機能を低減するペイロード分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、発がん性ｍｉＲＮＡの発現もしくは機能を低減するタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、複数の発がん性ｍｉＲＮＡの発現もしくは機能を低減する複数のタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１７−９２の発現を低減し、肺癌（例えば、小細胞肺癌）を治療するために使用される。他の実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２２１及び／またはｍｉＲ−２１の発現を低減し、膠芽腫を治療するために使用される。ある特定の実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５５及び／またはｍｉＲ−１７−９２の発現を低減し、リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、または慢性リンパ球性白血病）を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、及び／またはｍｉＲ−１４６の発現を低減し、甲状腺癌を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−３７２及び／またはｍｉＲ−３７３の発現を低減し、精巣癌（例えば、精巣生殖細胞腫瘍）を治療するために使用される。いくつかの実施形態では該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１８及び／またはｍｉＲ−２２４の発現を低減し、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）を治療するために使用される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換えウイルスベクターは、いくつかの態様では、ウイルスの拡散を増強する腫瘍の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解するペイロード分子をコードするポリヌクレオチドを含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、その活性に基づいて、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン及びマトリリシンに分類される亜鉛依存性プロテアーゼである。これらのプロテアーゼは、一般に酵素前駆体（チモーゲン）として分泌され、プロペプチドのプロドメインのタンパク質分解除去により活性化される。ＭＭＰががんで果たす主な役割は、腫瘍の浸潤及び転移を促進するＥＣＭの分解におけるものである。ＭＭＰはまた、腫瘍進行、上皮から間葉への変化（ＥＭＴ）、及び血管形成にも関与する。ＭＭＰは、ｍｉＲと同様ＴＩＭＰによっても調節され、これには４つのプロテアーゼ阻害剤のファミリー（ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、及びＴＩＭＰ４）が含まれる。本発明の組み換えウイルスベクターで該ＭＭＰファミリーを負に調節するｍｉＲＮＡまたはＴＩＭＰを妨害することによって、広範囲の腫瘍微小環境を分解することができる。ｍｉＲ／ＭＭＰ相互作用の例を表５に示す。これら相互作用の多くは、複数のＭＭＰが単一のｍｉＲＮＡで調節されることを示す。例えば、ｌｅｔ−７はＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１４を調節し、ｍｉＲ−１４３はＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３を調節し、ｍｉＲ−２１８はＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、及びＭＭＰ−９を調節する。さらに、ＭＭＰの大部分は、単一のＴＩＭＰマスタースイッチによって調節され得る。例えば、ＴＩＭＰ１は、既知のＭＭＰのほとんどを阻害し、また、広範な細胞型で細胞増殖を促進することも知られており、ＴＩＭＰ２は、ＭＭＰ−１４及びＭＭＰ−２と相互作用する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、特に腫瘍微小環境において、該細胞外マトリックスを変更することが可能なまたは該細胞外マトリックスを変更する経路を調節することが可能なｍｉＲＮＡ（例えば、表５に記載のｍｉＲＮＡの１つ以上）の発現もしくは機能を低減するタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される、微小環境リモデリングｍｉＲとは、ｍｉＲを指す。いくつかの実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、１つの微小環境リモデリングｍｉＲの発現または機能を低減する。いくつかの実施形態では、該タンパク質またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以上の微小環境リモデリングｍｉＲの発現または機能を低減する。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、複数の微小環境リモデリングｍｉＲの発現または機能を低減する複数のタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＭＭＰを負に制御するｍｉＲまたはＴＩＭＰの発現もしくは機能を、本発明の組み換えウイルスベクターによってノックダウンまたは妨害するために使用され得る。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３及びＴＩＭＰ４から選択されるＴＩＭＰの発現を低減する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、当該宿主細胞ゲノムにおける遺伝子の発現または機能を低減するタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、該遺伝子は、発がん遺伝子（例えば、表７に記載の遺伝子から選択される遺伝子）である。いくつかの態様では、該遺伝子は、発がん性ｍｉＲ（例えば、表４に記載のｍｉＲＮＡ）、微小環境リモデリングｍｉＲ（例えば、表５に記載のｍｉＲＮＡ）、またはＥＣＭ分解の負の制御因子（例えば、ＴＩＭＰ）をコードする。遺伝子発現及び／または機能の低下は、転写のレベルで（例えば、ゲノムＤＮＡ配列の変異、欠失、もしくはサイレンシング）または翻訳のレベルで（例えば、ｍＲＮＡの分解を介して遺伝子産物の産生を抑制することにより）達成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子配列の変異、欠失、または転写の抑制を可能にすることにより、遺伝子の発現または機能を低減するヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、該ヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される。非限定的な例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４から選択される。
【０１５８】
本発明の組み換えウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系を利用する場合があり、この系は、哺乳類のゲノム工学に利用することができる細菌系に基づく工学ヌクレアーゼ系である。一般に、該系は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。該ｇＲＮＡは、２つの部分、すなわち、標的ゲノムＤＮＡ配列に特異的なｃｒｉｓｐｒ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及びＣａｓ結合を促進するｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）からなる。該ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、別々のＲＮＡオリゴヌクレオチドとして存在する場合もあれば、同じＲＮＡオリゴヌクレオチドに存在する場合もあり、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。本明細書で使用される、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、個々のｔｒＲＮＡ及び個々のｃｒＲＮＡの組み合わせまたはｓｇＲＮＡのいずれかを指す。例えば、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−１１８３、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１、Ｄａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００５６３、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８（１１）：２２８１−２３０８、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２５０９７号、第ＷＯ２００８／０２１２０７号、第ＷＯ２０１０／０１１９６１号、第ＷＯ２０１０／０５４１０８号、第ＷＯ２０１０／０５４１５４号、第ＷＯ２０１２／０５４７２６号、第ＷＯ２０１２／１４９４７０号、第ＷＯ２０１２／１６４５６５号、第ＷＯ２０１３／０９８２４４号、第ＷＯ２０１３／１２６７９４号、第ＷＯ２０１３／１４１６８０号、及び第ＷＯ２０１３／１４２５７８号、米国特許公開第２０１０−００９３６１７号、第２０１３−００１１８２８号、第２０１０−０２５７６３８号、第２０１０−００７６０５７号、第２０１１−０２１７７３９号、第２０１１−０３００５３８号、第２０１３−０２８８２５１号、及び第２０１２−０２７７１２０号、ならびに米国特許第８，５４６，５５３号を参照されたい。
【０１５９】
タイプＩ及びタイプＩＩＩの系を含む複数のクラス１ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が特定され、機能的に詳細に特徴づけられており、そのエフェクター複合体の複合体構造及び動力学を明らかにしている（Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，２００８，Ｈａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｉｎｋｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｕｌｅｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。さらに、Ｃａｓ９ファミリーの同種ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼをエフェクターとして採用するいくつかのクラス２−タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系もまた特定及び実験的に特徴づけられている（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。第二の、推定上のクラス２−タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、いくつかの細菌ゲノムにおいて最近特定された。該推定上のタイプＶ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、Ｃｐｆ１（プレボテラ属及びフランシセラ属１由来のＣＲＩＳＰＲ）と呼ばれる巨大な約１，３００アミノ酸のタンパク質を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスはさらに、該ｍｉＲＮＡまたは該ＴＩＭＰを標的とするｔｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。場合によっては、ｔｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡをコードする該少なくとも１つのポリヌクレオチドは、該ウイルスゲノムの遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、合成インシュレーターまたは天然のウイルス（例えば、ＨＳＶ）インシュレーターを含むインシュレートされた配列である。ある特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、ＲＮＡ結合部位をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、内部リピートジョイント領域（二倍体遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ４７プロモーターの各１つのコピーを含む）、ＩＣＰ０、ＬＡＴ、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及びＵＳ１２を含む１つ以上の遺伝子座に、またはその間に挿入される。１つの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり、ＲＮＡ結合部位をコードする該少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＵＬ３とＵＬ４のオープンリーディングフレーム（例えば、図３９及び図４０）間の遺伝子座に挿入される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、抗腫瘍免疫応答を活性化または強化するペイロード分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該ペイロード分子は、サイトカイン、ケモカイン、抗体またはその抗原結合断片、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）である。例えば、いくつかの実施形態では、該ペイロード分子は、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１等）に結合し、それらを抑制する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、該ペイロード分子は、抗ＰＤ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤＬ１抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、該ペイロード分子は、細胞表面受容体に結合し、これを活性化するタンパク質である。例えば、いくつかの実施形態では、ペイロード分子は、内因性細胞表面リガンド、例えば、４１ＢＢＬの細胞外ドメイン、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン、ＦＬＴ３Ｌを含む。いくつかの実施形態では、該ペイロード分子は、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＴＧＦβ等）またはケモカイン（例えば、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１３、もしくはＸＣＬ１）である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、該ペイロード分子は、活性化受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、共刺激受容体等）に結合し、これを活性化するタンパク質である。特定の実施形態では、該タンパク質は、ＥｐＣＡＭ、葉酸、Ａ２Ａ、抗ＦＧＦ２、抗ＦＧＦＲ／ＦＧＦＲ２ｂ、抗ＳＥＭＡ４Ｄ、ＣＤ１３７、ＣＤ２００、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＳＦ−１Ｒ、エンドセリンＢ受容体、ＩＳＲＥ７、ＬＦＡ−１、ＮＧ２（ＳＰＥＧ４としても知られる）、ＳＭＡＤｓ、ＳＴＩＮＧ、及びＶＣＡＭ１から選択される。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ、遺伝子、またはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、組み換え腫瘍溶解性ウイルスのウイルスゲノムの遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、合成インシュレーターまたは天然のウイルス（例えば、ＨＳＶ）インシュレーターを含むインシュレートされた配列である。ある特定の実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、ＲＮＡ結合部位をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、内部リピートジョイント領域（二倍体遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ４７プロモーターの各１つのコピーを含む）、ＩＣＰ０、ＬＡＴ、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及びＵＳ１２を含めた１つ以上の遺伝子座に、またはその間に挿入される。１つの実施形態では、該ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり、該少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＵＬ３とＵＬ４のオープンリーディングフレーム間の遺伝子座に挿入される（例えば、図３９及び図４０参照）。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体を含む。プロテアーゼ活性化抗体、例えば、Ｍｅｔｚらによって記載されたもの（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２５（１０）：５７１−８０，  ２０１２）は、保護キャップのプロテアーゼ切断後に活性化され、標的にのみ結合する。ある場合には、腫瘍微小環境は、周囲の健康な組織と十分に区別されるたくさんのプロテアーゼを有する。例えば、プロテアーゼのカテプシンＢは、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、及び甲状腺癌を含めた多くのがんで過剰発現している。ヒト細胞が合成するプロテアーゼの完全なリストからなるヒトデグラドームは、少なくとも５６９のプロテアーゼで構成され、５つの広いクラス（最大数から最小数の順に）：メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、セリン、システイン、スレオニン、及びアスパラギン酸プロテアーゼに分類される（Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，７（１０）：８００−８，  ２００７）。とりわけ、ＭＭＰは、細胞の細胞外及び細胞周囲の領域に見られるため、ＭＭＰによって特異的に切断されるプロテアーゼ抗体は、本明細書に記載の組み換えウイルスベクターを腫瘍微小環境に標的化する優れた手段として機能し得る。表６は、がんで過剰発現するプロテアーゼをまとめたものであり、これを利用して、プロテアーゼ活性化抗体で偽型化された組み換えウイルスベクターの特異的結合を可能にすることができる。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、該プロテアーゼ活性化抗体は、ウイルスの糖タンパク質エンベロープに組み込まれる。プロテアーゼ活性化抗体は、本発明の組み換えウイルスベクター（例えば、ＨＳＶベクター）の糖タンパク質エンベロープに組み込まれ、治療指数を向上させ、オフターゲット感染を低減することができる。ＨＳＶベクターの場合、いくつかの実施形態では、該糖タンパク質は、ｇＣまたはｇＤであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、プロテアーゼ活性化抗体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化抗体は、システインカテプシン、アスパラギン酸カテプシン、カリクレイン（ｈＫ）、セリンプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ならびにディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）から選択されるプロテアーゼによって活性化される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、カテプシンＫ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、カテプシンＥ、カテプシンＤ、ｈＫ１、ＰＳＡ（ｈＫ３）、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＭＭＰ−２１、ＭＭＰ−２３Ａ、ＭＭＰ−２３Ｂ、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−２５、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−２７、ＭＭＰ−２８、または表６に記載のプロテアーゼから選択される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、該プロテアーゼ活性化抗体は、がん細胞またはがん微小環境で、非がん細胞または非がん細胞の微小環境よりも高度に発現されるタンパク質に結合する。ある特定の態様では、プロテアーゼ活性化抗体は、ＮＫＧ２Ｄ、ｃ−ｍｅｔ、ＨＧＦＲ、ＣＤ８、ヘパラン硫酸、ＶＳＰＧ４（ＮＧ２としても知られる）、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＬＣ−３、アネキシンＩＩ、ヒトトランスフェリン受容体、またはＥｐＣＡＭに結合する。ある特定の例では、複数のプロテアーゼ活性化抗体を単一のウイルスベクター粒子に組み込み、多様な腫瘍組織型を標的とすることができるようにしてもよい。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のプロテアーゼ活性化抗体をウイルスの糖タンパク質エンベロープに組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、該組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のプロテアーゼ活性化抗体をコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞によって、またはがん微小環境において、非がん細胞による、または非がん微小環境においてよりも高度に発現する第一のタンパク質に結合する第一のプロテアーゼ活性化抗体、及びがん細胞によって、またはがん微小環境において、非がん細胞による、または非がん微小環境においてよりも高度に発現する第二のタンパク質に結合する第二のプロテアーゼ活性化抗体を含む。さらなる実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞によって、またはがん微小環境において、非がん細胞による、または非がん微小環境においてよりも高度に発現する複数のタンパク質に結合する複数のプロテアーゼ活性化抗体を含む。腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であるプロテアーゼ活性化抗体を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、完全長免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、単一ドメイン抗体、または多重特異性抗体である抗体を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、以下のうちの１つ以上を含む：ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列、１つ以上のタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ただし、該たんぱく質またはオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ、遺伝子、またはＴＩＭＰの発現を低減するもしくはその機能を抑制するもの、少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体、及び／または少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体をコードするポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは以下を含む：非がん性細胞におけるウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピー、及び／または発がん性ｍｉＲＮＡもしくは発がん遺伝子の発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする第一のポリヌクレオチド、及び／または微小環境リモデリングｍｉＲＮＡまたはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは以下を含む：非がん性細胞におけるウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピー、及び／または発がん性ｍｉＲＮＡもしくは発がん遺伝子の発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体。さらなる実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、非がん性細胞におけるウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピー、及び／または微小環境リモデリングｍｉＲＮＡもしくはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質もしくはオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体を含む。１つの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、非がん性細胞におけるウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列の複数のコピー、及び／または発がん性ｍｉＲＮＡもしくは発がん遺伝子の発現を低減することを標的とするたんぱく質もしくはオリゴヌクレオチドをコードする第一のポリヌクレオチド、及び／または微小環境リモデリングｍｉＲＮＡもしくはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質もしくはオリゴヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチド、及び／または少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体を含む。いくつかの特定の実施形態では、本パラグラフに記載の腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、非がん性細胞におけるウイルス複製に必要なウイルス遺伝子は、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ガンマ−３４．５、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、及びＵＳ１２である。
【０１６９】
ある特定の態様では、本発明は、発がん性ｍｉＲＮＡまたは発がん遺伝子の発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする第一のポリヌクレオチド、及び微小環境リモデリングｍｉＲＮＡまたはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。他の実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、発がん性ｍｉＲＮＡまたは発がん遺伝子の発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及び少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体を含む。いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、微小環境リモデリングｍｉＲＮＡまたはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及び少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体を含む。１つの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、発がん性ｍｉＲＮＡもしくは発がん遺伝子の発現を低減することを標的とするタンパク質もしくはオリゴヌクレオチドをコードする第一のポリヌクレオチド、及び／または微小環境リモデリングｍｉＲＮＡもしくはＴＩＭＰの発現を低減することを標的とするタンパク質もしくはオリゴヌクレオチドをコードする第二のポリヌクレオチド、及び／または少なくとも１つのプロテアーゼ活性化抗体を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲに挿入された第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ１２８−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ２７の３’ＵＴＲに挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびにｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＵＬ８の３’ＵＴＲに挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＸＣＬ１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＦＬＴ−３Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及び４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、４１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８４３、８４４、８４７、または８４８の１つと、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８４３、８４４、８４７、または８４８の１つの核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲに挿入された第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ１２８−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ２７の３’ＵＴＲに挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＵＬ８の３’ＵＴＲに挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＸＣＬ１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＦＬＴ−３Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及び４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、４１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８４５または８４６と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８４５または８４６の１つの核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲに挿入された第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ１２８−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ２７の３’ＵＴＲに挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＵＬ８の３’ＵＴＲに挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびにｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、及びｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ３４．５の３’ＵＴＲに挿入された第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＸＣＬ１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＦＬＴ−３Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及び４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、４１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８５０と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８５０の核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲに挿入された第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ１２８−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ２７の３’ＵＴＲに挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＵＬ８の３’ＵＴＲに挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびにｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、及びｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ３４．５の３’ＵＴＲに挿入された第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＸＣＬ１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＦＬＴ−３Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及び４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、４１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８４９と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８４９の核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−１４３−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲに挿入された第一のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｍｉＲ１２８−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ２７の３’ＵＴＲに挿入された第二のｍｉＲ−ＴＳカセット、ｍｉＲ−１３７−３ｐ、ｍｉＲ−２１７−５ｐ、及びｍｉＲ−１２６−３ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＵＬ８の３’ＵＴＲに挿入された第三のｍｉＲ−ＴＳカセット、ならびにｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、及びｍｉＲ−２１９ａ−５ｐの各々に対して４つの標的配列を含む、ＩＣＰ３４．５の３’ＵＴＲに挿入された第四のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶウイルスである。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＣＸＣＬ１０及びＭＭＰ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＸＣＬ１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＦＬＴ−３Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及び４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、４１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスはさらに、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８５１と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号８５１の核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１７５】
本発明はまた、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸分子も包含する。
【０１７６】
組成物及び使用方法
本発明のある特定の態様は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含むストック及び組成物に関する。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含むウイルスストックに関する。いくつかの実施形態では、ウイルスストックは、同種ストックである。ウイルスストックの調製及び分析は当技術分野では周知である。例えば、ウイルスストックは、当該ウイルスベクターを形質導入された細胞を含むローラーボトルで製造することができる。該ウイルスストックを次いで連続したニコデンツの勾配で精製し、アリコートに分け、必要になるまで保存することができる。ウイルスストックは、力価がかなり異なり、それらを調製するのに使用されるウイルス遺伝子型及びそのプロトコルならびに細胞株に大きく依存する。
【０１７７】
特定の実施形態では、本明細書で企図されるウイルスストック（例えば、ＨＳＶ系ベクターのウイルスストック）の力価は、少なくとも約１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、例えば、少なくとも約１０６ｐｆｕまたはさらにいっそう好ましくは、少なくとも約１０７ｐｆｕである。ある特定の実施形態では、該力価は、少なくとも約１０８ｐｆｕ、または少なくとも約１０９ｐｆｕであり得るとともに、少なくとも約１０１０ｐｆｕまたは少なくとも約１０１１ｐｆｕの高力価のストックが最も好ましい。
【０１７８】
本発明はさらに、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは核酸分子及び医薬的に許容される担体を含む組成物を企図する。「医薬的に許容される」という表現は、対象（例えば、ヒト）に投与された際にアレルギーまたは同様の有害反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用される、「組成物」という用語は、対象及び／または細胞に投与もしくは送達することが可能な本明細書に記載の１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスまたは核酸分子の製剤を指す。通常、製剤には、それらの誘導体及び／またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体、または互変異性体を含めたすべての生理学的に許容される組成物と、任意の生理学的に許容される担体、希釈剤、及び／または賦形剤が含まれる。「治療用組成物」または「医薬組成物」（本明細書では同義で用いられる）は、特定の疾患または障害の治療に対して、患者及び／または対象及び／または細胞に投与もしくは送達することが可能な１つ以上の薬剤の組成物である。
【０１７９】
本明細書に開示する組成物は、中性または塩形態で製剤化され得る。「医薬的に許容される塩」には、酸付加塩及び塩基付加塩の両方が含まれる。医薬的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これは、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、及び有機酸、例えば、これらに限定されないが、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソグルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸等で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩も同様に、無機塩基から誘導することができ、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等である。有機塩基から誘導される塩には、これらに限定されないが、一級、二級、及び三級アミン、天然に存在する置換アミンを含めた置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩が挙げられる。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。製剤化後、溶液は、投与製剤に適合する方法で、治療有効量で投与される。該製剤は、注射液、薬物放出カプセル等の様々な剤形で容易に投与される。
【０１８０】
本明細書で使用される、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。かかる媒体及び薬剤の医薬活性物質への使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が該活性成分と適合しない場合を除き、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助的活性成分もまた該組成物に組み込まれ得る。
【０１８１】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体」としては、米国食品医薬品局によってヒト及び／または家畜での使用に許容されるものとして承認された医薬的に許容される細胞培養培地及び／または乳化剤を含めた生理学的に適合する任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存料、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な医薬的に許容される担体としては、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース、デンプン、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン、セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース、トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター、ワックス、動物性及び植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛、油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油、グリコール、例えば、プロピレングリコール、ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール、エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、寒天、緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で使用される任意の他の適合性物質が挙げられるがこれらに限定されない。任意の従来の媒体及び／または薬剤が本開示の薬剤と適合しない場合を除き、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助的活性成分もまた該組成物に組み込まれ得る。
【０１８２】
湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味剤及び香料、保存料及び酸化防止剤もまた該組成物中に含まれ得る。
【０１８３】
医薬的に許容される酸化防止剤の例としては：（１）水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、（２）油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等、（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。
【０１８４】
１つの実施形態では、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与に適している。医薬的に許容される担体には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液または分散液及び滅菌粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤がウイルスベクターまたは核酸分子と適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１８５】
本発明の組成物は、本明細書に記載の１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、感染細胞等を、単独で、または１つ以上の他の治療法と組み合わせて細胞または動物へ投与するための医薬的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化されて含み得る。必要に応じて、本発明の組成物は、他の薬剤とも同様に、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子または様々な医薬活性薬剤等と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。実質的には、当該追加の薬剤が、意図した治療を送達する当該組成物の能力に悪影響を与えない限り、該組成物に同様に含まれ得る他の成分に制限はない。
【０１８６】
本発明の医薬組成物において、医薬的に許容される賦形剤及び担体溶液の製剤は、本明細書に記載の特定の組成物を様々な治療計画で使用するために適切な投与及び治療計画の発展と同様、当業者には周知である。製剤化後、溶液は、該投与製剤に適合する方法でかつ当該症状の改善または治療をもたらす治療効果のある量で投与される。該製剤は、様々な剤形、例えば、摂取可能な溶液、薬物放出カプセル等で容易に投与される。治療中の当該対象の状態に応じて、投与にいくらかの変動が生じ得る。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定することができる。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤はＦＤＡの生物学的製剤評価研究センターの基準で要求される無菌性、一般的な安全性及び純度の基準を満たす。投与の経路は、当然ながら、治療される疾患の位置及び性質によって異なり、例えば、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、非経口、鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射、及び経口投与を含み得る。
【０１８７】
ある特定の状況では、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号、米国特許第５，６４１，５１５号及び米国特許第５，３９９，３６３号（各々が、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に記載のように、本明細書に開示する組成物、組み換えウイルスベクター、及び核酸分子は、非経口、静脈内、筋肉内に、または腹腔内にも送達することが望ましい。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての該活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合された水で調製され得る。分散液は同様に、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中で調製してもよい。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。
【０１８８】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液または分散液及び滅菌粉末が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）。すべての場合において、該形態は無菌であるべきであり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造及び保存条件下で安定であるべきであり、かつ、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用から保護されるべきである。該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び／または植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって促進され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。該注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの該組成物での使用によりもたらされ得る。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。典型的には、かかる組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製され、注射前の液体の溶液または懸濁液に適した固体形態もまた調製することができる。該製剤は乳化されてもよい。
【０１８９】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、必要に応じて該溶液を適切に緩衝化するべきであり、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで当該液体希釈剤を等張にするべきである。これら特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適する。これに関連して、採用され得る滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には分かるであろう。例えば、１回の投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液に添加されるか、予定注入部位に注入され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００参照）。投与量のいくらかの変動は、治療中の対象の状態に応じて必然的に生じる。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤はＦＤＡの生物学的製剤事務局の基準で要求される無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性及び純度の基準を満たすべきである。
【０１９０】
滅菌注射用溶液は、必要量の該活性化合物を、必要に応じて上に列挙した様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することで調製することができる。一般に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒及び上に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、該活性成分の粉末に加えて、任意のさらなる所望の成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、該組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び／または他のエアロゾル送達媒体によって送達され得る。鼻腔用エアロゾルスプレーを介して肺にポリヌクレオチド及びペプチド組成物を直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号及び米国特許第５，８０４，２１２号（各々が、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）及びリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる）を使用した薬物の送達も、製薬分野では周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、該送達は、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞を、任意にＣＰＰポリペプチドと混合して使用すること等により行われ得る。特に、本発明の組成物は、送達用に脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子等のいずれかにカプセル化して製剤化され得る。かかる送達媒体の製剤化及び使用は、既知の従来の技術を使用して行うことができる。本発明の製剤及び組成物は、本明細書に記載の１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び小分子を、単独で、または１つ以上の他の治療法と組み合わせて細胞または動物へ投与するための医薬的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培地）中に製剤化されて含み得る。必要に応じて、本発明の組成物は、他の薬剤とも同様に、例えば、細胞、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは様々な医薬活性薬剤等と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。
【０１９３】
特定の実施形態では、本発明の製剤または組成物は、本明細書で企図される様々なポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの組み合わせと接触させた細胞を含む。
【０１９４】
ある特定の態様では、本発明は、ウイルスベクター系の送達に適した製剤または組成物を提供する。
【０１９５】
エキソビボ送達用の例示的な製剤は、当技術分野で既知の様々なトランスフェクション剤、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック及び様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介トランスフェクション）の使用も含み得る。リポソームは、水性流体の画分を封入する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外表面に自発的に結合し（その電荷により）、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態は、他の製剤、例えば、製薬分野で周知のもの、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００に記載の他の製剤を含んでもよい。
【０１９７】
ある特定の態様では、本発明は、１つ以上の医薬的に許容される担体（添加剤）及び／または希釈剤（例えば、医薬的に許容される細胞培養培地）とともに製剤化される、本明細書に記載の１つ以上のウイルスベクターまたはポリヌクレオチドの治療有効量を含む医薬的に許容される組成物を提供する。本明細書で使用される、「治療有効量」とは、所望の生理学的及び／または生物学的結果を達成するために必要な本明細書に記載の組成物または組み換えウイルスの量を指す。ウイルス、ウイルスストック、または組成物の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに該個体において幹細胞及び前駆細胞が所望の応答を誘発する能力等の要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、該ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の、どんな毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果が上回るものでもある。「治療有効量」という用語には、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量が含まれる。治療有効量は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）（例えば、少なくとも１ｅ１〜少なくとも１ｅ２０、具体的には、約１ｅ４〜約１ｅ１５、より具体的には、約１ｅ６〜約１ｅ１２ｐｆｕ）の合計数、またはウイルスゲノム数（例えば、少なくとも１ｅ１〜少なくとも１ｅ２０、具体的には、約１ｅ４〜約１ｅ１５、より具体的には、約１ｅ６〜約１ｅ１２個のウイルスゲノム）によって定量化され得る。当業者には、投与されるウイルスの種類、当該製剤の性質、投与経路、治療される疾患の性質及び／または重症度、及び／または当該対象の全身状態及び健全性に基づいて該治療有効量が変化することが理解されよう。
【０１９８】
本発明のいくつかの態様は、がん性細胞の殺傷方法を包含し、これは、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物に、当該がん性細胞を、当該がん性細胞内で該腫瘍溶解性ウイルスが感染及び複製するのに十分な条件下曝露することを含み、該がん性細胞内での該腫瘍溶解性ウイルスの複製が細胞死をもたらす。ある特定の実施形態では、該がん性細胞は、非がん性細胞と比較してｍｉＲの発現が低下している。いくつかの実施形態では、本方法で殺傷されるがん性細胞はインビボである。ある特定の実施形態では、本方法で殺傷されるがん性細胞は腫瘍内にある。
【０１９９】
本発明は、がんの治療を必要とする対象におけるがんの治療方法に関し、これは、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスストック、または組成物の予防有効量または治療有効量を該対象に投与することを含む。本明細書で使用される、「対象」には、本明細書に開示する組み換えウイルスベクター、組成物、及び方法で治療することができる疾患、障害、または状態の症状を示す任意の動物が含まれる。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット等）、家畜（ウマまたはウシ等）、及び飼いならされた動物またはペット（ネコまたはイヌ等）が挙げられる。非ヒト霊長類及び、好ましくは、ヒト患者が含まれる。
【０２００】
「投与」とは、本明細書では、腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスストック、もしくはその組成物を対象に導入すること、または腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスストック、もしくはその組成物と細胞及び／または組織を接触させることを指す。投与は、注入、潅注、吸入、飲食、電気浸透、血液透析、イオン導入、及び当技術分野で既知の他の方法によって行われ得る。投与経路は、当然ながら、治療される疾患の位置及び性質によって異なり、例えば、耳介、頬側、結膜、皮膚、歯、頸管内、洞内、気管内、経腸、硬膜外、間質、関節内、動脈内、腹腔内、耳介内、胆管内、気管支内、嚢内、空洞内、脳内、槽内、角膜内、頭蓋内、歯冠内、冠動脈内、頭蓋内、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、十二指腸内、硬膜内、心外膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、肝内、回腸内、病巣内、舌内（ｉｎｔｒａｌｉｎｇｕａｌ）、腔内、リンパ内、乳腺内、骨髄内、髄膜内、筋肉内、鼻腔内、結節内、眼内、網内、卵巣内、腹腔内、心膜内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、ルーメン内、洞内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、気管内、包膜内、胸腔内、管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、腹腔内、血管内、脳室内、膀胱内、前庭内、静脈内、硝子体内、喉頭部、鼻、鼻腔胃、経口、眼、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、呼吸器、管系組織後、直腸、脊髄、くも膜下、結膜下、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、歯肉下、舌下、粘膜下、網膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経心内膜、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓膜、尿管、尿道、及び／または膣かん流、洗浄、直接注射、ならびに経口投与を含み得る。
【０２０１】
本明細書で使用される、「治療すること」及び「治療」という用語は、対象が疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状を改善するように、本明細書に記載の組み換えウイルスまたはその組成物の治療有効量を対象に投与することを指す。該改善は、該疾患もしくは状態、または該疾患もしくは状態の症状の任意の改善または治療である。該改善は、目に見えるまたは測定可能な改善であるか、または当該対象の全身的な健全性の感覚の改善の場合もある。従って、当業者には、治療は病状を改善する場合があるが、疾患の完治ではない場合もあることが理解される。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するのに有効なウイルス、ウイルスストック、または組成物の量を指す。本明細書で使用される、「予防」は、疾患の症状の完全な防止、疾患の症状の発現の遅延、または後に発現する病徴の重症度の緩和を意味することができる。通常、必ずしもではないが、予防用量は疾患の初期段階の前、または初期段階に対象に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
【０２０２】
本明細書において、「がん」は、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類の生理学的状態を指すか、または説明する。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫（脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、髄膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病またはリンパ系腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。かかるがんのより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含めた肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）もしくは胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）もしくは腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫、及び他の癌腫、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ＨＳＶ）、ウイルスストック、または組成物は、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ））、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、膠芽腫、黒色腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択されるがんの治療に使用される。
【０２０４】
ある特定の態様では、本発明は、本明細書に開示する図面または実施形態のいずれか１つに示す腫瘍溶解性ウイルスベクターに関する。
【実施例】
【０２０５】
本発明の様々な実施形態を説明する目的のための以下の実施例は、本発明をいかなる形でも限定することを意図しない。本実施例は、本明細書に記載の方法と併せ、例示的なものであり、本発明の範囲の限定を意図しない。特許請求の範囲が定義する本発明の趣旨に含まれる記載された実施形態に対する変更、修正、及び他の変更は、明確に企図される。
【０２０６】
実施例１−正常及び悪性細胞のｍｉＲ配列分析
差次的ｍｉＲ発現は、多くのがんの特質である（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５）。８種の異なるがん細胞株で主に高度に差次的に発現するｍｉＲを特定するために実験を行った。差次的発現は、非がん性対照組織との比較により特定した。合計で１０８個のサンプルをシーケンシングした。サンプルの詳細を表１１に示す。
【表１１】
2020532951.tif 000005
【０２０７】
選定した細胞型におけるＨＳＶ減弱向けに適切なｍｉＲＮＡの標的配列の特定を容易にするため、がん株及び非がん対照組織のｍｉＲＮＡ配列プロファイリングを行った。ダイサーでプロセシングされたＲＮＡのシーケンシングライブラリを、膀胱、結腸、乳房、膵臓、肺、頭頸部、神経鞘腫、膠芽腫、脳、肝臓、及び骨髄を含めたがん及び非がん細胞について生成した。これらのｍｉＲＮＡシーケンシングライブラリをＲＮＡ全体に対して正規化し、ＨｉＳｅｑ  ２５００超ハイスループットスクリーニングシステムとＨｉＳｅｑ  Ｖ４化学試薬を使用し、シーケンシングリード最大３ｅ８リード／ラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。シーケンシングランからのＦＡＳＴＱファイルをＢａｓｅｓｐａｃｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にてｍｉＲＮＡ分析ツールを使用して分析した。ランキングは、正常の平均、がんの平均を計算し、正常／がんの比を高いものから低いものにソートすることで行った。ヒートマップは、ゼロと負の値をゼロに換算した自然対数値で生成した（スケール：黒は高発現であり、白は低発現である）。サンプルにわたる正規化データを所与のサンプルで正規化ｍｉＲＮＡリードカウントとして表現した。正規化は、比較において他のサンプルに対する所与のサンプルのリード数の合計に関連する。
【０２０８】
図１は、２５種のｍｉＲＮＡの非がん性及びがん性脳組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップの実例を示す。ｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップのさらなる例を、各例において２５種のｍｉＲＮＡに対応する非がん性及びがん性膀胱（図２）、乳房（図３）、結腸（図４）、脳（図５）、頭頸部（図６）、肺（図７）、膵臓（図８）、及び神経鞘腫（図９）組織に関して示す。表１２は、がん性及び非がん性組織間の特定のｍｉＲの発現レベルの概要を示す。示されるように、ｍｉＲ−４５１ａのレベルは、すべての腫瘍型において非がん性組織と比較して下方制御されており、潜在的な汎腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡを表している。ｍｉＲ−１−３ｐは、調べたすべての腫瘍型で下方制御され、非がん性組織では中程度のレベルで存在し、頭頸部組織では高レベルで存在する。ｍｉＲ−５５９は、調べたすべての腫瘍型で下方制御され、非がん性組織では一般に低レベルで存在し、非がん性肺組織では高レベルで存在する。ｍｉＲ−１４５−５ｐは、調べたすべての腫瘍型で下方制御され、調べた非がん性組織の大部分に一般に高レベルで存在する。ｍｉＲ−１４３−３ｐは、結腸、肺、及び膵臓腫瘍で下方制御され、すべての正常な組織型及び一部の乳房の腫瘍株に高レベルで存在する。ｍｉＲＮＡのデータ分析で、少なくとも１１種のｍｉＲＮＡが、これまでに文献で特定されていない新規かつ予想外のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを表すことが明らかになった。
【表１２】
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【０２０９】
これらの特定されたｍｉＲＮＡの多くは、汎または多腫瘍特異的である。例えば、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、及びｍｉＲ１４３−３ｐの発現は、調べたすべてのがん細胞株にわたり、対照組織と比較して一般に下方制御された。このことは、特にｍｉＲ−４５１ａで顕著であり、これはすべての正常組織型で高度に発現され、すべてのがん型で実質的に下方制御され、ひいては汎特異的腫瘍抑制ｍｉＲＮＡを表している。ｍｉＲ−５５９の発現は、正常肺組織以外の正常組織型で低く、ｍｉＲ−１−３ｐ及びｍｉｒ−１４５−３ｐの正常組織における発現は可変であった。差の大きさ及び絶対発現レベルの変動性にもかかわらず、がん細胞株における各ｍｉＲの発現の平均は、対応する正常組織のレベルと比較して実質的に低かった。これらのｍｉＲＮＡは、様々ながん型を広く治療することが可能な汎腫瘍ＨＳＶビリオンを生成するための候補である。ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、及びｍｉＲ１４３−３ｐに関する平均発現ががん細胞株で正常対照と比較して低いものの、発現の減少は、全がん細胞株に十分に浸透していなかった。例えば、調べた正常膀胱サンプルの２／３は、ｍｉＲ−１４５−３ｐの発現の増加を示した一方で、残りのサンプルでの発現は、これらがん細胞株で認められた平均と実質的に同様であった。同様の結果が乳癌細胞株で認められた。全乳癌サンプルの平均リードカウントは１０６であったが、５／１２のサンプルは正規化リードカウントが＞１０００カウントであり、そのうちの２つが＞４０，０００カウントであった。
【０２１０】
これらのデータは、広範囲の腫瘍型を標的とすることが可能な単一のｍｉＲ減弱腫瘍溶解性ウイルスを生成する可能性を示す。例えば、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−１、及びｍｉＲ−１４５−３ｐの標的配列を含む構築物は、調べたすべての腫瘍型（例えば、膀胱、結腸、乳房、膵臓、肺、頭頸部、神経鞘腫、膠芽腫）の治療に使用され得る。異なるがん型におけるｍｉＲの発現レベルの変動性は、ｍｉＲの発現によって、またはさらなるバイオマーカーの使用を介して患者を階層化する潜在的な必要性を示す。
【０２１１】
がん性及び非がん性組織間のさらなるｍｉＲＮＡプロファイリングを、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇの定量的発現アッセイを使用して行った。これらの実験の結果を脳サンプルに関して示す（図５０）。この結果は、上記で概説した以前の研究ではこれまでに特定されなかったがん性及び非がん性脳組織で差次的発現を示すさらなるｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１２９−２−３ｐ、及びｍｉＲ−４８７ｂ−３ｐの特定を示している。さらなる結果を心臓サンプルに関して示しており（図５１）、ｍｉＲ−２０８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ−３ｐ、ｍｉＲ１３３−３ｐ、ｍｉＲ−４２８４、及びｍｉＲ−４９９ａ−５ｐの差次的発現をがん性及び非がん性心臓組織間で示す。さらなる結果を末梢神経系サンプルに関して示し（図５２Ａ〜Ｂ）、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−５７４−３ｐの差次的発現を示している。特に、ｍｉＲ−２１９ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−９−５、ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−２０４−５ｐは脊髄で差次的に発現される。
【０２１２】
実施例２−ｍｉＲ−Ｔ減弱に関するウイルス遺伝子の特定
減弱表現型ＨＳＶ遺伝子を調べるため、ｓｉＲＮＡスクリーニングを行った。ｓｉＲＮＡスクリーニングは、前初期遺伝子のＲＩＳＣ減弱表現型を調べ、初期遺伝子を選択するための理想的な方法である。ＨＳＶ遺伝子ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ０、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＩＣＰ８、ＵＬＣ３９／４０、ＩＣＰ２２、ＵＬ３０、ＵＬ４２、及びＶＰ１９を標的とするｓｉＲＮＡを個別に、及びプールでＡ２５３細胞にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後、細胞に、各々がＧＦＰカセットを含むＯＮＣＲ−００３またはＯＮＣＲ−０１０（下記表１３に記載）を感染させた。ウイルスの拡散を、感染の４８時間後にＧＦＰ強度を定量化することで測定した。潜在的なヒットとして特定したＨＳＶ遺伝子をウェスタンブロット、ウイルス価測定、及びＲＴ−ＰＣＲで確認した。
【０２１３】
これらのスクリーニングの結果を図４７Ａ及び４７Ｂに示す。対応するＨＳＶ遺伝子の＞７５％ノックダウンを媒介する個々のｓｉＲＮＡを図４７Ａにおいて矢印で示し、選定したｓｉＲＮＡのサブセットのＧＦＰ強度を図４７Ｂに示す。図４８に示すように、ＩＣＰ４、ＵＬ５、ＵＬ８、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、及びＵＬ３０のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＧＦＰ強度の低下が示す通り、ＯＮＣＲ−００３のウイルス複製を実質的に低減した。さらに、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ３０のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＧＦＰ強度の低下が示す通り、ＯＮＣＲ−０１０のウイルス複製を実質的に低減した。ＯＮＣＲ−０１０が感染した細胞をさらに、ウェスタンブロットで特定のウイルスタンパク質の発現について分析した。図４９に示すように、これらＨＳＶ遺伝子の有意な減少がタンパク質レベルでも認められた。
【０２１４】
実施例３−ｍｉＲＮＡベースの遺伝子減弱を迅速にアッセイするためのレポーター系の構築及び使用
ｍｉＲＮＡベースの遺伝子減弱を実質的に任意のｍｉＲＮＡの標的配列及び同種ｍｉＲＮＡを用いて評価するためにレポーター系を開発した。この系（図１０に示す）では、ｍｉＲＮＡ（すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２）が認識する標的配列を、不安定化緑色蛍光タンパク質（ｄｓＧＦＰ）の３’ＵＴＲに挿入した。同種ｍｉＲＮＡを次いでｍＣｈｅｒｒｙをｍｉＲＮＡ発現の対照として使用し、テトラサイクリン（ｔｅｔ）誘導性プロモーターを介して発現させた。すべての発現ベクターを、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＴＦ００２）も発現するｔｅｔ抑制ベクターｐｃＤＮＡ５  Ｆｒｔ／Ｔｏにクローニングした。ヒトゲノムＤＮＡからの遺伝子合成によって生成された発現用のすべてのｍｉＲＮＡをｐＴＦ００２にクローニングした。減弱レポーターベクターを生成するため、ｄｓＧＦＰをｃＤＮＡ３．１＋にクローニングし、ベクターｐＴＦ００４を生成した。減弱ベクターは、８〜１６ヌクレオチドで区切られた目的のｍｉＲＮＡ配列の逆相補体の４つのタンデムリピートを含む。プラスミドは、ｐＴＦ００４のｄｓＧＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲに、標準的な分子生物学技術を使用して、合成的に生成されたオリゴヌクレオチドを挿入して構築した。１日目に、ＨＥＫ２９３ＴｅｔＲ細胞に、ｍｉＲＮＡ減弱及びレポーター発現プラスミド（各０．１５μｇ、合計０．３μｇのＣＭＶプロモーター含有プラスミド）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で使用してトランスフェクトした。２日目に、細胞を５ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンで処理し、最大７２時間インキュベートした。インキュベート後、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光シグナルを毎日ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ｘ  Ｍｉｎｉｍａｘマルチモードミクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して検出し、Ｓｏｆｔｍａｘ  ＰｒｏまたはＭｅｔａｍｏｒｐｈイメージングソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。位相画像を５〜６ミリ秒の露光で取得した。蛍光画像は、ＧＦＰ（５４１ｎｍチャンネル）露光１０ミリ秒、及びｍＣｈｅｒｒｙ（７１３ｎｍチャンネル）２００〜１５００ミリ秒で取得した。
【０２１５】
図１１は、ｍｉＲ−１２２の発現のｔｅｔを介した誘導後２４時間でのＧＦＰ発現のｍｉＲ−１２２媒介減弱を示す。対照のｍｉＲＮＡ模倣体、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、及びＬｅｔ７ａは、ＧＦＰのレベルを減弱せず、ｔｅｔがない場合もＧＦＰの減弱は認められない。図１２は、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、及びＬｅｔ７ａ模倣体が、各ｍｉＲの標的配列を個別に、及びｍｉＲ−１２２／Ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ−１２２／Ｌｅｔ７ａ／ｍｉＲ−３４ａ、またはｍｉＲ−１２２／Ｌｅｔ７ａ／ｍｉＲ−１８４のカセットの組み合わせで含むｍｉＲ−ＴＳカセットを備えたＧＦＰカセットの減弱に与える影響を示す。ＧＦＰの減少は、適切なｍｉＲと同種標的配列が一緒に存在する場合にのみ認められる（丸で囲んだウェル）。図１３は、非減弱対照としての役割を果たし、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−３４ａ、及びＬｅｔ７ａ模倣体の発現の尺度としてのｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す。図１４は、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９、及びｍｉＲ−４５１模倣体発現が、各ｍｉＲの標的配列を個別に含むｍｉＲ−ＴＳカセットを備えた減弱されたＧＦＰカセットに与える影響を示す（丸で囲んだウェル）。非減弱対照を図１５に示し、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９９、及びｍｉＲ−４５１の発現ならびにｍＣｈｅｒｒｙの発現を、各標的配列を個別に使用して示す。
【０２１６】
さらなる組み合わせのｍｉＲの標的配列が同種ｍｉＲ模倣体の存在下でＧＦＰの発現を減弱する能力を図１６〜図２６に示す。各図において、ＧＦＰの蛍光は、トランスフェクションの７２時間後に測定する。各例において、表示されたｍｉＲの標的配列の挿入により、同種ｍｉＲもまた発現である場合にＧＦＰ発現が減弱した。ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１８４の標的配列（図１６）、ｍｉＲ−３４ａ及びｍｉＲ−１８４の標的配列（図１７）、Ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１８４の標的配列（図１８）、ｍｉＲ−１２４及びｍｉＲ−１８４の標的配列（図１９）、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−１８４の標的配列（図２０）、ｍｉＲ−１９９及びｍｉＲ−４５１の標的配列（図２１）、ｍｉＲ−１２５及びｍｉＲ−４５１の標的配列（図２２）、ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−４５１の標的配列（図２３）、ｍｉＲ−１２７及びｍｉＲ−４５１の標的配列（図２４）、ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−４５１の標的配列（図２５）、ならびにｍｉＲ−２２３及びｍｉＲ−４５１の標的配列（図２６）の挿入の影響を各々示す。
【０２１７】
従って、これらのデータは、ｍｉＲの発現が同種ｍｉＲの標的配列を発現する遺伝子の特異的減弱をもたらし得ることを示す。
【０２１８】
実施例４−ｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶの生成
ｍｉＲＮＡの標的配列及び同種ｍｉＲＮＡ対のレポーター遺伝子ベースの検証後、ｍｉＲ−ＴＳカセットを含むＨＳＶベースのウイルスを生成した。一連の修飾をＫＯＳ−３７  ＢＡＣ、すなわち、記載の通り細菌人工染色体（ＢＡＣ）上のＨＳＶ−１のＫＯＳ株の完全長ゲノムクローン（Ｍａｚｚａｃｕｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２０１５）で行った。その生成物ＫＧＢＡＣは、二倍体遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ、及びＩＣＰ４と、ＩＣＰ４７遺伝子のプロモーターの各１つのコピーを含む内部リピート（ジョイント）領域を欠失した。この欠失により、これら４つの欠失遺伝子の残りのコピーの操作が容易になり、このウイルスの腫瘍溶解活性を高める導入遺伝子の潜在的組み込みのための豊富なスペースを提供し、神経毒性因子ＩＣＰ３４．５の発現の低減により腫瘍特異性を高め、ＩＣＰ４７発現の除去は、ウイルス特異的Ｔ細胞による感染がん細胞の免疫認識に役立つ。ＫＧＢＡＣはまた、ＧＦＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）ＯＲＦに２Ａペプチド配列を介して融合して含み、後期（複製後）ウイルス遺伝子発現の観察を可能にする。最後に、ＫＧＢＡＣは、非標準受容体を介したＨＳＶの侵入を高めることが分かっているｇＢ遺伝子に変異の対を含む（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１３０７４９号参照）。ｍｉＲ−１２４−３ｐの標的配列の４つのリピートを含むｍｉＲ−ＴＳカセットを、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲに組み換え、２Ａ５Ｂベクターを生成し（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０６６０４２号参照）、ＭＭＰ９の発現カセットをＵＬ３及びＵＬ４遺伝子間の遺伝子間領域に挿入して、２Ａ５Ｂ−ＭＭＰ９ベクターを生成した（ＯＮＣＲ−００３）。ＯＮＣＲ−００３のＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＵＬ８、ＵＬ４２、及び／またはＩＣＰ３４．５遺伝子の３’ＵＴＲにさらなるｍｉＲＮＡの標的配列カセットを組み換え、以下の表１３に示す構築物を生成した。すべてのＢＡＣ構築物を、Ｖｅｒｏ−Ｃｒｅ細胞のトランスフェクションによりｌｏｘＰ部位間に位置するＢＡＣ配列を同時に除去してウイルス粒子に変換した。プラーク精製後、ウイルスストックを調製し、Ｖｅｒｏ細胞で力価を測定した。
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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＃ｍｉＲ−４５１ａは、Ａｇｏ２により非標準的にプロセシングされ、−３ｐ及び−５ｐアームを有さない
【０２１９】
実施例５−ｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶ粒子を使用したウイルス感染性アッセイ
正常及びがん性細胞におけるウイルスの感染性及び複製をアッセイするため、ｍｉＲＮＡ減弱ＨＳＶ粒子を以下のインビトロアッセイで調べた。１日目、各感染細胞型に、ＨＳＶ粒子を導入し、感染多重度（ｍｏｉ）０．０１を達成した。２日目から５日目に、ウイルス感染性をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ｘ  Ｍｉｎｉｍａｘマルチモードミクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用したＧＦＰ検出によりアッセイし、Ｓｏｆｔｍａｘ  ＰｒｏまたはＭｅｔａｍｏｒｐｈイメージングソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。位相画像を５〜６ミリ秒の露光で取得した。蛍光画像は、ＧＦＰ（５４１ｎｍチャンネル）露光１０ミリ秒、及びｍＣｈｅｒｒｙ（７１３ｎｍチャンネル）露光２００〜１５００ミリ秒で取得し、任意の潜在的な非特異的自己蛍光シグナルを評価した。
【０２２０】
ＯＮＣＲ−０１１の複製は、図２７Ａ（ＧＦＰ陽性細胞定量による読み出し）及び図２７Ｃ（定量的ＰＣＲによる読み出し）に示すように、ＩＣＰ２７遺伝子でのｍｉＲ−Ｔ１２５カセットの存在及びこれら細胞でのｍｉＲ−１２５ａの高レベル（３０００カウント、下記表１４）のため、有糸分裂後の肺組織で有意に減弱した。ＯＮＣＲ−０１１及びその対照ウイルス、ＯＮＣＲ−００３はＩＣＰ４遺伝子にｍｉＲ−１２４の標的配列を含むが、ｍｉＲ−１２４は、ウイルス複製を減弱するには不十分な低レベル（＜１００カウント、下記表１４）で存在する（図２７Ｂ及び図２７Ｄ）。ＯＮＣＲ−０１１及びＯＮＣＲ−００３は両方とも、頭頸部癌細胞（Ａ２５３）で自由に複製した。これは、これらの細胞がｍｉＲ−１２５ａとｍｉＲ−１２４の両方を低レベルで含む（＜１００カウント）ためである（表１４）。
【表１４】
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【０２２１】
図２８は、ｍｉＲ−１４５減弱構築物、ＯＮＣＲ−０１３のＨＣＣ１３９５及びＡ２５３細胞での複製を示す。図２８Ａ（ＧＦＰ陽性細胞定量による読み出し）及び図２８Ｂ（定量的ＰＣＲによる読み出し）に示すように、ＯＮＣＲ−０１３の複製は、ＨＣＣ１３９５細胞では有意に減弱したが、Ａ２５３細胞では、Ａ２５３でのｍｉＲ−１４５の高発現及びＨＣＣ１３９５細胞での発現がないことのために減弱しなかった（表１５）。
【表１５】
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【０２２２】
図２９は、正常ＢＥＡＳ−２Ｂ肺細胞におけるｍｉＲ−１４３−３ｐ減弱構築物（ＯＮＣＲ−０１２）及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ減弱構築物（ＯＮＣＲ−０１４）の減弱を示す。示されるように、ＯＮＣＲ−０１４の複製は、非がん性肺組織で有意に減弱され（図２９Ａ、ＧＦＰ陽性細胞定量による読み出し、及び図２９Ｂ、定量的ＰＣＲによる読み出し）、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの標的配列が、正常肺細胞でウイルス複製を減弱することができることを示す。
【０２２３】
実施例６−複数の遺伝子座に複数のｍｉＲＮＡの標的配列を含むｏＨＳＶの複製の減弱
複数の遺伝子座にｍｉＲ−ＴＳカセットを含む構築物のウイルス感染性及び複製を、Ａ２５３、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＨｕｈ７細胞で評価した。ＯＮＣＲ−０３６、ＯＮＣＲ−０６３、ＯＮＣＲ−０９３、ＯＮＣＲ−０９４、ＯＮＣＲ−０９５、及びＯＮＣＲ−０９６のｍｉＲ減弱ＨＳＶ構築物の結果を本明細書に提供する。これらウイルスの各々は、１つ以上のｍｉＲ−１２４の標的配列、１つ以上のｍｉＲ−１２２の標的配列、及び／または１つ以上のｍｉＲ−１２５ａの標的配列をＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及び／またはＵＬ４２の遺伝子座に挿入されて含んでいた。ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５ａの各細胞株における発現をＴａｑＭａｎアッセイで評価した。簡潔には、低分子ＲＮＡ画分を含めた全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙカラムで増殖細胞から単離した。このＲＮＡを次いでｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５特異的ＴａｑＭａｎアッセイの基質として使用し、Ｕ６  ｓｎＲＮＡに対する並行ＴａｑＭａｎアッセイを行い、ΔΔＣＴ法により、細胞型ごとの発現レベルを正規化した。これらのデータは、各アッセイで対象の最低細胞株に対する倍数変化として表されている（Ａ２５３細胞、図３０Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、図３０Ｂ）。示されるように、Ａ２５３細胞は、ｍｉＲ−１２２もｍｉＲ−１２５ａも発現しない。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、高レベルのｍｉＲ−１２５と低レベルのｍｉＲ−１２２を発現し、Ｈｕｈ７細胞は、ｍｉＲ−１２５aと高レベルのｍｉＲ−１２２を発現する。
【０２２４】
ウイルスの感染性及び複製をインビトロアッセイにて評価した。簡潔には、細胞を４８ウェルのディッシュに４５，０００細胞／ウェルで播種し、一夜培養した。１日目に、ＨＳＶ粒子を各細胞型に導入し、感染多重度（ｍｏｉ）０．０１を達成した。感染の４８時間後、ウイルス感染性を蛍光顕微鏡で評価した。本実験の結果を図３０Ｃに示し、ウイルス複製をｅＧＦＰレベルで示す。これらのデータは、ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５ａを両方とも中間〜高いレベルで発現する細胞（Ｈｕｈ７細胞）におけるウイルス複製の減弱が、同種ｍｉＲのうち１種のみを発現する細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、高レベルのｍｉＲ−１２５ａを発現する）で認められた減弱と比較して、または同種ｍｉＲのいずれも発現しない細胞（Ａ２５３細胞、ｍｉＲ−１２５ａもｍｉＲ−１２２も発現しない）と比較して向上したことを示している。
【０２２５】
ウイルス拡散及びタンパク質発現も評価した。簡潔には、細胞溶解物を感染の７２時間後に採取し、ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析に供した。抗ＨＳＶ１カプシド（ＶＰ５）抗体を使用してウイルス拡散／タンパク質発現を観察し、Ｂ−アクチン抗体をローディング対照として使用した。ｍｉＲ−１２５ａもｍｉＲ−１２２も発現しないＡ２５３細胞では、非減弱対照（図３１、非減弱対照としてのＯＮＣＲ−００３）と比較して、高いウイルス複製レベルがｍｉＲ減弱ウイルスのすべてで認められた（図３１、レーン３〜６）。しかしながら、ウイルス複製は、同種ｍｉＲＮＡの両方、特に高レベルのｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ７細胞で減少した。これらのデータは、対照ウイルスに対する特定のｍｉＲによるウイルス減弱の良い例となる。
【０２２６】
ｍｉＲ減弱ＨＳＶウイルスのウイルス複製の低減が、特定のｍｉＲの発現によって媒介されたことをさらに確認するため、内因性のｍｉＲ−１２２もｍｉＲ−１２５ａも発現しないＡ２５３細胞にｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５ａ模倣体をトランスフェクトした。簡潔には、Ａ２５３細胞を４８ウェルのディッシュに３５，０００細胞／ウェルで播種し、一夜培養した。これらの細胞に、次いでＡｍｂｉｏｎ  ｍｉＲＮＡ模倣体を２．５ｐＭ／ウェルにて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトした。低分子ＲＮＡ画分を含めた全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙカラムで増殖細胞から単離した。これらのＲＮＡサンプルをｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５特異的ＴａｑＭａｎアッセイの基質として使用し、Ｕ６  ｓｎＲＮＡに対する並行ＴａｑＭａｎアッセイを行い、ΔΔＣＴ法により、細胞型ごとの発現レベルを正規化した。これらの結果を図３２に示す。図３２Ａ及び図３２Ｂに示すように、ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５模倣体は、細胞内のｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５の発現レベルをＡ２５３細胞にて数桁特異的に増加させた。
【０２２７】
翌日、細胞を個別にカウントし、これにＯＮＣＲ−０３６、ＯＮＣＲ−０６３、ＯＮＣＲ−０９３、ＯＮＣＲ−０９４、ＯＮＣＲ−０９５、またはＯＮＣＲ−０９６のｍｉＲ減弱ＨＳＶ粒子及びＯＮＣＲ−００３の非減弱対照をＭＯＩ０．０１で感染させた。これらｏＨＳＶウイルスの各々を５０μＬで１時間加え、続いて完全培地を加えた。増殖ウイルス感染により発現されたｅＧＦＰは、感染の４８時間後に撮影した蛍光顕微鏡画像により評価した。すべての画像を同様に露光及び処理した。本実験の結果を図３２Ｃに示し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ｘ  Ｍｉｎｉｍａｘマルチモードミクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用したＧＦＰ検出により定量化し、図３２ＤにＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏを使用して分析した。これらのデータは、ＯＮＣＲ−００３（ＷＴ）を除いたすべてのウイルスに関して、ｍｉＲ−１２２模倣体の存在下でのウイルス複製の減弱を例示している。さらに、減弱のレベルは、ＨＳＶ構築物に存在するｍｉＲの標的配列のコピー数に比例し、各々がＩＣＰ２７遺伝子に４つのｍｉＲ−１２２の標的配列リピートを含むＯＮＣＲ−０６３、ＯＮＣＲ−０９３、ＯＮＣＲ−０９６でＧＦＰが最大に低下した。さらに、これらのデータは、ＯＮＣＲ−０９３、−０９４、−０９５、及び−０９６のｍｉＲ−１２５ａ模倣体の存在下での、ＯＮＣＲ−００３（ＷＴ）及びＯＮＣＲ−０３６／ＯＮＣＲ−０６３（各々、ｍｉＲ−１２２の標的配列のみ含む）と比較したウイルス複製の減弱を例示している。
【０２２８】
同様の実験を行い、２つ以上のウイルス遺伝子に複数のｍｉＲ−ＴＳカセットを含むさらなる構築物（例えば、ＯＮＣＲ−１２９、ＯＮＣＲ−１３１、ＯＮＣＲ−１２５、ＯＮＣＲ−１２６、ＯＮＣＲ−１２８、ＯＮＣＲ−１３０）のウイルス複製を評価した。いずれの場合にも、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現は、発現されたｍｉＲＮＡに対応する標的配列を含む特定の構築物のウイルス複製を減弱することが可能であった（データは示さず）。
【０２２９】
実施例７−ｍｉＲ−ＴＳカセットを生成するための計算法
先の実施例に記載したデータに基づき、ｍｉＲ−標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットを特定のＨＳＶ遺伝子に挿入するために生成した。異なる組織型のがん性及び非がん性細胞間で差次的発現を示すｍｉＲの標的配列を選択し、幅広く健康な細胞でウイルス複製を減弱することが可能である一方、同種ｍｉＲの発現が低いがん性細胞においてウイルスを複製させるカセットを生成した。
【０２３０】
本実施例は、候補となるｍｉＲ−ＴＳカセットを生成する方法及びそのリストから選択された好ましい候補を示す。コンピュータ言語Ｐｙｔｈｏｎにより実行される本方法を図１に示す。本方法の入力には、除外するシードのリストが含まれ、すなわち、本実施例では、がんで発現するｍｉＲＮＡのシード配列が除外され、カセットに含めるｍｉＲ−ＴＳのリストが含まれる。本実施例で使用した含まれたｍｉＲ−ＴＳを表１０に、親ｍｉＲＮＡの配列及び各ヌクレオチド（ｎｔ）長とともに提供する。ｍｉＲ−ＴＳは、マイクロＲＮＡとｍｉＲ−ＴＳ間の不完全な対応を許容するため、カセットは、不完全なｍｉＲ−ＴＳから作製され得ることが理解されよう。ｍｉＲ−ＴＳカセットは、他のｍｉＲ−ＴＳから作製することができ、当技術分野で既知の、または予め発見されたマイクロＲＮＡのいずれかに基づくｍｉＲ−ＴＳを含み得る。
【０２３１】
本実施例では、我々は、表１６に示すように、４つの必須ウイルス遺伝子：ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ３４．５、及びＵＬ８の各々に１つずつ、４つのｍｉＲ−ＴＳカセットを設計した。しかし原則として、これらのカセットは、他のウイルス（または非ウイルス）遺伝子とともに使用することができた。これらのウイルス遺伝子は、我々の好ましいベクターでは逆相補的な向きであるため、いずれの場合にも逆相補配列を使用した。「ｍｉＲ−１２６ｍ」という略語は、ｍｉＲ−１２６部位の、ｏｎｃｏｍｉＲであるｍｉＲ−１５５に対するシードマッチを除去することによって、この部位を改善するための突然変異型を指す。「ｍｉＲ−１２８ｍ」という略語は、ｍｉＲ−１２８部位の、ｏｎｃｏｍｉＲであるｍｉＲ−２７ａ−３ｐに対するシードマッチを除去することによって、この部位を改善するための突然変異型を指す。
【表１６−１】
2020532951.tif 000012
【表１６−２】
2020532951.tif 000013
【０２３２】
ＩＣＰ４に対して設計されたカセットは、平滑筋（ｍｉＲ−１４３の標的部位のため）及び横紋筋（ｍｉＲ−１の標的部位のため）において、それが動作可能に連結される任意の遺伝子を下方制御するために使用され得る。ＩＣＰ２７に対して設計されたカセットは、ｍｉＲ−１２８ｍ（皮質ニューロンで発現される）、ｍｉＲ−１２２（肝臓で発現される）、及びｍｉＲ−２１９（脳、脊柱及び神経で発現される）の標的部位のために健康な組織において、それが動作可能に連結される任意の遺伝子を下方制御するために使用され得る。ＩＣＰ２７に対して設計されたカセットは、ｍｉＲ−１２８ｍ、ｍｉＲ−２０４、及びｍｉＲ−２１９の標的部位のために健康な組織において、それが動作可能に連結される任意の遺伝子を下方制御するために使用され得る。ＵＬ８に対して設計されたカセットは、ｍＲＮＡの標的部位：ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６ｍのために非腫瘍組織において、それが動作可能に連結される任意の遺伝子を下方制御するために使用され得る。
【０２３３】
このプログラムを実行し、各組み合わせに対して以下のリストの例に使用される基準（それぞれがオプションである）に一致する１０，０００〜１００，０００のカセットを出力した：（１）順不同で配置された各ｍｉＲ−ＴＳ部位の４つのコピー（逆相補的な向き）、（２）同じｍｉＲ−ＴＳがそれ自体と隣接して反復することができないことを除いて、（３）ランダムな配列を有する４ヌクレオチドのスペーサーで区切られ、（４）除外するシードのリストのシードを含まず、（４）ポリアデニル化配列（ＡＡＴＡＡＡ）を含まない。このプログラムは、任意に、５’アーム（ＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣ）及び３’アーム（ＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＴＴＡＧ）配列を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリクローニング用に追加することもできる（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９、６（５）：３４３−５）。
【０２３４】
このプログラムは次に、４０ｎｔのスライディングウィンドウで、ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージの「ｆｏｌｄ」サブルーチンを使用して候補配列のフォールディングのデルタ−Ｇを計算した（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：１  ２６，２０１１、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ＲＮＡ／で入手可能）。このスライディングウィンドウの計算値を各候補配列のリストとして保存し、それら候補配列を、そのリスト内のすべてのデルタ−Ｇ値の絶対値の最大値でソートする（すなわち、ＲＮＡの最も強い二次構造要素のフォールディングエネルギーで）。配列をさらに手作業で見直し、複数の低いエネルギー極小を有する候補配列を排除した。可能な限り、極小値のない候補配列を選択した。このようにして、予測される二次構造のフォールディングエネルギーにおいて、強いＲＮＡ二次構造（デルタ−Ｇの絶対値の最大値が低い）がなく、極小値もないか、または極小値がほとんどない候補配列を特定した。
【０２３５】
最後に、マイクロＲＮＡの標的スキャンアルゴリズム（ｍｉｒａｎｄａ  ｖ３．３ａ）を各候補配列で実行し、所望のｍｉＲ−ＴＳが存在していること及びプログラムによって望ましくないｍｉＲ−ＴＳが挿入されていないことを確認した。
【０２３６】
本方法で生成された配列の例を表１７に提供する。カセットの長さは、最初のｍｉＲ−ＴＳから最後のｍｉＲ−ＴＳのヌクレオチドの、最初と最後のｍｉＲ−ＴＳを含めた数として定義される。このプログラムは、４ｎｔの５’の最初のスペーサー及び３’の最後のスペースを本明細書で使用される長さの定義とは別に追加するため、このカセットの長さは、このプログラムによって出力される配列の長さから８ｎｔ（＝２＊４ｎｔの最初と最後のスペーサー）を引いたものである。
【表１７−１】
2020532951.tif 000014
【表１７−２】
2020532951.tif 000015
【０２３７】
表１７に示すｍｉＲ−ＴＳカセットがウイルス複製を減弱する能力を図５３Ａ〜図５３Ｂに示す。
【０２３８】
表１８に示す本方法で設計されるｍｉＲ−ＴＳカセットを含むさらなる構築物を構築した。
【表１８−１】
2020532951.tif 000016
【表１８−２】
2020532951.tif 000017
【０２３９】
実施例８−ｍｉＲ減弱ＨＳＶ構築物の細胞毒性
選定したｍｉＲ減弱ＨＳＶ構築物、ＯＮＣＲ−１２５、ＯＮＣＲ−１３１、ＯＮＣＲ−１４２、及びＯＮＣＲ−１５７のインビトロ細胞毒性を評価するために実験を行った。様々ながん細胞株に、表示した構築物をＭＯＩ３０、１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２、０．０４、０．１３、０．００４５、及び０．００１５で感染させ、細胞の生存を感染の７２時間後に評価した。使用した細胞株は、結腸直腸腺癌細胞株ＳＷ８３７及びＣＯＬＯ２０５、黒色腫細胞株ＳＫＭＥＬ２８及びＡ３７５、小細胞肺癌細胞株Ｈ４４６、膵臓腺癌細胞株ＢＸＰＣ３、ならびに乳癌細胞株ＢＴ５４９を含む。各構築物のＩＣ５０を計算し、下記表１９に示す。これらの実験の各々の結果を図５４Ａ〜図５４Ｅに示す。
【表１９】
2020532951.tif 000018
【０２４０】
実施例９−ＩＬ−１２はＨＳＶの遠達効果を高める
ＩＬ−１２が腫瘍溶解性ＨＳＶの遠達効果に与える影響を評価するために実験を行った。簡潔には、ｍｉＲ−１２４−３ｐの４つのリピートを含むＩＣＰ４のｍｉＲ−ＴＳカセット及びマウスＩＬ−１２をコードする発現カセットを含むＯＮＣＲ−１３３構築物を、マウスに対して、ＭＣ３８腫瘍モデルに投与した。図５５に示すように、ＯＮＣＲ−１３３は、注入された腫瘍の腫瘍増殖を、媒体処理対照と比較して有意に抑制した（ｐ＜０．０００１）。ＯＮＣＲ−１３３処理はまた、非注入腫瘍の腫瘍増殖も有意に抑制し（ｐ＜０．００５）、遠達効果の向上を示した。
【０２４１】
意外にも、さらなる免疫活性化ペイロード、ＵＬＢＰ３の発現は、ＩＬ−１２を発現するＨＳＶの腫瘍増殖抑制効果をさらに高めることはなかった。図５６に示すように、ＯＮＣＲ−１３３＋ＯＮＣＲ−００７（ＵＬＢＰ３を発現するＨＳＶ構築物）またはＯＮＣＲ−１３３＋ＯＮＣＲ−００２（さらなるペイロード分子を発現しないＨＳＶ構築物）で処理されたマウスは両方とも、媒体処理対照と比較して腫瘍増殖の有意な抑制を示した。しかしながら、注入または非注入腫瘍の増殖の抑制においてＵＬＢＰ３の発現の追加の利点はなかった。実際、図５６の表に示すように、追加のＵＬＢＰ３の発現は、ＩＬ−１２の発現のみで認められた腫瘍増殖の抑制をわずかに減少させた。
【０２４２】
同様に、追加のＣＸＣＬ１０の発現がＩＬ−１２を発現するＨＳＶの抗腫瘍効果をさらに高めることはなかった。マウスをＯＮＣＲ−１１３（ＩＬ−１２とＭＭＰ９を発現するＨＳＶ構築物）＋ＯＮＣＲ−１０６（ＣＸＣＬ１０とＭＭＰ９を発現するＨＳＶ構築物）またはＯＮＣＲ−１１３＋ＯＮＣＲ−０３１（ＭＭＰ９を発現するＨＳＶ構築物）で処理した。図５７に示すように、ＯＮＣＲ−１０６＋ＯＮＣＲ−１１３処理群での追加のＣＸＣＬ１０の発現は、注入または非注入腫瘍のいずれにおける腫瘍増殖の抑制も、ＯＮＣＲ−０３１＋ＯＮＣＲ−１１３で処理されたマウスと比較して向上しなかった。実際、図５７の表に示すように、追加のＣＸＣＬ１０の発現は、注入及び非注入腫瘍の両方における腫瘍増殖抑制をわずかに減少させた。
【０２４３】
実施例１０−ＣＣＬ４の発現はＨＳＶの遠達効果をさらに高める
実施例Ｆに記載のＭＣ３８モデルにおいて、ＣＣＬ４の腫瘍増殖抑制の効果を評価するために実験を行った。本実験の結果を図５８及び下記表２０に示す。マウスを４つの構築物、ＯＮＣＲ−１３３（ＩＬ−１２を発現する）、ＯＮＣＲ−１５１（ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＸＣＬ１を発現する）、ＯＮＣＲ−１５２（ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＦＬＴ３リガンドを発現する）、またはＯＮＣＲ−１５３（ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４を発現する）のうちの１つで処理した。図５８に示すように、ＯＮＣＲ−１３３、−１５１、−１５２、及び−１５３のすべてでの処理は、注入及び非注入腫瘍の腫瘍増殖を媒体対照と比較して有意に抑制した。しかしながら、ＯＮＣＲ−１５３で処理したマウスは、注入腫瘍及び非注入腫瘍において、ＯＮＣＲ−１３３での処理と比較して腫瘍増殖抑制の増加を示した一方、ＯＮＣＲ−１５１または−１５２は、ＯＮＣＲ−１３３処理と比較して有効性にわずかな減少を示した。これらの結果は、ＣＣＬ４の発現が、腫瘍溶解性ＨＳＶの腫瘍増殖の抑制及び遠達効果を、ＩＬ−１２の発現のみで認められる効果を超えて増加させることができることを示す。
【表２０−１】
2020532951.tif 000019
【表２０−２】
2020532951.tif 000020
【０２４４】
ＯＮＣＲ−１５３で処理したマウスの腫瘍を採取し、ｇＤ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析によってＨＳＶの存在を評価した。図５９Ａ及び図５９Ｂに示すように、ＨＳＶは注入腫瘍で検出されたが、非注入腫瘍では検出されず、非注入腫瘍で認められた腫瘍増殖の抑制はウイルス拡散によるものではなく、ウイルス投与の遠達効果によるものだということを示している。腫瘍を３つのペイロード、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４の存在についても評価した。図６０Ａ〜６０Ｃに示すように、ペイロードの発現は、処理の２４時間後に注入腫瘍で最大になり、その後減少した。これらペイロードのレベルを、ＯＮＣＲ−１５３で処理したマウスの血清でも評価したところ（図６１Ａ〜６１Ｃ）、ＣＸＣＬ１０の発現のみが認められた。しかしながら、図６２に示すように、ＯＮＣＲ−１５３でのマウスの処理は、注入及び非注入腫瘍の両方で、腫瘍内ＩＦＮγ応答を誘導した（左のパネル）。同様に、ＩＦＮγの発現の増加は、ＯＮＣＲ−１５３処理マウスの血清で認められた。これらのデータはさらに、ＨＳＶによるＩＬ−１２とＣＣＬ４の発現の組み合わせが局所免疫応答を誘導し、これがＯＮＣＲ−１５３で認められた遠達効果に寄与し得ることを示す。
【０２４５】
実施例１１−ＦＬＴ３の発現はＨＳＶの遠達効果をさらに高める
実施例Ｆに記載のＭＣ３８モデルにおいて、ＦＬＴ３の腫瘍増殖抑制の効果を評価するために実験を行った。本実験の結果を図６３及び下記表２１に示す。マウスを表２１に概説する異なるペイロードを発現する３つの構築物の組み合わせのうちの１つで処理した。図６３に示すように、ＯＮＣＲ−１５２及びＯＮＣＲ−１４０の組み合わせでの処理は、非注入腫瘍で腫瘍増殖の抑制を高め、ＦＬＴ３Ｌの発現が、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４で認められるものを超えて遠達効果を高めることができることを示す。
【表２１】
2020532951.tif 000021
【０２４６】
実施例１３−ＣＤ４０Ｌの発現はＨＳＶの遠達効果をさらに高める
実施例Ｆに記載のＭＣ３８モデルにおいて、ＣＤ４０Ｌの腫瘍増殖抑制の効果を評価するために実験を行った。本実験の結果を図６４及び下記表２２に示す。マウスを表２２に概説する異なるペイロードを発現する構築物で処理した。図６４に示すように、ＯＮＣＲ−１５３及びＯＮＣＲ−１４７の組み合わせでの処理は、非注入腫瘍で腫瘍増殖の抑制を高め、ＣＤ４０Ｌの発現が、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４で認められるものを超えて遠達効果を高めることができることを示す。
【表２２】
2020532951.tif 000022
【０２４７】
実施例１２−抗ＣＴＬＡ４の発現はＨＳＶの遠達効果をさらに高める
実施例Ｆに記載のＭＣ３８モデルにおいて、ＣＴＬＡ４の腫瘍増殖抑制の効果を評価するために実験を行った。本実験の結果を図６４Ａ〜図６６Ｃ及び下記表２３に示す。マウスを表２３に概説する異なるペイロードを発現する構築物で処理した。図６６Ａ〜図６６Ｃに示すように、ＯＮＣＲ−１４９及びＯＮＣＲ−１３９の組み合わせでの処理は、注入及び非注入腫瘍で腫瘍増殖の抑制を、ＯＮＣＲ−１４９単独での処理と比較して高め、抗ＣＴＬＡ４の発現が、ＩＬ−１２で認められるものを超えて抗腫瘍効果及び遠達効果を高めることができることを示す。
【表２３】
2020532951.tif 000023
【０２４８】
同様の実験を行い、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、ＦＬＴ３Ｌ、及びＣＣＬ４の発現を超える抗ＣＴＬＡ４の効果を４Ｔ１−ｌｕｃモデルで評価した。簡潔には、１ｘ１０６個の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を含む１００μＬのＤＰＢＳをＢａｌｂ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍の体積が平均１００ｍｍ３に達したところで、マウスに対してＨＳＶ−１を３ｅ６ＰＦＵ／注入の用量で腫瘍内注入した。投与は３日ごとに２回反復し、合計３回投与した（Ｑ３Ｄｘ３）。腫瘍増殖及び体重を週２回観察した。この実験は、２２日目、転移性疾患の最初の臨床症状が認められた時点で終了した。肺転移をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＬＴシステムを使用してエキソビボで視覚化し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアで分析した。マウスを、表２４に示す構築物の組み合わせで処理した。本実験の結果を図６７に示す。示されるように、ＯＮＣＲ−１５２及び−１３９での処理は、ＯＮＣＲ−１３９単独での処理と比較して腫瘍増殖抑制の効果の向上を示した。
【表２４】
2020532951.tif 000024
【０２４９】
実施例１３−抗ＰＤ１発現での処理はＨＳＶの効果をさらに高める
実施例Ｆに記載のＭＣ３８モデルにおいて、抗ＰＤ１処理がＨＳＶ媒介腫瘍増殖抑制に与える影響を評価するために実験を行った。本実験の結果を図６８及び下記表２５に示す。マウスを表２５に概説する異なるペイロードを発現する構築物で処理した。図６８に示すように、ＯＮＣＲ−１５３と抗ＰＤ１の組み合わせでの処理は、注入腫瘍の腫瘍増殖の抑制を、ＯＮＣＲ−１５２または抗ＰＤ１単独で認められるものと比較して高めた。
【表２５】
2020532951.tif 000025
【０２５０】
実施例１４−膵臓癌、肺癌、または結腸癌患者の治療
膵臓癌、肺癌、または結腸癌患者を本明細書に開示する組成物及び方法を使用して治療する。図３９〜５０に示すように、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的配列を、ＵＬ１９、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、もしくはＵＬ４２（または他のウイルス遺伝子）に組み込むことで減弱されるＨＳＶベースのウイルスストックが生成され得る。場合によっては、腫瘍の崩壊及び／または微小環境のリモデリングに対するゲノム編集能力を、図４５〜４６に示すように、ｍｉＲＮＡの標的配列に加えてウイルスに組み込む。特定の実施例では、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、及びｍｉＲ−５５９減弱カセットをＩＣＰ４及びＩＣＰ２７に組み込まれて含むＨＳＶベースのストックを使用する。別の実施例では、ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１２５ａの標的配列の１つ以上のコピーを備えた減弱カセットをＩＣＰ２７及び／またはＵＬ４２遺伝子に組み込まれて含むＨＳＶベースのストック。これら組成物のいずれに関しても、ＨＳＶベースのストックを実施例３に記載の方法に従って生成する。ｍｉＲＮＡの標的配列のカセットは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７ＵＬ１９、及び／またはＵＬ４２遺伝子の３’ＵＴＲに導入する。ＢＡＣ構築物を、Ｖｅｒｏ−Ｃｒｅ細胞のトランスフェクションによりｌｏｘＰ部位間に位置するＢＡＣ配列を同時に除去してウイルス粒子に変換する。プラーク精製後、ウイルスストックをさらに精製し、緩衝液を交換し、Ｖｅｒｏ細胞で力価を測定する。膵臓癌、肺癌、または結腸癌患者へのインビボ投与に際して、ＨＳＶ粒子をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中医薬的に許容される安定剤とともに調製する。治療の当日、１０９個のベクターゲノムを含む体積１．０ｍＬの医薬的に許容される担体を腫瘍内注入で投与する。患者を腫瘍の退縮に関して標準的治療処置を用いて、患者の個別の予後に基づく適切な時間間隔で観察する。
【０２５１】
実施例１５−脳癌、膀胱癌、乳癌、または頭頸部癌患者の治療
脳癌、膀胱癌、乳癌、または頭頸部癌患者を本明細書に開示する組成物及び方法を使用して治療する。ＨＳＶベースのウイルスストックを実施例３に記載の方法に従って、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、及びｍｉＲ−５５９減弱カセットを含めて生成する。これらｍｉＲＮＡの標的配列のカセットは、図４８に示すように、ＩＣＰ４（ｍｉＲ−１２４）及びＩＣＰ２７（ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、及びｍｉＲ−５５９）遺伝子の３’ＵＴＲに導入する。ＢＡＣ構築物を、Ｖｅｒｏ−Ｃｒｅ細胞のトランスフェクションによりｌｏｘＰ部位間に位置するＢＡＣ配列を同時に除去してウイルス粒子に変換する。プラーク精製後、ウイルスストックをさらに精製し、緩衝液を交換し、Ｖｅｒｏ細胞で力価を測定する。脳癌、膀胱癌、乳癌、または頭頸部癌患者へのインビボ投与に際して、ＨＳＶ粒子をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中医薬的に許容される安定剤とともに調製する。治療の当日、１０９個のベクターゲノムを含む体積１．０ｍＬの医薬的に許容される担体を腫瘍内注入で投与する。患者を、標準的治療処置を用いて、患者の個別の予後に基づく適切な時間間隔で観察する。可能性があるこれら実験の転帰としては、腫瘍増殖の部分的または完全な抑制、腫瘍転移の抑制、長時間の寛解、及び／または標準的な治療と比較して低い再発率が挙げられる。
【０２５２】
実施例１６−神経鞘腫患者の治療
神経鞘腫患者を本明細書に開示する組成物及び方法を使用して治療する。ＨＳＶベースのウイルスストックを実施例３に記載の方法に従って、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｍｉＲ−１４１−５ｐ、及びｍｉＲ−３１−５ｐ減弱カセットを含めて生成する。これらｍｉＲＮＡの標的配列のカセットは、図４９に示すように、ＩＣＰ４（ｍｉＲ−１２４）及びＩＣＰ２７（ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｍｉＲ−１４１−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ）遺伝子の３’ＵＴＲに組み換えた。ＢＡＣ構築物を、Ｖｅｒｏ−Ｃｒｅ細胞のトランスフェクションによりｌｏｘＰ部位間に位置するＢＡＣ配列を同時に除去してウイルス粒子に変換する。プラーク精製後、ウイルスストックをさらに精製し、緩衝液を交換し、Ｖｅｒｏ細胞で力価を測定する。神経鞘腫患者へのインビボ投与に際して、ＨＳＶ粒子をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中医薬的に許容される安定剤とともに調製する。治療の当日、１０９個のベクターゲノムを含む体積１．０ｍＬの医薬的に許容される担体を腫瘍内注入で投与する。患者を、標準的治療処置を用いて、患者の個別の予後に基づく適切な時間間隔で観察する。可能性があるこれら実験の転帰としては、腫瘍増殖の部分的または完全な抑制、腫瘍転移の抑制、長時間の寛解、及び／または標準的な治療と比較して低い再発率が挙げられる。
【０２５３】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されているが、当業者には、かかる実施形態がほんの一例として提供されていることが明らかであろう。多数の変形、変更、及び置換が本発明から逸脱することなく当業者によって実施され得る。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実施する際に採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これら特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれに含まれることが意図されている。
【０２５４】
参照による援用
本明細書に引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願についての言及は、それらが有効な先行技術を構成するまたは世界のどの国においても共通の一般知識の一部を形成するという承認もしくはなんらかの提案の形ではなく、また、それと見なされるべきではない。
【表１−１】
2020532951.tif 000026
【表１−２】
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【表１−３】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３１Ｃ】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020532951.tif 000149
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