(57)【要約】【課題】本発明は、改変イガイ接着タンパク質類、それらの使用、改変イガイ接着タンパク質類をコードするヌクレオチド配列、改変イガイ接着タンパク質類を産生するのに適したアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、及び光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体の新規な使用に関する。【解決手段】改変イガイ接着タンパク質は、カテコール部分の少なくとも１つの水酸基残基への保護基を含む、少なくとも１つの光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基を備え、前記光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基は、天然のアミノ酸を置換し、前記保護基を、ＵＶ光での照射により、前記３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基から切断できる。【選択図】図４Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変イガイ接着タンパク質であって、カテコール部分の少なくとも１つの水酸基残基への保護基を含む、少なくとも１つの光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基を備え、前記光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基は、天然のアミノ酸を置換し、前記保護基を、ＵＶ光での照射により、前記３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基から切断できる、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の改変イガイ接着タンパク質において、改変ｆｐ−５タンパク質であることを特徴とする、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の改変イガイ接着タンパク質において、前記光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基が、チロシン残基を置換することを特徴とする、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質において、前記光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基が、オルト−ニトロベンジル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン残基であることを特徴とする、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質において、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の改変イガイ接着タンパク質において、請求項５又は６で定義された前記アミノ酸配列のＮ末端に融合している、配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、改変イガイ接着タンパク質。
【請求項８】
インビトロでの生分解性接着剤としての、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質の使用。
【請求項９】
表面を、前記改変イガイタンパク質に共有結合している機能的本体でインビトロ被覆するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用において、前記機能的本体が、抗菌特性を示すことを特徴とする、使用。
【請求項１１】
外科手術における使用又は治療における使用のための、特に、生分解性接着剤としての、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質。
【請求項１２】
骨折の処置における使用のための又は創傷治癒を促進するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変イガイ接着タンパク質。
【請求項１３】
配列番号５、配列番号６又は配列番号７と少なくとも９９％同一である配列を有する、請求項７に記載の改変イガイ接着タンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
配列番号８、配列番号９又は配列番号１０と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、アミノアシル−tＲＮＡシンターゼ。
【請求項１５】
合成されるペプチドにオルト−ニトロベンジル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを組み込むための、請求項１４に記載のアミノアシル−tＲＮＡシンターゼの使用。
【請求項１６】
ペプチドの合成中でのカテコール部分の少なくとも１つの水酸基残基へのＵＶ光の照射により切断できる保護基を含む、光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体の使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用において、前記光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基が、オルト−ニトロベンジル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンであることを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の前提部に記載の改変イガイタンパク質（modified mussel protein8）、請求項８、９、１１及び１２の前提部に記載のような改変イガイタンパク質の種々の使用、請求項１３の前提部に記載のような改変イガイタンパク質をコードする核酸、請求項１４の前提部に記載のような改変イガイタンパク質の製造に適したアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、請求項１５の前提部に記載のようなアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの使用、及び請求項１６の前提部に記載のオルト−ニトロベンジル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学において、ピン及び釘を使用する現存の限定的な治療手法に取って代わるために、骨折の処置に適用可能な又は創傷治癒を加速させる、生体適合性接着剤に対する長年の要求が存在する（非特許文献１）。生体適合性生物接着剤は、組織への良好な結合強度（接着）、生理学的な湿潤条件下での高い安定性（結合  cohesion）、制御可能な生分解性、生物における免疫原性がないこと並びに毒性がないこと等のいくつかの要求を満たさなければならない（非特許文献２）。しかし、これらの要求を満たす生物接着剤は、現在入手可能ではない。フィブリン等の生物接着剤は、弱い結合強度及び急速な生分解を示す。一方で、シアノアクリレート等の合成接着剤は、強い結合特性を示すが、生物にとって潜在的に毒性であり（非特許文献３）、同化されないため、内因性骨修復を損ねる（非特許文献１）。
【０００３】
上述の要求を満たし得る生物学的接着剤は、海洋イガイにおいて見出されている。当該イガイは、自らのタンパク質系接着剤により潮間帯の水中で硬い面に固着できる（非特許文献４、５）。接着を実現するために、イガイは、いわゆる足糸を作製する。当該足糸は、いくつかのタンパク質性糸からなり、その末端は接着性プラークとなる。接着性プラークは、表面と直接接触し、各種の有機物の表面及び無機物の表面に強力で永続的な接着を可能にする種々のイガイ接着タンパク質（ＭＡＰs）から構成される。その引張強度は、最大１０ＭＰａであり（非特許文献６）、この強度は、海綿骨の範囲（５ＭＰａ付近）にある（非特許文献７）。水中接着の重要な役割となるものは、チロシンから翻訳後に形成されるカテコールアミノ酸である３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｄｏｐａ）である。Ｄｏｐａは、水素結合、金属配位又はキノン媒介架橋などの種々のメカニズムにより接着に寄与する（非特許文献４）。イガイ接着に対するＤｏｐａの重要性の高さを反映して、ＭＡＰは、最大３０ｍｏｌ％の高いＤｏｐａ含量を特徴とする。
【０００４】
イガイから抽出を行う場合、収量が低くなる。そのため、酵素的インビトロヒドロキシル化工程、チロシナーゼの共発現を活用し、もしくは翻訳後にチロシン残基をヒドロキシル化するために真核生物発現系を活用して、イガイから誘発されたポリマーを合成したり（非特許文献８、９）、ＭＡＰを遺伝子組み換え的に産生したり（非特許文献１０、１１）する多くの努力がなされてきた。これらの手法はそれぞれ、低い結合強度、低いヒドロキシル化効率又は低いタンパク質収率の問題がある。しかし、最近、Ｅ．ｃｏｌｉのチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）の基質寛容性を利用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、チロシンのＤｏｐａによる残基特異的置換が行われた(非特許文献１１)。しかし、この手法には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴｙｒＲＳによるＤｏｐａの活性化速度が低いこと、及びＤｏｐａのプロテオーム全体にわたる取り込みによる細胞増殖の障害が発生することの問題がある。
以下において引用される文献または関連する文献としては、以下の非特許文献がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hoffmann, B.; Volkmer, E.; Kokott, A.; Augat, P.; Ohnmacht, M.; Sedlmayr, N.; Schieker, M.; Claes, L.; Mutschler, W.; Ziegler, G. J. Mater. Sci. Mater. Med. 2009, 20 (10), 2001.
【非特許文献２】Donkerwolcke, M.; Burny, F.; Muster, D. Biomaterials 1998, 19 (16), 1461.
【非特許文献３】Montanaro, L.; Arciola, C. R.; Cenni, E.; Ciapetti, G.; Savioli, F.; Filippini, F.; Barsanti, L. A. Biomaterials 2001, 22 (1), 59.
【非特許文献４】Silverman, H. G.; Roberto, F. F. Mar. Biotechnol. 2007, 9 (6), 661.
【非特許文献５】Stewart, R. J.; Ransom, T. C.; Hlady, V. J. Polym. Sci. B. Polym. Phys. 2011, 49 (11), 757.
【非特許文献６】Waite, J. H. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999, 875, 301.
【非特許文献７】Weber, S. C.; Chapman, M. W. Clin. Orthop. Relat. Res. 1984, No. 191, 249.
【非特許文献８】Lee, H.; Dellatore, S. M.; Miller, W. M.; Messersmith, P. B. Science2007, 318 (5849), 426.
【非特許文献９】Lee, B. P.; Messersmith, P. B.; Israelachvili, J. N.; Waite, J. H. Annu. Rev. Mater. Res. 2011, 41 (1), 99.
【非特許文献１０】Hwang, D. S.; Gim, Y.; Yoo, H. J.; Cha, H. J. Biomaterials 2007, 28 (24), 3560.
【非特許文献１１】Yang, B.; Ayyadurai, N.; Yun, H.; Choi, Y. S.; Hwang, B. H.; Huang, J.; Lu, Q.; Zeng, H.; Cha, H. J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014, 53 (49), 13360.
【非特許文献１２】Deiters, A.; Groff, D.; Ryu, Y.; Xie, J.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45 (17), 2728.
【非特許文献１３】Arbely, E.; Torres-Kolbus, J.; Deiters, A.; Chin, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134 (29), 11912.
【非特許文献１４】Luo, J.; Arbely, E.; Zhang, J.; Chou, C.; Uprety, R.; Chin, J. W.; Deiters, A. Chem. Commun. (Camb). 2016, 52 (55), 8529.
【非特許文献１５】Johnson, D. B. F.; Xu, J.; Shen, Z.; Takimoto, J. K.; Schultz, M. D.; Schmitz, R. J.; Xiang, Z.; Ecker, J. R.; Briggs, S. P.; Wang, L. Nat. Chem. Biol. 2011, 7 (11), 779.
【非特許文献１６】Lajoie, M. J.; Rovner, A. J.; Goodman, D. B.; Aerni, H.-R.; Haimovich, A. D.; Kuznetsov, G.; Mercer, J. A.; Wang, H. H.; Carr, P. A.; Mosberg, J. A.; Rohland, N.; Schultz, P. G.; Jacobson, J. M.; Rinehart, J.; Church, G. M.; Isaacs, F. J. Science 2013, 342 (6156), 357.
【非特許文献１７】Liu, C. C.; Schultz, P. G. Annu. Rev. Biochem.2010, 79, 413.
【非特許文献１８】Wilkins, B. J.; Marionni, S.; Young, D. D.; Liu, J.; Wang, Y.; Di Salvo, M. L.; Deiters, A.; Cropp, T. A. Biochemistry 2010, 49 (8), 1557.
【非特許文献１９】Yu, J.; Wei, W.; Danner, E.; Ashley, R. K.; Israelachvili, J. N.; Waite, J. H. Nat. Chem. Biol. 2011, 7 (9), 588.
【非特許文献２０】Danner, E. W.; Kan, Y.; Hammer, M. U.; Israelachvili, J. N.; Waite, J. H. Biochemistry 2012, 51 (33), 6511.
【非特許文献２１】Nguyen, D. P.; Mahesh, M.; Elsasser, S. J.; Hancock, S. M.; Uttamapinant, C.; Chin, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136 (6), 2240.
【非特許文献２２】Paz, M. A.; Fluckiger, R.; Boak, A.; Kagan, H. M.; Gallop, P. M. J. Biol. Chem. 1991, 266 (2), 689.
【非特許文献２３】T.S. Young, I. Ahmad, J.A. Yin, P.G. Schultz, J. Mol. Biol. 2010,395,361-374.
【非特許文献２４】A. Ebner, L. Wildling, A. S. M. Kamruzzahan, C. Rankl, J. Wruss, C. D. Hahn, M. Holzl, R. Zhu, F. Kienberger, D. Blaas, et al., Bioconjug. Chem. 2007, 18, 1176-84.
【非特許文献２５】L. Wildling, B. Unterauer, R. Zhu, A. Rupprecht, T. Haselgrubler, C. Rankl, A. Ebner, D. Vater, P. Pollheimer, E. E. Pohl, et al., Bioconjug. Chem. 2011, 22, 1239-48.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｄｏｐａ含有タンパク質類、特に、Ｄｏｐａ含有イガイタンパク質類を製造するための新規な系及び適切なツールを提供すること並びに改変イガイタンパク質類自体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、とりわけ、請求項１の特徴を有する改変イガイタンパク質により達成される。このようなイガイタンパク質は、改変イガイタンパク質の各天然類似体（例えば、天然のイガイタンパク）における天然のアミノ酸の代わりに、少なくとも１つの３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基を含む。それにより、前述の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基は、そのカテコール部分の少なくとも１つの水酸基残基への保護基を含む。またこれは、保護された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基と表しうる。
【０００８】
前述の改変イガイタンパク質は、一実施形態において、改変イガイ接着タンパク質類である。下記において、「改変イガイタンパク質類」という用語は、常に、改変イガイ接着タンパク質類を包含し、この実施形態に限定されうる。
【０００９】
前述の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基は、光ケージド（photocaged）３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基である。前述の保護基は、ＵＶ光の照射により、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基から切断できる。
【００１０】
一実施形態において、前述の改変イガイ接着タンパク質は、改変ｆｐ−５タンパク質（ＭＡＰ  ｆｐ−５）である。
【００１１】
一実施形態において、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンと比較して、光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体の唯一の改変は、そのカテコール部分の少なくとも１つの水酸基残基における保護基である。別の実施形態では、前述の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体は、さらにＣ２位においてアミノ基を欠く。
【００１２】
一実施形態において、前述の保護基は、カテコール部分の両水酸基残基に化学的に結合している。炭素数１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアルキル鎖が、この目的に特に適している。
【００１３】
前述の保護基の適切な例として、６−ニトロ−１，３−ベンゾジオキソールが挙げられる。この保護基は、３６５ｎｍの波長を有する光で照射された場合に、速やかに脱ケージ化のプロセスが進行すると説明されている。更に、ニトロ基のアミンへの望ましくない細胞内還元は、１−ニトロ−３，４−メチレンジオキシベンゼン基には観察されなかったため、全体的な脱ケージ化効率が改善されている。結果として、この保護基は、改変イガイタンパク質に組み込まれる光ケージドＤｏｐａを生成するのに非常に適している。この保護基の化学構造を下記に示す。式中、Ｒは、本実施形態において、Ｄｏｐａ誘導体残基又はＤｏｐａ残基である。
【００１４】
【化１】
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【００１５】
一実施形態において、前述の保護基は、カテコール部分の１つの水酸基残基に化学的に結合している。
【００１６】
一実施形態において、オルト−ニトロベンジルを、ＵＶ切断可能な保護基として使用する。これにより、光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体は、オルト−ニトロベンジル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＯＮＢ−Ｄｏｐａ）である。
【００１７】
オルトニトロベンジル基（ＯＮＢ基）（非特許文献１２）は、３６５ｎｍの紫外線の照射により、容易に切断できる保護基であり、したがってＤｏｐａのカテコール官能基を遊離する。
【００１８】
ＯＮＢ基は、ＵＶ光の単純な照射により活性化できるケージ化タンパク質類を産生するのに頻繁に使用されてきた。類似の化合物、例えば、ＯＮＢ−チロシン（非特許文献１２〜１４）及びＯＮＢ−フルオロチロシン（非特許文献１５）が記載されているが、ＯＮＢ−Ｄｏｐａは、本発明者らの知る限り、これまでいかなる研究にも使用されなかった。光保護されたＤｏｐａ類似体の利点は、光活性化可能な生物接着剤の産生を可能にし、接着特性を損なうと記載されてきたドパキノンへのＤｏｐａ自己酸化が回避されることである（非特許文献１６）。
【００１９】
改変イガイタンパク質を合成するために、本発明者らは、新規なアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼ（ａａＲＳ）及び対応するｔＲＮＡの系を確立した。近年、アンバー終止コドンに応答して非カノニカルアミノ酸（ｎｃＡＡ）のタンパク質類への組み込みの活性化を可能にするために、ａａＲＳ及び対応するｔＲＮＡからなる直交性ペア（ｏ−ペア）が設計されている(非特許文献１７)。同じ手法を、本明細書において取っている。使用されるｔＲＮＡは、アンバー終止コドン（ＴＧＡ）を認識する。結果として、もはや終止コドンとして機能せず、特定のｔＲＮＡに運搬されたアミノ酸をコードするコドンとして機能する。このアミノ酸は、新たに開発されたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより決定され、本件では、ＯＮＢ−Ｄｏｐａである。ｏ−ペアの改変により、他の光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基の組み込みが可能となりうる。
【００２０】
上述の新規なａａＲＳにより、複数の部位でのＯＮＢ−Ｄｏｐａのタンパク質類への取り込みが可能となり、ケージ化イガイタンパク質類を産生し、その接着特性を、３６５ｎｍでの照射時に時空間的に活性化できる。これらの光活性化可能な（光活性化可能な）イガイタンパク質類は、生物医学的目的、例えば、骨折の処置に大きな可能性を持つ。
【００２１】
複数のＤｏｐａ残基の協同効果がイガイ接着を強力に改善するため、いくつかの光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基、特に、複数のＯＮＢ−Ｄｏｐａ残基を、イガイの接着能力を模倣するために、一実施形態において、改変イガイタンパク質に同時に組み込む。このため、一実施形態において、改変イガイタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個のこのような光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基、特に、ＯＮＢ−Ｄｏｐａ残基を含む。一実施形態において、改変イガイタンパク質は、２〜１９個の上述の残基、特に３〜１８個、特に４〜１７個、特に５〜１６個、特に６〜１５個、特に７〜１４個、特に８〜１３個、特に９〜１２個、特に１０〜１１個の上述の残基を相応に含む。
【００２２】
一実施形態において、光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基、特に、ＯＮＢ−Ｄｏｐａ残基は、チロシン残基を置換する。したがって、改変イガイタンパク質を産生するために、チロシンをコードする少なくとも１つのコドンを、アンバー終止コドンにより遺伝的に置換する。アンバー終止コドンは、ついで、改変イガイタンパク質にＯＮＢ−Ｄｏｐａ又はタンパク質合成中の別の光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基を導入するために、ａａＲＳ及び対応するｔＲＮＡの新たに開発された直交性ペアにより使用される。
【００２３】
一実施形態において、改変イガイタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９と少なくとも９５％、特に少なくとも９６％、特に少なくとも９７％、特に少なくとも９８％、特に少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、とりわけ１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
配列番号１は、５つのＯＮＢ−Ｄｏｐａ残基を有する改変イガイタンパク質を記述する。配列番号２は、１０個のＯＮＢ−Ｄｏｐａ残基を有する改変イガイタンパク質を記述する。配列番号３は、１９個のＯＮＢ−Ｄｏｐａ残基を有する改変イガイタンパク質、すなわち、野生型イガイタンパク質（ｆｐ−５）の１９個全てのチロシン残基がＯＮＢ−Ｄｏｐａにより交換されることを記述する。配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３は、それぞれ配列番号１、配列番号２又は配列番号３の最初の７７個のアミノ酸と同一であるが、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含有しない。一実施形態において、改変イガイタンパク質は、このようなアミノ酸配列を含むだけでなく、このアミノ酸配列からなる。
【００２５】
配列番号１４は、５つの光ケージドＤｏｐａ残基を有する改変イガイタンパク質を記述する（ＯＮＢ−Ｄｏｐａ及び６−ニトロ−１，３−ベンゾジオキソールＤｏｐａは、光ケージドＤｏｐａ残基の例である）。配列番号１５は、１０個の光ケージドＤｏｐａ残基を有する改変イガイタンパク質を記述する。配列番号１６は、１９個の光ケージドＤｏｐａ残基を有する改変イガイタンパク質を記述する。すなわち、野生型イガイタンパク質（ｆｐ−５）の１９個全てのチロシン残基が、光ケージドＤｏｐａ残基により交換される。配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６の最初の７７個のアミノ酸と同一であるが、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含有しない。一実施形態において、改変イガイタンパク質は、このようなアミノ酸配列を含むだけでなく、このアミノ酸配列からなる。
【００２６】
一実施形態において、改変イガイタンパク質は、先の３つの段落で定義されたアミノ酸配列のＮ末端に融合している、配列番号４と少なくとも９５％、特に少なくとも９６％、特に少なくとも９７％、特に少なくとも９８％、特に少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、とりわけ１００％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号４を有するタンパク質は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位を有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であり、ＭＢＰ−ＴＥＶとも称することができる。ＴＥＶプロテアーゼで処理することにより、アミノ酸配列を融合するタンパク質から容易に切断できる。このような処理の後、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を得る。
【００２７】
一つの態様において、本発明は、生分解性接着剤としての、したがって特に、インビトロでの使用のための、先の説明による改変イガイタンパク質の使用に関する。
【００２８】
一つの態様において、本発明は、先の説明による改変イガイタンパク質を含む生分解性接着剤で接着することにより、２つの要素を組み合わせるための方法に関する。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、改変イガイタンパク質に共有結合している機能的本体（functional entity）により表面を被覆するための、先の説明による改変イガイタンパク質の使用に関する。それにより、本発明は、特に、インビトロでの使用に関する。改変イガイタンパク質のこのような使用により、多くの異なる基質の表面特性を、適切な機能を担う本体（機能的本体）を選択することにより、任意の所望の方法で調節できる。機能的本体は、例えば、ペプチド又はタンパク質であり得る。
【００３０】
一実施形態において、機能的本体は、抗菌特性を示す。この実施形態では、物品の抗菌性表面被覆を確立可能である。例を挙げると、インプラント、例えば、人口補綴又は別の医療用物品は、対応する機能化改変イガイタンパク質により被覆できる。それにより、抗菌ペプチドは、改変イガイタンパク質と融合するのに非常に適している。
【００３１】
一つの態様において、本発明は、先の説明による改変イガイタンパク質と、改変イガイタンパク質に共有結合している機能的本体とを含む、機能化改変イガイタンパク質により物品の表面を被覆するための方法に関する。
【００３２】
一つの態様において、本発明は、医学、特に、外科手術又は治療（第１の医学的使用）における、先の説明による改変イガイタンパク質の使用に関する。別の態様では、本発明は、生分解性接着剤としての、外科手術又は治療における、先の説明による改変イガイタンパク質の使用に関する。
【００３３】
一つの態様において、本発明は、先の説明による改変イガイタンパク質を含む生分解性接着剤を、連結される少なくとも１つの部分、特に、連結される両方の部分に適用することにより、それを必要とするヒト又は動物の身体の２つの部分をしっかりと連結するための治療方法に関する。
【００３４】
一つの態様において、本発明は、骨折の処置における又は創傷治癒を増強するための（第２の又はさらなる医学的使用）、先の説明による改変イガイタンパク質の使用に関する。創傷治癒は、例えば、改変イガイタンパク質を抗菌ペプチドなどの抗菌実体と結合させることにより、及びこの機能化改変イガイタンパク質を創傷上又は創傷内に適用して、創傷感染を予防し又は改善することにより促進できる。この目的で、機能化改変イガイタンパク質を、創傷処置のために使用される包帯上に適用できる。
【００３５】
一つの態様において、本発明は、それを必要とするヒト又は動物に先の説明による改変イガイタンパク質を適用することにより、特にこのような改変イガイタンパク質を、骨折した骨上又は治癒されるべき創傷上に適用することにより、骨折を処置する方法又創傷治癒を促進する方法に関する。
【００３６】
全ての記載された使用及び全ての対応する方法は、ＯＮＢ保護基を切断し、Ｄｏｐａ残基を露出させるように、対応する改変イガイタンパク質をＵＶ光、特に、３６０〜３７０ｎｍ（特に３６５ｎｍ）の波長を有するＵＶ光により活性化した後に、特に良好に適用できる。
【００３７】
一つの態様において、本発明は、配列番号５、配列番号６又は配列番号７と少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、特に１００％同一である配列を有する、先の説明による改変イガイタンパク質をコードする核酸に関する。配列番号５を有する核酸は、特定のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりＯＮＢ−Ｄｏｐａを負荷される特定のｔＲＮＡにより認識される５つのＴＡＧトリプレットを含む。このため、これらのＴＡＧトリプレットは、タンパク質合成中にＯＮＢ−Ｄｏｐａを合成される改変イガイタンパク質に組み込むのに役立つ。このため、この核酸は、配列番号１の改変イガイタンパク質をコードする。配列番号６を有する核酸は、１０個のＴＡＧトリプレットを含み、配列番号２の改変イガイタンパク質をコードする。配列番号７を有する核酸は、１９個のＴＡＧトリプレットを含み、配列番号３の改変イガイタンパク質をコードする。各場合において、ＴＡＧトリプレットは、基礎となる非改変イガイタンパク質中のチロシンをコードするトリプレットを置換する。
【００３８】
一つの態様において、本発明は、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０と少なくとも９８％、特に少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼに関する。一実施形態において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、対応するアミノ酸配列からなる。配列番号８のタンパク質は、ＯＮＢ−ＤｏｐａＲＳ−１と称することもでき、配列番号９のタンパク質は、ＯＮＢ−ＤｏｐａＲＳ−２と称することもでき、配列番号１０のタンパク質は、ＯＮＢ−ＤｏｐａＲＳ−３と称することもできる。このようなアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、対応するｔＲＮＡにＯＮＢ−Ｄｏｐａを負荷できる。このため、合成されるペプチドにＯＮＢ−Ｄｏｐａを組み込むのに使用するのに非常に適している。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの基質結合部位が約３０アミノ酸を含むため、２０３０≒１０３９の可能な配列が得られる。本発明者らにとって、対応するｔＲＮＡにＯＮＢ−Ｄｏｐａを負荷するのに非常に適した３つの異なる（ただし密接に関連する）アミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼを特定することは、非常に驚くべき知見であった。
【００３９】
一つの態様において、本発明は、合成されるペプチドにオルト−ニトロベンジル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを組み込むための、先の段落によるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの使用に関する。それにより、「ペプチド」という用語は、本開示の範囲内で、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質のいずれかに関する。一実施形態において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、合成されるタンパク質へのＯＮＢ−Ｄｏｐａの組み込みに使用される。合成は、細菌、酵母細胞、植物細胞、植物全体又は無細胞タンパク質合成系において行うことができる。
【００４０】
本発明者らの知識によれば、ＯＮＢ−Ｄｏｐａなどの光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基は、ペプチド合成には使用されていなかった。したがって、本発明は、一つの態様において、ペプチド合成における、光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基、特に、ＯＮＢ−Ｄｏｐａの使用に関する。「ペプチド」という用語及び適切な合成系の意味に関しては、先の段落を参照されたい。
【００４１】
ＯＮＢ−Ｄｏｐａは、立体異性体、すなわち、Ｄ型及びＬ型で存在できる。一実施形態において、ＯＮＢ−Ｄｏｐａは、ＯＮＢ−Ｌ−Ｄｏｐａである。この実施形態は、ＯＮＢ−Ｄｏｐａが存在する、本願に開示されたタンパク質配列に明示的に適用可能である。
【００４２】
ＯＮＢ基は、メタ（ｍ）又はパラ（ｐ）位でＤｏｐａに結合できる。一実施形態において、ＯＮＢ−Ｄｏｐａは、ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａ、特に、ｍ−ＯＮＢ−Ｌ−Ｄｏｐａである。この実施形態も、ＯＮＢ−Ｄｏｐａが存在する、本願に開示されたタンパク質配列に明示的に適用可能である。
【００４３】
ｍ−ＯＮＢ−Ｌ−Ｄｏｐａの化学構造は、式（Ｉ）に相当し、ＵＶ照射によりｍ−ＯＮＢ−Ｌ−Ｄｏｐａから得られるＯＮＢ−Ｌ−Ｄｏｐａの化学構造は、式（ＩＩ）に相当する。
【００４４】
【化２】
2020511996.tif 000004
【００４５】
更なる態様では、本発明は、先の説明による改変イガイタンパク質を製造するための方法に関する。この製造方法は、下記に説明する工程を特徴とする。
【００４６】
まず、合成される改変イガイタンパク質をコードする遺伝子改変核酸配列を提供する。それにより、この改変核酸配列は、核酸の同じ部位における天然トリプレットの代わりに、１つ以上のアンバー終止コドン（ＴＡＧトリプレット）を含有する。一実施形態において、チロシンをコードするトリプレット（ＴＡＴ又はＴＡＣトリプレット）は、ＴＡＧトリプレットにより置換される。
【００４７】
一実施形態において、配列番号５、配列番号６又は配列番号７と少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、特に１００％同一である核酸配列を提供できる。
【００４８】
その後、タンパク質合成を、提供された核酸を鋳型として行う。このタンパク質合成を、例えば、細菌において、酵母細胞において、植物細胞において、植物全体において又は無細胞タンパク質合成系において行うことができる。それにより、タンパク質合成に使用される系は、特定のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの直交性ペア及び対応するｔＲＮＡを含む。それにより、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基、特に、ＯＮＢ−Ｄｏｐａを、対応するｔＲＮＡ上に転移可能である。この目的は、特に、ＯＮＢ−Ｄｏｐａが光ケージド３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基として選択されると、アミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼが配列番号８、配列番号９又は配列番号１０と少なくとも９８％、特に少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる場合に、最良に達成できる。
【００４９】
ＯＮＢ−Ｄｏｐａを合成される改変イガイタンパク質に組み込むのに使用される適切なｔＲＮＡは、文献において以前に記載されているｔＲＮＡである（非特許文献２３）。タンパク質合成系は、適切なタンパク質合成を行うための「通常の」アミノ酸ｔＲＮＡシンターゼ及び対応するｔＲＮＡを更に含む。
【００５０】
ついで、合成された改変イガイタンパク質を、アガロース樹脂、磁性ビーズ又は適切なカラムを使用するなどの当業者に一般的に知られている技術により精製できる。それにより、Ｈｉｓ６タグを、精製目的に良好に使用できる（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６を参照）。
【００５１】
異なる物質、使用及び方法に関して記載された全ての実施形態は、任意の所望の方法で組み合わせることができ、任意の他の物質、使用、又は方法に任意の所望の組み合わせで転換することができる。それにより、物質の実施形態を、使用及び方法に転換することができ、使用の実施形態を、物質及び方法に転換することができ、方法の実施形態を、物質及び使用に転換することができる。
【００５２】
本発明の態様を、例示的な実施形態及び添付の図面を参照して、下記でより詳細に説明するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】Ｂ９５．ΔＡ２３で発現させたＭＢＰ−ｆｐ−５変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を示す。
【図１Ｂ】ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの存在下で発現させたｆｐ−５変異体のＮＢＴ染色を示す。
【図１Ｃ】乾燥条件下における表面被覆分析を示す。
【図２】ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの取り込み後のＭＢＰ−ｆｐ−５（５ＴＡＧ）の逆重畳されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図３Ａ】ＭＢＰ−ｆｐ−５（５ＴＡＧ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図３Ｂ】ＭＢＰ−ｆｐ−５（１０ＴＡＧ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図４Ａ】ＡＦＭ分析により得られた、マイカ表面と相互作用するｆｐ−５（５ＴＡＧ）のＦ−Ｄ曲線を示す。
【図４Ｂ】ＡＦＭ分析により得られた、ｆｐ−５  ＷＴ及びｆｐ−５（５ＴＡＧ）を有する２つの機能化チップの力の値（force value）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
［第１の例示的な実施形態]
保護された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体を生成するために、多くの一般に知られている保護基を使用でき、Ｄｏｐａの接着特性の時空間的な活性化を可能にする。
【００５５】
優れた戦略では、容易に入手可能で安価な前駆体分子から保護されたＬ−Ｄｏｐａ類似体を生成するために、細菌細胞の代謝を設計する。これらの前駆体をアミノ酸に変換するために、新規な設計されたフェニルアラニン−アンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）又はチロシン−アンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）を発現する組換え株を作製できる。
【００５６】
例えば、ＭｊＴｙｒＲＳに基づくＯペアは、これらの保護されたＬ−Ｄｏｐａ誘導体によるインビボｔＲＮＡアミノアシル化のために設計される。例えば露光により又は下記反応スキーム１に示されるような種々の方法により、酸性加水分解を経て脱保護を達成でき、最終的に水中接着タンパク質が得られる。
【００５７】
【化３】
2020511996.tif 000005
【００５８】
反応スキーム１：保護された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体を得るために、トシル酸（ＴｓＯＨ）に導入された２，２−ジメトキシプロパン（ＤＭＰ）によるイソプロピリデンとしてのカテコール官能基の保護。翻訳後、得られたペプチドを、酸性加水分解により翻訳後脱保護して、接着ペプチドをマスク除去する。
【００５９】
［第２の例示的な実施形態］
ＯＮＢ−Ｄｏｐａを、この例示全体を通して、保護された（光ケージド）３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体残基として使用した。
【００６０】
ＯＮＢ−Ｄｏｐａ（より具体的には、ＯＮＢ基がカテコール部分のメタヒドロキシル基に付着している；ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａ）の、高いＤｏｐａ含量を自然に示すタンパク質類への多部位取り込みが可能であるかを試験するために、ｆｐ−５がイガイの湿潤接着能の重要な要素であることから、ＭＡＰ５型（ｆｐ−５）を選択した。fｐ−５は、３０ｍｏｌ％までの最大Ｄｏｐａ含量を示し、これは、Ｄｏｐａ類似体の多部位取り込みに特に魅力的である。発現試験のために、更なるＴＥＶ切断部位を有するＮ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）配列と、Ｈｉｓ６タグを備えたM. galloprovincialis由来のＣ末端ｆｐ−５配列とからなる融合構築物を使用した。
【００６１】
チロシンコドンを、新規なＯＮＢ−Ｄｏｐａ特異的ａａＲＳ（ＯＮＢ−ＤｏｐａＲＳ−１、配列番号８）により、ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの部位特異的取り込みを可能にするために、５又は１０か所をアンバーコドンで置換した。タンパク質発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株から派生した、ＲＦ１を欠失しているＢ−９５．ΔＡ２３を選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットは、ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａのｆｐ−５（５つのアンバーコドン；５ＴＡＧ）及びｆｐ−５（１０個のアンバーコドン；１０ＴＡＧ）への取り込みを示す。結果を図１Ａに示す。ＷＴ  ＭＢＰ−ｆｐ−５（レーン１）、ＭＢＰ−ｆｐ−５（５ＴＡＧ）（レーン３）及びＭＢＰ−ｆｐ−５（１０ＴＡＧ）（レーン５）を、ＴＥＶプロテアーゼにより消化し、ｆｐ−５（レーン２）、ｆｐ−５（５ＴＡＧ）（レーン４）、及びｆｐ−５（１０ＴＡＧ）（レーン６）の不溶性画分を分析した。ＯＮＢ−Ｄｏｐａ含量に応じて、ＭＢＰ−ｆｐ−５変異体の予想される分子量は最大５１〜５４ｋＤａであり、ＴＥＶ消化後のｆｐ−５変異体については最大１０〜１２ｋＤａである。
【００６２】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析におけるｆｐ−５（５ＴＡＧ）及びｆｐ−５（１０ＴＡＧ）変異体を含有する精製ＯＮＢ−Ｄｏｐａの多重バンドの出現は、先に報告されたように、ＯＮＢのニトロ基のアミンへの部分的還元により生じうる(非特許文献２１)。ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの存在下において、約１８ｍｇｌ−１の野生型（ＷＴ）ｆｐ−５（１９個のＴｙｒ残基を含有する）と比較して、それぞれ約６ｍｇｌ−１及び約１ｍｇｌ−１の精製ｆｐ−５（５ＴＡＧ）又はｆｐ−５（１０ＴＡＧ）を得た。
【００６３】
ＯＮＢ−Ｄｏｐａを有するｆｐ−５（５ＴＡＧ）及びｆｐ−５（１０ＴＡＧ）変異体の産生及び脱ケージ化を、ＴＥＶ消化後に、Ｄｏｐａ又はＤｏｐａキノン含有タンパク質類を選択的に染色する酸化還元サイクリングニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を採用することにより検証した（非特許文献２２）。明確な染色が、照射された（＋）Ｆｐ−５（５ＴＡＧ）及びＦｐ−５（１０ＴＡＧ）サンプルにおいて生じたが、後者は、より強い染色を示し、照射なし（−）では、発色はほとんど観察されなかった（図１Ｂ）。これは、ＵＶ照射によるＯＮＢ−Ｄｏｐａの脱ケージ化の成功を示す。
【００６４】
Ｄｏｐａ媒介接着についての原理証明試験として、ｆｐ−５変異体の表面接着能を、乾燥条件下での直接表面被覆アッセイを使用して試験した(非特許文献１１)（図１Ｃ）。図１Ｃの上側パネルには、クーマシー染色ドットの画像を示す。等量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びｆｐ−５変異体を、３６５ｎｍでの照射あり（＋）又はなし（−）で、ポリスチレン表面上に少なくとも６回スポットした。図１Ｃの下側パネルに示されるドット強度の定量は、照射後の接着能の向上を示す。データを、平均±ｓ．ｄ．で表わす。
【００６５】
得られたデータは、ＵＶ照射後にＤｏｐａ含量が増加するにつれて、ポリスチレン表面への接着の向上を示し、これは、組み換え的に産生された光ケージドイガイタンパク質類の接着能を実証している。まとめると、これらの結果は、ＯＮＢ−ＤｏｐａＲＳ−１がイガイタンパク質ｆｐ−５へのＯＮＢ−Ｄｏｐａの効率的な多部位取り込みを促進するため、接着能を有する光ケージドＭＡＰの組み換え産生を可能にすることを示す。
【００６６】
産生されたタンパク質類の特性を、質量分析法により更に分析した（図２及び３）。図２は、ＯＮＢＹＲＳ−１を使用するｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの取り込み後のＭＢＰ−ｆｐ−５（５ＴＡＧ）のデコンボリューションＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。見出された質量及び予想された質量は、下記のとおりである。ＭＢＰ−ｆｐ−５（５ＯＮＢ−Ｄｏｐａ）、観察：５２１１４．７Ｄａ、予想：５２１１５．８Ｄａ。
【００６７】
図３Ａは、ＭＢＰ−ｆｐ−５（５ＴＡＧ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示し、図３Ｂは、ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの取り込み、ＴＥＶ消化及びＵＶ光照射後のＭＢＰ−ｆｐ−５（１０ＴＡＧ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。見出された質量及び予想された質量は、下記のとおりである。ｆｐ−５（５Ｄｏｐａ）、観察：９８０７．９Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）、予想：９８０７．７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）。ｆｐ−５（１０Ｄｏｐａ）、観察：９８８７．５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）、予想：９８８７．７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００６８】
光ケージドＭＡＰの水中接着能を実証するために、Ｄｏｐａ媒介湿潤接着を研究するのに使用される原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づく力分光法を利用した。この目的で、二官能性アセタール−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）リンカー分子（非特許文献２４、２５）は、リジン残基を介したＭＡＰの共有結合を可能にした。
【００６９】
機能化ＡＦＭチップの力−距離（Ｆ−Ｄ）曲線を、酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．６）中において、マイカ表面上で、ＵＶ光での照射の前後に測定した（図４Ａ及び４Ｂを参照）。図４Ａは、接近信号及び後退信号の両方を示す。図４Ｂは、照射前（白色バー）及び照射後（黒色バー）の異なるｆｐ−５変異体（すなわち、ｆｐ−５  ＷＴ、ｆｐ−５（５ＴＡＧ）及びｆｐ−５（１０ＴＡＧ））により機能化された２つのチップ（ａ、ｂ）の力値を示す。データを、１００本のＦ−Ｄ曲線の平均±ｓ．ｄで表わし、有意性を、記号＊ｐ＜１０−３、＊＊ｐ＜１０−６、＊＊＊ｐ＜１０−６により表わす。ｆｐ−５  ＷＴの接着力は、いずれの測定においてもＵＶ照射により有意に変化しなかったが、ｆｐ−５（５ＴＡＧ）及びｆｐ−５（１０ＴＡＧ）は、ＵＶ露光時に接着力の有意な向上（それぞれ１２倍又は６．５倍まで）を示した。
【００７０】
Ｄｏｐａが接着の向上の要因であることを検証するために、未改変及びアミノ機能化チップを調べた。両方とも、低いｐＮ範囲での接着を示し、いずれの場合も、ＵＶ露光に影響を受けなかった。ｍ−ＯＮＢ−Ｄｏｐａの５又は１０の場合を備えたｆｐ−５のデータは、Ｄｏｐａ媒介接着の時空間制御の実現可能性及び組み換え的に産生された光ケージドＭＡＰの高い可能性についての明確な証拠を提供する。
【図１Ａ】
2020511996.tif 000006
【図１Ｂ】
2020511996.tif 000007
【図１Ｃ】
2020511996.tif 000008
【図２】
2020511996.tif 000009
【図３Ａ】
2020511996.tif 000010
【図３Ｂ】
2020511996.tif 000011
【図４Ａ】
2020511996.tif 000012
【図４Ｂ】
2020511996.tif 000013
【配列表】
2020511996000001.app
【国際調査報告】
2020511996.tif 000014
2020511996.tif 000015
2020511996.tif 000016
2020511996.tif 000017