(57)【要約】  抗体または断片の骨への局在化を改善するために、１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチド（例えばＤ１０配列）で修飾された、組み換えられ、化学的にコンジュゲートされた抗体およびそれらの断片が提供される。これらの抗体および断片の製造方法および使用方法もまた開示される。
2020505919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖、軽鎖、ならびに重鎖および／または軽鎖のＣ末端に連結された１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチドを含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、化学的コンジュゲーションによって抗体または抗原結合断片に連結されている、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、ヒンジ領域で重鎖にコンジュゲートされている、請求項２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーによって抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされている、請求項２または３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と一体化しているポリＤペプチドを含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
重鎖のＮ末端と一体化しているポリＤペプチドを含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
重鎖のＣ末端と一体化しているポリＤペプチドを含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
重鎖のＮ末端と一体化している第１のポリＤペプチド、および重鎖のＣ末端と一体化している第２のポリＤペプチドを含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
軽鎖のＣ末端と一体化しているポリＤペプチドを含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
ポリＤペプチドは、ペプチドリンカーを介して重鎖または軽鎖に融合している、請求項５〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号９）の１〜３回のリピートを含む、請求項１０に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、それぞれ独立して２〜３０個のアスパラギン酸残基を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１３】
１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、１０個のアスパラギン酸残基（配列番号１）をそれぞれ含む、請求項１２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
抗体がＩｇＧである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１５】
抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１６】
抗体または抗原結合断片は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１７】
抗体は、配列番号１３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ１〜３を含む、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１８】
抗体は、配列番号１３の残基１〜１２０に対応する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、および配列番号１５の残基１〜１０８に対応する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１９】
抗体は、２２８位（ＥＵ番号付け）にプロリンを有するヒトＩｇＧ４定常領域を含む、請求項１７または１８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２０】
抗体の重鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２１】
重鎖は、配列番号１３、１４、１６または１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１５、１９、２１または２２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体は、配列番号２および６の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ含む、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２３】
抗体の重鎖は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合するＩｇＧ４抗体。
【請求項２４】
抗体の重鎖は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合するＩｇＧ４抗体。
【請求項２５】
抗体または抗原結合断片は、同じ重鎖および軽鎖を有するがポリＤペプチドを欠く抗体と比較して、骨への局在化において少なくとも２倍の増加を示す、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２７】
ＴＧＦβの阻害から利益を得る骨状態を有する個体を治療する方法であって、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の抗ＴＧＦβ抗体または抗原結合断片の有効量を個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
ＴＧＦβの阻害から利益を得る骨状態を有する個体を治療するのに使用するための、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２９】
ＴＧＦβの阻害から利益を得る骨状態を有する個体を治療するための医薬を製造するための、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
【請求項３０】
処置は、個体における（１）ＴＧＦβレベルの低下、（２）ＴＧＦβ活性の低下、（３）骨量減少の低下、（４）骨量減少率の低下、（５）骨密度の増加、（６）骨強度の増加、および（７）ＩＬ−１１レベルの低下の少なくとも１つをもたらす、請求項２７に記載の方法、請求項２８に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
個体はヒトである、請求項２７に記載の方法、請求項２８に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
ヒトは骨形成不全症を有する、請求項３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【請求項３３】
ヒトは骨量減少または骨粗鬆症を有する、請求項３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【請求項３４】
ヒトは慢性腎臓病を有する、請求項３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【請求項３５】
ヒトは骨転移を有する癌患者である、請求項３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【請求項３６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片の重鎖、軽鎖、またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
宿主細胞は哺乳動物細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片の製造方法であって、
抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第１および第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供すること、
抗体または抗原結合断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させること、ならびに
抗体または抗原結合断片を回収すること
を含む、前記製造方法。
【請求項４１】
第１のヌクレオチド配列は、配列番号２３、２４、２５または２６を含み、第２のヌクレオチド配列は、配列番号２７、２９、３１または３２を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の骨標的抗体または抗原結合断片の製造方法であって、
抗体またはその抗原結合断片および１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを提供すること、ならびに
化学的コンジュゲーションによる共有結合を介してポリＤペプチドを抗体に結合させること
を含む、前記製造方法。
【請求項４３】
薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として、抗体または抗原結合断片を調剤することをさらに含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
骨標的化医薬組成物の製造方法であって、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を提供すること、および
抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される担体と混合すること
を含む、前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４８，７６３号の優先権を主張し、その開示はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。２０１８年１月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０１２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、７５，１１３バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、骨標的ペプチドで修飾された抗体、および病態生理学的骨変性を治療するためのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
適切な骨の発達と維持は、正常な健康にとって重要な要素である。平均的なヒトでは、骨の発達は、骨密度が典型的に最大となる約２０歳の年齢まで生じる。その後、骨密度は適切な食事と身体運動が無いと、減少する可能性がある。しかしながら、正常な骨の維持は、古い骨が取り除かれて新しい骨と置き換えられる恒常性の骨代謝回転を必要とする。
【０００５】
いまだに、骨の発達と維持に影響し得る数多くの疾患および状態がある。例えば、骨強度が損なわれ、子供の骨が脆弱となり骨折しやすくなる骨形成不全症などの疾患においては、骨の発達が影響を受ける。さらに、加齢に伴って、他の点では健康な個体でも、恒常性の骨代謝回転の欠如を生じ、骨密度が経時的に低下する骨粗鬆症、最終的には脆弱な骨および骨折を招き得る。
【０００６】
さらにまた、骨の健康が原発性疾患に付随的に影響を受け、慢性腎臓病（ＣＫＤ）のような他の併発性続発症に関与している特定の疾患がある。ＣＫＤは腎機能が経時的に低下する進行性疾患であり、しばしば骨の健康不良および骨代謝回転速度の変化に関連した心血管疾患を引き起こす。骨の健康を改善する治療が同時に付随する心血管疾患を軽減することが示されている。そのような報告は、正常な骨代謝回転率が、原因とはならないにしても、他の疾患に影響を及ぼし得ることを示唆している。したがって、骨の発達および／または維持を調節するための改善された方法論は、多数の異なる疾患および状態に罹患している個体の健康を改善する上で、広範囲に直接的または間接的な影響を及ぼし得る。
【０００７】
ＴＧＦβはトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの一員であり、哺乳動物の発生時における骨形成において重要である（非特許文献１参照）。ＴＧＦβは、恒常性の骨維持にも同様に重要であるように思われる。興味深いことに、ＴＧＦβは、ＣＫＤの患者ではより高いレベルで発現されることが示されており、これが治療的介入のための現実性のあるターゲットであることが示唆されている。抗ＴＧＦβ抗体によるＣＫＤのｊｃｋマウスモデルの全身処置は、高い骨代謝回転率の低下を実証した（非特許文献２）。しかしながら、この研究は、骨における抗ＴＧＦβ抗体の局在が治療効果を改善し得る程度については調査していない。ＴＧＦβが、ほんの数例を挙げても、ＤＮＡ損傷応答、アレルギー性免疫応答、および創傷上皮化を含む多数の細胞プロセスに関与していることを考えれば、ＴＧＦβ活性を制御するためのより標的化されたアプローチが、潜在的な望ましくない副作用を最小限に抑えるために望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．８（２）：２７２−８８（２０１２）
【非特許文献２】Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２９（５）：１１４１−５７（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ＴＧＦβ活性を調節するためのより正確なアプローチが、骨の発達および／または維持を調節するための改善された治療を提供するために必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書において提供されるのは、骨を効果的に標的とする抗体、例えば抗ＴＧＦβ抗体である。第１の側面において、本開示は、重鎖、軽鎖、および１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチドを含む抗体、またはその抗原結合断片を提供する。特定の１つの実施態様では、抗体または抗原結合断片は、重鎖、軽鎖、ならびに重鎖および／または軽鎖のＣ末端に連結された１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチドを含む。
【００１１】
１つの実施態様では、抗体またはその抗原結合断片は、同じ重鎖および軽鎖を有するが１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを欠く抗体と比較して、骨への局在化において少なくとも２倍の増加を示す。
【００１２】
１つの実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、化学的コンジュゲーションによって抗体またはその抗原結合断片に連結されている。別の実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、重鎖のヒンジ領域で連結されている。さらなる実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、軽鎖のＮ末端またはＣ末端に連結されている。なおさらなる実施態様においては、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、１つまたはそれ以上のスペーサー／リンカー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーおよびペプチドリンカー）によって、抗体またはその抗原結合断片に連結されている。
【００１３】
１つの実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、重鎖のアミノ酸配列と一体化しており、および／または１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、軽鎖のアミノ酸配列と一体化している。アミノ酸配列と「一体化」しているポリＤペプチドは、同じポリペプチド鎖に含まれる。例えば、一体化したポリＤペプチドは、組換えＤＮＡプラスミドにコードされる、重鎖または軽鎖配列と同じＲＮＡ鎖から翻訳される。１つの実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、重鎖のＮ末端と一体化しており、および／または１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、重鎖のＣ末端と一体化している。２つ以上のポリＤペプチドが、０個、１個以上の他のアミノ酸残基（すなわち、アスパラギン酸でないアミノ酸）によって、またはペプチドリンカーによって分離されて、重鎖のＮ末端またはＣ末端にタンデムに連結される。さらなる１つの実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、軽鎖のＮ末端と一体化しており、および／または１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、軽鎖のＣ末端と一体化している。例えば、２つ以上のポリＤペプチドが、０個、１個以上の他のアミノ酸残基（すなわち、アスパラギン酸でないアミノ酸）によって、またはペプチドリンカーによって分離されて、軽鎖のＮ末端またはＣ末端にタンデムに連結される。１つの実施態様では、ポリＤペプチドは、重鎖のＣ末端と一体化している。別の実施態様では、ポリＤペプチドは、重鎖のＣ末端と一体化しており、かつポリＤペプチドは、重鎖のＮ末端と一体化している。
【００１４】
１つの実施態様では、軽鎖はポリＤペプチドを含まない。別の実施態様では、重鎖はポリＤペプチドを含まない。
【００１５】
１つの実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、それぞれ独立して、２〜３０個のアスパラギン酸残基を含む。例えば、ポリＤペプチドは、２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、または１６、または１７、または１８、または１９、または２０、または２１、または２２、または２３、または２４、または２５、または２６、または２７、または２８、または２９、または３０個のアスパラギン酸残基を含み得る。別の実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、それぞれ独立して、６、７、８、９、１０または１１個のアスパラギン酸残基を含む。別の実施態様では、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、１０個のアスパラギン酸残基をそれぞれ含む；そのようなペプチドは、本明細書において「Ｄ１０」（配列番号１）と呼ばれる。一部の実施態様では、抗体または断片は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２を超えるポリＤペプチドを含んでいてもよい。
【００１６】
別の実施態様では、抗体のアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤのいずれかである。別の実施態様では、抗体のアイソタイプはＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。別の実施態様では、抗体またはその抗原結合断片は、１つまたはそれ以上のヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３などといった、１つまたはそれ以上のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と特異的に結合する。
【００１７】
１つの実施態様では、抗体断片は、１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチドを有することが意図される。抗体断片は、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを欠く同じ抗体断片と比較して、骨への局在化において少なくとも２倍の増加を示すことが想定される。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、一価ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、ｓｃＦｖ−ｓｃ、ミニボディ、ＩｇＮＡＲ、Ｖ−ＮＡＲ、ｈｃＩｇＧ、またはＶｈＨのいずれかまたはそれらの組合せであり得る。１つの実施態様では、抗体断片は、１つまたはそれ以上のヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３などといった、１つまたはそれ以上のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と結合する。本明細書の抗体または抗体断片は、完全ヒト型、ヒト化型、またはキメラ型であり得る。
【００１８】
第２の側面において、本開示は、抗体重鎖を提供する工程、抗体軽鎖を提供する工程、重鎖に結合した１つまたはそれ以上のポリＤペプチドおよび／または軽鎖に結合した１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを提供する工程、重鎖と軽鎖を組み合わせて骨を標的とする抗体またはその抗原結合断片を生成する工程を含む、骨を標的とする抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００１９】
１つの実施態様では、重鎖に結合した１つまたはそれ以上のポリＤペプチドおよび／または軽鎖に結合した１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、化学的コンジュゲーションによって結合されている。別の実施態様では、重鎖に結合している１つまたはそれ以上のポリＤペプチドおよび／または軽鎖に結合している１つまたはそれ以上のポリＤペプチドは、組換えによって結合されている。
【００２０】
第３の側面において、本開示は、配列番号２、３、４、および５のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖、ならびに配列番号６、７、８、１１、および１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体であって、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号６である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号２（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない、抗ＴＧＦβ抗体を提供する。
【００２１】
第４の側面において、本開示は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖、ならびに配列番号１５、１８、１９、２０、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体であって、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない、抗ＴＧＦβ抗体を提供する。
【００２２】
第５の側面において、本開示は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ６）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２３】
第６の側面において、本開示は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ１６）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２４】
第７の側面において、本開示は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ１１）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２５】
第８の側面において、本開示は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ１７）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２６】
第９の側面において、本開示は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ１２）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２７】
第１０の側面において、本開示は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ７）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２８】
第１１の側面において、本開示は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体（例えば、ｍＡｂ２  Ｆ２）を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。１つの実施態様では、抗体はＴＧＦβ１に特異的に結合する。
【００２９】
第１２の側面において、本開示は、配列番号２３、２４、２５、および２６のいずれかに記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンのためのコドンを含む、または含まない）を含む重鎖、ならびに配列番号２７、２８、２９、３０、３１、および３２のいずれかに記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体であって、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号２７に記載の核酸配列によってコードされる場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号２３に記載の核酸配列によってコードされるもの（重鎖Ｃ末端リジンのためのコドンを含む、または含まない）ではない、抗ＴＧＦβ抗体を提供する。
【００３０】
第１３の側面において、本開示は、配列番号２５に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンのためのコドンを含む、または含まない）、および配列番号２７に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。
【００３１】
第１４の側面において、本開示は、配列番号２６に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖（重鎖Ｃ末端リジンのためのコドンを含む、または含まない）、および配列番号２７に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＩｇＧ４抗体を提供する。この抗体はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する。
【００３２】
第１５の側面において、本開示は、骨を標的とする有効量の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を個体に投与すること、およびＴＧＦβレベルの低下、ＴＧＦβ活性の低下、骨量減少の低下、骨量減少率の低下、骨密度の増加、骨強度の増加、およびＩＬ−１１レベルの低下の少なくとも１つを検出することを含む、骨量減少について個体を治療する方法を提供する。
【００３３】
１つの実施態様では、個体はヒトである。別の実施態様では、抗ＴＧＦβ抗体または抗体断片は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３のうちの１つまたはそれ以上に特異的に結合する。さらなる実施態様において、抗ＴＧＦβ抗体は、重鎖、軽鎖、および１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチドを含む。抗体は、同じ重鎖および軽鎖を有するが１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを欠く抗体と比較して、骨への局在化において少なくとも２倍の増加を示す。１つの実施態様では、抗体のアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかである。別の実施態様では、抗体のアイソタイプはＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。１つの実施態様では、個体は、慢性腎臓病および／または、癌の骨への転移を含む骨疾患を有する。骨疾患は、骨形成不全症または骨粗鬆症であり得る。１つの実施態様では、骨を標的とする有効量の抗ＴＧＦβ抗体または抗体断片が、皮下、静脈内または筋肉内に投与される。
【００３４】
第１６の側面において、本開示は、本発明の抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。例えば、抗体は、配列番号２、３、４、および５のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖、ならびに配列番号６、７、８、１１、および１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得るが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号６である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号２（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。別の実施態様では、抗体は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖、ならびに配列番号１５、１８、１９、２９、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得るが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。
【００３５】
第１７の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体の重鎖、軽鎖、またはその両方をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供し、ここで、抗ＴＧＦβ抗体の重鎖は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含み、抗ＴＧＦβ抗体の軽鎖は、配列番号１５、１８、１９、２０、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。
【００３６】
第１８の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体の重鎖、軽鎖、またはその両方をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し、ここで、抗ＴＧＦβ抗体の重鎖は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含み、抗ＴＧＦβ抗体の軽鎖は、配列番号１５、１８、１９、２０、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。
【００３７】
第１９の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体をコードする核酸配列を含む１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、ここで、抗ＴＧＦβ抗体の重鎖は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖並びに配列番号１５、１８、１９、２９、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。１つの実施態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞または原核細胞である。別の実施態様では、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
【００３８】
第２０の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供する。この方法は、抗体またはその抗原結合断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させることを含む。宿主細胞は（ｉ）配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖をコードする核酸配列；ならびに（ｉｉ）配列番号１５、１８、１９、２９、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする核酸配列を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。１つの実施態様では、方法は、許容される担体を含む医薬組成物として、抗体またはその抗原結合断片を調剤することをさらに含む。
【００３９】
第２１の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体を含む医薬組成物を提供する。骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体は、配列番号２、３、４、および５のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）を含む重鎖、および配列番号６、７、８、１１、および１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号６である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号２（重鎖Ｃ末端リジンを含む、もしくは含まない）ではなく、または、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列（重鎖Ｃ末端リジンを含む、もしくは含まない）を含む重鎖、および配列番号１５、１８、１９、２９、２１、および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３（重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない）ではない。１つの実施態様では、医薬組成物は液体医薬品として調剤される。別の実施態様では、医薬組成物は凍結乾燥医薬品として調剤される。
【００４０】
第２２の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体を提供する。抗体の重鎖は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。抗体の軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。抗体はさらに、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、および軽鎖のＣ末端のうちの１つまたはそれ以上にＤ１０ポリペプチドを含む。
【００４１】
第２３の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体を提供し、ここで、抗体の重鎖は、配列番号３９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３および配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１〜３を含み、抗体はさらに、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、および軽鎖のＣ末端のうちの１つまたはそれ以上にＤ１０ポリペプチドを含む。一部の態様において、抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨまたはＨＣＶＤ）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬまたはＬＣＶＤ）を含む。
【００４２】
第２４の側面において、本開示は、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体であって、ここで、抗体の重鎖は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、抗体の軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含み、抗体はさらに、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、および軽鎖のＣ末端のうちの１つもしくはそれ以上にＤ１０ポリペプチドを含む、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体；または、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体であって、ここで、抗体の重鎖は、配列番号３９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３および配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１〜３を含み、抗体はさらに、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、および軽鎖のＣ末端のうちの１つもしくはそれ以上にＤ１０ポリペプチドを含む、骨を標的とする抗ＴＧＦβ抗体をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００４３】
第２５の側面において、本開示は、本明細書に記載の治療方法において使用するための、本発明の骨標的抗ＴＧＦβ抗体または抗原結合断片などの骨標的抗体を提供する。
【００４４】
第２６の側面において、本開示は、本明細書に記載の治療方法のための医薬の製造のための、本発明の骨標的抗ＴＧＦβ抗体または抗原結合断片などの骨標的抗体の使用を提供する。
【００４５】
本明細書において企図される特定の実施態様が、以下にさらに記載される。本発明の上記および他の機能および利点は、付随する特許請求の範囲とあわせて解釈される以下の本発明の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。なお、特許請求の範囲は、その中の記載によって定義され、本明細書に記載の機能および利点の具体的な説明によって定義されるのではないことに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】抗ＴＧＦβ（α−ＴＧＦβ）抗体に化学的にコンジュゲートされたＤ１０ペプチドを示す図である。
【図２】リンカー（ペプチドリンカー）とマレイミド官能基を有するペプチドを、マウスＩｇＧ１抗体上の還元されたヒンジ領域ジスルフィドに化学的にコンジュゲートさせるプロセスを示す図である。
【図３Ａ】Ｄ１０ペプチド−リンカーと抗ＴＧＦβマウスＩｇＧ１、ｍＡｂ１との化学的コンジュゲートの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。上側のバンドは重鎖を表し、下側のバンドは軽鎖を表す。
【図３Ｂ】実施例１の化学的コンジュゲーション反応におけるペプチドと抗体の比（ＰＡＲ）の値に対するペプチド−マレイミド：ｍＡｂ比を示す図であり、これは、最大８モル：モルＰＡＲまでのペプチドの数の増加に伴うＰＡＲの直線的増加を示している。
【図４Ａ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。Ｄ１０ペプチドとｍＡｂ１との化学的コンジュゲートのＳＥＣプロファイルを示す。
【図４Ｂ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。ｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲートとＴＧＦβ１との１：１モル混合物のＳＥＣプロファイルを示す。
【図４Ｃ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。未修飾ｍＡｂ１のＳＥＣプロファイルを示す。
【図４Ｄ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。ｍＡｂ１とＴＧＦβ１の１：１モル混合物のＳＥＣプロファイルを示す。
【図４Ｅ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。ハーセプチン（登録商標）のＳＥＣプロファイルを示す。
【図４Ｆ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。Ｄ１０ペプチドとハーセプチン（登録商標）との化学的コンジュゲートのＳＥＣプロファイルを示す。
【図４Ｇ】ＴＧＦβ１と、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））または抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のいずれかとＤ１０ペプチドとの化学的コンジュゲートとの１：１モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。ＴＧＦβ１と１：１の比で混合されたＤ１０とハーセプチン（登録商標）との化学的コンジュゲートのＳＥＣプロファイルを示す。
【図５Ａ】ｍＡｂ１およびＤ１０−ｍＡｂ１コンジュゲートのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィのＡ２８０トレースを示す図である（ｘ軸＝分、ｙ軸＝吸光度（標準化））。
【図５Ｂ】フロースルー（ＦＴ）およびピーク４の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ａ】増加する数のペプチドを有する化学的コンジュゲートのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを示す。各コンジュゲートについての溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を示す図である（ｘ軸＝分、ｙ軸＝吸光度（標準化））。
【図６Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された、コンジュゲートされたペプチドの数の相関的要素としての、結合した分析物の割合（上の曲線、円、左の目盛り）と保持時間（下の曲線、三角形、右の目盛り）を示す図である。
【図７】対照のコンジュゲート（ＰＡＲ＝０）および、未修飾のｍＡｂ１と比較して平均４または９個のペプチドを有するコンジュゲートを用いて、Ａ５４９細胞により実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴＧＦβ中和アッセイを示す図である。
【図８Ａ】フルオロフォア標識ｍＡｂ１および約４．５個のペプチドを含む１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の化学的コンジュゲートの時間依存的な体内分布を示す図である。動物が画像化された時間が各パネルに表示されている。写真毎に、左のマウスはｍＡｂ１を、右のマウスは化学的コンジュゲートを投与された。画像の明暗度は、分布の違いを明らかにするように調整されている。
【図８Ｂ】図８Ａに示される画像において、遠位大腿骨に対応する関心領域と心臓に対応する関心領域に見られる蛍光の比率を示す図である。丸はｍＡｂ１抗体に対応し、四角はｍＡｂ１とコンジュゲートしたＤ１０ペプチド（Ｄ１０  ｍＡｂ１）に対応している。
【図９Ａ】組換え方法を用いたＤ１０ペプチドの重鎖および／または軽鎖末端への結合によって得られる一連のｍＡｂ１融合バリアント抗体を作製するための、ＩｇＧサブタイプ抗体上のＤ１０ペプチドの可能な位置を図式的に示す図である。Ｄ１０ペプチドの付加部位は丸で示され、ペプチドリンカー配列の使用は波線で示されている（長い波線は、短い波線より長いリンカーを表す）。
【図９Ｂ】図９Ａに示されているようなペプチドの配置によって得られる、一連の融合バリアント抗体（融合バリアント）を示す図である。結合位置およびペプチドの数の様々な組合せを有する組換え融合バリアントが生成された。各図の下の小さい数字は、明確さのために本明細書において参照される各組換え融合バリアントの識別番号を示している。本明細書で言う、融合バリアントは、「融合物」または「Ｆ」のいずれかの後に目的のバリアント番号が続くようにして指定される。例えば、「融合物１」および「Ｆ１」はどちらも、Ｄ１０ペプチドを含まない抗体「１」の構成を有する抗体を指す。より長い波線は、より短い波線よりも長いリンカーを表す。
【図１０】還元（上部ゲル）または非還元（下部ゲル）条件下における、表示の精製組換えｍＡｂ１融合バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１１】示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）によって決定された、組換えｍＡｂ１融合バリアントの熱安定性を示す図である。各温度における部分的に変性した形態への遷移は、色素蛍光の増加によって検出される。温度による蛍光増加の勾配（−ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ）が計算され、サンプルの温度に対して表示されている。変性速度は、熱転移（Ｔｍ）の中間点を表す曲線の最小値で最大となる。参考のために、各組換えｍＡｂ１融合バリアントの構造が図式的に示されている。
【図１２Ａ】図９Ｂに図式的に示されている８つの組換えｍＡｂ１融合バリアントによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡ５４９細胞によるＩＬ−１１産生の誘発におけるＴＧＦβの中和を示す図である。
【図１２Ｂ】図９Ｂに図式的に示されている８つの組換えｍＡｂ１融合バリアントによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡ５４９細胞によるＩＬ−１１産生の誘発におけるＴＧＦβの中和を示す図である。
【図１３】セラミックヒドロキシアパタイトカラムでのカラムクロマトグラフィーにより評価された、ヒドロキシアパタイトに対する組換えｍＡｂ１融合バリアントおよびｍＡｂ１化学的コンジュゲートの親和性を示す図である。
【図１４】ＣＤ−１マウスにおいて、投与後の様々な時点でのライブイメージングによって得られた、選択されたフルオロフォア標識組換えｍＡｂ１融合バリアントおよびｍＡｂ１化学的コンジュゲートの体内分布を示す図である。
【図１５】ＣＤ−１マウスに投与した後における、蛍光色素標識した抗体、組換えｍＡｂ１融合バリアントおよびｍＡｂ１化学的コンジュゲートの脊柱に局在した量を示す図である。蛍光は３週間の期間にわたりＩＶＩＳ装置により測定された。ＲＯＩ内の最大蛍光の対数が示されている。
【図１６】実施例１３および図１５に記載の試験において、組換えｍＡｂ１融合バリアントのｍＡｂ１  Ｆ６、ｍＡｂ１  Ｆ１６およびｍＡｂ１  Ｆ１７、ならびにｍＡｂ１化学的コンジュゲート（「Ｃｏｎｊ」）を投与したマウスの切除した脊椎および大腿骨の１０日後と２１日後における蛍光画像を示す図である。
【図１７Ａ】実施例１５に記載されている２４および９６時間後の１０μＬの血清、ならびに切除した腰椎、遠位（小柱）大腿骨、腎臓および心臓におけるｍＡｂ２  Ｆ１およびｍＡｂ２  Ｆ６の蛍光レベルを示す図である。
【図１７Ｂ】実施例１５に記載されている２４および９６時間後の１０μＬの血清、ならびに切除した腰椎、遠位（小柱）大腿骨、腎臓および心臓におけるｍＡｂ２  Ｆ１およびｍＡｂ２  Ｆ６の蛍光レベルを示す図である。
【図１８Ａ】単回投与後、ｍＡｂ１−Ｄ１０（ｍＡｂ１  Ｆ６）を介した骨標的化が血清ＰＫに大きく影響することを示す図である。ｍＡｂ１  Ｆ６は、ＥＬＩＳＡにより測定すると、ｍＡｂ１よりも１３から１４倍低い血清曝露（ＡＵＣ）、より速い血清クリアランス、および、より短い血清半減期（ｔ１／２）を示す。データは平均±ＳＤとして表されている：分散分析（ＡＶＯＶＡ）、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較）が観察された。ｍＡｂ１は、マウスの抑制性抗ＴＧＦβモノクローナル抗体であり、ｍＡｂ１  Ｆ６はｍＡｂ１の重鎖のＣ末端に結合したアスパラギン酸ポリペプチドＤ１０を有する組換えマウス抑制性抗ＴＧＦβモノクローナル抗体である。画像／骨のＡＵＣは１．０に標準化されている。各ｍＡｂ１  Ｆ６およびｍＡｂ１の用量は５ｍｇ／ｋｇであった。
【図１８Ｂ】光学イメージングにより測定した場合、ｍＡｂ１と比較して、ｍＡｂ１  Ｆ６が骨において２２倍高い曝露（ＡＵＣ）を呈することを示す図である。データは平均±ＳＤとして表されている：ＡＶＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較）が観察された。各ｍＡｂ１  Ｆ６およびｍＡｂ１の用量は１ｍｇ／ｋｇであった。
【図１９】複数回投与のピーク−トラフＰＫプロファイルを示す図である。（ｍＡｂ１  Ｆ６による）骨標的化は、複数回投与のピーク−トラフ血清ＰＫに大きな影響を及ぼす。ｍＡｂ１  Ｆ６は、投与後２４および４８時間の両方において、ならびに初回投与および投与２３後において、ｍＡｂ１よりも低い血清濃度を示している。倍率差は、２４時間で３〜４．５倍、４８時間で６〜９倍、ｍＡｂ１  Ｆ６のほうが低かった。蓄積もまた、ｍＡｂ１よりもｍＡｂ１  Ｆ６のほうが少ないようであった。データは平均±ＳＤとして表されている：独立ｔ検定によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較）が観察された。血清濃度は質量分析によって測定された。
【図２０】骨標的化（ｍＡｂ１  Ｆ６）およびｍＡｂ１が、Ｇ６１０Ｃ（ＯＩ）マウスにおいて用量依存的にＢＶ／ＴＶ（％）を増加させることを示す図である。対照の抗体１３Ｃ４（マウスＩｇＧ１抗体）で処置したＧ６１０Ｃマウスに比べて、ＢＶ／ＴＶ（％）の有意な変化が、１および５ｍｇ／ｋｇの用量で両方の処置について観察された。１３Ｃ４（１３Ｃ４）で処置したＧ６１０Ｃマウスは、ＷＴバックグラウンド系統（ＷＴ  １３Ｃ４）に比べて、ＢＶ／ＴＶの有意な減少を示した。データは平均±ＳＤとして表されている：一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較；＃ｐ≦０．０５、１３Ｃ４とＷＴ  １３Ｃ４との比較）が観察された。ＢＶ／ＴＶ（％）はμＣＴイメージングにより測定された。
【図２１】骨標的化（ｍＡｂ１  Ｆ６）およびｍＡｂ１が、Ｇ６１０Ｃ（ＯＩ）マウスにおいて用量依存的に最大破断力（ｍａｘｉｍｕｍ  ｆｏｒｃｅ  ｔｏ  ｆａｉｌｕｒｅ）を増加させることを示す図である。１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスと比較した最大破断力の有意な変化が、ｍＡｂ１  Ｆ６については１および５ｍｇ／ｋｇ、ｍＡｂ１については５ｍｇ／ｋｇのみで観察された。抗体対照（１３Ｃ４）で処置したＧ６１０Ｃマウスは、ＷＴバックグラウンド系統と比較して最大破断力の有意な減少を示した。データは平均±ＳＤとして表されている：一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較；＃ｐ≦０．０５、１３Ｃ４とＷＴ  １３Ｃ４との比較）が観察された。最大破断力は、生体力学的圧縮試験によって測定された。
【図２２】Ｇ６１０ＣマウスにおけるＢＶ／ＴＶに対するｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６の効果を示す図である。５ｍｇ／ｋｇの抗体が様々な頻度（毎週３回、毎週１回、２週間毎に１回、または４週間毎に１回）で１２週間投与された。抗体１３Ｃ４が対照として使用された。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較；＃ｐ≦０．０５、１３Ｃ４とＷＴ  １３Ｃ４との比較）が観察された。ＢＶ／ＴＶはμＣＴイメージングにより測定された。
【図２３】Ｇ６１０Ｃマウスにおける最大破断力に対するｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６の効果を示す図である。５ｍｇ／ｋｇの抗体が様々な頻度（毎週３回、毎週１回、２週間毎に１回、または４週間毎に１回）で１２週間投与された。抗体１３Ｃ４が対照として使用された。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ６と１３Ｃ４との比較）が観察された。最大破断力は、生体力学的圧縮試験によって測定された。
【図２４】Ｇ６１０ＣマウスにおけるＢＶ／ＴＶ（％）および抗体の平均血清レベルに対するｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６の効果を示す図である。抗体は５ｍｇ／ｋｇで２週間毎に１回または毎週１回、１２週間投与された。抗体１３Ｃ４が対照として使用された。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ６と１３Ｃ４との比較；＃ｐ≦０．０５、１３Ｃ４とＷＴ  １３Ｃ４との比較）が観察された。ＢＶ／ＴＶ（％）はμＣＴイメージングにより測定された。
【図２５】Ｇ６１０ＣマウスにおけるＢＶ／ＴＶ（％）に対するｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ１６の効果を示す図である。抗体は５ｍｇ／ｋｇで毎週３回、８週間投与された。抗体１３Ｃ４が対照として使用された。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ１６と１３Ｃ４との比較；＃ｐ≦０．０５、１３Ｃ４とＷＴ  １３Ｃ４との比較）が観察された。ＢＶ／ＴＶ（％）はμＣＴイメージングにより測定された。
【図２６】野生型マウスにおけるＢＶ／ＴＶ（％）に対するｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ１１の効果を示す図である。抗体は５ｍｇ／ｋｇで毎週３回、９週間投与された。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ１１と１３Ｃ４との比較）が観察された。ＢＶ／ＴＶ（％）はμＣＴイメージングにより測定された。
【図２７】ビヒクルまたは蛍光標識したｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ６の単回腹腔内投与を受けた後の野生型マウスの腰椎における総放射効率（ｔｏｔａｌ  ｒａｄｉａｎｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を示す図である。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１  Ｆ６とｍＡｂ１との比較）が観察された。
【図２８】ビヒクルまたは蛍光標識したｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ６の単回腹腔内投与を受けた後の野生型マウスの心臓における総放射効率を示す図である。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ６との比較）が観察された。
【図２９】ビヒクルまたは蛍光標識したｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ６の単回腹腔内投与を受けた後の野生型マウスの肝臓における総放射効率を示す図である。一元配置分散分析によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ６との比較）が観察された。
【図３０】ビヒクルまたは蛍光標識したｍＡｂ１またはｍＡｂ１  Ｆ６の単回腹腔内投与を受けた後の野生型マウスの腸における総放射効率を示す図である。
【図３１】蛍光標識したｍＡｂ２またはｍＡｂ２  Ｄ１０の単回腹腔内投与を受けた２４時間または９６時間後における野生型マウスの表示の組織における総放射効率を示す図である。ｔ検定によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ６との比較）が観察された。
【図３２】蛍光標識したｍＡｂ２またはｍＡｂ２  Ｄ１０の単回腹腔内投与を受けた２４時間または９６時間後における野生型マウスの腰椎／血清総放射効率比を示す図である。
【図３３】蛍光標識したｍＡｂ２またはｍＡｂ２  Ｄ１０の単回腹腔内投与を受けた２４時間または９６時間後における野生型マウスの大腿骨／血清総放射効率比を示す図である。ｔ検定によって測定したところ、統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、ｍＡｂ２  Ｄ１０とｍＡｂ２との比較）が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、それを必要とする患者において抗体および断片が優先的に骨にホーミングするように、１つまたはそれ以上の骨標的化ポリＤペプチドに連結されている抗体およびその抗原結合断片を提供する。そのような抗体または断片の骨標的化機能は、抗体および断片が骨組織を特異的に標的化し、抗体または断片への患者の全身曝露を減らすことを可能とし、それによって望ましくない有害な副作用を最小化しつつ、薬物の効能を高める。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリＤペプチド」とは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、またはそれ以上のアスパラギン酸アミノ酸（残基）などといった、複数のアスパラギン酸またはアスパルテートまたは「Ｄ」アミノ酸を有するペプチド配列を指す。１つの実施態様では、ポリＤペプチドは、約２から約３０、または約３から約１５、または約４から約１２、または約５から約１０、または約６から約８、または約７から約９、または約８から約１０、または約９から約１１、または約１２から約１４のアスパラギン酸残基を含み得る。１つの実施態様では、ポリＤペプチドはアスパラギン酸残基のみを含む。別の実施態様では、ポリＤペプチドは、１つまたはそれ以上の他のアミノ酸または類似の化合物を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、用語「Ｄ１０」は、配列番号１に見られるように、１０個のアスパラギン酸アミノ酸の連続した配列を指す。一部の実施態様では、本発明の抗体または抗体断片は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２を超えるポリＤペプチドを含んでいてもよい。
【００４９】
ポリＤペプチドは、組換え技術または化学的コンジュゲーションを介して目的の抗体または抗原結合断片に連結される。本明細書中で使用される場合、用語「融合バリアント」または「バリアント」とは、Ｄ１０配列などのようなポリＤペプチドが組み込まれているか、または何らかの形で結合している重鎖または軽鎖または抗体断片または下位部分の少なくとも１つを含む、組み立てられた抗体構築物（図９Ｂ参照）を指す。例えば、ポリＤペプチドは、組換え技術（例えば、ここで、ポリＤペプチド配列は、重鎖、軽鎖、または抗体断片もしくは下位部分のアミノ酸配列と一体化している）、化学的コンジュゲーション、またはその両方によって融合バリアント中の抗体鎖に連結される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「化学的コンジュゲート」とは、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドが化学反応によって、例えば、重鎖、軽鎖、抗体断片、または下位部分のアミノ酸配列に存在するシステイン残基と連結されている少なくとも１つの重鎖または軽鎖または抗体断片または下位部分を含む、組み立てられた抗体を指す。コンジュゲーションに使用し得る例示的なシステイン残基は、重鎖ヒンジ領域にあるものである。システイン残基またはコンジュゲーションに適切な他の残基はまた、突然変異誘発によっても抗体鎖に導入し得る。ペプチドリンカーまたは化学的部分（例えば、マレイミド官能基およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などのスペーサー／リンカーを、コンジュゲーションにおいてポリＤペプチドと抗体成分との間において使用してもよい。抗体への所望の部分の化学的コンジュゲーションのための方法は、当技術分野において周知である。例えば、ＢｅｈｒｅｎｓとＬｉｕ，ｍＡｂｓ  ６：１，４６−５３（２０１４）を参照。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「一体化している」とは、ポリＤペプチドが、抗体鎖と同じＲＮＡ転写物から転写され、抗体鎖と同じポリペプチド配列中に存在するような、組換え技術による抗体鎖とポリＤペプチドの統合を指す。このような場合、ポリＤペプチドは、抗体鎖のいずれかまたは両方の末端で、ペプチドリンカーまたはアミノ酸スペーサーを伴ってまたは伴わずに、抗体鎖に連結され、または、抗体鎖の適切なフォールディング、抗体分子の集合、または抗体のその抗原への結合に影響を及ぼすことなく、抗体鎖の内部に組み込まれる。
【００５２】
本発明の骨標的抗体の例示的なフォーマットが図９Ｂに示されている（フォーマットＦ２〜Ｆ２０）。骨標的ペプチド（丸で表される）は、抗体の重鎖および／または軽鎖の一方または両方の末端に結合または融合（例えば、一体化）される。一部の実施態様では、骨標的ペプチドは、軽鎖のＮ末端を介して軽鎖に結合されていない。結合または融合は、直接的な連結（すなわち、スペーサーまたはリンカーなし）、またはスペーサーまたはリンカー（波線で表される；例えば、ペプチドリンカー）を介するものであり得る。これらのフォーマットの具体例が以下の表１および７に示されている。
【００５３】
本発明においては、例えば、組換え技術または化学的コンジュゲーションによって骨標的ペプチドを目的の抗体に結合させるために、任意の適切なスペーサーまたはリンカーを使用し得る。例えば、Ｇ４Ｓペプチド（配列番号９）の１、２、３、またはそれ以上のリピートを有するペプチドリンカーを使用してもよい。他の適切なペプチドリンカーもまた使用し得る。例えば、Ｃｈｅｎら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６５（１０）：１３５７−１３６９（２０１３）を参照。
【００５４】
例示的な骨標的抗体およびその抗原結合断片
本発明は、それに結合した１つまたはそれ以上のポリＤ（ポリアスパラギン酸またはポリ−Ａｓｐ）ペプチド（例えば、Ｄ１０配列）を有する抗体および抗原結合断片を開示する。これらの修飾抗体および断片は、骨への局在化が改善されている。１つの特定の実施態様では、これらの抗体は、本明細書に記載のような抗ＴＧＦβ抗体である。理論に束縛されることを望まないが、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを用いて抗ＴＧＦβ抗体を骨に対して効果的に標的化することは、ＴＧＦβに関連する病態生理学的な骨変性を特徴とする疾患を有する個体に対して、新たな治療を提供し得ると考えられる。
【００５５】
しかしながら、本明細書中の多数の実施態様および実施例は、α−ＴＧＦβ抗体とＤ１０配列を使用する文脈で表現されているが、本明細書に記載の骨標的化部分で異常な骨状態または骨疾患を治療するのに適した他の抗体またはタンパク質を修飾し得ると考えられる。例えば、骨量減少を治療するため、骨成長を刺激するため、または骨中の異常な細胞（例えば癌細胞）を標的化するための治療用抗体が、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の骨標的ペプチドに連結される。治療用抗体は、骨の形成または維持に関与するタンパク質またはペプチドに結合し得る。さらに、他の骨局在化ペプチドまたは標的化ペプチドを使用してもよい。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「α−ＴＧＦβ抗体」および「抗ＴＧＦβ抗体」は交換可能に使用され、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３に特異的な抗体またはその抗原結合断片を指す。例えば、α−ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つの抗原結合部位（またはパラトープ）は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３に見出されるエピトープに結合する。
【００５７】
１つの実施態様において、企図されるα−ＴＧＦβ抗体−Ｄ１０構築物は、化学的コンジュゲーションによって作製される。例えば、化学的コンジュゲーションは、米国特許第７，７６３，７１２号、第４，６７１，９５８号、および第４，８６７，９７３号に開示されているものなど、当技術分野で既知の方法によって実施され、これらはそれぞれ参照によって本明細書に組み入れられる。別の例では、ペプチドまたは他のリンカーが、Ｄ１０ペプチドを抗体に結合させるために使用される（図１および図２を参照）。さらなる実施態様では、抗体のヒンジ領域のチオール基（例えば、ヒンジ領域のシステイン残基）の還元が、ＰＥＧスペーサーを用いたポリＤペプチドの化学的コンジュゲーションを可能にする。同様に、抗体および断片に天然に存在するか、または突然変異誘発によって導入された、企図される抗体および抗体断片の他のシステイン残基が、ポリＤペプチドと化学的にコンジュゲートされる。Ｄ１０ペプチドと化学的にコンジュゲートされたα−ＴＧＦβ抗体の１つのそのような考えられる組み立てスキームが図２に示されている。
【００５８】
別の実施態様では、企図されるα−ＴＧＦβ抗体−Ｄ１０構築物は、Ｄ１０配列がα−ＴＧＦβ抗体の重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に付加される組換え発現によって作製される。例えば、重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸配列が、α−ＴＧＦβ抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ末端、Ｃ末端のいずれか、またはＮ末端とＣ末端の両方で発現されるＤ１０配列をコードするように修飾される。同様に、１つまたはそれ以上のＤ１０配列が、抗体重鎖のアミノ酸配列のヒンジ領域またはその近傍において、および／または抗体軽鎖のアミノ酸配列内に付加される。Ｄ１０を有する重鎖および／または軽鎖の各核酸配列は、発現ベクターに組み込み、続いて、核酸配列を発現して対応するアミノ酸配列に翻訳することができる宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。さらに、宿主細胞は、重鎖および軽鎖のそれぞれをその相補的配列と組み合わせてα−ＴＧＦβ抗体−Ｄ１０構築物を形成することによって、発現されたアミノ酸配列を機能性タンパク質に組み立てることができる。企図される組換えα−ＴＧＦβ抗体−Ｄ１０融合バリアントの例が、図９Ａおよび図９Ｂに示されている。
【００５９】
本明細書ではポリＤペプチドについて論じられているが、抗体、別のタンパク質、またはペプチドの骨への標的化を可能にするために、他の類似のペプチドも使用し得る。例えば、アスパラギン酸リピート配列は、約２、または約４、または約６、または約８、または約１２、または約１４、または約１６、または約１８、または約２０、または約３０、または６、７、８、９、１０または１１残基などといった、Ｄ１０配列よりも多いまたは少ない残基を有していてもよい。さらに、グルタメートのような類似の化学的性質を有する他の天然アミノ酸、または非天然アミノ酸、および／または他の化学的に等価な化合物は、アスパラギン酸の代わりに、またはそれと組み合わせて使用し得る。
【００６０】
１つの実施態様では、それに結合した１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを有する抗体は、１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを含まない同じ抗体と比較して、骨への局在化において、少なくとも約２倍、または約３倍、または約５倍、または約１０倍、または約２０倍の増加を示すと考えられる。
【００６１】
さらに、α−ＴＧＦβ抗体が本明細書に記載されているものの、骨形成または骨維持に関与する他のタンパク質に結合する任意の抗体を、所望に応じて抗体を骨に標的化するために同様に修飾し得る。本明細書において企図される抗体またはその抗原結合断片は、任意の種に由来するものでよく、または、異なる種由来の重鎖および軽鎖を組み合わせたハイブリッド抗体であってもよく、任意の所望のエピトープに対して特異的であり得る。さらに、本明細書において使用し得る抗体は、アイソタイプによって限定されず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤのうちの任意のものであり得る。抗体断片もまた使用し得る。例えば、Ｄ１０配列または他の骨標的化化合物は、本明細書に記載されるような所望の結果を達成するために、Ｆａｂおよび／またはＦｃ断片または任意の他の抗体断片に結合される。さらに、Ｄ１０配列はｓｃＦｖ断片および他の類似の融合タンパク質に結合される。別の実施態様では、Ｄ１０配列は、Ｓ２２８Ｐコア−ヒンジ突然変異（ＥＵ番号付け方式に従った番号付け；または代替的にＫａｂａｔ方式に従うとＳ２４８Ｐ；Ｋａｂａｔら．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版，合衆国政府印刷局，１６５−４９２（１９８７）；およびＳｉｌｖａら，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０：５４６２−５４６９（２０１５）を参照）を有する抗体に結合させてもよい。
【００６２】
さらなる実施態様では、本明細書で企図される抗体および／または他のタンパク質は、追加的な分子とコンジュゲートされる。例えば、本明細書で企図される抗体または他のタンパク質は、注射されるかまたは他の方法で対象に導入された場合に、抗体／タンパク質を追跡することを可能にする化学標識とコンジュゲートされる。例えば、放射性標識、蛍光化合物などが、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの追跡を助けるために抗体／タンパク質に結合される。さらに、本明細書で企図される抗体および／または他のタンパク質はまた、小分子、医薬品、抗新生物剤、成長ホルモン、ビタミンなどといった治療効果を有するさらなる化合物とコンジュゲートされ、抗体および／または他のタンパク質が１つまたはそれ以上のそのような化合物のためのビヒクルとして働くようにしてもよい。
【００６３】
一部の実施態様では、骨標的抗ＴＧＦβ抗体は、配列番号２、３、４、および５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号６、７、８、１１、および１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号６である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号２ではない。例示的な抗体は、ｍＡｂ１  Ｆ３、ｍＡｂ１  Ｆ４、ｍＡｂ１  Ｆ５、ｍＡｂ１  Ｆ６、ｍＡｂ１  Ｆ８、ｍＡｂ１  Ｆ９、ｍＡｂ１  Ｆ１０、ｍＡｂ１  Ｆ１１、ｍＡｂ１  Ｆ１３、ｍＡｂ１  Ｆ１４、ｍＡｂ１  Ｆ１５、ｍＡｂ１  Ｆ１６、ｍＡｂ１  Ｆ１８、ｍＡｂ１  Ｆ１９、およびｍＡｂ１  Ｆ２０である（表１）。
【００６４】
他の実施態様では、骨標的抗ＴＧＦβ抗体は、配列番号１３、１４、１６、および１７のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号１５、１８、１９、２０、２１および２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むが、ただし、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５である場合、重鎖アミノ酸配列は配列番号１３ではない。例示的な抗体は、ｍＡｂ２  Ｆ３、ｍＡｂ２  Ｆ４、ｍＡｂ２  Ｆ５、ｍＡｂ２  Ｆ６、ｍＡｂ２  Ｆ８、ｍＡｂ２  Ｆ９、ｍＡｂ２  Ｆ１０、ｍＡｂ２  Ｆ１１、ｍＡｂ２  Ｆ１３、ｍＡｂ２  Ｆ１４、ｍＡｂ２  Ｆ１５、ｍＡｂ２  Ｆ１６、ｍＡｂ２  Ｆ１８、ｍＡｂ２  Ｆ１９、およびｍＡｂ２  Ｆ２０である（表７）。
【００６５】
一部の実施態様では、抗ＴＧＦβ抗体などの本発明の抗体は、重鎖にＣ末端リジンを有さない。Ｃ末端リジンは、製造中にまたは組換え技術によって除去できる（すなわち、重鎖のコード配列がＣ末端のリジンのコドンを含まない）。よって、本発明の範囲内で企図されるのは、Ｃ末端リジンを含まない、配列番号２または１３の重鎖アミノ酸配列を含む抗体でもある。ポリＤペプチドは、Ｃ末端リジンを伴って、または伴わずに、重鎖のＣ末端に結合される。
【００６６】
治療方法
１つの特定の実施態様では、ＴＧＦβに関連する骨量減少についてヒト患者などの個体を治療する方法は、骨を標的とする有効量の抗ＴＧＦβ抗体を個体に投与することを含む。この方法はさらに、ＴＧＦβレベルまたは活性の低下、骨量減少または骨量減少率の低下、骨密度の増加、および／または骨強度の増加を測定または検出する工程を含み得る。
【００６７】
本明細書で使用される「有効量」は、それを必要とする個体に投与されたときに、例えば、骨に関連するＴＧＦβのレベルまたは活性を低下させること、骨量減少または骨量減少率を低下させること、骨密度を増加させること、および／または骨強度を増加させること、などによって個体の健康を改善する、α−ＴＧＦβ抗体または抗体断片などの治療薬の量を指す。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「個体」とは動物を指す。個体の例は、ヒト、家畜、家庭用ペット、および他の動物を含むが、これらに限定はされない。個体のさらなる例は、ＴＧＦβに関連した骨疾患を有する動物を含む。
【００６９】
別の実施態様では、化学的コンジュゲートまたは組換え融合バリアントなどの１つまたはそれ以上の骨標的抗ＴＧＦβ抗体を含有する、水性液体医薬品製剤および凍結乾燥医薬品製剤を含む、医薬抗体製剤または組成物が企図される。骨標的抗ＴＧＦβ抗体および／または抗体断片を含む医薬組成物は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２８６９３３Ａ９号に記載されるように、またはそうでなければ当該分野で知られるようにして調剤し得る。
【００７０】
１つの特定の実施態様では、骨疾患を治療する方法は、慢性腎臓病に関連する骨疾患、骨への癌転移、または異常代謝状態などといった骨疾患を有する個体に骨を標的とする有効量の抗ＴＧＦβ抗体を投与することを含む。別の特定の実施態様では、骨形成不全症を治療する方法は、骨を標的とする有効量の抗ＴＧＦβ抗体を、骨形成不全症を有する個体に投与することを含む。さらなる特定の実施態様では、骨粗鬆症を治療する方法は、骨を標的とする有効量の抗ＴＧＦβ抗体を骨粗鬆症の個体に投与することを含む。
【００７１】
一部の実施態様において、患者は、本発明の骨標的化抗体または抗体断片と別
の治療薬、例えば骨量減少状態の治療薬（例えばビスホスホネート）との組合せで治療される。抗体または抗体断片および他の治療薬は、患者に同時にまたは逐次的に投与される。
【００７２】
一部の実施態様では、本発明の治療方法において使用される骨標的化抗体および他の成分は、キットまたは製品において提供される。
【００７３】
抗体の作製方法
本発明の抗体または断片は、当技術分野において十分に確立されている方法によって作製し得る。抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子が転写および翻訳制御配列などの必要な発現制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどを含む。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列は、別々のベクターに挿入してもよく、また、同一または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に機能的に連結してもよい。１つの実施態様では、両方のコード配列が同一の発現ベクターに挿入され、同じ発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）、別々の同一の発現制御配列（例えば、プロモーター）に、または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に機能的に連結される。抗体コード配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位とベクターとのライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端のライゲーション）によって発現ベクターに挿入し得る。
【００７４】
抗体鎖遺伝子に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有していてもよい。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例は、レトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のもの（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス由来のもの（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のものなどの哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルス要素、ならびに天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターのような強力な哺乳動物プロモーターを含む。
【００７５】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの、さらなる配列を保有していてもよい。例えば、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子は、（ｄｈｆｒ−宿主細胞においてメトトレキサート選択／増幅と共に使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、（Ｇ４１８選択のため）ｎｅｏ遺伝子、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子を含み得る。
【００７６】
本発明の抗体をコードする発現ベクターは、発現のために宿主細胞に導入される。宿主細胞は、抗体の発現に適した条件下で培養され、次いで、抗体が回収され単離される。宿主細胞は、哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞を含む。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３フリースタイル細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および他の多数の細胞株を含む。細胞株は、それらの発現レベルに基づいて選択し得る。使用可能な他の細胞株は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞のような昆虫細胞株である。
【００７７】
さらに、抗体の発現は、多くの既知の技術を用いて増強し得る。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。
【００７８】
宿主細胞用の組織培養培地は、ウシ血清アルブミンなどの動物由来成分（ＡＤＣ）を含んでも含まなくてもよい。一部の態様においては、ＡＤＣを含まない培地がヒトの安全のために好まれる。組織培養は、流加培養法、連続灌流法、または宿主細胞および所望の収率に適した他の任意の方法を用いて実施し得る。
【００７９】
医薬組成物
本発明の抗体は、適切な貯蔵安定性のために調剤できる。例えば、抗体は、凍結乾燥されるか、または薬学的に許容される賦形剤を用いて使用のために保存または再構成される。併用療法のために、抗体などの２つ以上の治療剤を共配合してもよく、例えば混合されて単一の組成物中において提供される。
【００８０】
用語「賦形剤」または「担体」は、本発明の化合物以外の任意の成分を記述するために本明細書中で使用される。賦形剤の選択は、特定の投与方法、溶解度および安定性に対する賦形剤の効果、ならびに剤形の性質などの要因に大きく左右される。「薬学的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組合せである。場合によっては、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムが組成物に含まれるであろう。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤または、湿潤剤または乳化剤のような少量の補助物質、保存料または緩衝剤であり、これらは抗体の貯蔵寿命または有効性を高める。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、単一の単位用量として、または複数の単一単位用量として、バルクで製造、包装、または販売される。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量、またはそのような投与量の簡便な割合、例えばそのような投与量の半分または三分の一に等しい。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、典型的には非経口投与に適している。本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的破壊および組織中の裂け目を通した医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路を含み、よって、一般に血流中、筋肉内、または内臓への直接的な投与をもたらす。したがって、非経口投与は、組成物の注射による、外科的切開部を通した組成物の適用による、組織貫通非外科的創傷を通した組成物の適用などによる、医薬組成物の投与を含むが、これらに限定はされない。特に、非経口投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、および滑液内注射または注入；ならびに腎臓透析注入技術を含むことが企図されるが、これらに限定はされない。局所灌流もまた企図される。好ましい実施態様は、静脈内経路および皮下経路を含み得る。
【００８３】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、無菌水または無菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わされた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、製造、包装、または販売される。注射用製剤は、アンプルまたは防腐剤を含む複数回投与用容器などの単位投与形態で、製造、包装、または販売される。非経口投与用の製剤は、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペーストなどを含むが、これらに限定はされない。そのような製剤は、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含むがこれらに限定されない１つまたはそれ以上の追加の成分をさらに含み得る。非経口投与用製剤の１つの実施態様では、活性成分は、再構成組成物の非経口投与の前に適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質非含有水）で再構成するための乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供される。非経口製剤はまた、塩、炭水化物および緩衝剤（例えば、３〜９のｐＨ）などの賦形剤を含み得る水溶液も含むが、一部の用途では、それらは滅菌非水溶液として、または無菌の発熱物質非含有水のような適切なビヒクルと共に使用される乾燥形態として、より適切に調剤し得る。例示的な非経口投与形態は、滅菌水溶液、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液中の溶液または懸濁液を含む。そのような剤形は、所望により適切に緩衝し得る。有用な他の非経口投与製剤は、微結晶形態またはリポソーム製剤中に活性成分を含むものを含む。非経口投与用の製剤は、即時放出および／または調節放出となるように調剤してもよい。調節放出製剤は、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出およびプログラム放出を含む。
【００８４】
一部の実施態様において、本発明の抗体または抗原結合断片は４０、２０、または１５ｍｇ／ｋｇ以下（１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍｇ／ｋｇなど）で投与される。一部のさらなる実施態様において、用量は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５ｍｇ／ｋｇであり得る。投与頻度は、例えば、毎日、２、３、４、または５日毎、毎週、隔週、または３週間毎、毎月、隔月、３ヶ月毎、６ヶ月毎、または１２ヶ月毎、または必要に応じてであり得る。抗体は、静脈内（例えば、０．５〜８時間にわたる静脈内注入）、皮下、筋肉内、または状態および医薬製剤に適した他の任意の投与経路によって投与し得る。
【００８５】
例示的な実施態様
本発明のさらなる特定の実施態様が、以下に記述される。
【００８６】
１．重鎖、軽鎖、ならびに（ｉ）重鎖、（ｉｉ）軽鎖のＣ末端、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方に連結された１つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸（ポリＤ）ペプチドを含む、抗体またはその抗原結合断片。
【００８７】
２．１つまたはそれ以上のポリＤペプチドが、化学的コンジュゲーションによって抗体または抗原結合断片に連結されている、実施態様１に記載の抗体または抗原結合断片。
【００８８】
３．１つまたはそれ以上のポリＤペプチドが、ヒンジ領域で重鎖にコンジュゲートされている、実施態様２に記載の抗体または抗原結合断片。
【００８９】
４．１つまたはそれ以上のポリＤペプチドが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーによって抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされている、実施態様２または３に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９０】
５．重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と一体化しているポリＤペプチドを含む、実施態様１に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９１】
６．重鎖のＮ末端と一体化しているポリＤペプチドを含む、実施態様５に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９２】
７．重鎖のＣ末端と一体化しているポリＤペプチドを含む、実施態様５に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９３】
８．重鎖のＮ末端と一体化している第１のポリＤペプチド、および重鎖のＣ末端と一体化している第２のポリＤペプチドを含む、実施態様５に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９４】
９．軽鎖のＣ末端と一体化しているポリＤペプチドを含む、実施態様５〜８のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【００９５】
１０．ポリＤペプチドが、ペプチドリンカーを介して重鎖または軽鎖に融合している、実施態様５〜９のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【００９６】
１１．ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号９）の１〜３回のリピートを含む、実施態様１０に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９７】
１２．１つまたはそれ以上のポリＤペプチドが、それぞれ独立して２〜３０個のアスパラギン酸残基を含む、前述の実施態様のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【００９８】
１３．１つまたはそれ以上のポリＤペプチドが、１０個のアスパラギン酸残基（配列番号１）をそれぞれ含む、実施態様１２に記載の抗体または抗原結合断片。
【００９９】
１４．抗体がＩｇＧである、前述の実施態様のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【０１００】
１５．抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、実施態様１５に記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０１】
１６．抗体または抗原結合断片が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の１つまたはそれ以上に特異的に結合する、前述の実施態様のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０２】
１７．抗体が、配列番号１３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ１〜３を含む、実施態様１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０３】
１８．抗体が、配列番号１３の残基１〜１２０に対応する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、および配列番号１５の残基１〜１０８に対応する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、実施態様１７に記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０４】
１９．抗体が、２２８位（ＥＵ番号付け）にプロリンを有するヒトＩｇＧ４定常領域を含む、実施態様１７または１８に記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０５】
２０．抗体の重鎖が、重鎖Ｃ末端リジンを含む、または含まない配列番号１３のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、実施態様１９に記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０６】
２１．重鎖が、重鎖Ｃ末端リジンを含む、もしくは含まない配列番号１３のアミノ酸配列、Ｃ末端Ｄ１０配列の直前にリジンを含む、もしくは含まない配列番号１４、重鎖Ｃ末端リジンを含む、もしくは含まない配列番号１６、またはＣ末端Ｄ１０配列の直前にリジンを含む、もしくは含まない配列番号１７を含み、軽鎖が、配列番号１５、１９、２１、もしくは２２のアミノ酸配列を含む、実施態様１７に記載の抗体。
【０１０７】
２２．抗体が、Ｃ末端リジンを含む、または含まない配列番号２、ならびに配列番号６の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ有するマウス抗体１Ｄ１１である、実施態様１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【０１０８】
２３．抗体の重鎖が、（Ｃ末端Ｄ１０配列の直前にリジンを含む、または含まない）配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合するＩｇＧ４抗体。
【０１０９】
２４．抗体の重鎖が、（Ｃ末端Ｄ１０配列の直前にリジンを含む、または含まない）配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合するＩｇＧ４抗体。
【０１１０】
２５．抗体または抗原結合断片が、同じ重鎖および軽鎖を有するがポリＤペプチドを欠く抗体と比較して、骨への局在化において少なくとも２倍の増加を示す、前述の実施態様のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【０１１１】
２６．前述の実施態様のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１１２】
２７．ＴＧＦβの阻害から利益を得る骨状態を有する個体を治療する方法であって、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の抗ＴＧＦβ抗体または抗原結合断片の有効量を個体に投与することを含む、前記方法。
【０１１３】
２８．（１）ＴＧＦβレベルの低下、（２）ＴＧＦβ活性の低下、（３）骨量減少の低下、（４）骨量減少率の低下、（５）骨密度の増加、（６）骨強度の増加、および（７）ＩＬ−１１レベルの低下の少なくとも１つを検出することをさらに含む、実施態様２７に記載の方法。
【０１１４】
２９．ＴＧＦβの阻害から利益を得る骨状態を有する個体を治療するのに使用するための、実施態様１６〜２５のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
【０１１５】
３０．ＴＧＦβの阻害から利益を得る骨状態を有する個体を治療するための医薬を製造するための、実施態様１６〜２５のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片の使用。
【０１１６】
３１．個体がヒトである、実施態様２７に記載の方法、実施態様２９に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または実施態様３０に記載の使用。
【０１１７】
３２．ヒトが骨形成不全症を有する、実施態様３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【０１１８】
３３．ヒトが骨量減少または骨粗鬆症を有する、実施態様３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【０１１９】
３４．ヒトが慢性腎臓病を有する、実施態様３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【０１２０】
３５．ヒトが骨転移を有する癌患者である、実施態様３１に記載の方法、使用のための抗体もしくは抗原結合断片、または使用。
【０１２１】
３６．実施態様１〜２５のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片の重鎖、軽鎖、またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【０１２２】
３７．実施態様３６に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【０１２３】
３８．実施態様３７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１２４】
３９．宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施態様３８に記載の宿主細胞。
【０１２５】
４０．実施態様１〜２５のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片の製造方法であって、
抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第１および第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供すること、
抗体または抗原結合断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させること、ならびに
抗体または抗原結合断片を回収すること
を含む、前記製造方法。
【０１２６】
４１．第１のヌクレオチド配列が、（重鎖Ｃ末端リジンのコドンを含む、または含まない）配列番号２３、２４、２５または２６を含み、第２のヌクレオチド配列が、配列番号２７、２９、３１または３２を含む、実施態様４０に記載の方法。
【０１２７】
４２．骨標的抗体または抗原結合断片の製造方法であって、
抗体またはその抗原結合断片および１つまたはそれ以上のポリＤペプチドを提供すること、ならびに
化学的コンジュゲーションによる共有結合を介してポリＤペプチドを抗体に結合させること
を含む、前記製造方法。
【０１２８】
４３．薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として、抗体または抗原結合断片を調剤することをさらに含む、実施態様４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０１２９】
４４．骨標的化医薬組成物の製造方法であって、
実施態様１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を提供すること、および
抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される担体と混合すること
を含む、前記製造方法。
【０１３０】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、それらは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
【０１３１】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様、およびその様々な用途を例示するものである。それらは説明の目的のためだけに記載されており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３２】
ＴＧＦβ抗体
本明細書においてｍＡｂ１と呼ばれる第１の抗ＴＧＦβ抗体は、ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に特異的（「汎特異的」）なマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体であり、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である（クローン＃１Ｄ１１、ミネアポリス、ミネソタ州）。ｍＡｂ１抗体は、実施例において鋳型として役立った。
【０１３３】
実施例において使用される、本明細書中でｍＡｂ２と呼ばれる第２の抗ＴＧＦβ抗体は、ヒンジ変異Ｓ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け）を有するヒト抗ＴＧＦβ  ＩｇＧ４抗体である。ｍＡｂ２抗体は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第９，０９０，６８５号に開示されている抗体と同様である。抗体ｍＡｂ２は、グリコシル化されていない場合、１４４ＫＤの推定分子量を有する。その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３および１５である。これら２つの配列は以下に示されている。可変ドメインはイタリック体で示されており、本明細書では重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ、配列番号３９）および軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＤ、配列番号４０）と名付けられている。ＣＤＲは四角で示されており、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１、配列番号３３）；ＨＣＤＲ２（配列番号３４）；およびＨＣＤＲ３（配列番号３５）、ならびに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１、配列番号３６）；ＬＣＤＲ２（配列番号３７）；およびＬＣＤＲ３（配列番号３８）と名付けられている。重鎖の定常ドメイン中のグリコシル化部位は、太字になっている（Ｎ２９７）。
【０１３４】
【化１】
2020505919.tif 000003
【０１３５】
本明細書中に記載されているように、骨形成または骨維持に関与するタンパク質に結合する他の抗体、抗体断片、タンパク質、またはペプチドを使用してもよい。
【実施例１】
【０１３６】
Ｄ１０ペプチドとｍＡｂ１  α−ＴＧＦβ抗体との化学的コンジュゲートの製造
α−ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１のＤ１０ペプチド化学的コンジュゲートを図２に示されるようにして製造した。ｍＡｂ１（２．０ｍｇ）をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた３回の限外濾過によって、脱気ホウ酸緩衝液（２５ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＰＡ、２０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中に交換した。次に、ヒンジ領域のジスルフィドをｍＡｂあたり１２モル：モルのジチオトレイトール（ＤＴＴ）により３７℃で２時間、還元した。この生成物を、脱気ホウ酸緩衝液４ｍＬによりＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａフィルターを用いて脱塩した。一定分量（１ｎｍｏｌ、１５０μｇ）を２５℃で漸増量（１〜１５モル：モル）のＤ１０−マレイミドペプチド（Ａｃ−Ｄ１０−Ｃ２−ＰＥＧ１２−Ｃ６−マレイミド、ここでＰＥＧ１２は１２個のエチレンオキシド基を含む規定の長さのＰＥＧから成る）と反応させた。１．５時間後、残りの未反応のチオール基をＮ−エチルマレイミド１２当量の添加と、それに続く１．５時間のインキュベーションによってブロックした。この生成物を限外濾過により脱塩した。図３Ａは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）近赤外スキャナー（ＬｉＣｏｒ）で画像化した４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル上における各生成物０．５μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーン蛍光プロファイルをＡｌｐｈａＶｉｅｗソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  Ｃｏｒｐ．）を用いて統合し、ペプチド対抗体比（ＰＡＲ）を決定した。重鎖または軽鎖のそれぞれにおける移動度のわずかなシフトは、単一のＤ１０ペプチドの付加を表すと仮定されるが、これは、重鎖については最大５つの識別可能なバンド、軽鎖については１つの識別可能なバンドと一致し、それぞれのヒンジ領域システインの数とも一致する。重鎖および軽鎖上のペプチドの平均数は、各マイナーバンドの相対存在量とその割り当てられたペプチド数との積の合計から別々に計算された。各鎖はＩｇＧ全体中に２つあるため、ＰＡＲは、重鎖および軽鎖からのそれらの数の２倍の合計から計算された。化学的コンジュゲーション反応におけるＰＡＲ値対ペプチド−マレイミド：ｍＡｂ比が図３Ｂに示されており、これは、最大８モル：モルまでのコンジュゲートされたペプチドの数の増加に伴うＰＡＲの直線的な増加を示している。
【実施例２】
【０１３７】
ＴＧＦ−β１へのｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲートの結合
この例では、ＤＴＴの比を８〜１０モル：モルに変え、マレイミド−ペプチド：ｍＡｂを３または１５モル：モルのいずれかにしたことを除き、実施例１に記載したのと同じようにして、異なるＰＡＲの一群の化学的コンジュゲートを製造した。対照として、ヒトＩｇＧ１（ハーセプチン（登録商標））化学的コンジュゲートをアルゴン下、３７℃、２時間の３モル：モルのトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）による、そのヒンジジスルフィドの還元と、それに続く、２５℃で一晩、１５モル：モルのマレイミド−ペプチドによる反応によって製造し、限外濾過を用いて脱塩することにより精製した。
【０１３８】
ＴＧＦ−β１と結合するそれらの能力を評価するために、化学的コンジュゲートを１：１のモル比でＴＧＦ−β１と混合し、続いて、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でサイズ排除クロマトグラフィーを行った。ｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲート単独は、図４Ａに示されるように、未修飾ｍＡｂ１よりも早く溶出する幾分不均一なピークを生成し、これは、コンジュゲートされたペプチドによって生じる電荷効果による可能性が高い。コンジュゲートへのＴＧＦ−β１の添加は、ｍＡｂ１またはｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲートのいずれよりも早く溶出するピークを生じ、これは、より高分子量の複合体の形成を示している（図４Ｂ）。同様に、未修飾ｍＡｂ１抗体へのＴＧＦ−β１の添加は、より早い保持時間へのシフトを生じさせた（図４Ｃ、４Ｄ）。対照的に、ハーセプチン（登録商標）へのＤ１０の化学的コンジュゲーションは、ｍＡｂ１コンジュゲートと同様に抗体単独の保持時間にシフトを引き起こしたが（図４Ｅ、４Ｆ）、ハーセプチン（登録商標）−Ｄ１０コンジュゲートへのＴＧＦ−β１の添加（１モル：モル）は、その溶出時間または見かけのＭＷにいかなる変化も生じさせず（図４Ｆ、４Ｇ）、これは、コンジュゲートへの結合が、コンジュゲーションの結果として生じたものではないことを示している。
【実施例３】
【０１３９】
ヒドロキシアパタイトへのｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲートのペプチド依存的結合
この例では、図２に示されているように、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＰＡ、２０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８中、１２当量のＤＴＴを用いて、３７℃で２時間、ヒンジ領域ジスルフィドを還元し、続いて、遊離チオールの一部をジスルフィドに変換するために２モル：モルの２，２’−ジピリジルジスルフィド（Ｓｉｇｍａ）と反応させることによって、Ｄ１０とｍＡｂ１との化学的コンジュゲートを生成した。これに続き、実施例１に記載のＤ１０−マレイミドペプチドとの反応を行った。最終生成物は、限外濾過により精製した。一部（２５μｇ）は、スピンカラムで５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中に交換し、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）タイプＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）の１００μＬカラムでクロマトグラフィーにかけ、５〜５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の勾配で０．５ｍＬ／分の流速で溶出させた。未修飾のｍＡｂ１を対照として使用した。Ａ２８０カラムプロファイルが図５Ａに示されている。ｍＡｂ１はカラムへの微量の結合のみを示したが、コンジュゲートの約半分が結合し、０．２Ｍリン酸付近で溶出した。画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図５Ｂ）。未結合（フロースルーまたは「ＦＴ」）画分は、ほぼ未修飾ｍＡｂを示したが、主ピーク４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定で６のＰＡＲを有するコンジュゲートを含んでいた。
【実施例４】
【０１４０】
ヒドロキシアパタイトへの結合に対する一連のペプチド負荷の影響
この例では、実施例１に記載の様々な数のペプチドを有する一連のＤ１０ペプチド化学的コンジュゲートを、実施例３に記載のようなＣＨＴタイプＩＩカラムでのクロマトグラフィーにかけた。Ａ２８０プロファイルおよび結合したコンジュゲートの割合およびピーク保持時間のプロットが図６Ａに示されている。図６Ｂに見られるように、カラムに結合したコンジュゲートの量は、ＰＡＲ３．８まで増加して横ばいになり、より多くのペプチドでは減少し始めた。対照的に、樹脂によるコンジュゲートの保持時間（相互作用の強さを示す）は、９までのペプチド数の増加に伴い増加した。
【実施例５】
【０１４１】
ＴＧＦ−β１をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和する能力に対するｍＡｂ１へのＤ１０ペプチド化学的コンジュゲーションの効果
この例では、３つのｍＡｂ１−Ｄ１０コンジュゲートのセットを、図２に示されるように、実施例１に記載されているようにして製造した。対照のコンジュゲートは、コンジュゲーション中にＤ１０−マレイミドペプチドを省くことによって製造した。図３に示されるようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、これら３つのコンジュゲートについて、ペプチド負荷（ＰＡＲ）は０、５または９であると決定した。次いで、これらのコンジュゲートがＴＧＦ−β１を不活性化する能力を１時間のＴＧＦ−β１との共インキュベーションによって決定した。次いで、増殖培地中の連続希釈物をヒトＴＧＦ−β１受容体を発現するヒトＡ５４９細胞に加え、続いて一晩インキュベートした。次いで、活性ＴＧＦ−β１に対する細胞応答を増殖培地中へのＩＬ−１１の放出によって決定し、これをＩＬ−１１に特異的なＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。３つのコンジュゲートおよびｍＡｂ１対照についてのＩＬ−１１応答が図７に示されている。全ての場合において、約０．１ｎＭの抗体でＩＬ−１１放出の最大半量阻害（ＥＣ５０）が生じた。両方のコンジュゲート（ＰＡＲ＝５およびＰＡＲ＝９）とペプチドを欠く擬似コンジュゲート（ＰＡＲ＝０）は、ｍＡｂ１よりもわずかに良好な阻害を示した。コンジュゲートしたペプチドの数は、ＥＣ５０に影響を及ぼさなかった。
【実施例６】
【０１４２】
マウスに投与したｍＡｂ１の体内分布に対するコンジュゲートされたＤ１０ペプチドの影響
Ｄ１０−ｍＡｂ１化学的コンジュゲートを、図２に示されるように、実施例１に記載されているのと同様にして製造した。ｍＡｂ１（１９．６ｍｇ）を脱気ホウ酸緩衝液中に交換し、３７℃で１．５時間、１０．６当量（１．０６μｍｏｌ）のＤＴＴと反応させた後、緩衝液交換せずに、アルゴン下、２５℃で１．５時間、６当量のＤ１０ペプチド（Ａｃ−Ｄ１０−Ｃ２−ＰＥＧ１２−Ｃ６−マレイミド）と反応させた。コンジュゲーションされていない遊離のチオールは、Ｎ−エチルマレイミド１２当量の添加と、それに続く２５℃、３０分間のインキュベーションによりブロックした。最終生成物を限外濾過により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、ペプチド対抗体比を決定した（約４．８のＰＡＲ）。軽鎖は、軽鎖システイン残基への単一のペプチドの付加に対応する微量のバンドを示した。
【０１４３】
コンジュゲートおよびｍＡｂ１抗体対照を、製造者によって記載された条件を用いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）により別々に標識した。蛍光試験品をＳＫＨ−１無毛マウスに投与し、これを投与直後（０．３〜１時間）、および４時間後、ならびに１、２、３、４、７、８、および９日後にＩＶＩＳ装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により画像化した。１ｍｇ／ｋｇの標識ｍＡｂ１およびコンジュゲートを注射したマウスの画像が図８Ａに示されている。標識ｍＡｂ１の蛍光は、体全体に均一に分布しており、このパターンは９日間にわたって維持されたが、強度は減少した。対照的に、１日後、ｍＡｂ１−Ｄ１０コンジュゲートは、骨への局在化と一致して、背側正中、四肢および尾部またはその付近に濃縮されていたが、体の他の場所ではほとんど検出できないレベルであった。図８Ａの画像と一致して、図８Ａの画像において測定された心臓の蛍光と比較した遠位大腿骨の蛍光の比率は、対照と比較して、ｍＡｂ１−Ｄ１０コンジュゲートについては、２４時間までに有意に上昇しており（Ｐ＜０．０５）、１６８時間まで有意に上昇したままであった（図８Ｂを参照）。この分布は、強度がわずかに変化しただけで、９日間にわたって維持された。
【実施例７】
【０１４４】
組換えマウス抗ＴＧＦβ−Ｄ１０抗体融合バリアントの製造
図９Ａおよび図９Ｂに示される一群の組換え抗ＴＧＦβ−Ｄ１０ペプチド融合バリアントを以下のようにして製造した。
【０１４５】
重鎖および軽鎖発現ベクター構築物
様々な位置にＤ１０ペプチドを有するｍＡｂ１重鎖および軽鎖を発現するための一群のプラスミドを生成した。さらに、Ｄ１０ペプチドを含まない野生型のｍＡｂ１重鎖および軽鎖についても、２つのプラスミドを生成した。クローニング目的のためにインフレームで設計された適切な制限酵素部位に隣接した、全てのコドン最適化配列を合成により生成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。Ｃ末端にＤ１０ペプチドを含む、または含まないマウスＩｇＧ１定常領域、およびｍＡｂ１野生型軽鎖全体をコードする３つの遺伝子断片をＡｐａＬＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素およびその後のライゲーションを用いて、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（２００２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２）：Ｅ９）によって記載されたｐＴＴベクターの類似体である空のエピソーム哺乳動物発現ベクターｐＦＦにクローニングし、「ｍＩｇＧ１＿ＣＨ１２３＿ｐＦＦ」、「ｍＩｇＧ１＿ＣＨ１２３Ｄ１０＿ｐＦＦ」および「ｍＡｂ１＿ＶＬＣＬ＿ｐＦＦ」を作製した。Ｎ末端Ｄ１０ペプチドを含む、または含まない可変領域をコードする遺伝子断片は、重鎖についてはＡｐａＬＩ／ＥａｇＩを、軽鎖についてはＡｐａＬＩ／ＭｆｅＩを用いて、ベクターにクローニングした。野生型定常領域を置換するために、ＭｆｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用して、Ｃ末端Ｄ１０および異なる長さのＧ４Ｓ（配列番号９）スペーサーを有するマウスＩｇカッパ軽鎖の定常領域をコードする遺伝子断片を「ｍＡｂ１＿ＶＬＣＬ＿ｐＦＦ」にクローニングした。各構築物に予想される正しいＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定（ＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．）によって確認した。
【０１４６】
融合バリアントの構築および発現
表１に記載の融合バリアントおよびペプチドなしの対照を生成するために、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターの各々の１つを同時トランスフェクションのために選択することによって、融合バリアントを作製した。「ＰＡＲ」（ペプチド対抗体比）は、その重鎖および軽鎖の両方において、最終的に発現される抗体に付加されていると予想されるペプチドの総数を反映している。融合バリアントＩＤ「ｍＡｂ１  Ｆ１」は、修飾なしのｍＡｂ１配列と実質的に同一である「野生型」（「ｗｔ」）構築物を表す。「ＨＣ」はｍＡｂ１の重鎖を表し、「ＬＣ」はｍＡｂ１の軽鎖を表し、「Ｄ１０」はＤ１０ペプチド（配列番号１）を表し、「Ｇ４Ｓ」は一部の構築物に組み込まれるｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ（配列番号９）からなるスペーサー配列を表す。
【０１４７】
【表１】
2020505919.tif 000004
【０１４８】
所望の組換え融合バリアントが発現される能力を評価するために、表１からの１６個のバリアントを、製造者によって記載された条件を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への同時トランスフェクションによって評価した。４日後、発現を馴化培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。全てのバリアントが、１０〜３０μｇ／ｍＬと推定されるレベルで発現されていた。５および７日後にわずかに高いレベルが観察されたが、発現レベルはバリアントに依存的であった。ＷＴ（ｍＡｂ１  Ｆ１）、ＨＣ−Ｄ１０：ＬＣ−Ｄ１０（ｍＡｂ１  Ｆ８）、およびＨＣ−Ｄ１０：ＬＣ−Ｇ４Ｓ−Ｄ１０（ｍＡｂ１  Ｆ９）は特に高い発現を示したが、一方Ｄ１０−ＨＣ：Ｄ１０−ＬＣ（ｍＡｂ１  Ｆ１２）の発現は乏しかった。
【０１４９】
より大規模な発現
２０種類全ての組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントを３０ｍＬスケールでＥｘｐｉ２９３−Ｆ細胞において発現させた。馴化培地（ＣＭ）を６日目に回収し、発現レベルを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。最初の評価と比較して、やや高いレベルの発現（３０〜１５０μｇ／ｍｌ）が観察されたが、相対的な発現レベルは、より小規模のトランスフェクションと一致していた。
【実施例８】
【０１５０】
組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントの特徴付け
発現レベルおよびＴＧＦ−β１結合
発現レベルの定量化およびＴＧＦ−β１に結合する組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントの能力をＯｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ３８４を用いて評価した。マウスＩｇＧのためのＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを、サンプル希釈液（０．０１％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１：１０に希釈した馴化培地または１．２５〜１００μｇ／ｍＬの範囲の精製ｍＡｂ１標準の２倍連続希釈液中に浸漬させた。サンプルを５００ｒｐｍで振盪しながら、結合データを２分間収集した。力価は、初期結合速度の４パラメータフィットおよび標準から得られたものとの比較を用いて計算した。次いで、バイオセンサーを希釈液で１分間洗浄して培地を除去し、ベースラインを再確立して、次いで、結合を追跡するために４０ｎＭのＴＧＦ−β１を含有するウェルに１０００ｒｐｍで３分間浸漬させた。この後、１０００ｒｐｍで３分間、希釈液にセンサーを移すことによる解離工程が続いた。表２に見られるように、培地中の融合バリアントの濃度は、１１〜１７８μｇ／ｍＬの範囲（「Ｏｃｔｅｔ濃度」）であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察された傾向（「発現レベル」）と概して一致していた。さらに、融合バリアントの全てがＴＧＦ−β１に結合することができ、これは、表示の位置のいずれかにＤ１０ペプチドが存在することが、抗原結合に深刻な影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【０１５１】
マウスＦｃＲｎ結合
組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントによるマウスＦｃＲｎ結合をＯｃｔｅｔ  ＱＫ３８４を用いて評価した。全ての工程を１０００ｒｐｍで実施した。１０μｇ／ｍＬの抗体濃度を達成するように希釈された馴化培地を５分間、抗マウスＩｇＧ  Ｆｖバイオセンサーに接触させた。次いで、バイオセンサーを、ベースラインを確立するために、ＰＢＳＰ  ｐＨ６．０（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％界面活性剤Ｐ２Ｏ）中に浸漬させた。次いで、センサーをＰＢＳＰ  ｐＨ６．０中１μＭに希釈された可溶性マウスＦｃＲｎを含有するウェルに３分間移し、続いてＰＢＳＰ  ｐＨ６．０を含有するウェル中で３分間解離させた。表２に示されるように、全てのバリアントがマウスＦｃＲｎに結合した。
【０１５２】
プロテインＧ結合
組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントによるプロテインＧへの結合をＯｃｔｅｔ  ＱＫ３８４を用いて評価した。プロテインＧバイオセンサーをサンプル希釈液中１０μｇ／ｍＬ抗体に希釈した馴化培地を含むウェルに浸漬させ、１０００ｒｐｍで３分間シグナルを追跡した。表２に示されるように、全てのバリアントがプロテインＧに結合した。
【０１５３】
【表２】
2020505919.tif 000005
【０１５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製ＷＴ構築物ならびに組換え融合バリアントｍＡｂ１  Ｆ２、ｍＡｂ１  Ｆ６、ｍＡｂ１  Ｆ７、ｍＡｂ１  Ｆ１１、ｍＡｂ１  Ｆ１２、ｍＡｂ１  Ｆ１６、およびｍＡｂ１  Ｆ１７を還元および非還元条件下、４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、クマシーブルーにより染色した。ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標）イメージャーによって収集した可視光画像が図１０に示されている。重鎖および／または軽鎖の移動度のわずかな低下が観察され、これは、それぞれについて予想されるＤ１０ペプチドの存在および数と一致していた。不純物および共有結合性の凝集体は検出されなかった。
【０１５５】
示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）による熱安定性
重鎖および軽鎖の末端におけるＤ１０ペプチドの全ての可能な組合せを代表するいくつかの組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントの熱安定性を、レポーター色素としてＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した示差走査蛍光光度法によって決定した。より高い温度でのタンパク質の安定性は、典型的な貯蔵条件下でのそれらの安定性を予測するものであり、よって、治療薬としての製造および使用に対するそれらの適合性を評価するために使用し得ることが一般に受け入れられている。熱安定性は、タンパク質構造のアンフォールディングによって露出される疎水性領域への結合に伴って蛍光に増加を示す色素を用いて、リアルタイムＰＣＲ装置上で評価される（Ｌｏら，２００４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３２（１）：１５３−９）。１：１０００希釈のＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを含むサンプル（タンパク質１ｍｌあたり０．５ｍｇで１０μＬ）の蛍光をＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムで温度を上げながら追跡した。データはＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ３．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析した。図１１は、いくつかのバリアントについての温度による蛍光の変化率を示している。構造遷移によって影響されないタンパク質構造の部分への色素の結合を分離するため、一般に絶対蛍光ではなく変化率が使用される。負の変位は蛍光変化率の増加を反映し、最小値はアンフォールド状態への遷移の中間点（「Ｔｍ」）を表す。試験したバリアントのいくつか（ｍＡｂ１  Ｆ６、ｍＡｂ１  Ｆ１１、ｍＡｂ１  Ｆ１６）は、未修飾の抗体対照（「ＷＴ」＝ｍＡｂ１  Ｆ１）と区別がつかないＴｍプロファイルを示した。他の２つ（ｍＡｂ１  Ｆ２およびｍＡｂ１  Ｆ７）は、主要な遷移についてＴｍの有意な減少を示した。２つのバリアント（ｍＡｂ１  Ｆ１２およびｍＡｂ１  Ｆ１７）が最も低いＴｍ値を示した。特に、軽鎖のＮ末端にＤ１０ペプチドを含む４つ全ての組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントがＴｍの有意な減少を示し、これは、ｍＡｂ１抗体上のこの位置にペプチドが配置されると、その構造が不安定になることを示唆している。逆に、重鎖のいずれかの末端へのＤ１０ペプチドの配置は、Ｔｍのいかなる変化とも相関していなかった。図１１に示されているように観察されたいくつかの融合バリアントについての優勢な遷移のＴｍ値が表３にまとめられている。
【０１５６】
【表３】
2020505919.tif 000006
【実施例９】
【０１５７】
ＴＧＦ−β１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和における組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントの効力
ＴＧＦ−β１活性の中和における組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントの効力を、培地に添加したＴＧＦ−β１に応答したＡ５４９腫瘍細胞によるＩＬ−１１の分泌のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害によって決定した。手順は、実施例３に記載されているようにして行った。実施例７からのいくつかの代表的な融合バリアントを（それらの精製の容易さの指標として）それらのプロテインＧに対する親和性に基づき選択した。８つのバリアント（ｍＡｂ１  Ｆ１、ｍＡｂ１  Ｆ２、ｍＡｂ１  Ｆ６、ｍＡｂ１  Ｆ７、ｍＡｂ１  Ｆ１１、ｍＡｂ１  Ｆ１２、ｍＡｂ１  Ｆ１６、およびｍＡｂ１  Ｆ１７）についてのＴＧＦ−β１阻害プロファイルが図１２Ａおよび図１２Ｂに示されている。全ての融合タンパク質がｍＡｂ１対照と同様なＥＣ５０を示した。
【実施例１０】
【０１５８】
組換え融合バリアントによるＴＧＦ−β１の結合
実施例７の組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントをＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって検出される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使い、ＴＧＦ−β１結合について定量的にも評価した。平衡定数ＫＤを決定するために、精製されたバリアントを含有するサンプルを、アミンカップリングしたＴＧＦ−β１を有するセンサーチップに通した。チップ上の隣接するＴＧＦ−β１分子から生じるアビディティー効果の可能性を最小化するために、１００応答単位（ＲＵ）未満のＴＧＦ−β１の標的固定化レベルを選択した。固定化のレベルは、チップ表面のＮＨＳ／ＥＤＣ活性化後、エタノールアミンでクエンチする前の応答単位の変化によって決定した。融合バリアント、ＷＴ融合バリアントＦ１、およびｍＡｂ１対照をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で３０、１０、３、１および０．３７ｎＭに希釈し、ＴＧＦ−β１チップ上に３０μＬ／分で３分間通し、続いて５分間、同じ緩衝液中での解離を行った。試験の間に、流速７５μＬ／分でチップ上に４０ｍＭのＨＣｌを３０秒間で２回注入して通すことによって、チップ表面を再生し、結合した抗体を除去した。表４に示されるように、全ての融合バリアントおよびＷＴ構築物（Ｆ１）についての平衡定数（ＫＤ）がｍＡｂ１対照の２．４倍以内であった。予想外なことに、融合バリアントにより誘発された最大のシグナル（ＲＵ）は、ペプチドの数の増加に伴って減少し、バリアントＦ１７（Ｄ１０−ＨＣ−Ｄ１０／Ｄ１０−ＬＣ、ＰＡＲ＝６）が最も低いシグナルを示した。これは、試験された全ての融合バリアントがＴＧＦ−β１の中和においてｍＡｂ１またはＷＴ構築物のいずれかに匹敵するか、またはそれよりも強力であることを示した実施例９に記載されているＡ５４９細胞の効力アッセイとは対照的である。この低下の可能な説明は、チップマトリクス（カルボキシメチルデキストラン）と負に荷電したＤ１０ペプチドとの間の静電反発力から反映され得る。
【０１５９】
【表４】
2020505919.tif 000007
【実施例１１】
【０１６０】
ヒドロキシアパタイトへの組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントの結合
実施例７からの組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントを、実施例３に記載されているセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムへの結合についても試験し、それらが骨のミネラル構造に結合する可能性を評価した。組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアント（５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４中、各２５μｇ）をヒドロキシアパタイトの１００μＬカラム（ＣＨＴタイプＩＩ、ＢｉｏＲａｄ）に付し、０．００５〜０．５Ｍリン酸Ｎａ＋（ｐＨ７．４）の勾配を用いて溶出させた。カラムから溶出する移動相中のタンパク質をＡ２８０で追跡した。カラム性能の一貫性を確実にするために、各組の試験の始めと終わりに標準（通常、ｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲート）について試験した。図１３は各試験のＡ２８０プロファイルを示している。以下の表５には、保持時間（ＲＴ）および結合画分が示されている。１つを除く全ての組換え融合バリアントがほぼ定量的に結合したが、それらの保持時間に反映されるように、親和性に差を示した。保持時間の順位はＰＡＲとあまり相関せず、これは、ペプチドの位置が結合に有意に影響することを示唆している。特に、最も強い結合（最高のＲＴ）がバリアントＦ７（ＰＡＲ４）で観察された一方、バリアントＦ１７（ＰＡＲ６）はわずかに弱い結合を示した。１つのバリアント（Ｆ６、ＰＡＲ２）は、ほとんどのＰＡＲ４バリアントよりも弱い結合を示したが、他のＰＡＲ２バリアント（Ｆ２およびＦ１１）よりも有意に良好であった。軽鎖のＮ末端のみにペプチドを有する１つのバリアント（Ｆ２）は、そのＲＴおよび結合画分に反映されるように、弱い結合しか示さなかった（２３％）。ｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲート（「ＣＣ」；約４のＰＡＲ）は２つのピークを生成し、８４％が全てのＰＡＲ４融合バリアントよりも早いＲＴで溶出した。
【０１６１】
【表５】
2020505919.tif 000008
【実施例１２】
【０１６２】
組換え融合バリアントのマウスにおける体内分布
実施例６に記載されているようにして作製された組換えｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアント（Ｆ６、Ｆ１６、およびＦ１７）およびｍＡｂ１−Ｄ１０化学的コンジュゲートから選択されたサブセットの体内分布をＣＤ−１マウスへの尾静脈注射後に決定した。組換えバリアントは、発現および精製収率、ＴＧＦ−β１結合親和性、細胞での効力、およびヒドロキシアパタイトへの結合を含む、いくつかの要因に基づき選択した。これらのバリアントは、標的化がヒドロキシアパタイトへの結合を再現するかどうか、またはそれがペプチドの数の相関的要素であるかどうかを評価するために、２、４、または６個のＤ１０ペプチドを含む例を含んでいた。タンパク質をＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、プロテインＡ上で精製した。３つの組換えｍＡｂ１融合バリアントをｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏで詳細に分析した。これらにおいて、Ｄ１０ペプチドは、重鎖のＣ末端（ｍＡｂ１  Ｆ６）、重鎖のＮ末端およびＣ末端の両方（ｍＡｂ１  Ｆ１６）、または重鎖のＮ末端およびＣ末端と軽鎖のＣ末端（ｍＡｂ１  Ｆ１７）のいずれかのみに組換え的に付加されていた。ｍＡｂ１  Ｆ６、Ｆ１６およびＦ１７組換えバリアントはそれぞれ、２、４および６のペプチド対抗体比（ＰＡＲ）を有している。実施例６の試験において骨への標的化を示したｍＡｂ１−Ｄ１０ペプチド化学的コンジュゲート（約４．８のＰＡＲ）をポジティブコントロールとして選択した。
【０１６３】
組換え融合バリアントおよび化学的コンジュゲートは、５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ８．６５中、色素：タンパク質モル比およそ５：１でＤｙｌｉｇｈｔ（登録商標）８００−４×ＰＥＧ  ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との反応により標識した。標識の度合い（ＤＯＬ）は、色素：タンパク質比の調整によって２０％（約１．２モル：モル）以内に維持した。次いで、標識タンパク質を尾静脈注射によりＣＤ−１マウスに１ｍｇ／ｋｇで投与した。続いて、投与後２４、４８、１６８、および５０４時間（３週間）にＩＶＩＳ小動物近赤外イメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により麻酔をかけた動物を撮像した。骨への送達を確認するために、２４０および５０４時間において、大腿骨および脊椎を各群の動物から回収した。
【０１６４】
図１４の背面図に示されているように、ｍＡｂ１−Ｄ１０融合バリアントおよび化学的コンジュゲートは全て、脊柱近くの背側正中に濃縮され、３週間（５０４時間）そこに留まったが、試験品のシグナル強度間に有意差が観察された。図１４に示されているように、肩と骨盤との間の脊柱の部分を含む関心領域（ＲＯＩ）を定量化に使用した。ＤＯＬに対して標準化したＲＯＩ内の最大放射効率を計算し、図１５に示されるようにプロットした。重鎖Ｃ末端のそれぞれにＤ１０ペプチドを有する組換え融合バリアントＦ６は、試験の全過程（３週間）にわたって、全ての構築物の脊柱において最高のレベルを示した。４８時間後、ＲＯＩ内のシグナル強度の順位は、バリアントＦ６＞バリアントＦ１６＞バリアントＦ１７≒化学的コンジュゲートとなっており、この順序は、試験の過程を通して維持された（図１５）。Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を使用して計算された、経時的なＲＯＩ内の最大放射効率からバックグラウンドの自己蛍光（ビヒクルのみの対照動物由来）を差し引いた曲線下面積（ＡＵＣ）が表６に示されている。ｍＡｂ１対照と比較して、骨曝露（ＡＵＣ）には８〜２２倍の増加があり、Ｄ１０含有構築物間では中程度の差（最大２．５倍）があった。バリアントＦ６は、ｍＡｂ１と比較して、最も高い増加を示した（２１．８倍、ｐ＜０．０５）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）を使用して計算された組織半減期も同様に、バリアントＦ６ではｍＡｂ１と比較して、骨における半減期に１０倍超の増加を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１６５】
各コホートの代表的な動物からの脊椎および大腿骨を２４０および５０４時間後に単離し、周囲の組織から分離して画像化した（図１６）。これらのサンプルの相対蛍光強度は、生きている動物で観察された背面画像シグナルと一致しており、これは、それらが骨における組換え融合バリアントおよび化学的コンジュゲートの存在を反映していることを示している。
【０１６６】
【表６】
2020505919.tif 000009
【実施例１３】
【０１６７】
組換えヒト抗ＴＧＦβ−Ｄ１０抗体融合バリアントの製造
重鎖Ｃ末端にＤ１０配列を有するｍＡｂ２（ヒンジ変異Ｓ２２８Ｐを有するヒト抗ＴＧＦβＩｇＧ４抗体）を製造するための発現ベクター（すなわち、ｍＡｂ２  ＨＣ−Ｄ１０／ｍＡｂ２  ｗｔ  ＬＣ（配列番号１４／配列番号１５）、これはバリアントＦ６におけるものに対応する立体配置を有し（図９Ｂ参照）、以下ｍＡｂ２  Ｆ６と呼ばれる；表７参照）を、実施例７に記載されているのと同様にして生成した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をミニプレップＤＮＡでトランスフェクトし、６日後に馴化培地（６０ｍＬ）を回収し、タンパク質生成物をＨｉＴｒａｐプロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。
【０１６８】
【表７】
2020505919.tif 000010
【実施例１４】
【０１６９】
マウスにおけるヒト抗ＴＧＦβ−Ｄ１０抗体融合タンパク質の体内分布
組換えｍＡｂ２バリアントＦ６（ｍＡｂ２  Ｆ６）およびｍＡｂ２対照抗体をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、１ｍｇ／ｋｇの用量でＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与した。２４時間後および９６時間後、数匹のマウスを屠殺し、脊椎および大腿骨を切除し、ＩＶＩＳ装置で画像化した。屠殺時に得られた血清サンプル（１０μＬ）を並行して画像化した。大腿骨遠位（小柱）ＲＯＩおよび腰椎についての平均総放射効率が図１７Ａおよび図１７Ｂに示されている。表８には相対強度がまとめられている。これらの結果は、ｍＡｂ２へのＤ１０の組換え付加の結果として、９６時間後における腰椎および大腿骨における抗体量の大幅な増加を示し、血清中の有意な減少を示している。
【０１７０】
【表８】
2020505919.tif 000011
【実施例１５】
【０１７１】
マウス抗ＴＧＦβ−Ｄ１０抗体融合タンパク質のマウスにおける単回投与の血清および骨での薬物動態
この例では、マウス抗ＴＧＦβ−Ｄ１０抗体融合タンパク質の薬物動態をマウスにおいて測定した。
【０１７２】
ｍＡｂ１または組換えｍＡｂ１  Ｆ６（表２参照）の単回用量をＧ６１０Ｃマウス（骨形成不全症動物モデル；各時点につきｎ＝１２）に腹腔内投与し、投与後４時間または２、７、１５、２２、および４３日後に血液サンプルを採取した。関連する抗体の血清濃度を検出および定量するために最適化されたＥＬＩＳＡが利用された。
【０１７３】
骨の画像化のために、フルオロフォア標識ｍＡｂ１、組換えｍＡｂ１  Ｆ６または他の様々なＤ１０代替物の単回用量をヌードＣＤ−１マウスに静脈内投与し（各時点につきｎ＝３）、投与後４時間または１、２、４、７、１０、および２１日後にｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングを実施した。マウス脊柱の蛍光画像を生成し、これは、骨中のｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ６との間の相対的な試験品の比較を可能にした（図示せず）。
【０１７４】
血清および骨における薬物動態プロファイルはそれぞれ、図１８Ａおよび１８Ｂに見られ、以下の表９の薬物動態パラメータを与えた。
【０１７５】
結果は、単回投与後の血清および骨中のｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ６との間の薬物動態における基本的な対比を明らかにした。ｍＡｂ１  Ｆ６は、ｍＡｂ１と比較して、血清中において１３倍少ないＡＵＣ（曝露）、骨中で２２倍高い曝露を示した。加えて、ｍＡｂ１  Ｆ６は血清中でｍＡｂ１よりも１４倍短いｔ１／２と、それに応じて１３倍速いクリアランスを示した。最後に骨については、ｍＡｂ１  Ｆ６はｍＡｂ１よりも１１倍長いｔ１／２と、それに応じて１７倍遅いクリアランスを示した。これらの属性は、安全性の観点からＴＧＦβの末梢（血清）阻害が望ましくない場合がある臨床領域におけるヒト型のｍＡｂ１−Ｄ１０にとって有利であり得る一方、骨中のより高い曝露は効能を高め得る。
【０１７６】
【表９】
2020505919.tif 000012
【実施例１６】
【０１７７】
マウス抗ＴＧＦβ−Ｄ１０抗体融合タンパク質のマウスにおける複数回投与のピークトラフ血清薬物動態
この例では、骨形成不全症の動物モデルにおいて、複数回投与のピーク−トラフ薬物動態試験を実施した。
【０１７８】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６（表２参照）を０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの濃度でＧ６１０Ｃマウス（ｎ＝１０）の腹腔内に８週間にわたって毎週３回（合計２４回投与）投与し、血液サンプルを投与１および投与２３の後（試験の開始時および終了時）、２４時間および４８時間後に採取した。結果は１ｍｇ／ｋｇの投与量についてのみ示されている（図１９参照）。関連する抗体の血清濃度を検出および定量するために最適化された質量分析アッセイが利用された。
【０１７９】
結果は以下の表１０に表示されている。結果は、投与１および２３の両方の後の血清におけるｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ６との間の薬物動態の基本的な対比を明らかにした。投与１および２３のどちらについても、投与後２４および４８時間の両方で、ｍＡｂ１と比較してｍＡｂ１  Ｆ６について有意に低い血清濃度が観察された。加えて、ｍＡｂ１  Ｆ６の投与後２４から４８時間の間の勾配は、投与量１および２３の両方でｍＡｂ１と比較して、より急勾配であり、これは、ｍＡｂ１  Ｆ６はおそらくその高い骨（ヒドロキシアパタイト）への親和性のために、ｍＡｂ１よりも速い速度で血清（全身循環）を離脱することを示唆している。最後に、ｍＡｂ１  Ｆ６およびｍＡｂ１の両方が、投与１から２３まで血清中に蓄積しているように見えるが、ｍＡｂ１  Ｆ６はｍＡｂ１と比較して、低下した濃度で蓄積するように見える（投与１から２３までに、ｍＡｂ１  Ｆ６：２．５〜３．５倍蓄積、ｍＡｂ１：４〜５．５倍蓄積）。これらの属性は、安全性の観点からＴＧＦβの末梢（血清）阻害が望ましくない場合がある臨床領域におけるヒト型のｍＡｂ１  Ｆ６にとって有利であり得る。
【０１８０】
【表１０】
2020505919.tif 000013
【実施例１７】
【０１８１】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６を用いた腰椎骨における複数回投与効能試験
この例では、骨の密度および強度に対する非標的化ｍＡｂ１に対する骨標的化（ｍＡｂ１  Ｆ６）の効能を決定するために、骨形成不全症の動物モデルにおいて複数回投与の効能試験を実施した。
【０１８２】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６を０．３、１および５ｍｇ／ｋｇで毎週３回、８週間、Ｇ６１０Ｃマウスの腹腔内に投与した。最終の投与後、マウスを剖検し、第６腰骨をμＣＴにより画像化して、全体積に対する骨体積（ＢＶ／ＴＶ）を決定し、最大破断力（骨強度）を確かめるために生体力学的試験にかけた。
【０１８３】
図２０および２１に結果が示されている。１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスに比べて、ＢＶ／ＴＶ（％）の有意な変化が、１および５ｍｇ／ｋｇの用量での両方の処置について観察された。１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスに比べて、最大破断力の有意な変化がｍＡｂ１  Ｆ１については１および５ｍｇ／ｋｇ、ｍＡｂ１については１ｍｇ／ｋｇのみで観察された。抗体対照（１３Ｃ４）で処置したＧ６１０Ｃマウスは、ＷＴバックグラウンド系統と比較してＢＶ／ＴＶと最大破断力の両方の有意な減少を示した。これらの結果は、両方の処置が、週に３回の投与のこのレジメンで、Ｇ６１０Ｃマウスにおいて、ＢＶ／ＴＶと最大破断力に同様な用量関連変化を誘導することを明らかにしている。５ｍｇ／ｋｇのマウスのコホートの半分が、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１で処置されたマウスよりも実質的に高い最大破断力値（４０ニュートン以上）を示したことから、骨強度に対するｍＡｂ１  Ｆ６の効能向上の傾向が確かに存在していた。
【実施例１８】
【０１８４】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６を用いた腰椎骨における投与頻度試験
この例では、ｍＡｂ１  Ｆ６についての適切な投与頻度を決定し、骨標的抗体のその最適有効性を達成するために、骨形成不全症の動物モデルにおいて、投与頻度試験を実施した。
【０１８５】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６を５ｍｇ／ｋｇで様々な頻度（毎週３回、毎週１回、２週間毎に１回、または４週間毎に１回）で１２週間、Ｇ６１０Ｃマウスに腹腔内投与した。ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６の両方についてピーク値およびトラフ値を確認するため、薬物動態（ＰＫ）血清サンプルを試験の開始時および終了時に採取した。最終の投与後、マウスを剖検し、第６腰骨をμＣＴにより画像化して、全体積に対する骨体積（ＢＶ／ＴＶ）を決定し、最大破断力（骨強度）を確かめるために生体力学的試験にかけた。
【０１８６】
図２２、２３および２４に結果が示されている。ｍＡｂ１については、１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスに比べて、ＢＶ／ＴＶ（％）の有意な変化が、毎週３回、毎週１回、２週間毎に１回、および４週間毎に１回において観察された。ｍＡｂ１  Ｆ６については、１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスに比べて、ＢＶ／ＴＶ（％）の有意な変化が、毎週３回および毎週１回において観察された。ｍＡｂ１処置は、２週間毎に１回および４週間毎に１回の投与頻度で、ｍＡｂ１  Ｆ６処置と比較して、有意に高いＢＶ／ＴＶを示した。ｍＡｂ１については、１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスと比較した最大破断力の有意な変化が、毎週３回、毎週１回、および２週間毎に１回において観察された。ｍＡｂ１  Ｆ６については、１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスと比較した最大破断力の有意な変化が、毎週３回および毎週１回において観察された。対照抗体（１３Ｃ４）で処置したＧ６１０Ｃマウスは、ＷＴバックグラウンド系統と比較して、ＢＶ／ＴＶの有意な減少と、より低い最大破断力の傾向を示した。
【０１８７】
これらの結果は、ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６の両方が、Ｇ６１０ＣマウスにおけるＢＶ／ＴＶおよび最大破断力において、同様な最大効果を誘発し得ることを実証している。ｍＡｂ１は、ｍＡｂ１  Ｆ６と比較して、有効性の持続性において利点を有するようであり、ＢＶ／ＴＶについては４週間毎に１回、最大破断力については２週間毎に１回投与された場合に有意な有効性を維持する。しかしながら、同等に有効な投与レジメン（ｍＡｂ１、２週間毎に１回、ｍＡｂ１  Ｆ６、毎週１回）におけるＰＫ血清サンプルの平均は、ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６についてそれぞれ、約３８μｇ／ｍＬおよび８μｇ／ｍＬという結果となった。これは、血清曝露がｍＡｂ１  Ｆ６ではより少なくなり得ることを示唆しており、これは、ＯＩ患者に安全性の利点を提供し得る。
【実施例１９】
【０１８８】
ｍＡｂ１  Ｆ１６を用いた腰椎骨における投与頻度試験
この例では、ｍＡｂ１  Ｆ１６についての適切な投与頻度を決定し、骨密度に対するその最適な影響を達成するために、骨形成不全症の動物モデルにおいて投与頻度試験を実施した。
【０１８９】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ１６を５ｍｇ／ｋｇで毎週３回、８週間、Ｇ６１０Ｃマウスの腹腔内に投与した。最終の投与後、マウスを剖検し、第６腰骨をμＣＴにより画像化して、全体積に対する骨体積（ＢＶ／ＴＶ）を決定した。
【０１９０】
結果が図２５に示されている。１３Ｃ４で処置したＧ６１０Ｃマウスに比べて、ＢＶ／ＴＶ（％）の有意な変化が、ｍＡｂ１およびｍＡｂ  Ｆ１６の両方について５ｍｇ／ｋｇで観察された。対照抗体（１３Ｃ４）で処置したＧ６１０Ｃマウスは、ＷＴバックグラウンド系統と比較してＢＶ／ＴＶの有意な減少を示した。これらの結果は、ｍＡｂ１とｍＡｂ  Ｆ１６の両方が、この投与レジメンの下で、Ｇ６１０Ｃマウスにおいて同様なＢＶ／ＴＶの用量関連変化を誘導することを実証している。
【実施例２０】
【０１９１】
ｍＡｂ１  Ｆ１１を用いた骨における投与頻度試験
この例では、ｍＡｂ１  Ｆ１１についての適切な投与頻度を決定し、骨密度に対するその最適な影響を達成するために、野生型マウスにおいて投与頻度試験を実施した。
【０１９２】
ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ１１を５ｍｇ／ｋｇで毎週３回、１１週間、野生型マウスの腹腔内に投与した。試験の生存部分中に、いくつかの時点でｉｎ  ｖｉｖｏ  μＣＴをとった。データは、総体積に対する骨体積（ＢＶ／ＴＶ％）について、投与後９週間でのみ示されている。
【０１９３】
結果が図２６に示されている。１３Ｃ４で処置した野生型マウスに比べて、ＢＶ／ＴＶ（％）の有意な変化が、５ｍｇ／ｋｇの用量での両方の処置について観察された。これらの結果は、ｍＡｂ１とｍＡｂ１  Ｆ１１の両方が、この投与レジメンにおいて、野生型マウスにおいて同様なＢＶ／ＴＶの用量関連変化を誘導することを実証している。
【実施例２１】
【０１９４】
マウスおよびヒトの骨標的化抗ＴＧＦβ抗体ｍＡｂ１  Ｆ６およびｍＡｂ２  Ｆ６のマウスにおける体内分布
この例では、蛍光標識したｍＡｂ１、ｍＡｂ１  Ｆ６、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ２  Ｄ１０（ｍＡｂ２の重鎖Ｃ末端にコンジュゲートしたＤ１０；ｍＡｂ２  Ｆ６）の、野生型マウスにおける体内分布を比較するための試験を実施した。各試験品およびビヒクルの単回腹腔内投与をマウスに行い、組織採取のために様々な時点でマウスを安楽死させた。採取した他の組織（データは示さず）のうち、ｍＡｂ１およびｍＡｂ１  Ｆ６を投与した１、４、１０、２０、４３、および９８日後に腰椎、心臓、肝臓、および腸を回収した。また、ｍＡｂ２およびｍＡｂ２  Ｄ１０を投与した後、２４および９６時間においても組織をサンプリングした。
【０１９５】
図２７〜３３に結果が示されている。図２７〜３０は、投与後１〜９８日目における、ｍＡｂ１、ｍＡｂ１  Ｆ６、またはビヒクルを投与されたマウスからの組織における総放射効率（ＴＲＥ）を示している。腰椎は、ｍＡｂ１に比べて、ｍＡｂ１  Ｆ６の頑強な持続的存在を示し、各時点において有意に高い総放射効率（ＴＲＥ）を示す。心臓および肝臓においては、ｍＡｂ１  Ｆ６はｍＡｂ１に比べて、はるかに低いＴＲＥを示す。最後に、腸では、ビヒクルといずれの試験品との間にも、有意差は認められなかった。
【０１９６】
これらの結果は、ｍＡｂ１  Ｆ６が他の組織（例えば、心臓および肝臓）において、より低い曝露を逆にもたらす、高い骨親和性によって特徴付けられることを実証している。結果はまた、全身性ＴＧＦ−β阻害を制限し、有害な副作用を減少させながら、骨にＴＧＦ−β阻害の部位を標的化することの安全性の利点を示している。腸において、ビヒクルと比較して、いかなるＴＲＥも存在しないことは、フルオロフォアがそれぞれの抗体上でその標識を維持したことを明らかにしている。以前のデータは、フルオロフォアが抗体上にその標識を維持しなかった場合、それが腸内で検出されることを示している。
【０１９７】
図３１〜３３は、ｍＡｂ２またはｍＡｂ２  Ｄ１０のいずれかが投与されたマウスからの組織におけるＴＲＥを示している。図３１は、ｍＡｂ２と比較して、ｍＡｂ２  Ｄ１０の高い骨親和性を実証している。意義深いことに、ｍＡｂ２と比較して、ｍＡｂ２  Ｄ１０については、より高いＴＲＥが大腿骨において観察される。同じ全体的な傾向が腰椎で観察された。ｍＡｂ２が投与されたマウスにおける腰椎／血清および大腿骨／血清比も、ｍＡｂ２が投与されたマウスにおける比と比較して、ｍＡｂ２  Ｄ１０の骨標的化能を強く支持している（図３２および３３）。
【０１９８】
本発明を詳細に、またその特定の実施態様を参照して説明したが、添付の特許請求の範囲において定義された本発明の範囲から逸脱することなく、変更および変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明の一部の側面がここでは特に有利であると識別されているが、本発明は必ずしも本発明のこれらの特定の側面に限定されないことが企図される。一部の実施態様において、本明細書に開示された値は、開示された値から±１０、２０、または３０％の量で代替的に変動してもよく、企図される発明の範囲内にとどまる。
【０１９９】
本明細書中で他に定義されない限り、本発明に関して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に使用される。本明細書において言及された全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照によって組み入れられる。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書が優先するものとする。本明細書では多数の文献が引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における一般常識の一部を形成することを認めるものではない。さらに、文脈によって別段要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される学術用語、および技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書および実施態様を通じて、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された整数または整数の群を含むことを意味すると理解されるが、他の整数または整数の群を除外するものではない。さらに、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、１つまたはそれ以上の抗体を意味する。
【０２００】
本発明を説明し定義する目的で、「実質的に」という用語は、定量的比較、値、測定、または他の表現に起因する固有の不確実性の程度を表すために本明細書において利用される。「実質的に」という用語はまた、問題となっている主題の基本機能に変化をもたらすことなく、定量的表現が、記述された基準から異なり得る程度を表すためにも本明細書において利用される。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、所与の量の±１０％を指すが、問題の量がその同一性を失うであろうアミノ酸または他の対象などの不可分な対象が細分されることを指す場合は、「約」は不可分の対象の±１を指す。例えば、約２％の水は１．８％〜２．２％の水を指し、一方、約６個のアミノ酸残基は５〜７個のアミノ酸残基を指す。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、用語「または」および「および／または」は、互いに組み合わせてまたは互いに排他的に、複数の構成要素を説明するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。
【０２０３】
本明細書において参照される配列は、以下の表１１および配列表に提供される。
【０２０４】
【表１１】
2020505919.tif 000014
【０２０５】
【表１２】
2020505919.tif 000015
【０２０６】
【表１３】
2020505919.tif 000016
【０２０７】
【表１４】
2020505919.tif 000017
【０２０８】
【表１５】
2020505919.tif 000018
【０２０９】
【表１６】
2020505919.tif 000019
【０２１０】
【表１７】
2020505919.tif 000020
【０２１１】
【表１８】
2020505919.tif 000021
【図１】
2020505919.tif 000022
【図２】
2020505919.tif 000023
【図３Ａ】
2020505919.tif 000024
【図３Ｂ】
2020505919.tif 000025
【図４Ａ】
2020505919.tif 000026
【図４Ｂ】
2020505919.tif 000027
【図４Ｃ】
2020505919.tif 000028
【図４Ｄ】
2020505919.tif 000029
【図４Ｅ】
2020505919.tif 000030
【図４Ｆ】
2020505919.tif 000031
【図４Ｇ】
2020505919.tif 000032
【図５Ａ】
2020505919.tif 000033
【図５Ｂ】
2020505919.tif 000034
【図６Ａ】
2020505919.tif 000035
【図６Ｂ】
2020505919.tif 000036
【図７】
2020505919.tif 000037
【図８Ａ】
2020505919.tif 000038
【図８Ｂ】
2020505919.tif 000039
【図９Ａ】
2020505919.tif 000040
【図９Ｂ】
2020505919.tif 000041
【図１０】
2020505919.tif 000042
【図１１】
2020505919.tif 000043
【図１２Ａ】
2020505919.tif 000044
【図１２Ｂ】
2020505919.tif 000045
【図１３】
2020505919.tif 000046
【図１４】
2020505919.tif 000047
【図１５】
2020505919.tif 000048
【図１６】
2020505919.tif 000049
【図１７Ａ】
2020505919.tif 000050
【図１７Ｂ】
2020505919.tif 000051
【図１８Ａ】
2020505919.tif 000052
【図１８Ｂ】
2020505919.tif 000053
【図１９】
2020505919.tif 000054
【図２０】
2020505919.tif 000055
【図２１】
2020505919.tif 000056
【図２２】
2020505919.tif 000057
【図２３】
2020505919.tif 000058
【図２４】
2020505919.tif 000059
【図２５】
2020505919.tif 000060
【図２６】
2020505919.tif 000061
【図２７】
2020505919.tif 000062
【図２８】
2020505919.tif 000063
【図２９】
2020505919.tif 000064
【図３０】
2020505919.tif 000065
【図３１】
2020505919.tif 000066
【図３２】
2020505919.tif 000067
【図３３】
2020505919.tif 000068
【配列表】
2020505919000001.app
【国際調査報告】
2020505919.tif 000069
2020505919.tif 000070
2020505919.tif 000071
2020505919.tif 000072
2020505919.tif 000073
2020505919.tif 000074