(57)【要約】  本発明は、場合によっては有機足場に連結される、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原を標的化できる複数のペプチドと、毒素とを含むコンストラクトを提供する。癌の処置におけるこのようなコンストラクトの使用も提供される。本発明はまた、特定の細胞外腫瘍抗原を結合する特定のペプチドならびに抗腫瘍活性を有する毒素も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトであって、前記ペプチドおよび前記毒素が直接共有結合されるかまたは担体を通じて共有結合される、コンストラクト。
【請求項２】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記少なくとも２つのペプチドの別の１つが、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記ペプチドのそれぞれが、５〜３０個または１０〜２５個のアミノ酸残基からなる、請求項１〜３の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記コンストラクトが、３〜１０個の異なるペプチドを含む、請求項１〜４の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ＥＧＦＲに特異的に結合する、請求項１〜５の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列またはその類似体を含む、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記類似体が、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項１〜５の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列またはその類似体を含む、請求項９に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記類似体が、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１０に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記ペプチドの１つが、ＥＧＦＲに特異的に結合しかつ前記ペプチドの１つが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項１〜５の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドが、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体であり、かつＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドが、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体である、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記コンストラクトが、前記ペプチドの少なくとも１つの複数コピーを含む、請求項１〜１３の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
前記コンストラクトが、前記ペプチドの少なくとも１つの２〜５０コピーを含む、請求項１４に記載のコンストラクト。
【請求項１６】
前記毒素が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質毒素である、請求項１〜１５の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１７】
前記毒素が、真核細胞伸長因子２に特異的に結合する毒素、配列番号５のＢＩＭ−ＢＨ３、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１８】
真核細胞伸長因子２に結合する毒素が、配列番号３、４またはその類似体から選択されるアミノ酸配列を含む毒素である、請求項１７に記載のコンストラクト。
【請求項１９】
前記毒素が、配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７または１８に記載のコンストラクト。
【請求項２０】
前記コンストラクトが、２〜１０個の異なる毒素を含む、請求項１６〜１９の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２１】
前記コンストラクトが、配列番号３を有する毒素および配列番号４を有する毒素を含む、請求項２０に記載のコンストラクト。
【請求項２２】
前記コンストラクトが、前記毒素の少なくとも１つの複数コピーを含む、請求項１６〜２１の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２３】
前記コンストラクトが、前記毒素の少なくとも１つの２〜５０コピーを含む、請求項２２に記載のコンストラクト。
【請求項２４】
前記コンストラクトが、配列番号３を有する毒素の２〜５０コピーおよび配列番号４を有する毒素の２〜５０コピーを含む、請求項２３に記載のコンストラクト。
【請求項２５】
前記ペプチドの１つが、ＥＧＦＲに特異的に結合しかつ前記ペプチドの１つが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合しかつ前記毒素が、真核細胞伸長因子２に結合する毒素および配列番号５を有する毒素から選択される、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項２６】
配列番号１を有するペプチドまたはその類似体、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体、および配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの毒素を含む、請求項２５に記載のコンストラクト。
【請求項２７】
配列番号１を含むペプチドまたはその類似体、配列番号２を含むペプチドまたはその類似体、配列番号３を含む毒素、および配列番号４を含む毒素を含む、請求項２６に記載のコンストラクト。
【請求項２８】
前記ペプチドのそれぞれ１つおよび前記毒素の複数コピーを含む、請求項２５〜２７の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２９】
前記ペプチドの少なくとも１つおよび／または少なくとも１つの毒素が、担体を通じて共有結合され、前記担体が、有機足場である、請求項１〜２８の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３０】
前記ペプチドのそれぞれ１つおよび前記毒素が、担体に結合されかつ前記担体が、有機足場である、請求項１〜２９の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３１】
前記有機足場が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子または修飾ＰＥＧ分子を含む、請求項２９または３０に記載のコンストラクト。
【請求項３２】
前記ＰＥＧ分子が、前記ペプチドおよび前記毒素を結合するために利用可能な８〜５６個の部位を含む、請求項３１に記載のコンストラクト。
【請求項３３】
前記ペプチドのそれぞれ１つの複数コピーおよび少なくとも１つの毒素の複数コピーが、前記担体に結合されかつ前記ペプチドの少なくとも１つが、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項２９〜３２の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３４】
前記ペプチドの１つが、ＥＧＦＲに特異的に結合しかつ前記ペプチドの１つが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項３３に記載のコンストラクト。
【請求項３５】
ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドが、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体であり、かつＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドが、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体である、請求項３４に記載のコンストラクト。
【請求項３６】
前記毒素が、配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列、またはその類似体を含む、請求項３４または３５に記載のコンストラクト。
【請求項３７】
前記コンストラクトが、（ｉ）配列番号１を有するペプチド、（ｉｉ）配列番号２を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３を有する毒素および（ｉｖ）配列番号４を有する毒素：の複数コピーを含み、前記ペプチドのそれぞれ１つおよび前記毒素が、前記足場に結合される、請求項３３に記載のコンストラクト。
【請求項３８】
前記コンストラクトが、（ｉ）配列番号１からなるペプチド（ｉｉ）配列番号２からなるペプチドおよび（ｉｉｉ）配列番号３からなる毒素、および（ｉｖ）配列番号４からなる毒素：の複数コピーを含み、前記ペプチドのそれぞれ１つおよび前記毒素が、前記足場に結合される、請求項３３に記載のコンストラクト。
【請求項３９】
配列番号１を有するかまたはそれからなるペプチド、配列番号２を有するかまたはそれからなるペプチド、配列番号３を有するかまたはそれからなる毒素および配列番号４を有するかまたはそれからなる毒素の間の化学量論的分子比が、１：１：３：３である、請求項３７または３８に記載のコンストラクト。
【請求項４０】
前記ペプチドまたは前記毒素の少なくとも１つが、リンカーまたはスペーサーを通じて前記足場に連結される、請求項１〜３９の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４１】
透過性促進部分をさらに含む、請求項１〜４０の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４２】
請求項１〜４１の何れか１項に記載のコンストラクトと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４３】
癌を処置することにおける使用のための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含むそれを必要とする前記対象において癌を処置する方法。
【請求項４５】
前記医薬組成物が、少なくとも１つの抗癌剤と組み合わせて処置計画の一部として投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ヒト真核細胞伸長因子２（ｅＥＦ２）に特異的に結合するペプチドであって、配列番号３、配列番号４またはその類似体から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項４７】
前記類似体が、前記ペプチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４６に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記ペプチドまたはその類似体が、環状である、請求項４６または４７に記載のペプチド。
【請求項４９】
ｅＥＦ２活性を増強する、請求項４６〜４８の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項５０】
細胞死を誘導することにおける使用のための、請求項４６〜４９の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記細胞が、癌細胞である、請求項５０に記載のペプチド。
【請求項５２】
配列番号３および配列番号４から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４６〜５０の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項５３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列またはその類似体を含むペプチド。
【請求項５４】
ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のアンタゴニストである、請求項５３に記載のペプチド。
【請求項５５】
前記類似体が、配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５３または５４に記載のペプチド。
【請求項５６】
前記ペプチドまたはその類似体が、環状である、請求項５３〜５５の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項５７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、請求項５３〜５６の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項５８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその類似体。
【請求項５９】
前記ペプチドまたはその類似体が、ヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）のアンタゴニストである、請求項５８に記載のペプチド。
【請求項６０】
前記類似体が、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５８または５９に記載のペプチド。
【請求項６１】
前記ペプチドが、環状である、請求項５８〜６０の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、請求項５８〜６１の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項６３】
癌細胞への標的化における使用のための、請求項５８〜６２の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項６４】
請求項４６〜６３の何れか１項に記載の少なくとも１つのペプチドを含む抱合体。
【請求項６５】
請求項４６〜６３の何れか１項に記載のペプチドまたは請求項６４に記載の抱合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項６６】
複数の前記ペプチドまたは前記抱合体を含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
癌を処置することにおける使用のための、請求項６５または６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
請求項４６〜６３の何れか１項に記載のペプチドまたは請求項６４に記載の抱合体の治療的有効量を投与することを含むそれを必要とする対象において癌を処置する方法。
【請求項６９】
請求項４６〜６３の何れか１項に記載のペプチドまたはその類似体をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７０】
（ｉ）配列番号１の少なくとも１コピー；（ｉｉ）配列番号２の少なくとも１コピー；（ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも１コピー、および／または配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７１】
プロモーターに操作可能に連結される、請求項６９または７０に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト。
【請求項７２】
請求項７０に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、場合によっては有機足場に連結される、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原を標的可能な複数のペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトに関し、癌の処置におけるこのようなコンストラクトの使用も提供される。本発明は、ある種の細胞外腫瘍抗原を結合する特定のペプチドならびに抗腫瘍活性を有する毒素、およびこれらのペプチドおよび毒素の抱合体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
標的化治療剤は、癌細胞の増殖および生存に関与する特異的分子を干渉するために設計された薬物または他の物質である。全ての活発に分裂する細胞に対して通常は作用する従来からの化学療法薬とは反対に、標的化治療剤の主要な目的は、より精密に、かつ副作用の可能性をより少なくして、癌細胞と戦うことである。特定の癌に対する使用のために承認されている標的化癌治療剤としては、細胞増殖シグナル伝達を防ぎ、腫瘍血管発生を妨げ、癌細胞死を促進し、免疫系を刺激して癌細胞を破壊し、癌細胞へ毒性薬を送達する薬剤が挙げられる。後者は主に、毒性分子を送達するモノクローナル抗体を含む。抗体がその標的細胞に結合したら、放射活性物質、毒性ポリペプチドまたは有毒な化学物質などの、抗体に連結される毒性分子が細胞により取り込まれ、その細胞を最終的に死滅させる。毒素は抗体に対する標的を欠く細胞には影響しない。
【０００３】
効率的な腫瘍標的化は、多くの理由により困難である。第１に、それは、可能な限り細胞の非特異的な死滅を回避するために腫瘍細胞に十分に特異的である標的を特定することを必要とする。さらに、癌細胞は、癌のタイプの間でおよび同じタイプの癌内での両方で可変である傾向があり：表面標的の発現パターンは、特定の腫瘍の細胞間で変動し得る。癌細胞はまた、腫瘍発達中にそれらの細胞表面受容体の発現を変更させ得るか、または治療に耐性となり得る。耐性は、２通り：突然変異を通じて標的そのものが変化し、標的化治療剤がもはやそれと十分に相互作用しなくなること、および／または腫瘍が、標的に依存しない腫瘍増殖に到達するための新しい経路を発見すること、で起こり得る。殆どの抗癌薬は、癌細胞上または癌細胞中の特異的な標的を攻撃する。標的の阻害は通常、癌を促進する生理的経路を阻止することを目的とする。標的における、またはそれらの下流の生理的経路における突然変異は、標的を、細胞の癌性の性質と無関係にする。
【０００４】
ＤｅＮａｒｄｏら、２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９（１０  Ｐｔ  ２）：３８５４Ｓ−６４Ｓは、薬物動態および体内分布に対する分子量および腫瘍特異性の両方の効果を評価するための、腫瘍特異的なまたは対照のペプチドに接合される分岐状ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ化）ポリマー（Ｍｒ４０，０００、Ｍｒ７０，０００、Ｍｒ１００，０００およびＭｒ１５０，０００）の合成について報告する。
【０００５】
Ｔｓａｉら、２０１１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．１０３（２）：２５５−２６６は、ヒト神経膠芽腫細胞上の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および腫瘍新生血管上のウロキナーゼ受容体（ｕＰＡＲ）を同時に標的化するために設計された二特異性リガンド標的毒素を記載する。コンストラクトは、ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ウロキナーゼ断片および短縮化緑膿菌外毒素（ＰＥ３８）からなる１本鎖ポリペプチドである。
【０００６】
ＭｃＧｕｉｒｅら、２０１４，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，４：４４８０は、ファージディスプレーライブラリから同定される非小細胞肺癌に対する一連の腫瘍標的化ペプチドの特徴評価について報告する。これらのペプチドは、モノマーおよびホモテトラマーとして合成された。
【０００７】
米国特許第７，９４７，２８９号明細書は、修飾細菌毒素を含む組成物および、特定の細胞集団を標的とするために、および疾患を処置するために、修飾細菌毒素を使用するための方法を開示する。
【０００８】
米国特許出願公開第２００４／００５８８６５号明細書は、細胞特異的および器官特異的な標的化の促進を提供する合成多量体リガンド、およびそれらの調製および使用方法を開示する。
【０００９】
米国特許出願公開第２００９／０１３０１０５号明細書は、ＩＧＦ−１Ｒの複数のエピトープに結合する組成物、例えば一特異性結合分子または多特異性結合分子（例えば二特異性分子）の組み合わせを開示する。対象結合分子を作製する方法および結合分子を使用してＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に拮抗する方法も開示される。
【００１０】
国際公開第２００７／０９３３７３号パンフレットは、腫瘍診断または治療の何れかのための、癌細胞の特異的な標的化のための機能単位に接合された、インビボで安定な分岐状ペプチド、特にニューロテンシン（ＮＴ）および黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）の配列由来のものを開示する。
【００１１】
国際公開第２００８／０８８４２２号パンフレットは、ＯＳＫ１ペプチド類似体、およびいくつかの実施形態においては、薬学的に許容可能なその塩、を含む組成物を開示する。本組成物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物、本組成物をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含む発現ベクター、およびこの発現ベクター含む宿主細胞がさらに開示される。自己免疫障害を処置する、および多発性硬化症の症状の再発を防ぐまたは軽減する方法も開示される。
【００１２】
効力を増進し非特異的な悪影響を低下させた、標的化癌治療のための改善された組成物および方法について、依然として満たされていない要求が残っている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトに関し、この場合、ペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合される。本発明は、癌細胞上の２つの異なる標的を結合する２つのペプチドと、毒素とを含むコンストラクトが、これらのペプチドの１つのみを有するコンストラクトと比較して、有利なおよび、いくつかのケースでは相乗的な、細胞毒性効果を有するという予想外の観察に基づく。
【００１４】
一態様によれば、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ペプチドの少なくとも１つは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、少なくとも２つのペプチドの別の１つは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、異なる細胞外腫瘍抗原に結合する３〜１０個の異なるペプチドを含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合され、このペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲに特異的に結合する。一実施形態において、本ペプチドは、配列番号１（ＣＨＰＧＤＫＱＥＤＰＮＣＬＱＡＤＫ）で示されるとおりであるかまたはその類似体であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合され、このペプチドの少なくとも１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。一実施形態において、本ペプチドは、配列番号２（ＣＥＧＬＰＡＤＷＡＡＡＣ）で示されるとおりであるかまたはその類似体であるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合され、このペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、このペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。一実施形態によれば、ＥＧＦＲ  ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体であり、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体である。
【００２０】
上記実施形態の何れか１つによれば、本コンストラクトは、本ペプチドの少なくとも１つまたは少なくとも２つの複数コピーを含む。いくつかの実施形態において、本コンストラクトは、このペプチドの少なくとも１つの２〜５０コピーを含む。
【００２１】
上記実施形態の何れか１つによれば、毒素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質毒素である。いくつかの実施形態において、毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素、配列番号５からなるＢＩＭ−ＢＨ３、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒−毒素、およびシアノトキシンから選択される。一実施形態において、真核細胞伸長因子２に結合する毒素は、配列番号３（ＣＳＡＲＷＧＰＴＭＰＷＣ）、配列番号４（ＣＲＲＧＳＲＡＳＧＡＨＣ）から選択されるアミノ酸配列、またはその類似体を含む毒素である。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは２〜１０個の異なる毒素を含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３を有する毒素および配列番号４を有する毒素を含む。
【００２２】
上記実施形態の何れか１つによれば、本コンストラクトは、毒素の少なくとも１つまたは少なくとも２つの複数コピーを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、毒素の少なくとも１つの２〜５０コピーを含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３を有する毒素の２〜５０コピーおよび配列番号４を有する毒素の２〜５０コピーを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本ペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し本ペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、かつ本毒素が真核細胞伸長因子２に特異的に結合する毒素および配列番号５を有する毒素から選択される、コンストラクトを提供する。このような実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体、および配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの毒素を含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を含むペプチドまたはその類似体、配列番号２を含むペプチドまたはその類似体、配列番号３を含む毒素、および配列番号４を含む毒素を含む。このような実施形態の何れか１つによれば、本コンストラクトは、本ペプチドのそれぞれ１つおよび毒素の複数コピーを含む。
【００２４】
上記実施形態の何れか１つによれば、本ペプチドの少なくとも１つおよび／または少なくとも１つの毒素は、担体を通じて共有結合される。一実施形態によれば、担体は有機足場である。別の実施形態によれば、本ペプチドおよび本毒素のそれぞれが担体に結合され、この担体は有機足場である。いくつかの実施形態によれば、足場は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子または修飾ＰＥＧ分子である。一実施形態によれば、ＰＥＧ分子は分岐状分子である。別の実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、本発明のペプチドおよび／または毒素を結合するための複数の部位を含む。一実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、本ペプチドおよび本毒素を結合するのに利用可能な８〜５６個の部位を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドのそれぞれの複数コピーと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は足場に結合され、このペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、このペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、このペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。一実施形態によれば、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体であり、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体である。特定の実施形態によれば、本毒素は、配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列、またはその類似体を含む。一実施形態によれば、足場はＰＥＧ足場である。一実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、ペプチドおよび毒素を結合するのに利用可能な８〜５６個の部位を含む。
【００２６】
一実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）配列番号１を有するペプチド、（ｉｉ）配列番号２を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３を有する毒素および（ｉｖ）配列番号４を有する毒素、のそれぞれ１つの複数コピーを含み、このペプチドおよび毒素のそれぞれが足場に結合される。一実施形態によれば、足場はＰＥＧ足場である。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）配列番号１からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号２からなるペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３からなる毒素および（ｉｖ）配列番号４からなる毒素、のそれぞれ１つの複数コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、配列番号１を有するかまたはそれからなるペプチドと、配列番号２を有するかまたはそれからなるペプチドと、配列番号３を有するかまたはそれからなる毒素と、配列番号４を有するかまたはそれからなる毒素の間の化学量論的モル比は、１：１：３：３である。
【００２７】
上記実施形態の何れか１つによれば、このペプチドまたはこの毒素の少なくとも１つが、リンカーまたはスペーサーを通じて足場に連結される。
【００２８】
上記実施形態の何れか１つによれば、本コンストラクトは、透過性促進部分をさらに含む。
【００２９】
別の態様によれば、本発明は、本発明のコンストラクトを含む組成物を提供する。一実施形態によれば、本組成物は医薬組成物である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のコンストラクトと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態によれば、本医薬組成物は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドのそれぞれ１つの複数コピーと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを含み、このペプチドおよび毒素は足場に結合され、このペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、このペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、このペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。一実施形態によれば、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体であり、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体である。特定の実施形態によれば、本毒素は、配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列、またはその類似体を含む。一実施形態によれば、足場はＰＥＧ足場である。
【００３０】
一実施形態によれば、本医薬組成物は、（ｉ）配列番号１を有するペプチド、（ｉｉ）配列番号２を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３を有する毒素および（ｉｖ）配列番号４を有する毒素、のそれぞれ１つの複数コピーを含むコンストラクトを含み、このペプチドおよび毒素のそれぞれ１つは足場に結合される。一実施形態によれば、足場はＰＥＧ足場である。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）配列番号１からなるペプチド（ｉｉ）配列番号２からなるペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３からなる毒素および（ｉｖ）配列番号４からなる毒素、のそれぞれ１つの複数コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、配列番号１を有するかまたはそれからなるペプチドと、配列番号２を有するかまたはそれからなるペプチドと、配列番号３を有するかまたはそれからなる毒素と、配列番号４を有するかまたはそれからなる毒素の間の化学量論的モル比は、１：１：３：３である。
【００３１】
一実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、癌の処置での使用のためである。
【００３２】
特定の態様によれば、本発明は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、本発明の医薬組成物をその対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態によれば、本医薬組成物は、本発明のコンストラクトを含む。一実施形態によれば、本発明は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、治療的有効量の本発明のコンストラクトを投与することを含む方法を提供する。
【００３３】
一態様によれば、本発明は、ヒト真核細胞伸長因子２（ｅＥＦ２）に特異的に結合するペプチドであって、配列番号３、配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドおよびその類似体を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は環状である。一実施形態によれば、配列番号３を含むかまたはそれらからなるペプチドまたはその類似体は、ｅＥＦ２活性を強化する。別の実施形態によれば、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドまたはその類似体はｅＥＦ２活性を強化する。一実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は、細胞死の誘発における使用のためである。
【００３４】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその類似体を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のアンタゴニストである。別の実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は環状である。一実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は、癌細胞の標的化における使用のためである。
【００３５】
さらなる実施形態によれば、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその類似体を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は、ヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）のアンタゴニストである。別の実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は環状である。一実施形態によれば、本ペプチドまたは類似体は癌細胞の標的化における使用のためである。
【００３６】
特定の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明ペプチドを含む抱合体を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドおよびこれらのペプチドの類似体から選択される。
【００３７】
別の態様によれば、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の抱合体を含む組成物を提供する。一実施形態によれば、本組成物は医薬組成物である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の抱合体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドおよびこれらのペプチドの類似体から選択される。別の実施形態によれば、抱合体は、これらのペプチドの抱合体である。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、癌の処置における使用のためである。
【００３８】
一態様によれば、本発明は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、治療的有効量の本発明のペプチドまたは本発明の抱合体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態によれば、癌を処置する方法は、このペプチドまたはこの抱合体を含む医薬組成物を投与することを含む。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドおよびこれらのペプチドの類似体から選択される。別の実施形態によれば、この抱合体はこのペプチドの抱合体である。いくつかの実施形態によれば、本方法は、これらのペプチドまたはこれらの抱合体を含む本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００３９】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のペプチドまたは類似体をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチドおよび配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドから選択される。別の実施形態によれば、この類似体はこれらのペプチドの類似体である。
【００４０】
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号１の少なくとも１コピーと；（ｉｉ）配列番号２の少なくとも１コピーと；（ｉｉｉ）配列番号３、４またはそれらの組み合わせの少なくとも１コピーとを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
また別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを提供する。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドはプロモーターに操作可能に連結される。
【００４２】
特定の態様によれば、本発明は、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは少なくとも１つの本発明の核酸コンストラクトを含むベクターを提供する。
【００４３】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは少なくとも１つの核酸コンストラクトを含む細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、Ｅ１３．３およびＰＬ−Ｌ１−ＧＲペプチドなどの２つの標的化分子（黒丸および四角）およびＴｏｘ１および／またはＴｏｘ２などの毒素（白丸）が搭載される多アーム型ＰＥＧ複合体の模式的な構造を示す。
【図２】図２は、２つの異なるインキュベート時間１．５分および３０分（ＴＢ２−Ｔｏｘ１、ＧＷ−Ｔｏｘ２）でのｅＥＦ２またはＢＳＡへのいくつかのペプチド（毒素）の結合を表すＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図３】図３は、インビトロ転写／翻訳系で試験したいくつかのペプチド（毒素）の活性の結果を示す（ＴＢ２−Ｔｏｘ１、ＧＷ−Ｔｏｘ２、ＧＲ−非ｅＥＦ２−結合対照）。
【図４】図４〜７は、Ａ４３１およびＭＣＦ−７細胞に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−毒素コンストラクトの効果を示す。対照（処置なし）：図４Ａおよび４Ｂ：それぞれＴ＝０および４８ｈでのＡ４３１細胞；図４Ｃおよび４Ｄ：それぞれＴ＝０および４８ｈでのＭＣＳ−７細胞。
【図５】図５は、様々な濃度でのＡ４３１細胞に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図５Ａ〜Ｃ）コンストラクトおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２（図５Ｄ〜５Ｆ）の効果を示す：１μＭ（図５Ａおよび５Ｄ）、３μＭ（図５Ｂおよび５Ｅ）および８μＭ（図５Ｃおよび５Ｆ）。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図６】図６は、様々な濃度でのＭＣＦ−７細胞に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図６Ａ〜Ｃ）コンストラクトおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２（図６Ｄ〜６Ｆ）の効果を示す：１μＭ（図６Ａおよび６Ｄ）、３μＭ（図６Ｂおよび６Ｅ）および８μＭ（図６Ｃおよび６Ｆ）。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図７】図７は、様々な濃度でのＰＥＧ−ＢＩＭ（Ｅ１３．３なし）の複合体でのＡ４３１細胞（図７Ａ〜７Ｃ）およびＭＣＦ−７（図７Ｄ〜７Ｆ）の処理を示す：１μＭ（図７Ａおよび６Ｄ）、３μＭ（図７Ｂおよび７Ｅ）および８μＭ（図７Ｃおよび７Ｆ）。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図８】図８は、様々な濃度での、様々なコンストラクト：ＰＥＧ−ＢＩＭ（図８Ｂ〜Ｄ）、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図８Ｅ〜Ｇ）、ＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ−ＢＩＭ（図８Ｈ〜Ｊ）およびＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１  ＧＲ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図８Ｋ〜Ｍ）でのＡ４３１細胞の処理の効果を示す：１０ｎＭ（図８Ｂ、８Ｅ、８Ｈおよび８Ｋ）、１００ｎＭ（図８Ｃ、８Ｆ、８Ｉおよび８Ｌ）および１μＭ（図８Ｄ、８Ｇ、８Ｊおよび８Ｍ）。図８Ａは対照である。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図９】図９は、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２：３および１０μＭ（それぞれ図９Ｃおよび９Ｄ）またはＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ  １０μＭでのＡ−５４９細胞の処置の効果を示す。図９Ａ（Ｔ＝０）および９Ｂ（Ｔ＝４８ｈ）は対照として使用する。図９Ｂ〜９Ｄは、処置の４８時間後に撮影した。
【図１０】図１０は、選択されたペプチドの、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓで染色した電気泳動ゲルを示す：レーン（左から右）：１−Ｅ７．１；２−Ｅ１０．２；３−Ｅ１３．３；４−Ｅ１４．１．１；５−Ｅ１４．１．４；６−Ｅ２３Ｉ３；７−Ｅ２３Ｉ５；８−Ｅ１５．１．３−Ｔ；９−Ａ４．３．１２−Ｔ；１０−タンパク質マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【図１１】図１１は、ＥＧＦＲの自己リン酸化を測定することによる選択ペプチドの阻害分析の正規化した結果を示す。
【図１２】図１２は、様々な期間の間ウシ血清中でインキュベートした選択ペプチドの安定性の測定についての結果を示す。
【図１３】図１３は、様々な濃度での選択ペプチドの阻害活性の評価の結果を示す（図１３Ａは全体図であり、図１３ＢはＥ１３．３のみを示す）。
【図１４】図１４は、Ｅ１３．３ペプチドの単独でのまたは８本アーム型ＰＥＧとの複合体でのインビボ安定性を示す。
【図１５】図１５は、２つの癌細胞株の生存能に対するＥ１３．３の効果を示す。
【図１６】図１６は、マウスでの腎臓、肝臓および腫瘍におけるＥ１３．３−ＰＥＧ複合体の蓄積を示す。
【図１７】図１７は、蛍光マークしたＥ１３．３−ＰＥＧ複合体のＩＶ注射から１時間（左パネル）および２４時間（右パネル）後の、マウス中の腫瘍から単離された癌細胞の写真を示す。
【図１８】図１８は、対照としてＰＢＳを用いた（１８Ａ）、１μＭのＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（１８Ｂ）、ＰＥＧ−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ（１８Ｃ）およびＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ（１８Ｄ）でのＡ−５４９細胞の処置の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、複数の多標的ペプチドと、少なくとも１つの毒素部分とを含む治療用コンストラクトに関する。特に、本発明によるコンストラクトは、異なる細胞標的にそれぞれ向けられる複数のペプチドを含む。本発明によるコンストラクト中に含有されるペプチドは、癌細胞の膜上で発現される少なくとも２つの異なる抗原を結合する、阻止する、阻害する、または活性化することができる。本発明は、一態様によれば、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合される。
【００４６】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合、すなわち１つのアミノ酸のカルボキシル基と隣接アミノ酸のアミノ基の間で形成される共有結合、により連結されるアミノ酸残基の短い鎖を指す。「ペプチド」という用語は、最大５０個のアミノ酸を有する短い配列を指す。５０アミノ酸よりも長いアミノ酸単量体の鎖は「ポリペプチド」と呼ばれる。このようなポリペプチドは、５０個を超えるアミノ酸残基を有する場合、タンパク質、より具体的には低または中分子量のタンパク質としても分類され得る。
【００４７】
「ペプチド」という用語は、「ペプチド類似体」という用語も包含する。「ペプチド類似体」および「類似体」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、本来のペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するペプチドの類似体を指し、この類似体は本来のペプチドの活性を保持する。したがって、「類似体」および「活性類似体」という用語は交換可能に使用され得る。「類似体」という用語は、親ペプチドのアミノ酸配列において、置換、再編成、欠失、付加および／または化学修飾を含有するペプチドを指す。「類似体」という用語は、ペプチド毒素、すなわちペプチドである毒素の類似体も指す。いくつかの実施形態によれば、ペプチド類似体は、本来のペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。一実施形態によれば、類似体は、本来のペプチドに対して、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９０％または約８５％〜約９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、本発明の類似体は、１、２、３、４または５個の置換がなされた本来のペプチドの配列を含む。
【００４８】
アミノ酸の置換は、保存的または非保存的置換であり得る。非保存的置換は、ある１個のアミノ酸の、何らかの他のアミノ酸による置換を包含する。特定の一実施形態において、アミノ酸は非天然アミノ酸によって置換される。
【００４９】
「アミノ酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミンおよびカルボン酸官能基の両方を含む有機化合物を指し、天然または非天然アミノ酸の何れかであり得る。２２種類の天然アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、およびピロリジン（Ｐｙｌ）である。非天然アミノ酸の非限定例としては、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、アミノアジピン酸、β−アラニン、１−ナフチルアラニン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、γ−アミノブチリック酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｉｒｉｃ  ａｃｉｄ）（ＧＡＢＡ）、３−（アミノメチル）安息香酸、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルグリ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙ）−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、アジドノルロイシン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、α−アミノカプリル酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、およびＮ−アセチルガラクトサミン−α−セリンが挙げられる。一実施形態によれば、置換は非天然アミノ酸での置換である。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、「類似体」という用語は、「保存的類似体」という用語も包含する。
【００５１】
当業者にとって公知のようなアミノ酸の保存的置換は本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸の、同じタイプの官能基または側鎖、例えば脂肪族、芳香族、正荷電、負荷電、を有する別のアミノ酸での置換を含む。当業者は、個々の置換が、変化が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された類似体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野で周知である。保存的置換のある典型例を以下で提供する。
【００５２】
次の６つの群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する：（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。他の実施形態において、保存的置換は、化学的に類似の非天然アミノ酸での置換を包含する。
【００５３】
したがって、いくつかの実施形態において、類似体は、ペプチドの保存的類似体である。いくつかの実施形態によれば、本発明の保存的類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換がなされた本来のペプチドの配列を含む。別の実施形態によれば、類似体は、１、２または３個の保存的置換がなされた本来のペプチドのアミノ酸配列からなる。したがって、類似体は、１、２または３個の保存的置換がある本来のペプチドのアミノ酸配列からなる。
【００５４】
「ペプチド」という用語は、「ペプチド断片」という用語も包含する。「断片」という用語は、本来のペプチドまたはその類似体の断片を指し、この断片は、本来のペプチドまたは類似体の活性を保持する。したがって、「断片」および「活性断片」という用語は、交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態によれば、断片は、本来の配列またはその類似体の、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の連続アミノ酸からなる。一実施形態によれば、断片は、本来の配列またはその類似体の６〜１１個、７〜１０個または８〜９個の連続アミノ酸からなる。
【００５５】
本発明の、ペプチド、類似体および断片は、組み換えの（遺伝子にコードされるアミノ酸からなるペプチドに対する）および合成の方法を含む、当技術分野において公知の何らかの方法により作製され得る。合成方法は、完全固相合成（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、部分的固相合成、断片縮合、または古典的な溶液合成を含む。固相ペプチド合成手順は、当業者にとって周知である。ペプチドを作製するための合成方法は、例えばＦｉｅｌｄｓ  Ｇ．Ｂ．，Ｎｏｂｌｅ  Ｒ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３５：１６１−２１４，１９９０に記載のＦＭＯＣ固相ペプチド合成を含むが限定されない。ＰＥＧ上のペプチドを合成するための方法は、例えばＤｅＮａｒｄｏら、同書に記載される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、合成ペプチドは、分取高性能液体クロマトグラフィーにより精製され、ペプチド配列は、当業者にとって公知の方法によってアミノ酸シーケンシングを介して確認される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、当技術分野で周知の組み換えタンパク質技術が、本発明のペプチドおよびペプチド多量体（遺伝子によりコードされるアミノ酸からなる）を作製するために使用される。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「毒素」という用語は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞などに対して有毒、有害または毒性（細胞毒性）であるペプチドまたはポリペプチド物質を指す。本発明による毒素は、微生物、植物または高等生物などの生きている生物由来であり得るか、またはこれらは、何らかの公知の技術を使用して、例えば国際公開第２００７／０１０５２５号パンフレットに記載のように、合成により調製、作製または設計され得る。毒素は一般的には、酵素および受容体などの細胞生物学的巨大分子と相互作用して、その効果を調節する。この用語は、毒素の生物学的活性サブユニットまたは断片を包含する。特定の実施形態によれば、毒素は、最大５０個のアミノ酸からなるペプチド毒素である。いくつかの実施形態によれば、ペプチドである毒素は環状ペプチドであり得る。明確にするために、環状ペプチドである毒素は、「シクロトキシン」または「環状毒素」と呼ばれる。本発明のコンストラクト内で、毒素部分は、コンストラクトにその特性の少なくとも一部を付与し、コンストラクトは、標的細胞に対する毒性のまたは有害な効果を調節する。ペプチド毒素の非限定例としては、ミクロシスチンおよびノジュラリンなどのシアノバクテリア毒素、ＰｒｏＴｘ−ＩおよびＰｒｏＴｘ−ＩＩ毒素、ビペリスタチン（Ｖｉｐｅｒｉｓｔａｔｉｎ）またはその断片などのヘビ毒由来ディスインテグリン、およびＨｍ−１およびＨｍ−２毒素が挙げられる。
【００５９】
「担体」という用語は、少なくとも２つの異なるペプチドおよび／または毒素に共有結合するか、または結合可能な、何らかの分子を指す。いくつかの可能な結合配置が包含される。一実施形態によれば、１つのペプチドおよび１つの毒素は、担体を介して結合され、第２のペプチドは、第１のペプチドに、または毒素に直接結合される。別の実施形態によれば、２個のペプチドが担体を介して結合され、毒素はこれらのペプチドの１つに結合される。さらなる実施形態によれば、全てのペプチドおよび毒素が担体に共有結合される。
【００６０】
上記実施形態の何れか１つによれば、本ペプチドおよび／または本毒素はリンカーを介して結合される。「リンカー」および「スペーサー」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、共有結合し、したがって２個の分子を連結する何らかの分子を指す。リンカーの非限定例は、アミノ酸、ペプチド、または２個の連結分子間の距離を可能にするために使用され得る任意の他の有機物質である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「標的」および「細胞標的」という用語は、癌細胞のマーカーであり得、かつ癌細胞成長、増殖、生存および転移発達に関与し得る、癌細胞上で見られる分子を指す。標的の特定例としては細胞表面タンパク質が挙げられ、これは、リガンドなどのそれらのカウンターパートへの結合時に、腫瘍成長および発達を促進するカスケードを開始させる。本発明による標的は場合によっては、癌細胞で高度に発現され、かつ正常な非癌細胞では見られないかまたは実質的により低いレベルでしか見られない。「標的」という用語はしたがって、「細胞外腫瘍抗原」という用語を包含する。「腫瘍抗原」または「細胞外腫瘍抗原」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的な抗原（ＴＳＡ）の両方を含む。腫瘍関連抗原は、正常細胞上で観察されるものよりも多量に腫瘍細胞の表面上で発現される抗原または胚発生中に正常細胞上で発現される抗原を意味する。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞に特有であり、正常細胞上で発現されない抗原である。腫瘍抗原という用語は、既に同定されているＴＡＡもしくはＴＳＡおよびまだ同定されていないものを含み、かつ断片、エピトープおよび腫瘍抗原に対するありとあらゆる修飾を含む。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「細胞標的化」という用語は、本発明のコンストラクトの一部である、部分、特にペプチドを指す場合、ペプチドが細胞−、組織−または臓器特異的な標的化を提供することを示す。特に、細胞標的化ペプチドは、癌細胞上の細胞標的を特異的に認識し結合する。その結合のおかげで、細胞標的化ペプチドは、癌性組織へとそのコンストラクト全体を向かわせて、癌性細胞の特異的な死滅／阻害を促進する。癌性細胞の死滅／阻害は一般的に、コンストラクト中に存在する毒素を介して影響されるが、いくつかの実施形態において、これは細胞標的化ペプチドの結合により直接影響され得る。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、このペプチドおよび毒素は直接、または担体を通じて共有結合される。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、少なくとも３個の異なる上記ペプチドを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、少なくとも４個の異なる上記ペプチドを含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、２個以上の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する２個以上の異なるペプチドを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、３個以上の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する３個以上の異なるペプチドを含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、４個以上の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する４個以上の異なるペプチドを含む。
【００６４】
細胞外腫瘍抗原の非限定例は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲであり、したがって一実施形態によれば、これらのペプチドの少なくとも１つが、１つのこのような細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。「ＰＤ−Ｌ１」および「ヒトＰＤ−Ｌ１」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。「ＥＧＦＲ」および「ヒトＥＧＦＲ」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。
【００６６】
他の実施形態によれば、少なくとも２つのペプチドの他方が、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００６７】
さらなる実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つが、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、少なくとも２つのペプチドの他方が、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲから選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００６８】
上記実施形態の何れか１つによれば、本ペプチドは５〜３０個のアミノ酸からなる。他の実施形態によれば、各ペプチドは６〜２５個のアミノ酸からなる。また他の実施形態によれば、各ペプチドは７〜２０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態によれば、各ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸からなる。各可能性は、本発明の個別の実施形態に相当する。
【００６９】
上記実施形態の何れか１つによれば、本発明のペプチドは環状ペプチドである。「環状ペプチド」および「シクロペプチド」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、２個の非隣接アミノ酸間の分子内結合を有するペプチドを指す。環化は、共有結合または非共有結合を通じてもたらされ得る。分子内結合としては、骨格と骨格、側鎖と骨格および側鎖と側鎖の結合が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態によれば、環化は、ペプチドのシステイン間、断片の類似体間で起こる。他の実施形態によれば、環化はＮ末端とＣ末端アミノ酸の間で起こる。
【００７０】
上記実施形態の何れか１つによれば、本コンストラクトは、２つ以上の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する２つ以上のペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、２〜１０個の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する２〜１０個の異なるペプチドを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、３〜８個、３〜１０個または４〜６個の異なるペプチドを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、２個の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する２個の異なるペプチドを含む。さらなる実施形態によれば、本コンストラクトは、３個の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する３個の異なるペプチドを含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、４個の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する４個の異なるペプチドを含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、それぞれ５、６、７または８個の異なる細胞外腫瘍抗原に結合する５、６、７または８個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つは、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。
【００７１】
一実施形態によれば、細胞外腫瘍アンタゴニストはヒトＥＧＦＲである。したがって、一実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１（ＣＨＰＧＤＫＱＥＤＰＮＣＬＱＡＤＫ）で示されるアミノ配列を有するペプチドである。他の実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１で示されるアミノ配列からなるペプチドである。いくつかのこのような実施形態によれば、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチドは環状である。
【００７２】
別の実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１を有するペプチドの類似体である。また別の実施形態において、本ペプチドは、配列番号１の保存的類似体である。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する類似体である。他の実施形態によれば、類似体は、配列番号１に対して７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の配列同一性を有するペプチドである。いくつかの実施形態によれば、配列番号１の類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換を有する配列番号１の保存的類似体である。
【００７３】
さらなる実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１またはその類似体の断片である。いくつかの実施形態によれば、断片は、配列番号１またはその類似体の少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個または少なくとも１６個の連続アミノ酸からなる。一実施形態によれば、断片は、配列番号１またはその類似体の５〜１６個、６〜１４個、７〜１３個、８〜１２個、８〜１２個または９〜１１個の連続アミノ酸からなる。別の実施形態において、ペプチド断片は、配列番号１の６〜１６個、８〜１４個または１０〜１２個の連続アミノ酸からなる。
【００７４】
本発明の態様および実施形態の何れか１つによれば、「配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列を含むペプチド」、「配列番号Ｘを含むペプチド」および「配列番号Ｘを有するペプチド」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。「配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列からなるペプチド」、「配列番号Ｘからなるペプチド」および「配列番号Ｘのペプチド」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００７５】
一実施形態によれば、細胞外腫瘍アンタゴニストはヒトＰＤ−Ｌ１である。したがって一実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号２（ＣＥＧＬＰＡＤＷＡＡＡＣ）で示されるアミノ配列を有するペプチドである。特定の実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号２からなるペプチドである。いくつかのこのような実施形態によれば、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチドは環状である。
【００７６】
別の実施形態によれば、本ペプチドは配列番号２の類似体である。また別の実施形態において、本ペプチドは、配列番号２の保存的変異体である。いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するペプチドである。他の実施形態によれば、類似体は、配列番号２に対して、７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の同一性を有するペプチドである。いくつかの実施形態によれば、類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換を有する配列番号２の保存的類似体である。
【００７７】
さらなる実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号２またはその類似体の断片である。いくつかの実施形態によれば、断片は、配列番号２またはその類似体の少なくとも（ａｓ  ｌｅａｓｔ）６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個または１１個の連続アミノ酸からなる。一実施形態によれば、断片は、配列番号１またはその類似体の、５〜１６個、６〜１４個、７〜１３個、８〜１２個、８〜１２個または９〜１１個の連続アミノ酸からなる。別の実施形態において、ペプチド断片は、配列番号１の６〜１６個、８〜１４個または１０〜１２個の連続アミノ酸からなる。
【００７８】
上記実施形態の何れか１つによれば、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチド、その断片の類似体は、環状ペプチド、類似体または断片である。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、本ペプチドの少なくとも１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは相乗的細胞毒性を有する。「相乗的細胞毒性」という用語は、本明細書中で使用される場合、２つ以上の腫瘍抗原標的化ペプチドを含むコンストラクトの細胞毒性が、このような各コンストラクトが標的化ペプチドのうち１つのみを含む場合の、それぞれ２つ以上のコンストラクトの細胞毒性よりも高いことを指す。したがって、ＰＤ−Ｌ１およびＥＧＦＲ標的化ペプチドを含むコンストラクトの細胞毒性は、ＰＤ−Ｌ１またはＥＧＦＲ標的化ペプチドをそれぞれ含む２個のコンストラクトの細胞毒性よりも高い（コンストラクトの濃度を考慮して）。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、ＥＧＦＲに特異的に結合する１つのペプチドおよびＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する別のペプチドを含む。一実施形態によれば、ＥＧＦＲに結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。別の実施形態によれば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片および配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片を含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチドおよび配列番号２を有するペプチドを含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１のペプチドおよび配列番号２のペプチドを含む。いくつかのこのような実施形態によれば、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチド、その断片の類似体は、環状ペプチド、類似体または断片である。いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは相乗的細胞毒性を有する。
【００８０】
上記実施形態の何れか１つによれば、本発明のコンストラクトは、異なるペプチドの少なくとも１つの複数コピーを含む。
【００８１】
他の実施形態によれば、本発明のコンストラクトは、異なるペプチドの少なくとも２個のそれぞれ１つの複数コピーを含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、本ペプチドのそれぞれ１つの複数コピーを含む。
【００８２】
「異なるペプチド」という用語は、異なる結合部位に結合するペプチドを指し、同じペプチドの２コピーを指すものではない。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、ペプチドの、２〜１００、３〜９０、４〜６０、５〜５０、６〜４０、７〜３５、８〜３０、９〜２５または１０〜２０コピーを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、ペプチドの２〜５０コピーを含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、ペプチドの７〜５６、１４〜４８、２１〜４２、２８〜３５、７〜２１コピーを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、２個の異なるペプチドのそれぞれ１つの２〜１００、３〜９０、４〜６０、５〜５０、６〜４０、７〜３５、８〜３０、９〜２５または１０〜２０コピーを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、２個の異なるペプチドのそれぞれ１つの２〜５０コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、２個の異なるペプチドのそれぞれ１つの７〜５６、１４〜４８、２１〜４２、２８〜３５、７〜２１コピーを含む。特定の実施形態において、本コントラクト（ｃｏｎｔｒａｃｔ）は、３、４または５個の異なるペプチドのそれぞれ１つの７〜または１４〜２８コピーを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドの複数コピーおよび／またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドの複数コピーを含む。いくつかの他の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片の複数コピーおよび配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片の複数コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片および／または配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片の、２〜１００、３〜９０、４〜６０、５〜５０、６〜４０、７〜３５、８〜３０、９〜２５または１０〜２０コピーを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片および／または配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片の、２〜５０コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するペプチドの、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５または７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号２を有するペプチドの、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２、２８〜３５または７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１および２を有するペプチドのそれぞれ１つの、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２、２８〜３５または７〜２１コピーを含む。上記実施形態の何れか１つによれば、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチド、その断片の類似体は、環状ペプチド、類似体または断片である。
【００８５】
上記実施形態の何れか１つによれば、毒素は、ペプチド毒素、ポリペプチド毒素またはペプチド毒素から選択される。
【００８６】
いくつかの実施形態によれば、毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素またはその毒素の類似体、ＢＩＭ−ＢＨ３毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＢＩＭ−ＢＨ３毒素は、アミノ酸配列ＭＲＰＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡ（配列番号５）からなる。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、真核細胞伸長因子２に結合する毒素は、ＣＳＡＲＷＧＰＴＭＰＷＣ（配列番号３で示されるとおり）またはＣＲＲＧＳＲＡＳＧＡＨＣ（配列番号４で示されるとおり）から選択されるアミノ酸配列を有する毒素、またはその類似体である。
【００８８】
別の実施形態によれば、毒素は、配列番号３を有する毒素、配列番号４を有する毒素、配列番号５の毒素（ＢＩＭ−ＢＨ３毒素）、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、本毒素は配列番号３を含む毒素である。他の実施形態によれば、本毒素は配列番号４を含む毒素である。別の実施形態によれば、本毒素は配列番号３からなる。また別の実施形態によれば、本毒素は配列番号４からなる。一実施形態によれば、本毒素は配列番号５からなる。いくつかの実施形態によれば、本毒素は、配列番号３または４を含む毒素の類似体である。特定の実施形態によれば、本毒素は、配列番号３または４からなる毒素の類似体である。いくつかのこのような実施形態によれば、本毒素またはその類似体は環状毒素または類似体である。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、配列番号３を含む毒素の類似体は、配列番号３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。他の実施形態によれば、本類似体は、配列番号３に対して、７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の配列同一性を有するペプチドである。いくつかの実施形態によれば、本類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換を有する配列番号３の保存的類似体である。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、配列番号４を含む毒素の類似体は、配列番号４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。他の実施形態によれば、本類似体は、配列番号４に対して７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の同一性を有するペプチドである。いくつかの実施形態によれば、本類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換を有する配列番号４の保存的類似体である。
【００９２】
いくつかのこのような実施形態によれば、ｅＥＦ２に結合する毒素、および特に配列番号３を含むかまたはそれからなる毒素、または、類似体またはその断片は、環状構造を有し、すなわちシクロトキシンである。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、２〜１０個の異なる毒素を含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、２個の異なる毒素を含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、３個の異なる毒素を含む。さらなる実施形態によれば、本コンストラクトは、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる毒素を含む。
【００９４】
特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、アミノ酸配列番号３を有する毒素およびアミノ酸配列番号４を有する毒素を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは、この毒素の少なくとも１つの複数コピーを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、少なくとも２つの毒素の複数コピーを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３または４を有する少なくとも１つの毒素の複数コピーを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３または４を有する少なくとも１つの毒素の複数コピーを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、毒素の、２〜１００、３〜９０、４〜６０、５〜５０、６〜４０、７〜３５、８〜３０、９〜２５または１０〜２０コピーを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、毒素の２〜５０コピーを含む。別の実施形態によれば、本コンストラクトは、毒素の７〜５６、１４〜４８、２１〜４２、２８〜３５、７〜２１コピーを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、２つの異なる毒素のそれぞれ１つの、２〜１００、３〜９０、４〜６０、５〜５０、６〜４０、７〜３５、８〜３０、９〜２５または１０〜２０コピーを含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、２つの異なる毒素のそれぞれ１つの２〜５０コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、２つの異なる毒素のそれぞれ１つの、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５、７〜２１コピーを含む。ある一定の実施形態において、本コントラクト（ｃｏｎｔｒａｃｔ）は、３、４または５個の異なる毒素のそれぞれ１つの７〜または１４〜２８コピーを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３を有する毒素、類似体またはそれらの断片および／または配列番号４を有する毒素、類似体またはそれらの断片の、２〜１００、３〜９０、４〜６０、５〜５０、６〜４０、７〜３５、８〜３０、９〜２５、２〜５０または１０〜２０コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３を有する毒素の、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５、７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号４を有する毒素の、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５、７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３および４を有する毒素のそれぞれ１つの、７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５、７〜２１コピーを含む。
【００９９】
一実施形態によれば、アミノ酸配列番号３を有する毒素対アミノ酸配列番号４を有する毒素のモル比は約０．１：１〜約１０：１である。いくつかの実施形態によれば、この比は、約０．２：１〜８：１、約０．４：１〜６：１  約０．５：１〜５：１  約０．６：１〜４：１、約０．８対１〜２：１または約１：１である。一実施形態によれば、アミノ酸配列番号３を有する毒素対アミノ酸配列番号４を有する毒素のモル比は１：１である。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含む本発明のコンストラクトを提供し、このペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、このペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＢＩＭ−ＢＨ３毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、シアノトキシン、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、本毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素である。いくつかの実施形態によれば、本発明は、本ペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、本ペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、本毒素が真核細胞伸長因子２に結合するか、または配列番号５の毒素である、コンストラクトを提供する。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片であり、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片であり、毒素は、配列番号３または４を有する毒素から選択される。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）１つのペプチド、（ｉｉ）２つのペプチド、（ｉｉｉ）１つの毒素および／または（ｉｖ）２つ毒素、の複数コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片、（ｉｉ）配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片および（ｉｉｉ）配列番号３または４を有する毒素から選択される毒素、またはそれらの組み合わせ、の複数コピーを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）配列番号１のペプチド、（ｉｉ）配列番号２のペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３または４の毒素、またはそれらの組み合わせ、の複数コピーを含む。他の実施形態によれば、本コンストラクトは、（ｉ）配列番号１のペプチド、（ｉｉ）配列番号２のペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３の毒素および（ｉｖ）配列番号４の毒素、のそれぞれ１つの複数コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは相乗的細胞毒性を有する。いくつかのこのような実施形態によれば、本ペプチド、その類似体またはその断片および／または毒素、その類似体またはその断片は、それぞれ、環状ペプチド、類似体またはその断片および／または環状毒素、その断片の類似体である。
【０１０１】
上記実施形態の何れか１つによれば、本発明のペプチドは互いに共有結合される。一実施形態によれば、本ペプチドおよび本毒素は、直接、すなわち担体なしで結合される。他の実施形態によれば、本発明のペプチドは、担体を通じて共有結合される。一実施形態によれば、担体は有機足場であり、したがって本ペプチドは足場を通じて共有結合される。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、足場はペプチド性足場である。他の実施形態によれば、ペプチド性足場はペプチドを、足場の１か所で互いに連結するか、または足場の異なる位置に連結する。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。いくつかの実施形態によれば、足場は、少なくとも１個のリジン（Ｌｙｓ）残基を含む。他の実施形態によれば、足場は、少なくとも３個のＬｙｓ残基を含む。さらなる実施形態によれば、少なくとも３個のＬｙｓ残基は、アミド結合により一緒に連結されて、分岐状の多量体の足場を形成する。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのアミド結合は、Ｌｙｓ残基のイプシロンアミンと別のＬｙｓ残基のカルボキシ基の間で形成される。
【０１０３】
特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、以下で与えるスキームの１つによる分子を含む
【化１】
2020501513.tif 000002
（式中、Ｘは、カルボキシ酸（ｃａｒｂｏｘｙ  ａｃｉｄ）、アミドまたはアルコール基および場合によってはリンカーまたはスペーサーから選択されるペプチドのおよび／または毒素のＣ末端に相当し、ペプチドは、本発明による、例えば細胞−標的に結合可能な７〜２０個のアミノ酸を有するペプチドを示す）。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０４】
いくつかの具体的な実施形態によれば、本ペプチドおよび／または本毒素の少なくとも１つは複数コピーで存在する。いくつかの実施形態によれば、この複数コピーが連結され、それによって多標的ペプチド多量体を形成する。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドおよび／または本毒素コピーは、リンカーを通じて連結される。他の実施形態によれば、本ペプチドおよび／または本毒素コピーは直接連結される。さらなる実施形態によれば、多量体は、直接およびリンカーを介しての両方で連結されるコピーを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、交互に並ぶポリマー構造Ｂ（Ｘ１Ｘ２Ｘ３．．．Ｘｍ）ｎＢでまたはブロックコポリマー構造Ｂ（Ｘ１）ｎＺ（Ｘ２）ｎＺ（Ｘ３）ｎＺ．．．（Ｘｍ）ｎで配置される複数の細胞−標的化ペプチドを含むペプチド多量体を含み、式中、Ｂは、１〜１０個のアミノ酸残基の任意選択の配列であり；ｎは、各出現時に独立に２〜５０の整数であり；ｍは３〜５０の整数であり；Ｘ１、Ｘ２．．．Ｘｍのそれぞれは、５〜３０個のアミノ酸残基からなる同一であるかまたは異なるペプチドであり；各出現時でのＺは、結合または１〜４個のアミノ酸残基のスペーサーである。特定の実施形態によれば、ｎは、各出現時に独立に２〜１０の整数であり；ｍは３〜１０の整数であり；Ｘ１、Ｘ２．．．Ｘｍのそれぞれは、７〜２０個のアミノ酸残基からなる同一であるかまたは異なるペプチドであり；Ｚは各出現時に、結合または１〜４個のアミノ酸残基からなるスペーサーである。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチド多量体は、２〜８個の異なるかまたは同一のペプチドを含む。特定の実施形態によれば、本ペプチド多量体は、１つのペプチド配列の４〜１０コピーを含む。また他の実施形態によれば、本ペプチド多量体は、２〜１０個、３〜９個、４〜８個または１０〜１００個の異なるかまたは同一のペプチドからなる。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０７】
他の実施形態によれば、足場は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子または修飾ＰＥＧ分子を含むかまたはそれらから形成される。特定の実施形態によれば、足場は、分岐状ＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態によれば、分岐状分子は、本発明のペプチドを結合させるために利用可能な少なくとも２つの部位を含む。他の実施形態によれば、足場は、ペプチドを結合するために利用可能な２〜１００個、３〜９０個、４〜６０個、５〜５０個、６〜４０個、７〜３５個、８〜３０個、９〜２５個または１０〜２０個または２〜５０個の部位を含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、ペプチドを結合するために利用可能な７〜５６個、１４〜４８個、２１〜４２個  ２８〜３５個、７〜２１個の部位を含む。特定の実施形態によれば、足場は、ペプチドを結合するために利用可能な８個または５６個の部位を含む。さらなる実施形態によれば、足場は、ペプチドを結合するために利用可能な４２個または４９〜５６個の部位を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、ペプチドへの少なくとも２つの個別の連結を含む分岐状分子である。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは８個の結合部位を有する。他の実施形態によれば、ＰＥＧはさらなるＰＥＧ分子に結合される。特定の実施形態によれば、複数のＰＥＧ分子が結合されて多アーム型ＰＥＧ分子を提供する。いくつかの実施形態によれば、１つの中央の８本アーム型ＰＥＧ分子に８個の８本アーム型ＰＥＧ分子が結合されて本発明の毒素のペプチドを結合できる部位が５６個ある１個のＰＥＧ分子を提供する。特定の実施形態によれば、本ペプチドは、ＮＨ２−ＰＥＧ分子のアミノ基間で形成されるアミド結合を通じてＰＥＧ足場に連結される。また他の実施形態によれば、少なくとも１つのペプチドがＬｙｓ残基を通じてＰＥＧ足場に連結される。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは、Ｌｙｓ残基を通じてＰＥＧ足場に結合される。
【０１１０】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＰＥＧ足場に結合されるペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲから選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合するコンストラクトを提供する。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ足場に結合されるペプチドの少なくとも１つは、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドおよびＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは両者とも足場に結合される。一実施形態によれば、ＥＧＦＲに結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。別の実施形態によれば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、両者とも足場に結合される、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片および配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片を含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、足場に結合される、配列番号１を有するペプチドおよび配列番号２を有するペプチドを含む。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、足場に結合される、配列番号１のペプチドおよび配列番号２のペプチドを含む。いくつかのこのような実施形態によれば、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチド、その断片の類似体は、環状ペプチド、類似体または断片である。
【０１１１】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、足場が本ペプチドの少なくとも１つの複数コピーに結合される、コンストラクトを提供する。いくつかの実施形態によれば、足場は、本ペプチドの少なくとも２つのそれぞれの複数コピーに結合される。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ足場に結合されるペプチドの少なくとも１つは、ＥＧＦＲまたはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、足場は、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドの複数コピーに結合される。他の実施形態によれば、足場は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドの複数コピーに結合される。さらなる実施形態によれば、足場は、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドの複数コピーにおよびＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドの複数コピーに結合される。一実施形態によれば、ＥＧＦＲに結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。別の実施形態によれば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。一実施形態によれば、足場は、配列番号１を有するペプチドの複数コピーにおよび配列番号２を有するペプチドの複数コピーに結合される。いくつかのこのような実施形態によれば、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチド、その断片の類似体は、環状ペプチド、類似体または断片である。
【０１１２】
いくつかの実施形態によれば、足場は炭水化物部分を含む。
【０１１３】
他の実施形態によれば、毒素は担体に結合される。担体は、本明細書中で上記に記載のとおりであり得る。したがって、一実施形態によれば、担体は足場である。特定の実施形態によれば、担体はペプチド性足場である。
【０１１４】
他の実施形態によれば、足場はＰＥＧ足場であり、すなわちＰＥＧから形成される。特定の実施形態によれば、足場は分岐状ＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態によれば、分岐状分子は、毒素に結合する少なくとも１つの利用可能な部位を含む。
【０１１５】
他の実施形態によれば、足場は、毒素を結合するのに利用可能な２〜１００個、３〜９０個、４〜６０個、５〜５０個、６〜４０個、７〜３５個、８〜３０個、９〜２５個または１０〜２０個または２〜５０個の部位を含む。一実施形態によれば、本コンストラクトは、毒素を結合するのに利用可能な７〜５６個、１４〜４８個、２１〜４２個、２８〜３５個、７〜２１個の部位を含む。特定の実施形態によれば、足場は、毒素を結合するのに利用可能な８個または５６個または４２個または４９〜５６個の部位を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、コンストラクトとして提供し、ここでＰＥＧ足場は、少なくとも１つの毒素の複数コピーに結合される。いくつかの実施形態によれば、本発明は、足場が少なくとも２つの毒素の複数コピーに結合される、コンストラクトを提供する。いくつかの実施形態によれば、毒素は、配列番号３を有する毒素、配列番号４を有する毒素、配列番号５を有する毒素（ＢＩＭ−ＢＨ３毒素）、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、シアノトキシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、毒素は、配列番号３または４の毒素である。
【０１１７】
一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号３を有する毒素、類似体またはそれらの断片の複数コピーに結合される。一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号４を有する毒素、類似体またはそれらの断片の複数コピーに結合される。一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号５を有する毒素の複数コピーに結合される。一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号３または４の毒素の複数コピーに結合される。
【０１１８】
一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、毒素のそれぞれ１つの複数コピーに結合される。一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号３を有する毒素の複数コピーにおよび配列番号４を有する毒素の複数コピーに結合される。一実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号３の毒素の複数コピーにおよび配列番号４の毒素の複数コピーに結合される。
【０１１９】
いくつかのこのような実施形態によれば、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチド、その断片の類似体は、環状ペプチド、類似体または断片である。さらに，配列番号３または４を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはその断片は、環状、すなわち環状毒素である。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドに、および少なくとも１つの毒素に結合されるＰＥＧ足場を含むコンストラクトを提供し、ここでペプチドの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲから選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを提供し、ここでこのペプチドおよび毒素のそれぞれは、ＰＥＧ足場に結合され、かつペプチドの少なくとも１つは、ＥＧＦＲおよびＰＤ−Ｌ１から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。一実施形態によれば、本ペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、この少なくとも２つのペプチドの別の１つは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。別の実施形態によれば、本ペプチドの１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、この少なくとも２つのペプチドの別の１つは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。他の実施形態によれば、本ペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、少なくとも２つのペプチドの他方はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。いくつかの実施形態によれば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。いくつかのこのような実施形態によれば、本ペプチドはシクロペプチドである。いくつかの実施形態によれば、本毒素は、配列番号３を有する毒素、配列番号４を有する毒素、配列番号５を有する毒素（ＢＩＭ−ＢＨ３毒素）、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、本毒素は、配列番号３の毒素、配列番号４の毒素および配列番号５の毒素からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、足場は、２、３または４個の異なる毒素に結合される。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、本ペプチドの少なくとも１つの複数コピーに結合される。他の実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、少なくとも２つのペプチドのそれぞれ１つの複数コピーに結合される。さらなる実施形態によれば、ＰＥＧ足場は毒素の複数コピーに結合される。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、２つ以上の毒素のそれぞれ１つの複数コピーに結合される。一実施形態によれば、足場は、配列番号１を有するペプチドの複数コピーに結合される。別の実施形態によれば、足場は、配列番号２を有す��ペプチドの複数コピーに結合される。さらなる実施形態によれば、足場は、配列番号１を有するペプチドの複数コピーおよび配列番号２を有するペプチドの複数コピーに結合される。一実施形態によれば、足場は、配列番号３を有する毒素の複数コピーに結合される。別の実施形態によれば、足場は、配列番号４を有する毒素の複数コピーに結合される。さらなる実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号３を有する毒素の複数コピーおよび配列番号４を有する毒素の複数コピーに結合される。また別の実施形態によれば、ＰＥＧ足場は、配列番号３の毒素の複数コピーおよび配列番号４の毒素の複数コピーに結合される。一実施形態によれば、アミノ酸配列番号３または５を有する毒素対アミノ酸配列番号４を有する毒素のモル比は、約０．１：１〜約１０：１または１：１である。いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは相乗的細胞毒性を有する。
【０１２２】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、配列番号１を有するペプチドの複数コピー、配列番号２を有するペプチドの複数コピー、配列番号３を有する毒素の複数コピーおよび配列番号４を有する毒素の複数コピーを含むコンストラクトを提供し、本ペプチドおよび本毒素のコピーのそれぞれはＰＥＧ足場に結合される。いくつかの実施形態によれば、本発明は、配列番号１のペプチドの複数コピーに、配列番号２のペプチドの複数コピーに、配列番号３の毒素の複数コピーにおよび配列番号４の毒素の複数コピーに結合されるＰＥＧ足場を含むコンストラクトを提供する。一実施形態によれば、アミノ酸配列番号３を有する毒素対アミノ酸配列番号４を有する毒素のモル比は、約０．１：１〜約１０：１または１：１である。いくつかの実施形態によれば、配列番号１を有するペプチドと、配列番号２のペプチドと、配列番号３を有する毒素と、配列番号３を有する毒素の間の化学量論的モル比は、１：１：３：３である。他の実施形態によれば、配列番号１を有するペプチドと配列番号２のペプチドと配列番号３を有する毒素と配列番号４を有する毒素の間の化学量論的モル比は、１：２：３：２、１：２：２：３、２：１：３：２、２：１：２：３および２：２：２：２から選択される。上述の実施形態において、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチドはシクロペプチドであり、配列番号３または４を含むかまたはそれからなる毒素はシクロトキシンである。いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは相乗的細胞毒性を有する。
【０１２３】
上記実施形態の何れか１つによれば、本ペプチドおよび／または本毒素は、直接、またはスペーサーを通じて結合される。他の実施形態によれば、本ペプチドおよび／または本毒素は、担体に、例えば足場に、スペーサーを通じて結合される。いくつかの具体的な実施形態によれば、スペーサーは少なくとも１個のアミノ酸残基を含む。
【０１２４】
上記実施形態の何れか１つによれば、本コンストラクトは、透過性促進部分をさらに含む。この透過性促進部分は、ペプチドにおよび／または毒素に直接結合され得るか、または、場合によってはスペーサーを介して、足場に結合され得る。「透過性促進部分」という用語は、身体障壁を通じる、または細胞中への、本化合物の透過性を、能動的もしくは受動的に促進するため、または増強するための当技術分野において公知の何らかの部分を指す。透過性促進部分の非限定例としては、疎水性部分、例えば脂肪酸、ステロイドおよび巨大な芳香族または脂肪族化合物；細胞−膜受容体または担体を有し得る部分、例えばステロイド、ビタミンおよび糖、天然および非天然アミノ酸および輸送体ペプチド、ナノ粒子およびリポソームが挙げられる。「透過性」という用語は、障壁、膜または皮膚層を通じて薬剤または物質を浸透させる、行き渡らせる、または拡散させる能力を指す。
【０１２５】
別の態様によれば、本発明は、本発明のコンストラクトを含む組成物を提供する。一実施形態によれば、本組成物は医薬組成物である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のコンストラクトと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。全ての定義、用語および先行する態様の実施形態はこの態様により明確に包含される。
【０１２６】
「医薬組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、場合によっては１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とともに処方される、本明細書中で開示されるような本発明のコンストラクトを含む組成物を指す。
【０１２７】
本医薬組成物の処方は、本願に従い調整され得る。特に、本医薬組成物は、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速な、連続するまたは遅延された放出をもたらすために、当技術分野において公知の方法を使用して処方され得る。例えば、本処方物は、硬膏剤、顆粒剤、ローション、リニメント剤、レモネード、アロマ水、粉末、シロップ、眼用軟膏、液体および溶液、エアロゾル、エキス剤、エリキシル剤、軟膏、流エキス剤、エマルション、懸濁液、浸出液、点滴、眼用の液剤、錠剤、坐薬、注射、酒精剤、カプセル、クリーム、トローチ、チンキ剤、ペースト剤、丸剤、および軟または硬ゼラチンカプセルの中から選択される何れか１つであり得る。
【０１２８】
「薬学的に許容可能な担体」または「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、医薬の投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、保存剤、抗酸化剤、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤、界面活性剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、希釈剤、滑沢剤、流動促進剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、促進剤、湿潤剤、可溶化剤、界面活性剤、抗酸化剤などを指す。適切な賦形剤の非限定例は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。他の適切な担体は当業者にとって周知である。薬学的活性物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。本組成物は、補助的な、追加的な、または強化された治療機能をもたらす他の活性化合物を含有し得る。
【０１２９】
本発明のコンストラクトは、いくつかの実施形態によれば、治療での使用のための滅菌食塩水溶液中に懸濁され得る。多数の適切な薬物送達系は公知であり、例えば、植え込み型薬物放出系、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルション、ミクロスフェアなどを含む。制御放出製剤は、本発明による分子を複合化または吸着するためのポリマーの使用を通じて調製され得る。例えば、生体適合性ポリマーは、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）のマトリクスおよびステアリン酸二量体およびセバリック酸（ｓｅｂａｒｉｃ  ａｃｉｄ）のポリ酸無水物コポリマーのマトリクスを含む。このようなマトリクスからの本発明による分子の放出速度は、分子の分子量、マトリクス内の分子の量、および分散粒子のサイズに依存する。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は任意の公知の方法により投与され得る。対象に物質、化合物または薬剤を「投与すること」または「投与」という用語は、当業者にとって公知の様々な方法の１つを使用して行われ得る。例えば、化合物または薬剤は、静脈内、動脈、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼内、舌下、経口（摂取による）、鼻腔内（吸入による）、脊髄内、脳内、および経皮（吸収による、例えば皮膚管（ｓｋｉｎ  ｄｕｃｔ）を通じて）で投与され得る。化合物または薬剤は、化合物または薬剤の延長された、緩徐なまたは制御された放出をもたらす、再投入可能なもしくは生体分解性のポリマー性装置または他の装置、例えばパッチおよびポンプ、または処方物によっても適切に導入され得る。投与はまた、例えば１回、複数回、および／または１回以上の長期間にわたって行われ得る。いくつかの実施形態において、投与は、自己投与を含む直接投与および、薬物を処方する行動を含む間接投与の両方を含む。例えば、本明細書中で使用される場合、患者に対して薬物を自己投与するように、または別の者に薬物を投与してもらうように指示する、および／または薬物に対する処方せんを患者に提供する医師が、患者に薬物を投与している。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内または非経口での投与などの、侵襲的な投与方式により投与される。
【０１３２】
当業者にとって当然のことながら、本発明による分子の治療的有効量は、とりわけ投与計画、投与される分子の単位用量、分子が他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、免疫状態および患者の健康、投与される分子の治療活性および処置する医師の判断に依存する。本明細書中で使用される場合、「治療的有効量」は、ある期間にわたり処置される障害と関連する１つ以上の症状を改善するために必要とされる分子の量を指す。
【０１３３】
本発明の分子の適切な投与量は、投与経路、分子のタイプ（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機分子など）患者の年齢、体重、性別または状態に依存して変動するものの、それは最終的に医師により決定される。有効量に到達することにおける様々な考察は、例えばＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に記載される。
【０１３４】
特定の一実施形態において、本発明の医薬組成物は、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを含み、このペプチドおよび毒素は、直接、または担体を通じて共有結合される。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲおよびＰＤ−Ｌ１から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。別の実施形態によれば、少なくとも２つのペプチドのうち他方は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する。特定の実施形態によれば、本コンストラクトは、２〜１０個の異なるペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、本ペプチドの少なくとも１つがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。一実施形態によれば、ＥＧＦＲに結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。別の実施形態によれば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。さらなる実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１を有するかまたはそれからなるペプチドおよび配列番号２を有するかまたはそれからなるペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、本ペプチドの１つまたは２つの複数コピーを含むコンストラクトを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号１および２を有するペプチドのそれぞれ１つの７〜５６、１４〜４８、２１〜４２、２８〜３５または７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素またはその毒素の類似体、ＢＩＭ−ＢＨ３毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＢＩＭ−ＢＨ３毒素は配列番号５からなる。特定の実施形態によれば、真核細胞伸長因子２に結合する毒素は、配列番号３または４から選択されるアミノ酸配列またはその類似体を有する毒素である。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、２〜１０個の異なる毒素を含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、２つの毒素のうち１つの７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５または７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３または４を有する毒素のそれぞれの７〜５６、１４〜４８、２１〜４２  ２８〜３５、７〜２１コピーを含む。いくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、配列番号３および４を有する毒素のそれぞれ１つの７〜５６、１４〜４８、２���〜４２  ２８〜３５、７〜２１コピーを含む。一実施形態によれば、アミノ酸配列番号３を有する毒素対アミノ酸配列番号４を有する毒素のモル比は、約０．１：１〜約１０：１または約１：１である。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは環状ペプチドであり、毒素は環状毒素である。
【０１３５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ足場、少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素とを含むコンストラクトを含み、ここでペプチドの少なくとも１つがＥＧＦＲおよびＰＤ−Ｌ１から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合し、このペプチドおよび毒素のそれぞれ１つが足場に結合される。他の実施形態によれば、本ペプチドの１つがＥＧＦＲに特異的に結合し、少なくとも２つのペプチドに対する他方がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドは、配列番号１を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。いくつかの実施形態によれば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドは、配列番号２を有するペプチド、類似体またはそれらの断片である。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＰＥＧ足場、配列番号１を有するペプチドの複数コピー、配列番号２を有するペプチドの複数コピーおよび配列番号３を有する毒素の複数コピーを含むコンストラクトを提供し、本ペプチドのそれぞれ１つの各コピーおよび毒素の各コピーは、足場に結合される。一実施形態によれば、本コンストラクトは、ＰＥＧ足場、配列番号１を有するペプチドの複数コピー、配列番号２を有するペプチドの複数コピーおよび配列番号４を有する毒素の複数コピーを含み、本ペプチドのそれぞれ１つの各コピーおよび本毒素の各コピーは、足場に結合される。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、配列番号１を有するペプチドの複数コピー、配列番号２を有するペプチドの複数コピー、配列番号３を有する毒素の複数コピーおよび配列番号４を有する毒素の複数コピーに結合されるＰＥＧ足場を含むコンストラクトを提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、配列番号１のペプチドの複数コピー、配列番号２のペプチドの複数コピー、配列番号３の毒素の複数コピーおよび配列番号４の毒素の複数コピーに結合されるＰＥＧ足場を含むコンストラクトを提供する。一実施形態によれば、アミノ酸配列番号３を有する毒素対アミノ酸配列番号４を有する毒素のモル比は、約０．１：１〜約１０：１または１：１である。いくつかの実施形態によれば、配列番号１を有するペプチドと、配列番号２のペプチドと、配列番号３を有する毒素と、配列番号３を有する毒素の間の化学量論的モル比は１：１：３：３である。他の実施形態によれば、配列番号１を有するペプチドと、配列番号２のペプチドと、配列番号３を有する毒素と、配列番号４を有する毒素の間の化学量論的モル比は、１：２：３：２、１：２：２：３、２：１：３：２、２：１：２：３および２：２：２：２から選択される。上述の実施形態において、配列番号１または２を含むかまたはそれからなるペプチドはシクロペプチドであり、配列番号３または４を含むかまたはそれからなる毒素はシクロトキシンである。いくつかの実施形態によれば、本発明のコンストラクトは相乗的細胞毒性を有し、したがってこのような医薬組成物は、投与される場合、強い治療効果をもたらす。
【０１３７】
上記実施形態の何れか１つによれば、本医薬組成物は、本発明によるおよび上記実施形態による複数のコンストラクトを含む。
【０１３８】
別の実施形態によれば、本発明は、細胞増殖性疾患または障害の処置での使用のための本発明による医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、細胞増殖性疾患または障害は癌である。したがって、一実施形態によれば、本発明の医薬組成物は癌の処置での使用のためである。
【０１３９】
状態または患者を「処置すること」、「処置」という用語は、臨床結果を含む、有益な、または所望の結果を得るための段階を踏むことを指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、疾患、状態または障害を、または改善する、抑止する、実質的に阻害する、その進行を遅らせる、または逆転させる、状態の臨床または審美的症状を実質的に改善する、または緩和する、疾患、状態または障害の臨床または審美的症状の発症を、実質的に防ぐ、および有害なもしくは厄介な症状から保護することが挙げられるが限定されない。処置することは、次のうち１つ以上を完遂することをさらに指す：（ａ）障害の重症度を軽減すること；（ｂ）処置される障害の特徴の症状の進行を制限すること；（ｃ）処置される障害の特徴である症状の悪化を制限すること；（ｄ）以前障害があった患者における障害再発を制限すること；および／または（ｅ）障害に対して以前無症候性であった患者における症状再発を制限すること。
【０１４０】
いくつかの実施形態によれば、癌を処置することは、腫瘍転移を予防または処置することを含む。特定の実施形態によれば、転移が減少される。他の実施形態によれば、転移が予防される。
【０１４１】
いくつかの実施形態によれば、癌を処置することは、癌を有する対象の生存期間を延長することを含み、それを必要とする対象に上記で定められるコンストラクトを含む組成物を投与しそれによりコンストラクトの投与が生存期間を延長させることを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態によれば、癌を処置することは、癌を有する対象の無進行生存期間を延長することを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、癌を処置することは、癌を有する対象の奏効期間を延長することを含む。他の実施形態によれば、癌を処置することは、腫瘍再発を予防することを含む。
【０１４４】
本発明による処置に関して修正可能な癌としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが限定されない。このような癌のより特定な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または胃の癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ−細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連するものなど）、およびメージュ症候群が挙げられる。
【０１４５】
いくつかの実施形態によれば、癌は、乳癌、結直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎臓細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される。本発明の処置に関して修正可能な癌の状態は転移性癌を含む。
【０１４６】
他の実施形態によれば、癌は固形癌である。
【０１４７】
本発明による医薬組成物は、独立型の処置として、または何らかの他の薬剤での処置と組み合わせて投与され得る。具体的な実施形態によれば、本発明によるコンストラクトは、少なくとも１つの抗癌剤と組み合わせた処置計画の一部として、それを必要とする対象に投与される。本発明による医薬組成物は、抗癌剤と組み合わせて、または個別に投与され得る。
【０１４８】
本発明による医薬組成物は、抗新生物組成物と一緒に投与され得る。
【０１４９】
具体的な実施形態によれば、抗新生物組成物は、少なくとも１つの化学療法剤を含む。
【０１５０】
「抗新生物組成物」という用語は、腫瘍の成長または機能または転移を阻害または予防可能なおよび／または腫瘍細胞の破壊を引き起こすことが可能な少なくとも１つの活性治療剤を含む、癌の処置において有用な組成物を指す。癌を処置するための抗新生物組成物中の適切な治療剤としては、化学療法剤、放射活性同位体、毒素、インターフェロンなどのサイトカイン、およびサイトカインを標的とするアンタゴニスト剤、サイトカイン受容体または腫瘍細胞と関連する抗原が挙げられるが限定されない。
【０１５１】
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学的な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮＲＴＭシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチローロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４））など；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮＲＴＭドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（���ｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬（ａｎｔｉａｄｒｅｎａｌｓ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば葉酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫＲＴＭ多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド，例えばＴＡＸＯＬＲＴＭパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭクレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミン改変型ナノ粒子処方物（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）およびＴＡＸＯＴＥＲＥＲＴＭドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲＲＴＭゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトレキサート；白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥＲＴＭビノレルビン；ノバントロ��；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；および上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１５２】
また、この定義には、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体修飾薬（ＳＥＲＭ）などの腫瘍におけるホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン薬が含まれ、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸＲＴＭタモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン；副腎でのエストロゲン産生を制御する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥＲＴＭ酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮＲＴＭエキセメスタン、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲＲＴＭボロゾール、ＦＥＭＡＲＡＲＴＭレトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸＲＴＭアナストロゾールなど；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異所性細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−アルファ、ＲａｆおよびＨ−Ｒａｓなど；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥＲＴＭリボザイム）およびＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ＤＮＡベースのワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮＲＴＭワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮＲＴＭワクチンおよびＶＡＸＩＤＲＴＭワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮＲＴＭ  ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮＲＴＭトポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸＲＴＭ  ｒｍＲＨ；および上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体を含む。
【０１５３】
別の態様によれば、本発明は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含むそれを必要とする対象において癌を処置する方法を提供する。一実施形態によれば、本発明は、治療的有効量の本発明のコンストラクトを対象に投与することを含むそれを必要とする対象において癌を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、少なくとも１つの抗癌剤と共に処置計画の一部として投与される。「治療的有効量」という用語は、対象に投与されたときに意図する治療効果を有する、薬物、化合物、コンストラクトなどの量である。完全な治療効果は、必ずしも１回の投与により生じるものではなく、一連の投与後に初めて生じる可能性がある。
【０１５４】
別の態様によれば、本発明は、ヒト真核細胞伸長因子２（ｅＥＦ２）、類似体またはそれらの断片に特異的に結合するペプチドを提供する。一実施形態によれば、本発明は、ヒトｅＥＦ２に特異的に結合するペプチドを提供する。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは毒素である。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは、５〜３０個のアミノ酸からなる。他の実施形態によれば、各ペプチドは、６〜２５個のアミノ酸からなる。また他の実施形態によれば、各ペプチドは、７〜２０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態によれば、各ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸からなる。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５５】
いくつかの実施形態によれば、ヒトｅＥＦ２に結合するペプチドは、配列番号３を有するペプチドである。特定の実施形態によれば、本発明は、配列番号３の類似体を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は、本ペプチドまたは類似体の断片を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号３を有するペプチドである。別の実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号３のペプチドである。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは環状ペプチドである。
【０１５６】
いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態によれば、類似体は、配列番号３に対して約７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号３の保存的類似体である。いくつかの実施形態によれば、配列番号３の保存的類似体は、配列番号３中に１、２、３、４または５個の保存的置換を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体はシクロペプチドである。
【０１５７】
一実施形態によれば、断片は、配列番号３またはその類似体の６〜１１個、７〜１０個または８〜９個の連続アミノ酸からなる。
【０１５８】
いくつかの実施形態によれば、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチドは、ヒトｅＥＦ２の活性を増強する。一実施形態によれば、本ペプチドはｅＥＦ２のアゴニストである。別の実施形態によれば、配列番号３の類似体または本ペプチドもしくは類似体の断片は、ｅＥＦ２の活性を増強する。
【０１５９】
一実施形態によれば、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体または本ペプチドもしくは上記類似体の断片は毒素である。一実施形態において、本ペプチドは、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。いくつかの実施形態によれば、細胞は癌細胞である。一実施形態によれば、配列番号３を含むペプチドは標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。別の実施形態によれば、配列番号３からなるペプチドは、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。さらなる実施形態によれば、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチドの類似体は、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。
【０１６０】
「細胞死を誘導する」および「細胞死を促進する」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、本発明のもの（すなわち本ペプチド、類似体または断片）が、細胞に対して細胞死を直接誘導し得ることを意味し、細胞死はアポトーシスおよび壊死を含む。細胞死は、細胞表面上で発現される分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）との、または細胞膜の内側に結合される、細胞小器官にある、またはその内側もしくは外側部分の何れかで細胞小器官の膜に存在する、細胞質ゾルにある分子などの、細胞内にある分子との、本発明の化合物の相互作用ゆえに起こり得る。
【０１６１】
「細胞死」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞の破壊および破損または損傷の両方を包含する。「細胞死」という用語は細胞消失を包含する。
【０１６２】
いくつかの実施形態によれば、ヒトｅＥＦ２に結合するペプチドは、配列番号４を有するペプチドである。特定の実施形態によれば、本発明は、配列番号４の類似体を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は、本ペプチドまたは類似体の断片を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号４を有するペプチドである。別の実施形態によれば、本ペプチドは配列番号４のペプチドである。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは環状ペプチドである。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は配列番号４の保存的類似体である。他の実施形態によれば、類似体は、配列番号４に対して７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号４の保存的類似体である。いくつかの実施形態によれば、配列番号４の保存的類似体は、配列番号４中に１、２、３、４または５個の保存的置換を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は環状ペプチドである。
【０１６４】
一実施形態によれば、断片は、配列番号４またはその類似体の６〜１１個、７〜１０個または８〜９個の連続アミノ酸からなる。
【０１６５】
いくつかの実施形態によれば、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドは、ヒトｅＥＦ２の活性を増強する。一実施形態によれば、本ペプチドは、ｅＥＦ２のアゴニストである。別の実施形態によれば、配列番号４の類似体または本ペプチドもしくは類似体の断片は、ｅＥＦ２の活性を増強する。
【０１６６】
一実施形態によれば、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体または本ペプチドもしくは前記類似体の断片は毒素である。一実施形態において、本ペプチドは、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。いくつかの実施形態によれば、細胞は癌細胞である。一実施形態によれば、配列番号４を含むペプチドは、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。別の実施形態によれば、配列番号４からなるペプチドは、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。さらなる実施形態によれば、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドの類似体は、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。
【０１６７】
別の態様によれば、本発明は、ヒトｅＥＦ２に特異的に結合するペプチドの抱合体を提供する。
【０１６８】
一実施形態によれば、本発明は、配列番号３、その類似体またはその断片を有するかまたはそれからなるペプチドから選択されるペプチドの抱合体を提供する。一実施形態によれば、本発明は、配列番号３を有するかまたはそれからなるシクロペプチドの抱合体を提供する。
【０１６９】
一実施形態によれば、本発明は、配列番号４を有するかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドの抱合体を提供する。一実施形態によれば、本発明は、配列番号４を有するかまたはそれからなるシクロペプチドの抱合体を提供する。
【０１７０】
「抱合体」という用語は、２つ以上の分子の共の連結または結合から形成される任意の物質を指す。特に、抱合体という用語は、上記実施形態の何れか１つの２つ以上のペプチドの結合から形成される化合物または別の分子に結合される上記ペプチドを含む化合物を包含する。いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチド、類似体または断片は、ペプチドの抗原性、溶解度、安定性または透過性を改善する担体タンパク質または部分と複合化される。本発明による少なくとも１つのペプチドを含む融合タンパク質もこの範囲内である。
【０１７１】
したがって、いくつかの実施形態によれば、抱合体は、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体または共有結合されるそれらの断片の少なくとも２コピーを含む。
【０１７２】
別の実施形態によれば、抱合体は、少なくとも１つの配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片および別の分子を含む。いくつかの実施形態によれば、上記分子は任意の分子であり得る。一実施形態によれば、本分子は、活性剤、細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、毒素、透過性促進部分および抗癌剤から選択される。
【０１７３】
いくつかの実施形態によれば、抱合体は、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体または共有結合されるそれらの断片の少なくとも２コピーを含む。
【０１７４】
別の実施形態によれば、抱合体は、少なくとも１つの配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片および別の分子を含む。いくつかの実施形態によれば、上記分子は任意の分子であり得る。一実施形態によれば、本分子は、活性剤、細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、毒素、透過性促進部分および抗癌剤から選択される。
【０１７５】
細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、毒素、抗癌剤は本発明により定められるとおりである。「活性剤」という用語は、生物学的活性、薬理学的効果および／または治療的有用性を有する薬剤を指す。
【０１７６】
一実施形態によれば、細胞外腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲから選択される。
【０１７７】
別の実施形態によれば、本毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＢＩＭ−ＢＨ３毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される。
【０１７８】
また別の実施形態によれば、担体は、ＰＥＧ担体またはペプチド性担体などの足場担体であり得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抱合体は、標的細胞での細胞死の誘導における使用のためである。
【０１８０】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。一実施形態によれば、本発明は、配列番号１を有するペプチドの類似体を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は、前記ペプチドまたは前記類似体の断片を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは配列番号１からなる。
【０１８１】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは５〜３０個のアミノ酸からなる。他の実施形態によれば、各ペプチドは６〜２５個のアミノ酸からなる。また他の実施形態によれば、各ペプチドは、７〜２０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態によれば、各ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸からなる。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８２】
いくつかの実施形態によれば、配列番号１、類似体またはそれらの断片を有するかまたはそれからなるペプチドは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する。一実施形態によれば、本ペプチド、断片の類似体は、ＥＧＦＲのアンタゴニストである。いくつかの実施形態によれば、本ペプチドはシクロペプチドである。
【０１８３】
いくつかの実施形態によれば、配列番号１の類似体は、配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の実施形態によれば、類似体は、配列番号１に対して７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号１の保存的類似体である。いくつかの実施形態によれば、配列番号１の保存的類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体はシクロペプチドである。
【０１８４】
一実施形態によれば、断片は、配列番号１またはその類似体の６〜１１個、７〜１０個または８〜９個の連続アミノ酸からなる。
【０１８５】
いくつかの実施形態によれば、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片は、癌細胞標的化ペプチドである。したがって、一実施形態において、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片は、癌細胞標的化における使用のためである。
【０１８６】
一実施形態によれば、本発明は、配列番号１を有するかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドの抱合体を提供する。一実施形態によれば、本発明は、配列番号１を有するかまたはそれからなるシクロペプチドの抱合体を提供する。
【０１８７】
いくつかの実施形態によれば、抱合体は、共有結合される、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片の少なくとも２コピーを含む。別の実施形態によれば、抱合体は、少なくとも１つの配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片および別の分子を含む。いくつかの実施形態によれば、前記分子は任意の分子であり得る。一実施形態によれば、本分子は、活性剤、細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、透過性促進部分、毒素、抗癌剤およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１８８】
細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、毒素、抗癌剤という用語は、本発明で定められるとおりである。
【０１８９】
一実施形態によれば、細胞外腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲから選択される。
【０１９０】
別の実施形態によれば、本毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素、配列番号５のＢＩＭ−ＢＨ３毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される。
【０１９１】
また別の実施形態によれば、担体は、ＰＥＧ担体またはペプチド性担体などの足場担体であり得る。
【０１９２】
別の態様によれば、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。一実施形態によれば、本発明は、配列番号２を有するペプチドの類似体を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は、前記ペプチドまたは前記類似体の断片を提供する。一実施形態によれば、本ペプチドは配列番号２からなる。
【０１９３】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチドは、５〜３０個のアミノ酸からなる。他の実施形態によれば、各ペプチドは、６〜２５個のアミノ酸からなる。また他の実施形態によれば、各ペプチドは、７〜２０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態によれば、各ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸からなる。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９４】
いくつかの実施形態によれば、配列番号２、類似体またはそれらの断片を有するかまたはそれからなるペプチドは、ヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する。
【０１９５】
上記実施形態の何れか１つによれば、本ペプチド、断片の類似体は、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストである。
【０１９６】
いくつかの実施形態によれば、本ペプチドはシクロペプチドである。
【０１９７】
いくつかの実施形態によれば、配列番号２の類似体は、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の実施形態によれば、類似体は、配列番号２に対して７０％〜９５％、７５％〜９０％または８０％〜８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は、配列番号２の保存的類似体である。いくつかの実施形態によれば、配列番号２の保存的類似体は、１、２、３、４または５個の保存的置換を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体はシクロペプチドである。
【０１９８】
一実施形態によれば、断片は、配列番号２またはその類似体の６〜１１個、７〜１０個または８〜９個の連続アミノ酸からなる。
【０１９９】
いくつかの実施形態によれば、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片は、癌細胞標的化ペプチドである。したがって、一実施形態において、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片は、癌細胞標的化における使用のためである。
【０２００】
一実施形態によれば、本発明は、配列番号２を有するかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドの抱合体を提供する。一実施形態によれば、本発明は、配列番号２を有するかまたはそれからなるシクロペプチドの抱合体を提供する。
【０２０１】
したがって、いくつかの実施形態によれば、抱合体は、共有結合される、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片の少なくとも２コピーを含む。別の実施形態によれば、抱合体は、少なくとも１つの配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片および別の分子を含む。いくつかの実施形態によれば、上記分子は任意の分子であり得る。一実施形態によれば、本分子は、活性剤、細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、毒素、抗癌剤、透過性促進部分およびそれらの組み合わせから選択される。
【０２０２】
細胞外腫瘍抗原標的化分子、担体、毒素、抗癌剤は本発明で定められるとおりである。
【０２０３】
一実施形態によれば、細胞外腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲから選択される。
【０２０４】
別の実施形態によれば、本毒素は、真核細胞伸長因子２に結合する毒素、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＢＩＭ−ＢＨ３毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、シアノトキシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０２０５】
また別の実施形態によれば、担体は、ペプチド性担体のＰＥＧ担体などの足場担体であり得る。
【０２０６】
別の態様によれば、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の抱合体を含む組成物を提供する。一実施形態によれば、本組成物は医薬組成物である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の抱合体を含む医薬組成物を提供する。
【０２０７】
一実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。別の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号１の類似体または上記ペプチドまたは上記類似体の断片を含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、複数の上記ペプチド、類似体または断片を含む。また別の実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片の１つ以上の抱合体を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。別の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号２の類似体または上記ペプチドもしくは前記類似体の断片を含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、複数の上記ペプチド、類似体または断片を含む。また別の実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片の１つ以上の抱合体を含む。
【０２０９】
特定の実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。別の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号３の類似体または上記ペプチドもしくは前記類似体の断片を含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、複数の上記ペプチド、類似体または断片を含む。また別の実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片の１つ以上の抱合体を含む。
【０２１０】
別の実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。別の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号４の類似体または上記ペプチドもしくは前記類似体の断片を含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、複数の上記ペプチド、類似体または断片を含む。また別の実施形態によれば、本医薬組成物は、上記実施形態の何れか１つによる、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチド、類似体またはそれらの断片の１つ以上の抱合体を含む。
【０２１１】
上記ペプチドおよび抱合体に関する本発明の他の態様の全ての定義および実施形態もこの態様に包含される。
【０２１２】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、細胞増殖性疾患または障害を処置するためである。いくつかの実施形態によれば、細胞増殖性疾患または障害は癌である。一実施形態によれば、本医薬組成物は、本発明の実施形態の何れか１つで定められるとおりの、配列番号１、２、３および４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、本発明は、癌の処置における使用のための、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチドを含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は、癌の処置における使用のための、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチドを含む医薬組成物を提供する。また別の実施形態によれば、本発明は、癌の処置における使用のための、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチドを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、癌の処置における使用のための、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチドを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態によれば、本医薬組成物は、本発明の実施形態の何れか１つで定められるとおりの上記ペプチドの１つ以上の抱合体を含む。
【０２１３】
別の態様によれば、本発明は、治療的有効量の本発明のペプチドまたは抱合体を投与することを含むそれを必要とする対象において増殖性疾患または障害を処置する方法を提供する。一実施形態によれば、本方法は、本発明のペプチドまたは抱合体を含む医薬組成物を投与することを含む。一実施形態によれば、本ペプチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体および上記ペプチドの断片からなる群から選択される。一実施形態によれば、抱合体は、上記ペプチドの抱合体である。一実施形態によれば、本ペプチド、類似体または断片は環状である。
【０２１４】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１、２、３および４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドから選択されるペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、本発明の実施形態の何れか１つで定められるとおりの、配列番号１、２、３および４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドまたはそれらの断片から選択されるペプチドの類似体をコードする配列を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片をコードする配列を含む。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号１を有するペプチドをコードする配列を含む。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号１のペプチドをコードする配列を含む。
【０２１６】
特定の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号２を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片をコードする配列を含む。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号２を有するペプチドをコードする配列を含む。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号２のペプチドをコードする配列を含む。
【０２１７】
別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号３を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片をコードする配列を含む。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号３を有するペプチドをコードする配列を含む。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号３のペプチドをコードする配列を含む。
【０２１８】
また別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号４を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片をコードする配列を含む。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号４を有するペプチドをコードする配列を含む。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号４のペプチドをコードする配列を含む。
【０２１９】
一実施形態によれば、本発明は、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。さらなる実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２、（ｉｉｉ）配列番号３および配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２２０】
別の態様によれば、本発明は、上記実施形態の何れか１つによるポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを提供する。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態によれば、本核酸コンストラクトは、本発明の実施形態の何れか１つで定められるとおりの、配列番号１、２、３および４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、本核酸コンストラクトは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含むものをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも1コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。さらなる実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２、（ｉｉｉ）配列番号３および配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２２１】
「核酸コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、人工的に構築された核酸セグメントを指す。これは、単離され得るか、または別の核酸分子において統合され得る。
【０２２２】
本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」、「操作可能にコードされる」および「操作可能に結合される」という用語は本明細書中で交換可能に使用され、プロモーターと核酸配列の間の機能的連結を指し、ここでプロモーターは、ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡの転写を開始させる。
【０２２３】
「プロモーター」という用語は、下流核酸の転写を開始させる制御配列である。「プロモーター」という用語は、それにＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始させ得る部位を定めるより大きなＤＮＡ配列内のＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、任意選択の遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、相同の、すなわち所望の核酸の発現を指揮するための天然のもの、または異種の、すなわち所望の核酸以外の遺伝子由来の核酸の発現を指示するための天然のもの、の何れかであり得る。プロモーターは、構成的または誘導的であり得る。構成的プロモーターは、殆どの環境および発生状態下で活性なプロモーターである。誘導的プロモーターは、環境または発生制御下で活性なプロモーターであり、例えばキシロース利用可能性に応答して上方制御である。
【０２２４】
別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列または核酸コンストラクトを含むベクターを提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明の実施形態の何れか１つで定められるとおりの、配列番号１、２、３および４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の実施形態によれば、本ベクターは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。さらなる実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２、（ｉｉｉ）配列番号３および配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２２５】
「ベクター」および「発現ベクター」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、プラスミド、コスミド、人工染色体（細菌または酵母）などの任意の非ウイルスベクター、またはウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージまたはファージなどのウイルスベクター、２本もしくは１本鎖直鎖状または環状形態のバイナリーベクター、または核酸、宿主細胞を形質転換可能な、および場合によっては宿主細胞中で複製可能な配列を指す。ベクターは、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性など、形質転換された細胞の同定での使用に適切な任意のマーカーを含有し得る。一実施形態によれば、ベクターはプラスミドである。別の実施形態によれば、ベクターはファージまたはバクテリオファージである。
【０２２６】
「プラスミド」という用語は、細胞に外来ＤＮＡ断片を挿入でき、場合によっては特定の細胞中で自己複製できる、環状の、場合によっては２本鎖のＤＮＡを指す。プラスミドは通常、発現されるべきものに加えて、それらの特異的な選択のためのマーカー遺伝子のようなさらなる配列および一部のケースでは標的細胞でのそれらのエピソーム複製のための配列を含有する。ある特定の実施形態において、プラスミドは、細菌中での増幅および発現のために設計される。プラスミドは、標準的な分子生物学的技術により操作され得る。
【０２２７】
別の態様によれば、本発明は、本発明の実施形態の何れか１つで定められるとおりの、配列番号１、２、３および４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチド、その類似体またはその断片から選択されるペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞を提供する。別の実施形態によれば、本発明は、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。別の実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２および（ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。さらなる実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２、（ｉｉｉ）配列番号３および配列番号４の少なくとも１コピーを含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０２２８】
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語は、本明細書中で使用される場合、「少なくとも一部、〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｉｎ  ｐａｒｔ  ｏｆ）」を意味する。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を含む本明細書中の各記述を解釈する場合、それ以外の特性またはその用語で始まるものも存在し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅおよびｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの関連用語は、同様に解釈されるものとする。「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という意味も包含し、これらの用語により置換され得る。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、具体的に描写または列挙されない、任意の成分、段階または手順を排除する。「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、組成物または成分が、さらなる成分を含み得るが、さらなる成分が、主張される組成物または方法の基本的および新規特徴を実質的に変化させない場合のみであることを意味する。
【０２２９】
本明細書中で使用される場合、「約」という用語は、量、時間の長さなどの測定可能な値を指す場合、指定される値からの、＋／−１０％または＋／−５％、＋／−１％またはさらに＋／−０．１％の変動を包含するものとする。
【０２３０】
次の実施例は、本発明の化合物および方法を作製および使用する方法を示すものであり、制限するものとして何ら解釈されるものではない。ここで本発明をその具体的な実施形態と併せて記載するが、多くの変更および改変が当業者にとって明らかなことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および幅広い範囲内に入る全てのこのような変更および改変を包含するものとする。
【０２３１】
実施例
実施例１．コンストラクトのライブラリ
分岐状ＰＥＧ、毒素ペプチドおよび２個の標的−結合ペプチドを含むコンストラクトのライブラリ。各コンストラクトは、８個の連結アームがあり、それぞれが、ペプチドのアミノ部分が連結されるＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）末端を有する分岐状ＰＥＧを含む。各足場に、８個のペプチドが連結される：ペプチド毒素の６コピーおよび２つの標的−結合ペプチドのそれぞれの１コピー。
【０２３２】
ペプチド毒素および標的−結合ペプチドの様々な組み合わせがライブラリの様々なコンストラクト中に含まれる（表１参照）。
【表１】
2020501513.tif 000003
【０２３３】
ある代表的な配置は次のとおり毒素が１−ノジュラリン、２−ＰｒｏＴｘ−Ｉ、３−ビペリスタチン（Ｖｉｐｅｒｉｓｔａｔｉｎ）断片であり、結合ペプチドが次の標的：Ａ−アンドロゲン受容体、Ｂ−ＥＲＢＢ４、およびＣ−ＣＸＣＲ４に向けられる。
【０２３４】
別の代表的な配置は、毒素１−配列番号３のシクロトキシン、毒素２−配列番号４のシクロ−トキシン；毒素３−配列番号３および４のシクロトキシンの組み合わせであり；ペプチドは、ペプチドＡ−環状ペプチド配列番号１；ペプチドＢ−環状ペプチド配列番号３であり；ペプチドＣは、アンドロゲン受容体、Ｂ−ＥＲＢＢ４、またはＣ−ＣＸＣＲ４を結合するように向けられる。
【０２３５】
本コンストラクトは、Ｆｍｏｃ−固相ペプチド合成を含む、当技術分野において公知の方法を使用して合成され、ＨＰＬＣを使用して精製され、当技術分野において周知のアッセイおよび動物モデルを使用して、抗増殖活性などの具体的な活性についてインビトロおよびインビボで試験される。
【０２３６】
実施例２．シクロトキシンＴｏｘ１およびＴｏｘ２の調製
国際公開第２００７／０１０５２５号パンフレットに記載の技術を使用して、ヒト真核細胞伸長因子２（ｅＥＦ２）に結合するシクロペプチド（毒素またはシクロトキシンＴｏｘ１およびＴｏｘ２と呼ぶ）を作製し、試験した。Ｔｏｘ１（配列番号３からなる）およびＴｏｘ２（配列番号４からなる）として示される環状ペプチドの配列を表２で提供する。
【表２】
2020501513.tif 000004
【０２３７】
実施例３．ｅＥＦ２へのＴｏｘ１およびＴｏｘ２の結合
リガンドとしてｅＥＦ２またはＢＳＡを使用するＥＬＩＳＡによってｅＥＦ２へのＴｏｘ１およびＴｏｘ２の結合を試験した。
【０２３８】
実験パート
０．２５μｇの標的タンパク質、ｅＥＦ２（ヒト；酵母由来）またはＢＳＡ（陰性対照）を、５０μＬ  ＰＢＳ中でｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）のいくつかのウェルに適用し、４℃で一晩インキュベートした。溶液を除去し、各ウェルに２８０μＬのブロッキング溶液（ＢＳＡ  ２ｍｇ／ｍＬ）を追加した。プレートを２５℃で１時間インキュベートした。
【０２３９】
１．５ｍＬチューブに、１００μＬのブロッキング溶液＋次のペプチド：ｅＥＦ２−結合：ＲＢ、ＬＢＲｌ、ＴＢ２（Ｔｏｘ１）、ＹＯ２、ＧＷ（Ｔｏｘ２）、ＤＲＢ、ＰＹ、ＢＷを発現する１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）のＭ１３ファージを添加した。プレートを２５℃で１時間インキュベートした。溶液を廃棄し、２８０μＬの洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％）でウェルを７回洗浄した。
【０２４０】
各ウェルに１：５０００希釈した５０μＬのＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル複合物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を追加した。プレートを２５℃で１時間インキュベートした。溶液を廃棄し、ウェルを２８０μＬ洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％）で７回洗浄した。各ウェルに５０μＬのＴＭＢ（Ｔ０４４０；Ｓｉｇｍａ）を追加した。
【０２４１】
プレートを、１．５分間および３０分間のインキュベート時間後にスキャナーを使用して写真撮影した。図２から、Ｔｏｘ１（図面中でＴＢ２として示される）が最強の効果を有したことが分かり得る。
【０２４２】
実施例４．Ｔｏｘ１およびＴｏｘ２はｅＥＦ２を活性化する。
Ｔｏｘ１およびＴｏｘ２の効果を、ＨｅＬａ  Ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ  １−Ｓｔｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ−ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してインビトロ転写／翻訳系で試験した。次のペプチド：ＧＷ（Ｔｏｘ１）、ＤＲＢ  ＲＢ、ＴＢ２（Ｔｏｘ２）およびＢＷを試験した。さらに、非ｅＥＦ２−結合対照ペプチド、ＧＲも試験した。
【０２４３】
ＩＶＴキット成分を混合し、一部を陰性対照とするために採取した。混合液の残りにｐＣＦＥ−ＧＦＰ  ＤＮＡを追加した。このＤＮＡは、転写および翻訳されるとき、蛍光タンパク質、ＧＦＰを与える。蛍光度は、タンパク質合成の程度の目安を与える。
【０２４４】
この混合物を９ｍＬのアリコートに分割した。各アリコートに１ｍＬの１種類の濃度の特異的ペプチドを追加した。陽性対照に１ｍＬのＰＢＳを追加した。反応混合物を３０℃で４時間インキュベートした。
【０２４５】
４０ｍＬのＰＢＳを各反応混合物に添加した。混合物を９６ウェル黒色ＥＬＩＳＡプレートに移し、ｅｘ／ｅｍ４８２／５１２ｎｍで蛍光を測定した。
【０２４６】
結果（図３参照）から、殆どのペプチドが、陽性対照（ペプチドを含有しなかった；橙色点線）よりも、および５μＭの濃度の非ｅＥＦ２−結合対照ペプチドよりも、高い蛍光を与えたことが分かり得る。これは、ＴＢ２およびＧＷが最大効果を与えた場合、それらがタンパク質合成を促進したことを意味する。
【０２４７】
実施例５．２つの標的化ペプチドおよび２つの毒素が搭載された多アーム型ＰＥＧ複合体の調製
２つの異なる癌−標的化部分および２つの異なる毒素部分が共有結合された分岐状ＰＥＧ分子のコンストラクトを設計し、合成した（足場の略図を図１で示す）。この実施例のコンストラクトに含まれる標的化部分は、環状ペプチドＥ１３．３（配列番号１からなる）およびＰＤ−Ｌ１−ＧＲ（配列番号２からなる）であり、毒素部分は環状ペプチドＴｏｘ１（配列番号からなる３）およびＴｏｘ２（配列番号４からなる）であった。
【０２４８】
調製方法は２段階を含んだ。第１段階で、７本のアームが標的化／毒素部分（保護されたペプチド）とカップリングされ、かつ１本がＦＭＯＣで保護されたリジン残基（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ）とカップリングされた、８本のアームを含有する分岐状ＰＥＧを作製した。第２段階で、段階１で作製されたペプチド／毒素−ＰＥＧ分子８個を８本アームの別の分岐状ＰＥＧ分子とカップリングして、５６個の毒素／標的化部分とカップリングされた多分岐状ＰＥＧのコンストラクトを得、このうち４２個の部分は毒素ペプチド（２１個のＴｏｘ１および２１個のＴｏｘ２）であり、１４個は、標的化ペプチド（ＥＧＲＦ標的化ペプチドＥ１３．３の７コピーおよびＰＤ−Ｌ１標的化ペプチドＰＤ−Ｌ１−ＧＲの７コピー）である。
【０２４９】
より詳細には次のとおりである：
【０２５０】
段階１−ある１つのタイプの標的化または毒素部分とカップリングされた分岐状ＰＥＧの調製
２．４μｍｏｌｅの標的化ペプチドまたは７．３μｍｏｌｅの毒素ペプチドをＤＭＳＯ中に溶解した。
【０２５１】
全てのペプチドは１級アミンを１個のみ有し、例外はＥ１３．３であり、それは３個の一級アミンを有し、そのうち１個がｄｄｅで保護され、Ｎ末端がアセテート残基でブロックされる。
【０２５２】
５．９ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）Ｃａｔ．Ｎｕｍ．８５２０２３；ＭＷ＝３６８．４３）を１５０μＬのＨＣｌ  ０．１Ｍ中に溶解し、続いて６５０μＬのＤＭＳＯを添加して、２０ｍＭの濃度にした。
【０２５３】
３３．４ｍｇの８本腕型スター（ｓｔａｒ）ＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｍｗ１０ＫＤａ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１６７μＬのジオキサン中に溶解して、２０ｍＭの濃度にした。
【０２５４】
標的化ペプチド溶液のそれぞれを１７μＬのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ溶液および１７μＬのＰＥＧ溶液と混合した。
【０２５５】
毒素ペプチド溶液のそれぞれを５２μＬのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ溶液および５２μＬのＰＥＧ溶液と混合した。各混合物に５％までＴＥＡ（トリメチルアミン）を追加した。各溶液をＲｏｔａｍｉｘ上で３０ｒｐｍで室温にて１５．５時間インキュベートして、特異的な標的化／毒素部分の７分子とカップリングされ、１本のアームが一級アミンを含有する８本アーム型ＰＥＧの透明な溶液を得た（各ＰＥＧ分子上で１個の遊離一級アミンを与えるために、この工程でＦｍｏｃ保護を除去する）。
【０２５６】
分岐状ＰＥＧ−ペプチド分子は、ＰＥＧ−Ｅ１３．３、ＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ、ＰＥＧ−Ｔｏｘ１およびＰＥＧ−Ｔｏｘ２で表示される。
【０２５７】
段階２−５６個の標的化／毒素部分にカップリングされた多分岐状ＰＥＧコンストラクトの構築
分岐状ＰＥＧ−ペプチド溶液：ＰＥＧ−Ｅ１３．３、ＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ、ＰＥＧ−Ｔｏｘ１およびＰＥＧ−Ｔｏｘ２を１：１：１：３：３のＰＥＧ−ＮＨＳ：ＰＥＧ−Ｅ１３．３：ＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ：ＰＥＧ−Ｔｏｘ１：ＰＥＧ−Ｔｏｘ２の化学量論的モル比で２０ｍＭ  ＰＥＧ−ＮＨＳ溶液と一緒に混合し、Ｒｏｔａｍｉｘ上、３０ｒｐｍで室温にて２時間インキュベートし、続いて５％の最終濃度まで８０％ヒドラジンをゆっくりと添加した。Ｅ１３．３部分からｄｄｅ保護基を除去するためにヒドラジンを使用した。混合物をＲｏｔａｍｉｘ上、３０ｒｐｍで、室温にて２時間インキュベートした。得られたコンストラクトは、５６個の標的化／毒素部分：Ｅ１３．３ペプチドの７コピー、ＰＤ−Ｌ１−ＧＲペプチドの７コピー、Ｔｏｘ１の２１コピーおよびＴｏｘ２の２１コピーとカップリングされた多分岐状ＰＥＧである。反応終了時に、穏やかに混合しながらＰＢＳを添加した。
【０２５８】
段階３−限外ろ過
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０濃縮器（３０Ｋ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ）を使用して２０ｍＬ  ＰＢＳを２回添加して試料を限外ろ過し、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２として表示される、搭載される多アーム型ＰＥＧの濃度を〜２０６μＭにし、緩衝液をＰＢＳに置換した。
【０２５９】
同様に、代替的な毒素またはペプチド（ＢＩＭなど）を保有するさらなる多分岐状ＰＥＧを作製した。このような多アーム型ＰＥＧの例は、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ−ＢＩＭであり、そこでは毒素Ｔｏｘ１およびＴｏｘ２がＢＩＭにより置換された。
【０２６０】
実施例６．Ｅ１３．３、Ｔｏｘ１およびＴｏｘ２を含むコンストラクトの毒性
配列番号１（ＣＨＰＧＤＫＱＥＤＰＮＣＬＱＡＤＫ）を有するＥ１３．３標的化ペプチドに結合される多アーム型ＰＥＧ足場配列およびＢＩＭＢＨ３（ＢＩＭとも呼ばれ、配列  配列番号５  ＭＲＰＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡを有する）またはＴｏｘ１およびＴｏｘ２の組み合わせから選択される毒素を含むコンストラクトを作製した。足場を実施例５に記載のように調製し、したがってＰＥＧ−Ｅ１３．３−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２およびＰＥＧ−１３．３−ＢＩＭとして表示する。
【０２６１】
細胞培養および播種：
Ａ４３１細胞（各細胞上で約１００，０００コピーのＥＧＦＲを発現するヒト扁平上皮癌）およびＭＣＦ−７細胞（各細胞上でＥＧＦＲ約３，０００コピーを発現する乳癌細胞）を凍結融解し、培養して、指数関数的増殖培養に到達させた。細胞を収集し、計数し、９６ウェル組織培養プレート中でそれぞれ細胞７，０００個／ウェルおよび細胞５，０００個／ウェルの密度で播種した。
【０２６２】
プレートを次の条件：３７±１℃、加湿および５±０．５％ＣＯ２／空気、にて翌日までインキュベートして、細胞がウェルに接着できるようにした。
【０２６３】
処理：
Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ生存能アッセイを使用してＡ５４９細胞の細胞生存能を試験した。播種後翌日に、増殖培地を、２％ＦＢＳおよび様々なコンストラクトの濃度の（１、３および８μＭ）の試験品またはビヒクル対照（ＰＢＳ；濃度−０）を含有した２００μＬのアッセイ培地に置き換えた。プレートを３７±１℃、加湿５±０．５％ＣＯ２／空気でインキュベートした。インキュベーションの４８時間後に、細胞処理の画像を顕微鏡下で撮影した（図４〜７参照）。
【０２６４】
これらの実験から数回の振動（ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ）をなし得る。第１に、ＰＥＧ−Ｅ１３．３および毒素の何れか１つを含むコンストラクトを添加したとき、Ａ４３１およびＭＣＦ−７の特徴である典型的な細胞凝集体が消失したことが図面で分かり得る（図５〜６）。さらに、この現象は用量依存的であった。しかし、コンストラクトがＥ１３．３ペプチドを欠いた場合（図７）、毒素濃度の上昇によって死細胞の比率は顕著に上昇せず、実際には対照との差異はなかった。この結果は明白に、Ｅ１３．３が本コンストラクトを細胞に標的化したことを示す。
【０２６５】
第２に、毒素濃度の上昇とともに死細胞の割合が上昇し（ＢＩＭおよびＴｏｘ１とＴｏｘ２との組み合わせの両方について）、用量依存性効果を示唆した。さらに、ＢＩＭおよびＴｏｘ１とＴｏｘ２の組み合わせについて得られた画像を比較すると、Ｔｏｘ１とＴｏｘ２の組み合わせがより強力であり、より重度の細胞死を引き起こすことが分かり得る。予想されるように、ＥＧＦＲの発現がより少ないＭＣＦ−７細胞は、Ａ４３１細胞よりも感受性が低かった。
【０２６６】
上記で述べられたこと全てをまとめると、Ｔｏｘ１、Ｔｏｘ２またはそれらの組み合わせなどの毒素および標的化ペプチドを含み、それらの少なくとも１つがＥ１３．３であるコンストラクトが癌を標的化するおよび処置することにおいて強力であることは明らかである。
【０２６７】
実施例７．Ａ４３１細胞上で試験した場合のコンストラクトの細胞毒性
実施例５および６と同様の条件において、ＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ−ＢＩＭ、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ−ＢＩＭコンストラクトを調製し、コンストラクト濃度を１０ｎＭから１μＭに変化させて、Ａ４３１細胞およびＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  Ｂｌｕｅ生存能アッセイを用いて細胞毒性について試験した。インキュベーションの４８時間後に、細胞処理の画像を顕微鏡下で撮影した。
【０２６８】
結果を図８で示す。１μＭ濃度でコンストラクトＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ−ＢＩＭおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭのＡ４３１細胞の殺細胞能は限定的であったことが分かり得る。一方で、Ｅ１３．３およびＰＤ−Ｌ１−ＧＲ標的化ペプチドの組み合わせは、細胞の６０％超を死滅させた。実際に、両方の標的化ペプチドを含むコンストラクトの細胞毒性効果は、２つのこれらのペプチドのうち１つを含む２つのコンストラクトの相加的効果よりも高かった。このことは明らかに、２個の標的化ペプチドおよびＴｏｘ１とＴｏｘ２の組み合わせを含むコンストラクトが有する相乗的細胞毒性効果を示す。
【０２６９】
実施例８．Ａ５４９細胞株の増殖および生存能に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２およびＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭコンストラクトの効果
材料および方法
実施例５に記載のように試験品ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２およびＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭを調製し、１０μＭの濃度で使用した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を対照として使用する。
【０２７０】
Ａ−５４９細胞（ヒト肺腫瘍細胞）を凍結融解し、培養して、指数関数的増殖培養に到達させた。細胞を収集し、計数し、次の条件：Ａ−５４９：細胞５，０００個／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに播種した。
【０２７１】
プレートを３７±１℃で、加湿して、５±０．５％ＣＯ２／空気で翌日までインキュベートして、細胞がウェルに接着できるようにした。
【０２７２】
処理
播種後翌日に、アッセイ培地（２％ｆＦＢＳ）中で調製した試験品溶液に増殖培地を置き換えた。試験品溶液を２００μＬ／ウェルの体積で慎重に適用して（細胞上に直接ではなく、ウェルの側面に）、最終濃度が次のようになるようにした：ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２：３または１０μＭおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ−１０μＭ。
【０２７３】
プレートを３７±１℃で、加湿して、５±０．５％ＣＯ２／空気でインキュベートした。
【０２７４】
インキュベーションの４８時間後に、細胞処理の代表的画像を顕微鏡下で撮影した。結果を図９で与える。
【０２７５】
結果
図９から明らかに分かり得るように、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２は、３および１０μＭの両濃度でＡ５４９細胞の死滅において効果的であった。興味深いことに、３μＭの濃度でのＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２は、周知のＢＩＭ毒素を含む１０μＭ  ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭコンストラクトよりもかなり効率的であった。
【０２７６】
実施例９．マウスにおけるＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２の急性ＩＶ毒性
実施例５に記載のようにＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２を調製し、表３に記載のレジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）に従い、４ｍＬ／ｋｇ用量を使用して３匹の雌Ｈｓｄ：ＩＣＲ（ＣＤ−１（登録商標））マウス、７週齢に静脈内注射した。
【表３】
2020501513.tif 000005
【０２７７】
体重および個々の臨床徴候を２０日間にわたり観察した。顕著な異常は体重においても試験した臨床徴候においても見られなかった。動物を第２０日に安楽死させ、個々の肉眼での剖検を行った。試験中に異常は検出されなかった。この例の結果は、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２コンストラクトがインビボで完全に安全であることを明らかに示す。
【０２７８】
実施例１０．インビボでのＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２の抗腫瘍効果の評価
材料および方法
動物：３群（１群の対照および２群の試験品群）に分けた１８匹の６〜７週齢胸腺欠損ヌード雌マウスを少なくとも５日間にわたり累積させた（ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ）。累積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）後、各マウスの右フラン（ｆｌａｎ）領域にＡ４３１腫瘍細胞を皮下注射し、その注射日を第０日とする。
【０２７９】
次のパラメーターを監視する：体重（週に２回）、腫瘍サイズ（デジタルノギスで測定し、幅２ｘ長さ／２として腫瘍体積を計算する。
【０２８０】
腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３のサイズに到達したら、第１週中にマウスに対して試験品の３回のＩＶ注射を行う。動物をさらなる３週から観察する。
【０２８１】
観察期間後に、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、測定し、さらなる分析のために４％ホルムアルデヒド溶液中で固定する。
【０２８２】
実施例１１：ＥＧＦ受容体のアンタゴニスト：スクリーニング、精製
スクリーニング
国際公開第２００７／０１０５２５号明細書に記載の技術を使用して、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する一連の新しいペプチド（シクロペプチド）を作製し、使用した。いくつかの可能性のあるペプチドの同定後、数回のさらなる最適化サイクルを行った。Ｅ１３．３と表示され、ＣＨＰＧＤＫＱＥＤＰＮＣＬＱＡＤＫ（配列番号１）の配列を有する、ペプチドの１つは、その結合部位での受容体への高い親和性を示した。
【０２８３】
発現および精製
同定したペプチドＥ７．１、Ｅ１０．２、Ｅ１０．３、Ｅ１３．３、Ｅ１５．１．３−Ｔ、Ｅ１４．１．１、Ｅ１４．１．４、Ｅ２３Ｉ３、Ｅ２３Ｉ５およびＡ４．３．１２−Ｔの発現のためのプラスミドを含む細菌を、アンピシリン入りの５ｍＬの２ＹＴ培地中で適切なペプチドのプラスミドを含む２．５μＬの細胞で開始し、３５０ｒｐｍで一晩、３８℃にて増殖させた。２ｍＬの各開始物を５０ｍＬの２ＹＴ中、３７℃で増殖させ；発現をＯＤ１．５〜２．５で３時間にわたりＩＰＴＧ、０．４３ｍＭにより誘導し、その後、細胞を遠心分離し、−２０℃で維持した。
【０２８４】
細胞をＤＮａｓｅｓ  ＩおよびＢ−Ｐｅｒ（細菌タンパク質抽出試薬）の存在下にてライソザイムで溶解させ、ペプチドをバッチ方式でＮｉ−ＮＴＡビーズを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。手短に述べると、ペプチドを２０ｍＭイミダゾールの存在下でＮｉ−ＮＴＡビーズ上に載せ、ＰＢＳで洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた。緩衝液を、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｅｉｎｃｅ、Ｎａｎｏｓｅｐ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ装置、３Ｋ  ｇｒａｙを使用して交換した。ペプチドの量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙによって試験した（図１０参照）。
【０２８５】
実施例１２．ＥＧＦＲに対する本ペプチドの効果
ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１におけるヒトＥＧＦＲのリン酸化レベルに対するいくつかのペプチドの効果を、ＥＬＩＳＡ試験によって評価した。簡潔に述べると、指数関数に増殖するＡ４３１細胞培養物を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコから剥離させ、２００μＬの細胞懸濁液を細胞２ｘ１０５個／ｍＬの濃度で９６ウェルプレートに移し、約３日間増殖させた。培地交換後、５０μＬのＥＧＦ希釈液およびＥＧＦ＋ペプチド（それぞれ５０ｎｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬ）を添加した。プレートを３７℃で７．５分間インキュベートした。ＥＧＦ含有培地を除去し、細胞を１５０μＬの固定液により固定し、室温で２０分間インキュベートした後、プレートをｔｒｉｔｏｎ洗浄溶液で２回洗浄した。リン酸化レベルを、一次抗体としてホスホ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０４５）抗体および二次抗体として抗ウサギＩｇＧとインキュベートすることにより評価した。様々なペプチドのＥＧＦＲ自己リン酸化阻害能を、図２で与える。（ＥＧＦＲ自己リン酸化の正規化した阻害パーセントを図１１および表４で与える。正規化した阻害パーセントは、試験品の蛍光シグナルを、同じＥＧＦ濃度で、試験品を含有しない対照の蛍光シグナルで除したものとして計算する。
【表４】
2020501513.tif 000006
【０２８６】
図１１および表４から明らかに分かり得るように、Ｅ１３．３は、本ペプチドの中で阻害活性がより高く、２μＭのＩＣ５０計算値を有する。
【０２８７】
実施例１３．ウシ血清中でのＥ１３．３の安定性
ウシ血清中での選択されたペプチドの安定性を、ウシ血清との本ペプチドのインキュベーション後の本ペプチドの阻害活性の測定によって評価した。阻害活性を実施例１２に記載のように測定した。本ペプチドの阻害活性を、３７℃で様々な時間にわたるウシ血清との本ペプチドのインキュベーション後に評価した。試料中のＥＧＦ濃度は５０ｎｇ／ｍＬであった。結果を図１２で与える。全てのペプチドがウシ血清中で同様の安定性を有し、ｔ０．５が約１．５時間であったことが明らかに分かり得る。
【０２８８】
実施例１４．本ペプチドの阻害効果は用量依存的である
様々な濃度の選択ペプチドの有効性を、実施例１２と同様にＥＬＩＳＡによって評価した。結果を図１３で与える。全ペプチドのＩＣ５０は約０．５〜１μＭであった。
【０２８９】
実施例１５．８本アーム型ＰＥＧに結合されるＥ１３．３の調製
９．８ｍｇのＥ１３．３（ｆｍｏｃ）Ｌｙｓを水中で２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に溶解した。１１．３ｍｇの８本アーム型ＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル、ＭＷ７３，０００（ＪＥＮＫＥＭ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＵＳＡ  ＩＮＣ）を５６５μＬのジオキサンとともに３７℃で加熱して、完全に溶解させた。Ｅ１３．３およびＰＥＧ溶液を５０μＬのＴＥＡの存在下で混合し、室温で一晩インキュベートした。得られた溶液に、５０μＬピペリジンを添加し、室温で０．５インキュベートした。この溶液に、１ｍＬの酢酸エチルを添加して懸濁液を得て、次に（ｔｈａｎ）これを遠心分離し、上相を除去した。酢酸エチルでの洗浄のこれらの段階を４〜５回反復した。最後に、上相を完全に除去し、残留ペレットを２００μＬ  ＰＢＳ中で溶解させた。酢酸エチルの痕跡を全て除くために、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０ｍＬ濃縮器を使用して、緩衝液をＰＢＳにさらに交換した。
【０２９０】
実施例１６．マウスにおけるＥ１３．３の安定性
蛍光で印を付したペプチドＥ１３．３単独または８本アーム型ＰＥＧに結合されたものの安定性を、マウスの尾静脈に本化合物を注射することによりインビボで評価した。動物の血液を、様々な時間間隔でペプチド（蛍光）の存在について分析した。図１４で示される結果から、遊離ペプチドのｔ０．５が、ＰＥＧ結合ペプチド（ｔ０．５約３．５時間）よりも大幅に短い（約数分）ことが明らかに分かり得る。
【０２９１】
実施例１７．様々な癌細胞株の生存能に対するＥ１３．３の効果
Ｅ１３．３の抗癌活性を、いくつかの癌細胞株（Ａ５４９−ヒト肺癌細胞株およびＦａＤｕ−ヒト咽頭癌細胞株）を使用して評価した。細胞培養物を、Ｅ１３．３の（様々な濃度での）存在下または非存在下でインキュベートし、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を使用して生存能について試験した。結果を図１５で与える。ＰＥＧに結合されたＥ１３．３が試験した全濃度において癌細胞の生存能を首尾よく低下させ得ることが分かり得る。
【０２９２】
実施例１８．癌腫瘍における蛍光ＰＥＧ−Ｅ１３．３の蓄積
Ｅ１３．３−ＰＥＧをフルオレセインで標識し、皮下ＮＣＩ−Ｈ１６５０腫瘍（肺癌）を有する異種移植マウスにＩＶ注射した。麻酔後、腎臓、肝臓および腫瘍を特定の時間点で収集し、蛍光を測定した。結果を図１６および１７で与える。
【０２９３】
図１６から分かり得るように、腎臓および肝臓において、後の典型的な排出曲線がある、蛍光の速い増加があった。それとは対照的に、癌細胞では蛍光が蓄積され、Ｅ１３．３が癌細胞において効率的に結合し、侵入し、蓄積することを示唆する。図１７で示される結果は、癌細胞の殆どが、Ｅ１３．３−ＰＥＧと相互作用し、蛍光ペプチドを内部移行させることをさらに裏付ける。
【０２９４】
実施例１９：ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質
スクリーニング
国際公開第２００７／０１０５２５号パンフレットに記載の技術を使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合に結合する一連の新しいペプチド（シクロペプチド）を作製し、試験した。いくつかの候補ペプチドの同定後に、さらに数回の最適化のサイクルを行った。ＰＤ−Ｌ１−ＧＲとして表されＣｙｓＧｌｕＧｌｙＬｅｕＰｒｏＡｌａＡｓｐＴｒｐＡｌａＡｌａＡｌａＣｙｓ（配列番号２）の配列を有するペプチドの１つは、その結合部位で受容体に対する高い親和性を示した。
【０２９５】
実施例２０．多アーム型ＰＥＧコンストラクトに結合されるＰＤ−Ｌ１−ＧＲペプチドの調製
（ｉ）ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ環状ペプチドおよびＢＩＭ−ＢＨ３（ＰＥＧ−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭとして示される）、（ｉｉ）Ｅ１３．３標的化ペプチド（配列番号１）およびＢＩＭ−ＢＨ３毒素（ＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭとして示される）および（ｉｉｉ）Ｅ１３．３、ＰＤ−Ｌ１−ＧＲおよびＢＩＭ−ＢＨ３毒素（ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭとして示される）を含む多アーム型ＰＥＧコンストラクトを実施例５に記載のように調製した。
【０２９６】
本コンストラクトを、１μＭの濃度で細胞増殖アッセイにおいて試験品として使用した。ＰＢＳを対照として使用した。アッセイについて、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞株）を凍結融解し、培養して、指数関数的増殖に到達させた。細胞を収集し、計数し、９６ウェル組織培養プレートにおいて細胞７，０００個／ウェルの密度で播種した。プレートを３７±１℃、加湿、５±０．５％ＣＯ２／空気で翌日までインキュベートして、細胞がウェルに接着できるようにした。翌日に、増殖培地をアッセイ培地（２％ｆＦＢＳ）中で調製した試験品溶液と交換した。試験品溶液を２００μＬ／ウェルの体積中で慎重に適用して、１μＭの試験品の最終濃度に到達させた。インキュベーションの４８時間後に、細胞処理の代表的画像を顕微鏡下で撮影し、図１８で与える。
【０２９７】
ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭを含むコンストラクトが、μＭの濃度で細胞増殖を阻害する唯一のコンストラクトであったことが、図１８から分かり得る。このことは、Ｅ１３．３およびＰＤ−Ｌ１−ＧＲペプチドの組み合わせを含む複合体は、これらのペプチドの１つのみを含むコンストラクトの合わせた細胞毒性よりも顕著に高い細胞毒性を有することを示す。
【０２９８】
本発明を本明細書中にて上でその好ましい実施形態により記載してきたが、それは添付の特許請求の範囲で定められるように、本発明の精神および性質から逸脱することなく、改変され得る。
【図１】
2020501513.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2020501513.tif 000059
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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