(57)【要約】  本明細書では、例えば多能性幹細胞（ＰＳＣ）からｉＭＧＬを産生する方法、ｉＭＧＬを使用する方法、およびｉＭＧＬの組成物に関する様々な実施形態が開示される。本明細書では、アルツハイマー病の試験など、様々な神経障害を試験する方法も開示される。さらに、本明細書では、ＣＮＳおよび脳の様々な生理学的および病理学的環境におけるミクログリア細胞の遺伝子型および表現型による効果を調査する方法が開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）を産生する方法であって、
（ｉ）造血分化因子を補充した培地を使用してＰＳＣを分化させて誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）を産生する工程と、
（ｉｉ）ミクログリア分化培地を使用してＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）に分化させる工程と
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、３日〜２１日の間のインキュベーション期間を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｉ）のインキュベーション期間が１０日である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーション期間の１〜１０日目に、前記ＰＳＣが低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーション期間の１日目および２日目に、前記培地がＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、およびＶＥＧＦの造血分化因子を含み；
前記インキュベーション期間の３日目および４日目に、前記培地がＦＧＦ２およびＶＥＧＦの造血分化因子を含み；
前記インキュベーション期間の５〜１０日目に、前記培地がＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６の造血分化因子を含む、
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記培地中のＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６の各々の濃度が、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のアクチビンＡの濃度が、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの間である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培地中のＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６の各々の濃度が、約５０ｎｇ／ｍｌであり、
前記培地中のアクチビンＡの濃度が、約１２．５ｎｇ／ｍｌであり、
ＬｉＣｌの濃度が約２ｍＭである、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離することが、ＣＤ４３＋マーカーを選択することによって実行される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
単離された前記ｉＨＰＣが、８０％を超える純度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
単離された前記ｉＨＰＣが、９０％を超える純度である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）が、２０〜３０日の間のインキュベーション期間をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉ）が、約２５日のインキュベーション期間をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）の前記ミクログリア分化培地が、因子ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ミクログリア分化培地が無血清である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地中のＣＳＦ−１の濃度が、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のＩＬ−３４の濃度が、２５ｎｇ／ｍｌ〜１２５ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のＴＧＦβ１の濃度が、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間である、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＳＦ−１の濃度が約２５ｎｇ／ｍｌであり、
ＩＬ−３４の濃度が約１００ｎｇ／ｍｌであり、
ＴＧＦβ１の濃度が約５０ｎｇ／ｍｌである、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉｉ）が、１〜５日の間のインキュベーション期間で前記ｉＭＧＬを成熟させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉ）が、約３日のインキュベーション期間で前記ｉＭＧＬを成熟させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉｉ）が、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１を含む培地中で前記ｉＭＧＬをインキュベートすることにより、前記ｉＭＧＬを成熟させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ２００がヒト組換えＣＤ２００であり、ＣＸ３ＣＬ１がヒト組換えＣＸ３ＣＬ１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地中のＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１の各々の濃度が、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの間である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１の各々の濃度が、１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
産生された前記ｉＭＧＬがｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋  ｉＭＧＬが２５日のインキュベーション期間の１４日目に検出することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ミクログリアの運命への拘束性に関する既知のマーカーである因子の発現について試験することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
試験される因子の前記発現がＰＵ．１およびＴＲＥＭ２を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｉＭＧＬが、２つの別個のｉＭＧＬの集団：（１）ＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１−および（２）ＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１＋を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
産生された前記ｉＭＧＬが少なくとも７０％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
産生された前記ｉＭＧＬが少なくとも９６％の純度である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
純度レベルが、プリン受容体、Ｐ２ｒｙ１２の発現、Ｔｒｅｍ２の発現、Ｉｂａ１の発現、またはＰｕ１の発現を使用して評価される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣがＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４１ａ＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）を産生する方法であって、
（ｉ）ＰＳＣを誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）に分化させる工程と、
（ｉｉ）前記ｉＨＰＣを分化させてｉＭＧＬを産生する工程と
を含む方法。
【請求項３４】
ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１を含む培地中で前記ｉＭＧＬをインキュベートすることにより、前記ｉＭＧＬを成熟させる工程（ｉｉｉ）をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｉＨＰＣがＣＤ４３＋／ＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４１＋である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｉＨＰＣが、工程（ｉｉ）において無血清分化培地中に前記ｉＨＰＣを置くことによって、前記ｉＭＧＬに分化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記無血清分化培地が、ＭＣＳＦ、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記産生されたｉＭＧＬがｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｉＭＧＬが、２つの別個のｉＭＧＬの集団：（１）ＣＤ４５＋／ＣＸ３Ｒ１−および（２）ＣＤ４５＋／ＣＸ３Ｒ１＋を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ｉ）が５〜１５日の間のインキュベーション期間を含み、工程（ｉｉ）が２０〜３０日の間のインキュベーション期間を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｉ）が１０日のインキュベーション期間を含み、工程（ｉｉ）が２５日のインキュベーション期間を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｉｉｉ）が１〜５日の間のインキュベーション期間を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ｉｉｉ）が、３日のインキュベーション期間を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
以下の遺伝子：ＲＵＮＸ１、ＰＵ．１、ＣＳＦ１ＦＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＲＳＧ１０、ＧＡＳ６、ＰＲＯＳ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＧＰＲ３４、Ｃ１Ｑ、ＣＲ３、ＣＡＢＬＥＳ１、ＢＨＬＨＥ４１、ＴＲＥＭ２、ＩＴＡＭ、ＡＰＯＥ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＰＰＡＲＤ、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＧＲＮ、ＬＲＲＫ２、ＴＡＲＤＢＰ、およびＣＲＹＢＢ１の任意の組み合わせの発現を含む、ｉＭＧＬの組成物。
【請求項４５】
前記ＴＲＥＭ２とＰ２ＲＹ１２とが共局在化している、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
遺伝子ＫＬＦ２、ＴＲＥＭ１、ＭＰＴ、ＩＴＧＡＬ、およびＡＤＧＲＥ５が発現していない、請求項４４または４５に記載の組成物。
【請求項４７】
ｉＭＧＬが基底状態にある場合にＣＤ３３、ＭＳ４Ａ４Ａ、およびＣＲ１の発現を含む、ｉＭＧＬの組成物。
【請求項４８】
前記ｉＭＧＬが、リポ多糖、ＩＦＧγ、またはＩＬ−１βによる刺激に応答して、ケモカイン：ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、およびＣＸＣＬ１０のいずれかの組み合わせを分泌する、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記ｉＭＧＬが、ＡＤＰに応答して遊走する、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
ＡＤＰ刺激が、前記ｉＭＧＬにおけるカルシウム移行の生成をもたらす、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５１】
前記ｉＭＧＬが、ヒトシナプトソームを貪食することができる、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５２】
前記ｉＭＧＬがシナプス刈り込みをすることができる、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５３】
前記シナプス刈り込みが、Ｃ１ｑ／ＣＲ３経路に媒介される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ｉＭＧＬが、Ａβおよびタウを貪食することができる、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
前記ｉＭＧＬが、蛍光標識線維性ＡβおよびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーを貪食することができる、請求項４４〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
ｉＭＧＬからの炎症性分子の分泌をプロファイリングする方法であって、
（ｉ）前記ｉＭＧＬを、リポ多糖、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはＩＬ−１βによって処理することと、
（ｉｉ）前記ｉＭＧＬによって分泌される炎症マーカーを測定することと
を含む方法。
【請求項５７】
前記ｉＭＧＬによって分泌される前記炎症マーカーが、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、およびＣＸＣＬ１０から選択される炎症性マーカーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ｉＭＧＬの遊走を評価する方法であって、
（ｉ）前記ｉＭＧＬをＡＤＰによって処理することと、
（ｉｉ）化学刺激に応答したｉＭＧＬの運動性および遊走を評価することと
を含む方法。
【請求項５９】
ｉＭＧＬにおいてカルシウム移行を生じさせる方法であって、
（ｉ）前記ｉＭＧＬをＡＤＰによって処理することと、
（ｉｉ）前記ｉＭＧＬにおけるカルシウムフラックスシグナルを調べることと
を含み、前記カルシウムフラックスシグナルが、電気的、生物学的、または化学的刺激に応答して生じる、方法。
【請求項６０】
化合物のミクログリア貪食を試験する方法であって、
（ｉ）ｉＭＧＬを、Ａβ、タウ、蛍光標識Ａβ、およびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーからなる群から選択される化合物に曝露し、前記化合物が前記ｉＭＧＬによって貪食、エンドサイトーシス、または摂取されることと、
（ｉｉ）前記化合物の前記貪食、エンドサイトーシス、または摂取を測定することと
を含む方法。
【請求項６１】
ｉＭＧＬのインビボ状態に類似するｉＭＧＬ遺伝子発現プロファイルを確立する方法であって、
ｉＭＧＬをニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養し、それにより、前記ｉＭＧＬが前記ニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養されていない場合に前記ｉＭＧＬに関して存在するよりも前記ｉＭＧＬに関してよりインビボの状態を再現することと
を含む方法。
【請求項６２】
前記ニューロンがラット海馬ニューロンである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
差次的に制御される遺伝子がＣＡＢＬＥＳ、ＴＲＩＭ４、ＭＩＴＦ、ＭＭＰ２、およびＳＬＣＡ２５であり、前記差次的に制御される遺伝子がｉＭＧＬにおいて上方制御されている、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
ｉＭＧＬを３Ｄ  ＣＮＳ環境に組み込む方法であって、
ｉＭＧＬをｈｉＰＳＣ  ３Ｄ脳オルガノイド（ＢＯＲＧ）と共培養することを含み、前記ｉＭＧＬが前記ＢＯＲＧに遊走し、前記ＢＯＲＧに集合するか、または前記ＢＯＲＧに組み込まれる、方法。
【請求項６５】
ｉＭＧＬを使用して健康および疾患におけるミクログリア制御不全を試験する方法であって、
（ｉ）ｉＭＧＬを、Ａβ、タウ、蛍光標識Ａβ、ｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマー、およびアルファ−シヌクレインからなる群から選択される化合物に曝露することと、
（ｉｉ）ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロテオミクス、メタボロミクス、およびリピドミクスから選択されるｉＭＧＬオミックシグネチャをプロファイリングすることと
を含む方法。
【請求項６６】
差次的に制御される遺伝子がＣＤ３３、ＴＹＲＯＰＢ、およびＰＩＣＡＬＭであり、前記差次的に制御される遺伝子がｉＭＧＬにおいて上方制御されている、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
シナプス刈り込みおよびシナプス可塑性におけるミクログリアの役割を調査する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬをヒトシナプトソームに曝露することと、（ｉｉ）前記ｉＭＧＬによるヒトシナプトソーム貪食を評価することとを含む方法。
【請求項６８】
ニューロンのキューに応答するｉＭＧＬにおける遺伝子制御を評価する方法であって、
（ｉ）ｉＭＧＬを、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＤ２００、およびＴＧＦβからなる群から選択される、中枢神経系に存在する因子に曝露することと、
（ｉｉ）Ｐ２ＲＹ１２、ＥＧＲ１、ＴＧＦβＲ１、ＥＴＶ５、ＣＸ３ＣＲ１、ＡＰＯＥ、ＢＩＮ１、ＣＤ３３、ＧＰＲ８４、ＣＯＭＴ、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＨＴＴ、ＧＲＮ、ＦＵＳ、ＴＡＲＤＰ、ＶＣＰ、ＳＮＣＡ、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＬＲＲＫ２、およびＳＯＤ１からなる群から選択される遺伝子を含む差次的に制御される遺伝子を評価することと
を含む方法。
【請求項６９】
皮質へのｉＭＧＬの生着を評価する方法であって、
（ｉ）ｉＭＧＬを皮質に移植することと、
（ｉｉ）前記皮質への前記ｉＭＧＬの生着を評価することと
を含む方法。
【請求項７０】
工程（ｉｉ）が工程（ｉ）の２か月後に起こる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ｉＭＧＬをマウスの皮質に移植することをさらに含む、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記マウスがＭＩＴＲＧマウスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＡＤニューロパシーとのｉＭＧＬの相互作用を評価する方法であって、
（ｉ）ｉＭＧＬをマウスの脳に移植することと、
（ｉｉ）前記マウスの脳と相互作用するｉＭＧＬを評価することと
を含む方法。
【請求項７４】
工程（ｉｉ）が、斑へのｉＭＧＬの遊走を評価することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
工程（ｉｉ）が、線維性ＡβのｉＭＧＬによる貪食を評価することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
３Ｄ神経環境でヒトミクログリアを試験する方法であって、ｉＭＧＬを哺乳動物の脳に移植することを含む方法。
【請求項７７】
前記哺乳動物の脳がマウスのものである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ｉＭＧＬが前記マウスの海馬に移植される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記マウスが野生型マウスである、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記マウスがＡＤマウス系統である、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記インキュベーション期間の１〜４日目に、前記ＰＳＣが５％酸素環境においてインキュベートされ、前記インキュベーション期間の５〜１０日目に、前記ＰＳＣが２０％酸素環境においてインキュベートされる、請求項３に記載の方法。
【請求項８２】
前記培地中のＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６の各々の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のアクチビンＡの濃度が、１１ｎｇ／ｍｌ〜１４ｎｇ／ｍｌの間であり、
ＬｉＣｌが、１ｍＭ〜３ｍＭである、
請求項５に記載の方法。
【請求項８３】
前記培地中のＣＳＦ−１の濃度が、１５ｎｇ／ｍｌ〜３５ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のＩＬ−３４の濃度が、８０ｎｇ／ｍｌ〜１２０ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のＴＧＦβ１の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌの間である、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項８４】
工程（ｉｉｉ）の前記ミクログリア分化培地が、因子ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８５】
前記培地中のＣＳＦ−１の濃度が、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のＩＬ−３４の濃度が、２５ｎｇ／ｍｌ〜１２５ｎｇ／ｍｌの間であり、
前記培地中のＴＧＦβ１の濃度が、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間である、
請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
工程（ｉｉｉ）の前記ミクログリア分化培地が、因子ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ模倣物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＴＧＦβ模倣物が、ＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＰＳＣが、単一細胞ＰＳＣまたはＰＳＣの小さな塊を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
前記ｉＭＧＬを成熟させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＰＳＣが胚様体に由来しない、請求項１または３３に記載の方法。
【請求項９１】
前記ｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋  ｉＭＧＬが、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ｑＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、またはプロテオミクスを使用して検出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＰＳＣが誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）を含む、請求項１または３３に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＰＳＣが胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む、請求項１または３３に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＰＳＣが哺乳動物のＰＳＣである、請求項１、３３、９２、または９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記ＰＳＣがヒトのＰＳＣである、請求項１、３３、９２、または９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
前記ＰＳＣがマウスのＰＳＣである、請求項１、３３、９２、または９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記ｉＨＰＣがＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋またはＣＤ４５＋である、請求項３５に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＰＳＣが、分化前に、ＣＤ４３＋、ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋、およびＣＤ４５＋のいずれでもない、請求項１または３３に記載の方法。
【請求項９９】
第１の型の細胞からヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）を産生する方法であって、
（ｉ）第１の型の細胞を誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）に分化させる工程と、
（ｉｉ）前記ｉＨＰＣを分化させてｉＭＧＬを産生する工程と
を含む方法。
【請求項１００】
ヒトミクログリア様細胞（ｉＨＰＣ）の生成を支持するための培地であって、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、およびＬｉＣｌを含む培地。
【請求項１０１】
ヒトミクログリア様細胞（ｉＨＰＣ）の生成を支持するための培地であって、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦを含む培地。
【請求項１０２】
ヒトミクログリア様細胞（ｉＨＰＣ）の生成を支持するための培地であって、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６を含む培地。
【請求項１０３】
ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、およびＬｉＣｌを含む、ヒトミクログリア様細胞（ｉＨＰＣ）の生成を支持するための培地を含むキット。
【請求項１０４】
ＦＧＦ２およびＶＥＧＦを含む、ヒトミクログリア様細胞（ｉＨＰＣ）の生成を支持するための培地を含むキット。
【請求項１０５】
ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６を含む、ヒトミクログリア様細胞（ｉＨＰＣ）の生成を支持するための培地を含むキット。
【請求項１０６】
ヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）の生成を支持するための培地であって、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１を含む培地。
【請求項１０７】
ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１を含む、ヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）の生成を支持するための培地を含むキット。
【請求項１０８】
ヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）の成熟および維持を支持するための培地であって、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１を含む培地。
【請求項１０９】
ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１を含む、ヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）の成熟および維持を支持するための培地を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年２月２８日に出願された米国仮出願第６２／４６４，９２５号の優先権を主張する。上述の出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けたＲ＆Ｄの記載
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられたＡＧ０４８０９９の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書には、（ｉ）ヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）および（ｉｉ）ｉＭＧＬを作製する方法の実施形態が記載されている。
【背景技術】
【０００４】
ミクログリア細胞は、ＣＮＳの先天性免疫細胞であり、ＣＮＳの生理学的発達に役割を果たすことが知られている。さらに、ミクログリア細胞はアルツハイマー病などの神経障害において役割を果たすことが知られている。ＣＮＳの発達および神経障害においてミクログリア細胞が果たす役割をさらに調査するためにミクログリア細胞を取得する技術には、欠陥がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）からヒトミクログリア様（ｉＭＧＬ）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）造血分化因子を補充した培地を使用してＰＳＣを分化させて誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）を産生する工程と、（ｉｉ）ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離する工程と、（ｉｉｉ）ミクログリア分化培地を使用してＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させる工程と、（ｉｖ）ｉＭＧＬを成熟させる工程とを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）造血分化因子を補充した培地を使用してＰＳＣを分化させる工程と、（ｉｉ）ミクログリア分化培地を使用してＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させる工程とを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、第１の型の細胞からヒトミクログリア様（ｉＭＧＬ）細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）第１の型の細胞を誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）に分化させる工程と、（ｉｉ）ｉＨＰＣを分化させてｉＭＧＬを産生する工程とを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは胚様体に由来しない。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは単一細胞ＰＳＣを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは哺乳動物のＰＳＣを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣはヒト起源のものである。いくつかの実施形態では、ＰＳＣはマウスＰＳＣである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣからｉＭＧＬを産生する方法であって、（ｉ）ＰＳＣをｉＨＰＣに分化させる工程と、（ｉｉ）ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させる工程とを含む方法が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子：ＲＵＮＸ１、ＳＰＩ１、ＣＳＦ１ＦＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＲＳＧ１０、ＧＡＳ６、ＭＥＲＴＫ、ＰＳＥＮ２、ＰＲＯＳ１、Ｐ２ＲＹ１２、Ｐ２ＲＹ１３、ＧＰＲ３４、Ｃ１Ｑ、ＣＲ３、ＣＡＢＬＥＳ１、ＢＨＬＨＥ４１、ＴＲＥＭ２、ＴＹＲＯＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＡＰＯＥ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＰＰＡＲＤ、ＴＭＥＭ１１９、ＧＰＲ５６、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＧＲＮ、ＬＲＲＫ２、ＴＡＲＤＢＰ、およびＣＲＹＢＢ１のうちのいずれか１つ、または２つ以上の任意の組み合わせの発現を含むｉＭＧＬの組成物が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ケモカイン、サイトカイン、および他の炎症性分子の分泌を評価する方法であって、（ｉ）リポ多糖、ＩＦＮγ、またはＩＬ−１βによってｉＭＧＬを処理する工程と、（ｉｉ）ｉＭＧＬからケモカイン、サイトカイン、および他の炎症または種々の神経変性疾患状態の潜在的なバイオマーカーとして機能する可能性がある分泌因子を測定する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬからの炎症性分子の分泌をプロファイリングする方法であって、（ｉ）リポ多糖、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはＩＬ−１βによってｉＭＧＬを処理することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬによって分泌される炎症マーカーを測定することとを含む方法に関する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬの遊走を評価する方法であって、（ｉ）ＡＤＰによってｉＭＧＬを処理する工程と、（ｉｉ）ｉＭＧＬの遊走を測定する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬの遊走を評価する方法であって、（ｉ）ＡＤＰによってｉＭＧＬを処理することと、（ｉｉ）化学刺激に応答したｉＭＧＬの運動性および遊走を評価することとを含む方法に関する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬにおいてカルシウム移行を生じさせる方法であって、（ｉ）ＡＤＰによってｉＭＧＬを処理する工程と、（ｉｉ）ｉＭＧＬにおいてカルシウム移行を生じさせる工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬにおいてカルシウム移行を生じさせる方法であって、（ｉ）ＡＤＰによってｉＭＧＬを処理することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬにおけるカルシウムフラックスシグナルを調べることと、を含み、カルシウムフラックスシグナルが、電気的、生物学的、または化学的刺激に応答して生じる、方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬにおける遺伝子発現を差次的に制御する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬをニューロンまたは星状細胞と共培養する工程と、（ｉｉ）ｉＭＧＬにおいて遺伝子を差次的に制御する工程とを含む方法が提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬをＣＮＳ／脳（例えば、ニューロン）環境に組み込む方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬをｈｉＰＳＣ  ３Ｄ脳オルガノイド（ＢＯＲＧ）と共培養する工程と、（ｉｉ）ｉＭＧＬをＢＯＲＧに侵入させる工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬを３Ｄ  ＣＮＳ環境に組み込む方法であって、ｉＭＧＬをｈｉＰＳＣ  ３Ｄ脳オルガノイド（ＢＯＲＧ）と共培養することを含み、ｉＭＧＬはＢＯＲＧに遊走し、ＢＯＲＧに集合するか、またはＢＯＲＧに組み込まれる、方法に関する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬにおける遺伝子発現を差次的に制御する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬを、以下の化合物：Ａβ、タウ、蛍光標識Ａβ、ｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマー、および神経変性疾患に関係する他の脳由来タンパク質、すなわち、シヌクレイン、ハンチンチン、プリオンのいずれかに曝露する工程と、（ｉｉ）ｉＭＧＬにおいて遺伝子を差次的に制御する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）状態に類似するｉＭＧＬ遺伝子発現プロファイルを確立する方法であって、ｉＭＧＬをニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養し、それにより、ｉＭＧＬがニューロン、星状細胞、または中枢神経系の他の細胞と共培養されていない場合にｉＭＧＬに関して存在するよりもｉＭＧＬに関してよりインビボの状態を再現することとを含む方法に関する。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬを使用して健康および疾患におけるミクログリア制御不全を試験する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬを、Ａβ、タウ、蛍光標識Ａβ、ｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマー、およびアルファ−シヌクレインからなる群から選択される化合物に曝露することと、（ｉｉ）ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロテオミクス、メタボロミクス、およびリピドミクスから選択されるｉＭＧＬオミックシグネチャをプロファイリングすることとを含む方法に関する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬにおけるヒトシナプトソーム（ｈＳ）を貪食する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬをｈＳに曝露する工程と、（ｉｉ）ｈＳの貪食を測定する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、化合物のミクログリア貪食を試験する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬを、Ａβ、タウ、蛍光標識Ａβ、およびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーからなる群から選択される化合物に曝露し、化合物がｉＭＧＬによって、貪食、エンドサイトーシス、または摂取されることと、（ｉｉ）化合物の貪食、エンドサイトーシス、または摂取を測定することとを含む方法に関する。
【００１９】
いくつかの実施形態は、シナプス刈り込みおよびシナプス可塑性におけるミクログリアの役割を調査する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬをヒトシナプトソームに曝露することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬによるヒトシナプトソーム貪食を評価することとを含む方法に関する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子制御を決定する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬを、任意の組み合わせの、因子、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＤ２００、およびＴＧＦβのうちの１つ以上に曝露することと、（ｉｉ）任意の組み合わせの、差次的に制御される遺伝子：Ｐ２ｒｙ１２、ＥＧＲ１、ＴＧＦβ１、ＥＴＶ５、ＣＸ３ＣＲ１、ＡＰＯＥ、ＢＩＮ１、ＣＤ３３、ＧＰＲ８４、ＣＯＭＴ、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＨＴＴ、ＧＲＮ、ＦＵＳ、ＴＡＲＤＰ、ＶＣＰ、ＳＮＣＡ、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＬＲＲＫ２、およびＳＯＤ１のうちの任意の１つ以上を評価することとを含む方法が提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬの神経組織（例えば、皮質）への生着を評価する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬを神経組織に移植することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬの神経組織への生着を評価することとを含む方法が提供される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬのＡＤニューロパシーとの相互作用を評価する方法であって、（ｉ）ｉＭＧＬを海馬に移植することと、（ｉｉ）海馬におけるｉＭＧＬの相互作用を評価することとを含む方法が提供される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、３Ｄ神経環境でヒトミクログリアを試験する方法であって、ｉＭＧＬを哺乳動物の脳に移植することを含む方法が提供される。
【００２４】
本明細書において提供される方法、キット、および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトｉＨＰＣの生成を支持するための培地であって、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、およびＬｉＣｌのうちの１つ以上を含む培地に関する。本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトｉＨＰＣの生成を支持するための培地であって、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦのうちの１つ以上を含む培地に関する。本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトｉＨＰＣの生成を支持するための培地であって、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６のうちの１つ以上を含む培地に関する。いくつかの実施形態は、ヒトｉＨＰＣの生成を支持するためのキットであって、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、およびＬｉＣｌのうちの１つ以上を含む培地を含むキットに関する。いくつかの実施形態は、ｉＨＰＣの生成を支持するためのキットであって、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦのうちの１つ以上を含む培地を含むキットに関する。いくつかの実施形態は、ヒトｉＨＰＣの生成を支持するためのキットであって、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６のうちの１つ以上を含む培地を含むキットに関する。
【００２５】
本明細書において提供される方法、キット、および組成物のいくつかの実施形態は、ヒトｉＭＧＬの生成を支持するための培地であって、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上を含む培地に関する。いくつかの実施形態は、ヒトｉＭＧＬの生成を支持するためのキットであって、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上を含む培地を含むキットに関する。
【００２６】
本明細書において提供される方法、キット、および組成物のいくつかの実施形態は、ｉＭＧＬの成熟または維持を支持するため培地であって、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１のうちの１つ以上を含む培地に関する。いくつかの実施形態は、ｉＭＧＬの成熟または維持を支持するためのキットであって、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１のうちの１つ以上を含む培地を含むキットに関する。
【００２７】
上述のように要約され、以下でさらに詳述される組成物および関連する方法は、開業医によってとられる特定の行動を説明するが、別の当事者によるこれらの行動の指示を含めることもできることを理解されたい。したがって、「ｉＭＧＬを哺乳動物の脳に移植すること」などの行動には、「ｉＭＧＬの哺乳動物の脳への移植を指示すること」が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ  完全に定義されたｉＭＧＬ分化プロトコールの概略図。（ｉ）ヒトｉＰＳＣは１０日間でＣＤ４３＋  ｉＨＰＣに分化し、次いで、ヒト組換えＭＣＳＦ、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ−１を含む無血清ミクログリア分化培地で培養される。分化はさらに２５日間行われ、その後、ｉＭＧＬはヒト組換えＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１に３日間曝露される。（ｉｉ）１０日目の細胞培養におけるｉＨＰＣの代表的な画像。スケールバー＝１００μｍ。（ｉｉｉ）１４日目までに、ｉＭＧＬはＰＵ．１（明るいスポット）およびＴＲＥＭ２（明るいスポット）を発現する。スケールバー＝５０μｍ。（ｉｖ）３８日目のｉＭＧＬの代表的な位相コントラスト画像。  図１Ｂ  ｉＰＳＣからｉＨＰＣへの分化の概略図。（ｉ）単一細胞ｉＰＳＣは、造血分化因子を補充した既知組成培地において、５％Ｏ２（４日）および２０％Ｏ２（６日）を使用して分化する。（ｉｉ）１０日後、ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣは、ＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４１ａ＋である。  図１Ｃ  ｉＭＧＬは、ＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１−（Ａ１）始原細胞およびＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１＋（Ａ２）始原細胞より発生する。  図１Ｄ  ＣＤ４５蛍光強度は、単球由来マクロファージ（ＭＤ−Ｍφ）と比較するとき、ｉＭＧＬ（暗い外側のスポット）がそれらのＣＤ４５ｌｏ−ｉｎｔのプロファイルを維持していることを示している。  図１Ｅ  ｉＭＧＬ始原細胞はＣＤ１１ｂｌｏであり、成熟するにつれてそれらのＣＤ１１ｂ発現を増加させる。１４ＤＩＶにおいて、ＣＤ１１ｂｉｎｔ−ｈｉを有する小集団（約１１％）の細胞が検出された。  図１Ｆ  ＣＤ１１ｂ蛍光強度は、ｉＭＧＬが老化するにつれてＣＤ１１ｂの発現が増加し、マウスのミクログリア始原細胞に類似することを実証する。  図１Ｇ  単球、ＭＤ−Ｍφ、胎児ミクログリア、およびｉＭＧＬのメイグリュンワルドギムザ染色。胎児ミクログリアとｉＭＧＬの両方は、単球およびＭＤ−Ｍφと比較して、高い核対細胞質比の形態を示す。スケールバー＝１６μｍ。  図１Ｈ  分化は、ミクログリア濃縮タンパク質Ｐ２ｒｙ１２、ミクログリア濃縮Ｔｒｅｍ２の共局在化によって評価される９６％を超える純度をもたらす（マージパネルは、Ｐ２ｒｙ１２、Ｔｒｅｍ２、およびＰ２ｒｙ１２とＴｒｅｍ２の発現が重複する核パネルのオーバーレイを示す）。  図１Ｉ  ｉＭＧＬはまた、伸長した突起を示し、Ｃｘ３Ｃｒ１（左上のパネル）とｈＣｙｔｏ（右上のパネル）を発現する。マージパネルは、ｈＣｙｔｏの発現（明るいスポット）が、Ｃｘ３Ｃｒ１の発現と同一の領域に局在化することを示す。
【図２】図２Ａ  ｉＭＧＬ、ヒト成人ミクログリア（成人ＭＧ）、およびヒト胎児ミクログリア（胎児ＭＧ）（成人ＭＧと胎児ＭＧは同一の円で囲まれたクラスター内に位置する）、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６−単球（ＣＤ１４  Ｍ）、ＣＤ１４＋／１６＋単球（ＣＤ１６  Ｍ）（ＣＤ１４  ＭとＣＤ１６  Ｍは同一の円で囲まれたクラスター内に位置する）、血液樹状細胞（血液ＤＣ）、ｉＨＰＣ、およびｉＰＳＣの３Ｄ主成分分析（ＰＣＡ）（ＦＰＫＭ≧１、ｎ＝２３，５８０遺伝子）。ＰＣＡ分析は、ｉＭＧＬが成人ＭＧおよび胎児ＭＧとクラスター化し、他の骨髄細胞とクラスター化しないことを明らかにしている。ＰＣ１（２１．３％ｖａｒ）は、ｉＰＳＣのｉＨＰＣへの分化（ｉＰＳＣクラスターからｉＨＰＣクラスターへの矢印）、および続くｉＭＧＬへの分化（ｉＨＰＣクラスターからｉＭＧＬクラスターへの矢印）の時系列を反映している。ＰＣ２（１５．４％ｖａｒ）は、血液ＤＣへの軌跡を反映している。ＰＣ３（７．６％ｖａｒ）は単球への軌跡を反映している。  図２Ｂ  ３００個のミクログリア、骨髄、およびその他の免疫関連遺伝子のヒートマップとバイクラスタリング（ユークリッド距離）（Butovsky et al., 2014、Hickman et al., 2013、Zhang et al., 2014）。擬似計数はＦＰＫＭ値（ＦＰＫＭ＋１）に使用され、ｌｏｇ２変換され、各遺伝子はそれぞれの行において標準化された（ｎ＝３００）。代表的なプロファイルは、ヒトミクログリア（胎児／成人）とｉＭＧＬの両方において上下に制御される遺伝子について示されている。  図２Ｃ  ｉＭＧＬ、胎児ＭＧおよび成人ＭＧ、血液ＤＣ、ＣＤ１４  Ｍ、およびＣＤ１６  ＭにおいてＦＰＫＭ＋１と続くＬｏｇ２変換［Ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）］として測定され、平均±ＳＥＭとして提示されたミクログリア特異的な濃縮遺伝子の棒グラフ。一元配置分散分析を使用して分析されたデータに続いて、テューキーの修正された多重比較事後検定が実行された。統計アノテーションは、他の骨髄細胞に対する、ｉＭＧＬ、胎児ＭＧ、および成人ＭＧの最大のｐ値を表す。ＣＤ１４  Ｍ（ｎ＝５）、ＣＤ１６  Ｍ（ｎ＝４）、血液ＤＣ（ｎ＝３）、ｉＭＧＬ（ｎ＝６）、胎児ＭＧ（ｎ＝３）、および成人ＭＧ（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３】図３Ａ  フローサイトメトリー分析により、ｉＭＧＬ（３つのパネルの外側の暗いスポット領域）は、胎児ＭＧ（３つのパネルの最も内側のスポット領域）と同様のＣＤ４５ｌｏ−ｉｎｔである。  図３Ｂ  ｉＭＧＬ（左のパネルの暗いスポット）は、ＣＤ４５−ｈｉ  ＭＤ−Ｍφ（左パネルの灰色のスポット）とは異なる。ＣＤ１１ｂ強度のヒストグラム（左のヒストグラム）は、胎児ＭＧがｉＭＧＬよりわずかに多くＣＤ１１ｂを発現しているが、ＭＤ−Ｍφよりも少ないことを明らかにする。  図３Ｃ  ｉＭＧＬは、ＥＬＩＳＡマルチプレックスによるＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかにより２４時間刺激するとき、サイトカインおよびケモカインを分泌する。  図３Ｄ  ＡＤＰ（１００μＭ）は、トランスウェルチャンバー（５μｍ）においてｉＭＧＬの遊走を誘導する。Ｐ２ｒｙ１２アンタゴニストＰＳＢ０７３９への事前曝露（５０μＭ、１時間）は、ＡＤＰ誘導性のｉＭＧＬの遊走を完全に無効にする（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。  図３Ｅ  ＡＤＰは、Ｐ２ｒｙ１２受容体を介してｉＭＧＬのカルシウムフラックスを誘導する。（左）ＡＤＰへの曝露は、媒体群（明るいトレース）においてカルシウム流入の増加（Ｉ３４０／Ｉ３８０比）をもたらすが、ＰＳＢ０７３９処理群（暗いトレース）においてはそうしない。（右）媒体（上）およびＰＳＢ０７３９（下）における２４０秒でのＡＤＰ誘導性のカルシウムフラックスの代表的な画像。  図３Ｆ  ｉＭＧＬは、ヒトの脳由来シナプトソーム（ｈＳ）を貪食する。Ａｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍで記録された代表的な画像は、ＭＤ−ＭφおよびｉＭＧＬによるｈＳの貪食を示す。  図３Ｇ  貪食の定量化は、ｉＭＧＬがマクロファージのキャパシティーの５０％でｈＳを内部移行することを示す（ｐ＜０．０００１）。  図３Ｈ  ＭｅｒＴＫ阻害剤ＵＮＣ５６９（上）または抗ＣＤ１１ｂ抗体（下）のいずれかの存在下でのｈＳのｉＭＧＬによる貪食の代表的な画像。  図３Ｉ  （上）ｈＳのｉＭＧＬによる貪食は、ＭｅｒＴＫを遮断することによりおよそ１２％（右から２番目のバー、ｐ＜０．０５）低下するが、ＣＤ１１ｂ遮断を介してＣＲ３を阻害することにより４０％（ｐ＜０．０００１、右のバー）低下する。（下）貪食事象を示すｉＭＧＬのサブ分析は、処理群全体にわたる内部移行の同様の平均量を明らかにする（ｐ＝０．１１６５）。全てのヒストグラムは平均±ＳＥＭとして報告される。サイトカインおよび遊走アッセイの一元配置分散分析、それに続くダネットの多重比較事後検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、サイトカインアッセイ：ｎ＝３ウェル／群。遊走アッセイ：ｎ＝５視野／条件。カルシウムアッセイ：媒体（ｎ＝３７細胞）、ＰＳＢ０７３９処理（ｎ＝１７細胞）、各時点での平均±ＳＥＭとして表されるＩ３４０／Ｉ３８０。貪食アッセイ：ＭＤ−Ｍφ対ｉＭＧＬ：対応のないｔ検定、＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３ウェル／群。ＭＥＲＴＫおよびＣＲ３アッセイ、一元配置分散分析、それに続くテューキーの多重比較事後検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１；媒体についてｎ＝６、ｎ＝３ウェル／群。
【図４】図４Ａ  ＬＯＡＤに関連する変異体を有する２５の免疫遺伝子のヒートマップは、主要なリスク因子ＡＰＯＥおよびＴＲＥＭ２がｉＭＧＬ、成人ＭＧ、および胎児ＭＧで高度に発現していることを明らかにする。  図４Ｂ  ｉＭＧＬは、蛍光標識ｆＡβおよびｐＨｒｏｄｏ−色素ＢＤＴＯを内部移行する。Ａｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅ  ＳｔｒｅａｍＸ  Ｍａｒｋ  ＩＩで記録された代表的な画像。  図４Ｃ  ｉＭＧＬは、未標識のｆＡβ（５μｇ−ｍｌ−１）およびＢＤＴＯ（５μｇ／ｍｌ）に２４時間曝露され、１９個のＧＷＡＳ遺伝子のｍＲＮＡ発現がｑＰＣＲアレイを介して評価された。試験した各遺伝子について、ｆＡβに対応するバーは左側にあり、ＢＤＴＯ処理に対応するバーは右側にある。ｆＡβ処理により、ＭＳ４Ａ６Ａ（６．３倍）、ＣＤ３３（６．１倍）、ＡＢＣＡ７（５．８倍）、ＴＹＲＯＢＰ（４．９８）、およびＴＲＥＭ２（４．８５倍）を含む１０個の遺伝子の発現が、媒体と比較して２倍より大きく上昇した。一方で、ＢＤＴＯ暴露により、４個の遺伝子の発現が、媒体と比較して２倍より大きく上昇した。ＢＤＴＯと比較して、ｆＡβにおいて６個の遺伝子が差次的に発現した。ｆＡβおよびＢＤＴＯの調製物は、オリゴマー（Ａ１１）の立体配座構造特異的抗体、繊維（ＯＣ）、ならびにヒトＡβ（６Ｅ１０）およびタウオリゴマー（タウ２２）の非構造特異的抗体によるドットブロット分析により確認された。標的遺伝子をＧＡＰＤＨに対して標準化し、ΔΔＣｔにより媒体による発現と比較した。棒は、発現倍率の平均±ＳＥＭを示す。赤いハッシュバーはΔΔＣｔ＝１である。二元配置分散分析、それに続くシダックの多重比較事後検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５；ｎ＝６ウェル／群。データは平均±ＳＥＭで表される。
【図５】図５Ａ  ラット海馬ニューロンを含むかまたは含まないｉＭＧＬ共培養の概略図。  図５Ｂ  ニューロンと共培養されたｉＭＧＬを収集し、フローサイトメトリーで評価し、ＲＮＡ配列決定でトランスクリプトームを評価した。  図５Ｃ  ｉＭＧＬおよびｉＭＧＬ−ＨＣの遺伝子発現のヒートマップは、固有に濃縮された遺伝子を強調する。  図５Ｄ  差次的遺伝子発現分析では、ｉＭＧＬ−ＨＣにおいて１５６個の上方制御された遺伝子と２４４個の下方制御された遺伝子が強調される。  図５Ｅ  差次的発現遺伝子［＞２Ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）］の散布図は、ＴＲＩＭ１４、ＣＡＢＬＥＳ１、ＭＭＰ２、ＳＩＧＬＥＣ  １１および１２、ＭＩＴＦ、ならびにＳＬＣ２Ａ５がｉＭＧＬ−ＨＣにおいて濃縮されていることを強調し、ｉＭＧＬが神経環境に適切に応答することを示唆する。単独で培養された細胞は、ＣＯＭＴ、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、およびＦＦＡＲ２について濃縮され、プライムされたミクログリア表現型を示唆する。
【図６】単一のＢＯＲＧを含む培地にｉＭＧＬ（５×１０５細胞）を７日間添加した。（パネルＡ）３日後にＢＯＲＧ中およびその近くで検出されたｉＭＧＬの代表的な明視野画像。ｉＭＧＬはＢＯＲＧの培地の境界（矢印）に見出され、それに付着しているが、培地中に自由に浮遊するのではなく、ｉＭＧＬの完全な走化性を示唆する。（パネルＢ）ＢＯＲＧの外側と内側の半径におけるｉＭＧＬの代表的な画像。（パネルＣ）埋め込まれたｉＭＧＬは、マクロファージ様の形態（白い矢印）と伸長した突起（黒い矢印）を示し、それぞれＥＣＭリモデリングと監視を示す。損傷していない（パネルＤ〜Ｆ）ＢＯＲＧおよび損傷した（パネルＧ〜Ｉ）ＢＯＲＧに埋め込まれたｉＭＧＬの形態の同時評価。（パネルＤ）ＢＯＲＧの免疫組織化学分析は、ｉＭＧＬがＢＯＲＧ全体に均等にタイリングを開始し、環境の監視のために分岐突起を突出させていることを明らかにした。ＢＯＲＧは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で発生する脳の代表であり、皮質様分布に自己組織化するニューロンおよび星状細胞を含むが、ミクログリア、ｉＭＧＬを欠く。（パネルＥ〜Ｆ）高倍率での３Ｄ神経環境内の伸長する突起を有するｉＭＧＬの代表的な免疫蛍光画像。（パネルＧ〜Ｉ）損傷したＢＯＲＧにおいて観察されたｉＭＧＬの形態の代表的な画像。（パネルＨ〜Ｉ）アメーバ様のミクログリアを連想させる球状体のｉＭＧＬは、損傷したＢＯＲＧに分布しており、活性化ミクログリアによく似ており、ｉＭＧＬが神経損傷に適切に応答することを実証する。スケールバー＝Ａ〜Ｃにおいて５０μｍ、Ｄ、Ｇにおいて２００μｍ、Ｅ、Ｈにおいて８０μｍ、およびパネルＦ、Ｉにおいて１５μｍ。
【図７】図７Ａ  単球、樹状細胞、および市販のＨＰＣの流動性の特性評価。ヒトのＣＤ１４＋／ＣＤ１６−単球およびＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋炎症性単球は、ＦＡＣｓによって若い健康なヒト（１８〜３９歳）の血液から単離された。細胞を、最初に生存率についてゲートし（示されない）、次いで白血球の混入を避けるためにＣＤ１４についてゲートし、最後にＣＤ１６の発現によって単離し、ＲＮＡのために収集した。  図７Ｂ  単球、樹状細胞、および市販のＨＰＣの流動性の特性評価。ヒト骨髄樹状細胞（血液ＤＣ）は、未処理の骨髄ＤＣ濃縮キットに続いてＦＡＣｓを使用して、若い健康なヒト（１８〜３９歳）の血液から単離された。形質細胞様ＤＣの混入を避けるため、ＤＣをＣＤ１２３で染色し、骨髄ＤＣサブタイプＣＤ１ｃおよびＣＤ１４１をＲＮＡのために収集した。  図７Ｃ  単球、樹状細胞、および市販のＨＰＣの流動性の特性評価。市販のＨＰＣの供給源（ＣＤ４３＋／２３５ａ＋／ＣＤ４１＋）の細胞を同定し、実験室内でのＨＰＣ分化およびさらにｉＭＧＬ分化と比較するために使用した。
【図８】図８Ａ  骨髄特異的遺伝子ＲＵＮＸ１、ＰＵ．１、およびＣＳＦ１Ｒについての、ＣＤ１４＋／１６−単球（ＣＤ１４  Ｍ）、ＣＤ１４＋／１６＋単球（ＣＤ１６  Ｍ）、およびｉＰＳ由来ミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）のＲＮＡ−ｓｅｑカバレッジマップと遺伝子ＦＰＫＭ値。  図８Ｂ  単球特異的遺伝子ＩＲＦ１、ＫＬＦ４、およびＮＲ４Ａ１についての、ＣＤ１４＋／１６−単球（ＣＤ１４  Ｍ）、ＣＤ１４＋／１６＋単球（ＣＤ１６  Ｍ）、およびｉＰＳ由来ミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）のＲＮＡ−ｓｅｑカバレッジマップと遺伝子ＦＰＫＭ値。  図８Ｃ  ｉＭＧＬ中のミクログリア濃縮遺伝子Ｐ２ＲＹ１２、ＯＬＦＭＬ３、およびＧＰＲ３４についての、ＣＤ１４＋／１６−単球（ＣＤ１４  Ｍ）、ＣＤ１４＋／１６＋単球（ＣＤ１６  Ｍ）、およびｉＰＳ由来ミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）のＲＮＡ−ｓｅｑカバレッジマップと遺伝子ＦＰＫＭ値。全てのＲＮＡカバレッジマップ（図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃ）について、ｙ軸は、全ての試料に応じてスケーリングされた１００万分のリード（ＲＰＭ）を表す。全ての遺伝子のＦＰＫＭ値を使用したヒストグラム比較は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。ＣＤ１４  Ｍ（Ｎ＝５）、ＣＤ１６（Ｎ＝４）、およびｉＭＧＬ（Ｎ＝６）についての生物学的反復は、一元配置分散分析と続くテューキーの多重比較事後検定による比較に含まれる。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。  図８Ｄ  ｉＭＧＬ（プロットの右側部分）、ＣＤ１４  Ｍ（プロットの左側部分）、および非有意（プロットの下部の明るい部分）における差次的に発現した遺伝子（ｐ値＜０．００１、２倍の変化）の代表的なボルケーノプロット。主要な遺伝子は標識されている。倍数変化（ｌｏｇ２）および−ｌｏｇ１０（ｐ値）は、それぞれｘ軸およびｙ軸を示す。灰色の破線の縦線は、遺伝子発現の２倍の変化を示す。ベン図は、条件ごとに差次的に発現した遺伝子の総数を示す。  図８Ｅ  ｉＭＧＬ（プロットの右側部分）、ＣＤ１６  Ｍ（プロットの左側部分）、および有意でないもの（プロットの下部の明るい部分）における差次的に発現した遺伝子（ｐ値＜０．００１、２倍の変化）の代表的なボルケーノプロット。主要な遺伝子は標識されている。倍数変化（ｌｏｇ２）および−ｌｏｇ１０（ｐ値）は、それぞれｘ軸およびｙ軸を示す。灰色の破線の縦線は、遺伝子発現の２倍の変化を示す。ベン図は、条件ごとに差次的に発現した遺伝子の総数を示す。
【図９】図９Ａ  ＲＮＡ配列決定において使用される生体試料のスピアマン相関マトリックスは、強い群内相関を強調する。ｉＭＧＬは、胎児および成人ＭＧとよく相関しており、試料間の強い遺伝子発現の類似性を示唆している。  図９Ｂ  様々な試料にわたって見出された主要な遺伝子のヒストグラム。ＣＤ１４およびＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６としても知られる）は、ミクログリアを含む全ての骨髄細胞で発現したが、それぞれＣＤ１４  ＭおよびＣＤ１６  Ｍで濃縮されている。予想どおり、ＦＬＴ３は血液ＤＣによって高度に発現されているが、他の細胞では発現せず、３つのミクログリア群全てでほとんど検出されない。単球／マクロファージ特異的転写因子ＫＬＦ２は、ＣＤ１４  ＭとＣＤ１６  Ｍのみで濃縮されていた。一方、ＧＡＴＡ１とＯＣＴ４は、それぞれｉＨＰＣとｉＰＳＣでのみ検出された。
【図１０】図１０Ａ  ミクログリアマーカーＣＸ３ＣＲ１（左パネル）およびＴＲＥＭ２（中央、右パネル）を発現するｉＭＧＬの代表的な免疫蛍光画像。ｈＣｙｔｏ（中央、左パネル）は細胞質マーカーである。マージパネル（右パネル）は、ＣＸ３ＣＲ１、ｈＣｙｔｏ、およびＴＲＥＭ２の共局在化を示す。  図１０Ｂ  ミクログリア（ｍｉｃｒｏｌｇｉａｌ）マーカーＴＧＦＢＲ１（左パネル）およびＭＥＲＴＫ（左、中央パネル）を発現するｉＭＧＬの代表的な免疫蛍光画像。Ｄａｐｉ（中央、右パネル）は核マーカーである。マージパネル（右パネル）は、ＴＧＦＢＲ１、ＭＥＲＴＫ、および核の共局在化を示す。  図１０Ｃ  ミクログリアマーカーＰＲＯＳ１（左パネル）、ＩＴＧＢ５（中央、左パネル）、ＴＲＥＭ２（中央、右パネル）を発現するｉＭＧＬの代表的な免疫蛍光画像。マージパネル（右パネル）は、ＰＲＯＳ１、ＩＴＧＢ５、およびＴＲＥＭ２の共局在化を示す。  図１０Ｄ  マクロファージ（上）およびｉＭＧＬ（下）内のＥ．ｃ貪食を可視化するＡｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍフローサイトメーターによって記録された代表的な明視野および免疫蛍光画像。  図１０Ｅ  予想どおり、食細胞の割合の定量化（上）は、ｉＭＧＬ（右のバー）がＥ．ｃを貪食することが、マクロファージ（左のバー）よりもほぼ１０倍少ないことを明らかにする。食（ｐｈａｔｏｃｙｔｉｃ）細胞内のＧＭＦＩによって内部移行されたＥ．ｃの量（下）は、ｉＭＧＬと比較して、マクロファージの貪食能が大きいことをさらに示す。
【図１１】ｉＭＧＬは、筋萎縮性（Ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型（Ｆｒｏｎｔａｌｔｅｍｐｏｒａｌ）認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）に関連する遺伝子を発現し、ミクログリアの機能障害をもたらす。ｉＭＧＬにおいて胎児ＭＧおよび成人ＭＧと同様に検出され、ＦＰＫＭ＋１と続くＬｏｇ２変換［Ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）］として表され、平均±ＳＥＭとして提示された神経変性疾患に関与する遺伝子の棒グラフ。単離されたヒト初代ミクログリアと同様に、ｉＭＧＬはバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）、（ＦＵＳ）、Ｃ９ＯＲＦ７２、プロガヌリン（ｐｒｏｇａｎｕｌｉｎ）（ＧＲＮ）、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）、ＬＲＲＫ２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、およびシヌクレイン（ＳＮＣＡ）を発現する。最近の文献は、ＡＬＳ（Ｃ９ＯＲＦ７２、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ）、ＦＴＤ（ＶＣＰ、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＧＲＮ、ＴＡＲＤＢＰ）、ＰＤ（ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ）、およびＤＬＢ（ＳＮＣＡ）の病因に関与するこれらの遺伝子の突然変異または機能喪失にミクログリアの機能障害が関連することを暗示し、これらの神経疾患におけるこれらの遺伝子の根底にあるメカニズムの試験におけるｉＭＧＬの有用性を示唆している。
【図１２】海馬ニューロンとともに培養されたｉＭＧＬの差次的遺伝子発現分析からのＧＯ用語。ラット海馬ニューロンと共培養されたｉＭＧＬ（ｉＭＧＬ−ＨＣ）の遺伝子発現プロファイルは、ニューロンに存在する可溶性および不溶性の因子によって強化された。ｉＭＧＬ−ＨＣで上方制御された遺伝子は、正のコレステロール流出、脂質輸送、免疫応答の正の制御、白血球分化の負の制御、および細胞接着分子を含む２０個の統計的に有意なＧＯ生物学的モジュール（ｉＭＧＬ−ＨＣヒストグラム）と関連付けられている。ニューロンの非存在下で培養された細胞は、２０個の統計的に有意なＧＯ生物学的モジュール（ｉＭＧＬヒストグラム）を備えた相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な遺伝子プロファイルを有し、それは特徴的なコレステロール恒常性、ＮＦ−κＢによる特徴的なＴＮＦαシグナル伝達、白血球分化、およびＩＬ−１β分泌の制御を含む用語であった。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｐ  野生型またはＡＤ移植コンピテントマウスのいずれかの脳に移植されたｉＭＧＬは、脳のミクログリアに類似している。異種移植に適合したマウスの脳内では、移植されたｉＭＧＬは分岐し、神経環境と相互作用する。（Ａ〜Ｌ）インビボで２か月後、マウスに移植されたｉＭＧＬは、脳内で見出される内因性ミクログリアに類似した高度な樹状突起を有して長期生存率を示す。（Ａ）Ｐ２ｒｙ１２（ＨＰＡ  ＨＰＡ０１４５１８、Ｓｉｇｍａ）およびヒト核（ｋｕ８０）で標識された移植ｉＭＧＬは、マウスで長期生存率を示す。（Ｂ〜Ｄ）高倍率では、Ｐ２ｒｙ１２はｉＭＧＬ樹状突起で高度に発現し、どちらも脳環境を監視する恒常性ミクログリアを示唆する。（Ｅ〜Ｈ）分岐したｉＭＧＬは、ヒト特異的Ｔｍｅｍ１１９抗体（ａｂ１８５３３３、Ａｂｃａｍ、［Bennet et al, PNAS 2016］において同定および検証済み）によって認識されるミクログリア濃縮Ｔｍｅｍ１１９、ならびにヒト細胞質マーカー（ｍａｋｅｒ）ＳＣ１２１（ｈＣｙｔｏ）も発現する。（Ｉ〜Ｌ）より高い倍率では、代表的なｉＭＧＬはＰ２ｒｙ１２、ｈＣｙｔｏ、およびＩｂａ１（ａｂ５０７６、Ａｂｃａｍ）を発現する。（Ｍ〜Ｐ）ＡＤ免疫不全マウスに移植されたヒトｉＭＧＬ（ｈＣｙｔｏ）（Marsh et al, PNAS 2016）は、アミロイド斑と相互作用し、貪食する。（Ｉ〜Ｊ）移植されたｉＭＧＬは突出を伸長し、斑に遊走する。ｉＭＧＬはアミロイド斑を完全に包み（Ｏ）、アミロイドを貪食し始める（Ｐ）。スケールバー；（Ａ、Ｅ、Ｎ）＝３０μｍ、（Ｂ〜Ｄ、Ｆ〜Ｈ、Ｉ〜Ｌ、Ｏ、Ｐ）＝１０μｍ、（Ｍ）＝３００μｍ。試験あたりｎ＝３動物。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｆ  ｉＰＳＣおよびｉＭＧＬのゲノム安定性。（図１４Ａ）上：多能性マーカーＯＣＴ４およびＳＯＸ２を発現するｉＰＳＣの代表的な蛍光画像。スケールバー＝３００μｍ。下：ｉＰＳＣの多能性の機能的検証。分化能を検証するための、内胚葉、中胚葉、および外胚葉に分化し、Ｓｏｘ１７、Ｔ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、およびＯｔｘ２についてそれぞれ染色されたｉＰＳＣの代表的な蛍光画像。スケールバー＝２００μｍ。（図１４Ｂ〜Ｃ）核型およびＰｌｕｒｉｔｅｓｔスコアは、センダイウイルスを使用して生成され、この試験で使用された全てのｉＰＳ株が核型的に正常で多能性であることを示している。Ｐｌｕｒｉｔｅｓｔは、機能的に検証されたｉＰＳＣのライブラリーを参照したｉＰＳ全トランスクリプトーム分析に基づくマイクロアレイベースの多能性の評価である（Muller, F.J. et al. 2011）。（図１４Ｄ〜Ｅ）多能性ｉＰＳまたは市販の造血始原細胞を使用したｉＭＧＬ分化過程にわたるゲノム安定性の維持。分化したｉＭＧＬのＣＮＶ評価は、分化の過程にわたってゲノムの安定性が維持されていることを明らかにした。（図Ｄ）代表的なＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒＫａｒｙｏｔｙｐｅの結果は、ＡＤＲＣ  ｉＰＳ株２２に由来するミクログリアが分化過程にわたって染色体外ＤＮＡを継承しないことを実証する。（図１４Ｅ）２４個全ての染色体にわたる３３８個のプローブセットの定量化では、染色体異常はいっさい明らかにならない（ｎ＝６）。（図１４Ｆ）そのｉＰＳＣに由来するｉＭＧＬの代表的な分析は、ＣＮＶの強い相関（ｒ２＝０．９２９）を示し、由来したｉＭＧＬのアッセイの感度とゲノム安定性を示す。
【図１５】図１５Ａ〜Ｂ  Ｐ２ＲＹ１２／ＴＲＥＭ２共局在化によるｉＭＧＬ純度の評価および単球、樹状細胞、および市販のｉＨＰＣのフローサイトメトリーによる特性評価。（図１５Ａ）ヒト単球およびｉＭＧＬにおける、ウサギ抗ヒトＰ２ｒｙ１２（ＨＰＡ０１４５１８、同様に最近検証されたもの）、およびヤギ抗ヒトＴｒｅｍ２（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ１８２８）の特異性評価。スケールバー＝２０μｍ（図１５Ｂ）Ｐ２ｒｙ１２／Ｔｒｅｍ２／ＤＡＰＩの共局在化によるｉＭＧＬ純度の代表的な免疫蛍光画像（代表的な５株から）。スケールバー＝１００μｍ
【図１６】図１６Ａ〜Ｅ  ＴＧＦβ−１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＤ２００、およびそれらの主要なミクログリア遺伝子に対する影響は、神経機能と環境の調節に関連している。（図１６Ａ〜Ｂ）ＴＧＦβ１は、コアなミクログリア遺伝子を維持する。ＴＧＦβ１の２４時間の撤去は、ミクログリアのトランスクリプトームに強く影響する。インビボでのマウスの試験と一致して、ＴＧＦβの除去は、表面受容体Ｐ２ＲＹ１２、ＴＧＦβＲ１、およびＣＸ３ＣＲ１を含む主要なミクログリア遺伝子の発現を低下させ、一方でミクログリア転写因子ＥＧＲ１およびＥＴＶ５の発現も低下させる。ＢＩＮ１、ＣＤ３３、およびＡＰＯＥなどのＡＤ関連経路遺伝子もＴＧＦβの欠如の影響を受ける。ＣＸ３ＣＬ１およびＣＤ２００の除去は、コアなミクログリアの同一性を変化させないが、ＣＯＭＴおよびＡＰＯＥなどの恒常性遺伝子発現に影響を及ぼすことにより状態に影響を与える（図１６Ｂ）。（図１６Ｃ）差次的遺伝子発現分析は、ＴＧＦβの存在がｉＭＧＬにおける１２６２個の遺伝子の発現を増加させる一方で、ＴＧＦβの欠如が１５１７個の遺伝子の発現を低下させ、ミクログリアの発達、遺伝子シグネチャ、および機能におけるＴＧＦβの役割を強調する以前の研究をさらに支持することを明らかにする。（図１６Ｄ）ＫＥＧＧ経路分析は、ＴＧＦβで上昇したミクログリアコア遺伝子が、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病などのＣＮＳ疾患の経路を調節することを強調する。（図１６Ｅ）ＴＧＦβによるｉＭＧＬに対するＡＤ  ＧＷＡＳ遺伝子座遺伝子の倍数変化。統計は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較事後検定を反映する。＊ｐ＜０．０５＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃ  ミクログリアＡＤ−ＧＷＡＳおよび他のＣＮＳ疾患関連遺伝子は、ｉＭＧＬを使用して試験することができる。（図１７Ａ〜Ｂ）ｉＭＧＬ  ＡＤ関連のＧＷＡＳ遺伝子は、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１の有無にかかわらずプライムされた場合、ｆＡβに差次的に応答する。ＣＮＳ因子、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１へのｉＭＧＬの曝露は、ＣＤ３３、ＡＢＣＡ７、ＴＹＲＯＢＰ、およびＴＲＥＭ２などのＡＤにおいてミクログリアの炎症と機能の調節に関与する機能をもつ遺伝子の発現を増加させることにより、ｆＡβへの応答を「プライム」する。ＣＤ２００またはＣＸ３ＣＬ１に曝露されていないｉＭＧＬのｆＡβによる刺激は、ミスフォールディングしたタンパク質への応答ならびに生存および恒常性に関与する遺伝子である、ＡＤ  ＧＷＡＳ関連遺伝子ＣＬＵおよびＡＰＯＥの発現を増加させる。（図１７Ｃ）主要な神経変性関連遺伝子、ＡＰＰ（ＡＤ）、ＳＣＮＡ（ＰＤ）、およびＨＴＴ（ＨＤ）は、ｉＭＧＬおよび初代培養ミクログリアで発現している。ｉＭＧＬはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）に関連する遺伝子を発現し、ミクログリアの機能障害に関するこれまでの研究を支持する。ｉＭＧＬにおいて胎児ＭＧおよび成人ＭＧと同様に検出され、Ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）として表され、平均±ＳＥＭとして提示された神経変性疾患に関与する遺伝子の棒グラフ。単離されたヒト初代培養ミクログリアと同様に、ｉＭＧＬは、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）、ＦＵＳ結合タンパク質（ＦＵＳ）、プロガヌリン（ＧＲＮ）、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）、ＬＲＲＫ２、およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を発現する。最近の文献は、ＡＬＳ（ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ）、ＦＴＤ（ＶＣＰ、ＧＲＮ、ＴＡＲＤＢＰ）、ＰＤ（ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ）、およびＤＬＢ（ＳＮＣＡ）の病因に関与するこれらの遺伝子の突然変異または機能喪失にミクログリアの機能障害が関連することを暗示し、これらの神経疾患におけるこれらの遺伝子の根底にあるメカニズムの試験におけるｉＭＧＬの有用性を示唆している。統計は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較事後検定を反映する。＊ｐ＜０．０５＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１８】ｉＰＳ由来のミクログリア細胞は、ヒト胎児ミクログリアのようにＡβを生着および貪食する。（Ａ〜Ｄ）ヒト胎児ミクログリア（ｈＣｙｔｏ）が免疫不全ＡＤマウスモデル、Ｒａｇ５×ｆＡＤに移植され、ベータアミロイド斑に応答する。胎児ミクログリアが斑の周囲に観察され（Ｃ）、Ａβを貪食する（Ｃ〜Ｄ）。（Ｅ〜Ｈ）胎児ミクログリアと同様に、ｉＭＧＬ（ｈＣｙｔｏ）がベータ−アミロイド斑の周囲にあり、ベータ−アミロイド斑を貪食する。スケールバー（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）＝２０μｍ、（Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｇ）５μｍ。
【図１９】図１Ｈからの（ｉ）Ｐ２ｒｙ１２を発現する細胞（左のバー）、（ｉｉ）ＴＲＥＭ２を発現する細胞（中央のバー）、ならびに（ｉｉｉ）Ｐ２ｒｙ１２、ＴＲＥＭ２、およびＤＡＰＩを発現する細胞（右のバー）のパーセンテージの評価。
【図２０】末梢マクロファージマーカーＴＲＥＭ１の発現は、ｉＭＧＬでは低い。ｉＭＧＬとマクロファージの両方が、骨髄性タンパク質Ｉｂａ−１を発現している（パネルの左の列）。しかしながら、ＴＲＥＭ１の発現（パネルの中央の列）はマクロファージで非常に濃縮されており、ＣＮＳ内のミクログリアに典型的な低いＴＲＥＭ１の発現に例示されるｉＭＧＬＳからマクロファージの個体発生を区別する。
【図２１】ｉＭＧＬは、インビトロで非常に運動性である。培養におけるｉＭＧＬ運動性のタイムラプス撮影位相コントラスト画像（２４時間を超える）は、ｉＭＧＬ（箱に囲まれる）が非常に運動性であり、突出によって環境を監視し、ｉＭＧＬが、例えば損傷またはストレスに応じて遊走する能力を示すことを明らかにする。
【図２２】ｉＭＧＬとｉＰＳＣ由来の星状細胞との共培養は、分岐したｉＭＧＬをもたらす。ＧＦＡＰの発現によって区別される星状細胞と共培養した場合（左パネル）、ｉＭＧＬ（Ｉｂａ−１、中央のパネル）は、２Ｄのインビトロ培養で突出を分岐および伸長し、ＣＮＳ環境に由来するキューがｉＭＧＬをさらに教育して、脳に見出されるミクログリアのインビボ表現型を採用させることができることをさらに示す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂ  ヒト造血始原細胞を使用したマウスの脳のヒト化。ｉＨＰＣは、ＣＮＳの常在マクロファージであるミクログリアに分化し、ＭＩＴＲＧマウスの内因性マウスミクログリアを打ち負かす可能性を示す。（Ａ）共焦点顕微鏡は、ヒト核特異的抗体により検出され（２３Ａの上部パネル）、骨髄マーカーであるＩｂａ−１（２３Ａの中央パネル）を発現するｉＨＰＣの生着が成功していることを明らかにする。（Ｂ）移植されたｉＨＰＣは、Ｐ２ｒｙ１２を発現するミクログリアに分化し（２３Ｂの右上のパネル）、ヒトＣＳＦ１を発現するＭＩＴＲＧのヒト化により、ヒト細胞は内因性マウス細胞を打ち負かす。
【図２４】Ｐ２ｒｙ１２のミクログリア特異的発現は、生着後ｉＨＰＣでわずか２週間後に検出される。ｉＨＰＣ移植の２週間後、移植を生き延び、ヒト核特異的抗体で標識された細胞（パネルの左の列）は、骨髄起源の細胞を示すＩｂａ−１（パネルの左中央の列）の発現を開始する。さらに、恒常性ミクログリアで高度に発現するミクログリア特異的遺伝子であるＰ２ｒｙ１２を検出できる（パネルの右中央の列；矢印）。
【図２５】移植された造血始原細胞は、マウス脳においてミクログリアに分化し、ＴＭＥＭ１１９を発現する。２か月後、マウスの脳に生着したＨＰＣは、成熟するミクログリアの高度に分岐した突起内で顕著に発現するミクログリアマーカー（Bennet et al., 2016）であるＴＭＥＭ１１９（パネルの左中央の列）を発現する。ＴＭＥＭ１１９抗体のヒト特異性は、ＴＭＥＭ１１９とヒト核に特異的な抗体（パネルの右中央の列）との共局在化により実証されるが、全ての核ではない（ＤＡＰＩ、パネルの左の列）。
【図２６】移植されたヒト細胞は恒常性ミクログリアマーカー、Ｐ２ｒｙ１２を発現する。ヒト特異的核マーカー（パネルの左中央の列）によって区別される生着ｉＭＧＬは、非特異的核染色ＤＡＰＩのみで染色される内因性マウス細胞核（パネルの左の列）と区別できる。生着されたｉＭＧＬは、インビボのミクログリアに典型的な伸長分岐突起を強調する恒常性ミクログリアマーカーＰ２ｒｙ１２（パネルの中央の列）を発現する。これは、一般的に使用されるミクログリアマーカーであるＩｂａ−１とは対照的に、ミクログリアにおいて細胞質性の細胞分布を示す（パネルの右中央の列）。
【図２７】ｉＭＧＬは、インビボでの星状細胞−ミクログリア間のクロストークの試験に利用できる。移植されたｉＭＧＬ（Ｉｂａ−１、左上のパネル）は、インビボで内因性マウス星状細胞と相互作用することが観察される（ＧＦＡＰ、左下のパネル）。最近の研究（Liddelow et al., 2017）は、ＣＮＳにおける免疫応答に影響を与える星状細胞−ミクログリア間のクロストークを暗示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ミクログリアはＣＮＳの先天性免疫細胞であり、シナプス可塑性、神経新生、恒常性機能、および免疫活性において重要な役割を果たす。ミクログリアはまた、ＡＤを含む神経障害において重要な役割を果たしており、健康と疾患の両方におけるそれらの機能の理解を改善する必要性を強調している。いまだに、ヒトのミクログリアの試験は、ヒトの胎児または成人のＣＮＳ組織から初代培養細胞を取得することがまれであり難しいため、困難である。したがって、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む、多能性幹細胞（ＰＳＣ）などからのヒトミクログリアの再生可能な供給源の開発が急務である。
【００３０】
ｉＰＳＣからミクログリアを生成する際の課題は、その独自の発生起源に起因する。明解な系統追跡試験は、ミクログリアが原始造血中に生成された卵黄嚢赤血球始原細胞（ＥＭＰ）に由来することを示している。ＥＭＰは、初期の原始マクロファージにさらに発達し、発達中の神経管に遊走し、ミクログリア始原細胞になる。その後、ミクログリア始原細胞は成熟し、その環境を監視し、ＣＮＳの発達を促進し、シナプス可塑性を調節し、ＣＮＳ損傷および病理に応答するために使用される分岐突起を発達させる。
【００３１】
患者由来のｉＰＳＣの生成により、遺伝的リスク因子と疾患の関係を検査する新たな機会が促進された。最近、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）は、遅発性ＡＤ（ＬＯＡＤ）を発症するリスクに関連するミクログリアによって発現されるいくつかの遺伝子を同定した。ミクログリアの機能とＡＤにおけるこれらの遺伝子の役割は、マウスモデルで検査し始めたばかりであるが、本明細書において記載されるようなヒトミクログリア様細胞の生成により、マウスではモデル化できないヒト特異的遺伝子を調べることが可能になる。
【００３２】
ＡＤでは、ベータアミロイド斑の周囲のミクログリアクラスターが、ベータアミロイドのクリアランスにおけるそれらの非効率性を強調している。ミクログリアはまた、疾患の病理を悪化させるサイトカイン／ケモカイン分泌を含む、ＡＤ病因の神経炎症性成分にも関与している。さらに、ＴＲＥＭ２およびＣＤ３３のようなＡＤ  ＧＷＡＳ遺伝子は、ＡＤの病理の影響を受け、ＡＤの進行に関与している可能性がある。ミクログリアは、脳の発達、神経の恒常性、および多くの神経障害の主要な調節因子でもある。したがって、ヒトのミクログリアおよびミクログリアの機能に対する病理と疾患関連遺伝子の両方の影響についての理解をさらに深めることが急務である。
【００３３】
本明細書に記載される実施形態のいくつかは、胎児および成人のミクログリアに類似するヒトｉＰＳＣミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）の効果的かつ堅牢な生成のための方法を提供する。これらの方法は、ＡＤのような神経疾患の調査に有用なｉＭＧＬを産生する。本明細書に記載される実施形態のいくつかでは、ミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）をｉＰＳＣから分化させて、アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経疾患における機能を試験する。
【００３４】
本明細書に記載されるｉＭＧＬは、インビボのミクログリアと同様にインビトロで発達する。トランスクリプトーム全体の分析は、それらが成人および胎児のヒトミクログリアに非常に類似していることを示す。これらのｉＭＧＬの機能評価は、それらが炎症性刺激に応答してサイトカインを分泌し、遊走し、カルシウム移行を起こし、成人／胎児ミクログリアと同様にＣＮＳ基質を堅牢に貪食することを明らかにする。
【００３５】
これらのｉＭＧＬを使用して、数ある使用の中でも、（ｉ）ＡＤ関連遺伝子発現に対する線維性Ａβおよび脳由来タウオリゴマーの効果を検査し、（ｉｉ）シナプス刈り込みに関与するメカニズムを同定する。さらに、ｉＭＧＬはミクログリア機能のハイスループット試験で使用でき、ヒトの神経疾患に対する重要な新しい洞察を提供する。
【００３６】
以下のセクションでは、ｉＭＧＬを産生する方法の様々な実施形態、およびｉＭＧＬの構造と機能の様々な実施形態を提供する。さらに、ｉＭＧＬの使用方法も提供される。また、方法の非限定的な詳細な説明も提供される。
ｉＭＧＬの作製方法：
【００３７】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）からヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）造血分化因子を補充した培地を使用してＰＳＣを分化させて誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）を産生する工程と、（ｉｉ）ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離する工程と、（ｉｉｉ）ミクログリア分化培地を使用してＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをヒトミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）に分化させる工程と、（ｉｖ）ｉＭＧＬを成熟させる工程とを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ生成技術は、前駆細胞が濃縮され、ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離することなく（ｉｉｉ）が実行される培地の収集を可能にする。
【００３８】
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）造血分化因子を補充した培地を使用してＰＳＣを分化させる工程と、（ｉｉ）ミクログリア分化培地を使用してＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させる工程とを含む。
【００３９】
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、第１の型の細胞からヒトｉＭＧＬを産生する方法であって、（ｉ）第１の型の細胞をｉＨＰＣに分化させる工程と、（ｉｉ）ｉＨＰＣを分化させてｉＭＧＬを産生する工程とを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、第１の型の細胞は、ＰＳＣでもＥＳＣでもない。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは胚様体に由来しない。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは単一細胞ＰＳＣを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは分化前にＣＤ４３＋ではない。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは分化前にＣＤ３４＋ではない。いくつかの実施形態では、ＰＳＣはＣＤ３１＋ではない。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは分化前にはＣＤ４５＋ではない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは胚性幹細胞（ＥＳＣ）であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは哺乳動物のＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ＰＳＣはヒトＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ＰＳＣはマウスＰＳＣである。
【００４２】
単一細胞ＰＳＣを分化させる
いくつかの実施形態では、ＰＳＣを分化させてｉＨＰＣを産生することは、５〜１５日の間のインキュベーション期間を含む。例えば、インキュベーション期間は、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または１５日である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は１０日である。いくつかの実施形態では、ＰＳＣが曝露される酸素のパーセンテージは、１０日の期間で変動する。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間中に、ｉＰＳＣは低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間の１〜１０日目に、ＰＳＣが低酸素または正常酸素環境においてインキュベートされる。いくつかの実施形態では、１０日の期間のうちの第１の部分で、ＰＳＣが３％〜７％の酸素環境に曝露される。いくつかの実施形態では、１０日の期間のうちの第１の部分が４日（１〜４日目）であり、酸素環境が５％である。いくつかの実施形態では、１０日の期間のうちの第２の部分で、ＰＳＣが１５％〜２５％の間の酸素環境に曝露される。いくつかの実施形態では、１０日の期間のうちの第２の部分が６日（５〜１０日目）であり、ＰＳＣが曝露される酸素環境が２０％である。いくつかの実施形態では、ＰＳＣを分化させてｉＨＰＣを産生することは、３〜２１日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は２８日までである。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は２８日を超える。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は３日未満である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣを分化させるために使用される造血分化因子は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６を含む。培地は、これらの因子のうちのいずれか１つ以上を任意の組み合わせで含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＰＳＣ分化工程のインキュベーション期間を通して異なる培地でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、１日目に、培地がＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、およびＬｉＣｌを含み、３日目および４日目に、培地がＦＧＦ２およびＶＥＧＦを含み、５〜１０日目に、培地がＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６を含む、１０日のインキュベーション期間が提供される。いくつかの実施形態は、因子ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６のうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む培地に関する。いくつかの実施形態は、因子ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、およびＬｉＣｌのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む培地に関する。いくつかの実施形態は、因子ＦＧＦ２およびＶＥＧＦのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む培地に関する。いくつかの実施形態は、因子ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３、およびＩＬ６のうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む培地に関する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、培地中の因子、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ６の各々の濃度が、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中の因子、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ６の各々の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌの間または４０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中の因子、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ６の各々の濃度が、５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、培地中のアクチビンＡの濃度が、９ｎｇ／ｍｌ〜１６ｎｇ／ｍｌの間または１１ｎｇ／ｍｌ〜１４ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のアクチビンＡの濃度が、１２．５ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、培地中のＬｉＣｌの濃度が、１ｎＭ〜３ｎＭの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＬｉＣｌの濃度が、１ｍＭ〜３ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＬｉＣＬの濃度が２ｍＭである。
【００４５】
ｉＨＰＣの単離
当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、ｉＨＰＣまたはＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離する。いくつかの実施形態では、ｉＨＰＣまたはＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離するために使用される方法はＦＡＣＳである。いくつかの実施形態では、単離工程は、ＣＤ４３＋マーカーを選択することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４３＋以外のマーカーを使用して、ＨＰＣを単離する。いくつかの実施形態では、単離工程は、ＣＤ３４＋細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、単離工程は、ＣＤ３１＋細胞またはＣＤ４５＋細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、単離工程は、ｉＨＰＣを同定することが知られている別のマーカーを選択することを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ｉＨＰＣを単離することによって、８０％を超える純度、例えば９０％を超える純度のｉＨＰＣが単離される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを単離することによって、８０％を超える純度、例えば９０％を超える純度のＣＤ４３＋  ｉＨＰＣが単離される。
【００４７】
ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させる
ミクログリア細胞を成熟させるための当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、ｉＭＧＬを成熟させることができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させることは、２０〜３０日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は２５日である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させるために使用される培地は、因子ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１のうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、因子ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１のうちの全てを含む。いくつかの実施形態では、培地中のＣＳＦ−１の濃度が、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＣＳＦ−１の濃度が、１５ｎｇ／ｍｌ〜３５ｎｇ／ｍｌの間または２０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＣＳＦ−１の濃度が２５ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、培地中のＩＬ−３４の濃度が、２５ｎｇ／ｍｌ〜１２５ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＩＬ−３４の濃度が、８０ｎｇ／ｍｌ〜１２０ｎｇ／ｍｌの間または９０ｎｇ／ｍｌ〜１１０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＩＬ−３４の濃度が１００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、培地中のＴＦＧβ−１の濃度が、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＴＦＧβ−１の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌの間または４０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＴＧＦβ−１の濃度が５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態は、因子ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１のうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む培地に関する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させるために使用される培地は、ＴＦＧβ−２を含む。いくつかの実施形態では、培地中のＴＦＧβ−２の濃度が、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＴＦＧβ−２の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌの間または４０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＴＧＦβ−２の濃度が５０ｎｇ／ｍｌである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させるために使用される培地は、ＴＦＧβ模倣物を含む。ＴＧＦβ模倣物の例には、ＩＤＥ−１およびＩＤＥ−２が含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＦＧβ模倣物は、１つ以上のオフターゲット効果を有し、および／またはＳＯＸシグナル伝達経路に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、培地中のＴＦＧβ模倣物の濃度が、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＴＦＧβ模倣物の濃度が、３０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌの間または４０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ模倣物は、ＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させるために使用される培地は、無血清培地である。
【００５３】
ｉＭＧＬの成熟
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬを成熟させることは、１〜５日の間のインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬを成熟させるためのインキュベーション期間は、３日である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、成熟させる工程は、ＣＤ２００とＣＸ３ＣＬ１のいずれかまたは両方を含む培地中でｉＭＧＬをインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００はヒト組換えＣＤ２００であり、ＣＸ３ＣＬ１はヒト組換えＣＸ３ＣＬ１である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、培地中のＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１の各々の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、培地中のＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１の各々の濃度が、８０ｎｇ／ｍｌ〜１２０ｎｇ／ｍｌの間または９０ｎｇ／ｍｌ〜１１０ｎｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１の各々の濃度が、１００ｎｇ／ｍｌである。
【００５６】
産生されたｉＭＧＬの特性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生されたｉＭＧＬは、７０％純度〜１００％純度の間のｉＭＧＬの純粋な集団をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生されたｉＭＧＬは、８０％純度〜１００％純度の間のｉＭＧＬの純粋な集団をもたらす。例えば、ｉＭＧＬの集団は、８０％純度、８１％純度、８２％純度、８３％純度、８４％純度、８５％純度、８６％純度、８７％純度、８８％純度、８９％純度、９０％純度、９１％純度、９２％純度、９３％純度、９４％純度、９５％純度、または９６％純度、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％であろう。いくつかの実施形態では、産生されるｉＭＧＬの集団は、９６％を超える。
【００５７】
ｉＭＧＬの純度の評価は、ミクログリア細胞の純度を決定する当該技術分野で公知の任意の方法を利用することにより達成される。いくつかの実施形態では、純度レベルは、因子Ｐ２ＲＹ１２およびＴＲＥＭ１２の発現および／または共局在化によって評価される。いくつかの実施形態では、純度レベルは、Ｔｒｅｍ２、Ｉｂａ１、および／またはＰｕ１の発現および／または共局在化によって評価される。
【００５８】
本明細書に記載される方法のいずれかによって産生されるｉＭＧＬは、典型的なミクログリア細胞が発現する任意の因子または因子の任意の組み合わせを発現するであろう。いくつかの実施形態では、産生されるｉＭＧＬは、ｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋である。いくつかの実施形態では、ｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋  ｉＭＧＬが、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ｑＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、またはプロテオミクスを使用して検出される。いくつかの実施形態では、他の細胞型が、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ｑＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、またはプロテオミクスを使用して検出される。いくつかの実施形態では、産生されるｉＭＧＬは、２つの別個のｉＭＧＬの集団：（１）ＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１−および（２）ＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１＋を含む。いくつかの実施形態では、産生されるｉＭＧＬは、ＣＤ４３＋、ＣＤ２３５ａ＋、またはＣＤ４１＋である。いくつかの実施形態では、産生されるｉＭＧＬは、ＣＤ４３＋／ＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４１＋である。
【００５９】
本明細書に記載されるｉＭＧＬを産生する方法のいずれかは、分化プロセスの初期にミクログリア系統への細胞の拘束性があるＣＤ４３＋  ｉＨＰＣの分化工程をもたらす。いくつかの実施形態では、ｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋であるｉＭＧＬは、ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣをｉＭＧＬに分化させるために使用されるインキュベーション期間の１４日目に検出される。ｉＭＧＬ系統への拘束性があるかどうかの判定は、ミクログリアの運命への拘束された細胞のマーカーであることが知られている任意の因子の発現を試験することによって行われる。いくつかの実施形態では、細胞がｉＭＧＬ系統に拘束されているかどうかは、転写因子ＰＵ．１および／またはミクログリア濃縮タンパク質Ｔｒｅｍ２の発現を評価することにより判定される。いくつかの実施形態では、細胞マーカーが、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ｑＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、またはプロテオミクスを使用して検出される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、誘導ＰＳＣからｉＭＧＬを産生する方法であって、（ｉ）ＰＳＣを誘導造血始原細胞（ｉＨＰＣ）に分化させる工程と、（ｉｉ）ｉＨＰＣを分化させてｉＭＧＬを産生する工程とを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、工程（ｉｉ）から産生されたｉＭＧＬを成熟させる工程（ｉｉｉ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ヒトまたはマウスなどからの哺乳動物のＰＳＣである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＴＲＩＭ１４、ＣＡＢＬＥＳ１、ＭＭＰ２、ＳＩＧＬＥＣ  １１および１２、ＭＩＴＦ、および／またはＳＬＣ２Ａ５のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現が、産生されたｉＭＧＬにおいて濃縮されている。いくつかの実施形態では、ＣＯＭＴ、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、および／またはＦＦＡＲ２のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現が、産生されたｉＭＧＬにおいて濃縮されている。
【００６２】
ｉＭＧＬの組成物
ｉＭＧＬの遺伝子発現
いくつかの実施形態では、特定の遺伝子プロファイルを発現するｉＭＧＬが提供される。本明細書に記載されるｉＭＧＬのいずれかは、ミクログリア細胞に類似した遺伝子発現プロファイルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＭＧＬの組成物のいずれかは、以下の遺伝子：ＲＵＮＸ１、ＰＵ．１、ＣＳＦ１ＦＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＲＳＧ１０、ＧＡＳ６、ＰＲＯＳ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＧＰＲ３４、Ｃ１Ｑ、ＣＲ３、ＣＡＢＬＥＳ１、ＢＨＬＨＥ４１、ＴＲＥＭ２、ＩＴＡＭ、ＡＰＯＥ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＰＰＡＲＤ、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＧＲＮ、ＬＲＲＫ２、ＴＡＲＤＢＰ、およびＣＲＹＢＢ１のうちのいずれかの発現を含む。本明細書に開示されるｉＭＧＬのいずれかは、これらの遺伝子のいずれかの発現を任意の組み合わせで含む。
【００６３】
ＲＵＮＸ１、ＳＰＩ１、ＣＳＦ１ＦＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＲＳＧ１０、ＧＡＳ６、ＭＥＲＴＫ、ＰＳＥＮ２、ＰＲＯＳ１、Ｐ２ＲＹ１２、Ｐ２ＲＹ１３、ＧＰＲ３４、Ｃ１Ｑ、ＣＲ３、ＣＡＢＬＥＳ１、ＢＨＬＨＥ４１、ＴＲＥＭ２、ＴＹＲＯＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＡＰＯＥ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＰＰＡＲＤ、ＴＭＥＭ１１９、ＧＰＲ５６、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＧＲＮ、ＬＲＲＫ２、ＴＡＲＤＢＰ、およびＣＲＹＢＢ１。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＭＧＬの組成物のいずれにおいても、ＴＲＥＭ２とＰ２ＲＹ１２は共発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＭＧＬの組成物のいずれも、遺伝子ＫＬＦ２、ＴＲＥＭ１、ＭＰＴ、ＩＴＧＡＬ、およびＡＤＧＲＥ５のうちのいずれか１つ以上を発現しない。
【００６５】
ｉＭＧＬの機能特性とｉＭＧＬの使用方法
ケモカイン分泌
本明細書に記載されるｉＭＧＬはいずれも、ミクログリア細胞内のケモカインを刺激することが当該技術分野において公知の任意の刺激に応答して、ミクログリア細胞と同様のケモカインプロファイルを分泌するであろう。いくつかの実施形態では、分泌されるケモカインは、ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、およびＣＸＣＬ１０のうちのいずれか１つ以上の任意の組み合わせであり、リポ多糖、ＩＦＮγ、またはＩＬ−１βによる刺激に応答して分泌される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬからのケモカイン分泌を刺激する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ミクログリア細胞におけるサイトカイン分泌を刺激するために当該技術分野において公知の任意の因子によってｉＭＧＬを処理することと、（ｉｉ）ミクログリア細胞からケモカインを分泌することとを含む。いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬを処理するために使用される因子は、リポ多糖、ＩＮＦγ、またはＩＬ−１βである。分泌されるケモカインは、ミクログリア細胞によって分泌されることが知られている任意のケモカインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、分泌されるケモカインは、ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、およびＣＸＣＬ１０のうちの任意の１つ以上を含む。
【００６７】
遊走とカルシウム移行
本明細書に記載されるｉＭＧＬのいずれかは、ＡＤＰ処理に応答して遊走し、および／またはＡＤＰ処理がカルシウム移行を誘発する。いくつかの実施形態では、Ｐ２ｒｙ１２の阻害は、ＡＤＰ媒介性のｉＭＧＬの遊走および／またはＡＤＰ媒介性のカルシウム移行を無効にする。いくつかの実施形態では、Ｐ２ｒｙ１２の阻害は、阻害剤ＰＳＢ０７３９を介して起こる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬを遊走させる方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＡＤＰによってｉＭＧＬを処理することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬを遊走させることとを含む。いくつかの実施形態では、カルシウム移行を生じさせる方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＡＤＰによってｉＭＧＬを処理することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬにおいてカルシウム移行を生じさせることとを含む。
【００６９】
ｉＭＧＬによる貪食
本明細書に記載されるｉＭＧＬのいずれかは、貪食が可能である。本明細書に記載されるｉＭＧＬのいずれかは、ミクログリアが貪食することができる当該技術分野において公知の任意の因子を貪食することができる。いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬが貪食する因子には、Ａβ、蛍光標識Ａβ、タウ、およびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか１つ以上が含まれる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬ貪食の方法が提供される。この方法は、（ｉ）ｉＭＧＬを化合物：Ａβ、蛍光標識Ａβ、タウ、およびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか１つ以上に曝露することと、（ｉｉ）化合物を貪食することとを含む。
【００７１】
本明細書で提供されるｉＭＧＬのいずれかは、ヒトシナプトソーム（ｈＳ）を貪食することができる。いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬがｈＳを貪食する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ｉＭＧＬをｈＳに曝露することと、（ｉｉ）ｈＳを貪食することと、を含む。いくつかの実施形態では、ｈＳは蛍光標識されている。
【００７２】
アルツハイマー病の試験におけるｉＭＧＬの有用性
本明細書に記載されるｉＭＧＬのいずれかは、異なる刺激に応答して遺伝子発現を制御することができる。いくつかの実施形態では、刺激は、ニューロン、例えばラット海馬ニューロンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｉＭＧＬのいずれかは、遺伝子：ＣＡＢＬＥＳ、ＴＲＩＭ４、ＭＩＴＦ、ＭＭＰ２、およびＳＬＣＡ２５のうちのいずれか１つ以上を差次的に制御することができる。いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬは、遺伝子：ＴＹＲＯＰＢ、ＣＤ３３、およびＰＩＣＡＬＭのうちのいずれか１つ以上を上方制御する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬにおける遺伝子発現を制御する方法が提供される。この方法のうちの１つは、（ｉ）ｉＭＧＬをニューロンと共培養することと、（ｉｉ）ｉＭＧＬにおいて遺伝子を差次的に制御することとを含む。ｉＭＧＬと共培養されるニューロンは、あらゆる種の任意のニューロンを含む。いくつかの実施形態では、ニューロンはラット海馬ニューロンである。
【００７４】
別の方法は、（ｉ）ｉＭＧＬを、化合物：Ａβ、蛍光標識Ａβ、タウ、およびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーのうちのいずれか１つ以上に曝露することと、（ｉｉ）差次的に遺伝子を制御することとを含む。差次的に制御される遺伝子は、Ａβ、蛍光標識Ａβ、タウ、およびｐＨｒｏｄｏ標識脳由来タウオリゴマーに応答してミクログリアにおいて差次的に制御される遺伝子の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、差次的に制御される遺伝子は、ＣＤ３３、ＴＹＲＯＰＢ、およびＰＩＣＡＬＭのうちのいずれか１つ以上を任意の組み合わせで含む上方制御された遺伝子である。
【００７５】
ｉＭＧＬの使用方法
いくつかの実施形態では、ニューロンのキューに応答してｉＭＧＬにおいて遺伝子発現を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、この方法は、（ｉ）ｉＭＧＬを、任意の組み合わせの、因子ＣＸ３ＣＬ１、ＣＤ２００、およびＴＧＦβのうちの１つ以上に曝露することと、（ｉｉ）任意の組み合わせの、差次的に制御される遺伝子：Ｐ２ｒｙ１２、ＥＧＲ１、ＴＧＦβ１、ＥＴＶ５、ＣＸ３ＣＲ１、ＡＰＯＥ、ＢＩＮ１、ＣＤ３３、ＧＰＲ８４、ＣＯＭＴ、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＨＴＴ、ＧＲＮ、ＦＵＳ、ＴＡＲＤＰ、ＶＣＰ、ＳＮＣＡ、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＬＲＲＫ２、およびＳＯＤ１のうちの１つ以上を評価することとを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、皮質へのｉＭＧＬの生着を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、この方法は、（ｉ）ｉＭＧＬを皮質に移植することと、（ｉｉ）皮質へのｉＭＧＬの生着を評価することとを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の少なくとも２週間後に、例えば、工程（ｉ）の少なくとも３週間後に、工程（ｉ）の少なくとも４週間後に、工程（ｉ）の少なくとも５週間後に、工程（ｉ）の少なくとも６週間後に、工程（ｉ）の少なくとも７週間後に、工程（ｉ）の少なくとも８週間後に、工程（ｉ）の少なくとも９週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１０週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１１週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１２週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１３週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１４週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１５週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１６週間後に、（ｉ）の少なくとも１７週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１８週間後に、工程（ｉ）の少なくとも１９週間後に、または工程（ｉ）の少なくとも２０週間後に、起こる。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は工程（ｉ）の２か月後に起こる。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉＭＧＬをマウスの皮質に移植することをさらに含む。いくつかの実施形態では、マウスは、ＭＩＴＲＧマウスである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＡＤニューロパシーとｉＭＧＬの相互作用を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）ｉＭＧＬを海馬に移植することと、（ｉｉ）海馬におけるｉＭＧＬの相互作用を評価することとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、斑へのｉＭＧＬの遊走を評価することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、線維性ＡβのｉＭＧＬによる貪食を評価することを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、３Ｄ神経環境でヒトミクログリアを試験する方法であって、ｉＭＧＬを哺乳動物の脳に移植することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、哺乳動物の脳はマウスの脳である。いくつかの実施形態では、ｉＭＧＬはマウスの脳の海馬に移植される。いくつかの実施形態では、マウスは野生型マウスである。いくつかの実施形態では、マウスはＡＤマウス系統である。
【実施例】
【００７９】
上述の実施形態のいくつかの態様は、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の実施例においてさらに詳細に開示される。
【実施例１】
【００８０】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からのヒトミクログリア様（ｉＭＧＬ）細胞の産生
わずか５週間でｉＰＳＣからミクログリア様細胞（ｉＭＧＬ）を首尾よく生成するために、２段階の完全に定義されたプロトコールが開発された（図１Ａ）。このおよび他の実施例の方法およびプロトコールを同様の方法で使用して、ＥＳＣを含む他のＰＳＣからｉＭＧＬを生成することができる。このアプローチを利用して、１０を超える独立したｉＰＳＣ株からｉＭＧＬを首尾よく生成した。第１に、ｉＰＳＣは、造血始原細胞（ｉＨＰＣ）に分化し、ｉＨＰＣが発達中にミクログリアを生じる卵黄嚢に由来する初期原始造血細胞を表すため、これはミクログリアの個体発生を再現する。このプロトコール（図１Ｂｉ）は、１０日後に、ＣＤ４３＋／ＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４１＋である原始ｉＨＰＣをもたらした。ＣＤ４３＋細胞のＦＡＣＳ選別は、このアプローチが、９０％を超える純度で、ｉＨＰＣを産生したことを明らかにした（図１Ｂｉｉ）。
【００８１】
第２に、ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣは、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４、およびＴＧＦβ１を含む無血清分化培地（実験室で配合）で増殖した。１４日目までに、細胞は、骨髄関連転写因子ＰＵ．１およびミクログリアで濃縮されるタンパク質ＴＲＥＭ２（図１Ａ  ｉｉｉ）を発現し、ミクログリアの運命への初期の拘束性を実証した。このプロトコールでは大量のｉＭＧＬをもたらしたため、それらの発達に続いて、フローサイトメトリーにより４日ごとにｉＭＧＬのインビトロでの特性評価をした。１４日目の初期ｉＭＧＬは、ｃ−ｋｉｔ−／ＣＤ４５＋であり（図１Ｃ）、骨髄系統への拘束性が示唆された。さらに、細胞は、ＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１−（Ａ１）およびＣＤ４５＋／ＣＸ３ＣＲ１＋（Ａ２）の集団にさらに細分化された。ＣＤ４５の発現は、発達しているｉＭＧＬにおいて一貫してモニターされ、単球由来マクロファージ（ＭＤ−Ｍφ）と比較された。ＣＤ４５の発現は成熟とともに増加したが、レベルはマクロファージのレベルに達することはなく（図１Ｄ）、マウスの発達と一致した。ｉＭＧＬの小集団（約１０％）もまた１４日目までに中間のＣＤ１１ｂレベルを発現し、これも細胞の成熟に伴い増加したが、同様にマクロファージのレベルに達することはなかった（図１Ｅおよび１Ｆ）。
【００８２】
３８日目までに、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１２およびＴＲＥＭ２の共局在化および定量化（＞９６％）によって評価されるように、ｉＭＧＬは高純度を示した（図１Ｈ）。１００万個のｉＰＳＣが、このプロトコールによって３，０００万〜４，０００万個のｉＭＧＬを産生し、このアプローチがハイコンテントスクリーニングのために容易にスケールアップできることを示唆している。得られるｉＭＧＬは、サイトスピン／ギムザ染色（図１Ｇ）およびタンパク質発現（図１Ｉ）によると、ヒトミクログリアに類似するが、単球またはマクロファージには類似しない。インビボでのマウスのミクログリアの発達と同様に、インビトロで発達したｉＭＧＬは、ＰＵ．１、ＴＲＥＭ２、およびＣＤ１１ｂｉｎｔ／ＣＤ４５ｌｏｗを発現し、胎児ミクログリアに類似する。ｉＭＧＬがインビトロで成熟するにつれて、インビボのミクログリアと同様に、より分岐した（図１Ａ  ｉｖ）。
【実施例２】
【００８３】
ｉＭＧＬのトランスクリプトーム分析
ｉＭＧＬのトランスクリプトームは、ヒト初代培養胎児ミクログリア（胎児ＭＧ）および成人ミクログリア（成人ＭＧ）と比較してプロファイリングされた。ＣＤ１４＋／ＣＤ１６−単球（ＣＤ１４  Ｍ）、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋炎症性単球（ＣＤ１６  Ｍ）、骨髄樹状細胞（血液ＤＣ）、ｉＨＰＣ、およびｉＰＳＣもまた、幹細胞および他の骨髄分子シグネチャと比較するために検査された。相関分析および主成分分析（ＰＣＡ）により、ｉＭＧＬの胎児ＭＧおよび成人ＭＧとの顕著な類似性が明らかになった（胎児ＭＧおよび成人ＭＧは、図２Ａの同一の円で囲まれたクラスター内に位置する；図９Ａも参照されたい）。さらに、第１の主成分ＰＣ１（２１．３％分散、図２Ａ矢印）は、ｉＰＳＣからｉＨＰＣを介してｉＭＧＬ細胞への分化の時系列を定義し、ＰＣ２とＰＣ３はそれぞれ樹状突起と単球の軌跡を定義した。
【００８４】
３００個のミクログリア、マクロファージ、およびこれまでの研究から適応した他の免疫関連遺伝子を使用したバイクラスタリング分析により、群間の類似性が同定され、一般的な遺伝子クラスターが強調された。この分析は、ｉＭＧＬがミクログリアとクラスター化するが、他の骨髄細胞、ｉＨＰＣ、およびｉＰＳＣとは異なることを再び示した（図２Ｂ）。重要なことに、ｉＭＧＬ、胎児ＭＧ、および成人ＭＧは、Ｐ２ＲＹ１２、ＧＰＲ３４、Ｃ１Ｑ、ＣＡＢＬＥＳ１、ＢＨＬＨＥ４１、ＴＲＥＭ２、ＩＴＡＭ  ＰＲＯＳ１、ＡＰＯＥ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＰＰＡＲＤ、およびＣＲＹＢＢ１などの標準的なミクログリア遺伝子を発現していた（図２Ｃ；表１）。単球と比較するとき、ｉＭＧＬは骨髄性遺伝子ＲＵＮＸ１、ＰＵ．１、およびＣＳＦ１Ｒを発現していたが（図８Ａ）、単球特異的転写因子ＩＲＦ１、ＫＬＦ４、ＮＲ４Ａ１を発現していなかった（図８Ｂ）。ｉＭＧＬ、ＣＤ１４  Ｍ、およびＣＤ１６  Ｍの差次的分析（図８Ｄおよび８Ｅ）は、ｉＭＧＬがＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＲＧＳ１０、およびＧＡＳ６を含むミクログリア遺伝子（２倍より大きい変化かつｐ＜０．００１）を主に発現していたが、単球およびマクロファージ遺伝子ＫＬＦ２、ＴＲＥＭ１、ＭＰＯ、ＩＴＧＡＬ、およびＡＤＧＲＥ５を発現していなかったことをさらに強調した。タンパク質レベルでは、初代培養ミクログリアのように、ｉＭＧＬはＣＤ４５ｈｉ  ＭＤ−Ｍφと比較してＣＤ４５ｌｏであり、ミクログリア表面タンパク質ＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦＢＲ１、およびＰＲＯＳ１を発現していた（図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃ）。表２は、胎児ＭＧおよびｉＭＧＬと比較して、成人ＭＧにおいて濃縮された上位ＧＯ経路を示している。表３は、成人ＭＧおよびｉＭＧＬと比較して、胎児ＭＧにおいて濃縮されたＧＯ経路を示している。表４は、胎児ＭＧおよび成人ＭＧと比較して、ｉＭＧＬにおいて濃縮されたＧＯ経路を示している。集合的に、偏りのない全トランスクリプトーム分析により、ｉＭＧＬが、ヒトの健康と疾患におけるミクログリアの生理学と機能を試験するために使用できる主要なヒトミクログリアに非常に類似した細胞モデルとして強力に確立された。
【００８５】
【表１】
2020513794.tif 000003
【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】
【表４】
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【実施例３】
【００８９】
ｉＭＧＬの機能分析
ｉＭＧＬは、機能的アッセイと生理学的アッセイの両方を使用して、ミクログリアの代替物として検証された。リポ多糖（ＬＰＳ）により刺激された、ならびにＩＬ−１βおよびＩＦＮγにより刺激された（ＡＤ患者およびマウスモデルで上昇する２つのサイトカイン）ｉＭＧＬによるサイトカイン／ケモカイン分泌を測定した。結果は、ｉＭＧＬが、１０個の検査されたサイトカインを低いが検出可能なレベルで分泌したことを示している（表５）。しかしながら、ＩＦＮγまたはＩＬ−１βに応答して、ｉＭＧＬはＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、およびＣＸＣＬ１０を含む８個の異なるケモカインを分泌した。予想されたとおり、ｉＭＧＬはＣＣＬ３を除く全ての測定されたサイトカインの誘導によって、ＬＰＳに堅牢に応答した（値については表５を参照されたい）。まとめると、このデータは、ｉＭＧＬが細胞表面受容体刺激に基づいてサイトカイン／ケモカインを差次的に放出することを示しており、これは、急性に単離された初代培養ミクログリアで観察される応答（Rustenhoven et al., 2016）に密接に一致する発見である。
【００９０】
ｉＭＧＬは、変性ニューロンから漏出した細胞外ヌクレオチドを感知することができ、ミクログリアの恒常性機能に重要であることが示されているミクログリアにおいて濃縮されたプリン受容体Ｐ２ｒｙ１２を発現するため（図１Ｈおよび２Ｃ）、ＡＤＰ−Ｐ２ｒｙ１２媒介性の走化性およびカルシウム移行が評価された。ＡＤＰに応答してｉＭＧＬが堅牢に遊走し、ＡＤＰがカルシウム移行を誘発することが判定され（図３Ｄおよび３Ｅ）、これは、Ｐ２ｒｙ１２特異的阻害剤ＰＳＢ０７３９によって無効にすることができる。これらの生理学的発見は、ｉＭＧＬが機能的表面受容体を発現し、ミクログリアの生理学の定量分析を可能にすることをさらに明確にする。
【００９１】
ミクログリアは星状細胞とともに、シナプス刈り込みにも重要な役割を果たす。インビトロシナプトソーム貪食アッセイは刈り込みを試験するための確立された代替物であるため、ｉＭＧＬのヒトシナプトソーム（ｈＳ）を貪食する能力を定量的に評価した。ＭＤ−Ｍφと比較して、ｐＨｒｏｄｏ標識ｈＳのｉＭＧＬによる貪食はそれほど堅牢ではなかった（図３Ｆ  ３Ｇ）。しかしながら、ｉＭＧＬはイー・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）粒子と比較してｈＳを優先的に内部移行し、ＭＤ−Ｍφ（図１０Ｄおよび１０Ｅ）に対して標準化すると、ｉＭＧＬおよびミクログリアはＭＤ−Ｍφよりも恒常性機能に偏っているという概念を支持する。
【００９２】
ミクログリア（およびｉＭＧＬ）はＣ１ｑとＣＲ３（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８二量体）の両方を発現するため、ｉＭＧＬを使用して、ヒトミクログリアにおけるシナプス刈り込みが主にこの経路に関与するかどうかを評価した。無添加のＣＤ１１ｂ抗体を使用すると、ｈＳのｉＭＧＬによる貪食が有意に低下した（−４０．０％、＊＊＊ｐ＜０．０００１）（図３Ｈおよび３Ｉ）。対照的に、シナプス刈り込みにも関与しているＭＥＲＴＫの阻害剤（ＵＮＣ５６９）は、ｉＭＧＬによるｈＳ貪食をわずかに減少させたのみであった（−１２．６％、＊ｐ＜０．０５）（図３Ｈおよび３Ｉ）。マウスＫＯ試験の試験と同様に、そのデータはＭＥＲＴＫがヒトのミクログリア媒介性シナプス刈り込みに小さな役割を果たしていることを示し、Ｃ１ｑ／ＣＲ３がヒトのミクログリア媒介性シナプス刈り込みに不可欠であることを実証している。
【００９３】
【表５】
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【実施例４】
【００９４】
ｉＭＧＬを使用してアルツハイマー病を試験することの有用性を検証する
これまでの報告では、ベータ−アミロイド（Ａβ）のミクログリアクリアランスの障害がＡＤの病態生理に関与していることが示されている。したがって、ｉＭＧＬを検査して、２つの特徴的なＡＤ病理であるＡβまたはタウを貪食できるかどうかを判定した。初代培養ミクログリアと同様に、ｉＭＧＬは蛍光標識された線維性Ａβを内部移行した（図４Ｂ、下）。ｉＭＧＬはまた、ｐＨｒｏｄｏ標識された脳由来タウオリゴマー（ＢＤＴＯ）を認識し、内部移行した（図４Ｂ、上）。放射された蛍光は、酸性リソソーム区画へのｐＨｒｏｄｏコンジュゲートＢＤＴＯの輸送を示し、ｉＭＧＬが神経細胞死中に放出される可能性のある細胞外タウを積極的に摂取できることを示した。これらのデータは、ミクログリアがＡＤおよび他のタウオパシーのタウ伝播に役割を果たす可能性があるという最近の発見を支持する。まとめると、これらの発見は、Ａβ分解を強化するか、またはエキソソーム媒介性タウ放出を遮断するハイスループット薬物スクリーニングアッセイで化合物を同定するためにｉＭＧＬを利用できることを示唆している。
【００９５】
ミクログリア遺伝子は遅発性ＡＤに関与しているが、疾患のリスクをどのように修正するかはほとんどわかっていない。したがって、ｉＭＧＬを調査して、これらの遺伝子がミクログリアの機能とＡＤリスクにどのように影響し得るかを判定した。これらの２５個のＡＤ−ＧＷＡＳ遺伝子のみを使用した階層的クラスタリングは、ｉＭＧＬがミクログリアに類似し、末梢骨髄細胞に類似しないことを実証した（図４Ａ）。調査した基底状態では、ｉＭＧＬとミクログリアは、マウスのオーソログを持たないもの、すなわちＣＤ３３、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＣＲ１を含む多くのＡＤ−ＧＷＡＳ関連遺伝子を発現していた。したがって、ｉＭＧＬを使用して、トランスジェニックマウスでは再現できない方法において、これらの遺伝子の発現の変化がミクログリアの表現型にどのように影響するかを試験することができる。次に、ｆＡβまたはＢＤＴＯ処理を調査して、ミクログリアにおけるＡＤ−ＧＷＡＳ遺伝子発現にどのように影響するかを判定した。ｆＡβ曝露後、ｉＭＧＬは、ＡＢＣＡ７（５．７９±０．４４）、ＣＤ３３（６．０２±０．４１）、ＴＲＥＭ２（４．８６±０．５０）、およびＡＰＯＥ（２．５２±０．１９）、Ａβクリアランス／分解に関与する遺伝子を含む１０個の遺伝子（表６）の発現を増加させた。ＢＤＴＯは、これまでにタウ媒介性毒性に関与していたＣＤ２ＡＰ（４．６２±０．４５）を含む４個の遺伝子の発現を増加させた。さらに、ＢＤＴＯと比較して、ｆＡβにおいて６個の遺伝子が差次的に上昇した（表６）。さらに、ベースライン時に他の骨髄細胞でより濃縮されていた遺伝子であるＣＤ３３、ＴＹＲＯＢＰ、およびＰＩＣＡＬＭは、ｆＡβおよびＢＤＴＯによって上方制御され、タンパク質症がミクログリアの表現型を変化させて浸潤性末梢骨髄細胞に類似するようにしている可能性を示唆する（Stalder et al., 2005、Prinz et al., 2011、Chan et al., 2007）。ＡＤ−ＧＷＡＳ遺伝子に加えて、ｉＭＧＬはＣ９ｏｒｆ７２、ＧＲＮ、ＬＲＲＫ２、およびＴＡＲＤＢＰを発現し、ミクログリアが病因において顕著な役割を果たすＡＬＳ、ＦＴＤ、およびＤＬＢなどの他の神経疾患の試験に使用することができる（図１１）。
【００９６】
【表６】
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【実施例５】
【００９７】
神経環境におけるｉＭＧＬの相互作用と機能
脳では、ニューロンとグリアがミクログリアと相互作用し、機能と遺伝子発現に影響する。したがって、ｉＭＧＬをラット海馬ニューロン（２１  ｄｉｖ）とともに培養して、ｉＭＧＬがニューロンのキューにどのように応答するかを評価した（図５Ａ）。ラット海馬ニューロンは、培養においてシナプスを容易に形成し、限られた変動で生成できるために使用された。その後、ｉＭＧＬは、ヒト特異的ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂ抗体によるＦＡＣｓによってニューロンから分離され、トランスクリプトームレベルでプロファイリングされた（図５Ｂ）。差次的遺伝子発現分析により、ニューロンの共培養が１５６個のｉＭＧＬ遺伝子を上方制御し、２４４個のｉＭＧＬ遺伝子を下方制御したことが明らかになった（図５Ｃおよび５Ｄ）。ＦＦＡＲ２とＣＯＬ２６Ａ１は、定義された因子のみで培養されたｉＭＧＬで差次的に発現する２個の遺伝子であり、発生的にプライムされたミクログリアプロファイルを示す。対照的に、ニューロンとのミクログリアの共培養は、ニューロンのグリコカリックスと相互作用するヒト特異的シアル酸結合タンパク質であるＳｉｇｌｅｃ１１および１２の発現を増加させた。さらに、ミクログリア遺伝子ＣＡＢＬＥＳ１、ＴＲＩＭ１４、ＭＩＴＦ、ＭＭＰ２、およびＳＬＣＡ２５の発現増加は、ミクログリアの成熟におけるニューロン表面のキューと可溶性因子の両方に関与している（図５Ｅおよび１２）。
【００９８】
ミクログリアの基本的な特性は、高度に分岐した突起によるＣＮＳ環境の監視である。ＣＮＳ環境においてｉＭＧＬがどのように相互作用し得るかを調査するために、ｉＭＧＬをヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）３Ｄ脳オルガノイド（ＢＯＲＧ）と培養した。ＢＯＲＧには、皮質様ネットワークに自己組織化するニューロンおよび星状細胞が含まれるが、ミクログリアを欠く（図６、パネルＢ）。ミクログリアが発達中の神経管に入る方法と同様に、ｉＭＧＬがＢＯＲＧに侵入するかどうかを試験するために、ｉＭＧＬがＢＯＲＧ培養に追加された。３日目までに、ｉＭＧＬはＢＯＲＧＳに埋め込まれ、培地内でもはや検出できなくなり、ニューロンのキューに対する急速なｉＭＧＬの走化性を示唆した（図６、パネルＡ）。また、ｉＭＧＬは、３Ｄオルガノイド環境において様々な程度の分岐突起をタイリングおよび伸長した（図６、パネルＢ）。ｉＭＧＬ突出は、大多数の細胞で観察され、インビボのミクログリアと同様の形態を示した（図６、パネルＢ）。一部のｉＭＧＬのＩＭＡＲＩＳ  ３Ｄ画像再構成は、ＢＯＲＧにおいて分岐したｉＭＧＬの発達を強調している。ｉＭＧＬが神経損傷に応答するかどうかを判定するために、ＢＯＲＧに２５ゲージの針を突き刺した（白い長い矢印、図６、パネルＣ）。損傷後、ｉＭＧＬは損傷部位の近くおよびＢＯＲＧの縁部にクラスター化し（図６、パネルＣ）、よりアメーバ様の形態を採用し、損傷または疾患の脳に見出される「活性化」ミクログリアに類似する（図６、パネルＣ）。まとめると、これらのデータは、ｉＭＧＬが３Ｄ脳環境内に組み込まれ、成熟し、分岐し、脳ミクログリアと同様に、損傷に応答できることを示している。
【実施例６】
【００９９】
脳内のニューロン、星状細胞、および内皮細胞とのｉＭＧＬの相互作用
脳内のニューロン、星状細胞、および内皮細胞は、ミクログリアと相互作用して、遺伝子発現および機能に影響を与える。分化プロトコールは、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＤ２００、ＴＧＦβを含むこれらの他の細胞型に由来するシグナルを含めることにより、脳に存在するＣＮＳキューを再現しようとした。全トランスクリプトームＲＮＡ−ｓｅｑ分析により、インビトロにおいてミクログリアを確立するためのこれらの因子の重要性が確認された（図１６Ａ〜Ｅおよび１７Ａ〜Ｅ）。グリア由来のサイトカインであるＴＧＦβは、マウスのミクログリアのインビボにおける発達およびミクログリア特異的なトランスクリプトームシグネチャの維持に必要である。差次的遺伝子発現分析により、ヒトミクログリアのトランスクリプトームシグネチャの維持におけるＴＧＦβの役割が確認され、ＴＧＦβによってｉＭＧＬにおいて、１２６２個の遺伝子が差次的に発現したが、ＴＧＦβを除去した後（２４時間）、ｉＭＧＬにおいて１５１７個の遺伝子が差次的に発現した。差次的に発現される遺伝子の多くは、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＧＦβＲ１、およびＣＤ３３、転写因子ＥＧＲ１およびＥＴＶ５、およびＡＰＯＥを含むコアミクログリアシグネチャ標的として同定されている（図１６Ａ〜Ｃ）。遺伝子オントロジーの検査により、ＴＧＦβ依存性のＡＤ、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患経路が強調された（図１６Ｄ）。さらに、ＴＧＦβの除去により、ＴＲＥＭ２、ＡＰＯＥ、ＡＢＣＡ７、ＳＰＩ１（ＣＥＬＦ１遺伝子座）、ＰＩＬＲＡ（ＺＣＷＰＷ１遺伝子座）、ならびにＨＬＡ−ＤＲおよびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターを含むＡＤ  ＧＷＡＳ遺伝子座遺伝子（Karch et al.、2016）としても同定される多くのヒトミクログリア恒常性標的に顕著な変化がもたらされ、多くの同定されたＡＤ  ＧＷＡＳ遺伝子がミクログリアの恒常性の維持に機能することを示唆し（図１６Ｅ）、ＡＤ  ＧＷＡＳ遺伝子機能を調べるためのｉＭＧＬの有用性を明確にしている。
【実施例７】
【０１００】
ｉＭＧＬ表現型に対するＣＸ３ＣＬ１およびＣＤ２００の効果
ＣＸ３ＣＬ１とＣＤ２００は、内因性ミクログリア表現型に向けてｉＭＧＬをさらに教育できる、ニューロンおよび内皮由来のキューである。ＣＸ３ＣＬ１とＣＤ２００を試験して、これらの因子の包含または除外がｉＭＧＬ表現型をどのように調節するかを判定した。ｉＭＧＬへのＣＤ２００とＣＸ３ＣＬ１の添加により、ＣＯＭＴ（図１６Ｂ）、Ｓｉｇｌｅｃ−１０に結合し、ミクログリアセンソームの一部としてＤＡＰ１２と相互作用する細胞表面受容体であるＣＤ５２、ＡＤに関与するＭＨＣ  ＩＩ複合体の一員である、ＨＬＡＤＲＢ５などの選択された遺伝子の発現を増加させたが、コアミクログリア遺伝子（例えば、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＹＲＯＢＰ、ＯＬＦＭＬ３）およびＡＤリスク遺伝子の同様の発現レベルを維持した（図１７Ａ）。結果は、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１が、ｆＡβなどのＣＮＳ刺激に対するｉＭＧＬの応答を調節することを示した。ＣＤ２００とＣＸ３ＣＬ１の非存在下で、ｆＡβは、ミスフォールディングしたフォールディングしたタンパク質、表面受容体、またはＣＬＵ（ＡＰＯＪ）などの抗アポトーシス事象との相互作用に関与するＡＤ−ＧＷＡＳ遺伝子の発現を刺激した。これらの２つの因子に曝露された細胞は、ｆＡβに差次的に応答するが、ＭＳ４Ａ遺伝子、ＴＲＥＭ２、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＤ３３、およびＡＢＣＡ７を含む、ニューロンモチーフの細胞表面認識またはＣＮＳ基質の貪食に関与する遺伝子の発現を増加させる（図１７８Ｂ）。これらの試験は、ＣＤ２００−ＣＤ２００Ｒ１および／またはＣＸ３ＣＬ１−ＣＸ３ＣＲ１軸がミクログリアを調節して神経変性状態に応答させることができるという概念をさらに支持する。したがって、ＣＤ２００およびＣＸ３ＣＬ１などの可溶性ＣＮＳ因子への曝露により、ミクログリア特異的転写制御エレメントへのアクセスが可能になる可能性がある。
【実施例８】
【０１０１】
ＣＮＳ環境とのｉＭＧＬの直接接触がｉＭＧＬ成熟に与える影響を検査する
次に、ＣＮＳ環境と直接接触することによってｉＭＧＬの成熟を達成できるかどうかを検査した。ｉＭＧＬをラット海馬ニューロン（２１  ＤＩＶ）とともに培養して、ｉＭＧＬがニューロン表面のキューにどのように応答するかを評価した（図５Ａ）。ラット海馬ニューロンは、培養においてシナプスを容易に形成し、限られた変動で生成できるために使用された。その後、ｉＭＧＬは、ヒト特異的ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂ抗体によるＦＡＣｓによってニューロンから分離され、トランスクリプトームレベルでプロファイリングされた（図５Ｂ）。差次的遺伝子発現分析により、ニューロンの共培養が１５６個のｉＭＧＬ遺伝子を上方制御し、２４４個のｉＭＧＬ遺伝子を下方制御したことが明らかになった（図５ＣおよびＤ）。ＦＦＡＲ２とＣＯＬ２６Ａ１は、定義された因子のみで培養されたｉＭＧＬで差次的に発現する２個の遺伝子であり、発生的にプライムされたミクログリアプロファイルを示す。対照的に、ニューロンとのミクログリアの共培養は、ニューロンのグリコカリックスと相互作用し、神経保護において機能し、炎症誘発性シグナル伝達を抑制し、それによりミクログリアの恒常性状態を維持する、ヒト特異的シアル酸結合タンパク質であるＳｉｇｌｅｃ１１および１２の発現を増加させた。さらに、ミクログリア遺伝子ＣＡＢＬＥＳ１、ＴＲＩＭ１４、ＭＩＴＦ、ＭＭＰ２、およびＳＬＣ２Ａ５の発現の増加が観察された。全体として、これらの結果は、ミクログリアの成熟における因子として、可溶性および表面の両方のＣＮＳキューを暗示している（図５Ａ〜Ｆ）。
【実施例９】
【０１０２】
ヒトの脳環境におけるｉＭＧＬ相互作用
ミクログリアの基本的な特性は、高度に分岐した突起によるＣＮＳ環境の監視である。ヒトの脳環境においてｉＭＧＬがどのように相互作用し得るかを調査するために、ｉＭＧＬをｈｉＰＳＣ  ３Ｄ脳オルガノイド（ＢＯＲＧ）と培養した。ＢＯＲＧには、皮質様ネットワークに自己組織化するニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトが含まれるが、ミクログリアを欠く（図６）。ミクログリアが発達中の神経管に入る方法と同様に、ｉＭＧＬがＢＯＲＧに侵入するかどうかを試験するために、ｉＭＧＬがＢＯＲＧ培養に追加された。３日目までに、ｉＭＧＬはＢＯＲＧに埋め込まれ、培地内でもはや検出できなくなり、ＣＮＳのキューに対する急速なｉＭＧＬの走化性を示唆した（図６、パネルＡ〜Ｃ）。また、７日目までに、ｉＭＧＬは、３Ｄオルガノイド環境において様々な程度の分岐突起をタイリングおよび伸長した（図６、パネルＤ〜Ｆ）。ｉＭＧＬが神経損傷に応答するかどうかを判定するために、ＢＯＲＧに２５ゲージの針を突き刺した。損傷後、ｉＭＧＬは損傷部位の近くにクラスター化し、よりアメーバ様の形態を採用し、損傷または疾患の脳に見出される「活性化」ミクログリアに類似する（図６、パネルＧ〜Ｉ）。まとめると、これらのデータは、ｉＭＧＬがインビトロ３Ｄ脳およびＣＮＳ環境内に組み込まれ、そこでｉＭＧＬは、成熟し、分岐し、脳ミクログリアと同様に、損傷に応答できることを示している。
【実施例１０】
【０１０３】
インビボのＣＮＳ環境の状況におけるｉＭＧＬの調査
ｉＭＧＬは、インビボのＣＮＳ環境の状況において検査された。ｉＭＧＬ（３８日目）は、Ｒａｇ２欠損マウスおよびＩＬ２ｒγ欠損マウスであり、ノックインされた４つのサイトカイン（Ｍ−ＣＳＦｈ；ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦｈ；ＴＰＯｈ）のヒト型も発現し、骨髄および他の白血球の異種移植および生存を可能にするＭＩＴＲＧマウスの皮質に移植された（図１３）。移植の２カ月後、ＭＩＴＲＧ皮質の生着の程度を免疫組織化学により評価した。それぞれヒト特異的核または細胞質マーカーである、ｋｕ８０（ｈＮｕｃｌｅｉ）およびＳＣ１２１（ｈＣｙｔｏ）を使用して、ヒトｉＭＧＬを内因性ミクログリアと区別した。Ｐ２ｒｙ１２およびヒト特異的Ｔｍｅｍ１１９抗体を使用して、移植されたミクログリアの恒常性状態と同一性を評価した。ｋｕ８０とＰ２ｒｙ１２の両方を共発現する移植されたヒトｉＭＧＬは、ＭＩＴＲＧ脳内に豊富であり、長期生着可能性を示唆した（図１３パネルＡ〜Ｄ）。より高倍率の画像は、膜分布がより微細な伸長突起を強調する静止皮質ミクログリアに類似する高度に分岐したｉＭＧＬにおけるＰ２ｒｙ１２発現を示した（図１３パネルＢ〜Ｄ）。Ｔｍｅｍ１１９はまた、ｈＣｙｔｏ＋細胞体と高度に樹状化されたｉＭＧＬの突起の両方で発現していた（図１３パネルＥ〜Ｈ）。ｈＣｙｔｏ＋細胞の高倍率画像は、Ｔｍｅｍ１１９が主に膜に結合しており、発表された研究と一致していることを示す。まとめると、これらの発見は、ｉＭＧＬの長期生存と生着により、Ｉｂａ１、Ｐ２ｒｙ１２、およびＴｍｅｍ１１９を発現し（図１３パネルＩ〜Ｌ）、内因性静止ミクログリアに類似している、高度に分岐したミクログリア様細胞が生じることを示唆している。また、恒常性Ｐ２ｒｙ１２受容体の形態と高発現は、移植されたｉＭＧＬがマウスＣＮＳ疾患モデルにおけるヒトミクログリアの試験における潜在的な使用に変換される神経環境を活動的に監視していることを示唆している。
【実施例１１】
【０１０４】
海馬へとｉＭＧＬを移植して、ｉＭＧＬがＡＤ神経病理とどのように相互作用するかを判定する
ｉＭＧＬは、これまでに生成され特性評価された異種移植適合性ＡＤマウスの海馬に移植されて、インビボでｉＭＧＬがＡＤ神経病理とどのように相互作用するかを検査した（図１３パネルＭ〜Ｐおよび図１８）。移植されたｉＭＧＬは、発達中のミクログリアと同様に、白質路に沿って生着および遊走する（図１３パネルＭ）。多くの場合、ｉＭＧＬは、Ａβ斑に向かって遊走し、突起を伸長させ、それらを壁で囲い始めた（図１３パネルＮ〜Ｐ）。多数のｉＭＧＬも線維性Ａβを貪食し始めた（図１３パネルＮ〜Ｐ、図１８パネルＥ〜Ｈ）。同様に、ヒト胎児ミクログリアは、同一のＡＤトランスジェニックモデルに移植されると、Ａβに向かって遊走し、突起を伸長し、Ａβを貪食した（図１８パネルＡ〜Ｄ）。
【０１０５】
実験方法および材料
試薬
別段の記載がない限り、全ての細胞培養フラスコ、試薬、サプリメント、サイトカイン、および一般的な試薬は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から購入した。
【０１０６】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の維持と培養
全ての幹細胞試験は、ＵＣアーバインヒト幹細胞研究監視（ｈＳＣＲＯ）およびＩＢＣ委員会の承認を得て実施された。ヒト組織の使用は、治験審査委員会（ＩＲＢ）の順守と承認によって行われた。ヒトｉＰＳＣ細胞株ＡＤＲＣ  Ｆ５およびＡＤＲＣ  Ｆ１４（対照対象）は、非組み込みセンダイウイルス（Ｃｙｔｏｔｕｎｅ）を使用して、ＵＣＩ  ＡＤＲＣ誘導多能性幹細胞コアによって生成された。ｉＰＳＣは、Ｇバンドにより核型が正常であること、無菌性、およびＰｌｕｒｉｔｅｓｔ（ＵＣＬＡ）分析により多能性であることが確認された。ｉＰＳＣは、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で完全なＴｅＳＲ−Ｅ８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のマトリゲル（ＭＴＧ）上でフィーダーなしで維持された。
【０１０７】
ｉＰＳＣの造血始原細胞（ｉＨＰＣ）への分化
ヒトｉＰＳＣ由来の造血始原細胞は、これまでに公開されたプロトコールにいくつかの修正を加えた定義された条件を使用して生成された（Kennedy et al., 2007、Sturgeon et al., 2014）。簡潔に述べると、ｉＰＳＣを粉砕して単一細胞懸濁液を生成し、Ｅ８培地＋Ｙ−２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で１ウェルあたり１〜６×１０５細胞で６ウェルプレートに播種した。いくつかの実施形態では、Ｙ−２７６３２はチアゾビビン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に置き換えられる。細胞を正常酸素（２０％Ｏ２）条件下で２４時間培養した後、Ｅ８培地をベース培地とサイトカイン：ＩＭＤＭ／Ｆ１２（５０：５０）、インスリン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、ホロトランスフェリン（０．０１１ｍｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０１３４ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸マグネシウム（６４μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール（４００μＭ）、ＰＶＡ（５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、既知組成脂質濃縮物（１倍）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；１倍）、ＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビン−Ａ（１２．５ｎｇ／ｍｌ）、および低酸素（５％Ｏ２）におけるＬｉＣｌ（２ｍＭ）からなる分化培地に変更した。２日後、培地をＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したベース培地に変更した。４日目に、培地をＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−３（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地に変更した。６日目に、培地に上述の培地を補充した。細胞をさらに４日間（合計１０日）培養した後、ｉＭＧＬ分化のためにＦＡＣＳによりＣＤ４３＋細胞を単離した。さらに、ｉＰＳＣ由来のＨＰＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）は、ＣＤ４３＋始原細胞の商用供給源として同定された。
【０１０８】
ｉＨＰＣからのミクログリア様細胞の生成
ＣＤ４３＋  ｉＨＰＣを、１ウェルあたり１〜２×１０５細胞の密度で無血清完全分化培地を含むマトリゲルコートされた６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。分化培地は、ベース培地（フェノール不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、インスリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）、ホロトランスフェリン（０．０１１ｍｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０１３４ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％ｖ／ｖ）、Ｂ２７（１％ｖ／ｖ）、Ｎ２（０．５％、ｖ／ｖ）、モノチオグリセロール（２００μＭ）、および細胞に添加する直前の追加のインスリン（４μｇ／ｍｌ））に添加された、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３４（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、およびＴＧＦβ−１（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ）からなる。２日ごとに完全な分化培地を細胞に補充した。１２日目に、初期のｉＭＧＬが収集され（２５℃で５分間３００×ｇ）、５０％の培地交換が行われた。２５日のミクログリア分化（ｉＰＳＣから３５日）後、ｉＭＧＬをＣＤ２００（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびＣＸ３ＣＬ１（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した完全分化培地においてさらに３日間培養し、海馬ニューロンとともに培養したかまたはヒトの脳オルガノイドとともに培養した。
【０１０９】
ヒト血液からのＰＢＭＣの単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配分離を使用して健康なドナーから単離された。簡潔に述べると、血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に重ね、ブレーキをかけずにスイングバケットローテーターで遠心分離した（４００×ｇ、４０分、１８℃）。遠心分離後、血漿と上層を除去し、ＰＢＭＣを層間から単離した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳによって１回洗浄し、すぐに使用した。
【０１１０】
ＰＢＭＣからの単球の単離
ＣＤ１４およびＣＤ１６の単球は、製造者の取扱説明書に従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）単球濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＢＭＣからのネガティブ選択により単離された。単離された細胞をＰＢＳによって３回洗浄し、ＲＮＡ配列分析のためにＦＡＣｓで選別するか、またはさらなるマクロファージ分化に使用した。
【０１１１】
単球由来マクロファージ
単離した単球を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいてＲＰＭＩ−１６４０培地中の２×１０６細胞／ｍｌで組織培養処理６ウェル上に播種した。２時間後、培地を吸引して廃棄し、接着した単球をＤＰＢＳによって３回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０、ＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％ｖ／ｖ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）からなる完全培地と交換した。ＭＤ−Ｍφを生成するために、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、細胞を５日間分化させた。
【０１１２】
ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー構築
細胞を採取し、ＤＰＢＳによって３回洗浄し、ＲＮＡｌａｔｅｒ、ＲＮＡ保存液に保管した。製造者のガイドラインに従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ての細胞型からＲＮＡを抽出した。Ｂｉｏａｎａｌｚｙｅｒ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００シリーズを使用して、全ての試料のＲＮＡ整合性（ＲＩＮ）を測定した。分析された全ての配列決定ライブラリーは、ＲＩＮスコアが９以上と測定されたＲＮＡ試料から生成された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ｍＲＮＡ  ｓｔｒａｎｄｅｄプロトコールを使用して、全ての試料からポリＡ  ｍＲＮＡを取得した。２００ｎｇの単離ｍＲＮＡを使用してＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを構築した。ライブラリーは、Ｋａｐａ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＬｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して定量化および標準化され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００プラットフォームによってペアエンド１００ｂｐリードとして配列決定された。
【０１１３】
ＲＮＡ−ｓｅｑ分析
ＲＮＡ−ｓｅｑリードは、ＳＴＡＲアライナーを使用してｈｇ３８参照ゲノムにマッピングされ、ＲＳＥＭを使用してＧｅｎｃｏｄｅバージョン２４遺伝子アノテーションにマッピングされた。全ての試料にわたる発現（＜１ＦＰＫＭ）を有する遺伝子は、その後の全ての分析からフィルターされた。ＥｄｇｅＲによって、ＴＭＭの標準化された計数に対して、差次的遺伝子発現分析を実行した（Robinson et al., 2010）。複数の生物学的複製が全ての比較分析に使用された。ｐ値≦０．００１および発現の２倍の変化を使用して、それぞれの比較について有意に差次的に発現した遺伝子を判定した。Ｒパッケージｒｇｌを使用してＰＣＡ分析を実行し、ｐｌｏｔ３ｄを使用してプロットした。Ｒ  ｈｃｌｕｓｔ２を使用してクラスタリングを実行し、Ｊａｖａ  Ｔｒｅｅ  Ｖｉｅｗ  ３．０を使用して可視化した。
【０１１４】
ＡＤＰ遊走およびカルシウムイメージングアッセイ
ＡＤＰへのトランスウェル遊走アッセイは、これまでに記載されているように実行された（De Simone et al., 2010;Moore et al., 2015）。ｉＭＧＬ（５．５×１０４細胞／ウェル）を、サイトカインを含まない無血清基礎培地において１時間培養した。次に、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター内において３７℃で、ｉＭＧＬをＤＭＳＯまたはＰＳＢ０７３９（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）に１時間事前曝露した。次いで、細胞を基礎培地によって３回洗浄し、５％ＣＯ２中、３７℃で、底部チャンバー内の、アデノシン５’−リン酸（ＡＤＰ、１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）を含むトランスウェル遊走チャンバー（２４ウェルに５μｍのポリカーボネートインサート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種した。４時間後、細胞を３回洗浄し、ＰＦＡ（４％）において室温で１５分間固定した。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染色で１０分間染色して、細胞の核を可視化した。盲検化された観察者は、スライドあたりの総細胞数を計数し、次いで表面から細胞をこすり落とし、ＰＢＳによって洗浄し、再集計して遊走した細胞を記録した。遊走は、ウェルあたりの総細胞数に対する遊走したものとして報告された。細胞の蛍光画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立顕微鏡を使用して記録された。
【０１１５】
カルシウムイメージングについて、ｉＭＧＬをポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたカバースリップに播種し、１時間後に、（ｍＭで）ＮａＣｌ  １４０、ＫＣｌ  ４．５、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、グルコース１０、スクロース５、を含むリンガー溶液ｐＨ＝７．４で希釈したＦｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）カルシウム色素とインキュベートした。１時間のインキュベーション後、リンガー溶液を使用して色素を３回洗浄し、Ｐ２ＲＹ１２阻害剤ＰＳＢ０７３９（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）または媒体（ＤＭＳＯ）で１時間処理し、実験に使用した。ベースラインＣａ２＋シグナル（Ｉ３４０／Ｉ３８０）を、１００秒を超えて測定し、ベースライン測定後、定常流下でＡＤＰ（１０μＭ）を導入した。Ｃａ２＋記録は、Ｚｅｉｓｓ（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ３５）ベースのイメージング設定で実行され、データ取得はＭｅｔａｆｌｕｏｒソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実行された。データ分析は、Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ、Ｏｒｉｇｉｎ  Ｐｒｏ、およびＰｒｉｓｍ  ６．０を使用して実行された。
【０１１６】
免疫細胞化学および免疫組織化学
細胞を冷ＰＢＳによって洗浄し、２５℃で２０分間冷ＰＦＡ（４％）によって固定した後、ＰＢＳによって３回洗浄した。０．０５％ヤギ血清またはロバ血清のいずれかを含み、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（０．０１％）を含むＰＢＳによって、２５℃で１時間、細胞をブロッキングした。一次抗体（１：５００）をブロッキング溶液に４℃で一晩添加した。次いで、細胞をＰＢＳによって３回洗浄し、１：４００のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲート二次抗体で２５℃において１時間染色した。二次染色後、細胞を３回洗浄し、続いてＤＡＰＩ−カウンターステインマウンティングメディア（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってカバースリップした。免疫細胞化学分析に使用される一次抗体には：β−３チューブリン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ）、Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ）、ＩＴＧＢ５（Ａｂｃａｍ）、ＭＭＰ−９（Ｎｏｖｕｓ）、ＭｅｒＴＫ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｐ２ＲＹ１２（Ｓｉｇｍａ）、ＰＲＯＳ１（Ａｂｃａｍ）、ＰＵ．１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｈＣｙｔｏｐｌａｓｍ（ＳＣ１２１；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）、ＴＲＥＭ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦβＲ１（Ａｂｃａｍ）が含まれる。
【０１１７】
ＩＣＣの場合、細胞をＤＰＢＳ（１倍）によって３回洗浄し、室温で２０分間冷ＰＦＡ（４％ｗ／ｖ）によって固定した後、ＰＢＳ（１倍）によって３回洗浄した。細胞をブロッキング溶液（１倍ＰＢＳ、５％ヤギまたはロバ血清、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）によって室温で１時間ブロッキングした。ＩＣＣ一次抗体をブロッキング溶液中に各希釈（下記参照）で添加し、４℃で一晩静置した。翌日、細胞をＰＢＳによって５分間３回洗浄し、１：４００のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲート二次抗体で、室温において１時間暗所で染色した。
【０１１８】
二次染色後、細胞をＰＢＳによって３回洗浄し、ＤＡＰＩ−カウンターステインマウンティングメディア（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でカバースリップした。ＢＯＲＧ  ＩＨＣの場合、組織を収集し、室温において３０分間ＰＦＡ（４％ｗ／ｖ）に滴下固定し、ＰＢＳによって３回洗浄した。次いで、ＢＯＲＧをスクロース溶液（３０％ｗ／ｖ）に一晩静置してから、Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に埋め込んだ。埋め込んだ組織は、クライオスタットを使用して２０μｍで切片化され、マウントされたスライドは染色まで−２０℃で保菅された。ＢＯＲＧ染色の場合、マウントされた組織を保管場所から取り出し、室温に３０分間静置して加温した。組織を再水和し、室温のＰＢＳ（１倍）によって５分間３回洗浄した。
【０１１９】
熱媒介性抗原回復は、クエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ＝６．０）を使用して９７℃で２０分間行い、次いで室温まで冷却した。抗原回復後、スライドをＰＢＳによって３回洗浄した。次いで、スライドをＰＢＳ−Ａ溶液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１×ＰＢＳ）によって１５分間１回洗浄した。ＰＢＳ−Ｂ溶液（ＰＢＳ−Ａ、０．２％ＢＳＡ、および１．５％ヤギまたはロバ血清）を使用して、室温において１時間、組織をブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体を適切な希釈でＰＢＳ−Ｂ溶液（２５０〜３５０μｌ／スライド）に添加し（以下を参照）、室温において一晩インキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳ−Ａ溶液によって各５分間３回洗浄した。室温においてＰＢＳ−Ｂ溶液を使用して組織を１時間ブロッキングした。ブロッキング後、スライドを、ＰＢＳ−Ｂ（２５０〜３００μｌ／スライド）中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲート二次抗体（全て１：５００）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（１倍）によって、室温において２時間、暗所でインキュベートした。
【０１２０】
二次染色後、スライドをＰＢＳによって５分間５回洗浄した。フルオロマウント（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してスライドをカバースリップした。マウス脳ＩＨＣの場合、脳は上記のように収集、固定、および処理された。浮遊する切片をブロッキング溶液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０％ヤギ血清）中で室温において１時間、穏やかに振とうしながらブロッキングした。ヒトＴＭＥＭ１１９染色では、これまでに行われたように、ブロッキングの前に熱媒介性抗原回復が行われた（Bennett et al., 2016）。浮遊する組織抗原の回復は、１ｍｌのクエン酸緩衝液を含む１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに浮遊切片を入れ、１００℃に設定された予熱された温度ブロックに静置することで行った。組織を１００℃において１０分間加熱した後、取り出して２０分間室温に戻した後、ＰＢＳによって５分間３回洗浄し、その後ブロッキング工程に進んだ。アミロイド斑のＡＤマウス脳染色の場合、浮遊切片を１×Ａｍｙｌｏ−Ｇｌｏ（登録商標）ＲＴＤ（商標）（Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ）染色溶液に室温において１０分間振とうせずに静置した。
【０１２１】
染色後、切片を各５分間ＰＢＳによって３回洗浄し、ＭｉｌｉＱ  ＤＩ水で簡単にすすいだ後、ＰＢＳに戻した後、ブロッキングした。一次抗体を染色溶液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ヤギ血清）に適切な希釈（以下を参照）で加え、わずかに振とうしながら４℃において一晩インキュベートした。翌日、切片をＰＢＳによって３回洗浄し、１：４００のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲート二次抗体で、わずかに振とうしながら室温において１時間暗所で染色した。二次染色の後、切片をＰＢＳによって５分間３回洗浄し、スライドガラスにマウントした。マウント後、スライドをＤＡＰＩカウンターステインマウンティングメディア（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってカバースリップした。一次抗体：
ウサギ抗アミロイド線維（ＯＣ）（１：１，０００、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ２２８６）
ウサギ抗アミロイドオリゴマー（Ａ１１）（１：１，０００、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９２３４）
マウス抗アミロイド１〜１６ａａ（６ｅ１０）（１：１，０００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、８０３００１）
マウス抗β３チューブリン（１：５００；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、８０１２０１）
マウス抗ヒト細胞質（ＳＣ１２１、１：１００；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｙ４０４１０）、
マウス抗ヒト核（ｋｕ８０、１：１００；Ａｂｃａｍ、ａｂ７９２２０）
ニワトリ抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ａｂｃａｍ、ａｂ４６７４）
ウサギ抗Ｉｂａ１（１：５００；Ｗａｋｏ；０１９−１９７４１）
ヤギ抗Ｉｂａ１（１：１００；Ａｂｃａｍ  ａｂ５０７６）＊Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５５５二次抗体のみとの使用が推奨される。
マウス抗ＩＴＧＢ５（１：５００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１７７００４）
マウス抗ＭＭＰ−９（１：５００；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ１９０１６）
マウス抗ヒトＭｅｒｔｋ（１：５００；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３６７６０２）
ウサギ抗Ｐ２ｒｙ１２（１：１２５；Ｓｉｇｍａ；ＨＰＡ０１４５１８）
ウサギ抗Ｐｒｏｓ（１：５００；Ａｂｃａｍ、ａｂ９７３８７）
ウサギ抗ＰＵ．１（１：５００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２６６Ｓ）
ウサギ抗ヒトＴｍｅｍ１１９（１：１００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１８５３３３）
ヤギ抗ヒトＴｒｅｍ２（１：１００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１８２８）
ウサギ抗Ｔｇｆｂｒ１（１：５００；Ａｂｃａｍ、ａｂ３１０１３）。
【０１２２】
共焦点顕微鏡と明視野イメージング
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＸ１２００共焦点顕微鏡を使用して、免疫蛍光切片を可視化し、画像を記録した。非特異的なブリードスルーを回避するために、各レーザーラインは独立して励起および検出された。示されている全ての画像は、単一の共焦点ｚスライスまたはｚスタックを表す。細胞培養の明視野画像をＥｖｏｓ  ＸＬ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ顕微鏡で記録した。
【０１２３】
フローサイトメーター分析
細胞をＦＡＣｓ緩衝液（ＤＰＢＳ、２％ＢＳＡ、および０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、４℃において１５分間、ヒトＦｃブロック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってインキュベートした。ミクログリア表面マーカーの検出のために、細胞を抗ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣクローンＩＣＲＦ４４、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ／Ｃｙ７クローンＨＩ３０、抗ＣＸ３ＣＲ１−ＡＰＣクローン２Ａ９−１、抗ＣＤ１１５−ＰＥクローン９−４Ｄ、および抗ＣＤ１１７−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローン１０４Ｄ２によって染色した。生／死細胞は、全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ（商標）生／死染色を使用してゲートされた。細胞をＦＡＣｓ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）で分析した。
【０１２４】
サイトスピンとメイグリュンワルドギムザ染色
１×１０５細胞を１００μｌのＦＡＣｓ緩衝液に懸濁し、Ｓｈａｎｄｏｎスライドガラス（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）に加えて、細胞学漏斗装置で組み立てた。細胞を含む組み立てられたスライドは、サイトスピン機器にロードされ、遠心分離された（５００ｒｐｍ、５分）。スライドを２分間風乾し、すぐに１００％メイグリュンワルド染色（Ｓｉｇｍａ）によって５分間染色した。次に、スライドをＰＢＳによって１．５分間洗浄し、すぐに室温において２０分間４％ギムザ染色（Ｓｉｇｍａ）に入れた。スライドを二段蒸留したＨ２Ｏによって６回洗浄し、１０分間風乾させた。スライドは、ガラス製のカバースリップとパーマウント（Ｓｉｇｍａ）を使用して保存された。
【０１２５】
ＲＮＡ単離およびｑＰＣＲ分析
細胞をＲＮＡｌａｔｅｒ安定化試薬に保管し、製造者のガイドラインに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＲＮＡを単離した。ＶｉｉＡ（商標）７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍおよびＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲプライマーを使用して、ｑＰＣＲ分析を実施した。ＡＤ−ＧＷＡＳ遺伝子の分析では、以下に記載するプライマーを使用する、カスタムＴａｑｍａｎ低密度アレイカードを利用した。
【０１２６】
ラット皮質および海馬ニューロンの単離
全ての手順は、ＩＵＣＡＣ承認プロトコールの下で実行された。初代培養の皮質および海馬ニューロン培養は、胚性ラット（Ｅ１８）に由来した。簡潔に述べると、解剖した組織をトリプシンで解離し、粉砕し、Ｂ２７（１％ｖ／ｖ）を補充した無血清Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ培地）中でコーティングしたポリ−Ｌ−リジンによってコーティングした６ウェルプレートに播種した。細胞を５×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、使用するまで培養で維持した。
【０１２７】
ラットニューロンとのｉＭＧＬの共培養
ラット海馬または皮質ニューロンを、３〜４日ごとに５０％の培地交換を行いながら２１日間培養した。ｉＭＧＬは、５０％ｉＭＧＬおよび５０％ＮＢ培地で１：５の比率でニューロン（１×１０６  ｉＭＧＬ対５×１０６ニューロン）とともに培養した。３日後、ｉＭＧＬはＲＮＡ単離のために収集された。
【０１２８】
メソスケールマルチプレックスサイトカインおよびケモカインアッセイ
ＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）によって２４時間刺激する前に、ｉＭＧＬ培養培地を２時間基礎培地に交換し、その後ＲＮＡのために細胞を収集し、培養上清がサイトカイン分泌について評価された。ｉＭＧＬ培養上清から複数のサイトカインおよびケモカイン分析物を同時に評価するために、各処理群からの培養上清を処理し、製造者のプロトコールに従ってＶ−ＰＬＥＸヒトサイトカイン３０プレックスキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）を使用して分析した。
【０１２９】
３Ｄ脳オルガノイド細胞培養
ヒト３Ｄ脳オルガノイドは、いくつかの修正でこれまでに記載されたように生成され（Lancaster et al., 2013）、修正は補足情報に詳述されている。
【０１３０】
線維性Ａβの調製。
線維性蛍光アミロイドベータ（ｆＡβ１−４２）が生成された。簡潔に述べると、蛍光標識されたＡβペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ；Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を最初に０．１％ＮＨ４ＯＨ中に１ｍｇ／ｍｌまで溶解し、次いでエンドトキシン不含の滅菌水によってさらに希釈し、３７℃で７日間インキュベートした。細胞曝露の前にｆＡβを完全に混合した。
【０１３１】
ＢＤＴＯの調製
タウオリゴマーは、ＡＤ脳から調製したホモジネートのＰＢＳ可溶性画分を使用したＴ２２抗体による免疫沈降により単離された。次いで、これらをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を使用した高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって精製した。追加の分析には、単量体タウまたは大きなタウ凝集体（タウ−５、通常はスタッキングゲルの上部に現れる）の混入を検出するウエスタンブロット、およびマウス抗ＩｇＧを使用した非特異的バンドの特定が含まれる。続いて、製造者のプロトコールに従ってＢＤＴＯをｐＨｒｏｄｏ−Ｒｅｄにコンジュゲートさせた。
【０１３２】
ヒトシナプトソーム
ヒト組織試料を剖検で入手し、刻み、１０％ＤＭＳＯを含む０．３２Ｍスクロース中ゆっくりと凍結し、−８０℃で保管した。粗シナプトソーム画分を得るために、組織を３７℃の水浴で解凍し、ガラス／テフロンホモジナイザー（クリアランス０．１〜０．１５ｍｍ）を使用して、プロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１０ｍｍＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７．４）中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃において１０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、４℃において１００００ｇで２０分間再度遠心分離した。得られたペレットをスクロース／トリス溶液に再懸濁し、−８０℃で保管した。製造者のプロトコールに従ってシナプトソームをｐＨｒｏｄｏ−Ｒｅｄにコンジュゲートさせた。
【０１３３】
貪食アッセイ
ｉＭＧＬとＭＤ−Ｍφを、マウス抗ＣＤ１６／３２Ｆｃ受容体ブロック（２ｍｇ／ｍｌ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに４℃において１５分間インキュベートした。次いで、細胞を、フローサイトメーター緩衝液中の１：２００で、抗ＣＤ４５−ＡＰＣクローン（マウス細胞；Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって染色した。次に、Ａｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍｅｒｘ  Ｍａｒｋ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して試料を分析した。イー・コリ、ヒトシナプトソーム、ｆＡβ、およびＢＤＴＯの貪食は、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｚａｒｄアルゴリズムを搭載したＩＤＥＡＳソフトウェアを使用して分析した。無添加の抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をＣＤ１１ｂ遮断に使用した。
【０１３４】
統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して統計分析を実施した。一元配置分散分析と後に続くテューキーの事後検定を利用した２つを超える群を含む比較では、複数の比較のために修正されたｐ値が報告された。２つの群の比較では、両側スチューデントｔ検定を利用した。ｐ＜０．０５の場合、全ての差は有意差があるとみなされた。ＲＮＡ配列決定の統計分析は上記で詳述されており、他の全ての統計分析は図の凡例で報告されている。
【０１３５】
ＡＤＰ遊走およびカルシウムイメージングアッセイ
ｉＭＧＬ（５．５×１０４細胞／ウェル）を、サイトカインを含まない無血清基礎培地において１時間培養した。次に、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター内において３７℃で、ｉＭＧＬをＤＭＳＯまたはＰＳＢ０７３９（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）に１時間事前曝露した。次いで、細胞を基礎培地によって３回洗浄し、５％ＣＯ２中、３７℃で、底部チャンバー内の、アデノシン５’−リン酸（ＡＤＰ、１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）を含むトランスウェル遊走チャンバー（２４ウェルに５μｍのポリカーボネートインサート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種した。４時間後、細胞を３回洗浄し、ＰＦＡ（４％）において室温で１５分間固定した。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染色で１０分間染色して、細胞の核を可視化した。盲検化された観察者は、スライドあたりの総細胞数を計数し、次いで表面から細胞をこすり落とし、ＰＢＳによって洗浄し、再集計して遊走した細胞を記録した。遊走は、ウェルあたりの総細胞数に対する遊走したものとして報告された。細胞の蛍光画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立顕微鏡を使用して記録された。
【０１３６】
３Ｄ脳オルガノイド細胞培養
ｉＰＳＣは、６ウェル組織培養処理プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）のＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養および維持し、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって５％ＣＯ２によって３７°Ｃにおいて毎日維持した。およそ８０％のコンフルエンシーで、標準のＲｅＬｅＳＲプロトコール（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｉＰＳＣをＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦ基質から分離し、遠心分離、ペレット化、およびＫＯ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＫＯＳＲ（２０％ｖ／ｖ）（ｖ／ｖ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＮＥＡＡ（１倍）、２−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、ｒｈｕｂＦＧＦ（４μｇ／ｍｌ）、およびＨＳＡ（０．１％ｖ／ｖ）、およびＲＯＣＫ阻害剤（５０μＭ）からなる胚様体（ＥＢ）培地によって懸濁し、ＥＢを形成した。ＥＢが９６ウェルプレートに付着しないように、リピジュア（１％ｖ／ｖ；ＡＭＳＢｉｏ）でコーティングされた標準Ｖ底９６ウェルプレートのウェルごとにおよそ１×１０４個の細胞を播種した。ｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）およびＲＯＣＫ阻害剤（５０μＭ）を含むＥＢ培地中で４日間の後、ｂＦＧＦとＲＯＣＫ阻害剤の両方を中止し、さらに３日間（合計７日）基本的なＥＢ培地に脳オルガノイドを残した。ＥＢ培地段階の後、ＥＢ培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２サプリメント（０．１％ｖ／ｖ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（０．１％ｖ／ｖ）、ヘパリン溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）からなり、０．２２μｍ  ＰＥＳフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した、神経上皮（ＮＥ）培地と交換した。脳オルガノイドは、１ｍｌのＮＥ培地中でウェルあたり１〜２個のＥＢで、切断したＰ２００ピペットチップを使用して、超低付着２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＥＢをＮＥ培地で５日間神経化し、その後、サイロコナイズドパラフィルムと無菌の空のＰ２００ボックスから作成した型を使用して、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。脳オルガノイドは、ＫＯ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（５０％）、神経基礎培地（５０％）、Ｎ２サプリメント（０．１％ｖ／ｖ）、ビタミンＡサプリメントなしのＢ２７（０．１％ｖ／ｖ）、インスリン溶液（０．１％ｖ／ｖ；Ｓｉｇｍａ）、２−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（１倍）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（０．１％ｖ／ｖ）からなる分化培地によって、６ｃｍ懸濁ペトリ皿中に維持された。ビタミンＡを含まないＢ２７を含む分化培地に５日間曝露した後、ビタミンＡを含まないＢ２７をビタミンＡを含むＢ２７に交換する以外は同一の製剤に分化培地を交換し、この時点で、脳オルガノイドは、Ｓｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ）でシリコン処理した１２５ｍｌの回転フラスコバイオリアクター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にも移され、そこで８週間、ビタミンＡを含む分化培地が毎週与えられた。１２週間後、ＢｏｒｇはｉＭＧＬの共培養試験に利用された。
【０１３７】
ヒトの成人ミクログリアおよび胎児ミクログリアの単離
簡潔に述べると、正常に見える皮質組織は、側頭葉てんかんの薬理学的に難治性の非悪性症例から切除された。組織は広範囲に洗浄され、機械的に解離された。ナイロンメッシュフィルターを通過する前に、トリプシンとＤＮＡｓｅを使用して穏やかに酵素消化した後、単一細胞懸濁液を生成した。単一細胞懸濁液は、ミエリンを除去するためのｆｉｃｋｌｅ超遠心分離工程を受けた。解離した細胞を遠心分離し、計数し、５％ＦＢＳ、０．１％Ｐ／Ｓおよび０．１％グルタミンを補充したＭＥＭに２×１０６細胞／ｍＬで播種した。ミクログリアを３日間増殖させ、収集し、１×１０５細胞／ｍＬで播種し、６日間培養で維持し、この期間に細胞は３日目と５日目の２回のＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍＬ）処理を受けた。ヒト胎児脳組織は、胎児組織保管所（Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｒｏｎｘ，ＮＹ）から入手した。標準のＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プロトコールを使用して総ＲＮＡを単離し、−８０℃で保管した。いくつかの実施形態では、細胞の小さな塊の懸濁液が産生され、単一細胞懸濁液と同様の方法で使用される。
【０１３８】
ＭＩＴＲＧおよびＲａｇ５×ｆＡＤ脳におけるｉＭＧＬの移植
全ての動物の手順は、ＮＩＨおよびカリフォルニア大学のガイドラインが承認したＩＡＵＣプロトコール（ＩＡＵＣ＃２０１１−３００４）に従って実行された。ＭＩＴＲＧマウスはＪａｘ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、＃０１７７１１）から購入し、以前に特性評価されている（Rongvaux et al., 2014）。ＭＩＴＲＧマウスは、異種移植を可能にし、ヒト骨髄生着を支持するように設計されている。ｉＭＧＬは３８日目に採取され、注入緩衝液：Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３４（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＴＧＦβ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）を含む１×ＨＢＳＳに懸濁された。ｉＭＧＬは、これまでに記載された定位手術（Blurton-Jones, et al, 2009）を使用して、次の座標を使用して送達された；ＡＰ：−０．６、ＭＬ：±２．０、ＤＶ：−１．６５。確立されたプロトコール（Blurton-Jones, et al, 2009）に従って、移植後６０日目にマウスから脳を収集した。Ｒａｇ５×ｆＡＤマウスはこの実験室で生成され、以前に特性評価された（Marsh et al., 2016）。Ｒａｇ５×ｆＡＤマウスは堅牢なベータアミロイド病理を示し、ヒト細胞の異種移植を可能にする。ｉＭＧＬは、次の座標を使用して海馬に移植された；ＡＰ：−２．０６、ＭＬ：±１．７５、ＤＶ：−１．９５。移植後、マウスを殺傷し、以前に確立されたプロトコールを使用して脳を収集した。簡潔に述べると、マウスをバルビツール酸ナトリウムを使用して麻酔し、４分間冷１×ＨＢＳＳによって左心室に灌流した。灌流マウスを断頭し、脳を摘出し、ＰＦＡ（４％ｗ／ｖ）によって４℃において４８時間滴下固定した。次いで、脳をＰＢＳによって３回洗浄し、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して冠状切片（４０μｍ）の前に４８時間スクロース（３０％ｗ／ｖ）溶液に沈めた。浮遊する切片は、ＩＨＣが実行されるまで、４℃のＰＢＳアジ化ナトリウム（０．０５％）溶液に保管された。
【０１３９】
ドットブロット
タンパク質の連続希釈液（２μｌ）を、あらかじめ湿らせたニトロセルロース紙にブロットし、乾燥させた。乾燥後、室温において１時間、わずかに振とうしながら、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中の５％ＢＳＡによってブロットをブロッキングした。次に、ブロットを一次抗体（下記参照）とともに室温において１時間インキュベートした。その後、ブロットをＴＢＳＴによって各５分間３回洗浄した。次いで、ブロットをＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と１：１０，０００で、室温において１時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。１時間後、ブロットをＴＢＳＴによって各５分間、３回洗浄した。洗浄後、ブロットを濾紙上で乾燥させ、暗所において１０分間、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬウエスタンブロッティング現像基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。ブロットはＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋イメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ）でイメージングした。
【０１４０】
ＡＤ−ＧＷＡＳ  ｑＰＣＲプライマー
以下の検証済みで利用可能なＴａｑｍａｎプライマーを使用した：ＡＰＯＥ  Ｈｓ００１７１１６８＿ｍ１、ＣＲ１  Ｈｓ００５５９３４２＿ｍ１、ＣＤ３３  Ｈｓ０１０７６２８１＿ｍ１、ＡＢＣＡ７  Ｈｓ０１１０５１１７＿ｍ１、ＴＲＥＭ２  Ｈｓ００２１９１３２＿ｍ１、ＴＲＥＭＬ２  Ｈｓ０１０７７５５７＿ｍ１、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）  Ｈｓ００１８２４２６＿ｍ１、ＰＩＣＡＬＭ  Ｈｓ００２００３１８＿ｍ１、ＣＬＵ  Ｈｓ００１５６５４８＿ｍ１、ＭＳ４Ａ６Ａ  Ｈｓ０１５５６７４７＿ｍ１、ＢＩＮ１  Ｈｓ００１８４９１３＿ｍ１、ＣＤ２ＡＰ  Ｈｓ００９６１４５１＿ｍ１、ＣＡＳＳ４  Ｈｓ００２２０５０３＿ｍ１、ＭＥＦ２Ｃ  Ｈｓ００２３１１４９＿ｍ１、ＤＳＧ２  Ｈｓ００１７００７１＿ｍ１、ＭＳ４Ａ４Ａ  Ｈｓ０１１０６８６３＿ｍ１、ＺＣＷＰＷ１  Ｈｓ００２１５８８１＿ｍ１、ＩＮＰＰ５Ｄ  Ｈｓ００１８３２９０＿ｍ１、およびＰＴＫ２Ｂ  Ｈｓ００１６９４４４＿ｍ１。
【０１４１】
上述で開示された実施形態の特定の特徴および態様の様々な組み合わせまたはサブコンビネーションを作製できるが、それでも本発明のうちの１つ以上の範囲内に入ることが企図される。さらに、実施形態に関連する任意の特定の特徴、態様、方法、特性（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）、特性（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、品質、属性、要素などの本明細書の開示は、本明細書に記載される他の全ての実施形態で使用することができる。したがって、開示された実施形態の様々な特徴および態様は、開示された発明の様々なモードを形成するために互いに組み合わせること、または互いに置き換えることができることを理解されたい。したがって、本明細書において開示される本発明の範囲は、上述の特定の開示される実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な修正および代替形態が可能であるが、その特定の例が図面に示されており、本明細書で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は、開示された特定の形態または方法に限定されるものではなく、反対に、本発明は、記載される様々な実施形態および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にある全ての修正、均等物、および代替物を包含することを理解されたい。本明細書において開示される任意の方法は、言及された順序で実行される必要はない。本明細書において開示される方法は、開業医によってとられる特定の行動を含むが、明示的または暗黙的に、これらの行動の任意の第三者の指示を含めることもできる。例えば、「増殖ＮＫ細胞の集団の投与」などの行動には、「増殖ＮＫ細胞の集団の投与の指示」が含まれる。さらに、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群で記載される場合、本開示がまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個別のメンバー、またはマーカッシュ群のメンバーのサブグループで記載されていることを、当業者は理解するであろう。
【０１４２】
本明細書に開示された範囲はまた、任意のおよび全ての重複、部分範囲、ならびにそれらの組み合わせを包含する。「最大でも」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「間」などの言語には、言及された数字が含まれる。「約」や「およそ」などの用語が前に付いている数字には、言及された数字が含まれている。例えば、「約１０ナノメートル」には「１０ナノメートル」が含まれる。
【実施例１２】
【０１４３】
ｉＨＰＣ移植により、完全な脳環境におけるヒトのミクログリアの発達を試験することができる。完全なＣＮＳ環境におけるヒトミクログリアの正常な発達と老化は、マウスの脳にｉＨＰＣを移植することにより試験することができる（図２４および２５を参照）。
参照文献
【表７】
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【表８】
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【表９】
2020513794.tif 000011
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2020513794.tif 000082
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