(57)【要約】  本発明は線維症の処置方法に関する。本発明は、インターフェロン−ラムダが、インビトロ及びインビボの両方で直接作用する抗線維化効果を有すること、並びに複数のタイプの線維症の処置に効果的な新規の治療法を提供するために使用され得ることを実証する新規の研究を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症の処置での使用のためのインターフェロン−ラムダ。
【請求項２】
前記インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３若しくはＩＦＮ−λ４又はこれらの機能的模倣物である、請求項１に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項３】
前記機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３又はＩＦＮ−λ４の断片、バリアント又は誘導体である、請求項２に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項４】
前記機能的模倣物はペグ化されている、請求項３に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項５】
前記機能的模倣物はペグ−インターフェロンラムダ−１ａである、請求項４に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項６】
前記機能的模倣物は抗体である、請求項２に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項７】
前記機能的模倣物は低分子化学物質である、請求項２に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項８】
前記インターフェロン−ラムダ又は機能的模倣物は、インターフェロン−ラムダレセプターを活性化させる、請求項１から７までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項９】
前記線維症は腎線維症である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項１０】
前記線維症は肺線維症である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項１１】
前記線維症は小腸線維症である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項１２】
前記線維症は皮膚線維症である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項１３】
前記線維症は肝線維症である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダ。
【請求項１４】
線維症の処置用の薬剤の調製のためのインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項１５】
前記インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３若しくはＩＦＮ−λ４又はこれらの機能的模倣物である、請求項１４に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項１６】
前記機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３又はＩＦＮ−λ４の断片、バリアント又は誘導体である、請求項１５に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項１７】
前記機能的模倣物はペグ化されている、請求項１６に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項１８】
前記機能的模倣物はペグ−インターフェロンラムダ−１ａである、請求項１７に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項１９】
前記機能的模倣物は抗体である、請求項１５に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２０】
前記機能的模倣物は低分子化学物質である、請求項１５に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２１】
前記インターフェロン−ラムダ又は機能的模倣物は、インターフェロン−ラムダレセプターを活性化させる、請求項１４から２０までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２２】
前記線維症は腎線維症である、請求項１４から２１までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２３】
前記線維症は肺線維症である、請求項１４から２１までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２４】
前記線維症は小腸線維症である、請求項１４から２１までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２５】
前記線維症は皮膚線維症である、請求項１４から２１までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２６】
前記線維症は肝線維症である、請求項１４から２１までのいずれか一項に記載のインターフェロン−ラムダの使用。
【請求項２７】
治療上有効な量のインターフェロン−ラムダを投与するステップを含む、線維症の処置方法。
【請求項２８】
前記インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３若しくはＩＦＮ−λ４又はこれらの機能的模倣物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３又はＩＦＮ−λ４の断片、バリアント又は誘導体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記機能的模倣物はペグ化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記機能的模倣物はペグ−インターフェロンラムダ−１ａである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記機能的模倣物は抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記機能的模倣物は低分子化学物質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記インターフェロン−ラムダ又は機能的模倣物は、インターフェロン−ラムダレセプターを活性化させる、請求項２７から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記線維症は腎線維症である、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記線維症は肺線維症である、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記線維症は小腸線維症である、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記線維症は皮膚線維症である、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記線維症は肝線維症である、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記インターフェロン−ラムダ又は機能的模倣物は、別の治療上活性な化合物と組み合わせて投与される、請求項２７から３９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記別の治療上活性な化合物は別の抗線維化治療薬である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は線維症の処置方法に関する。本発明は、インターフェロン−ラムダが、インビトロ及びインビボの両方で直接作用する抗線維化効果を有すること、並びに複数のタイプの線維症の処置に効果的な新規の治療法を提供するために使用され得ることを実証する新規の研究を開示する。
【背景技術】
【０００２】
線維性疾患は、過剰な線維性結合組織が臓器又は組織で形成される異常な創傷治癒反応を特徴とする疾患である。過剰な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（例えば、コラーゲン及びフィブロネクチン）の沈着及び蓄積により、臓器の病理学的リモデリングが引き起こされる組織の硬化及び瘢痕化を生じ、最終的には臓器不全を引き起こし得る。
【０００３】
固形臓器における創傷は概して、創傷部位への好中球、マクロファージ、好酸球及びリンパ球の浸潤を伴う炎症反応を引き起こす内皮損傷、血小板凝集及び活性化から始まる。浸潤性の炎症細胞及び罹患した上皮細胞は、この炎症反応をさらに増幅させるのに役立つ様々な成長因子及びサイトカインを分泌する。ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ及びＩＬ−１３等の分子はマクロファージを活性化し、この創傷部位での線維芽細胞の動員、増殖及び活性化を引き起こす。活性化された線維芽細胞又は筋線維芽細胞はα−平滑筋アクチンの発現を特徴とし、コラーゲン及び他のＥＣＭ成分を分泌して細胞基層（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）を安定化させる。これにより、この一時的なマトリックス上での上皮細胞及び内皮細胞の増殖及び遊走が可能となり、損傷組織が再生される。完了すると、炎症プロセスは停止し、線維芽細胞はアポトーシスを受けて創傷反応が消散する。
【０００４】
線維性リモデリングでは、持続的な組織の傷害若しくは損傷又は修復経路の調節不全により、不適切な創傷反応が引き起こされる。コラーゲン及びＥＣＭの過剰な沈着及び過度な架橋が起こり、その結果、通常の必要量を超えたＥＣＭの過剰な蓄積が起こり、このことは、持続的な筋線維芽細胞活性化、上皮細胞への損傷及び正常組織構造の喪失と関連する。
【０００５】
線維性疾患は、あらゆる臓器又は組織（例えば、腎臓、肺、腸、皮膚、又は肝臓）に影響を及ぼす可能性がある。線維性疾患の原因は、関与する臓器又は組織に依存する可能性があり、突発性肺線維症等の一部の疾患では未知のままである。他のタイプの間質性肺疾患では、過敏性肺炎を引き起こす環境アレルゲンへの曝露等の原因が認識されている。肝線維症、最終的には肝硬変は、環境要因及び食事要因又は感染因子等の様々な要因への曝露を通して持続される慢性的な肝臓損傷に起因する。持続的なアルコールの過剰摂取又は高脂肪／糖質食事もまた、肝臓の肝硬変を引き起こす可能性がある。同様に、糖尿病、高血圧、毒物への曝露、及び様々なタイプの自己免疫疾患は、腎臓に損傷を与えて線維性リモデリング及び機能の喪失を引き起こす可能性がある。多くのタイプの炎症性腸疾患（例えば、クローン病又はセリアック病）は、狭窄及び／又は吸収障害を引き起こす線維性リモデリングの原因となる可能性がある。
【０００６】
進行性線維症の処置は主に、根本的な疾患を処置することによっている。例えば、血圧のコントロール、糖尿病でのグルコース管理の改善、又は有害なアレルゲン若しくは環境要因の除去である。しかしながら、多くの患者では、線維性リモデリングが一旦確立されると、この疾患は自己永続的となり、起因する疾患の単純な改善治療では、このプロセスを停止させることはできない。一部の線維性疾患は抗炎症剤及び免疫抑制剤により処置され得るが、これらは患者のサブセットでのみ有効であり、この疾患を停止させるというよりもむしろ遅延させる。
【０００７】
これまで、線維性リモデリングに有効な治療法はわずか２つであり、これらは両方とも、特発性肺線維症（ＩＰＦ）での使用のみが認可されている。ピルフェニドンは、２００８年に日本において及び２０１１年に欧州において、ＩＰＦの処置での使用に承認された低分子薬剤であり、完全には理解されていないがＴＧＦ−βの下方制御を介して部分的に作用し得る複数の作用機序を介して作用する可能性がある。ニンテダニブは、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター及びＰＤＧＦレセプターでのチロシンキナーゼ活性を阻害するトリアンジオキナーゼ阻害剤である。両方の化合物ともＩＰＦの発症を遅延させるが、現在の研究に基づくと寿命を最大２年延ばすだけである可能性がある。さらに、両方とも重大な副作用と関連しており、その結果、患者の３０％超が長期にわたるそれらの使用を許容し得ない。これまで、線維症の適応症に承認されている標準的治療法は存在しない。
【発明の概要】
【０００８】
従って、現在では、全ての臓器における線維性疾患の処置の改善に対して満たされていない医学的な必要性が存在する。従って、本発明の目的は、線維症の新規の処置方法を提供することである。
【０００９】
２００３年初めのインターフェロン−λ（ＩＦＮ−λ）ファミリの発見及び最初の説明は、ＩＦＮ研究の分野において刺激的な新たなる章を開いた。ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３及びＩＦＮ−λ４と示される４種の異なるが高度に関連したタンパク質が存在する。これらのタンパク質はまた、それぞれインターロイキン−２９（ＩＬ−２９）、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＦＮＬ４としても既知である。まとめて、これら４種のサイトカインはＩＦＮのＩＩＩ型サブセットを構成する。これらは、それらが、Ｉ型又はＩＩ型のＩＦＮにより使用されるレセプターとは異なるヘテロ二量体レセプター複合体を介してシグナル伝達するという事実等の多くの理由のために、Ｉ型及びＩＩ型の両方のＩＦＮとは異なる。Ｉ型ＩＦＮ（ＩＮＦ−ａ／ｂ）及びＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−１）は別々のレセプター複合体を介してシグナル伝達するが、これらは、様々な標的細胞中で、同一の細胞内シグナル伝達経路と、抗ウイルス活性等の多くの同一の生物活性とを活性化させる。これらの抗ウイルス活性と一致して、ＩＦＮ−λ遺伝子及びこの対応するタンパク質の発現は、多くのタイプのウイルスによる感染によって誘発可能である。従って、ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λ）の発現及びこの主要な生物活性は、Ｉ型ＩＦＮと非常に類似する。しかしながら、白血球等のほとんどの細胞型上で広く発現されるＩＦＮ−αレセプターとは異なり、ＩＦＮ−λレセプターは、上皮起源の細胞に主に制限されている。新規抗ウイルス治療薬としてのＩＦＮ−λの潜在的な臨床的重要性は既に明らかである。加えて、いくつかのグループによる前臨床研究は、ＩＦＮ−λは、ある特定のタイプのがん用の潜在的な治療薬としても有用であり得ることを示す。
【００１０】
本発明では、本発明者らは、インターフェロン−ラムダファミリのサイトカインが、インビトロ及びインビボの両方で直接作用する抗線維化効果を有すること、並びにこれらのタンパク質が、複数のタイプの線維症の効果的な新規の処置方法を設計するために使用され得ることを初めて実証する新規の研究を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】腎疾患のアドリアマイシンモデルにおける抗線維化ヒットとしてのＩＬ−２８Ａの同定を示す図である。スクリーニング条件では、マウスＩＬ−２８Ａ（ＩＬＦＮＬ２）を、慢性腎疾患を誘発するためのＩＶ注射によるアドリアマイシンの投与前に、ｃＤＮＡ対（即ち、ＩＬ−２８Ａ  ｃＤＮＡ及び別の未開示のｃＤＮＡ）（全ての処置群に関してｎ＝１５群サイズ）として、流体力学的トランスフェクション（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によりマウスに導入した。コントロールマウスには、アドリアマイシン注射の前に生理食塩水のみをトランスフェクトさせた。マウスを最大４９日間モニタリングし、終了時に腎臓ヒドロキシプロリンレベル（図１（ａ）及び図１（ｂ））並びに血清クレアチニンレベル（図１（ｃ））を測定した（一次スクリーニングに関する条件付き生存データはない）。ヒドロキシプロリン（腎臓１ｍｇ当たりのμｇ）及び血清クレアチン（μｇ／ｍＬ）に関する図面は箱髭図である。中心の横線はデータの中央値を示し、箱は２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまで延びている。「髭」はデータの典型的な範囲をカバーする。正規化されたヒドロキシプロリン（腎臓コラーゲン）は、平均と＋ＳＥＭのエラーバーで示される、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。
【図２】腎疾患のアドリアマイシンモデルにおける抗線維化ヒットとしてのＩＬ−２８Ａの確認を示す図である。マウスＩＬ−２８Ａ（ＩＦＮＬ２）を、慢性腎疾患を誘発するためのＩＶ注射によるアドリアマイシンの投与前に、単一ｃＤＮＡ（全ての処置群に関してｎ＝２２群サイズ）として、流体力学的トランスフェクションによりマウスに導入した。コントロールマウスには、アドリアマイシン注射の前に生理食塩水のみをトランスフェクトさせた。マウスを４９日にわたり経過観察した。終了時に、腎臓ヒドロキシプロリンレベル（図２（ａ）及び図２（ｂ））並びに血清クレアチンレベル（図２（ｃ））を測定し、この研究期間全体にわたり条件付き生存データを記録した（図２（ｄ））。ヒドロキシプロリン（腎臓１ｍｇ当たりのμｇ）及び血清クレアチン（μｇ／ｍＬ）に関する図面は箱髭図である。中心の横線はデータの中央値を示し、箱は２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまで延びている。「髭」はデータの典型的な範囲をカバーする。正規化されたヒドロキシプロリン（腎臓コラーゲン）は、平均と＋ＳＥＭのエラーバーで示される、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。
【図３】腎疾患のアドリアマイシンモデルにおける抗線維化ヒットとしてのＩＬ−２８Ｂの同定を示す図である。一次スクリーニングでは、マウスＩＬ−２８Ｂ（ＩＬＦＮＬ３）を、アドリアマイシンの前に、ｃＤＮＡ対（全ての処置群に関してｎ＝１５群サイズ）として、流体力学的トランスフェクションによりマウス群に導入し、このマウスを最大４９日間モニタリングし、終了時に腎臓ヒドロキシプロリンレベル（図３（ａ）及び図３（ｂ））並びに血清クレアチニンレベル（図３（ｃ））を測定した（この一次スクリーニングに関する条件付き生存データはない）。コントロールマウスには、アドリアマイシン注射の前に生理食塩水のみをトランスフェクトさせた。ヒドロキシプロリン（腎臓１ｍｇ当たりのμｇ）及び血清クレアチン（μｇ／ｍＬ）に関する図面は箱髭図である。中心の横線はデータの中央値を示し、箱は２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまで延びている。「髭」はデータの典型的な範囲をカバーする。正規化されたヒドロキシプロリン（腎臓コラーゲン）は、平均と＋ＳＥＭのエラーバーで示される、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。
【図４】腎疾患のアドリアマイシンモデルにおける抗線維化ヒットとしてのＩＬ−２８Ｂの確認を示す図である。マウスＩＬ−２８Ｂ（ＩＦＮＬ３）を、アドリアマイシンの前に、単一クローン（各処置群においてｎ＝２２群サイズ）として、流体力学的トランスフェクションによりマウス群に導入し、このマウスを最大４９日間経過観察した。コントロールマウスには、アドリアマイシン注射の前に生理食塩水のみをトランスフェクトさせた。終了時に、腎臓ヒドロキシプロリンレベル（図４（ａ）及び図４（ｂ））並びに血清クレアチンレベル（図４（ｃ））を測定し、この研究期間全体にわたり条件付き生存データを記録した（図４（ｄ））。ヒドロキシプロリン（腎臓１ｍｇ当たりのμｇ）及び血清クレアチン（μｇ／ｍＬ）に関する図面は箱髭図である。中心の横線はデータの中央値を示し、箱は２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまで延びている。「髭」はデータの典型的な範囲をカバーする。正規化されたヒドロキシプロリン（腎臓コラーゲン）は、平均と＋ＳＥＭのエラーバーで示される、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。
【図５】腎疾患のアドリアマイシンモデルにおける抗線維化としてのＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２８Ａの組織学的確認を示す図である。終了時に、図２及び図４で説明した研究からの腎臓をＮＢＦで固定し、パラフィン包埋し、薄片を作り、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）、又はマッソントリクローム（ｍａｓｏｎｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）（ＭＴ）のいずれかで染色した。次いで、スライドをＨａｍａｍａｔｓｕスライドスキャナで撮像した。ＰＳＲ染色した腎臓薄片の代表的な画像を、１匹の未処置マウス、３匹の生理食塩水アドリアマイシン処置マウス、及びＩＬ−２８Ｂも投与した３匹のアドリアマイシン処置マウスに関して図５（ａ）でＩＬ−２８Ｂの場合を示し、１匹の未処置マウス、３匹の生理食塩水アドリアマイシン処置マウス、及びＩＬ−２８Ａも投与した３匹のアドリアマイシン処置マウスに関して図５（ｆ）でＩＬ−２８Ａの場合を示す。ＩＬ−２８Ｂ群（１０匹の未処置マウス、１８匹の生理食塩水マウス、及び２２匹のＩＬ−２８Ｂ処置マウス）、並びにＩＬ−２８Ａ群（８匹の未処置マウス、２０匹の生理食塩水マウス、及び１９匹のＩＬ−２８Ａ処置マウス）の両方の全ての最終マウス腎臓薄片を撮像し、ＰＳＲ染色によりカバーされる総領域を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析プラットフォームを使用して推定し、それぞれ図５（ｂ）及び図５（ｇ）に示す。加えて、全てのスライドを、線維症の分野の別々の専門家（２人の科学者、及び１人の臨床病理医）により線維症に関して手動で採点してもらい、病理スコアを、Ｈ＆Ｅ染色（図５（ｃ））並びにＰＳＲ染色（図５（ｄ）及び図５（ｅ））からＩＬ−２８Ｂに関して、並びにＰＳＲ染色（図（ｈ））及びＭＴ染色（図（ｉ））からＩＬ−２８Ａに関して算出した。倍率＝×１００。
【図６ａ】インビトロのＥＣＭ線維症モデルにおける肝臓中でのＩＬ−２８Ａの効果を示す図である。ヒト初代星状細胞（１０００個の細胞／ウェルで播種した）を、５日にわたる培養でＩＬ−２８Ａにより処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図６ｂ】インビトロのＥＣＭ線維症モデルにおける肝臓中でのＩＬ−２８Ａの効果を示す図である。ヒト初代肝細胞との共培養でのヒト初代星状細胞（１０００個の細胞／ウェル、１：１比で播種した、）を、５日にわたる培養でＩＬ−２８Ａにより処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図７ａ】インビトロのＥＣＭ線維症モデル及びＴＧＦβにおける肝臓中でのＩＬ２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効果を示す図である。ヒト初代星状細胞（１０００個の細胞／ウェル）を、２５０ｐｇ／ｍｌでのＴＧＦβの存在下にて、５日にわたる培養でＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂにより処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図７ｂ】インビトロのＥＣＭ線維症モデル及びＴＧＦβにおける肝臓中でのＩＬ２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効果を示す図である。ヒト初代肝細胞との共培養でのヒト初代星状細胞（１０００個の細胞／ウェル、１：１比）を、２５０ｐｇ／ｍｌでのＴＧＦβの存在下にて、５日にわたる培養でＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂにより処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図８】ＴＧＦβ１により刺激された星状細胞−肝細胞共培養ＥＣＭにおけるＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効果を示すハイコンテントイメージを示す図である。ＴＧＦβ１（２５０ｐｇ／ｍｌ）で刺激した、初代肝細胞との共培養でのヒト初代星状細胞（１０００個の細胞／ウェルの最終細胞濃度での１：１の比）を、５日にわたり、単独で培養した（ＴＧＦβ１共培養）、又は１００００、１０００、１００若しくは１０ｎｇ／ｍｌにてＩＬ−２８Ａ若しくはＩＬ−２８Ｂで処理した。示す画像は、各条件に関する１６の視野のうちの１つの代表的な視野からである。拡大を×１０の対物レンズで実施した。
【図９】ＴＧＦβ１により刺激された小腸線維芽細胞ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９の効果を示す図である。ヒト初代小腸線維芽細胞（２０００個の細胞／ウェル）を、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下にて、７日にわたる培養でＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ又はＩＬ−２９（全て１０ｎｇ／ｍｌ）により処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図１０】皮膚ケラチノサイト−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの阻害％を示す図である。３つの個々のバッチからのヒト初代真皮線維芽細胞を初代ヒトケラチノサイトと共培養し（１５００個の細胞／ウェルの最終細胞濃度での９：１の比）、７日にわたりＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂの漸増量で処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。３つのバッチからの正規化されたデータを阻害％として算出し、平均±ＳＤとしてプロットした。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅで測定し、ケラチノサイトとの共培養での３つの線維芽細胞バッチをコントロール共培養に対して正規化し、データを平均化して倍率変化を得た。
【図１１】皮膚ケラチノサイト−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９の効果を示す図である。初代ヒトケラチノサイトとの共培養でのヒト初代真皮線維芽細胞（１５００個の細胞／ウェルの最終細胞濃度での９：１の比）を、１２５０〜１００００ｎｇ／ｍｌのサイトカインの濃度範囲で、７日にわたりＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂで処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅで測定した。
【図１２】皮膚ケラチノサイト−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９の効果を示すハイコンテントイメージを示す図である。初代ケラチノサイトとの共培養での、代表的なドナーからのヒト初代真皮線維芽細胞（１５００個の細胞／ウェルの最終細胞濃度での９：１の比）を、７日にわたり、単独で培養した（コントール）、又は１００００若しくは１２５０ｎｇ／ｍｌにてＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ若しくはＩＬ−２８Ｂで処理した。画像は、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶ  ＥＣＭマトリックスタンパク質からのシグナルの組合わせを示し、１つの条件当たり合計１６の視野からの１つの代表的な視野を示す。拡大を×１０の対物レンズで実施した。
【図１３】ＩＬ−１αにより刺激された皮膚線維芽細胞ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効果を示す図である。ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激したヒト初代真皮線維芽細胞（１５００個の細胞／ウェル）を、７日にわたる培養でＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂの漸増量により処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅで測定した。データは、２つの異なる線維芽細胞バッチのうちの１つを表す。
【図１４ａ】腎臓ＲＰＴＥＣ−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９の効果を示す図である。７日にわたり、ヒト初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を初代ヒト腎線維芽細胞と共培養し（２０００個の細胞／ウェルの最終播種細胞濃度で１：１の比）、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂで処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅで測定した。ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、又はＩＬ−２８Ｂのいずれかを、０日目にＲＰＴＥＣ及び線維芽細胞の共培養物に添加した。
【図１４ｂ】腎臓ＲＰＴＥＣ−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９の効果を示す図である。７日にわたり、ヒト初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を初代ヒト腎線維芽細胞と共培養し（２０００個の細胞／ウェルの最終播種細胞濃度で１：１の比）、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂで処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅで測定した。ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、又はＩＬ−２８Ｂのいずれかを、線維芽細胞と組み合わせる２４時間前にＲＰＴＥＣに添加した。
【図１４ｃ】腎臓ＲＰＴＥＣ−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９の効果を示す図である。７日にわたり、ヒト初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を初代ヒト腎線維芽細胞と共培養し（２０００個の細胞／ウェルの最終播種細胞濃度で１：１の比）、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂで処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅで測定した。ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、又はＩＬ−２８Ｂのいずれかを、ＲＰＴＥＣと組み合わせる２４時間前に線維芽細胞に添加した。
【図１５ａ】腎臓ＲＰＴＥＣ−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９の効果への添加形式の比較を示す図である。図１４で示したデータを、１つのグラフにおいて３つの異なる添加プロトコルを使用して、腎臓共培養細胞系中でのＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９の効果を示すように再プロットし、ここで、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、又はＩＬ−２９を、ＲＰＴＥＣ及びＨＲＦの一緒の共培養物に添加し（共培養物と称する）、最初にＲＰＴＥＣに添加し、２４時間後にＨＲＦを導入し（最初にＲＰＴＥＣを添加と称する）、最初にＨＲＦに添加し、２４時間後にＲＰＴＥＣを導入し（最初にＨＲＦを添加と称する）、共培養を７日にわたり続けて、図１５（ａ）に再プロットしたフィブロネクチンのデータと共にそれぞれ再プロットした。各サイトカインに関して、添加順序（共培養物、最初にＲＰＴＥＣ、及び最初にＨＲＦ）と用量（０〜１００００ｎｇ／ｍｌ）との間の差異を説明する分散分析を使用して、ＥＣＭマーカーを分析した。分析後比較を実施し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用して、報告されたｐ値を調整した。全ての分析を、ＳＡＳ  ｖ９．４（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して実施した。グラフ上において、有意に達するサイトカインの用量を、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５で示す。
【図１５ｂ】腎臓ＲＰＴＥＣ−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９の効果への添加形式の比較を示す図である。図１４で示したデータを、１つのグラフにおいて３つの異なる添加プロトコルを使用して、腎臓共培養細胞系中でのＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９の効果を示すように再プロットし、ここで、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、又はＩＬ−２９を、ＲＰＴＥＣ及びＨＲＦの一緒の共培養物に添加し（共培養物と称する）、最初にＲＰＴＥＣに添加し、２４時間後にＨＲＦを導入し（最初にＲＰＴＥＣを添加と称する）、最初にＨＲＦに添加し、２４時間後にＲＰＴＥＣを導入し（最初にＨＲＦを添加と称する）、共培養を７日にわたり続けて、図１５（ｂ）に再プロットしたコラーゲンＩ＆ＩＩＩのデータと共にそれぞれ再プロットした。各サイトカインに関して、添加順序（共培養物、最初にＲＰＴＥＣ、及び最初にＨＲＦ）と用量（０〜１００００ｎｇ／ｍｌ）との間の差異を説明する分散分析を使用して、ＥＣＭマーカーを分析した。分析後比較を実施し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用して、報告されたｐ値を調整した。全ての分析を、ＳＡＳ  ｖ９．４（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して実施した。グラフ上において、有意に達するサイトカインの用量を、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５で示す。
【図１６】腎臓ＲＰＴＥＣ−線維芽細胞共培養ＥＣＭにおけるＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９の効果を示すハイコンテントイメージを示す図である。初代ヒト腎線維芽細胞との共培養のヒト初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）（播種時での２０００個の細胞／ウェルの最終細胞濃度での１：１の比）を、７日にわたり、単独で培養した（コントロール）、又は１０００、１００、若しくは１０ｎｇ／ｍｌにてＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、若しくはＩＬ−２８Ｂで処理した。図１４（ｂ）に示すように培養物中への線維芽細胞の包含の２４時間前に、ＲＰＴＥＣにサイトカインを添加した。示す画像は、各条件に関する合計１６の視野のうちの１つの代表的な視野からである。拡大を×１０の対物レンズで実施した。
【図１７】肺ＳＡ上皮−線維芽細胞共培養ＥＣＭインビトロモデルにおけるＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効果を示す図である。ヒトＩＰＦ初代肺線維芽細胞との共培養の初代ヒト小気道肺上皮細胞（ＳＡ上皮）（播種時での２０００個の細胞／ウェルの最終細胞濃度での１：１比）を、７日にわたりＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂで処理した。細胞を除去し、免疫蛍光標識によりＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定し、フラミンゴピンク染色で総ＥＣＭタンパク質を同定した。撮像及び定量をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎで実施した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅにより測定し、蛍光を読み取った。
【図１８】ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、及びＩＦＮＬ４のタンパク質及びＤＮＡ配列を示す図である。ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、及びＩＦＮＬ４のタンパク質配列をＵｎｉｐｒｏｔデータベースから得て、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、及びＩＦＮＬ４のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋからであった。
【図１９】肝線維症のインビトロヒト肝星状細胞及び上皮細胞共培養モデルにおけるＩＬ−２８Ａ、及びＩＬ−２９の効果を示す図である。５日にわたり、ヒト初代星状細胞及び初代肝内胆管上皮細胞を１０００個の細胞／ウェル（１：１比）で共培養し、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２９で処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図２０】糸球体硬化症のインビトロ３Ｄ糸球体スフェロイドモデルにおける有足細胞生存へのＩＬ−２８Ａの効果を示す図である。（ａ）３Ｄ糸球体スフェロイドは、ＧＦＰ標識ヒト有足細胞により囲まれたヒト糸球体内皮細胞の内核で構成された。（ｂ）スフェロイドを培地中で増殖させた、又は１５％最終濃度プラスマイナスヒトＩＬ−２８Ａタンパク質の存在下で、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）患者血漿で処理した。各実験において、及び各条件に関して、少なくとも５つのスフェロイドを撮像した。（ｃ）次いで、これらのスフェロイドの２Ｄ最大強度投影（ＭＩＰ）を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析を使用して解析して、様々な培養条件下において緑色チャネルでの閾値強度を超えるマーカー領域を定義し、全スフェロイド領域の割合としての細胞マーカー領域としてプロットした。有足細胞の７％がＧＦＰ標識されていた。
【図２１】マウスＩＬ−２８Ｂの流体力学的トランスフェクションはマウス片側尿管閉塞（ＵＵＯ）腎線維症モデルにおいて線維症を防ぐことを示す図。マウスを、ＵＵＯ手術し（ＵＵＯ手術コントロールＨＤＴ、ｎ＝１０）、手術せず（非ｏｐ、ｎ＝５）、ＵＵＯ手術したが予防的投与のために−１日目にＩＬ−２８Ｂで処置し（ＩＬ−２８Ｂ  ＨＤＴ  −１日、ｎ＝１０）、又は治療的投与のために７日目にＩＬ−２８Ｂで処置し（ＩＬ−２８Ｂ  ＨＤＴ  ７日、ｎ＝１０）、全ての動物を２１日目に屠殺し、腎臓を摘出し、ＮＢＦで固定し、パラフィン包埋し、薄片を作り、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）で染色した。次いで、スライドをＨａｍａｍａｔｓｕスライドスキャナで撮像した。ＰＳＲ染色した腎臓薄片の代表的な画像を、１匹の正常マウス、２匹のＵＵＯ手術コントロールマウス、２匹のＵＵＯ手術及び−１日目にＩＬ−２８Ｂ処置マウス、又は流体力学的トランスフェクションによる、２匹のＵＵＯ手術及び７日目ＩＬ−２８Ｂ処置マウスに関して図２１（ａ）に示す。全ての最終マウス腎臓薄片（５匹×非手術、１０匹×ＵＵＯコントロール、１０匹×ＵＵＯ  −１日目にＩＬ−２８Ｂ、及び１０匹×ＵＵＯ  ７日目にＩＬ−２８Ｂ処置マウス）を撮像し、ＰＳＲ染色によりカバーされる総領域を、総染色領域（図２１（ｂ））又は高強度染色領域（図２１（ｃ））を読み取るＤｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析プラットフォームを使用して推定した。コラーゲン領域％を、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定を使用してＳＥＡＰコントロ−ルと比較した処置群による平均±ＳＥＭとして示す、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。ＳＥＡＰ＝分泌型アルカリホスファターゼコントロ−ルタンパク質
【図２２】腎線維症のインビトロヒト腎近位尿細管上皮細胞単培養モデルにおけるＩＬ−２９の効果を示す図である。５日にわたり、ヒト初代腎近位尿細管上皮細胞を２０００個の細胞／ウェルで共培養してＩＬ−２９で処理した。細胞を除去し、撮像を伴う免疫蛍光標識、及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎによる定量により、ＥＣＭタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶを測定した。データは、４つの別々のウェルの平均±ＳＤとしてプロットされた平均総強度を示す。
【図２３】流体力学的トランスフェクションによるヒトＩＬ−２９での処置は腎線維症のマウス片側尿管閉塞モデルにおいて尿細管間質性線維症を防ぐことを示す図である。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、ＳＥＡＰを含むコントロールベクター（ｎ＝１０）又はヒトＩＬ−２９構築物を含むベクター（ｎ＝９）による流体力学的トランスフェクションに供した。トランスフェクションの２４時間後、マウスを左腎臓の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供した、又はマウスを手術しなかった（ｎ＝４）７日後、流体力学的トランスフェクションを繰り返し、ＵＵＯの１９日後に動物を処分した。図２３（ａ）：血清サンプルを、０日目（トランスフェクションの２４時間後）にマウスから採取し、１９日目に再度採取し、ヒトＩＬ−２９タンパク質に関して分析した。０日目のＵＵＯ  ＩＬ−２９群、最終Ｄ１９  ＵＵＯ  ＳＥＡＰ群、及び最終ＵＵＯ  ＩＬ−２９群におけるＩＬ−２９レベルと比較して、ヒトＩＬ−２９レベルをプロットした。腎臓を回収し、ＮＢＦで固定し、パラフィン包埋し、薄片を作り、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）で染色し、次いでスライドをＨａｍａｍａｔｓｕスライドスキャナで撮像した。図２３（ｂ）は、１００×（上方の列）及び２００×（下方の列）倍率で示す、正常腎臓、コントロールＳＥＡＰ含有ベクター又はヒトＩＬ−２９含有ベクターのいずれかでトランスフェクトしたＵＵＯ腎臓からの代表的な画像を示す。全ての最終マウス腎臓薄片（４匹×非手術、１０匹×ＵＵＯ  ＳＥＡＰコントロール、９匹×ＵＵＯ  −１日目にＩＬ−２９）を撮像し、ＰＳＲ染色によりカバーされる総領域を、総染色領域を読み取るＤｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析プラットフォームを使用して推定した（図２３（ｃ））。コラーゲン領域％を、未補正のＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ比較検定を使用してＵＵＯ＋ＳＥＡＰコントロール群と比較したＩＬ−２９処置群による平均±ＳＥＭとして示す、＊＊＝ｐ＜０．０１。ＳＥＡＰ＝分泌型アルカリホスファターゼコントロ−ルタンパク質
【発明を実施するための形態】
【００１２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学用語及び技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で参照される全ての刊行物及び特許は、参照により組み込まれる。
【００１３】
本明細書で説明された実施形態のうちのいずれかを組み合わせ得ることが認識されるだろう。
【００１４】
本発明は、線維症の処置での使用のためのインターフェロン−ラムダを提供する。本発明はまた、線維症の処置用の薬剤の調製のためのインターフェロン−ラムダの使用も提供する。本発明は、治療上有効な量のインターフェロン−ラムダを投与するステップを含む、線維症の処置方法をさらに提供する。
【００１５】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染からの宿主保護及び免疫反応調節において多様な役割を有する、サイトカインの重要なクラスである。３種の異なる型のインターフェロンが、それらの構造的特徴、レセプターの使用、及び生物活性に基づいて認識されており（Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型）、宿主防御におけるこれらの役割は、異なる型の間で異なる。
【００１６】
Ｉ型ＩＦＮ（ヒトにおけるＩＦＮ−α／β／ω／ε／κ）は強い抗ウイルス活性を有し、多種多様な細胞型において強力な抗ウイルス反応を誘発し得る（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）。ＩＦＮ−α／βは、ＩＦＮαＲ（ＩＦＮＡＲ１サブユニット及びＩＦＮＡＲ２サブユニットで構成されている）と呼ばれるヘテロ二量体膜貫通レセプターに結合し、リガンドと会合すると、キナーゼ、ＪＡＫ１及びＴＹＫ２の活性化を引き起こし、次いで、このレセプターの細胞内ドメイン中の特定のチロシンをリン酸化する。これにより、ＳＴＡＴ１シグナル伝達分子及びＳＴＡＴ２シグナル伝達分子のためのドッキング部位が作られ、これらの動員及びそれに続くリン酸化が引き起こされる。リン酸化されたＳＴＡＴはＩＦＮ調節因子９（ＩＲＦ９）を動員し、これらは一緒にＩＦＮ刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）を形成し、この因子は核中に入ってＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の転写を駆動する。
【００１７】
ＩＩ型クラスにはＩＦＮ−γのみが含まれ、このＩＦＮ−γは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）等の病原性微生物に対する宿主防御にとって重要である細胞媒介性免疫反応を刺激し（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）、腫瘍免疫において中心的役割を果たし、且つＩ型ＩＦＮの抗ウイルス活性を増幅させるＴｈ１型サイトカインとして分類される。従って、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩ型ＩＦＮは、感染及び腫瘍浸潤の両方に対して宿主を防御する目的で、先天性免疫反応及び適応的免疫反応の両方を活性化させるために一緒に働く（Ｂｉｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。
【００１８】
ＩＦＮは、下記の６種のＩＬ−１０関連サイトカイン：ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４及びＩＬ−２６を含むＩＩ型サイトカインのより大きなファミリの一部であり（Ｋｏｔｅｎｋｏ  ２００２）、これらは、細胞外ドメイン中の共通モチーフを共有するセレプターを介してシグナル伝達することから一緒に分類される。これらのレセプターはＩＩ型サイトカインレセプターファミリ（ＣＲＦ２）を含み、典型的には、２種の異なるレセプター鎖（αレセプターサブユニット及びβレセプターサブユニット）で構成されたヘテロに量体である（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）。一般に、αサブユニットは主要なサイトカイン結合タンパク質であり、βサブユニットは高親和性結合部位の形成及びシグナル伝達に必要とされている。
【００１９】
ＩＩＩ型ＩＦＮ又はＩＦＮ−λは、ＣＲＦ２ファミリについ最近追加されたものである。これはＩＬ−１０関連サイトカインの構造的特徴を示し、Ｉ型ＩＦＮと比べて制限された細胞集団（即ち、上皮細胞及びある特定の免疫細胞）で抗ウイルス活性を誘発する（Ｋｏｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。ヒトでは、ＩＩＩ型ＩＦＮファミリは下記の４種の密接に関連したタンパク種：ＩＦＮ−λ１、−λ２、−λ３及び−λ４（それぞれＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＦＮＬ４としても既知である）で構成されているが、マウスはＩＦＮ−λ２及び−λ３（それぞれＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂ）のみを有する。これらの相同性は非常に高く、ＩＦＮ−λ２とＩＦＮ−λ３との間のアミノ酸同一性は約９６％であり、ＩＦＮ−λ１とＩＦＮ−λ２／λ３との間の同一性は約８１％である。ＩＦＮ−λ４はＩＦＮ−λ３に最も密接に似ているが、これらのタンパク質は約３０％の同一性しか共有しておらず、ＩＦＮ−λ４は主に細胞内に存在し、ヒトでの分泌は非常に不十分である（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６）。
【００２０】
ＩＦＮ−λレセプター複合体は、特有のＩＦＮ−λセレプター鎖１（ＩＦＮ−λＲ１又はＩＬ−２８ＲＡ）及び共有のＩＬ−１０レセプター鎖２（ＩＬ−１０Ｒ２又はＩＬ−１０Ｒβ）で構成されている。４種のリガンドのうちのいずれかのＩＦＮ−λレセプター複合体への会合により、ＪＡＫ１及びＴＹＫ２が活性され、転写因子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及びＩＲＦ９が活性化されてＩＦＮ−刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）が形成される。ＩＳＧＦ３は、抗ウイルス表現型と関連する多くの遺伝子（例えば、ＯＡＳ１、ＭＸ１、ＥＩＦ２ＡＫ２（二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ）及びＩＲＦ７）を含む数百のＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）のプロモーター中のＩＦＮ刺激要素（ＩＳＲＥ）への結合により、遺伝子転写を調節する。比較ｃＤＮＡマイクロアレイ分析により、ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λ）により誘発される遺伝子のレパートリーは、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α／β）により誘発されるものと本質的に同一であることが示されている（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）。結論として、異なるレセプターの使用にもかかわらず、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方ともＩＳＧＦ３を活性化し（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）、従って同様の転写反応を誘発する。
【００２１】
Ｉ型ＩＦＮ又はＩＩＩ型ＩＦＮのいずれかにより誘発される遺伝子発現のパターンは非常に類似しているが、ＩＦＮ−αにより誘発される遺伝子発現の相対的な大きさはＩＦＮ−λと比べて大きい場合が多い。このことは、Ｉ型レセプター対ＩＩＩ型レセプターを介するシグナル伝達の相対的強度の差異を反映しているか、又はこれらのリガンドに対するそれぞれのレセプターの発現レベルの差異を単に反映している可能性がある。
【００２２】
ＩＦＮ−λの結晶構造は、ＩＩ型サイトカインに典型的な４ヘリックス束構造を明らかにし、ＩＦＮ−λの最も近い構造類似体はＩＬ−２２であり（Ｇａｄ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）、ＩＦＮ−λ及びＩＬ−２２はそれぞれウイルス感染及び細菌感染に対して上皮組織を保護する並行機能を有することを示唆する可能性がある。ＩＦＮ−λＲ１レセプター鎖上の結合部位は４種全てのＩＦＮ−λの間で良く保存されているが、ＩＬ−１０Ｒ２上の結合部位の定義は不十分である（Ｍｉｋｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。ＩＦＮ−λＲ１は、それぞれ約１００個のアミノ酸の２つの異なるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインからなる。リガンド−レセプター界面は、ＩＦＮ部位上のヘリックスＡ、ループＡＢ及びヘリックスＦと、主にＩＦＮ−λＲ１のＮ末端ドメイン及びドメイン間ヒンジ領域由来のループとを含む。リガンドとレセプターとの間の結合様式は、水素結合を介して媒介される初期の長距離イオン相互作用を支持し、次いで、フィットを完成させるための疎水性相互作用が続く。
【００２３】
ＩＦＮλは、ウイルス感染に反応して様々な造血細胞及び上皮細胞により発現される。粘膜上皮表面上の侵入ウイルスを検出するパターン認識レセプターは、転写因子ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＭｅｄ２３を介して転写反応を開始する（Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  ２００７，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。粘膜界面での抗ウイルス防御の媒介におけるＩ型ＩＦＮ及びＩＩＩ型ＩＦＮの役割は、ウイルス及び侵入点に応じて、冗長及び独特の両方であることが示されている。腸上皮細胞は、ロタウイルス等の上皮親和性ウイルスの制御を非冗長的に媒介するＩＩＩ型ＩＦＮに排他的に反応する（Ｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１）。レオウイルスは腸上皮で感染し始めるが、マウスでは腸上皮層を通過して全身感染を引き起こす可能性があり、ＩＩＩ型ＩＦＮは腸上皮における初期複製を制限するが、Ｉ型ＩＦＮは全身感染の予防に不可欠である（Ｍａｈｌａｋｏｉｖ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。２種のＩＦＮ系の間にある程度の冗長性が存在する気道では、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩＩ型ＩＦＮの区分はあまり明確ではない（Ｍｏｒｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）。そのため、気道上皮は両方のＩＦＮ型のレセプターを発現するが、腸上皮はＩＦＮ−λレセプターのみを発現する。
【００２４】
ＩＦＮ−λＲ１レセプター発現は、ある特定のシナリオでは、主に上皮細胞並びにある特定の免疫細胞サブセット（例えば、単球由来のマクロファージ、形質細胞様樹状細胞及びＮＫ細胞）に制限されている。ＮＫ細胞中でのＩＮＦ−λＲ１の活性化はＩＦＮ−λの最大産生及び抗腫瘍活性に関連しており、これらは、他の刺激と相乗的に又は他の細胞型と組み合わせて媒介される効果であり得る（Ｓｏｕｚａ−Ｆｏｎｓｅｃａ−Ｇｕｉｍａｒａｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。ＩＦＮ−λＲ１発現が免疫細胞及び上皮細胞に制限されているために、ＩＩＩ型ＩＦＮの免疫調節効果は限定されるが、局所粘膜反応がウイルスを制御するのに十分である場合には、非常に効果的な抗ウイルスである。このことは、感染に対する反応の最中でのＩ型ＩＦＮの遍在的活動とは対照的であり、従って、幅広い免疫活性化が必要である重症の又は全身性の感染の制御においてより適切である。
【００２５】
下記の参考文献は、Ｉ型インターフェロンとＩＩＩ型インターフェロンとの間のシグナル伝達効果及び生物学的効果の差異を説明している：Ｗａｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５、Ｃｈｏｗ  ＆  Ｇａｌｅ  ２０１５、Ｈｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７、Ｂｒｏｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７、Ｂｌｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７、Ｃｈｉｒｉａｃ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７、Ｂｈｕｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７、Ａｎｄｒｅａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７及びＢｈｕｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７。
【００２６】
抗ウイルス療法へのＩＦＮ−λの寄与は、マウス及びチンパンジーでの前臨床モデルで利用可能なデータ、並びにＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した初代ヒト幹細胞においてインビトロで利用可能なデータ（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）、並びにヒト臨床試験で利用可能なデータ（ＰｈＩＩ  ＢＭＳデータ）で十分に確立されている。ＩＦＮ−λにより標的とされ得るウイルスの範囲は、下記を含むがこれらに限定されない：インフルエンザＡ／Ｂ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、コロナウイルス、Ｈ１Ｎ１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ノロウイルス、ロタウイルス及びエボラ（Ｅｓｌａｍ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ  ２０１５；Ｇｒｅｓｓｅｒ  ２０１５）。これらのウイルスは全て上皮侵入点を標的としており、治療では、このアクセスポイントでＩＦＮ−λＲ１レセプター複合体を活性化させ得るＩＦＮ−λの標的となる可能性がある。
【００２７】
多数の前臨床研究により、ＩＦＮ−λが様々な腫瘍タイプ（例えば、肝がん、黒色腫、食道癌、神経内分泌腫瘍、結腸直腸癌、肺腺癌、及びバーキットリンパ腫）で抗腫瘍活性を有することが実証されている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００６、Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６、Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。ＩＦＮ−λの抗腫瘍メカニズムは、アポトーシスの腫瘍細胞誘発、並びに先天性免疫刺激活性及び適応的免疫刺激活性の両方を後押しするための免疫細胞への直接効果である。ＩＦＮ−λは腫瘍微小環境中で誘発され、ＩＦＮ−λＲ１レセプターを介するシグナル伝達は、移植腫瘍モデルにおいて肉腫形成及び死亡に対してより感受性であるＩＦＮ−λＲ１ノックアウトマウスにおいて抗腫瘍の役割を果たすことが示されている。ＩＦＮ−λ処置により、致死性が遅延し、肉腫の発達が抑えられた（Ｎｕｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）。がんの処置という背景において、ＩＦＮ−λは、免疫チェックポイント阻害剤である現在のＩＦＮ−α療法を補完するか、又は従来の抗がん剤（例えば、ボルテゾミブ、テモゾロミド、シスプラチン若しくは５−ＦＵ）の補助剤として想定される可能性がある（Ｇｕｅｎｔｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。
【００２８】
遺伝的証拠及び機能的証拠は、炎症性疾患（例えば、喘息、乾癬及び関節リウマチ）におけるＩＦＮ−λの保護的役割を示唆している。喘息のマウスモデルでは、ＩＦＮ−λは疾患重症度を最小限に抑え、好酸球浸潤を低減させ、並びにＴｈ２サイトカイン及びＴｈ１７サイトカインから離れるＴｈ１免疫傾斜効果が実証された（Ｋｏｌｔｓｉｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１）。マウスコラーゲン誘発型関節炎モデルでは、ＩＦＮ−λ２処置により、ＩＬ−１応答及びＩＬ−１７応答の抑制による疾患の抑止、並びに好中球動員が引き起こされた（Ｂｌａｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。乾癬病変では、Ｔｈ１７細胞はＩＦＮ−λの供給源であることが示されており、ＩＦＮ−λはＴｈ２サイトカインＩＬ−１３を抑制し得る（Ｗｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。炎症性疾患及び自己免疫疾患におけるＩＦＮ−λの役割は、依然として不明瞭である。
【００２９】
ＨＣＶに関する３つの画期的なゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、ＩＦＮ−λ領域における一塩基多型（ＳＮＰ）が、ペグ化ＩＦＮ−λ１／リバビリン（ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ）療法及び慢性ＨＣＶ感染の自発的クリアランスに対する両方の応答の最も強い単一予測因子であることが実証されている。このＳＮＰはＩＦＮＬ３／ＩＦＮＬ４遺伝子座に位置しており、全てのＨＣＶ遺伝子型に対して及び全ての地理的位置において有効であることが示されている（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００９、Ｓｕｐｐｉａｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００９、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。全ての抗ウイルス療法（第一世代及び第二世代の両方の直接作用型抗ウイルス薬を含む）に対する処置結果の予測におけるＩＦＮＬ３／ＩＦＮＬ４遺伝子型の役割はまた、ＣＭＶ、ＨＳＶ及びＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）等の他のウイルス感染の広範なリスト並びにＨＣＶ／ＨＩＶ及びＨＣＶ／ＨＢＶとの同時感染にまで及ぶ（Ｒａｌｌｏｎ  ｅｔ  ２０１０、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。データは、様々な臓器（特に上皮起源のもの）でのウイルス感染の制御におけるＩＦＮ−λの主な役割と一致している。
【００３０】
Ｃ型肝炎ウイルス感染及びＢ型肝炎ウイルス感染並びに非アルコール性脂肪肝疾患における、肝線維症での２種のＳＮＰ（即ち、ｒｓ１２９７９８６０及びｒｓ８０９９９１７「レスポンダー」遺伝子型）の役割、並びに肝臓の炎症及び線維症の促進に関する証拠が存在する（Ｂｏｃｈｕｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２、Ｅｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。
【００３１】
ＩＦＮＬ３／ＩＦＮＬ４領域における２種の機能的バリアントは最初のＧＷＡＳ発見につながっていると説明されているが、まだ同定されていない多くの他の寄与因子が存在し得る。第１のＳＮＰは、ＩＦＮ−λ４の産生を制御し、ＨＣＶクリアランスも予測するΔＧ／ＴＴ（ｒｓ３６８２３４８１５）である（Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ−Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。祖先の「ΔＧ」対立遺伝子は機能的ＩＦＮ−λ４をコードし、ＨＣＶクリアランスを損ない、従ってウイルス量が増加するが、ｒｓ３６８２３４８１５の（進化的な用語で）より最近の「ＴＴ」対立遺伝子はＩＦＮＬ４のオープンリーディングフレームを破壊し（タンパク質発現の破壊）、ウイルスクリアランスの改善と関連している。この見掛け上のパラドックスは、主に細胞内局在化及びＩＦＮＬ４の不十分な分泌、並びにＩＦＮＬ４は分泌を阻害し得、従って他のＩＦＮ−λファミリメンバーの機能を阻害し得るという示唆と関係し得る。ＩＦＮＬ３の３’ＵＴＲ領域中の第２のＳＮＰ（ｒｓ４８０３２１７）は、ＩＦＮＬ３のメッセンジャーＲＮＡの安定性に影響を及ぼす（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。肝線維症の予測におけるこれらのバリアントの役割は、特に非ＨＣＶコホートにおいて未知であるが、これらはｒｓ１２９７９８６０と連鎖不均衡であり、そのため、何らかの関連があるかどうかを示すためにはさらなる研究が必要である。
【００３２】
まとめると、今日まで、ＩＦＮ−λは、抗ウイルス活性及び抗腫瘍活性、免疫炎症機能、並びに恒常性効果を有すると説明されている。本発明において、本発明者らは、ＩＦＮ−λがインビトロ及びインビボの両方で直接作用する抗線維化効果を予想外にも有することを開示する。実施例は、インターフェロン−ラムダタンパク質が、インビボでのマウス慢性腎疾患モデルにおいて、並びに肝臓臓器系、小腸臓器系、皮膚臓器系、腎臓臓器系及び肺臓器系に由来する関連一次細胞を有するインビトロでのヒト線維症モデルにおいて、抗線維化効果を有することを実証する。従って、このタンパク質は、複数のタイプの線維症における抗線維化剤としての予想外の可能性を有し、線維症疾患の処置に効果的な新規の治療法を設計するために使用され得る。
【００３３】
用語インターフェロン−ラムダ（ＩＦＮ−λ）（単数）及びインターフェロン−ラムダ（ＩＦＮ−λ）（複数）は、インターフェロン−ラムダファミリのサイトカインに言及するために本明細書で互換的に使用される。インターフェロン−ラムダタンパク質及びインターフェロン−ラムダレセプターはまた、表１に示すように多くの他の同義語によっても知られている。
【表１】
2020511415.tif 000002
【００３４】
一実施形態では、インターフェロン−ラムダはＩＦＮ−λ１である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダはＩＦＮ−λ２である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダはＩＦＮ−λ３である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダはＩＦＮ−λ４である。
【００３５】
ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３及びＩＦＮ−λ４のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を図１８に示す。
【００３６】
ＩＦＮ−λは、Ｆｃ融合等の融合タンパク質の形態で使用され得る。Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＦＮ−λに融合した抗体（例えばＩｇＧ）のＦｃドメインで構成されている。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインの会合の結果として二量体を形成する。そのため、ＩＦＮ−λは二量体型及び単量体型であり得る。
【００３７】
機能的模倣物
一実施系形態では、インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ１の機能的模倣物である。一実施系形態では、インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ２の機能的模倣物である。一実施系形態では、インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ３の機能的模倣物である。一実施系形態では、インターフェロン−ラムダは、ＩＦＮ−λ４の機能的模倣物である。
【００３８】
用語「機能的模倣物」は、野生型タンパク質と同一の又は類似の生物学的効果を有する分子を意味する。例えば、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、インターフェロン−ラムダレセプターを活性化し得、且つＩＦＮ刺激因子の転写を駆動し得る
【００３９】
一実施形態では、機能的模倣物は、例１で説明されているように、線維症のインビボモデルにおいてヒドロキシプロリンレベルを低減させ得る。一実施形態では、機能的模倣物は、例２で説明されているように、線維症のインビトロモデルにおいてフィブロネクチン及び／又はコラーゲンの沈着を阻害し得る。
【００４０】
一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ１の断片である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ２の断片である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ３の断片である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ４の断片である。
【００４１】
一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ１のバリアントである。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ２のバリアントである。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ３のバリアントである。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ４のバリアントである。
【００４２】
バリアントインターフェロン−ラムダは、図１８に示す特定の配列のうちの１つのバリアントであり得る、又はこのバリアントを含み得る。例えば、バリアントは、図１８のアミノ酸配列のいずれかの置換バリアント、欠失バリアント又は付加バリアントであり得る。ＩＦＮ−λの断片は、例えば、５０個超のアミノ酸、１００個超のアミノ酸又は１５０個超のアミノ酸のサイズを有し得る。
【００４３】
バリアントインターフェロン−ラムダは、図１８の特定のアミノ酸配列と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個又はより多く（概して最大５０個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含み得る。「欠失」バリアントは、個々のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小グループ（例えば、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸）の欠失、又はより大きなアミノ酸領域の欠失（例えば、特定のアミノ酸ドメイン若しくは他の特徴の欠失）を含み得る。「置換」バリアントは概して、１個又は複数個のアミノ酸の同数のアミノ酸による置き換え、及び保存的アミノ酸置換を行なうことを含む。例えば、アミノ酸を、類似の特性を有する代替アミノ酸（例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、又は別の脂肪族アミノ酸）で置換し得る。適切な置換基を選択するために使用され得る２０種の主なアミノ酸のいくつかの特性を表２に示す。
【表２】
2020511415.tif 000003
【００４４】
バリアントインターフェロン−ラムダは、図１８のアミノ酸配列に対して約６０％超の、又は約７０％超の、例えば７５若しくは８０％の、典型的には約８５％超の、例えば約９０若しくは９５％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。バリアントは、図１８の配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を保持し得る。バリアントは概して、約６０％〜約９９％の同一性、約８０％〜約９９％の同一性、約９０％〜約９９％の同一性、又は約９５％〜約９９％の同一性を保持する。このレベルのアミノ酸同一性は、関連する配列番号の配列の全長にわたり又はこの配列の一部にわたり見られ得、例えば、約２０個、３０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個又はより多くのアミノ酸にわたり見られ得る。
【００４５】
用語「同一性」は、本明細書で使用される場合、整列させた配列中の任意の特定の位置において、配列間でアミノ酸残基が同一であることを示す。用語「類似性」は、本明細書で使用される場合、整列させた配列中の任意の特定の位置において、配列間でアミノ酸残基が類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンの代わりとなり得る。互いの代わりとなり得ることが多い他のアミノ酸として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：
・フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
・リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
・アスパラギン酸、及びグルタミン酸（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
・システイン、及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
【００４６】
一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ１の誘導体である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ２の誘導体である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ３の誘導体である。一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は、ＩＦＮ−λ４の誘導体である。
【００４７】
一実施形態では、インターフェロン−ラムダは、図１８に示す特定の配列のうちの１つの誘導体であり得る、又はこの誘導体を含み得る。一例では、誘導体は、天然に存在するアミノ酸の構造類似体を含み得る。或いは、アミノ酸を改変し得、例えばアミノ酸に標識を付し得る。
【００４８】
一実施形態では、本発明のインターフェロン−ラムダはペグ化されており、即ち、このインターフェロン−ラムダは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に共有結合的に付着している。ペグ化タンパク質を製造する方法は当分野で公知であり、例えばＣｈａｐｍａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：５３１−５４５を参照されたい。
【００４９】
一実施形態では、ペグ化インターフェロン−ラムダは、ペグインターフェロンラムダ−１ａ「ラムダ」である（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。「ラムダ」は、元々はＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ（現在はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂの全額出資の子会社）で開発された治験中のＩＩＩ型インターフェロン治療薬である。この治療薬は２０１６年にＥｉｇｅｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにライセンス供与され、現在は慢性デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染の処置用に臨床開発中である。
【００５０】
一実施形態では、インターフェロン−ラムダの機能的模倣物は抗体である。
【００５１】
本発明の抗体分子は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子、又はその断片若しくは抗原結合部分を含み得る。抗体の用語「抗原結合部分」は、抗原に選択的に結合する能力を保持する、抗体の１個又は複数個の断片を指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片により実施され得ることが分かっている。抗体並びにその断片及び抗原結合部分は、限定されないが、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体又は四価抗体、ビスｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片であり得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作製する方法及び製造する方法は当分野で公知である（例えば、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。本発明での使用のための他の抗体断片として、国際公開第２００５／００３１６９号パンフレット、同第２００５／００３１７０号パンフレット及び同第２００５／００３１７１号パンフレットで説明されているＦａｂ断片及びＦａｂ’断片、並びに国際公開第２００９／０４０５６２号パンフレットで説明されているＦａｂ−ｄＡｂ断片が挙げられる。多価抗体は、複数の特異性を含んでもよいし単一特異的であってもよい（例えば、国際公開第９２／２２８５３号パンフレット及び同第０５／１１３６０５号パンフレットを参照されたい）。これらの抗体断片を、当業者に既知の従来の技術を使用して得ることができ、この断片をインタクトな抗体と同一の方法で有用性に関してスクリーニングすることができる。
【００５２】
本発明の抗体はインターフェロン−ラムダの機能的模倣物であり、野生型タンパク質と同一の又は類似の生物学的効果を誘発する。例えば、この抗体は、インターフェロン−ラムダレセプター上のエピトープに結合し得、レセプターシグナル伝達を活性化してＩＦＮ刺激遺伝子の転写を駆動する。
【００５３】
一実施形態では、本インターフェロン−ラムダ誘導体は低分子化学物質（例えば、分子量が９００ダルトン未満の化学物質）である。
【００５４】
潜在的な薬物候補であり得る低分子化学物質を同定するために化学ライブラリをスクリーニングする方法は、当分野で既知である。例えば、例２で説明されているように、化学ライブラリを、リガンド−レセプター結合アッセイ又は臓器線維症の細胞培養モデルで試験し得る。
【００５５】
線維症疾患
本発明のインターフェロン−ラムダを使用して処置され得る線維症疾患の例として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：間質性肺疾患、肺線維症、例えば、特発性肺線維症、珪肺症、過敏性肺炎、非特異的な間質性肺炎、リウマチ肺、強皮症、慢性障害肺疾患、及び嚢胞性線維症；腎線維症（例えば、慢性糸球体腎炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｌｏｍｅｒｕｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、尿細管間質性腎症、及び腎臓の遺伝的疾患）、例えば、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、巣状分節性糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、糸球体間質
増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、腎血管性疾患、多発性嚢胞腎疾患、慢性移植腎症、並びにグッドパスチャー病；肝線維症、及び肝硬変、例えば、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、アルコール誘発型肝疾患、及び非アルコール性脂肪肝炎（例えば、他の脂肪酸肝疾患）；並びに心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、被嚢性腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病（及び他の腸の狭窄が起こる疾患）、ケロイド、心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症、及び関節線維症。
【００５６】
一実施形態では、線維症は腎線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症は肺線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症は小腸線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症は皮膚線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症は肝線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症は腹膜線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症は膵線維症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。一実施形態では、線維症はアテローム性動脈硬化症である（この場合、ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３、又はＩＦＮ−λ４であり得る）。
【００５７】
一実施形態では、線維症は、腎線維症、肺線維症、小腸線維症、皮膚線維症、肝線維症、腹膜線維症、膵線維症、及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【００５８】
一実施形態では、線維症は、腎線維症、肺線維症、小腸線維症、皮膚線維症、腹膜線維症、膵線維症、及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【００５９】
一実施形態では、線維症は、微生物感染（例えばウイルス感染）とは関連していない。そのため、本発明で処置される対象は、ウイルス感染等の感染を患っていないものであり得る。例えば、この対象は、ＩＦＮ−λにより処置されることが知られているウイルス感染に患っていないものであり得る。この対象は、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎若しくはＣ型肝炎；インフルエンザウイルス；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス；コロナウイスル；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス；ノロウイルス；ロタウイルス；又はエボラウイルスに感染していないものであり得る。
【００６０】
医薬組成物、投与量、及び投与レジメン
本発明のインターフェロン−ラムダ又はその機能的に活性な断片若しくは誘導体は、医薬組成物に含まれ得る。この医薬組成物は通常は無菌であり、薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体をさらに含み得る
【００６１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに同類のものを含む。この担体は非経口に適し得、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路、例えば注射若しくは注入による非経口投与経路に適し得る。或いは、この担体は、非経口投与（例えば、局所投与経路、表皮投与経路、又は粘膜投与経路）に適し得る。この担体は経口投与に適し得る。投与経路に応じて、インターフェロン−ラムダ又はその機能的に活性な断片若しくは誘導体は、酸の作用及びこれを不活性化し得る他の自然条件から保護する材料でコーティングされ得る。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、１種又は複数種の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し且ついかなる所望されない毒性学的効果も付与しない塩を指す。そのような塩の例として、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。
【００６３】
薬学的に許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物で用いられ得る適切な水性担体の例として、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例として、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及び同類のもの）、並びにこれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。多くの場合では、この組成物中に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムを含めることが望ましいだろう。
【００６４】
治療用組成物は概して、無菌であり且つ製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならない。この組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の規則的な構造として製剤化し得る。
【００６５】
本発明の医薬組成物は追加の活性成分を含み得る。
【００６６】
同様に本発明の範囲内のものは、本発明のインターフェロン−ラムダ及び使用説明書を含むキットである。このキットは、１種又は複数種の追加の試薬（例えば、上記で論じた追加の治療薬又は予防薬）をさらに含み得る。
【００６７】
本発明のインターフェロン−ラムダ又はその製剤若しくは組成物を、線維性疾患の予防的処置及び／又は治療的処置のために投与し得る。
【００６８】
一実施形態では、線維性疾患の処置は治療的処置である。治療的用途では、化合物を、上記で説明された障害又は状態に既に罹患している対象に、この状態又はその症状のうちの１種若しくは複数種を治癒するのに、緩和するのに又は部分的に停止するのに十分な量で投与する。そのような治療的処置により、疾患の症状の重症度の低減、又は無症状期間の頻度若しくは持続期間の増加がもたらされ得る。これを達成するのに十分な量は「治療上有効な量」と定義される。
【００６９】
一実施形態では、線維性疾患の処置は予防的処置である。予防的用途では、製剤を、上記で説明された障害又は状態のリスクがある対象に、この状態又はその症状のうちの１種若しくは複数種のその後の影響を予防するのに又は低減するのに十分な量で投与する。これを達成するのに十分な量は「予防上有効な量」と定義される。
【００７０】
各目的に有効な量は、疾患又は傷害の重症度、並びに対象の体重及び全身状態に依存するだろう。
【００７１】
投与対象はヒト又は非ヒト動物であり得る。用語「非ヒト動物」は全ての脊椎動物を含み、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等）を含む。ヒトへの投与が代表的である。
【００７２】
本発明の抗体／修飾薬又は医薬組成物を、当分野で既知の様々な方法のうちの１種又は複数種を使用して、１つ又は複数の投与経路を介して投与し得る。当業者に認識されるように、投与経路及び／又は投与様式は所望の結果に応じて変わるだろう。本発明の医薬組成物の投与経路の例として、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路、例えば注射若しくは注入による非経口投与経路が挙げられる。語句「非経口投与」は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味する。或いは、本発明の医薬組成物を、非経口投与（例えば、局所投与経路、表皮投与経路、又は粘膜投与経路）を介して投与し得る。本発明の医薬組成物は経口投与用であり得る。
【００７３】
本発明の医薬組成物の適切な投与量は、熟練した医師により決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者に対して毒性を示すことなく、この患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動し得る。選択される投与量レベルは様々な薬物動態学的要因に依存し、例えば、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、並びに処置される患者の過去の病歴、並び医学分野で公知の同様の要因に依存するだろう。
【００７４】
適切な用量は、例えば、処置される患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得、典型的には体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００ｍｇの範囲であり得る。例えば、適切な投与量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１０ｍｇであり得る、又は１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約５ｍｇであり得る。
【００７５】
投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば治療反応）をもたらすように調整され得る。例えば、単回用量を投与してもよいし、複数の分割された用量を、経時的に投与しても又は治療状況の緊急性により示されるように相対的に減少させても若しくは増加させてもよい。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に単位投与量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。
【００７６】
投与は、単回用量であってもよいし複数回用量であってもよい。複数回用量を、同一の又は異なる経路を介して及び同一の又は異なる位置に投与し得る。或いは、用量は徐放製剤によってもよく、この場合には、より少ない頻度の投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者中におけるアンタゴニストの半減期及び所望の処置期間に応じて変わり得る。
【００７７】
上述したように、本発明の修飾薬／抗体又は医薬組成物を、１種又は他の複数種の他の治療薬と共投与し得る。
【００７８】
２種以上の薬剤の併用投与を多くの異なる方法で達成し得る。両方を単一の組成物で一緒に投与してもよいし、それらを併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、一方を他方の前に投与してもよいし、後に投与してもよいし、同時に投与してもよい。
【００７９】
一実施形態では、本発明のインターフェロン−ラムダを、別の治療上活性な化合物と組み合わせて投与する。一実施形態では、この他の治療上活性な化合物は別の抗線維化治療薬である。
【００８０】
或いは、本インターフェロン−ラムダを、別の治療上活性な化合物と組み合わせることなく投与してもよい。例えば、インターフェロン−ラムダで処置される患者は、別のインターフェロン（例えば、Ｉ型インターフェロン又はＩＩ型インターフェロン、例えばインターフェロン−ガンマ）等の抗ウイルス剤で処置されていないものであり得る。
【００８１】
参考文献
2020511415.tif 000004
2020511415.tif 000005
2020511415.tif 000006
2020511415.tif 000007
2020511415.tif 000008
【実施例】
【００８２】
概要
インターフェロン−λ（ＩＦＮ−λ）ファミリのサイトカイン（ＩＦＮ−λ１（ＩＬ−２９）、ＩＦＮ−λ２（ＩＬ−２８Ａ）及びＩＦＮ−λ３（ＩＬ−２８Ｂ）として既知である）は、ＩＦＮ−λＲ１（ＩＬ−２８Ｒ１）及びインターロイキン−１０Ｒ２（ＩＬ−１０Ｒ２）レセプター鎖で構成されている別々のレセプター複合体を介してシグナル伝達する。
【００８３】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）のマウスアドリアマイシン誘発型モデルにおける流体力学的トランスフェクションインビボスクリーニングを使用して、ＩＦＮ−λ２及びＩＦＮ−λ３をヒットとして報告した。ヒットを、腎臓ヒドロキシプロリンレベル（腎臓コラーゲン）の４０％減少により決定した腎線維症のレベルに基づいて判定した（ｃａｌｌｅｄ）。ＩＦＮ−λ２及びＩＦＮ−λ３の両方が、血清クレアチニンにより測定した、対応する腎機能の保存も示した。これにより、条件付き生存率（即ち、末期腎不全には至らない）は、生理食塩水をトランスフェクトしたマウスにおけるアドリアマイシン後４９日目の５０％から、ＩＦＮ−λ２をトランスフェクトした場合には８５％に至り、ＩＦＮ−λ３をトランスフェクトした場合には１００％に至った。刺激が異なるＣＫＤの代替モデルにおける、この抗線維化効果を検証するために、ＩＦＮ−λ１及びＩＦＮ−λ３の両方を、慢性腎疾患の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）誘発型腎線維症モデルにおける流体力学的トランスフェクションにより適用し、両方とも、尿細管間質性線維症に対する保護を与えた。
【００８４】
ＩＬ−２８Ｒ１リガンドの抗線維化効果が、成熟した、蓄積した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質について読み出された線維症のいくつかのヒト初代細胞インビトロモデルで確認されている。組換えヒトＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２及びＩＦＮ−λ３はそれぞれ、肝線維症、肺線維症、腸線維症、皮膚線維症及び腎線維症の初代ヒト細胞インビトロモデルにおける、線維症に関連したＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、並びにコラーゲンＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）の蓄積を阻害した。このことは、肝星状細胞、肝星状細胞−肝細胞共培養（基底マトリックス及びＴＧＦβ誘発型）、肝星状細胞−上皮細胞共培養、ＴＧＦβ誘発型小腸線維芽細胞、ＩＬ−１α誘発型真皮線維芽細胞、ケラチノサイト−真皮線維芽細胞共培養、腎近位尿細管上皮細胞−腎線維芽細胞の共培養及び単一培養、並びに肺小気道上皮−ＩＰＦ肺線維芽細胞共培養を含むいくつかのモデルで見られる。糸球体硬化症のより複雑な糸球体オルガノイドモデルでは、再発性ネフローゼ症候群を有する患者からの血漿の適用により、糸球体硬化症及び腎線維症に至る多くの糸球体疾患で見られる、有足細胞数の減少、並びに有足細胞の消滅及び消失に合致する形での突起及び茎の退縮の両方が引き起こされた。このモデルでの組換えＩＦＮ−λ２の適用により、この患者の血漿により引き起こされる有足細胞に対する変化が完全に防止された。
【００８５】
ＩＬ−２８Ｒ１リガンドは、インビトロ及びインビボの両方での線維症スクリーニングにおいて強力な抗線維化効果を有することが分かっている。強力な効果が、腎線維症のインビボマウスモデルにおいて、並びに肝臓、小腸、皮膚、腎臓及び肺の臓器系からの関連する初代細胞を有する多数のインビトロヒト線維症モデルにおいて説明されている。従って、このタンパク質は、複数のタイプの線維症における抗線維化剤としての予想外の可能性を有する。
【００８６】
方法
マウスインビボ
慢性腎疾患（ＣＫＤ）のアドリアマイシン誘発型腎線維症モデルにおけるＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効果
雌のＢａｌｂ／ｃマウス（少なくとも６週齢及び２４ｇ超の体重）に、適切な流体力学的トランスフェクション発現ベクター中のｃＤＮＡ（又は一対研究の場合にはｃＤＮＡの対）を、尾静脈を介してＩＶ注射した。７日後、マウスにアドリアマイシン（ドキソルビシン）を１１ｍｇ／ｋｇ  ＩＰで与え、４９日にわたりモニタリングした。マウスを体重及び健康状態に関して毎日モニタリングし、開始体重の４０％超を喪失したマウス又は末期腎不全の身体的徴候を示すマウスを屠殺してデータを集めた。４９日の研究期間の終了時に、全てのマウスを屠殺して、分析のために腎臓及び血清を採取した。腎臓ヒドロキシプロリンを、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅアッセイ方法（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定し、血清クレアチンを、三酵素方法を使用して測定してμｇ／ｍｌ血清クレアチニンとして読み取った。生理食塩水＋アドリアマイシン群での腎線維症（ヒドロキシプロリン）（グラフでは「生理食塩水」として示される）を、最大の疾患反応であると見なした。これを１００％に設定し、処置群全体にわたる正規化に使用した。未処置動物にはアドリアマイシンを投与せず、各スクリーニング実験は、アドリアマイシン及びＨＧＦのｃＤＮＡを投与する「ＨＧＦ」群を含んだ。ＨＧＦを抗線維化陽性コントロールとして使用し、ヒドロキシプロリンの＞４０％減少を品質管理に使用した。
【００８７】
マウス片側尿管閉塞誘発型腎線維症モデルにおけるＩＬ−２８及びＩＬ−２９の効果
マウスＩＬ２８Ｂ及びヒトＩＬ２９の流体力学的トランスフェクション用のＤＮＡ構築
流体力学的トランスフェクション用のＤＮＡ構築物を、ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ制限消化を使用した、ヒトＩＬ２９前駆体タンパク質（ＮＰ＿７４２１５２．１）をコードするＤＮＡ配列（ＮＭ＿１７２１４０．１）のｐＬｉｖｅベクター（Ｍｉｒ５４２０，Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ，５４５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１  ＵＳＡ）への挿入、及びその後の相同末端のＤＮＡライゲーションにより作製した。マウスＩＦＮＬ３（ＮＰ＿７９６３７０）をコードする遺伝子（ｍＲＮＡ参照配列ＮＭ＿１７７３９６）構築物を、ベクター及び挿入物の両方のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限消化戦略、並びにその後のライゲーションを使用して、ｐＬｉｖｅ（Ｍｉｒｕｓ）にクローニングした。ｐＬｉｖｅへの遺伝子挿入をＤＮＡ配列決定により検証した。この遺伝子には、シグナル配列の開始メチオニンをコードするＡＴＧのすぐ上流のＣＣＡＣＣ配列が先行した。このベクターは、カナマイシン耐性遺伝子、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中でのＤＮＡ増幅を可能にするｐＵＣ起点を有する。さらに、このベクターは、両側でイントロンに隣接するヒトＩＦＮＬ−１遺伝子を転写するためのマウス最小アルブミンプロモーターを有する。［このｐＬｉｖｅベクターは、肝臓中での長期タンパク質発現を可能にする］。
【００８８】
この流体力学的トランスフェクション用のＤＮＡ構築物を、溶液中のエンドトキシンの量を制限するプラスミド単離キット（ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  ＥＦ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、この構築物を含む大腸菌培養物から単離した。プラスミドＤＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定して、挿入物を検証した。
【００８９】
Ｋａｎｅｆｕｊｉ他及びＬｉｕ他は、流体力学的トランスフェクション用の典型的なベクターを説明する。
【００９０】
流体力学的トランスフェクション（ＨＤＴ）によるタンパク質の発現
マウスを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＥＥビヒクル中のｐＬＩＶＥ−ヒトＩＬ−２９、ｐＬＩＶＥ−マウスＩＬ−２８Ｂ又はｐＬＩＶＥ  ＳＥＡＰ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、カタログ番号ＭＩＲ  ５３２０）のいずれか５０μｇで流体力学的にトランスフェクトした。このベクターを含む溶液を、２ｍｌの容量で急速に（２．５秒未満）静脈内注射した。イソフルランによる全身麻酔を流体力学的注射の前に導入し、注射後少なくとも１分間維持した。
【００９１】
マウス血清からのマウスＩＬ−２８Ｂ及びヒトＩＬ−２９の定量
マウスＩＬ−２８Ｂを、市販の抗体対（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ１５９８Ｂ）を使用するメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）定量アッセイを使用して定量し、マウス血清を１００倍に希釈して線形標準曲線上に置いた。ヒトＩＬ−２９を、ＭＳＤ  Ｕ−ｐｌｅｘヒトＩＬ−２９抗体セット（カタログ番号Ｂ２１ＷＤ）を使用して定量し、マウス血清を１００倍に希釈して線形範囲内に置いた。
【００９２】
慢性腎疾患の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）誘発型腎線維症モデル
体重が少なくとも１９ｇである雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、慢性腎疾患の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）誘発型腎線維症モデルに供した。
【００９３】
手術を、イソフルラン導入型全身麻酔を使用して、且つ手術技術に適した無菌条件下で実施した。マウスを開腹し、続いて３．０  Ｍｅｒｓｉｌｋ結紮糸を使用して左尿管を縛った。筋肉壁を、連続パターンで５−０  Ｖｉｃｒｙｌを使用して閉じ、５−０  Ｖｉｃｒｙｌを使用する表皮下縫合により皮膚を閉じた。手術前及び手術後に、適切な鎮痛剤を投与した。結果で詳述するように、適切な時間に血液サンプルを採取した。マウスを、認められているマウス保定器を使用して拘束し、血液サンプルを正確に測定するためにピペットを使用して、テールプリック法（ｔａｉｌ  ｐｒｉｃｋ  ｍｅｔｈｏｄ）により尾静脈から血液３０μｌを採取した。このサンプルを０．２ｍｌのＰＣＲチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ）に入れ、遠心沈降させて（２０，０００ｇ、５分）可能な限り多くの血清を取り出し、新たなＰＣＲチューブに入れて−８０℃で貯蔵した。
【００９４】
１９日目又は２１日目に、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、血液を心臓穿刺により血清チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に取り出し、このマウスを頚椎脱臼により殺した。左腎臓を取り出し、２つの４分の１を液体窒素で急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。残りの半分を１０％中性緩衝ホルマリンに入れ、組織処理機で脱水し、組織学的分析のためにパラフィン包埋した。パラフィンブロックからミクロトームで４μｍにて薄片を作り、ガラススライドに載せた。次いで、スライドを脱ロウし、水和し、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）で染色した後に酸性化水で洗浄した。次いで、スライドを脱水し、きれいにしてカバーガラスをかけた。スライドを乾燥させ、次いでＨａｍａｍａｔｓｕスライドスキャナを使用してスキャンした。
【００９５】
全スライド画像をＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤ  ６４にインポートし、明視野モジュールを使用して解析した。簡潔に言うと、皮質領域に手動で注釈を付けて髄質を解析から取り除いた。４つ以上の画像のトレーニングデータセット上の個々のマーカーに関して、マーカー閾値レベル（例えばＰＳＲ染色）を決定した。次いで、解析アルゴリズムを専用サーバー上で実行して、各個々のマーカーに関する閾値強度を超えるマーカー領域を決定し、閾値強度を超える各マーカーの領域を皮質の領域の割合として決定した。
【００９６】
線維症のレベルの組織学的評価を、好ましいピクロシリウスレッド、マッソントリクローム、並びにヘマトキシリン及びエオシンで染色した薄片の組合わせを使用して、腎線維症の分野の専門知識を有する盲検研究者により実施した。１０が末期腎不全に相当する非常に重度の線維症であり１が正常である１０点スケールを使用した。このスコアで評価したパラメータは、尿細管基底膜の拡大、上皮細胞の平坦化、刷子縁の完全性、尿細管の萎縮及び崩壊、尿細管の管腔サイズ、間質細胞の浸潤、糸球体係蹄の構造、糸球体間質の拡大、糸球体の浸潤、糸球体尿腔、糸球体基底膜、並びに糸球体間質マトリックスの拡大であった。
【００９７】
Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析及び画像の組織学的評価を、アドリアマイシンで処置された腎臓の薄片にも適用した。
【００９８】
ヒトインビトロ細胞外マトリックス線維症アッセイ測定
ａ）細胞培養
全ての細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蓄積アッセイを、３８４ウェル黒色透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  カタログ番号７８１０９０）で実施し、培地、細胞数／ウェル、インキュベーション時間、及び刺激は、使用する初代細胞型により異なった。
【００９９】
ヒト肝星状細胞（ＨＨＳｔｅＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号ｓｃ−５３００）（４代継代）及びヒト肝内胆管上皮細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号ｓｃ−５１００）（３代継代）共培養物を、栄養補助剤が入った上皮細胞培地−フェノールレッド不含（ＥｐｉＣＭ−ｐｒｆ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号ｓｃ−ｓｃ−４１０１−ｐｒｆ）２５ｕＬに、１０００個の細胞／ウェル（１：１比）で播種した。単一培養のヒト星状細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を、星状細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）に１０００個の細胞／ウェルで播種し、ヒト星状細胞及び肝細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）共培養物を、混合培養培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）に１０００個の細胞／ウェル（１：１比）で播種した。
【０１００】
ヒト小腸線維芽細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を、腎上皮細胞基本培地＋０．５％ＦＣＳ及び栄養補助剤（ＡＴＣＣ）に、２０００個の細胞／ウェルで播種した。
【０１０１】
ヒト真皮皮膚線維芽細胞を線維芽細胞増殖培地で増殖させ、ヒトケラチノサイトをケラチノサイト培地で増殖させ、１５００個の細胞／ウェルで播種した。線維芽細胞−ケラチノサイト共培養物（９：１比）を培地の１：１混合物で増殖させ、１５００個の細胞／ウェルで播種した。
【０１０２】
ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）及びヒト腎線維芽細胞（ＨＲＦ、ＩｎｎｏＰｒｏｔ）を、腎上皮細胞基本培地（ＡＴＣＣ）＋０．５％ＦＣＳ及び栄養補助剤（ＡＴＣＣ）を使用して、共培養で１つのウェル当たり２０００個の細胞（比１：１）で播種した。
【０１０３】
ヒト小気道上皮細胞（ＡＴＣＣ）を、基本増殖培地＋気管支上皮増殖キット栄養補助剤（ＡＴＣＣ）で増殖させ、ＩＰＦ１３４肺線維芽細胞（ＡＴＣＣ）を、線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）で増殖させた。この共培養物を、２０００個の細胞／ウェル（１：１比）で播種した。
【０１０４】
ｂ）細胞増殖の測定
３７℃、５％ＣＯ２での７日間インキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞増殖を評価した。
【０１０５】
ｃ）ＥＣＭ蓄積の測定
個々のＥＣＭ成分の測定：免疫蛍光
５％ＣＯ２中における３７℃での７日間インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で１５分にわたり、０．２５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２０μｌ／ウェルで溶解させた。次いで、マトリックスをＰＢＳで３回洗浄し、−２０℃で３０分にわたり１００％メタノール４０μｌで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、抗フィブロネクチン抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗コラーゲンＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗コラーゲンＩＩＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗コラーゲンＩＶ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び抗コラーゲンＶ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して染色した。「Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＣｅｌｌＨｅａｌｔｈ」プロファイリングバイオアプリケーション、及び２×２ビニング（１．１０４×１．１０４ピクセル／視野）を有する１０×対物レンズ（新規Ｘ１カメラ）の下で、３チャンネルプロトコルを使用して、プレートをＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）でスキャンした。
【０１０６】
総ＥＣＭ成分の測定：Ｆｌａｍｉｎｇｏ（商標）染色
免疫蛍光プレートをＦｌｏｗｆｕｓｏｒ水で３回洗浄した後、製造業者の指示に従って、Ｆｌａｍｉｎｇｏ（商標）蛍光ゲル染色試薬（ＢｉｏＲａｄ）を使用して染色した。「Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＣｅｌｌＨｅａｌｔｈ」プロファイリングバイオアプリケーション、及び２×２ビニング（１．１０４×１．１０４ピクセル／視野）を有する１０×対物レンズ（新規Ｘ１カメラ）の下で、２チャンネルプロトコルを使用して、プレートをＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）でスキャンした。
【０１０７】
３Ｄヒト糸球体スフェロイドの生成方法
スフェロイドの生成及び処理
安定してトランスフェクトさせたＧＦＰタグ付きアクチン、条件付き不死化ＳＶ４０感染有足細胞、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｓｔｏｌにより提供されるヒト糸球体内皮細胞（ＨＲＧＥＣ）のＴ７５フラスコに、Ｎａｎｏ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＬ（カタログ番号６５７８４１）を添加し、それぞれＬｏｎｚａからの栄養補助剤キット（カタログ番号ＣＣ４１４７）と共に、ＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％  ＦＣＳ、５ＭＬ  Ｌ−グルタミン、及び１ＸＩＴＳ、Ｇｉｂｃｏ）並びにＥＢＭ−２培地で増殖させた。ＧＦＰトランスフェクト有足細胞をＦＡＣＳにより確認した。ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して全ての細胞を回収し、磁化したＨＲＧＥＣを、９６ウェル低付着Ｇｒｅｉｎｅｒプレート（カタログ番号６５５９７６）に５０００個の細胞／ウェルにて播種した。６時間にわたり、この９６ウェルプレートの下にＧｒｅｉｎｅｒ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｄｒｉｖｅ（カタログ番号６５５８３０）を置き、３７℃／５％ＣＯ２／１００％湿度にてＥＢＭ−２培地でスフェロイドを増殖させた。このＤｒｉｖｅを取り除き、磁化したＧＦＰ有足細胞を５０００個の細胞／ウェルで播種した。このＤｒｉｖｅを一晩下に戻し、Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｄｒｉｖｅを使用して、３日毎に１０日の給餌にわたりスフェロイドを分化させた。次いで、スフェロイドを、７日にわたり、１５％最終濃度でのヒトＦＳＧＳ血漿±ＩＬ−２８Ａ（１０，０００ｎｇ／ｍＬ）又は培地のみで処理した。
【０１０８】
固定及び染色
スフェロイドを、１０％ホルマリン／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで４℃にて３時間にわたり固定して透過処理した。３×１０分のＰＢＳ洗浄の後、スフェロイドを、それぞれ３０分にわたり２５％、５０％、７５％、９５％のＰＢＳ中の４℃での上昇系列のメタノールで脱水し、一晩１００％メタノール中で放置した。スフェロイドを同一の下降系列で再水和し、上述同様にＰＢＳで洗浄した後、４℃にて一晩、３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）でブロックした。４×３０分のＰＢＳＴ洗浄の後、二次抗体（１：５００／ＰＢＳＴ：Ａｌｅｘａ  ＧＡＲ−ＡＦ６４７及びＧＡＭ−ＡＦ５５５）を添加した。ＧＦＰシグナルを増強するために、抗ＧＦＰ−ＡＦ４８８を２４時間にわたり１：２００で添加した。スフェロイドを洗浄（４×３０分／ＰＢＳＴ）した後、×２０の倍率でＹｏｋｏＧａｗａ共焦点定量１（ＣＱ１）を使用して画像を捕捉した。
【０１０９】
有足細胞の細胞マーカー領域の定量
最大強度投影をＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤ  ６４にインポートし、免疫蛍光モジュールを使用して解析した。スフェロイド領域に手動で注釈を付け、マーカー閾値レベルを個々のマーカーに関して決定し、解析アルゴリズムを実行させて、各マーカーに関して閾値強度を超えるマーカー領域を決定した。閾値強度を超える各マーカーの領域を、スフェロイドの領域の割合として決定した。
【０１１０】
結果
（１）慢性腎疾患（ＣＫＤ）のマウスアドリアマイシン誘発型モデル
流体力学的にトランスフェクトされたｃＤＮＡ対の一員として最初に、マウスアドリアマイシンＣＫＤモデルでの線維症改変タンパク質のスクリーニングにおいてマウスＩＬ−２８Ａ（ＩＦＮＬ２）を同定した（ｎ＝１５のマウス）。このトランスフェクトされた対は、生理食塩水トランスフェクションコントロール群と比較して、総腎臓ヒドロキシプロリンにより測定した腎線維症を５１％低下させ（ｐ＝０．０２）（図１（ａ）及び図１（ｂ））、血清クレアチニンレベルに基づいて腎機能を正規化した（ｐ＜０．０５）（図１（ｃ））。ＩＬ−２８Ａの抗線維化効果を、同一モデルにおいて独立してＩＬ−２８Ａ  ｃＤＮＡをトランスフェクトする反復研究で確認した（１つの群当たりｎ＝２２のマウス）。ＩＬ−２８Ａは、生理食塩水コントロール群と比較して、総腎臓ヒドロキシプロリンにより測定した腎線維症を４８％低下させた（ｐ＝０．０００４）（図２（ａ）及び図２（ｂ））が、血清クレアチニンにより測定した場合には、腎機能の喪失は正常範囲に戻った（未処置アドリアマイシン生理食塩水コントロール群での４．８μｇ／ｍｌに対して、ＩＬ−２８Ａ群では平均血清クレアチニン＝１μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０００１）；平均未処置群血清クレアチニン＝０．８μｇ／ｍＬ）（図２（ｃ））。末期腎不全の症状により測定した条件付き生存率は、生理食塩水処置アドリアマイシン群での５０％から、マウスＩＬ−２８Ａをトランスフェクトさせた場合での８５％に増加した（図２（ｄ））。４９日目に、生き残ったマウス（（未処置（ｎ＝８）、未処置アドリアマイシン動物（ｎ＝２０）、及びＩＬ−２８Ａ流体力学的トランスフェクト動物（ｎ＝１９））からの全ての腎臓を固定し、パラフィン包埋し、薄片を作り、マッソントリクローム（ＭＴ）又はピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）のいずれかで染色し、Ｈａｍａｍａｔｓｕスライドスキャナで撮像した。１匹の未処置、３匹の未処置アドリアマイシン、及び３匹のＩＬ−２８Ｂ処置アドリアマイシン動物についてのＰＳＲ染色腎臓の例示的且つ代表的な画像を図５（ｆ）に示す。アドリアマイシン処置により、糸球体の約５０％が、主に糸球体基底膜において、しかしながら糸球体間質マトリックスにおいても、ＰＳＲ染色の増強により糸球体硬化症を明確に示す。尿細管間質では、皮質の７０％超での一貫した尿細管基底膜の拡大が存在し、多数の尿細管が、刷子縁がない大きな管腔に至る尿細管の大きな膨張を伴う尿細管構造の有意な喪失を引き起こす扁平上皮を示す。これらの領域は、軽度から中程度の細胞浸潤を有する。
【０１１１】
ＩＬ−２８Ａの適用により糸球体硬化症の徴候がほぼ完全に予防され、糸球体基底膜肥厚の証拠はほとんどない。２２匹の動物のうちの２匹のみが、上皮平坦化の顕著な徴候、及び未処置動物に特徴的な管腔拡大を示した。残りの動物は、皮質の８０％超でほぼ正常で現れて尿細管基底膜の影響がほとんどない尿細管間質を有した。
【０１１２】
ＰＳＲで染色した４７例のマウス腎臓サンプルを、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアを使用するハイコンテントイメージ解析にかけ、３つの群で測定したＰＳＲ染色の領域をＰＳＲ染色領域百分率としてプロットした（図５（ｇ））。同一の４７例のマウス腎臓スライドを、腎臓病理学の専門知識を有する２人の個人による線維症の程度の盲検病理学的評価にかけた。腎臓科学専門家が、０〜１０点スケール（０は線維症がないことを示し、１０は最も高い線維症を示す）の採点範囲を使用してＰＳＲ染色スライドを採点した。ＩＬ−２８Ａ処置は、未処置群と比較して病理スコアの有意な４７％減少（ｐ＜０．０００１）を示した（図５（ｈ））。２人目の腎臓科学専門家が、１〜１０のスケール（１は線維症がないことを示し、１０は最高を示す）を使用して、４７例のＭＴ染色スライドを手動で採点した。ＩＬ−２８Ａ処置群は、未処置群と比較して線維化リモデリングのレベルの明確な改善（ｐ＜０．０００１）を再び示した（図５（ｉ））。
【０１１３】
流体力学的にトランスフェクトされたｃＤＮＡ対の一員として最初に、マウスアドリアマイシンＣＫＤモデルでの線維症改変タンパク質のスクリーニングにおいてマウスＩＬ−２８Ｂ（ＩＦＮＬ３）も同定した（１群当たりｎ＝１５のマウス）。このトランスフェクトされた対は、生理食塩水トランスフェクションコントロール群と比較して、総腎臓ヒドロキシプロリンにより測定した腎線維症を５９％低下させ（ｐ＝０．０００８６）（図３（ａ）及び図３（ｂ））、血清クレアチニンレベルに基づいて腎機能を正規化した（有意ではない）（図３（ｃ））。ＩＬ−２８Ｂの抗線維化効果を、同一モデルにおいて独立してＩＬ−２８Ｂ  ｃＤＮＡをトランスフェクトする反復研究で確認した（１群当たりｎ＝２２のマウス）。総腎臓ヒドロキシプロリンにより測定した腎線維症は、生理食塩水コントロール群と比較して６５％減少した（ｐ＝０．０００００１８）（図４（ａ）及び図４（ｂ））が、腎機能は、未処置生理食塩水コントロール群での有意な増加と比較して正常に戻った（未処置アドリアマイシン生理食塩水コントロール群での３．２μｇ／ｍｌの平均に対して、ＩＬ−２８Ｂ群では平均血清クレアチニン＝１．２μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）；平均未処置群血清クレアチニン＝０．８μｇ／ｍＬ）（図４（ｃ））。条件付き生存率は、未処置アドリアマイシン動物での＜５０％から、ＩＬ−２８Ｂを投与した場合での１００％に増加した（図４（ｄ））。４９日目に、生き残ったマウス（（未処置（ｎ＝１０）、未処置アドリアマイシン動物（ｎ＝１８）、及びＩＬ−２８Ｂ流体力学的トランスフェクト動物（ｎ＝２２））からの全ての腎臓を固定し、パラフィン包埋し、薄片を作り、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）又はピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）のいずれかで染色し、Ｈａｍａｍａｔｓｕスライドスキャナで撮像した。１匹の未処置、３匹の未処置アドリアマイシン、及び３匹のＩＬ−２８Ｂ処置アドリアマイシン動物についてのＰＳＲ染色腎臓の例示的且つ代表的な画像を図５（ａ）に示す。未処置マウスの腎臓は、顕著な尿細管基底膜の拡大、尿細管上皮の平坦化、刷子縁の喪失を伴う広範囲の尿細管拡張、及び尿細管萎縮を伴う広範囲の糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症を有した。対照的に、ＩＬ２８Ｂ処置マウスは、両方のタイプの線維症リモデリングからほぼ保護された。ＰＳＲで染色した５０例のマウス腎臓サンプルを、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアを使用するハイコンテントイメージ解析にかけ、３つの群で測定したＰＳＲ染色の領域をＰＳＲ染色領域百分率としてプロットした（図５（ｂ））。ＩＬ−２８Ｂ処置群のＰＳＲ染色領域を、未処置腎臓での３倍増加と比較して正規化した（ｐ＜０．０００１）。同一の５０例のマウス腎臓スライドを、腎臓病理学の専門知識を有する３人の個人による線維症の程度の盲検病理学的評価にかけた。臨床病理医が、０〜４点スケール（０は線維症がないことを示し、４は最も高い線維症を示す）の採点範囲を使用して、Ｈ＆Ｅ染色スライドを採点した。ＩＬ−２８Ｂ処置は、未処置群と比較して病理スコアの有意な４５％減少（ｐ＜０．０１）を示した（図５（ｃ））。２人の専門家の腎臓科学者が、１〜１０のスケール（１は線維���がないことを示し、１０は最高を示す）を使用して、５０例のＰＳＲ染色スライドを手動で採点した。ＩＬ−２８Ｂ処置群は、未処置群と比較して線維化リモデリングのレベルの明確な改善（ｐ＜０．０００１）を再び示した（図５（ｄ）及び図５（ｅ））。
【０１１４】
（２）臓器線維症の初代ヒト細胞インビトロモデル
（２．１）肝線維症
プラスチック上で増殖させたヒト初代星状細胞は自己活性化し、ＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩのレベルにより測定された細胞外マトリックスの実質的な基礎レベルを蓄積する。このＥＣＭ蓄積は、組換えＩＬ−２８Ａによる培養物の処理により用量依存的に阻害され得る（図６（ａ））。ヒト初代星状細胞及び初代ヒト肝細胞の共培養（１：１比）は、組換えヒトＩＬ−２８Ａによる処理によっても用量依存的に阻害され得る基底細胞外マトリックスをもたらし、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩは減少する（図６（ｂ））。
【０１１５】
星状細胞の単一培養物及び星状−肝細胞共培養物の両方のＴＧＦβ１刺激は、ＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩのさらなる増加を誘発した。ＴＧＦβ１により刺激された、星状細胞単一培養物又は星状−肝細胞共培養物の、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂのいずれかによる処理は、ＩＬ−２８Ａ又はＢの最高濃度１０μｇ／ｍｌで全てのＥＣＭタンパク質の任意の増加のほぼ完全な阻害を示し、両方とも用量依存的に阻害した。ＩＬ−２８Ａは、ＴＧＦβ１により刺激された肝細胞中の全てのＥＣＭタンパク質にわたりＩＬ−２８Ｂと比べて強力であった（図７（ａ）及び図７（ｂ））。ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂのいずれかで処理された共培養物の存在下での、ＴＧＦβ１により刺激された共培養物ＥＣＭの画像は、ＴＧＦβ１処理のみと比較してＥＣＭ量の明確な減少を示し、このことは画像解析定量と一致する（図８）。
【０１１６】
（２．２）小腸線維症
ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたヒト小腸線維芽細胞は、細胞外マトリックスタンパク質であるフィブロネクチン及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩを誘導する。フィブロネクチンレベルは、コントロールＴＧＦβ１刺激と比較して、それぞれ７６％、７３％及び８３％の阻害で、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９（１０ｎｇ／ｍｌ）により有意に阻害された。コラーゲンＩ＆ＩＩＩは、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９（１０ｎｇ／ｍｌ）により、それぞれ４８％、３３％及び３５％阻害された。コラーゲンＩＶは、コントロールＴＧＦβ１刺激と比較して、ＩＬ−２８Ａによりのみ有意に阻害された（１０μｇ／ｍｌで３７％阻害）（図９）。
【０１１７】
（２．３）皮膚線維症
ヒト初代真皮線維芽細胞と初代ケラチノサイトとの共培養物（９：１比）は、共培養するだけで相当量のフィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ及びコラーゲンＩＶを蓄積する。単一ドナーのケラチノサイトと組み合わせて線維芽細胞の３つ別々のバッチを使用して、培養物をＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂのいずれかで処理した。未処理培養物に対するＥＣＭタンパク質の阻害百分率を３つ全ての線維芽細胞バッチで測定し、平均阻害をプロットした（図１０）。ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂは両方とも、同様の効力により１０μｇ／ｍｌの最高濃度で４種全てのマトリックスタンパク質を完全に阻害した。ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂは両方とも、１０〜１００００ｎｇ／ｍｌでコラーゲンＩＶ  ＥＣＭマーカーの用量依存的阻害を示した。細胞生存率を、ｐｒｅｓｔｏｂｌｕｅアッセイを使用して試験し、ＩＬ−２８ＡもＩＬ−２８Ｂも、試験したいずれの濃度でも毒性ではないことが示された（図１０）。
【０１１８】
真皮線維芽細胞−ケラチノサイト共培養物を、１２５０〜１００００ｎｇ／ｍｌのより狭い濃度範囲にわたりＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂで試験した。これにより、コントロール共培養物と比較して、フィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ及びコラーゲンＩＶの用量依存的阻害が示された（図１１）。試験した全ての濃度で、コラーゲンＩＶがＩＦＮＬにより最も阻害された（図１１）。細胞生存率は、Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ細胞生存率アッセイにより決定した場合に、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂによる処理の影響を受けなかった（図１１）。
【０１１９】
１２５０ｎｇ／ｍｌ及び１００００ｎｇ／ｍｌの両方でのＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂ試験共培養物と比較した未処理真皮共培養物の画像から、１０ｕｇ／ｍｌ  ＩＦＮＬの存在下での画像解析により決定したＥＣＭ蓄積の完全予防を確認した（図１２）。
【０１２０】
最後に、ヒト真皮線維芽細胞をＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）による単一培養で刺激して、ＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ及びコラーゲンＩＶを誘導した。ＩＬ−１αで刺激された線維芽細胞単一培養物のＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂによる処理は、最高濃度１０μｇ／ｍｌでのマトリックスの完全な阻害を伴う全てのＥＣＭタンパク質のプロマトリックス反応の強力な阻害を示した。線維芽細胞の全てのバッチでＩＬ−２８ＡはＩＬ−２８Ｂと比べて強力であり、１つの代表例を示す（図１３）。ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂは、ｐｒｅｓｔｏｂｌｕｅにより測定した細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図１３）。
【０１２１】
（２．４）腎線維症
ヒト初代腎線維芽細胞と共培養したヒト初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）（１：１比にて２０００個の細胞／ウェルで播種した）は、フィブロネクチン及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩで高い頑強なＥＣＭを生成する。この共培養物を、サイトカインの付加のための３つの異なるプロトコルを使用して、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂで処理した。
【０１２２】
最初に、０日目にこの腎臓共培養物にＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂを添加し、この培養物を７日にわたりインキュベートした。３種全てのサイトカインが、フィブロネクチン及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩの蓄積を用量依存的に強力に阻害した（図１４（ａ））。ＩＬ−２９は最も強力な効果を示し、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの間の差異はほとんどなかった。細胞生存率は、サイトカイン処理により損なわれなかった（図１４（ａ））。
【０１２３】
次に、０日目にＲＰＴＥＣ細胞にＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂを添加し、２４時間後に線維芽細胞を添加し、次いで、合計７日にわたり培養し続け、その後にＥＣＭを測定した。ここで、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂは全て、フィブロネクチン及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩの蓄積を用量依存的に再び阻害した（図１４（ｂ））。ＩＦＮＬ存在下でのＥＣＭタンパク質の阻害の大きさは、同時に両方の細胞にではなく、線維芽細胞の添加によりＥＣＭの共培養誘導が開始される２４時間前にＲＰＴＥＣにサイトカインを添加した場合に、より大きかった（図１４（ａ）及び図１４（ｂ）の比較）。
【０１２４】
最後に、０日目に線維芽細胞にＩＬ−２９、ＩＬ−２８及びＩＬ−２８Ｂを添加した。２４時間後、ＲＰＴＥＣを添加し、合計７日にわたり共培養し続けてフィブロネクチン及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩを測定した。最初に線維芽細胞にＩＦＮＬを添加することもＥＣＭタンパク質の有意な阻害を示した（図１４（ｃ））が、共培養物への０日目でのサイトカインの添加及び線維芽細胞の２４時間前のＲＰＴＥＣへのサイトカインの添加の両方と比較して、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの効力は低下した。この観察は、上皮細胞型及び線維芽細胞型の両方の共培養において、ＥＣＭシグナルの阻害をもたらす抗線維化表現型を媒介する、ＲＰＴＥＣ中のＩＬ−２８Ｒ１媒介型シグナル伝達反応を指摘する。同時添加に対する異なる細胞型へのＩＦＮＬの添加順序の異なる効果を明確に実証するために、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９のデータを、各個々のＩＬ−２８Ｒ１リガンドについての阻害のレベルへの異なる添加プロトコルの相対的効果を示すフィブロネクチンに関して（図１５（ａ））及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩに関して（図１５（ｂ））再プロットした。ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ又はＩＬ−２９のある程度のより低い濃度では、最初にＲＰＴＥＣへの添加（線維芽細胞の前）と比較した、細胞及びサイトカインの同時添加の間の差異は統計学的有意性に達しており、これらの値をグラフ上に示す。
【０１２５】
細胞生存率は、ｐｒｅｓｔｏ  ｂｌｕｅにより読み取った場合に、共培養物の互いの細胞の前のＲＰＴＥＣ又は線維芽細胞への最初のサイトカインの添加により損なわれなかった（図１４（ａ）、図１４（ｂ）及び図１４（ｃ））。
【０１２６】
ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２９試験共培養物と比較した未処理共培養物の代表的な画像（１つの処理当たり合計１６の視野のうちの１つ）から、ＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２８Ｂの用量依存的効果及び１０００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２９の存在下で観察したほぼ完全な阻害（図１６）の両方が示され、画像解析データが裏付けられる。
【０１２７】
単一培養での腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）は、低レベルではあるが、プラスチック上で増殖することにより基底ＥＣＭタンパク質を蓄積する。図２２でフィブロネクチン、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩについて示すように、低レベルのＥＣＭは、非常に低い濃度のＩＬ−２９の存在下で依然として阻害され得る。
【０１２８】
（２．５）肺線維症
突発性肺線維症（ＩＰＦ）患者から単離された肺線維芽細胞との共培養のヒト初代小気道肺上皮細胞（１：１比で２０００個の細胞／ウェル）は、培養７日後に頑強な総ＥＣＭ（フラミンゴ染色により測定した）を生成し、ＥＣＭマーカーであるフィブロネクチン、コラーゲンＩ＆ＩＩＩ及びコラーゲンＩＶに関して陽性であった。ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂは、フィブロネクチンのレベルへの有意な効果がなかった。しかしながら、ＩＬ−２８Ｂは、最高濃度１０μｇ／ｍｌでコラーゲンＩ＆ＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、及びフラミンゴ染色の有意な阻害を示した（図１７）。しかしながら、ＩＬ−２８Ａの効果はそれほど顕著ではなかった。ＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂのいずれによっても、７日目の細胞生存率に変化はなかった（図１７）。
【０１２９】
（３）臓器線維症の初代ヒト細胞モデル
（３．１）肝線維症
ヒト初代星状細胞及び初代ヒト肝内胆管上皮細胞の共培養（１：１比）は、組換えヒトＩＬ−２８Ａ及びＩＬ−２９による処理によっても用量依存的に阻害され得る基底細胞外マトリックスをもたらし、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、及びコラーゲンＩ＆ＩＩＩは減少する（図１９）。
【０１３０】
（３．２）３Ｄ糸球体スフェロイドモデル
最大３週にわたり安定した培養物中で維持され得る温度条件付きヒト有足細胞の外核を有する、磁化されたヒト初代糸球体内皮細胞の内核から、糸球体スフェロイドを構築した。巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の患者からの１５％再発血漿による糸球体スフェロイドの処理により、ＩＬ−２８Ａの存在下で保護され得る外核からのＧＦＰ標識有足細胞の喪失が誘導された。健康な志願者からの血漿は有足細胞に影響を及ぼさなかった。緑色蛍光有足細胞マーカー領域の定量は、ＩＬ−２８Ａ処理で有意に増加したＦＳＧＳ再発血漿の存在下で有意な減少を示した（図２０（ａ）、図２０（ｂ）及び図２０（ｃ））。ＦＳＧＳの臨床的進行は、有足細胞の消滅及び消失を特徴とする。このモデルは、ＦＳＧＳ血漿中の循環因子からの有足細胞への影響を再現しており、関連するネフローゼ症候群及び糸球体硬化症を予防するためのＩＬ−２８療法の臨床的な翻訳可能性を示唆する。
【０１３１】
（４）腎線維症のマウス片側尿管閉塞モデル（ＵＵＯ）
（４．１）流体力学的トランスフェクション（ＨＤＴ）により送達されるマウスＩＬ２８Ｂ
ＨＤＴによりコントロールＳＥＡＰベクターを投与した動物のＵＵＯ腎臓は、手術後２１日目に、このモデルに典型的な皮質中の尿細管間質性線維症を示し、尿細管基底膜の広範な拡大、基底膜による強いコラーゲン染色、特に髄腔内での強い染色、上皮細胞体積の広範な喪失、尿細管萎縮、近位尿細管刷子縁の喪失、及び広範な尿細管間質性浸潤物を伴った。尿細管の１５％未満が、ほぼ正常な構造を有した。糸球体への変化は最小限であったが、髄質は事実上破壊されて欠けていた（図２１（ａ））。
【０１３２】
ＵＵＯの１日前及びＵＵＯの７日後にマウスＩＬ−２８ＢによるＨＤＴを受けている動物のＵＵＯ腎臓は両方とも、手術後２１日目に、皮質尿細管間質性線維症からの保護を示した（図２１（ａ））。尿細管基底の拡大及びコラーゲン染色は、コントロールベクターを投与したＵＵＯマウスと比べて、ＨＤＴによりマウスＩＬ−２８Ｂを投与した両方の群において少なくとも３０％又は４０％低かった。両方のＩＬ２８Ｂ群は尿細管構造を保存し、上皮の平坦化及び萎縮の発生はより少なかった。ＨＤＴの１日前からＨＤＴを有するものでは、尿細管の３０〜４０％がほぼ正常な構造を示し、その後の処置を有するものでは、わずかに少なかった（２０〜３０％）。間質性浸潤は、コントロールベクター群と比較して、両方のＩＬ−２８群において約４０％であった。いずれのＩＬ２８群も、髄質構造の顕著な保護を有しなかった。全体として、ＨＤＴによるＩＬ２８Ｂの早期及び後期の両方の送達は、腎皮質において、ＵＵＯ誘発型線維症リモデリングからの有意な保護を有した。
【０１３３】
ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色したコラーゲン薄片を、ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析アルゴリズムを使用して定量し、コントロールプラスミド処置マウスと比較して、総コラーゲン領域（図２１（ｂ））又は高強度コラーゲン領域（図２１（ｃ））のいずれかとしてプロットした場合に、−１日目又は７日目のいずれかに送達されたマウスＩＬ−２８Ｂの統計学的に有意な保護効果を示す。このことは、上記で説明した染色薄片の視覚による組織学的評価と一致する。
【０１３４】
マウスＵＵＯモデルにおいてＨＤＴ後２１日目に達成されたマウスＩＬ２８Ｂタンパク質の血清レベルをＥＬＩＳＡで測定し、全ての群にわたり４３〜４８５ｎｇ／ｍｌであった。コントロールＳＥＡＰ  ＨＤＴマウスではマウスＩＬ２８Ｂタンパク質を測定し得えず、そのため、このレベルは、使用したアッセイの定量下限（ＬＬＱ）である４ｎｇ／ｍｌ未満であった。
【０１３５】
（４．２）流体力学的トランスフェクション（ＨＤＴ）により送達されるヒトＩＬ−２９
ＨＤＴにより送達されたヒトＩＬ−２９は、ＳＥＡＰコントロールプラスミド処置群と比較して、０日目（トランスフェクション後２４時間）及びこのモデルを終了させた１９日目の両方で、全てのマウスにおいて有意なタンパク質発現を示す（図２３（ａ））。非トランスフェクトマウス又はＳＥＡＰコントロールマウスの血清中では、ヒトＩＬ−２９を検出し得なかった。
【０１３６】
未処理１９日ＵＵＯは、このモデルに典型的な組織学的変化を示す。腎臓の全てで、腎髄質の広範囲の破壊及び喪失が存在する。この皮質は、増加したピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色により示されるように、有意な間質性コラーゲン蓄積を伴う尿細管基底膜の広範な拡大を示す。皮質全体を通して、間質への細胞の顕著な浸潤も存在する。尿細管上皮構造は著しく損傷している。管腔が拡張された少数の尿細管等の、上皮細胞の大部分は、体積を喪失し、平坦化しているように概して見える。特に、尿細管の８０％超は広範な萎縮を受けており、多くの場合では完全に崩壊している。尿細管の管腔は、開存性の喪失に起因して、ほとんどの場合では区別することが困難であり、上皮細胞は、ネフロン尿細管基底膜から明らかに外れており、管腔であるだろうものの中に存在する。
【０１３７】
ＩＬ−２９によりＵＵＯの時から処置された１９日ＵＵＯ腎臓は、ＳＥＡＰベクターのみを投与したものとは劇的に異なる外観を有し、構造が明らかに保存されている。髄質は損傷しているが存在したままであり、動物の７５％において未処置ＵＵＯと比べて多くの認識可能な構造を有する。この皮質では、より低レベルの拡大での主な観察は、ＳＥＡＰ  ＵＵＯと比較して拡張された尿細管管腔を有する多数の尿細管である。しかしながら、このことが、未処理ＵＵＯでの非常に平坦化された上皮細胞及び尿細管基底膜の拡大と概して関連しているであろう場合、ＩＬ−２９処置により、この上皮細胞は体積を保持しており、尿細管基底膜の拡大は最小であり、尿細管の構造は有意に保存されており、萎縮及び尿細管崩壊の証拠がほとんど又は全くない。間質性コラーゲンの明らかにより低いレベル及び尿細管基底膜の拡大の減少が存在する。全体として、ＩＬ−２９の適用は、ＵＵＯにより引き起こされる尿細管間質性線維症を有意に減少させ、間質性コラーゲンの減少及び図２３（ｂ）の代表的画像で示されるように尿細管構造の劇的な保存を伴う。
【０１３８】
全てのピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色コラーゲン薄片を、ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析アルゴリズムを使用して定量し、コントロールＳＥＡＰプラスミド処置マウスと比較して総染色コラーゲン領域としてプロットした場合に、−１日目に送達されたヒトＩＬ−２９の統計学的に有意な保護効果を示す（図２３（ｃ））。このことは、上記で説明した染色薄片の視覚による組織学的評価と一致する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４ａ−１】
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【図１４ａ−２】
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【図１４ｂ−１】
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【図１４ｂ−２】
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【図１４ｃ−１】
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【図１４ｃ−２】
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【図１５ａ−１】
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【図１５ａ−２】
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【図１５ｂ−１】
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【図１５ｂ−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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