(57)【要約】  本発明は、概して、血液−脳関門を移行することが可能なポリペプチド、及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、現存する抗体断片の部位特異的変異誘発により誘導されたポリペプチド及びそれらの使用、並びにそのような分子の作製方法に関する。本発明のポリペプチドは、増強された血液−脳関門の横断並びにインビトロ及びインビボにおける脳曝露レベルを示す。【選択図】図９
2020511941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離又は精製された抗体断片であって：
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列；
ＲＩＴＷＧＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：２）のＣＤＲ２配列（ここで、Ｘ１はＤ又はＫであり、Ｘ２はＮ又はＤであり、及びＸ３はＦ、Ｉ又はＬである）；並びに、
ＧＳＴＳＴＡＸ４ＰＬＲＶＤＹ（配列番号：３）のＣＤＲ３配列（ここで、Ｘ４はＴ又はＫである）
を含み；
ここで、位置Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４のアミノ酸残基の少なくとも１つは、配列番号：１６のＣＤＲ２（配列番号：４）又はＣＤＲ３（配列番号：１０）の対応する残基とは異なる、単離又は精製された抗体断片。
【請求項２】
ＣＤＲ２が、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）、ＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：５）、ＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：６）、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：７）、及びＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：８）からなる群から選択され；但しＣＤＲ２配列がＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）である場合、ＣＤＲ３は、ＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）ではないことを条件とする、請求項１に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項３】
ＣＤＲ３が、ＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹ（配列番号：９）又はＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）であり；但しＣＤＲ３配列がＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）である場合、ＣＲＤ２は、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）ではないことを条件とする、請求項１に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項４】
以下を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片：
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹ（配列番号：９）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：５）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：６）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：７）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；又は、
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：８）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列。
【請求項５】
以下からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１１）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１３）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１４）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１５）；及び
それらと実質的に同一の配列。
【請求項６】
前記抗体断片が、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項７】
前記ｓｄＡｂが、ヒト化されている、請求項６に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項８】
前記抗体断片が、多価ディスプレイフォーマットである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項９】
前記抗体断片が、Ｆｃ断片に連結されている、請求項８に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１０】
前記Ｆｃ断片が、マウスＦｃ２ｂ又はヒトＦｃ１である、請求項９に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１１】
前記Ｆｃが、配列番号：２９の配列を含む、請求項１０に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１２】
前記単離又は精製された抗体断片が、血液−脳関門を移行する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片をコードしている、核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
前記抗体又はその断片が、表面上に固定されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体又はその断片が、カーゴ分子に連結されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１７】
前記カーゴ分子が、約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１６に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１８】
前記カーゴ分子が、検出物質、治療薬、薬物、ペプチド、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、糖鎖部分、酵素、抗体もしくはその断片、ＤＮＡベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞傷害性物質；検出物質、治療薬、薬物、ペプチド、酵素、抗体もしくはその断片、ＤＮＡベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞傷害性物質を負荷した１又は複数のリポソームもしくはナノ担体；あるいは、１又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、もしくは量子ドットである、請求項１６又は１７に記載の単離又は精製された抗体断片。
【請求項１９】
請求項１〜１２及び１５〜１８のいずれか一項に記載の１又は２以上の単離又は精製された抗体断片、並びに医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液−脳関門を移行(transmigrate)する抗体断片、及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、現存する抗体断片の点−変異により誘導された抗体断片及びそれらの使用に関し；本発明の抗体断片は、脳内皮細胞への増強された結合又は血液−脳関門を超える増強された移行を示す。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患は、現在これらの不能状態に有効な治療が存在しないので、我々の高齢化社会の負担を増大している。脳に起源があるこれら及び他の疾患の治療に加え早期診断は、好適な治療的分子及び診断薬の大半は、タイトで且つ高度に制限的な血液−脳関門（ＢＢＢ）を浸透することができないので、依然課題であり続ける（Abbott、2013）。ＢＢＢは、血管が並び且つ互いにタイトジャンクションにより接続している脳内皮細胞（ＢＥＣ）により形成される物理的障壁を構成している（Abbott、2013）。ＢＥＣ間に形成されたタイトジャンクションは、ＢＢＢの完全性にとって必須であり、且つ５００ダルトン（Ｄａ）よりも大きい親水性分子の傍細胞輸送を妨げる。脳内皮細胞は、非常に低いピノサイトーシスの割合を示す（Abbott、2013）ので、比較的大型分子の経細胞輸送は、高度に特異的な受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）経路、及び且つ受動的な電荷ベースの吸着が媒介したトランスサイトーシスに限定される（Abbott、2013；Pardridge、2002）。加えて、Ｐ−糖タンパク質又は多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ−１）などの、高密度の排出ポンプは、望ましくない物質の脳からの除去に寄与する（Abbott、2013）。
【０００３】
これらの特徴は全て、脳を病原体及び毒素から保護するが、これらはほとんどの治療薬の侵入も同等に妨害する。実際、小型分子の治療薬の５％未満しか、及び比較的大型の治療薬の実質的に全てが、それらが特別に「運ばれる(ferried)」、すなわちトランスポーター分子とカップリングされることがない限りは、薬学的に関連のある濃度（すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）標的に連動し、且つ薬学的／治療的反応を誘起するのに十分な濃度）でＢＢＢを超えることができない。ＢＢＢを超える分子の輸送のための効果的な「担体」の欠如のために、神経変性疾患に対する多くの薬物は、十分な量で脳へ送達されることができないので、更なる開発から「棚上げされている」か又は排除されている。
【０００４】
比較的大型分子の脳への送達のための様々なアプローチが利用されている。例えば、ＢＢＢの完全性は破壊されることがあり、漏出性のＢＢＢを生じ、このことは次に脳への比較的大型分子の制限されない傍細胞侵入を可能にする。タイトジャンクションは、様々なアプローチにより、うまく緩められるか、又は破壊され得る。例えば、浸透圧ショックを誘導する物質（例えば、マンニトール、高張溶液）の血流への注入は、細胞収縮を引き起こし、且つタイトジャンクションの破壊を生じ、その結果ＢＢＢをひどく損なう（Guillaume、2010）。他のタイトジャンクションのモジュレーターは、アルキルグリセロール、ブラジキニン及びそれらのいくつかのアナログ、並びにタイトジャンクションの維持に関与したタンパク質の発現を調節するウイルスを含む（Erdlenbruchら、2003；Prestonら、2008；Ganら、2013）。ＢＢＢのより局所的な破壊は、集束超音波の適用により可能である（Nhanら、2013）。しかしＢＢＢが破壊される期間は、脳ホメオスタシスを変更し、且つ有害な化学物質、毒素及び病原体が脳へ侵入するのに十分であり；このことは、重篤な副作用、例えば発作及び脳腫脹、感染症並びにおそらく永久的な神経病理学的変化をもたらす。従って、複数の脳領域に影響を及ぼす慢性且つびまん性の脳疾患のこれらの技術による反復治療は、実践的ではない。これらの治療のほとんどは、高価であり、入院を必要とし、且つ一部のアプローチは麻酔を必要とする。
【０００５】
ＢＢＢを迂回する別のアプローチは、治療的分子の、脳脊髄液（ＣＳＦ）、実質空間、又は他の脳の部分への直接注入である。以下を含む、いくつかの送達方法が、開発されている：注入又は対流強化薬物送達（ＣＥＤ）ポンプによる、脳内（実質内）、脳室内、及び髄腔内送達。しかし、脳又は大脳内インプラントへの直接注入のいずれの型も、入院、麻酔、及び時には手術を必要とするので、これは侵襲性であり且つ高価な手技である。更に、治療薬、特に大型生物製剤の脳実質内での拡散速度の遅さは、治療薬の浸透を注入／インプラント部位の周囲の狭い領域のみに制限する。注入、カテーテル、及びインプラントの正確な配置は、脳の標的とされた領域への薬物の拡散を達成するために、依然重要な課題である。加えて、カテーテル及びインプラントは、外来物質に対する感染及び／又は免疫応答の部位を提供する。
【０００６】
ＢＢＢを超える送達を増大する別の試みにおいて、ＣＮＳ薬物は、それらの脳取込みを増大するように修飾されている。そのような修飾は、それらの表面電荷の変化、分子サイズの減少、及び薬物の親油性への変化を含むことができる。しかし、脳浸透を増大する何らかの修飾はまた、おそらく薬物の、その望ましい活性及び／又は特異性を含む、全般的薬理を変更するであろう。加えて、親油性分子は、Ｐ−糖タンパク質排出ポンプにより、脳から搬出される傾向が大きい。
【０００７】
最後に、ＢＢＢを超える内在性輸送機序が利用されている。大型分子をＢＢＢを超えて輸送することができる生理的機序は、高度に特異的な受容体媒介型トランスサイトーシス（ＲＭＴ）と、非−特異的電荷ベースの吸着媒介型エンドサイトーシスの経路に分けることができる。エンドサイトーシスは、特異的リガンドのその受容体への結合時に、又は陽イオン性リガンド又は薬物と、脳内皮細胞表面（管腔側）上の陰イオン性官能基の間の静電気相互作用時に、各々誘起される。引き続き、新たに形成されたエンドソームが、その細胞を超えて、管腔の反対側にトランスサイトーシスされ、そのカーゴを放出する。
【０００８】
吸着媒介型トランスサイトーシスは、非−特異的、電荷−媒介型相互作用であるので、これは全ての血管床及び臓器において生じ、脳送達のための薬物の利用可能性を制限する。従って、ＲＭＴ経路の活用は、単に生理的で、非侵襲性で更に高度に受容体−特異的な脳送達方法のままである。
【０００９】
わずか数種の受容体のみが、ＢＢＢでＲＭＴを受け、且つそれらの天然のリガンドを超えて「運ぶ」ことが現在知られており：良く研究されたトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、低密度リポタンパク受容体関連タンパク質１及び２（ＬＲＰ−１及び−２）、並びにジフテリア毒素受容体が挙げられる。ペプチド、天然のリガンド、及び抗体又は抗体断片は、これらの受容体に結合するように、開発されており（Pardridgeら、1991；Yuら、2011；Muruganandamら、2001；Abulrobら、2005；Demeule、2008；Sumbriaら、2013）、これらは内在性ＲＭＴ経路を利用する血液−から−脳へのトランスポーターとして機能する。最近、大型天然アミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１）の成分である、ＣＤ９８ｈｃに対する抗体が、ＢＢＢを超えるトランスサイトーシスを受けることが示されており、これは、このトランスポーターは、ＢＢＢ担体の開発のための別の標的であり得ることを示唆している。しかし、今日まで、ただ一つのペプチド（Ａｎｇｉｏｐｅｐ  ＡＮＧ１００５、ＬＲＰ−１標的化）のみが、第Ｉ相臨床試験において分析されている一方で、他の候補は、研究室の状況で試験されている。ＲＭＴ経路は、生物学的製剤の脳への輸送に最も見込みがある経路であるように思われるが、現在のアプローチには制限があり、これは以下を含む：他の臓器の血管内皮と比べＢＢＢでの標的受容体の非選択的発現、受容体に対する担体と天然のリガンドの間の競合、受容体の効果のないトランスサイトーシス、並びにエンドサイトーシスされた担体のリソソーム分解（Xiao及びGun、2013）。
【００１０】
高い能力及び高い選択性のあるＢＢＢ担体を欠いていることは、脳腫瘍及び神経変性疾患を含む、脳に起源のある疾患のための、新規の治療薬及び診断薬の開発を遅らせている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、血液−脳関門を移行する抗体断片、及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、現存する抗体断片の点変異により誘導される抗体断片、及びその使用に関し；本発明の抗体断片は、血液−脳関門を超える増強された移行を示す。
【００１２】
本発明は：
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列；
ＲＩＴＷＧＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：２）のＣＤＲ２配列（ここでＸ１はＤ又はＫであり、Ｘ２はＮ又はＤであり、及びＸ３はＦ、Ｉ又はＬである）；並びに
ＧＳＴＳＴＡＸ４ＰＬＲＶＤＹ（配列番号：３）のＣＤＲ３配列（ここで、Ｘ４はＴ又はＫである）：を含む、単離又は精製された抗体断片を提供する。
【００１３】
本発明の単離又は精製された抗体断片において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４の少なくとも一つは、ＦＣ５のＣＤＲ２又はＣＤＲ３における対応する野生型残基とは異なる。より詳細には、本発明の実施態様において、ＣＤＲ２（配列番号：２）のＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＣＤＲ３（配列番号：３）のＸ４の少なくとも一つは、配列番号：１６の対応する野生型ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とは異なり、ここで野生型ＣＤＲ２（配列番号：４）及びＣＤＲ３（配列番号：１０）は、各々、配列番号：１６の残基５０−６６及び９９−１１１に対応している。
【００１４】
本発明の単離又は精製された抗体断片の特定の実施態様において、ＣＤＲ２は、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）、ＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：５）、ＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：６）、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：７）、及びＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：８）からなる群から選択され；但しＣＤＲ２配列がＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）である場合、ＣＤＲ３は、ＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）ではないことを条件とする。
【００１５】
本発明の単離又は精製された抗体断片の特定の実施態様において、ＣＤＲ３は、ＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹ（配列番号：９）又はＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）であり；但しＣＤＲ３配列がＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）である場合、ＣＲＤ２は、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）ではないことを条件とする。
【００１６】
本発明の非限定的例において、単離又は精製された抗体断片は、以下を含んでよい：
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹ（配列番号：９）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：５）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：６）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：７）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；又は、
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：８）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列。
【００１７】
特定の実施態様において、本発明の単離又は精製された抗体断片は、以下からなる群から選択される配列を含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１１）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１３）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１４）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１５）；及び
それらと実質的に同一の配列。
【００１８】
本発明の単離又は精製された抗体断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であってよい。このｓｄＡｂは、ヒト化されてよい。
【００１９】
本明細書に記載のように、単離又は精製された抗体断片は、任意の好適な多量体化技術を使用し、多価ディスプレイフォーマットにあることができる。例えば、単離又は精製された抗体断片は、Ｆｃ断片へ連結され、結果的に二量体を形成する。この実施態様において、Ｆｃ断片は、任意の好適なＦｃ断片、例えば、マウスＦｃ２ｂ配列又はヒトＦｃ１、Ｆｃ２もしくはＦｃ４配列であってよい。具体例において、Ｆｃは、配列番号：２９の配列を含んでよい。
【００２０】
本発明の単離又は精製された抗体断片は、血液−脳関門を移行する。
【００２１】
本発明はまた、本明細書記載の単離又は精製された抗体断片をコードしている核酸分子も包含している。この単離又は精製された抗体断片をコードしている核酸分子を含むベクターも、本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明の単離又は精製された抗体断片は、表面上に固定されてよい。
【００２３】
他の適用において、前述の単離又は精製された抗体断片は、カーゴ分子に連結されてよい。任意の好適なカーゴ分子が使用されてよい。カーゴ分子は、約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有してよい。例えば、限定を意図するものではないが、カーゴ分子は、検出物質、治療薬、薬物、ペプチド、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、糖鎖部分、酵素、カーゴ抗体又はその抗原−結合断片、例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２など、又は抗原−結合活性を持つカーゴ「抗体−様分子」、例えばｓｃＦｖ、タンデム ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、もしくはトリアボディ、ＤＮＡ−ベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞傷害性物質；検出物質、治療薬、薬物、ペプチド、酵素、抗体又はその断片、ＤＮＡ−ベースの分子、ウイルスベクター、もしくは細胞傷害性物質を負荷した１又は複数のリポソーム又はナノ担体；あるいは、１又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、もしくは量子ドットであってよい。そのような構築体において、単離又は精製された抗体断片は、血液−脳関門を超えるカーゴ分子を保有する。
【００２４】
特定の実施態様において、一つの抗体断片が、カーゴ分子に連結されている。他の実施態様において、２又はそれよりも多い抗体断片が、カーゴ分子に連結されている。そのような実施態様において、抗体断片は、カーゴ分子へ、直接、例えば、ペプチド結合を介して連結されてよいか、又は１つの抗体断片もしくは複数の断片は、長さが１〜２０個のアミノ酸のペプチド配列などのリンカーを介して、あるいは様々な化学リンカーを介して、カーゴ分子へ連結される。リンカーの非限定的例は、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのセリン−グリシンリッチ（Ｓ／Ｇ）リンカーであり、ここでｎは、１、２又は３であってよい。
【００２５】
本発明は更に、１又は２以上の前述の単離又は精製された抗体断片、並びに医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤を含有する組成物を包含している。
【００２６】
本発明は、ＢＢＢ通過がＦＣ５のそれを上回り、更に２〜３倍の改善を示す、ヒト化されたＦＣ５  ＣＤＲ変異体を包含している。加えて、これらの抗体断片は、ＦＣ５と比べて脳内皮受容体への改善された結合親和性を示す。
【００２７】
本発明のこれら及び他の特徴は、ここで、添付図面を参照し、実施例により説明される：
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＦＣ５−Ｈ７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における３１８の点変異の分布のグラフ表示を示す。黒色バーは、１８個の位置での、完全アミノ酸レパートリー（Ｃｙｓ及びＭｅｔを除く）を指す。わずかな変動は、潜在的グリコシル化部位の除去によるものである。灰色バーは、５個の位置での、限定されたレパートリー（標識した）を指す。
【００２９】
【図２】図２は、親和性−改善されたクローンを、ＦＣ５−Ｈ７変異ライブラリーから選択するための、選択戦略の概略を示す。
【００３０】
【図３】図３は、図８由来のスクリーン１で選択された「トップ」４８の親和性改善された変種のＦＣ５−Ｈ７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における単独の点変異の分布のグラフ表示を示す。３１８の単独の変異性変種の親和性は、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ装置で実行した、シミアンウイルス４０−不死化した成体ラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）への、ハイスループット結合アッセイにより決定した。白色文字は、ＦＣ５−Ｈ７と同等の中等度のバインダーを指し（２０時間結合）；マイナス（-）印は、低い結合を示す変異体を指し（２０時間結合、ＦＣ５−Ｈ７未満）；アスタリスク（＊）印は、強力なバインダーを指し（２０時間結合）；並びに、アスタリスクの付いた下線付き文字は、非常に強力なバインダーを指す（２時間結合）。
【００３１】
【図４】図４は、ラットＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞株（図４Ａ）及びヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）−Ｄ３細胞株（図４Ｂ）を使用する結合アッセイにおける、図３に示したＦＣ５−Ｈ７の４８の単独の変異性変種のランキングを示す。結合曲線は、細胞−結合した抗体の検出のためのＤｒａｑ  ５核染色（２ｕＭ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を補充した蛍光コンジュゲートｃ−ｍｙｃ  Ａｌｅｘａ  ４８８検出抗体（１６００ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、各抗体の連続希釈により作製した。全てのプレートは、４℃で２時間及び２０時間インキュベーションした。測定値は、以下に説明するように、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ高感度マイクロプレートサイトメトリーを用い、各時点で得た。
【００３２】
【図５】図５は、図２に示されたスクリーン２で選択された図４に示した「トップ」２９の親和性改善された変種のＦＣ５−Ｈ７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における単独の点変異の分布のグラフ表示を示す。白色文字は、ＦＣ５−Ｈ７と類似の中等度の親和性を指し；マイナス（-）印は、ＦＣ５−Ｈ７よりも低い親和性を示す変異体を指し；アスタリスク（＊）印は、ＦＣ５−Ｈ７よりも高い親和性を指し；並びに、アスタリスクの付いた下線付き文字は、ＦＣ５−Ｈ７よりも著しく高い親和性を指す。
【００３３】
【図６】図６は、ＦＣ５、ＦＣ５−Ｈ７及び図５から選択されたＦＣ５−Ｈ７変異体のインビトロＢＢＢモデルにおいて得られたＰａｐｐ値を示す。陰性対照Ａ２０．１  ＶＨＨは、各ＦＣ５−由来の抗体と一緒に、トップチャンバーに同時投与し、且つ輸送を測定した。アスタリスクは、ＦＣ５−Ｈ７又はＦＣ５のいずれかと比較して、増強されたＰａｐｐ値を示すＦＣ５−Ｈ７変異体を指す。各変種の相対結合親和性は、このグラフの下の表に示した。
【００３４】
【図７】図７は、野生型ＦＣ５配列（配列番号：１６）、ヒト化ＦＣ５変種ＦＣ５−Ｈ７（配列番号：１７）、及びＣＤＲ変異体Ｄ５６Ｋ（配列番号：１２）、Ｎ５７Ｄ（配列番号：１３）、Ｆ５９Ｉ（配列番号：１４）、Ｆ５９Ｌ（配列番号：１５）、及びＴ１０５Ｋ（配列番号：１１）の間の、配列アラインメントを示す。
【００３５】
【図８】図８は、ラット（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）、ヒト（ＨＢＥＣ−Ｄ３）及び非−ヒト霊長類（ＣｙｎｏＢＥＣ）脳内皮細胞への、全てヒトＦｃとの融合において発現された（配列表参照）、選択されたＦＣ５−Ｈ７変異性変種（Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、Ｔ１０５Ｋ）、ＦＣ５−Ｈ７及びＦＣ５の結合を示す。結合曲線は、細胞−結合した抗体の検出のためのＤｒａｑ  ５核染色（２ｕＭ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を補充した蛍光コンジュゲートｃ−ｍｙｃ  Ａｌｅｘａ  ４８８検出抗体（１６００ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、各抗体の連続希釈により作製した。全てのプレートは、４℃で２０時間インキュベーションした。測定値は、以下に説明するように、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ高感度マイクロプレートサイトメトリーを用い、各時点で得た。
【００３６】
【図９】図９は、ＦＣ５、ＦＣ５−Ｈ７及び選択された親和性−最適化されたＦＣ５−Ｈ７変異性変種（Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、Ｔ１０５Ｋ）のＦｃ融合体のインビトロＢＢＢモデルにおいて得られたＰａｐｐ値を示す。陰性対照Ａ２０．１  ＶＨＨは、ＦＣ５−由来の抗体と一緒に、トップチャンバーに同時投与し、且つ輸送を測定した。全てのＦＣ５−Ｈ７変異性変種は、ＦＣ５−Ｈ７Ｆｃ又はＦＣ５Ｆｃのいずれかと比較して、増強されたＰａｐｐ値を示す。
【００３７】
【図１０Ａ】図１０は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ（図１０Ａ）、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｂ）、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｃ）、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ（図１０Ｄ）、及びＦ５９Ｌ−Ｆｃ（図１０Ｅ）の、５ｍｇ／ｋｇでの全身（尾静脈）投与後の、血漿及びＣＳＦの薬物動態を示す。ＣＳＦは、大槽(cisternae magna)から、指定された時点での反復穿刺により収集した。抗体の血漿及びＣＳＦ濃度は、特異的タンパク質ペプチド署名を基にした、反復反応のモニタリング−アイソタイプ標識した内部標準（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）法を用いて決定した。ＣＳＦ中のアルブミンレベルは、ＭＲＭにより同時に決定した。１５００未満の血漿／ＣＳＦ比を有する全てのＣＳＦ試料は、潜在的に血液が夾雑したとして、除外した。
【図１０Ｂ】図１０は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ（図１０Ａ）、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｂ）、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｃ）、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ（図１０Ｄ）、及びＦ５９Ｌ−Ｆｃ（図１０Ｅ）の、５ｍｇ／ｋｇでの全身（尾静脈）投与後の、血漿及びＣＳＦの薬物動態を示す。ＣＳＦは、大槽(cisternae magna)から、指定された時点での反復穿刺により収集した。抗体の血漿及びＣＳＦ濃度は、特異的タンパク質ペプチド署名を基にした、反復反応のモニタリング−アイソタイプ標識した内部標準（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）法を用いて決定した。ＣＳＦ中のアルブミンレベルは、ＭＲＭにより同時に決定した。１５００未満の血漿／ＣＳＦ比を有する全てのＣＳＦ試料は、潜在的に血液が夾雑したとして、除外した。
【図１０Ｃ】図１０は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ（図１０Ａ）、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｂ）、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｃ）、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ（図１０Ｄ）、及びＦ５９Ｌ−Ｆｃ（図１０Ｅ）の、５ｍｇ／ｋｇでの全身（尾静脈）投与後の、血漿及びＣＳＦの薬物動態を示す。ＣＳＦは、大槽(cisternae magna)から、指定された時点での反復穿刺により収集した。抗体の血漿及びＣＳＦ濃度は、特異的タンパク質ペプチド署名を基にした、反復反応のモニタリング−アイソタイプ標識した内部標準（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）法を用いて決定した。ＣＳＦ中のアルブミンレベルは、ＭＲＭにより同時に決定した。１５００未満の血漿／ＣＳＦ比を有する全てのＣＳＦ試料は、潜在的に血液が夾雑したとして、除外した。
【図１０Ｄ】図１０は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ（図１０Ａ）、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｂ）、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｃ）、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ（図１０Ｄ）、及びＦ５９Ｌ−Ｆｃ（図１０Ｅ）の、５ｍｇ／ｋｇでの全身（尾静脈）投与後の、血漿及びＣＳＦの薬物動態を示す。ＣＳＦは、大槽(cisternae magna)から、指定された時点での反復穿刺により収集した。抗体の血漿及びＣＳＦ濃度は、特異的タンパク質ペプチド署名を基にした、反復反応のモニタリング−アイソタイプ標識した内部標準（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）法を用いて決定した。ＣＳＦ中のアルブミンレベルは、ＭＲＭにより同時に決定した。１５００未満の血漿／ＣＳＦ比を有する全てのＣＳＦ試料は、潜在的に血液が夾雑したとして、除外した。
【図１０Ｅ】図１０は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ（図１０Ａ）、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｂ）、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ（図１０Ｃ）、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ（図１０Ｄ）、及びＦ５９Ｌ−Ｆｃ（図１０Ｅ）の、５ｍｇ／ｋｇでの全身（尾静脈）投与後の、血漿及びＣＳＦの薬物動態を示す。ＣＳＦは、大槽(cisternae magna)から、指定された時点での反復穿刺により収集した。抗体の血漿及びＣＳＦ濃度は、特異的タンパク質ペプチド署名を基にした、反復反応のモニタリング−アイソタイプ標識した内部標準（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）法を用いて決定した。ＣＳＦ中のアルブミンレベルは、ＭＲＭにより同時に決定した。１５００未満の血漿／ＣＳＦ比を有する全てのＣＳＦ試料は、潜在的に血液が夾雑したとして、除外した。
【００３８】
【図１１】図１１は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ、Ｆ５９Ｌ−Ｆｃ、Ｆ５９Ｉ−Ｆｃ、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ及び対照Ａ２０．１マウスＦｃ融合体（Ａ２０．１−ｍＦｃ）の、５ｍｇ／ｋｇでの全身（尾静脈）投与後の、脳レベルを示す。脳レベルは、特異的タンパク質ペプチド署名を定量するＭＲＭ−ＩＬＩＳ法を使用する、頸動脈を介した脳灌流後に、測定した。結果は、１群につき３匹の動物の且つ２回の個別の統計的決定での平均±ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、血液−脳関門を移行する単離又は精製された抗体断片、及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、現存する抗体断片の点変異により誘導される抗体断片、及びその使用に関し；本発明の抗体断片は、血液−脳関門を超える増強された移行を示す。
【００４０】
本発明は：
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列；
ＲＩＴＷＧＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：２）のＣＤＲ２配列（ここでＸ１はＤ又はＫであり、Ｘ２はＮ又はＤであり、及びＸ３はＦ、Ｉ又はＬである）；並びに
ＧＳＴＳＴＡＸ４ＰＬＲＶＤＹ（配列番号：３）のＣＤＲ３配列（ここで、Ｘ４はＴ又はＫである）：を含む、単離又は精製された抗体断片を提供する。
【００４１】
本発明の抗体断片は、ＷＯ２００２／０５７４４５に記載されたＦＣ５抗体の変異された型である。ＦＣ５（配列番号：１６）は、哺乳動物の脳内皮細胞の表面に結合し、その後血液−脳関門（ＢＢＢ）を移行する。ＦＣ５はまた、ＢＢＢを超えて様々なサイズの分子を先導する担体として作用することが示されている（例えば、ＷＯ２０１１／１２７５８０参照）。理論と結びつけられることを意図するものではないが、それにＦＣ５が選択的に結合し且つＦＣ５移行を媒介する抗原は、膜貫通ドメインタンパク質３０Ａであると提唱されており（ＴＭＥＭ３０Ａ；ＷＯ２００７／０３６０２１）、これは脳内皮細胞の表面上に集積されている。
【００４２】
本発明の単離又は精製された抗体断片において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４の少なくとも一つは、ＦＣ５のＣＤＲ２又はＣＤＲ３の対応する野生型残基とは異なる。より詳細には、本発明の実施態様において、ＣＤＲ２（配列番号：２）のＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＣＤＲ３（配列番号：３）のＸ４  の少なくとも一つは、配列番号：１６の対応する野生型ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とは異なり、ここで野生型ＣＤＲ２（配列番号：４）及びＣＤＲ３（配列番号：１０）は、各々、配列番号：１６の残基５０−６６及び９９−１１１に対応している。
【００４３】
前述の抗体断片において、ＣＤＲ２は、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）、ＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：５）、ＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：６）、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：７）、及びＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：８）からなる群から選択され；それに対し、ＣＤＲ３は、ＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹ（配列番号：９）又はＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）からなる群から選択されてよく、但しＣＤＲ３配列がＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）である場合、ＣＲＤ２は、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）ではないことを条件とする。
【００４４】
用語「抗体」は、当該技術分野において「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも称され、一般に、対をなした重ポリペプチド鎖及び軽ポリペプチド鎖で構築されたタンパク質を指し；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む、様々なＩｇアイソタイプが存在する。抗体が正確にフォールディングされる場合、各鎖は、より線状のポリペプチド配列により結合され数多くの異なる球状ドメインにフォールディングする。例えば、免疫グロブリン軽鎖は、可変（ＶＬ）ドメイン及び定常（ＣＬ）ドメインへフォールディングするのに対し、重鎖は、可変（ＶＨ）ドメイン及び３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインへフォールディングする。重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成を生じる。各ドメインは、当業者が熟知している良く確立された構造を有する。
【００４５】
軽鎖及び重鎖可変領域は、標的抗原の結合に係わり、従って抗体間の著しい配列多様性を示すことができる。定常領域は、より少ない配列多様性を示し、且つ数多くの天然のタンパク質の結合に係わり、重要な生化学的事象を誘起する。抗体の可変領域は、その分子の抗原−結合決定基を含み、従って抗体のその標的抗原に対する特異性を決定する。配列多様性の大半は、６つの超可変領域において生じ、各可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）につき３つであり；超可変領域は一緒に、抗原−結合部位を形成し、且つ結合及び抗原決定基の認識に寄与する。抗体のその抗原に対する特異性及び親和性は、超可変領域の構造、並びにそれらのサイズ、形状及びそれらが抗原に提示する表面の化学により決定される。様々なスキームが、超可変領域の同定のために存在し、その中の最も一般的な２つは、Kabatのスキーム並びにChothia及びLeskのスキームである。Kabatら(1991)は、ＶＨ及びＶＬドメインの抗原−結合領域の配列多様性を基に、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を規定した。Chothia及びLesk(1987)は、ＶＨ及びＶＬドメイン内の構造的ループ領域の配置を基に、「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を規定した。これらの個別のスキームは、隣接するか又は重複しているＣＤＲ領域及び超可変ループ領域を規定し、抗体技術分野の業者は、用語「ＣＤＲ」と「超可変ループ」を互換的に使用することが多く、且つこれらは本明細書においてもそのように使用されている。ＣＤＲ／ループは、本明細書において、Kabatスキームに従い規定されている。
【００４６】
本明細書において言及される「抗体断片」は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；単独のＶＬ又はＶＨで構成された断片）及びｓｄＡｂの多価の表示を含んでよい。ここで説明されたものなどの抗体断片は、リンカー配列、ジスルフィド結合、又は断片の異なる部分を連結する他の型の共有結合を必要としてよく；当業者は、異なる型の断片の必要要件及び様々なアプローチ及びそれらの構築のための様々なアプローチを熟知しているであろう。
【００４７】
抗体断片は、天然の又は組換え給源からのｓｄＡｂに由来する。ラクダ科の動物起源の重鎖抗体（Hamers-Castermanら、1993）は、軽鎖を欠いており、従ってそれらの抗原結合部位は、ＶＨＨと称される、１つのドメインからなる。ｓｄＡｂはまた、サメにおいても認められ、ＶＮＡＲと称される（Nuttallら、2003）。他のｓｄＡｂは、ヒトＩｇ重鎖又は軽鎖配列を基に操作されてよい（Jespersら、2004；Toら、2005）。本明細書において使用されるように、用語「ｓｄＡｂ」は、ファージディスプレイ又は他の技術により任意の起源のＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、又はＶＮＡＲリザーバーから直接単離されるそれらのｓｄＡｂ、前述のｓｄＡｂに由来するｓｄＡｂ、組換え作製されたｓｄＡｂ、並びにヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化、ラクダ化もしくは抗体操作の他の方法によりそのようなｓｄＡｂの更なる修飾を介して作製されたそれらのｓｄＡｂを含む。ｓｄＡｂの抗原−結合機能及び特異性を保持し、且つＦＣ５を上回る改善された能力によりＢＢＢを移行する、相同体、誘導体、又は断片も、本明細書により包含されている。
【００４８】
ＳｄＡｂは、高い熱安定性、高い界面活性剤抵抗性、比較的高いプロテアーゼ抵抗性（Dumoulinら、2002）、及び高い産生収率（Arbabi-Ghahroudiら、1997）などの、抗体分子の望ましい特性を持ち；これらはまた、免疫ライブラリーからの単離による（Liら、2009）か、又はインビトロにおける親和性成熟により（Davies及びRiechmann、1996）、非常に高い親和性を有するように、操作されることもできる。非標準のジスルフィド結合の導入（Hussackら、2011；Kimら、2012）などの、安定性を増加するための更なる修飾もまた、ｓｄＡｂにもたらされてよい。
【００４９】
当業者は、単一ドメイン抗体の構造に精通しているであろう（例えば、タンパク質データバンクの３ＤＷＴ、２Ｐ４２参照）。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンフォールドを保持している単独の免疫グロブリンドメインを含み；最も注目すべきことに、３つのＣＤＲ／超可変フープのみが、抗原−結合部位を形成する。しかし、当業者により理解されるように、全てのＣＤＲが、抗原の結合に必要なわけではない。例えば、限定を意図せずに、１、２又は３つのＣＤＲは、本発明のｓｄＡｂによる、抗原の結合及び認識に寄与し得る。ｓｄＡｂ又は可変ドメインのＣＤＲは、本明細書において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称される。
【００５０】
一つの非限定的例において、本発明の抗体断片は、以下を含む：
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：４）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹ（配列番号：９）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：５）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：６）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：７）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列；又は、
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号：１）のＣＤＲ１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号：８）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号：１０）のＣＤＲ３配列。
【００５１】
先に言及したように、抗体断片は、ラクダ科の動物起源の又はラクダ科の動物ＶＨＨから誘導されるｓｄＡｂであってよく、従ってラクダ科の動物フレームワーク領域を基にしてよい。本発明は更に、キメラの（又はキメラ化された）、ベニヤ化された(veneered)、又はヒト化された抗体断片を包含している。キメラ抗体断片は、未変性の可変ドメイン（ラクダ科の動物起源の）が、ヒト定常ドメイン（複数可）に連結されている構築体を包含している（Gonzalesら、2005参照）。抗体のベニヤ化又は再表面化は、未変性の抗体断片のフレームワーク領域中の露出された残基の、それらのヒト対応物中のアミノ酸残基との置き換えに関与している（Padlan、1991；Gonzalesら、2005）。抗体のヒト化は、抗原−結合能又は特異性を損なうことのない、配列中のアミノ酸の、ヒトコンセンサス配列中に認められるようなそのヒト対応物による置き換えを含み；このアプローチは、ヒト対象へ導入される場合に、抗体断片の免疫原性を低下する。このプロセスにおいて、本明細書に規定された１又は２以上のＣＤＲは、ヒト可変領域（ＶＨ又はＶＬ）へ、他のヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）へ、ヒト抗体断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）へ、又はその上へＣＤＲがグラフトされ得る類似のサイズ及び性質のヒトタンパク質（Nicaiseら、2004）へ、融合されるか又はグラフトされることができる。このような場合において、該１又は２以上の超可変ループの高次構造は、おそらく保存され、且つｓｄＡｂのその標的（すなわち、脳内皮細胞）に対する親和性及び特異性は、おそらく最小の影響を受ける。当業者により公知であるように、結合及び特異性を保持するために、特定の未変性のアミノ酸残基を、ヒトフレームワークへ組み込むことは、必要であろう。ＣＤＲグラフティングによるヒト化は、当該技術分野において公知であり（例えば、Tsurushitaら、2005；Jonesら、1986；Tempestら、1991；Riechmannら、1988；Queenら、1989参照；Gonzalesら、2005の総説−同じくそれらに引用された参考文献）、従って当業者は、そのようなヒト化された抗体又はその断片の調製方法を十分に熟知しているであろう。
【００５２】
先に記載したＣＤＲ配列は、好適な抗体断片スキャフォールドへ組み込まれてよい。例えば、限定を意図するものではないが、ＣＤＲ配列は、ＦＣ５スキャフォールド（配列番号：１６）へ；又は、２０１６年７月６日に出願された米国特許仮出願第６２／３５８，７７７号に記載された、ＦＣ５スキャフォールドのヒト化された型、例えば、ＦＣ５−Ｈ７（配列番号：１７）へ組み込まれてよい。ＦＣ５又はヒト化されたスキャフォールド中のＣＤＲは、残基２６−３５（ＣＤＲ１）、残基５０−６６（ＣＤＲ２）、及び残基９９−１１１（ＣＤＲ３）に対応している。
【００５３】
例えば、いかなる方式でも限定を意図するものではないが、先に説明された単離又は精製された抗体断片は、以下からなる群から選択されてよい：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＫＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１１）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＫＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＤＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１３）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＩＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１４）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＬＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１５）；及び
それらの実質的に同一の配列。
【００５４】
実質的に同一の配列は、１又は複数の保存的アミノ酸変異を含んでよい。参照配列に対する１又は複数の保存的アミノ酸変異は、参照配列と比べて、生理的、化学的、物理化学的又は機能的特性の実質的変化がない、変異体ペプチドを生じることができ；そのような場合、参照配列及び変異体配列は、「実質的に同一の」ポリペプチドと考えられることは、当該技術分野において、公知である。
【００５５】
非限定的例において、保存的変異は、保存的アミノ酸置換であってよい。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の、類似の化学特性（例えば、サイズ、電荷、又は極性）を持つ別のアミノ酸残基との置換として、本明細書において規定される。これらの保存的アミノ酸変異は、ｓｄＡｂのフレームワーク領域に作製されるが、先に列挙されたＣＤＲ配列及び抗体断片のＣＤＲの全体の構造は維持し；従って、抗体の特異性及び結合は維持される。そのような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、又は酸性のアミノ酸を、同じ群の別のものと置換してよい。用語「塩基性アミノ酸」により、これは、典型的には生理的ｐＨで正帯電した、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する、親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）を含む。用語「中性アミノ酸」（同じく「極性アミノ酸」）により、これは、生理的ｐＨで非帯電の側鎖を有するが、２個の原子により通常共有される電子対が１個の原子によりより密に保持されている少なくとも一つの結合を有する、親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸は、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）を含む。用語「疎水性アミノ酸」（同じく「非極性アミノ酸」）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）の規準化されたコンセンサス疎水性スケールに従い０よりも大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸は、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）を含む。「酸性アミノ酸」は、側鎖ｐＫ値７未満を有し、典型的には生理的ｐＨで負帯電している、親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）を含む。
【００５６】
配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用され；これは、２つの配列が残基位置間が最大の対応になるように並置された場合に、同じである残基の割合を計算することにより決定される。任意の公知の方法を使用し、配列同一性を計算することができ；例えば、コンピュータソフトウェアが、配列同一性を計算するために利用可能である。限定を意図するものではないが、配列同一性は、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより維持されたＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２サービス（及び、ca.expasy.org/tools/blast/で認められる）、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、Ｂｌａｓｔ−Ｎ、もしくはＦＡＳＴＡ−Ｎなどのソフトウェアにより、又は当該技術分野において公知である他の好適なソフトウェアにより、計算することができる。
【００５７】
本発明の実質的に同一の配列とは、少なくとも９０％同一であってよく；別の例においては、実質的に同一の配列とは、本明細書記載の配列に対するアミノ酸レベルで、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％、又はそれらの間の任意の割合で、同一である。これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２の保存的アミノ酸変異に対応している。重要なことに、実質的に同一の配列は、参照配列の活性及び特異性（すなわち、ＢＢＢを移行する能力）を保持している。非限定的実施態様において、配列同一性の差は、保存的アミノ酸変異（複数可）によるものであることができる。非限定的例において、本発明は、本明細書記載の抗体のそれと、少なくとも９５％（６つの保存的アミノ酸変異に対応）、９８％（２つの保存的アミノ酸変異に対応）、又は９９％（１つの保存的アミノ酸変異に対応）同一である配列を含む抗体断片に対することができる。加えて、配列同一性の割合の計算は、抗体断片の完全な配列との比較に関与することも理解される。
【００５８】
本発明の抗体断片はまた、組換え抗体又はその断片の発現、検出又は精製を助けるための、追加の配列を含んでよい。当業者に公知の任意のそのような配列又はタグを、使用してよい。例えば、限定を意図するものではないが、抗体断片は、標的化又はシグナル配列（例えば、非限定的に、ｏｍｐＡ）、検出／精製タグ（例えば、非限定的に、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ５、又はＨｉｓ６）、もしくはそれらの組合せを含んでよい。別の例において、追加の配列は、CronanらのＷＯ９５／０４０６９、又はVogesらのＷＯ／２００４／０７６６７０に説明されたものなどの、ビオチン認識部位であってよい。同じく当業者に公知であるように、リンカー配列は、追加の配列又はタグと結合して使用されるか、又は検出／精製タグとして働いてもよい。
【００５９】
本発明の抗体断片はまた、多価ディスプレイフォーマットにあってよく、これは本明細書において多価提示とも称される。多量体化は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法により達成されてよい。例えば、いかなる方式でも限定されることを意図しないが、多量体化は、ＷＯ２００３／０４６５６０に記載されたもののような、自己集合分子を使用し、達成されてよく、この文献では、五量体が、抗体断片及びＡＢ５毒素ファミリーのＢ−サブユニットの五量体化ドメインを含む融合タンパク質の発現により作製される（Merritt及びHol、1995）。多量体はまた、Zhuらの文献(2010)に説明された多量体化ドメインを用いても形成されることができ；この形状は、本明細書において「コムボディ(combopdy)」形と称されるが、これは抗体断片のコイルドコイルペプチドとの融合であり、多量体分子を生じる。多価ディスプレイの他の形状も、本発明により包含される。例えば、限定されることを意図するものではないが、抗体断片は、二量体、三量体、又は任意の他の好適なオリゴマーとして提示されてよい。これは、当該技術分野において公知の方法、例えば、直接連結結合（Nielsonら、2000）、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（de Kruif及びLogtenberg、1996）、「ノブイントゥーホール」相互作用（Ridgwayら、1996）などにより達成される。
【００６０】
多量体化に関する本明細書において公知の別法は、Ｆｃドメイン、例えば、非限定的に、ヒトＦｃドメインを使用する、抗体断片の二量体化である。Ｆｃドメインは、非限定的に、ＩｇＧ、ＩｇＭを含む様々なクラス、又は非限定的にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む様々なサブクラスから選択されてよい。このアプローチにおいて、Ｆｃをコードしているポリヌクレオチドは、ｓｄＡｂをコードしているポリヌクレオチドと共に、ベクターへ挿入され、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を形成し（Ｂｅｌｌら、２０１０；Ｉｑｂａｌら、２０１０）；この融合タンパク質は、組換えにより発現され、次に精製される。例えば、いかなる方式でも限定されることを意図しないが、多価ディスプレイフォーマットは、Ｆｃドメインに連結されたＦＣ５−Ｈ７変異性変種のキメラフォーマットを包含してよい。そのようなキメラフォーマット分子は、容易に操作され且つ作出され、ｓｄＡｂの血清半減期を大きく延長することができ、且つ優れた主要造影剤であることができる（Bellら、2010）。
【００６１】
ここで説明された多量体複合体中のＦｃドメインは、当該技術分野において公知の任意の好適なＦｃ断片であってよい。Ｆｃ断片は、任意の好適な給源由来であってよく；例えば、Ｆｃは、マウス又はヒト起源であってよい。具体的で非限定的な例において、Ｆｃは、マウスＩｇＧ２ｂ  Ｆｃ断片又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４  Ｆｃ断片であってよい（Bellら、2010；Iqbalら、2010）。具体的で非限定的な例において、多量体化された構築体は、本明細書に記載されたような単離又は精製された抗体断片及び配列番号：２９の配列を含むＦｃを含んでよい。
【００６２】
先に記載した多量体の各サブユニットは、本発明の同じ又は異なる抗体断片を含んでよく、これは同じ又は異なる特異性を有してよい。加えて、多量体化ドメインは、必要に応じ、リンカーを使用し、抗体断片へ連結されてよく；そのようなリンカーは、２つの分子の柔軟な結合を提供するのに、十分な長さ及び好適な組成でなければならないが、抗体の抗原−結合特性を妨害してはならない。
【００６３】
本明細書記載の抗体断片は、血液−脳関門を移行する。脳は、血液−脳関門（ＢＢＢ）として公知の特定された内皮組織により、体の残りの部分から分離されている。ＢＢＢの内皮細胞は、タイトジャンクションにより接続され、且つ多くの治療的化合物が脳に侵入することを効果的に防止する。小胞輸送の遅い速度に加え、ＢＢＢの一つの特異的特徴は、酵素関門（複数可）の存在及びＰ−糖タンパク質を含むＢＢＢの反管腔（脳）側上のＡＴＰ−依存型トランスポーターの高レベル（複数可）の発現であり（Gottesmanら、1993；Watanabe、1995）、このトランスポーターは様々な分子を脳から血流へ能動輸送する（Samuels、1993）。小型（＜５００ダルトン）及び疎水性（Pardridge、1995）分子のみが、ＢＢＢをより容易に横断することができる。従って、表面受容体へ特異的に結合し、脳内皮細胞へインターナライズし、リボソーム分解を回避することによりＢＢＢを超えるトランスサイトーシスを受ける、先に記載された抗体断片の能力は、神経学的分野において有用である。
【００６４】
本発明はまた、本明細書記載の分子をコードしている核酸配列も包含している。遺伝暗号の縮重があるとすると、数多くのヌクレオチド配列は、当業者により容易に理解されるように、そのポリペプチドをコードする作用を有するであろう。核酸配列は、様々な微生物における発現のためにコドン−最適化され得る。本発明はまた、ここに説明したような核酸を含むベクターを包含している。更に本発明は、説明したような核酸及び／又はベクターを含む細胞を包含している。
【００６５】
本発明は更に、様々な方法を用い、表面上に固定された単離又は精製された抗体断片を包含し；例えば、限定されることを意図しないが、抗体断片は、Ｈｉｓ−タグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着、及び同類のものにより、表面へ連結又はカップリングされてよい。本発明の抗体断片の固定は、タンパク質の捕獲、精製、又は単離のための様々な適用において有用であることができる。固体表面は、任意の好適な表面、例えば、非限定的に、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、メンブレン、ビーズ（磁気ベースの又はセファロースベースのビーズ又は他のクロマトグラフィー樹脂など）、ガラス、プラスチック、ステンレス鋼、フィルム、又はナノ粒子、ナノワイヤ及びカンチレバー表面などの任意の他の有用な表面であってよい。
【００６６】
本発明はまた、カーゴ分子に連結された前述のような１又は複数の抗体断片を包含している。カーゴ分子は、本抗体断片によりＢＢＢを超えて送達される、任意の好適な分子であってよい。カーゴ分子は、約１ｋＤ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有し；例えば、カーゴ分子は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、もしくは２００ｋＤａの分子量、又はその間の任意の分子量、又は前述の分子量の任意の２つにより規定される任意の範囲の分子量を有する。具体的で非限定的な例において、カーゴ分子は、分子量約８０ｋＤａ（例えば、非限定的にＦｃ断片、毒素、成長因子、サイトカイン、酵素、タンパク質、抗体、単一ドメイン抗体、又は抗体断片など）、又は約２００ｋＤａ（例えば、非限定的にモノクローナル抗体）を有することができる。
【００６７】
例えば、任意の方式で限定されることを意図するものではないが、カーゴ分子は、検出物質、治療薬、薬物、ペプチド、酵素、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、カーゴ抗体又はカーゴ抗体の断片（例えば、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＶＨＨなど）、化合物、糖鎖部分、ＤＮＡ−ベースの分子（アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド）、細胞傷害性物質、ウイルスベクター（アデノ−、レンチ−、レトロ）、先に引用したカーゴ分子の型のいずれかを負荷した１又は複数のリポソーム、あるいは１又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、もしくは量子ドットであってよい。前述のカーゴ分子は、検出可能な物質であることができる。例えば、ＦＣ５抗体変種断片は、放射性同位体、常磁性ラベル、発蛍光団、蛍光剤、近赤外線（ＮＩＲ；例えば、Ｃｙ５．５）、蛍光色素又は色素、音波を発する微小気泡、親和性ラベル、検出可能なタンパク質−ベースの分子、ヌクレオチド、量子ドット、ナノ粒子、ナノワイヤ、もしくはナノチューブ、又は造影法により検出され得る任意の他の好適な物質へ連結されることができる。本抗体断片は、当該技術分野において公知の方法（組換え技術、化学コンジュゲートなど）を用いて、カーゴ分子へ連結され得る。
【００６８】
本明細書記載のカーゴ分子は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法により抗体断片へ、連結されてよく、また本明細書においては「コンジュゲートされる」とも称される。例えば、限定されることを意図するものではないが、カーゴ分子は、共有結合により、ペプチド結合により、又はイオン相互作用により、抗体断片へ連結されてよい。例えば、限定されることを意図するものではないが、カーゴ分子に連結された抗体断片は、融合タンパク質として発現されてよい。この連結は、化学架橋反応を介して、又は細菌、酵母もしくは哺乳動物の細胞−ベースの系などの、任意のペプチド発現系と組合せた組換えＤＮＡ法を用いる融合を介して、達成することができる。カーゴ分子を抗体断片へコンジュゲーションする場合、好適なリンカーを使用することができる。抗体断片を治療物質又は検出物質などのカーゴ分子へ連結する方法は、当業者には周知であろう。
【００６９】
一つの非限定的例において、カーゴ分子は、検出可能なラベル、放射性同位体、ガドリニウムもしくは酸化鉄などの常磁性ラベル、発蛍光団、近赤外線（ＮＩＲ）、蛍光色素又は色素、音波を発する微小気泡、親和性ラベル（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素、又は診断造影法により検出され得る任意の他の好適な物質であってよい。具体的な非限定的例において、抗体断片は、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）造影色素へ、例えば、限定されることを意図するものではないが、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、又はＤｙｌｉｇｈｔ８００へ連結されてよい。
【００７０】
前述の方法におけるインビボ検出工程は、診断目的の全身造影、又は、疾患の進行もしくは治療レジメンに対する宿主反応を評価するための定量的方式での、非限定的に脳血管もしくは脳腫瘍血管などの、特定部位での局所造影であることができる。前述の方法における検出工程は、非限定的に以下を含む、免疫組織化学、又は非侵襲的（分子）診断造影技術であることができる：
・光学的造影；
・ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、ここで検出物質は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ及び６８Ｇａなどの同位体であり、１８Ｆが最も臨床で利用される；
・単光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ここで検出物質は、具体的適用に応じて、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅなどの放射性トレーサーである；
・磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ここで検出物質は、例えば非限定的に、ガドリニウム、酸化鉄のナノ粒子及び炭素−コートされた鉄−コバルトナノ粒子であり、これにより、プラークの検出のためのＭＲＩの感度を増強する；
・コントラスト−増強型超音波検査法（ＣＥＵＳ）又は超音波、ここで検出物質は、少なくとも１つの音響学的に活性のある気体−充填された微小気泡である。超音波は、ヒト疾患のスクリーニング及び早期発見のために広く採用される技術である。これは、ＭＲＩ又はシンチグラフィーほど高価ではなく、且つこれは放射線とは関わりがないので、放射性核種造影などの分子造影モダリティよりもより安全である。
【００７１】
本発明は更に、血液−脳関門を超えて、関心対象の分子を輸送する方法を提供する。この方法は、本明細書記載の抗体断片に連結された分子を、対象へ投与することを含む。この分子は、先に説明されたカーゴ分子を含む、任意の所望の分子であってよく；この分子は、非限定的に、コンジュゲーション又は融合タンパク質における発現を含む、任意の好適な方法を使用し、抗体断片へ「連結」されてよい。この投与は、例えば、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、及び筋肉内（ｉｍ）投与を含むが、これらに限定されるものではない、非経口投与など、任意の好適な方法によることができる。この方法において、本発明の抗体断片は、その脳標的へＢＢＢを超えて関心対象の分子を「運ぶ」。
【００７２】
本発明はまた、１又は２よりも多い本明細書記載の単離又は精製された抗体断片を含有する組成物も包含している。この組成物は、前記のような単独の抗体断片を含むことができるか、又は抗体断片の混合物であることができる。更に、本発明の抗体断片の混合物を含有する組成物において、抗体は、同じ特異性を有することができるか、又はそれらの特異性が異なることができる；
【００７３】
この組成物はまた、医薬として許容し得る希釈剤、賦形剤、又は担体を含んでもよい。希釈剤、賦形剤、又は担体は、当該技術分野において公知の任意の好適な希釈剤、賦形剤、又は担体であってよく、且つ組成物の送達方法により、組成物中の他の構成成分と適合可能でなければならず、且つその組成物のレシピエントに対し有害ではない。この組成物は、任意の好適な形状であってよく；例えば、この組成物は、懸濁液形状、粉末形状（例えば、必ずしも限定されないが、凍結乾燥された又はカプセル封入された）、カプセル剤又は錠剤形状で提供されてよい。例えば、限定されることを意図するものではないが、組成物が懸濁液形状で提供される場合、担体は、水、食塩水、好適な緩衝液、又は溶解度及び／もしくは安定性を改善するための添加剤を含んでよく；懸濁液を作製するための再構成は、抗体断片の生存度を確実にするために好適なｐＨで緩衝液中で達成される。乾燥粉末もまた、安定性を向上するための添加剤及び／又は嵩高／容積を増大するための担体を含んでよく；例えば、限定されることを意図するものではないが、乾燥粉末組成物は、ショ糖又はトレハロースを含んでよい。具体的な非限定的例において、この組成物は、抗体断片を対象の胃腸管へ送達するように製剤化されてよい。従って、この組成物は、カプセル封入、持続放出型(time-release)、又は他の好適な抗体断片の送達技術を含んでよい。本化合物を含有する好適な組成物を調製することは、当業者の能力内であろう。
【００７４】
典型的には、注射された抗体又は抗体断片の投与量の小さい画分（＜０．０１％）のみが、ＢＢＢを超える。ＦＣ５  ＶＨＨ（ＷＯ２００２／０５７４４５）は先に、ＢＢＢを移行するその能力について同定された。ＦＣ５との様々な抗体又はタンパク質の融合構築体は、ＦＣ５成分を伴わない対照抗体と比べ、脳の取込みが１０〜１５倍改善されることを示した。本発明者らは、ここで、脳内皮細胞への抗体の結合を改善することに繋がるＦＣ５の相補性決定領域内の特異的変異を同定した。具体的には、変異体Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋは、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ及びＨＢＥＣの両方において改善された結合を明らかにした。同じ変異体は、ＦＣ５−Ｈ７（ヒト化ＦＣ５）と比べて、Ｐａｐｐ値の３３〜４４８％の範囲の増加という改善を示し、このことは、インビトロＢＢＢモデルを超える輸送のそれらの割合の改善を指摘している。Ｆｃに融合される場合、ほとんどの変異体は、ＦＣ５−Ｆｃと比べてＳＶ−ＡＲＢＥＣへの改善された結合を維持し、且つＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ融合体と比べて、より高いＰａｐｐ値を示した。これらの結果は、ＣＤＲへ導入された特異的変異は、親和性の改善及びインビトロにおける増強されたＢＢＢ横断を生じることを示唆している。更に、抗体断片の脳への送達について試験された選択された変異体は、脳レベルの１．５〜３倍の増加を示し、これはＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ構築体と比べて、より良い脳浸透及びより高い脳レベルを明らかにしている。
【００７５】
本発明は、以下の実施例において更に例証されるであろう。しかしこれらの実施例は、単に例証目的であり、いかなる方式においても本発明の範囲を限定するために使用されてはならないことは理解されるべきである。
【実施例】
【００７６】
実施例１：ＣＤＲ変異ライブラリーの設計
ＦＣ５の配列（配列番号：１６）を基に、抗体のＣＤＲ内の単独の点変異を、性能を向上するように、設計した。ＦＣ５のＣＤＲコンフォメーションのモデリングした３Ｄ−構造を使用し、ｓｄＡｂ変異体の構築の情報をもたらした。
【００７７】
ラクダ科の動物ＶＨＨの３Ｄ−構造モデリング。ＦＣ５  ＶＨＨに類似している鋳型構造を、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）に対するＢＬＡＳＴ検索を用いて、同定した。ＦＣ５  ＶＨＨの３Ｄ構造は、鋳型として、２Ｘ１Ｏ｜Ａ（ＰＤＢコード｜Ｃｈａｉｎ  ＩＤ）構造を基に、ホモロジーモデリングを用いて、近似した。次にＦＣ５  ＶＨＨ構造を、ＦＣ５配列へ鋳型構造を変異することにより、構築し；これは、様々な位置に３２の変異を含んだ（ＣＤＲ中２６及びフレームワーク領域中６）。次に、ＦＣ５  ＶＨＨモデルを、ＡＭＢＥＲ力場によるエネルギーの最小化及び制約の段階的放出により精緻化し、最初に緩和したＣＤＲループから、最後のステージでのみ完全に緩和しているフレームワーク領域の主鎖重原子へ、位置を評定した(ranging)。次にＶＨＨモデルのＣＤＲ−Ｈ３ループを、モンテカルロ最小化（ＭＣＭ）立体構造サンプリングにより精緻化し、ここでＣＤＲ−Ｈ３領域中の二面角は、エネルギー最小化の前にサンプリングされた。
【００７８】
この作業のための選択されたヒト化されたフレームワークは、ＦＣ５−Ｈ７のそれ（配列番号：１７）であり、これは低い予測される免疫原性、高い生成収量、及び上昇した熱安定性の最適なバランスを明らかにした。ヒト化されたＦＣ５−Ｈ７は、その内容が引用により本明細書中に組み込まれている、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５４０３６に記載されたように、構築され且つ作製された。
【００７９】
ＦＣ５  ＣＤＲは、２９残基を含み：ＣＤＲ１（残基２６−３５、配列番号：１６）に７、ＣＤＲ２（残基５０−６６、配列番号：１６）に１０、及びＣＤＲ３（残基９９−１１１、配列番号：１６）に１２。変異は、ＣＤＲにおいて構造上の役割を果たすようには見えない、溶媒−接近可能な残基に集中された。以下の変異が、ＦＣ５−Ｈ７へ導入するために選択された：Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋ。
【００８０】
実施例２：ライブラリー構築及びプラスミド作製
実施例１において同定した単独の変異を、ＦＣ５−Ｈ７配列へ導入した。
【００８１】
単独点変異体に関するｃＤＮＡ配列を作製するために、各々好ましい大腸菌コドンを、点変異体のために使用し、且つＦＣ５−Ｈ７のｃＤＮＡ配列内に埋め込んだ。全ての変種を、Ｈｉｓ５タグ及びｃ−ｍｙｃタグを持つ融合体において発現させ、各々、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（商標）カラムを使用する固定された金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製、及び免疫化学による検出を可能にした。
【００８２】
簡単には、ｓｄＡｂ  ＦＣ５−Ｈ７をコードしているＤＮＡ（配列番号：１７）又は点変異体を、プラスミドｐＳＪＦ２ＨのＢｂｓＩ／ＢａｍＨＩ部位へクローニングし、ＦＣ５の発現ベクターを作製した（Muruganandamら、2002）。これらのＤＮＡ構築体を、プライマーｆｄＴＧＩＩＩ、５’−ＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：１８）及び９６ＧＩＩＩ、５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号：１９）を使用する、３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーストレッチ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でのヌクレオチド配列決定により、確認した。
【００８３】
実施例３：３１８  ＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変異体の非常に小規模な発現及び精製
実施例２において作製したプラスミドを、大腸菌細胞へクローニングし、発現させ、且つ小規模で精製し、各クローンの性能を評価した。
【００８４】
タンパク質発現：ＣＤＲ−変異した変種を、実施例２に説明したように、合成し、且つｐＳＪＦ２Ｈへ直接クローニングした。引き続き、５０ｎｇのＤＮＡを、５μｌのＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｉｘ  ａｎｄ  Ｇｏエレクトロ−コンピテントＴＧ１大腸菌（Ｃａｄａｒｌａｎｅ）へ、４℃で１０分間形質転換し、次に２ＹＴ培地１００μｌを添加した（１Ｌ中にトリプトン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇ、及びＮａＣｌ  ５ｇ）。クローンを、６ウェル２ＹＴ寒天プレート＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン上で選択し、３２℃で一晩成長させ、その後３７℃で３〜４時間成長させた。培養物を、２ＹＴ／ｇｌｕ／ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１％グルコースを補充した２ＹＴ培地）５ｍｌへ接種し、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ２４ウェル深型プレートにおいて、３７℃、２５０ｒｐｍで成長させた。タンパク質発現を、ＩＰＴＧの最終濃度１ｍＭとなるような添加により、ＯＤ６００の０．４〜０．５で誘導した。培養物を、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩成長させた。細菌を、プレート遠心分離、３０００ｒｐｍで１５分間により、ペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを、−８０℃で２０分間凍結させた。部分的に解凍したペレットを、溶解緩衝液（１００ｍｌ中に、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍｌ  ＦａｓｔＢｒｅａｋ（Ｆｉｓｈｅｒ）、１×ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビター錠（Ｒｏｃｈｅ）、２００μｌ  ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を補充した１×ＰＢＳ）の１ｍｌ中に再懸濁させ、２５０ｒｐｍで３０分間溶解した。これらのプレートを、３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ精製用の新たな２４ウェル深型プレートへ移した。Ｐｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅニッケル磁気ビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、４００×ｇで１分間遠心し、次に緩衝液Ａ（５００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５）の４０ｍｌで洗浄し、再度遠心し、次に最終容積１０ｍｌ中に再懸濁した。調製したビーズの容積２００μｌを、発現されたｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ−デュアルタグ付きＶＨＨ単一ドメイン抗体変種を含むＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ２４ウェル深型プレートへ添加し、２７０ｒｐｍで３０分間インキュベーションした。
【００８５】
ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）フレックス磁気粒子プロセッサ精製：洗浄緩衝液プレート（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、及び１０ｍＭイミダゾール、２ｍｌ／ウェル）、溶出緩衝液プレート（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、及び３００ｍＭイミダゾール、３００μｌ／ウェル）、収集緩衝液プレート（５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍｌ／ウェル）、２４ウェルチップコーム（ＶＷＲ）、及びｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ−デュアルタグ付きＶＨＨ単一ドメイン抗体／ニッケル磁気ビーズを含むＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ２４ウェル深型プレートを、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）フレックス磁気粒子プロセッサに挿入した。この精製プロトコール（最適化されたＨｉｂａ＿ＫＦ）を、以下の工程で開始した：試料プレートからのビーズの収集−中速で１分間の洗浄−ビーズ収集−中速で５分間の混合による、溶出−ビーズ収集−ビーズのＥＤＴＡへの放出、及びホームへの戻し(drive home)。最終濃度２ｍＭのＥＤＴＡを、各タンパク質溶出プレートへ添加し、その後４℃で貯蔵した。Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）高感度マイクロプレートサイトメトリーによる細胞結合分析及び親和性ランキングのための調製において、試料を、９６−ウェルＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５脱塩プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ移し、イミダゾールを除去し、精製したＶＨＨ単一ドメイン抗体をＰＢＳの２５０μｌ＋ＥＤＴＡ  ０．５ｍＭへ、緩衝液交換した。タンパク質純度を、ミニ−プロテインＴＧＸ  ４−２０％無染色ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルにより評価し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｋ（商標）ＥＺシステムによりバンドを可視化した。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより測定した。
【００８６】
実施例４：親和性−改善されたＦＣ５変種の最初の選択
ＦＣ５変異体の選択戦略は、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）結合アッセイ（下記参照）を用い、少量で発現された全ての変種のスクリーニングを基にした。最初のスクリーニングラウンドは、ラットの脳内皮細胞ＳＶ−ＡＲＢＥＣにおいて行った。次にＳＶ−ＡＲＢＥＣへの最良の結合親和性を持つクローンを、同じ結合アッセイを用い、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ及びヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）の両方における結合について再度試験した。
【００８７】
Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）高感度マイクロプレートサイトメトリー（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）：全ての緩衝液及び試薬は、４℃で予め冷却した。各ｓｄＡｂ変異体を、０．５×ＰＢＳ／２．５ｍＭ  ＥＤＴＡと、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌアッセイ緩衝液−生存細胞造影溶液、ＬＣＩＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、ｍＯｓｍ＝３００）の１：１の緩衝液の混合液中で、１０００ｎＭの出発濃度に希釈した。ＬＣＩＢと、０．５×ＰＢＳ／２．５ｍＭ  ＥＤＴＡの１：１混合液の容積２０μｌを、各３８４ウェルＭｉｒｒｏｒｂａｌｌアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７１２）の全てのウェルに添加し；但し、１０００ｎＭ被験ＶＨＨ抗体４０μｌを入れたＡ行を除いた。連続希釈物を、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ  ３８４ウェルアッセイプレート内に各被験変種について調製した。１６−チャネルＦｉｎｎピペット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、ＶＨＨ抗体２０μｌを、Ａ行−１−２４列から、Ｂ行−１−２４列へ移し、８×混合し、次にＶＨＨ抗体２０μｌをＢ行−１−２４列から、Ｃ行−１−２４列へ移し、８×混合した。希釈を、Ｇ行−１−２４列まで繰り返し、各変異体について、７ポイント曲線を作製した。被験ＶＨＨ抗体変種（１０００ｎＭ）の第二セットを、Ｉ行−１−２４列へ添加し、この希釈プロトコールを、Ｏ行−１−２４列まで繰り返した。Ｈ行−１−２４列は、各プレート上で、参照ＦＣ５−Ｈ７  ＶＨＨ単一ドメイン抗体のために確保した。Ｐ行−１−２４列は、抗体を受け取らず；これは、関心対象の細胞に付随する(secondary)非特異的結合のための、バックグラウンド対照であり；従って、４８の変種を、各３８４ウェルＭｉｒｒｏｒｂａｌｌアッセイプレート上で試験することができる。不死化した成体ラット脳微小血管の内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）及び／又はヒト微小血管の脳内皮細胞（ＨＢＥＣ−Ｄ３）を、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中で解離させ、単一細胞集団を作製した。細胞を、ＬＣＩＢ中で洗浄し、次に、２００×ｇで、５分間遠心分離し、ペレットとした。洗浄緩衝液を除去し、細胞ペレットを、ＬＣＩＢの１ｍＬ中に再懸濁した。細胞数を、トリパンブルー色素により、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＴＣ２０自動細胞カウンターを用いて計測し、生存度を評価した。これらの細胞を、ＬＣＩＢ  １ｍｌ中３５０，０００個生存細胞に希釈した。Ｄｒａｑ  ５核染色（２ｕＭ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を補充した蛍光コンジュゲートｃ−ｍｙｃ  Ａｌｅｘａ  ４８８検出抗体（１６００ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、ＬＣＩＢアッセイ緩衝液中に調製した。細胞及び二次検出／Ｄｒａｑ  ５溶液を、１：１で混合し、３５００個細胞を含有する溶液２０μｌを、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ  ３８４ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加し；これは既に、最終濃度５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３及び７．８１ｎＭを生じる、７ポイント希釈シリーズの各ＶＨＨ抗体変種を含んでいた。全てのプレートは、４℃で２時間及び２０時間インキュベ���ションした。読み取りは、以下の設定で、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ高感度マイクロプレートサイトメトリーを用い、各時点で行った：
レーザー設定：４８８及び可能なら６４０、６．０ｍＷ
チャネル設定：ＦＬ−２（４８８−５４０ｎｍ）電圧６００、感度４、Ｔｉｆｆファイルセーブド、並びにＦＬ-４（６５０−６９０ｎｍ）電圧６００、感度４、トリガー４、Ｔｉｆｆファイルセーブド
オブジェクト特徴：ＦＬ−２（ピーク強度、平均強度、総強度、及びベースライン）、並びにＦＬ−４（ピーク強度、平均強度、総強度、及びベースライン）
集団定義：オブジェクト−セルフィルター（ＦＬ−４周辺長範囲０−５００ｎｍ、並びにＦＬ−２平均強度範囲０−１５０００）
集団統計：オブジェクト：オブジェクトの数、オブジェクト：平均（ＦＬ−２ピーク、平均、総強度及び周辺長）、並びにオブジェクト：平均ＦＬ−２ベースライン。オブジェクト：中央値（ＦＬ-２ピーク、平均、及び総強度）、オブジェクト：平均（ＦＬ−４ピーク、平均、総強度及び周辺長）、並びにオブジェクト：平均ＦＬ−４ベースライン。オブジェクト：中央値（ＦＬ−４ピーク、平均、及び総強度）セル：オブジェクトの数、セル：平均（ＦＬ−２ピーク、平均、及び総強度）、並びにセル：平均ＦＬ−２ベースライン。セル：中央値（ＦＬ−２ピーク、平均、及び総強度）セル：平均（ＦＬ−４ピーク、平均、及び総強度）、並びにセル：平均ＦＬ−４ベースライン。セル：中央値（ＦＬ−４ピーク、平均、及び総強度）。
【００８８】
残っている生存細胞材料を、アッセイプレートに隣接するよう４℃でインキュベーションし、そのため細胞生存度は、２時間及び２０時間の両方の時点でモニタリングすることができた。３１８変種全てが関心対象のＳＶ−ＡＲＢＥＣ及びＨＢＥＣ−Ｄ３の両細胞株においてスクリーニングされるまで、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌアッセイ手順を、全てのＶＨＨ単一ドメイン抗体について繰り返した。データは、Ｃｅｌｌｉｓｔａソフトウェア（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアのプログラムにより解析した。
【００８９】
一部のクローンは、ＳＶ−ＡＲＢＥＣに対し、ＦＣ５と比べて、結合を示さないか、又は低い結合を示した。改善された結合を示すクローンを、前述のように、ＳＶ-ＡＲＢＥＣ細胞及びＨＢＥＣ細胞の両方における更なる試験のために選択した。図４は、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞及びＨＢＥＣ細胞における、４８クローンの結合曲線を示す。
【００９０】
実施例５：インビトロＢＢＢモデルを超えるＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変種の輸送
ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞及びＨＢＥＣ細胞の両方において改善された結合を明らかにしている実施例４において同定した４８のクローンの最高の候補を、インビトロＢＢＢ透過性アッセイにおいて、Ｐａｐｐ決定のために単独の時点を使用し、スクリーニングした。変種の定量は、ＭＲＭ−ＩＬＩＳを用いて行った。
【００９１】
ＳＶ４０−不死化した成体ラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）を使用し、文献に記載されたようなインビトロ血液−脳関門（ＢＢＢ）モデルを作製した（Garbergら、2005；Haqqaniら、2012）。Ｓｖ−ＡＲＢＥＣ（８０，０００個細胞／メンブレン）を、成長培地１ｍｌ中の、０．１ｍｇ／ｍＬラット尾Ｉ型コラーゲン−コートされた組織培養インサート（細孔サイズ−１μｍ；表面積０．９ｃｍ２、Ｆａｌｃｏｎ）上に、播種した。このインサート集成体のボトムチャンバーは、不死化した新生児ラットの星状膠細胞−馴化培地を１：１（ｖ／ｖ）比で補充した成長培地２ｍｌを含んだ。等モル量（５．６μＭ）の陽性対照（ＦＣ５）又は陰性対照（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium・difficile）毒素Ａ結合ＶＨＨ；並びにＥＧ２、ＥＧＦＲ結合ＶＨＨ）、ＦＣ５、ＦＣ５−Ｈ７及び実施例４由来の２９の点−変異体を、ラットのインビトロＢＢＢモデルを横断するそれらの能力について試験した。ＢＢＢの管腔側への等モル量のｓｄＡｂの曝露後、試料を、管腔の反対側から、１５、３０及び６０分後に採取した。次に各試料のｓｄＡｂ含量を、質量分析（マルチ反応モニタリング−アイソタイプラベルした標準；ＭＲＭ-ＩＬＩＳ）により定量した。
【００９２】
ＭＲＭ−ＩＬＩＳ：これらの方法は全て、Haqqaniらの文献(2012)に説明されている。簡単には、ＶＨＨに関するＳＲＭ（選択された反応モニタリングはまたマルチ反応モニタリング（ＭＲＭ）としても公知）アッセイを開発するために、各ＶＨＨを最初に、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、データ依存型取得(acquisition)を使用し、解析し、イオン化可能なペプチド全てを同定した。各ペプチドに関して、３から５の最も強いフラグメンテーションを、選択した。最初のＳＲＭアッセイは、これらのフラグメントを、消化物のアトモル(attomole)量（約１００〜３００ａｍｏｌ）でモニタリングするために開発した。低量で再現可能な強度比を示すフラグメント（すなわち、より高量と比べ、ピアソンｒ２≧０．９５を有する）を、安定しているとみなし、且つ最終ＳＲＭアッセイのために選択した。アッセイの更なる最適化のために、各ペプチドの溶出時間も含み、近いｍ／ｚ（質量対電荷比）及び溶出時間を有するペプチドを選択しないよう注意した。
【００９３】
細胞培地又は体液（血清もしくは脳脊髄液（ＣＳＦ））中のＶＨＨの典型的マルチプレックス化したＳＲＭ分析は、既知量のＩＬＩＳのスパイキング（０．１〜１０ｎＭ）、それに続く１００−４００ｎｇのＣＳＦもしくは培養した培地タンパク質（０．３−１μＬ）又は約５０−１００ｎｇの血清タンパク質（１−３ナノリットル）の、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳシステムへの注入が関与している。各標的ペプチドイオンのプレカーサーｍ／ｚは、標的の特定の溶離時間で、イオントラップにおいて選択され（及び残りの無関係のイオンは、廃棄された）、引き続き衝突誘起解離（ＣＩＤ）フラグメンテーション、及び検出器によりモニタリングするためのイオントラップにおける所望のフラグメントイオンのみの選択が続く。定量分析のために、ＬＴＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により作製された生ファイルを、標準質量分析データフォーマットｍｚＸＭＬへ変換し、且つ強度は、ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアの改変版であるＱ−ＭＲＭと称する研究室内のソフトウェア（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ−ＭＲＭ；Haqqaniら、2012参照）を用いて抽出した。各ＶＨＨに関して、抽出されたイオンクロマトグラムを、全溶離時間にわたるフラグメントｍ／ｚの０．２５Ｄａ以内の組合せ強度からなる、そのフラグメントイオンの各々について作製した。各フラグメントに関する最終強度値を得るために、予想された保持時間の０．５分以内の全ての強度を、合計した。ＶＨＨは、そのペプチドの少なくとも１つのフラグメントが、予想される強度比を示した場合に、試料中の検出可能なものとして規定し、すなわち最終強度値は、その対応する純粋なＶＨＨの最終強度値と比べ、強力なピアソン相関ｒ≧０．９５及びｐ＜０．０５を示した。
【００９４】
ＶＨＨの混合物を含有する試料（培地、血清、ＣＳＦ）は、先に説明されたように、還元し、アルキル化し、且つトリプシン消化した（Haqqaniら、2012；Gergovら、2003）。これらの消化物（トリプシンペプチド）は、酢酸により酸性とし（最終濃度５％）、且つＬＴＱ  ＸＬ  ＥＴＤ又はＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＥＴＤ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）と組合せた逆相ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、ＭＡ）上で分析した。試料の所望のアリコートを、注入し、且つ３００μｍ  Ｉ．Ｄ．×０．５ｍｍ  ３μｍ  ＰｅｐＭａｐｓ  Ｃ１８トラップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上に負荷し、次に勾配０％〜２０％アセトニトリル（０．１％ギ酸中）で１分間、２０％〜４６％で１６分間、及び４６％〜９５％で１分間を、流量４００ｎＬ／分で使用し、内径１００μｍ×１０ｃｍ  １．７μｍ  ＢＥＨ１３０Ｃ１８  ｎａｎｏＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に溶離した。溶離したペプチドを、ペプチドイオンのフラグメンテーションのためのＣＩＤを用い、ＭＳ／ＭＳ及びＳＲＭ分析のためのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により質量分析計へイオン化した。ＣＩＤは、規準化された衝突エネルギー３５％及び活性化時間３０ミリ秒（ｍｓ）で、衝突ガスとしてヘリウムにより実行した。線形イオントラップへのイオン注入時間は、自動ゲイン制御（ＡＧＣ）標的値６×１０３及び最大集積時間２００ミリ秒を使用し、この装置により調節した。
【００９５】
ＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変異性変種の検出及び定量に使用した具体的ペプチドは、表１に示している。
【００９６】
表１．  選択されたＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変異性変種のｎａｎｏＬＣ−ＳＲＭ検出において使用したペプチド。記載した様々な試験において、アッセイは、同じ試料の同時モニタリングのために、異なる組合せで多重化した。各ペプチドのＳＲＭアッセイの検出及び定量の限界は、１．５〜２．５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。１ｎｇ／ｍＬは、ＶＨＨの約６０〜７０ｐＭに相当する。Ａ２０−１は、Hussackら(2011b)が説明したものである。（ａ）重ラベルしたペプチド。
【表１】
2020511941.tif 000003
【００９７】
見かけの透過性係数の決定：定量された値は、直接プロットされ得るか、又はＰａｐｐ（見かけの透過性係数）値は、所定の式により決定され［Ｑｒ／ｄｔ＝レシーバーコンパートメント中の累積量  対  時間；Ａ＝細胞単層の面積；Ｃ０＝投与溶液の初期濃度］、プロットされ得る。Ｐａｐｐ値は、分子のＢＢＢを横断する能力を決定するために、通常使用される。Ｐａｐｐ値は、脳内皮単層を超える化合物の特異的透過性の測定である。
【００９８】
ＦＣ５−Ｈ７と比べ類似の又はより高いＰａｐｐ値を持つ変種に関するスクリーニング結果は、図６に示している。これらの１２−１５クローンは、次に前述のようなＢＢＢ透過性アッセイ（完全な時間経過）における詳細なスクリーニングのために、再発現した。いくつかのＦＣ５−Ｈ７の単独ＣＤＲ変異性変種は、ＦＣ５−Ｈ７と比べ、Ｐａｐｐ値の有意な増加を示し、これはそれらのインビトロＢＢＢモデルを超える輸送の割合の改善を指摘している。注目すべきは、変異体Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋは、各々、ＦＣ５−Ｈ７と比べて、３７％、２６８％、４４８％、３１５％、及び３３％より高いＰａｐｐ値を示した（図６）。これらの変種のＳＶ−ＡＲＢＥＣへの結合親和性と、同じ細胞を使用するインビトロＢＢＢモデルにおけるそれらのトランスサイトーシス（ＢＢＢ−横断）の間には、明らかな相関は存在しなかった。
【００９９】
実施例６：ＦＣ５変種−Ｆｃ構築体の発現及び精製
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片（配列番号：２９）のＮ−末端へ融合した、ＦＣ５変種ＦＣ５、ＦＣ５−Ｈ７、Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋ  ＶＨＨを含む構築体（図７）を、調製し、発現し、且つ精製した。
【０１００】
ＦＣ５変種ｃＤＮＡを、ヒトＦｃ断片を含む哺乳動物の発現ベクターｐＴＴ５（Durocher、2002）へ、クローニングした。両方ともＦ１７培地中に作製された、１８７．５μｇのｐＴＴ５−ＩＲ５ｍＦｃ２ｂ、５６．２５μｇのｐＴＴ−ＡＫＴｄｄ（プロテインキナーゼＢの活性化された変異体）、１８．７５μｇのｐＴＴｏ−ＧＦＰ（トランスフェクション効率をモニタリングするため）、及び１１２．５μｇのサケ精巣ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、プラスミドＤＮＡ溶液２５ｍｌ；並びに、１．１２５ｍｇのＰＥＩｐｒｏＴＭ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含有するＰＥＩ溶液２５ｍｌを混合することにより、生じるベクターのポリプレックスを、予め形成した。この混合物を、１０分間インキュベーションし、その後細胞培養物に添加した。切断型ＥＢＮＡ１タンパク質（ＣＨＯ−３Ｅ７）を安定して発現し、且つＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において成長させた、ＣＨＯ細胞の培養物４５０ｍｌを、ポリプレックス５０ｍｌによりトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、培養物に、４０％（ｗ／ｖ）トリプトンＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）溶液１２．５ｍｌ及び２００ｍＭバルプロ酸溶液１．２５ｍｌを供した。トランスフェクションの８日後、培養物を収集し、遠心分離により透明化した。透明化された培地を、０．２２μｍメンブレンを通して濾過し、その後それを、プロテイン−Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍｌを充填したカラムへ適用した。装加後、カラムを、５倍容積のリン酸−緩衝食塩水ｐＨ７．１（ＰＢＳ）により洗浄し、抗体を、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０により溶出した。溶出した抗体を含有する画分を、プールし、且つＰＢＳ中で平衡とした脱塩Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃカラム（ＢｉｏＲａｄ）上に装加することにより、緩衝液交換を行った。次に脱塩された抗体を、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターユニット（０．２２μｍ）を通過させることにより、滅菌濾過し、且つアリコート化した。
【０１０１】
実施例７：Ｆｃ−融合したＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変種の脳内皮細胞への結合
Ｆｃ−融合したＦＣ５  ＣＤＲ変種（ＦＣ５、ＦＣ５−Ｈ７、Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋ；実施例６）のラット（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）、ヒト（ＨＢＥＣ−Ｄ３）及び非−ヒト霊長類（ＣｙｎｏＢＥＣ）の脳内皮細胞への結合を、実施例４に記載したように、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）高感度マイクロプレートサイトメトリー（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて評価した。
【０１０２】
結果を、図８に示す。変種Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９ＬのＦｃ融合体は、ＦＣ５−Ｆｃ又はＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃのいずれかと比べ、３つの種（ラット、ヒト、ｃｙｎｏ）全てに由来する脳内皮細胞への改善された結合を示した。結果は、ＦＣ５及びＦＣ５−Ｈ７並びにその変異された変種の種の交差反応性を示す。
【０１０３】
実施例８：Ｆｃ−融合したＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変種のインビトロＢＢＢモデルを超える輸送
実施例６からのＦｃ−融合したＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変異性変種（ＦＣ５、ＦＣ５−Ｈ７、Ｄ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋ）は、血液−脳関門を移行するかどうかを評価するために、実施例５に記載したようなインビトロにおけるアッセイ及び定量法を、使用した。
【０１０４】
図９に示したように、ヒトＦｃへ融合したＤ５６Ｋ、Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ、Ｆ５９Ｌ、及びＴ１０５Ｋ変種は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ融合体と比べ、３１％、３９％、６９％、２５％及び９２％より高いＰａｐｐを示した。これらの結果は、選択されたＦＣ５  ＣＤＲ変異体に関する親和性の改善は、インビトロにおいて増強されたＢＢＢ横断を生じること；親和性及びＢＢＢ横断の両方の改善は、変種が、一価のＶＨＨフォーマットである場合、従ってこれらが二価のＦｃ融合フォーマットで発現される場合に、より顕著であることを示唆している。Ｆｃ融合フォーマットにおいて変種Ｆ５９Ｉ及びＴ１０５Ｋを、インビボ試験のために選択した。
【０１０５】
実施例９：ＣＳＦ及び血漿におけるＦＣ５  ＣＤＲ変種ｓ−Ｆｃ融合体の薬物動態
ＦＣ５−Ｈ７変異性変種Ｆ５９Ｉ及びＴ１０５ＫとのＦｃ融合体は、脳へ、具体的には脳脊髄液（ＣＳＦ）へ横断することができるかどうかを決定し、並びにＣＳＦ及び血清中のその存在を定量するために、インビボアッセイを行った。
【０１０６】
大槽ＣＳＦの複数の試料採取のために使用した技術は、先に説明した方法（Huangら、1995；Kornhuberら、1986）の改変により、ＮＲＣで開発した。全ての動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ウィルミントン、ＭＡ、米国）から購入した。動物は、１２時間の明／暗サイクルで、温度２４℃、相対湿度５０±５％で、３群で飼育し、且つ飼料及び水は自在摂取させた。全ての動物手順は、ＮＲＣのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、且つＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ指針を順守した。雄のＷｉｓｔａｒラット、年齢８〜１０週齢（体重範囲２３０〜２５０ｇ）を、全ての試験に使用した。
【０１０７】
全ての実験において、被験抗体（ＦＣ５−Ｈ７変異体Ｆｃ−融合体）を、等モル投与量（７ｍｇ／ｋｇ）で、尾静脈へ静脈内投与した。ＣＳＦ試料収集は、大槽から、９６時間にわたる最大５回の針穿刺により行った。試料収集に関して、ラットを、３％イソフルランにより短時間で軽く麻酔をかけ、頭部を４５°の角度で下向きに回転させながら、定位固定フレームに配置した。後頭頂部から始まる耳の間に２ｃｍの正中切開を行い、筋肉を剥離し、大槽を覆っている硬膜を露出した。１ｍｌ注射器に装着したチューブをつけた２７Ｇ翼状針（ＱｕｉｃｋＭｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＳＶ２７ＥＬ）を使用し、硬膜を穿刺し、ＣＳＦの〜２０μｌを吸引した。次にＣＳＦを、試料用ガラスバイアル（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号１８６０００３８４ｃ）へ移し、且つ更なる分析まで、−８０℃のフリーザーに入れておいた。
【０１０８】
血液試料を、尾静脈から、市販のチューブ（ＢＤ  ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ、カタログ番号３６５９５６）中に、収集した。室温で１５〜３０分間凝固させた後、凝血塊を１１００ｒｃｆ（３４２２ｒｐｍ）で１０分間の遠心分離により除去し；その後、血清を、清浄なガラスバイアル（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号１８６０００３８４ｃ）へ移し、ドライアイス上で凍結させ、更なる分析まで、−８０℃で貯蔵した。収集の最後に、ラットは、心穿刺により屠殺した。血液及びＣＳＦのＰＫ分析は、ＷｉｎＬｉｎ  ６．０プログラムを使用し、行った。
【０１０９】
血清及びＣＳＦ試料は、表１に示したペプチド署名を用い、実施例５に記載したような、質量分析及びｎａｎｏＬＣ−ＳＲＭベースの定量により分析した。
【０１１０】
ＣＳＦ収集は、その間にＣＳＦは容易に血液と夾雑され得る繊細な手順である。ＶＨＨの量は、血液よりもＣＳＦ中で遙かに少ない（＜０．１％）と予想されるので、血液のわずかな夾雑も、個々のＣＳＦ試料の値をひどく損なう。従って、血液−夾雑したＣＳＦ試料に関する厳密な除外基準を開発することが必要である。血液−ＣＳＦアルブミン比を評価するために、ｎａｎｏＬＣ−ＳＲＭ法を、血漿及びＣＳＦ中のアルブミンレベルの定量のために、開発した。マルチプレックスアッセイにおける他のペプチドのピークとの干渉を最小にするために、アルブミンペプチドＡＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＡＡＲ（配列番号：２８）を、その独自の保持時間及びｍ／ｚ値（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ）を基に選択した。このペプチドの強度は、前述のようなＳＲＭを用い、ＣＳＦ及び血漿の両試料において、定量した。アルブミン比は、各ラットについて下記のように計算した：
アルブミン比＝分析した血漿１ｎＬ当たりの強度／分析したＣＳＦの１ｎＬ当たりの強度
１５００及びそれ以下の比は、血液が夾雑したとみなした。
【０１１１】
結果は、図１０及び表２に示している。各分子に関するＣＳＦ／血清の曲線下面積（ＡＵＣ）比は、９６時間の期間にわたる変種のＣＳＦの「曝露」の指標であった。ＦＣ５変異性変種を保持するＦｃ−融合体分子の各々は、対照ＶＨＨ−Ｆｃ融合体分子（Ａ２０．１Ｆｃ）と比べ、より高い（１５〜３５倍）ＣＳＦ曝露を示した。更に、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ及びＮ５７Ｄ−Ｆｃは、増大したＣＳＦ曝露を示した（〜２倍）のに対し、Ｆ５９Ｌ−Ｆｃは、親ＦＣ５Ｈ７−Ｆｃと比べ同様のＣＳＦ曝露を示した。これらの結果は、ＦＣ５−Ｈ７のＣＤＲ変異性変種は、インビボにおいて同じ又は改善したＣＳＦ曝露プロファイルを有することを、確立した。特に、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ、及びＮ５７Ｄ−Ｆｃはまた、ラットのインビトロＢＢＢモデルにおいて、改善されたＢＢＢ横断特性も明らかにし（図９）、これは観察されたインビボにおける増強されたＣＳＦ曝露と一致している。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
実施例１０．全身投与後のＦｃ−融合したＦＣ５−Ｈ７  ＣＤＲ変異体の脳レベル
個別の実験において、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ、Ｆ５９Ｉ−Ｆｃ、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ、Ｆ５９Ｌ−Ｆｃ及びＡ２０．１−Ｆｃを、各７ｍｇ／ｋｇで、尾静脈を介した静脈内注射により投与し、２４時間循環させた。その後ラットを、脳の特異的潅流を促進するために、ヘパリン添加（１００Ｕ／ｍｌ）食塩水１０ｍｌで、左総頸動脈を介して、速度１ｍｌ／分で、十分に潅流した。その後脳を摘出し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、ＯＮ）を含有する氷冷したホモジナイゼーション緩衝液中で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いホモジナイズした（４℃で１０−１２ストローク）。次に試料を、各４℃で１０秒間を３回音波処理し、不溶性物質を、除去した（１０，０００×ｇで１０分間、４℃）。上清を、タンパク質含量について分析し、約０．５μｇのタンパク質を、実施例５に説明した方法及び表１に示したペプチド署名を使用する、ＳＲＭ分析に使用した。
【０１１４】
結果は、図１１に示している。全てのＦｃ−融合したＦＣ５変異性変種（ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ、Ｆ５９Ｉ−Ｆｃ、Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ、Ｎ５７Ｄ−Ｆｃ、Ｆ５９Ｌ−Ｆｃ）は、対照物質Ａ２０．１Ｆｃと比べて、投与後２４時間で、有意により高い（６〜１５倍）脳レベルを有した。親ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ変種と比べて、ＣＤＲ変異性変種Ｔ１０５Ｋ−Ｆｃ、Ｄ５６Ｋ−Ｆｃ及びＮ５７Ｄ−Ｆｃは、同じ投与量での投与後２４時間で、およそ２倍より高い脳レベルを示した。Ｆ５９Ｉ−Ｆｃ及びＦ５９Ｌ−Ｆｃは、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃと類似の脳レベルを有した。これらの結果は、ＦＣ５−Ｈ７の一部の変異性変種は、親変種と比べ、より良い脳浸透を示し、且つより高い脳レベルを達成したことを明らかにした。これらの結果はまた、脳内皮細胞への改善された結合親和性は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて選択された変種の改善されたＢＢＢ横断及びより高い脳曝露を予測するには十分ではないことも明らかにした。例えば、変種Ｎ５７Ｄ、Ｆ５９Ｉ及びＦ５９Ｌは、ラット脳内皮細胞への類似の結合特性、及びＴ１０５Ｋ及びＤ５６Ｋよりもより高い親和性結合を有するが、依然Ｎ５７Ｄ及びＴ１０５Ｋは、インビボにおける最良のＢＢＢ横断及び脳曝露を示した。
【０１１５】
本明細書記載の実施態様及び実施例は、例証であり、請求項のように本発明の範囲を限定する意味はない。代替、変更及び同等物を含む、前述の実施態様の変動は、請求項により包含されることが、本発明者らにより意図される。更に、特徴の考察された組合せは、本発明の解法に不可欠ではない。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０１１６】
参考文献
本明細書および本出願全体を通して参照されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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