(57)【要約】  癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの癌に対する攻撃性、予後及び治療応答を決定する方法が本明細書において提供され、前記方法は、対象からのエキソソームサンプル中の１又は複数の差次的に発現されるタンパク質マーカーの発現レベルの決定を含む。癌を治療する方法及び薬剤も提供される。
2020513549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の攻撃性の決定方法であって、前記対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、前記癌の攻撃性のレベルを示すか、又はそれと相関する、方法。
【請求項２】
対象における癌の予後の決定方法であって、前記対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、前記癌についてのより好ましくないか又はより好ましい予後を示すか又はそれと相関する、方法。
【請求項３】
１又は複数のマーカーの比較的低減された発現レベルが、より好ましい予後及び／又は低い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関し；及び／又は１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルが、あまり好ましくない予後及び／又は高い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）高い攻撃性の癌又は低い攻撃性の癌；及び／又は（ii）それほど好ましくない予後又はより好ましい予後を有するとして前記対象を診断するさらなる工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌の予後又は攻撃性が、前記対象における癌の転移の可能性を決定するために、少なくとも部分的に使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１又は複数のマーカーの比較的低減された発現レベルが、前記癌の転移の低減された可能性を示すか又はそれと相関し；及び／又は前記１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルが、前記癌の転移の増加した可能性を示すか又はそれと相関する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象における抗癌治療に対する癌の応答性の予測方法であって、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの改変された又は調節された発現レベルが、抗癌治療に対する癌の比較的増加した又は低減された応答性を示すか又はそれと相関する、方法。
【請求項８】
対象における癌を治療するさらなる工程を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象における癌の治療方法であって、前記対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び行われた決定に基づいて、抗癌治療を開始するか、継続するか、修正するか、又は中止することを含む方法。
【請求項１０】
前記抗癌治療が、１又は複数のマーカーの発現及び／又は活性を低減する、治療的有効量の抗癌剤の前記対象への投与を含む、請求項７〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗癌治療が、前記癌の転移を予防するか、又は阻害する、治療的有効量の抗癌剤の前記対象への投与を含む、請求項７〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗癌剤が、抗体又は小分子である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象からエキソソームサンプルを得る工程をさらに含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルと、それぞれ１又は複数のマーカーの参照エキソソーム発現レベルとを比較する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が肺癌であるか、又はそれを含む、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺癌が、非小細胞癌であるか、又はそれを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象における癌の治療への使用のための薬剤の同定又は製造方法であって、
（ａ）表１及び／又は表２に列挙されるマーカーを発現する細胞と、候補薬剤とを接触すること；及び
（ｂ）前記候補薬剤が前記マーカーの発現及び／又は活性を調節するか否かを決定する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記候補薬剤が、前記マーカーの発現及び／又は活性を、少なくとも部分的に、低減するか、排除するか、抑制するか又は阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１０〜１６の何れか１項に記載の方法に従って使用するための、請求項１７又は１８に記載の方法により製造された薬剤。
【請求項２０】
前記１又は複数のマーカーが、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、中性α−グルコシダーゼＡＢ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα２型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法、又は請求項１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記１又は複数のマーカーが、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、トロンボスポンジン−１及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、請求項２０に記載の方法又は薬剤。
【請求項２２】
前記１又は複数のマーカーが、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、中性αグルコシダーゼＡＢ及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される、請求項２０に記載の方法又は薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌に関する。より特定には、本発明は、癌、特に肺癌の予後の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、多くの国において癌死亡及び疾病負荷の主要原因である。一例として、オーストラリアにおける肺癌は、何れかの原因から、男性において１４人に１人の死亡及び女性においては２５人に１人の死亡を占めている。患者の応答性及び非応答性カテゴリーへの分類は、現在、肺癌に関しては不可能である。
【０００３】
手術は、外科的切除に十分に適している人々における早期肺癌のための最適な治療として見なされている。それにもかかわらず、治療目的で治療された人々は依然として再発の有意な可能性を有するので、臨床病期分類は不完全である。例えば、ステージＩ、II又はIII Ａ期の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）においては、ステージＩＢ期の患者の約４０〜５０％、ステージII期の５５〜７０％、及びステージIII Ａ期のＮＳＣＬＣ患者のそれ以上の割合が、治癒の可能性がある手術にもかかわらず、それら疾病を再発し、そして死亡している。最近では、より活性的なプラチナベースの併用治療法、及び切除されたＮＳＣＬＣのための補助的化学療法の有効性を実証する多数の大規模臨床試験は、完全に切除されたＮＳＣＬＣの患者の結果を改善するための補助的化学療法の使用を導いて来た。
【０００４】
現在、病理学的（ＴＮＭ）病期分類は、肺癌の再発の可能性を決定する最も重要な予後因子である。ゲノムバイオマーカーは、それらの潜在的な予後値（３−５）について調査されているが、しかし現時点では、ＦＤＡ承認された試験が患者においてますます利用されている（例えば、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ）乳癌とは異なり、診療所においては日常的に使用されていない。同様に、タンパク質発現及びプロテオミクスを含む他のバイオマーカーが肺癌への使用のために提案されて来たが、まだ日常的には、臨床学的に適用されていない。
【０００５】
従って、明らかに治療可能な肺癌の一次治療として完全な切除又は化学放射線療法を受け、最終的に逆戻りし、そして再発するＮＳＣＬＣ患者のかなりの割合として、治療目的での治療の後、正確な予後バイオマーカーのための緊急の必要性がある。どの患者が補助化学療法の恩恵を受けることができ、そして誰が何の恩恵も受けずに化学療法関連の潜在的悪影響を受けることになるかを決定する際に、予後因子が臨床医を導くために必要とされる。
【０００６】
上記に加えて、従来の確認された予後バイオマーカーは、一般的に侵襲性生検の実施を必要とする。しかしながら、ＮＳＣＬＣ患者においては、併存症及び一般的な健康上の問題により、患者の２０％がそのような生検には不適切である。さらに、生検自体が傷害及び炎症を引起す可能性があり、ＮＳＣＬＣ患者の罹患率及び死亡率の一因となっている。このために、血液試験などの低侵襲性サンプリングからの患者の転帰を評価するための改善された方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、概して、対象における癌進行の予後マーカーとしての１つ以上のエキソソームタンパク質の発現レベルの決定に関する。いくつかの態様において、本発明はまた、概して、そのようなエキソソームタンパク質を用いて治療の選択又は意思決定を通知するための癌の治療にも関する。特定の形態において、癌は肺癌、例えば非小細胞肺癌である。
【０００８】
第１の態様において、本発明は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含む、対象における癌の攻撃性の決定方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、そして前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、癌の攻撃性のレベルを示すか、又はそれと相関する。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含む、対象における癌の予後の決定方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、そして前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、前記癌についてのより少ないか又はより好ましい予後を示すか又はそれと相関する。
【００１０】
上記態様の方法の一実施形態において、１又は複数のマーカーの比較的減少した発現レベルが、より好ましい予後及び／又は低い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関し； 及び／又は１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルが、あまり好ましくない予後及び／又は高い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関する。
【００１１】
適切には、第１及び第２の態様の方法はさらに、（ｉ）高い攻撃性の癌又は低い攻撃性の癌；及び／又は（ii）それほど好ましくない予後又はより好ましい予後を有するとして前記対象を診断するさらなる工程を含む。
【００１２】
前述の態様の方法の一実施形態において、前記癌の予後又は攻撃性が、前記対象における癌の転移の可能性を決定するために、少なくとも部分的に使用される。適切には、前記１又は複数のマーカーの比較的減少した発現レベルが、前記癌の転移の減少した可能性を示すか又はそれと相関し； 及び／又は前記１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルが、前記癌の転移の増加した可能性を示すか又はそれと相関する。
【００１３】
第３の態様において、本発明は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含む、対象における抗癌治療に対する癌の応答性の予測方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、そして前記１又は複数のマーカーの改変された、又は調節された発現レベルが、抗癌治療に対する癌の比較的増加したか又は低減された応答性を示すか又はそれと相関する。
【００１４】
第１、第２及び第３の態様の発明に関して、前記方法は、適切には、対象における癌を治療するさらなる工程を含む。
【００１５】
第４の態様において、本発明は、対象における癌の治療方法であって、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程の提供含み、対象における癌の治療方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び行われた決定に基づいて、抗癌治療を開始するか、継続するか、修正するか、又は中止する。
【００１６】
適切には、第３及び第４の態様の方法に関して、前記抗癌治療が、１又は複数のマーカーの発現及び／又は活性を低減する、治療的有効量の抗癌剤の対象への投与を含む。
【００１７】
第３及び第４の態様の方法の１つの実施形態によれば、前記抗癌治療が、前記癌の転移を予防するか、又は阻害する、治療的有効量の抗癌剤の対象への投与を含む。
【００１８】
第３及び第４の態様の方法に関して、抗癌剤は、適切には、抗体又は小分子（例えば、有機又は無機小分子アンタゴニスト）である。
【００１９】
適切には、前述の態様の方法はさらに、対象からエキソソームサンプルを得る工程をさらに含む。
【００２０】
前述の態様の方法に関して、１又は複数のマーカーは適切には、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、中性α−グルコシダーゼＡＢ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα２型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。１つの特定の実施形態において、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、トロンボスポンジン−１及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。
【００２１】
適切には、前述の態様の方法はさらに、エキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルと、それぞれ１又は複数のマーカーの参照エキソソーム発現レベルとを比較する工程をさらに含む。
【００２２】
第５の態様において、本発明は、
（ａ）表１及び／又は表２に列挙されるマーカーを発現する細胞と、候補薬剤とを接触すること；及び
（ｂ）前記候補薬剤がマーカーの発現及び／又は活性を調節するか否かを決定することを含む、対象における癌の治療への使用のための薬剤の同定又は製造方法を提供する。
【００２３】
特定の実施形態において、前記候補薬剤が、マーカーの発現及び／又は活性を、少なくとも部分的に、低減するか、排除するか、抑制するか又は阻害する。
【００２４】
適切には、前述の側面の癌は、肺癌であるか、又はそれを含む。好ましくは、肺癌は、扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌及び中皮腫を含む。さらにより好ましくは、肺癌は、非小細胞肺癌である。
【００２５】
適切には、上記態様の対象は、哺乳類、好ましくはヒトである。
【００２６】
別段の定めが無い限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は類似する用語は、列挙された要素又は特徴のリストが、それらの記載又は列挙された要素を単に含まないが、しかし列挙されていないか又は記載されていない他の要素又は特徴を含み得るように、非排他的包含を意味する。
【００２７】
不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書においては、単数又は複数の要素又は特徴を示すか又は包含するために使用され、そして「１つ（ｏｎｅ）」又は「単一（ｓｉｎｇｌｅ）」の要素又は特徴を意味又は定義するものとして解釈されるべきではなく、例えば、「ａ」細胞とは、１つの細胞、１つ以上の細胞及び複数の細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】図１は、エキソソームがＮＳＣＬＣ細胞から分泌されることを示す。Ａ：エキソソームのタンパク質同定は、エキソソームマーカーの存在、及び非エキソソームカルネキシンの非存在を実証する。Ｂ：ＮＳＣＬＣにより分泌されるエキソソームは、予想されるサイズ分布を有する。Ｃ：低酸素は、エキソソームの分泌を増加させるが、しかしエキソソームサイズ範囲を変更しない。Ｄ：低酸素は、ＮＳＣＬＣ細胞のエキソソーム分泌を有意に増加させる。ＣＬ：細胞溶解物；Ｅ：エキソソーム溶解物。
【図１−２】図１は、エキソソームがＮＳＣＬＣ細胞から分泌されることを示す。Ａ：エキソソームのタンパク質同定は、エキソソームマーカーの存在、及び非エキソソームカルネキシンの非存在を実証する。Ｂ：ＮＳＣＬＣにより分泌されるエキソソームは、予想されるサイズ分布を有する。Ｃ：低酸素は、エキソソームの分泌を増加させるが、しかしエキソソームサイズ範囲を変更しない。Ｄ：低酸素は、ＮＳＣＬＣ細胞のエキソソーム分泌を有意に増加させる。ＣＬ：細胞溶解物；Ｅ：エキソソーム溶解物。
【図１−３】図１は、エキソソームがＮＳＣＬＣ細胞から分泌されることを示す。Ａ：エキソソームのタンパク質同定は、エキソソームマーカーの存在、及び非エキソソームカルネキシンの非存在を実証する。Ｂ：ＮＳＣＬＣにより分泌されるエキソソームは、予想されるサイズ分布を有する。Ｃ：低酸素は、エキソソームの分泌を増加させるが、しかしエキソソームサイズ範囲を変更しない。Ｄ：低酸素は、ＮＳＣＬＣ細胞のエキソソーム分泌を有意に増加させる。ＣＬ：細胞溶解物；Ｅ：エキソソーム溶解物。
【図２】図２は、低酸素がエキソソーム含有量を変えることを示す。エキソソームは、酸素正常状態（２１％ＣＯ2）又は低酸素（２％ＣＯ2）の条件下で２４時間、培養された細胞からの、ならし培地から収穫された。Ａ：走査型電子顕微鏡は、従来のエキソソーム形態を実証する。Ｂ：定量的質量分析は、低酸素下で上方制御される５５のタンパク質を明らかにした、ｎ＝５、ＦＤＲ１％。Ｃ、Ｄ：タンパク質標的がウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡにより検証された。
【図３−１】図３は、上方制御されたタンパク質が患者の疾患の進行と相関することを示す。Ａ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、予想されるサイズ範囲及び形態を示す。Ｂ、Ｃ：インビトロで同定された低酸素タンパク質マーカーは、最初の１８ヶ月以内に再発した患者において上方制御される。Ｄ：１２ヶ月以内に再発する患者を同定するための複合タンパク質サイン（ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質）のＲＯＣ曲線。Ｅ：エキソソーム含有量に関連した患者の無病生存期間。上記マーカーのうち少なくとも２つを有した患者は、それらのエキソソームにおいてマーカーを１つしか発現していないか、又は全く発現していない患者に比較して、急速に進行した。
【図３−２】図３は、上方制御されたタンパク質が患者の疾患の進行と相関することを示す。Ａ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、予想されるサイズ範囲及び形態を示す。Ｂ、Ｃ：インビトロで同定された低酸素タンパク質マーカーは、最初の１８ヶ月以内に再発した患者において上方制御される。Ｄ：１２ヶ月以内に再発する患者を同定するための複合タンパク質サイン（ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質）のＲＯＣ曲線。Ｅ：エキソソーム含有量に関連した患者の無病生存期間。上記マーカーのうち少なくとも２つを有した患者は、それらのエキソソームにおいてマーカーを１つしか発現していないか、又は全く発現していない患者に比較して、急速に進行した。
【図３−３】図３は、上方制御されたタンパク質が患者の疾患の進行と相関することを示す。Ａ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、予想されるサイズ範囲及び形態を示す。Ｂ、Ｃ：インビトロで同定された低酸素タンパク質マーカーは、最初の１８ヶ月以内に再発した患者において上方制御される。Ｄ：１２ヶ月以内に再発する患者を同定するための複合タンパク質サイン（ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質）のＲＯＣ曲線。Ｅ：エキソソーム含有量に関連した患者の無病生存期間。上記マーカーのうち少なくとも２つを有した患者は、それらのエキソソームにおいてマーカーを１つしか発現していないか、又は全く発現していない患者に比較して、急速に進行した。
【図４】図４は、低酸素エキソソームにおいて同定された他の上方制御されたタンパク質が予後値を有することを示す。ＴＮＣは低酸素下で上方制御され、そして急速に進行するＮＳＣＬＣ患者のエキソソームにおいてより豊富である。
【図５】図５は、患者のサインに使用されるタンパク質の個々のＲＯＣ及び生存曲線を示す。
【図６−１】図６は、ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームのタンパク質組成に対する低酸素誘発の変化を示す。ａ：単離されたエキソソームの形態が透過型電子顕微鏡を用いて評価された。酸素正常状態及び低酸素状態のＳＫＭＥＳ１由来のエキソソーム（サイズバー２００ｎｍ）の画像はまた、エキソソーム濃度の明らかな上方制御を示す。ｂ：４つの異なるＮＳＣＬＣ細胞系から単離されたエキソソームのＴＲＰＳを用いてのナノ粒子分析は、大部分のエキソソームが３０~１５０ｎｍのサイズ範囲を有することを実証する。ｃ：定量的質量分析は、Ｈ３５８及びＳＫＭＥＳ１エキソソームにおいて一般的に上方制御される３２個のタンパク質を同定した（ＦＤＲ＜０．１%；ｎ＝５）。ｄ、ｅ：質量分析の結果は、ＶＣＰのウェスタンブロット分析（ＦＬＯＴ１がローディングコントロールとして使用される）、及びＨ３５８、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ２３及びＨ１９７５  ＮＳＣＬＣ細胞系におけるＭＡＣ２ＢＰ、ＴＮＣ、ＰＳＭＡ２及びＴＨＢＳ１についてのＥＬＩＳＡを用いて確認された（● − Ｈ３５８、■−ＳＫＭＥＳ１、▲ −Ｈ２３、◆−Ｈ１９７５）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図６−２】図６は、ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームのタンパク質組成に対する低酸素誘発の変化を示す。ａ：単離されたエキソソームの形態が透過型電子顕微鏡を用いて評価された。酸素正常状態及び低酸素状態のＳＫＭＥＳ１由来のエキソソーム（サイズバー２００ｎｍ）の画像はまた、エキソソーム濃度の明らかな上方制御を示す。ｂ：４つの異なるＮＳＣＬＣ細胞系から単離されたエキソソームのＴＲＰＳを用いてのナノ粒子分析は、大部分のエキソソームが３０~１５０ｎｍのサイズ範囲を有することを実証する。ｃ：定量的質量分析は、Ｈ３５８及びＳＫＭＥＳ１エキソソームにおいて一般的に上方制御される３２個のタンパク質を同定した（ＦＤＲ＜０．１%；ｎ＝５）。ｄ、ｅ：質量分析の結果は、ＶＣＰのウェスタンブロット分析（ＦＬＯＴ１がローディングコントロールとして使用される）、及びＨ３５８、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ２３及びＨ１９７５  ＮＳＣＬＣ細胞系におけるＭＡＣ２ＢＰ、ＴＮＣ、ＰＳＭＡ２及びＴＨＢＳ１についてのＥＬＩＳＡを用いて確認された（● − Ｈ３５８、■−ＳＫＭＥＳ１、▲ −Ｈ２３、◆−Ｈ１９７５）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図６−３】図６は、ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームのタンパク質組成に対する低酸素誘発の変化を示す。ａ：単離されたエキソソームの形態が透過型電子顕微鏡を用いて評価された。酸素正常状態及び低酸素状態のＳＫＭＥＳ１由来のエキソソーム（サイズバー２００ｎｍ）の画像はまた、エキソソーム濃度の明らかな上方制御を示す。ｂ：４つの異なるＮＳＣＬＣ細胞系から単離されたエキソソームのＴＲＰＳを用いてのナノ粒子分析は、大部分のエキソソームが３０~１５０ｎｍのサイズ範囲を有することを実証する。ｃ：定量的質量分析は、Ｈ３５８及びＳＫＭＥＳ１エキソソームにおいて一般的に上方制御される３２個のタンパク質を同定した（ＦＤＲ＜０．１%；ｎ＝５）。ｄ、ｅ：質量分析の結果は、ＶＣＰのウェスタンブロット分析（ＦＬＯＴ１がローディングコントロールとして使用される）、及びＨ３５８、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ２３及びＨ１９７５  ＮＳＣＬＣ細胞系におけるＭＡＣ２ＢＰ、ＴＮＣ、ＰＳＭＡ２及びＴＨＢＳ１についてのＥＬＩＳＡを用いて確認された（● − Ｈ３５８、■−ＳＫＭＥＳ１、▲ −Ｈ２３、◆−Ｈ１９７５）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図７−１】図７は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行を予測することを示す。ａ、ｂ：エキソソームは、ＴＥＭ（サイズバー２００ｎｍ）及び２０〜１５０ｎｍのサイズ分布により示されるように、形態に基づいてＮＳＣＬＣ血漿から単離され得る。ｃ：ＴＲＰＳは、健康なコントロール、又は１８ヶ月以内に進行する患者、又は１８ヶ月で再発していない患者から血漿におけるエキソソーム濃度に差がないことを実証する。ｄ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、再発しなかった患者及び健康なコントロールと比較して、１８ヶ月で進行する患者においてＶＣＰの富化を示す（ＦＬＯＴ１が負荷対象として使用される）。ｅ：低酸素エキソソームサインは、１８ヶ月で進行する患者に由来するエキソソームにおいて上方制御される。ｆ：Ｙｏｕｄｅｎの指標閾値を越える低酸素タンパク質マーカーの数は、１８ヶ月以内で進行する患者と、１８ヶ月で再発する患者との間の明確な分離を実証する。ｇ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒは、低酸素エキソソームサインからのタンパク質の豊富さに基づいて、患者ＤＦＳの明確な分離を示す（Ｙｏｕｄｅｎ指標値を超える３以上のマーカー）。ｈ：ＲＯＣ曲線は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行（＜１８ヶ月）の完全な予後マーカーであるが、一方では、エキソソームにサイン濃度は予後的価値を有さないことを実証する。ｉ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、低酸素エキソソームサインがまた、ＮＳＣＬＣ患者における全体としての生存と相関することを実証する。
【図７−２】図７は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行を予測することを示す。ａ、ｂ：エキソソームは、ＴＥＭ（サイズバー２００ｎｍ）及び２０〜１５０ｎｍのサイズ分布により示されるように、形態に基づいてＮＳＣＬＣ血漿から単離され得る。ｃ：ＴＲＰＳは、健康なコントロール、又は１８ヶ月以内に進行する患者、又は１８ヶ月で再発していない患者から血漿におけるエキソソーム濃度に差がないことを実証する。ｄ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、再発しなかった患者及び健康なコントロールと比較して、１８ヶ月で進行する患者においてＶＣＰの富化を示す（ＦＬＯＴ１が負荷対象として使用される）。ｅ：低酸素エキソソームサインは、１８ヶ月で進行する患者に由来するエキソソームにおいて上方制御される。ｆ：Ｙｏｕｄｅｎの指標閾値を越える低酸素タンパク質マーカーの数は、１８ヶ月以内で進行する患者と、１８ヶ月で再発する患者との間の明確な分離を実証する。ｇ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒは、低酸素エキソソームサインからのタンパク質の豊富さに基づいて、患者ＤＦＳの明確な分離を示す（Ｙｏｕｄｅｎ指標値を超える３以上のマーカー）。ｈ：ＲＯＣ曲線は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行（＜１８ヶ月）の完全な予後マーカーであるが、一方では、エキソソームにサイン濃度は予後的価値を有さないことを実証する。ｉ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、低酸素エキソソームサインがまた、ＮＳＣＬＣ患者における全体としての生存と相関することを実証する。
【図７−３】図７は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行を予測することを示す。ａ、ｂ：エキソソームは、ＴＥＭ（サイズバー２００ｎｍ）及び２０〜１５０ｎｍのサイズ分布により示されるように、形態に基づいてＮＳＣＬＣ血漿から単離され得る。ｃ：ＴＲＰＳは、健康なコントロール、又は１８ヶ月以内に進行する患者、又は１８ヶ月で再発していない患者から血漿におけるエキソソーム濃度に差がないことを実証する。ｄ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、再発しなかった患者及び健康なコントロールと比較して、１８ヶ月で進行する患者においてＶＣＰの富化を示す（ＦＬＯＴ１が負荷対象として使用される）。ｅ：低酸素エキソソームサインは、１８ヶ月で進行する患者に由来するエキソソームにおいて上方制御される。ｆ：Ｙｏｕｄｅｎの指標閾値を越える低酸素タンパク質マーカーの数は、１８ヶ月以内で進行する患者と、１８ヶ月で再発する患者との間の明確な分離を実証する。ｇ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒは、低酸素エキソソームサインからのタンパク質の豊富さに基づいて、患者ＤＦＳの明確な分離を示す（Ｙｏｕｄｅｎ指標値を超える３以上のマーカー）。ｈ：ＲＯＣ曲線は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行（＜１８ヶ月）の完全な予後マーカーであるが、一方では、エキソソームにサイン濃度は予後的価値を有さないことを実証する。ｉ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、低酸素エキソソームサインがまた、ＮＳＣＬＣ患者における全体としての生存と相関することを実証する。
【図７−４】図７は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行を予測することを示す。ａ、ｂ：エキソソームは、ＴＥＭ（サイズバー２００ｎｍ）及び２０〜１５０ｎｍのサイズ分布により示されるように、形態に基づいてＮＳＣＬＣ血漿から単離され得る。ｃ：ＴＲＰＳは、健康なコントロール、又は１８ヶ月以内に進行する患者、又は１８ヶ月で再発していない患者から血漿におけるエキソソーム濃度に差がないことを実証する。ｄ：ＮＳＣＬＣ患者から単離されたエキソソームは、再発しなかった患者及び健康なコントロールと比較して、１８ヶ月で進行する患者においてＶＣＰの富化を示す（ＦＬＯＴ１が負荷対象として使用される）。ｅ：低酸素エキソソームサインは、１８ヶ月で進行する患者に由来するエキソソームにおいて上方制御される。ｆ：Ｙｏｕｄｅｎの指標閾値を越える低酸素タンパク質マーカーの数は、１８ヶ月以内で進行する患者と、１８ヶ月で再発する患者との間の明確な分離を実証する。ｇ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒは、低酸素エキソソームサインからのタンパク質の豊富さに基づいて、患者ＤＦＳの明確な分離を示す（Ｙｏｕｄｅｎ指標値を超える３以上のマーカー）。ｈ：ＲＯＣ曲線は、低酸素エキソソームサインがＮＳＣＬＣ患者における疾患進行（＜１８ヶ月）の完全な予後マーカーであるが、一方では、エキソソームにサイン濃度は予後的価値を有さないことを実証する。ｉ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、低酸素エキソソームサインがまた、ＮＳＣＬＣ患者における全体としての生存と相関することを実証する。
【図８−１】図８は、低酸素エキソソームサインがＥＭＴを受けた肺細胞に由来することを示す。ａ：ＧＳＥＡは、顕著な上皮間葉遷移遺伝子セットが低酸素ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームと有意に関連していることを同定した。ｂ：間質性表現型への発癌誘発性表現型移行を示す、正常肺上皮細胞（３０ＫＴ）及び形質転換された肺間葉細胞（３０ＫＴp53/KRAS/LKB1）の免疫蛍光。ｃ：細胞様怪物中のウェスタンブロットは、３０ＫＴp53/KRAS/LKB1細胞における上皮マーカーＥ−カドヘリンの損失及び間葉マーカービメンチンの獲得を実証する。ｄ：上皮（３０ＫＴ）及び間葉（３０ＫＴp53/KRAS/LKB1）肺細胞由来のエキソソームにおけるＶＣＰのウェスタンブロット（ＣＤ９が、ローディングコントロールとして使用される）。ｅ：上皮（３０ＫＴ）及び間葉（３０ＫＴp53/KRAS/LKB1）肺細胞由来のエキソソームにおけるＭＡＣ２ＢＰ、 ＴＮＣ、ＰＳＭＡ２及びＴＨＢＳ１のＥＬＩＳＡ。＊ｐ＜０．０５、 ＊＊ｐ＜０．０１、 ***ｐ＜０．００１。ｆ：原発腫瘍の免疫組織化学は、Ｅ−カドヘリン発現の損失が、高いサイングループに分類された患者と相関することを実証している（Ｙｏｕｄｅｎの指標値を越える３以上のマーカー）。
【図８−２】図８は、低酸素エキソソームサインがＥＭＴを受けた肺細胞に由来することを示す。ａ：ＧＳＥＡは、顕著な上皮間葉遷移遺伝子セットが低酸素ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームと有意に関連していることを同定した。ｂ：間質性表現型への発癌誘発性表現型移行を示す、正常肺上皮細胞（３０ＫＴ）及び形質転換された肺間葉細胞（３０ＫＴp53/KRAS/LKB1）の免疫蛍光。ｃ：細胞様怪物中のウェスタンブロットは、３０ＫＴp53/KRAS/LKB1細胞における上皮マーカーＥ−カドヘリンの損失及び間葉マーカービメンチンの獲得を実証する。ｄ：上皮（３０ＫＴ）及び間葉（３０ＫＴp53/KRAS/LKB1）肺細胞由来のエキソソームにおけるＶＣＰのウェスタンブロット（ＣＤ９が、ローディングコントロールとして使用される）。ｅ：上皮（３０ＫＴ）及び間葉（３０ＫＴp53/KRAS/LKB1）肺細胞由来のエキソソームにおけるＭＡＣ２ＢＰ、 ＴＮＣ、ＰＳＭＡ２及びＴＨＢＳ１のＥＬＩＳＡ。＊ｐ＜０．０５、 ＊＊ｐ＜０．０１、 ***ｐ＜０．００１。ｆ：原発腫瘍の免疫組織化学は、Ｅ−カドヘリン発現の損失が、高いサイングループに分類された患者と相関することを実証している（Ｙｏｕｄｅｎの指標値を越える３以上のマーカー）。
【図９−１】図９は、低酸素エキソソームサインが、ＮＳＣＬＣ患者における疾患再発を予測するという確認を示す。ａ、ｂ：指示された点で、ｃで追跡される２人の患者（確認コホート）の18Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴ画像。ｃ：発見コホートの支持下で、１８ヶ月後に再発する患者比較して１８ヶ月以内に再発する患者、特に患者４４と及び５３におけるエキソソームに濃度は類似する。ｄ：Ｙｏｕｄｅｎの指標閾値を越える低酸素タンパク質の数は、１８ヶ月以内に進行する患者と、１８ヶ月で再発しない患者との間の明確な区別を実証する。ｅ：低存在量又は高存在量の低酸素エキソソームタンパク質を有するＮＳＣＬＣ患者のＤＦＳのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットは、ＤＦＳにおける明確な区別を示す。ｆ：ＲＯＣ曲線分析はまた、１８ヶ月以内に進行するであろう患者の完全な分類を示す。ｇ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットは、このサインがまた、ＮＳＣＬＣ患者における全生存の予後マーカーでもあることを確かめる。
【図９−２】図９は、低酸素エキソソームサインが、ＮＳＣＬＣ患者における疾患再発を予測するという確認を示す。ａ、ｂ：指示された点で、ｃで追跡される２人の患者（確認コホート）の18Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴ画像。ｃ：発見コホートの支持下で、１８ヶ月後に再発する患者比較して１８ヶ月以内に再発する患者、特に患者４４と及び５３におけるエキソソームに濃度は類似する。ｄ：Ｙｏｕｄｅｎの指標閾値を越える低酸素タンパク質の数は、１８ヶ月以内に進行する患者と、１８ヶ月で再発しない患者との間の明確な区別を実証する。ｅ：低存在量又は高存在量の低酸素エキソソームタンパク質を有するＮＳＣＬＣ患者のＤＦＳのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットは、ＤＦＳにおける明確な区別を示す。ｆ：ＲＯＣ曲線分析はまた、１８ヶ月以内に進行するであろう患者の完全な分類を示す。ｇ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットは、このサインがまた、ＮＳＣＬＣ患者における全生存の予後マーカーでもあることを確かめる。
【図１０】図１０は、低酸素がＮＳＣＬＣ細胞からのエキソソーム分泌を増加することを示す。ａ：ＮＳＣＬＣ細胞から単離されたエキソソームは、標準的エキソソームマーカーＨＳＰ７０、ＦＬＯＴ１及びＣＤ６３を発現する。細胞マーカーＣＡＮＸは、エキソソーム溶解物ではなく、細胞溶解物においてのみ見出される。ｂ：低酸素は、ＮＳＣＬＣ細胞系からのエキソソーム分泌を増加する。ｎ ＝ ３ ± ＳＥＭ、 *ｐ＜０．０５、 **ｐ＜０．０１ 、***ｐ＜０．００１。
【図１１−１】図１１は、発見コホートは、エキソソームタンパク質がＮＳＣＬＣ患者における疾患進行と関連していることを実証していることを示す。ａ−ｅ：低酸素エキソソームサインにおける各タンパク質の個々のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ及びＲＯＣ曲線。
【図１１−２】図１１は、発見コホートは、エキソソームタンパク質がＮＳＣＬＣ患者における疾患進行と関連していることを実証していることを示す。ａ−ｅ：低酸素エキソソームサインにおける各タンパク質の個々のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ及びＲＯＣ曲線。
【図１１−３】図１１は、発見コホートは、エキソソームタンパク質がＮＳＣＬＣ患者における疾患進行と関連していることを実証していることを示す。ａ−ｅ：低酸素エキソソームサインにおける各タンパク質の個々のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ及びＲＯＣ曲線。
【図１１−４】図１１は、発見コホートは、エキソソームタンパク質がＮＳＣＬＣ患者における疾患進行と関連していることを実証していることを示す。ａ−ｅ：低酸素エキソソームサインにおける各タンパク質の個々のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ及びＲＯＣ曲線。
【図１２−１】図１２は、遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）は、低酸素ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームにおいて有意に増加した遺伝子セットを同定したことを示す。ａ：ＥＭＴ遺伝子セットにおいて同定されたタンパク質のヒートマップ。ｂ−ｅ：特徴的遺伝子セットに対する全エキソソームタンパク質発現データセットを用いてのＧＳＥＡは、低酸素エキソソームが解糖、ＭＹＣ標的、Ｅ２Ｆ標的及び生体異物代謝に関連するタンパク質において富化されることを明らかにする（ＦＤＲ＜０．０５）。ＮＥＳ−正規化された富化スコア。
【図１２−２】図１２は、遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）は、低酸素ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームにおいて有意に増加した遺伝子セットを同定したことを示す。ａ：ＥＭＴ遺伝子セットにおいて同定されたタンパク質のヒートマップ。ｂ−ｅ：特徴的遺伝子セットに対する全エキソソームタンパク質発現データセットを用いてのＧＳＥＡは、低酸素エキソソームが解糖、ＭＹＣ標的、Ｅ２Ｆ標的及び生体異物代謝に関連するタンパク質において富化されることを明らかにする（ＦＤＲ＜０．０５）。ＮＥＳ−正規化された富化スコア。
【図１２−３】図１２は、遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）は、低酸素ＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームにおいて有意に増加した遺伝子セットを同定したことを示す。ａ：ＥＭＴ遺伝子セットにおいて同定されたタンパク質のヒートマップ。ｂ−ｅ：特徴的遺伝子セットに対する全エキソソームタンパク質発現データセットを用いてのＧＳＥＡは、低酸素エキソソームが解糖、ＭＹＣ標的、Ｅ２Ｆ標的及び生体異物代謝に関連するタンパク質において富化されることを明らかにする（ＦＤＲ＜０．０５）。ＮＥＳ−正規化された富化スコア。
【図１３】図１３は、低減されたＥ−カドヘリン発現がＹｏｕｄｅｎの指標閾値を超えるサインタンパク質の数と相関することを示す。ａ：サイン得点に対するＩＨＣ得点の表。ｂ：低Ｅ−カドヘリンＩＨＣ得点は、１８ヶ月以内に再発する患者とより顕著に関連する。
【図１４】図１４は、確認コホートにおける上方制御されたサインタンパク質ＤＦＳと相関することを示す。ａ：ＶＣＰのウェスタンブロットは、１８ヶ月後に進行する患者に比較して、１８ヶ月以内に進行する患者の上方制御を実証する（ＦＬＯＴ１がローディングコントロールとして使用される）。ｂ：患者４４及び５３の個々のサイン値は、１８ヶ月以内に進行する患者５３が、患者４４に比較してサインタンパク質のベースラインレベルを有意に増加させていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、インビトロで同定された低酸素誘発されたエキソソームタンパク質が患者における癌進行及び攻撃性の正確な予後バイオマーカーであるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づかれている。
【００３０】
一態様において、本発明は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含む、対象における癌の攻撃性の決定方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、そして前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、癌の攻撃性のレベルを示すか、又はそれと相関する。
【００３１】
関連する態様において、本発明は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含む、対象における癌の予後の決定方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、そして前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、前記癌についてのより少ないか又はより好ましい予後を示すか又はそれと相関する。
【００３２】
上記態様に関して、１又は複数のマーカーは適切には、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、中性α−グルコシダーゼＡＢ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα２型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される。１つの特定の実施形態によれば、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、トロンボスポンジン−１及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される。
【００３３】
本明細書において一般的に使用される場合、（ａ）表１において上方制御されていると同定された５５のマーカータンパク質；及び（ｂ）表２において上方制御されていると同定された３２のマーカータンパク質の１つ以上の発現レベルは、他に特定されない限り、前記タンパク質をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ）、タンパク質自体又は両者の発現レベルを言及することができる。
【００３４】
本明細書において一般的に使用される場合、用語「癌（cancer）」、「腫瘍（tumor）」。「悪性（malignant）」及び「悪性腫瘍（malignancy）」とは、１つ以上の遺伝子突然変異、又は発癌、腫瘍マーカーの発現、腫瘍サプレッサー発現又は活性の損失、及び／又は異常又は異常細胞表面マーカー発現に関連する１つ以上の遺伝子変異又は他遺伝的変化をしばしば伴う、異常又は異常細胞増殖、分化及び／又は転位により特徴付けられる、疾患又は状態、又はその疾患又は状態に関連する細胞又は組織を指す。
【００３５】
「攻撃性（aggressiveness）」及び「攻撃的（aggressive）」とは、以下を含む特徴又は要因の組合せのうち１つ以上に起因して、癌が比較的不良な予後を有するという性質又は傾向を意味する：癌治療に利用可能な療法に対する少なくとも部分的な耐性；侵襲性；転移の可能性；治療後の再発；及び患者の生存の低い可能性（但し、それらだけには限定されない）。
【００３６】
特定の実施形態において、本明細書に提供されるタンパク質、例えば表１及び２に提供されるそれらは、攻撃的疾患、及び特に病理学的再発までの短い時間、及び／又はより短い患者の生存期間について予後的である。さらなる実施形態において、本明細書に提供されるタンパク質、例えば表１及び２に提供されるそれらは、転移性癌、及びより特定には、転移性ＮＳＣＬＣと相関するか、又はそれを示す。これに関して、例えばＬＴＢＰ３を除いて、表２に提供される３２のタンパク質がまた、表１に列挙されることは明らかであろう。
【００３７】
癌は、すべての主要な癌形、例えば肉腫、癌腫、リンパ腫、白血病及び芽細胞腫（但し、それらだけには限定されない）を含む、http://www.cancer.gov/cancertopics/alphalistでＮＣＩ癌指数に列挙されるような任意の攻撃的又は潜在的に攻撃的な癌、腫瘍又は他の悪性腫瘍を含む。それらは、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：乳癌、肺腺癌及び中皮腫を含む肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮癌及び前立腺癌を含む生殖器系の癌、脳及び神経系の癌、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌及び胃癌を含む胃腸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、例えば黒色腫及び皮膚癌腫、リンパ性癌及び骨髄単球性癌を含む血球癌、内分泌系の癌、例えば膵臓癌及び下垂体癌、骨及び軟部組織癌を含む筋骨格系癌。
【００３８】
特定の実施形態において、癌は、以下を含む：乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、前立腺癌、脳や神経系の癌、頭頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、膵臓癌、下垂体癌又は副腎癌。より好ましくは、癌は、肺癌、例えばＮＳＣＬＣであるか、又はそれを含む。
【００３９】
特定の実施形態によれば、本明細書に開示される側面の癌は、肺癌であるか、又はそれを含む。この目的のためには、肺癌は、任意の攻撃的肺癌、及び当業界において知られているサブタイプの癌、例えば非小細胞癌（すなわち、扁平上皮癌、腺癌及び大細胞癌）、小細胞癌及び中皮腫を含むことができることは明らかであろう。１つの好ましい実施形態によれば、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であるか、又はそれを含む。
【００４０】
用語「予後（prognosis）」及び「予後的（prognostic）」とは、臨床学的結果の予測（医学的治療を伴うか又は伴わない）、適切な治療方針の選択（又は治療が有効か否か）、及び／又は現在の治療のモニタリング、及び治療の実質的変更を提供できる、予後を行うことを含むために、本明細書において使用される。これは、追加のタンパク質及び／又は他の核酸バイオマーカーの発現レベルの決定と組み合わせられ得る。本発明の方法による１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルの決定に、少なくとも部分的に基づかれ得る。予後はまた、癌が都合よく治療されるか、又は他方では、解決された後、対象により罹患される癌の任意の持続的又は永久的な物理学的又は心理学的効果の予測、予想又は期待を含むことができる。さらに、予後は、転移の可能性又は再発の決定、治療的応答性、適切な治療計画の実施、治療後の癌再発の可能性、傾向又は可能性の決定、及び確立された治療（例えば、化学療法）に対する耐性の進行の予測のうち１つ以上を含むことができる。正の予後とは、典型的には、有益な臨床学的結果又は見通し、例えば対象の癌の再発を伴わない長期生存を指すが、一方では、負の予後は典型的には、負の臨床学的結果又は見通し、例えば癌再発又は進行を指すことが理解されるであろう。
【００４１】
２つの前述の態様の方法の一実施形態において、１又は複数のマーカーの比較的減少した発現レベルは、より好ましい予後及び／又は低い攻撃的の癌を示す上、又はそれと相関し；及び／又は１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルは、あまり好ましくない予後及び／又は高い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関する。
【００４２】
１つの特定の実施形態によれば、癌の予後又は攻撃性は、前記対象における癌の転移の可能性を決定するために、少なくとも部分的使用される。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「転移（metastasis）」又は「転移性（metastatic）」とは、典型的には、腫瘍、癌又は新生物の主要病巣から身体におけるは離れた部位への、循環系又はリンパ系を介して、又は自然の体腔を介して悪性腫瘍細胞又は新生物の移動又は転移、及び１つ以上の新規位置における１つ以上の二次腫瘍又はコロニーの続く進行を指す。「転移（metastases）」とは、転移の結果として形成される二次腫瘍又はコロニーを言及し、そして微小転移、及びリンパ節を含む局所転移、及び遠隔転移を包含する。
【００４４】
適切には、１又は複数のマーカーの比較的減少した発現レベルは、前記癌の転移の減少した可能性を示すか、又はそれと相関し； 及び／又は１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルは、前記癌の転移の可能性の増加を示すか、又はそれと相関する。
【００４５】
１つの実施形態によれば、癌予後又は攻撃性は、対象が癌の治療から利益を得るか否かを決定するために、少なくとも部分的に使用される。例えば、好ましい予後及び／又は低い攻撃的の癌を有する患者は、癌の急速な局所的進行及び／又は転移に苦しむ可能性が低く、及び／又はより積極的なモニタリング及び／又は治療から免れることができる。
【００４６】
別の実施形態によれば、癌予後又は攻撃性は、対象に対する治療戦略を開発するために、少なくとも部分的に使用される。
【００４７】
１つの実施形態によれば、癌予後又は攻撃性は、対象における疾患の進行又は再発を決定するために、少なくとも部分的に使用される。
【００４８】
１つの実施形態によれば、癌予後又は攻撃性は、推定生存期間を決定するために、少なくとも部分的に使用される。
【００４９】
本発明のためには、「単離された（isolated）」とは、その天然の状態から除かれているか、又は他方では、ヒト操作を受けている材料を意味する。単離された材料は、その天然の状態で通常、それに付随する成分を実質的に又は本質的に有さないか、又はその天然の状態で通常、それに付随する成分と一緒に人工状態で存在するよう操作され得る。単離された材料は、天然型、化学合成型又は組換え型であり得る。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「遺伝子（gene）」とは、１つ以上のアミノ酸コードヌクレオチド配列、及びプロモーターを含む１つ以上の非コードヌクレオチド配列、及びその５′未翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化配列及び他の３′未翻訳配列（但し、それらだけには限定されない）を含むことができるゲノムの構造的遺伝的単位である核酸である。ほとんどの細胞生物においては、遺伝子は、二本鎖ＤＮＡを含む核酸である。
【００５１】
用語「核酸（nucleic acid）」とは、本明細書において使用される場合、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを示す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ及び自己触媒性ＲＮＡを含む。核酸はまた、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。核酸は、典型的には、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ塩基を含むヌクレオチドを、典型的には含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、他の塩基、例えばそれらだけには限定されないが、イノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシン及び／又はチオウリジンを含むことができる。
【００５２】
天然に存在する（例えば、対立遺伝子）変異体のヌクレオチド配列を含む核酸、及び本明細書に提供される１つ又は複数のマーカーをそれぞれコードする核酸のオルソログ（例えば、異なる種からの）を含む「変異体（variant）」核酸も含まれる。好ましくは、核酸変異体は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列と、少なくとも７０％又は７５％、好ましくは少なくとも８０％又は８５％、又はより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％ 又は９９％共有する。
【００５３】
核酸フラグメントも含まれる。「フラグメント（fragment）」は、それぞれヌクレオチド配列の１００％未満を構成する、核酸のセグメント、ドメイン、部分又は領域である。非限定的な例は、増幅産物又はプライマーもしくはプローブである。特定の実施形態によれば、核酸フラグメントは、例えば前記核酸の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０ 、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、 ８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００及び７５００の連続ヌクレオチドを含むことができる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」は、８０個又はそれ以上の連続ヌクレオチドを有する核酸であり、一方「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、８０個未満の連続ヌクレオチドを有する。「プローブ（probe）」は、例えばノーザン又はサザンブロットにおいて相補的配列を検出するために適切に標識された、一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。「プライマー（primer）」は、通常、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくは１５〜５０の連続したヌクレオチドを有し、これは相補的核酸「鋳型」にアニーリングすることができ、そしてＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存症ＤＮＡポリメラーゼ又はシーケナーゼ（sequenase）（商標）の作用により鋳型依存的に伸長され得る。「鋳型（template）」核酸は、核酸増幅にゆだねられる核酸である。
【００５５】
「タンパク質（protein）」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当業界において十分に理解されているように、天然又非天然のアミノ酸、Ｄ−又はＬ−アミノ酸であり得る。当業者により理解されているように、用語「タンパク質」はまた、その範囲内に、タンパク質のリン酸化形態（すなわち、リンタンパク質）及び／又はタンパク質のグリコシル化形態（すなわち、糖タンパク質）を含む。「ペプチド（peptide）」は、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。「ポリペプチド（polypeptide）」は、５０個超のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００５６】
タンパク質「変異体（variant）」、例えば天然に存在する変異体（例えば、対立遺伝子変異体）、及び本明細書に提供される１又は複数のマーカー、例えば表１及び２に列挙されるそれらのオルソログ又はアイソフォームもまた提供される。好ましくは、タンパク質変異体は、本明細書に開示されるか、又は当業界において知られている１又は複数のマーカーのアミノ酸配列と、少なくとも７０％又は７５％、好ましくは少なくとも８０％又は８５％、又はより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％ 又は９９％の配列同一性を共有する。このためには、表１及び２はまた、当業界において十分に理解され、そして本明細書中の参照により組込まれるように、列挙されるタンパク質マーカーのタンパク質配列の例を参照する受託番号を含む。
【００５７】
全アミノ酸配列の１００％未満を含むペプチドフラグメントを含むタンパク質フラグメントも提供される。特定の実施形態によれば、タンパク質フラグメントは、例えば前記タンパク質の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０及び１２００の連続アミノ酸を含むことができる。
【００５８】
エキソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな（すなわち、典型的には３０〜１５０ｎｍ）、細胞由来の膜小胞であることが当業者により理解されるであろう。それらは、脂質、核酸及びタンパク質を含み、そして原形質膜との融合に基づいて細胞外環境に放出される。一般的に、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＨＳＰ７０、フロチリン−１及びＴＳＧ１０１を含むマーカータンパク質の存在、並びにそれらの形態及びサイズにより特徴付けられる。
【００５９】
本発明の方法において、１つ以上のエキソソームを含むエキソソームサンプルは、それらだけには限定されないが、血液、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸水、腹水、脳脊髄液、涙液、尿、唾液、痰、乳頭吸引液、リンパ液、気道、腸管、尿生殖路の体液、母乳、臓器内システム液、又はそれらの組合せを含むほとんどの生体を含むか、又はそれらから得られる。このためには、エキソソームサンプルは、体液、又はサンプル、例えば上記に提供されたそれらから、汚染性タンパク質、リポタンパク質、等の除去を促進するために、単離されるか又は精製される。
【００６０】
このためには、エキソソーム又はエキソソームタンパク質は、当業界において知られている何れかの手段、例えばそれらだけには限定されないが、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、エキソソーム沈殿（例えば、System BiosciencesからのExoQuick）、エキソソームの親和性に基づく捕捉（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９、Ａｌｉｘ、アネキシン、ＥｐＣＡＭ、及びＲａｂ５に対する抗体を用いた親和性精製）及びそれらの組合せにより単離され得る。
【００６１】
当業者により理解されるように、本明細書に提供される１つ以上のタンパク質の遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、比較的（ｉ）より高いか又は大きい可能性があるか；又は（ｉｉ）コントロール又は参照サンプルにおける発現レベル、又は閾値発現レベルと比較して、より低いか、低減されるか、又は減じられ得る。一実施形態において、発現レベルは、それが参照集団の発現レベルの平均及び／又は中央値を超える場合、より高い、増加したか又はより大きいとして分類され得る。１つの実施形態によれば、発現レベルは、それが参照集団の発現レベルの平均及び／又は中央値未満である場合、より低い、低減されたか又は減じられたとして分類され得る。これに関して、参照集団は、発現レベルが決定される前記哺乳類と同じ癌タイプ、サブグループ、病期及び／又はグレードを有するコントロールグループであり得る。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「より高い（higher）」、「増加した（increased」」及びより大きい（greater）」は、コントロール又は参照レベルもしくは量と比較される場合、エキソソームサンプル中の核酸及び／又はタンパク質の増加した量又はレベルを指す。１又は複数のマーカーの核酸及び／又はタンパク質の発現レベルは、相対的又は絶対的であり得る。いくつかの実施形態において、１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現は、その発現レベルが、コントロール又は参照レベルもしくは量において、それぞれの又は対応するタンパク質の遺伝子及び／又はタンパク質発現のレベルよりも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、又は少なくとも約５００％高い場合、より高い、増加したか又は大きい。
【００６３】
本明細書において使用される場合、用語「より低い（lower）」、「減少された（reduced）」及び「減じられた（decreased）」とは、コントロール又は参照レベルもしくは量に比較される場合、例えばエキソソームサンプルにおける核酸及び／又はタンパク質のより低い量又はレベルを言及する。本明細書に提供される１又は複数のマーカーの核酸及び／又はタンパク質の発現レベルは、相対的又は絶対的であり得る。いくつかの実施形態によれば、１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現は、その発現レベルが、コントロール又は参照レベルもしくは量においてそれぞれ又は対応するタンパク質の遺伝子及び／又はタンパク質発現のレベル又は量の約１％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％未満、又はさらに、約５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又は０．０００１％未満である場合、より低い、減少されたか又は減じられる。
【００６４】
用語「コントロールサンプル（control sample）」とは典型的には、癌を有さない非疾患（健康）の個人からの生物学的サンプル、例えばエキソソームサンプルを指す。一実施形態において、コントロールサンプルは、癌に罹患していないことが知られている対象、又はより早い時点で対象から得られたサンプル由来であり得る。他方では、コントロールサンプルは、癌から寛解している対象由来であり得る。コントロールサンプルはプールされたサンプル、平均サンプル又は個々のサンプルであり得る。内部コントロールは、試験されているのと同じ生物学的サンプル（例えば、エキソソームサンプル）からのマーカーである。
【００６５】
本明細書において使用される場合、遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、その絶対量又は相対量であり得る。従って、いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、発現のコントロールレベル、例えば対象のエキソソームサンプルにおける１又は複数の「ハウスキーピング（housekeeping）」遺伝子及び／又はタンパク質の遺伝子及び／又はタンパク質発現のレベルに比較される。
【００６６】
さらなる実施形態によれば、１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、発現の閾値レベル、例えば、エキソソームサンプルにおける遺伝子及び／又はタンパク質発現のレベルに比較される。発現の閾値レベルは、一般的に、本発明の１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現の定量化されたレベルである。典型的には、発現の閾値レベルを越えるか又は下回る、エキソソームサンプルにおける１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、特定の疾患状態又は結果の予測である。閾値レベルの発現の性質及び数値（存在するなら）は、典型的には、例えば対象における予後及び／又は抗癌療法に対する応答の決定に使用される、１つ以上の遺伝子又はその産物の発現を決定するために選択された方法に基づいて変わるであろう。
【００６７】
当業者は、当業界において知られている遺伝子又はタンパク質発現を測定する任意の方法、例えば本明細書に記載されるそれらの方法を用いて、予後及び／又は抗癌療法に対する応答の決定に使用され得る、エキソソームサンプルにおける遺伝子及び／又はタンパク質発現の閾値レベルを決定することができるであろう。一実施形態において、閾値レベルは、発現レベルが決定される前記対象と同じ癌タイプ、サブグループ、病期及び／又はグレードを有する、参照集団における１又は複数のマーカーの平均及び／又は中央値遺伝子及び／又はタンパク質発現レベル（中央値又は絶対値）である。さらに、発現の閾値レベルの概念は、単一の値又は結果に限定されるべきではない。これに関して、発現の閾値レベルは、例えば対象の癌の転移の高い、中程度の又は低い可能性を意味し得る複数の閾値発現レベルを包含することができる。
【００６８】
一実施形態において、本明細書に提供される１又は複数のマーカーのより低い遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、抗癌治療に対する癌の比較的増加した応答性を示すか、又はそれと相関する。別の実施形態において、本明細書に提供される１又は複数のマーカーのより近い遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルは、抗癌治療に対する癌の比較的減少した応答性を示すか、又はそれと相関する。
【００６９】
用語「決定する（determining）」、「測定する（measuring）」、「評価する（evaluating）」、「査定する（assessing）」及び「アッセイする（assaying）」とは、本明細書においては互換的に使用され、そして当業界において知られている何れかの形の測定、例えばこの後に記載されるそれらを含むことができる。
【００７０】
本明細書に提供される１又は複数のマーカーの対応する核酸、例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの決定、査定、評価、アッセイ又は測定は、当業界において知られている何れかの技法により実施され得る。それらは、核酸配列増幅、核酸ハイブリダイゼーション、ヌクレオチド配列決定、質量分析及びそれらの組み合わせの何れかを含む技法であり得る。
【００７１】
核酸増幅技法は典型的には、１つ以上のプライマーを、適切な条件下で「鋳型」ヌクレオチド配列にアニーリングし、ポリメラーゼを用いて、標的に相補的なヌクレオチド配列を合成し、それにより、標的ヌクレオチド配列を増幅する反復サイクルを含む。核酸増幅技法は、当業者に周知であり、そしてそれらに限定されないが、以下を含む：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；ローリングサークル複製（ＲＣＲ）；核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）；Ｑβレプリカーゼ増幅；ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）；ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）；ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）。本明細書において一般的に使用される場合、「増幅産物（amplification product）」とは、核酸増幅技法により生成される核酸産物を指す。
【００７２】
ＰＣＲは、以下を含む：定量的及び半定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、及び「基本的な」ＰＣＲ増幅に対する他の変形及び改変。
【００７３】
核酸増幅技法は、細胞又は組織源から抽出され、単離されるか、又は他の方法で得られたＤＮＡ又はＲＮＡを用いて実施され得る。他の実施形態によれば、核酸増幅は、適切に処理された細胞又は組織サンプルに対して直接的に実施され得る。
【００７４】
核酸ハイブリダイゼーションは典型的には、ヌクレオチド配列を、典型的にはプローブの形で、標的ヌクレオチド配列に適切な条件下でハイブリダイズさせることを含み、それにより、ハイブリダイズされたプローブ標的ヌクレオチド配列が続いて検出される。非制限的な例としては、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）検出が挙げられるが、但しそれらだけには限定されない。核酸ハイブリダイゼーションは、細胞又は組織源からの抽出、単離、増幅又は他の方法で得られたＤＮＡ又はＲＮＡを用いて、又は適切に処理された細胞又は組織サンプルに対して直接的に実施され得る。
【００７５】
核酸増幅及び核酸ハイブリダイゼーションの組合せが利用され得ることもまた理解されるであろう。
【００７６】
１又は複数のエキソソームタンパク質のタンパク質レベルの決定、評価、査定、アッセイ又は測定は、エキソソームの表面上であるか、又は内部発現されているかにかかわらず、そのようなタンパク質、又は対象のエキソソームサンプルから単離され、抽出されるか、又は他方では他の手段で得られたタンパク質を検出できる、当業界において知られている任意の技法により実施され得る。それらの技法は、それらだけには限定されないが、タンパク質を結合する１つ以上の抗体を用いる抗体ベースの検出、電気泳動、等電点電気泳動、タンパク質配列決定、クロマトグラフィー技法及び質量分析、並びにそれらの組合せを含む。抗体ベースの検出は、それらだけには限定されないが、蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫細胞化学を含み得る。
【００７７】
本明細書に提供される１又は複数のマーカーも発現は、核酸増幅及び／又は核酸ハイブリダイゼーション等によるその核酸レベル、及びそのタンパク質レベルの両者の決定を含むことができることは理解されるであろう。従って、対象のエキソソームサンプルからの１又は複数のマーカーの発現の検出及び／又は測定は、本明細書に記載されるそれらの方法又はそれらの組合せのいずれか（例えば、それらだけには限定されないが、ｍＲＮＡレベル又はその増幅されたｃＤＭＡコピーの測定、及び／又はそのタンパク質産物により）により実施され得る。
【００７８】
上記を考慮して、本明細書に提供される１又は複数のマーカーの発現レベルは、核酸、例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ、及び／又はタンパク質を含む、発現された遺伝子又はその遺伝子産物の絶対又は相対量であり得ることはさらに理解されるであろう。
【００７９】
適切には、前述の側面の方法はさらに、（ｉ）高い攻撃性の癌又は低い攻撃的の癌；及び／又は（ｉｉ）より好ましくない予後又はより好ましい予後を有するように前記対象を診断する工程を含む。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含む、対象における抗癌治療に対する癌の応答性の予測方法を提供し、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの改変された又は調節された発現レベルが、抗癌治療に対する癌の比較的増加したか又は減少した応答性を示すか又はそれと相関する。
【００８１】
当業者により理解されるように、遺伝子又はタンパク質の発現レベルは、発現レベルが、コントロール又は参照サンプル、又は発現レベル、例えば閾値レベルと比較して、より高い／増加したか、又はより低い／低減される場合、「改変される（altered）」又は「調製される（medulated）」と見なされ得る。一実施形態において、発現レベルは、参照集団の平均及び／又は中央相対発現レベルよりも大きい場合、高いと分類され得、そして発現レベルは、参照集団の平均及び／又は中央相対発現レベルよりも小さい場合、低いと分類され得る。これに関して、参照集団は、発現レベルが決定される前記哺乳類と同じ癌タイプ、サブグループ、病期及び／又はグレードを有する対象グループであり得る。さらに、発現レベルは、相対的又は絶対的であり得る。
【００８２】
適切には、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、中性α−グルコシダーゼＡＢ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα２型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される。１つの特定の実施形態によれば、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、トロンボスポンジン−１及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。
【００８３】
一実施形態において、１又は複数のマーカーのより高い発現レベルは、抗癌治療に対する癌の比較的増加した応答性を示すか、又はそれと相関する。他の実施形態において、１又は複数のマーカーのより高い発現レベルは、抗癌治療に対する癌の比較的減少した応答性を示すか、又はそれと相関する。
【００８４】
前述の態様の発明に関して、当該方法は適切には、対象における癌のさらなる治療工程を含む。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、対象における癌の治療に関する。
【００８６】
１つの特定の態様において、癌治療は、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルの決定と組合して実施され、ここで前記マーカーは、表１及び／又は表２に列挙されるそれらのタンパク質のうち１つ以上を含み、及び行われた決定に基づいて、抗癌治療を開始するか、継続するか、修正するか、又は中止する。
【００８７】
適切には、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、中性α−グルコシダーゼＡＢ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα２型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。１つの特定の実施形態において、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、トロンボスポンジン−１及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。
【００８８】
これに関して、抗癌剤に対する癌の応答性を予測するための本明細書に記載されるそれらの方法はさらに、治療的有効量の抗癌治療剤、例えば抗癌剤を哺乳類に投与する工程も含むことができる。好ましい実施形態において、抗癌治療剤は、本明細書に記載される１又は複数のマーカーの遺伝子及び／又はタンパク質発現レベルが抗癌剤に対する癌の比較的増加した応答性を示すか、又はそれと相関する場合に投与される。
【００８９】
適切には、前記薬剤は、医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物として対象に投与される。これに関しては、任意の投与形及び投与経路、例えば本明細書に提供されるそれらが、本発明の組成物を対象に提供するために使用され得る。
【００９０】
癌治療は、小有機又は無機分子などの薬物療法、放射線療法、手術、栄養療法、リラクゼーション又は瞑想療法、その他の自然療法又は総合療法を含むが、但しそれらだけには限定されない。一般的に、薬物（例えば、有機又は無機の小分子）、生体分子（例えば、抗体、siRNAなどの阻害性核酸）又は化学療法剤は、本明細書では「抗癌治療剤（anti-cancer therapeutic agents）」又は「抗癌剤（anti-cancer agents）」と呼ばれる。
【００９１】
癌の治療方法は、予防的（prophylactic）、予防的（preventative）又は治療的であり、そして哺乳類、特にヒトにおける癌の治療のために適切である。本明細書において使用される場合、「治療する（treating）」又は「治療（treatment）」とは、癌及び／又はその症状が少なくとも発症し始めた後、癌の症状を少なくとも改善する、治療的介入、作用方針又はプロトコールを指す。本明細書において使用される場合、「予防する（preventing）」、「予防する（prevent）」又は「予防（prevention）」とは、癌又は症状の発生又は進行を予防し、阻害し又は遅延するために、癌及び／又は癌の症状の開始の前に開始される治療的介入、作用方針又はプロトコールを指す。
【００９２】
用語「治療的有効量（therapeutically effective amount）」とは、その薬剤により治療される対象において所望の効果を達成するために十分な特定薬物の量を記載する。例えば、これは、癌又は癌関連疾患、障害又は状態を低減し、軽減し、及び／又は予防するために必要な化学療法剤の量であり得る。いくつかの実施形態によれば、「治療的有効量」は、癌の症状を低減するか又は排除するのに十分である。他の実施形態によれば、「治療的有効量」は、所望する生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば癌の増殖及び／又は転移を低減するか又は防止するのに有効である量である。
【００９３】
理想的には、薬剤の治療的有効量は、対象において実質的な細胞毒性効果を引起さないで、所望する結果を誘発するのに十分な量である。癌を低減し、軽減し、及び／又は予防するのに有用な薬剤の有効量は、治療されている対象、任意の関連する疾患、障害及び／又は状態（例えば、任意の関連する転移の数及び位置）のタイプ及び重症度、並びに治療用組成物の投与方法に依存するであろう。
【００９４】
適切には、抗癌治療剤は、医薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物として哺乳類に投与される。
【００９５】
「医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤（pharmaceutically acceptable carrier、diluent or excipient）」とは、全身投与に完全に使用され得る固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当業界において良く知られている種々の担体が使用され得る。それらの担体は、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、リポソーム及び他の脂質ベースの担体、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水、及び塩、例えば塩酸塩、臭化物及び硫酸塩を含む鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩などの有機酸塩、及び発熱物質を含まない水から成る群から選択され得る。
【００９６】
医薬的に許容できる担体、希釈剤及び賦形剤を記載する有用な参考文献は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)であり、これは参照により本明細書に組込まれる。
【００９７】
何れかの安全な投与経路が、本発明の組成物を患者に提供するために使用され得る。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、頬側、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮及び同様のものが使用され得る。筋肉内及び皮下注射は、例えば、免疫療法用組成物、タンパク質性ワクチン及び核酸ワクチンの投与に適している。
【００９８】
剤形は、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアロゾル剤、経皮パッチ剤及び同様のものを含む。それらの剤形はまた、この目的のために特別に設計された注射又は移植制御放出装置、又はこの様式でさらに作用するよう改変された他の形のインプラントを含むことができる。治療薬の制御された放出は、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸並びに特定のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む疎水性ポリマーにより治療薬を被覆することによりもたらされ得る。さらに、制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又は微小球体を用いることによりもたらされ得る。
【００９９】
経口又は非経口投与のために適切な本発明の組成物は、それぞれ所定量の１以上の本発明の治療剤を含む、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤などの個別の単位として、粉末又は顆粒として、又は水性液体、非水性液体、水中油エマルジョン又は油水水液体エマルジョン中において、溶液又は懸濁液として提供され得る。そのような組成物は、任意の製薬方法により調製され得るが、しかしすべての方法は、１以上の必要な成分を構成する担体と、上記のような１以上の薬剤とを組み合わせる工程を含む。一般的に、組成物は、本発明の薬剤と、液体担体又は微粉化された固体担体、又は両者とを均一且つ、密接に混合し、そして次に、必要な場合、生成物を所望の形状に成形することにより製造される。
【０１００】
上記組成物は、剤形と適合できる態様で、及び医薬的に有効であるような量で投与され得る。本発明においては、患者に投与される用量は、適切な期間にわたって有益な応答を患者にもたらすのに十分であるべきである。投与される薬剤の量は、年齢、性別、体重及びその一般的な健康状態、施術者の判断に依存し得る要因を含めて、治療されるべき対象に依存し得る。
【０１０１】
特定の実施形態において、抗癌治療及び／又は薬剤は、１又は複数のマーカーの作用を阻害すること、及び／又はその発現を低減することに向けられ得る。
【０１０２】
他の実施形態において、抗癌治療及び／又は薬剤は、癌の転移を予防し、又は阻害することに向けられ得る。
【０１０３】
別の実施形態において、抗癌治療及び／又は薬剤は、本発明の１又は複数のマーカー以外の遺伝子又は遺伝子産物に向けられ得る。例として、抗癌治療は、１又は複数のマーカーと、直接的に又は間接的に相互作用することが知られている遺伝子又は遺伝子産物を標的とし得る。
【０１０４】
特定の実施形態によれば、本発明は、癌治療に関する「コンパニオン診断（companion diagnostic）を提供し、それにより、本発明の１又は複数のマーカーの発現レベルは、前記癌治療の安全及び／又は効果的な投与のために使用される情報を臨床医等に提供する。
【０１０５】
適切には、癌は、上記タイプのものであるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０６】
前述の態様を参照すると、この方法は適切には、対象から、例えばそれらの生物学的サンプルから、及び／又は前述の単離方法を用いて、エキソソームサンプルを取得する初期工程を含む。
【０１０７】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）表１及び／又は表２に列挙されるマーカーを発現する細胞と、候補薬剤とを接触すること；及び
（ｂ）前記候補薬剤がマーカーの発現及び／又は活性を調節するか否かを決定することを含む、対象における癌の治療への使用のための薬剤の同定又は製造方法を提供する。
【０１０８】
特定の実施形態において、前記候補薬剤は、マーカーの発現及び／又は活性を、少なくとも部分的に、低減するか、排除するか、抑制するか又は阻害する。
【０１０９】
適切には、薬剤は、有意なオフターゲット（off-target）効果及び／又は非特異的効果をほとんどか又は全く有さない。
【０１１０】
好ましくは、薬剤は、抗体又は小分子である。
【０１１１】
適切には、マーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、中性α−グルコシダーゼＡＢ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα２型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。１つの特定の実施形態によれば、１又は複数のマーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、プロテアソームサブユニットα２型、トロンボスポンジン−１及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される。
【０１１２】
抗体阻害剤に関連する実施形態によれば、抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、天然又は組換えのものであり得る。抗体産生、精製及び使用に適用できる周知のプロトコールは、例えばColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994)のチャプター２、及びHarlow, E. & Lane, D.  Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988（それらの両者は参照により本明細書に組込まれる）に見出され得る。
【０１１３】
一般的に、本発明の抗体は、マーカーの単離されたタンパク質、フラグメント、変異体又は誘導体に結合するか、又はそれと接合する。例えば、抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。そのような抗体は、マーカータンパク質産生の単離されたタンパク質、フラグメント、変異体又は誘導体を、マウス又はウサギを含む生産種中に注射し、ポリクローナル抗血清を得ることにより調製され得る。ポリクローナル抗体の生成方法は、当業者に良く知られている。使用され得る典型的なプロトコールは、Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 前掲及びHarlow & Lane, 1988, 前掲に記載されている。
【０１１４】
モノクローナル抗体は、例えば参照により本明細書に組込まれる、Kohler & Milstein, 1975, Nature 256, 495による論文に記載される標準方法を用いて、又は例えば１つ以上の単離されたマーカータンパク質産物及び／又はそのフラグメント、変異体及び／又は誘導体により接種された生産種に由来する脾臓又は他の抗体産生細胞を不死化することにより、Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 前掲に記載されるようなより最近の改良法により製造され得る。
【０１１５】
典型的に、候補阻害剤抗体の阻害活性は、抗体の存在下でマーカータンパク質の発現レベル及び／又は活性を検出するか、又は測定するインビトロ及び／又はインビボアッセイにより評価され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、モジュレーター、例えば阻害剤は、合理的に設計され得る。それらの方法は、マーカーの構造分析、及びマーカーの活性に結合し、それと相互作用するか、又は他方では、それを調節する分子の設計及び／又は構築を含むことができる。それらの方法は特に、候補モジュレーターとマーカーとの間の相互作用のコンピューター支援三次元モデリングを含む。
【０１１７】
他の実施形態において、モジュレーター、例えば有機小分子阻害剤は、潜在的新薬又はリード化合物を見出すために数百の分子標的のいずれか１つでの生物学的活性についてスクリーニング又は試験され得る、数十文〜数百万の候補阻害剤（合成小有機分子を含む化合物、又は阻害ペプチド又はタンパク質などの天然の産物）の大化合物のライブラリーのスクリーニングを含むことができる。スクリーニング方法は、コンピューターベースの（「イン・シリコ（in silico）」）スクリーニング及びインビトロアッセイに基づくハイスループットスクリーニングを含むことができるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１８】
典型的に、この最初のスクリーニングプロセスからの活性化合物又は「ヒット（hits）」は、次に、活性化合物をさらに特徴づけるために一連の他のインビトロ及び／又はインビボ試験を通して順次試験される。各段階での連続的に少数の「成功した（successful）」化合物が続く試験のために選択され、最終的に、ヒト臨床試験において試験されるのに進むために選択される１つ以上の薬物候補が導かれる。
【０１１９】
臨床レベルでは、候補薬物のスクリーニングは、対象が試験化合物に暴露される前後、試験対象からサンプルを得ることを含む。次に、エキソソームサンプル等のサンプルにおけるマーカータンパク質のレベルが、候補薬物への暴露の後、マーカータンパク質のレベル及び／又は活性が変化するか否かを決定するために測定され、そして分析される。例として、サンプル中のタンパク質産物レベルは、質量分析、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、電気化学、及び／又は当業者に公知の何れか他の適切な手段により決定され得る。
【０１２０】
これに関して、マーカーの発現レベル及び／又は活性を減じ、排除し、抑制するか、又は阻害できるとして同定される候補薬剤は、次に、癌に罹患している患者に投与され得る。例えば、マーカーの活性及び／又は発現を阻害するか又は低減する候補薬物の投与は、バイオマーカーの増加した活性が、少なくとも部分的に癌の進行及び／又は発症の原因である場合、癌を治療し、及び／又は癌のリスクを低減することができる。
【０１２１】
上記側面に関して、用語「対象（subject）」とは、ヒトを含む哺乳類、パフォーマンス動物（例えば、ウマ、ラクダ、グレイハウンド）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ）及びコンパニオン動物（例えば、ネコ及びイヌ）を含むが、但しそれらだけには限定されない。好ましくは、対象はヒトである。
【０１２２】
本明細書に言及される全てのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許及び科学文献は、参照により本明細書に組込まれる。
【０１２３】
本発明に関して、遺伝子又はタンパク質について本明細書に提供されるデータベース受託番号又は固有の識別子、例えば表１及び２に提供されるそれら、並びに遺伝子及び／又はタンパク質配列又はそれに関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。
【０１２４】
本発明の好ましい実施形態が十分に理解され、そして実用的効果がもたらされるように、以下の非制限的な実施例を参照する。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
最近のデータは、腫瘍低酸素が転移性播種を促進する因子の分泌のための強力な推進力であることを示唆している8,9。転移の促進に関与されると思われる分泌された因子の重要な要素は、エキソソームの放出である。増加する証拠は、腫瘍由来のエキソソームにより担持されるプロテオーム及びゲノム情報の豊富な配列が、癌細胞が周囲の間質及び悪性細胞の行動を変える新規メカニズムであることを示差している10。エキソソームは、心血管新生11、免疫抑制12に関連するシグナル伝達プロセスに影響を与え、そして薬剤耐性及び発癌性転移を誘発する13-15．さらに、全身性変化を誘発するエキソソームの能力は、転移性播種を促進すると思われ、これは、患者の死因の大部分を占める16。
【０１２６】
エキソソームによる発癌タンパク質の転移もまた報告されている14。グルオーマ細胞におけるエキソソーム転移は、変異型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｖIII ）アイソフォームの送達を通して腫瘍形成を促進し、抗アポトーシス遺伝子の増加した発現及び増強された増殖をもたらすことが最近実証されている14。同様に、変異型のＫＲＡＳを有する結腸癌細胞は、変異型ＫＲＡＳの野生型細胞へのエキソソーム転移を介して野性方ＫＲＡＳ結腸細胞の三次元増殖を増強することができる。さらに、非転移性メラノーマ細胞は、高度に転移性のメラノーマ細胞に由来するエキソソームの取り込みにより、より転移性になるように誘導され得る17。しかしながら、この転移能力の変化が永久的であるか否かは、不明のままである。
【０１２７】
エキソソームのタンパク質及びＲＮＡ含有量は、典型的にはそれらが由来する細胞型、組織、及び微小環境に応じて著しく変動する。この理由のために、癌分泌エキソソーム及びそれらの分子量は、癌における潜在的なバイオマーカー源及び治療標的を表す。従って、この実施例の全体的な目的は、エキソソームを使用して患者らの血液からＮＳＣＬＣ患者における疾患の進行を非侵襲的に予測するための手段を確立することであった。
【０１２８】
現在、種々の固形悪性腫瘍のための非侵襲的且つ、有益な診断マーカーを開発する、満たされていない大きな必要性が存在する。腫瘍由来のエキソソームに含まれるプロテオーム及びＲＮＡ情報は、非侵襲的診断ツールとしてのエキソソームの使用に大きな関心を寄せている。エキソソーム単離技法は現在、十分に確立されているので、そしてエキソソームは、血清、尿及び唾液を含む体液中で安定しているので、それらは疾患の進行の信頼できるバイオマーカーとして大きな可能性を示す23。エキソソームがそれらの起源の細胞の分子サインを提供できることを考えると、プロテオーム及びＲＮＡ分析はまた、発癌性突然変異を決定するための効率的手段を提供し得る。最近、エキソソームベースのタンパク質、この場合、グリピカン−１（Glypican-1）の存在が、膵臓癌患者における短い無病生存期間を予測できることが示されている24。
【０１２９】
さらに、患者由来のエキソソームは、疾患についての進行及び治療の選択肢の理解に有用であると証明することができる。これは、メラノーマ患者から単離されたエキソソームで既に実証されており、これは、高いタンパク質含有量、及びＴＹＲＰ２、ＶＬＡ４及びＨＳＰ７０の増加した発現を示し；それらのタンパク質は、不良な予後の患者において富化されていた16。さらに、多数の異なるグループが、以下を同定した：微小胞中のレトロトランスポゾンＲＮＡ転写物、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、及び癌遺伝子増幅（すなわち、ｃＭｙｃ）、並びにエキソソーム中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）25。エキソソームにおける発癌遺伝子の中で、ｃＭｅｔ（メラノーマ）16、突然変異したＫＲＡＳ、及び膵臓癌におけるｐ５３26がこれまでに報告されている。従って、腫瘍細胞によるそれらの既知の放出と結びついたそれらの特異的エキソソーム生体分子の存在を考えると、エキソソームは、シンプレックス又は多重化された診断バイオマーカー27のための臨床的に有用な富化された鋳型を証明することができ、これは28により再考されている。
【０１３０】
材料及び方法
細胞株及び細胞培養物
ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株を、American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)から購入した。全ての細胞株は、シュートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングにより確認され、そしてマイコプラズマに対して陰性であることが見出された。全ての細胞は、５％ＣＯ2の加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持された。ＳＫＭＥＳ１細胞は、１０％ＦＢＳ（Gibco, Thermo Fisher Scientific）及びペニシリン−ストレプトマイシンにより補充されたＤＭＥＭにおいて培養された。全ての他の細胞は、１０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンにより補充されたＲＰＭＩにおいて培養された。低酸素実験のために、細胞は、２％ＣＯ2及び５％ＣＯ2の加湿されたインキュベーターにおいて３７℃で培養された。
【０１３１】
エキソソーム単離
血清培地は、ＰＢＳにより細胞を２度洗浄し、そして１５ｍｌの無血清培地と交換することにより除去された。培地は、酸素正常状態（２１％のＯ2）又は低酸素（２％のＯ2）で２４時間、調整された。調整された培地を、ファルコン管中に等分し、そし浮遊細胞及び残骸は、４℃で１０分間、３００ｘｇで遠心分離することにより除去された。得られる上清液は、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、残存する大きな粒子を除去された。清澄化された、ならし培地は、Centricon Plus-70 Centrifugal Filter (Ultracel-PL Membrane, 100 kDa)装置を用いて、４℃で、３００〜５００μｌに濃縮された。次に、エキソソームは、OptiPrep（登録商標）密度勾配を用いて精製された。濃縮された培地は、不連続イオジキサノール勾配上に重層され、そして１００，０００ gavg (k-factor: 277.5)で４℃で１６時間、遠心分離された。エキソソーム含有画分は、調整可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により同定され、そしてＰＢＳ中で２０ｍｌに希釈し、そして４℃で２時間、１００，０００gavgで遠心分離された。得られるペレットは、さらなる分析のためにＰＢＳにおいて再懸濁された。
【０１３２】
電子顕微鏡法
エキソソームは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて可視化された。３μｌのエキソソーム懸濁液は、５０〜１００μｌの２％パラホルムアルデヒドにおいて固定された。次に２μｌのマイクロフィルターアリコートは、２つのFormvar−炭素被覆された電子顕微鏡グリッドのそれぞれに移され、そして次に、２０分間、覆われた。グリッドは洗浄され、そして５０μｌのシュウ酸ウラニル溶液（ｐＨ７）に、５分間、次に５０μｌのメチルセルロースＵＡ（それぞれ、４％酢酸ウラニル及び２％メチルセルロースの１００μｌ／９００μｌの比での混合物）に、氷上で１０分間、移された。グリッドは取り外され、乾燥した後、８０ｋＶでＪＥＭ  １．０１１透過型電子顕微鏡で観察された。
【０１３３】
調整可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）
エキソソーム濃度及びサイズは、４５ｍｍのストレッチでＮＰ１００ナノポアを用いてＴＲＰＳ (qNano, Izon Science Ltd)により分析された。エキソソーム濃度及びサイズは、既知の濃度で７０ｎｍのカルボキシル化ポリスチレンビーズを用いた多重圧力較正を用いて標準化された。
【０１３４】
ウェスタンブロッティング
以下の抗体は、ウェスタンブロットに使用された：ＴＳＧ１０１ (Santa Cruz, sc-6037)、ＣＤ６３ (Abcam, ab8219)、フロチリン−１ (BD Transduction Laboratories, 610821)、ＨＳＰ７０ (Transduction Laboratories, 610608)、カルネキシン(Cell Signaling Technology, 2679S)、ＶＣＰ (Abcam, ab11433)、ＧＡＮＡＢ (Abcam, ab179805)。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合された二次抗体を、Thermo Scientificから購入した。サンプルは、還元サンプル緩衝液［０．２５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４０％グリセロール、８％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール及び０．０４％ブロモフェノールブルー］、又は非還元サンプル緩衝液（２−メチルカプトエタノールを含まない）に溶解され、そして９５℃で１０分間、煮沸された。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、そしてポリ弗化ビニリデン膜に移され、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）中、５％脱脂粉乳でブロックし、そして抗体によりプローブされた。タンパク質は、Ｘ線フィルム及び増強された化学発光試薬（Amersham ECL Select）を用いて検出された。
【０１３５】
ＥＬＩＳＡ
Douset ELISAを、Ｒ＆Ｄ systemsから購入し、そして製造業者の指示に従って使用した。簡単に説明すると、捕捉抗体は、ＰＢＳにおいて作業濃度に希釈され、そして９６ウェルマイクロプレートに、室温で一晩静置された。次に、捕捉抗体は除かれ、そしてプレートを洗浄緩衝液により３度、洗浄された。次に、プレートは、試薬希釈剤により２時間ブロックされ、その後、洗浄緩衝液により３度、洗浄された。次に、標準及びサンプルは、プレートにおいて２時間インキュベートされ、その後、前と同様に洗浄された。次に、プレートは、検出抗体と共に２時間インキュベートされ、そして次に、前と同様に洗浄された。次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰは、２０分間、添加し、そして続いて、プレートを再び洗浄された。２０分間、基質溶液の添加により発色させ、その後、反応を停止溶液の添加により停止させた。各ウェルの光学密度は、４５０nmで設定されたマイクロプレートリーダー、及び５４０nmでの波長補正により決定された。
【０１３６】
ＴＮＣ  ＥＬＩＳＡキットを、RayBiotechから購入し、そして製造業者の指示に従って使用した。
【０１３７】
血漿
血漿は、氷上で解凍され、そして４℃で１０分間、１，５００ｇで遠心分離された。上清液は除かれ、そしてさらに、大きな小胞は、４℃で２０分間、１０．０００ｇで別の遠心分離工程で除去された。次に、５００μlは、ｑＥＶサイズ排除カラム（Ｉｚｏｎ）上に重層され、続いてＰＢＳにより溶出された。エキソソーム陽性画分は、プールされ、そしてAmicon（登録商標）Ultra-4 10 kDa遠心フィルターユニットにより、５０〜１００μｌの最終体積に濃縮された。
【０１３８】
質量分析
破壊されたエキソソームからのタンパク質は、タンパク質分解消化され、そしてWaters NanoAcquity UltraHighPressure 液体クロマトグラフィーと組合わされたLTQ-OrbitrapElite機器で分析された。定量的に異なるエキソソー内の識別できる個別のタンパク質の数は、多くの目的別のソフトウェアパッケージを介して処理された。
【０１３９】
統計学的分析
GraphPad Prismバージョン６．０及びMedCalcバージョン１６．８．４が、すべての計算に使用された。対応のないスチューデントｔ検定が用いられ、エキソソーム由来のタンパク質の発現値の差が計算された。受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線が用いられ、予測値の感度及び特異度が決定された。閾値は、Youdenインデックスを用いて選択された。ロックランク検定を用いての単変量分析が使用され、無病生存率が評価された（Kaplan-Meier曲線）。
【０１４０】
結果
本研究は、エキソソームがＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ３５８、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ２３及びＨ１９７５により分泌されたことを最初に実証した。図１ａは、上記プロトコールを用いて単離されたエキソソームからの標準的エキソソームタンパク質の存在、及び小胞体タンパク質カルネキシンの不在を示す。さらに、単離されたエキソソームは、純粋なエキソソーム調製物と一致する予想される形態及びサイズプロフィールを示す（図１ｂ及び２ａ）。
【０１４１】
次に、それらのＮＳＣＬＣ細胞系は、低酸素条件下で培養され、そしてエキソソーム分泌に対する効果をモニターされた。図１ｃ、１ｄ及び２ａにおいて観察され得るように、低酸素条件は、調べられた４つの細胞系のそれぞれからのエキソソームの分泌を誘発したが、しかしエキソソームのサイズ範囲及び形態は変わらなかった。
【０１４２】
次に、本研究は、低酸素がＮＳＣＬＣ細胞系により分泌されたエキソソームのタンパク質含有量又はサインを改変したか否かの決定を試みた。定量的質量分析は、Ｈ３５８及びＳＫＭＥＳ−１細胞系からのエキソソームが低酸素状態でそれぞれ８３及び１５６の上方制御されたタンパク質を有し、そのうち５５の上方制御されたタンパク質が両細胞株に共通したことを実証した（図２ｂ、表１）。次に、本研究は、この質量分析データを検証しようとした。このために、質量分析により同定された２つの上方制御されたタンパク質、すなわち中性α−グルコシダーゼＡＢ（ＧＡＮＡＢ）及び移行小胞体ＡＴＰアーゼ（ＶＣＰ）は、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡにより、４つのＮＳＣＬＣ細胞由来の低酸素エキソソームにおいて上方制御されることが示され（図２ｃ及び２ｄ）、それにより、質量分析データを支持する。
【０１４３】
次に、本研究は、低酸素により上方制御されたそれらのタンパク質がＮＳＣＬＣにおける患者の疾患進行と相関したか否かの決定を試みた。図３ａに見られるように、ＮＳＣＬＣ患者の血漿から単離されたエキソソームは、典型的なサイズ範囲及び形態を示す。次に、ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ、ガレクチン−３結合タンパク質、ＴＮＣ及びＰＭＳＡ ２の低酸素エキソソームタンパク質マーカーは、不良予後のＮＳＣＬＣ患者（すなわち、治療の最初の１２ヶ月以内に進行するか又は再発する）において有意に上方制御されたことが示された（図３ｃ）。図３ｄにおけるＲＯＣ曲線はさらに、ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質の組合わされたタンパク質サインが、不良な予後のＮＳＣＬＣ患者の同定に関して高い全体的精度を有することを実証する。これは、ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質の少なくとも２つのタンパク質の上方制御されたエキソソーム発現を有するＮＳＣＬＣ患者が、それらのエキソソームにおいて高く発現されたそれらのマーカーの１つのみを有するか、又はまったく有さないそれらの患者よりも、有意に短い無病生存期間を実証することを示す図３eにより支持される。
【０１４４】
ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質のエキソソームタンパク質マーカーに加えて、ＮＳＣＬＣ細胞系において同定された元の５５の低酸素タンパク質サインからの追加のタンパク質もまた予後的価値があるものであり得る。例えば、図４は、テナシンＣ（ＴＮＣ）タンパク質レベルがまた、治療の後に進行する可能性が高いＮＳＣＬＣ患者のエキソソームにおいて上方制御されることを実証する。さらに、図４におけるＲＯＣ曲線は、不良予後のＮＳＣＬＣ患者の同定に関して相当の精度を、それ自体で実証することを示す。
【０１４５】
図３ｄ及び３ｅに示される、ＧＡＮＡＢ、ＶＣＰ及びガレクチン−３−結合タンパク質（ＭＡＣ２ＢＰ）の患者エキソソームタンパク質に関するそのデータについての個々のタンパク質ＲＯＣ及び生存曲線を図５に提供する。このデータは、それら自体でも、それらの３種のタンパク質のそれぞれが、ＮＳＣＬＣ患者における疾患進行に関して正確な予後マーカーであることを裏付けている。
【０１４６】
結論
それらのデータは、インビトロで低酸素エキソソームにおいて同定された上記タンパク質マーカーが、ＮＳＣＬＣ癌患者における疾患進行又は再発についての潜在的な予後バイオマーカーを表すことを示している。従って、そのようなエキソソームバイオマーカーは、種々の固形悪性腫瘍についての信頼でき且つ、非侵襲的な予後マーカーを表し得る。
【０１４７】
【表１−１】
2020513549.tif 000003
【表１−２】
2020513549.tif 000004
【０１４８】
参照文献
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【０１４９】
実施例２
有意な治療上の進歩にもかかわらず、肺癌は、依然として世界的に癌関連死の主な原因のままである1。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者は、５年生存率が１５％と非常に低い2。生検は、ＮＳＣＬＣの診断及びサブタイプ分類に使用され、そしてＴＮＭ病期分類は、生存を予測し、そして臨床的介入を導くための最も重要な要素である2。しかしながら、初期段階及び局所領域限定のＮＳＣＬＣ患者のかなりの割合が、外科放射線療法又は化学放射線療法による根治的治療にもかかわらず、治療抵抗性疾患を有し、又は転移性疾患を発症し、このことは、ＴＮＭ病期分類のみでは、疾患管理の指針として不十分であることを実証している。従って、現在の治療に対して反応が悪く、そして治療介入の調整を可能にするそれらの患者を同定するための満たされていない必要性が存在する。予後のバイオマーカー、特に非侵襲性バイオマーカーは、治療の強化又は補助の治療介入を必要とする患者の臨床医によるトリアージを可能にすることができる。
【０１５０】
エキソソームと呼ばれる小さな細胞外小胞は、膵臓癌における転帰を同定するための非侵襲性方法として役立つことが示されている3。エキソソームは、分泌され、直接３０〜１５０ｎｍのサイズ範囲を有する膜に囲まれた小胞である4。多小胞体の内側への出芽に起因するエキソソームは、それらの起源の細胞に由来する種々の核酸、脂質及びタンパク質を含む4。原形質膜との融合に基づいて、エキソソームは、細胞外環境に放出され、そして環境系に入ることができる4。患者の体液からのエキソソーム単離は、現在利用できる臨床技術と比較して、より詳細にＮＳＣＬＣを特徴付けるのに役立ち得る新規マーカーの潜在的供給源として役立つのは、この理由のためである。
【０１５１】
低酸素が、腫瘍発生の初期に起こり、そして攻撃的、侵襲的及び転移的表現型を引起すことは良く知られている5,6。我々は、低酸素条件に暴露されたＮＳＣＬＣ細胞は、起源の細胞の攻撃的な表現型を示す、明確なプロテオームプロフィールを有するエキソソームを分泌するだろうと仮定した。低酸素がエキソソームタンパク質含有量の変化を引起すか否かに対処するために、確立された方法を用いて、正常酸素（２１％のＯ2）又は低酸素（２％のＯ2）条件下で培養されたヒトＮＳＣＬＣ細胞系（Ｈ３５８、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ２３及びＨ１９７５）により分泌されたエキソソームを単離した（図６Ａ＆Ｂ、及び図１０）7、8。調整可能抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により測定される場合、エキソソームは、典型的なサイズ分布を示し、そして標準的なエキソソームマーカーＨＳＰ７０、ＦＬＯＴ１及びＣＤ６３を含んだ（図６Ｂ；図１０Ａ）。興味深いことには、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及びＴＲＰＳナノ粒子分析は、ＮＳＣＬＣ細胞が低酸素に応答してエキソソーム分泌を増強したことを示した（図６Ａ＆Ｂ；図１０Ｂ）。腺癌Ｈ３５８及び扁平上皮癌ＳＫＭＥＳ１細胞由来の酸素正常状態及び低酸素由来のエキソソームのプロテオームを、質量分析法を用いて評価した。スペクトル計数による無標識定量化は、Ｈ３５８及びＳＫＭＥＳ１エキソソームの両者において、低酸素下で上方制御された３２個のタンパク質を同定した（１６個の細胞質、１０個の分泌及び６個の膜貫通）（図６Ｃ；表２＆３）。癌の進行との以前の関連性に基づいて、それらのタンパク質のうち５つ（２つの細胞質［ＶＣＰ9, ＰＳＭＡ２10］、２つの分泌［ＴＮＣ11,12, ＴＨＢＳ１13］及び１つの膜貫通タンパク質［ＭＡＣ２ＢＰ14］）に基づくエキソソームサインを選択した。全ての５つのタンパク質は、追加の低酸素ＮＳＣＬＣ細胞系由来のエキソソームにおいて高い存在量で含まれていることが確認された（図１Ｄ＆Ｅ）。
【０１５２】
次に、低酸素誘発されたエキソソーム変化が、早期ＮＳＣＬＣにおける疾患進行のための予後マーカーとして利用され得ると仮定した。エキソソームを、診断時にサンプリングされた３２人の患者の治療を受けていない未病期Ｉ−III のＮＳＣＬＣ発見コホートの血漿から単離した（図７Ａ＆Ｂ）。低酸素はＮＳＣＬＣ細胞からのエキソソーム分泌を増加するが（図１０Ｂ）、驚くべきことには、ＮＳＣＬＣ患者の血漿におけるエキソソーム濃度が、カテゴリー変数として１８ヶ月以内に臨床的再発についての予後値を有さないことを見出した（図７Ｃ）。興味深いことには、組合わされた５つのタンパク質エキソソームサイン（ＶＣＰ、ＭＡＣ２ＢＰ、ＴＮＣＰＳＭＡ２及びＴＨＢＳ１）は、再発したＮＳＣＬＣ対象由来のエキソソームにおいて特異的に増加した（図７Ｄ）。エキソソームサインからの各タンパク質は、個々に、疾患再発の卓越した予後バイオマーカーであった（図１１）。興味深いことには、我々は、Youdenの閾値を越えたそれらの５つのエキソソームタンパク質の存在量に基づいて、無病生存期間（ＤＦＳ）を明確に区別することができた（≦＝再発なし；≧３＝再発）（図７Ｆ＆Ｇ）。重要なことには、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、それらの５つのエキソソームタンパク質が、この発見コホート内で１００％の特異性及び感度で疾患の進行を予測する能力を有することを実証している（図７Ｆ）。さらに、エキソソームサインは、発見コホートにおける患者の全生存期間（ＯＳ）を分離することができ（図７Ｉ）、このことは、再発及びＯＳの両者がエキソソームサインの存在量に関連していることを示唆する。
【０１５３】
エキソソームサインの予後価値に基づいて、このエキソソームサインを支える潜在的なメカニズムを調べた。最近、エキソソームのタンパク質含有量が起源の細胞の表現型を反映することができることを実証し15、正常酸素又は低酸素状態に由来するエキソソームにおける総タンパク質存在量に対する遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を実施した。多数の遺伝子セットが、解糖、ＭＹＣ標的、Ｅ２Ｆ標的及び生体異物代謝を含む、低酸素条件下で単離されたＮＳＣＬＣ細胞由来のエキソソームにおいて、有意に富化された（図１２）。興味深いことには、低酸素エキソソームに富むトップランクの遺伝子セットは、ＥＭＴと関連していた（図３Ａ；図１２Ａ）。低酸素が癌細胞におけるＥＭＴの強力な誘導物質であると考えると16、間葉系表現型のみがエキソソームサイン分泌を引起すのに十分であり得ることを仮定した。５つのエキソソームタンパク質が正常又は形質転換された肺上皮細胞により分泌されるか否かを決定するために、同質遺伝子型ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）系からエキソソームを単離した。驚くべきことには、ｐ５３ノックダウン、Ｋｒａｓ  v１２過剰発現及びＬＫＢ１ノックダウン(３０ＫＴp53/KRAS/LKB1)17を通して発癌誘発性ＥＭＴ（図８Ｂ＆Ｃ）を受けたＨＢＥＣは、正常酸素条件下でさえ、増加したエキソソームサインタンパク質を分泌した（図８Ｄ＆Ｅ）。エキソソームサインを分泌する間葉性肺癌細胞の関連性を検証するために、次に我々は、発見コホートからの患者の腫瘍生検におけるＥ−カドヘリン発現を分析した。腫瘍生検の免疫組織化学は、２以下のエキソソームサイン標点を有する患者に比較して（図８Ｆ）、３以上の高いエキソソームサイン標点を有する患者からの腫瘍における低減されたＥ−カドヘリン発現の有意な相関（Ｒ2=０．４５８、ｐ＜０．００１）（図１３）を明らかにした。それらのデータは、発癌的に形質転換された肺細胞におけるＥＭＴが、ＮＳＣＬＣ患者においてインビボの両者で、エキソソームサインに見出される増加したタンパク質レベルの原因であるという考えを支持する。
【０１５４】
伸長された間葉系細胞への上皮細胞の表現型の脱分極は、癌細胞の攻撃的且つ転移性の表現型のみならず、また化学療法耐性も促進する17,18。従って、独立した検証のために、併用化学療法（シスプラチン／エトポシド又はカルボプラチン／パクリタキセルの何れか）とのコンフォーマルＲＴ（６０Ｇｙ／３０画分、６週間）から成る、標準治療の化学放射線療法を受ける２０人の局所的に進行したＮＳＣＬＣ対象（確認コホート）を評価した。患者は、ベースライン、１０日目、２４日目及び９０日目で、18Ｆ−ＦＤＧ及びＰＥＴ／ＣＴ及び標準ＣＴスキャンを用いて、１２ヶ月、３ヶ月間隔及びその後、６ヶ月間隔でモニターされた（図９Ａ＆Ｂ；表５）。エキソソーム濃度は、ＴＲＰＳを用いてベースラインで測定された。１８ヶ月以内に再発した対象は、循環エキソソーム存在量に有意な差異はなかった（図９Ｃ）。発見コホートと一致して、エキソソームタンパク質サインは、１８ヶ月以内に再発しなかったそれらと比較して、１８ヶ月以内に再発した対象において有意な増加及び予後値を示した（図９D：図１４）。発見コホートで確立された同じ閾値及びアルゴリズム（≦マーカー＝１８ヶ月以内での再発のリスクが低い；≧３＝１８ヶ月以内に再発するリスクが高い）を用いて、そのサインは、１８ヶ月以内に再発した患者と１８ヶ月後に再発した患者とを明確に分けた（図９Ｄ＆Ｅ）。ＲＯＣ曲線分析はさらに、疾患再発に対するエキソソームサインの特異性及び感度を確認した（図９Ｆ）。発現コホートとのさらなる一致において、エキソソームサインは、ＯＳに基づいて患者を分類し、このことは、エキソソームタンパク質サインが、早期に再発し、及び全生存率が低い対象の理想的な分類であることを示唆する。
【０１５５】
ＥＭＴと転移及び化学療法耐性との関連を考慮すると16-20、それらのデータは、この研究におけるＮＳＣＬＣ患者の両方のコホートに見られる無病生存期間についてのメカニズムを同定する。この研究は、低酸素／ＥＭＴ関連エキソソームバイオマーカーが、早期再発及び不十分な臨床成績のリスクの点で早期ＮＳＣＬＣ患者の同定に非常に有望であることを示している。低酸素は、発達中のＥＭＴプログラム16の誘導を含む、腫瘍増殖及び転移の促進において多様な機能を有し、それにより、癌細胞における転移及び化学療法耐性を促進する16-20、22。重要なことには、ＮＳＣＬＣにおける低酸素症及び／又はＥＭＴを非侵襲的に且つ確実に検出する能力は、早期ＮＳＣＬＣにおける潜在的予後スクリーニングとして役立ち、根治療法を促進し、そして全体的死亡率を低減する。我々の結果は、ＮＳＣＬＣにおける疾患進行のマーカーとしての新しく発見されたエキソソームタンパク質サインのための強力な初期証拠を提供する。さらなる研究が、エキソソームサインが化学放射線療法の設定における予測バイオマーカーであるか否か、又はエキソソームサインが一般的に、ＮＳＣＬＣの設定において予後バイオマーカーであるか否かを決定するために実証されるであろう。ＴＮＭ病期分類は、患者の管理において有意な利益を提供し、そしてＮＳＣＬＣ患者の臨床的管理において重要であり続けるであろうが、エキソソームサインは、ＴＮＭ病期分類を補足し、そして臨床成績を改善するための治療介入の特異的な調整を可能にする可能性を有する。
【０１５６】
材料及び方法
細胞培養
ヒト非細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株（腺扁平上皮癌）Ｈ３５８、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ２３及びＨ１９７５を、ＡＴＣＣから購入した。細胞株認証は、ショートタンデムリピートプロファイリングを用いて実施された。ＮＳＣＬＣは、１０％ウシ胎児血清、１００ Ｕ/ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ/ｍＬのストレプトマイシンにより補充されたＤＭＥＭ又はＲＰＭＩに維持され、そして５％ＣＯ2下で３７℃でインキュベートされた。同質遺伝子型正常ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）は、Dr. Jill Larsenからの寄贈であった19,23。ＨＢＥＣは、ＥＧＦ（５μｇ／ｌ）及びウシ下垂体抽出物（５０ｍｇ／ｌ）により補充されたケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）において、５％ＣＯ2下で３７℃で培養された。ＮＳＣＬＣ細胞株からの細胞ならし培地（ＣＣＭ）は、無血清培地中、酸素正常状態（２１％のＯ2）又は低酸素（２％のＯ2）条件下で培養された細胞から回収された。ＣＣＭは、１００，０００ｇａｖｇでの一晩の遠心分離を通してウシエキソソーム枯渇ＫＳＦＭ中、正常酸素又は低酸素条件下でコンディショニングされたＨＢＥＣ細胞から回収された。
【０１５７】
抗体及び試薬
以下の抗体が、ウェスタンブロットのために使用された：カルネキシン（Cell Signaling Technology、2679S）、ＣＤ９（Abcam、ab92726）、ＣＤ６３（Abcam、ab8219）、フロチリン−１（BD Transduction Laboratories、610821）、ＨＳＰ７０（トランスダクションラボラトリーズ、610608）、ＴＳＧ１０１（サンタクルーズ、sc-6037）、ＶＣＰ（Abcam、ab11433）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体を、Thermo Scientificから購入した。ＡＣ２ＢＰ、ＰＳＭＡ２、及びＴＨＢＳ１ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔｓは、R＆D Systemsから購入し、ＴＮＣ ＥＬＩＳＡキットはAbcamから購入した。ｑＥＶカラムを、Ｉｚｏｎから購入し、そして４℃でＰＢＳ（０．１％アジ化ナトリウム）において貯蔵した。ＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｑＰＣＲは、以前に記載されているようにして実施された24。
【０１５８】
患者
独立した確認コホートは、治験目的の化学療法ＲＴの前、その間及び後、ＥＲＢ承認の逐次的ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴの前向き試験に参加するためのインフォームドコンセントを提供した２０人の患者を含んだ。以前に報告されたように、この試験の適格性は、０〜１の米国東海岸癌臨床試験グループ（Eastern Cooperative Oncology Group）（ＥＣＯＧ）の性能状態と共に、病期分類18Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴ、ステージＩ−III のＮＳＣＬＣの組織学的又は細胞学的確認を含んだ25。除外基準は、以前の胸部放射線療法及び完全な外科的腫瘍切除を含んだ。患者は、２つの標準化されたプロトコールに従って、同時化学放射線療法を受けた。ＲＴは、６週間にわたって３０画分の６０Ｇｙから成った。２つの化学療法レジメンの１つが投与された：年配の患者又は重大な併存症を有する患者について毎週、カルボプラチン［曲線下面積、２回の静脈内］及びパクリタキセル［４５ｍｇ／ｍ2、静脈内］；又は若年の罹患者については、１、８、２９及び３６日目にシスプラチン「５０ｍｇ／ｍ2、静脈内」及び１週と５週の間にエトポシド［５０ｍｇ／ｍ2、静脈内］の何れか。18Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴスキャンは、ベースライン、１０日目、２４日目及び９０日目で取得された。継続的なモニタリングを、標準的ＣＴイメージングを用いて、１２ヶ月間、３日間間隔で、その後、６ヶ月間隔で実施した。
【０１５９】
エキソソーム単離及び分析
エキソソームは、以前に記載されているようにして、単離され、そして分析された7,17,26。インビトロ細胞培養からのエキソソーム単離のために、ＣＣＭは、４℃で１０分間、３００ｇで遠心分離され、そして０．２２μｍのフィルターを通して濾過され、浮遊細胞及び大きな細胞外小胞が除去された。次に、清澄化されたＣＣＭは、５００μｌに濃縮され、そして不連続イオジキサノール密度勾配上に重層され、そして４℃で１６時間、１００，０００ｇａｖｇで遠心分離された。エキソソーム含有画分は、ＰＢＳにより２０ｍｌに希釈され、そして４℃で２時間、１００，０００ｇａｖｇで遠心分離された。得られるペレットは、ＰＢＳに再懸濁され、そして使用まで−８０℃で貯蔵された。ヒト血漿からのエキソソームに単離のために、３ｍｌの血漿は、室温で解凍され、そしてそれぞれ、１，５００ｇ及び１０，０００ｇでの１０分及び２０分間の遠心分離により残存するペレット及び大きな小胞を除くことにより調製された。続いて、調製された血漿は、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにより２０ｍｌに希釈され、そして４℃で２時間、１００，０００ｇａｖｇで遠心分離された。得られるペレットは、５００μｌのＰＢＳに再懸濁され、そしてサイズ排除カラム上に装填され、続いてＰＢＳにより溶出された。エキソソーム含有画分が回収され、そしてＡｍｉｃｏｍ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤＡ公称分子量遠心フィルターユニットを用いて、１００μｌに濃縮された。濃縮されたエキソソームは、使用まで−８０℃で貯蔵された。細胞培養物及びヒト血漿からのエキソソーム単離は、以前に記載されているようにして、ウェスタンブロット、可変抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）及び透過型電子顕微鏡を用いて確認された7,17、26。
【０１６０】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットは、以前に記載されているようにして実施された7,24。簡単に説明すると、タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、フッ化ポリビニリデン膜に移され、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中、５％脱脂粉乳中でブロックされ、そして抗体によりプローブされた。タンパク質バンドは、増強された化学発光試薬（Amersham ECL Select）により検出された。タンパク質バンドは、ImageJにより定量化され、そして装填コントロールに対して標準化された。ゲル間の変動性を制御するために、患者のＶＣＰのレベルは、ローディングコントロールとしてフロチリン−１に標準化される前、同じゲルからの低酸素由来のＳＫＭＥＳ１エキソソーム５μｇに対して校正された。
【０１６１】
免疫組織化学
ＩＨＣ分析は、自動染色及び最適化された方法を用いて、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＧ）サンプルについて実施された。腫瘍細胞内のＥ−カドヘリンの発現を評価するために、免疫染色された腫瘍細胞は、それらの染色強度に関してスコアを付けられた；Ｏ（負）、１＋（弱い）、２＋（中程度）及び３＋（強い）。
【０１６２】
質量分析
エキソソーム調製物は、２％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（SigmaAldrich, P8340）及び５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．９）の存在下で１０ｍＭのジチオトレイトール（４℃  １時間、２２℃  ２時間）の添加により還元された。次に、サンプルは、ヨードアセトアミドの添加によりアルキル化され、そしてメタノールは、トリプシン（１：１００の酵素：基質）により−２０℃で一晩、共沈された。ペレットは、１０％アセトニトリル、４０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに再懸濁され、そして２時間後に添加される追加のトリプシン（１：１００の酵素：基質）により、３７℃で８時間、消化された。
【０１６３】
酸性化された消化物（トリフルオロ酢酸）のＬＣＭＳ分析は、Ｅｌｉｔｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＴＤ 質量分析計(Thermo Fisher Scientific)の前にNanoAcquity UPLC (Waters)を接続することにより実施された。２μｇの消化物は、２０ｍｍ ｘ １８０μｍ のＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８トラップ(Waters)上に充填され、そして一連の洗浄勾配（緩衝液Ａ：水性０．１％蟻酸；緩衝液Ｂ：アセトニトリル中、０．１％蟻酸）、５分にわたって２％Ｂから５％Ｂ、７５分にわたって３０％Ｂ、１０分間にわたって５０％Ｂ、５分間にわたって９５％Ｂを用いて、２００ ｍｍ ｘ ７５ μｍ、 ＢＥＨ１３０ １．７ μｍカラム (Waters)上に充填され、そして６分間、維持され、２％Ｂ中で再平衡化された。カラムからの溶出液は、１００μｍのＰ２００Ｐ被覆ミリカエミッター（New Objective）及びＮａｎｏｓｐｒａｙ−Ｆｌｅｘ 源(Proxeon Biosystems A/S)を通して質量分析計に導入された。電源電圧１．８ｋＶ、加熱された毛細管温度２７５℃、１２００００分解能ＡＧＣ  １Ｅ６でのオービットラップにおいて取得されたトップ１５方法ＭＳの使用、イオントラップＡＧＣ １Ｅ４におけるＭＳ２、５０ｍｓの最大注入時間。４４５．１２００２４のＭＳ１ロック質量を使用した。
【０１６４】
タンパク質同定及び無標識定量化は、ＭａｘＱｕａｎｔ(バージョン1.4.1.2)を用いて実施された27。ＭａｘＱｕａｎｔを用いて、Ｘｃａｌｉｂｕｒ 生ファイル (Thermo Fisher Scientific, Germany)からピークリストを抽出し、そして組込まれたデータベース検索エンジンＡｎｄｒｏｍｅｄａ28を用いて、ペプチド対スペクトルの一致（ＰＳＭ）を割り当てた。検索されたデータベースは、ホモサピエンスの完全なプロテオームから成った（２０１３年８月、www.uniprot.orgからダウンロードされた８８、３７８の標準配列）。逆配列及びＭａｘＱｕａｎｔ汚染物質データベースもまた検索した。無標識定量化を行い、機器タイプをＯｒｂｉｔｒａｐに設定し、前駆体の質量許容差を最初の検索のために、２０ｐｐｍに、主な検索のために４．５ｐｐｍの設定し、フラグメントイオン質量許容度を０．５Ｄａに設定し、酵素特異性をトリプシン／Pに設定し、最大２つの見逃し切断（cleavage）が許容され、カルバミドメチルシステインが、固定された修飾として特定され、そしてタンパク質N末端のアセチル化、アスパラギン／グルタミンの脱アミド化、及びメチオニンの酸化が、可変修飾として特定された。２回目のペプチド検索及び実施間の一致は、デフォルト設定により可能にされた。同定のために、ＰＳＭ及びタンパク質レベルＦＤＲを、０．０１に設定した。デフォルト設定は、すべての他のパラメーターに適用された。タンパク質の推論及びスペクトル計数による無標識定量化（標準化を含む）は、以前に記載されているようにして実施された29。
【０１６５】
遺伝子セット富化解析
遺伝子セット富化解析（ＧＳＥＡ）30、バージョン２．２．３を使用して、以前に記載されたようにして、低酸素ＳＫＭＥＳ１細胞から単離されたエキソソームにおける富化経路を同定した15。酸素正常状態又は低酸素ＳＫＭＥＳ１エキソソーム由来のエキソソーム中の全タンパク質の非ｌｏｇ２形質転換タンパク質強度値は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ (MSigDB)を用いて解析された。Hallmark遺伝子セットデータベース（バージョン5.2）、Signal2Noiseランキング測定基準、1000遺伝子セット順列、及び加重富化統計を用いて分析が行われた。結果は、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０５で有意と見なされた。
【０１６６】
統計学的分析
GraphPad Prismバージョン６．０、EdgeRバージョン２．６.１０３１、MedCalcバージョン１６．８.４、及びＳＰＳＳ統計が、すべての計算のために使用された。対応のないスチューデントｔ検定を用いて、インビトロでエキソソームからのタンパク質の発現値の差が計算された。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定が、患者由来のエキソソームに使用された。負の二項式の正確検定を用いて、質量分析由来のスペクトル計数が評価され、ここでＦＤＲを制御するために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ-Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整が適用された。受信者オペレーター特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、予後値の感度及び特異性が決定された。閾値は、Ｙｏｕｄｅｎインデックスを用いて選択された。ログラング検定（log-rank test）を用いての単変量分析を用いて、無病生存率が評価された（Kaplan-Meier曲線）。０．０５未満のｐ値での差は有意であると見なされ（*ｐ＜０．０５、 **ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）、但し、それぞれ、スペクトル数及びＧＳＥＡデータについての０．００１及び０．０５のＦＤＲ閾値を除く。
【０１６７】
本明細書を通して、その目的は、本発明をいずれか１つの実施形態又は特定の特徴の集まりに制限することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することであった。従って、本開示に照らして、例示された特定の実施形態において本発明の範囲から逸脱することなく様々な修正及び改変を行うことができることを当業者は理解するであろう。
【０１６８】
本明細書で言及されるすべてのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
【表２】
2020513549.tif 000005
【０１７０】
【表３】
2020513549.tif 000006
【０１７１】
【表４】
2020513549.tif 000007
【０１７２】
【表５】
2020513549.tif 000008
【０１７３】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
2020513549.tif 000019
【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月18日(2018.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の攻撃性の決定方法であって、前記対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、プロテアソームサブユニットα２型、中性α−グルコシダーゼＡＢ及びそれら何れかの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、前記癌の攻撃性のレベルを示すか、又はそれと相関する、方法。
【請求項２】
対象における癌の予後の決定方法であって、前記対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、プロテアソームサブユニットα２型、中性α−グルコシダーゼＡＢ及びそれら何れかの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの発現レベルが、前記癌についてのより好ましくないか又はより好ましい予後を示すか又はそれと相関する、方法。
【請求項３】
１又は複数のマーカーの比較的低減された発現レベルが、より好ましい予後及び／又は低い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関し；及び／又は１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルが、あまり好ましくない予後及び／又は高い攻撃性の癌を示すか、又はそれと相関する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）高い攻撃性の癌又は低い攻撃性の癌；及び／又は（ii）それほど好ましくない予後又はより好ましい予後を有するとして前記対象を診断するさらなる工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌の予後又は攻撃性が、前記対象における癌の転移の可能性を決定するために、少なくとも部分的に使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１又は複数のマーカーの比較的低減された発現レベルが、前記癌の転移の低減された可能性を示すか又はそれと相関し；及び／又は前記１又は複数のマーカーの比較的増加した発現レベルが、前記癌の転移の増加した可能性を示すか、又はそれと相関する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象における抗癌治療に対する癌の応答性の予測方法であって、対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、プロテアソームサブユニットα２型、中性α−グルコシダーゼＡＢ及びそれら何れかの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質のうち１つ以上を含み、及び前記１又は複数のマーカーの改変された又は調節された発現レベルが、抗癌治療に対する癌の比較的増加した又は低減された応答性を示すか又はそれと相関する、方法。
【請求項８】
対象における癌を治療するさらなる工程を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象における癌の治療方法であって、前記対象のエキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、ここで前記マーカーは、ガレクチン−３−結合タンパク質、プロテアソームサブユニットα２型、中性α−グルコシダーゼＡＢ及びそれら何れかの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質のうち１つ以上を含み、及び行われた決定に基づいて、抗癌治療を開始するか、継続するか、修正するか、又は中止することを含む方法。
【請求項１０】
前記抗癌治療が、１又は複数のマーカーの発現及び／又は活性を低減する、治療的有効量の抗癌剤の前記対象への投与を含む、請求項７〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗癌治療が、前記癌の転移を予防するか、又は阻害する、治療的有効量の抗癌剤の前記対象への投与を含む、請求項７〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗癌剤が、抗体又は小分子である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象からエキソソームサンプルを得る工程をさらに含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エキソソームサンプル中の１又は複数のマーカーの発現レベルと、それぞれ１又は複数のマーカーの参照エキソソーム発現レベルとを比較する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が肺癌であるか、又はそれを含む、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺癌が、非小細胞癌であるか、又はそれを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象における癌の治療への使用のための薬剤の同定又は製造方法であって、
（ａ）ガレクチン−３−結合タンパク質、プロテアソームサブユニットα２型、中性α−グルコシダーゼＡＢ及びそれら何れかの組み合わせから成る群から選択されるマーカーを発現する細胞と、候補薬剤とを接触すること；及び
（ｂ）前記候補薬剤が前記マーカーの発現及び／又は活性を調節するか否かを決定する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記候補薬剤が、前記マーカーの発現及び／又は活性を、少なくとも部分的に、低減するか、排除するか、抑制するか又は阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１０〜１６の何れか１項に記載の方法に従って使用するための、請求項１７又は１８に記載の方法により製造された薬剤。
【請求項２０】
請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法であって、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、リシルオキシダーゼホモログ２、テネイシンＣ、脂肪酸シンターゼ、アグリン、アスパルチルアミノペプチダーゼ、プロテアソームサブユニットα１型、プロテアソームサブユニットα３型、プロテアソームサブユニットα４型、プロテアソームサブユニットα５型、プロテアソームサブユニットα６型、プロテアソームサブユニットβ１型、プロテアソームサブユニットβ２型、プロテアソームサブユニットβ３型、プロテアソームサブユニットβ４型、プロテアソームサブユニットβ５型、プロテアソームサブユニットβ６型、プロテアソームサブユニットβ７型、プロテアソームサブユニットβ８型、トロンボスポンジン−１、潜在的トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質３、及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、１又は複数の追加のマーカーの発現レベルを決定する工程をさらに含む、方法。
【請求項２１】
前記１又は複数の追加のマーカーが、移行性小胞体ＡＴＰアーゼ、テネイシンＣ、トロンボスポンジン−１及びそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１又は複数のマーカーが、ガレクチン−３−結合タンパク質を含み、及び前記１又は複数の追加のマーカーが、トロンボスポンジン−１を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１又は複数のマーカーが、ガレクチン−３−結合タンパク質及びプロテアソームサブユニットα２型、並びに前記１又は複数の追加のマーカーが、テネイシンＣ及びトロンボスポンジン−１を含む、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2020513549.tif 000039
2020513549.tif 000040
2020513549.tif 000041
2020513549.tif 000042
2020513549.tif 000043