(57)【要約】本発明は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．から単離可能な単離タンパク質を提供するものである。また、そのタンパク質のうちの１種以上を具備する組成物、ならびにタンパク質の製造方法及び使用方法も、本発明によって提供されている。特定の実施形態では、例えば、本組成物は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露に対して、例えば、ニワトリなどの動物を防御するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸２５〜９６８に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号４のアミノ酸２７〜７９０に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号６のアミノ酸２３〜７２７に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号８のアミノ酸２５〜９６４に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１０のアミノ酸２６〜８４８に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１２のアミノ酸２７〜７８４に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１４のアミノ酸２５〜７４２に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号４４のアミノ酸２６〜８０５に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを具備する組成物であって、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸２５〜９６８に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号４のアミノ酸２７〜７９０に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号６のアミノ酸２３〜７２７に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号８のアミノ酸２５〜９６４に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１０のアミノ酸２６〜８４８に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１２のアミノ酸２７〜７８４に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、及び配列番号１４のアミノ酸２５〜７４２に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
分子量が９９ｋＤａ、８１ｋＤａ、及び８０ｋＤａである単離されたタンパク質であって、前記タンパク質が、鉄キレート剤含有の培地中でインキュベートした場合にはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能である一方、前記鉄キレート剤不含の培地中で成長させた場合には単離不可能である前記タンパク質、
分子量が１０９ｋＤａ、８９ｋＤａ、及び８７ｋＤａである単離されたタンパク質であって、前記タンパク質が、鉄キレート剤含有の培地中でインキュベートされた場合にＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能であり、且つ前記タンパク質が、前記鉄キレート剤不含の培地中でインキュベートされた場合に前記Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによって発現し、鉄キレート剤含有の培地中での成長中には発現レベルが増強する前記タンパク質、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
【請求項４】
配列番号４４のアミノ酸２６〜８０５に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質を具備する組成物であって、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
【請求項５】
分子量が２４９ｋＤａ、６０ｋＤａ、４２ｋＤａ、３８ｋＤａ、２７ｋＤａ、２６ｋＤａもしくは２２ｋＤａで少なくとも１つの単離されたタンパク質であって、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能である前記タンパク質を更に含む、請求項１、３、または４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載の組成物のタンパク質または請求項４に記載の組成物のタンパク質のうちの少なくとも１種を含む単離された全細胞を具備する組成物であって、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
【請求項７】
前記全細胞が、前記タンパク質のうちの１種以上を発現するように操作された細胞である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
医薬的に許容される担体を更に含む、請求項１、３または４に記載の組成物。
【請求項１０】
アジュバントを更に含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ニワトリが第１のニワトリであり、前記組成物によって前記第１のニワトリがＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ血清型２×５を用いた抗原曝露から保護され、前記組成物によって第２のニワトリがＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ血清型３×４を用いた抗原曝露から保護される、請求項１、３、または４に記載の組成物。
【請求項１２】
対象前記組成物の少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するように前記対象を誘導するのに有効な量の請求項１、３または４に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１３】
対象における感染症を治療するための方法であって、前記方法が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の請求項１、３もしくは４に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
対象における症状を治療するための方法であって、前記方法が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の１、３もしくは４に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
対象におけるコロニー形成を低減させるための方法であって、前記方法が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによるコロニー形成を被った対象に対し有効量の１、３または４に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
対象における感染症を治療するための方法であって、前記方法が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、１、３もしくは４に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項１７】
対象における症状を治療するための方法であって、前記方法が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、１、３もしくは４に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項１８】
対象におけるコロニー形成を低減させるための方法であって、前記方法が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによるコロニー形成を被った対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が１、３または４に記載の組成物のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記対象が哺乳動物である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物がウシである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が鳥類である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記鳥類がニワトリまたはシチメンチョウである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも７００マイクログラム（μｇ）乃至１２００μｇ以下のタンパク質が投与される、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質に特異的に結合する抗体を検出するためのキットであって、
請求項１、３または４に記載の組成物の単離されたタンパク質と、
前記タンパク質に特異的に結合する抗体を検出する試薬とが、別々の容器に収容されている、前記キット。
【請求項２５】
タンパク質を検出するためのキットであって、
請求項１、３または４に記載の組成物の単離されたタンパク質に特異的に結合する抗体と、タンパク質に特異的に結合する第２の試薬と、
別々の容器に具備する、前記キット。
【請求項２６】
請求項１、３または４に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する単離された抗体を具備する組成物。
【請求項２７】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項２６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／４５７，５９９号の利益を主張するものであり、本文献は本明細書において参照により援用されている。
【背景技術】
【０００２】
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、様々な動物においてだけでなくヒトにおいても疾患を発症させる恐れのあるグラム陰性、通性嫌気性及び多形桿菌である。家畜及び野生動物におけるＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａの種は、上気道の粘膜、口腔の粘膜、及び下部生殖管に対する特定のニッチを進化させてきた。家畜における疾患は、臨床症状に基づくほか、疾患に付随する特定のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種にも基づく。今日、家畜（とりわけ、家禽、畜牛、豚、及びラビット）に関する臨床疾患に関し、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科の中で最も広く認識されている２つの種が、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａである。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科は昨今では、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＬｏｎｅｐｉｎｅｌｌａの５つの属を含み、大規模な再分類の対象とされてきた（Ａｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：６７−８６（１９９９）。最近になってから、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａは、リボソームシークエンシング及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づいて分類学的にＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａに分類されてきた（Ｏｙｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：６−８６（１９９９）。
【０００３】
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａは、鳥コレラ菌（俗称：家禽コレラ）の病原因子とされており、広範囲に分布し、且つニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒルにおいて発生率が高く、経済的に重大な意味を持つ家禽の疾患である（Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｗｌ  Ｃｈｏｌｅｒａ．Ｉｎ：Ａｄｌａｍ，Ｃ．Ｆ．及びＲｕｔｔｅｒ，Ｊ．Ｍ．（Ｅｄｓ．），Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９５−１１３．１９８９）。また、この生物は野鳥、商業的に飼育された猟鳥及びシスタチンにおける臨床疾患の誘発にも関与している（Ｒｈｏａｄｅｓ及びＲｉｍｌｅｒ，１９８９，Ｆｏｗｌ  ｃｈｏｌｅｒａ．Ｉｎ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ，ｐｐ．９５−１１３．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｆ．Ａｄｌａｍ  ＆  Ｊ．Ｍ．Ｒｕｔｔｅｒ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。トリは全種にわたって感受性の度合いが多様である。重種は軽種よりも感受性が高く、成鳥や成長後期のトリは、若鳥よりも感受性が高いと思われる（Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂａｌｌｉｅｒｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｐｐ４２−５０．１９９０．）。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの鳥類株の中で認識されている莢膜血清群には、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＦの４通りがある（Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３１：８９５−８９８（１９８７）。家禽においてＰａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓの主な病原体として認識されているのが、Ａ型莢膜に属する菌株である（Ｒｈｏａｄｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｍｌｅｒ，１９８７，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ  ３１，８９５−８９８；Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｗｌ  Ｃｈｏｌｅｒａ．Ｉｎ：Ａｄｌａｍ，Ｃ．Ｆ．ａｎｄ  Ｒｕｔｔｅｒ，Ｊ．Ｍ．（Ｅｄｓ．），Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９５−１１３．１９８９；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２５５−２５９  １９９３））。多座酵素電気泳動及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって実証済みであるように、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの鳥類株は遺伝的に多種多様であることが、明らかにされてきた。これらの所見に基づき、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａは現在、ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、ｓｐｔｉｃａ及びｇａｌｌｉｃｉｄａの３通りの亜種に細分されている。
【０００４】
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａの病因は、十分には判明していないが、宿主及び病原体の両方の特異的因子に依存している。今日に至るまで、株間の疾患と関連する病原性因子は１つも存在していない。今日までに研究されてきた毒性因子としては、カプセル、内毒素、外膜タンパク質、血清耐性、鉄獲得系、熱ショックタンパク質、ノイラミニダーゼ産生、接着因子、抗体開裂酵素、及び細胞変性毒素の存在する可能性が挙げられる。
【０００５】
疾患の臨床症状は、甚急性／急性から慢性感染までの範囲に及ぶことがあり、初期には上気道のコロニー形成によって起こる場合もあれば、続いて浸潤及び敗血症によって起こる場合もある。急性感染症を患っている間じゅう、臨床的徴候は死亡までに殆ど観察されず、敗血症性病変が猛威を奮うのが一般的である。慢性型Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ感染症の場合、化膿性病変は、気道の粘膜、咽頭、鼻腔、結膜及び頭部の隣接組織を含め、広範囲に分布する可能性がある。
【０００６】
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａの偏在性、ひいては経済的損失が莫大な額に及ぶ可能性があるという理由から、採卵鶏及び繁殖用ブロイラーの養鶏事業における家禽コレラの勃発を防ぐため、米国全土だけでなく海外においても市販ワクチンが開発されてきた。現在出回っている市販の不活化家禽コレラワクチンは、防御が為されるように、体細胞の血清型に依存している。殆どの不活化ワクチンは、最小限でも、血清型１（別称：Ａ対１）、血清型３（別称：Ａ対３）、及び血清型４（別称：Ａ対４）のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株を含む。１種の血清型を用いて作製された家禽コレラワクチンの場合、他の血清型を交差防御の対象としない。例えば、血清型１株を用いて作製されたワクチンの場合、血清型３または４を防御の対象としない。
【０００７】
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａが脊椎動物宿主の自然防御機構を回避する能力は、宿主の鉄を獲得する能力に幾分かは依存するものであり、ひいては、宿主−病原体相互作用に直接的に影響を及ぼす。鉄の本質的性質ゆえに、脊椎動物の宿主は、体液中の鉄を結合するための精巧な機序（例えば、血液中のトランスフェリン及びリンパ液中のトランスフェリン、ならびに外部分泌物中のラクトフェリン）を発達させてきた。これらの高親和性鉄結合タンパク質によって、宿主内に鉄制限環境が創出され、鉄のレベルが、およそ１０〜１８モルまで（すなわち、ほぼ全ての細菌の成長を支持するには低すぎる濃度まで）低減することになる。これらの宿主の鉄封鎖機序は、細菌の侵入を食い止めるための自然界の防御機序として作用する。細菌種の多くは、これらの鉄制限条件を回避する目的から、鉄を獲得するための機序を進化させてきた。最も一般的な機序としては、ポーリンを介した可溶性鉄の拡散、及びシデロフォアを介して鉄の取り込みを媒介する特殊な輸送系が挙げられる。この後者の系は、鉄獲得のための最も普遍的且つ徹底的に研究された機序の１つであり、シデロフォアを介した三価鉄の特異的キレート化及びそれらの同族輸送系の合成を含む。これにより、引き続き、細菌が宿主の非特異的防御機序を複製し克服することを可能にしている。継続的な複製、ひいては感染プロセスにおける各ステップは、最終的に、生物がその宿主から鉄を獲得する能力に依存する。
【０００８】
鉄、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、及び亜鉛のような二価金属イオンは、動物及びヒトの両方の宿主に感染する細菌が生存するうえでしばしば必須とされる微量元素である。これらの微量金属元素は、生物に必要とされる様々な代謝経路に対する生化学反応を触媒する酵素のための補因子として、細菌により使用される。細菌の病因に対し鉄が及ぼす影響は、大々的に研究されてきた。鉄は、ほぼ全ての生命にとって不可欠であり、しかも、あらゆる系統発生レベルにおいて生物の酵素経路及び代謝経路に必要とされる。細菌性敗血症中に、血清中の鉄、銅、及び亜鉛のような数種の金属イオンの濃度に変動が生ずることは、十分に文書化されてきた。例えば、感染症の発症に伴い、亜鉛の血清レベルが１０パーセント乃至６０パーセントまで低下する。感染の発症に続いて間もなく、亜鉛は血漿から肝臓へと再分配され、肝臓内でメタロチオネインに結合する。感染症の間は血清鉄が最大５０パーセントまで減少することが記載されてきた一方で、炎症性刺激に反応して血清銅が増加することも明らかにされてきた。これらの微量の血清中金属イオンが変動すると、細菌感染性の重篤度及び進行に対し直接的な影響が及ぶ可能性がある。
【０００９】
細菌類は、鉄の利用可能性に依拠する基本的機能を非常に多く備えていることから、多様な生理学的条件下にて鉄を獲得するための、複雑な規制ネットワークを進化させてきた。嫌気性条件下では、鉄は可溶性の二価鉄の形態（Ｆｅ  ＩＩ）で存在し、外膜のポーリンを通過してペリプラズム内へと自由に拡散できる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、細胞質膜内に存在するＦｅｏＡＢ輸送系によって、二価鉄分子が細胞の細胞質内へと輸送される。好気的条件下及び中性ｐＨ下では、鉄は、主に不溶性三価鉄の形態（Ｆｅ  ＩＩＩ）で存在するため、受動拡散では外膜ポーリンを通過できない。代わりに、三価鉄に対して高い親和性を有する、シデロフォアと呼ばれる分子が、細菌によって分泌される。三価鉄−シデロフォア複合体は、ＴｏｎＢ依存性受容体と総称される外膜内の受容体によって認識される。これらの受容体は、いったんロードされたシデロフォアに結合すると、周辺質内及び細胞質膜内に局在する、ＴｏｎＢ及びその関連タンパク質と相互作用するものと考えられている。これらのタンパク質間相互作用は、十分には解明されていないが、外膜を貫通してペリプラズム空間を通して三価鉄−シデロフォア複合体を輸送するのに必要なエネルギーを供給する機能を果たす。細胞質膜内に存在するＡＢＣ輸送系は、細胞質膜を貫通して鉄−シデロフォア複合体を輸送する機能を果たす。三価鉄がレダクターゼ酵素を介して二価鉄形態に還元されると、この二価鉄が、シデロフォアから解離されて細胞内に放出される。
【００１０】
いくつかの種の病原性細菌は、哺乳動物宿主から鉄を獲得する目的で、トランスフェリン、ヘム及び他のヘム含有化合物を直接的に結合するなどの、追加的な機序を用いる。これらの鉄含有分子を結合する受容体タンパク質は、鉄−シデロフォア複合体と同様、外膜を貫通してヘムを輸送するのに必要とされるエネルギーを得るには、ＴｏｎＢ複合体に依存するのが最も確実と思われる。この場合、特異的なＡＢＣトランスポーターを用いることにより、ヘムが細胞質膜を貫通して輸送される。加えて、いくつかの細菌によって、低分子のヘモフォアが分泌される。このヘモフォアは、ヘムを結合して細菌細胞表面上の受容体に対し提示し得る。また、いくつかの病原性種は、赤血球を溶かす毒素である溶血素を産生し、ヘム及びヘモグロビンを、細菌によって取り込まれるように放出する。
【００１１】
動物及び人間において疾患を発症させる全ての病原性細菌をはじめとする細菌類が生存するうえで不可欠な多くの必須栄養素の選択的透過性は、グラム陰性菌の外膜タンパク質によって制御される。こうした栄養素の選択的透過性は、ポーリンと呼ばれる或るクラスの膜タンパク質によって制御される。昨今では、グラム陰性菌の表面上の外膜タンパク質の大部分が、ポーリン類であると考えられるようになり、これらのポーリン類は、一般ポーリン（例、ＯｍｐＦ）、単量体ポーリン（例、ＯｍｐＡ）、特異的ポーリン（例、マルトース特異的ポーリンＬａｍＢ）、及びＴｏｎＢ依存性ゲート型ポーリン（例、シデロフォア受容体ＦｅｐＡ）として同定されている。ポーリンクラスのタンパク質は、概して、外膜へと延在するβバレルを含む、構造的特徴を共有している。
【００１２】
微生物が生存するための必須栄養素としての鉄の役目を超越し、細菌の生存、恒常性及び病因において危急的役割を果たす明確に定義された遷移金属は、鉄、マンガン、銅、亜鉛、マグネシウム、コバルト、ニッケルなど、他にも数多く存在する（Ｗａｌｄｒｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ２００９；Ｐｏｒｃｈｅｒｏｎ；２０１３）。哺乳類において最も豊富に存在する２価金属イオンを、濃度の降順に挙げれば、鉄、亜鉛、銅の３つである。これらの遷移金属を、高精度に調節された取り込み系または獲得系を介して細菌が利用できれば、病原性細菌類の毒性に多大に寄与する。周知のように、同じ属／種内の細菌が有する遷移金属獲得用の取り込み系がそれぞれ異なり、その原因は、菌株毎に病原性が相違することに起因している。細菌類が、発現した取り込み系に応じて異なる遷移金属を使用する能力がこのように相違することを鑑みれば、或る生物の侵入可能な臓器または組織が具体的に指示され得る。
【００１３】
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａによる鉄獲得については殆ど未解明であり、その研究はＥ．ｃｏｌｉ鉄輸送系が研究されてきた程度には大方匹敵しない。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａの鉄調節タンパク質は、これまで調査されてきたように、複数の動物種における種々のワクチン戦略に対する標的抗原として将来性ある免疫原であるとされている。これまでに明らかにされてきたように、これらのタンパク質は相同的な抗原曝露に対しては防御効果を発揮する。ところが、これらのタンパク質が非相同な防御を発揮するための組み合わせについては、研究未踏となっていた。
Ｇｌｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３７：１０７４−１０７９，１９９３）は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株Ｘ−７３（血清型１）及びＰ−１０５９（血清型３）から鉄制限培養条件下でバクテリンを調製することにより、血清型をまたがって交差防御が誘導されるようにすることを試み、低鉄培地中で産生されたバクテリンが、非相同的な抗原曝露に対し一貫して有意な防御を誘発しなかったことを、見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ａｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：６７−８６（１９９９）
【非特許文献２】Ｏｙｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：６−８６（１９９９）
【非特許文献３】Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｗｌ  Ｃｈｏｌｅｒａ．Ｉｎ：Ａｄｌａｍ，Ｃ．Ｆ．及びＲｕｔｔｅｒ，Ｊ．Ｍ．（Ｅｄｓ．），Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９５−１１３．１９８９
【非特許文献４】Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂａｌｌｉｅｒｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｐｐ４２−５０．１９９０
【非特許文献５】Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３１：８９５−８９８（１９８７）
【非特許文献６】Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２５５−２５９  １９９３
【非特許文献７】Ｗａｌｄｒｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ２００９；Ｐｏｒｃｈｅｒｏｎ；２０１３
【非特許文献８】Ｇｌｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３７：１０７４−１０７９，１９９３）
【発明の概要】
【００１５】
我々の観察によると、２つの非相同株（血清型３×４中の１つ、及び血清型１中の１つ）を鉄制限培地中で成長させ、一方の株をワクチン株とし他方の株を抗原曝露株としたワクチン及び抗原曝露モデルを企図したときに、ワクチンと抗原曝露とが異なる血清型であった場合、結果はＧｌｉｓｏｎと同様（実施例６〜９を参照）であった。すなわち、或る程度の保護が観察された。一方、我々が病原性Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの野外株どうしを比較した際、とりわけ、これらの株内に存在する金属調節タンパク質のパターンを比較した際に見出されたのが、これらの病原性株の中でも優勢な金属調節タンパク質における２つの主要パターンであった。一方のパターンには２つまたは３つの主要な金属調節タンパク質が含まれ、他方のパターンには４つの別個の金属調節タンパク質が含まれる。これら２つのパターン型の金属調節タンパク質を、２つのＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株（血清型２、５中の１つ、及び血清型３，４中の１つ）から採取し、それらを併用して動物にワクチン接種したときに、我々が観察したのは、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａの血清型をまたいで非相同な防御が為されたこと、例えば、ワクチンの製造に用いられた２つの株には見られない別の血清型のＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに対して防御が為されたことであった。この結果は、予想外で、しかも驚愕的なものであった。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ感染症に対する防御を施すワクチンにおいてこの種の非相同防御が観察されていたレポートを我々は一つも知らなかった。
【００１６】
組成物類が、本明細書中に提供されている。一実施形態において、組成物は、配列番号２のアミノ酸２５〜９６８に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号４のアミノ酸２７〜７９０に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号６のアミノ酸２３〜７２７に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号８のアミノ酸２５〜９６４に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１０のアミノ酸２６〜８４８に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１２のアミノ酸２７〜７８４に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号１４のアミノ酸２５〜７４２に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号４４のアミノ酸２６〜８０５に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む。本組成物は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露に対して、例えば、ニワトリなどの動物を防御するものである。
【００１７】
別の実施形態において、或る組成物は、分子量が９９ｋＤａ、８１ｋＤａ、及び８０ｋＤａであり、鉄キレート剤含有の培地中でインキュベートした場合にはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能である一方、鉄キレート剤不含の培地中で成長させた場合には単離不可能である単離されたタンパク質、分子量が１０９ｋＤａ、８９ｋＤａ、及び８７ｋＤａであり、鉄キレート剤含有の培地中でインキュベートされた場合にＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能であり、且つ鉄キレート剤不含の培地中でインキュベートされた場合に前記Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによって発現し、鉄キレート剤含有の培地中での成長中には発現レベルが増強する単離されたタンパク質を含む。本組成物は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露に対して、例えば、ニワトリなどの動物を防御するものである。
【００１８】
一実施形態において、組成物は、配列番号４４のアミノ酸２６〜８０５に対して少なくとも８０％の類似性を有する単離されたタンパク質を含み、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露からニワトリを保護する組成物である。
【００１９】
本明細書中に記載されている組成物には、任意に、分子量が２４９ｋＤａ、６０ｋＤａ、４２ｋＤａ、３８ｋＤａ、２７ｋＤａ、２６ｋＤａもしくは２２ｋＤａで少なくとも１つの単離されたタンパク質であってＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能であるタンパク質を、更に含めてもよい。
【００２０】
一実施形態において、或る組成物は、本明細書中に記載されている組成物のタンパク質のうちの少なくとも１種を含む単離された全細胞を含む。本組成物は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いた抗原曝露に対して、例えば、ニワトリなどの動物を防御するものである。一実施形態において、全細胞は、タンパク質のうちの１種以上を発現するように操作された細胞である。一実施形態において、本細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００２１】
本明細書中に記載されている組成物のタンパク質に特異的に結合する単離された抗体を具備する組成物も、更に提供されている。一実施形態において、本抗体はポリクローナル抗体である。
【００２２】
本明細書中に記載されている組成物に、医薬的に許容される担体、アジュバント、またはそれらの組み合わせを、更に含めてもよい。
【００２３】
また、方法も提供されている。一実施形態において、或る方法は、本明細書中に記載されている組成物を対象に投与することを含み、この投与量は、本組成物の少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するように対象を誘導するのに有効な量とされる。一実施形態において、或る方法は、対象における感染症に対する治療を目的としたものであり、本方法は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一実施形態において、或る方法は、対象における症状を治療することを目的としたものであり、本方法は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の本明細書中に記載されている組成物を投与することを含む。一実施形態において、或る方法は、対象におけるコロニー形成を低減させることを目的としたものであり、本方法は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによるコロニー形成を被った対象に対し有効量の本明細書中に記載されている組成物を投与することを含む。一実施形態において、或る方法は、対象における感染症に対する治療を目的としたものであり、本方法は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、本組成物は、本明細書中に記載されている組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。一実施形態において、或る方法は、対象における症状に対する治療を目的としたものであり、本方法は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、本組成物は、本明細書中に記載されている組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。一実施形態において、或る方法は、対象におけるコロニー形成を低減させることを目的としたものであり、本方法は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによるコロニー形成を被った対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、本組成物は、本明細書中に記載されている組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。
【００２４】
一実施形態において、本対象は、ウシなどの哺乳動物、またはチキンもしくはシチメンチョウなどの鳥類であり得る。一実施形態では、少なくとも７００マイクログラム（μｇ）乃至１２００μｇ以下のタンパク質が投与される。
【００２５】
また、キットも提供されている。一実施形態において、或るキットは、タンパク質に特異的に結合する抗体を検出することを目的としたものであり、本キットには、（ｉ）請求項１または２に記載の組成物の単離されたタンパク質と、（ｉｉ）そのタンパク質と特異的に結合する抗体を検出する試薬とが、別々の容器に収容されている。一実施形態において、或るキットは、タンパク質を検出することを目的としたものであり、（ｉ）本明細書中に記載されている組成物の単離されたタンパク質に特異的に結合する抗体と、そのタンパク質に特異的に結合する第２の試薬と、を具備する。
【００２６】
「及び／または」という用語は、列挙された要素のうちの１つもしくは全て、または列挙された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００２７】
「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、或る特定の状況下で或る特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下では、他の実施形態もまた、好ましいものとなり得る。更になお、１つ以上の好ましい実施形態が列挙されているからといって、他の実施形態が有用ではないことを含意するものではないし、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図するものでもない。
【００２８】
「含む」という用語及びその変形は、これらの用語が明細書中及び特許請求の範囲中に出現する場合には限定的な意味を有さない。
【００２９】
本明細書において実施形態が「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「をはじめとする（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの用語を伴って記載されている場合は常に、「からなる」及び／または「から本質的になる」に関して記載された別段の類似の実施形態もまた提供されていることが理解される。
【００３０】
別途指定しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」は同義に用いられ、１つ以上を意味する。
【００３１】
また、本明細書において、端点による数値範囲が列挙されている場合は、その範囲内に包含される全ての数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。
【００３２】
本明細書中に開示されている、個別のステップを含む如何なる方法についても、当該のステップを任意の実行可能な順序で実行できる。また、必要に応じて、２つ以上のステップを任意に組み合わせて同時に実行してもよい。
【００３３】
本発明の上記概要は、開示されている各実施形態、または本発明の全ての実施態様を説明することを意図したものではない。例証的な実施形態については、下記説明に更に具体的に例示する。本出願全体を通したいくつかの箇所で、実施例のリストを介したガイダンスが用意されており、それらの実施例を様々な組み合わせで使用できる。各実例において、列挙されているリストは、あくまで代表的な群としての役割を果たすものに過ぎず、排他的なリストとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】鉄制限条件下、及び鉄充足条件下で成長する、細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１及び１０は広範囲の分子量マーカーであり、レーン２は鉄制限下のワクチン候補ＭＳ０６１１３０であり、レーン３は鉄充足条件下でのワクチン候補株である。レーン４は鉄限定条件下での血清型１基準株Ｘ−７３である。レーン５は鉄充足条件下でのＸ−７３である。レーン６は鉄限定条件下での血清型３基準株Ｐ１０５９である。レーン７は鉄充足条件下でのＰ１０５９である。レーン８は鉄制限条件下での参照株Ｐ−１６６２であり、レーン９は鉄分充足条件下でのＰ−１６６２である。矩形中に描かれている鉄調節タンパク質どうしの分子量がほぼ同じであることに注目されたい。
【図２】非相同Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ血清型１を用いた抗原曝露に対抗する単一株から産生された３つのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａワクチン系列の効力を示す。同じ抗原からなる３つのワクチン系列を、Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ  ＭＳ０６１１３０から調製した。注：２つの別々の発酵プロセスを表す２つの抗原調製物を用いて、抗原Ａ及び抗原Ｂと命名された２つの抗原ロットを調製した。抗原Ａと抗原Ｂの混合物を用いて第１のワクチン系列を調製し、抗原Ａのみを用いて第２のワクチン系列を調製し、抗原Ｂのみを用いて第３のワクチン系列を調製した。
【図３】血清型Ａ：１及び血清型Ａ：３の基準抗原曝露株内にあることが公知であるタンパク質を、ワクチン株と比較した表である。基準株ゲノムのうちの少なくとも１つに存在し但しワクチン株内には存在しないタンパク質が８つ存在することに注目されたい。
【図４】ワクチン株（ＭＳ０６１１３０）が欠落している外膜タンパク質を例証するベン図である。番号は、図３のタンパク質識別番号と相関する。
【図５】Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの３０以上の臨床野外分離株、及び基準株の金属調節タンパク質バンディングパターンの樹状図である。大括弧［］内の４つのバンドパターン、及び中括弧｛｝内の３つのバンドパターンとして描かれている、２つの主要バンドパターンに注目されたい。他の殆どの株は、これら２つのパターンのバリエーションであるように見える。
【図６】図５のパターン型を表す１３通りの分離株において発現した３８個の鉄調節タンパク質の比較である。（＋）はタンパク質が発現したことを示し、（−）はタンパク質が検出可能なレベルでは発現しなかったことを示す。大多数のタンパク質を網羅する２つの潜在的ワクチン標的は、楕円で同定されている。
【図７】非相同防御を示すニワトリにおいてＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ血清型１を用いて抗原曝露された２つのマスターシード株からなるワクチンを用いたワクチンの有効性を示す。
【図８−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図８−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図９−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図９−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１０−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１０−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１１−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１１−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１２−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１２−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１３−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１３−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１４−１】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１４−２】配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列、ならびに各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３）の例である。
【図１５−１】配列番号２の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０５３５２１０９０．１（配列番号１５）、１１２１＿ＨｇｂＡ＿９６８ａａ（配列番号２）、ＷＰ＿００５７５６１４１．１（配列番号１６）、ＡＡＱ１４８７３．１（配列番号１７）、ＷＰ＿０６１４０５９２８．１（配列番号１８）である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅであるＷＰ＿０５３５２１０９０．１を除き、全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１５−２】配列番号２の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０５３５２１０９０．１（配列番号１５）、１１２１＿ＨｇｂＡ＿９６８ａａ（配列番号２）、ＷＰ＿００５７５６１４１．１（配列番号１６）、ＡＡＱ１４８７３．１（配列番号１７）、ＷＰ＿０６１４０５９２８．１（配列番号１８）である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅであるＷＰ＿０５３５２１０９０．１を除き、全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１６−１】配列番号４の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＥＳＱ７１１３６．１（配列番号１９）、ＷＰ＿０１４３９１２０５．１（配列番号２０）、ＷＰ＿０１６５３４０４４．１（配列番号２１）、１１２１＿ＦｅｐＡ＿７９０ａａ（配列番号４）、ＷＰ＿００５７５６８８３．１（配列番号２２）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１６−２】配列番号４の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＥＳＱ７１１３６．１（配列番号１９）、ＷＰ＿０１４３９１２０５．１（配列番号２０）、ＷＰ＿０１６５３４０４４．１（配列番号２１）、１１２１＿ＦｅｐＡ＿７９０ａａ（配列番号４）、ＷＰ＿００５７５６８８３．１（配列番号２２）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１７−１】配列番号６の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０７１５２２７７３．１（配列番号２３）、ＷＰ＿０１６５３４４４４．１（配列番号２４）、ＷＰ＿００５７５５８１９．１（配列番号２５）、１１２１＿ＰｆｈＲ＿７２７ａａ（配列番号６）、ＥＧＰ０５５８０．１（配列番号２６）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１７−２】配列番号６の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０７１５２２７７３．１（配列番号２３）、ＷＰ＿０１６５３４４４４．１（配列番号２４）、ＷＰ＿００５７５５８１９．１（配列番号２５）、１１２１＿ＰｆｈＲ＿７２７ａａ（配列番号６）、ＥＧＰ０５５８０．１（配列番号２６）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１８−１】配列番号８の配列アラインメント、及び他の５つの配列１１３５＿ＰＭ０３００＿９６４ａａ（配列番号８）、ＷＰ＿００５７５３６４２．１（配列番号２７）、ＷＰ＿０１６５３４５５７．１（配列番号２８）、ＷＰ＿０１０９０６５７３．１（配列番号２９）、ＡＡＱ  １４８７３．１（配列番号３０）、１１２１＿ＨｇｂＡ＿９６８ａａ（配列番号２）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１８−２】配列番号８の配列アラインメント、及び他の５つの配列１１３５＿ＰＭ０３００＿９６４ａａ（配列番号８）、ＷＰ＿００５７５３６４２．１（配列番号２７）、ＷＰ＿０１６５３４５５７．１（配列番号２８）、ＷＰ＿０１０９０６５７３．１（配列番号２９）、ＡＡＱ  １４８７３．１（配列番号３０）、１１２１＿ＨｇｂＡ＿９６８ａａ（配列番号２）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１８−３】配列番号８の配列アラインメント、及び他の５つの配列１１３５＿ＰＭ０３００＿９６４ａａ（配列番号８）、ＷＰ＿００５７５３６４２．１（配列番号２７）、ＷＰ＿０１６５３４５５７．１（配列番号２８）、ＷＰ＿０１０９０６５７３．１（配列番号２９）、ＡＡＱ  １４８７３．１（配列番号３０）、１１２１＿ＨｇｂＡ＿９６８ａａ（配列番号２）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１９−１】配列番号１０の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０１７８６１１８６．１（配列番号３１）、ＡＡＵ２９２０２．１（配列番号３２）、ＥＧＰ０４５１１．１（配列番号３３）、１１３５＿ＨａｓＲ＿８４８ａａ（配列番号１０）、ＷＰ＿００５７５２１６３．１（配列番号３４）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図１９−２】配列番号１０の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０１７８６１１８６．１（配列番号３１）、ＡＡＵ２９２０２．１（配列番号３２）、ＥＧＰ０４５１１．１（配列番号３３）、１１３５＿ＨａｓＲ＿８４８ａａ（配列番号１０）、ＷＰ＿００５７５２１６３．１（配列番号３４）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図２０−１】配列番号１２の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿００５７５１５５７．１（配列番号３５）、１１３５＿ＰＭ０７４１＿７８４ａａ（配列番号１２）、ＷＰ＿０１６５３４５５４．１（配列番号３６）、ＷＰ＿０６４９７２８１６．１（配列番号３７）、ＷＰ＿０７４８６５０２０．１（配列番号３８）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図２０−２】配列番号１２の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿００５７５１５５７．１（配列番号３５）、１１３５＿ＰＭ０７４１＿７８４ａａ（配列番号１２）、ＷＰ＿０１６５３４５５４．１（配列番号３６）、ＷＰ＿０６４９７２８１６．１（配列番号３７）、ＷＰ＿０７４８６５０２０．１（配列番号３８）である。全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図２１−１】配列番号１４の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０５０９４８９５７．１（配列番号３９）、ＷＰ＿０１４３９１０４３．１（配列番号４０）、ＷＰ＿０１６５３３７３８．１（配列番号４１）、１１３５＿Ｐ１０６２＿０２０７６００＿７４２ａａ（配列番号１４）、ＷＰ＿０２５２４８４５６．１（配列番号４２）である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅであるＷＰ＿０５０９４８９５７．１を除き、全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図２１−２】配列番号１４の配列アラインメント、及び他の４つの配列ＷＰ＿０５０９４８９５７．１（配列番号３９）、ＷＰ＿０１４３９１０４３．１（配列番号４０）、ＷＰ＿０１６５３３７３８．１（配列番号４１）、１１３５＿Ｐ１０６２＿０２０７６００＿７４２ａａ（配列番号１４）、ＷＰ＿０２５２４８４５６．１（配列番号４２）である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅであるＷＰ＿０５０９４８９５７．１を除き、全ての配列はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。
【図２２−１】配列番号４４のアミノ酸配列、及びそのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）の例である。配列番号４３の最初の７８ヌクレオチドは、配列番号４４のシグナル配列（アミノ酸１〜２６）をコードするものと予測される。
【図２２−２】配列番号４４のアミノ酸配列、及びそのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）の例である。配列番号４３の最初の７８ヌクレオチドは、配列番号４４のシグナル配列（アミノ酸１〜２６）をコードするものと予測される。
【図２３】組み換え亜鉛（ｒＺｉｎｃ）タンパク質をＳＲＰ抽出物と比較した、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いて抗原曝露されたニワトリの生存率である。その結果から、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａのＳＲＰ抽出物及びｒＺｉｎｃタンパク質の両方の有効性が、非ワクチン接種のプラセボ対照と比較して明らかに認められる。
【図２４】Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ組み換え亜鉛獲得タンパク質の封入体調製物を示す、ゲル画像である。レーン１は未誘導全細胞であり、レーン２は誘導全細胞であり、レーン３は溶解細胞上清であり、レーン４は１×Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒウォッシュであり、レーン  ５は１／１０×Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒウォッシュであり、レーン６はＴＢＷウォッシュであり、レーン７は可溶化封入体であり、レーン８は分子量９０．８５ｋＤａの組み換えタンパク質を示す可溶化後ペレットである。
【図２５】Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（ＺＡＰ、配列番号４５）由来の亜鉛獲得タンパク質の亜鉛親和性領域の配列アライメント、及びその他１０個の呼吸器病原体ＡＨＧ８１８３６．１（配列番号４６）、ＷＰ＿００５６１２２６９．１（配列番号４７），ＷＰ＿０２７０７４５９７．１（配列番号４８）、ＡＨＧ７３３９１．１（配列番号４９）、ＷＰ＿０２１１１４８５７．１（配列番号５０）、ＷＰ＿０２６２１２９５７．１（配列番号５１）、ＷＰ＿０２８８５８７９２．１（配列番号５２）、ＷＰ＿０１６５３４５９０．１（配列番号５３）、ＫＤＮ２４５４８．１（配列番号５４）、及びＷＰ＿０２７０２１６７６．１（配列番号５５）である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
タンパク質
一態様において、本開示には、タンパク質、及びタンパク質を具備する組成物が提供されている。本明細書中に用いられている「タンパク質」とは、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸のポリマーを指す。それゆえ、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及び酵素という用語は、タンパク質の定義範囲内に包含される。また、この用語には、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような、タンパク質に対する１つ以上の発現後修飾を含み得るタンパク質も包含される。タンパク質という用語は、アミノ酸のポリマーの特定の長さは含意しない。タンパク質は、天然の供給源から直接的に単離可能な場合もあれば、または組み換え技法、酵素技法もしくは化学的技法を利用して調製される場合もある。天然に存在するタンパク質の事例において、そのようなタンパク質は単離されるのがごく一般的である。
【００３６】
「単離された」タンパク質は、その自然環境から除去されたものである。例えば、単離されたタンパク質とは、細胞質からまたは細胞膜から除去されていて、その自然環境のタンパク質、核酸、及び他の細胞材料の多くがもはや存在していないタンパク質を言う。
【００３７】
特定の供給源から「単離可能」として特徴付けられるタンパク質とは、適切な条件下で、同定された供給源によって産生されるタンパク質で、但し、例えば従来の組み換え技法、化学技法、または酵素技法を用いて代替供給源から得ることが可能なタンパク質である。それゆえ、タンパク質を特定の供給源から「単離可能」なものとして特徴付けたからといって、そのタンパク質を採取すべき特定の供給源を示唆するわけではないし、またはそのタンパク質を採取すべき特定の条件もしくはプロセスを示唆するわけでもない。
【００３８】
「精製」タンパク質とは、天然に会合している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％含まないタンパク質を言う。天然に存在する生物体の外部において、例えば化学的手段または組み換え手段により産生されるタンパク質は、自然の環境内には存在していなかったことから、定義上、単離及び精製されたものであると見なされる。
【００３９】
概して、タンパク質は、分子量、アミノ酸配列、質量指紋、そのタンパク質をコードする核酸、免疫学的活性、またはそのような２つ以上の特徴の任意の組み合わせにより特徴付けることができる。タンパク質の分子量は、典型的にはキロダルトン（ｋＤａ）で表され、例えば、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を含むゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量スペクトロメトリー、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣなど）をはじめとする常法を用い、観察または予測されたアミノ酸配列から分子量を計算することによって、算定することが可能である。分子量に言及した場合、別途指示されていない限り、還元条件及び変性条件下で、約４％の濃縮用ゲル及び約１０％の分離用ゲル含有のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離することによって算定される分子量を指す。一実施形態において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定されたタンパク質の分子量には、規定された値の上下１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、または５ｋＤａの分子量が包含される。
【００４０】
本明細書に記載のタンパク質は、金属調節されたものであり得る。本明細書中に用いられている「金属調節タンパク質」とは、微生物により発現するタンパク質において、微生物を低金属条件下で成長させた場合の方が、同じ微生物を高金属条件下で成長させた場合と比べて発現レベルが増強されるタンパク質を言う。低金属条件及び高金属条件は、本明細書中に記載されている。例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによって産生される金属調節タンパク質によっては、高金属条件下では微生物の成長中に検出可能なレベルにて発現しない反面、低金属条件下では成長中に検出可能なレベルにて発現するものもある。一実施形態では、金属調節タンパク質を、シデロフォア受容体タンパク質とする場合もある。低鉄条件において成長した後のＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能な金属調節タンパク質の例としては、分子量が１０４ｋＤａ〜７５ｋＤａである金属調節タンパク質が挙げられる。低鉄条件において成長した後のＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能な金属調節タンパク質の具体例としては、還元条件及び変性条件下で、約４％濃縮用ゲル及び約１０％分離用ゲルを含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用してタンパク質を分離することによって算定された９９ｋＤａ、８１ｋＤａ、及び８０ｋＤａのタンパク質が挙げられる。一実施形態において、低鉄条件とは、２，２’−ジピリジルの存在下で成長させることを言う。分子量が９９ｋＤａ、８１ｋＤａ、及び８０ｋＤａである鉄調節タンパク質の例、ならびにこれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を、それぞれ図１０、図１４、及び図６に示す。低亜鉛条件下での成長後にＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能な金属調節タンパク質の具体例には、還元条件及び変性条件下で、約４％濃縮用ゲル及び約１０％分離用ゲルを含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用してタンパク質を分離することによって算定された９１ｋＤａのタンパク質が挙げられる。一実施形態において、低亜鉛条件とは、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）の存在下で成長させることを言う。分子量が９１ｋＤａである亜鉛調節タンパク質、及びそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を、図２２に示す。
【００４１】
本明細書中に記載されているタンパク質は、高金属条件下では微生物の成長中における発現レベルが検出可能レベルの場合がある一方、低金属条件下では成長中における発現レベルが増強される場合もある。そのようなタンパク質の発現を、本明細書中では、低金属条件における成長中に「増強された」と呼んでいる。典型的に、低金属条件下で成長中のタンパク質の発現の増加率は、高金属条件下で成長中のタンパク質の発現と比較して５０％〜５００％である。
【００４２】
低鉄条件で成長した後に、発現が増強し且つＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能となった金属調節タンパク質の例としては、分子量が１１４ｋＤａ〜８２ｋＤａの金属調節タンパク質が挙げられる。低鉄条件での成長後にＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能な金属調節タンパク質の具体例としては、還元条件及び変性条件下で、約４％濃縮用ゲル及び約１０％分離用ゲルを含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用してタンパク質を分離することによって算定された１０９ｋＤａ、８９ｋＤａ、及び８７ｋＤａのタンパク質が挙げられる。分子量が１０９ｋＤａであるタンパク質、及びそれらをコードするヌクレオチド配列の例を、図８及び図１１に示す。分子量が８９ｋＤａ及び８７ｋＤａであるタンパク質、ならびにそれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を、それぞれ図１３及び図９に示す。
【００４３】
また、本開示には、金属調節されていない特定のタンパク質に関しても記載されている。そのようなタンパク質は、例えば塩化鉄の存在下などの、金属イオンの存在下にて発現するだけでなく、低鉄条件において成長させた場合にも発現する。この種のタンパク質のうち、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能なものの例には、分子量が２５４ｋＤａ〜２４４ｋＤａ、６５ｋＤａ〜５５ｋＤａ、及び４７ｋＤａ〜１７ｋＤａのタンパク質が挙げられる。この種のタンパク質の分子量の例としては、２４９ｋＤａ、６０ｋＤａ、４２ｋＤａ、３８ｋＤａ、２７ｋＤａ、２６ｋＤａ、及び２２ｋＤａが挙げられる。タンパク質の更なる例としては、組み換え産生バージョンの、本明細書に記載のタンパク質が挙げられる。組み換え産生タンパク質には、ｍＲＮＡ転写物から翻訳可能な全アミノ酸配列が含まれる場合がある。代替的に、組み換え産生タンパク質には、翻訳可能なアミノ酸配列全体のフラグメントが含まれる場合がある。例えば、組み換え産生タンパク質は、タンパク質のいずれかの末端において開裂性配列（例えば、タンパク質のアミノ末端において開裂性シグナル配列）を欠く場合がある。
【００４４】
一実施形態において、タンパク質は、野生型細胞から得られたコード配列によってコードされるタンパク質のアミノ末端からの１以上のアミノ酸を欠く。例えば、タンパク質はシグナル配列を欠いている。それゆえフラグメントは、タンパク質のアミノ末端からの少なくとも１アミノ酸、少なくとも２アミノ酸、少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも１６アミノ酸、少なくとも１７アミノ酸、少なくとも１８アミノ酸、少なくとも１９アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２１アミノ酸、少なくとも２２アミノ酸、少なくとも２３アミノ酸、少なくとも２４アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも２６アミノ酸、少なくとも２７アミノ酸、少なくとも２８アミノ酸、少なくとも２９アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３１アミノ酸、少なくとも３２アミノ酸、少なくとも３３アミノ酸、少なくとも３４アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも３６アミノ酸、少なくとも３７アミノ酸、少なくとも３８アミノ酸、少なくとも３９アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも４１アミノ酸、少なくとも４２アミノ酸、少なくとも４３アミノ酸、少なくとも４４アミノ酸、少なくとも４５アミノ酸、少なくとも４６アミノ酸、少なくとも４７アミノ酸、少なくとも４８アミノ酸、少なくとも４９アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５１アミノ酸、少なくとも５２アミノ酸、少なくとも５３アミノ酸、少なくとも５４アミノ酸、少なくとも５５アミノ酸、少なくとも５６アミノ酸、少なくとも５７アミノ酸、少なくとも５８アミノ酸、少なくとも５９アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも６１アミノ酸、少なくとも６２アミノ酸、または少なくとも６３アミノ酸を欠く可能性がある。一実施形態において、配列番号２に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２４を含まない。一実施形態において、配列番号４に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２６を含まない。一実施形態において、配列番号６に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２２を含まない。一実施形態において、配列番号８に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２４を含まない。一実施形態において、配列番号１０に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２５を含まない。一実施形態において、配列番号１２に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２６を含まない。一実施形態において、配列番号１４に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２４を含まない。一実施形態において、配列番号４４に示されるタンパク質のフラグメントはアミノ酸１〜２６を含まない。
【００４５】
タンパク質が金属調節タンパク質、増強タンパク質または非金属調節タンパク質のいずれに該当するかは、タンパク質の存在を比較するうえで有用な方法により判別できる。それらの方法としては、例えば、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を含むゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量スペクトロメトリー、相対及び絶対定量用の同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）、ならびにＨＰＬＣを含めた液体クロマトグラフィーが挙げられる。微生物の別々の培養物を、高金属条件下及び低金属条件下で成長させる場合もあれば、タンパク質を本明細書に記載のようにして単離させる場合もあれば、各培養物中に存在するタンパク質を分離及び比較する場合もある。各培養物からのタンパク質を等量ずつ使用するのが、ごく一般的である。一実施形態では、還元条件及び変性条件下で、約４％の濃縮用ゲル及び約１０％の分離用ゲル含有のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離させる場合もある。例えば、各培養物からの全タンパク質３０μｇを用いて、ゲルのウェルに充填してもよいし、ゲルを泳動させ、タンパク質をクマシーブリリアントブルーで染色した後、２つのレーンを比較してもよい。タンパク質が検出可能なレベルで発現するか否かを判別する際は、培養物からの全タンパク質３０μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させてから、当該技術分野において公知の方法を用いてクマシーブリリアントブルーで染色する。目視で明視化できるタンパク質は検出可能なレベルで発現するものと考えられ、一方、目視で明視化できないタンパク質は検出可能なレベルでは発現しないものと考えられる。
【００４６】
代替的に、タンパク質が金属調節タンパク質であるかそれとも非金属調節タンパク質であるかを、マイクロアレイに基づく遺伝子発現分析を用いて判別する場合もある。微生物の別々の培養物を、高金属条件下及び低金属条件下で成長させてもよいし、ＲＮＡは各培養物の細胞から抽出してもよいし、高金属条件下で成長させた細胞内でのＲＮＡ発現と低金属条件で成長させた細胞内でのＲＮＡ発現との相違を検出し比較してもよい。例えば、確立済みのプロトコールを用い、８〜１０μｇの細菌ＲＮＡから標識ｃＤＮＡを調製してもよいし、標識ｃＤＮＡを、微生物のゲノムのマイクロアレイに適用してもよい。そのようなマイクロアレイは市販のものが出回っていて、そのようなアレイを用いて遺伝子発現を評価することは通常である。
【００４７】
本明細書中に記載されているタンパク質は、免疫学的活性を有し得る。「免疫学的活性」とは、動物においてタンパク質が免疫学的応答を誘発させる能力を指す。タンパク質に対する免疫学的応答とは、動物においてタンパク質に対する細胞性の免疫応答及び／または抗体媒介性の免疫応答が発生することを言う。通常、免疫学的応答としては、限定されるものではないが、以下の効果：タンパク質のエピトープ（単数または複数）に対する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞を産生することのうちの、１つ以上が挙げられる。「エピトープ」とは、特定のＢ細胞及び／またはＴ細胞が抗体産生を目的に応答を向ける、抗原上の部位を指す。免疫学的活性は、防御的であり得る。「免疫学的活性」とは、動物においてタンパク質が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによる感染を阻害または制限するための免疫学的応答を誘発させる能力を指す。タンパク質が防御的免疫学的活性を有するかどうかは、例えば、実施例６〜９及び実施例１５〜１６に記載の方法などの、当該技術分野において公知の方法により判別できる。タンパク質は血清反応活性を有し得る。本明細書中に用いられている「血清反応活性」とは、候補タンパク質が、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａに感染した動物由来の回復期血清中に存在する抗体に反応する能力を指す。
【００４８】
本明細書に記載のタンパク質は、基準タンパク質の特徴を有し得る。その特徴としては、例えば、分子量、質量指紋、アミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一実施形態において、タンパク質は微生物から得られる場合がある。微生物は、本明細書に記載の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのタンパク質を発現し得る。基準タンパク質は、グラム陰性菌、好ましくはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバー（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属など）から単離させることが可能である。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属のメンバーは、本明細書においてそれぞれＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｐ．及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．とも呼ばれている。一実施形態において、基準タンパク質はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによって発現する。一実施形態において、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａは血清型２、５または血清型３、４であり得る。
【００４９】
本明細書において、タンパク質のアミノ酸配列が基準タンパク質と比較して指定量の配列類似性及び／または配列同一性を有する場合、タンパク質は基準タンパク質と「構造的に類似」であり得る。また、基準タンパク質の同等の質量指紋と比較して指定量の同一性を有する質量指紋を呈する場合も、タンパク質は基準タンパク質と「構造的に類似」であり得る。それゆえ、タンパク質は、基準タンパク質と比較して、十分なレベルのアミノ酸配列同一性、アミノ酸配列類似性、またはそれらの組み合わせを有する場合、基準タンパク質と「構造的に類似」であり得る。一実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、以下に記載するように、構造的にアミノ酸２５〜９６８配列番号２、アミノ酸２７〜７９０配列番号４、アミノ酸２３〜７２７配列番号６、アミノ酸２５〜９６４配列番号８、アミノ酸２６〜８４８配列番号１０、アミノ酸２７〜７８４配列番号１２、アミノ酸２５〜７４２配列番号１４、またはアミノ酸２６〜８０５配列番号４４に類似のアミノ酸配列を有する可能性がある。
【００５０】
タンパク質配列の類似性、及びタンパク質配列の同一性
２つのタンパク質の構造的類似性は、それらの配列の長さに沿って同一アミノ酸の数を最適化するために２つのタンパク質の残基（例えば、本明細書に記載の候補タンパク質及び任意の適切な参照タンパク質）を整列させて、同一アミノ酸の数をそれらの配列の長さに沿って最適化することによって算定できる。同一アミノ酸の数を最適化する目的で整列を行う際に、いずれか一方または両方の配列におけるギャップが許容されるが、にもかかわらず、各配列中のアミノ酸はそれらの適切な順序を維持していなければならない。基準タンパク質は、適宜に、本明細書に記載のタンパク質、または任意の公知の金属調節タンパク質であり得る。基準タンパク質の例としては、限定されるものではないが、アミノ酸２５〜９６８配列番号２、アミノ酸２７〜７９０配列番号４、アミノ酸２３〜７２７配列番号６、アミノ酸２５〜９６４配列番号８、アミノ酸２６〜８４８配列番号１０、アミノ酸２７〜７８４配列番号１２、アミノ酸２５〜７４２配列番号１４、及びアミノ酸２６〜８０５配列番号４４が挙げられる。候補タンパク質とは、基準タンパク質と比較されるタンパク質である。候補タンパク質は、例えば、微生物から単離される場合もあれば、あるいは組み換え技法を使用して製造される場合もあれば、あるいは化学的または酵素的に合成される場合もある。
【００５１】
本明細書中に別途に記載されているような修正がない限り、ＧＣＧパッケージのＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用して、アミノ酸配列のペアワイズ比較分析を遂行できる（バージョン１０．２，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。代替的に、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１７４：２４７−２５０（１９９９））に記載のＢＬＡＳＴ  ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用してタンパク質を比較してもよい。このＢｌａｓｔｐプログラムは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトで入手可能である。全てのＢＬＡＳＴ２検索パラメータのデフォルト値（例えば、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティ＝１１、エクステンションギャップペナルティ＝１、ギャップ×ドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝３、及びフィルターオン）を使用できる。
【００５２】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性（％）」と呼ばれる場合もあれば、または「類似性（％）」と呼ばれる場合もある。「同一性」とは、同一アミノ酸の存在を指す。「類似性」とは、同一アミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在をも指す。タンパク質中のアミノ酸に対する保存的置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択できる。例えば、タンパク質生化学の分野では、特に活性とは直接的に関連しないタンパク質の領域においてタンパク質の活性を改変させることなしに、特定のサイズまたは特徴（電荷、疎水性もしくは親水性など）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のアミノ酸で置換できることは、周知となっている。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。保存的置換としては、例えば、ＬｙｓをＡｒｇで置換及びその逆の置換によって正電荷を維持すること、ＧｌｕをＡｓｐで置換及びその逆の置換によって負電荷を維持すること、ＳｅｒをＴｈｒで置換して遊離ＯＨが維持すること、ならびにＧｌｎをＡｓｎで置換して遊離ＮＨ２を維持することが挙げられる。同様に、例えばタンパク質の免疫学的活性のような機能的活性を排除しない、１つ以上の隣接または非隣接アミノ酸の欠失または付加を含むタンパク質の生物学的に活性な類似体もまた、意図される。
【００５３】
それゆえ、本明細書中に記載されるようなタンパク質及び／または１つ以上の配列ＩＤ番号のアミノ酸配列は、本明細書中に用いられている場合、基準アミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％）、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するタンパク質が含まれる場合がある。
【００５４】
代替的に、本明細書中に記載されるようなタンパク質及び／または１つ以上の配列ＩＤ番号のアミノ酸配列は、本明細書中に用いられている場合、基準アミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するタンパク質が含まれる場合がある。
【００５５】
図１５〜図２１に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対するＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａアライメントを示す。このアラインメントは、種々のＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株にわたって、及び図１５及び２１に関してはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにわたって各タンパク質の変異体内にアミノ酸が保存されていることを示す。図１５〜図２１中、アスタリスク（＊）は、完全に保存された単一残基を有する位置を示す。コロン（：）は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックスにおいてスコアを０．５超とした場合とほぼ同等な強く類似した特性のグループ間の保存を示す。ピリオド（．）は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックスでスコアリングが０より大きく且つ０．５以下であるとほぼ同等である、弱く類似した特性のグループ間の保存を示す。当業者であれば、活性（免疫学的活性、防御的免疫学的活性、または修飾タンパク質の血清学的活性）に過度に影響を及ぼすことなしに、置換（特に保存的置換）が許容され得ることを、タンパク質のそのようなデータ領域から推測することができる。
【００５６】
前述の理由により、本明細書に記載のタンパク質としては、例えばタンパク質が最初に単離／または同定された微生物種もしくは株以外の微生物種もしくは株に由来する（生物学的及び／または組み換え的に）相同タンパク質をはじめとする特定の変異体を挙げることができる。
【００５７】
また、本明細書中に記載されるタンパク質を、例えば、付加されたＣ末端アミノ酸及び／またはＮ末端アミノ酸に対しコード配列を付加するといったように、更に１つ以上の配列が提供されるように設計することにより、抗体をカラム上に捕捉するかあるいは抗体を使用して、精製を容易にすることが可能である。そのようなタグとしては、例えばヒスチジンリッチタグが挙げられ、このタグは、ニッケルカラム上でタンパク質の精製を可能にする。そのような遺伝子改変技法及び好適な更なる配列は、分子生物学分野において周知である。また、本明細書に記載のタンパク質は、Ｃ末端及び／またはＮ末端の或るアミノ酸が欠失されるように設計してもよい。
【００５８】
本明細書に記載のタンパク質に「修飾」を含めてもよい。修飾とは、１つ以上の構成アミノ酸における化学的または酵素的誘導体化を指す。そのような修飾としては、例えば、側鎖修飾、主鎖修飾、Ｎ末端修飾、及び／またはＣ末端修飾、例えばアセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、炭水化物及び／または脂質部分、補因子など、ならびにそれらの組み合わせの付着を挙げることができる。本明細書に記載の修飾タンパク質は、未修飾タンパク質の生物学的活性（例えば、免疫学的活性など）を保持する場合もあれば、または未修飾タンパク質と比較して生物学的活性の低下もしくは上昇が見られる場合もある。
【００５９】
本明細書に記載のタンパク質（その生物学的に活性な類似体及び／またはその修飾体を含む）としては、天然（天然に存在する）タンパク質、組み換えタンパク質、化学合成タンパク質もしくは酵素合成タンパク質を挙げることができる。例えば、本明細書中に記載されるタンパク質は、天然の供給源からタンパク質を単離することによって調製される場合もあれば、または、例えば細菌もしくは他の宿主細胞内の融合タンパク質として調製することを含む従来の方法によって組み換え的に調製される場合もある。
【００６０】
ポリヌクレオチド配列の類似性、及びポリヌクレオチド配列の同一性
本明細書中に記載されているようなタンパク質はまた、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドという点で同定可能である。それゆえ、本開示は、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、あるいは標準的なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００６１】
本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチド及び／または１つ以上の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３もしくは４３またはそのフラグメントの核酸配列は、本明細書中に用いられている場合、同定された基準ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％）、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる場合がある。
【００６２】
これに関連して、「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を指す。配列同一性は概して、２つのポリヌクレオチドの塩基（例えば、候補配列のヌクレオチド配列と、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３もしくは４３またはそれらのフラグメントなどの本明細書中に開示されているヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列）を整列させて、同一ヌクレオチドの数をそれらの配列の長さに沿って最適化することによって算定される。共有ヌクレオチドの数を最適化する目的で整列を行う際に、いずれか一方または両方の配列におけるギャップが許容されるが、にもかかわらず、各配列中のアミノ酸はそれらの適切な順序を維持していなければならない。候補配列は、既知の配列（本明細書に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３もしくは４３など、またはそのフラグメント）と比較される配列である。例えば、Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１７４：２４７−２５０（１９９９）に記載されているように、ＢＬＡＳＴ  ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを使用して２つのポリヌクレオチド配列を比較することができ、このＢｌａｓｔｎプログラムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のワールドワイドウェブサイト上で入手可能である。全てのＢＬＡＳＴ２検索パラメータのデフォルト値（例えば、一致に対する加点＝１、不一致に対する減点＝−２、オープンギャップ減点＝５、エクステンションギャップペナルティ＝２、ギャップ×ドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝１１、及びフィルターオン）を使用できる。
【００６３】
最後に、本明細書に記載のポリヌクレオチドには、本明細書に記載のタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドが含まれる場合がある。それゆえ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるべきアミノ酸配列から推定することが可能である。
【００６４】
本開示は、微生物の全細胞調製物も提供する。一実施形態において、調製物は、本明細書に記載のタンパク質を発現するように操作された微生物を含む。例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは４４と構造的類似性を有するタンパク質、もしくはそれらのフラグメント、またはそれら８つのタンパク質の任意の副組み合わせを発現するように、微生物を操作してもよい。微生物は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌を含む、遺伝子操作に適した任意の微生物細胞であり得る。グラム陰性菌の例としては、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、及びＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａのようなＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【００６５】
一実施形態において、調製物は、微生物の２つ以上の母集団を含む。各母集団は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の全て、またはそれらのフラグメントを発現していない。寧ろ、各個体群は７つのタンパク質のサブセットを発現し、２つ以上の母集団は、全体として考えると７つのタンパク質を発現する。例えば、一実施形態では、微生物の１つの母集団は配列番号２、４及び６を発現し、微生物の第２の母集団は配列番号８、１０、１２及び１４、またはそのフラグメントを発現する。母集団は、野生型微生物、または操作された微生物であり得る。調製物は、１つ以上の野生型微生物、１つ以上の操作された微生物、または野生型微生物と操作された微生物との組み合わせが含まれる場合がある。野生型細胞の例としては、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属のメンバーが挙げられる。一実施形態において、細胞は弱毒化されたＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａである。我々が判断したように、特定の種のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ株を全細胞として投与することによって、個々の株を別々に投与した結果とは異なる免疫学的性質が得られることが予期される。異なる免疫学的特性には、動物に投与されたＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ細胞とは異なる血清型を有するＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株に対して防御する能力が含まれる。一実施形態において、ある全細胞はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ血清型２、５であり、第２の全細胞はＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ血清型３，４であり、一方は７つのタンパク質のうちの３つを発現し、他方は７つのタンパク質のうち４つを発現する。一実施形態において、微生物の母集団のうちの１つ以上は、配列番号４４またはそのフラグメントを発現できる。
【００６６】
全細胞調製物中に存在する細胞は、細胞が複製できないように不活性化できるが、微生物によって発現される本明細書に記載のタンパク質の免疫学的活性は維持される。典型的には、細胞は、グルタルアルデヒド、ホルマリン、またはホルムアルデヒドなどの薬剤に曝すことによって殺滅させることができる。
【００６７】
組成物
組成物は、本明細書に記載の単離された１つのタンパク質、本明細書に記載の少なくとも２つの単離されたタンパク質、または２を超える整数（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個もしくは少なくとも２０個など）であるいくつかのタンパク質が含まれる場合がある。一実施形態において、本明細書に記載の１つのタンパク質を含む組成物は、配列番号４４と同一であるか、または構造的類似性を有するタンパク質もしくはそのフラグメントを含む。特定のレベルの配列類似性及び／または同一性が本明細書に明示的に指示されていない限り（例えば、少なくとも８０％の配列類似性、少なくとも９０％の配列同一性など）、同定された配列ＩＤ番号のアミノ酸配列に言及した場合、本明細書中の「タンパク質配列類似性及びタンパク質配列同一性」の節に記載される配列類似性のレベル、及び／または配列同一性のレベルを有する変異体を含む。
【００６８】
ベクターが適切な宿主細胞内に導入されたときに、タンパク質の発現を可能にするベクターから、組み換え産生タンパク質を発現させることができる。宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上の組み換え産生タンパク質を産生するように構築することが可能であり、そうすることで、本明細書に記載のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを含めることができる。それゆえ、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、すなわち本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、各ベクターに含めてもよい。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどの微生物に対する遺伝子操作の方法は、当該技術分野において公知の常法である。
【００６９】
或る組成物、例えば、組み換え産生タンパク質を含むものなどには、最大数のタンパク質が含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、タンパク質の最大数は、タンパク質の最大総数を指し得る。特定の組成物は、例えば、５０個以下のタンパク質（例えば、４０個以下のタンパク質、３０個以下のタンパク質、２５個以下のタンパク質、２０個以下のタンパク質、１７個以下のタンパク質、１６個以下のタンパク質、１５個以下のタンパク質、１４個以下のタンパク質、１３個以下のタンパク質、１２個以下のタンパク質、１１個以下のタンパク質、１０個以下のタンパク質、９個以下のタンパク質、８個以下のタンパク質、７個以下のタンパク質、６個以下のタンパク質、５個以下のタンパク質、４個以下のタンパク質、３個以下のタンパク質、２個のタンパク質、または１個以下のタンパク質など）が含まれる場合がある。他の実施形態では、類似の方法で、最大数の組み換え産生タンパク質を特定する場合がある。更に他の実施形態では、類似の方法で、最大数の非組み換え産生タンパク質を特定する場合がある。
【００７０】
一実施形態では、微生物が、本明細書中に記載されるタンパク質と同一であるタンパク質または構造的類似性を有する１つ以上のタンパク質を発現するように操作されている場合、組成物は、１つの微生物から単離可能なタンパク質が含まれる場合がある。一実施形態において、微生物は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び４４のうちの１つ以上もしくはそれらのフラグメントと同一であるタンパク質、または構造的類似性を有するタンパク質を発現するように操作されている。一実施形態において、微生物は、配列番号４４もしくはそのフラグメントと同一であるタンパク質、または構造的類似性を有するタンパク質を発現する。一実施形態において、組成物には、２つ以上の微生物から単離可能なタンパク質が含まれる場合がある。例えば、組成物には、２つ以上の野生型Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能なタンパク質が含まれる場合がある。
【００７１】
特定の実施形態において、組成物には、全細胞の調製物が含まれる場合がある。一実施形態において、調製物は、本明細書中に記載されるタンパク質と同一であるタンパク質または構造的類似性を有する１つ以上のタンパク質を発現するように操作された、全細胞である。一実施形態において、微生物は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４もしくはそれらのフラグメントと同一であるタンパク質、または構造的類似性を有するタンパク質を発現するように操作されている。一実施形態において、微生物は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び４４もしくはそれらのフラグメントと同一であるタンパク質、または構造的類似性を有するタンパク質を発現するように操作されている。一実施形態において、微生物は、配列番号４４もしくはそのフラグメントと同一であるタンパク質、または構造的類似性を有するタンパク質を発現する。一実施形態において、調製物は、各集団がタンパク質のサブセット、例えば７つのタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４もしくはそれらのフラグメントと同一または構造的類似性を有するタンパク質）、または８つのタンパク質
（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び４４もしくはそれらのフラグメントと同一または構造的類似性を有するタンパク質）を発現する２以上の微生物集団であり、且つ２つ以上の母集団は、全体として考えると７つのタンパク質を発現する。これらの実施形態のいくつかにおいて、全細胞は、野生型Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａのようなＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａであり得る。いくつかの実施形態において、組成物には、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの株からの全細胞調製物が含まれる場合がある。
【００７２】
組成物の具体例としては、これらに限定されるものではないが、下記のものが挙げられる。一実施形態において、組成物は、金属規制タンパク質と強化タンパク質とが含まれている。金属調節タンパク質は、低鉄条件において成長した後にＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能であり、その分子量は、１０４ｋＤａ〜７５ｋＤａ（例えば９９ｋＤａ、８１ｋＤａ及び８０ｋＤａ）である。タンパク質は、配列番号６、１０もしくは１４のフラグメントである場合もあれば、またはそのフラグメントに対し構造的類似性を有する場合もある。強化タンパク質は、低鉄条件において成長した後にＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能であり、その分子量は、１５６ｋＤａ〜１４６ｋＤａ（例えば１５１ｋＤａ）、１１４ｋＤａ〜８２ｋＤａ（例えば１０９ｋＤａ、８９ｋＤａ及び８７ｋＤａ）である。タンパク質は、配列番号２、４、８、または１２のフラグメントである場合もあれば、またはそのフラグメントに対し構造的類似性を有する場合もある。任意に、組成物には、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離可能な非金属調節タンパク質が含まれる場合がある。非金属調節タンパク質の分子量は、２５４ｋＤａ〜２４４ｋＤａ、例えば２４９ｋＤａ、６５ｋＤａ〜５５ｋＤａ、例えば６０ｋＤａ、及び４７ｋＤａ〜１７ｋＤａ、例えば４２ｋＤａ、３８ｋＤａ、２７ｋＤａ、２６ｋＤａ、及び２２ｋＤａであり得る。組成物の別の具体例は、配列番号４４のフラグメントであるタンパク質、またはそのフラグメントに対し構造的類似性を有するタンパク質もしくはそのフラグメントを含むものである。
【００７３】
任意に、本明細書に記載のタンパク質を、担体タンパク質に共有結合させることにより、タンパク質の免疫学的特性を向上させることが可能である。有用な担体タンパク質は、当該技術分野において公知である。本明細書に記載のタンパク質の化学的結合は、公知の常法を用いて遂行できる。例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート、ビス（ジアゾベンジジン）、ジメチルアジピミデート、ジメチルピメミデート、ジメチルスプライデート、ジスクシンイミジルスベレート、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート及び（１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）などの様々なホモ二官能性及び／またはヘテロ二官能性架橋剤を使用できる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８８））。
【００７４】
本明細書中に記載されている組成物は、低濃度のリポ多糖（ＬＰＳ）を含み得る。ＬＰＳは、殆どのグラム陰性微生物の外膜の成分であり（例えば、Ｎｉｋａｉｄｏ  ａｎｄ  Ｖａａｒａ，Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｉｎ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．７−２２（１９８７）を参照、典型的には多糖類（Ｏ−特異的鎖、外側及び内側コア）、ならびに脂質Ａ領域を含む。ＬＰＳの脂質Ａ成分は、ＬＰＳ構造において最も生物学的に活性な成分であると共に、哺乳動物においては広範な病態生理学的効果を誘発する成分でもある。最も劇的な影響は、発熱、播種性血管内凝固、補体活性化、低血圧性ショック、及び死亡である。ＬＰＳの非特異的な免疫刺激活性によって、ＬＰＳを含む組成物の投与部位における肉芽腫の形成を促進することが可能である。そのような反応は、動物に対し過度のストレスを引き起こす可能性があり、それにより、動物に一定期間にわたって飼料または水を断念させて、動物における感染状態を悪化させる恐れもある。加えて、注射部位に肉芽腫が形成されると、注射部位に組織の瘢痕化または傷が生じることから、屠殺体のダウングレードが見込まれる尤度が助長される可能性がある。
【００７５】
ＬＰＳの濃度は、当該技術分野において公知の常法を用いて算定できる。そのような方法としては、典型的には、ＬＰＳによる染料結合の測定（例えば、Ｋｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６，１８９（１９８６））、またはリムルスアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）試験の使用（例えば、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓｔａｔｅ  Ｔｅｓｔ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１５０  Ｆｉｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８２）を参照）が挙げられる。ＬＡＬ試験で通常使用される基本的な市販の方法には、ゲル−クロット試験、濁度（分光光度）試験、比色試験、及び発色試験の４通りがある。ゲルクロットアッセイの実施例は、Ｅ−ＴＯＸＡＴＥ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｓｉｇｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．２１０を参照）、及びＰＹＲＯＴＥＬＬ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）という商標名で市販されている。典型的には、アッセイ条件は、カブトガニＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓの循環アメーバ様細胞の溶解物を含む調製物と組成物とを接触させることを含む。溶解物は、ＬＰＳに曝された際に、粘度だけでなく不透明度も増し、ゲル化する場合がある。約０．１ミリリットルの組成物を溶解物に加える。組成物のｐＨは、典型的には６〜８の間、好ましくは６．８〜７．５の間である。組成物と溶解物との混合物を、３７℃にて１時間静置してインキュベートする。インキュベーション後は、混合物を観察することによって、混合物のゲル化があったかどうかを判別する。ゲル化が認められた場合、内毒素が存在するものと判定される。組成物中に存在するエンドトキシンの量を算定するには、エンドトキシン標準化溶液の希釈液を作製して、本組成物の試験と同時に本希釈液の試験を行う。エンドトキシンの標準液は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ番号２１０−ＳＥ）、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，カタログ番号２３５５０３）、及びＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，（カタログ番号Ｅ０００５）から市販されている。本発明の組成物は、本明細書に記載の方法（例えば、細胞を破壊及び可溶化して不溶性タンパク質を回収することを含む方法）により、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどの微生物からタンパク質を単離することによって調製されるのが、一般的である。本発明の組成物中のＬＰＳ量は、同じ条件下で破砕され但し可溶化されていない同量の微生物の混合物中に存在するＬＰＳ量未満となる。典型的には、本発明の組成物中のＬＰＳレベルは、同じ微生物を破壊し但し可溶化させずに調製された組成物中のＬＰＳレベルに対して、優先度の昇順に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％減少する。
【００７６】
本明細書中に記載されている組成物は、任意に、医薬的に許容される担体を更に含む。「医薬的に許容される」とは、本組成物の他の成分と相溶性があり、そのレシピエントに対し有害にはならない、希釈剤、担体、賦形剤、塩などを指す。典型的には、本組成物が本明細書に記載のように用いられている場合、本組成物中に医薬的に許容される担体が含まれる。例示的な医薬的に許容される担体には緩衝液が含まれ、一般的には、例えば全血及び／または血漿のような血液産物は除外される。本明細書に記載の組成物は、選択された投与経路（抗原に対する免疫応答を刺激するのに好適な経路など）に適合した様々な形態の医薬製剤に製剤化できる。それゆえ、本明細書に記載の組成物は、例えば、経口；皮内、経皮及び皮下を含む非経口；筋肉内、静脈内、腹腔内などをはじめとする公知の経路を介して投与することも可能であるし、ならびに、鼻腔内投与、肺内投与、乳房内投与、膣内投与、子宮内投与、皮内投与、経皮投与及び直腸投与など局所的投与も可能である。動物の体全体に対し分泌性ＩｇＡ抗体を産生する等、粘膜免疫を刺激する目的で、（例えばスプレーまたはエアロゾルで）鼻粘膜または呼吸粘膜への投与によって、組成物を粘膜表面に投与する場合のあることが予測される。
【００７７】
また、本明細書に記載の組成物は、徐放インプラントまたは遅延放出インプラントを介して投与される場合もある。本発明による使用に適したインプラントは公知であり、例えば、国際公開第ＷＯ２００１／０３７８１０号及び／または国際公開第ＷＯ１９９６／００１６２０号に開示されているものが挙げられる。インプラントは、エアロゾルまたはスプレーで投与するのに十分に小さいサイズで製造できる。また、インプラントには、ナノスフェア及びマイクロスフェアが含まれる場合がある。
【００７８】
本発明の組成物は、本明細書に記載のタンパク質または全細胞に対する免疫学的応答を生ずるのに十分な量で投与される。組成物中に存在するタンパク質の量は、変動する可能性がある。例えば、タンパク質の投与量は、０．０１マイクログラム（μｇ）〜３０００ミリグラム（ｍｇ）、典型的には１００μｇ〜２０００ｕｇとされる場合がある。組成物が全細胞調製物である場合、細胞は、１０６細菌／ｍｌ、１０７細菌／ｍｌ、１０８細菌／ｍｌ、または１０９細菌／ｍｌの濃度で存在可能である。全細胞の混合物（例えば、タンパク質のサブセットを発現する或る細胞母集団、及び別のタンパク質のサブセットを発現する第２の母集団）を投与する場合、母集団の比率は１：１であり得る。注射用組成物（例えば、皮下、筋肉内など）では、タンパク質が、投与される組成物の総容量が、好ましくは０．５ｍｌ〜５．０ｍｌとなる量にて、典型的には１．０〜３．０ｍｌとなる量にて、本組成物中に存在する。組成物を全細胞調製物とした場合、細胞は、投与される組成物の総容量が、好ましくは０．５ｍｌ〜５．０ｍｌとなる量にて、典型的には１．０〜２．０ｍｌとなる量にて、本組成物中に存在する。投与量は多様な要因に応じて異なる。これらの要因としては、限定されるものではないが、選択された特定のタンパク質または細胞、動物の体重、体調及び年齢、ならびに投与経路が挙げられる。それゆえ、したがって、所与の単位剤形に含有されるタンパク質の絶対重量、または細胞数は、変動する可能性があり、動物の種、年齢、体重及び体調などの要因、ならびに投与方法に依存する。そのような因子は当業者によって特定される場合がある。本発明に好適な投薬量の他の例は、Ｅｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，０２７，７３６号）に開示されている。
【００７９】
製剤は、便宜的に単位剤形で提供される場合もあれば、薬学分野において周知の方法により調製される場合もある。医薬的に許容される担体を含む組成物を調製する方法はいずれも、活性化合物（例えば、本明細書に記載のタンパク質または全細胞）を１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般には、活性化合物を液体担体、微細に分割された固体担体、またはその両方と均一且つ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を所望の製剤に成形することによって、製剤を調製する。
【００８０】
また、医薬的に許容される担体を含む組成物中に、アジュバントを含める場合もある。「アジュバント」とは、非特異的に作用して特定の抗原に対する免疫応答を増強させ、ひいては、任意の所与の免疫化組成物中に必要とされる抗原の量、及び／または必要な注射の頻度を潜在的に低減させることにより、目的の抗原に対する適切な免疫応答を生起させる薬剤を指す。アジュバントとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、乳化剤、ムラミルジペプチド、臭化ジメチルジクラデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、アビジン、水酸化アルミニウム、油、サポニン、α−トコフェロール、多糖類、乳化パラフィン（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ製ＥＭＵＬＳＩＧＥＮという商標名で入手可能）、ＩＳＡ−７０、ＲＩＢＩ、及び当該技術分野において公知の他の物質を挙げることができる。
【００８１】
別の実施形態では、医薬的に許容される担体を含む組成物中に、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４及び／またはＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ならびに免疫細胞に影響を及ぼす他のサイトカインなどの生物学的応答調節剤を含める場合がある。また、組成物中に抗生物質、保存料、抗酸化剤、キレート剤などを含める場合もあり、そのような成分は当該技術分野において公知である。
【００８２】
製造方法
また、本開示には、本明細書に記載のタンパク質及び全細胞を得るための方法も提供されている。本明細書に記載のタンパク質及び全細胞調製物は、本明細書に記載のタンパク質のうちの１種以上の発現を促進する条件下で、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａのような微生物をインキュベートすることによって得ることができる。本明細書に記載のタンパク質及び全細胞調製物は、タンパク質のうちの１種以上を組み換え的に発現するように操作された微生物から単離可能であり得る。一実施形態では、血清型２、５または血清型３，４のＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａが使用される。加えて、そのような微生物は、当該技術分野において公知の常法の技法により、容易に入手可能である。微生物は、感染した動物から野外分離株として誘導されてから、本明細書中に記載されるようなタンパク質及び／または全細胞調製物を得るため使用される場合もあれば、あるいは将来の使用に備えて、例えば、２０％グリセロール含有の細菌学的培地、及び他の同様の培地中に入れて、−２０℃〜−９５℃または−４０℃〜−５０℃の凍結貯蔵庫内で貯蔵される場合もある。
【００８３】
また、本発明は、本明細書中に開示されている方法により調製された組成物を含む。そのような条件は、典型的に、低金属条件である。本明細書中に用いられている「低金属条件」という語句は、微生物に検出可能なレベルにて金属調節タンパク質を発現させる量の遊離金属を含有する、環境、典型的には細菌学的媒地を指す。本明細書中に用いられている「高金属条件」という語句は、低金属条件下にて金属調節タンパク質を発現させる場合と比較して、微生物による金属調節タンパク質発現レベルを低減させる量の遊離金属を含有する環境を指す。いくつかの事例において、「高金属条件」とは、細胞に対し本明細書に記載の金属調節タンパク質のうちの１つ以上を検出可能なレベルで発現させないようにする環境を指す場合がある。
【００８４】
いくつかの事例において、「高金属条件」は、金属分に富む自然環境及び／または金属キレート剤を含まない金属分に富む培地中での培養を含み得る。対照的に、いくつかの事例において、「低金属条件」は、以下により詳細に記載されているように、金属キレート剤を含む培地中での培養を含み得る。金属は、周期律表中、第１〜１７族（ＩＵＰＡＣ表記；ＣＡＳ表記では、それぞれ、Ｉ−Ａ族、ＩＩ−Ａ族、ＩＩＩ−Ｂ族、ＩＶ−Ｂ族、Ｖ−Ｂ族、ＶＩ−Ｂ族、ＶＩＩ−Ｂ族、ＶＩＩＩ族、Ｉ−Ｂ族、ＩＩ−Ｂ族、ＩＩＩ−Ａ族、ＩＶ−Ａ族、Ｖ−Ａ族、ＶＩ−Ａ、及びＶＩＩ−Ａ族とも呼ばれる）の配下に存在するものである。金属は、好ましくは２〜１２族、より好ましくは３〜１２族のものである。金属は、更により好ましくは鉄、亜鉛、銅、マグネシウム、ニッケル、コバルト、マンガン、モリブデン、またはセレンであり、最も好ましくは鉄、銅、または亜鉛である。
【００８５】
低金属条件は、一般に、金属キレート化合物を細菌学的媒地に添加するか、金属含有量の少ない細菌学的培地を使用するか、またはそれらの併用により得られる結果である。媒地中にキレート剤が存在していない場合、媒地に金属を添加した場合、またはそれらを併用した場合には、一般的に、高金属条件が存在する。金属キレート剤の例としては、天然及び合成の化合物が挙げられる。天然化合物の例としては、フラボノイド類のような植物フェノール化合物が挙げられる。フラボノイドの例としては、鉄キレート剤ミリセチンが挙げられる。合成鉄キレート剤の例には、２，２’−ジピリジル（当該技術分野において２，２’−ビピリジルとも呼ばれる）、８−ヒドロキシキノリン、エチレンジアミン−ジ−Ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）、デスフェリオキサミンメタンスルホネート（デスフェロール）、トランスフェリン、ラクトフェリン、オボトランスフェリン、生物学的シデロフォア（カテコレート及びヒドロキサメートなど）、ならびにクエン酸塩が挙げられる。
【００８６】
一実施形態において、２，２’−ジピリジルは、鉄をキレート化する用途に使用される。典型的に、２，２’−ジピリジルは、少なくとも０．００２５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）、少なくとも０．０２５μｇ／ｍｌ、または少なくとも０．２５μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加される。２，２’−ジピリジルは、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、または３０μｇ／ｍｌとした場合、高レベルとされる。
【００８７】
ＴＰＥＮは、典型的に、少なくとも２５マイクロモル濃度（μＭ）、少なくとも５０μＭ、または少なくとも７０μＭの濃度で培地に添加される。一実施形態において、ＴＰＥＮは、本明細書中に記載のポリペプチドを発現させるために７０μＭとする場合もあれば、また、それより高いレベルで使用される場合もある。
【００８８】
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａのｆｕｒ遺伝子において突然変異が起きた場合、本発明の金属調節タンパク質の全てではないにしてもその多くに構成的発現を生ずるものと予想される。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａにおけるｆｕｒ突然変異体の生成は、常法を用いて生起させることが可能である。方法としては、例えば、グラム陰性菌における遺伝子ノックアウトに有用なエレクトロポレーション及び遺伝子構築物が挙げられる。
【００８９】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物、例えば単離されたタンパク質を含む組成物または全細胞を含む組成物を作製するために使用されるＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどの微生物は、本明細書に記載のタンパク質のうちの１種以上を組み換え的に発現するように操作されたＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを用いて産生される場合がある。一実施形態では、タンパク質のうちの１種以上を発現するＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを、他のタンパク質が発現されるように操作する場合がある。一実施形態では、低鉄条件の存在下で、そのようなＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａをインキュベートし、その低鉄条件でインキュベートしている間に、１つ以上の組み換えタンパク質を発現させる。その結果として得られるＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａは、鉄調節タンパク質及び１つ以上の組み換えタンパク質を発現する。
【００９０】
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種の多くは、適応後にはじめて、低金属条件にて人工培地中ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長できる。例えば、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、低濃度の鉄キレート剤の存在下で成長させ、キレート剤を含有する培地中で成長させた後にキレート剤の濃度を徐々に漸増させることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで低鉄条件に適応させることができる。例えば、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、培地に０．００２５μｇ／ｍｌの２，２’−ジピリジルを添加し、キレート剤の濃度をより高い濃度、例えば２５μｇ／ｍｌまで徐々に漸増させることにより、低鉄条件での成長に適応させることができる。
【００９１】
微生物をインキュベートするのに使用される培地は、危急的なものではなく、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａの培養に有用な条件は当業者に公知である。微生物をインキュベートするために使用される培地の量は、変動する可能性がある。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ微生物における、本明細書に記載のタンパク質の産生能力を評価する際には、その微生物を好適な容量、例えば１０ミリリットル〜１リットルの培地中で成長させる場合がある。例えば、動物への投与に用いられるタンパク質を得る目的で微生物を成長させる場合、単離させるタンパク質を大量化するため微生物をバイオリアクター中で成長させる場合もある。バイオリアクター内で微生物を成長させるための方法は、当該技術分野において公知の常法である。微生物を成長させるために用いられる条件は、好ましくは金属キレート剤、より好ましくは鉄キレート剤、例えば２，２’−ジピリジル、ＴＰＥＮ、またはケルセチンを含み、ｐＨを６．５〜７．５、好ましくは６．９〜７．１とし、且つ温度を３７℃とする。発酵槽を使用したときは、溶存酸素含有率を低減する目的で、培養物を適切なガスでパージする場合がある。そのようなガスの一例が、窒素である。溶存酸素を、撹拌によって自動的にまたは手動で調整することによって、滅菌空気または純粋な酸素を培養物に導入することが可能である。
【００９２】
本発明のいくつかの態様では、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを成長後に採取する場合がある。採取することは、微生物を濃縮して体積を減少させることと、成長培地とは異なる培地に懸濁させることとを含む。微生物を濃縮するための方法は、当該技術分野において公知の常法であり、例えば濾過及び／または遠心分離を含む。典型的には、濃縮微生物を漸減量の緩衝液中に懸濁させる。最終緩衝剤は、金属キレート剤、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことが好ましい。使用可能な緩衝剤の実施例は、ｐＨ８．５にてトリス塩基（７．３グラム／リットル）及びＥＤＴＡ（０．９グラム／リットル）を含有する。任意に、最終緩衝液によっても、タンパク質の分解を最小限に抑えられる。これを達成するために、最終緩衝液をｐＨ８．０超、好ましくは少なくとも８．５とし、及び／または１つ以上のプロテイナーゼ阻害剤（例えば、フェニルメタンスルホニルフルオリド）を含める場合がある。任意に、好ましくは、濃縮された微生物を破砕されるまで−２０℃以下で凍結する。一実施形態において、細菌細胞を遠心分離などによってペレットに濃縮し、濃縮細胞を浸透圧ショック緩衝液（ＯＭＳ；７．２６グラム／リットルのトリス塩基及び０．９３グラム／リットルのＥＤＴＡを、ｐＨ８．５に調整したもの）中に懸濁させる場合がある。細胞とＯＭＳの比率は、１リットルのＯＭＳに対して細胞ペレット５０グラム、細胞ペレット６０グラム、または細胞ペレット７０グラムであり得る。ＯＭＳ中の細胞の懸濁液を、２〜８℃で少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも６０時間インキュベートすることによって、細胞から余分なエンドトキシンを除去してもよい。一実施形態において、インキュベーションは７２時間以内である。インキュベーション後、懸濁液を再度遠心分離させ、上清を破棄して遊離のエンドトキシン及び細胞外物質、例えば分泌タンパク質を除去する。
【００９３】
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを全細胞調製物として使用する必要がある場合、採取された細胞を、公知の常法を用いて処理して、細胞を不活性化してもよい。代替的に、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを使用して、本発明のタンパク質を調製する場合、例えば、焼入れプレス、超音波処理もしくは均質化など、当該技術分野において公知の化学的、物理的または機械的な常法を用いて、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを破砕してもよい。好ましくは、均質化を用いる。本明細書中に用いられている「破砕」は、細胞が破壊されることを指す。微生物の破砕度は、例えば、光学密度の変化をはじめとする、当該技術分野において公知の常法によって測定できる。典型的には、１：１００の希釈率を測定したときに透過率（％）が２０％増加するまで、微生物を破砕させる。破砕中の温度を通常４℃に保つことによって、タンパク質分解が更に最小限に抑えられる。
【００９４】
破砕された微生物を、陰イオン性、双性イオン性、非イオン性、または陽イオン性洗剤などの洗剤中で可溶化する。洗剤は、好ましくはサルコシン、より好ましくはラウロイルサルコシン酸ナトリウムである。本明細書中に用いられている「可溶化する」という用語は、細胞材料（例えばタンパク質、核酸、炭水化物）を、微生物が破砕された緩衝液の水相中に溶解させること、及び不溶性細胞材料の凝集体を形成することを指す。可溶化のための条件は、好ましくは、本発明のタンパク質を凝集させることによって、例えば遠心分離により容易に単離できるほど十分大きい不溶性凝集体を生ずることである。
【００９５】
好ましくは、破砕された微生物のグラム重量に対するサルコシンの最終比が１．０グラムサルコシン／４．５グラムペレット質量〜６．０グラムサルコシン／４．５グラムペレット質量、好ましくは４．５グラムサルコシン／４．５グラムペレット質量となるように、サルコシンを添加する。微生物の溶解度は、例えば、光学密度の変化をはじめとする、当該技術分野において公知の常法によって測定できる。可溶化は、典型的には、少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、最も好ましくは少なくとも６０時間生起させる。破砕中の温度は、典型的には低く維持され、好ましくは４℃に維持される。
【００９６】
本明細書に記載のタンパク質を含む不溶性凝集物は、遠心分離、濾過、またはそれらの組み合わせなどの、当該技術分野において公知の常法によって単離することが可能である。一実施形態では、不溶性凝集物を、接線方向またはクロスフロー濾過などの濾過によって単離する。接線方向の濾過と共に用いられる分子量カットオフの例は、１００ｋＤａまたは３００ｋＤａである。一実施形態において、接線濾過システムは、孔径０．２ミクロンである。接線方向の濾過は、タンパク質懸濁液から残留サルコシンを除去する助けになり得る。接線方向の濾過によって、結果として、タンパク質懸濁液が濃縮されるので、不溶性凝集物を単離するためのコストを、大幅に削減できる。
【００９７】
一実施形態では、単離されたタンパク質からサルコシンを除去する。単離されたタンパク質からサルコシンを除去する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、透析濾過、沈殿、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び限外濾過のほか、透析濾過によってイソプロピルアルコールなどのアルコール中でタンパク質を洗浄することが挙げられる。単離後のタンパク質を緩衝液中に懸濁させ、−２０℃以下などの低温にて貯蔵した。
【００９８】
全細胞調製物を作製する必要のある本発明の態様では、成長後の微生物を、培養物中の細胞を不活性化するのに十分な濃度で、グルタルアルデヒド、ホルマリン、またはホルムアルデヒドなどの薬剤を添加することにより、殺滅させる場合がある。例えば、ホルマリンは、０．３％（体積：体積）の濃度で添加できる。細胞を不活性化するのに十分な時間が経過した後、細胞を、例えば透析濾過及び／または遠心分離により採取し、洗浄してもよい。
【００９９】
他の態様では、本発明の単離されたタンパク質は、組み換え的に調製できる。タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組み換え的に調製されている場合に、同定して、適切な発現宿主にクローン化できる。組み換え発現宿主を適当な培地中で成長させ、破砕して、タンパク質を上記のように単離してもよい。
【０１００】
使用方法
また、本明細書に記載の組成物を使用する方法も、提供されている。本方法は、動物に対し有効量の本明細書中に記載されている組成物を投与することを含む。本明細書に記載の組成物の「有効量」とは、本明細書中に用いられている場合、レシピエントにおいて所望の反応を誘発できる量である。組成物は、母系抗体が存在し得る時点で、例えば、早ければ生後１日目に投与される場合もあれば、または動物の生涯の後期に投与される場合もある。一実施形態において、本組成物が動物に投与されるのは、動物の離乳前、または動物の離乳した時点（動物が母親の母乳以外の食物に慣れ始めた頃）である。動物は、例えば、魚類、鳥類（例えば、ニワトリまたはシチメンチョウを含む）、ウシ類（例えば、畜牛を含む）、ヤギ類（例えば、ヤギを含む）、ヒツジ類（例えば、ヒツジを含む）、ブタ類（例えば、ブタを含む）、バイソン類（例えば、バッファローを含む）、ウマ類（例えば、ウマを含む）、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコを含む）、Ｃｅｒｖｉｄａｅ科のメンバー（例えば、シカ、エルク、ムース、カリブー、トナカイを含む）、またはヒトであり得る。伴侶動物の例としては、イヌ及びネコが挙げられる。一実施形態において、動物はマウスである。一実施形態において、動物は飼い慣らされた動物である。
【０１０１】
本明細書に記載の方法は、グラム陰性微生物に言及する。本明細書中に用いられているグラム陰性微生物としては、限定されるものではないが、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．などのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバー、例えば、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．（例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａなど）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ  ｓｕｂｓｐ．、Ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（旧称：Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｐ．、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉなど）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．など）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバー、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）が挙げられる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．の例としては、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＫ．ｏｘｙｔｏｃａが挙げられる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒｓ．、Ｂｒｅｄｅｎｅｙ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ａｇｏｎａ、Ｂｌｏｃｋｌｅｙ、Ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ、Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈａｄａｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、及びＳ．ｔｙｐｈｉが挙げられる。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株の例としては、例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ血清型１〜１６（血清型１、２、３，４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６）またはそれらの組み合わせは、（例えば２、５、別名：２×５；血清型２及び５の両方をＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａが発現する。あるいは３、４、別名：３×４；血清型３及び４の両方をＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａが発現する）が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例には、例えばＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏｌａ、Ｏ２ａ、Ｏ７８、及びＯ１５７；０１０４、０１１１、０２６、０１１３、０９１などの、種々のＯ：Ｈ血清型；Ｋ８８＋、Ｆ４＋、Ｆ１８ａｂ＋及びＦ１８ａｃ＋のような腸管毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉの溶血性菌株；Ｅ．ｃｏｌｉの腸管病原性（ＥＰＥＣ）株、腸管出血性（ＥＨＥＣ）株、腸管侵入性（ＥＩＥＣ）株及び腸管凝集性（ＥＡＥＣ）株；尿路病原性株などの腸管外感染症を発症させる恐れのあるＥ．ｃｏｌｉが挙げられる。一実施形態において、グラム陰性微生物は病原微生物である。呼吸器病原体は、例えば、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ種、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ種及びＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ種、ならびにＢ．ａｖｉｕｍ種などのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、或る方法は、動物に対し、組成物を更に投与（例えば、１回以上の追加免疫投与）することによって、二次免疫応答を増強または刺激することを更に含み得る。追加免疫は、初回投与後の或る時点で、例えば、組成物の初回投与後、１〜８週間目に、好ましくは２〜４週間目に投与できる。後続の追加免疫は、１年に１回、２回、３回、４回、またはそれ以上の回数投与できる。理論に束縛されることを意図するものではないが、いくつかの実施形態では、動物に投与される組成物のタンパク質上に存在するエピトープに対し構造的に関連するエピトープを有するタンパク質を発現する微生物に曝露することによって、実地にて動物に抗原曝露が為されるので、年次の追加免疫は必要のないことが予期される。
【０１０３】
一実施形態において、或る方法は、例えば、動物において抗体の産生を誘導することにより、または組み換え技法により、本明細書に記載のタンパク質に対する抗体を作製することを含む。産生される抗体としては、本組成物中に存在する少なくとも１つのタンパク質に対し特異的に結合する抗体が挙げられる。本実施形態において、「有効量」は、動物において抗体を産生させるのに有効な量である。本明細書に記載の組成物中に存在するタンパク質に特異的に結合する抗体が動物によって産生されたかどうかを判別するための方法は、常法を用いて特定できる。また、本明細書に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体、及びそのような抗体を含む組成物も、提供されている。
【０１０４】
本明細書中に用いられている、タンパク質に対し「特異的に結合する」できる抗体は、抗体の合成を誘導した抗原のエピトープと相互作用する抗体、または構造的に関連するエピトープと相互作用する抗体である。本明細書に記載のタンパク質中に存在するエピトープのうちの少なくともいくつかは、異なる種のタンパク質及び異なる属の微生物内に保存されているエピトープである。したがって、本明細書に記載のタンパク質を使用して産生された抗体は、２つ以上の種の微生物によって発現されるタンパク質に結合し、グラム陰性微生物に対して広域スペクトル保護を提供すると予期される。
【０１０５】
一実施形態において、或る方法は、グラム陰性微生物に起因する、動物における感染症の治療を含む。本明細書中に用いられている「感染症」という用語は、動物の体内にグラム陰性微生物が存在することが、臨床的に明らかである可能性もあればそうでない可能性もあることを意味する。感染症の治療は予防的である場合もあれば、あるいは動物が微生物に感染した後に開始される場合もある。例えば、対象が微生物に感染する前、または感染が無症候性のまま維持されているうちに開始される予防的な治療は、本明細書中では、「リスクに曝されている」対象の治療と呼ばれている。本明細書中に用いられている「リスクに曝されている」という用語は、記載されたリスクを実際に保持している可能性もあればそうでない可能性もある動物を指す。それゆえ、典型的には、微生物による感染の「リスクに曝されている」動物は、たとえ動物が微生物による感染の検出可能な徴候をまだいっさい顕現化していない場合でも、且つ動物が無症状量の微生物を保有しているかどうかには関係なしに、動物が微生物に感染していると同定され、及び／または微生物に曝露される可能性の高い地域に存在する動物である。したがって、組成物の投与は、動物が初めて微生物と接触する前、接触している間、または接触した後に実施できる。治療開始が、動物が初めて微生物に接触した後であった場合、微生物による症状の重篤度及び／または感染の臨床的徴候が軽減され、微生物が完全に除去され、及び／または組成物が投与されていない動物と比較して臨床的に明らかな感染を経験する尤度が低下する。本方法は、本明細書に記載の有効量の組成物を、グラム陰性微生物に起因する感染症を有するかまたは有するリスクに曝されている動物に投与することと、感染症を発症させる微生物の数が減少したかどうかを判別することとを含む。本実施形態において、「有効量」とは、組成物が投与されていない動物と比較して、動物における特定の微生物の数を減少させるのに有効な量、または動物が臨床的に明らかな感染を経験する尤度を低下させるのに有効な量である。感染症がグラム陰性微生物に起因するかどうかを判別するための方法は、感染症が軽減されたかどうかを判別するための方法と同様に、当該技術分野において公知の常法である。動物におけるグラム陰性微生物感染症に対する治療の奏功については、実施例１５〜１６に開示されており、本明細書に記載の組成物が２つのＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株（１つの血清型２×５及び１つの血清型３×４）から作製されたものであり、血清型１のＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによる抗原曝露からニワトリを保護したことを実証する。
【０１０６】
別の実施形態において、或る方法は、グラム陰性微生物による感染に起因する可能性のある、動物の特定の病態の１つ以上の症状または臨床徴候を治療することを含む。本方法は、本明細書に記載の有効量の組成物を、病態を有するかまたは有するリスクに曝されているか、または病態の症状及び／または臨床的徴候を示す動物に投与することと、その病態の少なくとも１つの症状及び／または臨床徴候が変化したか、好ましくは低減したかどうかを判別することと、を含む。一実施形態において、その動物は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．（例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、及びＰ．ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒなど）、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｐ．、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．のようなＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバーに起因する症状を有する。症状の例としては、限定されるものではないが、家禽コレラ、ニューダック病、ウシ呼吸器病症候群（出荷熱肺炎、または単に肺炎とも呼ばれる）、熱帯・亜熱帯地域内の畜牛、バッファロー及びバイソンの出血性敗血症、ブタの肺炎及び萎縮性鼻炎、ウサギの鼻カタル、及びヒツジの乳房炎及び肺炎が挙げられる。Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａは、  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとしても公知であり、ウシの海綿状熱、新生児の敗血症、及び成体のヒツジの肺炎と乳房炎に関与する線維性胸膜炎の病因となる恐れがある。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．は、ブタのグレーサー病、ニワトリのトリコリーザ、ウマ類の伝染性子宮炎の病因となる恐れがある。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａは、甚急性の形態では最も有毒でしかも非常に感染力の高い家禽疾患の１つである、家禽コレラの病因となる恐れがある。Ｐ．ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒは、ニューダック病（別称：アヒル敗血症、または感染性漿膜炎）の病因となる恐れがある。
【０１０７】
グラム陰性微生物による感染に起因する病態に付随する症状及び／または臨床徴候の治療は、予防的とされる場合もあれば、代替的に本明細書に記載の病態が発症した後に開始される場合もある。本明細書中に用いられている「症状」という用語は、患者が経験し、微生物による感染に起因する疾患または病態の主観的証拠を指す。本明細書中に用いられている「臨床徴候」または単に「徴候」という用語は、微生物による感染に起因する疾患または病態の客観的証拠を指す。本明細書で言及される病態に付随する症状及び／または臨床徴候、ならびにそのような症状の評価は、当該技術分野において公知の常法である。例えば、対象が微生物に起因する病態の症状または徴候を示す前に開始される予防的治療は、本明細書では、病態を発症する「リスクに曝されている」対象に対する治療と呼ばれる。それゆえ、典型的には、病態を発症する「リスクに曝されている」動物とは、動物が微生物に起因する如何なる病態の症状もしくは徴候をまだ顕現化していない場合でさえも、その病態を有する動物が診断されている及び／またはその病態の原因となる微生物に曝露される恐れの高い地域に存在する動物である。したがって、組成物の投与は、本明細書に記載の病態が発呈する前、発呈している間、または発呈した後に実施できる。グラム陰性微生物感染に起因する症状及び／または臨床徴候は、当業者に公知である。症状及び／または臨床徴候の例としては、限定されるものではないが、肺炎、鬱病及び中毒症；粘液膿性鼻分泌に対し深刻な発熱；湿咳；急速表浅呼吸率；畜牛及びブタの肺における膿瘍または病変；家禽及び野鳥における急性敗血症、関節感染症及び関節炎；ブタにおける鼻甲介萎縮；ネコにおける表在性膿瘍；ヒトにおける（通常はイヌもしくはネコによる咬傷が原因で起こる）咬傷感染症が挙げられる。病態の発症後に治療を開始することによって、結果的に、その病態のうちの１つの症状もしくは徴候の重篤度が軽減される可能性もあれば、またはその症状もしくは徴候が完全に解消される可能性もある。本実施形態において、「有効量」とは、疾患の症状もしくは徴候の顕現化を予防し、疾患の症状もしくは徴候の重篤度を軽減し、及び／またはその症状もしくは徴候を完全に解消するのに有効な量である。
【０１０８】
また、グラム陰性微生物によるコロニー形成抑制法、例えば、骨格系の組織（骨、軟骨、腱及び靭帯など）、筋肉系（骨格筋及び平滑筋など）、循環器系（心臓、血管、毛細血管及び血液など）、神経系（脳、脊髄、肛門及び末梢神経など）、呼吸器系（鼻、気管の肺、気管支、細気管支、肺胞など）、消化器系（口、唾液腺、食道、肝臓、胃、大腸及び小腸など）、排泄系（腎臓、尿管、膀胱、尿道及び尿道など）、内分泌系（視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓及び副腎など）、生殖器系（卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣及び精嚢など）、リンパ系／免疫系（リンパ球、リンパ節及びリンパ管；単核球；または白血球、例えばマクロファージ、好中球、単球、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞もしくはＢ細胞などのリンパ球）、特異的な細胞系譜（前駆細胞、上皮細胞、幹細胞）ならびにそれらに類するものなどのグラム陰性微生物の付着部位を遮断する方法も提供されている。
【０１０９】
動物におけるコロニー形成の低減は、予防的に行われる場合もあれば、代替的に、動物が微生物によるコロニー形成を被った後に開始される場合もある。本明細書において予防的な治療は、例えば、対象が微生物によるコロニー形成を被る前にまたは何らかのコロニー形成が未検出のままのうちに開始された場合、微生物によるコロニー形成を被る「リスクに曝されている」対象に対する治療と呼ばれている。それゆえ、典型的には、微生物によるコロニー形成を被る「リスクに曝されている」動物は、たとえ動物が微生物によるコロニー形成を被る検出可能な徴候をまだいっさい顕現化していない場合でも、且つ動物の保有している微生物数がコロニー形成数を下回るかどうかには関係なしに、動物が微生物に感染していると同定され、及び／または微生物に曝される可能性の高い地域に存在する動物である。したがって、組成物の投与は、動物が初めて微生物と接触する前、接触している間、または接触した後に実施できる。治療開始が、動物が初めて微生物に接触した後であった場合、微生物によるコロニー形成の度合いを低減させ、微生物を完全に除去し、及び／または組成物の投与されていない動物と比較して動物に微生物がコロニー形成する尤度を低下させる。それゆえ、本方法は、グラム陰性微生物によるコロニー形成を被った動物に対し、またはそのグラム陰性微生物によるコロニー形成を被るリスクに曝されている動物に対し、本明細書に記載の有効量の組成物を投与することを含む。本実施形態において、「有効量」とは、動物における微生物のコロニー形成を減少させるのに十分な量であり、ここで言うコロニー形成の低減とは、微生物によるコロニー形成の度合いを低減させること、微生物を完全に除去すること、及び／または組成物の投与されていない動物と比較して動物に微生物がコロニー形成する尤度を低下させること、のうちの１つ以上を指す。動物における微生物のコロニー形成を評価するための方法は、当該技術分野において公知の常法である。例えば、動物の気道に微生物がコロニー形成したかどうかは、気管スワブ、経気管洗浄、または気管支肺胞洗浄によって動物の下気道から採取された標本内の微生物の存在を測定することによって確認できる。動物における微生物のコロニー形成を低減させることにより、同じ種または異なる種の他の動物に対する微生物の伝播が低減することが、予期される。
【０１１０】
また、本明細書に記載のタンパク質上に存在するエピトープと構造的に関連するエピトープを有するタンパク質を発現する微生物を標的とすることを目的とした、そのような抗体の使用も提供されている。本明細書に記載の組成物を用いることにより、細菌感染に対する能動的または受動的免疫を提供することが可能となる。一般に、本組成物を動物に投与することにより、能動免疫を提供できる。一方、また、本組成物を使用して、抗体のような免疫産物の産生を誘導することも可能であるし、これらの免疫産物を産生動物から採取して別の動物に投与することで、受動免疫をもたらすことも可能である。抗体のような免疫成分を収集して、受動免疫療法用の血清、血漿、血液、初乳などから組成物（好ましくは、抗体を含有するもの）を調製できる。モノクローナル抗体及び／または抗イディオタイプを含む抗体組成物もまた、公知の方法を用いて調製できる。キメラ抗体は、重鎖及び軽鎖両方のヒト由来定常領域と、抗原特異的であるネズミ由来可変領域と、を含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１（２１）：６８５１−５；ＬｏＢｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６（１１）：４２２０−４；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２（５９９５）：６４３−６．）。ヒト化抗体は、（可変領域の）ネズミの定常及びフレームワーク（ＦＲ）をヒトの対応物で置換する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１（６０６９）：５２２−５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２（６１６２）：３２３−７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９（４８４７）：１５３４−６；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６（２４）：１００２９−３３；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９（９）：２４７１−６．）。代替的に、ほぼ完全にヒト起源の抗体を産生するように遺伝的に操作された或るマウス株を用い、免疫後に、これらのマウスのＢ細胞を採取して不死化させることによって、ヒトモノクローナル抗体の産生が可能になる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８（４）：４５５−８；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；１３（１）：６５−９３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６８：８５６−９；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：６２８７−９５．）。受動抗体組成物及びそのフラグメント、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ、またはそれらの他の修飾型は、血清、血漿、血液、初乳などの形態でレシピエントに投与できる。一方、また、公知の方法を用い、血清、血漿、血液、初乳などから抗体を単離することで、爾後に、例えば洗浄溶液、含浸包帯剤及び／または局所剤などのような、濃縮形態または再構成形態にて使用する目的に���応できる。受動免疫製剤は、急性全身性疾患の治療、または母体初乳を通して適切なレベルの受動免疫を受けられなかった幼若動物の受動免疫にとりわけ有利であり得る。また、受動免疫に有用な抗体は、全身的もしくは局所的感染の最中に、本明細書に記載のタンパク質上に存在するエピトープと構造的に関連するエピトープを有するタンパク質を発現する細菌を直接標的とし得る、種々の薬物または抗生物質に対し共役させるのに有用であり得る。
【０１１１】
動物モデルは、本明細書に記載の組成物を実験的に評価する目的に利用可能である。これらのモデルは、グラム陰性微生物に起因する疾患を研究する目的で、一般に是認されたモデルである。グラム陰性微生物が、ウシまたはニワトリのような動物において疾患を発症させる事例では、天然宿主を用い、本明細書に記載の組成物を実験的に評価してもよい。
【０１１２】
しかし、組成物がグラム陰性微生物による感染に対して動物を保護できるかどうかを評価する方法は、動物モデルにおける防御だけに限られたものではない。適応免疫応答は、体液性（抗体）応答及び細胞性（Ｔ細胞）応答の、２つの主要区分からなる。感染部位の樹状細胞は、細菌性病原体に感染した後、微生物抗原に遭遇し、特定の細菌に関連する保存された分子パターンに応答して、例えば表面受容体及びサイトカインなどのシグナル伝達分子を産生する。これらのシグナルは病原体の性質によって形作られ、理想的には適切な抗体反応及びＴ細胞反応に至り、宿主を疾患から防御する。いくつかの細菌性疾患は、主に抗体機能によって制御されるのに対し、他の細菌性疾患は、防御にＴ細胞応答、または抗体及びＴ細胞の両方の応答を必要とする。ワクチン生物学の目的は、まず防御を施す免疫応答を同定すること、次にこれらの応答のうちの１つ以上をヒトにおいて生ずるようなワクチンを設計することにある。
【０１１３】
抗体は、例えば補体固定、オプソニン化、中和及び／または凝集のような、感染に対し防御を施すうえで多種多様な機能を有し得る。更にそのうえ、抗体のサブクラスによっては、特定の機能が他のサブクラスより優れるものもある。例えば、ヒトＩｇＧサブクラスでは、補体固定用に存在する階層は以下の通り：ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４である。
【０１１４】
抗体の免疫学的機能を研究する方法は、多岐にわたり得る。例えば、分離されたタンパク質のサイズに基づいて抗原特異的結合を同定するには、ウエスタンブロットを用いる一方、血清中の抗体価に関する定量的な情報を生成するには、標準の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いる。抗体表面結合研究を用いて、血清中の抗体が無傷の細菌表面上の抗原を認識できるかどうかを判別する。これは、抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで作用し得るかどうかに関する重要な指標となる。それゆえ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（例えば、ヒト抗血清を用いる）などの抗体結合アッセイ、及び／または表面結合が、微生物感染に対する免疫学的活性を提供する特異的に結合した抗原と正に相関することが、当業者に認識される。しかしながら、当業者に更に認識されるように、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または表面結合アッセイのようなアッセイにおいて抗体結合が欠如するからといって、アッセイされた抗原が微生物感染に対して免疫学的活性を提供できないことを意味するものではない。
【０１１５】
抗体は、栄養素の獲得を妨げるか、または補体媒介性の膜貫通を開始することにより、細菌死を仲介する場合があり、これは浸透圧溶解につながる。殺菌抗体は、当業者に公知の適切な条件下で、血清を生培養物と混合し、生存細菌の存在に関する測定を行うことによってアッセイできる。抗体及び補体結合細菌を、ヒトまたはマウスの食細胞と組み合わせて細菌殺滅レベルを判別するオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）などの技法は、抗体機能を研究するうえで有用である。同様の酸化的バーストアッセイを用いて、抗体及び補体結合細菌との相互作用後の、新鮮なヒトまたはマウス好中球による活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを評価してもよい。
【０１１６】
いくつかの事例において、本明細書に記載のタンパク質は、グラム陰性微生物に対して細胞性免疫活性を有し、抗体の産生を誘導することなしに、そのタンパク質が免疫活性を呈し得ることを判別できる。細胞傷害性またはＣＤ８  Ｔ細胞は、主に様々なエフェクター機序を介して直接的に感染細胞を殺滅させる一方、ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞はサイトカインのように、重要なシグナル伝達が提供されるように機能する。これらのＴ細胞クラスにより産生されたサイトカインに基づいて、Ｔ細胞クラスを更に細分でき、種々の細菌性病原体に対して種々のサブクラスが有効となる。Ｔ細胞は、多くの場合、フローサイトメトリーで表現型を評価し、抗体を使用し、特異的表面マーカーのレベルを視覚化し、Ｔ細胞の分類（例えば、最近活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞など）を可能にすることにより、研究される。加えて、サイトカイン及びＴ細胞の他の産物は、リンパ系組織からＴ細胞を単離してそれらを同種抗原で再刺激することによって研究できる。抗原刺激後、Ｔ細胞によってサイトカインが産生される。このサイトカインを明視化する目的で、例えば、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリーとを併用するかまたは細胞上清を収集しＬｕｍｉｎｅｘビーズ技術を用いて、１５〜２５個のサイトカインを同時測定する場合もある。
【０１１７】
それゆえ、当業者に認識されるように、本明細書に記載の方法と相応な免疫学的活性は、動物モデルと相関し得るだけでなく、微生物病原体に曝露された動物由来の血清が本明細書に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを示すウエスタンブロットデータ；本明細書に記載のタンパク質に曝露された動物由来の血清がグラム陰性微生物に特異的に結合する抗体を含むことを示すウエスタンブロットデータ；本明細書に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体がグラム陰性微生物に特異的に結合することを実証する細胞表面結合アッセイ；オプソニン食作用データ；及びサイトカイン誘導のうちのいずれか１つ以上とも相関し得る。
【０１１８】
また、本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を検出する方法も、提供されている。これらの方法は、例えば、動物が本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を有するかどうかを検出するうえで、及び動物が本明細書に記載のタンパク質とエピトープを共有するタンパク質を発現する微生物に起因する病態を有し得るかどうかを診断するうえで有用である。そのような診断システムは、キットの形態とされる場合もある。本方法は、本明細書に記載のタンパク質含有の調製物に抗体を接触させることにより、混合物を得ることを含む。抗体は、血液、乳汁または初乳のような、生物学的サンプル中に存在する場合がある。本方法は、タンパク質に対し抗体が特異的に結合するのを可能にする条件下で、混合物をインキュベートすることにより、タンパク質：抗体複合体を形成することを更に含む。本明細書中に用いられている「タンパク質−抗体複合体」という用語は、抗体がタンパク質に対し特異的に結合したときに結果として生ずる複合体を指す。また、本明細書に記載のタンパク質を含む調製物には、タンパク質：抗体複合体の形成に適した条件を提供する、緩衝液などの試薬を含める場合もある。次いで、プロテイン抗体複合体が検出される。抗体の検出は、当該技術分野において公知であり、例えば免疫蛍光またはペルオキシダーゼを含む場合がある。本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体の存在を検出するための方法は、抗体を検出する目的に使用されてきたラジオイムノアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイをはじめとする、様々な形式で使用できる。
【０１１９】
キット
また、キットも提供されている。一実施形態において、キットは、本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を検出することを目的としたものである。検出された抗体は、グラム陰性微生物に起因する感染症を有することが疑われる動物から得ることが可能である。別の実施形態において、キットは本明細書に記載のタンパク質を検出することを目的としたものである。更に別の実施形態において、キットは、例えば、本明細書に記載のタンパク質を用いて、抗体を産生すること、病態を治療すること、または感染症を治療することを目的としたものである。
【０１２０】
本キットは、本明細書に記載のタンパク質のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つなど）、または好適なパッケージング材料中の本明細書に記載の抗体を、少なくとも１つのアッセイもしくは使用に十分な量にて具備する。また、任意に、緩衝液及び溶液など、他の試薬を含めてもよい。例えば、本キットはまた、試薬も含み得る。この試薬は、本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体（例えば、動物から得られる抗体に特異的に結合するように設計され、検出可能に標識された二次抗体など）の検出を可能にする。
また、パッケージされた抗体またはタンパク質の使用指示書も、付属しているのが一般的である。本明細書中に用いられている「パッケージング材料」という語句は、本キットの内容物を収容するために用いられる１つ以上の物理的構造を指す。パッケージング材料は、概して、汚染物フリーの無菌環境が提供されるように常法で作製されている。パッケージング材料には、本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を検出する目的に、または本明細書に記載のタンパク質を使用する目的に、タンパク質を使用可能であることを指示するラベルを付けることができる。加えて、パッケージング材料には、本キット中の材料の使用法を指示する指示書も収録されており、抗体の検出、または動物に対するタンパク質投与が可能になっている。本明細書中に用いられている「パッケージ」という用語は、タンパク質及び他の試薬（例えば、二次抗体）を一定範囲内に保持できる、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどのような容器を指す。それゆえ、例えば、パッケージを、マイクログラム量のタンパク質が付着されたマイクロタイタープレートウェルとしてもよい。また、パッケージに、二次抗体も収録されている場合もある。「使用指示書」には通常、試薬濃度、または混合される試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持期間、温度、緩衝液条件などのような少なくとも１つのアッセイ方法パラメータを記述した、実体的な表現が含まれる。
【０１２１】
本発明を、下記実施例によって例証する。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び趣旨に従って広く解釈する必要のあることを理解すべきである。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
型株の選択及び調製
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株Ｘ−７３、Ｐ−１０５９及びＰ−１６６２は、それぞれ血清型Ａ：１、Ａ：３及びＡ：４に対する基準株である。また、血清型１、３、及び４は、それぞれ血清型１、３、及び４とも呼ばれる。これらの菌株をそれぞれ凍結乾燥培養物として、ＵＳＤＡ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＶＳＬ）（Ａｍｅｓ，ＩＡ）から入手した。培養液を滅菌食塩水中に再懸濁させ、単離用に、滅菌接種用ループを用いてトリプチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）＋５％ヒツジ血液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ  ＭＤ）上に画線し、３７℃で一晩インキュベートした。無菌接種ループを用いて、プレートからいくつかの単離したコロニーを選び取り、凍結保存の目的で、ポリスチレンビーズ含有のクライオバンクチューブ（Ｃｏｐａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｕｒｒｉｅｔｔａ  ＣＡ）に移した。その後、クライオバンクチューブを−６０℃未満で貯蔵した。
【０１２３】
実施例２
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ分離株の調製
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの血清型３×４は当初に、パスツレラ症の臨床徴候を示した自然界条件下にて、４４週齢のシチメンチョウ繁殖鶏の肝臓及び肺から単離されたものであった。分離株をトリプシン大豆寒天培地（ＴＳＡ）＋５％ヒツジ血液上に播種した。この生体を、初回分離後に、非動物由来のトリプチケースソイブロス（ｎａＴＳＢ）（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｒｍｓｔａｔｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１８μｇ／ｍｌの２，２’−ジピリジル（ＤＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）及び酵母エキス６ｇ／１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｏｋｅｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）を補充したもの）に５回通した。概略説明すると、コロニーを採取し、５００ｍｌのｎａＴＳＢ中に接種し、毎分１０５回転（ＲＰＭ）に設定された卓上振盪機上で、培養物を３７℃にて１６時間２５分間インキュベートした。翌朝、２５ｍｌの一晩培養物を５００ｍｌの新鮮なｎａＴＳＢに移し、同じ温度にて撹拌しながら８時間インキュベートした。５ｍｌの培養物を５００ｍｌの新鮮なｎａＴＳＢに移し、上記と同じ条件下で１５時間インキュベートした。この培養液５０ｍｌを５００ｍｌの新鮮なｎａＴＳＢに移し、同じ方法で４時間かけてインキュベートした。ｎａＴＳＢ９００ｍｌをそれぞれ含有する４本のボトルに、それぞれ先行の培地を１００ｍｌずつ接種し、３時間４５分かけてインキュベートした。培養物４リットルを無菌的に５００ｍｌのＮａｌｇｅｎｅジャーに分注し、ＢｅｃｋｍａｎモデルＪ２−２１遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ  ＣＡ）で３５００ｒｐｍまたは約１３５０×ｇにて２０分間遠心分離させて、細菌細胞をペレット化した。上清を吸引により無菌的に除去し、凍結保存剤として２０％グリセロールを含有する総量５００ｍｌのｎａＴＳＢ中に、細胞ペレットを再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液をバイアル２４３本に、１バイアル当たり２ｍｌずつ分注して、−６０℃未満で凍結させた。この冷凍マスターシードは、ＭＳ０６１１３０と命名された。
【０１２４】
上記の冷凍マスター種子から作業用種子を調製した。概略説明すると、凍結種子１〜２５μｌを、６ｇ／ｌの酵母抽出物を含有する修飾トリプトースホスフェートブロス（ｍＴＰＢ）１００ｍｌ内に接種した。５４０ｎｍまたは６３０ｎｍに設定されたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）上で、培養物が０．６〜０．８の光学密度（Ｏ．Ｄ．）に達するまで、培養物を卓上振盪機上で３７℃にて１３時間インキュベートした。１８μｇ／ｍｌの２，２’ジピリジルを補充された９０ｍｌのｍＴＰＢ中に、培養物１０ｍｌを移して、撹拌しながら３７℃にて２〜３時間インキュベートした。上記と同じ方法で、培養物を更に２回移して成長させた。培養物がＯ．Ｄ．０．８に達したときに細胞を約３５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離させ、上清を吸引により無菌的に除去して、培養物を元の容量の新鮮ｍＴＰＢ中に再懸濁させた。最終濃度が２０％に達するように、滅菌グリセロールを加えた。培養物を十分に混合し、滅菌極低温バイアルに１バイアル当たり２ｍｌ分取して、−６０℃未満で凍結貯蔵した。
【０１２５】
実施例３
金属調節タンパク質の製造
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ型株（Ｘ−７３、Ｐ−１０５９、及びＰ−１６６２）及び実施例２のワクチン候補株（ＭＳ０６１１３０）を、差次的な膜タンパク質発現を呈するように、鉄制限条件及び鉄充足条件で成長させた。
【０１２６】
実施例１からの凍結型株培養物、及び実施例２からの作業種子単離物の各々を、１０ｍｌのブタ脳心臓注入ブロス（ＢＤ−Ｄｉｆｃｏ，Ｓｐａｒｋｓ  ＭＤ）＋  ６ｇの酵母抽出物（ｐＢＨＩ）中に接種してから、撹拌しながら３７℃にて一晩インキュベートした。培養液のうち２つはブロス中で直接的に成長しなかったので、まずＴＳＡ＋血液寒天プレート上に接種してから、３７℃にて一晩インキュベートした後、コロニーをｐＢＨＩに移した。一晩培養された培養物各５ｍｌを、鉄充足条件または鉄枯渇条件に対して、それぞれ２０μｇ／ｍｌのＦｅＣｌ３もしくはＤＰを含有する新鮮なｐＢＨＩ１００ｍｌに移した。培養物を、卓上シェーカー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ，Ｄｕｂｕｑｕｅ  ＩＡ）上で撹拌しながら３７℃にて７時間３０分インキュベートした。インキュベーション後に、ボトルが白濁したことから、力強い成長が示唆された。次いで、培養物５０ｍｌを、ＦｅＣｌ３またはＤＰのいずれかを含有する５００ｍｌの新鮮ｐＢＨＩに移してから、撹拌しながら３７℃で１５時間インキュベートした。
【０１２７】
培養物を処理し、外膜タンパク質を単離した。概略説明すると、ＪＡ−１０ローター装備のＢｅｃｋｍａｎフロアモデル遠心分離機で、培養物を約１１，０００×ｇにて２０分間遠心分離させた（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ  ＣＡ）。上清を傾瀉させて破棄した。７．２６グラム／リットルのトリス塩基及び０．９３グラム／リットルのＥＤＴＡ含有の浸透圧ショック緩衝液（ＯＭＳ）３５ｍｌ中に、細胞ペレットを再懸濁させ、ｐＨを８．５に調整して、細胞懸濁液を−８０℃で３時間凍結することにより、細胞壁構造の減弱化を助けた。次いで、細胞懸濁液を解凍し、氷水浴なかで９０秒間超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ，モデル１０２ｃ）（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）、破壊された細胞懸濁液が過剰に加熱するのを防止した。細胞残屑を、約３７，０００×ｇにて２０分間遠心分離することにより、除去した。保持された上清に、ラウロイルサルコシルナトリウムを添加し、３％ｖ／ｖの濃度に達したら、タンパク質懸濁液を４℃で１８〜２４時間かけて、わずかに撹拌しながら可溶化させた。不溶性膜タンパク質を、３７，０００×ｇにて少なくとも２時間遠心分離することにより収集した。トリス緩衝水中にペレットを再懸濁させ、メーカーの指示に従い、結果として得られた抗原のタンパク質含有率を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）により、測定した。
【０１２８】
実施例４
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる金属調節タンパク質パターンカバレッジに対する試験、及びタンパク質結合の分析
鉄制限下で成長させた各単離物由来の細胞抽出物を、４％濃縮用ゲル及び１０％分離用ゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズ分画させた。４分間煮沸した３０μｌのＳＤＳ還元サンプル緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール）とサンプル３０μｇとを混合することによって、電気泳動用サンプルを調製した。標準的な方法に従い、各抽出物のサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させ、クマシーブルー染色により明視化した（図１）。ワクチン候補株（ＭＳ０６１１３０）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の型株と比較した。６６〜１１６ｋＤａの間の領域における、バンディングパターンに特に注目した。ワクチン候補株は、図１に示すような、型株と重複するバンドを実証しており、更なる防御研究のための有力候補であると考えられた。
【０１２９】
実施例５
金属調節タンパク質の製造
抗原Ａ及び抗原Ｂと命名された、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの単一のＭａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ  ＭＳ０６１１３０株を用いて、２つの別々の抗原組成物を生産規模にて調製した。この調製を実施することにより、製造プロセスの一貫性を評価した。
【０１３０】
発酵
実施例２の作業用種子の極低温バイアルを３０〜３５℃で１０〜１５分間解凍し、解凍した細胞懸濁液０．１ｍｌを３７℃のｍＴＰＢ２５０ｍｌに添加した。７０ｒｐｍに設定された卓上振盪機上で、培養物を３７℃にて６．５時間インキュベートした。インキュベーション後に、培養物２５ｍｌを３００ｍｌのｍＴＰＢと１８μｇ／ｍｌのＤＰに移して鉄を制限した。この第２の培養物を、７０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で約２時間インキュベートした。培養物２５０ｍｌを上記の培地３リットル中に移し、（５４０ｎｍにて測定された）ＯＤが１に達するまで７０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で約３時間インキュベートした。全培養物を使用して、７０リットルのｍＴＰＢ＋１８μｇ／ｍｌのＤＰ及び０．５ｍｌ／消泡剤１個（ＭＡＺＵ  ＤＦ  ２０４  Ｃｈｅｍ／Ｓｅｒｖ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を充填した１３０リットルの発酵槽（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に接種した。発酵のパラメータは以下の通り：自動撹拌制御及び気流スパージを、毎分６０リットル（ＬＰＭ）及び１平方インチ当たり５ポンド（ＰＳＩ）の背圧に設定することによって、溶存酸素（ＤＯ）を２０％（目標１５〜３０％）に維持した。溶存酸素を２０％に制御することにより自動的に制御し、培養物を撹拌しながらインキュベートした。５０％水酸化ナトリウムまたは１０％塩酸を自動滴定することにより、ｐＨを６．９〜７．１の間に自動的に制御した。温度を３７℃に維持した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定して５４０ｎｍにて光学濃度が４．２１に達するまで、このようにして培養物を約５時間成長させた。増殖培養物全体を、上記のように９８９ｌのｍＴＰＢ＋ＤＰ及び消泡剤を充填した１２００リットルの発酵容器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）に移した。発酵条件は以下の通り：気流を３００ＬＰＭに設定し、背圧を５ＰＳＩに設定した。まず撹拌を１００ＲＰＭに設定し、次いで２０％溶存酸素設定値（１５〜３０％の範囲）により制御した。培養物を更に５時間成長させる。遂には、１：１００希釈で１．５時間かけて成長をプラトーに到達させることにより、光学密度測定により５４０ｎｍにて約２．５と測定され、成長が安定となる。培養ｐＨを８．７に調節し、温度を２３℃に調節することによって、採取まで成長を中断させた。
【０１３１】
採取
接線流濾過によって、細菌細胞を収集した。２つの３０ｆｔ２  Ａｌｐｈａ  ３００−Ｋオープンチャンネルフィルター（カタログ番号ＡＳ３００Ｃ５）装備のＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｍａｘｉｓｅｔｔｅ−２５（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏ，ＭＡ）、カタログ番号ＡＳ３００Ｃ５（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）を、約４４Ｈｚに設定されたＷａｕｋｅｓｈａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｕ−６０フィードポンプ（Ｗａｋｅｓｈａ  Ｃｈｅｍｙ−Ｂｕｒｒｅｌｌ，Ｄｅｌｅｖａｎ，Ｗｉｓ．）に接続し、これを使用して、細菌発酵物を濃縮し、洗浄した。元の培養液量１０７８リットルを、フィルター入口圧力３０ｐｓｉ及び残留物圧力１２〜１４ｐｓｉを用い、プロセスタンク（Ｌｅｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，モデル２０００ＬＢＤＴ）に注入して、約１００リットルに減少させた。保持液（１００リットル）を、７．２６グラム／リットルのトリス塩基と０．９３グラム／リットルのＥＤＴＡとを含有する無菌の浸透圧衝撃緩衝液（ＯＭＳ）を用いて２００リットルに調整し、ｐＨを８．５に調整した。ＯＭＳ中のＥＤＴＡは、細胞壁からＬＰＳを除去するのに役立つ一方、ｐＨを上昇させることで、凍結及び破砕後のタンパク質分解の多くを防止する。ｐＨを上昇させる代わりに、またはそれに加えて、プロテアーゼ阻害剤を使用してもよい。保持液を濃縮して約６５リットルに戻し、系を２０リットルのＯＭＳでフラッシュした。ボトムマウント磁気駆動ミキサーを使用して、２００リットルタンク中で、保持液を完全に混合した。
【０１３２】
保持液をバイオセイフティキャビネット内の４リットルの滅菌ＮＡＬＧＥＮＥコンテナ番号２１２２に無菌的に分取（３．５リットル）し、貯蔵用に−２０℃の冷凍庫に入れた。細菌ペレットを凍結すると、細胞壁構造の脆弱化が助長され、下流の破砕が効率化されることになる。発酵培養物のサンプル３０ｍｌを遠心分離させ、最終採取することにより、ペレット質量を計算した。概略説明すると、ＪＡ−２１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  Ｃａｌｉｆ）を用い、予備秤量された５０ｍｌのＮＡＬＧＥＮＥコニカルチューブを、ＢＥＣＫＭＡＮ  Ｊ２−２１遠心分離機で３９，０００×ｇにて９０分間遠心分離させた。実験の終了時点で、上清を破棄してチューブを再び秤量した。ペレット質量をステージ毎に計算した。発酵プロセスで、湿潤ペレット塊３．７キログラムが生じた。
【０１３３】
細菌採取のための代替方法を使用してもよい。細菌採取を行う際に、中空糸フィルター法が用いられる場合もある。細菌培養物の採取には、０．６μＭ〜７５０ｋＤａの範囲のサイズのフィルターカートリッジ、好ましくは７５０ｋＤａカートリッジが使用される。培養液を１／２〜１／２０に減量し、続いて透析濾過により緩衝液で１〜５回洗浄した後、４℃で保存するかまたは−２０℃で凍結した。このようにすると、所望されない培地タンパク質、細菌タンパク質及びＬＰＳが、培養物から除去される。別の代替法では、細菌採取を行う際には、例えばディスクスタック遠心分離機を使用するといったように、産業規模の遠心分離が用いられる。
【０１３４】
破砕
凍結細菌細胞スラリーのＯＭＳ混液６５リットル（ペレット塊３．７ｋｇ）を、４℃で解凍した。各容器からの液体培養懸濁液を、１５０リットルのジャケット付きプロセスタンク（Ｌｅｅ，Ｍｏｄｅｌ  Ｓｔｙｌｅ  Ｕ）の蒸気中に無菌的に吸引した。細胞懸濁液をホモジナイズして破砕した。概略説明すると、細菌懸濁液を含有する１５０リットルタンクを、ＡｖｅｓｔｉｎモデルＥＦ−Ｃ５００Ｂホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に接続した。トップマウントミキサー（Ｅａｓｔｅｒｎ、Ｍｏｄｅｌ  ＴＭＥ−１／２、ＥＭＩ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｌｉｎｔｏｎ、ＣＴ）装備の２５０リットルジャケット付きプロセスタンク（空）（Ｌｅｅ、モデル２５９ＬＵ）をホモジナイザーに接続し、プロセスタンク内の流体を、ホモジナイザーに通して空のタンク内に元通りに収容する。これにより、この流体を複数回にわたってホモジナイザーを通しながら、依然として閉鎖系を維持することが可能となる。均質化中の温度を４℃に維持した。通過開始時に、流体をホモジナイザー（５００ガロン／時）に通し、Ｗａｕｋｅｓｈａモデル１０ＤＯポンプ（Ｗａｕｋｅｓｈａ）を介して６０ｐｓｉにて循環させ、元のタンクに戻した一方、ホモジナイザーの圧力を１５，０００ｐｓｉに調整した。均質化に先立って、均質化前のサンプル２つをホモジナイザーから取り出し、破砕度を特定してｐＨモニター用にベースラインを確立した。破砕度を透過率（５４０ｎｍにて１：１００希釈時の％Ｔ）によりモニターし、均質化されていないサンプルと比較した。１：１００希釈では、開始時の％Ｔが８６．６５であった。細胞スラリーをホモジナイザーに１回通した。結果として得られた％Ｔは、１：１００希釈で８９．９であった。
【０１３５】
ホモジナイズした後、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム１リットル（Ｈａｍｐｏｓｙｌ  Ｌ−３０，Ｃｈｅｍ  Ｓｅｒｖ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を均質化スラリー８１リットルに無菌的に通して可溶化させた。ジャケット付き容器をホモジナイザーから取り出し、３０％のミキサー速度で５℃にて混合しながら、チラーループに保持した。２９時間後に、ホルムアルデヒド１２１ｍｌを防腐剤として加え、続いて２リットルのＯＭＳで洗浄した。可溶化を合計４６時間１６分かけて続行した。この期間は、可溶化を完了するうえで重要とされた。高ｐＨ（８．０〜８．５）にてＯＭＳの可溶化時間を長くすると、金属調節タンパク質が凝集して大きな不溶性凝集塊を形成することが、発見された。この不溶性凝集塊は、遠心分離によって容易に除去された。
【０１３６】
タンパク質採取
可溶化プロセス流体内の凝集した金属調節タンパク質を、Ｔ−１  ＳＨＡＲＰＬＥＳ（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）を用い、遠心分離によって収集した。概略説明すると、可溶化ホモジネートのタンクを、１１ｐｓｉにて供給速度１７０ｍｌ／分で１２台のＳｈａｒｐｌｅｓに給送した。Ｓｈａｒｐｌｅｓのボウルに収集された、大型の細胞残屑と細胞壁材料とから成る、初回通過タンパク質を破棄した。流出液を閉鎖滅菌ループに通し、第２の２５０リットルジャケット付きプロセスタンク内に収集することによって、この流出液を遠心分離機に複数回通しながら、閉鎖系を維持することが可能になる。遠心分離中の温度を４℃に維持した。可溶化ホモジネートを、給送速度１５０ｍｌ／分及び圧力２１ＰＳＩにて、更に７回遠心分離機に通し、通過させるたびにタンパク質を収集した。タンパク質を回収して再懸濁させ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）７．４６リットル中に分取した。ホルムアルデヒド２５ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）を防腐剤として加え、０．３％濃度に到達させた。
【０１３７】
タンパク質採取のための代替方法を使用してもよい。例えば、所望されるタンパク質を採取する際に、中空糸フィルター法が用いられる場合もある。タンパク質の採取には、５ｋＤａ〜０．２μＭのサイズの範囲のフィルターカートリッジ、好ましくは５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａのカートリッジが使用される。培養液を１／２〜１／２０に減量し、続いて透析濾過により緩衝液で１〜５回洗浄した後、４℃で保存するかまたは−２０℃で凍結した。
【０１３８】
透析濾過
タンパク質懸濁液を４℃での透析濾過により洗浄し、タンパク質に結合された可能性のあるあらゆる混入サルコシンを取り除いた。概略説明すると、タンパク質８６４０ｍｌを、回転するボトムマウントＤａｙｔｏｎミキサーモデル２Ｚ８４６（Ｄａｙｔｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．）を備えた無菌トリス緩衝液（ｐＨ８．５）５０リットル含有の２００リットルプロセスタンク内に無菌的に１２５回転／分にて吸引した。Ｗａｕｋｅｓｈａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｕ３０フィードポンプに接続された２５平方フィートのスクリーンチャンネルシリーズＡｌｐｈａ  １０Ｋ  Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅフィルター（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）装備のＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＰＥＬＬＩＣＯＮ  ＴＡＮＧＥＮＴＩＡＬ  ＦＬＯＷ  ＦＩＬＴＥＲアセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に対し、プロセスタンクを無菌的に接続した。タンパク質溶液５９リットルにＴＢＷを添加して１５０リットルにし、３５リットルに濃縮させて、１１０リットル容量のＴＢＷとした後、最終抗原容量を１０．４リットルに濃縮した。タンパク質濃縮物を、４リットルの滅菌ＮＡＬＧＥＮＥ容器に無菌的に分取（３．５リットル）し、貯蔵用に−２０℃の冷凍庫に入れた。
【０１３９】
このプロセスは、ＬＰＳ含量が低く、且つサルコシン残基の含量が殆どゼロ乃至ゼロである金属調節タンパク質を含有する組成物を製造した。タンパク質を、純度及びバンディングプロファイルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べ、また細菌混入、残存サルコシン及びＬＰＳについても調べた。完成品のバンディングプロファイルは、電気泳動により調べたところ、一貫したパターンを示した。ヒツジ赤血球（５％）を寒天ベース（１．５％）に組み入れた改良寒天ゲル拡散試験を用いて、本組成物のサルコシン試験を実施した。ウェルを寒天に切り込み、最終製品のサンプルを、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１．０％及び２．０％の濃度のサルコシンの対照サンプルと共にウェルに入れた。ゲルを２５℃で２４時間インキュベートし、溶血度を対照と比較して決定した。このプロセスでは、０．０５％未満のレベルの検出可能なサルコシンを除去し、この濃度では対照サンプルにおいて最小限の溶血を示した。ＬＰＳの濃度は、商標名ＰＹＲＯＴＥＬＬ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ，Ｍａｓｓ．）で入手可能なリムルスアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）試験により調べる。
【０１４０】
実施例６
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａから得られた免疫化組成物の調製
同じ抗原からなる３つのワクチン系列を、実施例５のマスターシードＭＳ０６１１３０から調製した。注記：２つの別々の発酵プロセスを表す２つの抗原調製物を用いて、抗原Ａ及び抗原Ｂと命名された２つの抗原ロットを調製した。こうして、抗原Ａと抗原Ｂの混合物を用いて第１のワクチン系列を調製し、抗原Ａのみを用いて第２のワクチン系列を調製し、抗原Ｂのみを用いて第３のワクチン系列を調製した。
【０１４１】
抗原Ａ、Ｂ及びＡ＋Ｂからなるワクチン組成物を、以下の成分：４４．４４％水性タンパク質懸濁液を０．１％正規化食塩水中に溶かしたもの（１ニワトリ用量当たり１５０μｇタンパク質に標準化）５０％Ｄｒａｋｅｏｌ  ６鉱油（ＶＯＰＡＫ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）、３．０％Ｓｐａｎ８５及び２．５６％Ｔｗｅｅｎ８５（Ｒｕｇｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｅｌｌｓｉｄｅ，ＮＪ）で調製した。概略説明すると、鉱油とＳｐａｎ８５とを混合し、高速乳化装置（ＩＫＡモデルＰｒｏｃｅｓｓ  ｐｉｌｏｔ  ２０００／４または同等品）を備えた容器に分取した。抗原、Ｔｗｅｅｎ８５及び０．１％ホルマール食塩水を、第２の容器に分取した。乳化装置を６０ｈｚに設定し、水溶液を７℃に予備冷却した油中にポンプ輸送した。ワクチンを連続的に撹拌しながら、滅菌ボトルにポンプ注入した。
【０１４２】
実施例７
ニワトリのワクチン接種
レグホン型特異的病原体フリー（ＳＰＦ）ニワトリ（Ｈｙ−Ｖａｃ，Ａｄｅｌ，ＩＡ）に実施例６の組成物をワクチン接種した。概略説明すると、１１週齢の（ＷＯＡ）特定病原体フリー（ＳＰＦ）レグホンニワトリ７４羽を入手し、１週間順応させた後で、ワクチン接種した。トリを抗原Ａ＋Ｂ（トリ２１羽）、抗原Ａ（トリ２１羽）、抗原Ｂ（トリ２１羽）、と称される３つの群及び非ワクチン接種対照群（トリ１１羽）に分類した。トリは色付きの脚バンドで識別されていた。抗原Ａ＋Ｂ群、抗原Ａ群、及び抗原Ｂ群における、１２週齢の全てのトリの胸部に、適切なワクチンを０．２５ｍｌ筋肉内接種した。ニワトリ１１羽の群は、ワクチン非投与とし、対照群としての役目を果たした。１５週齢の時点で、または第２のワクチン接種後２１日目に、ワクチン接種を受けた全てのトリを対象として、第２のワクチン接種を施した。
【０１４３】
実施例８
抗原曝露生物の調製及び投与
抗原曝露の１日前に、実施例１のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａのＸ−７３株の極低温ビーズ１つを凍結ストックから無菌的に取り出し、５％のヒツジ血液を含有する２つのＴＳＡ  ＩＩプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に広げた。次いで、これをコロニー分離用に画線した。プレートを３７℃にて１６〜１９時間インキュベートした。第２のワクチン接種後１４日目または１４日を経た時点で、ヒツジ血液寒天プレートからのいくつかのコロニーを血液プレートから掻き取り、滅菌１３×１００試験管中に懸濁させた。コロニーを添加するか、または懸濁液をトリプトースブロスで希釈し、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２０Ｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）分光光度計を使用して、６３０ｎｍにおける透過率（％Ｔ）として７１〜７５％が得られた。懸濁液をトリプトースブロス中で１：１００，０００の希釈率になるまで連続希釈した。この希釈物を抗原曝露用に血清バイアルに分取した。
【０１４４】
各ワクチン接種群のニワトリ（１群当たり２０羽）、及び対照群のニワトリ１０匹に対し、上記希釈された抗原曝露物０．５ｍｌをそれぞれ胸部に筋肉内接種した。この時点で、ワクチン接種群及び対照群から追加のニワトリが除去された。
【０１４５】
実施例９
抗原曝露の結果
図２に示されている結果は、３回連続して実施された３通りの個別の抗原曝露研究の平均値である。抑制率（ＰＦ）という用語は、リスク比（ＲＲ）の補数であり、保護因子の予防的役割、または実施された介入プログラムの予防的奏功を示す表現として、疫学者に使用されてきて久しい（Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ，１９７４，Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ９９：３２５−３３２）（Ｆｉｅｌｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２，ｐｐｌ４７−７）。抑制率ＰＦ＝１−ｐ２／ｐ１（式中、ｐ２＝ワクチン接種群における罹患率、及びｐ１＝非ワクチン接種群またはプラセボ群における罹患率）。獣医用コレラワクチンは、ＰＦ５３％以上、好ましくは６２．５％以上を日常的に実証するものであると予期されている。ワクチンのＰＦが５３％未満の場合、防御能を有することが実証されている。
【０１４６】
表１は、図２からの死亡率データ、及び図２の抗原Ｂに対する抑制率についての計算を示す。ワクチンの有効率（すなわち抑制率）は、３０％であると計算された。この３０％とは、ワクチン接種を受けなかった場合に発生した可能性のある症例の３０％が、ワクチン接種を受けたトリの間ではワクチン接種によって予防されたことを示唆するものである。抗原Ａ及びＡ＋Ｂについてこれらの計算を繰り返して、各ワクチンについて抑制率を得た。
【表１】
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【０１４７】
ワクチン接種と対照との間の差分は、３つのワクチン接種群のうちの２群に対して有意である（ｐ＜０．０５）が、抑制率は、抗原１、抗原２、及び複合抗原に対してそれぞれ５３％、３０％、及び４４％であった。このワクチンは、或る事例において５３％ＰＦレベルを満たした反面、終始一貫した実証は不可能であったので、市販の家禽コレラワクチンとしての効力は不十分とされる。実施例４で観察されたバンディングプロファイルに基づいて、発明者らは防御が極めて良好となることを予期した。残念なことに、観察された防御は、予想を下回っていた。これらの予期せぬ結果から判るように、図１に示すようなＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で視覚的に重なり合うように見えるバンドは、所望される保護レベルを付与するうえで十分ではない。
【０１４８】
実施例１０
公知のゲノム分析
現在公知のゲノムを対象に、有望な金属調節タンパク質に関する調査が実施された。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａのいくつかの株は、パブリックドメイン内で利用可能な完全または部分的ゲノム配列を有する。タンパク質配列及び注釈データのための包括的なリソースが、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ）である。このデータベース内には、検索の時点で、血清型１の基準株Ｘ−７３及び血清型３の基準株Ｐ−１０５９の全配列データまたは部分配列データが存在していた。これらの生物の各々について、分子量が５０キロダルトン〜１５０キロダルトンの間で、鉄摂取に関する注釈リファレンスが付された全てのタンパク質を対象として、データベース検索を行った。同定されたタンパク質を、系統立てて表の形に編成した（図３）。表中、類似性が９５％以上の異種株どうしが、一体的にグループ化されている。これらの株の間では、１４通りの別個のタンパク質が同定された。
【０１４９】
それらのタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により同定された以前のワクチン候補（ＭＳ０６１１３０）の発現済み金属調節タンパク質と比較した。鳥類に由来する他のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株の更なるゲノムにおいて同定されたタンパク質のうち、ワクチン候補には存在しないと思われるタンパク質には、８通りが存在した（図３及び図４を参照）。
【０１５０】
これらの結果によって実証されたように、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａの追加的な株に関するゲノム分析によって同定された所望される７種のタンパク質が、我々のワクチン候補（ＭＳ０６１１３０）には欠落している可能性があった。これと同じ観察は、実施例９で使用された抗原曝露株のゲノム分析においても見られた。この抗原曝露株には、ＭＳ０６１１３０ワクチン候補に存在していなかった７通りのタンパク質サブセットも存在していた。ゆえに、実施例６〜９に記載のワクチン株は、抗原曝露株に存在していた７つのタンパク質を欠いていた（図３）。図４のベン図には、関連する抗原曝露株Ｐ１０５９及びＸ７３内には存在し、但しワクチン株ＭＳ０６１１３０内には存在しない、タンパク質の数が例証されている。これらの所見を基に、７通りのタンパク質サブセットの包括的シデロフォア受容体カバレッジと２つ以上の株との併用によって、防御効力度が向上するだけでなく、交差防御が血清型非依存にもなることが明らかである、と我々は仮定するに至った。
【０１５１】
実施例１１
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの野生株と型株における鉄制限タンパク質のバンディングパターンの比較
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ中の金属調節タンパク質に関してもっと徹底的な理解が得られるように、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの３３種の型株及び臨床野外株を鉄制限培地中で成長させ、実施例３の方法で膜結合タンパク質を処理し、精製した。結果として得られたタンパク質組成物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル上で、金属調節タンパク質のバンディングパターンについて分析した（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ  ｇｅｌｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。個々のレーンを比較し、１次元ゲル分析プログラムであるＰｈｏｒｅｔｉｘ  １Ｄ（ＴｏｔａｌＬａｂ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ，ＵＫ）を使用してグループ分けした。図５に例証するような、バンディングパターンの類似性を示す樹状図を、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  １Ｄソフトウェアで作成した。型株及び臨床野外分離株の分析によって、発現された金属調節タンパク質の２つの主要パターン、角括弧［］でマークされた４バンドパターン、及び中括弧｛｝で示された３バンドパターンが明らかにされた。他の株は、これらの２つのパターンにバリエーションがあり、１つまたは２つのタンパク質バンドが欠落しているように見える。
【０１５２】
実施例１２
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるタンパク質の分析
図５で観察された様々なバンドパターンの代表として、実施例１１から、分離株１３個を選択した。これら実施例１１の分離株１３個からの、７５，０００〜１１５，０００の分子量範囲の各タンパク質バンドを、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間スペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）及びペプチドマスフィンガープリンティングを用い、タンパク質同定分析用に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した。ペプチド質量を、ゲノムの公知のタンパク質配列が収録されているデータベース（この場合、Ｕｎｉｐｒｏｔ）と比較した。この比較は、コンピュータプログラムを使用して生物の既知のゲノムをタンパク質に変換し、次いで理論的にタンパク質をペプチドに切断し、各タンパク質からペプチドの絶対質量を計算することによって達成された。続いて、未知のタンパク質のペプチドの質量と、ゲノム内にコードされた各タンパク質の理論上のペプチド質量との比較を行う。結果を統計的に分析し、ベストマッチを見つけた。図６では、これらのタンパク質の同一性を、９３％超の類似性でグループ化し、その結果を表に示してある。分離株１３個からの合計３８のバンドを分析し、７つのタンパク質のうちの１つであると同定した。図６には、それらのタンパク質の分子量が示されている。２つの分離株（図６に楕円で指し示めされている１１２１及び１１３５）を併用して、７通りの全てのタンパク質バンドを発現させた。これら２つの株は共に、図６では、残りの分離株１１個の全てのタンパク質を発現し、また、図５では、同定された２つの主要バンディングパターンの代表であったことから、新規な混合ワクチン用に選択された。
【０１５３】
実施例１３
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ培養種子の調製
実施例１２及び図６からのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株１１２１及び１１３５のマスターシードストックを調製した。株１１２１は血清型３×４として同定され、株１１３５は血清型２×５として同定された。これらの分離株は、トリパスツレラ症で死亡したシチメンチョウから単離されたものである。典型的には、肝臓及び肺の標本を綿棒で集めて、結果として得られたスワブを５％ヒツジ血液寒天プレートに画線し、３７℃にて２４時間インキュベートした。６ｇ／ｌの酵母抽出物及び１２ｕｇ／ｍｌのＤＰを含有するｐＢＨＩ中に分離株を接種することによって、マスターシードを調製した。次いで、培養物を１８μｇ／ｍｌのＤＰ含有の上記培地に連続的に移し、更に５回通過させて、有機体を鉄制限環境に適応させ、目的タンパク質の成長及び発現を最大限に高めた。培養物を７，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｉｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で３０分間遠心分離によって濃縮し、２０％グリセロール（凍結防止剤として）を含有し但しＤＰ不含の新鮮なｐＢＨＩ中に再懸濁させた。結果として得られたマスターシードを、３ｍｌのクライオバイアル中に２．２ｍｌ容量ずつ等分し、−６０℃以下で貯蔵した。分離株に、識別番号ＰＭ１１２１、２０１４０９１１及びＰＭ１１３５、２０１４０９２５を付与し、それぞれマスター種子ＭＳ１１２１及びＭＳ１１３５として確立させた。その後、マスター種子を、金属規制タンパク質の生産に用いられる作業用種子に展開した。
【０１５４】
実施例１４
金属調節タンパク質の製造
制御された発酵条件下でＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａを成長させることで、外膜と会合したタンパク質をはじめとするタンパク質を発現させることが可能である。その後、細菌を採取することにより、タンパク質を単離し、精製して、組成物中の免疫原として使用できる。
【０１５５】
発酵：
実施例１３の１１３５株の作業用種子の極低温バイアル（１０９ＣＦＵ／ｍｌにて１ｍｌ）を使用して、酵母抽出物６ｇ／１（ＢＤ）含有の３７℃改良ブタ脳心臓注入培地（ｐＢＨＩ）３００ｍｌ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）に接種した。培養物を３０〜４００ｒｐｍで５時間振盪しながら３５〜３８℃でインキュベートし、その時点で２２ｕｇ／ｍｌのＤＰ含有の修飾ｐＢＨＩ１５００ｍｌに移して、利用可能な鉄を制限する。培養物を、光学濃度が０．６以上に達するまで、３７℃で２時間３８分間インキュベートした。全培養物を、１８リットルフラスコ中の修飾ｐＢＨＩ１５リットル＋２２ｕｇ／ｍｌのＤＰに移した。この培養物を約２時間３０分インキュベートし、５４０ｎｍで０．７５の光学密度に達した。次いで、培養物を、鉄制限を維持するためＤＰ２２μｇを有する修飾ｐＢＨＩ２７０リットルと、炭素源として１リットル当たり４０ｍｌの５０％グルコース溶液とを含有する３００リットルの発酵槽に移した。培養物を撹拌しながら３５〜３８℃でインキュベートし、溶存酸素含有率を３０％以上に維持することにより制御した。培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎシリーズ６００分光光度計で測定して、光学密度約５．４まで成長させた。発酵の終了時に、培養物のｐＨを８．５以上に調整し、温度を１５℃以下に調整した。
【０１５６】
全細胞の採取：
２つの３０ｆｔ  ２  Ａｌｐｈａ  ３００−Ｋオープンチャンネルフィルター（カタログ番号ＡＳ３００Ｃ５）装備のＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｍａｘｉｓｅｔｔｅ−２５（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）を、約４４Ｈｚに設定されたＷａｕｋｅｓｈａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｕ−６０フィードポンプ（Ｗａｕｋｅｓｈａ  Ｃｈｅｍｙ−Ｂｕｒｒｅｌｌ，Ｄｅｌｅｖａｎ，Ｗｉｓ．）に接続し、接線流濾過により、全細胞細菌懸濁液を約１／１０の体積に濃縮した。培養物をトリス緩衝食塩水で更に洗浄し、次いで全細胞懸濁液約４５リットルに濃縮した。細胞懸濁液の副サンプルを乾燥させ、秤量して最終的な乾燥ペレット重量を得た。次いで、最終的な全細胞懸濁液を−２０℃で凍結した。
【０１５７】
全細胞の破砕：
全細胞懸濁液を５〜７℃で３日間解凍した。全細胞の個々の容器をプールし、４０％に設定したミキサー付き滅菌タンク中で混合した。液体細胞懸濁液を均質化により破砕した。概略説明すると、懸濁した全細胞を、１５，０００〜１８，０００ポンド／平方インチ（ＰＳＩ）の圧力で、Ａｖｅｓｔｉｎホモジナイザー、モデルＥｍｕｌｓｉｆｌｉｘ  Ｃ５００Ｂ（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）に２回通し、遂には、Ｂｅｃｋｍａｎシリーズ６００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、ホモジネートの１：１００希釈率を８０％透明度（５４０ｎｍにおける％Ｔ）に到達させた。第２のプロセスタンクをホモジナイザーに接続し、閉鎖系を維持しながら、流体をホモジナイザーに複数回通して往復させてもよい。ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（Ｈａｍｐｏｓｙｌ  Ｌ−３０，Ｃｈａｔｔｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｈａｔｔａｎｏｏｇａ，ＴＮ）を、破砕した細胞ホモジネートに３％容量／容量で加えて、細胞膜及び非膜タンパク質を可溶化した。２〜７℃にて約７２時間可溶化を続行した。１１ＰＳＩに設定されたＳｈａｒｐｌｅｓ  Ｔ１連続遠心分離機を用いた遠心分離により、細胞残屑を取り除いた。
【０１５８】
タンパク質採取：
タンパク質懸濁液を、連続洗浄接線流濾過により、０．２％ホルマリン含有のトリス緩衝水（ＴＢＷ）（ｐＨ７．４）８００リットルで洗浄した（Ｍａｘｉｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａ  ｆｉｌｔｅｒ，Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐ，ＮＹ，ＮＹ）。タンパク質を、ホルマリンと１０％エタノールとを含有する１００リットルのＴＢＷで更に洗浄した。エタノール洗浄後、タンパク質懸濁液を２００リットルのＴＢＷ＋ホルマリン（０．２％）で更に洗浄して、エタノールを除去した。残存ＴＢＷを系から洗い流したとき、最終抗原容量が約２０リットルになるまで、連続濾過によって容量を減少させた。次いで、最終抗原ロット１１３５−Ａ０００１を、３３℃にて９３時間連続混合しながら、０．２％ホルマリンで不活性化した。
【０１５９】
株１１２１の作業用種子を用いて、抗原ロット１１２１−Ａ０００１を株１１３５と同じ方法で調製した。
【０１６０】
実施例１５
ワクチンの調製
実施例１４で調製された抗原を使用し、５０％鉱油をアジュバントとして用い、実施例６に記載のＴｗｅｅｎ／Ｓｐａｎを乳化剤として用いた、２つの２０リットル水中油型ワクチンを調製した。
【０１６１】
概略説明すると、１０，１４５ｍｌのＤｒａｋｅｏｌ６鉱油及び６０９ｍｌのＳｐａｎ８５を乳化剤として、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎモデル１５０ＵＨＳＬＳミキサー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ，Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ，ＭＡ）装備の滅菌容器に加えた。ミキサーを５２Ｈｚに設定し、アジュバント相再循環を毎分２．５リットルに設定した。水相成分：Ｔｗｅｅｎ  ８５（５１７ｍｌ）、５４０ｍｌの抗原ロット１１２１−Ａ０００１、１４２０ｍｌの抗原ロット１１３５−Ａ０００１を第２の容器に加え、７０１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を２０分かけてゆっくり加えた。０．２５ｍｌ用量当たり１００μｇの全抗原（各株から５０ｕｇ）及び２００μｇの全抗原（１００μｇの各株）がそれぞれ含有されるように、ワクチンを調合した。これらの２つの結合抗原は、非相同血清型保護の増強に必要とされる、実施例１２及び図６の７つのタンパク質を表す。
【０１６２】
実施例１６
ワクチン接種及び抗原曝露モデル
実施例１５で調製したワクチンを、ワクチン接種抗原曝露モデルにおいて、ＳＰＦニワトリの１型抗原曝露に対し使用した。概略説明すると、雄と雌の両方のＳＰＦレグホンニワトリ６０匹を、Ｖａｌｏ  ＢｉｏＭｅｄｉａ（Ａｄｅｌ，ＩＡ）から入手した。ニワトリを雄雌別に分類し、メンドリとオンドリとからなり、それぞれ雌及び雄の数が等しい、トリ２０羽ずつの３つの群に分けた。トリの翼帯に番号付けして識別する一方、各トリの左右の羽に同じ番号を付けて同一性を保持した。一方の群には、実施例１４の２００μｇワクチンを０．２５ｍｌ接種した。第２の群には、実施例１４の１００μｇワクチンを０．２５ｍｌ接種した。第３の群には、抗原の代わりにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に油性アジュバントを含有するプラセボを、ワクチン接種した。１２週齢及び１５週齢の全てのトリの首の背後にワクチンを皮下接種し、実施例８の方法で調製された約６，０００ｃｆｕの血清型１抗原曝露株Ｘ−７３を、１７週齢の全てのトリの乳房筋肉内に抗原曝露した。図７に、試験結果を示す。１００μｇ及び２００μｇワクチン接種群に対し、それぞれ抑制率６９％及び７５％、ならびにｐ値０．００１及び０．０００４以下で、防御レベルが大幅に改善されることは明らかである。これらの結果から明らかに分かるように、ニワトリワクチン接種及び抗原曝露モデルにおいて、図６の７つ全てのタンパク質を発現する２つの抗原の組み合わせが、非相同抗原曝露に対して抑制率の増加に寄与する。
【０１６３】
実施例１７
亜鉛及び呼吸器病原体
我々の以前の研究（データ不図示）において、我々はグラム陰性病原体の多くが、亜鉛制限下で新規なタンパク質を発現することを明らかにした。これらの細菌の多くは呼吸器病原体である。これらの病原体のいくつかとしては、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａが挙げられる（Ｓｔｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，６（７），ｅｌ  ０００９６９  ２０１０）。これまでレポートされてきたように、この亜鉛獲得タンパク質は、細胞外壁に位置するＺｎｕＤとして現在同定されている膜貫通βバレルタンパク質であり、このＺｎｕＤは、２つのシステインを含む単一表面露出ループを利用し、ジスルフィド結合によって一体化されたとき、亜鉛イオンと相互作用し得るヒスチジンのクラスターを形成する（Ｓｔｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，６（７），ｅｌ０００９６９．２０１０）。それゆえ、ＺｎｕＤは、宿主生物によって隔離された亜鉛の獲得に用いられるスカベンジャータンパク質として作用する。
【０１６４】
これら全てのＺｎｕＤ同族体には、亜鉛の結合において同定されているＨｉｓ及びＡｓｐに富む領域が含まれる。これは、亜鉛獲得機序が、気道内内に常駐する細菌にとって重要であることを示唆している。ここでの説明によると、粘膜管内の未結合亜鉛濃度が低すぎるため、ポーリンタンパク質を介して細菌膜を貫通する単純な拡散が不可能であり（Ｓｔｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，６（７），ｅｌ０００９６９  ２０１０）、この理由から、ＺｎｕＤのようなタンパク質が、亜鉛を捕捉する目的に必要とされている。このスカベンジングには、非結合亜鉛だけでなく、カルプロテクチンなどのタンパク質からの封鎖亜鉛のストリッピングも含まれる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ，１１（３），Ｐｐ２２７−２３９．２０１２）。この理論は、健常保因者由来のＺｎｕＤに対する回復性抗体が検出されることにより裏付けられてきた。このことは、気道内に存在する細菌によってＺｎｕＤが発現するという想定を可能にしている（Ｓｔｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，６（７），ｅｌ  ０００９６９．２０１０）。この実験の目標は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの亜鉛獲得タンパク質の有効性を同定し、クローニングし、評価することであった。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ内にＺｎｕＤホモログが発現する場合、この呼吸器病原体を制御できるように、現在未踏のワクチン開発を目的に、もう１つの想定し得る標的を提供する。
【０１６５】
実施例１８
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  Ｐ−１０５９のゲノム配列決定
本研究に用いられたＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの分離株は、実施例１の基準株Ｐ−１０５９であった。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ｇＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｋｉｔを使用して、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ分離株からゲノムＤＮＡを単離した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，製品番号：ＣＳ１１３０１）。ゲノムＤＮＡの抽出に先立って、分離株の新鮮培養物を、５％ヒツジ血液含有トリプチケース・ソイ寒天培地ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，製品コード：２２１２６１）中、３７℃にて一晩成長させた。メーカーのプロトコールに従って手順を行った。最終収量３３．７μｇのゲノムＤＮＡを、配列決定が為されるまで−２０℃で貯蔵した。このゲノムＤＮＡを、配列決定用にＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．に送付した（Ｗｈｅｅｌｉｎｇ，ＩＬ）。Ｇｅｎｂａｎｋ基準配列ＣＰ００４７５２及びＣＰ００４７５３を、分離株の全ゲノム配列のアセンブリに使用した。
【０１６６】
実施例１９
想定し得る標的遺伝子
分離株の完全なゲノム配列を受け取った後、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースを用い、ｔＢｌａｓｔｎアライメントを行い、ＺｎｕＤに対する相同性に基づいて目的の遺伝子を同定した（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＦ６２３２３．１）。ｔｂｌａｓｔｎアラインメントで見つかった相同遺伝子によって翻訳されたタンパク質を、ｂｌａｓｔｘ検索を用いて同定した。同定されたＺｎｕＤホモログ及びＺｎｕＤ亜鉛親和性領域を対象に、ＥＭＢＯＳＳ  Ｍａｔｃｈｅｒを使用して対配列アラインメントを行った（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６（６）、ｐｐ２７６−２７７．２０００）。
【０１６７】
実施例２０
亜鉛獲得タンパク質の発現
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの亜鉛獲得タンパク質を同定することを目的に、我々は、自身の実験室において以前に同定されたＭａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの亜鉛獲得タンパク質の配列を用いた。概略説明すると、ＴＰＥＮ（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｄｅ：Ｔ１４８７）を用いた細菌細胞成長に使用されたＢａｃｔｏ  Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ブタ培養培地（ＢＨＩ）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，製品コード：２５６１１０）を補充することによって、標的タンパク質の発現を評価した。細菌成長中に、０〜１００μＭの範囲にわたってＴＰＥＮの滴定を用いた。種々の濃度のＴＰＥＮを含有するＢＨＩ培地中に、ＴＰＥＮ不含のＢＨＩ中の分離株のスターターカルチャーを接種した。この接種量は、最終培養物の全容量の１％であった。細菌が特定の濃度で成長できない場合を除き、激しく撹拌しながら、培養物を、ＯＤ５４０が１．０になるまで３７℃で成長させた。
【０１６８】
いったんＯＤが１．０に到達したら、細菌を７，０００×ｇにて１０分間遠心分離することによりペレット化した。（Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７（１０），ｐｐ２８７１−２８８１．２０００）に記載されている手順に変更を加えて実施し、ペレット化した細菌に対して外膜調製を行い、外膜内の内在性膜タンパク質を単離する。細菌ペレットを、３０ｍｌの６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，製品コード：Ｔ３２５３）及び２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）（ＥＭＤ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，製品コード：ＥＸ０５３９−３）中に再懸濁させた。次いで、ａｌ０２−Ｃ変換器（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，製品コード：１０１−０６３−１９８，１０１−４７−０３７、及び１０１−１３５−０６６の各々）に取り付けられた直径１／２インチチップ付きバイオホーン装備のＳｏｎｉｆｉｅｒ  Ｓ−４５０Ａアナログ超音波プロセッサーを使用して、電力設定９、デューティサイクル９０にて、氷上で１分間３０秒間、超音波処理によって細菌を溶解した。サンプルを３９，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離することにより清澄化させて、大型の細胞残屑を取り除いた。内膜、ペプチドグリカン及び外膜の内部に見つからないタンパク質を除去するために、Ｈａｍｐｏｓｙｌ  Ｌ−３０（Ｃｈａｔｔｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｔａｎｏｏｇａ，ＴＮ，製品コード：ＢＤ２０９９）を最終濃度１％にて上清に添加し、上下に揺らしながら４℃で１６時間インキュベートする。外膜を３９，０００×ｇ及び４℃にて２時間遠心分離することにより、ペレット化した。外膜ペレットを洗浄し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝水（ｐＨ７．２）中に再懸濁させた。
【０１６９】
内在性膜タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明視化した。電気泳動に先立って、ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，製品コード：２３２２５）を実施し、等価タンパク質負荷３０μｇを見込んで、各サンプル内のタンパク質を定量した。サンプルを等容量にし、続いて３×負荷緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，製品番号：Ｂ７７０３Ｓ）を添加した。サンプルをゲル上で比較して、標的タンパク質が発現しているかどうか調べた。
【０１７０】
実施例２１
タンパク質の同定
外膜調製物からのバンディングプロファイルを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ）により分析し、目的のバンドのいずれかが、ＢＬＡＳＴ相同性により同定された遺伝子と一致するかどうかを判別した。メスを使用してバンドをゲルから切り出し、分析用にＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ施設に送付した。
【０１７１】
実施例２２
構造モデリング
Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌを用い、相同性シーケンシングに基づいて、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの亜鉛獲得タンパク質の３Ｄ構造モデルを作成した（Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２２）、ｐｐ１９５−２０１．２００６）．）。タンパク質モデルを作成する際に用いられたＰＤＢテンプレートは、４ｅｐａＡであった。細胞外ループ（ＥＣＬ）配列位置を、Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌから入手された３Ｄ構造モデルを使用して同定した（Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２２），ｐｐ１９５−２０１．２００６）．），Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｂａｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５（２９）．２００４）．），Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  （ＯＭＰ）  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎＭｅｍｂｒａｎｅｓ（ＰＰＭ）ｓｅｒｖｅｒ（Ｌｏｍｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４０（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３７０−６．２０１２）。
【０１７２】
実施例２３
ターゲット遺伝子の同定
いったん同定されたバンディングプロファイル内のタンパク質を、ＢＬＡＳＴ相同性により同定された目的タンパク質と比較した。バンディングプロファイル内の１つのタンパク質は、ＢＬＡＳＴ相同性により同定されたタンパク質と一致した。このタンパク質は、ＯＭＲファミリー外膜鉄受容体（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＤＮ７３８１２．１）として同定された。この受容体は、本論文中では亜鉛獲得タンパク質とも呼ばれている。標的遺伝子は、ゲノム内のヌクレオチド１，１６０，３１９．．．１，１６２，６９１に位置していた。シグナルペプチドを、ＳｉｇｎａｌＰ  ４．１を用いて同定した（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ，８（１０），ｐｐ７８５−７８６．２０１１））。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａにおいて同定された亜鉛獲得タンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図２２に示す。
【０１７３】
実施例２４
呼吸器病原体全体にわたる亜鉛獲得タンパク質の相同性
Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの獲得タンパク質の配列（データ不図示）を用いて、呼吸器病原体全体にわたる亜鉛獲得タンパク質の相同性、特に亜鉛親和性領域を、ＮＣＢＩによって確立されたタンパク質ブラストサーチツールを用いて判別した。１０通りの異なる種の細菌に、同一性が４９％超である亜鉛獲得タンパク質ホモログが含有されていることが見出された。同定された種はいずれも、呼吸器系病原体である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを使用して、相同タンパク質をＺＡＰの亜鉛親和性領域に整合させると、著しく類似したアミノ酸モチーフ同士が強調される。全ての同族体には、２つのシステイン、ならびに複数のヒスチジン及びアスパラギン酸が含有される。図２５では、アミノ酸モチーフが、ＧＬＡＭ２を用いて強調されている。システイン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸の空間配置は、相同体全体にわたって一定のまま維持されている。
【０１７４】
【表２】
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結果から明らかであるように、事実上、複数の呼吸器病原体は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの亜鉛獲得タンパク質に対し或る程度の相同性を呈し、同一性は４９〜９８パーセントの範囲に及ぶ。
【０１７５】
実施例２５
亜鉛獲得タンパク質の発現及び識別
クローニング
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ亜鉛遺伝子を、Ｐ−１０５９株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ギブソンアセンブリ法を用いてプラスミドベクターｐＱＥ−Ｔ７−２（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に挿入した。次いで、アセンブルされたプラスミドを、クローン選択及び発現用に、ＮＥＢ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ；カタログ番号Ｃ２５６６Ｈ）。
【０１７６】
発現
５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢブロスのスターターカルチャーに、組み換えプラスミド含有のクローンを接種した。培養物を、ＯＤ５４０が０．６になるまで増殖させ、次いで新鮮なＬＢブロスに移した。新しい培養物を、ＯＤ５４０が０．６になるまで再び増殖させた。次いで、発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導させ、更に１６時間インキュベートした。細胞を遠心分離により収集し、処理を施すまで−８０℃で貯蔵した。
【０１７７】
封入体の精製
細胞を解凍し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ番号７０５８４−４）中に再懸濁させた。リゾナーゼバイオプロセシング試薬１０μＬ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ番号７１２３０）を加えて、懸濁液を周囲温度で１時間インキュベートした。次いで、マイクロチップを用い、出力６、９０％デューティサイクルにて、懸濁液を３０秒間超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ，モデル１０２ｃ；Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）。溶解物を１６０００×ｇで２０分間遠心分離し、不溶性物質を収集した。ペレットを、３回（第一にＢｕｇＢｕｓｔｅｒで、第二に１／１０×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒで、第三にトリス緩衝水で）洗浄した。８Ｍ尿素と１ｍＭジチオトレイトールとを含有するｐＨ８．０のトリス緩衝食塩水中に、封入体プレップを可溶化させて、組み換えタンパク質１０ｍｇを得た。図２４は、３００Ｖで１０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ−ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で泳動させた亜鉛獲得タンパク質の様々な発現段階を示す。この泳動には、未誘導全細胞調製物、誘導全細胞調製物、溶解細胞上清、１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ洗浄液、１／１０×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ洗浄液、可溶化封入体及び可溶化後のペレットを含めた。
【０１７８】
実施例２６
ニワトリ敗血症モデルにおけるＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの新規組み換え亜鉛タンパク質のワクチン媒介防御
以下の実験的研究の目的は、ニワトリ敗血症モデルにおけるＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａの有毒な抗原曝露に対する組み換え亜鉛タンパク質（ｒＺｉｎｃ）の防御効力を評価することにあった。実施例１４で非ワクチン接種対照と比較されたＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａのＳＲＰ抽出組成物の有効性を、実施例２５のｒＺｉｎｃタンパク質の有効性と比較した。概略説明すると、ＳＰＦレグホンニワトリ（雄）３０匹を、Ｖａｌｏ  ＢｉｏＭｅｄｉａ（Ａｄｅｌ，ＩＡ）から入手した。ニワトリをそれぞれ、トリ１０羽ずつの３つのグループに分けた。トリは色付きの脚バンドで識別されていた。処置群を、Ａ群（プラセボ）、Ｂ群（ｒＺｉｎｃ）及びＣ群（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａタンパク質抽出物）と命名した。この実験においてワクチンの有効性を評価する目的に使用された結果パラメータは、非ワクチン接種のプラセボ群と比較対照された、ワクチン接種群間の総死亡率であった。全てのニワトリに、食物及び水を自由に与えた。
【０１７９】
実施例２７
免疫組成物の調製
８．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、１．４４ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４及び０．２４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で抗原を希釈することにより、実施例１４及び２５のタンパク質組成物からワクチン（ＳＲＰ抽出物及びｒＺｉｎｃ）を調製した。以下の成分：４４．４４％水性タンパク質懸濁液を０．１％正規化食塩水中に溶かしたもの、５０％Ｄｒａｋｅｏｌ  ６鉱油（ＶＯＰＡＫ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）、３．０％Ｓｐａｎ８５及び２．５６％Ｔｗｅｅｎ（Ｒｕｇｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｅｌｌｓｉｄｅ，ＮＪ）を乳化することにより、各ワクチンを調製した。ワクチン組成物（亜鉛及びＳＲＰ抽出物）毎の最終的なトリの１回分用量は２５０μｇ及び４００μｇであった。この用量は、それぞれ０．５ｍｌ及び０．２５ｍｌ容量で投与された。抗原を生理食塩水で置換し、上記製剤０．５ｍｌ用量で用いて懸濁液を乳化することにより、プラセボを調製した。１４週齢及び１７週齢（２１日間隔）の全てのトリに、皮下接種した。
【０１８０】
実施例２８
抗原曝露及び結果
実施例８に記載のように調製した５４５０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（血清型１）株Ｘ−７３を、１９週齢の時点の全てのトリに乳房筋肉内に抗原曝露した。抗原曝露後の１４日間にわたって、トリの死亡率を観察した。この結果から明らかに実証されるように、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａのＳＲＰ抽出物及びｒＺｉｎｃワクチンは両方とも有効（両方の生存率はそれぞれ１００％及び５０％）であり、生存率ゼロの非ワクチン接種対照とは対照的であった（図２３）。本研究における組み換え亜鉛タンパク質を単一濃度２５０μｇで評価し、有毒抗原曝露に対して５０％の生存率（ｐ＝０．０３２５）が示された。
【０１８１】
本明細書中に引用されている全ての特許、特許出願、及び出版物、ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑなどにおけるヌクレオチド配列提出；及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどにおけるアミノ酸配列提出；ならびにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、その全体が参照により援用されている。出版物中に参照されている補足資料（例えば、補足表、補足図、補足資料及び方法、及び／または補足実験データ）も、その全体が参照により援用されている。本明細書中に参照により援用されている任意の文書の開示（複数可）と本出願の開示との間に何らかの矛盾が存在する場合、本出願の開示の方が優先されるものとする。前述の詳細説明及び実施例は、もっぱら理解を明確にすることを期して提供されているに過ぎないので、詳細説明及び実施例によって不必要な制限を理解するべきではない。当業者にとって明らかな変形例は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれるので、本発明は図示及び記載されている正確な詳細だけに限定されない。
【０１８２】
別途指示されていない限り、明細書及び特許請求の範囲において用いられている成分の量、分子量などを表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語により修飾されているものと理解すべきである。したがって、別途指示されていない限り、本明細書及び特許請求の範囲において規定されている数値パラメータは、本発明により得られるよう企図された所望の特性に応じて変動する可能性のある近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等物の原則を限定する試みとしてではなく、レポートされている有効桁数を考慮し、通常の丸め技法を適用することにより、各数値パラメータを少なくとも解釈すべきである。
【０１８３】
本発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において規定されている数値は可能な限り精密にレポートされている。一方、全ての数値には、それらの各々の試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生ずる範囲が本質的に含まれる。
【０１８４】
全ての見出しは読者の便宜を図ることを目的としたものであって、別途そのような指定がない限り、見出しの後に続く本文の意味を制限する目的に使用すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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