(57)【要約】  本発明は、モノクローナル抗α−シヌクレイン抗体の新規な使用に関する。この抗体を用いて、タウ凝集を防止し、それによって、アルツハイマー病などのタウオパチーを治療することができる。
2020504729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウの凝集を阻害するのに使用するための、α−シヌクレイン結合モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体が、凝集した可溶性形態のα−シヌクレインに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
タウ凝集の阻害が、インビボまたはインビトロで行われる、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記α−シヌクレイン抗体が、アルツハイマー病の患者に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記患者が、レビー小体変異型アルツハイマー病または複合されたパーキンソン病およびアルツハイマー病に罹患していない、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記α−シヌクレイン抗体が、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症を含む群から選択されるタウオパチーの患者に投与される。より典型的に、前記タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記α−シヌクレイン抗体が、α−シヌクレインのＣ末端部分に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトα−シヌクレインのＣ末端アミノ酸１１０〜１４０内のエピトープに結合する、請求項７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記エピトープが、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１１２〜１１７、１１２〜１１５、１１８〜１２６、１２６〜１３８または１３６〜１４０内にある、請求項７または８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
先行請求項のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−シヌクレインに免疫特異的に結合するモノクローナル抗体の新規な使用、ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチーの治療にこれらの分子およびそれらのα−シヌクレイン結合フラグメントを使用する方法に関する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、米国特許法施行規則（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２１条にしたがう１つまたは複数の配列表（以下参照）を含み、これは、紙およびコンピュータ可読媒体の両方に開示され、この紙およびコンピュータ可読の開示は、全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）および認知症などの加齢性神経変性疾患は、現在、最大の社会的課題の１つである。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、高齢者の介護のコストが、今後増加し続け、診断される認知症事例の数が２０５０年までに３倍になるであろうと推定している（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ−Ｓｔａｔｕｓ  Ｒｅｐｏｒｔ（２０１２）ＤＥＭＥＮＴＩＡ：Ａ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｐｒｉｏｒｉｔｙ，ＷＨＯ）。ＡＤの最初の治療は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびＮＭＤＡ調節剤などの神経伝達物質調節剤であった。これらの治療は、世紀の変わり目に利用可能になり、依然として、認知症およびＡＤに関連する記憶障害の症状緩和のための基礎を成すものである。しかしながら、これらの薬剤は、ＡＤの根本原因である、アミロイド−β（Ａβ）ペプチドおよびタウタンパク質凝集体の蓄積ならびにそれに関連する、ニューロンシナプス、最終的にはニューロンの喪失を標的にしていない。
【０００４】
高齢者の長期的なコミュニティ規模の研究（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＡＤＮＩ；Ｂｒｅｔｅｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １１  Ｓｕｐｐｌ  １，２３−２８；Ｌａｕｎｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １１  Ｓｕｐｐｌ  １，２−１３）は、大規模なゲノムワイド関連解析（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５，１４５２−１４５８）とともに、ＡＤが認知症の多様な混合であり、進行したＡＤ患者の最大で１０パーセントに、アミロイド病変がないことを示した（Ｃｒａｒｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２８，７５５−７６６）。さらに、ＢｒａａｋおよびＢｒａａｋによる重要な病理学的研究（Ｂｒａａｋ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｒａａｋ，Ｅ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ  １６５，３−１２）は、解剖前の神経原線維変化病変の程度と認識状態との間の明らかな相関関係を実証した。これらの観察は、幾人かの研究者（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１，３６２−３８１）によって、および最近の長期的なバイオマーカー研究において裏付けられており、このバイオマーカー研究は、タウおよびリン酸化タウの脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルが、疾患の初期および後期を通して増加することを示す（Ｊａｃｋ，Ｃ．Ｒ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．１２，２０７−２１６）。
【０００５】
上に示されるように、微小管関連タンパク質タウ、およびその過リン酸化形態は、ＡＤの主な特徴の１つである細胞内神経原線維変化の主な構成要素である。さらに、タウの特定の遺伝的変異体が、家族性の前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に関連している。ＡＤにおけるタウ病変の出現は、内嗅皮質から出発し、その後、海馬および皮質領域が続く明確な空間的パターンで起こる（Ｂｒａａｋ，Ｈ．およびＢｒａａｋ，Ｅ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ  １６５，３−１２）。また、タウ病変の特定の段階が、認知能力と深く関係している（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１，３６２−３８１；Ｂｒａａｋ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４９  Ｓｕｐｐｌ  ３，１４−２２）。総合すると、このエビデンスは、ＡＤについてのタウに基づく仮説の基礎となる。それは、タウの細胞内蓄積が、微小管変性および脊柱崩壊をもたらすことを含む。結果として、ニューロン間の伝達の機能不全および細胞死が続く。最近、タウ自体が、１つの細胞から次の細胞へと神経変性を伝達し得る内因性病原性（ｅｎｄｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）種となり得ることも示された（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，９０９−９１３）。
【０００６】
内因性病原体としてのタウ
Ｃｌａｖａｇｕｅｒａおよび同僚は、タウ自体が内因性病原体（ｅｎｄｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎ）として働き得ることを実証した（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，９０９−９１３）。低スピン（ｌｏｗ  ｓｐｉｎ）脳抽出物を、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスから単離し（Ａｌｌｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２，９３４０−９３５１）、希釈し、幼若ＡＬＺ１７マウスの海馬および皮質領域に注入した。ＡＬＺ１７マウスは、遅い病変（ｌａｔｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）のみを発現するタウトランスジェニックマウス株である（Ｐｒｏｂｓｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．９９，４６９−４８１）。注入されたＡＬＺ１７マウスは、固体線維状病変を直ぐに発現し、Ｐ３０１Ｓマウスに由来する免疫枯渇された脳抽出物または野生型マウスに由来する抽出物の投与は、タウ病変を誘発しなかった。可溶性（Ｓ１）およびサルコシル不溶性タウ（Ｐ３）中の脳抽出物の分別（Ｓａｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ．Ｄｉｓ．３３，２４９−２６３）およびＡＬＺ１７マウスへのこれらの注入は、Ｐ３画分が、病変の誘発に最も有効であることを実証した。それは、細胞内過リン酸化線維状タウの大部分を含有する。病変の大部分は、Ｐ３０１Ｓ抽出物を野生型マウスの脳内に注入した場合にも誘発され得るが、ＮＦＴは形成されなかった。その後の研究において、Ｃｌａｖａｇｕｅｒａらは、他のタウオパチー（嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ））の死後脳組織から抽出されたヒトタウも、ＡＬＺ１７モデルにおいてタウ病変を誘発し得ることを示した（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，９５３５−９５４０）。これらのデータの提示以来、いくつかの他のタウシーディングおよび拡散モデルが報告されている（Ａｈｍｅｄ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７，６６７−６８３；Ｗａｌｋｅｒ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌ．７０，３０４−３１０）。これらの研究からの主な結論は、細胞内封入体中の病原性タウが細胞から細胞周辺腔中へと分泌される機構を示す。次に、病理学的タウ材料は、順行および逆行方向の両方で、小胞の鞘に沿って輸送され、その後、バルクエンドサイトーシスによって、隣接する細胞によって取り込まれる。この機構は、ヒトの疾患において観察される病変の拡散が、明確な解剖学的パターンにしたがう理由を説明する。興味深いことに、病理学的タウの末梢投与は、ＡＬＺ１７マウスにおけるタウ病変の形成を加速させ得る（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７，２９９−３０１）。
【０００７】
α−シヌクレインとタウ病変との間の関係
α−シヌクレインは、β−およびγ−シヌクレインおよびシノレチン（ｓｙｎｏｒｅｔｉｎ）を含むタンパク質のファミリーの１つである。α−シヌクレインは、シナプスに関連して正常な状態で発現され、シナプス小胞放出を調節し、それによって、神経、可塑性、学習および記憶に影響を与える役割を果たすものと考えられる。
【０００８】
いくつかの研究により、α−シヌクレインがパーキンソン病（ＰＤ）発症に中心的役割を果たすことが示唆されている。タンパク質は、病的状態において、凝集して細胞内の不溶性原線維を形成し得る。例えば、レビー小体（ＬＢ）においてシヌクレインが蓄積する（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９−４０；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：３６７−７２；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５−８）。稀な家族性パーキンソン病では、α−シヌクレイン遺伝子の突然変異ならびにこの遺伝子の重複および三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が共分離する（Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６−８；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５−７）。
【０００９】
α−シヌクレインが、血漿および脳脊髄液（ＣＳＦ）中に分泌され存在し得るという重要な発見があった。例えばＰａｃｈｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）およびその他（Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：５７１−５７６；Ｖｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）４２：７８７１−７８７８）によるいくつかの研究により、細胞外シヌクレインが、脳において病因的役割を果たすことが示唆されている。それらの研究により、α−シヌクレインが、細胞外シヌクレインオリゴマーに直接曝される脳神経細胞膜に対して神経毒性を有することが実証された。シヌクレイン分泌のデータに基づいた別の興味深い仮説は、α−シヌクレインのプリオン様の広がりが、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーの進行の根底にあるというものである（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１：７１５−７２５）。これらの発見により、細胞外シヌクレインが、免疫療法によって標的にされ得（Ｖｅｋｒｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  １０：１０１５−１０２５）、α−シヌクレイノパチーの治療に使える可能性があり得るという期待が生じた。突然変異に加えて、α−シヌクレイン遺伝子の選択的スプライシングおよびタンパク質の翻訳後修飾（リン酸化、ユビキチン化、ニトロ化、および切断など）が、α−シヌクレインの凝集および／または毒性形態を形成する強化された能力を有するα−シヌクレインタンパク質形態を生じ得る（Ｂｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ａｒｉｚａ，Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；４７（２）：５０９−２４）。しかしながら、α−シヌクレイノパチーのα−シヌクレインの正確な病理学的な種は、依然として不明である。オリゴマーから原線維に及ぶ様々なミスフォールド／凝集／分泌された種、および様々な翻訳後修飾が、毒性と関連付けられているが、実際に１つの毒性種があった場合でさえ、どれが最も重要かについての意見の一致はない。
【００１０】
ＡＤ患者のサブセットにおけるＰＤまたはレビー小体を有する患者のサブセットにおける病変、例えばレビー小体、Ａβプラークおよび神経原線維変化の同時出現（Ｇａｌｐｅｒｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００８），５９：４４９−４５８）は、凝集しやすいタンパク質がどの程度まで互いにクロスシードし得るかの研究につながった。α−シヌクレインおよびタウタンパク質は、インビトロでの共インキュベーションの度に原線維化を誘発することが可能であることが報告された（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：６３６−６４０）。細胞系において、α−シヌクレイン原線維によるタウのクロスシーディングを裏付けるエビデンスと裏付けないエビデンスの両方が存在する。Ｈｏｌｍｅｓらは、ＦＲＥＴベースのタウレポーター細胞株において完全長α−シヌクレインから作製された原線維によるタウのクロスシーディングを実証することができなかった（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ＰＮＡＳ  ｄｏｉ／１０．１０７３：Ｅ４３７６−Ｅ４３８５）。多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者からの原線維化完全長α−シヌクレインＡ５３ＴまたはＰＴＡ沈殿処理された（原線維化α−シヌクレインを富化するために）脳試料でも、タウ凝集を誘発することはできなかった（Ｗｏｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）ＰＮＡＳ  ｄｏｉ／１０．１０７３：Ｅ４９４９−Ｅ４９５８。ある条件下で、α−シヌクレインが、タウ凝集を誘発することができ、例えば、Ｎ末端切断型（２１〜１４０）α−シヌクレインから作製されたα−シヌクレイン原線維が、ＱＢＩ２９３細胞内のタウリン酸化を誘発することが示されたことを報告する者もあった（Ｗａｘｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉａｓｓｏｎ（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３１：７６０４−７６１８）。神経培養において、完全長原線維化α−シヌクレインは、タウ凝集をシードしない。しかしながら、切断型α−シヌクレイン（１〜１２０または３２〜１４０）から作製された原線維化α−シヌクレインは、細胞内の繰り返されるセルフシーディングを通すことができる（各継代からの原線維化α−シヌクレインの５または１０％が、その後の継代の原線維化におけるシードとして含まれる）（Ｇｕｏ  ｅｌ  ａｔ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５４：１０９−１１７）。
【００１１】
本発明者らが知る限り、α−シヌクレインの分泌されたオリゴマーまたは原線維化形態が、一般に、可視のα−シヌクレイン封入体に関係なく、ＡＤまたは他のタウオパチーの早期の発症における寄与因子であり得ると仮説を立てた研究はない。α−シヌクレインによるタウのクロスシーディングを実証することができた報告は、明らかなシヌクレイン凝集（レビー小体）を有する一部のＰＤ患者において、神経原線維変化がなぜ見られるのかを説明することに焦点を合わせていた。これらの研究は、クロスシーディングが、タウとα−シヌクレイン堆積との密接な生理学的関連がある領域において起こり得ると推測している（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：６３６−６４０；Ｗａｘｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉａｓｓｏｎ（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３１：７６０４−７６１８；Ｇｕｏ  ｅｌ  ａｔ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５４：１０９−１１７）。レビー小体またはレビー神経突起の形態の細胞内凝集体ではなく、α−シヌクレインの可溶性の細胞外オリゴマー／原線維化形態が、タウ神経原線維変化の生成における重要な寄与因子であるという考えは新規である。
【００１２】
α−シヌクレイン免疫療法
α−シヌクレインに結合する抗体は、レビー小体病（ＬＢＤ）としても知られているシヌクレイノパチーを治療するための潜在的な治療剤として開発された。シヌクレイノパチーは、タンパク質α−シヌクレインが主要な構成要素である、レビー小体（ＬＢ）および／またはレビー神経突起として顕微鏡で見られる細胞内タンパク質凝集体の堆積によって特徴付けられる（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２  Ｊａｎ；２７（１）：８−３０；ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４）。シヌクレイノパチーとしては、パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）およびびまん性レビー小体（ＤＬＢ）病（レビー小体認知症（ＤＬＢ）としても知られている、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合された（combined）アルツハイマー病およびパーキンソン病（ＰＤ）、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群））が挙げられる。
【００１３】
α−シヌクレインに対するいくつかの異なる抗体が、前臨床動物モデルにおいて治療効果を有することが示されている。α−シヌクレイン残基９１〜９９を含むエピトープを標的にする抗体およびα−シヌクレイン残基１１８〜１２６を含むエピトープを標的にする抗体は両方とも、トランスジェニックマウスの運動障害および認知障害に対する効果を与えることが示されている（Ｇａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。最先端のこれらの抗体は、α−シヌクレイン残基１１８〜１２６を含むエピトープを標的にし、現在、臨床試験のフェーズＩの段階にある、マウスモノクローナル抗体９Ｅ４に基づいたヒト化抗体である。α−シヌクレインのアミノ末端エピトープを標的にする抗体も、マウスプリオン様伝播モデルにおいて病変の広がりおよび毒性を防止する可能な治療可能性を有することが示されており（Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）、α−シヌクレイン残基１２０〜１４０を含むエピトープを標的にするＣ末端抗体２７４（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）も、前臨床モデルにおいて、細胞から細胞への病変の広がりに対する効果を有することが示された。これらに加えて、α−シヌクレインのオリゴマーおよび原線維などの立体配座種を標的にする抗体は、これらのおそらく毒性のα−シヌクレイン種のレベルを少なくとも低下させることができることが示された（Ｌｉｎｄｔｓｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１４およびＳｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ｍａｂ４７などの、インビボでα−シヌクレインオリゴマーレベルを低下させるこれらの立体配座抗体も、アミノ酸１２１〜１２５からの、α−シヌクレインのＣ末端におけるエピトープを標的にすることが示された（米国特許出願公開第２０１２０３０８５７２号明細書）。他の立体配座、原線維およびオリゴマー特異的抗体も、Ｃ末端配列を標的にする（Ｖａｉｋａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．２０１５  Ａｐｒ  ３０；７９：８１−９９）。重要なことには、これらのα−シヌクレイン抗体のいずれも、タウ凝集を防止することができ、その結果として、タウオパチーを潜在的に治療することができるとは主張されていない。
【００１４】
本明細書において、本発明者らは、凝集／原線維化α−シヌクレインが、タウの凝集を誘発することができ、α−シヌクレインに結合するように生成された、いくつかの抗体が、この凝集を防止することができることを意外にも発見した。本発明者らは、一連の様々なα−シヌクレイン抗体が全て、細胞モデルにおいてタウの凝集を防止することができることを示す：毒性であると推定されるα−シヌクレインフラグメント１〜１１９／１２２（α−シヌクレインのアミノ酸１１２〜１１７への結合）に結合し、この切断型のα−シヌクレインを中和することができる抗体（ＧＭ３７）、α−シヌクレインのアミノ酸１３６〜１４０に結合する抗体（２Ｅ６）、α−シヌクレインのアミノ酸１２６〜１３８に結合する抗体（ＧＭ６３）およびα−シヌクレインのアミノ酸１１８〜１２６に結合する抗体９Ｅ４。線維形態のα−シヌクレインが、早期のＡＤ病変に寄与し得ることを裏付けるために、本発明者らは、レビー小体病変の存在に関係なくＡＤ患者に由来する脳内の原線維化α−シヌクレインの存在を実証している。これは、可溶性の細胞外形態の原線維化α−シヌクレインが、可視のα−シヌクレイン凝集体（脳イメージングまたは死後の染色によって決定される）で特徴付けられるＡＤ患者だけではなく全てのＡＤ患者などのタウオパチーのタウ病変への寄与において役割を果たす可能性があり得ることを裏付ける。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、タウの凝集を阻害するためのα−シヌクレイン結合モノクローナル抗体の使用に関する。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲に開示される本発明の抗体は、アルツハイマー病の患者、または嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症などのタウオパチーの患者を治療するのに使用され得る。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ハイブリドーマの作製のための免疫化プロトコルを示す。表は、ＧＭ３７およびＧＭ２８５の同定に使用される免疫原およびマウス株の相違を要約している。異なるＨＣｏ１７−Ｂａｌｂ／ｃおよびＨＣｏ１２／Ｂａｌｂ／ｃマウスを、別々に免疫した（これらのマウスの説明が以下に示される）。アミノ酸１〜１４０原線維を含有する完全長α−シヌクレインで免疫され、完全長（ＦＬ）α−シヌクレイン（配列番号１０）の切断α−シヌクレインフラグメント１〜６０および１〜１１９を投与された（ｂｏｏｓｔｅｄ）マウスから、ハイブリドーマ発現ＧＭ３７を同定した。ハイブリドーマ発現抗体ＧＭ２８５は、ＨＣｏ１２−Ｂａｌｂ／ｃマウスが、完全長モノマーα−シヌクレイン、アミノ酸１〜１４０で免疫され、続いて、完全長線維性α−シヌクレインを投与された免疫化プロトコル（実施例１）から得られた。
【図２Ａ】（パネルＡ〜Ｃ）は、αシヌクレイン、α−シヌクレインホモログおよびオルソログへの結合についてのＧＭ３７のスクリーニングを示す。Ａ）非洗浄溶液ベースのＥＬＩＳＡ（ＦＭＡＴ）を用いたα−シヌクレインへの抗体ＧＭ３７の結合。
【図２Ｂ−１】（パネルＡ〜Ｃ）は、αシヌクレイン、α−シヌクレインホモログおよびオルソログへの結合についてのＧＭ３７のスクリーニングを示す。Ｂ）ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、抗体ＧＭ３７の結合は、α−シヌクレイン（αパネル）に特異的であり、他の関連するシヌクレインファミリータンパク質、β−シヌクレイン（βパネル）およびγ−シヌクレイン（γパネル）に結合しない。ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔｒｅｄ）を用いて測定を行い、ＧＭ３７は、カニクイザル（カニクイザルパネル）およびマウス（マウスパネル）に由来するα−シヌクレインへの同様の結合を示す（実施例１）。
【図２Ｂ−２】図２Ｂ−１と同じ。
【図２Ｂ−３】図２Ｂ−１と同じ。
【図２Ｃ−１】（パネルＡ〜Ｃ）は、αシヌクレイン、α−シヌクレインホモログおよびオルソログへの結合についてのＧＭ３７のスクリーニングを示す。Ｃ）ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔｒｅｄ）を用いて、抗体ＧＭ２８５の結合は、α−シヌクレインに特異的であり、他の関連するシヌクレインファミリータンパク質、β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに結合しない。ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔｒｅｄ）を用いて測定を行い、カニクイザル（カニクイザル）およびマウス（マウス）に由来するα−シヌクレインへのＧＭ２８５の同様の結合を示す（実施例１）。
【図２Ｃ−２】図２Ｃ−１と同じ。
【図２Ｃ−３】図２Ｃ−１と同じ。
【図２Ｃ−４】図２Ｃ−１と同じ。
【図２Ｃ−５】図２Ｃ−１と同じ。
【図３−１】（パネルＡ〜Ｃ）は、ＧＭ３７のリアルタイムの結合親和性を示す。Ａ）ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）によって決定される際の時間（Ｘ軸）に対するＲＵ（相対単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｕｎｉｔ））（ｙ軸）で測定されるα−シヌクレインへの抗体ＧＭ３７の結合。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定した。ＧＭ３７を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ固定化チップ上に捕捉し、一連の濃度のヒトα−シヌクレイン（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）を、表面への結合について試験した。各サイクル間でセンサー表面を再生した。
【図３−２】（パネルＡ〜Ｃ）は、ＧＭ３７のリアルタイムの結合親和性を示す。Ｂ）結合曲線に変換される異なる濃度における結合からの信号。Ｃ）抗体ＧＭ３７（ｈｌｇＧ１−６００４−０３７−Ｃ１０６Ｓと示される）の計算された結合定数（実施例２）。
【図４−１】（パネルＡ〜Ｃ）は、ＧＭ２８５のリアルタイムの結合親和性を示す。Ａ）ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）によって決定される際の時間（Ｘ軸）に対するＲＵ（ｙ軸）で測定されるα−シヌクレインへの抗体ＧＭ２８５の結合。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定した。ＧＭ２８５を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ固定化チップ上に捕捉し、一連の濃度のヒトα−シヌクレイン（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）を、表面への結合について試験した。各サイクル間でセンサー表面を再生した。
【図４−２】（パネルＡ〜Ｃ）は、ＧＭ２８５のリアルタイムの結合親和性を示す。Ｂ）結合曲線に変換される異なる濃度における結合からの信号。Ｃ）抗体ＧＭ２８５（ｈｌｇＧ１−６００４−２８５と示される）の計算された結合定数（実施例２）。
【図５−１】（パネルＡ〜Ｃ）は、比較用抗体９Ｅ４のリアルタイムの結合を示す。Ａ）ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）によって決定される際の時間（Ｘ軸）に対するＲＵ（ｙ軸）で測定されるα−シヌクレインへの９Ｅ４の結合を示す。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定した。９Ｅ４を、チップに固定されたヤギ抗ヒトＩｇＧへのその結合によってチップ上に捕捉した。一連の濃度のヒトα−シヌクレイン（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）を、表面への結合について試験した。各サイクル間でセンサー表面を再生した。
【図５−２】（パネルＡ〜Ｃ）は、比較用抗体９Ｅ４のリアルタイムの結合を示す。Ｂ）結合曲線に変換される異なる濃度における結合からの信号。Ｃ）抗体９Ｅ４についての計算された結合定数（実施例２）。
【図６】（パネルＡ〜Ｂ）は、抗体ＧＭ３７およびＧＭ２８５のエピトープマッピングを示す。α−シヌクレインアミノ酸配列９５〜１３２に由来する連続ペプチド（２０量体）（他の非結合ペプチドは図示されていない）への抗体の結合の相対レベルを示すＥＬＩＳＡデータ。  Ａ）ＧＭ３７エピトープは、完全な結合のためにペプチド配列ＩＬＥＤＭＰ（配列番号９）を必要とする。  Ｂ）ＧＭ２８５は、完全な結合のためにペプチドＩＬＥＤ（配列番号１９）を必要とする（実施例３）。
【図７】ＧＭ３７および変異体１〜３の結合速度動態パラメータを固定化組み換えヒトα−シヌクレインと比較する表を示す。ＳＰＲを用いて結合を測定し、１：１の結合アルゴリズム（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００）を用いて結合速度を決定した。
【図８】α−シヌクレイン抗体によって防止されるα−シヌクレインシードによって誘発されるタウ凝集。図７の上側パネルは、タウ凝集が、タウ凝集を妨げる薬剤の効果を評価するのに一般的に使用されるある種の細胞モデルにおいてα−シヌクレインシード（原線維化組み換えα−シヌクレイン）によって効率的に誘発され得ることを示す。α−シヌクレインシードで誘発されるタウ凝集は、一般に−９Ｅ４（Ｅｌａｎ，Ｐｒｏｔｈｅｎａ）ならびにＬｕｎｄｂｅｃｋ抗体ＨＬＤ１、ＧＭ３７（「３７」）およびＧＭ６３（「６３」）によって例示されるα−シヌクレイン抗体によって防止され得る。セリン３９６においてリン酸化されたタウに対する抗体（Ｄ１．２、Ｃ１０．２およびヒト化（ｈ）ｃ１０．２およびＬｕ００４１Ｇと示される別のタウ抗体）およびα−シヌクレインに対する親和性を有さない対照抗体は、タウ凝集に対する効果を与えず、これは、内因性タンパク質とではなく、シーディング種と相互作用する治療用抗体の重要性を裏付けている（実施例１２）。図８の下側パネルは、ＨＥＫ２９３細胞内での凝集アッセイの概要を示す。Ｐ３０１Ｌ突然変異を有するヒト完全長タウをコードするｃＤＮＡで細胞がトランスフェクトされる。２４時間後、細胞が、抗体と組み合わせてα−シヌクレインシードで処理される。４８時間後、生化学的アッセイを用いて、細胞ホモジネート中のタウ凝集のレベルが測定される（実施例５）。
【図９Ａ】５０全てのＡＤ事例−中期（Ｂｒａａｋ  ＩＩＩ／ＩＶ）および後期（Ｂｒａａｋ  Ｖ／ＶＩ）ＡＤに分類される群からの前頭葉におけるα−シヌクレイン凝集体の存在。２つのＤＬＢ試料が、対照（Ａにおける２つの上側の線）として含まれる。ＡＤ試料におけるα−シヌクレイン−セリン１２９リン酸化の検出なし。レビー小体型認知症（ＤＬＢ）試料が、陽性対照として含まれる。ＡおよびＢは、生化学的方法によって測定される５０のＡＤ患者の前頭葉における凝集α−シヌクレインの存在を示す。患者は、ＡＤであると臨床的に診断されており、診断は、タウおよびＡβの死後の組織学的染色によって確認された。患者のいずれも、レビー小体病変（凝集セリン１２９リン酸化α−シヌクレイン）を提示しなかった（図９Ｃ）。全ての患者におけるα−シヌクレイン凝集体の存在およびセリン１２９リン酸化α−シヌクレイン（レビー小体のマーカー）の非存在は、α−シヌクレイン病変がレビー小体として現れる前に、α−シヌクレインの凝集形態が、全てのＡＤ患者において存在するという仮説を裏付ける。本発明者らは、α−シヌクレインのこれらの凝集形態−レビー小体前の形態が、タウ病変を誘発する寄与因子として働き得ることを示唆する（図８）。要約すれば、本発明者らは、α−シヌクレイン凝集体（シード）を中和することが可能であるかまたは他の手段によってα−シヌクレイン凝集体がニューロンもしくはグリア細胞に入り、タウの凝集を促進するのを防ぐ任意のα−シヌクレイン抗体が、タウオパチーを治療するための治療薬としての可能性を有するという仮説を立てている。
【図９Ｂ】図９Ａと同じ。
【図９Ｃ】図９Ａと同じ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用される際、「α−シヌクレイン」という用語は、「α−シヌクレインタンパク質」と同義であり、α−シヌクレインタンパク質アイソフォーム（例えば、Ｐ３７８４０、１−３としてＵｎｉＰｒｏｔにおいて同定される）のいずれかを指す。α−シヌクレインのアミノ酸の番号付けは、以下に示されるように配列番号１０に対して示され、メチオニン（Ｍ）は、アミノ酸残基１である：
【化１】
2020504729.tif 000003
【００１９】
本発明は、α−シヌクレイン、特に、ヒトα−シヌクレインに免疫特異的に結合することが可能であり、一実施形態において、ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１１０〜１４０内のエピトープに免疫特異的に結合する能力を示す、抗体および抗体のフラグメントに関する。ある実施形態によれば、抗体は、ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１１２〜１１７、１１２〜１１５、１１８〜１２６、１２６〜１３８または１３６〜１４０内のエピトープに結合する。
【００２０】
「タウオパチー」という用語は、典型的に、タウの病理学的凝集に関連する神経変性疾患と称される。典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択される。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。特に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神症状から選択され得る。
【００２１】
本発明の文脈における「抗体」（Ａｂ）という用語は、分子（「抗原」）のエピトープに特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、または本発明のある実施形態によれば、免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然抗体は、典型的に、通常、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖から構成される四量体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および、３つの領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される重鎖定常領域から構成される。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）を含む任意のアイソタイプのものであり得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。重鎖および軽鎖可変領域が、典型的に、抗原認識に関与する一方、重鎖および軽鎖定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存される配列の領域が散在する「相補性決定領域」と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含有する。特に関連があるのは、自然界に存在し得るものと異なる物理的環境中で存在するように「単離され」ているか、またはアミノ酸配列中の天然抗体と異なるように修飾された抗体およびそれらのエピトープ結合フラグメントである。
【００２２】
本明細書において使用される際、「抗体のエピトープ結合フラグメント」という用語は、エピトープに免疫特異的に結合することが可能な抗体のフラグメントを意味する。エピトープ結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の１、２、３、４、５または６つ全てを含有してもよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合することが可能であるが、このような抗体のものと異なるこのようなエピトープに対して免疫特異性、親和性または選択性を示し得る。しかしながら、好ましくは、エピトープ結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の６つ全てを含有するであろう。抗体のエピトープ結合フラグメントは、単一のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）を含んでもよく、またはアミノ末端およびカルボキシル末端（例えば、二重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ2フラグメントなど）をそれぞれ有する２つ以上のポリペプチド鎖を含んでもよい。エピトープ結合能力を示す抗体のフラグメントは、例えば、無傷の抗体のプロテアーゼ切断によって得られる。より好ましくは、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、このような遺伝子配列またはそれらのコードｃＤＮＡは、ＶＬおよびＶＨ領域が結合して一価エピトープ結合分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：５８７９−５８８３を参照）としてそれらが作製されるのを可能にするフレキシブルリンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。あるいは、単一のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨ領域が一緒に結合するのを可能にするには短すぎるフレキシブルリンカー（例えば、約９個未満の残基）を用いることによって、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または同様の分子（２つのこのようなポリペプチド鎖が一緒に結合して、二価エピトープ結合分子を形成する）を形成することができる（二重特異性抗体の説明については、例えばＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１４），６４４４−８（１９９３）を参照）。本発明の範囲内に包含されるエピトープ結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＮ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価フラグメント、または国際公開第２００７０５９７８２号パンフレットに記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域から本質的になるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨ領域から本質的になるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨ領域から本質的になり、ドメイン抗体（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ；２ｉ（ｌｌ）：４８４−９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ科動��（ｃａｍｅｌｉｄ）またはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ；５＿（ｌ）：ｌ  ｌｌ−２４）および（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖抗体または単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）を参照）としてそれらが作製されるのを可能にする合成リンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。本発明の文脈におけるこれらのおよび他の有用な抗体フラグメントは、本明細書においてさらに説明される。抗体という用語は、特に規定されない限り、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに酵素的切断、ペプチド合成、および組み換え技術などの任意の公知の技術によって提供される、抗原（抗原結合フラグメント）に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメントも含むことも理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。本明細書において使用される際、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を指す。このような抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ；所望のエピトープに結合することが可能な好適なフラグメントは、無傷の抗体と同じように有用性について容易にスクリーニングされ得る。
【００２３】
抗体ＧＭ３７、３７またはＧＭ３７ｗｔ（本明細書において同義的に使用される）は、ＣＤＲ１〜３配列番号１〜３において示される重鎖および配列番号４〜６において示される軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むかそれからなる抗体またはその抗原結合フラグメントを意味することが意図される。
【００２４】
ＧＭ３７の変異体１、２および３は、
ＧＭ３７変異体１重鎖ＣＤＲ２配列番号３３
ＧＭ３７変異体２重鎖ＣＤＲ２配列番号３４
ＧＭ３７変異体３重鎖ＣＤＲ２配列番号３５
に示される重鎖におけるＣＤＲ２配列の相違だけＧＭ３７と異なる。
【００２５】
抗体ＧＭ２８５またはＩｇＧ−６００４−２８５（本明細書において同義的に使用される）は、ＣＤＲ１〜３配列番号２０〜２２において示される重鎖および配列番号２３〜２５において示される軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むかそれからなる抗体またはその抗原結合フラグメントを意味することが意図される。
【００２６】
抗体ＧＭ６３または６３（本明細書において同義的に使用される）は、ＣＤＲ１〜３配列番号５１〜５３において示される重鎖および配列番号５４〜５６において示される軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むかそれからなる抗体またはその抗原結合フラグメントを意味することが意図される。
【００２７】
抗体９Ｅ４は、ＣＤＲ１〜３配列番号４４〜４６において示される重鎖および配列番号４７〜４９において示される軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むかそれからなる抗体またはその抗原結合フラグメントを意味することが意図される。
【００２８】
抗体２Ｅ６またはｍ２Ｅ６は、ＣＤＲ１〜３配列番号６２〜６４において示される重鎖および配列番号６５〜６７において示される軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むかそれからなる抗体またはその抗原結合フラグメントを意味することが意図される。
【００２９】
２Ｅ６、ｃｈ２Ｅ６、２Ｅ６−ＨＬＤ１、２または３の変異体は、２Ｅ６と比較して、ＣＤＲ領域の外側のそれらの重鎖および軽鎖の相違を有する。
【００３０】
ｃｈ２Ｅ６は、重鎖配列番号７０を含むかまたはそれからなり、軽鎖配列番号７１を含むかまたはそれからなる。
【００３１】
２Ｅ６−ＨＬＤ−１は、重鎖配列番号７２を含むかまたはそれからなり、軽鎖配列番号７３を含むかまたはそれからなる。
【００３２】
２Ｅ６−ＨＬＤ−２は、重鎖配列番号７４を含むかまたはそれからなり、軽鎖配列番号７５を含むかまたはそれからなる。
【００３３】
２Ｅ６−ＨＬＤ−２は、重鎖配列番号７６を含むかまたはそれからなり、軽鎖配列番号７７を含むかまたはそれからなる。
【００３４】
ＨＬＤ１の親和性成熟形態：７Ａ１０、５Ａ１、９Ｄ７、９Ｇ１１、７Ｃ４、Ｌ３、８Ｄ９、９Ｃ１２または６Ｂ６は、２Ｅ６と比較して、配列表および特許請求の範囲において定義されるそれらのＣＤＲ領域の相違を有する。
【００３５】
抗体「’６Ｂ６」は、軽鎖配列番号１２０および重鎖配列番号１２１からなる抗体を意味することが意図される。
【００３６】
抗体「５Ａ１」は、軽鎖配列番号１０４および重鎖配列番号１０５からなる抗体を意味することが意図される。
【００３７】
抗体「９Ｄ７」は、軽鎖配列番号１０６および重鎖配列番号１０７からなる抗体を意味することが意図される。
【００３８】
抗体「９Ｇ１１」は、軽鎖配列番号１０８および重鎖配列番号１０９からなる抗体を意味することが意図される。
【００３９】
抗体「Ｌ３」は、軽鎖配列番号１１２および重鎖配列番号１１３からなる抗体を意味することが意図される。
【００４０】
抗体「７Ａ１０」は、軽鎖配列番号１１４および重鎖配列番号１１５からなる抗体を意味することが意図される。
【００４１】
抗体「８Ｄ９」は、軽鎖配列番号１１６および重鎖配列番号１１７からなる抗体を意味することが意図される。
【００４２】
抗体「９Ｃ１２」は、軽鎖配列番号１１８および重鎖配列番号１１９からなる抗体を意味することが意図される。
【００４３】
抗体「７Ｃ４」は、軽鎖配列番号１１０および重鎖配列番号１１１からなる抗体を意味することが意図される。
【００４４】
本明細書において特に規定されない限り、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）にしたがって行われる。
【００４５】
上記の抗体は、アルツハイマー病の患者、または嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症などのタウオパチーの患者を治療するのに使用され得る。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。
【００４６】
「抗α−シヌクレイン」抗体は、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインフラグメントに特異的に結合する抗体である。
【００４７】
本明細書において使用される際の「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異によって、または遺伝子再構成中に、または体細胞突然変異によって誘発される突然変異）。
【００４８】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４９】
本発明の抗体、およびそれらのα−シヌクレインエピトープ結合フラグメントは、特に、治療目的に用いられる場合、好ましくは、「ヒト化」されるであろう。「ヒト化」という用語は、一般に組み換え技術を用いて調製される、非ヒト種に由来する免疫グロブリンから得られる抗原結合部位、およびヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた残りの免疫グロブリン構造を有するキメラ分子を指す。抗原結合部位は、ヒト定常領域に融合された完全な非ヒト抗体可変領域、またはヒト可変領域の適切なヒトフレームワーク領域に移植されたこのような可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。このようなヒト化分子のフレームワーク残基は、野生型（例えば、完全ヒト）であってもよく、またはそれらは、配列がヒト化のための基盤として機能したヒト抗体に見られない１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように修飾され得る。ヒト化は、分子の定常領域がヒト個体における免疫原として働く可能性を低下させるかまたはなくすが、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）"Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：４２２０−４２２４）。別の手法は、ヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、可変領域を改変して、それらをヒト型にできる限り近くなるように再形成することにも焦点を当てている。重鎖および軽鎖の両方の可変領域が、該当する抗原に対する応答が異なり、結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、これらの相補性決定領域（ＣＤＲ）には、所与の種において比較的保存され、かつＣＤＲの足場を提供すると考えられる４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接することが知られている。非ヒト抗体が、特定の抗原に対して調製される場合、可変領域は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変されるヒト抗体中に存在するＦＲに移植することによって、「再形成」または「ヒト化」され得る。様々な抗体に対するこの手法の適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ａｎ  Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）"Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｙ  ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｏｎ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）"Ｃｏｎ��ｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｓｈａｐｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  ＨＩＶ−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ"，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＣＤ４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ"，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）"Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）"Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−ｐ１８５ｈｅｒ２  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４２８５−４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）"Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  ＣＤ３３  Ａｎｔｉｇｅｎ"，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４によって報告されている。ある実施形態において、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体に由来する全ての６つのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）を保存する。他の実施形態において、ヒト化抗体は、元の抗体に対して改変された１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有し、これらは、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。抗原をヒト化する能力は周知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，８５９，２０５号明細書；同第６，４０７，２１３号明細書；同第６，８８１，５５７号明細書を参照）。
【００５０】
本明細書において使用される際、抗体またはそのエピトープ抗原結合フラグメントは、別のエピトープと比べてそのエピトープと、より高頻度で、より迅速に、より長い期間および／またはより高い親和性または結合活性で反応または会合する場合、別の分子（すなわち、エピトープ）の領域に「免疫特異的に」結合するといわれる。この定義を読むことによって、例えば、抗体またはそのエピトープ結合抗原結合フラグメントが、第１の標的に特異的に結合し、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合してもまたは結合しなくてもよいことも理解される。本明細書において使用される際、所定の抗原への抗体の結合の文脈における「結合」という用語は、典型的に、抗原をリガンドとしておよび抗体を検体として用いてＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器において例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した際の約１０-7Ｍ以下、例えば約１０-8Ｍ以下、例えば約１０-9Ｍ以下のＫＤに対応する親和性での結合を指し、所定の抗原または密接に関連している抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性より少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低くなる量は、抗体のＫＤに依存するため、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が非常に特異的である）場合、抗原に対する親和性が、非特異的抗原に対する親和性より低くなる量は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
【００５１】
本明細書において使用される際の「ｋｄ」（秒−１または１／秒）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【００５２】
本明細書において使用される際の「ｋａ」（Ｍ−１×秒−１または１／秒）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数を指す。
【００５３】
本明細書において使用される際の「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
【００５４】
本明細書において使用される際の「ＫＡ」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合平衡定数を指し、ｋａをｋｄで除算することによって得られる。
【００５５】
いくつかの抗体において、ＣＤＲのごく一部、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる、結合に必要とされるＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を保持するのに必要とされる。抗原に接触せず、ＳＤＲ中にないＣＤＲ残基が、過去の研究に基づいて（例えばＣＤＲ  Ｈ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、必要とされないことが多い）、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループの外側にあるＫａｂａｔ  ＣＤＲの領域から（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）"Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ"，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照）、分子モデリングによっておよび／または実験により、またはＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）"ＳＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  Ｔｏ  Ｍｉｎｉｍｉｚｅ  Ｉｔｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ"，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３−８７２に記載されるように特定され得る。１つまたは複数のドナーＣＤＲ残基が存在しないかまたは全ドナーＣＲが省略される位置におけるこのようなヒト化抗体において、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において（Ｋａｂａｔ番号付けによって）対応する位置を占めるアミノ酸であり得る。含まれるＣＤＲ中のドナーアミノ酸に対する受容体のこのような置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として、潜在的な免疫原性を低下させるのに潜在的に有利である。しかしながら、置換は、親和性の変化も引き起こすことがあり、親和性の著しい低下は回避されるのが好ましい。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も、実験により選択され得る。
【００５６】
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸改変が、機能的結合の喪失をもたらし得るということ（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．ｅｔｃ．（１９８２）"Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９（６）：１９７９−１９８３）は、別の機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定するための手段を提供する。このような変異体ＣＤＲを得るための１つの好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが突然変異を起こされて（例えばランダム突然変異によって、または部位特異的方法（例えば、突然変異遺伝子座をコードするプライマーによるポリメラーゼ連鎖媒介性増幅）によって）、置換アミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列中の関連する残基の同一性を、置換される（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の同一性と比較することによって、その置換についてのＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアが特定され得る。ＢＬＯＳＵＭシステムは、信頼できるアラインメントについて配列のデータベースを分析することによって作成されるアミノ酸置換のマトリックスを提供する（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．（２００４）"Ｗｈｅｒｅ  Ｄｉｄ  Ｔｈｅ  ＢＬＯＳＵＭ６２  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｏｍｅ  Ｆｒｏｍ？"，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（８）：１０３５−１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）"Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１０９１５−１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅｓ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）"Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ"，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９，５５５−５６５）。現在、最先端のＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高くなるほど、置換がより保存的になり、ひいては置換が機能に影響を与えない可能性が高くなる）。得られるＣＤＲを含む抗原結合フラグメントが、ＲＯＲ１に結合できない場合、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、不十分に保存的であると見なされ、より高い置換スコアを有する新たな置換候補が選択され、生成される。したがって、例えば、元の残基がグルタミン酸塩（Ｅ）であり、非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは０であり、より保存的な変化（アスパラギン酸塩、アスパラギン、グルタミン、またはリジンなどへの���が好ましい。
【００５７】
【表１】
2020504729.tif 000004
【００５８】
したがって、本発明は、改良されたＣＤＲを同定するためのランダム突然変異の使用を想定している。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の３つの表の１つまたは複数に反映されているアミノ酸の種類の範囲内の置換によって定義され得る。
【００５９】
【表２】
2020504729.tif 000005
【００６０】
【表３】
2020504729.tif 000006
【００６１】
【表４】
2020504729.tif 000007
【００６２】
より保存的な置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００６３】
アミノ酸のさらなる基は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理を用いて配合され得る。
【００６４】
ファージディスプレイ技術が、ＣＤＲ親和性を増加させる（または低下させる）のに代わりに使用され得る。親和性成熟と呼ばれるこの技術は、突然変異または「ＣＤＲウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）」を用い、再選択（ｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、標的抗原またはその抗原性の抗原結合フラグメントを使用して、初期抗体または親抗体と比較した際に、抗原に対するより高い（またはより低い）親和性で結合するＣＤＲを有する抗体を同定する（例えばＧｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９０３を参照）。単一のヌクレオチドではなくコドン全体の突然変異誘発は、アミノ酸突然変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。変異体クローンのプールからなるライブラリーが構築され得、変異体クローンのそれぞれが、単一のＣＤＲ中の単一のアミノ酸改変により異なり、各ＣＤＲ残基に対して各可能なアミノ酸置換を提示する変異体を含む。抗原に対する増加した（または低下した）結合親和性を有する突然変異体は、固定化突然変異体を標識抗原と接触させることによってスクリーニングされ得る。当該技術分野において公知の任意のスクリーニング方法が、抗原に対する増加したまたは低下した親和性を有する突然変異体抗体を同定するのに使用され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９５：６０３７；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１９９４を参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングが、使用可能であり得る（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５１を参照）。
【００６５】
このような親和性成熟を達成するための方法は、例えば：Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）"Ａｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｔｏｒｔｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ"，ＭＢｉｏ．２（１）ｐｉｉ：ｅ００３４５−１０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００３４５−１０；Ｋｕａｎ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）"Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｍａｔｕｒｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＢ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ"，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０．１００２／ｉｊｃ．２５６４５；Ｈａｃｋｅｌ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）"Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  ＣＤＲ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｂｉａｓｅｓ  Ｅｎｒｉｃｈ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ"，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０１（１）：８４−９６；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）"Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１"，ＭＡｂｓ  １（５）：４６２−４７４；Ｇｕｓｔｃｈｉｎａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）"Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＣＤＲ−Ｈ２  Ｌｏｏｐ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｆａｂ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎａｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ  Ｏｆ  Ｇｐ４１  Ｙｉｅｌｄｓ  Ａ  Ｓｅｔ  Ｏｆ  Ｆａｂｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｎｄ  Ｂｒｅａｄｔｈ"，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９３（１）：１１２−１１９；最後に、Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）"Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ＲＡＧＥ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  Ｂｏｔｈ  Ｉｎｓｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｏｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ"，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８８（３）：５４１−５５８；Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）"Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ"，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３５３−３７６；Ｓｔｅｉｄｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）"Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ａｎｔ��ｂｏｄｉｅｓ  Ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣＤＲ−Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ"，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（１）：１３５−１４４；およびＢａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）"Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｂｙ  Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ"，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５（２６）：９０２９−９０３４に記載されている。
【００６６】
したがって、包含される抗体またはそれらのエピトープ結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって；例えば置換される４つのアミノ酸残基、３つのアミノ酸残基、２つのアミノ酸残基または１つのアミノ酸残基によって、親抗体のＣＤＲの配列と異なり得る。本発明の一実施形態によれば、ＣＤＲ領域中のアミノ酸が、下記の３つの表において定義されるように、保存的置換で置換され得ることがさらに想定される。例えば、酸性残基Ａｓｐは、抗体の結合特性に実質的に影響を与えずにＧｌｕで置換され得る。
【００６７】
「エピトープ」という用語は、抗体への免疫特異的結合が可能な抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、後者ではなく、前者への結合が、変性溶媒の存在下で常に失われる点で区別される。エピトープは、特異的抗原結合ペプチドによって有効に遮断されるアミノ酸残基（言い換えると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）などの、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。
【００６８】
「トランスジェニック非ヒト動物」という用語は、１つまたは複数のヒト重鎖および／または軽鎖導入遺伝子または導入染色体（その動物の生来のゲノムＤＮＡに組み込まれているかまたは組み込まれていない）を含むゲノムを有し、完全ヒト抗体を発現することが可能な非ヒト動物を指す。例えば、トランスジェニックマウスは、マウスがα−シヌクレイン抗原および／またはα−シヌクレインを発現する細胞で免疫化されたときにヒト抗α−シヌクレイン抗体を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子およびヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖導入染色体のいずれかを有し得る。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、例えばＨＣｏ７またはＨＣｏｌ２マウスなどのＨｕＭＡｂマウスの例のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込まれ得、またはヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載される染色体導入ＫＭマウスの例のように、染色体外で維持され得る。このようなトランスジェニックマウスおよび染色体導入マウス（本明細書においてまとめて「トランスジェニックマウス」と呼ばれる）は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組み換えおよびアイソタイプスイッチを行うことによって、所与の抗原に対して複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥなど）を産生することが可能である。
【００６９】
トランスジェニック、非ヒト動物はまた、特定の抗原に対する抗体の産生のために、このような特定の抗体をコードする遺伝子を、例えばその遺伝子を動物の乳中で発現される遺伝子に機能的に連結することによって導入することによって、使用され得る。
【００７０】
本明細書において使用される際の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患または障害の進行または重症度を改善し、遅らせ、または抑制すること、またはこのような疾患または障害の１つまたは複数の症状または副作用を改善し、遅らせ、または抑制することを意味する。本発明の趣旨では、「治療」または「治療すること」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法をさらに意味し、ここで、「有益なまたは所望の臨床結果」としては、限定はされないが、部分的であるかまたは全体的であるか、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、障害または疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化していない）疾患または障害状態、疾患または障害状態の進行の遅延または緩徐化、疾患または障害状態の改善または緩和、および疾患または障害の寛解が挙げられる。
【００７１】
「有効量」は、本発明の抗体に適用される場合、意図される生物学的効果または所望の治療結果（限定はされないが臨床結果を含む）を達成するのに、必要な投与量および期間にわたる、十分な量を指す。「治療的に有効な量」という語句は、本発明の抗体に適用される場合、障害もしくは疾患の状態の進行、または障害もしくは疾患の症状の進行を改善し、緩和し、安定させ、抑制し、遅らせ、または遅延させるのに十分な、抗体の量を表すことが意図される。一実施形態において、本発明の方法は、他の化合物と組み合わせた、抗体の投与を提供する。このような場合、「有効量」は、意図される生物学的効果を引き起こすのに十分な組合せの量である。
【００７２】
抗α−シヌクレイン抗体の治療的に有効な量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに抗α−シヌクレイン抗体が個体における所望の応答を引き起こす能力などの要因に応じて変化し得る。治療的に有効な量はまた、抗体または抗体部分の何らかの毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回る量である。
【００７３】
上に示されるように、本発明は、特に、ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１１０〜１４０内のエピトープに免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体に関する。一実施形態において、抗体は、α−シヌクレインの１１２〜１１７エピトープへの結合について抗体ＧＭ３７と競合することが可能である。別の実施形態において、抗体は、α−シヌクレインの１１２〜１１５エピトープへの結合について抗体ＧＭ２８５と競合することが可能である。別の実施形態において、抗体は、α−シヌクレインの１２６〜１３８エピトープへの結合について抗体ＧＭ６３と競合することが可能である。別の実施形態において、抗体は、α−シヌクレインの１２６〜１４０エピトープへの結合について抗体２Ｅ６と競合することが可能である。さらに別の実施形態において、抗体は、α−シヌクレインの１１８〜１２６エピトープへの結合について抗体９Ｅ４と競合することが可能である。
【００７４】
抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。
【００７５】
本発明の抗体は、特許請求の範囲においてさらに規定される。
【００７６】
本発明は、患者におけるタウもつれ形成を減少させる方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療的に有効な量の本発明の抗体を投与する工程を含む方法も提供する。
【００７７】
さらに、抗体は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または安定剤と一緒に組成物中にあり得る。本発明の抗体は、治療に使用され得る。特に、本発明の抗体は、タウオパチーを治療するのに使用され得る。典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択される。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される。特に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神症状から選択され得る。
【００７８】
治療は、長期であってもよく、患者は、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上治療され得る。
【００７９】
本発明の抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記載されているハイブリドーマ方法によって産生されるモノクローナル抗体であってもよく、または組み換えＤＮＡ方法によって産生され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体は、任意の好適な源から得られる。したがって、例えば、モノクローナル抗体は、例えば、表面において抗原を発現する細胞、または該当する抗原をコードする核酸の形態で、該当する抗原で免疫されたマウスから得られるマウス脾臓Ｂリンパ球細胞から調製されるハイブリドーマから得られる。モノクローナル抗体はまた、免疫されたヒトまたは非ヒト哺乳動物（ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、霊長類など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得られる。
【００８０】
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。α−シヌクレインに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックまたは染色体導入マウスを用いて生成され得る。このようなトランスジェニックおよび染色体導入マウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、ここではまとめてトランスジェニックマウスと呼ばれている。
【００８１】
ＨｕＭＡｂマウスは、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と一緒に、再配列されていないヒト重鎖可変および定常（μおよびＹ）ならびに軽鎖可変および定常（Ｋ）鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６−８５９（１９９４））。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはＩｇＫの減少した発現を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子が、クラススイッチおよび体細胞突然変異を起こして、高親和性ヒトＩｇＧ、κモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、上記参照；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３，４９−１０１（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４  ５３６−５４６（１９９５）に概説されている）。ＨｕＭＡｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，６２８７−６２９５（１９９２）、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，６４７−６５６（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９１２−２９２０（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，５７９−５９１（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に詳細に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットおよび国際公開第０１／０９１８７号パンフレットも参照されたい。
【００８２】
ＨＣｏ７マウスは、それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８２１−８３０（１９９３）に記載されているように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるＣＭＤ破壊（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例１に記載されているように）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように）、およびＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子（米国特許第５，７７０，４２９号明細書に記載されているように）を有する。
【００８３】
ＨＣｏｌ２マウスは、それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８２１−８３０（１９９３）に記載されているように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるＣＭＤ破壊（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例１に記載されているように）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように）、およびＨＣｏｌ２ヒト重鎖導入遺伝子（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例２に記載されているように）を有する。
【００８４】
ＫＭマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，８１１−８２０（１９９３）に記載されているようにホモ接合的に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−８５１（１９９６）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を保有する。このマウス株は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているように、染色体１４フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖導入染色体も保有する。
【００８５】
これらのトランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、周知の技術にしたがって、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するのに使用され得る。本発明のヒトモノクローナル、または他の種に由来する本発明の抗体はまた、該当する免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックな別の非ヒト哺乳動物または植物の生成、および回収可能な形態での抗体の産生によって遺伝子導入的に生成され得る。哺乳動物におけるトランスジェニック産生に関連して、抗体は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中で産生され、それから回収され得る。例えば米国特許第５，８２７，６９０号明細書、米国特許第５，７５６，６８７号明細書、米国特許第５，７５０，１７２号明細書および米国特許第５，７４１，９５７号明細書を参照されたい。
【００８６】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。アイソタイプの選択は、典型的に、ＡＤＣＣ誘導などの所望のエフェクター機能によって導かれる。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、κまたはλのいずれかが使用され得る。必要に応じて、本発明の抗α−シヌクレイン抗体のクラスは、公知の方法によってスイッチされ得る。例えば、元はＩｇＭであった本発明の抗体は、本発明のＩｇＧ抗体にクラススイッチされ得る。さらに、クラススイッチ技術は、あるＩｇＧサブクラスを別のＩｇＧサブクラスに、例えばＩｇＧｌからＩｇＧ２に変換するのに使用され得る。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療的使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチによって変更され得る。一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体、例えばＩｇＧ１、κである。
【００８７】
一実施形態において、本発明の抗体は、完全長抗体、好ましくは、ＩｇＧ抗体、特に、ＩｇＧ１、κ抗体である。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体である。
【００８８】
抗体フラグメントは、例えば従来の技術を用いた断片化によって得られ、フラグメントは、全抗体について本明細書に記載されるのと同じように有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するように処理されて、Ｆａｂ’フラグメントを生成し得る。ＦａｂフラグメントはＩｇＧ抗体をパパインで処理することによって得られ；Ｆａｂ’フラグメントは、ＩｇＧ抗体のペプシン消化により得られる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントはまた、チオエーテル結合またはジスルフィド結合により、以下に記載されるＦａｂ’を結合することによって生成され得る。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントである。Ｆａｂ’−フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、ジチオスレイトールなどの還元剤で処理することによって得られる。抗体フラグメントはまた、組み換え細胞におけるこのようなフラグメントをコードする核酸の発現によって生成され得る（例えばＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４、１２３−３８（１９９５）を参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、このような切断された抗体フラグメント分子を生成するために、Ｈ鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、続いて翻訳停止コドンを含み得る。
【００８９】
一実施形態において、抗α−シヌクレイン抗体は、一価抗体、好ましくは、ヒンジ領域の欠失を有する国際公開第２００７０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている一価抗体である。したがって、一実施形態において、抗体は、一価抗体であり、前記抗α−シヌクレイン抗体は、ｉ）前記一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗α−シヌクレイン抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列およびＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列およびＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結され、ＩｇＧ１サブタイプの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物もしくはヒトに投与されるとき、ＣＬ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともにジスルフィド結合または共有結合を形成することが可能なアミノ酸をＣＬ領域が含まないように修飾されている工程と；ｉｉ）前記一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列およびヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、ヒンジ領域に対応する領域および、Ｉｇサブタイプによって必要とされるように、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物ヒトに投与されるとき、ヒトＩｇのＣＨ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともに、ジスルフィド結合または共有結合または安定した非共有重鎖間結合の形成に関与するアミノ酸残基を含まないように修飾されており、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列および前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結される工程と；ｉｉｉ）前記一価抗体を生成するために細胞発現系を提供する工程と；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞内で（ｉ）および（ｉｉ）の核酸構築物を共発現することによって、前記一価抗体を生成する工程とを含む方法によって構築される。
【００９０】
同様に、一実施形態において、抗α−シヌクレイン抗体は、
（ｉ）本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域の抗原結合部分、および
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域またはＣＨ２およびＣＨ３領域を含むその抗原結合フラグメント
を含む一価抗体であり、ここで、ＣＨ領域またはその抗原結合フラグメントは、ヒンジ領域に対応する領域および、免疫グロブリンがＩｇＧ４サブタイプでない場合、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、同一のＣＨ領域とともにジスルフィド結合を形成するか、または同一のＣＨ領域とともに他の共有結合または安定した非共有重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。
【００９１】
さらなる実施形態において、一価抗α−シヌクレイン抗体の重鎖は、ヒンジ全体が欠失しているように修飾されている。
【００９２】
別のさらなる実施形態において、前記一価抗体の配列は、それがＮ結合型グリコシル化のための受容体部位を含まないように修飾されている。
【００９３】
本発明の抗α−シヌクレイン抗体は、一本鎖抗体も含む。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖Ｆｖ領域が結合されたペプチドである。一実施形態において、本発明は、本発明の抗α−シヌクレイン抗体のＦｖにおける重鎖および軽鎖が、ペプチド一本鎖において（典型的に、約１０、１２、１５つまたはそれ以上のアミノ酸残基の）フレキシブルペプチドリンカーと結合される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供する。このような抗体を産生する方法が、例えば米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，５５２−５５４（１９９０）に記載されている。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合、一価であり、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合、二価であり、または３つ以上のＶＨおよびＶＬが使用される場合、多価であり得る。
【００９４】
一般的に、本明細書に記載される抗α−シヌクレイン抗体は、任意の好適な数の修飾アミノ酸の包含および／またはこのような共役置換基との結合によって修飾され得る。これに関連する適合性は、一般に、非誘導体化親抗α−シヌクレイン抗体に関連するα−シヌクレイン選択性および／または抗α−シヌクレイン特異性を少なくとも実質的に保持する能力によって決定される。１つまたは複数の修飾アミノ酸の包含は、例えば、ポリペプチド血清半減期を増加させ、ポリペプチド抗原性を低下させ、またはポリペプチド貯蔵安定性を増加させるのに有利であり得る。アミノ酸は、例えば、組み換え産生の際に翻訳と同時に（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）もしくは翻訳後に（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾されるか（例えば、哺乳類細胞における発現の際のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ結合型グリコシル化）または合成手段によって修飾される。修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸の修飾の当業者の指針となるのに十分な言及は、文献全体を通して十分にある。例のプロトコルが、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｏｎ  ＣＤ−Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに見られる。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、または有機誘導化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択され得る。
【００９５】
抗α−シヌクレイン抗体はまた、例えばそれらの血中半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾され得る。例示的なポリマー、およびそれらをペプチドに結合するための方法が、例えば米国特許第４，７６６，１０６号明細書、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，４９５，２８５号明細書および米国特許第４，６０９，５４６号明細書に示されている。さらなる例示的なポリマーとしては、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、約１，０００〜約４０，０００、例えば約２，０００〜約２０，０００、例えば、約３，０００〜１２，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ）が挙げられる。
【００９６】
ある態様において、本発明は、
−本明細書に定義される抗α−シヌクレイン抗体、および
−薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
【００９７】
医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，２００５に開示されているものなどの従来の技術にしたがって、薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤とともに製剤化され得る。
【００９８】
薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤は、本発明の選択された化合物および選択された投与方法に好適であるべきである。医薬組成物の担体および他の成分のための適合性は、本発明の選択された化合物または医薬組成物の所望の生物学的特性に対する大きな悪影響がないことに基づいて決定される（例えば、抗原結合に対するそれほど大きくない影響（１０％以下の相対的阻害、５％以下の相対的阻害など））。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０などの非イオン性洗浄剤）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成物に含めるのに好適な他の材料も含み得る。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、または非毒性の、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス機能化（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）セファロース、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）などの、大型のゆっくりと代謝される高分子も含み得る。
【０１００】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、および投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。選択された投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、またはそのアミド、投与経路、投与時期、用いられる特定の化合物の排せつ速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康および過去の病歴、ならびに医療分野において周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に応じて決まる。
【０１０１】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のための非経口、局所、経口または経鼻手段を含む、任意の好適な経路および方法によって投与され得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、非経口的に投与される。本明細書において使用される際の「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常、注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
【０１０２】
インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与するさらなる好適な経路が、当該技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
【０１０３】
一実施形態において、その医薬組成物は、静脈内または皮下注射または注入によって投与される。
【０１０４】
薬学的に許容できる担体としては、本発明の化合物と生理学的に適合性の、あらゆる好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤、酸化防止剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の医薬組成物に用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、およびゴマ油などの植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガムおよび注射可能な有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）、および／または様々な緩衝液が挙げられる。他の担体が、医薬品分野において周知である。
【０１０６】
薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤、例えば（１）水溶性酸化防止剤（アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性酸化防止剤（パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）；および（３）金属キレート剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）も含み得る。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、組成物中に糖類、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール、グリセロールなど）または塩化ナトリウムなどの等張剤も含み得る。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の保存可能期間または有効性を向上させ得る、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、防腐剤または緩衝液などの、選択された投与経路に適切な１つまたは複数の補助剤も含有し得る。本発明の化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの速放性から化合物を保護する担体とともに調製され得る。このような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、生分解性、生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など）を単独でまたはワックスまたは当該技術分野において周知の他の材料とともに含み得る。このような製剤の調製のための方法は、一般に、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１１０】
一実施形態において、本発明の化合物は、インビボでの適切な分配を確実にするように製剤化され得る。非経口投与用の薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。補助的な活性化合物も、組成物に組み込まれ得る。
【０１１１】
注射用の医薬組成物は、典型的に、製造および貯蔵の条件下で、滅菌性かつ安定性でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬剤濃度に好適な他の規則構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）を含有する、水性または非水性溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合、所要の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール（グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収が、吸収を遅らせる物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、例えば上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および例えば上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１１２】
滅菌注射用溶液は、上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１１３】
治療の上記の方法および使用における投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割量が、時間をかけて投与されてもよく、または用量が、治療状況の要件によって示されるように比例的に減少または増加されてもよい。非経口組成物は、投与のしやすさおよび投与の均一性のために単位剤形で製剤化され得る。本明細書において使用される際の単位剤形は、治療される被験体のための統一された投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、所要の医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特性および得られる具体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体における敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。
【０１１４】
抗α−シヌクレイン抗体の有効投与量および投与計画は、治療される疾患または病態に応じて決まり、当業者によって決定され得る。いずれの日も所定の投与量が投与され、投与量は、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。したがって、例示的な投与量としては、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ／体重、例えば約０．１５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ／体重が挙げられる。
【０１１５】
当該技術分野において通常の技能を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物に用いられる抗α−シヌクレイン抗体の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされるより少ないレベルから開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加し得る。一般に、本発明の組成物の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量であろう。このような有効用量は、一般に、上述される要因に応じて決まる。投与は、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与であり得、たとえば対象の局所の近位に投与され得る。必要に応じて、医薬組成物の有効１日用量は、任意選択的に単位剤形で、１日を通して適切な間隔で、別々に投与される２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の分割用量として投与され得る。本発明の化合物は、単独で投与されることが可能であるが、上述されるように医薬組成物として化合物を投与するのが好ましい。
【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
本発明のさらなる実施形態
１．タウの凝集を阻害するのに使用するための、α−シヌクレイン結合モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２０】
２．抗体が、凝集した可溶性形態のα−シヌクレインに結合する、項目１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２１】
３．タウ凝集の阻害が、インビボまたはインビトロで行われる、項目１または２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２２】
４．前記α−シヌクレイン抗体が、アルツハイマー病の患者に投与される、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２３】
５．患者が、レビー小体変異型アルツハイマー病または複合されたパーキンソン病およびアルツハイマー病に罹患していない、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２４】
６．前記α−シヌクレイン抗体が、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソニズム、リティコ−ボディグ病（グアムパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症を含む群から選択されるタウオパチーの患者に投与される。より典型的に、タウオパチーは、アルツハイマー病、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤに起因する精神病またはＡＤの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神症状、進行性核上性まひ（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤまたはその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性または慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、およびピック病からなる群から選択される、項目１〜３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２５】
７．前記α−シヌクレイン抗体が、α−シヌクレインのＣ末端部分に結合する、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２６】
８．抗体が、ヒトα−シヌクレインのＣ末端アミノ酸１１０〜１４０内のエピトープに結合する、項目７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２７】
９．前記エピトープが、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１１２〜１１７、１１２〜１１５、１１８〜１２６、１２６〜１３８または１３６〜１４０内にある、項目７または８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１２８】
１０．前記抗体が、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１１２〜１１７（配列番号９（ＩＬＥＤＭＰ））内のエピトープに結合する、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
【０１２９】
１１．前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号８の軽鎖可変領域および配列番号７、３０、３１または３２の重鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１３０】
１２．前記抗体が、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０））のアミノ酸１１２〜１１５（配列番号１９（ＩＬＥＤ）内のエピトープに特異的に結合することが可能である、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
【０１３１】
１３．前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号２６の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１３２】
１４．前記抗体が、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１１８〜１２６（配列番号３６（ＮＥＡＹＥ）など）内のエピトープに結合する、項目９に記載のモノクローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
【０１３３】
１５．前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号４２の重鎖可変領域および配列番号４３の軽鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、項目９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１３４】
１６．前記抗体が、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１２６〜１３８（配列番号５０（ＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤ  ＹＥＰ）内のエピトープに結合する、項目９に記載のモノクローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
【０１３５】
１７．前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号５７の重鎖可変領域および配列番号５８の軽鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、項目９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１３６】
１８．前記抗体が、ヒトα−シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１２６〜１４０（配列番号６１（ＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤ  ＹＥＰＥＡ）内のエピトープに結合する、項目９に記載のモノクローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
【０１３７】
１９．前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号６８の重鎖可変領域および配列番号６９の軽鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、項目１８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１３８】
２０．無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体。
【０１３９】
２１．モノクローナル抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体。
【０１４０】
２２．Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）およびドメイン抗体（例えば単一のＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４１】
２３．抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特性：
ａ）０．５〜１０ｎＭ、例えば１〜５ｎＭまたは１〜２ｎＭの、α−シヌクレインに対する結合親和性（ＫＤ）；
ｂ）α−シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力；
ｃ）Ｆ２８−ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力；
ｄ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα−シヌクレインのレベルを減少させる能力；
ｅ）慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルの運動機能を回復させる能力；
ｆ）α−シヌクレインのシーディング（インビトロでの、および／またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など）を防止する能力；および／または
ｇ）ヒト脳における切断α−シヌクレインに結合する能力
の１つ以上を示す、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４２】
２４．ヒト、ヒト化、組み換えまたはキメラ抗体である、先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４３】
２５．抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、項目１〜１１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４４】
２６．配列番号７の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、項目２５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４５】
２７．配列番号７の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域からなる軽鎖を含む、項目２５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４６】
２８．抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、項目１〜１１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４７】
２９．配列番号３０の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、項目２８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４８】
３０．配列番号３０の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域からなる軽鎖を含む、項目２８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１４９】
３１．抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、項目１〜１１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５０】
３２．配列番号３１の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、項目３１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５１】
３３．配列番号３１の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域を含む、項目３１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５２】
３４．抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、項目１〜１１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５３】
３５．配列番号３２の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、項目３４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５４】
３６．配列番号３２の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域を含む、項目３４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５５】
３７．抗体、またはそのフラグメントが、
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、いずれかの項目１〜１３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５６】
３８．配列番号２６の重鎖可変領域または配列番号２７の軽鎖可変領域を含む、項目３７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５７】
３９．配列番号２６の可変領域からなる重鎖および配列番号２７の可変領域を含む、項目３７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５８】
４０．前記α−シヌクレイン抗体が、
（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、項目１〜９および項目１６〜１７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１５９】
４１．配列番号５７の重鎖可変領域または配列番号５８の軽鎖可変領域を含む、項目４０に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６０】
４２．配列番号５７の重鎖可変領域および配列番号５８の軽鎖可変領域を含む、項目４０に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６１】
４３．前記α−シヌクレイン抗体が、
（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、項目１〜９および項目１４〜１５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６２】
４４．配列番号４２の重鎖可変領域または配列番号４３の軽鎖可変領域を含む、項目４３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６３】
４５．配列番号４２の重鎖可変領域および配列番号４３の軽鎖可変領域を含む、項目４３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６４】
４６．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号９４または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６５】
４７．配列番号９４、６６および６７のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目４６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６６】
４８．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号９７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６３または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６４または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目４６または４７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６７】
４９．配列番号９７、６３および６４のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目４８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６８】
５０．配列番号１１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目４６または４７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１６９】
５１．配列番号１１１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目４８または４９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７０】
５２．配列番号１１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１１１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目５０および５１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７１】
５３．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号９５または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７２】
５４．配列番号９５、６６および６７のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目５３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７３】
５５．以下のＣＤＲ：
・配列番号６２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６３または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１０３または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目５３または５４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７４】
５６．配列番号６２、６３および１０３のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目５５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７５】
５７．配列番号１１４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目５３または５４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７６】
５８．配列番号１１５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目５５または５６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７７】
５９．配列番号１１４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１１５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目５７および５８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７８】
６０．配列番号１１６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目５３または５４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１７９】
６１．配列番号１１７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目５５および５６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８０】
６２．配列番号１１６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１１７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目６０および６１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８１】
６３．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号６５または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号９６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８２】
６４．配列番号６５、６６および９６のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目６３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８３】
６５．以下のＣＤＲ：
・配列番号６２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６３または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６４または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目６３または６４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８４】
６６．配列番号６２、６３および６４のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目６５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８５】
６７．配列番号１１２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目６３または６４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８６】
６８．配列番号１１３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目６５または６６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８７】
６９．配列番号１１２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１１３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目６７および６８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８８】
７０．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号６５または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１８９】
７１．配列番号６５、６６および６７のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目７０に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９０】
７２．以下のＣＤＲ：
・配列番号６２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号９８または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１０１または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目７０または７１に記載の使用。
【０１９１】
７３．配列番号６２、９８および１０１のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目７２に記載の使用。
【０１９２】
７４．配列番号１０４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目７０または７１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９３】
７５．配列番号１０５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目７２または７３に記載の使用アイテム。
【０１９４】
７６．配列番号１０４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１０５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目７４および７５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９５】
７７．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号６５または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９６】
７８．配列番号６５、６６および６７のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目７７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９７】
７９．以下のＣＤＲ：
・配列番号６２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号９９または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６４または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目７７または７８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９８】
８０．配列番号６２、９９および６４のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目７９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０１９９】
８１．配列番号１０８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目７７または７８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２００】
８２．配列番号１０９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目７９または８０に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０１】
８３．配列番号１０８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１０９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目８１および８２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０２】
８４．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号６５または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０３】
８５．配列番号６５、６６および６７のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目８４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０４】
８６．以下のＣＤＲ：
・配列番号６２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号１００または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６４または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目８４または８５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０５】
８７．配列番号６２、１００および６４のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目８６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０６】
８８．配列番号１１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目８４または８５に記載の使用。
【０２０７】
８９．配列番号１１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目８６または８７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０８】
９０．配列番号１１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、先行する項目８８および８９のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２０９】
９１．前記α−シヌクレイン抗体が、
・配列番号６５または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６６または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号６７または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む、項目１〜９および項目１８〜１９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２１０】
９２．配列番号６５、６６および６７のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目９１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２１１】
９３．以下のＣＤＲ：
・配列番号６２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；
・配列番号６３または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；および
・配列番号１０２または４つ以下のアミノ酸差、もしくは３つ以下のアミノ酸差、もしくは２つ以下のアミノ酸差、もしくは１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、先行する項目９１または９２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２１２】
９４．配列番号６２、６３および１０２のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、項目９３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２１３】
９５．配列番号１０６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、項目９１または９２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２１４】
９６．配列番号１０７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目９３または９４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０２１５】
９７．配列番号１０６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列番号１０７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、項目９５または９６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２１６】
９８．項目２５〜９７のいずれか１つに記載の抗体またはフラグメントをコードする核酸。
【０２１７】
９９．先行する項目のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは項目２５〜９７のいずれか１つに記載の調製物、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【０２１８】
１００．被験体における項目５または６に記載の疾患を治療する方法であって、項目１〜９７のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
【０２１９】
１０１．治療が長期である、項目１００に記載の方法。
【０２２０】
１０２．長期治療が、少なくとも２週間にわたる、項目１０１に記載の方法。
【０２２１】
１０３．被験体がヒトである、項目１００に記載の方法。
【０２２２】
１０４．項目１００に記載の方法に使用するための、項目１〜９７に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含むキット。
【０２２３】
１０５．項目１〜９７に記載のモノクローナル抗体が、検出可能に標識される、項目５または６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２２４】
１０６．前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識である、項目１０５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２２５】
１０７．被験体の脳または任意の他の器官または体液中の前記α−シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使用するための、項目１０５〜１０６に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２２６】
１０８．前記検出または測定が、前記α−シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体のインビボイメージングを含む、項目１０５〜１０７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２２７】
１０９．前記検出または測定が、前記α−シヌクレインに結合された、前記抗シヌクレイン抗体または前記その抗原結合フラグメントのエクスビボイメージングを含む、項目１０５〜１０８に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【０２２８】
１１０．項目５または６に記載の疾患を治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造に使用するための、項目１〜９７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用。
【０２２９】
１１１．患者における項目５または６に記載の疾患の進行を遅らせる方法であって、項目１〜９７に記載の抗体を投与することによって、前記患者における病理学的タウタンパク質の蓄積を低減または軽減する工程を含む方法。
【実施例】
【０２３０】
実施例１：抗体スクリーニング
１．免疫原およびリガンド産生
以下のタンパク質を、図１に示される免疫原として使用するための取得または産生した。マウスを３つの免疫原で免疫した：完全長組み換えヒトα−シヌクレイン原線維；アミノ酸１〜６０を含有するヒトα−シヌクレイン組み換えタンパク質（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｏｇａｒｔ，Ｇｅｏｒｇｉａ）およびアミノ酸１〜１１９を含有するヒトα−シヌクレイン組み換えタンパク質。完全長α−シヌクレインから原線維を作製するために、Ｒｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂｏｇａｒｔ，Ｇｅｏｒｇｉａ）製の凍結乾燥製品（カタログ番号Ｓ−１００１−２）を使用した。これを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の濃度で、２０ｍＭのトリスおよび３００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に溶解させた。原線維を作製するために、７日間にわたって３７℃で、Ｖｏｒｔｅｍｐ  ５６シェーカーインキュベータ（Ｌａｂｎｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）において２００ｒｐｍで各ウェル中に直径７０μｍのセラミックビーズを含む９６ウェルプレート中で、タンパク質溶液を１７０μｌのアリコートでインキュベートし、原線維の形成の後、チオフラビンＴを加え、ウェルの１つにおける蛍光を測定した。アミノ酸１〜６０を含有する組み換えα−シヌクレインを、水に溶解させて、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。
【０２３１】
アミノ酸１〜１１９を含有する組み換えα−シヌクレインを、以下の構築物を用いて作製した：６つのアミノ酸ヒスチジンタグをコードする合成遺伝子、続いて、Ｘａ因子切断部位およびヒトα−シヌクレインアミノ酸１〜１１９をコードする配列：
【化２】
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を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成し、ｐＥＴ２４ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へとクローニングした。
【０２３２】
発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１へと形質転換させ、Ｎｏｖａｇｅｎ製のｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ自己誘導システム（Ｕｓｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＴＢ３８３  ｒｅｖ．Ｈ１００５）を用いて、単一コロニーを発現のために採取した。規模は、５００ｍｌの最終培養物体積であった。細胞を６０００ｇで１０分間の遠心分離によって採取し、続いて、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｕｓｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＴＢ２４５  Ｒｅｖ．０３０４）を用いて溶解させた。溶解の後、試料を遠心分離によって取り除き、上清をさらなる精製に使用した。
【０２３３】
Ｈｉｓタグ化タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ（Ａ−緩衝液）中で平衡化された５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。試料の適用およびＡ−緩衝液を用いた洗浄の後、タンパク質を、２０カラム体積にわたってＡ−緩衝液中の０．２５Ｍのイミダゾールの勾配になるまで溶離した。５ｍｌの画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。該当するタンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ中でＳ２００（２６／６０）サイズ排除カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。再度、画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける予測サイズを有するバンドの存在に応じてプールした。
【０２３４】
Ｎ末端タグを除去するために、精製されたｈｉｓタグ化α−シヌクレイン１〜１１９を、Ｎｏｖａｇｅｎキット（６９０３７−３ＦＲＸ）を用いて、１：５０の比率で、Ｘａ因子とともにインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、Ｘａ因子を、Ｘａｒｒｅｓｔアガロースを用いてバッチ式に除去した。切断されたα−シヌクレイン１〜１１９を、上述されるように許容（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）ＨｉｓＴｒａｐクロマトグラフィーによって最後に精製した。通過画分（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）から、精製されたα−シヌクレイン１〜１１９が得られ、それを、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置を用いて約４００μｇ／ｍｌになるまで濃縮した。
【０２３５】
α−シヌクレイン（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）を、２ｍｇ／ｍｌで、ＰＢＳ中で再水和し、ペルオキシナイトライト（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｉｒｉｔｅ）（１００μＬ／ｍｇのタンパク質）を、混合しながら滴下して加えた。次に、ニトロシル化α−シヌクレインを、５ＬのＰＢＳ中で透析し、−２０℃で貯蔵した。
【０２３６】
ドーパミンを用いて、α−シヌクレインを酸化した。１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中で調製されたドーパミン−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５２４４）の等体積の２００ｕＭの溶液および１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中のα−シヌクレイン（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）の２８μＭの溶液を組み合わせた。得られた１４ｕＭのα−シヌクレイン／１００ｕＭのドーパミンを、３７℃でＯ／Ｎ（一晩）インキュベートした。次に、酸化されたα−シヌクレインを、ＰＢＳ中で透析し、−２０℃で貯蔵した。
【０２３７】
様々な天然およびキメラ形態のシヌクレインタンパク質を、抗α−シヌクレイン抗体の多様なライブラリーをスクリーニングするために産生した。スクリーニング構築物は、以下のものを含んでいた：ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルα−シヌクレイン、ヒトβ−シヌクレイン、ヒトγ−シヌクレインおよび最後に、α−シヌクレインの残基１２０〜１４０が欠如したα−シヌクレイン誘導体。さらに、一連の４つのシャッフル構築物（ｓｈｕｆｆｌｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）：Ａ−Ｓｙｎ−ＡＡＫＫ−ＢＡＰ、Ａ−Ｓｙｎ−ＢＡＡＫ−ＢＡＰ、Ａ−Ｓｙｎ−ＢＢＡＡ−ＢＡＰ、Ａ−Ｓｙｎ−ＢＢＫＫ−ＢＡＰ（配列番号１１〜１４）を産生した。これらの構築物は、ヒトα−シヌクレイン（Ａ）、ヒトβ−シヌクレイン（Ｂ）およびニワトリα−シヌクレイン（Ｋ）の線形伸長（ｌｉｎｅａｒ  ｓｔｒｅｔｃｈ）を含んでいた。リガンドのそれぞれの部位特異的ビオチン化を促進するために、リガンドのＣ末端に融合されたビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）タグを含む遺伝子をクローニングした。ビオチン化は、可溶性ＥＬＩＳＡフォーマットに使用されるビーズへのリガンドの結合を可能にした。様々なα−シヌクレインＢＡＰタグ融合構築物（ＡＳｙｎＢＡＰ）を保有する哺乳動物発現ベクターを構築した。リガンドを、一過性トランスフェクション（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）を用いて、ＨＥＫ  ２９３細胞内で発現させた。
【０２３８】
２．免疫化
抗体ＨｕＭａｂ−シヌクレインは、完全にマウスである抗体の発現を防ぐよう、マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖およびマウスκ軽鎖をダブルノックアウトされた、ＨｕＭＡｂマウス株ＨＣｏ１７−ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＣｏ１２−ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化から得られた（ヒトモノクローナル抗体；Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。様々なマウス株を、ヒトＩｇ重鎖およびヒトＩｇ  κ軽鎖遺伝子座の挿入によってトランスジェニックにし、これは、ヒトＶＨ（重鎖の可変領域）およびＶＬ（軽鎖の可変領域）遺伝子の数が異なる。
【０２３９】
４８匹のマウスを、１４日間の間隔を空けて、２０μｇの抗原で腹腔内に（ＩＰ）および同じ免疫原で皮下に（ＳＣ、尾基底に）交互に免疫した。４回のＩＰおよび４回のＳＣで、最大で８回の免疫化を行った。
【０２４０】
第１の免疫化を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）中のα−シヌクレイン免疫原で行い、次の免疫化を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で行った。血清抗体価が十分であることが分かった（１／５０以下の血清の希釈物が、少なくとも２回連続の、隔週のスクリーニング事象において、本明細書において上述される抗原特異的スクリーニングアッセイにおいて陽性であることが分かった）とき、マウスに、融合の４および３日前に、１００μＬのＰＢＳ中の１０μｇのα−シヌクレイン免疫原タンパク質を静脈内に（ＩＶ）２回さらに投与した（ｂｏｏｓｔ）。
【０２４１】
免疫化プロトコルが、図１に示される。
【０２４２】
抗体ＧＭ３７は、アミノ酸１〜６０および１〜１１９を含むα−シヌクレインＣ末端切断型と交互に、ヒト完全長α−シヌクレイン−原線維を使用した免疫化プロトコルから得られた。
【０２４３】
抗体ＧＭ２８５は、ヒトα−シヌクレイン−モノマー１〜１４０を最初の４回の免疫化に使用した免疫化プロトコルから得られた。抗体価がない場合、免疫化を、原線維（ｉｐ／ｓｃ）を用いて続け、あるいは、免疫化を、モノマーを用いて続けた。
【０２４４】
３．ＨｕＭａｂハイブリドーマ生成
上に定義される十分な抗原特異的抗体価発現を有するＨｕＭＡｂマウスを殺処分し、腹部大動脈および大静脈に隣接する脾臓およびリンパ節を採取した。マウス骨髄腫細胞株との脾細胞およびリンパ節細胞の融合は、基本的に製造業者の指示にしたがって、ＣＥＥＦ  ５０  Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いた電気融合によって行った。融合細胞を、ＨｙＱ  ｍＡＤＣＦ−Ｍａｂ（Ｐｅｒｂｉｏ）中の１０％のＦｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ  Ｂｏｖｉｎｅ血清（Ｐｅｒｂｉｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｃａｍｂｒｅｘ）、０．５Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、６００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン６（ＩＬ−６）（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ）、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）および０．５ｍｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する融合培地に播種した。１０日後、上清を収集し、細胞を、ＨｙＱ  ｍＡＤＣＦ−Ｍａｂ中の１０％のＦｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ  Ｂｏｖｉｎｅ血清、０．５Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、６００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６および１×ｐｒｏＨＴ（Ｃａｍｂｒｅｘ）を含有する収集培地で洗浄した。ハイブリドーマ培養物の上清を、一次スクリーニングアッセイによってスクリーニングした。上清を、８つの異なるリガンドへの結合について特性評価した。これらは、４つのオルソログ：ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザル、ヒトα−シヌクレインβ−シヌクレインおよびヒトγ−シヌクレイン（配列番号３７〜４１）を含み、最後に、それらを、α−シヌクレインの残基１２０〜１４０が欠如したヒトα−シヌクレイン誘導体に結合するそれらの能力について試験した。
【０２４５】
抗α−シヌクレイン抗体のスクリーニングを、自動液体分注システム（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）を用いて、ハイスループット懸濁ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて行った。プレートの読み取りを、２つのシステムによって行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＦＭＡＴ  ８２００を用いて、３８４ウェルプレートを読み取り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｖｅｌｏｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて、１５３６ウェルプレートを読み取った。
【０２４６】
一次スクリーニングにおいて、クローンを、８つの異なるリガンドに結合するそれらの能力によって特性評価した。これらは、一連の４つのシャッフル構築物：Ａ−Ｓｙｎ−ＡＡＫＫ−ＢＡＰ、Ａ−Ｓｙｎ−ＢＡＡＫ−ＢＡＰ、Ａ−Ｓｙｎ−ＢＢＡＡ−ＢＡＰ、Ａ−Ｓｙｎ−ＢＢＫＫ−ＢＡＰ（配列番号１１〜１４）、α−シヌクレイン１２０〜１４０欠失−ＢＡＰ、ニトロ化ヒトα−シヌクレイン−ＢＡＰおよび酸化ヒトα−シヌクレイン−ＢＡＰを含んでいた。
【０２４７】
簡潔に述べると、α−シヌクレイン特異的抗体を潜在的に含有する血清または上清を、ビーズに加えて、α−シヌクレインおよび／またはα−シヌクレイン由来の構築物への結合を可能にする。抗α−シヌクレイン抗体の結合は、蛍光コンジュゲート、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を用いて検出される。２つの公知のマウス抗α−シヌクレイン抗体、ＬＢ５０９およびＳｙｎ２１１が、陽性対照としてスクリーニングに含まれていた。α−シヌクレイン抗体の特異的検出を確実にするために、抗α−シヌクレイン血清プールが、３８４ウェルフォーマット抗体価スクリーニングにおいて陰性対照として使用される一方、ヒトＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  ＩｇＧが、１５３６ウェルフォーマット８−ビーズに基づくアッセイにおいて使用される。
【０２４８】
最も良好な一次ウェルからのハイブリドーマ細胞を、４０％のＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）および６０％のＨｙＱ  ２×完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）から作製された半固形培地に播種した。各一次ウェルについて、Ｇｅｎｅｔｉｘ黒色６−ウェルプレートのウェルを播種した。各ウェルから、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステム（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を用いて２５個のサブクローンを採取した。サブクローンを収集培地中に採取した。７日後、サブクローンの上清を、シヌクレイン特異的ヒトＩｇＧ結合について再度スクリーニングし、ヒトＩｇＧ濃度を、Ｏｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）を用いて測定した。各一次ウェルから、最も良好なサブクローンを選択し、６００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、０．５Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１×ｐｒｏＨＴのみを含有する展開培地（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）中で展開させた。このサブクローンを、１つの９６ウェルプレートウェルから１つの２４ウェルプレートウェルへ、４つの２４ウェルプレートウェルへ、６つの６ウェルプレートウェルへと展開させた。このプロセスによって得られたクローンを、初代クローン（ＰＣ）と表した。
【０２４９】
さらなる抗体結合研究を、Ｏｃｔｅｔ  ３８４ＲＥＤ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）を用いて行った。２μｇ／ｍｌのＨｕＭａｂ抗体溶液を、試料希釈剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ａｒｔ．Ｎｏ．１８−５０２８）中での希釈によって作製した。アミン反応性センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ａｒｔ．ｎｏ．１８−０００８）を、ＨｕＭａｂの固定化に使用した。アミン反応性センサーへのカップリングの前に、ＨｕＭａｂを、ＭＥＳ  ｐＨ６．０緩衝液（１８−５０２７）中で希釈した。カップリングを、３０℃および１０００ｒｐｍで、以下のとおりに行った：アミン反応性センサーを、ＰＢＳ中で予め湿らせ、続いて、３００秒間にわたって（製造業者の指示にしたがって）ＥＤＣ／ＮＨＳ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ．Ａｒｔ．ｎｏ．１８−１０３３／１８−１０３４）活性化溶液で活性化した。活性化センサーを、６００秒間、ＨｕＭａｂで固定化した。
【０２５０】
組み換えヒト、カニクイザルおよびマウスα−シヌクレインへの、Ｏｃｔｅｔ中のＧＭ３７およびＧＭ２８５の結合、およびヒトβまたはγ−シヌクレインへの結合の欠如が図２に示される。
【０２５１】
４．シヌクレイン特異的ＨｕＭａｂ可変領域の配列分析および発現ベクターにおけるクローニング
ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、全ＲＮＡを、０．２〜５×１０６個のハイブリドーマ細胞から調製し、５'−ＲＡＣＥ−相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、１００ｎｇの全ＲＮＡから調製した。ＶＨおよびＶＬコード領域を、ＰＣＲによって増幅させ、ライゲーション非依存クローニング（Ａｓｌａｎｉｄｉｓ，Ｃ．ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９０；１８（２０）：６０６９−７４）によって、ｐ３３Ｇ１ｆおよびｐ３３κ発現ベクター（ヒトＩｇＧ１／κ定常領域コード配列を含む）中で、フレーム内で、直接クローニングした。各抗体について、１６個のＶＬクローンおよび１６個のＶＨクローンをシークエンシングした。適切なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するクローンを、さらなる研究および発現のために選択した。重鎖および軽鎖の全ての組合せのベクターを、２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞中で一時的に共発現させた。
【０２５２】
ＧＭ３７の場合、ＶＨ領域のシークエンシングにより、位置１０６におけるＣＤＲ３領域中の余分なシステインが同定された。誤った折り畳みの可能性およびジスルフィド結合形成による抗体活性の低下の可能性を推定するために、システインを、位置１０６でセリンへと突然変異させた。
【０２５３】
比較用抗体９Ｅ４を、ハイブリドーマＰＴＡ−８２２１に由来するＶＨおよびＶＬ配列（米国特許出願公開第２００８０１７５８３８号明細書）（配列番号４２および４３）に基づいて作製した。
【０２５４】
５．抗体の発現／精製
抗体を、一過性トランスフェクション剤としてｐＴＴ５ベクターおよびＰＥＩｐｒｏ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ）を用いた、ＨＥＫ２９３  ６Ｅ細胞中でのトランスフェクションによって産生した。簡潔に述べると、重鎖および軽鎖を、ＰＥＩｐｒｏ（ＶＷＲ）を用いてＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、細胞にＴＮ１（Ｓｉｇｍａ）を補充した。生存率が５０％に近づくまで細胞を増殖させ、抗体の収量をｅａｓｙ  ＩｇＧ  ｔｉｔｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって測定した。培養物の上清を、０．２μｍのデッドエンドフィルタ上でろ過し、５ｍＬのタンパク質Ａカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に充填し、０．１Ｍのクエン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ３で溶離した。溶出液を、２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９で直ちに中和し、１２．６ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）に対して一晩（Ｏ／Ｎ）透析した。透析の後、試料を、０．２μｍのデッドエンドフィルタ上で滅菌ろ過した。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、濃度を比濁法および２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。精製された抗体を分割し、−８０℃で貯蔵した。
【０２５５】
実施例２：表面プラズモン共鳴を用いた抗体の特性評価
α−シヌクレインへの抗体のリアルタイムの結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００を用いて測定した。捕捉表面を、ＣＭ５チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））の第１のフローセル（Ｆｃ１）および第２のフローセル（Ｆｃ２）中で、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．ｎｏ：ＢＲ−１００８−３８）の一部）をアミンカップリングすることによって調製した。マウス抗体を、約５００ＲＵのリガンドレベルを達成するのに必要な濃度で、Ｆｃ２中で捕捉した。検体（ＡＳｙｎＢＡＰ）を３０μｌ／分でＦｃ１〜２中に注入する前に、ベースラインを１０分間安定させた。ＡＳｙｎＢＡＰを、それぞれ１００〜３２００ｎＭおよび２５〜３２００ＲＵで試験した。それぞれの一連の滴定における最高濃度は、二連で試験した。各サイクルの最後に、表面を１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．７（３０秒の注入）で再生して、捕捉されたマウス抗体および検体を除去した。ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ−１００１−８８）を、全ての実験において試験緩衝液および試料希釈剤として使用し、アッセイを２５℃で行った。全ての試料を、収集する前に４℃に保持した。
【０２５６】
捕捉抗体が固定されたが、α−シヌクレイン抗体が捕捉されていない、Ｆｃ１に記録された応答値を、Ｆｃ２における応答値から差し引いた。１：１または２：１の結合アルゴリズムを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１．１を用いてデータセットに適合させた。結果が図３、４および５に見られ、これらの図は、ヒトα−シヌクレインへの抗体ＧＭ３７、ＧＭ２８５および９Ｅ４の結合を示す。
【０２５７】
実施例３：エピトープマッピング
α−シヌクレインに対する抗体のエピトープマッピングを、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｚｕｉｄｅｒｓｌｕｉｓｗｅｇ  ２  ８２４３  ＲＣ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において一連の重複直鎖ペプチドを用いて行った。合成された２０量体ペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、Ｐｅｐｓｃａｎに基づくＥＬＩＳＡにおいて試験した。α−シヌクレインの全コード配列をカバーする直鎖ペプチドアレイ、ならびに酸化メチオニンまたはニトロシル化チロシンを含む全てのペプチドを、（４℃で一晩）一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、２５℃で１時間にわたって１／１０００希釈率の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ，ｃａｔ．ｎｒ．２０１０−０５）とともにインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２'−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３パーセントのＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。データ処理のために、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０〜３０００ｍＡＵのＣＣＤカメラ範囲からの値を得た。結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保存した。時々、ウェルは、偽陽性値をもたらす気泡を含み、カードを手動で調べて、気泡によって生じる値を０として採点する。それぞれ配列ＩＬＥＤＭＰまたはＩＬＥＤを含有するペプチドへの抗体ＧＭ３７およびＧＭ２８５の結合データが、図６に見られる。
【０２５８】
実施例４：ＧＭ３７およびＧＭ３７変異体
抗α−シヌクレイン抗体は、患者に使用するための臨床グレード材料を製造するのに使用される製造条件を模倣する条件下で、哺乳動物細胞培養物中で産生される。このように産生されたタンパク質は、抗体の治療有効性ならびに経時的な抗体の安定性に影響を与える生物物理学的特性の両方に影響を与え得る翻訳後修飾を起こすことが周知である。数十年の研究から確認された経験的知識により、特定の分子の発現性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）のリスクを生じることが知られている一連の翻訳後修飾が確認された。これらの翻訳後修飾は、重鎖および軽鎖タンパク質の一次配列中に存在するアミノ酸鎖と相関することが示されている。これらの配列を同定し、それらが治療用抗体の製造可能性および発現性に与える潜在的リスクを決定し得るアルゴリズムが作成された。
【０２５９】
抗体の一次配列のインシリコ分析が、治療薬として開発される可能性のために分子のリスクを回避する（ｄｅｒｉｓｋ）のに使用され得る。特に、ＶＨおよびＶＬ領域の詳細な分析が、経時的なその安定性に対する潜在的リスクにもなり得る分子活性に重要であると考えられる独自のアミノ酸を特定し得る。配列特異的脱アミド化は、タンパク質構造に対する潜在的リスクとして特定された。タンパク質脱アミド化は、グルタミンまたはアスパラギン残基のアミド側鎖上で発生し、それらをカルボン酸基へと変換し得る（Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬＯＳｏｎｅ，ＤＯＩ：１０．１３７１，Ｄｅｃ．（２０１５））。中性ｐＨにおける非酵素的脱アミド化が、アスパラギンについてより早く起こり、したがって、グルタミンより高いリスクが考えられる。この活性は、配列内の後続のアミノ酸によってさらに影響され、数日または数年の率で起こり得る。脱アミド化を起こすタンパク質の実際の結果物は、その安定性および活性の両方に対する変化の影響を決定するために、実験的に評価する必要がある。
【０２６０】
本発明者らは、ＧＭ３７のＶＨ領域内の脱アミド化のための部位を特定した。アミノ酸残基５４は、位置５５におけるグリシン（Ｇ）が後続するアスパラギン（Ｎ）である。Ｎ５４は、自然発生的な脱アミド化の高いリスクがある。このリスクを低下させるために、本発明者らは、アスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはヒスチジン（Ｈ）で置き換えた一連の３つの変異体を作製した。全ての３つの変異体を、一過性トランスフェクション方法を用いて哺乳動物細胞培養物中で生成した。全ての３つの変異体は、ＧＭ３７ｗｔと同様の発現および精製特性を示した。
【０２６１】
８つの産物のそれぞれについて、４００ｍｌの一過性トランスフェクションを、最小で２週間にわたって培養物中に入れていたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞を用いて行った。細胞を、トランスフェクションの２４時間前に継代培養した。全てのトランスフェクションを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅ  ＸＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたエレクトロポレーションによって行った。各トランスフェクションについて、生細胞を、２．８６×１０7個の細胞／ｍｌになるまで６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した予め温めたＣＤ−ＣＨＯ培地中で再懸濁させた。適切な重鎖および軽鎖を含有する、４０μｇのそれぞれの確立されたＳＧＶ  ＤＮＡを、各キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット、０．４ｃｍの間隙、１６５−２０８８）に分割し、７００μｌの細胞懸濁液を加えた。細胞を、３００Ｖ、９００μＦで電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞を、エルレンマイヤーフラスコ中の予め温めた培地に移し、予め温めた培地で２回すすいだキュベットの内容物もフラスコに移した。トランスフェクタント培養物を、３６．５℃、５％のＣＯ2、８５％の湿度、１４０ｒｐｍで６日間、振とう培養器中でインキュベートした。細胞生存性を、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓ自動細胞計数器（Ｒｏｓｃｈｅ）を用いて、採取時に測定した。
【０２６２】
ヒトα−シヌクレインへの結合における残基５４の重要性を評価するために、本発明者らは、２つの異なる実験において変異体が結合する能力を分析した。競合ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて、本発明者らは、残基５４における変化が溶液中のα−シヌクレインに結合するＧＭ３７の能力に与え得る影響を評価した。シヌクレインで被覆されたＥＬＩＳＡプレートへの抗体の結合を阻害することが可能なシヌクレインの濃度を評価することによって、本発明者らは、全ての３つの変異体がＧＭ３７ｗｔと同じ結合を維持しており、１〜２ｎＭのＩＣ５０をもたらす高い親和性でα−シヌクレインに結合することを示した（図７）。室温で６０分間にわたって、０〜１０００ｎＭの範囲のヒトα−シヌクレインを用いて、一定の濃度（０．３μｇ／ｍｌ）の以下の抗体、ＧＭ３７（ＧＭ３７  ｗｔと呼ばれる）、ＧＭ３７変異体１、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ３７変異体３のそれぞれのプレインキュベーションを用いて競合アッセイを行った。残りの非結合抗体を捕捉し、電気化学発光（ＭＳＤ，Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって、抗ヒト検出抗体を用いて、１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトα−シヌクレインで被覆されたＥＬＩＳＡプレート上で測定した。相互作用のＩＣ５０は、ＧＭ３７  ｗｔ、ＧＭ３７変異体１、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ３７変異体３についてそれぞれ、１．９ｎＭ、１．６ｎＭ、２．１ｎＭおよび１．４ｎＭである（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標）を用いて決定した際）。
【０２６３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、本発明者らは、ＧＭ３７  ｗｔ（２バッチ）および３つの変異体の結合のリアルタイム速度を評価した（実施例２）。ヒトα−シヌクレインをスライド（リガンド）に捕捉し、抗体をそれぞれ、検体として複数の濃度で試験した。複数の濃度における抗体の存在下での結合曲線の分析は、抗体を緩衝液から除去したときと同様に、オンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）が全ての４つの抗体について同じであったことを示し、測定されたオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、抗体間の統計学的差異を示さなかった。１：１の結合アルゴリズムを用いて、全ての４つの抗体は、ほぼ同一の結合定数を有する（図７）。効力の喪失に対する懸念。
【０２６４】
実施例５：α−シヌクレインシードによって誘発されるタウ凝集が、α−シヌクレインに対する抗体によって防止され得る。
α−シヌクレイン原線維（シード）調製の説明
α−シヌクレインの原線維化が、わずかに異なるプロトコルにしたがって行われ得る。
【０２６５】
ｒＰｅｐｔｉｄｅ（カタログ番号Ｓ−１００１−２）から購入した組み換えα−シヌクレインを、製造業者の勧告にしたがって、ダブル蒸留水に溶解させて、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ／１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４中の１ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。α−シヌクレインの予め形成された原線維（ＰＦＦ）を、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｌｅｅ／Ｋｅｌｖｉｎ  Ｌｕｋプロトコル（Ｌｕｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，１６；３３８（６１０９）：９４９−５３）を用いて、モノマーα−シヌクレインから生成した。１ｍｇ／ｍｌの溶液を、２日間にわたって撹拌しながら（３００ｒｐｍ）、３７℃でインキュベートし、次に、３日間停止し、次に、１日撹拌し、次に、１日停止し、次に、４日間撹拌した。その後、原線維を採取し、使用するまで−２０℃に保持した。原線維を細胞アッセイに使用する場合、それらを、添加の直前に、ホーンプローブ超音波装置（ｈｏｒｎ  ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて、５．５０％のサイクルを設定して、５分で常に超音波処理した。あるいは、１ｍｇ／ｍｌの溶液を、３７℃で５〜７日間にわたって絶えず振とうする。最終生成物は、「粗原線維」と呼ばれる。超音波処理の後、それらは、「粗シード」と呼ばれる。粗原線維を、遠心分離され得、凝集α−シヌクレインを含有するペレットは、新鮮なＰＢＳ中で懸濁され、「純粋な原線維」と呼ばれる。「純粋なシード」は、純粋な原線維を超音波処理することによって得られる。
【０２６６】
タウのシーディングのα−シヌクレイン抗体に仲介される阻害
細胞内タウのシーディングのα−シヌクレイン抗体に仲介される阻害の効果を示すために、ＨＥＫ２９３細胞ベースのシーディングアッセイを設定した（図８、下側パネルは、アッセイの設備を示す）。ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレート中で、１００，０００個の細胞／ウェルで平板培養し、平板培養後２４時間でヒトタウ−Ｐ３０１Ｌ−ＦＬＡＧをコードするｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２４時間にわたって、抗体を用いてまたは用いずに、凝集した原線維化α−シヌクレイン（シード）を細胞に播種し（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクションを用いて）、続いて、細胞を分割し、再度平板培養し、さらに２４時間後に採取した。細胞を溶解させ、ＰＢＳ中で超音波処理し、１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、ｐｈｏｓ−ｓｔｏｐおよび完全ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）緩衝液を補充した。全細胞溶解物を、Ｃｉｓｂｉｏ製のタウ凝集アッセイを用いて分析した。このアッセイは、ＦＲＥＴにおいてドナー（Ｔｂ３＋共役）およびアクセプタ（ｄ２共役）抗体の両方に同じ抗体を用いた、時間分解蛍光に基づいている。１０μｌの試料を、１０μｌの抗体混合物と混合し、２０時間インキュベートした。プレートを、Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーで読み取って、時間分解蛍光（励起光の切り替え後に測定／積分されるＦＲＥＴ信号）を評価した。このアッセイは、ＡＤ患者に由来するヒト脳剖検材料、タウトランスジェニックマウス（ｒＴｇ４５１０）に由来する脳材料、および高い特異性および感受性を有する播種されたＨＥＫ２９３細胞の両方において、凝集タウを測定する。シードとして原線維化タウタンパク質の様々な調製物を用いて、このタイプのＨＥＫ２９３細胞ベースのシーディングアッセイが、タウ抗体の臨床候補を選択するために効率的に使用された。結果が図８の上側パネルに示される。α−シヌクレインシード（３００ｎｇの粗シード）単独のトランスフェクションは、約１００の相対的タウ凝集（α−Ｓｙｎ、３つ目のバー）をもたらし、これは、α−シヌクレインが、内因性タウのクロスシーディングを強力に誘発することを示す。シーディング効果は、Ｂ１２（対照抗体）および以下のタウ抗体（ｍＣ１０−２、ｍＤ１．２、ＬＵ００４１Ｇと示されるタウ結合抗体およびヒト化（ｈ）Ｃ１０−２）との共トランスフェクションによって影響されなかった。しかしながら、α−シヌクレインＨＬＤ１、ＧＭ３７（３７）、ＧＭ６３（６３）および９Ｅ４に対する４つの異なる抗体とともに、細胞を共インキュベートすることによって、タウ凝集の部分的な改善があった。例えば、抗体９Ｅ４は、相対的凝集の増加を（非処理の対照における１００と比較して）２０にする。全ての抗体を、粗シード（４００ｕｌの総体積中、２．４ｕｇの抗体および３００ｎｇのシード）とともに共トランスフェクトした。
【０２６７】
実施例６：抗体発見２Ｅ６および２Ｅ６変異体
Ａ．免疫化／ハイブリドーマスクリーニング
α−シヌクレインに対するモノクローナル抗体を、例えば反応性アルデヒドで架橋された様々なシヌクレイン凝集体でマウスを免疫化することによって生成した。第１の抗原を、Ｒｐｅｐｔｉｄｅ（４２４１  Ｍａｒｓ  Ｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ，Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡ  ３０６２２，ＵＳＡ）製の組み換え凍結乾燥α−シヌクレインで作製した。それは、タンパク質をＰＢＳに溶解させて、７０ｕＭのα−シヌクレイン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液を得ることによって作製した。溶液を３７℃で１８時間インキュベートし、１００ｕｌのアリコートで凍結させた。第２の抗原を、組み換えα−シヌクレイン（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）から、それを７０マイクロＭで、２０ｍＭのトリス（ｐＨ＝７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌに溶解させることによって、同様に作製した。反応性アルデヒドＯＮＥ（４−オキソ−２−ノネナール、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製のＣａｔ  ＃  １０１８５）を、２０：１のモル比で加えて、α−シヌクレインのオリゴマーを共有結合的に架橋した。溶液を、（振とうせずに）３７℃で１８時間インキュベートした。未反応のＯＮＥを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００スピンカラム（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）によって除去し、試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌに対して透析し、アリコートで凍結させた。第３の抗原は、凍結乾燥粉末（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ製の原材料）として送られた、組み換えα−シヌクレインフラグメントアミノ酸１〜６０（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）であった。簡潔に述べると、３匹の雌マウス（４〜７週齢）を免疫し、３回まで追加免疫した。尾採血を行い、抗原に対する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって抗シヌクレイン抗体についてスクリーニングした。力価が、ＥＬＩＳＡにおいてベースラインの３倍のＯＤ読み取りを達成することが血清希釈によって定義される。対照に対して１：５０，０００より高い力価を示すマウスを、融合のために選択した。採取された脾細胞を、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞に融合し、希釈し、単細胞融合から平板培養した。上清を、融合の１４日後に採取し、抗体産生についてスクリーニングした。シヌクレインＥＬＩＳＡを用いて、５０の陽性クローンを、約１０００ウェルから回収した。Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ／ＡＰキットを、免疫グロブリンアイソタイピング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）に使用した。５０の抗α−シヌクレイン上清を、以下のＳＫＭＥＬ５細胞アッセイにおいてａｔｔｏ標識α−シヌクレイン凝集体の蓄積の減少についてスクリーニングした。市販の抗体ＬＢ５０９が、陽性対照として含まれていた。５０の抗血清のうち、４つのみの抗血清が、α−シヌクレインの細胞内蓄積を減少させたことが分かり、これらの抗体を、クローニングのために取った。次に、これらの４つの抗体を、アッセイにおいて用量反応で試験した。最も高い効果を有する抗体、２Ｅ６を、ＰＤ関連モデルにおいてさらなる特性評価のために選択した。
【０２６８】
原線維調製の説明
組み換えα−シヌクレインを、ｒＰｅｐｔｉｄｅ（カタログ番号Ｓ−１００１−２）から注文し、製造業者の勧告にしたがって、ダブル蒸留水に溶解させて、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ／１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４中の１ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。Ｓｉｇｍａ（＃３８３７１）製のＡｔｔｏ４８８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いることによって、α−シヌクレインをＡｔｔｏ４８８で蛍光標識した。３０％のＡｔｔｏ４８８で標識されたα−シヌクレインと７０％の非標識α−シヌクレインとの混合物を作製し、次に、この混合物を、２日間にわたって撹拌しながら（３００ｒｐｍ）３７℃でインキュベートし、次に、３日間停止し、次に、１日撹拌し、次に、１日停止し、次に、４日間撹拌した。その後、原線維を採取し、使用するまで−２０℃に保持した。原線維を細胞アッセイに使用する場合、それらを、添加の直前に、ホーンプローブ超音波装置を用いて、５．５０％のサイクルを設定して、５分で常に超音波処理した。
【０２６９】
ＳＫ−ｍｅｌ５細胞中の蓄積の抗体に仲介される阻害
ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ｍｅｌ５（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−７０）を、ＡＴＣＣガイドラインにしたがって増殖させた。細胞を、Ｆａｌｃｏｎ  ＢＤ  ９６ウェルプレート中で、ウェル当たり３０００個の細胞の密度で平板培養し、一晩、付着させた。Ａｔｔｏ４８８で標識されたα−シヌクレイン原線維を、ｍ２Ｅ６抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）およびα−シヌクレインペプチド１１３〜１２５または１２６〜１４０（０．０１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に、細胞（０．０１ｍｇ／ｍｌ）に加えた。２４時間のインキュベーションの後、細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドによって固定した。次に、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎにおいて読み取った。核を、１つのチャネル中で検出し、有効なオブジェクトの数を定義した。Ａｔｔｏ４８８で標識された原線維を、核を取り囲む、したがって細胞の細胞質を表す、予め定義された環で形成された領域において別のチャネル中で検出した。α−シヌクレインスポットを含む細胞のパーセントを定量した。結果は、原線維が与えられない細胞において、スポット含有細胞のごく少ないバックグラウンドがあったに過ぎないことを示す（バックグラウンドは、おそらく自己蛍光によるものであった）（図７Ｃ）。原線維が与えられた細胞のみにおいて、細胞の７５％が、蓄積された細胞内スポットを有していた。原線維およびｍ２Ｅ６抗体とともに共インキュベートされた細胞において、約３０％のみのスポット陽性細胞があった。細胞を、原線維、ｍ２Ｅ６および１２６〜１４０ペプチドとともに共インキュベートしたとき、約６０％の陽性細胞があり、したがって、このペプチドは、ｍ２Ｅ６の効果を有意に阻害した。１１３〜１２０ペプチドと、原線維および２Ｅ６との共インキュベーションは、ｍ２Ｅ６の効果を変化させなかった。ペプチド１１３〜１２０または１２６〜１４０のいずれかと一緒の原線維のインキュベーションは、細胞内の原線維の蓄積に影響を与えなかった。したがって、ｍ２Ｅ６は、溶液中でα−シヌクレイン原線維に結合し、細胞内のそれらの蓄積を阻害する。
【０２７０】
増加する用量の２Ｅ６−ＨＬＤ１による処理は、スポットを有する細胞のパーセンテージの用量依存的な減少を示した。無関係の対照抗体（Ｂ１２）で処理された細胞は、効果を示さなかった。
【０２７１】
Ｂ．シヌクレインＥＬＩＳＡ
抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、抗体陽性融合を結合について分析した。Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウェル高結合プレートを、１００ｎｇの凝集シヌクレインで被覆した。ウェルを、室温（ＲＴ）で１時間（ｈｒ）にわたってＰＢＳ中５％のミルクを用いてブロックした。プレートを、ＰＢＳ＋１％のＴｗｅｅｎ  ２０を用いて３回洗浄した。１００マイクロリットルのハイブリドーマ上清を各ウェルに加え、プレートを室温でインキュベートした。その後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的またはγ鎖特異的）二次抗体を各ウェルに加えて、結合された抗シヌクレイン抗体の存在を検出した。定量基質のために、１つの成分ＴＭＢを加え、プレートをＯＤ６２０で測定した。
【０２７２】
Ｃ．抗体ＨＣおよびＬＣ可変領域のＤＮＡ配列の決定
４つの抗αシヌクレイン陽性ハイブリドーマを選択し、ｍＲＮＡを細胞ペレットから抽出した。各ｍＲＮＡ  ｐｒｅｐからのｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、逆転写酵素によって生成した。その後、可変領域プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行って、ＨＣおよびＬＣ遺伝子のＶＨおよびＶＬ領域の両方を増幅した。増幅されたＤＮＡを、アガロースゲル上に分離させ、ＶＨおよびＶＬ産物の両方を単離し、ゲルから精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化し、ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。最小で６つの陽性コロニーを選択し、ＤＮＡシーケンシングによって分析して、ＶＨおよびＶＬ領域の配列を決定した。
【０２７３】
実施例７：抗体工学
モノクローナル抗体の発現
ハイブリドーマクローンの培養物を増殖させ、タンパク質Ｇクロマトグラフィーを用いて、マウスモノクローナル抗体を、培養された上清から精製した。ＨＥＫ２９３細胞への重鎖および軽鎖遺伝子の一過性共トランスフェクション、培養物の増殖、上清の採取およびタンパク質クロマトグラフィーによる精製を用いて、組み換えマウス、ヒトおよびキメラ抗体を産生した。グラム量の抗体が繰り返し必要とされる場合、安定した細胞株をＣＨＯ細胞中で生成した。これらの安定した細胞株を、必要に応じて増殖させることができ、抗体精製を前述のとおりに行った。
【０２７４】
組み換え抗体のクローニング
組み換えモノクローナル抗体を、重鎖および軽鎖遺伝子（Ｇｅｎｅａｒｔ  Ａ／Ｇ）の遺伝子合成によって生成した。その後、合成された遺伝子を、哺乳動物細胞培養物中での発現のために標準的な発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１）へとクローン化した。
【０２７５】
ヒト化
ｍ２Ｅ６のヒト化を、構造ベースのＣＤＲグラフトによって行った。２Ｅ６  ＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を、ＰＤＢおよびＩＭＧＴデータベース中で見られる全てのヒト抗体ＶＬおよびＶＨフレームワークアミノ酸配列に対する相同性についてスクリーニングした。構造モデリングを、ＰＤＢデータベースからの２０ＳＬ抗体を用いて、ｍ２Ｅ６  Ｆｖ領域について行った。２０ＳＬアミノ酸配列は、２Ｅ６  ＶＨおよびＶＬドメインのそれぞれに対して８２．７％および８３．２％相同である。重要なことには、２０ＳＬの構造を、２．１Åの解像度で決定した。２０ＳＬを用いた２Ｅ６ヒト化フレームワークの構造アライメントは、立体障害または立体構造力（ｓｔｅｒｉｃ  ｆｏｒｃｅ）によって折り畳みまたは局所構造に潜在的に影響を与え得る、フレームワーク領域中の重要な残基の決定を可能にした。ヒト化抗体の理論的な抗体構造モデリングを用いて、結合特異性および親和性を維持するために、元のマウスアミノ酸として特異的な残基を２Ｅ６のヒト化形態に維持することの潜在的な重要性について示唆した。この構造モデリングを用いて、ヒト化２Ｅ６の活性を最適化した。
【０２７６】
２Ｅ６  ＶＨ領域のヒト化を、ＶＨ  ＣＤＲを、ヒト生殖細胞系列遺伝子、ＩＧＨＶ１−４６*０１（６９％の相動性）のフレームワーク上にグラフトすることによって行った。マウス２Ｅ６と、選択されたヒトフレームワーク領域との間に２３アミノ酸差がある。構造モデリングにより、ヒト残基への変化が２Ｅ６の活性に悪影響を与える可能性を有していた７つのアミノ酸位置を同定した。これらの残基を、元のマウスアミノ酸に復帰突然変異させた。３つの異なる形態のヒト化重鎖を生成した。ヒト化ＨＬＤ−１は、７つ全ての復帰突然変異、Ｍ３７Ｖ、Ｉ４８Ｍ、Ａ６８Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ｖ７２Ｒ、Ｋ７４Ｔ、Ａ７９Ｖを含有し、ＨＬＤ−２は、Ｉ４８Ｍ、Ａ６８Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ｖ７２Ｒ、Ｋ７４Ｔ、Ａ７９Ｖを含有し、ＨＬＤ−３は、Ｍ３７Ｖ、Ｉ４８Ｍ、Ｌ７０Ｍ、Ｖ７２Ｒ、Ｋ７４Ｔ、Ａ７９Ｖを含有する。
【０２７７】
２Ｅ６  ＶＬ領域のヒト化を、ＶＬ  ＣＤＲを、ヒト生殖細胞系列遺伝子、ＩＧＫＶ３−１１*０１（６４％の相動性）のフレームワーク上にグラフトすることによって行った。マウス２Ｅ６と、選択されたヒトフレームワーク領域との間に２６アミノ酸差がある。構造モデリングにより、ヒト残基への変化が２Ｅ６の活性に悪影響を与える可能性を有していた４つのアミノ酸位置、Ｒ４５Ｌ、Ｗ４６Ｌ、Ｖ５７Ｉ、Ｙ７０Ｆを同定した。ＨＬＤ−１、ＨＬＤ−２およびＨＬＤ−３について、４つ全ての残基を、元のマウスアミノ酸に復帰突然変異させた。
【０２７８】
ＨＬＤ−１、ＨＬＤ−２およびＨＬＤ−３を、ＨＥＫ  ２９３細胞内で一過性に発現させた。抗体を、培養された上清から精製し、その後、シヌクレインリガンドフォーマットを用いて、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によって、シヌクレインへの結合について分析した（表５）。
【０２７９】
【表５】
2020504729.tif 000012
【０２８０】
コドン縮重ＰＣＲプライマーによる軽鎖ＣＤＲ３中のランダム化突然変異、および同様に、コドン縮重ＰＣＲプライマーによる重鎖ＣＤＲ３中のランダム化突然変異によって、およびエラープローンＰＣＲによるインビトロ進化を用いて、ＨＬＤ１の親和性成熟を行った。抗体を、培養された上清から精製し、その後、ＣＭ５チップ上に固定された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて捕捉されたＩｇＧを用いて、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によって、シヌクレインへの結合について分析した（表６）。
【０２８１】
【表６】
2020504729.tif 000013
【０２８２】
１回目の親和性成熟の後、本発明者らは、４つの突然変異（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を構築した：Ａ）重鎖ＣＤＲ２（ＫＹＮＶＮＦＫＴをＫＹＮＶＮＩＫＴに突然変異させる）および重鎖ＣＤＲ３（ＬＧＨＹＧＮＬＹＡＭＤＹをＬＧＨＹＧＮＬＹＡＫＤＹに突然変異させる）中の２つの突然変異を組み合わせた；Ｂ）軽鎖ＣＤＲ１突然変異（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨをＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨに突然変異させる）をＬ３−１１軽鎖に組み込んだ；Ｃ）軽鎖フレームワーク突然変異（ＣＤＲ２の直ぐ上流で、ＰＲＲＷＩＹをＰＲＲＬＩＹに突然変異させる）をＬ３−１１軽鎖に組み込んだ；およびＤ）軽鎖ＣＤＲ１突然変異（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨをＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨに突然変異させる）および軽鎖フレームワーク突然変異（ＰＲＲＷＩＹをＰＲＲＬＩＹに突然変異させる）をＬ３−１１軽鎖に組み込んだ。Ｂｉａｃｏｒｅデータおよび抗体配列に基づいて、本発明者らは、様々な組合せで、軽鎖および重鎖の共発現を試験した：
１．Ｌ３−１１軽鎖＋９Ｃ１２重鎖
２．Ｌ３−１１軽鎖＋８Ｄ９重鎖
３．７Ａ１０軽鎖＋９Ｃ１２重鎖
４．Ｌ３−１１軽鎖＋Ａ
５．７Ａ１０軽鎖＋Ａ
９．Ｂ＋９Ｃ１２重鎖
１０．Ｃ＋９Ｃ１２重鎖
１１．Ｄ＋９Ｃ１２重鎖
１２．Ｂ＋８Ｄ９重鎖
１３．Ｃ＋８Ｄ９重鎖
１４．Ｄ＋８Ｄ９重鎖
１５．Ｂ＋重鎖
１６．Ｃ＋重鎖
１７．Ｄ＋重鎖
抗体を、培養された上清から精製し、その後、ＣＭ５チップ上に固定された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて捕捉されたＩｇＧを用いて、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によって、シヌクレインへの結合について分析した（表７）。
【０２８３】
【表７】
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【０２８４】
実施例８
ＡＤ患者に由来する前頭葉を、氷冷した滅菌ＰＢＳ中で均質化し、ナイフホモジナイザーによって均質化し、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（５パルス０．９秒、アウトプット２）を用いて超音波処理し、４℃で５分間、３０００ｇで清浄化した。上清を収集し、タンパク質濃度をＢＣＡによって決定した。α−シヌクレイン凝集体のレベルを決定するのに使用される試料は、２．１〜４．８ｕｇ／μｌのタンパク質を含有していた。α−シヌクレイン凝集体を、Ｃｉｓｂｉｏ製の市販のα−シヌクレイン凝集アッセイ（カタログ番号６ＦＡＳＹＰＥＧ）を用いて測定した。レビー小体のマーカーである、セリン１２９においてリン酸化されたα−シヌクレイン（シヌクレイン−ｐ１２９）を、Ｃｉｓｂｉｏ製の近日発売予定の市販のシヌクレイン−ｐ１２９凝集アッセイを用いて測定した。各キットからのそれぞれの緩衝液を用いて、製造業者のプロトコルにしたがって、２つのアッセイを行った。簡潔に述べると、全ての１０％のホモジネートを、溶解緩衝液のいずれかの中で１：１２および１：７２で連続希釈し、１０μｌの試料を、１０μｌのそれぞれの抗体混合物（５μｌのＴｂ−クリプテート抗体および５μｌのｄ２コンジュゲート）と混合し、２０時間インキュベートした。時間分解ＦＲＥＴを、Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーにおいて測定し、信号対雑音比を計算し、各試料についてタンパク質に対して正規化した。
【０２８５】
ＡＤ患者に由来する前頭葉の５０の新鮮凍結組織試料を、Ｂａｎｎｅｒ  Ｓｕｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＢＤＰ）（Ｓｕｎ  ｃｉｔｙ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳ）から入手した。中期ＡＤ（Ｂｒａａｋ段階ＩＩＩ／ＩＶ）の患者からの２５の試料および後期ＡＤ（Ｂｒａａｋ段階Ｖ／ＶＩ）の患者からの２５の試料を入手した。いずれの試料も、免疫組織化学的に、α−シヌクレイン病変の証拠を含んでいることは報告されなかった。
【０２８６】
結果が図９に示される。α−シヌクレイン凝集体が、５０全てのＡＤ事例において測定され得る。図９Ａにおいて、１０％の脳ホモジネート（Ｗ／Ｖ）の１２倍および７２倍希釈からの生データは、濃度依存的な信号強度を示す。レビー小体認知症（ＤＬＢ）の患者に由来する２つの試料が、陽性対照（図９Ａ中の赤色の線）として含まれていた。図９Ｂにおいて、１：１２希釈からのデータが、中期ＡＤ（Ｂｒａａｋ段階ＩＩＩ／ＩＶ）および後期ＡＤ（Ｂｒａａｋ段階Ｖ／ＶＩ）の両方において同様のレベルでα−シヌクレイン凝集体の存在を示す試料中の総タンパク質に対して正規化される。
【０２８７】
セリン１２９においてリン酸化されたα−シヌクレインは、ＡＤ試料のいずれにおいても検出されなかったが、それは、ＤＬＢ試料中に明らかに存在していた（図９Ｃ）。セリン１２９においてリン酸化されたα−シヌクレインは、明らかなレビー小体病変のマーカーであり、α−シヌクレイン−セリン１２９−ホスホ抗体による死後の脳の組織学的染色が、パーキンソン病およびＤＬＢのようなシヌクレイノパチーの診断を確認するために日常的に使用される。５０のＡＤ試料中のこのマーカーの非存在は、α−シヌクレイン凝集体が、ＡＤ脳中に常に存在すること、およびシヌクレイン凝集体が、明らかなレビー小体病変の存在なしで存在し得ることを示し得る。
【０２８８】
図８中の所見と組み合わせてこれらの所見に基づいて、本発明者らは、α−シヌクレイン凝集体（シード）を中和することが可能であるかまたは他の手段によってα−シヌクレイン凝集体がニューロンもしくはグリア細胞に入り、タウの凝集を促進するのを防ぐ任意のα−シヌクレイン抗体が、タウオパチーを治療するための治療薬としての可能性を有するという仮説を立てている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｃ−４】
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【図２Ｃ−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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