(57)【要約】  本発明は、癌の治療のためのファージミドベクターおよび関連するファージミド粒子を提供し、特に、癌の治療、予防、改善、または管理のための新規ファージミド粒子および関連する発現システムの使用を提供する。特に、本発明は、癌の治療、予防、改善、または管理のための、サイトカインをコードする導入遺伝子の送達のためのファージミド粒子および発現システムの使用に関する。本発明はまた、導入遺伝子の送達のための、および癌の治療、予防、改善、または管理のために、養子移入されたＴ細胞を使用するそのような治療との組み合わせのための、ファージミド粒子および発現システムの使用にも及ぶ。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療、予防、または改善する方法においての使用のための、組換えファージミド粒子が形質導入された標的腫瘍細胞内で導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、前記方法が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、前記腫瘍細胞に少なくとも隣接して前記核酸配列を送達することを含む、組換えファージミド粒子。
【請求項２】
前記導入遺伝子発現カセットが、前記腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発、内因性抗腫瘍応答を促進するための前記腫瘍細胞の変化、他の治療を促進するための前記腫瘍細胞の変化、または治療を促進するための腫瘍微小環境の変化の効果を有するサイトカインをコードする、請求項１に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組み合わせであり、任意選択的に前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項１または２に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項４】
前記サイトカインが、前記サイトカインの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドサイトカインである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項５】
前記非内因性シグナルペプチドが、ＩＬ−２シグナルペプチドである、請求項４に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項６】
前記ハイブリッドサイトカインが、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成されたＩＬ−２シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである、請求項５に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項７】
前記ハイブリッドＴＮＦαが、実質的に配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む、請求項６に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項８】
前記ハイブリッドＴＮＦαが、配列番号２３を含む核酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体によってコードされている、請求項６または７に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項９】
小児脳腫瘍、任意選択的にびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）または髄芽腫の治療、予防、または改善に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
【請求項１０】
原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するためのシステムであって、前記システムは、
（ｉ）原核宿主内に存続するように構成され、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクター；ならびに
（ｉｉ）前記一本鎖ＤＮＡのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含み、前記原核宿主からの組換えファージミド粒子を形成させおよび押し出させる第２のベクター
を含む、システム。
【請求項１１】
原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、前記方法が、
ｉ）前記原核宿主内に存続するように構成され、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む第１のベクターを、原核宿主細胞に導入すること；
ｉｉ）バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを前記宿主に導入すること；ならびに
ｉｉｉ）前記原核宿主から組換えファージミド粒子を形成して押し出すように、前記一本鎖ＤＮＡが前記構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で前記宿主を培養する
ことを含む、方法。
【請求項１２】
原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、前記方法が、
ｉ）（ａ）前記原核宿主内に存続するように構成され、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクター、ならびに（ｂ）前記一本鎖ＤＮＡのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む、第２のベクターを、原核宿主細胞に導入すること；ならびに
ｉｉ）前記原核宿主から組換えファージミド粒子を形成して押し出すように、前記一本鎖ＤＮＡが前記構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で前記宿主を培養する
ことを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される組換えファージミドウイルス粒子、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスであって、前記プロセスは、治療有効量の、請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される組換えファージミド粒子、および薬学的に許容されるビヒクルを接触させることを含む、プロセス。
【請求項１５】
組換えファージミド粒子が形質導入された標的腫瘍細胞内で導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、さらに、使用時に、前記粒子が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、前記腫瘍細胞に少なくとも隣接して前記核酸配列を送達するように構成され、前記サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、ハイブリッドＴＮＦαのうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせであり、任意選択的に前記サイトカインがＩＬ−１５である、組換えファージミド粒子。
【請求項１６】
治療または診断に使用するための、請求項１５に記載の組換えファージミド粒子。
【請求項１７】
組換えファージミド粒子が形質導入された標的腫瘍細胞内で少なくとも１つの抗原を発現するための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、使用時に、前記粒子が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、前記腫瘍細胞に少なくとも隣接して前記核酸配列を送達するように構成される、組換えファージミド粒子。
【請求項１８】
治療または診断に使用するための、請求項１７に記載の組換えファージミド粒子。
【請求項１９】
癌の治療、予防、または改善に使用するための、請求項１７に記載の組換えファージミド粒子。
【請求項２０】
原核宿主から請求項１７に記載の組換えファージミド粒子を産生するための、ウイルスベクター構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージの使用。
【請求項２１】
請求項１７に記載の、請求項１０に記載のシステムによって産生される、請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０の使用によって産生される組換えファージミドウイルス粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、前記ファージミド粒子の前記ゲノム内の前記ウイルスゲノムを含むまたはこれに由来する組換えウイルスベクターの産生のためのものであり、前記組換えウイルスベクターが、１つ以上のサイトカインが発現されるように、少なくとも前記腫瘍細胞に隣接して、１つ以上の抗原をコードする核酸配列を送達するために使用される、組換えファージミドウイルス粒子。
【請求項２２】
癌の治療、予防、または改善に使用するための、ｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、アデノヘルパー遺伝子、および１つ以上の抗原またはサイトカインをコードする核酸配列を含む、組換えベクター。
【請求項２３】
癌の治療、予防、または改善のための方法において使用するための、請求項２２に記載のベクターを含む、組換えファージミド粒子。
【請求項２４】
請求項１５もしくは１７に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、前記導入遺伝子発現カセットを前記標的腫瘍細胞に送達するように構成される、組換えファージミド粒子。
【請求項２５】
請求項１５、１７、もしくは２４に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、一本鎖ＤＮＡへの前記ファージミドゲノムの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含み、これに続いて、原核宿主内の前記ファージミド粒子にパッケージングされ得、任意選択的に前記パッケージングシグナルが、複製起点、任意選択的にＦ１  ｏｒｉを含む、粒子。
【請求項２６】
請求項１５、１７、２４、もしくは２５に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、原核宿主内への二本鎖ベクターの複製を可能にするための複製起点、任意選択的にｐＵＣ  ｏｒｉを含む、粒子。
【請求項２７】
請求項１５、１７、２４〜２６のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、宿主ゲノムへの標的化された組込みに好ましい、１つ以上のＤＮＡ配列を含む、粒子。
【請求項２８】
請求項１５、１７、２４〜２７のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットが、ウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
【請求項２９】
請求項１５、１７、２４〜２８のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、複数の導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
【請求項３０】
請求項１５、１７、２４〜２９のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシスシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットが、哺乳動物のウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
【請求項３１】
請求項１５、１７、２４〜３０のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記導入遺伝子発現カセットが、プロモーター、前記発現された物質に付着可能なポリＡテールをコードするための核酸、ならびに左および／または右末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または左および／または右末端長反復配列（ＬＴＲ）のいずれかからなる群から選択される、前記標的細胞における前記核酸の発現に必要とされる１つ以上の機能的要素を含む、粒子。
【請求項３２】
請求項１５、１７、２４〜３１のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットが、レンチウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
【請求項３３】
請求項１５、１７、２４〜３２のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
【請求項３４】
請求項１５、１７、２４〜３３のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記導入遺伝子発現カセットが、前記標的細胞または組織において治療的または工業的有用性を有する、物質をコードする核酸をさらに含み、任意選択的に、前記核酸によってコードされる前記物質がポリペプチドまたはタンパク質である、粒子。
【請求項３５】
請求項１５、１７、２４〜３４のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、１つ以上のカプシドマイナーコートタンパク質を含み、任意選択的に、前記組換えファージミド粒子が、前記粒子の前記標的腫瘍細胞への送達を可能にするための細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されるｐＩＩＩカプシドマイナーコートタンパク質を含む、粒子。
【請求項３６】
請求項１５、１７、２４〜３５のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生されるか、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、１つ以上のカプシドメジャーコートタンパク質を含み、任意選択的に、前記組換えファージミド粒子が、その上に外来ペプチドをディスプレイするように構成される少なくとも１つのｐＶＩＩＩカプシドメジャーコートタンパク質を含む、粒子。
【請求項３７】
請求項１５、１７、２４〜３６のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、正味の正電荷を有する複合体を形成するようにカチオン性ポリマーと組み合わされ、任意選択的に、前記カチオン性ポリマーが、キトサン；ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）；ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ポリブレン；硫酸プロタミン；５およびカチオン性脂質からなる群から選択される、粒子。
【請求項３８】
請求項１５、１７、２４〜３７のいずれか１項に記載の、または請求項１０に記載のシステムによって産生される、または請求項１１もしくは１２に記載の方法によって産生される、または請求項２０もしくは２１に記載の使用によって産生される、または請求項１〜９および２２〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、または請求項１３に記載の医薬組成物による、または請求項１４に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、
ａ．前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、それが由来する前記バクテリオファージゲノムの少なくとも６０％、７０％、もしくは少なくとも８０％を欠いている、
ｂ．請求項１〜３７のいずれか１項に記載の粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、それが由来する前記バクテリオファージゲノムの少なくとも９０％、９５％、もしくは少なくとも９９％を欠いている、または
ｃ．請求項１〜３７のいずれか１項に記載の粒子であって、前記ファージミド粒子が、原核宿主からの前記粒子の形成、パッケージング、または押し出しに必要なそのゲノム中にバクテリオファージ構造遺伝子、好ましくはカプシドタンパク質をコードする構造遺伝子を欠いている、粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に関し、特に、癌の治療、予防、改善、または管理のための新規ファージミド粒子および関連する発現システムの使用に関する。特に、本発明は、癌の治療、予防、改善、または管理のための、サイトカインをコードする導入遺伝子の送達のためのファージミド粒子および発現システムの使用に関する。本発明はまた、導入遺伝子の送達のための、および癌の治療、予防、改善、または管理のために養子移入された(adoptively tranferred)Ｔ細胞の使用とそのような治療との組み合わせのための、ファージミド粒子および発現システムの使用にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
小児の高悪性度神経膠腫は、小児のすべての小児中枢神経システム（ＣＮＳ）腫瘍の１５％〜２０％を占める腫瘍の異種グループである。腫瘍は、ＣＮＳ内の任意の部位から発生し得る。脳幹、特に橋(pons)から生じる場合、それらはＤＩＰＧと呼ばれる。診断は、画像検査および組織学的外観に基づく。多くの臨床試験にもかかわらず、予後診断は不十分なままであり、２年生存率は１０％未満であり、小児癌の脳腫瘍関連死の主な原因のうちの１つとなっている。腫瘍の位置を考えると、腫瘍は手術不能であり、従来の分割放射線照射は一時的な利益を提供するための主力治療であり、他の治療法は従来の放射線治療を上回るいかなる効果も示していない。したがって、ＤＩＰＧの従来の治療に対する反応が悪いため、革新的な治療アプローチが必要である。
【０００３】
近年、腫瘍細胞を特異的に標的とし、抗腫瘍活性を引き起こす生物学的メカニズムに基づいた技術として遺伝子治療を研究することに努力が注がれている。遺伝子治療は、伝統的に、先天性疾患の治療のために考案されてきたが、化学療法および放射線療法などの併用療法の効率を改善し、腫瘍細胞の死を直接誘発するために、癌の治療においてますます使用されている。健康な組織と腫瘍組織とを区別できない従来の癌治療から生じる多くの副作用を考慮すると、標的ベクターを介した治療遺伝子の送達は、より多くの特異性および安全性を与える。
【０００４】
インターロイキン（ＩＬ−４、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）など、様々なサイトカイン遺伝子が癌免疫遺伝子治療における使用に好適である。ＴＮＦファミリーのメンバーであるＴＲＡＩＬは、様々な癌細胞株においてアポトーシスを誘発し、高い耐性を有し、正常組織への毒性を最小限に抑える。ＴＲＡＩＬタンパク質の局所注射および全身注射の両方が、マウスのヒト腫瘍異種移植片に対する抗腫瘍効果を発揮する。しかしながら、全身投与後のＴＲＡＩＬの急速なクリアランスおよび腫瘍退縮を達成するために必要な大量投与により、患者におけるＴＲＡＩＬの有効性が制限されている。現在開示されている粒子は、癌におけるＴＲＡＩＬ遺伝子の効率的な送達および持続的発現にとって理想的であり、費用効果が高い。ＩＬ−４は、癌のマウスモデルにおいて、抗腫瘍効果の誘発に効果的であった。さらに、対流促進送達(convection enhanced delivery)（ＣＥＤ）によって腫瘍内に注射された場合の再発性ヒト悪性神経膠腫におけるＩＬ−４の安全性および忍容性を決定するために、フェーズＩ臨床試験が開始された。正常な脳に対する神経毒性の組織学的証拠はいずれの患者にも確認されておらず、薬物関連の全身毒性は、いずれの治療患者にも明らかではなかった。９人の患者のうち６人が神経膠腫壊死を示し、１人は手術後１８か月以上無病のままであった。それでも、再び、有効性を達成するために必要な大量のタンパク質用量および費用、ならびに頭蓋内送達の侵襲性が、重大な制限を課している。
【０００５】
過去２０年間に、ＩＬ−１２は、様々な前臨床モデルで抗腫瘍活性を媒介する最も強力なサイトカインのうちの１つとして出現した。ＩＬ−１２は、腫瘍微小環境を形成する様々な免疫細胞に対する多面的効果により、腫瘍または罹患組織の種類に応じて、様々な免疫エフェクター細胞およびサイトカインが関与する自然免疫と適応免疫の間に関連性を確立する。ＩＬ−１２は腫瘍細胞に対する直接の効果は有しないが、腫瘍溶解を媒介する細胞傷害性ＴおよびＮＫエフェクター細胞の活性化を改善する。さらに、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞の反応を改善し、ＩＦＮ−γを含むサイトカインのパネルを誘発し、抗血管新生を示す。マウスでは、ＩＬ−１２遺伝子の局所腫瘍内アデノウイルスベクター送達が安全に完了し、動物の生存期間を大幅に延長し、腫瘍サイズの劇的な退縮を誘発した。
【０００６】
最近、ＩＬ−１２をコードする組換えｒＡＡＶベクターの頭蓋内注射は、ラットモデルの脳腫瘍遺伝子治療に使用され、活性化ミクログリア細胞の誘発増加に関連する抗腫瘍効果をもたらした。最後に、ＴＮＦαは、アポトーシスによって直接、または免疫調節活性によって間接的に、強力な抗腫瘍細胞効果を示し、また、腫瘍血管新生を標的にして破壊する。
【０００７】
インターロイキン１５は、重要な免疫抗腫瘍メカニズムの開発に参加している。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ  Ｔ細胞を活性化し、抗腫瘍抗体の形成を促進することができる。ＩＬ−１５は、Ｔ調節細胞の作用からＴエフェクター細胞を保護し、腫瘍関連抗原に対する耐性を逆転させることもできる。
【０００８】
腫瘍免疫療法におけるＩＬ−１５の利点は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の発生および活性を含む抗腫瘍免疫の重要なメカニズムを活性化し、記憶Ｔ細胞に対するその作用を通じて持続的な免疫反応を促進する、その特殊な能力に起因する。さらに、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と比較して毒性が低く、Ｔｒｅｇ細胞活性の誘発効果が低く、特定の状況では、Ｔｒｅｇ細胞の作用からヒトエフェクターＴ細胞を保護することさえできる。ＩＬ−１５は、国立癌研究所の腫瘍免疫療法において最大の潜在的用途を持つ薬剤のリストの上位にあり、難治性転移性黒色腫および転移性腎細胞癌の成人における組換えヒトＩＬ−１５の最初の臨床研究は、現在患者を募集している（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１０２１０５９）。
【０００９】
結腸癌を有するマウスの生存率は、ＩＬ−１５での治療により大幅に改善されており、プログラムされた死リガンド１(programmed death ligand1)（ＰＤ−Ｌ１）の遮断によりさらに改善された。それでも、ＩＬ−１５の適用ならびにＰＤ−Ｌ１および細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）の両方の遮断に基づく併用療法で、最大の治療効果が達成された。
【００１０】
残念ながら、高い期待にもかかわらず、ＩＬ−１５は転移性悪性腫瘍の治療に有効性を示しているが、インビボでの生化学的安定性の欠如は重大な制限事項である。臨床試験における全身ｒｈＩＬ−１５サイトカインは、非常に短い血漿中半減期（１時間未満）および急速な腎クリアランスを有し、これは有効性のインピーダンスを容易にもたらす。さらに、ｒｈＩＬ１５の全身投与は、自己免疫の誘発を含む毒性の副作用を引き起こす可能性がある。
【００１１】
全身投与の代わりにＩＬ−１５を腫瘍に直接送達することは、毒性を減らし、有効性を高めるのに理想的であろう。しかしながら、腫瘍塊への直接注射または養子細胞移入における導入遺伝子としてのＩＬ−１５の組込みは、実施が困難である。複数の転移部位の存在、または形質導入された細胞の過剰な増殖および白血病性形質転換の可能性により、実際には治療の妥当性が制限される場合がある。
【００１２】
ＩＬ−１５生物学的利用能の時間窓(time window)を延長させる別の解決策は、遺伝子治療アプローチにおいて発見された。遺伝子治療の利点には、局所領域産生、融合構築物を生成する能力、および組み合わせ戦略の汎用性が含まれる。残念ながら、真核生物ウイルスを使用した全身送達は、肝臓および細網内皮システムによる望ましくない取り込み、挿入変異誘発、補体システムまたは既存の抗体との反応から生じる免疫原性、および哺乳動物細胞の幅広い指向性により、限られた成功しか収めていない。ウイルス指向性は、標的組織上のリガンド−受容体相互作用を媒介するために、ウイルスカプシドタンパク質に組織特異的リガンドを追加することにより改変され得る。しかしながら、これらのリガンドを真核生物ウイルスに追加すると、ウイルスカプシドの構造が変化し、ペプチド自体の有効性が低下し、標的特性が低下する可能性がある。
【発明の概要】
【００１３】
したがって、上記に記載されているサイトカインは、癌免疫療法での使用に好適であるが、サイトカインを伴う臨床試験の大部分は、全身毒性をもたらす腫瘍選択性の欠如のため、持続的な抗腫瘍応答を示すことができない。
【００１４】
したがって、免疫腫瘍療法におけるサイトカインの送達のための改善された方法が必要である。
【００１５】
第１の態様では、癌を治療、予防、または改善するための方法において使用するための組換えファージミド粒子であって、粒子で形質導入された標的腫瘍細胞内に導入遺伝子を発現するためのものであり、ファージミド粒子が、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、該方法が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、腫瘍細胞に少なくとも隣接して核酸配列を送達することを含む、組換えファージミド粒子を提供する。
【００１６】
好ましい実施形態では、導入遺伝子発現カセットは、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発、内因性抗腫瘍応答を促進する腫瘍細胞の変化、他の治療を促進する腫瘍細胞の変化の効果、または治療を促進する腫瘍微小環境の変化を有し得るサイトカインをコードし得る。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１５であり、好ましくは、サイトカインはＩＬ−４である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１２である。好ましくは、サイトカインはＴＲＡＩＬである。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。好ましい一実施形態では、サイトカインはＴＮＦαではない。
【００１８】
しかしながら、別の好ましい実施形態では、サイトカインはＴＮＦαである。好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである。好ましくは、シグナルペプチドは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチドである。例えば、シグナルペプチドは、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドである。
【００１９】
したがって、一実施形態では、ＴＮＦαの膜貫通ドメインは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチド、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドと置き換えられる。別の実施形態では、本発明の任意の他のサイトカインとは異なるシグナルペプチド、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドを、本発明の任意の他のサイトカインと組み合わせて、得られるハイブリッドサイトカインの発現および／または分泌を増加させるようにする。特に、ハイブリッドサイトカインは、ハイブリッドＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＲＡＩＬ、またはＩＦＮ−γのうちのいずれか１つであり得る。
【００２０】
ハイブリッドＩＬ−２−ＴＮＦα配列は、ＴＮＦαの膜貫通ドメインをＩＬ−２のシグナルペプチドと置き換えて、ＴＮＦαの分泌型をコードする配列を残し、より大きな発現および／または分泌をディスプレイするハイブリッドＴＮＦαを産生するようにする。
【００２１】
当業者であれば、「シグナルペプチド配列」が、タンパク質の細胞膜への移行を配向するように機能し、タンパク質の分泌を調節する、Ｎ末端配列に関連し得ることを理解するであろう。
【００２２】
特に、当業者であれば、「非内因性シグナルペプチド配列」が、発現されているサイトカインのものとは異なる、インターロイキンなどのサイトカインシグナルペプチドに関連し得ることを理解するであろう。
【００２３】
当業者であれば、「ハイブリッドサイトカイン」が、非内因性シグナルペプチド配列を含むサイトカインに関連し得ることを理解するであろう。
【００２４】
一実施形態では、膜貫通ドメインを含む全長ＴＮＦαは、以下のように、配列番号１２として本明細書に提供されるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
【化１】
2020517272.tif 000003
【００２６】
膜貫通ドメインを含む全長ＴＮＦαをコードする核酸配列は、以下のように、本明細書で表され得る。
【００２７】
【化２】
2020517272.tif 000004
【００２８】
一実施形態では、ＴＮＦαの分泌型は、以下のように、配列番号１８として本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する。
【００２９】
【化３】
2020517272.tif 000005
【００３０】
一実施形態では、ＴＮＦαの分泌型をコードする核酸配列は、以下のように、本明細書で表され得る。
【００３１】
【化４】
2020517272.tif 000006
【００３２】
一実施形態では、ＩＬ−２シグナルペプチドは、以下のように、配列番号２０として本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する。
【００３３】
【化５】
2020517272.tif 000007
【００３４】
一実施形態では、ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸配列は、以下のように、配列番号２１として本明細書で表され得る。
【００３５】
【化６】
2020517272.tif 000008
【００３６】
したがって、一実施形態では、ハイブリッドＩＬ−２−ＴＮＦαは、以下のように、配列番号２２として本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する。
【００３７】
【化７】
2020517272.tif 000009
【００３８】
したがって、一実施形態では、ハイブリッドＩＬ−２−ＴＮＦαをコードする核酸配列は、以下のように、配列番号２３として本明細書で表され得る。
【００３９】
【化８】
2020517272.tif 000010
【００４０】
したがって、一実施形態では、１つ以上のサイトカインは、配列番号１２、１８、２０、および２２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体(variant)を含む。
【００４１】
好ましくは、１つ以上のサイトカインは、実質的に配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００４２】
したがって、一実施形態では、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列は、配列番号１３、１９、２１、および２３のうちのいずれか１つまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００４３】
好ましくは、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列は、配列番号２３またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００４４】
第２の態様では、対象の癌を治療、予防、または改善するための方法であって、治療有効量の第１の態様による組換えファージミド粒子を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００４５】
第２の態様の方法は、対象の癌の管理に使用され得る。
【００４６】
一実施形態では、組換えファージミド粒子は、小児脳腫瘍の治療、予防、または改善に使用するためのものである。他の実施形態では、組換えファージミド粒子は、びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）または髄芽腫の治療、予防、または改善に使用するためのものである。
【００４７】
第３の態様では、原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するためのシステムであって、
（ｉ）原核宿主内に存続するように構成された第１のベクターであって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクターと、
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む第２のベクターと、を含み、原核宿主からの組換えファージミド粒子の形成および押し出しをもたらす、システムを提供する。
【００４８】
第４の態様では、原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、
（ｉ）原核宿主内に存続するように構成された第１のベクターであって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
（ｉｉ）バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを宿主に導入することと、
（ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
【００４９】
第５の態様では、原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、
（ｉ）（ａ）原核宿主内に存続するように構成された第１のベクターであって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクター、ならびに（ｂ）一本鎖ＤＮＡのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む、第２のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
【００５０】
本発明の第６の態様では、第３の態様によるシステムによって産生されるか、または第４もしくは第５の態様の方法によって産生される組換えファージミドウイルス粒子と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む、医薬組成物を提供する。
【００５１】
第７の態様では、本発明はまた、第６の態様による医薬組成物を作製するためのプロセスであって、第３の態様によるシステムによって産生されるか、または第４もしくは第５の態様の方法によって産生される治療有効量の組換えファージミド粒子、および薬学的に許容されるビヒクルに接触させることを含む、プロセスを提供する。
【００５２】
本発明の別の態様では、粒子で形質導入された標的腫瘍細胞内に導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、使用中、粒子が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、腫瘍細胞に少なくとも隣接して核酸配列を送達するように構成され、サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、ハイブリッドＴＮＦαのうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせである、組換えファージミド粒子を提供する。
【００５３】
好ましくは、サイトカインはＩＬ−１５であり、好ましくは、サイトカインはＩＬ−４である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１２である。好ましくは、サイトカインはＴＲＡＩＬである。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。
【００５４】
好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである。好ましくは、シグナルペプチドは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチドである。例えば、シグナルペプチドは、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドである。
【００５５】
別の実施形態では、本発明の任意の他のサイトカインとは異なるシグナルペプチド、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドを、本発明の任意の他のサイトカインと組み合わせて、得られるハイブリッドサイトカインの発現および／または分泌を増加させるようにする。特に、ハイブリッドサイトカインは、ハイブリッドＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＲＡＩＬ、またはＩＦＮ−γのうちのいずれか１つであり得る。
【００５６】
好ましい実施形態では、導入遺伝子発現カセットは、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発、内因性抗腫瘍応答を促進する腫瘍細胞の変化、他の治療を促進する腫瘍細胞の変化、または治療を促進する腫瘍微小環境の変化の効果を有し得るサイトカインをコードし得る。
【００５７】
さらなる態様では、粒子で形質導入された標的腫瘍細胞内に導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、使用中、粒子が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、腫瘍細胞に少なくとも隣接して核酸配列を送達するように構成され、サイトカインが、治療または診断において使用するための、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、ハイブリッドＴＮＦαのうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせである、組換えファージミド粒子を提供する。
【００５８】
好ましくは、サイトカインはＩＬ−１５であり、好ましくは、サイトカインはＩＬ−４である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１２である。好ましくは、サイトカインはＴＲＡＩＬである。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。
【００５９】
好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである。好ましくは、シグナルペプチドは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチドである。例えば、シグナルペプチドは、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドである。
【００６０】
別の実施形態では、本発明の任意の他のサイトカインとは異なるシグナルペプチド、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドを、本発明の任意の他のサイトカインと組み合わせて、得られるハイブリッドサイトカインの発現および／または分泌を増加させるようにする。特に、ハイブリッドサイトカインは、ハイブリッドＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＲＡＩＬ、またはＩＦＮ−γのうちのいずれか１つであり得る。
【００６１】
また、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療などの養子移入療法で使用するための、癌を治療するための改善された方法が必要である。本発明者らは、実施例において、ＣＡＲ  Ｔ細胞などによって認識可能な抗原で腫瘍細胞を装飾または標識するために本明細書に記載される粒子を使用することが可能であることを示した。
【００６２】
したがって、本発明の第８の態様によると、粒子で形質導入された標的腫瘍細胞内に少なくとも１つの抗原を発現するための組換えファージミド粒子であって、１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識される１つ以上の抗原をコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、使用時に、粒子が、１つ以上の抗原が発現され、かつ１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識されるように、標的腫瘍細胞に少なくとも隣接して核酸配列を送達するように構成される、組換えファージミド粒子を提供する。
【００６３】
第９の態様では、治療または診断に使用するための、第８の態様による組換えファージミド粒子を提供する。
【００６４】
第１０の態様では、癌の治療、予防、または改善に使用するための、第８の態様による組換えファージミド粒子を提供する。
【００６５】
有利には、本発明の粒子を使用して、腫瘍細胞へのサイトカインおよび抗原の送達および発現を標的とすることにより、腫瘍殺傷効果が大きくなり、従来の治療と関連する標的外効果が低減する。本発明者らは、腫瘍細胞への抗原またはサイトカインの送達に特に有益な新規のベクターおよびシステム（いわゆる「ハイブリッドファージミドウイルスベクターシステム」）を開発した。ファージミド／アデノ随伴ビリオン（すなわち、ＰＡＡＶ）と呼ばれる、いわゆるファージミド粒子を提供する。発明者が、彼らが作成した新規ベクターに使用する別の名前は、「ファスミド」である。バクテリオファージ誘導サイトカイン療法を本明細書に提供する。バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療も本明細書に提供する。
【００６６】
線状ファージゲノムに挿入されたｒＡＡＶカセットからなる先行技術のＡＡＶＰゲノム（Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，５２３−５３１（２００７）；Ｃｅｌｌ  １２５，３８５−３９８（２００６））とは異なり、本発明のＰＡＡＶゲノムは構造バクテリオファージ（ファージ）遺伝子を全く含まないので、宿主におけるベクター組立てを容易にするために原核ヘルパーウイルスが必要とされる。これは、ＡＡＶＰがバクテリオファージの特定の固有の制限を依然として有しており、したがって一般的にＡＡＶＰまたはファージベクターの大幅な改善の余地を残しているため、有利である。例えば、ＡＡＶＰは２つのウイルス種（すなわち、バクテリオファージおよびＡＡＶ）の間のハイブリッドであり、ＡＡＶＰベクターは真核生物および原核生物ウイルスの両方のゲノムを含む。原核細胞ゲノムは、ＡＡＶＰウイルスの複製に不可欠であるにもかかわらず、機能的または治療的に無関係である。したがって、ファージウイルスゲノムの包含は、ベクター効率および生産方法に有害な影響を与え、哺乳動物ウイルスと比較した場合、ＡＡＶＰの比較的低い遺伝子導入効率をもたらす。
【００６７】
有利には、第８または任意の上記の態様によるファージミド粒子へのハイブリッドウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルス）の再設計は、このファージミド粒子が由来するファージゲノムを実質的に欠き、得られるベクター（すなわち、ファージミド粒子）の機能的特性を劇的に高める。ウイルス発現システムの本発明によるファージミドベースシステムへの改変は、より広い意味でのファージミドウイルスベクターの適用の可能性を拡大する。この粒子のゲノムから、ゲノムサイズの５０％を超える、バクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を排除することにより、得られるファージミド粒子の粒径が劇的に減少する。
【００６８】
用語「ファージミド粒子」は、ファージ由来コートタンパク質によってカプセル化されたハイブリッドファージミドゲノムを意味することができる。ハイブリッドファージミドゲノムは、「ファージミドゲノム」（すなわち、バクテリオファージ（例えば、Ｆ１）からの複製および細菌（例えば、ｐＵＣ１）からの複製の２つの複製起点を含む遺伝子構築物）である。一実施形態では、ファージミドゲノムは組込まれた「ＡＡＶ由来の組換え導入遺伝子カセット」（ｒＡＡＶ）を含有することができ、したがってハイブリッドであり、正常な（すなわち、一般的な非ウイルス性）組換え導入遺伝子発現カセットを有する従来のファージミドゲノムではない。ファージミド粒子は、トランス作用性作用因子（例えば、ヘルパーファージ）由来のファージタンパク質によってカプセル化されたハイブリッドファージミドゲノム（すなわち、本発明）を意味することができる。
【００６９】
非常に大きいまたは複数の導入遺伝子カセットを組込む追加の能力を可能にする一方で、これらのより小さいファージミド粒子はまた、遺伝子導入、生産収率、生体内分布、および真核生物の細胞障壁からの回避の増強において付加的な利点を示す。本発明のファージミド粒子を使用することの別の重要な利点は、それらが、後述するように、極めて大きく多数の導入遺伝子カセットまたは遺伝子挿入物、例えば、トランスフェクションによる組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶまたはレンチウイルス）産生のために使用される３つのプラスミドの遺伝子、を収容する能力を有することである。したがって、単一または複数のファージミドベクター（複数可）におけるウイルス産生のための遺伝子構成要素を組み合わせることにより、効率的な商業規模のウイルス産生遺伝子送達システムが設計されている。したがって、好ましくは、粒子は複数の導入遺伝子カセットを含む。
【００７０】
一実施形態では、組換えファージミド粒子は、例えば事前のワクチン接種により、送達された１つ以上の抗原に曝露されていない対象の治療に使用するためのものである。
【００７１】
一実施形態では、ファージミド粒子は、好ましくは、核酸配列が発現されるように、標的腫瘍細胞に隣接する細胞に導入遺伝子発現カセットを送達するように構成され、それにより、抗原または各抗原またはサイトカインが産生され、その後、抗原は腫瘍細胞の標的に関連するか、またはこれに付着するようになり得る。
【００７２】
しかしながら、好ましい実施形態では、ファージミド粒子は、導入遺伝子発現カセットを標的腫瘍細胞に送達するように構成される。好ましくは、抗原または各抗原は、標的腫瘍細胞の細胞表面に発現されるペプチドまたはタンパク質である。好ましくは、抗原または各抗原は、腫瘍細胞によって発現された場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞にアクセス可能なペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質は、腫瘍細胞によって発現された場合、細胞表面で、または細胞表面上に折り畳まれたペプチドタンパク質として存在するようなものであり得る。
【００７３】
本発明の第１１の態様では、粒子で形質導入された標的腫瘍細胞内に少なくとも１つの抗原を発現するための組換えファージミド粒子であって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、使用時に、粒子が、１つ以上のサイトカインが発現されるように、標的腫瘍細胞に少なくとも隣接して核酸配列を送達するように構成される、組換えファージミド粒子を提供する。
【００７４】
第１２の態様では、治療または診断に使用するための、第１１の態様による組換えファージミド粒子を提供する。
【００７５】
第１３の態様では、癌の治療、予防、または改善に使用するための、第１１の態様による組換えファージミド粒子を提供する。
【００７６】
第１４の態様では、対象の癌を治療、予防、または改善するための方法であって、治療有効量の第１１の態様による組換えファージミド粒子を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００７７】
第１５の態様では、原核宿主から第１１の態様による組換えファージミド粒子を産生するための、ウイルスベクター構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージの使用を提供する。
【００７８】
第１６の態様では、第１１の態様によるか、第３の態様によるシステムによって産生されるか、第４もしくは第５の態様の方法によって産生されるか、または第１５の態様の使用によって産生される、組換えファージミドウイルス粒子であって、組換えファージミド粒子が、ファージミド粒子のゲノム内のウイルスゲノムを含むか、またはこれに由来する組換えウイルスベクターの産生のためのものであり、組換えウイルスベクターが、１つ以上のサイトカインが発現されるように、腫瘍細胞に少なくとも隣接して、１つ以上の抗原をコードする核酸配列を送達するために使用される、組換えファージミドウイルス粒子を提供する。
【００７９】
第１７の態様では、癌の治療、予防、または改善に使用するための、ｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、アデノヘルパー遺伝子、および１つ以上の抗原またはサイトカインをコードする核酸配列を含む、組換えベクターを提供する。
【００８０】
第１８の態様では、癌の治療、予防、または改善のための方法において使用するための、第１７の態様のベクターを含む、組換えファージミド粒子を提供する。
【００８１】
抗原または各抗原は、ヒトにおける使用に好適な既存のＣＡＲ  Ｔ細胞の既知の標的であり得る。例えば、抗原または各抗原は、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エストロゲン関連受容体ベータ２型（ＥｒＲＢ２）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。抗原または各抗原は、ＭＵＣ１またはＰＳＭＡであってもよい。
【００８２】
一実施形態では、適切な抗原（例えば、ＭＵＣ１．ＣＤ２８．ＩＬ４）をコードする核酸配列は、以下のように、本明細書で表され得る。
【００８３】
【化９】
2020517272.tif 000011
【００８４】
別の実施形態では、抗原をコードする核酸配列（例えば、ＭＵＣ１．ＧＰＩ．ＩＬ４）は、以下のように、本明細書で表され得る。
【００８５】
【化１０】
2020517272.tif 000012
【００８６】
さらに別の実施形態では、抗原をコードする核酸配列（例えば、ＰＳＭＡ）は、以下のように、本明細書で表され得る。
【００８７】
【化１１】
2020517272.tif 000013
【００８８】
したがって、好ましくは、導入遺伝子は、実質的に配列番号１４〜１６のうちのいずれか１つに示される核酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００８９】
さらに別の実施形態では、抗原は、実質的に配列番号１７に示されるアミノ酸配列（例えば、ＭＵＣ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：Ｐ１５９４１）、またはそのフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれに由来し得る。
【００９０】
【化１２】
2020517272.tif 000014
【００９１】
いくつかの実施形態では、１つの抗原型もしくは種、またはサイトカインは、標的腫瘍細胞に少なくとも隣接して送達される。他の実施形態では、２つ以上の抗原型もしくは種、またはサイトカインは、腫瘍細胞に少なくとも隣接して送達される。２つ以上の抗原またはサイトカインは、同じ組換えファージミド粒子によって送達され得るか、または２つ以上の組換えファージミド粒子によって別々に送達され得る。
【００９２】
一実施形態では、抗原または各抗原は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が発生された自己抗原であり得る。自己抗原は、対象の非腫瘍組織によって発現される抗原であると考えられ、そのような抗原は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的として利用されており、本発明での使用に好適である。
【００９３】
しかしながら、好ましい実施形態では、抗原または各抗原は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が発生された完全に非自己の抗原であり得る。非自己抗原には、腫瘍によって新たに発現される新抗原が含まれる場合があり、これらの新抗原は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的としても利用されており、また本発明での使用にも好適である。非自己抗原には、ＣＡＲ  Ｔ細胞が発生された対象のいかなる組織によっても発現されない外来抗原が含まれる場合がある。そのような外来抗原は、治療が、標的抗原を発現する非腫瘍組織の標的化によって引き起こされる「標的外」効果をより少なくする可能性があるため、有利であり得る。
【００９４】
一実施形態では、抗原または各抗原は、デング熱ウイルスに由来し得るか、または黄熱病ウイルスに由来し得る。
【００９５】
好ましい実施形態では、組換えファージミド粒子は、養子移入されたＴ細胞の使用をさらに含む方法において使用するためのものである。養子移入されたＴ細胞は、組換えファージミド粒子によって標的腫瘍細胞に導入された抗原または各抗原に特異的であり得る。好ましくは、１つ超の型のＴ細胞が養子移入される。好ましくは、１つ超の型のＴ細胞は、同じ抗原または異なる抗原に特異的である。
【００９６】
好ましくは、標的腫瘍細胞に少なくとも隣接して発現される１つ以上の抗原を認識する養子移入されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＴ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなる群から選択される。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、導入された抗原または各抗原に関連するエピトープに特異的であり得る。ＴＩＬは、既知の抗原に対する特異性を持つリンパ球を含むことが知られている組織に由来する場合がある。
【００９７】
しかしながら、最も好ましくは、養子移入されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、組換えファージミド粒子によって腫瘍細胞に導入された抗原または各抗原に特異的であり得る。
【００９８】
最も好ましい実施形態では、組換えファージミド粒子は、組換えファージミド粒子による腫瘍細胞の特異的標的化、およびその後の腫瘍細胞による発現のための１つ以上の抗原またはサイトカインをコードする１つ以上の配列の腫瘍細胞への送達、ならびに抗原に関連した、１つ以上の送達された抗原に対する特異性を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の移入、およびその後の癌の治療、予防、または改善のための腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を含む、方法において使用するためのものである。
【００９９】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞であってもよく、これは、１つ以上の組換えファージミド粒子によって送達される１つ以上の抗原に対して特異性を有し得る。例えば、組換えファージミド粒子の単一型または種は、単一型の二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞による認識のために２つ以上の抗原を送達し得る。
【０１００】
好ましくは、ファージミド粒子はビリオンを含む。組換えファージミド粒子のゲノムの好ましい一実施形態を図３に示し、好ましい成分を図４〜６に示す。
【０１０１】
好ましくは、組換えファージミド粒子のゲノムは、ファージミドゲノムの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含み、続いて一本鎖ＤＮＡが、原核宿主内のファージミド粒子にパッケージングすることができる。パッケージングシグナルは、複製起点を含むことが好ましい場合がある。例えば、複製起点は、好ましくはＦ１  ｏｒｉ、より好ましくはＦ１バクテリオファージからなる。Ｆ１  ｏｒｉの一実施形態のＤＮＡ配列は、以下のように、配列番号１として本明細書で表される。
【０１０２】
【化１３】
2020517272.tif 000015
【０１０３】
好ましくは、組換えファージミド粒子のゲノムは、原核宿主内で二本鎖ベクターの複製を可能にするための複製起点を含む。好ましくは、この複製起点は、宿主内のベクターの高コピー数複製を可能にする。好ましくは、複製起点はｐＵＣ  ｏｒｉを含む。ｐＵＣ  ｏｒｉの一実施形態のＤＮＡ配列は、以下のように、配列番号２として本明細書で表される。
【０１０４】
【化１４】
2020517272.tif 000016
【０１０５】
あるいは、別の実施形態において、ファージミド粒子は、それが宿主細胞のゲノムに組込まれるように設計され得る。この場合、粒子のゲノムの標的化された組込み（例えば、相同組換えによる）に有利な核酸配列が想定される。したがって、組換えファージミド粒子のゲノムは、宿主ゲノム内への標的化された組み込みに有利な１つ以上のＤＮＡ配列を含み得る。
【０１０６】
別の実施形態では、好ましくは、ファージミド粒子は、ベクターがインビボで対象に全身的または局所的に投与されるかにかかわらず、組織特異的標的（例えば、腫瘍組織）への導入遺伝子の送達のための組換えベクターとして使用することができる。
【０１０７】
好ましくは、少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットは、ウイルス導入遺伝子発現カセット、より好ましくは哺乳動物ウイルス導入遺伝子発現カセットを含む。例えば、少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットは、好ましい一実施形態では、レンチウイルス導入遺伝子発現カセットを含むことができる。少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットは、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入遺伝子発現カセットである。
【０１０８】
導入遺伝子発現カセットは、標的腫瘍細胞または組織において発現される抗原もしくは各抗原またはサイトカインをコードする任意の核酸を含み得る。本発明の一実施形態では、核酸はＤＮＡであり得、これはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、天然に存在しないｃＤＮＡが好ましい場合がある。別の実施形態では、核酸は、アンチセンスＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい。
【０１０９】
例示的な実施例７に示されるように、ファージミドは、腫瘍細胞に遺伝子を送達するために使用され得る。この例では、ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ（ＲＧＤ４Ｃ−ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ）をコードする配列を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミドによる処理によって、腫瘍細胞（例えば、髄芽腫細胞）におけるｍＴＯＲ発現のダウンレギュレーションを達成することができる。実施例７は、腫瘍細胞に遺伝子を送達するためのファージミドの使用の別の例示的な例を提供する。実施例７に示されるように、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドは、選択的にＴＮＦαをＤＩＰＧ（びまん性内在性橋グリオーマ）に首尾よく送達することができ、アポトーシス誘発をもたらす。したがって、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドは、サイトカインを使用したＤＩＰＧに対する標的療法に使用するための治療上の可能性を有する。
【０１１０】
しかしながら、組換えファージミド粒子によって標的化される腫瘍細胞の型は、粒子の表面に発現され得る細胞標的化リガンドの型に依存することが理解されるであろう。細胞を標的とするリガンドについては以下に論じる。
【０１１１】
導入遺伝子発現カセットは、標的腫瘍細胞における核酸の発現に必要な１つ以上の機能的要素を含み得る。例えば、好ましくは、導入遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターを含む。ＣＭＶプロモーターの一実施形態のＤＮＡ配列は、以下のように、配列番号３として本明細書で表される。
【０１１２】
【化１５】
2020517272.tif 000017
【０１１３】
別の好ましい実施形態では、導入遺伝子発現カセットは、標的腫瘍細胞においてのみ活性であるプロモーターを含む。したがって、プロモーターは、腫瘍活性化および／またはテモゾロミド誘発性であり得る。
【０１１４】
一実施形態では、プロモーターは、癌細胞において高度に活性である多剤耐性プロモーター（ＭＤＲ）であってもよい。このプロモーターは、癌薬物によって活性化され、Ｐ−ｇｐおよびＡＢＣトランスポーターを産生して、細胞から薬物を排出する。このプロモーターは、癌薬物と組み合わせて遺伝子治療のために使用することができる。
【０１１５】
別の実施形態では、プロモーターは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターであり得る。このプロモーターは腫瘍細胞でのみ活性がありますが、正常な増殖細胞では活性ではない。したがって、このプロモーターは腫瘍特異的プロモーターとして使用することができる。
【０１１６】
好ましい実施形態では、導入遺伝子発現カセットは、ｇｒｐ７８プロモーターを含む。ｇｒｐ７８プロモーターの一実施形態の核酸配列は、以下のように、配列番号８として本明細書に表される。
【０１１７】
【化１６】
2020517272.tif 000018
【０１１８】
好ましくは、導入遺伝子発現カセットは、発現された抗原もしくは各抗原またはサイトカインに付着可能なポリＡテールをコードするための核酸を含む。ポリＡテールをコードするための核酸の一実施形態のＤＮＡ配列は、以下のように、配列番号４として本明細書で表される。
【０１１９】
【化１７】
2020517272.tif 000019
【０１２０】
好ましくは、導入遺伝子発現カセットは、左および／または右末端逆位反復配列(Inverted Terminal Repeat sequences)（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲは、レンチウイルスの血清型に特異的なＡＡＶまたは末端長反復配列(Long Terminal repeat sequences)（ＬＴＲ）に特異的であり得、その二次構造にヘアピンループを形成する限り、任意の配列であり得る。例えば、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ１〜９であり得るが、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８である。ＩＴＲの一実施形態のＤＮＡ配列（市販のＡＡＶプラスミド由来の左ＩＴＲ）は、以下のように、配列番号５として本明細書で表される。
【０１２１】
【化１８】
2020517272.tif 000020
【０１２２】
ＩＴＲの別の実施形態のＤＮＡ配列（市販のＡＡＶプラスミド由来の右ＩＴＲ）は、以下のように、配列番号６として本明細書で表される。
【０１２３】
【化１９】
2020517272.tif 000021
【０１２４】
好ましくは、組換えファージミド粒子のゲノムは、例えば、宿主細胞、好ましくは細菌においてアンピシリン耐性を付与するために、ベクターを内包する宿主細胞に依存する選択マーカーを含む。マーカーは、宿主細胞中のファージミド粒子の産生中に選択圧を提供する。
【０１２５】
好ましくは、組換えファージミド粒子は、１つ以上のカプシドマイナーコートタンパク質(capsid minor coat protein)を含む。組換えファージミド粒子は、この粒子の標的腫瘍細胞への送達を可能にする細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されたｐＩＩＩカプシドマイナーコートタンパク質を含み得る。好ましくは、組換えファージミド粒子は、１つ以上のカプシドメジャーコートタンパク質(capsid major coat protein)を含む。組換えファージミド粒子は、上に外来ペプチドをディスプレイするように構成された少なくとも１つのｐＶＩＩＩカプシドメジャーコートタンパク質を含み得る。
【０１２６】
組換えファージミド粒子は、例えば治療、または化学的もしくは生化学的結合によるカプシド構造の改変を含み得る。好適な改変の例は、ファージミド粒子上へのペプチド残基の架橋を含み得る。別の実施形態では、組換えファージミド粒子は、そのカプシドに付着した１つまたは機能的ペプチドを含み得る。例えば、機能的ペプチドは核移行シグナルを含み得る。したがって、ファージミド粒子は、多機能性であり、ＷＯ２０１４／１８４５２８に開示されている特徴を使用することができる。
【０１２７】
別の実施形態では、ＷＯ２０１４／１８４５２９に記載されているように、組換えファージミド粒子をカチオン性ポリマーと組み合わせて正味の正電荷を有する複合体を形成することができる。カチオン性ポリマーは、キトサン、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリブレン、硫酸プロタミン、およびカチオン性脂質からなる群から選択され得る。好ましくは、カチオン性脂質は、ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、およびＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート）からなる群から選択される。好ましくは、カチオン性ポリマーはＤＥＡＥ、より好ましくはＤＥＡＥ．ＤＥＸを含む。
【０１２８】
好ましくは、ファージミド粒子は、その粒子が由来するファージゲノムを実質的に欠くゲノムを含む。好ましくは、組換えファージミド粒子のゲノムは、それが由来するバクテリオファージゲノムの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％を欠く。より好ましくは、組換えファージミド粒子のゲノムは、それが由来するバクテリオファージゲノムの少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％を欠く。好ましくは、組換えファージミド粒子のゲノムは、それが由来するバクテリオファージゲノムのすべてを欠く。しかしながら、上記に論じられるように、ファージミドウイルス粒子のゲノムは、いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡへの粒子の複製を可能にするためのバクテリオファージの複製起点、すなわち、Ｆ１バクテリオファージｏｒｉを含み得る。
【０１２９】
好ましくは、ファージミド粒子は、１４Ｋｂ未満の相対ゲノムサイズを有するゲノムを含む。相対ゲノムサイズは、約１３Ｋｂ未満、約１２Ｋｂ未満、約１１Ｋｂ未満、約１０Ｋｂ未満、約９Ｋｂ未満、約８Ｋｂ未満、または約７Ｋｂ未満であり得る。相対ゲノムサイズは、３Ｋｂ〜９Ｋｂ、４Ｋｂ〜８Ｋｂ、５Ｋｂ〜７Ｋｂ、または好ましくは約６Ｋｂであり得る。
【０１３０】
好ましくは、ファージミド粒子は、原核宿主からの粒子の形成、パッケージング、または押し出しに必要とされるそのゲノム中にバクテリオファージ構造遺伝子を欠いている。このような構造遺伝子は、カプシドタンパク質などをコードする。好ましくは、ファージミド粒子は、その粒子が由来する少数またはメジャーコートタンパク質をコードする遺伝子を欠くゲノムを含む。好ましくは、ファージミド粒子は、ｐＩＩＩカプシドマイナーコートタンパク質を欠くか、またはｐＶＩＩＩカプシドメジャーコートタンパク質を欠くゲノムを含む。最も好ましくは、ファージミド粒子は、ｐＩＩＩカプシドマイナーコートタンパク質およびｐＶＩＩＩカプシドメジャーコートタンパク質の両方を欠くゲノムを含む。
【０１３１】
このように、組換えファージミド粒子は、それが由来するバクテリオファージの構造遺伝子を含まない粒子のゲノムにもかかわらず、好ましくは、限定されるものではないが、バクテリオファージに由来するタンパク質および他のコンジュゲート化合物を含む構造成分から構築され、ディスプレイされる、複製欠損ウイルス様粒子またはビリオンを含む。
【０１３２】
したがって、第８の態様または任意の上記の態様の組換えファージミド粒子のゲノムが構造遺伝子を含む誘導体ファージゲノムを欠いていることを考えると、組換えファージミドゲノムをバクテリオファージカプシドにパッケージングして、本発明の粒子を産生するのに必要とされる必要な構造（すなわち、カプシド）遺伝子を提供するための代替システムが必要である。したがって、本発明者らは、別個のいわゆる「ヘルパーウイルス」ベクターの使用を含む、第８の態様または任意の上記の態様の粒子を産生するための新規なシステムを考案した。したがって、実際には、第８の態様または任意の上記の態様の粒子は、ファージミドおよび真核生物ウイルスの成分を含むハイブリッドファージミドベクターである。
【０１３３】
したがって、第１９の態様では、原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するためのシステムであって、
（ｉ）原核宿主内に存続するように構成された第１のベクターであって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、または１つ以上の養子移入されたＴ細胞である１つ以上の抗原、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクターと、
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む第２のベクターと、を含み、原核宿主からの組換えファージミド粒子の形成および押し出しをもたらす、システムを提供する。
【０１３４】
有利には、ファージミド粒子の複製要素を、そのまたは各養子移入されたＴ細胞またはサイトカインによって認識された抗原または各抗原をコードする導入遺伝子を保有する第１の「治療用」ベクターと、ウイルス構造遺伝子を保有する第２の別個の「ヘルパー」ベクターとに分離することは、ゲノム／ベクターサイズを実質的に減少させ、それにより導入遺伝子の能力を有意に増加させる。ファージミド粒子は治療的に使用され（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療）、導入遺伝子の容量が増加することは、新しいシステムの遺伝子治療用途にとって特に有用な利点である。その結果、これは、生産収率、遺伝子導入効率、および他の用途のベクターシステムの柔軟性を向上させる。
【０１３５】
第１９の態様のシステムの新規性は、第１のベクターによって提供される真核生物ウイルス（ＡＡＶまたはレンチウイルスなど）のゲノムを、第２のベクターによって提供される原核生物ウイルスカプシド（すなわち、バクテリオファージ）にパッケージングする能力である。したがって、従来技術のシステム（すなわち、ＡＡＶＰ）は、２つのゲノムのキメラであるが、第１９の態様のシステム（すなわち、ＰＡＡＶ）は、原核生物ウイルス表現型と真核生物ウイルス遺伝子型との間のキメラである。
【０１３６】
抗原は、本明細書に開示される任意のものであり得る。好ましい実施形態では、抗原または各抗原は、標的腫瘍細胞の細胞表面に発現されるペプチドまたはタンパク質である。好ましくは、抗原または各抗原は、腫瘍細胞によって発現された場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞にアクセス可能なペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質は、腫瘍細胞によって発現された場合、細胞表面で、または細胞表面上に折り畳まれたペプチドタンパク質として存在するようなものであり得る。抗原または各抗原は、ヒトにおける使用に好適な既存のＣＡＲ  Ｔ細胞の既知の標的であり得る。例えば、抗原または各抗原は、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エストロゲン関連受容体ベータ２型（ＥｒＲＢ２）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。一実施形態では、抗原または各抗原は、デングウイルスまたは黄熱ワクチン抗原であり得る。
【０１３７】
好ましくは、第１９の態様のシステムは、第８の態様の組換えファージミド粒子を産生するために使用される。したがって、好ましくは、第１のベクターは組換えファージミド粒子のゲノムを含む。第１のベクターのパッケージングシグナルは、好ましくは起点または複製を含み得る。好ましくは、第１ベクターの複製起点は、Ｆ１  ｏｒｉ、より好ましくはＦ１バクテリオファージからなる。
【０１３８】
好ましくは、第１のベクターは、原核宿主内での二本鎖ベクターの複製を可能にするための第２の複製起点を含む。好ましくは、この複製起点は、宿主内のベクターの高コピー数複製を可能にする。好ましくは、複製起点はｐＵＣ  ｏｒｉを含む。あるいは、第１のベクターは、宿主ゲノムへの標的化した組み込みを助長する１つ以上のＤＮＡ配列を含み得、したがって任意の複製起点の必要性を除去する。
【０１３９】
導入遺伝子発現カセットは、ウイルス導入遺伝子発現カセット、より好ましくは哺乳動物ウイルス導入遺伝子発現カセットを含む。例えば、少なくとも１つの導入遺伝子発現カセットは、レンチウイルス導入遺伝子発現カセットまたはＡＡＶ導入遺伝子発現カセットを含み得る。ＡＡＶ導入遺伝子発現カセットが好ましい。
【０１４０】
第２のベクトルの好ましい一実施形態を図７に示し、好ましい構成要素を図８に示す。第２のベクターまたは「ヘルパーファージ」は、好ましくは、第１のベクター（すなわち、ファージミド粒子のゲノム）を保有するファージミド粒子を原核宿主からレスキューするために特別に設計されたバクテリオファージであり、その実施形態を図３に示す。したがって、第２のベクター（すなわち、ヘルパーファージ）は、そのタンパク質およびポリペプチドを、第１のベクター（すなわち、ファージミド粒子のゲノム）、または、機能的パッケージングシグナルおよび／または一本鎖起点または複製を含む、他のＤＮＡ実体に与えるために提供される。第２のベクターは、最も好ましくは複製欠損である。好ましくは、第２のベクターは、それ自体をファージ粒子にパッケージングする能力を著しく低下させる、破壊されたパッケージングシグナルを含む。好ましくは、第２のベクターは、破壊された複製起点を含む。一実施形態では、破壊された複製起点は、ｐ１５ａのような中程度のコピー数起点である。別の実施形態では、破壊された複製起点は、ｐＭＢ１などの低程度のコピー数起点である。好ましくは、第１のベクター（すなわち、ファージミド粒子のゲノム）は、複製およびパッケージングの両方において、第２のベクター（すなわち、ヘルパーファージ）を打ち負かすように構成される。
【０１４１】
第２のベクターのゲノムは、得られた組換えファージミド粒子標的化特性（またはＷＯ２０１４／１８４５２８に記載されているような多機能性特性）を与えるように操作することができる。したがって、ファージミド粒子アセンブリのための構造カプシドタンパク質を提供する。好ましくは、第２のベクターは、１つ以上のカプシドマイナーコートタンパク質または１つ以上のカプシドメジャーコートタンパク質をコードする核酸を含む。すべてのカプシドタンパク質は、野生型または組換え型であり、単一または複数のコピーで存在し、キメラまたは合成ペプチドをディスプレイするように改変されていてもよい。これには、ペプチドワクチン送達のための他のウイルスの抗原のディスプレイ、またはＤＮＡワクチン（第８の態様のファージミド粒子によって送達される）が所望される場合のアジュバントのディスプレイが含まれる。
【０１４２】
したがって、一例では、第２のベクターは、組換えファージミド粒子の標的細胞（例えば腫瘍）への送達を可能にするための細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されたｐＩＩＩマイナーコートタンパク質をコードする第１の核酸配列を含むことができる。したがって、組換えファージミド粒子のｐＩＩＩマイナーコートタンパク質に９−アミノ酸変異を誘発して、腫瘍細胞およびαｖβ３およびαｖβ５インテグリンを発現する血管新生腫瘍関連内皮細胞にその特異性を付与することが望ましい場合がある。したがって、第２のベクターのゲノムは、ＲＧＤ４Ｃ標的化ペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ−配列番号７）を含み得る。
【０１４３】
別の例では、第２のベクターは、その上に外来ペプチドをディスプレイするように構成された少なくとも１つのｐＶＩＩＩカプシドメジャーコートタンパク質をコードする第２の核酸配列を含むことができる。したがって、例えば１０未満のアミノ酸長の短いペプチドをディスプレイするために、組換えファージミド粒子の野生型ｐＶＩＩＩメジャーコートタンパク質に突然変異を誘発することが望ましい場合がある。短いペプチドは、標的化部分であってもよく、かつ／またはインビボまたはインビトロで固有の生物学的／化学的機能性を有し得る。例えば、抗原ディスプレイを介したインビボでの免疫刺激では、ｐＶＩＩＩコートタンパク質にディスプレイされたペプチドが外因性経路を介して処理され、標的細胞のＭＨＣ  ＩＩにディスプレイされるため、養子移入されたＴ細胞の別の標的がディスプレイされる。あるいは、少なくとも１つのｐＶＩＩＩメジャーコートタンパク質は、例えば、金結合ペプチドをディスプレイすることにより、インビトロでナノ粒子（例えば金）への結合機能を有し得る。
【０１４４】
第１のベクターは、レトロウイルス科またはオルソレトロウイルス亜科のメンバーであり得る。第１のベクターは、レンチウイルス属のメンバーであり得る。好ましくは、第１のベクターは、はパルボウイルス科または亜科のメンバーである。好ましくは、第１のベクターは、ディペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）またはアデノ随伴ウイルス種のメンバーである。
【０１４５】
第１のベクター（すなわち、ファージミド粒子のゲノム）および第２のベクター（すなわち、ヘルパーファージ）が構築されると、これらを一緒に使用して原核宿主において第８の態様または任意の上記の態様の組換えファージミド粒子を産生する。それはファージミドゲノムの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にする第１のベクターのパッケージングシグナル（例えば、複製起点）が、第２のベクター（すなわち、ヘルパーファージ）構造タンパク質にシグナル伝達して、ファージミドゲノムをパッケージングし（すなわち、それらは宿主内で一緒にトランスで作用する）、第８の態様または任意の上記の態様において使用される粒子を作成するよう機能すると、理解されるであろう。
【０１４６】
１つの好ましい実施形態では、第１のベクター（ファージミド粒子ゲノム）は、実質的に配列番号９に示される核酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、ここで配列番号９は以下のように表され、「Ｎ」は導入遺伝子である。
【０１４７】
【化２０−１】
2020517272.tif 000022
【０１４８】
【化２０−２】
2020517272.tif 000023
【０１４９】
１つの好ましい実施形態では、第２のベクター（ＲＧＤ配列を有するヘルパーファージ）は、実質的に配列番号１０に示される核酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、配列番号１０は以下のように表される。
【０１５０】
【化２１−１】
2020517272.tif 000024
【０１５１】
【化２１−２】
2020517272.tif 000025
【０１５２】
【化２１−３】
2020517272.tif 000026
【０１５３】
【化２１−４】
2020517272.tif 000027
【０１５４】
【化２１−５】
2020517272.tif 000028
【０１５５】
好ましい一実施形態では、第２のベクター（ＲＧＤ配列を有さないヘルパーファージ）は、実質的に配列番号１１に示される核酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、配列番号１１は以下のように表される。
【０１５６】
【化２２−１】
2020517272.tif 000029
【０１５７】
【化２２−２】
2020517272.tif 000030
【０１５８】
【化２２−３】
2020517272.tif 000031
【０１５９】
【化２２−４】
2020517272.tif 000032
【０１６０】
【化２２−５】
2020517272.tif 000033
【０１６１】
第１９の態様によるシステムを使用して、本明細書に開示される任意の使用に従って使用するための粒子を産生することができる。粒子は、第２、第９、または第１０の態様に従って使用するためのものであり得る。一実施形態では、産生された組換えファージミド粒子は、例えば事前のワクチン接種によって、送達された１つ以上の抗原に曝露されていない対象の治療に使用するためのものである。
【０１６２】
一実施形態では、第１９の態様のシステムによって産生される組換えファージミド粒子は、１つ以上の養子移入されたＴ細胞の使用をさらに含む方法において使用するためのものである。好ましくは、養子移入されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＴ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなる群から選択される。養子移入されたＴ細胞は、組換えファージミド粒子によって腫瘍細胞に導入された１つ以上の抗原に特異的であり得る。好ましい実施形態では、養子移入されたＴ細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０１６３】
実施例１に記載されるように、本発明者らは、原核宿主において本発明の組換えファージミド粒子を産生するための２つの代替アプローチ（図９および１０参照）を考案した。
【０１６４】
したがって、第２０の態様では、原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、
（ｉ）原核宿主内に存続するように構成された第１のベクターであって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、または１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識される１つ以上の抗原、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
（ｉｉ）バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを宿主に導入することと、
（ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
【０１６５】
有利なことに、この方法（図９に示す）は、非常に高い収率の粒子をもたらす。第１のベクター（すなわち、ファージミド粒子のゲノム）は、例えば感染によって宿主細胞に導入され得る。次に、宿主細胞をヘルパーファージで形質転換することができ、それにより組換えファージミド粒子が産生される。好ましくは、この方法は、培養工程に続く精製工程を含む。精製は、遠心分離および／またはろ過を含み得る。
【０１６６】
抗原は、本明細書に開示される任意のものであり得る。好ましい実施形態では、抗原または各抗原は、標的腫瘍細胞の細胞表面に発現されるペプチドまたはタンパク質である。好ましくは、抗原または各抗原は、腫瘍細胞によって発現された場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞にアクセス可能なペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質は、腫瘍細胞によって発現された場合、細胞表面で、または細胞表面上に折り畳まれたペプチドタンパク質として存在するようなものであり得る。抗原または各抗原は、ヒトにおける使用に好適な既存のＣＡＲ  Ｔ細胞の既知の標的であり得る。例えば、抗原または各抗原は、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エストロゲン関連受容体ベータ２型（ＥｒＲＢ２）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。一実施形態では、抗原または各抗原は、デングウイルスまたは黄熱ワクチン抗原であり得る。
【０１６７】
サイトカインは、本明細書に開示されている任意のものであり得る。特に、サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１５であり、好ましくは、サイトカインはＩＬ−４である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１２である。好ましくは、サイトカインはＴＲＡＩＬである。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。
【０１６８】
好ましくは、サイトカインはＴＮＦαではない。好ましくは、サイトカインはＴＮＦαである。好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである。好ましくは、シグナルペプチドは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチドである。
【０１６９】
好ましくは、第２０の態様の方法は、第８の態様の組換えファージミド粒子を産生するために使用される。したがって、好ましくは、第１のベクターは組換えファージミド粒子のゲノムを含む。第１のベクターのパッケージングシグナルは、好ましくは起点または複製を含み得る。好ましくは、第１ベクターの複製起点は、Ｆ１  ｏｒｉ、より好ましくはＦ１バクテリオファージからなる。
【０１７０】
第２０の態様による方法は、本明細書に開示される任意の使用に従って使用するための粒子を産生するために使用することができる。粒子は、第２、第９、または第１０の態様に従って使用するためのものであり得る。一実施形態では、産生された組換えファージミド粒子は、例えば事前のワクチン接種によって、送達された１つ以上の抗原に曝露されていない対象の治療に使用するためのものである。
【０１７１】
一実施形態では、第２０の態様の方法によって産生された組換えファージミド粒子は、１つ以上の養子移入されたＴ細胞の使用をさらに含む方法において使用するためのものである。好ましくは、養子移入されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＴ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなる群から選択される。養子移入されたＴ細胞は、組換えファージミド粒子によって腫瘍細胞に導入された１つ以上の抗原に特異的であり得る。好ましい実施形態では、養子移入されたＴ細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０１７２】
第２１の態様では、原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、
（ｉ）原核宿主内に存続するように構成された第１のベクターであって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、または１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識される１つ以上の抗原、およびベクターの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第１のベクター、ならびに（ｂ）一本鎖ＤＮＡをパッケージングするのに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む第２のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
【０１７３】
有利なことに、この方法（図１０に示すような）は、改善された安全性をもたらす。第２のベクター（すなわちヘルパーファージ）は、例えば感染によって宿主細胞に導入され得る。次に、宿主細胞を、第１のベクター（すなわち、ファージミド粒子のゲノム）で形質転換することができ、それにより組換えファージミド粒子の産生をもたらす。好ましくは、この方法は、培養工程に続く精製工程を含む。精製は、遠心分離および／またはろ過を含み得る。
【０１７４】
抗原は、本明細書に開示される任意のものであり得る。好ましい実施形態では、抗原または各抗原は、標的腫瘍細胞の細胞表面に発現されるペプチドまたはタンパク質である。好ましくは、抗原または各抗原は、腫瘍細胞によって発現された場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞にアクセス可能なペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質は、腫瘍細胞によって発現された場合、細胞表面で、または細胞表面上に折り畳まれたペプチドタンパク質として存在するようなものであり得る。抗原または各抗原は、ヒトにおける使用に好適な既存のＣＡＲ  Ｔ細胞の既知の標的であり得る。例えば、抗原または各抗原は、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エストロゲン関連受容体ベータ２型（ＥｒＲＢ２）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。一実施形態では、抗原または各抗原は、デングウイルスまたは黄熱ワクチン抗原であり得る。
【０１７５】
サイトカインは、本明細書に開示されている任意のものであり得る。特に、サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１５である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−４である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１２である。好ましくは、サイトカインはＴＲＡＩＬである。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。
【０１７６】
好ましくは、サイトカインはＴＮＦαではない。好ましくは、サイトカインはＴＮＦαである。好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである。好ましくは、シグナルペプチドは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチドである。
【０１７７】
好ましくは、第２１の態様の方法は、第８の態様の組換えファージミド粒子を産生するために使用される。したがって、好ましくは、第１のベクターは組換えファージミド粒子のゲノムを含む。第１のベクターのパッケージングシグナルは、複製起点を含むことが好ましい場合がある。好ましくは、第１ベクターの複製起点は、Ｆ１  ｏｒｉ、より好ましくはＦ１バクテリオファージからなる。
【０１７８】
第２１の態様の方法は、本明細書に開示される任意の使用のための組換えファージミド粒子を産生するために使用することができる。粒子は、第２、第９、または第１０の態様に従って使用するためのものであり得る。一実施形態では、組換えファージミド粒子は、例えば事前のワクチン接種により、送達された１つ以上の抗原に曝露されていない対象の治療に使用するためのものである。
【０１７９】
一実施形態では、第２１の態様の方法によって産生された組換えファージミド粒子は、１つ以上の養子移入されたＴ細胞の使用をさらに含む方法において使用するためのものである。好ましくは、養子移入されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＴ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなる群から選択される。養子移入されたＴ細胞は、組換えファージミド粒子によって腫瘍細胞に導入された１つ以上の抗原に特異的であり得る。好ましい実施形態では、養子移入されたＴ細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０１８０】
第２２の態様では、原核宿主から第８の態様による組換えファージミド粒子を産生するための、ウイルスベクター構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージの使用を提供する。
【０１８１】
第２１の態様で定義されるような第１および／または第２のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１８２】
宿主細胞は、好ましくは原核生物であり、より好ましくは細菌細胞である。好適な宿主細胞の例には、（ｉ）ＴＧ１（遺伝子型：Ｋ−１２  ｓｕｐＥ  ｔｈｉ−１Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＢ−ｈｓｄＳＭ）５、（ｒＫ−ｍＫ−）、プラスミド：Ｆ’［ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑ  ｌａｃＺΔＭ１５］）、（ｉｉ）ＤＨ５αＦ’ＩＱ（商標）（遺伝子型：Ｆ−φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１、プラスミド：Ｆ’ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑＺΔＭ１５ｚｚｆ  Ｔｎ５［ＫｍＲ］、および（ｉｉｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（遺伝子型：Δ（ｍｃｒＡ）１８３Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３  ｅｎｄＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ、プラスミド：Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）が挙げられる。
【０１８３】
粒子は、治療的または診断的方法で、好ましくはインビボで使用される。
【０１８４】
本発明は、本発明の組換えファージミド粒子の標的特異的性質および改良された形質導入効率に起因する多種多様な癌の治療に使用することができる。その結果、遺伝子治療に使用される組換えバクテリオファージの治療機会は、１つ以上の導入遺伝子発現カセットを保有するその能力のために本発明によって有意に増加され得る。本発明は、癌を予防するため予防的に、または癌の発症後、癌を改善、管理、および／または治療するために、使用することができる。
【０１８５】
本発明を使用して、粒子の性質およびディスプレイされた外来タンパク質（抗原の場合）に応じて様々な癌の治療および／または診断に使用することができる様々な異なる組換えファージミド粒子を作成することができることは理解されよう。サイトカインは腫瘍細胞上にディスプレイされない可能性があることが理解されよう。遺伝子治療技術における標的細胞は、好ましくは真核生物、好ましくは哺乳動物である。
【０１８６】
遺伝子治療技術は、癌を治療、予防、改善、または管理するために使用される。腫瘍は、血液悪性腫瘍または造血組織などの液体腫瘍、または血液悪性腫瘍であり得る。腫瘍は固形腫瘍であり得る。腫瘍は脳内のもの、例えば、髄芽腫、膠芽腫、またはびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）であり得る。組換えファージミド粒子は、化学療法薬（すなわち、ドキソルビシン、テモゾロミド、ロムスチン、シスプラチン、ビンクリスチン）、放射線療法、または、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）、プロテアソーム阻害薬（例えば、ＭＧ１３２、ボルゾテミブ、カルフィルゾミブ）、ならびに天然および食事源（すなわち、ゲニステイン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、レスベラトロール）由来の抗癌剤を含むがこれらに限定されない、他の薬物／生体異物化合物などの従来の治療法と組み合わせて使用することができる。
【０１８７】
組換えファージミド粒子はまた、対象となる抗原を主要なｐＶＩＩＩコートタンパク質上に直接ディスプレイおよび発現させるために使用することができ、したがって、単一のファージ粒子による、多数の抗原の、またはタンパク質、もしくは関連する生物学的活性を有するタンパク質の、同時送達のための効率的なプラットフォームを提供する。対象は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。
【０１８８】
本発明の組換えファージミド粒子およびシステム（すなわち、以下では「作用因子」と呼ぶ）は、単剤療法において、または癌の治療、改善、管理、または予防のための既知の治療法の補助剤として、またはそれらと組み合わせて使用され得る医薬において使用することができることが理解されよう。例えば、本発明のファージミド粒子およびシステムを、テモゾラミド、シスプラチン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、またはゲニステインなどの既存の化学療法薬と併用する併用治療アプローチが好ましい。
【０１８９】
別の好ましい実施形態では、治療法は、本発明の組換えファージミド粒子およびシステムと、酵素またはロサルタンのような細胞外マトリックス分解剤との組み合わせを含み得る。本発明者らは、細胞外マトリックス分解剤が、治療されている対象、特に固形腫瘍内で、ファージミドの拡散を増強するはずであると考えている。
【０１９０】
本発明による作用因子（すなわち、第８または任意の上記の態様において使用されるか、または第１９の態様によるシステムによって産生される組換えファージミド粒子）は、特に、組成物が使用される様式に応じて、多くの異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、散剤、錠剤、カプセル、液体などの形態、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与され得る任意の他の好適な形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容されるものでなければならないことは理解されよう。
【０１９１】
本発明による薬剤を含む薬剤は、いくつかの方法で使用することができる。例えば、経口投与が要求されることがあり、この場合、作用因子は、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形態で経口的に摂取され得る組成物内に含有され得る。本発明の作用因子を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）によって投与することができる。組成物はまた、局所使用のために製剤化され得る。例えば、クリームまたは軟膏を皮膚に適用することができる。
【０１９２】
本発明による薬剤はまた、徐放型または遅延型放出デバイスに組込まれ得る。このようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、医薬は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。このようなデバイスは、本発明に従って使用される作用因子による長期治療が必要であり、通常は頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）が必要とされる場合に特に有利であり得る。
【０１９３】
好ましい実施形態では、本発明による作用因子および組成物は、血流への注射によって、または治療を必要とする部位へ直接的に、対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）、皮下（ボーラスまたは点滴）、皮内（ボーラスまたは点滴）であり得るか、または従来の方法（疾患部位における局所注入に関連する−対流増強送達(convection enhanced delivery)）によって強化され得る。
【０１９４】
必要とされる作用因子の量は、順次、投与様式、作用因子（すなわち、組換えファージミドウイルス粒子またはシステム）の物理化学的特性、および単独療法として、または併用療法において使用されるかどうかに依存するその生物学的活性および生物学的利用能によって決定されることが理解されよう。投与頻度はまた、治療される対象内の作用因子の半減期によっても影響される。投与される最適な投薬量は、当業者によって決定されることができ、使用される特定の作用因子、医薬組成物の強度、投与様式、および疾患の進行によって変化する。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む、治療される特定の対象によるさらなる要因は、投与量を調整する必要性をもたらすであろう。
【０１９５】
一般に、１日用量０．０１μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の本発明による作用因子を指標することができる。より好ましくは、１日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１９６】
実施例に論じられるように、作用因子は、疾患の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。例えば、対象が疾患を発症した直後に作用因子を投与してもよい。１日量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として全身に与えられてもよい。あるいは、作用因子は１日に２回以上投与する必要があってもよい。一例として、作用因子は、２５ｍｇ〜７０００ｍｇの間の１日用量（すなわち、体重７０ｋｇを想定）２回（または治療される疾患の重篤度に応じてそれ以上の回数）として投与することができる。治療を受けている患者は、起床時には第１の用量を、その後は夕方（２回投与計画の場合）またはその後３または４時間間隔で第２の用量を摂取することができる。あるいは、徐放デバイスを使用して、反復投与を投与する必要なく、本発明による作用因子の最適用量を患者に提供することができる。
【０１９７】
製薬業界で従来使用されている手順などの既知の手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）を使用して、本発明による粒子またはシステムを含む特定の製剤および正確な治療計画（作用因子の１日用量および投与頻度など）を形成することができる。
【０１９８】
したがって、本発明の第２３の態様では、第８の態様によるか、第１９の態様によるシステムによって産生されるか、第２０または第２１の態様の方法によって産生されるか、または２２の態様の使用によって産生される組換えファージミドウイルス粒子と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む、医薬組成物を提供する。
【０１９９】
本発明はまた、第２４の態様では、第２３の態様に従って医薬組成物を作製するためのプロセスであって、第８の態様によるシステムによるか、第１９の態様の方法によるシステムによって産生されるか、第２０または２１の態様の方法によって産生されるか、または第２２の態様の使用によって産生される治療有効量の組換えファージミドウイルス粒子、および薬学的に許容されるビヒクルに接触させることを含む、プロセスを提供する。
【０２００】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による作用因子、組成物、および医薬は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、馬）、ペットを治療するために使用され得るか、または他の獣医学の用途に使用され得る。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。
【０２０１】
作用因子（すなわち、組換えファージミドウイルス粒子）の「治療有効量」は、対象に投与されたときに、標的疾患を治療するために、または所望の効果を生じるのに、例えば腫瘍死をもたらすなど標的細胞または組織への導入遺伝子の効果的な送達をもたらすのに、必要な薬剤の量である、任意の量である。
【０２０２】
例えば、使用される作用因子の治療有効量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであってもよい。
【０２０３】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物を製剤するのに有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【０２０４】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってよく、組成物は散剤または錠剤の形態であってよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含んでもよい。ビヒクルは、封入材料でもあり得る。粉末剤では、ビヒクルは、本発明による微粉化活性剤と混合されている微粉化固体である。錠剤では、活性作用因子（例えば、本発明の粒子またはシステム）を、必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合し、所望の形状およびサイズに圧縮することができる。粉末剤および錠剤は、好ましくは最大９９％の活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであってよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【０２０５】
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、および加圧組成物を調製するのに使用される。本発明による粒子またはシステムは、水、有機溶媒、両者の混合物または薬学的に許容される油もしくは脂肪のような、薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁されてもよい。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤などの他の適切な薬学的添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例には、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）、およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分別ヤシ油および落花生油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルでもあり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【０２０６】
滅菌溶液または懸濁剤である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射によって利用することができる。粒子またはシステム（すなわち、ハイブリッドベクター）は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【０２０７】
本発明の組換えファージミド粒子、システム、および医薬組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびそのエチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含む滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与することができる。本発明による粒子およびシステムは、液体または固体組成物のいずれかの形態で経口投与することもできる。経口投与に好適な組成物には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および散剤などの固体形態、ならびに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、乳剤、および懸濁剤が挙げられる。
【０２０８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はしばしば遺伝子治療のために選択されるベクターであることが理解されるであろう。遺伝子送達ベクターとして、レンチウイルスベクターはまた、他のシステムよりもいくつかの重要な利点を有する。それらは、少なくとも８ＫｂのＤＮＡの大きなパッケージング能力を有し、これは、組織特異的プロモーターおよび導入遺伝子のかなりの発現カセットをパッケージングする際の重要な特徴である。さらに、レンチベクターは、アデノウイルスベクターと比較して免疫原性を低下させ、全身送達経路を検討することを可能にする。しかしながら、ＡＡＶまたはレンチウイルスを実験室および臨床研究に使用することの障壁には、非常に高い生産コストおよび低い収率を含む。
【０２０９】
本発明者らは、遺伝子治療における有用な適用を示すことに加えて、本発明の組換えファージミド粒子はまた、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどの組換えウイルスベクターを（インサイチュを含む）インビトロまたはインビボで産生するために使用することができる。ファージ誘導ＡＡＶ産生は、大量の一本鎖ｓｓＤＮＡをパッケージングするファージミド粒子の能力を利用する。典型的なＡＡＶ産生システムは、一緒に機能してｒＡＡＶ粒子を産生するｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、およびアデノヘルパー遺伝子の３つの主要な要素からなる。
【０２１０】
したがって、第２５の態様では、第８の態様によるか、第１９の太陽のシステムによって産生されるか、第２０もしくは第２１の態様の方法によって産生されるか、または第２２の態様の使用によって産生される、組換えファージミド粒子であって、組換えファージミド粒子が、ファージミド粒子のゲノム内のウイルスゲノムを含むか、またはこれに由来する組換えウイルスベクターの産生のためのものであり、組換えウイルスベクターが、１つ以上の抗原またはサイトカインをコードする核酸配列を、腫瘍細胞に少なくとも隣接して送達するために使用され、配列が１つ以上の抗原をコードするとき、１つ以上の抗原が発現され、１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識可能である、組換えファージミドウイルス粒子を提供する。
【０２１１】
次に、養子移入されたＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞など）による認識のための抗原をコードする組換えウイルスベクターを産生することができる組換えファージミド粒子が有利であり得る。図１６は、悪性腫瘍への核酸配列の送達を示しており、ウイルスベクターの産生により、腫瘍の自己感染が可能になり、その結果、腫瘍全体に核酸配列が送達される。これは、養子移入されたＴ細胞による認識のための抗原が腫瘍全体に送達されることを可能にするため、有利であり得る。これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の好適な標的を提供するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療などの任意のその後の養子移入療法と相乗効果がある。さらに、導入されたベクター（すなわち、組換えファージミド粒子）のより低い濃度が使用されることを可能にし得る。
【０２１２】
好ましい実施形態では、抗原または各抗原は、標的腫瘍細胞の細胞表面に発現されるペプチドまたはタンパク質である。好ましくは、抗原または各抗原は、腫瘍細胞によって発現された場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞にアクセス可能なペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質は、腫瘍細胞によって発現された場合、細胞表面で、または細胞表面上に折り畳まれたペプチドタンパク質として存在するようなものであり得る。抗原または各抗原は、ヒトにおける使用に好適な既存のＣＡＲ  Ｔ細胞の既知の標的であり得る。例えば、抗原または各抗原は、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、エストロゲン関連受容体ベータ２型（ＥｒＲＢ２）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。一実施形態では、抗原または各抗原は、デングウイルスまたは黄熱ワクチン抗原であり得る。
【０２１３】
第２５の態様による組換えファージミド粒子は、本明細書に開示される任意の使用のためのものであり得る。粒子は、第２、第９、または第１０の態様に従って使用するためのものであり得る。一実施形態では、組換えファージミド粒子は、例えば事前のワクチン接種により、送達された１つ以上の抗原に曝露されていない対象の治療に使用するためのものである。
【０２１４】
一実施形態では、第２５の態様の組換えファージミド粒子は、１つ以上の養子移入されたＴ細胞の使用をさらに含む方法において使用するためのものである。好ましくは、養子移入されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＴ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなる群から選択される。養子移入されたＴ細胞は、組換えファージミド粒子によって腫瘍細胞に導入された１つ以上の抗原に特異的であり得る。好ましい実施形態では、養子移入されたＴ細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０２１５】
組換えウイルスベクターを産生するための方法であって、第８の態様による組換えファージミド粒子または第１９の態様によるシステムを真核宿主細胞に導入し、宿主細胞が組換えウイルスベクターを産生することを可能にすることを含む、方法も提供する。
【０２１６】
好ましくは、組換えウイルス産物は、組換え哺乳動物ウイルス、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスである。好ましくは、ウイルスベクター産物はｒＡＡＶである。好ましくは、第８の態様によるファージミドウイルス粒子、または第１９の態様によるシステムは、真核宿主細胞内で、ファージミド粒子のゲノムによって決定される、哺乳動物ウイルスの産生に必要とされる他の遺伝要素の送達および／または存在と共に、シスおよび／またはトランスで使用される。ファージミド粒子による宿主細胞への遺伝子導入を助けるまたは増強するために使用される方法は、ＷＯ２０１４／１８４５２８（すなわち、多機能性）およびＷＯ２０１４／１８４５２９（すなわち、正味の正電荷を有する複合体を形成するためのカチオン性ポリマーとの組み合わせ）に記載された方法を含む。
【０２１７】
真核生物の宿主細胞は哺乳動物であってもよい。宿主細胞は、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、スポドプテラ・フルギペルダ蛹卵巣組織（Ｓｆ９）、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）を含むか、またはそれに由来し得る。昆虫細胞もまた想定される。
【０２１８】
一例では、宿主細胞は、ｒＡＡＶ、レンチウイルス、カプシド、複製、ヘルパータンパク質コード遺伝子、ならびに哺乳動物ウイルスの発現およびパッケージングに必要な任意の他の遺伝子からなる群から選択される遺伝子を保有する１つ以上のファージミド粒子ゲノムで形質転換され得る。
【０２１９】
例えば、ハイブリッドファージミド粒子誘導ｒＡＡＶ産生において、図３に示されるように、ｒＡＡＶ遺伝子は、第８の態様による組換えファージミドウイルス粒子によって保有され得るか、アデノヘルパーおよびｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子は、別々のベクター上に保有され得るか、または真核宿主ゲノムに組込まれ得る。例えば、図１２は１つのベクター上のアデノヘルパー遺伝子を示し、図１３は別個のベクター上のｒｅｐ−ｃａｐを示す。ｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、およびアデノヘルパー遺伝子の任意の組み合わせは、１つ以上のベクター、すなわちシスまたはトランス配置で保有されてもよい。あるいは、ｒｅｐ−ｃａｐまたはアデノヘルパータンパク質は、ｒＡＡＶ産生の状況下で、安定的に発現されたアクセサリーＤＮＡ（例えば、プラスミド）として真核宿主に組込まれるか、または導入され得、それにより、ハイブリッドファージミド粒子は、ファージミド粒子のゲノム内の導入遺伝子カセットによって決定される、組換えウイルスへのパッケージングのための組換えウイルスゲノムを供給する。
【０２２０】
１つの好ましい実施形態では、ｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、およびアデノヘルパー遺伝子は、図１４および１５に示されるように、単一のベクター上に保有される。本発明者らは、３つの遺伝子セットすべてが同じベクター上に内包するのはこれが、初めてであると考えている。
【０２２１】
したがって、第２６の態様では、癌の治療、予防、または改善に使用するための、ｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、アデノヘルパー遺伝子、および１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識するための１つ以上のサイトカインまたは１つ以上の抗原をコードする核酸配列を含む、組換えベクターを提供する。
【０２２２】
組換えベクターは、本明細書に開示される任意の使用または方法のためのものであり得る。
【０２２３】
第２７の態様では、癌の治療、予防、または改善のための方法において使用するための、第１２の態様のベクターを含む、組換えファージミド粒子を提供する。
【０２２４】
組換えファージミド粒子は、本明細書に開示される任意の使用または方法のためのものであり得る。
【０２２５】
ファージミド粒子のウイルスゲノムを含むか、またはそれに由来する組換えＡＡＶウイルスベクターを産生するための、第２６の態様によるベクターまたは第２７の態様の粒子の使用を提供する。
【０２２６】
組換えＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法であって、該方法が、真核宿主細胞に、第２６の態様によるベクターまたは第２７の態様の粒子を導入し、宿主細胞が組換えウイルスベクターを産生することを可能にする、方法を提供する。
【０２２７】
同じ真核宿主細胞に導入された場合（図１１および１４参照）、ベクター上のｒｅｐ−ｃａｐおよびアデノヘルパー遺伝子は、ｒＡＡＶ産生の状況において、トランス作用もしくはシス作用として、またはＡＡＶウイルスカプシドにおけるｒＡＡＶゲノムのパッケージングを促進する両方の要素の組み合わせとして挙動する。この産生プロセスは、複数のプラスミドの一時的な同時トランスフェクションに匹敵し、通常は３つのプラスミドを含む。しかしながら、この実施形態では、プラスミドは、同一の要素も保有する真核細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を標的とする本発明の組換えファージミド粒子で置き換えられる。
【０２２８】
該方法は、インビボ(in vivo)、インビトロ(in vitro)、エキソビボ(ex vivo)、またはインサイチュ(in situ)で行うことができる。インサイチュ生産のために、組換えファージミド粒子は、好ましくは、指定された真核宿主である標的真核細胞のための標的化部分を含む。好ましくは、インサイチュ、エキソビボ、およびインビボウイルス産生の状況において、指定された真核宿主細胞型は疾患細胞である。好ましくは、罹患細胞は悪性または良性の腫瘍である。インビトロウイルス産生の状況において、好ましくは、真核宿主は、上記に列挙された真核宿主のうちのいずれかの誘導体である。（ハイブリッドファージミド粒子中の導入遺伝子カセットによって決定される）組換えウイルスの産生に必要な組換えファージミド粒子および遺伝子要素の適用は、真核宿主細胞の内部で、シス作用またはトランス作用の組み合わせのいずれかにおいて先に示したような任意の様式であり得る。
【０２２９】
第２８の態様では、癌を治療、予防、または改善するための方法において使用するための、粒子で形質導入された標的腫瘍細胞内に導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子発現カセット、または１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識可能な抗原を含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも５０％を欠くゲノムを含み、該方法が、主要細胞に少なくとも隣接して核酸配列を送達することを含み、核酸が１つ以上の抗原をコードするとき、１つ以上のサイトカインが発現され、かつ１つ以上の養子移入されたＴ細胞によって認識可能である、組換えファージミド粒子を提供する。
【０２３０】
本発明は、本明細書で言及される配列のうちのいずれかのアミノ酸または核酸配列を実質的に含む任意の核酸もしくはペプチド、またはその変異体、誘導体、もしくは類似体におよび、その機能的変異体または機能的フラグメントを含むことが理解されるであろう。「実質的にアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列」、「機能的変異体」、および「機能的フラグメント」という用語は、本明細書で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であり得、例えば本明細書において同定された核酸と４０％同一性を有する配列であり得る。
【０２３１】
言及された配列のうちのいずれかと６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは７５％を超える、さらにより好ましくは８０％を超える、配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のうちのいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【０２３２】
当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合をどのように計算するかを理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージを計算するために、２つの配列のアラインメントを最初に調製し、次に配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性のパーセンテージは、（ｉ）例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装されている）、または３Ｄ比較からの構造的アラインメントなどの、配列を整列させるために使用される方法、ならびに（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ、例えば、機能的な形態および定数、に応じて異なる値をとることができる。
【０２３３】
アライメントをしたので、２つの配列間の同一性百分率を計算するための多くの異なる方法がある。例えば、同一性の数を次のもの：（ｉ）最短配列の長さ、（ｉｉ）アライメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置の数、または（ｖ）オーバーハングを除いた同値位置の数で割ることができる。さらに、同一性百分率もまた、長さに強く依存することが理解されるであろう。したがって、一対の配列が短いほど、偶然に起こると予想され得る配列同一性が高くなる。
【０２３４】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアライメントは、複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡの複数のアライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下の通りであり得る。ＤＮＡアライメントについて：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップエクステンションペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝同一性。タンパク質アライメントについて：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップエクステンションペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質アライメントについて：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アライメントのために、これらおよび他のパラメータを変えることが必要であり得ることを認識しているだろう。
【０２３５】
次に、好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアラインメントから計算され、Ｎは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含むがオーバーハングを除く比較された位置の総数である。したがって、２つの配列間の相対同一性百分率を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上述のような好適なパラメータのセットを使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した配列アライメントを準備することと、（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することと、を含む。
【０２３６】
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、本明細書に記載される核酸配列またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、３倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中に約４５℃でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし、続いて、０．２倍のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中に約２０〜６５℃で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドでは、本明細書中に示される配列と少なくとも１個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個未満でアミノ酸が異なっていてもよい。
【０２３７】
遺伝暗号の縮重のために、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、任意の核酸配列を変化させることができ、その機能的変異体を提供することができることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、したがってサイレントな変化を生じる。他の好適な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、それが置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変されて保存的な変化を産生する、配列の全部または一部を含むものである。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、リシン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。負帯電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置き換えられ得るかが理解され、当業者であれば、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【０２３８】
本明細書に記載されている特徴のうちの全て（任意の添付の特許請求の範囲、要約、および図面を含む）、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップのうちの全ては、そのような特徴および／もしくはステップのうちの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記態様のうちのいずれかと組み合わせされ得る。疑念を避けるために、サイトカインへの言及は、好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組み合わせに関する場合がある。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１５であり、好ましくは、サイトカインはＩＬ−４である。好ましくは、サイトカインはＩＬ−１２である。好ましくは、サイトカインはＴＲＡＩＬである。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。
【０２３９】
しかしながら、別の好ましい実施形態では、サイトカインはＴＮＦαである。好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦαの発現および／または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドＴＮＦαである。好ましくは、シグナルペプチドは、ＴＮＦαのもの以外のサイトカインシグナルペプチドである。例えば、シグナルペプチドは、好ましくはＩＬ−２シグナルペプチドである。
【０２４０】
本発明をよりよく理解するために、また本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、添付の図面を例として参照する。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１は、従来技術のＡＡＶＰウイルス粒子と比較した、本発明によるファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）ウイルス粒子の特徴を示す表である。
【図２】図２は、本発明によるヘルパーファージおよびファージミドゲノム（ＰＡＡＶ）、ならびにヘルパーおよびファージミドによって作成されるファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子の実施形態の概略図を示す。構造遺伝子は、ウイルス粒子へのＤＮＡのパッケージングに不可欠であり、複製ヘルパーファージによって供給される。ファージミドゲノムは、ヘルパーファージに非常に寄生的である。最終的に、ＰＡＡＶ粒子は、従来技術のシステムをはるかに超える収率で産生される。
【図３】図３は、ファージミドゲノム（ＰＡＡＶ）の一実施形態の概略表示である。
【図４】図４は、図３に示すファージミドゲノム上のｆ１  ｏｒｉおよびｐＵＣ  ｏｒｉのそれぞれの位置を示す。
【図５】図５は、図３に示すファージミドゲノム上の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）導入遺伝子カセット上の選択マーカー遺伝子（ＡｍｐＲ）の位置を示す。
【図６】図６は、発現がＣＭＶプロモーターおよび／またはエンハンサー配列によって駆動され、ポリＡシグナルでテールされた、対象となる遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を含む、図３に示すファージミドゲノム上のｒＡＡＶ導入遺伝子カセットを示す。導入遺伝子カセット全体は、ＡＡＶからの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。
【図７】図７は、図３に示すようなファージミドゲノムを保有する原核宿主からファージミド粒子をレスキューするために操作されたバクテリオファージであるヘルパーファージの一実施形態を示す。
【図８】図８は、ｐＩＩＩマイナーコートタンパク質中のＲＧＤ４Ｃ標的化ペプチドを含み、配列番号２６および２７に示すような、図５に示すヘルパーファージのゲノムの一部を示す。
【図９−１】図９は、ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子を産生するための方法の第１の実施形態を示す。
【図９−２】図９は、ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子を産生するための方法の第１の実施形態を示す。
【図１０−１】図１０は、ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子を産生するための方法の第２の実施形態を示す。
【図１０−２】図１０は、ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子を産生するための方法の第２の実施形態を示す。
【図１１】図１１は、（ｉ）ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）、（ｉｉ）Ｒｅｐ−Ｃａｐファージミド、および（ｉｉｉ）アデノヘルパーファージミドの３つのベクターを示すインビトロＡＡＶ産生のためのファージに基づくアプローチの一実施形態を示す。
【図１２】図１２は、図１１に示されるアデノヘルパーファージミドベクターの一実施形態のゲノムマップを示す。
【図１３】図１３は、図１１に示されるＲｅｐ−Ｃａｐファージミドベクターの一実施形態のゲノムマップを示す。
【図１４】図１４は、統合されたアデノヘルパー／Ｒｅｐ−ｃａｐ／ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）ベクターの実施形態を示す。
【図１５】図１５は、図１１に示される統合されたアデノヘルパー−Ｒｅｐ−Ｃａｐファージミドベクターの一実施形態のゲノムマップを示す。
【図１６】図１６は、図１１〜１３に示される３つのファージミドベクター、または図１４および１５に示される統合されたアデノヘルパー−Ｒｅｐ−Ｃａｐ−ＡＡＶファージミドベクターのいずれかを使用するインサイチュＡＡＶ産生の一実施形態を示す。
【図１７】図１７は、既知のＡＡＶＰベクターおよび本発明によるＰＡＡＶベクターの透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を示す。（Ａ）ＲＧＤ．ＡＡＶＰ．ＧＦＰフィラメント（ピンク）は、典型的には１４５５．０２ｎｍの長さである。（Ｂ）ＲＧＤ。ＰＡＡＶ．ＧＦＰフィラメント（青色）は、典型的には、７２９．９６ｎｍの長さであり、ウイルスサンプル（緑色）に存在するヘルパーファージは、典型的には、１１８６．０３ｎｍの長さである。
【図１８】図１８は、（Ａ）２９３ＡＡＶおよび（Ｂ）Ｕ８７細胞における、２時間および４時間後の既知のＡＡＶＰベクターおよび本発明によるＰＡＡＶベクターの内在化を示す。全細胞集団の２００００事象で設定されたゲート閾値を用いた、フローサイトメトリー分析を使用した。（ｎ＝３）＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図１９】図１９は、（Ａ）２９３ＡＡＶ、（Ｂ）ＤＥＡＥ．ＤＥＸＴＲＡＮの添加を伴う２９３ＡＡＶ、（Ｃ）Ｕ８７、および（Ｄ）ＤＥＡＥ．ＤＥＸＴＲＡＮの添加を伴うＵ８７における形質導入９日後のＧＦＰ陽性細胞の定量を示す。全細胞集団の２００００事象で設定されたゲート閾値を用いた、フローサイトメトリー分析を使用した。（ｎ＝３）＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図２０】図２０は、ファージミド誘導遺伝子導入（Ａ）またはｒＡＡＶ発現要素のトランスフェクション（Ｂ）後の細胞溶解物由来のｒＡＡＶ−ＧＦＰのゲノムコピー数の定量を示す。（実験Ａ：ｎ＝１、実験Ｂ：ｎ＝３）。
【図２１】図２１は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドに対する受容体である、αＶ、β３、およびβ５インテグリンサブユニットの発現を実証するためのＵＷ２２８およびＤＡＯＹヒト髄芽腫細胞の免疫蛍光染色を示す。腫瘍細胞を、一次ウサギ抗αＶ、β３、またはβ５抗体（ＰＢＳ−１％ＢＳＡで１：５０に希釈）、次にヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体（緑色で示す）で染色し、０．０５μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。画像は共焦点顕微鏡を使用して撮影された。
【図２２】図２２は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドによる小児髄芽細胞腫細胞への標的遺伝子送達を示す。髄芽腫細胞（ＵＷ２２８）を９６ウェルプレート上で増殖させ、次にルシフェラーゼ遺伝子（ＲＧＤ）を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミドベクターで形質導入した。未処理細胞または非標的ベクター（Ｍ１３）で処理した細胞を陰性対照として使用した。ルシフェラーゼ発現は、形質導入後２日目〜４日目までの経時変化をモニターした。
【図２３】図２３は、ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ（ＲＧＤ４Ｃ−ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ）をコードする配列を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミドによる処理後の小児ＵＷ２２８およびＤＡＯＹ髄芽細胞腫細胞におけるｍＴＯＲ発現のダウンレギュレーションを示すウエスタンブロット分析を示す。ベクター処理後４日目に細胞溶解物を回収し、全タンパク質をＢＣＡアッセイによって測定した。ウエスタンブロットを、ヒトｍＴＯＲ（細胞シグナル伝達）に対するモノクローナル抗体でプローブした。非処理細胞（対照）およびｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡを欠くＲＧＤ４Ｃ−ファージミド（ＲＧＤ４Ｃ）で処理した細胞を陰性対照として使用した。
【図２４】図２４は、髄芽細胞腫におけるテモゾロミド（ＴＭＺ）およびｍＴＯＲに対するｓｈＲＮＡをコードする配列を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミドの併用処理を示す。髄芽細胞腫細胞（ＵＷ２２８およびＤＡＯＹ）を、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド（ＲＧＤ４Ｃ）またはｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡをコードする配列を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミド（ＲＧＤ４Ｃ−ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ）で形質導入した。未処理の細胞もまた対照として使用した。ベクター処理後７日目に、少数のウェルにテモゾルミド（ＴＭＺ、１００μＭ）を加えて、ベクターと化学療法の併用効果を評価した。ベクター処理後８日目に画像を撮影した。
【図２５】図２５は、ＴＮＦαファージミドベクターによる髄芽細胞腫細胞の処理を示す。ＵＷ２２８細胞を、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦａ（ＲＧＤ４Ｃ／ＴＮＦａ）および非標的化（ｃｔｒ）で処理した。Ａ）ＴＮＦαの発現後、ＭＴＴアッセイを使用した細胞生存率。Ｂ）ヒトＴＮＦα  ＥＬＩＳＡ  Ｍａｘを使用して測定された、ベクター処理細胞の培地におけるＴＮＦαの発現。エラーバー：平均±ＳＥＭ。
【図２６】図２６は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドに対する受容体であるαＶ、β３、およびβ５インテグリンサブユニットの発現を実証するためのＤＩＰＧ細胞の免疫蛍光染色を示す。一次ウサギ抗体を使用し、次にヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体を用いて細胞を染色した。対照細胞は二次抗体のみを受けた。画像は共焦点顕微鏡を使用して撮影された。
【図２７Ａ】図２７は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド／ＡＡＶによる、ＵＷ２２８、ＤＡＯＹ、ＤＩＰＧ細胞への遺伝子発現の選択的かつ用量依存的送達を示す。レポーターＬｕｃ（ルシフェラーゼ）遺伝子を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−Ｌｕｃ（ＲＧＤ４Ｃ）のベクター用量１×１０６または２×１０６ＴＵ／細胞の増加を使用して、細胞を処理した。Ｌｕｃの発現は毎日測定された。ＲＧＤ４Ｃを欠く非標的ベクター（ｃｔｒ）を、標的化の陰性対照として使用した。エラーバー：平均±ＳＥＭ。（Ａ）ＤＩＰＧ細胞の治療を示し、（Ｂ）ＵＷ２２８の治療を示し、（Ｃ）ＤＡＯＹ細胞の治療を示す。
【図２７Ｂ】図２７は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド／ＡＡＶによる、ＵＷ２２８、ＤＡＯＹ、ＤＩＰＧ細胞への遺伝子発現の選択的かつ用量依存的送達を示す。レポーターＬｕｃ（ルシフェラーゼ）遺伝子を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−Ｌｕｃ（ＲＧＤ４Ｃ）のベクター用量１×１０６または２×１０６ＴＵ／細胞の増加を使用して、細胞を処理した。Ｌｕｃの発現は毎日測定された。ＲＧＤ４Ｃを欠く非標的ベクター（ｃｔｒ）を、標的化の陰性対照として使用した。エラーバー：平均±ＳＥＭ。（Ａ）ＤＩＰＧ細胞の治療を示し、（Ｂ）ＵＷ２２８の治療を示し、（Ｃ）ＤＡＯＹ細胞の治療を示す。
【図２７Ｃ】図２７は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド／ＡＡＶによる、ＵＷ２２８、ＤＡＯＹ、ＤＩＰＧ細胞への遺伝子発現の選択的かつ用量依存的送達を示す。レポーターＬｕｃ（ルシフェラーゼ）遺伝子を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−Ｌｕｃ（ＲＧＤ４Ｃ）のベクター用量１×１０６または２×１０６ＴＵ／細胞の増加を使用して、細胞を処理した。Ｌｕｃの発現は毎日測定された。ＲＧＤ４Ｃを欠く非標的ベクター（ｃｔｒ）を、標的化の陰性対照として使用した。エラーバー：平均±ＳＥＭ。（Ａ）ＤＩＰＧ細胞の治療を示し、（Ｂ）ＵＷ２２８の治療を示し、（Ｃ）ＤＡＯＹ細胞の治療を示す。
【図２８−１】図２８は、ＵＷ２８８、ＤＡＯＹ、またはＤＩＰＧ細胞のＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦαによる治療を示す。ＤＩＰＧを、２ｘ１０６ＴＵ／細胞ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦａ（ＲＧＤ４Ｃ）および陰性対照（ｃｔｒ）としての非標的ベクターで形質導入した。ＵＷ２８８またはＤＡＯＹ細胞を、ＤＥＡＥデキストランを含むか、または含まない１×１０６ＴＵ／細胞で形質導入した。アポトーシス活性は、生存細胞のパーセンテージを測定することによって、またはカスパーゼ−Ｇｌｏアッセイ（カスパーゼ３／７、カスパーゼ８、およびカスパーゼ９）を使用することによって、ベクター処理後９日目に測定した。エラーバー：平均±ＳＥＭ。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図２８−２】図２８は、ＵＷ２８８、ＤＡＯＹ、またはＤＩＰＧ細胞のＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦαによる治療を示す。ＤＩＰＧを、２ｘ１０６ＴＵ／細胞ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦａ（ＲＧＤ４Ｃ）および陰性対照（ｃｔｒ）としての非標的ベクターで形質導入した。ＵＷ２８８またはＤＡＯＹ細胞を、ＤＥＡＥデキストランを含むか、または含まない１×１０６ＴＵ／細胞で形質導入した。アポトーシス活性は、生存細胞のパーセンテージを測定することによって、またはカスパーゼ−Ｇｌｏアッセイ（カスパーゼ３／７、カスパーゼ８、およびカスパーゼ９）を使用することによって、ベクター処理後９日目に測定した。エラーバー：平均±ＳＥＭ。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図２９】図２９は、様々な形質導入単位のＲＧＤ．ＰＡＡＶでのＲＧＤ．ＰＡＡＶによる形質導入後のルシフェラーゼ発現を示す。
【図３０】図３０は、２９３個のＡＡＶ細胞の細胞表面に結合したＰＡＡＶベクターのパーセンテージを示す。それぞれの対照と比較して、ＲＧＤ．ＰＡＡＶベクターは５８．２％の結合効率を有したが、Ｍ１３．ＰＡＡＶベクターは、７．１％の結合効率を有した。
【図３１ａ】図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、図３１ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３１ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３１ｂ】図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、図３１ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３１ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３１ｃ】図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、図３１ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３１ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３１ｄ】図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、図３１ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３１ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３１ｅ】図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、図３１ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３１ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３１ｆ】図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、図３１ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３１ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３１ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３２】図３２は、形質導入後６日目のＭＵＣ−１．ＣＤ２８、ＭＵＣ−１．ＧＰＩ、およびＰＳＭＡ抗原の発現を示す。ＨＥＫ  ２９３細胞は、１０６ＴＵ／細胞のＲＧＤ標的化ＰＡＡＶ（ＲＧＤ）または非標的化ＰＡＡＶ（ＮＴ）のいずれかによって形質導入された。未処理のＨＥＫ  ２９３細胞（Ｃｔｒｌ）、および４８８個のみの二次抗体染色（Ａｎｔ．４８８）を有する標的化ＰＡＡＶ形質導入−ＨＥＫ  ２９３細胞を対照として示した。Ａは、ＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＨＥＫ  ２９３細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す（図３１ａ、３１ｂ、および３１ｃの構築物）。ＤＥＡＥ−デキストランを添加した。Ｂは、ＤＥＡＥデキストランを添加しないＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクター（図３１ａ、３１ｂ、および３１ｃの構築物）によって形質導入されたＨＥＫ  ２９３細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。Ｃは、ＤＥＡＥデキストランを添加しないＧｒｐ７８プロモーター駆動ＰＡＡＶベクター（図３１ｄおよび３１ｅの構築物）によって形質導入されたＨＥＫ  ２９３細胞のＭＵＣ−１発現を表す。
【図３３ａ】図３３は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、図３３ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３３ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３３ｂ】図３３は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、図３３ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３３ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３３ｃ】図３３は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、図３３ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３３ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３３ｄ】図３３は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、図３３ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３３ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３３ｅ】図３３は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、図３３ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３３ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３３ｆ】図３３は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、図３３ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、図３３ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、図３３ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【図３４】図３４は、形質導入後６日目の癌細胞のＭＵＣ−１．ＣＤ２８、ＭＵＣ−１．ＧＰＩ、およびＰＳＭＡ抗原の発現を示す。癌細胞は、１０６  ＴＵ／細胞のＲＧＤ標的化ＰＡＡＶ（ＲＧＤ）または非標的化ＰＡＡＶ（Ｍ１３）のいずれかによって形質導入された。ＦＡＣＳによる抗原の内部発現を確認するために、いかなる抗体染色なしの未処理細胞（ＣＴＲＬ）を対照として示し、未処理細胞を一次および二次抗体（染色）で染色した。Ａは、ＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＡ５４９細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。Ｂは、ＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＳｕｉｔ２細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。Ｃは、ＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＵＷ  ２２８細胞のＭＵＣ−１発現を表す。
【図３５】図３５は、安定した癌細胞におけるＭＵＣ−１．ＣＤ２８、ＭＵＣ−１．ＧＰＩ、およびＰＳＭＡ抗原の発現を示す。ＭＵＣ１またはＰＳＭＡ抗原を発現するＲＧＤ４Ｃ−ＰＡＡＶ安定形質導入癌細胞（安定細胞）をピューロマイシン抗生物質で選択し、ＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現に対するＦＡＣＳ分析を行うために使用した。抗原の内部発現を確認するために、いかなる抗体染色なしの未処理細胞（ＣＴＲＬ）を対照として示し、未処理細胞を一次および二次抗体（染色）で染色した。Ａは、Ａ５４９細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。Ｂは、Ｓｕｉｔ２細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。Ｃは、ＵＷ  ２２８細胞のＭＵＣ−１発現を表す。
【図３６】図３６は、膜貫通型ｔｍＴＮＦαまたは分泌型ｓＴＮＦαのいずれかを保持するＰＡＡＶ間のインビトロでのＤＩＰＧ細胞殺傷の治療および比較を示す。ＤＩＰＧ細胞を、ＲＧＤ４Ｃ−ＰＡＡＶ−ｔｍＴＮＦαまたはＲＧＤ４Ｃ−ＰＡＡＶ−ｓＴＮＦα（ＲＧＤ４Ｃおよび非標的Ｍ１３［ｃｔｒ］）のいずれかで処理し、ベクター処理後７日目に細胞生存率を測定した。分泌型ｓＴＮＦαを保有するＲＧＤ４Ｃ−ＰＡＡＶ−ｓＴＮＦα粒子は、ベクターによって少数の細胞集団のみが形質導入される一時的な形質導入状況においてさえ、ＲＧＤ４Ｃ−ＰＡＡＶ−ｔｍＴＮＦαよりもＤＩＰＧ細胞殺傷の誘発において強力であった。
【図３７−１】図３７は、現在開示されている方法で使用されるプラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、３７ａはＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ  ＧＦＰプラスミドを表し、３７ｂはＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＩＲＥＳ．ＧＦＰを表す。
【図３７−２】図３７は、現在開示されている方法で使用されるプラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、３７ａはＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ  ＧＦＰプラスミドを表し、３７ｂはＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＩＲＥＳ．ＧＦＰを表す。
【図３８】図３８は、ＰＡＡＶ−ｔｍ．ＴＮＦα形質導入後のＴＮＦαの発現を示す。（Ａ）ＵＷ２２８およびＤａｏｙを９６ウェルプレートに播種し、ＤＥＡＥデキストランを含む１×１０６ＴＵ／細胞で形質導入し、上清を６日目に回収し、上清中のＴＮＦαをＥＬＩＳＡで測定した。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【図３９】図３９は、ＵＷ２２８細胞におけるＴＮＦαおよびシスプラチン併用治療の効果を示す。スルホローダミンＢアッセイを使用して、細胞生存率を様々な時点で測定した。安定的に形質導入されたＵＷ２２８を、細胞播種の４８時間後に１μＭおよび５μＭのシスプラチン化学療法で治療した。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊Ｐ≦０．００１。図は、シスプラチン（シス）化学療法との併用が髄芽腫に対するｔｍＴＮＦαサイトカイン遺伝子治療を増加させることを示す。
【図４０】図４０は、ＰＡＡＶ−ｓＴＮＦ形質導入後のＴＮＦの発現を示す。ＤＩＰＧを９６ウェルプレートに播種し、ＤＥＡＥデキストランを含む２×１０６ＴＵ／細胞で形質導入し、上清を３日目に回収し、上清中のＴＮＦαをＥＬＩＳＡで測定した。
【図４１】図４１は、ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ｔｍＴＮＦαの生成を示す。
【図４２】図４２は、ＰＡＡＶ−ｓＴＮＦαの生成を示す。
【図４３】図４３は、標的化ＰＡＡＶベクターを示しており、ＲＧＤ−４ＣリガンドがＭ１３線状ファージのｐＩＩＩコートタンパク質上にディスプレイされていることを示す。ハイブリッドゲノムは、所望の遺伝子の発現に必要な重要な遺伝子フラグメントを示す。
【図４４】図４４は、ＲＧＤ  ｐＶＩＩＩヘルパーウイルスを産生するための概略図を示す。
【図４５】図４５は、ベクターの効率および遺伝子発現レベルを評価するためにインビトロ形質導入実験で使用される、ＲＧＤ  ｐＶＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰおよびＲＧＤ  ｐＶＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａを産生するための概略図を示す。
【図４６−１】図４６は、ＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬ（ＳｎａｐＧｅｎｅの画像）を産生するための概略図を示す。
【図４６−２】図４６は、ＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬ（ＳｎａｐＧｅｎｅの画像）を産生するための概略図を示す。
【図４７】図４７は、インテグリン（αｖ／β３／β５）発現を評価するために、一次抗ファージ抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８標識二次抗体（緑色）とインキュベートしたＤＩＰＧ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。バックグラウンド蛍光を考慮して、抗体を含まないか、または二次抗体のみを含む対照細胞の画像を撮影した。核をＤＡＰＩ（青）で染色した。
【図４８】図４８は、Ｍ１３線状ファージのｐＩＩＩ（左）またはｐＶＩＩＩ（右）コートタンパク質上にディスプレイされるＲＧＤ−４Ｃリガンドの理論構築物を示す。
【図４９】図４９は、形質導入後６日目に０．１ｍのＴＵ、０．５ｍのＴＵ、および１ｍのＴＵで非標的化ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰまたはＲＧＤ  ｐＶＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰベクターとインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。ＧＦＰ発現は、すべてのＴｕｓでＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰで最も高くなる。
【図５０】図５０は、形質導入後６日目に０．１ｍのＴＵ、０．５ｍのＴＵ、および１ｍのＴＵで非標的化ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａまたはＲＧＤ  ｐＶＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａベクターとインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＬＵを示す。ＲＬＵは、すべてのＴＵでＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａで最も高くなる。エラーバーは＋／−１標準エラーである。
【図５１】図５１は、形質導入後４日目のベクターとインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＬＵを示す。ＲＬＵは、すべてのＴＵでＨ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａで最も高くなる。エラーバーは＋／−１標準エラーである。（Ｓａｊｅｅ  Ｗａｒａｍｉｔ、未公開データ）。
【図５２】図５２は、形質導入後３日目に１ｍのＴＵおよび２ｍのＴＵで非標的化ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａまたはＨ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａベクターとインキュベートしたＤＩＰＧ細胞のＲＬＵを示す。ＲＬＵは、すべてのＴＵでＨ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａで最も高くなる。エラーバーは＋／−１標準エラーである。
【図５３】図５３は、ＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬおよび対照ＰＡＡＶ−ＧＦＰプラスミドを０．２ｎｇ、０．４ｎｇ、および０．６ｎｇのＤＮＡでトランスフェクトされたＤＩＰＧ細胞の顕微鏡画像。トランスフェクションの１８時間後に画像を撮影した。すべてのＤＮＡ濃度でＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬでトランスフェクトされた細胞において、細胞の生存率が低くなる。
【図５４】図５４は、１μｇのタンパク質に正規化されたＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＩＬ−１２による形質導入後６日目に回収された培地のＩＬ−１２濃度を示す棒グラフを示す。ＣＭＶプロモーターおよび模擬形質導入を用いた、標的化および非標的化空ベクターによる形質導入の制御を示す。外側の選択バーは、２因子ＡＮＯＶＡによるすべてのベクター力価および対照のＩＬ−１２産生データの分析を示す。内側の選択バーは、対応のないｔ検定による各力価でのベクターと対照との比較を示す。実験を３回行った。
【図５５】図５５は、ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２による形質導入後の様々な日にサンプリングされた培地のマウスＩＬ−１２濃度を示す折れ線グラフを示す。ＣＭＶプロモーターおよび模擬形質導入を用いた、標的化および非標的化空ベクターによる形質導入の制御を示す。外側の選択バーは、２因子ＡＮＯＶＡによるベクターおよび対照に対するすべてのサンプリング日からのマウスＩＬ−１２産生データの分析を示す。特定のデータポイント上のアスタリスクは、対応のないｔ検定(unpaired t-test)による、指定された各日のベクターと対照と間の比較を示す。
【図５６】図５６は、ＲＧＤ−４Ｃ標的化ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍＩＬ−１２（ｎ＝４）による、ＲＧＤ−４Ｃ標的化ＰＡＡＶ−ＣＭＶによる、導入遺伝子なし（ｎ＝４）および治療対照なし（ｎ＝４）による治療後７日間のＣ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ腫瘍の平均腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す棒グラフを示す。５×１０１０ＴＵベクターの３回の投与を、０、２、および５日目に静脈内投与した。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた２因子ＡＮＯＶＡによって、データを分析した。
【図５７】図５７は、ＩＬ２シグナル配列を示す。
【図５８】図５８は、Ｉｌ−２／ＴＮＦα構築物を示す。
【図５９】図５９は、ＤＩＰＧにおけるＲＧＤ４Ｃ−ｓＴＮＦαおよびＲＧＤ４Ｃ−ｔｍＴＮＦαの細胞殺傷効率を示す。分泌型または膜貫通ＴＮＦα（ｓＴＮＦα）導入遺伝子を保有するＰＡＡＶ標的化（ＲＧＤ４Ｃ）または非標的化（Ｍ１３）で、ＤＩＰＧ細胞を形質導入した。細胞を９６ウェルプレートに播種した。２日後、４０ｎｇ／μｇのタンパク質ＤＥＡＥデキストランを有する、２×１０６ＴＵ／セルで、細胞を形質導入した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイで、生存率を測定した。学生のｔ検定(student's t-test)によって統計的有意性を決定した。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図６０】ＰＡＡＶ−ｓＴＮＦαおよびＰＡＡＶ−ｔｍＴＮＦαによる形質導入後のＴＮＦαの発現を示す。ＤＩＰＧ細胞を６ウェルプレートに播種し、分泌型または膜貫通型のＴＮＦα導入遺伝子を保有するＲＧＤ４ＣおよびＭ１３で形質導入した。Ａ）ＲＮＡを抽出し、ＴＮＦαの発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。Ｂ）上清を回収し、上清中のＴＮＦαをＥＬＩＳＡによって決定した。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊Ｐ≦０．０１＊＊＊Ｐ≦０．００１。学生のｔ検定によって、統計的有意性を決定した。
【発明を実施するための形態】
【０２４２】
背景
遺伝子送達技術の開発は、基礎研究の社会への成功を収める転換に有益である。過去１０年間に、多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが、産業および治療用途の潜在的な送達ベクターとして出現した。ベクターの重要な特性は、遺伝子を送達するのに有効であることに加えて、容易に産生され、商業的に実行可能でなければならないということである。２００６年に、Ｈａｊｉｔｏｕらは、アデノ随伴ウイルス／ファージ（ＡＡＶＰ）と呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と線状バクテリオファージ（ファージ）との間のハイブリッドを作成することによってそのようなベクターの必要性を満たすことを試みた（Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，５２３−５３１（２００７）；Ｃｅｌｌ  １２５，３８５−３９８（２００６））。得られるＡＡＶＰベクターは、哺乳動物および原核生物ウイルスの好ましい特性を有するが、それらの個々のベクターが通常保有する欠点を受けない。しかしながら、有意な改善の余地をまだ残しているＡＡＶＰベクターの特定の局面が存在する。とりわけ、これには、その生産および治療特性に影響を及ぼすベクターの遺伝子設計が含まれる。最終的に、これは、哺乳動物ウイルスと比較した場合、ＡＡＶＰの比較的低い遺伝子導入効率をもたらす。
【０２４３】
本明細書に記載される研究は、ファージミド／アデノ随伴ビリオンファージミド（すなわち、ＰＡＡＶ）と呼ばれる新しいファージミドベクターを用いるいわゆるファージミドシステムを使用することによる、ファージ遺伝子送達ベクターの最も進歩したバージョンの設計、および既知で既存のファージベクター、ＡＡＶＰに対するそれらの優位性に関する。線状ファージゲノムに挿入するｒＡＡＶカセットからなるＡＡＶＰゲノムとは異なり、ＰＡＡＶゲノムは、任意の構造のファージ遺伝子を含んでいない−原核ヘルパーウイルスはベクターアセンブリを容易にするために必要である（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３，４７６−４８４；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，４００−４２０（２０１０））。ウイルスの生殖および治療要素を、導入遺伝子を保有する治療用ベクターと構造遺伝子を保有する別個のヘルパーウイルスとに分離することにより、ゲノム／ベクターサイズが実質的に減少し、それにより導入遺伝子の能力が著しく増加し、新しいシステムの遺伝子治療への応用にとって有用な利点である。その結果、このことが原核生物ウイルスのカプシドへの真核生物ウイルスゲノムのカプシド形成をもたらし、高められた生産収率、遺伝子導入効率、他の用途のためのベクターシステムの柔軟性を有する真核生物ゲノムと原核生物カプシドとの間のハイブリッドとしてのベクターをもたらす。
【０２４４】
以下の実施例に記載されているように、本発明者らは、
１．ハイブリッドファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）粒子発現システムを設計および構築し、
２．ファージミド／ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）が、以下を含むがこれに限定されない様々な段階で、既知のＡＡＶＰシステムよりも遺伝子導入においてより効率的であるかどうかを特徴付け、決定し、
ａ．細胞表面への結合、
ｂ．細胞表面からのベクターの内部化、
ｃ．組換え導入遺伝子の発現。
【０２４５】
３．ハイブリッドファージミドＰＡＡＶベクターシステムが哺乳類プロデューサー細胞株からｒＡＡＶを産生することができるかどうかを決定した。
【０２４６】
４．このシステムは、癌の治療のためのＣＡＲ−Ｔ療法で使用することができることを実証した。
【０２４７】
５．このシステムは、癌の治療のために、サイトカインＩＬ−１２、ＴＲＡＩＬ、およびハイブリッドＴＮＦαを標的細胞に送達するために使用することができることを実証した。
【０２４８】
６．ハイブリッドＴＮＦα構築物を含むファージミド粒子を設計および構築した。
【０２４９】
７．ハイブリッドＴＮＦα構築物が、全長ＴＮＦαと比較した場合、発現、分泌、および細胞殺傷効率の増加を示すことを実証した。
【０２５０】
最初に図１を参照すると、本発明によるファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子（すなわちビリオン）の特徴を従来技術のＡＡＶＰウイルス粒子と比較した表を示す。図から分かるように、本発明のＰＡＡＶ粒子（６ｋｂ）は、既知のＡＡＶＰ粒子（１４ｋｂ）よりもはるかに小さく、すなわちＤＮＡが４２％少なく、ウイルス粒子が５０％短く、ＰＡＡＶ粒子は、先行技術のシステム、ＡＡＶＰの収率（１００倍）をはるかに上回る収率で産生される。その結果、本発明のＰＡＡＶ粒子は、より大きなペイロードを保有することができ、これは、遺伝子治療アプローチにおいて複数の導入遺伝子を送達するために非常に有用である。したがって、本発明者らは、改変バクテリオファージ発現システム（ＰＡＡＶ）が、遺伝子治療またはウイルスベクターの大規模生産のための高度にウイルス性のベクターとして使用され得ることを実証した。
【０２５１】
実施例１−ファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）構築
図２を参照すると、本発明のヘルパーファージゲノムおよびファージミドゲノム（ＰＡＡＶ  ＤＮＡ）の実施形態が示されており、これらは図１にも示されているように、原核生物における発現に際して共に一緒にしてファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）粒子を産生する。構造遺伝子は、ウイルス粒子へのＤＮＡのパッケージングに不可欠であり、以下に詳細に論じられる複製欠損ヘルパーファージによって供給される。ファージミドゲノムは、ヘルパーファージに対して極めて寄生的であり、複製およびパッケージングの両方において、それが複製欠損ヘルパーファージを打ち負かすことを意味する。
【０２５２】
Ａ）ファージミド／ＡＡＶベクター
ここで図３を参照すると、２つの複製起点および２つの他の遺伝子要素を含むプラスミドであるファージミドゲノムの一実施形態が示されている。ファージミドゲノムは、原核（例えば、細菌）宿主内でのその複製およびヘルパーウイルスによってレスキューされたときのファージミド粒子へのパッケージングの両方を促進するために、２つの複製起点を必要とする。
【０２５３】
図４を参照すると、第１の複製起点（ｏｒｉ）は、大量の原核宿主内の二本鎖ファージミド（ｄｓＤＮＡ）の複製を可能にする高コピー数複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）である。第２の複製起点は、プラスミドの一本鎖ＤＮＡへの複製を可能にするファージ複製起点（ｆ１  ｏｒｉ）であり、その後、ファージミドベクター粒子（ＰＡＡＶ）にパッケージングすることができる。
【０２５４】
図５を参照すると、ファージミドゲノムは選択マーカー遺伝子を含む。ファージミドゲノムが原核宿主内で効率的に複製するために、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性）を、発現を確実にするために使用し、抗生物質耐性遺伝子（それ自身のプロモーターを有する）の形態でのファージミドゲノムの喪失を防止する選択的圧力を与える。これは、選択マーカーが耐性を付与する抗生物質の存在下で原核宿主を培養する場合、ファージミドゲノムの発現（および複製）を確実にする。
【０２５５】
図６を参照すると、ファージミドゲノムは、対象となる導入遺伝子を含む組換え（アデノ随伴ウイルス、ＡＡＶ）導入遺伝子カセットをさらに含む。これには、ポリペプチド／タンパク質、短ヘアピン／小干渉／短誘導ＲＮＡ、またはそれらの両方の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。ほんの一例として、図６に示す導入遺伝子は、ＧＦＰおよびヒトβ−グロビンをコードする。導入遺伝子の発現は、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ）および／またはエンハンサー配列によって駆動され、ポリＡシグナルでテールされる。プロモーターはまた、癌遺伝子治療適用（すなわち、グルコース調節タンパク質［ｇｒｐ７８］のプロモーター）における哺乳動物および腫瘍特異的プロモーターであり得る。導入遺伝子カセット全体が、ＡＡＶ由来の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）で隣接され、それはファージミド粒子によって形質導入された哺乳類細胞核内のコンカテマー性エピソーム（染色体外）ＤＮＡとして導入遺伝子カセットを安定に維持することを可能にする保護ヘアピン構造を形成する。ＩＴＲは、ＡＡＶのコンカテマー形成を可能にし、その後、ＡＡＶ導入遺伝子カセットを長期間にわたって安定して発現させることを可能にする。
【０２５６】
ファージミドは、それが構造的ファージ遺伝子を欠くので、それ自体を粒子にパッケージングすることができない。その結果、原核宿主からの粒子の形成および押し出しに必要な構造的（すなわちカプシド）タンパク質を提供する、図７に示すような、ヘルパーウイルスによる「レスキューすること」が必要となる。従来の考え方では、ベクター中の遺伝子要素は一般的であり、遺伝子工学において広く使用されている。
【０２５７】
Ｂ）ヘルパーファージ
図７を参照すると、ヘルパーファージ（本明細書においてＭ１３ＫＯ７と呼ぶ）は、図３に示すファージミドゲノムを保有および／または含有する原核宿主からファージミド粒子（すなわちＰＡＡＶ）をレスキューするために特別に設計されたバクテリオファージである。へルパーファージは、破壊された複製起点（ｐ１５ａ、中程度のコピー数）および、ファージ粒子にそれ自身のパッケージングする能力を著しく低下させるパッケージングシグナルを含む。その結果、ファージミドゲノムは、複製およびパッケージングの両方において、ヘルパーファージを打ち負かすであろう。
【０２５８】
ファージミド標的化特性（またはＷＯ２０１４／１８４５２８中のパンフレットに記載されているような多機能性特性）を付与するために、ヘルパーファージのゲノムは、ファージミド粒子アセンブリのための構造カプシドタンパク質を提供するので、ヘルパーファージのゲノムはそれを行うように操作されなければならない。例えば、ヘルパーゲノムは、得られたＰＡＡＶＰ粒子の所望の標的細胞（例えば、腫瘍）への送達を可能にする細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されたｐＩＩＩカプシドマイナーコートタンパク質をコードし得る。それはまた、得られたＰＡＡＶ粒子上に外来ペプチドをディスプレイするように構成された少なくとも１つのｐＶＩＩＩメジャーコートタンパク質をコードすることもできる。したがって、一実施形態では、αＶβ３およびαＶβ５インテグリン受容体を発現する腫瘍細胞および血管形成腫瘍関連の内皮細胞に特異性を付与するために、ｐＩＩＩマイナーコートタンパク質に９つのアミノ酸変異を誘導することが望ましい。したがって、図８を参照すると、ヘルパーファージのゲノムは、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンを標的とするＲＧＤ４Ｃペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ−配列番号７）を含む。
【０２５９】
ＰＡＡＶファージミドゲノムおよびヘルパーファージが構築されると、以下に論じられるように、それらを一緒に使用して、原核宿主において、ファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）粒子を産生する。
【０２６０】
実施例２−ファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）の産生
本発明者らは、ファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）粒子を産生するための２つの異なる方法（方法１および２）を発明し、これらを図９および１０に示す。
【０２６１】
注釈(Notes)：
−ＴＧ１：繁殖因子（Ｆ’線毛）を保有するＥ．ｃｏｌｉ株。
−２×ＹＴ：ＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉを培養するために使用される液体ブロス。
−カナマイシン：ヘルパーファージ上に存在する抗生物質耐性選択マーカー。
−アンピシリン：ファージミドベクター上に存在する抗生物質耐性選択マーカー。
−ＴＹＥトップアガー：ＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉを培養するために使用される固体培地で、１．２５％細菌用寒天の添加により２ｘＴＹから適合させた。
【０２６２】
ファージミド／ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）製造方法１：感染性レスキュー
図９を参照すると、
１．１％のグルコースを補充した２×ＹＴ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）６０ｍｌに４〜５ｍｌの前培養（一晩）のＰＡＡＶゲノムを保有するＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉを加える。
２．シェーカー（２５０  ＲＰＭ）中に３７°で培養物をインキュベートする。
３．ＯＤ６００が０．５〜０．８（対数期）の範囲になってすぐに、少なくとも１×１０１０のヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）の形質導入単位を培養物に加える。
４．混合のため反転させる。３７°で３０分間インキュベートする。
５．ステップ３からの感染したスターター培養物を、１％のグルコースを補充した２×ＹＴ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン＋２５μｇ／ｍＬのカナマイシン）を含む２Ｌのフラスコに最終容量４００〜４５０ｍＬまで注ぐ。
６．オービタルシェーカーで３７°、２５０ｒｐｍで１６〜２０時間一晩インキュベートする。
７．培養上清からファージミド（ＰＡＡＶ）粒子を精製する。
【０２６３】
方法１の利点はその非常に高い収率である。
【０２６４】
ファージミド／ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）産生方法２：安定したプロデューサー細胞株
図１０を参照すると、
パート１：コンピテントプロデューサー細胞株の産生
１．ヘルパーヘッジＭ１３ＫＯ７由来のｓｓＤＮＡゲノムでＴＧ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を形質転換し、ＴＹＥトップアガー（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）に蒔き、
１．個々のコロニーを選択し、１％のグルコースを補充した５ｍＬ  ２×ＹＴ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）に接種する。
２．オービタルシェーカーで３７°、２５０ｒｐｍで１６〜２０時間一晩インキュベートする。
３．市販の抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、オランダ）を使用して５ｍＬの一晩培養物からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡラダーに対して１％アガロースゲル（１００ボルト、２．５ｍＡ）で泳動させることにより、真の陽性形質転換体を確認する。
４．公表されたプロトコル（Ｋｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙにより出版されたものに適合）を使用して、ステップ４で同定された正確な形質転換体から化学的にコンピテントな細胞を調製する。
【０２６５】
パート２：ＰＡＡＶファージミド粒子の産生
１．パート１で作成したコンピテント細胞株をファージミド／ＡＡＶゲノムで形質転換し、ＴＹＥトップアガー（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）に蒔く。
２．コロニーを選択し、１％のグルコースを補充した５ｍＬ  ２×ＹＴ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）に接種する。
３．オービタルシェーカーで３７°、２５０ｒｐｍで４時間インキュベートする。
４．ステップ３の感染したスターター培養物を、１％のグルコースを補充した２×ＹＴ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン＋２５μｇ／ｍＬカナマイシン）を含む２Ｌのフラスコに、４００〜４５０ｍＬの最終容量まで注ぐ。
５．オービタルシェーカーで３７°、２５０ｒｐｍで１６〜２０時間一晩インキュベートする。
６．培養上清からファージミド粒子を精製する。
【０２６６】
ＰＡＡＶファージミド粒子精製
１．温かい一夜培養物を遠心分離ボトルに移し、３３００Ｇ、４°で３０分間遠心分離することによって細菌をペレット化する。
２．ペレットを捨て、上清を清潔な遠心分離ボトルに移す。
３．各ボトルに上清の３０％容量を氷冷２０％ＰＥＧ−８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌと共に加え、混合のため渦状撹拌する。
４．氷上で４〜２４時間インキュベートする
５．１００００Ｇ、４°で３０分間の遠心分離によってファージミド粒子を沈殿させる。上清を捨てる。
６．ファージミド粒子ペレットを１００００Ｇ、４°で１分間遠心分離して乾燥させる。
７．ＰＥＧ／ＮａＣｌで残りの上清を除去する
８．ファージミド粒子ペレットを０．５〜２ｍＬのＰＢＳに再懸濁する
９．再懸濁したファージミド粒子調製物を０．４５ミクロンのフィルターを使用してろ過する。
１０．調製物を４°に保つ。この調製物は４°で２年まで安定である。２５％のグリセロールストックは無期限に−８０°で保存することができる。
【０２６７】
実施例３−遺伝子治療技術のためのファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）の使用
実施例１および２は、ファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）粒子および２つの産生方法を産生するために必要とされる本発明の構成要素（すなわち、図３に示すファージミドゲノムおよび図７に示すヘルパーファージ）を記載する。一旦産生され、精製されると、ＰＡＡＶ粒子は、遺伝子治療などの使用範囲を有することができる。
【０２６８】
一例として、本明細書に記載されるＰＡＡＶ粒子は、標的細胞への送達が成功していることを既知のアッセイで容易に検出できるので、ＧＦＰ導入遺伝子を保有する。治療では、任意の導入遺伝子を選択して、図３に示すファージミドゲノムに操作し、得られたＰＡＡＶ粒子中に保有することができる。例えば、導入遺伝子は、治療的または工業的有用性を有し得るタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。例えば、導入遺伝子は、ＣＡＲ  Ｔ細胞などの養子移入されたＴ細胞による認識のための１つ以上の抗原をコードしてもよい。導入遺伝子はまた、ＲＮＡｉ療法において使用する短ヘアピン／小干渉／短誘導ＲＮＡ分子をコードし得る。導入遺伝子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）またはウイルス融合ペプチド（インフレーム融合のためのＴ２Ａペプチド）を使用して一緒に融合された複数のポリペプチド、核酸、またはそれらの両方の組み合わせをコードし得る。
【０２６９】
実施例４−インビトロＡＡＶ産生のためのファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）の使用
遺伝子治療に加えて、本明細書に記載されるＰＡＡＶ粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生するための新規な方法に使用することができる。ファージ誘導ＡＡＶ産生は、大量のｄｓＤＮＡをパッケージングするファージミド粒子の能力を利用する。典型的なＡＡＶ産生システムは、組換えＡＡＶ粒子の産生に一緒に機能するｒＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐ、およびアデノヘルパー遺伝子の３つの主要な要素からなる。本発明者らは、２つの異なる戦略を考案した。
【０２７０】
図１１を参照すると、使用される第１の戦略は、ｒＡＡＶ産生要素を保有する３つの異なるファージミドベクターを産生することである。これらは、ファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）（図３参照）、アデノヘルパーファージミド粒子（図１２参照）、およびｒｅｐ−ｃａｐファージミド粒子（図１３参照）である。これらの粒子の基本構造は、ファージミド／ＡＡＶ構築セクションに記載されているように、２つの複製起点および選択マーカーを含むので、同様である。しかしながら、重要な違いは導入遺伝子カセットである。図３に示されるように、ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）ゲノムはＡＡＶ導入遺伝子カセットを含むが、アデノヘルパーおよびｒｅｐ−ｃａｐ粒子は、それぞれ図１２および１３に示されるように、アデノヘルパー導入遺伝子またはｒｅｐ−ｃａｐ導入遺伝子を含む。
【０２７１】
別の実施形態では、本発明者らは、図１４および１５に示されるように、単一ベクターゲノム内の必要な要素のすべてを含む、いわゆる「統合された構築物」を遺伝子操作した。
【０２７２】
別々のベクター上または同じ統合されたベクター上のいずれかの同じ哺乳動物プロデューサー細胞（図１１および１４参照）に導入された場合、ｒｅｐ−ｃａｐおよびアデノヘルパー遺伝子は、ｒＡＡＶゲノムのファージミド／ＡＡＶベクターへのパッケージングを促進するトランス作用性要素として挙動する。この産生プロセスは、３つのプラスミドの一時的な同時トランスフェクションに匹敵する。しかしながら、この場合、プラスミドは、全く同じ要素を保有するファージミドベクターで置き換えられる。
【０２７３】
以下は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のＰＡＡＶファージミド誘導産生のためのプロトコルについて記載する。
【０２７４】
注釈(Notes)：
ＤＭＥＭ：ダルベッコの改良イーグル培地。
ＦＢＳ：胎児ウシ血清、成長補助剤。
完全培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ。
ＥＤＴＡ：エチル−ジアミン四酢酸、タイトジャンクション形成に必要なカルシウムイオンを隔離することによって細胞を解離するために使用されるイオンキレーター。
ＧｌｕｔａＭａｘ：成長補助剤、Ｌ−グルタミンの類似体。
【０２７５】
ファージミド誘導ＡＡＶ産生のためのプロトコル：
１．１５ｃｍ組織培養プレート中の完全培地（１０％のＦＢＳ、２０ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ）に、ＨＥＫ２９３細胞を播種し、８０％コンフルエンスに到達するまで、最低４８時間、増殖させる。
２．ファージミド／ＡＡＶ、ｒｅｐ−ｃａｐファージミド、およびアデノヘルパーファージミドを混合して全容量５ｍＬ未満で１：１：１の形質導入単位比を達成するか、または、１細胞あたり百万個の形質導入単位を達成するために統合されたベクター（単一粒子中に３つの要素をすべて含む単一ベクター）を分取する。
３．ステップ３で作製した形質導入混合物に、等容量の無血清ＤＭＥＭ（２０ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘで補充）を添加する。
４．混合のため反転させる。室温で１５分間インキュベートする。
５．ステップ１で蒔いたＨＥＫ２９３細胞をＰＢＳで洗浄し、３回繰り返す。
６．形質導入混合物を加え、穏やかに渦状撹拌して混合物を均一に分散させる。
７．細胞培養インキュベーター中、３７°、５％のＣＯ２で７２時間インキュベートする：
ａ．形質導入混合物との６時間のインキュベーションの後、等容量の完全培地（１０％のＦＢＳ、２０ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ）を補充する、
ｂ．２４時間後、培地を完全培地（１０％のＦＢＳ、２０ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ）と交換する。
【０２７６】
ｒＡＡＶ精製：
１．０．５ＭのＥＤＴＡ溶液を組織培養プレート中の培地に０．０１０Ｍの最終濃度まで添加し、室温で５分間インキュベートする。
２．細胞および培地を吸引し、粉砕し、５０ｍＬの遠心分離管に移す。
３．１５００ＲＰＭ、５分間、室温で遠心分離することにより細胞をペレット化する：
ａ．オプション：さらなるＡＡＶ精製のために上清を回収する。
４．２〜５ｍＬの無血清ＤＭＥＭに細胞ペレットを再懸濁する。
５．エタノール−ドライアイスバスおよび３７°に設定された水浴中で４回の凍結−解凍サイクルを行うことによって、懸濁液中の細胞を溶解する。
６．室温で１０分間、１００００Ｇで細胞溶解物を遠心分離する：
ａ．定量化／さらなる精製／濃縮のために上清を分取する。
【０２７７】
ｂ．ペレット（破片）を捨てる。
【０２７８】
実施例５−インサイチュＡＡＶ産生のためのファージミド−ＡＡＶベクター（ＰＡＡＶ）の使用
図１６を参照すると、本発明者らは、ＰＡＡＶを使用したＡＡＶ粒子のインサイチュ生産のための方法を考案した。
【０２７９】
第１に、３つのファージミドベクターまたは統合されたベクターの最適用量（または複数回用量）を、静脈内／皮下／腹腔内または筋肉内／皮下（または前述の投与経路のいずれか）を介してインビボで導入する。病変組織は、関連するインテグリンをディスプレイする腫瘍であり、したがって、ファージミドＰＡＡＶ粒子上の標的化部分は、ＲＧＤ４Ｃ配列である。腫瘍は、野生型ＡＡＶではなく、ハイブリッドファージミド粒子にコードされたウイルス導入遺伝子を含むｒＡＡＶを産生し始めるはずである。これらのＡＡＶ治療粒子は、自然に哺乳類組織に高い親和性を有するため、近くの部位を自家感染させ、所与の時間にわたって腫瘍を根絶するはずである。
【０２８０】
実施例６−大規模標的遺伝子導入および組換えアデノ随伴ウイルス産生のための工学的疑ウイルスの作製
透過型電子顕微鏡法
粒子を特徴付ける際に、本発明者らは、ファージミドベースのベクターシステムを使用する場合、ベクターサイズが実質的に減少することを示すためにＰＡＡＶ粒子を画像化した。透過型電子顕微鏡法を使用して、本発明者らは、ウラニルアセテートでネガティブ染色した後、メッシュ銅ＴＥＭグリッド上の本発明のＰＡＡＶおよび既知のＡＡＶＰ粒子の長さを画像化し、測定した（図１７参照）。平均ＡＡＶＰ粒子は長さが１４５５．０２ｎｍであり（図１７Ａ）、本発明による典型的なＰＡＡＶ粒子は長さがわずか７２９．９６ｎｍであり（図１７Ｂ）、これは粒子サイズの約５０％の減少に相当することが分かった。ＰＡＡＶ粒子（典型的には１１８６．０３ｎｍ、図１７Ｂ）を産生するために使用されるヘルパーファージと比較して、相対ベクターサイズはヘルパーウイルスよりも約３８％短い。
【０２８１】
ベクターサイズの差異は、ＰＡＡＶがＡＡＶＰよりも遺伝子送達ベクターとしてより効率的であり得るという理論の基礎を成しており、これは、生産収率だけでなく、哺乳動物細胞に遺伝子を導入し発現させる際のその後の感染プロセスにおいても同様である。したがって、本発明者らは、２９３ＡＡＶ（ヒト胎児腎臓２９３の誘導体）およびＵ８７神経膠芽腫細胞株における結合、内在化、および遺伝子発現を含む、感染の様々な段階でベクター効率を調べた。
【０２８２】
ベクターの内部化
結合後、ベクターは標的細胞による受容体介在性エンドサイトーシスを受ける。ベクター内在化の潜在的な差異を調べるために、本発明者らは、フローサイトメトリー（図１８参照）を使用して、２つの時点（２時間、２Ｈ、４時間、４Ｈ）における標的細胞の内在化ベクターの数をアッセイした。両方の細胞株でＡＡＶＰと比較した場合、ＰＡＡＶベクターは２時間でより効果的に内在化され（中央値蛍光強度（ＭＦＩ）＝１０３１．７、ＡＡＶＰよりも３３５高い、ｐ＜０．０５）、そして４時間で全体的な程度がより大きく内在化することが見出された。ＰＡＡＶの２時間でのＭＦＩは、ＡＡＶＰより２９３ＡＡＶで３３５およびＵ８７細胞で２０７（ｐ＜０．０５）有意に高かった。形質導入の４時間後、この差は２９３ＡＡＶ（８２９ＭＦＩ、ｐ＜０．０５）では有意に大きかったが、Ｕ８７（１５７ＭＦＩ、有意ではない）ではそれほど少なかった。全体として、ＭＦＩはＰＡＡＶ１処理細胞について２０９２（２９３ＡＡＶ、ｐ＜０．０５、図１８Ａ）および１１３７（Ｕ８７、図１８Ｂ）でピークに到達し、ＡＡＶＰよりも有意に高く、それぞれ１０６３（２９３ＡＡＶ）および９８０（Ｕ８７）でピークに到達した。このデータは、ＰＡＡＶが両方の細胞株における両方の時点について内在化の速度および程度においてＡＡＶＰより一貫して良好に実施されたことを実証する。
【０２８３】
ＡＡＶＰおよびＰＡＡＶ媒介遺伝子導入後の緑色蛍光タンパク質発現
ベクター内在化の差異が遺伝子発現の増加につながるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＲＧＤおよびＮＴ  ＰＡＡＶ．ＧＦＰおよびＡＡＶＰ．ＧＦＰベクターを使用してＧＦＰ発現アッセイを行った（図１９参照）。この実験において、それらをまた、ＷＯ２０１４／１８４５２９に記載されているように、カチオン性ポリマーＤＥＡＥ．ＤＥＸＴＲＡＮ（Ｄｅｘ）の添加がＰＡＡＶベクターのバイオアベイラビリティーおよびエンドソームエスケープを増加させることにより遺伝子導入を増強できるかどうかを試験した。形質導入の９日後、細胞をトリプシン処理し、計数し、フローサイトメーターを使用して分析した。ベクター形質導入を補助するためにＤｅｘを使用したかどうかに関わらず、導入遺伝子の発現は一般にＵ８７よりも２９３ＡＡＶ細胞で高かった。ベクターのみを使用する場合、標的ＲＧＤ．ＰＡＡＶ．ＧＦＰベクターは、ＡＡＶＰと比較して、より高い有効性（それぞれ２９３ＡＡＶおよびＵ８７細胞におけるＧＦＰ＋ｖｅ細胞で７．７％、ｐ＜０．０１および１．４％、ｐ＜０．０５）で標的細胞に形質導入し、これは２９３ＡＡＶおよびＵ８７細胞でそれぞれ２．４４倍および１．５６倍の増加となる（図１９Ａ、Ｃ）。
【０２８４】
しかしながら、Ｄｅｘを添加すると、ＲＧＤ．ＡＡＶＰおよびＲＧＤ．ＰＡＡＶベクターの遺伝子発現が劇的に増加する。２９３ＡＡＶ細胞では、ＲＧＤ．ＡＡＶＰ．ＧＦＰ処理細胞におけるＧＦＰ発現はＲＧＤで２５％に増加した。ＰＡＡＶ．ＧＦＰ処理細胞は５０％まで実質的に増加し（すべてｐ＜０．０１）、Ｄｅｘの添加は、ＲＧＤ．ＡＡＶＰについては７．９倍、ＲＧＤについては６．５倍の遺伝子発現の増加をもたらした。ＰＡＡＶＰ（図１９Ｂ、Ｄ）。形質導入に対して高い活発性を有すると考えられているＵ８７細胞では、Ｄｅｘは、４．８％ＧＦＰ＋ｖｅ細胞に対してＲＧＤ．ＰＡＡＶ．ＧＦＰの遺伝子発現を３．６倍以上増加させることができた（ｐ＜０．０１）−Ｄｅｘが１．３％のＧＦＰ＋ｖｅ細胞に対してわずか１．５倍だけ遺伝子発現を増加させた（ｐ＜０．０５）ため、これは、ＲＧＤ．ＰＡＡＶ．ＧＦＰの場合ではなかった。興味深いことに、Ｄｅｘは、２９３ＡＡＶ細胞におけるＮＴ．ＰＡＡＶ（非標的）ベクターによる形質導入を可能にした（７．３４％）が、Ｕ８７ではそうでなかった。
【０２８５】
ファージミド誘導組換えアデノ随伴ウイルス産生
本発明者らは、ＰＡＡＶおよびファージミド由来のベクターが市販のプロデューサー細胞株においてｒＡＡＶを産生するために使用することができるかどうかを評価するために、通常、遺伝子導入のためのトランスフェクションを必要とする３つの標的ベクターで２９３ＡＡＶ細胞を形質導入した。彼らは、細胞溶解物からｒＡＡＶ粒子を採取し、ファージミド誘導形質導入後の３つの時点（図２０Ａ）にわたってｍＬ当たりｒＡＡＶ遺伝子コピー数（ＧＣ）を定量化することができた。ＦｕＧｅｎｅ６（トランスフェクション試薬、３．９９ｅ１１  ＧＣ／ｍＬ、図２０Ｂ）による従来のトランスフェクションと比較すると、ファージミド誘導ｒＡＡＶ産生は、ｒＡＡＶ収量において１６８時間（７．６９ｅ１１  ＧＣ／ｍＬ、図２１Ａ）で１．９倍以上の増加をもたらす。ファージミド誘導遺伝子導入は、（トランスフェクションとは異なり）広範囲の細胞内プロセシングを必要とするため、ウイルス遺伝子を発現させて機能性粒子にパッケージングするのにより長い時間を必要とする。しかしながら、同じ７２時間の時点で収率を比較すると、トランスフェクションはファージ誘導ｒＡＡＶ産生より１．７６ｅ１１  ＧＣ／ｍＬ高い値を示した。すべての時点でのトランスフェクションまたはファージミド誘導産生皿からの１ｍＬの培養上清あたりのｒＡＡＶ収率は、観察可能な傾向はなくおよそ８〜９ｅ１０  ＧＣ／ｍＬであった（データは示さず）。
【０２８６】
実施例７−ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドの構築および使用
トリペプチドＲＧＤは、フィブロネクチンを含む細胞外マトリックスのタンパク質に見出される。インテグリンは、αＶβ３インテグリンへの細胞接着部位においてフィブロネクチンに位置するＲＧＤモチーフに結合することによりフィブロネクチンの受容体として働き、組換えファージミド粒子のｐＩＩＩマイナーコートタンパク質に９アミノ酸変異を順に誘導したその特異性をαＶβ３およびαＶβ５インテグリンを発現する腫瘍細胞および血管新生腫瘍関連内皮細胞に付与する。したがって、第２のベクターのゲノムは、ＲＧＤ４Ｃ標的ペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ−配列番号７）を含む。
【０２８７】
図２１を参照すると、αＶ、β３およびβ５インテグリンサブユニット、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドの受容体の発現を実証する、ＵＷ２２８およびＤＡＯＹヒト髄芽腫細胞の免疫蛍光染色が示されている。これらのデータは、ＲＧＤ４Ｃ標的ペプチドを含有するファージミドベクターが、小児脳腫瘍、髄芽腫における標的遺伝子送達および遺伝子治療に使用することができることを実証している。
【０２８８】
図２２を参照すると、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドによる小児髄芽細胞腫細胞への標的遺伝子送達が、４日間の時間経過にわたって示されている。このデータは、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドが、髄芽腫においてオーバータイムに増加した効率的かつ選択的な遺伝子送達を媒介することを示している。
【０２８９】
図２３は、ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ（ＲＧＤ４Ｃ−ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡ）をコードする配列を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミドによる処理後の小児ＵＷ２２８およびＤＡＯＹ髄芽細胞腫細胞における、哺乳動物標的のラパマイシン（ｍＴＯＲ）発現のダウンレギュレーションを示すウエスタンブロット分析を示す。これらのデータは、選択的かつ効率的な方法で治療標的ｍＴＯＲの発現をノックダウンするために腫瘍細胞中でｓｈＲＮＡを送達するのにＲＧＤ４Ｃ−ファージミドをうまく使用することができることを実証している。
【０２９０】
図２４は、テモゾロミド耐性であることが知られている、髄芽細胞腫細胞におけるｍＴＯＲに対するテモゾロミド（ＴＭＺ）とｓｈＲＮＡをコードする配列を保有するＲＧＤ４Ｃ−ファージミドとの併用処理を示す。このデータは、標的化されたＲＧＤ４Ｃ−ｍＴＯＲ／ｓｈＲＮＡが髄芽腫細胞をＴＭＺに再感作し、完全な腫瘍細胞の根絶を達成することができることを実証している。したがって、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドによるｍＴＯＲ発現の標的化されたノックダウンは、髄芽腫のような化学療法抵抗性腫瘍細胞に対してテメゾロマイドと組み合わせて使用する効率的な戦略である。
【０２９１】
図２５は、ＴＮＦαベクターによる髄芽細胞腫細胞の処理を示す。このため、ＲＧＤ４Ｃ／ＴＮＦαは、髄芽腫のような標的腫瘍の殺傷に使用する治療可能性を有する。図２６は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドの受容体であるαＶ、β３、およびβ５インテグリンサブユニットの発現を実証するＤＩＰＧ細胞の免疫蛍光染色を示す。これらのデータは、ＲＧＤ４Ｃ標的ペプチドを含有するファージミドベクターが、小児脳腫瘍、ＤＩＰＧにおける標的化遺伝子送達および遺伝子治療に使用することができることを実証している。
【０２９２】
図２７は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド／ＡＡＶによるＵＷ２８８、ＤＡＯＹ、またはＤＩＰＧ細胞への遺伝子発現の選択的かつ用量依存的送達を示す。これらのデータは、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドがＤＩＰＧに遺伝子発現を用量依存的かつ選択的にうまく送達できることを証明している。これらのデータはまた、ＲＧＤ４Ｃ−ＰＡＡＶがインビトロで髄芽腫への効率的な遺伝子導入を示し、それが時間と共に増加することも示す。対照（非標的化ＰＡＡＶ−Ｌｕｃ）で形質導入された細胞には、非特異的な取り込みはなかった。髄芽腫細胞株に対するカチオン性ポリマーＤＥＡＥデキストランにより、形質導入効率が向上した。
【０２９３】
図２８は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦαによる処理を示す。これらのデータは、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドが選択的にＤＩＰＧにＴＮＦαを送達し、アポトーシス誘導をもたらすことを実証している。したがって、ＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦαは、ＤＩＰＧに対する標的療法に使用する治療可能性を有する。図２８はまた、細胞株ＵＷ２８８またはＤＡＯＹのいずれかで試験した場合、治療により腫瘍細胞が殺傷されるため、髄芽腫がＲＧＤ４Ｃ−ファージミド−ＴＮＦαによる治療の良好な候補であることを示す。例えば、ＵＷ２８８は、対照と比較して６日目に約６０％の細胞死を示した。カチオン性ポリマーＤＥＡＥデキストランにより、腫瘍細胞の殺傷がさらに促進された。
【０２９４】
実施例８−ＲＧＤ４Ｃ−ファージミドのルシフェラーゼ発現
プロトコル：
ＨＥＫ細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン）中４８ウェルプレートに蒔き、７０〜８０％のコンフルエンスに到達するまで少なくとも４８時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁したハイブリッドファージ／ファージミドベクターで１２時間形質導入した後、培地に完全培地を補充した。ルシフェラーゼ発現は、調製したＱｕａｎｔｉ−ｌｕｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＵＳＡ）試薬５０μＬに１０μＬの培地を加えることによって測定した。ルミノメーター（ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を備えたプレートリーダーを使用して光の放出を測定した。
【０２９５】
図２９は、様々な濃度の形質導入単位でのＲＧＤ．ＰＡＡＶによる形質導入後のルシフェラーゼ発現を示す。グラフは、様々な濃度のハイブリッドファージ／ファージミドベクターとのインキュベーション後のルシフェラーゼの時間と発現との間の用量依存性指数関数的関係を実証している。数字は、定量化可能な遺伝子発現が、分泌型ルシフェラーゼのアッセイを介してファージミドベクターによって達成され得ることを実証している。
【０２９６】
実施例９−２９３個のＡＡＶ細胞へのＲＧＤ．ＰＡＡＶベクターの結合
プロトコル：
２９３ＡＡＶ細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン）中２４ウェルプレートに蒔き、最低４８時間、７０〜９０％のコンフルエンスに到達させた。細胞を５００ｕＬのＰＢＳで２回洗浄し、氷上に置いた後、２００ｕＬの無血清ＤＭＥＭに懸濁した２０００００  ＴＵ／細胞（形質導入単位／細胞）のＰＡＡＶベクターで形質導入した。氷上で１時間インキュベートした後、培地をウェルから回収し、ファージミド粒子の量をＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉで滴定し、コロニー計数によって定量化した。
【０２９７】
図３０を参照すると、２９３個のＡＡＶ細胞の細胞表面に結合したＰＡＡＶベクターのパーセンテージが示されている。ＲＧＤ．ＰＡＡＶベクターは５８．２％の結合効率を有し、Ｍ１３．ＰＡＡＶベクターは、それぞれの対照に対して７．１％の結合効率を有していた。
【０２９８】
実施例１０−特定のＣＡＲ  Ｔ細胞により標的化され得るように、細胞表面にＭＵＣ１またはＰＳＭＡ抗原のいずれかを発現するＰＡＡＶによる腫瘍細胞の形質導入
現在、癌の従来の治療法は、手術、化学療法、および放射線療法の３つのうち１つ以上のオプションからなる。これらの介入によって病気が治癒することもあるが、多くの場合、癌細胞は完全に排除されないため、再発率は高くなる。さらに悪いことに、化学療法および放射線療法は不快な副作用が伴う。その結果、癌治療の代替アプローチの開発に大きな関心が寄せられている。これらの新しい治療法の最も有望なものの１つは、癌細胞を排除するために患者自身の免疫システムの力および特異性を利用することを目的とする癌免疫療法である。癌免疫療法は発展途上の治療法である。２つの主な戦略には、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする能動免疫療法、および既存の抗腫瘍応答を強化する受動免疫療法が含まれる。
【０２９９】
癌の例には、髄芽腫およびびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）などの小児脳腫瘍が含まれる。髄芽腫は最も一般的な脳腫瘍であり、外科的切除、放射線療法、および化学療法からなる現在の治療戦略に従って、５年生存率で小脳に発生する（Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかしながら、生存者はしばしば長期の内分泌および神経認知の副作用を有する。したがって、現在の治療による長期的な副作用を回避するために、非侵襲的、腫瘍特異的、より安全で、費用効果が高く、効率的な新しい治療アプローチの開発が緊急に必要である。一方、びまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）は、２年後の生存率がわずか６〜１０％の小児にのみ発生する最も攻撃的な脳腫瘍である。そのびまん性のため、この種の癌に対する効果的な治療戦略はない（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，２００９）。
【０３００】
免疫システムの特殊な特性および生物におけるその中心的かつ普遍的な役割により、免疫療法は癌を治療する大きな可能性を秘め、長期的な保護を提供する一方で、他の治療よりも副作用が少ない可能性がある。１つの特定のアプローチである養子細胞治療（ＡＣＴ）は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞の移植を伴う。これらの細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）として知られる腫瘍にすでに存在するＴ細胞であり得、それらの一部はＴＡＡに特異的であろう。これらの細胞は切除された腫瘍組織から分離され、エキソビボで培養、活性化、および拡大され、その後患者に再注入される。ＡＣＴに有用な他の型の細胞には、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかを発現する遺伝子操作されたＴ細胞が含まれる。これらの人工受容体は、腫瘍細胞によって発現される抗原を標的とするようにＴ細胞を特異的に配向する（Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：３０７−１３．；Ｓｈａｒｐｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｍｏｕｎｔ  Ｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．２０１５；８（４）：３３７−５０．）。
【０３０１】
ＣＡＲタンパク質はＴ細胞の表面に発現し、特定の腫瘍抗原に強く結合する細胞外結合ドメイン、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとをつなぐヒンジ領域、膜貫通ドメイン、およびＣＤ２８およびＯＸ４０（腫瘍壊死因子受容体）などの細胞内シグナル伝達ドメイン（共刺激ドメインとも呼ばれる）を含む。これらのドメインによって媒介される共刺激シグナルにより、Ｔ細胞の効率が向上し、抗腫瘍活性が延長される（Ｓｈａｒｐｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｍｏｕｎｔ  Ｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．２０１５；８（４）：３３７−５０；Ｔｉｌｌ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．ＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｈ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ４−１ＢＢ  ｄｏｍａｉｎｓ：ｐｉｌｏｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１７）：３９４０−５０；Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．ＣＤ２８  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｋ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（５）：２２６５−７３）。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍の細胞表面に発現する可能性のある幅広い種類の抗原を認識するように設計することができる。潜在的な標的抗原には、タンパク質、炭水化物、および糖脂質が含まれる。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、従来のＴ細胞およびトランスジェニックＴＣＲ  Ｔ細胞とは異なり、ＭＨＣが処理および提示する抗原を必要としない。したがって、同じＣＡＲベースの戦略を、患者のＭＨＣハプロ型に関係なく同じ腫瘍抗原を発現するすべての患者に適用することができる（Ｓｈａｒｐｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｍｏｕｎｔ  Ｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．２０１５；８（４）：３３７−５０，Ｈａｊｉ−Ｆａｔａｈａｌｉｈａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＣＡＲ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５：１−１１）。
【０３０２】
多くの利点があるにもかかわらず、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療にはいくつかの制限がある。例えば、腫瘍が好適な標的抗原を発現しない場合がある。これは、新抗原が未知である、不適切なレベルで発現している、腫瘍細胞の亜集団でのみ発現している、非腫瘍組織でも発現している、ＣＡＲ  Ｔ細胞の組織への標的化に好適である方法で発現されていないなど、様々な理由で、または腫瘍による抗原の発現が治療中に減少または消失する可能性が高い場合に発生する可能性がある。
【０３０３】
例えば、一部のＣＡＲ  Ｔ細胞治療には、動物モデルおよび臨床試験の両方で望ましくない毒性があることが報告されている。この問題は、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識される抗原が単に腫瘍細胞で発現されるだけでなく、正常組織の損傷につながる正常細胞でも提示される場合に発生する可能性がある（Ｐａｌｍｅｒ  ＤＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ／ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｏｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８；１０５（２３）：８０６１−６；Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｉｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ＥＲＢＢ２．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０；１８（４）：８４３−５１；Ｌａｍｅｒｓ  ＣＨＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ＩＸ：Ｆｉｒｓｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００６；２４（１３）：ｅ２０−ｅ２；Ｇｒｕｐｐ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１３；３６８（１６）：１５０９−１８．）。したがって、標的抗原の可用性および選択が問題である。理想的には、抗原は、腫瘍細胞のみ、または代替的に生存に必須ではない正常細胞のみが提示される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，Ｒｅｓｔｉｆｏ  ＮＰ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８（６２３０）：６２−８）。現在、前立腺癌および乳癌の治療のためのムチン１（ＭＵＣ１）など、様々な腫瘍抗原に対する多くのＣＡＲ  Ｔ細胞の開発に成功している（Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓ．２０１３；１６（２）：１２３−３１，Ｓ１；Ｗｉｌｋｉｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＭＵＣ１：Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００８；１８０（７）：４９０１−９），ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ（Ｍａｈｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＴＣＲ［ｚｅｔａ］／ＣＤ２８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２；２０（１）：７０−５．），ＣＤ１９  ａｎｄ  ＣＤ２０  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１８）：４８１７−２８．）ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  ２（ＥｒＲＢ２）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ（Ｐｉｎｔｈｕｓ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏ−Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００３；６３（１０）：２４７０−６．）。さらに、腫瘍細胞に対するより高い選択性を追求するために、Ｔ細胞は、同じ腫瘍細胞に発現される２つの異なる抗原を特異的に標的とする２つのＣＡＲを発現するように改変されたデュアルＣＡＲ  Ｔ細胞を含むいくつかの戦略を通じて開発された（Ｋｌｏｓｓ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（１）：７１−５；Ｗｉｌｋｉｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＥｒｂＢ２  ａｎｄ  ＭＵＣ１  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；３２（５）：１０５９−７０．）。
【０３０４】
分子クローニングおよび遺伝子工学
各ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＣＤ２８−ＩＬ４、ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＰＩ−ＩＬ４、およびＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＳＭＡ（図３２ｆ）が、ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰプラスミド（図３）を、ｐＵＣ５７−ＣＤ２８−ＩＬ４プラスミド、ｐＵＣ５７−ＧＰＩ−ＩＬ４またはｐＵＣ５７−ＰＳＭＡプラスミドのいずれかと組み合わせることによって構築され、ＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＧＦＰプラスミドを、ｐＵＣ５７−ＣＤ２８−ＩＬ４プラスミド、ｐＵＣ５７−ＧＰＩ−ＩＬ４またはｐＵＣ５７−ＰＳＭＡプラスミドのいずれかと組み合わせて、ＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＣＤ２８−ＩＬ４、ＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＧＰＩ−ＩＬ４、およびＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＰＳＭＡを構築した。
【０３０５】
新しいプラスミド；ＰＡＡＶ．ＣＭＶ．ＭＵＣ１．ＣＤ２８．ＩＬ４、ＰＡＡＶ．ＣＭＶ．ＭＵＣ１．ＧＰＩ．ＩＬ４、ＰＡＡＶ．ＣＭＶ．ＰＳＭＡ、ＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＭＵＣ１．ＣＤ２８．ＩＬ４、ＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＭＵＣ１．ＧＰＩ．ＩＬ４、およびＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＰＳＭＡを、制限酵素消化およびライゲーションによって行い、ＴＧ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、アンピシリンを含む２×ＹＴトップアガー上に蒔いた。すべての構築物が、まず制限消化およびゲル電気泳動によって検証され、次にＤＮＡシーケンス（ＭＲＣ  ＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、英国）によって検証された。
【０３０６】
図３１は、バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療のための発現プラスミド構築物の実施形態の概略図を示し、３２ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３２ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３２ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、３２ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３２ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３２ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【０３０７】
ＣＤ２８、ＧＰＩ、およびＰＳＭＡ抗原の発現
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、シグマ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ、シグマ）、およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ、シグマ）からなる完全培地中に各ベクター（１，０００，０００ＴＵ／細胞）により、１２ウェルプレートに約６０％コンフルエントなＨＥＫ  ２９３細胞を２４時間インキュベートした。未処理の細胞を陰性対照として使用した。翌日、すべてのベクターを培養物から除去し、細胞を完全培地の単層として５％のＣＯ２の３７℃の加湿インキュベーターで維持した。培地は２日ごとに更新した。
【０３０８】
形質導入後６日目に、細胞を細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収し、洗浄バッファー（２％のＦＢＳおよび０．１％のＮａＮ３を含むＰＢＳ）で洗浄し、Ｃｌｅａｒ  Ｂａｃｋ（ヒトＦｃ受容体ブロッキング剤、ＭＢＬ）で室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞をＪｏｈｎ  Ｍａｈｅｒ博士（英国キングス・カレッジ・ロンドン、英国）から提供されたＨＭＦＧ２抗体または洗浄バッファーで４℃で一晩希釈したＰＳＭＡ抗体（ＭＢＬ）のいずれかとインキュベートした。翌日、細胞を洗浄バッファーで洗浄し、抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で３０分間インキュベートした。細胞を最終的に洗浄バッファーで洗浄し、ＦＡＣ  ｃａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけた。３連のウェルあたり少なくとも２０，０００個のゲート細胞について、平均蛍光強度を測定した。Ｆｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを使用して、結果を分析した。
【０３０９】
形質導入後６日目のＭＵＣ−１．ＣＤ２８、ＭＵＣ−１．ＧＰＩ、およびＰＳＭＡ抗原発現
ＨＥＫ  ２９３細胞は、１０６ＴＵ／細胞のＲＧＤ標的化ＰＡＡＶ（ＲＧＤ）または非標的化ＰＡＡＶ（ＮＴ）のいずれかによって形質導入された。図３３は得られたデータを示す。未処理のＨＥＫ  ２９３細胞（Ｃｔｒｌ）、および４８８個のみの二次抗体染色（Ａｎｔ．４８８）を有する標的化ＰＡＡＶ形質導入−ＨＥＫ  ２９３細胞を対照として示した。（Ａ）ＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＨＥＫ  ２９３細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。ＤＥＡＥ−デキストランを添加した。（Ｂ）ＤＥＡＥデキストランが添加されていないＣＭＶプロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＨＥＫ  ２９３細胞のＭＵＣ−１またはＰＳＭＡ発現を表す。（Ｃ）ＤＥＡＥデキストランが添加されていないＧｒｐ７８プロモーター駆動ＰＡＡＶベクターによって形質導入されたＨＥＫ  ２９３細胞のＭＵＣ−１発現を表す。
【０３１０】
安定した細胞株選択
細胞表面にＭＵＣ−１．ＣＤ２８、ＭＵＣ−１．ＧＰＩ、またはＰＳＭＡ抗原を発現する安定した細胞株を選択するために、ピューロマイシン耐性配列をＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＣＤ２８−ＩＬ４、ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＰＩ−ＩＬ４、ＰＡＡＶ−ＣＭＶ−ＰＳＭＡ、ＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＣＤ２８−ＩＬ４、ＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＧＰＩ−ＩＬ４、およびＰＡＡＶ−Ｇｒｐ７８−ＰＳＭＡプラスミドに挿入した。
【０３１１】
図３４は、安定した細胞株選択バクテリオファージ誘導ＣＡＲ  Ｔ細胞治療療法のためのピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現プラスミド構築物の概略図を示し、３４ａはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３４ｂはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３４ｃはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表し、３４ｄはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＣＤ２８．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３４ｅはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＭＵＣ１−ＧＰＩ．ＩＬ４発現プラスミドを表し、３４ｆはＧｒｐ７８プロモーターによって駆動されるＰＳＭＡ発現プラスミドを表す。
【０３１２】
新しいプラスミドは、制限酵素消化およびライゲーションによって行われ、ＴＧ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換され、アンピシリンを含む２×ＹＴトップアガーに蒔いた。すべての構築物が、まず制限消化およびゲル電気泳動によって検証され、次にＤＮＡシーケンス（ＭＲＣ  ＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、英国）によって検証された。
【０３１３】
結果
ＭＵＣ１またはＰＳＭＡ導入遺伝子のいずれかをコードするＰＡＡＶベクターは、ヘルパーファージシステムを使用して産生された。これらの導入遺伝子産物は、ＰＡＡＶによって形質導入された後、腫瘍細胞表面にディスプレイされる。ＭＵＣ１およびＰＳＭＡ抗原は、ＭＵＣ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＰＳＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞によって特異的に認識される。
【０３１４】
本発明のファージミド粒子を使用して癌細胞を形質導入することができ、癌細胞が引き続いて養子移入されたＴ細胞の標的として使用するのに好適な方法で送達された抗原を安定にディスプレイすることを示すデータを本明細書に提示する。
【０３１５】
討論
標的ＰＡＡＶベクターは、商業的および疾患細胞株の両方における遺伝子導入において、ＡＡＶＰベクターよりも効率的であることを示唆する強力な証拠がある。内在化および遺伝子発現の両方のデータは、ＰＡＡＶがＡＡＶＰよりも効率的であることを一致して示している。また、遺伝子導入において、それについてのＡＡＶＰを上回るＤｅｘとＰＡＡＶベクターとの間に強い相乗効果があることを示唆する証拠も提供されている。これらのデータは、ＰＡＡＶがＡＡＶＰよりも優れていることを示唆しているが、ＰＡＡＶベクターサンプルがヘルパーファージ汚染を含むとも考えなければならない。ベクター産生中の実験条件を最適化する努力にもかかわらず、ヘルパーファージの混入は（この場合、約１／１０）避けられず、その小さなコートタンパク質上にＲＧＤターゲティング配列をもディスプレイするので、形質導入を競合的に阻害する。これを考慮すると、内在化と遺伝子発現データは、ＲＧＤ．ＰＡＡＶの「真の」効能を非常に過小評価している可能性がある。さらに、内在化アッセイはシグナル検出のための細胞内ファージカプシドの染色を利用するため、ＰＡＡＶの全体的なサイズ（および粒子当たりの利用可能なカプシドタンパク質）が小さいことは、内在化粒子の比例数が、ＴＥＭを用いてＰＡＡＶ粒子と比較して２倍の長さであることを示しているＡＡＶＰの比例数と直接比較できないことを意味する。したがって、本発明の方法は、ヘルパーファージを除去するための精製工程（例えばＦＰＬＣ）を含む。
【０３１６】
機械論的な洞察を提供することに加えて、将来の研究は、純粋なＰＡＡＶサンプルを使用するすべての実験の複製を包含しなければならないことが不可欠である。特に、ファージミド誘導ｒＡＡＶ産生は、従来のトランスフェクションプロトコルと比較して、ヘルパーファージ汚染による競合阻害の減少及び複数倍高いｒＡＡＶ粒子の収率から大きく利益を得ることができる。
【０３１７】
要約
哺乳動物細胞への遺伝子導入において非常に効率的なハイブリッドファージミドベクターが記載されている。これらのファージミド／ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）ベクターは非常に大きなクローニング能力を有し、哺乳動物細胞を標的としており、トランスフェクション試薬は必要でないことを意味する。このプラットフォームにより、治療用遺伝子治療に好適なベクターを産生することができる。このプラットフォームが養子Ｔ細胞移入治療またはＣＡＲ  Ｔ細胞治療による標的化に好適な抗原を含む遺伝子を腫瘍細胞に送達することができるという証拠が提供されている。
【０３１８】
実施例１１−小児ＤＩＰＧ細胞へのＴＲＡＩＬ遺伝子の誘導送達のための優れたファージミド／ＡＡＶハイブリッドベクター。
【０３１９】
サイトカインがアポトーシスによる細胞死の分化、増殖、活性化、または誘発として多様な機能を果たすため、遺伝子治療におけるサイトカインの使用が調査された。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、腫瘍細胞の死を誘発する能力があるため、興味深い分子のグループの１つである。Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）、およびＴＮＦαを含むＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、癌の生物学的治療のための重要な治療薬として同定されている。それらの投与は、異なる癌細胞でアポトーシスを誘発する可能性があるが、肝臓への重度の毒性を引き起こし、臨床におけるそれらの適用を妨げる。
【０３２０】
全身毒性のジレンマを考えると、ＴＮＦスーパーファミリーの別のメンバーであるＴＲＡＩＬは、有望な癌の治療薬として上昇している。組換えＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ受容体に対する抗体を使用した前臨床および初期臨床試験では、ＴＲＡＩＬが腫瘍細胞に対して優先的な毒性を示し、その抗腫瘍特性を保持しながら、正常な組織に対する毒性はほとんどまたはまったくないことが示されている。ＴＲＡＩＬは多くの組織にｍＲＮＡレベルで、主に脾臓、肺、および前立腺に構成的に存在し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージなどの免疫システムの細胞によって主に発現される。
【０３２１】
ＴＲＡＩＬはＩＩ型膜貫通タンパク質として合成され、システインプロテアーゼによってタンパク質分解的にも切断され得、分泌型７を生成する。ＴＲＡＩＬはホモ三量体として生物学的に活性であり、この特定のコンフォメーションはおそらくリガンド受容体複合体の架橋を促進し、それによりシグナル伝達強度を高めるため、膜結合コンフォメーションはより強力であると思われる。分泌型はそれほど強力ではないが、ホモ三量体の安定化および形成に役立つロイシンジッパーなどのモチーフに融合した細胞外ドメインを操作することによって、効果を高めることができる。
【０３２２】
他のＴＮＦスーパーファミリーのメンバーと同様に、ＴＲＡＩＬは、標的細胞５、１０の表面にある架橋受容体分子との相互作用を通じてアポトーシスを誘発する。識別された５つの受容体がある：ＴＲＡＩＬ  Ｒ−１およびＲ−２は、アポトーシスを引き起こす細胞質配列死ドメイン（ＤＤ）を含む死受容体であり、ＴＲＡＩＬ  Ｒ−３、Ｒ−４およびオステオプロテグリンは、アポトーシス５、６、１０を予防するデコイ受容体である。
【０３２３】
ホモ三量体ＴＲＡＩＬが死受容体に結合すると、受容体は三量体を形成し、アダプタータンパク質Ｆａｓ関連死ドメイン（ＦＡＤＤ）を動員する。ＦＡＤＤはイニシエーターカスパーゼ８または１０を動員し、死誘発シグナル複合体（ＤＩＳＣ）を形成し、イニシエーターカスパーゼはタンパク質分解によって自動的に活性化される。活性化されたカスパーゼ８または１０は、エフェクターカスパーゼ３を切断し、死の基質の切断および細胞死を引き起こす。代わりにＴＲＡＩＬがデコイ受容体に結合する場合、ＦＡＤＤは動員されず、アポトーシスは誘発されない。ＴＲＡＩＬ誘発アポトーシスに抵抗性の細胞でも、ＴＲＡＩＬはネクロトーシス１１を誘発することができる１１。ＴＲＡＩＬ受容体システムは、腫瘍を支える免疫細胞の直接的な殺傷を誘発することができ、ＮＫ細胞でのその発現は、免疫システムが癌細胞を殺傷するために使用される重要なメカニズムである。
【０３２４】
組換えＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ受容体に対するアゴニスト抗体を含む、ＴＮＦスーパーファミリーのアゴニストを送達するための現在の臨床試験は、残念なことに、不十分なアゴニスト活性および薬物の半減期のために、癌患者に臨床的利益をもたらすことができなかった。さらに、これらの薬物は、より強力な作用因子の全身送達が致命的な副作用を引き起こす可能性があるという懸念により、設計からのそれらの有効性が制限されることが多い。臨床結果を産生するのに最適な濃度でＴＲＡＩＬを確実に送達するためには、ＴＲＡＩＬを選択的に標的にして癌細胞に輸送するための好適なベクターが必要である。
【０３２５】
ファージディスプレイベースの技術を使用すると、腫瘍組織で選択的に発現される受容体を標的として結合するリガンドをディスプレイするウイルスベクターを使用して、ＴＲＡＩＬを送達することができる。ほとんどの研究は、レトロウイルスおよびアデノウイルスなどの真核生物ウイルスが優れた導入遺伝子送達を提供するため、ベクターとしての使用に焦点を合わせている。しかしながら、哺乳類の細胞膜受容体に対する広い指向性により、全身遺伝子治療での成功は限られており、肝臓、細網内皮システム、および望ましくない組織による望ましくない取り込み、ならびに免疫原性をもたらす。対照的に、原核生物ウイルスは、哺乳動物細胞で使用するために天然の向性の除去を必要とせず、費用効率が高く、高力価で容易に産生されるため、有利である。向性が欠如しているため、哺乳類細胞の形質導入１３には本質的に弱い媒体である。しかしながら、選択的なリガンドペプチドモチーフをディスプレイするようにコートタンパク質を変更することによって、ファージを細胞内に取り込むことができる。
【０３２６】
全身毒性のない長期効果のための腫瘍のみへの治療の効果的な投与は、細菌ウイルス、バクテリオファージ、またはファージに基づくベクターを使用して達成することができる。これらのバクテリオファージベースのベクターは、それらのコートタンパク質上に選択的なリガンドペプチドモチーフをディスプレイするように操作することができ、標的細胞へのウイルス結合、およびその後の遺伝子１９のリガンド指向送達のための内在化を可能にする。真核生物および原核生物のウイルスの好ましい生物学的特性を組み合わせることによって、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびＡＡＶ／ファージまたはＡＡＶＰ１３と名付けられたＭ１３由来線状ファージを含むキメラウイルスベクターが構築された。ファージのｐＩＩＩコートタンパク質を操作して、二重環状ペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（ＲＧＤ−４Ｃ、配列番号７）をディスプレイし、これが、腫瘍および支持血管システムの両方において過剰発現された特異的αｖインテグリン受容体（αｖβ３またはαｖβ５）に結合する。これにより、標的プラットフォームとして優れたリガンド指向送達および治療的導入遺伝子の細胞形質導入が可能になり、これらの機能的特性は、前立腺、乳癌、および軟部組織肉腫を含むいくつかの癌の前臨床モデルで確認されている。
【０３２７】
本発明者らは、ファージミドシステムを使用して、ファージミド−ＡＡＶ（ＰＡＡＶ）として知られる次世代ベクターを産生することによって、既知のベクタープラットフォームを改善した（図４３）。ＰＡＡＶベクターはキメラウイルスであり、ＡＡＶ血清型２のＤＮＡ配列を使用して構築されたハイブリッドゲノムを含むＭ１３線状ファージである。対照となる遺伝子は、構成的に活性なサイトメガロウイルス、ＣＭＶプロモーターによって調節され、完全長の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ファージミドはｆ１複製起点を含み、これは一本鎖複製およびファージ粒子へのパッケージング、ならびに標的細胞に入った後の二本鎖複製の複製起点に使用される。ウイルスベクターのクローニングおよび産生中に、アンピシリンを使用して選択することができる。
【０３２８】
このハイブリッドベクターモデルでは、ファージゲノムのほとんどが除去され、より長いＤＮＡ配列に対応することができるが、ヘルパーウイルスを使用してカプシドおよび他のファージ成分を提供する必要がある。ＲＧＤ−４Ｃペプチドモチーフは、Ｍ１３バクテリオファージのｐＩＩＩコートタンパク質上に最初にディスプレイされ、標的化骨格ヘルパーウイルスを産生する。次に、ヘルパーウイルスを使用して、操作されたファージミドを含むＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を形質導入し、抗生物質による選択圧を使用して、ファージミドを含む標的ベクターの選択を行うことができる。新しいモデルは、より長いＤＮＡ配列に対応することができ、形質導入効率が高く、元のＡＡＶＰよりも高い力価で産生され得る。
【０３２９】
特定の理論に縛られることを望まないが、２つの方法により、変換効率をさらに向上させることができる。まず、ＲＧＤ−４Ｃペプチドを操作して、ｐＩＩＩコートタンパク質ではなくｐＶＩＩＩにディスプレイすることによって、メジャーコートタンパク質であるｐＶＩＩＩは最大２７００コピーで発現されるが、ｐＩＩＩはわずか最大５コピーで発現される。したがって、インテグリンの標的化および結合に利用可能なＲＧＤ−４Ｃリガンドの数が多いほど、細胞の結合および形質導入の効率が高いと考えられる。
【０３３０】
特定の理論に縛られることを望まないが、効率を高める別の戦略は、組換えｐＶＩＩＩコートタンパク質上のエンドソームエスケープペプチドであるヒスチジンリッチＨ５Ｗリガンドをディスプレイすることによるものである。エンドソームなどの細胞内障壁は、内在化の効率が高い場合でも、ベクターをトラップし、その治療効果を発揮しないようにすることによって、遺伝子発現の速度を制限する可能性がある。ヒスチジン側鎖は双性イオンを形成し、これが、プロトンスポンジとして作用し、ファージベクターのリガンド指向性エンドサイトーシスに続くエンドソームの低ｐＨを緩衝することを可能にする。プロトンがエンドソームに入ると、水が液胞膜プロトンポンプを介してエンドソームに引き込まれ、エンドソームに細孔が形成され、それによってファージベクターが放出される。
【０３３１】
この研究の目的は、ベクターのコートタンパク質にディスプレイされるペプチドを変更することによって、ＤＩＰＧ細胞の最適な形質導入効率を有する優れたＰＡＡＶベクターを開発することであった。次に、最適なＰＡＡＶベクターを使用してＴＲＡＩＬ導入遺伝子を送達し、ＤＩＰＧの治療における治療遺伝子としてのＴＲＡＩＬの有効性を評価した。
【０３３２】
特定の理論に縛られることを望まないが、発明者らは次のように仮定した：
１．標的化の特異性および遺伝子導入の有効性は、ｐＶＩＩＩコートタンパク質上のＲＧＤ−４Ｃリガンドまたは組換えｐＶＩＩＩコートタンパク質上のＨ５Ｗペプチドをディスプレイすることによって強化することができる。
２．ＴＲＡＩＬは、インビトロ実験およびインビボ同所性ＤＩＰＧ動物モデルでＤＩＰＧ細胞死を特異的に誘発する効果的な治療遺伝子である。
【０３３３】
研究の目的
１．所望の遺伝子の最適な発現によりＤＩＰＧ細胞を特異的に標的化するためのウイルスベクターを設計および産生する。
【０３３４】
２．ＤＩＰＧに対する治療遺伝子ＴＲＡＩＬの殺傷の可能性を評価および調査する
３．ＴＲＡＩＬ発現をインビボでＤＩＰＧに標的化する特異性を評価し、同所性ヒトＤＩＰＧが確立された免疫不全マウスにベクターを静脈内投与した後の治療効果を調査する。
【０３３５】
プロトコル
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）ならびに１％のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ＤＩＰＧ腫瘍細胞株は、サンジョアンドドゥバルセロナ病院から入手した。それらを、１０％のＦＢＳを補充した腫瘍幹培地（ＴＳＭ）ベースで維持した。ＴＳＭは、提供されているレシピに従って作製されている（表ＸＸＸ）。
【０３３６】
インテグリン染色
ＤＩＰＧ細胞を２４ウェルプレートのポリ−Ｄ−リジン被覆カバースリップに播種し、６０〜７０％コンフルエントになるまで成長させた。５つのウェル：対照、二次抗体のみ、αｖ、β３、およびβ５インテグリンを使用して染色した。細胞を洗浄し、４％のホルムアルデヒドで室温（ＲＴ）で１０分間固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５０ｍＭの塩化アンモニウムで５分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳで３回洗浄し、２％のウシ血清アルバム（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３０分間ブロックした。その後、細胞を１％のＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した一次抗体抗αｖ（１：１００）、抗β３（１：５０）、および抗β５インテグリン（１：１００）と共に１日間インキュベートし、４℃の湿室に保存した。その後、細胞を１％のＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、二次Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗体（１：７５０）および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１：２０００）で１時間インキュベートした。カバーガラスを１％のＢＳＡ−ＰＢＳで３回、ＰＢＳで３回、および滅菌水で１回洗浄した。風乾後、カバースリップをＭｏｗｉｏｌ封入剤に封入した。細胞を観察し、蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
【０３３７】
ｐＶＩＩＩコートタンパク質上にディスプレイされたＲＧＤ−４Ｃリガンドによるヘルパーファージの産生、精製、および滴定（図４４）
野生型Ｍ１３ファージＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｐＶＩＩＩコートタンパク質上でＲＧＤ−４Ｃを発現するように改変した。ＰＣＲで使用されるプライマーは、このプロジェクトの開始前に同僚（Ｓａｊｅｅ  Ｗａｒａｍｉｔ）によって設計された。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ産物を連結し、クローニングのためにＤＨ５α細菌に形質転換した。プラスミドは、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）によって抽出され、制限消化およびゲル電気泳動によって検証され、次に、ＤＮＡ配列（ＭＲＣ  ＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ）の完全性を確保するためにシーケンスに送られる。次に、選択されるクローンをＴＧ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）に形質転換し、３７°Ｃのインキュベーターで５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ（Ｓｉｇｍａ）寒天に蒔いた。
【０３３８】
コロニーが形成された後、単一のコロニーを選択し、１Ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地で、振盪インキュベーター（３２°Ｃ、２２０ｒｐｍ）で１８時間成長させる。一晩培養物を４℃で３０分間６０００ｇで遠心分離した。ファージ上清を回収し、２０％ｖ／ｖのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のＰＥＧ６０００、２．５ＭのＮａＣｌ）を添加し、完全に混合した。冷蔵室で一晩インキュベートした後、上清を４℃で３０分間１００００ｇで再び遠心分離した。ファージペレットを１６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および２０％ｖ／ｖのＰＥＧ／ＮａＣｌに再懸濁し、冷室で一晩保持した。最終的なファージ懸濁液を１０，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離し、上清を廃棄した。精製されたファージペレットを１〜２ｍＬのＰＢＳに再懸濁し（ペレットサイズに応じて）、０．４５μｍのフィルターカートリッジにより滅菌ろ過した。
【０３３９】
１０倍増分の段階希釈を使用して滴定を実施した。ファージの各希釈液５μＬを使用して、３７°Ｃで３０分間インキュベートすることによって、対数期（ＯＤ６００＝０．４５〜０．５０）に成長したナイーブＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ５００μＬに感染させた。インキュベーション後、３７℃のインキュベーター内で、１００μＬの細菌を、カナマイシンを含む２×ＹＴ寒天に一晩蒔いた。１８時間のインキュベーション後の翌朝にコロニーを計数し、ウイルス力価を推定し、細菌形質導入単位（ＴＵ）として表した。
【０３４０】
レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］およびｌｕｃｉａルシフェラーゼ［ｌｕｃｉａ］）を含むＲＧＤ  ｐＶＩＩＩベクターの産生、精製、および滴定（図４５）
ＤＩＰＧ細胞の形質導入の効率を評価するために、レポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびｌｕｃｉａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含むファージミドを含むベクターを構築した。ＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡で検出することができるが、ｌｕｃｉａは分泌型ルシフェラーゼであり、これは相対ルシフェラーゼユニット（ＲＬＵ）を測定することによって、その基質Ｑｕａｎｔｉ−Ｌｕｃで定量化することができる。以下のプロトコルでは、ＰＡＡＶ−ＧＦＰプラスミドまたはＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａプラスミドを使用する。
【０３４１】
最初にプラスミドをＴＧ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）に形質転換し、３７°Ｃのインキュベーターで一晩、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ（Ｓｉｇｍａ）寒天に蒔いた。コロニーが形成された後、単一のコロニーを選択し、振盪インキュベーター（３２°Ｃ、２２０ｒｐｍ）でアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で成長させる。１００ｍＬの細菌を対数期まで増殖させ（ＯＤ６００＝０．４５〜０．５０）、その後１５〜２０μＬのＲＧＤ  ｐＶＩＩＩヘルパーファージを添加し、振盪インキュベーター（３２°Ｃ、１５０ｒｐｍ）でインキュベートする。次に、細菌を、振盪インキュベーター（３２°Ｃ、１５０ｒｐｍ）で１８時間、カナマイシンおよびアンピシリンを含む１Ｌの２×ＹＴ培地で成長させる。以前の調査に従って、精製を実施した。レポーター遺伝子ベクターおよびヘルパーファージの力価をそれぞれ推定するために、アンピシリンのみを含む２×ＹＴおよびカナマイシンのみを含む別のプレート上に細菌を成長させることによって、滴定を実施した。
【０３４２】
レポーター遺伝子（ｌｕｃｉａ）を含むＨ５ＷペプチドＲＧＤ  ｐＩＩＩベクターの産生、精製、および滴定
Ｈ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩヘルパーファージは、このプロジェクトの開始前に同僚（Ｓａｊｅｅ  Ｗａｒａｍｉｔ）によって産生された。産生は、Ｈ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩベクターを選択するために１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）も添加されたことを除いて、前述のプロトコルとほぼ同様であった。以前の調査に従って、ベクターの精製と滴定を実施した。
【０３４３】
ベクターの細胞への形質導入
形質導入に使用される細胞（ＨＥＫ２９３ＴまたはＤＩＰＧ）は、６０〜７０％コンフルエントになるまでプレートに播種された。その後、培地を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで希釈したベクターと一晩インキュベートし、ベクターの量は、滴定から得られたウイルス力価に基づいている。次に、形質導入培地を除去し、完全な培地と交換する。ＧＦＰで形質導入された細胞については、指定された時点で蛍光下で細胞を観察し、ＧＦＰを発現する細胞を探すために画像を撮影する。ｌｕｃｉａで形質導入された細胞については、指定された時点で、１０μｌの細胞培地および２５μｌのｌｕｃｉａの基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｌｕｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、白いポリスチレン９６ウェルプレートで混合し、次に、室温で５分間インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇｌｏｍａｘマイクロプレートリーダーを使用して、ルシフェラーゼ発現を定量化した。
【０３４４】
ＤＩＰＧに対する治療遺伝子ＴＲＡＩＬの殺傷の可能性を評価および調査する
トランスフェクション用のＰＡＡＶ−ヒトＴＲＡＩＬ（ｈＴＲＡＩＬ）プラスミドの産生（図４６）
ＰＡＡＶ−ＧＦＰプラスミドのＧＦＰ配列を、ＰＣＲによってｈＴＲＡＩＬ遺伝子配列に置き換えた。特定のプライマーを使用して、ｐＵＮＯ１−ｈＴＲＡＩＬ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）をクローニングすることによって、ｈＴＲＡＩＬ遺伝子を増幅し、末端にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩの制限部位を含むように設計した（表１）。以前の調査に従って、分子クローニング、プラスミド抽出、およびＤＮＡ配列の検証を実施した。選択されるクローンを増幅のためにＴＧ１細菌に形質転換し、次に、Ｍａｘｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。
【０３４５】
【表１】
2020517272.tif 000034
【０３４６】
細胞へのプラスミドのトランスフェクション
ＤＩＰＧ細胞を４８ウェルプレートに６０〜７０％コンフルエントになるまで播種した。実験を開始する前に、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ低血清培地で１〜２時間インキュベートした。４８ウェルプレートについては、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクションプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、０．５〜２．０ｍｌの培地容量、０．６〜１．８μｌのＦｕＧＥＮＥ容量、０．２〜０．６μｇのＤＮＡ量を目指すことを推奨する。トランスフェクション効率は、ＦｕＧＥＮＥとＤＮＡとの比率に依存し、この場合、３：１の比率が使用される。
【０３４７】
エッペンドルフチューブを準備し、実験で使用するために標識化した。使用されるＦｕＧＥＮＥの容量に応じて、ＯｐｔｉＭＥＭを各チューブに最大２０μｌ添加した。次に、ＦｕＧＥＮＥをプラスチックチューブの壁と接触することなく培地に直接添加し、混合物をＲＴで５分間インキュベートする。プラスミドＤＮＡをチューブに添加し、トランスフェクション試薬：ＤＮＡ複合体をＲＴで１５分間インキュベートする。次に、この複合体をドロップ方式でＤＩＰＧセルに加え、プレートを旋回させて均一な分布を確保する。細胞を３７℃で６時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を、抗生物質を含まないＦＢＳを補充したＴＳＭ培地と交換した。インキュベーター内で細胞を交換し、次の２４〜４８時間で細胞の生存率を観察する。
【０３４８】
結果
ＤＩＰＧ細胞は、ＲＧＤ−４Ｃリガンド結合のためにインテグリン受容体を発現する
標的遺伝子送達のためのこの細胞株におけるこのベクターモデルの適合性を確立するために、蛍光顕微鏡の手段によって、インテグリンαｖβ３およびαｖβ５の発現について、最初に細胞を調査した。図４７に示されるように、試験したＤＩＰＧ細胞は、αｖ、β３、およびβ５ユニットの発現が陽性であり、抗体または二次抗体のみなしでインキュベートした細胞では蛍光は観察されなかった。
【０３４９】
ｐＩＩＩコートタンパク質にディスプレイされるＲＧＤ−４Ｃリガンドは、ｐＶＩＩＩコートタンパク質よりも高い形質導入効率および遺伝子発現レベルをもたらした
発明者の実験室からの以前のデータは、標的ＲＧＤ−４Ｃ  ｐＩＩＩベクター媒介遺伝子送達および発現が、非標的ベクターと比較して選択的かつ効率的であることを示した。形質導入を最適化するために、仮説のうちの１つは、ファージあたりのリガンドのコピー数を増やすために、ｐＶＩＩＩコートタンパク質上にＲＧＤ−４Ｃをディスプレイすることであった（図４８）。
【０３５０】
レポーター遺伝子ベクター（ＧＦＰまたはｌｕｃｉａ）を使用して、ファージベクターを特徴付けるために継続的に使用された細胞モデルであるヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｔを使用して、形質導入効率を比較した。細胞を非標的ベクター（ＲＧＤ−４Ｃを欠く対照）、標的ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰまたはＲＧＤ  ｐＶＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰベクターと共にインキュベートし、蛍光顕微鏡下で観察した（図４９）。すべてのＴＵにわたって、ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ＧＦＰで形質導入された細胞において、最も高いＧＦＰ発現が見られた。
【０３５１】
同様に、非標的ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａまたはＲＧＤ  ｐＶＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａにおいて最も高いＲＬＵが観察されている（図５０）。これは、ｐＩＩＩにディスプレイされたＲＧＤが、形質導入および遺伝子発現においてｐＶＩＩＩよりも優れていることを示唆した。
【０３５２】
組換えｐＶＩＩＩコートタンパク質にディスプレイされるＨ５Ｗペプチドは、形質導入効率および遺伝子発現を改善する
ベクターを最適化する別の戦略は、組換えｐＶＩＩＩコートタンパク質上にＨ５Ｗペプチドをディスプレイすることであった。実験室からの以前のデータは、レポーター遺伝子ｌｕｃｉａを含むベクターを使用した形質導入実験（Ｓａｊｅｅ  Ｗａｒａｍｉｔ、未公開データ）において、ＲＧＤ  ｐＩＩＩ単独と比較して、Ｈ５ＷペプチドのディスプレイがＨＥＫ２９３Ｔ細胞でルシフェラーゼ発現を増加させることを示した（図５１）。
【０３５３】
この発見をＤＩＰＧ細胞に適用することができるかどうかを調べるために、ＤＩＰＧ細胞を非標的ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａまたはＨ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａベクターと共にインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔデータと一致して、ＤＩＰＧ細胞において最も高いＲＬＵは、Ｈ５Ｗ  ＲＧＤ  ｐＩＩＩ  ＰＡＡＶ−ｌｕｃｉａで観察される（図５２）。これは、Ｈ５ＷペプチドがＤＩＰＧ細胞のベクター効率を改善することができ、最終ベクター構築物で使用されるべきであることを示唆した。
【０３５４】
ＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬプラスミドのＤＩＰＧ細胞へのトランスフェクションは細胞死を誘発した
ベクターの最適化後、さらに実験を行う前に、選択される対象となる遺伝子であるヒトＴＲＡＩＬ（ｈＴＲＡＩＬ）がトランスフェクションを介してＤＩＰＧ細胞の細胞死を誘発することができるかどうかを決定することが不可欠であった。
【０３５５】
ＤＩＰＧ細胞を、ＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬまたは対照ＰＡＡＶ−ＧＦＰプラスミドのいずれかでトランスフェクトした。すべてのＤＮＡ濃度でトランスフェクションの１８時間後に撮影された顕微鏡画像によると、ＰＡＡＶ−ｈＴＲＡＩＬでトランスフェクトされた細胞では、細胞死が有意に多かった（図５３）。
【０３５６】
討論
特定の理論に縛られることを望まないが、データはこれまでのところ、ｐＩＩＩコートタンパク質上でＨ５ＷおよびＲＧＤ−４Ｃを発現するベクターがＤＩＰＧ細胞での所望の遺伝子の標的化および発現の誘発において最も最適であったことを示している。トランスフェクション実験からのデータは、治療遺伝子ＴＲＡＩＬがＤＩＰＧ細胞死を誘発することができることも示唆しているため、さらなる調査が必要である。
【０３５７】
実施例１２−ハイブリッドＩＬ２−ＴＮＦａ
腫瘍部位内のＴＮＦａの標的局所領域産生を増加させるために、本発明者らは、ＩＬ−２からシグナルペプチドを挿入して膜貫通ドメインを欠くＴＮＦａ配列に先行することによって、分泌型ＴＮＦａをコードするファージミドを構築した。発明者の知る限り、これはハイブリッドＩＬ２−ＴＮＦａが設計された初めての例であり、それらのデータは、ＩＬ２シグナルペプチド配列を有するＴＮＦａ遺伝子に先行して癌細胞におけるＴＮＦａの発現および分泌を著しく増強したことを示唆している。そのような改変は、腫瘍微小環境におけるＴＮＦａの標的化された産生および放出に利用可能な技術の著しい進歩を表し、ＴＮＦａの治療レベルを増加させるために考慮されるべきである。
【０３５８】
プロトコル
ＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＩＬ−２ＳＰ．ｈＴＮＦａの構築
ファージミドに挿入されたコーディング治療配列は、グルコース調節タンパク質（Ｇｒｐ７８）の腫瘍特異的プロモーター、ＩＬ−２からのシグナルペプチド（ＳＰ）配列（図５７）、およびＴＮＦａのヒト配列を含むハイブリッド配列である。Ｇｒｐ７８プロモーターはストレス誘発性であり、グルコース欠乏、慢性無酸素症、および酸性ｐＨの条件によって強力に活性化され、攻撃的で灌流不良の腫瘍内に存続する。さらに、Ｇｒｐ７８プロモーターは多種多様な腫瘍で誘発されるため、遺伝子治療での使用に魅力的な候補となっている。以前の研究では、このプロモーターがウイルスのプロモーターよりも優れている点がいくつか実証されている。このプロモーターの安全性および腫瘍特異性がまた、ＬａｃＺ導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスでもエレガントに報告されている。これらのトランスジェニックマウスで確立された腫瘍では高いＬａｃＺ発現が示されたが、主要な正常組織ではプロモーター活性は検出されなかった。さらに、遺伝子治療ベクターで使用されるウイルスプロモーターとは異なり、Ｇｒｐ７８などの哺乳動物プロモーターは真核細胞ではサイレンシングされない。発明者の以前に発表された研究において、彼らは、二重標的ＲＧＤ４Ｃ／ファージ−Ｇｒｐ７８がサイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターを保有するＲＧＤ４Ｃ／ファージ−ＣＭＶよりも持続的な導入遺伝子発現を提供することを報告した。ＲＧＤ４ＣリガンドおよびＧｒｐ７８プロモーターの両方を含めると、細胞侵入レベルおよび転写レベルの両方を標的とするデュアル腫瘍を有するベクターが生成される。
【０３５９】
ＴＮＦαは膜貫通型であり、腫瘍細胞の細胞表面でその受容体をより利用しやすい分泌型ＴＮＦαを生成するために、ＴＮＦαの膜貫通ドメインを除去し、インターロイキン２（ＩＬ−２）のシグナルペプチドで置き換えることによって、分泌型ＴＮＦαを生成した。ＩＬ−２は以前、様々な研究で試験された有効なシグナルペプチドとして使用され、他のサイトカインまたは成長因子の細胞外環境への分泌を促進し、その後、それらの対応する受容体の有効性および可用性を高めた。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に隣接するＩＬ−２シグナルペプチド配列（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）をＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８骨格に連結した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限部位に隣接するｈＴＮＦα配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｐＵＮＯ１−ｈＴＮＦαプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、フランス）から提供され、その後、ＰＡＡＶ．Ｇｒｐ７８．ＩＬ−２骨格に連結された。制限酵素消化（ＮＥＢ、英国）およびライゲーション用のクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、英国）を使用して、分子クローニング工程を行った。改変されたプラスミドをＴＧ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）。次に、２×ＹＴ寒天プレート上でのアンピシリン選択によって、プラスミドを保持する細菌を選択した。構築物は、制限消化およびゲル電気泳動、およびＤＮＡシーケンス（ＭＲＣ  ＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、英国）によって検証された（図５８参照）。
【０３６０】
実施例１３−ＤＩＰＧにおけるＰＡＡＶ送達ＴＮＦαサイトカイン遺伝子治療の適用
序論
びまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）は、２年後の生存率がわずか６〜１０％の小児にのみ発生する最も攻撃的な脳腫瘍である。そのびまん性および脳幹内のその繊細な位置のため、外科的切除は不可能であり、この種の癌に対する効果的な治療戦略はない。ＤＩＰＧに対する現在の標準治療は放射線療法であり、放射線増感剤と組み合わせても、すべての小児がその後再発するため、いかなる成功も示していない。多くの臨床試験では、化学療法の効果を従来の放射線療法と組み合わせて試験したが、高用量の化学療法薬を組み合わせた場合でも、全生存期間の延長に関して改善はない。化学療法に対するこの抵抗性は、無傷の血液脳関門なたびに橋内のＤＩＰＧの解剖学的位置により、任意の薬物が標的位置に到達することをより困難にしている。この問題を克服するために、臨床試験では、２人の小児のＤＩＰＧの治療のために、対流強化送達（ＣＥＤ）の使用を適用して化学作用因子トポテカンを送達した。このパイロット研究では、両方の患者が治療後に死亡したが、最初は腫瘍サイズが縮小していた。ＣＥＤは、持続的な流れを通した脳腫瘍への化学療法薬の送達を配向する技術である。この技術は最近、血液脳関門を迂回することで薬物送達の課題を克服するために臨床試験で使用されている。
【０３６１】
ＤＩＰＧに対する標的療法は、その拡散性および繊細な位置のために最良の解決策と思われる。ＤＩＰＧ腫瘍を標的とする試みにおいて、健康な脳細胞を温存する癌細胞に選択的に結合することが知られている８Ｈ９抗体で放射性物質１２４Ｉを標識することにより、標的放射線の概念を適用する進行中の臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＩＤ  ＮＣＴ０１５０２９１７）［８］。我々のグループ（Ｈａｊｉｔｏｕの実験室）によって示唆され、膠芽腫で高い選択性を示した脳腫瘍を標的とするもう１つの候補は、第３章で論じられるＲＧＤ４Ｃペプチドの結合によるインテグリンαｖβ３およびαｖβ５である。実際、ＤＩＰＧを標的とするＲＧＤ４Ｃは、現在進行中の第Ｉ相臨床試験で使用されている（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＩＤ  ＮＣＴ０３１７８０３２）。この試験では、腫瘍溶解性アデノウイルスＤＮＸ２４０１を使用して腫瘍細胞を標的とし、細胞死を誘発する。ＤＩＰＧに対する３０件の進行中の臨床試験の中で、大半は様々な薬物および放射線療法の試験に焦点を当てており、遺伝子治療を含む他の治療法はまだ適用されていない。ＴＮＦαは、アポトーシス、壊死、および免疫細胞の活性化を媒介することによるその抗癌特性で知られる炎症性サイトカインである。細胞の状況に応じて、細胞の増殖および血管新生も誘発することができる。その抗腫瘍活性は、結腸癌、食道腺癌、黒色腫、膵臓癌、および他の多くを含む多くの固形腫瘍で研究されている。しかしながら、治療薬としての効率は、全身に導入された場合のその重大な毒性のために非常に制限されていた。これは、軟部肉腫、黒色腫、および四肢切断を回避するために孤立した四肢灌流（ＩＬＰ）の形で四肢に限定された他の切除不能な腫瘍に使用される癌の治療薬としての臨床におけるＴＮＦαの臨床使用を制限した。実際、ＴＮＦαは、ＶＥ−カドヘリンを破壊する腫瘍血管システムを標的とすることにより、インビボで化学療法薬と相乗的に作用し、したがって腫瘍環境への化学療法薬の浸透を増加させる。したがって、ＴＮＦαの治療効果を高めるには、全身毒性の制限を克服する努力が必要である。ＴＮＦαの突然変異型を作製することによって、ＴＮＦαの毒性を低減し、さらにその抗腫瘍活性を保持するための１つの戦略が作製された。この変異型ＴＮＦαは、シグナル伝達ペプチドＲＧＤ４Ｃによって腫瘍環境をさらに標的とし、肝癌および肉腫同種移植における化学療法薬の効率を高めた。
【０３６２】
ＤＩＰＧに対するインビトロ研究は非常に限られており、研究に利用できるヒト組織はほとんどなく、この破壊的な種類の脳腫瘍の理解が制限されている。化学療法薬および放射線療法以外の治療への適用も、インビトロでの適および理解が不足しているために妨げられている。したがって、本発明者らは、ＤＩＰＧに対するＴＮＦαの２つの形態、膜貫通（ｔｍＴＮＦα）、および分泌型（ｓＴＮＦα）の治療効果を調査した。ＴＮＦαは、シグナル伝達ペプチドＲＧＤ４Ｃによって標的化されたＰＡＡＶを使用して、細胞に発現および送達される遺伝子治療の形態で使用された。特定の理論に縛られることを望まないが、腫瘍部位への治療遺伝子送達ビヒクルとしてＲＧＤ４Ｃ標的化ＰＡＡＶの使用は、ＤＩＰＧの治療のためのより安全で選択的かつ効率的な遺伝子導入を保証するであろう。
【０３６３】
ＴＮＦαによって誘発される細胞死のメカニズムを理解するために、本発明者らは、２つの異なる形態のＴＮＦα、ｔｍＴＮＦα、およびｓＴＮＦαを保有するＰＡＡＶの形質導入に反応した生存率およびアポトーシス活性を研究した。カスパーゼ３／７、カスパーゼ８、およびカスパーゼ９の活性を測定することによって、アポトーシス活性を決定した。
【０３６４】
最後に、遺伝子治療の強化における化学療法薬のシスプラチンの効果を研究した。したがって、ＴＮＦαの上流の２つの異なるプロモーター、ＧＲＰ７８およびＣＭＶを使用して、シスプラチンによる遺伝子治療の相乗効果を理解した。ＧＲＰ７８およびＣＭＶプロモーターの制御下にあるｌｕｃｉａレポーター遺伝子は、シスプラチン治療後の遺伝子発現の定量分析に使用され、遺伝子発現の増強におけるシスプラチンの役割をさらに理解している。
【０３６５】
結果
膜貫通型ｔｍＴＮＦαおよび分泌型ｓＴＮＦα導入遺伝子を保有するＰＡＡＶによるＤＩＰＧの形質導入：
膜貫通ＴＮＦα遺伝子および分泌型ＴＮＦαは、ＰＡＡＶベクター、ＰＡＡＶ−ｔｍＴＮＦαおよびＰＡＡＶ−ｓＴＮＦα（実施例１２に示されるベクターを含む）にクローン化され、続いて標的ウイルス（ＲＧＤ４Ｃ）および非標的ウイルス（Ｍ１３／対照）の産生が行われた。ＤＩＰＧ細胞を形質導入し、形質導入後７日目に細胞生存率を測定した。４０ｎｇ／μｇのファージタンパク質ＤＥＡＥデキストランにより、形質導入効率がさらに向上した。ＤＩＰＧ細胞は、ＰＡＡＶ−ｔｍＴＮＦαと比較して、細胞死の誘発においてＰＡＡＶ−ｓＴＮＦαに対してより良好な反応を示し、前者は、図５９に示される膜貫通型によって誘発された２０％のみの細胞死と比較して、７日目に約５０％の細胞死を示す。併せて、これらのデータは、ｓＴＮＦαがＤＩＰＧの治療に対する良好な候補であることを示唆している。
【０３６６】
ＰＡＡＶによる形質導入後の遺伝子送達およびＴＮＦα発現：
形質導入後のｍＲＮＡレベルを測定することによって、ＰＡＡＶ遺伝子送達の効率を評価した。図６０Ａに示されるように、非標的（Ｍ１３）型は標的化ＰＡＡＶ（ＲＧＤ４Ｃ）と比較して、ＴＮＦαの無視できるｍＲＮＡ発現を示すため、ＴＮＦαの両方の形態は形質導入細胞において高い特異性で発現された。タンパク質レベルでは、ＰＡＡＶ−ｔｍＴＮＦαの形質導入は、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、培地中のＴＮＦαの分泌を引き起こさなかった（図６０Ｂ）。両方の形態での形質導入はｍＲＮＡレベルでＴＮＦα発現を示すが、分泌型形態のみがＴＮＦαタンパク質のレベルに関連していた。これはさらに、導入遺伝子の形質導入が効率的であることを確認し、膜貫通型による細胞死の誘発の非効率性は可溶性分泌タンパク質の欠如によるものであることを示唆し得る。初期の膜結合型からのｓＴＮＦαの放出には、酵素活性またはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）の発現が必要である。したがって、ＴＡＣＥ酵素の発現はウエスタンブロットによって測定され、他の小児脳腫瘍細胞（髄芽腫）と比較された。ＴＡＣＥ酵素のＤＩＰＧ発現は、ＵＷ２２８の発現レベルよりも４倍低く、Ｄａｏｙ細胞の発現レベルよりも２倍低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３１ｃ】
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【図３１ｄ】
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【図３１ｅ】
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【図３１ｆ】
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【図３２】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３３ｃ】
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【図３３ｄ】
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【図３３ｅ】
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【図３３ｆ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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