(57)【要約】本発明は、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。本発明は、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、被験体を処置するのに有効である、方法を提供する。本発明はまた、がんに罹患しておりチェックポイント阻害剤を受容している被験体を処置する方法であって、チェックポイント阻害剤単独と比較して処置を増強するのに有効な量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて前記被験体に投与することを含み、合わせた場合の前記量が、前記被験体を処置するのに有効である、方法。
【請求項２】
がんに罹患しておりチェックポイント阻害剤を受容している被験体を処置する方法であって、前記チェックポイント阻害剤単独と比較して処置を増強するのに有効な量のＰＰ２Ａ阻害剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３】
被験体における腫瘍またはがんを処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて前記被験体に投与することを含み、合わせた場合の前記量が、前記腫瘍または前記がんを処置するのに有効である、方法。
【請求項４】
がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させる方法であって、ある量のＰＰ２Ａ阻害剤を前記がん細胞に対する前記Ｔ細胞応答を増大させるのに有効な有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５】
がんに罹患した被験体におけるＴ細胞の活性化を増大させる方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて前記被験体に投与し、それによって、前記Ｔ細胞の活性化を増大させることを含む、方法。
【請求項６】
前記量の前記化合物および前記量の前記チェックポイント阻害剤が、各々定期的に前記被験体に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記量の前記化合物および前記量の前記チェックポイント阻害剤が、同時に、個別に、または逐次的に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記チェックポイント阻害剤が、前記ＰＰ２Ａ阻害剤と同時に、前記ＰＰ２Ａ阻害剤の前に、または前記ＰＰ２Ａ阻害剤の後に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
一緒に投与される場合の前記量のチェックポイント阻害剤および前記量の化合物が、同量の各薬剤が単独で投与される場合よりも、前記被験体を処置するのに有効である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一緒に投与される場合の前記量の前記化合物および前記量の前記チェックポイント阻害剤が、前記被験体における前記がんの臨床症状を低減させるのに有効である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、前記チェックポイント阻害剤の免疫療法的効果を増強させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんが、免疫応答による処置に対して感受性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤が、イピリムマブまたはトレメリムマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、黒色腫、腎細胞癌、前立腺がん、尿路上皮癌、または卵巣がんである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが黒色腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、０．８３ｍｇ／ｍ２、１．２５ｍｇ／ｍ２、１．７５ｍｇ／ｍ２、２．３３ｍｇ／ｍ２、または３．１ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、２．３３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が３週間毎に３日間投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記イピリムマブが、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記イピリムマブが、３週間毎またはそれより少なく、９０分にわたり静脈内に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アテゾリズマブが、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記アテゾリズマブが、３週間毎またはそれより少なく、６０分にわたり静脈内に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ニボルマブが、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ニボルマブが、２週間毎またはそれより少なく、６０分にわたり静脈内に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペムブロリズマブが、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペムブロリズマブが、３週間毎またはそれより少なく、３０分にわたり静脈内に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害する方法であって、前記Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによって前記ＣＴＬＡ−４の機能を阻害することを含む、方法。
【請求項３１】
Ｔ細胞におけるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害する方法であって、前記Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによってＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害することを含む、方法。
【請求項３２】
前記ＰＰ２Ａ阻害剤が、構造：
【化３０】
2020502094.tif 000035
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
一緒になったＲ１およびＲ２が＝Ｏであり、
Ｒ３が、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ９、Ｏ（ＣＨ２）１〜６Ｒ９、ＳＨ、Ｓ−、もしくはＳＲ９であり、
ここで、Ｒ９が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり、
Ｒ４が、
【化３１】
2020502094.tif 000036
であり、
式中、Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、Ｎ＋ＨＲ１０、もしくはＮ＋Ｒ１０Ｒ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
【化３２】
2020502094.tif 000037
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１１、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１１であり、
ここで、各Ｒ１１が、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニルであり、
Ｒ５およびＲ６が、一緒になって＝Ｏであり、
Ｒ７およびＲ８が、それぞれＨである、
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、構造：
【化３３】
2020502094.tif 000038
を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物内の結合αが存在する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物内の結合αが存在しない、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ３が、ＯＨ、Ｏ−、またはＯＲ９であり、
ここで、Ｒ９が、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、
Ｒ４が、
【化３４】
2020502094.tif 000039
であり、
式中、Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、Ｎ＋ＨＲ１０、またはＮ＋Ｒ１０Ｒ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
【化３５】
2020502094.tif 000040
である、
請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ３が、ＯＨ、Ｏ−、またはＯＲ９であり、ここで、Ｒ９が、Ｈ、メチル、エチル、またはフェニルである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ３が、ＯＨ、Ｏ−、またはＯＲ９であり、ここで、Ｒ９がメチルである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ４が、
【化３６】
2020502094.tif 000041
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ４が、
【化３７】
2020502094.tif 000042
であり、式中、Ｒ１０が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、または
【化３８】
2020502094.tif 000043
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ４が、
【化３９】
2020502094.tif 000044
であり、式中、Ｒ１０が、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または
【化４０】
2020502094.tif 000045
である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ４が、
【化４１】
2020502094.tif 000046
である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ４が、
【化４２】
2020502094.tif 000047
であり、式中、Ｒ１０が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
【化４３】
2020502094.tif 000048
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
Ｒ４が、
【化４４】
2020502094.tif 000049
である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｒ４が、
【化４５】
2020502094.tif 000050
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物が、構造
【化４６】
2020502094.tif 000051
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
Ｒ９が、存在しているかもしくは存在せず、存在している場合には、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはフェニルであり、かつ
Ｘが、Ｏ、ＮＲ１０、ＮＨ＋Ｒ１０、もしくはＮ＋Ｒ１０Ｒ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、
【化４７】
2020502094.tif 000052
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１２、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１２であり、
ここで、Ｒ１２が、Ｈもしくはアルキルである、
請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、構造
【化４８】
2020502094.tif 000053
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
Ｘが、ＯもしくはＮＲ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、
【化４９】
2020502094.tif 000054
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１２、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１２であり、
ここで、Ｒ１２が、Ｈもしくはアルキルである、
請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物が、構造
【化５０】
2020502094.tif 000055
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
Ｘが、ＯもしくはＮＨ＋Ｒ１０であり、
ここで、Ｒ１０が、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、
【化５１】
2020502094.tif 000056
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１２、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１２であり、
ここで、Ｒ１２が、Ｈもしくはアルキルである、
請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が、構造
【化５２】
2020502094.tif 000057
を有するか、またはその塩もしくはエステルである、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４９７，９４９号、２０１７年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４６５，００１号および２０１７年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５４５，３７３号（これらの全体は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、ＡＴＭ／ＡＴＲ依存性の応答経路およびＡＴＭ／ＡＴＲ非依存性の応答経路の両方の多くのタンパク質を脱リン酸化する遍在性セリン／スレオニンホスファターゼである（Ｍｕｍｂｙ，  Ｍ．、２００７年）。ＰＰ２Ａの薬理学的阻害は、ｐ５３、γＨ２ＡＸ、ＰＬＫ１、およびＡｋｔなどの様々なシグナル伝達タンパク質の構成的リン酸化を介して、がん細胞を放射線媒介性のＤＮＡ損傷に対して感作し、その結果、細胞周期の脱調節、ＤＮＡ修復の阻害、およびアポトーシスをもたらすことが、これまでに示されている（Ｗｅｉ，  Ｄ．ら、２０１３年）。
ツチハンミョウ抽出物（Ｍｙｌａｂｒｉｓ）の主な活性成分であるカンタリジンは、ＰＰ２Ａの強力な阻害剤であることが示されている伝統的な漢方薬に由来する化合物である（Ｅｆｆｅｒｔｈ，  Ｔ．ら、２００５年）。カンタリジンはヘパトーマの処置においてこれまで使用されており、多剤耐性の白血病細胞株に対する有効性を示しているが（Ｅｆｆｅｒｔｈ，  Ｔ．ら、２００２年）、その重度の毒性によりその臨床的有用性は制限される。ＬＢ−１００は、毒性が大幅に少ない、カンタリジンの小分子誘導体である。これまでの前臨床研究によって、ＬＢ−１００が、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、転移性褐色細胞腫、および膵臓がんに対するテモゾロミド、ドキソルビシン、および放射線療法の細胞傷害性効果を増強させ得ることが示されている（Ｗｅｉ，  Ｄ．ら、２０１３年；Ｌｕ，  Ｊ．ら、２００９年；Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．ら、２０１０年；Ｍａｒｔｉｎｉｏｖａ，  Ｌ．ら、２０１１年）。ＬＢ−１００では、充実性腫瘍の処置のための、ドセタキセルと組み合わせた第１相研究も行われている（Ｃｈｕｎｇ，  Ｖ．、２０１３年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｅｉ，Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１３）１９（１６）：ｐ．４４２２〜３２
【非特許文献２】Ｌｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２００９）１０６（２８）：ｐ．１１６９７〜７０２
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１０）３１（３６）：ｐ．９５３５〜４３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、被験体を処置するのに有効である、方法を提供する。
【０００５】
本発明はまた、がんに罹患しておりチェックポイント阻害剤を受容している被験体を処置する方法であって、チェックポイント阻害剤単独と比較して処置を増強するのに有効な量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、被験体における腫瘍またはがんを処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、腫瘍またはがんを処置するのに有効である、方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させる方法であって、ある量のＰＰ２Ａ阻害剤をがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させるのに有効な有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、がんに罹患した被験体におけるＴ細胞の活性化を増大させる方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与し、それによって、Ｔ細胞の活性化を増大させることを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害する方法であって、Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによってＣＴＬＡ−４の機能を阻害することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、Ｔ細胞におけるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害する方法であって、Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによってＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、エントリー時に測定可能な疾患を有する患者における指標病変の大きさの最大変化を示す図である。
【００１２】
【図２】図２は、研究へのエントリーの昇順での各患者の疾患の安定性または部分応答（赤色丸）の期間（サイクルの数）を示す図である。
【００１３】
【図３】（図３Ａ）図３Ａは、ＰＰ２Ａの阻害が、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を大幅に増強することを示す図である。４０ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化されたＣＤ４Ｔ細胞からのＩＦＮガンマ産生。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００１４】
（図３Ｂ）図３Ｂは、ＰＰ２Ａの阻害が、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を大幅に増強することを示す図である。種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化されたＣＤ４Ｔ細胞からのＩＦＮガンマ産生。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００１５】
【図４】（図４Ａ）図４Ａは、ＰＰ２Ａの阻害が、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を大幅に増強することを示す図である。１０００ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて増殖されたＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００１６】
（図４Ｂ）図４Ｂは、ＰＰ２Ａの阻害が、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を大幅に増強することを示す図である。種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて増殖されたＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００１７】
【図５】（図５Ａ）図５Ａは、ＰＰ２Ａの阻害が、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を大幅に増強することを示す図である。ＬＢ−１００の非存在下で５日間、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて増殖されたＣＤ４Ｔ細胞の代表的なフロープロット。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００１８】
（図５Ｂ）図５Ｂは、ＰＰ２Ａの阻害が、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を大幅に増強することを示す図である。１０００ｎＭのＬＢ−１００の存在下で５日間、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて増殖されたＣＤ４Ｔ細胞の代表的なフロープロット。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００１９】
【図６】（図６Ａ）図６Ａは、ＰＰ２Ａの阻害が、Ｔ細胞での共起刺激分子ＯＸ４０発現を大幅に増強することを示す図である。１０００ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた場合のＯＸ４０を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００２０】
（図６Ｂ）図６Ｂは、ＰＰ２Ａの阻害が、Ｔ細胞での共起刺激分子ＯＸ４０発現を大幅に増強することを示す図である。種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた場合のＯＸ４０を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００２１】
【図７】（図７Ａ）図７Ａは、ＰＰ２Ａの阻害が、Ｔｂｅｔ（ＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生を駆動するための転写因子）を増強することを示す図である。１０００ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間のＣＤ３／Ｃｄ２８ビーズを用いた場合のＴｂｅｔを発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００２２】
（図７Ｂ）図７Ｂは、ＰＰ２Ａの阻害が、Ｔｂｅｔ（ＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生を駆動するための転写因子）を増強することを示す図である。抗ＰＤ１抗体を伴うまたは伴わない種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間増殖された、共培養単球由来樹状細胞、ＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００２３】
【図８】（図８Ａ）図８Ａは、組み合わせ処置を用いた場合のＣＤ４Ｔ細胞の増強された増殖を示す図である。抗ＰＤ１抗体を伴うまたは伴わない８ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、単球由来樹状細胞と共培養された、増殖されたＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００２４】
（図８Ｂ）図８Ｂは、組み合わせ処置を用いた場合のＣＤ４Ｔ細胞の増強された増殖を示す図である。抗ＰＤ１抗体を伴うまたは伴わない種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、単球由来樹状細胞と共培養された、増殖されたＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００２５】
【図９】（図９Ａ）図９Ａは、対照におけるＣＤ４Ｔ細胞増殖の代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。
【００２６】
（図９Ｂ）図９Ｂは、ＬＢ−１００におけるＣＤ４Ｔ細胞増殖の代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。
【００２７】
（図９Ｃ）図９Ｃは、抗ＰＤ−１におけるＣＤ４Ｔ細胞増殖の代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。
【００２８】
（図９Ｄ）図９Ｄは、ＬＢ−１００＋抗ＰＤ−１におけるＣＤ４Ｔ細胞増殖の代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。
【００２９】
【図１０】（図１０Ａ）図１０Ａは、組み合わせ処置を用いた場合のＣＤ４Ｔ細胞の増強されたＯＸ４０発現を示す図である。０．０５ｎＭの抗ＰＤ１抗体を伴うまたは伴わない８ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、単球由来樹状細胞と共培養されたＯＸ４０を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００３０】
（図１０Ｂ）図１０Ｂは、組み合わせ処置を用いた場合のＣＤ４Ｔ細胞の増強されたＯＸ４０発現を示す図である。抗ＰＤ１を伴うまたは伴わない種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、単球由来樹状細胞と共培養されたＯＸ４０を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００３１】
【図１１】（図１１Ａ）図１１Ａは、組み合わせ処置を用いた場合のＣＤ４Ｔ細胞における、増強されたＴｂｅｔ発現を示す図である。抗ＰＤ１抗体を伴うまたは伴わない２００ｎＭのＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、単球由来樹状細胞と共培養されたＴｂｅｔを発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００３２】
（図１１Ｂ）図１１Ｂは、組み合わせ処置を用いた場合のＣＤ４Ｔ細胞における、増強されたＴｂｅｔ発現を示す図である。抗ＰＤ１抗体を伴うまたは伴わない種々の濃度のＬＢ−１００の存在下または非存在下で５日間、単球由来樹状細胞と共培養されたＣＤ４Ｔ細胞におけるＴｂｅｔ発現のパーセンテージ。ＬＢ−１００は３日目に添加または置換した。
【００３３】
【図１２】図１２は、８用量を２日毎に処置されたマウスにおいてＰＰ２Ａ阻害剤が、マウスＢ１６黒色腫腫瘍成長を大幅に低減したことを示す図である。処置は、腫瘍移植の同日に開始した。対照−ＰＢＳ、低用量−０．１６ｍｇ／ｋｇ、中用量−０．３２ｍｇ／ｋｇ。
【００３４】
【図１３】（図１３Ａ）図１３Ａは、ＰＰ２Ａ阻害剤がナイーブマウスにおいてＣＤ４／８エフェクター細胞を増大したことを示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの低用量のＬＢ処置は、リンパ節においてより多いＣＤ８（左）およびＣＤ４（右）エフェクターＴ細胞を誘導した。群あたり５匹のマウス。対照−ＰＢＳ、低用量−０．１６ｍｇ／ｋｇ、中用量−０．３２ｍｇ／ｋｇ。
【００３５】
（図１３Ｂ）図１３Ｂは、ＰＰ２Ａ阻害剤がナイーブマウスにおいてＣＤ４／８エフェクター細胞を増大したことを示す図である。図１３ＡにおけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８（左）およびＣＤ４（右）の代表的なフローサイトメトリープロット。対照−ＰＢＳ、低用量−０．１６ｍｇ／ｋｇ、中用量−０．３２ｍｇ／ｋｇ。
【００３６】
【図１４】（図１４Ａ）図１４Ａは、ＰＰ２Ａ阻害剤が、血液および脾臓におけるＣＤ８Ｔ細胞でのＰＤ−１発現を低減したことを示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの低用量のＬＢ処置は、血液においてＰＤ−１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を低減した。
【００３７】
（図１４Ｂ）図１４Ｂは、ＰＰ２Ａ阻害剤が、血液および脾臓におけるＣＤ８Ｔ細胞でのＰＤ−１発現を低減したことを示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの中用量のＬＢ処置は、脾臓においてＰＤ−１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を低減した。
【００３８】
【図１５】図１５は、ＰＰ２Ａ阻害剤が、ヒトＴ細胞からのＩＦＮ−ｇ産生を増強したことを示す図である。ＬＢ−１００または抗ＰＤ−１または組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）の存在下での単球由来ＤＣと共培養されたＣＤ４Ｔ細胞から得た上清におけるＩＦＮγ産生。
【００３９】
【図１６】（図１６Ａ）図１６Ａは、ＰＰ２Ａ阻害剤が、ヒトＣＤ４Ｔ細胞でのＰＤ−１発現を低減したことを示す図である。アイソタイプ対照の存在下で単球由来ＤＣと共培養されたＰＤ−１を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。
【００４０】
（図１６Ｂ）図１６Ｂは、ＰＰ２Ａ阻害剤が、ヒトＣＤ４Ｔ細胞でのＰＤ−１発現を低減したことを示す図である。ＬＢ−１００の存在下で単球由来ＤＣと共培養されたＰＤ−１を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。
【００４１】
（図１６Ｃ）図１６Ｃは、ＰＰ２Ａ阻害剤が、ヒトＣＤ４Ｔ細胞でのＰＤ−１発現を低減したことを示す図である。抗ＰＤ−１の存在下で単球由来ＤＣと共培養されたＰＤ−１を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。
【００４２】
（図１６Ｄ）図１６Ｄは、ＰＰ２Ａ阻害剤が、ヒトＣＤ４Ｔ細胞でのＰＤ−１発現を低減したことを示す図である。組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）の存在下で単球由来ＤＣと共培養されたＰＤ−１を発現するＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。
【００４３】
【図１７】（図１７Ａ）図１７Ａは、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋エフェクターＴ細胞が、ＰＰ２Ａ阻害剤ＬＢ−１００処置により増大されることを示す図である。ＬＢ−１００またはＰＢＳを用いて処置されたＢ１６腫瘍を有するマウスから得た腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔエフェクター細胞集団のパーセンテージ。群あたり５匹のマウス。
【００４４】
（図１７Ｂ）図１７Ｂは、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋エフェクターＴ細胞が、ＰＰ２Ａ阻害剤ＬＢ−１００処置により増大されることを示す図である。図１７Ａに示されるデータの代表的なフローサイトメトリープロット。
【００４５】
【図１８】（図１８Ａ）図１８Ａは、Ｂ１６腫瘍を有するマウスから得たリンパ節における増加したＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４エフェクターＴ細胞を示す図である。ＬＢ−１００またはＰＢＳを用いて処置されたＢ１６腫瘍を有するマウスから得たリンパ節におけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４エフェクターＴ細胞集団のパーセンテージ。群あたり５匹のマウス。
【００４６】
（図１８Ｂ）図１８Ｂは、Ｂ１６腫瘍を有するマウスから得たリンパ節における増加したＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４エフェクターＴ細胞を示す図である。図１８Ａに示されるデータの代表的なフローサイトメトリープロット。
【００４７】
【図１９】（図１９Ａ）図１９Ａは、Ｂ１６腫瘍を有するマウスから得たリンパ節における増加したＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８エフェクターＴ細胞を示す図である。ＬＢ−１００またはＰＢＳを用いて処置されたＢ１６腫瘍を有するマウスから得たリンパ節におけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８エフェクターＴ細胞のパーセンテージ。群あたり５匹のマウス。
【００４８】
（図１９Ｂ）図１９Ｂは、Ｂ１６腫瘍を有するマウスから得たリンパ節における増加したＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８エフェクターＴ細胞を示す図である。図１９Ａにおいて示されるデータの代表的なフローサイトメトリープロット。
【００４９】
【図２０】（図２０Ａ）図２０Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、その右胸部脇腹（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｆｌａｎｋ）にＣＴ２６細胞を皮下移植したことを示す図である。１３日後、３０〜１００ｍｍ３の大きさに到達した腫瘍を有するマウスを無作為化し、ＰＢＳ対照、抗ＰＤ−Ｌ１、ＬＢ−１００または組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）を用いて２８日間処置した。経時的な個体の腫瘍体積。
【００５０】
（図２０Ｂ）図２０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、その右胸部脇腹（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｆｌａｎｋ）にＣＴ２６細胞を皮下移植したことを示す図である。１３日後、３０〜１００ｍｍ３の大きさに到達した腫瘍を有するマウスを無作為化し、ＰＢＳ対照、抗ＰＤ−Ｌ１、ＬＢ−１００または組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）を用いて２８日間処置した。経時的なメジアン腫瘍体積。
【００５１】
（図２０Ｃ）図２０Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、その右胸部脇腹（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｆｌａｎｋ）にＣＴ２６細胞を皮下移植したことを示す図である。１３日後、３０〜１００ｍｍ３の大きさに到達した腫瘍を有するマウスを無作為化し、ＰＢＳ対照、抗ＰＤ−Ｌ１、ＬＢ−１００または組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）を用いて２８日間処置した。経時的なマウス生存。
【００５２】
【図２１】（図２１Ａ）図２１Ａは、最初の接種の約６０日後、治癒したマウスおよびＣＴ２６−ナイーブ対照マウスに、ＣＴ２６細胞をその左脇腹に（再）接種したことを示す図である。経時的な個体の腫瘍体積。
【００５３】
（図２１Ｂ）図２１Ｂは、最初の接種の約６０日後、治癒したマウスおよびＣＴ２６−ナイーブ対照マウスに、ＣＴ２６細胞をその左脇腹に（再）接種したことを示す図である。経時的なメジアン腫瘍体積。
【００５４】
【図２２】（図２２Ａ）図２２Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、その右胸部脇腹にＣＴ２６細胞を皮下移植したことを示す図である。１１日後、３０〜１００ｍｍ３の大きさに到達した腫瘍を有するマウスを、４群に無作為化した：対照、ＣＤ８枯渇、ＣＤ８枯渇＋組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）または組み合わせのみ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）。次いで、枯渇群のマウスに、ＣＤ８枯渇抗体を与えた。次いで２日後、マウスにそれぞれの処置を開始した。経時的な個体の腫瘍体積。
【００５５】
（図２２Ｂ）図２２Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、その右胸部脇腹にＣＴ２６細胞を皮下移植したことを示す図である。１１日後、３０〜１００ｍｍ３の大きさに到達した腫瘍を有するマウスを、４群に無作為化した：対照、ＣＤ８枯渇、ＣＤ８枯渇＋組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）または組み合わせのみ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）。次いで、枯渇群のマウスに、ＣＤ８枯渇抗体を与えた。次いで２日後、マウスにそれぞれの処置を開始した。経時的なメジアン腫瘍体積。
【００５６】
（図２２Ｃ）図２２Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、その右胸部脇腹にＣＴ２６細胞を皮下移植したことを示す図である。１１日後、３０〜１００ｍｍ３の大きさに到達した腫瘍を有するマウスを、４群に無作為化した：対照、ＣＤ８枯渇、ＣＤ８枯渇＋組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）または組み合わせのみ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）。次いで、枯渇群のマウスに、ＣＤ８枯渇抗体を与えた。次いで２日後、マウスにそれぞれの処置を開始した。経時的なマウス生存。
【００５７】
【図２３】（図２３Ａ）図２３Ａは、ＢＡＬＢ／ＣマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を右胸部脇腹に皮下接種し、図２２Ａ〜Ｃに記載されるように、対照（ＰＢＳ）、ＬＢ−１００、抗ＰＤ−１または組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）を用いて処置したことを示す図である。処置の開始の１２日後、フローサイトメトリーによって腫瘍浸潤Ｔ細胞を解析した。ＰＭＡ刺激の４時間後にＩＦＮｇ＋を産生するＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞のパーセンテージは、組み合わせ群において増大した（＊ｐ＝０．０５）。
【００５８】
（図２３Ｂ）図２３Ｂは、ＢＡＬＢ／ＣマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を右胸部脇腹に皮下接種し、図２２Ａ〜Ｃに記載されるように、対照（ＰＢＳ）、ＬＢ−１００、抗ＰＤ−１または組み合わせ（ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１）を用いて処置したことを示す図である。処置の開始の１２日後、フローサイトメトリーによって腫瘍浸潤Ｔ細胞を解析した。腫瘍におけるＣＤ４５＋細胞のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞のパーセンテージは、ＬＢ−１００処置群において減少した（＊＊ｐ＜０．０１）。
【００５９】
【図２４】（図２４Ａ）図２４Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．５×１０６個のＣＴ２６細胞を右胸部脇腹に皮下接種したことを示す図である。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の間に到達した時点で、マウスを４つの処置群に無作為化し、２日毎に４週間処置した。
【００６０】
（図２４Ｂ）図２４Ｂは、左、個体の腫瘍成長曲線：対照、ＬＢ−１００、ａ−ＰＤ−１および組み合わせ、中央、経時的な平均腫瘍サイズ、右、継時的な累積生存を示す図である。
【００６１】
（図２４Ｃ）図２４Ｃは、ＰＤ−１遮断を伴うＰＰ２Ａ阻害の有効性が、ＣＤ８＋Ｔ細胞に依存することを示す図である。２４Ａにおけるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。腫瘍が３０〜１００ｍｍ３に到達した時点で、マウスはＣＤ８＋Ｔ細胞が一時的に枯渇し、組み合わせを用いて処置した。
【００６２】
（図２４Ｄ）図２４Ｄは、左、個体の腫瘍成長曲線：対照、組み合わせ、ＣＤ−８枯渇のみおよびＣＤ８枯渇との組み合わせ、中央、経時的な平均腫瘍サイズ、右、経時的な累積生存を示す図である。データは、２つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ログ−ランクマンテル−コックス（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定）。
【００６３】
【図２５】（図２５Ａ）図２５Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．５×１０６個のＣＴ２６細胞を皮下接種し、処置したことを示す図である。ＣＲまたはナイーブ対照マウスに、最初の移植の約６０日後に０．５×１０６個のＣＴ２６細胞を左胸部脇腹に、または乳頭脂肪パッドに１．２５×１０５個の４Ｔ１乳癌細胞と組み合わせて再負荷した。ＣＴ２６を単独で（再）負荷されたマウスは、ＣＴ２６腫瘍の成長がないことを実証した。
【００６４】
（図２５Ｂ）図２５Ｂは、左、個体の腫瘍成長曲線：ナイーブ、ＣＲ、右、経時的な平均腫瘍サイズを示す図である。
【００６５】
（図２５Ｃ）図２５Ｃは、接種の１８日後のＣＴ２６腫瘍体積の定量化を示す図である（Ｐ＜０．００１、両側スチューデントのｔ検定）。
【００６６】
（図２５Ｄ）図２５Ｄは、ＣＲおよびナイーブマウスにＣＴ２６および４Ｔ１腫瘍細胞を用いて（再）負荷したことを示す図である：ナイーブ−ＣＴ２６、ＣＲ−ＣＴ２６、ナイーブ−４Ｔ１、ＣＲ−４Ｔ１。左、個体の腫瘍成長曲線、右、経時的な平均腫瘍サイズ。
【００６７】
（図２５Ｅ）図２５Ｅは、接種の１８日後のＣＴ２６および４Ｔ１腫瘍体積の定量化を示す図である（Ｐ＜０．０００１、チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。
【００６８】
（図２５Ｆ）図２５Ｆは、ＣＴ２６および４Ｔ１腫瘍接種後の代表的なナイーブおよびＣＲマウスの像を示す図である。
【００６９】
【図２６】（図２６Ａ）図２６Ａは、脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。
【００７０】
（図２６Ｂ）図２６Ｂは、脾臓におけるＣＤ６２−ＣＤ４４＋の（ＣＤ８＋Ｔ細胞の）定量化（ｎ＝４〜５）を示す図である。
【００７１】
（図２６Ｃ）図２６Ｃは、腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＤ６２−ＣＤ４４＋の（ＣＤ８＋Ｔ細胞の）定量化（ｎ＝４〜５）を示す図である。
【００７２】
（図２６Ｄ）図２６Ｄは、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。
【００７３】
（図２６Ｅ）図２６Ｅは、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表されるＣＤ３＋の免疫浸潤解析（ｎ＝５）を示す図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００７４】
（図２６Ｆ）図２６Ｆは、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表されるＣＤ８＋の免疫浸潤解析（ｎ＝５）を示す図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００７５】
（図２６Ｇ）図２６Ｇは、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表されるＣＤ４＋の免疫浸潤解析（ｎ＝５）を示す図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００７６】
（図２６Ｈ）図２６Ｈは、腫瘍におけるＣＤ８＋のＣＤ４＋細胞に対する比を示す図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００７７】
（図２６Ｉ）図２６Ｉは、腫瘍におけるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表されるＣＤ８＋およびＣＤ４４＋を示す図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００７８】
（図２６Ｊ）図２６Ｊは、腫瘍におけるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表されるＣＤ８＋およびＫｉ６７＋を示す図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００７９】
（図２６Ｋ）図２６Ｋは、腫瘍におけるＣＤ８＋細胞におけるＰＤ１＋の発現を示す図である。＊Ｐ＜０．０５、（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。
【００８０】
（図２６Ｌ）図２６Ｌは、腫瘍におけるＣＤ４＋細胞の発現を示す図である。＊Ｐ＜０．０５、（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。
【００８１】
【図２７】（図２７Ａ）図２７Ａは、腫瘍におけるＦｏｘＰ３＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。（図２７Ｂ）図２７Ｂは、総ＣＤ３＋細胞のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【００８２】
（図２７Ｃ）図２７Ｃは、腫瘍におけるＣＤ８＋のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞に対する比（ｎ＝５）を示す図である。
【００８３】
（図２７Ｄ）図２７Ｄは、ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。
【００８４】
（図２７Ｅ）図２７Ｅは、ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【００８５】
（図２７Ｆ）図２７Ｆは、ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【００８６】
（図２７Ｇ）図２７Ｇは、ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋二重陽性ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【００８７】
（図２７Ｈ）図２７Ｈは、ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋ＧｒａｎｚｙｍｅＢ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【００８８】
（図２７Ｉ）図２７Ｉは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４＋ＩＦＮγ＋のパーセンテージを示す図である。
【００８９】
（図２７Ｊ）図２７Ｊは、ＦＡＣＳによって決定されるようなＣＤ４５＋免疫細胞サブセットおよびＣＤ４５−細胞のまとめを示す図である。サブセットは、すべての獲得された生事象（右）およびＣＤ３＋細胞（左）のパーセンテージとして示される；右側の図：非ＣＤ４５−、ＣＤ３＋、非ＣＤ３＋ＣＤ４５白血球；左側の図：ＣＤ８、ＣＤ４−Ｔｒｅｇ、ＣＤ４−ｃｏｎｖ．＊Ｐ＜０．０５、（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データは、５匹の独立に解析されたマウス／群を用いる２つの実験のうち一方を表す。
【００９０】
【図２８】（図２８Ａ）図２８Ａは、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１処置を受けているマウスの脾臓における（Ａ）ＣＤ４＋の活性化および免疫チェックポイントマーカーのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とは異なり、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋発現の発現において変化がなかった。また、免疫チェックポイントマーカー：ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＯｘ４０の発現において変化がなかった。
【００９１】
（図２８Ｂ）図２８Ｂは、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１処置を受けているマウスの脾臓におけるＣＤ８＋リンパ球の活性化および免疫チェックポイントマーカーのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞では、免疫チェックポイントマーカー：ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＯｘ４０の発現において変化はなかった。
【００９２】
【図２９】（図２９Ａ）図２９Ａは、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１処置を受けているマウスの流入領域リンパ節（ｄＬＮ）におけるＣＤ４＋の活性化および免疫チェックポイントマーカーのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とは異なり、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋発現の発現において変化はなかった。ａＰＤ−１処置群におけるＰＤ−１発現において小さいが有意な増大があったが、単独または組み合わせたＬＢ−１００は、ＰＤ−１発現をさらに変更しなかった。その他の免疫チェックポイントマーカー：ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＯｘ４０の発現において変化はなかった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜Ｐ＜０．０１（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【００９３】
（図２９Ｂ）図２９Ｂは、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１処置を受けているマウスの流入領域リンパ節（ｄＬＮ）におけるＣＤ８＋リンパ球の活性化および免疫チェックポイントマーカーのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞では、免疫チェックポイントマーカー：ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＯｘ４０の発現において変化はなかった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜Ｐ＜０．０１（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【００９４】
【図３０】図３０は、腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリー解析のゲート（ｇａｔｉｎｇ）戦略を示す図である。ＳＳＣ−ＦＳＣゲートを使用して、非細胞性残屑を排除し、続いて、ＦＳＣ−Ｈ−ＦＳＡ−Ａゲートによってデュプレット（ｄｕｐｌｅｔ）を排除した。固定可能な生−死（Ｌ／Ｄ）染色を使用して、死細胞を排除した。次いで、ＣＤ４５＋汎白血球マーカーの発現に基づいて生細胞をゲートした。ＣＤ４５−細胞を腫瘍細胞とみなした。次いで、ＣＤ４５＋細胞をＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４発現にさらに基づいて表現型決定した。ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞をＣＤ８＋リンパ球としてゲートし、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞をＣＤ４＋リンパ球としてゲートした。次いで、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットのさらなる染色を本文に示されるように実施した。
【００９５】
【図３１】（図３１Ａ）図３１Ａは、各処置群について、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞の、ＣＤ４５−腫瘍常在細胞に対する比を示す図である。対照と比較して、組み合わせ群において、ＣＤ３／腫瘍およびＣＤ８／腫瘍比において増大があったが、ＣＤ４／腫瘍比には変化がなかった。
【００９６】
（図３１Ｂ）図３１Ｂは、各処置群について、１グラムの腫瘍重量あたりのＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞の数を示す図である。同様の傾向が図３１Ａにおいても見られるが、対照と比較してａＰＤ−１処置群単独において腫瘍１グラムあたりのＣＤ３＋およびＣＤ８＋に有意差があった。組み合わせ処置のＣＤ３＋およびＣＤ８＋／腫瘍においてさらなる増大の傾向があったが、統計的に有意ではなかった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＜Ｐ＜０．００１（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【００９７】
【図３２】（図３２Ａ）図３２Ａは、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１処置を受けているマウスの腫瘍におけるＣＤ４＋リンパ球の免疫チェックポイントマーカーのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞では、免疫チェックポイントマーカー：ＴＩＭ３、Ｏｘ４０、ＣＴＬＡ４およびＬＡＧ３の発現において変化はなかった。
【００９８】
（図３２Ｂ）図３２Ｂは、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１処置を受けているマウスの腫瘍におけるＣＤ８＋リンパ球の、および免疫チェックポイントマーカーのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞では、免疫チェックポイントマーカー：ＴＩＭ３、Ｏｘ４０、ＣＴＬＡ４およびＬＡＧ３の発現において変化はなかった。
【００９９】
【図３３】（図３３Ａ）図３３Ａは、増加したＴＮＦ−α＋を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。示されたパーセンテージは、総ＣＤ３＋のものである。
【０１００】
（図３３Ｂ）図３３Ｂは、増加したＴＮＦ−α＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。示されたパーセンテージは、総ＣＤ８＋のものである。
【０１０１】
（図３３Ｃ）図３３Ｃは、増加したＧｒａｎｚｙｍｅＢ＋ＣＤ８腫瘍浸潤Ｔ細胞を示す代表的なフローサイトメトリーを示す図である。示されたパーセンテージは、総ＣＤ３＋細胞のものである。
【０１０２】
【図３４】（図３４Ａ）図３４Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを４つの処置群に無作為化したことを示す図である。２．５×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞を、処置の開始の２日後に右胸部脇腹に皮下接種した。マウスを生存エンドポイントまで２日毎に処置した。
【０１０３】
（図３４Ｂ）図３４Ｂは、左、個体の腫瘍成長曲線：対照、ＬＢ−１００、ａ−ＰＤ−１および組み合わせ、右、継時的な平均腫瘍サイズを示す図である。
【０１０４】
（図３４Ｃ）図３４Ｃは、接種の１５日後のＢ１６腫瘍体積の定量化を示す図である（Ｐ＜０．０００１、チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。
【０１０５】
（図３４Ｄ）図３４Ｄは、継時的な累積生存を示す図である。＊Ｐ＜０．０５、（ログ−ランクマンテル−コックス検定）データは、２つの独立した実験からプールされている。
【０１０６】
（図３４Ｅ）図３４Ｅは、各処置群（群あたりｎ＝２〜３）の皮膚および唾液腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色の代表的な画像を示す図である。スケールバー、１００μｍ。
【０１０７】
【図３５】図３５は、各処置群（群あたりｎ＝２〜３）の膵臓、肺および胃のヘマトキシリンおよびエオシン染色の代表的な画像を示す図である。スケールバー、１００μｍ。
【０１０８】
【図３６】（図３６Ａ）図３６Ａは、ＣＤ３Ｔ細胞をマウス脾細胞から単離し、固定化された抗ＣＤ３（１０．ｉｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８（２．ｉｇ／ｍｌ）を使用して刺激と伴ってまたは伴わずに培養したことを示す図である。活性化の３時間後にＰＰ２Ａ酵素活性を測定した。ＰＰ２Ａ活性を、ＬＢ−１００用量滴定の存在下で活性化された対照と比べて測定した。
【０１０９】
（図３６Ｂ）図３６Ｂは、ＬＢ−１００用量滴定の存在下で刺激の３時間後にＴｈｒ３０８（ｐ−ＡＫＴ（Ｔ３０８））またはＳｅｒ４７３（ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３））でリン酸化されたＡＫＴを解析するフローサイトメトリーを示す図である。
【０１１０】
（図３６Ｃ）図３６Ｃは、ＬＢ−１００用量滴定の存在下でリン酸化されたＳ６（ｐ−Ｓ６）を解析するフローサイトメトリーを示す図である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。データは、同様の結果を有する２つの独立した実験を代表する１つの実験に由来する。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【０１１１】
【図３７】図３７は、刺激の３０分後のＡＫＴおよびｍＴＯＲＣシグナル伝達を示す図である。ＬＢ−１００用量滴定の存在下で刺激の３０分後に、Ｔｈｒ３０８（ｐ−ＡＫＴ（Ｔ３０８））、Ｓｅｒ４７３（ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３））でリン酸化されたＡＫＴまたはリン酸化されたＳ６（ｐ−Ｓ６）を解析するフローサイトメトリー。（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。データは、同様の結果を有する２つの独立した実験を代表する１つの実験に由来する。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【０１１２】
【図３８】（図３８Ａ）図３８Ａは、左、Ｆｏｘｐ３について陽性のＣＤ４細胞の％、右、ＬＢ−１００を用いた場合のＦｏｘｐ３細胞の％の減少を実証する代表的なフローサイトメトリーデータを示す図である。ＣＤ４＋細胞で細胞をゲートした。
【０１１３】
（図３８Ｂ）図３８Ｂは、フローサイトメトリーを用いてＧＡＴＡ３の細胞内レベルを測定したことを示す図である。左、ＧＡＴＡ３について陽性のＣＤ４細胞の％。右、ＬＢ−１００を用いた場合のＧＡＴＡ３細胞の％の減少を実証する代表的なフローサイトメトリーデータ。
【０１１４】
（図３８Ｃ）図３８Ｃは、ＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２の、Ｔｂｅｔ＋Ｔｈ１  ＣＤ４細胞に対する比を示す図である。
【０１１５】
（図３８Ｄ）図３８Ｄは、フローサイトメトリーによってＩＦＮ−γの細胞内産生が測定されたことを示す図である。左、ＴＨ１およびＴＨ２条件においてＩＦＮ−γについて陽性であるＣＤ４細胞の％。右、ＴＨ１およびＴＨ２条件の両方においてＬＢ−１００を用いた場合のＩＦＮ−γの％の増大を実証する代表的なフローサイトメトリーデータ。
【０１１６】
（図３８Ｅ）図３８Ｅは、ＴＨ１傾斜条件において３日間活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の上清におけるＴＮＦ、ＩＬ２およびＩＦＮ−γ産生を示す図である。
【０１１７】
（図３８Ｆ）図３８Ｆは、ＴＨ２傾斜条件において３日間活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の上清におけるＴＮＦ、ＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ４産生を示す図である。サイトカインレベルは絶対細胞数に対して補正された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。データは、同様の結果を有する２つの独立した実験を代表する１つの実験に由来する。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【０１１８】
【図３９】（図３９Ａ）図３９Ａは、ＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦ中で７日間培養することによって、ＤＣが精製単球から誘導されたことを示す図である。次いで、１０５個のＣＦＳＥ標識された精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、２連または３連で５日間、ＬＢ−１００の滴定の存在下で１０４個の同種異系ＤＣと共培養した。ＬＢ−１００を３日目に補充した。５日目に上清を回収し、ＩＦＮ−γ産生について測定した。ＦＡＣＳ解析を培養細胞で実施した。
【０１１９】
（図３９Ｂ）図３９Ｂは、サイトゾルＣＦＳＥの希釈によって測定される、ＬＢ−１００用量滴定の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を示す図である。左、分裂した細胞の％をＬＢ−１００の濃度に対してプロットした。右、１ｕＭのＬＢ−１００での分裂した細胞の％の増大を実証する代表的なフローサイトメトリーデータ。
【０１２０】
（図３９Ｃ）図３９Ｃは、ＩＦＮ−α産生を５日目に測定し、ＬＢ−１００を用いた場合の、ＩＦＮ−α分泌の用量依存性増大を実証したことを示す図である。
【０１２１】
（図３９Ｄ）図３９Ｄは、５日間の共培養後にＣＤ４＋Ｔ細胞においてＴ−ｂｅｔの細胞内染色を実施したことを示す図である。ＬＢ−１００濃度に対するＣＤ４＋Ｔｂｅｔ＋の（ＣＤ４＋細胞の）パーセンテージ。
【０１２２】
（図３９Ｅ）図３９Ｅは、アイソタイプ対照、ＬＢ−１００および／またはニボルマブを用いて処置した細胞における（Ｅ）ＩＦＮ−γ産生を示す図であり、組み合わせ処置に対する相乗応答を実証する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（チューキーの多重比較検定を用いる一元配置分散分析）。データは、同様の結果を有する２つの独立した実験を代表する１つの実験に由来する。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
本発明は、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、被験体を処置するのに有効である、方法を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、がんに罹患しておりチェックポイント阻害剤を受容している被験体を処置する方法であって、チェックポイント阻害剤単独と比較して処置を増強するのに有効な量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０１２５】
本発明はまた、被験体における腫瘍またはがんを処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、腫瘍またはがんを処置するのに有効である、方法を提供する。
【０１２６】
本発明はまた、がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させる方法であって、ある量のＰＰ２Ａ阻害剤を、がん細胞に対するＴ細胞応答を増大させるのに有効な有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０１２７】
本発明はまた、がんに罹患した被験体におけるＴ細胞の活性化を増大させる方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与し、それによって、Ｔ細胞の活性化を増大させることを含む方法を提供する。
【０１２８】
一部の実施形態では、上記量の化合物および上記量のチェックポイント阻害剤は、各々定期的に被験体に投与される。
【０１２９】
一部の実施形態では、上記量の化合物および上記量のチェックポイント阻害剤は、同時に、個別に、または逐次的に投与される。
【０１３０】
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＰ２Ａ阻害剤と同時に、ＰＰ２Ａ阻害剤の前に、またはＰＰ２Ａ阻害剤の後に投与される。
【０１３１】
一部の実施形態では、一緒に投与される場合の上記量のチェックポイント阻害剤および上記量の化合物は、同量の各薬剤が単独で投与される場合よりも、被験体を処置するのに有効である。
【０１３２】
一部の実施形態では、一緒に投与される場合の上記量の化合物および上記量のチェックポイント阻害剤は、被験体におけるがんの臨床症状を低減させるのに有効である。
【０１３３】
一部の実施形態では、化合物は、チェックポイント阻害剤の免疫療法的効果を増強させる。
【０１３４】
一部の実施形態では、がんは、免疫応答による処置に対して感受性である。
【０１３５】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４剤である。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブである。
【０１３７】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１剤である。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブである。
【０１３９】
一部の実施形態では、がんは、黒色腫、腎細胞癌、前立腺がん、尿路上皮癌、または卵巣がんである。
【０１４０】
一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、０．８３ｍｇ／ｍ２、１．２５ｍｇ／ｍ２、１．７５ｍｇ／ｍ２、２．３３ｍｇ／ｍ２、または３．１ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１４２】
一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、２．３３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、３週間毎に３日間投与される。
【０１４４】
一部の実施形態では、イピリムマブは、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される。
【０１４５】
一部の実施形態では、イピリムマブは、３週間毎またはそれより少なく、９０分にわたり静脈内に投与される。
【０１４６】
一部の実施形態では、アテゾリズマブは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される。
【０１４７】
一部の実施形態では、アテゾリズマブは、３週間毎またはそれより少なく、６０分にわたり静脈内に投与される。
【０１４８】
一部の実施形態では、ニボルマブは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される。
【０１４９】
一部の実施形態では、ニボルマブは、２週間毎またはそれより少なく、６０分にわたり静脈内に投与される。
【０１５０】
一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で静脈内に投与される。
【０１５１】
一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、３週間毎またはそれより少なく、３０分にわたり静脈内に投与される。
【０１５２】
本発明はまた、Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害する方法であって、Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによってＣＴＬＡ−４の機能を阻害することを含む方法を提供する。
【０１５３】
本発明はまた、Ｔ細胞におけるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害する方法であって、Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによってＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害することを含む方法を提供する。
【０１５４】
一部の実施形態では、本方法において、ＰＰ２Ａ阻害剤は、構造：
【化１】
2020502094.tif 000002
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
一緒になったＲ１およびＲ２が、＝Ｏであり、
Ｒ３が、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ９、Ｏ（ＣＨ２）１〜６Ｒ９、ＳＨ、Ｓ−、もしくはＳＲ９であり、
ここで、Ｒ９が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり、
Ｒ４が、
【化２】
2020502094.tif 000003
であり、
式中、Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、Ｎ＋ＨＲ１０、もしくはＮ＋Ｒ１０Ｒ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
【化３】
2020502094.tif 000004
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１１、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１１であり、
ここで、各Ｒ１１が、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニルであり、
Ｒ５およびＲ６が、一緒になって＝Ｏであり、
Ｒ７およびＲ８が、各々Ｈである。
【０１５５】
一部の実施形態では、化合物は、構造：
【化４】
2020502094.tif 000005
を有する。
【０１５６】
一部の実施形態では、化合物内の結合αは存在する。
【０１５７】
一部の実施形態では、化合物内の結合αは存在しない。
【０１５８】
一部の実施形態では、Ｒ３は、ＯＨ、Ｏ−、またはＯＲ９であり、
ここで、Ｒ９は、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、
Ｒ４は、
【化５】
2020502094.tif 000006
であり、
式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、Ｎ＋ＨＲ１０、またはＮ＋Ｒ１０Ｒ１０であり、
ここで、各Ｒ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
【化６】
2020502094.tif 000007
である。
【０１５９】
一部の実施形態では、Ｒ３は、ＯＨ、Ｏ−、またはＯＲ９であり、ここで、Ｒ９は、Ｈ、メチル、エチル、またはフェニルである。
【０１６０】
一部の実施形態では、Ｒ３は、ＯＨ、Ｏ−、またはＯＲ９であり、ここで、Ｒ９は、メチルである。
【０１６１】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化７】
2020502094.tif 000008
である。
【０１６２】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化８】
2020502094.tif 000009
であり、式中、Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、または
【化９】
2020502094.tif 000010
である。
【０１６３】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化１０】
2020502094.tif 000011
であり、式中、Ｒ１０は、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または
【化１１】
2020502094.tif 000012
である。
【０１６４】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化１２】
2020502094.tif 000013
である。
【０１６５】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化１３】
2020502094.tif 000014
であり、式中、Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
【化１４】
2020502094.tif 000015
である。
【０１６６】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化１５】
2020502094.tif 000016
である。
【０１６７】
一部の実施形態では、Ｒ４は、
【化１６】
2020502094.tif 000017
である。
【０１６８】
一部の実施形態では、化合物は、構造
【化１７】
2020502094.tif 000018
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
Ｒ９が、存在しているかもしくは存在せず、存在している場合には、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはフェニルであり、かつ
Ｘが、Ｏ、ＮＲ１０、ＮＨ＋Ｒ１０、もしくはＮ＋Ｒ１０Ｒ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、
【化１８】
2020502094.tif 000019
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１２、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１２であり、
ここで、Ｒ１２が、Ｈもしくはアルキルである。
【０１６９】
一部の実施形態では、化合物は、構造
【化１９】
2020502094.tif 000020
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
Ｘが、ＯもしくはＮＲ１０であり、
ここで、各Ｒ１０が、独立して、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、
【化２０】
2020502094.tif 000021
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１２、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１２であり、
ここで、Ｒ１２が、Ｈもしくはアルキルである。
【０１７０】
一部の実施形態では、化合物は、構造
【化２１】
2020502094.tif 000022
を有するか、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルであり、式中、
結合αが、存在しているかもしくは存在せず、
Ｘが、ＯもしくはＮＨ＋Ｒ１０であり、
ここで、Ｒ１０が、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、
【化２２】
2020502094.tif 000023
、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１２、もしくは−ＣＨ２ＣＯＲ１２であり、
ここで、Ｒ１２が、Ｈもしくはアルキルである。
【０１７１】
一部の実施形態では、化合物は、構造
【化２３】
2020502094.tif 000024
を有するか、またはその塩もしくはエステルである。
【０１７２】
本発明は、Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害する方法であって、Ｔ細胞にＰＰ２Ａ阻害剤を投与し、それによってＣＴＬＡ−４の機能を阻害することを含む方法を提供する。
【０１７３】
本発明はまた、がんに罹患した被験体におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害する方法であって、ＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害することを含む方法を提供する。
【０１７４】
本発明は、がんに罹患した被験体におけるＴ細胞の活性化を増大させる方法であって、ＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与し、それによってＴ細胞の活性化を増大させることを含む方法をさらに提供する。
【０１７５】
本発明は、がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させる方法であって、ＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与し、それによってがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させることを含む方法をさらに提供する。
【０１７６】
本発明はまた、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤および有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、被験体を処置するのに有効である、方法を提供する。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、ＰＰ２ＡとＣＴＬＡ−４との相互作用を改変する。
【０１７８】
一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、ＣＴＬＡ−４へのＰＰ２Ａの結合を低下させる。
【０１７９】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、がんは、抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性である。
【０１８０】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、被験体は、ＣＴＬＡ−４によって媒介される、Ｔ細胞の活性化の低減を有する。
【０１８１】
本発明はまた、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与し、それによってがんを処置することを含み、がんが抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性である、方法を提供する。
【０１８２】
本発明はまた、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与し、それによってがんを処置することを含み、がんが免疫療法に対して感受性である、方法を提供する。
【０１８３】
本発明はまた、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与し、それによってがんを処置することを含み、被験体が、ＣＴＬＡ−４によって媒介される、Ｔ細胞の活性化の低減を有する、方法を提供する。
【０１８４】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、がんは、抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性である。
【０１８５】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、被験体は、ＣＴＬＡ−４によって媒介される、Ｔ細胞の活性化の低減を有する。
【０１８６】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、がんは、黒色腫、腎細胞癌、前立腺がん、尿路上皮癌、または卵巣がんである。
【０１８７】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。
【０１８８】
上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性であるがんは、黒色腫である。
【０１８９】
一部の実施形態では、がんは、膵臓がんである。
【０１９０】
一部の実施形態では、がんは膵臓がんであり、膵臓がんのがん細胞は、Ｍａｄ２を過剰発現する。
【０１９１】
一部の実施形態では、がんは、ＰＰ２Ａ機能および／またはＤＮＡ損傷修復経路に異常を有する。
【０１９２】
一部の実施形態では、被験体は、線維肉腫、軟骨肉腫、胸腺腫、非定型肺カルチノイド、または卵巣がん、精巣がん、乳がん、もしくは前立腺がんに罹患している。
【０１９３】
上記の方法の一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、がんに罹患した被験体を処置するのに有効である。
【０１９４】
一部の実施形態では、上記の方法は、ＰＰ２Ａ阻害剤と同時に、ＰＰ２Ａ阻害剤の前に、またはＰＰ２Ａ阻害剤の後に、抗がん療法を投与することをさらに含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、抗がん療法は、チェックポイント阻害剤、例えばＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤を投与することを含む。上記の方法の一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤の化学療法的効果を増強させる。
【０１９６】
上記の方法の一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤は、抗体である。
【０１９７】
上記の方法の一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、ＰＰ２ＡとＣＴＬＡ−４との相互作用を改変する。
【０１９８】
上記の方法の一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、ＣＴＬＡ−４へのＰＰ２Ａの結合を増大させる。
【０１９９】
抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性であるがんには、限定はしないが、前臨床または臨床試験において抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に適していることが示されているがんが含まれる。
【０２００】
抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１免疫療法に対して感受性であるがんには、限定はしないが、前臨床または臨床試験において抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１免疫療法に適していることが示されているがんが含まれる。
【０２０１】
一部の実施形態では、化合物の量は、被験体におけるがんの臨床症状を低減させるのに有効である。
【０２０２】
一部の実施形態では、処置は、被験体における細胞傷害性Ｔ細胞の量を増大させることを含む。
【０２０３】
一部の実施形態では、処置は、被験体におけるがん細胞と相互作用する細胞傷害性Ｔ細胞の量を増大させることを含む。
【０２０４】
一部の実施形態では、処置は、被験体における細胞傷害性Ｔ細胞によって死滅するがん細胞の量を増大させることを含む。
【０２０５】
Ｔ細胞のタイプには、「キラー」細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞および「ヘルパー」ＣＤ４＋Ｔ細胞が含まれる。後者は、「Ｔｒｅｇ」細胞などの免疫応答の調節に関与するサブタイプ、および、キラーＴ細胞または抗体産生Ｂ細胞を刺激し得る「非自己」タンパク質の認識を含む獲得免疫系を刺激するその他のサブタイプを包含する。低レベルでの抗原曝露後に「記憶」Ｔ細胞としてその一部が維持される特異的なＴ細胞クローンは、特定のＭＨＣ／エピトープの組み合わせによって活性化され、サイトカインの放出、クローンの増殖、および獲得免疫応答をもたらす。
【０２０６】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２０７】
一部の実施形態では、がんは、肝細胞癌、ヒト骨肉腫、原発性肝臓がん、胃がん、卵巣がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、軟組織肉腫、精上皮腫、乳がん、リンパ腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、粘液性卵巣がん、尿路上皮膀胱がん、子宮頚部の扁平上皮癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肺腺腫、ヘパトーマ、腸がん、線維肉腫、骨肉腫、前立腺がん、血管筋脂肪腫、乳腺癌、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、および多発性骨髄腫、ならびに他の形質細胞新生物である。
【０２０８】
一部の実施形態では、がんは、肺腺腫、ヘパトーマ、肝細胞癌、腸がん、リンパ腫、線維肉腫、骨肉腫、前立腺がん、血管筋脂肪腫、または乳腺癌である。
【０２０９】
一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病である。
【０２１０】
一部の実施形態では、がんは、乳がん、結腸がん、大細胞肺がん、肺腺癌、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、卵巣腺癌、膵臓癌、前立腺癌、前骨髄球性白血病（ｐｒｏｍｙｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫および形質細胞新生物、結腸直腸がん、卵巣がん、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、神経膠芽腫、脊索腫、髄膜腫（非悪性のおよび悪性の）、びまん性内在性橋神経膠腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｏｔｉｎｅ  ｇｌｉｏｍａ）、または非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍である。
【０２１１】
上記の方法の一部の実施形態では、がんは、乳がん、結腸がん、大細胞肺がん、肺腺癌、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、卵巣腺癌、膵臓癌、前立腺癌、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫および形質細胞新生物、結腸直腸がん、卵巣がん、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫である。
【０２１２】
上記の方法の一部の実施形態では、がんは、脳がんである。
【０２１３】
上記の方法の一部の実施形態では、脳がんは、神経膠腫、重細胞性星状細胞腫、低悪性度びまん性星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｒｎｅ）、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｒｎａ）、上衣腫、髄膜腫、脳下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、またはびまん性内在性橋神経膠腫である。
【０２１４】
上記の方法の一部の実施形態では、抗がん剤を被験体に投与することをさらに含む。
【０２１５】
上記の方法の一部の実施形態では、抗がん剤は、Ｘ線放射または電離放射線から選択される。
【０２１６】
上記の方法の一部の実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。
【０２１７】
上記の方法の一部の実施形態では、がん細胞は、乳がん、結腸がん、大細胞肺がん、肺腺癌、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、卵巣腺癌、膵臓癌、前立腺癌、前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病（ｌｅｕｅｍｉａ）、急性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、卵巣がん、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫の細胞である。
【０２１８】
ＬＢ−１００の類似体は、ＬＢ−１００と類似の活性を有し、本明細書において記載される方法において同様の効果を示す。このような類似体には、その各々の内容が参照によって本明細書に組み込まれる、２００８年８月１４日に公開されたＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００８／０９７５６１号、２０１０年２月４日に公開されたＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１０／０１４２５４号、２０１５年５月２１日に公開されたＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１５／０７３８０２号、および２０１６年１１月２４日に公開されたＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１６／１８６９６３号において記載されている化合物が含まれる。
【０２１９】
ＬＢ−１００および／またはエンドタールのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のためのプロドラッグとして作用する化合物は、ＬＢ−１００と類似の活性を有し、本明細書において記載される方法において同様の効果を示す。より具体的には、プロドラッグの投与は、ＬＢ−１００の投与と同様の効果をもたらす。ＬＢ−１００および／またはエンドタールのプロドラッグには、その各々の内容が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年５月２１日に公開されたＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１５／０７３８０２号、および２０１６年１１月２４日に公開されたＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１６／１８６９６３号において記載されている化合物が含まれる。
【０２２０】
別段の特定がある場合を除き、本発明の方法において使用される化合物の構造が不斉炭素原子を含む場合、化合物が、ラセミ体、ラセミ混合物、および単離された単一のエナンチオマーとして生じることが理解される。これらの化合物の全てのこのような異性体形態は、本発明に明白に含まれる。別段の特定がある場合を除き、各不斉炭素（ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ）は、ＲまたはＳ立体配置のものであり得る。したがって、別段の指示がない限り、このような非対称から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）が、本発明の範囲内に含まれることが理解されよう。このような異性体は、伝統的な分離技術によって、および、Ｊ．  Ｊａｃｑｕｅｓ、Ａ．  Ｃｏｌｌｅｔ、およびＳ．  Ｗｉｌｅｎによる「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ刊、ＮＹ、１９８１年において記載されているものなどの、立体化学的に制御された合成によって、実質的に純粋な形態で得ることができる。例えば、分割は、キラルカラム上での分取クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０２２１】
本発明はまた、本明細書において開示される方法において、化合物上に生じる原子の全ての同位体を含むものである。同位体には、同一の原子番号を有するが異なる質量数を有する原子が含まれる。一般例として、また限定はしないが、水素の同位体には、トリチウムおよび重水素が含まれる。炭素の同位体には、Ｃ−１３およびＣ−１４が含まれる。
【０２２２】
本願の全体を通して、構造における炭素のいかなる表記法も、さらなる表記法を伴わずに使用される場合、１２Ｃ、１３Ｃ、または１４Ｃなどの炭素の全ての同位体を表すものであることに留意されたい。さらに、１３Ｃまたは１４Ｃを含有するいかなる化合物も、本明細書において開示される化合物のいずれかの構造を具体的に有し得る。本願の全体を通して、構造における水素のいかなる表記法も、さらなる表記法を伴わずに使用される場合、１Ｈ、２Ｈ、または３Ｈなどの水素の全ての同位体を表すものであることにも留意されたい。さらに、２Ｈまたは３Ｈを含有するいかなる化合物も、本明細書において開示される化合物のいずれかの構造を具体的に有し得る。同位体で標識された化合物は、一般に、利用される標識されていない試薬の代わりに、同位体で標識された適切な試薬を使用して、当業者に公知の従来の技術によって調製することができる。
【０２２３】
一部の実施形態では、本方法では、被験体に、被験体におけるがんを処置するための、本発明の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が投与される。
【０２２４】
一部の実施形態では、医薬組成物において、薬学的に許容される担体は、リポソームを含む。
【０２２５】
一部の実施形態では、医薬組成物において、化合物は、リポソームまたはミクロスフェア内に含有される。
【０２２６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＰＰ２Ａ阻害剤およびＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤を含む。
【０２２７】
上記の方法または使用のいずれかの、一部の実施形態では、被験体はヒトである。
【０２２８】
上記の方法または使用のいずれかの、一部の実施形態では、化合物および／またはＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤は、被験体に経口投与される。
【０２２９】
本発明は、Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の機能の阻害において使用するための、ＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３０】
本発明は、がんに罹患した被験体におけるＣＴＬＡ−４の機能の阻害において使用するための、ＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３１】
本発明は、がんに罹患した被験体におけるＴ細胞の活性化の増大において使用するための、ＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３２】
本発明は、がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答の増大において使用するための、ＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３３】
本発明は、がんに罹患した被験体の処置において使用するためのＰＰ２Ａ阻害剤であって、がんが抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性である、ＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３４】
本発明は、がんに罹患した被験体の処置において使用するためのＰＰ２Ａ阻害剤であって、被験体がＣＴＬＡ−４によって媒介される、Ｔ細胞の活性化の低減を有する、ＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３５】
本発明は、がんに罹患した被験体の処置において使用するための、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたＰＰ２Ａ阻害剤を提供する。
【０２３６】
Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害するための、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２３７】
がんに罹患した被験体におけるＣＴＬＡ−４の機能を阻害するための、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２３８】
がんに罹患した被験体におけるＴ細胞の活性化を増大させるための、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２３９】
がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させるための、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２４０】
がんに罹患した被験体を処置するための、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用であって、がんが抗ＣＴＬＡ−４免疫療法に対して感受性である、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２４１】
がんに罹患した被験体を処置するための、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用であって、被験体がＣＴＬＡ−４によって媒介される、Ｔ細胞の活性化の低減を有する、ＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２４２】
がんに罹患した被験体を処置するための、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたＰＰ２Ａ阻害剤の使用。
【０２４３】
本発明はまた、１投与量のＬＢ−１００を投与されている被験体の血流中のＬＢ−１００の濃度を最適化する方法であって、
【０２４４】
（ａ）被験体におけるＬＢ−１００の血漿中濃度を測定するステップ、
【０２４５】
（ｂ）さらなるＬＢ−１００用量を被験体に投与する必要があるかを、（ａ）の測定値に基づいて決定するステップ、および
【０２４６】
（ｃ）（ｂ）の決定に基づいて、必要に応じてさらなる１投与量または複数投与量のＬＢ−１００を投与するステップ
を含む方法を提供する。
【０２４７】
一部の実施形態では、上記のステップ（ｂ）は、さらなるＬＢ−１００用量を被験体に投与する必要があるかを、（ａ）の測定値がＬＢ−１００の最小有効濃度（ＭＥＣ）を上回るか、下回るか、またはそれに等しいかに基づいて決定することを含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００の初回用量は、０．１ｍｇ／ｍ２から５ｍｇ／ｍ２の量である。
【０２４９】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、０．１ｍｇ／ｍ２から５ｍｇ／ｍ２の量である。
【０２５０】
一部の実施形態では、化合物は、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、０．８３ｍｇ／ｍ２、１．２５ｍｇ／ｍ２、１．７５ｍｇ／ｍ２、２．３３ｍｇ／ｍ２、または３．１ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０２５１】
一部の実施形態では、化合物は、２．３３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０２５２】
一部の実施形態では、化合物は、３週間毎に３日間投与される。
【０２５３】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、初回用量よりも２５％少ない量である。
【０２５４】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、初回用量よりも５０％少ない量である。
【０２５５】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、初回用量よりも７５％少ない量である。
【０２５６】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、初回用量よりも２５％多い量である。
【０２５７】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、初回用量よりも５０％多い量である。
【０２５８】
一部の実施形態では、被験体に投与されるＬＢ−１００のさらなる用量は、初回用量よりも７５％多い量である。
【０２５９】
一部の実施形態では、被験体は、投与と同時に、投与前に、または投与後に、抗がん療法でさらに処置される。
【０２６０】
抗がん療法の例には、放射線療法もしくは化学療法、抗原放出を促進するための標的化療法、抗原提示を促進するためのワクチン接種、Ｔ細胞の活性化を増幅させるための共刺激分子のアゴニストもしくは共阻害分子の遮断、調節性Ｔ細胞もしくは骨髄由来サプレッサー細胞の輸送阻害、腫瘍内のＴ細胞の浸潤を刺激するための抗血管内皮増殖因子、Ｔ細胞の浸潤によるがんの認識を増大させるための養子細胞移入、または腫瘍の死滅の刺激が含まれる。さらなる例は、Ｓｗａｒｔら、２０１６年；Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１５年；およびＴｓｉａｔａｓら、２０１６年で見ることができる。
【０２６１】
一部の実施形態では、抗がん療法は、免疫療法を含む。用語「免疫療法」は、免疫応答を誘発する、増強する、抑制する、または他の仕方で修飾することを含む方法による、疾患に罹患した被験体の処置を指す。免疫療法剤には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＯＣ４０、ＬＡＧ−３、ＫＩＲ、ＴＩＭ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２８、ＣＤ４０、およびＣＤ１３７の１つまたは複数を標的化する抗体剤が含まれ得る。
【０２６２】
一部の実施形態では、抗がん療法は、抗がん剤を投与することを含む。
【０２６３】
一部の実施形態では、抗がん剤は、免疫チェックポイント調節物質である。用語「免疫チェックポイント調節物質」は、免疫チェックポイントと直接的または間接的に相互作用する薬剤を指す。免疫チェックポイント調節物質は、阻害シグナルを克服し、がん細胞に対する免疫攻撃を許可するおよび／または強めるために投与され得る。一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節物質は、免疫エフェクター応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を増大させる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節物質は、１つまたは複数の抗原に対する免疫寛容を低減させる、除去する、または予防する。例えば、免疫チェックポイント調節物質は、負の免疫応答調節因子（例えば、ＣＴＬＡ４）によるシグナル伝達を低下させる、阻害する、もしくは無効にすることによって、免疫応答の正の調節因子（例えば、ＣＤ２８）のシグナル伝達を刺激するもしくは増強させることによって、または、自己免疫応答を予防し、免疫細胞媒介性の組織損傷を限定することによって、免疫細胞応答を容易にし得る。
【０２６４】
一部の実施形態では、抗がん剤は、抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０２６５】
一部の実施形態では、抗がん剤は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブである。
【０２６６】
Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）の活性成分であるアテゾリズマブは、ヒトプログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）の遮断抗体である。アテゾリズマブは、特異的抗体によって同定される（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（参照ＩＤ：４０００５２５）［オンライン］、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、２０１６年［２０１７年２月２４日に検索した］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１６／７６１０４１ｌｂｌ．ｐｄｆ＞から検索した）。
【０２６７】
アテゾリズマブの推奨される用量およびスケジュールは、１２００ｍｇであり、これは、疾患の進行または許容されない毒性が生じるまで、３週間毎に６０分にわたり静脈内に投与される。その後の注入は、最初の注入が耐容性を示す場合、３０分にわたり送達され得る。
【０２６８】
一部の実施形態では、アテゾリズマブの投与は、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満のアテゾリズマブを含む。
【０２６９】
一部の実施形態では、アテゾリズマブの定期的な投与は、１回、２回、３回、４回、またはそれ未満のアテゾリズマブの投与を含む。
【０２７０】
一部の実施形態では、ニボルマブの投与は、２週間もしくは３週間毎かまたはそれより少ない。
【０２７１】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体に特異的に結合し、ＰＤ−１の活性を阻害する（「抗ＰＤ−１抗体」）。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブまたはペムブロリズマブである。
【０２７２】
Ｏｐｄｉｖｏ（商標）の活性成分であるニボルマブは、ヒトプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）の遮断抗体である。ニボルマブは、特異的抗体によって同定される（Ｏｐｄｉｖｏ（商標）、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（参照ＩＤ：３６７７０２１）［オンライン］、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、２０１４年［２０１７年２月２４日に検索した］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１４／１２５５５４ｌｂｌ．ｐｄｆ＞から検索した）。
【０２７３】
ニボルマブの推奨される用量およびスケジュールは３ｍｇ／ｋｇであり、これは、疾患の進行または許容されない毒性が生じるまで、４用量が２週間毎に６０分にわたり静脈内に投与される。
【０２７４】
一部の実施形態では、ニボルマブの投与は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満のニボルマブを含む。
【０２７５】
一部の実施形態では、ニボルマブの定期的な投与は、１回、２回、３回、４回、またはそれ未満のニボルマブの投与を含む。
【０２７６】
一部の実施形態では、ニボルマブの投与は、２週間もしくは３週間毎かまたはそれより少ない。
【０２７７】
Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）の活性成分であるペムブロリズマブは、ヒトプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）の遮断抗体である。ペムブロリズマブは、特異的抗体によって同定される（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（参照ＩＤ：３６２１８７６）［オンライン］、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．、２０１４年［２０１７年２月２４日に検索した］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１４／１２５５１４ｌｂｌ．ｐｄｆ＞から検索した）。
【０２７８】
ペムブロリズマブの推奨される用量およびスケジュールは、２ｍｇ／ｋｇであり、これは、疾患の進行または許容されない毒性が生じるまで、３週間毎に３０分にわたり静脈内に投与される。
【０２７９】
一部の実施形態では、ペムブロリズマブの投与は、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満のペムブロリズマブを含む。
【０２８０】
一部の実施形態では、ペムブロリズマブの定期的な投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、またはそれ未満のペムブロリズマブの投与を含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、ペムブロリズマブの投与は、２週間もしくは３週間毎かまたはそれより少ない。
【０２８２】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の活性を阻害する（「抗ＣＴＬＡ−４抗体」）。別の実施形態では、一部の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブである。
【０２８３】
Ｙｅｒｖｏｙ（商標）の活性成分であるイピリムマブは、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）の遮断抗体である。イピリムマブは、特異的抗体によって同定される（Ｙｅｒｖｏｙ、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（参照ＩＤ：３８３９６５３）［オンライン］、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、２０１５年［２０１７年２月２４日に検索した］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１５／１２５３７７ｓ０７３ｌｂｌ．ｐｄｆ＞から検索した）。
【０２８４】
切除不能または転移性の黒色腫のためのイピリムマブの推奨される用量およびスケジュールは３ｍｇ／ｋｇであり、これは、４用量が３週間毎に９０分にわたり静脈内に投与される。黒色腫のアジュバント処置のためのイピリムマブの推奨される用量およびスケジュールは１０ｍｇ／ｋｇ（４用量が３週間毎に９０分にわたり静脈内に投与される）、それに続き、最大３年間、１２週間毎に１０ｍｇ／ｋｇである。
【０２８５】
一部の実施形態では、イピリムマブの投与は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満のイピリムマブを含む。
【０２８６】
一部の実施形態では、イピリムマブの定期的な投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、またはそれ未満のイピリムマブの投与を含む。
【０２８７】
本発明はまた、被験体における腫瘍またはがんを処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含み、腫瘍またはがんが、免疫応答による処置に対して感受性である、方法を提供する。
【０２８８】
本発明はまた、がんに罹患した被験体におけるがん細胞に対するＴ細胞応答を増大させる方法であって、Ｔ細胞応答を増大させるのに有効な量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０２８９】
一部の実施形態では、ＰＰ２Ａ阻害剤は、構造：
【化２４】
2020502094.tif 000025
を有する。
【０２９０】
一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数のさらなる抗がん剤を投与することをさらに含む。
【０２９１】
本発明はまた、がんに罹患した被験体を処置する方法であって、有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を有効量の抗がん療法と組み合わせて被験体に投与することを含み、合わせた場合の量が、被験体を処置するのに有効である、方法を提供する。
【０２９２】
本発明はまた、がんに罹患し、抗がん療法を受けている被験体を処置する方法であって、抗がん療法単独と比較して処置を増強させるのに有効な有効量のＰＰ２Ａ阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０２９３】
一部の実施形態では、がんは、免疫応答による処置に対して感受性である。
【０２９４】
本発明の方法において使用される化合物は、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）阻害剤である。調製方法は、Ｌｕら、２００９年；ＵＳ７，９９８，９５７Ｂ２；およびＵＳ８，４２６，４４４Ｂ２で見ることができる。化合物ＬＢ−１００は、ヒトがん細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびマウスに非経口投与した場合にはマウスにおけるヒト腫瘍細胞の異種移植片における、ＰＰ２Ａの阻害剤である。ＬＢ−１００は、マウスモデル系におけるがん細胞の成長を阻害する。
【０２９５】
本明細書において使用する場合、再灌流傷害に関連する「症状」には、再灌流傷害に関連するあらゆる臨床上または実験上の症状発現が含まれ、これは、被験体が感じ得るかまたは観察し得るものに限定されない。
【０２９６】
本明細書において使用する場合、「疾患の処置」または例えば再灌流傷害を「処置すること」は、疾患、または疾患に関連する症状もしくは状態の予防、阻害、退縮、または静止を誘発することを包含する。
【０２９７】
本明細書において使用する場合、被験体における疾患の進行または疾患の合併症の「阻害」は、被験体における疾患の進行および／または疾患の合併症を予防することまたは低減させることを意味する。
【０２９８】
本明細書において使用する場合、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する分岐鎖状および直鎖状の両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むことが意図される。したがって、「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」のようにＣ１〜Ｃｎは、１つ、２つ、・・・ｎ−１個、またはｎ個の炭素を直鎖状または分岐鎖状の配置で有する基を含むと定義され、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルなどを含む。一実施形態は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキル、Ｃ３〜Ｃ２０アルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルなどであり得る。一実施形態は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキル、Ｃ３〜Ｃ３０アルキル、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルなどであり得る。「アルコキシ」は、酸素架橋を介して付着している上記のアルキル基を表す。
【０２９９】
用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素間二重結合を含有する、直鎖状または分岐鎖状の非芳香族炭化水素ラジカルを指し、可能性のある最大数の非芳香族炭素間二重結合が存在し得る。したがって、Ｃ２〜Ｃｎアルケニルは、１つ、２つ、・・・ｎ−１個、またはｎ個の炭素を有する基を含むと定義される。例えば、「Ｃ２〜Ｃ６アルケニル」は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの炭素原子、および少なくとも１つの炭素間二重結合、および例えばＣ６アルケニルの場合では最大３つの炭素間二重結合を有するアルケニルラジカルをそれぞれ意味する。アルケニル基には、エテニル、プロペニル、ブテニル、およびシクロヘキセニルが含まれる。アルキルに関して上記に記載したように、アルケニル基の直鎖状、分岐鎖状、または環状の部分は、二重結合を含有し得、置換されたアルケニル基が示される場合には、置換されていてよい。一実施形態は、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、またはＣ３〜Ｃ３０アルケニルであり得る。
【０３００】
用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素間三重結合を含有する直鎖状または分岐鎖状の炭化水素ラジカルを指し、可能性のある最大数の非芳香族炭素間三重結合が存在し得る。したがって、Ｃ２〜Ｃｎアルキニルは、１つ、２つ、・・・ｎ−１個、またはｎ個の炭素を有する基を含むと定義される。例えば、「Ｃ２〜Ｃ６アルキニル」は、２つもしくは３つの炭素原子および１つの炭素間三重結合を有する、または４つもしくは５つの炭素原子および最大２つの炭素間三重結合を有する、または６つの炭素原子および最大３つの炭素間三重結合を有するアルキニルラジカルを意味する。アルキニル基には、エチニル、プロピニル、およびブチニルが含まれる。アルキルに関して上記に記載したように、アルキニル基の直鎖状または分岐鎖状の部分は、三重結合を含有し得、置換されたアルキニル基が示される場合には、置換されていてよい。一実施形態は、Ｃ２〜Ｃｎアルキニルであり得る。一実施形態は、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、またはＣ３〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニル、またはＣ３〜Ｃ３０アルキニルであり得る。
【０３０１】
本明細書において使用する場合、「アリール」は、少なくとも１つの環が芳香族である、各環内に最大１０個の原子がある、任意の安定な単環式または二環式の炭素環を意味するものである。このようなアリールエレメントの例には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロ−ナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリル、またはアセナフチルが含まれる。アリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族である場合では、付着が芳香環を介するものであることが理解される。本発明に含まれる置換されたアリールは、任意の適切な位置での、アミン、置換されたアミン、アルキルアミン、ヒドロキシ、およびアルキルヒドロキシでの置換を含み、ここで、アルキルアミンおよびアルキルヒドロキシの「アルキル」部分は、本明細書において上記で定義したように、Ｃ２〜Ｃｎアルキルである。置換されたアミンは、本明細書において上記で定義したような、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール基で置換されていてよい。
【０３０２】
アルキル、アルケニル、またはアルキニルのそれぞれの存在は、分岐しているかまたは分岐しておらず、置換されていないかまたは置換されている。
【０３０３】
アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリール置換基は、具体的に別段の定義がない限り、置換されていても置換されていなくてもよい。例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは、ＯＨ、オキソ、ハロゲン、アルコキシ、ジアルキルアミノ、またはヘテロシクリル、例えば、モルホリニル、ピペリジニルなどから選択される１つまたは複数の置換基で置換されていてよい。
【０３０４】
本発明の化合物において、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１つまたは複数の水素原子を、本明細書において記載される非水素基によって可能な限り置き換えることによって、さらに置換され得る。これらには、限定はしないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、シアノ、およびカルバモイルが含まれる。
【０３０５】
用語「置換された」は、本明細書において使用する場合、所与の構造が、上記に定義したようなアルキル、アルケニル、またはアリール基であり得る置換基を有することを意味する。この用語は、指定された置換基による複数の度合いの置換を含むと見なされるものとする。複数の置換基部分が開示されるかまたは特許請求される場合、置換された化合物は、開示されたまたは特許請求された置換基部分の１つまたは複数によって、単独でまたは複数で、独立して置換され得る。独立して置換されるとは、（２つまたはそれよりも多くの）置換基が同一であっても異なっていてもよいことを意味する。
【０３０６】
化学的に安定で、かつ、容易に入手可能な出発材料から当技術分野において公知の技術および以下に記載する方法によって容易に合成され得る化合物を得るために、本発明の化合物上の置換基および置換パターンが当業者によって選択され得ることが理解される。置換基がそれ自体、１つより多くの基で置換されていれば、これらの複数の基は、安定な構造が得られる限り、同一の炭素上または異なる炭素上に存在し得ることが理解される。
【０３０７】
本明細書において使用する場合、薬剤を「投与すること」は、当業者に周知の様々な方法または送達系のいずれかを使用して行うことができる。投与は、例えば、経口的に、非経口的に、腹腔内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、舌下に、筋肉内に、直腸に、経頬的に（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌｌｙ）、鼻腔内に、リポソームによって、吸入を介して、膣に、眼内に、局所的送達を介して、皮下に、脂肪内に（ｉｎｔｒａａｄｉｐｏｓａｌｌｙ）、関節内に、髄腔内に、脳室内に、心室内に、腫瘍内に、脳実質内に、または実質内に行うことができる。
【０３０８】
いくつかの通常使用される薬学的担体を利用する以下の送達系が使用され得るが、これらは、本発明に従って組成物を投与するために想定される多くの考えられる系の代表にすぎない。
【０３０９】
注射可能な薬物送達系には、溶液、懸濁物、ゲル、ミクロスフェア、およびポリマー性注射液が含まれ、これらは、溶解度改変剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、およびスクロース）およびポリマー（例えば、ポリカプロラクトンおよびＰＬＧＡ）などの賦形剤を含み得る。
【０３１０】
他の注射可能な薬物送達系には、溶液、懸濁物、ゲルが含まれる。経口送達系には、錠剤およびカプセルが含まれる。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のセルロース性の材料、およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、ならびにセルロース性の材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース性の材料）、および滑沢剤（例えば、ステアレートおよびタルク）などの賦形剤を含有し得る。
【０３１１】
移植可能な系には、ロッドおよびディスクが含まれ、これらは、ＰＬＧＡおよびポリカプロラクトンなどの賦形剤を含有し得る。
【０３１２】
経口送達系には、錠剤およびカプセルが含まれる。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のセルロース性の材料、およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、およびセルロース性の材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース性の材料）、および滑沢剤（例えば、ステアレートおよびタルク）などの賦形剤を含有し得る。
【０３１３】
経粘膜送達系には、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲル、およびクリームが含まれ、これらは、可溶化剤および増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、およびアミノ酸）、および他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤を含有し得る。
【０３１４】
皮膚送達系には、例えば、水性および非水性のゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏剤、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤ならびに粉末が含まれ、これらは、可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含有し得る。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮増強剤である。
【０３１５】
再構成可能な送達系のための溶液、懸濁物、および粉末には、懸濁化剤（例えば、ゴム、キサンタン（ｚａｎｔｈａｎ）、セルロース性物質、および糖）、保湿剤（例えば、ソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧ、およびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎ、Ｔｗｅｅｎ、およびセチルピリジン（ｃｅｔｙｌ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ））、防腐剤および抗酸化剤（例えば、パラベン、ビタミンＥおよびＣ、ならびにアスコルビン酸）、抗ケーキング剤（ａｎｔｉ−ｃａｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、被覆剤、ならびにキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのビヒクルが含まれる。
【０３１６】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー応答など）を伴わない、ヒトおよび／または動物での使用に適した担体または賦形剤を指す。これは、本化合物を被験体に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、またはビヒクルであり得る。
【０３１７】
本発明の方法において使用される化合物は、塩の形態であり得る。本明細書において使用する場合、「塩」は、化合物の酸性塩または塩基性塩を作ることによって修飾されている、本化合物の塩である。感染または疾患を処置するために使用される化合物の場合では、塩は、薬学的に許容される。薬学的に許容される塩の例には、限定はしないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩；フェノールなどの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が含まれる。塩は、有機酸または無機酸を使用して作ることができる。このような酸性塩は、塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩などである。フェノレート塩は、アルカリ土類金属塩、ナトリウム、カリウム、またはリチウムである。用語「薬学的に許容される塩」は、この点において、本発明の化合物の、比較的無毒の、無機および有機の酸または塩基付加塩を指す。これらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間に、または、その遊離塩基もしくは遊離酸の形態の精製された本発明の化合物を、適切な有機もしくは無機の酸もしくは塩基と個別に反応させ、こうして形成された塩を単離することによって、ｉｎ  ｓｉｔｕで調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７年）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
【０３１８】
本発明は、本方法の化合物のエステルまたは薬学的に許容されるエステルを含む。用語「エステル」には、限定はしないが、Ｒ−ＣＯ−ＯＲ’基を含有する化合物が含まれる。「Ｒ−ＣＯ−Ｏ」部分は、本発明の親化合物に由来し得る。「Ｒ’」部分には、限定はしないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、アリール、およびカルボキシアルキル基が含まれる。
【０３１９】
本発明には、本方法の化合物の薬学的に許容されるプロドラッグエステルが含まれる。本発明の化合物の薬学的に許容されるプロドラッグエステルは、加溶媒分解によってまたは生理学的条件下で親化合物の遊離カルボン酸に変換可能なエステル誘導体である。プロドラッグの例は、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて目的の化合物をもたらす、アルキルエステルである。
【０３２０】
化合物、またはその塩、両性イオン、もしくはエステルは、任意選択で、適切な薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物内で、提供される。
【０３２１】
本明細書において使用する場合、ミリグラム単位で測定される薬剤の「量」または「用量」は、薬物製品の形態にかかわらず、薬物製品中に存在する薬剤のミリグラムを指す。
【０３２２】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）は、体重に対する表面積の比率を、種間において考慮に入れた変換係数を提供する、以下の、同等表面積投与量変換係数（Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）（表Ａ）を提供している。
【０３２３】
【表Ａ】
2020502094.tif 000026
【０３２４】
本明細書において使用する場合、用語「治療有効量」または「有効量」は、本発明の様式で使用する場合に、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー応答など）を伴わない、所望の治療応答を得るのに十分な構成成分の量を指す。具体的な有効量は、処置される特定の状態、患者の身体状態、処置される哺乳動物のタイプ、処置の期間、併用療法の性質（存在する場合）、ならびに、利用する具体的な製剤、および化合物またはその誘導体の構造などの因子によって変化する。
【０３２５】
範囲が本明細書内で与えられる場合、この範囲は、その範囲内の全ての整数および０．１単位、ならびにその任意の部分範囲を含むことが理解される。例えば、７７から９０％の範囲は、７７、７８、７９、８０、および８１％などの開示である。
【０３２６】
本明細書において使用する場合、言及された数に関する「約」は、言及された値の＋１パーセントから−１パーセントの範囲を包含する。例えば、約１００ｍｇ／ｋｇは、したがって、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９、１００、１００．１、１００．２、１００．３、１００．４、１００．５、１００．６、１００．７、１００．８、１００．９、および１０１ｍｇ／ｋｇを含む。したがって、約１００ｍｇ／ｋｇは、一実施形態では、１００ｍｇ／ｋｇを含む。
【０３２７】
パラメータの範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数、およびその１０分の１もまた、本発明によって提供されることが理解される。例えば、「０．２〜５ｍｇ／ｋｇ／日」は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．６ｍｇ／ｋｇ／日など、最大５．０ｍｇ／ｋｇ／日の開示である。
【０３２８】
前述の実施形態では、本明細書において開示される各実施形態は、他の開示される実施形態のそれぞれに適用可能であると考えられる。したがって、本明細書において記載される様々なエレメントの全ての組み合わせは、本発明の範囲内である。
【０３２９】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってより良く理解されるが、当業者は、詳述される具体的な実験は、その後に続く特許請求の範囲においてより完全に記載される本発明の実例にすぎないことを容易に理解するであろう。
【０３３０】
組み合わせ療法
黒色腫などの所与の状態を処置するための２つの薬物の投与は、いくつかの潜在的な問題を生じさせる。２つの薬物の間でのｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用は、複雑である。任意の単一の薬物の効果は、その吸収、分布、および排出に関連する。２つの薬物が体内に導入されると、各薬物は、他方の薬物の吸収、分布、および排出に影響し得、したがって他方の薬物の効果を改変し得る。例えば、１つの薬物は、他方の薬物の排出の代謝経路に関与する酵素の生産を阻害、活性化、または誘発し得る（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１９９９年）。したがって、２つの薬物を、同一の状態を処置するために投与する場合、各薬物が、ヒト被験体における他方の薬物の治療的活性を補う、他方の薬物の治療的活性に対して影響を有さない、または他方の薬物の治療的活性に干渉するかどうかは、予測不可能である。
【０３３１】
２つの薬物間の相互作用が各薬物の目的の治療的活性に影響し得るだけではなく、この相互作用は、毒性代謝物のレベルを増大させ得る（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１９９９年）。この相互作用はまた、各薬物の副作用を高め得るかまたは下げ得る。したがって、疾患を処置するために２つの薬物を投与する際、どのような変化が各薬物の負の副作用のプロファイルにおいて生じるかは、予測不可能である。
【０３３２】
加えて、２つの薬物間の相互作用の影響がいつ現れるかを正確に予測することは困難である。例えば、薬物間の代謝相互作用は、第２の薬物の初回投与の際、２つの薬物が定常状態濃度に達した後、または薬物の一方を中断した際に、明らかになり得る（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１９９９年）。
【実施例】
【０３３３】
実験の詳細
（実施例１  ＰＰ２Ａ阻害およびＣＴＬＡ−４活性）
化合物ＬＢ−１００および本明細書において開示されるＬＢ−１００のその他の同族体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＰ２Ａの相互作用を変更し、それによって、Ｔ細胞活性化のＣＴＬＡ−４媒介性阻害を遮断することによって、Ｔ細胞においてＣＴＬＡ−４の機能を阻害する。このような相互作用は、Ｔ細胞活性化の増大をもたらす。
【０３３４】
（実施例２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究：ＰＰ２ＡおよびＣＴＬＡ４）
初代ヒトＴ細胞およびジャーカットＴ細胞をＬＢ−１００を用いて処置し、Ｔ細胞活性化レベルを測定する。ＬＢ−１００は、Ｔ細胞の活性化を増大する。
【０３３５】
初代ヒトＴ細胞およびジャーカットＴ細胞をＬＢ−１００を用いて処置し、ＰＰ２Ａ：ＣＴＬＡ−４相互作用を評価する。ＬＢ−１００は、ＰＰ２ＡおよびＣＴＬＡ−４の相互作用を減少させる。
【０３３６】
初代ヒトＴ細胞およびジャーカットＴ細胞をＬＢ−１００を用いて処置し、ＰＰ２Ａリン酸化のレベルを測定する。ＬＢ−１００は、Ｔ細胞においてリン酸化を増大する。
【０３３７】
（実施例３  ＬＢ−１００および類似体の投与）
ある量の化合物ＬＢ−１００を、がんに罹患した被験体に投与する。化合物の量は、被験体において細胞傷害性Ｔ細胞の数を増大することによってがんを処置するのに有効である。
【０３３８】
本明細書において開示される化合物ＬＢ−１００の類似体を、がんに罹患した被験体に投与する。化合物の量は、被験体において細胞傷害性Ｔ細胞の数を増大することによってがんを処置するのに有効である。
【０３３９】
ある量の化合物ＬＢ−１００を、黒色腫に罹患した被験体に投与する。化合物の量は、被験体において細胞傷害性Ｔ細胞の数を増大することによってがんを処置するのに有効である。
【０３４０】
本明細書において開示される化合物ＬＢ−１００の類似体を、黒色腫に罹患した被験体に投与する。化合物の量は、被験体において細胞傷害性Ｔ細胞の数を増大することによってがんを処置するのに有効である。
【０３４１】
（実施例４  ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたＬＢ−１００の投与）
ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたある量の化合物ＬＢ−１００を、がんに罹患した被験体に投与する。化合物および阻害剤の量は、被験体を処置するのに有効である。
【０３４２】
ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたある量の化合物ＬＢ−１００を、がんに罹患した被験体に投与する。化合物の量は、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤の抗がん活性を増強するのに有効である。
【０３４３】
ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたある量の化合物ＬＢ−１００を、黒色腫に罹患した被験体に投与する。化合物および阻害剤の量は、被験体を処置するのに有効である。
【０３４４】
ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせたある量の化合物ＬＢ−１００を、黒色腫に罹患した被験体に投与する。化合物の量は、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤の抗がん活性を増強するのに有効である。
【０３４５】
（実施例５  イピリムマブまたはトレメリムマブへの追加療法としてのＬＢ−１００の有効性の評価）
追加療法は、相乗作用を提供し、副作用が低減したより低い用量を可能にする。
【０３４６】
すでにイピリムマブまたはトレメリムマブを受けている、黒色腫に罹患したヒト患者のための追加療法としてのＬＢ−１００の定期的な投与は、イピリムマブまたはトレメリムマブが単独で投与されている（同一用量で）場合よりも患者の処置において、臨床上有意義な利点を提供し、より有効である（少なくとも相加作用を、または相加作用を超えたものを提供する）。
【０３４７】
すでにＬＢ−１００を受けている、黒色腫に罹患したヒト患者のための追加療法としてのイピリムマブまたはトレメリムマブの定期的な投与は、ＬＢ−１００が単独で投与されている（同一用量で）場合よりも患者の処置において、臨床上有意義な利点を提供し、より有効である（少なくとも相加作用を、または相加作用を超えたものを提供する）。
【０３４８】
追加療法はまた、過度の有害な副作用を伴わずに、または処置の安全性に影響を及ぼさずに、患者の処置において有効性を提供する（少なくとも相加作用を、または相加作用を超えたものを提供する）。各薬剤が単独で投与される場合と比較して：
【０３４９】
１．追加療法は、黒色腫を有する患者において細胞傷害性Ｔ細胞の量の増大においてより有効である（相加作用または相加作用を超えたものを提供する）；
【０３５０】
２．追加療法は、黒色腫を有する患者において黒色腫の進行の減速においてより有効である（相加作用または相加作用を超えたものを提供する）および／または
【０３５１】
３．追加療法は、黒色腫患者においてＣＴＬＡ−４の機能の低減においてより有効である（相加作用または相加作用を超えたものを提供する）。
【０３５２】
考察（実施例１〜５）
がんとの関連で、免疫系の重要性は、がん免疫療法の開発とともにますます認識されるようになった。自己免疫を防ぐ免疫系の天然制御機序が、免疫監視を逃れるために腫瘍によって利用されることが多い。プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）などのチェックポイント分子は、腫瘍のネオ抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞の活性を抑制するように腫瘍によって構成的に活性化される免疫系の負の調節因子である（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１５年）。免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）もまた、ＣＤ８Ｔ細胞の有効性を低減するために腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に動員される。ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４シグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体は、転移性黒色腫を有する一部の患者において耐久性のある長期間応答を誘導し得る。これは、進行した黒色腫の処置のための米国食品医薬品局による２０１１年のイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）の承認および２０１４年のニボルマブ（抗ＰＤ−１）の承認につながった。複数のその他のがんにチェックポイント阻害剤の使用を拡大するために現在の臨床治験が進行中であり、がん療法へのアプローチにおいてパラダイムシフトの先駆けとなっている。しかし、患者のサブセットのみが、単剤では、チェックポイント阻害に有効に応答し、これは、免疫抑制ＴＭＥを作り出すことに複数の重複した機序が関与しているという事実を強調する。したがって、研究の活性領域は、チェックポイント阻害の効果を増大し得る組み合わせ戦略を同定することである。
【０３５３】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの活性化誘導性糖タンパク質であり、その主な機能は、Ｔ細胞応答を下方制御することである（Ｂｒｕｎｅｔ，  Ｊ．Ｆ．ら、１９８７年）。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞の表面に発現され、そこで、阻害性下流Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を誘導することおよびＴ細胞共起刺激受容体、ＣＤ２８の活性に対抗することによって主にその活性化の初期段階を抑制し、したがってＴ細胞活性化を阻害し、特定の疾患、例えば、がんに対する免疫寛容を増大する。ＣＴＬＡ−４の阻害能を説明するために、ＣＤ２８依存性共起刺激の拮抗作用および直接的な負のシグナル伝達を含むいくつかの機序が報告されている（Ｃａｒｒｅｎｏ，  Ｂ．Ｍ．ら、２０００年）。ＣＴＬＡ−４の細胞質テールは、固有の酵素活性を欠くので、このような負のシグナルの送達は、ＣＴＬＡ−４の、重要なシグナル伝達分子との会合によって提供される可能性が高い（Ｔｅｆｔ，  Ｗ．Ａ．ら、２００６年）。
【０３５４】
ＣＴＬＡ−４の阻害は、免疫チェックポイント遮断によるがんの処置のために標的化されている。細胞性およびマウス悪性疾患モデルは、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｔ細胞応答の負の調節因子の遮断が、それ自身だけで、またはその他の治療的介入とともに利用された場合に、腫瘍細胞に対する内因性応答を増大し、したがって腫瘍細胞死につながる（Ｇｒｏｓｓｏ，  Ｊ．Ｆ．ら、２０１３年）ことを実証する。前臨床知見が、それぞれＣＴＬＡ−４と結合する、完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、イピリムマブおよび完全ヒトＩｇＧ２ｍＡｂ、トレメリムマブの臨床的開発へとつながった。
【０３５５】
キナーゼによるタンパク質のリン酸化およびホスファターゼによるその脱リン酸化は、細胞増殖および細胞死を含むプロセスの多重度を調節する細胞性シグナル伝達経路の重大な構成要素である（Ｓｈｉら、２００９年）。ホスファターゼは、がん処置の潜在的に重要な標的と長く考えられてきたが、毒性に対する懸念からホスファターゼ阻害剤を開発する努力はほとんどなかった（Ｊａｎｓｓｅｎｓら、２０１２年）。
【０３５６】
プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、ＡＴＭ／ＡＴＲ依存性の応答経路および非依存性の応答経路の両方の多数のタンパク質を脱リン酸化する遍在性セリン／トレオニンホスファターゼである（Ｍｕｍｂｙ  Ｍ．、２００７年）。ＰＰ２Ａは、細胞プロセスの多様なセットに関与している。免疫系では、ＰＰ２Ａは、ＣＴＬＡ−４と会合し、活性化Ｔ細胞の阻害につながるＡｋｔの脱リン酸化を媒介すると示されている（Ｐａｒｒｙら、２００５年）。ＰＰ２Ａの薬理学的阻害は、ｐ５３、γＨ２ＡＸ、ＰＬＫ１およびＡｋｔなどの種々のシグナル伝達タンパク質の構成的リン酸化によって放射線媒介性ＤＮＡ損傷に対してがん細胞を感作し、細胞周期調節解除、ＤＮＡ修復の阻害およびアポトーシスをもたらすことがこれまでに示されている（Ｗｅｉ，  Ｄ．ら、２０１３年）。
【０３５７】
ツチハンミョウ抽出物（Ｍｙｌａｂｒｉｓ）の主な有効成分であるカンタリジンは、ＰＰ２Ａの強力な阻害剤であると示されている伝統的な漢方薬に由来する化合物である（Ｅｆｆｅｒｔｈ，  Ｔ．ら、２００５年）。カンタリジンは、これまでにヘパトーマの処置において使用されており、多剤耐性白血病細胞株に対して有効性を示しているが（Ｅｆｆｅｒｔｈ，  Ｔ．ら、２００２年）、その重度の毒性によりその臨床的有用性は制限される。天然に存在する毒素であるカンタリジン、およびその脱メチル化類似体であるノルカンタリジンは、両方ともＰＰ２Ａの強力な阻害剤であり（Ｂｅｒｔｉｎｉら、２００９年）、これらは中国において胃腸癌を有する患者において抗がん活性を有すると報告された（Ｗａｎｇら、１９８９年）が、臨床的詳細はほとんど入手できない。
【０３５８】
フォストリエシン、ＰＰ２Ａの別の選択的阻害剤は、２０年以上前に、いくつかのＵＳ  ＮＣＩ支援を受けた第１相治験において評価された。最大の治験において、フォストリエシンは、４６人の固形腫瘍患者のうち１６人（３４．８％）において疾患安定性と関連しており、用量制限毒性（ＤＬＴ）を有さなかった（Ｌｅら、２００４年）。不十分な薬物供給のために、治験は完了しなかった。
【０３５９】
ＬＢ−１００は、毒性が大幅に少ない、カンタリジンの小分子誘導体である。ＬＢ−１００およびその脂溶性同族体、ＬＢ−１０２は、種々のヒト固形腫瘍由来の細胞株の増殖を阻害する。両化合物とも、膵臓癌および肝細胞癌、線維肉腫、褐色細胞腫、神経芽細胞腫および神経膠芽腫の異種移植片に対するシスプラチン、ドキソルビシンおよびテモゾロミドの、ならびに膵臓、鼻咽頭および神経膠芽腫異種移植片に対する限局性Ｘ線の毒性を大幅に増大することなく、活性を強める（Ｂａｉら、２０１４年ａ；Ｂａｉら、２０１４年ｂ；Ｚｈａｎｇら、２０１０年；Ｍａｔｉｎｉｏｖａら、２０１１年；Ｌｕら、２００９年；Ｗｅｉら、２０１３年；Ｌｖら、２０１４年；Ｇｏｒｄｏｎら、２０１５年）。さらに、ＬＢ−１００は、卵巣癌および髄芽腫異種移植片においてシスプラチンに対する耐性を逆転させた（Ｃｈａｎｇら、２０１５年；Ｈｏら、２０１６年）。これまでの前臨床研究によって、ＬＢ−１００は、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、転移性褐色細胞腫および膵臓がんに対するテモゾロミド、ドキソルビシンおよび放射線療法の細胞傷害性効果を増強させ得ることが示されている（Ｗｅｉ，  Ｄ．ら、２０１３年；Ｌｕ，  Ｊ．ら、２００９年；Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．ら、２０１０年；Ｍａｒｔｉｎｉｏｖａ，  Ｌ．ら、２０１１年）。
【０３６０】
ＬＢ−１００では、固形腫瘍の処置のための、ドセタキセルと組み合わせた第１相研究も行われている（Ｃｈｕｎｇ，  Ｖ．、２０１３年）。ＬＢ−１００は、第１相治験において進行性固形腫瘍の安定化と関連する用量で良好に耐容されると最近示された、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の新規の画期的な小分子阻害剤である（Ｃｈｕｎｇら、２０１７年）。ＰＰ２Ａは、ＣＴＬＡ−４の下流でＡｋｔシグナル伝達を媒介することに関与していた（Ｐａｒｒｙら、２００５年）。ｉｎ  ｖｉｖｏプールされた短いヘアピンＲＮＡスクリーニングでは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、ＰＰ２Ａの調節因子サブユニットは、ノックダウンされた場合に、腫瘍浸潤リンパ球の増殖を、ＲＮＡライブラリー中のすべての遺伝子の中で最大程度まで増大することがわかり、ＰＰ２Ａを、腫瘍微小環境におけるＴ細胞増殖の抑制において重要な調節因子として同定した（Ｚｈｏｕら、２０１４年）。さらに、ＰＰ２Ａは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能にとって必須であるとわかった（Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓら、２０１４年）。
【０３６１】
複数の前臨床研究が、種々の腫瘍モデルにおいてＬＢ−１００は有効な化学感作物質または放射線感作物質であると示しているが（Ｈｏｎｅら、２０１５年）、免疫系に対するその効果を研究したものはなかった。
【０３６２】
ＣＴＬＡ−４機能の機能障害によって、がん患者がそのがんに対して、より有効な細胞傷害性ｔ細胞攻撃を開始することが可能となる。ＣＴＬＡ−４の主要な、臨床的に使用される調節物質、治療有効用量で顕著な毒性と関連する抗体イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）とは異なり、化合物ＬＢ−１００は、いかなる顕著な毒性も副作用も伴うこともなく、いくつかの異なる種類のがんの安定性と関連している。
【０３６３】
特に、進行した黒色腫を有する患者においてイピリムマブを用いてＣＴＬＡ−４を阻害することによる臨床的活性のいくつかの報告がある。これらの研究は、単剤イピリムマブおよびダカルバジンなどの細胞傷害性薬物と組み合わせた、または別の免疫チェックポイント阻害剤、ニボルマブと組み合わせたイピリムマブが、がんの退縮を引き起こすことを示す。イピリムマブは、単独でまたはその他の薬剤と組み合わせて、２．１％の死亡率を含む患者の最大１５％がグレード３または４の有害事象を有していたＨｏｄｉら（２０１０年）による研究においてなど、顕著な毒性と関連している。Ｗｏｌｃｈｏｋら（２０１３年）は、進行した黒色腫を有する患者においてイピリムマブおよびニボルマブを研究したが、患者の５３％においてグレード３または４の有害事象が生じた。したがって、進行性がんの安定化と関連する用量で制限毒性のない、抗ＣＴＬＡ−４活性を有するＬＢ−１００などの分子の利用可能性は、ヒトがんの処置のための魅力的な臨床候補である。現在、ＣＴＬＡ−４調節に対する臨床応答の分子決定因子はない。Ｓｎｙｄｅｒら（２０１４年）は、黒色腫のＣＴＬＡ−４処置からの潜在的利益の遺伝的根拠を報告し、各患者の候補腫瘍ネオ抗原を特徴付けるための潜在的根拠を提供した。
【０３６４】
いかなる理論にも捉われることなく、ＣＴＬＡ−４は、ヒトＴ細胞においてＰＰ２Ａと相互作用し、このような相互作用は、ＣＴＬＡ−４の適切な機能にとって必須であると考えられる。ＣＴＬＡ−４は、正しく機能している場合には、Ｔ細胞活性化を阻害し、したがって、がん細胞に対する免疫応答を低減する。がんを有する被験体へのＰＰ２Ａ阻害剤の投与は、ＰＰ２ＡのＣＴＬＡ−４との相互作用を変更し、それによって、ＣＴＬＡ−４の正常機能を乱す。Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４機能の低減または排除は、Ｔ細胞活性化の増大につながる。Ｔ細胞活性化の増大は、被験体において、がん細胞を標的とし、破壊する細胞傷害性Ｔ細胞の増大をもたらす。既存の免疫チェックポイント阻害剤と同様に、ＬＢ−１００は、単独でおよび／またはその他のチェックポイント阻害剤と組み合わせて有効である。
【０３６５】
（実施例６  進行性固形腫瘍を有する成人患者におけるＬＢ−１００の評価）
ＰＰ２Ａは、細胞分裂、ＤＮＡ損傷応答、相同組換え修復および有糸分裂停止におけるその調節性役割のために、がん療法のための潜在的に重要な標的として長く認識されているが、この酵素の阻害は、臨床使用には毒性が高すぎる可能性が高いと考えられてきた。この研究は、難治性固形腫瘍を有する患者におけるＰＰ２Ａの阻害剤ＬＢ−１００の安全性、耐容性、および潜在的抗がん活性を示す。ＰＰ２Ａ活性は、多数の種類のがんにおいて変異によって直接的にまたは間接的に変更される。ＰＰ２Ａの臨床上安全な阻害剤の利用可能性は、がん療法にとって有望な新規手段、すなわち、ＰＰ２Ａ機能において、および／またはＤＮＡ−損傷−修復経路において変異により獲得された異常を有するがんにおけるＰＰ２Ａの薬理学的阻害を開く。この研究の結果は、単独およびがんの処置のためのその他の薬剤と組み合わせたＬＢ−１００のさらなる開発を支援する。
【０３６６】
目的：進行性固形腫瘍を有する成人患者における、ＬＢ−１００、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の画期的な小分子阻害剤の安全性、耐容性および潜在的活性を評価すること。
【０３６７】
実験デザイン：ＬＢ−１００を、３＋３用量漸増デザインにおいて２１日サイクルで３日間、静脈内に毎日投与した。主な目的は、最大耐容用量および推奨第２相用量（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０１８３７６６７）を決定することであった。
【０３６８】
材料および方法
適格な患者は、進行性固形腫瘍を有すると証明された、標準治療が失敗した１８歳またはそれよりも年長とした。患者は、少なくとも１２週間の平均余命、０または１のＥＣＯＧパフォーマンスステータスを有さなくてはならず、インフォームドコンセントを得ることができなければならなかった。参加前に、患者は、先の処置からベースラインまたはグレード１未満の毒性に回復していなければならず、適当な骨髄（絶対好中球数＞１．５×１０９個／Ｌおよび血小板数＞１００×１０９個／Ｌ）、腎臓（血清クレアチニン＜１．２ｍｇ／ｄＬおよび＞１．２ｍｇ／ｄＬである場合には、クレアチニンクリアランス［Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ法］＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）および肝機能（血漿総ビリルビン＜１．５ｍｇ／ｄＬ、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）＜２．５×正常の上限）を有さなくてはならない。患者は、いかなる他の制御されない全身性疾患も有してはならない。妊娠可能性のある女性は、陰性の血清または尿妊娠検査結果を有さなくてはならなかった。
【０３６９】
研究デザインおよび処置
オープンラベル、用量漸増、第Ｉ相研究を実施して、３週間毎に３日間連続投与したＬＢ−１００の安全性、耐容性および活性を評価した。薬物動態研究を最大耐容用量（ＭＴＤ）でデザインした。出発用量、０．２５ｍｇ／ｍ２、イヌにおいて最も高い非重度毒性用量の１／１５および用量漸増のデザインは、ＦＤＡによって指定されたものである。研究は、各研究センターでヒト調査委員会によって承認され、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０１８３７６６７に登録されている。
【０３７０】
ＬＢ−１００は、単回使用溶液として供給された。最初に、ＬＢ−１００を、５０ｍＬの生理食塩水中で１５分かけて投与した。２．３３ｍｇ／ｍ２レベルでの血清クレアチニンの限定されない可逆的増大のために、ＬＢ−１００を、その後、５００ｍＬの生理食塩水中で２時間かけて投与した。用量漸増は、どのコホート内でも禁止した。患者は、容認できない毒性、疾患進行または併発性疾病が中止を必要としない限り、最大６サイクルの研究療法を受けるのに適格であった。進行および毒性の非存在下では、６を超えるサイクルが許可された。動物毒性学研究における高用量での心臓および腎毒性のために、患者は、すべてのサイクルの前に、ＥＣＧ、ＭＵＧＡまたは心エコー図、心筋トロポニンおよびＢＮＰを含む広範なモニタリングを有していた。血液化学、尿検査、血液学的プロファイルおよびバイタルサインを、各サイクルに先立って、ならびに１、３、８、１５および２２日目にモニタリングした。実験室パラメータを、最大ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥ（バージョン４．０）重症度グレードによって作表した。安全性検討委員会が２週間毎にすべての臨床データを評価し、コホート間の用量漸増を承認した。
【０３７１】
毒性および臨床活性の評価
ＬＢ−１００の用量を、３人の患者の群において漸増した。新規用量レベルの第１の患者を３週間観察し、その後、次の２人をその用量で処置した。潜在的なＤＬＴが生じた場合には、３人の新規患者をその用量に入れた。別のＤＬＴが生じた場合には、３人のさらなる患者を、以前の非ＤＬＴ用量で処置して、第２相治験のためにそのレベルの安全性を決定した。
【０３７２】
ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１を使用して処置に対する応答を評価した。測定可能な疾患を有し、ＬＢ−１００の２サイクルを完了し、少なくとも１回のベースライン後腫瘍評価を有したすべての患者が、有効性について評価可能であった。任意のＬＢ−１００を受けている患者が安全性について評価可能であった。有害な事象および実験室異常の重症度は、ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥバージョン４．０に従って報告され、医薬品規制用語集を使用してコードされている。
【０３７３】
転帰
主目的は、３週間毎に、３日間連続で静脈内に毎日投与されたＬＢ−１００の安全性、耐容性および最大耐容用量を決定することであった。二次的目的は、潜在的な抗腫瘍活性のいかなる証拠も文書に記録し、ＬＢ−１００をＭＴＤで受けている患者における、ＬＢ−１００および代謝産物、エンドタールに関する薬物動態データを得ることであった（Ｑｕａｎｇら、２０１６年）。
【０３７４】
結果：
７回の用量漸増にわたり２９人の患者のエントリーがあった。１人の患者は、急性感染のために１回の用量後に処置を停止し、回復後に再登録した。両経過は、別個の患者エントリーとして解析した。２人の患者は、３．１ｍｇ／ｍ２レベルで用量制限毒性を有していた（血清クレアチニンまたは算出された血清クレアチニンクリアランスにおける可逆的増大）。６人（２０．７％）の患者において研究薬物が関連することがほぼ確実なまたは可能性があるグレード３の有害事象が発生した［貧血（ｎ＝２）、クレアチニンクリアランスの減少、呼吸困難、低ナトリウム血症、リンパ球減少症］。応答が評価可能である２０人の患者のうち１０人（５０％）が、４またはそれより多いサイクルの間、安定病態を有していた。膵臓癌を有する１人の患者は、１０サイクル後に記載された部分応答を有しており、それは、さらに５サイクルの間維持された。安定病態に達しているその他の患者は、以下のうちの１つを有していた：線維肉腫、軟骨肉腫、胸腺腫、非定型肺カルチノイドまたは卵巣がん、精巣がん、乳がん（ｎ＝２）および前立腺がん。ＬＢ−１００の推奨第２相用量は、２．３３ｍｇ／ｍ２、３週間毎に３日間の間、毎日である。
【０３７５】
患者の特徴
進行した固形腫瘍を有する２８人の患者が４つの臨床現場で登録された。患者の人口統計学的特徴が表１に列挙されている。４人の患者は、毒性について評価可能ではなかった。これらの患者のうち３人は、サイクル１を完了する前に疾患関連合併症を有していた。非定型肺カルチノイドを有する４番目の患者を、急性感染のために１回の用量のＬＢ−１００の後に研究から除外した；該患者を７週間後に研究に再度入れ、５サイクルの間安定病態に達した。両経過を解析に含めた。これらの有害な事象のうち、薬物投与と関連していると考えられるものはなかった。
【表１】
2020502094.tif 000027
【０３７６】
用量漸増および毒性
２４人の患者が、ＬＢ−１００の３日サイクルの少なくとも１つを完了した。試験した用量レベルは、０．２５、０．５０、０．８３、１．２５、１．７５、２．３３および３．１ｍｇ／ｍ２であった。最初の６用量レベルの間、ＤＬＴはなかった。３．１ｍｇ／ｍ２用量レベルで、前立腺がんを有する患者および軟骨肉腫を有する患者は、それぞれ、４および９サイクルの処置の間、ＤＬＴを有していなかった。卵巣がんを有する第３の患者は、サイクル１後に算出されたクレアチニンクリアランスにおいてグレード３の増大を有しており、８日目までに正常に戻り、腫瘍進行前に２．３３ｍｇ／ｍ２の低減された用量でさらに３つのサイクルを受けた。線維肉腫を有する第４の患者は、第１の経過後に算出されたクレアチニンクリアランスにおいてグレード３の増大を有していた。クレアチニンは、２１日目までに処置前の値に戻り、２．３３ｍｇ／ｍ２での第２の経過は、クレアチニンクリアランスにおいてグレード２の増大をもたらし、その他の毒性は伴わなかった。用量は１．７５ｍｇ／ｍ２に低下し、さらに１０のサイクルが投与され、３６週後の進行まで毒性を伴わなかった。３．１ｍｇ／ｍ２で２／４人の患者が、サイクル１の間にクレアチニンクリアランスにおいてグレード３の増大を有していたので、３人のさらなる患者は、２．３３ｍｇ／ｍ２の先行用量レベルで評価した。該患者は制限毒性を有さず、それによって、そのレベルでＭＴＤを確立した。可逆性の軽度から中程度の疲労以外の症候性毒性はなかった。薬物投与と関連している可能性がある有害事象を、表２に列挙する。
【表２】
2020502094.tif 000028
【０３７７】
薬物動態
１人の患者において１日目に、ならびに２人の患者において１日目および３日目に２．３３ｍｇ／ｍ２のＬＢ−１００のＭＴＤで２時間注入の前および完了後４時間かけてＬＢ−１００およびエンドタールの血漿中濃度を測定した（Ｑｕａｎｇら、２０１６年）。ＬＢ−１００の薬物動態は、１日目および３日目で同様であり、低クリアランス、低分布体積および短い半減期を特徴とした。エンドタールの血漿中濃度は注入を通じて低く、１人の患者では検出の下限（５ｎｇ／ｍＬ）未満であった。その他の２人の患者では、最後のサンプリング時点（４時間）でエンドタールの最大濃度（３４．７ｎｇ／ｍＬ）が観察され、これは、その排出半減期の決定を妨げた（表３）。
【表３】
2020502094.tif 000029
【０３７８】
臨床活性の評価
測定可能な疾患を有する２０人の患者のうち、膵臓がんを有する１人の患者が、１０サイクル後に認められ、さらに５サイクル持続する部分応答を有しており、１６人の患者では、その指標病変（複数可）の進行はなかった。該患者は、新規病変の出現または臨床進行を表すと判断された症状のいずれかのために研究から除外した。十二指腸腺癌を有する１人および結腸腺癌を有する２人の、３人の患者のみが、ＲＥＣＩＳＴ判定基準によるその指標病変（複数可）の大きさの有意な増加を有していた（図１）。
【０３７９】
疾患の部分応答または安定性に達することは、明確に用量依存性ではなく、膵臓がん（１５サイクル）および非定型肺カルチノイド（５サイクル）では０．８３ｍｇ／ｍ２で、乳がん（４サイクル）および精巣がん（５サイクル）では１．２５ｍｇ／ｍ２で；および悪性胸腺腫（８サイクル）および卵巣がん（６サイクル）では１．７５ｍｇ／ｍ２で生じた。３．１ｍｇ／ｍ２で、軟骨肉腫を有する患者は、ＬＢ−１００の８サイクルの間安定であり、正常腎機能に変化は全くなかったが、３．１ｍｇ／ｍ２で開始した線維肉腫を有する患者は２回の用量低減後１２サイクルの間安定であった（図２）。
【０３８０】
結論：ＬＢ−１００の安全性、耐容性、抗腫瘍活性の予備的証拠および新規作用機序は、単独およびその他の療法と組み合わせたその継続開発を支持する。
【０３８１】
考察（実施例６）
ＬＢ−１００、ＰＰ２Ａの強力な阻害剤のＭＴＤを、固形腫瘍を有する患者において決定した。推奨第２相開始用量は、腎毒性の非存在下では３．１ｍｇ／ｍ２までの漸増、および疾患が安定または退縮している場合、腎毒性があるなら１．７５ｍｇ／ｍ２またはそれより低いものへの漸減を伴って、２．３３ｍｇ／ｍ２、３週間毎に３日間毎日である。患者は、疾患の安定性を有しており、膵臓がんを有する１人の患者は、３週間毎に３日間毎日、０．８３ｍｇ／ｍ２ほどの低い用量で膵臓がんの客観的退縮があったので、ヒトにおける最適抗がん活性は、ＭＴＤよりもかなり低い可能性がある。
【０３８２】
少なくとも２サイクルのＬＢ−１００を受けている２０人の患者のうち１０人（５０％）が、最大１５サイクルの療法の間、制限毒性も累積毒性も有さずに安定病態を有していた。この現象の根底にある機序は明らかではない。ＰＰ２Ａ活性は、変異によって、またはいくつかの内因性ＰＰ２Ａ阻害剤のうち１種もしくは複数の発現の増大によって多数の種類のがんにおいて損なわれている、または増強されている（Ｃｈａｎｇら、２０１５年；Ｐｅｒｏｔｔｉら、２０１３年；Ｓｅｓｈａｃｈａｒｙｕｌｕら、２０１３年；Ｓａｎｇｏｄｋａｒら、２０１６年）。本研究において、膵臓がんを有する１人の患者が、１１ヶ月を超える間、客観的応答およびそうでなければ安定病態を有していたので、ヒト膵臓癌の大多数においてＰＰ２Ａ活性亢進と関連しているＰＰ２Ａの調節性サブユニットの著しい過剰発現が最近報告されたことは、特別注目される（Ｈｅｉｎら、２０１６年）。ヌードマウスに同所性に移植された、ヒト膵臓細胞株における、このサブユニット、ＰＲ５５αのノックダウンは、その腫瘍形成能および転移潜在能を大幅に低減した（Ｈｅｉｎら、２０１６年）。
【０３８３】
他方、特定の理論に束縛されることを望まないが、ＰＰ２Ａ活性における後天的な欠陥は、ＰＰ２Ａのさらなる薬理学的阻害に対して腫瘍を選択的に脆弱性にし得る。例えば、ｄｅｌ（５ｑ）骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）では、ＰＰ２Ａの触媒サブユニットの対立遺伝子が欠失している（Ｓａｌｌｍａｎら、２０１４年）。レナリドミド、ＭＤＳの処置のための標準薬剤は、その中程度のＰＰ２Ａ阻害活性のために、これらのＰＰ２Ａハプロ不全のｄｅｌ（５ｑ）ＭＤＳ細胞に対して選択的に細胞傷害性であると報告された（Ｓａｌｌｍａｎら、２０１４年）。ＰＰ２Ａ阻害はまた、Ｒｂおよび／またはｐ５３経路における変異と協調して生じる、Ｍａｄ２（有糸分裂停止欠損タンパク質２）を過剰発現するがん細胞の合成致死をもたらす（Ｂｉａｎら、２０１４年；Ｓｃｈｖａｒｔｍａｎら、２０１１年）。本研究では、部分応答を有する膵臓がんの患者は、Ｍａｄ２を著しく過剰発現した。
【０３８４】
単一薬剤ＬＢ−１００が、がんの進行を阻害し得る別の可能性ある機序として、細胞傷害性Ｔ細胞機能を増強することによるものがある。特定の理論に束縛されることを望まないが、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性は、ＣＴＬＡ−４媒介性Ｔ細胞活性化にとって重要であり（Ｔｅｆｔら、２００９年）、制御性Ｔ細胞機能にとって必須である（Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓら、２０１６年）。さらに、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、ＰＰ２Ａの調節性サブユニットの阻害は、Ｔ細胞機能の公知の負の調節因子のもの以外の機序によってＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を増強する（Ｚｈｏｕら、２０１４年）。しかし、本研究では、免疫チェックポイント遮断を誘導する現在承認されている化合物を用いた場合に生じる自己免疫活性を示唆する毒性を経験した患者はいなかった。
【０３８５】
ＰＰ２Ａの臨床上安全な阻害剤の利用可能性は、がん療法のための、長い間認識されていたが、無視されてきた治療標的を利用する機会を提供する。現在の治験は、ＬＢ−１００単独が抗がん活性を有するということを示唆する。しかし、ＰＰ２Ａの薬理学的阻害は、特に、ＰＰ２Ａ機能において、および／またはＤＮＡ−損傷−修復経路において後天的異常を有する腫瘍に対して、細胞傷害性薬物と（Ｚｈｕａｎｇら、２００９年；Ｈｏｎｇら、２０１５年）および／またはその他の種類の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に、がん療法に最も有効である可能性が高い。
【０３８６】
（実施例７  組み合わせでのＬＢ−１００の投与）
抗がん療法と組み合わせたある量の化合物ＬＢ−１００を、がんに罹患した被験体に投与する。化合物および抗がん療法の量は、被験体を処置するのに有効である。
【０３８７】
抗がん療法と組み合わせたある量の化合物ＬＢ−１００を、がんに罹患した被験体に投与する。化合物の量は、抗がん療法単独に対して、抗がん活性を増強するのに有効である。
【０３８８】
（実施例８  ＰＰ２ＡおよびＰＤ−１）
ＰＰ２Ａの薬理学的阻害は、免疫活性化およびがん免疫療法を増強し得る。ＰＰ２Ａの阻害は、従来のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖を直接的に増大することによって、およびＴｒｅｇの免疫抑制機能を損なうことによって、がん免疫療法を増強するはずである。ＬＢ−１００は、免疫チェックポイント遮断の効果を増大し得ると仮定した。これは、前臨床モデルにおいて、ＰＰ２Ａの薬理学的阻害が免疫療法と相乗作用し得ることを実証する最初の研究である。
【０３８９】
Ｔ細胞に対するＬＢ−１００の効果を、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞が自己単球由来樹状細胞と共培養された、ヒト同種異系混合リンパ球反応において評価した。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞におけるＴ細胞増殖の用量依存性増大（図４Ａ〜Ｂおよび５Ａ〜Ｂ）ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ分泌の増大（図３Ａ〜Ｂ）が見られた。用量依存性増大は、Ｔ細胞での共起刺激分子ＯＸ４０発現（図６Ａ〜Ｂ）およびＴｂｅｔ、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生を駆動する転写因子（図７Ａ〜Ｂ）を増強するとわかった。ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１抗体の効果を、同一アッセイにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞で調べた。組み合わせは、抗ＰＤ−１単独（図１５）と比較して、増殖（図８Ａ〜Ｂ、９Ａ〜Ｄ）、ＯＸ４０発現（図１０Ａ〜Ｂ）、Ｔｂｅｔ発現（図１１Ａ〜Ｂ）およびＩＦＮγ産生を増強した。
【０３９０】
（実施例９  ＬＢ−１００阻害およびＰＤ−１遮断は、耐久性のあるＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性腫瘍拒絶を誘発する）
ＬＢ−１００を用いるＰＰ２Ａの阻害は免疫媒介性抗腫瘍応答を増強し得るという仮説を試験するために、マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を移植した。ＣＴ２６は、低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現するマウス結腸腺癌であり、抗ＰＤ１療法に対して耐性である。約１３日後、３０〜１００ｍｍ３の間の腫瘍サイズを有するマウスを、４つの処置群（ＰＢＳ対照、ＬＢ−１００のみ  −  ０．１６ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ−１のみ  −  １０ｍｇ／ｋｇまたは両方の組み合わせ）に無作為化した。処置は、合計２８日間２日毎に行った。２日毎に腫瘍サイズを評価した（図２０Ａ〜Ｃ）。抗ＰＤ１を用いる単剤処置は、腫瘍負荷の低減または生存の増大において有効ではなかった。ＬＢ−１００単独は、メジアン生存を２１から３３日に増大できた（ｐ＝０．０２）。組み合わせ処置は、処置後１４日目に対照と比較して（ｐ＜０．０１）平均腫瘍体積を７０％有意に低下させた。メジアン生存はまた、２１から７２日に増大した（ｐ＜０．０１）。より著しくは、マウスの５０％が、腫瘍の完全退縮（ＣＲ）に達し、疾患の証拠はなかった。この応答は、処置の完了後に耐久性のあるものであった。
【０３９１】
次に、組み合わせ療法からＣＲに達したマウスが、長期の免疫記憶を発達させたか否かを調べた。最初の接種の約６０日後、治癒したマウスに同一ＣＴ２６細胞を再接種した（図２１Ａ〜Ｂ）。マウス（ｎ＝８）のうち、再負荷で腫瘍を発生したものはなかった。対照として働くように、ＣＴ２６ナイーブマウスに同時に接種した。この結果は、組み合わせ療法によって治癒したマウスは、腫瘍特異的抗原に対して長期記憶を確立することができたということを示す。
【０３９２】
次いで、腫瘍退縮をもたらしたＬＢ−１００の抗ＰＤ−１との相乗作用が、ＣＤ８Ｔ細胞によって媒介されるか否かを調査した。ＣＴ２６腫瘍を有するマウスを、処置の開始に先立って枯渇性抗生物質を使用するＣＤ８除去に供した。ＣＤ８＋Ｔ細胞除去は、処置の３日後に脾細胞のＦＡＣＳを用いて確認した。ＣＤ８が枯渇すると、組み合わせ療法は、抗腫瘍応答を誘発できなかった。ＣＤ８＋非枯渇群の７２％と比較して、組み合わせを受けているＣＤ８＋枯渇マウスのうちＣＲに達したものは０％であった（図２２Ａ〜Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＬＢ−１００の効果は、腫瘍に対する直接的な細胞傷害性効果ではなく免疫系によって媒介されるということを実証した。
【０３９３】
方法
試薬−ＬＢ−１００は、Ｌｉｘｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供された。抗マウスＰＤ−１、クローンＲＭＰ１−１４、抗体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。フローサイトメトリーに以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した：ラット抗マウスＣＤ４−ＢＶ４２１、ラット抗マウスＣＤ３−ＰＥ、ラット抗マウスＣＤ８ａ−Ａｌｅｘａ６４７、ラット抗マウスＣＤ４５−ＢＶ７８５、ラット抗マウスＩＦＮｇ−ＦＩＴＣ、ラット抗マウスＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ６４７。これらの抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【０３９４】
細胞株およびマウス−ＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌株は、ＡＴＣＣから入手した。腫瘍細胞は、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０；Ｃｅｌｌｇｒｏ）で培養した。６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。マウスは国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の実験動物施設に収容した。すべての実験は、国立衛生研究所の動物管理使用局（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ）によって承認され、国立衛生研究所ガイドラインに従って実施された。
【０３９５】
腫瘍接種および動物研究−ＣＴ２６腫瘍細胞（０．５×１０６個）を、腹部の右側に皮下注射した。ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１を、それぞれ０．１６ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．経路によって注射し、腫瘍移植の１１日後に開始して、２日毎に２８日間継続した。腫瘍サイズは、デジタルノギスを用いて２〜３日毎にモニタリングし、体積（長さ×幅２×０．５）として表した。腫瘍が潰瘍化した／壊死した、または２，０００ｍｍ３を超えるもしくは最大直径が２ｃｍより大きい腫瘍負荷の動物は、安楽死させた。
【０３９６】
ＣＤ８Ｔ細胞の枯渇。抗ＣＤ８（クローン５３．６．７）ｍＡｂ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、療法の２日および１日前、療法の当日ならびに療法の開始の５および８日後に注射した。用量は、注射あたり０．１ｍｇとした。
【０３９７】
腫瘍再負荷研究。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスおよび上記のような組み合わせ処置により以前に治癒していたマウスに、ＣＴ２６細胞を左（これまでに接種していない）胸部脇腹に接種した。腫瘍を、上記のように週に２回測定した。腫瘍が潰瘍化した／壊死した、または２，０００ｍｍ３を超えるもしくは最大直径が２ｃｍより大きい腫瘍負荷の動物は、安楽死させた。
【０３９８】
（実施例１０  ＬＢ−１００およびＰＤ−１遮断は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調節する）
処置効果を、腫瘍浸潤リンパ球で評価した（図２３Ａ〜Ｂ）。ＣＴ２６腫瘍を有するマウスを、上記のようにＬＢ−１００および／または抗ＰＤ−１抗体を用いて処置した。処置の１２日後、腫瘍をＦＡＣＳによって解析した。ＬＢ−１００および抗ＰＤ−１抗体の組み合わせを用いて処置したマウスから得た腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照動物および抗ＰＤ−１単独を用いて処置した動物から得た細胞と比較してＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増大を示した（それぞれ１１．０％および１０．５％と比較して２５．３％、ｐ＝０．０５）。ＩＦＮγは、抗腫瘍応答を媒介する最も重大なサイトカインであるので、この結果は、組み合わせで処置されたマウスが、移植された腫瘍に対して増強された免疫を有することの機能的確認である。さらに、ＴｒｅｇにおけるＰＰ２Ａの公知の重要性を考慮し、ＬＢ−１００および／または抗ＰＤ−１処置の効果を腫瘍中に存在するＴｒｅｇの量に関して調べた。ＬＢ−１００単独は、腫瘍環境中のＴｒｅｇを有意に枯渇させた（対照における１４．７％と比較して２．１％）。この効果は、抗ＰＤ−１または組み合わせによるＴｒｅｇ枯渇に対する効果に対して同程度である。ＬＢ−１００単独がＴｒｅｇを枯渇させることができるという事実は、ＬＢ−１００単独処置群において観察された、小さいが有意な生存利益を説明する、可能性のある機序を示唆する。
【０３９９】
さらに、ＣＲに達しているマウスは、ＣＴ２６細胞を再接種した場合に腫瘍成長に対して抵抗性であった。枯渇抗体を使用するＣＤ８＋Ｔ細胞除去に供されたマウスは、組み合わせ療法を用いる処置にもかかわらずＣＴ２６腫瘍を拒絶できず−０／８（０％）、これは、抗ＰＤ−１処置を用いるＬＢ−１００の抗腫瘍効果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されるということを示す。結論として、同系動物モデルでは、ＰＰ２Ａ阻害剤、ＬＢ−１００は、チェックポイント遮断とともに相乗作用の可能性を有し、臨床において免疫療法を増強するその能力の調査を支持する。
【０４００】
要約すると、この前臨床モデルにおいて、ＬＢ−１００が、抗ＰＤ−１と組み合わされた場合に、処置されたマウスの相当な部分の完全退縮をもたらす頑強な相乗作用を有することが実証された。この効果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を介する適応免疫によって媒介される。また、腫瘍の退縮と関連する免疫記憶の確立も存在する。これは、免疫療法を増強するための標的としてＰＰ２Ａの薬理学的阻害を使用する最初の報告である。
【０４０１】
腫瘍は、多くの場合免疫系から逃れるために複数の機序を発達させたが、そのうちの１つが、Ｔ細胞のＰＤ−１の発現であり、これは、Ｔ細胞が腫瘍を攻撃することを有効に阻害する。抗ＰＤ−１は、この阻害性シグナルを取り消し、それによって、Ｔ細胞が腫瘍を認識し、根絶することが可能となる。ＬＢ−１００、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の阻害剤は、結腸がんの前臨床モデルにおいて劇的な抗腫瘍効果を有することがわかった。この効果は、免疫系の増強によって媒介されることがわかった。
【０４０２】
（実施例１１  ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤との組み合わせでのＬＢ−１００の投与）
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤との組み合わせで、ある量の化合物ＬＢ−１００をがんに罹患した被験体に投与する。化合物および阻害剤の量は、被験体を処置するのに有効である。
【０４０３】
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤との組み合わせで、ある量の化合物ＬＢ−１００をがんに罹患した被験体に投与する。化合物の量は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤の抗がん活性を増強するのに有効である。
【０４０４】
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤との組み合わせで、ある量の化合物ＬＢ−１００を黒色腫に罹患した被験体に投与する。化合物および阻害剤の量は、被験体を処置するのに有効である。
【０４０５】
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤との組み合わせで、ある量の化合物ＬＢ−１００を黒色腫に罹患した被験体に投与する。化合物の量は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤の抗がん活性を増強するのに有効である。
【０４０６】
（実施例１２  アテゾリズマブ、ニボルマブまたはペムブロリズマブへの追加療法としてのＬＢ−１００の有効性の評価）
追加療法は、相乗作用を提供し、低減された副作用しか伴わないより少ない用量を可能にする。
【０４０７】
すでにアテゾリズマブ、ニボルマブまたはペムブロリズマブを受けている黒色腫に罹患したヒト患者のための追加療法としてのＬＢ−１００の定期的な投与は、臨床上有意義な利点を提供し、アテゾリズマブ、ニボルマブまたはペムブロリズマブが単独で投与される場合よりも（同一用量で）患者の処置においてより有効である（少なくとも相加作用を、または相加作用を超えたものを提供する）。
【０４０８】
ＬＢ−１００をすでに受けている黒色腫に罹患したヒト患者のための追加療法としてのアテゾリズマブ、ニボルマブまたはペムブロリズマブの定期的な投与は、臨床上有意義な利点を提供し、ＬＢ−１００が単独で投与される場合よりも（同一用量で）患者の処置においてより有効である（少なくとも相加作用を、または相加作用を超えたものを提供する）。
【０４０９】
追加療法はまた、過度の有害な副作用を伴わない、または処置の安全性に影響を及ぼさない患者の処置において有効性を提供する（少なくとも相加作用を、または相加作用を超えたものを提供する）。各薬剤を単独で投与した場合と比較して：
【０４１０】
１．追加療法は、黒色腫を有する患者における細胞傷害性Ｔ細胞の量の増大においてより有効である（相加作用または相加作用を超えたものを提供する）、
【０４１１】
２．追加療法は、黒色腫を有する患者における黒色腫の進行の減速においてより有効である（相加作用または相加作用を超えたものを提供する）および／または
【０４１２】
３．追加療法は、黒色腫患者におけるＰＤ−１およびまたはＰＤ−Ｌ１の機能の低減においてより有効である（相加作用または相加作用を超えたものを提供する）。
【０４１３】
（実施例１３  ＬＢ−１００を用いるプロテインホスファターゼ−２Ａの薬理学的阻害は、ＰＤ−１遮断と組み合わせた場合に耐久性のある免疫媒介性抗腫瘍活性を達成する）
本実施例は、とりわけ、小分子ＰＰ２Ａ阻害剤、ＬＢ−１００が、抗ＰＤ１（ａＰＤ−１）遮断と組み合わせた場合に、ＣＴ２６結腸がんモデルにおいて耐久性のある免疫媒介性抗腫瘍応答を相乗的に誘発することを実証する。この効果は、Ｔ細胞依存性であり、腫瘍の相当な割合の著しい退縮につながった。腫瘍リンパ球の解析は、エフェクター対制御性Ｔ細胞比の著しい増大をもたらすエフェクターＴ細胞の浸潤の増強および抑制性制御性Ｔ細胞の枯渇を実証した。腫瘍のクリアランスは、抗原特異的二次防御免疫を確立した。ＬＢ−１００およびａＰＤ−１遮断の相乗作用はまた、Ｂ１６黒色腫モデルにおいても観察された。さらに、本明細書において、ＬＢ−１００によってｍＴＯＲＣ１シグナル伝達経路が特異的に活性化され、ナイーブＣＤ４細胞の制御性Ｔ細胞への分化の減少がもたらされたという知見が記載される。Ｔｈ１の発現の増大およびＴｈ２サイトカインの発現の減少も見られた。これらのデータは、チェックポイント阻害と組み合わせたＰＰ２Ａ阻害の橋渡しの可能性を強調する。
【０４１４】
ＬＢ−１００およびａＰＤ−１の組み合わせ処置は、ＣＴ２６腫瘍の拒絶を相乗的に誘発する。ＰＰ２Ａ阻害が、ａＰＤ−１難治性腫瘍においてｉｎ  ｖｉｖｏでａＰＤ−１療法と協同するという仮説を試験するために、高いＰＤ−Ｌ１発現を有するが、ａＰＤ−１療法に対して制限された応答を有するマウス結腸直腸癌であるＣＴ２６腫瘍を使用した。マウスにＣＴ２６腫瘍細胞（０．２５×１０６個）を接種した。１０〜１３日後、５０〜１００ｍｍ３の大きさに達している腫瘍を有するマウスを、４つの処置群に無作為化した：対照（ＰＢＳ）、ａＰＤ−１、ＬＢ−１００ならびにａＰＤ−１およびＬＢ−１００の組み合わせ。処置を、２日毎に３０日間施した。腫瘍成長を２日毎に評価した（図２４Ａ）。このモデルでは、ＬＢ−１００単独は、腫瘍成長を有意に減少させなかったが、メジアン生存を拡張した（３３対２１日、ｐ＝０．０２）。さらに、ａＰＤ１単独は、腫瘍成長または生存に対して効果がなかった。しかし、ＬＢ−１００およびａＰＤ１の組み合わせは、腫瘍の相当な部分の著しい退縮をもたらし、５０％が研究の期間の間の完全退縮（ＣＲ）に達した。処置後８日における腫瘍サイズに有意差（ｐ≦０．０５）があり、組み合わせと対照処置アーム間に生存において有意な増大（ｐ＜０．００５）があった（図２４Ｂ）。
【０４１５】
ＬＢ１００およびａＰＤ−１の組み合わせの効果は、ＣＤ８Ｔ細胞に依存する：耐久性のある腫瘍退縮をもたらすＬＢ−１００およびａＰＤ−１の組み合わせの相乗効果が、免疫媒介性プロセスであったか否かを次いで調べた。ＣＴ２６腫瘍を有するマウスを、ＬＢ−１００およびａＰＤ−１を用いる処置に先立って、およびその処置の間に、枯渇抗体を使用するＣＤ８＋Ｔ細胞除去に供した（図２４Ｃ）。ＦＡＣＳによって処置の５日後に末梢ＣＤ８＋枯渇が確認された（示されていないデータ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇すると、ＬＢ−１００およびａＰＤ−１の組み合わせは、腫瘍拒絶を誘発しなかった（０対７２％、ｐ＝０．００１５）（図２４Ｄ）。非枯渇群における腫瘍体積と比較して、ＣＤ８が枯渇した組み合わせ群において平均腫瘍体積は、処置の１０日後には１３倍に増大した（６１２対４６ｍｍ３、ｐ＜０．００１）。生存も、ＣＤ８枯渇を用いた場合に有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。ＣＤ８Ｔ細胞枯渇単独は、腫瘍成長および生存の両方において、対照と比較してわずかな有害効果を有しており、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫のベースラインレベルが、ベースライン条件におけるＣＴ２６成長を制限するように働くことを示唆する。これらのデータは、ＬＢ−１００およびａＰＤ−１の相乗作用が、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性後天的免疫に依存し、腫瘍成長のＰＰ２Ａ阻害の直接的な効果ではないことを示した。
【０４１６】
組み合わせ療法によって治癒されたマウスは、抗原特異的長期記憶を発達させる：適応免疫応答の成功の特徴は、免疫学的記憶の確立である。以下の実験は、その二次的な保護抗腫瘍応答について完全応答（ＣＲ）を経験したマウスを試験した。ＣＴ２６細胞を用いて、最初の腫瘍移植の約６０日後にマウスに再負荷した（図２５Ａ）。これらのマウスは、ＣＴ２６細胞再負荷に対して完全に抵抗性であった（図２５Ｂ）。（再）移植後１８日での平均腫瘍サイズは、ＣＲマウスにおける０ｍｍ３と比較して、ナイーブにおいて４８０ｍｍ３であった（ｐ＜０．０００１）（図２５Ｃ）。
【０４１７】
次いで、二次的な保護免疫学的応答が、ＣＴ２６腫瘍に対して特異的であったか否かを試験した。最初の移植から約６０日後、ＣＲマウスに、ＣＴ２６細胞を用いて側腹部に、および４Ｔ１細胞、無関係のマウスの乳がん細胞株を用いて乳頭脂肪パッドに再負荷した（図２５Ｄ）。ＣＲを有するマウスは、ＣＴ２６に対して抵抗性であったが、４Ｔ１細胞に対しては抵抗性ではなかった。接種の１８日後、ナイーブおよびＣＲマウス間で４Ｔ１腫瘍体積において差はなかったが、ＣＴ２６は、ＣＲマウスでは増殖できなかった（図２５Ｅ〜Ｆ）。この結果は、二次的記憶応答は、ＣＴ２６によって発現された抗原に対して特異的であることを示す。
【０４１８】
組み合わせ処置を用いるリンパ球の活性化の増強：ＬＢ−１００／ａＰＤ−１組み合わせによる腫瘍拒絶を媒介する細胞性機序に対処するために、二次的リンパ器官における、および腫瘍における免疫系の状態を調べた。マウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、上記のように、ＬＢ−１００および／またはａＰＤ−１を用いて処置した。３日目に、２回の処置後、脾臓、腫瘍流入領域リンパ節（ｄＬＮ）および腫瘍を回収し、フローサイトメトリーによって解析した（図２６〜２７）。二次的リンパ系組織では、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋Ｔ細胞のより大きな頻度によって示されるように、対照と比較した、組み合わせレジメンを用いて処置したマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のより大きな活性化が観察された（図２６Ａ〜Ｃ）。脾臓では、ＬＢ−１００単独を用いる処置は、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋Ｔ細胞のわずかな増大をもたらした（１３．０から１６．６％、ｐ＜０．０５）が、組み合わせ処置は、ＬＢ−１００またはａＰＤ１いずれか単独よりも大きい増大をもたらした（それぞれ１６．６および１５．５％に対して２０．８、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００５）（図２６Ｂ）。同様に、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比較して、組み合わせを用いて処置されたマウスのｄＬＮにおいて増大した（７．４から１７．９％、ｐ＜０．０５）（図２６Ｃ）。脾臓およびｄＬＮの両方においてＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−サブセットの頻度に差はなかった（図２８Ａおよび２９Ａ）。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞でのＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＯｘ４０の発現を含む免疫チェックポイントマーカーを腫瘍流入領域リンパ節および脾臓において調べた（図２８および２９）。ｄＬＮにおけるａＰＤ−１処置されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１発現の、小さいが有意な増大を除いて、これらのマーカーの発現に差はなかったが、単独または組み合わせたＬＢ−１００は、ＰＤ−１発現をさらに変更しなかった（図２９Ａ）。
【０４１９】
腫瘍浸潤リンパ球の包括的解析（図２６〜２７、３０）を次いで実施した。第１に、ＣＤ４５＋細胞の絶対パーセンテージを調べた。処置群の間に有意差はなかった。しかし、ＣＤ４５＋集団内に、対照と比較して組み合わせ処置においてＣＤ３＋Ｔ細胞の有意な増大があった（３３．３から４９．９％、ｐ＜０．０５）（図２６Ｅ）。より重要なことに、ＣＤ３＋Ｔ細胞集団のこの増大は、ＣＤ４５＋細胞に対して（２５．９から４５．３％、ｐ≦０．０１）（図２６Ｆ）正規化されるか、または腫瘍常在細胞数に対して（８から１９％、ｐ＜０．０５）正規化されるか（図３１Ａ）に関わらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増大に起因していた（図２６Ｄ）。同様の傾向が、腫瘍重量に対して正規化されたＣＤ８＋Ｔ細胞において観察された（図３１Ｂ）。代わりに、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、変化がないままであり（図２６Ｇ、３１）、ＣＤ８／ＣＤ４比の著しい増大をもたらした（３．６から９．０、ｐ＜０．００１）（図２７Ｈ）。これは、ＬＢ−１００／ａＰＤ−１組み合わせが、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞輸送の増強をもたらすことを示し、これは、一貫して免疫療法に対する応答の１つの最も重要な予測因子であると示されている。エフェクター表現型マーカーＣＤ４４＋を標識することによってＣＤ８＋ＴＩＬの部分集団をさらに調べた。対照に対して組み合わせを用いて処置されたマウスにおいて、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の有意な増大があった（９．８から１７．１％、ｐ≦０．０１）（図２６Ｉ）。また、細胞周期関連タンパク質Ｋｉ６７の発現によって測定されるような、ＣＤ８＋ＴＩＬの増殖の増大が見られた（１２．３から２２．５％、ｐ＜０．０５）（図２６Ｊ）。次いで、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、Ｏｘ４０、ＣＴＬＡ４およびＬＡＧ３を含む、ＴＩＬにおける免疫チェックポイントマーカーのアレイの発現を調べた。ａＰＤ−１を用いる処置は、ＰＤ−１発現の予測された低下をもたらしたが、ＬＢ−１００は、単独またはａＰＤ−１に加えて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬの両方においてＰＤ−１発現をさらに変更しなかった（図２６Ｋ〜Ｌ）。ＴＩＭ３、Ｏｘ４０、ＣＴＬＡ４およびＬＡＧ３の発現は、単独または組み合わせ処置を用いてもＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＴＩＬにおいて有意に変化せず（図３２）、これは、ＬＢ−１００を、これらのチェックポイントマーカーに対する標的化治療薬と組み合わせることに可能性があることを示唆した。
【０４２０】
ＰＰ２Ａが抑制性Ｔｒｅｇにおいて必須の役割を果たすことを実証するこれまでの研究を考慮し、次いで、ＬＢ−１００の添加が抗ＣＴＬＡ４療法と同様にＴｒｅｇ枯渇をもたらし得るか否かを調べた。ａＰＤ−１は、腫瘍のレベルで作用すると知られており、Ｔｒｅｇを枯渇させる限定された能力を有する。しかし、ＬＢ−１００の添加を用いて、組み合わせ処置は、ＴＩＬの中でもＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを有意に低下させた（ＣＤ３＋Ｔ細胞の１０．３から４．９％、ｐ＜０．０５）（図２７Ａ〜Ｂ）。同時のＴｒｅｇの低下およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増大は、ＴＩＬにおける、ＣＤ８＋のＴｒｅｇに対する比に、３．５倍という劇的な増大をもたらした（７．５から２６．４、ｐ＜０．０５）（図２７Ｃ）。その後、ＴＩＬにおけるＬＢ−１００／ａＰＤ−１組み合わせの機能的結果を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシンを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に応じたＩＦＮ−γの細胞内発現を解析した。組み合わせ処置は、対照に対して、ＣＤ８＋ＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生を有意に増強した（ＣＤ４５＋の１６．６から３１．５％、ｐ＜０．０５）（図２７Ｄ〜Ｅ）。さらに、組み合わせ処置により、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）産生ＣＤ８＋ＴＩＬ（図２７Ｆ、３３Ａ）およびＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α二重産生ＣＤ８＋ＴＩＬ（図２７Ｇ、３３Ｂ）の頻度が有意に増大した。ＣＤ８＋ＴＩＬの細胞溶解能力もＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（ＧｚｍＢ）発現によって決定し、これは、ＬＢ−１００／ａ−ＰＤ１処置により有意に増大した（図２７Ｈ、３３Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＩＦＮ−γ産生の、小さいが統計的に有意な増大（ＣＤ４＋細胞の６．１から１０．８％、ｐ＜０．０５）が観察された（図２７Ｉ）。これは、ＬＢ−１００／ａ−ＰＤ１組み合わせを用いた場合にＣＤ４＋浸潤の全体的な増大はなかったが、腫瘍中に存在するエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、それにもかかわらず、より機能的に活性であり、ＩＦＮ−γ産生が増強されたことを示唆する。
【０４２１】
総合すると、ＬＢ−１００を、ａＰＤ−１遮断と組み合わせることは、ＴＩＬの組成に有意な変化をもたらした（図２７Ｊ）。全体的なＣＤ４５＋集団は比較的安定したままであったが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の優勢によって駆動されるＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤の著しい増大があった。同時に、Ｔｒｅｇ集団を同時に枯渇させ、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の劇的な増大をもたらした。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、サイトカイン発現によって示されるように、より増殖性であり、機能的に活性であった。これらの知見は、ＬＢ−１００／ａ−ＰＤ１組み合わせが、免疫依存的な様式でＣＴ２６において耐久性のある腫瘍拒絶を誘発できたという観察結果と一致する。
【０４２２】
ＬＢ−１００およびａＰＤ−１は、自己免疫の組織学的証拠を伴わずにＢ１６黒色腫において抗腫瘍活性を増強する：次いで、ＬＢ−１００／ａＰＤ−１組み合わせが、その他のａＰＤ−１耐性腫瘍に対して有効であるか否かを決定した。腫瘍予防モデルでは、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、４つの処置群：ＰＢＳ、ＬＢ−１００、ａＰＤ−１および組み合わせに無作為化した。処置の開始の２日後にＢ１６Ｆ１０細胞（２．５×１０５個）を右胸部脇腹に皮下接種した。生存に従って、処置を２日毎に施した（図３４Ａ）。腫瘍移植後１５日目まで、対照および単剤アーム間で差はなかった。しかし、腫瘍サイズは、対照に対して組み合わせ群において有意により小さく（３０５．９から１０９．０ｍｍ３、ｐ＜０．０５）（図３４Ｂ〜Ｃ）、生存は、組み合わせ処置によって延長された（ｐ＜０．０５）（図３４Ｄ）。
【０４２３】
組み合わせ群中のマウスのうち、自己免疫炎症事象のいかなる臨床徴候も実証したものがなかったことは注目すべきである。しかし、ＬＢ−１００／ａＰＤ−１組み合わせが、エフェクター機能の増大およびＴｒｅｇ枯渇をもたらしたことを考慮すると、自己免疫が懸念事項である。したがって、本発明者らは、炎症の徴候を探すために、処置されたマウスの複数の臓器の組織構造を調べた。生存エンドポイントに到達したＣ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、皮膚、唾液腺、膵臓、肺および胃の組織構造を調べた（図３４Ｅ、３５）。いずれの処置群にも、リンパ球浸潤の増大または自己免疫の徴候を示唆する証拠はなかった。
【０４２４】
ＬＢ−１００は、ＰＰ２Ａ活性を阻害し、ｍＴＯＲＣ１活性化を増強する：マウス脾細胞から単離されたＣＤ４およびＣＤ８細胞のＰＰ２Ａ酵素活性を、プレーティングされたＣＤ３および可溶性ＣＤ２８を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の３時間後に測定した。ＣＤ４およびＣＤ８細胞の両方においてＰＰ２Ａ酵素活性の用量依存性低下があり、ＣＤ４細胞よりもＣＤ８においてより大きな効果を有していた（図３６Ａ）。
【０４２５】
単離されたＣＤ３細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化の３時間後、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２およびＰＩ（３）Ｋ−ＡＫＴ経路の活性を、それぞれ、リボソームＳ６タンパク質（Ｓ６）、Ｔｈｒ４７３でのＡＫＴおよびＴｈｒ３０８でのＡＫＴのリン酸化をチェックすることによって評価した。ＬＢ−１００は、ｍＴＯＲＣ２およびＰＩ（３）Ｋ−ＡＫＴ経路に対して最小の効果を有する一方で（図３６Ｂ）、Ｓ６のリン酸化によって測定されるようなｍＴＯＲＣ１の活性において用量依存性増大があった（図３６ｃ）ことがわかった。この差は、活性化の３０分後のより早い時点では、３経路のいずれにおいても観察されなかった（図３７）。
【０４２６】
ＬＢ−１００は、制御性細胞またはＴｈ２  ＣＤ４細胞へのナイーブＣＤ４細胞発生を阻害する：
【０４２７】
ナイーブＣＤ４細胞をマウス脾細胞から単離し、ＴＧＦ−βまたはＩＬ４の存在下で抗ＣＤ３およびＣＤ２８を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化して、ＴｒｅｇまたはＴｈ２  ＣＤ４＋細胞のそれぞれの発生を誘導した。７２時間後、Ｆｏｘｐ３またはＧＡＴＡ３の核内発現を、フローサイトメトリーによって定量化して、ＴｒｅｇまたはＴｈ２細胞のそれぞれのパーセンテージを決定した。ＬＢ−１００処置は、ＴＧＦ−βによるＦｏｘｐ３（図３８Ａ）またはＩＬ−４によるＧＡＴＡ３（図３８Ｂ）の誘導を用量依存的な様式で有意に損なった。さらに、Ｔ−ｂｅｔについて標識することによってＴｈ２およびＴｈ１  ＣＤ４＋細胞の相対割合を定量化した。Ｔｂｅｔ発現細胞に対するＧＡＴＡ３発現細胞の頻度は、ＬＢ−１００処置により有意に低下した（図３８Ｃ）。次に、ＬＢ−１００処置を用いたＴｈ１  ＣＤ４＋細胞の機能的結果を調査した。Ｔｈ１およびＴｈ２傾斜条件の両方の下で、ＰＰ２Ａ阻害を伴うＩＦＮ−γ発現の用量依存性増大があった。これは、細胞内染色（図３８Ｄ）およびサイトカイン分泌の測定（図３８Ｅ〜Ｆ）の両方を用いて示された。ＴＮＦ−αおよびＩＬ２を含むその他のＴｈ１関連サイトカインも、Ｔｈ１およびＴｈ２の両条件において増大した。ＩＬ４の分泌は、予測されたように低下した（図３８Ｆ）。これらのデータは、ＰＰ２Ａ阻害が、Ｔｒｅｇ形成を減少させ、ＣＤ４細胞分化をＴｈ１系統に向けて傾斜させて、Ｔｈ１サイトカイン分泌の全体的な増大をもたらしたことを示唆する。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、ｉｎ−ｖｉｖｏ  ＴＩＬ知見と一致し、ＰＰ２Ａ阻害が、ｍＴＯＲＣ１超活性化によってがん免疫を増強したことを潜在的に示唆する。
【０４２８】
ヒト混合リンパ球反応におけるＬＢ−１００のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性：ＬＢ−１００の免疫調節性効果が臨床有用性を有することをさらに確認するために、健常ヒトドナーから得たＰＢＭＣを使用して混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施した。単球由来樹状細胞を、サイトゾル色素ＣＦＳＥを用いて標識された同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。ＬＢ−１００を共培養の当日（０日目）に投与し、３日目に再度投与した。ＣＤ４Ｔ細胞による増殖およびＩＦＮ−γ分泌を５日目に評価した（図３９Ａ）。ＬＢ−１００処置を１μＭで用いた場合に、分裂細胞のパーセンテージによって測定されるようなＣＤ４Ｔ細胞増殖において有意な増大があった（対照における２０％と比較して３１％）（図３９Ｂ）。また、より低いＬＢ１００濃度（マイクロモル濃度未満の範囲で）で増殖の増大への傾向があった。５μＭという高用量では、増殖は損なわれ、これは、免疫を増強するＬＢ−１００曝露の最適ウィンドウがあることを示唆した。ＩＦＮ−γ分泌についても同様のパターンが観察された（図３９Ｃ）。０．２および１μＭのＬＢ−１００で、ＩＦＮ−γ放出はそれぞれ３．５〜４倍に有意に増強された。また、Ｔ−ｂｅｔについて標識することによって、ＣＤ４Ｔ細胞における系統分化の効果を調べた。１μＭのＬＢ−１００は、Ｔ−ｂｅｔ発現を有意に増大し（図８Ｄ）、ＬＢ−１００は、ＣＤ４系統をＴｈ１分化に向けて傾斜させると思われるという本発明者らのこれまでの知見が確認された。次いで、ＬＢ−１００が、ニボルマブを使用するＰＤ１遮断と組み合わせて、ＩＦＮ−γ分泌をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増強できるか否かを試験した。ＬＢ−１００を用いて同様のＭＬＲアッセイを実施した。ＬＢ−１００は、抗ＰＤ１（ａＰＤ−１）遮断と協同し、単剤と比較してＩＦＮ−γ分泌を増強することがわかった（図３９Ｅ）。
【０４２９】
材料および方法
【０４３０】
薬物−ニボルマブはＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから入手し、ＬＢ−１００は、Ｌｉｘｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ，  Ｉｎｃ．から入手した。
【０４３１】
細胞株−ＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌、Ｂ１６  Ｆ１０黒色腫および４Ｔ１乳癌細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。腫瘍細胞は、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
【０４３２】
同系腫瘍モデル−マウスを維持し、ＮＩＮＤＳ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓの承認を得て実験を実施した。ＣＴ２６腫瘍について：ＢＡＬＢ／ｃ（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＣＴ２６細胞（０．５×１０６個）を、右脇腹に皮下注射した。ひとたび腫瘍が３０〜１００ｍｍ３の体積に到達すると（０日目）、マウスを無作為化し、ＰＢＳ、ＬＢ−１００（０．１５６ｍｇ／ｋｇ）および／または抗マウスＰＤ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）（ＲＭＰ１−１４；ラットＩｇＧ２ｂ；Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）を用いて処置した。処置は、２日毎に３０日間施した。腫瘍体積をノギスを使用して２日毎に測定し、腫瘍体積を次式に従って算出した：体積（ｍｍ３）＝Ｌ×Ｗ２／２（式中、Ｌは、腫瘍の長さであり、Ｗは幅である（ミリメートルでの）。Ｂ１６腫瘍について：Ｃ５７ＢＬ／６（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスをそれぞれの処置群に無作為化し、最初の処置の２日後に、Ｂ１６Ｆ１０細胞（０．５×１０６個）を、右脇腹に皮下注射した。処置および測定は２日毎に行った。生存エンドポイントは以下の基準のうちいずれかに到達した時点と定義した：１）２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積、２）２ｃｍを超える腫瘍直径、３）腫瘍上の重度の非治癒性皮膚壊死。指示があった時点で、一部のマウスは、２５０∝ｇのＣＤ８枯渇抗体（クローン５３．６．７；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）の注射によってＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。注射は、療法の２日前および１日前、療法開始の当日ならびに療法の開始の５日後および８日後に、それ以降毎週与えた。
【０４３３】
腫瘍再負荷研究−ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスおよび組み合わせ療法によりＣＴ２６腫瘍から以前に治癒していた（ＣＲ）マウスに、０．５×１０６個のＣＴ２６細胞を左（ＣＲ）および右（ナイーブ）胸部脇腹に接種した。指示があった場合にはまた、一部のマウスに、１．２５×１０５個の４Ｔ１乳癌細胞を乳頭脂肪パッド中に接種した。次いで、腫瘍体積を上記と同様にモニタリングした。
【０４３４】
ＴＩＬの単離−マウスに０．５×１０６個のＣＴ２６細胞を右胸部脇腹に注射し、腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の間に到達した後に上記のように処置した。２回の処置後、マウスを屠殺し、腫瘍を切り出した。腫瘍を、腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する酵素消化の存在下で、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する機械的破壊に供した。ＴＩＬの解析のために使用したゲート戦略を図Ｓ３に示す。細胞内サイトカイン染色、ホスホフロー（ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ）およびフローサイトメトリー−Ｔ細胞を含有する懸濁物をＰＢＳ中での固定可能な生／死染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、それに続く、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％  ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中での表面抗体染色を用いて染色した。細胞内染色のために、細胞を表面分子について染色し、続いて、固定および透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）した。サイトカイン染色のために、細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンおよびタンパク質輸送阻害剤を含有する細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてまず刺激し、その後、染色を行った。リン酸染色（ｐｈｏｓｐｈｏｓｔａｉｎｉｎｇ）のために、固定のために４％ホルムアルデヒドを使用し、透過処理プロトコールのために１００％メタノールを使用した。細胞をフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって解析した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して実施した。
【０４３５】
ＰＰ２Ａホスファターゼアッセイ−マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれＣＤ４およびＣＤ８単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を用いて単離した。細胞を固定化された抗ＣＤ３（１０ｕｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８（２ｕｇ／ｍｌ）を使用して３時間活性化した。次いで、製造業者の指示（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のとおりにマラカイトグリーンホスファターゼアッセイキットを使用して免疫沈降後にＰＰ２Ａ活性を評価した。
【０４３６】
Ｔ細胞刺激および傾斜−マウス脾細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）からナイーブＣＤ４細胞を単離した。細胞を固定化された抗ＣＤ３（１０ｕｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８（２ｕｇ／ｍｌ）を使用して３日間活性化した。傾斜条件は以下のとおりとした：ＴＨ１、１．ｉｇ／ｍＬ抗ＩＬ４、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ２および１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ１２；ＴＨ２、１．ｉｇ／ｍＬ抗ＩＦＮ−γ、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ２および１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ４；Ｔｒｅｇ、１．ｉｇ／ｍＬ  抗ＩＦＮγおよび１ｉｇ／ｍＬ抗ＩＬ４および２ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβ１。ビーズベースの多検体フローイムノアッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の指示のとおりに使用して、上清中のサイトカイン産生を測定した。計数ビーズ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリーを用いて絶対細胞数を定量化した。
【０４３７】
フローサイトメトリーのための抗体−抗マウス：α−ＣＤ４５（３０−Ｆ１１、ＢＤ）、α−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＣＤ４（ＧＫ１．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＣＤ８（５３−６．７、ＢＤ）、α−ＰＤ−１（Ｊ４３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、α−ＣＴＬＡ４（１Ｂ８、ａｂｃａｍ）、α−ＴＩＭ−３（Ｂ８．２Ｃ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＯＸ−４０（ＯＸ−８６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４、ＢＤ）、α−ＣＤ４４（ＩＭ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＬＡＧ−３（Ｃ９Ｂ７Ｗ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ＴＮＦ−α（ＭＰ６−ＸＴ２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（ＮＧＺＢ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、α−ＦＯＸＰ３（ＭＦ−１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−Ｋｉ６７（ＳｏｌＡ１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。抗ヒト：α−ＣＤ４（Ａ１６１Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−Ｔ−ｂｅｔ（４Ｂ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、α−ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、α−ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）（Ｄ２５Ｅ６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、α−ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Ｄ５７．２．２Ｅ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【０４３８】
組織構造−ホルマリン固定された組織を処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色し、委員会認定病理学者によって盲検的に評価した。
【０４３９】
ヒト混合リンパ球反応−３９にこれまでに記載されたとおり。単球単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、ＰＢＭＣから単離された単球を、５００Ｕ／ｍｌインターロイキン−４（ＩＬ−４）および２５０Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間培養することによって樹状細胞（ＤＣ）を作製した。ＣＤ４単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を用いて単離し、ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて標識したＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５個）を、同種異系のＤＣ（１×１０４個）と共培養した。アッセイの開始時に、ＬＢ−１００および／またはニボルマブの滴定を付加した。３日後、ＬＢ−１００を最終指示濃度に補充した。５日後、培養上清をＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって解析し、フローサイトメトリーによって細胞を解析した。少なくとも３人の別個のドナーが得られ、１人の代表的なドナーの結果が報告された。
【０４４０】
統計−図の凡例で他に述べられていなければ、サンプルはチューキーの多重比較検定を用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。散布図は、ＳＥＭをともなう平均として表されている。
参考
【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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