(57)【要約】核酸の検出または他のアッセイを実行するための使い捨てカセット。カセットは、使用中にベースステーションに挿入できる。カセットに、重力下でデバイスが正しく動作するようにするための多数のフィーチャを有する。例えば、ベントポケットが開封されたときに、あるチャンバから次のチャンバへ試料流体を流すことができるベントポケットなどである。ベントポケットには、偶発的な再封止を防ぐための突起がある。カセットはまた、開いたベントポケット間で空気が自由に移動できることを確保するために、ガスケットを有している。熱安定性材料上に配置されるパターンを持つ金属製の電気部品を備えたフレキシブル回路は、チャンバ内の流体と直接接触することができ、通気ポケットとチャンバと整列した抵抗加熱要素とを備えている。カセットチャネルまたはチャンバの凹部は、凹部に配置された凍結乾燥試薬の再水和を強化するために、流体の流れを方向付けるための隆起または溝などの構造を持つことができる。チャンバスキャンにおける分流器は、試料ガスの流速を低下させ、有効な流路の長さを長くし、カセット内の流体の流れをより正確に制御できるようにする。各チャンバの屋根には、チャンバの上部を横切る毛細管流体の流れを防ぐ突起があり、反応液の大部分から新たに再懸濁した試薬の隔離を減少または防止する。【選択図】図４６
2020517916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出するためのカセットであって、前記カセットは少なくとも１つの反応チャンバを備え、
前記反応チャンバの頂部は、前記カセットが鉛直に配向されている場合に、前記反応チャンバの前記頂部を横切る毛細管流体流動を最小化または防止するように、入口と、前記反応チャンバの中に入って下方に延在する突出部とを備える、前記カセット。
【請求項２】
前記突出部が、略三角形の形状である、請求項１に記載のカセット。
【請求項３】
前記突出部の第１の側面が、前記入口に隣接して実質的に鉛直に延在する、請求項１に記載のカセット。
【請求項４】
前記突出部の第２の側面が、鉛直から近似的に６０度未満の角度で前記反応チャンバの前記頂部へ向けて上方に延在する、請求項３に記載のカセット。
【請求項５】
前記角度が、鉛直から近似的に４５度未満である、請求項４に記載のカセット。
【請求項６】
前記角度が、鉛直から近似的に３０度未満である、請求項５に記載のカセット。
【請求項７】
前記突出部の前記第２の側面が、前記反応チャンバの前記頂部へ向けて鉛直に延在する、請求項６に記載のカセット。
【請求項８】
少なくとも１つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための凹部を備え、前記凹部が、前記反応チャンバの前記入口に接続されたチャネルに配置されている、請求項１に記載のカセット。
【請求項９】
前記突出部が、前記反応液体積の大部分から新規に再懸濁された試薬の隔離を低減または防止する、請求項８に記載のカセット。
【請求項１０】
前記凹部は、流体が前記少なくとも１つの乾燥試薬または凍結乾燥試薬の再水和を促進させるようにする１つ以上の構造を備える、請求項８に記載のカセット。
【請求項１１】
前記構造が、隆起、溝、ディンプル、またはそれらの組み合わせを備える、請求項１０に記載のカセット。
【請求項１２】
前記反応チャンバが、少なくとも１つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための凹部を備える、請求項１に記載のカセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２１日出願の「Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｔｅｓｔ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ」と題した米国仮特許出願第６２／４８８，４５３号に対する優先権、及びこの仮特許出願の利益を主張するものであり、この仮特許出願の明細書及び特許請求の範囲を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明の実施形態は、核酸の検出及び識別のための一体型デバイス及び関連方法に関する。デバイスは、完全に使い捨てであってもよく、または使い捨て部分と繰り返し使える部分とを含んでもよい。
【背景技術】
【０００３】
以下の説明は、いくつかの刊行物及び参考文献に言及する場合があることに留意されたい。本明細書では、そのような刊行物からの説明は、より完全な科学原理の背景を与えるためのものであって、そのような刊行物が特許性を判断する目的のための先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【０００４】
感染症及び新興疾患、生物学的脅威因子、遺伝病、ならびに病原体の環境供給源の公衆衛生に及ぼす影響及び公衆衛生に対する認知度が増大するにつれて、より有益で感度の高い特異的なポイントオブユース迅速アッセイの必要性により、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのツールに対する需要がますます増大するようになっている。ＰＣＲベースの増幅などの方法による核酸分子検査は、非常に感度が高く、特異的で、有益である。残念ながら、現在利用可能な核酸検査は、精巧で高価な計測設備、特殊な検査室用材料、及び／またはユーザの介入に頼る複数操作を必要とするため、現場での使用には不向きであり、または効用が限られる。したがって、ほとんどの試料が、分子検査のために中央検査機関に送り出され、必要な情報を取得するには長期にわたる所要時間がかかる。
【０００５】
迅速なポイントオブユース分子検査の必要性に対処するために、これまでの取組みでは、使い捨てカートリッジと比較的高価な関連機器とを使用する製品設計に焦点が当てられていた。流体移動、増幅温度制御及び検出を達成するために外部計測設備を使用するのは、分子検査に必要な複数プロセスの統合に伴う工学的課題の多くを簡単なものにする。残念ながら、精巧な計測設備に依存することにより、小規模診療所、地方自治体、州政府、及び法執行機関には大きな経済的障壁が課される。さらに、検査を実施するために少数の機器に依存すると、生物兵器剤の放出が疑われる間や、または新興の病気が流行している間に起こるように、必要性が高まる期間中に不必要な遅延を引き起こすおそれがある。実際に、機器と使い捨て試薬カートリッジモデルとは、アウトブレイクにより緊急時対応能力と高スループットとが要求される際には、潜在的に大きな影響を与えるネックとなる。さらに、計測設備への依存は、物流上の制約によって巨大な関連器材の輸送が妨げられ、またはインフラストラクチャ要件（例えば、信頼性のある電源）が不在である配備場所への検査デバイスの臨時の頒布を困難にする。
【０００６】
既存のマイクロ流体デバイスでは、重力が流体移動の手段とされている。ただし、典型的なデバイスでは、そのような流体移動の設定可能な制御、もしくは電子制御、または３つ以上の流体の混合が可能にならない。また、一部のデバイスでは、不活性流体または事前に充填された流体の落下によって生成される圧力降下を利用して、鉛直に配向されたときに、わずかな真空を誘発し、反応物を処理チャンバに引き込む。このことは、事前に充填された流体の安定性を確保するために、貯蔵及び輸送の複雑さを増大させる。複数の別個のステップで流体を動かすことを教示する既存のデバイスは、チャンバ間の壊れやすいシールまたはバルブを必要とし、これは動作及び製造を複雑にする。これらのデバイスは、チャンバごとに別々に離れた場所にあるベントの使用を教示していない。
【０００７】
典型的なマイクロ流体デバイスは、標準的な検査室手順で用いられるよりも小さめの反応体積を駆使する。ＰＣＲまたはその他の核酸増幅反応、例えば、ループ介在増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ならびにその他の等温法及び熱サイクル法は、通常、５〜１００マイクロリットルの反応体積を使用して、試験研究室で実施される。これらの反応体積は、希薄な被検査物中の少ないアッセイ対象の検出を保証するのに十分な試験体体積を収容できる。従来の検査室の分子検査で用いられているものと比較して反応体積を減少させるマイクロ流体システムは、必然的に反応に加えることができる被検査物の体積をも減少させる。反応体積が小さくなる結果、希薄な被検査物中に、またはアッセイ対象が少ない場合に、検出可能な量の対象が確実に存在する十分な被検査物量を収容するための容量が低下する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、標的核酸を検出するためのカセットであって、本カセットは、複数のチャンバと、チャンバに接続された複数のベントポケットと、ベントポケットの１つ以上を封止するための熱不安定性材料とを備え、少なくとも１つのベントポケットが突起を備える。突起は、好ましくは、ディンプルまたは凹凸を備え、好ましくは、溶融した熱不安定性材料が、この熱不安定性材料に隣接して配置された熱安定性材料に付着するのを十分に防止して、熱不安定性材料が破れた後に、ベントポケットを再封止することを防止する。
【０００９】
本発明はまた、標的核酸を検出するためのカセットであって、本カセットは、複数のチャンバと、チャンバに接続された複数のベントポケットと、ベントポケットの１つ以上を封止するための熱不安定性材料と、熱安定性材料と、熱不安定性材料と熱安定性材料との間に配置されたガスケットであって、このガスケットが複数のベントポケットを取り囲む開口部を備える、ガスケットとを備える。ガスケットは、圧力を平衡させるとともに、開いたベントポケット間の自由な空気移動を確保するのに十分な空気体積を提供するように十分な厚さであることが好ましい。カセットは、好ましくは、フレキシブル回路を備え、フレキシブル回路は、熱安定性材料上に配置されたパターンを持つ金属製の電気部品を備える。ガスケットは、好ましくは、フレキシブル回路が直接、少なくとも１つのチャンバ内の流体に接するように、第２の開口部を備えるか、または寸法が制限される。電気部品は、抵抗加熱要素または導電性トレースを備えることが好ましい。抵抗加熱要素は、好ましくは、ベントポケット及びチャンバに整列する。カセットは、好ましくは、１つ以上のチャンバの加熱温度、加熱時間、及び／または加熱速度を調節するための１つ以上の周囲温度センサを備える。
【００１０】
本発明はまた、標的核酸を検出するためのカセットであって、本カセットは、鉛直に配向した検出チャンバと、検出チャンバ内に配置されたラテラルフロー検出ストリップであって、検出ストリップの試料受容端部が検出ストリップの下端部にあるように配向したラテラルフロー検出ストリップと、増幅した標的核酸を含む流体を受け入れるためのラテラルフロー検出ストリップの下の検出チャンバ内の空間とを備え、この空間は、流体が、検出ストリップの領域をあふれさせたり、または別の方法で迂回したりすることなく、毛細管現象によって検出ストリップ上へ流れることを可能にする高さの流体の全体積を収容するのに十分な容量を有する。この空間は、好ましくは、染料ポリスチレンミクロスフェア、ラテックス、コロイド金、コロイドセルロース、金ナノ粒子、または半導体ナノ結晶などの検出粒子を含む。検出粒子は、増幅した標的核酸に結合することができるビオチン、ストレプトアビジン、ハプテン、または抗体などの増幅した標的核酸またはリガンドの配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。検出粒子は、好ましくは、乾燥され、凍結乾燥され、または多糖類、界面活性剤、もしくはタンパク質などの担体中の検出粒子の乾燥混合物として、内部表面の少なくとも一部に存在して、検出粒子の再懸濁を促進する。流体の毛細管プールが空間内に形成され、検出粒子の混合及び分散の改善をもたらして、検出粒子と増幅した標的核酸との混合を促進することが好ましい。カセットは、任意選択で、約２００μＬ未満、好ましくは約６０μＬ未満の容積を有するアッセイを行う。
【００１１】
本発明はまた、標的核酸を検出するためのカセットであって、本カセットは、少なくとも１つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための１つ以上の凹部を備え、凹部の少なくとも１つは、流体が少なくとも１つの乾燥試薬または凍結乾燥試薬の再水和を促進させるようにする１つ以上の構造を備え、凹部は、１つ以上の検出チャンバか、または検出チャンバに接続された１つ以上のチャネルに配置される。この構造は、好ましくは、隆起、溝、ディンプル、またはそれらの組み合わせを備える。
【００１２】
本発明はまた、標的核酸を検出するためのカセットであって、本カセットは、チャンバの頂部に垂直に入る流体が、チャンバの出口に直接流入するのを防ぐフィーチャを備えた少なくとも１つのチャンバを含む。このフィーチャは、好ましくは、流体を出口とは反対側のチャンバの側面へ偏向させる。結果として生じる流体の流路は、水平方向成分を含むことが好ましく、それによって流路の有効長が十分に長くなるとともに、流体の流速が十分に低下して、出口から出る流体の量を制限する。このフィーチャは、好ましくは、チャンバ内で流体の渦を作り出し、それによって流体内の試薬の混合を増進させる。フィーチャは、好ましくは三角形または台形の形状である。出口は、任意選択で先細りにされている。出口の下流に位置するチャネルは、チャネルの有効長を増加させるためのターンを任意選択で備える。フィーチャは、好ましくは、チャンバの底部近くに、もしくはチャンバの底部に、またはチャンバの中央近くに配置される。
【００１３】
本発明はまた、標的核酸を検出するためのカセットの中にあるチャンバを通る流体の鉛直流を制御する方法でもあり、本方法は、チャンバの頂部に入る流体の流れを偏向させ、それによって流体がチャンバの出口に直接流入するのを防ぐことを含む。本方法は、好ましくは、流体の流速を低下させ、それにより、流体が停止するまでに、流体が出口に接続されたチャネルを流れ落ちる距離を減少させることを含む。本方法は、好ましくは、チャンバに入る流体の流れを、チャンバの壁に接触して上方に向けられる第１の流体流動と、出口に入る第２の流体流動とに分けることを含む。第１の流体流動は、好ましくは、チャンバ内で渦巻き、それによって流体内の試薬の混合を増進させる。第２の流体流動は、メニスカスを形成し、出口に接続されたチャネルを通って移動することが好ましく、メニスカスは、流体の下流にあるチャネル内の閉鎖気室の圧力を、圧力によってチャネル内の流体の流れが止まるまで増加させる。出口は任意選択で先細りにされており、それによって出口への入口での圧縮性の空気体積を増大させる。本方法は、任意選択で、出口に接続されたチャネルにターンを設けることを含み、それによってチャネルの有効経路長を増加させるとともに、チャネル内の流体の流速を低下させる。
【００１４】
本発明はまた、核酸を検出するためのカセットであって、本カセットは少なくとも１つの反応チャンバを備え、反応チャンバの頂部は、カセットが鉛直に配向されている場合に、反応チャンバの頂部を横切る毛細管流体流動を最小化または防止するように、入口と、反応チャンバの中に入って下方に延在する突出部とを備える。突出部は、好ましくは、略三角形の形状である。突出部の第１の側面が、入口に隣接して実質的に鉛直に延在することが好ましい。突出部の第２の側面が、鉛直から近似的に６０度未満、より好ましくは鉛直から近似的に４５度未満、さらに一層好ましくは鉛直から近似的に３０度未満の角度で、任意選択で鉛直に、反応チャンバの頂部へ向けて上方に延在することが好ましい。本カセットは、好ましくは、少なくとも１つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための凹部を備え、凹部が、反応チャンバの入口に接続されたチャネルに配置されている。突出部は、反応液体積の大部分から新規に再懸濁された試薬の隔離を低減または防止することが好ましい。凹部は、流体が少なくとも１つの乾燥試薬または凍結乾燥試薬の再水和を促進させるようにする１つ以上の構造を備えることが好ましい。この構造は、好ましくは、隆起、溝、ディンプル、またはそれらの組み合わせを備える。代替または追加として、反応チャンバは、少なくとも１つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための凹部を備える。
【００１５】
本発明の目的、利点、及び新規の特徴、ならびに適用可能性のさらなる範囲は、添付の図面を併用して以下の詳細な説明で部分的に述べられ、部分的には以下の検討の上で当業者には明らかになり、または本発明の実施によって理解され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段及び組み合わせによって実現され得る。
【００１６】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を例示し、説明とともに、本発明の原理を説明する役割を果たす。図面は、本発明の特定の実施形態を例示するためのものに過ぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の検査用カセットの実施形態を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、スライドシール、試料口、試料カップ、及び膨張チャンバの内部領域を示す検査用カセットの一実施形態の分解立体図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の検査用カセットの一実施形態における流体ネットワークを表す図である。
【図２Ｂ−２Ｃ】図２Ｂ及び図２Ｃは、密閉封止された検査用カセットという状況で流体流動制御を達成するために、熱によってトリガされるベントをどのように用いて膨張チャンバに通気させるかに関して、ベントが開くより前と開いた後とをそれぞれ示す概略図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、抵抗加熱要素及び温度センサを備えたプリント回路アセンブリ（ＰＣＡ）の配置を示す使い捨て検査用カセットの一実施形態の図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、図２Ａに記載したフィーチャを含む射出成形プラスチック検査用カセットの写真を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、膨張チャンバの実施形態の動作原理を表す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、検査用カセット内のガス膨張前のピストン式膨張チャンバの断面図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、検査用カセット内のガス膨張後のピストン式膨張チャンバの断面図である。
【図４Ａ】図４Ａは、内容積を膨張させるために膨張可能なブラダが用いられた膨張チャンバを構成するアプローチを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、検査用カセット内のガス膨張よりも前のブラダ式膨張チャンバの断面図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、検査用カセット内のガス膨張の後のブラダ式膨張チャンバの断面図である。
【図５Ａ】図５Ａは、内容積を膨張させるために膨張可能なベローズが用いられた膨張チャンバを構成するアプローチを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、検査用カセット内のガス膨張よりも前のベローズ式膨張チャンバの断面図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、検査用カセット内のガス膨張の後のベローズ式膨張チャンバの断面図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ガスは自由に通過できるが、細菌、ウイルス、またはＤＮＡやＲＮＡといった巨大分子などの粒子はデバイス内に保定される半透性バリア、メンブレン、または材料の使用法を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、内圧を周囲圧力と等しくするため、または内圧を減少させるために、膨張チャンバの代わりに用いられる半透性バリアの断面図である。
【図７】二軸延伸ポリスチレン（ＢＯＰＳ）フィルムの層の間にスペーサによって膨張チャンバが作られる検査用カセット設計の分解立体図である。
【図８Ａ】図８Ａは、２つの流体チャンバ、検出ストリップチャンバ、及び３つのベントのための抵抗加熱要素と電気接触パッドとを備えるフレキシブル回路の実施形態の図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、２つの流体チャンバ、検出ストリップチャンバ、及び３つのベントのための抵抗加熱要素と、抵抗加熱要素に通電するための電気接触パッドとを備えるフレキシブル回路の実施形態を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、検査用カセットの実施形態の分解立体図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、組み立てられた図８Ｃの検査用カセットの図である。
【図９】ストリップの試料受容端部に毛細管プールが有るデバイス、及び無いデバイスからのラテラルフローストリップを示す図である。毛細管プールが有る場合は、検出粒子のより均一な分布と、ストリップ全体にわたるより均一な信号とが観察される。
【図１０】試料分割への階層的アプローチを示す図である。
【図１１】多重化及び試料細分化のための複数チャネルの流体ネットワークであり、検査ごとの流体流路を示す図である。追加の流体経路またはチャネルをネットワークに組み入れて、単一の使い捨て検査用カセット内で同時に行うことができる平行検査の数をさらに増やすことができる。
【図１２】試料口経由で試料カップへの導入後に試料が分割されて、同じ投入試料に対する平行独立検査を可能にする、本発明の検査用カセットの一実施形態における流体ネットワークの図である。試料カップから分岐するチャネルにより、試料液が検査用カセットの２つの別個の流体チャネルまたはチャネルに分割されるようにして、分割された試料に対して同時の検査を平行に実施できるようにする。
【図１３Ａ】図１３Ａは、内部構成要素の配置を示す組み立てられた試料調製サブシステムの図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、検査用カセットと一体化するように構成された核酸精製装置の構成要素を示す試料調製サブシステムの分解立体図である。
【図１４】試料を処理する過程で生じる構成要素の動きを示す試料調製サブシステムを通る断面図である。
【図１５】密閉シール構成要素、射出成形流体サブシステム、対応するカセット支持体及びＰＣＡを備えた試料調製サブシステムを示す分解立体図である。
【図１６】一体型試料調製サブシステムを備えた検査用カセットの実施形態の写真を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、密閉シール構成要素及び射出成形流体サブシステム設計を備えたサンプル調製サブシステムを示す分解立体図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、提示した一体型試料調製サブシステムをＰＣＡに接続した検査用カセットの実施形態の図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、流体経路、接続した電子機器、及び試料調製構成要素を示す検査用カセットの実施形態の切取図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、蓋が開いた位置にあり、検査用カセットが挿入された状態を示す本発明のドッキングユニットの実施形態の図である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、蓋が閉じた位置にある状態を示すドッキングユニットの図である。
【図１９】蓋が開いた位置にあり、検査用カセットが挿入された状態を示すドッキングユニットの一実施形態の写真を示す図であるＬＣＤディスプレイは、インフルエンザＡ／Ｂ検査用カセットの挿入を検出したことを表示している。
【図２０】本発明のカセット封止機構の実施形態を示す図である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、シールを備えた挿入カセットが開いた位置にある状態のドッキングユニット内のカセットシールセンサ配置の図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、シールを備えた挿入カセットが開いた位置にある状態のドッキングユニット内のカセットシールセンサ配置の切取図である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、シールを備えた挿入カセットが閉じた位置にある状態のドッキングユニット内のカセットシールセンサ配置の図である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、シールを備えた挿入カセットが閉じた位置にある状態のドッキングユニット内のカセットシールセンサ配置の切取図である。
【図２２】回転バルブを用いたシール閉鎖をもたらすために駆動ギアが使用されるカセット封止機構の実施形態の図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、蓋が、Ｏリングシールと、膨張チャンバとして機能する空の空気体積とを備えたヒンジ式の蓋である検査用カセットの実施形態を示す図である。この図では、蓋は開いた位置にある。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、Ｏリングが試料口の縁と密閉シールを構成している閉じた位置の蓋を示す図である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、検査用カセットを収容するサブアセンブリを構成するドッキングユニットのヒータボード及び検査用カセットホルダ構成要素の分解立体図である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ドッキングユニットの検査用カセット収容サブアセンブリの実施形態の図である。
【図２５】係合位置及び非係合位置での検査用カセットホルダ及びヒータボード取付けシステムであるスライド図である。
【図２６】第１の加熱流体チャンバの温度と第２の加熱流体チャンバの温度とを監視するドッキングユニットの一実施形態での赤外線温度センサ配置を示す図である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、検査用カセットの底部近くに位置するバーコードの読取りを可能にするドッキングユニットの実施形態の内部の光学センサ配置を示す図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、図２７Ａの細部を示す図である。
【図２８Ａ−２８Ｂ】図２８Ａ及び図２８Ｂは、それぞれ、検査用カセットが２つのヒータボードアセンブリの間に挟まれた二重ヒートボード構成の分解図及び組立図である。
【図２９Ａ−２９Ｂ】図２９Ａ及び図２９Ｂは、それぞれ、検査用カセットを収容するために枢動ドアが使用されたドッキングユニットの実施形態の実線図及び透過図である。枢動ドアを閉じると、検査用カセットの背面が、ドッキングユニット内に取り付けられたヒータボードと接触する。
【図３０Ａ−３０Ｂ】図３０Ａ及び図３０Ｂは、試料調製を作動させるためのサーボモータと検査結果収集のための光学系とを備えたドッキングユニットの内部構成要素のそれぞれ正面切取図及び側面切取図である。
【図３１Ａ−３１Ｂ】図３１Ａ及び図３１Ｂは、検査読取り装置を組み込んだドッキングユニットの実施形態の光学サブシステムの正面からの写真と側面からの写真とを示す図である。
【図３２Ａ−３２Ｂ】図３２Ａ及び図３２Ｂは、枢動する検査用カセット収容ドアが、それぞれ、開いた位置と閉じた位置とにあるドッキングユニットの実施形態の写真を示す図である。
【図３３】本発明のドッキングユニットのための再利用可能なサブアセンブリを示す図である。
【図３４】本明細書に記載の実施例１で得られた検査結果を示す図である。
【図３５】本明細書に記載の実施例２で得られた検査結果を示す図である。
【図３６】本明細書に記載の実施例３で得られた検査結果を示す図である。
【図３７Ａ】図３７Ａは、３つのチャンバを備えるカセットの透視図である。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、図３７Ａのカセットの分解立体図である。
【図３８】流体のフィーチャを示す図３７Ａのカセットの透過図である。
【図３９】三角形状の突出した流れのフィーチャと先細の出口とを備える本発明のチャンバの実施形態を示す図である。
【図４０】三角形状の突出した流れのフィーチャと平行な出口とを備える本発明のチャンバの実施形態を示す図である。
【図４１】台形状の突出した流れのフィーチャと平行な出口とを備える本発明のチャンバの実施形態を示す図である。
【図４２】積み重なる三角形状の流れのフィーチャと平行な出口とを備える本発明のチャンバの実施形態を示す図である。
【図４３】チャンバのほぼ中央に突出した流れのフィーチャを備える本発明のチャンバの実施形態を示す図である。
【図４４】流体流動を方向付けるための内部フィーチャを備える試薬凹部を示す図である。
【図４５】ディンプル構造を備える本発明のベントポケットの実施形態を示す図である。
【図４６Ａ】図４６Ａは、流体流路に配置された凍結乾燥試薬凹部を備える本発明のカセットの流体層の実施形態を示す図である。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、チャンバ内に延在する垂直突出部を示す凹部及び反応チャンバの拡大図である。
【図４７Ａ】図４７Ａは、１つ以上の反応チャンバに配置された凍結乾燥試薬凹部を備える本発明のカセットの流体層の実施形態を示す図である。
【図４７Ｂ】図４７Ｂは、チャンバ内に延在する垂直突出部を示す反応チャンバ内の凹部の拡大図である。
【図４８】垂直突出部を持たない反応チャンバを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態は、標的核酸を検出するための封止可能な使い捨てプラットフォームであり、この使い捨てプラットフォームは、好ましくは、標的核酸を含む試料を収容するための試料チャンバと、第１のチャネルを介して試料チャンバに接続され、第２のチャネルを介して第１のベントポケットに接続された増幅チャンバと、第３のチャネルを介して増幅チャンバに接続され、第４のチャネルを介して第２のベントポケットに接続された標識化チャンバと、第５のチャネルを介して標識化チャンバに接続され、第６のチャネルを介して第３のベントポケットに接続された検出サブシステムと、複数の抵抗加熱要素と、１つ以上の測温デバイスとを備え、ベントポケットはそれぞれ、抵抗加熱要素の１つ以上の近くに配置されたメンブレン、フィルム、またはプラスチックシートなどの好適な形態の熱不安定性材料によって、空気室との連通から封止されている。使い捨てプラットフォームは、任意選択で、検出アッセイの開始前にプラットフォームを封止するためのシールを備える。使い捨てプラットフォームは、好ましくは、乾燥試薬または凍結乾燥試薬を使い捨てプラットフォームへの組込みに適応させるように、チャンバ間のチャネルに沿って凹部を備える。これらの凹部は、任意選択で、試薬（複数可）に面した１つ以上の表面上の構造を備えて、乾燥試薬の再水和を促進するために、好ましくは毛細管現象または表面張力効果を利用して、封入した乾燥試薬へ流体を誘導し易くすることができる。そのようなフィーチャは、流体が凹部を通過するときに、流体を凹部の内部空間に誘導するために、図４４の隆起７００１などの隆起、溝、ディンプル、もしくはその他の構造を備えてもよく、またはその他の方法で、流体流動時の凹部の内部空間への流体の流動を補助してもよい。代替形態として、凹部は、１つ（または複数）のチャンバ内に直接配置されてもよい。
【００１９】
使い捨てプラットフォームは、任意選択でさらに、試料チャンバの投入口と直接流体接続する流出口を備えた試料調製ステージを備える。増幅チャンバの実質的に平坦な表面の寸法は、増幅チャンバと熱接触している抵抗加熱要素の実質的に平坦な表面の寸法とほぼ同じであることが好ましい。増幅チャンバは、任意選択で増幅溶液を収容しており、試料チャンバから増幅チャンバへのチャネルの凹部は、任意選択で凍結乾燥増幅試薬混合物を含み、好ましくは、増幅チャンバから標識化チャンバへのチャネルに、乾燥した検出粒子または凍結乾燥した検出粒子を含む凹部がある。増幅チャンバ及び標識化チャンバは、好ましくは、抵抗加熱要素を用いて加熱可能である。検出サブシステムは、好ましくは、検出粒子を含むラテラルフローストリップを備える。チャンバ、チャネル、及びベントポケットは、好ましくは、流体アセンブリ層に配置され、デバイスの電子的要素は、プリント回路基板を構成する別個の層に配置されることが好ましく、この別個の層は、流体アセンブリ層に結合されるか、またはドッキングユニットによって流体アセンブリ層と接触して配置される。検出サブシステムは、好ましくは、流体アセンブリ層に、または任意選択で第２の流体アセンブリ層に配置される。チャンバの少なくとも１つの体積は、好ましくは約１マイクロリットルから約１５０マイクロリットルの間である。使い捨てプラットフォームは、好ましくは使い捨てプラットフォームをドッキングユニットにドッキングさせるための連結器をさらに備え、好ましくは、使い捨てプラットフォームを鉛直の向きまたは傾いた向きに維持し、任意選択で電気的接触、電気部品、及び／または電源を提供する。
【００２０】
本発明の実施形態は、１つ以上の標的核酸を検出する方法であり、本方法は、好ましくは、使い捨てプラットフォームの試料チャンバ内に標的核酸を含む試料を投入すること、使い捨てプラットフォームを鉛直にまたは傾けた方向に向けること、増幅チャンバに接続された第１のベントポケットを、封入した空気体積に開放し、それによって試料が増幅チャンバに流入できるようにすること、試料を、試料チャンバと増幅チャンバとの間のチャネルの凹部に位置する、前もって凍結乾燥させた増幅試薬混合物と反応させること、増幅チャンバ内で標的核酸を増幅させること、標識化チャンバに接続された第２のベントポケットを、封入した空気体積に開放し、それによって、増幅した標的核酸が標識化チャンバに流入できるようにすること、増幅チャンバと標識化チャンバとの間のチャネルの凹部にある検出粒子を用いて、増幅した標的核酸を標識化すること、検出サブシステムに接続された第３のベントポケットを封入した空気体積に開放し、それによって、標識化した標的核酸が検出サブシステムに流入できるようにすること、及び増幅した標的核酸を検出することを含む。増幅のステップは、好ましくは、増幅チャンバに近接して使い捨てプラットフォーム内に配置された抵抗加熱要素を使用して、標的核酸を増幅することを含む。本方法は、好ましくは増幅チャンバを受動的に冷却することをさらに含む。本方法は、好ましくは標識化チャンバに近接して使い捨てプラットフォーム内に配置された抵抗加熱要素を使用して、標識化のステップ中に標識化チャンバを加熱することをさらに含む。本方法は、好ましくは外部機器ではないドッキングユニットを使用することにより、使い捨てプラットフォームの動作を制御することをさらに含む。
【００２１】
本発明の実施形態は、核酸分子アッセイの必要な全ステップを実施する非外部機器依存手段を統合し、より有益で高感度の分析を提供する新世代の核酸検査で現在のイムノラテラルフロー迅速アッセイを補完する使い捨てプラットフォームを含む。本発明の実施形態は、感染症疾患、生物学的脅威薬剤、農業試験、及び環境試験が大きな影響を与える可能性が最も高い小規模のクリニックや簡易環境または遠隔環境でのより広範に及ぶ迅速核酸検査の利用を促進する。本発明の特定の実施形態は、完全に自己完結型で使い捨て可能であり、外部機器が課すボトルネックを伴うことなく、平行検査を実行できるようにすることにより、需要増加時の「緊急時対応能力」を可能にする。さらに、安価なバッテリ駆動式またはＡＣアダプタ通電式のドッキングユニットと結合した低価格の使い捨てカートリッジが好ましい応用領域では、シンプルなドッキングユニットが用いられる本発明の実施形態は、再利用可能な構成要素を再利用可能でありながらも安価なベースに配置することによって、検査コストをさらに削減する。本明細書に開示されるプラットフォーム技術は、検査室の核酸増幅を基盤とした方法とほぼ同等の感度、最小限のユーザの介入及び訓練要求、増幅及び検出の両方によって与えられる配列特異性、多重容量、安定な試薬、低コストの大規模製造との親和性、簡易環境での使用を可能にするバッテリまたは太陽光を動力源とした稼働、及びデバイスを再設計することなく、追加または代替の生物標識を組み込むことを可能にする柔軟なプラットフォーム技術を提供する。
【００２２】
本発明の実施形態は、検査が通常行われる検査室環境から離れた場所で分析を実施するのに適した低コストの、ポイントオブユース核酸検出及び核酸同定のためのシステム及び方法を提供する。有利なことには、核酸増幅反応体積は、従来の検査室検査で一般的に使用されているのと同じ体積範囲（例えば、５〜１５０μＬ）であり得る。したがって、本発明の実施形態で行われる反応は、一般に認められた検査室アッセイと直接に比較でき、従来の分子検査で典型的に用いられるのと同じ被検査物体積の収容を可能にする。さらに、核酸の増幅は、好ましくは、増幅の開始前に恒久的に封止されていることが好ましい密閉封止された検査用カセット内で行われる。増幅した核酸を封止されたシステム内で保定することで、増幅産物による検査環境及び周辺領域の汚染を防止し、その結果、後続の検査で偽陽性結果が生じる可能性を低減する。検査用カセットに封止システムを統合することにより、ドッキングユニット内の対応するシール係合システムを使用して、アッセイ開始時のシール形成を強制できるようになる。本発明の実施形態では、増幅に先立ってシールを確実に閉じるために、検査用カセット一体型の封止機構を所定の位置に摺動させるラックアンドピニオン機構が使用される。ドッキングユニットに配置されたセンサが、検査用カセットに問い合わせて、検査反応を開始する前にシールが形成されたことを確認する。
【００２３】
本発明の実施形態は、射出成形プロセス及び超音波溶接を使用して製造され、高スループットの製造と低コストの使い捨て構成要素とを達成し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の凹部が流体構成要素に、それぞれが乾燥試薬ペレットを収容するために設けられている。超音波溶接が、溶接中にシステムに導入されるいかなるエネルギーによってもペレットを破壊することなしに使用され得る最終組立を通じて、凹部は、流体構成要素内に存在すべき凍結乾燥材料または他の方法で乾燥させた材料の使用を可能にする。
【００２４】
本発明の実施形態は、試料中の１つまたは複数の標的核酸配列の存在を検出するのに使用され得る。標的配列は、染色体ＤＮＡや染色体外ＤＮＡ（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）といったＤＮＡ、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ）であり得る。同様に、本発明の実施形態は、一塩基多型、欠失、挿入、逆位、及び配列重複を含む核酸多型を同定するのに使用され得る。さらに、本発明の実施形態は、転写レベルでの遺伝子の上方制御や下方制御などの遺伝子調節イベントを検出するのに使用され得る。したがって、本発明の実施形態は、１）農産物試料、臨床試料、食品試料、環境試料、及び獣医学的試料中の病原体核酸の検出及び同定、２）病気の遺伝子バイオマーカの検出、ならびに３）病原体、毒素、他の病因因子、環境刺激、または代謝状態の存在を受けて起こる遺伝子調節イベント（ｍＲＮＡの上方制御もしくは下方制御、または病気または代謝状態中に生成もしくは抑制された小分子ＲＮＡもしくは他の核酸分子の誘導）などの病気または代謝状態に関連するバイオマーカの検出による病気または代謝状態の存在の診断などの用途に使用され得る。
【００２５】
本発明の実施形態は、流体制御、温度制御、及び試薬混合の全ての態様を含む、核酸試料の添加時の標的核酸試料の調製、増幅、及び検出の手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、デバイスは、バッテリなどの携帯用電源を使用して核酸検査を実施する手段を提供し、完全に使い捨て可能である。本発明の他の実施形態では、使い捨ての核酸検査カートリッジは、核酸検査に通常必要とされる外部機器などの検査室計測設備の機能の全てを、そのような検査室計測設備または外部機器の使用を必要とすることなく実施できる単純で再利用可能な電子部品と連携して作動する。
【００２６】
本発明の実施形態は、容器、回路基板、及び流体構成要素またはマイクロ流体構成要素を備えるが、これらに限定されない核酸増幅及び核酸検出デバイスを提供する。特定の実施形態では、回路基板は、抵抗器、サーミスタ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、フォトダイオード、及びマイクロコントローラなどの様々な表面実装部品を含み得る。特定の実施形態では、回路基板は、ポリイミドなどの熱安定性基板を含むフレキシブル回路基板を備え得る。いくつかの実施形態では、フレキシブル回路は、熱安定性基板上に堆積または結合された銅またはその他の導電性コーティングまたは導電性層を備え得る。これらのコーティングは、生化学反応温度制御に用いられる抵抗加熱要素、及び／またはそのようなヒータ及び／または抵抗器、サーミスタ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、フォトダイオード、及びマイクロコントローラなどの、表面実装部品に適合する導電性トレースを備えるようにエッチングし、または他の方法でパターン化することができる。流体構成要素またはマイクロ流体構成要素は、水性試料を受け入れ、収容し、移動させるデバイス部分であり、様々なプラスチックから、超音波溶接、ボンディング、ヒュージング、またはラミネート加工、レーザ切断、水ジェット切断、及び／または射出成形を含む様々な製造技術によって作成され得る。流体工学的構成要素と回路基板構成要素とは、可逆的または不可逆的のいずれかにまとめられ、それらの熱的結合は、熱伝導材料または熱伝導複合物によって強化される。容器は、好ましくは、マイクロ流体及び回路基板層の精巧な構成要素を覆い隠して、装飾用及び保護用の外装として部分的に機能し、試料の投入、緩衝剤の放出、核酸の溶出、シール形成、及びデバイスを機能させるのに必要なプロセスの開始を容易にするのにも役立つ。例えば、容器は、試料投入口、シールの形成または係合のための機械システム、ユーザの有効化、緩衝剤の放出、試料流動の開始、核酸の溶出、及び電子部品と流体構成要素との間の熱界面またはその他の物理的界面の形成  を可能にするボタンまたは同等の機械的フィーチャを内蔵してもよい。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、流体構成要素またはマイクロ流体構成要素は、チャンバが任意選択で温度制御される制御された流体連通状態にある一連のチャンバを備え、それによって、その中に含まれる流体を設定が可能な温度レジメンの下に置く。本発明のいくつかの実施形態では、流体構成要素またはマイクロ流体構成要素は、好ましくは膨張チャンバ、試料投入チャンバ、逆転写チャンバ、増幅チャンバ、及び検出チャンバを含む５つのチャンバを備える。試料投入チャンバは、膨張チャンバへの導管と、核酸を含む試料を供給することができる試料投入オリフィスと、投入試料と混合させるために、製造の過程で乾燥材料を配置できる第１の凹部と、製造の過程で乾燥材料を配置できる第２の凹部につながる出口導管と、そこから逆転写チャンバにつながる導管とを備えることが好ましい。他の実施形態では、２つ以上のチャンバの機能が単一のチャンバに整理統合され、より少ないチャンバの使用で済むことを可能にする。
【００２８】
例えば、第１の凹部及び第２の凹部はまた、適切な緩衝剤、塩、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマ、及びＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素などの酵素を含み得る凍結乾燥試薬を備えてもよい。そのような凍結乾燥試薬は、好ましくは、凹部に核酸試料が入ると可溶化される。本発明のいくつかの実施形態では、第１の凹部は、生物学的薬剤の溶解及び／または投入試料中に存在する核酸の安定化に有用な塩、化学物質、及び緩衝剤を備える。本発明のいくつかの実施形態では、投入試料は、試料中に存在する細胞またはウイルスの溶解を達成するために、試料投入チャンバ中で加熱される。本発明のいくつかの実施形態では、第２の凹部は、凍結乾燥試薬と、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するのに有用な逆転写酵素などの酵素とを備える。本発明の実施形態では、第２の凹部は、加熱中に第２の凹部内の材料が、試料投入チャンバの温度よりも低い温度を維持できるように、試料投入チャンバから十分に隔離されている。本発明のいくつかの実施形態では、逆転写チャンバは、核酸を増幅させるための凍結乾燥試薬を含む第３の凹部を有した導管を備える。試料投入チャンバ、逆転写チャンバ、増幅チャンバ、及び検出チャンバは、ヒータボードに直接、あるいは流体構成要素もしくはマイクロ流体構成要素またはカセットのドッキングユニットへの挿入により取り付けられたときに、熱伝導をもたらすように、ヒータ回路基板上の加熱要素と位置合わせされ、かつ加熱要素に十分に近接して位置していることが好ましい。同様に、ベントの開放による電子制御を可能にするように、ヒータ回路基板上に存在する電子部品が、流体構成要素のベントポケットに物理的に接触し、または近接して配置されるのが好ましい。ヒータ回路基板の物理的レイアウトは、流体構成要素またはマイクロ流体構成要素の要素との位置合せを可能にするように設計され、その結果、溶解、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／または流体流動制御のためのヒータ回路基板の抵抗加熱要素が、それらが相互作用する流体構成要素の要素と熱界面を形成するように位置付けられる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態では、流体構成要素またはマイクロ流体構成要素は、試料投入チャンバ、溶解チャンバ、逆転写チャンバ、増幅チャンバ、及び検出チャンバを含む５つのチャンバと、各チャンバ間のチャネルに沿って配置される乾燥試薬または凍結乾燥試薬用の凹部とを備えることが好ましい。この実施形態では、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写とｃＤＮＡの増幅とは別々のチャンバで起こる。この実施形態では、試料投入カップから溶解チャンバに至る導管に沿って配置された第１の凹部は、生物学的薬剤の溶解及び／または投入試料中に存在する核酸の安定化に有用な塩、化学物質（例えば、ジチオスレイトール）、及び（例えば、ｐＨの安定化、増加、または減少のための）緩衝剤を備える。本発明のいくつかの実施形態では、投入試料は、最初に試料投入カップから第１の凹部を通って流れて熱溶解チャンバ内で加熱され、試料は任意選択で第１の凹部を構成する物質と混合される。本発明の他の実施形態では、溶解は、第１の凹部での化学物質との試料の混合と、溶解チャンバ内のこれらの化学物質の存在下での試料のインキュベーションとによって生じる化学的処理によって達成される。
【００３０】
溶解チャンバ内の処理が実質的に完了した後に、ベントを非機械的に破断させるヒータの電子制御により試料液が放出されて、試料液がチャネルによって第２の凹部を通って逆転写チャンバ内に流れるようにする。
【００３１】
上記の第２の凹部は、任意選択で、適切な緩衝液、塩、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマ、及び試料中のＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を達成するのに必要なＤＮＡポリメラーゼ及び／または逆転写酵素などの酵素を含み得る凍結乾燥試薬を備えてもよい。逆転写反応の実質的な完了に続いて、第２のベントが開放されて試料液が放出され、試料液はチャネルと、適切な緩衝剤、塩、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマ、及びＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を含む凍結乾燥試薬などの、核酸増幅に必要な試薬で構成される第３の凹部とを通って増幅チャンバに流れる。
【００３２】
増幅チャンバ内での核酸増幅の実質的な完了に続いて、第３のベントが開放されて、検出チャンバに通じるチャネルに試料液が放出される。上記のチャネルは、任意選択であるが好ましくは、検出チャンバ中の核酸の検出に有用な化学物質及び／または検出粒子複合体などの乾燥検出試薬または凍結乾燥検出試薬を備えた第４の凹部を備えてもよい。検出チャンバは、好ましくは、毛細管プール、増幅された核酸を検出するための試薬、及びラテラルフロー検出ストリップを備える。毛細管プールは、好ましくは、流体が、検出ストリップの上方への適正な毛管分子移動を対象にして流体を受け入れるように設計された検出ストリップの領域をあふれさせたり、または別の方法で迂回したりすることなく、毛細管現象によって検出ストリップ上へ流れることを可能にする高さである検出チャンバ内の流体の全体積を収容するのに十分な容量の空間を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、検出試薬は凍結乾燥試薬である。本発明のいくつかの実施形態では、検出試薬は、着色ポリスチレンミクロスフェア、コロイド金、半導体ナノ結晶、またはセルロースナノ粒子を含む。試料液は、検出チャンバ内で検出試薬と混合し、毛細管現象によって検出ストリップ上へ流れる。任意選択で、検出チャンバと位置合わせされたマイクロヒータを使用して、溶液が検出ストリップ上方へ移動する際に溶液の温度を制御してもよい。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、増幅反応は、反応における各プライマ対の一方のプライマが、所与の対の他方のプライマとは異なる濃度で存在する非対称増幅反応である。非対称反応は、ハイブリダイゼーションによる検出の容易化のための一本鎖核酸の生成に有用であり得る。非対称反応はまた、試料中の標的レベルの定量的または半定量的な分析を可能にする線形増幅反応におけるアンプリコンの生成にも有用であり得る。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、試料調製デバイスと一体化した核酸逆転写デバイス、増幅デバイス、及び検出デバイスを備える。試料調製デバイスを含む実施形態は、試料調製サブシステムの流出口またはバルブと、デバイスの流体構成要素またはマイクロ流体構成要素の１つまたは複数の投入口との間に、流体の伝達手段を提供する。
【００３５】
本発明の他の実施形態は、投入試料を流体構成要素またはマイクロ流体構成要素内の２つ以上の流体経路に分割する手段を含む。投入試料を分割する手段は、流入した流体を複数の流体経路にわたって流体を分配するように設計された体積計量チャンバに搬送するための分岐導管を備える。各計量チャンバは、ベントポケットへのチャネル管と、流体経路内の次のチャンバ、例えば溶解チャンバ、または逆転写チャンバ、または増幅チャンバへのチャネル管とを備える。
【００３６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法、及びその他の科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図されている。本明細書に記載され、または言及されている技法及び手順は、一般に十分よく理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．２００１）に記載され広く利用されている分子クローニング的方法など、従来の方法を用いて当業者によって一般的に使用されている。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は、別段の明記がない限り、一般に製造業者が規定したプロトコル及び／またはパラメータに従って実行される。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「標的核酸」または「鋳型核酸」という用語は、検出されることが意図された一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの断片または配列を意味する。
【００３８】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「微粒子」または「検出粒子」という用語は、二本鎖核酸に対して特異的な蛍光色素、蛍光修飾されたオリゴヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドコンジュゲートした量子ドット、あるいはポリスチレン、ラテックス、セルロース、または常磁性粒子もしくはミクロスフェアなどの固相要素を含む、増幅反応中に生成された核酸産物の標識に使用される任意の化合物を意味する。
【００３９】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「チャンバ」という用語は、流体がある期間にわたって滞留する流体区画を意味する。例えば、チャンバは、試料チャンバ、増幅チャンバ、標識化チャンバ、または検出チャンバであり得る。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「カセット」という用語は、アッセイまたはその他の化学分析もしくは生化学分析を行う際に使用される使い捨てまたは消耗型のカセット、容器、構成要素、またはカートリッジであると定義される。カセットは、単回使用であっても複数回使用であってもよい。
【００４１】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「ポケット」という用語は、通気機構として機能する区画を意味する。ポケットは、抵抗器またはポケットを開くための他の機構に隣接し、またはこれらに重ね合わされることが好ましい。例えば、上記の流体チャンバとは異なり、カセットの流体構成要素内に作成されたポケットは、ＰＣＡ上の抵抗器に位置合わせされた１つの開放面を有し得る。この開放面は、好ましくは、薄いメンブレン、フィルム、またはその他の材料によって覆われて、下層の抵抗器に通電することによって簡単に破れる、封止された空洞を作成する。
【００４２】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「チャネル」という用語は、一般に、例えば、入口、出口、またはベントチャネルを含む、２つ以上のチャンバ及び／またはポケットまたはそれらの組合せを接続する流体アセンブリ内の細い導管を意味する。入口チャネルまたは出口チャネルの場合、流体試料はチャネルを通って移動する。ベントチャネルの場合、導管は、流体を含まないままであり、流体チャンバをベントポケットに接続することが好ましい。
【００４３】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「外部機器」という用語は、次の特徴の１つ以上を有する再利用可能な機器を意味する。すなわち、この機器は、カセットを封止する以外に、使い捨てアッセイもしくは使い捨てカセットに対して機械的動作を行い、これには、限定されるものではないが、緩衝剤パケットに穴を開けること、及び／または流体をポンプで圧送すること、もしくは他の方法で流体に輸送力を能動的に提供することが含まれ、カセットもしくは使い捨てアッセイにおける流体流動の制御のためのバルブ及びその他の構成要素を制御するための可動パーツを備え、アッセイの選択的加熱による以外の流体流動を制御し、または定期的な較正を要求する。
【００４４】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用するとき、「ドッキングユニット」という用語は、アッセイを制御するが、外部機器について上記のいずれの特徴も有さない再利用可能なデバイスを意味する。
【００４５】
本発明の実施形態は、検査が通常行われる検査室環境から離れた場所で分析を行うのに好適な、低コストのポイントオブユース核酸検査のためのデバイスである。ある種のデバイスは、流体構成要素または流体層、及び電子部品または電子層を備え、任意選択で保護容器に入れられている。本発明の実施形態では、流体構成要素は、プラスチックによって構成され、動作中にチャンバが互いに垂直に配向される細いチャネルによって接続された一連のチャンバ及びポケットを備える。流体構成要素は、既製の表面実装デバイス（ＳＭＤ）を含むプリント回路基板、及び／またはエッチングされた導電性材料を備えて抵抗加熱要素を形成し、任意選択でＳＭＤを含むフレキシブル回路などの電子部品と重ね合わせられるか、または他の方法で電子部品と物理的に接触して設置され、マイクロコントローラを介して制御されることが好ましい。デバイスのいくつかの実施形態では、アセンブリ全体が使い捨てである。他の実施形態では、流体層及び物理的に結合された電子層は使い捨てであり、一方、小さな安価な制御ユニットは再利用可能である。別の実施形態では、流体構成要素は使い捨てであり、小型の制御ドッキングユニットまたはドッキングユニットは再利用可能である。全ての実施形態について、本発明は、「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」と題された国際公開第ＷＯ２００９／１３７０５９Ａ１号（参照により本明細書に援用される）に記載されているものなどの核酸試料調製デバイス、及び／またはこの国際公開に記載されている使用方法と統合することができる。本発明の実施形態は、確立された製造プロセスで安価に製造することができる一体型の核酸検査デバイスを含む。本発明は、広く受け入れられているハンドヘルドイムノアッセイのエンドユーザの観点からの単純さを維持しながら、デバイス内の流体温度を調整するという課題を克服し、連続的なステップ、試薬の添加、試薬の混合、核酸の検出では少量の試料を輸送して、分子試験データを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、アッセイ結果の収集、解釈、報告、及び／または送信のためのサブシステムが本発明に組み込まれている。本発明の実施形態は、標準的な組立技法によって構築することができる既製の電子的要素を利用するように独特に構成され、可動パーツを全くまたはほとんど必要としない。さらに、流体層の設計により、容易に入手可能なプラスチックと製造技法とが使用できるようになる。その結果、専用の検査室施設を必要とせずに、核酸の単離、増幅、及び検出が可能な、安価で使い捨てできる信頼性の高いデバイスが得られる。
【００４６】
既存の核酸検査デバイスは、一般に、多くのコストを付加し、及び／または特殊な製造方法を必要とする堆積フィルムヒータやペルチェ素子などの高性能の加熱要素を使用している。本発明の実施形態では、反応液の加熱は、数セント以下で購入できて、共通の製造基準により組み立てられ、試験される単純な抵抗表面実装デバイスを用いて達成されることが好ましい。これらの抵抗要素及び関連センサ要素の上に流体チャンバを層状に積み重ねることにより、反応液の流体温度を都合よく調整することができる。エレクトロニクス産業におけるＳＭＤ抵抗器及びフレキシブル回路の広範な使用は、本発明が十分に確立された品質管理方法に適していることを保証する。本発明の他の実施形態では、抵抗加熱は、フレキシブル回路基板の導電層に作られたパターンによって形成された加熱要素を用いて実現される。ＰＣＲなどの多くの核酸増幅技法では、反応液の急速な加熱のみでなく、急速な冷却もまた必要とされる。本発明の反応チャンバは、好ましくは、一面で加熱が行われ、対向する面にわたって流体温度を下げるのを助長するために周囲温度が用いられる。さらに、デバイスの実施形態の鉛直配向により、デバイスが水平の向きにある場合に比べて急速な受動的対流による冷却が可能となり、したがって、ペルチェ素子などの高価なデバイスを使わずに熱サイクル期間が短縮される。本発明のいくつかの実施形態では、冷却を促進するためにファンが使用される。
【００４７】
流体制御は、低コストの核酸検査デバイスの設計に関連するもう１つの課題である。当技術分野で知られているデバイスは、一般に、電気機械式、動電式、または圧電式のポンプ機構を用いて、デバイスの動作中に流体を操作する。これらのポンプ要素は、デバイスの複雑さとコストとの両方を増大させる。同様に、精巧なマイクロメカニカル設計または可動パーツを利用するバルブは、可動パーツの故障や生物付着といった複雑化させる要因のために、製造コストを増加させ、信頼性を低下させるおそれがある。前述の核酸検査デバイスとは異なり、本発明の実施形態は、マイクロコントローラ制御下の静水圧を毛細管力及び表面張力と共に利用して、流体体積を操作する。本発明のいくつかの実施形態の鉛直配向によって、アッセイの必要な操作に対応するように、反応液が、マイクロコントローラ制御下でチャンバからチャンバへと段階的に伝わることが可能になる。流体は、チャネルサイズ、静水圧、及び表面張力のバランスによって個々の反応チャンバに保持することができ、そこでは表面張力及び静水圧が、ガス置換により流体の進行を妨げる。試料は、好ましくは、マイクロコントローラ制御下で単純な通気機構が作動した後にのみ、下方チャンバに進む。ベントは、一旦開くと、流体が入るときに押し出される空気が第２のチャンバから抜けるように経路を供給することによって、流体が第１のチャンバから第２のチャンバに移動できるようにする。流体構成要素内の各チャンバ（またはチャンバ間の各チャネル）は、細いベントチャネルを介して、封止されたベントポケットに接続していることが好ましい。ベントポケットは、好ましくは、薄い熱不安定性プラスチックのメンブレンまたはシートで一面が封止され、このメンブレンまたはシートの下、その近く、またはそれに隣接する小型の表面実装抵抗器を加熱することによって、このメンブレンまたはシートは容易に破れる。下方チャンバのベントが開くと、流体の進行は、低い静水圧下でも進む。
【００４８】
以下で詳しく説明するように、本発明のいくつかの実施形態で使用される流体またはマイクロ流体のベント機構は、熱不安定性シールと熱的及び（任意選択で）物理的に接触している加熱要素を用いて、高度が低いチャンバを通気して、高度が高いチャンバからの流体をこの低いチャンバへ流動させることにより、流体移動の電子制御を可能にする。一実施形態では、抵抗器は、広く使用され十分に確立された電子装置製造方法を使用して、プリント回路基板に取り付けられ、熱不安定性材料を含むチャネルシールと物理的に接触して設置される。通電されると、表面実装抵抗器はシールを破断させるのに十分な熱を生成し、これにより、チャンバの通気が行われて、流体が移動される領域またはチャンバの内圧が、通気の前に流体が滞留する領域またはチャンバと平衡状態になる。チャンバ間の圧力の平衡により、高度が高いチャンバから高度が低いチャンバへの流体の移動が可能になる。高度が高いチャンバと高度が低いチャンバとの間の直接シールは、使用されないことが好ましい。チャネル及びベントシールを、流体チャンバから離して配置してもよく、それによって製造に効率的な構成での流体デバイスレイアウトが容易になる。シール材は、ベントチャネルを封止し、記載したように加熱により破れ得るあらゆる材料、例えば薄いプラスチックシートを含んでもよい。装置内の流体移動制御へのこのアプローチは、マイクロプロセッサやマイクロコントローラなどの電子制御回路の制御下で一連のチャンバを通して流体を移動させる能力を提供しながら、材料コストが低く、確立された製造技法を使用した製造に適していることから恩恵を受ける。ベント、ベントを封止する（及び流体チャンバまたは流体マイクロチャネル自体は封止しない）ための熱不安定性材料、及び熱で上記の封止を破壊する電子的手段の使用により、所定の時間または特定のイベントの完了（例えば、温度の到達、温度変化、もしくは一連の温度変化の達成、あるいは１つもしくは複数のインキュベーション時間、または他のイベントの完了）後に流体の移動が可能となるように、デバイスを通る流体の流動を制御する手段を提供する。いくつかの実施形態では、チャネルによって接続されたチャンバから気相水が分離されなければならない場合は、チャンバ間の上記のチャネルに妨害物が導入され得る。妨害物は、ベントを開いた後に液体水と接触すると溶解する可溶性材料、または妨害物の部位に熱を導入することにより除去できるパラフィンなどの融解し易い材料であってもよい。
【００４９】
さらに、ベントのアプローチは、流体チャンバ自体を封止することに勝るいくつかの利点を有する。ベントポケットは、流体工学的レイアウトのどこにでも配置でき、ベントポケットがベントチャネルを介して調整するチャンバと簡単に連通できる。製造上の観点から、好ましくは、接着剤、熱ラミネート加工、超音波溶接、レーザ溶接などの十分に確立された方法によって、全てのベントポケット（ベントポケットマニホールドを備えてもよい）に対して単一の封止メンブレンのみが流体構成要素に固定されるように、ベントポケットを局在化することができる。対照的に、流体チャンバを直接封止するには、各チャンバの位置に対応する別々の位置にシール材を配置する必要があり、これは製造がより困難である。これにより、単一のメンブレンによって封止された単一のベントポケットマニホールドと比較して、製造中により課題の多いシナリオが提示される。さらに、チャンバが直接封止されている場合には、溶融した封止材がチャンバ間のチャネルに残り、流れを妨げるおそれがある。封止材の粘度によっては、小型重力駆動装置で得られるよりも大きな圧力が流体カラムに必要になる場合がある。
【００５０】
本発明の実施形態では、試薬混合は、他のシステムほど複雑ではない。核酸増幅に必要な、緩衝剤、塩、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマ、及び酵素などの試薬は、凍結乾燥のペレットまたはケーキの使用により、安定に組み込まれることが好ましい。これらの凍結乾燥試薬は、流体チャンバ、流体チャンバの凹部、またはチャネルの凹部に封止され、水溶液との接触時に容易に可溶化され得る。さらなる混合が必要な場合に、本発明の実施形態の鉛直配向性は、溶液を混合する新規の方法のための機会を与えてくれる。流体チャンバの下層にあるヒータを利用することによって、ガスが加熱され、その上のチャンバ内の反応液が熱的に敏感な成分を含むとき、その溶液に気泡が送り出され得る。あるいは、溶液が熱的に敏感な成分を含まない場合は、溶液を沸騰するまで直接加熱するために、ヒータを使用してもよい。気泡の発生は、流体チャンバ及びチャネルに蓄積し、反応液を動かし、デバイス内の流体移動を妨げる可能性があるため、以前に開示された流体デバイス及びマイクロ流体デバイスでは望ましくないことが多い。本明細書に提示される本発明の実施形態の縦型の設計は、最小かつ一時的な流体置換のみをもたらして、気泡が流体表面まで上昇することを可能にし、流体システムまたはマイクロ流体システムに対する気泡の不利な影響をいずれも効果的に改善する。この縦型の設計により、加熱要素の電源を切った後に、プロセス中に動かされた流体が重力によって元の流体チャンバに簡単に戻るので、沸騰による混合もまた便利である。
【００５１】
本発明の実施形態では、比色検出ストリップを使用して、増幅した核酸を検出する。ラテラルフローアッセイは、使いやすさ、信頼性、及び低コストのために、イムノアッセイ検査で一般に使用されている。先行技術は、多孔質材料を試料受容区域として使用する核酸検出のためのラテラルフローストリップの使用の記述を含み、この試料受容区域は、標識化区域またはその近くにあり、この標識化区域はまた、多孔質材料で構成され、ラテラルフローアッセイデバイスの一端またはその近くに配置される。これらの従来の発明では、標識部分は標識化区域内にある。試料受容区域及び標識化区域として多孔質材料を用いると、一部の試料液及び検出粒子が多孔質材料内に保持されるようになる。本発明の実施形態では、検出に必要な可逆的に固定化された部分を有した多孔質材料を含む標識化区域を使用してもよいが、本発明の実施形態は、好ましくは、ラテラルフローストリップの試料受容区域とは異なるデバイスの領域に保持され、低い流体保持特性を有した非多孔質材料を含む検出粒子または検出部分を利用する。このアプローチにより、試料を含む核酸標的が、デバイスに属すラテラルフロー構成要素の試料受容端部を構成する多孔質構成要素に導入される前に、標識付けされるようになり、それによって、多孔質標識化区域における試料材料及び検出粒子の保持及び／または消失が不要となる。この方法はさらに、検出部分が存在するときの試料に、高温を伴う処理などの、様々な処理を用いることを可能にして、多孔質試料の受容もしくは標識化の区域の材料またはラテラルフロー検出ストリップ材料への温度の影響を考慮することなく、二本鎖標的または一本鎖標的内の二次構造の変性を達成する。さらに、試料受容区域とラテラルフロー接触するのではなく、ベントなどの流体構成要素の制御を受ける標識化区域の使用により、標的と標識とは、流体流動制御システムによって制御されている期間、接触したままにすることができる。したがって、本発明の実施形態は、試料及び検出粒子の相互作用時間及び条件が、材料の毛管輸送特性によって決定される従来のラテラルフロー検査ストリップとは異なり得る。温度調整されたチャンバに検出粒子を組み込むことにより、二本鎖核酸の変性が可能であり、効率的なハイブリダイゼーションベースの検出が可能になる。代替実施形態では、ＬＥＤ、フォトダイオード、及び光学フィルタの組合せを使用して、核酸増幅を検出するために蛍光が用いられる。これらの光学検出システムを使用して、増幅中のリアルタイムの核酸検出及び核酸定量と、増幅後のエンドポイント検出とを行うことができる。
【００５２】
本発明の実施形態は、核酸試料が選択的に増幅及び検出され得る低コストのポイントオブユースシステムを含む。さらなる実施形態は、「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」と題された国際公開第ＷＯ２００９／１３７０５９Ａ１号に記載されているような核酸試料調製デバイスとの一体化を含む。デバイスの実施形態は、好ましくは、プラスチック製の流体構成要素とプリント回路アセンブリ（ＰＣＡ）及び／またはフレキシブル回路との両方を備え、任意選択で、作動中の構成要素を保護する容器に入れられる。温度調整、流体及び試薬の混合は、マイクロコントローラによって連携されることが好ましい。反応カセットは、重力、静水圧、毛細管力、及び表面張力が、マイクロコントローラでトリガされるベントと連動して、デバイス内の流体移動を制御するように、鉛直に向けて動作することが好ましい。
【００５３】
本発明の実施形態では、調製済み試料流体または粗試料流体は、試料口に入り、試料カップを満たすか、または部分的に満たす。試料は、乾燥試薬または凍結乾燥試薬が試料と混合できる試料カップに、様々な期間保持することができる。検査の実施に有益な陽性対照試薬、対照鋳型、または化学試薬のような試薬を、試料カップ中に乾燥、液体、または凍結乾燥の形態で含めることによって、試料液に導入することができる。細菌検体もしくはウイルス検体の温度制御されたインキュベーションや熱溶解といった他の処理は、任意選択で、温度制御エレクトロニクスに接続された下層のマイクロヒータ及び温度センサシステムを用いて、試料カップ内で達成され得る。流体ネットワークは、ユーザが手動で、または自動化システム、例えば、ドッキングユニットに一体化しているサブシステム、もしくは試料処理サブシステムを介して、試料をカセットに導入するための試料口と、試料導入の間の蓄積を容易にし、試薬、化学成分を添加して、流体ネットワークの下流部分への試料のさらなる移動の前に必要とされる処理（例えば、細菌細胞またはウイルスの溶解を行うための熱処理）を行うために試料が保持される試料カップと、流体チャネル及び／またはチャンバの空気、ガス、または溶液の圧力をカセットの膨張チャンバの圧力と平衡させるための再循環ベント通路と、乾いた状態／乾燥させた状態、または凍結乾燥された状態、または半乾きの状態である試薬ビーズ（例えば、材料、試薬、化学物質、生物学的薬剤、タンパク質、酵素、その他の物質、またはこれらの物質の混合物であるビーズまたはペレット）が、試料を添加する前に、試料液またはカセットに導入された緩衝液によって再水和されて、その中に含まれるビーズまたはペレットを再水和し、その結果、その中の材料を試料液に混合し得るビーズ凹部と、カセット内の流体移動を制御するために開くことができる１つ以上のベントのセットと、試料が温度レジメンに従い得る第１のチャンバと、液体及び／またはガスの第２のチャンバへの早期侵入を防ぐため、または溶液またはガスの第２のチャンバへの移動を一時的に制御するために、第１のチャンバを第２のチャンバに接続する流体チャネル内の任意選択のバリアと、第２のチャンバであって、第１のチャンバと第２のチャンバとの間に任意選択で位置する任意選択の試薬ビーズ凹部から、任意選択で試薬を添加することに続いて、試料液がさらなる温度レジメンに従い得る第２のチャンバと、検体、またはレポータ分子、または検体の存在を示す他の物質を検出するために検査ストリップが取り付けられているチャンバを形成する検査ストリップ凹部とを備える。いくつかの実施形態では、カセットが、カセットの封止、溶出、検出、及びデータ伝達の機能を実施するドッキングユニットに挿入される。カセットがドッキングユニットに挿入され、試料が装填され、蓋が閉じられると、ユーザの介入を必要としないことが好ましい。
【００５４】
図１〜図２のカセット２５００の代表的な図を参照すると、核酸試料は、試料口２０を通して流体構成要素５の試料カップ１０に加えられる。アッセイ開始時にドッキングユニットの蓋を閉じることにより、スライドシール９１が閉位置に移動する。膨張チャンバ５２を封止するために、カバー２５が、スライド９１を適所に保持する。核酸試料は、オンライン（すなわち、一体型核酸調製サブシステム）か、別個の核酸調製プロセス（多くの市販の方法の１つ、例えばスピンカラムなど）に続いて、精製された核酸をピペットでデバイスに添加するか、または未処理の核酸含有試料から得ることができる。試料カップか、または試料カップ内もしくは試料カップに隣接する凹部１３にすでに存在するのは、試薬混合物１６であり、細胞及びウイルスの溶解を促進し、及び／または遊離した核酸を安定化するのに有用な成分を含んで、液体または乾燥の形態であってもよい。例えば、ジチオスレイトール及び／またはｐＨ緩衝試薬を使用して、核酸を安定化し、ＲＮａｓｅを阻害することができる。同様に、酸または塩基を媒介した溶解を達成するための試薬を使用してもよい。いくつかの実施形態では、試薬混合物が凍結乾燥されて、凍結乾燥試薬を形成する。いくつかの実施形態では、ウイルス、細菌、または核酸などの陽性対照が試薬混合物中に存在する。試料を試料カップに導入すると、試薬と試料とが混合して、その結果、試薬が試料に作用する。試料を試薬とさらに混合するか、または試薬を再懸濁するための任意選択の気泡混合ステップを任意選択で実施してもよい。次いで、任意選択で、試料カップ１０内で流体が加熱されて、細胞及びウイルス粒子を溶解する。次いで、流体は、好ましくは、チャネル４０を通って、デバイスが鉛直方向にあるときに試料カップの下に存在する第１のチャンバ３０に導かれる。試薬凹部１５は、好ましくは、流体が凹部を通過して第１のチャンバ３０に入る前に、凹部に含まれる乾燥試薬または凍結乾燥試薬と混合するように、入口チャネルに沿って位置している。第１のチャンバが逆転写チャンバである実施形態では、好ましくは試薬凹部１５に存在するのは、緩衝試薬、ｄＮＴＰ、オリゴヌクレオチドプライマ、及び／または乾燥形態または凍結乾燥形態にある酵素（例えば逆転写酵素）などの逆転写反応に必要な全ての成分である。逆転写チャンバは、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を支援するのに必要な温度調整のための手段を提供するように、加熱要素と接触していることが好ましい。チャネル３５は、チャンバ３０を試薬凹部３７に接続する。チャンバ３０でのｃＤＮＡ合成に続いて、ベント５０が開かれて、逆転写反応がチャネル３５を介して試薬凹部３７に流れることを可能にする。乾燥試薬または凍結乾燥試薬は、試薬が好ましくは増幅チャンバである第２のチャンバ内の試料に作用するように、入口３９を経て第２のチャンバ９０へと凹部を通過する際に流体と混合する試薬凹部３７を提供する。好ましくは試薬凹部３７に存在するものは、緩衝薬、塩、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、オリゴヌクレオチドプライマ、及び／または酵素などの増幅反応に必要な全ての化学成分である。いくつかの実施形態では、試薬混合物が凍結乾燥されて、凍結乾燥試薬を形成する。複数のアンプリコンが生成される多重化検査を容易にするために、多重化増幅は、増幅チャンバ（複数可）内、または好ましくは同増幅チャンバ（複数可）の上流の試薬凹部内に複数のプライマセットを堆積させることにより達成できる。さらに、複数の増幅チャンバ及び検出チャンバがデバイスに組み込まれている回路基板及び流体設計は、単一反応または多重反応であり得る複数の並列増幅反応を支援する。このアプローチは、同じ反応で複数対のプライマを使用する多重増幅から生じる当業者に知られている複雑化を低減または排除する。さらに、複数の増幅反応チャンバの使用により、種々の標的配列及び／またはプライマ配列に必要とされるそれぞれの溶解温度またはアニーリング温度などの、最適な増幅のための要件に適応させるように、個別の温度レジメン下での同時増幅が可能になる。
【００５５】
核酸増幅に続いて、ベントポケット１５０が開かれて、増幅反応産物がチャネル１３５を通ってチャンバ２３０に流れるようにする。チャンバ２３０内に位置している検出ストリップ２３５は、検出ストリップ２３５の領域上に配置されるか、または任意選択で毛細管プール９３内に配置される検出粒子によって標識された標的核酸の検出を可能にする。
【００５６】
試料カップ１０から第１のチャンバ３０への流体移動は、チャンバ３０が開口部５１を介して膨張チャンバ５２に通気されるために生じる。デバイスの第１のチャンバから第２のチャンバへの流体移動は、好ましくは、第２のチャンバに接続されたベントを開くことによって達成される。流体が第１のチャンバ３０に入ると、下流のチャンバに接続されたベントポケット５０が封止され、結果として、流体は、２つのチャンバを接続するチャネル３５を通過しないようになる。ここで図２Ａを参照すると、チャンバ３０からチャンバ９０への流体の移動は、ベントポケット５０を覆うシールを破ることにより、チャンバ９０内の空気を膨張チャンバ５２内の空気と連通させることによって達成され得る。ベントポケット５０でのシールの破断により、ベントチャネル６０を介してチャンバ９０内の空気が、開口部５１を通してベントポケット５４に接続された膨張チャンバ５２内の空気と連通することが可能になる。ベントポケット５４のシールは、図２Ｂに示すように、開いているか、前もって破かれていることが好ましい。図２Ｃに示すように、ベントポケット５０のシールの破断により、ベントポケット５０（したがってチャンバ９０）がベントポケット５４（したがって膨張チャンバ５２）と連通できるようになる。この流体移動の方法は、好ましくは、検査用カセット内に生体有害試料と増幅した核酸とを閉じ込めるように、密封された空間内で実施される。密封されたカセットを可能にするために、選択的に耐熱性材料と熱不安定性材料とが、図２Ｂ〜図２Ｃの断面図で概略的に表されるようにして層状に積み重ねられる。ここで図２Ｂ〜図２Ｃを参照すると、プリント回路基板またはＰＣＡ７５上に好ましくは抵抗器を備える熱源７０が、ベントポケット５０、５４と位置合わせされるとともに、熱不安定性のベントポケットシール材８０に近接して設置される。ベントポケットシールは、ポリオレフィンやポリスチレンといった熱不安定性材料を含み得る。密閉バリアを形成するために、熱源７０と熱不安定性ベントポケットシール材料８０との間に、熱安定性材料（ポリイミドなど）７２が配置されることが好ましい。いくつかの実施形態では、ベントポケット間の、またはベントポケットを囲む封止された空間５５は、熱安定性材料７２を熱不安定性材料８０及び／または流体構成要素５に結合し、１つ以上のベントが開かれた後に、ベントの領域に検査用カセットの密閉シールを維持する一方で、好ましくは、開いたベント及び／または任意選択の膨張チャンバの間の空気の連通のための空隙をも提供する接着層を備えた任意選択のガスケットまたはスペーサ５６を組み入れることで強化される。この実施形態では、熱が熱源７０から熱安定性材料７２及び封止空間５５を通して熱不安定性のベントポケットシール材８０に伝達されて、シール材８０を破いてベントポケット５０を開放する。マイクロコントローラが、熱源７０に電流を送る役割を担うことが好ましい。ベントポケット５０は、検査用カセット内のガスが、検査用カセットの外側の環境に対して封止されたままであり得るように、密閉されている空間に対して開放することが好ましい。この密閉空間は、検査用カセット内の空気を含んでもよく、任意選択で、膨張チャンバなどのガス膨張を可能にする空の空気チャンバを含んでもよい。図２Ｃに示すように、ベントポケット５４は熱源７１により前もって破かれ、ベントポケット５４は膨張チャンバとガス連通しているため、ベントポケット５０を開くと、通気される流体チャンバ内のガスが膨張チャンバのガスと連通する結果になる。通気された流体チャンバ内で結果として生じる減圧は、流体が重力によって、上方に位置するチャンバからその通気されたチャンバに流れ込むことを可能にする。ベントポケットの他の実施形態は、感熱性メンブレン以外のシールを備えてもよく、穿刺、引き裂き、または溶解など、シールを破る他の方法を利用してもよい。そのようなカセットの写真を図２Ｅに示す。ベントポケットの開放面の向かい側の面が、任意選択で、ディンプル、突起、凹凸、または図４５のディンプル７００４などのその他の同様の構造を備えて、ベントシール材を破く間の開口部の形成を促進してもよい。そのような構造はまた、好ましくは、シールの破断後のベントの再封止を防ぐ。これは、表面実装部品を持つ回路基板を備えた実施形態で起こり得る。そのような実施形態では、表面実装抵抗器は、ポリイミドフィルムを引き伸ばし、これをガスケットの開口部内に押し込んで、熱不安定性材料に押し付ける場合がある。
【００５７】
シールが破断すると、溶けたシール材がそのポリイミドと二次シールを形成し、それによってベントが閉じられ得る。加熱要素を形成する金属トレースを備えたフレックス回路を持つ実施形態では、ヒータによりポリイミドフレックス回路が局所的に変形して、ガスケット内の開口部に延在する突起（多くの場合、ヒータ材料を含む）を形成しがちであり、場合によっては、溶けたシール材によってベント開口部を塞ぐ可能性がある。ディンプル７００４は、これらの発生を防止するのに役立つ。
【００５８】
封止空間５５は、任意選択で、他のベント、ベントポケット、またはチャンバ（膨張チャンバ５２など）への導管を提供する。ベントを開いた後で、流体構成要素５は、外部環境５９から封止され続ける。膨張チャンバ５２は、温度変化によるガス膨張がシステムの圧力に大きな影響を与えないように十分に大きな容積を提供することによって、またはピストン（図３）、フレキシブルブラダ（図４）、ベローズ（図５）の変位、もしくは巨大分子を除いて気体がバリアを自由に通過できるようにする疎水性バリア（図６）によって、いずれかで空気／水蒸気体積を緩衝することにより、加熱中のガス膨張に対応することが好ましい。図３では、膨張チャンバは、封止された流体システム内の圧力が増加することによって変位するピストンを利用している。膨張チャンバは、封止されたシステム内の圧力の蓄積を低減または排除するのに役立つ。密封された検査用カセット内の圧力の増加に応じてピストンの変位が起こり、加熱中のガス膨張などのプロセスから生じた検査用カセット内の内圧を低減させる。図４では、密封された検査用カセット内の圧力の増加に応じてブラダのゆがみが生じる。ブラダの変位により、加熱中のガス膨張などのプロセスから生じた検査用カセット内の内圧が減少する。図５では、密封された検査用カセット内の圧力の増加に応じてベローズの伸びが起こる。ベローズが伸びると、加熱中のガス膨張などのプロセスから生じた検査用カセット内の内圧が減少する。
【００５９】
膨張チャンバは、図１に示された検査用カセットの上部の膨張チャンバ５２に示す内包される体積など、空の空気体積として組み込まれ得る。図７に示すように、最小限の厚さのカセットの製造を容易にするために、熱不安定性材料４１０及び熱安定性材料４３０に封止されて流体構成要素４００の支持体を形成する場合に、適切に設計されたガスケット４２０によって形成される空隙４４０に膨張チャンバを組み込むこともできる。検査用カセットの物理的寸法の最小化は、輸送コストを削減し、熱質量を削減し、見た目がよく使いやすいデザインを提供するために望ましい。ガス膨張のために空気体積を形成することに加えて、ガスケット４２０は、熱安定性材料４３０と熱不安定性材料４１０との間に空間を作り出して、環境への露出を防ぐように封止システムを維持しながら、開いたベントを通る空気の自由な移動を促進する。ガスケット４２０は、好ましくは、開いたベントの間の圧力を平衡化するのに十分な空隙を提供するように十分な厚さであるが、ガスケット４２０はまた、ヒータと対応するベントポケットとの間の界面、または熱安定性材料によるカセットの封止に実質的に影響を及ぼさないほどに十分に薄い。フレックス回路を含む本発明の実施形態では、フレックス回路は、ポリイミドなどの熱安定性材料を含むことができ、その場合は、例えば図８Ｃに示すように、熱安定性材料の別個のシート４３０は必要とされない。封止された検査用カセット内の圧力を減圧または平衡化するために膨張チャンバを使用することによって、圧力の不均衡が検査用カセット内での好ましくないか、または早すぎる溶液の動きを引き起こさず、圧力の蓄積が、チャンバ間の移動やチャネルを通る移動といった所望の流体の動きに悪影響を与えないことが保証される。この圧力の制御、つまりデバイス全体にわたっての指定された圧力分布の確立は、システムが大気圧にかかわらずに、設計通りに作動できるようにする。したがって、膨張チャンバは、使用されるシステム内の安定した圧力に依存する制御された流体移動を可能にするとともに、密封された検査用カセットの使用をも可能にし、それによって、検査用カセットを大気に排出することの不利な点、例えば、大気へのアンプリコンの潜在的な放出を回避する。さらに、膨張チャンバへのベントを開くなど、流体の下流の圧力を減少させることによって流体流動を可能にする本方法は、流体の上流に正圧を生成するポンプ、または可動パーツを有したその他のデバイスの必要性を排除する。流体の下流の領域を、下流の領域と実質的に同じ圧力で比較的大きなリザーバ（膨張チャンバなど）に通気することにより、同様の利点が可能であり、それによって（デバイスが適切な向きにあるということ条件で）流体が重力の下で流れることを可能にする。膨張チャンバの大きさは、流体が流れるのに必要な毛細管力または重力に打ち勝つ点までシステムの圧力を増加させることなしに、アッセイ中に生成される反応蒸気を収容するのに十分に大きいことが好ましい。
【００６０】
第２のチャンバが増幅チャンバである実施形態では、このチャンバは、好ましくは加熱要素と接触して、核酸増幅を支援するのに必要な温度調整のための手段を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、増幅チャンバは、内面の少なくとも一部にオリゴヌクレオチドを含み得る。図２Ｄに示すように、チャンバ３０の壁９５と１つ以上の加熱要素１００との間の界面に、熱グリースや熱的コンパウンドといった熱伝導性材料を配置することが有利であり得る。マイクロコントローラは、好ましくは、ＰＣＡ７５上の温度センサ１１０から収集されたデータに基づき、単純なオン／オフ温度制御方法もしくは比例積分微分（ＰＩＤ）温度制御方法、または当業者に知られているその他のアルゴリズムによる温度制御を使用して、好ましくは金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）によって抵抗加熱要素（複数可）への電流を変調する。
【００６１】
加熱要素と、いくつかの実施形態では対応する温度センサ（複数可）とを使い捨て部品上に配置することにより、温度制御サブシステムと、これらが接続して機能する増幅チャンバ及び検出チャンバとの間に、再現性の高い熱的結合を製造することが可能になる。このアプローチは、製造中に熱伝導性境界面を形成することにより、流体サブシステムを電子サーマル制御サブシステムに結合する信頼性の高い手段を可能にする。結果として得られる電子温度制御構成要素と流体サブシステムとの間の優れた熱接触により、急速温度平衡、したがって迅速アッセイがもたらされる。フレキシブル回路を使用して、流体構成要素の支持体の裏側に直接またはガスケットを介在させて融着される使い捨ての抵抗加熱要素を提供することにより、優れた熱接触、急速な温度サイクル、及び再現性のある製造を達成する低コストの手段が可能になる。フレックス回路の導電層をエッチングして、必要な抵抗を発揮する形状を形成することにより、逆転写、増幅、及び流体流動ベント制御用の抵抗加熱要素をフレックス回路上に直接形成することができる。このアプローチにより、追加の電子部品が不要になり、製造が簡素化され、コストが削減される。
【００６２】
本発明の実施形態では、抵抗加熱及びベント開口のためのフレキシブル回路７９９を図８に示している。使い捨てカセットの構成要素としてフレキシブルヒータを使用することにより、カセット支持体を、加熱された流体チャンバ内の流体が、フレキシブルヒータ回路を構成する材料と直接接触することを可能にする構成となるようにすることができる。例えば、図８Ｃに示すように、カセットの後部を形成する熱的不安定性材料８０７（好ましくはＢＯＰＳを含む）の窓８０６を、流体がフレキシブル回路７９９に直接接触することが可能となるように、流体チャンバ上に配置してもよい。フレキシブル回路層と、フレキシブル回路上のヒータによって温度制御される流体との間の直接接触により、急速な温度変化が可能な低熱質量システムが提供される。温度調整に使用する温度データの収集を可能にするために、温度センサをフレキシブル回路に任意選択で組み込んでもよく、及び／または赤外線センサなどの非接触式の温度監視手段を使用してもよい。フレキシブル回路内の加熱要素８００などの抵抗加熱要素は、これらがベントポケットと位置合わせされている場合に、ベントを破くのに利用することができる。電気パッド８１２は、加熱要素８００に電流を供給する。同様に、１つまたは複数のフレキシブル回路は、流体チャンバを加熱するための抵抗加熱要素８０２及び８０３、及び検出ストリップの温度を調整するための任意選択の抵抗加熱要素８０４を備えてもよい。
【００６３】
この実施形態では、フレキシブル回路７９９はまた、上述の熱安定性材料７２と同様に、密封されたカセットを維持するための熱安定性シールとしても機能することが好ましい。任意選択で、追加の熱安定層（例えば、ポリイミドを含む）を、フレキシブル回路７９９と後部容器またはパネル８０５との間に配置することができる。スペーサまたはガスケット８０８が、熱的不安定性材料８０７とフレキシブル回路７９９との間のベント抵抗器８００の周りに配置され、封止されたカセットを維持しながら、開放されたベントを通る自由な空気の移動を確保することが好ましい。後部容器またはパネル８０５は、好ましくは薄いプラスチックを含み、好ましくは、フレキシブル回路の露出した表面の上に、取り扱い中に回路を保護するために設置される。後部容器またはパネル８０５は、冷却及び温度監視を容易にするために、フレキシブル回路７９９上の加熱要素の上に窓を備えてもよい。ドッキングユニットの制御電子機器（後述）との電気的接触は、好ましくは、エッジコネクタ、またはバネ負荷ピンなどのコネクタピンを含む一組の電気パッド８１０によって任意選択で提供されてもよい。
【００６４】
検査用カセットチャンバの実施形態は、約３０℃〜約１１０℃の範囲の温度への加熱及び冷却の繰返しに耐えることができる材料を含むことが好ましい。さらにより好ましくは、チャンバは、毎秒約１０℃〜毎秒約５０℃の範囲の温度変化率で、約３０℃〜約１１０℃の範囲の温度への加熱及び冷却の繰返しに耐えることができる材料を含む。チャンバは、好ましくはマイクロコントローラのプログラミングによって制御される、逆転写、熱サイクル、または等温増幅プロトコルなどの熱媒介溶解及び生化学反応に適した温度で、その中の溶液を維持できることが好ましい。いくつかの核酸増幅用途では、標的核酸を変性させるため、及び／またはホットスタートポリメラーゼを活性化するために、例えば約３７℃〜約１１０℃の温度で１秒間〜５分間の、高温での初期インキュベーションを提供することが望ましい。続いて、反応溶液は、等温増幅のために増幅チャンバ内の増幅温度に保持されるか、または熱サイクリングベースの増幅のために、核酸二本鎖変性をもたらす温度と、標的とのハイブリダイゼーションによるプライマアニーリングとポリメラーゼ触媒核酸重合によるプライマの伸長とに適した温度とを含むが、これらに限定されない、少なくとも２つの温度の間で温度が変化する。熱サイクルレジメンにおける各必須温度でのインキュベーションの持続時間は、標的核酸の配列組成及び反応混合物の組成によって異なり得るが、好ましくは約０．１秒〜約２０秒の間である。通常、加熱と冷却の繰返しは、約２０サイクル〜約５０サイクル行われる。等温増幅法を含む実施形態では、反応液の温度が、使用される増幅技法に応じて約３分〜約９０分の間、（場合によっては高温での最初のインキュベーション後に）一定温度に維持される。増幅反応が完了すると、増幅反応液は、増幅に使用されるチャンバの下のチャンバと連通しているベントを開くことによって、下方チャンバに輸送されて、増幅された核酸のさらなる操作を達成する。本発明のいくつかの実施形態では、操作は、増幅した核酸の変性、及び検出粒子にコンジュゲートした検出オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む。本発明のいくつかの実施形態では、増幅した核酸は、検出粒子にコンジュゲートした検出オリゴヌクレオチド、及び検出ストリップに固定された捕捉プローブにハイブリダイズされる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、追加の生化学反応が、増幅反応の前に、増幅反応中に、または増幅反応後に、増幅チャンバで行われ得る。そのようなプロセスには、ＲＮＡがｃＤＮＡに転写される逆転写、複数のプライマ対が複数の標的核酸を同時に増幅する多重化、及び増幅反応プロセス中に増幅産物が検出されるリアルタイム増幅が含まれるが、これらに限定されない。後者の場合、増幅チャンバは、バルブまたは出口チャネルを含まなくてもよく、増幅チャンバは、好ましくは光学窓を備え、または別の方法で増幅反応プロセス中にアンプリコン濃度の問合せを可能にするように構成される。リアルタイム増幅の一実施形態では、標的核酸に相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光色素のいずれかが、ＬＥＤやダイオードレーザ（複数可）などの励起光源、フォトダイオードなどの検出器、及び光学フィルタを含むがこれに限定されない適切な光学構成要素を用いて、蛍光強度について監視される。
【００６６】
検出
検出チャンバ２３０の実施形態は、好ましくは、増幅チャンバ内で生成された増幅した標的核酸の特異的標識化を提供する。図２Ａに示すように、検出チャンバ２３０は、毛細管プールまたは空間９３及び検出ストリップ２３５を含むのが好ましい。毛細管プール９３中に、染料ポリスチレンミクロスフェア、ラテックス、コロイド金、コロイドセルロース、金ナノ粒子、または半導体ナノ結晶を含む検出粒子が存在するのが好ましい。上記の検出粒子は、標的分析物に相補的なオリゴヌクレオチドを含み得るか、またはビオチン、ストレプトアビジン、ハプテン、または標的増幅核酸上に存在するハプテンなどの標識に対する抗体に結合し得るリガンドを含み得る。検出チャンバ２３０は、乾燥した検出粒子、凍結乾燥した検出粒子、または多糖類、界面活性剤、タンパク質、もしくは検出粒子の再懸濁を促進するための当業者に知られている他の化合物などの担体中の検出粒子の乾燥混合物として内面の少なくとも一部に存在する検出粒子を含むことができる。いくつかの実施形態では、ラテラルフロー検出ストリップは検出粒子を含み得る。他の実施形態では、検出チャンバに通じる試薬凹部チャネル１３５が、検出粒子を含み得る。検出チャンバは、加熱及び／または冷却することができてもよい。
【００６７】
適切な検出粒子には、二本鎖核酸に特異的な蛍光色素、蛍光修飾されたオリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドコンジュゲートした染色微粒子またはコロイド金もしくはコロイドセルロースが含まれるが、これらに限定されない。アンプリコンの検出には、検出すべきアンプリコンに相補的であるか、または他の仕方で特異的に結合できる「検出オリゴヌクレオチド」または他の「検出プローブ」が必要とされる。検出オリゴヌクレオチドの微粒子へのコンジュゲートは、ストレプトアビジン被覆粒子とビオチン化オリゴヌクレオチドの使用により、またはカルボジイミドの存在下でカルボキシル化粒子が活性化され、検出オリゴヌクレオチドに存在する一級アミンと特異的に反応するカルボジイミド化学作用によって起こり得る。検出オリゴヌクレオチドの検出可能な部分へのコンジュゲートは、内部で、または５’末端もしくは３’末端で起こり得る。検出オリゴヌクレオチドは、微粒子に直接、またはより好ましくはエチレングリコールやポリヌクレオチドといったスペーサ部分を介して付着させてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、検出粒子は、多重化増幅などのプロセスから生じる増幅した核酸の複数の種に結合し得る。これらの実施形態では、増幅した核酸の各種の特異的検出は、検出すべき種ごとに特異的な方法を用いる検出ストリップ上での検出によって実現され得る。そのような実施形態では、増幅中に標的核酸に導入されたタグは、存在する全ての増幅した種を標識するために使用され得、一方、標識核酸の検出ストリップに固定化された種特異的捕捉プローブへの後続のハイブリダイゼーションは、増幅したＤＮＡのどの特異的種が存在するかを決定するために使用される。
【００６８】
二本鎖ＤＮＡ増幅産物の場合、検出チャンバへの導入後に反応液を加熱すると、検出が容易になることがある。二本鎖ＤＮＡを融解するか、一本鎖ＤＮＡの二次構造を変性させ、次いで検出オリゴヌクレオチドの存在下で冷却すると、増幅した標的核酸の配列特異的標識が得られる。検出チャンバの下にある加熱要素を使用して、流体体積を約１〜約１２０秒間加熱して、二本鎖ＤＮＡの融解または一本鎖ＤＮＡ二次構造の変性を開始することができる。溶液が室温まで冷却され得るとき、増幅した標的核酸は検出微粒子に特異的にハイブリダイズし得る。次いで、反応体積は、好ましくは、検出チャンバのベントを開くことによって、標識化チャンバの下の検出チャンバの領域に導かれる。
【００６９】
効率的な標識化が生じるためには、可溶化された検出粒子が、反応液とよく混合されることが好ましい。本発明の実施形態では、検出粒子を、チャネル１３５の出口の毛細管プール９３に局在化させて、溶液がチャンバ２３０に入るときに溶液との混合を促進することができる。毛細管プール９３内の検出粒子は、任意選択で、凍結乾燥された検出粒子であってもよい。毛細管プールは、粒子の改善された混合及び分散を提供して、検出粒子と、検出粒子が結合する核酸との混合を促進する。図９に示すように、毛細管プールはまた、検出ストリップ上の粒子移動の均一性を高める。毛細管プールは、２００μＬ未満、より詳細には約１００μＬ未満、さらにより具体的には約６０μＬ未満、さらにより具体的には約４０μＬの容量などの低容量アッセイに特に有利である。
【００７０】
本発明の検出チャンバの実施形態は、増幅した標的核酸の特異的な検出を提供する。本発明の特定の実施形態では、検出は、線、ドット、マイクロアレイ、または直接または間接的に標識化アンプリコンに特異的に結合できる結合部分を含む視覚的に識別可能な他の要素でパターン化された多孔質材料（セルロース、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷修飾ナイロン、またはポリテトラフルオロエチレンなど）で構成される吸収性ストリップを介して、標識化アンプリコンを含む溶液を毛細管作用で運ぶこと（ウィッキング）によって達成される。いくつかの実施形態では、デバイスの吸収性ストリップ構成要素は、物理的に接触した最大３つの多孔質基材を含む。すなわち、ウィッキングを高める両親媒性試薬を含む界面活性剤パッド、標識化アンプリコンを選択的に結合できる少なくとも１つの結合部分が固定化されている多孔質材料（セルロース、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷修飾ナイロン、またはポリテトラフルオロエチレンなど）を含む検出区域、及び／または追加の吸収能力を提供する吸収性パッドである。検出粒子は、検出チャンバ内のラテラルフロー多孔質材料内に任意に組み込むことができるが、前述のラテラルフロー検出デバイスとは異なり、代わりに、検出粒子は、毛細管プールの上流に保持されることが好ましく、そこではアンプリコンと検出粒子との間の結合複合体の形成が、結果として生じた標識化核酸のデバイスの多孔質構成要素への導入の前に、またはそれと同時に行われ得る。
【００７１】
「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉プローブ」は、ＵＶ照射などの当業者に知られている様々な手段のいずれかによって、デバイスの検出ストリップ要素に固定化されることが好ましい。捕捉プローブは、標識化核酸を含有した溶液が、捕捉ゾーンを毛細管作用で運ばれて通過するときに、標識化核酸を捕捉するように設計されており、その結果、捕捉プローブの固定化部位で標識の濃度が増加し、したがって、標識された標的核酸アンプリコン（複数可）の存在を示す検出可能なシグナルが生成される。単一の検出ストリップを、１つまたは複数の捕捉プローブでパターン化して、複数のアンプリコンの多重検出、アンプリコン配列の決定、検出信号の直線性の拡張によるアンプリコンの定量、及びアッセイ品質管理（ポジティブコントロールとネガティブコントロール）を可能にすることができる。
【００７２】
流体構成要素
流体構成要素の実施形態は、好ましくは、アクリル、ポリカーボネート、ＰＥＴＧ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、及び／またはその他の同様の材料などのプラスチックを含む。これらの材料は容易に入手可能であり、標準的な方法で製造することができる。流体構成要素は、チャンバ及びチャネルの両方を備える。流体チャンバは、壁、２つの面を備え、入口、出口、凹部、またはベントなどの１つ以上のチャネルに接続する。チャネルは、２つの流体チャンバまたは流体チャンバ及び凹部を接続することができ、壁と２つの面とで構成されている。流体チャンバの設計は、体積に対する表面積の比を最大化して、加熱及び冷却を促進することが好ましい。チャンバの内容積は、約１μＬ〜約２００μＬであることが好ましい。溶液と接触するチャンバ面の面積は、加熱中に均一な流体温度を確保するために、加熱要素が接続される面積に対応していることが好ましい。流体チャンバの形状は、加熱要素と結合し、溶液の出入りに好ましい形状を提供するように選択することができる。いくつかの実施形態では、チャンバの容積は、デバイスの動作中に現れる気泡のための空間を提供するために、流体体積よりも大きくてもよい。流体チャンバは、毛細管現象によって流体がチャネルに侵入したり、通気機構を塞いだりしないことが確かとなるように、ベントチャネルにつながる拡大された延長部を備えてもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、溶液放出の時間の前に、液相または気相の水がチャンバに侵入するのを低減または排除することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態のプロセスで使用される昇温は、蒸気（例えば、気相水）を生成し、その結果、チャネル、チャンバ、または凹部への水分の早期侵入をもたらす可能性がある。例えば、チャンバまたは凹部に存在する乾燥試薬または凍結乾燥試薬の乾燥状態を保持するために、液相または気相の侵入を低減させることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、チャネルを、熱、水分、及び／または圧力などの外力によって除去できる材料で、完全にまたは部分的に、一時的に塞いでもよい。チャネルの一時的な閉塞に適した材料には、ラテックス、セルロース、ポリスチレン、熱接着剤、パラフィン、ワックス、及びオイルが含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、検査用カセットは、試料カップ、チャンバ、チャネル、ベントポケット、及びエネルギー導波器を備えた、好ましくは射出成形された流体構成要素を備える。射出成形された検査用カセット流体構成要素は、好ましくは、同様の組成の支持体プラスチックへの超音波溶接に適したプラスチックで構成される。本発明の一実施形態では、検査用カセット流体構成要素は、支持体材料に超音波溶接された単一の射出成形部品を備える。エネルギー導波器は、流体構成要素に結合することを意図する熱不安定性層の領域のみに超音波エネルギーを誘導する、流体構成要素のオプション機能である。射出成形された流体構成要素は、任意選択で容器に収容されてもよい。図７は、好ましくは射出成形された流体構成要素４００（好ましくは、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはＮＡＳ３０、スチレンアクリル共重合体などのポリマーを含む）、熱不安定性材料４１０（例えば、約２３９℃の比較的低い融解温度と約１００℃のガラス転移温度を持ち、変性中の高温に耐えるのに十分なＢＯＰＳ、または２６５℃の融解温度と１５０℃のガラス転移温度を持つポリカーボネートを含む）、接着スペーサ４２０（例えば、担体を組み込まないことが好ましいシリコン転写接着剤、ポリエステル担体を含むアクリル接着剤、またはデバイスの高温に耐えることができる任意の接着剤を含む）、及び耐熱性層４３０を備えるカセットを示す。熱不安定性材料４１０は、好ましくは上に横たわる耐熱性層４３０（例えば、ポリイミド、または耐熱性の高い他のポリマーを含む）を通して伝達される熱によって破断する。カセットのベント機能上の熱不安定性材料の融解により、膨張チャンバへのベント及びベントチャネルが開かれ、それによって、カセット内の圧力の均一化が可能になる。上に横たわる耐熱性層４３０は、好ましくは損傷を受けていない状態のままであり、それによって、ベントを開いた後にカセットが密閉シールを維持することを可能にする。
【００７５】
いくつかの実施形態では、接着スペーサは、加熱中のガスの膨張を緩衝して、密閉されたカセットの内圧を低下させる膨張チャンバとして機能し得る空の領域４４０を備える。熱不安定層４１０は、超音波溶接または接着剤の使用などの結合方法またはプロセスによって、流体構成要素４００に結合される。次に、得られた部品をスペーサ及び耐熱性層に接着する。いくつかの実施形態では、耐熱性層は、加熱されたチャンバ上に存在しないように構築される。他の実施形態では、耐熱性層は加熱チャンバの上に存在する。さらに他の実施形態では、接着スペーサ及び耐熱性層は、流体構成要素のベントポケットのフィーチャと一致する領域上にのみ存在する。この実施形態では、耐熱性層は、任意選択で、加熱されるチャンバと位置合わせされた領域内の熱不安定性材料上に直接配置されてもよい。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態において、流体チャンバ壁及びチャネル壁の厚さは、約０．０２５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲であり、好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．５ｍｍの範囲である。この厚さは、好ましくは、流体構成要素の構造的完全性と、高温及び関連圧力下での閉じられたチャンバの封止を支持することとの両方の要件を満たす。チャネル壁、特にベントチャネル壁の厚さは、チャンバの厚さよりも小さく、約０．０２５ｍｍ〜約０．２５ｍｍの範囲であることが好ましい。入口チャネル及び出口チャネルの幅は、毛管現象を高めるように選択することが好ましい。浅いベントチャネルは、通気に悪影響を与えることなく、流体構成要素の剛性を向上させる。流体構成要素のプラスチック形成面は、熱伝達を最大化するために壁を形成する面よりも薄いことが好ましい。任意選択の断熱層は、流体構成要素の一部の構成要素を切り開き、増幅チャンバ及び検出チャンバを囲み、温度制御されたチャンバの熱的分離に寄与する。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態では、流体構成要素４００が熱不安定性支持体材料４１０に結合される前に、凍結乾燥試薬１６、検出ストリップアセンブリ２３０、及び検出粒子などの検査用カセットの追加構成要素が組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、構成要素を、良好な接着を確保するために圧力を加えることによって、貼り合わしてもよい。いくつかの実施形態では、構成要素を、感圧接着剤及び超音波溶接などの方法の組合せによって結合してもよい。核酸増幅反応の性能に悪影響を与えることが知られており、または見つかった接着剤は回避されなければならない。アクリル系接着剤またはシリコン系接着剤は、本発明においては正常に使用されている。好ましい接着フィルムの１つは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによって提供されるＳＩ７８７６である。他の接着剤は、デバイスの動作中に遭遇する温度に対して堅牢なシールを提供しながら、使用中の緩衝剤、プラスチック、及び反応化学物質と化学的に適合していることが判明した場合に、使用することができる。
【００７８】
図２及び図７を参照すると、ベントポケットは、その構成において他のチャンバと区別されることが好ましい。上記のように流体構成要素を構築した後に、ベントポケットは、直接的に、またはいくつかの実施形態では、介在する空隙４２０またはベントポケット５４及び耐熱性材料４３０を介して間接的に、これらのいずれかで、ＰＣＡ７５と接触する流体構成要素の側面に開放面を有する。ベントポケットを形成するために、追加のプラスチック部品が、好ましくはＰＣＡのベント抵抗器７０に隣接する薄い熱不安定性メンブレン４１０を備えて、結合されてチャンバを封止する。フィルム４１０は、ポリスチレンなどの射出成形された流体構成要素への超音波溶接に適した材料を含むが、他の同様の材料が使用されてもよい。このフィルムは、ベントポケットを封止すること、及び簡単に穴を開けることの両方に適しており、したがって、電流がベント抵抗器を通過して、急速な温度上昇を生じる場合に、より低い圧力のチャンバに通気する。
【００７９】
好ましくは、フィルムは、材料が、熱溶解、逆転写、及び核酸増幅などの検査用カセットの他の操作で使用される温度に耐えることができるように、加熱時に十分に安定である。変性、標識化、逆転写、核酸増幅、及び検出に使用される温度範囲で安定であるが、抵抗器７０によって容易に達成する融解温度を有する材料の使用により、単一の材料を、射出成形された流体構成要素４００の支持体に使用して、チャンバの面とベントポケットの面との両方としての機能を果たすことができるようになる。いくつかの実施形態では、温度制御されたチャンバの領域におけるさらなる温度安定性は、ポリイミドなどの耐熱性材料の上層フィルムによって実現することができる。本発明の他の実施形態では、熱不安定性フィルムの窓が温度制御チャンバと位置合わせされて、チャンバ内の流体と検査用カセットの背面に融着されたフレキシブル回路の基板との間の直接接触を可能にする。
【００８０】
流体構成要素の追加構成要素
上記のように、いくつかの追加の構成要素が、好ましくは最終的な結合の前に、本発明の流体構成要素内に組み込まれる。デバイスの組立て前に、緩衝剤、塩、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、オリゴヌクレオチドプライマ、及びＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素などの酵素を含む試薬を、凍結乾燥またはフリーズドライして、ペレット、球体、またはケーキにすることができる。試薬の凍結乾燥は、当技術分野で周知であり、適用された真空下での昇華による凍結試薬アリコートの脱水を伴う。凍結する前に、糖（二糖類及び多糖類）や多価アルコールなどの凍結保護剤の特定の製剤を試薬に添加することにより、酵素の活性が保持され、再水和速度が増加する場合がある。凍結乾燥試薬のペレット、球体、またはケーキは、標準的な方法で製造され、一度形成されると適度に耐久性があり、最終面をラミネートする前に流体構成要素の特定のチャンバに簡単に設置できる。より好ましくは、流体構成要素を支持体材料に結合する前に、凹部を流体ネットワークに組み込んで、凍結乾燥試薬のペレット、球体、またはケーキを流体構成要素に設置できるようにする。流体ネットワークの配置と凹部の位置及び順序とを選択することにより、試料を目的の時間に目的の凍結乾燥試薬と反応させて、性能を最適化できる。例えば、凍結乾燥（または乾燥）逆転写（ＲＴ）及び増幅の試薬球を、ＲＴ反応チャンバ及び増幅チャンバの流路の２つの別々の凹部に堆積することにより、増幅酵素の干渉なしに最適な逆転写反応が可能になる。さらに、その後の増幅反応に対するＲＴ酵素の干渉を最小限に抑えるために、ＲＴ反応中に含まれるＲＴ反応後のＲＴ酵素は、増幅試薬への導入前に熱不活性化して、増幅への干渉を最小限に抑えることができる。任意選択で、他の塩、界面活性剤、及び他の増強化学物質を個別の凹部に添加して、アッセイの性能を調整することができる。さらに、これらの凹部は、凍結乾燥試薬が凹部を通過する際に液体と混ざりやすくし、また、超音波溶接中に凍結乾燥材料を超音波エネルギーから隔離し、可溶化前の検査の加熱ステップ中に極端な温度から凍結乾燥試薬を隔離するのにも役立つ。さらに、凹部は、製造中に凍結乾燥ペレットが圧縮または粉砕されないようにし、多孔質のままにして再水和時間を最小限に抑えるようにする。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態では、検出微粒子が、流体構成要素の別の追加構成要素である。いくつかの実施形態では、これらの微粒子は、上記の反応試薬について記載されるように凍結乾燥され得る。他の実施形態では、液体緩衝剤中の微粒子を、流体カセットの内面に直接塗布し、検査用カセットの最終組立ての前に乾燥させてもよい。微粒子を含む液体緩衝剤はまた、好ましくは、再水和を促進する糖または多価アルコールをも含む。乾燥前に水性緩衝剤中の微粒子を流体構成要素に直接組み込むことによって、製造の最終コストを簡素化及び削減し、凍結乾燥粒子と反応溶液との混合が完了する場合があり、二本鎖核酸または核酸の二本鎖領域の一本鎖核酸への変性が、加熱または核沸騰により促進され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥検出粒子は、流体ネットワークの凹部に設置される。他の実施形態では、凍結乾燥または乾燥した検出粒子は、検出ストリップの真下の空間９３に設置される。他の実施形態では、検出粒子は、検出ストリップと毛細管連通する吸湿性基材に乾燥または凍結乾燥させるか、または検出ストリップ上で直接乾燥または凍結乾燥させる。毛細管連通は、上記の吸湿性基材と検出ストリップとの直接の物理的接触か、または間接的であってもよく、毛細管連通は、検出粒子を含んだ吸湿性基材から検出ストリップに流体を輸送するための毛管輸送が達成されるチャネルまたはチャンバ領域で構成された介在距離にわたって行われる。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態では、ラテラルフロー検出ストリップアセンブリがまた、流体構成要素に組み込まれる。検出ストリップは、好ましくは、少なくとも１つの多孔質構成要素で構成されるメンブレンアセンブリを備え、吸収性パッド、検出メンブレン、界面活性剤パッド、及び支持体フィルムを任意選択で備えてもよい。検出メンブレンは、ニトロセルロース、セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷修飾ナイロン、またはポリテトラフルオロエチレンで作られていることが好ましく、プラスチックフィルムで裏打ちされていてもよい。上記のように、捕捉プローブは、人の肉眼またはイメージングシステムなどの自動検出システムによって視覚化できるライン、スポット、マイクロアレイまたは任意のパターンで検出メンブレン上に堆積し、不可逆的に固定することができる。堆積したオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブの堆積に続いて検出メンブレンに紫外線を照射することにより、永久的に固定化される。界面活性剤パッドは、核酸産物及び検出微粒子の妨害されない移動を可能にする、好ましくは最小限の核酸結合及び流体保持特性を有した多孔質基材を含んでもよい。界面活性剤パッドは、ガラス繊維、セルロース、またはポリエステルなどの材料を含んでもよい。本発明の実施形態では、少なくとも１つの両親媒性試薬を含む製剤が界面活性剤パッド上で乾燥されて、検出メンブレンを通る試料の均一な移動を可能にする。吸収性パッドは、任意の吸収性材料を含むことができ、検出メンブレンアセンブリを通して、試料のウィッキングを誘発するのに役立つ。検出メンブレンコンポーネントは、両面粘着フィルムなどの接着剤支持体フィルムをベースとして使用して、最初に検出メンブレンを配置することによって、続いて任意選択の吸収性パッド及び／または界面活性剤パッドを、約１ｍｍ〜約２ｍｍだけ重ねて検出メンブレンと物理的に接触させることによって、組み立てる。本発明のいくつかの実施形態では、検出メンブレンは、界面活性剤パッドと間接的に毛細管連通していてもよく、界面活性剤パッドと検出パッドとの間に物理的分離があり、この介在空間は毛管空間で構成され、この空間を流体が毛管作用によって横断し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤パッドまたは界面活性剤パッドの領域は、検出粒子、乾燥検出粒子、または凍結乾燥検出粒子を含み得る。
【００８３】
スリーチャンバカセット
本発明のいくつかの実施形態では、乾燥試薬または凍結乾燥試薬のための追加の反応チャンバ、及び／または追加の凹部を組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、そのような設計は、逆転写及び増幅の前に、最初に別個の溶解反応を提供することが望ましい検査を容易にする。図３７Ａ、３７Ｂ、及び３８に示すように、カセット５０００は、膨張チャンバ５０２１を封止するカバー５０２０、好ましくは流体構成要素５０２３と密接に接触して配置されるフレキシブルヒータ回路５０２２、及びユーザから回路を隠す後部カバー５０２４を備える。核酸を含む試料は、試料口５００１を通して試料カップ５００２に導入される。試料は凹部５００３に自由に流入し、ここで第１の凍結乾燥ビーズ５００４を再構成し、好ましくは溶解試薬を含めて、その後にチャネル５００５を流れ下り、第１の反応チャンバ５００６に流入する。この自由な流れは、試料カップ５００２の頂部に接続するベントチャネル５００７によって促進される。ベントチャネル５００７は、さらに、孔５００８を介して膨張チャンバ５０２１に接続してもよい。第１の反応チャンバ５００６の下の封止された空気の空間は、流体の流れのためにわずかに加圧され、流れを第１の反応チャンバ５００６の真下で停止させる。次に、第１の反応チャンバ５００６は、好ましくは、溶解試薬との適切な反応を促進し、試料中の生物学的粒子及び／または細胞を溶解し、その中に存在する任意の核酸を露出させる温度まで加熱される。次に、第２の反応チャンバ５０１１の頂部に接続されたベントバルブ５００９を開くと、好ましくは逆転写用の試薬を含む第２の凍結乾燥ビーズ５０１０が再構成される第２の凹部への試料の流れが促進される。次いで、流体は、第２の反応チャンバ５０１１に入り、そこで流動下の閉じられた空気体積内の空気圧が増加した結果として、流体の流れが停止する。次いで、その後、第２の反応チャンバ５０１１が、好ましくは適切な温度に加熱されて、逆転写プロセスを促進させる。
【００８４】
第３の反応チャンバ５０１３の頂部に接続された次のベントバルブ５００９を開くと、第２の反応チャンバ５０１１から第３の凹部を通る試料の流れが開始され、ここで好ましくは凍結乾燥ＰＣＲ増幅試薬を含む凍結乾燥ビーズ５０１２が再構成される。次に、試料は第３の反応チャンバ５０１３に流入し、そこで熱サイクリングを受けて、試料に存在する標的分析物を増幅させる。
【００８５】
続いて、ラテラルフローストリップ５０１４の遠端に接続された最終ベントバルブ５００９を開くと、増幅された分析物をこのときに含む試料が、ラテラルフローストリップ５０１４を流れ、前述のように分析物を検出できるようになる。
【００８６】
流動制御フィーチャ
流体構成要素の設計は、任意選択で、反応チャンバ内または反応チャンバの出口に流量制御フィーチャを備えてもよい。これらのフィーチャは、チャンバに入る流れを、流れが出口に流入する前に、出口とは反対側のチャンバの側に偏向させる。その結果、流れはより遅い速度で出口チャネルに入り、流体が停止するまでに流体がチャネルを流れ落ちる距離を減少させる。さらに、流路の水平成分は、チャンバ間に垂直方向の間隔を追加せずにチャネルに長さを追加して、流路の有効な長さを増加させるため、減少した流速に基づいて所望の位置で流れを停止するのに十分である。これにより、必要な垂直チャネルが少なくて済むので、カセットのチャンバ間の垂直間隔を近づけることができる。さらに、反応チャンバを横切る流れの方向を変えることにより、チャンバ内の流れに旋回作用が生じて、試薬と試料流体との混合が改善される。フロー制御フィーチャは、任意の形状を備えてもよい。
【００８７】
図３９に示す実施形態では、流体は、入口チャネル４００２から反応チャンバ４００３に入り、反応チャンバの底部に流れ、そこで三角形の流れ制御フィーチャ４００１によって入口チャネル４００２への開口部とは反対側の反応チャンバ４００３の側面に向け直される。流れが反対側のコーナ４００４に進むと、流れは分かれ、一部が出口４００５に入り、残りが壁に接触して上方に向けられ、混合を改善する旋回効果を生み出す。出口への流れは、好ましくはメニスカスを形成し、出口チャネル４００６を通って次の反応チャンバまたは凍結乾燥ビーズの凹部に向かって移動する。出口チャネル４００６は反応チャンバ４００３の下方で封止されているため、流体が出口チャネル４００６に沿って移動するにつれて、流体圧力ヘッドと平衡に達するまで流れの下のチャネルで空気圧が増加し、したがって流れが停止する。この実施形態では、流れの下流の閉鎖気室内の圧力を引き続き増加させることができるメニスカスを効果的に形成するために、出口４００５が反応チャンバ４００３から出口チャネル４００６まで先細になっている。出口チャネルへのこのより大きな開口部は、より広い開口部でメニスカスを確実に形成することができるように、圧縮可能な空気体積を増加させることが好ましい。
【００８８】
図４０に示す実施形態では、流体は、入口チャネル４１０２から反応チャンバ４１０３に入り、反応チャンバの底部に流れ、そこで三角形の流れ制御フィーチャ４１０１によって入口チャネル４１０２への開口部とは反対側の反応チャンバ４１０３の側面に向け直される。流れが反対側のコーナ４１０４に進むと、流れは分かれ、一部が出口４１０５に入り、残りが壁に接触して上方に向けられ、混合を改善する旋回効果を生み出す。出口への流れは、好ましくはメニスカスを形成し、出口チャネル４１０６を通って次の反応チャンバまたは凍結乾燥ビーズの凹部に向かって移動する。出口チャネル４１０６は反応チャンバ４１０３の下方で封止されているため、流体が出口チャネル４１０６に沿って移動するにつれて、流体圧力ヘッドと平衡に達するまで流れの下のチャネルで空気圧が増加し、したがって流れが停止する。この実施形態では、出口４１０５及び出口チャネル４１０６は均一な幅を有する。この実施形態では、反応チャンバでのメニスカスの形成は、より狭いチャネルの結果として、幾分信頼性が高くなり得る。メニスカスは、その後、流れの下流の閉鎖気室の圧力を増加させる。
【００８９】
図４１に示す実施形態では、流体は、入口チャネル４２０２から反応チャンバ４１０３に入り、反応チャンバの底部に流れ、そこで台形の流れ制御フィーチャ４２０１によって入口チャネル４２０２への開口部とは反対側の反応チャンバ４２０３の側面に向け直される。流れが反対側のコーナ４２０４に進むと、流れは分かれ、一部が出口４２０５に入り、残りが壁に接触して上方に向けられ、混合を改善する旋回効果を生み出す。この実施形態では、出口４２０５は実質的に垂直に配向されている。出口への流れは、好ましくはメニスカスを形成し、出口チャネル４２０６を通って次の反応チャンバまたは凍結乾燥ビーズの凹部に向かって移動する。出口チャネル４２０６は反応チャンバ４２０３の下方で封止されているため、流体が出口チャネル４２０６に沿って移動するにつれて、流体圧力ヘッドと平衡に達するまで流れの下のチャネルで空気圧が増加し、したがって流れが停止する。この実施形態では、出口４２０５及び出口チャネル４２０６は均一な幅を有する。この実施形態では、反応チャンバでのメニスカスの形成は、より狭いチャネルの結果として、幾分信頼性が高くなり得る。メニスカスは、その後、流れの下流の閉鎖気室の圧力を増加させる。
【００９０】
図４２に示す実施形態では、流体は、入口チャネル４３０４から反応チャンバ４３０５に入り、反応チャンバの底部に流れ、そこで三角形の流れ制御フィーチャ４３０３によって入口チャネル４３０４への開口部とは反対側の反応チャンバ４３０５の側面に向け直される。流れが反対側のコーナ４３０６に進むと、流れは分かれ、一部が出口４３０７に入り、残りが壁に接触して上方に向けられ、混合を改善する旋回効果を生み出す。出口への流れは、好ましくはメニスカスを形成し、出口チャネル４３０６を通って次の反応チャンバまたは凍結乾燥ビーズの凹部に向かって移動する。この実施形態では、出口チャネル４３０６は、流体が流れるための曲がりくねった経路を提供する積み重ねられた連続的な流れ制御フィーチャ４３０３、４３０２、及び４３０１を通って移動し、小さな垂直空間内に増大した出口チャネル長を提供する。
【００９１】
図４３に示す実施形態では、流体は、入口チャネル４４０２から反応チャンバ４４０３に入り、反応チャンバの底部の上に、好ましくは反応チャンバ４４０３の長さに沿ってほぼ中間に配置された流量制御機能４４０１によって、入口チャネル４４０２の開口部とは反対側の反応チャンバ４４０３の側面に向け直される。Ｉ前の実施形態とは異なり、流量制御フィーチャ４４０１は、反応チャンバ４４０３の出口を形成しない。流れ制御フィーチャ４４０１は、流れを出口チャネル４４０５から反対側のコーナ４４０４に偏向させ、それによって、チャンバを出る前の流速を低下させる。前の実施形態と同様に、流体の方向転換は乱流と試薬の混合とを促進する。
【００９２】
反応液と凍結乾燥試薬との効果的な混合を促進するために、流体流路を含む検査用カセット部分の実施形態は、図４６Ａ及び図４６Ｂに示すように、チャンバ間の流体流路に組み込まれた専用の試薬凹部４６００を含んでもよい。代替実施形態では、図４７Ａ及び図４７Ｂに示すように、試薬凹部４７００が反応チャンバ自体の中に配置される。凍結乾燥試薬ペレットは、製造中に試薬凹部に配置されることが好ましい。流体チャンバ内に配置される試薬凹部の場合、流体チャンバ内の反応液の存在によって、製造中に凹部内に配置された１つまたは複数の凍結乾燥試薬の再懸濁が生じる。試薬の再懸濁が、あるチャンバから別のチャンバへの溶液が流れる間に、チャネルの局所的な凹部を通る流体の一時的な通過によってもたらされるよりも長い再懸濁時間を必要とする場合は、凍結乾燥試薬（複数可）を流体チャンバの凹部内に設置することは、試薬（複数可）を流体チャネル内の試薬凹部内に置くことよりも好ましい場合がある。液体チャンバ内に凍結乾燥試薬を収容することにより、反応液の試薬との滞留時間が長くなり、凍結乾燥物質の流体への露出が増加し、凍結乾燥試薬のより完全な再懸濁と、試薬の反応液とのより完全な混合とが保証される。さらに、流路の凹部に配置された凍結乾燥試薬は、反応が完了する前に、チャンバの上方から漏出（または毛細管細流）を受けやすくなる。これは、試薬にシロップ状の粘稠性を与え、溶液の大部分が上部チャンバから凹部を通って輸送されるときに、流体の流れの問題を引き起こす場合がある。この問題は、凹部が下方チャンバ自体に配置される場合には回避されることが好ましい。
【００９３】
図４８に示す標準的な実施形態に示すように、流体チャネル内に試薬凹部を配置することが望ましい用途では、試薬再懸濁及び試薬と反応液との混合に対する改善は、図４６Ｂに示す突出部４６０５または図４７Ｂに示す突出部４７０５など、流体チャンバ内への突出部の組込みによって実現され得る。チャンバ内の突出部の側面における垂直方向の急激な上昇は、液体チャンバの頂部またはルーフを横切る毛細管流体の流れを妨げ、新たに再懸濁された試薬の反応液体積の大部分からの隔離を低減または防止する。
【００９４】
アッセイの多重化
本発明のいくつかの実施形態では、入力流体試料を、デバイスを通る２つ以上の平行な流体経路に分割することを可能にする流体設計を採用することによって、複数の独立したアッセイを並行して実施できる。図１０は、例えば８０ｕＬの流体容積を２つの連続的なステップで最初に２つの別個の４０ｕＬ容積に、続いて４つの２０ｕＬ容積に分割する概略図である。例示されるスキームは、生化学反応などの独立した別個の操作を分割体積に対して実行できるようにするのに役立つ。このような構成は、多重化された核酸の逆転写及び／または増幅反応における核酸配列などの複数の標的の多重検出を容易にすることによって、単一のデバイスで検出できる分析物の数を増やすのに役立つ。同様に、独立した流体経路の末端での複数の検出ストリップの使用は、複数の標的の検出、または核酸分析物における配列差異もしくは突然変異の識別のためのストリップの可読性を高めることができるさらに、複数の増幅反応産物の独立した照合のための追加の検出ストリップを提供することで、検査の検出ステップ中のクロスハイブリダイゼーションなどの偽交差反応の可能性を低減することによって特異性を高めることができる。図１１は、単一の検査用カセット内に２つの流体経路を含む検査用カセットを示す。各流体経路は、タイミング、反応タイプなどに関して独立して制御することができる。ここで図１２を参照すると、試料カップ１０００に導入された試料が、ほぼ等しい体積に分割され、体積分割チャンバ１００１及び１００２に流れ込み、内部への流れがベントバルブ１００３及び１００４によって調整される。分割チャンバ１００１及び１００２は、各チャンバ内の試料の量を受動的に平衡化することによって、各検査経路内の試料の体積を制御する。体積分割後に、ベント１００５及び１００６の開放によって、溶液が試薬凹部１００７及び１００８を通って流れることができるようになる。凍結乾燥試薬などの試薬は、凹部１００７、１００８に配置され、試料が凹部を通って好ましくは温度制御された第１のセットのチャンバ１００９及び１０１０に流入するときに試料と混じり合う。熱溶解、逆転写、及び／または核酸増幅などの反応は、試薬凹部１００７、１００８に設けられた試薬によって促進される第１のセットの加熱チャンバのそれぞれで実施される。このような試薬には、それだけに限らないが、凍結乾燥陽性対照薬剤（例えば、核酸、ウイルス、細菌細胞等）、凍結乾燥逆転写酵素、及びＲＮＡからＤＮＡへの逆転写に必要な関連する付属試薬（ヌクレオチド、緩衝剤、ＤＴＴ、塩等）、及び／または凍結乾燥ＤＮＡポリメラーゼまたは熱安定性凍結乾燥ＤＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡ増幅及び必要な付属試薬（ヌクレオチド、緩衝剤、及び塩など）が含まれる。
【００９５】
チャンバの第１のセットでの逆転写、核酸増幅または付随する逆転写及び核酸増幅（例えば、単管逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または一段階ＲＴ−ＰＣＲまたは一段階ＲＴ−Ｏｓｃａｒ）などの生化学反応の完了後、ベントポケット１０１１及び１０１２のシールが破られ、流体がチャンバの第１のセットから、試薬凹部１０１３及び１０１４の第２のセットを通って、好ましくは温度制御されたチャンバ１０１５及び１０１６の第２のセットに流入することが可能になる。凍結乾燥試薬などの試薬は、流体がチャンバ１００９及び１０１０からチャンバ１０１５及び１０１６に流れるときに、試料液と混じり合うように、凹部１０１３及び１０１４に配置されてもよい。核酸増幅用の凍結乾燥試薬または乾燥検出粒子もしくは凍結乾燥検出粒子（プローブコンジュゲート染色ポリスチレンミクロスフェアまたはプローブコンジュゲートコロイド金など）などの試薬は、任意選択で試薬凹部１０１３及び／または１０１４に配置され得る。加熱されたチャンバ内のプローブコンジュゲート検出粒子への結合またはハイブリダイゼーションなどの反応または他の操作の完了後に、溶液は、ベントバルブ１０１９及び１０２０を開くことによって、検出ストリップチャンバ１０１７及び１０１８に流入することができる。いくつかの実施形態では、検出粒子、塩及び／または界面活性剤、ならびにハイブリダイゼーションまたは他の検出様式を容易にするのに有用な他の物質を含む検出試薬などの追加の試薬をストリップチャンバ１０１７及び１０１８に流入する溶液と混じり合わせることができるように、試薬凹部の第３のセットをチャンバ１０１５及び１０１６からの流体経路に配置することができる検出ストリップチャンバ１０１７及び１０１８は加熱されてもよく、好ましくは、増幅された核酸などの分析物の検出のためのラテラルフローストリップなどの検出ストリップを含み得る。検出ストリップは、検出粒子（例えば、染色ミクロスフェアコンジュゲート及び／またはコロイド金コンジュゲート）などの乾燥または凍結乾燥検出試薬、分析物を捕捉するための捕捉プローブ（配列特異的ハイブリダイゼーションにより核酸分析物を捕捉するためのハイブリダイゼーション捕捉オリゴヌクレオチドなど）、リガンド（適当に修飾された分析物を捕捉するためのビオチンまたはストレプトアビジンなど）、及び毛管作用またはウィッキングのような手段によって検出ストリップを通した同じ溶液体積の完全な移動を確保するのに十分な吸収能力を提供する吸収性材料をドープされたまたはパターン化された一連の吸収性材料を含み得る。
【００９６】
試料調製
本発明のいくつかの実施形態では、試料調製システムをカセットに組み込むことが望ましい場合がある。核酸精製システムなどの試料調製システムは、試料調製と、精製ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの精製分子の検査用カセットへの溶出を達成するためのカプセル化溶液を含んでもよい。図１３は、検査用カセットとの統合のために設計された核酸試料調製サブシステム１３００を示す。試料調製サブシステムは、サブシステムの構成要素を収容するための主容器１３０２と容器蓋１３０１とを含む。溶液区画化構成要素１３０３は、好ましくは上面が開いているが、下部シール１３０５によって下側が封止されている粗試料リザーバ１３１２を含む。溶液区画化構成要素１３０３はまた、好ましくは、第１の洗浄緩衝剤を含むリザーバ１３１４と、第２の洗浄緩衝剤を含むリザーバ１３１５とを含み、両方とも好ましくは上部シール１３０４及び下部シール１３０５によって封止される。核酸結合マトリックス１３０６は、吸収材料１３０７及び１３０８によって提供される溶液毛細管流路に配置される。
【００９７】
核酸結合特性及びウィッキング特性を示すガラス繊維またはシリカゲルは、結合マトリックス１３０６としての使用に適した材料の例である。広範囲の吸収性材料は、ポリエステル、ガラス繊維、ニトロセルロース、ポリスルホン、セルロース、綿またはそれらの組合せを含む吸収材料１３０７及び１３０８、ならびにサブシステムによって精製すべき分子への十分な毛細管現象及び最小限の結合を提供する他のウィッキング材料を含んでもよい。溶液区画化構成要素１３０３に封止され、カプセル化された溶液と化学的に適合し得る任意の容易に破断しまたは壊れやすい材料が、シール材料１３０４及び１３０５としての使用に適している。シール材１３０５は、試料または試料溶解物と接触し、さらに試料または試料溶解物溶液と化学的に適合しなければならない。適切なシール材の例は、ヒートシール可能な金属フィルム及びプラスチックフィルムである。シール材１３０５は、シール１３０５が容器１３０２内に存在する構造１３１１によって穿孔されるように、溶液区画化構成要素１３０３の変位によって使用時に破断させる。粗試料またはカオトロピック剤で構成される緩衝剤などの溶解緩衝剤と混合された粗試料が、使用時に、蓋１３０１の試料口１３０９を介して試料リザーバ１３１２に導入される。いくつかの実施形態では、リザーバ１３１２の上部オリフィスを覆うようにシール１３０４を伸長することによって、溶解緩衝剤を任意選択でリザーバ１３１２内にカプセル化することができる。このような実施形態では、リザーバ１３１２を覆うシール１３０４のその領域の部分的除去のためのタブまたは他の手段を含むことが望ましく、これにより、粗試料がリザーバ１３１２に混入するか、またはそこに含まれる溶解緩衝剤と混合することができるように、粗試料のリザーバ１３１２への添加を可能にする。
【００９８】
試料材料を含有する試料液または溶解物は、試料添加口１３０９に導入され、試料調製プロセスの開始まで、緩衝剤リザーバ１３０３の試料リザーバ１３１２内に保持される。
【００９９】
試料調製の開始時に、溶液区画化構成要素１３０３がシール穿孔構造１３１１に押し付けられ、その結果、リザーバ１３１２内の試料溶液または溶解物と、リザーバ１３１４及び１３１５内の第１及び第２の洗浄緩衝剤が同時に放出される。構成要素１３０３の機械的変位は、手動で、または使用時に使い捨て検査用カセットが配置される再利用可能な機器に存在するアクチュエータの使用によって達成されてもよい。リザーバ１３０３へのアクチュエータアクセスまたは手動変位機構アクセスは、好ましくは、容器蓋１３０１のアクセスポート１３１０を通して提供される。試料または溶解液、及び第１及び第２の洗浄緩衝剤は、毛細管現象によって材料１３０７、１３０６、及び１３０８を通って移動する。リザーバの物理的配置及び吸収性材料１３０７の幾何学的構成は、結合マトリックス１３０６を通る粗溶解物、第１の洗浄緩衝剤及び第２の洗浄緩衝剤の連続的な流れを保証する。システムを通る全ての溶液容量の毛管輸送を継続することを保証する追加の吸収能力は、ウィック１３０８と接触して配置された吸収パッド１３１３によって提供される。吸収性材料を通る溶液輸送の完了時に、使用済みの溶液は吸収性パッド１３１３内で静止する。システムを通る全ての溶液の毛管輸送の枯渇後、精製された核酸は結合マトリックス１３０６に結合され、そこから図１５に示すように、核酸は、統合された検査用カセットの試料カップ１４０２内に溶出され得る。
【０１００】
試料調製プロセス中に発生する試料調製サブシステム構成要素の動きは図１４に示されており、試料処理の前後の試料調製サブシステムの実施形態の断面を示している。溶出の前に、結合マトリクス１３０６が、関連する再利用可能な試験機器内のアクチュエータの動作によって、毛管流路からシール構成要素１３１６を通って移動する。シール構成要素１３１６は、溶出緩衝剤導管１３１８の一部とシールを形成して、試料調製サブシステムの毛細管流路への溶液損失なしに、溶出緩衝剤を結合マトリックス１３０６を通して試料カップ１４０２内に注入することを可能にする。導管１３１８は、溶出緩衝剤リザーバ１３１７及びプランジャ１３１９からなる溶出緩衝剤注入器構成要素に取り付けられるか、またはその一部である。プランジャ１３１９は、リザーバ１３１７内の溶出緩衝剤の封止を促進するために、任意選択でＯリングを備えてもよい。精製された核酸の溶出中に、アクチュエータが溶出リザーバ構成要素１３１７を移動させ、それにより、取り付けられた導管１３１８がシール構成要素１３１６とシールを形成し、結合マトリクス１３０６をチャンバ１３２１内に移動させる。溶出リザーバ１３１７を押し下げるための機械的アクセスは、アクチュエータアクセスポート１３２０を介して提供される。結合マトリックス１３０６を試料調製サブシステムの主毛細管溶液流路から移動させた後、結合マトリックス１３０６は溶出チャンバ１３２１内に存在する。精製された核酸の試料カップ１４０２への溶出は、アクチュエータポート１３２２を介して作用するアクチュエータによって溶出緩衝剤リザーバ１３１７から溶出緩衝剤を押し出し、シリンジのような動作でプランジャ１３１９をリザーバ１３１７を通して移動させることにより達成される。溶出緩衝剤は、導管１３１８を介して結合マトリックス１３０６を通って進み、溶出された精製核酸を含む溶出緩衝剤の試料カップ１４０２への注入をもたらす。
【０１０１】
ここで図１５を参照すると、試料調製サブシステム１３００は、好ましくは、超音波溶接のような広く使用されている製造方法によってカセット１５００の流体構成要素１４０３に結合されて、一体化された単回使用試料−結果検査用カセットを形成する。いくつかの実施形態では、増幅された核酸がカセットから漏れる可能性を低減するために、精製された核酸を含む溶出液の導入後に検査用カセットの流体を密封することが望ましい。任意選択であるが、好ましくは、スライドシール１４０４を試料調製サブシステムと試験カセット流体容器１４０３との間に配置して、試料カップ１４０２への入口でカセットを封止することができる。スライドシール１４０４は、アクチュエータの動作によって封止位置に移動して、Ｏリング１４０５を含む密閉シールを形成する。カセット支持体１４０６は、乾燥試薬と検査ストリップとの導入後に流体容器に接着される。他の検査用カセット実施形態の支持体について上述したように、支持体１４０６は、通気機能性、密閉シール維持、熱界面、膨張チャンバ（複数可）のための材料を含み、流体及び温度制御電子部品を担持するプリント回路基板またはフレキシブル回路層を任意に含むことができる。電子部品は、任意選択で再利用可能なドッキングユニットに収納できる。電子部品を含むＰＣＡ１５０１は、低熱質量材料及び表面実装電子部品で構成されることが好ましい。表面実装抵抗器のアレイと近位に配置された温度センサとは、検査用カセット内のチャンバ温度を調整する１つの手段を提供する。ＰＣＡ１５０１の表面実装抵抗器と温度センサアレイとは、検査用カセットがドッキングユニットに装着されると、検査用カセットと一致するように配置される。試料から結果への一体型カセットを図１６に示す。図１７は、従来のプリント回路基板及び表面実装部品に基づく、下層にエレクトロニクス層を備えた一体型カセットを示す。いくつかの実施形態では、検査用カセットの背面にフレキシブル回路を接着してもよい。
【０１０２】
エレクトロニクス
いくつかの実施形態では、ヒータ、センサ及び他の電子機器が、これらがインタフェース接続しなければならない使い捨て検査用カセットの上にある要素と電子機器の好ましい熱インタフェース及び正確な整合を確立することができる手段によって使い捨て検査用カセットにインタフェース接続されるように、電子部品を再使用可能な部品に配置することが望ましい。他の実施形態では、温度制御のために再利用可能な構成要素と使い捨ての構成要素との組合せを使用することが望ましい。例えば、スタンドオフ温度モニタリングは、再利用可能なドッキングユニットに配置された赤外線センサで実現することができ、一方、温度制御及び流体制御用の抵抗ヒータは、使い捨て検査用カセットに組み込まれたフレキシブル回路に配置される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、プリント回路基板（ＰＣＢ）は、標準の０．０６２インチ厚のＦＲ４銅クラッドラミネート材を含むが、他の標準的な基板材料及び厚さを使用してもよい。抵抗器、サーミスタ、ＬＥＤ、及びマイクロコントローラなどの電子部品は、市販の表面実装デバイス（ＳＭＤ）で構成され、業界標準の方法論に従って配置されることが好ましい。
【０１０４】
別の実施形態では、ＰＣＡはカセット壁と一体化され、フレキシブルプラスチック回路を含むことができる。図８に示すように、ＰＥＴやポリイミドなどのフレックス回路材料を使用してもよい。フレキシブルプラスチック回路の使用は、当技術分野では広く知られている。別の実施形態では、加熱要素及び温度センサは、Ｓｏｌｉｇｉｅ，  Ｉｎｃ．などの会社によって開発された技術を用いて、プラスチック流体構成要素上にスクリーン印刷され得る。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＢの厚さ、ならびに抵抗加熱器を囲む領域における銅の量及び配置は、流体構成要素内の反応液の熱管理のために調整される。これは、すでに述べた標準的な製造技術を使用することで実現できる。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態では、抵抗器は厚膜２５１２パッケージであるが、他の抵抗器を使用してもよい。流体構成要素内の加熱チャンバは、優先的に抵抗器の寸法と同様の寸法であり、室全体の均一な加熱を保証する。流体構成要素の厚さを０．５ｍｍと仮定すると、このサイズの抵抗器１つで約１５μＬの溶液を加熱できる。図２Ｄの図は、０．５ｍｍの流体構成要素の厚さを想定して、約３０μＬの溶液を加熱するのに十分なヒータを形成する２つの抵抗器１００を示している。この場合、抵抗器はそれぞれ４０オームであり、並列構成に配置されていることが好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、温度センサ１１０は、好ましくは、０４０２  ＮＴＣデバイスなどのサーミスタ、またはＡｔｍｅｌ  ＡＴ３０ＴＳ７５０などの温度センサを含み、それぞれが２５１２抵抗器パッケージの高さと同様である。サーミスタは、抵抗器が１つまたは２つ設定されている場合、抵抗器ヒータに隣接するか、抵抗器ヒータの間に配置することが望ましい。これらの電子的要素を密接に配置することにより、それらの間に非常に薄い空隙のみが生じます。さらに、流体を電子層と組み立てる前に熱化合物を塗布すると、流体構成要素、抵抗器、及びサーミスタ間の良好な熱接触が保証される。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態では、ベント抵抗器７０、７１は厚膜０８０５パッケージを含むが、同様の抵抗器を使用してもよい。抵抗器の代わりに、４０ゲージのニクロム線などの小さなゲージのニクロム線加熱要素も使用できる。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態では、マイクロコントローラは、Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＰＩＣ１６Ｆ１７８９である。
【０１０９】
マイクロコントローラは、流体システムの複雑さに適合することが好ましい。例えば、多重化では、個々のベント及びヒータの数は、マイクロコントローラのＩ／Ｏラインの数に比例する。プログラムサイズに合わせてメモリサイズを選択することができる。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態では、ＯＮ−ＯＦＦモードで作動するＳＯＴ−２３パッケージ内のＮチャネルＭＯＳＦＥＴを使用して、ベント抵抗器及びヒータ抵抗器に対する電流負荷を変調する。変調信号は、マイクロコントローラを介して送信される。代替実施形態では、パルス幅変調方式及び／または他の制御アルゴリズムを使用して、流体工学のより高度な熱管理を行うことができる。これは通常、マイクロコントローラによって処理され、当業者に知られている追加のハードウェア及び／またはソフトウェア機能が必要になる場合がある。
【０１１１】
用途に応じて、いくつかの実施形態は、小型制御ドッキングユニットまたはドッキングユニットが、検査用カセットと呼ばれる生体物質と接触する流体システムを含む小さな使い捨てユニットを操作するデバイスを含む。そのような一実施形態では、ドッキングユニットが電子部品を備える。使い捨ての検査用カセットから電気部品を排除すると、コストが削減され、場合によっては環境への影響を軽減する。別の実施形態では、いくつかの電子部品がドッキングユニットと検査用カセットとの両方に含まれる。この特定の実施形態では、検査用カセットは、適切なインタフェースを介してドッキングユニットによって通電、制御、及び／または調査される温度制御、流体流動制御、温度検知などのいくつかの電気機能を提供するために、低コストのＰＣＡまたは好ましくはフレキシブル回路を含むことが好ましい。上記のように、そのようなデバイスの電子機能は、２つの別々のサブアセンブリに分割されることが好ましい。使い捨てカセット２５００は、好ましくは、ドッキングユニットの抵抗加熱及び感知要素とインタフェースするように設計された後面を備える。検査用カセットの背面を構成する材料は、適切な熱伝導率と安定性を提供し、ベントの破れによる流体の流れの制御を可能にするように選択することが好ましい。いくつかの実施形態では、検査用カセットの背面またはその一部は、ポリイミドなどの基板上に製造されたフレキシブル回路を含む。フレキシブル回路を使用して、低熱質量で低コストの抵抗加熱要素を提供することができる。フレキシブル回路基板は、検査用カセットの流体ネットワークに存在する溶液と直接接触するように配置して、非常に効率的かつ迅速な加熱及び冷却を可能にすることが好ましい。図８に示すコネクタ８１０は、好ましくは、任意選択のサーミスタ（複数可）への電力及び信号線と共に抵抗ヒータに電流を供給する。
【０１１２】
フレキシブル回路７９９を使用する場合、ドッキングユニット中に位置する１つ以上のＩＲセンサは、支持体８０５の窓を通して、またはフレキシブル回路７９９の背面から直接信号を読み取ることによって、加熱されたチャンバ（例えば、増幅チャンバまたは検出チャンバ）の温度を監視することができる。任意選択で、ＰＣＡまたはフレキシブル回路７９９のサーミスタを使用して温度を監視することができる。任意選択で、ＩＲセンサとサーミスタの出力の加重平均を実行することにより、読取り値とカセット内の流体温度との相関が改善される。さらに、センサは周囲温度も検出することもでき、試料流体が所望の温度に迅速に平衡化することを保証するために、システムが周囲温度を補正することを可能にする。
【０１１３】
ここで図３３を参照すると、ドッキングユニットは、好ましくはマイクロコントローラ、ＭＯＳＦＥＴ、スイッチ、電源またはパワージャック及び／またはバッテリ、任意選択の冷却ファン９０３、任意選択のユーザインタフェース、赤外線温度センサ９０１、９０２ならびにカセット２５００のコネクタ８１０と適合性のあるコネクタ９００を含む再利用可能な構成要素サブアセンブリ３９８０を含む。サブアセンブリがコネクタ８１０及び９００を介して嵌合されると、ドッキングユニットは、好ましくは、使い捨てカセット２５００を実質的に鉛直またはほぼ鉛直の向きで支持する。本明細書に記載のいくつかの実施形態では実質的に鉛直方向が好ましいが、デバイスが傾斜で動作する場合、特に使用される溶液の濡れ角を減らすために特定の経路がコーティングされる場合、同様の結果が得られる場合がある。
【０１１４】
装置の別の実施形態は、使い捨て部品に配置された全ての電子回路を排除することによりシステムの消耗部品のコストを削減することによって、運用コストを最小化するために使用され得る。マイクロコントローラ、ヒータ、センサ、電源、及び他の全ての回路は、複数のＰＣＡに配置され、高導体数の業界標準リボンケーブルを介して互いに電気的に接続されている。ディスプレイを追加して、ユーザがデバイスを操作しやすくすることもできる。ユーザが検査パラメータの変更をアップロードし、検査の進行状況を監視できるようにするために、任意選択のシリアル制御ポートも利用できる。この実施形態の１つのバージョンは、５つの異なるＰＣＡを含む。メインボードＰＣＡには、制御回路、シリアルポート、電源、及びシステム内の他のボードに接続するためのコネクタが含まれるす。ヒータボードＰＣＡは、加熱抵抗要素、温度センサ、及びベントバーン加熱要素を含む。このヒータボードと使い捨ての流体カセットの間の熱インタフェースを促進するために、このボードは、流体カセットとの接触が行われるまで、蓋の閉動作によって流体カセットの背面に向かって移動するバネ式キャリアに取り付けられている。薄い熱伝導性の加熱パッドがチャンバヒータ抵抗と温度センサの頂部に取り付けられ、ヒータボードと流体カセットとの間の熱伝達を改善する。加熱要素を燃焼させる耐久性のあるベントは、小さなセラミックキャリアに巻き付けられたニクロム線を使用して実現できる。ＩＲセンサボードＰＣＡは、カセットの反対側から少し距離を置いて取り付けられ、加熱室の温度を監視するために使用される。これにより、加熱及び冷却プロセスの閉ループ温度制御が可能になり、周囲温度の変動に対応できる。また、ＩＲセンサボードには、カセットの存在を検知できる複数の反射検知光学カプラが搭載されており、カセット上にある構成可能な反射パターンで示されるカセットのタイプを識別するために使用できる。ディスプレイボードＰＣＡは、ユーザがデバイスの正面からディスプレイを見ることができるように、ＩＲボードのほぼ後ろに配置できる。最後のＰＣＡでは、シャッターボードは、カセットの上端から反対側に配置され、カセットがすでに使用されているかどうかを検知するために使用されるスイッチ及び反射型光カプラを含み、蓋が閉じたときに、カセットを検査のために所定の位置に保持する。
【０１１５】
システムの冷却は、検査の冷却段階でのみマイクロコントローラによってオンにされるマフィン型ファンなどのファンを使用して、任意選択で強化される。ベントのシステムは、好ましくは、より冷たい外気を加熱チャンバに向けて、それを装置の側面から排出するように使用される。
【０１１６】
完全な試料対結果の分子検査を提供するために、本発明の上記の実施形態のいずれかを、試料チャンバ１４０２への出力として核酸を提供する試料調製システム１３００にインタフェース接続することができる。このことは、「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」と題される、国際公開番号ＷＯ２００９／１３７０５９Ａ１に記載されている試料調製技術を使用して実証されている。結果として生じる一体型デバイスの実施形態を、図１５及び図１６に示す。
【０１１７】
ドッキングユニット
再利用可能なドッキングユニットは、検査用カセット機能を実現するために必要な電子部品を備えている。検査用カセット設計の対応する変形形態とインタフェース接続するように、様々なドッキングユニット実施形態が発明されている。一実施形態では、図１８及び図１９に示すドッキングユニットは、検査の実行に必要な全ての電子部品を備え、検査用カセット内の電子部品の必要性を排除する。ここで図１８を参照すると、試料を加える前に、カセット２５００がドッキングユニット２５０１に挿入される。ドッキングユニット２５０１は、検査プロトコルや検査状態などの情報をユーザに伝達するためのＬＣＤディスプレイ２５０２などのディスプレイを備える。カセットをドッキングユニット２５０１に挿入した後、試料をカセット２５００の試料口２０に導入し、ドッキングユニット蓋２５０３を閉じて検査を開始する。検査用カセットが挿入されたドッキングユニットを図１９に示し、蓋が閉位置にあるドッキングユニット２５０１を図１８Ｂに示す。
【０１１８】
ドッキングユニットのいくつかの実施形態では、機構が蓋２５０３のヒンジに組み込まれ、検査用カセットのスライドシール９１を閉位置に移動させる。封止された検査用カセットは、増幅された核酸を検査用カセット内に確実に保持するのに役立つ。ここで図２０を参照すると、手動または自動のいずれかの方法を使用して、バルブを試料口上でスライドさせてカセットを封止することができる。いくつかの実施形態において、スライドは、Ｏリングと係合することにより試料口を封止する。膨張チャンバカバーは、バルブスライドを試料口Ｏリングの上の所定の位置に保持する。シールは、サーボモータによって、または再利用可能なドッキングユニットの蓋を閉じるなどの手動操作によって、所定の位置に移動し、次にカセットシールを閉じる機構を作動させる。図示の実施形態では、ラックアンドピニオン機構２５０４は、スライドシールアクチュエータ３９７９を使用して、スライドシール９１を閉位置に移動させる。ラックアンドピニオン機構２５０４は、蓋ヒンジへの機械的結合を介したドッキングユニット蓋２５０３の閉鎖の作用により、電動または移動され得る。任意選択で、図２１に示すように、アッセイ開始前の適切なシール配置を確保するために、光学センサ２５０５などのセンサを配置して、スライドシール９１の位置を調べることができる。光学センサは、カセットの試料口シールの状態（すなわち、位置）を検出する。光学センサにより、ドッキングユニットをプログラムして、以前に使用した検査用カセットが誤って挿入されたことを検出し、検査用カセットシールが正常に閉じたことを検出できる。シールの誤動作を示すエラーメッセージがディスプレイ２５０２に表示され、センサ２５０５がシールの閉鎖の検出に失敗した場合、検査プログラムは中止される。検査用カセット及びドッキングユニットの他の実施形態では、シール機構は、図２２に示すような回転バルブなど、チャンバを機械的に封止する他の手段を備えてもよい。さらに別の実施形態では、最初にカセット蓋を閉じてシールを装着しなければドッキングユニットへの挿入が不可能になるように配置されたヒンジ付きカセット蓋に、検査用カセットシールを配置することができる。この実施形態では、試料は、ドッキングユニットに挿入する前に検査用カセットに追加される。シール付きヒンジ式蓋を含む検査用カセットを図２３に示す。一般に、カセットをドッキングユニットに挿入し、試料をカセットに装填した後、ドッキングユニットの蓋を閉じることによって、好ましくはサーボモータも他の機械的装置も使用することなく、カセットが自動的に密封されると同時に、アッセイが開始されることが好ましい。
【０１１９】
いくつかのドッキングユニットの実施形態では、構成要素のセットが適切な検査用カセットの挿入を容易にし、検査用カセットとインタフェースする必要のある電子部品がカセットの挿入を物理的に妨害せず、検査中に信頼できる熱インタフェースを形成することを保証することが好ましい。これらの構成要素は、蓋２５０３が閉じるまでカセット挿入経路からＰＣＡ７５を遠ざけるための機構を形成する。ここで図２４を参照すると、ドッキングユニット内でヒータボードがＰＣＡホルダ２５０６上に装着され、好ましくは低熱質量足場として機能する一方で、検査用カセットが低熱質量カセットホルダ２５０７に装填され、レール２５０９は、カセットをドッキングユニットに導き、これをＰＣＡホルダ２５０６に取り付けられたＰＣＡ７５とインタフェース接続するために、ヒータボード表面に平行であるなどの正しい位置に保持する。蓋開放位置では、カセットホルダ２５０７の突出部２５０８がＰＣＡホルダ２５０６と干渉し、カセット挿入用のレール２５０９に沿った開放経路を維持する。好ましくは、斜面が突出部２５０８と部品２５０７の下部隆起との間の距離に及び、蓋２５０３の閉鎖時に突出部２５０８のＰＣＡホルダ２５０６上の窪み２５１１への円滑な移動を促進する。ドッキングユニットの蓋が閉じられると、突出部２５０８が窪み２５１１と係合し、それによって、ヒータボードのマウントが検査用カセット２５００の後面に近づく。蓋２５０３を閉じると、カセットホルダ２５０７に下向きの力がかかり、それにより、カセットホルダ２５０７が突出部２５０８が窪み２５１１に収まる位置に移動し、ＰＣＡホルダ２５０６が動き、ＰＣＡ７５がカセット２５００の背面に押し付けられる。好ましくは、ＰＣＡホルダ２５０６は、蓋の閉鎖後に、ＰＣＡ７５によるカセットの背面に対する再現可能な圧力の作用を可能にするために、ばね力などの一定の力の下にある。カセット２５００の背面に対するＰＣＡ７５の配置は、ＰＣＡ上の抵抗加熱素子から熱を検査用カセットの温度制御されたチャンバ及びベントに伝導する熱インタフェースを形成する。好ましくは、構成要素２５０６及び２５０７は、システムへの最小熱質量に寄与し、ファンなどの冷却装置及び赤外線センサなどのセンサによる温度監視のための検査用カセット表面へのアクセスを提供するように構成される。よって、蓋閉鎖後、ヒータボードは、好ましくは、検査用カセットの後部に対してしっかりと押し付けられ、好ましくはマイクロコントローラまたはマイクロプロセッサ制御によって、ヒータボード上のマイクロヒータが検査用カセットの流体チャンバ内の溶液を加熱し、検査用カセットの熱不安定性ベントフィルムを溶融させることを可能にする熱インタフェースを形成する。図２５は、非係合（蓋が開いた）位置と係合（蓋が閉じた）位置との両方における断面のカセット−ＰＣＡインタフェース機構を示す。いくつかの実施形態では、ドッキングユニットは、温度感知、検査用カセットの存在または除去の検出、及び試験パラメータの自動選択を可能にする特定の検査用カセットの検出などの用途のための追加のセンサを含む。ここで図２６を参照すると、赤外線センサ２６００は、チャンバ３０及び９０などの温度制御されたチャンバの上にある領域で検査用カセットの温度を検出する。センサは、センサ１１０などのＰＣＡ７５局所温度センサによって収集された温度データに加えて、またはその代わりに温度データの収集を可能にする。場合によるが、好ましくは光センサを使用して特定の検査用カセットを検出して、特定の疾患または状態についてカセットを特定し、特定の検査に適した温度プロファイルの自動選択を可能にすることができる。ここで図２７Ａ及び２７Ｂを参照すると、光学センサまたは光学センサアレイ２６０１などの光学センサアレイは、検査用カセットのタイプを決定し、検査用カセットの完全な挿入と正しい装着を確認するために、検査用カセット上のバーコードまたはバーコード状のフィーチャ２６０２とともに使用されてもよい。センサ２５０５と協同するセンサアレイ２６０２を使用して、蓋が閉じる前に閉じられたシールを検出することにより、以前に使用された検査用カセットの挿入を検出することができる。ドッキングユニットは、ドッキングユニットに挿入された検査用カセットのタイプを検出し、及び／またはドッキングユニット内のカセットの正しい挿入、位置決め、及び整列を確認するためのセンサを備えてもよい。インフルエンザＡ／Ｂ検査用カセットの検出を、図１９に示すドッキングユニット及び検査用カセットシステムに例示する。ドッキングユニットは、好ましくは、各カセット上のバーコードまたは他の記号を読み取り、異なるアッセイ用の保存されたプログラムに従ってそのプログラミングを変更することもできる。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態では、検査用カセットの両側を加熱することが望ましい。検査用カセットが２つのヒータＰＣＡの間に挿入されるデュアルヒータＰＣＡ構成が図２８Ａ及び２８Ｂに示されている。
【０１２１】
別の実施形態では、ドッキングユニットは、サーボアクチュエータ、自動結果読出し用の光学サブシステム、無線データ通信サブシステム、タッチスクリーンユーザインタフェース、充電式バッテリ電源、及び一体型試料調製サブシステムを含む検査用カセットを受け入れる検査用カセットレシーバを備えている。ここで図２９Ａ、２９Ｂ、及び３０を参照すると、ドッキングユニット２７００は、検査用カセット１５００を受け入れ、検査用カセットをＰＣＡ１５０１と熱接触させて、検査用カセットの温度制御及び流体流動制御を可能にする。検査用カセット１５００は、ピボット式ドッキングユニットドア２７０２のカセットレシーバスロット３６０５に挿入される。粗試料または溶解物を検査用カセットに追加した後に、ドッキングユニットのドアを閉じると、検査用カセットの背面がＰＣＡ１５０１と位置合わせされて接触するとともに、サーボアクチュエータと整列される。サーボアクチュエータ３６０２は、カセット１５００のアクチュエータポート１３１０を介して溶液区画化構成要素１３０３にアクセスし、封止材１３０５を破るために必要な機械的力を提供するように配置されている。メカニカルシール１３０５の破断により、粗溶解物及び洗浄緩衝剤が放出され、上述のように試料調製サブシステムの試料調製毛細管材料を通って流れる。毛管流体輸送の完了後、カセット１５００のアクチュエータポート１３２０を通して溶出リザーバ１３１７にアクセスするよう配置されたサーボアクチュエータ３６０１は、取り付けられた導管１３１８がシール１３１６とシールを形成し、結合マトリックス１３０６を溶出区画１３２１に移動させるように、機械的力を提供して部品１３１７を移動させる。次いで、カセット１５００のアクチュエータポート１３２２を通して溶出プランジャ１３１９にアクセスするよう配置されたサーボアクチュエータ３６０４が、プランジャ１３１９に機械的力を与えて、溶出緩衝剤を溶出リザーバ１３１７から結合マトリックス１３０６を通して排出し、カセット１５００の試料カップ１４０２への核酸の溶出をもたらす。サーボアクチュエータ３６０３は、上記のように溶出後にカセットを封止する。アクチュエータ制御は、ファームウェアまたはソフトウェア命令に従って、制御電子機器ＰＣＡ３６０６上のマイクロコントローラまたはマイクロプロセッサによって提供されることが好ましい。同様に、検査用カセット内の温度及び流体制御は、マイクロコントローラまたはマイクロプロセッサのメモリに保存されているファームウェアまたはソフトウェアルーチンで提供される指示に従う。図３１に示すＬＥＤ光源３６０８及びＣＭＯＳセンサ３６０９を含む光学サブシステム３６０７は、検出ストリップ信号データをデジタル化する。
【０１２２】
収集された検出ストリップ画像は、ドッキングユニット内のメモリに保存され、オンボードプロセッサを使用して結果の解釈を行い、ＬＣＤディスプレイ２７０１に報告される。ＬＥＤのリングは、ＣＭＯＳベースのデジタルカメラでの画像収集中に均一な照明を提供する。切手サイズのデバイスで収集された画像は、比色分析のラテラルフロー信号分析に適した高解像度データ（５メガピクセル、１０ビット）を提供できる。作動距離が短い光学部品と一緒に、好ましくは薄型デザイン（約１ｃｍ）を使用すると、システムを薄いデバイス容器に組み込むことができる。
【０１２３】
任意選択で、デジタル化された結果は、標準のＷｉＦｉまたはセルラ通信ネットワークを使用するドッキングユニットに組み込まれた無線通信システムを介して、オフライン分析、保存、及び／または視覚化のために送信することができる。このドッキングユニットの実施形態の写真を図３２Ａ及び３２Ｂに示す。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：精製されたウイルスＲＮＡ（ｉｎｆＡ／Ｂ）及び内部陽性対照ウイルスの多重増幅及び検出の方法
インフルエンザＡ及びＢ検査用カセットをドッキングユニットに設置した。試料口に４０μＬの試料液を添加した。試料液は、５０００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに相当する濃度の精製Ａ／プエルトリコインフルエンザＲＮＡ、５００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに相当する濃度の精製Ｂ／ブリスベンインフルエンザＲＮＡ、または分子等級水（鋳型対照なし試料）のいずれかで構成した。試料口に入ると、４０μＬの試料が凍結乾燥ビーズと混じり合い、検査用カセットの最初のチャンバに流れた。凍結乾燥ビーズは、ポジティブ内部コントロールとしてのＭＳ２ファージウイルス粒子とＤＴＴで構成した。カセットの最初のチャンバでは、試料を１分間９０℃に加熱してウイルス溶解を促進し、その後、２番目のチャンバに接続した通気口を開く前に５０℃に冷却した。第２のチャンバに接続されるベントを開くと、試料が第２のチャンバ内の空気を膨張チャンバに移動できるようにすることで、試料が第２のチャンバに流れ込んだ。試料が第２のチャンバに移動すると、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＭＳ２ファージに対するオリゴヌクレオチド増幅プライマが混じり合い、逆転写及び核酸増幅試薬及び酵素は、第１及び第２のチャンバ間の流路の凹部に凍結乾燥ペレットとして存在した。
【０１２５】
増幅チャンバを４７℃に６分間加熱し、その間にＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写した。逆転写の完了後、４０サイクルの熱サイクル増幅を第２のチャンバで行った。熱サイクリングが完了した後、第３のチャンバに接続されたベントを開いて、反応液を第３のチャンバに流入させた。第３のチャンバは、検査ストリップと、検出粒子として使用する３つの青色染色ポリスチレンミクロスフェア結合体を含む凍結乾燥ビーズとを含んでいた。コンジュゲートは、インフルエンザＡ、またはインフルエンザＢまたはＭＳ２ファージの増幅配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブに共有結合した３００ｎｍのポリスチレンミクロスフェアで構成された。溶液は、凍結乾燥された検出粒子が第３のチャンバに流入するときに再構成された。装置の底部から、３本の捕捉線がラテラルフローメンブレンに固定され、装置の底部からそれらは：アッセイされたターゲットに相補的でないネガティブコントロールオリゴヌクレオチド；Ｂ型インフルエンザの増幅産物に相補的な捕捉プローブ；インフルエンザＡの増幅産物に相補的な捕捉プローブ；及びＭＳ２ファージの増幅産物に相補的なオリゴヌクレオチドであった。結果の視覚的解釈の前に、ラテラルフローストリップを６分間展開させた。
【０１２６】
ラテラルフローストリップが展開すると、図３４に示すように、インフルエンザＡ陽性サンプルは、インフルエンザＡ及びＭＳ２ファージの位置で青い検査ラインの形成を示し、インフルエンザＢ陽性サンプルは、インフルエンザＢ及びＭＳ２ファージの位置で青い検査ラインの形成を示し、陰性試料は、ＭＳ２ファージの位置でのみ青色の検査ラインの形成を示した。
【０１２７】
実施例２：緩衝剤及び内部陽性対照ウイルス中のウイルス溶解物の多重増幅及び検出の方法
インフルエンザＡ及びＢ検査用カセットをドッキングユニットに設置した。試料口に４０μＬの試料液を添加した。試料液は、５０００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに相当する濃度のＡ／プエルトリコインフルエンザウイルス、５００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに相当する濃度のＢ／ブリスベンインフルエンザウイルス、または分子等級水（鋳型対照なし試料）のいずれかを含んだ。試料口に入ると、４０μＬの試料が凍結乾燥ビーズと混じり合い、検査用カセットの最初のチャンバに流れた。凍結乾燥ビーズは、ポジティブ内部コントロールとしてのＭＳ２ファージウイルス粒子とＤＴＴで構成した。カセットの最初のチャンバでは、試料を１分間９０℃に加熱してウイルス溶解を促進し、その後、２番目のチャンバに接続した通気口を開く前に５０℃に冷却した。第２のチャンバに接続されるベントを開くと、試料が第２のチャンバ内の空気を膨張チャンバに移動できるようにすることで、試料が第２のチャンバに流れ込んだ。試料が第２のチャンバに移動すると、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＭＳ２ファージに対するオリゴヌクレオチド増幅プライマが混じり合い、逆転写及び核酸増幅試薬及び酵素は、第１及び第２のチャンバ間の流路の凹部に凍結乾燥ペレットとして存在した。増幅チャンバを４７℃に６分間加熱し、その間にＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写した。
【０１２８】
逆転写の完了後、４０サイクルの熱サイクル増幅を第２のチャンバで行った。熱サイクリングが完了した後、第３のチャンバに接続されたベントを開いて、反応液を第３のチャンバに流入させた。第３のチャンバは、検査ストリップと、検出粒子として使用する３つの青色染色ポリスチレンミクロスフェア結合体を含む凍結乾燥ビーズとを含んでいた。コンジュゲートは、インフルエンザＡ、またはインフルエンザＢまたはＭＳ２ファージの増幅配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブに共有結合した３００ｎｍのポリスチレンミクロスフェアで構成された。溶液は、凍結乾燥された検出粒子が第３のチャンバに流入するときに再構成された。装置の底部から、３本の捕捉線がラテラルフローメンブレンに固定され、装置の底部からそれらは：アッセイされたターゲットに相補的でないネガティブコントロールオリゴヌクレオチド；Ｂ型インフルエンザの増幅産物に相補的な捕捉プローブ；インフルエンザＡの増幅産物に相補的な捕捉プローブ；及びＭＳ２ファージの増幅産物に相補的なオリゴヌクレオチドであった。結果の視覚的解釈の前に、ラテラルフローストリップを６分間展開させた。ラテラルフローストリップが展開すると、図３５に示すように、インフルエンザＡ陽性サンプルは、インフルエンザＡ及びＭＳ２ファージの位置で青い検査ラインの形成を示し、インフルエンザＢ陽性サンプルは、インフルエンザＢ及びＭＳ２ファージの位置で青い検査ラインの形成を示し、陰性試料は、ＭＳ２ファージの位置でのみ青色の検査ラインの形成を示した。
【０１２９】
実施例３：陰性臨床的鼻腔試料にスパイクされたインフルエンザウイルス（精製）及び内部陽性対照ウイルスの多重増幅及び検出の方法
ヒト被験者から採取した鼻腔スワブの試料を３ｍｌの０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３溶液に入れ、ＦＤＡ承認のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験を実施して、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの存在を検査した。この研究で使用する前に、試料がインフルエンザＡ及びインフルエンザＢについて陰性であることを確認した。確認したインフルエンザ陰性鼻腔試料に、５０００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに相当する濃度のＡ／プエルトリコインフルエンザウイルスをスパイクして使用し、または陰性対照としてウイルスを添加せずに使用した。得られたスパイク試料またはネガティブコントロール試料４０μＬを、インフルエンザＡ及びＢ検査用カセットの試料口に添加した。試料口に入ると、４０μＬの試料が凍結乾燥ビーズと混じり合い、検査用カセットの最初のチャンバに流れた。凍結乾燥ビーズは、ポジティブ内部コントロールとしてのＭＳ２ファージウイルス粒子とＤＴＴで構成した。カセットの最初のチャンバでは、試料を１分間９０℃に加熱してウイルス溶解を促進し、その後、２番目のチャンバに接続した通気口を開く前に５０℃に冷却した。第２のチャンバに接続されるベントを開くと、試料が第２のチャンバ内の空気を膨張チャンバに移動できるようにすることで、試料が第２のチャンバに流れ込んだ。試料が第２のチャンバに移動すると、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＭＳ２ファージに対するオリゴヌクレオチド増幅プライマが混じり合い、逆転写及び核酸増幅試薬及び酵素は、第１及び第２のチャンバ間の流路の凹部に凍結乾燥ペレットとして存在した。
【０１３０】
増幅チャンバを４７℃に６分間加熱し、その間にＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写した。逆転写の完了後、４０サイクルの熱サイクル増幅を第２のチャンバで行った。熱サイクリングが完了した後、第３のチャンバに接続されたベントを開いて、反応液を第３のチャンバに流入させた。第３のチャンバは、検査ストリップと、検出粒子として使用する３つの青色染色ポリスチレンミクロスフェア結合体を含む凍結乾燥ビーズとを含んでいた。コンジュゲートは、インフルエンザＡ、またはインフルエンザＢまたはＭＳ２ファージの増幅配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブに共有結合した３００ｎｍのポリスチレンミクロスフェアで構成された。溶液は、凍結乾燥された検出粒子が第３のチャンバに流入するときに再構成された。装置の底部から、３本の捕捉線がラテラルフローメンブレンに固定され、装置の底部からそれらは：アッセイされたターゲットに相補的でないネガティブコントロールオリゴヌクレオチド；Ｂ型インフルエンザの増幅産物に相補的な捕捉プローブ；インフルエンザＡの増幅産物に相補的な捕捉プローブ；及びＭＳ２ファージの増幅産物に相補的なオリゴヌクレオチドであった。結果の視覚的解釈の前に、ラテラルフローストリップを６分間展開させた。ラテラルフローストリップが展開すると、図３６に示すように、インフルエンザＡ陽性試料は、インフルエンザＡ及びＭＳ２ファージの位置に青色検査線の形成を示し、陰性対照試料はＭＳ２ファージの位置にのみ青色検査線の形成を示した。
【０１３１】
本明細書及び特許請求の範囲において、「約」または「およそ」とは、引用された数値の２０パーセント（２０％）以内を意味することに留意されたい。本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段に明示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「官能基」への言及は１つまたは複数の官能基を指し、「方法」への言及は、当業者によって理解及び認識されるであろう同等のステップ及び方法への言及を含む、などである。
【０１３２】
開示された実施形態を特に参照して本発明を詳細に説明したが、他の実施形態でも同じ結果を達成することができる。本発明の変形及び修正は、当業者には明らかであり、全てのそのような修正及び均等物を網羅することを意図している。上記に引用した全ての特許及び刊行物の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020517916.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８】
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【国際調査報告】
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