(57)【要約】  本明細書において、試料を対象から得た後、約８時間以内に（又は約８時間以下のうちに）、ヒト対象から採取された血液試料を処理し、この中の、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルを測定して検出する、改善された方法が開示される。ＵＣＨ−Ｌ１は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）についての早期バイオマーカーであり、血液中のＵＣＨ−Ｌ１を評価するための、改善された方法であって、頭部への損傷を負った、又は負った可能性があるヒト対象の診断及び査定の一助となりうる方法が必要とされている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた全血試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）の量を測定する方法の改善であって、前記試料の保存から生じるＵＣＨ−Ｌ１レベルの上昇を回避するように、前記試料が前記対象から得られた後、約８時間以内に、前記試料を処理するステップを含む改善。
【請求項２】
前記試料が前記対象から得られた後、（ａ）約０時間〜約６時間；（ｂ）約０時間〜約４時間；（ｃ）約０時間〜約２時間；及び（ｄ）約０時間〜約１時間からなる群から選択される時間以内に、前記試料が処理される、請求項１に記載の改善。
【請求項３】
前記試料が前記対象から得られた後、（ａ）約１時間〜約８時間；（ｂ）約１時間〜約６時間；（ｃ）約１時間〜約４時間；及び（ｄ）約１時間〜約２時間からなる群から選択される時間以内に、前記試料が処理される、請求項１に記載の改善。
【請求項４】
前記試料を処理するステップが、前記試料中の血液細胞から、血漿を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の量を測定する、前記血漿を使用する検査を実施することとを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改善。
【請求項５】
前記試料が、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、前記対象から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改善。
【請求項６】
前記試料を処理するステップが、前記試料中の任意の凝血塊から、血清を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の量を測定する、前記血清を使用する検査を実施することとを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改善。
【請求項７】
前記試料が、血清回収チューブを使用して回収される、請求項６に記載の改善。
【請求項８】
前記試料を処理するステップが、前記ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する検査を実施することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改善。
【請求項９】
前記検査が、ＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる任意の方法を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の改善。
【請求項１０】
前記検査が、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択される、請求項９に記載の改善。
【請求項１１】
前記検査が、臨床化学フォーマットにおいて利用される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の改善。
【請求項１２】
前記検査が、
ａ）前記試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、
（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び
（２）検出可能な標識を含み、前記捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体
と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びに
ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の前記試料中量又は前記試料中濃度を、前記捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の前記検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定すること
を含むイムノアッセイである、請求項１０又は１１に記載の改善。
【請求項１３】
前記試料が前記対象から得られた時点から前記検査が実施される時点までの、ある時間にわたり、前記試料が、室温において維持される、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の改善。
【請求項１４】
前記試料が前記対象から得られた時点から前記検査が実施される時点までの、ある時間にわたり、前記試料が、約２℃〜約８℃の温度において維持される、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の改善。
【請求項１５】
前記試料が前記対象から得られた後から前記検査が実施される時点までの時間において、前記試料が混合されない、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の改善。
【請求項１６】
前記対象に由来する、前記試料中の前記ＵＣＨ−Ｌ１の量が、外傷性脳損傷の尺度として評価され、前記対象が、頭部への損傷を負った可能性がある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改善。
【請求項１７】
全血試料が対象から得られた時点から、前記試料に対してアッセイを実施する前までの間の、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避又は防止する方法であって、前記アッセイを実施する前に、前記試料の保存から生じるＵＣＨ−Ｌ１レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避するように、前記試料が前記対象から得られた後、約８時間以内に、前記試料を処理するステップを含む方法。
【請求項１８】
前記試料が前記対象から得られた時点から、前記アッセイを実施する前までの間の、前記試料中のＵＣＨ−Ｌ１の、誤った高レベルを回避又は防止する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が前記対象から得られた後、（ａ）約０時間〜約６時間；（ｂ）約０時間〜約４時間；（ｃ）約０時間〜約２時間；及び（ｄ）約０時間〜約１時間からなる群から選択される時間以内に、前記試料が処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が前記対象から得られた後、（ａ）約１時間〜約８時間；（ｂ）約１時間〜約６時間；（ｃ）約１時間〜約４時間；及び（ｄ）約１時間〜約２時間からなる群から選択される時間以内に、前記試料が処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
その後、前記ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定するアッセイを実施するステップをさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料を処理するステップが、前記試料中の血液細胞から、血漿を分離することと；その後、前記ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する、前記血漿を使用するアッセイを実施することとを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、前記対象から得られる、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料を処理するステップが、前記試料中の任意の凝血塊から、血清を分離することと；その後、前記ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する、前記血清を使用するアッセイを実施することとを含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、血清回収チューブを使用して回収される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アッセイがＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる、任意の方法を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アッセイが、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アッセイが、臨床化学フォーマットにおいて利用される、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アッセイが、
ａ）前記試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、
（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び
（２）検出可能な標識を含み、前記捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体
と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びに
ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の、前記試料中量又は前記試料中濃度を、前記捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の前記検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定すること
を含むイムノアッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が前記対象から得られた時点と、前記アッセイが実施される時点との間の、ある時間にわたり、前記試料が、室温において維持される、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が前記対象から得られた時点と、前記アッセイが実施される時点との間の、ある時間にわたり、前記試料が、約２℃〜約８℃の温度において維持される、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が前記対象から得られた時点と、前記検査が実施される時点との間の時間において、前記試料が混合されない、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象に由来する、前記試料中の前記ＵＣＨ−Ｌ１の量が、外傷性脳損傷の尺度として評価され、前記対象が、頭部への損傷を負った可能性がある、請求項１７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
対象から得られた全血試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）の量を測定する方法の改善であって、解析前の処理条件を制御することにより、ＵＣＨ−Ｌ１測定値の誤差を低減することを含む改善。
【請求項３５】
解析前の処理条件を制御することが、前記試料が前記対象から得られた後、約８時間以内に、前記試料を処理することを含む、請求項３４に記載の改善。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、その内容が、参照により本明細書に組み込まれた、２０１７年７月３日に出願された、米国特許第６２／５２８，１８７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、試料を対象から得た後、約８時間以内に（すなわち、約８時間で又はそれより短い時間で）、ヒト対象から採取された血液試料を処理し、この中の、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルを測定して検出する、改善された方法に関する。ＵＣＨ−Ｌ１は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）についての早期バイオマーカーであり；したがって、血液中のＵＣＨ−Ｌ１を評価するための、改善された方法は、頭部への損傷を負った、又は負った可能性があるヒト対象の診断及び査定の一助となりうる。
【背景技術】
【０００３】
米国だけにおいても、毎年５００万例を超える軽度の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が生じている。身体検査及び問診などの臨床ツールは、主観的であり、感度及び特異度を欠く。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、高価であり、世界の全ての地域において利用可能であるわけではなく、臨床ツール及び／又は問診が、このようなイメージングを実施する必要を示唆する場合に限りルーチン的になされる。したがって、ＴＢＩの診断及び査定には、高い偽陰性率を伴う。医師及び患者は、この状態を正確に査定して、適切なトリアージ及び回復を促進するのに、客観的で、信頼できる情報を必要とする。
【０００４】
いくつかの場合、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）及びＳ−１００βを含む、ＴＢＩについてのバイオマーカーが同定されている。バイオマーカーデータの使用は、臨床医及び患者により求められている、客観的かつ信頼できる診断情報をもたらすために有望であるが、急性ケア状況における、患者の査定及び管理の一助となるＴＢＩバイオマーカーの使用に利用可能なデータは限定的である。
【０００５】
さらに、患者から試料を得た後において、バイオマーカーの評価によりもたらされた特異性及び精度が、確立されかつ維持されうるように、患者試料を得て処理するために最も有利な臨床パラメータ及び条件を決定することは、困難であった。例えば、当技術分野のポイントオブケア検査を含む血液検査の領域において、解析前の誤差が、極めて高頻度であることは周知である（その内容が、参照により本明細書に組み込まれた、Ｈｅｙｅｒら、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ＥＤｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４５（０）：１０１２〜１０３２（２０１２年９月）を参照されたい）。残念ながら、検査誤差のうちの約６０〜８０％は、解析フェーズの外において生じ、極めてしばしば、検査室の外（例えば、すなわち、時に解析前フェーズ及び解析後フェーズ）において生じる。さらに、最も誤差を生じやすいのは、解析前フェーズである。最も一般的な解析前誤差は以下を含む：
１．不正確な時間におけるサンプリングなどの、患者の調整誤差。多くの解析物及び血液パラメータは、１日、１カ月なお又は１シーズンにおいて、時間と共に変動することが公知であるため、サンプリング時間は、重要である；
２．毛細管サンプリング時の「ミルキング」及びシリンジを使用する経静脈サンプリングなどのサンプリング法の誤差。穿刺部位周囲の過剰なマッサージ及び圧迫（一般に、「ミルキング」と呼ばれる）は、毛細管の血流が、チューブを充填するのに必要な血液容量を得るために十分ではない場合に、なされることが多い。過剰なマッサージは、組織液による血液試料の希釈に起因する一部の解析濃度の不当な低下（１０％以下）及び試料溶血に起因するカリウム濃度の不当な上昇を、引き起こしうる。シリンジの使用は、一般に、溶血及び凝血塊の形成の危険性を上昇させる；
３．回収チューブの充填不足又は不適正な充填。添加物を伴う回収チューブが使用される場合、サンプリング時に、真空がなくなり血流が止まるまで、チューブに充填するように注意しなければならない。適正な血液対添加物比を確保することが、重要である。チューブの充填不足は、最も一般的な解析前誤差のうちの１つである。チューブに完全に充填した場合、添加物（例えば、抗凝固剤）の、チューブ内数量は、血液と抗凝固剤との適正な比を確保する数量である；
４．血液の溶解により引き起こされる溶血。溶血は、最も高頻度な解析前誤差である。溶血はまた、中央検査室による試料の棄却の、最も一般的な原因でもある。溶血例は、溶解した血液細胞からの、血液細胞成分の放出に起因して、多くのアッセイに干渉する。血液試料が溶血すると、新たな臨床試料が必要とされることが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｅｙｅｒら、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ＥＤｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４５（０）：１０１２〜１０３２（２０１２年９月）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、試料を得て処理する改善された方法であって、解析前誤差を低減することにより、とりわけ急性ケアの文脈において、患者を診断及び処置するのに使用されうる、ＴＢＩのバイオマーカーのより正確な測定を可能とする方法が、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本開示は、対象から得られた血液試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）の量を測定する方法の改善を、対象とする。一実施形態において、本方法は、試料の保存から生じるＵＣＨ−Ｌ１レベルの上昇を回避するために、試料が対象から得られた後、約８時間以内に（又は約８時間以下のうちに）、対象に由来する試料を処理するステップを含む。例えば、一態様において、試料は、試料が対象から得られた後、約０時間〜約６時間以内に処理される。例えば、別の態様において、試料は、試料が対象から得られた後、約０時間〜約２時間以内に処理される。さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約０〜約１時間の時間のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間〜約８時間以内に処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間〜約６時間以内に処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間〜約２時間以内に処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約８時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約６時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約４時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約２時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間以下のうちに処理される。
【０００９】
別の態様において、上記された方法は、その後、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定するアッセイ又は検査を実施するステップをさらに含む。
【００１０】
さらに別の態様において、上記された方法は、その後、試料中のＵＣＨ−Ｌ１を検出するアッセイ又は検査を実施するステップをさらに含む。
【００１１】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料を処理するステップは、試料中の血液細胞から血漿を分離することと、その後、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する血漿を使用するアッセイを実施することとを含む。
【００１２】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料は、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、対象から得られる。
【００１３】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料を処理するステップは、試料中の任意の凝血塊から血清を分離することと、その後、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する血清を使用するアッセイを実施することとを含む。
【００１４】
上記された方法において、試料は、血清回収チューブを使用して回収される。
【００１５】
上記された方法において、アッセイは、ＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる、任意の方法（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１は、検出及び／又は測定される）を含む。例えば、アッセイは、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択されうる。一態様において、アッセイは、臨床化学フォーマットにおいて利用される。別の態様において、利用されるアッセイは、
ａ）試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、
（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び
（２）検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体
と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びに
ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の前記検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定すること
を含むイムノアッセイである。
【００１６】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料が対象から得られた時点とアッセイが実施される時点との間の、ある時間にわたり、試料は室温において維持される。
【００１７】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料が対象から得られた時点とアッセイが実施される時点との間の、ある時間にわたり、試料は約２℃〜約８℃の温度において維持される。
【００１８】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料が対象から得られた時点とアッセイが実施される時点との間の時間において、又はこの時間にわたり、試料は混合されない。
【００１９】
上記された方法の、さらに別の態様において、対象に由来する試料中のＵＣＨ−Ｌ１量は、外傷性脳損傷の尺度として評価され、対象は、頭部への損傷を負った、又は負った可能性がある。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、全血試料が対象から得られた時点から、試料に対してアッセイ（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を検出及び／又は測定するアッセイなど）を実施する前までの間の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避又は防止する方法を対象とする。具体的に、方法は、偽陽性、誤った結果又は他の間違った結果をもたらしうる、試料が対象から得られた時点からアッセイを実施する前までの間の、試料中のＵＣＨ−Ｌ１の誤った高レベルを、回避又は防止する。方法は、アッセイを実施する前に試料の保存から生じるＵＣＨ−Ｌ１レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避するように、試料が対象から得られた後、約８時間以内（例えば、８時間以下のうちなど）に試料を処理するステップを伴う。例えば、一態様において、試料は、試料が対象から得られた後、約０時間〜約６時間以内に処理される。例えば、別の態様において、試料は、試料が対象から得られた後、約０時間〜約２時間以内に処理される。さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約０〜約１時間の時間のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間〜約８時間以内に処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間〜約６時間以内に処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間〜約２時間以内に処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約８時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約６時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約４時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約２時間以下のうちに処理される。なお、さらに別の例において、試料は、試料が対象から得られた後、約１時間以下のうちに処理される。
【００２１】
別の態様において、上記された方法は、その後、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定するアッセイ又は検査を実施するステップをさらに含む。
【００２２】
さらに別の態様において、上記された方法は、その後、試料中のＵＣＨ−Ｌ１を検出するアッセイ又は検査を実施するステップをさらに含む。
【００２３】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料を処理するステップは、試料中の血液細胞から血漿を分離することと、その後、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する血漿を使用するアッセイを実施することとを含む。
【００２４】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料は、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、対象から得られる。
【００２５】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料を処理するステップは、試料中の任意の凝血塊から血清を分離することと、その後、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を測定する血清を使用するアッセイを実施することとを含む。
【００２６】
上記された方法において、試料は、血清回収チューブを使用して回収される。
【００２７】
上記された方法において、アッセイは、ＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる、任意の方法（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１は、検出及び／又は測定される）を含む。例えば、アッセイは、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択されうる。一態様において、アッセイは、臨床化学フォーマットにおいて利用される。別の態様において、利用されるアッセイは、
ａ）試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、
（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び
（２）検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体
と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びに
ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の前記検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定すること
を含むイムノアッセイである。
【００２８】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料が対象から得られた時点とアッセイが実施される時点との間のある時間にわたり、試料は、室温において維持される。
【００２９】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料が対象から得られた時点とアッセイが実施される時点との間のある時間にわたり、試料は、約２℃〜約８℃の温度において維持される。
【００３０】
上記された方法の、さらに別の態様において、試料が対象から得られた時点とアッセイが実施される時点との間の時間において、又はこの時間にわたり、試料は混合されない。
【００３１】
上記された方法の、さらに別の態様において、対象に由来する試料中のＵＣＨ−Ｌ１量は、外傷性脳損傷の尺度として評価され、対象は、頭部への損傷を負った、又は負った可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】ＵＣＨ−Ｌ１の、全血試料中レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図１Ｂ】ＵＣＨ−Ｌ１の、全血試料中レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図２Ａ】ＵＣＨ−Ｌ１の、血漿試料中レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図２Ｂ】ＵＣＨ−Ｌ１の、血漿試料中レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図３Ａ】ヘパリンリチウム回収チューブを使用して得られた全血試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図３Ｂ】ＥＤＴＡ回収チューブを使用して得られた全血試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図４Ａ】室温において、ＥＤＴＡ回収チューブを使用して得られた血漿試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図４Ｂ】２〜８℃において、ＥＤＴＡ回収チューブを使用して得られた血漿試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図５Ａ】室温において、ヘパリンリチウム回収チューブを使用して得られた血漿試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図５Ｂ】２〜８℃において、ヘパリンリチウム回収チューブを使用して得られた血漿試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図６Ａ】ＵＣＨ−Ｌ１の、室温の血清試料中レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図６Ｂ】ＵＣＨ−Ｌ１の、２〜８℃の血清試料中レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図７】凝血塊への曝露を伴う血清試料又はこれを伴わない血清試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【図８】ＥＤＴＡ回収チューブに由来する血漿をスパイクされた溶血物試料中のヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを、ＵＣＨ−Ｌ１レベルと比較する、代表的な折れ線グラフを示す図である。
【図９】ＵＣＨ−Ｌ１組換え解析物をスパイクされたＥＤＴＡ回収チューブを使用して得られた全血試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについての、代表的な棒グラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、試料を対象から得た後約８時間以内又は約８時間以下の時点において、ヒト対象から採取された血液試料を処理し、この中の、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルを測定して検出する、改善された方法に関する。本明細書において開示された方法は、頭部への損傷を負ったか又は負った可能性があるヒト対象の診断及び査定の一助となるように、血液中のＵＣＨ−Ｌ１（一般に、ＴＢＩのバイオマーカーであると考えられる）を評価するために有用でありうる。加えて、研究は、血液試料が対象から得られた後最初の２４時間にわたり、ＵＣＨ−Ｌ１の血中レベルが不安定となり、この上昇の少なくとも一部は、試料が検査されるか又はアッセイが実施される（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１レベルを検出及び／又は測定するように）時点より前に起こるか又は生じる、解析前の処理条件又は因子に起因しうることを、報告している。例えば、溶血を引き起こすある特定の標準的な処理条件が、ＵＣＨ−Ｌ１レベルに対して、ほとんど又は全く影響を及ぼさなかったことが報告されている。しかし、本開示は、驚くべきことに、ある特定の解析前の処理条件及び処理法が、ＵＣＨ−Ｌ１の、全血中レベルの上昇（すなわち、誤った上昇）を引き起こすことにより、その結果として偽陽性をもたらしうることを見出した。このような偽陽性は、ＵＣＨ−Ｌ１を、ＴＢＩなどの障害の検出、決定及び／又は評価の一助となるための診断的マーカーとして使用する精度を損ないうる。
【００３４】
したがって、本開示は、ＵＣＨ−Ｌ１が、血液試料（例えば、全血又は血漿）中などの試料中において得られ、測定される方式を改善する方法を提示する。具体的に、本開示は、検査又はアッセイを実施する前に対象から得られた血液試料（例えば、全血試料又は血漿試料）中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避又は防止する方法を提示する。より具体的には、本明細書において記載された方法は、試料が、対象から得られた時点からアッセイを実施する前までの間の、試料中のＵＣＨ−Ｌ１の誤った高レベルを回避又は防止する。このような方法は、アッセイを実施する前に試料を保存することから生じる、ＵＣＨ−Ｌ１レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避するように、試料が対象から得られた後約８時間以内に血液試料を処理するステップを伴う。このような方法は、試料中のＵＣＨ−Ｌ１を評価する（例えば、検出及び／又は測定する）ように、検査又はアッセイが実施されるまで、ＵＣＨ−Ｌ１の、血液試料中レベルを安定化させるのに効果的である。
【００３５】
本明細書の本節及び全開示において使用された節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、限定的であることを意図するものではない。
【００３６】
１．定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用された、全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。齟齬が生じる場合は、定義を含む本文献に従う。本開示の実施又は試験において、本明細書において記載された方法及び材料と同様又は同等な方法及び材料も使用されうるが、下記において、好ましい方法及び材料について記載される。本明細書において言及された、全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書において開示された材料、方法及び例は、例示的なものであるに過ぎず、限定を意図するものではない。
【００３７】
本明細書において使用された「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」「〜を有すること」、「〜を有する」、「〜でありうる」、「〜を含有する」という用語は、さらなる行為又は構造の可能性を除外しない、オープンエンドな移行句、移行用語又は移行語である。単数形の「ある（ａ及びａｎ）」及び「その（ｔｈａｔ）」は、文脈によりそうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示されているのであれ、そうでないのであれ、本明細書において提示された実施形態又は要素「を含み」、これら「からなり」、これら「から本質的になる」、他の実施形態も想定する。
【００３８】
本明細書において、数値範囲を列挙するために、それらの間に介在する、同じ精度を伴う各数が明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲について、６及び９に加えて、７及び８の数も想定され、６．０〜７．０の範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の数が、明示的に想定される。
【００３９】
本明細書において使用された「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とは、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全ヒト化抗体又は部分的ヒト化抗体）、鳥類（例えば、アヒル又はガチョウ）抗体、サメ抗体、クジラ抗体及び非霊長動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）抗体又は非ヒト霊長動物（例えば、サル、チンパンジーなど）抗体を含む哺乳動物抗体などであるがこれらに限定されない動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結型Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）及び抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二重ドメイン抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）又は三重可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作り出すための方法について、各々の内容が参照により本明細書に組み込まれるＷｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（１１）：１２９０〜１２９７（２００７）及びＰＣＴ国際出願第２００１／０５８９５６号において記載されている）並びに上記のうちのいずれかの、機能的に活性なエピトープ結合性断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性断片、すなわち、解析物結合性部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの分子でありうる。簡潔さのために、本明細書において、解析物に対する抗体は、「抗解析物抗体」又は、単に、「解析物抗体」（例えば、抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はＵＣＨ−Ｌ１抗体）と称されることが多い。
【００４０】
本明細書において「アフィニティー成熟抗体」とは、標的抗原に対する抗体のアフィニティー（すなわち、ＫＤ、ｋｄ又はｋａ）の変更を有さない親抗体と比較した改善を結果としてもたらす、１つ以上のＣＤＲ内の、１カ所以上の変更を伴う抗体を指すように使用される。例示的なアフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対する、ナノモル単位なお又はピコモル単位のアフィニティーを有する。ＢｉｏＤｉｓｐｌａｙ法を使用して調製されたコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニングを含め、アフィニティー成熟抗体を作製するための様々な手順が当技術分野において公知である。例えば、Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２）は、ＶＨとＶＬとのドメインシャッフリングによるアフィニティー成熟について記載している。ＣＤＲ残基及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発については、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜３３１９（１９９５）及びＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６（１９９２）により記載されている。選択的突然変異誘発位置及び活性増強アミノ酸残基を伴う接触位置又は超変異位置における選択的突然変異については、米国特許第６，９１４，１２８Ｂ１号において記載されている。
【００４１】
本明細書において使用された「抗体断片」とは、抗原結合性部位又は可変領域を含む、無傷抗体の部分を指す。部分は、無傷抗体のＦｃ領域の重鎖定常ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４）を含まない。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディー、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つだけの軽鎖可変ドメインを含有する単鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチド、１つだけの重鎖可変領域を含有する単鎖ポリペプチド及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチドを含むがこれらに限定されない。
【００４２】
「曲線下面積」又は「ＡＵＣ」とは、ＲＯＣ曲線下面積を指す。ＲＯＣ曲線下ＡＵＣとは、精度についての尺度である。ＡＵＣが１であることが、完全な検査を表すのに対し、ＡＵＣが０．５であることは、非有意な検査を表す。好ましいＡＵＣは、少なくとも約０．７００、少なくとも約０．７５０、少なくとも約０．８００、少なくとも約０．８５０、少なくとも約０．９００、少なくとも約０．９１０、少なくとも約０．９２０、少なくとも約０．９３０、少なくとも約０．９４０、少なくとも約０．９５０、少なくとも約０．９６０、少なくとも約０．９７０、少なくとも約０．９８０、少なくとも約０．９９０又は少なくとも約０．９９５でありうる。
【００４３】
本明細書において、「ビーズ」と「粒子」とは、互換的に使用され、実質的に球形の固体支持体を指す。ビーズ又は粒子の一例は、マイクロ粒子である。本明細書において使用されうるマイクロ粒子は、当技術分野において公知である、任意の種類でありうる。例えば、ビーズ又は粒子は、磁気ビーズ又は磁気粒子でありうる。磁気ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は磁性流体でありうる。例示的な強磁性材料は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ及びＮｉＯ／Ｆｅを含む。フェリ磁性材料の例は、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（又はＦｅＯ．Ｆｅ２Ｏ３）を含む。ビーズは、磁性であり、１つ以上の非磁性層により取り囲まれた、固体コア部分を有しうる。代替的に、磁性部分は、非磁性コアの周囲の層でありうる。マイクロ粒子は、本明細書において記載された方法において働く、任意のサイズ、例えば、約０．７５〜約５ｎｍ又は約１〜約５ｎｍ又は約１〜約３ｎｍでありうる。
【００４４】
本明細書において、「結合性タンパク質」とは、例えば、ポリペプチド、抗原、化合物若しくは他の分子、又は任意の種類の基質などの結合パートナーに結合し、これと共に複合体を形成する、単量体又は多量体のタンパク質を指すように使用される。結合性タンパク質は、結合パートナーに特異的に結合する。結合性タンパク質は、抗体のほか、当技術分野において公知であり本明細書の下記において記載される、これらの抗原結合性断片及びこれらの他の多様な形態及び誘導体並びに抗原分子又は抗原分子上の特定の部位（エピトープ）に結合する、１つ以上の抗原結合性ドメインを含む他の分子を含む。したがって、結合性タンパク質は、四量体の免疫グロブリンである抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ１分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、アフィニティー成熟抗体及び抗原に結合する能力を保持する、任意のこのような抗体の断片を含むがこれらに限定されない。
【００４５】
本明細書において、「二特異性抗体」とは、それらのうちの１つだけが機能的な二特異性抗体である複数の異なる免疫グロブリン分子種を結果としてもたらす形で、クァドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５（５９３４）：５３７〜５４０（１９８３）を参照されたい）、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーション（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４（６０１２）：６２８〜６３１（１９８５）を参照されたい）、又はＦｃ領域内の突然変異を導入するＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）法若しくは同様の手法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（１４）：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい）により作出された全長抗体を指すように使用される。二特異性抗体は、その２つの結合性アーム（ＨＣ／ＬＣの１つの対）のうちの１つにおける、１つの抗原（又はエピトープ）に結合し、その第２のアーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）における、異なる抗原（又はエピトープ）に結合する。この定義により、二特異性抗体は、２つの顕著に異なる抗原結合性アーム（特異性配列及びＣＤＲ配列の両方）を有し、それが結合する各抗原について一価である。
【００４６】
本明細書において、「ＣＤＲ」とは、抗体の可変配列内の「相補性決定領域」を指すように使用される。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々において、３つずつのＣＤＲが存在する。重鎖又は軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、可変領域の各々について、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と表記されている。本明細書において使用された「ＣＤＲセット」という用語は、単一の可変領域において生じる、３つのＣＤＲの群であって、抗原に結合するＣＤＲの群を指す。したがって、抗原結合性部位は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含みうる。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、「分子認識単位」と称されうる。抗原−抗体複合体についての結晶構造解析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が、結合した抗原との広範な接触部を形成し、この場合、最も広範な抗原の接触部は、重鎖ＣＤＲ３との接触部であることを裏付けている。したがって、分子認識単位は、主に、抗原結合性部位の特異性の一因となりうる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。
【００４７】
これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従い、異なる形で規定されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１））により記載されているシステムは、抗体の任意の可変領域へと適用可能である、明確な残基番号付けシステムを提示するだけではなく、また、３つのＣＤＲを規定する、正確な残基の境界も提示している。これらのＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ」と称されうる。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）；並びにＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内の、ある特定の下位部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）が、アミノ酸配列のレベルにおいて大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一なペプチド骨格のコンフォメーションを取ることを見出した。これらの下位部分は、「Ｌ」及び「Ｈ」が、それぞれ、軽鎖領域及び重鎖領域を名指す、「Ｌ１」、「Ｌ２」及び「Ｌ３」、又は「Ｈ１」、「Ｈ２」及び「Ｈ３」と名指された。これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ」と称される場合があり、これらは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを規定する他の境界について、Ｐａｄｌａｎ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９：１３３〜１３９（１９９５）；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２（５）：７３２〜７４５（１９９６）により記載されている。さらに他のＣＤＲの境界の定義は、本明細書のシステムの定義に厳密に従わない場合もあり、特定の残基若しくは残基群なお又は全ＣＤＲが、抗原への結合に、著明な影響を及ぼさないという予測又は実験による知見に照らして、短くなる場合もあり、長くなる場合もあるが、それでも、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する。本明細書において使用された方法は、これらのシステムのうちのいずれに従い規定されたＣＤＲも用いうるが、ある特定の実施形態は、Ｋａｂａｔより規定されたＣＤＲ又はＣｈｏｔｈｉａにより規定されたＣＤＲを使用する。
【００４８】
「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」又は「少なくとも１つの構成要素」とは、一般に、本明細書において記載された方法及び当技術分野において公知である他の方法に従う、患者の尿試料、全血試料、血清試料又は血漿試料などの被験試料についてのアッセイのためのキット内に含まれうる捕捉抗体、検出試薬又は検出コンジュゲート、較正物質、対照、感度パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素に対する補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液としての）、停止溶液などを指す。一部の構成要素は、溶液でありうる、又はアッセイにおける使用のための復元のために、凍結乾燥させられうる。
【００４９】
本明細書において使用された「〜と相関した」とは、「〜と比較した」を指す。
【００５０】
本明細書において使用された「ＣＴスキャン」とは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを指す。ＣＴスキャンは、異なる角度から得られた、一連のＸ線画像を組み合わせ、コンピュータ処理を使用して、体内の骨、血管及び軟部組織についての断面画像又は切片を創出する。ＣＴスキャンは、Ｘ線ＣＴ、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ軸方向断層撮影（ＣＡＴスキャン）又はコンピュータ支援断層撮影を使用しうる。ＣＴスキャンは、従来のＣＴスキャン又は渦巻き状／らせん状ＣＴスキャンでありうる。従来のＣＴスキャンにおいて、スキャンは、切片ごとに得られ、各切片のスキャンの後、停止及び次の切片への移動、例えば、腹部の上方から、骨盤への移動がなされる。従来のＣＴスキャンは、動きによるアーチファクトを回避するために、患者が息を止めることを要求する。渦巻き状／らせん状ＣＴスキャンは、連続スキャンであり、渦巻き状に得られ、スキャンされた画像が連続的であるので、工程がはるかに迅速である。
【００５１】
本明細書において「アッセイにより決定された」とは、任意の適切なアッセイによる、基準レベルの決定を指すように使用される。一部の実施形態において、基準レベルの決定は、対象に由来する試料へと適用されるアッセイと同じ種類のアッセイにより（例えば、イムノアッセイ、臨床化学アッセイ、単一分子検出アッセイ、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動、化学分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析又はタンパク質免疫染色、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）若しくは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）などの、クロマトグラフィー法若しくは分光法により）達成されうる。一部の実施形態において、基準レベルの決定は、対象に由来する試料へと適用されるアッセイと同じ種類のアッセイにより、同じアッセイ条件下において達成されうる。本明細書において言及される通り、本開示は、例示的な基準レベル（例えば、異なる時点における基準レベルを比較することにより計算された）を提示する。本明細書における本開示を他のアッセイに適合させて、本開示により提示された記載に基づき、これらの他のアッセイについてアッセイ特異的な基準レベル及び絶対量を得ることは、十分に当業者の技術の範囲内にある。例えば、頭部への損傷を負ったことが分かっているヒト対象から得られた試料（そして、より特定すると、（ｉ）軽度ＴＢＩ及び／又は（ｉｉ）中等度〜重度のＴＢＩを負ったことが分かっているヒト対象から得られた試料）及び頭部への損傷を負っていないことが分かっているヒト対象から得られた試料を含むトレーニング試料のセットは、アッセイ特異的な基準レベルを得るのに使用されうる。本明細書において、「アッセイにより決定され」、列挙されたレベルの「感度」及び／又は「特異度」を有する、基準レベルは、前記基準レベルが、本発明の方法において採用された場合に、列挙された感度及び／又は特異度についての方法をもたらすことが決定された、基準レベルを指すように使用されることが理解される。例えば、複数の異なる可能な基準レベルを使用する、アッセイデータについての統計学的解析の反復により、本発明の方法において与えられた基準レベルと関連する感度及び特異度を決定することは、十分に、当業者の技術の範囲内にある。
【００５２】
実質的に、外傷性脳損傷を有するものとしての対象と、外傷性脳損傷を有さないものとしての対象とを識別する場合、又は軽度外傷性脳損傷を有するものとしての対象を、中等度、重度又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有するものとしての対象と対比して識別する場合、当業者は、カットオフを上昇させることの、感度及び特異度に対する効果を秤にかける。カットオフを上昇又は下落させることは、十分に規定され、予測可能な影響を、感度及び特異度並びに他の標準的な統計学的尺度に対して及ぼす。カットオフを上昇させることは、特異度を改善するが、感度（疾患を伴う対象の、検査陽性となる比率）を悪化させることが、周知である。これに対し、カットオフを下落させることは、感度を改善するが、特異度（疾患を伴わない対象の、検査陰性となる比率）を悪化させる。外傷性脳損傷を検出する、又は中等度、重度若しくは中等度〜重度の外傷性脳損傷と対比した、軽度外傷性脳損傷を決定するための分岐点は、当業者にたやすく明らかである。対象が、外傷性脳損傷又は中等度、重度又は中等度〜重度の外傷性脳損傷と対比した、軽度外傷性脳損傷を有するのか、有さないのかの識別において、カットオフが上昇するほど、より多くの真陰性（すなわち、外傷性脳損傷を有さない、軽度外傷性脳損傷を有さない、中等度外傷性脳損傷を有さない、重度外傷性脳損傷を有さない、又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有さない対象）が、外傷性脳損傷、軽度外傷性脳損傷、中等度外傷性脳損傷、重度外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有する対象から区別されるので、特異度が改善される。しかし、同時に、カットオフを上昇させることは、陽性として同定された症例の数の全体並びに真陽性の数を減少させるので、感度は低下するはずである。逆に、カットオフが下落するほど、より多くの真陽性（すなわち、外傷性脳損傷を有する、軽度外傷性脳損傷を有する、中等度外傷性脳損傷を有する、重度外傷性脳損傷を有する、又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有する対象）が、外傷性脳損傷、軽度外傷性脳損傷、中等度外傷性脳損傷、重度外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有さない対象から区別されるので、感度が改善される。しかし、同時に、カットオフを下落させることは、陽性として同定された症例の数の全体並びに偽陽性の数を増大させるので、特異度は低下するはずである。
【００５３】
一般に、高感度値は、当業者が、疾患又は状態（外傷性脳損傷、軽度外傷性脳損傷、中等度外傷性脳損傷、重度外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷など）を除外する一助となり、高特異度値は、当業者が、疾患又は状態を認める（ｒｕｌｅ  ｉｎ）一助となる。当業者が、疾患を除外するのか、これを認めるのかは、各種の誤差について、どのような帰結が患者のためになるのかに依存する。したがって、値がどのようにして選択されたのかについての基本情報の完全な開示がなされなければ、検査カットオフを導出するのに利用される正確なバランスを知ること、又は予測することができない。特異度に対する感度のバランス及び他の因子は、症例ごとに異なる。このために、医師又は医療従事者が選択しうるように、代替的なカットオフ（例えば、基準）値を提示することが、場合によって好ましい。
【００５４】
本明細書において使用された、抗体の「誘導体」とは、純正抗体又は親抗体と比較した場合、そのアミノ酸配列に対する１つ以上の修飾を有する抗体を指す場合があり、修飾ドメイン構造を呈しうる。誘導体は、標的（抗原）に特異的に結合することが可能なアミノ酸配列を採用するだけでなく、天然抗体内で見出された、典型的なドメイン構成を採用することもさらに可能でありうる。抗体誘導体の典型的な例は、他のポリペプチドへとカップリングさせた抗体、再配列された抗体ドメイン又は抗体の断片である。誘導体はまた、少なくとも１つのさらなる化合物、例えば、タンパク質ドメインも含むことが可能であり、前記タンパク質ドメインは、共有結合又は非共有結合により連結されている。連結は、当技術分野で公知の方法に従う遺伝子融合に基づきうる。抗体を含む融合タンパク質内に存在するさらなるドメインは、可撓性リンカー（有利にはペプチドリンカーである）により連結されることが好ましい場合があり、この場合、前記ペプチドリンカーは、さらなるタンパク質ドメインのＣ末端及び抗体のＮ末端又はこの逆の間の距離にわたるのに十分な長さである、複数の親水性でありかつペプチド結合されたアミノ酸を含む。抗体は、生物学的活性に適するコンフォメーションを有する、又は、例えば、固体支持体、生物学的活性物質（例えば、サイトカイン又は成長ホルモン）、化学的薬剤、ペプチド、タンパク質若しくは薬物に選択的に結合する、エフェクター分子へと連結されうる。
【００５５】
本明細書において「乱用薬物」とは、非医学的理由（例えば、気晴らし効果及び／又は気分を変える効果など）のために服用される、１つ以上の添加物質（薬物など）を指すように使用される。このような乱用薬物への、過剰な耽溺、これらの使用又はこれらへの依存は、「物質乱用」と称されることが多い。乱用薬物の例は、アルコール、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、カナビス、コカイン、幻覚剤（ケタミン、メスカリン（ペヨーテ）、ＰＣＰ、シロシビン、ＤＭＴ及び／又はＬＳＤなど）、メタカロン、オピオイド、アンフェタミン（メタンフェタミンを含む）、同化ステロイド、吸入剤（すなわち、例えば、ニトレート、スプレー塗料、洗浄液、マーカー、糊などの、向精神特性を含有する揮発性物質を含有する物質）及びこれらの組合せを含む。
【００５６】
本明細書において、「二重特異性抗体」とは、その２つの結合性アーム（ＨＣ／ＬＣの対）の各々において、２つの異なる抗原（又はエピトープ）に結合しうる全長抗体（ＰＣＴ公開第０２／０２７７３号を参照されたい）を指すように使用される。したがって、二重特異性結合タンパク質は、同一な特異性及び同一なＣＤＲ配列を伴う、２つの同一な抗原結合性アームを有し、それが結合する各抗原について二価である。
【００５７】
本明細書において、「二重可変ドメイン」とは、二価結合性タンパク質（２つの抗原結合性部位）、四価結合性タンパク質（４つの抗原結合性部位）、又は多価結合性タンパク質でありうる結合性タンパク質上の、２つ以上の抗原結合性部位を指すように使用される。ＤＶＤは、単一特異性、すなわち、１つの抗原（又は１つの特異性エピトープ）に結合することが可能な場合もあり、多特異性、すなわち、２つ以上の抗原（すなわち、同じ標的抗原分子の２つ以上のエピトープ又は異なる標的抗原２つ以上のエピトープ）に結合することが可能な場合もある。好ましいＤＶＤ結合性タンパク質は、２つの重鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含み、「ＤＶＤ免疫グロブリン」又は「ＤＶＤ−Ｉｇ」と称される。したがって、このようなＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質は、四量体であり、ＩｇＧ分子と類似するが、ＩｇＧ分子より多くの抗原結合性部位をもたらす。したがって、四量体ＤＶＤ−Ｉｇ分子の各半分は、ＩｇＧ分子の半分と類似し、重鎖ＤＶＤポリペプチド及び軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むが、単一の抗原結合性ドメインをもたらすＩｇＧ分子の重鎖及び軽鎖の対と異なり、ＤＶＤ−Ｉｇの重鎖及び軽鎖の対は、２つ以上の抗原結合性部位をもたらす。
【００５８】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質の各抗原結合性部位は、ドナー（「親」）モノクローナル抗体に由来しうるので、抗原結合性部位１つ当たり、合計６つのＣＤＲであって、抗原への結合に関与するＣＤＲを伴う、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含みうる。したがって、２つの異なるエピトープ（すなわち、２つの異なる抗原分子の、２つの異なるエピトープ又は同じ抗原分子の、２つの異なるエピトープ）に結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質は、第１の親モノクローナル抗体に由来する抗原結合性部位及び第２の親モノクローナル抗体の抗原結合性部位を含む。
【００５９】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性分子のデザイン、発現及び特徴付けについての記載は、ＰＣＴ公開第２００７／０２４７１５号、米国特許第７，６１２，１８１号及びＷｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５：１２９０〜１２９７（２００７）においてなされている。このようなＤＶＤ−Ｉｇ分子の好ましい例は、構造式：ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ［式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、それがＣＨ１ではないことを条件として、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０又は１であるが、好ましくは１である］を含む重鎖；及び構造式：ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ［式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、これがＣＨ１ではないことを条件として、リンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０又は１であるが、好ましくは１である］を含む軽鎖を含む。このようなＤＶＤ−Ｉｇは、２つのこのような重鎖及び２つのこのような軽鎖を含むことが可能であり、この場合、各鎖は、可変領域の間に介在する定常領域を伴わずに、タンデムにより連結された可変ドメインを含み、重鎖及び軽鎖は、会合して、タンデムの機能的抗原結合性部位を形成し、重鎖及び軽鎖の対は、重鎖及び軽鎖の別の対と会合して、４つの機能的な抗原結合性部位を伴う、四量体の結合性タンパク質を形成しうる。別の例において、ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、各々が可変ドメインの間に介在する定常領域を伴わずに、タンデムに連結された、３つの可変ドメイン（ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３）を含む重鎖及び軽鎖を含むことが可能であり、この場合、重鎖及び軽鎖の対は、会合して、３つの抗原結合性部位を形成することが可能であり、重鎖及び軽鎖の対は、重鎖及び軽鎖の別の対と会合して、６つの抗原結合性部位を伴う、四量体の結合性タンパク質を形成しうる。
【００６０】
好ましい実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質は、その親モノクローナル抗体が結合する同じ標的分子に結合するだけでなく、また、その親モノクローナル抗体のうちの１つ以上の、１つ以上の所望の特性も保有する。好ましくは、このようなさらなる特性は、親モノクローナル抗体のうちの１つ以上の抗体パラメータである。その親モノクローナル抗体のうちの１つ以上に由来するＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質に寄与されうる抗体パラメータは、抗原特異性、抗原アフィニティー、効力、生物学的機能、エピトープの認識、タンパク質の安定性、タンパク質の可溶性、作製効率、免疫原性、薬物動態、バイオアベイラビリティー、組織との交差反応性、及びオーソログ抗原への結合を含むがこれらに限定されない。
【００６１】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質は、ＵＣＨ−Ｌ１の少なくとも１つのエピトープに結合する。ＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質の非限定例は、ＵＣＨ−Ｌ１の１つ以上のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質、ヒトＵＣＨ−Ｌ１のエピトープ及び別の種（例えば、マウス）のＵＣＨ−Ｌ１のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質及びヒトＵＣＨ−Ｌ１のエピトープ及び別の標的分子のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合性タンパク質を含む。
【００６２】
本明細書において使用された「ダイナミックレンジ」とは、アッセイのリードアウトが、解析される試料中の標的分子又は解析物の量と比例する範囲を指す。
【００６３】
「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」又は「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」又は「目的のエピトープ」とは、認識され、その特異的結合パートナー上の相補的な部位に結合しうる、任意の分子上の部位を指す。分子及び特異的結合パートナーは、特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖のようであるがこれらに限定されない）又は多糖の上にありうる。その特異的結合パートナーは、抗体でありうるがこれに限定されない。
【００６４】
本明細書において使用された、「検出域の拡大」とは、記載されそして／又は特許請求されている改善された方法が、他のＵＣＨ−Ｌ１アッセイと比較して様々な臨床状況において又は様々な臨床状況の下で、実行されうるという事実を指す。例えば、本開示の方法は、対象の臨床状態（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１についてチェックする理由に加え、併発状態が存在するのかどうか）、対象の検査値（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１レベル以外の検査値であって、患者の全体的な健康状態を評価するためになされる標準的な検査室検査における値及び対象が、事故に遭ったか又は頭部損傷をもたらしうる外傷を含むがこれらに限定されないある種の外傷に曝露されたと推測される場合になされる、より特定された検査における値を含むがこれらに限定されない検査値）、軽度ＴＢＩ、中等度ＴＢＩ、重度ＴＢＩ、中等度若しくは重度のＴＢＩ、又は中等度〜重度のＴＢＩを患う対象としての、対象の分類、対象による、低レベル又は高レベルのＵＣＨ−Ｌ１の呈示（例えば、顕示又は保有）、対象が、頭部への損傷を負った可能性がある、任意の事象のタイミング（例えば、検査に照らした）からなる群から選択される因子に関わらず、任意の対象に対して実行されうる。加えて、さらなる例として、本開示の方法は、希釈を要求する場合もあり、代替的に、本明細書において記載された、改善されたアッセイの利益（例えば、２５，０００ｐｇ／ｍＬ以下の尺度、５ｌｏｇのダイナミックレンジ、ダイナミックレンジにわたるアッセイの直線性、２０マイクロリットル未満の試料容量中のＵＣＨ−Ｌ１尺度、検出域の拡大など）のうちの１又は複数を欠く場合もある、先行技術において公知の他の方法と異なる。
【００６５】
本明細書において使用された「Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）断片」又は「Ｆａｂ断片」とは、抗原に結合し、１つの抗原結合性部位である、１つの完全な軽鎖及び１つの重鎖の一部を含有する抗体の断片を指す。Ｆａｂは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である。Ｆａｂは、各重鎖及び各軽鎖の、１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインから構成される。可変ドメインは、単量体のアミノ末端において相補性決定領域のセットを含むパラトープ（抗原結合性部位）を含有する。したがって、Ｙ字の各アームは、抗原上のエピトープに結合する。Ｆａｂ断片は、例えば、免疫グロブリン単量体を２つのＦａｂ断片及びＦｃ断片へと切断するのに使用されうる酵素であるパパインを使用して、当技術分野において記載されている通りに作出されうる、又は組換え手段により作製されうる。
【００６６】
本明細書において使用された「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、ヒンジ領域の一部を無傷のままとしながら、Ｆｃ領域の大半を除去する、全ＩｇＧ抗体のペプシン消化により作出された抗体を指す。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合により、一体に連結された、２つの抗原結合性Ｆ（ａｂ）部分を有するので、分子量を約１１０ｋＤａとする、二価断片である。二価抗体断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）は、全ＩｇＧ分子より小型であり、組織への良好な浸透を可能とするので、免疫組織化学における、良好な抗原認識を容易とする。Ｆ（ａｂ’）２断片の使用はまた、生細胞上のＦｃ受容体又はプロテインＡ／Ｇへの非特異的結合も回避する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原に結合し、かつ、これを沈殿させうる。
【００６７】
本明細書において使用された「フレームワーク」（ＦＲ）又は「フレームワーク配列」とは、ＣＤＲを除いた、可変領域の残りの配列を意味しうる。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なるシステム（例えば、上記を参照されたい）により決定されうるため、フレームワーク配列の意味は、これに応じて異なる解釈を受ける。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）はまた、軽鎖上及び重鎖上のフレームワーク領域を、各鎖上の４つの部分領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）へも分割するが、ここで、ＣＤＲ１は、ＦＲ１及びＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２は、ＦＲ２及びＦＲ３の間に位置し、ＣＤＲ３は、ＦＲ３及びＦＲ４の間に位置する。他の研究者により言及される通りに、特定の部分領域を、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と指定しない場合、フレームワーク領域は、単一の、天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内の、ＦＲの組合せを表す。本明細書において使用されたＦＲは、４つの部分領域のうちの１つを表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構成する、４つの部分領域のうちの２つ以上を表す。
【００６８】
当技術分野において公知の技法を使用して、非ヒト抗体をヒト化するのに、重鎖及び軽鎖の「アクセプター」フレームワーク配列（又は、単に、「アクセプター」配列）として使用されうる、ヒト重鎖及びヒト軽鎖のＦＲ配列は、当技術分野において公知である。一実施形態において、ヒト重鎖及びヒト軽鎖のアクセプター配列は、Ｖ−ｂａｓｅ（ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／；電話番号：  ＋４９  −  ５３１  −  ６１８１  ６８７）又は国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））情報システム（ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／；電話番号：  ＋３３  （０）４  ３４  ３５  ９９  ６５）などの、一般に公開されているデータベースにおいて列挙されたフレームワーク配列から選択される。
【００６９】
本明細書において使用された「機能的な抗原結合性部位」とは、標的抗原に結合することが可能な、結合性タンパク質（例えば、抗体）上の部位を意味しうる。抗原結合性部位の抗原結合アフィニティーは、抗原結合性部位が由来する親の結合性タンパク質（例えば、親抗体）ほど強くない場合があるが、抗原に結合する能力は、抗原に結合するタンパク質（例えば、抗体）を査定するための公知の様々な方法のうちのいずれか１つを使用して、測定可能でなければならない。さらに、多価タンパク質、例えば、本明細書の多価抗体の抗原結合性部位の各々の抗原結合アフィニティーは、定量的に同じである必要はない。
【００７０】
本明細書において使用された「ＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）」又は「ＧＣＳ」とは、全般的な社会的能力又は他者への依存に基づき、脳損傷の転帰を推定及び類別するための、１５点のスケールを指す。検査は、運動応答、言語応答及び開眼応答を、これらの値：Ｉ．運動応答（６：指示に完全に従う；５：侵害刺激を位置特定する；４：侵害刺激から身を引く；３：異常屈曲、すなわち、除皮質姿勢；２：伸長応答、すなわち、除脳姿勢及び１：応答なし）；ＩＩ．言語応答（５：意識清明で見当識がある；４：混乱しているが、一貫した発話；３：不適切な単語及び単語からなる支離滅裂な文章；２：理解不可能な音声及び１：音声なし）及びＩＩＩ．開眼（４：自発的開眼；３：発話に応じた開眼；２：疼痛に応じた開眼及び１：開眼なし）により測定する。最終的なスコアは、Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの値を足し合わせることにより決定される。最終的なスコアは、生存についての４つの可能なレベルへと類別される場合があり、数が小さいほど、より重度損傷及び予後不良を指し示す：軽度（１３〜１５）；中等度身体障害（９〜１２）（３０分間を超える意識の喪失；消失する場合もあり、消失しない場合もある、身体機能障害又は認知機能障害；リハビリから利益を得る）；重度身体障害（３〜８）（昏迷：意識不明状態：有意味な応答なし、自発的な活動なし）；及び植物状態（３未満）（睡眠覚醒周期；目覚めるが、環境との相互作用なし；疼痛に対する、位置特定されない応答）。中等度脳損傷とは、２０分間〜６時間の意識喪失及び９〜１２のＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）を結果としてもたらす脳損傷と規定される。重度脳損傷とは、６時間を超える意識喪失及び３〜８のＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）を結果としてもたらす脳損傷と規定される。
【００７１】
本明細書において使用された「ＧＯＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｃａｌｅ）」とは、機能的転帰についてのグローバルスケールであって、患者の状態を、５つの類型：死、植物状態、重度身体障害、中等度身体障害又は回復良好のうちの１つへと評価するグローバルスケールを指す。
【００７２】
本明細書において互換的に使用された「ＧＯＳＥ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｃａｌｅ）」又は「ＧＯＳＥ」は、重度身体障害、中等度身体障害及び回復良好の類型を、表１において示される、上下の類型へと細分することによる、８つの類型への、より詳細な類別を提示する。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
本明細書において、「ヒト化抗体」は、非ヒト種（例えば、マウス）に由来する重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒト様」となる、すなわち、ヒト生殖細胞系列可変配列と、より類似するように変更された抗体について記載するのに使用される。「ヒト化抗体」とは、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又はこの変異体、誘導体、類似体若しくは断片である。本明細書において使用された、ＣＤＲの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つであるが、典型的に２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）であって、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である可変ドメインの実質的に全てを含む。ある実施形態において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部も含む。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のほか、重鎖の、少なくとも可変ドメインを含有する。抗体はまた、重鎖の、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域及びＣＨ４領域も含みうる。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖だけを含有する。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖だけを含有する。具体的な実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖及び／又はヒト化重鎖のヒト化可変ドメインだけを含有する。
【００７５】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む、免疫グロブリンの任意のクラス並びに、限定なしに述べると、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、任意のアイソタイプから選択されうる。ヒト化抗体は、１つを超えるクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことが可能であり、特定の定常ドメインは、当技術分野において周知の技法を使用して、所望のエフェクター機能を最適化するように選択されうる。
【００７６】
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲは、親配列に正確に対応する必要がなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、この部位におけるＣＤＲ残基又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークに対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により突然変異誘発されてもよい。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異は、広範にわたる突然変異ではない。通例、ヒト化抗体残基のうちの、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％であり、最も好ましくは、少なくとも９５％は、親のＦＲ配列及びＣＤＲ配列の残基に対応する。本明細書において使用された「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサスの免疫グロブリン配列内のフレームワーク領域を指す。本明細書において使用された「コンセンサスの免疫グロブリン配列」という用語は、類縁の免疫グロブリン配列のファミリーにおいて、最も高頻度で発生するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成された配列（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８７）を参照されたい）を指す。したがって、「コンセンサスの免疫グロブリン配列」は、「コンセンサスフレームワーク領域」及び／又は「コンセンサスＣＤＲ」を含みうる。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列内の各位置は、ファミリー内のこの位置において、最も高頻度で発生するアミノ酸により占有されている。２つのアミノ酸が、同等に高頻度で発生する場合、いずれもが、コンセンサス配列内に含まれうる。
【００７７】
本明細書の、２つ以上のポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の文脈において使用された「同一な」又は「同一性」とは、配列が、指定された領域にわたり同じである、指定された百分率の残基を有することを意味しうる。百分率は、２つの配列を、最適にアライメントし、２つの配列を、指定された領域にわたり比較し、両方の配列内において、同一な残基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を、指定された領域内の位置の総数により除し、結果を、１００により乗じて、配列同一性の百分率を求めることにより計算されうる。２つの配列の長さが異なる、又はアライメントが１つ以上の粘着末端をもたらし、指定された比較領域が、単一の配列だけを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分母に組み入れられるが、分子に組み入れられない。
【００７８】
本明細書において互換的に使用された「頭部への損傷」又は「頭部損傷」とは、頭皮、頭蓋骨又は脳への、任意の外傷を指す。このような損傷は、頭蓋骨上の軽症の瘤だけを含みうる、又は重篤な脳損傷でありうる。このような損傷は、脳への一次損傷及び／又は脳への二次損傷を含む。一次脳損傷は、初期傷害時に生じ、脳の物理的構造のずれの結果としてもたらされる。より具体的に、一次脳損傷は、外傷性事象時に生じる、実質（組織、血管）への物理的ダメージであり、周囲の脳組織のせん断及び圧迫を結果としてもたらす。二次脳損傷は、一次損傷に後続して生じ、一連の細胞過程を伴いうる。より具体的に、二次脳損傷は、一次脳損傷の後、ある期間（数時間〜数日間）にわたり発展する変化を指す。二次脳損傷は、脳内の、細胞、化学物質、組織又は血管の変化の全体のカスケードであって、脳組織のさらなる破壊に寄与するカスケードを含む。
【００７９】
頭部への損傷は、閉鎖性又は開放性（穿通性）でありうる。閉鎖性頭部損傷とは、頭皮、頭蓋骨又は脳への外傷であって、ぶつかる物体による頭蓋骨への貫通が見られない外傷を指す。開放性頭部損傷は、頭皮、頭蓋骨又は脳への外傷であって、ぶつかる物体による頭蓋骨への貫通が見られる外傷を指す。頭部への損傷は、人の物理的振盪、閉鎖性頭部外傷若しくは開放性頭部外傷をもたらす外部の機械的力若しくは他の力による鈍的打撃（例えば、自動車、航空機、列車などによる車両事故などの車両事故；野球のバットによる痛撃又は火器からの痛撃などの頭部への痛撃）、脳血管発作（例えば、脳卒中）、１回以上の転倒（例えば、スポーツ又は他の活動における）、爆発若しくは爆破（まとめて、「爆破損傷」）及び他の種類の鈍的外傷に引き起こされうる。代替的に、頭部への損傷は、化学物質、毒素又は化学物質と毒素との組合せの摂取及び／又はこれらへの曝露により引き起こされうる。このような化学物質及び／又は毒素の例は、火、カビ、アスベスト、害虫駆除剤、殺虫剤、有機溶剤、塗料、糊、ガス（一酸化炭素、硫化水素及びシアン化物など）、有機金属（メチル水銀、テトラエチル鉛及び有機スズなど）及び／又は１つ以上の乱用薬物を含む。代替的に、頭部への損傷は、自己免疫疾患、代謝性障害、脳腫瘍、１つ以上のウイルス、髄膜炎、水頭症、低酸素症又はこれらの組合せを対象が患うことの結果として引き起こされうる。場合によって、任意のこのような事象又は損傷が生じた、又は起こったのかどうかを確認することは不可能である。例えば、患者又は対象において、病歴が見られない場合があり、対象は、発話が不可能な場合があり、対象は、どのような事象に曝露されたのか気づいている場合があるなどである。本明細書においてこのような状況は、対象「は、頭部への損傷を負った可能性がある」と記載される。本明細書の、ある特定の実施形態において、閉鎖性頭部損傷は、脳卒中などの脳血管発作を含まず、明確にこれを除外する。
【００８０】
本明細書において使用された「単離ポリヌクレオチド」とは、その単離ポリヌクレオチドが、その由来において、「単離ポリヌクレオチド」が天然において共に見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部に付随していない；それが天然においては連結されてないポリヌクレオチドと作動可能に連結されている；又は天然においてより大きな配列の一部として存在してはいないようなポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成由来又はこれらの一部の組合せによる）を意味しうる。
【００８１】
本明細書において使用された「標識」及び「検出可能な標識」とは、抗体と解析物との反応を検出可能とするように、抗体又は解析物へと接合された部分を指し、このように標識された抗体又は解析物は、「検出可能に標識された」と称される。標識は、視覚手段又は計測手段により検出可能なシグナルをもたらしうる。多様な標識は、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などのシグナル発生物質を含む。標識の代表例は、光をもたらす部分、例えば、アクリジニウム化合物及び蛍光をもたらす部分、例えば、フルオレセインを含む。他の標識も、本明細書において記載されている。この点で、部分自体は、検出可能でない場合もあるが、さらに別の部分と反応すると、検出可能となりうる。「検出可能に標識された」という用語の使用は、このような標識を包含することが意図される。
【００８２】
本明細書において使用された、「検出限界（ＬＯＤ）」とは、指定された信頼性水準において検出されうる、測定された対象物の最低濃度（すなわち、測定されることが意図される数量）を指す。信頼性水準は、典型的に、偽陰性の測定の可能性を５％として、９５％である。本明細書において使用されたＬｏＤという用語は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）のプロトコールＥＰ１７−Ａ２（「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ、２版」、ＥＰ１７Ａ２Ｅ、Ｊａｍｅｓ  Ｆ．Ｐｉｅｒｓｏｎ−Ｐｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２０１２年６月１日）による定義に基づく。
【００８３】
「線形」とは、列挙された、例示的な範囲にわたり、又は値を通して、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％又は約８％以下の変動が見られることを意味する。
【００８４】
当技術分野において公知である、任意の適切な、検出可能な標識が使用されうる。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光標識（アクリジニウムエステル、チオエステル又はスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセインなど）など）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛によりキャッピングされたセレン化カドミウム）、測熱標識又はイムノポリメラーゼ連鎖反応標識でありうる。標識、標識手順及び標識の検出への導入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより公刊された、ハンドブックとカタログとの組合せである、Ｐｏｌａｋ及びＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）並びにＨａｕｇｌａｎｄ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」（１９９６）において見出される。蛍光標識は、ＦＰＩＡ（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれた、米国特許第５，５９３，８９６号、同第５，５７３，９０４号、同第５，４９６，９２５号、同第５，３５９，０９３号及び同第５，３５２，８０３号を参照されたい）において使用されうる。アクリジニウム化合物は、同種化学発光アッセイにおける検出可能な標識（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１６：１３２４〜１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、４：２３１３〜２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１４：３９１７〜３９２１（２００４）及びＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、５：３７７９〜３７８２（２００３）を参照されたい）として使用されうる。
【００８５】
一態様において、アクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム９−カルボキサミドを調製するための方法については、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．、６：１０７〜１１４（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６３：５６３６〜５６３９（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５５：１０８９９〜１０９１４（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、１：７７９〜７８１（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１１：７１４〜７２４（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、「Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、７７〜１０５（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、５：３７７９〜３７８２（２００３）；並びに米国特許第５，４６８，６４６号、同第５，５４３，５２４号及び同第５，７８３，６９９号（それらの各々が、参照によりその全体において、これについてのその教示について、本明細書に組み込まれる）において記載されている。
【００８６】
アクリジニウム化合物の別の例は、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの例は、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩから市販されている）である。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルを調製するための方法については、ＭｃＣａｐｒａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４：１１１１〜２１（１９６５）；Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、１５：２４５〜２４９（２０００）；Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、１５：２３９〜２４４（２０００）及び米国特許第５，２４１，０７０号（それらの各々が、参照によりその全体において、これについてのその教示について、本明細書に組み込まれる）において記載されている。このようなアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、シグナルの強度及び／又はシグナルの迅速性の点において、少なくとも１つのオキシダーゼによる、解析物の酸化において生成された過酸化水素についての、有効な化学発光指示薬である。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの化学発光過程は、迅速に、すなわち、１秒間未満において完了されるが、アクリジニウム−９−カルボキサミドの化学発光は、２秒間を超えて遷延する。しかし、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、タンパク質の存在下において、その化学発光特性を失う。したがって、その使用は、シグナルの発生時及び検出時における、タンパク質の非存在を要求する。試料中のタンパク質を分離又は除去するための方法は、当業者に周知であり、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィー及び／又は消化（例えば、Ｗｅｌｌｓ、「Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  （２００３）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。被験試料から除去又は分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％でありうる。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステル及びその使用に関する、さらなる詳細については、２００７年４月９日において出願された、米国特許出願第１１／６９７，８３５号において明示されている。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、脱気無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又は含水コール酸ナトリウムなどの、任意の適切な溶媒中に溶解されうる。
【００８７】
「連結配列」又は「連結ペプチド配列」とは、１つ以上の、目的のポリペプチド配列（例えば、全長配列、配列断片など）へと接続された、天然又は人工のポリペプチド配列を指す。「接続された」という用語は、連結配列の、目的のポリペプチド配列への接合を指す。このようなポリペプチド配列は、１つ以上のペプチド結合により接合されることが好ましい。連結配列は、約４〜約５０アミノ酸の長さを有しうる。好ましくは、連結配列の長さは、約６〜約３０アミノ酸である。天然の連結配列は、人工の連結配列を創出するように、アミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されうる。連結配列は、組換えＦａｂ内の使用を含む、多くの目的で使用されうる。例示的な連結配列は、以下を含むがこれらに限定されない：（ｉ）ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、６×Ｈｉｓタグなどのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグは、目的のポリペプチド及び抗体の単離及び精製を容易とする連結配列として有用である；（ｉｉ）Ｈｉｓタグなどのエンテロキナーゼ切断部位は、目的のタンパク質及び抗体の単離及び精製において使用される。エンテロキナーゼ切断部位は、Ｈｉｓタグと併せて、目的のタンパク質及び抗体の単離及び精製において使用されることが多い。当技術分野において、多様なエンテロキナーゼ切断部位が公知である。エンテロキナーゼ切断部位の例は、ＤＤＤＤＫ（配列番号３）のアミノ酸配列及びその誘導体（例えば、ＡＤＤＤＤＫ（配列番号４）など）を含むがこれらに限定されない；（ｉｉｉ）その他の配列も、単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を連結又は接続するのに使用されうる。他の連結配列の例は、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）において見出されうる。連結配列はまた、薬物の接合又は固体支持体への接合などの、さらなる機能のためにも修飾されうる。本開示の文脈において、モノクローナル抗体は、例えば、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ切断部位又はこれらの両方などの連結配列を含有しうる。
【００８８】
本明細書において使用された「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種である抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量で存在しうる可能な天然の突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対して方向付けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられた、異なる抗体を含むことが典型的な、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられている。本明細書におけるモノクローナル抗体は、とりわけ、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体のほか、それらが、所望の生体活性を呈する限りにおいて、このような抗体の断片も含む。
【００８９】
本明細書において互換的に使用された「磁気共鳴イメージング」又は「ＭＲＩ」とは、健常及び疾患両方の体内における解剖学及び生理学的過程についての描像を形成するように、放射線医学において使用される医学的イメージング法である、磁気共鳴イメージングを指す。ＭＲＩは、強力な磁界内に置いた場合に、体内組織の原子核の、高周波数のラジオ波に対する応答を測定し、内部の臓器についての画像を作成する、医学的イメージングの形態である。核磁気共鳴（ＮＭＲ）学に基づくＭＲＩスキャナーは、強力な磁界、ラジオ波及び磁界勾配を使用して、体内についての画像を作成する。
【００９０】
本明細書において、「多価結合性タンパク質」とは、２つ以上の抗原結合性部位（本明細書において、「抗原結合性ドメイン」ともまた称される）を含む結合性タンパク質を指すように使用される。多価結合性タンパク質は、３つ以上の抗原結合性部位を有するように操作されていることが好ましく、一般に、天然の抗体ではない。「多特異性結合性タンパク質」という用語は、２つ以上の、類縁又は非類縁の標的に結合しうる結合性タンパク質であって、同じ標的分子の、２つ以上の異なるエピトープへの結合が可能な結合性タンパク質を含む結合性タンパク質を指す。
【００９１】
本明細書において互換的に使用された「陰性予測値」又は「ＮＰＶ」とは、対象が、陰性の検査結果を有する場合に、陰性の転帰を有する確率を指す。
【００９２】
本明細書において互換的に使用された、「解析前処理条件」とは、試料が対象から得られた時点と、試料に対してアッセイ又は検査が行われたか又は実施された時点との間の時間において、試料（全血試料など）へと適用されたか又はこれに対して行われた１つ以上の操作、温度、化学反応及び／又は環境条件を指す。一実施形態において、解析前処理条件は、試料が対象から得られた後、約８時間以内に試料を処理することでありうる。別の実施形態において、解析前処理条件は、試料が対象から得られた時点と、アッセイが実施される時点との間の時間において、室温で試料を保存することでありうる。別の実施形態において、解析前処理条件は、試料が対象から得られた時点と、アッセイが実施される時点との間の時間において、２〜８℃で試料を保存することでありうる。別の実施形態において、解析前処理条件は、試料が対象から得られた時点と、アッセイ又は検査が実施される時点との間の時間において、試料を混合しないことでありうる。
【００９３】
本明細書において使用された「基準レベル」とは、診断的有効性、予後診断的有効性又は治療的有効性を評価するのに使用され、多様な臨床パラメータ（例えば、疾患の存在、疾患の病期、疾患の重症度、疾患の進行、非進行又は改善など）と連関づけられた、又は関連づけられた、アッセイカットオフ値を指す。本開示は、例示的な基準レベルを提示する。しかし、基準レベルは、イムノアッセイの性質（例えば、利用された抗体、反応条件、試料の純度など）に応じて変動する場合があり、アッセイは、比較及び標準化されうることが周知である。さらに、本明細書における本開示を他のイムノアッセイに適合させて、本開示により提示された記載に基づき、これらの他のイムノアッセイについて、イムノアッセイ特異的な基準レベルを得ることは、十分に当業者の技術の範囲内にある。基準レベルの正確な値は、アッセイ間において変動しうるが、本明細書において記載された知見は、一般に、適用可能であり、他のアッセイへの外挿が可能であるものとする。
【００９４】
「ポイントオブケアデバイス」とは、ポイントオブケア（すなわち、検査室の外部）又はこの近傍の、患者ケアの時間及び場所（病院、診療所、救急ケア施設又は他の医療ケア施設、患者の自宅、介護施設及び／又は長期ケア施設及び／又はホスピス施設など）において、医学的診断検査を提供するのに使用されるデバイスを指す。ポイントオブケアデバイスの例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）（例えば、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）及びｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）  Ａｌｉｎｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｒｏｗｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ））（ＵＳ２００６／０１３４７１３を参照されたい）、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＵＳＡ）により作製されたポイントオブケアデバイスを含む。
【００９５】
本明細書において互換的に使用された「陽性予測値」又は「ＰＰＶ」とは、対象が、陽性の検査結果を有する場合に、陽性の転帰を有する確率を指す。
【００９６】
本明細書において記載されたイムノアッセイ及びキットの文脈における「品質管理試薬」は、較正物質、対照及び感度パネルを含むがこれらに限定されない。「較正物質」又は「標準物質」（例えば、複数などの、１つ以上の）は、抗体又は解析物などの、解析物の濃度を内挿するための、較正曲線（検量線）を確立するために使用されることが典型的である。代替的に、基準レベル又は対照レベルの近傍（例えば、「低」レベル、「中」レベル、又は「高」レベル）にある、単一の較正物質も使用されうる。「感度パネル」を含むように、複数の較正物質（すなわち、１つを超える較正物質又は変動量の較正物質）が使用されうる。
【００９７】
「ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）」曲線又は「ＲＯＣ」曲線とは、その識別閾値が変動するのに応じて、二項分類子システムの作動を例示する、グラフによるプロットを指す。例えば、ＲＯＣ曲線は、診断検査の、異なる可能なカットオフ点についての、偽陽性率に対する真陽性率のプロットでありうる。ＲＯＣ曲線は、多様な閾値状況において、陽性中の真陽性の割合（ＴＰＲ＝真陽性率）を、陰性中の偽陽性の割合（ＦＰＲ＝偽陽性率）と対比してプロットすることにより創出される。ＴＰＲはまた、感度としても公知であり、ＦＰＲは、［１−特異度又は真陰性率］である。ＲＯＣ曲線は、感度と特異度とのトレードオフ（任意の感度の上昇は、特異度の低下により伴われる）；曲線が、ＲＯＣ空間の左側境界に近接し、次いで、上側境界に近接するほど、検査は、より正確となること；曲線が、ＲＯＣ空間の４５度の対角線に近接するほど、検査は、より正確でなくなること；カットオフ点における接線の傾きが、検査のこの値についての尤度比（ＬＲ）を与えること及び曲線下面積が、検査の精度の尺度であることを裏付ける。
【００９８】
「組換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「組換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とは、組換え法により、１つ以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を、適切な発現ベクターへとクローニングし、その後、抗体を、適切な宿主細胞において発現させるステップを含む、１つ以上のステップにより調製された抗体を指す。用語は、組換えにより作製されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全ヒト化抗体又は部分的ヒト化抗体）、抗体断片から形成された多特異性構造又は多価構造、二官能性抗体、ヘテロコンジュゲートＡｂ、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）及び本明細書の（ｉ）において記載された他の抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作り出すための方法について、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１２９０〜１２９７（２００７）において記載されている）を含むがこれらに限定されない。本明細書において使用された「二官能性抗体」という用語は、１つの抗原性部位に対する特異性を有する第１のアーム及び異なる抗原性部位に対する特異性を有する第２のアームを含む抗体を指す。すなわち、二官能性抗体は、二重特異性を有する。
【００９９】
本明細書において使用された、対象（例えば、患者）についての「危険性の評価」、「危険性の分類」、「危険性の同定」又は「危険性の層別化」とは、対象に関する処置決定が、より情報を得た状態ベースにおいてなされうるように、疾患の発生又は疾患の進行を含む将来の事象の発生の危険性を予測するためのバイオマーカーを含む因子についての査定を指す。
【０１００】
本明細書において使用された「試料」、「被験試料」、「検体」、「生物学的試料」、「対象に由来する試料」及び「患者試料」は、互換的に使用される場合があり、全血、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞又は胎盤組織、内皮細胞、白血球又は単球などの血液試料でありうる。一部の実施形態において、試料は、全血試料である。一部の実施形態において、試料は、血清試料である。さらに他の実施形態において、試料は、血漿清試料である。試料は、患者から得られた通りに直接使用されうる、又は濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活化、試薬の添加など、本明細書において論じられている形において、又は当技術分野において公知である、別の形において、試料の特徴を変更するように前処置されうる。
【０１０１】
試料を得るのに、様々な細胞型、組織又は体液が用いられうる。このような細胞型、組織及び体液は、生検試料及び剖検試料などの組織切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液（全血など）、血漿、血清、赤血球、血小板、間質液、脳脊髄液などを含みうる。細胞型及び組織はまた、リンパ液、脳脊髄液、により回収された体液も含みうる。組織又は細胞型は、細胞試料を、ヒト及び非ヒト動物から摘出することにより用意されうるが、また、あらかじめ単離された細胞（例えば、別の者により、別の時間において、かつ／又は別の目的のために単離された）を使用することによっても達せられうる。処置履歴又は転帰履歴を有する組織などのアーカイブ組織もまた、使用されうる。タンパク質又はヌクレオチドの単離及び／又は精製は、必要でない場合もある。
【０１０２】
本明細書において使用された、アッセイの「感度」とは、その転帰が陽性である対象のうち、陽性であると正しく同定された比率（例えば、対象が検査されつつある疾患又は医学的状態を伴う対象を、正しく同定する比率）を指す。例えば、これは、対象を、ＴＢＩを有さない対象から区別して、ＴＢＩを有すると正しく同定すること、対象を、軽度ＴＢＩを有する対象から区別して、中等度、重度又は中等度〜重度のＴＢＩを有すると、正しく同定すること、対象を、中等度、重度又は中等度〜重度のＴＢＩを有する対象から区別して、軽度ＴＢＩを有すると、正しく同定すること、対象を、ＴＢＩを有さない対象から区別して、中等度、重度又は中等度〜重度のＴＢＩを有すると、正しく同定すること、又は対象を、ＴＢＩを有さない対象から区別して、軽度ＴＢＩを有すると、正しく同定すること、対象を、イメージング又は頭部ＣＴスキャン若しくはＭＲＩから利益を得る可能性が高くない対象から区別して、イメージング又は頭部ＣＴスキャン若しくはＭＲＩから利益を得る可能性が高いと、正しく同定することなどを含みうる。
【０１０３】
本明細書において使用された、アッセイの「特異度」とは、その転帰が陰性である対象のうち、陰性であると正しく同定された比率（例えば、対象が検査されつつある疾患又は医学的状態を有さない対象を、正しく同定する比率）を指す。例えば、これは、対象を、ＴＢＩを有さない対象から区別して、ＴＢＩを有すると、正しく同定すること、対象を、軽度のＴＢＩを有する対象から区別して、中等度、重度又は中等度〜重度のＴＢＩを有さないと、正しく同定すること、中等度、重度又は中等度〜重度のＴＢＩを有する対象から区別して、軽度のＴＢＩを有さないと、正しく同定すること若しくは対象を、任意のＴＢＩを有さないと、正しく同定すること又はＴＢＩを有さない対象から区別して、軽度ＴＢＩを有すると、正しく同定することを含みうる。
【０１０４】
「較正組成物のシリーズ」とは、公知の濃度のＵＣＨ−Ｌ１を含む複数の組成物であって、組成物の各々が、シリーズ内の他の組成物とＵＣＨ−Ｌ１の濃度が異なる組成物を指す。
【０１０５】
本明細書において使用された「特異的結合」又は「〜に特異的に結合すること」とは、抗体、タンパク質、又はペプチドの、第２の化学的分子種との相互作用を指す場合があり、この場合、相互作用は、化学的分子種上の特定の構造（例えば、抗原性決定基又はエピトープ）の存在に依存する；例えば、抗体は、タンパク質一般ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、これに結合する。抗体が、エピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、エピトープＡを含有する分子（又は遊離のＡ、非標識Ａ）の、標識「Ａ」及び抗体を含有する反応物中の存在は、抗体に結合した標識Ａの量を低減する。
【０１０６】
本明細書において互換的に使用された、「固相」又は「固体支持体」とは、（１）１つ以上の捕捉剤若しくは捕捉のための特異的結合パートナー又は（２）１つ以上の検出剤若しくは検出のための特異的結合パートナーを接合させ、かつ／又は誘引し、固定化させる、任意の材料を指す。固相は、捕捉剤を誘引し、固定化させる、その内因性の能力について選択されうる。代替的に、固相は、（１）捕捉剤若しくは捕捉のための特異的結合パートナー又は（２）検出剤若しくは検出のための特異的結合パートナーを誘引し、固定化させる能力を有する、連結剤を付加されている。例えば、連結剤は、捕捉剤（例えば、捕捉のための特異的結合パートナー）又は検出剤（例えば、検出のための特異的結合パートナー）自体若しくは（１）捕捉剤若しくは捕捉のための特異的結合パートナー又は（２）検出剤若しくは検出のための特異的結合パートナーへとコンジュゲートされた帯電物質に対して、逆向きに帯電した帯電物質を含みうる。一般に、連結剤は、固相上に固定化され（固相へと接合され）、結合反応を介して、（１）捕捉剤若しくは捕捉のための特異的結合パートナー又は（２）検出剤若しくは検出のための特異的結合パートナーを固定化させる能力を有する、任意の結合パートナー（好ましくは特異的結合パートナー）でありうる。連結剤は、アッセイの実施前に、又はアッセイの実施時に、捕捉剤の、固相材料への間接的結合を可能とする。例えば、固相は、例えば、試験管、マイクロ滴定ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び当業者に公知の他の構成を含む、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性金属又は非磁性金属、ガラス又はシリコンでありうる。
【０１０７】
「特異的結合パートナー」とは、特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学物質又は物理的手段を介して、互いと特異的に結合する、２つの異なる分子を含む。したがって、一般的なイムノアッセイの、抗原と抗体との特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチン及びアビジン（又はストレプトアビジン）、炭水化物及びレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクター分子及び受容体分子、補因子及び酵素、酵素及び酵素阻害剤などを含みうる。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば、解析物類似体であるメンバーを含みうる。免疫反応性の特異的結合メンバーは、抗原、抗原断片並びにモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のほか、単離されたものであれ、組換えにより作製されたものであれ、これらの複合体及び断片を含む抗体を含む。
【０１０８】
本明細書において使用された、「安定性」とは、解析物、バイオマーカー（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１など）又は標的物質の（試料中などの）濃度の、時間経過にわたる変化を指す。安定性は、第１の検査値と、１つ以上の後続の検査値（例えば、第２の検査値、第３の検査値、第４の検査値、第５の検査値、第６の検査値、第７の検査値、第８の検査値、第９の検査値、第１０の検査値など）との差違を計算することにより決定されうる。第１の検査値と、１つ以上の後続の検査値との差違が、１０％（±１０％）未満である場合、試料中の解析物、バイオマーカー又は標的物質は、安定であると考えられる。第１の検査値と、１つ以上の後続の検査値との差違が、１０％（±１０％）を超える場合、試料中の解析物、バイオマーカー又は標的物質は、安定であると考えられない。
【０１０９】
本明細書において使用された「統計学的に有意な」とは、２つ以上の変数の間の関係が、ランダムな偶然以外の何かにより引き起こされる可能性を指す。統計学的仮説検定は、データセットの結果が、統計学的に有意であるのかどうかを決定するのに使用される。統計学的仮説検定において、統計学的有意な結果は、検定統計量について観察されたｐ値が、研究について規定された有意性レベル未満である場合なら、いかなる場合にも達せられる。ｐ値とは、少なくとも帰無仮説が真である場合に観察される結果と、少なくとも同程度に極端な結果を得る確率である。統計学的仮説解析の例は、ウィルコクソンの符合順位検定、ｔ検定、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確検定を含む。本明細書において使用された「著明な」とは、統計学的に有意であることが決定されていない変化（例えば、統計学的仮説検定にかけられていない可能性がある）を指す。
【０１１０】
本明細書において互換的に使用された、「対象」及び「患者」とは、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル又はアカゲザル、チンパンジーなどのサル）及びヒト）を含むがこれらに限定されない、任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒトでありうる。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。対象又は患者は、他の形態の処置を受けつつある場合がある。一部の実施形態において、対象が、ヒトである場合、対象は、脳血管発作（例えば、脳卒中）を患っているヒトを含まない。
【０１１１】
本明細書において、「〜を処置する」、「〜を処置すること」又は「処置」は各々、疾患及び／若しくは損傷又はこのような用語が適用される、このような疾患の、１つ以上の症状を阻止、緩和すること又はこれらの進行を阻害することについて記載するのに、互換的に使用される。対象の状態に依存して、用語はまた、疾患を予防することも指し、疾患の発生を予防すること又は疾患と関連する症状を予防することを含む。処置は、急性的に、又は慢性的に実施されうる。用語はまた、疾患への罹患の前における、疾患又はこのような疾患と関連する症状の重症度を軽減することも指す。罹患の前における、疾患の重症度のこのような予防又は低減は、医薬組成物の、投与時において疾患に罹患していない対象への投与を指す。「〜を予防すること」はまた、疾患又はこのような疾患と関連する、１つ以上の症状の再発を予防することも指す。「処置」及び「治療的に」とは、「〜を処置すること」が、上記において規定された通りである場合の、処置する行為を指す。本明細書において互換的に使用された「外傷性脳損傷」又は「ＴＢＩ」とは、広範囲にわたる症状及び身体障害を伴う複合損傷を指す。ＴＢＩは、他の損傷と同様の、急性事象であることが最も多い。ＴＢＩは、「軽度」、「中等度」又は「重度」と分類されうる。ＴＢＩの原因は、多様であり、人力による物理的振盪、自動車事故、火器による損傷、脳血管発作（例えば、脳卒中）、転倒、爆発又は爆破及び他の種類の鈍的外傷を含む。ＴＢＩの他の原因は、１つ以上の化学物質又は毒素（火、カビ、アスベスト、害虫駆除剤及び殺虫剤、有機溶剤、塗料、糊、ガス（一酸化炭素、硫化水素及びシアン化物など）、有機金属（メチル水銀、テトラエチル鉛及び有機スズなど）、１つ以上の乱用薬物又はこれらの組合せ）の摂取及び／又はこれらへの曝露を含む。代替的に、ＴＢＩは、自己免疫疾患、代謝性障害、脳腫瘍、低酸素症、１つ以上のウイルス、髄膜炎、水頭症又はこれらの組合せを患うヒト対象において生じうる。若年成人及び老齢者は、ＴＢＩの危険性が最も高い年齢群である。本明細書の、ある特定の実施形態において、外傷性脳損傷又はＴＢＩは、脳卒中などの脳血管発作を含まず、明確にこれを除外する。
【０１１２】
本明細書において使用された「軽度ＴＢＩ」とは、意識喪失が短時間であり、通例数秒間若しくは数分間であり、かつ／又は意識混濁及び見当識の喪失が、１時間より短い脳損傷を指す。軽度ＴＢＩはまた、脳振盪、軽症の頭部外傷、軽症のＴＢＩ、軽症の脳損傷及び軽症の頭部損傷とも称される。ＭＲＩ及びＣＴスキャンは、正常であることが多いが、軽度ＴＢＩを伴う個体は、頭痛、思考困難、記憶問題、注意欠陥、気分変動及び欲求不満などの認知問題を有しうる。
【０１１３】
軽度ＴＢＩは、最も高頻度のＴＢＩであり、初期損傷時に、見逃されることが多い。典型的に、対象は、１３〜１５（１３〜１５又は１４〜１５など）の間のＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）数を有する。軽度ＴＢＩを伴う人々のうち、１５パーセント（１５％）は、３カ月間以上にわたり持続する症状を有する。軽度ＴＢＩは、頭部の強制的な運動又は精神状態の短い変化（意識混濁、見当識の喪失又は記憶喪失）を引き起こす衝撃又は３０分間未満にわたる意識喪失の結果として規定される。軽度ＴＢＩの一般的な症状は、疲労感、頭痛、視覚障害、記憶喪失、注意／集中力の低下、睡眠障害、回転性めまい／平衡感覚の喪失、易刺激性（感情障害）、抑うつ感覚及び発作を含む。軽度ＴＢＩと関連する他の症状は、悪心、嗅覚喪失、光及び音への過敏性、気分の変化、迷子若しくは意識混濁及び／又は思考遅滞を含む。
【０１１４】
本明細書において使用された「中等度ＴＢＩ」とは、意識喪失及び／又は意識混濁並びに見当識の喪失が、１〜２４時間の間であり、対象が、９〜１３（９〜１２又は９〜１３など）の間のＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）数を有する脳損傷を指す。中等度ＴＢＩを伴う個体は、脳イメージング結果の異常を有する。本明細書において使用された「重度ＴＢＩ」とは、意識喪失が、２４時間を超え、損傷又は穿通性頭蓋骨損傷後の記憶喪失が、２４時間より長く、対象が、３〜８の間のＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）数を有する脳損傷を指す。欠損は、高レベルの認知機能の機能障害〜昏睡状態の範囲にわたる。生存者は、腕部又は脚部の機能の限定、発話又は言語の異常、思考能力の喪失又は感情問題を有しうる。重度損傷を伴う個体は、長期にわたる不応状態に置かれたままになりうる重度ＴＢＩを伴う多くの人々の場合、機能及び自立を最大化するために、長期にわたるリハビリが必要となることが多い。
【０１１５】
本明細書において使用された、「中等度〜重度」のＴＢＩとは、中等度〜重度を含む、脳損傷のスペクトルを指し、したがって、中等度ＴＢＩ単独、重度ＴＢＩ単独及び組み合わされた中等度〜重度のＴＢＩを包含する。中等度〜重度のＴＢＩを患う対象は、３〜１３の間（３〜１２の間又は３〜１３の間など）のＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）数を有しうる。例えば、臨床状況によって、対象は、初期に、中等度ＴＢＩを有すると診断されうるが、時間の経過（数分間、数時間又は数日間）を経て、重度ＴＢＩを有する対象へ進行しうる（例えば、脳出血が存在する状況におけるように）。このような対象は、「中等度〜重度」として分類されうる患者の例となる。中等度〜重度のＴＢＩの一般的な症状は、注意に関する困難、集中力、散漫性、記憶、処理速度、混乱、固執、衝動性、言語処理及び／又は「実行機能」、発話された単語の無理解（受容失語症）、発話及び理解されることの困難（表現失語症）、発話の不明瞭、発話が極めて速い又は極めて遅い、読むときの問題、書くときの問題、接触、温度、運動の解釈、下肢の位置及び微細な識別、感覚的印象の、心理学的に有意味なデータへの統合又はパターン化に関する困難、部分的又は全体的な視覚の喪失、眼筋力の低下及び二重視覚（複視）、かすみ目、距離を判断するときの問題、非自発的な眼運動（眼振）、光不耐性（羞明）、聴覚問題、などの、聴力の低下又は喪失、耳が鳴ること（耳鳴り）、音に対する過敏性、嗅覚の喪失又は低下（無嗅覚）、味覚の喪失又は低下、てんかんと関連する痙攣であって、いくつかの種類であることが可能であり、意識、感覚的認知又は運動、腸及び膀胱の制御の破壊を伴いうる痙攣、睡眠障害、気力の喪失、食欲の変化、体内温度の調節、月経困難、依存性行動、感情能力、意欲の欠如、易刺激性、攻撃、抑うつ、脱抑制又は意識の否認／欠如を含む認知欠損を含む。
【０１１６】
本明細書において互換的に使用された「ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１」又は「ＵＣＨ−Ｌ１」とは、ヒトにおいて、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によりコードされ、作製されうる（例えば、他の種において、組換え手段により）、脱ユビキチン化酵素を指す。ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１及びユビキチンチオールエステラーゼとしてもまた公知のＵＣＨ−Ｌ１は、その産物が、ユビキチンの、小型のＣ末端付加物を加水分解して、ユビキチン単量体を発生させる遺伝子ファミリーのメンバーである。
【０１１７】
「ＵＣＨ−Ｌ１状態」とは、ある時点（ＵＣＨ−Ｌ１の単一の測定値を伴う時点など）における、ＵＣＨ−Ｌ１のレベル若しくは量、モニタリング（対象において、ＵＣＨ−Ｌ１量の上昇又は低下を同定する反復検査を伴うモニタリングなど）と関連する、ＵＣＨ−Ｌ１のレベル若しくは量、外傷性脳損傷（一次脳損傷であれ、かつ／又は二次脳損傷であれ）のための処置と関連する、ＵＣＨ−Ｌ１のレベル若しくは量又はこれらの組合せを意味しうる。
【０１１８】
本明細書において、「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換により、アミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドについて記載するのに使用される。「生物学的活性」の代表例は、特異的抗体による結合を受ける能力又は免疫反応を促進する能力を含む。本明細書において、変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を伴う基準タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を伴うタンパク質について記載するのにも使用される。当技術分野において、アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、帯電の程度及び帯電領域の分布）を有する、異なるアミノ酸により置き換えることは、典型的に、小さな変化を伴うこととして当技術分野において認識されている。当技術分野において理解された通り、これらの小さな変化は、部分的に、アミノ酸の疎水性指数を検討することにより同定されうる（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２（１９８２））。アミノ酸の疎水性指数は、その疎水性及び電荷の検討に基づく。当技術分野において、同様の疎水性指数を有するアミノ酸は、置換される場合があるが、なおも、タンパク質の機能を保持することが公知である。一態様において、±２の疎水性指数を有するアミノ酸は、置換される。アミノ酸の親水性もまた、生物学的機能を保持するタンパク質を結果としてもたらす置換を明らかにするのに使用されうる。ペプチドの文脈における、アミノ酸の親水性についての検討は、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている、有用な尺度である、このペプチドの局所平均親水性の最大値の計算を可能とする（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５５４，１０１号）。同様の親水性値を有するアミノ酸による置換は、生物学的活性、例えば、当技術分野において理解された免疫原性を保持するペプチドを結果としてもたらしうる。置換は、互いから±２以内の親水性値を有するアミノ酸により実施されうる。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値のいずれも、このアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性により明らかにされる通り、アミノ酸の相対的類似性に依存し、特に、これらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されることは、この観察と符合する。「変異体」はまた、抗原的に反応性の抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体の断片であって、アミノ酸配列内の、対応する抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体の断片と異なるが、なおも抗原的に反応性であり、ＵＣＨ−Ｌ１との結合について、対応する抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体の断片と競合しうる断片を指すようにも使用されうる。「変異体」はまた、タンパク質分解、リン酸化又は他の翻訳後修飾によるような、異なる形でプロセシングされているが、その抗原反応性を保持する、ポリペプチド又はこの断片について記載するのにも使用されうる。
【０１１９】
本明細書において、「ベクター」とは、連結された別の核酸を運びうる核酸分子について記載するのに使用される。ベクターの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされうる、環状二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムへとライゲーションされうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点及び哺乳動物エピソームベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞へと導入されると、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製されうる。さらに、ある特定のベクターは、作動的に連結される遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書において、このようなベクターは、「組換え発現ベクター」（又は、単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドは、最も一般に、ベクターの形態で使用されるので、「プラスミド」と「ベクター」とは、互換的に使用されうる。しかし、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性のレトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの、同等な機能を果たす、発現ベクターの他の形態も使用されうる。この点で、ベクターのＲＮＡ形（ウイルス性ＲＮＡベクターを含む）もまた、本開示の文脈において使用されうる。
【０１２０】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有するものとする。例えば、本明細書において記載された、細胞培養法及び組織培養法、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質化学及び核酸化学及びハイブリダイゼーションとの関連において使用された用語法、並びにこれらについての技法は、周知の用語法及び技法であり、当技術分野において一般的に使用されている用語法及び技法である。用語の意味及び範囲は、明確であるものとするが、万一、なんらかの潜在的な曖昧さが生じた場合、本明細書において提示された定義が、任意の辞書又は外部の定義に対して優先される。さらに、文脈により、そうでないことが要求されない限りにおいて、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【０１２１】
２．ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）の、試料中レベルに影響を及ぼす解析前処理条件及びユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルを測定する方法
本開示は、対象から得られた試料（例えば、血液試料（全血試料、血清試料又は血漿試料など））中のＵＣＨ−Ｌ１量を測定する方法の改善を対象とする。本明細書において記載された通り、ある特定の解析前の処理条件又は因子は、ＵＣＨ−Ｌ１のレベル又は濃度に影響を及ぼし、場合によって、検査又はアッセイが、実施される（ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を検出及び／又は測定するように）まで、血液試料が、維持又は保存されつつある時間における、又はこの間の、ＵＣＨ−Ｌ１のレベル又は濃度の上昇をもたらしうる。このようなＵＣＨ−Ｌ１のレベル又は濃度の上昇は、誤ったもの（すなわち、誤った上昇又は誤った高値）であり、疾患状態（ＴＢＩなど）の正確な反映でない場合があり、偽陽性結果をもたらしうる。したがって、本開示はまた、本明細書において記載された方法を実施することにより、検査又はアッセイを実施して、ＵＣＨ−Ｌ１レベルを検出及び／又は測定する前に、対象から得られた血液試料中のＵＣＨ−Ｌ１レベルの、誤った増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避又は防止する方法も対象とする。最後に、本開示はまた、検査又はアッセイを実施して、ＵＣＨ−Ｌ１レベルＵＣＨ−Ｌ１の、血液試料中レベルを検出及び／又は測定する前の保存時に、このようなレベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を防止する又は回避するように、血液試料を安定化させる方法も対象とする。
【０１２２】
一実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１レベル又は濃度に影響を及ぼすことが発見された解析前処理条件又は因子は、血液試料の処理時間、すなわち、血液試料が対象から得られた後（すなわち、検査するか又はアッセイを実施する前に）どのくらい迅速に処理されるのかである。一部の実施形態において、血液試料が対象から採取されたか又は得られた時点（しかし、検査するか又はアッセイを実施する前に）から約２４時間以内に、対象から得られた血液試料（例えば、全血試料）を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約１２時間以内、約１０時間以内、約８時間以内、約６時間以内、約４時間以内、約２時間以内又は約１時間以内に、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。他の実施形態において、試料が対象から得られた後の時間であって、試料が対象から得られた後、約１時間〜約１２時間、約１時間〜約１０時間、約１時間〜約８時間、約１時間〜約６時間、約１時間〜約４時間又は約１時間〜約２時間を含む時間のうちに、血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約１２時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約１０時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約８時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約６時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約４時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約２時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。一部の実施形態において、血液試料が、対象から採取された時点から、約１時間以下のうちに、対象から得られた血液試料を処理することが有利である。
【０１２３】
これらの実施形態に従い、処理時にわたって、試料が対象から得られた後〜検査又はアッセイが実施された（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１を検出及び／又は測定する）時点の時間におけるか又はこの時間にわたり、血液試料の機械的攪拌（混合など）は、回避されるべきであることが見出された。言い換えれば、検査又はアッセイの実施まで、持続的混合は回避されるべきである。場合によって、処理時における血液試料の混合は、血液試料の溶血を引き起こし、ＵＣＨ−Ｌ１を、試料へと放出し、得られるＵＣＨ−Ｌ１レベルの上昇を引き起こしうる。しかし、当業者は、血液試料を処理する場合に、若干の機械的攪拌又は混合が必要であることを認識するが、溶血をもたらす程度の混合は、一般に、回避されるべきである。例えば、血液試料を、回収チューブ（例えば、ヘパリンチューブ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブなど）内に存在しうる、任意の抗凝固剤と混合するのに必要な時間より長い時間にわたり、血液試料は混合されるべきではない。別の態様において、血液試料は、５秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１０秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１５秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、２０秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、２５秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、３０秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、４０秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、５０秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、６０秒間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、２分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、３分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、４分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、５分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、５分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、２分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、３分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、４分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、５分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、６分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、７分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、８分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、９分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１０分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１１分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１２分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１３分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１４分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１５分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１６分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１７分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１８分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、１９分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、２０分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、２５分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。さらに別の態様において、血液試料は、３０分間より長い時間にわたり混合されるべきではない。
【０１２４】
これらの実施形態に従う、別の態様において、血液試料は、処理時の多様な温度であって、例えば、約２℃〜約８℃〜ほぼ室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）の範囲の温度を含む温度において維持又は調整されうる。血液試料は、検査又はアッセイを実施して、ＵＣＨ−Ｌ１レベルを評価する（例えば、検出及び／又は測定する）前の、任意の時間であって、試料が対象から得られた後、約２４時間以下を含む時間にわたり、これらの温度範囲内に維持されうる。場合によって、血液試料を、約２℃〜約８℃の範囲の温度において、試料が対象から得られた後約８時間以下であり、かつ、試料がＵＣＨ−Ｌ１濃度について評価されるまでにわたり、維持することが有利である。場合によって、血液試料を、ほぼ室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）において、試料が対象から得られた後、約８時間以下であり、かつ、試料がＵＣＨ−Ｌ１濃度について評価されるまでにわたり、維持することが有利である。一部の実施形態において、全血アッセイ（例えば、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）及びｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）Ａｌｉｎｉｔｙ）は、本明細書において記載される通り、混合又は長時間にわたって室温に曝露することを含みうる様式で、試料を処理する必要があり、それによって、ＵＣＨ−Ｌ１濃度の評価に対して影響を及ぼす場合がある。一部の実施形態において、血液試料は、約２℃〜約８℃の温度において維持されうる。例えば、血液試料が、全試料である場合、試料は、約２℃〜約８℃の温度において維持されうる。別の例として、血液試料が、血漿試料である場合、試料は、約２℃〜約８℃の温度において維持されうる。さらに別の例において、血液試料が、血清試料である場合、試料は、約２℃〜約８℃の温度において維持されうる。別の実施形態において、血液試料は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）において維持されうる。例えば、血液試料が、血漿試料である場合、試料は、室温において維持されうる。さらに別の例において、血液試料が、血清試料である場合、試料は、室温において維持されうる。
【０１２５】
全血試料の処理は、対象から血液試料を得るのに使用される任意のステップ又は方法のほか、多様な血液成分を、血清画分、血漿画分、及び赤血球（ＲＢＣ）画分へと分離するのに使用される任意のステップ又は方法を含みうる。処理はまた、血液試料を、ＵＣＨ−Ｌ１及びＴＢＩの他のバイオマーカーなどの、多様な成分について検査、検出、測定又は評価することに関与する、任意のステップ又は方法も含みうる。ＵＣＨ−Ｌ１のレベルを評価することが、全血試料を処理することの一部として含まれない（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１の評価が、血液試料が対象から得られる施設とは別個の検査室において実施される）場合、ＵＣＨ−Ｌ１試料を検査、検出又は測定することは、全血試料が処理されてから短い時間の後すなわちその直後に生じうる。一部の実施形態において、本開示の方法は、不適切な保存条件及び／又は処理法に起因して生じる、ＵＣＨ−Ｌ１レベルの上昇を回避するために、試料が、対象から得られた後、約８時間以内に、対象に由来する全血試料を処理するステップを含む。
【０１２６】
一部の実施形態において、処理するステップは、ＵＣＨ−Ｌ１の血漿中レベル及び／又は血清中レベルを評価するために、血清及び／又は血漿を、試料中の血液細胞から分離することを含む。この工程は、一般に、血液分画と称され、血液試料を、例えば、遠心分離、クロマトグラフィー、エタノール分画、ＬＯＣ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）細胞分取（例えば、磁気細胞分取）、サイズ除外クロスフロー濾過、誘電泳動法、ＰＦＦ（ｐｉｎｃｈｅｄ−ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、慣性マイクロ流体チップ、電気流体力を使用する分離及びこれらの組合せなどの、当技術分野で公知である、規定の技法にかけることによりなされうる。
【０１２７】
一部の実施形態において、血液の分画は、試料の、血漿成分、バフィーコート（白血球及び血小板）及び赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ））への分離をもたらす遠心分離によりなされうる。対象から得られた血液試料を回収及び保存するのに使用される回収チューブはまた、例えば、遠心分離の間、血漿を血液細胞から分離するのにも使用されうる。様々な回収チューブは、本明細書において記載された方法において使用されうる。例えば、回収チューブは、血液成分の分画を容易とするように、多様な成分を含有する場合もあり、又はこれらを含有するようにコーティングされる場合もある。一部の実施形態において、回収チューブは、不可欠の凝固成分であるカルシウムをキレート化させることにより凝固を防止するのに使用されうる、１つ以上の抗凝固剤（ＥＤＴＡなど）又は抗凝固剤である、ＥＤＴＡの塩（Ｋ２ＥＤＴＡ又はＫ３ＥＤＴＡなど）を含有しうる。さらに、ＥＤＴＡ回収チューブにより採取された血液試料から単離された血漿もまた、ＵＣＨ−Ｌ１及びＴＢＩの他のバイオマーカーなどの、血漿中に見出される、様々なタンパク質を測定又は検出するのに使用される場合があり、遺伝子素材も、ＥＤＴＡ回収チューブのバフィーコートから、容易に保存されうる。使用されうる、他の抗凝固剤の例は、限定せずに述べると、ヘパリンリチウム又はヘパリンナトリウムなどのヘパリン、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＥＧＴＡの塩、ヒルジン、ヘパリン、クエン酸、クエン酸の塩、シュウ酸、シュウ酸の塩（例えば、シュウ酸カリウム、シュウ酸ナトリウムなど）及びこれらの組合せを含む。
【０１２８】
一部の実施形態において、処理するステップは、ＵＣＨ−Ｌ１の、血清中レベルを評価するために、試料中の血漿及び血液細胞から血清を分離することを含む。血清とは一般に、凝固が生じた後で残存する血液成分を指し；血清は、凝固因子もまた枯渇させた、無細胞の液体である。血清は、本明細書の前出において記載された方法を使用して、試料中の血漿及び血液細胞から分離されうる。具体的に、血清分離チューブ（ＳＳＴ）は、血液細胞から、血清を分離する（遠心分離時のように）のに使用されうる。具体的に、ＳＳＴは、シリコーンゲルなどのゲルを含有しうるチューブである。遠心分離されると、シリコーンゲルは、バフィーコートの上に、層を形成し、血清が、検査及び関連する目的のために、より効果的に除去されることを可能とする。ＳＳＴは、場合によって、金、上部に金を伴う赤又は赤とグレーとのマーブルである止栓を指す、「マーブルトップチューブ」、「ターゲットトップチューブ」又は「ゴールドトップチューブ」と呼ばれる。マーブルトップチューブはまた、一部の臨床状況において、「タイガートップ」とも称される。
【０１２９】
本開示は、ＵＣＨ−Ｌ１の、血液試料中量を測定する方法の改善であって、試料を処理するステップが、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定する検査を実施することを含む改善を対象とする。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１を検出、測定、定量、又は評価するための検査は、タンパク質をアッセイするための、任意の利用可能な方法であって、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、分光法などを含むがこれらに限定されない方法を含む。一部の実施形態において、本明細書において記載された種類などのイムノアッセイ（例えば、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）及びｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）Ａｌｉｎｉｔｙ）は、ＵＣＨ−Ｌ１の、全血試料中レベルを測定するために有利である。
【０１３０】
一部の実施形態において、本開示は、ＵＣＨ−Ｌ１の、血液試料中量を測定する方法の改善であって、ＵＣＨ−Ｌ１を測定するために、イムノアッセイベースの検査を実施することを含む改善を対象とする。イムノアッセイ検査は、試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、加えて、検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されることを含みうる。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を測定することは、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の検出可能な標識により発生したシグナルに基づく。
【０１３１】
３．ヒト対象が、頭部への損傷を負ったのかどうかについての診断及び査定の一助となる方法
別の実施形態において、本明細書において記載された方法は、対象におけるＵＣＨ−Ｌ１のレベルを決定することにより、ヒト対象が、頭部への損傷を負ったか又は負った可能性があるのかどうかの診断及び査定の一助となるために使用されうる。本方法は、推測される頭部への損傷を伴うヒト対象における外傷性脳損傷の程度を決定するための、例えば、対象が、軽度外傷性脳損傷を有するのか、中等度〜重度の外傷性脳損傷を有するのか、又は軽度外傷性脳損傷を有するのか、中等度〜重度の外傷性脳損傷を有するのかを決定するための、一助となりうる。本明細書において使用された、「対象が、軽度外傷性脳損傷を有するのか、中等度〜重度の外傷性脳損傷を有するのかを決定すること」とは、対象が、軽度外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有する可能性が、そうでない場合より高いことを決定するのに、他の情報（例えば、臨床評価データ）と共に、前述の方法が使用されうるという事実を指す。方法は、下記において記載される抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこの抗体断片を使用して、対象における外傷性脳損傷を検出又は評価するのに使用されうる。方法は、（ａ）１つ以上の抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこの抗体断片を使用して、対象から試料を得るステップ、（ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の試料中レベルを決定するステップ、及び（ｃ）対象が、軽度外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を負ったのか、中等度〜重度のＴＢＩを負ったのかを、ＵＣＨ−Ｌ１レベルに基づき決定するステップを含みうる。一部の実施形態において、（１）早期バイオマーカーの試料中レベルが、早期バイオマーカーの基準レベルより高い場合、対象は、中等度、重度若しくは中等度〜重度の外傷性脳損傷を有すると決定される、又は（２）早期バイオマーカーの試料中レベルが、早期バイオマーカーの基準レベルより低い場合、対象は、軽度外傷性脳損傷を有すると決定される。試料は、血液試料でありうる。
【０１３２】
代替的に、方法は、（ａ）１つ以上の抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこの抗体断片を使用して、対象から得られた試料中のＵＣＨ−Ｌ１レベルを決定するステップ、及び（ｂ）対象が、軽度外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を負ったのか又は中等度〜重度のＴＢＩを負ったのかを、ＵＣＨ−Ｌ１レベルに基づき決定するステップを含みうる。一部の実施形態において、（１）早期バイオマーカーの試料中レベルが早期バイオマーカーの基準レベルより高い場合、対象は、中等度、重度若しくは中等度〜重度の外傷性脳損傷を有すると決定される、又は（２）早期バイオマーカーの試料中レベルが早期バイオマーカーの基準レベルより低い場合、対象は、軽度外傷性脳損傷を有すると決定される。試料は、血液試料でありうる。
【０１３３】
ＵＣＨ−Ｌ１を測定及び評価することにより、方法は、他の市販のＵＣＨ−Ｌ１イムノアッセイと比較して、より多くの疾患が、より正確に診断され、その後、より成功裏に処置されることを可能とする。方法は、自動システム又は半自動システムにおける使用に適合させられうる。
【０１３４】
一般に、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、被験試料を、ＵＣＨ−Ｌ１についてアッセイしたときに得られた結果を評価するためのベンチマークとして利用されうる。一般に、このような比較を行う場合に、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、解析物の存在、量又は濃度の、ＴＢＩの特定の病期若しくはエンドポイント又は特定の徴候との連関又は関連が成立させられうるような、十分な回数及び適切な条件下において、特定のアッセイを行うことにより得られる。典型的に、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、基準対象（又は対象の集団）についてのアッセイにより得られる。測定されるＵＣＨ−Ｌ１は、このＵＣＨ−Ｌ１断片、この分解産物及び／又は酵素によるこの切断産物を含みうる。ある特定の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、頭部損傷を負っていない、対照の対象と相関しうる。一般に、基準レベルを決定するのに使用された同じアッセイは、試料をアッセイ又は検査するのに使用される。
【０１３５】
この方法における基準レベルは、外傷性脳損傷を有する、又はこれを有することが推測される患者における、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルでありうる。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の、５ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、２０ｐｇ／ｍＬ、３０ｐｇ／ｍＬ、４０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ、７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、５０００ｐｇ／ｍＬ、１００００ｐｇ／ｍＬ又は５００００ｐｇ／ｍＬ以上の血清中レベルは、対象を、外傷性脳損傷を有するものとして同定する。任意選択的に、場合によって、ＵＣＨ−Ｌ１の、１０００００ｐｇ／ｍＬ、５０００００ｐｇ／ｍＬ、１００００００ｐｇ／ｍＬ、１５００００ｐｇ／ｍＬ、２０００００ｐｇ／ｍＬ又は５０００００ｐｇ／ｍＬ以上の血清中レベルは、対象を、外傷性脳損傷を有するものとして同定する。標準化がなされなければ、基準レベルは、方法及びアッセイの間で変動しうることが公知である。したがって、本明細書において記載された方法は、任意の適切な基準レベルに適用されることが意図される。
【０１３６】
一部の実施形態において、本方法は、下記において記載される通り、中等度〜重度の外傷性脳損傷を有すると予測されたヒト対象を、外傷性脳損傷処置により処置するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、下記において記載される通り、軽度の外傷性脳損傷を有すると予測されたヒト対象をモニタリングするステップをさらに含む。
【０１３７】
４．対象が外傷性脳損傷を発症する危険性を決定する一助となるための方法
さらに別の実施形態において、本明細書において記載された方法は、また、下記において記載される抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこれらの抗体断片を使用して、対象におけるＵＣＨ−Ｌ１のレベルを決定することにより、対象が、外傷性脳損傷（中等度外傷性脳損傷〜重度外傷性脳損傷など）を有するか又は外傷性脳損傷を発症する危険性があるのかどうかを決定する一助としても使用されうる。したがって、特定の実施形態において、本開示はまた、本明細書において論じられ、当技術分野において公知である、外傷性脳損傷を有するか又はこれを発症する危険性がある対象が、治療又は処置の候補であるのかどうかを決定するための方法も提示する。本明細書において使用された、「対象が、外傷性脳損傷を有するか又はこれを発症する危険性があるのかどうかを決定すること」とは、対象が、外傷性脳損傷を有する可能性が、そうでない場合より高いことを決定するために、他の情報（例えば、臨床評価データ）と共に、前述の方法が使用されうるという事実を指す。一般に、対象は、少なくとも（ｉ）頭部への損傷を受けた、又はこれを受けたことが推測される対象；（ｉｉ）１つ以上の化学物質及び／若しくは毒素を摂取した、及び／若しくはこれらへと曝露された対象；（ｉｉｉ）自己免疫疾患、代謝性障害、脳腫瘍、低酸素症、１つ以上のウイルス、髄膜炎、水頭症を患う、若しくはこれらの任意の組合せを患う対象又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組合せ又は（ｖ）ＴＢＩを有する、又はＴＢＩの危険性があると診断された対象（例えば、自己免疫疾患、代謝性障害、脳腫瘍、低酸素症、１つ以上のウイルス、髄膜炎、水頭症若しくはこれらの組合せを患う対象など）及び／又は本明細書において記載された、望ましくない（すなわち、臨床的に所望されない）濃度若しくは量のＵＣＨ−Ｌ１若しくはＵＣＨ−Ｌ１断片を顕示する対象である。
【０１３８】
具体的に、このような方法は、（ａ）本明細書において記載された方法、又は当技術分野において公知の方法を使用して、対象に由来する被験試料中のＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量を決定するステップ；及び（ｂ）ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量を基準レベルと比較するステップであって、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が基準レベルに対して好ましい場合、対象が本明細書において論じられ、当技術分野において公知である、外傷性脳損傷を有さないか又はその危険性がないことが決定されるステップを含みうる。しかし、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が、基準レベルに対して好ましくない場合、対象は、本明細書において論じられ、当技術分野において公知である、外傷性脳損傷を有する、又はこの危険性があることが決定される。
【０１３９】
この方法における基準レベルは、外傷性脳損傷を有する、又はこれを有することが推測される患者における、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルでありうる。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の、５ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、２０ｐｇ／ｍＬ、３０ｐｇ／ｍＬ、４０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ、７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、５０００ｐｇ／ｍＬ、１００００ｐｇ／ｍＬ又は５００００ｐｇ／ｍＬ以上の血清中レベルは、対象を、外傷性脳損傷を有するものとして同定する。任意選択的に、場合によって、ＵＣＨ−Ｌ１の、１０００００ｐｇ／ｍＬ、５０００００ｐｇ／ｍＬ、１００００００ｐｇ／ｍＬ、１５００００ｐｇ／ｍＬ、２０００００ｐｇ／ｍＬ又は５０００００ｐｇ／ｍＬ以上の血清中レベルは、対象を、外傷性脳損傷を有するものとして同定する。標準化がなされなければ、基準レベルは、方法及びアッセイの間で変動しうることが公知である。したがって、本明細書において記載された方法は、任意の適切な基準レベルに適用されることが意図される。
【０１４０】
一部の実施形態において、本方法は、下記において記載される通り、外傷性脳損傷を伴うヒト対象を、外傷性脳損傷処置により処置し、かつ／又はヒト対象をモニタリングするステップをさらに含む。
【０１４１】
５．頭部への損傷を負ったヒト対象に対して、ＣＴスキャンを実施するのかどうかの決定の一助となる方法
本開示は、とりわけ、推測される、頭部への損傷を負ったか又は負った可能性があるヒト対象に対して、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを実施するのかどうかについて決定する一助となる方法に関する。本明細書において使用された「ヒト対象に対して、ＣＴスキャンを実施するのかどうかについての決定」とは、対象の頭部ＣＴスキャンが陽性となる可能性が、そうでない場合より高いことを決定するために、他の情報（例えば、臨床評価データ）と共に、前述の方法が使用されうるという事実を指す。具体的に、このような方法は、（ａ）推測される、頭部への損傷後約２４時間以内に、対象から得られた試料に対するアッセイを実施して、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中レベルを測定又は検出するステップ及び（ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の試料中レベルが、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルより高い場合に、対象に対して、ＣＴスキャンを実施し、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中レベルが、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルより低い場合に、対象に対して、ＣＴスキャンを実施しないステップを含みうる。試料は、試料でありうる。
【０１４２】
本発明のこの態様において、このような対象から得られた血液試料が、本明細書において記載される通り、検査又はアッセイが推測される頭部への損傷後約２４時間以内に実施されることを可能とするように、本明細書の前出において記載された方法を使用して、可能な限り迅速に（例えば、約８時間以下の時間内に）処理されることを、当業者は理解する。
【０１４３】
ＵＣＨ−Ｌ１を測定及び評価することにより、本方法は、他の市販のＵＣＨ−Ｌ１イムノアッセイと比較して、対象に対して、より正確にＣＴを実施し、その後、より成功裏に対象を処置する必要を許容する。本方法は、自動システム又は半自動システムにおける使用に適合させられうる。
【０１４４】
一般に、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、被験試料を、ＵＣＨ−Ｌ１についてアッセイしたときに得られた結果を評価するためのベンチマークとしても利用されうる。一般に、このような比較を行う場合に、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、解析物の存在、量又は濃度の、ＴＢＩの特定の病期若しくはエンドポイント又は特定の徴候との連関又は関連が成立させられうるような、十分な回数及び適切な条件下において、特定のアッセイを行うことにより得られる。典型的に、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、基準対象（又は対象の集団）についてのアッセイにより得られる。測定されるＵＣＨ−Ｌ１は、このＵＣＨ−Ｌ１断片、この分解産物及び／又は酵素によるこの切断産物を含みうる。ある特定の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の基準レベルは、頭部損傷を負っていない対照の対象と相関しうる。
【０１４５】
この方法における基準レベルは、外傷性脳損傷を有する、又はこれを有することが推測される患者における、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルでありうる。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の、５ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、２０ｐｇ／ｍＬ、３０ｐｇ／ｍＬ、４０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ、７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、５０００ｐｇ／ｍＬ、１００００ｐｇ／ｍＬ又は５００００ｐｇ／ｍＬ以上の血清中レベルは、対象を、外傷性脳損傷を有するものとして同定する。任意選択的に、場合によって、ＵＣＨ−Ｌ１の、１０００００ｐｇ／ｍＬ、５０００００ｐｇ／ｍＬ、１００００００ｐｇ／ｍＬ、１５００００ｐｇ／ｍＬ、２０００００ｐｇ／ｍＬ又は５０００００ｐｇ／ｍＬ以上の血清中レベルは、対象を、外傷性脳損傷を有するものとして同定する。標準化がなされなければ、基準レベルは、方法及びアッセイの間で変動しうることが公知である。したがって、本明細書において記載された方法は、任意の適切な基準レベルに適用されることが意図される。
【０１４６】
一部の実施形態において、本方法は、下記において記載される通り、外傷性脳損傷を伴うヒト対象を、外傷性脳損傷処置により処置し、かつ／又はヒト対象をモニタリングするステップをさらに含む。
【０１４７】
６．頭部への損傷を負った可能性があるヒト対象における、外傷性脳損傷の程度を決定する一助となる方法
本開示は、推測される頭部への損傷を伴うヒト対象における、外傷性脳損傷の程度を決定する一助となる方法、例えば、対象が、軽度外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有するのかどうかを決定する一助となる方法に、関する。本明細書において使用された、「推測される頭部への損傷を伴うヒト対象における、外傷性脳損傷の程度を決定すること」とは、対象が、軽度の外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有する可能性が、そうでない場合より高いことを決定するのに、他の情報（例えば、臨床評価データ）と共に、前述の方法が使用されうるという事実を指す。本方法は、対象から得られた、少なくとも２つの試料に対して、アッセイを実施するステップ及び少なくとも２つの試料中に、ＵＣＨ−Ｌ１を検出するステップを含む。第１の試料は、損傷から２４時間以内に、ヒト対象から採取され、第２の試料は、第１の試料が採取された、約３〜約６時間後に、ヒト対象から採取される。ＵＣＨ−Ｌ１は、頭部への損傷の発生後、約２〜約２４時間以内に現れる。ＵＣＨ−Ｌ１の存在の開始は、推測される損傷の発生後、約０〜約６時間以内に現れる。ＵＣＨ−Ｌ１のレベルは、第１の試料及び第２の試料の各々について決定される。ＵＣＨ−Ｌ１のレベルは、低下又は上昇することが決定される。外傷性脳損傷の程度は、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルが、第１の試料から第２の試料へ、低下するのか、上昇するのか、又は同じレベルを維持するのかに基づき、対象において決定される。ＵＣＨ−Ｌ１は、推測される損傷後、約０〜約６時間以内に上昇し、次いで、外傷性脳損傷を伴う対象において、低下又は上昇する。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１の存在の開始は、頭部への損傷後、約０、約０．５時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、又は約６時間以内に現れる。
【０１４８】
本発明のこの態様において、このような対象から得られた血液試料が、本明細書において記載される通り、検査又はアッセイが、推測される、頭部への損傷後約２４時間以内に実施されることを可能とするように、本明細書の前出において記載された方法を使用して、可能な限り迅速に（例えば、約８時間以下の時間内に）処理されることを、当業者は理解する。
【０１４９】
一部の実施形態において、第１の試料が、推測される損傷から２４時間以内である第１の時点において対象から採取され、第２の試料は、第１の時点の後である第２の時点において対象から採取され、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルが第１の試料から第２の試料へ低下する場合に、対象は、軽度又は軽度〜重度の外傷性脳損傷を有することが決定される。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１は、上昇したレベルから、少なくとも約５％低下する。例えば、ＵＣＨ−Ｌ１レベルは、上昇したレベルから、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、又は約１０００％低下しうる。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１は、上昇したレベルから、約０．１分の１以下、約０．２分の１以下、約０．３分の１以下、約０．４分の１以下、約０．５分の１以下、約０．５５分の１以下、約０．６分の１以下、約０．７分の１以下、約０．７３分の１以下、約０．８分の１以下、約０．９分の１以下、約１分の１以下、約１．５分の１以下、約２分の１以下、約３分の１以下、約４分の１以下、約５分の１以下、約６分の１以下、約７分の１以下、約８分の１以下、約９分の１以下、約１０分の１以下、約１１分の１以下、約１２分の１以下、約１３分の１以下、約１４分の１以下、約１５分の１以下、約１６分の１以下、約１７分の１以下、約１８分の１以下、約１９分の１以下又は約２０分の１以下に低下する。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１は、上昇したレベルから、約０．１分の１を超える、約０．２分の１を超える、約０．３分の１を超える、約０．４分の１を超える、約０．５分の１を超える、約０．５５分の１を超える、約０．６分の１を超える、約０．７分の１を超える、約０．７３分の１を超える、約０．８分の１を超える、約０．９分の１を超える、約１分の１を超える、約１．５分の１を超える、約２分の１を超える、約３分の１を超える、約４分の１を超える、約５分の１を超える、約６分の１を超える、約７分の１を超える、約８分の１を超える、約９分の１を超える、約１０分の１を超える、約１１分の１を超える、約１２分の１を超える、約１３分の１を超える、約１４分の１を超える、約１５分の１を超える、約１６分の１を超える、約１７分の１を超える、約１８分の１を超える、約１９分の１を超える又は約２０分の１を超えるレベルに低下する。
【０１５０】
一部の実施形態において、第２の試料は、第１の試料が得られた約３時間〜約６時間後、例えば、第１の試料が得られた後、約１時間〜約１０時間以内に得られる。一部の実施形態において、第２の時点の試料は、第１の試料が得られた後、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間又は約１０時間以内に、得られる。
【０１５１】
一部の実施形態において、本方法は、下記において記載される通り、中等度〜重度の外傷性脳損傷を有すると評価された対象を、外傷性脳損傷処置により処置するステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、下記において記載される通り、軽度外傷性脳損傷を有すると評価されたヒト対象をモニタリングするステップをさらに含む。
【０１５２】
７．対象における外傷性脳損傷の進行をモニタリングする方法
さらに別の実施形態において、本明細書において記載された方法は、また、下記において記載される抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこれらの抗体断片を使用して、対象におけるＵＣＨ−Ｌ１のレベルを決定することにより、対象における疾患及び／又は外傷性脳損傷などの損傷の進行をモニタリングする一助としても使用されうる。本明細書において使用された、「疾患及び／又は損傷の進行をモニタリングすること」とは、対象における疾患が、持続、進行又は悪化している可能性が、そうでない場合より高いのかどうかを決定するために、他の情報（例えば、臨床評価データ）と共に、前述の方法が使用されうるという事実を指す。最適な場合、方法は、（ａ）下記において記載される抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこの抗体断片を使用して、対象に由来する被験試料中のＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量を決定するステップ、（ｂ）下記において記載される抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体又はこの抗体断片を使用して、対象に由来する後続の被験試料中のＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量を決定するステップ及び（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量を、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量と比較するステップであって、ステップ（ｂ）において決定された濃度又は量が、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量と比較されたときに、不変であるか又は好ましくない場合、対象における疾患が、持続、進行又は悪化していることが決定されるステップを含む。比較により、ステップ（ｂ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量と比較して好ましい場合、対象における疾患は、途絶、退縮又は改善していることが決定される。
【０１５３】
任意選択的に、本方法は、ステップ（ｂ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量を、例えば、基準レベルと比較するステップをさらに含む。さらに、任意選択的に、本方法は、比較が、ステップ（ｂ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が、例えば、基準レベルに照らして望ましくなく変更されたことを示す場合、対象を、１つ以上の医薬組成物により、ある期間にわたり処置するステップを含む。
【０１５４】
なお、さらに本方法は、下記において記載される１つ以上の医薬組成物又は他の外傷性脳損傷処置による処置を受ける対象における処置をモニタリングするのに使用されうる。具体的に、このような方法は、対象に１つ以上の医薬組成物が投与される前に、対象に由来する第１の被験試料を用意するステップを伴う。次に、対象に由来する第１の被験試料中のＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量は、（例えば、本明細書において記載された方法又は当技術分野で公知の方法を使用して）決定される。ＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が決定された後、次いで、任意選択的に、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が基準レベルと比較される。第１の被験試料中において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が基準レベルより低濃度又は低量である場合、対象は、１つ以上の医薬組成物により処置されないか、又は、代替的に、対象は、１つ以上の医薬組成物により処置されうる。第１の被験試料中において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が、基準レベルより高濃度又は高量である場合、対象は、１つ以上の医薬組成物により処置されるか、又は、代替的に、対象は、１つ以上の医薬組成物により処置されない。対象が、１つ以上の医薬組成物により処置される時間は、当業者により決定されうる（例えば、時間は、約７日間〜約２年間、好ましくは、約１４日間〜約１年間でありうる）。
【０１５５】
次いで、１つ以上の医薬組成物による処置コースにおいて、第２の被験試料及び後続の被験試料が、対象から得られる。被験試料の数及び前記被験試料が対象から得られた時点は、それほど重要ではない。例えば、第２の被験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された７日間後に得られてもよく、第３の被験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された２週間後に得られてもよく、第４の被験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された３週間後に得られてもよく、第５の被験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された４週間後に得られてもよい、などである。
【０１５６】
第２の被験試料又は後続の被験試料の各々が、対象から得られた後、第２の被験試料中又は後続の被験試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が、（例えば、本明細書において記載された方法又は当技術分野で公知の方法を使用して）決定される。次いで、第２の被験試料及び後続の被験試料の各々において決定された、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量は、第１の被験試料中において決定された、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量（例えば、元は、任意選択的に、基準レベルと比較された被験試料）と比較される。ステップ（ｃ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量が、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量と比較して好ましい場合、対象における疾患は、停止、退縮又は改善していることが決定され、対象は、引き続き、ステップ（ｂ）の、１つ以上の医薬組成物を投与されうる。しかし、ステップ（ｃ）において決定された濃度又は量が、ステップ（ａ）において決定されたＵＣＨ−Ｌ１の濃度又は量と比較されたときに、不変である、又は好ましくない場合、対象における疾患が、持続、進行又は悪化していることが決定され、対象は、ステップ（ｂ）において対象へと投与された、高濃度の１つ以上の医薬組成物により処置される場合もあり、対象は、ステップ（ｂ）において、対象へと投与された１つ以上の医薬組成物と異なる１つ以上の医薬組成物により処置される場合もある。具体的に、対象は、前記対象のＵＣＨ−Ｌ１レベルを低下又は下落させるように、対象が既に施された１つ以上の医薬組成物と異なる１つ以上の医薬組成物により処置される場合もある。
【０１５７】
一般に、反復検査（例えば、疾患の進行及び／又は処置に対する応答のモニタリング）がなされうるアッセイのために、第２の被験試料又は後続の被験試料は、第１の被験試料が対象から得られた後の時点において得られる。具体的に、対象に由来する第２の被験試料は、第１の被験試料が対象から得られた、数分間、数時間、数日間、数週間又は数年間後に得られうる。例えば、第２の被験試料は、対象に由来する第１の被験試料が得られた、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８  時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、約１２週、約１３週、約１４週、約１５週、約１６週、約１７週、約１８週、約１９週、約２０週、約２１週、約２２週、約２３週、約２４週、約２５週、約２６週、約２７週、約２８週、約２９週、約３０週、約３１週、約３２週、約３３週、約３４週、約３５週、約３６週、約３７週、約３８週、約３９週、約４０週、約４１週、約４２週、約４３週、約４４週、約４５週、約４６週、約４７週、約４８週、約４９週、約５０週、約５１週、約５２週、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５．年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年、又は約１０．０年間後の時点において、対象から得られうる。
【０１５８】
疾患の進行をモニタリングするのに使用される場合、上記のアッセイは、急性状態を患う対象における疾患の進行をモニタリングするのに使用されうる。救命救急状態としてもまた公知の急性状態とは、例えば、心血管系又は排泄系に関与する、急性かつ致死性の疾患又は他の極めて重篤な医学的状態を指す。典型的に、救命救急状態とは、病院ベースの状況（救急治療室、集中治療室、外傷センター又は他の救急ケア状況を含むがこれらに限定されない）における急性医学的介入又は医療補助員又は他の分野ベースの医療従事者による投与を要求する状態を指す。救命救急状態のために、反復モニタリングは、一般に、短い時間枠内において、すなわち、数分間、数時間又は数日間（例えば、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日又は約７日）のうちになされ、初期アッセイもまた、一般に、短い時間枠内において、例えば、疾患又は状態の発生から、約数分間、数時間又は数日間のうちになされる。
【０１５９】
アッセイはまた、慢性状態又は非急性状態を患う対象における疾患の進行をモニタリングするのにも使用されうる。非救命救急状態又は非急性状態とは、例えば、心血管系及び／又は排泄系に関与する、急性かつ致死性の疾患又は他の極めて重篤な医学的状態以外の状態を指す。典型的に、非急性状態は、持続期間が長期間又は慢性である状態を含む。非急性状態のために、反復モニタリングは、一般に、数時間、数日間、数週間又は数年間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、約１２週、約１３週、約１４週、約１５週、約１６週、約１７週、約１８週、約１９週、約２０週、約２１週、約２２週、約２３週、約２４週、約２５週、約２６週、約２７週、約２８週、約２９週、約３０週、約３１週、約３２週、約３３週、約３４週、約３５週、約３６週、約３７週、約３８週、約３９週、約４０週、約４１週、約４２週、約４３週、約４４週、約４５週、約４６週、約４７週、約４８週、約４９週、約５０週、約５１週、約５２週、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５．年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年又は約１０．０年）などの、長い時間枠によりなされ、初期アッセイもまた、一般に、長い時間枠内において、例えば、疾患又は状態の発生から、約数時間、数日間、数か月又は数年間のうちになされる。
【０１６０】
さらに、上記のアッセイは、対象から得られた全血、血清又は血漿などの、１つの供給源から得られた第１の被験試料を使用して実施されうる。任意選択的に、次いで、上記のアッセイは、当該対象から得られた、別の供給源から得られた第２の被験試料を使用して反復されてもよい。例えば、第１の被験試料が全血から得られる場合、第２の被験試料は血清又は血漿から得られうる。第１の被験試料及び第２の被験試料を使用するアッセイから得られた結果は、比較されうる。比較は、対象における疾患又は状態の状況を評価するのに使用されうる。
【０１６１】
疾患の進行及び／若しくは処置をモニタリングする、又は対象が外傷性脳損傷を発症する危険性を決定するために利用された基準レベルに照らして、ＵＣＨ−Ｌ１又はＵＣＨ−Ｌ１断片の量又は濃度は、「不変」でありうるか、「好適」でありうる（又は「好適に変更されうる」）か又は「望ましくない」場合がある（又は「望ましくなく変更されうる」）。「上昇した（ｅｌｅｖａｔｅｄ）」又は「上昇した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」とは、典型的若しくは正常なレベル若しくは範囲（例えば、基準レベル）以上である、又は別の基準レベル又は範囲（例えば、初期試料又はベースライン試料）以上である、被験試料中の量又は濃度を指す。「低下した」又は「低減された」という用語は、典型的若しくは正常なレベル若しくは範囲（例えば、基準レベル）以下である、又は別の基準レベル又は範囲（例えば、初期試料又はベースライン試料）以下である、被験試料中の量又は濃度を指す。「変更された」という用語は、典型的若しくは正常なレベル若しくは範囲（例えば、基準レベル）を超えて、又は別の基準レベル又は範囲（例えば、初期試料又はベースライン試料）を超えて変更された（上昇又は低下させられた）、試料中の量又は濃度を指す。
【０１６２】
ＵＣＨ−Ｌ１の典型的又は正常なレベル又は範囲は、標準的な慣行に従い規定される。いわゆるレベルの変更又は変更は、実験における誤差又は試料のばらつきによって説明されえない、典型的若しくは正常なレベル若しくは範囲又は基準レベル若しくは基準範囲と比較した、任意の正味の変化が見られる場合に、生じたと考えられうる。したがって、特定の試料中において測定されたレベルは、いわゆる正常対象に由来する、同様の試料中において決定されたレベル又はレベルの範囲と比較される。この文脈において、「正常対象」とは、検出可能な疾患又は障害を伴わない個体であり、「正常」（場合によって、「対照」とも称される）な患者又は集団とは、例えば、それぞれ、検出可能な疾患又は障害を呈しない患者又は集団である。「見かけ上正常な対象」とは、ＵＣＨ−Ｌ１が、評価されていない、又は評価されつつある対象である。解析物が、正常において、検出不能である（例えば、正常レベルはゼロである、又は正常集団の約２５〜約７５百分位数の範囲内にある）が、被験試料中において検出される場合に、並びに解析物が、被験試料中、正常レベルより高レベルにおいて存在する場合に、解析物のレベルは、「上昇した」という。したがって、本開示は、とりわけ、外傷性脳損傷を有する、又はこれらを有する危険性がある対象についてスクリーニングする方法を提示する。
【０１６３】
８．他の因子を伴う診断法又は評価法
上記された、診断法、予後診断法及び／又は評価法は、診断、予後診断及び評価のための他の因子の使用をさらに含みうる。一部の実施形態において、外傷性脳損傷が、ＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）を使用して診断される場合もあり、外傷性脳損傷の転帰が、ＧＯＳＥ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｃａｌｅ）を使用して予測される場合もある。他の検査、スケール又は指標もまた、単独で、又はＧＣＳ（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ）と組み合わせて使用されうる。例は、ＲＬＡＳ（Ｒａｎｃｈｏｓ  Ｌｏｓ  Ａｍｉｇｏｓ  Ｓｃａｌｅ）である。ＲＬＡＳ（Ｒａｎｃｈｏｓ  Ｌｏｓ  Ａｍｉｇｏｓ  Ｓｃａｌｅ）は、意識、認知、行動及び環境との相互作用のレベルを測定する。ＲＬＡＳ（Ｒａｎｃｈｏｓ  Ｌｏｓ  Ａｍｉｇｏｓ  Ｓｃａｌｅ）は、レベルＩ：応答なし；レベルＩＩ：一般的な応答；レベルＩＩＩ：局所的応答；レベルＩＶ：混乱（興奮）；レベルＶ：混乱（不適切）；レベルＶＩ：混乱（適切）；レベルＶＩＩ：自動的（適切）及びレベルＶＩＩＩ：意図的（適切）を含む。
【０１６４】
ＣＴスキャン結果に基づく、他の分類システムは、当技術分野で公知である、任意の分類システムなどの、患者における転帰を予測するのに使用されうる。例は、患者を、脳の非造影ＣＴスキャンについての所見に基づく、昇順重度の６つの類型（Ｉ〜ＶＩ）に分類する、外傷性脳損傷のマーシャル分類である。重度の大きな類型は、予後診断不良であり、生存率も低い。マーシャル分類は、主に、２つの特色：１）正中線のシフト及び／又は基底槽の圧迫により決定される、腫脹の程度、並びに２）「高密度又は混合密度の病変」と称される、挫傷／出血の存在及びサイズに関する。別の例は、さらなる変数（例えば、くも膜下出血）及び認識されているマーシャルシステムの限界の一部に対処しようとする試みであって、複数種類の損傷を有する患者を分類しようとする取組みなどの試みを組み込む、ロッテルダムスコアである。ロッテルダム分類は、４つの独立にスコア化された要素を含む。マーシャルシステムと同様に、ロッテルダム分類は、１）基底槽の圧迫の程度及び２）正中線シフトの程度を含む。しかし、ロッテルダム分類は、挫傷を含まず、大きな病変を、３）硬膜外血腫に限定し、４）脳室内出血及び／又はくも膜下出血を追加する。これらの各々にスコアが与えられ、総計に１を加えて、これらのスコアが集計される。スコアが大きいほど、予後診断不良であり、生存率も低い。
【０１６５】
ポイントオブケアデバイス以外の、一部の測定器（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製の測定器であるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及び他のコア検査測定器など）は、ＵＣＨ−Ｌ１の、２５，０００ｐｇ／ｍＬを超える（ｈｉｇｈｅｒ又はｇｒｅａｔｅｒ）試料中レベルを測定することが可能でありうる。本明細書において記載された方法の使用は、本明細書において記載された利益（例えば、２５，０００ｐｇ／ｍＬ以下の尺度、５ｌｏｇのダイナミックレンジ、ダイナミックレンジにわたるアッセイの直線性、２０マイクロリットル未満の試料容量中のＵＣＨ−Ｌ１尺度、検出域の拡大など）のうちの１又は複数を、これらのデバイス上においてもたらしうる。
【０１６６】
他の検出法は、ナノ小孔デバイス又はナノウェルデバイスの使用又はこれらの上における使用を含む。ナノポアデバイスの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、国際特許公開第２０１６／１６１４０２号において記載されている。ナノウェルデバイスの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、国際特許公開第２０１６／１６１４００号において記載されている。
【０１６７】
９．ＵＣＨ−Ｌ１の、他のバイオマーカーとの組合せ
本明細書において記載された抗体は、疾患に特異的な、１つ以上のバイオマーカー又はイムノアッセイと組み合わせた、ＵＣＨ−Ｌ１のレベル及び濃度を検出及び測定する、様々な方法において使用されうる。本開示は、ＵＣＨ−Ｌ１の、疾患に特異的な、１つ以上のバイオマーカー又はイムノアッセイとの組合せが、健常対照と、疾患を伴う個体との、ＵＣＨ−Ｌ１を単独で測定することと比較して、より良好な識別をもたらすことを想定する。例えば、ＵＣＨ−Ｌ１及びさらなる外傷性脳損傷バイオマーカーのパネルを測定することは、健常対照と、疾患を伴う個体との、ＵＣＨ−Ｌ１単独のパネルと比較して、より良好な識別をもたらしうる。ＵＣＨ−Ｌ１の、少なくとも１つ以上のバイオマーカーとの組合せは、健常対照と、軽度又は中等度〜重度の外傷性脳損傷を有する個体との、より良好な識別をもたらしうる。
【０１６８】
１つ以上のバイオマーカーの例は、グリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、Ｓ１００カルシウム結合性タンパク質Ｂ（Ｓ１００ｂ）、脳脂質結合性タンパク質（ＢＬＢＰ）、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）、星状細胞リンタンパク質１５（ＰＥＡ１５）、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）及びクリスタリンＢ鎖（ＣＲＹＡＢ）である。
【０１６９】
１０．外傷性脳損傷を患う対象の処置及びモニタリング
上記された方法において、軽度外傷性脳損傷又は中等度〜重度の外傷性脳損傷などの外傷性脳損傷を有すると同定又は評価された対象は、処置又はモニタリングされうる。一部の実施形態において、方法は、外傷性脳損傷を有すると評価されたヒト対象を、当技術分野において公知である任意の処置などの、外傷性脳損傷処置により処置するステップをさらに含む。例えば、外傷性脳損傷の処置は、頭部への損傷の重症度に応じて、様々な形態を取りうる。例えば、軽度ＴＢＩを患う対象の場合、処置は、休息、スポーツなどの身体活動を控えること、日向に出るときの光線の回避又はサングラスの着用、頭痛又は偏頭痛を緩和するための投薬、抗悪心薬などのうちの１つ以上を含みうる。重度ＴＢＩを患う患者のための処置は、１つ以上の適切な薬物（例えば、利尿剤、抗痙攣薬、個体を鎮静させ、薬物誘導性昏睡へと導く薬物など）又は他の医薬若しくは生物医薬（ＴＢＩの処置のために公知の医薬又は将来開発される医薬）、１つ以上の手術手順（例えば、血腫の除去、頭蓋骨骨折の修復、減圧開頭術など）及び１つ以上の治療（例えば、１つ以上のリハビリ、認知行動学的治療、アンガーマネージメント、心理カウンセリングなど）を含みうる。一部の実施形態において、方法は、外傷性脳損傷（例えば、軽度又は中等度〜重度の外傷性脳損傷）を有すると評価されたヒト対象をモニタリングするステップをさらに含む。一部の実施形態において、軽度外傷性脳損傷又は重度外傷性脳損傷などの外傷性脳損傷を有すると同定された対象は、ＣＴスキャン又はＭＲＩによりモニタリングされうる。
【０１７０】
１１．ＵＣＨ−Ｌ１を測定する方法
上記された方法において、ＵＣＨ−Ｌ１レベルは、イムノアッセイ、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動、化学解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、タンパク質免疫染色などの抗体依存的方法などの電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）若しくは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）などのクロマトグラフィー法若しくは分光法などの、任意の手段により測定されうる。また、当業者に公知の臨床化学フォーマットのアッセイも利用されうる。例えば、臨床化学フォーマットは、１つの抗体を伴うアッセイ又は抗体を伴わないアッセイを含みうる。臨床化学フォーマットのために使用されうる解析器の例については、米国特許公開第２０１６／０３２０４２２号及び同第２０１５／０１１２６３０号において記載されている。
【０１７１】
一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルを測定するステップは、試料を、第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーと接触させるステップを含む。一部の実施形態において、第１の特異的結合メンバーは、捕捉抗体であり、第２の特異的結合メンバーは、検出抗体である。一部の実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１のレベルを測定するステップは、試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体）を形成する捕捉抗体（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１捕捉抗体）、及び（２）検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−ＵＣＨ−Ｌ１検出抗体複合体）を形成する検出抗体（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１検出抗体）と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−ＵＣＨ−Ｌ１検出抗体複合体）が形成されること、並びにＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定することを含む。
【０１７２】
一部の実施形態において、第１の特異的結合メンバーは、固体支持体上に固定化される。一部の実施形態において、第２の特異的結合メンバーは、固体支持体上に固定化される。一部の実施形態において、第１の特異的結合メンバーは、下記で記載されるＵＣＨ−Ｌ１抗体である。
【０１７３】
一部の実施形態において、試料は、希釈される、又は希釈されない。試料は、約１〜約２５マイクロリットル、約１〜約２４マイクロリットル、約１〜約２３マイクロリットル、約１〜約２２マイクロリットル、約１〜約２１マイクロリットル、約１〜約２０マイクロリットル、約１〜約１８マイクロリットル、約１〜約１７マイクロリットル、約１〜約１６マイクロリットル、約１５マイクロリットル又は約１マイクロリットル、約２マイクロリットル、約３マイクロリットル、約４マイクロリットル、約５マイクロリットル、約６マイクロリットル、約７マイクロリットル、約８マイクロリットル、約９マイクロリットル、約１０マイクロリットル、約１１マイクロリットル、約１２マイクロリットル、約１３マイクロリットル、約１４マイクロリットル、約１５マイクロリットル、約１６マイクロリットル、約１７マイクロリットル、約１８マイクロリットル、約１９マイクロリットル、約２０マイクロリットル、約２１マイクロリットル、約２２マイクロリットル、約２３マイクロリットル、約２４マイクロリットル又は約２５マイクロリットルでありうる。一部の実施形態において、試料は、約１〜約１５０マイクロリットル若しくはこれ未満又は約１〜約２５マイクロリットル若しくはこれ未満である。
【０１７４】
ポイントオブケアデバイス以外の、一部の測定器（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製の測定器であるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及び他のコア検査測定器など）は、ＵＣＨ−Ｌ１の、２５，０００ｐｇ／ｍＬ以上の試料中レベルを測定することが可能でありうる。
【０１７５】
他の検出法は、ナノポアデバイス又はナノウェルデバイスの使用を含む、又はこれらにおける使用に適合させられうる。ナノポアデバイスの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、国際特許公開第２０１６／１６１４０２号において記載されている。ナノウェルデバイスの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、国際特許公開第２０１６／１６１４００号において記載されている。
【０１７６】
１２．ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）抗体
本明細書において記載された方法は、「ＵＣＨ−Ｌ１抗体」と称される、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（「ＵＣＨ−Ｌ１」）（又はこの断片）に特異的に結合する単離抗体を使用しうる。ＵＣＨ−Ｌ１抗体は、ＵＣＨ−Ｌ１状態を外傷性脳損傷の尺度として評価するか、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中の存在を検出するか、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を定量するか、若しくはＵＣＨ−Ｌ１の試料中の存在を検出し、かつ、ＵＣＨ−Ｌ１の試料中量を定量するために、使用されうる。
【０１７７】
ａ）ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）
「ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ」としてもまた公知のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）（「ＵＣＨ−Ｌ１」）は、脱ユビキチン化酵素である。ＵＣＨ−Ｌ１は、遺伝子ファミリーのメンバーであり、その産物は、ユビキチンの小型のＣ末端付加物を加水分解して、ユビキチン単量体を発生させる。ＵＣＨ−Ｌ１の発現は、ニューロン及びびまん性神経内分泌系の細胞並びにそれらの腫瘍に、高度に特異的である。ＵＣＨ−Ｌ１は、全てのニューロン内に、豊富に存在し（全脳タンパク質のうちの、１〜２％を占める）、とりわけ、ニューロン及び精巣／卵巣において発現される。ＵＣＨ−Ｌ１の触媒三残基は、そのヒドロラーゼ活性の一因となる、９０位におけるシステイン、１７６位におけるアスパラギン酸及び１６１位におけるヒスチジンを含有する。
【０１７８】
ヒトＵＣＨ−Ｌ１は、以下のアミノ酸配列：
【０１７９】
【化１】
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を有しうる。ヒトＵＣＨ−Ｌ１は、配列番号１の断片又は変異体でありうる。ＵＣＨ−Ｌ１の断片は、５〜２２５アミノ酸の間、１０〜２２５アミノ酸の間、５０〜２２５アミノ酸の間、６０〜２２５アミノ酸の間、６５〜２２５アミノ酸の間、１００〜２２５アミノ酸の間、１５０〜２２５アミノ酸の間、１００〜１７５アミノ酸の間又は１７５〜２２５アミノ酸の間の長さでありうる。断片は、配列番号１に由来する、連続番号のアミノ酸を含みうる。
【０１８０】
ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１認識抗体
抗体は、ＵＣＨ−Ｌ１、この断片、ＵＣＨ−Ｌ１のエピトープ又はこの変異体に結合する抗体である。抗体は、抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体の断片又はこの変異体若しくは誘導体でありうる。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、アフィニティー成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はＦａｂ断片などの抗体断片又はこれらの混合物でありうる。抗体の断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片又はｓｃＦｖ断片を含みうる。抗体の誘導体は、ペプチド模倣体により作製されうる。さらに、単鎖抗体を作製するために記載されている技法は、単鎖抗体を作製するように適合させられうる。
【０１８１】
抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体は、キメラ抗ＵＣＨ−Ｌ１又はヒト化抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体でありうる。一実施形態において、ヒト化抗体及びキメラ抗体のいずれも、一価である。一実施形態において、ヒト化抗体及びキメラ抗体のいずれも、Ｆｃ領域へと連結された、単一のＦａｂ領域を含む。
【０１８２】
ヒト抗体は、ファージディスプレイ技術又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにより導出されうる。ヒト抗体は、ヒトのインビボにおける免疫応答の結果として作出及び単離されうる。例えば、Ｆｕｎａｒｏら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８（８）：８５を参照されたい。したがって、抗体は、ヒトの産物であることが可能であり、動物レパートリーではない場合がある。抗体は、ヒト由来であるため、自己抗原に対する反応性の危険性は、最小化されうる。代替的に、標準的な酵母ディスプレイライブラリー及び酵母ディスプレイ技術は、ヒト抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を選択及び単離するのに使用されうる。例えば、ナイーブヒト単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のライブラリーは、ヒト抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を選択するのに使用されうる。トランスジェニック動物は、ヒト抗体を発現させるのに使用されうる。
【０１８３】
ヒト化抗体は、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子であって、非ヒト種に由来する、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する抗体分子でありうる。
【０１８４】
抗体は、それが、当技術分野において公知の抗体と異なる生物学的機能を保有するという点で、公知の抗体と識別可能である。
【０１８５】
（１）エピトープ
抗体は、ＵＣＨ−Ｌ１（配列番号１）、その断片又はその変異体に、免疫特異的に結合しうる。抗体は、エピトープ領域内の、少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸又は少なくとも１０アミノ酸を免疫特異的に認識することが可能であり、これらに結合しうる。抗体は、エピトープ領域のうちの、少なくとも３連続アミノ酸、少なくとも４連続アミノ酸、少なくとも５連続アミノ酸、少なくとも６連続アミノ酸、少なくとも７連続アミノ酸、少なくとも８連続アミノ酸、少なくとも９連続アミノ酸又は少なくとも１０連続アミノ酸を有するエピトープを免疫特異的に認識することが可能であり、これらに結合しうる。
【０１８６】
ｃ）抗体の調製／作製
抗体は、当業者に周知の技法を含む、様々な技法のうちのいずれかにより調製されうる。一般に、抗体は、従来の技法を介して、又は組換え体であってもよい抗体の作製を可能とするための、適切な細菌細胞宿主若しくは哺乳動物細胞宿主への抗体の遺伝子、重鎖及び／若しくは軽鎖のトランスフェクションを介して、モノクローナル抗体の作出を含む細胞培養法により、作製されうる。「トランスフェクション」という用語の多様な形態は、外因性ＤＮＡの、原核宿主細胞又は真核宿主細胞への導入のために一般に使用されている、多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。抗体を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現させることが可能であるが、そのような真核細胞（そして、特に、哺乳動物の細胞）は、原核細胞より、アセンブルし、適正にフォールディングされ、免疫学的に活性である抗体を分泌する可能性が高いため、抗体の、真核細胞内の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞内の発現が最も好ましい。
【０１８７】
組換え抗体を発現させるための、例示的な哺乳動物宿主細胞は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１〜６２１（１９８２）において記載されているようにＤＨＦＲ選択用マーカーと共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０（１９８０）において記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞へと導入される場合、抗体は、宿主細胞内の抗体の発現又はより好ましくは宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間にわたり、宿主細胞を培養することにより作製される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して、培養培地から回収されうる。
【０１８８】
宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの、機能的抗体断片を作製するのにも使用されうる。上記の手順に対する変動は、実施されうることが理解される。例えば、宿主細胞に、抗体の軽鎖及び／又は重鎖の機能的断片をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが所望されうる。組換えＤＮＡ技術はまた、目的の抗原への結合に必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するのにも使用されうる。また、このような切断型ＤＮＡ分子から発現させた分子も、抗体に包含される。加えて、１つの重鎖及び１つの軽鎖が、抗体（すなわち、ヒトＵＣＨ−Ｌ１に結合する抗体）であり、他の重鎖及び軽鎖が、ヒトＵＣＨ−Ｌ１以外の抗原に特異的である、二官能性抗体も、抗体を、標準的な化学的架橋法を介して、第２の抗体へと架橋することにより作製されうる。
【０１８９】
抗体又はこの抗原結合性部分を組換え発現させるための好ましい系において、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介型トランスフェクションにより、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞へと導入される。組換え発現ベクター内において、高レベルの遺伝子の転写を駆動するように、抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子の各々が、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントへと作動的に連結される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサートによる選択／増幅を使用するベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も保有する。抗体の重鎖及び軽鎖の発現を可能とするように、選択された形質転換体の宿主細胞が培養され、無傷抗体が培養培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収するのに、標準的な分子生物学法が使用される。なお、さらに、組換え抗体を合成する方法は、組換え抗体が合成されるまで、宿主細胞を、適切な培養培地中において培養することによる。方法は、組換え抗体を、培養培地から単離するステップをさらに含みうる。
【０１９０】
モノクローナル抗体を調製する方法は、所望の特異性を有する抗体を作製することが可能な不死細胞株の調製を伴う。このような細胞株は、免疫化された動物から得られた脾臓細胞から作製されうる。動物は、ＵＣＨ−Ｌ１又はこの断片及び／若しくは変異体により免疫化されうる。動物を免疫化するのに使用されるペプチドは、ヒトＦｃ、例えば、ヒト抗体のＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域又はテール領域をコードするアミノ酸を含みうる。次いで、脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナーとの融合により免疫化される。様々な融合法が利用されうる。例えば、脾臓細胞及び骨髄腫細胞が、非イオン性界面活性剤と、数分間にわたり組み合わされ、次いで、低密度において、ハイブリッド細胞の増殖を支援するが、骨髄腫細胞の増殖を支援しない選択培地上に播種される。このような一技法は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）選択を使用する。別の技法は、電気融合を含む。十分な時間、通例、約１〜２週間の後、ハイブリッド体のコロニーが観察される。単一のコロニーが選択され、それらの培養物上清は、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高度な反応性及び特異性を有するハイブリドーマが使用されうる。
【０１９１】
モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離されうる。加えて、収率を増強するように、ハイブリドーマ細胞株の、マウスなどの適切な脊椎動物宿主の、腹腔への注射などの多様な技法が利用されうる。次いで、モノクローナル抗体は、腹水又は血液から採取されうる。夾雑物は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿及び抽出などの従来の技法により、抗体から除去されうる。アフィニティークロマトグラフィーは、抗体を精製する工程において使用されうる方法の例である。
【０１９２】
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的にいくつかの断片に切断して、これらのうちの２つの（Ｆ（ａｂ）断片）の各々が、無傷の抗原結合部位を含む、共有結合的ヘテロ二量体を含む断片をもたらす。酵素であるペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合性部位を含む、Ｆ（ａｂ’）２断片を含む、いくつかの断片をもたらすことが可能である。
【０１９３】
Ｆｖ断片は、ＩｇＭの、優先的なタンパク質分解性切断により作製されうるが、まれな場合に、ＩｇＧ免疫グロブリン分子又はＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解性切断によっても作製されうる。Ｆｖ断片は、組換え法を使用して導出されうる。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識能及び抗原結合能の大半を保持する抗原結合部位を含む、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。
【０１９４】
抗体、抗体断片又は誘導体は、それぞれ、ＣＤＲに対する支持をもたらし、ＣＤＲの、互いに対する空間的関係を規定する、重鎖及び軽鎖のフレームワーク（「ＦＲ」）のセットの間に挿入された、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを含みうる。ＣＤＲのセットは、重鎖Ｖ領域又は軽鎖Ｖ領域からなる、３つの超可変領域を含有しうる。
【０１９５】
必須の特異性を有する抗体を作製又は単離する、他の適する方法であって、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｄｅｌ．）、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）などの、多様な市販品の販売元から市販されている、ペプチドライブラリー又はタンパク質ライブラリー（例えば、バクテリオファージライブラリー、リボソームライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリー、ＲＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、酵母ライブラリーなどのディスプレイライブラリーであるがこれらに限定されない）から組換え抗体を選択する方法を含むがこれらに限定されない方法が使用されうる。米国特許第４，７０４，６９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８２４，５１４号；同第５，９７６，８６２号を参照されたい。代替的な方法は、ヒト抗体のレパートリーを作製することが可能な、トランスジェニック動物の免疫化（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎら（１９９７）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４１：９０１〜９０７；Ｓａｎｄｈｕら（１９９６）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：９５〜１１８；Ｅｒｅｎら（１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９３：１５４〜１６１）であって、当技術分野において公知であり、かつ／又は本明細書において記載された、トランスジェニック動物の免疫化に依拠する。このような技法は、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４９３７〜４９４２；Ｈａｎｅｓら（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１４１３０〜１４１３５）；単一細胞による抗体作製技術（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７：８８７〜８９２；Ｂａｂｃｏｏｋら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：７８４３〜７８４８）；ゲル微小液滴及びフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら（１９９０）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８：３３３−３３７；Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）；Ｇｒａｙら（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．、１８２：１５５〜１６３；Ｋｅｎｎｙら（１９９５）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１３：７８７〜７９０）；Ｂ細胞の選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら（１９９４）、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９：１２５〜１３４（１９９４））を含むがこれらに限定されない。
【０１９６】
アフィニティー成熟抗体は、当技術分野において公知である、多数の手順のうちのいずれか１つにより作製されうる。例えば、Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２）は、ＶＨとＶＬとのドメインシャッフリングによるアフィニティー成熟について記載している。ＣＤＲ残基及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発については、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜３３１９（１９９５）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６（１９９２）により記載されている。選択的突然変異誘発位置及び活性増強アミノ酸残基を伴う接触位置又は超変異位置における選択的突然変異については、米国特許第６，９１４，１２８Ｂ１号において記載されている。
【０１９７】
抗体の変異体はまた、抗体をコードするポリヌクレオチドを、トランスジェニック動物又はこのような抗体をそれらのミルク中に産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物をもたらすのに適する宿主へと送達することを使用しても調製されうる。これらの方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号及び同第５，３０４，４８９号において記載されている。
【０１９８】
抗体の変異体はまた、このような抗体、指定された部分又は変異体を、植物の部分又はこれらから培養された細胞において産生する、トランスジェニック植物及び培養植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、及びウキクサであるがこれらに限定されない）をもたらすように、ポリヌクレオチドを送達することによっても調製されうる。例えば、Ｃｒａｍｅｒら（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０：９５〜１１８及びこの文献において引用された参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを使用する、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックのタバコ葉の産生について記載している。トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において産生された、又は天然の供給源から精製された哺乳動物タンパク質と同等の生物学的活性を伴う哺乳動物タンパク質を、市販品生産のレベルにおいて発現させるのに使用されている。例えば、Ｈｏｏｄら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、４６４：１２７〜１４７及びこの文献において引用された参考文献を参照されたい。抗体の変異体はまた、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物の種子であって、タバコの種子及びバレイショの塊茎を含む種子からも大量に作製されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄら（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３８：１０１〜１０９及びこの文献において引用された参考文献を参照されたい。したがって、抗体はまた、公知の方法に従いトランスジェニック植物を使用しても作製されうる。
【０１９９】
抗体の誘導体は、例えば、外因性配列を付加して、免疫原性を修飾する、又は結合、アフィニティー、オン速度、オフ速度、アビディティー、特異性、半減期若しくは他の任意の適切な特徴を低減、増強若しくは修飾することにより作製されうる。一般に、可変領域及び定常領域の非ヒト配列を、ヒトアミノ酸又は他のアミノ酸により置換しながら、非ヒトＣＤＲ配列又はヒトＣＤＲ配列のうちの一部又は全部は維持される。
【０２００】
小型の抗体断片は、２つの抗原結合性部位を有するダイアボディーであって、断片が、同じポリペプチド鎖において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へと接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む、ダイアボディーでありうる。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８を参照されたい。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合性部位を創出するように強いられる。また、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、かつ、１つ以上のアミノ酸が、親抗体の超可変領域内へと挿入され、標的抗原に対する結合アフィニティーが、この抗原に対する親抗体の結合アフィニティーの少なくとも約２倍強い抗体変異体についても開示する、Ｃｈｅｎらによる、米国特許第６，６３２，９２６号も参照されたい。
【０２０１】
抗体は、直鎖状抗体でありうる。当技術分野において、直鎖状抗体を作るための手順が公知であり、Ｚａｐａｔａら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７〜１０６２において記載されている。略述すると、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成する、タンデムのＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性でありうる。
【０２０２】
抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィー又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、公知の方法により、組換え細胞培養物から回収及び精製されうる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた、精製のために使用されうる。
【０２０３】
抗体を検出可能に標識することは、有用でありうる。抗体を、これらの薬剤へとコンジュゲートさせるための方法は、当技術分野において公知である。例示だけを目的として述べると、抗体は、放射性原子、発色団、フルオロフォアなどの検出可能部分により標識されうる。このような標識抗体は、インビボにおける、又は単離された被験試料中の診断法のために使用されうる。このような標識抗体は、サイトカイン、リガンド、別の抗体へと連結されうる。抗腫瘍効果を達成するための、抗体へのカップリングに適する薬剤は、インターロイキン２（ＩＬ−２）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；光力学療法における使用のための光増感剤であって、アルミニウム（ＩＩＩ）フタロシアニンテトラスルホン酸、ヘマトポルフィリン及びフタロシアニンを含む光増感剤；ヨウ素１３１（１３１Ｉ）、イットリウム９０（９０Ｙ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、テクネシウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）及びレニウム１８８（１８８Ｒｅ）などの放射性核種；ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、メトトレキサート、ダウノマイシン、ネオカルチノスタチン及びカルボプラチンなどの抗生剤；ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリンＡ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化リシンＡ及び天然リシンＡ）、ＴＧＦ−アルファ毒素、タイワンコブラに由来する細胞毒素（ナジャ・ナジャ・アトラ）及びゲロニン（植物毒素）などの、細菌毒素、植物毒素及び他の毒素；レストリクトシン（アスペルギルス・レストリクツスにより産生されたリボソーム不活化タンパク質）、サポリン（サポナリア・オフィキナリスに由来するリボソーム不活化タンパク質）及びＲＮアーゼなどの、植物、細菌及び真菌に由来する、リボソーム不活化タンパク質；チロシンキナーゼ阻害剤；ｌｙ２０７７０２（二フッ素化プリンヌクレオシド）；抗嚢胞剤を含有するリポソーム（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素をコードするプラスミド、メトトレキサートなど）並びに他の抗体又はＦ（ａｂ）などの抗体断片を含む。
【０２０４】
ハイブリドーマ技術、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）、トランスジェニック動物及び組換え抗体ライブラリーの使用を介する抗体の作製については、下記において、より詳細に記載される。
（１）ハイブリドーマ技術を使用する、抗ＵＣＨ−Ｌ１モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の、多種多様な技法であって、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せの使用を含む技法を使用して調製されうる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）において教示されているハイブリドーマ法を含むハイブリドーマ法を使用して作製されうる。また、本明細書において使用された「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を介して作製された抗体に限定されないことも留意される。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン又はファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが作製された方法を指すものではない。
【０２０５】
本方法により作製されるモノクローナル抗体並びに抗体を作出する方法は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養するステップを含みうるが、この場合、ハイブリドーマは、ＵＣＨ−Ｌ１により免疫化された動物、例えば、ラット又はマウスから単離された脾臓細胞を、骨髄腫細胞と融合させ、次いで、融合体から生じるハイブリドーマを、本発明のポリペプチドに結合することが可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより作出されることが好ましい。略述すると、ラットは、ＵＣＨ−Ｌ１抗原により免疫化されうる。好ましい実施形態において、ＵＣＨ−Ｌ１抗原は、免疫応答を刺激するように、アジュバントと共に投与される。このようなアジュバントは、フロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を含む。このようなアジュバントは、ポリペプチドを、局所的な沈着物内に封入することにより、急速な分散から保護しうる、又はこのようなアジュバントは、マクロファージ及び免疫系の他の構成要素に対して走化性である因子を分泌するように、宿主を刺激する物質を含有しうる。ポリペプチドが投与される場合、免疫化スケジュールは、何週間かにわたる、２回以上のポリペプチドの投与を伴うことが好ましいが、ポリペプチドの単回投与もまた、使用されうる。
【０２０６】
ＵＣＨ−Ｌ１抗原による動物の免疫化の後、抗体及び／又は抗体産生細胞が、動物から得られうる。抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体含有血清は、動物から採血する、又は動物を屠殺することにより、動物から得られる。血清は、動物から得られたままに使用されてもよく、免疫グロブリン画分が血清から得られてもよく、又は抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体が血清から精製されてもよい。このようにして得られた血清又は免疫グロブリンは、ポリクローナルであるので、一連の異種特性を有する。
【０２０７】
免疫応答が検出されたら、例えば、ラット血清中において、抗原であるＵＣＨ−Ｌ１に特異的な抗体が検出されたら、ラット脾臓が摘出され、脾臓細胞が単離される。次いで、脾臓細胞が、周知の技法により、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、ＵＳ）から市販されている細胞株である、ＳＰ２０に由来する細胞へと融合させられる。ハイブリドーマが選択され、限界希釈によりクローニングされる。次いで、ハイブリドーマクローンが、当技術分野において公知の方法により、ＵＣＨ−Ｌ１に結合することが可能な抗体を分泌する細胞についてアッセイされる。ラットを、陽性のハイブリドーマクローンにより免疫化することにより、一般に、高レベルの抗体を含有する腹水が作出されうる。
【０２０８】
別の実施形態において、抗体を産生する免疫化ハイブリドーマが、免疫化された動物から調製されうる。免疫化の後、動物は、屠殺され、当技術分野において周知の通り、脾臓Ｂ細胞は、免疫化された骨髄腫細胞へと融合される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、前出を参照されたい。好ましい実施形態において、骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞株）。融合及び抗生剤による選択の後、ハイブリドーマは、ＵＣＨ−Ｌ１若しくはこの部分又はＵＣＨ−Ｌ１を発現する細胞を使用してスクリーニングされる。好ましい実施形態において、初期スクリーニングは、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して実施される。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、ＰＣＴ公開第００／３７５０４号において提示されている。
【０２０９】
抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を産生するハイブリドーマは、ロバストなハイブリドーマの増殖、高度な抗体の産生、及び所望の抗体特徴を含む、所望の特徴について選択され、クローニングされ、さらにスクリーニングされる。ハイブリドーマは、インビボの同系動物、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいて、又はインビトロの細胞培養物中において培養され、拡大されうる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、拡大する方法は、当業者に周知である。
【０２１０】
好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ラットハイブリドーマである。別の実施形態において、ハイブリドーマは、マウス、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、ヒト以外でラット以外の種において作製される。さらに別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性骨髄腫が、抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を発現するヒト細胞と融合させられた、ヒトハイブリドーマである。
【０２１１】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技法により作出されうる。例えば、本発明のＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（２つの同一なＦａｂ断片をもたらす）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす）などの酵素を使用する、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断により作製されうる。ＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）２断片は、大型の（「親」）ＩｇＧ分子の、２つの抗原結合性部位であって、親ＩｇＧ分子の、両方の軽鎖（軽鎖可変領域及び定常領域を含有する）、重鎖のＣＨ１ドメイン及びジスルフィド形成ヒンジ領域を含む、抗原結合性部位を保持する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、親ＩｇＧ分子と同様に、抗原分子を架橋することが可能である。
【０２１２】
（２）ＳＬＡＭを使用する、抗ＵＣＨ−Ｌ１モノクローナル抗体
本発明の別の態様において、組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号；ＰＣＴ公開第９２／０２５５１号及びＢａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：７８４３〜７８４８（１９９６）において記載されている通り、当技術分野において、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）と称される手順を使用して、単一の単離リンパ球から作出される。この方法において、ビオチンなどのリンカーを使用して、抗原であるＵＣＨ−Ｌ１、ＵＣＨ−Ｌ１のサブユニット又はこの断片が、ヒツジ赤血球へとカップリングされ、ＵＣＨ−Ｌ１に対する特異性を伴う抗体を分泌する単一細胞を同定するのに使用される、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用して、目的の抗体を分泌する、単一の細胞、例えば、免疫化された動物のうちのいずれか１つに由来するリンパ球がスクリーニングされる。目的の抗体分泌細胞を同定した後、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のｃＤＮＡが、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、細胞からレスキューされ、次いで、これらの可変領域を、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞などの、哺乳動物宿主細胞内の、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）の文脈において発現させる。次いで、インビボにおいて選択されたリンパ球に由来する、増幅された免疫グロブリン配列をトランスフェクトされた宿主細胞は、例えば、ＵＣＨ−Ｌ１に対する抗体を発現する細胞を単離するように、トランスフェクト細胞をパニングすることにより、インビトロにおいて、さらなる解析及び選択を経る場合がある。増幅された免疫グロブリン配列は、インビトロアフィニティー成熟法によるように、インビトロにおいて、さらに操作されうる。例えば、ＰＣＴ公開第９７／２９１３１号及びＰＣＴ公開第００／５６７７２号を参照されたい。
【０２１３】
（３）トランスジェニック動物を使用する、抗ＵＣＨ−Ｌ１モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全部を含む非ヒト動物を、ＵＣＨ−Ｌ１抗原により免疫化することにより作製される。ある実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大型断片を含み、マウス抗体の作製が欠損する操作マウス株である、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：１３〜２１（１９９４）並びに米国特許第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；同第５，９８５，６１５号；同第５，９９８，２０９号；同第６，０７５，１８１号；同第６，０９１，００１号；同第６，１１４，５９８号及び同第６，１３０，３６４号を参照されたい。また、ＰＣＴ公開第９１／１０７４１号；ＰＣＴ公開第９４／０２６０２号；ＰＣＴ公開第９６／３４０９６号；ＰＣＴ公開第９６／３３７３５号；ＰＣＴ公開第９８／１６６５４号；ＰＣＴ公開第９８／２４８９３号；ＰＣＴ公開第９８／５０４３３号；ＰＣＴ公開第９９／４５０３１号；ＰＣＴ公開第９９／５３０４９号；ＰＣＴ公開第００／０９５６０号及びＰＣＴ公開第００／３７５０４号も参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を発生させる。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及びｘ軽鎖遺伝子座の、メガ塩基サイズの、生殖細胞系列構成のＹＡＣ断片を導入することにより、ヒト抗体レパートリーのうちの約８０％を含有する。その開示が参照により組み込まれた、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６〜１５６（１９９７）；Ｇｒｅｅｎ及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８８：４８３〜４９５（１９９８）を参照されたい。
【０２１４】
（４）組換え抗体ライブラリーを使用する、抗ＵＣＨ−Ｌ１モノクローナル抗体
インビトロ法もまた、本発明の抗体を作るのに使用できる場合があり、この場合、所望のＵＣＨ−Ｌ１結合特異性を有する抗体を同定するのに、抗体ライブラリーがスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーの、このようなスクリーニングのための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、それらの各々の内容が、参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒら）；ＰＣＴ公開第９２／１８６１９号（Ｋａｎｇら）；ＰＣＴ公開第９１／１７２７１号（Ｄｏｗｅｒら）；ＰＣＴ公開第９２／２０７９１号（Ｗｉｎｔｅｒら）；ＰＣＴ公開第９２／１５６７９号（Ｍａｒｋｌａｎｄら）；ＰＣＴ公開第９３／０１２８８号（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら）；ＰＣＴ公開第９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）；ＰＣＴ公開第９２／０９６９０号（Ｇａｒｒａｒｄら）；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３６９〜１３７２（１９９１）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｏｄｏｍａｓ、３：８１〜８５（１９９２）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯＪ．、１２：７２５〜７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３５７６〜３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｒｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３７３〜１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３〜４１３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８〜７９８２（１９９１）；米国特許出願公開第２００３／０１８６３７４号及びＰＣＴ公開第９７／２９１３１号、において記載されている方法を含む。
【０２１５】
組換え抗体ライブラリーは、ＵＣＨ−Ｌ１又はＵＣＨ−Ｌ１の部分により免疫化された対象に由来しうる。代替的に、組換え抗体ライブラリーは、ヒトＵＣＨ−Ｌ１により免疫化されていないヒト対象に由来する、ヒト抗体ライブラリーのように、ナイーブ対象、すなわち、ＵＣＨ−Ｌ１により免疫化されていない対象に由来しうる。本発明の抗体は、ヒトＵＣＨ−Ｌ１を含むペプチドを伴う組換え抗体ライブラリーをスクリーニングして、これにより、ＵＣＨ−Ｌ１を認識する抗体を選択することにより選択される。このようなスクリーニング及び選択を行うための方法は、前出の段落内の参考文献において記載されている方法のように、当技術分野において周知である。ＵＣＨ−Ｌ１に対して、特定の結合アフィニティーを有する、本発明の抗体であって、ヒトＵＣＨ−Ｌ１から、特定のＫｏｆｆ速度定数により解離する抗体などの抗体を選択するために、所望のＫｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択するように、当技術分野において公知の表面プラズモン共鳴法が使用されうる。ｈＵＣＨ−Ｌ１に対する、特定の中和活性を有する本発明の抗体であって、特定のＩＣ５０を伴う抗体などの抗体を選択するために、ＵＣＨ−Ｌ１活性の阻害を評価するための、当技術分野において公知の標準的方法が使用されうる。
【０２１６】
一態様において、本発明は、ヒトＵＣＨ−Ｌ１に結合する、単離抗体又はこの抗原結合性部分に関する。好ましくは、抗体は、中和抗体である。多様な実施形態において、抗体は、組換え抗体又はモノクローナル抗体である。
【０２１７】
例えば、抗体はまた、当技術分野において公知である、多様なファージディスプレイ法を使用しても作出されうる。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。このようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウスの）から発現させた抗原結合性ドメインを提示するのに用いられうる。目的の抗原に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原又は固体表面若しくはビーズに結合された、若しくはこれらへと捕捉された抗原を使用して選択又は同定されうる。これらの方法において使用されたファージは典型的に、ファージから発現させたｆｄ結合性ドメイン及びＭ１３結合性ドメインを、組換えにより、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質又はファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質へと融合させた、Ｆａｂ抗体ドメイン、Ｆｖ抗体ドメイン又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインと共に含む、繊維状ファージである。抗体を作るのに使用されうるファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７〜１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７：９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開第９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開第９０／０２８０９号；ＰＣＴ公開第９１／１０７３７号；ＰＣＴ公開第９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開第９２／１８６１９号；ＰＣＴ公開第９３／１１２３６号；ＰＣＴ公開第９５／１５９８２号；ＰＣＴ公開第９５／２０４０１号及び米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号において開示されているファージディスプレイ法を含む。
【０２１８】
上記の参考文献において記載された通り、ファージ選択の後、ファージに由来する抗体のコード領域は、単離され、ヒト抗体を含む全抗体又は他の任意の所望の抗原結合性断片を作出するのに使用され、例えば、下記において詳細に記載される通り、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む、任意の所望の宿主内において発現させうる。ＰＣＴ公開第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２（６）：８６４〜８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４：２６〜３４（１９９５）及びＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１〜１０４３（１９８８）において開示されている方法などの、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより作製する技法もまた利用されうる。単鎖Ｆｖ抗体を作製するのに使用されうる技法の例は、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６〜８８（１９９１）；Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７９９５〜７９９９（１９９３）及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３８〜１０４１（１９８８）において記載されている技法を含む。
【０２１９】
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングに対する代替法である、大型のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための、当技術分野において公知である、他の方法も、本発明の抗体の同定へと適用されうる。代替的発現系の１つの種類は、組換え抗体ライブラリーをＲＮＡ−タンパク質融合体として発現させた発現系であって、ＰＣＴ公開第９８／３１７００号（Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓ）並びにＲｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７〜１２３０２（１９９７）において記載されている発現系である。３’末端において、ペプチジルアクセプター抗生剤であるピューロマイシンを保有する、合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、この系の、ｍＲＮＡと、ｍＲＮＡがコードする、ペプチド又はタンパク質との間において、共有結合的融合が創出される。したがって、特異的ｍＲＮＡは、抗体又はこの部分の、二重特異性抗原への結合などの、コードされたペプチド又はタンパク質、例えば、抗体又はこの部分の特性に基づき、ｍＲＮＡの複合体混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から濃縮されうる。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された、抗体又はこの部分をコードする核酸配列は、上記された（例えば、哺乳動物の宿主細胞内の）組換え手段により発現され、さらに、突然変異が、当初選択された配列へと導入された、ｍＲＮＡ−ペプチド融合体のスクリーニングのさらなるラウンドにより、又は上記された、インビトロにおける、組換え抗体のアフィニティー成熟のための他の方法により、さらなるアフィニティー成熟にかけられうる。この方法論の好ましい例は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎディスプレイ技術である。
【０２２０】
別の手法において、抗体はまた、当技術分野において公知の酵母ディスプレイ法を使用しても作出されうる。酵母ディスプレイ法において、抗体ドメインを、酵母細胞壁へとテザリングし、それらを、酵母の表面上に提示するのに、遺伝子法が使用される。特に、このような酵母は、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウスの）から発現させた抗原結合性ドメインを提示するのに用いられうる。抗体を作るのに使用されうる、酵母ディスプレイ法の例は、参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第６，６９９，６５８号（Ｗｉｔｔｒｕｐら）において開示された酵母ディスプレイ法を含む。
【０２２１】
ｄ）組換えＵＣＨ−Ｌ１抗体の作製
抗体は、当技術分野において公知である、多数の技法のうちのいずれかにより作製されうる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターが標準的技法により宿主細胞へとトランスフェクトされた、宿主細胞からの発現である。「トランスフェクション」という用語の多様な形態は、外因性ＤＮＡの、原核宿主細胞又は真核宿主細胞への導入のために一般に使用されている、多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本発明の抗体を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現させることが可能であるが、そのような真核細胞（そして、特に、哺乳動物の細胞）は、原核細胞より、アセンブルし、適正にフォールディングさせられ、免疫学的に活性である抗体を分泌する可能性が高いため、抗体の、真核細胞内の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞内の発現が最も好ましい。
【０２２２】
本発明の組換え抗体を発現させるための、例示的な哺乳動物宿主細胞は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１〜６２１（１９８２）において記載されているようにＤＨＦＲ選択用マーカーと共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０（１９８０））において記載されている、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞へと導入される場合、抗体は、宿主細胞内の抗体の発現又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間にわたり、宿主細胞を培養することにより作製される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して、培養培地から回収されうる。
【０２２３】
宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を作製するのにも使用されうる。上記の手順に対する変動は、実施されうることが理解される。例えば、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖の機能的断片をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが所望されうる。組換えＤＮＡ技術はまた、目的の抗原への結合に必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するのにも使用されうる。また、このような切断型ＤＮＡ分子から発現させた分子も、本発明の抗体に包含される。加えて、１つの重鎖及び１つの軽鎖が、本発明の抗体（すなわち、ヒトＵＣＨ−Ｌ１に結合する抗体）であり、他の重鎖及び軽鎖が、ヒトＵＣＨ−Ｌ１以外の抗原に特異的である、二官能性抗体も、本発明の抗体を、標準的な化学的架橋法を介して、第２の抗体へと架橋することにより作製されうる。二官能性抗体はまた、二官能性抗体をコードするように操作された核酸を発現させることによっても作製されうる。
【０２２４】
本発明の抗体又はこの抗原結合性部分を組換え発現させるための好ましい系において、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介型トランスフェクションにより、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞へと導入される。組換え発現ベクター内において、高レベルの遺伝子の転写を駆動するように、抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子の各々が、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントへと作動的に連結される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサートによる選択／増幅を使用するベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も保有する。抗体の重鎖及び軽鎖の発現を可能とし、無傷抗体が培養培地から回収されるように、選択された形質転換体の宿主細胞が培養される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収するのに、標準的な分子生物学法が使用される。なお、さらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を、適切な培養培地中において培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。方法は、組換え抗体を、培養培地から単離するステップをさらに含みうる。
【０２２５】
（１）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又はこの変異体、誘導体、類似体若しくは部分でありうる。ヒト化抗体は、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体であって、非ヒト種に由来する、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する非ヒト種抗体に由来しうる。
【０２２６】
本明細書において使用された、ＣＤＲの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つであるが、典型的に２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）であって、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である可変ドメインの実質的に全てを含む。一態様に従い、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部も含む。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖、及び重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体はまた、重鎖の、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域及びＣＨ４領域も含みうる。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖だけを含有する。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖だけを含有する。具体的な実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖及び／又は重鎖のヒト化可変ドメインだけを含有する。
【０２２７】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む、免疫グロブリンの任意のクラス、並びに、限定なしに述べると、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、任意のアイソタイプから選択されうる。ヒト化抗体は、１つを超えるクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことが可能であり、特定の定常ドメインは、当技術分野において周知の技法を使用して、所望のエフェクター機能を最適化するように選択されうる。
【０２２８】
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲは、親配列に正確に対応する必要がない、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、この部位におけるＣＤＲ残基又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークに対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により突然変異誘発されうる。しかし、一実施形態において、このような突然変異は、広範にわたる突然変異ではない。通例、ヒト化抗体残基のうちの、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％は、親のＦＲ配列及びＣＤＲ配列の残基に対応する。本明細書において使用された「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサスの免疫グロブリン配列内のフレームワーク領域を指す。本明細書において使用された「コンセンサスの免疫グロブリン配列」という用語は、類縁の免疫グロブリン配列のファミリーにおいて、最も高頻度で発生するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成された配列（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８７）を参照されたい）を指す。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列内の各位置は、ファミリー内のこの位置において、最も高頻度で発生するアミノ酸により占有されている。２つのアミノ酸が、同等に高頻度で発生する場合、いずれもが、コンセンサス配列内に含まれうる。
【０２２９】
ヒト化抗体は、ヒトレシピエントにおける、これらの部分の治療適用の持続時間及び有効性を制限する、抗ヒト齧歯動物抗体に対する、望ましくない免疫応答を最小化するようにデザインされうる。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から、それへと導入された、１つ以上のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒト残基は、典型的に、可変ドメインから採取される、「インポート」残基と称されることが多い。ヒト化は、超可変領域配列を、ヒト抗体の対応する配列で置換することにより実施されうる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する、対応する配列により置換されたキメラ抗体である。例えば、その内容が、参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の相似部位に由来する残基により置換されたヒト抗体でありうる。本開示の抗体のヒト化又は操作は、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号及び同第４，８１６，５６７号において記載されている方法のようであるがこれらに限定されない、任意の公知の方法を使用して実施されうる。
【０２３０】
ヒト化抗体は、ＵＣＨ−Ｌ１に対する高アフィニティー及び他の好適な生物学的特性を保持しうる。ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列についての三次元モデルを使用して、親配列及び多様な概念的ヒト化産物を解析する工程により調製されうる。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能である。選択された候補免疫グロブリン配列の、可能な三次元コンフォメーション構造を例示及び提示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討は、残基の、候補免疫グロブリン配列の機能における鍵となる役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析を可能とする。このようにして、ＵＣＨ−Ｌ１に対するアフィニティーの上昇などの、所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基が、レシピエント及びインポート配列から選択され、組み合わされうる。一般に、超可変領域残基は、直接、かつ、最も実質的に、抗原結合への影響に関与しうる。
【０２３１】
ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体（本明細書において、「完全ヒト抗体」ともまた言及された）が作出されうる。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ及び／又は酵母関連技術を介して、ヒト抗体を、ライブラリーから単離することが可能である。また、トランスジェニック動物（例えば、免疫化すると、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全レパートリーを作製することが可能なマウス）を作製することも可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系列突然変異体マウスにおける、抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を結果としてもたらす。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異体マウスへの移入は、抗原投与時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす。ヒト化抗体又は完全ヒト抗体は、それらの各々の内容が、参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，７７０，４２９号；同第５，８３３，９８５号；同第５，８３７，２４３号；同第５，９２２，８４５号；同第６，０１７，５１７号；同第６，０９６，３１１号；同第６，１１１，１６６号；同第６，２７０，７６５号；同第６，３０３，７５５号；同第６，３６５，１１６号；同第６，４１０，６９０号；同第６，６８２，９２８号及び同第６，９８４，７２０号において記載されている方法に従い調製されうる。
【０２３２】
ｅ）抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体
抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体は、上記された技法を使用して、並びに、当技術分野において公知である、規定の技法を使用して作出されうる。一部の実施形態において、抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（型番：０３１３２０）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（型番：３５２４）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（型番：ＨＰＡ００５９９３）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（型番：ｓｃ−５８５９３又はｓｃ−５８５９４）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（型番：ＭＡＢ６００７）、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（型番：ＮＢ６００−１１６０）、Ｂｉｏｒｂｙｔ（型番：ｏｒｂ３３７１５）、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（型番：ＡＤＩ−９０５−５２０−１）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（型番：ＶＭＡ００００４）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（型番：６１３０−５０）、Ａｂｃａｍ（型番：ａｂ７５２７５又はａｂ１０４９３８）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（型番：４８００１２）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（型番：ＭＡ１−４６０７９、ＭＡ５−１７２３５、ＭＡ１−９０００８  、又はＭＡ１−８３４２８）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（型番：ＭＡＢＮ４８）、又はＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（型番：５０６９０−Ｒ０１１）から市販されているＵＣＨ−Ｌ１抗体などの非コンジュゲートＵＣＨ−Ｌ１抗体でありうる。抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体は、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（型番：６９６０−２５）又はＡｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（型番：ＯＡＡＦ０１９０４−ＦＩＴＣ）から市販されている、コンジュゲートＵＣＨ−Ｌ１抗体などのフルオロフォアへとコンジュゲートされうる。
【０２３３】
１３．方法の変化形
試料中に存在するＵＣＨ−Ｌ１の存在又は量を決定する、開示された方法は、上記された通りでありうる。方法はまた、解析物を解析するための他の方法を念頭に置いて、適合させられる場合もある。周知の変化形の例は、酵素による検出（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ））を含む、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、モノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード競合阻害イムノアッセイ及びリバース競合阻害イムノアッセイ）、酵素多重化イムノアッセイ法（ＥＭＩＴ）、競合結合アッセイなどのイムノアッセイ、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、ワンステップ抗体検出アッセイ、同種アッセイ、異種アッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイなどを含むがこれらに限定されない。
【０２３４】
ａ）イムノアッセイ
目的の解析物及び／又はペプチド若しくはこれらの断片（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１及び／又はペプチド若しくはこれらの断片、すなわち、ＵＣＨ−Ｌ１断片）は、ＵＣＨ−Ｌ１抗体を、イムノアッセイにおいて使用して解析されうる。解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の存在又は量は、抗体を使用し、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）への特異的結合を検出して決定されうる。例えば、抗体又はこの抗体断片は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に特異的に結合しうる。所望の場合、抗体のうちの１つ以上は、１つ以上の、市販のモノクローナル／ポリクローナル抗体と組み合わせて使用されうる。このような抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）などの企業から市販されている。
【０２３５】
体内試料中に存在する、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の存在又は量は、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、放射性同位元素の検出（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））及び酵素による検出（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含む、モノクローナル−モノクローナルサンドイッチイムノアッセイ、モノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）などのイムノアッセイを使用して、たやすく決定されうる。使用されうるポイントオブケアデバイスの例は、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）である。使用されうる、他の方法は、化学発光マイクロ粒子イムノアッセイ、特に、例として述べると、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動式解析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を利用する化学発光マイクロ粒子イムノアッセイを含む。他の方法は、例えば、質量分析及び解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に対する抗解析物（例えば、抗ＵＣＨ−Ｌ１）抗体（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトなど）又はこれらの抗体断片を使用する、免疫組織化学（例えば、組織生検に由来する切片を伴う）を含む。他の検出法は、例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号及び同第５，４８０，７９２号において記載されている検出法を含む。抗体の、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）への特異的免疫的結合は、抗体へと接合された、蛍光タグ又は発光タグ、金属及び放射性核種などの直接的標識を介して、又はアルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼなどの間接的標識を介して検出されうる。
【０２３６】
固定化された抗体又はこの断片の使用は、イムノアッセイへと組み込まれうる。抗体は、磁性粒子又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（マイクロ滴定プレートなど）の表面、固体基質材料の小片などの、様々な支持体へと固定化されうる。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイ内の抗体又は複数の抗体をコーティングすることにより調製されうる。次いで、このストリップは、被験試料へと浸漬させられ、有色スポットなどの、測定可能なシグナルを発生させるように、洗浄及び検出ステップを介して、速やかに処理されうる。
【０２３７】
同種フォーマットが使用されうる。例えば、被験試料が、対象から得られた後に、混合物が調製されうる。混合物は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）について評価される被験試料、第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーを含有する。混合物を形成するのに、被験試料、第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーが添加される順序は、それほど重要ではない。被験試料は、第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーと同時に接触される。一部の実施形態において、第１の特異的結合パートナーと、被験試料中に含有された、任意のＵＣＨ−Ｌ１とは、第１の特異的結合パートナー−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）抗原複合体を形成することが可能であり、第２の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナー−目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−第２の特異的結合パートナー複合体を形成しうる。一部の実施形態において、第２の特異的結合パートナーと、被験試料中に含有された、任意のＵＣＨ−Ｌ１とは、第２の特異的結合パートナー−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）抗原複合体を形成することが可能であり、第１の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナー−目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−第２の特異的結合パートナー複合体を形成しうる。第１の特異的結合パートナーは、抗解析物抗体（例えば、配列番号１の、少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに結合する抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体）でありうる。第２の特異的結合パートナーは、抗解析物抗体（例えば、配列番号１の、少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに結合する抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体）でありうる。さらに、第２の特異的結合パートナーは、上記された、検出可能な標識により標識されるか、又はこれを含有する。
【０２３８】
異種フォーマットが使用されうる。例えば、被験試料が、対象から得られた後に、第１の混合物が調製されうる。混合物は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）について評価される被験試料及び第１の特異的結合パートナーを含有し、この場合、第１の特異的結合パートナーと、被験試料中に含有された、任意のＵＣＨ−Ｌ１とは、第１の特異的結合パートナー−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）抗原複合体を形成する。第１の特異的結合パートナーは、抗解析物抗体（例えば、配列番号１の、少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに結合する抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体）でありうる。混合物を形成するのに、被験試料及び第１の特異的結合パートナーが添加される順序は、それほど重要ではない。
【０２３９】
第１の特異的結合パートナーは、固相上に固定化されうる。イムノアッセイにおいて使用される固相（第１の特異的結合パートナー、及び、任意選択的に、第２の特異的結合パートナー）は、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロ滴定プレート、キュベット、膜、足場形成分子、薄膜、濾紙、ディスク及びチップのようであるがこれらに限定されない、当技術分野において公知である、任意の固相でありうる。固相がビーズである実施形態において、ビーズは、磁気ビーズ又は磁性粒子でありうる。磁気ビーズ／磁性粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は磁性流体でありうる。例示的な強磁性材料は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ及びＮｉＯ／Ｆｅを含む。フェリ磁性材料の例は、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（又はＦｅＯ．Ｆｅ２Ｏ３）を含む。ビーズは、磁性であり、１つ以上の非磁性層により取り囲まれた固体コア部分を有しうる。代替的に、磁性部分は、非磁性コアの周囲の層でありうる。第１の特異的結合メンバーが固定化される固体支持体は、乾燥形態又は液体で保管されうる。磁気ビーズは、第１の特異的結合メンバーが固定化される磁気ビーズを伴う試料と接触させる前に、又はこの後で、磁界下に置かれうる。
【０２４０】
第１の特異的結合パートナー−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）抗原複合体を含有する混合物が形成された後に、当技術分野において公知である、任意の技法を使用して、任意の結合していない解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）が、複合体から除去される。例えば、結合していない解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）は、洗浄することにより除去されうる。しかし、被験試料中に存在する、全ての解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に、第１の特異的結合パートナーが結合するように、第１の特異的結合パートナーは、被験試料中に存在する、任意の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に対する過剰量において存在することが所望される。
【０２４１】
任意の結合していない解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）が除去された後に、第２の特異的結合パートナーが、混合物へと添加されて、第１の特異的結合パートナー−目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−第２の特異的結合パートナー複合体を形成する。第２の特異的結合パートナーは、抗解析物抗体（例えば、配列番号１の、少なくとも３連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに結合する抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体）でありうる。さらに、第２の特異的結合パートナーは、上記された、検出可能な標識により標識されるか、又は検出可能な標識を含有する。
【０２４２】
固定化された抗体又はこの断片の使用は、イムノアッセイへと組み込まれうる。抗体は、磁性粒子又はクロマトグラフィーマトリックス粒子（磁気ビーズなど）、ラテックス粒子又は表面修飾ラテックス粒子、ポリマー又はポリマー薄膜、プラスチック又はプラスチック薄膜、平面状基質、アッセイプレート（マイクロ滴定プレートなど）の表面、固体基質材料の小片などの様々な支持体へと固定化されうる。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイ内の抗体又は複数の抗体をコーティングすることにより調製されうる。次いで、このストリップは、被験試料へと浸漬させられ、有色スポットなどの、測定可能なシグナルを発生させるように、洗浄及び検出ステップを介して、速やかに処理されうる。
【０２４３】
（１）サンドイッチイムノアッセイ
サンドイッチイムノアッセイは、抗体（すなわち、少なくとも１つの捕捉抗体）と、検出抗体（すなわち、少なくとも１つの検出抗体）とからなる、２つの層の間の抗原の量を測定する。捕捉抗体及び検出抗体は、抗原、例えば、ＵＣＨ−Ｌ１などの、目的の解析物上の、異なるエピトープに結合する。捕捉抗体の、エピトープへの結合は、検出抗体の、エピトープへの結合に干渉しないことが所望される。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれも、サンドイッチイムノアッセイにおける、捕捉抗体及び検出抗体として使用されうる。
【０２４４】
一般に、少なくとも２つの抗体が、被験試料中の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を分離及び定量するのに利用される。より具体的に、少なくとも２つの抗体は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の、ある特定のエピトープに結合し、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成する。１つ以上の抗体が、被験試料中の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を捕捉する（これらの抗体は、しばしば、「捕捉」抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は「捕捉」抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と称する）のに使用される場合があり、１つ以上の抗体が、検出可能な（すなわち、定量可能な）標識を、サンドイッチに結合させるのに使用される（これらの抗体は、しばしば、「検出」抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は「検出」抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と称する）。サンドイッチアッセイにおいて、抗体の、そのエピトープへの結合は、アッセイ中の他の任意の抗体の、そのそれぞれのエピトープへの結合により減弱されない。抗体は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を含有することが推測される被験試料と接触された、１つ以上の第１の抗体が、第２の抗体又は後続の抗体により認識されるエピトープの全部又は一部に結合せず、これにより、１つ以上の第２の検出抗体が、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に結合する能力に干渉しないように選択される。
【０２４５】
抗体は、前記イムノアッセイ中の、第１の抗体として使用されうる。抗体は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）上のエピトープに免疫特異的に結合する。本開示の抗体に加えて、前記イムノアッセイは、第１の抗体により認識されない、又は第１の抗体が結合しないエピトープに免疫特異的に結合する、第２の抗体を含みうる。
【０２４６】
解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を含有することが推測される被験試料は、少なくとも１つの、第１の捕捉抗体（又は抗体）及び少なくとも１つの、第２の検出抗体と同時に、又は逐次的に接触されうる。サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、被験試料を含有することが推測される解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）はまず、第１の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）抗原複合体の形成を可能とする条件下で、特定のエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの、第１の捕捉抗体と接触される。１つを超える捕捉抗体が使用される場合、第１の複数の捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、被験試料に予測される解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の最大量に対するモル過剰量において使用される。例えば、マイクロ粒子コーティング緩衝液１ｍｌ当たり約５μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの抗体が使用されうる。
【０２４７】
ｉ．抗ＵＣＨ−Ｌ１捕捉抗体
任意選択的に、被験試料を、少なくとも１つの、第１の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１つの、第１の捕捉抗体は、第１の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）複合体の、被験試料からの分離を容易とする固体支持体に結合されうる。当技術分野において公知である、任意の固体支持体であって、ウェル、チューブ又はビーズ（マイクロ粒子など）の形態のポリマー材料から作られた固体支持体を含むがこれらに限定されない固体支持体が使用されうる。抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ（又はａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））は、そのような結合が、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に結合する抗体の能力に干渉しないという条件において、吸着により、化学的カップリング剤を使用する共有結合により、又は当技術分野において公知である他の手段により、固体支持体に結合されうる。さらに、必要な場合、固体支持体は、抗体上の多様な官能基との反応性を可能とするように、誘導体化されうる。このような誘導体化は、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのようであるがこれらに限定されない、ある特定のカップリング剤の使用を必要とする。
【０２４８】
その後、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を含有することが推測される被験試料は、第１の捕捉抗体（又は複数の抗体）−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）複合体の形成を可能とするためにインキュベートされる。インキュベーションは、約４．５〜約１０．０のｐＨ、約２℃〜約４５℃の温度において、少なくとも約１分間〜約１８時間、約２〜６分間、約７〜１２分間、約５〜１５分間又は約３〜４分間の時間にわたり実行されうる。
【０２４９】
ｉｉ．検出抗体
次いで、第１の／複数の捕捉抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）複合体の形成後、複合体は、少なくとも１つの、第２の検出抗体（第１の／複数の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）抗原−第２の抗体複合体の形成を可能とする条件下において）と接触される。一部の実施形態において、被験試料は、捕捉抗体と同時に、検出抗体と接触される。第１の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）複合体が、１つを超える検出抗体と接触される場合、第１の／複数の捕捉抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−複数の抗体検出複合体が形成される。少なくとも第２の（及び後続の）抗体が、第１の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）複合体と接触される場合、第１の抗体と同様に、上記された条件と同様の条件下におけるインキュベーション時間が、第１の／複数の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−第２の／複数の抗体複合体の形成に要求される。好ましくは、少なくとも１つの、第２の抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、第１の／複数の抗体−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−第２の／複数の抗体複合体の形成の前に、これと同時に、又はこの後に、少なくとも１つの、第２の抗体に結合されうる。当技術分野において公知である、任意の検出可能な標識が使用されうる。
【０２５０】
化学発光アッセイは、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、５７９（１）：６１〜６７（２００６）において記載されている方法に従い実施されうる。任意の適切なアッセイフォーマットが使用されうるが、マイクロプレート用化学発光測定器（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，ＬＬＣ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）は、小容量の複数の試料についてのアッセイを、迅速に可能とする。化学発光測定器は、９６ウェル黒色ポリスチレン製マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、型番：３７９２）を使用する、複数の試薬注入器を装備されうる。各試料が、個別のウェルへと添加されうるのに続き、利用されたアッセイの種類により決定される通り、他の試薬の同時的／逐次的な添加がなされうる。酸性化によるように、アクリジニウムアリールエステルを利用する、中性溶液中又は塩基性溶液中の擬塩基の形成は回避されることが所望される。次いで、化学発光応答が、ウェルごとに記録される。この点で、化学発光応答を記録するための時間は、部分的に、利用された試薬の添加と、特定のアクリジニウムの添加との間の遅延に依存する。
【０２５１】
化学発光アッセイのための混合物を形成するのに、被験試料及び特異的結合パートナーが添加される順序は、それほど重要ではない。第１の特異的結合パートナーが、アクリジニウム化合物により、検出可能に標識される場合、検出可能に標識された第１の特異的結合パートナー−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体が形成される。代替的に、第２の特異的結合パートナーが使用され、第２の特異的結合パートナーが、アクリジニウム化合物により、検出可能に標識される場合、検出可能に標識された第１の特異的結合パートナー−解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）−第２の特異的結合パートナー複合体が形成される。標識されたものであれ、標識されていないものであれ、結合していない任意の特異的結合パートナーは、洗浄などの、当技術分野において公知である、任意の技法を使用して、混合物から除去されうる。
【０２５２】
過酸化水素は、混合物中、インサイチューにおいて発生されうる、又は上記されたアクリジニウム化合物の添加の前に、これと同時に、又はこの後に、混合物へと施されうる、若しくは供給されうる。過酸化水素は、当業者に明らかであるような、多数の方式により、インサイチューにおいて発生されうる。
【０２５３】
代替的に、過酸化水素の供給源は、混合物へと、単純に添加されうる。例えば、過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含有することが公知である、１つ以上の緩衝液又は他の溶液でありうる。この点で、過酸化水素の溶液が、単純に添加されうる。
【０２５４】
少なくとも１つの塩基性溶液を、試料へと、同時的に、又はその後において添加したら、検出可能なシグナル、すなわち、ＵＣＨ−Ｌ１の存在を示す化学発光シグナルが発生する。塩基性溶液は、少なくとも１つの塩基を含有し、１０以上、好ましくは、１２以上のｐＨを有する。塩基性溶液の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、ナトリウム炭酸、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び重炭酸カルシウムを含むがこれらに限定されない。試料へと添加される塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度に依存する。使用された塩基性溶液の濃度に基づき、当業者は、試料へと添加される塩基性溶液の量を容易に決定しうる。化学発光標識以外の他の標識も利用されうる。例えば、酵素標識（アルカリホスファターゼを含むがこれに限定されない）が利用されうる。
【０２５５】
発生した化学発光シグナル又は他のシグナルは、当業者に公知の規定の技法を使用して検出されうる。発生したシグナルの強度に基づき、目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の、試料中の量が定量されうる。具体的に、目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の、試料中の量は、発生したシグナルの強度に比例する。存在する解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の量は、発生した光の量を、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）についての検量線と比較することにより、又は参照標準物質との比較により定量されうる。検量線は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）の公知の濃度の系列希釈液又は溶液を使用して、質量分析、重量測定法及び当技術分野において公知の他の技法により作成されうる。
【０２５６】
（２）フォワード競合阻害アッセイ
フォワード競合フォーマットにおいて、公知の濃度の、標識された目的の解析物（例えば、蛍光標識、切断可能なリンカーと接合されたタグなどを有する解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１））のアリコートが、被験試料中の目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）と、目的の解析物抗体（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１抗体）への結合について競合するように使用される。
【０２５７】
フォワード競合アッセイにおいて、固定化された特異的結合パートナー（抗体など）は、被験試料及び標識された目的の解析物、目的の解析物の断片又は目的の解析物の変異体と、逐次的に、又は同時に接触されうる。目的の解析物ペプチド、目的の解析物の断片又は目的の解析物の変異体は、切断可能なリンカーと接合されたタグから構成された、検出可能な標識を含む、任意の検出可能な標識により標識されうる。このアッセイにおいて、抗体は、固体支持体へと固定化されうる。代替的に、抗体は、マイクロ粒子又は平面状基質などの固体支持体上に固定化された、抗分子種抗体などの抗体へとカップリングされうる。
【０２５８】
標識された目的の解析物、被験試料及び抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットとの関連において、上記で記載された条件と同様の条件下においてインキュベートされる。次いで、抗体−目的の解析物複合体の、２つの異なる分子種が作出されうる。具体的に述べると、作出された抗体−目的の解析物複合体のうちの１つが、検出可能な標識（例えば、蛍光標識など）を含有するのに対し、他の抗体−目的の解析物複合体は、検出可能な標識を含有しない。抗体−目的の解析物複合体は、検出可能な標識の定量の前に、残りの被験試料から分離されうるが、そうされなくともよい。次いで、抗体−目的の解析物複合体が、残りの被験試料から分離されるのかどうかに関わらず、抗体−目的の解析物複合体内において検出可能な標識の量が定量される。次いで、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物、可溶性の目的の解析物、可溶性の目的の解析物の断片、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物又は可溶性の目的の解析物）の変異体又はこれらの任意の組合せなど）の、被験試料中濃度が、例えば、上記で記載された通りに決定されうる。
【０２５９】
（３）リバース競合阻害アッセイ
リバース競合アッセイにおいて、固定化された目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）は、被験試料及び少なくとも１つの標識された抗体と、逐次的に、又は同時に接触されうる。
【０２６０】
目的の解析物は、上記においてサンドイッチアッセイフォーマットとの関連において論じられた固体支持体などの固体支持体に結合される。
【０２６１】
固定化された目的の解析物、被験試料及び少なくとも１つの標識された抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットとの関連において、上記された条件と同様の条件下においてインキュベートされる。次いで、目的の解析物−抗体複合体の２つの異なる分子種が作出されうる。具体的に述べると、作出された目的の解析物−抗体複合体のうちの１つが、固定化され、検出可能な標識（例えば、蛍光標識など）を含有するのに対し、他の目的の解析物−抗体複合体は、固定化されず、検出可能な標識を含有しない。固定化されなかった目的の解析物−抗体複合体及び残りの被験試料は、洗浄などの、当技術分野において公知の技法を介して、固定化された目的の解析物−抗体複合体の存在から除去される。次いで、固定化されなかった目的の解析物−抗体複合体が除去されたら、タグの切断後に、固定化された、目的の解析物−抗体複合体内の、検出可能な標識の量が定量される。次いで、目的の解析物の、被験試料中濃度が、上記で記載された通り、検出可能な標識の数量を比較することにより決定されうる。
【０２６２】
（４）ワンステップイムノアッセイ又は「キャプチャーオンザフライ」アッセイ
キャプチャーオンザフライアッセイにおいて、固体基質は、固定化剤によりあらかじめコーティングされている。捕捉剤、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）及び検出剤が、固体基質へと併せて添加されるのに続き、検出の前に、洗浄ステップがなされる。捕捉剤は、解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に結合することが可能であり、固定化剤のためのリガンドを含む。捕捉剤及び検出剤は、本明細書において記載された、又は当技術分野で公知である、捕捉又は検出が可能な、抗体又は他の任意の部分でありうる。リガンドは、ペプチドタグを含むことが可能であり、固定化剤は、抗ペプチドタグ抗体を含みうる。代替的に、リガンド及び固定化剤は、キャプチャーオンザフライアッセイのために利用されるように、併せて結合することが可能な薬剤の任意の対（例えば、特異的結合対及び当技術分野で公知であるような他の対）でありうる。１つを超える解析物が測定されうる。一部の実施形態において、固体基質は、抗原によりコーティングされる場合があり、解析される解析物は、抗体である。
【０２６３】
ワンステップイムノアッセイ又は「キャプチャーオンザフライ」における、ある特定の、他の実施形態において、固定化剤（ビオチン、ストレプトアビジンなど）によりあらかじめコーティングされた固体支持体（マイクロ粒子など）並びに少なくとも第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバー（それぞれ、捕捉試薬及び検出試薬として機能する）が使用される。第１の特異的結合メンバーは、固定化剤のためのリガンド（例えば、固体支持体上の固定化剤が、ストレプトアビジンである場合、第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、ビオチンでありうる）を含み、また、目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）にも結合する。第２の特異的結合メンバーは、検出可能な標識を含み、目的の解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）に結合する。固体支持体並びに第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーは、被験試料へと（逐次的に、又は同時に）添加されうる。第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、固体支持体上の固定化剤に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー複合体を形成する。試料中に存在する、任意の目的の解析物は、固体支持体／第１の特異的結合メンバー複合体に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／解析物複合体を形成する。第２の特異的結合メンバーは、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／解析物複合体に結合し、検出可能な標識が検出される。検出の前に、任意選択の洗浄ステップが利用されうる。ワンステップアッセイにおける、ある特定の実施形態において、１つを超える解析物が測定されうる。ある特定の、他の実施形態において、２つを超える特異的結合メンバーが利用されうる。ある特定の、他の実施形態において、複数の検出可能な標識が添加されうる。ある特定の、他の実施形態において、複数の、目的の解析物が検出されうる、又はこれらの量、レベル若しくは濃度が、測定、決定若しくは評価されうる。
【０２６４】
キャプチャーオンザフライアッセイの使用は、本明細書において記載され、当技術分野において公知である、様々なフォーマットにおいてなされうる。例えば、フォーマットは、上記されたようなサンドイッチアッセイでありうるが、代替的に、競合アッセイであることも可能であり、単一特異性の結合メンバーを利用しうる、又は公知であるような、他の変化形も使用しうる。
【０２６５】
１４．キット
本明細書において、被験血液試料を、対象から得、被験試料を、ＵＣＨ−Ｌ１又はＵＣＨ−Ｌ１断片のレベルについてアッセイ又は評価するために使用されうるキットが提示される。本開示のキットは、血液試料を採取するための構成要素のパッケージを含みうる。限定せずに述べると、キットは、例えば、成人患者、若年患者、新生児患者及び外傷性脳損傷を患った可能性がある患者から、血液試料を得るために使用されうる。キットの構成要素は、意図された穿刺領域内の、対象の皮膚を除菌するための手段を含みうる。典型的かつ従来型の除菌手段は、一般にガーゼと称される織布片である。ガーゼは、好ましくは、その中に除菌剤を吸蔵させており、任意選択的に、把持部分へも取り付けられうる。好ましい除菌剤は、アルコールであるが、抗菌剤などの、他の除菌剤も使用されうる。適切な抗菌剤の例は、ビスグアニドであり、これらのうち、クロルヘキシジンが、公知の最良のメンバーである。クロルヘキシジンは、好ましくは、水溶液中又はアルコール溶液中の、可溶性塩として提供されうる。
【０２６６】
血流を開始するための皮膚穿刺手段は、従来型のランセットの場合もあり、注射針を含む、様々な従来型のデバイスのうちのいずれかの場合もある。注射針は、単一端型の場合もあり、両端型の場合もあり、任意のゲージ、好ましくは２１又は２３ゲージでありうる。注射針は、安全性スリーブを含む場合もあり、注射針ハブへと取り付けられる場合もあり、従来型のチューブホルダーと共に使用される場合もある。注射針はまた、バレル及びプランジャーを含む、従来型のシリンジアセンブリーの一部でもありうる。当技術分野で公知の通り、穿刺手段はまた、ウィングなどの把持手段を有する穿刺（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）注射針が、ハブ及びチュービングを介して、真空チューブの隔膜を穿刺（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）するための送達注射針へと接続された、従来型の血液回収セットの一部でもありうる。
【０２６７】
キットの保持手段は、例えば、シリンジバレルなどの、試料を受容するための、任意の種類の容器でありうる。好ましい保持手段は、開放端及び閉止端を有する、従来型のチューブ又はバイアルである。このようなチューブは、１００μｌ〜１０ｍＬの内部容量を有しうる。小型のチューブは、一般に、重力流により、極めて少量の血液を回収するために、ランセットと共に使用される。このようなチューブの代表的なものは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製の、Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（商標）ブランドのチューブである。キットのチューブはまた、開放端が、穿刺可能な隔膜又は止栓により覆われた真空チューブであって、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ製の、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ブランドのチューブなどの真空チューブでもありうる。真空チューブは、一般に、複数かつ大量の血液試料を回収するために、従来型のチューブホルダー及び血液回収セットと共に使用され、様々な従来型の血液解析用添加剤であって、抗凝固剤、凝固薬剤及び血清分離ゲルなどの血液解析用添加剤のうちのいずれかを含有しうる。例示的な抗凝固剤は、ヘパリンリチウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む場合があり、シリカ粒子を含みうる。保持手段はまた、試料が、イムノアッセイなどの解析のための試薬を含有する、ガラス又はプラスチック製のストリップ上へと直接流れ込まされる、検査用ストリップでもありうる。
【０２６８】
血液試料を採取するために、対象の皮膚が穿刺される場合、穿刺創傷は、通例、止血し、治癒時の創傷を保護するために覆われる。したがって、本発明のキットは、創傷を覆うさらなるガーゼ及び創傷の上を覆うガーゼを固定する接着剤などの手段を含みうる。現行の医療慣行に従い、キットは、静脈切開医と試料との接触を回避するための、使い捨て型の手袋を含みうる。血流を促進するために、キットはまた、止血帯も含みうる。
【０２６９】
キットの全ての成分は、好ましくは、キットの内容物が、保存のために、滅菌及び封止されうるように、密封可能なカバーを伴う、区画されたプラスチック製の筐体などのパッケージングにより供給されうる。
【０２７０】
キットは、被験試料を、ＵＣＨ−Ｌ１についてアッセイするための、少なくとも１つの構成要素、被験試料を、ＵＣＨ−Ｌ１についてアッセイするための指示書を含みうる。例えば、キットは、被験試料を、ＵＣＨ−Ｌ１について、イムノアッセイ、例えば、化学発光マイクロ粒子イムノアッセイによりアッセイするための指示書を含みうる。キット内に含まれる指示書は、パッケージング材料に貼付されうる、又はパッケージの添付文書として含まれうる。指示書は、典型的に、文書又は印刷物でありうるが、このようなものに限定されない。このような指示書を保存し、これらを末端使用者へと通信することが可能な、任意のメディアが、本開示により想定される。このようなメディアは、電子保存メディア（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学メディア（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用された「指示書」は、指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含みうる。少なくとも１つの構成要素は、ＵＣＨ−Ｌ１に特異的に結合する、１つ以上の単離抗体又はこれらの抗体断片を含む、少なくとも１つの組成物を含みうる。抗体は、ＵＣＨ−Ｌ１捕捉抗体及び／又はＵＣＨ−Ｌ１検出抗体でありうる。
【０２７１】
代替的に、又は、加えて、キットは、較正物質若しくは対照、例えば、精製され、任意選択的に、凍結乾燥させられたＵＣＨ−Ｌ１及び／又はアッセイを行うための、少なくとも１つの容器（例えば、抗ＵＣＨ−Ｌ１モノクローナル抗体により、あらかじめコーティングされうる、チューブ、マイクロ滴定プレート又はストリップ）及び／又はそれらのうちの一方が濃縮溶液、検出可能な標識（例えば、酵素標識）のための基質溶液若しくは停止溶液として提供されうる、アッセイ緩衝液若しくは洗浄緩衝液などの緩衝液を含みうる。好ましくは、キットは、アッセイを実施するのに必要な、全ての構成要素、すなわち、試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。指示書はまた、検量線を作成するための指示書も含みうる。
【０２７２】
キットは、ＵＣＨ−Ｌ１を定量するための参照標準物質をさらに含みうる。参照標準物質は、ＵＣＨ−Ｌ１濃度を内挿及び／又は外挿するための検量線を確立するのに利用されうる。参照標準物質は、高度のＵＣＨ−Ｌ１濃度レベル、例えば、約１０００００ｐｇ／ｍＬ、約１２５０００ｐｇ／ｍＬ、約１５００００ｐｇ／ｍＬ、約１７５０００ｐｇ／ｍＬ、約２０００００ｐｇ／ｍＬ、約２２５０００ｐｇ／ｍＬ、約２５００００ｐｇ／ｍＬ、約２７５０００ｐｇ／ｍＬ若しくは約３０００００ｐｇ／ｍＬ；中程度のＵＣＨ−Ｌ１濃度レベル、例えば、約２５０００ｐｇ／ｍＬ、約４００００ｐｇ／ｍＬ、約４５０００ｐｇ／ｍＬ、約５００００ｐｇ／ｍＬ、約５５０００ｐｇ／ｍＬ、約６００００ｐｇ／ｍＬ、約７５０００ｐｇ／ｍＬ若しくは約１０００００ｐｇ／ｍＬ及び／又は低度のＵＣＨ−Ｌ１濃度レベル、例えば、約１ｐｇ／ｍＬ、約５ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約１２．５ｐｇ／ｍＬ、約１５ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約２５ｐｇ／ｍＬ、約３０ｐｇ／ｍＬ、約３５ｐｇ／ｍＬ、約４０ｐｇ／ｍＬ、約４５ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約５５ｐｇ／ｍＬ、約６０ｐｇ／ｍＬ、約６５ｐｇ／ｍＬ、約７０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約８０ｐｇ／ｍＬ、約８５ｐｇ／ｍＬ、約９０ｐｇ／ｍＬ、約９５ｐｇ／ｍＬ若しくは約１００ｐｇ／ｍＬを含みうる。
【０２７３】
キット内に提供される、任意の抗体であって、ＵＣＨ−Ｌ１に特異的な組換え抗体などの抗体は、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの、検出可能な標識を組み込むことが可能である、又はキットは、抗体を標識付けするための試薬若しくは抗体（例えば、検出抗体）を検出するための試薬及び／又は解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を標識付けするための試薬若しくは解析物（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１）を検出するための試薬を含みうる。抗体、較正物質及び／又は対照は、個別の容器内に用意されうる、又は適切なアッセイフォーマット、例えば、マイクロ滴定プレートへとあらかじめ分注されうる。
【０２７４】
任意選択的に、キットは、品質管理のための構成要素（例えば、感度パネル、較正物質及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、当技術分野において周知であり、様々な免疫診断用生成物のための添付シート上に記載されている。感度パネルメンバーは、任意選択的に、アッセイ性能の特徴を確立するのに使用され、さらに、任意選択的に、イムノアッセイキット試薬の完全性及びアッセイの標準化についての、有用な指標である。
【０２７５】
キットはまた、任意選択的に、診断的アッセイを行うのに要求される、又は品質管理査定を容易とする、他の試薬であって、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの試薬も含みうる。被験試料の単離及び／又は処理のための緩衝液及び溶液（例えば、前処理試薬）などの、他の構成要素もまた、キットに含まれうる。加えて、キットは、１つ以上の他の対照も含みうる。キットの構成要素のうちの１つ以上は、凍結乾燥させられる場合があり、この場合、キットは、凍結乾燥させられた構成要素の復元に適する試薬をさらに含みうる。
【０２７６】
キットの多様な構成要素は、必要に応じて、任意選択的に、適切な容器、例えば、マイクロ滴定プレートにより提供される。キットは、試料を保持又は保存するための容器（例えば、尿試料、全血試料、血漿試料又は血清試料のための容器又はカートリッジ）をさらに含みうる。適切な場合、キットはまた、任意選択的に、反応槽、混合槽及び試薬又は被験試料の調製を容易とする他の構成要素も含有しうる。キットはまた、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーンなどの、被験試料を得る一助となるための、１つ以上の器具も含みうる。
【０２７７】
検出可能な標識が、少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステル、又はこれらの任意の組合せを含みうる。検出可能な標識が、少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットはまた、緩衝液、溶液及び／又は少なくとも１つの塩基性溶液などの、過酸化水素の供給源も含みうる。所望の場合、キットは、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロ滴定プレート、キュベット、膜、足場形成分子、薄膜、濾紙、ディスク又はチップなどの固相を含有しうる。
【０２７８】
所望の場合、キットは、単独で、又は被験試料を、外傷性脳損傷又は障害のバイオマーカーなどのバイオマーカーでありうる、別の解析物についてアッセイするための指示書とさらに組み合わせて、１つ以上の構成要素をさらに含みうる。
【０２７９】
本明細書において記載されたイムノアッセイにより、ＵＣＨ−Ｌ１の、被験試料中濃度を評価又は決定するためのキット（又はこの構成要素）並びに方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、同第２００４／００１８５７７号、同第２００５／００５４０７８号及び同第２００６／０１６０１６４号において記載されており、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）又はｉ−ＳＴＡＴ  Ａｌｉｎｉｔｙ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として市販されている、様々な自動式システム及び半自動式システム（固相がマイクロ粒子を含むシステムを含む）のほか、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号において記載されており、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）又はＡｂｂｏｔｔ  Ａｌｉｎｉｔｙデバイスのシリーズとして市販されているシステムにおける使用に適合させられうる。
【０２８０】
自動式システム又は半自動式システムの、非自動式システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した、一部の差違は、第１の特異的結合パートナー（例えば、解析物抗体又は捕捉抗体）が、接合された基質（サンドイッチの形成及び解析物の反応性に影響を及ぼしうる）並びに捕捉ステップ、検出ステップ及び／又は任意選択の洗浄ステップの長さ及びタイミングを含む。ＥＬＩＳＡなどの非自動式フォーマットが、試料及び捕捉試薬（例えば、約２時間）を伴う、比較的長いインキュベーション時間を要求しうるのに対し、自動式フォーマット又は半自動式フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及び任意の後継のプラットフォーム、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）の場合、約１８分間）を有しうる。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動式フォーマットが、コンジュゲート試薬などの検出抗体を、比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）にわたりインキュベートするのに対し、自動式フォーマット又は半自動式フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及び任意の後継のプラットフォーム）は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及び任意の後継のプラットフォームの場合、約４分間）を有しうる。
【０２８１】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている、他のプラットフォームは、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、米国特許第５，２９４，４０４号を参照されたい）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ並びに他のプラットフォームを含むがこれらに限定されない。加えて、アッセイ、キット及びキットの構成要素は、例えば、電気化学アッセイシステム又は他の携帯型アッセイシステム若しくはポイントオブケアアッセイシステム上の、他のフォーマットにおいて利用されうる。前述の通り、本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する、市販の、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学イムノアッセイシステムに適用可能である。イムノセンサー並びにこれらの製造法及び単回使用のための検査デバイスにおける動作については、例えば、参照によりこれに関するそれらの教示について本明細書に組み込まれた、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、同第２００４／００１８５７７号、同第２００５／００５４０７８号及び同第２００６／０１６０１６４号において記載されている。
【０２８２】
特に、アッセイの、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）システムへの適合に関して、以下の構成が好ましい。微細加工シリコンチップが、金製の電流測定用作業電極及び銀塩化銀基準電極の対と共に作製される。作業電極のうちの１つにおいて、捕捉抗体を固定化されたポリスチレンビーズ（直径を０．２μｍとする）が、電極上の、パターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングへと接着させられる。このチップが、イムノアッセイに適する流体フォーマットと共に、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジへとアセンブルされる。シリコンチップの部分に、それらのうちのいずれも、検出可能に標識されうる、１つ以上のＵＣＨ−Ｌ１抗体（ＵＣＨ−Ｌ１に結合しうる、１つ以上のモノクローナル／ポリクローナル抗体又はこれらの断片、これらの変異体又はこれらの変異体の断片）又は１つ以上の抗ＵＣＨ−Ｌ１ＤＶＤ−Ｉｇ（又はＵＣＨ−Ｌ１に結合しうる、これらの断片、これらの変異体又はこれらの変異体の断片）などの、ＵＣＨ−Ｌ１に対する特異的結合パートナーが存在する。カートリッジの流体パウチ内に、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬が存在する。
【０２８３】
作動時に、ＴＢＩを患うことが推測される対象に由来する試料が、検査カートリッジの保持チャンバーへと添加され、カートリッジが、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）リーダーへと挿入される。カートリッジ内のポンプエレメントが、試料を、チップを含有する導管へと押し出す。試料は、センサーと接触され、酵素コンジュゲートを、試料へと溶存させる。試料は、センサーにわたり振動させられて、約２〜１２分間にわたる、サンドイッチの形成を促進する。アッセイの最後から二番目のステップにおいて、試料は、廃液チャンバーへと押し出され、アルカリホスファターゼ酵素に対する基質を含有する洗浄液が、過剰量の酵素コンジュゲート及び試料を、センサーチップから洗い落とすのに使用される。アッセイの最後のステップにおいて、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールホスフェートと反応して、リン酸基を切断し、作業電極において、遊離ｐ−アミノフェノールを、電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づき、リーダーは、組み込まれたアルゴリズム及び工場において決定された較正曲線により、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を計算することが可能となる。
【０２８４】
本明細書において記載された方法及びキットは、必然的に、イムノアッセイを実行するための、他の試薬及び方法を包含する。例えば、当技術分野において公知であり、かつ／又は、コンジュゲート希釈剤及び／若しくは較正物質希釈剤として、例えば、洗浄用に、たやすく調製若しくは最適化され利用されうる、多様な緩衝液が包含される。例示的なコンジュゲート希釈剤は、ある特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において利用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッキング剤、抗微生物剤及び界面活性剤を含有する、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）コンジュゲート希釈剤である。例示的な較正物質希釈剤は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッキング剤及び抗微生物剤を含有する緩衝液を含む、ある特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において利用された、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ヒト較正物質希釈剤である。加えて、２００８年１２月３１日に出願された、米国特許出願第６１／１４２，０４８号において記載されている通り、シグナル発生の改善は、例えば、シグナル増幅剤としてのシグナル抗体へと連結された核酸配列を使用する、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジフォーマットにおいて得られうる。
【０２８５】
本明細書の、ある特定の実施形態は、外傷性脳損傷などの疾患を評価するのに利用されると有利であるが、アッセイ及びキットはまた、適宜、任意選択的に、他の疾患、障害及び状態におけるＵＣＨ−Ｌ１を評価するのにも利用されうる。
【０２８６】
アッセイ法はまた、外傷性脳損傷などの疾患を改善する化合物を同定するのにも使用されうる。例えば、ＵＣＨ−Ｌ１を発現する細胞は、候補化合物と接触されうる。本明細書において記載されたアッセイ法を使用して、化合物と接触された細胞内の、ＵＣＨ−Ｌ１の発現レベルは、対照細胞内の発現レベルと比較されうる。
【実施例】
【０２８７】
１５．実施例
当業者に、本明細書において記載された、本開示の方法の、他の適切な改変及び適合は、たやすく適用可能かつ認識可能であり、本開示の範囲又は本明細書において開示された態様及び実施形態から逸脱しない限りにおいて、適切な同等物を使用してなされうることが容易に明らかとなる。さて、本開示について詳細に記載してきたが、これは、本開示の実施形態の、一部の態様を例示することだけを意図するものであり、本開示の範囲に対して限定的であると考えられるべきではない、以下の例を参照することにより、より明確に理解される。本明細書において言及された、全ての雑誌の参考文献、米国特許及び刊行物の開示は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている。
【０２８８】
本発明は、以下の非限定例により例示された、複数の態様を有する。
【０２８９】
［実施例１］
ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）ＵＣＨ−Ｌ１アッセイ
開発中のｉ−ＳＴＡＴ  ＵＣＨ−Ｌ１アッセイを、本明細書において記載された例において使用した。しかし、本明細書において記載された本開示を使用して、同じ抗体又は異なる抗体を使用する、任意のＵＣＨ−Ｌ１アッセイを改善しうることが理解される。捕捉モノクローナル抗体としての抗体Ａ及び検出モノクローナル抗体としての抗体Ｂ及び抗体Ｃなどのモノクローナル抗体対を使用した。抗体Ａは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）社内において開発された、例示的な抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体である。Ｂａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（Ａｌａｃｈｕａ、Ｆｌｏｒｉｄａ）により開発された、抗体Ｂ及び抗体Ｃは、ＵＣＨ−Ｌ１の異なるエピトープを認識し、試料中の抗原の検出を増強する。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）社内において開発された、又は文献において記載された、他の抗体もまた、捕捉抗体又は検出抗体として、多様な組合せにおいて、併せて使用された場合に、同様のシグナルの増強を示す、又はこれを示すことが期待されている。ＵＣＨ−Ｌ１アッセイデザインを、鍵となる性能属性に対して査定した。カートリッジ構成は、抗体構成：抗体Ａ（捕捉抗体）／抗体Ｂ＋Ｃ（検出抗体）；試薬条件：０．８％の固体、１２５μｇ／ｍＬのＦａｂアルカリホスファターゼクラスターコンジュゲート及び試料注入口の印字：ＵＣＨ−Ｌ１標準物質であった。アッセイ時間は、１０〜１５分間（試料捕捉時間を７〜１２分間とする）であった。
【０２９０】
［実施例２］
ＵＣＨ−Ｌ１の、全血中の安定性
ＵＣＨ−Ｌ１の、血液試料中の安定性は、頭部への損傷を受けていない、又はＵＣＨ−Ｌ１に関する疾患若しくは障害を有すると診断されていない対象（「正常」対象）が、ＵＣＨ−Ｌ１の、測定可能な全血試料中レベルを有するという観察により査定した。ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）プラットフォームを使用して、細胞を、血漿部分から、あらかじめ分離せずに、全血中のＵＣＨ−Ｌ１を測定した。結果を、図１Ａ〜１Ｂに示す。
【０２９１】
正常対象に由来する全血中の内因性ＵＣＨ−Ｌ１抗原の安定性を理解するように、初期実験をデザインした。血液は、承認された、治験審査委員会による研究プロトコールに従い、５例の正常ドナーから、ＥＤＴＡ回収チューブへと採取し；各参加者は、説明同意文書を提出した。血液は、室温において、２４時間にわたり持続的に混合し、回収／混合の後、１時間、４時間、８時間及び２４時間の時点において検査した。各時点において、少量の血液を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）ＬｏＢｉｎｄチューブへと移し、各時点において、対応する血漿を検査するように、遠心分離した。
【０２９２】
図１Ａ〜１Ｂ（それぞれ、ＵＣＨ−Ｌ１レベル及びベースラインに対するパーセントとしてのＵＣＨ−Ｌ１レベル）において裏付けられた通り、全血試料の各々について、各時点及び２４時間後におけるＵＣＨ−Ｌ１濃度は上昇した。加えて、加えて、２４時間中（例えば、検査時間中の全時間中を意味する）、持続的に混合された、全血試料の各々について、ＵＣＨ−Ｌ１濃度の有意な上昇が見られた。各ドナーについて、実験を開始した時点（例えば、全血を得た、第１の検査時点であるベースライン）からの差違を、図１Ｂに示す。
【０２９３】
［実施例３］
ＵＣＨ−Ｌ１の、血漿中の安定性
ＵＣＨ−Ｌ１の、血漿試料中の安定性は、正常対象において査定した（図２Ａ〜２Ｂ）。上記の実施例１において論じた、これらの時点の各々において分離された、対応する血漿のＵＣＨ−Ｌ１濃度（図１Ａ〜１Ｂ）は、同様の結果を示した。血液は、承認された、治験審査委員会による研究プロトコールに従い、５例の正常ドナーから、ＥＤＴＡ回収チューブへと採取し；各参加者は、説明同意文書を提出した。血液は、室温において、２４時間にわたり持続的に混合し、回収／混合の後、１時間、４時間、８時間及び２４時間の時点において検査した。各時点において、少量の血液を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）ＬｏＢｉｎｄチューブへと移し、各時点において、対応する血漿を検査するように、遠心分離した。図２Ａに示す通り、血漿を、全血から分離しなかった場合、試料を、混合デバイスから取り出し、ＵＣＨ−Ｌ１評価のために処理するまでの２４時間にわたり、血漿値は、２〜５倍に上昇した。これらの実験において使用した持続的混合は、溶血が、ＵＣＨ−Ｌ１の測定値に影響を及ぼす、重要な因子でありうることを指し示す。
【０２９４】
図２Ａ〜２Ｂ（それぞれ、ＵＣＨ−Ｌ１レベル及びベースラインに対するパーセントとしてのＵＣＨ−Ｌ１レベル）において裏付けられた通り、血漿試料の各々について、時間中に全血として保存された場合、各時点及び２４時間後におけるＵＣＨ−Ｌ１の濃度は上昇した。加えて、２４時間中、持続的に混合された、全血試料の各々について、ＵＣＨ−Ｌ１濃度の有意な上昇が見られた。各ドナーについて、実験を開始した時点（ベースライン）からの差違を、図２Ｂに示す。
【０２９５】
［実施例４］
抗凝固剤の、ＵＣＨ−Ｌ１安定性に対する影響
正常対象に由来する全血試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１の安定性に対する、抗凝固剤の影響について探索するために、実験を行った。血液を、４例のドナーから、ヘパリンＬｉ／ＥＤＴＡ／血清チューブに回収した。ＥＤＴＡ／ヘパリンリチウム（Ｌｉ）全血試料を、２ｍＬのチューブへと、迅速にアリコート分割し、これらの試料を、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについて処理及び検査する前に、室温及び２〜８℃において、２時間、６時間、２４時間及び４８時間にわたり、定常状態に保った。各時点において、全血試料（図３Ａ〜３Ｂ）及び対応する血漿試料（表２）を、ＵＣＨ−Ｌ１濃度について評価した。検査の前に、全血試料を、倒立により（約１０回（所要時間：６０秒間未満））混合した。
【０２９６】
室温のヘパリンＬｉチューブ内において処理された全血試料に由来するＵＣＨ−Ｌ１の、２〜８℃と比較した安定性を、図３Ａに示す。室温において、定常状態に保存した場合、ＵＣＨ−Ｌ１の、全血試料中濃度は、試料を得た後、少なくとも初期の２４時間にわたり、安定（＜１０％の変化）であった。しかし、同じドナーに由来する全血試料によるＵＣＨ−Ｌ１濃度は、２〜８℃において、最初の約６時間までに限り安定であり；２４時間後及び４８時間後の、試料４例中３例において、少なくとも約１０％の差違（ＵＣＨ−Ｌ１レベルの上昇）が見られた（図３Ａ）。下記の表２を参照されたい。
【０２９７】
室温のＥＤＴＡチューブ内において処理された全血試料に由来するＵＣＨ−Ｌ１の、２〜８℃と比較した安定性を、図３Ｂに示す。室温において、定常状態に保存した場合、ＵＣＨ−Ｌ１の、全血試料中濃度は、試料を得た後、少なくとも初期の６時間にわたり、安定（＜１５％の変化）であった。しかし、２４時間後及び４８時間後において検査された同じドナーに由来する全血試料によるＵＣＨ−Ｌ１濃度は、２〜８℃における保存が、ＵＣＨ−Ｌ１の安定性を、室温における保存と比較して改善することを示した。２〜８℃において保存された試料の濃度に、約２０％未満の差違が見られたのに対し、室温において保存された全血は、初期濃度を、最大約２００％超える、ＵＣＨ−Ｌ１濃度の上昇を示した（図３Ｂ）。下記の表２を参照されたい。
【０２９８】
【表２】
2020526745.tif 000004
【０２９９】
室温のＥＤＴＡ／ヘパリンＬｉチューブ内において処理された、対応する血漿試料に由来するＵＣＨ−Ｌ１の、２〜８℃と比較した安定性を、下記の表３に示す。各時点において、被験全血試料の各々について、対応する血漿試料を単離し、速やかに検査して、血漿試料中のばらつきを査定した。血漿試料中において観察された、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度値及び差違は、全血中の結果と、極めて類似した（図３Ａ〜３Ｂ）ことから、２４時間後及び４８時間における、ＵＣＨ−Ｌ１濃度の上昇に寄与する因子は、試料処理の解析前フェーズ（すなわち、血液試料を得た後及び／又は保存時）に関与する可能性が高く、試薬によって変動しなかったことが指し示される。
【０３００】
【表３】
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【０３０１】
表２及び３における結果は、いずれの試料型（全血及び血漿）においても、ある程度のドナー間のばらつきが見られるので、ヘパリンＬｉ／ＥＤＴＡチューブが、同様の影響を示すことを示す。しかし、表２及び３における結果は、温度に関わらず（すなわち、室温又は２〜８℃において）、保存時に、試料を定常状態に保つこと（すなわち、実施例２において示した持続的混合を行わないこと）により、混合の量を低減する場合における、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中レベルの安定性の改善を裏付ける。このような試料（例えば、持続的に混合されない試料）を、２〜８℃の温度において保存する場合、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中レベルの安定性の、さらなる改善が示される（このような試料は、対象から得られた後、２４〜４８時間以下において安定である）。
【０３０２】
［実施例５］
ＵＣＨ−Ｌ１の、血漿中及び血清中の安定性
正常ドナーから全血試料を得た直後に単離した血漿試料中及び血清試料中の、ＵＣＨ−Ｌ１の安定性を、全血試料を混合にかけ、かつ／又は室温若しくは２〜８℃において保存した後で単離した場合の安定性と対比して評価するために、実験を行った。新鮮な血清及び血漿を、実験の開始の前に（時点０において）分離した。次いで、試料をアリコート分割し、室温又は２〜８℃において保存した。各時点において（採血の０時間、２時間、８時間、２４時間及び４８時間後に）、血漿のアリコートを混合し、ＵＣＨ−Ｌ１レベルについて検査した。
【０３０３】
図４Ａ（室温）及び４Ｂ（２〜８℃）に示す通り、ＵＣＨ−Ｌ１は、血液試料を得、ＥＤＴＡチューブを使用して、血漿を分離した後、初期のわずか数時間にわたり安定であり、室温における、ＵＣＨ−Ｌ１の、血漿中の安定性に、２〜８℃と比較した有意差は見られなかった。図５Ａ（室温）及び５Ｂ（２〜８℃）において、ヘパリンＬｉチューブの使用は、ＥＤＴＡチューブと比較して、著明に異なる結果をもたらさなかった。加えて、図６Ａ（室温）及び６Ｂ（２〜８℃）に示す通り、血清を単離するための、血清チューブの使用及びＵＣＨ−Ｌ１レベルについての検査は、血漿試料と比較して、著明に異なる結果をもたらさなかった。
【０３０４】
これらの結果は、ＵＣＨ−Ｌ１濃度が、２４及び４８時間後に上昇した、全血試料についての上記の結果と対照的であることから、全血試料は、同じ処理条件に対して、血漿試料及び血清試料と異なる形で反応することが指し示される。具体的に、これらの結果は、全血試料（例えば、これらの試料との混合は、回避すべきであり、これらの試料は、２〜８℃で保存すべきである）に関して、試料操作が重要であることを示す。
【０３０５】
［実施例６］
ＵＣＨ−Ｌ１の、血清中の安定性に対する、凝血塊形成の影響
血清とは、凝血塊及び凝固因子が形成された後で単離された、全血の液体部分（すなわち、凝固因子を伴わない血漿）である。一般に、試料を遠心分離して、血清を分離しうる前に、室温の全血試料中において、凝血塊が形成するには、約３０〜６０分間を要する。凝固過程において、細胞は、溶解することが可能であり、これは、血清中の、細胞成分の放出を結果としてもたらしうる。血清が、凝血塊へと曝露される場合に、凝血塊が、血清の成分に対して及ぼしうる影響を査定するために、４例の正常ドナーに由来する、チューブ２本の血液を、標準的な血清チューブ内に回収した。血清を、１本のチューブから単離し、各ドナーについて、第２のチューブへと移した。第２のチューブを、室温において、８時間にわたり、定常状態に保ち、凝血塊を伴う、第２のチューブからの血清を、８時間後に分離し、検査した。
【０３０６】
図７に示す通り、ＵＣＨ−Ｌ１濃度は、血清を、凝血塊から分離しなかった場合より、高濃度であった。ＵＣＨ−Ｌ１濃度は、各試料について、少なくとも３０％高濃度であったことから、ＵＣＨ−Ｌ１の、凝血塊から血清への、放出の可能性が指し示される。
【０３０７】
別の実験において、新鮮な血清及び血漿を、回収から１時間以内に、全血から単離し、別個のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）ＬｏＢｉｎｄチューブへとアリコート分割し、各アリコートを、ＲＴ又は２〜８℃において保存した。全血試料から単離された、未混合の血漿及び血清の安定性を査定するように、血漿及び血清のアリコートを、２時間、８時間、２４時間及び４８時間後において検査した。下記の表４は、血漿試料の濃度を、４例のドナーの各々について、時間経過にわたり示す。ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中レベルは、２〜８℃において、８時間以下にわたり、ＲＴにおいて、２時間以下にわたり比較的安定であった。しかし、全血の安定性結果と異なり、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度は、全ての試料型について、いずれの温度においても、時間と共に低下したことから、ＵＣＨ−Ｌ１の、全血試料中レベルの上昇は、血液の細胞成分の存在に起因したことが示唆される。まとめると、これらの結果は、全血試料（例えば、これらの試料との混合は、回避すべきであり、これらの試料は、２〜８℃で保存すべきである）に関して、試料操作が極めて重要であることを示す。これに対し、血漿及び血清を、細胞／凝血塊から分離すれば、これらの試料は、８時間以下の良好な安定性を示す。
【０３０８】
【表４】
2020526745.tif 000006
【０３０９】
［実施例７］
ＵＣＨ−Ｌ１の安定性に対する、溶血の寄与
干渉研究の査定は、溶血物を、ＵＣＨ−Ｌ１低パネルへとスパイクした場合に、溶血物中に存在する成分が、ＵＣＨ−Ｌ１リーディングの上昇の原因である可能性を指し示した（データは示さない）。また、このＵＣＨ−Ｌ１「干渉」シグナルを、イムノアッセイにおいて使用された、抗ＵＣＨ−Ｌ１捕捉抗体の添加により、特異的に低減しうることも示されたが、非特異的マウスＩｇＧは、対照として添加したところ、差違を示さなかった。
【０３１０】
溶血物の干渉の可能性について検査するために、４例の正常ドナー対象に由来する、チューブの底部からの濃厚赤血球（ＲＢＣ）を使用して、４つの溶血物を調製した。底部からの細胞の除去は、これらの溶血物中のバフィーコートの量を最小化しようとする試みであった。濃厚ＲＢＣを、生理食塩液により、反復洗浄し、凍結により溶解させて、溶血物溶液を作出した。この溶血物溶液の小部分を、熱処理されたＥＤＴＡ血漿（約１０ｐｇ／ｍＬのＵＣＨ−Ｌ１を含有する）へと添加し、シグナルの変化を査定するように検査した。
【０３１１】
各溶血物を、３つのヘモグロビン濃度（０．７５、０．５０及び０．２５ｇ／ｄＬ）をターゲティングするＥＤＴＡ血漿プールへとスパイクし、ＵＣＨ−Ｌ１アッセイを使用して、試料を検査した。これらの試料の各々についてのヘモグロビンレベルを、血液解析器上において測定した。スパイキング時及び測定時において、当技術分野で公知の通り、試料を、２０〜３０分間にわたり混合した。図８は、ＵＣＨ−Ｌ１の濃度差を、ヘモグロビン濃度の関数として示す。加えて、図９は、３例の正常ドナーに由来する全血試料であって、組換えＵＣＨ−Ｌ１をスパイクされた全血試料が、時間経過にわたり、ＵＣＨ−Ｌ１の、同じ上昇を呈示しなかったことを示す。これらのデータは、上記で記載した、ＵＣＨ−Ｌ１の、全血中レベルの上昇が、ベースラインのＵＣＨ−Ｌ１濃度が比較的低濃度である対象において明らかであることを指し示す。
【０３１２】
前出の詳細な記載及び付属の実施例は、例示的なものであるに過ぎず、併載の特許請求の範囲及びそれらの均等物だけによって規定される、本発明の範囲に対する限定として理解されないものとすることが理解される。
【０３１３】
開示された実施形態に対する、多様な変化及び改変が、当業者に明らかである。この精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、限定せずに述べると、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤又は本発明の使用法に関する変化及び改変を含む、このような変化及び改変がなされうる。
【０３１４】
完全を期するため、本発明の多様な態様は、以下の番号付けされた条項に明示される。
【０３１５】
条項１．対象から得られた全血試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）の量を測定する方法の改善であって、試料の保存から生じるＵＣＨ−Ｌ１レベルの上昇を回避するように、試料が対象から得られた後、約８時間以内に、試料を処理するステップを含む改善。
【０３１６】
条項２．試料が対象から得られた後、（ａ）約０時間〜約６時間；（ｂ）約０時間〜約４時間；（ｃ）約０時間〜約２時間；及び（ｄ）約０時間〜約１時間からなる群から選択される時間以内に、試料が処理される、条項１に記載の改善。
【０３１７】
条項３．試料が対象から得られた後、（ａ）約１時間〜約８時間；（ｂ）約１時間〜約６時間；（ｃ）約１時間〜約４時間；及び（ｄ）約１時間〜約２時間からなる群から選択される時間以内に、試料が処理される、条項１に記載の改善。
【０３１８】
条項４．試料を処理するステップが、試料中の血液細胞から、血漿を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の量を測定する、血漿を使用する検査を実施することとを含む、条項１〜３のいずれか一項に記載の改善。
【０３１９】
条項５．試料が、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、対象から得られる、条項１〜４のいずれか一項に記載の改善。
【０３２０】
条項６．試料を処理するステップが、試料中の任意の凝血塊から、血清を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の量を測定する、血清を使用する検査を実施することとを含む、条項１〜４のいずれか一項に記載の改善。
【０３２１】
条項７．試料が、血清回収チューブを使用して回収される、条項６に記載の改善。
【０３２２】
条項８．試料を処理するステップが、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定する検査を実施することを含む、条項１〜３のいずれか一項に記載の改善。
【０３２３】
条項９．検査が、ＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる、任意の方法を含む、条項４〜８のいずれか一項に記載の改善。
【０３２４】
条項１０．検査が、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択される、条項９に記載の改善。
【０３２５】
条項１１．検査が、臨床化学フォーマットにおいて利用される、条項４〜１０のいずれか一項に記載の改善。
【０３２６】
条項１２．検査が、試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び（２）検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びにＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定することを含むイムノアッセイである、条項１０又は１１に記載の改善。
【０３２７】
条項１３．試料が対象から得られた時点〜検査が実施される時点の、ある時間にわたり、試料が、室温において維持される、条項４〜１２のいずれか一項に記載の改善。
【０３２８】
条項１４．試料が対象から得られた時点〜検査が実施される時点の、ある時間にわたり、試料が、約２℃〜約８℃の温度において維持される、条項４〜１２のいずれか一項に記載の改善。
【０３２９】
条項１５．試料が対象から得られた後〜検査が実施される時点の時間において、試料が混合されない、条項８〜１２のいずれか一項に記載の改善。
【０３３０】
条項１６．対象に由来する、試料中のＵＣＨ−Ｌ１の量が、外傷性脳損傷の尺度として評価され、対象が、頭部への損傷を負った可能性がある、条項１〜１５のいずれか一項に記載の改善。
【０３３１】
条項１７．全血試料が、対象から得られた時点から、試料に対して、アッセイを実施する前までの間の、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避又は防止する方法であって、アッセイを実施する前に、試料の保存から生じるＵＣＨ−Ｌ１レベルの増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）すなわち上昇（ｒｉｓｅ）を回避するように、試料が対象から得られた後、約８時間以内に、試料を処理するステップを含む方法。
【０３３２】
条項１８．試料が対象から得られた時点から、アッセイを実施する前までの間の、試料中のＵＣＨ−Ｌ１の、誤った高レベルを回避又は防止する、条項１７に記載の方法。
【０３３３】
条項１９．試料が対象から得られた後、（ａ）約０時間〜約６時間；（ｂ）約０時間〜約４時間；（ｃ）約０時間〜約２時間；及び（ｄ）約０時間〜約１時間からなる群から選択される時間以内に、試料が処理される、条項１７に記載の方法。
【０３３４】
条項２０．試料が対象から得られた後、（ａ）約１時間〜約８時間；（ｂ）約１時間〜約６時間；（ｃ）約１時間〜約４時間；及び（ｄ）約１時間〜約２時間からなる群から選択される時間以内に、試料が処理される、条項１７に記載の方法。
【０３３５】
条項２１．その後、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定するアッセイを実施するステップをさらに含む、条項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０３３６】
条項２２．試料を処理するステップが、試料中の血液細胞から、血漿を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定する、血漿を使用するアッセイを実施することとを含む、条項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０３３７】
条項２３．試料が、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、対象から得られる、条項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０３３８】
条項２４．試料を処理するステップが、試料中の任意の凝血塊から、血清を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定する、血清を使用するアッセイを実施することとを含む、条項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０３３９】
条項２５．試料が、血清回収チューブを使用して回収される、条項２４に記載の方法。
【０３４０】
条項２６．アッセイが、ＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる、任意の方法を含む、条項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【０３４１】
条項２７．アッセイが、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択される、条項２６に記載の方法。
【０３４２】
条項２８．アッセイが、臨床化学フォーマットにおいて利用される、条項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【０３４３】
条項２９．アッセイが、
ａ）試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、
（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び
（２）検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体
と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びに
ｂ）ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定すること
を含むイムノアッセイである、条項２７に記載の方法。
【０３４４】
条項３０．試料が対象から得られた時点と、アッセイが実施される時点との間の、ある時間にわたり、試料が、室温において維持される、条項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０３４５】
条項３１．試料が対象から得られた時点と、アッセイが実施される時点との間の、ある時間にわたり、試料が、約２℃〜約８℃の温度において維持される、条項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０３４６】
条項３２．試料が対象から得られた時点と、検査が実施される時点との間の時間において、試料が混合されない、条項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０３４７】
条項３３．対象に由来する、試料中のＵＣＨ−Ｌ１の量が、外傷性脳損傷の尺度として評価され、対象が、頭部への損傷を負った可能性がある、条項１７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【０３４８】
条項３４．対象から得られた全血試料中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−Ｌ１）の量を測定する方法の改善であって、解析前の処理条件を制御することにより、ＵＣＨ−Ｌ１測定値の誤差を低減することを含む改善。
【０３４９】
条項３５．解析前の処理条件を制御することが、試料が対象から得られた後、約８時間以内に、試料を処理することを含む、条項３４に記載の改善。
【０３５０】
条項３６．試料が対象から得られた後、（ａ）約０時間〜約６時間；（ｂ）約０時間〜約４時間；（ｃ）約０時間〜約２時間；及び（ｄ）約０時間〜約１時間からなる群から選択される時間以内に、試料が処理される、条項３５に記載の改善。
【０３５１】
条項３７．試料が対象から得られた後、（ａ）約１時間〜約８時間；（ｂ）約１時間〜約６時間；（ｃ）約１時間〜約４時間；及び（ｄ）約１時間〜約２時間からなる群から選択される時間以内に、試料が処理される、条項３５に記載の改善。
【０３５２】
条項３８．試料を処理するステップが、試料中の血液細胞から、血漿を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の量を測定する、血漿を使用する検査を実施することとを含む、条項３５〜３７のいずれか一項に記載の改善。
【０３５３】
条項３９．試料が、ヘパリン及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤を含む容器を使用して、対象から得られる、条項３４〜３８のいずれか一項に記載の改善。
【０３５４】
条項４０．試料を処理するステップが、試料中の任意の凝血塊から、血清を分離することと；その後、ＵＣＨ−Ｌ１の量を測定する、血清を使用する検査を実施することとを含む、条項３５〜３９のいずれか一項に記載の改善。
【０３５５】
条項４１．試料が、血清回収チューブを使用して回収される、条項４０に記載の改善。
【０３５６】
条項４２．試料を処理するステップが、ＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量を測定する検査を実施することを含む、条項３５〜４０のいずれか一項に記載の改善。
【０３５７】
条項４３．検査が、ＵＣＨ−Ｌ１の量が評価されうる、任意の方法を含む、条項３８〜４１のいずれか一項に記載の改善。
【０３５８】
条項４４．検査が、イムノアッセイ、化学分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析、電気泳動解析、タンパク質アッセイ、競合的結合アッセイ、機能的タンパク質アッセイ、クロマトグラフィー、並びに分光法からなる群から選択される、条項４３に記載の改善。
【０３５９】
条項４５．検査が、臨床化学フォーマットにおいて利用される、条項３８〜４４のいずれか一項に記載の改善。
【０３６０】
条項４６．検査が、試料を、同時に、又は任意の順序において逐次的に、（１）ＵＣＨ−Ｌ１上又はＵＣＨ−Ｌ１断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原複合体を形成する、少なくとも１つの捕捉抗体、及び（２）検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合していないＵＣＨ−Ｌ１上のエピトープに結合して、ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体を形成する、少なくとも１つの検出抗体と接触させることにより、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体が形成されること、並びにＵＣＨ−Ｌ１の、試料中量又は試料中濃度を、捕捉抗体−ＵＣＨ−Ｌ１抗原−検出抗体複合体内の検出可能な標識により発生したシグナルに基づき測定することを含むイムノアッセイである、条項４４又は４５に記載の改善。
【０３６１】
条項４７．試料が対象から得られた時点〜検査が実施される時点の、ある時間にわたり、試料が、室温において維持される、条項３８〜４６のいずれか一項に記載の改善。
【０３６２】
条項４８．試料が対象から得られた時点〜検査が実施される時点の、ある時間にわたり、試料が、約２℃〜約８℃の温度において維持される、条項３８〜４６のいずれか一項に記載の改善。
【０３６３】
条項４９．試料が対象から得られた後〜検査が実施される時点の時間において、試料が混合されない、条項４２〜４６のいずれか一項に記載の改善。
【０３６４】
条項５０．対象に由来する、試料中のＵＣＨ−Ｌ１の量が、外傷性脳損傷の尺度として評価され、対象が、頭部への損傷を負った可能性がある、条項３４〜４９のいずれか一項に記載の改善。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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